DOI: http://dx.doi.org/10.15578/bawal.13.1.2021.11-21
Tersedia online di: http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/bawal e-mail:bawal.puslitbangkan@gmail.com BAWAL WIDYA RISET PERIKANAN TANGKAP Volume 13 Nomor 1 April 2021 p-ISSN: 1907-8226 e-ISSN: 2502-6410 Nomor Akreditasi Kementerian RISTEK-BRIN: 148/M/KPT/2020
IDENTIFIKASI MOLEKULAR DAN STRUKTUR FILOGENETIK MOLUSKA (GASTROPODA DAN BIVALVIA) DI PERAIRAN BIAK, PAPUA

## MOLECULAR IDENTIFICATION AND PHILOGENETIC STRUCTURE OF MOLLUSCA (GASTROPODS AND BIVALVIANS) IN BIAK WATERS, PAPUA
Anna Rejeki Simbolon* dan Ludi Parwadani Aji
1 Pusat Penelitian Oseanografi LIPI. Jalan Pasir Putih 1, Ancol Timur, Jakarta Utara. 14430, Indonesia Teregistrasi I tanggal: 25Juni 2021; Diterima setelah perbaikan tanggal: 30 Juli 2021;
Disetujui terbit tanggal: 2 Agustus 2021

## ABSTRAK
Perairan Biak di wilayah Papua termasuk kawasan segitiga terumbu karang dengan tingkat keanekaragaman spesies yang tinggi, salah satu diantaranya adalah Phylum Moluska, namun lebih dari 90% spesies Moluska belum terdokumentasi secara akurat. Sebagai biota dengan keanekaragaman spesies yang tinggi, kesamaan morfologi cangkang moluska sering ditemukan sehingga menyebabkan kesulitan dalam identifikasi yang tepat. Untuk hal tersebut penanda molekular “DNA mitokondria cytochrome oxidase I” (mt-COI), biasa disebut DNA barcoding , dapat diterapkan untuk identifikasi species. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi spesies Moluska dengan menggunakan DNA barcoding serta menyusun struktur filogenetik Moluska di perairan Biak, Papua. Contoh biologi Moluska diambil dengan metode jelajah di area padang lamun pada saat air surut. Analisis DNA menggunakan primer universal LCO 1490 dan HCO 2198, pengeditan dan pengurutan sekuen DNA dengan program Geneious ver 9 dan program BLAST. Struktur filogenetik dilakukan dengan metode neighbor joining (NJ) pada model Kimura-2. Hasil menunjukkan spesies moluska yang berhasil diidentifikasi secara molekular terdiri dari 23 spesies dengan tingkat kesamaan 97-100%. Pohon filogenetik menunjukkan pengelompokkan spesies berdasarkan ordo, famili hingga genus yang berbeda. Nerita sp. memiliki jarak genetik terendah dan nilai bootstrap yang tinggi serta memiliki kesamaan warna dan pola yang hampir sama sehingga sering terjadi kesalahan identifikasi secara morfologi. Hasil analisis memperlihatkan DNA barcoding dapat digunakan dalam identifikasi spesies moluska dengan cepat dan akurat serta memberikan keragaman spesies yang tinggi. Identifikasi secara molekular dengan menggunakan DNA barcoding dapat dijadikan alat dalam mengidentiifkasi spesies moluska secara lebih tepat sehingga pengelolaan spesies akan tepat sasaran serta bermanfaat bagi kajian pengelolaan selanjutnya.
Kata Kunci: Identifikasi molekular; DNA- barcoding; Phylum Moluska; Biak (Papua)

## ABSTRACT
Biak waters in the Papua region are included in the coral reef triangle area with a high level of species diversity, one of which is the Mollusk Phylum, but more than 90% of Mollusk species have not been accurately documented. As a biota with high species diversity, similarity in morphology of mollusk shells is often found, causing difficulties in proper identification. For this reason, the molecular marker “mitochondrial DNA cytochrome oxidase I” (mt-COI), commonly called DNA barcoding , can be applied for species identification. This study aims to identify mollusk species using DNA barcoding and compose the phylogenetic structure of mollusks in the waters of Biak, Papua. Mollusk biology samples were taken by roaming the seagrass area at low tide. DNA analysis using universal primers LCO 1490 and HCO 2198, editing and sequencing DNA with the Geneious ver 9 program and the BLAST program. The phylogenetic structure was carried out using the neighbor joining (NJ) method on the Kimura-2 model. The results show that the mollusk species that have been identified molecularly consist of 23 species with a similarity level of 97-100%. The phylogenetic tree shows the grouping of species based on different orders, families and genera. Nerita sp. has the lowest genetic distance and high bootstrap value and has almost the same color and pattern so that morphological identification errors often occur. The results of the analysis show that DNA barcoding can be used in the identification of mollusk species quickly and
BAWAL. 13 (1) April 2021: 11-21

