## POTENSI ANTIOKSIDAN METABOLIT SEKUNDER FRAKSI ETIL ASETAT DARI KULIT
BATANG EBONI ( Diospyros celebica Bakh.)
[Antioxidant Potential of The Secondary Metabolite Compund Ethyl Acetate  From Ebony Bark ( Diospyros celebica Bakh.)]
Vivi Sasmita 1* , Ahmad Ridhay 1 , Hardi Ys 1
1) Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Tadulako, Palu Jl. Soekarno Hatta Km.9, Kampus Bumi Tadulako Tondo Palu, Telp. 0451- 422611
*)Coresponding author: sasmitathomes@gmail.com (085145045652)
Diterima 26 Desember 2018, Disetujui 2 Juni 2019

## ABSTRACT
Research  on  the  antioxidant  potential  of  the  secondary  metabolite  compound,  ethyl  acetate  from ebony  bark  ( Diospyros  celebica Bakh.)  has  been  conducted.  This  study  aims  to  characterize  and determine the antioxidant activity of secondary metabolites of ethyl acetate fraction from ebony bark. Ethyl  acetate  extract  was  fractionated  using  Liquid  Vacum  Chromatography  (KVC)  and  Gravity Column  Chromatography  (KKG).  The  isolated  compounds  were  characterized  using  UV-Vis  and  IR spectrophotometers. Data on maximum absorption of λ max 273 nm from UV-Vis  analysis showed the presence of chromophore phenol. IR spectral  data showed several specific peaks, among others, at wave  number  ( ʋ) of 3425.58 cm -1 indicating  the  presence  of –OH group, C-H  aliphatic bond at  ʋ  of 2924.09  cm -1 and  2854.65  cm -1 ,  and  the  peak  at ʋ  of  1604.77  -1465.90  cm -1 and  3078.39  cm -1 indicated  the  aromatic  group,  reinforcing  the  assumption  that  the  isolates  produced  were  phenolic compounds.  IC 50 value  of  75.47  µg/mL  from  antioxidant  activity  testing  showed  that  the  isolates obtained were antioxidant compounds with strong antioxidant categories.
Keyword : antioxidant, Diospyros, ebony, phenolic, isolation

## ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian terhadap potensi antioksidan senyawa metabolit sekunder fraksi etil asetat dari  kulit  batang  eboni  ( Diospyros  celebica Bakh.).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengkarakterisasi serta mengetahui aktivitas antioksidan senyawa metabolit sekunder fraksi etil asetat  dari kulit batang eboni.  Ekstrak  etil  asetat  difraksinasi  menggunakan  Kromatografi  Vakum  Cair  (KVC)  dan Kromatografi  Kolom  Gravitasi  (KKG).  Senyawa  hasil  isolasi  dikarakterisasi  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  dan  IR .  Data  pada  serapan  maksimum  λ maks 273  nm  dari  analisis  UV-Vis menunjukkan  adanya  kromofor  fenol.  Data  spektra  IR  memperlihatkan  beberapa  puncak  spesifik antara  lain  pada  bilangan  gelombang  ( ʋ) 3425,58 cm -1 mengindikasikan  adanya  gugus –OH,  ikatan C-H  alifatik  pada ʋ  2924,09  dan  2854,65  cm -1 ,  serta  adanya  puncak  pada ʋ 1604,77-1465,90  cm -1 dan  3078,39  cm -1 mengindikasikan  gugus  aromatik,  memperkuat  dugaan  bahwa  isolat  yang dihasilkan adalah senyawa fenolik. Nilai IC 50 sebesar 75,47 µg/mL dari pengujian aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa  isolat  yang diperoleh adalah senyawa  antioksidan dengan kategori antioksidan kuat.
