## Variasi Suhu Inkubasi Mempengaruhi Jumlah Sel Vegetatif Dan Spora Bacillus Sphaericus
Incubation Temperature Variation Affecting the Number of Vegetative Cells and Spora Bacillus Sphaericus
Yunan Jiwintarum* 1 , Maruni Wiwin Diarti 1 , Baiq Lely Zaeniati 2
1 Poltekkes Kemenkes Mataram
2 Instalasi Litbang RSUP NTB (*yujijiwintarum@gmail.com)

## ABSTRAK
Aplikasi  Bacillus  sphaericus  di  lapang  ditentukan  oleh  adanya  inklusi  kristal  pada  spora  Bacillus sphaericus dan semua strain Bacillus sphaericus yang bersifat toksik terhadap nyamuk. Jumlahinklusi kristal  pada  spora  dan  sel  vegetative  Bacillus  sphaericus  sangat  dipengaruhi  oleh  lingkungan inkubasinya, salah satunya adalah suhu inkubasi.Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh variasi waktu inkubasi terhadap jumlah sel vegetatif dan spora Bacillus sphaericus” pada media NYSM padat  dan  media  NYSM  cair.Penelitian  ini  merupakan  penelitian  Pre  eksperimental  di  laboratorium, menggunakan 10 macam perlakuan variasi waktu inkubasi yaitu suhu 37 oC selama 1 hari, 2 hari, 3 hari,4 hari,5 hari, 6 hari, 7 hari,8 hari,9 hari dan 10 hari pada media NYSM padat dan NYSM cair. Data yang diambil yaitu jumlah sel vegetative Bacillus sphaericus dan jumlah spora Bacillus sphaericus Data dianalisisis secara deskriptif. Hasil penelitian menunjukkan hari pertama dan kedua (1 hari dan 2 hari) rerata  jumlah  sel  vegetative  85,7  sel  dan  spora  14,3  spora.  hari  ke  3  sampai  dengan  ke  -10  secara berurutan  jumlah  sel  vegetative  adalah  60,7;  36,4  ,18,4  ;10,4,  8,4;7,7dan  0.  Jumlah  Spora  Bacillus sphaericus secara berurutan mulai hari ke-3 sampai dengan hari ke-10 adalah 39,4 ,63,7 ,81,7, 89,7, 91,7 ,92,3 dan 100. Kesimpulan yaitu semakin lamanya waktu inkubasi menyebabkan jumlah sel vegetative semakin berkurang dan jumlah spora semaki bertambah.

## Kata kunci: Bacillus sphaericus, Inkubasi, Spora, Sel vegetative

## ABSTRACT
The  application  of  Bacillus  sphaericus  in  the  field  was  determined  by  crystal  inclusions  in  Bacillus sphaericus spores and all Bacillus sphaericus strains toxic to mosquitoes. The number of crystalline inclusions  in  the  spores  and  vegetative  cells  of  Bacillus  sphaericus  is  strongly  influenced  by  the incubation environment, one of which is the incubation temperature. This study aims to determine the effect of variations in incubation time on the number of vegetative cells and spores of Bacillus sphaericus on  solid  NYSM  media  and  liquid  NYSM  media.  This research is  pre-experimental  in the laboratory, using ten kinds of treatment with variations in incubation time, namely 37 ° C for one day, two days, three days, four days, five days, six days, seven days, eight days, nine days and ten days. On solid and liquid NYSM media. The data taken were the number of Bacillus sphaericus vegetative cells and the number of Bacillus sphaericus spores. Data were analyzed descriptively. The results showed that on the first and second days (1 day and 2 days) the mean number of vegetative cells was 85.7 cells and spores 14.3 spores. days 3 to -10, respectively, the number of vegetative cells was 60.7; 36,4, 18,4; 10,4, 8,4; 7,7 and 0. The number of Bacillus sphaericus spores sequentially from day 3 to day 10 were 39,4, 63,7, 81,  7,  89,7,  91,7,  92,3  and  100.  Conclusion  the  longer  the  incubation  time  causes  the  number  of vegetative cells to decrease and the number of spores to grow.

## Key words: Bacillus sphaericus, Incubation, Spores, Vegetative Cells
Vol.15 No.1 Mei 2021: Hal. 76-83 p-ISSN: 1907-459X e-ISSN: 2527-7170
Poltekita: Jurnal Ilmu Kesehatan http://jurnal.poltekkespalu.ac.id/index.php/JIK
© 2021 by the authors. Submitted for possible open access publication under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY SA) license (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/).

