## PENDAHULUAN
Informasi teknik  pemekatan, purifikasi (pemurnian) dan karakterisasi protein sangat diperlukan untuk memperoleh protein  rekombinan dengan kualitas, aktivitas dan kemurnian yang  tinggi.  Dengan mengetahui informasi  dan sekaligus  menguasai teknikteknik dalam  memproduksi protein rekombinan, diharapkan dapat  menghasilkan  produk  protein rekombinan yang memiliki  tingkat kemurnian yang  sangat tinggi (>99%)  untuk keperluan  diagnostik dan  terapitik yang dapat dikonsumsi manusia.  Protein yang digunakan untuk  terapi  atau  tujuan diagnostik secara in vivo biasanya  harus melalui proses purifikasi yang sangat  ketat  karena  apabila ada sedikit saja molekul pengotor dapat  menyebabkan efek klinis yang tidak diinginkan.
Protein  rekombinan ini dapat diisolasi  dari mikroba, sel tanaman dan sel hewan.  Protein  hasil isolasi
ini merupakan protein campuran sehingga  perlu dikarakterisasi untuk  menentukan  bahwa  protein target telah berada dalam campuran  tersebut.  Kemudian  pro- tein hasil pemurnian perlu dikarakterisasi  untuk menentukan bahwa protein  murni tersebut adalah  benar  protein yang diinginkan.  Metode karakterisasi protein pada umumnya  didasarkan pada berat molekul, muatan  total protein dan reaksi  imunokimi'b."
Karakterisasi  protein berdasarkan berat molekul  maupun  muatan pada umumnya  menggunakan elektroforesis,  sedangkan untuk reaksi imunokimia  dapat meng- gunakan analisis Western Blot.
Apa ltu Protein  Rekombinan?
Sebelum membahas  definisi protein rekombinan, terlebih dulu harus diketahui definisi protein.
Menurut  Rachman  (2005), protein adalah  kelompok  biopolimer  yang merupakan  hasil ekspresi infor-
Dedi Noviendri  dan  Sugiyono
Balai Besar Riset Pengolahan  Produk  dan  Bioteknologi
Kelautan  dan  Perikanan Squalen  Vol. 1 No. 1, Desember 2006
masi genetik yang terdiri atas rangkaian  monomer  alfa-asam amino  yg dihubungkan  oleh ikatan peptida.  Struktur  protein  terdapat dalam  empat  tingkatan, yaitu struktur primer, sekunder, tersier dan kuartern_gr, Protein hanya berfungsi  pada  kondisi alaminya (baik  dalam bentuk struktur tersier maupun kuarterner).
Menurut Retnoningrum (2005), protein  rekombinan adalah protein yang diproduksi oleh Sel  yang DNAnya  telah dimodifikasi dengan rekombinasi genetik (rekayasa genetika).  Protein rekombinan dihasilkan  untuk tujuan  medis  (in- sulin, interferon dan lain-lain) atau untuk industri (enzim). Protein rekombinan  yang  telah diproduksi dengan teknik genetik dapat dilihat  pada Tabel 1. Rekayasa genetiKa pfotein  adalah suatu proses yang berdasarkan  pada: (1). Penggunaan vektor ekspresi (bakteri,  virus,  plasmid  dan lain sebagainya) yang berfungsi sebagai  pembawa gen penyandi protein yang diinginkan (Gambar 1); (2). Penggunaan  sel inang yang melaksanakan instruksi yang" disediakan  oleh gen tersebut  untuk mensintesis protein  yang di- inginkan; (3). Produksi massa  pro- tein yang diinginkan; (4). Pemisahan dan ekstraksi protein dari kulturnya,  kemudian di- lanjutkan dengan purifikasinya.
lsolasi dan  Pemurnian  Protein
Tahap awal dari proses pemurnian  adalah  mengisolasi  pro- tein  dari sumber yang memproduksinya, baik sel ta naman, hewan, mau pu n
Tabell. Protein target yang diproduksi  dengan teknik genetik (Gusdinar,2005)
Interleukin Interferon Alfal -antitripsin Hepatitis  B sudace  antigen Hormon  pertumbuhan Chymosin Phytase Antikanker Antiviral,  antikanker
Pencegahan life-th reating emphysema
Vaksin  Hepatitis B
lnduksi  pertumbuhan
Hidrolisis kasein dalam  produksi  keju Pelepasan gugus fosfat  dari asam fitat

## D. Noviendri  dan Sugiyono
ffi
Gambar 1. Penyisipan (insersi)  sampel DNA target  ke dalam vektor plasmid.
