JPHPI 2012, Volume 15 Nomor 1
Tepung biji teratai pencegah diare, Fitrial, Y. et al.

## AKTIVITAS BIOLOGIS TEPUNG BIJI TERATAI PRA-MASAK SEBAGAI PRODUK PANGAN PENCEGAH DIARE

## Biological Activity of Pre-Cooked Waterlily Seeds Flour as a Food Product Preventing Diarrhea
Yuspihana F 1 *, Rita Khairina 1 , Ika K. Oktaviyanti 2
1 Jurusan Pengolahan Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan Universitas Lambung Mangkurat 2 Bagian Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran, Universitas Lambung Mangkurat Diterima 19 Maret 2012/Disetujui 24 September 2012
Abstract
Raw waterlilly seeds are known to have activity to prevent diarrhea. It has been proven through testing both in vitro and in vivo against E. coli K1.1 Enterophatogenic (EPEC), the bacteria that causes diarrhea. This study aimed to determine the biological activity of pre-cooked waterlilly seed flour as the prevention of diarrhea through in vivo testing. Results showed that mice fed a ransum substituted with waterlilly seed flour and intervented with EPEC had an increased in body weight 25% lower compared with controls, as well as a declining in fecal water content average of 2% a day after the EPEC intervention was stopped. Rationing followed by EPEC intervention did not increase the number of microbes, causing reduction in the number of E. coli , and did not cause a decrease in lactic acid bacteria (LAB). Rationing waterlilly seed flour shown to inhibit inflammation in the intestinal villi, preventing necrosis of the intestinal mucosa cell (jejenum), reduce inflammation, and prevent adhesion of E. coli in the intestinal mucosa.
Key words: diarrhea, EPEC, jejunum, waterlily seeds pre-cooked flour
Abstrak
Biji teratai mentah diketahui memiliki aktivitas untuk mencegah diare.  Hal tersebut  telah dibuktikan melalui  pengujian  baik  secara  in  vitro  maupun  in  vivo  terhadap E.  coli Enteropatogenik  K1.1  (EPEC), bakteri penyebab diare.  Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas biologis tepung biji teratai pra masak sebagai pencegah diare melalui uji in vivo.  Hasil penelitian menunjukkan bahwa tikus yang diberi ransum yang disubstitusi dengan tepung biji teratai dan diintervensi dengan EPEC mengalami kenaikan bobot  badan  25%  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  kontrol,    juga  terjadi  penurunan  kadar  air  feses rata-rata 2% sehari setelah intervensi EPEC dihentikan.  Pemberian ransum tersebut yang diikuti dengan intervensi EPEC tidak meningkatkan jumlah mikroba, menyebabkan penurunan jumlah E. coli , serta tidak menyebabkan penurunan bakteri asam laktat (BAL).  Pemberian ransum yang disubstitusi tepung biji teratai terbukti dapat menghambat terjadinya peradangan pada vili usus, mencegah nekrosis pada mukosa usus, mengurangi inflamasi, dan mencegah melekatnya E. coli pada mukosa usus.
Kata kunci: biji teratai, diare, EPEC,  jejunum, pra masak
*Korespondensi: Jl. Batu Piring No. 25 Banjarmasin, Telp. +628157747377  email: yuspis@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Teratai  merupakan  tanaman  air  yang banyak  tumbuh  secara  alami  di  perairan rawa dan sungai yang tidak begitu dalam dan berair  tenang.    Bagian  tanaman  teratai  yang dapat  dimanfaatkan  sebagai  bahan  makanan
adalah bunga, biji, batang dan umbinya, akan tetapi yang paling banyak dimanfaatkan oleh penduduk,  terutama  di  daerah  Hulu  Sungai Utara  Kalimantan  Selatan,  adalah  bijinya. Biji teratai oleh penduduk setempat dijadikan sebagai  sumber  karbohidrat  pengganti  beras saat paceklik ataupun tepung untuk membuat kue.  Biji  teratai  yang  dijual  di  pasar  adalah biji  kering  yang  sudah  dikupas  kulitnya.
Potensi  rawa  di  Kalimantan  Selatan  sangat memungkinkan  biji  teratai  dijual  di  pasar tradisional  dengan  harga  yang  hampir  sama dengan beras.
Biji teratai merupakan sumber karbohidrat (78%  bk),  kadar  proteinnya  relatif  tinggi  (9% bk)  dan  asam  amino  esensial  yang  lengkap, kadar  lemaknya  yang  rendah  dengan  asam lemak  utamanya  adalah  linoleat  dan  stearat. Kadar serat biji teratai yang tinggi merupakan sumber  serat  yang  baik  (Khairina  dan  Fitrial 2002).
Hasil penelitian sebelumnya membuktikan bahwa biji teratai memiliki aktivitas antidiare, baik secara in vitro  maupun in vivo terhadap E.coli Enteropatogenik K.1.1 (EPEC) penyebab diare  dan Salmonella  typhimurium (Fitrial et  al. 2008;  Fitrial et  al .  2012).  Biji  teratai mampu  mencegah  terjadinya  diare  akibat EPEC  K.1.1  setelah  dikonsumsi  selama  dua minggu dengan kadar per hari 1,87 g tepung biji teratai atau ≈ 13,23 mg/g bobot badan tikus percobaan. Biji teratai juga dapat menstimulasi pertumbuhan  bakteri  asam  laktat  pada  tikus percobaan  karena mengandung rafinosa yang diketahui mampu menstimulasi pertumbuhan bakteri asam laktat, dengan demikian diduga biji  teratai  memiliki  potensi  sebagai  sumber prebiotik.
Pengembangan  biji  teratai  menjadi produk tepung pra masak dan kajian aktivitas biologisnya sebagai pencegah diare dilakukan sebagai  upaya  untuk  memanfaatkannya sebagai pangan fungsional. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan aktivitas biologis tepung biji teratai pra-masak sebagai pencegah diare.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Biji  teratai  dari  jenis Nymphaea  pubescens diperoleh  dari  daerah  Hulu  Sungai  Utara, Kalimantan  Selatan.  Mikroba  uji  adalah Escherichia coli yang merupakan Enteropatogenik (EPEC) diperoleh dari Laboratorium Bakteriologi Fakultas  Kedokteran  Hewan  IPB.  Tikus  jantan jenis Sprague Dawley (140±5 g).
Bahan  penyusun  ransum  terdiri  atas kasein sebagai  sumber protein yang digunakan dan  minyak  jagung  sebagai  sumber  lemak. Mineral yang digunakan merupakan mineral mixed  yang  terdiri  atas  KI  0,79  g,  NaCl 139,30  g,  KH 2 PO 4 389,00  g,  MgSO 4 anhidrat 53,702  g,  CaCO 3 381,40  g,  FeSO 4 .7H 2 O  27,00 g,  MnSO 4 .2H 2 O  4,01  g,  ZnSO 4 .7H 2 O  0,55  g, CuSO 4 .5H 2 O 0,48 g dan CoCl 2 .6H 2 O 0,02 g. Air yang digunakan adalah air minum kemasan, sebagai  sumber  serat  adalah  selulosa  dan vitamin yang digunakan adalah vitamin mixed (Vitamin A, B1, B2, B3, B6, B12,C, D3, E,  Ca Panthotenat). Pati yang digunakan adalah pati jagung.
