## ENDOGAMY MARRIAGE MITOCHONDRIAL DNA VARIATION OF NORTH CIGINTUNG GARUT ISOLATES
1 Rina Budi Satiyarti, Rindu Anggita 2
1 UIN Raden Intan Lampung, Jalan Letkol H. Endro Suratmin Bandar Lampung
2 Universitas Jenderal Achmad Yani Cimahi, Jalan Terusan Jenderal Sudirman Cimahi email: rinabudi07@gmail.com
Diterima : 07 Maret 2018. Disetujui: 15 Mei 2018. Dipublikasikan: 29 Juni 2018

## Abstract
Mitochondrial  DNA  (mtDNA)  has  an  unique  genetic  sequences  which  made  its  different from nuclear DNA. MtDNA is maternally inherited without recombination, and it has higher mutation rate rather than nuclear DNA. D-loop is an  noncoding area in mtDNA which has highest  polymorphism  among  mtDNA.  The  objective  of  this  research  is  to  study  about nucleotide variation in D-Loop area from people who has endogamy marriage. The subject is four  generation  of  maternally  inherited.  The  research  steps  are  sample  collection,  DNA template preparation, mtDNA amplification, agarose gel electrophoresis, sequencing analysis and homology analysis. The amplification of D-Loop fragment has 0,9 kb in size. Homology analysis showed fifty varians nucleotides.
Key words : Mitochondrial DNA (mtDNA), D-loop, nucleotides variation.

## PENDAHULUAN
Genom  mitokondria  terdiri  dari  dua  daerah  yaitu  daerah  yang  mengkode  gen yang terdiri atas gen penyandi rRNA yaitu12S dan 16S, 22 gen penyandi tRNA, dan 13 protein sub unit kompleks enzim rantai respirasi, dan daerah yang tidakmengkode genyang  disebut  dengandaerah  D-Loop.D-loop  memiliki  tiga  daerah  hipervariabel (HV),  yaitu  HV1  pada  urutan  16024-16383,  HVII  pada  urutan  57-732,  dan  HVIII pada  urutan  438-594  (Anderson, et.al .,  1981;  Hiroaki, et.al .,  2006).  Keunikan  dari daerah D-Loop adalah memiliki tingkat  polimorfisme  yang tertinggi  dalam  mtDNA (Ratnayani,dkk.,  2007).  Tingkat  polimorfisme  yang  tinggi  tersebut  ditandai  dengan laju  mutasi  yang  tinggi,  yaitu  sekitar  10-17  kali  DNA  inti  (Wallace, et  al .,  1997). Tingginya  laju  mutasi  dapat  mengakibatkan  adanya  heteroplasmi.  Heteroplasmi terdeteksi dalam bentuk perbedaan urutan mtDNA, baik berupa substitusi basa pada
satu  titik  atau  delesi  dan  insersi  yang  akan  menyebabkan  variasi  panjang  mtDNA. Pola panjang heteroplasmi mirip untuk individu-individu segaris keturunan ibu tetapi bervariasi untuk individu yang tidak segaris keturunan ibu (Malik,dkk . , 2002).
Beberapa penelitian yang dilakukan di daerah D-loop pada individu segaris ibu sudah  pernah  dilakukan  para  peneliti.  Lim, et  al .  (2010)  menemukan  pewarisan maternal  pada  daerah  Hipervariabel  I  (HVI)  terhadap  suku  asli  di  Malaysia  yaitu adanya  delesi  9  pasang  basa  (pb).  Hal  ini  dapat  dipengaruhi  oleh  faktor  geografi (Lim, et  al .,  2010).    Penelitian  lainnya  oleh  Maksum  pada  tahun  2003  yang menemukan  urutan  nukleotida  387  pb  daerah  D-loop  pada  tujuh  generasi  segaris keturunan  ibu.  Analisis  homologi  menunjukkan  enam  mutasi    substitusi  terhadap urutan  Cambridge,  tiga  merupakan  mutasi  spesifik  untuk  keluarga  yang  diteliti.  D- loop  signifikan  untuk  menentukan  identitas  seseorang  sampai  tujuh  generasi  atas dasar  hasil  yang  diperoleh  menunjukkan  bahwa  urutan  nukleotida  D-loop  tujuh generasi  masih  lestari  (Maksum,  2003).  Kemudian  pada  tahun  2012  oleh  Yudianto dan Indah telah diteliti variasi nukleotida lokus 126 pb daerah D-loop mtDNA pada individu segaris ibu di pulau Madura. Hasil penelitian tersebut menunjukkan adanya 10  varian  nukleotida  yang  ditemukan  pada  3  keluarga  segaris  ibu  suku  madura (Yudianto dan Indah, 2012).
