INDUKSI KALUS DARI EKSPLAN DAUN IN VITRO KELADI TIKUS ( Typhonium sp.) DENGAN PERLAKUAN 2,4-D DAN KINETIN

## Marlina Agustina Sitinjak, Mayta Novaliza Isda, Siti Fatonah
Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Riau Pekanbaru
*Coresspondinga author: maytaisda@yahoo.com

## Abstract
Rodent  tuber  (Typhonium sp. )  belongs  to  Araceae  that  has  a  potential  as  medicinal  plant.  This procedure  takes  a  long  periode  to  produce  a  large  quantity  of  plant.  Therefore,  an  in  vitro propagation  using  callus  culture  is  necessary  to  solve  this  problem.    This  research  aimed  to determine the best concentration of 2,4-D and kinetin to induce callus of in vitro leaf rodent tuber explants.  This  research  used  in  vitro  leaft  explants  of  rodent  tuber  with  MS  medium.    The  design used  is  Randomize  Group  Design  with  10  treatment.  The  results  showed  that  explants  could  not produce callus, the explants response just a swelling leaf explants. The treatment that could give up to 100% swelling response was 2.4-D 0.5 mg / L dan 1 mg / L and the combination treatment 0.5 mg / L 2.4-D + 0.3 mg /L kinetin, 0.5 mg / L 2.4-D + 0.5 mg / L kinetin and 1.5 mg / L 2.4-D + 0.5 mg / L kinetin.   The treatments that could maintain 66.67% explants growth was the combination 0.5 mg / L 2.4-D + 0.5 mg / L kinetin and 1 mg /L 2.4-D + 0.5 mg / L kinetin .
Keywords: Callus, in vitro, kinetin, rodent tuber, 2.4-D

## PENDAHULUAN
Keladi  tikus  ( Typhonium sp.)  tergolong famili  Araceae,  termasuk  salah satu  jenis tumbuhan  liar  yang  berpotensi  sebagai tanaman  obat  yang  mengandung    senyawa alkaloid,  triterpenoid,  saponin  dan  steroid digunakan  sebagai  tanaman  obat  penyakit kanker  (Mudahar et  al .,  2006).  Perbanyakan tanaman keladi tikus hingga saat ini dilakukan melalui  perbanyakan  vegetatif  menggunakan umbi  yang  membutuhkan  waktu  lebih  lama untuk  memproduksi  tanaman  dalam  jumlah banyak.
Salah  satu  solusi  dari  permasalahan tersebut  adalah  perbanyakan  tanaman  dengan menggunakan  metode  kultur  jaringan  ( in vitro )  yang dapat  dilakukan  secara  langsung dari  organ  tanaman  ataupun  melalui  fase kalus.  Kultur  kalus  sering  digunakan  untuk memperoleh  tanaman  bebas  virus,  embrio- genesis  somatik,  regenerasi  varian  genetika dan  menghasilkan  senyawa  metabolit  sekun- der  (Zulkarnain,  2009).  Untuk  itu  dilakukan penelitian  pemberian  zat  pengatur  tumbuh 2,4-D  dan  kinetin  dalam  beberapa  taraf
perlakuan  untuk  menginduksi  kalus  pada eksplan daun in vitro keladi tikus.
Induksi  kalus  sangat  berkaitan  dengan zat  pengatur  tumbuh  endogen  dan  eksogen. Zat pengatur tumbuh yang paling berpengaruh pada  induksi  kalus  adalah  auksin  dan sitokinin.  Penggunaan  auksin  (2,4-D)  dan sitokinin  (BA  atau  kinetin)  akan  meningkat- kan proses induksi kalus. Penambahan auksin atau  sitokinin  ke  dalam  media  kultur  dapat meningkatkan  konsentrasi  zat  pengatur  tum- buh  endogen  di  dalam  sel,  sehingga  menjadi “faktor  pemicu”  dalam  proses  tumbuh  dan perkembangan jaringan (Lestari, 2011). Kom-binasi  zat  pengatur  tumbuh  yang ditambahkan  ke  dalam  medium  merupakan faktor  utama  penentu  keberhasilan  kultur in vitro (Indah  &  Ermavitalini,  2013).  2,4-D efektif untuk  merangsang pembentukan kalus karena  aktiv-itas  yang  kuat  untuk  memacu proses  diferensiasi  sel,  organogenesis  dan menjaga pertumbuhan kalus. Beberapa golongan  sito-kinin  yang  sering  digunakan dalam metode kultur jaringan untuk menginduksi  kalus  adalah  BA  dan  kinetin. Hasil  penelitian  Syahid  &  Kristina  (2007)
mengatakan bahwa induksi  kalus  keladi tikus berhasil diperoleh dengan perlakuan 2,4-D 1,0 mg/L + kinetin 0,1 mg/L dan 2,4-D 1,0 mg/L + kinetin  0,3 mg/L dalam  umur 8-10 minggu setelah  kultur.  Tujuan  dari  penelitian  ini adalah  untuk  menentukan  konsentrasi  terbaik dari  2,4-D  dan  kinetin  untuk  menginduksi kalus pada eksplan daun in vitro keladi tikus.