Kata Kunci : antioksidan, Diospyros, eboni, fenolik, isolasi

## LATAR BELAKANG
Radikal  bebas  merupakan  senyawa yang  memiliki  sifat  kereaktifan  yang sangat  tinggi,  karena  adanya  elektron yang  tidak  berpasangan.  Sifat  tersebut mengakibatkan radikal bebas dapat mengambil  elektron  dari  senyawa  lain seperti protein, karbohidrat, lipid dan DNA untuk menetralkan  diri  (Sadeli,  2016).  Hal ini  dapat  menyebabkan  gangguan  fungsi sel,  kerusakan  struktur  sel,  modifikasi molekul dan bahkan menyebabkan mutasi (Rahmawan  dan  Dwiatmaka,  2013).  Jika Radikal  bebas  yang  masuk  ke  dalam tubuh  dalam  jumlah  yang  berlebih  dapat memicu terjadinya stres oksidatif sel, yang menyebabkan penyakit degeneratif seperti hipertensi, gejala penuaan, diabetes melitus, kanker dan kardiovaskuler (Praditasari, 2016).
Efek negatif dari radikal bebas dapat dieliminir  dengan  senyawa  antioksidan, karena  kemampuannya  mengembalikan keseimbangan  tubuh  dan    memperlambat oksidasi  senyawa  radikal  bebas.  Hal  ini karena  antioksidan  mampu  menstabilkan radikal  bebas  dengan  mendonorkan  atom hidrogen/elektron (Ikhlas, 2013).
Berdasarkan sumbernya, antioksidan  dapat  dibedakan  menjadi antioksidan sintetis dan antioksidan alami. Namun,  penggunaan  antioksidan  sintetis memiliki  efek  samping,  karena  dapat bersifat  toksik  dalam  dosis  yang  tinggi, sehingga antioksidan alami perlu dikembangkan  (Praditasari,  2016).  Salah satu  sumber  antioksidan  alami  yang
berasal  dari  tumbuhan  adalah  senyawa mtabolit sekunder golongan fenolik.
Senyawa fenolik memiliki kemampuan untuk menghambat autooksidasi  melalui  mekanisme  radikal scavenging , yaitu dengan menyumbangkan  satu elektron  yang tidak berpasangan kepada radikal bebas (Pokorny et  al., dalam  Rahmawan  dan Dwiatmaka, 2013).
Berdasarkan  penelusuran  literatur, genus Diospyros memiliki banyak kandungan fenolik dan beberapa diantaranya  telah  terbukti  berpotensi sebagai  antioksidan. Diospyros  blancoi memiliki kandungan senyawa fenolik lebih dari  30  mg  ekivalen  asam  galat  per  gram ekstrak  tanaman  (Lee et  al., dalam Rahmawan dan Dwiatmaka, 2013). Kandungan  senyawa  fenolik  dalam D. blancoi memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi  (Khan et  al .,  2016).  Kuersetin merupakan  senyawa  golongan  flavonoid (fenolik) yang ditemukan pada D. virginiana L. (Duke dalam Rahmawan dan Dwiatmaka, 2013).
Huang et  al., (2016)  melaporkan daun  kesemek  ( D.  kaki )  mengandung  2 jenis  baru  glukosida  secoiridoid,  yaitu persimmonoid  A  dan  B  dan  beberapa senyawa lain seperti (+)-medioresinol, (+)- pinoresinol,  (+)-pinoresinol- β-D-glukosida dan (-)-(7'S,8S,8'R)-4,4'-dihidroksi-
3,3',5,5'-tetrametoksi-7',9-epoksilignan-9'- ol-7-on.  Ekstrak  metanol  buah  sampanye ( D.  virginiana )  menghasilkan  beragam senyawa  metabolit  sekunder  diantaranya
m-gallat,  asam  gallat,  luteolin,  kuarsetin, mirisetin, mirisetin 3-O-ramnosid, miricetin
3-O-glukosida dan mirisetin 3-O- glukuronid (Rashet et al. , 2014). Penelitian yang dilakukan Hermawan dan Dwiatmaka  (2013),  terhadap  ekstrak  apel beludru  ( Diospyros  blancoi )  membuktikan bahwa D.  Blancoi berpotensi  sebagai senyawa  antioksidan  dengan  nilai  IC 50 sebesar 29,92 µg/mL.
Eboni merupakan salah satu spesies  dari  genus Diospyros dengan nama  ilmiah  Diospyros celebica Bakh., yang  secara  alami  hanya  tumbuh  di Sulawesi,  terutama  Sulawesi  Tengah  dan Sulawesi  Selatan.  Tumbuhan  ini  memiliki nilai  ekonomis  yang  tinggi  dan  termasuk sumber devisa yang cukup besar (Pitopang et  al. dalam  Alwi et  al. ,  2010).