\ tVlirrartcb
mikroorganisme.  Protein  ekstra- seluleryang  disekresikan ke dalam medium  diperoleh melalui pemisahan sel dari media fermentasi  dengan  teknik filtrasi dan sentrifugasi.  Protein target berada dalam medium bebas  sel yang biasanya dalam bentuk  yang sangat  encer.  Sedangkan untuk protein intraseluler, sel dipanen dan diresuspensi  dalam  larutan  dapar (butter) atau air kemudian dipecahkan agar dapat  diambil proteinnya (Ellyasheva & Rachman,2005).

## Pemekatan  Protein
Protein target biasanya berada dalam  bentuk terlarut  sehingga perlu dilakukan  proses  pemekatan. Metode  pemekatan  yang umum dilakukan di laboratorium  adalah:
(1 ) pemekatan  dengan peng- endapan/presipitasi  menggunakan garam  amonium  sulfat atau pelarut;
(2) pemekatan dengan meng-
gunakan ultrafi ltrasi. Pengendapan menggunakan  amonium  sulfat adalah salah satu cara yang pa- ling sering digunakan  dan populer karena kelarutannya yang tinggi, murah, tidak menyebabkan denaturasi orotein dan memiliki efek stabilitas pada protein.
Penambahan  amonium sulfat dapat meningkatkan  kelarutan protein (safti ng-i n) dan penambahan  garam selanjutnya akan  mendestabilisasi protein sehingga protein akan mengendap (salting-ouf). Pe- mekatan dengan  pengendapan
garam  biasanya  tidak  memberikan peningkatan  kemurnian  yang tinggi, namun  memberikan  rendemen (yield) tinggi (Nurachman,  2006).
Pelarut yang  biasa digunakan dalam pemekatan protein adalah etanoli. isopropanol,  aseton dan dietil eter. Namun penggunaan pelarut ini memiliki kelemahan, karena  proses  ini harus dilakukan pada suhu 0"C atau lebih rendah lagi untuk  mencegah denaturasi protein.  Larutan  protein  dapat juga dipekatkan dengan menggunakan ultrafiltrasi. Pemekatan  orotein menggunakan  ultrafiltrasi  dengan ukuran pori membran  1-20 nm cukup untuk menahan  protein berbobot  molekul  (BM)  rendah (Ellyasheva & Rachman, 2005).

## Pemurnian  Protein
Setelah  protein yang  diinginkan dipisahkan  dari selnya, tahap selanjutnya adalah memurnikan orotein tersebut  dari kontaminan yang  tidak  diinginkan. Hal ini dapat
dicapai dengan menggunakan kolom kromatografi.  Prosedur ini dioakai secara luas untuk memurnikan  prgtein (Nurachman, 2006).  Metode ini dapat me- misahkan  orotein  berdasarkan  sifat karakteristiknya,  karena  setiap  pro- tein memiliki ukuran, bentuk, muatan  dan  permukaan  hidrofobik yang sangat bervariasi. Tiaptiap teknik pemurnian protein dengan kromatografi  kolom (Tabel 2) memiliki kineria berbeda-beda. Kromatografi kclom yang sering digunakan antara lain  kroma- tografi gel filtrasi, penukar ion,
Tabel2. Pemurnian protein berdasarkan  sifatnya (Nurachman,  2006)
Muatan
Ukuran Kehidrofoban
Kespesifikan  ligan Penukar  ion

## Filtrasigel
Interaksi  hidrofob,  fase  terbalik
Afinitas
Tabel  3. Derajat kemurnian  protein  target (Nurachman,  2006) hidrofobik  dan kromatografi afi nitas (Ellyasheva & Rachman, 2005). Adapun  prinsip pemurnian  protein menggunakan kolom menurut Ellyashevd (2005) adalah sebagai berikut: (1) campuran protein dimasukkan ke dalam  kolom; (2) protein yang  diinginkan teri.kat di dalam  kolom; (3) protein yang tidak diinginkan dicuci; dan (4) protein yang diinginkan  dielusi.
