Optimasi  Perolehan  DNA  Mikrobioma  yang  Diekstraksi  dari Mekonium dan Feses Neonatus Prematur untuk diaplikasikan pada Next -Gen Sequencing 16S rRNA
(Optimization of Microbiome DNA Yield Extracted from Meconium and Feces of Preterm Neonates to be applied in 16S rRNA Next-Gen Sequencing)
LARASHINTYA RULITA 1 , AMARILA MALIK 1 *, RADHIAN AMANDITO 2 , RINAWATI ROHSISWATMO 2
1 Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia, Depok, 16424, Jawa Barat, Indonesia.
2 Departemen Ilmu Kesehatan Anak Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo (RSCM)-FKUI, Jl. Diponegoro No.71, Jakarta Pusat, Daerah Khusus Ibukota Jakarta, 10430.
Diterima 30 Juni 2021, Disetujui 14 Oktober 2021
Vol. 19, No. 2 JURNAL ILMU KEFARMASIAN  INDONESIA, Oktober 2021,  hlm. 174-183 ISSN 1693-1831, E-ISSN 2614-6495
*Penulis korespondensi: Email: amarila.malik@ui.ac.id
Abstract: The composition of the intestinal microbiome of neonates can be identiﬁ ed from meconium and feces by Next-Generation Sequencing (NGS) technology. However, the yield of microbiome DNA of meconium and feces has its own challenges due to  the consistency and the high  content of PCR inhibitors in these samples. This study aims to optimize the yield of microbiome DNA from meconium sample and feces of pre-term neonates. The DNA yield  was obtained by applying certain optimized parameters, i.e., considering the replication and condition of the sample, using a particular kit for DNA extraction, and modifying  the  DNA  elution of the column puriﬁ cation. The genomic DNA obtained was quantiﬁ ed  and conﬁ rmed  using  Polymerase Chain Reaction. Results showed that the best DNA yield was achieved by replicating the number of samples twice in the pre-extraction stage, working on fresh meconium and feces samples instead, and suspended the sample in ddH 2 O prior to extraction process as observed on agarose gel visualization with UV trans-illuminator, as well as in quantitative measurement  by  a  nano  spectrophotometer.  The  best  extraction  process  was  using  MP  Biomedical FastDNA Spin Kit for Soil, in addition to the use of an elution buﬀ er in a smaller volume, resulting in a higher concentration and purity of DNA. In conclusion, we were able to obtain an optimized yet reliable DNA yields, especially from meconium, which fulﬁ lled the quality and quantity requirement for further sequencing process of microbiome.
Keywords : feces, meconium, microbiome, microbiota, neonates, NGS.
Abstrak: Komposisi mikrobioma usus pada neonatus prematur dapat diidentiﬁ kasi dari mekonium dan feses dengan teknologi Next-Generation Sequencing (NGS). Akan tetapi, perolehan DNA mikrobioma sampel  mekonium  dan  feses  memiliki  tantangan  karena  konsistensi  serta  kandungan  inhibitor  PCR yang tinggi pada sampel tersebut. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengoptimasi perolehan DNA mikrobioma dari mekonium dan feses neonatus. Proses perolehan DNA dilakukan dengan menerapkan optimasi  parameter  yaitu  pertimbangan  tahap pra -ekstraksi  yaitu  replikasi  dan  kondisi  sampel, penggunaan pilihan kit ekstraksi, dan tahap elusi DNA hasil ekstraksi. DNA genomik yang diperoleh dikuantiﬁ kasi  serta  dikonﬁ rmasi  menggunakan Polymerase  Chain  Reaction .  Hasil  optimasi  terbaik berdasarkan pengamatan visual kualitas DNA dengan agaros gel dan transiluminator UV, maupun secara kuantitas yang diukur dengan spektrofotometer nano adalah dengan replikasi jumlah sampel sebanyak 2 kali lipat, menggunakan sampel mekonium dan feses yang segar, dan terlebih dahulu disuspensikan menggunakan  ddH 2 O  untuk  tahap-tahap pra -ekstraksi.  Kit  terbaik  untuk  ekstraksi  DNA  adalah MP Biomedical Fast DNA Spin Kit for Soil , serta penggunaan dapar elusi dengan volume yang lebih sedikit untuk menghasilkan konsentrasi  serta kemurnian DNA yang  lebih tinggi. Dapat  disimpulkan bahwa perolehan  DNA  yang  andal  terutama  dari  sampel  mekonium  berhasil  teroptimasi  untuk  memenuhi kualitas dan kuantitas DNA untuk tahap selanjutnya dengan teknologi sekuensing mikrobioma.
