## Research Article

## P erbaikan Metode Ekstraksi dsRNA Virus secara Sederhana untuk RT-PCR Tiga Virus Tumbuhan
Improvement of Simple dsRNA Virus Extraction Method for RT-PCR of Three Plant Viruses
Wiwik Endarsih 1) * , Sedyo Hartono 2) , & Sri Sulandari 2)
1) Balai Besar Karantina Pertanian Surabaya Jln. Raya Ir. H. Juanda, Sidoarjo, Jawa Timur 61253
2) Departemen Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada Jln. Flora 1, Bulaksumur, Sleman, Yogyakarta 55281
*Penulis untuk korespondensi. E-mail: weendarsih@gmail.com

## ABSTRACT
Replicative form (RF) of RNA viruses are dsRNA structured nucleic acid, always found in plants infected by RNA virus. The principle of dsRNA extraction is based on the different affinity of nucleic acids for the cellulose powder and the specific adsorption in 16.6% ethanol buffer. The study aims to develop the simple dsRNA extraction method for the preparation of RT-PCR detection for Rehmannia mosaic virus (ReMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tomato chlorosis virus (ToCV), and compared with commercial kit. The analysis was performed by quantification of nucleic acid with spectrophotometer, efficiency of method (level of complexity, time, cost per reaction) and sequencing. The RNA concentration with simple methode of dsRNA extraction was lower than kit extraction method but the both methods have same pure RNA result. The PCR and sequencing result showed that viral pathogen of pepper, tobacco, and tomato leaf was CMV, ReMV, and ToCV, respectively with amplicon size at 500, 568, and 360 bp. This method is quite cheap and the RNA quantity is proportional to the commercial kit. The simple method of dsRNA extraction can be proposed for the preparation of RT-PCR detection for CMV, ReMV, ToCV.
Keywords: cellulose powder, dsRNA extraction, Rehmannia mosaic virus , RNA quantity, RT-PCR

## INTISARI
Replicative form (RF) virus RNA merupakan asam nukleat berstruktur dsRNA, selalu ditemukan pada tumbuhan terinfeksi oleh virus RNA. Prinsip kerja ekstraksi dsRNA berdasarkan afinitas serbuk selulosa terhadap asam nukleat dan adsorbsi spesifik dsRNA pada konsentrasi etanol 16,6 %. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode ekstraksi dsRNA secara sederhana untuk preparasi deteksi RT-PCR terhadap Rehmannia mosaic virus (ReMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tomato chlorosis virus (ToCV) dan dibandingkan dengan kit komersil. Data yang dibandingkan adalah kuantitas asam nukleat, analisa efisiensi metode (tingkat kerumitan, waktu, biaya per reaksi) serta sekuensing. Konsentrasi RNA hasil ekstraksi metode dsRNA secara sederhana lebih rendah dibanding dengan metode kit, namun kedua metode menghasilkan RNA yang murni. Berdasarkan hasil PCR dan sekuensing disimpulkan bahwa virus penyebab mosaik daun lada dan tembakau serta klorosis daun tomat berturut-turut adalah CMV, ReMV, dan ToCV dengan ukuran amplikon berturut turut 500, 568 dan 360 pb. Metode ini cukup murah dan kuantitas RNA yang dihasilkan sebanding dengan kit komersil. Ekstraksi RNA menggunakan metode dsRNA secara sederhana dapat dikembangkan untuk preparasi deteksi RT-PCR terhadap CMV, ReMV, ToCV.
Kata kunci: ekstraksi dsRNA, kuantitas RNA, Rehmannia mosaic virus , RT-PCR, serbuk selulosa
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, Vol. 21, No. 2, 2017: 106–113 DOI: 10.22146/jpti.26026

## PENGANTAR
Ekstraksi double stranded RNA (dsRNA) virus merupakan salah satu pendekatan dalam mendeteksi virus RNA (ssRNA dan dsRNA) dari jaringan tanaman. Metode ini telah diaplikasikan untuk deteksi virus yang tidak dapat ditularkan secara mekanik (Dodds et al. , 1984), virus pada tanaman berkayu yang mengandung
senyawa fenol dan polisakarida tinggi (Watkins et al ., 1990; Jones, 1992), satelit virus, subgenom RNA virus dan mycovirus (Morris & Dods, 1979; Okada, 2015). Molekul dsRNA dengan berat molekul tinggi (> 0,1 ×10 6 Da) ini disintesis ketika replikasi virus RNA di mana pada fase replicative intermediet (RI), sintesis ssRNA membentuk komplementer berupa replika
Diterima 19 Juni 2017; diterima untuk diterbitkan 19 September 2017
dari ssRNA (Balijja et al. , 2008). Produk dari fase RI ini  adalah  asam  nukleat  yang  berstruktur  dsRNA yang lazim disebut replicative form (RF) yang selalu ada pada tumbuhan terinfeksi virus ssRNA (Dodds et al ., 1984; Valverde, 1990). Hal inilah yang mendasari deteksi dan deskripsi dsRNA untuk diagnosis penyakit, dimana stabilitas pada perubahan suhu (Karan et al ., 1991) dan resistensi terhadap degradasi RNAse (Edy et al ., 1976) menyebabkan dsRNA dijadikan sebagai matrik untuk karakterisasi virus RNA (Tzanetakis & Martin, 2008) yangmendominasi sebagai virus patogen tanaman.
