# Korespondensi:  Departemen  Akuakultur,  Fakultas  Perikanan dan  Ilmu  Kelautan,  Institut  Pertanian  Bogor.
Jl.    Agatis,  Kampus  IPB  Dramaga,  Bogor,  Indonesia E-mail:  sukenda@apss.ipb.ac.id
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## PROFIL  FARMAKOKINETIK  OKSITETRASIKLIN  PADA  IKAN  LELE,  Clarias  gariepinus DENGAN  INFEKSI  ARTIFISIAL  Aeromonas  hydrophila
Tatik  Mufidah *)# ,  Sukenda *)# ,  Widanarni *) ,  Huda  Shalahudin  Darusman **) ,  dan  Angela  Mariana Lusiastuti ***)
*) Departemen Akuakultur, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor Jl.  Agatis, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680
**) Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor Jl. Agatis  Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680
***) Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan Bogor Jl. Sempur  No. 1, Bogor 16129
(Naskah diterima: 23 Mei 2022; Revisi final: 7 Juni 2022; Disetujui publikasi: 7 Juni 2022)

## ABSTRAK
Oksitetrasiklin banyak digunakan dalam manajemen terapeutik maupun preventif infeksi penyakit bakterial pada akuakultur. Konsentrasi obat yang tepat dalam tubuh penting untuk kemanjuran terapi tidak hanya ditentukan  oleh  dosis  obat  tetapi  juga  farmakokinetik  obat  yang  dapat  diketahui  dari  parameter farmakokinetiknya. Parameter farmakokinetik meliputi waktu paruh, kadar puncak, waktu puncak, volume distribusi, area di bawah kurva (AUC), eliminasi, dan distribusi obat baik dalam keadaan fisiologi maupun patologi.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  parameter  farmakokinetik  dan  waktu  henti  obat (withdrawal time) oksitetrasiklin yang diberikan secara oral pada ikan lele yang diinfeksi dengan Aeromonas hydrophila.  Kondisi  patofisiologi  yang  memengaruhi  mekanisme  kerja  obat  akibat  infeksi A.  hydrophila diketahui dengan pengamatan histologi. Visualisasi keberadaan bakteri A. hydrophila pada organ ikan lele menggunakan imunohistokimia. Konsentrasi obat dalam plasma diukur dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Studi ini mengungkapkan farmakokinetik obat dan waktu henti obat yang berbeda pada ikan sehat/tidak diinfeksi dan sakit/diinfeksi A. hydrophila. Kadar oksitetrasiklin pada plasma ikan sehat 229,00 mg/L dan ikan terinfeksi A. hydrophila 99,16 mg/L yang dicapai pada 1,5 jam setelah pemberian. Area di bawah kurva yang menggambarkan jumlah obat dalam sirkulasi sistemik pada ikan sehat sebesar 943,6 mg.h/L; sedangkan pada ikan sakit sebesar 814,05 mg.h/L. Area di bawah kurva untuk waktu tak terhingga pada  ikan sehat  1.586,42 mg.h/L  dan  1.516,47 mg.h/L.  Waktu  paruh pada  ikan sehat  9,36  jam dan  ikan tidak terinfeksi 9,65 jam. Pengamatan histologi pada organ yang berperan dalam mekanisme obat yaitu hati,  ginjal,  dan  usus  mengalami  kelainan  patologi.  Visualisasi  A.  hydrophila  dengan  imunohistokimia menunjukkan bakteri banyak terlokalisasi dalam lumen pembuluh darah. Waktu henti obat setelah 10 hari pemberian  dengan  dosis  terapeutik  yaitu  20  hari  pada ikan  sehat  dan  30  hari  pada  ikan  sakit.  Sebagai kesimpulan kadar oksitetrasiklin pada plasma ikan sehat lebih besar daripada ikan sakit, dan diikuti dengan perbedaan pada parameter farmakokinetik lainnya dan waktu henti obat yang lebih lama pada ikan sakit.
KATA KUNCI: oksitetrasiklin; farmakokinetik; Aeromonas hydrophila; Clarias  gariepinus; imunohistokimia
ABSTRACT: Pharmacokinetic profile of oxytetracycline in catfish, Clarias gariepinus with Aeromonas hydrophila artificial infection. By: Tatik Mufidah, Sukenda, Widanarni, Huda Shalahudin Darusman, and Angela Mariana Lusiastuti
Oxytetracycline is widely used in the therapeutic and preventive management of bacterial infections in aquaculture. The accurate concentration of drug in the body is important for therapeutic efficacy not only determined by the dose but also the pharmacokinetics of the drug which can be known from its pharmacokinetic parameters. Pharmacokinetic parameters include half-life, maximum concentration, time of maximum concretation, volume distribution, area under
the curve (AUC), elimination, and distribution of the drug in both physiological and pathological conditions. This study aimed to determine the pharmacokinetic parameters and withdrawal time of oxytetracycline administered orally to uninfected and infected catfish infected with Aeromonas hydrophila. Pathophysiological conditions that affect the drug’s mechanism of action due to infection with A. hydrophila by histological observations. Visualization of A. hydrophila bacteria in catfish organs using immunohistochemical assay. The plasma drug concentration was measured by high performance liquid chromatography (HPLC). This study revealed different drug pharmacokinetics parameters and withdrawl time of uninfected and infected fish with A. hydrophila. Oxytetracycline levels in the plasma of the uninfected fish were 229.00 mg/L and 99.16 mg/L in infected fish which were reached 1.5 hours after administration. The area under the curve that describes the amount of drug in the systemic circulation of uninfected fish is 943.6 mg.h/ L, while in infected fish is 814.05 mg.h/L. The area under the curve for infinitive depicting the amount of drug in the systemic circulation in uninfected fish was 943.6 mg.h/L, while in infected fish was 814.05 mg.h/L. Histological observations on the organs that play a role in the drug mechanism, to be specific on the liver, kidney, and intestine showed pathological abnormalities. Visualization of A. hydrophila by immunohistochemistry showed that bacteria were located in the lumen of blood vessels. The withdrawal time of oxytetracycline after 10 days of administration in uninfected and infected fish were 20 and 30 days, repectively. In conclusion, plasma levels of oxytetracycline in uninfected fish were greater than in infected fish and were followed by differences in other pharmacokinetic parameters and longer drug withdrawal times in infected fish.
KEYWORDS: oxytetracycline; pharmacokinetic; Aeromonas hydrophila; Clarias gariepinus; immunohistochemistry
dalam  surat  keputusan  tersebut.  Okstetrasiklin merupakan golongan antibiotik berspektrum luas yang aktif  terhadap  gram  positif  maupun  gram  negatif, aerobik  dan  anaerobik  dengan  mekanisme  kerja bersifat bakteriostatik menghambat sintesis protein bakteri  pada  ribosomnya  (Ganiswara,  2009;  Pérez- Rodríguez  et  al.,  2018).  Dalam  budidaya  perikanan oksitetrasiklin banyak digunakan untuk menanggulangi infeksi penyakit bakterial salah satunya infeksi MAS pada ikan lele.
Tindakan terapi pengobatan pada ikan sakit akan aman dan mendapatkan hasil optimal apabila dilakukan sesuai  aturan  yang  benar.  Peningkatan  akurasi pengobatan  dapat  dijelaskan  melalui  kajian pengukuran konsentrasi obat dalam plasma (plasma level) yang berkorelasi dengan banyaknya obat yang tersedia  dalam  tubuh,  dan  selanjutnya  berkorelasi dengan  kemampuan  obat  yang  lebih  poten. Mekanisme kerja obat pada umumnya terjadi melalui interaksi dengan reseptor pada sel organisme. Obat harus berinteraksi dengan target aksi obat untuk dapat menimbulkan  efek  (Shergel  et  al.,  2012).  Kondisi patologis  akibat  infeksi  penyakit  tentu  saja  akan memengaruhi interaksi  dan menganggu  mekanisme kerja  obat  tersebut.  Dilaporkan  oleh  Al  Yahya  et  al. (2017)  bahwa  pada  ikan  yang  terserang  MAS mempunyai  lesi  patologis  pada  beberapa  organ terutama  hati  dan  ginjal,  hal  ini  tentu  akan memengaruhi  mekanisme,  waktu  paruh  atau pembersihan obat melalui ginjal  (Riviere & Sundlof, 2001) yang akan berbeda dengan ikan sehat dengan fungsi  organ  yang  normal.  Keberadaan  bakteri  A. hydrophila  pada  organ-organ  yang  berperan  dalam proses absorbsi yaitu usus, metabolisme, dan eksresi obat yaitu hati dan ginjal juga perlu diketahui.

