## PENURUNAN PRODUKSI ASAM DAN PERTUMBUHAN BAKTERI STREPTOCOCCUS SOBRINUS SETELAH TERPAPAR REBUSAN DAUN SIRIH MERAH 10%

## (REDUCTION OF ACID PRODUCTION AND GROWTH OF STREPTOCOCCUS SOBRINUS
AFTER EXPOSING 10% RED PIPER BETLE LEAVES DECOCTION)
Tetiana Haniastuti, Ristini Asih
Bagian Biologi Mulut Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Gadjah Mada Jl. Denta Sekip Utara Yogyakarta 55281

## Abstract
Dental caries is an infectious disease which is caused by cariogenic bacteria in oral cavity such as Streptococcus sobrinus. The bacteria produce organic acids which demineralize the enamel surface and destroy the hard structure of the tooth. Red piper  betel  is  one  of  the  medicinal  plants  which  is  commonly  planted  by  Indonesian  people  in  all  over  the  country. Traditionally, red piper betel leaves decoction frequently used by people as an agent to treat oral diseases. The purpose of the research was to study anticariogenic activity of red piper  betle leaves decoction  by examining acid production and growth of S. sobrinus after exposed red piper  betle leaves decoction. Acid production and growth of S. sobrinus were examined  by adding  5%  and  10% red piper  betel  leaves decoction,  aquadest  (negative  control)  and  Listerine (positive control)  into  brain  heart  infusion  broth  medium  containing  1%  glucose.  The  medium  was  then  inoculated  with  10 6 S.  sobrinus  and  incubated  at  37 o C  for  1,  2,  4,  6,  and  8  hours.  The  absorbance  of  the  medium  was  measured spectrophotometrically at 550 nm. The pH of the cultures was determined using pH meter. Kruskal Wallis test showed no significant difference pH among the groups immediately after the treatment (p> 0.05). Mann Whitney test showed that after 6 hours, the group treated with 10% red piper betel leaves decoction had a significant higher pH (p< 0.05) compared to the other groups, indicating that 10% red piper betle leaves decoction reduced acid production of S. sobrinus. After 24 hours, the colony number of S. sobrinus of the group treated with 10% red piper betle leaves decoction was significantly fewer  (p<  0.05)  compared  to  the  negative  control  group,  but  significantly  higher  (p<  0.05)  compared  to  the  positive control  group.  These  results  indicated  that  10%  red  piper  betle  leaves  decoction  reduced  the  growth  of  S.  sobrinus. In conclusion, 10% red piper betle leaves decoction has anticariogenic activity due to its ability to reduceacid production and growth of S. sobrinus.
Key words: Streptococcus sobrinus, bacterial growth, acid production, red piper betel

## Abstrak
Karies merupakan penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri kariogenik yang terdapat di dalam rongga mulut, antara lain Streptococcus  sobrinus .  Bakteri  tersebut  mampu  menghasilkan  asamorganik  yang  menyebabkan  demineralisasi email  gigi,  sehingga  menghancurkan  jaringan  keras  gigi.  