## Pengembangan Biosensor Berbasis Kertas untuk Penentuan Aktivitas Antihiperlipidemia pada Sampel Ekstrak Tanaman

## ( Development of Paper-Based Biosensor for Screening of Antihyperlipidemia Activities on Herbal Extracts )
Vinda Aisya Vira, Bambang Kuswandi, Indah Purnama Sary Fakultas Farmasi, Universitas Jember Jln. Kalimantan 37, Kampus Tegal Boto Jember 68121 e-mail korespondensi: vindavira9a@gmail.com

## Abstract
A  biosensor  is  an  alternative  method  to  determine  the  antihyperlipidemic  activity  to  be  more  simple, effective, and efficient in various herbal extracts. This study aimed to develop a biosensor with the principle of pancreatic lipase enzyme inhibition in paper microzone plates using Whatman filter paper for the matrix, 200  unit/mL  of  lipase  enzyme  solution,  1%  extract,  and  80  mM  p-NPB  substrate.  This  paper-based biosensor  method  shows  results  that  fulfilled  the  several  characterizations,  that  are  the  30  min  of  the incubation  time;  linearity  using  7  standards  orlistat  concentrations  of  5-35  mg/mL  with  the  regression equation of Y= 22.09585 + 2.170514X, correlation coefficient value (r)= 0.9996745, Vx0= 1.509906%, Xp= 1.572533 mg/mL; LOD and LOQ are 1,573 mg/mL and 4,718 mg/mL; precision with RSD value of 2.545%; accuracy with % recovery value of 99.222%; biosensor usage time after storage remained stable for 3 days at chiller temperatures and for 45 minutes at room temperature. The paper-based biosensor can be an alternative  method  for  detecting  antihyperlipidemic  activity  in  plant  extracts  as  same  as  UV-Vis spectrophotometry method.

## Keywords: Antihyperlipidemia, Biosensor, Plant Extracts, Lipase

## Abstrak
Biosensor merupakan metode alternatif untuk menentukan aktivitas anitihiperlipidemia secara lebih efektif dan  efisien  pada  berbagai  ekstrak  tanaman  obat.  Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan  untuk mengembangkan biosensor dengan prinsip inhibisi ezim lipase pankreas pada lempeng kertas zona mikro dengan menggunakan media kertas saring Whatman dan larutan enzim lipase 200 Unit/ml, ekstrak 1%, dan substrat p-NPB konsentrasi 80 Mm. Metode biosensor berbasis kertas ini menunjukkan hasil yang memenuhi  beberapa  karakterisasi,  yaitu  waktu  inkubasi  substrat  selama  30  menit;  linieritas  dari  7 konsentrasi  standar  orlistat  5-35  mg/mL  dengan  persamaan  regresi  Y  =  22,09585  +  2,170514X,nilai koefisien korelasi (r) = 0,9996745, nilai Vx0 = 1,509906%, dan nilai Xp = 1,572533 mg/mL; LOD pada konsentrasi  1,573  mg/mL  dan  LOD  pada  konsentrasi  4,718  mg/mL;  presisi  dengan  nilai  RSD  sebesar 2,545%; akurasi dengan nilai % recovery sebesar 99,222%; waktu pakai biosensor setelah penyimpanan tetap  stabil  selama  3  hari  pada  suhu chiller 2-4°C  dan  selama  45  menit  pada  suhu  ruangan  ±25°C. Biosensor berbasis kertas dapat menjadi metode alternatif untuk deteksi aktivitas antihiperlidemia pada ekstrak  tanaman  karena  memberikan  hasil  analisis  yang  tidak  berbeda  signifikan  dengan  metode spektrofotometri UV-Vis.
