Aktivitas Sitotoksik dan Antiproliferasi Fraksi n-Heksan Biji Alpukat ( Percea americana Mill.) Terhadap sel T47D
Cytotoxic and Antiproliferation Activity of n-Hexane Fraction of Avocado seed ( Percea americana Mill) on T47D cell
Juwita Rahmawati, *Maryati Maryati
Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta ,Jl. Ahmad Yani, Pabelan, Kartasura, Surakarta 57162 *E-mail: maryati@ums.ac.id
Received: 27 Mei 2021; Accepted: 08 Juni 2021; Published: 30 Juni 2021

## Abstrak
Tanaman  alpukat  banyak  digunakan  dalam  pengobatan  tradisional  di  Indonesia.  Tujuan  penelitian  ini  untuk mengetahui  aktivitas  sitotoksik  dan  antiproliferasi  biji  buah  alpukat  terhadap  sel  T47D.  Ekstraksi  dilakukan dengan maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Fraksinasi dilakukan dengan fraksinasi cair-cair dengan pel- arut heksan dan etil asetat. Uji sitotoksik dan antiproliferasi dilakukan dengan metode MTT. Pengamatan apop- tosis dilakukan dengan double stainning menggunakan campuran acridine orange dan propidium iodide . Hasil uji  menunjukkan  bahwa  fraksi  n-heksan  memiliki  aktivitas  sitotoksik  dengan  nilai  IC 50 sebesar  27,9  µg/mL. Fraksi n-heksan  mampu menghambat proliferasi sel dan menginduksi apoptosis pada sel T47D. Kata kunci : Percea americana Mill., T47D, MTT, sitotoksik, Apoptosis

## Abtract
Avocado  plants  are  widely  used  as  traditional  medicine  in  Indonesia.  This  research  aimed  to  determine  the cytotoxic and antiproliferation activity of avocado seed extract and fractions on the T47D breast cancer cell line. Extraction was done by maceration method using 96% ethanol, then fractionation was done by liquid-liquid partition using n-hexane, chloroform, and ethyl acetate. Cytotoxic and antiproliferation tests were done by the MTT  method.  Apoptosis  activity  was  investigated  by  the  double  staining  method,  using  acridine  orange- propidium  iodide  as  a  staining  reagent.  Results  showed  that  the  n-hexane  fraction  of  avocado  seed  had  a cytotoxic activity with IC 50 27.9 µg/mL. N-hexane fraction of avocado seed inhibited proliferation and induced apoptosis of T47D cell line.
Keywords : Percea americana Mill., breast cancer, MTT, cytotoxic, Apoptosis

## PENDAHULUAN
Kanker payudara memiliki prevalensi yang  cukup  tinggi.  Hingga  2018  tercatat  2,1 juta  kasus  kanker  payudara  dengan  angka kematian  sebesar  627.000  (6,6%)  di  seluruh dunia  (WHO,  2018).  Di  Indonesia  sendiri, angka  kejadian  kanker  payudara    hingga tahun  2018    sebanyak  58.256  kasus  (WHO, 2019).  Kasus  kanker  payudara  diprediksi akan  terus  meningkat  pada  tahun-tahun mendatang, terutama pada negara berkembang (Momenimovahed & Salehiniya, 2019). Terapi kanker payudara yang digunakan  saat  ini  masih  memiliki  banyak kekurangan,  seperti  efek  samping  yang merugikan,  efikasi yang  kurang,  dan mahalnya biaya terapi. Hal tersebut mendorong  dilakukannya  eksplorasi  bahan
alam  yang  berpotensi  sebagai  agen  terapi kanker  payudara,  salah  satunya  adalah alpukat. Tanaman alpukat ( Percea americana Mill.)  diketahui  memiliki  banyak  manfaat bagi kesehatan, diantaranya adalah antihiperglikemi  (Ezejiofor et  al .,  2013), antihipertensi (Désiré et al ., 2014), hepatoprotektif  (Mahmoed  dan  Rezq,  2013), antiosteoartritis  (Christiansen  et  al.,  2015), dan kemoprotektif (Paul et a l., 2011). Selain itu  alpukat  memiliki  aktivitas  antioksidan, antibakteri,  dan  sitotoksik  (Melgar et  al ., 2018). Ekstrak etanol daun alpukat diketahui memiliki  aktivitas  sitotoksik  terhadap  sel HeLa,  dengan  nilai  IC 50 sebesar  360  µg/ml (Mardiyaningsih  &  Ismiyati,  2014).  Biji alpukat  merupakan  bagian  dari  tanaman alpukat  dengan  aktivitas  farmakologi  yang
cukup potensial untuk dimanfaatkan. Berdasarkan  penelitian  Morcuende et  al (2011)  biji  alpukat  menunjukkan  aktivitas antioksidan yang tinggi.