Sirih  merah  merupakan  salah  satu  tanaman  yang  banyak ditanam oleh masyarakat Indonesia. Secara tradisional, rebusan daun sirih merah sering digunakan oleh masyarakat untuk mengobati penyakit gigi dan mulut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi antikariogenik rebusan daun sirih merah  dengan  menguji  produksi  asam  dan  pertumbuhan Streptococcus  sobrinus setelah  terpapar  rebusan  daun  sirih merah . Produksi asam dan laju pertumbuhan diuji dengan menambahkan rebusan daun sirih merah konsentrasi 5% dan 10%  serta  akuades  (kontrol  negatif)  dan  Listerine(kontrol  positif)  pada  media brain  heart  infusion  broth yang mengandung 1% glukosa. Media kemudian diinokulasi dengan 10 6 sel bakteri dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama1, 2, 4, 6, dan 8 jam. Absorbansi media diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 550 nm, sedangkan pH media ditentukan dengan menggunakan pH-meter. Hasil uji  Kruskal Wallismenunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan pH yang  signifikan  antar  kelompok  sesaat  setelah  perlakuan  (p>  0,05).  Hasil  uji  Mann  Whitney  menunjukkan  bahwa kelompok  yang  terpapar  rebusan daun  sirih  merah  10%  mempunyai  pH  yang  secara  signifikan  lebih tinggi  (p<  0,05) dibandingkan kelompok yang lain, mengindikasikan bahwa paparan rebusan daun sirih merah 10% mampu menurunkan produksi asam dari S. sobrinus . Setelah 24 jam, jumlah koloni bakteri S. sobrinus pada kelompok yang terpapar rebusan daun  sirih  merah  10%  secara  signifikan  lebih  sedikit  dibandingkan  kelompok  kontrol  negative  (p<  0,05),  tapi  secara Edisi Cetak Dentika Dental Journal, Desember 2013 (ISSN: 1693-671X)
signifikan  lebih  banyak  dibandingkan  kelompok  kontrol  positif  (p<  0,05).  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  paparan rebusan daun sirih merah 10% dapat menurunkan jumlah koloni S. sobrinus . Dari hasil penelitian ini disimpulkan bahwa rebusan daun sirih merah 10% mempunyai potensi antikariogenik karena mempunyai kemampuan menurunkan produksi asam dan laju pertumbuhan S. sobrinus .
Kata kunci: Streptococcus sobrinus , pertumbuhan bakteri, produksi asam, daun sirih merah

## PENDAHULUAN
Karies  merupakan  penyakit  infeksi  kronis  yang menyebabkan  destruksi  jaringan  keras  gigi.  Pre- valensi penyakit ini sangat tinggi, terutama di negara sedang  berkembang.  Berdasarkan  data  hasil  Riset Kesehatan  Dasar  Badan  Penelitian  dan  Pe- ngembangan  Kesehatan  Kementerian  Kesehatan Republik  Indonesia  tahun  2007,  diketahui  bahwa jumlah  penderita  karies  di  Indonesia  masih  sangat tinggi. Prevalensi karies aktif penduduk di Indonesia mencapai 43,4%, sedangkan persen pengalaman ka- ries mencapai 67,2%. 1
Karies merupakan penyakit multifaktorial. Faktor- faktor  yang  berperan  dalam  terjadinya  lesi  karies yaitu  bakteri,  diet  terutama  karbohidrat,  saliva,  dan gigi. 2 Penyakit ini terjadi akibat interaksi antara bak- teri  kariogenik  dengan  diet  pada  host  yang  rentan. Bakteri  kariogenik  tersebut  antara  lain Streptococ- cus sobrinus, Streptococcus mutans, dan Lactobacil- lus acidophilus. Asam laktat dan asam organik lain- nya  hasil  metabolisme  bakteri  kariogenik  akan mengakibatkan  demineralisasi  jaringan  keras  gigi sehingga menimbulkan lesi pada  gigi. 3