Kata kunci : Antihiperlipidemia, Biosensor, Ekstrak Tanaman, Lipase
Pendahuluan Hiperlipidemia merupakan kondisi abnormal  pada  lipid  dalam  darah  berupa peningkatan kadar kolesterol dan/atau trigliserida [1].  Tanaman  obat  sering  dipakai  sebagai pengobatan  alternatif  penyakit  hiperlipidemia karena  memiliki  efek  samping  merugikan  yang lebih  kecil  [2],  sehingga  sebagai  upaya  dalam pencarian senyawa dengan aktivitas antihiperlipidemia  alami,  maka  perlu  dilakukan pengujian  aktivitas  antihiperlipidemia  pada berbagai tanaman obat.
Prinsip  penghambatan  aktivitas  enzim lipase  merupakan  salah  satu  contoh  pengujian secara in  vitro .  Pengujian  ini  dapat  dilakukan dengan  berbagai  metode  instrumentasi, diantaranya yaitu menggunakan
High
Performance  Liquid  Chromatography-Diode Array  Detection  Mass  Spectroscopy (HPLC- DAD-MS)  [3],  Kromatografi  Lapis  Tipis bioautografi [4], dan Spektrofotometri UV-Vis [5]. Metode instrumentasi tersebut memiliki beberapa kelemahan,  yaitu  membutuhkan  laboratorium atau tempat kerja khusus dan tenaga profesional untuk mengoperasikannya, proses analisis yang panjang  dan  biaya  yang  dikeluarkan  juga  lebih besar.
Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan untuk  mengembangkan  biosensor  aktivitas antihiperlipidemia  sebagai  metode  alternatif untuk  menentukan  aktivitas  anti-hiperlipidemia pada  ekstrak  tanaman  dengan  prinsip  inhibisi ezim lipase pankreas pada lempeng kertas zona mikro  ( Paper  Microzone  Plates )  menggunakan kertas  saring Whatman. Substrat  p-NPB  (p- Nitrofenil Butirat) ditambahkan untuk menghasilkan produk dari reaksi hidrolisis yaitu p-Nitrofenol  yang  akan  menjadi  indikator perubahan  warna.  Sampel  yang  digunakan berupa  serbuk  tanaman  dari  Materia  Medika yang  memiliki  aktivitas  antihiperkolesterolemia berdasarkan formula saintifikasi jamu. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan suatu metode alternatif untuk penentuan aktivitas antihiperlipidemia  dalam  berbagai  sampel ekstrak  tanaman  obat  yang  lebih  praktis  dan
mudah  namun  memiliki  sensitivitas  spesifisitas yang tinggi.

## Metode Penelitian
Alat Neraca analitik, pH meter, oven, ultrasonic degasser ,  spektrofotometer  UV-Vis  (Hitachi  U- 1800), stopwatch,  scanner  (Canon  LiDE  120), software  ImageJ , ball  filler ,  mikropipet,  pipet volume,  kertas  saring Whatman ,  batang pengaduk, kuvet, dan seperangkat alat gelas.
Bahan Lipase  pankreas (SIGMA  L3126),  p- Nitrofenil  Butirat  (SIGMA  N9876),  Orlistat (SIGMA), Tris(hydroxymethyl)amino-methane (SIGMA  252859),  HCl  1,0  N  (Merck),  metanol p.a.  (Merck),  asetonitril  (Merck),  akuades  steril, beberapa  serbuk  tanaman  dari  Materia  Medika Batu  berdasarkan  formula  ramuan  jamu  untuk hiperkolesterolemia  yaitu  daun  jati  belanda ( Guazuma  ulmifolia Lamk.);  daun  jati  cina ( Cassia  angustifolia Vahl.);  herba  tempuyung ( Sonchus  arvensis Linn.);  rimpang  kunyit ( Curcuma longa Linn.); daun teh hijau ( Camellia sinensis Linn.);  herba  temulawak  ( Curcuma xanthorriza Roxb.);  dan  herba  meniran
( Phyllanthus niruri Linn.) [6].

## Prosedur Pengukuran
Pembuatan Larutan Buffer Tris-HCl Larutan  buffer  Tris-HCl  dibuat  dengan melarutkan Tris(hydroxymethyl)amino-methane sebanyak 12,114 g dalam 100 mL akuades steril sehingga diperoleh konsentrasi 1,0 M. Kemudian ditambahkan  larutan  HCl  dengan  konsentrasi serupa  dan  diukur  menggunakan  pH  meter hingga mencapai pH 7,2-7,8.
