Cytotoxic Activity of Ethyl Acetate Fraction Moringa oleifera Leaves and Its Effect on Apoptosis Induction Against T47D Breast Cancer Cell Line
Riza Apriani 1 , Shabarni Gaffar 2 , Tati Herlina 2
1 Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Garut
2 Depatermen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadajran
Corresponding author: Riza Apriani (aprianiriza@uniga.ac.id)

## ARTICLE HISTORY
Received: 20 November  2018                Revised: 12 December 2018           Accepted: 15 January  2019

## Abstract
Moringa  oleifera is  one  of  plant  that  has  been  widely  used  in  traditional  medicine industry.  Several  studies  have  reported  that M.  oleifera leaf  extract  has antiproliferative  activity  in  several  cancer  cells,  including  HepG2  liver  cancer  cells, A549 lung cancer cells, Caco-2 colon cancer cells and MDA-MB-231 breast cancer cells, but studies on T47D breast cancer cells have not reported yet. Therefore, this study  aimed  to  determine  the  anticancer  activity  of M.  oleifera leaves  on  T47D breast  cancer  cells. M.  oleifera leaves  extract  was  obtained  by  extraction  using ethanol  then  fractionated  with n -hexane  and  ethyl  acetate.  Cytotoxic  activity  was determined under MTT assay. Apoptosis induction was performed using Annexin V- PI  staining  method  and  analyzed  by  flow  cytometry.  Molecular  study  was  also carried  out  through  observation  of  regulatory  apoptotic  protein,  namely  Bcl-2  by immunocytochemistry  method.  Based  on  the  result,  T47D  cells  treated  with  ethyl acetate fraction of M. oleifera leaves showed medium activity as an anticancer with IC 50 values of  243.58  μg/mL.  Detection  of  apoptosis  showed  that  ethyl  acetate fraction of M. oleifera leaves induced apoptosis. Immunocytochemistry observations showed that ethyl acetate fraction of M. oleifera leaves decreased expression of Bcl- 2 protein.
Key words: Apoptosis, Breast cancer, Moringa oleifera , T47D cell
Vol. 10; No. 1; Januari 2019 Halaman 9-16
Aktivitas Sitotoksik Fraksi Etil Asetat Daun Kelor ( Moringa Oleifera ) dan pengaruhnya Terhadap Induksi Apoptosis Pada Sel Kanker Payudara T47D

## Abstrak
Tanaman  kelor  ( Moringa  oleifera )  adalah  salah  satu  tanaman  yang  telah  banyak digunakan  dalam  industri  pengobatan  tradisional.  Beberapa  penelitian  telah melaporkan  bahwa  ekstrak  daun M.  oleifera memiliki  aktivitas  antiproliferatif  pada beberapa sel kanker, di antaranya terhadap sel kanker hati HepG2, sel kanker paru A549,  sel  kanker  kolon  Caco-2  dan  sel  kanker  payudara  MDA-MB-231,  namun penelitian  terhadap  sel  kanker  payudara  T47D  belum  dilakukan.  Oleh  karena  itu, penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  aktivitas  antikanker  daun M.  oleifera terhadap  sel  kanker  payudara  T47D.  Ekstrak  daun M.  oleifera diperoleh  dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut etanol, kemudian difraksionasi dengan pelarut n -heksana  dan  etil  asetat.  Uji  sitotoksik  yang  dilakukan  pada  penelitian  ini menggunakan metode MTT assay.  Pengujian terhadap induksi apoptosis dilakukan dengan  metode  pewarnaan  Annexin  V-PI  dan  dianalisis  dengan flow  cytometry . Kajian  molekular  juga  dilakukan  melalui  pengamatan  protein  regulator  apoptosis, yaitu  Bcl-2  dengan  metode  imunositokimia.  Berdasarkan  hasil  dari  MTT  assay,  sel T47D yang diberi perlakuan dengan fraksi etil asetat daun M. oleifera menunjukkan aktivitas  medium  sebagai  antikanker  dengan  nilai  IC 50 sebesar  243,58  μg/mL. Pengujian terhadap apoptosis menunjukkan bahwa fraksi etil asetat daun M. oleifera dapat  menginduksi  apoptosis.  Hasil  pengamatan  dengan  imunositokimia menunjukkan  bahwa  pemberian  fraksi  etil  asetat  daun  M.  oleifera  mampu menurunkan ekspresi protein Bcl-2.
Kata kunci: Apoptosis, Moringa oleifera , kanker payudara, sel T47D

