ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (2) (2011) : 58 – 63

## Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi
Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Uji Antikanker Isolat Bioaktif L- Asparaginase dari Kunyit Putih ( Curcuma mangga Val.) terhadap Sel Kanker Serviks
Citrawati Octavia Suprobo a , Suprihati b , Wuryanti a*
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang b Otolaryngology Department, Faculty of Medicine, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
Art ic le   Info

## Ab s t rac t
Keywords: L- asparaginase , Curcuma mangga
Val., anticancer, Hela cells
White turmeric ( Curcuma mangga Val.) Is one of the potential sources of L- asparaginase as an anticancer bioactive. The purpose of this study was to determine the value of LC 50 and anticancer potential of L- asparaginase enzyme from white turmeric on cervical cancer cell culture  (Hela).  The  L- asparaginase enzyme  was  isolated  by  extraction  method  then purified by fractionation and dialysis. L- asparaginase enzyme activity test was performed by  Nessler method  while  protein  content  test  with  Lowry  method.  Specific  activity  was determined through the ratio of activity units to protein content. The enzyme fraction of L- asparaginase having the highest specific activity was tested for its cytotoxicity against Hela cells by MTT method
(3- (4,5-dimethyltiazole-2-yl) -2,5-
diphenyltetrazoliumbromide) and its anticancer potential was determined by calculating the  LC 50 value.  The  results  showed  that  L- asparaginase enzyme  could  be  isolated  and purified from white turmeric with the weight of enzyme fraction 5 which is 0.0097 g of 1000  g  fresh  material.  The  highest  specific  activity  was  found  in  fraction  5  of  247.925 units/mg  protein.  The  cytotoxicity  test  on  Hela  cells  showed  a  LC 50 value  of  122.462 μg/mL. It can be concluded that L - asparaginase enzyme fraction 5 of white turmeric was able  to  inhibit  Hela  cell  growth,  but  less  potential  as  anticancer  agent  based  on  NCI (National Cancer Institute) standard.

## Ab s t rak
Kata kunci: L- asparaginase ,
Curcuma mangga
Val., antikanker, sel Hela
Kunyit putih ( Curcuma mangga Val.) merupakan salah satu sumber L- asparaginase yang berpotensi sebagai bioaktif antikanker. Tujuan penelitian ini  adalah untuk menentukan nilai LC 50 dan potensi antikanker enzim L- asparaginase dari kunyit putih pada kultur sel kanker serviks (Hela). Enzim L- asparaginase diisolasi dengan metode ekstraksi kemudian dimurnikan dengan fraksinasi dan dialisis. Uji aktivitas enzim L- asparaginase dilakukan dengan  metode  Nessler  sedangkan  uji  kadar  protein  dengan  metode  Lowry.  Aktivitas spesifik  ditentukan  melalui  perbandingan  unit  aktivitas  terhadap  kadar  protein.  Fraksi enzim  L- asparaginase yang  memiliki  aktivitas  spesifik  tertinggi  diuji  sitotoksisitasnya terhadap sel Hela dengan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazoliumbromida)  dan  potensi  antikankernya  ditentukan  dengan  menghitung nilai LC 50 . Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim L- asparaginase dapat diisolasi dan dimurnikan dari kunyit putih dengan berat enzim fraksi 5 yaitu 0,0097 g dari 1000 g bahan segar. Aktivitas spesifik tertinggi terdapat pada fraksi 5 sebesar 247,925 unit/mg protein. Uji  sitotoksisitas  pada  sel  Hela  menunjukkan  nilai  LC 50 sebesar  122,462  μg/mL .  Dapat disimpulkan bahwa enzim L- asparaginase fraksi 5 dari kunyit putih mampu menghambat pertumbuhan  sel  Hela,  namun  kurang  potensial  sebagai  agen  antikanker  berdasarkan standar NCI (National Cancer Institute).
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (2) (2011) : 58 – 63