## PENDAHULUAN
Moluska merupakan phylum biota laut yang memiliki tingkat keanekaragaman spesies yang tinggi dan persamaan bentuk morfologi sehingga seringkali menyebabkan kesulitan dalam identifikasi (Appeltans et al. , 2012). Setidaknya terdapat 239 spesies moluska di perairan Biak yang terdiri dari 177 spesies dari kelas Gastropoda dan 62 spesies dari kelas Bivalvia. Moluska dengan penyebaran yang luas ditemukan pada spesies Monetaria annulus , Conomurex luhuanus dan Canarium urceus dari kelas Gastropoda, sedangkan dari kelas Bivalvia adalah Anadara antiquata (Aji et al ., 2018).
Identifikasi molekular telah menjadi metode yang dapat digunakan dalam identifikasi spesies secara tepat dan akurat (Simbolon et al ., 2021). Satu metode penanda molekular terkini yang digunakan untuk identifikasi spesies ialah DNA mitokondria cytochrome oxidase I (mt- COI) (DNA barcoding ) karena bersifat non rekombinan dan tidak bergantung pada kondisi lingkungan (Palanisamy et al ., 2020), sehingga DNA barcoding menjadi standard dalam identifikasi molekuler (Hebert et al ., 2003). DNA barcoding telah digunakan dalam mengkonfirmasi taksonomi hewan laut hingga filogeni molekular Moluska (Barco et a l., 2016); metode ini juga menunjukkan bukti adanya keragaman spesies pada moluska di perairan Pasifik (Sun et al ., 2016).
Kress et al . (2015) menunjukkan bahwa DNA barcoding dapat menjadi alat yang efektif dalam pengelolaan dan pemantauan biota laut. Sementara itu, filogenetik merupakan metode taksonomi yang mengklasifikasikan spesies berdasarkan analisa sejarah evolusi yang dilakukan dengan analisa baik secara morfologi maupun analisa sekuen DNA (Juniar et al ., 2021) . Penggunaan DNA barcoding dalam identifikasi spesies secara molekuler pada kerang laut dalam telah dilakukan oleh Liu & Zhang (2018); penggunaan gen COI dikombinasikan dengan analisis pohon filogenetik beserta jarak genetik diketahui mampu mengindentifikasi serta mengkaji keragaman dan sejarah evolusi kerang laut dalam.
Indonesia menjadi salah satu negara di kawasan Segitiga Terumbu Karang ( coral triangle ). Hal ini pula yang menjadikan Indonesia memiliki tingkat keanekaragaman hayati laut yang tinggi. Sayangnya, minimnya kepedulian terhadap kelestarian ekosistem pesisir membuat kawasan pesisir tercemar. Kurangnya penegakan peraturan pemerintah juga turut andil dalam pengelolaan kawasan pesisir yang semakin tertekan
accurately and provides high species diversity. Molecular identification using DNA barcoding can be used as a tool in identifying mollusk species more precisely so that species management will be well targeted and useful for further management studies.
Keywords: Molecular identification; DNA- barcoding; Phylum Mollusk; Biak (Papua)
(Simbolon, 2018). Hal ini menyebabkan penurunan kualitas air pada ekosistem pesisir serta dapat menurunkan keanekaragaman hayati di wilayah tersebut. Ditambahkan, tekanan tingkat tinggi pada ekosistem pesisir dapat mengakibatkan pergeseran struktur komunitas bentik dan hilangnya keanekaragaman (Van der Meij, 2009).
Perairan Biak yang terletak di wilayah Papua merupakan salah satu kawasan segitiga terumbu karang dengan keanekaragaman hewan laut yang tinggi. Pengelolaan kawasan ini harus dijaga dan dilestarikan agar keanekaragam hewan laut dapat terjaga, salah satu biota laut yang umum ditemui adalah Moluska (Aji & Widyastuti, 2019). Sebagai phylum biota laut dengan keragaman tertinggi, lebih dari 90% spesies moluska belum terdokumentasikan secara molekuler (Barco et al., 2016). Diantara spesies yang teridentifikasi sebanyak 80.000- 10.0000 spesies, 98% dari total moluska merupakan kelas Gastropoda (Sturm et al ., 2006).
Penelitian mengenai identifikasi molekuler Moluska di perairan Biak (Papua) belum banyak dilakukan. Kondisi ini mendorong dilakukan penelitian dengan tujuan untuk mengidentifikasi spesies moluska dengan menggunakan teknik analisis DNA barcoding serta menyusun pohon filogenetik moluska di perairan tersebut. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi acuan dalam identifikasi moluska secara molekuler khususnya di sekitar perairan Biak, sehingga pengelolaan jenis moluska di perairan ini dapat terjaga dengan baik dan berkelanjutan.

