## UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL
HERBA ALFALFA ( Medicago sativa L.) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D DAN SEL KANKER LEHER RAHIM (SEL HeLa)

## SERTA UJI KANDUNGAN SENYAWA KIMIANYA
Devi Nisa Hidayati, Ibrahim Arifin, Sri Susilowati Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang

## ABSTRAK
Kanker  payudara  dan  kanker  leher  rahim  merupakan  jenis  penyakit    ganas  di Indonesia  maupun  dunia.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  potensi  sitotoksik fraksi etil asetat dari ekstrak etanol herba alfalfa terhadap sel kanker payudara (sel T47D) dan sel kanker leher rahim (sel HeLa) serta mengetahui kandungan kimianya.
Proses  ekstraksi  herba  alfalfa  dilakukan  dengan  metode  sokletasi  menggunakan pelarut etanol kemudian dilanjutkan fraksinasi secara bertingkat menggunakan n -heksan, kloroform, dietil eter dan etil asetat. Uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT dengan seri konsentrasi fraksi uji 1000; 500; 250; 125; 62,5 µg/ml terhadap kultur sel T47D dan sel  HeLa.  Data  berupa  absorbansi  sel  hidup  digunakan  untuk    menghitung  persentase kehidupan  sel  T47D  dan    sel  HeLa  kemudian  ditetapkan  IC 50 dengan  analisis  probit menggunakan SPSS  16  for  Windows .  Uji  kandungan  kimia  dilakukan  dengan  pereaksi kimia kemudian dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis (KLT).
Hasil    penelitian    menunjukkan  bahwa  fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  herba alfalfa memiliki efek sitotoksik terhadap sel T47D  namun tidak memiliki efek sitotoksik pada sel HeLa. Potensi sitotoksik fraksi etil asetat ekstrak etanol herba alfalfa terhadap sel T47D  yang    dinyatakan  dalam  nilai  IC 50 sebesar  1893,4  µg/ml.  Fraksi  etil  asetat  dari ekstrak etanol herba alfalfa mengandung flavonoid.
Kata  kunci:  Uji  sitotoksisitas,  fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  herba  alfalfa ( Medicago sativa L.), sel T47D, sel HeLa, flavonoid

## PENDAHULUAN
Kanker  payudara  yang  dalam  istilah  medis  biasa  disebut Carcinoma  Mammae muncul akibat terganggunya sistem pertumbuhan sel di dalam jaringan payudara. Kanker leher rahim merupakan salah satu penyakit yang menimbulkan dampak psikososial yang luas, terutama bagi pasien dan keluarganya.
Salah  satu  tanaman  yang  dipercaya  dapat  dijadikan  obat    adalah  alfalfa.  Alfalfa dipercaya dapat menyembuhkan berbagai macam penyakit diantaranya kanker (Astawan dan  Kasih,  2008).  Menurut  penelitian  Hong  dkk  (2011), Coumestrol merupakan komponen  fitoestrogen  dari  alfalfa.  Meningkatnya  kejadian  kanker  payudara  maupun kanker leher rahim, diperkirakan dipicu oleh hormon estrogen. Kelebihan estrogen yang menyebabkan  kanker  payudara  dapat  diturunkan  risikonya  dengan  asupan  tinggi fitoestrogen  karena  fitoestrogen  dapat  berikatan  dengan  reseptor  estrogen  pada  sel-sel payudara  sehingga  menurunkan  risiko  kanker  payudara  (Winarsi,  2005).  Bo-ping  dkk (2010) menyebutkan bahwa dalam ekstrak etanol alfalfa terkandung flavonoid. Fraksinasi dengan pelarut yang sesuai akan menghasilkan kandungan spesifik dari herba alfalfa yang memiliki aktivitas antikanker. Coumestrol merupakan isoflavonoid (Newall dkk., 1996). Isoflavonoid  merupakan  senyawa  flavonoid  yang  bersifat  kurang  polar  dapat  tersari dalam  etil  asetat (Andersen  dan  Markham,  2006).  Berdasarkan  berbagai  pernyataan  dan
penelitian tersebut, sangatlah menarik untuk melakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek  sitotoksik  herba  alfalfa.  Dalam  penelitian  ini  digunakan  fraksi  etil  asetat  ekstrak etanol herba alfalfa dan dilakukan secara in vitro terhadap sel T47D dan sel HeLa.

