Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi N-Heksan dari Ekstrak Metanol Daun  Binjai Mangifera  caesia Jack.  Ex. Wall  Menggunakan Metode DPPH
(Antioxidant Activity Assay from N-Hexane Fraction of Binjai Mangifera  caesia Jack.  Ex. Wall.  Leaves  Methanolic  Extract Using DPPH Method)
SITI PURNAMA 1 , HAFIZ RAMADHAN 1* , PUTRI INDAH SAYAKTI 2
1 Program Studi S1-Farmasi, Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Borneo Lestari, Banjarbaru, Kalimantan Selatan, 70714
2 Program Studi D3-Farmasi, Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Borneo Lestari, Banjarbaru, Kalimantan
Selatan, 70714
Diterima 12 September 2019, Disetujui 15 Maret 2022
JURNAL ILMU KEFARMASIAN  INDONESIA, April 2022,  hlm. 55-62 ISSN 1693-1831, E-ISSN 2614-6495
Abstract: Natural antioxidant compounds can be found in plants of the Mangifera genus, one of them is Mangifera caesia, Jack. ex. Wall or which was also known as binjai . This study aims to determine group compounds and the antioxidant activity of the n-hexane fraction from the binjai leaves methanol extract against 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radicals. The binjai leaves powder extraction was carried out using the soxhlet apparatus with methanol and liquid-liquid fractionation using water and n-hexane. Phytochemical screening was done by adding speciﬁ c reagents. The antioxidant activity assay qualitatively on TLC that being sprayed with DPPH and quantitative assay by measuring the absorbance of the fraction attenuation  against  DPPH  radicals  using  a  UV-Vis  Spectrophotometer.  The  Phytochemicals  screening results showed that the n-hexane fraction contained phenolic, ﬂ avonoid, and steroids. The qualitative test results showed some compounds had an antioxidant activity that appeared by changing the color of the spots to yellow on a purple background after spraying with DPPH solution. The n-hexane fraction resulted in an IC 50 value of 34.0668 ppm with quercetin IC 50 of 2.4469 ppm. Based on these results, it can be concluded that the n-hexane fraction of binjai leaves methanol extract contains phenolic and ﬂ avonoid compounds that played a role in producing very strong antioxidant activity.
Keywords: Antioxidant, binjai leaves, methanol extract, n-hexane fraction, DPPH.
Abstrak: Senyawa antioksidan alami dapat ditemukan pada tumbuhan dari genus Mangifera, salah satunya yaitu Mangifera  caesia Jack.  ex.  Wall  atau  yang  lebih  dikenal  dengan  binjai.  Penelitian  ini  bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa dan aktivitas antioksidan fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun binjai  terhadap  radikal  2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl  (DPPH).  Ekstraksi  serbuk  daun  binjai  dilakukan menggunakan alat soxlet dengan metanol dan difraksinasi cair-cair menggunakan air dan n-heksan. Skrining ﬁ tokimia dilakukan dengan penambahan pereaksi spesiﬁ k. Uji aktivitas antioksidan secara kualitatif pada plat  KLT  yang  disemprot  dengan  DPPH  dan  pengujian  secara  kuantitatif  dengan  mengukur  absorbansi peredaman fraksi terhadap radikal DPPH menggunakan Spektrofotometer UV-Vis. Hasil skrining ﬁ tokimia menunjukkan  bahwa  fraksi  n-heksan  mengandung  fenolik,  ﬂ avonoid  dan  steroid.  Hasil  uji  kualitatif menunjukkan terdapat senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan dengan berubahnya warna bercak noda menjadi kuning dengan latar ungu pada plat KLT setelah disemprot dengan larutan DPPH. Fraksi n-heksan memiliki  nilai  IC 50 sebesar  34,0668  ppm  dengan  IC 50 kuersetin  sebesar  2,4469  ppm.  Berdasarkan  hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun binjai mengandung senyawa golongan fenolik dan ﬂ avonoid yang berperan dalam menghasilkan aktivitas antioksidan yang sangat kuat.
Kata kunci: antioksidan, daun binjai, ekstrak metanol, fraksi n-heksan, DPPH.
ekstrak) dibanding menggunakan etanol (77,41 μgQE/ mg) pada ekstraksi secara soxlet (10) .
Berdasarkan  penelitian-penelitian  yang  telah dipaparkan menunjukkan kandungan ﬂ avonoid yang tinggi  pada  daun  binjai  memiliki  polaritas  yang rendah,  oleh  sebab  itu  fraksi  n-heksan  dari  ekstrak metanol daun binjai yang belum pernah dilaporkan sebelumnya dapat berpotensi dikembangkan sebagai komponen antioksidan alami, sehingga perlu diketahui potensinya  melalui  penelusuran  lebih  lanjut.  Latar belakang  tersebut  mendasari  penelitian  ini  untuk dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui golongan senyawa  dan  aktivitas  antioksidan  fraksi  n-heksan dari  ekstrak  metanol  daun  binjai  terhadap  radikal 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl  (DPPH)  secara kualitatif  dengan  Kromatograﬁ   Lapis  Tipis  (KLT) dan secara kuantitatif untuk mendapatkan nilai IC 50 .