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah untuk  mengetahui  aktivitas  sitotoksik  biji alpukat  ( Percea  americana Mill.)  dan mekanisme  aksinya  terhadap  sel  kanker payudara T47D. Hasil penelitian ini diharapkan  dapat  menjadi  dasar  pengem- bangan biji alpukat sebagai agen terapi kanker payudara  dan  menjadi  kontribusi  positif dalam  perkembangan  pengobatan  kanker payudara.

## METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  yaitu  timbangan analitik (Precisia, XT 120A), rotary evaporator (IKA RV8), waterbath (Heidolph), inkubator CO 2 (Binder), cytotoxic safety  cabinet (ESCO),  ELISA reader (Elx800  Bio-tech) ,  inverted  microscope (Olympus), mikropipet (Socorex), hemositometer (Neubauer) kamera mikroskop (Optilab), confocal laser scanning microscope (Zeis 900).
Bahan  yang  digunakan:  biji  alpukat ( Persea americana Mill.) yang diperoleh dari Desa  Nargoyoso  Kemuning  Tawangmangu, Kabupaten  Kranganyar,  sel  kanker  payudara T47D dan sel normal (Vero), etanol 96%, n- heksan,  kloroform,  etil  asetat,  aquadest, RPMI  1640  ( Rosewell  Park  Memorial Institue )  (Gibco),  NaHCO 3 (Merck),  DMSO 10%  (Merck),  HCl  1M  (Merck),  NaOH  1M (Merck),  FBS  10%  ( Fetal  Bovine  Serum ) (Gibco), antibiotik penisilin-streptomisin 3% (Gibco),  tripsin  0,025%  (Sigma),  PBS ( Phosphat  Buffered  Saline )  (Invitrogen), reagen MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) difenil tetrazolium  bromida)  (Invitrogen),  larutan SDS  ( Sodium  Dodesil  Sulfate )  (Merck), acridine  orange (Merck) ,  propidium  iodide (Merck) , doxorubicin  (Kalbe), well  plate  96 (Iwaki), well  plate  24 (Iwaki), plastic  round cover slips (Thermanox, Fisher Scientific).

## Ekstraksi dan Fraksinasi
Biji  alpukat  dipotong  kecil-kecil, kemudian  dikeringkan.  Simplisia  kering dimaserasi menggunakan etanol 96%, remaserasi dilakukan 2x. Pengentalan ekstrak dilakukan  menggunakan rotary  evaporator dilanjutkan dengan waterbath. Ekstrak kental yang diperoleh, selanjutnya difraksinasi cair- cair dengan pelarut n-heksan, kloroform, dan etil  asetat,  sehingga  diperoleh  3  fraksi  cair. Fraksi  cair  diuapkan  menggunakan rotary evaporator dan waterbath hingga  diperoleh fraksi  kental.  Ekstrak  dan  fraksi  selanjutnya diuji aktivitas sitotoksiknya.
Uji Sitotoksik
Suspensi  sel  T47D  dalam  medium RPMI  1640  sebanyak  100  l  (kepadatan  10 4 sel/sumuran) dimasukkan ke dalam wellplate 96  dan  diinkubasi  selama  24  jam  dalam inkubator  CO 2 5%.  Kemudian  ditambahkan 100  l seri konsentrasi sampel dalam medium pada  tiap  sumuran.    Plate  diinkubasi  dalam inkubator CO 2 5% selama 24 jam pada suhu 37 0 C.  Setelah  itu  ditambahkan  100  l  MTT 0,01% dalam PBS,  diinkubasi selama 2 jam pada  suhu  37°C.  Sel  hidup  akan  bereaksi dengan MTT membentuk formazan tidak larut yang berwarna ungu. Selanjutnya ditambahkan larutan stopper SDS dalam HCl 10%  dan  ditutup  rapat  dengan  alumunium foil.  Plate  diinkubasi  selama  semalam  pada suhu  ruang.  Serapan  dari  formazan  dibaca dengan elisa reader pada panjang gelombang 550  nm.  Persentase  sel  hidup  dihitung  dari data  absorbansi.  Selanjutnya  dibuat  kurva hubungan log konsentrasi versus viabilitas sel untuk  menghitung  nilai  IC 50 nya  (CCRC, 2012)
Uji Selektivitas Sel Vero dengan kepadatan 10 4 ditanam dalam  plate  96  dan  diinkubasi  semalam.  Sel diberi  perlakuan  dengan  fraksi  n-heksan dengan  konsentrasi  25;  50;  75;  100;  125 µg/ml dan diinkubasi selama 24 jam. Larutan MTT 0,01% ditambahkan ke dalam sumuran dan  diinkubasi  selama  2  jam,  selanjutnya ditambah larutan stoper SDS dalam HCl 10%, plate  dibungkus  dengan  alumunium  foil  dan
diinkubasi dalam suhu ruang selama semalam.  Serapan  dari  formazan  dibaca dengan elisa reader pada panjang gelombang 550  nm  .  Selanjutnya  ditentukan  nilai  IC 50 pada  sel  Vero.  Nilai  selektivitas  dihitung menggunakan rumus berikut :

## 𝑆𝐼 = 𝐼𝐶50 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑒𝑙 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙 𝐼𝐶50 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑒𝑙 𝑘𝑎𝑛𝑘𝑒𝑟
Ekstrak  dikatakan  kurang  selektif  bila  SI<3 dan selektif jika SI>3 (Sutejo et al ., 2016).

