## PENGARUH RISEDRONATE BISPHOSPHONATE TERHADAP ENZIM TRAP (EKSPRESI OSTEOKLAS) DI SEKITAR SUBSTRUKTUR IMPLAN GIGI ENDOSSEOUS
(EFFECT OF RISEDRONATE BISPHOSPHONATE ON ENZYM TRAP (OSTEOCLAST EXPRESSION) SURROUNDINGS SUBSTRUCTURE ENDOSSEOUS DENTAL IMPLANT)
Suparyono Saleh*, Iwan Dwi Prahasto**, Munakhir Mudjosemedi***, Ika Dewi Ana****
*Departemen Prostodonsia **Departemen Farmakologi dan Toksikologi
Fakultas Kedokteran, Universitas Gajah Mada
***Departemen Radiologi Dentomaksilofasial
****Departemen Biomedika Kedokteran Gigi
Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Gadjah Mada Jl. Denta No.1 Sekip Utara Yogyakarta

## Abstract
The success of dental implant insertion is oseointegration namely a direct connection between implant body (substructure) and bone tissue without any intervening soft tissue. Osteoclast plays an important role in bone resorption which interrupts oseointegration process. The purpose of study  was to investigate the effect of risedronate (Ris) as a potential drug for inhibiting of osteoclast proliferation. Thirtysix Wistar rats aged 9-10 weeks, weighed 280-300 grams were divided into 4 groups of 9 each. Each group was divided into 3 subgroups (n= 3). Group I as a control was injected by 0.05 mL 0.9% NaCL solution meanwhile group II,III, and IV were injected by 0.05 mL; 250, 500, 1000 µmol/L concentration Ris in 0.9% NaCL solution sequentially. All of subgroups received injection for 3 days interval in different duration day they were  14,  28  and  56  days.  Statistical  analysis  were  performed  by  using  Kruskal-Wallis  and  U  Mann-Whitney  test  to measure the significance of osteoclas amount between control and treatment group. The result showed that almost all of the groups were significantly different based on the dose (p< 0.05) and  not significantly different of the injection period (p> 0.05).
Key words: risedronate, oseointegration, substructure, proliferation

## Abstrak
Keberhasilan  gigi  tiruan  tanam,  tergantung  pada    proses  oseointegrasi,  yaitu  suatu  hubungan  langsung  antara  bagian implan gigi yang tertanam di dalam tulang rahang (substructure ) dengan jaringan tulang disekitarnya tanpa ada pengaruh dari  jaringan  lunak  yang  lain.  Osteoklas  berperan  penting  dalam  proses  oseointegrasi  karena  sel  tersebut  mempunyai kemampuan  untuk  meresorpsi  tulang.  Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengetahui  pengaruh  sediaan  farmasi Risedronate (Ris) yang mempunyai kemampuan untuk mencegah proliferasi osteoklas. Tiga puluh enam tikus Wistar berumur 9-10 minggu dengan berat antara 280-300 gram dibagi menjadi 4 kelompok (n= 9), setiap kelompok dibagi lagi menjadi 3 subkelompok  (n=  3).  Kelompok  I  sebagai  kontrol  dengan  perlakuan  injeksi  0,05  mL  cairan  0,9%  NaCL  sementara kelompok II, III, dan IV diinjeksi 0,05 mL sediaan Ris dengan konsentrasi 250, 500, dan 1000 µmol/L secara berurutan. Injeksi dilakukan setiap 3 hari sekali dengan lama waktu pemberian injeksi yang berbeda-beda, yaitu 14, 28, dan 56 hari. Analisis  statistik  menggunakan  Uji  Kruskal-Wallis  dan  U  Mann-Whitney.  Hasil  penelitian  menunjukkan  terdapat perbedaan yang bermakna pada kelompok dosis Ris (p< 0,05) dan tidak signifikan pada kelompok hari amatan (p> 0,05).