Kata kunci: feses, mekonium, mikrobioma, mikrobiota, neonatus, NGS .
175  MALIK ET AL.

## Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
mengganggu hasil perolehan DNA tersebut. Optimasi yang  dilakukan  yaitu  dengan  menggunakan  2 kit ekstraksi  berbeda,  pengkondisian  sampel  (segar/ beku) dan jumlah sampel dengan melakukan replikasi, penambahan tween-80 dan ddH 2 O untuk melarutkan sampel, serta membandingkan volume dapar elusi. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh kondisi ekstraksi DNA mikrobiota dari mekonium dan feses neonatus  yang  optimum  dengan  hasil  termurni  dan terbanyak berdasarkan optimasi yang dilakukan. DNA hasil ekstraksi akan diukur kualitas dan kuantitasnya agar terpenuhi untuk keperluan sekuensing 16S rRNA dengan  teknologi Next-Generation  Sequencing . DNA  hasil  ekstraksi  dari  sampel  mekonium  dan feses  dikuantiﬁ kasi,  divisualisasi,  dan  selanjutnya diamplifikasi  menggunakan Polymerase  Chain Reaction .

## BAHAN DAN METODE
BAHAN. Bahan  yang  digunakan  adalah DNeasy ® PowerSoil ® Kit [Qiagen, Jerman], Fast DNA™ Spin Kit for Soil [MP Biomedical, Amerika Serikat] dapar Tris-EDTA,  Etidium  Bromida  [Merck,  Jerman], Agarosa  [Aﬀ ymetrix, Amerika  Serikat],  KOD  Fx Neo [Toyobo, Jepang], penanda DNA 1 kb [Biospec, Amerika Serikat], penanda DNA  100 bp [BioLabs, Amerika  Serikat],  bromtimol  biru  (loading  dye) [BioLabs, Amerika Serikat], Aquadest, dan ddH 2 O. Primer  yang  digunakan  untuk  amplifikasi  DNA hasil  ekstraksi  dengan  menggunakan  PCR  yaitu 27F  (primer forward 5’- AGA  GTT  TGA  TCM TGG  CTC AG-3’)  dan  534R  (primer reverse 5’- ATTACCGCGGCTGCTGG  -3’)  [Integrated  DNA Technology, Coralville] dengan target gen 16S rRNA region hipervariabel V1-V2-V3 (12) . Alat. Alat yang digunakan tidak lazim disertakan untuk naskah hasil riset ini. Namun dapat disebutkan yang utama adalah: Alat yang digunakan atara lain tube feses steril, Vorteks mixer [Barnstead, Amerika Se ri kat ],  UV-t ra nsi ll umi nat or  [ Bi om et r a, Jerman],  alat  elektroforesis  gel  agarosa  [Mupid, Jepang],  NanoDrop™  One  Microvolume  UV-Vis Spectrophotometer, Freezer -20oC [GEA, Indonesia], dan alat-alat pendukung lain.
METODE. Sampel Penelitian. Sampel penelitian adalah mekonium dan feses dari subjek 14 neonatus prematur yang lahir pada Januari 2020-Maret 2020 di Rumah Sakit Dr. Cipto Mangunkusumo, Jakarta. Kriteria  inklusi  adalah  neonatus  yang  lahir  pre- term  dengan  usia  32-34  minggu  dan  berat  kurang dari  2.500  g  dengan  proses  persalinan  normal  dan persalinan  dengan  bedah  cesar,  sampel  mekonium yang  dikeluarkan  dari  neonatus  dalam 24  -  48  jam

## PENDAHULUAN
KOLONISASI mikrobiota dalam saluran pencernaan memainkan  peran  penting  dalam  mempertahankan homeostasis  usus  karena  mikrobiota  usus  terlibat dalam  proses  pencernaan,  penyerapan  nutrisi,  dan mekanisme  imunologis (1) .  Faktor-faktor  yang  dapat mempengaruhi komposisi dan keragaman mikrobiota dalam  saluran  pencernaan  neonatus  adalah  usia kehamilan,  diet  ibu  selama  kehamilan,  paparan antibiotik, dan cara persalinan. Perkembangan koloni mikrobiota di awal kehidupan neonatus berbeda antara individu dan terkait dengan status kesehatan individu di kemudian hari (2) .