Media  pertumbuhan  mikroba  yaitu Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), De Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA), Plate Count Agar (PCA), dan Tryptone Bile X-Glucuronide (TBX).  Pembuatan  preparat  histologi  yaitu formaldehid (untuk fiksasi jaringan), alkohol, xylol, hematoksilin, eosin, dan parafin. Pengolahan  tepung  biji  teratai  pra- masak    dilakukan  dengan  terlebih  dahulu merendam  biji  teratai  yang  sudah  dikupas kulitnya,  dilanjutkan  dengan  pengukusan dan  pengeringan  lalu  dihaluskan  sehingga menjadi tepung.

## Metode Penelitian
Analisis fitokimia
Analisis  fitokimia  dari  biji  teratai  dan tepung  biji  teratai  pra-masak,    meliputi alkaloid, tanin, saponin, glikosida, flavonoid, triterpenoid dan steroid (Harborne 1987).

## Pengujian aktivitas biologis tepung biji teratai
Pengujian secara in vivo dilakukan dengan tikus percobaan (jenis Sprague Dawley selama 28 hari)  untuk mengevaluasi aktivitas biologis produk  biji  teratai.    Pada  tahap  ini,  tepung biji  teratai  disubstitusikan  ke  dalam  ransum standar tikus percobaan (secara isokalori dan isonitrogen).  Substitusi  mempertimbangkan dosis  tepung  biji  teratai  mentah  yang  telah diketahui  mampu  mencegah  diare  pada
Tepung biji teratai pencegah diare, Fitrial, Y. et al.
tikus percobaan pada penelitian sebelumnya, yaitu  sebesar  0,187  g  tepung  biji  teratai  per g  ransum  atau  setara  dengan  13,23  mg/g bobot  badan  tikus  percobaan.  Pembuatan ransum  standar  mengikuti  metode  AOAC (1990) dengan kasein sebagai sumber protein ransum  (10%).  Tikus  percobaan  dibagi menjadi  3  grup  tikus,  yaitu  grup  tikus  yang mendapat ransum standar (tidak diintervensi
E.coli ) (kontrol A), grup tikus yang mendapat ransum standar (diintervensi E.coli ) (kontrol B),  dan  grup  tikus  yang  mendapat  ransum yang  disubstitusi  dengan  tepung  biji  teratai pra-masak (diintervensi E.coli ). Pemberian  ransum  dilakukan  dari  hari ke-1  hingga  ke-28  sebanyak  10  g/hari/ekor tikus  percobaan.  Perlakuan  ransum  yang diberikan  adalah  ransum  standar  (kontrol) dan  ransum  standar  disubstitusi  dengan tepung biji teratai  pra-masak  (secara isokalori dan isonitrogen). Tikus  percobaan  diintervensi  (dicekok) dengan E.  coli pada  konsentrasi  sel  tertentu (koloni/mL)  yang  sudah  diketahui  dari  hasil penelitian  sebelumnya  yaitu  0,3  mL  dari  10 6 cfu/mL E.coli agar  terjadi  diare  pada  tikus percobaan (Fitrial et al . 2012).
Evaluasi aktivitas biologis produk olahan biji  teratai  dilakukan  dengan  mengamati bobot  badan  tikus  (setiap  4  hari),  konsumsi ransum (setiap hari), kadar air feses, jumlah bakteri  asam  laktat  (pada  hari  ke-0,  14,  21 dan  28),  total    mikroba  (pada  hari  ke-0,  14, 21 dan 28), total E. coli feses (pada hari ke-0,
14, 21 dan 28), histopatologi dan sel inflamasi usus  halus  (jejunum)  tikus  percobaan  (pada hari    ke-0,  14,  21,  28).  Pada  hari  ke-7  tidak dilakukan  pengamatan  karena  berdasarkan hasil  penelitian  sebelumnya  menunjukkan bahwa pemberian produk biji teratai dengan dosis  yang  diberikan  tersebut  selama  7  hari tidak  menunjukkan  adanya  respon  yang berbeda  dibandingkan  dengan  kontrol (ransum standar).
Pengambilan  contoh  dilakukan  terlebih dahulu  dengan  membius  tikus  percobaan dengan    dietil  eter,    dan  selanjutnya  tikus
dibedah  untuk  diambil  bagian  ususnya. Pengamatan  mikroba  usus  dilakukan  dengan cara  menggunting  dinding  sekum  untuk dikeluarkan isi sekumnya. Tahapan ini dilakukan secara  aseptis,  selanjutnya  sesegera  mungkin dilakukan pengujian mikroba utama usus.
Pengamatan terhadap mikroba usus pada penelitian ini dilakukan pada bagian sekum, yaitu isi sekum (lumen). Pengamatan terhadap isi  sekum  dengan  pertimbangan  bahwa sekum  merupakan  bagian  proksimal  usus besar, diketahui  pada hewan non-ruminansia seperti tikus, proses fermentasi oleh mikroba sebagian  besar  terjadi  di  bagian  sekum  (Le Blay et al. 1990).
Pengamatan  mikroba  isi  sekum  (total mikroba, total E.coli dan bakteri asam laktat) dianalisis  dengan  terlebih  dahulu  membuat larutan contoh (Prestamo et al . 2003). Larutan contoh  dibuat  dengan    cara  mengambil  0,5 g  isi sekum, kemudian dilarutkan ke dalam NaCl fisiologis (0,85% NaCl) (5 mL) sehingga terbentuk suspensi contoh, selanjutnya  dibuat serangkaian  pengenceran  menggunakan pengencer NaCl fisiologis.
Total  mikroba. Suspensi  contoh (pengenceran  10 -1 )  dibuat  serangkaian pengenceran. Suspensi contoh dipipet secara aseptik  pada  tingkat  pengenceran  yang sesuai,  dan  digoreskan  sebanyak  1  mL  ke dalam cawan petri steril (duplo), selanjutnya dituangi  PCA,  dan  digoyang.  Inkubasi  pada suhu  35-37  °C  selama  48±2  jam  dilakukan setelah agar membeku. Koloni yang tumbuh dihitung sebagai total mikroba (cfu/mL).
Total  E.  coli .  Perhitungan  total  E. coli  isi  sekum  dilakukan  pertama-tama dengan membuat suspensi isi sekum dengan pengenceran  yang  sesuai.  Pada  tingkat pengenceran  tertentu  (dimana  diharapkan hasil  30-3000  koloni)  dipipet  1  mL  dan dipupuk  ke  TBX  dengan  metode  tuang  dan diinkubasi  secara  aerob  pada  suhu  37  °C selama 18-24 jam.  Koloni tipikal E. coli adalah koloni  dengan  warna  hijau  metalik,  shiny, conveks,  diameter  1-2  mm,  sel  berbentuk batang, Gram-negatif dan katalase positif.