Derajat  kemurnian  protein  tar- get tergantung  pada  keperluan penggunaan (Tabel 3). Protein-pro- tein yang  akan  digunakan untuk terapi harus  memiliki kemurnian yang  sangat tinggi  (di atas 99%) dan tidak  boleh mengandung pirogen (zat-zat yang dapat menimbulkan  demam). Untuk mempelajari  sifat  dan  struktur pro- tein diperlukan kemurnian  antara 95-99%.  Protein  dengan ke- murnian sedang (di bawah 95%) dipakai  untuk produksi antibodi (Nurachman,  2006).
Kromatografi Afinitas
Kromatografi afinitas me- rupakan salah satu tipe kromatografi  adsorpsi,  dimana molekul yang akan  dimurnikan diadsorpsi secara bolak-balik menggunakan senyawa pengikat komplementer (ligan) yang diimobilisasi pada  matriks (F ardiaz & Fardiaz, 1987). Dengan kemajuan  biokimia,  banyak  protein telah  diketahui  ligannya. Sifat ini dapat digunakan  untuk  pemurnian protein  dengan  cara melekatkan ligan pada suatu matriks dan menggunakan matriks ini untuk purifikasi  satu tahap. Kromatografi
afi nitas memisahkan  protein-protein atas dasar interaksi reversibel antara  protein dan ligan spesifik yang terikat  pada matriks kromatografi. Kromatografi  afinitas sangat  selektif, oleh karena itu teknik ini memiliki  resolusi tinggi dan cocok untuk mendapatkan protein spesifik.  Secara umum, kromatografi afinitas dapat
Sangat tinggi (>99%)
Tinggi(95-99%) Sedang  (<95%)

## Untuk terapi,  studi  rn yivo
Studi  struktur  dengan  kristalografi  sinar- X, karakteriQasi sifat fisikokimia
Untuk  produksi  antibodi,  penentuan urutan  ujung-N
digunakan untuk memisahkan protein yang  mengenal ligan melalui:  adsorpsi  pada  ligan yang terikat  secara  kovalen ke kolom; penambahan campuran protein  ke kolom,  lalu  dicuci  dengan  buffer untuk  memindahkan  protein yang tidak terikat,  kemudian  mengelusi protein yang diinginkan dengan menambahkan bentuk terlarut. ligan berkonsentrasi tinggi (Nurachman,  2006).
Dengan kemajuan teknologi DNA rekombinan, kini dapat dilakukan  purifikasi  protein yang ligannya  tidak diketahui.  Cara yang dilakukan adalah dengan menggabungkan fragmen DNA yang akan dipurifikasi dengan fragmen DNA pengkode suatu protein yang  ligannya  diketahui secara definitif. Fragmen re' kombinan  ini ketika diekspresikan
menghasilkan suatu protein fusi yang  dapat  dipurifikasi  dengan kromatografi afi nitas menggunakan ligannya yang  ditempelkan pada suatu matriks." Sebagai  contoh adalah suatu  vektorrekspresi yang menyediakan fragmen DNA penyandi  polihistidin (His-Tag).
Polihistidin  dapat membentuk kelat dengan logam nikel, sehingga prinsip  ini dapat digunakan untuk pemurnian  protein fusi dengan oolihistidin.  Gambar 2 mem- oerlihatkan bahwa orotein rekombinan  yang  berdifusi dengan polihistidin  dapat dimurnikan dengan kolom afinitas nikel (Ellyasheva & Rachman, 2005).

## Karakterisasi  Protein
Protein hasil pemurnian perlu dikarakterisasi  untuk menentu  kan
Gambar2. Proses  pemurnian  protein  dengan  kromatografi  kolom afinitas (kolom  nikel).

