J. Agroland 26 (1) : 58 -68 , April 2019 ISSN : 0854-641X E-ISSN :2407-7607

## KARAKTERISASI PATOGEN HAWAR DAUN BAKTERI SECARA FENOTIPIK PADA BAWANG MERAH ( ALLIUM CEPA
L.

## KELOMPOK AGGREGATUM)
Phenotypic Characterization of Bacterial Leaf Blight Pathogens on Shallot ( Allium cepa L. Aggregatum group)
Asrul 1) , Triwidodo Arwiyanto 2) . Bambang Hadisutrisno 2) dan Jaka Widada 2)
1) Fakultas Pertanian Universitas Tadulako, Kota Palu. Jln. Soekarno Hatta KM 5 Palu Timur,Kota Palu. E-mail: asrul1203@gmail.com
2) Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Jln. Flora 1, Bulaksumur, Yogyakarta 55281

## ABSTRACT
The  research  aimed  at  determining  the  types  of  pathogen  associated  with  bacterial  leaf blight  diseases  of  shallots.  The  bacteria  were  isolated  and  characterized  based  on  the morphological,  biochemical  and  physiological  morphology  of  their  colony  and  cell.    There  were eight isolates of pathogenic bacteria from pure culture.  Generally, the isolates have Gram-negative characters,  short  rod-shaped  cells,  have  peritrikus  flagellum  and  mucoid,  yellow  or  beige  colonies, round,  convex  or  flat  forms,  and  is  shiny.  The  isolates  react  positively  to  catalase,  urease,  levan, indole production, and tween 8 tests. They also can live at temperature between 20 – 37 0 C, pH 5 – 7 and tolerant to NaCl content ranging from 0 – 8.5%. The isolates react negatively to oxidases, reduce nitrates,  fluorescent  pigments,  arginine,  gelatin  and  starch.    Based  on  these  characteristics,  the isolates found generally have a closer resemblance to the properties of P. ananatis with a similarity coefficient of 88%  than bacteria X. axonopodis pv. allii with a similarity coefficient of 78%.  The symptoms  appeared  in  the  plant  leaves  were  wilted  (water  soaked),  shrinking,  curving  down, chlorosis, necrosis, and dieback.
Keywords :   Bacterial  leaf   blight, Pantoea  ananatis ,  Shallot,  and Xanthomonas  axonopodis pv. allii .

## ABSTRAK
Penelitian  ini bertujuan  untuk  menentukan jenis  patogen  yang  berasosiasi  dengan  bawang merah  sakit  hawar  daun  bakteri.Penelitian  dilakukan  dengan  metode  isolasi  dan  karakterisasi bakteri  berdasarkan  sifat  morfologi  koloni  dan  sel  bakteri,  serta  biokimiawi  dan  fisiologis.    Hasil isolasi dan karakterisasi diperoleh 8 isolat murni bakteri patogenik yang berasosiasi dengan bawang merah sakit.Umumnya isolat memiliki sifat gram negatif, sel berbentuk batang pendek, mempunyai flagel peritrikus, koloni berwarna kuning, atau krem, berbentuk bundar, cembung, rata, mucoid dan mengkilap.    Isolat  bereaksi  positif  terhadap  uji  katalase,  urease,  levan,  produksi  indol,  tween  80, dapat hidup pada suhu antara 20 - 37 O C, ph 5 - 7 dan toleran pada kandungan NaCl 0 - 8,5%.  Isolat bereaksi  negatif  terhadap  oksidase,  reduksi  nitrat,  pigmen  fluorescen,  arginine,  gelatin  dan pati.Berdasarkan  sifat-sifat  tersebut,  isolat  yang  ditemukan  umumnya  memiliki  kemiripan  lebih dekat  dengan  sifat-sifat  bakteri P.  ananatis (koofisien  kemiripan  88%)  dibanding  bakteri X. axonopodis pv. allii (koofisien  kemiripan  78%).    Gejala  yang  ditimbulkan  berupa  daun  layu kebasah-basahan ( water soaked ), mengkerut, melekuk kebawah, klorosis, nekrosis, dan mati pucuk.
Kata Kunci: Bacterial  leaf blight, Pantoea  Ananatis, Shallot  dan Xanthomonas  axonopodis  pv. Allii.

## PENDAHULUAN
Hawar  daun  bakteri  ( bacterial  leaf blight )  merupakan  salah  satu  penyakit penting  pada  bawang  sayuran  (genus Allium ),  seperti  bawang  bombay  ( Allium cepa L)  di  seluruh  dunia.  Penyakit  ini disebabkan  oleh Xanthomonas  axonopodis pv. Allii ( Xaa )  dan Pantoea  ananatis ( Pa ) (Schwartz et  al .,  2003).  Kedua  bakteri patogenik  mempunyai  tipe  gejala  yang hampir  sama,  yakni  daun  tampak  kebasah- basahan  ( water  soaked ),  layu,  terdapat bercak  klorosis  dan  nekrosis.    Pada  hawar daun Xanthomonas , bercak nekrosis berwarna  coklat  (Schwartz  &  Gent,  2005) dan  serangan  patogen  tidak  menyebabkan busuk  pada  umbi  (Gent et  al .,  2005), sedangkan  hawar  daun Pantoea ,  bercak nekrosis  berwarna  putih  (Goszczynska et al .,  2006)  dan  menimbulkan  busuk  pada umbi  ( center  rot  disease )  (Schwartz et  al ., 2003; Eric et al ., 2013).