Namun  demikian,  belum  banyak  data ilmiah  mengenai  kandungan  kimia  yang terdapat dalam tumbuhan tersebut.
Uji fitokimia yang dilakukan Budiarso et al. (2016) terhadap ekstrak sabetan dan serutan  kayu  eboni  menunjukkan  bahwa tumbuhan ini mengandung senyawa alkaloid,  flavonoid,  tanin,  saponin,  steroid dan terpenoid. Beberapa senyawa metabolit  sekunder  diantaranya  asam makasarat, Isocelabaquinon ,  8-Metoksi-6- metil-1,2-naptoquinon,  diosindigo  B  dan celebaquinon  telah  berhasil  diisolasi  dari tumbuhan  eboni  ( Diospyros  celebica ) (Rauf et  al., 2017).  Beragam  kandungan senyawa  kimia  pada  tumbuhan  selalu ditemukan  pada  tubuh  tumbuhan  seperti
daun,  biji,  buah,  akar,  bunga,  rimpang, atau kulit batang (Dorly, 2005).
Berdasarkan pendekatan kemotaksonomi, tumbuhan-tumbuhan yang  berasal  dari  genus  yang  sama cenderung memiliki kandungan dan struktur  senyawa  yang  hampir  sama, sehingga  memungkinkan  adanya  aktivitas biologis  yang  sama  (Tringali  dalam Supriadi,  2018).  Berdasarkan  uraian  di atas, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap tumbuhan  eboni, terutama untuk  mengetahui  potensi  antioksidan senyawa metabolit sekunder yang terkandung  dalam  kulit  batang  tumbuhan ini.

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan Peralatan
Sampel  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  kulit  batang  eboni ( Diospyros  celebika Bakh.)  yang  diambil dari Desa Manimbaya kecamatan Balaesang  Tanjung,  Donggala  dan  desa Sausu  Auma,  kecamatan  Sausu,  Parigi Moutong. Adapun pelarut yang digunakan untuk ekstraksi dan kromatografi berkualitas teknis sedangkan untuk analisis  spektroskopi  berkualitas  pro- analisis (p.a). Bahan-bahan yang digunakan  antara  lain  metanol, n -heksan, akuades,  etil  asetat,  kloroform,  aseton, kertas saring Whattman , larutan DPPH 50 µM,  asam  askorbat,  silika  gel  Merck  60 (70-200  mesh)  untuk  KKG,  silika  gel Merck 60 GF 254 (ukuran silika > 200 mesh) untuk  impregnasi,  silika  gel  Merck  (35-70
Mesh)  untuk  KVC  dan  plat  KLT  silika  gel Merck  kiesegal  60  F 254 0,25  mm  untuk KLT.
Alat-alat  yang  digunakan  meliputi rotary  vacum  evaporator ,  neraca  analitik,
1  set  alat  kromatografi  vakum  cair (KVC), kromatografi  kolom  gravitasi,  lampu  UV, sendok  zat,  alu,  botol  kecil  serta  alat-alat gelas  yang  umun  digunakan  dalam penelitian  kimia  organik.  Untuk  analisis senyawa hasil isolasi digunakan instrumen UV-Vis  dan IR.

## Prosedur Penelitian

## Ekstraksi dan Isolasi
Metode yang digunakan adalah hasil modifikasi
metode
Sari dan
Taufiqurrohmah  (2006).  Sebanyak  2,5  Kg kulit  batang  eboni  ( Diospyros  celebca
Bakh.) dimaserasi dengan pelarut metanol selama  3  kali  24  jam.  Ekstrak  hasil maserasi  kemudian  disaring  dengan  alat penyaring Buchner hingga  didapatkan filtrat  dan  residu.  Filtrat  hasil  penyaringan selanjutnya dipekatkan menggunakan rotary vacum evaporator dengan kecepatan  45  rpm  pada  suhu  50 o C.