Adanya  informasi  tentang  mikrobiota  usus neonatus dapat memberikan wawasan tentang akuisisi mikrobiota  awal,  perkembangan  selanjutnya,  dan peluang  potensial  untuk  intervensi  terkait  dengan kesehatan neonatus di masa depan (3) . Bakteri probiotik seperti Lactobacillus dan Bifidobacterium yang terkandung  dalam  mikrobiota  mekonium  berfungsi sebagai  mediator  untuk  meningkatkan  sistem  imun sehingga dapat membantu mencegah perkembangan penyakit pada neonatus (4) .
Mekonium adalah bahan dan hasil sekresi yang tertelan oleh janin di saluran pencernaan saat di dalam kandungan  yang  mengandung  campuran  dari  asam empedu, sekresi pankreas, sel epitel, dan residu dari cairan amnion yang tertelan (5) dan merupakan feses pertama dari neonatus yang dikeluarkan pada waktu 24–48 jam setelah kelahiran (6) . Mekonium dan feses dapat  dianalisis  sebagai  metode non-invasif untuk mempelajari  proﬁ l  mikrobiota  pada  lingkungan in- utero dan pada  saluran  pencernaan  neonatus. Akan tetapi,  terdapat  beberapa  faktor  yang  mempersulit proses ekstraksi sampel mekonium dan feses ini. Mekonium  mengandung  berbagai  mikrobiota yang  beragam  dengan  konsentrasi  biomassa  yang rendah (2,7-10) sehingga sulit untuk memperoleh DNA mikrobiota yang optimal dari mekonium. Selain itu, konsistensi mekonium yang seperti tar (lengket) dan konsistensi feses yang terkadang padat menyebabkan kedua  sampel  ini  sulit  untuk  diekstraksi  karena kelarutannya yang rendah. Faktor lain yaitu adanya inhibitor PCR yang terkandung di dalam mekonium maupun feses dengan konsentrasi yang cukup tinggi seperti  garam  empedu  dan  asam,  glikolipid,  serta urea sehingga perolehan DNA mikrobiota dari PCR rendah (5,11) .
Pada  penelitian  ini,  untuk  meningkatkan keberhasilan perolehan DNA dari mekonium dan feses maka dilakukan optimasi pada tahapan pemilihan kit ekstraksi, pengkondisian sampel, replikasi, preparasi, dan elusi sampel untuk mengatasi faktor-faktor yang
Vol 19, 2021
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia   176
pertama setelah kelahiran, serta sampel feses hari ke-4 dan ke-7 setelah kelahiran.
Sampel  mekonium  dan  feses  dikumpulkan dari  popok  dan  ditempatkan  di  tabung  steril  oleh perawat yang sudah terlatih. Semua sampel disimpan pada  suhu  4  °C.  Sampel  dibawa  ke  Laboratorium Mikrobiologi  dan  Bioteknologi  Farmasi,  Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia dengan menggunakan ice box untuk dilakukan ekstraksi DNA.
Etika  Penelitian. Sebelum  melakukan pengambilan  sampel  dilakukan  pengajuan  kaji  etik ke  Komite  Etik  Fakultas  Kedokteran,  Universitas Indonesia, dan mendapat persetujuan (ND-103 / UN2. F1  /  ETIK  /  PPM.00.02  /  2020,  No.  Protokol  Etik 19-02-0163).