Gejala  penyakit  bawang  bombay memiliki  kemiripan  dengan  gejala  hawar daun  bakteri  yang  pernah  terlihat  di  sentra produksi  bawang  merah    ( Allium  cepa L. kelompok  agregatum)  dan  bawang  wakegi ( Allium × wakegi Araki)  di  Indonesia, yaknidaun kebasah-basahan dan layu seperti tersiram  air  panas,  atau  berbekas  minyak tetapi  belum  diketahui  secara  jelas  spesies bakteri  patogeniknya.  Diduga  patogennya telah  berada  di  Indonesia  melalui  perdagangan benih  impor  dari  mancanegara.  Bakteri Xaa dan Pa diketahui  sebagai  patogen  terbawa benih (Rougmagnac et al ., 2004; Walcott et al., 2002),  sehingga  benih  menjadi  media yang  cocok  bagi  perpindahan  bakteri patogenik  tersebut.  Ini  berarti  peluang masuk  dan  menyebarnya  bakteri  patogenik menjadi  besar.  Duriat et  al .  (2004)  pernah melakukan identifikasi patogen pada sampel umbi  bawang  merah  impor  di  Pulau Jawa,tetapi tidak ditemukan adanya serangan  patogen  dari  kelompok  bakteri. Oleh  karena  itu,  penelitian  identifikasi patogen  saat  ini  lebih  diarahkan  pada sampel  daun  bawang  merah  sakit  di lapangan  berdasarkan  gejala  yang  diduga menyerupai hawar daun bakteri.
Identifikasi  bakteri  patogenik  dapat dilakukan  dengan  pendekatan  konvensional
(karakterisasi  fenotipik).  Sampai  saat  ini penggunaan  metode  konvensional  masih dipercaya untuk digunakan dalam identifikasi  bakteri  patogenik,  terutama dalam  kondisi  teknologi  yang  terbatas. Karakterisasi  fenotipik  penting  dilakukan untuk memberi gambaran mengenai morfologis  koloni  dan  sel,  maupun  sifat- sifat  fisiologis  dan  biokimiawi  bakteri patogenik  yang  menjadi  target.  Menurut Duveiller et  al . (1997), pengujian fisiologis dan biokimiawi merupakan metode konvensional  yang  masih  dapat  digunakan untuk identifikasi bakteri patogenik. Pendekatan konvensional ini dianggap telah cukup  digunakan  untuk  mengidentifikasi bakteri  karena  dengan  pengujian  tersebut sudah dapat membedakan sifat-sifat penting dari suatu spesies bakteri  patogenik  dengan spesies  lainnya.  Pengujian  sederhana  ini dapat  juga  digunakan  untuk  mengetahui identitas  suatu  bakteri  patogenik  sampai pada  tingkat  spesies.  Identifikasi  perlu dilakukan  agar  dapatmembantu usaha pengendalian  yang    tepat  terhadap  spesies yang bersangkutan dalam rangka mendukung keberhasilan kegiatan budidaya bawang  merah.  Karakterisasi  fenotipik (konvensional) ini bertujuan untuk menentukan  jenis  patogen  yang  berasosiasi dengan  bawang  merah  sakit  hawar  daun bakteri.

## METODE PENELITIAN
Pengambilan sampel. Pengambilan sampel bawang  yang  menunjukkan  gejala  hawar daun  bakteri  dilakukan  pada  bulan  Agustus –  September  tahun  2014  saat  memasuki akhir  musim  kemarau  di  sentra  produksi bawang merah (Kabupaten Bantul, Ciribon, Tegal,  Nganjuk)  dan  bawang  wakegi (Kabupaten  Sigi)  di  Indonesia.  Terdapat delapan  sampel  daun  bawang  merah  sakit yang  diambil  dengan  rincian:  Bantul  (2), Ciribon (3), Sigi (1), Tegal (1) dan Nganjuk (1). Selanjutnya, sampel dimasukkan dalam kantong  plastik,  kemudian  ditempatkan dalam ice box dan diuji di laboratorium.
Isolasi dan Pengamatan Morfologi Bakteri . Isolasi bakteri patogenik dilakukan dengan memotong jaringan daun pada batas antara  yang  bergejala  (sakit)  dan  sehat
menggunakan  skalpel  steril  (ukuran  0,5  x 0,5  cm).  Potongan  daun  disterilkan  melalui perendaman  dalam  larutan  alkohol  70% selama 1 menit, kemudian dibilas dalam air steril sebanyak 3 kali, dan dikeringanginkan diatas  kertas  filter  kering.  Selanjutnya, potongan  daun  dimasukkan  ke  dalam tabung  reaksi  berisi  larutan  PBS  ( Phospat Buffer  Saline )  steril  dan  digojok  agar ooze (massa  bakteri)  dari  jaringan  sakit  keluar. Suspensi yang terbentuk kemudian digoreskan (Goszczynska et al ., 2007) pada permukaan  medium  YPGA  ( Yeast  Peptone Glucose Agar ) (Janse, 2005) padat menggunakan  ooze  (sebelumnya  medium telah ditambahkan sikloheksimid 100 ppm). Koloni  yang tumbuh secara tunggal dengan karakteristik  berbentuk  bundar,  cembung, tepi  rata,  berlendir  ( mucoid ),  berwarna kuning  atau  krem,  dipindahkan  ke  medium YPGA  segar  beberapa  kali  menggunakan metode  gores  dan  diinkubasi  selama  3  -  5 hari    hingga  diperoleh  isolat  murni  dari biakan  tersebut.  Selanjutnya  8  isolat patogen  yang  berasal  dari  delapan  sampel dari  lokasi  yang  berbeda  dikarakterisasi. Karakteristik morfologis koloni yang diamati  meliputi  bentuk  koloni,  permukaan koloni,  tepi  koloni,  kepekatan,  wajah permukaan,  halus-kasar  permukaan,  warna koloni  dan  pigmen  fluoresen,  sedangkan pengamatan  morfologi  sel  meliputi  bentuk dan  ukuran  sel  bakteri  menggunakan mikroskop transmisi elektron (TEM).
