Comparison of Cerebral Malaria Mice Models Infected by P. berghei ANKA
Prawesty Diah Utami 1* , R. Varidianto Yudo Tjahjono 2 , Indi Jazilah 2 , Ismy Azizah Sisnawati 3
1 Departement of Parasitology, Faculty of Medicine, Universitas Hang Tuah
Jl. Gadung no. 1 Komplek Barat RSAL dr. Ramelan Surabaya 60111. Jawa Timur.
2 Faculty of Medicine,Universitas Hang Tuah Jl. Gadung no. 1 Komplek Barat RSAL dr. Ramelan Surabaya 60111. Jawa Timur.
2 Faculty of Medicine,Universitas Hang Tuah Jl. Gadung no. 1 Komplek Barat RSAL dr. Ramelan Surabaya 60111. Jawa Timur.
* Corresponding author: prawesty.diah@hangtuah.ac.id

## Abstract
The  high  morbidity  and  mortality  due  to  malaria  infection  makes  it  a  global health  problem. The  pathogenesis  and  pathophysiology  of  cerebral  malaria  has  not been fully understood. The use of cerebral malaria model mice is one alternative to understand its pathogenesis and pathophysiology. The purpose of this study was to compare Swiss mice and C57BL / 6 mice inoculated by P.berghei ANKA as a model of  cerebral  malaria  mice.  Methods:  The  study  design  was  a  randomized  Post  Test Control Only Group Design using 12 Swiss mice and 12 C57BL / 6 mice divided into 2 groups each: the treatment group inoculated by P.  berghei ANKA and the control group  without  inoculation.  Observation  of  clinical  manifestations  and  parasitemia level was carried out from day 1 to day -10. The study results showed that K2 group showed  a  significant  increase  in  the  degree  of  parasitemia  compared  to  K4.  K4 group  showed  clinical  manifestations  of  cerebral  malaria  while  K2  did  not  show clinical manifestations of cerebral malaria. Conclusion: C57BL / 6 mice inoculated by PbA can be used as cerebral malaria animal models.
Keywords: P.berghei ANKA, C57BL/6 mice, Swiss mice, Clinical manifestation,Parasitemia level.

## Abstrak
Tingginya angka kesakitan dan kematian akibat infeksi malaria menjadikannya  sebagai    masalah  kesehatan  global.  Patogenesis  dan  patofisiologi malaria  serebral    belum  difahami  secara  menyeluruh.  Penggunaan  mencit  model malaria  serebral  menjadi  salah  satu  alternatif  untuk  memahami  patogenesis  dan patofisiologisnya.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  membandingkan  mencit  swiss dan  mencit  C57BL/6  yang  diinokulasi  P.berghei  ANKA  sebagai  model  mencit malaria  serebral.  Metode  :  Rancangan  penelitian  randomized post  test  control  only group  design menggunakan  12  mencit  swiss  dan  12  mencit  C57BL/6  yang  terbagi masing-masing  menjadi  2  kelompok  :  kelompok  perlakuan  yang  diinokulasi P.berghei  ANKA  dan  kelompok  kontrol  tanpa  inokulasi.  Pengamatan  manifestasi klinis  dan  level  parasitemia  dilakukan  mulai  dari  hari  ke  1  -  hari  ke  -10.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  kelompok  K2  menunjukkan  kenaikan  derajat parasitemia  yang  signifikan  dibandingkan  K4.  Kelompok  K4  menunjukkan  adanya
manifestasi  klinis  malaria  serebral  sedangkan  K2  tidak  menunjukkan  manifestasi klinis  malaria  serebral.  Kesimpulan:  Mencit  C57BL/6  yang  diinokulasi  PbA  dapat dijadikan hewan model malaria serebral.
Kata kunci: P.berghei ANKA, mencitC57BL/6, mencit Swiss, manifestasi klinik, level parasitemia.