## BAHANDANMETODE Teknik Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel selama 8 bulan dari April sampai November 2017 di sekitar perairan Biak, Provinsi Papua (Gambar 1). Moluska diambil dengan metode jelajah di area padang lamun pada saat air surut. Sampel moluska beserta cangkangnya yang diambil berjumlah 34 spesimen. Moluska dimasukkan ke dalam botol sampel berisi larutan alkohol teknis, sementara contoh jaringan (tissue samples) moluska disimpan di dalam botol sampel berisi larutan ethanol absolute untuk analisa DNA barcoding .

## Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA jaringan moluska menggunakan standard protokol dari Qiagen kit untuk ekstraksi DNA pada jaringan dan darah dengan No catalog ID 69506. Ekstraksi DNA dilakukan dengan menempatkan irisan jaringan moluska (± 25 mg) pada 1,5 mL tabung
Simbolon, A, R., et al/BAWAL. 13 (1) April 2021: 11-21
microsentrifuge yang telah berisi 180 ìL larutan buffer ATL ( buffer tissue lysis ) kemudian dihaluskan dengan menggunakan gunting bedah. Sampel ditambahkan 20 ìL proteinase K dan divortex selama satu menit, serta diinkubasi selama semalam pada suhu 56°C di dalam thermostat waterbath . Sampel yang telah diinkubasi divortex lagi selama 15 detik dan ditambahkan 200 ìL buffer AL dan 200 ìL ET-OH (96%-100%) lalu divortex selama dua menit. Selanjutnya, sampel dipindahkan ke dalam DNA easy mini spin colomn yang sudah ditempatkan dalam 2 mL collection tube . Sampel disentrifugasi pada 8.000 rpm selama satu menit. Hasil sisa residu sentrifugasi dibuang dan DNAeasy spin colomn dipindahkan dalam 2 mL
collection tube yang baru. Selanjutnya ditambahkan500 ìL buffer AW1 ( buffer wash 1) dan disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama satu menit. Spin colomn ditempatkan dalam 2 mL collection tube baru dan ditambahkan 500 ìL buffer AW2 ( buffer wash 2); kemudian disentrifugasi pada 14.000 rpm selama tiga menit. Selanjutnya spin colomn dipindahkan ke dalam 1,5 mL tabung microsentrifuge baru. Eludasi DNA dilakukan dengan menambahkan 200 ìL buffer AE ( buffer elute ) lalu inkubasi selama satu menit pada suhu ruang dan di- sentrifugasi pada 8.000 rpm selama satu menit. Konsentrasi dan kualitas ekstrak DNA diukur pada nanophotometer IMPLEN dan disimpan di freezer pada suhu -80°C.
Gambar 1. Lokasi pengambilan sampel Mollusca di padang lamun sekitar perairan Biak, Saba, Kabupaten Biak Numfor Provinsi Papua (136.291576 E, 1.156432 S),April-November 2017.
Figure 1. Mollusca sampling locations in seagrass beds around Biak waters, Saba, Biak Numfor Regency, Papua Province (136.291576 E, 1.156432 S), April-November 2017.

## Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA dengan prosedur analisis PCR dilakukan dengan pembuatan larutan PCR yang terdiri dari 19,7 ìLddH2O; 3 ìLTaq buffer; 3 ìLMgCl2; 0,6 ìLdNTPmix; 0,5 ìL BSA, 1 ìL primer forward (LCO 1490) dan reverse (HCO2198); 0,2 ìL Taq DNA; serta 1 ìL DNA template (± 100 ng). Ruas gen COI genom mitokondria kemudian diamplifikasi menggunakan universal primer DNA barcoding primer forward yaitu LCO 1490 (5’- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’) dan primer reverse
yaitu HCO 2198 (5’-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’) (Folmer et al ., 1994).
Proses amplifikasi dilakukan dengan mengatur suhu mesin PCR step up seperti berikut; suhu pre-denaturation 95°C selama lima menit, masing-masing 35 siklus dengan denaturasi pada suhu 95°C selama 15 detik, anneling pada suhu 42°C-52°C selama 40 detik; serta extention pada suhu
72°C selama satu menit 30 detik dan diakhiri dengan post extention pada suhu 72°C selama lima menit. Visualisasi hasil PCR dengan menggunakan gel eletroforesis 2% dan UV transluminator. Sampel hasil PCR yang teramplifikasi kemudian dikirim ke 1 st Base Malaysia untuk dilakukan sekuensing DNA.