## Uji Antiproliferasi
Pengamatan  penghambatan  proliferasi fraksi n-heksan terhadap sel T47D dilakukan dengan  metode  MTT.  Konsentrasi  sampel yang digunakan adalah konsentrasi di bawah nilai  IC 50 (15  µg/ml  dan  10  µg/ml). Pengamatan viabilitas sel dilakukan pada jam ke  0,  24,  48  dan  72  (CCRC,  2009).    Hasil absorbansi  digunakan  untuk  menghitung viabilitas  sel.  Nilai doubling  time ,  dihitung dengan  membuat  grafik  hubungan  lama inkubasi versus log  jumlah  sel  hidup, sehingga  didapatkan  persamaan  regresi liniear Y = Bx + A. Selanjutnya Y adalah nilai log  2  kali  jumlah  sel  hidup  di  awal,  dan  X adalah nilai doubling time (Wati et al ., 2016). Pengamatan  apoptosis  dengan double stainning menggunakan acridine  orange dan propidium iodide .
Sel  T47D  dengan  kepadatan  5x10 4 ditanam pada 24- well plate yang telah diberi cover  slips pada  dasar  sumuran  sebagai tempat  menempelnya  sel.  Setelah  inkubasi selama semalam, sel diberi perlakuan dengan fraksi  n-heksan  biji  alpukat  konsentrasi  15 µg/ml dan 25 µg/ml dan diinkubasi selama 24 jam  (CCRC,  2009a).  Campuran acridine orange 0,1%  dan propidium  iodide 0,1%
(dicampur dan diencerkan hingga konsentrasi 0,05%), digunakan untuk pewarna sel. Cover slips diambil dari sumuran dan ditetesi 10 µL campuran  pewarna,  kemudian  diamati  di bawah confocal laser scanning microscope.

## Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan menggunakan  aplikasi  SPSS  versi  20.  Uji paired  T  Test dilakukan  untuk  menilai signifikansi  perbedaan  nilai doubling  time antara  kelompok  perlakuan  dan  kelompok kontrol.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan uji aktivitas si- totoksik  ekstrak  etanol,  fraksi  heksan,  fraksi etil  asetat  biji  buah  alpukat  terhadap  sel T47D.  Doksorubisin  digunakan  sebagai kontrol positif.  Hasil uji menunjukkan bahwa fraksi heksan memiliki aktivitas paling tinggi dibanding sampel yang lain dengan nilai IC 50 sebesar  27,9  µg/mL  (Tabel  1),  maka penelitian  selanjutnya  dilakukan  terhadap fraksi  n-heksan  tersebut.  Gambar  2  menun- jukkan bahwa dengan adanya kenaikan kon- sentrasi fraksi n-heksan menyebabkan penurunan  viabilitas  sel  (fenomena dose  de- pendent ).
Aktivitas sitotoksik fraksi n-heksan biji alpukat  menimbulkan  perubahan  morfologi sel T47D. Sel T47D  yang tidak diberi perla- kuan fraksi n heksan terlihat berbentuk bulat pejal dan berwarna terang transparan dengan nukleus yang utuh. Perlakuan fraksi n-heksan biji alpukat menyebabkan perubahan morfologi  sel  T47D  menjadi  bentuk    saling beragregasi,  dan  terlihat  gelap.  Terlihat  juga tidak ada perbedaan morfologi yang nyata an- tara  sel  kontrol  dan  sel  T47D  dengan  perla- kuan  DMSO  konsentrasi  0,125%  v/v (Gambar 2).
Tabel 1. Aktivitas sitotoksik ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform, fraksi etil asetat biji al- pukat dan doksorubisin
Sampel IC 50 (  g/mL) Ekstrak 203,1 ± 29 Fraksi n-heksan 27,9 ± 4,3 Fraksi kloroform 214 ± 148 Fraksi etil asetat Tidak dapat dihitung Doksorubisin 8,47 ± 4,2
Gambar 1. Kenaikan konsentrasi fraksi n-heksan menyebabkan penurunan viabilitas sel T47D (%). Sel T47D diinkubasi dengan berbagai konsentrasi fraksi heksan selama 24 jam. Penentuan jumlah sel hidup dilakukan dengan metode MTT.
