## ISOLASI OLIGOSAKARIDA MADU LOKAL DAN ANALISIS AKTIVITAS PREBIOTIKNYA
(Isolation of Oligosaccharides from Local Honey and Analysis of its Prebiotic Activity)
Umul Karimah 1 *, Yogi Nur Anggowo 1 , Syamsul Falah 1 , dan Suryani 1
1 Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB * Alamat korespondensi: Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut  Pertanian Bogor, Bogor 16680. Telp: 0251-8323166

## ABSTRACT
The objective of this study was to isolate oligosaccharides from local honey of Pulau Sumbawa and province of Kalimantan Timur and to analyze its prebiotic activity in vitro. Oligosaccharides were isolated with activated charcoal adsorption and ethanol treatment. Effectiveness of this method was evaluated by Thin Layer Chromatography and colorimetry. The isolates were then being a sample  to prebiotic examination. Honey from Sumbawa forest has higher oligosaccharides content than honey from Kalimantan. Qualitative and quantitative assays showed that  oligosaccharide isolation method was effective to concentrate the oligosaccharide with high degree of polymerization but ineffective for mono-  and disaccharides removal. The highest percentages of hydrolysis of oligosaccharide from Sumbawa and Kalimantan by  mimic gastric juice were 1.78% and 0.59 %. Whereas, the hydrolysis was higher with amylase, 11.87% for Sumbawa and 21.03% for Kalimantan honey oligosaccharides. Prebiotic activity was 0.32, and 0.09 for honey oligosaccharide from Sumbawa and Kalimantan respectively. Honey oligosaccharide from Sumbawa presented higher prebiotic activity than inulin as prebiotic reference (0.11). GC- MS chromatogram showed L. acidophilus cultured in media added with Sumbawa honey oligosaccharide produced lactic acid as the highest metabolite (48.01%).
Key words : oligosaccharide, local honey, prebiotic activity

## PENDAHULUAN
Prebiotik merupakan komposisi pangan yang tidak tercerna dan memberikan keun- tungan melalui modulasi mikrobiota (FAO 2007). Prebiotik mampu menstimulasi pertum- buhan mikroflora menguntungkan seperti Lac- tobacilli dan Bifidobacteria. Beberapa laporan tentang efek prebiotik antara lain efek antipa- togenik (Schley & Field 2002), menurunkan le- mak (Anderson & Gilliland 1999) dan kolesterol (Williams & Jackson 2002), meningkatkan ab- sorpsi mineral (Scholz-Ahrens et al. 2007), dan mencegah kanker (Reddy et al. 1997). Sumber prebiotik umumnya merupakan oligosakarida, yaitu karbohidrat dengan panjang rantai 3 sampai 10 unit (Roberfroid 2007).
Madu adalah salah satu campuran kar- bohidrat yang paling rumit di alam (Soga 2002). Kandungan terbesar pada madu adalah fruktosa dan glukosa. Komponen lainnya yaitu oligosakarida (Ruiz-Matute  et al. 2010), mine- ral (Nanda et al. 2003), senyawa fenolik (Yao et al. 2003), enzim, dan air. Oligosakarida dari madu dapat meningkatkan jumlah bakteri fe- ses secara in vitro (Sanz et al. 2005). Vamanu et al. (2008) membuat formulasi produk sim- biotik antara bakteri asam laktat sebagai
probiotik dengan polen dan madu sebagai sumber prebiotik.
Produksi madu lokal di Indonesia menca- pai 115 ton per tahun dengan daya serap sebe- sar 13% (Silitonga & Munthe 2009). Apis dor- sata  adalah lebah madu yang hidup di hutan Indonesia dan merupakan lebah madu lokal yang paling produktif (Hutagalung 2008). Pene- litian ilmiah mengenai madu lokal di Indonesia masih terbatas, termasuk tentang komponen oligosakarida madu lokal serta potensinya se- bagai prebiotik. Penelitian ini bertujuan meng- isolasi oligosakarida madu lokal dari lebah Apis dorsata  asal Pulau Sumbawa dan Provinsi Kalimantan Timur dan menganalisis aktivitas prebiotiknya secara in vitro.

