e-ISSN: 2549-3116 , p-ISSN: 2085-3653
http://jurnal.unimed.ac.id/2012/index.php/jpk
Vol. 9, No. 1, April 2017, p.265-272
Pemurnian Pretrombin-2 Manusia Rekombinan di Escherichia coli untuk Produksi Trombin sebagai Komponen Lem Fibrin
Purification of Recombinant Human Prethrombin-2 in Escherichia coli for Thrombin Production as Fibrin Glue Components
Saronom Silaban 1 *; Iman Permana Maksum 2 ; Khomaini Hasan 3 ; Sutarya Enus 4 ; Toto Subroto 2 ; Soetijoso Soemitro 2
1 Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Negeri Medan, Medan-Indonesia
2 Departemen Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Padjadjaran, Bandung-Indonesia
3 Pusat Penelitian Biosains dan Bioteknologi, Institut Teknologi Bandung, Bandung-Indonesia 4 Pusat Mata Nasional, Rumah Sakit Mata Cicendo, Bandung-Indonesia
* Korespondensi: saronomsilaban@unimed.ac.id
Abstrak: Pretrombin-2 (PT2) adalah precursor trombin yang berperan mengubah fibrinogen menjadi fibrin untuk proses penutupan luka. Bahan ini dapat diterapkan sebagai pengganti teknik jahitan bedah mata. Sistem pemurnian yang  dimediasi  intein  untuk  memurnikan  protein  menarik  untuk  dikembangkan,  karena  protein  diperoleh  dengan satu  tahap  pemurnian,  mampu  melakukan  pemotongan  sendiri  ( self-splicing ),  protein  dapat  difusikan  pada (pemotongan PT2 dari penanda intein terinduksi pH dan suhu) dan pada C-terminal (pemotongan PT2 dari penanda intein  terinduksi  pereaksi  tiol).  Dalam  studi  ini,  kami  memurnikan  fusi  PT2  hasil  ekspresi E.  coli BL21(DE3) ArcticExpress  dalam  kolom  matriks  kitin  yang  dimediasi  intein.  PT2  difusikan  dengan  suatu  tag  pada  posisi  N- terminalnya,  yang  mengandung  urutan  pengode  intein  SspDnaB  diikuti  oleh  domain  pengikat  kitin  (CBD). Selanjutnya  fusi  PT2  diekspresikan  pada  inang E.  coli ,  selanjutnya  dimurnikan  dalam  kolom  matriks  kitin.  Proses pemotongan PT2 dari penanda intein diinduksi perubahan pH dan suhu dalam kolom.Fusi PT2 berhasil dimurnikan dalam matriks kitin yang dimediasi intein.  Pemotongan  fusi PT2 dari penanda intein terinduksi buffer pH  6,5 dan suhu inkubasi 25 o C selama 48 jam.
Kata kunci: E. coli, ekspresi, pemurnian dimediasi intein, perubahan pH dan suhu, PT2
Abstract : Pretrombin-2 (PT2) is a thrombin precursor that plays a role in converting fibrinogen to fibrin for the process  of  wound  recovery.  This  material  can  be  applied  instead  of  eye  surgery  suture  technique.  The  intein- mediated  refining  system  to  purify  the  protein  is  attractive  to  be  developed,  since  the  protein  is  obtained  by  one purification step, capable of self-splicing, the protein can be diffused in to the N-terminal (PT2 cutting of the intein induced  marker  changes  in  pH  and  temperature)  and  on  the  C-terminal  (cutting  PT2  from  the  intein-induced marker of the thiol reagent). In this study, we purified the PT2 fusion of the expression of E. coli BL21 (DE3) Arctic Express  in  the  intein-mediated  chitin  matrix  column.  PT2  was  fused  with  a  tag  at  its  N-terminal  position, containing the sequence of intein codes SspDnaB followed by chitin binder domain (CBD). Furthermore, the PT 2 fusion was expressed on the E. coli host, then purified in the chitin matrix column. The PT2 cutting process of the intein marker induced changes in the pH and temperature in the column. PT2 fusion was successfully purified in the intein-mediated chitin matrix. The PT2 fusion cut from the induced intein buffer marker at pH 6.5 and incubation at the temperature of 25 o C for 48 hours.
Keywords: E. coli, expression, intein mediated purification, pH and temperature changes, PT2

## PENDAHULUAN
Meningkatnya jumlah pasien yang menjalani operasi di berbagai Rumah Sakit di Indonesia  saat  ini,  menjadi  tantangan  serius terhadap  dunia  kesehatan,  terutama  dalam upaya  meminimalkan  kerugian  pelaksanaan operasi.  Salah  satu  upaya  yang  perlu mendapat  perhatian  adalah  mengembangkan teknik  lain  pengganti  jahitan.  Teknik  jahitan merupakan  standar  emas  untuk  menutup luka.  Namun  penggunaannya  menimbulkan kerugian,  diantaranya  waktu  penyembuhan luka  berlangsung  lama,  proses  pembedahan lebih  panjang,  munculnya  trauma  tambahan
bagi pasien saat pemasangan dan pencabutan benang, meningkatnya inflamasi, serta kemungkinan timbul komplikasi yang berhubungan  dengan  jahitan  berupa  infeksi (Uy et al ., 2005; Enus dkk., 2011). Lem Fibrin (LF) pengganti teknik jahitan memiliki  kemampuan  untuk  merekatkan  dan menutup  luka.  LF  sebagai  bahan  bioadesif, tersusun  atas  trombin,  fibrinogen,  kalsium dan  faktor  XIII.  Bahan  ini  dirancang  untuk menyerupai  tahap  akhir  koagulasi  dengan membentuk  bekuan  fibrin.  LF  digunakan sebagai bahan hemostatis yang menghentikan pendarahan  dari  celah  insisi,  matriks  untuk
penyembuhan  luka  dan  perekat  jaringan (Spotnitz & Prabhu, 2005).
