## Pendugaan Kemunduran Benih dengan Uji Fisiologi dan Biokimiawi
Gani Jawak a , Eny Widajati b , Devi Liana c , Tri Astuti c a Fakultas Pertanian, Universitas Lambung Mangkurat, Kalimantan Selatan, Indonesia, email: ganijawak@gmail.com
b Fakultas Pertanian, IPB University, Bogor-Jawa Barat, Indonesia, email: eny.widajati61@gmail.com
c Fakultas Pertanian dan Peternakan, UNIKA St. Paulus, Ruteng-NTT, email: deviliana1121@gmail.com
c Fakultas Pertanian dan Peternakan, UNIKA St. Paulus, Ruteng-NTT, email: tri67984@gmail.com
Article Info

## Abstrak
Article history: Received 23 September 2022 Received in revised form 27 September 2022 Accepted 30 September 2022
Pengujian viabilitas benih merupakan salah satu uji rutin yang dilakukan dalam proses sertifikasi benih. Penurunan viabilitas benih dapat dilakukan secara biokimiawi dan secara fisiologi. Penelitian ini dilakukan dengan maksud untuk mempelajari kemunduran benih melalui pengujian secara biokimiawi dan secara fisiologi. Penelitian menggunakan dua lot benih kacang panjang (lot tinggi dan lot rendah). Uji viabilitas  benih  secara  fisiologi  dilakukan  melalui  uji  daya  berkecambah  dan  secara  biokimiawi  melalui  uji  respirasi  dengan  teknik pewarnaan menggunakan tetrazolium (TTZ) dan metode titrasi. Percobaan dirancang menggunakan rancangan acak lengkap satu faktor. Data yang diperoleh dianalisis dengan uji  F dan korelasi Pearson. Hasil penelitian menunjukkan  bahwa  perlakuan lot benih beberbeda nyata terhadap tolok ukur uji tetrazolium dan berat kering kecambah total sedangkan untuk tolok ukur indeks vigor, daya berkecambah, dan respirasi tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Terdapat korelasi yang positif tinggi pada tingkat respirasi benih lot tinggi dan benih lot benih rendah terhadap tolok ukur berat kering kecambah total, daya berkecambah, indeks vigor, dan uji tetrazolim. Oleh karena itu, uji biokimiawi dengan TTZ dan respirasi dengan metode titrasi dapat dijadikan alternatif untuk menduga kemunduran benih dengan cepat.
DOI: https://doi.org/10.32938/sc.v7i04.1921
Keywords:
Kacang Panjang
Respirasi Titrasi TTZ
Uji Viabilitas

## 1. Pendahuluan
Pengujian benih penting dilakukan dalam rangka memperoleh informasi tentang  viabilitas  benih,  terkait  dengan  mutu  suatu  lot  benih.  Benih  dikatakan bermutu bila memiliki kualitas sesuai standar mutu internasional tang ditetapkan oleh  ISTA  ( International  Seed  Testing  Association ).  Mutu  yang  ditetapkan secara internasional meliputi mutu fisik, fisiologi, genetik dan kesehatan benih. Salah satu parameter yang digunakan untuk menduga mutu fisiologi benih adalah viabilitas benih. Viabilitas benih bisa diduga melalui pengamatan dan pengujian baik secara fisik, anatomi, sitologi, matematik, fisiologis dan biokemis ( Widajati et al ., 2013 ).
Kemunduran  benih  didefinisikan  sebagai  perubahan  pada  benih  ke  arah yang  lebih  buruk  dan  terjadi  seiring  dengan  bertambahnya  waktu,  yang  dapat menyebabkan  paparan  benih  semakin  meningkat  tehadap  faktor  eksternal  dan akhirnya kemampuannya untuk bertahan hidup menjadi turun ( Jyoti dan Malik, 2013 ). Perbicara mengenai kemuduran benih berarti kita berbicara tentang satu proses. Proses dalam kemunduran benih terjadi secara perlahan, terus menerus, bersifat  kumulati,  serta irreversible .  Proses  tersebut  terjadi  akibat  terjadinya perubahan  fisiologis  benih  secara  intern.  Menurut Copeland  dan  McDonald  ( 2001) kemuduran  benih  dapat  diduga  baik  menggunakan  uji  secara  biokimia maupun fisiologi. Hasil penelitian Copeland dan McDonald (2001) menyebutkan bahwa proses kemunduran benih yang terjadi secara fisiologi dapat diindikasikan dari  turunnya  daya  berkecambah  benih,  meningkatnya  jumlah  kecambah  yang abnormal,  menurunnya  daya  tumbuh  di  lapangan  ( field  emergence ), pertumbuhan  dan  perkembangan  tanaman  menjadi  terhambat,  serta  turunnya produksi sebagai respon meningkatnya kepekaan tanaman terhadap lingkungan yang  ekstrim.  Selain  indikasi  secara  fisiologi,  kemunduran  benih  dapat  juga dilihat dari indikasi  secara biokimia. Tatipata et  al .  (2004) menyatakan bahwa kemunduran  benih  secara  biokimia  dapat  dicirikan  dengan  turunnya  aktivitas enzim  perkecambahan,  cadangan  makanan  semakin  menurun,  dan  nilai konduktivitas yang semakin meningkat.
