## Keragaman Gen Myxovirus (Mx) pada Ayam Kampung Terseleksi
Polymorphisms of Myxovirus Gene in Selected Kampung Chicken
P.Permatasari 1 , C.Sumantri 2 , S.Darwati 2 , N.Ulupi 2
1 Fakultas Peternakan, Sekolah Pascasarjana,Institut Pertanian Bogor
2 Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Jl. Agatis, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680, Indonesia Correspondence author: permatasaripandu@gmail.com

## ABSTRACT
The Mx gene is wellknown as marker genetic for chicken resistance of virus infection. The aim of this study was to analyze the mx gene polymorphisms in selected kampung chicken. A total of 25 heads of kampung chicken, which had been selected for ND virus resistant, were identified by PCR-RFLP meth- od.The Mx gene used Hpy8I restriction enzyme where digested at GTN|NAC nucleotides. There were two  alleles, A and G with three genotypes AA, AG dan GG. The result showed that 69.2% of kampung chicken were resistant toward the virus infection. This population was in Hardy-Weinberg equilibrium (x 2 < x 2 0.05 ).
Keywords: polymorphisms, Mx gene, selected kampung chicken

## PENDAHULUAN
Ayam kampung merupakan ayam asli Indonesia yang memiliki dua tujuan produksi, yaitu sebagai ayam pedaging dan ayam petelur. Beberapa tahun ke belakang, ayam kampung memiliki nilai ekonomis yang tinggi dan dipandang sebagai makanan yang mewah. Permintaan akan ayam kampung meningkat, khususnya untuk masyarakat kalangan menengah ke atas. Seiring dengan peningkatan permintaan, ternyata laju populasi ayam kampung tiap tahunnya tidak selalu meningkat. Tahun 2012 hingga 2014 terjadi penurunan laju populasi sebesar 10% (BPS 2014). Hal ini utamanya disebabkan oleh tingginya angka kematian pada ayam kampung.
Penyebab kematian terbesar pada ayam kampung adalah virus Newcastle Disease (ND). Secara genetik, ketahanan terhadap virus, termasuk virus ND salah satunya dikontrol oleh gen Mx. Berdasarkan data dari Gen Bank dengan nomor akses DQ788615, berada di kromosom 1danbekerja mentranskripsi protein Mx yang berfungsi sebagai promotor ketahanan terhadap infeksi virus. Gen Mx dilaporkan dapat digunakan sebagai penciri genetik untuk sifat ketahanan tubuh ayam terhadap infeksi virus, seperti virus Avian  Influenza (AI) dan Newcastle Disease (ND). Maeda (2005) melakukan penelitian gen  Mx pada ayam lokal Indonesia dan melaporkan bahwa sebesar 63% ayam lokal Indonesia tahan terhadap infeksi virus AI sedangkan 37% yang berada pada kategori tidak tahan. Pagala et al . (2013) melakukan penelitian pada ayam Tolaki dan melaporkan bahwa gen Mx| Hpy 8I dapat digunakan sebagai penciri genetik untuk sifat ketahanan tubuh ayam terhadap infeksi virus Newcastle Disease (ND). Selain itu, dilaporkan pula adanya asosiasi keragaman genotipe
gen Mx| Hpy 8I terhadap sifat antiviral pada ayam Tolaki. Genotipe gen Mx yang ditemukan pada ayam Tolaki adalah genotipe AA, AG, dan GG, genotipe yang memiliki alel A menampilkan ketahanan terhadap penyakit viral yang lebih baik dibandingkan dengan genotipe yang memiliki alel G.
Ayam kampung yang digunakan pada penelitian ini adalah ayam kampung yang telah diseleksi ketahanannya terhadap infeksi virus ND secara fenotipik. Penelitian ini bertujuan  untuk  mengidentifikasi  genotipe  gen  Mx  pada ayam kampung yang telah diseleksi tersebut.

## METODE

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Juli sampai bulan Oktober 2014. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor.

