## ACTIVITY TEST OF IMMUNOMODULATORY COMPONENT FROM NEEM LEAVES TO CANDIDA ALBICANS

## (UJI AKTIVITAS KOMPONEN IMUNOMODULATOR DARI NEEM TERHADAP
CANDIDA ALBICANS)
I Dewa Ayu Ratna Dewanti* ,  I Dewa Ayu Susilawati*, Purwanto*,  Depi Praharani**
* Departemen Biomedik ** Departemen Periodontik Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas of  Jember
Jl. Kalimantan street 37, Jember 68121 E-mail:  dewadewanti@yahoo.com

## Abstract
Empirically, societies have utilized neem plant to treat worm infection, scabies, malaria, candidal infection, and allergy. Several researches have indicated that consuming neem leaves could improve antibody production. Our previous research had demonstrated the existence of immunomodulatory component in neem leaves weighted 70 and 100 kDA. The aimed of study was to test the activity immunomodulatory components to Candida albicans. This research was an in vitro study with rats as experimental subject. The rats were divided into three treatment groups and one control group, which were labeled as KO (no treatment), KP1 (inoculated by C. albicans only), KP2 (inoculated by C. albicans and were given the 70  kDA  immunomodulatory  component),  KP3  (inoculated  by C.  albicans and  were  given  the  100  kDA  im- munomodulatory component). In day 21, preparations from rats’ tongue were done with immunohistochemistry staining and were analyzed for the activity of TNF-α macrophage phagocytosis and also for calculation of C. albicans colony from tongue swab. The result showed that there was no significant difference between the 70 and 100 kDA immunomodulatory components in increasing activity of TNF-α and macrophage phagocytosis and in decreasing the number of C. albicans colony.  It  was  assumed that  those  components might actívate NF-κB and AP-1 that play role  in protein  transcription, which  stimulated  gene  expression  like  TNF-α,  which  played  role  in  phagocytosis.  In  conclusión,  70  dan  100  kDA immunomodulatory  components  increased  the  activity  of  TNF-α  and  macrophage  phagocytosis  and  also  decrease  the number of C. albicans colony.
Key words: immunomodulator, Candida albicans , imunohistochemy, neem

## PENDAHULUAN
Krisis  multidimensional  di  Indonesia  telah  me- nimbulkan dampak terhadap menurunnya kesehatan masyarakat, ditandai dengan semakin meningkatnya penyakit  infeksi.  Salah  satu  penyakit  infeksi  yang paling banyak dijumpai adalah infeksi jamur (kandi- diasis)  yang  terutama  bermanifestasi  di  rongga mulut  (kandidiasis  oral).  Pada  umumnya,  penderita kandidiasis  akan  datang  ke  dokter  atau  dokter  gigi setelah kondisinya parah atau mengganggu, padahal infeksi ini seharusnya dicegah, karena dapat menjadi kelainan  praganas  (kandidal  leukoplakia).,  di  mana imunitas  alami  merupakan  imunitas  terdepan  yang melawan C.  albicans dan  diperankan  oleh  makro- fag.  Makrofag  berperan  penting    dalam  melawan infeksi oleh C. albicans .  Makrofag  sebagai  fagosit
profesional mengenali dan menghancurkan C. albi- cans melalui  beberapa  reseptor  merangsang  pro- duksi  substansi  mikrobial  melalui  CD14  yang diekspresikan ke permukaan sel akan mengaktifkan Toll-like  receptors (TLRs)  serta  NF-κB. 1-3 Di  sisi lain  obat  kimia  menimbulkan  efek  samping  dan harganya  semakin  mahal  menyebabkan  semakin tidak  terjangkau  masyarakati,  sehingga  diperlukan obat  yang  murah,  mudah  didapat  dan  denagn  efek samping minimal.