Meskipun  luas  penggunaannya,  LF  yang didapat  secara  komersial  relatif  mahal, sehingga  tidak  ekonomis.  LF  komersial  ini mengandung protein plasma yang dimurnikan dari  sumber  darah  lain,  yang  beresiko terjadinya kontaminasi patogen secara bersamaan dengan perawatan. Untuk membuat  LF,  diperlukan  sumber  bahan  yang lebih  berlimpah  dan  lebih  aman.  Saat  ini, trombin  pada  LF  komersial  biasanya  terbuat dari plasma beku segar sapi (Enus dkk., 2011). LF  komersial  sebagai  pengganti  jahitan memberikan  banyak  keuntungan,  yaitu operasi  lebih  nyaman,  lebih  cepat  dan  dapat terhindar  kerugian  akibat  jahitan  (Enus  dkk., 2009; Yuksel et al ., 2010). Sampai saat ini LF komersial  untuk  operasi  mata  belum  tersedia di Indonesia, sehingga  harus diimpor dengan harga  yang  sangat  mahal  dan  perlu penyimpanan  secara  khusus.  Permasalahan lain  yang  muncul  adalah  belum  adanya  izin khusus  dari Food  and  Drug  Administration untuk  pemakaian  LF  komersial  pada  operasi mata,  terkait  transmisi  penyakit  karena terbuat dari plasma donor (Enus dkk., 2009).
Aplikasi
teknologi
rekombinan memungkinkan  untuk  memproduksi  dan memasarkan  protein  plasma  untuk  aplikasi terapeutik manusia (Burnouf, 2011). Penggunaan  teknologi  rekombinan  untuk trombin  manusia  rekombinan  menggunakan E.  coli telah  dilakukan  (Soejima et al .,  2001). Pemilihan E.  coli untuk  produksi  trombin manusia  rekombinan  karena  sifatnya  yang dapat  tumbuh  cepat  dengan  siklus  hidup pendek,  informasi  dan  karakter  genomnya sudah lengkap sehingga mudah dimanipulasi, biaya produksi relatif murah, tingkat ekspresi protein  target  tinggi,  cepat,  dan  teknologinya sudah  mapan    (Baneyx  &  Mujacic,  2004; Cabrita et al ., 2006). Pemurnian protein menggunakan domain pengikat  kitin  yang  dimediasi  intein  menjadi menarik untuk dikembangkan. Sistem
IMPACT-TWIN ( Intein Mediated Purification with  an  Affinity  Chitin-binding  Tag-Two Intein )  merupakan  vektor  ekspresi  sekaligus sebagai sistem pemurnian yang menggunakan induksi  aktivitas  pemecahan  protein  target dari penanda intein. Penanda intein ini dapat memungkinkan  terjadinya  proses  pemisahan secara pemotongan diri sendiri ( self-cleavage ) dalam kolom kromatografi afinitas kitin.
Pelepasan protein target dari protein penanda intein  dapat  dilakukan  dengan  penambahan pereaksi  tiol  ( β-mercaptoetanol )  pada  C- terminal  (Li et  al .,  2012)  dan  atau  buffer perubahan  pH  dan  suhu  pada  N-terminal (Guo et  al .,  2004).  Manfaat  utama  dari strategi  pemurnian  protein  yang  dimediasi oleh  intein  adalah  menghasilkan  protein target  dalam  jumlah  banyak,  penggabungan protein  target  dapat  dilakukan  di  ujung  C ataupun  ujung  N  protein  intein,  dan  protein target  dapat  diisolasi  dengan  atau  tanpa tambahan  residu  asam  amino  metionin (Chong et  al .,  1998;  Xu  &  Evans,  2001). Penggunaan  pemurnian  dimediasi  intein dilaporkan dapat memurnikan protein hingga tingkat  kemurnian  mencapai  95%  (Li et  al ., 2012;  Guo et  al .,  2004;  Wu et  al .,  2002; Sharma et al ., 2006).