## 1. Pendahuluan
Kanker  serviks  (leher  rahim)  diakibatkan  oleh pertumbuhan  sel-sel  kanker  yang  abnormal  [1], dilaporkan  menjadi  penyebab  utama  kematian  yang diakibatkan  oleh  kanker  pada  wanita  di  negara-negara berkembang  [2].  Berdasarkan  data Globocan dari  IARC ( International  Agency  for  Research  on  Cancer )  milik  WHO pada  tahun  2002  tercatat  40.000  kasus  baru  kanker serviks  dengan  angka  kematian  sekitar  22.000  pada wanita di Asia Tenggara. Indonesia menempati peringkat pertama  dengan  15.050  kasus  baru  dan  angka  kematian 7.566 jiwa dalam setahun.
Sebagian  besar  obat  antikanker  yang  digunakan dalam  kemoterapi  bersifat  toksik  tidak  hanya  terhadap sel  kanker  tetapi  juga  pada  sel  normal  sehingga  tidak hanya  mempengaruhi  perkembangan  sel  kanker,  tetapi juga  mengganggu  sistem  kekebalan  tubuh  dan  semakin memperburuk  kondisi  penderita  kanker  [3].  Efektifitas senyawa  bahan  alam  terhadap  sel  kanker  merupakan penelitian  yang  banyak  dilakukan  pada  berbagai  studi immunofarmakologi  dalam  rangka  penemuan  obat antikanker dengan  efek  samping  yang  rendah  terhadap sistem kekebalan tubuh [4].
Bahan  alam  mempunyai  peranan  yang  penting sebagai  sumber  agen  antikanker  yang  efektif  dan  salah satu  tanaman  yang  berpotensi  sebagai  bioaktif antikanker  adalah  kunyit  putih  ( Curcuma  mangga Val.) [5].  Penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa  kunyit putih  dapat  digunakan  sebagai  sumber  enzim  L- asparaginase ,  yang  berperan  dalam  bidang  medis misalnya  untuk  pengobatan  penyakit  pankreatitis  akut [6]  dan  kanker  seperti  leukemia  limfoblastik  akut  pada anak  [7],  dengan  cara  bekerja  menghambat  sintesis protein  sel  kanker  tanpa  merusak  sel  normal  [8].  L- asparaginase akan  mengkatalisis  reaksi  hidrolisis  L- asparagin  yang  merupakan  asam  amino  non-esensial untuk sintesis protein dan pertumbuhan sel, menjadi L- aspartat  dan  ammonia  [9],  sehingga  proses  sintesis protein  terganggu  dan  menghambat  pertumbuhan  sel kanker yang pada akhirnya mengakibatkan kematian sel kanker tersebut.
L- asparaginase yang  diisolasi  dan  dikarakterisasi dari  kunyit  putih  memiliki  kondisi  optimum  pada  suhu 37 o C,  pH  8,5  dan  waktu  inkubasi  30  menit  dengan aktivitas spesifik tertinggi terdapat pada fraksi 5 (tingkat kejenuhan  80%-100%).  Satu  unit  aktivitas  enzim  L- asparaginase dapat  didefinisikan  sebagai  banyaknya enzim  yang  dapat  membentuk  1  μmol  NH 4+ per  menit pada  kondisi  optimum  [10].  Menurut  penelitian Arpintasari dkk. [11], enzim  L- asparaginase fraksi  5  dari kunyit  putih  memiliki  nilai  LC 50 yaitu  11,437 µg/mL terhadap  sel  leukemia  tipe  K-562, sehingga  dinyatakan berpotensi sebagai agen antikanker berdasarkan standar NCI ( National Cancer Institute ) karena memiliki nilai LC 50 ≤ 20 µg/mL [12]. Berdasarkan hal tersebut, penelitian ini perlu  dilakukan  untuk  mengetahui  aktivitas  antikanker enzim  L- asparaginase kunyit  putih  terhadap  kultur  sel kanker serviks (sel Hela) dan dapat diketahui potensinya sebagai  agen  antikanker  pada  kanker  serviks  sehingga
dapat  bermanfaat  sebagai  salah  satu  upaya  pengobatan kanker serviks.
Informasi  mengenai  potensi  antikanker  enzim  L- asparaginase kunyit  putih  terhadap  kultur  sel  kanker serviks yang diperoleh melalui penelitian ini diharapkan bermanfaat  sebagai  dasar  penelitian  obat  antikanker yang selama ini masih merupakan obat langka dan mahal harganya serta dapat dijadikan dasar bagi pengembangan  formulasi  obat  yang  menggunakan bahan dasar tersebut.

## 2. Metode Penelitian

## Bahan dan Alat
Bahan-bahan  yang  digunakan  adalah  kunyit  putih ( Curcuma mangga Val.), tris-hidroksimetil-aminometan, L-asparagin  ( Merck ),  BSA  ( Bovine  Serum  Albumin ),  TCA ( Trichloracetic  acid )  ( Merck ), Folin-ciocalteau , (NH 4 ) 2 SO 4 , BaCl 2 , Na 2 CO 3 , NaOH, K-Na Tartrat, CuSO 4 , KI, HgI 2 , HCl, akuades, sel Hela, PBS ( Phosphate Buffer Saline ), tripsin, medium  RPMI  ( Roswell  Park  Memorial  Institute )  1640 (Sigma),  FBS  ( Fetal  Bovine  Serum )  10%  (Gibco),  reagen SDS ( Sodium Dodecyl Sulfate ) 10%, MTT.
Alat-alat  yang  digunakan  adalah  alat-alat  gelas laboratorium  yang  biasa  digunakan  untuk  analisis, mikropipet, membran selofan, tabung sentrifus (Nunc), sentrifugator  ( Centrific-228 ),  inkubator  ( Memmert ), blender  ( Philip ),  neraca  analitik  ( Kern  870 ),  pHmeter ( Orain-420A ), magnetic  stirer ( Thermolyne  Cimarec ), spektrofotometer UV-Vis ( Shimadzu ), freeze  dryer , laminar  air  flow  cabinet , microplate 96- wells (Nunc), mikroskop  flouresens  dan  ELISA  ( Enzyme  Linked Immunosorbent Assay ) Reader .