## Pendahuluan
Malaria  menyebabkan  kematian  dari  satu  juta  orang  setiap  tahunnya,  dan sebagian  besar  disebabkan  oleh  malaria  serebral  akibat  infeksi  dari Plasmodium falciparum . Diagnosis malaria serebral ditegakkan jika adanya gejala neurologis dan bentuk  aseksual  parasit  malaria  pada  hapusan  darah  tepi(Sierro  and  Grau  2019).
Terdapat  90%  kasus  malaria  serebral  pada  anak-anak  di  sub-Saharan  Afrika, sedangkan  pada  dewasa  di  wilayah  Asia  Tenggara  memiliki  angka  kematian  untuk malaria serebral sebesar 50%, sedangkan di Indonesia angka kematiannya sebesar 21,5%  -30,5%(Nurhayati  2009;  Storm  and  Craig  2014).Keberhasilan  terapi  malaria serebral  terkait  dengan  pemahaman  terhadap  proses  biologi  perkembangan penyakit  tersebut.  Patogenesis  dan  patofisiologi  malaria  serebral  masih  belum terungkap jelas, disebabkan keterbatasan sampel otak hasil otopsi penderita malaria serebral yang sangat terbatas, sehingga sebagai alternatifnya, peneliti menggunakan hewan model malaria serebral, termasuk mencit model. Dari berbagai studi literatur didapatkan bahwa konsep – konsep dasar tentang malaria serebral di dapatkan dari penelitian menggunakan mencit coba(Souza, Hafalla, and Riley 2009).
Plasmodium  berghei ANKA/PbA  merupakan  parasit  malaria  pada  hewan pengerat  yang  sering  digunakan  untuk  menginokulasi  mencit  model  malaria serebral.  Patogenesis  dan  patofisiologi  pada  mencit  yang  dinfeksi  oleh  PbA menunjukkan  kesamaan  dengan  infeksi  malaria  serebral  pada  manusia,
Penggunaan model malaria serebral juga harus memperhatikan jenis spesies mencit
yang  diinokulasi  oleh  PbA (Doolan  2002;  Janse  2016). Studi  sebelumnya menyatakan  bahwa  mencit  C57BL/6  sangat  rentan  terhadap  inokulasi  PbA, sehingga sangat cocok digunakan sebagai hewan model malaria serebral(Blanco et al. 2008;  Oakley et  al. 2008).Inokulasi  PbA  pada  mencit  C57BL/6tersebut  dapat menyebabkan  munculnya manifestasi klinis malaria serebral pada hari ke-6 sampai dengan hari ke-12 post inokulasi PbA(Martins et al. 2009).Mencit swiss outbred telah lama  digunakan  dalam  penelitian  eksperimental  malaria  serebral,  tetapi  laporan penggunaannya  dalam  studi  malaria  serebral  sangat  terbatas  dan  deskripsi  infeksi
PbA  dalam  mencit  swiss  ini  kurang  memiliki  rincian  tentang  perjalanan  infeksinya serta  perubahan  histopatologis  jaringan  otaknya.  Dalam  penelitian  ini,  kami mencoba  menggunakan  mencit  swiss  inbreed  yang  diinokulasi  dengan  PbA,  untuk membuktikan  apakah  mencit  swiss  inbreed  ini  dapat  digunakan  sebagai  hewan model malaria serebral dan membandingkan manifestasi klinis dan level parasitemia dari  hari  ke-1  sampai  dengan  hari  ke-10  dengan  mencit  C57BL/6  yang  diinokulasi dengan PbA juga.

## Metode
Penelitian ini  merupakan true experimental  study dan  desain penelitian  yang digunakan  adalah Post  Test  Control  Only  Group  Design yang  telah  disetujui  oleh komite etik penelitian FK Hang Tuah Surabaya. Jumlah sampel penelitian ini dihitung menggunakan rumus Federer dengan 4 kelompok penelitian yang masing – masing kelompok  terdiri  dari  6  ekor  mencit  sehingga  didapatkan  24  mencit.Sampel  24 mencit  terdiri  dari  12  mencit  C57BL/6  betina  dan  12  mencit  swiss  betina  dan dikelompokkan sebagai berikut :
1.  Kelompok 1/K1 : 6 ekor mencit swiss betina yang tidak diinokulasi PbA
2.  Kelompok 2/K2 : 6 ekor mencit swiss betina yang diinokulasi PbA
3.  Kelompok 3/K3 : 6 ekor mencit C57BL/6 yang tidak diinokulasi PbA

