## KARAKTERISASI KITINASE ISOLAT BAKTERI RHIZOSFIR ASAL CIANJUR DAN AKTIVITASNYA TERHADAP PATOGEN Colletotrichum sp.
Yadi Suryadi 1) , Dwiningsih Susilowati 1) , I Made Samudra 1) , Mustika Permatasari 2) ,  dan Laksmi Ambarsari 2)
1 Departemen Biokimia dan Mikrobiologi, BB Biogen Bogor Jl. Tentara Pelajar 3 A Bogor,16111 email: yshid@yahoo.co.uk
2 Departemen Biokimia FMIPA IPB, Bogor, 16116 Jl Agatis Bogor

## CHARACTERIZATION OF CIANJUR RHIZOSFIR BACTERIA
ISOLATE AND ITS ACTIVITIES ON Colletotrichum sp. PATHOGEN

## ABSTRACT
Chitinase  is  capable  of  hydrolyzing  chitin  and  it  is  potential  used  as  biocontrol agent. The purpose of this study is to purify and characterize chitinolytic activity of  the  selected  bacteria,  and  to  determine  the  inhibitory  ability  against Colletotrichum sp.  The  chitinase  activity  was  determined  by  Spindler  method, whilst  protein  concentration  by  Bradford  method.  The  chitinase  production  of rhizobacteria isolate (C5C isolate) showed the highest specific enzyme activity of 0.0489  U/mg  using  70%  NH 4 SO 4 partial  purification,  and  increase  the  enzyme purity of 13.97 times compared with crude extracts. Chitinolytic characterization of C5C isolate showed that the enzyme is active at optimal temperature of 55 °C, pH 7, incubation time of 120 min, and had K m of 1.300 x 10 3 mg/L and V maks of 0.0294  mg  L -1 sec -1 .  Antifungal  activity  under in  vitro assay  showed  that chitinolytic C5C isolate, could inhibited the growth of Colletotrichum sp. Key words: biocontrol, chitinase, Colletotrichum sp., rhizobacteria

## ABSTRAK
Kitinase  mampu  menghidrolisis  kitin  dan  berpotensi  sebagai  agen  biokontrol. Tujuan  penelitian  adalah  memurnikan  dan  mengkarakterisasi  kitinase  dari  isolat terpilih, serta menentukan kemampuan kitinolitiknya dalam penghambatan jamur Colletotrichum sp.  Aktivitas  kitinase  ditentukan  dengan  metode  Spindler, sementara  kadar  protein  ditentukan  dengan  metode  Bradford.  Produksi  kitinase isolat  rizobakteri  (isolat  C5C)  menunjukkan  aktivitas  enzim  spesifik  tertinggi sebesar  0.0489  U/mg  melalui  pemurnian  parsial  NH 4 SO 4 70%,  serta  dapat meningkatkan  kemurnian  13.97  kali  dibandingkan  ekstrak  kasar.  Karakterisasi kitinase isolat C5C menunjukkan bahwa enzim aktif optimal  pada suhu 55°C, pH 7,  waktu  inkubasi  120  menit,  serta  memiliki  nilai  K m sebesar  1.300  x  10 3 mg/L dan  V maks sebesar  0.0294  mgL -1 detik -1 .  Aktivitas  antifungi  pada  uji in  vitro menunjukkan bahwa  isolat  C5C dapat  menghambat pertumbuhan Colletotrichum sp.
Kata kunci: biokontrol, Colletotrichum sp.,  kitinase, rizobakteri

## PENDAHULUAN
Pemanfaatan  rizobakteri  merupakan  salah  satu  alternatif  yang  dapat digunakan  sebagai  pengganti  pupuk  kimia  dalam  meningkatkan  pertumbuhan tanaman (Iqbal & Hasnain, 2013). Selain itu, terdapat rizobakteri penghasil enzim pendegradasi  dinding  sel  diantaranya  kitinase  (EC  3.2.1.14)  yang  bisa mendegradasi kitin menjadi N-asetil-D-glukosamin. Kitinase tersedia melimpah di alam  (ke  dua  setelah  selulase)  dan  bisa  diperoleh  dari  berbagai  mikroorganisme seperti  bakteri  dan  jamur.  Bakteri  penghasil  kitinase  diantaranya Aeromonas, Serratia , Vibrio¸ Streptomyces , Bacillus, Enterobacter, Arthrobacter , B. alvei, B. cereus , Serratia sp.  (Sutariati  et  al,  2006),  sedangkan  jamur  penghasil    kitinase diantaranya Trichoderma  viridae,  Aspergillus sp., Mortiella sp., Mucor subtillisimum , Aspergillus fumigatus (Mosttafiz et al. 2012).
Kitinase telah menarik perhatian dalam  bidang pertanian, farmakologi,  dan bioteknologi  (Kuzu  et  al.  2012).  Dibandingkan  senyawa  kimia  yang  sulit  terurai secara  alami,  dan  bersifat  toksik  bagi  makhluk  hidup  serta  berbahaya  bagi kesehatan manusia, kitinase dapat digunakan  sebagai biopestisida yang aman dan ramah  lingkungan.  Peranan  kitinase  dalam  bidang  pertanian  yaitu  sebagai  agen pengendali hayati untuk mengendalikan organisme pengganggu tumbuhan seperti jamur maupun serangga hama.
Alternatif  untuk  mengurangi  penggunaan  pestisida  kimia  diantaranya dengan  pemanfatan  bakteri  plant  growth  promoting  rhizobacteria  (PGPR). Beberapa strain bakteri PGPR dapat dipromosikan sebagai agen pengendali hayati yang  efektif dalam menghambat  pertumbuhan fungi  patogen tanaman. Penelitian terdahulu  juga  melaporkan  beberapa  isolat  bakteri  rizosfer  serta  endofit  dapat digunakan sebagai mikroba antagonis yang mampu mengendalikan  penyakit yang disebabkan oleh jamur patogen (Suryadi et al., 2013).