Metode ekstraksi dsRNA secara sederhana lebih menguntungkan karena diperoleh RNA partikel virus saja secara cepat dan mudah sehingga meminimalkan campuran dengan RNA lain (Okada et al. , 2015). Hal ini karena prinsip kerja ekstraksi dsRNA berdasarkan afinitas serbuk selulosa terhadap asam nukleat dan adsorbsi spesifik dsRNA pada konsentrasi etanol 16,6% (Dodds et al. , 1984). Pemilihan metode ekstraksi RNA terutama yang mampu meminimalkan sejumlah inhibitor reverse transcriptase dan/atau polymerase dalam ekstrak tanaman sehingga akan menghalangi deteksi virus meskipun virus ada dalam ekstrak (Azizi et al. , 2017). Polivynil pirolidone dengan polifenol komplek (John, 1992) dan/atau merkaptoetanol dapat berperan sebagai sebuah antioksidan, digunakan secara bersama dalam sebuah prosedur ekstraksi oleh beberapa peneliti dalam usaha untuk mengurangi level inhibitor (Nassuth et al ., 2000) seperti halnya polisakarida atau polifenol dalam jaringan tanaman (Newbury & Possingham, 1977; Sahu et al., 2012; John, 1992). Menurut Li et al. (2008) RNeasy Plant Mini Kits (Qiagen) tidak sesuai untuk tanaman yang kandungan polifenol dan polisakarida tinggi serta menghasilkan konsentrasi RNA Turnip mosaic virus rendah dengan kemurnian tinggi untuk mengekstraksi benih Brassica rappa (Adiputra et al. , 2012). Penelitian sebelumnya telah menggunakan teknik ini untuk deteksi mikovirus dan beberapa virus tanaman, namun analisa terhadap dsRNA terbatas dilakukan pada analisis fragmen dsRNA pada gel elektroforesis. Penelitian di Indonesia yang menggunakan metode ini untuk deteksi virus tanaman maupun mikovirus sangat sedikit, kebanyakan saat ini menggunakan kit komersil. Pada penelitian ini akan mengembangkan aplikasi ekstraksi dsRNA sederhana untuk preparasi deteksi RT-PCR terhadap virus tanaman yaitu Tomato chlorosis virus (ToCV), Tobamovirus, dan Cucumber mosaic virus (CMV).

## BAHAN DAN METODE

## Penyiapan Bahan Tanaman
Sampel virus ada 5 berupa Tobamovirus pada daun tembakau ( Nicotiana tabacum L.), CMV pada daun lada ( Piper nigrum L.), daun tomat ( Solanum lycopersicum L.), Chenopodium amaranthicolor H.J. Coste & A. Reyn. yang diinokulasi mekanik meng- gunakan sap Tobamovirus dan CMV (berturut-turut dengan kode sampel Te,L,To, Ca-Tobamovirus, Ca- CMV) dalam 0,1 M buffer sitrat yang mengandung 0,1% Na 2 SO 3 (pH 7) dengan perbandingan 1:10 (w/v) dengan bantuan karborundum (600 mesh). Masing- masing sampel dipotong kecil-kecil dan dilumatkan kemudian tiap sampel dibagi menjadi 4 untuk diuji menggunakan duametode ekstraksi yaitu dsRNA secara sederhana dan kit komersial.