## MATERI DAN METODE

## Bahan dan Alat
Sampel madu berasal dari Hutan Bukit Gunung Tambora, Kab. Bima, Provinsi Nusa Tenggara Barat, dan Hutan Kampung Bluan Kab. Kutai Barat, Provinsi Kalimantan Timur. Sampel diperoleh pada bulan Februari 2010. Bahan yang digunakan adalah arang aktif,
etanol, kertas saring Whatman No.1, lempeng KLT K6F silika 250μm (Merck), piridin, butanol, N*(1-naftil) etilendiamina dihidroklorida (Merck), metanol, H 2 SO 4 , glukosa, fruktosa, dan maltosa, asam lambung buatan, HCl, reagen Dinitrosalisilat (DNS), fenol, saliva, bufer Na-fosfat, isolat Lactobacillus acidophilus (koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Antar Universitas, PAU, IPB), kultur Escherichia coli, kaldu de Mann Rogosa Sharpe (MRS  Broth, MRSB) (Oxoid), Nutrient Broth (NB) (Oxoid), kaldu media Minimal M9 (MM9), inulin chicory (Merck).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, neraca analitik OHAUS GA 200, vakum, hot plate stirrer (Gerhardt), inkubator (Kottermann Wisebath), penangas air, spektro- fotometer Genesys 10UV, laminar, otoklaf TOMY  High  Pressure Steam Sterilizer  ES-315, GC-MS pirolisis Shimadzu (Pusat Penelitian dan Pengembangan Departemen Kehutanan).

## Metode
Penelitian ini diawali dengan isolasi oli- gosakarida madu lokal. Isolat kemudian diuji secara kualitatif dan kuantitatif untuk menge- tahui kandungan karbohidrat. Selain itu, diuji pula tiga kriteria prebiotik dari isolat, yaitu re- sistensi terhadap hidrolisis asam lambung dan α-amilase, stimulasi pertumbuhan bakteri, dan aktivitas fermentasi bakteri.

## Isolasi Oligosakarida (Hernandez et al. 2009)
Sebanyak 500 mg madu ditambah dengan 3 gram arang aktif kemudian dilarut- kan ke dalam 100 mL etanol 10 persen dan diaduk selama 30 menit. Campuran disaring dengan kertas saring Whatman No.1  pada keadaan vakum dan arang aktif dibilas dengan 25 mL etanol 10 persen. Desorpsi oligosakarida dilakukan dengan menambahkan 100 mL etanol 50  persen  v/v. Campuran diaduk selama 30 menit dan disaring lagi dengan kertas saring Whatman No.1. Filtrat dievaporasi pada ke- adaan vakum pada suhu 40 o C.

## Deteksi Oligosakarida dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Efektivitas metode isolasi oligosakarida diuji secara kualitatif dengan KLT. Sampel dilarutkan  dalam etanol 50  persen  dengan konsentrasi 5  persen  b/v, standar karbohidrat dibuat pada konsentrasi 1 persen  b/v. Sampel ditotolkan ke lempeng KLT dan dielusi dengan campuran pelarut piridin:butanol:air (4:6:3 v/v) (Aso et al. 1960). Setelah kering, lempeng
direndam hingga jenuh dengan larutan berisi 0.3g/100 mL N*(1-naftil) etilendiamina dihidroklorida pada sistem pelarut yang terdiri atas metanol:H 2 SO 4 (97:3 v/v) (Vergara  et al. 2010). Lempeng dipanaskan pada oven dengan suhu 90 o C hingga spot dapat terlihat.

## Pengukuran Komposisi Karbohidrat
Gula pereduksi diukur dengan metode DNS (modifikasi Wichienchot et al. 2010). Karbo-hidrat total diukur dengan metode fenol-sulfat (modifikasi Wichienchot et al. 2010). Kurva standar glukosa dibuat pada kon- sentrasi 0-1 mg/mL.