## PENDAHULUAN
Penyakit  motile  aeromonas  septicaemia  (MAS) disebabkan oleh infeksi A. hydrophila pada ikan lele menimbulkan  kerugian  ekonomi  pada  perikanan budidaya.  A.  hydrophila  dikenal  sebagai  patogen sekunder yang terkait dengan wabah penyakit, akan tetapi  dapat  menjadi  patogen  utama  yang menyebabkan wabah dengan tingkat kematian tinggi pada  budidaya  ikan  lele  di  seluruh  dunia  (Marinho- Neto  et  al.,  2019;  Xia  et  al.,  2021).  Dewasa  ini pengendalian infeksi A. hydrophila dilakukan dengan vaksinasi,  penggunaan  bahan-bahan  herbal, imunostimulan, probiotik, dan obat-obatan misalnya antibiotik (Sughra, 2021; Mzula et al., 2019).
Penggunaan  bahan-bahan  antibakteri  untuk penanggulangan serangan penyakit bakterial biasanya menggunakan  antibiotik  baik  yang  bersifat bakterisidal  maupun  bakteriostatik.  Penggunaan antibiotik diketahui mampu membunuh patogen dan menjanjikan  kesembuhan  pada  ikan  yang  sedang terinfeksi (Alderman & Hastings, 1998; Cabello, 2006; Teuber,  2001).  Sisi  lain  dari  penggunaan  antibiotik adalah dampaknya pada keamanan produk perikanan, resistensi mikroba dan cemaran lingkungan budidaya. Oleh karena itu, tata laksana penggunaan antibiotik yang tepat, hati-hati dan bertanggung jawab seperti yang tertuang dalam konsensus WHO mengenai anti- microbial  stewardship  (WHO,  2021)  harus  dilakukan untuk meminimalisir dampak yang tidak diharapkan. Pemerintah Indonesia melalui Kementerian Kelautan dan Perikanan mengatur penggunaan antibiotik dalam keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan Republik Indonesia  Nomor  52/KEPMEN-KP/2014  tentang Klasifikasi Obat Ikan. Oksitetrasiklin merupakan salah satu  antibiotik  yang  diperbolehkan  penggunaannya
Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui parameter farmakokinetik oksitetrasiklin dalam  plasma  ikan  lele  yang  diinfeksi  dengan  A. hydrophila, sehingga dapat dikaji kadar obat yang ada dalam  tubuh  pada  waktu  tertentu,  waktu  yang dibutuhkan untuk mencapai kadar obat yang konstan dalam tubuh selama pemberian obat, maupun waktu yang dibutuhkan tubuh untuk membuang obat setelah asupan obat dihentikan. Informasi farmakokinetik obat pada ikan sehat maupun ikan sakit tersebut diharapkan dapat menentukan rekomendasi suatu obat maupun bahan  kimia  terapeutik  untuk  terapi  penyakit  ikan sehingga dapat menjadi  model metode pengobatan yang poten, efisien, dan aman bagi produk perikanan dan  pada  akhirnya  akan  meningkatkan  produksi budidaya.

## BAHAN DAN METODE

## Ikan Uji
Ikan uji  yang digunakan  adalah ikan  lele (Clarias gariepinus)  yang  telah  diaklimatisasi  selama  dua minggu dan telah memenuhi asumsi spesifik pathogen free (SPF). Ukuran ikan uji 14-18 cm dengan bobot 20- 22 g yang diperoleh dari pembudidaya di daerah Bogor. Parameter  kualitas  air  disesuaikan  dengan  SNI  01- 7241-2006 yaitu pemeliharaan ikan pada suhu 25°C- 30°C;  pH  6,5-8,5;  oksigen  terlarut  (dissolved  oxygen/ DO) pada 2 mg/L. Setiap minggu dilakukan penggantian air 30% dan penyiponan untuk membuang sisa pakan dan kotoran.

## Isolat  Bakteri
Isolat  bakteri  yang  digunakan  adalah  koleksi Instalasi Riset Pengendalian Penyakit Ikan Depok, Balai Riset  Perikanan Budidaya  Air  Tawar dan  Penyuluhan Perikanan Bogor dengan kode MH3. Pembuatan isolat bakteri  dilakukan  dengan  menumbuhkan  bakteri selama  24  jam  dalam  media  tryptic  soy  agar  (TSA) dengan inkubasi 24 jam, selanjutnya diambil sebanyak satu  koloni  terpisah  dan  ditumbuhkan  pada  10  mL media cair (tryptic soy broth/TSB). Biakan pada media cair bakteri A. hydrophila kemudian diinkubasi dalam incubator shaker selama 24 jam pada suhu ruang. Biakan bakteri kemudian dicuci tiga kali dengan salin melalui sentrifugasi  pada  kecepatan  4.000  rpm  selama  10 menit.