## METODOLOGI

## Bahan Penelitian
Herba  alfalfa  diperoleh  dari  kebun  alfalfa  di  Selo  Pass  Boyolali  Jawa  Tengah. Pelarut  etanol  96%, n -heksan,  kloroform,  dietil  eter  dan  etil  asetat.  sel  T47D  dan  sel HeLa, medium RPMI 1640, medium penumbuh mengandung growth factor 10% FBS – 0,5  %  fungison  –  2%  antibiotik  penisilin  dan  streptomisin  (GIPCO),  dimetil  sulfoksida (E.Merck), aquades, tripsin (Sigma), PBS, larutan MTT 5 mg/ml PBS, larutan SDS 10% dalam  HCl  0,01  N,  doksorubisin.  FeCl 3 ,  butanol,  asam  asetat,  aquades,  lempeng  KLT (Selulosa).

## Alat Penelitian
Alat  membuat  serbuk  dan    larutan  uji  adalah  blender  (Maspion),  ayakan  nomor  25 mesh,  timbangan  elektrik  (Acis),  seperangkat  alat  sokletasi,  corong  pisah ,  thermostatic waterbath (Memmert),  viskometer  (Rion  VT-04C).  Alat  pembuatan  kultur  sel  yaitu tangki  nitrogen  cair,  mikropipet  1  ml  (Gilson), conical  tube (Nunclon), petri  dish  flask (Nunclon), Laminar Air Flow Cabinet (Gelman Sciences), sentrifugator (Sarfal MC12V), mikroskop  fase  kontras  (Zeiss  MC  80)  dan  CO 2 Incubator (Heraeus).  Alat  untuk  panen sel  :  pipet  pasteur  steril, mikropipet  1  ml  dan  200  μl  (Gilson), conical  tube (Nunclon), mikroskop  fase  kontras  (Zeiss  MC  80), haemocytometer (Neubauer) ,  counter. Alat  uji sitotoksisitas yaitu timbangan elektrik (Sartorius), 96-well plate (Nunclon) , conical tube (Nunclon) , dan ELISA reader (SLT  240  ATC) . Alat  uji  KLT  adalah  lempeng  KLT, bejana kromatografi, pipa kapiler, sinar lampu UV λ 366.