Optimasi  Perolehan  DNA. Parameter  yang dioptimasi pada tahap ini yaitu:
1.     Replikasi Sampel Dalam penelitian ini, sampel mekonium ditimbang pada  2  mikrotub  yang  berbeda  masing-masing ±100 mg dan dilakukan ekstraksi DNA. Pada tahap pengikatan DNA, ﬁ ltrat dari 2 mikrotub yang berbeda dimasukkan  kedalam  1  kolom  yang  sama  untuk selanjutnya dilakukan elusi DNA.
2.  Kondisi Sampel Optimasi  berdasarkan  kondisi  sampel  yaitu menggunakan sampel segar dan sampel beku. Sampel segar diekstraksi kurang dari 48 jam setelah mekonium dikeluarkan dari neonatus yang sebelumnya disimpan pada suhu 4 o C dan sampel beku adalah sampel yang disimpan pada suhu -20 o C lebih dari 48 jam setelah dikeluarkan dari neonatus.
3.  Tahap Preparasi Sampel Optimasi  pada  tahap  ini  dilakukan  dengan membandingkan  2  jenis  pelarut  yaitu  ddH 2 O  dan tween-80 konsentrasi 10% dalam melarutkan sampel mekonium dan feses (15) . Pelarut tersebut ditambahkan sebanyak 1 mL kedalam mikrotub yang berisi sampel sebanyak  ±100  mg.  Kemudian  mikrotub  divortex dengan  kecepatan  maksimum  selama  20  menit kemudian disentrifugasi selama 9 menit pada 13.000 g.
4.  Pemilihan Kit Ekstraksi Optimasi perolehan DNA mikrobiota mekonium dan  feses  berdasarkan  pemilihan  kit  ekstraksi dilakukan dengan membandingkan konsentrasi DNA yang dihasilkan dari ekstraksi menggunakan Qiagen DNeasy ® PowerSoil ® kit  dengan  MP  Biomedicals FastDNA ™ Spin Kit for Soil.
5.  Tahap Elusi DNA Optimasi  pada  tahap  ini  dilakukan  dengan
mengubah  volume  dapar  yang  digunakan  untuk mengelusi DNA. Berdasarkan protokol, volume dapar elusi  yang  ditambahkan  yaitu  sebesar  100  μL  dan optimasi yang dilakukan pada penelitian ini dengan menambahkan dapar elusi sebanyak 60 µL, 40 µL, dan 30 µL.
Ekstraksi  dan  Kuantifikasi  DNA. Sampel mekonium  dan  feses  yang  telah  diproses pra - ekstraksi  maupun  proses  ekstraksi  secara  optimum di atas, dilanjutkan dengan aplikasi proses ekstraksi DNA  untuk  keseluruhan  sampel  mekonium  dan feses.  DNA  genomik  yang  diperoleh  dikuantiﬁ kasi menggunakan NanoDrop™ One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer .
Polymerase  Chain  Reaction  gen  16S  rRNA. Pengujian  kualitas  DNA  hasil  ekstraksi  dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) gen 16S rRNA  dengan  menarget  region V1  – V3  dari  16S rRNA (12) dilakukan dengan menggunakan dua primer universal: 27F (5’- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3  ‘)  dan  534R  (5’-ATT ACC  GCG  GCT  GCT GG-3’) (IDT DNA, Singapore). Campuran reaksi PCR dilakukan dengan total volum 50 μL terdiri dari 6,5 μL ddH2O, 25 μL dari 2X FX Neo Dapar (Toyobo, Jepang),  10  μL  dari  2-mM  dNTPs,  masing-masing 0,75  μL  dari  10  pmol/μL  primer  27F  dan  534R, 6  μL  DNA  genomik  sebagai  cetakan  (konsentrasi 14,304 ng/6 μL-1.931,75/6 μL), dan 1 μL KOD FX Neo  polimerase  (Toyobo,  Jepang).  PCR  dilakukan dengan  kondisi  denaturasi  awal  pada  suhu  95 o C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 detik, penempelan pada suhu 63 o C selama 30 detik, pemanjangan pada suhu 68 o C selama 40 detik, dan pemanjangan akhir pada suhu 68 o C selama 6 menit. Tahap denaturasi hingga pemanjangan diulang sampai 30 siklus (13) .