## Original Article

## PENDAHULUAN
Mikroorganisme ada di berbagai lingkungan.  Namun  jenis  dan  sifat  dari  setiap bakteri  pada  setiap  lingkungan  berbeda-beda. Kemampuan  mikroorganisme  untuk  tumbuh dan  tetap  hidup  merupakan  hal  yang  penting dalam  ekosistem.Ada  berbagai  macam  faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme  diantaranya  adalah  faktor fisika,  kimia,  nutrisi,  dan  faktor  intern  dari mikroorgisme  itu  sendiri.  Salah  satu  contoh faktor  fisika  adalah  suhu  dan  lama  waktu inkubasi. Suhu dan lama waktu inkubasi dapat mempengaruhi  fase  pertumbuhan  bakteri, kecepatan pertumbuhan, konsentrasi sel, kebutuhan  nutrisi,  kegiatan  enzimatis,  dan komposisi  sel  mikroorganisme (1). Suhu  dan lama  inkubasi  dapat  dipergunakan  untuk mengendalikan  pertumbuhan  dan  kegiatan bakteri.  Suhu  dan  lama  inkubasi  di  atas  suhu maksimal  dan  waktu  inkubasi  maksimal  akan bersifat  mematikan  bagi  pertumbuhannya. Sedangkan  jika  suhu  dan  lama  inkubasi diturunkan  dibawah  suhu  maksimal  dan  lama waktu inkubasi maksimal akan memperpanjang fase  lag  pertumbuhannya.  Salah  satu  sebab kematian  bakteri  adalah  tergantung  dari  suhu pertumbuhan  optimum  dan  lama  waktu inkubasi  maksimum  bakteri  tersebut.  Dengan mengetahui  suhu  dan  lama  waktu  inkubasi optimum, minimum dan maksimum dari bakteri tertentu,  dapat  diketahui  cara  pembiakan mikroorganisme dengan baik. Bacillus sphaericus pertama  kali  diisolasi  oleh  Kellen dan  Meyers  (1964)  dari  tubuh  larva  mati Culiseta  incidens di  California,  Amerika Serikat.  Dari  larva  tersebut  didapatkan  dua strain yaitu K dan Q, yang memiliki daya bunuh yang  rendah  terhadap  serangga. (2) Bacillus sphaericus merupakan  bakteri  yang  bersifat Gram  positif,  berbentuk  batang,  dan  mampu membentuk  endospora  terminal  (di  ujung  sel) dengan  sporangium  yang  membesar  ( swollen sporangium ) yang dapat diisolasi dari tanah (3) . Adanya inklusi kristal pada Bacillus sphaericus dilaporkan pertama kali oleh Davidson (1981). Kristal  ini  dicurigai  berperan  dalam  aktivitas Bacillus Sphaericus yang menyebabkan kematian larva nyamuk. Semua strain Bacillus sphaericus yang  bersifat  toksik  terhadap nyamuk dapat menghasilkan kristal parasporal. Bakteri Bacillus sphaericus dapat ditumbuhkan pada beberapa jenis media pertumbuhan. Media yang  umum  digunakan  adalah  media NYSM (4) dan MBS (5) .  Dengan  menggunakan  medium
pertumbuhan  tersebut  biakan  bakteri Bacillus sphaericus akan  mencapai  fase  stasioner  pada 12-24  jam  dan  sporulasi  akan  tercapai  setelah 24 jam (konsentrasi biakan mebihi 10 9 sel/mL). Medium  lain  yang  dapat  digunakan  untuk menumbuhkan  bakteri Bacillus  Sphaericus adalah  medium NYST ( NY  Agar/NY  Broth , MnCl 2 ,  CaCl 2 ,  dan  MgCl 2 )  yang  mengandung Streptomycin  100  µg/mL.  Medium  yang  lain adalah BATS (Na 2 HPO 4 ,  K 2 HPO 4 ,  MgSO 4 , MnCl 2 , FeSO 4 , CaCl 2 , L-Arginin, Thiamin dan Biotin) yang merupakan medium selektif yang diperkaya, untuk menumbuhkan dan menyuburkan  pertumbuhan  bakteri Bacillus sphaericus yang diisolasi dari tanah (6) . Aplikasi Bacillus  sphaericus di  lapang  ditentukan  oleh adanya  inklusi  kristal  pada  spora Bacillus sphaericus dan semua strain Bacillus sphaericus yang  bersifat  toksik  terhadap nyamuk  dapat menghasilkan  kristal  parasporal pada  sporanya  pada  proses  sporulasi,  maka perlu dilakukan suatu penelitian untuk mengetahui  jumlah  sel vegetative dan  spora yang  dihasilkan  oleh Bacillus sphaericus pada pada kondisi suhu dan waktu inkubasi optimum dan  menggunakan  variasi  lama  inkubasi. Bacillus  sphaericus memiliki  spora  untuk mempertahankan hidupnya, untuk pertumbuhan bakteri  memerlukan  suhu  dan  waktu  inkubasi yang optimum.Studi pendahuluan yang dilaksanakan  di  laboratorium  instalasi  litbang RSUD  Provinsi  NTB  membuktikan  adanya pengaruh antara lama waktu inkubasi terhadap jumlah  sel vegetative dan  spora Bacillus sphaericus . Pengamatan yang dilakukan selama 15  hari  membuktikan  bahwa  pada  hari  ke  9 waktu  inkubasi  menunjukkan  jumlah  spora yang  terbanyak,  setelah  10  hari  jumlah  spora mulai menurun kembali. Untuk lebih mempelajari secara ilmiah bentuk morfologi sel vegetative dan spora Bacillus sphaericus terkait dengan variasi waktu inkubasi baik pada media padat  dan  media  cair  dan  untuk  menguatkan hasil studi pendahuluan sehingga secara ilmiah dapat  memberikan  informasi  yang  dipercaya maka  perlu  dilakukan  penelitian  mengenai pengaruh  variasi  waktu  inkubasi  terhadap jumlah  sel  vegetatif  dan  spora Bacillus sphaericus yang diinokulasi pada media NYSM padat  dan  media  NYSM  cair.  