## 4.  Kelompok 4/K4 : 6 ekor mencit C57BL/6 yang diinokulasi PbA
Mencit  swiss  didapatkan  dari  Universitas  Gajah  Mada  dan  mencit  C57BL/6 didapatkan dari PT. Indoanilab Bogor dengan berat sekitar 15 – 20 gram dan berusia 7 –  10  minggu.  PbA didapatkan dari laboratorium  parasitologi  klinik  FK  Universitas
Brawijaya  Malang.  Pada  kelompok  K2  dan  K4  diinokulasi  dengan  0.2  ml  eritrosit yang mengandung 1 x 10 6 PbA secara intraperitoneal(Adetutu et al . 2016).

## Inokulasi PbA
Proses  aklimatisasi  dan  adaptasi  mencit  coba  berlangsung  selama  7  hari, kemudian  dilakukan  randomisasi  untuk  penentuan  mencit  di  masing –  masing kelompok  penelitian.  Pada  kelompok  perlakuan  (K2  dan  K4)  dilakukan  proses inokulasi sebagai berikut :Darah yang mengandung yang mengandung ± 10 6 parasit
PbA  diinokulasikan  terhadap  6  ekor  mencit  donor,  masing –  masing  0,2  ml  secara intra  peritoneal.Setelah  proses  inokulasi  dilanjutkan  dengan  pengamatan  derajat parasitemia  setiap  hari  untuk  mengetahui  perkembangan  parasit.  Ketika  derajat parasitemia  mencapai  30 –  40%,  mencit  donor  dimatikan  menggunakan  injeksi ketamine-xylazine  secara  intraperitoneal  dan  dilakukan  pengambilan  darahmelalui pungsi jantung menggunakan spuit 3 ml dengan jarum spuit ukuran 22.Dari masing –  masing  mencit  didapatkan  sekitar  1,2  –  1,5  ml  darah,  kemudian  dimasukkan  ke tabung reaksi  dengan  heparin  (darah:heparin  =  90%:10%).  Semua  darah  dicampur supaya  homogen  jumlah  parasitnya.Darah  tersebut  diinokulasikan  ke  masing – masing  mencit  mencit  pada  K2  dan  K4  menggunakan  spuit  1  ml,  masing – masing
0,2 ml secara intra peritoneal (Baeti 2010).

## Pemeriksaan Derajat Parasitemia
Pengamatan tingkat parasitemia dilakukan serial setiap hari mulai hari ke-1 – hari ke-10 post inokulasi PbA. Tehnik tetes tipis digunakanuntuk menghitung jumlah eritrosit  yang  terinfeksi  dibagi  dengan  1000  eritrosit  dikalikan  100%  menggunakan mikroskop  binokular  dan  pewarnaan  Giemsa.  Tata  cara  pemeriksaan  derajat parasitemia  dimulai  dengan  proses  desinfeksi  dengan  alkohol    pada  ujung  ekor mencit,  dilanjutkan  dengan  pemotongan  pada  ujung  ekor  mencit  menggunakan gunting  steril.  Setelah ujung  ekor  dipotong dilanjutkan dengan  menekan  ujung  ekor untuk  meneteskan  darah  diatas  gelas  obyek,  dilakukan  hapusan  dengan  gelas obyek  yang  lain,  dan  dikeringkan  pada  suhu  kamar.  Proses  pewarnaan  dimulai dengan  menggenangi  obyek  glass  dengan  giemsa  ±  45  menit,  dicuci  pada  air mengalir,  dikeringkan  pada  suhu  kamar.  Pengamatan  parasit  di  dalam  eritrosit menggunakan mikroskop dengan pembesaran obyektif 100x dan pembesaran okular 10x.  Memilih  area  hapusan  darah  tepi  dengan  pengecatan giemsa dimana  eritrosit terdistribusi  dengan  baik,  menghitung  semua  eritrosit  pada  seluruh  lapangan pandang  dan  tanpa  menggeser  sediaan  sampai  eritrosit  yang  terhitung  mencapai 100  eritrosit.  Dilakukan  pengulangan  penghitungan  eritrosit  minimal  2x  dan pengamatan dilakukan pada 10 lapangan pandang dan didapatkan  jumlah rata-rata eritrosit  yang  terinfeksi  per  1000  eritrosit  kali  100  %  (Baeti  2010;  Adetutu et  al .
2016).Pengamatan  dilakukan  oleh  dua  orang  yang  berbeda  dan  dilakukan penghitungan  nilai  rata –  rata  pengamatan  derajat  parasitemia  antara  dua pengamatan.Jenis  skala  data  yang  didapatkan  dari  pemeriksaan  kadar  parasitemia adalah rasio.

