## SINTESIS O-KARBOKSIMETIL KITOSAN PADA BERBAGAI KONSENTRASI NaOH DAN SUHU REAKSI SERTA APLIKASINYA SEBAGAI ANTIBAKTERI
[Synthesis of O-Carboxymethyl Chitosan in Various of NaOH Concentrations and The Reaction Temperature and Applied as Antibacterial]
Jaya Hardi 1* , Nurakhirawati 1 , Ahmad Ridhay 1 , Musdalifah 1
1) Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Tadulako Jl. Soekarno Hatta, Kampus Bumi Tadulako Tondo Palu, Telp. 0451- 422611
Diterima  14 Desember 2016, Disetujui 28 Januari 2017

## ABSTRACT
The  research  about  the  influence  of  NaOH  concentrations  and  reaction  temperature  to  O- Carboxymethyl  Chitosan  (O-CMC)  synthesis  and  it  is  antibacterial  application  was  done.  This research intent on detect NaOH concentration and reaction temperature that resulting of O-CMC with highest  of  yield,  solubility,  and  substitution  degrees,  and  also  to  find  out  FTIR  spectrum  and antibacterial activity of O-CMC. The produce of O-CMC was done by using a Completely Randomized Design (CRD) with the variation of NaOH concentration of 20%, 30%, 40%, 50%, and 60%, and also reaction temperature of 20, 30, and 40oC. The result was showed that on the NaOH concentration of 60% (w/v) and temperature of 30oC was resulted highest of yield, solubility, and substitution degrees of 41.5%, 31 g/L, and 0.67, respectively. FTIR spectrum was showed that bending vibration of primary amine  (-NH2)  give  two  bands  for  O-CMC.  The  broadest  inhibition  area  of  O-CMC  (1.43  cm)  was showed on Salmonella sp .
Keywords: chitosan, O-CMC, substitution degree, antibacterial

## ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian tentang pengaruh konsentrasi NaOH dan suhu terhadap proses sintesis O- karboksimetil  kitosan  (O-KMK)  dan  aplikasinya  sebagai  antibakteri.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui konsentrasi NaOH dan suhu reaksi yang dapat menghasilkan O-KMK dengan rendemen, kelarutan,  dan  derajat  substitusi  tertinggi,  dan  pola  spektrum  FTIR  O-KMK,  serta  untuk  mengetahui daya  hambat  antibakteri  dari  O-KMK  yang  dihasilkan.  Pembuatan  O-KMK  dilakukan  dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan variasi konsentrasi NaOH 20, 30, 40, 50, dan 60% dan suhu reaksi 20, 30 dan 40 o C. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada konsentrasi NaOH 60%  (b/v)  dan  suhu  30 o C  menghasilkan  rendemen,  kelarutan,  dan  DS  tertinggi,  masing  41,5%;    31 g/L;  0,67.  Spektrum  FTIR  menunjukkan  terbentuknya  sepasang  pita  serapan  vibrasi  tekuk –NH2 primer atau terbentuk O-KMK. O-KMK hasil sintesis menghasilkan daya hambat tertinggi pada bakteri Salmonella sp. (1,43 cm).
Kata kunci : kitosan, O-KMK, derajat subtitusi, antibakteri
*) Coresponding Author : jr.hardi0803@gmail.com (hp/fax: +628114538600)

## LATAR BELAKANG
Kitosan  atau  poli-(2-amino-deoksi- β- (1-4)-D-glukopiranosa  merupakan  turunan dari  kitin  melalui  proses  deasetilasi dengan  menggunakan  basa  kuat  pada temperatur  yang  cukup  tinggi  (Kurita, 2006).  Kitosan  memiliki  fungsi  yang banyak,  akan  tetapi  kelarutan  kitosan yang rendah dalam air membatasi pemanfaatannya. Oleh karena itu, banyak dilakukan modifikasi struktur kimia kitosan untuk  meningkatkan  kelarutannya.  Salah satu modifikasi tersebut adalah karboksimetil  kitosan.  Chen et  al., (2003) memodifikasi  kitosan  dengan  asam  kloro asetat pada suhu rendah untuk mendapat produk  yang  larut  air  berupa  senyawa  O- karboksimetil kitosan.
