## CURRENT BIOCHEMISTRY
ISSN: 2355-7877 e-ISSN: 2355-7931 Journal homepage: http://journal.ipb.ac.id/index.php/cbj Journal E-mail: current.biochemistry@gmail.com

## Skrining Fitokimia, Kadar Total Flavonoid dan Antioksidan Daun Cocor Bebek
Phytochemical Screening, Total Flavonoids and Antioxidants of Kalanchoe Pinnata Linn. Leaves
Eka Nurul Qomaliyah 1* , Nurul Indriani 1 , Atika Rohma 2 , Ricka Islamiyati 2
1 Program Studi Farmasi, Fakultas Kesehatan, Universitas Bumigora, Indonesia
2 Program Studi Farmasi, Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Cendekia Utama Kudus, Indonesia
Received : 27 May 2023 ; Accepted: 20 July 2023
*email korespondensi: eka@universitasbumigora.ac.id

## ABSTRACT
Kalanchoe pinnata Linn. or in Indonesia known as cocor bebek, grow well in temperate and tropical regions.  Cocor  bebek  is  used  to  treat  several  diseases  including  skin  diseases,  wound  healing,  kidney stones,  gallstones,  diabetes.  The  pharmacological  activities  of  cocor  bebek  leaves  have  been  reported  as antiinflammatory,  antioxidant  and  antimicrobial.  The  objective  of  this  study  is  to  determine  the  metabolite content  of  cocor  bebek  leaves,  total  flavonoid  levels  and  antioxidant  activity.  Observations  of  secondary metabolites  of  cocor  bebek  leaves  were  carried  out  through  qualitative  secondary  metabolite  screening, while total flavonoid levels were measured using quantitative UV-VIS spectrophotometry with quercetin as a comparison, and antioxidant activity through DPPH molecular inhibition testing. The results of this study indicate that cocor bebek leaves contain alkaloids, flavonoids, saponins, triterpenoids, tannins and phenols. Extraction using 200 g of cocor bebek leaves resulted in yield of 14.63%. The total favonoid content obtained was 8.77% of quercetin, while the antioxidant inhibition of DPPH molecules obtained IC50 of 97.42 ppm.
Keywords : Antioxidant activity, DPPH, Flavonoid, Kalanchoe pinnata (Linn.)

## ABSTRAK
Kalanchoe pinnata atau di Indonesia di kenal dengan sebutan tanaman cocor bebek tumbuh dengan baik di  wilayah  beriklim  sedang  dan  tropis.  Cocor  bebek  digunakan  untuk  mengobati  beberapa  penyakit diantaranya penyakit kulit, penyembuhan luka, batu ginjal, batu empedu, diabetes. Aktivias farmakologis daun cocor bebek yang pernah dilaporkan sebagai antiinflamasi, antioksidan dan antimikroba Tujuan dari penelitian ini  yakni  untuk  mengetahui  kandungan  metabolit  daun  cocor  bebek,  kadar  total  flavonoid  serta  aktivitas antioksidan.  Pengamatan  metabolit  sekunder  daun  cocor  bebek  dilakukan  melalui  skirining  metabolit sekunder  kualitatatif,  sementara  kadar  total  flavonoid  dilakukan  secara  kuantitatif  menggunakan spektrofotometri  UV-VIS  dengan  kuersetin  sebagai  pembanding,  aktivitas  atioksidan  melalui  pengujian inhibisi  molekul  DPPH.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  daun cocor  bebek  mengandung  alkaloid, flavonoid,  saponin,  triterpenoid,  tanin  dan  fenol.  Ekstraksi  menggunakan  200  g  daun  cocor  bebek menghasilkan  rendemen  sebesar  14,63%.Kadar  total  favonoid  yang  diperoleh  yakni  sebesar  8,77% kuersetin, sementara antioksidan peredaman molekul DPPH diperoleh IC50 sebesar 97,42 ppm.
Kata kunci : Aktivitas antioksidan, DPPH, Flavonoid, Kalanchoe pinnata (Linn.)

