Karakterisasi Senyawa Bioaktif Kapang Laut Trichoderma asperellum MT02 dengan Aktivitas Anti- Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL) E . coli
Mada Triandala Sibero 1,4* , Aninditia Sabdaningsih 2 , Ocky Karna Radjasa 3 , Agus Sabdono 1 , Agus Trianto 1 dan Subagiyo 1
1 Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro 2 Departemen Sumberdaya Akuatik, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedharto, SH, Tembalang, Semarang, Indonesia 50275
3 Kementerian Riset, Teknologi, Dan Pendidikan Tinggi Republik Indonesia Jl. M. H. Thamrin No. 8, Jakarta Pusat 10340
4 Marine Science Techno Park Jl. UNDIP, Desa Teluk Awur, Jepara, Jawa Tengah, 59427 Email: madatriandala@hotmail.com

## Abstract
Characterization of Bioactive Compound from Marine Fungi Trichoderma asperellum MT02 Exhibiting Anti-Extended Spectrum Β-Lactamase (ESBL) E. coli
The Trichoderma asperellum MT02 has been reported to has antibacterial activity against the Extended Spectrum β-Lactamase (ESBL) E . coli based on the screening results through an agar plug method.  This  study  aimed  to  evaluate  the  antibacterial  activity  of T . asperellum MT02  and characterize the composition of the bioactive compounds group possessed in its crude extract. The isolate was cultured in the Malt Extract Broth (MEB) media (static, 27 o C, 15 days). The intracellular metabolites  from  mycelium  were  extracted  using  methanol  while  extracellular  metabolites  from broth media were extracted  using ethyl acetate.  The antibacterial activity of crude  extracts was tested using the paper disc diffusion method while bioactive compounds were characterized using the phytochemical method. The results showed  that the antibacterial activity of the broth media extract performed a greater activity than the crude extract from the mycelium. The crude extract from  mycelia  only  contained  flavonoid  and  phenol  hydroquinone  compounds  while  the  crude extract from broth media contains alkaloids, flavonoids, phenols hydroquinone and saponins.
Keywords : Antibacterial; bioactives; phytochemical; Trichoderma

## Abstrak
Kapang Trichoderma  asperellum MT02  telah  dilaporkan  memiliki  potensi  sebagai  penghasil senyawa  antibakteri  melawan Extended  Spectrum  β-Lactamase (ESBL) E . coli berdasarkan  hasil penapisan  melalui  metode agar  plug .  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  aktivitas antibakteri  ekstrak  kasar  kapang T . asperellum MT02  serta  komposisi  golongan  senyawa  bioaktif yang dimiliki. Kapang dikultur pada media Malt Extract Broth (MEB) (statis, 27 o C, 15 hari) di mana metabolit  intraseluler  dari  miselium  diekstrak  menggunakan  metanol  sedangkan  metabolit ekstraseluler dari media kaldu diekstrak menggunakan etil asetat. Aktivitas antibakteri ekstrak kasar diuji  menggunakan  metode  difusi  kertas  cakram  sedangkan  senyawa  bioaktif  dikarakterisasi menggunakan  metode  fitokimia.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  aktivitas  antibakteri  asal ekstrak  media  kaldu  lebih  baik  dibandingkan  ekstrak  kasar  asal  miselium  kapang.  Ekstrak  kasar kapang  asal  miselia  hanya  mengandung  senyawa  golongan  flavonoid  dan  fenol  hidrokuinon sedangkan ekstrak kasar asal media kaldu mengandung alkaloid, flavonoid, fenol hidroquinon dan saponin.
Kata Kunci : Antibakteri; bioaktif; fitokimia; Trichoderma
Jurnal Kelautan Tropis Maret 2019 Vol. 22(1):9 –18

## PENDAHULUAN
Sumber  daya  laut  diketahui  sebagai penyedia bahan aktif yang dapat dimanfaatkan  di  bidang  pangan  fungsional, kosmeseutikal  maupun  farmasi  (Suleria et  al ., 2015;  Guillerme et  al .,  2017).  Berbagai penelitian telah membuktikan spons asal laut Indonesia  menghasilkan  metabolit  yang mampu  menghambat  pertumbuhan  sel mikroba  patogen,  menghambat  kinerja enzim  tertentu  yang  tidak  diinginkan  hingga kandidat obat kanker yang potensial (Abdjul et  al .,  2017;  Ibrahim  dan  Mohamed,  2017; Maarisit et  al .,  2017;  Zubair et  al .,  2018). Namun, pengambilan biomassa suatu spesies spons tertentu secara terus  menerus dikarenakan  senyawa  target  bioaktif  yang dihasilkan  sangat  sedikit  diprediksikan  akan menyebabkan ketidakseimbangan ekosistem laut  hingga  punahnya  suatu  spesies. Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Ibrahim  dan Mohamed (2017) hanya memperoleh 2,6 mg senyawa  ingenine  E  yang  sangat  potensial sebagai antikanker dari 1,3 kg jaringan kering spons Acanthostrongylophora ingens . Penelitian serupa yang dilakukan oleh Ebada et  al .  (2017)  hanya  mampu  mengisolasi  1,7 mg  senyawa  Nakijiquinone  G  dari  130  gr jaringan kering spons Dactylospongia elegans yang  diperoleh  dari  Ambon.  Rendahnya rendemen  senyawa  yang  diperoleh  serta tingginya kemungkinan kerusakan lingkungan yang dapat terjadi menyebabkan pergantian  pemanfaatan  sumber  senyawa bioaktif  dari  spons  menjadi  mikroorganisme asosiasi spons, salah satunya adalah kapang.