## METODE
Galur, vektor, bahan kimia, media Kloning dan peremajaan plasmid menggunakan E.  coli TOP10F’  (Invitrogen, USA),  inang  ekspresi  yang  digunakan  adalah E.  coli BL21(DE3)  ArcticExpress  (didukung oleh Prof. Jiri Damborsky, Masaryk University,  Brno,  Czech  Republic).  Inang ditumbuhan  dalam  media  luria  bertani  (LB) dengan  komposisi  (tripton  1%,  ekstrak  ragi 0,5%,  dan  natrium  klorida  1%)  yang disuplemen dengan antibiotik tetrasiklin (100 µg/mL),  dan  ampisilin  (100  µg/mL).  Untuk media padat, komponen media LB ditambahkan  dengan  2%  agar.  Semua  enzim restriksi  dan  T4-DNA  ligase  dibeli  secara komersial  dari  (New  Englands  Biolabs, USA). Vektor  ekspresi  menggunakan  pTWIN1 diperoleh  dari  NEB  (NEB,  USA).  Gen pretrombin-2 manusia disintesis oleh GeneArt  (Life  Technologies,  Jerman).  Kit isolasi DNA (Roche Applied Science, USA), Kit fragmen  ekstraksi  gel  (Geneaid,  Taiwan). Isopropyl-β-d-thiogalactoside (IPTG)  dan β- mercaptoethanol ( Β-ME )  diperoleh  dari Sigma.  Poliakrilamid  dan  Coomassie  Brilliant Blue R250 (Biorad, Richmond, USA). Matriks kitin  diperoleh  dari  NEB  (New  Englands, Biolabs, USA). Bahan kimia lainnya tersedia di laboratorium  Biokimia,  Departemen  Kimia, Universitas  Padjadjaran,  dengan  tingkat pro- analysis (p.a.).
Konstruksi dan optimasi kodon gen PT2 Gen PT2 sintetik didesain ke dalam vektor
ekspresi  pTWIN1  menggunakan  dua  sisi restriksi  pada  ujung  5’  dan  3’  berturut-turut Xho I  dan Bam HI.  Urutan  asam  amino PT2 (308  aa)  termuat  dalam  data GenBank
Accession  number:  NM_000506.3.  Asam amino PT2 selanjutnya dioptimasi menggunakan  perangkat  lunak  OPTIMIZER (http://gnomes.urv.es/OPTIMIZER)  (Puigbo et  al .,  2007)  sesuai  kodon  preferensi E.  coli yang  termuat  dalam Codon  Usage  Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/).
Kodon PT2 hasil  optimasi  kemudian  dianalisis menggunakan Graphical Codon  Usage
Analyzer (GCUA)  (http://gcua.schoedl.de/) (Mclnerney, 1998).
Kloning gen pretrombin-2 Plasmid pMA-T- PT2 dipotong mengguna- kan  enzim  restriksi Xho I  dan Bam HI  sesuai rancangan  gen  sintetik  sebelumnya.  Secara paralel,
pTWIN1 dipotong dengan menggunakan  enzim  restriksi  yang  sama. Hasil  pemotongan  selanjutnya  dikarakterisasi menggunakan  elektroforesis  gel  agarose  1%. Selanjutnya  fragmen PT2 dan  pTWIN1  hasil pemotongan  diekstraksi  dari  gel  agarosa  dan dikarakterisasi.  Selanjutnya  fragmen PT2 diligasi ke dalam vektor pTWIN1
menggunakan  enzim  T4  DNA  ligase  hingga diperoleh plasmid pTWIN1 yang mengandung sisipan PT2 (pTWIN1- PT2 ).  Selanjutnya, dilakukan  transformasi  sel  kompeten E.  coli TOP10F’ dalam plasmid pTWIN1- PT2 dengan metode  kejut  panas  (Sambrook  &  Russell, 2001). Untuk mendapatkan plasmid pTWIN1- PT2 , maka koloni transforman E. coli TOP10F’ diisolasi . Penentuan urutan nukleotida dengan  DNA sequencer ( MacroGene ,  Korea) dilakukan  untuk  memverifikasi  keberhasilan kloning.
Ekspresi protein fusi PT2 dalam E. coli Ekspresi dilakukan dengan menggunakan penginduksi  IPTG  di  galur E.  coli BL21(DE3 ArcticExpress  Galur-galur  ini  merupakan E. coli dengan  sistem  promoter  T7  yang  sesuai dengan  vektor  pTWIN1.  Koloni tunggal transforman E. coli ditumbuhkan dalam 5 mL media  LB  cair  yang  mengandung  antibiotik sesuai, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 °C selama  16  jam.  Sebanyak  1  mL  kultur dimasukkan  ke  dalam  100  mL  LB  cair  yang ditambahkan antibiotik ampisilin (100 µg/mL) dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama  3-4  jam  dengan  pengocokan  150  rpm hingga  OD 600 5-7.  Sebanyak  1  mL  kultur
diambil  sebagai  sampel  sebelum  induksi.  Ke dalam  kultur  sisa, ditambahkan  IPTG  (100 mg/mL)  dengan  konsentrasi  akhir  0,1  mM. Selanjutnya  ditumbuhkan  pada  suhu  12  °C selama 16 jam. Sebanyak 1 mL kultur diambil sebagai sampel setelah induksi. Pelet dipanen dalam tabung Eppendorf 50 mL menggunakan  sentrifugator  pada  suhu  4 o C, 7500 g .  Selanjutnya  pelet  disuspensi  dengan 20  mL  buffer  lisis  A  (Tris-HCl  10  mM,  NaCl 500  mM,  PMSF  1  mM  pH  8.5,  Triton  X-100 1%), kemudian dilisis menggunakan sonikator selama  15  menit  dalam  wadah  dingin.  Lisat kemudian  disentrifugasi  pada  7500 g selama 20 menit. Sebanyak 40 μL supernatan diambil sebagai sampel protein larut. Pelet ditambahkan  dengan  50  μL  urea  8  M, dipanaskan pada suhu 95 °C selama 15 menit dan  disentrifugasi  selama  10  menit, sebanyak 40  μL  supernatan  diambil  sebagai  sampel protein  tidak  larut.  Masing-masing  sampel ditambahkan  5  μL  SDS-Dye,  kemudian dipanaskan pada suhu 95 °C selama 15 menit dan  disentrifugasi  7500 g selama  1  menit. Untuk  memverifikasi  ekspresi  PT2  dan kelarutannya,  sebanyak  10  μL  sampel  dimuat dalam  poliakrilamid  gel  12,5%.  Pita  protein divisualisasikan  dengan  pewarna  Coomassie Brilliant Blue R250.