## Infeksi  Buatan  A.  hydrophila  dan  Rute Pemberian Obat
Ikan uji C. gariepinus dibagi menjadi dua kelompok, pada kelompok pertama sebanyak 300 ekor ikan lele digunakan  untuk  untuk  analisis  parameter farmakokinetik.  Kelompok  kedua  merupakan kelompok untuk pengamatan pengukuran withdrawal
time  dan  survival  rate  (SR).  Pada  kelompok  dua, penelitian dilakukan dengan tiga perlakuan dan tiga kali ulangan. Infeksi A. hydrophila pada kedua kelompok ikan uji dilakukan dengan injeksi isolat bakteri aktif secara intra muskular. Injeksi dilakukan dengan dosis 0,1  mL  dan  konsentrasi  bakteri  sebanyak  10 9 CFU/mL.
Oksitetrasiklin komersial (400 mg oksitetrasiklin dalam 1 g produk) diberikan sebagai dosis tunggal 50 mg oxytetrasiklin/kg BB (Hughes, 2003) pada kelompok satu.  Pemberian  obat  oral  dilakukan  dengan mencampur  sediaan  obat  dengan  air  kemudian diberikan  melalui  metode  oral  dengan  gavage. Pemberian oksitetrasiklin pada  ikan sakit dilakukan pada 24 jam setelah infeksi buatan dan terlihat gejala klinis dan kelainan patologis. Pada kelompok dua Oxy- San dosis 50 mg oxytetrasiklin/kg BB diberikan secara oral  dengan  dengan  dicampur  pakan  dan  diberikan selama 10 hari sesuai aturan pada etiket obat.

## Koleksi  Sampel
Analisis  profil  farmakokinetik  dilakukan  sesuai metode yang dikembangkan oleh Intorre et al. (2000) dan Hughes (2003) dengan modifikasi. Dari masing- masing perlakuan sebanyak 10 ekor ikan dianestesi kemudian diambil sampelnya. Koleksi sampel plasma ikan dilakukan pada 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2; 4; 6; 8; dan 12 jam untuk mengetahui profil farmakokinetik. Param- eter farmakokinetik yang akan dianalisis yaitu area di bawah  kurva  (area  under  curve/AUC)  baik  AUC  total (AUCtot) dan AUC waktu tak terbatas (AUC infinitive/ AUCinf)  yang  menunjukkan  konsentrasi  obat  dalam plasma terhadap waktu pada fase absorbsi obat, waktu paruh  (half-life/T 1/2 ),  volume  distribusi  (Vd)  (mL), klierens (clearance/Cl), konsentrasi maksimal (Cmax), waktu maksimal (Tmax), dan tetapan laju eksresi (ke). Koleksi sampel plasma dilakukan dengan mengambil darah ikan sebanyak 0,3 mL dari arteri kaudal dengan jarum yang telah mengandung heparin. Sampel darah disentrifugasi pada 3.000 rpm selama 10 menit. Plasma kemudian  dikoleksi  dan  disimpan  pada  suhu  -20°C sampai diuji (Hughes, 2003). Koleksi sampel otot ikan lele untuk mengetahui withdrawal time dimulai pada hari terakhir pemberian OTC (hari ke-0) sampai hari ke-2;  4;  6;  8;  10;  12;  14;  17;  20;  25;  35  setelah penghentian pemberian OTC (Hughes, 2003). Untuk pemeriksaan  histologi  dan  imuno-histokimia dilakukan koleksi jaringan ginjal, hati, dan usus yang disimpan pada buffer paraformaldehyde 4%.

## Histologi
Sampel  organ  yang  telah  disimpan  dalam  buffer neutral  formalin  (BNF)  10%  untuk  kemudian  dibuat preparat histopatologi. Prosedur pemeriksaan dengan histopatologi dilakukan dengan pemotongan jaringan
(trimming) dengan ketebalan jaringan 5 mm. Pembuatan preparat histopatologi  selanjutnya dilakukan  sesuai metode  baku  dengan  pewarnaan  (staining)  Mayer- Haematoxyliln-eosin (H&E). Pemeriksaan lesi jaringan ikan dilakukan dengan mikroskop.

## Imunohistokimia  Bakteri  A.  hydrophila
Pewarnaan  imunohistokimia  dilakukan  untuk mendeteksi  sel  bakteri  A.  hydrophila  menggunakan serum hiperimun kelinci yang telah diimunisasi bakteri A.  hydrophila  (serum  koleksi  Instalasi  Riset Pengendalian  Penyakit  Ikan,  Balai  Riset  Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan (BRPBATPP), Bogor. Metode yang digunakan mengacu pada metode standar pengujian  imunohistokimia  pada  Pusat  Studi  Satwa Primata,  Institut  Pertanian  Bogor  (IPB);  dengan modifikasi metode yang dikembangkan oleh Adams & de Mateo (1994) dan Mahrous et al. (2020).
Slide  potongan  jaringan  dalam  parafin  terlebih dahulu dideparafinisasi, rehidrasi, dan direndam dalam akuades  selama  tiga  menit.  Selanjutnya  selama  30 menit dilakukan blocking endogenous peroksidase dalam etanol. Inkubasi dengan background sniper selama 30 menit pada suhu 37°C dilakukan untuk mengikat pro- tein non-spesifik. Selanjutnya slide diinkubasi dengan serum normal 10% selama 30 menit pada suhu 37°C. Slide kemudian diinkubasi dengan tripsin 0,2% dalam CaCl 2 selama 120 menit pada suhu ruang dan kemudian ditetesi  dengan  antibodi  pertama  yaitu  serum hiperimun dari kelinci dengan pengenceran 1:500 dan diinkubasi  semalaman  pada  suhu  4°C,  selanjutnya antibodi  kedua yaitu  anti  rabbit  biotinilated  antibody diaplikasikan  selama  30  menit  pada  suhu  37°C  dan dilanjutkan  inkubasi  dengan  Streptavidin  horseradish peroxsidase.  Pada  setiap  pergantian  langkah  dibilas dengan PBS 3x.

