## EKSTREMOFIL SEBAGAI PENGHASIL ENZIM YANG POTENSIAL UNTUK APLIKASI INDUSTRI PANGAN DAN NON PANGAN
Dewi Seswita Zilda *)

## ABSTRAK
Lingk ungan  ek strem  diketahui  ternyata  menunj ang  k ehidupan  bagi  berbagai  j enis mikroorganisme  yang  dikenal  dengan  sebutan  ekstremofil.  Mikroorganisme  yang  tumbuh  dan berkembang  di  lingkungan  yang  ekstrem  ini  menghasilkan  biokatalis  dengan  sifat-sifat  yang dapat  memenuhi  standar  proses  industri.  Untuk  memenuhi  permintaan  yang  semakin  tinggi, ek splorasi  yang  semak in  intensif  terhadap  biok atalis  ini  terus  dilak uk an.  Beberapa mikroorganisme  ekstremofilik  telah  diisolasi  dan  enzim  yang  dihasilkannya  telah  dikarakterisasi dan  diaplikasikan  dalam  industri  makanan,  detergen,  pengolahan  kayu,  dan  proses-proses bioteknologi.  Enzim-enzim  ini  mempunyai  kestabilan  yang  tinggi  terhadap  pH,  suhu,  salinitas, dan  kondisi  ekstrem  lainnya.
KATA KUNCI:  ekstremofil, enzim industri

## PENDAHULUAN
Pada beberapa tahun terakhir, eksplorasi enzim (biokatalis) banyak dilakukan untuk keperluan sintesis berbagai bahan obat-obatan yang kompleks, bahan industri makanan, pakan, serta bahan-bahan kimia tertentu untuk berbagai keperluan. Kemajuan yang pesat dalam teknologi DNA rekombinan, metode high troughput cultivation , genomic, dan proteomic turut menghangatkan perkembangan baru akan biokatalis dan proses biokatalisis. Hal ini ditunjukkan dengan pemanfaatan enzim untuk industri yang meningkat dari US$1 juta pada tahun 1995 (Godfrey & West, 1996) menjadi US$ 1,5 juta pada tahun 2000 (McCoy, 2000).
Dipacu  oleh  peningkatan  kebutuhan  industri terhadap biokatalis yang mampu memenuhi kondisi proses  industri,  maka  berbagai  usaha  dilakukan secara intensif untuk menemukan enzim seperti ini. Bila dibandingkan dengan sintesis secara organik, biokatalis  mempunyai  banyak  kelebihan,  seperti kemampuannya untuk melakukan proses produksi yang lebih efisien, menghasilkan lebih sedikit reaksi samping, dan  beban lingkungan yang lebih rendah (Rozell, 1999). Meskipun pada saat ini lebih dari 3.000 jenis enzim telah diidentifikasi dan kebanyakan telah digunakan  dalam  industri  maupun  dalam  bidang bioteknologi,  pada  kenyataannya  enzim  yang  ada masih  tidak  mencukupi  untuk  memenuhi  semua permintaan.  Penyebab  utamanya  adalah  tidak sesuainya  sifat-sifat  enzim  dengan  kondisi  reaksi industri (Van den Burg, 2003). Enzim-enzim tersebut kebanyakan dihasilkan dari mikroorganisme mesofilik, yang walaupun mempunyai banyak kelebihan, namun penggunaannya sangat terbatas karena kerentanan
stabilitasnya terhadap pH, suhu, salinitas, kekuatan ion, dan beberapa kondisi ekstrem lainnya. Perhatian kemudian tertuju pada mikroorganisme yang sanggup bertahan pada lingkungan ekstrem yang diduga kuat dapat menghasilkan enzim dengan sifat-sifat yang sama (Herbert, 1992; Madigan & Marrs, 1997).