Pemurnian protein fusi PT2 dimediasi intein Sebanyak  20  mL  supernatan  yang diperoleh  dari  1  L  kultur  dimasukkan  ke dalam  5  mL  matriks  kitin  pada  kolom,  yang disetimbangkan  sebelumnya  dengan  buffer  B (Tris-HCl 10 mM, NaCl 500 mM pH 8.5) 4 o C, 10 kali volume kolom. Supernatan ditampung sebagai sampel flowthrough untuk karakterisasi  SDS-PAGE.  Protein  yang  tidak diinginkan  dicuci  dengan  buffer  B  sebanyak 20 kali volume kolom dan ditampung sebagai sampel pencuci untuk karakterisasi, selanjutnya  resin  diambil  sebanyak  100  µL sebagai  sampel  resin  sebelum  pemotongan. Sebanyak 15 mL buffer pemotong (Tris-HCl 10 mM,  NaCl  500  mM  pH  6.5)  dimasukkan  ke dalam  kolom,  kemudian  kolom  diinkubasi pada  suhu  25 o C  selama  48  jam.  Setelah inkubasi,  kolom  dielusi  dengan  buffer pemotong  sebanyak  8  mL  dan  fraksi ditampung masing-masing 1 mL dalam tabung Eppendorf  1,5  mL.  Resin  diambil  kembali sebanyak 100 µL sebagai sampel setelah pemotongan.  Semua  sampel  dan  fraksi dikarakterisasi menggunakan SDS-PAGE 12.5%. Mekanisme pemurnian PT2
menggunakan  pTWIN1  yang  di  fusikan  pada C-terminal intein ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1. Pemurnian PT2 dengan vektor pTWIN1. Penanda  intein  difusikan  pada  N- terminal  PT2  dan  pelepasan  PT2 diinduksi  pemotongan  oleh  pH  dan suhu (dimodifikasi dari NEB).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi, kloning dan ekspresi pretrombin-2 manusia dalam E. coli Urutan  asam  amino PT2 dianalisis menggunakan  perangkat  lunak  OPTIMIZER. Hasil analisis diperoleh bahwa urutan gen PT2 berukuran  924  pb,  dengan  persentase  GC sebesar  52,56%  dan Codon  Adaptation  Index sebesar 0,89. Kodon PT2 tersebut selanjutnya dianalisis  menggunakan Graphical  Codon Usage  Analyzer .  Dari  hasil  analisis  diperoleh 149  asam  amino  dikode  oleh  kodon-kodon yang  tidak  preferensi  bagi E.  coli (Silaban et al ., 2015). Selanjutnya kodon-kodon PT2 yang tidak  preferens,  dioptimasi  sesuai  kodon preferensi E.  coli dan  dianalisis  kembali dengan  GCUA.  Hasil  analisis  kodon PT2 sintetik  teroptimasi  diperoleh  persentase  GC 54,7% dan  CAI  sebesar  1,00  (Silaban  dkk., 2016).
Untuk  mendapatkan  fragmen PT2 , plasmid  pMA-T- PT2 dipotong  menggunakan enzim Xho I  dan Bam HI.  Dengan  enzim  yang sama,  pTWIN1  dipotong  dan  dikarakterisasi menggunakan  elektroforesis  gel  agarose  1%. Hasil karakterisasi gel menunjukkan bahwa fragmen PT2 berhasil  dipotong dari pMA-T, dimana  terdapat  dua    pita  sebesar  939  pb ( PT2 ) dan  2374  pb  (pMA-T).  Demikian  juga hasil karakterisasi pTWIN1 dalam gel,
diperoleh dua pita sebesar 6536 pb (pTWIN1) dan  839  pb  ( Multi  Cloning  Site ) (Silaban et al .,  2015;  Silaban  dkk.,  2016).    Fragmen PT2 dan  pTWIN1  yang  diperoleh,  diekstrak  dan dimurnikan  menggunakan  kit  isolasi  DNA.