Ekstrak  metanol  pekat  dari  sampel dipartisi  berturut-turut  dengan n- heksan dan  etil  asetat.  Ekstrak  etil  asetat  yang didapatkan  diuapkan  pelarutnya  hingga kering  dan  ditimbang.  Ekstrak  tersebut difraksinasi menggunakan KVC, selanjutnya  fraksi-fraksi  yang  diperoleh dikumpulkan berdasarkan hasil KLT dengan  nilai  Rf  ( Retention  factor )  yang relatif  sama.  Berdasarkan  analisa  KLT,
fraksi  yang  menunjukkan  senyawa  yang prospektif akan diisolasi untuk mendapatkan  senyawa  tunggal.  Isolasi dan pemurnian senyawa dilakukan menggunakan  teknik  kromatografi  vakum cair dan kromatografi kolom gravitasi.
Fraksi-fraksi  yang  akan  difraksinasi maupun  fraksi-fraksi  setelah  perlakuan fraksinasi  semuanya  diuji  menggunakan KLT. Uji ini menggunakan sistem campuran eluen antara pelarut n -heksana, etil asetat, aseton, kloroform, dan metanol. Fraksi-fraksi  tersebut  dielusi  pada  plat KLT,  kemudian  bercak  yang  diperoleh dilihat di bawah lampu UV untuk memperlihatkan  bercak  hasil  KLT.  Fraksi- fraksi  yang  menunjukkan  Rf  yang  sama digabungkan  dan  dipekatkan  kemudian difraksinasi lebih lanjut.
Ekstrak kasar selanjutnya difraksinasi
menggunakan KVC.
Sebanyak  3  kali  berat  sampel,  silica  gel sebagai  fasa  diam  dimasukkan  ke  dalam kolom.  Kolom  dikemas  kering  dalam keadaan vakum. Eluen yang kepolarannya rendah dimasukkan terlebih dahulu, selanjutnya kolom divakum kembali hingga kering. Ekstrak etil asetat diimpregnasi, kemudian dimasukkan pada bagian  atas  kolom  yang  telah  berisi  fasa diam.  Selanjutnya  ekstrak/sampel  dielusi menggunakan  campuran  pelarut  heksan- etil asetat secara gradient. Setiap penambahan eluen, kolom dihisap dengan vakum sampai kering. Fraksi yang diperoleh  dikumpulkan  dalam  botol-botol kecil.
Fraksi-fraksi  hasil  KVC  difraksinasi lebih  lanjut  menggunakan  kromatografi kolom gravitasi dengan adsorben silika gel Merck  (35-70  Mesh).  Slurry  dari  silika  gel dimasukkan  ke  dalam  kolom  dan  fasa diam  diatur  sedemikan  sehingga  rata  dan tidak  berongga.  Kemudian  sampel    yang telah  diimpregnasi  dimasukkan  ke  dalam kolom  tersebut.  Agar  proses  elusi  tidak terganggu,  maka  kolom  diusahakan  tidak kehabisan  pelarut  pada  saat  sampel dimasukkan.

## Identifikasi  dan  Karakterisasi  Senyawa Metabolit Sekunder
Senyawa  yang  diperoleh  dianalisis menggunakan spektrofotometri yang bertujuan  untuk  mengidentifikasi  adanya gugus  kromofor  seperti  fenolik  dan  ikatan rangkap  (UV)  dan  penentukan  gugus- gugus fungsi senyawa (IR).