Pembuatan Larutan Enzim Lipase Larutan enzim dibuat dengan menimbang enzim  lipase  pankreas  sebanyak  0,025  g  yang selanjutnya  dilarutkan  ke  dalam  larutan  buffer Tris-HCl  1,0  M  pH  7,2-7,8  hingga  mencapai volume 5 mL sehingga didapatkan larutan enzim sebesar 200 Unit/mL.
Pembuatan Larutan Substrat p -NPB Substrat p -NPB  ditimbang  sebanyak 0,2092  g,  lalu  dilarutkan  dalam  asetonitril  [7] hingga  10  mL.  Konsentrasi  substrat  yang diperoleh yaitu sebesar 100 mM.
Pembuatan Larutan Standar Orlistat
Larutan  induk  orlistat  dibuat  pada konsentrasi  50  mg/mL,  yaitu  250 mg  dilarutkan dalam metanol hingga volume 5 mL. Selanjutnya dilakukan pengenceran larutan induk menggunakan  metanol  untuk  mendapatkan larutan standar dengan rentang konsentrasi 0,05- 35 mg/mL. Pembuatan Ekstrak Sampel Preparasi yang dilakukan yaitu menggunakan  pinsip  pembuatan  infusa.  Pada masing-masing simplisia ditimbang sebesar 1 g dan dilarutkan dalam aquades hingga mencapai volume  100  mL,  sehingga  didapatkan konsentrasi  sebesar  1%.  Sedangkan  untuk ramuan  jamu,  seluruh  simplisia  ditimbang dengan  masing-masing  berat  sepersepuluh bagian  sesuai  ramuan  yaitu  jati  belanda  0,6 gram, tempuyung 0,6 g, jati cina 0,1 g, teh hijau 0,5 g, meniran 0,3 g, temulawak 0,5 g, dan kunyit 0,4  g  yang  kemudian  dilarutkan  dalam  100  mL aquades [6].
Aplikasi Biosensor Enzim Kertas pada Sampel Ekstrak Tanaman Uji  aktivitas  antihiperlipidemia  pada berbagai  sampel  tanaman  tersebut  dilakukan dengan  mengimobilisasikan  enzim  lipase konsentrasi  200  Unit/mL  sebanyak  4  µL  pada area  deteksi,  selanjutnya  ditambahkan  ekstrak sampel sebanyak 4 µL dan diprainkubasi selama 15 menit pada suhu 37 °C, setelah itu direaksikan dengan 4 µL substrat p-NPB konsentrasi 80 mM
lalu diinkubasi 30 menit pada suhu yang sama. Perubahan  warna  yang  terbentuk  setelah inkubasi  kemudian  dianalisis  menggunakan program  ImageJ  untuk  mengetahui  nilai  % inhibisi masing-masing sampel.
Perbandingan  Hasil  Metode  Biosensor  Enzim Kertas dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis
Perbandingan hasil analisis antara metode biosensor kertas dengan metode spektrofotometri  UV-Vis  dilakukan  dengan menggunakan  uji Independent  Sample T-test untuk membuktikan bahwa kedua metode yang tidak saling berhubungan satu sama lain mampu memberikan  rata-rata  hasil  yang  sama,  kedua metode dapat dikatakan tidak berbeda signifikan apabila hasil uji T-Test (p > 0,05) [10].

## Hasil
Kondisi  Optimum  Fabrikasi  Biosensor Berbasis Kertas (Paper Microzone Plates) Volume  penetesan  4:4:4  µL  pada  area deteksi  dipilih  sebagai  volume  optimum  karena memberikan visualisasi perubahan warna paling baik  yang  memenuhi  seluruh  area  deteksi biosensor  tanpa  mengalami  kebocoran.  Warna Blue dipilih sebagai warna yang optimum untuk respon  biosensor  karena  memberikan  nilai koefisien  korelasi  (r)  paling  mendekati  1  yaitu sebesar 0,998 berdasarkan hasil pada Gambar 1 .