Manfaat  dari penelitian  ini  dapat  sebagai  sumber  informasi ilmiah  mengenai  pengaruh  variasi  waktu inkubasi terhadap jumlah sel vegetatif dan spora Bacillus sphaericus , sehingga dapat digunakan sebagai  rujukan  untuk  memperkaya  teori
tentang  pengaruh  variasi  waktu  inkubasi terhadap jumlah sel vegetatif dan spora Bacillus sphaericus dan sebagai acuan dalam memperbanyak  bakteri Bacillus  sphaericus terutama  kaitannya  antara  variasi  waktu inkubasi terhadap jumlah sel vegetatif dan spora Bacillus sphaericus , sehingga dapat digunakan sebagai  rujukan  untuk  memperkirakan  waktu inkubasi  yang  paling  baik  yang  dapat menghasikan  jumlah  spora  dengan  Kristal toksin  yang  maksimum  untuk  pemanfaatan aplikatif  pengaruh  variasi  waktu  inkubasi terhadap jumlah sel vegetatif dan spora Bacillus sphaericus .

## METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  merupakan  penelitian eksploratorik di laboratorium yang dilakukan di Laboratorium Unit Riset Biomedik RSUP NTB Tahun  2019.  Penelitian  ini  menggunakan  10 macam perlakuan variasi waktu inkubasi, pada NYSM  padat  dan  NYSM  cair.Besar  unit experimen  di  tentukan  dengan  menggunakan rumus fedeerer yaitu ( t – 1) (r – 1) ≥ 15 dengan jumlah 33 unit percobaan. Teknik pengambilan sampel  dilakukan  dengan  cara Non-Random Purpusive Sampling , yaitu pengambilan sampel yang  ditentukan  berdasarkan  kriteria  yang dibuat  oleh  peneliti.  Karena  penelitian  ini menggunakan perlakuan variasi waktu inkubasi, dimana waktu yang digunakan harus tepat  diperiksa,  maka  kriteria  pengambilan sampel  ditetapkan  berdasarkan  urutan  waktu inkubasi  dengan  replikasi  yang  dilakukan bersamaan  pada  masing  –  masing  perlakuan variasi lama waktu inkubasi.
Variabel  bebas  dalam  penelitian  ini adalah  variasi  waktu  inkubasi  dan  variabel terikat  dalam  penelitian  ini  adalah:  jumlah  sel vegetative Bacillus sphaericus dan jumlah spora Bacillus sphaericus .
Bahan  yang digunakan  dalam penelitian ini terdiri dari: Isolat Bacillus sphaericus yang digunakan  :  Isolat Bacillus  sphaericus yang digunakan dalam penelitian ini adalah Bacillus sphaericus isolat  MNT  mampu  membunuh larva  nyamuk Culex , Anopheles ,dan Aedes instar III yang dilakukan di laboratorium .
Jenis media yang digunakan: Jenis media yang  digunakan  adalah:  Medium  NYSM (Nutrient Broth 8,0 g/L; Yeast extract 0,5 g/L; MgCl 2 0,2 g/L; MnCl 2 0,01 g/L; dan CaCl 2 0,1 g/L),  untuk  pembuatan  media  NYSM  padat dengan menambahkan 15gram agar – agar putih dalam 1000 ml komposisi media NYSM broth.
NaCl 0,9% atau garan fisiologis (PZ), Aquades steril,  Alat  penelitian, Autoclave,  Oven, Incubator, Cawan petri,Tabung reaksi,Rak tabung  reaksi,  Labu  erlenmeyer,  Beaker  glas, Mortar,  Neraca  analitik,  Ose, Blue  tape, Swab kapas, Mistar, Laminar flow .
Metode Prosedur  Pembiakan :  Stok  isolat Bacillus spharicus yang  memiliki  aktivitas  larvasida diremajakan  dengan  menumbuhkannya  pada medium NYSM padat pada suhu 30 o C selama 24  jam.  Membiakan  /  inokulasi Bacillus sphaericus murni pada media NYSM agar dan broth  sesuai  dengan  perlakuan,  dengan  cara: Menyiapkan  media  NYSM  agar  dan  broth masing  –  masing  sebanyak  3  buah  tiap  –  tiap perlakuan.  Menginokulasikan  10  ul  suspense biakan  murni Bacillus  sphaericus pada  media NYSM  padat  dengan  teknik  spread  dan pemencilan  dan  pada  media  NYSM  broth dengan teknik penuangan menggunakan mikropipet.  Menginkubasi  selama  waktu inbubasi yaitu:
T0: Bacillus sphaericus tanpa inkubasi.