## D. Noviendri  dan Sugiyono
bahwa protein  murni tersebut adalah benar protein yang diinginkan.  Metode karakterisasi protein umumnya  didasarkan  pada:
(1) bobot molekul (BM) dengan menggunakan SDS-PAGE  (So- dium Dodecyl Sulfate - Polyacry- lamide Gel  Electrophoresis); (2) muatan total protein den$an menggunakan  IEF (lsoelectric  Fo- cusing);  dan  (3) reaksi imunokimia (kemampuan  protein  sebagai anti- gen  yang mengenali  antibodi) dengan  menggunakan Western Blot  (Ernawati & Kembaren, 2005; Kembaren & Rachman, 2005)

## SDS.PAGE
Protein  yang  didenaturasi dengan SDS akan menghasilkan protein yang bermuatan negatif sehingga bila diletakkan pada suatu medan listrik  akan  bergerak ke kutub positif atau anoda. Migrasi protein  pada gel proporsional terhadap ukurannya  sehingga pro- tein yang lebih kecil  akan bergerak lebih  cepat  dibandingkan  dengan protein  berukuran besar. Agar pro- tein yang bergerak  dalam  medan listrik tersebut terpisah ber- dasarkan  berat  molekulnya,  maka diperlukan suatu matriks  yang berpori.  Matriks  yang digunakan adalah  poliakrilamid,  suatu  polimer
yang monomernya  akrilamid (Kembaren & Rachman, 2005). Konsentrasi akrilamid yang digunakan untuk  memisahkan pro- tein dalam  berbagai  BM dapat dilihat  pada Tabel4 dan 5.
Elektroforesis  protein dengan SDS-PAGE terdiridari  dua lapis gel poliakrilamid dengan  pH dan konsentrasi  yang  berbeda serta dicetak pada pelat kaca. Gel poliakrilamid  lapisan bawah disebut sebagai  separating gel yang berperan  pada  pemisahan  protein berdasarkan BM. Gel poliakrilamid lapisan atas disebut sebagai stacking  gel yang  berfungsi  untuk menempatkan  sampel.  Untuk  me- nentukan BM protein, elektro- foresis  dilakukan bersamaan dengan  suatu  marka  protein yang
telah diketahui  BM-nya. Deteksi sampel setelah elektroforesis dapat  dilakukan  secara kualitatif menggunakan  Comassie  blue dan untuk  meningkatkan sensitivitas- nya dapat  menggunakan  pewarna- an perak nitrat (sl/ver staining) (Kembaren & Rachman, 2005). Adapun batas deteksi untuk Comassie blue adalah 36-47 ng, dan untuk  silver staining adalah 0,5-1,2 ng (Ernawati & Kembaren, 2005).
Tahap-tahap  proses elektro- foresis protein  dengan  SDS-PAGE adalah sebagai berikut:
(1). Alat elektroforesis protein (misalnya,  Bio-Rad  Mini Protean  ll) disiapkan, lempengan kaca, spacer, dan alat pencetak gel yang bersih disusun; (2).Untuk memastikan lempengan  kaca yang  disisipi spacer tidak bocor, dimasukkan  akuades ke ruang pencetak  gel; (3).Disiapkan  sepa- rating gel dan itacking get;
(4).Sisir  pencetak  sumur  diselipkan pada  stacking  gel secara  hati-hati sampai  menyentuh bagian  atas dari separating gel; (5).Chamber elektroforesis disiapkan  dan diisi dengan gel sandwich;  (6).Chamber diisi  dengan  buffer elektroforesis hingga  sumur  penuh;  (7).Preparasi marka  protein  dan sampel protein; (B).Marka dan  sampel protein dimasukkan  hingga  sumur terisi penuh;  (9).Semua  sampel  protein dan  marka  telah  masuk  ke dalam
Tabel5. Konsentrasi akrilamid  yang digunakan untuk memisdhkan protein  dalam berbagai  BM (Ernawati & Kembaren, 2005)
15,0 12,5
10,0
7,5 5,0
15-50 18-75
30,1 20 60'-212
Tabel4. Konsentrasiakrilamid  yang  digunakan untuk  memisahkan pro- tein dalam berbagai BM (Nuswantara, 2004)
5 10
10 I,O z,o 3,0 2,6 250.000 - 300.000 15.000 - 100.000 1000 - 100.000 1200 - 50.000
15
Keterangan:
/oQ=  persentase  closslinker = [g cross/rnkerl(g akrilamid + 100%
o/ol= persentase  monomer + crosslinker = [(g  akrilamid  + g volume (ml)lx 100%
24
g crosslinker)l x
crosslinker)ltotal
Squalen Vol. 1 No. 1, Desember 2006
Gambar  3. Beberapa  tahap  proses  elektroforesis  protein  dengan  SDS-PAGE:  (1) persiapan  alat dan gel (2) chamber diisi gel  dan buffer eleklroforesis; (3) pengisian  sampel dan marka ke dalam sumur gel;
(4) running elektroforesis; (5) pemotongan gel; (6)pewama'an (staining) gel; (7) penghitangan warna  (destaining)  pada  gel;  dan  (8) hasilelektroforesis berupa pita-pita protein  dan marka.