Benih  membutuhkan  energi  untuk  bermetabolisme,  hasil  metabolisme digunakan  benih  untuk  dapat  hidup,  berkecambah,  dan  berkembang  menjadi tanaman hingga berproduksi. Benih dengan aktivitas respirasi yang lebih tinggi akan  mampu  menghasilkan  lebih  banyak  energi  yang  nantinya  digunakan  sel untuk  bermetabolisme.  Berdasarkan  prinsip  tersebut,  akitivitas  respirasi  sel mungkin  dapat  dijadikan  acuan  dalam  menduga  viabilitas  suatu  lot  benih. Respirasi sel dapat diduga secara cepat menggunakan uji biokimia berdasarkan aktivitas  enzimnya  (uji tetrazolium)  atau berdasarkan  hasil  respirasinya  (titrasi benih).
Enzim  dehidrogenase  termasuk  salah  satu  enzim  yang  terlibat  dalam proses  respirasi,  dimana  fungsi  dari  enzim  ini  adalah  untuk  melepaskan  ion hidrogen dari senyawa antara yang terlibat dalam proses respirasi. Ion hidrogen dapat  bereaksi  dengan  senyawa  2,3,5  trifenil  tetrazolium  klorida  membentuk endapan formazan, dari pola dan intensitas endapan pada jaringan benih inilah bisa  diduga  pola  aktivitas  respirasi  benih.  Dalam  proses  respirasi  benih  juga dihasilkan  CO2  sebagai  hasil  dari  proses  metabolisme.  CO2  dapat  ditangkap menggunakan larutan KOH, dimana banyaknya mg CO2 yang dihasilkan benih dapat diduga melalui titrasi.
Dalam  ISTA  (2010)  disebutkan  bahwa  pengujian  viabilitas  dengan  uji tetrazolium  (TTZ)  tidak  berhubungan  dengan  uji  daya  berkecambah,  tetapi persentase benih viabel pada uji TTZ akan tidak berbeda nyata dengan persentase kecambah  normal  pada  uji  daya  berkecambah  hanya  apabila:  1)  benih  tidak dalam keadaan dorman atau mengalami kekerasan benih atau telah dipatahkan dormansinya  atau  kekerasan  benihnya;  2)  benih  tidak  terinfeksi  penyakit  atau sudah didesinfektan; 3) benih tidak disemprot di lapangan atau diberi perlakuan ’ coating ’  dalam  pengolahan  atau  difumigasi  di  gudang;  4)  benih  belum berkecambah;  5)  benih  belum  mengalami  deteriorasi  lebih  lanjut  pada  saat
pengujian  DB;  6)  benih  dikecambahkan  pada  kondisi  optimum;  dan  7)  benih tidak disimpan dalam ruangan yang diberi penghambat perkecambahan. Menurut Zanzibar  (2009) ,  uji  biokimia  dengan  menggunakan  tetrazolium  memiliki beberapa  kelebihan  seperti:  a)  menghemat  waktu  pengujian  (pengujian  relatif singkat), b) dapat diaplikasikan untuk menguji viabilitas benih pada benih yang masih  dorman  atau after  ripening ,  dan  c)  hasil  uji  memiliki  tingkat  ketelitian yang  tinggi.  Namun  pengujian  viabilitas  dengan  TTZ  memiliki  beberapa kelemahan  diantaranya:  a)  membutuhkan  tenaga  yang  ahli,  b)  memerlukan pelatihan yang intensif, c) pekerjaanya  bersifat laboratoris, dan  d) uji ini tidak dapat  digunakan  mendeteksi  kerusakan  pada  benih  yang  disebabkan  oleh cendawan  atau  mikroba  lain  yang  bersifat  merusak.  Uji  biokimia  dengan tetrazolium dapat juga digunakan sebagai uji vigor. Menurut Priandoko (2011) dan Afifah et  al. (2020) sebagai  uji  vigor  pengujian  dengan  tetrazolium  harus dilakukan  dengan  membuat  penilaian  pewarnaan  pada  benih  yang  lebih  ketat ( Priandoko, 2011 )
Cara lainnya yang  umum  digunakan untuk untuk  mengetahui  viabilitas/ kemunduran  benih  ialah  dengan  pengujian  fisiologis,  dengan  cara  menilai kemampuan  embrio  benih  untuk  berkembang  menjadi  kecambah  normal. Kemampuan  embrio  dalam  memanfaatkan  cadangan  makanan  yang  tersedia dengan  efektif  dan  efisien  membentuk  biomassa  kecambah  juga  dapat  diiuji melalui  berat kering kecambah total (BKKt). Penelitian dilakukan dengan tujuan mempelajari  kemunduran  benih  melalui  pengujian  secara  fisiologi  dan  secara biokimiawi.