Indonesia merupakan negara  yang sebagian daerahnya masih menganut pola perkawinan  endogami.  Perkawinan  endogami  adalah  suatu  perkawinan  antara  etnis, klan, suku, atau kekerabatan dalam lingkungan yang sama. Dalam sistem endogami, seseorang diharuskan untuk mencari jodoh di lingkungan sosialnya sendiri, misal di lingkungan  kekerabatan,  klan,  lingkungan  kelas  sosial,  atau  lingkungan  tempat tinggal  (Sunarto,  2004).Kampung  Cigintung  Kaler  merupakan  salah  satu  daerah pelosok  di  Garut  yang  sebagian  masyarakatnya  masih  menganut  pola  perkawinan endogami.  Perkawinan  endogami  dilihat  dari  sudut  pandang  genetik  akan meningkatkan  frekuensigenotip  homosigot.  Homosigot  terdiri  dari  dua  jenis  yaitu, homosigot dominan jika alelnya bersifat dominan, dan homosigot resesif jika alelnya bersifat  resesif.  Peningkatan  homogenitas  genetik  ini  akan  muncul  jika  perkawinan endogami terjadi terus menerus antar generasi hingga sampai pada satu titik dimana terjadi  semua  alel  homosigot  dalam  satu  lokus  atau  bahkan  pada  semua  lokus (Syukriani, 2012).

## METODE PENELITIAN
Pengambilan  sampel  dari  empat  individu  dengan  cara  melakukan pembicaraan  selama  20  menit,  selanjutnyasubjek  diminta  untuk  berkumur menggunakan30  mL  aquades  steril  selama  1  menit,  dan  meludahkannya  ke  dalam container  steril .  C ontainer  steril yang  berisi  sampel  dimasukkan  ke  dalam cooler box .
Lisis  sel  epitel  untuk  memperoleh  DNA  mitokondria  dengan  cara  sampel diinkubasi dalam 200 µL campuran reaksi yang terdiri dari 20 µL bufer lisis, 10 µL proteinase-K  (200  µg/mL)  dan  170  µL  ddH 2 O  steril.  Sampel  diinkubasi  pada  suhu 50 o C selama 1 jam dilanjutkan dengan pemanasan pada suhu 95 o C selama 5 menit. Kemudian hasil lisis disentrifuga dengan kecepatan 12.000 rpm menggunakansentrifuga mikro selama 3 menit. Supernatan yang diperoleh telah siap sebagai  templat  dandapat  langsung  diamplifikasi.  Penyimpanan  sampel  epitel  yang telah dilisis disimpan dalam tabung mikro pada suhu  -20°C.
Proses  perbanyakan  (amplifikasi)  dilakukan  secara in  vitro dengan  teknik PCR ( Polymerase Chain Reaction ). Primer yang digunakan adalah primer maju  M1 5’-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’, dan primer balik HV2R 5’- CTGTTAAAAGTGCATACCGCC-3’.  Pada  penelitian  ini  penentuan  urutan nukleotida  dilakukan  menggunakan  metoda  dideoksi  sanger.  Analisis  homologi dilakukan menggunakan program DNA STAR.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  penelitian  ini,  daerah  mtDNA  yang  dijadikan  fokus  penelitian  adalah daerah hipervariabel 1 (HV1) dan hipervariabel II (HVII) yang terdapat di daerah D- loop, karena daerah ini memiliki laju mutasi  yang tinggi. Proses perbanyakan DNA atau  amplifikasi  secara in  vitro dalam  penelitian  ini  dilakukan  dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Suhu optimum annealing pada penelitian ini adalah 49,7ºC (Gambar 1).