## Isolasi Enzim
Kunyit putih ( Curcuma mangga Val.) segar sebanyak 1000 g dipotong-potong kemudian ditambahkan 500 mL bufer tris-hidroksimetil-aminometan 0,2 M pH 8,6 dan diblender  selama  20  menit.  Campuran  kemudian dibiarkan  selama  1,5  jam  pada  suhu  5 o C  lalu  disaring. Filtrat kemudian disentrifugasi pada 3400 rpm selama 10 menit. Filtrat yang diperoleh disebut ekstrak kasar.

## Fraksinasi Enzim
Fraksinasi  enzim  dilakukan  dengan  menggunakan garam amonium sulfat secara bertingkat dengan tingkat kejenuhan 0-20% (F1), 20-40% (F2), 40-60% (F3), 60- 80% (F4) dan 80-100% (F5). Amonium sulfat ditimbang sesuai  fraksi  yang  dikehendaki,  lalu  dimasukkan  ke dalam filtrat hasil akhir tahap isolasi enzim sedikit demi sedikit  sambil  diaduk  dengan magnetic  stirer dalam penangas  es.  Campuran  kemudian  didiamkan  selama  1 malam  dalam  keadaan  dingin  kemudian  disentrifugasi dengan  kecepatan  3500  rpm  selama  50  menit.  Endapan dipisahkan  dari  filtratnya  dan  disuspensi  dengan  3  mL bufer trishidroksimetil-aminometan 0,2 M pH 8,6.

## Dialisis Enzim
Dialisis  dilakukan  dengan  menggunakan  membran selofan yang telah dipanaskan dalam air selama 30 menit dan dicuci dengan akuades. Selofan yang berisi suspensi
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (2) (2011) : 58 – 63
enzim  direndam  dalam  bufer  tris-hidroksimetil- aminometan  0,002  M  pH  8,6  yang  diaduk  dengan pengaduk magnet dalam keadaan dingin dan tiap 2 jam bufer diganti  serta  diuji  kandungan  amonium  sulfatnya dengan  BaCl 2 .  Dialisis  dihentikan  apabila  pengujian dengan  BaCl 2 tidak  membentuk  endapan  putih  BaSO 4 . Fraksi  yang  diujikan  pada  sel  Hela  dikeringkan  dengan freeze dryer .

## Uji Aktivitas Enzim
Sebanyak  1  mL  larutan  L-asparagin,  0,2  mL  enzim dan 0,8 mL bufer tris-hidroksimetil aminometan  0,2 M pH  8,6  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  30  menit.  Kemudian ditambah  0,2  mL  TCA  1,5  M  dan  disentrifus  pada  3400 rpm  selama  15  menit.  Sebagai  kontrol  adalah  0,2  mL enzim  yang  telah  dihilangkan  aktivitasnya  (dengan dipanaskan, didinginkan dan ditambah 1 mL TCA 1,5 M), kemudian  ditambah  0,8  mL  bufer  trishidroksimetil- aminometan 0,2 M pH 8,6 dan 1 mL larutan L-asparagin. Sebanyak  0,5  mL  filtrat  diambil  lalu  ditambah  8,5  mL akuades dan 1 mL pereaksi Nessler, kemudian absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis .

## Uji Kadar Protein
Sebanyak  10  mL  larutan  Lowry  C  ditambah  1  mL enzim dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Selanjutnya  ditambah  1  mL  Lowry  D  dan  diinkubasi kembali  selama  10  menit  pada  suhu  kamar  sambil sesekali dikocok. Sebagai kontrol, larutan enzim diganti dengan  akuades,  kemudian  absorbansi  larutan  diukur dengan spektrofotometer UV-Vis .