Kapang  merupakan  anggota  dari kingdom  fungi  yang  berukuran  mikroskopik, multi seluler dan memproduksi filamen. Kajian mengenai  aktivitas  biologis  dari  kapang  laut asal  spons  diketahui  memiliki  aktivitas antibakteri yang sangat baik untuk dikembangkan  sebagai  antibiotik.  Liu et  al . (2018) berhasil mengisolasi senyawa penicillilactone  A asal kapang Penicillium sp. LS54 yang merupakan kapang asosiasi spons Haliclona sp.  Senyawa  ini  telah  dianggap sebagai  kandidat  antibakteri  yang  sangat baik melawan patogen udang Vibrio harveyi dengan  nilai  MIC  8  µg/mL.  Aplikasi  senyawa antibakteri  asal  kapang  melawan  bakteri patogen  manusia  telah  dilakukan  oleh
Fredimoses et  al .  (2018).  Penelitian  tersebut melaporkan bahwa senyawa emerixanthone E yang diproduksi oleh kapang Emericella sp. SCSIO  05240  mampu  melawan  bakteri patogen  manusia,  di  antaranya Escherichia coli (ATCC  29922), Klebsiella  pneumoniae (ATCC 13883), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Enterococcus  faecalis (ATCC  29212), dan Acinetobacter baumannii (ATCC 19606).
Pencarian  senyawa  antibiotik  baru menjadi sebuah topik penting bagi perkembangan  ilmu  kesehatan  dikarenakan sulitnya  penyembuhan  infeksi  bakteri  yang sudah resisten terhadap beberapa gelongon antibiotik  atau  lebih  dikenal  dengan multi- drugs  resistant (MDR) bacteria . Center  for Disease  Control  and  Prevention (CDC) mengungkapkan  bahwa  bakteri  MDR  dari famili Enterobacteriaceae seperti Escherichia coli telah  resisten  terhadap  antibiotik komersial  turunan  β-laktam  seperti  penicillins, cephalosporins, dan monobactam aztreonam  yang  dikenal  dengan  istilah extended  spectrum  β-lactamase (ESBL)  di mana hal ini akan mempersulit penyembuhan  pasien  yang  terinfeksi  oleh bakteri  ini  (CDC,  2018).  Bakteri  ESBL E . coli dilaporkan sebagai patogen yang mengakibatkan  diare  pada  beberapa  kasus kesehatan  di  kota  Surabaya  (Wasito et  al ., 2017). Kitagawa et al. (2018) juga melaporkan  bahwa  bakteri  ESBL E . coli merupakan patogen dominan yang menyebabkan  infeksi  saluran  kemih  (ISK) pada  pasien  di  rumah  sakit  Dr.  Soetomo, Surabaya.  Bakteri  ini  juga  diketahui  sebagai penyebab  infkesi  lain  seperti  pneumonia, abses,  sepsis  hingga  infeksi  kulit  dan  tulang (Natalia et  al., 2018).  Bakteri  ini  sangat berbahaya karena mampu menyebar malalui  vektor  lain  seperti  makanan  dari hewani  yang  berasal  dari  rumah  potong yang  telah  terkontaminasi.  Hasil  penelitian Sudarwanto et al . (2017) pada rumah potong hewan  di  Bogor  mendapatkan  bahwa  dari seluruh  total  bakteri  yang  diisolasi  diketahui bahwa  14,3%  diantaranya  merupakan bakteri ESBL E . coli . Penelitian ini meneruskan kajian  sebelumnya  yang  telah  melaporkan potensi  kapang  laut  fakultatif Trichoderma asperellum MT02  asal  spons Cinachyrella sp. yang menunjukkan potensi antibakteri melawan  bakteri  ESBL E . coli yang  diisolasi dari pasien rumah sakit Dr. Kariadi Semarang
(Sibero et  al., 2017).  Penelitian  ini  bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak kasar  kapang T . asperellum MT02  serta komposisi  golongan  senyawa  bioaktif  yang terdapat  di  ekstrak  kasar  asal  miselium  dan media kaldu ( broth ).

## MATERI DAN METODE
Kapang T. asperellum MT02 merupakan isolat  koleksi  dari  Divisi  Kapang  Laut, Laboratorium Bioteknologi Laut Tropis, Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan, Universitas  Diponegoro.  Kapang  ini  diisolasi dari  spons Cinachyrella sp.  asal  perairan Pulau  Panjang,  Jepara  (Sibero et  al .,  2017). Kapang  diremajakan  dari  stok  kultur menggunakan  media Malt  Extract  Agar (MEA)  dari  HiMedia  pada  suhu  ruangan (27 o C) selama 7 hari. Morfologi koloni kapang hasil  peremajaan  selanjutnya  dibandingkan dengan  foto  morfologi  stok,  koloni  yang memperlihatkan  kemiripan  yang  sesuai sehingga isolat ini dilanjutkan untuk digunakan pada penelitian ini.

## Kultivasi kapang
Sebanyak  4  potong  dengan  ukuran 1×1cm 2 kapang T . asperellum MT02  yang berusia  5  hari  dari  media  MEA  dipindahkan ke  dalam  media Malt  Extract  Broth (MEB) bervolume 100 mL dalam Erlenmeyer dengan tiga  ulangan.  Kapang  dikultivasi  dengan keadaan statis ( stand culture ) selama 15 hari pada suhu ruang (27 o C) (Sibero et al ., 2018 1 ).