Kata kunci : risedronate , oseointegrasi, substructure, proliferasi

## PENDAHULUAN
Sekitar  69%  orang  dewasa  telah  kehilangan  se-
tidaknya  satu  gigi  permanen  dan  permasalahan  ini telah  menjadi  perhatian  umat  manusia  di  seluruh dunia sejak beberapa abad yang lalu, tidak terkecuali
di Indonesia. Berbagai upaya telah dilakukan untuk mengatasi  keadaan  tersebut,  salah  satunya  ialah dengan  pemasangan  implan  gigi. 1 Implan  gigi  ke- mudian  menjadi  sangat  populer  dikarenakan  di- ketemukannya konsep oseointegrasi. 2,3 Istilah oeseo- integrasi  pada  ilmu  implan  gigi  ( dental  implan- tology )  dapat  diartikan  sebagai  suatu  proses  per- lekatan  antara  jaringan  tulang  dengan  permukaan bagian  implan  gigi  yang  tertanam  di  dalam  tulang rahang  ( substructure ) . Angka  keberhasilan  insersi implan  gigi  menunjukkan  perkembangan  yang  sig- nifikan.  Data  tentang  keberhasilan  pemasangan implan gigi mencapai 95,4 % setelah 5 tahun insersi dan  92,8  %  setelah  10  tahun  insersi. 4 Kegagalan yang terjadi di antaranya dikarenakan fenomena se- luler  dan  molekuler  pada  proses  oseointegrasi  se- bagian besar masih belum diketahui secara   pasti. 5-7
Kendala  yang  biasanya  timbul  pada  proses  oseo- integrasi  adalah  adanya  perlukaan  tulang  sebagi akibat dari prosedur insersi implan yang diikuti oleh munculnya  sel  osteoklas  pada  sekitar  perlukaan  tu- lang  ditempat  pertemuan  antara  jaringan  tulang dengan substructure. Keadaan  ini  akan  memacu terjadinya  resorpsi  tulang  yang  akan  mengganggu proses  oseointegrasi  dikarenakan  adanya  hambatan regenerasi tulang pada sekitar daerah tersebut. Dalam dunia farmakologi dikenal adanya risedro- nate (Ris) turunan dari bisphosphonate (BPs) suatu sediaan  yang  dapat mengatur  metabolisme  tulang. 8
Ada 13 macam turunan BPs yang sering diperguna- kan dalam kehidupan manusia terutama sebagai pe- ngobatan penyakit tulang.  Dari semua turunan ter- sebut Ris merupakan yang paling baik dikarenakan mempunyai  kemampuan  selektif  dalam  hal  meng- hambat  resorpsi  tulang  pada  rentang  dosis  yang lebar.  Perbedaan  respons  osteoklas  yang  ditimbul- kan oleh Ris tergantung pada metode pemberian dan dosis  Ris  yang  diberikan,  dan  sediaan  ini  telah banyak  dipakai  sebagai  obat  pada  pasien  osteo- porosis  dan  osteoarthritis  baik  dengan  pemberian secara injeksi maupun per oral. 9
Osteoklas merupakan salah satu jenis sel di dalam tulang  yang  mempunyai  kemampuan  untuk  dapat mengekspresikan enzim tartrate resistant acid phos- phatase (TRAP)  yang  merupakan  enzim  metalo- protein  dan  termasuk golongan asam  phospat. TRAP adalah produk bagi osteoklas dan merupakan penanda  secara  biokimia  untuk  mengenali  adanya resorpsi tulang. 10 Sel osteoklas diketahui secara pasti mempunyai  kemampuan  yang  tinggi  dalam  meng- ekspresikan  TRAP. 11 Adanya aktivitas TRAP  yang tinggi  dapat  dipakai  sebagi  petunjuk  bahwa  telah terjadi  absorpsi  tulang.  Peranan  Ris  sebagai  peng- hambat  resorpsi  tulang  dapat  dideteksi  melalui enzim TRAP dengan pengamatan secara histokimia
berdasarkan ekspresi osteoklas. Berkurangnya jum- lah  osteoklas  berarti  adanya  penurunan  produksi enzim  TRAP  dan  ini    merupakan  penanda  adanya penurunan  metabolisme  absorpsi  tulang  yang aktif. 12,13
Teori  yang  mendasari  mekanisme  cara  kerja  Ris terhadap  terjadinya  proses  regenerasi  tulang  dan oseointegrasi adalah sebagi berikut:
1.  Ris dapat mengikat secara kuat terhadap mineral tulang  kemudian  melakukan  penetrasi  ke  dalam osteoklas  dan  menstimulasi  untuk  terjadinya  apop- tosis pada osteoklas tersebut.