## Ekstraksi RNA Virus Tanaman
Ekstraksi dsRNA virus mengacu pada metode yang diperkenalkan Okada et al . (2015) dengan sedikit melakukan modifikasi. Micro-spin column digunakan untuk mengikat dsRNA, tersusun atas tabung berukuran 0,6 ml yang telah dilubangi ujungnya menggunakan jarum yang ditempatkan ke dalam tabung berukuran 2 ml. Tabung berukuran 0,6 mL diisi dengan 500 µl 50% selulosa D dalam buffer pencuci 1x STE (100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0) mengandung 16,6 % (v/v) etanol. Buffer pen- cuci dalam column dihilangkan dengan disentrifugasi pada 10.000×g selama 5 detik sebelum digunakan. Proses ekstraksi diawali dengan menimbang sampel daun sebanyak 0,1–0,2 g kemudian digerus meng- gunakan nitrogen cair, dengan ditambahkan 500 µl buffer ekstraksi kemudian larutan ekstrak di transfer ke tabung 1,5 ml. Bergantung pada sampel tanaman, ditambahkan sekitar 10 mg polyvinylpoly pyrrolidone (PVPP) untuk menghilangkan senyawa fenol seperti lignin, tannin dan melanin yang mengotori kemurnian asam  nukleat.  Phenol-Cloroform-IsoamilAlkohol/ PCIAA (25:24:1) sebanyak 500 µl ditambahkan ke dalam larutan ekstrak dan divortex selama 1 menit, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 20.000×g selama 5 menit. Langkah ini diulangi jika supernatan masih keruh. Sebanyak 400 µl supernatan sampel di- transfer ke tabung 1,5 ml baru, kemudian 80 µl etanol (konsentrasi akhir 16,6%) ditambahkan. Larutan yang diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 20.000×g selama 3 menit, supernatan ditransfer ke micro-spin column. Kemudian column disentrifugasi dengan
Endarsih et al. : Perbaikan Metode Ekstraksi dsRNA Virus untuk RT-PCR Virus Tumbuhan
kecepatan 10.000×g selama 5 menit, sehingga akan terikat banyak dsRNA, beberapa ssRNA dan DNA pada selulosa, cairan yang terkumpul di bawah column dibuang.  400  µl  buffer  pencuci  ditambahkan  ke dalam column , kemudian column disentrifugasi dengan kecepatan 10.000×g selama 5 menit untuk meng- eliminasi ssRNA dan DNA yang terikat pada selulosa, cairan yang terkumpul di bawah column dibuang, langkah ini diulang 2 kali. Setelah pencucian yang terakhir, column disentrifugasi  dengan  kecepatan 10.000×g selama  5  menit  untuk  menghilangkan etanol dari selulosa D. Tabung 0,6 ml ditempatkan pada tabung 2 ml baru dan ditambahkan 400 µl buffer elusi ke column , kemudian column disentrifugasi dengan kecepatan 10.000×g selama 5 detik. Proses elusi akan didapatkan dsRNA murni, tabung 0,6 ml dibuang. Kemudian ditambahkan 40 µl sodium asetat 3 M (pH 5,2) dan 1 mL etanol 99,5%, disimpan di suhu -20 o C selama 30 menit hingga semalam. Setelah itu tabung disentrifugasi dengan kecepatan 20.000×g selama 5 menit untuk presipitasi dsRNA. Cuci tabung dengan 100 µl alkohol 70% kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000×g selama 2 menit, alkohol dibuang secara hati-hati menggunakan pipet, langkah ini diulangi sekali lagi kemudian dikeringanginkan. dsRNA dilarutkan dalam 30 µl nuclease free water . Sebagai  pembanding  digunakan  metode  ekstraksi RNA total sesuai prosedur RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Jerman).

## Pengukuran Hasil Ekstraksi RNA
Total RNA hasil ekstraksi diukur kemurnian dan konsentrasinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (Nano Vue- Biochrom, USA). Pengukuran konsentrasi RNA di- lakukan pada panjang gelombang 260 nm dengan perhitungan 1 nilai absorbansi sama dengan 40 µg/ml. Kemurnian RNA total dari protein ditentukan ber- dasarkan  rasio  nilai  absorbansi  pada  panjang gelombang 260 dan 280 nm (A260/A280) (Rapley & Heptinstall, 1998).
Sintesis dan Amplifikasi complementary -DNA (cDNA) Sintesis  cDNA  menggunakan RevertAid  First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, USA) dalam total volume 20 µl dengan komposisi bahan 4 µl Reaction buffer 5x, 2 µl dNTP Mix 10 mM, 1 µl Oligo dT Primer 100 µM (digantikan dengan 1 µl Random primer untuk sintesis cDNA ToCV), 1 µl RiboLock RNaseInhibitor (20 U/µl), 1 µl ReverAid M-MuLV (200 U/µl), 3 µl template RNA, 8 µl nuclease free water . Reaksi sintesis  cDNA diinkubasi dalam Thermal Cycler (Mini cycler-Biorad, USA), dimana untuk ReMV dan CMV dengan program 65 o C selama 5 menit, 42 o C selama  60 menit, 70 o C selama 5 detik, 4 o C selama 5 menit. Sedangkan untuk ToCV inkubasi dilakukan dengan program 65 o C selama 5 menit, 25 o C selama 5 menit, 42 o C selama  60 menit, 70 o C selama 5 detik, 4 o C selama 5 menit. Reaksi amplifikasi cDNA tiap virus dilakukan secara terpisah menggunakan Ready to go PCR Bead menggunakan primer spesifik masing-masing (Tabel 1.) dan dengan siklus PCR yang berbeda-beda sesuai dengan suhu optimasi masing-masing (Tabel 2). Ada- pun total volume Ready To Go PCR Bead 25 µl dengan komposisi primer spesifik virus forward dan reverse masing-masing 1 µl, cDNA template 3 µl dan nuclease free water 19 µl. Reaksi amplifikasi cDNA diinkubasi dalam Thermal Cycler dengan suhu seperti pada Tabel 2. Visualisasi produk amplifikasi dilakukan menggunakan 1% gel agarosa dalam  TBE 1× (Tris-borate EDTA) dengan elektroforesis selama 30 menit pada 100 Volt.