## Ekstraksi senyawa bioaktif
Senyawa
bioaktif diekstrak menggunakan  metode  ekstraksi  tunggal,  di mana  setiap  sumber  diekstraksi  hanya menggunakan  satu  jenis  pelarut.  Kapang yang  telah  dikultivasi  selama  15  hari selanjutnya  dipisahkan  antara  media  kaldu ( broth )  dan  miseliumnya  menggunakan kertas  saring.  Miselium  kapang  yang diperoleh selanjutnya dikeringkan menggunakan  desikator  yang  berisi  gel  silika selama  3  ×  24  jam  kemudian  ditambahkan pelaurt  methanol  sebesar  100  mL  dan diagitasi menggunakan shaker (120 r.p.m.; 24 jam).  Selanjutnya  miselia  dan  pelarut dipisahkan  menggunakan  kertas  saring.
Pelarut  dipekatkan  menggunakan rotary evaporator pada  suhu  30-35 o C.  Ekstraksi senyawa bioaktif dari  media  kaldu dilakukan dengan  penambahan  pelarut  etil  asetat dengan  rasio  3:1  (pelarut:media  kaldu) kemudian  diagitasi  menggunakan shaker (120 r.p.m.; 24 jam). Media kaldu dan pelarut dipisahkan  menggunakan  corong  pisah ( separatory  funnel ),  selanjutnya  fase  pelarut dipekatkan menggunakan rotary evaporator ( Eyela )  pada  suhu  30-33 o C.  Ekstrak  kasar yang  diperoleh  selanjutnya  dikeringkan menggunakan  gas  nitrogen  dan  ditimbang untuk  mendapatkan  bobotnya.  Ekstrak selanjutnya  disimpan  menggunakan  pelapis aluminium  foil  pada  suhu  -20 o C  untuk menjaga  kestabilan  senyawa  bioaktif  dalam ekstrak kasar (Sibero et al . 2018 1 )
Uji aktivitas antibakteri
Bakteri  ESBL E . coli merupakan  isolat klinis  diisolasi  dari  pasien  rumah  sakit  Dr. Kariadi Semarang. Bakteri diremajakan pada media MacConkey ( HiMedia ) selama 24 jam sebelum  digunakan  dalam  uji  antibakteri. Tahap  ini  mengacu  pada  standar  pengujian yang  diberikan  oleh  CLSI  (2016).  Bakteri  uji diencerkan  menggunakan  garam  fisiologis hingga  mencapai  kekeruhan  0,5  McFarland selanjutnya  diinokulasikan  menggunakan cotton  swab steril  pada  seluruh  permukaan media Mueller  Hinton  Agar (MHA)  ( Merck ). Sediaan  ekstrak  dibuat  dengan  cara melarutkan  ekstrak  kasar  menggunakan dimethyl  sulfoxide (DMSO)  ( Merck )  menjadi konsentrasi 500 µg/mL, 350 µg/mL, 250 µg/mL, 100 µg/mL dan 50 µg/mL. Sebanyak 15 µL dari setiap konsentrasi sediaan ekstrak diinjeksikan ke  dalam  kertas  cakram  berukuran  8  µm ( Advantec )  kemudian  dikering  anginkan  lalu diletakkan  ke  atas  media  MHA  yang  telah diinokulasikan bakteri uji, kertas cakram yang berisi  antibiotik  Amoxicillin  10  µg/cakram ( Oxoid )  digunakan  sebagai  kontrol  positif sedangkan  DMSO  tanpa  ekstrak  sebagai kontrol  negatif.  Tahapan  ini  dilakukan dengan  empat  pengulangan.  Inkubasi dilakukan  pada  suhu  37 o C  selama  24  jam. Zona  hambat  yang  terbentuk  merupakan indikator  keberadaan  senyawa  bioaktif sebagai  antibakteri.  Diameter  zona  hambat yang  terbentuk  selanjutnya  diukur  dengan jangka  sorong  untuk  mengetahui  efektivitas konsentrasi (Sibero et al . 2018 1,2 ).

## Fitokimia
Kandungan  senyawa  bioaktif  pada ekstrak  kasar  kapang T . asperellum MT02 dilakukan  menggunakan  metode  fitokimia (Hidayat  dan  Nurjanah,  2016).  Modifikasi yang  dilakukan  berupa  ektrak  dilarutkan dalam DMSO dan akuades (1:5) untuk uji.

## Alkaloid
Masing-masing sebanyak 300 µL larutan ekstrak  dimasukkan  ke  dalam  sumur  uji kemudian  sebanyak  2  tetes  H 2 SO 4 2N ditambahkan  beserta  reagen  Dragendorff, Meyer  dan  Wagner.  Hasil  positif  pada Dragendorff  akan  memberikan  endapan berwarna  jingga  hingga  merah,  endapan putih  kekuningan  pada  reagen  Meyer  dan endapan cokelat untuk reagen Wagner.

## Flavonoid
Sebanyak  0.1  mg  bubuk  Magnesium (Mg),  350  µL  amil  alkohol  (dibuat  dengan cara menambahkan HCl 37% dan etanol 95% dengan  perbandingan  1:1),  dan  350  µL alkholol kedalam sumur  uji yang berisi  300 µL larutan  sampel.  Hasil  positif  diperlihatkan dengan  munculnya  warna  merah,  kuning maupun jingga pada lapisan amil alkohol.

