Versi Online: http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood e-ISSN: 2443-3446 Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) Vol. 10 No. 1 Mei 2024 ISSN: 2443-1095

## KONSTRUKSI DAN KLONING GEN CelE PENYANDI ENZIM SELULASE SEBAGAI KANDIDAT ENZIM BAGI INDUSTRI PANGAN DAN AGROINDUSTRI
[Construction and Cloning of the CelE Gene Encoding the Cellulase Enzyme as A Candidate Enzyme For the Food Industry and Agroindustry]
Sukarne 1) , Hasma 1) , Raudatul Jannah 2) , Muhammad Aidil Fitriyan Fadjar Suryadi 1) , Lalu Unsunnidhal 3)*
1) Fakultas Peternakan, Universitas Mataram, Mataram, NTB, Indonesia
2) Program Studi Diploma Kebidanan, STIKES Yarsi Mataram, Mataram, NTB, Indonesia
3) Fakultas Teknologi Pangan dan Agroindustri, Universitas Mataram, Mataram, NTB, Indonesia
* email: lalu.unsunnidhal@unram.ac.id

## ABSTRACT
Research on the construction and cloning of the CelE gene, which encodes the cellulase enzyme from Ruminococcus plavefaciens, emerged as a response to the urgent need for efficient enzyme resources in the food industry and agro-industry. Cellulase enzymes, with a focus on CelE, have a vital role in the degradation process of cellulose, a main component in plant cell walls. The existence of Ruminococcus plavefaciens as a source of the CelE gene is of interest because this microorganism is found in the digestive system of ruminant animals and has great potential to produce efficient cellulase enzymes. This research aimed to create and clone the pET15b plasmid with the CelE gene. Confirmation of the CelE gene in recombinant DNA was carried out by identifying host bacterial resistance  in  media  with  antibiotics  and  colony  PCR.  This  research  was  carried  out  by  applying  the  following methods: Implementation of Codon Optimization  and Recombinant Plasmid Construction (CelE), Preparation of Competent Cells, Cell Transformation, and Transformant Colony PCR Test. The results of the research show that this research has succeeded in obtaining the expected transformant bacteria with the results of the Transformant Colony PCR Test. obtained the appropriate product size, namely 205 bp, so it can be concluded that the pET15b plasmid with the optimized CelE gene was successfully constructed and cloned.
Keywords: CelE, Cellulase Enzyme, Recombinant DNA Cloning, Recombinant DNA Construction.

## ABSTRAK
Penelitian konstruksi dan kloning gen CelE, yang merupakan penyandi enzim selulase dari Ruminococcus plavefaciens, muncul sebagai respons terhadap kebutuhan mendesak akan sumber daya enzim yang efisien dalam industri  pangan  dan  agroindustri.  Enzim  selulase,  dengan  fokus  pada CelE,  memiliki  peran  vital  dalam  proses degradasi selulosa, sebuah komponen utama dalam dinding sel tanaman. Keberadaan Ruminococcus plavefaciens sebagai sumber gen CelE menarik perhatian karena mikroorganisme ini terdapat dalam sistem pencernaan hewan ruminansia dan memiliki potensi besar untuk menghasilkan enzim selulase yang efisien. Tujuan dari penelitian ini adalah  untuk  membuat  dan  mengkloning  plasmid  pET15b  dengan  gen CelE.  Konfirmasi  gen  CelE  pada  DNA rekombinan dilakukan dengan metode identifikasi resistensi ba kteri host pada media dengan antibiotik dan koloni PCR. Penelitian ini dilaksanakan dengan menerapkan metode sebagai berikut: Pelaksanaan Optimasi Kodon dan Konstruksi Plasmid Rekombinan (CelE), Persiapan Sel Kompeten, Transformasi Sel, Uji PCR Koloni Transforman Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  penelitian  ini  telah  berhasil  mendapatkan  bakteri  transforman  yang diharapkan dengan hasil Uji PCR Koloni Transforman mendapatkan product size yang sesuai yaitu 205 bp, sehingga dapat disimpulkan plasmid pET15b dengan gen CelE yang telah dioptimasi berhasil dikonstruksi dan dikloning.
Kata Kunci: CelE, Enzim Selulase, Kloning DNA Rekombinan, Konstruksi DNA Rekombinan.
Copyright © 2024 by Authors, published by Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan). This is an open access article distributed under the CC BY-SA 4.0 License https:// creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/
Versi Online: http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood e-ISSN: 2443-3446 Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) Vol. 10 No. 1 Mei 2024 ISSN: 2443-1095