Total  bakteri  asam  laktat .  Media  yang digunakan  untuk  menumbuhkan  bakteri asam laktat seperti Lactobacillus spp. adalah MRS agar yang ditambahkan CaCO3 dengan waktu inkubasi 3 hari. Inkubasi secara anaerob dilakukan  menggunakan  anaerobic  jar  yang dilengkapi gas generating kit, pada temperatur 37 °C.
Jumlah koloni spesifik (yaitu koloni yang dikelilingi  zona  bening)  dihitung  dengan metode  hitungan  cawan.  Hasil  kuantifikasi dinyatakan dalam log CFU per gram isi sekum.

## Analisis Data
Analisis  data  dilakukan  dengan rancangan acak lengkap (RAL) menggunakan program SPSS 11.5 dan uji beda lanjut dengan uji Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Pengolahan Biji Teratai terhadap Komponen Fitokimia Tepung Biji Teratai
Pengaruh pengolahan tepung biji teratai terhadap komposisi fitokimia  disajikan pada Tabel  1.  Perendaman  dilakukan  sebelum penepungan  dan  dilanjutkan  dengan pengukusan  dan  pengeringan  terhadap komponen  fitokimia  pada  produk  tepung. Komponen  fitokimia  yang  terdapat  pada biji  teratai  tidak  hilang  akibat  pengolahan meskipun  ada  beberapa  yang  diduga mengalami penurunan akibat pengolahan.
Biji  teratai  mengandung  komponen fitokimia  yaitu  alkaloid,  flavonoid,  steroid, glikosida,  fenolik,  saponin,  tanin  dan triterpenoid. Ekstrak biji teratai yang diekstrak secara  bertingkat  diawali  dengan  pelarut tidak  polar  (heksana),  dilanjutkan  dengan pelarut  semi  polar  (etil  asetat)  kemudian diekstrak  dengan  pelarut  polar  (etanol) diperoleh  penyebaran  komponen  fitokimia di  dalam  masing-masing  ekstrak.  Alkaloid, saponin, dan glikosida terdapat pada ekstrak heksana.  Alkaloid,  tanin,  glikosida,  saponin, flavonoid  dan  triterpenoid  terdapat  pada ekstrak  etil  asetat  (semi  polar)  dan  saponin, tanin,  flavonoid  dan  alkaloid  terdapat  pada
ekstrak  etanol  (polar)  (Fitrial et  al .  2008), hal  ini  menunjukkan  bahwa  alkaloid  yang merupakan komponen utama biji teratai larut pada pelarut tidak polar, semi polar maupun polar. Alkaloid yang terdapat pada biji teratai diduga tidak rusak akibat proses  perendaman, pengukusan dan pengeringan, demikian pula pada  komponen  fitokimia  yang  lain,  kecuali flavonoid.  Flavonoid  yang  terdapat  pada  biji teratai bersifat semi polar dan polar.  Komponen tersebut  diduga  menjadi  rusak  akibat  proses perendaman,  yang  dilanjutkan  dengan pengukusan  dan  pengeringan,  sebaliknya terjadi pada triterpenoid, setelah melalui proses pengolahan  meningkat  secara  kualitatif  dari positif lemah menjadi positif kuat.
Beberapa  bahan  pangan  lainnya  yang juga  mengandung  komponen  fitokimia yang  diketahui  memiliki  aktivitas  biologis untuk  kesehatan,  mengalami  penurunan kadarnya  akibat  proses  pengolahan  dari beberapa  komponen  tersebut,  seperti  pada biji  karabenguk  (pensubstitusi  kedelai) (Nwaoguikpe et  al .  2011),  sayuran  seperti brokoli (Yuan et al. 2009) dan  sawi (Palegrini et  al. 2010),  serta  buah-buahan  seperti acai  berry (Pacheco-Palencia et  al. 2009). Berdasarkan  beberapa  cara  pengolahan tersebut,  diantaranya  adalah  perebusan, pengukusan, microwaving , dan penggorengan,
Tabel 1 Komposisi fitokimia biji teratai dan te- pung biji teratai pra-masak Komponen fitokimia Biji teratai Tepung biji teratai pra masak Alkaloid ++++ ++++ Saponin + + Tannin + + Flavonoid +++ + Glikosida ++ ++++ Triterpenoid + +++ Steroid +++ ++ Keterangan: - = negatif; + = positif lemah;  ++ = positif;  +++ = positif kuat;    ++++ = positif kuat sekali
Tepung biji teratai pencegah diare, Fitrial, Y. et al.
cara  pengukusan  menyebabkan  penurunan terhadap  kadar  komponen  fitokimia  yang paling rendah.
Interaksi senyawa aktif antimikroba (seperti fenolik) dengan protein dan komponen pangan lainnya terjadi selama proses pengolahan dan aktivitasnya  mungkin  berubah  sebagai  hasil dari proses hidrolisis karena glikosida dan ester dikonversi  menjadi  derivatif  fenolik  bebas. Flavonoid  merupakan  golongan  terbesar  dari senyawa fenolik. Flavonoid umumnya terdapat dalam  tumbuhan,  dalam  bentuk  aglikon maupun  terikat  pada  gula  sebagai  glikosida (Harborne    1987).  Kemungkinan  lainnya adalah  terjadinya  kompleks  antara  senyawa fenolik dengan logam.
Proses pemanasan berpengaruh terhadap aktivitas  antibakteri  ekstrak  etil  asetat  biji teratai.  Semakin  tinggi  suhu  maka  aktivitas antibakteri  semakin  menurun,  meskipun demikian pada suhu 121°C ekstrak etil asetat biji teratai masih memiliki aktivitas antibakteri (Fitrial 2011).
Proses pemanasan berpengaruh terhadap kestabilan fraksi ekstrak etil asetat biji teratai.
Fraksi  dari  ekstrak  etil  asetat  yang  berperan sebagai antibakteri diantaranya adalah fraksi
5 dan 6 yang relatif lebih polar dibandingkan fraksi  lainnya  yang  lebih  tidak  polar  dan kedua  fraksi  ini  relatif  tidak  stabil  terhadap pemanasan  suhu  100  dan  121  °C  (Fitrial 2011),  meskipun demikian menurut Naufalin (2006), pemanasan pada suhu 80 °C dan 100 °C  selama  10,  20  dan  30  menit  dan  121°C selama 10 menit tidak berpengaruh terhadap aktivitas  antimikroba  dari  ekstrak  etil  asetat kecombrang terhadap Bacillus cereus, Listeria monocytogenes,  Staphylococcus  aureus,  S. typhimurium, Pseudomonas aeroginosa, E.coli dan Aeromonas hydrophila.