Colletotrichum sp. merupakan jamur patogen penyebab penyakit antraknosa yang  dapat  menimbulkan  kematian tanaman,  ditandai  dengan  gejala awal  berupa bercak bulat berwarna cokelat kehitaman yang dibatasi lingkaran berwarna kuning pada  permukaan  daun  (Leksono,  2010).  Bakteri  yang  mampu  menghambat
pertumbuhan  jamur  Colletotrichum  sp.  diantaranya  dilaporkan  terdiri  atas  genus Bacillus  dan Streptomyces  (Sriyanti  et   al, 2015). Kajian sebelumnya dilaporkan sebanyak  31 isolat bakteri (rizobakteri)  telah berhasil diisolasi tanah  asal Pacet Cianjur,  Jawa  Barat  yang  mempunyai  karakteristik  kemampuan  menghasilkan hormon  indol  acetic  acid  (IAA)  dan  kitinase  (Suryadi,  data  tidak  dipublikasi). Terdapat enam  isolat bakteri yang menghasilkan hormon IAA dan kitinase yang cukup  baik,  sehingga  diperlukan  adanya  analisis  lebih  lanjut  dari  enam  isolat bakteri  tersebut.  Hasil  evaluasi  terhadap  efektivitas  penghambatan  bakteri terhadap  patogen  masih  bervariasi.  Kitinase  diduga  dapat  dihasilkan  oleh  isolat bakteri  tanah  dalam    kondisi  pH,  suhu,  dan  waktu    inkubasi  yang  optimum  agar dapat menghambat pertumbuhan patogen jamur lainnya.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  memurnikan  dan  mengkarakterisasi  kitinase dari  isolat  terpilih,  serta  mengukur  kemampuan  bakteri  kitinolitik  dalam menghambat  pertumbuhan  jamur  Colletotrichum  sp.  Penelitian  ini  diharapkan dapat  memberikan  informasi  mengenai  potensi  isolat  rizobakteri  sebagai penghasil  kitinase  yang  dapat  dimanfaatkan  dalam  bidang  pertanian  maupun industri, agar dapat dikembangkan sebagai agen hayati penghambat pertumbuhan patogen.

## MATERIAL DAN METODE

## Isolasi dan Seleksi Bakteri Kitinolitik
Bakteri kitinolitik yang diuji terdiri atas isolat C2B, C3C, C3D, C4A, C5C, dan S2D asal tanah Cianjur, Jabar. Masing-masing isolat dibiakkan dalam media NB cair dan diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 24 jam. Biakan diambil sebanyak 5 μL, dan ditumbuhkan ke dalam media kitin padat  yang mengandung 0.3%  koloidal  kitin.  Media  yang  berisi  isolat  disimpan  dan  diinkubasi  kembali selama 4-6 hari pada suhu 28-30°C (Gohel et al., 2006).  Cawan Petri disimpan di suhu  ruangan  selama  24  jam,  dan  dilakukan  pengukuran  indeks  kitinolitik berdasarkan  diameter  zona  bening  yang  terbentuk  di  sekitar  koloni  bakteri
terhadap  diameter  koloni,  yang  diamati  setelah  pewarnaan congo  red dan pembilasan menggunakan NaCl 0.1%.

## Aktivitas Enzim dan Pemurnian Parsial Kitinase
Ekstraksi ekstraseluler kitinase dilakukan menurut modifikasi (Gohel et al., 2006). Kultur isolat bakteri diambil sebanyak 1 ose dan dilarutkan dalam  10 mL media kitin  cair.  Kultur  yang telah  diinkubasi  di  inkubator bergoyang  selama  48 jam pada kecepatan 120 rpm, disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit  pada  suhu  4°C.  Supernatan  yang  dihasilkan  sebagai  ekstrak  enzim  kasar dipisahkan  dan  diuji  aktivitasnya  menurut  prosedur  (Kumar,  2007)  dan  kadar proteinnya ditentukan dengan metode (Bradford, 1976).
Pemurnian  parsial  dilakukan  dengan  pengendapan  amonium  sulfat (NH4SO4)  (modifikasi  Gomes  et  al.  2001).  Ekstrak  enzim  kasar  dipresipitasi dengan beberapa tingkat kejenuhan NH4SO4 (konsentrasi 10%, 30%, 50%, 70%) sambil  diaduk  perlahan  dengan  magnetic  stirrer.  Supernatan  disimpan  selama  24 jam  pada  suhu  4°C.  Protein  yang  telah  mengendap  dipisahkan  dari  supernatan dengan  disentrifugasi  pada  10.000  rpm  selama  10  menit  pada  suhu  4°C.  Pelet disuspensikan  ke  dalam  3  mL  PBS  serta  diuji  aktivitasnya  menurut  petujuk Kumar, (2007) dan ditentukan kadar proteinnya dengan metode (Bradford, 1976).
Campuran sebanyak 150 μL sampel enzim, 150 μL phospate buffered saline (PBS) pH 6.8, dan 300 μLkoloid kitin diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit dan  disentrifugasi  dengan  kecepatan  5000  rpm  selama  5  menit  pada  suhu  4°C. Supernatan  yang  diperoleh  diambil  sebanyak  500  μL,    ditambahkan  500  μL akuades  dan  1000  μL  pereaksi  Schales  (0.05  g  K 3 Fe(CN) 6 dan  0.5  M  Na 2 CO 3 ). Campuran  divorteks  dan  dididihkan  pada  suhu  100°C  selama  10  menit  untuk menghentikan  aktivitas  enzim  dan  setelah  dingin  diukur  absorbansinya menggunakan  spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  420  nm.  Satu  unit aktivitas  kitinase  didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang  dapat  membebaskan N-asetil-D-glukosamin  sebesar  satu  μmol  per  menit  dalam  keadaan  optimal (Kumar, 2007).