## Jalannya Penelitian
1. Determinasi  Tanaman
Determinasi  terhadap  tanaman  dilakukan  di  Laboratorium  Ekologi  dan Biosistematika  Jurusan  Biologi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam Universitas Diponegoro Semarang.
2. Pembuatan Senyawa Uji
a. Pembuatan Serbuk
Herba Alfalfa dipanen pada bulan Februari-Maret tahun 2011. Herba alfalfa dicuci bersih  dan  dikeringkan  dengan  sinar  matahari  ditutupi  kain  hitam.  Simplisia  kering diblender. Serbuk diayak dengan ayakan ukuran 25 mesh, kemudian diukur kadar airnya dengan moisture balance .
b. Pembuatan Ekstrak Etanol Herba Alfalfa
Proses  sokletasi    dilakukan  12  kali  dengan  jumlah  total  serbuk  sebanyak  606,4 gram  menggunakan  5,5  liter  etanol  96%.  Serbuk  dibungkus  kertas  saring  kemudian dimasukkan ke dalam selongsong alat sokletasi dengan labu alas bulat 500 ml yang terisi kira-kira  450  ml  etanol  dan  beberapa  butir  batu  didih.  Serbuk  herba  alfalfa  diekstraksi dengan etanol 96% menggunakan alat soklet pada suhu 78 o C kemudian ditunggu hingga zat  aktif  dalam  simplisia  tersari  seluruhnya  yang  ditandai  dengan  jernihnya  cairan  yang lewat pada tabung sifron. Sari atau menstrum herba alfalfa diuapkan dengan thermostatic waterbath sampai diperoleh ekstrak kental. Kekentalan ekstrak diukur dengan viscometer.
Ekstrak  etanol  herba  alfalfa  yang  diperoleh  selanjutnya  dikumpulkan  dan  diukur bobotnya untuk menghitung rendemen yang dihasilkan.
c. Pembuatan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Herba Alfalfa
Ekstrak kental herba alfalfa yang diperoleh dilarutkan ke dalam campuran air dan etanol  dengan  perbandingan  9:1.  Selanjutnya,  difraksinasi  dengan  menggunakan  corong pisah berturut-turut dengan pelarut n -heksan, kloroform, dietil eter dan etil asetat. Proses ini  dilakukan  hingga  cairan  jernih.  Jumlah  pelarut  yang  digunakan  untuk  fraksinasi sebanding  dengan  jumlah  air-etanol  yang  ditambahkan  ke  dalam  ekstrak  etanol (perbandingan 1:1). Fraksi etil asetat ditampung dan diuapkan menggunakan thermostatic waterbath pada  suhu  50º  C . Fraksi  etil  asetat  yang  diperoleh  diukur  beratnya  dan dilakukan uji sitotoksisitas.
3. Uji Sitotoksisitas
a. Penyiapan Larutan Uji
Larutan    uji  dibuat  dari  fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  herba  alfalfa.  Larutan  uji tersebut  kemudian  diencerkan  menjadi  5  seri  konsentrasi  dengan  menggunakan  pelarut dimetil  sulfoksida  (DMSO).  Angka  kelipatan  seri  konsentrasi  diperoleh  berdasarkan rumus:
f=
Dimana: f = Angka kelipatan seri konsentrasi n = Banyaknya seri konsentrasi Dt = Konsentrasi tertinggi Dr = Konsentrasi terendah (CCRC, 2010)
Pada  penelitian  ini,  konsentrasi  tertinggi  yang  digunakan  sebesar  1000  µg/ml  dan konsentrasi terendah sebesar 62,5 µg/ml dengan angka kelipatan  seri konsentrasi 2. Seri konsentrasi yang digunakan adalah 62,5; 125; 250; 500 dan 1000 µg/ml.
b. Preparasi Sel
Sel  yang  inaktif  dalam  wadah  ampul  diambil  dari tangki  nitrogen  cair  dan  segera dicairkan pada suhu 37 o C kemudian ampul disemprot etanol 70%. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifuge  3000  rpm  selama  10  menit,  kemudian  bagian  supernatan  dibuang,  pellet ditambah  satu    ml  medium    penumbuh  yang  mengandung  10%  FBS,  disuspensikan hingga homogen, selanjutnya sel ditumbuhkan dalam beberapa petri dish flask kecil (3-4 buah),  diinkubasikan  dalam  inkubator  suhu  37 o C  CO 2 5%.  Setelah  24  jam,  medium diganti dan sel ditumbuhkan lagi hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.
c. Pemanenan Sel
Setelah  jumlah  sel  cukup,  medium  dibuang  dan  sel  dicuci  koloninya.  Larutan tersebut dibuang, lalu ditambah larutan tripsin 2,5% sebanyak 1 ml. Supaya distribusi sel merata maka ditambah larutan PBS 3 ml, didiamkan sekitar 3-5 menit agar tripsin bekerja dengan  baik.  Sel  kemudian  dipindah  ke  dalam  tabung  conical  steril  dan  ditambah  PBS sampai  volume  10  ml  dan  disentrifuge  3000  rpm  selama  10  menit.  Sel  dicuci  dua  kali dengan  medium  yang  sama  dan  dihitung  jumlah  selnya  menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah dengan sejumlah medium kultur sehingga diperoleh konsentrasi sel sebesar yang diperlukan.
d. Uji Sitotoksisitas (Metode MTT)
Suspensi sel dalam medium PRF RPMI 1640 sebanyak 100 μl (kepadatan sel T47D 5  x  10 3 dan  sel  HeLa  1,0  x  10 4 sel/sumuran)  dimasukkan  ke  dalam plate 96  sumuran berbeda  dan plate diinkubasi  selama  24  jam  dalam  inkubator  CO 2 5%.  Kemudian
ditambahkan sampel 100 μl  dalam medium padat tiap sumuran yang berbeda sehingga diperoleh  kadar  akhir  dari  sampel  dengan  variasi  kadar.  Selanjutnya  plate  diinkubasi dalam  inkubator  CO 2 5% selama  24 jam  pada  suhu  37 o C.  Pada  akhir  inkubasi, medium pada  masing-masing  sumuran  dibuang  dan  dicuci  dengan  PBS  kemudian  ditambahkan 100 μl MK campuran  MTT 0,5% dalam PBS. Plate diinkubasi lagi selama 4 jam pada suhu  37 o C.  Sel  hidup  akan  bereaksi  dengan  MTT  membentuk  formazan  yang  berwarna ungu. Formazan dilarutkan dalam larutan SDS, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Serapan  dibaca pada ELISA reader pada λ 595 nm.