Pengaruh Pemberian Tepung Biji Teratai Pra-Masak terhadap Konsumsi Ransum dan Bobot Badan Tikus Percobaan
Penyusunan  ransum  yang  disubstitusi dengan  produk  olahan  biji  teratai  dilakukan secara  isokalori  dan  isonitrogen  dengan
mempertimbangkan  zat  gizi  yang  terdapat pada tepung biji teratai yang mempengaruhi pertumbuhan tikus percobaan, seperti protein, lemak  dan  karbohidrat.  Komposisi  ransum pada penelitian disajikan pada Tabel 2. Total  konsumsi,  kenaikan  bobot badan  selama  perlakuan  (28  hari)  dan efisiensi  ransum  disajikan  pada  Tabel  3. Efisiensi  penggunaan  ransum  merupakan perbandingan  antara  kenaikan  berat  dengan total  konsumsi.  Pengaruh  perlakuan  ransum pada kelompok tikus yang sehat, berpengaruh nyata terhadap nilai efisiensi ransum. Kelompok  tikus  percobaan  yang  diberi ransum standar dan tidak diintervensi EPEC menunjukkan  kenaikan  bobot  badan  yang lebih  tinggi  (30,8  g)  dibanding  kelompok lainnya  yang  diintervensi  EPEC.  Grup kontrol  yang  diberi  ransum  standar  dan diintervensi  EPEC  menunjukkan  kenaikan bobot  badan  yang  paling  rendah  (16,8  g) dan  efisiensi  ransum  yang  paling  rendah (7,38%)  dibandingkan  dengan  grup  lainnya, hal ini menunjukkan bahwa intervensi EPEC mengakibatkan  menurunnya  konsumsi ransum  yang  berakibat  terhadap  kenaikan
Tabel 2  Komposisi ransum tikus percobaan Bahan (%) Grup tikus percobaan Kontrol Tepung  biji tertatai Kasein 11,36 9,24 Minyak jagung 7,94 6,46 Mineral mix 4,55 3,70 Air 4,50 3,66 Selulosa 1 0,81 Vitamin mix 1 0,81 Pati jagung 69,65 56,65 Tepung  pra masak 0 18,66 100 100 Keterangan : Grup kontrol menggunakan ransum standar  (Modifikasi  AOAC  1990). Ransum  yang  diberikan:  10  g/hari/ ekor  tikus.  Kasein    sebagai  sumber protein ransum (10%)
bobot badan. Intervensi EPEC selama 7 hari mengakibatnya  menurunnya  bobot  badan tikus  percobaan  mencapai  54%  dan  efisiensi ransum menurun hingga 38%.
Grup  yang  pada  ransumnya  disubstitusi dengan  tepung  biji    teratai  pra-masak    dan diintervensi EPEC terjadi penurunan konsumsi ransum  mencapai  12%  akibat  intervensi E.coli dan  kenaikan  bobot  badan  mencapai 23,2  g  atau  lebih  rendah  25%  dibandingkan dengan grup kontrol (tanpa intervensi EPEC), akan  tetapi  masih  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  grup  kontrol  yang  diintervensi EPEC  yang  lebih  rendah  mencapai  45%,  hal ini  menunjukkan  bahwa  substitusi  produk olahan biji teratai dapat membantu mengatasi penurunan bobot badan akibat  infeksi EPEC pada pencernaan. Efisiensi ransum tepung biji teratai mencapai 10%. Kadar protein 10% pada ransum  merupakan  kebutuhan  tubuh  akan protein  untuk  pemeliharaan  bukan  untuk pertumbuhan  yang  membutuhkan  protein >10%,  jadi  sangat  memungkinkan  mengapa kenaikan bobot badan tikus percobaan hanya berkisar 30% pada tikus yang normal.
Pengaruh Pemberian Tepung  Biji  Teratai Pra Masak terhadap Kadar Air Feses
Tikus Percobaan Pengamatan mengenai pengaruh pemberian  tepung  biji  teratai  pra-masak terhadap  kadar  air  feses  tikus  percobaan yang  dicekok  EPEC  dilakukan  sebelum  tikus percobaan  dicekok  EPEC  yaitu  hari  ke-14 perlakuan ransum, hari ke-17 (dua hari setelah dicekok EPEC), hari ke-20 (hari ke-6 dicekok EPEC), hari ke-22 (sehari setelah cekok EPEC dihentikan), hari ke 24 (hari ke-3 setelah cekok
EPEC  dihentikan)  dan  hari  ke-28  (tujuh  hari setelah cekok EPEC dihentikan) (Gambar 1). Peningkatan  kadar  air  feses  sekitar  10% terjadi setelah 2 hari dicekok EPEC yang diduga telah terjadi diare pada tikus percobaan untuk semua perlakuan yang dicekok EPEC,  hal ini berbeda  dengan  grup  yang  tidak  diintervensi EPEC, kadar air fesesnya tidak berbeda dengan kadar air feses sebelumnya (P<0,05). Penurunan kadar  air  feses  sekitar  5%  terjadi  setelah    hari ke-6  intervensi  EPEC  dilakukan.    Penurunan kadar  air  feses  rata-rata  2%  dari  sebelumnya pada  grup  yang  diberi  produk  olahan  biji teratai (P<0,05) terjadi setelah sehari intervensi EPEC  dihentikan.  Kondisi  sebaliknya  pada grup  kontrol  yang  diintervensi  EPEC,  terjadi peningkatan kadar air feses walaupun intervensi sudah  dihentikan,  hal  ini  menunjukkan terjadi  diare  yang  berlanjut.    Kondisi  ini  terus berlanjut hingga 7 hari setelah intervensi EPEC dihentikan. Tikus percobaan yang diberi tepung biji teratai pra masak, setelah tiga hari intervensi EPEC  dihentikan,    kadar  air  fesesnya  normal kembali  seperti  sebelum  dilakukan  intervensi EPEC. Hal ini   menunjukkan adanya pengaruh dari  ransum  terhadap  pertumbuhan  EPEC  di pencernaan tikus percobaan.