## Karakterisasi Kitinase Isolat C5C dan Kinetika Enzim
Optimasi  enzim  dilakukan  terhadap  kondisi  pH,  suhu  dan  waktu  inkubasi (Margino  et  al,  2012).  Uji  pengaruh  pH,  suhu,  dan  waktu  inkubasi  terhadap aktivitas  enzim  dilakukan  dengan  mereaksikan  enzim  150  μL,  150  μL  bufer  pH uji dan 300 μL koloid kitin 0.3%, dan kemudian campuran diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Penentuan pH yang diuji dalam penelitian ini adalah pH 3- 10  dengan  menggunakan  bufer  tri-natrium  sitrat  (pH  4-6),  bufer  natrium  fosfat (pH  6-8),  dan  bufer  glysin-NaOH  (pH  8-10)  dengan  konsentrasi  bufer  50  mM, sedangkan suhu  yang digunakan pada  rentang 30-65°C dengan interval  5°C, dan waktu inkubasi yang digunakan pada penelitian ini adalah 30-180 menit.
Larutan stok koloidal kitin 0.3% diencerkan menjadi 0.02% sampai dengan 0.14%. Sebanyak 300 µL koloid kitin variasi konsentrasi dicampur dengan 150µL sampel  enzim  dan  150µL  bufer  PBS.  Campuran  dihomogenkan  dengan  vorteks dan  diinkubasi  selama  30  menit  pada  suhu  37°C.  Aktivitas  kitinase  dilakukan dengan  menentukan  konsentrasi  N-asetil-D-glukosamin  (Kumar,  2007).  Nilai kinetika  K m dan  V maks ditentukan  berdasarkan  persamaan  Lineweaver-Burk  yang merupakan grafik hubungan antara 1/[S] dan 1/V (Rabeeth et al., 2011).
Aktivitas Kitinolitik Isolat C5C terhadap Jamur Colletotrichum sp.
Pengaruh isolat C5C terhadap jamur Colletotrichum sp. diuji secara in vitro menggunakan media potato dexxtrose agar (PDA). Aktivitas antagonis yang diuji yaitu  ekstrak  kitinase  kasar  dan  enzim  hasil  pemurnian  parsial  (NH 4 SO 4 70%) dengan metode difusi agar (Asril et al, 2014). Sampel dimasukkan kedalam sumur sebanyak  20  μl  pada  jarak  minimal  3  cm  dari  tempat  jamur  ditempatkan  pada cawan  petri.  Persentase  penghambatan  diukur  setelah  dinkubasi  selama  7  hari pada  suhu  28-30°C.  Persentase  penghambatan  pertumbuhan  dapat  ditentukan dengan  persamaan  berikut:  DP  = LK - LP LK 𝑥 100%,  dimana:  DP  =  daya penghambatan, LK = luas koloni pada kontrol, LP = luas koloni pada perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Indeks Kitinolitik Isolat Rizobakteri
Aktivitas  kitinase  hasil  uji  kualitatif  dilihat  dari  hasil  degradasi  kitin  pada media  sehingga  terbentuk  warna  bening  di  sekitar  koloni  bakteri.  Zona  bening menunjukkan  bahwa  kitin  telah  terdegradasi  oleh  kitinase  ekstraseluler  yang dihasilkan  oleh  bakteri  rizosfer.  Hasil  pengujian  indeks  kitinolitik  yang  tertinggi dimiliki oleh isolat bakteri C3D dengan nilai 1.43, sedangkan isolat bakteri C2B, C3C, C4A, C5C, dan S2D memiliki indeks kitinolitik berturut-turut sebesar 1.28, 1.29,  1.28,  1.23,  dan  1.14  (data  tidak  ditampilkan).  Indeks  kitinolitik  yang dihasilkan  oleh  setiap  isolat  mempunyai  aktivitas  kitinolitik  yang  berbeda-beda bergantung  pada  besarnya  monomer  N-asetil-D-glukosamin  yang  dihasilkan. Semakin  besar  monomer  N-asetil-D-glukosamin  yang  dihasilkan  maka  zona bening  yang  terbentuk  disekitar  koloni  akan  semakin  besar  (Muharni  & Widjajanti, 2011).

## Aktivitas Enzim dan Pemurnian Parsial Kitinase
Seleksi  enam  bakteri  yang  memiliki  aktivitas  kitinase  terbaik  juga  dilihat berdasarkan hasil pengukuran aktivitas spesifik enzim dari masing-masing ekstrak kasar  dan    hasil  pemurnian  parsialnya.  Aktivitas  spesifik  enzim  yang  dihasilkan pada  isolat  S2D,  C4A,  C3D,C3C  dan  C2B  berturut-turut  sebesar  0.0426  U/mg, 0.0411  U/mg,  0.0392  Umg,  0.0306  U/mg  dan  0.0282  U/mg  (data  tidak ditampikan).    Isolat  C5C  hasil  pemurnian  NH 4 SO 4 70%  menunjukkan  aktivitas spesifik kitinase paling tinggi (0.0489 U/mg)  (Tabel 1). Aktivitas spesifik enzim kasar  isolat  C5C  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini  sebesar  0.0035  U/mg,  dan mengalami  peningkatan  setelah  dilakukan  tahap  pemurnian  parsial  NH 4 SO 4 menjadi  0.0489  U/mg.  Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan  bahwa  pemurnian parsial  dapat  meningkatkan  kemurnian  13.97  kali  dengan yield sebesar  46.38%. Penambahan  NH 4 SO 4 menyebabkan  pengendapan  protein  dan  mengurangi kelarutannya (Margino et al, 2012).