## Uji Sitotoksisitas
Uji sitotoksisitas dilakukan dengan metode MTT dan menggunakan  sel  Hela.  Semua  pekerjaan  dilakukan dalam laminar  air  flow  cabinet yang  telah  dibersihkan dengan  alkohol  70%  dan  disterilkan  dengan  lampu ultraviolet. Ekstrak dibuat dengan seri konsentrasi 1000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 62,5 μg/mL, 31,25 μg/mL, 15,62 μg/mL, 7,81 μg/mL, 3,91 μg/mL, 1,95 μg/mL,  0,98  μg/mL  dan  0,49  μg/mL  dalam  medium RPMI.
Preparasi  sel  Hela  mula-mula  dilakukan  dengan pensentrifusan  sel  selama  5  menit  pada  1500  rpm. Setelah itu pellet sel yang diperoleh disuspensikan dalam 4  mL  FBS  10%.  Jumlah  sel/mL  dihitung  menggunakan Hemocytometer di  bawah  mikroskop.  Sel  ditambah medium RPMI lalu dimasukkan dalam plate sebanyak 100 μL/ well dengan  jumlah  sel  2x10 4 sel/ well .  Kemudian  sel diinkubasi  selama  24  jam  dalam  inkubator  CO 2 .  Setelah 24  jam,  sebanyak  100  μL/well  e nzim  L- asparaginase dengan  berbagai  konsentrasi  ditambahkan  pada  tiap sumuran  lalu  diinkubasi  kembali  selama  24  jam  dalam inkubator CO 2 . Selanjutnya ditambahkan larutan MTT 10 μL/well  dan  diinkubasi  kembali  selama  4  jam . Reaksi dihentikan dengan penambahan 100 μL/well reagen SDS 10%  lalu  didiamkan  selama  semalam  kemudian  diukur absorbansinya dengan ELISA reader .
Analisis Hasil
Data absorbansi yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dianalisis dengan menghitung % kematian sel Hela berdasarkan rumus:
% kematian= ( A-B ) -(C-D) (A-B) ×100%
Keterangan:
A = Nilai rata-rata absorbansi kontrol sel (sel + medium) B = Nilai rata-rata absorbansi kontrol medium (medium)
C = Nilai rata-rata absorbansi sampel (sel + medium + sampel)
D = Nilai rata-rata absorbansi kontrol sampel medium + sampel)
Data diplotkan dalam kurva yaitu log konsentrasi sebagai sumbu  x  versus  persen  kematian  sebagai  sumbu  y, sehingga diperoleh persamaan garis:
y = ax + b
Nilai LC 50 ditentukan dengan mensubstitusi nilai 50 (50% kematian sel) pada koefisien y sehingga diperoleh nilai x. Log konsentrasi adalah x maka konsentrasi adalah antilog  x.  Hasil  yang  diperoleh  merupakan  nilai  LC 50 , yaitu  konsentrasi  enzim  L- asparaginase yang  dapat menyebabkan kematian 50% populasi sel Hela [13].

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Isolasi dan Pemurnian Enzim
Isolasi  enzim  L- asparaginase dari  kunyit  putih dilakukan  dengan  metode  ekstraksi  yang  dilanjutkan dengan fraksinasi. Kunyit putih ditambahkan bufer tris- hidroksimetil-aminometan  0,2  M  kemudian  diblender dan  menghasilkan  campuran  kuning  kecoklatan  yang terdiri  dari  komponen  protein  dan  non-protein  seperti karbohidrat yang dapat dipisahkan dengan sentrifugasi. Supernatan yang diperoleh dari 1000 g kunyit putih segar yaitu  sebanyak  867  mL  disebut  dengan  ekstrak  kasar (EK).
Ekstrak  kasar  merupakan  campuran  protein  enzim dan  protein  non  enzim,  sehingga  perlu  dilakukan pemurnian.  Pemisahan  protein  enzim  dari  protein lainnya,  dilakukan  dengan  fraksinasi  bertingkat menggunakan garam amonium sulfat. Pemilihan garam amonium sulfat didasarkan pada kelarutannya dalam air, sebagian  besar  protein  tahan  terhadap  garam  tersebut, daya pengendap yang cukup besar dan mempunyai efek penstabil  terhadap  protein.  Fraksinasi  bertingkat menghasilkan fraksi-fraksi enzim (F1, F2, F3, F4 dan F5).
Enzim  L- asparaginase hasil  fraksinasi  masih mengandung amonium sulfat, sehingga perlu pemurnian lebih  lanjut  dengan  proses  dialisis  menggunakan membran  selofan.  Pada  proses  dialisis  terjadi  difusi amonium  sulfat  dari  dalam  membran  keluar  membran karena adanya perbedaan konsentrasi larutan bufer tris- hidroksimetil-aminometan  di  luar  membran  (0,002  M) yang lebih  rendah daripada di dalam membran (0,2 M). Untuk  mengetahui  adanya  amonium  sulfat  pada  fraksi tersebut,  dilakukan  uji  dengan  penambahan  larutan
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (2) (2011) : 58 – 63 61
BaCl 2 ke dalam larutan bufer di luar membran, maka Ba 2+ bereaksi  dengan  SO 42- membentuk  BaSO 4 berupa endapan  putih.  Dialisis  dihentikan  apabila  endapan tersebut  tidak terbentuk lagi, sehingga diperoleh enzim L- asparaginase yang telah bebas dari amonium sulfat.
Enzim  L- asparaginase yang  diujikan  terhadap  sel Hela dikeringkan dengan proses liofilisasi menggunakan freeze  dryer dan  diperoleh  enzim  F1,  F2,  F3,  F4  dan  F5 berturut-turut yaitu 1,421 g, 0,244 g, 0,593 g, 0,133 g dan 0,0097  g  dari  500  mL  ekstrak  kasar  yang  difraksinasi. Fraksi-fraksi  enzim  tersebut  memiliki  warna  yang semakin jernih dibandingkan dengan ekstrak kasar yang berwarna  kecoklatan,  hal  ini  menunjukkan  bahwa protein  enzim  semakin  terpisah  dari  komponen  non- protein  dalam  sel,  sehingga  proses  pemurnian  dengan fraksinasi  bertingkat  yang  dilanjutkan  dengan  dialisis menghasilkan  enzim  dengan  tingkat  kemurnian  yang semakin  tinggi  seiring  dengan  semakin  banyaknya tahapan pemurnian.