## Pendahuluan
Kanker  merupakan  salah  satu  penyakit  yang  menyebabkan  angka  kematian cukup  tinggi  di  Indonesia  maupun  di  dunia.  Kanker  merupakan  pertumbuhan  dan perkembangan  sel  yang  tidak  terkontrol  yang  terjadi  di  dalam  tubuh.  Insidensi berbagai  jenis  kanker  mengalami  peningkatan  di  negara-negara  berkembang 1 . Kanker  payudara  menduduki  peringkat    pertama  kasus  kanker  dan  menjadi penyebab kematian akibat kanker yang paling banyak diderita oleh wanita di seluruh dunia 2 .  Perkembangan  kanker  seringkali  dijumpai  sudah  dalam  stadium  lanjut (metastatis)  dan  melibatkan  mekanisme  molekuler  yang  kompleks  sehingga menimbulkan masalah dalam terapinya 3 .
Pengobatan  kanker  payudara  dengan  cara  kemoterapi  merupakan  pilihan potensial  yang  banyak  dipilih  oleh  penderita  kanker  di  Indonesia.  Akan  tetapi, pengobatan  kanker  menggunakan  agen  kemoterapi  cenderung  menimbulkan kegagalan  dikarenakan  rendahnya  selektifitas  obat-obat  antikanker 4 .  Maka  dari  itu, usaha penemuan obat antikanker yang aman dan selektif terhadap pengobatan dan pencegahan kanker khususnya yang berasal dari tanaman obat perlu dilakukan.
Tanaman  kelor  ( Moringa  oleifera L.)  merupakan  tanaman  dengan  batang  yang lembut yang memiliki buah, akar dan daun yang telah dilaporkan memiliki beberapa manfaat  dalam  industri  pengobatan.  Tanaman  ini  telah  banyak  dilaporkan  memiliki aktivitas  biologis  seperti  antiaterosklerosis 5 ,  penguat  imun 6 ,  antikardiovaskular 7 , antivirus 8,9,10,11 ,  antioksidan 12,11,13,14 ,  antimikroba 12 ,  antiinflamasi 15 dan  memiliki
Vol. 10; No. 1; Januari 2019 Halaman 9-16
aktivitas  antitumor  terhadap  kanker  hepato  karsinoma,  kanker  kolon  dan  kanker myeloma 16,17,18 .  Namun,  beberapa  penelitian  umumnya  hanya melaporkan  aktivitas antikanker  daun M.  oleifera ,  tetapi  tidak  pada  dasar  molekuler  dari  aktivitas antikanker  tersebut.  Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengamati  mekanisme  selular dan  molekular  yang  memperantarai  aktivitas  sitotoksik  fraksi  etil  asetat  daun M. oleifera terhadap sel kanker payudara T47D melalui pengamatan induksi apoptosis dan pengaruhnya terhadap ekspresi protein regulator apoptosis, yaitu Bcl-2.

## Metode Alat
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  terdiri  dari  alat-alat  gelas,  neraca analitik, mikropipet (Gilson), yellow tips, blue tips, tabung konikal (Iwaki), kultur dish , haemacytometer (Neubauer), cell counter , mikroskop inverted (Olympus), vortex, 96 well  plate (Nunc),  24 well  plate (Nunc),  6 well  plate (Nunc), cover  slip (Nunc), shaker ,  pinset,  jarum, object  glass ,  tabung eppendorf ,  sentrifugator,  inkubator  CO 2 (Heraeus),  ELISA reader (SLT  240 ATC), laminar  air  flow  cabinet (Labconco), flow cytometer FACS-Calibur, vacuum rotary evaporator (Buchi).

## Bahan
Bagian  daun  dari  tanaman M.  oleifera diperoleh  dari  Mangunreja,  Tasikmalaya. Sel  kanker  payudara  T47D  diperoleh  dari  Laboratorium  Parasitologi  Fakultas Kedokteran  Universitas  Gadjah  Mada;  pelarut  DMSO  (Merck);  Medium  Komplit  sel T47D  yang  terdiri  dari  RPMI  (Rosewell  Park  Memorial  Institute)  1640  (Gibco), Penicilin-Streptomisin  1%  (v/v),  FBS  (Fetal  Bovine  Serum)  10%  (v/v)  (Gibco)  dan fungizone 0,5% (Gibco); Tripsin-EDTA 0,25%, PBS (Phosphat Buffer Saline), Aqua Bidestilata,  etanol  70%,  reagen  MTT  [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida]  (Bio  Basic  Canada  Inc);  reagen  stopper  SDS  (Sodium  Deodesil  Sulfat) 10%; Propidium Iodida (Roche); Annexin V (Roche); antibodi monoklonal primer Bcl- 2  (Biocare) ,  streptavidin  berupa  Horse  Radish  Peroxidase  (HRP),  3,3’- diaminobinzidine  (DAB),  metanol,  larutan  hidrogen  peroksidase  (blocking  solution), aquades,  larutan  Maye  Haemotoxylin,  alkohol,  xylol,  etanol  96%,  etil  asetat, n - heksana, metanol.