## Tabel 1. Pemurnian kitinase asal isolat C5C
Fraksi Volume enzim (mL) Total aktivitas (U) Total Protein (mg) Aktivitas Spesifik (U/mg) Yield (%) Kemurnian (kali) Ekstrak kasar 100 0.0800 23.600 0 0.0035 100.00 1.00 NH 4 SO 4 10% 3.3 0.0067 0.8199 0.0082 8.38 2.34 NH 4 SO 4 30% 3.5 0.0183 0.8608 0.0213 22.88 6.08 NH 4 SO 4 50% 3.5 0.0276 0.9132 0.0302 34.50 8.63 NH 4 SO 4 70% 4 0.0371 0.7593 0.0489 46.38 13.97
Pengendapan  enzim  dengan  NH 4 SO 4 menunjukkan  kecenderungan kenaikkan  total  aktivitas  kitinase  dan  aktivitas  spesifik  seiring  meningkatnya konsentrasi  NH 4 SO 4 .  Hasil  pengukuran  aktivitas  total  kitinase  dan  aktivitas spesifik  enzim  pada  pemurnian  NH 4 SO 4 70%  memiliki  aktivitas  enzim  yang paling  tinggi  dibandingkan  dengan  ekstrak  kasarnya.  Hal  ini  mengindikasikan bahwa  pemekatan  NH 4 SO 4 70%  memiliki  kemampuan  yang  baik  dalam mengendapkan  protein  dibandingkan  dengan  ekstrak  kasar  enzim  dan  fraksi lainnya (Tabel 1).
Persentase  kejenuhan  NH 4 SO 4 untuk  setiap  kitinase  dari  berbagai  isolat yang berbeda memiliki tingkat  pengendapan  yang berbeda-beda (Revathi, 2012). Pemurnian  enzim  asal  bakteri  11UJ  menggunakan  garam  NH 4 SO 4 dan  dialisis dilaporkan  dapat  meningkatkan  faktor  kemurnian  enzim  sebesar  2-6  kali dibanding ekstrak kasar enzimnya  (Suryadi et al., 2013).  Kitinase asal Beauveria bassiana hasil pemurnian NH 4 SO 4 memiliki faktor kemurnian 1.2 kali  (Suryadi et al.,  2014).  Pandya et  al .,    2014)  menguji  kitinase  bakteri B.subtilis (MBCU4) dengan  tahap  pemurnian  NH 4 SO 4 80%  dan  melaporkan  faktor  kemurnian  1.17 kali dengan yield 87.61%.
Aktivitas spesifik adalah suatu ukuran kemurnian enzim yang nilainya akan meningkat selama pemurnian suatu enzim, dan menjadi maksimum dan tetap jika enzim  sudah  berada  pada  keadaan  murni  (Biswanger,  2554).  Nilai  aktivitas spesifik  kitinase  asal  isolat  C5C  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  kitinase  asal isolat 11 UJ yang diisolasi dari tanah untuk tahapan dialisis sebesar 0.00105 U/mg
(Suryadi  et  al.,  2013),  tetapi  lebih  rendah  dibandingkan  dengan Bacillus  subtilis MBCU4  (0.14  U/mg)  pada  presipitasi  NH 4 SO 4 80%  (Pandya  et  al.,  2014). Aktivitas  spesifik  semakin  tinggi  menunjukkan  enzim  yang  diperoleh  semakin murni. Penelitian ini menunjukkan bahwa isolat bakteri C5C adalah bakteri yang dapat  memproduksi  kitinase  dengan  baik.  Pemurnian  enzim  dengan  garam NH 4 SO 4 70%  dapat  meningkatkan  aktivitas  spesifik  dengan  faktor  pemurnian 13.97 kali dan yield 46.38%.

## Karakterisasi Kitinase Isolat C5C dan Kinetika Enzim
Kitinase  asal  isolat  C5C  aktif  pada  berbagai  pH  (3-10),  tetapi  aktivitas optimum  terlihat  pada  pH  netral  (7)  menggunakan  bufer  natrium  fosfat  dengan nilai aktivitas enzim yang diperoleh sebesar 0.0159 U/mL (Gambar 1).
Gambar 1. Pengaruh pH terhadap aktivitas kitinase pada bufer tri-natrium sitrat (pH 3-5), bufer natrium fosfat (pH 6-7), dan bufer glisin-NaOH (pH 8-10).
Aktivitas kitinase isolat C5C dalam  rentang suhu 30 - 60°C aktif pada suhu optimum 55°C dengan nilai 0.0170 U/mL (Gambar 2). Aktivitas enzim yang telah mencapai  keadaan  optimum  akan  mengalami  penurunan  seiring  bertambahnya suhu.  Pengaruh  suhu  terhadap  aktivitas  kitinase  diuji  pada  kondisi  pH  optimum (pH  7).  Isolat  C5C  yang  dianalisis  aktivitas  kitinasenya  mempunyai  akivitas tertinggi sebesar 0.0159 U/mL pada pH 7. Hasil ini sama dengan  yang dihasilkan isolat  rizobakteri  asal  rizosfer  cabai  (Nurdebyandaru et  al. ,  2012)  dan  bakteri B. thuringiensis SAHA 12.08 (Asril et al., 2014) yang mempunyai aktivitas optimum pada  pH  7.  Penelitian  sebelumnya  juga  melaporkan  aktivitas  optimum S.malthopilia pada  pH  5.5  (Hamid et  al. ,  2016),  Isolat Enterobacter  sp. NRG4
0,0130 0,0135 0,0140 0,0145 0,0150 0,0155 0,0160 0,0165 0,0170 3 4 5 6 7 8 9 10 A k tiv itas en zim ( U/m L ) pH
optimum  pada  pH  5.5  dan Sphingomonas sp. CJ-5 optimum  pada  pH  7 (Herdyastuti et al, 2009). Terjadinya pH optimum menunjukkan adanya interaksi yang  optimum  antara  enzim  dengan  substrat  yang  disebabkan  adanya  ionisasi asam-asam  amino  pada  sisi  aktif  enzim.  Enzim  pendegradasi  kitin  yang  baik optimum  pada  pH  asam  hingga  netral.  Kadar  pH  yang  terlalu  tinggi  atau  terlalu rendah  akan  menyebabkan  ketidakstabilan  pada  konformasi  enzim  sehingga menyebabkan struktur enzim rusak. pH optimum aktivitas enzim tidak harus sama dengan pH lingkungan (Margino et al., 2012). Pengaruh pH pada aktivitas enzim tidak hanya tergantung pada satu sistem bufer, tetapi juga tergantung berbagai tipe buffer.  Selain itu, produksi enzim dipengaruhi oleh derajat keasaman (pH) media, tetapi  pH  optimum  enzim  tidak  perlu  sama  dengan  pH  lingkungan  normalnya, dengan  pH  yang  mungkin  sedikit  berbeda  di  atas  atau  dibawah  pH  optimum (Biswanger, 2004).
Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim
Enzim sangat sensitif terhadap perubahan suhu, dan  suhu optimum untuk kitinase dari berbagai  mikroba pada umumnya berada pada rentang suhu  40°C  – 75°C (Haliza & Suhartono, 2012). Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas kitinase isolat  C5C tertinggi  berada pada suhu 55°C dengan nilai  sebesar 0.0170 U/mL.  Hasil  penelitian  ini  sama  dengan  kitinase  isolat  rizobakteri  dari  rizosfer cabai  11.14  dan  bakteri Bacillus sp.yang  memiliki  aktivitas  optimum  pada  suhu 55°C  (Nurdebyandaru  et  al.,  2012) . Hasil  penelitian  (Mahata et  al., 2010) melaporkan  suhu  optimum  kitinase  dari  isolat  99  adalah  50°C  dan Enterobacter
0,0120 0,0130 0,0140 0,0150 0,0160 0,0170 0,0180 30 35 40 45 50 55 60 65 A k tiv itas E n zim ( U/m L ) Suhu (˚C)
sp. G-1 (40°C), sedangkan suhu optimum kitinase asal B. cereus pada suhu 35°C. (Revathi et  al. 2012) menemukan kitinase dari genus Vibrio optimum pada suhu 45°C.
Kenaikan  suhu  akan  meningkatkan  energi  molekul  substrat  dan  pada akhirnya akan meningkatkan laju reaksi enzim.  Suhu yang lebih tinggi dari suhu optimum  akan  menyebabkan  enzim  kehilangan  aktivitas  katalitiknya.  Suhu optimum  yang  dicapai  menunjukkan  terjadinya  reaksi  antara  enzim  dan  substrat sangat  efektif,  sehingga  pembentukan  ikatan  kompleks  enzim-substrat  makin mudah  dan  produk  yang  terbentuk  meningkat.  Peningkatan  suhu  lebih  lanjut menyebabkan  aktivitas  enzim  mengalami  penurunan.  Hal  ini  disebabkan  karena struktur  enzim  telah  mengalami  denaturasi  akibat  panas  dan  terjadi  perubahan konformasi  enzim,  sehingga  kinerja  enzim  dalam  menghidrolisis  substrat mengalami penurunan (Kosim & Putra, 2010).
Berdasarkan  penelitian  yang  diperoleh  menunjukkan  bahwa  bakteri mesofilik  yang  diisolasi  pada  suhu  37°C  dapat  menghasilkan  enzim  termostabil pada  suhu  55°C.  Hasil  ini  sama  dengan  bakteri Bacillus sp.  yang  diisolasi  dari rizosfer  cabai  oleh  (Nurdebyandaru  et  al.,  2012)  dapat  menghasilkan  enzim termostabil pada suhu  55°C walaupun proses isolasi  bakterinya pada suhu 37°C. Enzim  termostabil  adalah  enzim  yang  suhu  aktivitas  maksimumnya  di  atas  suhu pertumbuhan  mikroorganisme  penghasilnya.  Bakteri  yang  dapat  menghasilkan enzim  termostabil  menunjukkan  bahwa  enzim  tersebut  sedikit  berbeda  dalam urutan asam amino.
Aktivitas  kitinase  isolat  C5C  mununjukkan  fase  logaritmik  (optimum) sampai  dengan  menit  ke-120,  dengan  nilai  aktivitas  0.0179  U/mL,  selanjutnya mengalami penurunan aktivitas enzim sampai dengan akhir pengamatan (Gambar 3).
Gambar 3. Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim
Waktu  inkubasi  merupakan  waktu  yang  diperlukan  oleh  enzim  untuk menghidrolisis  substrat  menjadi  produk.  Pengaruh  waktu  inkubasi  terhadap aktivitas optimum enzim pada isolat C5C terjadi setelah waktu inkubasi 120 menit meskipun  enzim  sudah  mulai  aktif  sejak  waktu  30  menit,  namun  reaksi  warna yang  terbentuk  masih  pudar.  Aktivitas  enzim  terus  mengalami  peningkatan  dari sejak 30 menit hingga mencapai 120 menit, setelah itu mengalami penurunan. Hal ini menunjukkan semakin lama waktu inkubasi, maka laju peningkatan absorbansi akan  semakin  kecil  dan  terjadinya  penurunan  laju  perubahan  substrat  sehingga produk yang dihasilkan menurun (Suhandana et al ., 2013).
Sifat  katilitik  enzim  biasanya  dianalisis  dengan  mengukur  dan menganalisis  laju  reaksi.  Analisis  terhadap  waktu  inkubasi  dapat  memberikan informasi  tambahan  tentang  sifat-sifat  enzim.  Penentuan  waktu  inkubasi menunjukkan  bahwa  konsentrasi  substrat  dan  produk  berubah  secara  substansial dan  enzim  mengalami  kejenuhan  ketika  waktu  inkubasi  terlalu  lama  (Duggleby, 2001). Lama inkubasi bakteri isolat C5C lebih rendah dibandingkan dengan hasil penelitian  (Asril  et  al.,  2014)  (bakteri B.  thuringiensis SAHA  12.08)  dimana akitivitas  kitinase  optimal  pada  waktu  inkubasi  180  menit,    sedangkan  hasil penelitian  aktivitas  enzim  isolat Beauveria  bassiana memiliki  waktu  inkubasi optimal 90 menit (Suryadi et al., 2014).