## MATERIAL DAN METODE
Alat  yang  digunakan  antara  lain:  botol kultur,  pipet  tetes,  gelas  ukur,  cawan  petri, gelas  kimia,  tisu,  plastik  kaca,  karet  gelang, kertas  saring, aluminium  foil , erlenmeyer , timbangan  analitik, hot  plate , autoclave , laminar air flow cabinet , pinset, scalpel , mata pisau,  lampu  bunsen,  batang  pengaduk, sprayer dan oven.
Bahan  yang  digunakan  adalah  eksplan daun in  vitro keladi  tikus,  media  MS,  agar, sukrosa,  2,4-D,  kinetin,  0,1N  HCl,  0,1N NaOH,  bakterisida,  fungisida,  deterjen,  Na- hipoklorit  (Bayclin),  70%  alkohol,  dan akuades.
Penelitian  ini  menggunakan  Rancangan Acak  Kelompok  (RAK)  yang  terdiri  dari  10 perlakuan dengan 3 kali ulangan. Konsentrasi yang diuji yaitu:
A :  Tanpa perlakuan (Kontrol)
B :  0,5 mg/L 2,4-D
C :  1 mg/L 2,4-D D : 1,5 mg/L 2,4-D
E : 0,5 mg/L 2,4-D + 0,3 mg/L kinetin F :   1 mg/L 2,4-D + 0,3 mg/L kinetin
G :  1,5 mg/L 2,4-D + 0,3 mg/L kinetin
H : 0,5 mg/L 2,4-D + 0,5 mg/L kinetin
I  : 1 mg/L 2,4-D + 0,5 mg/L kinetin
J  :  1,5 mg/L 2,4-D + 0,5 mg/L kinetin Pelaksanaan penelitian meliputi persiap- an  dan  sterilisasi  alat,  pembuatan  media, persiapan  dan  penanaman  eksplan.  Pemeliha- raan  dilakukan  di  ruang  inkubasi  dengan menjaga  agar  kondisi  selalu  bersih  dan  steril dengan  menyemprotkan  70  %  alkohol  2  hari sekali.  Suhu  ruang  diatur  23-25°C  dan  diberi penyinaran dengan menggunakan lampu.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian  ini  diawali  dengan  pena- naman  eksplan  daun in  vitro keladi  tikus
untuk  menghasilkan  kalus.  Daun in  vitro diperoleh dari planlet yang berasal dari nodus keladi  tikus  yang  ditanam  pada  media  MS kosong.  Eksplan  nodus  keladi  tikus  meng- hasilkan  satu  tunas  yang  memiliki  3-4  helai daun pada umur 4 bulan (Gambar 1).  Eksplan yang  digunakan  adalah  daun in  vitro keladi tikus yang sudah terbuka sempurna.
Penelitian  induksi  kalus  ini  dilakukan selama  70  hari.  Kalus  yang  diinginkan  diin- duksi dengan menggunakan zat pengatur tum- buh  2,4-D  dan  kinetin.  Salah  satu  indikator adanya  pertumbuhan  dalam  kultur in  vitro adalah munculnya kalus pada eksplan.  Menu- rut  Hendaryono  &  Wijayani  (1994);  Indah  & Ermavitalini  (2013)  bahwa  kalus  merupa-kan proliferasi  massa  sel  yang  masih  belum terdiferensiasi  dan berupa kumpulan sel  yang tidak  teratur.  Respon  dari  daun  keladi  tikus pada kultur yang ditanam adalah kemampuan eksplan  daun  merespon  dan  beradaptasi dengan  media  sesuai  dengan  perlakuan  yang digunakan. Respon diawali dengan perubahan warna potongan daun dan memberikan respon pembengkakan  pada  eksplan  daun  keladi tikus.  Namun  eksplan  daun  keladi  tikus sampai  akhir  penelitian  pada  umur  70  hari tidak terjadi induksi kalus.