2.  Tingkat seluler, secara invitro Ris dapat menaik- kan  biosintesis  kolagen,  pembentukan osteocalcin oleh  sel-sel  tulang  dan proteoglycan oleh  sel-sel kartilago,  mencegah  proliferasi,  adesi  dan  mem- perpendek umur dari osteoklas. 14-15
Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi yang  bermanfaat  mengenai  pengaruh  Ris  terhadap ekspresi  enzim  TRAP  melalui  pengamatan  pe- nurunan  jumlah    osteoklas.  Keadaan  tersebut  dapat dijadikan  pertimbangan  oleh  para  klinisi  yang  ber- kompeten  dalam  ilmu  implan  gigi  untuk  men- dukung  prognosis  yang  lebih  baik  terhadap  insersi implan  gigi  dengan  mewujudkan  terjadinya  proses oseointegrasi  yang  lebih  cepat  dan  lebih  luas,  se- hingga  dapat  segera  dilakukan  pemasangan  protesa gigi  dan  ini  berarti  mempersingkat  waktu  keadaan pasien tanpa gigi ( ompong ).

## BAHAN DAN METODE
Setelah selama 1 minggu  menjalani adaptasi kan- dang, 36 ekor tikus Wistar jantan dengan umur 9-10 minggu dan berat badan rata-rata 280-300gr. dibagi menjadi  4  kelompok  besar  (n=  9)  untuk  perlakuan variabel  dosis  dan  durasi  injeksi.  Kelompok  I sebagai  kelompok  kontrol  dengan  injeksi  0,05ml 0,9% NaCL, pH 7,4 sementara kelompok II, III, dan IV  menerima  perlakuan  injeksi  Ris  sebanyak  pada perlakuan  kontrol  sekitar substructure pada  tempat kedudukan  model  implan  terinsersi  dengan  kosen- trasi 250, 500, dan 1000 µmol/L dalam larutan 0,9% NaCL, pH 7,4 setiap 3 hari sekali selama 14, 28, dan 56  hari.  Seluruh  hewan  coba  dikorbankan  sesuai dengan  kelompok  durasi  pemberian  Ris  dengan metode trans cardial perfusion .
Prosedur  histokimia  dilakukan  untuk  pengamatan ekspresi enzim TRAP dengan menggunakan mikro- skop  cahaya  perbesaran  40  kali  yang  dihubungkan dengan optilab untuk  melakukan  penghitungan  sel osteoklas  dengan  menggunakan  program image raster . Pengamatan subjek penelitian dilakukan ber- dasarkan  potongan  menurut  sumbu  panjang sub- structure menjadi 2 segmen yaitu segmen kanan dan
kiri, setiap segmen dibagi menjadi 2 lapang pandang dengan  demikian  setiap  sampel  mempunyai  4  la- pang pandang.
model implan 2 mm Ø = 1,8 mm Keisei Ika Kikai, Japan Gambar 1. Model  implan;  panjang  2  mm,  diameter  1,8 mm
Gambar 2.  Kedudukan  model  implan  pad epicondylus lateralis femoris tikus Wistar

## HASIL
Hasil  pengamatan  secara  histologi  dengan  meng- gunakan optilab dan  perhitungan  osteoklas  ber- dasarkan  program image  raster untuk  4  lapang pandang  setiap  subjek  penelitian,  menunjukkan rerata  dan  simpangan  baku  ekspresi  osteoklas  ber- dasarkan  konsentrasi  dosis  dan  hari  amatan  (Ta- bel 1).