## PENDAHULUAN
Industri  pangan  dan  agroindustri  semakin  dihadapkan  pada  kebutuhan  mendesak  untuk meningkatkan efisiensi produksi dan menghadapi tantangan berkelanjutan dalam pengelolaan sumber daya. Dalam rangka memenuhi kebutuhan tersebut, penelitian konstruksi dan kloning gen CelE dari Ruminococcus  plavefaciens  menjadi  langkah  penting  dalam  pengembangan  sumber  daya  enzim selulase yang efisien. Enzim selulase, terutama yang difokuskan pada CelE, memainkan peran sentral dalam degradasi selulosa, komponen utama dinding sel tanaman (Datta, 2024).
Keberadaan Ruminococcus plavefaciens sebagai sumber gen CelE memberikan aspek unik dan menarik  dalam  penelitian  ini.  Mikroorganisme  ini,  yang  ditemukan  dalam  sistem  pencernaan  hewan ruminansia,  menunjukkan  potensi  besar  dalam  menghasilkan  enzim  selulase  dengan  efisiensi  tinggi (Hua et al., 2022). Sehingga, penelitian ini memiliki tujuan utama untuk mengembangkan konstruksi dan  kloning  gen CelE  dari  Ruminococcus  plavefaciens,  dengan  harapan  dapat  menciptakan  enzim selulase yang lebih efisien.
Proses pendegradasi selulosa menjadi komponen yang dapat dimanfaatkan di dalam industri menjadi  fokus  utama.  Melalui  pendekatan  rekayasa  genetika,  langkah  awal  yang  esensial  adalah konstruksi dan kloning gen CelE ke dalam plasmid pET15b. Plasmid ini memiliki peran krusial dalam menyediakan platform untuk ekspresi dan produksi enzim selulase secara efisien (Arthur et al., 2011). Oleh karena itu, penelitian ini memiliki kepentingan strategis dalam menciptakan solusi berkelanjutan untuk industri pangan dan agroindustri.
Dengan pencapaian tujuan ini, penelitian ini  diharapkan dapat menghasilkan enzim selulase yang memiliki potensi aplikasi luas dalam industri pangan dan agroindustri. Keseluruhan pendekatan ini menjadi langkah yang signifikan dalam menghadapi tantangan industri dan memberikan kontribusi pada  pengembangan  teknologi  yang  berkelanjutan.  Melalui  integrasi  yang  mendalam  antara  latar belakang dan tujuan penelitian, penelitian konstruksi dan kloning gen CelE menjadi langkah awal yang penting menuju solusi inovatif dan berkelanjutan.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini sebagai berikut: plasmid rekombinan pET- 15b- CelE, primer ORF pET-CelE-F (Sequence Left Primer pada Gambar 1) dan pET-CelE-R (Sequence Right Primer pada Gambar 1), E. coli BL21 (DE3), Media Luria Bertani (LB) broth (HIMEDIA M1245) dan agar (HIMEDIA M1151). Selain itu, bahan-bahan lain yang digunakan adalah ampisilin 50 µg/mL (Sigma), MgCl2, CaCl2, Nuclease Free Water, Gel Agarosa, Mix PCR (PowerPol), Marker DNA 100 bp (SMOBIO Technology, Inc.), pewarna SYBR safe (SMOBIO Technology, Inc.), Tris Borate EDTA (TBE) dan DNA loading dye.
Plasmid  rekombinan  pET-15b- CelE  yang  digunakan  memiliki  Mapping  sebagai  berikut: Ruminococcus flavefaciens cellulase (celE) gen GenBank: L03800.1 (Gambar 2) yang akan digunakan sebagai sumber gen selulase disisipkan pada vektor pET15b dengan sisi restriksi NdeI dan XhoI yang sebelumnya  telah  dilakukan  optimasi  kodon dengan  target  host E. coli sehingga menghasilkan  DNA rekombinan pET15b- celE (Gene Universal, USA) pada Gambar 3.
Versi Online: http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood e-ISSN: 2443-3446 Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) Vol. 10 No. 1 Mei 2024 ISSN: 2443-1095
Gambar 1. Desain Primer Left dan Right dengan target Gen CelE menggunakan Software Primer3Plus

