BERKALA SAINSTEK 2024 12(1): 30-36 doi: 10.19184/bst.v12i1.42341 https://jurnal.unej.ac.id/index.php/BST/article/view/42341

## RESEARCH   ARTICLE

## Virtual Screening of Inhibitor Compounds for HL-60 Cell Line Using QSAR and Molecular Docking Approaches
( Virtual Screening Senyawa Inhibitor untuk HL-60 Cell Line Menggunakan Pendekatan QSAR dan Docking Molekular)
Maulina Surindri Putri Handayani 1 , Sudarko 1*) , Ari Satia Nugraha 2 1 Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Jember, Jl. Kalimantan 37, 68121, Jember, Indonesia
2 Prodi S-1 Farmasi, Universitas Jember, Jl. Kalimantan 37, 68121, Jember, Indonesia

## ABSTRACT
Leukaemia is a type of heterogeneous malignancy disease in which the number of immature white blood cells in the bone marrow is increased or poorly differentiated. Inhibitors of HL-60 cell line are important drugs in the treatment of leukaemia. This study aims to identify potential inhibitors for HL-60 leukaemia cells using virtual screening with QSAR and molecular docking approaches. The best QSAR model obtained was the model with R 2 testing value of 0.72. The best model was applied to the Enamine database, obtained  3,841,278  compounds  with  pIC 50 above  9  were  clustered  to  end  up  with  50  inhibitor  candidate  compounds.  The compounds were further studied through molecular docking against CDK- 2 and BCL-2 target proteins with binding free energy analysis. Screened compounds have high inhibitory potential against CDK-2 and BCL-2 target proteins in HL-60 cells which can be proposed as potential inhibitors of HL-60 cells. These compounds can be further tested for the development of more effective antileukaemia drugs.
Leukemia adalah jenis penyakit keganasan heterogen di mana jumlah sel darah putih yang belum matang di sumsum tulang meningkat atau berdiferensiasi buruk. Inhibitor garis sel HL-60 adalah obat penting dalam pengobatan leukemia. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi potensi penghambat sel leukemia HL-60 menggunakan virtual screening dengan QSAR dan pendekatan molecular docking. Model QSAR terbaik yang diperoleh adalah model dengan nilai pengujian R 2 sebesar 0,72. Model terbaik diterapkan pada basis data Enamine, diperoleh 3.841.278 senyawa dengan pIC 50 di atas 9 diklasterkan hingga menghasilkan 50 senyawa kandidat inhibitor. Senyawa tersebut dipelajari lebih lanjut melalui penambatan molekuler terhadap protein target CDK-2 dan BCL-2 dengan analisis energi bebas pengikatan. Senyawa yang disaring memiliki potensi penghambatan yang tinggi terhadap protein target CDK-2 dan BCL-2 dalam sel HL-60 yang dapat diusulkan sebagai penghambat potensial sel HL-60. Senyawa ini dapat diuji lebih lanjut untuk pengembangan obat antileukemia yang lebih efektif.
Keywords: HL60, Inhibitor, QSAR, Virtual Screening, Docking Molecular.

## PENDAHULUAN
Leukaemia yaitu jenis keganasan heterogen di mana jumlah  sel  darah  putih  tidak  matang  dalam  sumsum tulang  meningkat  atau  berdiferensiasi  buruk  [1]. Yayasan Onkologi Anak Indonesia menyatakan bahwa terdapat sekitar 11.000 kasus kanker baru pada anak yang ditemukan setiap tahunnya di seluruh Indonesia dan 30 - 40% diantaranya merupakan leukaemia [2].
Metode Komputasi dapat digunakan untuk proses desain  obat.  Desain  obat  dapat  digunakan  untuk penemuan obat baru dalam berbagai penyakit dengan menggunakan  metode virtual  screening .  Metode virtual
screening dapat diklasifikasikan menjadi metode desain obat berbasis struktur dan berbasis ligan berdasarkan ketersediaan  informasi  strukturalnya.  Metode  desain obat  berbasis  struktur  menggambarkan  pengikatan molekul sementara metode berbasis ligan membahas hubungan  aktivitas  struktur  kuantitatif   dan pemodelan farmakologis [3].
Pendekatan  penelitian  menggunakan  analisis hubungan  kuantitatif structure-activity (QSAR)  dan docking molekuler  secara  teoritis  dapat  digunakan untuk  memprediksi  aktivitas  biologis  yang  paling optimal  dari  sebuah  senyawa.  Pendekatan  teoritis dengan  bantuan  kimia  Komputasi  sangat  penting
*) Corresponding author: Sudarko E-mail: darko@unej.ac.id