## Pengujian Aktivitas Antioksidan
Pengujian
mengkuti metode
Supriadi  (2018).  Sampel  hasil  isolasi  dan
asam askorbat (pembanding) dibuat larutan  induk  dengan  konsentrasi  1000 µg/mL. isolasi dan asam askorbat masing- masing  ditimbang  sebanyak  3  mg  dan dilarutkan  dengan  3  mL  metanol  p.a. Larutan  induk  sampel  dan  asam  askorbat masing-masing  diambil  2,25  mL,  19,44 mL,  17,85  mL,  15  mL  dan  8,33  mL dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  25  mL, kemudian  dicukupkan  volumenya  dengan metanol  p.a  sampai  tanda  batas,  untuk dibuatkan  larutan  uji  seri  konsentrasi  90 µg/ml,  70  µg/ml,  50  µg/ml,  30  µg/ml  dan
10 µg/ml. Larutan sampel dan pembanding masing-masing 0,2 mL dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan ditambahkan 3,8 mL larutan DPPH 50 µM. Kemudian  dikocok  hingga  homogen  dan didiamkan  selama  30  menit.  Selanjutnya diukur  serapannya  (absorbansi)  pada panjang  gelombang  517  nm.  Kemudian dilakukan  hingga  3  kali  pengulangan. Aktivitas antioksidan diekspresikan sebagai  persen  inhibisi  yang  dapat ditentukan dengan menggunakan
persamaan sebagai berikut:
% Inhibisi = x 100%
Persen  inhibisi  dan  konsentrasi sampel diplot masing-masing pada sumbu x dan y dengan persamaan regresi linear. Sumbu  y  dari  masing-masing  sampel dinyatakan  dengan  nilai  sebesar  50  dan sumbu x sebagai IC 50 (Nurjanah dkk, 2011 dalam Ikhlas, 2013).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil Ekstraksi dan Isolasi
Sampel yang telah berbentuk serbuk diekstraksi menggunakan metode maserasi  dengan  pelarut  metanol.  Pada proses ini, membran dan dinding sel akan pecah,  sehingga  metabolit  sekunder  yang terkandung dalam kulit batang eboni akan tertarik oleh metanol.
Ekstrak metanol  yang  diperoleh  dan telah  dipekatkan  dipartisi  berturut-turut menggunakan  pelarut n -heksan  dan  etil asetat  yang  ditambahkan  air.  Partisi menggunakan n -heksan  dilakukan  untuk
memisahkan  senyawa-senyawa  non  polar seperti  triterpenoid,  steroid,  lemak  dan pigmen  yang  masih  terdapat  dalam ekstrak metanol yang diperoleh.
Sedangkan  partisi  menggunakan  pelarut etil  asetat  bertujuan  untuk  menarik  asam fenolat  bebas  dan  aglikon  flavonoid  dari ekstrak.  Adapun  penambahan  air  saat partisi dengan etil asetat dilakukan karena metanol  dan  etil  asetat  sulit  terpisah  saat partisi.
Fraksi  etil  asetat  (120  g)  dielusi dengan  pelarut n -heksan  :  etil  asetat secara  bergradien  (8:2,  7:3,  6:4,  5:5,  4:6, 3:7,  2:8,  9:1  dan  100%  etil  asetat).  Dari hasil  KVC  diperoleh  17  subfraksi  yang kemudian  dibagi  menjadi  fraksi  A,  B  dan fraksi  C  berdasarkan  perbedaan  Rf  dari masing-masing  subfraksi.  Hasil  KVC  dari sampel  dapat  dilihat  pada  kromatogram KLT  (Gambar  1)  yang  menggunakan eluen n -heksan  :  etil  asetat  dengan perbandingan 5:5.
Gambar 1 Kromatogram KLT hasil KVC
ekstrak etil asetat
Hasil  KVC  pada  kromatogram  KLT menunjukkan  bahwa  senyawa  prospektif terdapat pada subfraksi A dan subfraksi B, sehingga memungkinkan untuk difraksinasi lebih lanjut. Terhadap
subfraksi B (3,529 g) dilakukan fraksinasi/pemisahan  menggunakan  KKG dengan  campuran  eluen n -heksan  :  etil asetat  secara  bergradien  (9:1,  8:2,  7:3, 6:4,  5:5,  4:6,  3:7,  2:8,  1:9  dan  100%  etil asetat). Hasil pemisahan dihasilkan subfraksi  B 1 dan  B 2 yang  dapat  dilihat pada  kromatogram  KLT  dengan  sistem campuran eluen n -heksan:etil asetat dengan perbandingan 6:4 (Gambar 2)
Gambar 2 Kromatogram KLT hasil KKG subfraksi B
Subfraksi  B 2 sejumlah  0,585  g  lebih memungkinkan  untuk  difraksinasi  lebih lanjut  (Gambar  2).  Menggunakan  metode yang sama diperoleh subfraksi B 21 , B 22 dan B 23 (Gambar 3).