Konsentrasi  substrat  koloidal  kitin  untuk  pengukuran  enzim  murni  berada pada kisaran antara 0.02 - 0.14%. Peningkatan konsentrasi substrat mempengaruhi kecepatan  enzim  dalam  mengkatalisis  reaksi.  Persamaan  Michaelis-Menten
0,0140 0,0145 0,0150 0,0155 0,0160 0,0165 0,0170 0,0175 0,0180 0,0185 30 60 90 120 150 180 A k tiv itas E n zim ( U /m L ) Waktu inkubasi (menit)
merupakan  hubungan  antara  konsentrasi  substrat  dengan  kecepatan  reaksi enzimatik. diperoleh dari reaksi enzim irreversible , yaitu substrat diubah menjadi produk,  tetapi  produk  tidak  dapat  diubah  menjadi  substrat  (Biswanger,  2008) Aktivitas  kitinase  meningkat  secara  linear  terhadap  konsentrasi  substrat,  namun kecepatan mengalami penurunan secara progresif setelah mencapai keadaan stabil. Konsentrasi  substrat  yang  rendah  menyebabkan  reaksi  rendah  namun  kecepatan reaksi  akan  berkurang,  dan  akan  mencapai  titik  batas  (enzim  menjadi  jenuh). Persamaan  Michaelis-Menten  adalah  K m yang  bersifat  khas  bagi  enzim  tertentu, dengan substrat spesifik pada kondisi pH dan suhu tertentu. Namun persamaan ini sulit digunakan untuk menentukan V maks dengan tepat, karena V maks hanya diduga dan tidak pernah dapat diketahui nilai sebenarnya. Nilai K m yang lebih tepat dapat diperoleh  dengan  memetakan  data  yang  sama  dengan  cara  yang  berbeda  yaitu dengan  persamaan  Lineweaver-Burk.  Kecepatan  maksimum  (V maks ) merupakan suatu  kondisi  saat  kecepatan  tidak  dapat  bertambah  lagi  dengan  bertambahnya konsentrasi  substrat.  Nilai  K m merupakan  ukuran  afinitas  suatu  enzim  dalam menghidrolisis  substrat  yang  menunjukkan  indikator  kekuatan  kompleks  enzim substrat.
Persamaan  linier  dari  kurva  Lineweaver-Burk  yang  diperoleh  dari  plot invers  deret  susbtrat  koloid  kitin  [1/S]  dengan  invers  kecepatan  reaksi  kitinase (1/V)  adalah  y=  0.0442x  +  34.002  dan  mempunyai  nilai  korelasi  r=0.9986. Berdasarkan persamaan tersebut, diperoleh nilai V maks sebesar 0.0294 mgL -1 detik - 1 dan  K m sebesar  1.300  x  10 -3 mg/L.  Kemiringan  yang  dihasilkan  dari perbandingan  K m /V maks yaitu 0.0442  dengan intersep pada kurva  (0, 34.002) dan (769.2986, 0) (Gambar 4).
Gambar 4. Kurva double reciprocal Lineweaver-Burk
Untuk  mencapai  setengah  dari  kecepatan  maksimum  dibutuhkan  substrat dengan konsentrasi  1.300x 10 -3 mg/L. Nilai K m lebih kecil dibandingkan dengan Nilai  V maks mengindikasikan  bahwa  afinitas  enzim  dengan  substrat  tinggi.  Nilai K m dari kitinase isolat  C5C lebih kecil jika  dibandingkan dengan nilai  K m enzim Bacillus sp.  BPPT  CC  2  sebesar  0.6959  mg/L  (Sugiarto,  2013).  Nilai  K m yang kecil  menunjukkan  bahwa  afinitas  substrat  dengan  enzim  semakin  tinggi  dan produk yang dihasilkan semakin cepat.

## Aktivitas Antifungi Isolat Kitinolitik C5C terhadap Jamur Colletotrichum sp.
Aktivitas  antagonis  isolat  bakteri  kitinolitik  C5C  terhadap Colletotrichum sp.  menunjukkan  bahwa  isolat  C5C  mampu  menghambat  pertumbuhan Colletotrichum sp. secara in vitro . Mekanisme penghambatan dari uji antagonisme dapat diamati dengan melihat terhambatnya pertumbuhan jamur patogen di sekitar koloni bakteri kitinolitik. Daya hambat kitinase isolat C5C hasil pemurnian parsial enzim terhadap Colletotrichum sp. menghambat  pertumbuhan Colletotrichum sp. sebesar 55.5% lebih baik dibandingkan dengan ekstrak kasarnya (49.8 %).
Produksi  kitinase  dapat  dianggap  sebagai  kriteria  untuk  pemilihan  agen pengendali  hayati  terhadap  jamur  patogen,  karena  pada  umumnya  dinding  sel jamur  penyebab  antraknosa  mengandung  kitin.  Aktivitas  antijamur  ditentukan dengan metode difusi agar karena metode ini dianggap praktis, cepat,  mudah. dan cocok untuk seleksi secara cepat. Pertumbuhan jamur tanpa perlakuan rizobakteri (kontrol)  tumbuh  dengan  baik  pada  media  PDA.  Berbeda  dengan  dua  perlakuan
y = 0.0442x + 34.002 R² = 0.9986 0 10 20 30 40 50 -800 -600 -400 -200 0 200 1 /V 1/[Koloid kitin]
kitinase  asal  isolat  C5C  yang  diuji  mampu  menghambat  pertumbuhan  jamur patogen secara in vitro . Hasil ini diduga disebabkan oleh adanya aktivitas kitinase isolat  C5C  yang  menyebabkan  pembengkakan  miselium  jamur,  pembentukan vakuola dan degradasi  dinding sel  hifa serta pelepasan komponen intraseluler  ke medium  yang  mengakibatkan  terjadinya  penghambatan  pertumbuhan  jamur Colletotrichum sp.
