## AMPLIFIKASI GEN COI (Cytochrome C  Oxidase Subunit I) PADA

## HOLOTHUROIDEA YANG DIKOLEKSI DARI KEPULAUAN RAJA AMPAT
Ninda Sahriyani 1 , Widodo 1 , Abdul Hamid A. Toha 2
1 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang
2 Jurusan Perikanan, Fakultas Peternakan, Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Negeri Papua, Manokwari,
Papua Barat
Ninda Sahriyani : ninda.sahriyani@gmail.com

## ABSTRAK
Kepulauan  Raja  Ampat  mempunyai  keanekaragaman  hewan  laut  yang  tinggi,  salah  satunya Timun  Laut  (Holothuroidea).  Tujuan  dilaksanakan  penelitian  ini,  yakni  mengamplifikasi  gen  COI  pada Holothuroidea  yang  dikoleksi  dari  Kepulauan  Raja  Ampat. Metode  yang  digunakan  pada  penelitian  ini yakni total DNA diisolasi dari jaringan menggunakan gSYNC TM DNA Extraction Kit GS100 (Gene Aid), kemudian  DNA  spesimen  UNP  106  diamplifikasi  berdasarkan  gen  COI  menggunakan  susunan  sekuen forward  COI  yakni  5’-GGCATCCAGAAGTTTACATCCT-3’  dan  sekuen  reverse  yakni  5’- TTGGAGATAGGCTTCTGTGGA-3’. Hasil penelitian menunjukkan bahwa spesimen UNP 106 berhasil diamplifikasi dengan ukuran amplikon sebesar 600-700 bp.
Kata kunci : Amplifikasi, COI, Timun Laut, UNP 106

## ABSTRACT
Raja  Ampat  Islands  have  highly  diversity  of  marine  animals,  such  as  Sea  Cucumbers (Holothuroidea).  The  aim  of  this  study  is amplification  based  on  COI  gene  markers  of  Holothuroidea which  collected  from  the  Raja  Ampat  Islands. DNA  total  was  isolated  from  the  tissue  using gSYNC TM DNA Extraction Kit GS100 (Gene Aid), DNA UNP 106 specimen was amplified based on COI gene using primer forward COI : 5’-GGCATCCAGAAGTTTACATCCT-3’ and reverse COI : 5’- TTGGAGATAGGCTTCTGTGGA-3’. The  results  showed  that  UNP  106  specimen  has  succesfully amplified with size of amplicon is 600-700 bp.
Keywords: Amplified, COI, Sea cucumber, UNP 106

## PENDAHULUAN
Kepulauan Raja Ampat merupakan wilayah di Provinsi Papua Barat yang mempunyai  keanekaragaman  hewan  laut  dan terumbu  karang  yang  tinggi  [1;2].    Salah  satu hewan  laut  yang  mempunyai  keberagaman tinggi,  yakni,  Timun  Laut  (Holothuroidea)  [3]. Timun  Laut  mempunyai  karakter  morfologi berupa tubuh yang berbentuk silinder menyerupai  mentimun,  berukuran  10-30  cm, kulit  bertekstur  kasar,  mempunyai  tentakel  dan papila  [4].  Namun,  karakter  tersebut  tidak memudahkan  bagi  peneliti  dalam  melakukan identifikasi  jenis  karena banyak  anggota  dari ordo-ordo Timun Laut yang mempunyai kesamaan  (cryptic  species)  ketika  didasarkan pada  puluhan  karakter  morfologi,  misalnya
bentuk tentakel dan keberadaan internal respiratory tree [5].
Maka dari itu, dibutuhkan teknik identifikasi secara molekuler, salah satu tahapannya yakni amplifikasi. Amplifikasi adalah  peningkatan  jumlah  urutan  DNA  target sebanyak  ribuan  bahkan  jutaan  kali  dari  jumlah DNA semula [6]. Tujuan dari penelitian ini yakni mengamplifikasi  gen  COI  pada  spesimen Holothuroidea  yang  dikoleksi  dari  Kepulauan Raja Ampat.