Gambar 3 Kromatogram KLT hasil KKG subfraksi B 2
Berdasarkan kromatogram KLT, dilakukan  pemurnian  pada  subfraksi  B 22 (31  mg)  dan  diperoleh  senyawa  dengan spot tunggal (Gambar 4).

## Gambar 4 Kromatogram  KLT  senyawa  hasil isolasi
Untuk menyakinkan bahwa senyawa yang  diperoleh  benar-benar  hanya  terdiri dari 1 spot, maka dilakukan KLT dengan 3 sistem perbandingan eluen, yaitu kloroform  :  metanol  (9:1),  kloroform  :  etil asetat  (8:2)  dan  kloroform  :  aseton (9,4:0,6). Hasil kromatogram KLT senyawa  noda  tunggal  dengan  3  sistem perbandingan  eluen  diperlihatkan  pada Gambar 5.
Gambar  5 Hasil  kromatogram  KLT  spot  noda tunggal  dengan  3  sistem  eluen campuran
Senyawa noda tunggal yang diperoleh  dari  hasil  isolasi  (isolat)  adalah sebanyak  9  mg.  Senyawa  hasil  isolasi tersebut diidentifikasi dengan menggunaan spektrofotometer UV-Vis untuk  mengidentifikasi  pola  kromofor  dan
spektrofotometer IR untuk mengidentifikasi  gugus  fungsi  dari  isolat yang diperoleh.

## Spektrum UV-Vis dan IR Senyawa Hasil Isolasi
Spektrofotometer  UV-Vis  digunakan untuk  analisis  senyawa  organik  yang mengandung  gugus  kromoform  yaitu diena  terkinjugasi  (C=C-C=C)  dan  enon (C=C - C=O), dengan kisaran sinar dengan panjang gelombang 200-400 nm. Panjang gelombang  maksimum  merupakan  dasar dari  analisis  kualitatif  karena  setiap senyawa yang mengandung kromofor dan berwarna  memiliki  panjang  gelombang maksimum  yang  spesifik  (Ibrahim  dan Marham, 2013).
Gambar 6 Spektra UV-Vis Isolat Kulit Eboni
Hasil pegukuran dengan spektrofotometer  UV-Vis,  diperoleh  2  pita dengan  λ maks 273  nm  dan  221  nm  yang menunjukkan adanya transisi dari π     π* dari ikatan rangkap C=C (Gambar 6).
Adanya  serapan  pada  panjang gelombang 273 nm menunjukkan senyawa  hasil  isolasi  tersebut  merupakan senyawa fenolik. Menurut Craswell (1991),
K:M
K:A
K:EA
senyawa fenolik akan menunjukkan serapan pada panjang gelombang kisaran 260-280 nm.
Setiap  ikatan  memiliki  bilangan gelombang  yang  spesifik,  menggunakan spekra  IR  dapat  dilakukan  pelacakan
terhadap  gugus  fungsional  suatu  molekul (Sitorus,  2009).  Spektrofotometer  IR  lebih banyak  digunakan  untuk  melacak  gugus fungsi  yang  berada  pada  kisaran  4000- 1500 cm -1 (Ibrahim dan Marham, 2013).

## Gambar 7 Spektrum IR isolat kulit eboni
Spektra  IR  menunjukkan  senyawa hasil  isolasi  memiliki  beberapa  gugus fungsi.  Serapan  pada  3425,58  cm -1 menunjukkan adanya gugus hidroksi –OH (Gambar  7).  Menurut  Sitorus  (2009), alkohol  dan  fenol  akan  memunculkan serapan  (-OH)  pada  sekitar  3500-3300 cm -1 . Serapan pada 2924,09-2854,65 cm -1 menunjukkcan  adanya  ikatan  C-H  alifatik. Serapan pada 1604,77-1465,90 cm -1 dan serapan 3078,39 cm -1 menunjukkan adanya  ikatan  C=C  dan  =C-H  dari senyawa aromatik.
Berdasarkan  data  spektra  UV-Vis dan  IR,  isolat  kulit  eboni  yang  diperoleh diduga merupakan senyawa fenolik.