Tabel  1.  Rerata  dan  simpangan  baku  ekspresi  osteoklas
berdasarkan  kelompok  dosis  Ris  dan  hari  per- lakuan Kelompok hari Larutan injeksi 0,9% NaCL (kontrol) Dosis Ris 250 μmol/L (dosis A) 500 μmol/L (dosis B) 1000 μmol/L (dosis C) Hari ke-14  0,666 ± 0,408 1,083 ± 0,584 0,416 ± 0.491 0,333 ± 0.408 Hari ke-14  1,583 ± 1,068 0,666 ± 0,408 0,333 ± 0,408 0,250 ± 0,418 Hari ke-14  0,916 ± 0,735 0,750 ± 0.689 0,583 ± 0,584 0,166 ± 0,258
Gambar 3.  Potongan  menurut  sumbu  panjang  subyek penelitian.  Osteoklas  tampak  berupa  sel  ben- tuk tidak beraturan dan berwarna merah (tanda panah)
Pengamatan  secara  histokimia  diperoleh  hasil  se- bagai  berikut;  untuk  kelompok  I  (kontrol)  masih banyak  osteoklas  yang  tersebar  baik  pada  daerah tengah  penulangan  maupun  daerah  pertemuan antara substructure dengan  tulang  disekitarnya (Gambar.4a). Kelompok II sebaran osteoklas mulai berkurang  pada  daerah  tengah  penulangan  tetapi masih  banyak  terlihat  daerah-daerah  yang  kosong (belum  ada  penulangan)  pada  daerah  tersebut (Gambar.4b).  Kelompok  perlakuan  III,  proses  pe- nulangan  mulai  terjadi  dan  hanya  terlihat  beberapa osteoklas  pada  tempat  pertemuan  antara sub- structure dengan  tulang  disekitarnya  (Gambar.4c). Kelompok  IV  menunjukkan  ada  perbedaan  yang sangat  signifikan  dengan  kelompok-kelompok  se- belumnya. Ekspresi osteoklas mulai jauh berkurang bahkan  sampai  tidak  terdeteksi  dan  hampir  sudah terjadi penulangan yang sempurna baik pada daerah pertemuan  antara substructure dengan  tulang  di- sekitarnya  maupun  pada  daerah  penulangan  bagian tengah (Gambar.4d).
Gambar 4. Osteoklas adalah sel-sel yang  berwarna merah (tanda  a=  14,  28,  dan  56  hari  injeksi  larutan 0,05mL  (kontrol) , b=  14,  28,  dan  56  hari injeksi 0,05mL dosis A , c= 14, 28, dan 56 hari injeksi  0,05mL    dosis  B , d=  14,  28,  dan  56 hari injeksi 0,05mL  dosisC
Hasil  uji  Krukal-Wallis  menunjukkan  ada  per- bedaan  yang  signifikan  dengan  nilai  p=  0,022  (p< 0,05),  membuktikan  bahwa  konsentrasi  pemberian bisphosphonate jenis  Ris berpengaruh terhadap pe-
A B
C D
nurunan  proliferasi  osteoklas  pada  daerah  pertemu- an  antara  tulang  dengan substructure berdasarkan dosis  Ris  yang  diberikan.  Sementara  berdasarkan hari amatan diperoleh nilai p= 0,813 (p> 0,05) ber- arti  tdak  terdapat  perbedaan  yang  bermakna  antar kelompok  hari  amatan  terhadap  penurunan  proli- ferasi  osteoklas  sehubungan  dengan  perlakuan  in- jeksi Ris.