Karboksimetil kitosan (KMK) merupakan  produk  hasil  sintesis  yang diperoleh  dengan  cara  substitusi  gugus karboksimetil  pada  rantai  glukosamin pada  struktur  kitosan.  Senyawa  ini memiliki kelarutan yang lebih tinggi dalam air  daripada  kitosan  akibat  pertambahan muatan ionik. Penelitian Patale & Patravale  (2011)  menunjukkan  selain memperbaiki kelarutan kitosan, karboksilasi  juga  mampu  meningkatkan sifat  fungsional  kitosan.  Karboksimetil kitosan  terbagi  dalam  4  jenis  senyawa yaitu N-, O-, N-O, dan N-N-KMK.
Pembuatan  karboksimetil  kitosan dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya  rasio  antara  kitosan  terhadap asam monokloroasetat, kemurnian kitosan,  suhu  reaksi,  dan  konsentarsi
NaOH  pada  proses  alkalisasi  (Kurita, 2006).  Jumlah  alkalis  kitosan  yang diperoleh (proses alkalinasi) juga berpengaruh  dalam  pembentukan  KMK. Banyaknya  jumlah  alkali  (NaOH)  yang ditambahkan  pada  kitosan  dalam  proses alkalinasi  mempengaruhi  jumlah  ion  Na + yang  diikat  oleh  kitosan.  Basmal  dkk., (2005) melaporkan bahwa alkalinasi menggunakan  NaOH  50%  pada  berbagai perlakuan konsentrasi
asam monokloroasetat menghasilkan O- karboksimetil  kitosan    dengan  tingkat kelarutan  dalam  air  sebesar  9,85  ml  /1  g KMK,  sedangkan  penelitian  berikutnya oleh  Basmal  dkk.,  (2007)  menggunakan NaOH 5% menghasilkan NO-karboksimetil kitosan  (NO-KMK)  dengan  jumlah  kitosan yang  terlarut  dalam  air  sebesar  5,37%. Sementar  itu,  Saputra  (2014)  melaporkan penggunaan NaOH 10M dapat menghasilkan  KMK  dengan  rendemen yang tinggi pada sekitar pH 4.
O-KMK  biasanya  dapat  disintesis pada  rasio  kitosan  terhadap  asam  (1:4) dan pada suhu yang rendah, yaitu 0-30 o C. Sementara  suhu  30 o C  hingga  60 o C  dapat menghasilkan campuran N-O-KMK dan O- KMK.  Sementara  itu,  konsentrasi  kitosan yang  sering  digunakan  adalah  4  -  20  % (b/v) dalam 40 – 50% (b/v) larutan NaOH. Pada  proses  eterifikasi, konsentrasi  asam monokloroasetat  yang  biasa  digunakan adalah 1:1, 1:4, dan 1:6 dalam isopropanol/etanol (b/v). Sementara itu, O- KMK  memiliki  sifat  antibakteri  yang  lebih tinggi  daripada  kitosan  dan  N-O-KMK,
sehingga  O-KMK  memiliki  potensi  yang sangat  besar  pada  peningkatan  nilai ekonomis  turunan  kitosan  (Mourya et  al., 2010).
Belum  dilakukannya  kajian  tentang penggunaan  berbagai  variasi  NaOH  yang selanjutnya  dihubungkan  dengan  suhu reaksi  terhadap  mutu  O-KMK  hasil sintesis, sehingga perlu adanya penelitian lanjut  ke  arah  tersebut  dan  selanjutnya digunakan untuk mengkaji aktivitas antibakteri dari senyawa O-KMK.

## METODE PENELITIAN Bahan dan Peralatan
Alat yang diperlukan dalam penelitian  ini  adalah  oven,  desikator, magnetik  stirrer,  neraca  analitik,  blender, homogenizer , water  bath ,  sentrifugasi, laminar  flow ,  pH  meter,  Spektrofotometer Fourier  Transform  Infra  Red (FTIR)  ATR alpha  Bruker,  dan  alat-alat  gelas  yang umum di laboratorium kimia.