Gambar 2. Morfologi  kontrol sel T47D (A), sel T47D dalam DMSO konsentrasi 0,125% (B), sel T47D yang mendapat perlakuan fraksi n-heksan 125 µg/mL (C). Sel kontrol dan sel dalam DMSO 0,125% tidak berbeda nyata, tetapi ada perbedaaan nyata antara sel kontrol dan sel akibat perlakuan dengan fraksi heksan 125 µg/ml. (          ) adalah sel hidup, dan (            ) adalah sel mati.
Hasil  penelitian  ini  sejalan  dengan penelitian  sebelumnya,  yang  menyebutkan bahwa  asam  lemak  yang  terkandung  dalam fraksi n-heksan biji alpukat dapat menghambat  pertumbuhan  sel  kanker  kolon (Caco-2)  dengan  nilai  IC 50 28 µg/mL  (Lara- Márquez et  al .,  2020).  Selain  asam  lemak, isolat triterpenoid yang terkandung dalam biji alpukat  juga  dapat  menghambat  sel  kanker payudara (MCF7) dan kanker hepar (Hep-G2) dengan nilai IC 50 berturut-turut 62 µg/mL dan 12  µg/mL  (Nur et  al .,  2017).  Penelitian  lain juga  menunjukkan  aktivitas  sitotoksik  biji alpukat  pada  berbagai  sel  kanker.  Ekstrak kloroform  biji  alpukat  mampu  menghambat pertumbuhan  sel  MCF7  dengan  nilai  IC 50 94,87 µg/mL (Widiastuti et al ., 2018). Fraksi n-heksan  biji  alpukat  (200  µg/mL)  dapat memberikan  penghambatan  sebesar  81±3  %
pada  pertumbuhan  sel  kanker  paru-paru (A549) (Vo et al ., 2019). Ekstrak biji alpukat terbukti memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker prostat (LNCaP), sel kanker payudara (MCF7),  sel  kanker  kolon  (HT29),  dan  sel kanker  paru-paru  (H1299)  (Dabas et  al ., 2019). Penelitian sebelumnya pada sel MCF- 7  juga  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol, fraksi heksan, dan isolat triterpenoid dari biji buah  alpukat    memiliki  aktivitas  sitotoksik (Nur et al ., 2017).

## Uji Selektivitas
Efek  samping  merugikan  yang  terjadi selama  kemoterapi  kanker  payudara  seperti kebotakan,  gangguan  pencernaan,  anemia, hingga  gangguan seksualitas, muncul karena agen kemoterapi juga merusak sel-sel normal tubuh  (Dipiro et  al .,  2012).  Oleh  karena  itu
A B C
penting  untuk  menemukan  dan  mengem- bangkan agen anti kanker yang selektif  hanya bekerja    pada  sel  kanker  dan  tidak  merusak sel-sel normal lainnya. Pada penelitian ini dil- akukan uji selektivitas menggunakan sel nor- mal  Vero.  Sel  vero  adalah  sel  normal  yang dikultur dari sel ginjal African Green Monkey (Ammerman et  al .,  2009).  Uji  ini  bertujuan untuk mendapatkan gambaran awal toksisitas fraksi  heksan  biji  buah  alpukat  terhadap  sel normal.
Penilaian selektivitas dilakukan dengan membandingkan  nilai  IC 50 sampel  pada  sel normal  terhadap  nilai  IC 50 sampel  pada  sel kanker.  Sampel  dikatakan  selektif  apabila memiliki nilai SI ( Selectivitas Index ) ≥ 3, dan tidak selektif apabila nilai SI < 3 (Sutejo et al ., 2016). Hasil uji menunjukkan bahwa fraksi n- heksan biji alpukat memiliki nilai IC 50 sebesar 226,5  ±  21  µg/mL  pada  sel  vero,  sedangkan IC 50 fraksi n-heksan biji alpukat terhadap sel T47D  adalah  27,9  µg/mL.  Nilai  SI  fraksi  n- heksan  terhadap  sel  vero  adalah  8,12.  Hasil tersebut menunjukkan bahwa fraksi n-heksan biji alpukat selektif terhadap sel normal.
Aktivitas  sitotoksik  fraksi  heksan  biji buah alpukat terhadap sel T47D secara umum bergantung  pada  kemampuan  untuk  meng- hambat signal proliferasi dan kemampuan un- tuk  memacu  apoptosis  dengan  berbagai kemungkinan mekanismenya. Untuk menge- tahui  kemungkinan  mekanisme  pengham- batan  proliferasi  tersebut,  selanjutnya  dil- akukan uji pengamatan penghambatan prolif- erasi  sel  dan  pengamatan  apoptosis  dengan double  staining menggunakan propidium io- dine-akridin oranye.