## ORIGIN
1 agatccagag cctttttaca agtgcttgtc ttatttggat ggaaagccat atatgacaga 61 ggtcattgcg tgtgctgcag aaaaagtacg tttggaatta aagtaagtat gcttaatata 121 aagaaccgat aattcatact cataaaacgc caagagcgtt caattcatag tcagaggtga 181 tactaatgtg gattttaaat aatgatgtat agaaaaacaa ttttgattgg agggctatt a 241 tgcgaaaaag aataacttca atgataacag taatttcatt gaccttatgc ggaactatag 301 gtacttatcc acacaatgct aatgcatcag cgaaagaagc gttcgaggat atatctaaaa 361 gatcagagtg tactaaagta tttgataacg ataacggaac atacaccgct tattcaaata 421 ctgcgccaat tcactatctt aataatgatg agtggaaaga aattgacaat acattaattg 481 aggacagcga tgattattac agaaacaaag ataactcttt caatatttat attccaaagg 541 aatattcgct tggtaagaat ataaaaaatc ctgttataat gaattatgac acatttagtc 601 tgtcaacgtc aataacagac attaagatgc ctgatagacc tgaagaagaa acgttttctg 661 agggagtata tgccgatatc aataatgagg tttatactac aattgataat tcagcaatag 721 ccgaaggaat gaaagcggct ttaaagaagt cagcatcaat ggcgacctat cattcgatcg 781 ttgaagatat tgatcttgat atagctgtgc ataacgcttc tgtcagcgag tcgataatca 841 tcaataagtt agaatcttta ccggaaacga tcacatattc tatttcggtt gaagacgcaa 901 ttattaagaa aactgaagac aacagattgc agcttatcaa agataatgaa gcagtgctca 961 tactatcccc gtttacgatc agcgattcat ctgaaaacgt caatgtcatg caggtagaat 1021 atgatcttac tgaatctgaa gaaggatatg aagttactct ctatccggca gaaacagtta 1081 atcgcatgag cagccctgtt atgccattat ctttaggctc ggagtattca tacgacagac 1141 cattttcaac agtttacaat agccaggctt cgcttcatcc gtctataata ataattacat 1201 aa aagtagga aatgaagcta ataatagtta tcatactata ggatcgtttc tcgaagattt 1261 ttctttttat ggtccatacg ttagaatagt agattcgaca ttttattatt atgtaacttc 1321 cttaagtaca
Gambar 2. Urutan Nukleotida dari Gen CelE yang digunakan (Bold Cokelat)
Versi Online: http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood e-ISSN: 2443-3446 Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) Vol. 10 No. 1 Mei 2024 ISSN: 2443-1095

## Gambar 3. Detail Mapping DNA rekombinan pET15b-celE

## Metode
Pelaksanaan optimasi kodon dan konstruksi plasmid rekombinan (CelE)
Optimasi  kodon  dilakukan  pada  sekuens  nukleotida  gen  celE  (GenBank:  L03800.1)  dari Ruminococcus flavefaciens. Selanjutnya, gen yang telah dioptimasi dikonstruksi pada plasmid vektor pET-15b dengan menggunakan jasa dari Gene Universal Inc. Konstruksi sekuens gen- celE hasil optimasi dilakukan  dengan  menambahkan  daerah  restriksi NdeI  (CATATG)  di  bagian  Upstream  dengan  ATG sebagai Start Codon dan diakhiri dengan kodon TAA sebagai Stop Codon disertai daerah restriksi XhoI (CTCGAG) di bagian Downstream, sehingga membentuk Double Digestion.