Tanaman mimba ( Azadirachta Indica Juss ), secara empiris telah dikenal oleh masyarakat sebagai salah satu obat tradisional yang dapat mengatasi berbagai macam  penyakit,  seperti:  cacingan,  kudis,  malaria, infeksi jamur, alergi dan kanker. Fenomena ini me- nunjukkan  bahwa  mimba  mengandung  komponen imunomodulator  yang  dapat  memodulasi  respons
imun.  Beberapa  penelitian  membuktikan  mimba memodulasi  imunitas  alami  dan  adaptif. 4-.9 Kom- ponen  imunumodulator  dengan  cepat  diabsorbsi oleh membran usus dan diedarkan dalam darah se- telah 45 menit diberikan secara per oral dengan half- life dalam plasma 5 jam, cepat diabsorbsi ke dalam semua jaringan tubuh dan sistem organ. Gugus OH pada  komponen  mimba  bersifat  polar,  sehingga mudah berikatan dengan senyawa lain. 10-12. Artikel- artikel ilmiah terutama dari para penulis India telah banyak mengungkap berbagai aktivitas farmakologi daun  mimba  misalnya  sebagai  antijamur,  antibak- teri,  antivirus,  obat  cacing,  antialergi,  anti  kanker baik in vitro maupu n in vivo . 13-15
Penelitian  tentang  ”Isolasi  imonomodulator  daun mimba  serta  uji  aktivitasnya  terhadap  infeksi C. albicans”, penting  dilakukan  karena  memiliki aspek-aspek yang bermanfaat membantu memecah- kan  permasalahan  kesehatan  yang  saat  ini  banyak dialami  masyarakat. 7-9 Permasalahannya  adalah, komponen  imunomodulator  daun  mimba  belum banyak diteliti. Selain itu, secara spesifik potensinya untuk  meningkatkan  ketahanan  terhadap  infeksi jamur C. albicans belum pernah dilaporkan.
Penelitian ini bertujuan membuktikan kemampuan komponen  imunomodulator  daun  mimba  yang  po- ten untuk meningkatkan ketahanan terhadap C. albi- cans .

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  ini  dimulai  dengan  pembuatan  ekstrak daun mimba. Sepuluh gram daun mimba dilarutkan dan ditaburi nitrogen cair kemudian digerus dan di- tambahkan bufer yang  mengandung SDS  (1:2)  dan digerus  kembali  sampai  halus.  Kemudian  gerusan mimba  disentrifuse  dengan  kecepatan  6000  rpm, selama 10 menit pada  temperatur 15°C,  supernatan dipisahkan dan siap untuk analisis kadar protein atau disimpan  dalam  suhu  -20°C.  Penelitian  berikutnya menguji lebih lanjut reaksi protein daun mimba ter- hadap antibodi (IgG) dalam serum darah tikus yang telah  mengonsumsi  daun  mimba,  untuk  meng- identifikasi adanya fraksi protein imunogenik. Ana- lisis  kadar  protein  dilakukan  dengan  metode  Brad- ford menggunakan estándar BSA. Ekstrak cair daun mimba  di  runing  dengan  metode  elektroforesis,  se- hingga  diperoleh  band  yang  menunjukkan  profil SDS  PAGE  (fraksi  daun  mimba  dan  berperan  se- bagai  antigen)  dan  dipindahkan  ke  membran  nitro- celulose  (NC).  Antigen/Ag  pada  membran  NC  ke- mudian direaksikan dengan antibodi primer ( mouse polyclonal  antibody)/ darah  tikus  dengan  cara  di- celup semalam. Setelah itu, membran NC diinkubasi dengan antibodi sekunder (yang telah dilabel dengan
enzim pendeteksi  alkalin  fosfatase, anti mouse  IgG label  AP),  yang  akan  berikatan  dengan  antibodi primer.  Imunoreaktivitas antara  antibodi primer  de- ngan  fraksi-fraksi  antigen  spesifik  dapat  dideteksi dengan  cara  mereaksikannya  dengan  substrat  kro- mogen  BCIB/NBT.  Komponen  imunomodulator yang telah diketahui BM nya diisolasi dari gel elek- troforesis  dengan  cara  elektroelusi  (membran  blot berupa  pita  biru),  yaitu  Band  dipotong  untuk  di- lakukan  isolasi,  kemudian  dilakukan  purifikasi. Hasil  elektroelusi  dipurifikasi  dengan  dialisis  pada PBS kemudian pada dH2O dengan cara dimasukkan ke dalam membran dialisis selama 24 jam, sehingga diperoleh suspensi komponen imunomodulator. Penelitian  ini  merupakan  studi in  vivo dengan menggunakan  20  hewan  coba  tikus  yang  terbagi menjadi  4  kelompok,  yaitu  KO  (tidak  diberi  per- lakuan), KP1 (diinokulasi C. albicans ), KP2 (diberi konsumsi komponen imunomodulator 70 KDA dan diinokulasi C.  albicans ),  KP3  (diberi  konsumsi komponen  imunomodulator  100  KDA  dan  di- inokulasi C.  albicans ).  Hari  ke  21  dibuat  sediaan pada Saburoud’s  agar dari  swab  lidah  dan  di- lakukan penghitungan koloni C. albicans. Selanjut- nya  dibuat  sediaan  lidah  tikus,  dan  dilakukan analisis  aktivitas  TNF-α  dan  fagositosis  makrofag dengan  pengecatan  imunohistokimia.  Data  yang diperoleh  dianalisis  menggunakan  Anova,  dilanjut- kan uji LSD.