## 1. PENDAHULUAN
Sumber  daya  alam  hayati  di  Indonesia sangat  melimpah.  Kekayaan  jumlah  tanaman Indonesia  yang  mendiami  hutan  hujan  tropis wilayah    Indonesia    diperkirakan    sebanyak 28.000  spesies  tanaman,  sekitar  6.000  spesies tanaman  merupakan  tanaman  obat  (Elfahmi et  al.,  2014).  Secara  empiris,  masyarakat Indonesia mengenal pengobatan menggunakan herbal  atau  obat  tradisional   sejak  lama (Bustanussalam,  2016).  Tantangan  terbesar pemanfaatan  tanaman  obat  di   Indonesia, yakni  masih  sedikitnya  pembuktian  ilmiah yang  komprehensif  dimulai  dengan  pengujian praklinik  dasar  seperti  determinasi  metabolit sekunder  yang  memiliki  potensi  bioaktivitas, kadar  metabolit  sekunder  secara  kuantitatif hingga  pengujian  bioaktivitas.  Tahap  awal  ini akan  mendorong  pengembangan  pengobatan tradisional  berdasarkan  standar  ilmiah  yang akan berkontribusi pada kemandirian kesehatan.
Penyakit-penyakit  sindrom  metabolik saat  ini  semakin  meningkat  seiring  dengan perubahan  gaya  hidup.  Berdasarkan  WHO sindrom  metabolik  ditandai  dengan  lima parameter  yakni  kadar  gula darah  yang tinggi, keadaan  obesitas  sentral,  tekanan  darah tinggi,  kadar  gliserida  dan  kadar  high  density lipoprotein  (HDL)  (Saklayen,  2018).  Kondisi sindrom  metabolik  yang  tidak  terkontrol memicu  pembentukan  radikal  bebas  yang berlebih  melalui  pembentukan spesies  oksigen reaktif  (ROS)  yang  semakin  memperparah kondisi kesehatan (Hasim et al., 2020; Maritim et  al.,  2003).  Radikal  bebas  yang  terbentuk mampu  menyerang  asam  lemak  tak  jenuh ganda  yang  akan  menghasilkan  radikal  lipid reaktif  dan  beracun,  pembentukan  ini  akan memicu  komplikasi  diabetes  (Matough  et al., 2012),  mendorong  risiko  penyakit  vaskular sistemik,  penyakit  jantung,  retinopati  dan kerusakan  ginjal  (Halliwell,  B.,  Gutteridge, J.,M.,  1999).Molekul  radikal  bebas  mampu dihambat  oleh  antioksidan.  Banyak  tanaman baik sayur-syuran maupun buah-buahan merupakan  sumber  antioksidan  alami,  potensi antioksidan alami yang dimiliki tanaman karena adanya  kandungan  femolik  dan  flavonoid (Ruslan et al., 2018).
Cocor     bebek     ( Kalanchoe     pinnata
Linn.)  merupakan  salah  satu  tanaman  dari suku  Crassulaceae  yang  tumbuh  dengan  baik didaerah  beriklim  sedang  dan  tropis.  Cocor bebek  umumnya  digunakan  sebagai  tanaman hias  (Pinilih  &  Hidayat,  2014;  Kistanti  H, 2012), namun juga berkhasiat mengobati bisul, penyembuhan  luka,  rematik,  penyakit  kulit, batu  empedu,  batu  ginjal,  diabetes  (Okwu  & Nnamdi,  2011;  Prasad  et  al.,  2014;  Sharker  et al.,  2012;  Verma  et  al.,  2014).  Aktivitas farmakologi dari  daun  cocor  bebek  juga  telah dilaporkan  sebagai  antikanker, antivirus, antimikroba,  antiinflamasi  dan  antioksidan (Bhatti  et  al.,  2012;  Okwu  &  Nnamdi,  2011; Rajsekhar et al., 2016; Singh et al., 2019).
Berdasarkan penelitian terdahulu diketahui  bahwa  daun  cocor  bebek  memiliki kandungan  metabolit  sekunder  diantaranya alkaloid,  fenol,  flavonoid,  dan  saponin  (Singh et  al.,  2019).  Aktivitas  antioksidan  ekstrak etanol,  metanol  daun  cocor  bebek  terhadap radikal bebas 2,2-diphenylpicryhydrazyl (DPPH)  yakni  sebesar  69.84%  dan  78,56% secara  berurutan  (Bhairappa  et  al.,  2016). Sementara,  aktivitas  ekstrak  etanol  dan  cocor bebek berdasarkan lainnya memiliki nilai IC50 sebesar  282.136±0.46μg/mL  (Ashfak  et  al., 2016).  Maka  perlu  untuk  menganalisis  secara komprehensif  kandungan  metabolit  sekunder cocor  bebek  secara  kualitatif,  pengujian  kadar total  flavonoid  secara  kuantitatif  serta  analisis antioksidan,  sehingga  dapat  diketahui  potensi antioksidan  daun  cocor  bebek.  Pengukuran kuantitatif  kadar  total  flavonoid  dan  antioksidan pada  penelitian  diawali  tahapan  penentuan gelombang  maksimum  serapan  dan  waktu inkubasi  maksimal  untuk  memperoleh  hasil yang lebih akurat.

## 2. METODOLOGI

## Preparasi sampel
Daun  cocor  bebek  diambil  sebanyak  3 kg,  dicuci  bersih  dengan  air  mengalir.  Daun cocor  bebek  yang  telah  dibersihkan  kemudian dipotong  kecil  dan  dikeringkan  dengan  cara diangin-anginkan dalam ruangan selama 6 hari. Daun  cocor  bebek  kering  di  haluskan  dengan ukuran 100 mesh.

## Ekstraksi
Sebanyak  200  gram  serbuk  daun  cocor bebek  diambil  dan  dimasukkan  ke  dalam wadah  ekstraksi.  Ekstraksi  dilakukan  dengan teknik  maserasi  sederhana,  yakni  dengan merendam  daun  cocor  bebek  menggunakan pelarut  etanol  96%  2000  mL  (1:10).  Wadah ekstraksi ditutup rapat dan disimpan di tempat yang tidak terpapar sinar matahari selama 2 x24 jam,  dengan  sesekali  dilakukan  pengadukan. Remaserasi  dilakukan  kembali  sebanyak  2x untuk  memaksimalkan  pengambilan  metabolit sekunder  dari  serbuk  daun  cocor  bebek. Maserat  disaring  menggunakan  kertas  saring, kemudian  dilanjutkan  dengan  penguapan pelarut menggunakan rotary evaporator dengan kecepatan 60 rpm pada suhu 60 °C .

## Analisis Fitokimia
Adapun  senyawa  yang  diidentifikasi secara  kualitatif  keberadaannya  dalam  sampel pada  penelitian  ini  yakni  senyawa  alkaloid, saponin,  tanin,  fenol,  flavonoid,  triterpenoid dan  steroid.  Adapun  pengujian  dilakukan berdasarkan  Nurcholis  et  al.  (2023)  dengan modifikasi.

## Uji Alkaloid
Sebanyak 0.5 g ekstrak daun cocor bebek dilarutkan  dalam  etanol  70%  ditambah  1  mL HCl  dan  3  mL  aquades,  dipanaskan  di  atas penangas air selama dua menit, lalu didinginkan dan  disaring.  Tiga  tetes  filtrat  diambil  dan dua  tetes  pereaksi  Dragendrof  ditambahkan. Terbentuknya warna jingga menunjukkan hasil yang positif adanya senyawa alkaloid.

## Uji Saponin
Sebanyak  1  mL  ekstrak  daun  cocor bebek  yang  telah  dilarutkan  dalam  70% etanol  ditambahkan  10  ml  aquadest  panas, didinginkan  kemudian  dikocok  selama  10 detik.  Terbentuknya  buih  yang  stabil  selama tidak kurang dari 10 menit menunjukkan hasil positif  adanya  senyawa  saponin  (Tiwari  et.al., 2017).

## Uji Fenol
Sebanyak  1mL  ekstrak  cair  daun  cocor
bebek yang telah dilarutkan dengan etanol 70% ditambahkan  dengan  tiga  tetes  larutan  FeCl 3 konsentrasi 5%. Apabila terbentuk warna ungu kehitaman  menunjukkan  hasil  positif  adanya senyawa fenol.