## METODE PENELITIAN
Koleksi  Spesimen.  Spesimen  dikoleksi dari  White  Arrow,  Aljui  Bay,  Pulau  Waigeo, Kepulauan  Raja  Ampat  pada  4  Juni  2013. Digunakan  satu  spesimen  dalam  penelitian  ini, yakni spesimen UNP 106.
Isolasi Total DNA dan Amplifikasi DNA Spesimen UNP 106. Total DNA spesimen 106  diisolasi  melalui  jaringan  menggunakan gSYNC TM DNA  Extraction  Kit  GS100  (Gene Aid) dengan prosedur isolasi mengikuti protokol dari  pabrik.  Amplifikasi  DNA  spesimen  UNP 106  menggunakan  primer  yang  dirancang  oleh [7]  dengan  susunan  sekuen  forward 5’-GGCATCCAGAAGTTTACATCCT Sekuen
reverse COI yakni 5’ TTGGAGATAGGCTTCTGTGGA
PCR  yang  digunakan,  yaitu  10 Extra  HotStart  ReadyMix  PCR  kit,  1 (Bovine  Serum  Albumin),  masing forward dan reverse sebanyak 1 spesimen  UNP  106. Program  PCR
digunakan,  yaitu hot  start  (95 denaturasi (95 0 C, 30 detik), annealing detik),  ekstensi  (72 0 C,  1  menit),  ekstensi  akhir (72 0 C, 1 menit) dengan setiap tahapan menggunakan  siklus  sebanyak PCR disimpan pada suhu-20 0 C. Uji  Kualitatif  Hasil  Isolasi  Total  DNA dan Amplifikasi DNA  Spesimen UNP 106 agarosa  dimasukkan  ke  dalam yang  berisi  350  ml  TBE  1x  pH  8. sebanyak  2  µL  diletakkan  di  aluminium  foil DNA  sebanyak  2  µL  dipipeting  bersamaan dengan  loading  dye  yang  telah  disiapkan, kemudian  dimasukkan  ke  dalam Besaran  voltase  diatur  pada  100  Volt, elektroforesis  dinyalakan  selama  lebih  kurang 30-45  menit  hingga  nampak  pita  mendekati  2 garis  penanda  terbawah.  Hasil  elektroforesis divisualisasikan  dengan  UV  transluminator  dan kemudian didokumentasikan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  Isolasi  Total  DNA 106.    Hasil  isolasi  total  DNA  diketahui  melalui uji kualitatif elektroforesis gel agarosa 1%
Keterangan :

## 1. DNA
Gambar 1. Hasil Uji Kualitatif Isolasi Total DNA
1
dan Amplifikasi DNA
Total DNA spesimen UNP isolasi  melalui  jaringan  menggunakan DNA  Extraction  Kit  GS100  (Gene dengan prosedur isolasi mengikuti protokol Amplifikasi  DNA  spesimen  UNP 106  menggunakan  primer  yang  dirancang  oleh
forward  COI  yakni GGCATCCAGAAGTTTACATCCT-3’. COI yakni 5’- TTGGAGATAGGCTTCTGTGGA-3’. Racikan 10  µL  Kapa  Taq Extra  HotStart  ReadyMix  PCR  kit,  10  µL  BSA ,  masing-masing  primer sebanyak 1 µL, 3 µL DNA
Program  PCR  yang (95 0 C,  3  menit), annealing (50 0 C, 30
),  ekstensi  akhir dengan setiap tahapan 30  siklus.  Hasil
Uji  Kualitatif  Hasil  Isolasi  Total  DNA DNA  Spesimen UNP 106. Gel dimasukkan  ke  dalam  chamber  Biorad yang  berisi  350  ml  TBE  1x  pH  8.  Loading  dye aluminium  foil  dan DNA  sebanyak  2  µL  dipipeting  bersamaan yang  telah  disiapkan, kemudian  dimasukkan  ke  dalam  sumuran. diatur  pada  100  Volt,  Chamber elektroforesis  dinyalakan  selama  lebih  kurang 45  menit  hingga  nampak  pita  mendekati  2 garis  penanda  terbawah.  Hasil  elektroforesis divisualisasikan  dengan  UV  transluminator  dan

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  Isolasi  Total  DNA  Spesimen  UNP diketahui  melalui uji kualitatif elektroforesis gel agarosa 1%.
Keterangan : DNA
Berdasarkan hasil elektoforesis gel agarosa menunjukkan bahwa total DNA spesimen UNP 106 berhasil diisolasi.
Hasil  Amplifikasi  DNA  Spesimen 106  Berdasarkan  Gen  COI. melalui elektroforesis gel agarosa 2% menunjukkan  bahwa  DNA  dari 106  berhasil  diamplifikasi  berdasarkan  gen  COI ditunjukkan  dengan  adanya  pita  yang  cukup tebal.
Keterangan  :
1.Amplikon UNP 106 2. 500 bp 3. 600 bp 4. 700 bp 5. 1000 bp
Gambar 2. Hasil Uji Kualitatif Ampifikasi  S UNP 106 Berdasarkan Gen COI.
Spesimen  UNP  106  mempunyai  ukuran amplikon  COI  sebesar  600 mempunyai  panjang  sekuen  sekitar  650bp Hal ini  menunjukkan  bahwa  spesimen  UNP  106 telah diamplifikasi sesuai target. merupakan  salah  satu  gen  yang  ada  di  Mt yang  sering  digunakan  untuk  proses  identifikasi jenis  organisme  secara  molekuler. yang  dimiliki  gen  COI  yakni  sp mengidentifikasi  suatu  jenis  organisme  hingga tingkat  spesies  [9]  dan  gen  tersebut sekuen gen yang terkonserv dengan baik [