Hasil  karakterisasi  menunjukkan  bahwa PT2 dan pTWIN1 berhasil diekstrak dan dimurnikan dari gel. Terdapat dua pita 939 pb ( PT2 ) dan  6536  pb  (pTWIN1)  (Silaban et  al ., 2015;  Silaban  dkk.,  2016).  Selanjutnya fragmen PT2 diligasi ke dalam vektor pTWIN1 menggunakan  enzim  T4  DNA  ligase.  Untuk mengkonfirmasi  keberhasilan  proses  ligasi, nukleotida pTWIN1- PT2 ditentukan oleh DNA
sequencing . Hasil pensejajaran urutan nukleotida  menunjukkan, PT2 berhasil terligasi  ke  vektor  pTWIN1  (Silaban et  al ., 2015; Silaban dkk., 2016).
Pemilihan  sistem  ekspresi  yang  tepat sangat  penting  untuk  produksi  dalam  jumlah besar  protein  yang  larut  dalam  sel  inang. Untuk  mencapai  hal  ini,  vektor  ekspresi pTWIN1  telah  digunakan.  Vektor  pTWIN1 dilaporkan  telah  berhasil  digunakan  untuk ekspresi  protein  rekombinan  dengan  hasil tinggi (Smith et al ., 2012). Penggunaan vektor pTWIN1  dalam  sistem  ekspresi,  karena kemampuannya  untuk  memproduksi  protein larut  dalam  jumlah  besar.  Kemampuan  ini disebabkan  kekhususan  promotor  T7,  yang hanya  mengikat  T7  RNA  polimerase. Diperkirakan bahwa induksi transkripsi dalam sistem  vektor  T7  lebih  besar  dari  1000  kali lipat,  sedangkan  besarnya  induksi  yang diperoleh  dengan  promotor  lac  represor umumnya  diatur  sekitar  50  kali  lipat.  Sistem ekspresi  T7  akan  aktif  dengan  adanya  enzim T7 RNA polimerase. T7 RNA polimerase tidak terdapat pada bakteri secara alami, namun E. coli ArcticExpress  telah  dirancang  untuk membawa gen yang mengkode RNA polimerase  pada  segmen  DNAnya.  Induksi ekspresi fusi PT2 dilakukan dengan penambahan IPTG. IPTG merupakan substansi yang mencegah lac represor terikat pada lac  operator sehingga  menginduksi ekspresi  gen  untuk  membentuk  protein  aktif. Hal  ini  mengawali  pembentukan  T7  RNA polimerase dalam jumlah yang lebih substansial,  karena  T7  RNA  polimerase spesifik untuk promoter T7, maka gen pt2 yang  dikode  di  dalam  plasmid  tersebut  akan mengalami over -ekspresi  (Dubendorf  & Studier, 1991).
Tabel  1.  Ekspresi  fusi  PT2  di E.  coli BL21(DE3)
ArcticExpress.
Fusi CBD-Intein SspDnaB-PT2 Larut Tidak larut BL21(DE3) ArcticExpress +++++ ++
Perbedaan  persentase  kandungan  GC antara  gen  target  dengan  inang  ekspresi menyebabkan  adanya  bias  kodon,  dan selanjutnya  bias  kodon  yang  tinggi  akan menurunkan tingkat ekspresi karena diperkirakan  akan  dapat  menyebabkan kesalahan  translasi  (Merkl,  2003;  Gustafsson et  al .,  2014),  sehingga  menghasilkan  protein agregat  kompleks  tidak  aktif yang  lazim dikenal sebagai badan inklusi (Freydell et al ., 2007). Nukleotida PT2 sintetik, selain banyak memiliki  kodon  jarang  juga  kandungan  GC nya  tinggi,  sehingga  diperlukan  optimasi kodon  gen  sesuai  preferensi  kodon E.  coli melalui memanfaatkan teknologi gen sintetik. Pemanfaatan  teknologi  gen  sintetik  mampu mengubah bias kodon dari gen target menjadi cocok  dengan  kodon  preferensi  inang rekombinan  (Graslund et  al .,  2008;  Xiong et al .,  2008).  Setiap  gen  dalam  genom  memiliki nilai  numerik  yang  disebut  indeks  adaptasi kodon ( Codon Adaptation Index ,CAI). Beberapa peneliti melaporkan bahwa nilai CAI dapat  digunakan  untuk  memprediksi  tingkat ekspresi  protein  heterolog  (Carbone et  al ., 2003; Xia, 2007; Fox & Erill, 2010). Optimasi kodon gen PT2 dapat meningkatkan nilai CAI PT2 sintetik  menjadi  1,00  dan  secara  teori nilai  CAI  tersebut  dianggap  bagus  untuk ekspresi (Carbone et al ., 2003; Xia, 2007).
Gambar  2.  Analisis  SDS-PAGE  12,5%  hasil  pemurnian protein  fusi  PT2  dimediasi  intein.  M:  marker protein standar, lajur 1: flowthrough , lajur 2: buffer  pencuci,  lajur  3:  resin  kitin  sebelum dipotong,  dan  lajur  4:  resin  kitin  setelah dipotong  menggunakan  buffer  pH  6.5  dan inkubasi selama 48 jam pada suhu 25 o C.