## Prosedur Rinci

## Pembuatan ekstrak
Daun M.  oleifera dicuci  dengan  air  mengalir,  lalu  dikeringkan  dan  dihaluskan. Serbuk  kering  kemudian  dimaserasi  dengan  pelarut  etanol  96%  selama  3x24  jam. Ekstrak  hasil  maserasi  kemudian  dipekatkan  menggunakan vacuum  rotary evaporator pada suhu 50 o C hingga konsistensinya kental. Ekstrak etanol yang telah dipekatkan  kemudian  diekstraksi  cair-cair  (partisi)  menggunakan  pelarut  air, n- heksana  dan  etil  asetat.  Fraksi  etil  asetat  kemudian  dievaporasi  menggunakan vacuum  rotary  evaporator untuk  menghasilkan  residu  fraksi  etil  asetat  daun M. oleifera .

## Uji sitotoksik
Uji  sitotoksik  dilakukan  dengan  metode  MTT  (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide). Sejumlah 1x10 4 sel didistribusikan ke dalam sumuran pada 96-well  plate dan  diinkubasi  dalam  inkubator  CO 2 5%  bersuhu  37˚C  selama semalam. Fraksi etil asetat daun M. oleifera yang sudah dilarutkan dalam co-solvent
Vol. 10; No. 1; Januari 2019 Halaman 9-16
DMSO  ditambahkan  ke  dalam sumuran dengan  sepuluh seri  kadar  yaitu 500;  250; 125;  63,5;  31,25;  15,625;  7,8125;  3,90;  1,95 μg/mL  selama  24  jam.  Pada  akhir inkubasi,  media  dan  ekstrak  dibuang  kemudian  sel  dicuci  dengan  PBS.  Pada masing- masing  sumuran  lalu  ditambahkan  100  μl  MTT  konsenrasi  0,5 mg/mL.  Sel diinkubasi  kembali  selama  4 –  6  jam  dalam  inkubator  CO 2 5%  bersuhu  37˚C.  Sel yang  hidup  akan  bereaksi  dengan  MTT  membentuk  warna  ungu.  Reaksi  MTT dihentikan dengan reagen stopper yaitu SDS 10% dalam HCl 0,01N, lalu diinkubasi semalam  pada  suhu  kamar.  Serapan  dibaca  dengan  ELISA reader pada  panjang gelombang 595 nm.

## Analisis data:
Regresi  linear  antara  konsentrasi  dan  %  sel  hidup  memberikan  persamaan  y  = Bx  +  A  yang  digunakan  untuk  menghitung  nilai  IC 50 ,  yaitu  konsentrasi  yang menghambat 50% pertumbuhan sel.

## Uji apoptosis:
Sel  T47D  ditanam  ke  dalam 6-well  plate dengan  kepadatan  sel  sebesar  1x10 5 sel/sumuran.  Setelah  diinkubasi  selama  24  jam  di  dalam  inkubator  CO 2 5%,  sel diberi  perlakuan  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera dengan  konsentrasi  300  µg/mL, 250 µg/mL, 200 µg/mL dan 150 µg/mL kemudian diinkubasi kembali selama 24 jam. Setelah  diinkubasi,  sel  dipanen  menggunakan  tripsin-EDTA  0,25%  kemudian disentrifugasi  pada  2000  rpm  selama  3  menit,  selanjutnya  dicuci  dengan  PBS dingin.  Sel  diresuspensi  dalam  500  mL  buffer  Annexin  V  dan  kemudian  diberi perlakuan dengan Annexin V dan Propidium Iodida (PI) selama 10 menit pada suhu ruang dan ditempat gelap.