## 2. Metode
Penelitian  ini  dilakukan    mulai  bulan  April  hingga  bulan  Juni  2014 bertempat di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Benih, Fakultas Pertanian, IPB University, Darmaga-Bogor. Analisis Korelasi Pearson dilakukan pada data yang diperoleh untuk melihat adanya hubungan keterkaitan antara hasil uji titrasi, berat kering kecambah total (BKKt), tetrazolium (TZ), dan daya berkecambah (DB). Koefisien korelasi (r) bernilai antara -1 ≤ r ≤ +1. Nilai koefisien korelasi yang positif menunjukkan bahwa jika nilai variable satu meningkat maka peningkatan juga terjadi pada variable 2. Nilai koefisien korelasi yang negatif menunjukkan bahwa nilai variable 1 yang semakin meningkat akan menyebabkan nilai variable 2  yang  semakin  kecil.  Nilai  koefisien  korelasi  yang  bernilai  nol  menunjukkan bahwa  tidak  adanya  hubungan  antara  2  variabel  yang  diuji.  Jika  koefisien korelasi nilainya semakin mendekati -1 atau 1, menunjukkan bahwa hubungan linear antara 2 peubah yang di uji semakin erat. Analisis data korelasi dilakukan dengan  program  Minitab  14.0.  Pada  metode  UKDdp  digunakan  rancangan percobaan  rancangan  acak  lengkap  (RAL)  satu  faktor,  dengan  lot  sebagai faktornya. Data daya berkecambah, berat kering total, respirasi, viabilitas TTZ dan  vigor  benih  diolah  menggunakan  program  SAS  9.1  portable  ( Statistical Analysis  System ).  Jika  hasil  percobaan  menunjukkan  adanya  perbedaan  yang nyata pada perlakuan maka akan dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) taraf α=5%.

## 2.1 Uji respirasi metode titrasi
Dua lot benih kacang panjang dengan vigor yang berbeda (masing-masing sebanyak 25 butir per ulangan) disterilisasi permukaan menggunakan klorox 1%. Benih  kemudian  ditanam  di  dalam toples  yang  telah  dialas  menggunakan  tiga lembar  kertas  saring  lembab.  Kemudian  botol  film  yang  berisi  20  ml  larutan KOH 0.8 N dimasukkan di posisi tengah toples.  Toples yang berisi botol film ditanami benih kacang panjang, kemudian ditutup rapat agar kedap udara. Untuk blangko disiapkan dengan metode yang sama akan tetapi benih tidak ditanam di dalam toples. Toples berisi tersebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama empat hari. Setelah empat hari toples dibuka dan larutan KOH pada botol film dituang ke dalam tabung erlenmeyer (volume tabung 50 ml). Selanjutnya 1 tetes
indikator phenolftalein ditambahkan ke dalam larutan KOH di dalam erlenmeyer dengan indicator warna merah jambu. Kemudian dilakukan titrasi menggunakan HCl 0.4 N sampai indikator warna merah jambu hilang. Selanjutnya tambahkan 1  tetes  indikator  metil  orange  dengan  indikator  warna  orange  dan  dititrasi kembali dengan  HCl 0.4  N hingga  warna  orange  berubah  menjadi  warna merah muda.