## Total Sampel
Sampel ayam kampung yang digunakan sebanyak 25 ekor. Ayam kampung yang digunakan merupakan ayam kampung yang telah diseleksi ketahanannya terhadap paparan virus ND.

## Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dimulai dengan pengambilan sampel darah. Darah diambil dari bagian vena axillaris , kemudian dimasukkan ke dalam tabung ependorf yang telah diisi EDTA. Selanjutnya sebanyak 50 µL sampel darah dimasukkan ke dalam tabung ependorf (1.5 mL) dan ditambahkan dengan 1 000 µL NaCl 0.2%, kemudian didiamkan selama 5 menit
Jurnal Ilmu Produksi dan Teknologi Hasil Peternakan
ISSN 2303-2227 Vol. 03 No. 1, Januari 2015 Hlm: 4-7
dan disentrifugasi pada kecepatan 8 000 rpm selama 5 menit, kemudian bagian supernatan dibuang.
Setelah bagian supernatan dibuang, larutan ditambahkan dengan 20 µL proteinase K 5 mg mL -1 , 40 µL sodium dodesil fosfat (SDS) 10% dan 30 µL 1 x STE (sodium tris EDTA). Selanjutnya campuran larutan tersebut dikocok pelan di dalam inkubator selama 2 jam pada suhu 55 o C. Setelah dikocok, campuran larutan tersebut ditambah 400 µL phenol, 400 µL CIAA dan 40 µL 5 M NaCl sambil digoyang pelan selama 1 jam pada suhu ruang. Setelah itu, campuran disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit.
Sebanyak 400 µL bagian yang berwarna bening (DNA) dipindahkan menggunakan pipet ke tabung baru (1.5 mL). Tabung yang sudah berisi DNA ini kemudian ditambahkan dengan 800 µL etanol absolut dan 40 µL 5 M NaCl lalu disimpan di dalam freezer selama semalam. Setelah itu, larutan disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit. Setelah disentrifugasi, bagian supernatan dibuang dan didiamkan dalam keadaan terbuka pada suhu ruang sampai etanol hilang. Selanjutnya ditambahkan 100 µL TE 80%. DNA yang diperoleh kemudian disimpan di freezer sampai siap untuk digunakan.

## Amplifikasi PCR
Primer  yang  digunakan  untuk  mengamplifikasi  gen Mx berdasarkan Sironi et al. (2010) adalah primer forward (5’-GCA CTG TCA CCT CTT AAT AGA-3’) dan primer reverse (5’GTA TTG GTA GGC TTT GTT GA-3’). Primer tersebut mampu mengamplifikasi gen Mx sepanjang 299 pb yaitu dari basa ke 20 670-20 968 (exon 13).
Amplifikasi DNA dilakukan pada total volume 15 µL yang terdiri dari 1 µL DNA, 10.75 µL DW, 0.2 µL primer forward , 0.2 µL primer reverse , 0.05 Taq polymerase , 1.5 µL buffer, 0.3µLdNTPsdan1 µL MgCl 2 . Metode amplifikasi dilakukan melalui tiga tahap. Tahap pertama meliputi proses denaturasi awal pada 95 o C selama 5 menit yang dilakukan 1 siklus. Tahap kedua meliputi proses denaturasi pada suhu 95 o C selama 10 detik, proses annealing suhu 60 o C selama 20 detik, dan proses ekstensi suhu 72 o C selama 30 detik. Tahap kedua dilakukan 35 siklus. Tahap ketiga meliputi proses ekstensi akhir pada suhu 72 o C selama 5 menit. Produk hasil PCR kemudian diinkubasi pada suhu 4 o C  untuk kemudian digunakan pada proses RFLP
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP) Penentuan genotipe gen Mx menggunakan metode PCR-RFLP. Sebanyak 5 µL produk PCR gen Mx dipotong menggunakan 2 µL restriction endonuclease mix yang terdiri dari 1 µL dH 2 O, 0.7 µL buffer, dan 0.3 µL enzim pemotong, kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 o C. Enzim pemotong yang digunakan adalah Hpy 8I yang mengenali situs potong GTN|NAC.
Produk PCR yang sudah dipotong oleh enzim restriksi kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarose 2% dengan buffer 0.5 TBE (Tris Borat EDTA) yang dialiri arus listrik dengan tegangan 100 V selama 40 menit.
Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan di bawah UV transiluminator.