Visualisasi  DNA  Genomik  dan Amplikon. DNA genomik hasil ekstraksi dan produk PCR (DNA amplikon) dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa  1%  dengan  penanda  DNA  1  kb  (Biospec, Amerika Serikat) sebagai pembanding hasil ekstraksi, dan penanda DNA 100 bp (BioLabs, Amerika Serikat) sebagai  pembanding  hasil  PCR. Alat  elektroforesis disambungkan  ke  sumber  listrik  dan  diatur  dengan kondisi  tegangan  listrik  100 Volt  selama  30  menit. Visualisasi  pita-pita  DNA  hasil  elektroforesis dilakukan dengan sistem dokumentasi menggunakan UV transilluminator.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
177  MALIK ET AL.
jumlah sampel yang lebih besar dimana total sampel yaitu  sebanyak  ±200  mg.  Sampel  yang  direplikasi mengalami proses pelisisan sel, penghilangan inhibitor dan  pengikatan  DNA  dua  kali  lebih  besar  daripada sampel yang tidak direplikasi, sehingga menyebabkan DNA yang terikat dengan membran silika pada kolom menjadi dua kali lebih banyak dan hasil DNA lebih konsentrat ketika dipooled setelah di elusi. 2.    Pemilihan Kit Ekstraksi Ekstraksi  DNA  dari  sampel  mekonium menggunakan MP Biomedicals FastDNA™ Spin Kit

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi  Perolehan  DNA. Hasil  dari  perolehan DNA, yaitu:
1.     Replikasi Sampel Hasil optimasi pada Tabel 1 menunjukkan bahwa konsentrasi sampel dengan perlakuan replikasi lebih tinggi dibandingkan sampel tanpa replikasi. Ekstraksi pada tahap ini menggunakan kit Qiagen DNeasy ® PowerSoil ® Kit.    Sampel  JUW  2.3+3.3 yang  dioptimasi  dengan  replikasi  mengandung
Kode Sampel Optimasi Hasil Kuantifikasi Konsentrasi (ng/μl) Kemurnian (A260/A280) JUW 1.3 - 1x ekstraksi (sampel 100 mg/kit) 2.429 1.358 JUW 2.3 + 3.3 - Dilakukan replikasi: 2x ekstraksi (sampel @100 mg/kit  pooled ) 10.327 1.584 1
Tabel 1. Hasil optimasi replikasi sampel untuk perolehan DNA.
Kode Sampel Hasil Kuantifikasi Konsentrasi (ng/μl) Kemurnian (A260/A280) MIR (M) 15.0 0.92 ADS (M) 8.6 1.37 MAH (M) 3.9 1.07 AJM (M) 14.46 1.43 F_MIR (M) 22.96 1.85 F_ADS (M) 10.8 2.15 F_MAH (M) 27.74 1.40 F_AJM (M) 24.7 1.70 1
Tabel 2. Hasil optimasi penggunaan Qiagen DNeasy PowerSoil Kit dan MP Bio FastDNA Spin Kit for Soil .
for menghasilkan  konsentrasi  dan  kemurnian  DNA yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan Qiagen DNeasy ® PowerSoil ® Kit dengan  rasio  konsentrasi rata-rata 2,6:1. Tabel 2 menunjukkan perbedaan hasil optimasi  menggunakan  sampel  yang  sama  dengan 2  kit  ekstraksi  berbeda.  Pada  tabel  tersebut,  kode sampel berawalan huruf “F” merupakan sampel yang diekstraksi menggunakan MP Bio FastDNA Spin Kit for Soil .
Perbedaan antara kedua kit yang digunakan adalah Qiagen DNeasy PowerSoil kit menggunakan Inhibitor Removal Technology (IRT) yaitu reagen yang mampu mengendapkan bahan-bahan organik dan anorganik non -DNA termasuk zat humat, sel debris, dan protein yang merupakan inhibitor PCR.