Aktivitas  Antioksidan  Senyawa  Hasil Isolasi
Metode pengujian aktivitas
antioksidan yang dipilih pada penelitian ini adalah metode DPPH. Metode ini merupakan metode yang sering digunakan dalam pengujian aktivitas antioksidan  secara in  vitro karena  relatif murah dan sederhana dibandingkan metode in vitro lain.
Larutan DPPH bersifat radikal karena  adanya  elektron  yang  tidak berpasangan. Penambahan senyawa antioksidan akan menjadikan DPPH bersifat  stabil  karena donor proton sebagai pasangan elektron yang bersumber  dari  senyawa  antioksidan  dan akan menyebabkan penurunan
absorbansi larutan DPPH secara stoikiometri.
Gambar 8  Reaksi  Radikal  DDPH  dengan antioksidan
Parameter pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH adalah nilai  IC 50 yaitu  konsentrasi  senyawa  uji yang dibutuhkan untuk mengurangi radikal DPPH  sebesar  50%.  Nilai  IC 50 diperoleh menggunakan  persamaan  regresi  linear yang  menunjukkan  hubungan  antara konsentrasi  senyawa  hasil  isolasi  dan persen  aktivitas  antioksidan  (%  inhibisi). Semakin  kecil  nilai  IC 50 dari  suatu senyawa,  menunjukkan  senyawa  tersebut semakin  potensial  sebagai  antioksidan
(Rahmawan dan Dwiatmaka, 2013). Menurut  Hidajat  (2005), senyawa  yang memiliki  nilai  IC 50 <  50  µg/mL  tergolong aktivitas antioksidan sangat kuat, antioksidan kuat jika memiliki nilai IC 50 50- 100  µg/mL,  antioksidan  sedang  jika memiliki    nilai  IC 50 100-150  µg/mL, antioksidan  lemah  jika  nilai  IC 50 150-200 µg/mL  dan  sangat  lemah  jika  nilai  >  200 µg/mL .
Hasil pengukuran absorbansi menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis menunjukkan bahwa isolat memiliki aktivitas  antioksidan,  hal  ini  ditandai dengan  penurunan  absorbansi  DPPH setelah  30  menit  penambahan  larutan isolat. Dari data absorbansi yang diperoleh, ditentukan aktivitas penghambatan  (%inhibisi)  radikal  DPPH oleh senyawa hasil isolasi.
Gambar 9 Gafik regresi hubungan %inhibisi dan konsentrasi
Senyawa hasil isolasi memiliki aktivitas  antioksidan  yang  kuat  dengan nilai  IC 50 sebesar  75,47  µg/mL,  walaupun tidak  seperti  aktivitas  antioksidan  dari
vitamin  C  yang  termasuk  golongan antioksidan  sangat  kuat  dengan  nilai  IC 50 yang mencapai 23,62 µg/mL (Gambar 9).
y = 0.501x + 12.195 R² = 0.971 y = 1.3654x + 15.385 R² = 0.9084 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 % inhibisi Konsentrasi %inhibisi isolat %inhibisi vit C
Linear (%inhibisi isolat) Linear (%inhibisi vit C)

## KESIMPULAN
Senyawa  metabolit  sekunder  yang berhasil diisolasi dari fraksi etil asetat kulit kayu  eboni  adalah  senyawa  fenolik  dan berpotensi  sebagai  senyawa  antioksidan dan  tergolong  antioksidan  kuat  dengan nilai IC 50 sebesar 75,47 µg/mL.

## DAFTAR PUSTAKA
Alwi,  M.,  Ramadanil,  Dewa  N.P.  2010.
Ekstrak  Serbuk  Gergaji  Kayu  Eboni ( Diospyros  celebica Bakh.)  sebagai Fungisida Terhadap Phytophthora palmivora Butler. Biocelebes, 4 : 89-97.
Budiarso  A  E.,  Budi,  A  S.,  Kusuma  I  W. 2016.  Analisis  Fitokimia  Ekstrak Kayu  Eboni  ( Diospyros  Celebica Bakh.). Warta Rimba ,  4: 61-68.