## Analisis Data
Genotipe yang didapat melalui metode PCR-RFLP digunakan untuk analisis data. Data yang dianalisis diantaranya frekuensi alel, genotipe, nilai keseimbangan Hardy-Weinberg, heterozigositas pengamatan, heterozigositas  harapan, dan nilai Polymorphic Informative Content (PIC). Frekuensi genotipe merupakan rasio jumlah suatu genotipe terhadap jumlah populasi.Frekuensi genotipe dapat diketahui dengan menghitung perbandingan jumlah genotipe tertentu pada setiap populasi, dengan rumus sebagai berikut (Neidan Kumar 2000):
Keterangan:
xii = ∑ ��� � ni N
xii = frekuensi genotipe ii ni  = jumlah individu bergenotipe ii N  = total sampel Frekuensi alel merupakan rasio suatu alel terhadap keseluruhan alel pada lokus suatu dalam populasi.Frekuensi alel dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut (Neidan Kumar 2000):
xi = (2nii + ∑ ��� nij) (2N)
Keterangan: xi  = frekuensi alel ke-i nii = jumlah individu bergenotipe ii nij = jumlah individu bergenotipe ij N  = total sampel Keragaman genetik dapat diketahui melalui estimasi frekuensi heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) yang diperoleh dengan menggunakan rumusNei (1987) sebagai berikut:
H � = ∑ � ��� � ��� H � = 1 − ∑ p �� � � ��� Keterangan:
H o = heterozigositas pengamatan
N 1ij = jumlah individu heterozigot pada lokus ke-1 N    = jumlah individu yang diamati H e = heterozigositas harapan p 1i = frekuensi alel ke-i pada lokus ke-1 Pengujian nilai genotipe antara hasil pengamatan dan nilai harapan diukur dengan menggunakan chi-square dengan rumus sebagai berikut(Hartl dan Clark 1997):
Keterangan:
x 2 = frekuensi genotipe ii O  = jumlah pengamatan genotipe ke-i E  = jumlah harapan genotipe ke-i Tingkat informatif suatu alel dihitung dengan menggunakan pendekatan nilai Polymorphic Informative Content (PIC) yang dihitung berdasarkan rumus Bostein et al. (1980) sebagai berikut:
Keterangan: PIC = Polymorphic Informative Content pi    = frekuensi alel ke-i pj    = frekuensi alel ke-j n     = jumlah alel per penciri

