## VAKSIN DNA HEAT SHOCK PROTEIN 65 (HSP65) DENGAN KLK YANG TERENKAPSULASI NANOPARTIKEL PLGA SEBAGAI INOVASI TERAPI PREVENTIF DAN KURATIF TUBERKULOSIS
Jaya Firmansyah, 1 Hana Nafisah, 1 Nabila Rayhan Yasmin 1
1 Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Lampung, Bandar Lampung

## ABSTRAK
Pendahuluan :  Tuberkulosis  merupakan  salah  satu  penyakit  dengan angka  mortalitas  yang  tinggi.  Untuk  mencegah  penyebaran  tuberkulosis adalah  dengan  pemberian  vaksin  BCG.  Namun,  efek  perlindungan  dari vaksin BCG bervariasi dari 0-80% dan menurun secara signifikan setelah 10-15  tahun.  Jadi,  dibutuhkan  inovasi  vaksin  baru  yang  lebih  protektif. Tujuan  dari  tinjauan  pustaka  ini  adalah  untuk  mengetahui  mekanisme kerja  dan  efektivitas  vaksin  DNA  hsp65  dengan  nanopartikel  PLGA berkapsul  dengan  adjuvan  KLK  dalam  meningkatkan  respon  imun terhadap tuberkulosis.
Metode :  Makalah  yang  telah  ditinjau  diperoleh  menggunakan  mesin pencari  seperti  Google  Scholar,  Proquest,  Science  Direct,  dan  PubMed dengan  rentang  publikasi  dari  2010  hingga  2021  dan  makalah  dipilih validitas  dan  reliabilitasnya.  Kemudian  dilakukan  tinjauan  pustaka  dan penulisan artikel.
Pembahasan : Vaksin DNA hsp65 dapat memicu produksi sitokin, seperti IFN- γ,  IL-2,  aktivitas  sel  T  CD4+  dan  CD8+  yang  lebih  tinggi  daripada vaksin BCG. Ada penurunan yang signifikan pada tingkat MTB pada tikus yang  disuntik  dengan  vaksin  hsp65.  Kombinasi  vaksin  hsp65  +  KLK menunjukkan kerusakan  paru-paru dan  area inflamasi paling sedikit dan respon  Th1  dan  produksi  IL-10  tertinggi  di  antara  vaksin  lainnya.  Untuk meningkatkan efisiensi vaksin DNA hsp65 + KLK, dilakukan pengurangan dosis  menjadi  dosis  tunggal  dengan  menggunakan  nanopartikel  PLGA biodegradable sebagai sistem pembawa antigen.
Simpulan : Kombinasi vaksin DNA hsp65 dan KLK dapat memicu respon imun  spesifik  terhadap  MTB  dan  dengan  enkapsulasi  PLGA  dapat meningkatkan  efisiensinya,  sehingga  berpotensi  tinggi  sebagai  terapi preventif dan kuratif tuberkulosis.
Kata  kunci : hsp65,  KLK,  Mycobacterium  Tuberkulosis,  Nanopartikel PLGA, Vaksin
Korespondensi:

## Jaya Firmansyah
Email Korespondensi: jaya.firmansyah29@gmail.com

## Riwayat Artikel
Diterima: 20 Maret 2021 Selesai revisi: 14 Juli 2021
DOI :
10.53366/jimki.v9i2.364
e-ISSN : 2721-1924 ISSN : 2302-6391

## MAHASISWA KEDOKTERAN
INDONESIA
DNA HEAT SHOCK PROTEIN 65 (HSP65) VACCINE WITH NANOPARTICLE PLGA ENCRYPTED KLK AS A PREVENTIVE AND CURATIVE TUBERCULOSIS THERAPY INNOVATION

## ABSTRACT
Introduction: Tuberculosis is a disease with a high mortality rate. To prevent the spread of tuberculosis  is by giving the BCG vaccine. However, the protective effect of the  BCG vaccine  varies  from  0-80%  and  decreases  significantly  after  10-15  years.  So,  new vaccine  innovations  that  are  more  protective  are  needed.  The  purpose  of  this  literature review  is  to  determine  the  mechanism  of  action  of  the  hsp65  DNA  vaccine  with  PLGA nanoparticles in capsules with KLK adjuvants in increasing the immune response against tuberculosis .
Methods:  The  reviewed  papers  were  obtained  using  search  engines  such  as  Google Scholar,  Proquest,  Science  Direct,  and  PubMed  with  a  publication  range  from  2010  to 2021 and the papers were selected for validity and reliability. Then carried out a literature review and article writing.
Discussion: DNA hsp65 vaccine can trigger the production of cytokines, such as IFN- γ, IL-2,  higher  CD4+  and  CD8+  T  cell  activity  than  BCG  vaccine.  There  was  a  significant reduction  in  MTB  levels  in  mice  injected  with  the  hsp65  vaccine.  The  combination  of hsp65 + KLK vaccine showed the least lung damage and areas of inflammation and the highest  Th1  response  and  IL-10  production  among  the  other  vaccines.  To  increase  the efficiency of the DNA hsp65 + KLK vaccine, the dose was reduced to a single dose using biodegradable PLGA nanoparticles as an antigen carrier system.
Conclusion:  The  combination  of  hsp65  DNA  vaccine  and  KLK  can  trigger  a  specific immune response against MTB and with PLGA encapsulation can increase its efficiency, so it has high potential as a preventive and curative therapy for tuberculosis.
Keywords:  hsp65, KLK, Mycobacterium tuberculosis, PLGA nanoparticles, vaccine

## 1.  PENDAHULUAN
Penyakit Tuberkulosis atau yang  lebih  dikenal  TBC  merupakan penyakit  infeksi  yang  disebabkan  oleh
Mycobacterium  tuberculosis . [1] Global Tuberculosis  Report 2019  melaporkan bahwa,  secara  global  pada  tahun  2018 diperkirakan terdapat 10 juta (kisaran 9- 11,1 juta) kasus insiden TBC.