## BAHAN DAN METODE
BAHAN. Bahan-Bahan yang digunakan antara lain sampel daun binjai, metanol p.a (Merck, Germany), aqua  dest  (Onemed,  Indonesia),  metanol  teknis (Bratachem, Indonesia), kloroform  (Merck, Germany), etil  asetat  (Bratachem,  Indonesia),  n-heksana (Bratachem,  Indonesia),  kuersetin  (Sigma  aldrich, USA), Pb asetat (Merck, Germany), asetat anhidrida (Merck, Germany), FeCl3 (Merck, Germany), NaOH (Merck, Germany), H2SO4 (Merck, Germany), HCl (Merck, Germany), gelatin (Oxoid, Indonesia), NaCl (Merck, Germany), Mg (Merck, Germany), pereaksi Wagner (Merck, Germany), pereaksi Mayer (Merck, Germany), pereaksi Dragendorﬀ  (Merck, Germany), plat  KLT  silika gel GF254  (Merck,  Germany),  dan DPPH  (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)  (Sigma aldrich, USA). UV-Vis.
Alat. Peralatan yang digunakan dalam penelitian antara  lain  seperangkat  alat  soxlet  (Pyrex®) beserta  alat  gelas  lainnya,  selain  itu  juga  corong pisah  (Pyrex®),  neraca  analitik  (Fujitsu®),  rotary evaporator (IKFR 10®), penangas air (Memmert®), mikropipet (Dragon Lab®), Vortex (Bionex®), dan pengukuran menggunakan spektrofotometer UV-Vis (PG Instruments-T60®).
METODE.  Penyiapan  Sampel  Daun  Binjai. Spesimen binjai dikumpulkan pada bulan November 2019 dari Kelurahan Guntung Manggis, Banjarbaru, Kalimantan  Selatan  dan  dideterminasi  oleh Laboratorium Dasar Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam  (FMIPA)  Universitas  Lambung Mangkurat, Kalimantan Selatan, sebagai Mangifera caesia Jack.  Ex.  Wall.  Sampel  daun  binjai  yang diambil merupakan daun binjai yang matang (daun keempat dari pucuk sampai daun kelima dari pangkal seperti pada Gambar 1(a) (11,12) .

## PENDAHULUAN
ANTIOKSIDAN adalah senyawa yang menghambat laju  oksidasi  molekul  lain  atau  menetralisir  radikal bebas.  Kebanyakan  stres  oksidatif  disebabkan  oleh radikal bebas yang memiliki satu atau lebih elektron tidak berpasangan sehingga menyebabkannya sangat reaktif.  Spesies  reaktif  yang  dihasilkan  dalam  sel termasuk hidrogen peroksida (H 2 O 2 ), asam hipoklorit (HClO),  radikal  hidroksil  (·OH),  radikal  anion superoksida  (O 2- ),  radikal  oksida  nitrat  (NO·),  dan radikal lipid peroksil (LOO·). Antioksidan bertugas mengurangi  spesies  oksigen  reaktif  agar  tidak menyebabkan  kerusakan  pada  komponen  seluler seperti DNA, protein, karbohidrat, dan lipid. Tubuh tidak  mempunyai  sistem  pertahanan  yang  berlebih, sehingga jika terjadi paparan radikal berlebih maka dibutuhkan antioksidan eksogen baik dalam bentuk sintetik maupun alami (1,2) .
Senyawa  antioksidan  alami  dapat  ditemukan pada tumbuhan dari genus Mangifera, salah satunya yaitu  Mangifera  caesia  Jack.  ex.  Wall  atau  yang lebih dikenal dengan binjai. Tanaman ini merupakan tanaman  endemik  Provinsi  Kalimantan  Selatan. Beberapa  penelitian  menyimpulkan  bahwa  bagian daun  dari  tanaman  tersebut  mengandung  senyawa fenolik dan ﬂ avonoid yang memiliki potensi tinggi sebagai antioksidan (3,4) . Ramadhan et  al. menyatakan  metode  ekstraksi soxlet  dengan  pelarut  metanol  lebih  efektif  dalam menghasilkan  aktivitas  antioksidan  dari  daun binjai  terhadap  radikal  DPPH  (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazil)  dengan  nilai  IC 50 sebesar  6,485 ppm  dibandingkan  ekstrak  etanol  daun  binjai  (IC 50 =  50,971  ppm)  pada  penelitian  Norliyanti et  al. (5,6)
Selain itu, ekstrak metanol daun binjai juga memiliki kemampuan  dalam  mereduksi  logam  yang  sangat kuat dengan EC 50 sebesar 5,647 ppm menggunakan metode CUPRAC (Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity).  Penelitian  Ramadhan et  al .  juga  telah membuktikan  fraksi  etil  asetat  dan  air  dari  ekstrak metanol daun binjai memiliki aktivitas penangkalan radikal  DPPH  yang  sangat  kuat  dengan  nilai  IC 50 secara  berturut-turut  yaitu  5,356  ppm  dan  23,175 ppm (7) .
Flavonoid adalah salah satu golongan polifenolik alami terbesar yang terkandung dalam tanaman dan memainkan  peranan  penting  dalam  menghasilkan aktivitas  antioksidan  dari  daun  binjai. Aktivitas tersebut  dihasilkan  karena  kandungan  flavonoid yang  tinggi  pada  daun  binjai,  sehingga    sehingga menghasilkan  aktivitas  protektif  terhadap  radikal bebas dan menghambat terjadinya oksidasi (8,9) . Daun binjai  memiliki  kadar  total  ﬂ avonoid  lebih  tinggi jika diekstraksi dengan n-heksan (168,129 μgQE/mg
Vol 20, 2022
P engolahan  Simplisia  Daun  Binjai. Sampel daun  binjai  ( Mangifera  caesia Jack  ex.  Wall) dikumpulkan,  disortasi  basah,  dicuci  selanjutnya daun dipotong hingga kecil, lalu dikeringkan di dalam ruangan  yang  bebas  dari  sinar  matahari  langsung hingga  kering.  Setelah  didapat  simplisia  kering, dilakukan  penyerbukan,  kemudian  serbuk  diayak hingga  halus  dengan  pengayakan  mesh  40.  Serbuk simplisia daun binjai hasil pengayakan ditampilkan pada Gambar 1(b) (3) . Pembuatan  Ekstrak. Ekstraksi  daun  binjai menggunakan seperangkat alat soxlet dengan pelarut metanol  dengan  perbandingan  antara  serbuk  dan pelarut  adalah  1:5  pada  suhu  60ºC  sampai  tetesan siklus  tidak  berwarna  lagi.  Ekstrak cair  dipekatkan menggunakan rotary evaporator dilanjutkan dengan penangas air pada suhu 50ºC hingga diperoleh ekstrak dengan  bobot  tetap  seperti  yang  ditunjukkan  pada Gambar 1(c) (10) .