## Uji Flavonoid
Sebanyak 1mL ekstrak daun cocor bebek yang  telah  dilarutkan  etanol  70%,  kemudian ditambahkan  sedikit  bubuk  logam  Mg  dan beberapa  tetes  HCl  pekat.  Apabila  terbentuk warna  jingga-kemerahan  menunjukan  adanya senyawa flavonoid.

## Uji Tanin
Ekstrak  etanol  daun  cocor  bebek ditimbang sebanyak 20 mg, ditambahkan 2 tetes larutan  FeCl 3 5%.  Reaksi  positif  senyawa  tanin ditandai dengan adanya warna hijau kehitaman (Safitri et.al., 2013)

## Uji Triterpenoid dan Steroid
Sebanyak  1  mL  ekstrak  sampel  daun cocor bebek yang telah dilarutkan dengan etanol 70%  ditambah  dengan  pereaksi  Lieberman Buchard,  dibiarkan  15  menit.  Campuran  yang dibuat  kemudian  dipipet  6  tetes  dan  larutan dipindahkan  ketabung  reaksi  lain  ditambah 2  sampai  3  tetes  H 2 SO 4 pekat.  Reaksi  positif adanya  senyawa  triterpenoid  ditandai  dengan terbentuknya  warna  merah-jingga  atau  ungu, sementara  reaksi  positif  adanya  senyawa steroid  ditandai  dengan  Terbentuknya  warna merah  jingga  atau  ungu  menunjukkan  adanya triterpenoid  sedangkan  terbentuknya  warna biru (Dewi et.al., 2017).

## Kadar Total Flavonoid

## Preparasi larutan baku kuersetin
Larutan induk kuersetin dengan konsetrasi 1000 ppm disiapkan dengan cara 0,05 g  kuersetin dilarutkan  dengan  etanol  96%  hingga,  ditera hingga  volume  50  mL.  Selanjutnya  dilakukan pengenceran dengan deret konsentrasi 40 ppm, 80  ppm,  120  ppm,  160  ppm,  dan  200  ppm. Masing-masing  konsentrasi  diambil  0,5  mL. Selanjutnya,  ditambahkan  1,5  mL  etanol 96%, 0,1 mL AlCl₃ 10%,  0,1 mL CH₃COONa 1 M dan 2,80 mL aquades. Campuran
Qomaliyah et al. – Skrining Fitokimia, Kadar Total Flavonoid dan Antioksidan Daun Cocor Bebek
dihomogenkan lalu dibiarkan selama 10 menit, kemudian  dianalisis  dengan  spektrofotometer UV-Vis (Chang, 2002).

## Penentuan panjang gelombang maksimum analisis flavonoid
Salah satu konsentrasi larutan baku yang disiapkan  diambil  untuk  penentuan  panjang gelombang  maksimum.  Konsentrasi  yang dipilih  yakni  konsentrasi  120  ppm  karena berada pada deretan tengah. Panjang gelombang maksimum ditentukan melalui pengukuran pada panjang gelombang 400-550 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang maksimum menunjukkan tingkat serapan yang tinggi (Winahyu et al., 2019).

## Penentuan waktu inkubasi optimal analisis flavonoid
Komponen larutan yang akan di uji sama seperti  pada  penentuan  panjang  gelombang maksimum,  akan  tetapi  dibuat  5  tabung pengukuran  dengan  lama  waktu  inkubasi yakni 5, 10, 15, 20, 25 menit. Adapun panjang gelombang  yang  digunakan  yakni  panjang gelombang  maksimum  yang  diperoleh  dari tahapan sebelumnya (Molyneux, 2004).

## Pembuatan kurva baku kuersetin
Kurva baku dibuat dengan menghubungkan hasil pengukuran serapan pada panjang  gelombang  maksimum  (serapan  pada ordinat  dan  konsentrasi  kuersetin  pada  absis) dengan  konsentrasi  larutan  standar  (Winahyu et al., 2019).

## Analisis total flavonoid secara kuantitatif
Analisis
kuantitatif
flavonoid dilaksanakan menggunakan metode kalorimetri dengan alumunium klorida berdasarkan prosedur Chang et  al. (2002).  Ekstrak  etanol daun  cocor bebek  ditimbang  10  mg  dilarutkan dengan  etanol  p.a  hingga  10  mL  (1000  ppm). Kemudian dipipet 0,5 mL ditambahkan 1,5 mL etanol  pa, 0,1 mL AlCl₃ 10%, 0,1 mL natrium asetat  1M  dan  2,80  mL  aquadest.  Setelah campuran dikocok hingga homogen, dicampur dengan  benar,  tunggu  selama  30  menit. Kemudian, gunakan spektrofotometer
ultraviolet-visible  (UV-Vis)  dengan  panjang gelombang maksimum untuk mengukur serapannya.  Masing-masing  sampel  dilakukan secara  triplikat.  Persamaan  garis  kurva  standar kuersetin digunakan untuk menentukan konsentrasi      sampel  dalam  pengujian  total flavonoid berdasarkan absorbansi yang diperoleh.
Total flavonoid dinyatakan dalam persen, adapun perhitungannnya sebagai berikut:

## Antioksidan DPPH

## Pembuatan Larutan Induk dan larutan blanko DPPH
Sebanyak 4mg 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH)  ditimbang  dan      dilarutakan      dalam 50  mL  etanol  96%  dalam  kabu  ukur  hingga diperoleh  konsentrasi  0,2  mM.  Labu  ukur dilapisi  alumunium  foil  agar  terlindung  dari cahaya dan sinar matahari langsung (Anwan et al.,  2022).  Sebagai  persiapan  larutan  blanko diambil larutan induk 0,2 mM sebanyak 1 mL, ditera ke dalam labu ukur 5 mL dengan etanol 96% (Novita et al., 2021).

## Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH
Disiapkan larutan DPPH dengan kosentrasi  0,2  mM,  kemudian  diambil  1  mL untuk  dimasukkan  dalam  labu  ukur  5  mL ditambah  etanol  96%  hingga  tanda  batas  dan dihomogenkan  kemudian  diukur  serapannya pada panjang gelombang 500-600 nm (Puspitasari, 2016).