Bahan  dalam  penelitian  ini  adalah kitosan,  NaOH,  natrium  monokloroasetat, asam  asetat  glasial,  methanol  70%, Isopropil  alkohol,  bakteri Staphylococcus aureus,  E.  coly, dan Salmonela  sp ., aquades,  indikator  metil  merah,  HCl  0,13 M, NaCl fisiologis, media NA, kapas.

## Prosedur Penelitian
Penelitian dilakukan dengan menggunakan  rancangan  acak  lengkap dengan dua faktor yaitu konsentrasi NaOH (20,  30,  40,  50,  dan  60%)  dan  suhu sintesis (20, 30, dan 40 o C).

## Sintesis O-Karboksimetil Kitosan
Senyawa O-KMK disintesis dengan menggunakan  metode  Chen et  al. (2003) dengan  beberapa  modifikasi.  2  gram kitosan  ditambah  50  mL  isopropil  alkohol dan dikocok menggunakan magnetik stirer pada suhu ruang selama 2 jam. Suspensi yang  terbentuk  selanjutnya  ditambahkan 40  mL  NaOH  dengan konsentrasi    sesuai perlakuan.  Campuran  diaduk  dengan magnetik  stirrer  selama  2  jam  pada temperatur ruang, kemudian 8 gram asam monokloro asetat di dalam 24 mL isopropil alkohol  ditambahkan  tetes  demi  tetes kedalam campuran. Campuran selanjutnya  dihomogenizer  selama  2  jam pada  suhu  sesuai  perlakuan.  Hasil homogenizer kemudian dinetralkan dengan  asam  asetat  glasial,  setelah  itu campuran hasil penetralan disaring.
Endapan  yang  terbentuk  dicuci  dengan metanol  70% dengan perbandingan 1:15, endapan kembali disaring dan selanjutnya dikeringkan  dalam  oven  suhu  60 o C semalaman.  Padatan  kering  selanjutnya digiling  untuk  mendapatkan  serbuk  O- KMK. Serbuk O-KMK ditentukan rendemen, kelarutan, derajat subsitusi dan pola spektrum FTIR. O-KMK dengan hasil terbaik selanjutnya diuji aktivitas anibakterinya.
Uji  Aktivtas  Antibakteri  (Nurainy et  al .,
2008)
Pengujian ini menggunakan metode sumur difusi dengan cara suspensi bakteri uji  yang  telah  disiapkan  dioleskan  merata pada  media  Nutrien  Agar,  selanjutnya
dibuat  empat  sumur/  lubang.  Dua  sumur ditetesi  pelarut  sebagai  kontrol  negatif, sedangkan  dua  sumur  lainnya  ditetesi masing-masing dengan O-KMK dan kitosan dengan konsentrasi 5%.  Media uji selanjutnya  diinkubasi  selama  24  jam pada  suhu  37 o C.  Area  yang  jernih  pada disekitar sumur diukur diameternya sebagai area zona hambatan bakteri.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
O-KMK  Hasil  Sintesis  Pada  Berbagai Konsentrasi NaOH
Hasil  sintesis  menunjukkan  bahwa rendemen  O-KMK  meningkat  seiring dengan  peningkatan  konsentrasi  NaOH (Gambar  1).  Peningkatan  rendemen  O- KMK disebabkan karena pada penggunaan konsentrasi  NaOH  yang  semakin  tinggi, maka  semakin  banyak  pula  kitosan  alkali yang  terbentuk  sehingga  meningkatkan kemampuan kitosan untuk berikatan dengan gugus karboksimetil. Rendemen O- KMK tertinggi diperoleh penggunaan NaOH 60%, yaitu 43,75%.