pereaksi  Mayer  terbentuk  endapan  kuning,  dan penambahan  pereaksi  Wagner  terbentuk  endapan coklat kemerahan (15) .
Uji Fenolik . Sampel sebanyak 1 mL ditambahkan 1 mL FeCl 3 5%, jika menghasilkan sedimen merah, ungu, biru, hitam pekat dan warna hijau, menunjukkan kandungan fenol (13) .
Uji Tanin. Sampel sebanyak 1 mL ditambahkan gelatin  1%  yang  mengandung  NaCl,  jika  terbentuk sedimen  putih,  maka  menunjukkan  kandungan tanin (15) .
Uji Saponin. Sampel sebanyak 1 mL ditambahkan 2 mL aquadest kemudian dikocok kuat selama 1 menit, lalu ditambahkan HCl 1N sebanyak 2 tetes, jika busa yang terbentuk stabil  dalam waktu 10 menit,  maka menunjukkan kandungan saponin (15) .
Uji  Steroid-Triterpenoid. Sampel  sebanyak 2 mL ditambahkan 0,5 mL kloroform lalu disaring, kemudian  1  mL  ﬁ ltrat  ditambahkan  0,5  mL  asam asetat anhidrat dan 2 mL H 2 SO 4 , jika terbentuk cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan, maka menunjukkan  kandungan  triterpenoid,  sedangkan jika  muncul  cincin  biru  kehijauan  menunjukkan kandungan steroid (16) .
Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan. Sampel dengan  konsentrasi  2%  ditotolkan  pada  fase  diam silika gel GF254 kemudian dielusi dengan fase gerak yang sudah dioptimasi yaitu n-heksan : etil asetat (1 :  3),  setelah  elusi  dan  dikeringkan,  lalu  disemprot dengan larutan DPPH 0,4 mM (17) .
Uji  Kuantitatif  Aktivitas  Antioksidan. Penentuan  Panjang  Gelombang  Maksimum. Larutan DPPH 0,4 mM sebanyak 1 mL dicampurkan dengan 4 mL metanol p.a ke dalam vial gelap (larutan blanko),  dihomogenkan  dengan  vortex  dan  diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 500-600 nm (8,18) .
Pengujian Aktivitas Antioksidan  Kuersetin. Kuersetin  digunakan  sebagai  standar  pembanding yang  dibuat  seri  konsentrasi  1,  2,  3,  4,  dan  5  ppm dalam pelarut metanol. Larutan seri tersebut masing- masing  sebanyak  4  mL  dimasukkan  ke  dalam  vial gelap  dan  ditambahkan  larutan  DPPH  0,4  mM sebanyak  1  mL  kemudian  dihomogenkan  dengan vortex. Campuran diinkubasi di ruang gelap selama 30 menit dan absorbansi diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum (2,3,18) .
Pengujian  Aktivitas  Antioksidan  Fraksi N-Heksan. Sampel  fraksi  dibuat  seri  konsentrasi berbeda  yaitu  20,  40,  60,  80  dan  100  ppm  dalam pelarut metanol. Larutan seri tersebut masing-masing sebanyak 4 mL dimasukkan ke dalam vial gelap dan ditambahkan larutan DPPH 0,4 mM sebanyak 1 mL kemudian dihomogenkan dengan vortex. Campuran
Gambar 1. (a) Sampel daun yang matang, (b) serbuk simpli- sia daun, (c) ekstrak metanol daun binjai.
Pembuatan  Fraksi  N-Heksan. Ekstrak metanol  daun  binjai  ditambahkan  aquadest  dengan perbandingan  1:2  (50  g  :  100  mL),  kemudian difraksinasi  dengan  100  mL  n-heksana.  Fraksinasi dilakukan  pengulangan  sampai  diperoleh  fase n-heksan  jernih. Total  fraksi  n-heksan  dipekatkan menggunakan  rotary  evaporator  dan  penangas  air hingga diperoleh bobot tetap (3) .
Skrining  Fitokimia. Sampel  sebanyak  0,125 g  dilarutkan  dalam  25  mL  pelarut  metanol  dan diidentiﬁ kasi golongan ﬁ tokimia.
Uji Flavonoid. Pengujian menunjukkan ekstrak mengandung ﬂ avonoid: (1). Sampel 1 mL ditambahkan beberapa  tetes  larutan  NaOH,  jika  warna  kuning muncul dan memudar ketika ditambahkan HCl; (2). Sampel 1 mL ditambahkan 1 mL Pb asetat 10% dan jika diaduk terjadi perubahan warna larutan menjadi coklat kekuningan; (3). Sampel 1 mL ditambah HCl pekat 1 ml dan serbuk Mg kemudian terbentuk warna kuning, jingga, merah dan hijau (3,13,14) .