Kebanyakan  dari  eksplan  mengalami kematian  pada  umur  28-56  HST  sedangkan eksplan  yang masih hidup  belum membentuk kalus  oleh  karena  itu  parameter-parameter yang akan diamati seperti waktu pembentukan kalus,  persentasi  terbentuknya  kalus,  warna dan  tekstur  kalus  yang  seharusnya  diamati menjadi  tidak  bisa  diperoleh.  Pada  penelitian ini  hanya  mengamati  morfologi  eksplan  dan respon yang terjadi pada eksplan yaitu respon pembengkakan  dan  pinggiran  eksplan  yang terluka karena pemotongan mengalami perubahan  warna  menjadi  coklat  (pencoklat- an).  Respon  eksplan  yang  terjadi  selama kultur  antara  lain  adalah  pencoklatan  pada potongan  atau  luka  eksplan,  pembengkakan pada  eksplan  daun  dan  respon  perubahan warna  pada  permukaan  eksplan.    Persentase respon  pencoklatan  pada  potongan  atau  luka eksplan dapat dilihat pada Tabel 1.
Pada  Tabel  1  menunjukkan  bahwa semua  perlakuan  memberikan  respon  pen-
coklatan  pada  potongan  atau  luka  eksplan hingga  100%.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa dengan  atau  tanpa  zat  pengatur  tumbuh, eksplan  mampu  memberikan  respon  pen- coklatan luka atau potongan eksplan.  Respon ini terjadi karena adanya interaksi yang terjadi antara  eksplan  dengan  media  pada  waktu yang berbeda-beda.  Respon pencoklatan pada potongan  atau  luka  eksplan  ini  menandakan dua kemungkinan. Pertama adalah menunjuk- kan  respon  yang  mengarah  ke  pembentukan kalus.  Seperti  dikatakan  oleh  Kartika et  al., (2014)  pertumbuhan  kalus  diawali  dengan mencoklatnya tepi daun. Kedua adalah respon menunjukkan  kerusakan  sel  yang  mengarah ke  kematian  sel.    Diduga  kemungkinan  yang terjadi  pada  eksplan  adalah  kerusakan  yang mengarah pada kematian sel.
Proses  pelukaan  yang  diberikan  pada eksplan  diduga  menjadi  faktor  yang  mem- pengaruhi  eksplan  mengalami  pencoklatan (Gambar  2).  Kerusakan  ini  diakibatkan  oleh senyawa  fenol  yang  terakumulasi  pada  sel kemudian mengalami oksidasi. Hutami (2008) menjelaskan bahwa pencoklatan terjadi  diakibatkan  oleh  enzim  oksidase  yang mengandung  senyawa  fenol  yang  disintesis dalam  kondisi  oksidatif  ketika  diberi  peluka- an.  Luka  eksplan  mengakibatkan  terjadinya enzim  dan  substrat  keluar  dari  sel  kemudian terjadi  ikatan  antara  hidrogen  dengan  protein yang  diikuti  dengan  meningkatnya  aktivitas fenilalanin  amonia  liase  (PAL)  yang  mem- produksi  fenilpropanoid  yang  menyebabkan adanya pencoklatan.
Respon  lain  yang  juga  terjadi  pada eksplan  selama  kultur  adalah  pembengkakan pada eksplan. Respon pembengkakan ini tidak tergantung  pada  pencoklatan  potongan  atau luka  daun.  Persentase  tertinggi  dari  eksplan yang  menunjukkan  pembengkakan  (100%) adalah perlakuan tunggal 2,4-D yaitu 0,5 mg/l dan  1  mg/l,  kemudian  untuk  perlakuan kombinasi dengan konsentrasi 0,5 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin, 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin dan 1,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin. Sedangkan persentase terendah adalah  1 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin yaitu 33,33%.
Konsentrasi  2,4-D  tunggal  yang  tinggi pada  perlakuan  1,5  mg/l  dan  kombinasi  1,5
mg/l  2,4-D  +  0,3  mg/l  kinetin  mampu  mem- berikan  respon  hingga  66,67.  Respon  pem- bengkakan  mencapai  100%  ketika  konsen- trasi  2,4-D  yang  diberikan  tinggi  (1,5  mg/l) dikombinasikan dengan 0,5 mg/l kinetin yaitu perlakuan  J.  Pada  pemberian  2,4-D  tunggal dengan  konsentrasi  rendah  (0,5  mg/l)  dan dikombinasikan  dengan  kinetin  (konsentrasi rendah dan tinggi) memberikan respon hingga 100%.  Konsentrasi  2,4-D  1  mg/l  yang diberikan  secara  tunggal  bisa  mencapai respon  pembengkakan  hingga  100%.  Apabila dikombinasikan  dengan  kinetin  konsentrasi rendah  0,3  mg/l,  respon  pembekakan  hanya 33,33%,  namun  jika  dikombinasikan  dengan kinetin  konsentrasi  tinggi  (0,5  mg/l)  persen- tase  respon  pembengkakan  naik  menjadi 66,67%.