Uji  Reaksi  Hipersensitif. Uji  reaksi hipersensitif dilakukan
dengan
menginjeksikan  suspensi  sel  bakteri  pada ruang  antar  sel  daun  bunga  pukul  4 ( Mirabilis  jalapa )  (Hibberd et  al .,  1996) menggunakan  alat  suntik  tanpa  jarum hingga membentuk lapisan kebasah- basahan  ( water  soaked )  dan  nekrotik. Pengamatan  perkembangan  gejala  nekrotik antara 24 – 72  jam setelah injeksi.
Uji  Postulat  Koch. Suspensi  disiapkan dengan  cara  menumbuhkan  biakan  murni isolat  patogen  hasil  isolasi  yang  telah dikulturkan  selama  48  jam,  kemudian ditambahkan  air  steril  sampai  suspensi menjadi  keruh,  atau  diencerkan  hingga mencapai konsentrasi 10 7 . Suspensi sel bakteri patogenik  diinokulasikan  ke  daun  bawang
menggunakan metode semprot menurut Nunez et al . (2002) yang telah dimodifikasi.
Uji  Patogenisitas  pada  Umbi. Delapan isolat  bakteri  patogenik  yang  berhasil diisolasi dari lapang diinokulasikan ke daun bawang  sehat  dan  setelah  menunjukkan gejala  hawar  daun  bakteri  kemudian digunakan  dalam  uji  patogenisitas  pada  umbi bawang  menggunakan  metode  injeksi  menurut Schwartz & Otto  (2000)  yang telah dimodifikasi. Perkembangan  gejala  penyakit  dimonitor setiap  hari  sejak  umbi  diinjeksi  sampai muncul  gejala,  kemudian  dibelah  untuk visualisasi  patogenisitas  patogen  dan  umbi yang  menunjukkan  gejala  penyakit  dicatat. Dalam  uji  patogenesitas  ini,  isolat  bakteri patogenik yang diuji pada umbi berasal dari jenis bawang merah yang sama.
Pengujian Sifat-sifat Fisiologis dan Biokimiawi. Uji  fisiologis  dan  biokimiawi menggunakan  sistem  pendekatan,  yaitu hasil yang diperoleh dari penelitian dibandingkan dengan hasil deskripsi bakteri sebelumnya.  Uji  ini  dilakukan  untuk mengetahui  karakteristik  isolat  patogen berdasarkan  reaksi  biokimiawi,  antara  lain uji  gram,  uji  OF,  uji  oksidase,  uji  katalase, uji  indol  dan  uji  penggunaan  sumber karbon.
Analisis  Data. Hasil  uji  fisiologis  dan biokimiawi semua isolat patogen digunakan sebagai  sumber  data  kemudian  dikonversi ke dalam bentuk data biner, yakni bila hasil uji  biokimia  bereaksi  positif  maka  diberi nilai  1  dan  bila  bereaksi  negatif  mendapat nilai  0.  Selanjutnya,  data  yang  diperoleh dimasukkan  kedalam  program  komputer Numerical  Taxonomy  and  Multivarite Analysis  System (NTSys)  versi  2.00  untuk penyusunan  dendogram  (Ogunjobi et  al., 2010). Hasil pengujian semua isolat patogen diperbandingkan  dengan  sifat-sifat  bakteri Xaa dan Pa yang  telah  dideskripsikan sebelumnya  oleh  Schaad et  al .  (2001), Kadota et  al .  (2000),  Roumagnac et  al . (2004),  Mergaert et  al .(1993),  Azad et  al .
(2000),  Coplin  &  Kado  (2001),  dan  Perez- y-Terron et  al .  (2009).  Perbandingan dilakukan  untuk  dianalisis  kemiripan  sifat
antara isolat-isolat  patogen  yang ditemukan dengan  bakteri  yang  telah  dideskripsikan sebelumnya melalui dendogram.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi, Morfologi Koloni dan Sel Bakteri.
Hasil  isolasi  dan  pengamatan  morfologi bakteri  pada  medium  YPGA  menunjukkan bahwa  semua  isolat  patogen  uji  memiliki karakteristik  koloni  berbentuk  bundar, permukaan  cembung,  tepi  rata,  berlendir ( mucoid ),  mengkilap,  tekstur  halus  dan berwarna  kuning,  atau  krem,  tidak  tembus cahaya  dan  koloni  bakteri  tidak  berpendar membentuk  warna  kehijauan  dibawah  sinar ultraviolet  (Gambar  1).    Secara  umum, karakteristik  ini  memiliki  kesamaan  baik dengan  koloni  bakteri P.  ananatis (Janse, 2005;  Alippi  &  Lopez,  2010;  Zaid et  al ., 2012)  maupun Xanthomonas spp.  (Schaad et  al .,  2001;  Rougmagnac et  al .  2004; Mortensen et  al .,  2011;  Schumann    & D’Arcy, 2010).
Hasil  pengamatan  morfologis  sel menggunakan  Mikroskop  Elektron  Transmisi (TEM) menunjukkan karakteristik sel berbentuk  batang  pendek,  lurus  dengan ukuran panjang 1,2 - 1,4 μm dan lebar 0,6 -
0,8  μm.  Ujung  sel  membulat,  tidak berkapsul  dan  tidak  membentuk  spora, mempunyai flagel
yang dapat
menggerakkan  bakteri  secara  aktif  (motil) dengan  bentuk flagel  peritrikus yang tersebar  pada  seluruh  permukaan  sel. Karakteristik isolat-isolat patogen ini umumnya  memiliki  kemiripan  dengan  sel bakteri Pa yang  telah  dilaporkan  oleh Grimont  &  Grimont  (2006)  dan  Mondal et al . (2011).  Sebaliknya pada Xaa , sel bakteri mempunyai  bentuk flagel  polar  tunggal (Schwartz & Mohan, 2008) yang menempel pada  salah  satu  ujung  selnya  sehingga berbeda dengan isolat yang ditemukan.