Streptococcus  sobrinus merupakan  bakteri  Gram positif,  berbentuk  bulat,  yang  bersifat  non  motil. Bakteri  ini  sering diisolasi dari  lesi  karies.  Individu dengan  konsentrasi S.  sobrinus dalam  saliva  yang tinggi akan didapatkan lesi karies yang lebih banyak bila  dibandingkan  individudengan  konsentrasi S. sobrinus yang  rendah. 4 Faktor-faktor  virulensi S. sobrinus yang  berperan  penting  dalam  patogenesis karies  adalah  kemampuan  bakteri  ini  dalam  meng- hasilkan  asam  ( acidogenic) dan  kemampuannya untuk  dapat  tetap  berkembang  biak  dalam  suasana asam  ( aciduric) .  Asam  yang  dihasilkan  oleh S. sobrinus akan  menyebabkan  demineralisasi  email gigi,  sehingga  terbentuk  lesi  karies.  Selain  itu, bak- teri  ini  mampu  memproduksi  glukosiltransferase. Glukosiltransferase  merupakan  enzim  yang  ber- peran  sebagai  katalisator  sintesis  glukan  dari  suk- rosa. Glukan berperan penting dalam perlekatan dan kolonisasi  bakteri  pada  permukaan  gigi  sehingga terbentuk plak. 5 Kontrol pertumbuhan bakteri kario- genik  termasuk S.sobrinus dan  faktor virulensinya dalam rongga mulut merupakan salah satu tahap penting dalam upaya pencegahan karies. 6
Upaya  pencegahan  karies yang  paling sederhana
adalah  dengan  menyikat  permukaan  gigi,  namun menyikat gigi secara adekuat untuk menghilangkan plak yang melekat pada seluruh permukaan gigi ter- kadang sulit dilakukan, karena tidak terjangkau oleh bulu-bulu  sikat  gigi.  Untuk  mengatasi  hal  tersebut diperlukan  tambahan  bahan  kimiawi  misalnya  obat kumur yang bersifat antiseptik. Obat kumur dengan berbagai merek dagang banyak  tersedia di pasaran, namun  harganya  relatif  mahal  sehingga  tidak  ter- jangkau oleh masyarakat luas. 7
Sejak jaman dahulu, tanaman obat sudah sering di- gunakan  secara  tradisional  untuk  pengobatan  ber- bagai  macam  penyakit.  Sirih  merah  merupakan  sa- lah satu tanaman yang banyak ditanam oleh masya- rakat  Indonesia.  Secara tradisional,  tanaman  ini  ba- nyak  digunakan  oleh  masyarakat  untuk  mengobati penyakit-penyakit gusi berdarah, sariawan, gigi ber- lubang,  bau  mulut,  dan  radang  tenggorokan. 8 Daun sirih  merah  mengandung  flavonoid,  alkaloid,  se- nyawa  polifenolat,  tannin  dan  minyak  atsiri  yang mempunyai  aktivitas  sebagai  antibakteri.  Hasil penelitian  yang dilakukan oleh Juliantina dkk. 9 me- nunjukkan  bahwa  ekstrak  sirih  merah  konsentrasi 25%  bersifat  antibakteri  terhadap Staphylococcus aureus ,  sedangkan  konsentrasi  6,25%  dapat  meng- hambat pertumbuhan Escherichia coli .
Pada  saat  ini,  penelitian  untuk  menggali  potensi tanaman  obat  sebagai  sumber  komponen  obat-obat antibakteri,  antifungal,  antiviral  dan  antikanker  se- makin berkembang. Dalam bidang kedokteran gigi, penelitian  untuk  mengetahui  potensi  tanaman  obat sebagai  alternatif  bahan  pencegah  karies  juga  se- makin  dikembangkan. 10-12 Adanya  zat-zat  aktif  da- lam  daun  sirih  merah  yang  bersifat  sebagai  anti- bakteri, serta penggunaannya secara tradisional oleh masyarakat  sebagai  obat  untuk  menjaga  kesehatan rongga mulut, maka kemungkinan daun sirih merah berpotensi sebagai bahan antiseptik obat kumur. Pe- nelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi anti- kariogenik  rebusan  daun  sirih  merah  dengan  me- nguji produksi asam dan laju pertumbuhan Strepto- coccus sobrinus setelah  terpapar rebusan daun sirih merah .

## BAHAN DAN METODE
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris.  Rebusan  daun  sirih  merah  konsentrasi
10% dibuat dengan cara merebus 10 gram daun sirih merah ( Piper crocatum ) dalam air sebanyak 200 ml sampai  mendidih  dan  air  rebusan  tersisa  100  ml. Rebusan  daun  sirih  merah  konsentrasi  5%  dibuat dengan mencampur 50 ml rebusan daun sirih merah konsentrasi 10% dengan 50 ml akuades.