## HASIL
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pembuatan ekstrak daun mimba dengan etanol tidak menghasil- kan komponen imunomodulator, sedangkan dengan cara  ekstrak  tetes  (pembuatannya  seperti  pada  me- tode) dari perasan daun mimba menghasilkan kom- ponen imunomodulator yang telah kami lakukan pa- da penelitian sebelumnya.
Pada  Gambar  1  dapat  dilihat  profil  protein  daun mimba  yang  tidak  terdenaturasi  mengandung  pro- tein  BM  besar  yakni  antara  200-250  kDa,  protein yang lain (sebagian besar) BMnya lebih kecil di ba- wah 30 kDa. Sedangkan pada daun mimba yang di- denaturasi  tampak  sebagian  besar  proteinnya  me- miliki BM di bawah 55 kDa.
Hasil  uji  Western  blotting,  komponen  imuno- modulator  yang  ditemukan,  adalah  70  dan  100 KDA.
Pada  penelitian  ini  dilakukan  uji  aktivitas  kom- ponen  iumnomodulator  yang  telah  ditemukan  pada penelitian sebelumnya (70 dan 100 KDA) terhadap TNF-α  dan  aktivitas  fagositosis  pada  tikus  yang diinokulai C. albicans . Hasil  ekspresi TNF-α dapat dilihat pada Gambar 3. Gambar 3 terlihat bahwa sel
yang mengekspreikan TNF-α (sel warna coklat tua) pada KP2 dan KP3 berjumlah seimbang, sedangkan KP1  (diinokulasi C.  albicans tanpa  komponen imunomodulator) lebih sedikit.
Gambar 1.  Profil  protein  daun  mimba  pada  gel  12,5% pewarnaan comassie  brilliant  blue .  1:  daun (denaturasi  pemanasan  100°C,  5  menit),  2: daun tanpa denaturasi,  3: marker
Gambar 2.  Hasil  Westernblotting  yang  menunjukkan reaksi  protein  daun  mimba terhadap antibodi (IgG) tikus (rat polyclonal antibody). 1: mar- ker,  2,3,4:  fraksi  protein  mimba  imunogenik (tanda panah)
Gambar  3.  Hasil  Imunohistokimia  aktivitas  TNF-α.  KO =  Kelompok  Kontrol,  KP1=  Kelompok  Per- lakuan 1 (diinokulasi C. albicans ), KP2= Ke- lompok  perlakuan  2  (diinokulasi C.  albicans dan  diberi  konsumsi  komponen  imunomo- dulator  70  KDA),  KP3=  Kelompok  per- lakuan  3  (diinokulasi C.  albicans dan  diberi konsumsi  komponen  imunomodulator  100 KDA).
Hasil  analisis  statistik  menggunakan  Anova  dan dilanjutkan  uji  LSD  menunjukkan  antara  KP2  de- ngan KP3 tidak terdapat perbedaan yang signifikan, sedangkan  antara KO dengan kelompok perlakuan, KP1  dengan  KP2,  KP3  terdapat  perbedaan  signifi- kan (Gambar 4).
Gambar 4. Diagram batang TNF-α
Pada  Gambar  5  terlihat  sel  makrofag  yang  aktif menfagosit  (sel  warna  coklat  tua)  pada  KP2  dan KP3  berjumlah  seimbang,  sedangkan  KP1  (di- inokulasi C. albicans tanpa komponen imunomodu- lator) lebih sedikit.
Gambar 5.  Hasil  Imunohistokimia  aktivitas  fagositosis. KO =   Kelompok Control KP1=   Kelompok Perlakuan  1  (diinokulasi C.  albicans ),  KP2=
Kelompok  perlakuan  2  (diinokulasi C.  albi- cans dan  diberi  konsumsi komponen imuno- modulator  70  KDA),  KP3=  Kelompok  per- lakuan  3  (diinokulasi C.  albicans dan  diberi konsumsi  komponen  imunomodulator  100 KDA
Analisis statistik menggunakan Anova dilanjutkan uji  LSD  antara  KP2  dengan  KP3,  hasilnya  tidak terdapat  perbedaan  yang  signifikan,  sedangkan antara  KO  dengan  kelompok  perlakuan,  KP1  de- ngan  KP2,  KP3  terdapat  perbedaan  signifikan (Gambar 6).