## Pengujian Kriteria Prebiotik
Resistensi terhadap hidrolisis asam lambung (Wichienchot et al. 2010)
Isolat oligosakarida dilarutkan dalam air reverse osmosis  (RO) dengan konsentrasi 1 mg/mL. Asam lambung buatan dibuat dengan buffer HCl dengan komposisi dalam g/L: NaCl (8), KCl (0.2), Na 2 HPO 4 ·2H 2 O (8.25), NaH 2 PO 4 (14.35), CaCl 2 ·2H 2 O (0.01), MgCl 2 ·6H 2 O (0.18). Pengaturan pH 2 dilakukan dengan HCl 5 M. Buffer HCl ditambahkan ke larutan sampel dengan perbandingan 1:1 dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 jam. Pada jam ke-0, 1, dan 2 diambil 0.2 mL untuk pengujian kandungan gula pereduksi, sementara itu untuk peng- ukuran karbohidrat total diambil sebanyak 0.2 mL dan hanya diukur pada jam ke-0. Pengujian dilakukan dengan dua kali ulangan. Persentase hidrolisis dihitung dengan rumus sebagai berikut:
( ) 100 (%) 0 0 × − − = Gp KH total Gp Gp
Hidrolisis t
Keterangan Gp t = konsentrasi gula pereduksi jam ke-t Gp 0 = konsentrasi gula pereduksi jam ke-0 KH  = konsentrasi karbohidrat
Resistensi  terhadap hidrolisis  α-amilase (Wichienchot et al. 2010).
Amilase diperoleh dari saliva yang dien- cerkan hingga konsentrasinya 3 unit/mL. Isolat oligosakarida disiapkan dengan membuat larut- an 1  persen  sampel pada bufer Na-fosfat. Kemudian larutan enzim ditambahkan ke larut- an sampel dengan perbandingan 1:1. Campur- an diinkubasi selama 4 jam dan diukur gula pereduksinya pada jam ke-0, 1, 2, dan 4. Lang- kah lainnya sesuai dengan pengujian resistensi terhadap hidrolisis asam lambung.
Stimulasi pertumbuhan bakteri (modifikasi Huebner et al. 2008)
Bakteri yang digunakan adalah bakteri probiotik L. acidophilus dan bakteri enterik E. coli. Sebelum digunakan, kultur L. acidophilus ditumbuhkan pada MRSB semalam pada suhu 37 o C secara aerob dengan aerasi 100 rpm. Kultur  E. coli  diperlakukan sama dengan per- bedaan media kultur yaitu NB. Media uji sti- mulasi terdiri atas 10 mL MRSB untuk bakteri probiotik dan media MM9 untuk bakteri enterik. Setiap media ditambah dengan 1 mL larutan berisi 10 mg sampel. Kultur bakteri kemudian diinokulasi sebanyak 5 persen v/v ke dalam media uji stimulasi dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C dengan aerasi. Rapat Optik (Optical Density, OD) diukur pada λ  600 nm pada jam ke-0, dan 24. Blanko adalah media uji stimulasi tanpa inokulasi bakteri.  Aktivitas stimulasi dinyatakan secara kuantitatif melalui
     
− − −       − − 0 0 0 0 Eg Egt Ep Ept Pg Pgt Pp Ppt

## Keterangan:
Ppt  = OD probiotik pada prebiotik setelah t jam Pp0  = OD probiotik pada prebiotik setelah 0 jam Pgt  = OD probiotik pada kontrol (glukosa)  setelah t jam Pg0  = OD probiotik pada kontrol (glukosa)  setelah 0 jam Ept  = OD enterik pada prebiotik setelah t jam
Ep0  = OD enterik pada prebiotik setelah 0 jam Egt  = OD enterik pada kontrol (glukosa)  setelah
t  jam Eg0  = OD enterik pada kontrol (glukosa) setelah  0 jam

## Aktivitas Fermentasi Bakteri
Kultur L. acidophilus yang menunjukkan efek stimulasi pertumbuhan tertinggi diuji untuk aktivitas fermentasi bakteri.  Aktivitas kultur ditentukan dengan mengukur produk akhir fermentasi yang berupa asam organik dengan GC-MS Pirolisis Shimadzu. Suhu injek- tor 200 o C, helium sebagai gas pembawa, dan Flame Ionization Detector (FID) sebagai detek- tor. Kromatogram yang diperoleh dibandingkan dengan basis data Wiley7.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Warna dan Isolat Oligosakarida Madu
Hutan Sumbawa dan Kalimantan meru- pakan sentra perburuan madu hutan di Indonesia. Sampel madu hutan diambil pada bulan Februari 2010 dengan bantuan penduduk setempat. Madu lokal yang digunakan dihasil-
kan dari lebah hutan Apis dorsata. Kedua sampel madu yang digunakan adalah madu multifloral.
Madu lokal Sumbawa memiliki warna coklat keruh, sementara madu Kalimantan berwarna coklat bening. Aso et al. (1960) menyebutkan beberapa warna madu antara lain kuning, kuning pucat, coklat, coklat pucat, dan coklat gelap. Faktor utama yang menyebabkan perbedaan warna pada madu adalah sumber nektar (National Honey Board). Faktor lain yang mempengaruhi warna madu adalah proses penyimpanan, kadar senyawa fenolik, dan kadar mineral (Anklam 1997).
Rendemen isolat oligosakarida madu Sumbawa adalah 1.79 persen, sedangkan ren- demen isolah madu Kalimantan sebesar 2.06 persen. Isolat yang dihasilkan berwarna hitam untuk madu Sumbawa dan coklat untuk madu Kalimantan. Hal ini terkait dengan warna madu sebelum isolasi. Kedua isolat yang diper- oleh terlihat mengilap yang diduga merupakan gula yang mengalami karamelisasi.