Produksi  asam  diuji  dengan  menambahkan  re- busan daun  sirih merah  konsentrasi 5%, 10%,  kon- trol  negatif(akuades)  dan  kontrol  positif  (Listerine) pada  tabung  yang  berisi  5  ml  media brain  heart infusionbroth (BHI) yang mengandung 1% glukosa (pH  7,1).  Tabung-tabung  tersebut  kemudian  diino- kulasi dengan 10 6 sel bakteri S. sobrinus OMZ176.
Selanjutnya  seluruh  tabung  diinkubasi  pada  suhu 37 o C.  Produksi  asam  ditentukan  dengan  mengukur pH  media  kultur  dengan  menggunakan  pH  meter sesaat setelah dicampur (0), 1, 2, 4, 6, dan 8 jam se- telah  paparan.  Laju  pertumbuhan  dimonitor  secara turbidimetri  dengan  mengukur  absorbansi  media kultur  pada  panjang  gelombang  550  nm  dengan menggunakan  spektrometer  pada  waktu-waktu  ter- sebut.  Setelah  24  jam,  media  kultur  ditanam  pada media BHI dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C.  Data  diperoleh  dengan  menghitung  jumlah koloni  bakteri  yang  tumbuh  pada  media  dikalikan dengan faktor pengenceran.
Dilakukan  replikasi  3  kali  pada  seluruh  prosedur penelitian. Data produksi asam dan laju pertumbuh- an  dianalisis  dengan  menggunakan  uji  statistik Kruskal Wallis dan Mann Whitney, sedangkan jum- lah koloni bakteri dianalisis dengan uji T.

## HASIL
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  sesaat  se- telah paparan rebusan daun  sirih merah konsentrasi 5%, 10%, dan akuades tidak menyebabkan pH me- dia  kultur  bakteri  menurun  (Gambar  1).  Namun paparan Listerine (kontrol positif) menyebabkan pH media turun. Hasil uji Kruskal-Wallis menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan pH yang signifikan (p> 0,05) antar kelompok rebusan daun sirih merah 5%,  10%,  dan  kontrol  negatif.  Hal  tersebut  meng- indikasikan  bahwa  paparan  rebusan  daun  sirih  me- rah  mempunyai  efek  yang  sama  dengan  akuades, yaitu  tidak  menyebabkan  penurunan  pH.  Setelah  4 jam,  pH  media  kultur  bakteri  pada  kelompok  yang terpapar  rebusan  daun  sirih  merah  5%,  10%,  dan kontrol  negatif  tampak  sedikit  menurun,  dan  se- makin menurun setelah 6 jam.
Pada  pengamatan  6  dan  8  jam,  pH  media  kultur kelompok  yang  terpapar  rebusan  daun  sirih  merah 10% tampak  lebih tinggi bila dibandingkan kelom- pok  yang  lain.  Hasil  uji  Mann-Whitney  menunjuk- kan  bahwa  terdapat  perbedaan  yang  signifikan  (p<
0,05)  pH  media  kultur  antara  kelompok  yang  ter- papar  rebusan  sirih  merah  10%  bila  dibandingkan dengan rebusan sirih merah 5% dan kontrol negative pada pengamatan 4, 6, dan 8 jam. Hal ini menunjuk- kan  bahwa  rebusan  daun  sirih  merah  10%  mampu menurunkan produksi asam dari S. sobrinus.