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Keragaman Gen Mx dengan Metode PCR RFLP Produk PCR yang didapat pada penelitian ini sepanjang 299 bp. Hasil visualisasi produk PCR disajikan pada Gambar 1.Visualisasi  produk PCR-RFLP  dengan menggunakan enzim Hpy8I menunjukkan adanya titik potong pada basa ke  99.  Hal  ini  mengindikasikan  adanya  mutasi  pada  titik tersebut. Mutasi diketahui merupakan perubahan basa dari
muncul  pita  hasil  produk  PCR  dengan  panjang  299  bp. Genotipe  GG  diidentifikasi  dengan  munculnya  basa  pada pita ke 200 bp dan ke 99 bp. Genotipe AG ditandai dengan munculnya pita pada basa ke 299, basa ke 200, dan basa ke 99. Frekuensi Genotipe, Frekuensi Alel dan Keseimbangan Hardy-Weinberg Gen Mx Nilai frekuensi genotipe dan alel serta keseimbangan Hardy-Weinberg gen Mx pada ayam kampung terseleksi ditunjukkan pada Tabel 1. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen Mx pada ayam kampung terseleksi bersifat polimorfik. Nei (1987) menjelaskan bahwa jika sebuah gen memiliki frekuensi alel kurang dari atau sama dengan 0.99 maka gen tersebut bersifat polimorfik.
Frekuensi genotipe tertinggi adalah genotipe AA (0,462) dan AG (0,462), sedangkan frekuensi alel tertinggi adalah  alel  A  (0,692).  Hal  ini  berarti  berarti  frekuensi ayam yang memiliki sifat ketahanan terhadap infeksi virus adalah tinggi. Frekuensi ayam kampung yang membawa alel tahan terhadap infeksi virus pada penelitian ini lebih tinggidaripada yang dilaporkan oleh Maeda (2005) pada ayam lokal Indonesia yang menyebutkan bahwa sebesar 63% ayam lokal Indonesia tahan terhadap infeksi virus AI sedangkan 37% yang berada pada kategori tidak tahan. Hasil penelitian Pagala et al. (2013) melaporkan bahwa sebesar 72% ayam Tollaki tahan terhadap infeksi virus ND, sedangkan 28% ayam Tollaki tidak tahan. Hal ini menunjukkan bahwa ayam Tollaki lebih tahan terhadap infeksi virus dibandingkan ayam kampung. Hasil penelitian Sulandari et al. (2007) melaporkan bahwa frekuensi ayam lokal Indonesia yang tahan terhadap infeksi virus AI berkisar antara 35– 89 persen.
Nilai keseimbangan Hardy-Weinberg pada penelitian ini menunjukkan nilai chi-kuadrat hitung lebih rendah daripada chi-kuadrat tabel. Hal ini berarti bahwa frekuensi gen Mx pada penelitian ini berada dalam keadaan seimbang. Keseimbangan tersebut menunjukkkan bahwa tidak terjadinya seleksi secara sengaja terutama seleksi yang dilakukan terhadap gen Mx. Menurut Noor (2010), populasi yang besar tidak akan berubah dari satu generasi ke generasi lainnya jika tidak ada seleksi, migrasi, mutasi, dan genetic drift .

## Nilai Heterozigositas dan PICGen Mx pada Ayam Kampung Terseleksi
Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) pada penelitian ini ditemukan di bawah 0.5 (50%). Javanmard et al. (2005) menjelaskan bahwa jika ditemukan nilai heterozigositas pada sebuah populasi di bawah 0.5 (50%) dapat diindikasikan bahwa nilai keragaman pada populasi
Gambar 1 Visualisasi hasil PCR-RFLP gen Mx. M (marker); 1-4 (DNA ayam kampung) adenin  menjadi  guanin  (AG)  (Elfidasari et al. 2013). Perubahan basa tersebut menyebabkan perubahan asam amino Asparagin (AAT) menjadi  Serin (AGT). Keberadaan asam amino asparagin mengindikasikan ayam tersebut resisten terhadap infeksi virus (Ko et al. 2002). Hasil amplifikasi kemudian diidentifikasi genotipenya berdasarkan pada perubahan basa. Genotipe yang ditemukan pada penelitian ini adalah tiga macam genotipe, yaitu genotipe AA, AG dan GG. Genotipe AA diidentifikasikan jika tidak ada pemotongan oleh enzim Hpy8I sehingga Tabel 1 Frekuensi genotipe dan alel serta keseimbangan HW gen Mx pada ayam kampung terseleksi
FrekuensiGenotipe Frekuensi Alel Keseimbangan Hardy-Weinberg AA AG GG A G x 2 hitung x 2 tabel 0.462(n=12) 0.462 (n=12) 0.077 (n=2) 0.692 0.308 0.181 5.99
PIC = 1 −
− 2
Tersebut rendah. Hal tersebut juga tidak jauh berbeda dengan nilai yang ditemukan pada nilai heterozigositas harapan (He). Nilai heterozigositas harapan (He) yang ditemukan pada penelitian ini juga di bawah 0.5.
Menurut Hildebrand et al. (1992) nilai Polymorphic Informative Content (PIC) berkisar antara 0 sampai 1. Nilai PIC sama dengan 0 apabila hanya ditemukan satu alel dan PIC sama dengan 1 apabila terdapat jumlah alel yang tak terhingga. Apabila ditemukan dua alel, Hildebrand et al. (1992) menjelaskan bahwa nilai PIC maksimum yang ditemukan adalah sebesar 0.375. Nilai PIC gen Mx yang ditemukan pada populasi ayam kampung terseleksi adalah sebesar 0.335. Hal ini berarti nilai PIC gen Mx pada ayam kampung terseleksi rendah. Nilai PIC yang rendah menyebabkan primer tersebut tidak informatif. Menurut Hildebrand (1992), nilai heterozigositas akan selalu lebih tinggi dibandingkan dengan nilai PIC, karena nilai PIC merupakan nilai heterozigositas yang dikoreksi.