Ekstremofil  adalah  organisme  yang  mampu bertahan hidup pada kondisi ekstrem atau bahkan membutuhkan kondisi tersebut untuk beraktivitas dan berkembang biak sementara bagi makhluk lainnya kondisi tersebut justru mematikan. Beberapa faktor ekstrem itu adalah suhu, pH, salinitas, tekanan, dan beberapa kondisi lainnya.  Hasil penyesuaian terhadap lingkungan  ini  menyebabkan  m ikroorganisme ekstremofilik  mempunyai  sifat-sifat  unik  yang dibutuhkan  dalam  proses  bioteknologi  sehingga mempunyai daya jual yang sangat tinggi untuk industri. Kemampuan  ekstremofil bertahan pada kondisi yang tidak  standar dan lingkungan yang non-konvensional memunculkan asumsi bahwa sifat-sifat enzim yang dihasilkan juga mampu beraktivitas optimum pada kondisi tersebut.
Dalam  tulisan  ini  akan  dibahas  mengenai mikroorganisme  ekstremofilik  dan  lingkungannya, serta  enzim  potensial  yang  dihasilkan  beserta aplikasinya dalam industri.

## LINGKUNGAN EKSTREM

## Suhu
Di  alam,  makhluk  hidup  menghuni  lingkungan mulai dari suhu tinggi, yaitu hipertermofil dengan suhu pertumbuhan maksimum > 80 o C, sampai pada suhu
*) Peneliti  pada Balai  Besar  Riset Pengolahan  Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan dan  Perikanan
Gambar 1. Taman Nasional Yellowstones, USA, sumber dari beberapa jenis ekstremofil (Rothschild & Mancinelli, 2001).
Gambar 2.  Pengambilan sampel es di Antartika untuk isolasi psikrofil (Rothschild & Mancinelli, 2001).
rendah,  yaitu  psikrofil  dengan  suhu  pertumbuhan <–15 o C. Masing-masing kelompok mempunyai batas- batas  toleransi  terhadap  suhu  untuk  tumbuh  dan beraktivitas.
Termofil  adalah  mikroorganisme  yang  mampu bertahan hidup, tumbuh, dan bahkan membutuhkan suhu yang tinggi untuk bisa beraktivitas, yaitu pada suhu 70–80 o C (termofil) dan 85 o C sampai lebih dari 100 o C (hipertermofil). Contoh mikroorganisme yang termasuk ke dalam hipertermofil adalah Pyrolobus fumarii, yang  dapat  tumbuh  pada  suhu  mencapai 113 o C (Blochl et al., 1997). Enzim dari hipertermofil bahkan bisa stabil pada suhu yang lebih tinggi seperti enzim amilopullulanase yang   mempunyai  suhu optimum mencapai 142 o C (Schuliger et al., 1993). Beberapa  bakteri  fototropik,  yaitu  bakteri  yang membutuhkan cahaya untuk tumbuh dan beraktivitas seperti Cyanobacteria , eubacteria ( Bacillus, Clostridium,  Thiobacillus,  Desulfotomacullum, Thermus, bakteri    asam    laktat, Actinomycetes,
Spirochetes ) ,  dan Archaea ( Pyr ococc us , Thermoc occus , Thermoplasm a , Sulfolobus, Methanogens ),  termasuk  ke  dalam  kelompok  ini (Rothschild & Mancinelli, 2001).
Lingkungan yang dingin juga merupakan sumber kehidupan ekstremofil. Misalnya laut dalam dengan suhu antara 1– 4 o C yang menutupi lebih dari setengah permukaan bumi. Selain itu, daratan yang sangat luas dan selalu membeku di Artik dan Antartika secara mengejutkan mampu menunjang suatu kehidupan. Mikroorganisme yang tumbuh di lingkungan bersuhu rendah ini dikenal dengan sebutan psikrofil. Moraxella sp. (Tutino,1999) dan Psyichrobacter (Rothschild & Mancinel li,  2001)   m erupakan  contoh  dari mikroorganisme yang termasuk ke dalam golongan ini.