## Kromatogram Oligosakarida Madu Sumbawa dan Kalimantan
Kromatogram yang dihasilkan menun- jukkan kandungan madu dan isolat oligo- sakarida madu Sumbawa relatif sama yakni monosakarida campuran glukosa dan fruktosa, dan karbohidrat dengan DP ≥2  (Gambar  1a). Terdapat sedikit perbedaan nilai Rf  yang diduga berasal dari matriks sampel yang mempengaruhi pergerakan karbohidrat selama proses elusi.
Spot kromatogram isolat oligosakarida dengan nilai Rf  0.46, 0.56, dan 0.68 memiliki ketebalan yang hampir sama dengan spot pada madu Sumbawa. Ini mengindikasikan bahwa ta- hap isolasi tidak begitu mempengaruhi jumlah karbohidrat tersebut. Spot untuk di-  dan mo- nosakarida yang tebal menunjukkan kandungan keduanya masih tinggi. Hal ini memperkuat ha- sil yang diperoleh pada visualisasi isolat oligo- sakarida yang mengkilap.
Kromatogram isolat oligosakarida juga menunjukkan 2 spot baru dengan Rf  0.12 dan 0.46 yang dapat dibedakan menjadi spot se- cara jelas dan  diduga merupakan oligosa- karida yang paling banyak dikandung oleh ma- du Sumbawa. Selain itu di antara kedua spot terdapat ekor yang menunjukkan kumpulan oligosakarida. Ekor tersebut tidak dapat dibe- dakan secara jelas menjadi spot-spot tertentu. Hal ini  dikarenakan pada madu terdapat pu- luhan jenis senyawa karbohidrat dengan kadar
yang rendah sehingga tidak memberikan batas antarspot yang spesifik.
Kromatogram madu Kalimantan meng- hasilkan empat spot sementara isolat oligo- sakaridanya menghasilkan lima spot (Gambar 1b). Kromatogram isolat menunjukkan kompo- sisi karbohidrat yang relatif sama dengan madu tanpa isolasi yakni mono-, disakarida, dan karbohidrat DP≥2.  Jika  dibandingkan  dengan nilai  Rf  standar, spot dengan nilai Rf  0.69 diduga sebenarnya terdiri atas dua spot yaitu mono- dan disakarida. Spot ini jauh lebih tebal dibandingkan spot lain. Oleh karenanya isolat oligosakarida madu Kalimantan juga diper- kirakan masih mengandung mono-  dan disa- karida yang tinggi. Terdapat dua spot oligosakarida dengan nilai  Rf  0.11 dan 0.37. Kedua spot ini hanya muncul pada kroma- togram isolat oligosakarida. Isolat oligo- sakarida madu Kalimantan juga menunjukkan adanya ekor pada kromatogram yang mengindikasikan beragam karbohidrat dalam jumlah yang rendah (Gambar 1b).
Gambar 1. Kromatogram  Isolat Oligosakarida Madu (a) Sumbawa; (b) Kalimantan. F: fruktosa, G: glukosa, M: Maltosa, SX: madu Sumbawa, S: isolat oligosakarida madu Sumbawa, KX: madu Kalimantan, K: isolat oligosakarida madu Kalimantan. Ekor kromatogram ditunjukkan dengan tanda panah.
Kromatogram isolat oligosakarida madu Sumbawa dan Kalimantan menunjukkan meto- de isolasi oligosakarida yang digunakan efektif dalam memekatkan kadar karbohidrat dengan DP yang lebih tinggi (DP ≥3).  Ini  dapat  dilihat dari sampel isolat oligosakarida yang menun- jukkan adanya spot-spot baru. Hasil kroma- togram isolat oligosakarida madu Sumbawa dan Kalimantan juga menunjukkan adanya ekor pada kromatogram. Hal ini menandakan bahwa pada konsentrasi dan penotolan sampel KLT yang sama, oligosakarida pada madu berada pada kadar yang sangat rendah
sehingga tidak dapat dideteksi dan mengha- silkan spot. Sementara itu proses isolasi mampu meningkatkan kadar oligosakarida se- hingga dapat terlihat pada kromatogram mes- kipun belum dapat digolongkan menjadi spot yang spesifik. Masih adanya spot mono-  dan disakarida menandakan senyawa-senyawa ter- sebut  belum berhasil dihilangkan dan masih berada dalam jumlah yang tinggi.