T1:  inkubasi Bacillus  sphaericus suhu  37 o C selama 1 hari.
T2:  inkubasi Bacillus  sphaericus suhu  37 o C selama 2 hari.
T3:  inkubasi Bacillus  sphaericus suhu  37 o C selama 3 hari.
T4:  inkubasi Bacillus  sphaericus suhu  37 o C selama 4 hari.
T5:  inkubasi Bacillus  sphaericus suhu  37 o C selama 5 hari.
T6:  inkubasi Bacillus  sphaericus suhu  37 o C selama 6 hari.
T7:  inkubasi Bacillus  sphaericus suhu  37 o C selama 7 hari.
T8:  inkubasi Bacillus  sphaericus suhu  37 o C selama 8 hari.
T9:  inkubasi Bacillus  sphaericus suhu  37 o C selama 9 hari.
T10:  inkubasi Bacillus  sphaericus suhu  37 o C selama 10 hari.
Membuat  daerah  hitung  seluas  1  cm 2 pada  objek  glass,  selanjutnya  diambil  10  ul suspense Bacillus  sphaericus dari  masing masing perlakuan , di buat hapusan seluas 1 cm 2 dilakukan  pewarnaan  Gram  dan  Spora  dan dilakukan  perhitungan  jumlah  sel vegetative dan  spora Bacillus  sphaericus .  Perhitungan jumlah sel vegetative dan spora dihitung dengan menggunakan  metode  slide. (9) Data  yang diperoleh  jumlah  sel  vegetatif Bacillus
sphaericus akan  berkurang  dan  spora Bacillus sphaericus dianalisis  secara  deskriptif  dengan melihat  porsentase  dari  sel  vegetatif Bacillus sphaericus akan  berkurang  dan  spora Bacillus sphaericus setiap  variasi  waktu  inkubasi  pada media NYSM padat dan media NYSM cair.

## HASIL
Tabel 1 dan tabel 2 menunjukkan jumlah sel vegetative dan  spora Bacillus  sphaericus yang  dihitung  dengan  menggunakan  metode langsung  ( slide )  dengan  luas  daerah  hitung  1 cm 2 yang  diwarnai  dengan  pewarnaan  Spora dan  Gram  pada  media  NYSM  padat  terdapat perbedaan. Semakin lama waktu inkubasi maka jumlah  sel vegetative bakteri  semakin  sedikit dan  jumlah  spora  semakin  banyak.  Dari  tabel tersebut  juga  menunjukkan  bahwa  pada  hari pertama  dan  kedua  (1  hari  dan  2  hari)  waktu inkubasi  terdapat  rerata  jumlah  sel vegetative 85,7 sel (85,7%) dan spora 14,3 spora (14,3%). Pada hari ketiga dan seterusnya sampai dengan hari  ke  10  waktu  inkubasi  menunjukkan  hasil jumlah perhitungan sel vegetative bakteri mulai hari ke 3 sampai dengan ke -10 secara berurutan adalah  60,7  (60,7%)  ;  36,4  (36,4%),18,4 (18,4%) ;10,4 (10,4%), 8,4 (8,4%);7,7 (7,7%) ,0 (0%) , dan 0 (0%). Jumlah Spora Bacillus sphaericus secara berurutan  mulai  hari  ke-3  sampai  dengan  hari ke-10 adalah 39,4 (39,4%) ,63,7 (63,7%) ,81,7 (81,7%),  89,7  (89,7%),  91,7  (91,7%),92,3
(92,3%),100  (100%),  dan  100  (100%).  Data Jumlah  sel vegetative dan  spora Bacillus sphaericus yang dihitung dengan menggunakan metode  langsung  ( slide )  dengan  luas  daerah hitung 1 cm 2 yang diwarnai dengan pewarnaan
Spora dan Gram pada media NYSM cair dapat dilihat pada tabel 3 dan 4.
Tabel 3 dan tabel 4 menunjukkan bahwa terdapat  perbedaan  jumlah  sel vegetative dan spora Bacillus sphaericus yang dihitung dengan menggunakan  metode  langsung  ( slide )  dengan luas daerah hitung 1 cm 2 yang diwarnai dengan pewarnaan  Spora  pada  media  NYSM  cair. Semakin lama waktu inkubasi maka jumlah sel vegetative bakteri  semakin  sedikit  dan  jumlah spora semakin banyak.Pada tabel tersebut juga menunjukkan  bahwa  pada  hari  pertama  dan kedua  (1  hari  dan  2  hari)  waktu  inkubasi terdapat  rerata  jumlah  sel vegetative 100  sel (100%) dan spora 0 spora (0%). Pada hari ketiga dan seterusnya sampai dengan hari ke 10 waktu inkubasi menunjukkan hasil jumlah perhitungan sel vegetative bakteri mulai hari ke 3 sampai dengan ke -10 secara berurutan adalah 99,7  (99,7%),  ,98  (98%),96,7  (96,7%),90 (90%),89,4  (89,4%),80  (80%),7  (7%),  dan  0 (0%).