## Prosedur  Kromatografi Cair  Kinerja  Tinggi
(KCKT)/High  Performance  Liquid  Chromatography

## (HPLC)
Ekstraksi  sampel  plasma  dilakukan  menurut prosedur  yang  dikembangkan  oleh  Hughes  (2003), plasma dicairkan kemudian difiltrasi dengan tabung MPS  micropartition  (Millipore,  Bedford,  MA)  yang dilengkapi  membran  dispossable  ultrafiltration  YMT dengan cut off 3000 MW (Amicon, Inc., Beverly, MA) dan disentrifugasi pada 14.000 x g selama 40 menit (Thermo Scientific, CL10 Centrifuge). Ultrafiltrat dari sampel  (20  µL)  kemudian  disuntikkan  langsung  ke kolom HPLC.
Ekstraksi  senyawa  dari  jaringan  otot  dilakukan dengan homogenisasi 1 g jaringan otot yang dicairkan di dalam 4 mL buffer HPLC kemudian disonikasi selama 10 detik pada 20 kHz. Larutan kemudian disentrifugasi
pada  2.000  x  g  selama  15  menit,  supernatan dikumpulkan  dan  disaring  dengan  filter  0,45  µm kemudian disimpan pada -20°C untuk analisis HPLC. Kolom yang digunakan adalah Hypersil 3 mikron C- 18,  150  mm  x  4,6  mm  ID  (Phenomenex,  Torrance, CA). Sistem HPLC terdiri atas unit kromatografi GBC scientific instruments yang dilengkapi dengan injektor sampel manual dan 126 solvent delivery modul (GBC). Efluent HPLC dianalisis dengan detektor panjang 355 nm, fase gerak (pH 3,3) adalah campuran 70:30 dari fase  gerak  aqueous  (asam  oksalat  0,01M  dan  garam natrium asam oktan sulfonat 0,03M) dan fase gerak organik (asetonitril) (Meinertz et al., 1998). Campuran ini disimpan dalam wadah tertutup dan diaduk untuk mencegah pemisahan fase. Laju aliran adalah 1,5 mL/ menit, dengan masing-masing sampel berjalan sekitar 10 menit.
Data diproses oleh perangkat lunak Winchrome. Konsentrasi  standar  oksitetrasiklin  yang  digunakan 0,05-50,0 g/mL untuk menetapkan garis regresi dan menghitung  konsentrasi  OTC  yang  tidak  diketahui. Kurva regresi kalibrasi ditolak jika kurang dari 0,995. Untuk  mengetahui  waktu  yang  dibutuhkan  untuk mengurangi  konsentrasi  obat  dalam  plasma  atau jumlah total dalam tubuh sebesar 50% (waktu paruh/ T 1/2 ), dipergunakan rumus perhitungan:

## Analisis  Data
Konsentrasi oksitetrasiklin pada plasma dan otot diperoleh dari kromatogram yang dijabarkan sebagai grafik  konsentrasi  versus  waktu,  parameter farmakokinetik  dihitung  dengan  model  satu kompartemen dan AUC oksitetrasiklin dalam plasma ditentukan menggunakan metode trapesium (Shargel et al., 2012).

## HASIL DAN BAHASAN
Hasil pengamatan histologi  terlihat lesi patologi pada organ ginjal, hati, dan usus ikan sakit, sedangkan pada ikan sehat menunjukkan tampak normal dengan vena sentral dan morfologi sel yang utuh (Gambar 1). Pada ikan sakit kongesti pembuluh darah besar tampak pada organ ginjal dan hati, infiltrasi multifokal sel-sel radang mononuklear pada area parenkim terjadi pada ginjal sedangkan mayoritas sel hepatosit mengalami degenerasi. Pada pada multifokal area mukosa usus juga terdapat infiltrasi sel radang mononuklear dan agregasi sel darah di sekitar pembuluh darah. Gupta et al. (2018) dan Biswas et al. (2021) menyatakan bahwa jaringan ginjal dari ikan yang terinfeksi A. hydrophila menunjukkan degenerasi tubulus ginjal, sel nekrotik dalam jaringan hematopoietik, dan adanya ruang si-
Ke 693 0 T 2 1 . / 
nusoid,  lebih  lanjut  mengakibatkan  nekrosis, hipertrofi, dan degenerasi glomerulus dan peningkatan ruang Bowman.
Salah satu tujuan pewarnaan imunohistokimia yang dilakukan  adalah  untuk  mengetahui  visualisasi  A. hydrophila yang terdistribusi pada organ ginjal, hati, dan usus ikan uji. Hasil pewarnaan imunohistokimia dapat  dilihat  pada  Gambar  2.  Visualisasi imunohistokimia  terlihat  bahwa  A.  hydrophila menyebar ke organ hati, ginjal, dan usus.
Visualisasi  A.  hydrophila  pada  ikan  terinfeksi terutama  pada  organ  ginjal  dan  hati  tampak berhubungan dengan pembuluh darah, area nekrotik dan rongga tubuh. Setelah injeksi IM pada awal infeksi
A. hydrophila berada dalam lumen pembuluh darah dan dengan cepat mengikuti aliran darah menyebar secara sistemik ke organ target. Hal tersebut menyebabkan kondisi bakteremia yang cepat, yang terdeteksi pada organ hati, usus, dan ginjal, kolonisasi jaringan dan hubungan langsung antara keberadaan A. hydrophila dan  perkembangan  lesi  yang  tampak  dari  hasil pengamatan histologi. Lebih lanjut Cosceli et al. (2014) menjelaskan  bahwa  kerusakan  pembuluh  darah kemungkinan  disebabkan  oleh  nekrosis  jaringan akibat hipoksia seluler, serta kerusakan langsung yang disebabkan oleh toksin dan enzim yang disekresikan oleh patogen. Penelitian pada ikan rainbow trout yang diinfeksi buatan oleh A. salmonicida, hasil pewarnaan dengan  imunohistokimia  menunjukkan  pola  yang
Gambar 1. Pewarnaan HE pada beberapa organ ikan uji (pembesaran 40x). (a) hati ikan sehat tampak normal;  (b)  organ  hati  ikan  sakit,  panah  menunjukkan  sel-sel  hepatosit  mengalami degenersi; (c) ginjal ikan sehat terlihat glomeruli dan tubulus ginjal utuh; (d) ginjal ikan sakit [tanda panah menunjukkan infiltrasi multifokal sel-sel radang mononuklear, tanda * menunjukkan  kongesti  pada  pembuluh  darah];  (e)  usus  ikan  sehat;  (f)  usus  ikan  sakit, terlihat infiltrasi sel radang.
Figure 1. HE staining on several experimental fish organs (40x magnification). (a) liver of healthy fish looks normal, (b) liver of the infected fish, arrows show degeneration on hepatocyte cells; (c) he kidneys of  healthy  fish  show  glomeruli  and  intact  renal  tubule;  (d)  diseased  fish  kidney  [arrows  show multifocal infiltration of mononuclear inflammatory cells, * indicates congestion of blood vessels]; (e) healthy fish intestines; (f) intestine of infected fish, showed infiltration of inflammatory cells.
serupa, yaitu sebaran patogen cenderung berhubungan dengan pembuluh darah dan area nekrotik.
Nilai  sintasan  (SR)  pada  ikan  uji  menunjukkan adanya perbedaan nyata (P<0,05) pada ikan sakit yang diobati dengan ikan sakit yang tidak diobati (Gambar 3). Nilai SR tertinggi didapatkan pada ikan sehat yang tidak diinfeksi sebesar 99,44 ± 0,96; sedangkan nilai SR untuk ikan sakit tidak diobati dan ikan sakit yang diobati masing-masing 40,67 ± 0,839 dan 69,41 ± 0,89.