## 4. Uji Kandungan Kimia
Uji  kandungan  kimia  dalam  penelitian  ini  hanya  dilakukan  terhadap  senyawa golongan  flavonoid.  Uji  kandungan  kimia  terhadap  larutan  uji  pada  penelitian  ini dilakukan    melalui  uji  pendahuluan  dengan  pereaksi  kimia  yang  dilanjutkan  uji  KLT. Pada  uji  pendahuluan,  pemeriksaan  flavonoid  dilakukan  dengan  cara  ekstrak  dilarutkan dalam  etanol  96%  kemudian  ditetesi  dengan  FeCl 3 .  Perubahan  warna  pada  awalnya berwarna  kuning  bening  menjadi  kuning  pekat  menandakan  adanya  flavonoid  dalam fraksi uji. Pada uji Kromatografi Lapis Tipis digunakan fase gerak, fase diam dan reagen untuk deteksi bercak dalam pemeriksaan senyawa flavonoid sebagai berikut:
Fase Diam : Selulosa Fase Gerak : Butanol –Asam Asetat – Air (7:1:2) Reagen Pendeteksi : Uap ammonia

## 5. Uji Sitotoksisitas
Data  yang  didapat  dari  hasil  pembacaan  ELISA reader berupa  absorbansi  (OD) masing-masing  sumuran  dikonversikan  dalam  persentase  kehidupan  sel.  OD  kontrol pelarut dianggap sama dengan OD kontrol sel maka dihitung persentase sel hidup dengan rumus:
Persentase kehidupan sel = OD sel dengan perlakuan - OD kontrol media ×100% OD kontrol sel- OD kontrol media
Data  persentase  kehidupan  sel  T47D  tersebut  digunakan  untuk  menghitung  nilai IC 50 yang merupakan potensi sitotoksik fraksi etil asetat dari ekstrak etanol herba alfalfa menggunakan program SPSS 16 for windows melalui analisis probit (CCRC, 2010).

## 6. Analisis Kandungan Kimia
Analisis hasil identifikasi golongan senyawa aktif dari fraksi uji dilakukan dengan 2  uji  yaitu  uji  pendahuluan  dan  uji  KLT.  Uji  pendahuluan  dilakukan  dengan  melihat perubahan  warna  pada  larutan  uji.  Uji  KLT  dengan  membandingkan  kesesuaian  warna bercak  pada KLT setelah elusi dan bercak senyawa standar dengan literatur. Pengamatan lempeng KLT dilakukan di bawah sinar UV λ 366 dan pereaksi semprot.