## Komposisi Karbohidrat Madu Hasil Isolasi
Kandungan karbohidrat isolat oligosaka- rida madu juga ditentukan secara  kuantitatif dengan metode spektrofotometri.  Madu Sum- bawa mengandung gula pereduksi 36.24±0.24 persen  dan karbohidrat total 66.02±0.54  per- sen  b/b. Adapun isolat oligo-sakarida madu Sumbawa mengandung gula pereduksi dan kar- bohidrat total berturut-turut 33.59±0.66 dan 64.38±2.99  persen  b/b. Madu Kalimantan mengandung gula pereduksi 67.8±0.38 persen dan karbohidrat total 82.45±3.7  persen  b/b. Sementara itu isolat oligosakaridanya mengan- dung gula pereduksi 42.39±1.19  persen  dan karbohidrat total 73.99±2.55 persen b/b.
Menurut Khalil et al. (2001), kandungan gula pereduksi madu sekitar 75 persen, dan karbohidrat totalnya mencapai 85 persen. Madu Sumbawa mengandung gula pereduksi dan karbohidrat total yang lebih rendah. Sementara itu, madu Kalimantan mengandung gula pereduksi dan karbohidrat total dalam rentang umum tersebut.  Namun demikian, madu Sumbawa mengandung lebih banyak oligosakarida dibandingkan madu Kalimantan. Kandungan oligosakarida ini dapat dilihat dari selisih antara karbohidrat total dengan gula pereduksinya. Oligosakarida tergolong gula nonpereduksi. Beberapa disakarida juga meru- pakan gula nonpereduksi. Kandungan oligo- sakarida madu Sumbawa sekitar 29.78 persen, sementara oligosakarida madu Kalimantan sekitar 14.65 persen.
Uji kuantitatif menunjukkan metode ad- sorpsi arang aktif dan konsentrasi etanol ber- tingkat hampir tidak memberi pengaruh pada madu Sumbawa. Kandungan gula pereduksi iso- lat oligosakarida yang masih tinggi ini mem- perkuat hasil visualisasi dan kromatogram isolat.
Metode isolasi menurunkan  kadar gula pereduksi hingga 25 persen  pada isolat oligosakarida madu Kalimantan, sementara karbohidrat total hanya berkurang sedikit. Berdasarkan kromatogramnya, isolat oligo- sakarida madu Kalimantan menunjukkan spot
0.74
0.68 0.68 0.56 0.46 0.12 0.6 0.73 0.73 0.65 0.56 0.46 0.67 0.63 0.69 0.54 0.46 0.37
0.11 0.74 0.58 0.5 F  SX  G   S   M F  KX  G   K   M a b
mono-  dan disakarida yang masih tebal. Sementara itu metode kolorimetri menun- jukkan kandungan gula pereduksinya sudah jauh berkurang dari kandungan madu awal. Hal ini dapat  terjadi karena tidak semua disa- karida adalah gula pereduksi, sehingga pada pengujian KLT terdeteksi sebagai disakarida tetapi pada kolorimetri tidak terdeteksi sebagai gula pereduksi.
Hernandez et al. (2009) dan Sanz et al. (2005) menyebutkan mono-  dan disakarida dapat dihilangkan hampir seluruhnya dengan metode adsorpsi arang aktif. Hal ini berbeda dengan hasil yang diperoleh baik dengan pengujian kualitatif maupun kuantitatif.  Per- bedaan hasil yang diperoleh ini dapat dise- babkan perbedaan grade  bahan isolasi yang digunakan.

## Resistensi terhadap Asam Lambung dan Amilase
Resistensi terhadap asam lambung dan amilase adalah salah satu syarat dari prebiotik (Roberfroid  2007). Sampel menunjukkan per- sentase hidrolisis isolat oligosakarida madu Sumbawa dan madu Kalimantan berbeda. Keduanya memiliki tingkat hidrolisis asam lambung tertinggi pada jam pertama inkubasi yakni 1.78  persen  untuk isolat oligosakarida madu Sumbawa dan 0.59 persen  untuk madu Kalimantan. Jumlah ini kemudian menurun pada jam kedua yaitu 1.27 persen untuk isolat oligosakarida madu Sumbawa dan -0.4  persen untuk madu Kalimantan.
Pengukuran pada jam ke-2 menunjukkan persentase hidrolisis bernilai negatif untuk isolat oligosakarida madu Kalimantan. Nilai negatif ini dapat disebabkan adanya gangguan ion dari garam yang menyusun asam lambung buatan. Metode DNS yang digunakan untuk mengukur gula pereduksi akan terganggu bila sampel mengandung banyak ion (Sinegani & Emtiazi 2006).
Hidrolisis amilase saliva meningkat se- iring waktu untuk masing-masing isolat oligo- sakarida madu. Isolat oligosakarida madu Sum- bawa mengalami hidrolisis sebanyak 8.18, 10.92, dan 11.87 persen pada jam ke-1, 2, dan 4. Sementara isolat oligosakarida madu Kali- mantan mengalami hidrolisis sebesar 13.76, 16.12, dan 21.03  persen. Berbeda dengan pengujian resistensi terhadap asam lambung, isolat oligosakarida madu Kalimantan menga- lami tingkat hidrolisis yang lebih tinggi. Hal ini dapat dikaitkan dengan hasil pengukuran kom- posisi karbohidrat sebelumnya yang menunjuk-
kan jumlah gula pereduksi pada isolat oligo- sakarida madu Kalimantan yang lebih tinggi di- bandingkan madu Sumbawa. Resistensi oligosa- karida ini sesuai dengan Rittig (2001) dalam Sanz  et al. (2005) yang menyebutkan bahwa oligosakarida madu memiliki resistensi terha- dap asam lambung dan enzim pencernaan se- cara in vitro.