Pembengkakan  eksplan  pada  penelitian ini  diduga  merupakan  respon  yang  mengarah ke  pembentukan  kalus.  Ajijah et  al., (2010) mengatakan  bahwa  pembengkakan  pada eksplan adalah tahap awal pembentukan kalus yang  mengindikasikan  adanya  aktifitas  sel pada  eksplan.  Repon  pembengkakan  ini terjadi  dalam  waktu  yang  berbeda-beda dimana  perlakuan  yang  memberikan  waktu respon  paling  cepat  adalah  0,5  mg/l  2,4-D. Diduga  pembesaran  pada  sel  yang  terjadi sebagai  aktifitas  sel  berupa  penyerapan mengakibatkan eksplan mengalami pembeng- kakan  (Gambar  3).  Respon  pembengkakan terjadi karena adanya interaksi antara eksplan terhadap lingkungan tumbuh dan zat pengatur tumbuh  melalui  penyerapan  nutrisi  yang dilakukan  oleh  eksplan.  Penambahan  2,4-D secara  tungal  pada  penelitian  ini  sudah mampu  memberikan  respon  pembengkakan. Apabila  dikombinasikan  dengan  kinetin, maka perlu diperhatikan keseimbangan kedua zat  pengatur  tumbuh.  Kombinasi  dengan kinetin  konsentrasi  tinggi  diduga  lebih optimal  untuk  memberikan  respon  pembeng- kakan.
Respon  selanjutnya  yang  terjadi  selama pengamatan  adalah  perubahan  warna  pada eksplan  menjadi  hijau  kekuningan  atau  hijau kecoklatan.  Namun  tidak  semua  eksplan mengalami  perubahan  ini.  Respon  eksplan terhadap perubahan warna eksplan dari setiap
perlakuan  berbeda-beda.  Perlakuan  kontrol, 0,5  mg/l  2,4-D  dan  1  mg/l  2,4-D  +  0,5  mg/l kinetin  terjadi  perubahan  warna  menjadi kekuningan  dan  tidak  mengalami  perubahan menjadi  hijau  kecoklatan.  Perlakuan  lain memberikan respon keduanya.  Perlakuan 1,5 mg/l 2,4-D; 0,5 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin; 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin memberikan respon hijau kekuningan dan hijau kecoklatan sedangkan  1 mg/l 2,4-D;  1 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin memberikan respon yang dimulai dari  hijau  kekuningan  dan  hijau  kecoklatan Namun  ada  juga  eksplan  yang  tidak  meng- alami perubahan warna. Seperti pada perlaku- an  1,5  mg/l  2,4-D  +  0,3  mg/l  kinetin  yang hanya  mengalami  perubahan  menjadi  hijau tua 33,33%.
Perubahan  eksplan  daun in  vitro menjadi  hijau  kekuningan  dan  hijau  ke- coklatan  ini  diduga  menandakan  eksplan mengalami  kerusakan.  Eksplan  yang  berwar- na  hijau  kekuningan  diduga  memperlambat kematian  eksplan.  Perubahan  warna  eksplan mungkin  dipengaruhi  ukuran  eksplan  dan  zat pengatur  tumbuh.  Eksplan  yang  digunakan pada  penelitian  ini  memiliki  ukuran  yang kurang besar untuk mengimbangi zat pengatur tumbuh  yang  diberikan.  Selain  itu  umur eksplan  tentu  juga  mempengaruhi.  Pada penelitian ini eksplan yang digunakan berasal dari  planlet  umur  sekitar  4  bulan  yang ditanam  pada  media  MS  kosong.  Eksplan yang  berumur  4  bulan  merupakan  umur diamana planlet memiliki daun berjumlah 3-4 helai  dan  belum  mengalami  kerusakan  daun (mati),  apabila  kurang  dari  4  bulan  planlet hanya  memiliki  2-3  daun  dan  belum  terbuka sempurna.  Diduga  pada  umur  4  bulan, jaringan eksplan masih kurang tebal sehingga jumlah  sel  menjadi  kurang  banyak  untuk menjadi  meristematis  kembali.  Faktor  lain juga  dipengaruhi  oleh  konsentrasi  sitokinin yang  kurang  mencukupi.  Menurut  Salisbury &  Ross  (1992)  keberadaan  sitokinin  dapat menunda  penuaan  pada  daun  tanaman. Eksplan  yang  mengalami  penuaan  perlahan- lahan  akan  mati  pada  waktu  yang  tidak bersamaan.  Perubahan  menjadi  hijau  ke- coklatan  diduga  menandakan  eksplan  meng- alami  kerusakan  akibat  akumulasi  fenol  yang
teroksidasi.  Tanaman  keladi  tikus  mengan- dung  senyawa  triterpenoid,  alkaloid  dan lignin (polifenol). Diduga hijau kecoklatan ini merupakan akibat dari oksidasi senyawa fenol yang  terjadi  pada  eksplan.  Hal  ini  terbukti dari  perubahan  eksplan  menjadi  coklat  dan mati.  Menurut  Wahyudi  (2014)  ekpresi eksplan  menjadi  cokelat  merupakan  dampak pelukaan  yang  diberikan  pada  eksplan, umumnya  peencoklatan  akan  menghambat perkembangan  jaringan.  Adri  (2012)  menya- takan bahwa kematian eksplan yang mengalami  pencoklatan  diakibatkan  oleh oksidasi senyawa fenol.