## Pengamatan Manifestasi Klinis
Pengamatan manifestasi klinis malaria serebral dilakukan mulai dari hari ke-1 sampai  dengan  hari  ke-10  post  inokulasi  PbA.  Pengamatan  manifestasi    klinis dengan  pemberian  skor  oleh(Waknine-Grinberg et  al. 2010)  yang  telah  dimodifikasi oleh (Runtuk, Fitri, and Noviyanti 2018):

## Tabel 1 Skoring Penilaian Manifestasi Klinis Malaria Serebral
Tanda Klinis Skor Keadaan bulu Normal 0 Kusut 1 Perilaku Normal 0 Postur membungkuk 1 Imobilisasi atau parsial paralisis 2 Koma, kejang 3 Suhu tubuh Normal 0 Menggigil 1
Penilaian  skoring  manifestasi  klinis  dilakukan  dengan  menjumlahkan  skor  tiap  poin penilaian yang dilakukan oleh dua orang yang berbeda. Skor akhir merupakan nilai rata – rata hasil pengamatan antara pengamat 1 dan 2.  Mencit yang memiliki skor ≥
4 dianggap menderita serebral malaria (Runtuk, Fitri, and Noviyanti 2018).
Setelah  dilakukan  pengamatan  gejala  klinis  malaria  serebral  dan  telah dilakukan  perhitungan  derajat  parasitemia,  mencit  dari  semua  kelompok  dilakukan terminasi, dengan cara membiusnya dengan ketamine-xylazine secara intraperitoneal(Leary et al. 2013; Einstein 2015), kemudian dilakukan diseksi thorax untuk  mengambil  darahnya  secara  intrakardiak.  Setelah  dilakukan  terminasi  sesuai protokol,  lalu  sisa  tubuh  mencit  dikirim  ke  insenerator  untuk  dimusnahkan (Darmawan 2014).

## Analisis Data
Dari  hasil  penelitian,  data  dianalisis  dengan  menggunakandengan  tingkat kemaknaan yang digunakan pada penelitian ini sebesar 5 %. Data dianalisis secara deskriptif  dan  statistik  parametrik  Kruskal  wallis  dan  Mann  Whitney  U  karena  data tidak terdistribusi normal dan homogen.

## Hasil dan Diskusi
Data  pemeriksaan  derajat  parasitemia  menunjukkan  bahwa  data  tidak berdistribusi  normal  sehingga  analisis  menggunakan  Kruskal Wallis,  dan  data  hasil pemeriksaan dapat dilihat pada tabel dibawah ini :