## Salinitas
Lingkungan dengan kadar garam tinggi, seperti laut mati, danau dengan kadar garam tinggi, dan kolam
Gambar 3. Tempat isolasi halofil di kolam pembuatan garam Pamekasan, Madura.
Gambar 4. Batas-batas pH kehidupan mikroorganisme (Rothschild & Mancinelli, 2001).
pembuatan garam, merupakan habitat bagi ekstremofil yang  lebih  dikenal  dengan  sebutan  halofil,  yaitu mikroorganisme  yang membutuhkan  garam  untuk pertumbuhannya.  Nonhalofil  yang  dapat  tumbuh dengan adanya garam disebut halotoleran. Halotoleran yang dapat tumbuh pada konsentrasi 15% NaCl (2,5 M) disebut dengan halotoleran ekstrem (Margesin & Schimer, 2000).  Kamekura (1998), membagi  halofil ke dalam 3 kelompok yaitu aerobic halophilic Archaea (Halobacterium, Halococcus, Haloarcula), halophilic Methanogenic   Archaea  (Methanohalophilus, Methanohalobium), dan halophilic  halobacteria (Actinoholispora halophila) .

## pH
Proses biologi cenderung terjadi pada pH netral, seperti kebanyakan pH intraselular dan pH lingkungan yang  juga  berada  pada  kisaran  ini.  Pengecualian terdapat pada asidofil dan alkalifil (Gambar 4).  Asidofil adalah  m ikroorganism e  yang  dapat  atau membutuhkan kondisi lingkungan dengan pH di bawah 5 untuk tumbuh dan beraktivitas, sementara alkalifil membutuhkan pH 9 atau lebih.  Lingkungan asam bisa terjadi secara alamiah dari aktivitas geotermal
seperti kawah hidrotermal yang menghasilkan gas sulfur.  Aktivitas  metabolik  dari  mikroorganisme terkadang juga menghasilkan  suasana asam. Dari sumber inilah asidofil sering ditemukan. Lingkungan lainnya  adalah  sumber  air  panas  dan  lokasi penambangan timah. Contoh mikroorganisme yang termasuk ke dalam kelompok ini adalah beberapa spesies kapang ( Acontium cylatium , Cephalosporium sp., dan Trichosporoncerebriae ) yang tumbuh pada pH mendekati 0 (Schleper et al., 1995a) dan beberapa heterotrop aerob ( Picrophilus oshimae dan Picrophilus torridus ) dengan pH pertumbuhan 0,7 (Schleper et al., 1995b).
Alkalifil adalah organisme yang tumbuh optimal pada pH di atas 9, umumnya antara pH 10–12, tetapi tidak dapat tumbuh atau tumbuh dengan lambat pada pH netral sekitar 6,5. Berdasarkan fisiologinya, alkalifil terdiri  atas  2  kelompok  utama,  yaitu  alkalifil  dan haloalkalifil.  Haloalkalifil  membutuhkan  2  kondisi ekstrem  sekaligus  untuk  pertumbuhan,  yaitu  pH alkalin  dan salinitas tinggi di atas 33% (w/v). Alkalifil umumnya diisolasi dari lingkungan netral. Beberapa diantaranya juga diisolasi dari sampel tanah asam dan  feses.  Haloalkalifil  biasanya  ditemukan  pada
Asidofil Alkalifil
Tabel 1.  Jenis-jenis ekstremofil dan lingkungannya
lingkungan ekstrem alkali yang bergaram seperti pada danau di Lembah Rift,  Afrika Timur, dan danau-danau soda di Amerika Barat (Horikoshi, 1999). Beberapa mikroorganisme  yang  termasuk  dalam  kelompok alkalifil  adalah Amphibacillus  xylanus (Kodama  & Koyama, 1997), Halobacterium trapanicum (Xu et al., 1999), dan Methanosalsus zhilinaeae (Kevbrin et al., 1997).