Berdasarkan  laporan World  Health Organization (WHO)  pada  tahun  2016, TBC merupakan penyakit ke-10 penyebab  kematian  terbesar.  Selain  itu, berdasarkan laporan tuberkulosis global, Asia  Tenggara  merupakan  regional dengan  estimasi  insidensi  TBC  tertinggi mencapai 45%. [2] WHO telah
mendefinisikan  negara  dengan  beban tinggi/ high  burden  countries (HBC) untuk TBC berdasarkan 3 indikator yaitu TBC, TBC-HIV, dan MDR-TBC.
Indonesia  bersama  13  negara  lain, masuk  dalam  daftar  HBC  untuk  ketiga indikator  tersebut.  Data  jumlah  kasus TBC  di  Indonesia  berjumlah  420.994 kasus pada tahun 2017. [1] Permasalahan TBC menjadi permasalahan  kesehatan  yang  sangat serius dan membutuhkan upaya penanganan  yang  tepat.  WHO  telah menetapkan 3  indikator dan target yang harus  dicapai  oleh  seluruh  negara dalam mengatasi permasalah TBC yaitu 1)  menurunkan  jumlah  kematian  TBC sebanyak 70% pada tahun  2025
dibandingkan  kematian  pada  tahun 2015,  2)  menurunkan  insidens  TBC sebanyak 50% pada tahun  2025 dibandingkan  tahun  2015,  3)  tidak  ada keluarga  pasien  TBC  yang  terbebani pembiayaannya terkait pengobatan TBC pada  tahun  2035.  Indonesia  sendiri pada Permenkes Nomor 67 Tahun 2016 tentang  Penanggulangan  Tuberkulosis menetapkan target program penanggulangan  TBC  nasional  yaitu eliminasi pada tahun 2035 dan Indonesia  Bebas  TBC  Tahun  2050.
Eliminasi TBC adalah tercapainya jumlah  kasus  TBC  1  per  1  juta penduduk. Sementara tahun 2017
jumlah  kasus  TBC  masih  sebesar  254 per  100.000  atau  25,40  per  1  juta penduduk. [1] Penanganan kuratif untuk penyakit  TBC  dengan  memberikan  obat anti-tuberkulosis (OAT), namun ketidakpatuhan
pasien
dapat
menyebabkan Mycobacterium tuberculosis (MTB)  menjadi  resisten terhadap OAT. Mycobacterium tuberculosis yang  resisten  terhadap isoniazid  dan  rifampicin  disebut Multi- drug  Resistant  Tuberculosis (MDR- TBC).  Keadaan  MDR-TBC  yang  tidak ditangani
dengan tepat
dapat berkembang  menjadi eXtensively  Drug- Resistant Tuberculosis (XDR-TBC) yang menyebabkan  penyakit  TBC  makin  sulit disembuhkan. [3] Berdasarkan data, WHO  memperkirakan  terdapat  480.000 kasus  TBC  MDR  di  seluruh  dunia, sedangkan  kematian  akibat  TBC  MDR diperkirakan  250.000  kasus  pada  tahun 2015.  WHO  dalam Global  Tuberculosis
Report 2015 melaporkan bahwa
Indonesia  termasuk  salah  satu  negara dari  27  negara  lainnya  di  dunia  dengan kasus  TBC  MDR  yang  cukup  banyak yaitu  terdapat  6800  kasus  baru  TBC MDR  setiap  tahunnya. [4] Berdasarkan Annual Report 2017, Indonesia menempati  posisi  ke  dua  kasus  TBC MDR  tertinggi  di  Asia  Tenggara. [2] Artinya, Indonesia memiliki permasalahan besar dalam menghadapi penyakit TBC. Pemerintah Indonesia telah menetapkan  pedoman  penangulangan tuberkulosis yang salah satu komponennya,  yaitu  dengan  program pengobatan pencegahan pada kelompok yang rentan dan berisiko serta pemberian vaksin TBC. Vaksinasi dengan  BCG  merupakan  upaya  yang saat ini masih digunakan dalam pencegahan  TBC.  Vaksin  BCG  terbukti protektif  pada  anak  namun  menurun signifikan setelah 10-15 tahun serta efek proteksi  vaksin  BCG  bervariasi  dari  0- 80%,  bergantung  pada  genetik  dan kondisi geografis. [5,6]
Berdasarkan penelitian yang dilakukan Barreto et al . [7] di  Brazil  juga  menunjukan  bahwa efektivitas  tertingginya  hanya  12%. [7] Vaksinasi ulang juga tidak akan meningkatkan  proteksi  terhadap  TBC dan  bahkan  memberikan  efek  samping seperti  pembengkakan  kelenjar  limfe, demam,  muntah  dan  nyeri  perut. [5] Vaksin  BCG  merupakan  vaksin  hidup strain bakteri Mycobacterium bovis yang dilemahkan yang berpotensi membahayakan bagi anak-anak dengan masalah gizi. [8]
Berdasarkan  studi  Zufferey et al ., [9] dengan  makin  bertambahnya umur,  terjadi  pergeseran  peningkatan produksi  limfosit  T.  Saat  umur  awal divaksinasi, limfosit yang banyak adalah sel T CD4+. Namun, seiring berjalannya waktu, konsentrasi sel T CD4+ menurun dan produksi sel T CD8+ meningkat. Hal ini justru menurunkan efek proteksi BCG karena  respons  imun  sel  T  CD8+ terhadap  antigen  MTB  tidak  begitu  kuat dibanding sel T CD4+. [9] Pada  saat  ini,  salah  satu pengembangan  vaksin  untuk  TBC  yaitu vaksin  DNA.  Penelitian  yang  pernah dilakukan  mengenai  vaksin  DNA  yaitu vaksin DNA yang mengkode Mycobacterium  leprae  protein  heat- shock 65  kDa  (DNA  hsp65)  yang  telah terbukti protektif terhadap Mycobacterium  Tuberculosis secara  in vivo  pada  hewan  coba. [5] Selain  efek preventif,  vaksin  DNA  hsp65  juga memiliki  efek  kuratif,  sehingga  dapat digunakan untuk menyembuhkan penyakit  TBC. [10] Namun  terapi  tunggal kurang memberikan hasil yang
maksimal  untuk  proteksi  sehingga  lebih disarankan  untuk  terapi  kombinasi.