## Parameter  Farmakokinetik
Hasil pengukuran konsentrasi oksitetrasiklin pada plasma ikan lele setelah pemberian oksitetrasiklin 50 mg/kg secara oral dapat dilihat pada Gambar 4.
Parameter  farmakokinetik  yang  menggambarkan laju absorbsi obat adalah konsentrasi maksimal (Cp max ), waktu  mencapai  konsentrasi  maksimal  (t max ),  dan tetapan  laju  absorbs  (ka).  Waktu  untuk  mencapai konsentrasi maksimal (t max ) oksitetrasiklin adalah 1,5 jam setelah pemberian secara oral yang menunjukkan rata-rata  laju  absorbsi  obat.  Cp max untuk  ikan  sehat (229,00 mg/L) lebih tinggi daripada hewan sakit (99,16 mg/L).  t max tidak  tergantung  pada  dosis  tetapi  pada tetapan absorbsi dan eliminasi, demikian pula Cp max dan AUC (Shergel et al, 2012). Cp max ikan sehat lebih tinggi diikuti nilai AUC tot dan AUC ” yang lebih tinggi hal  ini  berarti  konsentrasi  obat  pada  plasma  lebih besar pada ikan yang sehat.
Gambar 2. Uji imunohistokimia A. hydrophila pada beberapa organ ikan lele. Figure 2.
Immunohistochemichal assay of A. hydrophila in several organs of catfish.
Keterangan: (a) ginjal ikan sehat; (b) ginjal ikan sakit,  A.  hydrophila pada  jaringan ekstraseluker [tanda panah menunjukkan bakteri A. hydrophila (Ah) terlihat difagositosis]; (c) hati ikan sehat; (d) hati ikan terinfeksi A. hydrophila; (e) usus ikan sehat; (f) usus ikan terinfeksi A. hydrophila, terlihat koloni A. hydrophila pada villi usus dan terjadi fagositosis
Description: (a)  kidney  of  healty  fish;  (b)  kidney  of  infected  fish,  A.  hydrophila  in  extracellular  tissue [arrows  indicate phagocytosed  A. hydrophila  (Ah)];  (c)  liver  of  healty  fish;  (d)  the  liver  of infected  fish;  (e)  intestine  of  healty  fish;  (f)  intestine  of  infected  fish,  phagocytosis  and colonies of A. hydrophila seen in  intestinal villi
AUC  merupakan  parameter  farmakokinetik  yang menggambarkan  besarnya  obat  mencapai  sirkulasi sistemik (Shergel et al., 2012). Rigos & Smith (2015); Shergel et al. (2012); dan Hughes (2003) menyatakan ketika  ikan  sakit,  dinamika  aliran  darah  dan  fungsi jaringan  dapat  berubah  sehingga  penyerapan  dan distribusi  obat  berubah  dibandingkan  dengan  ikan sehat. Uno (1996) mendapatkan hasil bahwa nilai AUC
pada Plecoglossus altivelis sehat lebih tinggi dibanding yang  terinfeksi  vibrio.  Lebih  lanjut  Hughes  (2003) melaporkan  pemberian  oksitetrasiklin  secara  intra muskular pada Paralichthys dentatus sehat memiliki nilai AUC  yang  lebih  tinggi  dibanding  yang  sakit,  hal tersebut  terjadi  karena  penurunan  daya  serap  obat pada  usus  diakibatkan  kerusakan  oleh  bakteri  atau toksinnya.
Keterangan: K-: kontrol negatif (ikan sehat dan tidak diberi oksitetrasiklin; K+: ikan diinfeksi A. hydrophila tanpa diobati oksitetrasiklin; OTC: ikan sakit dengan pengobatan oksitetrasiklin. (Superskrip yang berbeda menunjukkan perbedaan nyata) Notes: K-:  negative  control  (healthy  fish  and  no  oxytetracycline administered;  K+:  infected  fish  without  oxytetracycline administered; OTC: infected fish with oxytetracycline administered
(different  superscripts  show  significant  differences) a c b 0 40 80 120 K- K+ OTC Pe rs en ta se s in ta sa n Pe rc en ta g e of s ur vi va l ra te ( % ) Perlakuan (Treatments) Gambar 3. Sintasan ikan uji. Figure 3. Survival rate of experimental fish. 0 50 100 150 200 250 0 2 4 6 8 10 12 14 K o n se n tr as i OT C p la sm a
O T C p la sm a co nc en tr at io n (m g /L )/ Jam (Hours) Ikan sehat (Healthy fish) Ikan sakit (Infected fish)
Gambar 4. Konsentrasi oksitetrasiklin pada plasma ikan lele sehat dan sakit dengan pemberian per oral 50 mg/kg BB.
Figure 4. Concentration of oxytetracycline in plasma of healthy and infected fish with oral administration of 50 mg/kg BW.
Cp max pada  ikan  sehat  lebih  besar  menunjukkan obat banyak terdistribusi pada jaringan intravaskular yang  ditunjukkan  dengan  nilai  V d yang  lebih  kecil (0,0786 mL) dibanding V d ikan sakit (0,0922 mL). Pada ikan sakit V d lebih besar  kemungkinan obat  banyak terpusat pada jaringan ekstravaskuler misalnya pada perifer dan organ, dan sedikit dalam intravaskuler. Hal ini menunjukkan bahwa dosis obat yang lebih tinggi diperlukan  untuk  mencapai  konsentrasi  plasma tertentu.  Obat  dengan  V d rendah  memiliki kecenderungan untuk tetap berada dalam plasma yang berarti dosis obat yang lebih rendah diperlukan untuk mencapai konsentrasi plasma tertentu. Tetapan laju ekskresi  ikan  sehat  0,0738  per  jam  dan  ikan  sakit sebesar  0,0718  per  jam,  nilai  ke  didapatkan  dari kemiringan  (slope)  kurva  plasma  terhadap  waktu. Waktu  paruh  oksitetrasiklin  pada  ikan  sakit dibandingkan dengan  ikan sehat hampir  sama pada (masing-masing 9,39 jam dan 9,65 jam). Waktu paruh merupakan bilangan konstan,  tidak tergantung dari besarnya  dosis,  interval  pemberian  maupun  cara pemberian.  Akan  tetapi  dipengaruhi  oleh  absorpsi, metabolisme  dan  ekskresi  (Setiawati,  2012).  Waktu paruh  merupakan  parameter  farmakokinetik  yang penting  karena  dapat  memberikan  dasar  untuk perhitungan  dosis  pada  pemberian  berulang. Sedangkan klirens yang merupakan ukuran eliminasi obat pada tubuh, pada ikan sehat sebesar 0,0058 mL/ h dan 0,0066 mL/h pada ikan sakit. Eliminasi obat pada tubuh  merupakan  proses  yang  disebabkan  oleh metabolisme maupun eksresi obat melalui ginjal dan rute lain (Shergel et al., 2012). Retensi dan eliminasi obat  tertunda  pada  ikan  yang  sakit  terjadi  sebagai akibat  dari  status  fisiologis  ikan  yang  sakit.  Param- eter ini menunjukkan bahwa OTC dapat bertahan lebih
lama pada ikan yang sakit daripada ikan yang sehat. Keseluruhan  laju  absorbsi  sistemik  obat  dari  suatu bentuk  sediaan  padat  yang  diberikan  per  oral mencakup sejumlah proses laju, termasuk pelarutan obat, motilitas saluran cerna, aliran darah, dan transpor obat  melewati  membran  kapiler  ke  dalam  sirkulasi sistemik.  Absorbsi  oksitetrasiklin  akan  menurun apabila  bereaksi  dengan  kation  seperti  Ca2+  dan Mg2+ dalam air karena mengakibatkan ikatan yang irreversibel. Martínez-Álvarez (2002) menyatakan bahwa ikan air tawar memiliki kadar air dalam otot yang lebih tinggi daripada ikan air laut, yang dapat memengaruhi aliran darah otot, kelarutan obat, dan distribusi obat.
Pengujian waktu henti obat pada ikan uji dilakukan untuk mengetahui keamanan daging ikan lele untuk dikonsumsi  setelah  pemberian  oksitetrasiklin. Penghitungan  waktu  henti  obat  dilakukan  dengan menambahkan rentang waktu 25% ketika konsentrasi obat dalam jaringan turun  di bawah batas toleransi minimal (minimal tolerance limit (MTL)) sesuai dengan standar The European Agency for the Evaluation of Me- dicinal  Products  (EAEMP)  (Gambar  5).  Waktu  henti obat pada pemberian dosis tunggal per oral OTC 50 mg/kg bobot badan dalam  menunjukkan ikan sehat memiliki perkiraan waktu henti obat 20 hari dan ikan sakit memiliki waktu henti obat yang lebih lama yaitu 30  hari  (Tabel  2).  Standar  waktu  henti  obat oksitetrasiklin pada ikan lele adalah 21 hari (EAEMP, 1996). Pada penelitian ini waktu henti obat pada ikan lele sakit lebih lama, hal ini bisa disebabkan karena kondisi  patofisiologi  organ  akibat  infeksi  A. hydrophila.  Di  samping  itu,  oksitetrasiklin  dikenal mudah larut lemak dan tidak polar sehingga meskipun diberikan dalam dosis rendah akan tetap diserap dan memerlukan waktu henti agar obat dapat hilang.
Keterangan: Cp max : konsentrsi maksimal; t max : waktu untuk mencapai konsentrasi maksimal; AUC tot : total area di bawah kurva; AUC ” : area di bawah kurva untuk waktu tak terhingga (infinitive); T 1/2 : waktu paruh; Vd: volume distribusi; Cl: klirens; ka: tetapan laju absorbsi; ke: tetapan laju eliminasi
Note: Cpmax:  maximum  concentration;  t max :  time  to  reach  maximum  concentration;  AUC tot :  total  area  under  the curve; AUC ” : area under the curve for infinitive time; T 1/2 : half-life; Vd: volume distribution; Cl: clearance; ka: absorption  rate  constant;  ke:  elimination  rate  constant
Tabel 1. Profil  parameter  farmakokinetik  oksitetrasiklin  pada  ikan  lele,  C.  gariepinus  sehat  dan sakit pada pemberian per oral 50 mg/kg BB
Table 1. Pharmacokinetic  parameters  of  oxytetracycline  in  healthy  and  infected  C.  gariepinus  on  oral administration of 50 mg/kg BW
Cp max (mg/L) t max (h) AUC tot (mg.h/L) AUC ? (mg.h/L) T 1/2 (h) V d (mL) Cl (mL/h) k a (h -1 ) k e (h -1 ) Sehat (Healthy ) 229.00 1.5 943.60 1,586.42 9.39 0.0786 0.0058 7.91 0.0738 Sakit (Infected ) 99.16 1.5 814.05 1,516.47 9.65 0.0922 0.0066 1.91 0.0718
Ikan Fish Parameter (Parameters )
Infeksi  A.  hydrophila  mengakibatkan  kondisi patofisiologis yang membawa pengaruh pada absorbsi, biotransformasi, metabolisme maupun ekskresi obat. Absorbsi suatu obat bergantung pada sifat fisika kimia obat,  sifat  produk  obat,  anatomi,  dan  fisiologi  site obat  (Shergel  et  al.,  2012).  Biotransformasi  dan metabolisme  obat  merupakan  proses  di  mana  obat diubah  secara  kimia  dalam  tubuh  menjadi  suatu metabolit  dengan  menggunakan  enzim-enzim  yang berada dalam organ hati, ginjal maupun usus. Ginjal dan hati merupakan organ utama dalam eliminasi, dan ginjal juga berperan dalam eksresi obat. Mekanisme absorbsi  obat  terjadi  melalui  disfusi  pasif  yang dipengaruhi oleh pKa obat, pH tempat absorbsi, dan fraksi obat yang tidak terionkan. Hal-hal yang dapat memperlambat atau mempercepat perpindahan obat dari tempat absorbsi ke dalam sirkulasi sistemik akan memengaruhi laju absorbsi obat, misalnya kecepatan
Gambar 5. Konsentrasi  oksitetrasiklin  pada  otot  setelah  hari  terakhir  pengobatan (garis hitam tebal mewakili batas toleransi maksimal (maximum tolerance limit (MTL)) oksitetrasiklin 2 mg/L pada otot oleh FDA (FDA, 2022).
Figure 5.
Oxytetracycline concentration after last day administration, the thick black line represents maximum tolerance limit (MTL) of oxytetracycline 2 ppm in the muscle by FDA (FDA, 2022).
Tabel 2. Withdrawal time oksitetrasiklin pada ikan lele dengan dosis 50 mg/kg per oral
Table 2. Withdrawal time of oxytetracycline in catfish with a dose of 50 mg/kg orally 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 10 12 14 16 18 20 22 24 27 30 35 40 45 K o n se n tr as i OT C pa da o to t O T C c on ce nt ra ti on i n m us cl es Waktu (hari) Time (days) Kontrol Sehat Sakit MTL
penggosongan lambung (apabila tempat absorbsinya pada  saluran  cerna)  dan  peningkatan  aliran  darah. Sebaliknya penurunan aliran  darah disebabkan oleh penyakit akan menghambat absorbsi.
Konsentrasi  efektif  minimum  obat  dalam  tubuh penting untuk diketahui agar mendapatkan respons terapeutik  yang  diinginkan.  Dalam  penelitian  ini konsentrasi  oksitetrasiklin  dalam  plasma  setelah pemberian secara oral 50 mg/kg BB pada ikan sehat lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  ikan  terinfeksi  A. hydrophila  dan  masih  dalam  rentang  nilai  MIC  yang efektif untuk pengobatan. Shergel et al. (2012); Binarjo et  al.  (2018)  menyatakan  bahwa  avinitas  obat  lebih baik pada individu dengan fungsi organ yang normal daripada yang sakit, sehingga obat lebih terpusat pada jaringan intravaskuler yang berarti konsentrasi obat dalam  plasma  cukup  banyak.  Oksitetrasiklin merupakan antibiotik yang aktivitasnya bersifat time-