## Persiapan sel kompeten
Bakteri E. coli BL21(DE3) yang didapatkan  dari  Laboratorium  Mikrobiologi dan  Bioteknologi, Fakultas Peternakan, Universitas Mataram pada 100 mL media LB broth, kemudian diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 170 RPM pada suhu 37 °C selama 24 jam. Selanjutnya, sejumlah 1% pre-culture dipindahkan ke media LB cair yang baru dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 3 jam. Setelah nilai Optical Density (OD) mencapai 0,4, kultur bakteri diinkubasi dalam boks berisi es selama 10 menit. Untuk pemanenan bakteri, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 2.700 rcf dengan suhu 4 ºC selama 10 menit. Supernatan dibuang dan dituangkan 100 mM CaCl 2 -MgCl 2 sebanyak 1,6 mL pada pelet,  kemudian  diresuspensi.  Selanjutnya,  diinkubasi  dalam  boks  yang  berisi  es  selama  30  menit dengan sesekali digoyang-goyangkan. Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 2.700 rcf dengan suhu 4  ºC  selama  10  menit.  Dituangkan  sebanyak  100  mM  CaCl 2 sebanyak  1,6  mL  pada  pelet  untuk resuspensi. Diinkubasi kembali di dalam boks berisi es selama 20 menit. Kedua kultur dicampurkan ke dalam satu tabung falcon dan ditambahkan dengan 0,5 mL gliserol untuk disimpan dalam freezer (Ishak et  al.,  2019;  Jannah  &  Unsunnidhal,  2019;  Unsunnidhal  et  al.,  2019,  2021b;  Barokah  et  al.,  2023; Unsunnidhal & Jannah, 2019; Unsunnidhal et al., 2021c, 2021a).
Versi Online: http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood e-ISSN: 2443-3446 Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) Vol. 10 No. 1 Mei 2024 ISSN: 2443-1095

## Transformasi sel
Sejumlah 150 µL sel kompeten dimasukkan ke dalam microtube. Gen sintetik ditambahkan 2 µL ke dalam microtube yang telah berisi sel kompeten. Microtube diletakkan ke dalam freezer selama 30 menit. Setelah itu, dilakukan metode heat shock dengan merendam microtube ke dalam water bath dengan suhu 42 ºC selama 45 detik. Selanjutnya, microtube diletakkan kembali ke dalam boks berisi es  selama  2  menit.  LB  broth  ditambahkan  1  mL  ke  dalam  masing-masing microtube,  selanjutnya microtube diletakkan ke dalam shaker incubator selama 1 jam dengan suhu 37 ºC dan kecepatan 170 RPM. Setelah itu, dilakukan metode spread kultur dengan volume bertingkat 20 µL, 40 µL, 80 µL, dan 160 µL masing-masing di atas 4 cawan petri yang berisi dengan media LB agar dan telah ditambahkan ampisilin (100 µL dalam 100 mL LB agar). Kultur diinkubasi semalam pada inkubator dengan suhu 37 ºC  (Unsunnidhal  et  al.,  2019,  2021a,  2021b;  Jannah  &  Unsunnidhal,  2019;  Unsunnidhal  &  Jannah, 2019; Unsunnidhal et al., 2021c; Barokah et al., 2023; Ishak et al., 2019).