Respirasi  menggunakan  metode  titrasi  dapat  dihitung  berdasarkan  CO 2 yang diproduksi dengan menggunakan rumus:
mg CO2= (a-b) x N x 44 t ..........................(1)
Keterangan: a : merupakan banyaknya HCl (ml) yang digunakan pada titrasi tahap kedua dari toples berisi benih
b : merupakan banyaknya HCl (ml) yang digunakan pada titrasi tahap kedua dari toples blangko
N : merupakan nilai molaritas HCl t : merupakan lama inkubasi (hari)
Benih  kacang  panjang  dibiarkan  tetap  di  dalam  toples  hingga  hari  ke-6  untuk mendapatkan kecambah yang lebih besar ukurannya. Kecambah yang terbentuk dilepaskan  kotiledonnya  dan  dimasukkan  ke  dalam  amplop  yang  sebelumnya telah  ditimbang  bobotnya  (B0).  Amplop  berisi  kecambah  kemudian  diuapkan kandungan airnya menggunakan oven suhu 60 ºC selama 3x24 jam. Kemudian amplop  dikeluarkan  dan  dimasukkan  dalam  desikator  sampai  panasnya  hilang (15-30 menit), ditimbang berat akhirnya (B1). Bobot kering kecambah dihitung dengan menguragkan B1-B0.

## 2.2 Uji respirasi benih menggunakan metode tetrazolium
Dua lot benih kacang panjang dengan vigor yang berbeda (masing-masing sebanyak 25 butir per ulangan) direndam terlebih dahulu selama 12 jam. Benih lalu ditiriskan, dibuang kulit arinya menggunakan scalpel dan direndam kembali dalam  larutan  2,3,5-Trifenil  tetrazolium  klorida.  Untuk  mempercepat  proses pewarnaan, rendaman benih dalam TTZ diinkubasi selama ±1 jam dalam oven suhu  40 º C.  Benih  dikeluarkan  dari  oven,  disaring  dan  dicuci  bersih  dibuka kepingnya  dan  dilakukan  pengamatan  terhadap  pola  pewarnaan  yang  muncul pada  benih,  benih  dengan  pola  pewarnaan  vigor  kemudian  dipersentasekan sehingga  diperoleh  persentase  benih  germinabel.  Pola  pewarnaan  TTZ  pada kacang panjang diamati sesuai ketentuan AOSA (2005) .

## 2.3 Uji Fisiologis Benih menggunakan metode UKDdp
Dua lot benih kacang panjang dengan vigor yang berbeda (masing-masing sebanyak 25 butir per ulangan) ditanam diatas tiga lembar kertas stensil lembab yang dialasi plastik. Selanjutnya benih tersebut ditutup dengan 2 lembar kertas stensil  lembab  dan  digulung.  Gulungan  ditempatkan  pada  ecogerminator  APB IPB 72-1. Dilakukan pengamatan terhadap indeks vigor pada hari ke-5 dan daya berkecambah benih pada hari ke-5 dan hari ke-8. Tolok ukur yang diamati untuk mengukur  vigor  benih  kacang  panjang  melalui  uji  perkecambahan  (fisiologis) adalah  daya  berkecambah  (DB)  dan  indeks  vigor  (IV).  Persentase  daya berkecambah  benih  dihitung  menggunakan  rumus  ISTA  (2010).  Sedangkan indeks vigor dihitung dengan rumus:
IV = Σ KN hitungan I
X 100% .....(2) Σ benih total Keterangan:
ΣKN =  persentase kecambah normal
Hasil  analisis  anova  menunjukkan  bahwa  perlakuan  lot  benih menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap tolok ukur uji tetrazolium dan berat kering  kecambah  total,  sedangkan  untuk  tolok  ukur  indeks  vigor,  daya berkecambah, dan respirasi tidak menunjukkan perbedaan yang nyata ( Gambar 1 dan Gambar  2 ).  Lot  benih  tinggi  memiliki  nilai  tertinggi  untuk  semua  tolok ukur yang diamati. Hal ini mengindikasikan bahwa benih yang berasal dari lot tinggi  memiliki  vigor  lebih  tinggi  dibandingkan  benih  dari  lot  rendah. Pada tahap awal perkecambahan respirasi merupakan salah satu peristiwa yang memegang  peranan  penting.  Saat  respirasi  maka  akan  terjadi pelepasan  energi akibat  putus  atau  melemahnya  ikatan  antara  karbon  -  karbon  dan  karbon  - hidrogen  pada  suatu  molekul.  Respirasi  memegang  peranan  utama  pada organisme untuk keberlangsungan hidupnya. Benih tanaman dapat dikategorikan sebagai  organisme.  Benih  sebagai  organisme  melakukan  respirasi  untuk mempertahankan keberlangsungan hidupnya.