Beberapa perlakuan memberikan respon dengan  pinggiran  eksplan  berubah  warna menjadi putih transparan. Respon ini menunjukkan adanya kerusakan pada eksplan yaitu  kehilangan  zat  hijau  daun  yang kemungkinan disebabkan oleh keberadaan zat pengatur  tumbuh  sitokinin  yang  tidak  sesuai dan  faktor  adaptasi  eksplan  terhadap  media. Sebagaimana  dijelaskan  oleh  Ajijah et  al., (2010)  hal  ini  menandakan  bahwa  eksplan kehilangan  klorofil  sebagai  pertanda  adanya adaptasi  eksplan  terhadap  media.  Diduga adaptasi tersebut merupakan respon fisiologis eksplan  untuk  bertahan  hidup  atau  respon menuju  kematian.  Perubahan  seperti  ini disebabkan  oleh  beberapa  faktor  seperti kandungan  NH 4 + media  MS,  bisa  juga diakibatkan  oleh  zat  pengatur  tumbuh  2,4-D dan kinetin (Ajijah et al., 2010).  Keberadaan sitokinin yang kurang juga mungkin menyebabkan  hal  ini  terjadi.  Sebagaimana ditambahkan  oleh  Salisbury  &  Ross  (1992) bahwa  keberadan  sitokinin  dengan  jumlah yang  cukup  akan  memacu  perkembangan kloroplas.  Pengamatan  yang  dapat  dilakukan pada  akhir  pengamatan  adalah  eksplan  yang masih bertahan hidup. Penambahan 2,4-D dan kinetin  terhadap  persentase  eksplan  yang masih  hidup  hingga  hari  ke  70  dapat  dilihat pada Tabel 2.
Hasil penelitian ini menunjukkan sebanyak  7  (tujuh)  dari  10  perlakuan  yang diberikan mengalami pencoklatan (mati) pada saat  memasuki  umur  ke  28-56  hst.  Tiga perlakuan  yang lain mampu mempertahankan eksplan  tetap  hidup  dengan  perubahan  warna
eksplan  menjadi  hijau  kekuningan  namun tidak  mampu  menghasilkan  kalus.  Tiga perlakuan tersebut adalah perlakuan  0,5 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin  yaitu 33,33  0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin  dan  I  1 mg/l 2,4-D +  0,5  mg/l  kinetin    masing-masing  sebesar 66,67%.    Perlakuan  kombinasi  antara  2,4-D dengan kinetin lebih mampu mempertahankan eksplan  tetap  hidup  dibandingkan  perlakuan tunggal  dan  kontrol.  Hal  ini  mungkin dikarenakan  adanya  sinergis  antara  kedua  zat pengatur  tumbuh  terhadap  interkasi  eksplan dengan  media  dibandingkan  dengan  kontrol dan  perlakuan  tunggal.  Induksi  kalus  pada penelitian  ini  hanya  mampu  memberikan respon  pembengkakan  yang  mengarah  ke pembentukan  kalus.  Pembengkakan  ini  me- nandakan kondisi sel pada eksplan mengalami pembesaran.  Namun  tidak  sampai  ke  pem- belahan  sel  yang  nantinya  akan  membentuki kalus.  Seharusnya  setelah  terjadi  pembeng- kakan  eksplan  akan  menghasilkan  kalus. Menurut  Lizawati et  al., (2012)  pembeng- kakan pada eksplan daun akan disusul dengan terbentuknya  kalus  disekitar  pinggiran  daun (potongan  daun).  Namun  hingga  akhir pengamatan  (hari  ke  70)  kalus  yang diharapkan  pada  penelitian  ini  tidak  muncul. Hal  yang  sama  terjadi  pada  penelitian Manuhara  (2012)  yang  menemukan  bahwa eksplan  daun Anthurium  plowmanii tidak mampu menginduksi kalus hingga minggu ke 12  (84  hari)  pada  pemberian  zat  pengatur tumbuh  yang  sama.  Diduga  hal  ini  di- pengaruhi  oleh  konsentrasi  zat  pengatur tumbuh  yang  belum  optimal  untuk  meng- induksi  kalus  keladi  tikus.  Berdasarkan penelitian Syahid & Kristina (2007) diperlukan  konsentrasi  auksin  eksogen  yang lebih tinggi  untuk  menginduksi  kalus,  namun ternyata  berdasarkan  hasil  penelitian  ini penambahan  konsentrasi  auksin  yang  lebih tinggi  belum  mampu  untuk  menginduksi kalus dari eksplan daun in vitro keladi tikus.