## Uji imunositokimia:
Sel T47D dengan kepadatan 5x10 4 sel/sumuran ditanam pada cover slips (Nunc) dalam 24-well  plate  (Nunc)  sampai  80% konfluen.  Setelah  itu,  plate  tersebut  diberi perlakuan  senyawa  uji  dan  diinkubasi  dalam  inkubator  pada  suhu  37 o C  selama  24 jam.  Selanjutnya,  medium  diambil  dan  plate  yang  berisi  sel  dicuci  dengan  PBS. Selanjutnya,  sel  difikasasi  dengan metanol  dingin  selama  10 menit  pada  suhu  4 o C kemudian  dicuci  PBS.  Selanjutnya  sel  diberi  larutan  hidrogen  peroksida  (blocking solution) pada suhu ruang. Sel kemudian dicuci kembali dengan PBS dan diinkubasi dengan prediluted  blocking  serum (Background Sniper).  Selanjutnya,  sel  dicat dengan antibodi primer Bcl-2 dan Cyclin D1 selama 1 jam pada suhu ruang. Setelah dicuci kembali menggunakan PBS, antibodi sekunder ditambahkan ke dalam sel dan diinkubasi selama 10 menit lalu dicuci dengan PBS. Selanjutnya reagen yang berisi kompleks  streptavidin-enzim  peroksidase  ditambahkan  dan  diinkubasi  selama  20 menit  lalu  dibuang  dan  dicuci  dengan  PBS.  Setelah  itu,  larutan  substrat  kromogen DAB ditambahkan dan diinkubasi selama sepuluh menit. Setelah diinkubasi, reagen DAB  dibuang  lalu  dicuci  dengan  aquades.  Selanjutnya  larutan  Haematoxylin ditambahkan  ke  dalam  sumuran  lalu  diinkubasi  selama  sepuluh  menit  dan selanjutnya dibuang dan dicuci dengan aquades. Cover slip diangkat dengan pinset, kemudian  dicelupkan  dalam  etanol  dan  dikeringkan.  Setelah  kering, cover  slip dicelupkan lagi ke dalam xylol dan dikeringkan kembali. Cover slip diletakkan di atas object  glass, kemudian  ditetesi  dengan  lem  (Mentellan), cover  slip lalu  ditutup dengan cover slip kotak. Ekspresi protein dapat diamati dengan mikroskop cahaya. Sel  yang  mengekspresikan  protein  Bcl-2  akan  memberikan  warna  coklat/gelap, sedangkan  yang  tidak  mengekspresikan  protein  Bcl-2  akan  memberikan  warna ungu/ biru.
Vol. 10; No. 1; Januari 2019 Halaman 9-16
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 0.00 200.00 400.00 600.00 S e l h id u p ( % ) Konsentrasi (µg/mL)