Perombakan cadangan makanan menjadi senyawa sederhana terjadi pada saat respirasi. Cadangan makanan berupa karbohidrat dan protein akan dirombak menjadi  senyawa  sederhana  berupa  CO2  dan  H2O  dan  pembebasan  sejumlah tenaga  yang  disimpan  dalam  cadangan  makanan  (endosperm)  terjadi  selama proses  respirasi  ( Sulastrini,  1996 ).  Semakin  tinggi  tingkat  cadangan  makanan maka  laju  respirasi  semakin  tinggi  dan  energi  (ATP)  yang  dibutuhkan  untuk perkecambahan akan terbentuk semakin banyak. Banyaknya ATP yang terbentuk akan  meningkatkan  laju perkecambahan benih  sehingga dapat  dikatakan benih yang  memiliki  laju  perkecambahan  tinggi  adalah  benih  yang  bervigor  tinggi. Laju  perkecambahan  ini  dapat  diukur  dari  tolok  ukur  indeks  vigor  dan  daya berkecambah benih. Coopeland dan McDonald (2001) menyatakan bahwa proses respirasi  merupakan  ekspresi  dari  sekelompok  enzim  yang  bekerja  bersama dalam  merombak  cadangan  makanan.  Pada  benih  yang  sudah  mengalami
kemunduran,  respirasinya  akan  menjadi  lemah  sehingga  menyebabkan kehilangan daya berkecambah.
Gambar 1. Pengaruh lot benih terhadap viabilitas benih (TTZ, indeks vigor, dan daya berkecambah) kacang panjang (Keterangan: pada tolok ukur yang sama, huruf yang berbeda dibelakang angka menunjukkan adanya perbedaan yang nyata)
Gambar 2. Pengaruh lot benih terhadap berat kering kecambah dan respirasi benih (Keterangan: pada tolok ukur yang sama, huruf yang berbeda dibelakang angka menunjukkan adanya perbedaan yang nyata).
Korelasi  tingkat  respirasi  antara  benih  lot  tinggi  dan  lot  benih  rendah dengan tolok ukur berat kering kecambah total, daya berkecambah, indeks vigor, dan uji tetrazolium menunjukkan korelasi yang positif tinggi ( Tabel 1 dan Tabel 2 ). Pada lot benih tinggi respirasi memiliki korelasi dengan indeks vigor, daya berkecambah, dan  berat kering kecambah total masing  masing  sebesar  r=0.67, r=0.71 dan r=0.63. Pada lot benih rendah nilai korelasi respirasi dengan indeks vigor, daya berkecambah, dan berat kering kecambah total masing-masing yaitu r=0.89, r=0.92, dan r=0.77. Korelasi yang positif menunjukkan bahwa bila salah satu  peubah  mengalami  peningkatan  nilai  maka  akan  diikuti  oleh  peningkatan nilai peubah yang lainnya atau hubungannya searah ( Gomez dan Gomez 2007 ). Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  tingkat  respirasi  dapat  digunakan  untuk menduga vigor benih dimana respirasi yang semakin meningkat selama proses perkecambahan  menunjukkan  tingginya  ATP  yang  terkandung  dalam  benih. Proses  respirasi umumnya  menggunakan  ATP sebagai  sumber  energi.  Tingkat ATP yang tinggi mengindikasikan vigor benih yang tinggi. Tingkat korelasi yang positif ini sejalan dengan pernyataan Tatipata et al., (2004) dimana benih yang mengalami  kemunduran  dapat  ditunjukkan  dengan  semakin  rendahnya  tingkat respirasinya.