## Fenol hidrokuinon
Larutan  ekstrak  ditambahkan  2  tetes larutan  FeCl 3 5%,  perubahan  warna  menjadi hijau  menandakan  keberadaan  senyawa fenol pada ekstrak kapang.

## Saponin
Sebanyak
1 mg ektrak kasar ditambahkan  ke  dalam  5  mL  akuades selanjutnya  dipanaskan  dan  diaditasi  secara vertikal.  Munculnya  busa  yang  stabil  selama 30 menit menunjukkan hasil positif pada uji ini.

## Steroid/Terpenoid
Sebanyak 1 mg ekstrak kasar dilarutkan dalam 1 mL kloroform, kemudian ditambhkan 5  tetes  asetat  anhidrat  dan  3  tetes  H 2 SO 4 pekat.  Munculnya  warna  merah  dan berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan hasil positif pada uji ini.
Seluruh  data  diolah  menggunakan perangkat  lunak  SPPS Statistic 21.  Pengaruh konsentrasi  ekstrak  kasar  kapang  terhadap aktivitas  antibakteri  melawan  ESBL E . coli diolah  menggunakan  rancangan  acak
tunggal dengan selang kepercayaan 95% ( P <0,05).  Uji  lanjut  yang  digunakan  adalah Duncan test .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kapang  laut  merupakan  kapang  yang diduga  berasal  dari  lingkungan  darat maupun  perairan  tawar  yang  terbawa  ke lingkungan  laut,  namun  kapang  ini  tidak dapat  tumbuh  dan  berkembang  pada lingkungan  laut  yang  bersalinitas.  Salah  satu kapang  laut  yang  berhasil  diisolasi  dari penelitian  sebelumnya  adalah T . asperellum MT02 (Sibero et al ., 2017). Kapang ini menjadi koleksi isolat yang dipreservasi menggunakan air  steril  selama  3  bulan  pada  suhu  4 o C. Penumbuhan  isolat  ini  pada  media Malt
Extract Agar (MEA) selama 7 hari memperlihatkan  bahwa  morfologi  koloni kapang  hasil  penumbuhan  kembali  memiliki kesamaan  identik  dengan  morfologi  koloni kapang  sebelum  dipreservasi  (Sibero et  al ., 2017).  Kapang  ini  memiliki  karakteristik  khas koloni  berupa  adanya  pola  pertumbuhan radial hijau tua dan hijau muda (Gambar 1). Stocco et  al .  (2010)  melaporkan  bahwa kapang  yang  dipreservasi  menggunakan  air steril  dapat  menyimpan  isolat Trichoderma hingga  umur  12-18  bulan.  Selama  masa penyimpanan,  air  akan  menjaga  bentuk  sel konidia kapang dan tidak memicu pertumbuhan  konidia  menjadi  miselium sehingga konidia tidak kering dan mati (Bhai dan Anandaraj, 2014).
Metode  preservasi  mennggunakan  air steril banyak dilakukan untuk spesies kapang dari  genus Trichoderma (Stocco et  al .,  2010; Bhai dan Anandaraj, 2014; Iqbal et al ., 2017). Kapang T.  asperellum MT02  selanjutnya dikultivasi pada media kaldu ( broth ) dengan tujuan produksi senyawa antibakteri. Senyawa  antibakteri  dari  isolat T . asperellum MT02  diekstrak  dari  miselium  menggunakan metanol dan media kaldu menggunakan etil asetat. Jumlah rendemen ekstrak dari kedua sumber (Tabel 1). Berdasarkan hasil pengukuran  jumlah  ekstrak  kasar  diketahui bahwa miselium yang
diekstrak menggunakan metanol menghasilkan rendemen  yang  lebih  banyak  (7,5309±3,1305 b/b  %)  dibandingkan  dengan  ekstrak  kasar yang dihasilkan oleh media kaldu
(0,0191±0,0078  b/v  %).  Jumlah  rendemen dipengaruhi  oleh  jumlah  senyawa  yang dapat  diekstrak  oleh  pelarut  organik  yang digunakan,  etil  asetat  akan  mengekstrak senyawa yang bersifat semi-polar sedangkan metanol  akan  mengekstrak  senyawa  polar, sedikit semi-polar dan senyawa non-polar.
Tujuan  mengekstraksi  miselium  dan media  kaldu  ( broth )  secara  terpisah  adalah untuk mengevaluasi aktivitas antibakteri serta mengkarakterisasi golongan senyawa bioaktif yang  terkandung  pada  metabolit  yang diproduksi sencara intraselular dan ekstraselular.  Metabolit  intraselular  adalah metabolit  yang  dihasilkan  dan  disimpan  di dalam  sel  sehingga  ekstraksi  yang  dilakukan bertujuan  untuk  menarik  metabolit  agar berpindah  dari  dalam  sel  menuju  pelarut organik yang digunakan; sedangkan metabolit  ekstraselular  adalah  metabolit yang dihasilkan oleh sel kemudian disekresikan ke lingkungan (luar sel) sehingga ekstraksi  yang  dilakukan  bertujuan  untuk memindahkan metabolit dari media kultur ke pelarut  organik.  Penelitian  ini  menggunakan pelarut  etil  asetat  untuk  mengekstrak senyawa  metabolit  ekstraselular,  hal  ini didasari  kepolaran  etil  asetat  (4,4)  lebih
rendah  dibandingkan  media  kaldu  yang terbuat dari air (9,0) dan nilai kelarutan yang rendah  di  dalam  air  (8,7%)  sehingga  selama proses  ekstraksi  akan  terbentuk  dua  fase organik  yang  terpisah  dan  memudahkan peneliti untuk melakukan melakukan pemekatan metabolit yang diekstrak (Sadek, 2002).  Evaluasi  kemampuan T . asperellum MT02  dalam  menginhibisi  pertumbuhan bakteri ESBL E . coli (Gambar 2).