Kualitas  O-KMK  yang  dihasilkan dapat  ditinjau  pada  kelarutannya  dalam air. Adanya substitusi gugus karboksimetil dari  asam  monokloroasetat  pada  kitosan maka  terdapat  gugus  polar  tambahan dalam  molekul  yang  menyebabkan  O- KMK  dapat  larut  dalam  air.  Analisis kelarutan  untuk  pengaruh  konsentrasi NaOH  menunjukkan  bahwa  kelarutan karboksimetil  kitosan  berkisar  antara  14 hingga  30,5  g/L  (Gambar  2).  Seperti halnya  rendemen,  kelarutan  O-KMK  juga meningkat  seiring  dengan  meningkatnya
konsentrasi NaOH. Hal ini tidak lepas dari semakin  banyaknya  NaOH  tentu  akan mengaktifkan gugus –OH semakin banyak,  sehingga  kemampuan  untuk berikatan dengan
karbokation ( + CH 2 COOCl)  akan  tinggi.  Banyaknya gugus CH 2 COO - yang terikat pada kitosan tentunya  akan  meningkatkan  kepolaran dan meningkatkan pula kelarutannya.
Derajat subtitusi merupakan parameter  selanjutnya  yang  harus  dikaji pada  sintesis  O-KMK.  Nilai  derajat substitusi    tertinggi  pada  O-KMK  hasil sintesis diperoleh pada penggunaan NaOH  60%,  yaitu  0,66  (Gambar  3). Penggunaan  NaOH  dengan  konsentrasi yang  semakin  tinggi  akan  meningkatkan jumlah  ion  Na + yang  selanjutnya  bereaksi dengan kitosan membentuk kitosan alkali. Oleh  karena  itu,  pada  saat  penambahan natrium  monokloroasetat  akan  terjadi pertukaran ion, yakni ion Na + yang mudah larut dalam air akan terikat dengan ion Cl - dari  monokloroasetat  dan  membentuk garam NaCl. Kitosan yang telah melepaskan  ion  Na + akan  bersifat  reaktif terhadap gugus karboksil dari monokloroasetat  sehingga  membentuk KMK (Rahmawati dan Iskandar, 2014).
Hasil  analisis  spektrum  FTIR  senya O-KMK  (Gambar  4)  menunjukkan  bahwa pada  bilangan  gelombang  sekitar  1653 cm -1 dan  1561  cm -1 diasumsikan  sebagai pasangan  serapan  vibrasi  tekuk  untuk gugus  N-H  primer  sebagai  ciri  bahwa subtitusi  sebagian  besar  terjadi  pada gugus –OH.
Gambar 1.  Rendemen O-KMK pada berbagai konsentrasi NaOH
Gambar 2.  Kelarutan  O-KMK  pada  berbagai konsentrasi NaOH
Gambar 3.  DS O-KMK pada berbagai
konsentrasi NaOH
Gambar 4.  Hasil analisis FTIR pada penggunaan NaOH 60%
O-KMK  Hasil  Sintesis  pada  Berbagai Suhu Sintesis.
Perlakuan  suhu  terhadap  rendemen O-KMK  yang  dihasilkan  menunjukkan peningkatan  hingga  rendemen  tertinggi 44,9% pada suhu 40 o C (Gambar 5). Akan tetapi,  berdasarkan  uji  statistik  diperoleh bahwa  rendemen  pada  suhu  30 o C  dan 40 o C memiliki perbedaan yang tidak nyata atau  dengan  kata  lain  penggunaan  suhu 30 o C  lebih  efisien.  Peningkatan  jumlah rendemen disebabkan oleh semakin banyaknya  karbo  kation  yang  terbentuk dari  natrium  monokloro  asetat  pada  saat suhu meningkat. Dengan demikian, reaksi eterifikasi  semakin  berjalan  efektif  atau substitusi  gugus  -CH 2 COO - semakin banyak.
Penggunaa suhu sintesis yang tinggi pada  reaksi  eterifikasi  cenderung  tidak mempengaruhi kelarutan O-KMK (Gambar 6).  Sintesis  O-KMK  pada  suhu  30 o C  dan 40 o C  menghasilkan  kelarutan  yang  paling tinggi, yaitu 31 g/L. Akan tetapi penggunaan  suhu  di  atas  30 o C  tidak dianjurkan  pada  sintesis  O-KMK,  karena subtitusi  dapat  terjadi  pada  gugus  amina kitosan  (Mourya et.al. ,  2010).  Rahmawati dan Iskandar (2014) melaporkan kelarutan KMK pada suhu 60 o C adalah 27,7 g/L.