## Penentuan Operating Time
Ekstrak  etanol  daun  cocor  bebek  dan larutan  kontrol  positif  kuersetin  50  ppm  (1:1) ditambahkan  dengan  larutan  induk  DPPH  0,2 mM  dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  5  mL ditera dengan penambahan pelarut etanol 96%. Komponen  larutan  dikocok  sampai  homogen kemudian  diamati  absorbansinya  dengan panjang  gelombang  maksimum  setiap  5  menit hingga  35  menit.  Penentuan  O perating  time yakni  ketika  diperoleh  absorbansi  yang  stabil (Puspitasari, 2016).

## Penentuan aktivitas antioksidan DPPH
Sebanyak  10  mg  ekstrak  etanol  cocor bebek  dilarutkan  dengan  etanol  pekat  (96%) dalam  labu  ukur  10  mL  dan  dicukupkan sampai  tanda batas hingga didapatkan konsentrasi  1000 ppm.  Larutan  induk  diambil sebanyak  0,6  mL,  0,7  mL,  0,8  mL,  0,9  mL, dan 1,0 mL, kemudian dimasukkan dalam labu ukur  10  mL  (untuk  mendapatkan  konsentrasi 60  ppm,  70  ppm,  80  ppm,  90  ppm,  100  ppm) volume dicukupkan sampai garis batas dengan etanol  pekat.  Diambil  1  mL  dari  setiap konsentrasi  ditambahkan  1  mL  larutan  DPPH (0,2  mM)  dimasukkan  dalam labu  ukur  5  mL dan  ditambahkan  dengan  etanol pekat  sampai tanda  batas,  kemudian  didiamkan  ditempat gelap  selama  25  menit.  Selanjutnya,  diukur serapannya  pada  spektrofotometer  dengan panjang  gelombang  516  nm.  Replikasi dilakukan  sebanyak  3  kali  setelah  itu  dihitung persen  peredaman  dan  dimasukkan  dalam persamaan  regresi  linier  dan  didapatkan  nilai IC 50 (Anwar et al., 2022).

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Persiapan  sampel  dilakukan  melalui berbagai  proses  persiapan  simplisia  pada umumnya  yakni  melalui  pengumpulan  bahan baku  berupa  daun  cocor  bebek  dilanjutkan dengan  proses  sortasi  basah,  pencucian, perajangan,  pengeringan  serta  sortasi  kering. Bobot daun cocor bebek awal  yang digunakan sebesar  3  kg  menghasilkan  simplisia  kering yang  siap  uji  sebesar  320  g.  Sehingga,  terjadi susut  selama  proses  persiapan  sampel  hingga menjadi simplisia kering sebesar 89,33%.

## 1. Ekstraksi
Pelaksanaan ekstraksi pada penelitian ini menggunakan  teknik  konsensional  sederhana yakni  maserasi,  dengan  menggunakan  pelarut
etanol (1:10) serta dilakukan remaserasi dengan total 3x. Waktu yang digunakan untuk maserasi selama  2x24  jam  dengan  bantuan  pengadukan sesekali.  Sampel  daun  cocor  bebek  yang digunakan  sebanyak  200  g  menghasil  ekstrak kental merupakan hasil  penguapan dari proses rotary  evaporator  sebesar  29.26  g,  sehingga diperoleh %rendemen ekstraksi sebesar 14,63%.

## 2. Identifikasi Fitokimia Kualitatif
Identifikasi  fitokimia  secara  kualitatif dilakukan untuk mengetahui keberadaan fitokimia  atau  metabolit  sekunder  tertentu dalam  suatu  sampel.  Identifiaksi  atau  skrining fitokimia  merupakan  uji  pendahuluan  yang dilaksanakan  untuk  mengetahui  keberadaan baik  metabolit  primer  maupun  metabolit sekunder  dalam  suatu  ekstrak      (Abubakar  & Haque,  2020).  Jenis  senyawa  metabolit sekunder  yang  diuji  pada  sampel  daun  cocor bebek ini adalah alkaloid, saponin, tanin, fenol, flavonoid,  dan  triterpenoid  serta  steroid.  Hasil skrining fitokimia ditunjukkan pada Tabel 1.
Uji keberadaan senyawa alkaloid menggunakanreagenDragendroffmenghasilkan warna  khas  positif  berupa  merah  jingga  atau jingga.  Kontrol  positif  yang  dapat  dijadikan pembanding  untuk  uji  kualitatif  dragendrof yakni  quinin  (Sakti  et  al.,  2019).  Golongan senyawa alkaloid terutama alkaloid jenis indol mempunyai  kemampuan  menghentikan  reaksi rantai radikal bebas secara cepat (Załuski et al., 2015). Sementara pada uji flavonoid digunakan bubuk  logam  Mg  dalam  suasana  asam  pekat HCl, metode uji kualitatif flavonoid ini disebut dengan  metode  Wilstater  cyanidin,  dengan warna  khas  positif  pada  uji  ini  kemerahan (Lindawati  &  Ma’ruf,  2020).  Hasil  yang diperoleh  dari penelitian  menunjukkan  adanya Tabel 1 Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Cocor Bebek No Identifikasi Hasil Keterangan 1 Alkaloid + Terbentuk warna jingga 2 Flavonoid + Terbentuk warna jingga kemerahan 3 Saponi n + Terbentuknya buih/busa yang stabil ± 10 menit 4 Triterpenoid + Terbentuknya warna merah jingga 5 Steroid - Terbentuknya warna biru 6 Tanin + Terbentuknya warna hijau kehitaman 7 Fenol + Terbentuknya warna hitam hijau kebiruan
warna  jingga  kemerahan,  yang  menunjukkan adanya  reaksi  positif.  Adanya  serbuk  Mg  dan HCl  pada  uji  kualitatif  flavonoid  bertujuan untuk  mereduksi  flavonoid  terutama  inti benzopiron  pada  struktur  flavonoid  (Dwitiyanti et al., 2019).
Pada  uji  kualitatif  saponin  dilakukan melalui pengocokan yang kuat hingga menghasilkan buih yang stabil hingga mencapai  10  menit  pada  penelitian  ini.  Buih yang  dihasilkan  sebagai  reaksi  positif  dalam pengujian ini dikarenanakan adanya kandungan glikosida pada saponin  yang akan terhidrolisis menjadi glukosa dan senyawa lainnya sehingga menghasilkan  buih  atau  busa  yang  stabil (Kumalasari  &  Andiarna,  2020).  Sementara pada  uji  kualitatif  triterpenoid  dan  steroid menggunakan asam sulfat pekat. Uji kualitatif ini menggunakan  perekasi  Liebermann-Buchard, dan  reaksi  dimulai  dengan  asetilasi  gugus hidroksi  oleh  asetat  anhidrat.  Pembentukan ikatan  rangkap  disebabkan  oleh  gugus  asetil. Akibatnya,  gugus  hidrogen  dan  elektronnya dilepaskan,  yang  menyebabkan  resonansi  dan menyebabkan karbokation. Pelepasan hidrogen mengikuti  reaksi  adisi  elektrofilik.  Dalam mekanisme  reaksi  ini,  gugus  hidrogen  dan elektron  yang  lepas  mengalami  perpanjangan konjugasi,  yang  menghasilkan  terbentuknya warna  merah.  (Siadi,  2012;  Nurcholis  et  al., 2023).  Sementara,  pada  penelitian  ini  tidak terdapat  reaksi  positif  yang  menunjukkan adanya steroid.
Senyawa  tanin  pada  daun  cocor  bebek menyebabkan rasa sepat. Pada pengamatan uji kualitatif  tanin  daun  cocor  bebek  memberikan warna  biru  kehijauan.  terbentuknya  kompleks warna  hijau  kebiruan  atau  biru  kehiauan dikarenakan  adanya  senyawa  golongan  tanin terkondensasi, sedangkan senyawa tanin terhidrolisis  akan  memberikan  waena  biru kehitaman  saat  direaksikan  dengan  FeCl 3 (Soamole, 2018). Warna khas positif terbentuk dari kompleks antara pusat Fe3 + dengan senyawa tanin (Sonam et al., 2017).
Hasil  pengamatan  menunjukkan  warna khas  ungu  kehitaman  pada  uji  kualitatif  fenol sampel daun cocor bebek. Sampel direaksikan dengan  FeCl 3 ,  reaksi  positif  dari  hasil  reaksi ini ditunjukkan dengan terbentuknya kompleks
ungu  kehitaman  yang  berasal  dari  besi  (III) klorida  (  Nurcholis  et  al.,  2023).  Pada  uji kualitatif  atau  skrining  fitokimia  daun  cocor bebek  diketahui  daun  cocor  bebek  sampel dalam  penelitian  ini  mengandung  senyawa alkaloid, saponin, triterpenoid, tanin, fenol, dan flavonoid.