## Stimulasi Pertumbuhan Bakteri
Kurva pertumbuhan L. acidophilus  yang ditumbuhkan dalam MRSB menunjukkan kultur usia 24 jam telah berada di fase stationer (Gambar 2). Kurva pertumbuhan E. coli berpe- doman pada Kao et al. (2004) dan Kaur & Chakraborti (2010) yang menyebutkan pada jam ke-24, kultur E. coli telah berada pada fase stasioner. Fase stasioner terjadi saat sum- ber nutrisi yang berasal dari media mulai ha- bis. Uji stimulasi dilakukan dengan memberi- kan isolat oligosakarida sebagai sumber karbon (C) tambahan ke dalam media kultur bakteri. Bakteri yang mampu memanfaatkan sampel isolat oligosakarida madu sebagai sumber kar- bonnya akan menunjukkan pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan kultur bakteri lainnya. Hal ini ditunjukkan melalui selisih nilai OD an- tara jam ke-24 dan jam ke-0 yang lebih tinggi.
Gambar 2. Kurva Pertumbuhan Lactobacillus acidophilus dalam MRSB
Berdasarkan OD yang diperoleh pada jam ke-0 dan ke-24, diperoleh bahwa isolat oligosakarida madu Sumbawa, Kalimantan, dan inulin memiliki aktivitas prebiotik yaitu mam- pu menstimulasi pertumbuhan bakteri L. acidophilus. Isolat oligosakarida madu Sumba- wa memberikan pengaruh prebiotik sebesar 0.3274, yang hampir tiga kali lebih besar dibanding inulin yakni sebesar 0.1189, Semen- tara isolat oligosakarida madu Kalimantan me- nunjukkan kemampuan stimulasi yang paling rendah yakni 0.0973.
L.acidophilus  diduga memiliki enzim yang mampu mendegradasi oligosakarida madu dan memanfaatkannya sebagai sumber karbon. L. acidophilus memiliki gen msm dan BfrA yang
terlibat dalam pemanfaatan FOS, salah satu jenis prebiotik, sebagai sumber karbon.  Gen msm mengodekan ATP binding cassette (ABC) transporter  yang menyalurkan sumber karbon ke dalam sel. Sementara itu gen BfrA mengodekan fruktosidase yang berfungsi untuk mencerna FOS. Efek stimulasi pertumbuhan yang ditunjukkan oleh prebiotik bersifat spesifik terhadap galur bakteri. Tidak semua bakteri  probiotik dapat memanfaatkan semua prebiotik (Artanti 2009).
Isolat oligosakarida madu Sumbawa menunjukkan aktivitas prebiotik yang lebih tinggi  dibandingkan inulin Biedrzycka dan Bielecka (2004) menyebutkan oligosakarida rantai pendek, tanpa percabangan, dan larut air lebih mudah dimanfaatkan oleh bakteri. Oligosakarida madu umumnya merupakan di-, tri-, dan tetrasakarida, sementara inulin adalah oligosakarida dengan DP 10-60.