Uji Alkaloid. Pengujian  alkaloid  dilakukan dengan  3  pereaksi,  dimana  sebelumnya  1  mL sampel  ditambahkan  HCl  2N  sebanyak  2  mL  lalu digojok,  kemudian  masukan  1  mL  sampel  pada  3 tabung  reaksi  yang  berbeda.  Reaksi  menunjukkan kandungan alkaloid, jika dengan penambahan pereaksi Dragendroﬀ  terbentuk endapan merah, penambahan
58 PURNAMA ET AL.
metanol daun Kasturi ( Mangifera casturi K.) sebesar 10,27%.  Pada  penelitian  Eden et  al . (20) ,  didapatkan hasil % rendemen fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun  Mangga  ( Mangifera  indica )  sebesar  7,16%. Perbedaan hasil yang didapatkan tersebut dikarenakan adanya perbedaan metode ekstraksi yang digunakan dan  juga  jenis  tanaman  yang  berbeda  walaupun termasuk genus yang sama.
tersebut diinkubasi di ruang gelap selama 30 menit dan absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum (8,18) . Penentuan  IC 50 . Aktivitas  peredaman  radikal DPPH diekspresikan sebagai nilai IC 50 (ppm) yaitu konsentrasi  yang  dapat  meredam  radikal  DPPH sebesar 50%. IC 50 didapatkan dari nilai x dari regresi linier antara konsentrasi vs % inhibisi. Nilai % inhibisi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut (18) :
% inhibisi = Abs blanko - Abs sampel x 100% Abs sampel
Keterangan :
Abs. Blanko = Absorbansi DPPH dalam pelarut metanol (tanpa sampel) Abs.Sampel = Absorbansi sampel uji yang direaksikan dengan DPPH

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi  dan  Fraksinasi  Daun  Binjai. Binjai merupakan spesies Mangifera yang memiliki potensi aktivitas antioksidan yang sangat tinggi dibandingkan dengan  (Mangga) M.  indica (18) .  Pada  penelitian ini  dilakukan  evaluasi  aktivitas  antioksidan  dari fraksi  n-heksan  dari  ekstrak  metanol  daun  binjai serta  kandungan  fitokimia  yang  berperan  dalam menghasilkan  sifat  antioksidan.  Pemilihan  metanol sebagai  pelarut  ekstraksi  dikarenakan  metanol bersifat polar sehingga dapat melarutkan komponen atau  senyawa  antioksidan  yang  mayoritas  bersifat polar  yaitu  golongan  fenolik  seperti  ﬂ avonoid  dan tanin. Penelitian Adham et al. menunjukkan bahwa total  flavonoid  tertinggi  didapatkan  pada  ekstrak daun  binjai  yang  dimaserasi  menggunakan  pelarut metanol (0,0522 mgQE/mg ekstrak), diikuti pelarut etanol  (0,0382  mgQE/mg  ekstrak)  dan  n-heksan (0,0121 mgQE/mg ekstrak). Hal ini terbukti bahwa total kandungan ﬂ avanoid berbanding lurus dengan tingkat  polaritas  pelarut.  Semakin  tinggi  tingkat polaritas suatu pelarut, semakin tinggi ﬂ avonoid dapat diekstraksi (8) .
Fraksi  n-heksan  didapatkan  dari  fraksinasi ekstrak  metanol  daun  binjai  yang  potensi  aktivitas antioksidannya belum pernah dilaporkan sebelumnya. Rendemen fraksi n-heksan yang didapat seperti pada Tabel  1  menunjukkan  bahwa  hasil  rendemen  yang diperoleh lebih besar daripada fraksi etil asetat yaitu 3,6% dan lebih rendah dibanding fraksi air (11,68%) dari  ekstrak  metanol  daun  binjai (7) .  Hasil  tersebut masih lebih rendah jika dibandingkan dengan genus Mangifera lain, misalnya pada penelitian Dwiatun (19) didapatkan  rendemen  fraksi  n-heksan  dari  ekstrak
Tabel  1.  Data  rendemen  fraksi  n-heksan  dari  ekstrak metanol daun binjai.
Metode ekstraksi dengan soklet memiliki prinsip pemanasan  dan  perendaman  sampel.  Metode  ini menyebabkan terjadinya perbedaan tekanan antara di dalam sel dan di luar sel sehingga terjadi pemecahan dinding dan membran sel. Hal tersebut terjadi karena pemanasan dapat membantu dalam membuka jaringan tumbuhan  agar  dapat  menarik  beberapa  zat  aktif metabolit  sekunder  yang  tidak  dapat  keluar  hanya dengan  suhu  kamar  seperti  pada  metode  maserasi. Peningkatan  suhu  akan  menyebabkan  proses  difusi juga lebih besar, sehingga proses ekstraksi juga akan berjalan lebih cepat (21) . Menurut Wijaya et al. adapun faktor lain yang dapat mempengaruhi nilai rendemen yang dihasilkan yaitu ukuran partikel sampel, kondisi dan waktu penyimpanan, lama waktu ekstraksi, dan perbandingan jumlah sampel terhadap jumlah pelarut yang digunakan (22) .