Uji  Reaksi  Hipersensitif .  Hasil  uji  reaksi hipersensitif  menunjukkan  bahwa  semua isolat patogen menimbulkan respon nekrosis  pada  daun  bunga    pukul  4 ( Mirabilis  jalapa )  (Gambar  2).  Respon nekrosis  ini  merupakan  karakteristik  dari reaksi  hipersensitif  (Alarcon et  al .,  1998).
Isolat  patogen  yang  dapat  menimbulkan
reaksi  hipersensitif  pada  daun  bunga  pukul 4 merupakan bakteri yang bersifat patogen.
Uji  Postulat Koch. Hasil uji postulat Koch pada  daun  bawang  merah  membuktian bahwa  isolat-isolat  patogen  uji  tersebut mampu  menimbulkan  gejala  seperti  yang ditemukan  di  lapangan.  Gejala  tersebut meliputi kebasahan-basahan ( water soaked ), layu, lunak, berkerut, berwarna hijau pucat, coklat,  atau  hampir  putih  (klorosis), mengering  berwarna  putih  atau  coklat (nekrosis),  dan  mati  pucuk  (Gambar  3). Menurut  Yousef  (2008),  uji  postulat  Koch dikatakan  berhasil  jika  patogen  yang diinokulasikan  ke  tanaman  menimbulkan gejala  yang  serupa  dengan  gejala  awal tanaman  sakit.  Gejala  penyakit  bawang merah ini memiliki kesamaan dengan gejala hawar  daun Pantoea pada  bawang  bombay seperti  yang  dilaporkan  oleh  Goszczynska et al . (2006).
Pengujian  postulat  Koch  ini  telah mendukung  hasil  uji  reaksi  hipersensitif yang  menunjukkan  bahwa  semua  isolat tersebut  merupakan  bakteri  patogenik  pada bawang merah.
Gambar 1. Karakteristik  koloni  bakteri  uji  yang ditumbuhkan  pada  medium  YPGA  (A); Karakteristik  sel  bakteri  uji  yang  diamati dengan menggunakan TEM.
Gambar  2.  Uji  reaksi  hipersensitif:  bercak nekrosis berwarna putih kecoklatan pada daun  bunga  pukul  4  (A);  gejala watersoaked pada  daun  bawang merah (B)
Gambar 3. Uji postulat Koch: gejala hawar daun bakteri pada bawang merah di lapangan (A) mempunyai  kemiripan  dengan  gejala di rumah kasa (B)
Gambar 4. Uji patogenisitas pada umbi bawang merah:  kontrol  (A),  tampak  gejala penyakit (B)
Uji  Patogenisitas  pada  Umbi. Hasil  uji patogenisitas  menunjukkan  bahwa  bakteri patogenik  asal  daun  bawang  merah  mampu menginfeksi  dan  menimbulkan  gejala  penyakit pada umbinya, sedangkan pada kontrol tidak menyebabkan  gejala  penyakit  (Gambar  4). Gejala  penyakit  yang  teramati  berupa jaringan bagian dalam umbi yang terinfeksi menjadi  lebih  gelap,  berwarna  agak kecoklatan,  lunak,  agak  kebasahan  tetapi tidak  berair,  sedikit  menimbulkan  bau busuk,  dan  infeksi  meluas  melampaui tempat inokulasi.
Gejala  tersebut  memiliki  kesamaan dengan  gejala  penyakit  yang  dilaporkan
oleh  Schwartz  &  Mohan  (2008)  bahwa patogen  penyebab  penyakit  hawar  daun bakteri    pada  bawang  bombay  akan menginvasi umbi dan menyebabkan jaringan umbi yang  terinfeksi  akan  melunak,  berair,  dan membusuk.    Pembusukan  terjadi  kemungkinan karena  kehadiran  patogen  sekunder  atau saprofit  yang  menyerang  bagian  tanaman yang  terinfeksi.  Hasil  penelitian  Eric et  al . (2013) menunjukkan bahwa selain menginfeksi daun bawang bombay, patogen
P. ananatis juga dapat menyebabkan infeksi pada umbinya.
Analisis Hasil Uji Fisiologis dan Biokimiawi. Hasil  uji  fisiologis  dan biokimiawi delapan isolat bakteri patogenik asal  daun  bawang  merah  sakit  dan  dua bakteri  penyebab  penyakit  hawar  daun acuan  sebagai  pembanding  ( X.  axonopodis pv. allii dan P.  ananatis )  ditampilkan  pada Tabel 1.  Pada Tabel 1 terlihat bahwa semua isolat menunjukkan karakteristik dasar yang khas  untuk  spesies P.  ananatis seperti bakteri bersifat oksidatif/ fermentatif, produksi  indol,  dan  bakteri  tidak  dapat menghidrolisis gelatin. Selanjutnya, hasil uji fisiologis  dan  biokimiawi  ditransformasikan  ke dalam  bentuk  dendogram  pada  Gambar  5.  Pada dendogram  terlihat  bahwa  seluruh  isolat mempunyai koefisien kemiripan antara 78 - 100%. Isolat CR11, CR14, TG24, PL7, dan BT14  menunjukkan  kemiripan  sifat,  atau karakteristik  yang  sangat  identik  (koefisien kemiripan  100%)  dan  berada  dalam  satu klaster  yang  terpisah  dengan  isolat  lainnya. Demikian  pula,  isolat  CR30  dan  NG25 memiliki  kesamaan  sifat  yang  identik (koefisien kemiripan 100%).