Gambar 1 . Hasil kurva penentuan intensitas warna pada program ImageJ
Waktu  prainkubasi  yang  paling  optimum adalah 15 menit karena kenaikan nilai % inhibisi
tidak  berbeda  jauh  atau  relatif  tetap  sehingga dapat dikatakan steady state pada rentang waktu
BLUE y = 2,1388x + 23,386 r = 0,998 RED y = 1,4724x + 50,12 r = 0,790 RGB y = 1,4271x + 19,783 r = 0,770 GREEN y = 2,5095x + 37,61 r = 0,789 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 % Inhi bi si [Orlistat] mg/mL
berikutnya.  Hasil  tersebut  dapat  diamati  pada Gambar 2 berikut ini.
Gambar 2. Kurva perolehan % inhibisi berdasarkan waktu prainkubasi
Hasil  yang  diperoleh  untuk  optimasi konsentrasi  substrat  berdasarkan Gambar  3 yaitu substrat 80 mM dipilih sebagai konsentrasi optimum karena pada konsentrasi tersebut kurva telah  mengalami  kondisi steady  state atau biosensor telah memberikan respon yang stabil. Tercapainya  respon  yang  stabil  karena  hampir seluruh sisi aktif enzim bereaksi dengan substrat dan  hampir  tidak  ada  lagi  produk p-nitrophenol yang  terbentuk  selama  konsentrasi  substrat ditingkatkan.
Gambar 3. Kurva optimasi konsentrasi substrat dengan nilai Δ Mean Blue
Optimasi  pH memberikan  hasil  seperti  pada Gambar 4 , yang menunjukkan larutan buffer Tris- HCl pH 7,7 dipilih sebagai  pelarut enzim lipase karena  memberikan  nilai  Δ Mean  Blue paling optimum sebesar 32,719. Nilai optimum tersebut menunjukkan bahwa biosensor mampu
memberikan kinerja dengan respon deteksi yang optimal.
Gambar 4. Grafik optimasi pH buffer Tris-HCl 1,0 M berdasarkan nilai Δ Mean Blue Karakterisasi Biosensor Kertas Hasil pengujian karakterisasi waktu respon yang  diperoleh  dapat  dilihat  pada Gambar  5 . Kurva yang diperoleh menunjukkan bahwa waktu respon  biosensor  yang  paling  baik  adalah  30 menit inkubasi substrat karena memberikan nilai %  inhibisi  yang  optimum  sebesar  64,792%  dan steady state pada waktu berikutnya.
Gambar 5. Kurva penentuan waktu respon berdasarkan % inhibisi
Uji linieritas memberikan hasil persamaan regresi Y= 22,09585 + 2,170514X dengan nilai koefisien korelasi  (r)=  0,9996745,  nilai  Vx0=  1,509906%, dan  nilai  Xp=  1,572533  mg/mL.  Hasil  tersebut menunjukkan bahwa biosensor mampu memberikan  respon  deteksi  yang  proporsional dengan  konsentrasi  analit  pada  standar  karena memenuhi  beberapa  parameter  linieritas  yaitu nilai  koefisien  korelasi  (r)  mendekati  1,  Vx0 mencapai <5% dan nilai Xp lebih rendah dari nilai konsentrasi  standar  terkecil  [11].  Uji  LOD  dan LOQ biosensor didapatkan hasil yaitu untuk nilai
50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 0 5 10 15 20 25 30 '% in hib is i Waktu prainkubasi (menit) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 20 40 60 80 100 Δ M ean bl ue [Substrat p-NPB] mM 7,652 21,13122,148 23,873 27,061 32,719 30,673 0 5 10 15 20 25 30 35 40 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 Δ M ean Bl ue pH buffer 0 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 % In hib isi Waktu respon (menit)