Skrining  Fitokimia. Hasil  skrining  ﬁ tokimia pada  fraksi  n-heksan  menunjukkan  kandungan ﬂ avonoid, fenol dan steroid (Tabel 2). Hasil tersebut berbeda  dengan  fraksi  air  yang  teridentifikasi ﬂ avonoid, fenol, tannin dan terpenoid, begitupula pada fraksi etil asetat dari ekstrak metanol daun binjai (7) . Berdasarkan hasil tersebut terdapat persamaan hasil skrining ﬁ tokimia pada fraksi air, fraksi etil asetat dan fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun binjai, yaitu mengandung senyawa ﬂ avonoid dan fenol. Namun, perbedaan hasil skrining yaitu tidak adanya senyawa tanin dan terpenoid pada fraksi n-heksan, sedangkan pada  fraksi  air  dan  etil  asetat  tidak  menunjukkan kandungan steroid. Hal tersebut mungkin dikarenakan berbedanya sifat kepolaran zat aktif sehingga senyawa polar seperti tannin cenderung larut pada pelarut polar, sehingga  pada  fraksi  n-heksan  tidak  teridentiﬁ kasi kandungan tannin dikarenakan n-heksan yang bersifat non  polar.  Senyawa  non  polar  seperti  steroid  akan larut pada pelarut non polar juga, sehingga pada fraksi
Parameter Hasil Bahan tumbuhan Simplisia daun binjai Bobot ekstrak 10 gram Bobot fraksi n-heksan 0,446 gram Rendemen 4,46 %
Tabel 2. Hasil skrining ﬁ tokimia fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun binjai.
Uji  Kualitatif Aktivitas Antioksidan. Uji kualitatif  aktivitas  antioksidan  dari  fraksi  n-heksan dari ekstrak metanol daun binjai menggunakan metode Kromatograﬁ  Lapis Tipis (KLT) yang dielusi dengan fase gerak hasil optimasi yaitu n-heksan : etil asetat (1  :  3),  terdapat  senyawa  yang  memiliki  aktivitas antioksidan dengan ditandai perubahan warna bercak noda  menjadi  kuning  dengan  latar  ungu  pada  plat KLT setelah disemprot dengan larutan DPPH. Hasil uji terlihat 4 bercak noda dengan Rf noda 1 = 0,67; noda 2 = 0,53; noda 3 = 0,33 dan noda 4 = 0,13 seperti pada Gambar 2.
Pada metode ini, larutan DPPH berperan sebagai
n-heksan  menunjukkan  hasil  positif  mengandung steroid,  sedangkan  pada  fraksi  air  dan  etil  asetat teridentifikasi  negatif (23) .  Penelitian  Dwiatun et al. menyebutkan  bahwa  pada  fraksi  n-heksan  dari ekstrak metanol daun kasturi ( Mangifera casturi K.) menunjukan kandungan senyawa triterpenoid saja (19) . Sedangkan pada penelitian Eden et al . menunjukan kandungan saponin dan terpenoid pada fraksi n-heksan ekstrak metanol daun mangga ( Mangifera indica L.)
(20) .
radikal  bebas  yang  akan  bereaksi  dengan  senyawa antioksidan  sehingga  2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl akan berubah menjadi 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazin yang  bersifat  non-radikal.  Peningkatan  jumlah 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazin akan ditandai dengan berubahnya warna ungu tua yang memudar menjadi warna merah muda atau kuning pucat dan bisa diamati pada plat KLT atau diukur dengan spektrofotometer UV-Vis, sehingga aktivitas peredaman radikal bebas oleh sampel dapat ditentukan (24) .
Uji Kuantitatif Aktivitas Antioksidan. Metode DPPH  juga  digunakan  untuk  menyelidiki  aktivitas antioksidan  secara  kuantitatif  dari  sampel  dengan kontrol positif kuersetin. Nilai aktivitas reduksi radikal bebas DPPH dinyatakan dengan IC 50 , dimana semakin kecil  nilai  IC 50, semakin  tinggi  aktivitas  penangkal radikal bebas dari suatu sampel (18) . Hasil uji kuantitatif kuersetin dan  fraksi  n-heksan  dari  ekstrak  metanol daun binjai yang merupakan nilai IC 50 didapatkan dari kurva regresi linier hubungan antara konsentrasi vs % inhibisi yang ditunjukkan pada Gambar 3 dan 4.
Gambar 2. Pengamatan hasil KLT fraksi n-heksan: (a) se- cara visual, (b) dibawah sinar UV 254 nm, (c) dibawah sinar UV 366 nm, (d) setelah disemprot DPPH 0,4 mM.
Metabolit
Sekunder Pereaksi Hasil Keterangan Fenol FeCl 3 5% (+) Terbentuk sedimen hitam Flavonoid 1. NaOH 10% + HCl 2N (+) Terbentuk warna kuning setelah ditambah pereaksi NaOH, memudar setelah penambahan HCl 2.  Pb Asetat 10% (-) Tidak terbentuk warna coklat kekuningan 3. Mg-HCl (+) Terbentuk warna kuning kehijauan Alkaloid 1.   HCl + Pereaksi Dragendorf (-) Tidak terbentuk endapan merah 2. HCl + Pereaksi Mayer (-) Tidak terbentuk endapan kuning 3. HCl + Pereaksi Wagner (-) Tidak terbentuk endapan coklat kemerahan Tanin Larutan gelatin 1% dalam NaCl 2% (-) Tidak terbentuk sedimen putih Saponin Aquadest + HCl 2N (-) Tidak terbentuk buih setinggi 1-10 cm selama tidak kurang dari 10 menit, dan setelah penambahan HCl 2N. Steroid- Triterpenoid Kloroform + Pereaksi Liebermann Burchard (+) Terbentuk cincin biru kehijauan menandakan kandungan steroid
Gambar 3. Kurva persamaan regresi linier hubungan kon- sentrasi vs % inhibisi kuersetin.