## Analisis Data
Produk PCR dari masing-masing sampel dikirim ke PT Genetika Science untuk dilakukan sekuensing nukleotida. Hasil sekuen nukleotida kemudian digunakan untuk analisis kesejajaran dengan sekuen nukleotida ToCV, Tobamovirus atau CMV yang telah dipublikasikan di GenBank dengan program Basic Local Alignment Search Tools (BLAST). Hasil sekuensing berupa kromatogram dibaca dan disejajarkan urutan basa nukleotida menggunakan program Mega 5.1.
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia                                                                Vol. 21 No. 2
108
Target Kode Primer Urutan Basa Primer (5’-3’) Ukuran Produk Referensi CMV CMV-P1 GCCGTAAGCTGGATGGACAA 500 pb Wylie et al . (1993) CMV-P2 TATGATAAGAAGCTTGTTTCGCG ToCV ToCV-CF   GTGTCAGGCCATTGTAAACCAG 360 pb Hartono et al . (2003) ToCV-CR CACAAAGCGTTTCTTTTCATAAGCAGG Tobamovirus TobRT-up1  GARTAYSCIGCIYTICARAC 568 pb Dovas et al. (2004) TobRT-do2 BGCYTCRAARTTCCA
Tabel 1. Sekuen Primer untuk amplifikasi CMV, ToCV, dan Tobamovirus

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Secara  kuantitas,  konsentrasi  dsRNA  yang  di- hasilkan menggunakan metode ekstraksi dsRNA secara sederhana lebih kecil dibandingkan menggu- nakan metode ekstraksi kit, sedangkan kemurnian RNA yang dihasilkan hampir memiliki kemurnian yang tinggi di antara kedua metode yang diperoleh, berkisar 1,8−2,1 untuk metode ekstraksi secara seder- hana dan 1,9−2,1 untuk metode ekstraksi kit. RNA hasil ekstraksi ini kemudian diamplifikasi menggu- nakan RT-PCR menghasilkan amplikon berukuran 500, 568, dan 360 pb berturut turut untuk CMV, Tobamovirus, dan ToCV (Gambar 1). Konsistensi pita  DNA  yang  dihasilkan  menggunakan  kedua metode berbeda tergantung dari konsentrasi cDNA sebagai template PCR. Sebagai konfirmasi dan verifikasi terhadap hasil amplifikasi DNA yang dihasilkan, di- lakukan sekuensing dan didapatkan bahwa perunutan basa nukleotida yang dihasilkan adalah CMV, ToCV, dan spesies dari Tobamovirus yaitu Rehmannia mosaic virus (ReMV). Hasil analisis ini menunjukkan bahwa  metode  ekstraksi  dsRNA  secara  sederhana dapat dikembangkan sebagai metode preparasi RNA untuk deteksi RT-PCR yang cukup sederhana, mudah serta murah.