Tabel 1. Korelasi antar tolok ukur viabilitas pada benih kacang panjang lot tinggi
Tolok ukur TTZ IV DB BKKT IV 0.798 DB 0.765 0.982 BKKT 0.872 0.505 0.403 Respirasi 0.911 0.670 0.713 0.673
Tabel  2.  Korelasi  antar  tolok  ukur  viabilitas  pada  benih  kacang  panjang  lot rendah Tolok ukur TTZ IV DB BKKT IV 0.633 DB 0.596 0.997* BKKT 0.724 0.504 0.521 Respirasi 0.592 0.898 0.921 0.77 *: berbeda nyata
Respirasi dan uji TTZ memiliki keterkaitan yang erat. Pada Tabel 1 dan Tabel 2 terlihat bahwa respirasi dan TTZ memiliki korelasi yang positif tinggi baik pada lot benih tinggi (r= 0.91) maupun lot benih rendah (r= 0.59). Proses respirasi  dalam  lintasan  siklus  kreps  akan  melepaskan  ion  H + .  Ion  H + yang
78,25A
73,75A 74,75A 25B 66A 66,75A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Uji TTZ Iindeks Vigor Daya Berkecambah Lot tinggi Lot rendah 2.65A 1.24A 1.89B 1.11A 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 BKKT (dalam satuan gram) Respirasi (dalam satuan mg CO2) Lot tinggi Lot rendah Tolok ukur Persentase (%) Tolok ukur
terlepas  akan  berikatan  dengan  2,3,5  trifenil  tettrazolim  membentuk  larutan formazan berwarna merah pada uji tetrazolium. Banyak sedikitnya pelepasan ion H + dalam proses respirasi ini tergantung dari banyaknya siklus krebs yang terjadi selama  proses  respirasi,  yang  berarti  pula  tergantung  pada  cadangan  makanan yang tersedia dalam benih. Semakin tinggi cadangan makan dalam benih maka semakin banyak energi yang tersedia saat dibutuhkan dalam proses perombakan cadangan  makanan  selama  respirasi  dan  semakin  banyak  pula  ion  H + yang dilepaskan sehingga saat direndam dalam larutan 2,3,5 trifenil tetrazolium akan semakin  banyak  formazan  yang  terbentuk.  Formazan  yang  tebentuk  pada jaringan benih yang hidup berupa pewarnaan berwarna merah cerah pada bagian poros embrio dan kotiledon. Bila pola pewarnaan menunjukkan pola pewarnaan seperti pada Gambar 1a mengindikasikan ion H + yang dilepas semakin banyak, respirasi yang terjadi tinggi (mg CO 2 yang terbentuk tinggi), cadangan makanan benih yang tersedia tinggi dan benih memiliki vigor yang tinggi.
Gambar 3. Hasil uji tetrazolium pada benih kacang panjang: a-c = germinabel dan d-f = non germinabel
Kriteria  benih  yang  dikatakan  germinabel  pada  penelitian  ini  adalah:  a) seluruh embrio dan kotiledon berwarna merah merata, merah cerah, merah merah muda atau merah dengan bercak sedikit merah tua, dan  b) <25% kotiledon tidak terwarnai  ( Gambar  3a-c )  ,  sedangkan  kriteria  non  germinabel  bila:  a)  >25% bagian kotiledon tidak terwarnai,  dan b) poros embrio tidak terwarnai atau hanya sedikit poros embrio yang terwarnai ( Gambar 3d-f ).  Berdasarkan Tabel 1 dan Tabel 2 dapat dilihat bahwa uji tetrazolium dan indeks vigor memiliki korelasi positif  tinggi  pada  benih  lot  tinggi  (r=  0.79)  dan  lot  rendah  (r=0.63).  Pada  lot benih  tinggi  uji  TTZ  memiliki  korelasi  positif  tinggi  dengan  tolok  ukur  daya berkecambah (r=0.76) dan berat kering kecambah total (r=0.87). Pada lot benih rendah uji TTZ memiliki korelasi positif dengan tolok ukur daya berkecambah (r=0.59) dan berat kering kecambah total (r=0.72). Hal ini sejalan dengan Afifah et  al. (2020) yang  menyatakan  bahwa  kriteria  normal  kuat pada hasil uji  TTZ memiliki korelasi positif tinggi dengan indeks vigor (r=0.88), daya berkecambah (r=0.80) dan BKKN-h6 (r=0.89). Oleh karena itu pola pewarnaan pada kriteria normal  kuat  pada  uji  TTZ  dapat  digunakan  untuk  mengestimasi  vigor  dan viabilitas  potensial  pada  benih  botani  bawang  merah  ( Afifah et  al. ,  2020 ). Fatmawati et al. (2018) juga menyatakan bahwa pola pewarnaan pada uji TTZ berkorelasi  dengan  viabilitas  potensial  yaitu  daya  berkecambah.  Pada  benih kedelai  uji accelerated  aging tetrazolium,  dan cold  test dapat  digunakan mengestimasi daya tumbuh di lapangan ( Kulik dan Yaklich, 1982 )