Santos et al ., [8] mengombinasikan vaksin hsp65 dengan KLK, dan hasilnya membuktikan  bahwa  kombinasi  vaksin hsp65  dan  KLK  memiliki  efikasi  lebih tinggi. [8] Permasalahan yang lain mengenai  penggunaan  vaksin  adalah perlunya  vaksinasi  berulang  karena perlindungan vaksin tidak dapat
bertahan  lama  serta  perlunya  biaya yang  besar  untuk  vaksin  berulang terutama  di  negara  berkembang.  Solusi terhadap  permasalahan  tersebut  dapat diatasi dengan penggunaan vaksin yang berbasis  nanopartikel  PLGA  sehingga dosis, ketahanan vaksin dan penggunaanya  dapat  lebih  sederhana. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa nanopartikel polylactic polyglycolic  acid (PLGA)  terbukti  dapat mengantarkan  antigen  TBC  menuju  ke makrofag alveolar secara utuh. [11] Selain itu,  injeksi  suatu  antigen  dengan  PLGA dengan  dosis  tunggal  saja  sudah  dapat memicu respons imum secara optimal. [12] Oleh karena itu tujuan dalam literature review ini yaitu ingin membahas  mengenai  mekanisme  kerja vaksin DNA hsp65 dengan adjuvan KLK
berbasis nanopartikel PLGA untuk perlindungan terhadap infeksi TBC.
2.  METODE Metode  yang  digunakan  dalam penyusunan literature review ini dilakukan  dengan  pencarian  literatur melalui penelusuran menggunakan pencarian online dengan  instrumen Google Scholar, Proquest, Sciencedirect,  PubMed,  WHO,  dan Kemenkes.  Kata  kunci  yang  digunakan adalah mycobacterium tuberculosis, vaksin,  hsp65,  KLK,  dan  nanopartikel PLGA  dengan  publikasi  bahasa  Inggris dan  Indonesia  dalam  rentang  tahun 2010-2021. Dari hasil pencarian , didapat  sebanyak  735  jurnal  yang sesuai  kata  kunci  pencarian  tersebut dilakukan skrining berdasarkan beberapa  kriteria  inklusi  dan  kriteria eksklusi.  Kriteria  inklusi  untuk  pemilihan artikel yang relevan antara lain: 1) artikel asli yang ditulis dalam bahasa inggris, 2) penelitian
eksperimental, 3)
penggunaan  nanopartikel  PLGA,  4) vaksin  DNA  hsp65,  dan  5) adjuvant vaksin  berupa  KLK.  Sedangkan  untuk kriteria  eksklusi  antara  lain:  1)  abstrak dari sebuah artikel, 2) review artikel dan buku,  3)  penelitian  observasional,  4) jurnal  yang  duplikasi,  dan  5)  tidak tersedia  artikel full  text .  Sebanyak  735 jurnal tersebut setelah dilakukan skrining  berdasarkan  judul  didapatkan hasil  606  jurnal  dieksklusi  karena  tidak tersedia full text dan tidak sesuai kriteria inklusi.  Penilaian  kelayakan  terhadap 129 jurnal full text dilakukan, jurnal yang duplikasi,  bukan  artikel  asli,  dan  tidak sesuai  dengan  topik  bahasan  dilakukan eksklusi  sebanyak  103  jurnal.  Sehingga diperoleh  hasil  akhir  17  jurnal full  text yang  memenuhi  kriteria  inklusi  dan eksklusi  serta  dianggap  valid  dan reliabel.  Data  yang  telah  terkumpul dianalisis  secara  ilmiah  dan  sistematis. Teknik  analisis  data  yang  digunakan yaitu deskriptif dan argumentative.
Gambar 1 . Diagram Alur Review Jurnal

## 3.  HASIL DAN PEMBAHASAN
Vaksin hsp65 dan Cara Kerjanya Heat shock protein (hsp) merupakan  jenis  protein  yang  memiliki fungsi untuk meregulasi protein fungsional dalam respon terhadap stres, hipoksia,  toksin,  inflamasi  dan  panas. Hsp  dapat  memicu antigen  presenting cell (APC)  untuk  bekerja,  sehingga muncul  respons  imun  adaptif.  Hsp65 merupakan salah satu antigen hsp pada bakteri MTB yang paling banyak diekspresikan.  Peran  hsp65  adalah sebagai  protein  yang  mengaktivasi monosit  saat  terjadi  infeksi  MTB, sehingga  dapat  meningkatkan  produksi TNF, IL-6 dan IL-8 yang berfungsi dalam respon  imun  spesifik  yang  dimediasi oleh sel limfosit T. [5] Pada  penelitian  Santos et  al [8] , mengenai  respon  imun  terhadap  vaksin hsp65  memberikan  hasil  peningkatan antibodi  IgG1  dan  IgG2  setelah  30  dan 90  hari  diimunisasi  baik  oleh  vaksin tunggal  hsp65  atau  vaksin  hsp65  yang dikombinasikan  dengan  adjuvan  KLK. [8] Wowk et al . [13] juga melakukan penelitan mengenai  respon  imun  individu  sehat dan pasien TBC terhadap antigen hsp65 dan  didapatkan  hasil  yang  signfikan terhadap  peningkatan  produksi  CD8+, CD4+  dan  IFN- γ. [13] Penelitian  pada hewan  percobaan  untuk  melihat  efikasi dari  vaksin  DNA  hsp65  tunggal  dan vaksin  hsp65+IL-2  memberikan  hasil yang  signifikan  terhadap  peningkatan jumlah  CD4+,  CD8+,  IL-2  dan  IFN- γ dibandingkan vaksin BCG. [10]
Gambar 2. Jumlah Produksi IFN- γ dan IL-2 pada Tikus Setelah 72 Jam
Divaksinasi. [10]
Vaksin  DNA  hsp65  bekerja dengan  cara  mengekpresikan  protein hsp65 yang akan meningkatkan produksi sel T, CD4+ dan CD8+ sebagai bentuk  pertahanan  adaptif.  Penelitian vaksin hsp65+IL2 dan BCG pada hewan coba  menunjukan  perbedaan  signifikan terhadap produksi sitokin IFN- γ dan IL-2 dibandingkan  dengan  respon  imun terhadap  vaksin  BCG  tunggal  ( Tabel 1 ). [10] Peningkatan  jumlah  sitokin  IFN- γ dan  IL-2  akan  merangsang  aktivasi  dan poliferasi  sel  T  CD4+  dan  CD8+  yang berperan  penting  sebagai  respon  imun terhadap MTB.