Perbandingan Kuantitas RNA Hasil Ekstraksi Berbagai buffer digunakan untuk mengoptimalkan pelepasan RNA dari jaringan tanaman. Ekstraksi dsRNA menggunakan fenol atau kloroform, merkaptoetanol dan PVPP-40 secara bersamaan dalam ekstraksi digunakan untuk mengeliminasi protein, polisakarida dan senyawa fenol yang dapat memengaruhi kemurnian asam nukleat. Sedangkan pada metode ekstraksi menggunakan  kit  komersial  digunakan guanidine thiocyanate atau guanidine hydrochloride sebagai buffer lisis dan mencegah aktivitas RNAse. Pada ekstraksi sampel daun lada, proses oksidasi sampel sangat cepat karena kandungan fenol yang tinggi. Polifenol akan mengikat secara kovalen dan ireversibel terhadap protein dan asam nukleat (Maréchal-Drouard
& Guillemaut, 1995), sehingga menghasilkan warna cokelat yang akan menurunkan hasil dan kualitas RNA yang diekstraksi (Porebskim et al ., 1997) serta mencegah kelarutan RNA secara sempurna. Konsentrasi RNA yang rendah pada daun lada (Tabel 3) bisa disebab- kan oleh kandungan virus dalam jaringan sedikit, proses  ekstraksi  yang  kurang  sempurna  sehingga proses pelepasan RNA dari sel kurang optimum serta rusak karena teroksidasi pada proses ekstraksi. Optimasi penggunaan buffer dilakukan dengan pengulangan penambahan PCIAA. Proses pengikatan molekul dsRNA dilakukan pada serbuk selulosa sedangkan RNA total menggunakan membran silika. Asam nukleat akan ter- absorpsi pada buffer dengan kandungan alkohol di atas 35% sementara pada konsentrasi 16,6% hanya dsRNA saja yang terikat. Pada prinsipnya RNA dapat terikat karena afinitas tinggi ikatan antara muatan positif pada membran silika maupun serbuk selulosa terhadap muatan negatif RNA. Sodium berperan sebagai kation yang dapat menarik ikatan negatif dari oksigen pada rantai fosfat asam nukleat. Kation sodium akan  memecah  ikatan  hidrogen  antara  hidrogen dalam air dan ion negatif oksigen pada silika dibawah kondisi garam tinggi (pH ≤ 7) (Tan & Yiap, 2009). Pada suasana basa akan menyebabkan hidrolisis rantai fosfat sehingga RNA akan terlepas dari ikatan pada serbuk selulosa ataupun membran silika. Penambahan etanol absolut dan sodium asetat pada proses presipitasi menghilangkan polisakarida pada asam nukleat selama proses presipitasi RNA, sedangkan pada RNEasy Mini kit tidak dilakukan presipitasi. Kemurnian dan konsentrasi RNA diukur dengan spektrofotometer pada 280 dan 260 nm. Prosedur ekstraksi molekul dsRNA dan RNA total menghasilkan kemurnian RNA tinggi namun dengan konsentrasi dsRNA yang lebih rendah dibandingkan konsentrasi RNA total. Adapun konsentrasi dan kemurnian RNA (Tabel 3) bervariasi untuk masing masing virus dimana tertinggi didapatkan konsentrasi virus pada daun tomat dan terendah pada daun lada.
No. Inkubasi PCR Target Virus Tobamovirus CMV ToCV 1 Pre denaturasi 94ºC 5 menit 94ºC 2 menit 94ºC 2 menit 2 Denaturasi 95ºC 1 menit 95ºC 30 detik 95ºC 30 detik 3 Penempelan 46ºC 1 menit 51ºC 30 detik 62ºC 30 detik 4 Pemanjangan 72ºC 1 menit 72ºC 1 menit 72ºC 1 menit 5 Pemanjangan Akhir 72ºC 5 menit 72ºC 3 menit 72ºC 5 menit Jumlah Siklus 35 × 35 × 30 × Tabel 2. Siklus PCR untuk amplifikasi CMV, ToCV, dan Tobamovirus Endarsih et al. : Perbaikan Metode Ekstraksi dsRNA Virus untuk RT-PCR Virus Tumbuhan
Amplifikasi RNA Tiga Virus Tumbuhan Menggunakan RT-PCR
Kualitas RNA hasil ekstraksi juga dianalisis meng- gunakan RT-PCR two step. Pada proses RT ini diguna- kan primer Oligo d(T) untuk mengenali ujung polytail A dari RNA Tobamovirus dan CMV untuk kemudian
ditranskrip. Lain halnya bagi RNA ToCV yang tidak memiliki poly tail A sehingga digunakan random Primer yang akan mengamplifikasi pada beberapa bagian dari mRNA.
Berdasarkan nilai absorbansi pada A260 dan A280, dengan  kemurnian  RNA  yang  sama-sama  tinggi,
Gambar 1. Visualisasi hasil PCR, pada gel agarosa 1 % dalam 1x TBE; (A) amplifikasi gen ORF2 Tobamovirus dengan metode ekstraksi dsRNA sederhana [(1) Te, (2) Ca-Tobamovirus] dan metode ekstraksi kit komersil [(3) Te, (4) Ca-Tobamovirus]; (B) amplifikasi gen RNA2 ToCV pada sampel To: (1) dengan metode ekstraksi dsRNA (2) metode ekstraksi kit komersil 2; (C) amplifikasi gen RNA3 CMV: dengan metode ekstraksi dsRNA sederhana [(1) L, (2) Ca-CMV] dan metode ekstraksi kit komersil [(3) L, (4) Ca-CMV]; (M) penanda DNA
Sampel Nilai absorbansi Rerata Kemurnian b) Konsentrasi a) (µg ml -1 ) A230 A260 A280 A260/A280 A260/A230 Metode Ekstraksi dsRNA sederhana L 0,1 0,18 0,1 1,8 1,8 4,7 Te 0,2 0,42 0,2 2,1 2,1 16,8 To 1,27 2,4 1,2 2 1,89 68 Ca-Tobamovirus 0,5 1,05 0,5 2,1 2,1 12,8 Ca-CMV 0,4 0,76 0,4 1,9 1,9 8,7 Metode Ekstraksi Kit Komersial L 10,2 7,03 3,7 1,9 0,68 85,8 Te 8,24 12,6 6,02 2,1 1,5 581,4 To 12,48 23,62 11,25 2,1 1,89 730 Ca-Tobamovirus 4,97 9,6 4,6 2,1 1,9 438,8 Ca-CMV 2,8 2,1 1 2,1 0,75 78 Tabel 3. Rerata konsentrasi (μg ml -1 ) dan kemurnian RNA sampel daun lada, tembakau dan tomat menggunakan metode ekstraksi dsRNA secara sederhana dan kit komersial
Keterangan: a) Konsentrasi diukur pada gelombang 260 nm x 40 µg ml -1 .