Gambar 1. Optimasi suhu penempelan template ( annealing )
Proses amplifikasi melalui proses PCR berhasil dengan munculnya satu pita pada daerah 0,9 kb (Gambar 2).
Gambar 2 Elektroforesis amplifikasi  fragmen 0,9 kb
Keterangan : 1& 4 = kontrol (-) 6 = generasi 3 2 = generasi 1 7 = generasi 4 3 = generasi 2 8 = kontrol 5 = kontrol (+)
250 pb 500 pb 750 pb 1000 pb 250 pb 500 pb 750 pb 1000 pb
Sekuensing  ini  dilakukan  oleh Macrogen  Inc. Dan  hasil  yang  diperoleh berupa elektroforegram.  Dapat dilihat bahwa terdapat puncak-puncak dengan warna yang  berbeda.  Warna-  warna  tersebut  tergantung  jenis  basanya.  Puncak  berwarna merah menunjukkan basa timin (T), puncak berwarna hijau menunjukan basa adenin (A),  puncak  berwarna  hitam  menunjukkan  basa  guanin  (G),  dan  puncak  berwarna biru  menunjukkan  basa  sitosin  (C).  Selain  itu,  dapat  dilihat  bahwa  puncak  untuk setiap  nukleotida  tingginya  berbeda-beda  karena  jumlah  DNA  mitokondria  yang sangat banyak dalam satu sel. Puncak yang rendah menunjukkan nukleotida dengan jumlah  yang  sedikit  atau  minoritas,  sedangkan  puncak  yang  tinggi  menunjukkan nukleotida dengan jumlah yang banyak atau mayoritas (Gambar 3).
Gambar 3. Eletroforegram hasil penentuan urutan nukleotida
Pada  penelitian  ini  akan  dilihat  apakah  terdapat  variasi  urutan  nukleotida  pada sampel. Untuk mengetahui  adanya variasi  urutan  nukleotida pada sampel  dilakukan perbandingan dengan urutan nukleotida dan elektroforegram sampel terhadap kontrol yaitu  penduduk  Kp.  Cigintung  Kaler  yang  tidak  menganut  perkawinan  endogami menggunakan  program  komputer  Seqman  (DNASTAR). Hasil  pensejajaran  urutan
nukleotida  dari  generasi  ketiga  dan  generasi  keempat  dengan  individu  yang  tidak melakukan endogami menunjukkan adanya 50 varian nukleotida (Tabel 1).
No Variasi Nukleotida 1 A16194C 2 G16208T 3 T16217C 4 T16224C 5 T16226C 6 C16241A 7 A16243C 8 C16244T 9 G16277A 10 G16258C 11 A16261C 12 T16266C 13 A16268C 14 T16275A 15 T16280A 16 A16281C 17 C16286A 18 A16289C 19 A16293C 20 C16300T 21 C16305A 22 A16317C 23 C16318A 24 A16326C 25 G16333C
http://ejournal.radenintan.ac.id/index.php/biosfer/index
Dalam  penelitian  ini  sampel/sukarelawan  yakni  mereka  yang  asli  kelahiran Kp.Cigintung  Kaler,  Garut  serta  pola  perkawinannya  endogami.  Dari  hasil  analisis sekuensing  dapat  dilihat  bahwa  terdapat  perbedaan  urutan  nukleotida  yang  cukup
No Variasi 26 A16340G 27 C16341G 28 T16356A 29 C16365T 30 A97T 31 A106T 32 A108T 33 C109T 34 C110T 35 G112T 36 G125C 37 A129C 38 C156T 39 A167G 40 A168G 41 T176A 42 T178C 43 C182A 44 G211A 45 C215A 46 T216A 47 A254C 48 A258G 49 C283A 50 G336T
banyak  antara  sampel  dengan  kontrol.  Hal  ini  disebabkan  karena  daerah  D-loop mempunyai tingkat polimorfisme yang paling tinggi di dalam rantai mtDNA, dimana derajat keragaman daerah tersebut di antara individu-individu yang tidak mempunyai hubungan kekerabatan secara maternal cukup tinggi.