Tabel 1 . Kadar Sel T CD4+ dan CD8+ pada Tikus Setelah Divaksinasi. [10] Grup CD4 (%) CD8(%) BCG 26.52±1.30 13.51±0.65 HSP65-IL2- DNA 25.36±0.88 19.64±1.01 HSP65-DNA 22.08±1.03 12.22±0.69 Selain berfungsi untuk
mencegah  penyakit  TBC,  penelitian Changhong et  al. [10] juga  membuktikan bahwa vaksin hsp65 juga dapat berfungsi sebagai terapi kuratif terhadap penyakit  TBC.  Pada  penelitian  tersebut, tikus yang telah terinfeksi MTB diinjeksikan  dengan  vaksin  hsp65  dan kemudian  kadar  bakteri  dalam  tubuh tikus tersebut diukur. Hasilnya menunjukkan  bahwa  terjadi  penurunan 735  jurnal  ditemukan sesuai kata kunci dan dilakukan skrining 606  jurnal  dieksklusi karena  tidak  tersedia full  text  dan  tidak sesuai kriteria inklusi 129  jurnal  full  text dilakukan penilaian kelayakan 103  jurnal  full  text dieksklusi karena bukan  artikel  asli  dan tidak sesuai topik
17 jurnal  full text dilakukan review
signifikan  kadar  bakteri  MTB  pada  tikus yang  diinjeksi  dengan  vaksin  hsp65 ( Tabel 2 ).
Tabel 2. Kadar Bakteri MTB pada Tikus yang Terinfeksi MTB Setelah Divaksinasi dengan Vaksin hsp65. [10] Grup Jumlah biakan koloni M. tuberculosis (log 10 ±S.D.) Limfa Paru-paru Cairan salin 5.44±0.23 5.94±0.19 BCG 4.30±0.38 4.44±0.25 HSP65-IL2- DNA 4.35±0.28 4.70±0.20 HSP65- DNA 4.88±0.30 4.82±0.25 Penelitian-penelitian  yang  telah dilakukan sebelumnya telah membuktikan bahwa vaksin atau antigen hsp65 merangsang peningkatan jumlah  produksi  sitokin  dan  antibodi sebagai  respon  imun  terhadap  infeksi TBC.  Hal  ini  menunjukkan  potensi hsp65  sebagai  vaksin  terhadap  MTB sangat  besar  terutama  karena  sifatnya yang sangat antigenik.
3.1   KLK Meningkatkan Efek Proteksi Vaksin DNA Hsp65 Human kallikrein-related peptidase (KLK),  peptida  poli-kationik
sintesis,  merupakan  bagian  dari serine protease yang  berperan  dalam  jalur proteolitik  dan  mengontrol  kadar  protein dalam  fisiologi  baik  dalam  kondisi normal maupun beberapa kondisi patologis. [14,15] Rangsangan  dan  inhibisi pada KLK dapat memicu respon inflamasi  serta  berpengaruh  terhadap fenotip neoplastik melalui regulasi
beberapa proses seluler, seperti proliferasi, survival , migrasi, dan invasi. [14] Selain  itu,  KLK  juga  memiliki
sifat imunomodulator  yaitu  dengan mengaktivasi  neutrofil  dan  monosit
U937 untuk menghasilkan anion superoksida melalui pengikatan calreticulin di permukaan sel. Kombinasi KLK dengan antigen akan meningkatkan transpor  antigen  ke  sel-sel  APC  dan memicu  respon  imun  spesifik  antigen Th2.  Ketika  KLK  bercampur  dengan antigen,  KLK  yang  diberikan  secara tunggal merupakan adjuvan yang buruk,
sehingga  lebih  baik  dikombinasikan dengan zat lain. [15]
Santos et al. [8] melakukan penelitian  mengenai  hubungan  KLK pada  nanopartikel  hsp65  rekombinan (rhsp65) yang bertujuan untuk meningkatkan respon imun yang
ditimbulkan  oleh  vaksin  subunit. [8] Tikus divaksinasi  melalui  rute  intramuskular dengan  dosis  tunggal  dari  nanopartikel rhsp65,  rhsp65  +  KLK  atau  rhsp65  + CPG  dan  kemudian  setelah  30  hari divaksinasi, tikus tersebut diinfeksi dengan M.  tuberculosis melalui  rute intratekal. Kemudian dilakukan
pemeriksaa  kadar Colony  Forming  Unit (CFU)  setelah  30  hari  infeksi.  Hasil penelitian  histopatologis  paru  yang diambil  dari  tikus  yang  telah  divaksin dan telah terinfeksi dengan M. tuberculosis menunjukkan  bahwa hanya tikus  yang  mendapat  vaksin  hsp65  + KLK  yang  terlindungi  dari  infeksi M. tuberculosis .  Hal  tersebut  dibuktikan dengan  penurunan  sekitar  2-log  pada bacterial load . [8]
Hasil analisis histopatologis paru  pun  sesuai  dengan  jumlah  CFU. Kerusakan paru paling sedikit ditemukan pada  kelompok  dengan  pemberian vaksinasi hsp65 + KLK. Gambaran yang terlihat  yaitu  struktur  mirip  granuloma dimana  terdapat  limfosit,  makrofag, beberapa  neutrofil,  serta  kadar  basil terendah. Area inflamasi pada kelompok hsp65  +  KLK  pun  berkurang  jika dibandingkan  dengan  kelompok  lain. Ditemukan jumlah basil yang tinggi pada area  inflamasi  di  kelompok  lain,  hal tersebut  berbeda  dengan  kelompok hsp65+. Hasil penelitian tersebut
menunjukkan  bahwa  rHsp65  bersama dengan adjuvan KLK yang di enkapsulasi  pada  nanopartikel  PLGA memiliki  kemampuan  proteksi  terhadap strain M. tuberculosis H37Rv. [8]
Pemberian vaksin  dengan  dosis tunggal  dari  nanopartikel  akan  memicu respon  imun  humoral  dan  selular. Nanopartikel dengan rHsp65 tidak
menginduksi  respon  Th1  dan  tidak mampu  mengurangi bacil  load .  Namun, formulasi  vaksin  Hsp65  +  KLK  dapat memicu  respon  Th1  dan  produksi  IL-10 tertinggi  diantara  vaksin  yang  diuji. Terjadi  penurunan  jumlah  CFU  yang signifikan  dan  kerusakan  parenkim  paru yang minimal setelah infeksi M.