## Aktivitas Fermentasi
Kriteria prebiotik ketiga ialah mem- pengaruhi aktivitas fermentasi. Aktivitas fer- mentasi diukur melalui produk fermentasi yang dihasilkan kultur. Isolat oligosakarida madu Sumbawa menunjukkan efek stimulasi pertum- buhan yang paling tinggi sehingga kultur L. acidophilus  yang ditumbuhkan pada media tersebut diuji untuk mengetahui produk fermentasi yang dihasilkan. Kromatogram me- nunjukkan 19 puncak senyawa terdeteksi dari kultur tersebut (Gambar 3).
Kultur bakteri usia 24 jam yang ditum- buhkan dalam lingkungan aerob menghasilkan
asam laktat (puncak E) sebagai metabolit uta- ma yaitu 48.01  persen.  L. acidophilus  tergo- long bakteri asam laktat homofermentatif se- hingga metabolit utamanya adalah asam lak- tat. Berdasarkan kromatogram, asam laktat yang dibentuk seluruhnya merupakan tipe L(+). Hasil ini berbeda dengan Sanders dan Klaenhammer (2001) yang menyebutkan bahwa L. acidophilus menghasilkan asam laktat tipe L(+) dan D(-).
Dalam lingkungan aerob, L. acidophilus menghasilkan asam laktat sebagai metabolit utama, namun dalam keadaan anaerob seperti pada kolon, bakteri ini juga menghasilkan asam asetat yang merupakan asam lemak rantai pendek (Naaber et al. 2004). Asam asetat juga mungkin terbentuk karena asam laktat digunakan oleh bakteri hetero- fermentatif. Gibson et al. (1996) menyebutkan bahwa dalam kolon, metabolit yang dihasilkan suatu jenis bakteri dapat digunakan oleh bakteri lain dan menghasilkan metabolit yang baru. Jiang dan  Savaiano (1997) menyebutkan bahwa penambahan L. acidophilus pada fer- mentasi kultur berkesinambungan yang diinokulasi dengan bakteri feces menghasilkan peningkatan produksi asam asetat. Asam laktat adalah asam organik yang menguntungkan pada pencernaan karena dapat berfungsi sebagai antimikrob bagi bakteri di dalam kolon (Sanders & Klaenhammer 2001). Selain itu, salah satu mekanisme penurunan kolesterol oleh  L. acidophilus  adalah pengikatan kolesterol dengan asam laktat (Suzuki et al. 1991 dalam Jiang & Savaiano 1997).
Gambar 3. Kromatogram GC-MS  Pirolisis Kultur  L. acidophilus  dalam MRSB dengan Isolat Oligosakarida Madu Sumbawa sebagai Tambahan Sumber Karbon Menunjukkan Asam Laktat (E) sebagai Metabolit Ekstraseluler yang Utama
D C E B F L M N O P Q R G H I J K S A