## Uji PCR koloni transforman
Tahap persiapan dilakukan dengan mencampurkan 12,5 µL PowerPol, 11,5 µL Nuclease Free Water (NFW), 0,5 µL Primer Left, dan 0,5 µL Primer Right ke dalam tube PCR. Kemudian, koloni diambil menggunakan tusuk gigi  dan  disuspensikan ke  dalam tube PCR yang berisi mix PCR. Untuk kontrol Negatif,  koloni E.  coli  BL21(DE3)  kosong  ditambahkan  sebagai  pengganti  koloni  E.  coli  BL21(DE3) transforman. Kemudian, untuk kontrol positif, ditambahkan dengan 0,5 µL gen sintetik. Proses uji PCR dijalankan sesuai protokol PowerPol dengan suhu pre-denaturasi sebesar 98 °C selama 45 detik, suhu denaturasi  sebesar  98  °C  selama  10  detik,  suhu  annealing  sebesar  54,2  °C  selama  30  detik,  suhu extension 72 °C selama 30 detik, 16 post-extension dengan suhu 72 °C selama 7 menit. Proses PCR dilakukan  sebanyak  30  siklus.  Hasil  amplifikasi  PCR  selanjutnya  dielektroforesis  dengan  gel  agarosa 1%, proses running dilakukan dengan tegangan 100 V selama 20 menit. Untuk visualisasi hasil, gel hasil  elektroforesis  diletakkan  di  bawah  sinar  UV  menggunakan  alat  UV  illuminator  sebagai  proses verifikasi  keberadaan  pita  DNA  gen CelE  (Unsunnidhal  et  al.,  2019,  2021a,  2021b;  Jannah  & Unsunnidhal, 2019; Unsunnidhal et al., 2023; Fathurrahman et al., 2022; Unsunnidhal & Jannah, 2019; Unsunnidhal et al., 2021c; Ishak et al., 2019; Rahman et al., 2022; Barokah et al., 2023).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Optimasi Kodon
Hasil konstruksi dan kloning gen celE pada plasmid pET15b dapat dilihat pada Gambar 4. Sistem ekspresi yang digunakan adalah dengan menggunakan inang E. coli (Expression System: Escherichia coli)  dengan  panjang  gen  sebanyak  963  pasang  basa  (Gene  Length:  963  bp).  Dari  hasil  optimasi tersebut diperoleh CAI sebelum adjaustment adalah 0,77 dan CAI setelah adjustment adalah 0,96.
Optimasi kodon dilakukan dalam rangka merekayasa gen dengan cara mengubah kodon yang ada dengan Synonymous Codon untuk meningkatkan produksi protein yang dikodekannya. Optimasi kodon dalam konteks rekayasa genetika merujuk pada upaya untuk meningkatkan efisiensi ekspresi gen melalui penggunaan kodon yang optimal. Kodon adalah rangkaian tiga nukleotida pada RNA yang mengode  satu  asam  amino  dalam  polipeptida  atau protein.  Setiap  kodon  koresponden dengan  satu asam  amino  atau  memberikan  sinyal  penghentian  translasi.  Dalam  penelitian  ini,  optimasi  kodon dilakukan  dengan  cara  mengganti  kodon-kodon  yang  kurang  efisien  atau  jarang  digunakan  dengan kodon-kodon yang lebih sering digunakan dalam sistem ekspresi E. coli yang merupakan Host ekspresi dalam penelitian ini (Unsunnidhal et al., 2019; Ishak et al., 2019; Unsunnidhal et al., 2021b). Optimasi kodon dilakukan dengan memanfaatkan layanan jasa Gene Universal Corp. Uruatan basa Gen (CelE) yang  dioptimasi  berasal  dari  urutan  basa  nukleotida  gen  ( GenBank:  L03800.1)  dari  Ruminococcus flavefaciens yang diperoleh dari bank gen.
Versi Online: http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood e-ISSN: 2443-3446 Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) Vol. 10 No. 1 Mei 2024 ISSN: 2443-1095
Gambar 4. Hasil Optimasi Kodon Gen (pET15b- CelE)
Berdasarkan data hasil optimasi kodon yang dilakukan oleh Gene Universal Corp. sebagaimana ditampilkan pada Gambar 4. didapatkan peningkatan nilai Codon Adaptation Index (CAI) dari angka 0,77  menjadi  0,96.  CAI  sendiri  menghitung  frekuensi  penggunaan  masing-masing  kodon  dan menghitung rata-rata geometrik frekuensi penggunaan di setiap protein pada target Expression System (Unsunnidhal et al., 2019; Ishak et al., 2019; Unsunnidhal et al., 2021b) sehingga peningkatan CAI dapat mengoptimalkan ekspresi dari gen pET- CelE yang mengkode enzim selulase (Gambar 5). Plasmid DNA rekombinan pET-15b siap untuk disisipkan oleh gen CelE pasca optimasi kodon. Preparasi  persiapan  fragmen  backbone  tersebut  dilakukan  dengan  restriksi  enzim NdeI  dan  XhoI. Berdasarkan peta plasmid sirkular sebagaimana ditunjukkan pada Gambar 3 dapat dijelaskan bahwa total  jumlah  pasang basa  plasmid  pET15b  yang  sudah  disisipi  gen  Cel  E  adalah  6671  pasang  basa. Dimana gen CelE sendiri terdiri dari 963 pasang basa. Pada peta pasmid tersebut juga dapat dijelaskan bahwa telah disisipkan 2 titik potong enzim XhoI dan NdeI (Multiple Cloning Site) pada kedua ujung gen target CelE (Double Digestion). Strategi Double Digestion dalam rekayasa genetika bertujuan untuk mempersiapkan ujung-ujung DNA yang kompatibel antara gen yang akan disisipkan dan vektor plasmid. Dua enzim restriksi dengan situs pemotongan yang berbeda telah digunakan, teknik ini memungkinkan terciptanya ujung yang saling mempermudah penggabungan gen ke dalam vektor. Selain itu, Double Digestion membantu mencegah rekombinasi tak terduga antara vektor dan insert, memastikan bahwa penyisipan  gen  berlangsung  sesuai  rencana  tanpa  perubahan  tak  diinginkan.  Proses  ini  juga memberikan  penanda  pemotongan  yang  jelas,  memudahkan  verifikasi  keberhasilan  pemotongan melalui analisis gel elektroforesis. Kontrol lebih baik terhadap ujung-ujung DNA yang dihasilkan dan peningkatan efisiensi ligasi merupakan keuntungan tambahan dari strategi double digestion (Barokah et al., 2023; Unsunnidhal et al., 2019, 2021c; Unsunnidhal & Jannah, 2019; Jannah & Unsunnidhal, 2019; Ishak et al., 2019; Unsunnidhal et al., 2021b, 2021a).
Versi Online: http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood e-ISSN: 2443-3446 Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) Vol. 10 No. 1 Mei 2024 ISSN: 2443-1095