## Analisis Data Hasil Sekuen
Hasil sekuen diedit dan diurutkan dengan menggunakan program Geneious Prime, hasil aligmentnya kemudian dicocokan dengan program Basic Local Assignment Search Tool (BLAST) dan validasi spesies dipilih dengan tingkat kesamaan tertinggi. Prinsip dalam program ini yaitu mencocokan sekuen yang diperoleh dengan sekuen spesies yang terdapat pada genbank library . Struktur pohon filogenetik dianalisis dengan program MEGA X dengan menambahkan sekuen dari GenBank dengan tingkat kesamaan tertinggi. Analisis filogenetik dilaksanakan berdasarkan metode neighbor
joining (NJ) model Kimura-2 parameter dengan uji pada 1.000x bootstrap (Keskin & Atar, 2013).

## HASIL DAN BAHASAN Hasil

## Identifikasi Molekular
Diperoleh sebanyak 34 spesimen moluska selama penelitian yang berhasil di ekstraksi dan diamplifikasi dengan barcode DNA universal primer LCO 1490 dan HCO 2198. Hasil amplifikasi ditandai dengan adanya pita (band) pada marker dengan panjang produk PCR sekitar 740 bp (Gambar 2). Urutan sekuen kemudian diidentifikasi dalam program BLAST untuk menentukan kecocokan yang paling mendekati dengan urutan bank gen.
Dalam identifikasi molekuler tersebut tidak ditemukan adanya kodon stop yang menunjukkan bahwa panjang variasi tidak terkait dengan ko amplifikasi dari gen semu ( co-amplification pseudogenes ) dan tidak terjadi kemungkinan bias dari analisis yang dilakukan (Barco et al ., 2016). Setelah dilakukan pemotongan primer dan penggabungan dengan sekuen COI dari genebank serta melalui proses aligment diperoleh sekuen 618 bp yang dapat dianalisa lebih lanjut.
Hasil identifikasi molekular berdasarkan program BLAST terhadap 34 spesimen moluska ditunjukkan dalam Tabel 1, sedangkan morfologi moluska diperlihatkan pada Gambar 3. Dari 34 spesimen teridentifikasi sebanyak 23 spesies moluska di perairan padang lamun di sekitar Biak, yang meliputi 5 spesies kelas Bivalvia dan 18 kelas Gastropoda. Species-species tersebut meliputi: Monetaria annulus, Hippopus porcellanus, Vasticardium flavum, Conus leopardus, Pinctada margaritifera, Plankobranchus sp, Cypraea tigris, Conus virgo, Conus literatus, Conus marmoreus, Lambis lambis, Conomurex luhuanus, Nerita undata, Vasum turbinellus, Canarium
urceus, Pinna muricata, Conus miles, Drupa grossularia, Luria Isabella, Nassa serta, Conus quernicus, Nerita undulata, dan Spondylus squamosus . Jenis-jenis moluska tersebut tersebar dalam 7 ordo yaitu Littorinimorpha, Neogastropoda, Cycloneritida, Nudibranchia, Ostreida, Cardiida, dan Pectinida. Sebagian besar moluska berasal dari ordo Neogastropoda (12 spesies), antara lain dari famili Strombidae (3 spesies), Muricidae (2 spesies), Turbinellidae (1 spesies) dan Conidae (6 spesies).

## Jarak Genetik dan Struktur Pohon Filogenetik
Analisis jarak genetik antar spesies ditampilkan dalam Tabel 2. Penelitian ini menunjukkan jarak genetik berkisar antara 0,109-0,713; jarak genetik terendah ditemukan pada Nerita undata dan Nerita undulata yaitu 0,109, dan terbesar pada spesies Spondylus squamosus dan Luria isabella sebesar 0,713. Berdasarkan data dugaan jarak genetik yang diperoleh dapat disusun pohon filogenetik spesies-spesies Moluska dibandingkan dengan data GenBank seperti disajikan pada Gambar 4. Hampir seluruh moluska memiliki nilai bootstrap yang tinggi dengan sekuen genbank, hal ini menunjukkan tingginya kesamaan antar sekuen. Nilai boostrap merupakan nilai yang menyatakan peluang terjadinya perubahan susunan clade pada pohon filogenetik. Semakin tinggi nilai bootstrap menunjukkan semakin kecil terjadinya perubahan susunan antar clade sehingga pohon yang dibentuk akan konsisten dan tidak berubah. Nilai bootstrap lebih dari 90% menunjukkan clade yang dapat dipercaya (Hall, 2001). Pohon filogenetik menunjukkan sekuen mengelompok berdasarkan kelas, ordo dan family yang berbeda. Konstruksi tersebut menampilkan pengelompokkan spesies terjadi berdasarkan kesamaan genetik yang berkaitan dengan hubungan kekerabatan. Jenis moluska dengan spesies N. undata dan N. undulata memiliki nilai bootstrap 100, semakin tinggi nilai bootstrap pada masing- masing spesies menunjukan kesamaan genetik yang tinggi dan kekerabatan yang dekat.
Gambar 2. Hasil amplifikasi gen COI menggunakan barcode DNA universal primer LCO 1490 dan HCO 2198 terhadap produk PCR sebesar ±740 bp.
Figure 2. COI gene amplification using universal DNA barcode primers LCO 1490 and HCO 2198 with a PCR product of 740 bp.