## Handayani, Virtual Screening of Inhibitor …
dalam proses perancangan obat-obatan baru. Metode QSAR  menggambarkan  hubungan  antara  deskriptor molekul  dan  aktivitas  biologisnya  [4].  Interaksi senyawa dengan protein target dapat divisualisasikan dengan  metode docking dan  dapat  digunakan  untuk mengetahui pharmacophore dari suatu senyawa [5]. Dalam  penelitian  ini,  kami  melaporkan  desain senyawa-senyawa potensial yang mampu menghambat sel  HL-60  menggunakan  analisis  QSAR  untuk merekomendasikan  beberapa  senyawa  dengan aktivitas penghambatan yang lebih baik. Selanjutnya, senyawa-senyawa  potensial  di docking untuk memprediksi interaksi senyawa dengan protein target CDK-2  (PDB  ID:  7KJS)  dan  BCL-2  (PDB  ID: 6O0K).

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat  perangkat  keras  yang  di  gunakan  adalah Komputer/PC Laptop Lenovo Idea Center AIO 520- 5MID sebanyak 5 buah dengan sistem operasi Linux Ubuntu  20.04  LTS,  RAM  4GB  dan  prosesor  Intel Core  i5.  Perangkat  lunak  menggunakan  Smina, OpenBabel, PyMOL, dan Biovia Discovery Studio.
Bahan-bahan  yang  digunakan  adalah  website protein  data  bank  ( https://www.ebi.ac.uk/chembl/ ) dan Enamine database ( www.enamine.net ).
Konstruksi Model Dataset  sebanyak  2.903  dari  HL-60 cell  line untuk masa inkubasi 72 jam diunduh dari database ChEMBL 31  ( https://www.ebi.ac.uk/chembl/ )  dengan  kode ChEMBL383.  Dataset  berisi  data  senyawa  dan  nilai aktivitas dibagi menjadi tiga bagian yaitu data training (85%), data validation (5%) dan data testing (10%). Komputer  dengan  sistem  operasi Linux Ubuntu 20.04  LTS  yang  telah  dilengkapi  dengan  program Anaconda dan Python disiapkan. Dataset dari HL-60 dilakukan  optimalisasi  model  QSAR  sebanyak  375 kombinasi hyperparameter  neural  network .  Hasil  yang diperoleh  berupa  model  terbaik  yang  kemudian digunakan untuk proses prediksi nilai aktivitas.

## Virtual Screening
Skrining  virtual  menggunakan  molekul  pada database Enamine  ( www.enamine.net )  sebanyak  6 milyar  molekul  untuk  dilakukan  pemeringkatan. Proses pemeringkatan dilakukan berdasarkan prediksi nilai  pIC 50 menggunakan  model  terbaik  yang  telah
dihasilkan  pada  prosedur  sebelumnya.  Skrining tersebut  akan  menghasilkan  molekul  dengan  nilai pIC 50 terbaik. Molekul hasil pemeringkatan selanjutnya disaring  kembali  menggunakan  metode clustering K- Means. Clustering bertujuan  untuk  membantu mengidentifikasi  kelompok-kelompok  senyawa  yang memiliki karakteristik serupa.