Proses pelisisan dilakukan secara mekanis dengan bead  beating dan  secara  kimia  dengan  larutan  C1 yang  mengandung Sodium  Dodecyl  Sulfate (SDS). Sementara FastDNA Spin Kit For Soil menggunakan
tabung Lysing  Matrix ,  campuran  partikel  keramik, silika, dan manik-manik kaca yang dirancang untuk pelisisan sel dengan bantuan larutan dapar MT  dan dapar Sodium  Phosphate ,  reagen  yang  berfungsi melindungi dan melarutkan asam nukleat dan protein saat pelisisan sel. Kedua kit ini menggunakan bead beating dalam  proses  pelisisan  sel. Bead  beating menghasilkan perolehan DNA dan jumlah OTU yang lebih tinggi pada bakteri yang sulit untuk dilisiskan seperti bakteri gram positif (14) . Proses pengikatan DNA kedua kit ini menggunakan kolom dengan membran berbasis silika.
Berdasarkan  eﬁ siensi  waktu,  proses  ekstraksi menggunakan FastDNA  Spin  Kit  for  Soil hanya membutuhkan  waktu  kurang  dari  2  jam  sementara Qiagen DNeasy PowerSoil kit membutuhkan proses yang lebih lama yaitu hingga 5 jam. Proses pelisisan menggunakan bead  beating pada Qiagen  DNeasy PowerSoil Kit membutuhkan waktu 20 menit ketika
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia  178
Vol 19, 2021
dihomogenkan  dengan  vorteks  dengan  kecepatan maksimum. Proses pelisisan sel dengan bead beating pada  kecepatan  yang  lebih  tinggi  dan  waktu  lebih lama  dapat  menghasilkan  lebih  banyak  DNA  yang terdegradasi (15) .
Sampel yang diekstraksi menggunakan MP Bio FastDNA Spin Kit for Soil menghasilkan konsentrasi dan kemurnian yang lebih tinggi karena menggunakan sejumlah besar bahan pengikat (16) . Proses pengikatan MP  Bio  FastDNA  Spin  Kit  for  Soil menggunakan suspensi binding matrix dengan  waktu  inkubasi selama 5 menit pada suhu 55 o C sehingga DNA akan berikatan dengan matriks silika karena adanya garam
chaotropic  sebagai  kondisi  penyesuaian  pengikatan DNA  untuk  kemudian  berikatan  dengan  membran silika  pada  kolom.  Teknik  ini  didasarkan  pada prinsip pengikatan selektif DNA bermuatan negatif dengan  permukaan  silika  yang  dilapisi  dengan  ion bermuatan positif. Sementara itu, proses pengikatan DNA  menggunakan Qiagen  DNeasy  PowerSoil  kit hanya terjadi pada membran silika pada kolom dengan waktu inkubasi selama 10 menit yang menyebabkan proses  pengikatan  DNA  menjadi  kurang  optimal. Pada MP Bio FastDNA Spin Kit for Soil , digunakan tabung falcon 15 mL sehingga proses pencampuran
Nama Sampel Optimasi Hasil Kuantifikasi Konsentrasi (ng/μl) Kemurnian (A260/A280) F_MAH (M) Sampel  segar  (disimpan  kurang  dari 48 jam) 27.749 1.406 F_MIR (M) 22.962 1.853 Fro_F_MAH (M) Sampel beku (disimpan lebih dari 48 jam) 13.80 1.50 Fro_F_MIR (M) 10.50 1.80 1 Tabel 3. Hasil optimasi berdasarkan kondisi sampel.
dan  pengikatan  DNA  dengan binding  matrix akan lebih  maksimal  karena  menggunakan  tabung  yang lebih besar.
3.   Kondisi Sampel Optimasi sampel mekonium berdasarkan kondisi sampel menggunakan MP Biomedicals FastDNA Spin Kit for Soil pada Tabel 3 menunjukkan bahwa sampel segar  menghasilkan  konsentrasi  DNA  yang  lebih tinggi daripada sampel beku.
Hal ini karena pada sampel beku terjadi siklus pencairan beku dan ﬂ uktuasi suhu berulang. Siklus pencairan  beku  merupakan  faktor  utama  penyebab degradasi  DNA  pada  suatu  sampel  yang  dapat menyebabkan  kualitas  DNA  metagenomik  buruk. Perubahan  suhu  yang  signifikan  juga  merupakan tekanan  bagi  banyak  mikrobiota  di  sampel,  karena
dapat membunuh mikroba dan memperbesar degradasi DNA (17) .
Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Panek et  al (18) mengidentiﬁ kasi penurunan rasio ﬁ lum Firmicutes/ Bacteroidetes , yang merupakan bakteri yang banyak terdapat di mekonium dan feses serta penurunan rasio Lachnospiraceae dan Bacteroidaceae ketika sampel dibekukan pada suhu -20 °C. Secara umum, hasil DNA genomik akan berkurang jika sampel disimpan pada 2-8 °C atau -20 °C tanpa perlakuan sebelumnya seperti penambahan gliserol atau media pengawet lainnya (19) . 4.     Preparasi Sampel
Penambahan  tween-80  10%  sebanyak  1  mL untuk  melarutkan  sampel  mekonium  dan  feses menghasilkan  konsentrasi  asam  nukleat  yang  lebih kecil  dibandingkan  dengan  sampel  yang  dilarutkan
Kode Sampel Optimasi Hasil Kuantifikasi Konsentrasi (ng/μl) Kemurnian (A260/A280) TRI (M) - Dilakukan replikasi: 2x ekstraksi (sampel @100 mg/kit  pooled) - Penambahan ddH 2 O 1 ml 6.161 0.983 SUS (4) 57.041 1.797 (t) TRI (M) -  Dilakukan replikasi: 2x ekstraksi (sampel @100 mg/kit  pooled) - Penambahan tween 80 10% 1 ml 0.896 1.505 (t) SUS (4) 4.113 1.765
Tabel 4. Hasil optimasi tahap preparasi sampel mekonium.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
179   MALIK ET AL.
dalam  ddH 2 O  dengan  rasio  konsentrasi  6,8:1  pada sampel mekonium dan 13,8:1 pada sampel feses. Tabel 4 menunjukkan perolehan hasil optimasi tahap  preparasi  sampel  meconium.  Konsentrasi asam  nukleat  yang  diperoleh  lebih  rendah  dengan adanya penambahan tween-80 10%, namun dengan kemurnian  lebih  tinggi.  Hal  ini  disebabkan  karena tween 80 adalah surfaktan nonionik polisorbat, sebuah molekul yang memecah gumpalan lipid.
Molekul tween 80 akan mengikat lipid dan air, sehingga tween 80 mampu melarutkan atau melisiskan membran  sel  menyebabkan  membran  sel  bakteri akan rusak dan DNA akan terbawa ke dalam larutan tween-80 10% (20) . Bagian yang diambil untuk diproses lebih  lanjut adalah bagian pellet  bukan supernatan, sedangkan  DNA  sudah  terlarut  bersama  dengan larutan tween-80 yang merupakan supernatan. Oleh karena itu, DNA yang dipreparasi dengan melarutkan dalam tween-80 10% menghasilkan konsentrasi yang
lebih rendah. 5.    Tahap Elusi DNA
Elusi  DNA  menggunakan  volume  dapar  elusi yang  lebih  sedikit  menghasilkan  konsentrasi  DNA yang lebih tinggi. Untuk memperoleh DNA genomik yang lebih pekat atau konsentrat, volume elusi dapat dikurangi sampai 35 μL. Jika volume kurang dari 35 μL  digunakan  untuk  elusi,  fraksi  yang  lebih  besar dari dapar elusi akan tertahan, yang mengakibatkan hilangnya  korelasi  linear  antara  volume  elusi  dan hasil perolehan DNA (21) . Pada Tabel 5 menunjukkan adanya korelasi dimana semakin banyak volume dapar elusi yang ditambahkan ke membran pengikat DNA akan menghasilkan volume yang lebih banyak dengan konsentrasi yang lebih sedikit (22) .