## Tabel 1. Hasil identifikasi species Molluska dengan program BLAST
Table 1. Results of identification in the BLAST program No Kode DNA Identifikasi BLAST % Identifikasi Query cover E value Accession Number 1 DRM1 Conus leopardus 99,84 100 0 MW278517.1 2 DRM3 Vasticardium flavum 98,28 100 0 JN860021.1 3 DRM4 Hippopus porcellanus 99,84 100 0 MT755622.1 4 DRM5 Monetaria annulus 97,31 99 0 MN389075.1 5 DRM6 Pinctada margaritifera 98,05 100 0 HM467838.1 6 DRM7 Plakobranchus sp. 99,69 100 0 KC573723.1 7 DRM8 Cypraea tigris 99,53 100 0 MW278160.1 8 DRM9 Cypraea tigris 97,83 100 0 MW278160.1 9 DRM14 Conus virgo 99,84 100 0 KJ550523.1 10 DRM15 Conus virgo 99,84 100 0 KJ550523.1 11 DRM21 Conus litteratus 100 100 0 KJ550336.1 12 DRM22 Conus marmoreus 99,53 100 0 KJ549950.1 13 DRM27 Lambis lambis 99,68 100 0 MN690208.1 14 DRM29 Conomurex luhuanus 99,69 100 0 KY853669.1 15 DRM32 Monetaria annulus 99,38 99 0 MN389075.1 16 DRM33 Nerita undata 99,07 100 0 EU732327.1 17 DRM39 Vasum turbinellus 98,76 100 0 HQ834084.1 18 DRM41 Canarium urceus 100 100 0 MN389050.1 19 DRM42 Pinna muricata 100 100 0 KJ366405.1 20 DRM43 Conus miles 99,84 100 0 KJ549952.1 21 DRM46 Monetaria annulus 99,38 99 0 MN389075.1 22 DRM49 Drupa grossularia 99,85 100 0 HE584488.1 23 DRM51 Cypraea tigris 99,69 100 0 MW278160.1 24 DRM55 Luria isabella 99,54 99 0 MW277757.1 25 DRM58 Hippopus porcellanus 99,53 100 0 MT755622.1 26 DRM59 Nassa serta 99,22 100 0 HE584349.1 27 DRM60 Vasum turbinellus 99,53 100 0 JN053025.1 28 DRM61 Conomurex luhuanus 99,38 100 0 MN389060.1 29 DRM62 Conomurex luhuanus 99,85 100 0 KY853669.1 30 DRM70 Conomurex luhuanus 99,85 100 0 KY853669.1 31 DRM78 Conus quercinus 99,84 100 0 MH400188.1 32 DRM79 Nerita undulata 99,06 100 0 EU732351.1 33 DRM81 Nassarius coronatus 99,22 100 0 KY451287.1 34 DRM87 Spondylus squamosus 99,56 100 0 MW278517.1
Gambar 3. Morfologi moluska di perairan Biak yang diidentifikasi dengan Teknik DNA barcoding (Sumber: Aji, 2019). Figure 3. Molluscs in Biak Waters identified by DNA barcoding Molecular Techniques.
Simbolon, A, R., et al/BAWAL. 13 (1) April 2021: 11-21
Gambar 4. Pohon filogenetik Moluska berdasarkan jarak genetik dari sekuen DNA gen COI menggunakan metode neighbor joining (NJ) model Kimura 2 parameter, bootstrap 1.000 replikasi.
Figure 4. Mollusc phylogenetic tree based on COI gene DNA sequence using neighbor joining (NJ) method with Kimura-2 parameter model, bootstrap 1000 replications.

## T ab el 2 . Ja ra k g e n e ti k a n ta r sp es ie s M o lu sk a d i p
er ai ra n B ia k , P a p u a se la m a p en el it ia n
T a b e l 2 . G e n e ti c d is ta n ce b et w ee n m o ll u sk sp ec ie s in B ia k W a te rs , P a p u a o b ta in ed d u ri n g re se a rc h