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

## Pembuatan Senyawa Uji
Herba alfalfa yang sudah dicuci bersih dikeringkan di bawah sinar matahari agar menjadi  kering  sehingga  mempermudah  proses  pembuatan  menjadi  serbuk  memiliki tujuan untuk meningkatkan luas permukaan bahan  baku (Voigt, 1994). Serbuk simplisia herba alfalfa memiliki kadar air sebesar 6 %.  Secara umum  kadar air simplisia tanaman obat  maksimum  10%.  Pemantauan  kadar  air  ini  dimaksudkan  untuk  mencegah tumbuhnya  kapang  dan  menurunkan  reaksi  enzimatik  sehingga  dapat  menghindari terjadinya  penurunan  mutu  atau  pengrusakan  simplisia  (Gunawan  dan  Mulyani,  2004).
Serbuk simplisia herba alfalfa sebesar 1576,2 gram diperoleh dari 13,5 Kg herba alfalfa segar.  Serbuk  simplisia  herba  alfalfa  yang  digunakan  dalam  penelitian  sebesar  606,4 gram.  Serbuk  herba  alfalfa  diekstraksi  menggunakan  metode  sokletasi.  Metode  ini membutuhkan bahan pelarut dalam jumlah kecil (Voigt, 1994). Pemilihan etanol sebagai larutan  penyari  dikarenakan  etanol  dapat  menyari  hampir  semua  jenis  senyawa  aktif terekstraksi,  yaitu  senyawa  yang  bersifat  polar,  semi  polar,  hingga  non  polar.  Ekstrak kental  yang  dihasilkan  dalam  penelitian  ini  sebanyak  113,6  gram,  sehingga  rendemen hasil  yang  diperoleh  adalah  18,73  % dengan  kekentalan  sebesar  100  cPa.s.  Secara makroskopis  ekstrak  etanol  herba  alfalfa  berwarna  hijau  kehitaman  dengan  bau  seperti gula-gula kacang.
Ekstrak kental yang digunakan untuk fraksinasi sebesar 50 gram. Fraksi etil asetat yang  diperoleh  setelah  diuapkan  adalah  548  mg  dengan  rendemen  sebesar  1,09  %. Rendemen yang diperoleh pada proses pembuatan  larutan uji sangat kecil karena proses fraksinasi  dilakukan  secara  bertingkat  sehingga  senyawa  aktif  telah  banyak  tersari  pada pelarut  sebelumnya.  Proses  fraksinasi  dilakukan  secara  bertingkat  dengan  pelarut n - heksan,  kloroform,  dietil  eter,  dan  etil  asetat.  Metode  partisi  cair-cair  bertujuan  untuk memisahkan  senyawa  berdasarkan  kelarutannya  artinya  memisahkan  senyawa  yang terlarut dalam n -heksan, kloroform, dietil eter dan etil asetat.

## Uji Sitotoksisitas
1. Uji Sitotoksisitas Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Herba Alfalfa terhadap Sel T47D
Fraksi uji pada penelitian ini menunjukkan efek sitotoksik yang rendah terhadap sel T47D    meskipun    perlakuan  fraksi  uji  pada    konsentrasi  tertinggi  yaitu  1000  µg/ml menyebabkan kematian terhadap sel T47D. Sel T47D yang hidup berbentuk memanjang seperti  daun  sedangkan  yang  mati  berbentuk  bulat  (Gambar  1).  Tabel  I  menunjukkan hasil  uji  sitotoksisitas  fraksi  uji  terhadap  sel  T47D  dengan  berbagai  seri  konsentrasi. Data  analisis  probit  dari  persentase  kehidupan  sel  diperoleh  nilai  IC 50 sebesar  1893,4 µg/ml.
Gambar 1. Efek Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Herba Alfalfa terhadap Sel T47D.
(A) Kontrol sel T47D
(B) Kontrol positif, doksorubisin konsentrasi 20 µg/ml
(C) Perlakuan  fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  herba  alfalfa  1000  µg/ml terhadap sel T47D Sel  T47D hidup Sel T47D yang mati
Nilai  IC 50 doksorubisin  dalam  penelitian  ini  tidak  dapat  dihitung  karena  data persentase kehidupan sel yang didapat di bawah 50 %, bahkan pada konsentrasi terendah (2,5  µg/ml)  masih  menunjukkan  persentase  kehidupan  sel  yang  rendah  yaitu  16,1  % (Tabel  II).  Bila  dilihat  dari  nilai  persentase  kehidupan  sel  pada  perlakuan  doksorubisin
A
B C
maka persentase kehidupan sel pada fraksi uji jauh lebih besar. Bisa disimpulkan bahwa potensi  fraksi  uji  masih  terlalu  jauh  dibandingkan  kontrol  positifnya.  Hal  tersebut menunjukkan bahwa doksorubisin memiliki efek sitotoksik terhadap sel T47D yang lebih besar dibandingkan dengan efek sitotoksik senyawa uji.
Tabel I. Hasil Uji Sitotoksisitas Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Herba Alfalfa terhadap Sel
T47D Konsentrasi larutan uji (µg/ml) Persentase kehidupan sel T47D (%) Probit IC 50 1000 88,9 8,8 500 93,9 9,7 1893,4 µg/ml 250 106,8 9,8 125 114,3 62,5 102,5