## Uji Aktivitas Spesifik Enzim
Penentuan aktivitas L- asparaginase didasarkan pada reaksi  penguraian  L-asparagin  menjadi  L-aspartat  dan amonia  oleh  enzim  L- asparaginase .  Karena  mekanisme reaksi  enzimatisnya  telah  diketahui,  maka  penentuan aktivitas  enzim  dapat  dilakukan  melalui  identifikasi pembentukan  produk  yaitu  amonia  yang  diuji  dengan pereaksi  Nessler  menghasilkan  senyawa  kompleks berwarna  coklat  kekuningan  lalu  diukur  absorbansinya dengan  spektrofotometer UV-Vis .  Absorbansi  yang terukur kemudian diolah dengan bantuan kurva standar amonium  sulfat,  sehingga  didapatkan  unit  aktivitas enzim  L- asparaginase pada  ekstrak  kasar  dan  tiap-tiap fraksi. Sesuai dengan definisi unit aktivitas menurut Paul [10],  maka  nilai  unit  aktivitas  pada  penelitian  ini menunjukkan  banyaknya  amonia  yang  terbentuk. Aktivitas  spesifik  enzim  L- asparaginase dapat  dihitung dari unit aktivitas enzim per mg protein, sehingga untuk menentukan  nilai  aktivitas  spesifik  tidak  hanya diperlukan nilai unit aktivitas tetapi juga besarnya kadar protein suatu fraksi.
Penentuan kadar protein dilakukan dengan  metode Lowry  berdasarkan  pada  reaksi  antara  protein  dengan reagen  Lowry  membentuk  senyawa  kompleks  berwarna biru  yang  dapat  diukur  absorbansinya  dengan spektrofotometer UV-Vis .  Absorbansi  yang  terukur kemudian  diolah  dengan  bantuan  kurva  standar  BSA, sehingga  didapatkan  kadar  protein  pada  ekstrak  kasar dan tiap-tiap fraksi.
Aktivitas  spesifik  enzim  merupakan  perbandingan antara unit aktivitas enzim terhadap kadar protein. Hasil penentuan aktivitas spesifik enzim L- asparaginase pada setiap fraksi dapat dilihat pada gambar 1.
Gambar 1 menunjukkan nilai aktivitas spesifik yang berbeda pada setiap fraksi enzim L- asparaginase , hal ini dipengaruhi oleh dua faktor yaitu unit aktivitas dan kadar protein.  Suatu  fraksi  dengan  nilai  unit  aktivitas  tinggi belum tentu memiliki aktivitas spesifik yang tinggi juga, tergantung  pada  kadar  proteinnya.  Tingginya  unit aktivitas  enzim  suatu  fraksi  bergantung  pada  jumlah
enzim  yang  berinteraksi  dengan  substrat  yang  spesifik sedangkan kadar protein merupakan jumlah protein total pada fraksi tersebut. Enzim merupakan protein, sehingga dengan  mengetahui  kadar  protein  keseluruhan,  maka dapat diketahui besarnya protein yang berfungsi sebagai enzim  melalui  kemampuannya  dalam  mengubah substrat  menjadi  produk  yang  diinginkan.  Tingkat kemurnian  enzim  L- asparaginase tiap  fraksi  dihitung dengan  membandingkan  aktivitas  spesifik  enzim  tiap fraksi  dengan  aktivitas  spesifik  ekstrak  kasar.  Semakin tinggi  kemurnian  enzim  L- asparaginase maka  semakin tinggi  kandungan  protein  enzim  L- asparaginase dalam suatu  fraksi  sehingga  semakin  tinggi  juga  aktivitas spesifiknya.
Gambar 1 . Grafik aktivitas spesifik enzim L- asparaginase dari kunyit putih
Gambar  1  menunjukkan  bahwa  ekstrak  kasar mempunyai  aktivitas  spesifik  terendah  sebesar  38,893 unit/mg protein, hal ini dipengaruhi oleh tingginya kadar protein non enzim pada ekstrak kasar. Aktivitas spesifik tertinggi  diperoleh  pada  fraksi  5  (F5)  sebesar  247,925 unit/mg  protein,  hal  ini  menunjukkan  bahwa  sebagian besar protein yang terkandung dalam fraksi 5 merupakan enzim L- asparaginase , dengan demikian dapat disimpulkan bahwa enzim pada fraksi 5 adalah enzim L- asparaginase yang paling murni dan aktivitas spesifiknya paling tinggi diantara fraksi lainnya.
Uji Sitotoksik Enzim L- asparaginase Terhadap Sel Hela