Jumlah Spora Bacillus sphaericus secara berurutan  mulai  hari  ke-3  sampai  dengan  hari ke-10 adalah 0,4 (0,4%),2 (2%),3,4 (3,4%) ,3,4 (3,4%)  ,10  (10%)  ,10,7  (10,7%)  ,22,7(22,7%) dan 100 (100%). Pada media cair jumlah spora bakteri yang terbentuk walaupun menunjukkan semakin lama waktu inkubasi terjadi peningkatan  jumlah,  namun  lebih  lambat  dan lebih sedikit dibandingkan pada media NYSM padat (Tabel 4) .
Tabel 1 Jumlah sel vegetative Bacillus sphaericus pada media NYSM padat
Replikasi J umlah Sel Vegetatif berdasarkan lama inkubasi pada media NYSM padat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 R1 83 83 59 34 30 10 5 5 0 0 R2 87 87 63 44 15 8 10 8 0 0 R3 87 87 60 31 10 13 10 10 0 0 Total 257 257 182 109 55 31 25 23 0 0 Rerata 85.7 85.7 60.7 36.4 18.4 10.4 8.4 7.7 0 0 % 85.7 85.7 60.7 36.4 18.4 10.4 8.4 7.7 0 0 Keterangan: T1
: inkubasi Bacillus sphaericus suhu 37 o C selama 1 hari. T2 : inkubasi Bacillus sphaericus suhu 37 o C selama 2 hari. T3 : inkubasi Bacillus sphaericus suhu 37 o C selama 3 hari. T4 : inkubasi Bacillus sphaericus suhu 37 o C selama 4 hari. T5 : inkubasi Bacillus sphaericus suhu 37 o C selama 5 hari. T6 : inkubasi Bacillus sphaericus suhu 37 o C selama 6 hari.
T7
: inkubasi Bacillus sphaericus suhu 37 o C selama 7 hari. T8 : inkubasi Bacillus sphaericus suhu 37 o C selama 8 hari. T9 : inkubasi Bacillus sphaericus suhu 37 o C selama 9 hari. T10 : inkubasi Bacillus sphaericus suhu 37 o C selama 10 hari. R1 : Replikasi 1 R2 : Replikasi 2 R3 : Replikasi 3
Tabel 2 Jumlah sporaBacillus sphaericus pada media NYSM padat
Replikasi Jumlah Spora berdasarkan lama inkubasi pada media NYSM padat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 R1 17 17 41 66 70 90 95 95 100 100 R2 13 13 37 56 85 92 90 92 100 100 R3 13 13 40 69 90 87 90 90 100 100 Total 43 43 118 191 245 269 275 277 300 300 Rerata 14,3 14,3 39.4 63,7 81,7 89.7 91,7 92,3 100 100 % 14,3 14,3 39.4 63,7 81,7 89.7 91,7 92,3 100 100 Tabel 3 Jumlah sel vegetative Bacillus sphaericus pada media NYSM cair Replikasi Jumlah sel vegetative Bacillus sphaericus pada media NYSM cair 1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 R1 100 100 100 98 96 96 91 92 68 0 R2 100 100 100 97 95 95 89 86 85 0 R3 100 100 99 99 99 99 90 90 89 0 Total 300 300 299 294 290 290 270 268 242 0 Rerata 100 100 99.7 98 96.7 96.7 90 89.4 80.7 0 % 100 100 99.7 98 96.7 96.7 90 89.4 80.7 0

## Tabel 4 Jumlah sel vegetative Bacillus sphaericus pada media NYSM cair
Replikasi Jumlah Spora berdasarkan lama inkubasi pada media NYSM cair 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 R1 0 0 0 2 4 4
9 8 32 15 R2 0 0 0 3 5 5
11 14 15 10 R3 0 0 1 1 1 1
10 10 21 13 Total 0 0 1 6 10 10 30 32 68 300 Rerata 0 0 0.4 2 3.4 3.4 10 10.7 22.7 100 % 0 0 0.4 2 3.4 3.4 10 10.7 22.7 100

## PEMBAHASAN
Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh  dan  tetap  hidup  merupakan  hal  yang penting dalam ekosistem. Ada berbagai macam faktor  yang  mempengaruhi  pertumbuhan mikroorganisme  diantaranya  adalah  faktor fisika,  kimia,  nutrisi,  dan  faktor  intern  dari mikroorgisme  itu  sendiri.  Salah  satu  contoh faktor  fisika  adalah  suhu  dan  lama  waktu inkubasi. Suhu dan lama waktu inkubasi dapat mempengaruhi  fase  pertumbuhan  bakteri, kecepatan pertumbuhan, konsentrasi sel,
kebutuhan  nutrisi,  kegiatan  enzimatis,  dan komposisi  sel  mikroorganisme (1) .  Suhu  dan lama  inkubasi  dapat  dipergunakan  untuk mengendalikan  pertumbuhan  dan  kegiatan bakteri.  Suhu  dan  lama  inkubasi  di  atas  suhu maksimal  dan  waktu  inkubasi  maksimal  akan bersifat  mematikan  bagi  pertumbuhannya. Sedangkan  jika  suhu  dan  lama  inkubasi diturunkan  dibawah  suhu  maksimal  dan  lama waktu inkubasi maksimal akan memperpanjang fase  lag  pertumbuhannya.  Salah  satu  sebab kematian  bakteri  adalah  ter  gantung  dari  suhu
pertumbuhan  optimum  dan  lama  waktu inkubasi  maksimum  bakteri  tersebut.  Dengan mengetahui  suhu  dan  lama  waktu  inkubasi optimum, minimum dan maksimum dari bakteri tertentu,  dapat  diketahui  cara  pembiakan mikroorganisme dengan baik.