Hasil uji U Mann-Whithney diperoleh hasil bahwa seluruh  masing-masing  kelompok  perlakuan  (kon- trol  dan  dosis  Ris)  terdapat  perbedaan  yang  ber- makna  (p<  0,05)  terhadap  penurunan  proliferasi osteoklas  kecuali  kelompok  kontrol  terhadap  dosis A (p> 0,05). (Tabel 2)
Tabel 2.  Hasil  uji  U  Mann-Whithney  ekspresi  mosteo-
klas berdasarkan dosis Ris Dosis obat  Kontrol Dosis A Dosis B Dosis C Kontrol 0,504 0,019* 0,001* Dosis A 0,038* 0,001* Dosis B 0,017* Dosis C *bermakna ( p-value < 0,05)
Gambar 5. Ekspresi  osteoklas  berdasarkan  konsentarsi dosis obat dan hasil pemeriksaan
Gambar 6. Ekspresi  osteoklas  berdasarkan  hari  amatan dan hasil pemeriksaan

## PEMBAHASAN
Hasil  uji  U  Mann-Whitney  (Tabel  2)  menunjuk- kan  bahwa  terdapat  perbedaan  yang  bermakna antara  kelompok  kontrol  dan  kelompok  perlakuan
terhadap  penurunan  ekspresi  osteoklas  yang  di- pengaruhi oleh besarnya konsentrasi dosis  yang  di- berikan  (Gambar.5).  Penurunan  jumlah  osteoklas pada  kelompok  perlakuan  terhadap  kelompok  kon- trol  diakibatkan  oleh  karena  adanya  aktifitas  Ris yang  berfungsi  untuk  mendegradasi  osteoklas  pada daerah  perlukaan  tulang  sekitar substructure . Rise- dronate adalah  turunan  dari  BPs  dan  merupakan  1 diantara  13  turunan  BPs  yang  paling  berpotensi dalam  menghambat  resorpsi  tulang  ( potent blocker of bone resorption ) . Ris  secara  efektif  dapat  mem- perlambat  proses  kerusakan  tulang  dengan  cara menghambat resorpsi tulang oleh osteoklas.
Mekanisme  kerja  Ris  pada  tingkat  seluler,  secara invitro  dapat  menaikan  biosintesis  kolagen,  pem- bentukan osteocalcin oleh sel-sel tulang dan proteo- glycan oleh  sel-sel  kartilago.  Selain  itu  juga  men- cegah  proliferasi  dan  adesi  osteoklas,  memper- pendek  umur  osteoklas  dan  menghambat  aktivitas osteoklas. 9,13
Penurunan  ekspresi  osteoklas  dimulai  pada  dosis 500 dan 1000 µmol/L sementara dosisi 250 µmol/L belum mampu umtuk menurunkan proliferasi osteo- klas.  Keadaan  ini  sesuai  dengan  pernyataan  yang mengatakan  bahwa  perbedaan  respons  osteoklas terhadap  hambatan  proliferasinya  oleh  karena  Ris tergantung  pada  metode  pemberian  dan  dosis  yang diberikan. 9,10
Berdasarkan  hasil  uji  Kruskal-Wallis  diperoleh adanya  perbedaan  ekspresi  osteoklas  yang  tidak signifikan  antara  kelompok  hari  amatan  terhadap proliferasi osteoklas. Keadaan ini terjadi karena Ris akan  melakukan  tahapan  biosintesis  pada  protein- protein  yang bertanggung jawab terhadap keutuhan sitoskeletal sel osteoklas hanya berdasarkan konsen- trasi  dosis  yang  diberikan  tidak  dan  berdasarkan durasi pemberiannya. Berarti pada setiap kelompok kontrol  maupun kelompok dosis Ris bekerja sesuai konsentrasinya  dan  tidak  terpengaruhn  oleh  durasi hari  pemberian  Ris  (Gambar.6).  Ekspresi  osteoklas berdasarkan konsentrasi dosis perkelompok perlaku- an  ini  dapat  digunakan  sebagai  indikator  bahwa sedang terjadi penurunan volume enzim TRAP pada daerah  sekitar substructure (Tabel  1).  Hal  ini  ter- bukti setelah dilakukan uji  U Mann-Whitney untuk melihat  signifikansi  perbedaan  antara  masing-ma- sing  kelompok  dosis  Ris  menunjukkan  bahwa penurunan  proliferasi  osteoklas  berdasarkan  kon- sentrasi dosis yang diberikan (p< 0,05).  Sebagai ke- simpulan, risedronate (Ris)  dapat  menurunkan produksi enzim tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) berdasarkan ekspresi osteoklas pada daerah sekitar substructure hanya  berdasarkan  dosis  yang diberikan.  Akibat  penurunan  enzim  ini  proliferasi osteoklas  menurun  yang  akan  berpengaruh  terjadi-
nya  regenerasi  tulang  lebih  cepat  dan  lebih  luas sehingga  fenomena  tersebut  akan  mendukung  per- cepatan  dan  perluasan  proses  oseointegrasi  dengan demikian  pemasangan  bangunan  protesa  gigi  pada implant  abutment / superstruture dapat  segera  di- lakukan.