Tabel 6. Jen is-jen  is mem bran dan karakteristi  knya (N uswantara, 2OO4)
semua sumur pada  gel, dan siap dilakukan  running elektroforesis;
(1 0).Running dilakukan pada tegangan  listrik  dan waktu tertentu hasil optimasi; (11).Selesai  run- ning, gel diambil;  (12).Gel  dipotong
Kapasitas (mg DNA/cm2) 80-1 20 Ukuran asam > 400
nukleat untuk
penempelan maksimum (bp)
Buffer transfer Daya ionik tinggi pada  pH netral
lmmobilisasi Pemanasan {fiksasi) pada olen mkum pada
80oC selama
21am
dan dirapikan  pada  bagian yang tidak  dipedukan;  (13).Gel dibilas dengan  akuades;  (14).Gel  diwarnai (staining)  dengan merendamnya dalam staining solution, dalam hal ini dalam Comassie  b/ue  selama
100
400-500 >50 ,> 50
Daya ionik rendah  pada berbagai  interval  pH
Pemanasan pada  oren biasa pada  70oC, metode alkalin  atau irradiasi UV
15 menit;  (15).Gel didestaining untuk menghilangkan sisa  sfarnrng pada gel yang  tidak  mengandung pita protein;  (16).Diperoleh gel elektroforesis yang mengandung pita-pita  protein dan marka. BM pro- tein dapat dikelahui  dengan cara membandingkan  pita  protein  yang dihasilkan terhadap  pita-pita protein pada  marka.
Secara  garis besar tahaptahap di atas,  dapat dilihat pada  Gambar J.
Analisis Protein dengan Western Blot
Karakterisasi  protein dengan metode  ini dilakukan  berdasarkan kemampuan  protein  sebagai  anti- gen yang  mengenali antibodi (Ernawati & Kembaren,  2005). Untuk  melakukan analisis Westem B/of  diperlukan  antibodi yang spesifik  mengenali  protein  target. Tahap  pertama pada analisis Western Blot adalah  SDS-PAGE, dimana protein  dipisahkan terlebih dahulu berdasarkan  BM-nya. Pro- tein yang berada  pada geltersebut

## D. Noviendri dan Sugiyono
ditransfer ke suatu membran  dalam hal  ini nitroselulosa  dengan  metode elektroforesis. Membran di- tempatkan.pada  kutub Positif, sedangkan gel diletakkan Pada kutub  negatif, sehingga Protein bermigrasi ke kutub  positif, dimana akhirnya  protein  ditransfer ke membran.
Membran  yang telah  membawa protein  selanjutnya diinkubasi dengan  antibodi  (antibodi  primer) terhadap  protein target.  Membran kemudian  dicuci, lalu diinkubasi dengan  antibodi  sekunder yg telah berkonyugasi dengan alkalin fosfatase  alau h o rse rad i sh pe roxi - dase yang dapat menguraikan substrat tertentu  dan menghasilkan warna  (Kembaren & Rachman, 2005). Jenis  membran  yang  daPat digunakan dalam analisis inidapat dilihat pada  Tabel 6.
Tahap-tahap  analisis Protein dengan  Western Blot adalah sebagaiberikut:
(1).Membran dalam hal ini nitroselulosa disiapkan, lalu digunting  sesuai  ukuran gel;
(2).Kertas saring dan membran nitroselulosa dibasahi dengan merendamnya  dalam buffer trans- fer; (3).Gel hasil SDS-PAGE ditempatkan di atas membran;
(a).Gel disusun seperti sandwich pada  alat  yang  tersedia  terdiri dari berturut-turut,  busa, 3 lembar kertas  Whatman 3 MM/kertas saring, gelakrilamid, membran  ni- tro-selulosa, 3 lembar kertas Whatman 3 MM dan busa;
(5).Model  sandwich siaP di- tempatkan dalam chamber elektroforesis; (6).Membran nitroselulosa ditempatkan Pada daerah  yang  menjadianoda  (kutub positif); (7). Proses  transfer  protein, dilakukan  semalam pada tegangan
100 Volt pada  suhu  4 "C; (B).Setelah
1 malam,  selanjutnya membran dikeringudarakan  selama 30-60 menit. Kemudian  membran  di- rendam bertu  rut-turu t dalam b uffer PBS,  antibodi primer, bufferTBS,
Gambar4.  Beberapa  tahap  analisis protein dengah  Western Blot: persiapan  membran  (1); penyusunan  gel dan membran (2); proses transfer  protein  (3); perendaman  membran  (4),  dan hasil lz'llesfern Blot  (5).