Gambar 1. pH media kultursetelah terpapar rebusan daun sirih merah
Gambar 2. Laju pertumbuhan S. sobrinus setelah terpapar rebusan daun sirih merah
Hasil uji Kruskal-Wallis menunjukkan bahwa ter- dapat  perbedaan  absorbansi  yang  signifikan  antar kelompok (p< 0,05), mengindikasikan bahwa rebus- an daun sirih merah berpengaruh terhadap laju per- tumbuhan S. sobrinus. Pada Gambar 2 tampak bah- wa  absorbansi  media  kultur  mulai  meningkat  pada semua kelompok setelah 2 jam, kecuali pada kelom- pok rebusan daun sirih merah 10% dan kontrol posi- tif.  Hasil  uji  Mann  Whitney  menunjukkan  bahwa pa-da  pengamatan  4  dan  6  jam  terdapat  perbedaan yang signifikan (p< 0,05) absorbansi pada kelompok yang terpapar rebusan daun sirih merah 10% bila di- bandingkan  dengan  rebusan  daun  sirih  merah  5% dan kontrol negatif, namun tidak terdapat perbedaan yang signifikan (p> 0,05) bila dibandingkan dengan kontrol  positif.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pada pengamatan 4 dan 6 jam laju pertumbuhan S. sobri- nus lebih rendah setelah terpapar rebusan daun sirih merah  10%  bila  dibandingkan  dengan  kelompok rebusan  daun  sirih  merah  5%  dan  kontrol  negatif, namun  sama   dengan laju pertumbuhan S. sobrinus Edisi Cetak Dentika Dental Journal, Desember 2013 (ISSN: 1693-671X)
yang terpapar dengan kontrol positif.
Gambar 3. Jumlah  koloni S.  sobrinus setelah  terpapar rebusan daun sirih merah
Hasil  perhitungan  jumlah  koloni S.  sobrinus se- telah diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam de- ngan  rebusan  daun  sirih  merah  10%  menunjukkan bahwa  jumlah  koloni S.  sobrinus lebih  sedikit  di- bandingkan  kontrol  negatif.  Tidak  tampak  koloni S.  sobrinus tumbuh  pada  kelompok  kontrol  positif (Gambar  3).  Hasil  uji  t  menunjukkan  bahwa  ter- dapat  perbedaan  yang  bermakna  (p<  0,05)  antara jumlah  koloni S.  sobrinus setelah  terpapar  rebusan daun  sirih  merah  10%  bila  dibandingkan  dengan kontrol  negatif  dan  kontrol  positif.  Hal  ini  me- nunjukkan bahwa paparan rebusan daun sirih merah 10%  dapat  menurunkan  jumlah  koloni S.  sobrinus, walaupun efeknya tidak sebaik kontrol positif.

## PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  paparan rebusan  sirih  merah  menyebabkan  penurunan  pro- duksi asam dan laju pertumbuhan S.sobrinus. Hasil uji laju pertumbuhan S. sobrinus yang diukur secara turbidimetri serta perhitungan jumlah koloni bakteri menunjukkan  bahwa  terjadi  penurunan  laju  per- tumbuhan S.sobrinus setelah  terpapar  rebusan daun sirih  merah  konsentrasi  10%.  Hal  ini  mungkin karena  rebusan  daun  sirih  merah  mengandung  zat- zat yang mempunyai kemampuan antibakteri antara lain flavonoid, tanin, dan saponin. 9
Senyawa  flavonoid  dan  tanin  merupakan  turunan fenol  yang  bersifat  antibakteri  karena  mampu  ber- interaksi dengan protein, enzim, dan lipid dari mem- bran  sel  bakteri,    sehingga  merubah  permeabilitas sel  dan  menyebabkan  lepasnya  proton,  ion  dan makromolekul  yang  berakibat  lisis  membran  sel. Selain  itu,  apabila  senyawa-senyawa  tersebut  me- lewati  membran  sel  bakteri,  akan  merusak  enzim dan  mendenaturasi  protein  intraseluler  yang  dapat berakibat kematian sel bakteri. 13