## Perlakuan
Treatments Konsentrasi oksitetrasiklin 2 mg/L di otot (hari) Concentration of 2 mg/L oxytetracycline in muscle (days) Perkiraan waktu henti obat (hari) Withdrawal time estimation (days) Ikan sehat Healthy fish 16 20 Ikan sakit Infected fish 24 30 Kontrol (Control ) 0 0
dependent killing (Craig & Gudmundsson, 1996; Craig, 2007), sehingga lamanya waktu kadar obat bertahan di atas MIC sangat penting untuk kemanjuran terapi (Shergel et al., 2012). Manna et al. (2022); Ali Abadi & Lees  (2000);  dan  Stamm  (1989)  menyatakan  bahwa konsentrasi puncak obat pada plasma harus melebihi nilai  MIC  dengan  faktor  >2  agar  diperoleh  efek pengobatan yang efektif. Julinta et al. (2017); Neowajh et al. (2015); dan Prasad et al. (2013) menentukan bahwa nilai  MIC  oksitetrasiklin  terhadap  A.  hydrophila  dan Aeromonas  sp.  lainnya  sebesar  12,5-500  mL/L.  Hal berbeda dinyatakan oleh British Society for Antimicro- bial Kemoterapi (BSAC, 1991) yang menyarankan bahwa untuk memprediksi hasil terapi akan bermanfaat jika C max plasma  empat  kali  lebih  besar  dari  MIC  yang ditentukan,  meskipun  Rigos  &  Smith  (2015) menyatakan aturan 4:1 ini tidak memiliki validasi.
Terapi oksiterasiklin  pada ikan uji  yang diinfeksi dengan A. hydrophila menunjukkan bahwa pemberian oksitetrasiklin meningkatkan survival rate dengan with- drawal  time  30  hari.  Hal  tersebut  menghindarkan kerugian ekonomi akibat kematian ikan dan setelah melewati withdrawal time ikan aman untuk dikonsumsi.