## Lingkungan ekstrem lainnya
Beberapa  kondisi  lingkungan  lainnya  seperti tekanan, kadar oksigen, radiasi, konsentrasi bahan kimia, lingkungan vakum, dan berbagai kondisi lain yang  berada  pada  level  abnormal,  dikategorikan sebagai lingkungan ekstrem. Pada lingkungan seperti ini  beberapa  mikroorganisme  juga  sudah  berhasil diisolasi.

## APLIKASI ENZIM EKSTREMOFIL PADA INDUSTRI PANGAN DAN NON PANGAN
Enzim  ekstremofilik  atau  yang  lebih  dikenal dengan  sebutan  ekstremozim   dihasilkan  dari ekstremofil.  Ekstremozim  mempunyai  kestabilan yang tinggi dan kemampuan untuk bisa aktif pada kondisi yang sebelumnya diduga tidak mungkin terjadi pada  material  biologi.  Karena  sebagian  besar ekstremofil mempunyai metabolic pathway yang baru, maka kemungkinan besar enzim yang dihasilkan juga mempunyai sifat-sifat baru yang aplikatif.
Di  antara  ekstremozim  yang  saat  ini  sudah diaplikasikan, enzim termostabil adalah ekstremozim
yang  paling  banyak  digunakan  dalam  industri. Pemakaian enzim termostabil pada proses industri yang menggunakan suhu tinggi sangat berguna dalam proses pencampuran,  karena pada proses ini terjadi penurunan viskositas cairan sehingga bahan dengan konsentrasi tinggi tetap mempunyai kelarutan yang rendah.  Perpindahan massa juga meningkat pada suhu tinggi seperti yang terjadi pada  reaksi-reaksi kimia. Selain itu, pada produksi  yang menggunakan suhu tinggi, resiko kontaminasi bisa dihindari atau bahkan dihilangkan sama sekali.
Aplikasi yang paling banyak dari enzim termostabil adalah liquefaction pati menggunakan amilase dari B. licheniformis and B. stearothermophilus . Protease juga merupakan produk andalan dari termofil yang banyak dipakai pada industri pengolahan makanan dan detergen. Beberapa industri terbaru dari enzim ter m ostabil  adalah  produksi  siklodekst rin menggunakan cyclodextrin  glycosyl  transferase (CGTase) dan bleaching bubur kayu menggunakan xilanase.  Enzim lain yang menjadi perhatian adalah ter m oli sin  y ang  dihasilkan  oleh Bacillus thermoproteolyticus (Endo, 1962). Termolisin adalah protease netral  yang  membutuhkan  seng  untuk aktiv itasnya  dan  kalsium  untuk  kestabilannya terhadap  panas.  Enzim  komersial  dengan  merek dagang SP-369 yang mempunyai sifat-sifat hampir sama  dengan  termolisin  telah  diaplikasikan  untuk hidrolisis protein pada suhu tinggi, produksi aspartam, serta peptida lain. Selain itu, lipase termostabil non spesifik yang diisolasi dari Candida antarctica (suhu optimum  70 o C)  diaplikasikan  untuk  sintesa  ester (Heldt-Hansen et al., 1989), sintesa glikolipid (Bjorkling et al., 1989), dan untuk asidolisis (Bruce et al., 1991).
Je nis e kstre m ofil Contoh m ikroorga nism e Termofil 55 – 80 o C Methanob acterium , Thermoplasma ,
Thermus , beberapa B acillus sp. Hipertermofil >  80 o C A quifex , Archaeoglob us , Hydrogenob acter , Methanothermus , Pyrococcus , P yrodictium , P yrolob us , Sulfolob us , Themococcus ,
Thermoproteus , Thermotoga P sikrofil <  15 o C A lteromonas , P sychrob acter Halofil 2 – 5 M NaCl Haloarcula , Halob acterium , Haloferax , Halorub rum A sidofil pH <  4 A cidianus , Desulfurolob us , Sulfolob us , Thiob acillus A lkalifil pH >  9 Natronob acterium , Natronococcus ,
beberapa Bacillus sp.