Saponin  bersifat  sebagai surfactant  agent yang kuat,  karena dapat  menurunkan  tegangan permuka- an  antar  sel.  Saponin  yang  diabsorpsi  pada  per- mukaan  sel  akan  menyebabkan  kerusakan  sel  bak-
teri  dengan  meningkatnya  permeabilitas  membran, sehingga  bahan-bahan  esensial  yang  dibutuhkan oleh  bakteri  untuk  hidup  menjadi  hilang  dan  me- nyebabkan kematian sel. 14
Kemampuan untuk menghasilkan asam dan hidup dalam suasana asam merupakan faktor virulensi dari S.  sobrinus dalam  menyebabkan  karies.  Asam  di- hasilkan  oleh  bakteri S.  sobrinus sebagai  hasil  fer- mentasi glukosa yang dapat menyebabkan dekalsifi- kasi email gigi sehingga menginisiasi terjadinya ka- ries. Dari hasil penelitian sebelumnya diketahui bah- wa S. sobrinus mempunyai kemampuan yang lebih kuat dalam menghasilkan asam daripada S. mutans. Penelitian ini membuktikan bahwa produksi asam S. sobrinus menurun  setelah  terpapar  rebusan  daun sirih  merah  konsentrasi  10%.  Hal  ini  mungkin  di- sebabkan  karena  kemampuan  rebusan  daun  sirih merah  konsentrasi  10%  dalam  menurunkan  laju pertumbuhan  bakteri.  Apabila  jumlah  bakteri S. sobrinus menurun  maka  produksi  asamnya  juga akan menurun. Selain itu, mungkin juga disebabkan karena  rebusan  daun  sirih  merah  berpengaruh  ter- hadap  kemampuan  glikolisis  bakteri. Streptococcus sobrinus yang  terpapar  senyawa  turunan  fenol  ke- mungkinan  mampu  meningkatkan  regulasi  protein- protein  yang  berhubungan  dengan  mekanisme  per- tahanan  dirinya  untuk  melindungi  sel  sehingga  sel tetap  bertahan  hidup  namun  pada  saat  yang  ber- samaan  menurunkan  laju  metabolismenya. 13 Ke- mungkinan lain dari kemampuan rebusan daun sirih merah  konsentrasi  10%  dalam  menurunkan  ke- mampuan  produksi  asam  dari S.  sobrinus adalah karena  komponen-komponen  dari  rebusan  daun sirih  merah  mampu  mengganggu  membran  yang berhubungan  dengan  enzim  yang  berfungsi  dalam transport  gula,  enzim-enzim  glikolitik  dan  ekspresi protein-protein  yang berkaitan dengan metabolisme bakteri. 15
Pada  penelitian  ini  digunakan  Listerine  sebagai kontrol  positif,  karena  merupakan  salah  satu  obat kumur  yang  banyak  digunakan  oleh  masyarakat. Listerine  mengandung  bahan  aktif thymol , eucaly- ptol , methylsalicylate dan menthol . Thymol dan eu- calyptol bersifat  antibakteri  karena  dapat  merusak dinding  sel  dan  menghambat  aktivitas  enzim  se- hingga menyebabkan lisis sel. Selain itu, bahan ter- sebut  juga  mampu  mencegah  agregasi  bakteridan menurunkan kecepatan replikasi bakteri. 16 Hasil  pe- nelitian  ini  membuktikan  bahwa  Listerine  efektif membunuh  bakteri S.  sobrinus ,  namun  paparannya menyebabkan  turunnya pH media  kultur. Hasil  ter- sebut  didukung  hasil  penelitian  Cavalcanti  dkk. 17 bahwa  Listerine  mempunyai  pH  kurang  dari  5,5, sehingga  paparandalam  jangka  waktu  lama  ber- potensi  menyebabkan  erosi  pada  email.  Dari  hasil
penelitian ini disimpulkan bahwa rebusan daun sirih merah  konsentrasi  10%  mempunyai  potensi  anti- kariogenik  karena  mempunyai  kemampuan  dalam menurunkan  produksi  asam  dan  laju  pertumbuhan S. sobrinus .

## Daftar Pustaka
1. Kementerian  Kesehatan  RI,  Riset  kesehatan  dasar 2007, Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kementerian Kesehatan RI, 2008.