tuberculosis.  Alasan  hal  tersebut  terjadi diperkirakan  karena  tipe  sel  yang berkaitan  dengan  proses  formulasi vaksin. Kemampuan
tubuh juga
berperan  terhadap  respon  imun  yang dipicu  hsp65  +  KLK,  yaitu  dengan mengaktifkan  mekanisme  antibakterial sehingga mengakibatkan penurunan bacil  load dan  perbaikan  jaringan  paru.
Respon  Th1  mengakibatkan  terjadinya inflamasi  berlebihan  dan  perburukan kerusakan  jaringan  karena  rendahnya produksi  IL-10,  yang  kemudian  akan menginduksi  terjadinya  nekrosis  pada sel  yang  terinfeksi  dalam  granuloma.
Proses tersebut mengakibatkan penyebaran mycobacterial karena pecahnya  membran  granuloma,  lalu terjadi  pelepasan  enzim  lisosom  dan adanya sitokin lain. [8]
3.2 Nanopartikel PLGA sebagai Carrier Vaksin DNA hsp65 dan KLK Kebutuhan  untuk  meningkatkan efisiensi vaksin DNA hsp65+KLK
dengan  cara  menurunkan  dosisnya menjadi dosis tunggal dilakukan dengan menggunakan
nanopartikel biodegradable  Poly  (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)  sebagai  sistem  pembawa antigen.  Nanopartikel  adalah  struktur padat  dan  bulat  dengan  ukuran  sekitar 100  nm  dan  dibuat  dari  polimer  alami atau  sintetis.  Berbagai  macam  obat dapat  diberikan  dengan  menggunakan nanopartikel  seperti  obat  kecil  hidrofilik, obat kecil hidrofobik, vaksin dan makromolekul  biologis. [16] Sedangkan
PLGA  adalah  salah  satu  nanopartikel sintesis yang merupakan polimer biodegradable yang  paling  berhasil digunakan karena
hidrolisisnya menghasilkankan  monomer  metabolit, asam  laktat  dan  asam  glikolat ( Gambar 4 ). Penggunaan PLGA untuk pemberian vaksin,  obat,  atau  aplikasi  biomaterial
memiliki  toksisitas  sistemik  minimal karena  mudah  dimetabolisme  secara endogen  oleh  tubuh  melalui  siklus Krebs. [17]
Secara umum nanopartikel PLGA  memiliki  beberapa  keunggulan antara  lain  dapat  melindungi  obat  dari degradasi dan meningkatkan
stabilitasnya,  dapat  meningkatkan  profil farmakokinetik dan farmakodinamik, dapat  menembus  jaringan  yang  spesifik melalui  penestrasi  pada  endotelium kanker  dan  jaringan  yang  meradang atau melalui reseptor yang diekspresikan  secara  berlebihan  oleh sel target. Nanopartikel PLGA
memungkinkan
pengiriman obat, protein,  peptida  atau  asam  nukleat tertentu  ke  jaringan  target  mereka. PLGA juga dapat meningkatkan efektivitas pengobatan
karena
pelepasan  berkelanjutan  dari  agen terapeutik.  Keuntungan  utama  lain  dari PLGA  dibandingkan  polimer  lain  adalah bahwa  PLGA  disetujui  oleh Food  and Drug Administration (FDA) dan European  Medicine  Agency (EMA) dalam  berbagai  sistem  pengiriman  obat pada manusia sehingga dapat digunakan  lebih  lanjut  pada  penelitian klinis  untuk  terapi  preventif  dan  kuratif baru di masa depan. [18]
Polimer  PLGA  memiliki  berat molekul  dan  komposisi  kopolimer  yang berbeda  yang  menyebabkan  waktu degradasi  PLGA  dapat  bervariasi  dari beberapa bulan hingga beberapa tahun. Bentuk-bentuk
PLGA biasanya diidentifikasi  oleh  rasio  monomer  yang digunakan. Misalnya, PLGA 50:50 menjelaskan  suatu  kopolimer  yang komposisinya  adalah  50%  asam  laktat dan  50%  asam  glikolat. [19] Nanopartikel PLGA sebagian diinternalisasi dalam sel melalui  fase  cairan  pinositosis  dan  juga melalui  endositosis  yang  dimediasi clathrin.  Nanopartikel  PLGA  dengan cepat  keluar  dari  endolisosom  dan memasuki  sitoplasma  dalam  waktu  10 menit  ( Gambar  2 ). [20] Sejumlah  antigen seperti  protein,  peptida,  lipopeptida, virus  atau  DNA  plasmid  telah  berhasil diformulasikan dalam nanopartikel
PLGA. [21, 22] Beberapa penelitian telah menunjukkan  bahwa  pengiriman  dalam formulasi nanopartikel dapat
meningkatkan  penyerapan  antigen  atau