## Tabel II. Hasil Uji Sitotoksisitas Doksorubisin terhadap Sel T47D
Konsentrasi doksorubisin (µg/ml) Persentase kehidupan sel T47D (%) 20 13,3 10 13,6 5 14,0 2,5 16,1
Doksorubisin  merupakan  senyawa  tunggal  yang  berfungsi  sebagai  antikanker (Nafrialdi  dan  Ganiswarna,  1995).  Sementara  fraksi  uji  kemungkinan  besar  terdiri  dari beberapa senyawa sehingga efek sitotoksik belum terlalu dominan. Potensi sitotoksisitas yang  rendah  tersebut  diduga  diakibatkan  karena  sedikitnya  kandungan  senyawa  aktif flavonoid pada larutan uji.
2. Uji  Sitotoksisitas  Fraksi  Etil  Asetat  Ekstrak  Etanol  Herba  Alfalfa  terhadap  Sel HeLa
Hasil  uji  sitotoksisitas  fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  herba  alfalfa  terhadap  sel HeLa dengan metode MTT assay dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 2. Efek Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Herba Alfalfa  terhadap Sel HeLa.
(A) Kontrol sel HeLa (B) Perlakuan doksorubisin dengan konsentrasi 5 µg/ml (C) Perlakuan fraksi etil asetat ekstrak etanol herba alfalfa 1000 µg/ml terhadap sel HeLa sel HeLa hidup sel HeLa yang mati
Tabel  III  menunjukkan  bahwa  pada  konsentrasi  rendah  tidak  terdapat  sel  yang mati namun fraksi uji pada konsentrasi 1000 µg/ml memperlihatkan adanya kematian sel.
B A C
Analisis  probit  digunakan  untuk  membuat  kurva  yang  sigmoid  menjadi  linier,  namun karena  persentase  kehidupan  sel  pada  fraksi  uji  sebagian  besar  lebih  dari  100%,  maka analisis probit tidak bisa digunakan.
Tabel III.  Hasil Uji Sitotoksisitas Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Herba Alfalfa  terhadap
Sel HeLa. No Konsentrasi larutan uji (µg/ml) % Kehidupan Sel 1 62,5 103,3 2 125 104,3 3 250 101,6 4 500 106,2 5 1000 96,7 Tabel IV. Hasil Uji Sitotoksisitas Doksorubisin terhadap Sel HeLa Konsentrasi doksorubisin (µg/ml) Persentase kehidupan sel HeLa (%) Probit IC 50 5 47,2 4,2 2,5 47,2 5,6 1,25 56,9 6,4 3,6  µg/ml 0,625 66,4 6,7 0,3125 79,8 6,9
Kontrol  positif  doksorubisin  terhadap  sel  HeLa  memiliki  nilai  IC 50 3,6  µg/ml (Tabel  IV).    Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa    fraksi  uji  tidak  memiliki  efek sitotoksik terhadap  sel  kanker  leher  rahim (sel  HeLa)  meskipun   pada  konsentrasi 1000 µg/ml mengakibatkan kematian sel, namun tidak signifikan.