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambat yang terbentuk maka diketahui bahwa  ekstrak  kasar  yang  berasal  dari miselium  memiliki  kemampuan  antibakteri yang  lebih  rendah  dibandingkan  kontrol positif  Amoxicillin  10  µg/cakram  (11,83  ±  0,2 mm). Gambar 2 menunjukkan bahwa ekstrak pada  konsentrasi  250  hingga  500  µg/mL memiliki  diameter  zona  hambat  yang  tidak saling  berbeda  nyata.  Hal  ini  berarti konsentrasi  ekstrak  kasar  sebesar  250  µg/mL (3,73  ±  0,2  mm)  dan  350  µg/mL  (3,73  ±  0,2 mm)  mampu  menghambat  pertumbuhan bakteri  uji  sama  baiknya  dengan  konsentrasi ekstrak  kasar  sebesar  500  µg/mL  (3,73  ±  1,2 mm).  Hal  ini  berbeda  dengan  aktivitas antibakteri  ekstrak  kasar  asal  media  kaldu yang  ditunjukkan  oleh  Gambar  2.  Hasil  uji
Gambar 1. Kloni kapang T. asperellum MT02 umur 7 hari pada media MEA
Tabel 1. Jumlah rendemen ekstrak kasar kapang T . asperellum MT02
Sumber Bobot rendemen ekstrak kapang (%) Miselium 7,5309 ± 3,1305 (b/b) Media 0,0191 ± 0,0078 (b/v) (Rata-rata ± standar deviasi; b / b : bobot/bobot ; b / v : bobot / volum )
statistik  memperlihatkan  konsentrasi  ekstrak kasar
berpengaruh
nyata terhadap kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri ESBL E . coli ( P < 0,05).
Ekstrak dengan konsentrasi  sebesar 350 µg/mL (11,85 ± 1,9 mm) memiliki zona hambat yang  tidak  berbeda  nyata  dengan  kontrol positif, lebih lagi pada konsentrasi 500 µg/mL (13,90±0,6  cm)  diketahui  bahwa  ekstrak kapang dari media kaldu mampu menghambat  bakteri  ESBL E . coli lebih  baik jika  dibandingkan  dengan  kontrol  positif Amoxicillin  10  µg/cakram  (11,95  ±  0,1  cm). Penelitian  ini  juga  menunjukkan  bahwa senyawa antibakteri dari kapang T . asperellum MT02  lebih  banyak  dihasilkan
sebagai metabolit ekstraselular yang disekresikan  pada  media  kultur  MEB.  Hal  ini didukung  oleh  Ismaiel  dan  Ali  (2017)  yang menyatakan  bahwa  senyawa  antibakteri  6- pentyl-α-pyrone  dihasilkan  oleh  kapang Trichoderma sebagai  metabolit  ekstraselular yang  dapat  diekstrak  menggunakan  pelarut etil  asetat.  Senyawa  antimikroba  lain  yang dihasilakn  oleh  genus Trichoderma dan diekstrak  dengan  etil  asetat  adalah  6- methylthiochroman-4-one,  6-chlorothiochrom an-4-one, dan trichodermides A−E (Jiao et al . 2018;  Pinedo-Rivilla et  al .  2018;).  Hasil penelitian  ini  dapat  dilihat  bahwa  kapang T . asperellum MT02 berpotensi dijadikan sumber antibiotik  baru  untuk  menyembuhkan  infeksi bakteri patogen ESBL E . coli .
Gambar 2. Aktivitas antibakteri ekstrak kasar kapang T . asperellum MT02 (Keterangan:     = Miselia;      = Media)
Tabel 2. Hasil analisis fitokimia ekstrak kasar kapang T . asperellum MT02 Golongan senyawa Parameter Hasil Miselia  Kaldu Alkaloid - Metode Dragendorff  Endapan berwarna oranye hingga merah - + - Metode Mayer Endapan berwarna putih kekuningan - + - Metode Wagner Endapan berwarna cokelat - + Fenol hidrokuinon Perubahan warna menjadi hijau + + Flavonoid Perubahan warna menjadi jingga hingga merah + + Saponin Terbentuknya busa stabil selama 30 menit - + Steroid/terpenoid Perubahan  warna  dari  merah  menjadi  biru  dan kehijauan - - Keterangan: + : Menunjukkan hasil yang sesuai dengan parameter
- : Menunjukkan hasil yang tidak sesuai dengan parameter
Hasil  karakterisasi  golongan  senyawa aktif  menggunakan  metode  fitokimia  pada Tabel 2 menunjukkan bahwa hanya terdapat dua  golongan  senyawa  bioaktif  pada miselium  kapang T . asperellum MT02 menggunakan  pelarut  metanol  yakni  fenol hidrokuinon  dan  flavonoid.  Sedangkan ekstrak kasar dari media kaldu yang diekstrak menggunakan  etil  asetat  mengandung alkaloid,  fenol  hidrokuinon,  flavonoid  dan saponin.  Beberapa  golongan  senyawa  yang dilaporkan  dapat  diekstrak  oleh  pelarut metanol adalah gula, asam amino, senyawa glycoside, senyawa fenolik, flavonoid, antosianin, terpenoid, saponin, tanin, xantoxilin, totarol, quacinoid, lacton, flavone, phenone,  dan  polifenol  (Yu-Lin et  al .,  2009; Dehkharghanian et al ., 2010; Widyawati et al . 2014). Grub senyawa bioaktif yang sebelumnya  dilaporkan  dapat  diekstrak  oleh etil  asetat  adalah  alkaloid,  aglicon,  dan senyawa  glikosida,  sterol,  terpenoid,  dan flavonoid (Dehkharghanian et al ., 2010; Liu et al ., 2011; Widyawati et al. 2014). Penelitian ini juga memberikan informasi tambahan bahwa  pelarut  etil  asetat  juga  mampu menarik  senyawa  fenol  dan  saponin  dari dalam media kultur kapang.