adjuvan oleh APC dan dikaitkan dengan respon  imun  yang  lebih  baik  daripada tanpa  dikemas  dalam  nanopartikel. 23 Selain  itu,  dalam  vaksin  terenkapsulasi nanopartikel  PLGA  pelepasan  antigen dalam  waktu  lama  dapat  memberikan respons  imun  yang  lebih  efektif.  Hal tersebut  juga  dapat  menghindari  risiko toleransi  dan  menggantikan  kebutuhan beberapa vaksinasi booster untuk meningkatakan  imunitas.  Nanopartikel PLGA  mampu  memberikan  pelepasan antigen  yang  terperangkap  in  vitro secara  terus-menerus  untuk  jangka waktu yang lama, [24] juga dapat berfungsi  sebagai  sistem  pengiriman yang  merangkum  antigen,  kombinasi antigen  yang  berbeda,  atau  kombinasi antigen dan adjuvan dalam partikel yang sama.  Kombinasi  antigen  dan  adjuvan harus  diberikan  bersama  dalam  partikel yang  sama  untuk  diinternalisasi  secara bersamaan.  Selain  itu,  nanopartikel PLGA  yang  mengandung  antigen  dan adjuvan  dosis  sangat  rendah  mampu memicu  respons  sel  T  yang  kuat. Penggunaan  dosis  yang  lebih  rendah dari
molekul-molekul
ini akan menguntungkan,  tidak  hanya  untuk meminimalkan  potensi  efek  samping tetapi juga dari sudut pandang ekonomi. [25]
Nanopartikel  PLGA  digunakan sebagai pembawa vaksin dapat memberikan  antigen  eksogen  yang dipresentasikan  secara  silang  melalui kompleks MHC I ke sel CD8+. Presentasi  antigen  melalui  kompleks MHC  I  sangat  penting  untuk  kontrol penyakit  menular  karena  merupakan jalur  yang  dapat  merangsang  sel  T CD8+ untuk memperoleh fenotipe sitotoksik.  Nanopartikel  PLGA  memiliki kemampuan  khusus  untuk  mencapai jalur MHC I setelah internalisasi oleh sel dendritik (DC). [26]
Pada  penelitian  Santos  S.A et al . [8] vaksin DNA hsp65+KLK dienkapsulasi dalam nanopartikel biodegradable PLGA  dengan  teknik emulsi  ganda  dan  penguapan  pelarut.
Secara singkat, 20 ml larutan diklorometana  yang  mengandung  200 mg  polimer  PLGA  50:50  diemulsi dengan  0,2  ml  fase  encer  inner  yang mengandung 3 mg rHsp65 yang digabungkan  dengan  2  mg  adjuvan KLK.  Homogenizer  T25  Ultraturrax
digunakan  untuk  menghasilkan  emulsi primer water-in-oil .  Emulsi  ini  kemudian dicampur  dengan  100  ml  fase  encer eksternal  yang  mengandung  3%  poli- (vinil  alkohol)  Mowiol  40-88  sebagai surfaktan  untuk  membentuk  emulsi water-in-oil-in-water yang  stabil.  Emulsi diaduk selama 6 jam dengan homogenizer eurostar agar terjadi penguapan pelarut. Nanopartikel dikumpulkan  dengan  sentrifugasi  dan dicuci  tiga  kali  dengan  air  steril, dibekukan  dan  disimpan  pada  suhu 4°C. [8]
Tabel 3 . Karakterisasi Nanopartikel (MS) / Nanopartikel. [8] Formulasi Encapsula -tion rate (µg/mg) Diameter rata-rata (µm) Kadar endotoksin (UE/mg) MS-empty - 4,78 0,111 MS-rhsp65 1 3,89 0,304 MS- rhsp65+KLK 0,97 7,07 0,300 Dalam penelitian Santos S. A et al ., [8] vaksin DNA hsp65+KLK dirancang memiliki  diameter  kurang  dari  10  μm untuk  memungkinkan  pengambilan  oleh APC.  Kombinasi  KLK  dengan  rhsp65 dalam  nanopartikel  PLGA  memberikan ukuran  partikel  terbesar.  Formulasi nanopartikel  PLGA  juga  diuji  untuk aktivitas  endotoksin  menggunakan  uji Limulus Amebocyte Lysate (LAL). Nanopartikel PLGA disuspensikan
kembali  dalam Phosphate  Buffer  Saline
(PBS)  dan  suspensi  vortex  sampai homogenisasi  lengkap.  Dan  hasilnya menunjukkan bahwa
konsentrasi
endotoksin  kurang  dari  0,4  EU/mg dalam  semua  formulasi  nanopartikel. Menurut European Pharmacopoeia, tingkat  keamanan  untuk  pemberian endovena  adalah  5  EU/kg/jam,  setara dengan  0,1  EU  per  mouse  (20  g)  per jam.  Dengan  demikian,  hewan  yang diimunisasi dengan 5 mg setiap formulasi  menerima  kurang  dari  2  EU endotoksin  yang  dilepaskan  selama degradasi nanopartikel dengan pelepasan  protein  melalui  desorpsi  dan difusi.  Profil  rilis  in  vitro  rhsp65  yang dienkapsulasi  dalam  nanopartikel  PLGA dievaluasi  selama  lebih  dari  30  hari. Sebagian besar protein yang terperangkap  dilepaskan  lebih  awal: 20% di hari pertama, sekitar 40% di hari kedua  dan  sisa  protein  dilepaskan
secara  menurun  hingga  30  hari.  Oleh karena  itu,  kadar  endotoksin  yang dilepaskan selama degradasi nanopartikel berada pada tingkat