Induksi  kalus  tidak  diperoleh  pada penelitian  ini  diduga  hal  karena  kondisi eksplan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini berasal  dari  daun in  vitro yang  memiliki ketebalan sangat tipis.  Berdasarkan penelitian Fatonah  dan  Isda  (2011)  pemberian  zat
pengatur tumbuh tidak berbeda nyata terhadap kontrol  untuk  menginduksi  tunas  keladi. Pada  penelitian  ini  digunakan  eksplan  yang ditumbuhkan  pada  media  MS  kosong  untuk menyeragamkan  sumber  eksplan.    Perlakuan tanpa  zat  pengatur  tumbuh  diduga  meng- hasilkan planlet yang ketebalannya lebih tipis. Hal  ini  tentunya  berpengaruh  pada  senyawa yang  terkandung  pada  eksplan  tersebut. Zulkarnain  (2009)  mengatakan  bahwa  daun planlet  hasil  kultur in  vitro memiliki  sel palisade  yang  lebih  kecil  dan  jumlah  yang lebih sedikit.  Kondisi eksplan yang kecil dan tipis  ini  memiliki  jumlah  sel  yang  lebih sedikit.  Diduga jumlah sel yang terdapat pada eksplan  kurang  mencukupi  untuk    membelah hanya  mampu  untuk  beradaptasi  dengan lingkungan  sehingga  meskipun  ditambah dengan  zat  pengatur  tumbuh  akan  lebih  sulit merangsang  pembelahan  sel-sel  untuk  ber- diferensiasi membentuk kalus.
Ukuran dan asal eksplan daun berpengaruh terhadap keberhasilan terbentuk- nya kalus.  Eksplan yang berasal dari kultur in vitro memiliki  keuntungan  dan  kelemahan. Salah  satu  keuntungannya  adalah  eksplan sudah  dalam  kondisi  steril  sehingga  tidak membutuhkan  sterilasi  eksplan  kembali. Kelemahan  dari  eksplan  yang  berasal  dari kultur in  vitro adalah  ukuran  planlet berukuran  lebih  kecil  baik  batang,  daun,  dan akar.  Selain  itu,  planlet  juga  tampak  lebih lunak  dan  tidak  kokoh.  Zulkarnain  (2009) menyatakan  bahwa  ukuran  eksplan  dapat mempengaruhi  repon  hidup  dari  eksplan  itu sendiri  sehingga  akan  berpengaruh  pada keberhasilan  kultur in  vitro .    Ukuran  eksplan yang  kecil  akan  mempengaruhi  fungsi fisiologis  eksplan.  Hal  ini  mungkin  meng- akibatkan  eksplan  tidak  mampu  bertahan lama.  Ukuran  eksplan  yang  terlalu  kecil, memiliki  kandungan  senyawa  metabolit  yang tidak  mencukupi  untuk  mengimbangi  zat pengatur  tumbuh  yang  diberikan  pada  media sehingga  hanya  mampu  beradaptasi  dan memberikan  respon  pembengkakan  saja  dan pada akhirnya eksplan mengalami kematian.
Dibutuhkan  alternatif  yang  diharapkan mampu menghasilkan kalus dari eksplan daun in  vitro keladi  tikus.  Penambahan  vitamin
sebagai nutrisi tambahan mungkin dibutuhkan agar eksplan mampu meningkatkan kemampuan sel untuk bertahan hidup.