## Uji Penghambatan Proliferasi sel
Uji  penghambatan  proliferasi  sel  dil- akukan  dengan  metode  MTT.  Uji  ini  untuk mengamati  efek  fraksi  n-heksan  terhadap waktu  penggandaan  sel  T47D  ( doubling time ). Doubling  time adalah  waktu  yang dibutuhkan  sel  untuk  berkembang  menjadi dua  kali  jumlahnya  (Mehrara et  al .,  2014). Senyawa  yang  dapat  menunda  waktu  peng- gandaan sel,  diduga dapat  menghambat  gen- gen  atau  protein  yang  meregulasi cell  cycle . Konsentrasi senyawa uji yang digunakan ada- lah 2 konsentrasi di bawah nilai IC 50 , agar sel
tidak terlalu banyak yang mati pada pengama- tan selama 72 jam akibat efek sitotoksik sen- yawa  uji  (Maryati et  al .,  2019).  Pada  uji pengamatan penghambatan proliferasi sel ini digunakan  konsentrasi  di  bawah  nilai  IC 50 yaitu  10  dan  15  µg/ml,  dan  konsentrasi DMSO 0,02%.
Hasil uji menunjukkan bahwa fraksi n- heksan biji alpukat pada konsentrasi di bawah IC 50 tidak  menghentikan cell  cycle tetapi menyebabkan cell  cycle  arrest yaitu  dapat menghambat  proliferasi  sel  T47D  (Tabel  2). Hasil  penelitian  ini  sejalan  dengan  beberapa penelitian  sebelumnya.  Penelitian  Dabas et al .,  2019  menyebutkan  bahwa  pemberian ekstrak  biji  alpukat  dengan  konsentrasi  42,5 µg/mL selama 12 jam dapat menginduksi cell cycle  arrest  pada  fase  sub  G0/G1  sel  kanker prostat  (LNCaP).  Pemberian ekstrak biji  al- pukat juga menyebabkan penurunan eksperesi Cyclin  D1  dan  Cylin  E2  tanpa  adanya  peru- bahan  pada  Cyclin  A  (Dabas et  al .,  2019). Diketahui  bahwa  Cyclin  D1  dan  Cylin  E2 adalah  protein  kinase  yang  mengatur  proses proliferasi  sel,  dengan  cara  mengirimkan transduksi sinyal internal pada setiap fase da- lam siklus sel (Malumbres & Barbacid, 2007). Senyawa  acetogenin  alifatik  yang  diisolasi dari buah alpukat diketahui dapat mengham- bat  proliferasi  sel  kanker  mulut  melalui mekanisme  penghambatan  fosforilasi  EGFR ( Epidermal Growth Factor Receptors ), ERK 1/2  ( Extracelullar-Signal-Regulated-Kinase 1/2),  dan  c-Raf  (Ser  338)  dalam  proses  per- tumbuhan  sel  kanker  (D’Ambrosio et  al ., 2011).
Hasil  perhitungan  diperoleh  bahwa fraksi n-heksan biji alpukat dengan konsentrasi  15  µg/mL  mempunyai doubling time sebesar 162,94 jam, sedangkan konsentrasi  10  µg/mL  memberikan  nilai doubling  time sebesar  111,77  jam.  Kedua nilai doubling time tersebut berbeda signifikan  (p  <  0.05)  jika  dibandingkan dengan nilai doubling time kontrol sel,  yaitu 66,01  jam.    Nilai doubling  time dapat menggambarkan  volume  pertumbuhan  sel kanker,  sehingga  sering  digunakan  untuk mengevaluasi  efikasi  berbagai  model  terapi anti kanker (Mehrara et al ., 2007).