Pengaruh Pemberian Tepung Biji Teratai Pra Masak terhadap Total Mikroba, Total E. coli dan Total Bakteri Asam Laktat Isi Sekum Tikus Percobaan
Pengamatan terhadap pengaruh substitusi tepung  biji teratai terhadap total mikroba  tikus percobaan yang  diintervensi EPEC dilakukan dengan menghitung total mikroba  yang ada dalam  isi  sekum.  Total  mikroba  pada  grup yang diberi ransum yang disubstitusi tepung Tabel 3 Total konsumsi, kenaikan bobot badan dan efisiensi ransum tikus percobaan Total konsumsi (g) Kenaikan bobot badan (g) Efisiensi ransum (%) Kontrol A 260,6a 30,8a 11,83a Kontrol B 227,6b 16,8c 7,38b Grup tepung biji teratai 228,2b 23,2b 10,17a
Huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata (P>0,05)
Tepung biji teratai pencegah diare, Fitrial, Y. et al.
biji teratai terlihat tidak berbeda dibandingkan dengan grup lainnya (P>0,05) setelah 14 hari pemberian  ransum  perlakuan  (Gambar  2). Total  mikroba  dari  grup  tikus  percobaan kontrol    yang  dicekok E.coli selama  7  hari, terlihat mengalami penurunan dibandingkan dengan  grup  lainnya  (P<0,05),  sedangkan pada grup yang disubstitusi tepung biji teratai total  mikrobanya  lebih  tinggi  dari  kondisi sebelumnya.  Kondisi setelah  7 hari intervensi E.coli dihentikan,  total  mikroba  isi  sekum dari  grup  kontrol  yang  diintervensi E.coli mengalami  peningkatan  dari  sebelumnya, sementara pada grup yang disubstitusi tepung biji  teratai  tidak  menunjukkan  perbedaan dengan kondisi sebelumnya. Pengamatan terhadap pengaruh substitusi biji teratai terhadap total E. coli tikus
percobaan yang  diintervensi EPEC dilakukan dengan menghitung total E. coli yang ada di dalam  isi  sekum.  Setelah  14  hari  pemberian ransum  perlakuan,  total E.  coli pada  grup yang diberi ransum yang disubstitusi tepung biji teratai terlihat lebih rendah dibandingkan dengan grup lainnya (Gambar 3).
Total E. coli terlihat tidak berbeda pada semua grup (P>0,05) setelah 7 hari diintervensi EPEC,  akan  tetapi  setelah  7  hari  intervensi dihentikan terjadi penurunan total E. coli pada grup yang diberi tepung biji teratai (P<0,05). Hal sebaliknya terjadi pada grup kontrol yang diintervensi E. coli, dimana terjadi peningkatan pada  total E.coli. Hal  ini  menunjukkan tepung  biji  teratai  dapat  menghambat  atau mencegah  tumbuhnya E.  coli patogen  pada saluran  pencernaan  hewan  percobaan.
Grup tikus percobaan Sebelum perlakuan Setelah 14 hari perlakuan Setelah intervensi EPEC Setelah 7 hari intervensi EPEC dihentikan 1 2 3 1        2 3 1 2 3 1 2 3 Kontrol A - - - Kontrol B -      - - ++ (N)  + ++ (N) +++ (N) +++ (N) ++ (N) Tepung biji teratai pra masak - + + - + + + ++ +
Keterangan :  N= nekrosis - = tidak ada inflamasi, + = inflamasi ringan, ++ = inflamasi sedang, dan +++  = inflamasi berat
Gambar 1  Kadar air feses tikus percobaan, sebelum, saat diintervensi EPEC dan setelah intervensi EPEC dihentikan. Huruf yang sama pada setiap tahap perlakuan menunjukkan tidak berbeda nyata (P>0,05) Kontrol A tidak diintervensi E. coli ;     Kontrol B, yang diintervensi E. coli ;
Tepung biji teratai pra-masak 0 2 4 6 8 10 12 14 16 14 17 20 22 24 28 Kadar air feses (% ) Perlakuan hari ke- a a b b a b c a a b a a b a a b  b a
Gambar 1 Kadar air feses tikus percobaan, sebelum, saat diintervensi EPEC dan setelah intervensi EPEC dihentikan. Huruf yang sama pada setiap tahap perlakuan menunjukkan tidak berbeda nyata (P>0,05). Kontrol A tidak diintervensi E. coli (black shading) ; Kontrol B, yang diintervensi E. coli (empty shading) ; Tepung biji teratai pra-masak ( grey shading )
Gambar 2 Total mikroba isi sekum tikus percobaan selama 28 hari perlakuan. Huruf yang sama pada setiap tahap perlakuan menunjukkan tidak berbeda nyata (P>0,05) Kontrol A tidak diintervensi E. coli ;     Kontrol B, yang diintervensi E. coli ; Tepung biji teratai pra-masak
Gambar 3  Total E. coli isi sekum percobaan selama 28 hari perlakuan. Huruf yang sama menunjukkan tidak  berbeda nyata (P>0,05) Kontrol A tidak diintervensi E. coli ;     Kontrol B, yang diintervensi E. coli ; Tepung biji teratai pra-masak
0 1 2 3 4 5 6 7 8 14 hari setelah pemberian ransum Setelah intervensi E.coli 7 hari setelah intervensi E.coli dihentikan
To tal E.co li is i sek um ( Lo g 10 CFU/g) Waktu perlakuan a a a a ab b a b a 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 14 hari setelah pemberian ransum setelah intervensi  EPEC 7 hari setelah intervensi EPEC dihentikan To tal m ik ro ba i si sek um ( Lo g 10 CFU/g) Waktu perlakuan a a a a a b a ab b
Gambar 2 Total mikroba isi sekum tikus percobaan selama 28 hari perlakuan. Huruf yang sama pada setiap tahap perlakuan menunjukkan tidak berbeda nyata (P>0,05). Kontrol A tidak diintervensi E. coli (black shading) ; Kontrol B, yang diintervensi E. coli (empty shading) ; Tepung biji teratai pra-masak ( grey shading ).
Mekanisme  penghambatan  terhadap  EPEC pada perlakuan substitusi tepung biji teratai, karena  adanya  komponen  antimikroba  yang diketahui  dapat  menghambat  pertumbuhan EPEC.  Adanya  tanin  pada  tepung  biji teratai  dapat  menghambat  aktivitas  protease (Scalbert  1991)  yang  diproduksi  oleh  EPEC K1.1  (Budiarti  dan  Mubarik  2007)  untuk mendegradasi  mucin  yang  merupakan  salah satu  mekanisme  pertahanan  inang  untuk mencegah melekatnya patogen pada sel epitel usus, selain itu terutama adanya alkaloid yang juga berperan sebagai antibakteri (Ramkumar et al. 2007).
Pengamatan  terhadap  total  BAL  aerob diharapkan  dapat  mewakili  pengamatan terhadap  BAL  aerob,  terutama Lactobacillus . Pengaruh  intervensi  EPEC  terhadap pertumbuhan  BAL  aerob  isi  sekum  pada hewan  percobaan  yang  diberi  ransum  yang
disubstitusi tepung biji teratai disajikan pada Gambar 4.
Pemberian  ransum  yang  disubstitusi tepung  biji teratai selama 14 hari terlihat tidak dapat menstimulasi pertumbuhan bakteri asam laktat di sekum tikus percobaan. Hal ini dapat dilihat  pada  total  BAL  yang  tidak  berbeda dengan  total  BAL  pada  kontrol  yang  diberi ransum stándar (P>0,05). Hal yang sama terjadi setelah  intervensi  EPEC  (pada  hari  ke-22), dimana BAL aerob isi sekum pertumbuhannya tidak  terpengaruh  dengan  adanya  intervensi EPEC pada grup tikus yang diberi ransum yang disubstitusi tepung biji teratai.