## Docking Molecular
Smina  digunakan  untuk  proses docking molekuler karena  tersedia  secara  gratis.  Smina  dikembangkan berdasarkan  AutoDock  Vina  dengan  peningkatan performa  dan  efisiensi  [6]. Docking dengan  Smina dijalankan  pada  Jupyter  Notebooks  berdasarkan Talktorial T015 [7].
Struktur  protein  target  yang  digunakan  dapat diunduh  dengan  format  *.pdb  pada  Protein  Data Bank. Protein dipreparasi menggunakan modul Pybel yang  merupakan  bagian  dari  OpenBabel  untuk mengubah  parameter-parameter  seperti  muatan parsial  pada  atom  dan  penambahan  atom  hidrogen. Struktur  protein  target  tersebut  kemudian  diubah menjadi format *.pdbqt menggunakan OpenBabel.
Preparasi ligan dilakukan dengan mengambil ligan dalam format SMILES yang telah diperoleh dari virtual screening .  Ligan  dengan  format  SMILES  diubah menjadi  format  *.pdbqt  menggunakan  OpenBabel. Selanjutnya, penentuan binding site berupa gridbox yang dilakukan  dengan  memasukkan  Ligan_ID  dari  ligan yang terikat pada protein target. Struktur Protein dan ligan  yang  sudah  dipreparasi  kemudian  dilakukan proses docking menggunakan Smina. Hasil dari docking berupa nilai binding affinity dan RMSD. Visualisasi hasil docking dilakukan  menggunakan  PyMOL  dan  Biovia Discovery Studio.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Model QSAR
Dataset  dengan  kode  ChEMBL383  untuk  masa inkubasi  72  jam  yang  diperoleh  dari  database ChEMBL
( https://www.ebi.ac.uk/chembl/ ) digunakan untuk mendapatkan model. Dataset dengan format *.csv terdiri dari 2.903 data struktur molekul yang ditulis dalam bentuk SMILES dan nilai aktivitas molekul  yang  dinyatakan  dengan  nilai  pIC 50 . Pemodelan QSAR dilakukan dengan menjalankan 375 x  1000 jobs berdasarkan  hasil  variasi  pemisahan  data dan  kombinasi hyperparameter  neural  network yang

## Handayani, Virtual Screening of Inhibitor …
digunakan  pada  proses  pelatihan  menggunakan machine learning . Kombinasi hyperparameter ini bertujuan untuk  menemukan  model  dengan  nilai validation  loss terkecil. Model yang memiliki nilai validation loss terkecil dari 375 model tersebut akan dipilih untuk dilakukan uji  dengan  data testing agar  akurasi  model  dapat diketahui berdasarkan parameter R 2 dan MSE. Model terbaik dipilih berdasarkan nilai R 2 dan MSE pada setiap state id . Parameter R 2 memiliki rentang nilai antara 0 hingga 1. Model terbaik yang didapatkan yaitu pada state id 82 dengan kombinasi l1; l2; l3; drop out rate ;
dan batch size berturut - turut yaitu 256; 256; 64; 0,4; dan 64. Nilai parameter R 2 yang dihasilkan untuk data training , validation , dan testing berturut – turut yaitu 0,96; 0,73;  dan  0,78.  Nilai-nilai  tersebut  sudah  memenuhi syarat minimal nilai R 2 . Menurut Hermansyah et al. , [8], menyatakan bahwa nilai minimum yang direkomendasikan  untuk  model  QSAR  regresi  agar dapat menghasilkan prediksi yang akurat adalah R ≥ 0,8 dan R 2 ≥ 0,6. Plot regresi antara nilai pIC 50 prediksi vs eksperimen  dari  model  terbaik  dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Gambar 1. Plot Regresi Nilai pIC 50 Prediksi vs Eksperimen pada Model Terbaik Virtual Screening pada Database Enamine Model  terbaik  dengan  nilai  R 2 testing sebesar  0,72 digunakan  untuk  proses virtual  screening dari  6  milyar senyawa pada database Enamine ( www.enamine.net ). Senyawa dari hasil virtual screening tersebut di peringkat dari  yang  memiliki  nilai  pIC 50 tertinggi  dan  dipilih senyawa dengan nilai pIC 50 diatas 9,0 yaitu sebanyak 3.841.278  senyawa.  Pemilihan  senyawa  dengan  nilai pIC 50 sebesar 9 didasarkan pada obat leukaemia seperti venetoclax  yang  sudah  beredar  memiliki  nilai  pIC 50 sebesar 9, yang bertujuan untuk mendapatkan senyawa dengan  aktivitas  penghambatan  yang  lebih  baik  jika dibandingkan [9].
Senyawa  hasil screening tersebut  disaring  kembali berdasarkan  kesamaan  struktur  menggunakan pengelompokan ( clustering ) dengan metode K-Means. Clustering K-Means  pada  3.841.278  senyawa menghasilkan 50 cluster yang terdapat senyawa dengan nilai  pIC 50 tertinggi  pada  setiap  cluster-nya.  Hasil clustering beberapa senyawa ditunjukkan pada Tabel 1.
Senyawa-senyawa yang dihasilkan dengan prediksi aktivitas  nilai  pIC 50 memiliki  kemungkinan  untuk menjadi calon obat baru leukaemia yang efektif  karena tersebut telah memenuhi aturan 5 Lipinski. Senyawa- senyawa  tersebut  kemudian  di  docking  untuk mengetahui interaksi senyawa dengan protein target.