## Gambar 5. Optimasi Kodon dan CAI yang Dihasilkan

## Kloning plasmid rekombinan pET-15b-CelE pada E. coli BL21(DE3)
Proses transformasi dilakukan menggunakan E. coli BL21(DH3) sebagai sel inang transforman. Transforman  selanjutnya  ditumbuhkan  ke  dalam  media  LB  agar  yang  telah  ditambahkan  ampisilin sebagai Selectable Marker. Hasil pertumbuhan koloni diamati secara morfologi sebagai indikator awal keberhasilan tahap transformasi. Koloni kompeten E. coli BL21(DE3) memiliki ciri morfologi yang identik dengan  koloni E.  coli  BL21(DE3)  Wild  Type.  Morfologi  koloni  kompeten  E.  coli  BL21(DE3)  biasanya melingkar atau membulat dengan tepi yang rata. Ciri morfologi lain yang dapat diamati adalah warna pada koloni yang tumbuh pada media agar. Secara umum, koloni kompeten E. coli BL21(DE3) berwarna
Versi Online: http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood e-ISSN: 2443-3446 Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) Vol. 10 No. 1 Mei 2024 ISSN: 2443-1095
putih gading dan tidak tembus cahaya. Akan tetapi, warna koloni juga bisa sedikit berbeda tergantung pada  media pertumbuhan  yang  digunakan  (Tuttle  et  al.,  2021).  Pada penelitian  ini,  metode Spread digunakan untuk menginokulasikan sejumlah 40 µL sel kompeten di atas media agar dengan ampisilin (Gambar  6).  Tahap  awal  skrining  dilakukan  dengan  mengamati  koloni  yang  berhasil  tumbuh  dan memastikan  kesesuaian  koloni  dengan  ciri-ciri  morfologi  sel  kompeten E. coli BL21(DE3),  kemudian dilakukan uji PCR koloni sebagai tahap verifikasi keberadaan plasmid rekombinan pET-15b- CelE.
Gambar 6. Hasil transformasi plasmid rekombinan pET-15b- CelE pada E. coli BL21(DE3)