kisaran  yang  direkomendasikan  untuk semua  formulasi  yang  digunakan  untuk imunisasi. [8] Pada  penelitian  Santos  S.A et al ., [8] tikus  BALB/c  dewasa  muda menerima  injeksi  intramuskular  tunggal 2,5  mg  dari  salah  satu  nanopartikel berbeda yang mengandung rhsp65 saja (MS-hsp65) atau dalam kombinasi dengan  KLK  (MS-rhsp65  +  KLK)  pada 50  μL  saline  di  setiap  paha  depan. Kelompok  hewan  kontrol  tambahan menerima  nanopartikel  kosong  (MS), kemudian  tikus  diberikan  10 5 CFU  M. tuberculosis H37Rv melalui rute intratrakea.  Hasil  dari  analisis  statistik yang  ditentukan  oleh  analisis  satu  arah dari  uji  varians  dan  post  test  Dunnett menunjukkan  hasil  yang  signifikan  yaitu p<0,05,  yang  berarti  formulasi  vaksin DNA hsp65 + KLK terenkapsulasi PLGA menginduksi  respon  tipe  Th1  dan produksi  IL-10  tertinggi  di  antara  vaksin lain  yang  diuji  dan  tikus  dari  kelompok ini menunjukkan penurunan jumlah CFU yang signifikan dan kerusakan parenkim paru  minimal  setelah  diinfeksi  M. tuberculosis. [8]

## 4. KESIMPULAN
Kombinasi  vaksin  DNA  hsp65 dan  KLK  dapat  memicu  respons  imun spesifik  terhadap  bakteri  MTB.  Vaksin DNA  hsp65  dapat  memicu  produksi sitokin,  seperti  IFN- γ  dan  IL-2,  yang berperan  penting  dalam  aktivasi  dan proliferasi  sel  T  CD4+  sebagai  respons imun terhadap MTB.  Selain itu, aktivitas sel  T  CD4+  dan  CD8+  juga  meningkat setelah  diberi  vaksin  DNA  hsp65. Peningkatan  produksi  IFN- γ,  IL-2,  sel  T CD4+  dan  CD8+  pada  vaksin  hsp65 lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  BCG. Selain berfungsi untuk mencegah penyakit  TBC,  vaksin  hsp65  juga  dapat berfungsi sebagai terapi kuratif terhadap penyakit TBC. Terjadi penurunan signifikan  kadar  bakteri  MTB  pada  tikus yang  diinjeksi  dengan  vaksin  hsp65 dibandingkan dengan vaksin BCG. Untuk  memaksimalkan  efikasi vaksin DNA hsp65 dibutuhkan
tambahan  adjuvant.  KLK  memberikan solusi bagi keterbatasan tersebut.
Histopatologis  paru  yang  diambil  dari tikus  yang  telah  divaksin  dan  telah terinfeksi dengan M. tuberculosis menunjukkan  bahwa  hanya  tikus  yang mendapat  vaksin  hsp65  +  KLK  yang terlindungi  dari  infeksi M.  tuberculosis . Kerusakan  paru  dan  area  inflamasi paling  sedikit  juga  ditemukan  pada kelompok  dengan  pemberian  vaksinasi hsp65  +  KLK.  Selain  itu,  formulasi vaksin  hsp65  +  KLK  dapat  memicu respon  Th1  dan  produksi  IL-10  tertinggi diantara vaksin lain yang diuji.
Kebutuhan  untuk  meningkatkan efisiensi vaksin DNA hsp65+KLK
dengan  cara  menurunkan  dosisnya menjadi dosis tunggal dilakukan dengan menggunakan nanopartikel
biodegradable  Poly  (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)  sebagai  sistem  pembawa antigen.  PLGA  disetujui  oleh  FDA  dan EMA dalam berbagai sistem pengiriman obat  pada  manusia  sehingga  dapat digunakan  lebih  lanjut  pada  penelitian klinis  untuk  terapi  preventif  dan  kuratif baru di masa depan.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Kemenkes  RI .  Infodatin  Tuberculosis Pusat Data dan Informasi Kementerian  Kesehatan  Republik Indonesia . 2018
<https://pusdatin.kemkes.go.id/article /view/18101500001/infodatin- tuberkulosis-2018.html> 2.  WHO. Bending  The  Curve  Ending TBC.  World  Health  Organization Regional  Office  for  South-east  Asia . 2016
< ht tps://apps.who.int/iris/handle/106
65/258693>
3.  Prasad  R,  Srivastava  DK. Multi  drug and  extensively  drug-resistant  TBC (M/XDR-TBC)  management:  Current issues.  Clin  Epidemiol  Glob  Health . 2013;1(3), 124 –8
4.  WHO.  Global  Tuberculosis  Report 2015. Geneva. 2015
< h ttps://apps.who.int/iris/handle/1066
5/191102>
5.  Surbakti,  C.  A.,  Novitawati,  S.,  & Billy,  M. Inovasi  Vaksin  DNA  Heat
Shock  Protein  65  (hsp65)  dengan Ubiquitin Terenkapsulasi Nanopartikel  PLGA  sebagai  Terapi Preventif dan Kuratif
Tuberkulosis . Cermin Dunia Kedokteran , 2016; 43 (3), 230-34. 6.  Riani,  R.  E.  S.,  &  Machmud,  P.  B. Kasus  Kontrol  Hubungan  Imunisasi BCG  dengan  kejadian  TBC  Paru pada  anak  tahun  2015-2016. Sari Pediatri , 2018; 19 (6), 321-27.
7.  Barreto  ML,  Pereira  SM,  Pilger  D, Cruz AA, Cunha SS, Sant’Anna et al . Evidence  of  an  effect  of  BCG revaccination on incidence of tuberculosis  in  school-aged  children in  Brazil:  second  report  of  the  BCG- REVAC cluster-randomised trial . Vaccine 2011; 29, 4875-7.