Aktivitas  antioksidan  kuersetin  diperoleh  IC 50 sebesar  2,4469  ppm  yang  tergolong  sangat  kuat sebagai  antioksidan  dibanding  nilai  IC 50 dari  fraksi n-heksan  sebesar  34,0668  ppm  (Tabel  3  dan  4). Kuersetin termasuk ﬂ avonoid golongan ﬂ avonol yang memiliki sifat bioaktif yang sangat potensial terutama sifat antioksidan karena mengandung gugus hidroksil (fenolik)  yang  dapat  menetralisir  radikal  melalui donor atom hidogen, sehingga mampu menghasilkan aktivitas  antioksidan  yang  sangat  kuat (25) .  Namun, fraksi  n-heksan  dari  ekstrak  metanol  daun  binjai tergolong kategori aktivitas antioksidan yang sangat kuat karena masih  memiliki nilai IC 50 yang  kurang dari 50 ppm (26) .
kuat (7,23) . Penelitian Yuliani et al . juga menyebutkan kadar total fenolik yang berperan dalam menghasilkan aktivitas  antioksidan  pada  fraksi  n-heksan  ekstrak metanol  daun  binjai  yaitu  45,2  μgGAE/mg  fraksi yang tergolong lebih kecil jika dibandingkan fraksi etil asetat (430 μgGAE/mg fraksi) dan fraksi airnya (782 μgGAE/mg fraksi) (27) . Akan tetapi, kadar total ﬂ avonoid  yang  dihasilkan  oleh  fraksi  n-heksan  ini (165,06 μgQE/mg fraksi) lebih tinggi dibandingkan fraksi airnya (118,8 μgQE/mg fraksi), walaupun masih tergolong lebih rendah jika dibandingkan fraksi etil asetatnya  (274,32  μgQE/mg  fraksi) (7,27) .  Hasil  ini menunjukkan bahwa kandungan senyawa ﬂ avonoid dalam ekstrak metanol daun binjai mayoritas memiliki kepolaran yang cukup rendah atau bersifat semi polar sampai non polar (10) .
Potensi fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun binjai masih perlu ditelusuri lebih lanjut kandungan senyawanya yang berperan dalam meredam radikal DPPH,  karena  aktivitas  yang  dimiliki  tergolong dalam kategori antioksidan yang sangat kuat. Selain itu, aktivitas yang dihasilkan masih jauh sangat kuat dibanding fraksi etil asetat buah binjai dengan nilai IC 50 sebesar 170,63 ppm (kategori antioksidan lemah)
(28) .  Hasil  yang  didapat  tersebut  jika  dibandingkan dengan  penelitian  Dwiatun (19) ,  yang  melakukan  uji kuantitatif aktivitas antioksidan pada fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun Kasturi ( Mangifera casturi K.) mendapatkan hasil IC 50 sebesar 219,42 ppm yang termasuk kategori sangat lemah sebagai antioksidan. Sedangkan pada penelitian Eden et al. yang melakukan uji  aktivitas  antioksidan  pada  fraksi  n-heksan  dari ekstrak metanol daun Mangga ( Mangifera indica L.) mendapatkan IC 50 sebesar 106,84 ppm yang termasuk kategori sedang sebagai antioksidan (20) .
Berdasarkan  hasil  perbandingan  dengan penelitian-penelitian  tersebut,  dapat  disimpulkan bahwa aktivitas antioksidan yang dihasilkan oleh fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun binjai dikarenakan terdapat kandungan fenol dan ﬂ avonoid pada skrining ﬁ tokimianya, sehingga memiliki aktivitas yang lebih kuat  dalam  meredam  radikal  DPPH  dibandingkan dengan  fraksi  n-heksan  dari  ekstrak  metanol  daun Kasturi dan fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun Mangga. Senyawa fenolik utama yang terdapat pada binjai salah satunya adalah Mangiferin (29) . Senyawa tersebut merupakan senyawa fenolik yang memiliki lebih dari satu gugus hidroksil (polifenol) (30) . Selain itu, kuersetin yang digunakan sebagai kontrol positif pada penelitian ini juga termasuk golongan  fenolik berupa senyawa ﬂ avonoid yang banyak teridentiﬁ kasi dalam beberapa spesies dari genus Mangifera (31) .
Kuersetin  lebih  efektif  sebagai  antiradikal karena  memiliki  gugus  hidroksi  fenolik  dalam
60 PURNAMA ET AL.
Gambar 4. Kurva persamaan regresi linier hubungan kon- sentrasi vs % inhibisi fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun binjai.
Tabel 3. Hasil uji aktivitas antioksidan kuersetin.
Tabel 4. Hasil uji aktivitas antioksidan fraksi n-heksan dari ekstrak metanol daun binjai.
Aktivitas antioksidan fraksi n-heksan lebih kecil jika  dibandingkan  fraksi  air  dengan  IC 50 23,175 ppm  dan  fraksi  etil  asetat  dari  ekstrak  metanol daun binjai dengan IC 50 5,356 ppm. Aktivitas yang dihasilkan berbanding lurus dengan golongan senyawa yang  terekstraksi  yaitu  pada  fraksi  n-heksan  tidak menunjukkan  kandungan  tannin,  sedangkan  pada fraksi air dan etil asetat terbukti mengandung tannin yang  juga  merupakan  senyawa  fenolik,  sehingga mampu menghasilkan aktivitas antioksidan yang lebih
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia  61
Vol 20, 2022
struktur  molekulnya  yang  dapat  mendonorkan hidrogen radikal (32) . Kuersetin memiliki lima gugus hidroksil yang jumlahnya cukup banyak pada setiap molekulnya untuk mereduksi DPPH. Semakin banyak gugus hidroksil bebas yang dapat menyumbangkan hidrogen maka semakin banyak reduksi yang dapat dilakukan  terhadap  DPPH (24) .  Senyawa  fenolik  dan polifenol merupakan penangkap radikal yang poten serta  memiliki  aktivitas  peredaman  radikal  yang memungkinkan  mereka  untuk  menghambat  reaksi oksidatif dengan memindahkan salah satu elektronnya (menyumbang hidrogen) pada radikal bebas sehingga menjadi molekul non-radikal yang stabil (9,33) .

## SIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian, maka dapat disimpulkan bahwa  fraksi  n-heksan  dari  ekstrak  metanol  daun binjai  ( M.  caesia  Jack .  ex.  Wall.)  mengandung senyawa  golongan  fenolik  dan  flavonoid  yang berperan  dalam  menghasilkan  aktivitas  antioksidan secara kualitatif yang dinyatakan dengan terbentuknya bercak berwarna kuning dengan latar belakang ungu pada plat KLT setelah penyemprotan larutan DPPH 0,4 mM dan secara kuantitatif menghasilkan IC 50 sebesar 34,0668 ppm dengan kategori sangat kuat.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  ingin  mengucapkan  terima  kasih  kepada Kementerian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi (KEMENRISTEK DIKTI)  Republik Indonesia  atas dukungan  dana  (Hibah  Penelitian  Dosen  Pemula Tahun Anggaran 2020) dan STIKES Borneo Lestari atas penyediaan fasilitas laboratorium.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Moussa Z, Judeh ZMA, Ahmed SA. Nonenzymatic Exogenous, and Endogenous Antioxidants. In: Das K, Editor. Free Radical Medicine and Biology. London: IntechOpen; 2019, p. 1-22.
2.  Ramadhan  H,  Baidah  D,  Lestari  NP, Yuliana  KA. Aktivitas  antioksidan  ekstrak  etanol  96%  daun, buah  dan  kulit  Terap  ( Artocarpus  odorratissimus ) menggunakan  metode  CUPRAC.  Farmasains. 2020.7(1):7-12.
3.  Khairiah K, Tauﬁ qurrahman I, Putri DKT. Antioxidant Activity  Test  Of  Ethyl Acetate  Fraction  Of  Binjai ( Mangifera  caesia )  Leaf  Ethanol  Extract.  Dental Journal (Majalah Kedokteran Gigi). 2018.51(4):164- 68.
4.  Ismail  NA, Abu  Bakar  MF, Abu  Bakar  FI,  Rahim AC,  Murdin  N.  Underutilized Mangifera  species
( Mangifera  caesia,  Mangifera  quadrifida ,  and Mangifera odorata ) from Borneo: A potential source of antioxidant. J. Eng. Appl. Sci. 2019.14(4):1169-77. 5.  Ramadhan  H,  Hipmi AF,  Sayakti  PI. Antioxidant activity of Binjai leaves ( Mangifera caesia Jack. Ex. Wall) methanol extract from South Kalimantan using DPPH and CUPRAC methods. Proceeding Book The 1st ITB International Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy. Bandung, 2020:9–19.
6.  Norliyanti, Tauﬁ qurrahman I, Sukmana BI. Comparison of Antioxidant Activity  between  Socletation  and Maceration Extraction Method on Binjai Leaf Extract. Jurnal Kedokteran Gigi. 2018.3(2):182-88.
7.  Ramadhan H, Sayakti PI, Ulya R, Hidayati M, Putri ZP,  Rauf A,  Naﬁ la.  Fenol-ﬂ avonoid  dan  aktivitas antioksidan fraksi air dan etil asetat dari daun Binjai ( Mangifera  caesia Jack.  Ex.  Wall).  Jurnal  Ilmiah Pharmacy. 2022.9(1):49-58.
8.  Adham  D, Tauﬁ qurrahman I, Helmi ZN.  Flavonoid Level Analysis  of  Binjai  Leaf  Extract  ( Mangifera caesia ) in Ethanol, Methanol, and N-Hexane Solvents.
Dentino Jurnal Kedokteran Gigi. 2019.4(1):46-49.
9.  Putri AD,  Tauﬁ qurrahman  I,  Dewi  N. Antioxidant Activity  of  Binjai  Leaves  ( Mangifera  caesia) Ethanol  Extracts.  Dentino  Jurnal  Kedokteran  Gigi. 2019.4(1):55–5\9.
10.  Rosita JM, Tauﬁ qurrahman I, Edyson. Perbedaan Total Flavonoid Antara Metode Maserasi dengan Sokletasi pada Ekstrak Daun Binjai ( Mangifera caesia ). Dentino Jurnal Kedokteran Gigi. 2017.1(1):100-5.
11.  Dwidhanti  F,  Taufiqurrahman  I,  Sukmana  BI. Cytotoxicity Test of Binjai Leaf ( Mangifera caesia ) Ethanol  Extract  in  Relation  to  Vero  Cells.  Dental Journal. 2018.51(3):108-13.
12.  Shinde SS & Chavan AR. Isolation of Mangiferin from Diﬀ erent Varieties of Mangifera indica Dried Leaves. International  Journal  of  Scientiﬁ c  &  Engineering Research. 2014.5(6):928-34.
13.  Ramadhan  H,  Rezky  DP,  Susiani  EF.  Penetapan Kandungan  Total  Fenolik-Flavonoid  pada  Fraksi Etil Asetat Kulit Batang Kasturi ( Mangifera casturi Kosterman).  Jurnal  Farmasi  dan  Ilmu  Kefarmasian Indonesia. 2021.8(1):58-67.