## KESIMPULAN
Spesimen UNP 106 yang tergolong dalam kelompok  Holothuroidea  berhasil  diamplifikasi berdasarkan  gen  COI.  Amplikon  COI  dari spesimen  UNP  106  mempunyai  ukuran  600 bp.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih saya ucapkan kepada USAID yang  telah  mendanai  proyek  penelitian Biodiversity  of  Raja  Ampat  Islands Bapak  Abdul  Hamid  A. Ketua  Proyek  dan  Bapak  Widodo,  S.Si.,  M.Si., PhD.Med.Sc yang telah mendanai dan memberikan bimbingan selama penelitian.
1 2 3 4 5
Berdasarkan hasil elektoforesis gel agarosa menunjukkan bahwa total DNA
berhasil diisolasi. DNA  Spesimen  UNP Berdasarkan  Gen  COI.  Hasil  uji  kualitatif melalui elektroforesis gel agarosa 2% menunjukkan  bahwa  DNA  dari  spesimen  UNP 106  berhasil  diamplifikasi  berdasarkan  gen  COI ditunjukkan  dengan  adanya  pita  yang  cukup
Keterangan  : 1.Amplikon UNP 106 2. 500 bp 3. 600 bp 4. 700 bp
5. 1000 bp Hasil Uji Kualitatif Ampifikasi  Spesimen Berdasarkan Gen COI.
Spesimen  UNP  106  mempunyai  ukuran 600-700  bp.  Gen  COI mempunyai  panjang  sekuen  sekitar  650bp  [8]. Hal ini  menunjukkan  bahwa  spesimen  UNP  106 sesuai target. COI salah  satu  gen  yang  ada  di  Mt-DNA yang  sering  digunakan  untuk  proses  identifikasi jenis  organisme  secara  molekuler.  Kelebihan
yakni  spesifik  dalam mengidentifikasi  suatu  jenis  organisme  hingga
en  tersebut  mempunyai terkonserv dengan baik [10].

## KESIMPULAN
Spesimen UNP 106 yang tergolong dalam kelompok  Holothuroidea  berhasil  diamplifikasi berdasarkan  gen  COI.  Amplikon  COI  dari spesimen  UNP  106  mempunyai  ukuran  600-700

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih saya ucapkan kepada USAID yang  telah  mendanai  proyek  penelitian  Marine Biodiversity  of  Raja  Ampat  Islands  (MB-RAI).
Toha,  M.Si  sebagai dan  Bapak  Widodo,  S.Si.,  M.Si., ng telah mendanai dan selama penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
(1) Veron,  J.E.N.,  L.M.  Devantier,  E.Turak, A.L.Green,  S.Kininmonth,  M.S.Smith  & N.Petersoon.  2009.  Delineating  The  Coral Triangle.Galaxea.  Journal  of  Coral  Reef Studies.
(2) Sala,  R.,  Y.  Kabera  &  V.Rumereb.  2011. Destructive  Fishing  In  Coremap  II  Area Raja  Ampat.  Journal  of  Indonesia  Coral Reefs 1.
(3) Kerr, A.M & Junhyong, K. 2001. Phylogeny of  Holothuroidea  (Echinodermata)  inferred from morphology. Zoological Journal of the Linnean Society. 133: 63–81.
(4) Bordbar,  S.,  Anwar,  F  &  Saari,  N.  2011. High-value components and bioactives from sea  cucumbers  for  functional  foods  –  A review. Marine Drugs. 9, 1761–1805.
(5) Arndt,  A.,  C.  Marques.,  P.  Lambert  &
M.J.Smith.  1996.  Molecular  Phylogeny  of Eastern Pacific Sea Cucumbers (Echinodermata:  Holothuroidea)  Based  on Mitochondrial  DNA  Sequence.  Molecular
Phylogenetics And Evolution. Vol. 6, No. 3.
(6) Fatchiyah,  E.L.Arumningtyas,  S.Widyarti dan  S.  Rahayu.  2011.  Biologi  Molekular Prinsip Dasar Analisis. Erlangga. Jakarta
(7) SiGang, F.A.N., H.U. ChaoQun., W. Jing &
Z.  LvPing.  2011.  Characterization  of mitochondrial  genome  of  sea  cucumber
Stichopus horrens: A novel gene arrangement in
Holothuroidea. Life
Sciences. doi: 10.1007/s11427-011-4168-8.
(8) Ahmed, M.I. 2006. Morphological, Ecological  and  Molecular  examination  of the Sea cucumber species along the Red Sea
Coast of Egypt and Gulf of Aqaba, with the investigation  of  the  possibility  of  using DNA  barcoding  technique  as  a  standard method  for  Sea  cucumber  ID.  Thesis.
Marine Biology. University of Hull.
(9) Galtier,  N.,  B.  Nabholz.,  S.  Glemin  & G.D.D. Hurst. 2009. Mitochondrial DNA as a  marker  of  molecular  diversity:  a reappraisal.  Molecular  Ecology  18,  4541- 4550.
(10) Kamarudin, K.R. A. M. Rehan, R. Hashim, G.USUP,  H.  F.  Ahmad,  M.  H.  Anua  &  M. Y.  IDRIS.  2011.  Molecular  Phylogeny  of Holothuria  (Mertensiothuria)  leucospilota (Brandt 1835) as Inferred from Cytochrome
C  Oxidase  I  Mitochondrial  DNA  Gene Sequences.  Sains  Malaysiana  40(2):  125– 133.