batas  deteksi  sebesar  1,573  mg/mL  dan  nilai batas kuantitasi sebesar 4,718 mg/mL. Uji presisi berdasarkan  perolehan  nilai  RSD  presisi  pada standar  selama  tiga  hari  berturut-turut  yaitu 0,495%, 0,565%, dan 0,856% dengan nilai rata- ratanya yaitu 0,639%. Sedangkan untuk sampel, nilai  RSD  pada  3  hari  berturut-turut  sebesar 2,232%,  2,621%,  dan  2,781%  dengan  rata-rata sebesar  2,545%.  Hasil  yang  diperoleh  dari  uji akurasi yaitu nilai % recovery untuk adisi standar 30%,  45%,  dan  60%  masing-masing  adalah 98,836%,  99,777%,  dan  99,054%  sehingga dihasilkan  % recovery rata-rata  sebesar 99,222%. Berdasarkan hasil tersebut, biosensor dikatakan telah memenuhi kriteria penerimaan uji presisi dan akurasi, yaitu untuk konsentrasi analit pada  standar  dan  sampel  yang  digunakan sebesar  ≥1%  atau  10  mg/mL  maka  nilai  RSD harus  ≤2,8%  dan  % recovery rata-rata  yaitu sebesar  97-103%  [12].  Waktu  pakai  biosensor berbasis kertas pada suhu ruangan berdasarkan kurva  yang  diperoleh  seperti  pada Gambar  6 yaitu selama selama 45 menit.
Gambar  6. Grafik  penurunan  nilai  %  inhibisi berdasarkan  waktu  penyimpanan (menit) dalam suhu ruangan
Perbandingan Hasil Metode Biosensor Enzim Kertas  dengan  Metode Spektrofotometri  UV-
Vis Perbandingan  antara  metode  biosensor kertas dengan spektrofotometri UV-Vis berdasarkan  hasil  aktivitas  inhibisi  sampel dijelaskan  pada Tabel  2 berikut  ini.  Semua sampel  memberikan  nilai  sig  >0,05  dengan tingkat  kepercayaan  95%.  Hal  ini  menandakan bahwa kedua metode tersebut tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan. Tabel 2. Perbandingan hasil analisis biosensor dan spektrofotometri UV-Vis (n= 3) Sampel % Inhibisi Signifikasi (Nilai sig T) Biosensor  Spektrofotometri UV-Vis Tempuyung 54,926 52,936 0,583 Jati belanda 55,931 56,162 0,946 Jati cina 35,898 34,574 0,465 Meniran 41,357 40,943 0,913 Kunyit 41,931 41,646 0,944 Temulawak 48,507 47.105 0,580 Teh 42,563 42,887 0,829 Ramuan 45,646 45.451 0,953 Pembahasan Biosensor  berbasis  kertas  ( Paper Microzone Plates ) dibuat dari bahan kertas saring Whatman yang  dicetak  melalui  teknik  sablon dengan  menggunakan  tinta  pasta  karet berdasarkan desain yaitu terdiri dari lima kolom dan  tiga  baris  lingkaran  sebagai  area  deteksi (bagian  kertas  yang  tidak  disablon)  yang berdiameter 0,8 cm. Biosensor ini menggunakan enzim  lipase  dan  substrat  p-NPB  sebagai
bioelemen atau reagen yang diaplikasikan pada sampel  ekstrak  air  (infusa)  tanaman.  Enzim lipase  yang  telah  diimobilisasikan  pada  area deteksi  kemudian  diteteskan  sampel  dan dilakukan  prainkubasi  selama  15  menit  pada suhu  ±37  °C,  setelah  itu  diteteskan  substrat  p- NPB dan dilakukan inkubasi kembali selama 30 menit  pada  suhu  yang  sama.  Larutan  enzim, sampel  ekstrak  tanaman,  dan  substrat  yang diteteskan  sesuai  kondisi  analisis  yang  telah
-2,358 -10,444
-13,362 -15,027
-28,664 -37,846 -44,173 -45,535 -54,048 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 % P enur unan Waktu (menit)
dioptimasi pada area deteksi, yaitu menggunakan enzim lipase 200 Unit/ml; sampel konsentrasi  1%;  substrat  konsentrasi  80  mM dengan  perbandingan  volume  1:1:1  sebanyak 4:4:4  µL,  waktu  inhibisi  enzim  15  menit,  dan larutan  buffer  pada  pH  7,7.  Warna  yang  akan terbentuk  dengan  adanya  penambahan  sampel setelah  diinkubasi  yaitu  akan  tetap  berwarna putih atau hingga berubah menjadi kuning pudar. Hal  ini  disebabkan  karena  substrat  yang diinkubasi mengalami reaksi hidrolisis oleh enzim lipase  dan  akan  menghasilkan  produk  p- nitrofenol yang berwarna kuning, namun sampel yang  mengandung  analit  dengan  aktivitas antihiperlipidemia  akan  menginhibisi  aktivitas enzim  lipase  sehingga  produk  hasil  dari  reaksi hidrolisis  substrat  tersebut  akan terbentuk  lebih sedikit atau hingga tidak sama sekali.