## 3. Kadar Total Flavonoid
Analisis  kuantitatif total flavonoid dalam  suatu  sampel  diukur  menggunakan spektrofotometri  UV-Vis.  Adanya  sistem aromatik  yang  terkonjugasi  pada  struktur flavonoid  sehingga  akan  menunjukkan  pita serapan  kuat  pada  daerah  panjang  gelombang sinar  ultraviolet  dan  daerah  spektrum  sinar tampak.  Prinsip  pengujian  total  flavonoid  secara kuantitatif  menggunakan  AlCl₃  yakni  adanya pembentukan kompleks stabil C-4 gugus keto, C-3  atau  C-5  C-5  gugus  hidroksil  dari  flavon dan flavonol. Karena kuersetin termasuk dalam kelompok  flavonoid  kelas  flavonol,  kompleks stabil dengan gugus ortohidroksil pada struktur flavonoid  akan  terbentuk  karena  adanya penambahan  AlCl 3 atau  kation  aluminium. Struktur  flavonoid  kuersetin  memiliki  gugus keto  pada  atom  C-4  dan  gugus  hidroksil  pada atom  C-3  dan  C-5  yang  bertetangga  (Sari, 2017).
Pada  pengujian  kadar  total  flavonoid terlebih dahulu ditentukan panjang gelombang maksimum  kuersetin  sebagai  standar  yang digunakan  untuk  mengukur  total  flavonoid pada  sampel,  diperoleh  panjang  gelombang maksimum  yakni  437,3  nm  dengan  nilai absorbansi  0,648  pada  konsentrasi  120  ppm. Hal  ini  diperkuat  dari  hasil  penelitian  bahwa kuercetin  hanya  menyerap  cahaya  dalam kisaran  400-500  nm  ketika  kation  aluminium ditambahkan  ke  dalam  larutan  (Da  Silva Uebel  et  al.,  2016).  Selain  penentuan  panjang gelombang  maksimum  juga  ditentukan  waktu inkubasi  maksimum  atau  penentuan operating time sehingga intensitas warna selama periode inkubasi  pengamatan  kadar  total  flavonoid  yang dihasilkan  secara  maksimal.  Hasil  penentuan waktu inkubasi maksimum diperoleh pada menit ke-10 berdasarkan pengamatan nilai absorbansi maksimum pada panjang gelombang 437,3 nm. Adapun  tabel  hasil  penentuan  waktu  inkubasi
maksimum  flavonoid  ditunjukkan  pada  Tabel 2.  Adapu  kurva  kalibrasi  kuersetin  yang diperoleh pada panjang gelombang maksimum ditunjukkan pada Gambar 1.

## Gambar 1. Kurva kalibrasi kuersetin
Tabel 2 Penentuan masa inkubasi maksimum flavonoid Waktu (menit) Absorbansi 5 0,677 10 0,705 15 0,694 20 0,530 25 0,444
Dari penentuan kurva kalibrasi diperoleh bahwa  semakin  tinggi  perlakuan  konsentrasi maka  akan  semakin  tinggi  absorban.  Adapun persamaan regresi linier yaitu  y = 0,0038x +  0,032  dengan  nilai  koefisien  korelasi  (r)  = 0,9996. Nilai r semakin mendekati 1 pada kurva baku  linear  menunjukkan  adanya  hubungan antara konsentrasi larutan kuersetin dengan nilai serapan  (Sari,  2017).  Sehingga,  persamaan kurva  kalibrasi  kuersetin  digunakan  untuk penentuan konsentrasi senyawa flavonoid pada sampel daun cocor bebek. Nilai absorbansi dari ekstrak  etanol  daun  cocor  bebek  diplotkan terhadap  kurva  standar  kuersetin  untuk menghitung nilai kadar total flavonoid. Adapun nilai  kadar total flavonoid  yang diperoleh dari hasil  replikasi  3  kali  ulangan  sebesar  8,77% KE.