Tabel 2. Efek Penghambatan Fraksi n-Heksan Biji Buah Alpukat terhadap Sel T47D
Waktu (Jam) % Penghambatan DMSO Fraksi n-Heksan (10 µg/mL) Fraksi n-Heksan (15 µg/mL) 24 3,27 27,42 35,01 48 4,22 30,23 39,19 72 223 31,73 39.33
Gambar 3. Morfologi sel T47D setelah pengecatan double stainning menggunakan propidium iodine- akridin oranye pada sel kontrol (A), perlakuan dengan fraksi heksan 15 µg/ml (B) dan fraksi heksan 25 µg/ml (C). Pada sel kontrol terlihat sel yang hidup berwarna hijau. Pada perlakuan dengan fraksi hek- san terlihat  sel mengalami apoptosis (fluorosensi merah) dan terlihat adanya fragmentasi DNA. (           ) sel normal (           )  sel yang kemungkinan apoptosis
Pengamatan  Apoptosis  dengan double stainning
Apoptosis  adalah  proses  kematian  sel yang  terprogram  yang  secara  normal  terjadi dalam siklus sel. Fungsi dari apoptosis adalah untuk menghilangkan sel-sel yang berbahaya, sel-sel  yang  rusak,  dan  sel-sel  yang  tidak diinginkan (Alenzi, 2014). Induksi apoptosis memiliki peran penting dalam perkembangan terapi  kanker,  sebab  sel  kanker  akan menginisasi kematiannya  sendiri  tanpa merusak  sel  normal  lainnya  (Wong,  2011). Uji apoptosis dalam penelitian ini menggunakan  metode double  stainning dengan  campuran acridine  orange dan propidium  iodide 0,05%  (Foglieni et  al ., 2001). Sel T47D yang telah diberi perlakuan fraksi n-heksan biji alpukat (25 µg/mL dan 15 µg/mL) kemudian diwarnai dengan campuran acridine orange dan propidium iodide 0,05%. Acridine  orange dapat  diabsorbsi  oleh  sel hidup  dan  sel  mati. Acridine  orange akan berikatan dengan DNA  untai ganda pada sel hidup, menghasilkan fluorosen hijau, sedangkan pada sel mati acridine orange akan berikatan  dengan  DNA  untai  tunggal, menghasilkan  fluorosen  berwarna  merah. Propidium  idode berinteraksi  dengan  asam
nukleat  sel  membentuk  fluorosen  merah, sehingga hanya dapat diabsorbsi oleh sel yang mengalami membrane blebbing . Pada penggunaan  bersamaan, propidium  iodide akan mengabsorbsi acridine orange pada sel mati, sehingga tidak menyebabkan hasil yang bias (Mascotti et al ., 2000).  Karakteristik sel yang mengalami apotosis adalah terbentuknya membrane blebbing, penyusutan  ukuran  sel,  fragmentasi  organel, dan nuclear  condensation (Bjelaković et  al ., 2005).  Hasil  uji    menunjukkan  bahwa pemberian  fraksi  n-heksan  biji  alpukat dengan konsentrasi 15 µg/mL dan 25 µg/mL dapat menginduksi apoptosis pada sel T47D. Hal  itu  terlihat  dari    sel  yang  berfluorosensi merah  pada  sel  T47D  yang  diberi  perlakuan fraksi n-heksan, sedangkan kontrol sel T47D (tanpa  perlakuan)  terlihat  sel  berfluorosensi hijau (Gambar 3).
Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa  tanaman  alpukat  dapat  menginduksi apoptosis  berbagai  sel  kanker.  Penelitian Veles-Pardo et  al (2014)  melaporkan  bahwa ekstrak  kulit  buah  alpukat,  ekstrak  biji alpukat,  ekstrak  bagian  dalam  biji  alpukat, dan ekstrak daun alpukat dapat menginduksi apoptosis pada sel jurkat leukimia
A
B
C
limfoblastik. Fraksi metanol ekstrak kloroform  biji alpukat  terbukti  dapat meningkatkan  (21,9%)  populasi  sel  MCF7 yang berada pada fase sub G1 dibandingkan dengan  kontrol  sel  (3,7%),  hasil  tersebut mengindikasikan terjadinya induksi apoptosis pada  sel  MCF7  (Widiastuti et  al .,  2018). Penelitian  lain  melaporkan  bahwa  ekstrak lipid  buah  alpukat    dapat  meningkatkan ekspresi  caspase8  dan  caspase  9  pada  sel kanker kolon (Caco-2) (Lara-Márquez et al ., 2020).
Data-data  di  atas  menunjukkan  bahwa fraksi n-heksan biji buah alpukat mempunyai kemampuan  menghambat  proliferasi  sel T47D.  Penghambatan  ini  mungkin  terjadi pada signal proliferasi atau melalui pengham- batan cell  cycle  progression dengan  meng- hambat  protoonkogen  seperti  CycD  atau
cdk4/6.  Mekanisme  lain  diduga  dengan  me- macu  terjadinya  apoptosis  dengan  memodu- lasi  ekspresi  protein  pengatur  apoptosis  sep- erti  p53,  Bax,  Bcl-2,  dan  NOXA.    (Velez- pardo,  2014).  Potensi  fraksi  n-heksan  biji buah  alpukat  sebagai  senyawa  antikanker perlu ditelusuri lebih lanjut untuk memastikan mekanisme  molekuler  aktivitas  antikanker tersebut.

## KESIMPULAN
Fraksi  n-heksan  biji  alpukat  memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker payudara T47D  dengan  nilai  IC 50 27,9  µg/mL  dan selektif terhadap sel normal (Vero).  Fraksi n- heksan  biji  alpukat  dapat  menghambat proliferasi sel dan menginduksi apoptosis sel T47D.