Gambar  1 .  Morfologi  sumber  eksplan  yang  berasal  dari  nodus keladi  tikus  (A),  eksplan  mengalami  pencoklatan  pada  potongan  atau  luka  pada  perlakuan  control (B) dan 1 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin (C)
Tabel 1 . Persentase respon pencoklatan dan pembengkakan pada potongan atau luka eksplan Perlakuan Pelukaan (%) Pembengkakan (%) Kontrol 100 66,67 0,5 mg/l 2,4-D 100 100,00 1 mg/l 2,4-D 100 100,00 1,5 mg/l 2,4-D 100 66,67 0,5 mg/l 2,4 D + 0,3 mg/l kinetin 100 100,00 1 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin 100 33,33 1,5 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin 100 66,67 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin 100 100,00 1 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin 100 66,67 1,5 mg/l 2,4-D +0,5 mg/l kinetin 100 100,00 Tabel 2 . Persentase eksplan daun yang  masih hidup Perlakuan % eksplan hidup Kontrol 0,00 0,5 mg/l 2,4-D 0,00 1 mg/l 2,4-D 0,00 1,5 mg/l 2,4-D 0,00 0,5 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin 33,33 1 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin 0,00 1,5 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin 0,00 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin 66,67 1 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin 66,67 1,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin 0,00
Hal  serupa  juga  ditemukan  pada penelitian  yang  dilakukan  oleh  Syahid  dan
Kristina  (2007)  yang  memberikan  penam-
bahan  vitamin  pada  media  yang  digunakan untuk menginduksi kalus daun in vitro keladi tikus.  Hal  tersebut  akan  membantu  nutrisi
A
B
A C
eksplan  sehingga  mampu  bertahan  dan menghasilkan kalus pada minggu ke-8 dan 10. Hasil  penelitian  ini  membuktikan  bahwa pemberian 2,4-D konsentrasi tinggi (1,5 mg/l) dan  dikombinasikan  dengan  kinetin  konsen- trasi  tinggi  (0,5  mg/l)  memberikan  pening- katan  persentase  respon  pembengkakan. Dengan  demikian  perlu  penambahan  konsen- trasi  zat  pengatur  tumbuh  yang  digunakan untuk keberhasilan induksi kalus keladi tikus.
Selanjutnya  penambahan  zat  pengatur tumbuh  yaitu  sitokinin  juga  diperlukan  untuk meningkatkan kemapuan sel untuk membelah. Keberadaan  2,4-D  konsentrasi  tinggi  hanya mampu  memberikan  respon  pembengkakan, karena  itu  diperlukan  penambahan  konsen- trasi  sitokinin  yang  diharapkan  mampu memicu pembelahan sel lebih cepat.  Menurut Kaniyah et  al., (2012)  bahwa  kemungkinan berhentinya  respon  eksplan  diakibatkan  oleh konsentrasi  zat  pengatur  tumbuh  yang digunakan,  jika  konsentrasi  zat  pengatur tumbuh  terlalu  rendah  maka  tidak  mampu menginduksi  kalus,  namun  sebaliknya  jika terlalu tinggi akan bersifat toksik bagi eksplan dan  jika  konsentrasi  yang  diberikan  tidak seimbang  maka  interaksi  kedua  zat  pengatur tumbuh  tidak  cocok  untuk  merangsang pembentukan kalus.

## KESIMPULAN
Kesimpulan dari penelitian ini adalah :
1. Pemberian zat pengatur tumbuh 2,4-D dan kinetin  belum  mampu  menginduksi  pem- bentukan  kalus  dari  daun in  vitro keladi tikus hingga hari ke 70 hst namun mampu memberikan  respon  pembengkakan  dan perubahan warna.
2. Perlakuan  yang  mampu  memberikan respon  pembengkakan  pada  eksplan  daun in  vitro hingga  100  %  adalah  perlakuan tunggal  2,4-D  yaitu  konsentrasi  0,5  mg/l dan  1  mg/l,  untuk  perlakuan  kombinasi pada  konsentrasi  0,5  mg/l  2,4-D  +  0,3 mg/l  kinetin,    0,5  mg/l  2,4-D  +  0,5  mg/l kinetin  dan  1,5  mg/l  2,4-D  +  0,5  mg/l kinetin.
3. Perlakuan  yang  mampu  mempertahankan eksplan  tetap  hidup  hingga  66,67  %
adalah perlakuan kombinasi yaitu 0,5 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin dan 1 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l kinetin.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini terselenggara atas bantuan dana PNPB Universitas Riau tahun 2015.