Perbedaan kemampuan penghambatan bakteri terhadap pertumbuhan jamur patogen  kemungkinan  disebabkan  oleh  perbedaan  konsentrasi  enzim  hidrolitik dan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh ekstrak kasar dan pemurnian parsial (Prapagdee et  al .,  2008).  Kemampuan  bakteri  dalam  mensekresikan  senyawa antijamur tergantung pada jenis tanaman dan sumber karbon yang ditambahkan ke dalam  media berdasarkan produksi antibiotik optimal (Heng et al ., 2011).
Manfaat  mikroba  terutama  bakteri  sebagai  agen  pengendali  hayati  telah banyak  dilakukan  pada  golongan  bakteri Bacillus,  Pseudomonas,  Serratia., dan isolat  rizobakteri  tersebut  berpotensi  dapat  digunakan  sebagai  bakteri  antagonis terhadap  jamur Colletotrichum sp.  serta  memacu  pertumbuhan  bibit  cabai (Sutariati et  al .  2006).  Bakteri  kitinolitik  lainnya  yaitu B.  thuringiensis SAHA 12.08  juga  berpotensi  sebagai  agen  hayati  karena  mampu  menghambat pertumbuhan C.  affinis dan C.  gloeosporioides (Asril  et  al.,  2014),    sedangkan Streptomyces hygroscopicus mampu mengambat pertumbuhan C. gloeosporioides (Prapagdee et al., 2008).
Persentase penghambatan bakteri kitinolitik isolat C5C menunjukkan bahwa isolat  ini  juga  efektif  mencegah  pertumbuhan  lebih  lanjut  patogen  jamur Colletrotichum sp. serta berpotensi dimanfaatkan sebagai agen pengendali hayati. Perlunya  penambahan  waktu  inkubasi  yang  lebih  lama  (sekitar  60  menit)  perlu dikaji untuk mendapatkan warna  reaksi  yang lebih baik sehingga aktivitas enzim lebih  meningkat.  Selain  itu,  perlu  dilakukan  pengujian  secara in  vivo untuk mengetahui  keefektifan  kitinase  isolat  C5C  dalam  menghambat  pertumbuhan jamur Colletotrichum sp. penyebab penyakit antraknosa pada tanaman.

## KESIMPULAN
Seleksi  pemurnian  parsial  kitinase  dari  isolat  bakteri  tanah  asal  Cianjur diperoleh isolat C5C yang memiliki aktivitas kitinase tertinggi hasil pengendapan NH 4 SO 4 70%.  Karakterisasi  terhadap  isolat  C5C  menghasilkan  aktivitas  spesifik kitinase sebesar 0.0489 U/mg. Kitinase ini optimal  pada  suhu 55°C,  pH 7  (bufer natrium  fosfat)  serta  waktu  inkubasi  120  menit,  dengan  nilai  K m sebesar  1.300x 10 3 mg/L  dan  V maks sebesar  0.0294  mg  L -1 detik -1 .  Kitinase  ini  juga  memiliki kemampuan  antagonistik  dalam  menghambat  pertumbuhan  jamur  patogen Colletotrichum sp. secara in vitro .

## DAFTAR PUSTAKA
Asril,  M.,  Mubarik,  N.  R.,  &  Wahyudi,  A.  T.  (2014).  Partial  purification  of bacterial chitinase as biocontrol of leaf blight disease on oil palm.  Res. J. of Microbiology . https://doi.org/10.3923/jm.2014.265.277
Biswanger. (2554). Practical enzymology . Weinheim Germany (Ed): Willey-VCH Verlag GmbH & Co.
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method of microgram quantities of protein  utilizing  the  principle  of  protein-dye  binding. Anal  Biochem .  12: 248-254.https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3
Duggleby,  R.  G.  (2001).  Quantitative  analysis  of  the  time  courses  of  enzyme- catalyzed reactions. Methods, 24(2), 168–174. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1177
Gohel,  V.,  Singh,  A.,  Vimal,  M.,  &  Ashwini,  P.  (2006).  Bioprospecting  and antifungal  potential  of  chitinolytic  microorganisms. African  Journal  of Biotechnology , 5(2), 54–72.
Gomes, R. C., Sêmedo, L. T. A. S., & Soares, R. M. A. (2001). Purification of a thermostable  endochitinase  from  Streptomyces  RC1071  isolated  from  a cerrado  soil  and  its  antagonism  against  phytopathogenic  fungi. J.of Applied  Microbiology ,  90(4),  653–661.  https://doi.org/10.1046/j.1365- 2672.2001.01294.x
Haliza,  W.,  &  Suhartono,  M.  T.  (2012).  Karakteristik  kitinase  dari  mikrobia.
Buletin Teknologi Pascananen Pertanian , 8(1), 1–14.
Hamid,  R.,  Ahmad,  M.,  Ahmad,  M.  M.,  Abdin,  Z.,  &  Javed,  S.  (2016). Purification and characterization of thermostable chitinase from a novel S. maltophilia  strain. Malaysian  Journal  of  Microbiology ,  (May  2014). https://doi.org/10.21161/mjm.44612
Heng  JLS,  Umi  KS,  &  Halizah  H.  (2011).  Isolation,  characterization  and identification of potential actinobacteria with antifungal activities towards chilli anthracnose. African Journal of Biotechnology, 10(32), 5979–5987.
Herdyastuti,  Nuniek,  T.  J.  R.,  &  Matsjeh,  M.S.  (2009).  Kitinase  dan mikroorganisme  kitinolitik:  Isolasi,  karakterisasi  dan  manfaatnya. Indonesian Journal Chemistry , 9(1), 37–47.
Iqbal,  A.,  &    Hasnain,  S.  (2013).  Auxin  producing  pseudomonas  strains: biological  candidates  to  modulate  the  growth  of  Triticum  aestivum benevicially. American  Journal  of  Plant  Sciences ,  04(09),  1693–1700. https://doi.org/10.4236/ajps.2013.49206.