## KESIMPULAN
Pengobatan  oksitetrasiklin  dengan dosis  50  mg/ kg  bobot  badan  mampu  meningkatkan  survival  rate ikan  sakit  sebesar  69,41  ±  0,89%.  Pemberian oksitetrasiklin dengan dosis 50 mg/kg bobot badan pada ikan sehat dan ikan sakit menunjukkan bahwa kadar obat dalam plasma ikan sehat lebih besar daripada ikan  sakit.  Perbedaan  konsentrasi  oksitetrasiklin dalam  plasma  menunjukkan  bahwa  kondisi patofisiologis berkaitan dengan terganggunya fungsi organ  akibat  infeksi  A.  hydrophila  memengaruhi absorbsi,  metabolisme,  maupun  ekskresi oksitetrasiklin  yang  terlihat  dari  parameter farmakokinetik dan waktu henti obat yang lebih lama pada ikan sakit.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini telah terlaksana dengan sumber dana dari Badan Riset dan Sumber Daya Manusia Kelautan dan Perikanan, Kementerian Kelautan dan Perikanan, Penulis  mengucapkan  terima  kasih  atas  kerja  sama dalam pelaksanaan kegiatan penelitian kepada Bapak Ahmad Wahyudi, Setiadi, Edy Farid Wadjdy, dan Johan Afandi.