Perbedaan  urutan  basa  yang  ditemukan  pada  sekelompok  individu  dalam suatu  spesies  disebut  dengan  ‘ genetic  marker ’  (penanda  gen).  Dua  individu  yang memiliki genetic  marker pada  posisi  yang  sama  mengindikasikan  hubungan kekerabatan.  Dari  sinilah  kita  bisa  menelusuri  leluhur  kita  sesungguhnya  dan darimana mereka berasal. Semakin banyak genetic marker khas yang terdapat dalam suatu ras atau spesies, makin beragam karakteristik individu penyusunnya (Yudianto dan Indah, 2012).

## Gambar  4.  Tampilan  program  Seqman  untuk  analisis  sampel  generasi  ketiga dan generasi keempat
Hasil  analisis  pada  sampel  menunjukkan  bahwa  adanya    variasi  nukleotida pada C16241A, A16243C, C16244T, G16258C, A16261C, T16266C, dan A16268C. Terdapat  empat  mekanisme  utama  yang  dapat  merubah  frekuensi  gen  dan  genotip dalam  populasi  yaitu  mutasi,  seleksi, gene  flow dan genetic  drift .Mutasi  dan gene flow akan  menaikkan  variasi  dalam  pupolasi .  Gene  flow adalah  pertukaran  material
genetik antar populasi yang disebabkan oleh proses migrasi dan perkawinan ( Stinson S., et.al ,    2000). Genetic  drift terjadi  pada  populasi  di  daerah  yang  tertutup  atau terisolasi atau sedikit menerima migrant dari daerah lain. Terdapat dua keadaan yang dapat memicu genetic drift , yakni bottleneck dimanaukuran populasi berkurang pada suatu  saat  tertentudan founder  effect dimana  semua  individu  dalam  suatu  populasi setelah ditelusuri ternyata kembali ke sejumlah kecil individu asalnya (Bodmer WF. and Cavalli-Sforza LL, 1976).

## KESIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan  hasil  penelitian,  dapat  disimpulkan  bahwa  hasil  analisis homologi urutan nukleotida pada daerah HVI dan HVII generasi ketiga dan generasi keempat dengan kontrol didapatkan 50 jenis varian nukleotida.

## DAFTAR PUSTAKA
Anderson, S., Bankier, A. T., Barrel, B.G., de Brujin, M.H., Coulson, A.R., Drouin, J., Eperon, I.C., Nierlich, D.P., Roe, B.A., Sanger, F., Schreier, P.H., Smith, A.J.,  Staden,  R.,  and  Young,  I.G.  1981.  Sequence  and  Organizatiom  of  the Human Mitokondrial Genome. Nature . 290, 457-465.
Andrews,  R.M.,  Kubacka  I,  Chinnery  PF,  Lightowlers  R.N.,  Turnbull  D.M.,  and Howell  N.  1999.  Reanalysts  and  revision  of  the  cambridge  reference sequence for human mitchondrial DNA. Nat Genet . 23: 147.
Barnes,  M.W. 1994. PCR amplification of up to  35-kb DNA with  high fidelity and high  yield  from  λ  bacteriophage  templates,  proc.  Natl.  Acad.Sci.USA,  91, 2216-2220
Bodmer,  WF.,  Cavalli-Sforza  LL,  1976. Genetics,  Evolution  and  Man .  San Fransisco;WH Freeman and Company
Chen,  X.,  Prosser,  R.,  Simonetti,  S.,  Sadlock,  J.,  Jagiello,  G.,  Schon, E.A.1995.Rearranged  Mitochondrial  Genomes  are  Present  in  Human Oocytes. Am. J. Hum. Genet . 57, 239-247.
Cheng, S., Fockler, C.,Barnes, M.W., and Higuchi, R. 1994. Effective amplification of  long  target  from  cloned  inserts  and  human  genomicDNA,  Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 91, 5695-5699
Cheng,  S.,  Kolmodulin,  L.A.  1997.  XL  PCR  amplification  of  long  targets  from genomic  DNA,  Methods  in  Molecular  Biology  :  PCR  Cloning Protocols,edited by Bruce A. White, 67, Humana Press, Totowa, New Jersey,
17-29
Clayton,  D.A.  1991.  Nuclear  godgets  in  Mitochondrial  DNA  Replication  and Transcription . Foends . Biol. Sci. 16: 107-111
Cole,  A.S.,  Eastol,  J.E.  1978. Biochemistry  and  oral  biology .  Toppan  Co.  Ltd.. Singapore.