Kosim,  M.,  &  Putra,  R.  S.  (2010).  Pengaruh  suhu  pada  protease  dari  Bacillus subtilis. Prosiding Skripsi Semester Genap . Retrieved from http://digilib.its.ac.id/public/ITS-Undergraduate-12616-Paper.pdf
Kumar. (2007). Biochemical Characterization  Of An Aspartic Protease Inhibitor From  Bacillus  Licheniformis:  Interactions  With  Hydrolytic  Enzymes . Thesis, Pune India.
Kuzu,  S.  B.,  Güvenmez,  H.  K.,  &  Denizci,  A.  A.  (2012).    Production  of  a Thermostable  and  Alkaline  Chitinase  by  Bacillus  thuringiensis  subsp. kurstaki Strain HBK-51. Biotechnology Research International , 2012, 1–6. https://doi.org/10.1155/2012/135498
Leksono  KD,  Nasahi  C,  &  Susniahti  N.  2010.  Inventarisasi  penyakit  pada tanaman Jarak Pagar (Jatpropha curcas L.) pada tiga daerah di Jawa Barat. J Agrikultura . 21(1):31-38.
Mahata  E,  Dharma  MA.,  Ryanto,  I.,  &  Rizal,  Y.  (2010).  Characterization  of Extracellular  chitinase  from  bacterial  isolate  99  and  Enterobacter  sp.  G-1 from  Matsue  City,  Japan. J.  Microbiology  Indonesia ,  2(1),  34–38. https://doi.org/10.5454/mi.2.1.7
Margino, S., Behar C, & Asmara W. (2012). Isolation and purification of chitinase Bacillus  sp.  D2  isolated  from  potato  rhizosfer. Indonesian  J  Biotech. 17(1):69-78.
Mosttafiz  S,  Rahman  M,  Rahman  M.  2012.  Biotechnology:  Rule  of  microbes  in sustainable  agriculture  and  environmental  health.  Internat. J.  Microbiol . 10(1):1-5.
Muharni, & Widjajanti, H. (2011). Skrining bakteri kitinolitik antagonis terhadap pertumbuhan  jamur  akar  putih  (Rigidoporus  lignosus)  dari  rizosfir tanaman karet. Jurnal Penelitian Sains , 14(1): 51–56.
Nurdebyandaru,  N.,  Rachmania  Mubarik,  N.,  &  Sri  Prawasti,  T.  (2012). Chitinolytic  bacteria  isolated  from  chili  rhizosphere:  chitinase characterization  and  application  as  biocontrol  for  Aphis  gossypii.
J.Microbiology Indonesia , 4(3), 103–107. https://doi.org/10.5454/mi.4.3.1
Pandya,  U.,  Sudhir,  A.,  Gohel,  H.,  Subramanian,  R.  B.,  &  Saraf,  M.  (2014).
Zymographic  identification  and  biochemical  characterization  of  chitinase against  phytofungal  pathogens. Journal  of  Microbiology,  Biotechnology and Food Sciences , 4(1), 44–47. https://doi.org/10.15414/jmbfs.2014.4.1.44-47
Prapagdee, B., Kuekulvong, C., & Mongkolsuk, S. (2008). Antifungal potential of extracellular metabolites produced by Streptomyces hygroscopicus against phytopathogenic fungi.  International Journal of  Biological Sciences , 4(5), 330-337. https://doi.org/10.7150/ijbs.4.330.
Rabeeth,  M.,  Anitha,  A.,  &  Srikanth,  G.  (2011).  Purification  of  an  antifungal endochitinase  from  a  potential  biocontrol  agent  Streptomyces  griseus. Pakistan Journal of Biological Sciences . https://doi.org/10.3923/pjbs.2011.788.797 Revathi,  M.  (2012).  Production  and  characterization  of  chitinase  from  Vibrio species, a head waste of shrimp  Metapenaeus dobsonii (Miers, 1878) and chitin  of  Sepiella  inermis  Orbigny,  1848. Advances  in  Bioscience  and Biotechnology , 03(04), 392–397. https://doi.org/10.4236/abb.2012.34056
Sriyanti,  N.  L.  G.,  Suprapta,  D.  N.,  &  Suada,  I.  K.  (2015).  Uji  keefektifan rizobakteri  dalam  menghambat  pertumbuhan  jamur  Colletotrichum  spp. penyebab Antraknosa pada cabai merah (Capsicum annuum L.). E-Jurnal Agroekoteknologi Tropika , 4(1), 53–65.
Sugiarto  OK.  2013. Isolasi,  pemurnian  parsial,  dan  karakterisasi  enzim  kitinase dari Bacillus sp . Bppt cc 2 [skripsi]. Bogor(ID): Institut Pertanian Bogor.
Suhandana,  M.,  Nurhayati,  T.,  &  Ambarsari,  L.  (2013).  Karakterisasi  ekstrak kasar  enzim  polyphenoloxidase  dari  udang  windu  (Penaeus  monodon). Jurnal Ilmu Dan Teknologi Kelautan Tropis , 5(2), 353–364.
Suryadi,  Y.,  Priyatno,  T.  P.,  Samudra,  I.  M.,  Susilowati,  D.  N.,  Lawati,  N.,  & Kustaman,  E.  (2014).  Pemurnian  parsial  dan  karakterisasi  kitinase  asal jamur  entomopatogen  Beauveria  bassiana  isolat  BB200109. Jurnal AgroBiogen, 9(2), 77. https://doi.org/10.21082/jbio.v9n2.2013.p77-84
Suryadi, Y., Priyatno, T. P., Susilowati, D. N., Samudra, I. M., Yudhistira, N., & Purwakusumah,  E.  D.  (2013).  Isolasi  dan  karakterisasi  kitinase  asal Bacillus cereus 11 UJ. Jurnal Biologi Indonesia , 9(1), 51–62.
Sutariati, & Ilyas, S. (2006). Karakter fisiologis dan keefektifan isolat rizobakteri sebagai  agens  antagonis  Colletotrichum  capsici  dan  rizobakteri  pemacu pertumbuhan  tanaman  cabai. Jurnal  Ilmiah  Pertanian  Kultura .  41(1):28- 34.