## KESIMPULAN
Madu Sumbawa mengandung jumlah oligosakarida yang lebih tinggi dibandingkan madu Kalimantan. Isolasi oligosakarida dengan arang aktif dan etanol bertingkat 10 dan 50% tidak efektif untuk menghilangkan mono-  dan disakarida tetapi efektif untuk memekatkan konsentrasi oligosakarida DP≥3.
Pengujian  in vitro menunjukkan  isolat oligosakarida madu Sumbawa dan Kalimantan memenuhi kriteria prebiotik yakni resisten ter- hadap asam lambung dan enzim pencernaan, memiliki efek stimulasi pertumbuhan yang selektif, dan mempengaruhi aktivitas fermen- tasi. Isolat oligosakarida madu Sumbawa me- nunjukkan efek stimulasi pertumbuhan bakteri L. acidophilus  terbesar. Kultur L. acidophilus yang ditumbuhkan pada media dengan isolat oligosakarida madu Sumbawa sebagai tambah- an sumber C menghasilkan asam laktat sebagai metabolit utama (48.01%)
Selain itu pemanfaatan potensi ekonomi juga perlu dioptimalkan untuk meningkatkan PDRB/kapita dan dilakukan pendistribusian yang merata agar pembangunan pangan dapat dirasakan oleh semua pihak.
Perlu dilakukan penentuan konsentrasi etanol yang optimum untuk menghilangkan mono- dan disakarida madu. Oligosakarida ma- du lokal perlu diidentifikasi lebih lanjut. Uji stimulasi pertumbuhan bakteri perlu dilakukan dalam keadaan anaerob sesuai keadaan in vivo pada kolon, dengan isolat berupa campuran bakteri kolon dan fruktooligosakarida (FOS) sebagai prebiotik pembanding.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terimakasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (Ditjen Dikti) yang telah mendanai Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) Penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Anderson JW &  Gilliland SE. 1999. Effect of fermented milk (yogurt) containing Lactobacillus acidophilus L1 on serum cholesterol in hypercholesterolemic humans.  J Am Col Nutrition,  18(1), 43- 50.
Anklam E. 1997. A review of the analyitical methods to determine the geographical
and botanical origin of honey. Food Chem, 63(4), 549-562.
Artanti A. 2009. Pengaruh Prebiotik Inulin dan Fruktooligosakarida (FOS) Terhadap Pertumbuhan Tiga Jenis Probiotik. Skripsi Sarjana Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor.
Aso K, Watanabe T  &  Yamao K. 1960. Studies on honey: on the sugar composition of honey.  Tohoku Journal of Agriculture Research, 1, 101-108.
Biedrzycka &  Bielecka M. 2004. Prebiotic effectiveness of fructans different degrees polymerization. Trends in Food Sci & Tech, 15, 170-175.
[FAO] Food Agriculture Organization. 2007.
FAO Technical Meeting on Prebiotics. FAO, Rome.
Gibson GR, Willems A, Reading S, & Collins MD. 1996. Fermentation of non-digestible oligosaccharides by human colonic bacteria.  Proceedings of the Nutrition Society, 55, 899-912.
Hernandez O, Ruiz-Matute AI, Olano A, Moreno FJ &  Sanz ML. 2009. Comparison of fractionation techniques to obtain prebiotic galactooligosaccharides. Int Dairy J, 19, 531-536.
Huebner J, Wehling RL, Parkhurst A & Hutkins RW. 2008. Effect of processing conditions on the prebiotic activity of commercial prebiotics. Int Dairy J, 18,
287-293.
Hutagalung LE. 2008. Perkembangan Perolehan Madu Lebah Hutan (Apis dorsata) oleh Pemanen Madu di Kabupaten Tapanuli Utara. Skripsi Sarjana Departemen Teknologi Hasil Hutan, Fakultas Kehutanan, IPB, Bogor.
Jiang T &  Savaiano DA. 1997. In vitro  lactose fermentation by human colonic bacteria is modified by Lactobacillus acidophilus supplementation. J Nut, 127, 1489- 1495.
Kao  et al. 2003. Transcriptome-based determination of multiple transcription regulator activities in Escherichia coli by using network component analysis. PNAS, 101, 641-646.
Kaur P  &  Chakraborti A. 2010. Proteome analysis of food borne pathogen enteroaggregative
Escherichia coli under acid stress. J Proteomics
Bioinform, 3, 10-19. Khalil  et al. 2001. Biochemical analysis of different brands of unifloral honey available at the northern region of Bangladesh. The Sciences,  1(6), 385- 388.
Naaber  et al. 2004. Inhibition of Clostridium
difficile
strains by intestinal Lactobacillus  species. J Med Microbiol, 53, 551-554.
Nanda et al. 2003. Physico-chemical properties and estimation of mineral content in honey produced from different plants in Northern India.
[NHB]  National Honey Board. Honey color.
Reddy BS, Hamid R,  Rao CV. 1997. Effect of dietary oligofructose and inulin on colonic preneoplastic aberrant crypt foci inhibition. Carcinogenesis,  18(7), 1371-1374.
Roberfroid M. 2007. Prebiotics: the concept revisited. J Nut, 137, 830-837.
Ruiz-Matute AI, Brokl M, Soria AC, Sanz ML, Matinez-Castro. 2010. Gas chroma- tographic-mass  spectrometric charac- terisation of tri- and tetrasaccharides in honey. Food Chem, 120, 637-642.
Sanders ME   Klaenhammer TR. 2001. Invited review: the scientific basis of Lactobacillus acidophilus NCFM functionality as a probiotic. J Dairy Sci, 84(2), 319-331.
Sanz et al. 2005. In vitro investigation into the potential prebiotic activity of honey oligosaccharides.  J Agric Food Chem,
53(8), 2914-2921.
Schley PD   Field CJ. 2002. The immune- enhancing effects of dietary fibres and prebiotics. British J Nutr, 87, 221-230.
Scholz-Ahrens  et al. 2007. Prebiotics, probiotics, and synbiotics affect mineral absorption, bone mineral content, and bone structure. J Nutr, 137, 838-846.
Silitonga LT  Munthe MG. 2009. Amway jajaki madu RI masuk pasar dunia. Bisnis Indonesia, 11 September.
Sinegani AAS   Emtiazi G. 2006. The relative effects of some elements on the DNS method in cellulose assay. J Appl Sci Environ, 10(3), 93-96.
Soga T. 2002. Analysis of carbohydrates in food and bevarages by HPLC and CE. J Chromatogr  Library, 66, 483-502.
Vamanu et al. 2008. Obtaining of a symbiotics product based on lactic acid bacteria, pollen and honey. Pakistan J Biol Sci, 11(4), 613-617.
Vergara  CMAC, Honorato TL, Maia GA, Rodrigues S. 2010. Prebiotic effect of fermented cashew apple (Anacardium occidentale L) juice. Food Sci Tech, 43, 141-145.
Wichienchot S, Jatupornpipat M,  Rastall RA.
2010. Oligosaccharides of pitaya (dragon fruit) flesh and their prebiotic properties. Food Chem, 120, 850-857.
Williams CM   Jackson KG. 2002. Inulin and oligofructose: effects on lipid metabolism from human studies. British J  Nutr, 87, 261-264.
Yao et al. 2003. Flavonoids, phenolic acids and abscisic acid in Australian and New Zealand  Leptospermum  honeys. Food Chem, 81, 159-168.