Bakteri Bacillus  sphaericus dapat ditumbuhkan  pada  beberapa  jenis  media pertumbuhan.  Media  yang  umum  digunakan adalah  media NYSM (4) dan MBS (2) .  Dengan menggunakan  medium  pertumbuhan  tersebut biakan  bakteri Bacillus  sphaericus akan mencapai  fase  stasioner  pada  12-24  jam  dan sporulasi  akan  tercapai  setelah  24  jam (konsentrasi  biakan  melebihi  10 9 sel/mL).
Medium  lain  yang  dapat  digunakan  untuk menumbuhkan  bakteri Bacillus  Sphaericus adalah  medium NYST ( NY  Agar/NY  Broth , MnCl 2 ,  CaCl 2 ,  dan  MgCl 2 )  yang  mengandung Streptomycin  100  µg/mL.  Medium  yang  lain adalah BATS (Na 2 HPO 4 ,  K 2 HPO 4 ,  MgSO 4 , MnCl 2 , FeSO 4 , CaCl 2 , L-Arginin, Thiamin dan Biotin) yang merupakan medium selektif yang diperkaya, untuk menumbuhkan dan menyuburkan  pertumbuhan  bakteri Bacillus sphaericus yang diisolasi dari tanah (5) . Bacillus sphaericus memiliki spora untuk mempertahankan hidupnya, untuk pertumbuhan bakteri  memerlukan  suhu  dan  waktu  inkubasi yang  optimum.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  pengaruh  variasi  waktu  inkubasi terhadap jumlah sel vegetatif dan spora Bacillus sphaericus ”  pada  media  NYSM  padat  dan media NYSM cair.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa terdapat  perbedaan  jumlah  sel vegetative Jumlah  dan  spora Bacillus  sphaericus yang dihitung dengan menggunakan metode langsung  ( slide )  dengan  luas  daerah  hitung  1 cm 2 yang  diwarnai  dengan  pewarnaan  Spora pada media NYSM padat.Semakin lama waktu inkubasi  maka  jumlah  sel vegetative bakteri semakin  sedikit  dan  jumlah  spora  semakin banyak.
Tabel  4  juga  menunjukkan  bahwa  pada hari pertama dan kedua (1 hari dan 2 hari) waktu inkubasi  terdapat  rerata  jumlah  sel vegetative 85,7 sel (85,7%) dan spora 14,3 spora (14,3%).
Pada hari ketiga dan seterusnya sampai dengan hari  ke  10  waktu  inkubasi  menunjukkan  hasil jumlah perhitungan sel vegetative bakteri mulai hari ke 3 sampai dengan ke -10 secara berurutan adalah  60,7  (60,7%)  ;  36,4  (36,4%),18,4 (18,4%) ;10,4 (10,4%), 8,4 (8,4%);7,7 (7,7%) ,0 (0%)  ,  dan  0  (0%).  Jumlah  Spora Bacillus
sphaericus secara  berurutan  mulai  hari  ke-3 sampai dengan hari ke-10 adalah 39,4 (39,4%)
,63,7 (63,7%) ,81,7 (81,7%), 89,7 (89,7%), 91,7
(91,7%),92,3  (92,3%),100  (100%),  dan  100 (100%).  Hasil  penelitian  juga  membuktikan bahwa terdapat perbedaan jumlah sel vegetative Jumlah  dan  spora Bacillus  sphaericus yang dihitung dengan menggunakan metode langsung  ( slide )  dengan  luas  daerah  hitung  1 cm 2 yang  diwarnai  dengan  pewarnaan  Spora pada  media  NYSM  cair.  Semakin  lama  waktu inkubasi  maka  jumlah  sel vegetative bakteri semakin  sedikit  dan  jumlah  spora  semakin banyak. Tabel 1 juga menunjukkan bahwa pada hari pertama dan kedua (1 hari dan 2 hari) waktu inkubasi  terdapat  rerata  jumlah  sel vegetative 100  sel  (100%)  dan  spora  0  spora  (0%).  Pada hari ketiga dan seterusnya sampai dengan hari ke  10  waktu  inkubasi  menunjukkan  hasil jumlah perhitungan sel vegetative bakteri mulai hari ke 3 sampai dengan ke -10 secara berurutan adalah 99,7 (99,7%), ,98 (98%),96,7