## Docking Molecular
Hasil dari docking berupa nilai binding affinity dan RMSD yang kemudian dilakukan pemeringkatan dari nilai  binding  affinity  yang  terkecil.  Nilai  binding affinity  diukur  dengan  satuan  energi  bebas  Gibbs (∆G).  Nilai  ∆G  yang  negatif   memengaruhi kemampuan  sebuah  ligan  untuk  berinteraksi  dengan molekul target [10]. Interaksi antara ligan dan protein target  menghasilkan  residu  asam  amino  yang  dapat menentukan  kekuatan  interaksi  yang  terjadi.  Hasil docking dari beberapa senyawa terhadap protein target CDK-2 dapat dilihat pada Tabel 2.

## Handayani, Virtual Screening of Inhibitor …

## Tabel 1. Hasil Clustering Beberapa Senyawa
ID Enamine Struktur Molekul pIC 50 PV-008392343646 9,01 PV-005945500657 9,92 PV-005944179637 9,65 PV-005944793561 9,46 PV-005943606370 9,16 PV-008392560869 10,00 PV-004072924727 9,95

## Tabel 2. Hasil Docking Molecular CDK-2
Ligan Binding Affinity (kcal/mol) RMSD (Å) Residu Asam Amino Ikatan Hidrogen Interaksi Hidrofobik PV-008392343646 -9,3 1,4 Asp86; Lys89; Ala31; Val64; Leu134; Ile10; PV-005945500657 -9,2 1,4 Asp145; Ile10; Ala31; Val64; Ala144; Val18; Leu134; PV-005944179637 -9,0 1,9 Phe82; Glu81; Leu134; Ala31; Ile10; Val18; Ala144: PV-005944793561 -8,9 0,9 Asp86; Leu134; Phe80; Ala31; Val18; Lys33; PV-005943606370 -8,8 1,8 Asp145; Gln131; Ile10; Phe80; Ile10; Alvocidib -10,2 1,2 Lys33; Asp86; Val18; Ala31; Val64; Ala144;
Hasil  docking  yang  tertera  pada  Tabel  2 menunjukkan  ligan  dengan  kode  PV-008392343646 memiliki nilai binding affinity paling negatif  yaitu -9,3 kcal/mol.  Ligan  uji  dan  ligan  pembanding  yang  di docking dengan protein CDK-2 memiliki nilai binding affinity kurang dari 0 yang menunjukkan semua ligan uji dan ligan pembanding mudah berinteraksi dengan protein  target.  Nilai  RMSD  antara  ligan  dan  residu
WG1  digunakan  untuk  validasi  protokol  docking. Hasil docking dapat dikatakan valid jika kalkulasi nilai RMSD pada ligan kurang dari 2 Å.  Ligan uji juga di docking  dengan  protein  BCL-2  menggunakan parameter  binding  affinity.  Hasil  docking  molecular ligan terhadap protein BCL-2 dapat dilihat pada Tabel 3.