## Tabel  2  Analisis  Deskriptif  dan  Statistik  Penghitungan  Derajat Parasitemia Hari 1-10
Kelompok NILAI RERATA PENGHITUNGAN DERAJAT PARASITEMIA (%) Hari 1 Hari 2 Hari 3 Hari 4 Hari 5 Hari 6 Hari 7 Hari 8 Hari 9 Hari 10 K1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 K2 0.00 0.00 0.22 0.65 2.85 4.58 5.72 12.03 12.96 14.40 K3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 K4 0.00 0.00 0.27 1.18 2.03 2.43 6.50 2.68 1.67 1.83 Analisis Kruskal Wallis; Nilai p = 1.00 1.00 0.00* 0.00* 0.00* 0.00* 0.00* 0.00* 0.00* 0.00* Analisis Mann Whitney K1-K2 Nilai p = 1.00 1.00 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* Analisis Mann Whitney K1-K3 Nilai p = 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Analisis Mann Whitney K1-K4 Nilai p = 1.00 1.00 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* Analisis Mann Whitney K2-K3 Nilai p = 1.00 1.00 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* Analisis Mann Whitney K2-K4 Nilai p = 1.00 1.00 0.699 0.132 0.093 0.026* 0.394 0.015 0.002* 0.002* Analisis Mann Whitney K3-K4 Nilai p = 1.00 1.00 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002* 0.002*
Tanda *: nilai p < 0.05, menunjukkan perbedaan yang signifikan
Hasil  analisis  statistik  dan  deskriptif  pada  tabel  diatas  menunjukkan  bahwa pengamatan  hari  ke-1  dan  ke  -2  post  inokulasi  PbA  pada  semua  kelompok
menunjukkan tidak adanya perbedaan yang signifikan. Hal ini berarti pada hari ke-1 dan  ke-2  belum  terjadi  pertumbuhan  parasit  post  proses  inokulasi  PbA  sehingga antara  kelompok  kontrol  K1  dan  K3  dengan  kelompok  perlakuan  K2  dan  K4  sama derajat  parasitemianya.  Pada  hari  ke  3  sampai  dengan  hari  ke-10  telah menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol K1 dan K3 dengan kelompok  perlakuan  K2  dan  K4.  Hal  ini  disebabkan  karena  pada  kelompok perlakuan  dilakukan  proses inokulasi  PbA  sehingga  pada  hari  ke-3  sampai  dengan hari  ke-10  telah  menunjukkan  progresifitas  perkembangan  parasit  dalam  sirkulasi darah.Proses  inokulasi  intravena  dari  skizon P.berghei ANKA  yang  matur  akan menghasilkan  multiplikasi  aseksual  yang  sinkron  selama  2  siklus  (dari  stadium trofozoit / ring form sampai terbentuk ring form lagi)(Franke-fayard et al. 2010; Janse
2016), perkembangan parasit dalam eritrosit ini yang menyebabkan kenaikan derajat parasitemia pada kelompok yang diinokulasi PbA .
Derajat  parasitemia  antara  K2  dan  K4  juga  menunjukkan  perbedaan  yang signifikan,  dimana  pada  hari  ke-3  dan  ke  -4 derajat  parasitemia  K4 lebih  tinggi  dari K2;  pada  hari  ke-5,  hari  ke-7  sampai  hari  ke-10  derajat  parasitemia  K2  lebih  tinggi dari  K4.  Derajat  parasitemia  K4  menunjukkan  pola  penurunan  sejak  hari  ke-8  dan ke-10,  tetapi  pola  perkembangan  derajat  parasitemia  K2  selalu  menunjukkan  pola peningkatan  dari  hari  ke-3  sampai  ke-10.  Penurunan  derajat  parasitemia  pada  K4 kemungkinan  berhubungan  dengan  sekuestrasi  eritrosit  pada  sel  endotel  vaskular jaringan  lainnya  seperti  hepar,  lien,  paru –  paru,  ginjal  dan  otak,  sehingga  eritrosit yang  terinfeksi  ditemukan  dalam  jumlah  yang  kecil  di  sirkulasi  darah (Franke-fayard et al . 2005).
Data  pemeriksaan  manifestasi  klinis  malaria  serebral  menunjukkan  bahwa data  tidak  berdistribusi normal  sehingga  analisis  menggunakan  Kruskal Wallis,  dan data hasil pemeriksaan dapat dilihat pada gambar dibawah ini :