Banyak  faktor  yang  dapat  memengaruhi  hasil  pengujian  TTZ  dan hubungannya  dengan  daya  berkecambah.  Pengujian  viabilitas  dengan  daya berkecambah  dan  secara  biokimiawi  dengan  TTZ  tidak  akan  berbeda  secara nyata  apabila  (a)  benih  dalam  kondisi  tidak  dorman  maupun  benih  keras  atau telah diperlakukan terlebih dahulu untuk mematahkan dormansi dan kekerasan benih,  (b)  benih  yang  digunakan  tidak  terinfeksi  atau  telah  diberi  disinfektan dengan  tepat,  (c)  benih  belum  disemprot  dilapangan  maupun  diberi  perlakuan selama  proses  atau  difumigasi  selama  penyimpanan  dengan  bahan  kimia,  (d) benih  belum  berkecambah,  (e)  benih  belum  mengalami  kemunduran  selama
pengujian perkecambahan dengan durasi normal atau diperpanjang dan (f) benih telah  dikecambahkan  dibawah  kondisi  optimal  ( BPMBTPH  2004 ; Leist  2004 ; ISTA 2010 ; Kramer 2010 ). Hasil percobaan yang dilakukan Sivasubramaniam dan  Selvarani  (2012) menunjukkan  bahwa  benih  jamur  yang  memiliki  embrio ganda, menyebabkan munculnya tiga kecambah per benih, dan pewarnaan TTZ pada embrionic axis , dengan bagian-bagian embrio lain (seperti kotiledon) yang tersisa tidak diwarnai sehingga hal ini dapat mengaburkan pembacaan data yang dihasilkan. Uji cepat secara biokimia menggunakan tetrazolium 1% digunakan sebagai metode uji mutu fisiologis benih damar dimana hasil uji TTZ memiliki nilai  korelasi  yang  tinggi  dengan  perkecambahan  dilapang.  Oleh  karena  itu, Zanzibar dan Herdiana (2009) menggunakan metode uji cepat dengan TTZ untuk penyusunan tabel daya berkecambah benih damar.
Uji  vigor  benih  saat  ini  dengan  TTZ  banyak  dikembangkan  dengan penilaian  yang  lebih  ketat  dibandingkan  dengan  uji  TTZ  untuk  uji  viabilitas. Pengembangan  uji  TTZ  sebagai  uji  vigor  dilakukan  karena  uji  TTZ  dapat mendeteksi kerusakan lebih dini pada embrio melalui pola warna yang tampak. Kerusakan  dini  pada  embrio  dapat  menunjukkan  terjadinya  deteriorasi  benih yang  menyebabkan  vigor  menjadi  turun.  Hasil  lain  yang  diperoleh  pada percobaan  ini  adalah  pada  benih  lot  tinggi  persentase  daya  berkecambahnya rendah  dikarenakan  oleh  banyaknya  benih  dan  kecambah  yang  busuk  dan terserang cendawan (lot tinggi = 10.17% dan lot rendah = 20.50%). Hal ini dapat mengaburkan hasil penelitian yang sebenarnya seperti terlihat pada nilai korelasi antara berat kering kecambah total pada lot tinggi dan lot rendah terhadap nilai indeks  vigor  (lot  tinggi  r=  0.50,  lot  rendah  r=0.50)  dan  daya  berceambah  (lot tinggi r=0.40, lot rendah r=0.52) . Sehingga untuk mendapatkan hasil yang valid disarankan  melakukan  sterilisasi  alat  dan  bahan  terlebih  dahulu  sebelum menggunakan TTZ sebagai penduga viabilitas pada benih.
.
4. Simpulan
Uji  fisiologi  dengan  uji  viabilitas  (persentase  indeks  vigor,  persentase daya berkecambah) dan vigor (berat kering kecambah total) pada benih kacang panjang lot tinggi dan lot rendah masing-masing memiliki korelasi yang positif tinggi dengan uji biokimia dengan uji tetrazolium dan respirasi. Demikian juga dengan  uji  respirasi  terhadap  uji  tetrazolim  memiliki  korelasi  positif  tinggi dengan r = 0.911 pada lot tinggi dan r = 0.592 pada lot randah. Lot benih tinggi dan lot benih rendah tidak berbeda secara nyata pada nilai indeks vigor, tingkat respirasi, dan daya berkecambah, namun berbeda nyata pada hasil uji TTZ dan BKKt. Uji biokimiawi melalui uji TTZ dan respirasi dengan metode titrasi dapat digunakan untuk mengestimasi viabilitas potensial benih.