antibodi  sekunder, buffer TBS, buffer akalin fosfatase. Se- lanjutnya  dilakukan  pewarnaan dengan merendam membran dalam buffer alkalin  fosfatase yang mengandung  NBT dan BCIP; (9).Setelah reaksi dihentikan dengan  memindahkan  membran  ke dalam buffer TBS Yang mengandung  EDTA,  lalu dikering- udarakan.  Diperoleh  hasil We  ste rn B/of berupa spot-sPot hasil hibridisasi  protein dan antibodi pada  membran.
Secara  garis besar, tahaPtahap di atas dapat dilihat pada Gambar 4.

## DAFTAR PUSTAKA
Ellyasheva,  R. 2005.  Purifikasi Pro- tein. Makalah kursus singkat: Perkembangan terkini dan Prosoek Protein Rekombinan dalam Bidang  Industri.  School of Pharmacy  lTB, Bandung. 13-17 Desember 2005.  P 1-10.
Ellyasheva,  R. dan Rachman,  E.A.G. 2005.  Purifikasi  Protein.  Makalah kursus singkat:  Perkembangan terkini  dan Prospek Protein Rekombinan dalam Bidang Industri. School of PharmacY  lTB, Bandung.  13-17 Desember 2005. o.20-26
Ernawati dan  Kembaren, R.F. 2005. Karakterisasi Protein Re- kombinan.  Makalah kursus singkat:  Perkembangan terkini dan Prospek
Protein Rekombinan dalam Bidang Industri. School of PharmacY  lTB, Bandung.  13-17 Desember 2005. o.1-12.
Fardiaz, D. dan  Fardiaz, S.1987. Teknik Penelitian  Protein.  Lab. Kimia dan Biokimia  Pangan.  PAU Pangan dan Gizi. lPB, Bogor. 305 pp.
Gusdinar, T,  2005. Enzim Rekombinan dalam Bidang Farmasi . Makalah kursus singkat:  Perkembangan  terkini dan Prospek Protein Rekombinan dalam Bidang lndustri.  School of PharmacY lTB,' Bandung.  13.17 Desember
2005. p.49-58.
Kembaren,  R.F. dan Rachman,  E. A. G. 2005. Karakterisasi  Protein Rekombinan.  Makalah  kursus singkat:  Perkembangan terkini dan Prospek Protein Re- kombinan dalam Bidang  Industri. School of PharmacY lTB, Bandung.  13-17 Desember 2005. o.27-30.
Nurachman, Z. 2006. Pemurnian Protein. Makalah The Gruber- Soedigdo Lecture 2006. Work- shop  Carbohydrate Acting En- zymes:  Structure, Modelling and
Application.  Biochemictry  Lab. lTB, Bandung.21-22 Juni 2006. p.24-39.
Nuswantara, S. 2004. Kuliah dan Pel ati ha n. El e ktrofore sls DNA, Protein, Blot-transfer DNA  & Pro- tein. Ma[*an kuliah dan pelatihan. Laboratorium  Terpadu Universitas lslam l(tegeri Jakarta. 27-29 Desember  2004. 48 pp.
Rachman, E. A. G 2005.  Protein  dan Modifikasinya.  Makalah kursus singkat:  Perkembangan terkini dan Prospek Protein Re- kombinan dalam Bidang  lndustri. School of Pharmacy- lTB, Bandung. 13-17 Desember
Squalen  Vol. 1 Noi 1, Desember 2006 2Q05. p. 1-7. ?
Retnoningrum,  D. S. 2005.  Protein Rekombinan untuk Vaksin. Makalah kursus singkat: Perkembangan terkini dan Prospek Protein Rekombinan dalam Bidang Industri.  School of FSarmacy lTB, Bandung. 13-17 Desember 2005. p. 104-107.
.:
nft