## Gambar 1 Diagram Nilai Rerata Skoring Pemeriksaan Manifestasi Klinis Malaria Serebral
Pengamatan  manifestasi  klinis  pada  gambar  diatas  menunjukkan  bahwa  pada  hari
1-2  belum  menunjukkan  perbedaan  manifestasi  klinis,  pada  setiap  kelompok menunjukkan  skor  0.  Pada  hari  ke-3  sampai  dengan hari  ke-10  telah  menunjukkan manifestasi  klinis  pada  K2  dan  K4,  sedangkan  kelompok  kontrol  (K1  dan  K3)  tetap tidak  menunjukkan  manifestasi  klinis.  Skor  manifestasi  klinis  pada  kelompok  K2 menunjukkan  skor  kurang  dari  4  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  mencit  pada kelompok K2 tidak menderita malaria serebral, namun  munculnya manifestasi klinis lebih disebabkan karena efek pecahnya eritrosit sehingga menyebabkan penurunan jumlah eritrosit. Skor manifestasi klinis K4 hari ke-3 sampai ke-9 menunjukkan skor <
4,  tetapi  pada  hari  ke-10  menunjukkan  rerata  skor  4  yang  berarti  mencit  pada  K4 telah mengalami malaria serebral.
Hasil  analisis  statistik  uji  beda  terhadap  manifestasi  klinis  malaria  serebral dapat dilihat pada tabel berikut :
Tabel 3 Analisis Statistik Manifestasi Klinis Malaria Serebral
Pada Hari Ke-1 – Hari Ke-10
Kelompok NILAI RERATA SKORING PENGAMATAN MANIFESTASI KLINIS Hari 1  Hari 2 Hari 3 Hari 4 Hari 5 Hari 6 Hari 7 Hari 8 Hari 9 Hari 10 Analisis Kruskal Wallis Nilai p = 1.00 1.00 0.088  0.005* 0.00* 0.00* 0.00* 0.00* 0.00* 0.00* Analisis Mann Whitney K1- K2 Nilai p = 1.00 1.00 0.394 0.180 0.002*  0.002*  0.002*  0.002* 0.002*  0.002* Analisis Mann Whitney K1- K3 Nilai p = 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Analisis Mann Whitney K1- K4 Nilai p = 1.00 1.00 0.180 0.015*  0.002*  0.002*  0.002*  0.002* 0.002* 0.002* Analisis Mann Whitney K2- K3 Nilai p = 1.00 1.00 0.394 0.180 0.002*  0.002*  0.002*  0.002* 0.002* 0.002* Analisis Mann Whitney K2- K4 Nilai p = 1.00 1.00 0.699 0.394 0.180 0.394 0.065 0.589 0.015* 0.002* Analisis Mann Whitney K3- K4 Nilai p = 1.00 1.00 0.180 0.015*  0.002*  0.002*  0.002*  0.002* 0.002* 0.002*
Tanda *: nilai p < 0.05, menunjukkan perbedaan yang signifikan
Hasil analisis statistik uji beda juga  menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang  signifikan  antara  kelompok  kontrol  (K1  dan  K3)  dengan  kelompok  perlakuan (K2  dan  K4),  perbedaan  antara  K1  dan  K3  dengan  K2  muncul  saat  hari  ke-5  dan
perbedaan manifestasi klinis dengan K4 muncul lebih awal yaitu pada hari ke-4 post inokulasi PbA, Manifestasi klinis pada K2 juga lebih rendah signifikan dibandingkan K4 pada hari ke-9 dan ke-10, meskipun secara deskriptif rerata skor K4 selalu lebih tinggi  dari  K2  mulai  dari  hari  ke-3  sampai  ke-10.  Tidak  ada  perbedaan  manifestasi klinis antara kelompok kontrol yaitu K1 dan K3.
Tingginya skor manifestasi klinis malaria serebral pada kelompok K4 dikaitkan dengan  mekanisme  patogenesis  malaria  serebral.  Munculnya  gejala  pada  malaria diawali  oleh  tingginya  derajat  parasitemia,  dikeluarkannya  berbagai  molekul  PAMP oleh PRBC yang akan menginduksi respon imun innnate maupun adaptif. Pelepasan berbagai sitokin proinflamasi oleh respon imun innate maupun adaptif akan memicu munculnya  gejala  sistemik  pada  malaria.  Munculnya  gejala  sistemik  dipicu  oleh pelepasan berbagai mediator inflamasi seperti sitokin proinflamasi disekresikan oleh imunitas  innate  sebagai  respon  pengenalan  terhadap pathogen  associated molecular  pattern (PAMP)  atau damage  associatedmolecular  pattern oleh  (DAMP) oleh pattern  recognition  receptor (PRR)  (Evans et  al. 2016).  Skor  manifestasi  klinis pada  kelompok  K2  tidak  mencerminkan  manifestasi  klinis  malaria  serebral,  tapi disebabkan  penurunan  eritrosit  akibat  proses  hemolisis  yang  dipicu  oleh progresifitas perkembangan parasit dalam eritrosit.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa mencit swiss inbreed yang diinokulasi
PbA tidak dapat menjadi mencit model malaria serebral, karena sampai dengan hari terakhir  pengamatan  manifestasi  klinis  malaria  serebral  tidak  ditemukan.  Namun mencit  ini  dapat  digunakan  sebagai  model  malaria  dengan  anemia  berat  karena perkembangan  derajat  parasitemia  yang  progresif  berhubungan  dengan  makin tingginya  eritrosit  yang  pecah.  Mencit  C57BL/6  yang  diinokulasi  PbA  membuktikan adanya perkembangan parasit meskipun tidak progresif seperti mencit swiss, dan di
hari  akhir  pengamatan  memperlihatkan  adanya  manifestasi  klinis  malaria  serebral.
Hasil penelitian ini telah membuktikan bahwa mencit C57BL/6 yang diinokulasi PbA terbukti dapat menjadi hewan model untuk penelitian malaria serebral.