## Handayani, Virtual Screening of Inhibitor …

## Tabel 3. Hasil Docking Molecular BCL-2
Ligan Binding Affinity (kcal/mol) RMSD (Å) Residu Asam Amino Ikatan Hidrogen Interaksi Hidrofobik PV-008392560869 -9,0 1,9 Ala34; Val41; PV-004072924727 -8,9 1,0 Val33; PV-005945500657 -8,7 0,8 Gly30; Tyr7; Ala34; Arg31; Val33; PV-005944793561 -8,2 1,1 Arg31; Ala34; PV-005944179637 -7,9 1,8 Ala34; Arg31; Val18; Leu22; Venetoclax -11,4 1,7 Gly30; Tyr7; Leu22; (a) (b)
Gambar 2. Visualisasi Hasil Docking dari Ligan (a) Alvocidib; (b) PV-008392343646 Terhadap CDK-2
(a)
(b)
Gambar 3. Visualisasi Hasil Docking dari Ligan (a) Venetoclax; (b) PV-008392560869 Terhadap BCL-2 Hasil visualisasi ligan menggunakan PyMOL yang dapat  dilihat  pada  Gambar  2  dan  Gambar  3 menunjukkan kesamaan posisi untuk ligan berinteraksi dengan  protein  target.  Ligan-ligan  yang  di docking memiliki binding  site yang  sama  dengan  ligan pembanding.
Visualisasi  ligan  uji  juga  dilakukan  menggunakan Biovia  Discovery  Studio untuk  melihat  interaksi  ligan pada  protein  target.  Interaksi  yang  terjadi  diantara ligan uji dan protein target yaitu ikatan hidrogen dan interaksi  hidrofobik.  Visualisasi  dari Biovia  Discovery Studio untuk  protein  CDK-2  dapat  dilihat  pada Gambar 4 dan untuk protein BCL-2 dapat dilihat pada Gambar 5.
Hasil  interaksi  antara  ligan  uji  dan  ligan pembanding dengan protein target yang tertera pada Tabel  2  dan  Tabel  3  menunjukkan  adanya  beberapa
kesamaan  interaksi.  Ligan  uji  PV-008392343646 memiliki interaksi paling mirip dengan alvocidib yaitu untuk  ikatan  hidrogen  pada  residu  Asp86;  serta interaksi  hidrofobik  pada  residu  Ala31  dan  Val64. Interaksi pada ligan PV-005945500657 juga memiliki kesamaan  dengan  venetoclax  yaitu  untuk  ikatan hidrogen pada residu Gly30 dan interaksi hidrofobik pada  residu  Tyr7.  Hasil  visualisasi  hasil docking yang menunjukkan potensial yang paling baik untuk protein target CDK-2 dan BCL-2 yaitu senyawa dengan kode PV-005945500657.
Senyawa PV-005945500657 menunjukkan  nilai  energi  bebas binding yang  rendah terhadap kedua protein target dan memiliki interaksi yang  sama  dengan  ligan  pembanding.  Menurut Prasetiawati et al ., [11] ligan uji yang memiliki ikatan hidrogen  pada  residu  yang  sama  dengan  ligan pembanding dapat memiliki aktivitas yang serupa juga.

## Handayani, Virtual Screening of Inhibitor …
Hasil penelitian yang telah dilakukan ini menunjukkan bahwa  beberapa  ligan  uji  hasil  screening  diprediksi bersifat  inhibisi  untuk  HL-60 cell  line .  Namun, diperlukan  validasi  dan  penelitian  lebih  lanjut  untuk
meningkatkan  keakuratan  hasil docking dalam pemilihan  senyawa  yang  potensial  menghambat  sel HL-60.
(a)                                                     (b)
Gambar 4 Visualisasi 2D Interaksi (a) Alvocidib; (b) PV-008392343646 dengan CDK-2
(a)                                                    (b)
Gambar 5 Visualisasi 2D Interaksi (a) Venetoclax; (b) PV-005945500657 dengan BCL-2