## 4.  Antioksidan
Aktivitas  antioksidan  dalam  penelitian ini  diukur  menggunakan  metode  penangkal radikal bebas 2,2-diphenylpicryhydrazyl (DPPH).  Satuan  antioksidan  yang  diukur dalam  penelitian  ini  berupa  konsentrasi penghambatan      ( inhibition      concentration ) atau  IC 50 .  IC 50 antioksidan  diartikan  sebagai konsentrasi  sampel  yang  menghambat  50%
aktivitas radikal bebas DPPH (Molyneux, 2004; Nofita  et.al.,  2021).  Metode  ini  menggunakan molekul  DPPH,  molekul  ini  me  ngandung nitrogen  tidak  stabil  dengan absorbansi maksimum  pada  estimasi  panjang  gelombang 515-520  nm  (Suryanti  et  al.,  2018).  Dalam penelitian  ini  diperoleh  panjang  gelombang maksimum  DPPH  konsentrasi  0,2  mM  yakni pada  516  nm. Hal  yang  sama  dilaporkan  oleh Yulizar et al., (2020) bahwa panjang gelombang maksimum pengamatan penangkalan DPPH yakni  516 nm, DPPH akan mengalami reduksi dari yang awalnya berawarna ungu menjadi kuning memucat yakni karena  adanya  pembentukan  DPPH-hidrazin. Selain pengujian panjang gelombang maksimum, hasil pengujian inkubasi maksimum pengujian  antioksidan  yang  diperoleh  yakni menit  ke-25,  sehingga  lama  waktu  inkubasi sebelum  pengamatan  menggunakan  UV-VIS pada panjang gelombang  516 nm yakni selama 25 menit.
Hasil menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun cocor bebek memiliki aktivitas antioksidan yang  kuat  dengan  nilai  IC 50 97,4213  ppm, sedangkan  pembanding  kuersetin  memiliki aktivitas  antioksidan  yang  sangat  kuat  dengan nilai  IC 50 5,1499  ppm.  Secara spesifik  dikatakan sebagai  antioksidan  sangat  kuat  untuk  IC 50 bernilai  <50  ppm,  kuat  jika  IC 50 bernilai  50- 100  ppm,  sedangkan  untuk  IC 50 101-150  ppm dan  lemah  untuk  IC 50 ˃  150  ppm  (Haerani  et al.,  2019;  Setha  et  al.,  2013).  Berdasarkan klasifikasi  tersebut,  ekstrak  etanol  daun  cocor bebek  memilkiki  aktivitas  antioksidan  yang kuat,  sedangkan  aktivitas  kontrol  (kuersetin) memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  sangat kuat.  Komponen  fenolik  seperti  flavonoid, asam fenolik, dan diterpen fenolik memberikan efek antioksidan terbesar (Ashfak et al., 2016; Simon et al., 1999).
Salah  satu  zat  pereduksi  yang  dapat menghambat  reaksi  oksidasi  adalah  flavonoid. Kemampuan  antioksidan  metabolit  sekunder flavonoid  begantung  pada  konfigurasi  atau gugus  fungsional  yang  ada  pada  struktur flavonoid, terutama keberadaan struktur hidroksil pada cincin aromatik B pada struktur flavonoid  menjadi  penentu  penangakalan radikal bebas (Kumar & Pandey, 2013).
Aktivitas  antioksidan meningkat apabila gugus  hidroksil  pada  struktur  B  flavonoid banyak,  dan  akan  menurun  dengan  adanya gugus  glikosida  (Fukumoto  &  Mazza,  2000). Flavonoid  juga  berperan  dalam  menghambat enzim  monooksigenase  mikrosomal,  xantine oksigenase,  lipooksigenase  dan  gluthathione S-tranferase  yang  terlibat  dalam  perbanyakan ROS (Mierziak & Kostyn, 2014).
Ekstrak etanol cocor bebek yang diamati dalam  penelitian  ini  diketahui  mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, triterpenoid,  tanin  dan  fenol.  Ekstrak  daun cocor  bebek  tidak  mengandung  senyawa steroid.  Kadar  total  flavonoid  ekstrak  etanol sebesar 8,77% kuersetin dengan waktu inkubasi maksimum  10  menit  dan  panjang  gelombang maksimum  437,3  nm.  Aktivitas  antioksidan ekstrak  etanol  daun  cocor  terhadap  DPPH memiliki  penghambatan  IC 50 sebesar  97,42 ppm.