## Bahasan

## Identifikasi Molekular
Hampir semua sampel dapat diidentifikasi hingga tingkat spesies, kecuali satu sampel yang teridentifikasi hingga tingkat genus, yaitu Plakobranchus sp. Justifikasi spesies umumnya digunakan pada nilai similaritas dari 99 - 100%. Semakin tinggi nilai identitas antar spesies menunjukkan kesamaan spesies yang semakin tinggi. Nilai identitas yang mendekati 100%, serta nilai E = 0 menunjukkan tingkat kesamaan spesies yang tinggi (Madduppa et al., 2017). Sementara itu menurut Hebert et al . (2003) identifikasi spesies di bawah 97% menunjukkan spesies berbeda. Penelitian ini menunjukkan sebagian besar nilai identitas berkisar 97% - 100% dengan demikian hasil BLAST yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan tingkat validasi kesamaan spesies yang tinggi.
Satu spesimen teridentifikasi hingga tingkat genus, yaitu Plakobranchus sp, hal ini memang menjadi salah satu kekurangan dalam identifikasi molekuler, yang mana metode ini bergantung pada taksonomi sekuen dari genbank library (Fahmi et al ., 2016). Plakobranchus sp merupakan salah satu kelompok Nudibranchia, dengan keragaman famili yang kompleks. Nudibranchia umumnya ditemukan pada perairan tropis hingga subtropis di sepajang perairan Indo-West Pacific. Kesulitan dalam mengidentifikasi kelompok Nudibranchia disebabkan tingginya variasi perbedaan pola warna pada tubuh sehingga mengakibatkan kesulitan dalam penetapan taksonomi antar spesies (Furfaro et al ., 2016).
Seluruh spesimen dapat diidentifikasi dengan baik hingga tingkat spesies dengan tingkat kesamaan spesies yang tinggi, hal ini mengkonfirmasi bahwa gen COI dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies moluska dengan baik. Hasil identifikasi yang diperoleh diharapkan dapat menjadi bahan referensi dalam mengidentifikasi moluska di perairan Indonesia khususnya perairan Biak. Identifikasi molekuler dengan menggunakan gen COI pada moluska di perairan Indonesia juga telah dilakukan oleh Juniar et al . (2021) yang mengidentifikasi spesies Clithon oualaniense di perairan Madura dengan tingkat kesamaan spesies 98-100%. Saleky et al . (2020) juga menggunakan gen yang sama dalam mengindentifikasi Turbo stenogyrus di pesisir pantai Yekwandi Distrik Momiwaren Kabupaten Manokwari Selatan.

## Struktur Filogenetik
Jarak genetik yang semakin rendah antar spesies menandai semakin sedikitnya perbedaan pasangan basa antar spesies yang diikuti tingginya persamaan morfologi. Moluska dengan jenis N. undata dan N. undulata memiliki jarak genetik terendah, menunjukkan hubungan
kekerabatan yang erat, hal yang sama dilaporkan oleh Chee & Siti (2014) pada N. undata dan N. undulata di perairan Malaysia. Famili Neritidia memiliki warna dan pola yang hampir sama sehingga sering mengalami kesulitan dalam identifikasi secara morfologi, kesamaan pola warna tidak dapat digunakan dalam identifikasi Neritidia dikarenakan kemungkinan tingginya variasi antar spesies (Chee & Siti, 2014). Penelitian ini menunjukkan identifikasi molekular khususnya dengan menggunakan DNA barcoding pada gen mt-COI dapat dijadikan metode dalam mengidentifikasi spesies pada genus Nerita yang memiliki morfologi antar spesies yang hampir sama.
S. squamosus dan L. Isabella memiliki jarak genetik yang besar yang mengindikasikan tingginya perbedaan genetik antara kedua spesies. Besarnya jarak genetik menandakan perbedaan dalam tingkat family hingga genus (Ran et al ., 2020). Perbedaan jarak genetik dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor lingkungan. Genetic drift dan seleksi alam merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi perbedaan jarak genetik (Freeland, 2012). Selain itu, perbedaan geografis dan kondisi lingkungan dapat menyebabkan perubahan morfologi dan filogenetik (Twindiko et al ., 2013). Moluska memiliki variasi genetik yang luas sehingga identifikasi spesies tidak hanya berdasarkan jarak genetik intraspesies dan antarspesies.
Kesamaan genetik tinggi ditandai dengan kesamaan morfologi yang tinggi, hal ini lah yang menyebabkan sering terjadinya kesalahan dalam identifikasi spesies secara morfologi (Simbolon et al ., 2021). Spesies Hippopus porcelanus dan Vasticardium flavum memiliki nilai bootsrap 100 (Gambar 3), hal ini menunjukkan tingginya kesamaan genetik sehingga kesamaan morfologi kedua spesies tersebut cukup tinggi (Gambar 2). Hal yang sama juga terlihat pada spesies Nerita undata dan Nerita undulata dengan nilai bootsrap 100 kedua spesies ini secara morfologi sangat mirip (Gambar 2) namun secara molekuler merupakan 2 spesies yang berbeda (spesies kriptik).
Identifikasi spesies secara molekuler dengan menggunakan DNA barcoding dapat menjadi metode dalam mengungkap spesies dengan kesamaan morfologi yang tinggi (spesies kriptik) sehingga identifikasi spesies dapat lebih tepat. Namun identifikasi secara molekuler sangat tergantung dengan jumlah data sekuen yang tersimpan dalam library genbank (Fahmi et al ., 2016) sehingga identifikasi morfologi dan molekuler sebaiknya dilakukan secara bersamaan agar identifikasi lebih tepat dan akurat.