Lingkunga n
Tabel 2.  Contoh-contoh ekstremofil dan aplikasi enzim dalam industri
Beberapa enzim dari  psikrofil dan rekombinannya juga telah diproduksi dan dikarakterisasi.  Contohnya adalah  alkohol  dehidrogenase  dari Moraxela sp. (Tsigos et  al., 1998),  -amilase  dari Alteromonas haloplanctis (F eller et  al., 1992),  aspar tat transkarboamilase dari isolat bakteri strain TAD (Sun, et al., 1998), Ca 2+ -Zn 2+ protease dari Pseudomonas aeruginosa (Villeret et al., 1997), sitrat sintetase dari isolat bakteri strain DS2-3R (Gerike et al., 1997),  - laktamase dari Psychrobacter immobilis (Feller et al., 1997),  malat  dehidrogenase  dari Aquaspirillium arcticum (Kim et  al., 1999),  subtilisin  dari  bakteri Antartika  (Narinx et  al .,  1997),  dan  triose  pospat isomerase dari Vibrio marinus (Alvarez et al., 1998).
Enzim psikrofil seperti protease , lipase , amilase , dan selulase yang digunakan sebagai bahan tambahan detergen akan menurunkan kebutuhan energi selama proses pencucian. Penggunaan suhu rendah pada proses  pencucian  juga  akan  mengurangi  resiko kerusakan terhadap bahan-bahan pakaian. Dalam industri tekstil, selulase psikrofil dapat meningkatkan kelembutan produk, menurunkan suhu proses, dan jumlah  enzim  yang  digunakan,  sehingga  pada akhirnya  dapat  menurunkan biaya  produksi.  Pada industri susu, enzim  -galaktosidase yang digunakan pada suhu rendah bisa menurunkan jumlah laktosa
yang sering menimbulkan alergi pada kebanyakan konsumen. Pada industri jus, enzim pektinase yang dapat bekerja pada suhu rendah dapat membantu pada proses  ekstraksi,  menurunkan  v iskositas,  dan menghasilkan produk akhir yang lebih bening.
Enzim pertama yang diisolasi dari alkalifil adalah protease .  Enzim ini dihasilkan dari Bacillus sp., strain 221 yang diisolasi dari tanah (Horikoshi, 1971). Enzim dari  alkalifil  seperti protease , selulase ,  dan lipase merupakan enzim paling banyak diaplikasikan pada industri  detergen,  yaitu  sekitar  30%  dari  jumlah produksi enzim dunia (Horikoshi, 1999).  Enzim lain yang dihasilkan dari alkalifil adalah  -amilase (Kim et al., 1995) untuk memproduksi glukosa, maltosa, dan maltotriosa,  siklomaltodekstrin  glukanotransferase (Nomoto et al ., 1986) untuk produksi siklodekstrin, dan  xilanase (Nakamura et al., 1993) untuk proses bleaching pada industri  kayu,  dan pektinase pada industri kertas.

## POTENSI  EKSTREMOFIL  ASAL INDONESIA
Indonesia,  dengan  keanekaragaman  hayatinya yang sangat tinggi, merupakan sumber yang potensial untuk isolasi ekstremofil. Beberapa ekstremofil yang sudah  diisolasi  telah  dilaporkan  mampu  untuk

## Prose s industri
Hidrolisis pati menjadi solub le
dekstrin, m altodekstrin, sirup jagung  -amilase S tabilitas tinggi B acillus stearothermophilus Bleaching kertas Xilanase P engurangan jumlah pemutih yang diperlukan Termofil Pengolahan makanan, pembuatan k ue, pembuatan bir, detergen Protease S tabil pada tem peratur tinggi Termofil Reaksi PCR DNA polimerase Tidak m embutuhkan penam bahan enzim pada s etiap siklus Termofil Pematangan keju, perus ahaan susu Protease netral A ktif pada suhu rendah P sikrofil Pemecahan polimer pada detergen Protease, selulase, lipase Meningkatkan kemam puan enzim P sikrofil Bioremediasi Mengurangi limbah minyak B ekerja efisien pada air dingin P sikrofil Biom ole kul Ke untunga n Mikroorga nism e
Gambar 5. Pasir panas pantai Pulau Togian (A) dan isolat bakteri termofil TG 70E pada media padat dengan 2,5% agar (B).