## 4.  DAFTAR PUSTAKA
Abdullah  R  Abubakar,  M.  H.  (2020).
Preparation  of  Medicinal  Plants:  Basic Extraction  and  Fractionation  Procedures for  Experimental  Purposes. Journal  of Pharmacy Bioallied Science , 12 (1), 1–10.
Anwar  K,  Lokana  F.  M,  Budiarti,  A.  (2022). Antioxidant Activity of Dewandaru Leaf (Eugenia  UnifloraL.)  Ethanol  Extract and  Determination  of  Total  Flavonoid and  Phenolic  Content.  Jurnal  Ilmiah Sains, Oktober 2022, 22(2):161-171.
Ashfak, K., Chowdhury, A., Huq, M. E., Ali, S.,
Huq, I., Royhan, M. J., Chy, N. U., Kabir, I., Bin, R., & Auniq, J. (2016). Antioxidant ,  cytotoxic  and  thrombolytic  activity  of leaves  of  Kalanchoe  pinnata  (  LAM  .) PERS  . Journal  of  Pharmacognosy  and Phytochemistry , 5 (4), 309–315.
Astri  Pinilih,  H.  (2014).  Uji  Sensitivitas
Ekstrak     Daun     Cocor Bebek (Kalanchoe pinnata) Terhadap Staphylococcus aureus. Jurnal Kedokteran  Dan  Kesehatan , 1 (1),  35–
42.
Bhairappa, A. A.,  Dhoble,  V.  V,  &  Potabatti,
N.  V.  (2016). A  comparative  study  on the  antioxidant  activity  of  selected
medicinal plant extracts . 4 (1), 11–13.
Bhatti,  M.,  Kamboj,  A.,  Saluja,  A.,  &  Jain,  U. (2012). In vitro evaluation and comparison of  antioxidant  activities  of  various extracts of leaves and stems of Kalanchoe pinnatum. International Journal of Green Pharmacy , 6 (4),  340–347.  https://doi. org/10.4103/0973-8258.108255
Bustanussalam.  (2016).  Pemanfaataan  Obat
Tradisional (Herbal) Sebagai Obat Alternatif. BioTrends , 7 (1), 20–25.
Da  Silva  Uebel,  L.,  Angelica  Schmatz,  D.,
Goettems  Kuntzler,  S.,  Lima  Dora,  C., Luiza  Muccillo-Baisch,  A.,  Alberto Vieira  Costa,  J.,  &  Greque  De  Morais, M.  (2016).   Quercetin   and   curcumin in      nanofibers      of        polycaprolactone and poly(hydroxybutyrate-co- hydroxyvalerate): Assessment of in vitro antioxidant  activity. Journal  of  Applied Polymer  Science , 133 (30),  1–7.  https:// doi.org/10.1002/app.43712
Dwitiyanti,  Harahap, Y.,  Elya,  B.,  &  Bahtiar, A.  (2019).  Impact  of  solvent  on  the characteristics  of  standardized  binahong leaf (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis). Pharmacognosy  Journal , 11 (6),  1463– 1470. https://doi.org/10.5530/ PJ.2019.11.226
Elfahmi,  Woerdenbag,  H.  J.,  &  Kayser,  O.
(2014).  Jamu:  Indonesian  traditional herbal medicine towards rational phytopharmacological  use. Journal  of Herbal  Medicine , 4 (2),  51–73.  https:// doi.org/10.1016/j.hermed.2014.01.002
Fukumoto  LR,  M.  G.  (2000).  Assessing Antioxidant  and  Prooxidant  Activities of  Phenolic  Compounds. Journal  of Agricultural and Food Chemistry , 48 (8), 3597–3604.
Haerani,  A.,  Chaerunisa,  A.  Y.,  &  Subarnas, A. (2019).  Antioxidant  Activities  of Muntingia  calabura,  Syzygium  cumini, Ocimum  basilicum,  and  Eleutherine bulbosa using DPPH Method. Indonesian Journal  of  Pharmaceutics , 1 (2),  57–61. https://doi.org/10.24198/idjp.v1i2.21531
Halliwell, B., Gutteridge, J.,M., C. (1999).
Lipid  peroxidation:  a  radical  chain reaction. In: Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C. (Eds.), Free radicals  in  biology and  medicine . Clarendon Press.
Hasim,  H.,  Nuris,  M.  A.,  Setyono,  A.,
Qomaliyah,  E.  N.,  &  Faridah,  D.  N (2020).  Ekstrak  Angkak  dan  Bekatul untuk  Mencegah  Peroksidasi  Lipid Tikus  Spague-Dawley  Hiperglikemik. Jurnal  Aplikasi  Teknologi  Pangan ,
9 (2), 62–69.
Kistanti  H.  (2012). Obat-obatan  Herbal Ramuan Herbal Pusaka Penyembuh 101 Penyakit (Cetakan 1). Salam media.
Kumalasari,  M.  L.  F.,  &  Andiarna,  F.
(2020).  Uji  Fitokimia  Ekstrak  Etanol Daun  Kemangi  (Ocimum  basilicum  L).
Indonesian  Journal  for  Health  Sciences ,
4 (1),
39. https://doi. org/10.24269/ijhs.v4i1.2279
Lindawati,  N.  Y.,  &  Ma’ruf,  S.  H.  (2020).
Penetapan Kadar Total Flavonoid Ekstrak Etanol Kacang Merah (Phaseolus vulgaris  L.)  secara  Spektrofotometri Visibel. Jurnal Ilmiah Manuntung, 6(1),  83.
Maritim, A. C.,  Sanders,  R. A., & Watkins, J. B. (2003).  Diabetes,  oxidative  stress, and  antioxidants:  A  review. Journal  of Biochemical  and  Molecular  Toxicology ,
17 (1),  24–38.  https://doi.org/10.1002/ jbt.10058
Matough,  F.  A.,  Budin,  S.  B.,  Hamid,  Z.  A., Alwahaibi, N., & Mohamed, J. (2012). The role  of  oxidative  stress  and  antioxidants in diabetic complications. Sultan Qaboos University Medical Journal , 12 (1), 556– 569.
Mierziak  J,  Kostyn  K,  K.  A.  (2014).
Flavonoids  as     Important     Molecules
of
Plant  Interactions  with  the
Environment:  a  Review. Molecules ,
19 (4), 16240:16265.
Molyneux,  P.  (2004).  The  use  of  the  stable free      radical      diphenylpicryl- hydrazyl  (  DPPH  )  for  estimating antioxidant  activity. The  Use  of  Stable Free Radical Dipenhylpicrylhidrazyl
(DPPH)  for  Estimating  Antioxidant Activity , 50 , 211– 219.
Nofita,  Tutik,  Garini  T.  2021.  Pengaruh Pemilihan Teknik Ekstraksi Daun Jambu
Biji  Australia  (Psidium  guajava  L.) Terhadap  Aktivitas  Antioksidan  Dengan Metode DPPH. Jurnal Farmasi Malahayati . 4(1): 12-21.