## KESIMPULAN
Analisis DNA barcoding dengan gen mt-COI dapat digunakan dalam mengidentifikasi spesies Moluska. Dari
BAWAL. 13 (1) April 2021: 11-21
34 spesimen moluska yang dianalisis dapat diidentifikasi sebanyak 23 spesies moluska. Dalam pohon filogenetik yang disusun ke 23 spesies mengelompok berdasarkan genus, famili, dan ordo yang berbeda. Moluska merupakan phylum yang memiliki variasi spesies dan kesamaan morfologi yang tinggi. Tingginya variasi antar spesies moluska menyebabkan sering terjadinya kesalahan identifikasi secara morfologi. Identifikasi secara molekuler dengan menggunakan DNA barcoding dapat dijadikan alat dalam mengidentiifkasi spesies moluska secara lebih tepat sehingga pengelolaan spesies akan tepat sasaran serta bermanfaat bagi kajian pengelolaan selanjutnya.

## PERSANTUNAN
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Kepala Pusat Penelitian Oseanografi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang mengizinkan penelitian ini berlangsung. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Adriani Widyastuti, Yohana Farwas dan staf LKBL Biak LIPI yang telah membantu dalam pengambilan sampel. Penelitian ini dibiayai oleh Pusat Penelitian Oseanografi LIPI melalui hibah dana luar negeri dalam program UNESCO/Korean Funds-in-Trust Project Enhance the Capacity for Species Identification and Genetic Analysis on Marine Organisms in the Coral Reef Ecosystems in the Western Pacific - Third Phase (DRMREEF-II and III).