A
B
menghasilkan enzim yang potensial (Chasanah, 2004; Mubarik, 2001).
Kelompok  Peneliti  Bioteknologi  di  Balai  Besar Riset Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan  Perikanan  juga  telah  berhasil  mengisolasi beberapa jenis ekstremofil, seperti termofil dan halofil. Tiga dari delapan isolat termofil yang diisolasi dari pasir panas Pulau Togian mampu tumbuh pada suhu 70 o C setelah 12 jam  diinokulasikan pada media padat dengan 2,5% agar (Gambar 5). Salah satu bakteri ini diidentifikasi sebagai Geobacillus stearothermophilus . Halofil yang diisolasi dari kolam pembuatan garam di Pamekasan, Madura diketahui dapat menghasilkan protease pada  media  dengan penambahan NaCl 12,5 %. Enzim ini masih mampu beraktivitas dengan keberadaan NaCl 7,5%.

## PENUTUP
Ekstremozim  memiliki  peluang  ekonomi  yang pot ensial  dal am   berbagai  proses  i ndust ri. Penggunaannya yang terus meningkat mendorong usaha eksplorasi yang lebih intensif terhadap enzim ini.  Indonesia  mempunyai  prospek  besar  untuk penemuan  ekstremofil.  Hal  ini  disebabkan  oleh kekayaan biodiversitasnya, di samping itu diketahui bahwa lingkungan ekstrem di Indonesia masih banyak yang  belum  terjamah.    Hal  ini  tentu  saja  harus ditunjang dengan kegiatan riset untuk penemuan dan penguasaan  metode  baru  dalam  bidang  kultivasi, bioproses, serta rekayasa genetika, sehingga mampu menghasilkan  enzim  ekstremofil  untuk  keperluan industri.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih untuk Ariyanti, atas bantuan dan  kesabarannya  mencarikan  literatur  sehingga karya tulis ini bisa diselesaikan. Terima kasih juga untuk Gintung Patantis untuk suntingan awal.

## DAFTAR PUSTAKA
Alvarez,  M . ,  Zeelen,  J.Ph., Mainfroid,  V . ,  Rentier-Delrue, F . , Martial, J.A., Wyns, L., Wierenga, R.K., and Maes, D.  1998.    Triose  phosphate  isomerase  (TIM)  of  the psyc hrophilic  bacterium Vibrio  marinus . J.  Biol. Chem. 273:  2199–2206.
Bjorkling, F., Godtfredsen S.E.,  and Kirk, O. 1989. A highly simple  selective  enzyme-catalysed  esterification  of simple  glucosides. J.  Chem.  Soc.  Chem.  Commun. p.  934–935.
Blöchl,  E.,  Rachel,  R.,  Burggraf,  S.,  Hafenbradl,  D., Jannasch, H.W.,  and  Stetter, K.O. 1997. Pyrolobus fumarii, gen.  and  sp.  nov.,  represents  a  novel  group of archaea,  extending the  upper temperature  limit for life  to 113  7C. Extremophiles  1. p. 14–21.
Bruce  L.  Zamost,  Henrik  K.,  Nielsen,  and  Robert,  L. Starnes.  1991.  Thermostable  enzymes  for  industrial applications. Review. J.   of   Industrial  Microbiology . 8  :71–82.
Chasanah, E. 2004. Characterization  of  Chitosanase  of Bacillus  licheniformis MB-2  from Manado Hot Spring Water .  Dessertation,  IPB,  Bogor,  Indonesia.