14.  Fitriyanti,  Norhavid  MFR,  Ramadhan  H.  Uji  Daya Hambat  Ekstrak  Etanol  70%  Biji  Pepaya  ( Carica papaya L.) Terhadap Bakteri Propionibacterium acnes Penyebab Jerawat. Pharmacoscript. 2020.3(2):144-9. 15.  Ramadhan  H,  Arsyad  M,  Sayakti  PI.  Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol 70% Biji Kalangkala ( Litsea angulata Bl.) Terhadap Bakteri Penyebab Jerawat Propionibacterium acnes . Borneo Journal of Pharmascientech. 2020.4(1):60-70. 16.  Ramadhan  H, Andina  L,  Vebruati,  Naﬁ la, Yuliana KA, Baidah D, Lestari NP. Perbandingan Rendemen dan  Skrining  Fitokimia  dari  Ekstrak  Etanol  96% Daun,  Buah  dan  Kulit  Buah  Terap (Artocarpus odoratissimus Blanco). Jurnal Ilmiah Farmako Bahari. 2020.11(2):103-12.
17.  Sarker SD and Nahar L. Natural Products Isolation.
In: Walker JM, editor. Methods in Molecular Biology. Totowa, NJ: Humana Press; 2012. p. 20,339-42.
18.  Mirfat AHS, Salma I, Razali M. Natural antioxidant properties  of  selected  wild  Mangifera  species  in Malaysia. J. Trop. Agric. Food Sci. 2016.44(1):63-72.
19.  Dwiatun,  I.  Uji  Aktivitas  Antioksidan  Fraksi N-Heksan, Etil Asetat, Dan Fraksi Air Ekstrak Metanol Daun Mangga Kasturi ( Mangifera casturi Kosterm.) Terhadap DPPH. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi, Surakarta. 2018.
20.  Eden WT, Buanasari, Setyowati. Aktivitas Antioksidan Frasksi  dan  Ekstrak  Metanol  Daun  Mangga ( Mangifera indica L.) dengan Metode Serapan DPPH Menggunakan  Spektrofotometer  UV-Vis.  Prosiding SNKPK. 2016:305-15.
21.  Pamungkas  DK,  Retnaningtyas  Y,  Wulandari  L. Pengujian Aktivitas Antioksidan Kombinasi Ekstrak Metanol Daun Mangga Gadung ( Mangifera indica L. var. gadung) dan Ekstrak Etanol Daun Pandan Wangi ( Pandanus  amaryllifolius Roxb.).  e-Jurnal  Pustaka Kesehatan. 2017. 5(1):47-9.
22.  Wijaya  H,  Novitasari,  Jubaidah  S.  Perbandingan Metode Ekstraksi Terhadap Rendemen Ekstrak Daun Rambai Laut ( Sonneratia caseolaris L. Engl). Jurnal Ilmiah Manuntung. 2018.4(1):79-83.
23.  Saidi  N,  Ginting  B,  Murniana,  Mustanir. Analisis Metabolit  Sekunder.  Banda  Aceh:  Syiah  Kuala University Press; 2018. p. 12-29.
24.  Sayuti  K  and  Yenrina  R. Antioksidan Alami  dan Sintetik. Padang: Andalas University Press; 2015.
25.  Kumar S and Pandey AK. Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview. The Scientiﬁ c World Journal. 2013:1–16.
26.  Putri AAS and Hidayati N. Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa  Fenolik  Ekstrak  Metanol  Kulit  Batang Tumbuhan  Nyiri  Batu  ( Xylocarpus  moluccensis ). UNESA Journal of Chemistry. 2015.4(1):1-6.
27.  Yuliani CR, Ramadhan  H,  Sayakti PI, Torizellia C.
Total Phenolic and Flavonoid Contents of n-Hexane Fraction  in  Binjai  Leaves  ( Mangifera  caesia Jack. ex.  Wall).  Jurnal  Ilmiah  Farmasi.  2022.  Special Edition:11-2.
28.  Paulinus YVG, Jayuska A, Ardiningsih P, Noﬁ ani R. Aktivitas Antioksidan  dan  Kandungan  Total  Fenol Fraksi  Etil Asetat  Buah  Palasu  ( Mangifera  caesia Jack). Jurnal Kimia Khatulistiwa. 2015.4(1):47-50. 29.  Sulaiman  SF  and  Ooi  KL.  Polyphenolic  and Vitamin  C  Contents  and Antioxidant Activities  of Aqueous Extracts from Mature-Green and Ripe Fruit Fleshes of Mangifera sp . J Agric Food Chem. 2012. 60(47):11832-8.
30.  Anwar  K,  Fadillaturahmah,  Sari  DP.  Analisis Kandungan  Flavanoid  Total  Ekstrak  Etanol  Daun Binjai ( Mangifera caesia Jack.). Jurnal Ilmiah Ibnu Sina. 2017.2(1):20-30.
31.  Ahmad S, Sukari MA, Ismail N, Ismail IS, Abdul AB, Abu Bakar MF, et al. Phytochemicals from Mangifera pajang Kosterm and Their Biological Activities. BMC Complement Altern Med. 2015. 15(1):1-8.
32.  Murwanto PE and Santosa D. Uji Aktivitas Antioksidan Tumbuhan Cynara  scolimus L., Artemisia  china L., Borreria  repens DC., Polygala  paniculata L.  Hasil  Koleksi  dari  Taman  Nasional  Gunung Merapi  Dengan  Metode  Penangkapan  Radikal DPPH  (2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazil).  Majalah  Obat Tradisional. 2012.17(3):53-60.
33.  Karim  K,  Jura  MR,  Sabang  SM.  Uji  Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Patikan Kebo ( Euphorbia hirta L.). Jurnal Akademika Kimia. 2015. 4(2):57-63.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 62 PURNAMA ET AL.