## DAFTAR PUSTAKA
Aji, L. P., Widyastuti, A., & Capriati, A. (2018). Struktur Komunitas Moluska di Padang Lamun Perairan Kepulauan Padaido dan Aimando Kabupaten Biak Numfor, Papua. Oseanologi dan Limnologi di Indonesia , 3(3), 219-234. doi: 10.14203/ oldi.2018.v3i3.184.
Aji, L.P. & Widyastuti, A. (2019). The condition and composition of seagrass and mollusca on Biak island,
Papua. IOP Conference Series: Earth and
Environmental Science. Doi: 10.1088/1755-1315/404/ 1/012069.
Appeltans, W., Ahyong, S. T., & Anderson, Gl. (2012). The magnitude of global marine species diversity. Current Biology , 22, 2189–2202. doi: 10.1016/ j.cub.2012.09.036.
Barco, A., Michael, J., Raupach., Silke, L., Hermann.,
Neumann., & Thomas, K. N. (2016). Identification of North Sea molluscs with DNA barcoding . Molecular Ecology Resources , 16, 288–297. doi: 10.1111/1755- 0998.12440
Chee, S.Y., & Siti, A. M. N. (2014). Short communication: DNA barcoding reveals Neritid diversity (Mollusca:
Gastropoda) diversity in Malaysian waters. Mitochondrial DNA , Early Online, 1-3. doi: 10.3109/ 19401736.2014.987237
Fahmi, M.R., Prasetio, A.B., Kusumah, R.V., Hayuningtyas, E.P., & Ardi, I. (2016). Barcoding DNA ikan hias lahan gambut. Jurnal Riset Akuakultur , 11(2), 137-145. doi: 10.15578/jra.11.2.2016.137-145
Furfaro, G., Modica, M. V., Oliverio, M., & Mariottini, P.
(2016). A DNA- barcoding approach to the phenotypic diversity of Mediterranean species of Felimare Ev. Marcus & Er. Marcus, 1967 (Mollusca: Gastropoda), with a preliminary phylogenetic analysis. Italian Journal of Zoology , 1–13. doi: 10.1080/ 11250003.2016.1150525
Freeland, J.R., Kirk, H., & Petersen, S. (2012). Genetic analysis of multiple populations in molecular ecology . 2nd edition. New York: John Wiley and Sons.
Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., & Vrijenhoek, R. (1994). DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol Mar Biol Biotechnol , 3(5), 294– 299.
Hall, B.G. (2001). Phylogenetic Trees Made Easy: A How - To Manual for Molecular Biologists . Sinauer Associates, Inc. Sunderland, Massachusetts, USA.
Hebert, P.D.N., Cywinska, A., Ball, S.L., & deWaard, J.R. (2003). Biological identifications through DNA barcodes. Proc R Soc Lond B Biol Sci , 270, 313–321. doi: 10.1098/rspb.2002.2218.
Kress, W.J., Garcýa-Robledo, C., Uriarte, M., & Erickson, D.L. (2015). DNA barcodes for ecology, evolution and conservation. Trends in Ecology and Evolution , 30, 25–35. doi: 10.1016/j.tree.2014.10.008
Keskin, E., & Atar, H.H. (2013). DNA barcoding commercially important aquatic invertebrates of Turkey. Mitochondrial DNA , 24(4), 440–450. doi: 10.3109/19401736.2012.762576
Juniar, A.E., Reni, A., &, Dwi, A.R. (2021). Genetic identification of Clithon oualaniense (Gastropoda:
Neritidae) from Madura, Indonesia. AACL Bioflux , 14 (2), 1046-1056.
Liu, J., & Zhang, H. (2018). DNA barcoding for species identification in deep-sea clams (Mollusca: Bivalvia: Vesicomyidae), Mitochondrial DNA , Part A. doi:
10.1080/24701394.2018.1424843
Simbolon, A, R., et al/BAWAL. 13 (1) April 2021: 11-21
Madduppa, H., Taurusman, Am. A., Subhan, B., Anggraini, N.P., Fadillah, R., & Tarman, K. (2017). Short communication: DNA barcoding reveals vulnerable and not evaluated species of sea cucumbers (Holothuroidea and Stichopodidae) from Kepulauan Seribu Reefs, Indonesia. Biodiversitas , 18(3), 893-898. doi: 10.13057/biodiv/d180305
Palanisamy, S. K., Prasanna, K., Purushothaman, P., & Umamaheswari, S. (2020). Molecular approach to the identification and phylogenetic biogeography of snail Telescopium telescopium using mt-COI gene sequences. Regional Studies in Marine Science , 35, 1-17. doi:101016/j.rsma.2020.101109.
Ran K., Li Q., Qi L., Li W., Kong L. (2020). DNA barcoding for identification of marine gastropod species from Hainan Island, China. Fisheries Research , 225, doi:
105504. 10.1016/j.fishres.2020.105504
Saleky, D., Simon, P.O. L., Thomas, F.P., Isma., Rosa, D. P., Marius, A.W., Edy, H.P.M., Muhammad, D. (2020). Analisis pola pertumbuhan dan pendekatan DNA barcoding untuk identifikasi Turbo stenogyrus P. Fischer, 1873 (Mollusca: Gastropoda). Biotropika Journal of Tropical Biology, 8 (2), 79-84. doi: 10.21776/ ub.biotropika.2020.008.02.03.
Simbolon, A.R. (2018). Analisis risiko kesehatan pencemaran timbal (Pb) pada kerang hijau ( Perna viridis ) di Perairan Cilincing Pesisir DKI Jakarta. Oseanologi dan Limnologi di Indonesia , 3(3), 197- 208. doi: 10.14203/oldi.2018.v3i3.207.
Simbolon, A.R., Masteria, Y. P., & Ismiliana, W. (2021). Identifikasi spesies menggunakan DNA barcoding dalam menunjang budidaya dan konservasi teripang di Perairan Lampung. Jurnal Riset Akuakultur, 16 (1),
31-37. Doi: http://dx.doi.org/10.15578/jra.16.1.2021.31- 37
Sturm, C.F., Pearce, T.A. & Valdes, A. (2006). The Mollusks. A Guide to Their Study, Collection, and Preservation.American Malacological Society, Pittsburgh.
Sun, S., Qi, L., Lingfeng, K., Hong, Y., Xiaodong, Z., Ruihai, Y., Lina, D., Yan, S., Jun, C., Jun, L., Lehai, N., Yanwei, F., Zhenzhen, Y., Shanmei, Z., & Jiping, L. (2016). DNA barcoding reveal patterns of species diversity among northwestern Pacific molluscs. Scientific Reports , 6, 33367, 1-17. doi: 10.1038/srep33367.
Twindiko A. F., Wijayanti D. P., Ambariyanto A. (2013). Phylogenetic study of coral fish genus Pseudochromis and Pictichromis in Indo-Pacific Waters. Marina Oceanography Bulletin , 2(3), 29-37.
Van der Meij, S. E. T., Moolenbeek, R.G., & B.W.Hoeksema, B.W. (2009). Decline of the Jakarta Bay molluscan fauna linked to human impact. Marine Pollution Bulletin , 59, 101-107. doi:https:10.1016/
j.marpolbul.2009.02.021.
BAWAL. 13 (1) April 2021: 11-21