Pembentukan  badan  inklusi  selama produksi  protein  dalam  inang  prokariot  juga dapat  dicegah  dengan  mengurangi  suhu selama  ekspresi  protein,  karena  suhu  rendah
biasanya  meningkatkan  kelarutan  protein (Freydell et  al .,  2007).  Namun,  penurunan suhu  dapat  memperlambat  pertumbuhan  sel, sehingga tingkat sintesis protein lebih rendah. E.  coli BL21(DE3)  ArcticExpress  merupakan inang yang direkayasa untuk mampu tumbuh pada  suhu  rendah.  Inang  ini  mampu mengekspresikan  Cpn60/Cpn10 Oleispera antartica dari  bakteri  psikrofilik  laut Antartika,  sehingga  kegiatan  pelipatan  tinggi dengan  mengatur  pertumbuhan E.  coli pada suhu rendah (4-12 o C) (Strocchi et al ., 2006). Karakterisasi  tes  ekspresi  menunjukkan bahwa sel-sel E. coli BL21(DE3) ArcticExpress mampu  mengekspresikan  fusi  PT2  secara optimal  dalam  bentuk  larut  (Tabel  1). Perolehan  fusi  PT2  larut  pada  inang  ini disebabkan  bekerjanya  Cpn60/Cpn10  dalam membantu  pelipatan  protein  fusi  PT2  (Ferrer et al ., 2003; Ferrer et al ., 2004).
Pemurnian PT2 diinduksi perubahan pH dan suhu Fusi  PT2  dimurnikan  dalam  kolom matriks  kitin  dimediasi  intein.  Supernatan dimasukkan  ke  dalam  kolom  matriks  kitin yang  telah  disetimbangkan  sebelumnya dengan  buffer  B  pH  8.5  (lajur  1  Gambar  2). Selanjutnya  kolom  dicuci  dengan  buffer  B. Hasil  karakterisasi  SDS-PAGE  menunjukkan bahwa  setelah  kolom  dicuci  dengan  buffer  B untuk  menghilangkan  protein-protein  lain yang  tidak  spesifik,  tidak  ada  protein  fusi intein-CBD  yang  terlihat  (lajur  2).  Hasil  ini menunjukkan bahwa protein fusi terikat pada resin kitin karena adanya aktivitas pengikatan yang  tinggi  dari  domain  pengikat  kitin  yang terletak  pada  intein  terhadap  resin  (Li et  al ., 2012).  Setelah  dicuci,  selanjutnya  pemecahan diri  PT2  yang  dimediasi  intein  diinduksi dengan  penambahan  agen  pemecah  β- merkaptoetanol .  Protein  PT2  dipisahkan  dari kitin  dan  dielusi  dengan  buffer  pemecah. Efisiensi  pemecahan  dapat  terlihat  dengan membandingkan  matriks  kitin  sebelum pemecahan  (lajur  3)  dan  setelah  pemecahan (lajur  4).  Penambahan  agen  pemecah  dan inkubasi  selama  48  jam  pada  suhu  25 o C menyebabkan  pita  fusi  CBD-Intein  SspDnaB- PT2  berkurang  (lajur  4),  artinya  protein  PT2 telah terpotong sebagian dari fusi CBD-Intein SspDnaB.  Penanda  intein  mampu  melakukan proses pemotongan diri sendiri ( self-cleavage ) dengan mengubah pH dan suhu indusi dalam kolom  kromatografi  afinitas  kitin  pada  C- terminal intein (Guo et al ., 2004).
Gambar 3. Analisis SDS-PAGE 12,5% fraksi protein fusi  PT2  hasil  pemotongan.  M:  marker protein standar, lajur 1: fraksi PT2 hasil elusi  setelah  dipotong  dengan  pH  6.5 dan inkubasi selama 48 jam pada suhu 25 o C.
Pemotongan  fusi  PT2  dipisahkan  dari kitin  menggunakan  pengelusi  buffer  pe- motong.  Karakterisasi  dengan  SDS-PAGE menunjukkan  bahwa  matriks  kitin  sebelum pemotongan terdapat tiga pita yang terdeteksi yaitu  pita  berukuran  35,36  kDa  (lajur  3),  28 kDa (lajur 3) dan 63,36 kDa (lajur 3). Setelah pemotongan  dengan  buffer  pemotong  (lajur 4),  pada  matriks  kitin  hanya  dua  pita  yang terdeteksi  yaitu  pita  berukuran  35,36  kDa (lajur 4) dan pita berukuran 63,36 kDa (lajur 4).  Adanya  perbedaan  pola  pita  protein  dari sampel  matriks  kitin  sebelum  dan  setelah pemotongan mengindikasikan bahwa sebagian  fusi  PT2  (35,36  kDa)  telah  terlepas dari  fusi  CBD-intein  SspDnaB.  Gambar  3 menunjukkan  bahwa  telah  diperoleh  protein PT2  murni  dalam  jumlah  kecil.  Hanya  saja, PT2  belum  terpisah  sempurna,  sehingga optimasi  pemotongan  PT2  sampai  saat  ini masih  terus  dilakukan.  Pemurnian  protein yang dimediasi intein menggunakan penginduksi  pH  dan  suhu  pada  posisi  C- terminal  intein  sangat  sensitif  terhadap  pH buffer  ( Setrerrahmane et  al .,  2014; Zhang et al .,  2015).  Buffer  dengan  kondisi  pH  yang tidak  sesuai  menyebabkan  pemotongan protein dari fusi intein tidak akan maksimal.