Dorly.  2005.  Potensi  Tumbuhan  Obat Indonesia DalamPengembangan Industri Agromedisin. Bogor: IPB.
Hidajat, B. 2005. Penggunaan Antioksidan Pada  Anak.  Surabaya:  Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.
Huang,  S.  W.,  Jin-Wei  Q.,  Xue  S.,  Pin-Yi
G.,  Ling-Zhi  L.,  Qing-Bo  L.,  Bei  S., De-Ling  W.,  and  Shao-Jiang  S. 2016.  Secoiridoids  and  lignans  from the leaves of Diospyros kaki Thunb.with antioxidant and neuroprotective  activities. Journal  of Functional Foods , 24: 183 –195.
Ibrahim,  S.  Sitorus,  M.  2013.  Teknik
Laboatorium Kimia
Organik. Yogyakarta: Garaha Ilmu.
Ikhlas,  N.  2013.  Uji  Aktivitas  Antioksidan Ekstrak  Herba  Kemangi  ( Occinum americanum Linn)  dengan  Metode DPPH (2,2-difnil-1-pikrihidrazil). Skripsi. Jakarta: FKIK UIN
Syarifhidayatullah.
Khan,  M.  A.,  Mahbubur  R.,  Nazmul  S.,
Saiful I. A., Badrul I., Jahangir A. K.,
Mamunur  R.,  Golam  S.,  and  AHM Khurshid  A.  2016.  Comparative investigation  of  the  free  radical scavenging potential and anticancer, property of Diospyros blancoi (Ebenaceae). Asian  Pacific  Journal of Tropical Biomedicine , 6: 410 –417.
Praditasari,  A.  2016.  Metode  Uji  Aktivitas
Antioksidan  Secara In  Vitro Pada Ekstrak Tanaman: Review . Bandung: Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran.
Rahmawan,  J.  B.  Y.  dan  Y.  Dwiatmaka. 2013. Penetapan kandungan fenolat Total  dan  Uji  Aktivitas  Antioksidan Menggunakn  Radikal  DPPH  Fraksi Etil  Asetat  Sari  Buah  Apel  Beludru ( Diospyros  blancaoi A.  DC.). Jurnal Farmasi  Sains  dan  Komunitas ,  10:
101-110.
Rashet,  K.,  Ana  C,  Jasmina  G  C,  and Marina  Si.  2014.  Antibacterial  and antifungal  activities  of  methanol extract andphenolic compounds from Diospyros virginiana L. Industrial  Crops  and  Products,59:
210 –215.
Rauf,  A.,  Gias,  U.,  Seema,  P.,  Ajmal,  K.,
Shobia,  A.  H.,  Saud,  B.,  Khalid,  A., Naveed,  M.,  and  Mohammad,  S.  M. 2017. Diospyros An  Under-Utilized Multi-Purpose  Plant  :  A  review. Biomedicine  and  Pharmacotherapy, 91: 714-730.
Sadeli, R. A. 2016. Uji Aktivitas
Antioksidan  dengan  Metode  DPPH
( 1,1-diphenyl-2-pycryhydrazyl ) Ekstrak Bromelin Buah Nanas ( Ananas comosus (L.) Merr). Skripsi. Yogyakarta: Fakultas Farmasi.
Universitas Sanata Dharma.
Sari,  O  P.,  dan  Taufiqurrohmah,  T.  2006.
Isolation and Identification of Flavonoid Compound Extractire
Ethyl  Acetate  Fraction  Extracted

## From  The  Rhizomes  Fingerroot  of
( Boesenbergia  pandurata (Roxb.)
Schlecht)  ( Zingiberaceae ). Indo.  J.
Chem. , 6(2): 219 – 223.
Sitorus,  M.  2009.  Spektroskopi  Elusidasi Struktur Molekul Organik. Yogyakarta : Graha Ilmu. Supriadi,  R.  R.  2018.  Potensi  Antibakteri Senyawa  Turunan  Flavan-3-ol  Dari Ekstrak  Etil  Asetat  Kulit  Batang Kemerakan Sapenit ( Bauhinia Latisiliqua L ) . Skripsi. Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam,  Universitas  Tadulako.  Palu.