Menurut  Shegro et  al .  (2013), semakin  tinggi  nilai  koefisien  kemiripan maka  hubungan  individu-individu  dalam suatu  populasi  semakin  dekat.  Oleh  karena itu, isolat-isolat yang mempunyai kemiripan sifat  yang  identik  kemungkinan  berada dalam  satu  kelompok  strain,  atau  spesies bakteri  yang  sama.  Secara  umum,  isolat- isolat patogen asal daun memiliki kemiripan sifat  sebesar  88%  terhadap  bakteri Pa dan 78%  terhadap  bakteri Xaa berdasarkan reaksi fisiologis dan biokimiawi.
Tabel 1. Karakteristik  (sifat-sifat)  isolat  bakteri  patogenik  dari  daun  bawang  merah berdasarkan uji biokimiawi dan fisiologis.
Karakteristik bakteri Isolat bakteri 1 2 3 4 5 6 7 8 A B Reaksi gram - - - - - - - - - - Uji O-F O/F O/F O/F O/F O/F O/F O/F O/F O/F O Oksidase - - - - - - - - - - Katalase + + + + + + + + + + Urease + + - - + + + - - - Reduksi nitrat - - + + - - - - - - Levan + + + + - + + + Pigmen fluorescen - - - - - - - - Dehidrolase arginin - - - - - - - - - - Produksi indol + + + + + + + +
+ - Hidrolisis : Gelatin - - - - - - - - - + Pati - - - - - - - - + Tween 80 + + + + + + + + +
Sumber karbon:
Arabinosa + + + + + + + + +
Selobiosa + + + + + + + +
+ + Fruktosa + + + + + + + +
+ + Glukosa + + + + + + + +
+ + Sukrosa + + + + + + + +
+ + Laktosa + + + + + + + +
+ + Trehalosa + + + + + + + + + + Sorbitol - - - - - - - - + Dulsitol - - - - - - - - - Gliserol + + + + + + + + + + DL-arginin - - - - - - - - Pengaruh suhu: 4 O C + + + + + + + + + 10 O C + + + + + + + + 20 O C + + + + + + + + 25 O C + + + + + + + + 37 O C + + + + + + + + + 41 O C + + + + + + + + - - Pengaruh pH: 4 + + + + + + + + 4,5 + + + + + + + + 5 + + + + + + + + 6 + + + + + + + + 7 + + + + + + + + 8,5 + + + + + + + + 10 + + + + + + + +
Pengaruh NaCl:
0 + + + + + + + + 2 + + + + + + + + 4 + + + + + + + + + + 6 + + + + + + + + 8 + + + + + + + + 10 + + + + + + + +
Keterangan
= 1. CR11 4. NG25 7. BT14 A. Pa menurut Perez-y-Terron et al . (2009), Azad et al . (2000), Mergaert et al .(1993) dan Coplin & Kado (2001) 2. CR14 5. TG24 8. BT29 3. CR30 6. PL7 B. Xaa menurut Schaad et al ., 2001, Kadota et al ., 2000 Roumagnac et al ., 2004
Pada uji OF, semua isolat uji terlihat bersifat  oksidatif/  fermentatif  (anaerob fakultatif) yang menunjukkan bahwa bakteri dapat  tumbuh  dan  bertahan  hidup  baik dalam  suasana  oksigen  (aerob)  maupun tanpan  oksigen  (anaerob).  Dalam  kondisi anaerob,  bakteri  dapat  melakukan  proses metabolisme  melalui  fermentasi alkohol, asam  laktat,  atau  asam  sitrat  untuk menghasilkan energi. Pada fermentasi asam laktat bakteri akan mengoksidasi karbohidrat  (glukosa)  menjadi  asam  laktat (asam  susu)  dan  energi  (Pelczar  &  Chan, 2008)  untuk  pertumbuhannya.  Bakteri Pa diketahui bersifat anaerob fakultatif (Mergaert et  al .,  1993).  Namun  umumnya bakteri lebih cenderung melakukan metabolisme  respirasi  jika  tersedia  oksigen bebas  (aerob)  karena  akan  menghasilkan energi  yang  lebih  besar  (Pelczar  &  Chan, 2008).  Sebaliknya, Xaa bersifat  oksidasi (aerob)  (Schaad et  al .,  2001),  yakni  bakteri memerlukan  O 2 dari  udara  bebas  dalam melakukan  proses  metabolisme  sel  (respirasi) dengan  mengoksidasi  karbohidrat  (glukosa) menjadi  CO 2 dan  H 2 O,  sedangkan  energi yang diperoleh dari hasil oksidasi digunakan  oleh  bakteri  tersebut  (Yeung, 2011).  Udara  bebas  diperlukan  untuk memecahkan zat-zat yang diperlukan bakteri  dalam  hidupnya.  Tanpa  adanya oksigen  (proses  fermentasi),  bakteri  ini tidak dapat tumbuh.