## Uji Kandungan Kimia
Uji  pendahuluan  dilakukan  sebagai  awal  identifikasi  golongan  senyawa  aktif dalam  fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  herba  alfalfa.  Hasil  uji  flavonoid  pada  uji pendahuluan  menggunakan  FeCl 3 menghasilkan  warna  yang  lebih  intens  dari  warna semula, yang awalnya berwarna kuning jernih berubah menjadi kuning orange (Gambar 3).  Perubahan  warna  yang  terjadi  menandakan  bahwa  larutan  uji  mengandung  senyawa turunan fenolik. Flavonoid merupakan golongan terbesar senyawa fenol alam (Harborne, 1987). Perubahan warna yang terjadi pada larutan uji dikarenakan adanya gugus hidroksi pada inti aromatis yang bisa berikatan dengan Fe.
Gambar 3.  Uji Flavonoid dengan Pereaksi FeCl 3 terhadap Larutan Uji
Berdasarkan  hasil  uji  pendahuluan  yang  sudah  dilakukan  sebelumnya,  maka  uji KLT  dilakukan  untuk  identifikasi  flavonoid.  Uap  amoniak  digunakan  sebagai  pereaksi penampak  bercak  untuk  memberikan  suasana  basa  pada  bercak  supaya  dapat  terdeteksi secara  visibel  maupun  di  bawah  sinar  ultraviolet.  Flavonoid  akan  membentuk  warna kuning  atau  orange  dengan  pereaksi  amoniak  secara  visibel  (Wagner  dan  Bladt,  1995) seperti  terlihat  pada  gambar  4.  Pembanding  yang  digunakan  yaitu  kuersetin.  Kuersetin
Keterangan: A = fraksi uji + etanol 96%
B = fraksi uji + etanol 96% + FeCl 3 A B
dan  glikosidanya  berada  dalam  jumlah  sekitar  60-75%  dari  total  jumlah  flavonoid  yang ada  (Harborne,  1987).  Tujuan  penggunaan  pembanding  kuersetin  dalam  uji  ini  hanya untuk menegaskan adanya senyawa flavonoid dalam senyawa uji.
Pengamatan dilakukan secara visibel dan di bawah sinar UV 366 nm sebelum dan sesudah  diuapi  amoniak.  Bercak  sampel  terlihat  coklat  kekuningan  pada  pengamatan secara visible. Bercak sampel terlihat berfloresensi biru muda di bawah sinar UV 366 nm sebelum diuapi amonia, namun terjadi perubahan flouresensi menjadi warna murup biru muda  setelah  diuapi  amonia.  Diduga,  flavonoid  yang  terkandung  adalah  isoflavon (Riyanto,  1989).  Isoflavon  memberikan  warna  biru  muda  cemerlang  setelah  diuapi ammonia  bila  dilihat  di  bawah  sinar  UV  (Harborne,  1987  ).  Kandungan  isoflavon  pada akar  alfalfa  telah  dinyatakan  pada  penelitian  Tiller  (1994).  Kromatogram  sampel menunjukkan nilai Rf sebesar  0,775 sedangkan Rf pembanding kuersetin sebesar 0,625 sehingga Rf sampel  lebih  besar  dari Rf pembanding.  Hasil  KLT  membuktikan  bahwa fraksi  uji  mengandung  flavonoid  sehingga  golongan  senyawa  yang  menyebabkan  efek sitotoksik terhadap sel T47D kemungkinan adalah flavonoid, namun untuk sel HeLa tidak menimbulkan efek sitotoksik.
Gambar  4.    Kromatogram  Fraksi  Etil  Asetat  Ekstrak  Etanol  Herba  Alfalfa  (S)  dan Pembanding Kuersetin (P)
Keterangan:
A. Pengamatan secara visibel
B. Pengamatan pada sinar UV 366 nm sebelum diuapi amoniak
C. Pengamatan pada sinar UV 366 nm setelah diuapi amoniak
Fase Diam : Selulosa
Fase Gerak : Butanol-Asam Asetat-Air (7:1:2)
Beberapa  mekanisme  flavonoid  dalam  melawan  kanker  adalah:  (1)  sebagai antioksidan, (2) menekan produksi prostaglandin E2 (Winarsi, 2005). Beberapa penelitian juga telah menyebutkan tentang efek antikanker terkait dengan kandungan flavonoid yang ada  pada  tumbuhan  lain,  yaitu:  Penelitian  pada  tanaman  sambung  nyawa  sebagai  agen kemopreventif.  Pada  penelitian  tersebut  flavonoid  diduga  bertanggung  jawab  atas  efek kemopreventif  yang  ditimbulkan,  ekstrak  etanolik  daun  sambung  nyawa  telah  terbukti dapat menghambat proliferasi sel HeLa dan sel T47D serta memacu terjadinya apoptosis (Setiawati dkk., 2007)