Uji  sitotoksik  enzim  L- asparaginase terhadap  sel Hela  dilakukan  dengan  metode  MTT.  Prinsip  metode MTT  adalah  reaksi  pemecahan  garam  tetrazolium  MTT yang berwarna kuning oleh enzim suksinat dehidrogenase  yang  terdapat  dalam  mitokondria  sel hidup  menjadi  kristal  formazan  berwarna  ungu.  Reaksi tersebut  melibatkan  piridin  nukleotida  kofaktor  NADH dan  NADPH  yang  hanya  dikatalisis  oleh  sel  hidup, sehingga  jumlah  formazan  yang  terbentuk  sebanding dengan  jumlah  sel  yang  hidup.  Kristal  formazan  warna ungu yang terbentuk dapat diukur intensitasnya dengan ELISA Reader dan  data  absorbansi  yang  diperoleh menunjukkan banyaknya sel yang masih hidup.
Sel Hela ditumbuhkan pada medium RPMI 1640 yang mengandung  asam  amino,  vitamin,  garam-garam anorganik,  dan  glukosa.  Serum  yang  ditambahkan mengandung hormon-hormon yang memacu pertumbuhan  sel.  Albumin  berfungsi  sebagai  protein transport, lipid diperlukan untuk pertumbuhan sel, dan mineral  berfungsi  sebagai  kofaktor  enzim.  Seluruh komponen dalam media RPMI-serum tersebut
247,925 175,469 145,072 125,583 47,721 38,893 0 50 100 150 200 250 300 EK F1 F2 F3 F4 F5 Fraksi Enzim A k ti v ita s Sp e s ifi k (u n it/ m g p ro te in )
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (2) (2011) : 58 – 63
62
memberikan  nutrisi  yang  cukup  pada  sel  untuk  tetap bertahan  hidup dan  memperbanyak  diri  [14].  Penisillin dan  streptomisin  berfungsi  sebagai  antibiotik  dan fungizon sebagai antijamur [15].
Sampel  enzim  L- asparaginase fraksi  5  yang  telah dibuat dengan berbagai konsentrasi selanjutnya diujikan pada  sel  Hela  dalam microplate .  Sel  Hela  yang  diberi perlakuan  dengan  penambahan  enzim  L- asparaginase mengalami  perubahan  morfologi  dari  bentuk  semula yang dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 2. (a) Sel Hela sebelum penambahan enzim L- asparaginase , (b) Sel Hela setelah penambahan enzim L- asparaginase
Gambar 2 menunjukkan pada awalnya sel Hela yang belum  diberi  penambahan  enzim  L- asparaginase masih hidup,  berbentuk  bulat,  volumenya  tetap  dan  berwarna kuning terang, sedangkan sel Hela yang telah mati akibat penambahan  enzim  L- asparaginase memiliki  susunan membran sel yang telah rusak dan ukurannya cenderung lebih kecil akibat keluarnya sitoplasma sehingga volume sel  menyusut  dan  terlihat  berserabut.  Perubahan morfologi  ini  mengindikasikan  adanya  aktivitas penghambatan  pertumbuhan  sel  Hela  oleh  enzim  L- asparaginase sehingga sel tersebut mati.
Besarnya aktivitas penghambatan pertumbuhan sel Hela  oleh  enzim  L- asparaginase dapat  diketahui  dari jumlah  sel  Hela  yang  mengalami  kematian  setelah penambahan  enzim  L- asparaginase .  Kematian  sel  Hela akibat penambahan enzim L- asparaginase pada berbagai konsentrasi dapat dilihat pada gambar 3.
Gambar 3. Grafik hubungan konsentrasi ekstrak enzim L- asparaginase dengan kematian sel Hela
Gambar 3 menunjukkan adanya pengaruh perbedaan konsentrasi enzim L- asparaginase terhadap kematian sel Hela. Kematian sel Hela menurun pada konsentrasi 3,906 μg/mL,  7,813  μg/mL  dan  62,5  μg/mL  dalam  kisaran 1% yaitu  masing-masing  7,925%,  6,916%  dan  14,265%, sedangkan kematian sel Hela tertinggi pada konsentrasi 1000  μg/mL  sebesar  107,1 78%.  Semakin  tinggi konsentrasi  larutan  uji  maka  semakin  tinggi  juga
persentase  penghambatan  pertumbuhan  sel  uji,  hal  ini sesuai  dengan  nilai  positif  pada  pola  kemiringan (gradien)  kurva  dalam  gambar  4  yang  menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi enzim L- asparaginase maka semakin tinggi juga jumlah kematian sel Hela.