Total BAL isi sekum dari grup kontrol yang terinfeksi EPEC terlihat mengalami penurunan setelah  intervensi  EPEC  dihentikan,  yang berbeda  dengan  kondisi  sebelumnya.  Hal  ini menunjukkan intervensi EPEC mengakibatkan penurunan  total  BAL  aerob  isi  sekum,
Tepung biji teratai pra-masak
Gambar 3  Total E. coli isi sekum percobaan selama 28 hari perlakuan. Huruf yang sama menunjukkan tidak  berbeda nyata (P>0,05) Kontrol A tidak diintervensi E. coli ;     Kontrol B, yang diintervensi E. coli ;
Tepung biji teratai pra-masak 0 1 2 3 4 5 6 7 8 14 hari setelah pemberian ransum Setelah intervensi E.coli 7 hari setelah intervensi E.coli dihentikan To tal E.co li is i sek um ( Lo g 10 CFU/g) Waktu perlakuan a a a a ab b a b a 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9
14 hari setelah pemberian ransum setelah intervensi  EPEC 7 hari setelah intervensi EPEC dihentikan
To tal m ik ro ba i si sek um ( Lo g 10 CFU/g)
Gambar 3 Total E. coli isi sekum percobaan selama 28 hari perlakuan. Huruf yang sama menunjukkan tidak  berbeda nyata (P>0,05) Huruf yang sama pada setiap tahap Kontrol A tidak diintervensi E. coli (black shading) ; Kontrol B, yang diintervensi E. coli (empty shading) ; Tepung biji teratai pra-masak ( grey shading ).
Gambar 4 Total bakteri asam laktat isi sekum tikus percobaan. Huruf yang sama menunjukkan tidak  berbeda nyata (P>0,05) Kontrol A tidak diintervensi E. coli ;     Kontrol B, yang diintervensi E. coli ; Tepung biji teratai pra-masak
(a) normal (sehat) (b) akibt intervensi EPEC Gambar 5. Gambaran histopatologi jejunum  tikus percobaan (a) normal (sehat), (b) akibat intervensi EPEC. Necrosis Sel radang 5 6 7 8 9 14 hari setelah pemberian ransum setelah intervensi  EPEC 7 hari setelah intervensi EPEC dihentikan To tal B al is i sek um (L og 10 CFU/g) Waktu perlakuan a a a a a a a a b
Gambar 4 Total bakteri asam laktat isi sekum tikus percobaan. Huruf yang sama menunjukkan tidak  berbeda nyata (P>0,05) Kontrol A tidak diintervensi E. coli (black shading) ; Kontrol B, yang diintervensi E. coli (empty shading) ; Tepung biji teratai pra-masak ( grey shading ).
Tepung biji teratai pencegah diare, Fitrial, Y. et al.
yang  mengakibatkan  terjadinya  perubahan keseimbangan  mikroflora  di  sekum.  Berbeda halnya dengan grup yang diberi ransum tepung biji  teratai  yang  menunjukkan  jumlah  BAL aerob yang  tidak berbeda dengan jumlah BAL sebelumnya (P<0,05), meskipun terjadi sedikit penurunan jumlah BAL aerob jika dibandingkan dengan  kondisi  sehat  (tidak  diintervensi EPEC),  akan  tetapi  jumlahnya  masih  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  grup  kontrol (mendekati  1  unit  log).  Hal  ini  menunjukkan pemberian  tepung  biji  teratai  sebelum  inang terinfeksi bakteri patogen mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen yang  masuk ke dalam  tubuh  inang  dan  pemberian  perlakuan dilanjutkan  terus  setelah  terinfeksi  patogen, mampu  mempertahankan  kondisi  yang  sama dengan  sebelum  terinfeksi.  BAL  aerob  yang distimulasi  oleh  biji  teratai  mampu  bertahan akibat adanya intervensi patogen.
Ballongue  (2004)  menyatakan  bahwa keseimbangan ekosistem saluran gastrointestinal dapat  terjaga  melalui  beberapa  faktor  berupa mekanisme secara fisik, kimia dan pengaturan biologis  seperti  gerakan  peristaltik  usus  yang dapat menyebabkan eliminasi mikroorganisme dan  interaksi-interaksi  yang  terjadi  antara berbagai  macam  spesies  bakteri  yang  terdapat dalam  usus  baik  simbiosis  maupun  antagonis. Mekanisme  dan  kandungan  mikroflora  yang amat  kompleks  dalam  saluran  pencernaan hewan  percobaan  dapat  menyebabkan  BAL aerob  tidak  dapat  beradaptasi  dan  bersaing dalam saluran pencernaan hewan.

## Histologi  Mukosa Usus Halus Tikus Percobaan dan Sel Inflamasi
Pengamatan  histopatologi  dari  mukosa usus  halus  (jejunum)  tikus  percobaan dilakukan  dengan  mengamati  sel  inflamasi (sel radang) (secara kualitatif, dari 10 lapangan pandang per sampel pada pembesaran 100x) dan  kerusakan  pada  vili  usus  (nekrosis) yang  hasilnya  disajikan  pada  Tabel  4  dan Gambar 5. Pengamatan histopatologi sebelum diberikannya  perlakuan  menunjukkan  tidak ditemukannya  sel  radang  pada  sampel. Ditemukan  adanya  sel  radang  dari  tidak ada  hingga  dalam  jumlah  yang  ringan  pada perlakuan tepung biji teratai pra masak setelah 14  hari  perlakuan.  Akibat    intervensi  EPEC, pada grup kontrol yang diberi ransum standar jumlah sel radangnya mengalami peningkatan dari tidak ada menjadi sedang. Terjadinya nekrosis pada usus yang  ditemukan  pada  2  individu  hewan percobaan  menunjukkan  bahwa  intervensi enteropatogenik E.  coli dapat  menyebabkan terjadinya nekrosis pada sel-sel di usus halus, sebaliknya pada usus halus hewan coba yang diberi  perlakuan  tepung  biji  teratai  pra- masak  tidak  menunjukkan  adanya  nekrosis dan  sel  inflamasi  dari  tidak  ada  hingga ringan. Pemberian tepung biji teratai mampu mencegah  melekatnya E.  coli pada  mukosa usus dan mencegah timbulnya nekrosis pada sel akibat aktivitas bakteri tersebut.
Jumlah  sel  radang  pada  grup  kontrol, setelah  7  hari  intervensi  EPEC  dihentikan
Gambar 4 Total bakteri asam laktat isi sekum tikus percobaan. Huruf yang sama menunjukkan tidak  berbeda nyata (P>0,05) Kontrol A tidak diintervensi E. coli ;     Kontrol B, yang diintervensi E. coli ; Tepung biji teratai pra-masak
(a) normal (sehat) (b) akibt intervensi EPEC
Gambar 5. Gambaran histopatologi jejunum  tikus percobaan (a) normal (sehat), (b) akibat intervensi EPEC.