Czarnecka, A.M., Golik, P., and Bartnik, E. 2006. Mitochondrial DNA mutations in human neoplasia. J Appl Genet . 47, (1), 67-78.
Grzybowski, T. 2000. Extremely High Levels of Human Mitochondrial DNA Heteroplasmy in Single Hair Roots. Electrophoresis. 2f, 548-553
Gumilar, G., Ridha, I.L., dan Heli, S.M. 2013.Profil Genetik Daerah Hipervariabel I (HVI)  DNA  Mitokondria  pada  Populasi  Dataran  Tinggi .  Jurnal  Sains  dan Teknologi Kimia . Vol. 4 No. 2. Hal. 184-191. ISSN 2087-7412.
Handt,  O.,  S.  Meyer,  A.  Von  H.  1998.  Compilation  of  Human  mtDNA  Control Region Sequences . Nucleic Acids Research . 26, (1), 126-129.
Hiroaki,  N.,  et.  al.  2006.  Hypervariable  region  structure  and  polymorphism  of mtDNA. Journal of Oral Science . 48 . (3) , 145-152
Klug,  W.  S.,  Cummings,  M.  R.  1994. Concepts  of  genetics .  4th  ed.  Prentice Hall,Englewood cliffs.
Koolman,  J.,  Klaus-Heinrich,  R.  2005. Color  Atlas  of  Biochemistry .  Edisi  Kelima. Germany: Georg Thieme Verlag .
Lim,  S.L.,  Mah,  M.,  Khai,  A.,  Badrul,  and  M.  Md.  Z.  2010.  Mitochondrial  DNA Polymorphism abd Phylogenetic Relationships of Proto Malays in Peninsular Malaysia. Journal of Biological Sciences . 10(2), 71-83.
Maksum,  I.  P.  2003. Tiga  Mutasi  Substitusi  Spesifik  Daerah  D-loop  DNA Mitokondria  yang  Lestari  Pada  Tujuh  Generasi  Segaris  Keturunan  Ibu Manusia Indonesia .  Perpustakaan digital ITB (online). http://digilib.itb.ac.id/ diakses tanggal 20 Oktober 2016.
Malik,  S., Sudoyo  H,  Pramoonjago  P,  Sukarna  T.  Darwis  D,  dan  Marzuki  S.  2002.
Evidence  For  The  De  Novo  Regeneration  of  The  Pattern  of  The  Length Heteroplasmy  Associated  With  The  T16189C  Variant  In  The  Control  (D- Loop) Region Of Mitchondrial DNA. J Hum Genet 47: 122-130.
Newton,  C.R.  and  Graham,  A.  1997. PCR .  2 nd edition.  BIOS  Scientific  Publishers Limited. England.
Ngili, Y. 2003. Mengenal DNA Mitokondria dan Aplikasinya . Kompas . 4 November 2003.
Noer,  A.S.,  Martasih,  F.,  Mulyani,  S.,  Muktiningsih,  Wirahadikusumah.  1994. Analisis  Variasi  Urutan  Nukleotida  D-loop  MtDNA  Manusia  dari  Beberapa Daerah  di  Indonesia .  Prosiding  Seminar  Bersama  Universitas  Kebangsaan Malaysia-ITB Pertama. Bandung. 201-214.
Noer,  A.S.  dan  Gustiananda,  M.  1997. PCR  Tanpa  Isolasi  DNA  dari  Sel  Epitel Rongga Mulut. JMS Vol. 2 No. 1, hal. 35 – 45.
Palit,  E.  I.  Y.,  dan  Yohanis  N.  2016. Kuantifikasi  dan  Filogenetika  Mutasi  DNA. Innosain . Yogyakarta.
Poedjiadi,  A.,  dan  Supriyanti,  F.  M.  T.  2005. Dasar-Dasar  Biokimia  (edisi  revisi). Jakarta: UI Press
Puspitawati  Ria.  2003.  Struktur  Makroskopik  dan  Mikroskopik  Jaringan  Lunak Mulut. Jurnal  Kedokteran  Gigi  Universitas  Indonesia;10  (Edisi  Khusus) : 462-467.