## DAFTAR  ACUAN
Adams,  A.  &  de  Mateo,  M.M.  (1994).  Immunohis- tochemical detection of fish pathogens. Chapter 14, Techniques in Fish Immunology. Stolen, J.S., Fletcher,  T.C.,  Rowley,  A.F.,  Anderson,  D.P.,
Kaattari,  S.L.,  Zelikoff,  J.T.,  &  Smith,  S.A.  (Eds.). New Jersey: SOS Publications, Fair Haven, 07704- 3303, 3, 133-144.
Alderman, D.J. & Hastings, T.S. (2003). Antibiotic use in aquaculture:  Development of  antibiotic resis- tance-potential  for  consumer health  risks.  Inter- national  Journal  of  Food  Science  &  Technology,  33, 139-155.  DOI:10.1046/j.1365-2621.1998. 3320139.x.
Ali Abadi, F.S. & Lees, P. (2000). Antibiotic treatment for  animals:  effect  on  bacterial  population  and dosage  regimen  optimisation.  Int.  J.  Antimicrob. Agents, 14(4), 307–313.
Al  Yahya,  S.A.,  Ameen,  F.,  Al-Niaeem,  K.S.,  Al-Sa’adi, B.A.,  &  Mostafa,  A.A.  (2017).  Histopathological studies of experimental Aeromonas hydrophila in- fection  in  blue  tilapia,  Oreochromis  aureus.  Saudi Journal of Biological Sciences, https://doi.org/10.1016/ j.sjbs.2017.10.019.
BSAC.  (1991)  A  guide  to  sensitivity  testing.  Report of  the  Working  Party  on  Antibiotic  Sensitivity Testing  of  The  British  Society  for  Antimicrobial Chemotherapy.  Journal  of  Antimicrobial  Chemo- therapy, 23(Suppl D), 1-47.
Cabello, F.C. (2006). Heavy use of prophylactic antibi- otics in aquaculture: A growing problem for hu- man and animal health and for the environment. Environmental  Microbiology,  8,  1137-1144.  http:// dx.doi.org/10.1111/j.1462-2920.2006.01054.x.
Craig, W. (2007). Pharmacodynamics of antimicrobi- als: general concepts and applications. In: Night- ingale, C., Ambrose, P., Drusano, G., & Murakawa, T. (Eds.). New York: Antimicrobial Pharmacodynam- ics in Theory and Clinical Practice, Informa Health Care, p. 1-20.
Craig, W. & Gudmundsson, S. (1996). Post-antibiotic effect. In: Lorian, V (Ed.). Baltimore, MD: Antibi- otics  in  Laboratory  Medicine,  Williams  and Wilkins, p. 296-329.
FDA.  (2022).  Food and  drug  administration  Depart- ment of Health and Human Services. Subchapter E: Animal drugs, feeds, and related products, tol- erances for residues of new animal drugs in food. part 556.
Ganiswara,  S.G.  (2009).  Farmakologi  dan  Terapi. Edisi 5. Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran, Universitas  Indonesia.
Hughes, K.P. (2003). Pharmacokinetic studies and tissue residue analysis of oxytetracycline in summer flounder (Paralichthys dentatus) maintained at different pro- duction salinities and states of health. Dissertation.
Faculty of Veterinary Medicine Virginia Polytech- nic Institute and State University. p. 98-142.
Intorre, L., Cecchini, S., Bertini, S., Cognetti-Varriale, A.M.,  Soldani,  G.,  &  Mengozzi,  G.  (2000).  Phar- macokinetics  of  enroûoxacin  in  the  seabass (Dicentrarchus labrax). Aquaculture, 182, 49-59.
Julinta,  R.,  Roy,  A.,  Singha,  J.,  Abraham,  T.,  &  Patil, P.K.  (2017).  Evaluation of  efficacy  of  oxytetracy- cline  oral  and  bath  therapies  in  nile  tilapia, Oreochromis niloticus against Aeromonas hydrophila infection. International Jurnal of Current Microbiol- ogy. Appl. Sci., 6, 62-76. https:// doi.org/10.20546/ ijcmas.2017.607.008.
Mahrous,  K.F.,  Mabrouk,  D.M.,  Aboelenin,  M.M.,  El- Kadir,  H.A.M.A.,  Younes,  A.M.,  Mahmoud,  M.A., & Hassanane, W.S. (2020). Molecular characteriza- tion and immunohistochemical localization of ti- lapia piscidin 3 in response to Aeromonas hydrophila infection in nile tilapia. J. Pep. Sci., e3280. https:/ /doi.org/10.1002/psc.3280.
Manna, S.K., Das,  N., Sarkar, D.J., Bera,  A.K., Baitha, R., Nag, S.K., Das, B.K., Kumar, A., Ravindran, R., Krishna,  N.,  &  Patil,  P.K.  (2022).  Pharmacokinet- ics, bioavailability and withdrawal period of anti- biotic  oxytetracycline  in  catfish  Pangasianodon hypophthalmus. Environmental Toxicology and Phar- macology,  89,  103778.  https://doi.org/10.1016/ j.etap.2021.103778.
Marinho-Neto,  F.A.,  Claudiano,  G.S.,  Yunis-Aguinaga J.,  Cueva-Quiroz,  V.A.,  Kobashigawa  K.K.,  Cruz, N.R.N., Moraes, F.R., & Moraes, J.R.E. (2019). Mor- phological,  microbiological  and  ultrastructural aspects  of  sepsis  by  Aeromonas  hydrophila  in Piaractus  mesopotamicus.  PLOS  ONE  |  https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0222626.
Mzula, A., Wambura, P.N., Mdegela, R.H., & Shirima, G.M. (2019). Current state of modern biotechno- logical-based  Aeromonas  hydrophila  vaccines  for aquaculture: A systematic review. Bio. Med. Research International,  Article ID  3768948,  11 pp.  https:// doi.org/10.1155/2019/3768948.
Neowajh, S., Hossain, M.M.M., Kholil, I., Mona, S.N., Islam,  S.,  &  Kabi,  M.,  (2015).  Potentiality  of  se- lected  commercial  antibiotics  challenged  with Aeromonas sp. (https://). Immunol. Infect. Dis., 3(2), 11-15. https://doi.org/10.13189/ iid.2015.030201.
Prasad,  V.G.N.V.,  Swamy,  P.L.,  Rao,  T.S.,  &  Rao,  G.S., (2013).  Antibacterial  synergy  between  oxytetra- cycline and selected polyphenols against bacterial fish pathogens. Int. J. Vet. Sci., 2(2), 71-74.
Rigos, G. & Smith, P. (2015). A critical approach on pharmacokinetics,  pharmacodynamics,  dose optimisation  and  withdrawal  times  of  oxytetra- cycline  in  aquaculture.  Reviews  in  Aquaculture, 7, 77–106. doi: 10.1111/raq.12055.
Riviere, J.E. & Sundlof, S.F. (2001). Chemical residues in tissues of food animals. In: Adams, H.R. (Ed.). Veterinary  Pharmacology  and  Therapeutics,  8th edition,  Iowa  State.  University  Press,  Ames,  IA, Ch. 58, p. 1166-1174.
Pérez-Rodríguez,  M.,  Pellerano,  R.G.  ,  Pezza,  L.,  & Pezza, H.R. (2018). An overview of the main food- stuff  sample preparation  technologies for  tetra- cycline residue determination. Talanta, 182, 1-21.
Setiawati,  A.  (2012). Farmakokinetik  klinik.  Jakarta: Balai Penerbit FKUI, hlm. 67-69.
Shergel, L., Wu-Pong, S., & Yu, A.B.C. (2012). Applied biopharmaceutics and pharmacokinetics fifth ed. The McGraw-Hill Companies, Inc., p. 3-161.
Stamm, J.M. (1989). In vitro resistance by fish patho- gens to aquacultural antibacterials, including the quinolones difloxacin (A-56619) and sarafloxacin (A-56620). J. Aquat. Anim. Health, 1, 135-141.
Sughra, F., Hafeez-ur-Rehman, M., Abbas, F., Altaf, I., Aslam,  S.,  Ali,  A.K.,  Mustafa,  G.,  &  Azam,  S.M. (2021). Evaluation of oil-based inactivated vaccine against  Aeromonas  hydrophila  administered  to Labeo rohita, Cirrhinus mrigala and Ctenopharyngodon idella at different concentrations: Immune response, immersion challenge, growth performance and histopathology. Aquaculture Re- ports,  21,  100885.  https://doi.org/10.1016/ j.aqrep.2021.100885.
Teuber,  M.  (2001).  Veterinary  use  and  antibiotic  re- sistance.  Current  Opinion  in  Microbiology,  4,  493- 499.  https://doi.org/10.1016/S1369-5274(00) 00241-1.
Uno, K. (1996). Pharmacokinetic study of oxytetracy- cline  in  healthy  and  vibriosis-infected  ayu (Plecoglossus altivelis). Aquaculture, 143, 33-42.
WHO.  (2021).  https://www.who.int/news-room/fact- sheets/detail/antimicrobial-resistance  diakses  17 November 2021.
Xia,  X.,  Liu  G.,  Wu,  X.,  Cui,  S.,  Yang,  C.,  Du,  Q.,  & Zhang, X. (2021). Effects of Macleaya cordata ex- tract on TLR20 and the proinflammatory cytokines in  acute  spleen  injur y  of  loach  (Misgurnus anguillicaudatus) against Aeromonas hydrophila in- fection. Aquaculture, 544, 737105. https://doi.org/ 10.1016/j.aquaculture.2021.737105.