Data  hasil  uji  sitotoksisitas  enzim  L- asparaginase terhadap  sel  Hela  diplotkan  dalam  kurva  yaitu  log konsentrasi  enzim  L- asparaginase sebagai  sumbu  x versus  kematian  sel  Hela  sebagai  sumbu  y  sehingga diperoleh hasil yang memenuhi persamaan garis y = ax + b seperti pada gambar 4.
Berdasarkan  gambar  4  diperoleh  persamaan  y  = 27,023x – 6,4381  yang  menyatakan  keeratan  korelasi antara kematian sel Hela dengan log konsentrasi enzim L- asparaginase .  Nilai  koefisien  korelasi  (R 2 =  0,6944) menunjukkan  bahwa  antara  kematian  sel  Hela  dengan log konsentrasi enzim L- asparaginase memiliki korelasi yang  positif  dan  erat,  yaitu  log  konsentrasi  enzim  L- asparaginase memberikan  pengaruh  terhadap  kematian sel Hela sebesar 69,44%.
Gambar 4. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak enzim L- asparaginase dengan kematian sel Hela
Aktivitas  sitotoksik  enzim  L- asparaginase terhadap sel Hela dinyatakan dengan LC 50 yaitu konsentrasi enzim L- asparaginase yang  menyebabkan  kematian  50% populasi sel Hela. Persamaan garis y = 27,023x – 6,4381 yang diperoleh dari grafik digunakan untuk menghitung nilai  LC 50 dengan  cara  mensubstitusi  nilai  50  (50% kematian sel) pada koefisien y sehingga diperoleh nilai x yang merupakan log konsentrasi, sedangkan antilog dari x  adalah  konsentrasi  yang  merupakan  nilai  LC 50 . Berdasarkan  hasil  perhitungan  diperoleh  nilai  LC 50 sebesar 122,462 µg/mL yang menunjukkan bahwa enzim L- asparaginase pada  konsentrasi  tersebut  mampu mematikan sel Hela sebesar 50% dari populasi awal.
Berdasarkan standar NCI ( National Cancer Institute ), suatu senyawa dikatakan berpotensi untuk dikembangkan  lebih  lanjut  sebagai  antikanker  apabila memiliki nilai LC 50 ≤ 20 µg/mL [12]. Nilai LC 50 enzim L- asparaginase fraksi  5  dari  kunyit  putih  sebesar  122,462 μg/mL,  dengan  demikian  dapat  disimpulkan  bahwa enzim L- asparaginase fraksi 5 dari kunyit putih mampu menghambat  pertumbuhan  sel  Hela  tetapi  kurang potensial sebagai agen antikanker.  Hasil yang diperoleh dari  sampel  kunyit  putih  segar  sebanyak  1000  g kurang potensial  sebagai  antikanker,  hal  ini  bisa  ditingkatkan bila  sampel  yang  digunakan  dalam  bentuk  kering  dan dengan  jumlah  yang  lebih  banyak.  Kunyit  putih  yang dikeringkan,  kadar  airnya  rendah  dan  konsentrasi
4,899 8,79 8,357 7,925 6,916 8,645 15,85 14,265 29,251 58,471 88,184 107,178 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Konsentrasi ekstrak enzim L-asparaginase ( μ g/mL) Ke ma tia n se l H e la (% ) y = 27,023x - 6,4381 R 2 = 0,6944 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Log konsentrasi ekstrak enzim L-asparaginase (μg/mL) K em at ia n s el H el a (% )
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (2) (2011) : 58 – 63
ekstrak  lebih  tinggi  sehingga  diharapkan  aktivitasnya meningkat  dan  potensi  antikankernya  menjadi  lebih baik.
Potensi  antikanker  enzim  L- asparaginase fraksi  5 dari  kunyit  putih  terhadap  sel  Hela  lebih  rendah dibandingkan  terhadap  sel  leukemia  tipe  K-562  yang telah dilakukan sebelumnya oleh Arpintasari dkk. [11]. Hal tersebut ditunjukkan dari nilai LC 50 pada uji sitotoksisitas terhadap sel leukemia tipe K- 562 diperoleh 11,437 μg/mL sedangkan  terhadap  sel  Hela  pada  penelitian  ini diperoleh  122,462  µg/mL,  dengan  demikian  tampak bahwa  enzim  L- asparaginase fraksi  5  dari  kunyit  putih mempunyai  aktivitas  sitotoksik  yang  berbeda  terhadap jenis sel yang berbeda.