## Daftar Pustaka
1. Anonymous.  Memeriksa  laporan  pasar  seluruh dunia  nanoteknologi  implan  gigi.  http://www. azonano.com/news.aspx?newsID=11402&lang=id (1 Januari 2011).
2. Dimitriou  R,  Babis  GC.  Biomaterial  osseo- integration  Enhancement  with  biophysical  stimuli- tion. J Musculoskelet Neuronal Interact 2007; 7(3): 253-65.
3. Ustun Y, Erdogan O, Kurkcu M, Akova T, Damlar I.  Effect  of  Low-Intensity  Pulsed  U  trasound  on Dental  Implant  Osseointegration:  A  Preliminary Report. European J Dentistry 2008; 2: 254-62.
4. Ching Yu T. Using mini dental implant to improve the  stability  of  an  existing  mandibular  complete denture  in  patient  with  severe  ridge  resorption.  J Prosteth Dent 2012; 1(2): 48-52.
5. Lang  NP,  Berglundh  T,  Lisa  J,  Mayfield  H, Pjetursson  BE,  Solvi  GE,  et  al.  Consensus  state- ments  and  recommened  clinical  procedures  re- garding  implant  survival  and  complications.  Proc- cedings of the third ITI concensus conference 2004.
6. Xu B, Zhang J, Brewer E, Tul Q, Yu L, Tang J, et al.  Osterix  Enhances  BMSC-asociated  Osseo- integration  of  Implants.  J  Dent  Res  2009;  88(11): 1003-7.
7. Omar  O.  Mechanism  of  osseointegration:  experi- mental   studies   on   erlay   celluler   and  molecular
events  in  vivo.  University  dissertation  from University of Gonthenburg 2010.
8. Masud  T,  McClung  M,  Geusens  P.  Reducing  hip fracture risk eith risedronate in eldelery women with established  osteoporosis.  Clinical  Interventions  in Aging 2009; 4: 445-49.
9. Iwamoto  J,  Takeda  T,  Sato  Y,  Matsumoto  H. Effects  of  residronate  on  osteoarthritis  of  the knee. Yonsei Med J  2010; 51(2): 164-70.
10. Siris  ES,  Simon  JA,  Barton  IP,  McClung  MR, Grauer, A. Effects of residronate on fracture risk in postmenopausal  women  with  osteopenia.  Osteo- poros Int 2008; 19: 681-86.
11. Perez-Amodio  S,  Vogels  IMC,  Schoenmaker  T, Jansen  DC,  Alatalo  SL,  Halleen  JM,  et  al.  Endo- genous  expression  and  endocytosis  of  tartrate- resitant acid phosphatase (TRAP) by osteoblast-like. Bone 2005; 36(6): 1065-77.
12. Honig A, Rieger L, Kaap M, Krockenberger M, Eck M,  Dietl  J,  et  al.  Increased  tartrate-resistant  acid phosphatase  (TRAP)  expression  in maligna  breast, ovarian  and  melanoma  tissue:  an  investigational study. BMC Cancer 2006; 199.
13. Russell  RG,  Xia  Z,  Dunford  JE,  Oppermann  U, Kwaasi  A,  Hulley  PA,  et  al.  Bisphosphonate:  an update  on  mechanisms  of  action  and  how  these relate to clinical afficacy. Ann NY Acad Sci 2007; 1117: 209-57.
14. Woo SB, Hellstein JW, Kalmar JR. Bisphosphonate and osteonecrosis of the jaw. Ann Intern Med 2006; 16(10): 753-61.
15. Maria TV, Sandro G, Luca D, Mikro Z, Francesco B,  Stefania  S,  et  al.  The  effect  of  risedronate  on osteogenic lineage is mediated by cyclooxygenase-2 gene upregulation. J Athritis Res Ther. 12(4): 1-14.