Senyawa turunan dari golongan alkaloid,  fenol  dan  flavonoid  telah  banyak dilaporkan  sebagai  antibakteri  yang  sangat potensial (Cushnie et al . 2015; Xie et al . 2015; Paz et  al .  2018;  Wang et  al .  2019).  Selain senyawa  dari  golongan  alkaloid,  fenol  dan flavonoid,  senyawa  dari  turunan non- ribosomal  peptide (NRP)  dan  poliketida  (PK) juga  banyak  dilaporkan  sebagai  agen antibakteri  yang  sangat  kuat.  Kemampuan kapang  ini  untuk  menghasilkan  NRP  dan  PK dapat  dilakukan  melalui  pendeteksian  gen non - ribosomal  peptide  synthase (NRPS)  serta gen polyketide  synthase yang  menyandikan enzim  penghasil  senyawa  NRP  dan  PK.  Hasil penelitian  sebelumnya  telah  mengkonfirmasi bahwa T . asperellum MT02  memiliki  gen penyandi  NRPS  serta  mampu  menghambat pertumbuhan  bakteri  patogen  udang  yakni Vibrio  harveyii dan V . alginolyticus (Sibero et al .  2018 2 ),  sehingga  diduga  bahwa  kapang ini  mampu  menghasilkan  senyawa  antibiotik dari turunan NRP khususnya peptaibols . Hal ini diduga sangat berpengaruh atas kemampuan  antibakteri  ekstrak  kapang  ini
melawan  ESBL E . coli .  Beberapa  penelitian menyebutkan bahwa senyawa dari
golongan alkaloid, fenol, flavonoid, peptaibols  dan  saponin  memiliki  potensi  lain seperti  antifungal,  antivirus,  antioksidan hingga antikanker (Peralta et al ., 2018; Zhang et  al .,  2018; Wang et  al .,  2019),  sehingga kapang T . asperellum MT02  juga  diduga menjadi sumber obat masa depan penanganan penyakit menular hingga terapi kanker.

## KESIMPULAN
Ekstrak  kasar  dari  media  kaldu  kapang Trichoderma  asperellum MT02  menunjukkan aktivitas  antibakteri  melawan  ESBL E . coli yang  lebih  baik  dibandingkan  ektrak  dari miseliumnya. Berdasarkan hasil analisis fitokimia  diketahui  bahwa  ekstrak  kasar miselium  mengandung  senyawa  dari  grub fenol  hidrokuinon  dan  flavonoid,  sedangkan ekstrak kasar dari media kaldu mengandung alkaloid,  fenol  hidrokuinon,  flavonoid  dan saponin.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  Kementerian  Riset,  Teknologi  dan Pendidikan  Tinggi  (Kemenristekdikti)  yang telah membiayai penelitian ini melalui skema hibah  riset  Program  Pendidikan  Magister Menuju Doktor untuk Sarjana Unggul (PMDSU) dengan  nomer  kontrak  2993-12/UN7.5.1/PG/ 2016.

## DAFTAR PUSTAKA
[CDC]  Center  for  Disease  Control  and Prevention.  2018.  Biggest  Threats  and Data. (Dapat diakses di: https://www.cdc.gov/drugresistance/big gest_threats.html#ext).  [Diakses  pada  29
Oktober 2018]
[CLSI]  Clinical  Laboratory  Standard  Institute.
2016. Performance Standards for Antimicrobial  Susceptibility  Testing.  26th Ed. CLSI Supplement M100S.
Abdjul,  D.B.,  Yamazaki,  H.,  Kanno,  S., Wewengkang, D.S., Rotinsulu, H., Sumilat, D.A., Ukai, K., Kapojos M.M. & Namikoshi, M.  2017.  Furanoterpenes,  new  types  of protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors,  from  two  Indonesian  marine
sponges, Ircinia and Spongia spp. Bioorganic  and  Med.  Chem.  Lett. 27(5):1159-1161. DOI: 10.1016/j.bmcl.2017.
01.071
Bhai,  R.S.  &  Anandaraj,  M.  2014.  Enhancing shelf  life  of Trichoderma  harzianum by conidial  storage  in  sterile  deionized water. J.  Species  Aromatic  Crops. 23(2):243-249.
Cushnie, T.P.T., Cushnie, B. & Lamb, A.J. 2015. Alkaloids: an overview
of their antibacterial,  antibiotic-enhancing  and antivirulence activities. International
Journal  of  Antimicrobial  Agents 44(5): 377-386. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2014. 06.001 Dehkharghanian, M., Adenier, H. & Vijayalakshmi,  M.A.  2010.  Analytical methods  study  of  flavonoids  in  aqueous spinach extract using positive electrospray ionization tandem quadrupole  mass  spectrometry. Food Chem. 121: 863–870. DOI: 10.1016/j.foodchem.2010.01. 007
Ebada,  S.  S.,  de  Voogd,  N.J.,  Kalscheuer,  R., Müllerd,  W.E.G.,  Chaidir  &  Proksch,  P. 2017.  Cytotoxic  drimane  meroterpenoids from  the  Indonesian  marine  sponge Dactylospongia  elegans . Phytochemistry Letters 22: 154–158. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.phytol.2017.09.