Endo,  S.  1962.  Studies  of  protease  produc ed  by thermophilic bacteria. Hakka Kogaku Zasshi 40: 346- 353.
Feller, G., Lonhienne, T., Deroanne, C., Libioulle, C., Van Beeumen,  J.,  and  Gerday,  C.  1992.  Purification, characterization  and  nucleotide  sequence  of  the thermolabile  a-amylase  from  the  Antarctic psychrotroph A23. J. Biol.  Chem. 267:  5217–5221.
Feller,  G.,  Zekhnini,  Z.,  Brasseur,  J.L.,  and  Gerday,  C. 1997.  The  class  C  b-lactamase  from  the  Antarctic psychrophile Psychrobacter  immobilis A5. Eur.  J. Biochem. 244:  186–191.
Gerike, U., Danson, M.J., Russell, N.J., and Hough, D.W. 1997.  Sequencing  and  expression  of  the  gene encoding  a  cold-ac tive  citrate  synthase  from  an Antarctic  bacterium  strain  DS2-3R. Eur.  J.  Biochem. 248:  49–57.
Godfrey,  T.  and  West,  S. 1996. Introduction to industrial enzymology.    In    Godfrey, T.   and    West,    S.   (eds.). Industrial  Enzymology ,  edn  2.    London:  Macmillan Press:1-8.
Heldt-Hansen, H.P.,  Ishii,  M.,  Paktar,  S.A.,  Hansen, T.T., and  Eigtved  P.  1989.  A  new  immobilized  positional
nonspecific  lipase  for  fat  modific ation  and  ester synthesis.   In  (Whitaker, J.R. and  Sonnet, P.E., eds.) Biocatalysis  in  Agricultural  Biotechnology, ACS Sym- posium  Series  389 .  American  Chemical  Society, Washington,  DC.
Herbert,  R.A.  1992. A  perspective  on  the  biotechnologi- cal  potential  of  extremophiles. Trends  Biotechnol , 10:395-401.
Horikoshi,  K.  1999.  Production  of  alkaline  enzymes  by alkalophilic   microorganisms.I.  Alk aline  protease produced  by Bacillus no.  221. Agric.  Biol.  Chem . 35:1407–1414.
Horikoshi,  K.  1971.  Alkaliphiles:  Some  Applications  of their  product  for  biotechnology. Microbiology  and Molecular Biology Reviews .  63: 735-749.
Kamekura, M. 1998. Diversity of extremely halophilic bac- teria. Extremophiles .  2:  289-295.
Kevbrin,  V.V.,  Lysenko,  A.M.,  and  Zhilina,  T.N.  1997. Physiology  of  the  alkaliphilic  methanogen  Z-7936,  a new strain of Methanosalsus zhilinaeae isolated from Lake  Magadi. Microbiology .  66:  261–266.
Kim, S.Y., Hwang, K.Y., Kim, S.H., Sung, H.C., Han, Y.S., and Cho, Y. 1999. Structural basis of cold adaptation. Sequenc e,  biochemical  properties  and  c rystal struc ture  of  malate  dehyd rogenase  from  a psychrophile Aquaspirillium  arcticum . J.  Biol.  Chem. 274:  11761–11767.
Kim, T.U., Gu, B.G., Jeong, J.Y., Byun, S.M., and Shin, Y.C. 1995.  Purific ation  and  c harac terization  of  a maltotetraose-forming  alkaline  a-amylase  from  an alkalophilic Bacillus strain,  GM8901. Appl.  Environ. Microbiol .  61:  3105–3112.
Kodama,  H.  and  Koyama,  N.  1997.  Unique characteristics  of  anaerobic  alkalophiles  belonging to Amphibacillus  xylanus . Microbios .  89:  7–14. Madigan, M.T. and  Marrs, B.L. 1997. Extremophiles. Sci Am , April. p. 66–71.
Margesin,  R.  and  Schinner,  F.  2001.  Potential  of halotolerant  and  halophilic   mic roorganisms  for biotechnology. Extremophiles .  5:  73–83. McCoy, M. 2000. Novozymes emerges. Chem Eng News. 19: 23–25.