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  mencit  swiss inbreed  yang  diinokulasi  PbA  tidak  dapat  menjadi  model  malaria  serebral,  namun mencit C57BL/6 yang diinokulasi PbA dapat menjadi model malaria serebral.

## References
Adetutu,  Adewale,  Olubukola  S.  Olorunnisola,  Abiodun  O.  Owoade,  and  Peter Adegbola.  2016 .  “Inhibition  of  In  Vivo  Growth  of  Plasmodium  Berghei  by Launaea  Taraxacifolia  and  Amaranthus  Viridis  in  Mice.” Malaria  Research  and Treatment 2016 (1): 1 –9. https://doi.org/10.1155/2016/9248024. Baeti,  Devi  Nurul.  2010. Efek  Terapi  Kombinasi  Klorokuin  Dan  Serbuk  Lumbricus Rubellus Terhadap Ekspresi Gen ICAM 1 Pada Mencit Swiss Yang Diinfeksi P. Berghei ANKA . Fakultas Kedokteran Sebelas Maret.
Blanco  Yara  ,  Farias  Alessandro,  Goelnitz  Uta,  Amino  Rogério  Lopes  Stefanie  , Arrais-Silva  Wagner  ,  Carvalho  Bruna,  and  Costa  Fabio  Wunderlich  Gerhard, Santos  Leonilda,  Giorgio  Selma.  2008.  “Hyperbaric  Oxygen  Prevents  Early Death  Caused  by  Experimental  Cerebral  Malaria.” PLoS  ONE 3  (9):  2 –11. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003126.
Doolan,  Denise  L.  2002. Methods  and  Protocols  Edited  By . Humana  Press  Inc. Totowa.
Einstein, Medicine College of Albert. 2015. “Recommended Methods of Anesthesia , Analgesia  ,  and  Euthanasia  for  Laboratory  Animal  Species.”  In Laboratory Animal , 1:1 –12.
Evans,  Sharon  S,  Elizabeth  A  Repas ky, and Daniel T Fisher. 2016. “Fever and the Thermal Regulation of Immunity: The Immune System Feels the Heat.” Nature Reviews Immunology 15 (6): 335 –49. https://doi.org/10.1038/nri3843.Fever.
Franke-fayard, Blandine, Jannik Fonager, Anneke Braks, Shahid M Khan, and Chris J  Janse.  2010.  “Sequestration  and  Tissue  Accumulation  of  Human  Malaria Parasites :  Can  We  Learn  Anything  from  Rodent  Models  of  Malaria ? Sequestration  and  Tissue  Accumulation  of  Human  Malaria  Parasites :  Can We Learn  Anything  from  Rodent Models  of  Malaria ?,”  no.  June  2017. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001032.
Franke-fayard, Blandine, Chris J Janse, Cunha R. Margarida, Jai Ramesar, Philippe Buscher,  Ivo  Que,  Clemens  Lowik,  et  al.  2005.  “Murine  Malaria  Parasite Sequestration :  CD36  Is  the  Major  Receptor  ,  but  Cerebral  Pathology  Is Unlinked.”
Janse, Chris. 2016. “P.Berghei.” Netherlands: Leids Universitairs Medisch Centrum. Martins,  Yuri  Chaves,  Mary  Jane  Smith,  Marcelo  Pelajo-Machado,  Guilherme