Kedelapan  sampel  yang  digunakan berdasarkan formula saintifikasi jamu yaitu dalam bentuk ekstrak air (infusa) yang terdiri dari sebuk tanaman  tempuyung,  jati  belanda,  jati  cina, meniran,  kunyit,  temulawak,  dan  teh  dengan konsentrasi  masing-masing  sebesar  1%,  serta ramuan  atau  campuran  dari  semua  serbuk tanaman  dengan  konsentrasi  3%  sesuai komposisi  pada  formula  [6].  Tanaman  yang memiliki  nilai  %  inhibisi  tertinggi  adalah  jati belanda  dan  yang  paling  rendah  yaitu  jati  cina. Aktivitas inhibisi bila diurutkan dari yang tertinggi hingga terendah yaitu jati belanda > tempuyung > temulawak > ramuan > teh > kunyit > meniran > jati cina. Prinsip penghambatan aktivitas enzim lipase  oleh  berbagai  ekstrak  tanaman  tersebut yaitu kandungan metabolit sekunder yang terlarut seperti golongan senyawa polifenol dan lainnya, mampu  mengikat  sisi  aktif  serin  pada  enzim lipase  dengan  adanya  interaksi  ligan-protein melalui  pembentukan  ikatan  hidrogen  pada berbagai  asam  amino  pada  sisi  aktif  [13].  Jati belanda  sebagai  tanaman  yang  menghasilkan aktivitas  anti-hiperlipidemia  terbesar  dalam penelitian ini sebelumnya telah diketahui memiliki kandungan  senyawa  penciri  yaitu  kuersetin sebagai  antikolesterol  [14],  sehingga  sering digunakan  sebagai  alternatif  pengobatan  oleh dokter  praktik  jamu  untuk  pasien  hiperlipidemia pada  fasilitas  pelayanan  kesehatan  seperti puskesmas [15].
Berdasarkan  perbandingan  hasil  antara metode  biosensor  dan  spektrofotometri  UV-Vis, diperoleh hasil bahwa signifikasi semua sampel memberikan  nilai  sig  >0,05  dengan  tingkat kepercayaan  95%.  Hal  ini  menandakan  bahwa kedua  metode  tersebut  tidak  menunjukkan perbedaan  yang  signifikan,  sehingga  dapat
diketahui  bahwa  metode  biosensor  berbasis kertas  dapat  diterapkan  sebagai  metode alternatif dalam menentukan aktivitas antihiperlipidemia pada sampel ekstrak tanaman.
Simpulan dan Saran Berdasarkan  penelitian  yang  telah dilakukan, metode biosensor dapat diaplikasikan pada  ekstrak  tanaman  karena  mampu memberikan hasil pengukuran aktvitas antihiperlipidemia  yang  telah  memenuhi karakterisasi  linieritas,  batas  deteksi  (LOD), batas  kuantitasi  (LOQ),  presisi,  dan  akurasi. Biosensor berbasis kertas dapat menjadi metode alternatif  yang  lebih  mudah  dan  praktis  karena memberikan  hasil  analisis  yang  tidak  berbeda signifikan dengan metode instrumental spektrofotometri  UV-Vis.  Saran  untuk  penelitian ini  yaitu  perlu  dilakukan  pengembangan  lebih lanjut  untuk  meningkatkan  performansi  pada biosensor.