## KESIMPULAN
Dalam  studi  ini,  kami  mengoptimalkan ekspresi  PT2  dalam E.  coli .  Protokol dioptimalkan,  termasuk  penggunaan:  (i) penggunaan  kodon  gen PT2 yang  cocok dengan  kodon  inang E.  coli ,  (ii)  vektor ekspresi  dengan  promotor  T7  yang  kuat,  dan (iii) galur E. coli yang mampu tumbuh dengan penurunan  suhu.  Protokol  ini  menghasilkan PT2  larut.  Pemurnian  dalam  kolom  matriks
kitin yang dimediasi intein dapat memurnikan PT2,  dan  PT2  dapat  dipotong  dari  intein-tag menggunakan  buffer  pemecah  pH  6.5  dan inkubasi selama 48 jam pada suhu 25 o C. DAFTAR PUSTAKA Baneyx, F., & Mujacic, M. (2004). Recombinant protein folding and misfolding  ini Escherichia  coli.  Nat
Biotechnol , 22 :1399-1408. Burnouf,  T.  (2011).  Recombinant  plasma proteins. Vox Sanguinis , 100 :8-83. Cabrita,  L.D.,  Weiwen,  D.,  &  Stephen,  P.B.
(2006).  A  family  of E.coli expression vectors  for  laboratory  scale  and  high throughput  soluble  protein  production.
BMC Biotechno , 6 :12. Carbone, A., Zinovyev, A., & Kepes, F. (2003).
Codon  adaptation  index  as  a  measure  of dominating  codon  bias. Bioinformatics , 19 :2005-2015. Chong,  S.,  Montello,  G.E.,  Zhang,  A.,  Cantor, E.J.,  Liao,  W.,  Xu,  M.Q.,  &  Benner,  J. (1998).  Utilizing  the  C-terminal  cleavage activity  of  a  protein  splicing  element  to purify  recombinant  proteins  in  a  single chromatographic  step. Nucl.  Acids  Res , 26 :5109-5115. Dubendorff,  J.W.,  &  Studier,  F.W.  (1991). Controlling  basal  expression  in  an inducible  T7  expression  system  by blocking  the  target  T7  promoter  with  lac repressor. J. Mol. Biol , 219 :45-59.
Enus,  S.,  Dalimoenthe,  N.Z.,  &  Kartiwa,  A. (2009).  Teknik  lem  fibrin  otologus  pada cangkok  konjungtiva  bulbi  mata  Kelinci.
MKB , 41 :169-173.
Enus,  S.,  Natadisastra,  G.,  Shahib,  M.N.,  & Sulaiman,  R.  (2011).  Peran  lem  fibrin otologus pada penempelan tandur konjungtiva  bulbi  mata  kelinci  terhadap ekspresi  gen  fibronektin  dan  integrin.
MKB , 43 :183-188.
Ferrer, M., Chernikova, T.N., Yakimov, M.M., Golyshin,  P.N.,  &  Timmis,  K.N.  (2003). Chaperoneins govern growth of Escherichia  coli at  low  temperatures. Nature. Biotechnology , 21 :1266-1267.
Ferrer, M., Chernikova, T.N., Timmis, K.N., & Golyshin,  P.N.  (2004).  Expression  of  a temperature-sensitive  esterase  in  a  novel chaperonee-based Escherichia coli strain. APPL.  Environ.  Microbiol , 70 :4499- 4504.
Fox,  J.M.,  &  Erill,  I.  (2010).  Relative  codon adaptation: a generic codon bias index for
prediction  of  gene  expression. DNA Research , 17:185-196.
Freydell,  E.J.,  Ottens,  M.,  Eppink,  M.,  van Dedam,  G.,  &  van  der  Wielen,  L.  (2007). Efficient  solubilization  of  inclusion bodies. Biotechnol J , 2 :678-684.
Graslund,  S.,  Nordlund,  P.,  Weigelt,  J., Hallberg,  B.M.,  Bray,  J.,  Gileadi,  O  et  al.
(2008). Protein production and purification. Nature Method , 5:135-156.
Gustafsson, C., Govindrajan, S., & Minshull, J.
(2004).  Codon  bias  and  heterologous protein expression. Trends in Biotechnol , 22 :346-353.
Guo, C., Lia, Z., Shia, Y., Xub, M., Wisec, J.G., Trommerc,  W.E.,  &  Yuan,  J.  (2004). Intein-mediated  fusion  expression,  high efficient refolding,and one-step purification  of  gelonin  toxin. Protein
Expression and Purification , 37 :361-367.
Li,  J.,  Zheng,  L.,  Li,  P.,  &  Wang,  F.  (2012). Intein-mediated  expression,  purification, and  characterization  of  thymosin  1– thymopentin fusion peptida in Escherichia  coli . Protein  Expression  and Purification , 84 :1-8.