Necrosis Sel radang
5 6 7 8 9 14 hari setelah pemberian ransum setelah intervensi  EPEC 7 hari setelah intervensi EPEC dihentikan
To tal B al is i sek um (L og 10 CFU/g) Waktu perlakuan a a a a a a a
a b Gambar 5 Gambaran histopatologi jejunum  tikus percobaan (a) normal (sehat), (b) akibat intervensi EPEC. Necrosis Sel radang (a) (b)
berkisar  antara  sedang  hingga  berat  yang disertai  adanya  nekrosis  pada  3  individu yang diamati, hal ini menunjukkan walaupun intervensi  sudah  dihentikan  akan  tetapi kerusakan pada sel mukosa usus terus berlanjut, sebaliknya pada perlakuan pemberian tepung biji  teratai,  kerusakan  pada  sel  mukosa  usus tidak  ditemukan,    dan  adanya  sel  inflamasi berkisar dari ringan hingga moderat.
Ringler (1996) menyatakan bahwa suatu fenomena  patologi  yang  telah  lama  diketahui tentang  inflamasi  adalah  timbulnya  suatu reaksi  dari  jaringan  terhadap  adanya  suatu iritan.    Iritan  tersebut  dapat  berupa  toksin yang  dihasilkan  oleh  mikroba  atau  bagian dari  sel  mikroba.  Inflamasi  merupakan  suatu proses  yang  dinamis  dan  tidak  stabil,  dan proses tersebut tergantung dari jenis jaringan tubuh.    Inflamasi  dapat  bermula  dari  adanya kerusakan  jaringan  yang  sublethal  dan  dapat diakhiri dengan penyembuhan, selain hiperemi dan  peningkatan  permeabilitas  pembuluh darah,  reaksi  inflamasi  akut  juga  ditandai dengan  adanya  kejadian  yang  lebih  penting yaitu  keluarnya  leukosit  dari  sirkulasi  perifer ke  ruang  ekstraseluler.    Sel  leukosit  tersebut berfungsi  dalam  proses  fagositosis  agens penyebab inflamasi, dan dalam proses tersebut akan dihasilkan radikal bebas. Secara fisiologis, pada keadaan normal sel memproduksi radikal bebas  sebagai  konsekuensi  logis  pada  reaksi biokimia  dalam  kehidupan  aerobik.  Radikal bebas  dianggap  berbahaya  karena  terjadinya reaktif  dalam  upaya  mendapatkan  pasangan elektronnya (Wresdiyati et al. 2003).  Radikal bebas  dalam  jumlah  banyak  akan  menarik elektron  makromolekul  seperti  protein,  asam lemak dan polisakarida,  reaksi tersebut akan merusak  membran  sel  yang  komponennya adalah makromolekul tersebut, yang kemudian akan berakhir pada kerusakan sel. Kerusakan sel dalam hal ini termasuk kerusakan sel usus dan  kerusakan  sel  endotel  pembuluh  darah yang mengakibatkan permeabilitas pembuluh darah meningkat sel diapedesis sel radang atau leukosit.  Proses  fagositosis  yang  dilakukan oleh sel-sel inflamasi juga dapat menghasilkan
radikal bebas.  Kondisi ini lebih memperparah kerusakan  sel  akibat  radikal  bebas,  termasuk terjadinya inflamasi.
Nekrosis  merupakan  sebuah  kematian sel  yang  terjadi  secara  tidak  alami  dan umumnya  disebabkan  oleh  faktor  dari  luar secara  langsung,  misalnya  kematian  sel karena  kecelakaan,  infeksi  virus,  radiasi sinar  radio  aktif  atau  keracunan  zat  kimia. Sel  tidak  akan  dapat  mati  secara  nekrosis tanpa adanya tekanan dari luar (Hoerr 1998). Nekrosis  merupakan  proses  kematian  sel yang melibatkan sekelompok sel, dengan ciri membran sel mengalami kehilangan integritas dan membran sel terlihat membengkak untuk kemudian  mengalami  lisis.  Nekrosis  juga menyebabkan  terjadinya  kebocoran  lisosom dan sel yang mengalami nekrosis kromatinnya bergerombol  dan  terjadi  agregasi.  Terlihat respon  peradangan  yang  nyata  di  sekitar sel-sel  yang  mengalami  nekrosis.  Sel  yang mengalami  nekrosis  akan  dimakan  oleh makrofag.  Nekrosis  terjadi  karena  trauma nonfisiologis dan tidak disertai proses sintesis makromolekul baru.
Intervensi EPEC menyebabkan terjadinya inflamasi sel dan berlanjut dengan terjadinya nekrosis  pada  sel  mukosa  usus  halus (jejunum) tikus percobaan.  Substitusi tepung biji  teratai  pada  ransum  dapat  mencegah terjadinya  nekrosis  pada  sel  mukosa  usus akibat  intervensi  EPEC.    Makanan  berperan penting  pada  masuknya  suatu  nutrien  dan senyawa  fitokimia  ke  dalam  tubuh.  Aktivitas biologis  suatu  senyawa  aktif  tidak  tergantung pada  tinggi  atau  rendahnya  kadar  suatu senyawa  aktif,  akan  tetapi  lebih  ditentukan oleh kualitas nutrisinya ( bioavailability ), salah satunya  ditentukan  oleh  struktur  kimia  dari suatu  fitokimia  yang  terdapat  pada  bahan pangan  (Scalbert  dan  Williamson  2000).  Hal tersebut  menentukan  apakah  suatu  senyawa mudah diserap, tidak cepat didegradasi dalam jaringan  dan  dapat  mencapai  target,  sebagai contoh  flavonoid  yang  tidak  dapat  diserap. Flavonoid  tersebut  mengalami  degradasi oleh  mikroflora  usus  sehingga  peranannya
Tepung biji teratai pencegah diare, Fitrial, Y. et al.
hanya  terbatas  pada  pencegahan  kerusakan oksidatif  di  dalam  kolon.  Contoh  lainnya adalah  quercitin-β-glukosida  (terikat)  lebih mudah  diserap  daripada  quercitin  aglikon (tidak  terikat),  demikian  pula  pada  flavonol glikosida lebih mudah diserap daripada bentuk aglikonnya (Scalbert dan Williamson 2000). Hal  lain  yang  menjadi  pertimbangan adalah bahwa senyawa aktif yang terdapat di dalam tepung biji teratai pra-masak meskipun sudah  mengalami  proses  pengolahan  masih memiliki  aktivitas  antimikroba.  Hal  yang sama juga terjadi pada senyawa aktif lycopen dan  beta-karoten  yang  terdapat  di  tomat. Kualitas antioksidan  lycopen meningkat pada pasta  tomat  dibandingkan  pada  tomat  segar (Gartner et al .1997), demikian pula  kualitas beta-karoten pada wortel dan bayam mentah lebih  rendah  dibandingkan  setelah  dimasak (Rock et  al. 1998).  Proses  pengalengan mampu  meningkatkan  50-53%  aktivitas antioksidan  dari  fenolik  pada  blueberry, demikian  pula  proses  blanching  pada  awal proses  pengalengan  meningkatkan  retensi fitokimia  blueberry (Sablani et al . 2010).