Gambar 6. Diagram batang aktivitas fagositosis
positif negatif KO KP1 KP2 KP3 positif negatif positif negatif positif negatif KO KP1 KP2 positif negatif 1      2     3    kDa KP3 negatif positif
Hasil  swab  lidah  yang  ditumbuhkan  pada Sabu- roud’s agar terlihat KO  tidak terdapat koloni,  KP1 banyak  dijumpai  koloni,  sedangkan  KP1  dan  KP2 jumlah  koloni  seimbang  (tidak  berbeda  nyata) (Gambar 7).
Gambar  7.  Jumlah koloni C.  albicans . KO  =  Kelompok Kontrol,  KP1=  Kelompok  Perlakuan  1  (di- inokulasi C. albicans ), KP2= Kelompok per- lakuan  2  (diinokulasi C.  albicans dan  diberi, konsumsi  komponen  imunomodulator  70 KDA),  KP3=  Kelompok  perlakuan  3  (di- inokulasi C.  albicans dan  diberi  konsumsi komponen imunomodulator 100 KDA
Analisis statistik dengan Anova dan  uji LSD me- nunjukkan  antara  KP2  dengan  KP3  tidak  terdapat perbedaan  yang  signifikan,  sedangkan  antara  KO dengan  kelompok  perlakuan,  KP1  dengan  KP2, KP3 terdapat perbedaan signifikan (Gambar 7).
Gambar 7. Diagram  batang  jumlah  koloni C.  albi- cans

## PEMBAHASAN
Penelitian  ini  telah  memenuhi  ” Declaration  of Helsinki ” dengan menunjukkan bahwa daun mimba dengan komponen  imunomodulator  (70-100 KDA) membangun  keseimbangan  baru  melalui  regulasi sistem  imun  yang  hasilnya  dapat  kita  kenali  dari produk yang dihasilkan sel makrofag, dalam meng- hadapi  stresor.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan bahwa  komponen  imunomodulator  70  KDA  dan 100 KDA sama-sama meningkatkan aktivitas TNF- α dan fagositosis.  Kelompok Kontrol (TNF-α) juga terlihat  sel  makrofag  yang  aktif,  hal  ini  dapat  di- mengerti karena secara fisiologis sel makrofag akan mengekspresikan TNF-α. Sedangkan aktivitas fago-
sitosis tidak terdapat sel yang aktif , karena C. albi- cans tidak ditemukan secara normal di rongga mulut tikus.
TNF-α,  aktivitas  fagositosis  dan  jumlah  koloni C albicans menjadi  solusi  penting  pada  upaya  peme- cahan  masalah  ini,  karena  TNF-α,  aktivitas  fago- sitosis  adalah  komponen  pada  sistem  imun innate yang  bertugas  sebagai  sensor  stimuli  dari  ling- kungan,  sedangkan  jumlah  koloni C.  albicans di- gunakan  sebagai  parameter  adanya  efek  perubahan komponen imun innate terhadap C. albicans . Kom- ponen imunomodulator daun mimba mempengaruhi phospatidilinositol pada membran sel makrofag dan akan  mengaktifkan protein  Rac ,  selanjutnya  akan mengaktivasi NF-κB dan  AP-1  melalui  jun  kinase melalui jalur MAPK ( The mito-gen-activated protein kinase ). Termasuk  jalur  ini ERK ( Extracelluler  sig- nal-regulated kinase), JNK ( c-jun  N-terminal ki- nase)dan  p38. ERK mem-pengaruhi  aktivitas  jun, sedangkan p38 mem-pe-ngaruhi produksi IL-6, IL-8 dan  IL-12.  Aktivitas  p38  dan ERK dapat  meng- aktivasi AP-1 .  Ketiga  jalur MAPK dapat  diaktivasi dalam waktu yang  sama. NF-κB merupakan  regu- lator  dari  respons  awal  terhadap  patogen  dan  se- bagai  aktivator  respons  imun. NF-κB adalah  p50- p65  dari  keluarga  protein  heterodimer  yang  mens- transkripsi  bermacam  gen.  Aktivasi NF-κB me- merlukan fosforilasi protein IκB ,  kemudian  terjadi degradasi  yang  menyebabkan p50-p65 berada da- lam  nukleus  dan  mengaktifkan  gen.  Setelah  terjadi pelepasan I-κB ,  akan  terjadi  peningkatan  aktivitas faktor transkripsi NF-κB yang menstimulasi ekspresi gen yang mempengaruhi produksi TNF-α dan akti- vitas  fagositosis.  Stimulasi  ekspresi  gen  antara  lain mempengaruhi  produksi  TNF-α.  Dalam  respons imun terhadap C albicans, TNF-α berperan sebagai imun  primer  dalam  regulasi  sistem  imun.  Khusus pada  makrofag  sitokin  ini  meningkatkan  aktivitas dalam membunuh patogen, di mana aksi ini menjadi mediator  penting  pada  inflamasi.  Aktivitas  respons imun innate ini  dapat  mempengaruhi MHC ,  se- hingga akan berefek pada aktivitas imun adaptif (sel T dan sel B). Semua aktivitas ini dapat menurunkan jumlah koloni C. albicans .