Mclnerney,  J.O.  (1998).  GCUA:  General Codon  Usage  Analysis.  Bioinformatics Applications  Note. Oxford  University Press , 14 :372-373.
Merkl,  R.  (2003).  A  survey  of  codon  and amino  acid  frequency  bias  in  microbial genomes focusing on translational efficiency. J. Mol. Evol , 57 :453-466. Puigbo,  P.,  Guzma,  E.,  Romeu,  A.,  &  Vallve, S.G.  (2007).  OPTIMIZER:  a  web  server for  optimizing  the  codon  usage  of  DNA sequences. Nucleic.  Acids . Research , W126-W131. Sambrook,  J.,  &  Russel,  D.W.  (2001).
Molecular  cloning:  A  laboratory  manual. 3 nd Edn. CSHL Press , USA.
Setrerrahmane,  S.,  Zhang,  Y.,  Dai,  G.,  Lv,  J and Tan, S. (2014). Efficient Production of Native  Lunasin  with  Correct  N-terminal Processing by  Using  the  pH-InducedSelf- Cleavable Ssp DnaB Mini-intein System in
Escherichia coli . Appl. Biochem. Biotechnol , 174:612-622. Sharma,  S.S.,  Chong,  S.,  &  Harcum,  S.W. (2006). Intein-mediated protein purification  of  fusion  proteins  expressed under  high-cell  density  conditions  in E.
coli.  Journal  of  Biotechnology , 125 :48- 56.
Silaban,  S.,  Maksum,  I.P.,  Ghaffar,  S.,  Hasan, K.,  Enus,  S.,  Subroto,  T.,  &  Soemitro,  S. (2015). Codon Optimization and Chaperone  Assisted  Solubilization  of Recombinant  Human  Prethrombin-2 Expressed in Escherichia coli .
Microbiology Indonesia , 8 (4):177. Silaban, S., Maksum, I.P., Enus, S., Hasan, K.,
Subroto, T., & Soemitro, S. (2016). Kajian Ekspresi  Gen  Pretrombin-2  Manusia Sintetik  pada Escherichia  coli Secara  In Silico  untuk  Produksi  Trombin  Sebagai Komponen Lem Fibrin. Jurnal Pendidikan Kimia , 8(1):58-64. Smith, L.E., Yang, J., Goodman, L., Huang, X., Huang, R., Dressman, J., Morris, J., Silva, R.A.G.D.,  Davidson,  W.S  &  Cavigiolio,  G. (2012).  High  yield  expression  and purification of recombinanthuman apolipoprotein A-II in Escherichia coli . J.
Lipid. Res , 53:1708-1715. Soejima,  K.,  Mimura,  N.,  Yonemura,  H.,
Nakatake,  H.,  T.  Imamura,  T.,  &  Nozaki, C.  (2001).  An  efficient  refolding  method for  the  preparation  of  recombinant human prethrombin-2 and characterization  of  the  recombinant- derived α-thrombin. J. Biochem , 130 :269-277. Spotnitz,  W.D.  (2001).  Commercial  fibrin sealants    in    surgical  care. Am  J    Surg , 182 :8S-14. Strocchi,  M.,  Ferrer,  M.,  Timmis,  K.N.,  & Golyshin,  P.N.  (2006). Low  temperature- induced  systems  failure  in Escherichia coli : Insights from rescue by cold-adapted chaperoneines. Proteomics , 6 :193-206. Uy,  H.S.,  Reyes,  J.M.,  Flores,  J.D.,  &  Siong, R.L.B.  (2005).  Comparison  of  fibrin  glue and  sutures  for  attaching  conjungtival autografts  after  pterygium  excision. Ophthalmology , 112 :667-671.
Wu, W., Wood, D.W., Belfort, G., Derbyshire, V.,  &  Belfort,  M.  (2002)  Intein-mediated purification  of  cytotoxic  endonuclease  I- TevI  by  insertional  inactivation  and  pH- controllable  splicing. Nucleic  Acids Research , 30:4864-4871. Xia,  X.  (2007).  An  improved  implementation of  codon  adaptation  index. Evolutionary Bioinformatics , 3 :53-58.
Xiong,  A.S.,    Peng,  R.H.,  Zhuang,  J.,  Gao,  F., Li,  Y.,  Cheng,  Z.M.,  &  Yao,  Q.H.  (2008).
Chemical  gene  synthesis:  strategies, softwares, error corrections, and
applications. FEMS.Microbiol , 32 :522- 540.
Xu,  M.Q.,  &  Evans,  J.T.C.  (2001).  Intein- mediated  ligation  and  cyclization  of expressed  proteins, METHODS . 24: 257– 277.
Yuksel,  B.,  Unsal,  S.K.,  &  Onat,  S.  (2010). Comparison  of  fibrin  glue  and  suture technique in pterygium surgery performed  with  limbal  autograft. Int.  J.
Ophthalmol , 3:316-320.
Zhang, Y., Zhang, K., Wan, Y., Zi, J., Wang, Y., & Wang, J. (2015). A pH-Induced, Intein- Mediated  Expression  and  Purification  of Recombinant  Human  Epidermal  Growth Factor  in Escherichia  coli . Biotechnol, Prog , 000 :000-000.