b) Kemurnian diukur dengan menghitung rasio absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia                                                                Vol. 21 No. 2 110
meskipun konsentrasi dsRNA lebih rendah dibanding- kan dengan RNA total namun keduanya dapat ter- amplifikasi dengan PCR. Kualitas RNA yang murni terlihat pada hasil visualisasi (Gambar 1) menunjuk- kan adanya pita DNA tunggal berukuran 500, 568, dan 368 pb berturut-turut untuk target CMV, Tobamovirus, dan ToCV. Pada deteksi ToCV diperoleh konsistensi yang sama pita DNA dari kedua metode, hal ini menunjukkan bahwa keduanya dapat menghasilkan kualitas DNA yang sama. Sedangkan pada pita DNA Tobamovirus  nampak  konsistensi  yang  berbeda, dengan metode kit komersil diperoleh pita yang lebih tebal dibanding dengan metode ekstraksi dsRNA secara sederhana, kemungkinan disebabkan oleh faktor homogenisasi sampel.

## Perunutan Basa Nukleotida Hasil Amplifikasi RT- PCR
Berdasarkan hasil sekuensing isolat Tobamovirus dari inang tembakau yang berasal dari Temanggung menunjukkan homologi 97% terhadap sekuen gen RNA3 terhadap Rehmannia mosaic virus (ReMV) pada
inang Capsicum annum isolat Japanese (AB628188.1). Sehingga  disimpulkan  bahwa  Tobamovirus  yang menginfeksi tembakau adalah ReMV.
Gejala ReMV pada tembakau sangat mirip dengan yang  ditimbulkan  oleh TMV,  namun  berdasarkan susunan basa nukleotida terdapat perbedaan antara kedua metode hal ini ditunjukkan dengan tingkat homologi sebesar 83% terhadap isolat TMV (Tabel 4). Isolat CMV pada inang lada dari daerah Putat, Yogyakarta memiliki homologi 95,5% dengan CMV pada lada dari India (KU255792.1.) (Tabel 5).  Gejala penyakit virus pada daun lada sering merupakan gejala campuran CMV dan PYMoV, namun PYMoV ini merupakan virus dengan genom DNA dengan gejala mottle . Isolat ToCV pada tomat dari Magelang menunjukkan homologi 97,5% terhadap isolat ToCV dari USA (Tabel 6). ToCV dan TICV sering berasosiasi menimbulkan gejala yang hampir sama sulit untuk dibedakan. Dari hal inilah pentingnya deteksi molekuler dilanjutkan dengan perunutan basa nukleotida untuk mengidentifikasi virus patogen tanaman.
No. Isolat Homologi (%) 1 2 3 4 5 6 1 ReMV.Jateng ID 97 93,8 93,6 83,7 78.7 2 ReMV.Jepang ID 92,6 92,4 82,8 78,3 3 ReMV.Korea ID 98,8 83 77,8 4 ReMV.China ID 83,3 78,3 5 TMV.USA ID 79,2 6 ToMV.USA ID
Tabel 4. Persentase kesamaan basa nukleotida dari gen RNA3 isolat ReMV pada tembakau ( Nicotiana tabacum L.) asal Yogyakarta dengan beberapa isolat Tobamovirus dari beberapa negara dengan program Genetyx
Keterangan: ReMV-Yogya = merupakan hasil analisis sekuen dalam penelitian ini; Capsicum annum -Jepang (AB628188.1), Rehmannia glutinosa -Korea (KU133476.1), R. glutinosa -China (EF375551.1), Tembakau-USA (NC001367.1) Tembakau-USA (KR537870.1) .
Tabel 5. Persentase kesamaan basa nukleotida dari gen RNA3 isolat CMV pada lada ( Piper nigrum L) asal Yogyakarta dengan beberapa isolat CMV dari beberapa negara dengan program Genetyx
No. Isolat Homologi (%) 1 2 3 4 5 6 1 CMV.Yogya ID 95,5 91,6 93,3 94 94 2 CMV.China ID 91,3 93,8 94 93,3 3 CMV.China ID 93,3 92,3 92 4 CMV.Korea Selatan ID 95 94,8 5 CMV.Iran ID 95,5 6 CMV.Italia ID Keterangan: CMV-Yogya = merupakan hasil analisis sekuen dalam penelitian ini; Tomat_China (EF216867), Piper nigrum -China (KU255792.1.), Capsicum annum -Korea Selatan (KC527768.1.), Brassica napus -Iran (LC066467.1.), Capsicum sp.-Italia (HE962480.1.).