Mubarik ,  N.R.  2001. Pemurnian  dan  Karakterisasi Protease  Ekstraseluler  dari  Isolat  Bakteri  termofilik GP-04. Makalah seminar Program Pascasarjana IPB. Bogor,  Indonesia.
Nakamura, S., Wakabayashi, K., Nakai, R., Aono, R., and Horikoshi,  K.  1993.  Production  of  alkaline  xylanase by a newly isolated alkaliphilic Bacillus sp. strain 41M- 1. World  J.  Microbiol. Biotechnol. 9: 221–224.
Narinx, E., Baise, E., and Gerday, C. 1997. Subtilisin from psychrophilic Antarctic  bacteria:  characterization  and site-direc ted  mutagenesis  of  residues  possibly involved  in  the  adaptation  to  cold. Protein  Eng. 11: 1271–1279.
Nomoto, M.,  Chen, C.C., and Shen, D.C. 1986.  Purifica- tion and c harac terization of c yc lodextrin glucanotransferase  from  an  alkalophilic  bacterium of Taiwan. Agric.  Biol.  Chem .  50:  2701–2707.
Rothsc hild,  L.J.  and  Mancinelli,  R.L.  2001.  Life  in extreme  environments. Nature. 409:  1092–1101. Rozzell, J.D. 1999.  Commercial scale biocatalysis: myths and  realities. Bioorg  Med  Chem .  7:  2253–2261. Schleper,  C.,  Pühler,  G.,  Kühlmorgen,  B.,  and  Zillig,  W. 1995a.  Life  at  extremely  low  pH. Nature  375 .  741– 742.
Schleper,  C.,  Puehler,  G.,  Holz,  I.,  Gambacorta,  A., Janekovic, D., Santarius, U., Klenk, H.P., and Zillig, W. 1995b. Picrophilus gen. nov., fam. nov.: a novel aero- bic,  heterotrophic,  thermoacidophilic  genus  and  fam- ily  comprising  archaea  capable  of growth  around  pH 0. J. Bacteriol. 177: 7050–7059.
Schuliger, J.W., Brown, S.H., Baross, J. A., and  Kelly, R.
M.  1993.  Purification  and  characterization  of  a  novel amylolytic enzyme from ES4, a marine hyperthermophilic archaeum. Mol.  Mar. Biol. Biotech. 2:  76–87.
Sun, K., Camardella, L., Di Prisco, G., and Hervé, G. 1998. Properties  of  aspartate  transcarbamylase  from  TAD1 a psychrophilic bacterial strain. FEMS Microbiol. Lett. 164:  375–382.
Tsigos,  I.  1998.  Purification  and  characterization  of  an alcohol  dehydrogenase  from  the  Antarctic psychrophile Moraxella sp.TAE 123. Eur. J. Biochem. 254:  356–362.
Tutino,  M.L.  1999.  Aspartate  aminotransferase  from Moraxella TAC 125: an unusual psychrophilic       en- zyme. In Margesin, R.  and Schinner, F. (eds.). Cold- adapted  Organisms. Springer.  p.  305–316.
Van  de  Burg,  B.  2003.  Extremophiles  as  a  source  for novel  enzymes. Current  Opinion  in  Microbiology .  6: 213–218.
Villeret,  V., Chessa, J.P., Gerday, C.,  and  Van-Beeumen, J.  1997.  Preliminary  crystal  structure  determination of  the  alk aline  protease  from  the  Antarctic psychrophile Pseudomonas  aeruginosa . Protein  Sci. 6:  2462–2464.
Xu, Y., Zhou, P. J., and Tian, X. Y. 1999. Characterization of two  novel  haloalkaliphilic  archaea Natronorubrum bangense gen.  nov.,  sp.  nov.,  and Natronorubrum tibetense gen. nov., sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol . 49: 261–266.