8.  Santos  S.A et  al .  A  subunit  vaccine based on biodegradable microspheres carrying rHsp65
protein  and  KLK  protects  BALB/c mice  against  tuberculosis  infection. Human  Vaccines.  2010;  6  (12), 1047-53.
9.  Zufferey C, Germano S, Dutta B, Ritz N,  Curtis  N. The  contribution  of  non- conventional  T  cells  and  NK  cells  in the mycobacterial- specific IFNγ response  in  bacille  calmette-guerin
(BCG)- immunized
infants . PLOSOne. 2013; 8(10).
10. Changhong  S, Hai Z,  Limei W, Jiaze A,  Li  X, Tingfen Z, et al . Therapeutic efficacy  of  a  tuberculosis  DNA vaccine  encoding  heat  shock  protein 65  of  Mycobacterium  tuberculosis and  the  human  interleukin  2  fusion gene . Tuberculosis. 2009; 89(1), 54 – 61.
11. Hirota  K,  Hasegawa  T,  Nakajima  T, Inagawa  H,  Kohchi  C,  Soma  G-I, et al . Delivery of rifampicin –PLGA microspheres into alveolar macrophages is promising for treatment of tuberculosis . J
Controlled  Release.  2010;  142(3), 339 –46.
12. Kalluru  R,  Fenaroli  F,  Westmoreland D,  Ulanova  L,  Maleki  A,  Roos  N, et al .
Poly(lactide-co-glycolide)- rifampicin  nanoparticles  efficiently clear  Mycobacterium  bovis  BCG infection in macrophages and remain membrane-bound in phago-
lysosomes . J Cell Sci. 2013; 126(14), 3043 –54.
13. Wowk, P. F., Franco, L. H., Fonseca, D. M. D., Paula, M. O., Vianna, É. D. S.  O.,  Wendling,  A.  P.,  &  Vinhas,  S. A. Mycobacterial  Hsp65  antigen
upregulates  the  cellular  immune response of healthy individuals compared with tuberculosis patients . Human vaccines & immunotherapeutics ,2017; 13 (5), 1040-50. 14. Stefanini AC, da Cunha BR, Henrique  T,  Tajara  EH. Involvement of  Kallikrein-Related  Peptidases  in Normal and Pathologic Processes . Dis Markers. 2015:946572.
doi:10.1155/2015/946572
15. Chikh  G,  Luu  R,  Patel  S,  Davis  HL, Weeratna RD. Effects of KLK Peptide on  Adjuvanticity  of  Different  ODN Sequences. Vaccines  (Basel) .  2016; 4(2), 14. doi:10.3390/vaccines4020014 16. H. Hillaireau, P. Couvreur. Nanocarriers'  entry  into  the  cell: relevance to drug  delivery . Cell. Mol.
Life Sci. 2009; 66, 2873 –2896
17. A.  Kumari,  S.K.  Yadav,  S.C.  Yadav, Biodegradable polymeric nanoparticles  based  drug  delivery systems, Colloids Surf. B Biointerfaces . 2010; 75, 1 –18. 18. Danhier et al . PLGA-based nanoparticles: An overview of biomedical  applications.  Journal  of Controlled Release . 2012; 161, 505 – 522 19. J.K. Vasir, V. Labhasetwar, Biodegradable nanoparticles for cytosolic  delivery  of  therapeutics . Adv. Drug Deliv. Rev. 2010; 59, 718 – 728. 20. S.  Acharya,  S.K.  Sahoo, PLGA nanoparticles containing various anticancer agents and tumour delivery  by  EPR  effect ,  Adv.  Drug Deliv. Rev. 2011; 63, 170 –183
21. C. Clawson, C.T. Huang,  D. Futalan, D.M.  Seible,  R.  Saenz,  M.  Larsson, W.  Ma,  B.  Minev,  F.  Zhang,  M. Ozkan,  C.  Ozkan,  S.  Esener,  D. Messmer, Delivery  of  a  peptide  via poly(D,L-lactic-co-glycolic) acid nanoparticles  enhances  its  dendritic cellstimulatory capacity .
Nanomedicine. 2010; 6, 651 –661.
22. J.  Tian,  J.  Yu, Poly(lactic-co-glycolic acid)  nanoparticles  as  candidate DNA vaccine carrier for oral immunization  of  Japanese  flounder (Paralichthys olivaceus) against lymphocystis  disease  virus .  Fish
Shellfish  Immunol.  2011;  30,  109 – 117.
23. B.  Slutter,  S.  Bal,  C.  Keijzer,  R. Mallants,  N.  Hagenaars,  I.  Que,  E. Kaijzel,  W.  van  Eden,  P.  Augustijns, C. Lowik, J. Bouwstra,  F.  Broere, W. Jiskoot, Nasal  vaccination  with  N- trimethyl  chitosan  and  PLGA  based nanoparticles: nanoparticle characteristics  determine  quality  and strength  of  the  antibody  response  in mice against the encapsulated antigen .  Vaccine.  2010;  28,  6282 –
6291
24. C. Clawson, C.T. Huang,  D. Futalan, D.M.  Seible,  R.  Saenz,  M.  Larsson,
W.  Ma,  B.  Minev,  F.  Zhang,  M. Ozkan,  C.  Ozkan,  S.  Esener,  D.
Messmer, Delivery  of  a  peptide  via poly(D,L-lactic-co-glycolic) acid nanoparticles  enhances  its  dendritic cellstimulatory capacity . Nanomedicine. 2010; 6, 651 –661.
25. R.  Brunner,  E.  Jensen-Jarolim,  I. Pali-Scholl, The  ABC  of  clinical  and experimental adjuvants —a brief overview .  Immunol.  Lett.  2010;  128, 29 –35.
26. R. Arens, S.P. Schoenberger,
Plasticity  in  programming  of  effector and  memory  CD8  T-cell  formation . Immunol. Rev. 2010; 235, 190 –205.