026
Fredimoses, M., Zhou, X., Ai, W., Tian, X., Yang,
B.,  Lin,  X.,  Liu,  J.,  Liu,  Y.  2018. Emerixanthone  E,  a  new  xanthone derivative  from  deep  sea  fungus Emericella sp  SCSIO  05240. Natural Product Research 17: 1-7. DOI: 10.1080/14786419.2018.1487966. Guillerme,  J.B.,  Couteau,  C.  &  Coiffard,  L.
2017.  Application for marine resources in cosmetics. Cosmetics 4(35). DOI: 10.3390/cosmetics4030035
Hidayat,  T.  &  Nurnajah,  N.  2016.  Chemical compositions, extraction and
phytochemical
Cyperus
sp. plant. Frontiers in Biomedical Sciences 1(1):7-12. Ibrahim,  S.R.  &  Mohamed,  G.A.  2017. Ingenine  E,  a  new  cytotoxic  β-carboline alkaloid  from  the  Indonesian  sponge Acanthostrongylophora  ingens . J  Asian Nat.  Prod.  Res .  DOI:  10.1080/10286020.
2016.1213723
Iqbal,  S.,  Ashfaq,  M.,  Malik,  A.H.,  ul-Hag  I, Khan,  K.S.  &  Mathews,  P.  2017.  Isolation, preservation  and  revival  of Trichoderma viride in  culture  media. J.  Entomology Zool. Stud. 5(3): 1640-1646.
Ismaiel,  A.A.  &  Ali,  D.M.I.  2017.  Antimicrobial properties
of
6-pentyl-α-pyrone produced  by  endophytic  strains  of Trichoderma  koningii and  its  effect  on aflatoxin
B1 production. Biologia 72(12):1403-1415.  DOI:  10.1515/biolog- 2017-0173
Jiao,  W.H.,  Khalil,  Z.,  Dewapriya,  P.,  Salim,  A. A.,  Lin,  H.W.  &  Capon,  R.J.  2018. Trichodermides  A−E:  new  peptaibols isolated  from  the  Australian  termite  nest- derived  fungus Trichoderma  virens CMB- TN16. J.  Nat.  Prod. 81(4):  976-984.  DOI: 10.1021/acs.jnatprod. 7b01072
Kitagawa,  K.,  Shigemura,  K.,  Yamamichi,  F., Alimsardjono, L., Rahardjo, D., Kuntaman, K.,  Shirakawa,  T.  &  Fujisawa,  M.  2018. International  comparison  of  causative bacteria and antimicrobial susceptibilities of urinary tract infections between Kobe, Japan  and  Surabaya,  Indonesia. Japan J.  Infectious  Disease 71:  8-13.  DOI: 10.7883/yoken.JJID.2017.233
Liu, J., Wang, C., Wang, Z., Zhang, C., Lu, S., & Liu,  J.  2011.  The  antioxidant  and  free- radical  scavenging  activities  of  extract and fractions from corn silk ( Zea mays L.) and  related  flavone  glycosides. Food Chemistry 126: 261–269. DOI: 10.1016/j.foodchem.2010.11. 014
Liu,  Y.,  Ding,  L.,  Fang,  F.  &  He,  S.  2018. Penicillilactone A, a novel antibacterial 7- membered  lactone  derivative  from  the sponge-associated  fungus Penicillium sp. LS54.
Nat.l Prod. Res. DOI:
10.1080/14786419 .2018.1452012
Maarisit,  W.,  Abdjul,  D.B.,  Yamazaki,  H.,  Kato, H.,  Rotinsulu,  H.,  Wewengkang,  D.S., Sumilat,  D.A.,  Kapojos,  M.M.,  Ukai,  K.  & Namikoshi,  M.  2017.  Anti-mycobacterial alkaloids, cyclic 3-alkyl pyridinium dimers, from  the  Indonesian  marine  sponge Haliclona sp. Bioorg.  Med.  Chem.  Lett. 27(15):  3503-3506.  DOI:  10.1016/j.bmcl.20 17.05.067
Natalia,  D.,  Jo,  C.M.,  Nusatia,  A.C.M.,  & Mayasari,  M.  2018.  Prevalence  and  risk factors  of  extended-spectrum  beta- lactamases-producing Escherichia  coli
among  adult  inpatients  in  a  secondary hospital. Adv.  Sci.  Lett. 24:  6817-6820. DOI: 10.1166/asl.2018.12854 Paz,  J.E.W.,  Contreras,  C.R.,  Munguia,  A.R., Aguilar,  C.N.  &  Inungaray,  M.L.C.  2018. Phenolic  content  and  antibacterial activity  of  extracts  of Hamelia  patens obtained
by
different
extraction methods. Brazilian  J.  Microbiol. 49:656- 661. DOI: 10.1016/j.bjm.2017.03.018
Peralta,  M.A.,  Ortega,  M.G.,  Cabrera,  J.L.,  & Paraje,  M.G.  2018.  The  antioxidant activity  of  a  prenyl  flavonoid  alters  its antifungal  toxicity  on Candida  albicans biofilms. Food  Chem.  Tox. 114:285-291.