## Hasil Aktivitas Sitotoksik Fraksi Etil Asetat daun M. oleifera terhadap Sel T47D
Uji  sitotoksik  dilakukan  dengan  menggunakan  metode  MTT.  Absorbansi  yang diukur  linier  dengan  persentase  sel  hidup.  Pengujian  ini  dilakukan  dengan pemberian variasi konsentrasi fraksi etil asetat daun M. oleifera sebesar 1,95; 3,90; 7,8125;  15,625; 31,25;  62,5;  125;  250;  500 μg/mL. Nilai IC 50 fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera yang  diperoleh  dari  pengujian  terhadap  sel  T47D  yaitu  243,58  μg/mL. Berdasarkan  nilai  IC 50 -nya,  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera memiliki  aktivitas kurang  aktif  sebagai  antikanker  karena  menurut  Kamuhabwa 19 ,  suatu  ekstrak dianggap aktif jika memiliki nilai IC 50 ≤100 μg/mL, namun masih dapat dikembangkan sebagai  antikanker  karena  suatu  ekstrak  dianggap  tidak  aktif  jika  nilai  IC 50 >500 µg/mL 20 .
Berdasarkan  pada  pengamatan  mikroskopis,  pemberian    fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera mengubah  morfologi  sel  T47D  dan  menurunkan  kerapatan  sel. Meningkatnya konsentrasi fraksi etil asetat daun M. oleifera yang diberikan terhadap sel  memberikan  pengaruh  terhadap  perubahan  morfologi  sel,  yaitu  sel  terlihat mengambang,  pada  bagian  pinggir  sel  berwarna  gelap,  bagian  tengah  terlihat kosong,  kepadatan  sel  berkurang  dan  tidak  saling  menempel  (data  tidak ditampilkan).
Gambar  2. Grafik  persentase  viabilitas  sel  T47D  setelah  diberi  perlakuan  dengan fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera pada  berbagai  konsentrasi  (1,95 sampai 500 µg/mL) selama 24 jam. Fraksi etil asetat daun M. oleifera menghambat  pertumbuhan  sel  bergantung  pada  konsentrasi, menghasilkan nilai IC 50 sebesar 243,58 μg/mL.
Pengaruh Fraksi Etil Asetat M. oleifera Terhadap Apoptosis Sel Untuk  mengetahui  mekanisme  kematian  sel  yang  disebabkan  oleh  fraksi  etil asetat daun M. oleifera dilakukan pengujian dengan analisis flow cytometry . Metode flow cytometry yang didahului dengan pewarnaan sel menggunakan Annexin V dan PI  mampu  membedakan  sel  hidup,  apoptosis  awal,  apoptosis  akhir  dan  nekrosis. Perlakuan fraksi etil asetat daun M. oleifera dengan konsentrasi 150, 200, 250 dan 300  µg/mL  terhadap  sel  T47D  menyebabkan  terjadinya  induksi  apoptosis. Persentase  total  sel  yang  mengalami  apoptosis  meningkat  dari  2,27%  menjadi 14,17%;  56,81%;  75,92%  setelah  diberi  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera konsentrasi  150,  200,  250  µg/mL  secara  berturut-turut,  namun  mengalami penurunan  yaitu  menjadi  59,52%  setelah  diberi  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera konsentrasi  300  ug/mL.  Di  sisi  lain,  perlakuan  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera terhadap sel T47D juga menyebabkan tingginya persentase nekrosis yaitu 85,56%; 42,50%; 21,50% dan 23,33%.
Vol. 10; No. 1; Januari 2019 Halaman 9-16
Gambar  2. Pengujian  apoptosis menggunakan  pewarnaan  Annexin  V-PI  (a)  kontrol sel, (b-e) sel T47D yang telah diberi perlakuan fraksi etil asetat daun M. oleifera .  Sel  dengan  kepadatan  5x10 5 sel/sumuran  didistribusikan  ke dalam  6-well  plate,  kemudian  diberi  perlakuan  dengan  150,  200,  250 dan 300 µg/mL fraksi etil asetat daun M. oleifera . Hasil analisis dengan flowcytometry dari masing- masing sel: (a) kontrol sel, (b) 150 μg/mL (c) 200  μg/mL  (d)  250  μg/mL  dan  (e)  300  μg/mL.  R1:  sel  hidup;  R2:  sel apoptosis awal; R3: sel apoptosis akhir; R4: sel nekrosis.