## KESIMPULAN
Leukaemia  banyak  terjadi  pada  anak-anak  di Indonesia.  Pendekatan  komputasi  dapat  digunakan untuk  mengidentifikasi  senyawa-senyawa  yang berpotensi menghambat sel HL-60. Dalam penelitian ini, kami menggunakan virtual screening berbasis QSAR dan docking molecular untuk  mengidentifikasi kemungkinan  penghambat  CDK-2  dan  BCL-2. Akurasi prediksi diberikan oleh model terbaik dengan nilai  R 2 test  sebesar  0,72  yang  mampu  memprediksi nilai  pIC 50 pada  6  miliar  senyawa  dari  database Enamine.  Senyawa  hasil docking dengan  nilai  energi bebas binding terendah yaitu PV-005945500657 dipilih sebagai kandidat senyawa yang berpotensi menghambat sel HL-60.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  J.  M.  Han,  H.  L.  Kim,  and  H.  J.  Jung,  “Ampelopsin inhibits  cell  proliferation  and  induces  apoptosis  in HL60  and  K562  leukemia  cells  by  downregulating AKT and NF-κB signaling pathways,” Int. J. Mol. Sci. , vol. 22, no. 8, pp. 1-15, Apr. 2021. [2]  Yayasan  Onkologi  Anak  Indonesia,  “Informasi Kanker Anak,” 2016. https://www.yoaifoundation.org/kanker- anak.php#informasikankeranak  (accessed  Nov.  09, 2022).
[3]  A.  Tripathi  and  K.  Misra,  “Molecular  docking:  A structure-based drug designing approach,” JSM Chem , vol. 5, no. 2, p. 1042, 2017.
[4]  A.  Wadood,  N.  Ahmed,  L.  Shah,  A.  Ahmad,  H. Hassan,  and  S.  Shams,  “In-Silico  drug  design:  An approach  which  revolutionarised  the  drug  discovery process,” OA Drug Des. Deliv. , vol. 1, no. 1, pp. 1-4, Sep. 2013.

## Handayani, Virtual Screening of Inhibitor …
[5]  F.  F.  Setiawan  and  E.  P.  Istyastono,  “Uji  in  silico senyawa 2,6-Dihidroksiantraquinon sebagai ligan pada reseptor  estrogen  alfa,” J.  Farm.  Sains  dan  Komunitas , vol. 12, no. 2, pp. 77-80, 2015.
[6]  D.  R.  Koes,  M.  P.  Baumgartner,  and  C.  J.  Camacho, “Lessons learned in empirical scoring with smina from the CSAR 2011 benchmarking exercise,” J. Chem. Inf. Model. , vol. 53, no. 8, pp. 1893-1904, 2013.
[7]  D.  Sydow et  al. ,  “TeachOpenCADD  2022:  Open source  and  FAIR  python  pipelines  to  assist  in structural  bioinformatics  and  cheminformatics research,” Nucleic Acids Res. , vol. 50, no. W1, pp. W753-
W760, 2022.
[8]  O.  Hermansyah,  A.  Bustamam,  and  A.  Yanuar, “Virtual screening of  DPP-4 inhibitors using QSAR- based artificial intelligence and molecular docking of hit compounds to DPP-8 and DPP-9 Enzymes,” Res. Sq. Prepr. , 2020.
[9]  S.  Krishna et  al. ,  “Pharmacoinformatics  based screening  of   combined  synthetic  and  natural compounds  to  identify  novel  and  in  silico  potential Bcl-2 inhibitors,” J. Mol. Liq. , vol. 366, p. 120250, 2022. [10] T.  A.  Balogun et  al. ,  “Computational  evaluation  of bioactive compounds from colocasia affinis schott as a novel EGFR inhibitor for cancer treatment,” Cancer Inform. , vol. 20, no. 2021, pp. 1-12, 2021.
[11] R.  Prasetiawati,  M.  Suherman,  B.  Permana,  and Rahmawati, “Molecular docking study of anthocyanidin compounds against Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) as anti-lung cancer,” Indones. J. Pharm. Sci. Technol. , vol. 8, no. 1, pp. 8-20, 2021.