Endarsih et al. : Perbaikan Metode Ekstraksi dsRNA Virus untuk RT-PCR Virus Tumbuhan
Metode ekstraksi dsRNA secara sederhana memiliki prospek untuk dikembangkan dalam deteksi virus. Seperti  diketahui  bahwa  virus  patogen  tanaman didominasi oleh virus RNA (dsRNA dan ssRNA). Metode  ini merupakan pengembangan dari metode ekstraksi dsRNA yang sebelumnya dikembangkan oleh Valverde et al . (1990) menggunakan prinsip kerja titrasi dalam volume yang lebih besar, sementara metode ekstraksi dsRNA sederhana ini dikembangkan Okada et al. (2015) ini menggunakan prinsip kerja sentrifugasi untuk memperoleh dsRNA. Berdasarkan hasil  analisis  biaya  bahan  kimia  yang  digunakan dalam  metode  ekstraksi  dsRNA  secara  sederhana jauh lebih murah dibandingkan metode ekstraksi dengan kit dan tidak memerlukan peralatan khusus.

## KESIMPULAN
Metode ekstraksi dsRNA yang diuji dapat diguna- kan untuk preparasi RNA dalam deteksi RT-PCR terhadap CMV, ReMV, dan ToCV. Metode ini mampu menghasilkan RNA dengan tingkat kemurnian tinggi sebanding dengan metode ekstraksi menggunakan kit komersil, cepat, mudah, dan murah.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Badan Penyuluhan dan Pengembangan Sumber Daya Manusia Pertanian (BPPSDM) Kementerian Pertanian yang telah membiayai sebagian dari penelitian ini. Naskah ini  merupakan  bagian  dari  tesis  yang  berjudul “Ekstraksi dsRNA secara Sederhana untuk Preparasi Deteksi RT-PCR Tiga Spesies Virus Tanaman”.

## DAFTAR PUSTAKA
Adiputra, J., S.H. Hidayat, & T.A. Damayanti, 2012. Evaluasi Tiga Metode Preparasi RNA Total untuk Deteksi Turnip  mosaic  potyvirus dari  Benih Brassica rappa dengan Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction Jurnal Fitopatologi Indonesia 8: 44−49. Azizi, P., M. Y. Rafii, M. Mahmood, S.N.A. Abdullah, M.M.Hanafi,  M.A.  Latif  &  S. Ashkani.  2017. Evaluation of RNA Extraction Methods in Rice and their Application in Expression Analysis of Resistance Genes against Magnaporthe oryzae . Biotechnology and Biotechnological Equipment 31: 75−84.
Balijja, A., A. Kvarnheden, & T. Turchetti, 2008. A Non-phenol-chloroform  Extraction  of  Double- stranded RNA from Plant and Fungal Tissues.
Journal of Virological Methods 152: 32–37. Diningsih,  E.  2016.  Carnation  mottle  virus pada Tanaman Anyelir di Indonesia: Etiologi, Ekspresi Gen Protein Selubung, dan Eliminasinya . Tesis. Institut Pertanian Bogor, Bogor. 119 p.
Dodds, J.A., T.J. Morris & R.L. Jordan, 1984. Plant Viral Double-Stranded RNA. Annual Review of Phytopathology 22: 151−168. Dovas, C.I., K. Efthimiou, & N.I. Katis, 2004. Generic Detection and Differentiation of Tobamoviruses by  a  Spot  nested  RT-PCR-RFLP  Using  dI- Containing Primers Along with Homologous dG- Containing  Primers. Journal  of  Virological Methods 117: 137–144.
Edy, V. G., M. Szekely, T. Loviny, & C. Dreyer, 1976. Action of Nucleases on Double Stranded RNA. European Journal of Biochemistry 61: 563–572.