Pengaruh Fraksi Etil Asetat M. oleifera Terhadap Protein Bcl-2
Penelusuran  jalur  apoptosis  pada  penelitian  ini  dilakukan  melalui  pengamatan terhadap  ekspresi  protein  Bcl-2  menggunakan  metode  imunositokimia  dengan prinsip  pengikatan  antibodi  spesifik.  Gambar  3  secara  visual  menunjukkan  bahwa
File: KS APOPT.001 Patient ID: 0411.18 Acquisition Date: 11-Apr-18 Gate: No Gate
Total Ev ents: 20000
Quad Location: 64, 79 Quad % Gated % Total UL 2.06 2.06 UR 0.98 0.98 LL 95.84 95.84 LR 1.11 1.11 File: KS APOPT.001 Patient ID: 0411.18 Acquisition Date: 11-Apr-18 Gate: No Gate Total Ev ents: 20000 Region % Gated % Total R1 95.69 95.69 R2 1.27 1.27 R3 1.00 1.00 R4 2.06 2.06 R2 R3 R4 R1 (a) File: EA 150 APOPT.005 Patient ID: 0411.18 Acquisition Date: 11-Apr-18 Gate: No Gate
Total Ev ents: 20000 Quad Location: 64, 79 Quad % Gated % Total UL 85.99 85.99 UR 13.54 13.54 LL 0.34 0.34 LR 0.13 0.13 File: EA 150 APOPT.005 Patient ID: 0411.18 Acquisition Date: 11-Apr-18 Gate: No Gate Total Ev ents: 20000 Region % Gated % Total R1 0.33 0.33 R2 0.13 0.13 R3 14.04 14.04
R4 85.56 85.56 R2 R3 R4 R1 (b) File: EA 200 APOPT.003 Patient ID: 0411.18 Acquisition Date: 11-Apr-18 Gate: No Gate Total Ev ents: 20000
Quad Location: 64, 79 Quad % Gated % Total UL 44.55 44.55 UR 54.49 54.49 LL 0.84 0.84 LR 0.11 0.11 File: EA 200 APOPT.003 Patient ID: 0411.18 Acquisition Date: 11-Apr-18
Gate: No Gate Total Ev ents: 20000
Region % Gated % Total R1 0.83 0.83 R2 0.12 0.12 R3 56.69 56.69 R4 42.50 42.50 R2 R3 R4 R1 (c) File: EA 250 APOPT.004 Patient ID: 0411.18
Acquisition Date: 11-Apr-18 Gate: No Gate Total Ev ents: 20000
Quad Location: 64, 79 Quad % Gated % Total UL 22.45 22.45 UR 73.96 73.96 LL 2.66 2.66 LR 0.92 0.92 File: EA 250 APOPT.004 Patient ID: 0411.18 Acquisition Date: 11-Apr-18
Gate: No Gate Total Ev ents: 20000 Region % Gated % Total R1 2.63 2.63 R2 0.92 0.92 R3 75.00 75.00 R4 21.50 21.50 R2 R3 R4 R1 (d) File: EA 300 APOPT.008 Patient ID: 0411.18 Acquisition Date: 11-Apr-18
Gate: No Gate Total Ev ents: 20000
Quad Location: 64, 79 Quad % Gated % Total UL 24.30 24.30 UR 57.19 57.19 LL 17.31 17.31 LR 1.20 1.20 File: EA 300 APOPT.008 Patient ID: 0411.18 Acquisition Date: 11-Apr-18
Gate: No Gate
Total Ev ents: 20000 Region % Gated % Total R1 17.26 17.26 R2 1.21 1.21 R3 58.31 58.31 R4 23.33 23.33 R2 R3 R4 R1 (e)
Vol. 10; No. 1; Januari 2019 Halaman 9-16
sitoplasma  sel  perlakuan  uji  mempunyai  warna  biru  yang  berbeda  dengan  dengan kontrol sel dengan antibodi spesifik Bcl-2 yang berwarna coklat. Warna biru tersebut terlihat  lebih  banyak  diekspresikan seiring  dengan meningkatnya  konsentrasi  fraksi etil asetat daun M. oleifera yang diberikan. Hal ini menunjukkan bahwa telah terjadi penurunan  ekspresi  Bcl-2  karena  pemberian  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera . Penurunan  ekspresi  protein  ini  semakin  meningkat  seiring  dengan  meningkatnya konsentrasi fraksi etil asetat yang diberikan.
Gambar  3. Penentuan  ekspresi  Bcl-2  pada  sel  T47D  yang  telah  diberi  perlakuan dengan  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera menggunakan  metode imunositokimia.  (a)  kontrol  sel,  (b)  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera 150 μg/mL (c) 200 μg/mL dan (d) 250 μg/mL.