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
1. Fraksi  etil  asetat  dari  ekstrak  etanol  herba  alfalfa  mempunyai  efek  sitotoksik terhadap sel T47D namun tidak memiliki efek sitotoksik pada sel HeLa.
2. Nilai  IC 50 fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  herba  alfalfa  terhadap  sel  T47D  sebesar 1893,4 µg/ml.
3. Fraksi etil asetat ekstrak etanol herba alfalfa mengandung flavonoid.
A
C B

## Saran
1. Perlu  dilakukan  penelitian  untuk  mengisolasi  flavonoid  dari  herba  alfalfa  yang memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara.
2. Perlu dilakukan uji sitotoksisitas senyawa flavonoid fraksi etil asetat ekstrak etanol herba  alfalfa  terhadap  sel-sel  kanker  lainnya  seperti  sel  MCF-7,  sel  WiDr,  agar diketahui keefektifan dari senyawa uji pada sel kanker lain.

## DAFTAR PUSTAKA
Andersen,  Q.M.,  and  Markham,  K.R.,  2006, Flavonoid;  Chemistry,  Biochemistry  and Applications, CRC Press, USA, 2 Astawan, M., dan Kasih, A.L., 2008, Khasiat Warna Warni Makanan , Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, 212-214
Bo-ping,  W.,  Yong-mei,  Z.,  Zhi-Zhong,  C.,  and  Yong-zhil,  T.,  2010,    Study    on  Extraction    of Flavonoids  in  Alfalfa  Assisted  With  Ultrasonic   Wave, Acta Agrestia Sinica , 6
CCRC.,  2010, Standard  Operating  Procedure ,  Cancer  Chemoprevention  Research  Cancer Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Gunawan, D., dan Mulyani, S., 2004, Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) , Jilid I, Cetakan I, Penebar Swadaya, Jakarta, 12-13
Harborne,  J.  B.,  1987, Metode  Fitokimia;Penuntun  Cara  Modern  Menganalisis  Tumbuhan , Penerbit ITB, Bandung, 13, 47, 49, 69
Hong, Y., Wang, S., Hsu, C., Lin, B., Kuo, Y., and Huan, C., 2011, Phytoestrogenic Compounds in Alfalfa Sprout ( Medicago Sativa ) Beyond Coumestrol, J. Agri. Food Chem , 59 , 131- 137
Newall,  C.A.,  Anderson,    L.A.,  and    Phillipson,    J.D.,    1996, Herbal    Medicine;  A  Guide  for Health-care Professionals , The Pharmaceutical Press, London, 23
Riyanto, S., 1989, Flavonoid, dalam Mursyidi, A., Analisis Metabolit Sekunder , PAU Bioteknologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 304
Setiawati, A., Endah, P.S., Titi, R.W., dan Rifki, R., 2007, Sambung Nyawa ( Gynura Procumbens (Lour.) Merr.) Sebagai Agen Kemopreventif, Pharmacon , 5 , 1-12
Tiller, S.A., Parry, A.D., and Edwards, R., 1994, Change In The Accumulation of Flavonoid and Isoflavonoid  Conjugates  Associated  With  Plant  Age  and  Nodulation  In  Alfalfa,
Physiologia Plantarum , 91 , 27-36 Voigt,  R.,  1994, Buku  Pelajaran  Teknologi  Farmasi ,  Diterjemahkan  oleh  Soendani  Noerono Soewandhi, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, 135, 570-571
Wagner,  H.,  and  Bladt,  S.,  1995, Plant  Drug  Analysis-  A  Thin  Layer  Chromatography  Atlas , Second Edition, Springer, German, 196-197
Winarsi, H., 2005, Isoflavon , Gadjah Mada University Press, Yogjakarta, 53, 58