DOI: 10.1016/j.fct.2018.02. 042
Pinedo-Rivilla, C., Collado, I.G. & Aleu, J. 2018. Metabolism of antifungal Thiochroman-4- ones  by Trichoderma  viride and Botrytis cinerea . J.  Nat.  Prod. 81(4):1036-1040. DOI: 10.1021/acs.jnatprod.7 b00298 Sadek,  P.C.  2002. The  HPLC  Solvent  Guided, 2 nd Edition .  New  York  (US):  Wiley- Interscience.
Sibero,  M.T.,  Radjasa,  O.K.,  Sabdono,  A.,
Trianto,  A.,  Triningsih,  D.W.  &  Hutagaol, I.D.  2018 1 .  Antibacterial  activity  of Indonesian  sponge  associated  fungi against  clinical  pathogenic  multidrug resistant  bacteria. J.  App.  Pharmaceut.
Sci. 8(2):88-94.  DOI:  10.7324/JAPS.2018.82
14
Sibero 2 , M. T., Herdikiawan, D., Radjasa, O. K., Sabdono, A., Trianto, A. & Triningsih, D. W. 2018 2 .  Antibacterial  activity  of  sponge associated  fungi  against  vibriosis  agents in  shrimp  and  its  toxicity  to Litopenaeus vannamei . AACL Bioflux 11(1): 10-18.
Sibero,  M.T.,  Sabdaningsih,  A.,  Cristianawati, O.,  Nuryadi,  H.,  Radjasa,  O.  K.,  Sabdono & Trianto, A. 2017. Isolation, identification and screening antibacterial activity from marine  sponge-associated  fungi  against multi-drug  resistant  (MDR) Escherichia coli . IOP  Conference  Series:  Earth  and Environmental Science 55. DOI:
10.1088/1755-1315/55/1/012028
Stocco, M., Monaco, C. & Cordo, C. 2010.  A comparison  of  preservation  methods  for Trichoderma  harzianum cultures. Revista Iberoamericana de Micologia 27(4): 213-
215. DOI: 10.1016/j.riam.20 10.06.001
Sudarwanto, M.B., Lukman, D.W., Purnawarman, T., Latif, H., Pisestyani, H. & Sukmawinata, E. 2017. Multidrug resistance extended spectrum b- lactamase and AmpC producing Escherichia  coli isolated  from  the environment  of  Bogor  Slaughterhouse, Indonesia. Asian  Pacific  J.  Trop.  Biomed.
7(8):708-711.  DOI:  10.1016/j.apjtb.2017. 07.012
Suleria, H.A.R., Osborne, S., Masci, P. & Gobe, G. 2015. Marine-based nutraceuticals: an innovative  trend  in  the  food  and supplement industries. Mar. Drugs 13(10):6336-6351. DOI: 10.3390%2Fmd 131 06336
Wang,  X.  D.,  Su,  G.  Y.,  Zhao,  C.,  Qu,  F.Z., Wang,  P.  &  Zhao,  Y.Q.  2019.  Anticancer activity and potential mechanisms of 1C, a ginseng saponin derivative, on prostate cancer cells. J. of Ginseng Res. 42(2): 133- 143. DOI: 10.1016/j.jgr.2016.12.014 Wasito, E.B., Shigemura, K., Osawa, K., Fardah, A.  Kanaida,  A.,  Raharjo,  D.,  Kuntaman, K.,  Hadi,  U.,  Harijono,  S.,  Sudarmo,  S.M., Nakamura,  T.,  Shibayama,  K.,  Fujisawa, M.  &  Shirakawa,  T.  2017. Japan  J. Infectious  Disease. 70:378-382.  DOI: 10.7883/yoke n.JJID.2016.234
Widyawati.  P.S.,  Budianta,  T.D.W.,  Kusuma,  F. A.  &  Wijaya,  E.L.  2014.  Difference  of solvent polarity to phytochemical content  and  antioxidant  activity  of Pluchea  indicia Less  leaves  extracts. Int. J. Pharmacog. Phytochem. Res. 6(4):850- 855.
Xie,  Y.,  Yang,  W.,  Tang,  F.,  Chen,  X.,  Ren,  L. 2015.
Antimicrobial
activities of flavonoids:  structure-activity  relationship and  mechanisms. Current  Medicinal Chemistry 22: 132-149. DOI:
10.2174/0929867321666140916113443 Yu-Lin,  H.,  Kuo,  Y.H.,  Lin,  Y.L.  &  Chiang,  W. 2009.  Antioxidative  effect  and  active component  from  leaves  of  lotus ( Nelumbo  nucifera ). J.  Agricul.  Food Chem. 57:6623-6629.  DOI:  10.1021/jf9 00950z Zhang, X., Li, D., Xue, X., Zhang, Y., Zhang, J., Huang,  C.,  Guo,  Z.  &  Tadesse,  N.  2018. First  total  synthesis  of  a  novel  amide alkaloid derived
from Aconitum
taipeicum  and  its  anticancer  activity. Nat.  Prod.  Res. 32(2):  128-132.  DOI:
10.1080/14 786419.2017.1340283
Zubair, M. S., Lallo, S., Putra, M. Y., Hadi, T. A. &
Jantan,  I.  2018.  Antibacterial  and
cytotoxic  activities  of  sponges  collected off  the  coast  of  Togean  Islands, Indonesia. Pharmacognosy  J. 10(5):  988- 992. DOI: 10.5530/pj.2018.5. 168