## Verifikasi keberadaan plasmid pET-15b-CelE
PCR koloni adalah metode yang umum digunakan untuk skrining transforman E. coli. Skrining tahap awal sangat penting untuk dilakukan, mengingat tidak semua koloni yang tumbuh sebagai hasil dari transformasi tersisipi oleh gen target. Selain  itu, sisipan gen target juga memiliki kemungkinan berada dalam struktur orientasi yang tidak sesuai meskipun proses transkripsi dan translasi berjalan dengan  tepat.  PCR  koloni  merupakan  teknik  untuk  mengidentifikasi  bakteri  yang  mengandung  gen target dengan orientasi yang sesuai cepat dan efisien (Unsunnidhal et al., 2019; Jannah & Unsunnidhal, 2019; Ishak et al., 2019; Unsunnidhal et al., 2021b).
Hasil dari PCR koloni kemudian divisualisasikan menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa konsentrasi  1%.  Kontrol  negatif  yang  digunakan  adalah  koloni E.  coli  BL21(DE3)  nontransforman, sedangkan  kontrol  positif  yang  digunakan  adalah  gen  sintetik CelE.  Pita  yang  berpendar  pada  gel agarosa menunjukkan bahwa gen target CelE telah berhasil terinsersi ke dalam plasmid rekombinan. Hal ini dibuktikan bahwa size product dari amplikon PCR dengan yang berukuran 205 bp terletak di dekat marker dengan ukuran 200 bp (Gambar 7). Sehingga, dapat dikatakan bahwa transforman E. coli BL21(DE3) telah berhasil membawa plasmid rekombinan pET-15b-CelE.
Versi Online: http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood e-ISSN: 2443-3446 Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) Vol. 10 No. 1 Mei 2024 ISSN: 2443-1095
Gambar 7. Visualisasi hasil PCR koloni.  7A) Ukuran product size sejumlah 205 bp. 7B) Pendaran pita pada elektroforesis gel agarosa  (sumuran 1: marker 100 bp, sumuran 2: kontrol negatif, sumuran 3: kontrol positif, sumuran 4: sampel)

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilaksanakan,  dapat  disimpulkan  bahwa  konstruksi  dan kloning  gen CelE  pada  plasmid  pET15b  telah  berhasil  dilaksanakan  dengan  sukses,  menunjukkan keberhasilan  dalam  penyisipan  gen  yang  dioptimalkan  ke  dalam  vektor  plasmid  dan  pembentukan transforman E. coli yang membawa plasmid rekombinan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  dilaksanakan  dengan  menggunakan  Dana  Penelitian  dan  Pengabdian  kepada Masyarakat  Sumber  Dana  Internal  -  Penerimaan  Negara  Bukan  Pajak  (PNBP)  Universitas  Mataram Tahun 2023.