2. Fejerskov  O,  Kidd,  EAM,  Nyvad  B,  Baelum  V. Defining the disease: an introduction. In:  Fejerskov O,  Kidd  E.  eds.  Dental  caries  the  disease  and  its clinical  management.  2 nd ed.  Oxford:  Blackwell Munksgaard Ltd, 2008: 4.
3. Ritter AV, Eidson RS, Donovan TE. Dental caries: etiology,  clinical  characteristics,  risk  assessment, and management. In: Heymann HO, Swift EJ, Ritter AV.  eds.  Studevant’s  art  and  science  of  operative dentistry.  6 th ed.  Singapore:  Elsevier  Pte  Ltd,  2012: 41-6.
4. Jiang  Q, Yu  M, Min  Z, Yi  A,  Chen  D, Zhang  Q. AP-PCR  detection  of  Streptococcus  mutans  and Streptococcus  sobrinus  in  caries-free  and  caries- active  subjects.  Mol  Cell  Biochem  2012;  365: 159-64.
5. Beighton  D.  Can the  ecology of the  dental  biofilm be  beneficially  altered?  Adv  Dent  Res  2009;  21: 69-73.
6. Forssten SD, Björklund M, Ouwehan AC. Strepto- coccus  mutans,  caries  and  simulation  models. Nutrients 2010; 2: 290-8.
7. Li L, Guo L, Lux R, Eckert R, Yarbrough D, He J, Anderson M, Shi W. Targeted antimicrobial therapy against  Streptococcus  mutans  establishes  protective non-cariogenic oral biofilms and reduces subsequent
infection.  Int J Oral Sci 2010; 2:66-73.
8. Werdhany  WI,  Marton  A,  Setyorini.  Sirih  Merah. Sleman:  Balai  Pengkajian  Teknologi  Pertanian Yogyakarta. 2008.
9. Juliantina F, Citra, DA, Nirwani, B, Nurmasitoh, T, Bowo  ET.  Manfaat  sirih  merah  sebagai  agen  anti bakterial  terhadap  bakteri  gram  positif  dan  gram negatif. JKKI 2009: 1(1).
10. Song J, Kim a S, Chang K, Han S, Yi H, Jeon J. In vitro inhibitory effects of Polygonumcuspidatum on bacterial  viability  and  virulence  factors  of  Strepto- coccus  mutans  and  Streptococcus  sobrinus.  Arch Oral Biol 2006; 51: 1131-40.
11. Koo  H,  Jeon  JG. Naturally  occurring  molecules  as alternative  therapeutic  agents  against  cariogenic biofilms. Adv Dent Res 2009; 21: 63-8.
12. Fathilah AR. Piper betle L. and Psidium guajava L. in oral  health  maintenance.  J Med Plant Res 2011; 5(2): 156-163.
13. Petti  S,  Scully  C.  Polyphenols,  oral  health  and disease: A review. J Dent 2009; 37: 413-23.
14. Augustin  JM,  Kuzina  V,  Andersen  SB,  Bak  S. Molecular  activities,  biosynthesis  and  evolution of  triterpenoid  saponins.  J  Phytochem  2011;  72: 435-57.
15. Jeon JG, Rosalen PL, Falsetta ML, Koo H. Natural products  in caries research: current (limited) know- ledge, challenges and future perspective. Caries Res 2011; 45: 243-63.
16. Allaker  RP,  Douglas  CWI.  Novel  anti-microbial therapies  for  dental  plaque-related  diseases.  Int  J Antimicrob Agents 2009; 33: 8-13.
17. Cavalcanti  AL,  Ramos  IA,  Leite  RB,  Olivei  MC, Menezes KM, Fernandez LV, Castro RD, Viera FF. Endogenous  pH,  titrable  acidity  and  total  soluble solid content of mouthwashes available in Brazillian market. Eur J Dent 2010; 4(2): 156-9.