Seluruh  isolat  patogen  uji  dapat membentuk  indol  sebagai  sumber  karbon (bereaksi  positif).  Menurut  Coutinho  & Venter (2009), bakteri Pa dapat memproduksi  indol  (Coutinho  &  Venter , 2009). Sebaliknya Xaa tidak dapat menghasilkan  indol  (Roumagnac et  al ., 2004)  meskipun  kedua  patogen  merupakan penyebab penyakit hawar daun bakteri pada tanaman yang sama. Pembentukan indol ini menjadi  pembeda  yang  sangat  mendasar dalam  klasifikasi  antara  kedua  patogen. Indol  merupakan  senyawa  yang  mengandung nitrogen  yang  terbentuk  sebagai  hasil  pemecahan triptophan (Mukherjee, 2010), sedangkan triptophan adalah asam amino esensial yang
dapat  teroksidasi  oleh  aktivitas  enzimatik bakteri  (Cappuccino  &  Sherman,  2005). Pemecahan asam  amino triptophan menjadi produk  metabolik  seperti  amoniak,  asam piruvat,  dan  indol  dilakukan  oleh  enzim triptophanase (Cappuccino  &  Sherman, 2005) yang merupakan hasil sekresi bakteri. Amoniak dan asam piruvat hasil pemecahan akan dimetabolisme kembali untuk menghasilkan energi, sedangkan indol tidak dimetabolisme  (Benson  &  Brown,  2004) tetapi  dimanfaatkan  sebagai  sumber  karbon oleh  sebagian  bakteri  (Cappuccino  & Sherman,  2005).  Pengujian  indol  sangat penting  dilakukan  karena  tidak  semua bakteri  mampu  menghidrolisis  asam  amino triptophan membentuk indol. Produksi indol bukan merupakan karakteristik yang terdapat  pada  setiap  bakteri  sehingga  dapat digunakan  untuk  klasifikasi  bakteri.  Oleh karena  itu,  keberadaan  indol  pada  bakteri bersifat spesifik yang mengindikasikan sifat fenotip  yang  khusus  sehingga  sangat bermanfaat untuk identifikasi bakteri.
Selanjutnya,semua  isolat  uji  tidak dapat menghidrolisis gelatin (reaksi negatif) pada  uji  gelatin.  Reaksi  negatif  juga ditunjukkan  oleh Pa pada  uji  yang  sama (Coplin & Kado, 2001). Hal ini menandakan  bahwa  bakteri  tersebut  tidak mampu menghasilkan enzim gelatinase dan mendegradasi  gelatin  menjadi  asam  amino. Sebaliknya, Xaa bereaksi  positif  terhadap uji gelatin (Roumagnac et al ., 2004; Kadota et al ., 2000).
Isolat CR11, CR14, TG24, PL7, dan BT14  mampu  menghasilkan  enzim  urease dan  membentuk  klaster  4  (Gambar  5). Enzim  urease berperan dalam menyediakan energi  internal  dan  eksternal  bakteri  untuk menggunakan  urea,  atau  hidroksi  urea sebagai sumber  nitrogen (Suhartono, 1989).  Produksi  enzim  urease  ini  menjadi pembeda  ke  lima  isolat  tersebut  terhadap isolat  CR30,  NG25,  BT29,  serta Xaa dan Pa .  Selanjutnya,  isolat  CR30,  NG25  dan BT29  membentuk  satu  kelompok  tersendiri (klaster  5)  dan  terpisah  dengan  isolat lainnya berdasarkan ketidakmampuan
ketiga  isolat  tersebut  menghasilkan  enzim urease.    Schaad et  al .  (2001)  melaporkan bahwa Xaa (klaster  1)  tidak  mampu menghasilkan  enzim  urease,  demikian  pula Pa pada  klaster  3  (Perez-y-Terron et  al ., 2009).
Nilai positif pada penggunaan sumber  karbon  menunjukkan  bahwa  semua isolat uji mempunyai kemampuan melakukan fermentasi karbohidrat (mendegradasi  gula)  dan  menghasilkan produk  akhir  berupa  asam  organik.  Satu- satunya  komponen  karbohidrat  yang  tidak dapat  digunakan  sebagai  sumber  karbon oleh seluruh isolat uji adalah sorbitol (reaksi negatif), sedangkan bakteri pembanding Pa bereaksi  positif  terhadap  sumber  karbon tersebut  (Coplin  &  Kado,  2001).  Sebagian besar bakteri membutuhkan senyawa karbon  organik  (gula  dan  karbohidrat) untuk  keberlangsungan  hidupnya  tetapi beberapa  diantaranya  memerlukan  zat karbon dalam bentuk senyawa karbondioksida  (CO 2 )  sebagai sumber karbon utama.  Sumber  karbon  dibutuhkan sebagai nutrisi untuk membentuk energi dan menyusun komponen-komponen sel (Pelczar & Chan, 2008).
Semua  isolat  bakteri  yang  diuji mampu  tumbuh  hingga  pada  suhu  41 0 C, tetapi telah dilaporkan bahwa Pa (Mergaert et  al .,  1993)  dan Xaa (Kadota et  al .,  2000) tidak  dapat  tumbuh  pada  suhu  tersebut. Perbedaan lingkungan habitat  bakteri  untuk
tumbuh dan berkembangbiak diduga menjadi  penyebab  terjadinya  perbedaan faktor-faktor  ekologi  yang  lain  sehingga akan mempengaruhi sifat-sifat  fisiologi  dan biokimiawi  diantara  bakteri.  Di  Eropa  dan Amerika bawang bombay banyak dibudidayakan pada kondisi iklim subtropik, sedangkan di Indonesia memiliki kondisi  iklim  tropik  yang  sangat  sesuai untuk penanaman bawang merah.