## Daftar Pustaka
Alenzi, F. 2014. Links between apoptosis, proliferation and the cell cycle, British Journal Of Biomedical Science, 61(2). https://doi.org/10.1080/09674845.2004.11732652
Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. 2009. Growth and Maintenance of Vero Cell Lines Nicole. NIH , 1–10. https://doi.org/10.1002/9780471729259.mca04es11.Growth Bjelaković,  G.,  Nagorni,  A.,  Bjelaković,  M.,  Stamenković,  I.,  Arsic,  R.,  Katic,  V.  2005. Apoptosis:  Programmed  Cell  Death  And  Its  Clinical  Implications,  Medicines  and Biology, 12(1), 6–11.
CCRC.  2009a.  Prosedur  Tetap  Pengamatan  Apoptosis  Dengan  Metode  Double  Stainning (CCRC-03-011-01).
CCRC. 2009b. Prosedur Tetap Uji Pengamatan Proliferasi Sel (Dubling Time) (CCRC-03-015- 01).
CCRC. 2012. Prosedur Tetap Uji Sitotoksik Metode MTT (CCRC-03-010-01). Christiansen, B. A., Bhatti, S., Goudarzi, R., Emami, S. 2015. Management of Osteoarthritis with Avocado / Soybean Unsaponifiables, Sage, 6(1), 30–44. https://doi.org/10.1177/1947603514554992
D’Ambrosio, S. M., Han, C., Pan, L., Kinghorn, A. D., Ding, H. 2011. Aliphatic acetogenin constituents of avocado fruits inhibit human oral cancer cell proliferation by targeting the EGFR/RAS/ RAF/MEK/ERK1/2 pathway, National  Institute Of Health,  10; 409(3),  1– 11. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2011.05.027.Aliphatic
Dabas, D., Elias, R. J., Ziegler, G. R., Lambert, J. D. 2019. In Vitro Antioxidant and Cancer Inhibitory  Activity  of  a  Colored  Avocado  Seed  Extract.  International  Journal  of  Food Science, 2019(2017). https://doi.org/10.1155/2019/6509421
Désiré, P., Dzeufiet, D., Mogueo, A., Bilanda, D. C., Aboubakar, B. O., Tédong, L., Dimo, T., Kamtchouing, P. 2014. Antihypertensive potential of the aqueous extract which combine leaf of Persea americana Mill . ( Lauraceae ), stems and leaf of Cymbopogon citratus ( D . C ) Stapf . ( Poaceae ), fruits of Citrus medical L . ( Rutaceae ) as well as honey in ethanol and s. Complementary and Alternative Medicine, 14 :507 , 1–12.
Dipiro,  J.  T.,  Wells,  B.  G.,  Schwingammer,  T.  L.,  &  Dipiro,  V.  C.  2012.  Pharmacotherapy Handbook (9th ed.). Mc Graw Hill Education.
Ezejiofor,  A.  N.,  Okorie,  A.,  &  Orisakwe,  E.  2013.  Hypoglycaemic  and  Tissue-Protective Effects of the Aqueous Extract of Persea Americana Seeds on Alloxan-Induced Albino Rats. Malays J Med Sci, 20(5), 31–39.
Foglieni,  C.,  Meoni,  C.,  &  Davalli,  A.  M.  2001.  Fluorescent  dyes  for  cell  viability:  An application on prefixed conditions, Springer, 115(April 2001), 223–229. https://doi.org/10.1007/s004180100249
Lara-Márquez,  M.,  Báez-Magaña,  M.,  Raymundo-Ramos,  C.,  Spagnuolo,  P.  A.,  Macías- Rodríguez,  L.,  Salgado-Garciglia,  R.,  Ochoa-Zarzosa,  A.,  López-Meza,  J.  E.  (2020). Lipid-rich  extract  from  Mexican  avocado  (Persea  americana  var.  drymifolia)  induces apoptosis and modulates the inflammatory response in Caco-2 human colon cancer cells. Journal of Functional Foods,
64(October
2019), 103658.
https://doi.org/10.1016/j.jff.2019.103658 Mahmoed, M. Y., dan Rezq, A. A. 2013. Hepatoprotective Effect of Avocado Fruits Against Carbon  Tetrachloride-Induced  Liver  Damage  in  Male  Rats.  World  Applied  Sciences Journal, 21(10), 1445–1452. https://doi.org/10.5829/idosi.wasj.2013.21.10.72160
Malumbres,  M.,  &  Barbacid,  M.  2007.  Cell  cycle  kinases  in  cancer.  Elsevier,  17,  60–65. https://doi.org/10.1016/j.gde.2006.12.008
Mardiyaningsih, A., dan Ismiyati, N. 2014. Cytotoxic Activity Of Ethanolic Extract Of Persea americana  Mill.  Leaves  On  HeLa  Cervical  Cancer  Cell.  Traditional  Medicine Journal,Raditional Medicine Journal, 19, 24–28.