## Pembahasan
Pemberian  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera terhadap  sel  kanker  payudara T47D  menginduksi  kematian  sel  secara  apoptosis.  Persentase  total  sel  apoptosis meningkat  seiring  dengan  meningkatnya  konsentrasi  fraksi  etil  asetat  daun M. oleifera yang diberikan. Temuan ini sesuai dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh  Tiloke 21 bahwa  ekstrak  daun M.  oleifera memiliki  aktivitas  antiproliferatif terhadap  sel  kanker  paru  A549  dan  dapat  menginduksi  apoptosis  melalui peningkatan protein p53.
Sel T47D merupakan sel kanker payudara yang memiliki karakteristik caspase 2 wildtype ,  caspase  7 wildtype ,  ER/PR  positif  dan  p53 mutant 22 .  Pada  sel  T47D, induksi  apoptosis  yang  terjadi  dimungkinkan  tidak  melalui  mekanisme  p53.  Oleh karena  itu,  diperlukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk  mengetahui  mekanisme molekular  yang  memperantai  terjadinya  apoptosis.  Pada  penelitian  ini  dilakukan pengamatan pada salah satu protein antiapoptosis, yaitu Bcl-2.
Protein proapotosis seperti Bax dan Bak dapat menginduksi pelepasan sitokrom c  yang  bersama  dengan  Apaf-1  menginduksi  apoptosis  melalui  aktivasi  caspase. Namun,  keberadaan  Bcl-2  sebagai  protein  antiapoptosis  beraksi  kebalikan 23,24 . Dengan  adanya  efek  penurunan  terhadap  ekspresi  protein  Bcl-2,  semakin meyakinkan  bahwa  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera berpotensi  sebagai  agen antikanker.
Protein  Bcl-2  merupakan  salah  satu  jenis  protein  anti  apoptosis  yang  terlibat dalam  proses  apoptosis.  NFkB  dari  downstream  PI3K/Akt  merupakan  faktor transkripsi yang penting dalam transkripsi protein anti apoptosis seperti Bcl-2, IAP dan  Bcl-xL 25 .  Terjadinya  penurunan  ekspresi  Bcl-2  pada  penelitian  ini  diduga karena  adanya  penghambatan  jalur  PI3K/Akt/NFkB.  Hal  ini  berkorelasi  dengan hasil penelitian dari Berkovich 26 yang menyatakan bahwa ekstrak daun M. oleifera telah  dilaporkan  mampu  menghambat  faktor  transkripsi  NF-kB  pada  sel  Panc-1. Penekanan  ekspresi  protein  Bcl-2  ini  dapat  menyebabkan  terjadinya  induksi
(a) (b) (c) (d)
Vol. 10; No. 1; Januari 2019 Halaman 9-16
apoptosis  karena  pelepasan  sitokrom  c  oleh  mitokondria  menjadi  tidak  terhambat yang kemudian dapat mengaktivasi jalur caspase.
Proses  apoptosis  tetap  terjadi  meskipun  hasil  visualisasi  dari  imunositokimia menunjukkan  bahwa  penurunan  ekspresi  protein  Bcl-2  yang  diinduksi  oleh  fraksi etil  asetat  daun M.  oleifera tidak  terlalu  signifikan.  Apoptosis  yang  terjadi kemungkinan  melibatkan  adanya  peningkatan  ekspresi  protein  proapoptosis seperti  Bax  dan  Bak 27 .  Oleh  karena  itu,  perlu  penelitian  lebih  lanjut  untuk mengetahui  pengaruh  pemberian  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera terhadap ekspresi protein proapoptosis.