Derajat  substitusi  yang  diperoleh pada perlakuan suhu berkisar antara 0,48 hingga  0,7  dengan  nilai  tertinggi  pada perlakuan  suhu  40 o C  (Gambar  7),  akan tetapi secara statistik (uji ANOVA) berbeda  tidak  nyata  dengan  suhu  30 o C (0,67). Mouriya et al ., (2010)
18.35 21.4 25.55 36.55 43.75 0 10 20 30 40 50 20 30 40 50 60 R e n d e m e n Konsentrasi NaOH (%) 14 18.5 27 28.5 30.5 0 10 20 30 40 20 30 40 50 60 K e lar u tan ( g/ L) Konsentrasi NaOH (%) 0.36 0.47 0.54 0.58 0.66 0 0.2 0.4 0.6 0.8 20 30 40 50 60 D e rajat Su b sti tu si Konsentrasi NaOH (%)

## mengemukakan  bahwa  KMK  dengan  DS
±0,82  umumnya  dalam  bentuk  O-KMK yang tersubtitusi pada posisi C6, sedangkan  DS  ±0,65  membentuk  O-KMK yang  tersubtitusi  pada  posisi  C3  dan  C6,
serta untuk DS ±0,5 umumnya membentuk  N-KMK  atau  subtitusi  terjadi pada  posisi  amina.  Berdasarkan  data yang  diperoleh,  maka  penggunaan  suhu 30 o C  dan  40 o C    diasumsikan  bahwa menghasilkan  O-KMK  yang  tersubtitusi pada posisi C3 dan C6.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa spektrum FTIR karboksimetil kitosan yang disintesis dengan perlakuan suhu 20-40 o C menunjukkan terbentuknya gugus karboksimetil pada senyawa kitosan (Gambar  8).  Terlihat  bahwa  vibrasi  ulur gugus  -OH  untuk  terserap  pada  bilangan gelombang  3410  cm -1 .  Pada  bilangan gelombang  2977  cm -1 dan  2938  cm -1
merupakan  serapan  gugus  fungsi  -C-H. Serapan  pada  1649  cm -1 dan  1569  cm -1
diasumsikan  sebagai  vibrasi  tekuk  untuk gugus  -N-H  primer.  Mourya et.al. ,  (2010) melaporkan  bahwa  vibrasi  tekuk  gugus NH 3+ berada  pada  bilangan  gelombang 1624 dan 1506 cm -1 .
Gambar 5.  Rendemen O-KMK pada berbagai suhu
Gambar 6.  Kelarutan  O-KMK  pada  berbagai suhu
Gambar 7.  Derajat  substitusi  pada  berbagai suhu
Gambar 8.  Hasil  analisis  FTIR  pada  suhu 30 o C

## Aktivitas Antibakteri O-KMK
Pengujian daya hambat senyawa O- KMK  hasil  sintesis  terpilih  dilakukan terhadap  bakteri Staphylococus  aureus (bakteri  Gram  positif) ,  Escherichia  coli (bakteri Gram negatif) dan Salmonella sp.
(bakteri  Gram  negatif).  Pengamatan  zona hambat  terhadap Staphylococcus  aureus menunjukkan  diameter  zona  hambat  dari
36.2 41.5 44.9 0 10 20 30 40 50 20 30 40 R e n d e m e n Suhu ( o C)
28 31 31 0 5 10 15 20 25 30 35 20 30 40 K e lar u tan ( g/ L) Suhu ( o C) 0.48 0.67 0.7 0 0.2 0.4 0.6 0.8 20 30 40 D e rajat Su b sti tu si Suhu ( o C)
kitosan  sebagai  pembanding  diperoleh 0,27  cm  hampir  sama  dengan  O-KMK hasil  sintesis  dengan  zona  hambat  0,24 cm.  Pada  bakteri Escherichia  coli ,  zona hambat O-KMK yaitu 0,27 cm, sedangkan pada  kitosan  tidak  terdapat  zona  hambat. Zona  hambat bakteri Salmonella sp yang paling besar juga terdapat pada penggunaan  O-KMK,  yaitu  1,43  cm  dan pada  kitosan  hanya  0,40  cm.  Data tersebut  cukup  membuktikan  bahwa  O- KMK  lebih  efektif  sebagai  antibakteri dibandingkan dengan kitosan tanpa modifikasi  khususnya  pada  bakteri  Gram negatif,  yaitu Escherichia  coli dan
Salmonella sp.