Nurcholis,  W.,  Marliani,  N.,  Adam,  F., Da’inawari, K. S. F., & Mukti, Khalissa Sekar Amanda Sudarjat, T. R. U. (2023). Uji  Sitoksisitas  ,  Fitokimia  Kualitatif  , dan  Antibakteri  pada  Lima  Genotipe Rimpang  Temu  Hitam (  Curcuma aeruginosa  Roxb  ) , Jurnal  Sains  dan Teknologi , 6 (1), 1–11.
Okwu, D. ., & Nnamdi, F. . (2011). Journal of Chemical  and  Pharmaceutical  Research Two novel flavonoids from Bryophyllum pinnatum and their. Journal of Chemical and  Pharmaceutical  Research , 3 (2),  1–
10.
Prasad  AK, Kumar  S,  Iyer  SV,  Sudani  RJ,
V. S. (2012). Pharmacognostical, phytochemical and pharmacological
review on Bryophyllum pinnata. International Journal of Pharmaceutical
& Biological Archive , 3 (1), 423–433.
Raj,A., Gururaja, M. P., Joshi, H., & Shastry, C. S. (2014). Kalanchoe pinnatum in treatment of  gallstones:  An  ethnopharmacological review. International Journal of PharmTech Research , 6 (1), 252–261.
Rajsekhar,  P.  B.,  Arvind  Bharani,  R.  S., Ramachandran,  M.,  Jini  Angel,  K.,  & Rajsekhar, S. P. V. (2016). The “wonder plant” Kalanchoe pinnata (linn.) pers.: A review. JournalofApplied Pharmaceutical Science , 6 (3), 151–158.
Rohman,  A.  (2007).  Kimia  farmasi  analisis. Pustaka Pelajar, Yogyakarta , 222.
Ruslan,  K.,  Happyniar,  S.,  &  Fidrianny,  I. (2018).  Antioxidant  potential  of  two varieties  of  Sesamum  indicum  L. collected  from  Indonesia. Journal  of Taibah  University  Medical  Sciences , 13 (3), 211–218.
Safitri,  A.  R.,  Mohammad,  A.,  &  Abror,  I. (2013).  Uji  Efek  Analgetik  Infusa  Daun Cocor Bebek (Kalanchoe Pinnata (Lam.)
pers.)  Terhadap  Mencit  Jantan  Galur Swiss  Yang  Diinduksi  Dengan  Asam Asetat. Jurnal  Mahasiswa  PSPD  FK Universitas Tanjungpura , 3 (1).
Saklayen, M., G. (2018). The Global Epidemic of  the  Metabolic  Syndrome.  Current Hypertension Reports, 20(12), 1–8.
Sakti, A. S., Saputri, F. C., & Munim, A. (2019). Microscopic  characters,  phytochemical screening  focus  on  alkaloid  and  total phenolic content of Uncaria gambir Roxb. and  uncaria  sclerophylla  Roxb.  Leaves. Pharmacognosy Journal , 11 (1), 119–123.
Sari, A. K., Ayuchecaria, N. (2017). Penetapan Kadar Fenolik Total Dan Flavonoid Total Ekstrak  Beras  Hitam (Oryza  sativa  L  ) dari  Kalimantan  Selatan . 2 (September),
327–335.
Setha, B., Gaspersz, F. F., Idris, A. P. S., Rahman,
S.,  &  Mailoa,  M.  N.  (2013).  Potential Of Seaweed Padina Sp. As A Source Of Antioxidant. International  Journal  of Scientific  &  Technology  Research , 2 (6),
221–224.
Sharker, S. M., Hossain, M. K., Haque, M. R., Chowdhury, A. A., Kaisar, A., Hasan, C. M., & Rashid, M. A. (2012). Chemical and biological  studies  of  Kalanchoe  pinnata (Lam.)  growing  in  Bangladesh. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine ,
2 (3  SUPPL.),  S1317–S1322.  https://doi. org/10.1016/S2221-1691(12)60408-0
Shashank  Kumar,  A.  K.  P.  (2013).  Review
Article Chemistry and Biological Activities  of  Flavonoids:  An  Overview.
The Scientific World Journal , 1 (13), 34–
42.
Siadi,  K.  (2012).  Ekstrak  Bungkil  Biji  Jarak Pagar Jatropha curcas sebagai Biopestisida yang Efektif dengan Penambahan Larutan NaCl. Jurnal MIPA , 35 (1), 77–83.
Simon JE, Morales MR, Phippen WB, Vieira RF, H. Z. (1999). Basil: a source of aroma compounds  and  a  popular  culinary  and ornamental  herb.  In  J.  Janick  (Ed.),
Perspectives on new crops and new uses . ASHS Press.
Singh, S. K., Patel, J. R., & Dangi, A. (2019).
Physicochemical, Qualitative and Quantitative  Determination  of  Secondary Metabolites  and  Antioxidant  Potential of Kalanchoe  Pinnata  (Lam.)  Pers.  Leaf Extracts. Journal  of  Drug  Delivery  and Therapeutics , 9 (1),  220–224.  https://doi. org/10.22270/jddt.v9i1.2225
Sonam,  Mehta.,  Singh,  R.P,  Pooja,  S.  2017. Phytochemical  Screening  and  TLC Profiling of Various Extracts of Reinwardtia indica, Journal of Pharmacognosy and Phytochemical
Research , 9(4); 523-527. Suryanti,  V.,  Wibowo,  F.  R.,  Khotijah,  S., &  Andalucki,  N.  (2018).  Antioxidant
Activities of Cinnamaldehyde Derivatives. IOP  Conference  Series: Materials  Science  and  Engineering ,
333 (1). https://doi.org/10.1088/1757- 899X/333/1/012077
Winahyu,  DA.,  Retnaningsih,  A,  Aprilia.
(2019). Penetapan Kadar Flavonoid Pada
Kulit Batang  Kayu Raru (CotylelobiummelanoxylonP) Dengan Metode Spektrofotometri UV-VIS.
Jurnal Analis Farmasi , 4(1): 29-36
Verma,  P.,  Gauttam,  V.,  &  Kalia,  A.  N. (2014).      Comparative      pharmacognosy of  Pashanbhed. Journal  of  Ayurveda and  Integrative  Medicine , 5 (2),  104– 108. https://doi.org/10.4103/0975- 9476.131728
Yulizar, Y., Kusrini, E., Apriandanu, D. O. B., &
Nurdini, N. (2020). Datura metel L. Leaves extract  mediated  CeO2  nanoparticles: Synthesis, characterizations, and degradation  activity  of  DPPH  radical.
Surfaces  and  Interfaces , 19 (March), 100437. https://doi.org/10.1016/j. surfin.2020.100437
Załuski, D., Cies  la, Ł., & Janeczko, Z. (2015). The     structure-activity     relationships of  plant  secondary  metabolites  with antimicrobial,  free  radical  scavenging and  inhibitory  activity  toward  selected enzymes. In Studies in Natural Products  Chemistry (Vol.  45).  https:// doi.org/10.1016/B978-0-444-63473- 3.00007-1