## Ucapan Terima Kasih
Peneliti mengucapkan terimakasih kepada Fakultas Farmasi, Universitas Jember yang telah membantu  dan  mendukung  terlaksananya penelitian ini.
Daftar Pustaka [1]  Barbara G. Wells, Terry L. Schwinghammer,  Joseph  T.  Dipiro, Dipiro C V. Pharmacotherapy Handbook.
10th  ed.  New  York:  McGraw  Hill Education; 2017.
[2]  Mardiana  L.  Daun  Ajaib  Tumpas Penyakit.  Jakarta:  Penebar  Swadaya; 2012.
[3]  Swierczewska A, Buchholz T, Melzig MF, Czerwi  ME.  In  vitro  a-amylase  and pancreatic  lipase  inhibitory  activity  of Cornus mas L . and Cornus alba L . fruit extracts a. 2018;7:1–10. [4]  Moniem A, Hassan S. TLC Bioautographic  Method  for  Detecting Lipase Inhibitors. 2011;(October):3–5.
[5]  Dechakhamphu  A,  Wongchum  N. Screening  for  anti-pancreatic  lipase properties of 28 traditional Thai medicinal herbs.  Asian  Pac  J  Trop  Biomed [Internet].  Elsevier  (Singapore)  Pte  Ltd; 2015;1–4. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.apjtb.2015.09. 012 [6]  Novianto  F.  Jamu  Saintifik  Suatu Lompatan Ilmiah Pengembangan Jamu.
Tawangmangu:  Balai  besar  Penelitian dan Pengembangan Tanaman obat dan Obat tradisional; 2017. 83 p.
[7]  Jaradat  N.  Anti-Lipase  Potential  of  the Organic  and  Aqueous  Extracts  of  Ten Traditional Edible and Medicinal Plants in Palestine ;  a  Comparison  Study  with Orlistat. 2017;
[8]  Word  Health  Organization.  Guidelines On  Validation  –  Appendix  4:  Analytical Method Validation. 2016;(June):1–11.
[9]  Kuswandi B. Biosensor: Konsep, Desain, dan  Eksperimentasi.  Jember:  Jember University Press; 2010.
[10] Sujarweni  VW.  SPSS  Untuk  Penelitian. 1st ed. Yogyakarta: Yogyakarta Pustaka Baru Press; 2014. 97-100 p.
[11] Yuwono  M,  Indrayanto  G.  Validation  of Chromatographic  Methods  of  Analysis. 2005;32(05).
[12] Huber  L.  Validation  and  Qualification  in Analytical Laboratories. Vol. 2. 2007.
[13] Luo S, Gill H, Anthony D, Li M, Hung A, Toan L, et al. The inhibitory effects of an eight-herb  formula  (  RCM-107  )  on pancreatic  lipase :  enzymatic  ,  HPTLC pro  fi  ling  and  in  silico  approaches. Heliyon [Internet]. Elsevier Ltd; 2019;5(August):e02453.  Available  from: https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2019.e0 2453 [14] Batubara I, Darusman LK, Mitsunaga T.
Senyawa  Penciri  Ekstrak  Daun  Jati Belanda  (  Guazuma  ulmifolia  Lamk  ) sebagai  Anti-Kolesterol  (  Marker Compound  of  Jati  Belanda  (  Guazuma ulmifolia Lamk ) Extract as. 2017;22(2):87–91.
[15] Gitawati  R,  Widowati  L,  Suharyanto  F. Penggunaan  Jamu  pada  Pasien Hiperlipidemia Berdasarkan Data Rekam Medik , di Beberapa Fasilitas Pelayanan Kesehatan di Indonesia. 2015;41–8.