(96,7%),90  (90%),89,4  (89,4%),80  (80%),7 (7%),  dan  0  (0%).  Jumlah  Spora Bacillus sphaericus secara  berurutan  mulai  hari  ke-3 sampai  dengan hari  ke-10 adalah  0,4 (0,4%),2 (2%),3,4  (3,4%)  ,3,4  (3,4%)  ,10  (10%)  ,10,7 (10,7%)  ,22,7(22,7%)  dan  100  (100%).  Pada media cair jumlah spora bakteri yang terbentuk walaupun  menunjukkan  semakin  lama  waktu inkubasi  terjadi  peningkatan  jumlah,  namun lebih  lambat  dan  lebih  sedikit  dibandingkan pada  media  NYSM  padat.  Hal  ini  disebabkan karena  pada  media  cair  zat  –  zat  nutrisi anorganik dan organik yang dibutuhkan bakteri tersebar rata atau lebih homogeny, sehingga sel vegetative tumbuh  subur.  Spora  oleh  bakteri digunakan  untuk  mempertahankan  hidup, semakin  lama  inkubasi  pada  media  akan menunjukkan  nutrisi  semakin  berkurang, sehingga jumlah spora yang dihasilkan semakin banyak,  dan  sel vegetative bakteri  semakin sedikit.
Hasil penelitian secara deskriptif membuktikan  bahwa  adanya  pengaruh  antara lama  waktu  inkubasi  terhadap  jumlah  sel vegetative dan  spora Bacillus  sphaericus NYSM (4) dan MBS (5) .  Dengan  menggunakan medium  pertumbuhan  tersebut  biakan  bakteri Bacillus  sphaericus akan  mencapai  fase stasioner  pada  12-24  jam  dan  sporulasi  akan tercapai  setelah  24  jam  (konsentrasi  biakan mebihi  10 9 sel/mL).  Medium  lain  yang  dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri Bacillus Sphaericus adalah medium NYST ( NY
Agar/NY  Broth ,  MnCl 2 ,  CaCl 2 ,  dan  MgCl 2 ) yang  mengandung Streptomycin 100  µg/mL. Medium  yang  lain  adalah BATS (Na 2 HPO 4 , K 2 HPO 4 ,  MgSO 4 ,  MnCl 2 ,  FeSO 4 ,  CaCl 2 ,  L- Arginin, Thiamin dan Biotin) yang merupakan medium  selektif  yang  diperkaya,  untuk menumbuhkan dan menyuburkan pertumbuhan bakteri Bacillus  sphaericus yang  diisolasi  dari tanah (6) . Bacillus  sphaericus memiliki  spora untuk mempertahankan hidupnya, untuk pertumbuhan  bakteri  memerlukan  suhu  dan waktu  inkubasi  yang  optimum.Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  variasi waktu  inkubasi  terhadap  jumlah  sel  vegetatif dan  spora Bacillus  sphaericus ”  pada  media NYSM padat dan media NYSM cair.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa terdapat  perbedaan  jumlah  sel vegetative Jumlah  dan  spora Bacillus  sphaericus yang dihitung dengan menggunakan metode langsung  (slide)  dengan  luas  daerah  hitung  1 cm 2 yang  diwarnai  dengan  pewarnaan  Spora pada media NYSM padat. Semakin lama waktu inkubasi  maka  jumlah  sel vegetative bakteri semakin  sedikit  dan  jumlah  spora  semakin banyak.
Tabel  1  juga  menunjukkan  bahwa  pada hari pertama dan kedua (1 hari dan 2 hari) waktu inkubasi  terdapat  rerata  jumlah  sel vegetative 85,7 sel (85,7%) dan spora 14,3 spora (14,3%). Pada hari ketiga dan seterusnya sampai dengan hari  ke  10  waktu  inkubasi  menunjukkan  hasil jumlah perhitungan sel vegetative bakteri mulai hari ke 3 sampai dengan ke -10 secara berurutan adalah  60,7  (60,7%)  ;  36,4  (36,4%),18,4 (18,4%) ;10,4 (10,4%), 8,4 (8,4%);7,7 (7,7%) ,0 (0%)  ,  dan  0  (0%).  Jumlah  Spora Bacillus sphaericus secara  berurutan  mulai  hari  ke-3 sampai dengan hari ke-10 adalah 39,4 (39,4%)
,63,7 (63,7%) ,81,7 (81,7%), 89,7 (89,7%), 91,7
(91,7%),92,3  (92,3%),100  (100%),  dan  100 (100%).  Hasil  penelitian  juga  membuktikan bahwa terdapat perbedaan jumlah sel vegetative Jumlah  dan  spora Bacillus  sphaericus yang dihitung dengan menggunakan metode langsung  (slide)  dengan  luas  daerah  hitung  1 cm 2 yang  diwarnai  dengan  pewarnaan  Spora pada  media  NYSM  cair.  Semakin  lama  waktu inkubasi  maka  jumlah  sel vegetative bakteri semakin  sedikit  dan  jumlah  spora  semakin banyak.