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  terhadap  enzim  L- asparaginase dari sampel kunyit putih ( Curcuma mangga Val.)  dapat  disimpulkan  bahwa  enzim  L- asparaginase dapat diisolasi dan dimurnikan dari kunyit putih dengan berat  enzim  fraksi  5  yaitu  0,0097  g  dari  1000  g  bahan segar.  Aktivitas  spesifik  tertinggi  enzim  L-asparginase dari kunyit putih dengan kondisi optimum terdapat pada fraksi  5  sebesar  247,925  unit/mg  protein.  Nilai  LC 50 enzim  L- asparaginase fraksi  5  dari  kunyit  putih  sebesar 122,462  μg/m L  mampu  menghambat  pertumbuhan  sel Hela  tetapi  kurang  potensial  sebagai  agen  antikanker berdasarkan standar NCI ( National Cancer Institute ).

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Satmoko  Budi  Santoso,  Buku  pintar  kanker, Yogyakarta: power books (Ihdina) , (2009)
[2]  N  Lack,  B  West,  D  Jeffries,  G  Ekpo,  L  Morison,  WP Soutter,  G  Walraven, L  Boryseiwicz, Comparison  of non-invasive  sampling  methods  for  detection  of HPV  in  rural  African  women, Sexually  transmitted infections , 81, 3, (2005) 239-241 http://dx.doi.org/10.1136/sti.2004.010413
[3]  Keivan Zandi, Saeed Tajbakhsh, Iraj Nabipour, Zahra Rastian, Forough Yousefi, Samin Sharafian, Kohzad Sartavi,  In  vitro  antitumor  activity  of  Gracilaria corticata  (a  red  alga)  against  Jurkat  and  molt-4 human  cancer  cell  lines, African  Journal  of Biotechnology , 9, 40, (2010) 6787-6790
[4]  Haishun  Xu,  Li  Yao,  Hongxiang  Sun,  Yuanwen  Wu, Chemical  composition  and  antitumor  activity  of different polysaccharides from the roots of Actinidia eriantha, Carbohydrate  Polymers ,  78, 2, (2009)  316- 322 http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2009.04.007
[5]  Cheppy  Syukur,  Temu  putih  tanaman  obat antikanker, Penebar Swadaya, 2003.
[6]  R. Karabulut, K. Sönmez, C. Afsarlar, Z. Türkyilmaz, A.  Can  Baçaklar,  N.  Kale,  Pancreas  Pseudocyst Associated  with  L-asparaginase  Treatment:  a  Case Report, Acta  Chirurgica  Belgica ,  105,  6,  (2005)  667-
669 http://dx.doi.org/10.1080/00015458.2005.11679801
[7]  VP  Kamble,  R  Srinivasa  Rao,  Prita  S  Borkar, Purification  of  L-asparaginase  from  a  bacteria Erwinia carotovora and effect of a dihydropyrimidine derivative on some of its kinetic parameters, Indian
Journal  of  Biochemistry  &  Biophysics ,  43,  6,  (2006) 391-394
[8]  Mario Sanches, Sandra Krauchenco, Igor Polikarpov, Structure,  substrate  complexation  and  reaction mechanism  of  bacterial  asparaginases, Current Chemical Biology , 1, 1, (2007) 75-86
http://dx.doi.org/10.2174/187231307779814057
[9]  A.  A.  El-Bessoumy,  M.  Sarhan,  J.  Mansour, Production,  isolation,  and  purification  of  L- asparaginase  from  Pseudomonas  aeruginosa  50071 using solid-state fermentation, Journal of biochemistry and molecular biology , 37, 4, (2004) 387- 393 http://dx.doi.org/10.5483/BMBRep.2004.37.4.387
[10] JH  Paul,  Isolation  and  characterization  of  a Chlamydomonas L-asparaginase, Biochemical Journal , 203, 1, (1982) 109-115
http://dx.doi.org/10.1042/bj2030109
[11]  Agustina  Arpintasari,  Wuryanti  Wuryanti,  Wasino Hadi  Rahmanto,  Isolasi  dan  Uji  Potensi  L- Asparaginase  dari  Rimpang  Kunyit  Putih  (Curcuma mangga  Vall)  terhadap  Leukimia  Tipe  K562, Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi , 11, 3, (2008) 57-62
[12] M.  Suffness, J.  M.  Pezzuto, Assay  Related  to Cancer Drug Discovery,  in:  K.  Hostettman  (Ed.) Methods  in Plant  Biochemistry:  Assay  for  Bioactivity ,  Academic Press, London, 2009, pp. 71-133.
[13] Nurrahmi  Dewi  Fajarningsih,  Hedi  Indra  Januar, Muhammad  Nursid,  Thamrin  Wikanta,  Potensi antitumor ekstrak spons Crella papilata asal Taman Nasional  Laut  Kepulauan  Seribu, Jurnal  Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan , 1, 1, (2006) 35-42 http://dx.doi.org/10.15578/jpbkp.v1i1.229
[14] R. Ian  Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Aplication, Lissing, New York, 1986.
[15] J  Eryl  Liddell,  Anthony  Cryer,  A  practical  guide  to monoclonal antibodies, John Wiley & Sons, 1991.