## Pustaka
AOSA.  2005. Tetrazolium  Testing  Handbook .  Las  Cruces:  Association  of Official Seed Analysts.
Afifah,  N.,  Widajati,  E.  &  Palupi  E.  R.  2020.  Pengembangan  uji  tetrazolium sebagai  metode  analisis  vigor  benih  botani  bawang  merah. J.  Hort. Indonesia, 11 (2), 120-130. BPMBTPH. 2004. Pengujian Mutu Benih Tanaman Pangan dan Hortikultura; Laboratorium  dan  Metode  Standar .  Depok:  Balai  Pengembangan  Mutu Benih Tanaman Pangan dan Hortikultura, Direktorat Perbenihan, Dirjen Bina Produksi Tanaman Pangan.
Copeland,  L.  O.  &  McDonald,  M.  B.  2001. Seed  Science  and  Technology . London: Kluwer Academic Press.
Fatmawati,  L.  I.,  Suharsi,  T. K.  &  Qadir,  A. 2018.  Uji  tetrazolium  pada benih kecipir  (Psophocarpus  tetragonolobus  (L.)  DC.)  sebagai  tolok  ukur viabilitas.
Gomez,  K.  A  &  Gomez,  A.  A.  1995.  Prosedur  Statistik  untuk  Penelitian Pertanian (ed 2). Penerjemah: E. Sjamsudin & J. S. Baharsjah. Jakarta: UI Press.
ISTA.  2010. International  Rules  for  Seed  Testing .  Switzerland:  International Seed Testing Association.
Jyoti & Malik, C. P. 2013. Seed deterioration (a review). International Journal Life Sciences Biotechnology and Pharma Research, 2(3), 374-385 . Kramer, S. 2011. Relationship between tetrazolium  and germination tests. ISTA Annual Meeting, 13 Juni 2010.
Kulik, M. M & Yaklich, R. W. 1982. Evaluation of vigor tests in soybean seeds :  relationship  of  accelerated  aging,  cold,  sand  bench,  and  speed  of germination tests to field performance. Crop Sciences , 22, 766-770.
Leist,  N.  2004.  Seed  vigour  determination  by  means  of  the  topographical tetrazolium test. Makalah dalam ISTA Seed Quality Assesment Training Organized by APSA, Hanoi, Vietnam, 22-26 November 2004.
Priandoko,  S.  C.  2011.  Pengujian  benih  di  laboratorium.  Diakses  dari http://distan.pemda-diy . go.id/distan11/index.php?option=com_content&view=article&id=8158:p engujian-benih-di-laboratorium&catid=41:artikel&Itemid=514.
Sivasubramaniam,  K  &  Selvarani,  K.  2012.  Viability  and  vigor  of  jamun ( Syzygium cumini ) seeds. Brazilian Journal of Botany, 35(4), 397-400. Sulastrini.  1996.  Laju  respirasi  dan  metabolisme  gula  pada  jagung  manis.
Majalah Ilmiah Teknologi Pertanian , 2(1), 15-17.
Tatipata, A., Yudoyono, P., Purwantoro, A. & Mangoendidjojo, W. 2004. Kajian aspek  fisiologi  dan  biokimia  deteriorasi  benih  kedelai  dalam penyimpanan. Jurnal Ilmu Pertanian , 11(2), 76-87. Widajati, E. et al. 2013. Dasar Ilmu dan Teknologi Benih . Bogor: IPB Press.
a c b d e f
Zanzibar,  M.  2009.  Kajian  metode  uji  cepat  sebagai  metode  resmi  pengujian kualitas benih tanaman hutan di  Indonesia. Jurnal Standardisasi, Badan Standardisasi Nasional, 11(1), 38-45.
Zanzibar,  M  &  Herdiana,  N.  2009.  Akurasi  metode  uji  cepat  dalam  menduga mutu  fisiologis  benih  damar. Jurnal  Penelitian  Hutan  Tanaman ,  7(4), 181-189