Ratnayani,  K.,  I  Nengah  Wirajana,  dan  A.A.I.A.M  Laksmiwati.  2007.  Analisis Variasi  Nukleotida  Daerah  D-loop  DNA  Mitokondria  Pada  Satu  Individu Suku Bali Normal. Jurnal Kimia 1 (1). Hal. 7-14. ISSN 1907-9850.
Sanger,  F.,  Nicklen,  S.,  and  Coulson,  A.R.  1977. DNA  sequencing  with  chain- terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463-5467.
Shadel,  G.S.  and  D.A.  Clayton.  1997.  Mitochondrial  DNA  maintenance  in vertebrata. Annual Review of Biochemistry 66: 409-435.
Siti,  H.  H.,  Gun,  G.G.,  Dessy,  N.,  dan  Achmad,  S.N.  2007. Variasi  Urutan Nukleotida  Daerah  D-Loop  DNA  Mitokondria  Manusia  pada  Dua  Populasi Asli Indonesia Tenggara. Makalah pada Seminar Nasional Kimia Universitas Negeri Surabaya . Surabaya.
Stanfield, W. D., Jaime S. C., Raul J. C. 1996. Molecular and Cell Biology . McGraw- Hill, New York
Stinson S, Bogin B, Hush-Ashmore R, O’Rourke D, 2000. Human Biology, An
Evolutionary and Biocultural Perspective . New York : Willey-Liss, pp. 4-7 Sunarto,  K.  2004. Pengantar  Sosiologi .  Jakarta:  Penerbit  Fakultas  Ekonomi Universitas Indonesia.
Suryadi,  H.,  Malik,  S.  G.,  Gustiananda,  M.,Sudoyo,  H.,  2003. Polimorfisme  DNA Mitokondria  dan  Kedokteran  Forensik,  dalam  Mithocondrial  Medicine . Lembaga Biologi molekuler Eijkman . Jakarta. p. 53-56.
Syukriani, Y. 2012. DNA Forensik . PT Sagung Jakarta.
Thompson,  R.  &  B.  Fritchman. Illustrated  guide  to  home  biology  experiments:  All lab, no lecture . California, O’Reilly Media Inc. : xv + 358 hlm
Tully, L. A., Steighner, R. J., Parsons, T. J., Holland, M. M., Prenger, V. L., Marino,
M.  A.  1999.  A  High  Incidence  of  Mitochondrial  DNA  Heteroplasmy  in Hypervariable  I  in  Normal  Human  Tissues:  Implications  for  Forensic Casework. 16, 561-565
Wallace  DC,  Stugard  C,  Murdock  D,  Schurr  T,  and  Brown  MD.  1997.  Ancient mtDNA sequences in the human nuclear genome: a potential source of errors in identifying pathogenic mutations . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94(26):14900–14905.
Watson, J. D., Hopkins, N. H., Roberts, J. W., Steitz, J. A., and Weiner, A. M. 1987. Molecular  Biology  of  the  Gene.  fourth  edition.  The  Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc. Menlo Park, California.
Wilson, B., Teslow, J., and Osman-Jourchoux, R. 1995. The impact of constructivism (and  postmodernism)  on  instructional  design  fundamentals .  In  Seels,  B.  B. (Ed.),  Instructional  Design  Fundamentals  –  A  review  and  reconsideration, New Jersey: Educational Technology Publications, 137-157.
Yudianto,  A.,  dan  Indah  N.  M.  2012.  Variasi  Nukleotida  Lokus  126  pb  Daerah  D- loop  DNA  Mitokondria  (mtDNA)  pada  Individu  Segaris  Keturunan  Ibu. Indonesian Journal of Legal and Forensic Science 2012; 2 (3): 61-65. Yuwono,  T.,  2006. Teori  dan  Aplikasi  Polymerase  Chain  Reaction .  Penerbit  Andi. Yogyakarta. p. 1-3; 18-21
Zyskind,  J.  W.  and  S.  I.  Bernstain.  1992. Recombinant  DNA  Manual . Academic Press, Inc . California