Hal ini memungkinkan bakteri Pa di daerah tropik mampu tumbuh dan memperbanyak  diri  pada  kondisi  suhu ekstrim. Menurut
Suwanto (1995), karakteristik  bakteri berdasarkan  sifat fenotipik seringkali berbeda karena perbedaan  ekspresi  gen  yang  dipengaruhi oleh  faktor  lingkungan.  Informasi  yang diperoleh berdasarkan sifat fenotipik seringkali  memberikan  hasil  yang  tidak konsisten  karena  karakter  yang  terlihat bukan  hanya  menggambarkan  informasi secara genetik tetapi juga sudah dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Berdasarkan dendogram,  dapat  diperkirakan  bahwa semua  isolat  patogen  yang  diuji  cenderung memiliki hubungan kekerabatan lebih dekat dengan spesies Pa yang dideskripsikan oleh Mergaert et  al .  (1993),  Azad et  al .  (2000), Coplin & Kado (2001), dan Perez-y-Terron et  al .  (2009)  dari  pada Xaa .  Dengan demikian,  seluruh  isolat  asal  daun  bawang merah diduga merupakan bakteri Pa karena kemiripan  sifat  fisiologis  dan  biokimiawi yang lebih dekat.
Gambar 5.   Dendogram yang menunjukkan hubungan kemiripan antara 8 isolat bakteri patogenik asal  daun  bawang  merah  dengan  strain  acuan Pantoea  ananatis menurut  Perez-y- Terron et  al .  (2009),  Azad et  al .  (2000),  Mergaert et  al .(1993)  dan  Coplin  &  Kado (2001)  yang  dikonstruksi  berdasarkan  karakteristik  fenotipik  (biokimiawi  dan fisiologis) menggunakan algoritme UPGMA

## KESIMPULAN
Berdasarkan  karakteristik  morfologi koloni  dan  sel  bakteri,  fisiologi  dan biokimiawi,  patogen  yang  bertanggung
jawab terhadap timbulnya penyakit hawar daun  pada  bawang  merah  dan  bawang wakegi  di  sentra  produksi  di  Indonesia cenderung teridentifikasi sebagai P.ananatis.

## DAFTAR PUSTAKA
Alarcon,  C.,  J.Castro,  F.Munoz,  P.Arce-Johnson,  &J.Delgado.    1998. Protein(s)  from  the  gram- positive bacterium  Clavibacter michiganensis subsp. michiganensisinduces a  hypersensitive response in plants .  Bacteriology 88 (4): 306 -310
Alippi, A. M. & Lopez, A. C.  2010. First report of leaf spot disease of maize caused by Pantoea ananatis in Argentina.  Plant Disease 94 (4): 487
Azad,  H.  R.,  Holmes,  G.  J.,  &  Cooksey,  D.  A.    2000. A  new  leaf  blotch  disease  of  sudangrass caused by Pantoea ananas and Pantoea stewartii. Plant Disease, 84(9):973-979.
Cappuccino,  J.G.  &  Sherman,  N.  2005. Microbiology :  A  Laboratory  Manual  7th  ed.  Pearson Education, Inc., Publishing as Benjamin Cumming, San Francisco, CA 94111, USA
Coplin,  D.  L.    &  C.  I.  Kado.    2001.    Pantoea.    In:  Schaad,  N.  W.,  J.  B.  Jones,  &  W.  Chun. Laboratory  Guide  for  Identification  of  Plant  Pathogenic  Bacteria .    Third  Edition.    APS Press.  The American Phytopathology Society. St. Paul, Minnesota.
Coutinho,  T.  A.  &  Venter,  S.  N.  2009. Pantoea  ananatis : an  unconventional  plant  pathogen. Molecular Plant Pathology, 10: 325–335.
Duriat, A. S., Ganaeni, N., Widjaya, E. S., Gunawan, O. S., Kirana, R., Gaswanto, R.,Wulandari, A. W.,  Sulastrini,  I.,  Ratnawati,  M.  L.,  J.  M.  van  der  Wolf  &  van  der  Zouwen,  P.  S.2004. A survey  on  seed  borne  disease  in  tomato,  pepper  and  shallot  in  2004. Plant  Research International AA Wagebingen, the Netherlands.
Duveiller, E., Bragard, C., Rudolph, K.  & Fucikovsky, L.  1997. General concepts and methodes for the identification of pathogenic bacteria of wheat. In : Duveiller, E., L. Fucikovsky and K.  Rudolph.  The  Bacterial  Diseases  of  Wheat  Concepts  and  Methods  of  Disease Management, CIMMYT, Mexico.
Eric A. Carr, E. A., Zaid, A. M., Bonasera, J. M., Lorbeer, J. W.  & Beer, S. V.  2013. Infection of onion leaves by Pantoea ananatis leads to bulb infection .  Plant diseases, 94 (7): 916.1 - 916.2
Janse, J. D.  2005. Phytobacteriology: Principles and Practice . CABI Publishing, Cambridge, USA
Kadota, I., Uehara, K., Shinohara, H. & Nishiyama, K.  2000. Bacterial blight of welsh onion : a new disease caused by Xanthomonas axonopodis pv. allii  pv. nov .  The Journal of General Plant Pathology, 66: 310 – 315.
Mergaert, J., L. Verdonck & K. Kersters.  1993. Transfer of Erwinia ananatis (synonym, Erwinia uredovora) and Erwinia stewartii to the genus Pantoea emend as Pantoeaananas (Serrano, 1928)  comb.  Nov.  and  Pantoea  stewartii  (Smith  1989)  comb.  Nov.,  respectively,  and decription of Pantoea stewartii subsp. indologenes .  Int. J. Syst Bacteriology, 43: 162 – 173
Mondal,  K.  K., Mani, C., Singh, J., Kim, J. G.  & Mudgett, M. B.   2011. A new leaf blight of rice caused by Pantoea ananatis in India .  Plant Disease 95 (12): 1582
Mortensen, C. N., Ole, S. Lund, Adriko, J., Kubiriba, J., Mbega, E. R., Mabagala, R.B., Bila, J., & Mondjane,  A.M.  2011. PCR  diagnosis  of  Xanthomonas  campestris  pv.  musacearum. Technical Bulletin .  Research Outputs fro m Enreca pro ject Life-731.  Denmark.