Sifat  antibakteri  dari  senyawa  O- KMK terjadi karena pada O-KMK subtitusi hanya terjadi pada –OH, sedangkan pada –NH 2 tidak terjadi perubahan. Oleh karena itu, gugus –COOH akan mengalami reaksi inter-  ataupun  intramolekular  dengan gugus –NH 2 tadi  dan menghasilkan gugus –NH 3+ yang  lebih  banyak  dibandingkan pada  kitosan.  Gugus  inilah  yang  nantinya sangat efektif sebagai antibakteri (Mourya et al., 2010).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  maka  dapat disimpulkan bahwa penggunaan konsentrasi  NaOH  dan  suhu  sintesis terbaik  didapatkan  pada  konsentrasi  60% dan  suhu  30 o C  dengan  rendemen  41,5%, kelarutan  31  g/L,  dan  DS  0,67.  O-KMK menghasilkan bilangan gelombang sekitar 1650 cm -1 dan 1560 cm -1 sebagai serapan
vibrasi  tekuk  untuk  gugus  N-H  primer.  O- KMK  memiliki  daya  hambat  yang  tinggi pada  bakteri Salmonella  sp .  dengan diameter daya hambat 1,43 cm.
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh maka  perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut tentang pengaruh derajat deasetilasi kitosan terhadap sintesis O-KMK.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terimakasih dihaturkan kepada  jajaran  pimpinan  Faklutas  MIPA Universitas Tadulako yang telah memberikan Insentif Penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Basmal,  J.,  Prasetyo,  A.,  dan  Fawzya, Y.N.,  2005,  Pengaruh  Konsentrasi Asam  Monokloroasetat  dalam  proses
Karboksimetil Kitosan terhadap Karboksimetil Kitosan yang dihasilkan. J. Penel. Perik, Indonesia . 11(8): 47-58.
Basmal.  J.,  Prasetyo,  A.,  dan  Farida,  Y. 2007. Pengaruh Suhu Eterifikasi pada Pembuatan  Karboksimetil  Kitosan.
Jurnal  Pascapanen  dan  Bioteknologi Kelautan  dan  Per-ikanan .  2(2):  99- 106.
Chen,  X.G.,  and  Park,  H.J.  2003.
Chemical Characteristic of O- Carboxymethyl  Chitosan  Related  to the Preparation Conditions.
Carbohydrate Polymer . 53 : 355-359.
Kurita,  K.  2006.  Chitin  and  Chitosan: Functional  Biopolymers  from  Marine Crustaceans  (Mini  Review). Marine Biotechnology . 8:203 –226.
Mourya,  V.K.,  Inandar,  N.N.,  Tiwari,  A.
2010. Carboxymethyl Chitosan and Its Aplicasions.  [Review]. Adv  Mat.  Left . 1 (1):11-33.
Nurainy  F,  Rizal  S,  Yudiantoro.  2008.
Pengaruh Konsentrasi Kitosan

## Terhadap  Aktivitas  Antibakteri  dengan
Metode  Difusi  Agar  (Sumur). Jurnal Teknologi  Industri  dan  Hasil  Pertanian . 13(2): 117-125.
Patale,  R.L.  &  V.B.  Patravale.  2011.  O,N- carboxymethyl chitosan –zinc complex:  A  novel  chitosan  complex with  enhanced  antimicrobial  activity.
Carbohydrate Polymers . 85: 105 –110. Rahmawati H., Iskandar D. 2014. Sintesis Karboksimetil Kitosan Terhadap Pengaruh Konsentrasi Natrium Hidroksia  dan  Rasio  Kitosan  Dengan Asam Monokloro Asetat. Jurnal Teknologi  Technoscientia. 6(2):  145- 155. Saputra MJA. 2014. Karakterisasi Carboxymethil Chitosan dengan Variasi  Konsentrasi  NaOH.  [ Skripsi] . Bogor: Departemen THP IPB.