Tabel 6. Persentase kesamaan basa nukleotida dari gen RNA2 isolat ToCV pada tomat ( Lycopersicum esculentum ) asal Magelang, Jawa tengah dengan beberapa isolat genus Crinivirus yang berbeda dengan menggunakan program Genetyx No. Isolat Homologi (%) 1 2 3 4 5 6 1 ToCV.Magelang ID 97,5 96,1 97,2 96,8 94,6 2 ToCV.USA ID 97,9 99,6 98,8 99,3 3 ToCV.Spanyol ID 98,2 97,9 97,5 4 ToCV.Korsel ID 99,6 99,3 5 ToCV.Brasil ID 98,9 6 ToCV.Yunani ID Keterangan: ToCV-Yogya = merupakan hasil analisis sekuen dalam penelitian ini; Tomat-USA (AY903448.1.), Tomat-Spanyol (KJ200309.1.), Tomat-Korea Selatan ( KP137099.1.), Tomat-Brasil ( JQ952601.1.), Tomat-Yunani (EU284744.1). Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia                                                                Vol. 21 No. 2 112
Hartono, S., T. Natsuaki, H. Sayama, H. Atarashi, & S. Okuda, 2003. Yellowing Disease of Tomatoes Caused  by Tomato  infectious  chlorosis  virus Newly Recognized in Japan, Journal of General Plant Pathology 69: 61–64.
John, M. E., 1992. An Efficient Method for Isolation of  RNA  and  DNA  from  Plants  Containing Polyphenolics. Nucleic Acids Research 20: 2381.
Karan, M., S.Hicks, R.M. Harding & D.S.Teakle, 1991.  Stability  and  Extractability  of  Double- stranded RNA of Pangola Stunt and Sugarcane Fiji  Disease  Viruses  in  Dried  Plant  Tissues. Journal of Virological Methods 33: 211–216. Karp, A., P.G. Isaac, & D.S. Ingram, 1998. Isolation of Nucleic Acids Using Silica-Gel Based Membranes: Methods  Based  on  the  Use  of  QIAamp  Spin Columns. p. 59−63. In A. Karp, D.S. Ingram, P.G. Isaac (eds.) Molecular Tools for Screening Biodi- versity . Chapman & Hall Springer, Netherlands. Li, R., R. Mock, Q. Huang, J. Abad, J. Hartung, & G.  Kinard,  2008. A  Reliable  and  Inexpensive Method of Nucleic Acid Extraction for the PCR- based  Detection  of  Diverse  Plant  Pathogens. Journal of Virological Methods 154: 48–55.
Maréchal-Drouard, L & P. Guillemaut, 1995. A Powerful but Simple Technique to Prepare Polysaccharide- free DNA Quickly and without Phenol Extraction.
Plant Molecular Biology Reporter 13: 26−30. Morris, T.J., & J.A. Dodds. 1979. Isolation and Analysis of  Double-stranded  RNA  from  Virus-infected Plant and Fungal Tissue. Journal of Phytopathology 69: 854−858.
Nassuth, A., E. Pollari, K. Helmeczy, S. Stewart, &
S.A. Kofalvi. 2000. Improved RNA Extraction and One-tube RT-PCR Assay for Simultaneous Detection  of  Control  Plant  RNA  Plus  Several Viruses in Plant Extracts. Journal of Virological Methods 90: 37–49.
Newbury, H. J., & J.V. Possingham. 1977. Factors Affecting the Extraction of Intact Ribonucleic Acid from Plant Tissues Containing Interfering Phenolic Compounds. Plant Physiology 60: 543–
547.
Okada, R., E. Kiyota, H. Moriyama, T. Fukuhara, & T. Natsuaki. 2015. A Simple and Rapid Method to Purify Viral dsRNA from Plant and Fungal Tissue. Journal of General Plant Pathology 81: 103–107. Porebskim,  S.,  L.G.  Bailey  &  B.R.  Baum. 1997. Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components. Plant Molecular Biology Reporter Journal 15: 8−15. Rapley, R. & J. Heptinstall. 1998. Protocol RNA Isolation and Characterization Protocols Volume 86 of the Series Methods in Molecular Biology. p. 65−68. In R. Rapley & D.L. Manning (eds.) Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc., New Jersey.
Sahu, S.K., M. Thangaraj, & K. Kathiresan. 2012.
DNA Extraction Protocol for Plants with High Levels of Secondary Metabolites and Poly- saccharides without Using Liquid Nitrogen and Phenol. Molecular Biology 1: 1−6.
Scholthof, K-B. G. 2008. Tobacco Mosaic Virus: The Beginning of Plant Pathology . APS net Features. http://www.apsnet.org/publications/apsnetfeatures / Pages/TMV.aspx, modified 13/6/17.
Tan, S. C. & B.C.Yiap. 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2009: 1−10. Tzanetakis, I.E. & R.R. Martin. 2008. A New Method for  Extraction  of  Double-stranded  RNA  from Plants. Journal of Virological Methods 149: 167– 170.
Wyley, S., C. R. Wilson, R. A. C. Jones & M. G. K. Jones. 1993. A Polymerase Chain Reaction Assay for Cucumber Mosaic Virus in Lupin Seeds. Australian Journal Agriculture Research 44: 41– 51.
Valverde, R.A, 1990. Analysis of Double-stranded RNA for Plant Virus Diagnosis. Plant Disease 74: 255−258.