Sebagai  kesimpulan,  komponen  imunomodulator daun  mimba  dengan  berat  molekul  70  dan  100 KDA  dapat  meningkatkan  aktivitas  sel  makrofag yang  meliputi:  ekspresi  TNF-α  dan  aktivitas  fago- sitosis serta menurunkan jumlah koloni C. albicans .

## Daftar Pustaka
1.     Agrawal  D.P.  Medical  properties  of  Neem  new findings. http://www.infinityfoundation.com/man- dala/t_es/t_es_agraw_neem.htm. (3 Februari 2007).
KO KP1 KP 2 KP3
2. Netea  G.  Mihai,  Neil  A.R.  Gow,  Carol  A.  Monro, Stevens Bates, et al.  Immune sensing of C. albicans requires  cooperative  recognition  of  mannan  and glucans  by  lectin  and      Toll-Like  receptors.  J    Clin Invest 2006;  116:   1642-50.
3.    Pivarcsi A, Laszlo B, Bence R, Anna K.s, Andrea K, Marta. Expression and function of toll-like receptors 2  and  4  in  human  keratinocyte.  International  Im- munology 2003; 15: 6: 721-30.
4.     Hanachi P, Fauziah O, Peng LT, Wei LC, Nam LL, Tian  TS.  The  effect  of  Azadirachta  indica  on distribution of antioxidant elements and gluthathione S-transferase  acivity  in  liver  of  rats  during hepatocarcinogenesis. Asia Pacific J Clin Nutr 2004; 13(Suppl): S170.
5.     Sithisarn P, Subaphol R, Gritsanapan W. Antioxidant activity  of  Siamese  neem  tree.  J  Ethnoparmacol 2005; 13: 99(1): 109-12.
6.    Subapriya  Rajamanickam,  Ramasamy  K,  Sidda- varam  N.  Expression  of  PCNA,  cytokeratin,  Bcl-2, and p53 during  chemoprevention  of  hamster  buccal pouch by ethanolic neem leaf axtract. Clinical Bioc- hemistry 2006; 39: 1080-87.
7. Widi  R  E,  I  Dewa  Ayu  R  D.  Penurunan  ekspresi TNF-α makrofag pada tikus wistar yang diinokulasi C.  albicans .  Stomatognatic  J  Kedokteran  Gigi Universitas Jember 2009; 6; 2: 141-4.
8. Ayu  I  D  R.  Ekspresi  TLR4  makrofag  pada  tikus wistar  yang  diinokulasi C. albicans .  Stomatognatic
J  Kedokteran  Gigi  Universitas  Jember  2010;  7;  3: 29-34.
9. Ayu  I  D  R.  Aktivitas  fagositosis  pada  tikus  wistar yang  diinokulasi C.  albicans dan  diberi  mimba (Azadirachta indica). Dentofasial J Kedokteran Gigi 2011; 10; 1: 26-31.
10. Ganguli  S.  Neem:  A  Therapeutic  for  all  Seasons. Current Science 2002; 82(11).
11. Goel  RK,  Sairam  K.  Anti  ulcer  drugs  from  indi- genous  source  with  emphasis  on  musa  sapientum, tamrabhasma, asparagus racemous and zingiber offi- cinale. Indian J Pharmacology 2002; 34: 100-10.
12. Arivazhagan,  Balasenthil  S,  Nagini  S.  Garlic  and neem  leaf  Extracts  enhance  hepatic  glutathione  and glutathione  dependedent  enzyme  during  N-methyl- N’-nitro-N-nitrosoguanine (MNNG) induced gastric carcinogenesis  in  rats.  Phytother  Res  2002;  14(4): 291-3.
13. Biswas K, Ishita C, Ranajit KB, U Bandyopadhayay. Biological  activities  and  medical  properties  of neem  (Azadirachta  indica).  Current  Science  2002: 82; 11, 10.
14. Helmy A. Wafaa, Hassan Amer and Nefisa M.A. El- Shayeb.  Biological  and  antimicrobial  activity  of aquoeus extracts from neem tree (Azadirachta indica A.  Juss,  Meliaceae).  Applied  Sciences  Res  2007; 5(5): 1050-55.
15. Sukrasno. Mimba tanaman obat multifungsi, Jakarta: Agromedia Pustaka, 2003; 7-23.