## Kesimpulan
Fraksi etil asetat daun M. oleifera memiliki aktivitas antikanker pada sel kanker payudara T47D dengan nilai IC 50 sebesar 243,58 μg/mL melalui induksi apoptosis. Perlakuan  pada  sel  T47D  dengan  fraksi  etil  asetat  daun M.  oleifera juga dapat menurunkan ekspresi protein Bcl-2.

## Daftar Pustaka
1.  Garcia  M,  Jemal  A,  Ward  EM,  Center  MM,  Hao  Y,  Siegel  RL,  Thun  MJ.  Global Cancer Facts & Figures. Atlanta. GA: American Cancer Society. 2007.
2.  IARC.  Globocan  2012:  Estimated  Cancer  Insidence,  Mortality  and  Prevalence Worldwide  in  2012  [Internet].  2012  [cited  2017  Juli  12].  Available  from: http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx.
3.  Gibbs,  JB.  Mechanism-based  target  identification  and  drug  discovery  in  cancer research. Science. 2000;287(5460);1969-73.
4. Da’i M, Melannisa R, Trisharyanti I. Mekanisme Molekuler Sitotoksisitas Ekstrak Daun  Jati  Belanda  Terhadap  Sel  Kanker.  Penelitian  Fundamental.  Universitas Muhammadiyah Surakarta. 2013.p.8.
5.  Miyachi  K,  Fritzler  MJ,  Tan  EM.  Benzyl  isothiocyanate  inhibits  excessive superoxide  generation  in  inflammatory  leukocytes:  implication  for  prevention against inflammation-related carcinogenesis. Carcinogenesis. 2004;25;567 –75.
6.  Faizi, S., Siddiqui, B., Saleem, R., Saddiqui, S. & Aftab, K. Isolation and structure elucidation  of  new  nitrile  and  mustard  oil  glycosides  from  Moringa  oleifera  and their effect on blood pressure. J Nat Prod . 1994;57;1256 –61.
7.  Khalafalla MM, Abdellatef E, Dafalla HM, Nassrallah AA, Aboul-Enein KM. Active principle from Moringa oleifera lam leaves effective against two leukemias and a hepatocarcinoma. Afr J Biotech . 2010;9;8467 –71.
8.  Waiyaput  W,  Payungporn  S,  Issara-Amphorn1  J,  Panjaworayan  N.  Inhibitory effects  of  crude  extracts  from  some  edible  Thai  plants  against  replication  of hepatitis B virus and human liver cancer cells. BMC Com Alt Med . 2012;12;246 – 52.
9.  Lipipun  V,  Kurokawa  M,  Suttisri  R,  Taweechotipatr  P,  Pramyothin  P.  Efficacy  of Thai medicinal plant extracts against herpes simplex virus type 1 infection in vitro and in vivo. Antivir Res . 2003;60;175 –80.
Vol. 10; No. 1; Januari 2019 Halaman 9-16
10.  Murakami  A,  Kitazono  Y,  Jiwajinda  S,  Koshimizu  K,  Ohigashi  H.  Niaziminin,  a thiocarbamate  from  the  leaves  of Moringa  oleifera ,  holds  a  strict  structural requirement  for  inhibition  of  tumor-promoter-induced  Epstein-Barr  virus activation. Planta Med . 1998;64;319 –23.
11.  Iqbal  S,  Bhanger  MI.  Effect  of  season  and  production  location  on  antioxidant activity  of  Moringa  oleifera  leaves  grown  in  Pakistan. J  Food  Compos  Anal . 2006;19;544 –55.
12.  Sultana  B,  Anwar  F,  Ashraf  M.  Effect  of  extraction  solvent/technique  on  the antioxidant activity of selected medicinal plant extracts. Molecules . 2009;14;2167 –80.
13.  Kumar V, Pandey N, Mohan V, Singh RP. Antibacterial and antioxidant activity of extract  of  Moringa  oleifera  leaves-An  in  vitro  study. Int  J  Pharm  Scis . 2012;12;89 –94.
14.  Kumar NA, Pari L. Antioxidant action of Moringa oleifera Lam. (drumstick) against antitubercular drugs induced lipid peroxidation in rats. J Med Food . 2003;6;255 – 9.
15.  Kumar  GS,  Kumar  B,  Srinivasan  BP,  Nag  TC,  Srivastava  S,  Saxena  R, Anggarwal  A.  Retinoprotective  Effects  of  Moringa  oleifera  Via  Antioxidant,  Anti- Inflammatory,  and  Anti-Angiogenic  Mechanisms  in  Streptozotocin-Induced Diabetic Rats. J Ocul Pharmacol Ther . 2013;29(4);419 –26.
16.  Budda  S,  Butryee  C,  Tuntipopipat  S,  Rungsipipat  A,  Wangnaithum  S. Suppressive  effects  of  Moringa  oleifera  Lam  pod  against  mouse  colon carcinogenesis induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Asian Pac J Cancer . 2011;12;3221 –8.
17.  Bharali  R,  Tabassum  J,  Azad  MR.  Chemomodulatory  effect  of  Moringa  oleifera Lam  on  hepatic  carcinogen  metabolizing  enzymes,  antioxidant  parameters  and skin papillomagenesis in mice. Asian Pac J Cancer Prev 2003;4;131 –9.
18.  Brunelli  D,  Tavecchio  M,  Falcioni  C.  The  isothiocyanate  from  glucomoringin inhibits  NF-kB  and  reduces  myeloma  growth  in  nude  mice  in  vivo. Biochem Pharmacol 2010;79;1141 –8.
19.  Kamuhabwa A, Nshimo C, Witte P. Cytotoxicity of Some Medicinal Plant Extracts Used in Tanzanian Traditional Medicine. J. Ethnopharmacol. 2000;70(2);143 –9.
20.  Machana  S,  Weerapreeyakul  N,  Barusrux  S,  Nonpunya  A,  Sripanidkulchai  B, Thitimetharoch  T.  Cytotoxic  and  Apoptotic  Effects  of  Six  Herbal  Plants  Against The  Human  Hepatocarcinoma  (HepG2)  Cell  Line.  Chinese  Medicine.  2011;6(- );39.
21.  Tiloke C, Phulukdaree A, Chuturgoon AA. The antiproliferative effect of Moringa oleifera crude aqueous leaf extract on cancerous human alveolar epithelial cells. BMC Complement Altern Med. 2013;13;226.
Vol. 10; No. 1; Januari 2019 Halaman 9-16
22.  Schafer  JM,  Lee  ES ,  O’Regan  RM,  Yao  K,  Jordan  VC.  Rapid  Development  Of Tamoxifen-Stimulated  Mutant  p53  Breast  Tumors  (T47D)  In  Athymic  Mice.  Clin Cancer Res. 2000;6(11);4373-80.
23.  Padanilam  BJ.  Cell  Death  Induced  by  Acute  Renal  Injury:  A  Perspective  on  the Contributions  of  Apoptosis  and  Necrosis.  Am  J  Physiol  Renal  Physiol. 2003;284;F608 –F27.
24.  Sekti  DA,  Mubarok  MF,  Armandani  I,  Junedy  S,  Meiyanto  E.  Ekstrak  Etanolik Daun  Awar –awar  ( Ficus  septica Burm.  f.)  Memacu  Apoptosis  Sel  Kanker Payudara  MCF-7  Melalui  Penekanan  Ekspresi  Bcl-2.  Majalah  Obat  Tradisional. 2010;15;100 –104.
25.  Simstein  R,  Burow  M,  Parker  A,  Weldon  C,  Beckman  B.  Apoptosis, Chemoresistance and Breast Cancer: Insight from the MCF-7 Cell Model System. Exp. Biol. Med. 2003;228;995 –1003.
26.  Berkovich  L,  Earon  G,  Ron  I,  Rimmon  A,  Vexler  A,  Lev-Ari  S. Moringa  oleifera aqueous  leaf  extract  down-regulates  nuclear  factor-kappa  B  and  increases cytotoxic  effect  of  chemotherapy  in  pancreatic  cancer  cells.  BMC  Complement Altern Med 2013;13;212.
27.  Ricci  MS,  Zhong  WX.  Chemoteurapeutic  Approach  for  Targeting  Cell  Death Pathway. The Oncologist. 2006;11;342 –57.