Senyawa  aktif  yang  terdapat  di  dalam tepung  biji  teratai  pra-masak  diduga  juga tidak terpengaruh oleh pH lambung sehingga masih  memiliki  aktivitas  mencegah  diare. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya yang mengamati  pengaruh  pH  lambung  terhadap aktivitas  antibakteri  dari  ekstrak  dan  fraksi ekstrak  etil  asetat  biji  teratai  secara  in  vitro menunjukkan  bahwa  hingga  pH  1  aktivitas penghambatannya terhadap mikroba uji tidak berubah (Fitrial 2011).

## KESIMPULAN
Substitusi  tepung  biji  teratai  pra-masak sebelum, selama dan sesudah intervensi EPEC dapat  mencegah  diare  yang  berkepanjangan pada  tikus  dan  dapat  melindungi  kerusakan epitel usus halus akibat intervensi EPEC.

## DAFTAR PUSTAKA
[AOAC]  Assosiation  of  Official  Agricultural Chemists.  1990.  Official  Methods  of
Analysis. Washington DC: Assosiation of Official Agricultural Chemists. Ballongue  J.  1998. Lactic  Acid  Bacteria Microbiology  and  Functional  Aspects: Bifidobacteria  and  Probiotic. New  York: Marcell Dekker Inc. Budiarti  S,  Mubarik  NR.  2007.  Extracelluler protease  activity  of  Enteropathogenic Escherichia coli on mucin substrate. Short Communication. HAYATI  Journal  of
Biosciences 14(1): 36-38.
Fitrial Y, Astawan M, Soekarto ST, Wiryawan
KG,  Wresdiyati  T,  Khairina  R.  2008.
Potensi    biji  teratai  sebagai  antidiare. Jurnal  Teknologi  dan  Industri  Pangan 19(2): 158-164.
Fitrial Y. 2011. Aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat  biji  teratai  ( Nymphaea  pubescens Willd)  akibat  pemanasan. Jurnal Pengolahan  Hasil  Perikanan  Indonesia 14(1): 43-48.
Fitrial Y, Astawan M, Soekarto ST, Wiryawan
KG, Wresdiyati T. 2012.  Potensi  biji dan ekstrak biji teratai ( Nymphaea pubescens Willd)  sebagai  pencegah  diare  pada tikus percobaan yang diintervensi E. coli enteropatogenik. Jurnal Agritech 32(3): in press. Gartner C, Stahl W, Sies H.  1997.  Increased lycopene  bioavailability  from  tomato paste as compared to fresh tomatoes. The American Journal of Clinical Nutrition 66:
116-127 Harborne  JB.    1987. Metode  Fitokimia: Penuntun  Cara  Modern  Menganalisis Tumbuhan .    Ed  ke-2.    Padmawinata K,  Soediro  I,  penerjemah.  Bandung: Penerbit ITB Bandung. Terjemahan dari: Phytochemical Methods.
Hoerr  FJ.  1998.    Pathogenesis  of  enteric diseases. Poultry Science 77: 1150-1155. Khairina  R,    Fitrial  Y.    2002.    Produksi  dan kandungan  gizi  biji  teratai  (Nymphae pubescens  Wild)tanaman  air  yang terdapat  di  Hulu  Sungai  Utara. Jurnal Ilmiah Fakultas Pertanian 77-88. Le Blay G, Michel C, Blottiere HM, Cherbut
C.  1990.  Prolonged  intake  of  fructo- oligosaccharides  induces  a  short-term elevation  of  lactic  acid-producing bacteria  and  persistent  increase  in  cecal butyrate in rats. Journal of Nutrition 129: 2231-2235. Naufalin R, Jenie BSL, Kusnandar F,Sudarwanto M,  Rukmini  HS.  2006.  Pengaruh  pH, NaCl dan pemanasan terhadap kajian sifat antimikroba  ekstrak  bunga  kecombrang terhadap  stabilitas  antibakteri  bunga kecombrang dan aplikasinya pada daging sapi giling. Jurnal Teknologi dan Industri
Pangan 17(3): 197-203.
Nwaoguikpe  RN,  Braide  W,  Ojowundu  CO. 2011. The effect of processing on proximate and phytochemical composition of Mucuna pruriens  seeds  (velvet  beans). Pakistan Journal of Nutrition 10(10): 947-951.
Palegrini N, Chiavaro E, Gardana C, Mazzeo T, Contino D, Gallo M, Riso P, Fagliano V,  Porsini  M.  2010.  Effect  of  different cooking methods on color, phytochemical concentration, and antioxidants capacity of  raws  and  frozen  Brassica  vegetables. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58(77): 4310-4321.
Pacheco-Palencia  LA,  Duncan  CE,  Talcott ST.  2009.  Phytochemical  composition and thermal stability of two commercial acai spesies, Euterpe oleracea and Euterpe precatoria . Food Chemistry 115(4): 1199-
1205. Prestamo G, Pedrozuelo A, Perias E, Lasuncion MA,  Arroyo.  2003.  Role  of  buckwheat diet on rats as prebiotic and healthy food.
Nutrition Research 23(6): 803-814.
Ramkumar  KM,  Rajaguru  P,  Ananthan R.  2007.  Antimicrobial  properties and  phytocemical  constituents  of  an antidiabetic  plant Gymnema  montanum .
Advances  in  Biological  Research 1(1-2): 67-71. Ringler  DJ.  1996.  Inflammation  and  Repair. In:  Jones  TC  (ed), Veterinary  Pathology. Williams & Wilkins. p 113-157. Rock CL, Lovalvo JL, Emenniser C, Ruffin MT, Flatt SW, Schwartz SJ. 1998.  Bioavailability of beta-carotene is lower in raw than in processed carrots and spinach in women. Journal of Nutrition 128(5): 913-916.
Sablani  SS,  Andrews  PK,  Davies  NM,  Walters T,  Saez  H,  Syamaladevi  RM,  Mohekar PR.  2010.  Effect  of  thermal  treatments on  phytochemicals  in  conventionally  and organically  grown  berries. Journal  of    The Science of Food and Agriculture 90(5):769-77.
Scalbert A. 1991. Antimicrobial properties of tanins. Phytochemistry 30(12): 3875-3883.
Scalbert  A,  Williamson  G.  2000.  Dietary intake and bioavailability of polyphenols. Journal of Nutrition 130: 2073S-2085S.
Wresdiyati  T,  Astawan  M,  Adnyane  IKM. 2003.    Aktivitas  anti  inflamasi  oleoresin jahe ( Zingiber officinale ) pada ginjal tikus yang mengalami perlakuan stress. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan 14(2): 113- 120. Yuan  GF,  Sun  B,  Yuan  J,  Wang  QM.    2009. Effects  of  different  cooking  methods on  health-promotion  compounds  of broccoli. Journal  of  Zhejiang  University Science B 10(8): 580-588.