## SIMPULAN
Gen Mx pada ayam kampung terseleksi bersifat polimorfik.  Frekuensi  genotipe  tertinggi  adalah  genotipe GG dan AG, yaitu masing sebesar46.2%. Sebanyak 69.2% ayam kampung terseleksi membawa alel tahan terhadap infeksi virus dan30.8% membawa sifat tidak tahan. Frekuensi  gen  Mx  pada  ayam  kampung  terseleksi  berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg .

## DAFTAR PUSTAKA
Badan Pusat Statistik. 2014. Statistik Indonesia. Jakarta (ID): Badan Pusat Statistik Indonesia. Bostein D, White RL, Skolnick M, Davis RW. 1980. Construction of genetic linkage map in human using restriction fragmen lenght polymorphisms. Amer. J Hum Genet . 32:314-331.
Elfidasari D, Solihin DD, Soejoedono, Murtini S. 2013. Identification  of  gene  resistance  to  avian  influenza virus (Mx gene) amongwild waterbirds. Makara J Sci . 17(1):6-10.
Hartl  DL,  Clark  AG. 1997. Principle of Population Genetic . Sinauer Associates, Sunderland, MA. Hildebrand  CE,  Torney  DC,  Wagner  RP. 1992. Informativeness of polymorphic DNA markers. Los Alamos Sci. 20:100-102. Javanmard A, Asadzadeh N, Banabazi MH, Tavakolian J. 2005. The allele and genotype frequencies of bovine pituitary-specific transcription factor and leptin genes in Iranian cattle and buffalo populations using PCR- RFLP. Iran J Biotechol. 3(2):104-108. Ko JH, Jin HK, Asano A, Takada A, Ninomiya A, Kida H, Hokiyama, Ohara M,Tsuzuki, Nishibori, Mizutani, Watanabe T . 2002. Polymorphisms and thedifferential antiviral activity of the chicken Mx gene. Gen Res . 12 (4):595-601.
Maeda . 2005. Polymorphism of Mx Gene in Asian Indigenous chicken population. Seminar Nasional tentang Unggas Lokal III : 25 Agustus 2005. Universitas Diponegoro, Semarang (ID). Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics . New York (US): Columbia University Pr.
Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics . New York (US): Oxford Univ Pr. Noor RR. 2010. Genetika Ternak . Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
Pagala MA. Muladno, Sumantri C, Murtini S. 2013. Association of Mx gene genotype with antiviral and production traits in Tolaki chicken. J Poult Sci. 12 (12):735-739.
Sironi L, Ramelli P, Williams JL, Mariani P . 2010. PCR- RFLP Genotyping protocol for chicken Mx gene G/A polymorphism associated with the S631N mutation. Gen and Mol Res . 9(2):1104-1108.
Sulandari S, Zein MSA, Paryanti S, Sartika T, Astuti M, Widjastuti T,  Sujana  E,  Syafril  D,  Setiawan  I, Garnida D. 2007. Sumberdaya genetik ayam lokal Indonesia. Keanekaragaman Sumber Daya Hayati Ayam Lokal Indonesia : Manfaat dan Potensi. Pusat Penelitian Biologi. Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Bogor (ID). Hlm 45-104.
Tabel 2 Nilai Heterozigositas pengamatan (Ho), heterozigositas harapan (He), dan PIC gen Mx pada ayam kampung terseleksi Ho He PIC 0.462 0.426 0.335