Loureiro  Werneck,  Henrique  Leonel  Lenzi,  Claudio  Tadeu  Daniel-Ribeiro,  and Leonardo José De Moura Carvalho. 2009. “Characterization of Cerebral Malaria in the Outbred Swiss Webster Mouse Infected by Plasmodium Berghei ANKA.” International Journal of Experimental Pathology 90 (2): 119 –30. https://doi.org/10.1111/j.1365-2613.2008.00622.x.
Muntiha,  Mohamad.  2001. Teknik  Pembuatan  Preparat  Dengan  Pewarnaan Hematoksilin Dan . Balai Penelitian Veteriner . Nurhayati. 2009. “Status Hematologi Penderita.” Majalah Kedokteran Andalas 33 (1): 48 –53.
Oakley, Miranda S., Thomas F. McCutchan, Vivek Anantharaman, Jerrold M. Ward, Laurence  Faucette,  Cindy  Erexson,  Babita  Mahajan,  et  al.  2008.  “Host Biomarkers and Biological Pathways That Are Associated with the Expression of Experimental Cerebral Malaria in Mice.” Infection  and  Immunity 76 (10):  4518 – 29. https://doi.org/10.1128/IAI.00525-08.
Rahmad,  Darmawan.  2014.  “Uji  Aktivitas  Antiplasmodium  Ekstrak  Daun  Sungkai  ( Peronema  Canescens  )  Terhadap  Mencit  Jantan  (  Mus  Musculus  )  Serta Implementasinya Sebagai LKS Pada Materi Protista.” Universitas Bengkulu. Runtuk,  Kresna  Septiandy,  Loeki  Enggar  Fitri,  and  Rintis  Noviyanti.  2018. “Role  of Hypoxia-Inducible Factor (HIF)- 1α and CD11b in Pathogenesis of Experimental Cerebral Malaria in Mice.” Acta Microbiologica Hellenica 63 (01): 65 –72.
Sierro,  Frederic,  and  Georges  E.R.  Grau.  2019.  “The  Ins  and  Outs  of  Cerebral Malaria Pathogenesis: Immunopathology,
Extracellular Vesicles, Immunometabolism, and Trained Immunity.” Frontiers  in  Immunology 10  (830):
1 –11. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00830.
Souza,  J  Brian  D  E,  Julius  C  R  Hafalla,  and  Eleanor  M  Riley.  2009.  “Cerebral Malaria :  Why  Experimental  Murine  Models  Are  Required  to  Understand  the Pathogenesis of Disease” 137. https://doi.org/10.1017/S0031182009991715.
Storm,  Janet,  and  Alister  Craig.  2 014.  “Pathogenesis  of  Cerebral  Malaria-- Inflammation  and  Cytoadherence.” Frontiers  in  Cellular  and  Infection Microbiology 4 (July): 100. https://doi.org/10.3389/fcimb.2014.00100.
Waknine-Grinberg,  Judith  H.,  Nicholas  Hunt,  Annael  Bentura-Marciano,  James  A.
McQuillan,  Ho  Wai  Chan,  Wing  Chi  Chan,  Yechezkel  Barenholz,  Richard  K. Haynes,  and  Jacob  Golenser.  2010.  “Artemisone  Effective  against  Murine Cerebral  Malaria.” Malaria  Journal 9  (1):  1 –15.  https://doi.org/10.1186/1475- 2875-9-227.