## DAFTAR PUSTAKA
Arthur, P.K., Alvarado, L.J. & Dayie, T.K. (2011) Expression, purification and analysis of the activity of enzymes  from  the  pentose  phosphate  pathway. Protein  Expression and Purification. 76 (2), 229–237. doi:10.1016/j.pep.2010.11.008.
Barokah, U., Unsunnidhal, L., Kristianingrum, Y.P. & Kusumawati, A. (2023) Transformation of HBcAg gene of hepatitis B virus using pEGFP-C1 vector. In: THE 5TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON  BIOSCIENCE  AND  BIOTECHNOLOGY.  2023  Mataram,  AIP  Publishing.  p. doi:https://doi.org/10.1063/12.0020985.
Datta,  R.  (2024)  Enzymatic  degradation  of  cellulose  in  soil:  A  review. Heliyon.  10  (1),  e24022. doi:10.1016/j.heliyon.2024.e24022.
Versi Online: http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood e-ISSN: 2443-3446 Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) Vol. 10 No. 1 Mei 2024 ISSN: 2443-1095
Fathurrahman, I., Kusumawati, A., Rahman, A., Ulviani, Y., Prihantoko, K.D. & Unsunnidhal, L. (2022) Molecular sexing in Bos taurus using quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method. IOP  Conference  Series:  Earth  and  Environmental  Science.  976  (1).  doi:10.1088/1755- 1315/976/1/012002.
Hua, D., Hendriks, W.H., Xiong, B. & Pellikaan, W.F. (2022) Starch and Cellulose Degradation in the Rumen and Applications of Metagenomics on Ruminal Microorganisms. Animals. 12 (21), 1–13. doi:10.3390/ani12213020.
Ishak, J., Unsunnidhal, L., Martien, R. & Kusumawati, A. (2019) In vitro evaluation of chitosan-DNA plasmid  complex  encoding  Jembrana  disease  virus  Env-TM  protein  as  a  vaccine  candidate. Journal of Veterinary Research. 63 (1), 7–16. doi:https://doi.org/10.2478/jvetres-2019-0018.
Jannah, R. & Unsunnidhal, L. (2019) KONSTRUKSI DAN KLONING PLASMID PCDNA3 . 1 ( + ) DENGAN SUBGENOTIP B3 HEPATITIS B CORE ANTIGEN ( HBcAg ) SEBAGAI KANDIDAT VAKSIN DNA HEPATITIS B. Jurnal Penelitian dan Kajian Ilmiah Kesehatan. 5 (2), 125–131.
Rahman,  A.,  Kusumawati,  A.,  Budiyanto,  A.,  Ulviani,  Y.,  Fathurrahman,  I.,  Prihantoko,  K.D.  & Unsunnidhal, L. (2022)  Molecular Verification of Sex-separated Straw of Simmental Cattle ( Bos taurus ) by Polymerase Chain Reaction (PCR) . Proceedings of the 9th International Seminar on  Tropical  Animal  Production  (ISTAP  2021).  18  (Istap  2021),  223–226. doi:10.2991/absr.k.220207.046.
Tuttle, A.R., Trahan, N.D. & Son, M.S. (2021) Growth and Maintenance of Escherichia coli Laboratory Strains. Current Protocols. 1 (1), 1–13. doi:10.1002/cpz1.20.
Unsunnidhal, L., Ishak, J. & Kusumawati, A. (2019) Expression of gag-CA Gene of Jembrana Disease Virus  with  Cationic  Liposomes  and  Chitosan  Nanoparticle  Delivery  Systems  as  DNA  Vaccine Candidates. Tropical Life Sciences Research. 30 (3), 15–36.
doi:https://doi.org/10.21315/tlsr2019.30.3.2.
Unsunnidhal,  L.  &  Jannah,  R.  (2019)  POTENTIAL  OF  CATIONIC  LIPOSOMES  AND  CHITOSAN NANOPARTICLES FOR DELIVERY DNA VACCINE MODEL NTC8685-EGFP. Jurnal Penelitian dan Kajian Ilmiah Kesehatan. 5 (2), 120–124.
Unsunnidhal,  L.,  Jannah,  R.,  Haris,  A.,  Supinganto,  A.  &  Kusumawati,  A.  (2021a)  Potential  of Nanoparticles  Chitosan  for  Delivery  pcDNA3.1-SB3-  HBcAg. BIO  Web  of  Conferences.  41 (07003), 1–6.
Unsunnidhal, L., Perdhana, F.F., Utama, Q.D. & Jannah, R. (2023) Identifikasi Kandungan Daging Sapi Menggunakan  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)  Pada  Pedagang  Bakso  Tusuk  Keliling  Di Lingkungan  Kota  Mataram,  Nusa  Tenggara  Barat. Pro  Food.  9  (1),  76–81. doi:10.29303/profood.v9i1.312.
Unsunnidhal, L., Wasito, R., Nugraha Setyawan, E.M., Warsani, Z. & Kusumawati, A. (2021b) Potential of polylactic-co-glycolic acid (PLGA) for delivery Jembrana disease DNA vaccine Model (pEGFP- C1-tat). Journal of Veterinary Science. 22 (6), 1–15. doi:10.4142/jvs.2021.22.e76.
Unsunnidhal, L., Wasito, R., Setyawan, E.M.N. & Kusumawati, A. (2021c) Potential of Nanoparticles Chitosan for Delivery pcDNA3.1-tat. BIO Web of Conferences. 41 (07004), 1–6.