Mukherjee,  K.  L.    2010. Medical  Laboratory  Technology:  A  Procedure  Manual  for  Routine Dagnostic Test. 2nd Edition.  Tata McGraw-Hill, New Delhi
Ogunjobi,  A.  A.,  Fagade,  O.E.  &  Dixon,  A.G.O.  2010. Physiological  studies  on  Xanthomonas axonopodis  pv  manihotis  (Xam)  strains  isolated  in  Nigeria .  European  Journal  of Biological Sciences 2 (4): 84-90
Pelczar,  M.J.  &  E.C.S.  Chan.  2008. Dasar-dasar  Mikrobiologi  1 .  Penerjemah:  R.S.  Hadioetomo dkk. Elements of Microbiology. UI Press. Jakarta. 525-560.
Pérez-y-Terrón, R., M. C. Villegas, A. Cuellar, J. Muñoz-Rojas, M. Castañeda-Lucio, I. Hernández- Lucas,  R.  Bustillos-Cristales,  L.  Bautista-Sosa,  J.  A.  Munive,  R.  Caicedo-Rivas  and  L.  E. Fuentes-Ramírez. 2009. Detection of Pantoea ananatis, causal agent of leaf spot disease of maize, in Mexico. Australasian Plant Disease Notes. 4: 96 –99
Roumagnac,  P.,  Gagnevin,  L.,  Gardan,  L.,  Sutra,  L.,  Manceau,  C.,  Dickstein,  E.  R.,  Jones,  J.  B., Rott,  P.  &  Pruvost,  O.  2004. Polyphasic  characterization  of  Xanthomonas  isolated  from onion, garlic and welsh onion (Allium spp.) and their relatedness to different Xanthomonas species . International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 15 – 24.
Schaad,  N.  W.,  Jones,  J.  B.  &  Lacy,  G.  H.  2001. Xanthomonas.  In:  Laboratory  guide  for identification of plant pathogenic bacteria. Third Edition N. W. Schaad, J. B. Jones and W. Chun, APS Press, 3340 Pilot Knob Road, St. Paul, MN, 55121-2097, USA.
Schaad,  N.W.,  Jones,  J.B.  &    Chun,  W.  2001. Laboratory  Guide  for  Identification  of  Plant Pathogenic  Bacteria .  Third  Edition.  APS  Press.  St.  Paul  Minnessota.  Pathogenic  Bacteria. Third Edition. APS Press. St. Paul Minnessota.
Schumann  &  D'Arcy.  2010. Essential  Plant  Pathology. Second  Edition.  The  American Phytopathological Society.  St. Paul, Minnesota, USA.
Schwartz, H F & Otto, K.  2000. First report of a leaf blight and bulb decay of onion by Pantoea ananatis in Colorado . Plant Disease, 84 (7): 808
Schwartz,  H.  F.  &  Gent,  D.  H.  2005. Diseases  :  Xanthomonas  Leaf  Blight  of  Onion .    Gardening Series No. 2.951.  Colorado State University, USA.
Schwartz, H. F. & S. K. Mohan.  2008. Compendium of onion and garlic diseases .  APS Press, The American Phytopathological Society, USA.
Schwartz,  H.  F.,  Otto,  K.  L.  &  Gent,  D.  H.    2003. Relation  of  temperature  and  rainfall  to development of Xanthomonas and Pantoea leaf blights of onion in Colorado . Plant Disease 87: 11 – 14
Schwartz,  H.  F.,  Otto,  K.  L.  &  Gent,  D.  H.    2003. Relation  of  temperature  and  rainfall  to development of   Xanthomonas  and  Pantoea  leaf  blights  of  onion  in  Colorado .    Plant Disease 87: 11 – 14
Shegro, A.,  Labuschagne, M. T., van Biljon, A. & Srhargie, N. G.  2013. Assessment of genetic diversity  in  sorghum  accessions  using  amplified  fragment  length  polymorphism  (AFLP) analysis. African Journal of Biotechnology, 12 (11): 1178-1188
Suhartono,  M.  T.  1989. Enzim  dan  Bioteknologi .  Departemen  Pendidikan  dan  Kebudayaan Direktorat  Jenderal  Pendidikan  Tinggi.  Pusat  Antar  Universitas  Bioteknologi.  Institut Pertanian Bogor.
Suwanto, A. 1995. Bacterial fingerprinting in the investigation of hospital infection . P. 24 – 30. In: Proceeding of Asean-Japan Seminar and Workshop on Hospital Infection. Y. Ngeow and Y. Hiramatsu (Eds). Kuala Lumpur, Malaysia.
Walcott,  R.  R.,  Gitaitis,  R.  D.,  Castro,  A.  C.,  Sanders,  F.  H.  &  Diaz-Perez,  J.  C.    2002. Natural infestation of onion seed by Pantoea ananatis causal agent of center rot .  Plant Disease 86: 106 – 111.
Yousef, A. E.  2008. Detection of Bacterial Pathogens in Different Matrices: Current Practicesand Challenges.  In: Principles of Bacterial Detection. Zourob, M., S. Elwary   dan  A.  Turner. Springer Science+Business Media, LLC.  Canada.Zaid, A. M., Bonasera, J. M.  & Beer, S. V. 2012.OEM— A new medium for rapid isolation of onion- pathogenic and onion- associated bacteria. Journal of Microbiological Methods 91 : 520  – 526
Zaid,  A.  M.,  Bonasera,  J.  M.    &  Beer,  S.  V.    2012. OEM—A  new  medium  for  rapid  isolation  of onion-  pathogenic  and  onion-associated  bacteria. Journal  of  Microbiological  Methods  91: 520–526