## DAFTAR PUSTAKA
Adri, R. F. (2012). Pengaruh 2,4-D Terhadap Pembentukan Embrio Somatik Tanaman Gambir (Uncaria gambir Roxb.) dan Uji Responnya Terhadap PE6 dalam UPaya Memperoleh  Klon  Gambir  Toleran Cekaman Kekerinngan (artikel). Univer- sitas Andalas: Padang (diakses 4 Januari 2015).
Ajijah,  N.,  Tasma,  I.  M.,  Hadipoentyanti,  E. (2010).  Induksi  Kalus  Vanilli  ( Vanilla planifolia ANDREW.)  Dari  Eksplan Daun dan Buku. Buletin RISTRI. 1(5). Fatonah,  S.,  Isda,  M.  N.  (2011).  Induksi Tunas dari Eksplan Nodus Keladi Tikus dengan Perlakuan BAP. Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam,  Universitas  Riau.  Pekanbaru. (belum dipublikasikan).
Hendaryono, D., Wijayani, A. (1994). Teknik kultur jaringan, Pengenalan dan Petun- juk  Perbanyakan  Tanaman  secara Vegetatif-Modern. Kanisius. Yogyakarta. Hutami,  S.  2008.  Masalah  Pencoklatan  pada Kultur  Jaringan. Jurnal  Agrobien. 4(2), 83-88.
Indah,  P.N.,  Ermavitalini,  D.  (2013).  Induksi Kalus  Daun  Nyamplung  ( Calophyllum inophyllum Linn.)  pada  Beberapa  Kom- binasi Konsentrasi 6-Benzylaminopurine (BAP)  dan 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D). Jurnal  Sains  Dan  Seni Pomits. 2(1), 2337-3520.
Kartika  L.,  Atmojoyo,  P.K.,  Purwijan- tiningsih,  L.  M.  E.  (2014).  Kecepatan induksi  kalus  dan  kandungan  eugenol sirih  merah  ( piper  crocatum ruiz  and pav.)  yang  diperlakukan  menggunakan variasi  jenis  dan  konsentrasi  auksin (makalah).  Universittas  Atma  Jaya. Yogyakarta.
Khaniyah,  S.,  Habibah,  N.  A,  &  Sumadi.
(2012). Pertumbuhan Kalus Daun Dewa ( Gynura  procumbens [Lour]  Merr.) Dengan  Kombinasi  2,4-Dichlorophe- noxyacetic  Acid  dan  Kinetin  Secara in vitro . Biosaintifika. 4 (2).
Lestari,  E.  G.  (2011).  Peranan  Zat  Pengatur Tumbuh  dalam  Perbanyakan  Tanaman Melalui  Kultur  Jaringan. Jurnal  Agro- Biogen. 7(1), 63-68.
Lizawati, Neliyati, R. Desfira. (2012). Induksi Kalus  Eksplan  Daun  Durian  ( Zurio zibethinus murr.  Cv.  Selat  Jambi)  pada Beberapa  Kombinasi  2,4-D  dan  BAP. Fakultas  Pertanian,  Universitas  Jambi. Jambi.
Manuhara,  Y.  S.  W.  (2012).  Perbanyakan Anthurium plowmanii Croat Menggunakan Eksplan Daun dan Tangkai  Daun  Secara In  Vitro (artikel). Universitas Airlangga: Surabaya (diakses 20 Maret 2015). Mudahar  H.,  Widowati,  L.,  Sundari,  D.
(2006).  Uji  Aktivitas  Ekstrak  Etanol  50
%  Umbi  Keladi  Tikus  ( Thyphonium flagelliforme  (Lood)  BI) terhadap  Sel Kanker  Payudara  (MCF  -7  Cell  line) secara In  Vitro . Puslitbang  Biomedis dan Far-masi , Badan Litbang Kesehatan (diakses 4 Desember 2013).
Salisbury,  F.  S.,  Ross,  C.  W.  (1992). Fisiologi Tumbuhan . ITB. Bandung. Syahid,  S. F., Kristina,  N. N. (2007).  Induksi dan  Regenerasi  Kalus  Keladi  Tikus ( Typonium flagelliforme . Lodd. ) Secara
In vitro . Jurnal Littri. 13(4), 142-146.
Wahyudi,  S.  (2014).  Induksi  Tunas  dari Eksplan Mahkota Buah Tanaman Nanas ( Ananas  comosus (L.)  Merril)  Asal Kampar Secara In Vitro dengan enambahan  6-benzilaminopurine  (BAP) [skripsi].  Fakultas  Ilmu  Pengetahua Alam Universitas Riau. Pekanbaru.
Zulkarnain,  H.  (2009). Kultur  Jaringan Tanaman Solusi  Perbanyakan Tanaman Budi Daya . Bumi Aksara. Jakarta.