Maryati, M., Sutrisna, E., Saifudin, A., Kusumaningrum, I., Abu bakar, M. . 2019. Extract of ceplukan ( Physalis angulata L .) inhibited proliferation and induced apoptosis in myeloma cell line.
Food Research, 3 (December), 755–760.
https://doi.org/10.26656/fr.2017.3(6).169
Mascotti,  K.,  Mccullough,  J.,  &  Burger,  S.  2000.  HPC  viability  measurement:  Trypan  blue versus  acridine  orange  and  propidium  iodide.  Transfusion,  40,  693–696. https://doi.org/10.1046/j.1537-2995.2000.40060693.x
Mehrara, E., Forssell-aronsson, E., Bernhardt, P. 2007. Specific Growth Rate versus Doubling Time for Quantitative Characterization Specific Growth Rate versus Doubling Time for Quantitative Characterization of Tumor Growth Rate, May 2014. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-06-3822
Melgar, B., Inês, M., Ciric, A., Sokovic, M., Garcia-castello, E. M., Rodriguez-lopez, A. D., Barros, L., Ferreira, I. C. R. F. 2018. Bioactive characterization of Persea americana Mill .  by-products :  A  rich  source  of  inherent  antioxidants,  Industrial  Crops  &  Products, 111(2017), 212–218. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2017.10.024
Momenimovahed,  Z.,  dan  Salehiniya,  H.  2019.  Epidemiological  characteristics  of  and  risk factors for breast cancer in the world. Dovepress, 11, 151–164.
Morcuende, D., Kylli, P., Est, M. 2011. Avocado ( Persea americana Mill .) Phenolics , In Vitro Antioxidant and Antimicrobial Activities , and Inhibition of Lipid and Protein Oxidation in Porcine Patties. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59, 5625–5635.
Nur, A., Abubakar, F., Achmadi, S. S., Suparto, I. H. 2017. Triterpenoid of avocado (Persea americana) seed and its cytotoxic activity toward breast MCF-7 and liver HepG2 cancer cells. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 7 (5), 397–400. https://doi.org/10.1016/j.apjtb.2017.01.010
Paul, R., Kulkarni, P., Ganesh, N. 2011. Avocado fruit (Persea americana Mill) exhibits chemo- protective  potentiality  against  cyclophosphamide  induced  genotoxicity  in  human lymphocyte culture. Journal of Experimental Therapeutics and Oncology, 9(3), 221–230.
Sutejo,  I.  R.,  Putri,  H.,  Meiyanto,  E.  2016.  Selektivitas  Ekstrak  Etanolik  Buah  Makassar
(Brucea javanica ) pada Kanker Payudara Metastasis secara In Vitro.The Selectivity of Ethanolic Extract of Buah Makassar ( Brucea javanica ) on In Vitro Study of Metastatic Breast Cancer, Journal of Agromedicine and Medical Sciences, 2 (1), 1–5.
Velez-pardo, C. 2014. Pro-apoptotic effect of Persea americana var. Hass (avocado) on Jurkat lymphoblastic leukemia cells. Informa Healthcare, 52 (4), 458–465. https://doi.org/10.3109/13880209.2013.842599
Vo, T. S., Le, P. U., Ngo, D. H. 2019. Free radical scavenging and anti-proliferative activities of avocado (Persea americana Mill.) seed extract. 9(3), 91–97. https://doi.org/10.4103/2221-1691.254602
Wati, E. M., Puspaningtyas, A. R., Pangaribowo, D. A. 2016. Uji Sitotoksisitas dan Proliferasi Senyawa  1-  (  4-nitrobenzoiloksi-  metil  )  -5-fluorourasil  terhadap  Sel  Kanker  Payudara MCF-7  methyl  )  -5-fluorouracil  )  on  Breast  Cancer  Cells  MCF-7).  Pustaka  Kesehatan,
4 (3), 484–488.
WHO. 2018. Latest global cancer data : Cancer burden rises to 18.1 million new cases and 9 . 6 million cancer deaths in 2018 Latest global cancer data : Cancer burden rises to 18.1 million  new  cases  and  9.6  million  cancer  deaths  in  2018.  International  Agency  for Research on Cancer, September, 13–15.
WHO.  2019.  Global  Cancer  Statistics:  Indonesia  Fact  Sheets,  International  Agency  for Research on Cancer, 256 , 1–2.
Widiastuti,  Y.,  Pratiwi,  R.,  Riyanto,  S.,  Wahyuono,  S.  2018.  Persea  americana  Mill  .  seed extract on MCF-7 cancer cell line.  Indonesian Journal of Biotechnology, 23(2), 61–67. https://doi.org/10.22146/ijbiotech.32141
Wong,  R.  S.  2011.  Apoptosis  in  cancer;  from  pathogenesis  to  treatment.  Journal  of Experimental & Clinical Cancer Research, 30 :87 (2), 1–14.