Tabel  1  juga  menunjukkan  bahwa  pada hari pertama dan kedua (1 hari dan 2 hari) waktu inkubasi  terdapat  rerata  jumlah  sel vegetative 100  sel  (100%)  dan  spora  0  spora  (0%).  Pada
hari ketiga dan seterusnya sampai dengan hari ke  10  waktu  inkubasi  menunjukkan  hasil jumlah perhitungan sel vegetative bakteri mulai hari ke 3 sampai dengan ke -10 secara berurutan adalah 99,7 (99,7%), ,98 (98%),96,7
(96,7%),90  (90%),89,4  (89,4%),80  (80%),7 (7%),  dan  0  (0%).  Jumlah  Spora Bacillus sphaericus secara  berurutan  mulai  hari  ke-3 sampai  dengan hari  ke-10 adalah  0,4 (0,4%),2 (2%),3,4  (3,4%)  ,3,4  (3,4%)  ,10  (10%)  ,10,7 (10,7%)  ,22,7(22,7%)  dan  100  (100%).  Pada media cair jumlah spora bakteri yang terbentuk walaupun  menunjukkan  semakin  lama  waktu inkubasi  terjadi  peningkatan  jumlah,  namun lebih  lambat  dan  lebih  sedikit  dibandingkan pada  media  NYSM  padat.  Hal  ini  disebabkan karena  pada  media  cair  zat  –  zat  nutrisi anorganik dan organik yang dibutuhkan bakteri tersebar rata atau lebih homogen, sehingga sel vegetative tumbuh  subur.  Spora  oleh  bakteri digunakan  untuk  mempertahankan  hidup, semakin  lama  inkubasi  pada  media  akan menunjukkan  nutrisi  semakin  berkurang, sehingga jumlah spora yang dihasilkan semakin banyak,  dan  sel vegetative bakteri  semakin sedikit.Hasil penelitian secara deskriptif membuktikan  bahwa  adanya  pengaruh  antara lama  waktu  inkubasi  terhadap  jumlah  sel vegetative dan spora Bacillus sphaericus . .

## KESIMPULAN DAN SARAN
Semakin lamanya waktu inkubasi menyebabkan  jumlah  sel vegetative semakin berkurang dan jumlah spora semaki bertambah. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai  viabilitas  dan  kemampuan  tumbuh dari Bacillus  sphaericus yang  sudah  dalam bentuk spora

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada Direktur Poltekkes Kemenkes
Mataram, Kepala
Instalasi
Litbangkes  RSU  Provinsi  NTB  yang  telah memfasilitasi pelaksanaan penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Badan Pengembangan Sumber Daya Manusia Kesehatan RI. Mikrobiologi Bahan Ajar Keperawatan Gigi. Jakarta: BPPSDMK; 2017.
2. Vanlalhruaia N, Kumar S, Gurusubramanian G.  Bacillus  sphaericus  in  the  biological control of mosquito vector complex. Sci Vis. 2011;11(2):61–71.
3. Baumann  P,  Clark  MA,  Baumann  L,
Broadwell  AH.  Bacillus  sphaericus  as  a mosquito  patogen:  properties  of  the organism  and  its  toxin.  Microbiol  Rev. 1991;55:425–36.
4. Myers  M,  Yousten  AA.  Toxic  activity  of Bacillus  sphaericus  SSII-1  for  mosquito larvae. Infect Immun. 1978;19:1047–53.
5. Kalfon  A,  Charles  J-F,  Bourgouin  C,  De Barjac H. Sporulation of Bacillus sphaericus 2297:  an  Electron  Microscope  Study  of
Crystal-like  Inclusion  Biogenesis  and
Toxicity to Mosquito Larvae. Microbiology.
1984;130(4):893–900.
6. Yousten AA, Fretz SB, Jelley SA. Selective
Medium for Mosquito-Pathogenic Strains of
Bacillus sphaericus.
Appl Environ Microbiol. 1985;49(6):1532–3. 7. Notoatmojo Soekidjo. Metodologi penelitian kesehatan. Jakarta.: Rineka Cipta; 2016.
8. Suryadi  BF,  Yanuwiadi  B,  Ardyati  T,
Suharjono S. Evaluation of entomopathogenic Bacillus sphaericus isolated  from  Lombok  beach  area  against mosquito larvae. Asian Pac J Trop Biomed.
2016;6(2):148–54.
9. Soemarno.  Isolasi  dan  Identifikasi  Bacteri Klinik. Yogyakarta: Akademi Analis Kesehatan Yogyakarta Departemen Kesehatan RI; 2000