Kuantiﬁ kasi DNA Hasil Ekstraksi. Sampel DNA dikatakan murni ketika A260/280~1.8 – 2.0 (23) . Pada tahap kuantiﬁ kasi, rasio A260/280 yang kurang dari 1,8  menunjukkan  sampel  terkontaminasi  residu
Kode Sampel Optimasi Hasil Kuantifikasi Kosentrasi (ng/μl) Kemurnian (A260/A280) JUW1.1 - 1x ekstraksi - Volume dapar elusi 60 µl 3.572 1.254 JUW2.1+3.1 - 2x ekstraksi - Volume dapar elusi 60 µl 6.894 1.05 JUW1.2 - 1x ekstraksi - Volume dapar elusi 40 µl 2.085 1.129 JUW2.2+3.2 - 2x ekstraksi - Volume dapar elusi 40 µl 9.018 1.302 JUW1.3 - 1x ekstraksi - Volume dapar elusi 30 µl 2.429 1.358 JUW2.3+3.3 - 2x ekstraksi - Volume dapar elusi 30 µl 10.327 1.584 Tabel 5. Hasil optimasi berdasarkan volume dapar elusi.
Gambar 1. Konsentrasi perolehan DNA sampel mekonium dan feses.
Gambar 2. Kemurnian perolehan DNA sampel mekonium dan feses.
senyawa fenolik, TRIzol, garam chaotropic (guanidine HCL, guanidine isotiosianat) atau reagen lain yang digunakan pada protokol ekstraksi. Sedangkan rasio A260/280 lebih dari 2,0 menunjukkan kualitas blanko yang  buruk  ketika  blanking karena  menghilangkan terlalu banyak serapan di dekat panjang gelombang 280  nm (24) .  Gambar  1  dan  Gambar  2  menunjukkan hasil  kuantifikasi  dan  kemurnian  seluruh  sampel
mekonium dan feses.
Visualisasi  DNA  Genomik  dan Amplikon. Visualisasi  DNA  genom  dan  amplikon  dilakukan untuk  memastikan  bahwa  DNA  dapat  diekstraksi dari  sampel  mekonium  dan  feses  dan  DNA  yang diampliﬁ kasi sesuai dengan ukuran yang diharapkan ±500  bp.  Hasil  elektroforesis  DNA  genomik  pada
Gambar 3. Hasil elektroforesis DNA genomik.
Gambar 3 menunjukkan bahwa pita DNA tidak terlihat jelas  di  semua  sampel.  Hal  ini  dapat  disebabkan karena  konsentrasi  DNA  pada  hasil  ekstraksi  yang masih  terlalu  kecil  untuk  dapat  dideteksi  dalam
gel  elektroforesis.  Selain  itu,  volume  sampel  yang ditambahkan  cukup  sedikit  yaitu  hanya  3  μL, sedangkan  menurut  literatur  pada  tahap  preparasi sampel digunakan DNA sampel sebanyak 6 μL untuk
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
181  MALIK ET AL.
dicampur dengan loading dye sebanyak 1 μL (19) .
Sementara itu, pita DNA yang ditargetkan dari mekonium  dan  sampel  feses  dari  produk  yang diampliﬁ kasi adalah 500 bp sesuai dengan area target yang diampliﬁ kasi, V1-V3, yaitu sekitar 500 bp. Hasil elektroforesis  pada  DNA  yang  diampliﬁ kasi  dapat dilihat pada Gambar 4 menunjukkan pita DNA yang terlihat  jelas  hampir  disemua sampel  dan  memiliki ukuran seragam sekitar 500 bp sesuai target. Dari seluruh sampel tersebut, DNA sampel F_AJM (M) menunjukkan pita yang paling baik karena tidak adanya pita pengotor serta intensitas pita yang jelas. Sampel tersebut dioptimasi dengan dilakukan replikasi sebanyak 2 kali, dilarutkan dengan ddH 2 O sebanyak 1  mL  pada  tahap  preparasi  sampel,  menggunakan sampel  segar,  menggunakan  volume  dapar  elusi sebanyak 30 µL, dan diekstraksi menggunakan MP Biomedicals  FastDNA  Spin  Kit  for  Soil .  Secara keseluruhan, sampel yang diekstraksi menggunakan Qiagen DNeasy PowerSoil menghasilkan pita DNA target yang lebih jelas tetapi juga banyak pita pengotor jika dibandingkan dengan MP Biomedicals FastDNA Spin Kit . Hal ini menunjukkan IRT ( Inhibitor Removal Technology )  yang  digunakan  oleh Qiagen  DNeasy PowerSoil belum  cukup  baik  jika  dibandingkan dengan reagen PPS ( Protein Precipitation Solution ) yang  digunakan  oleh  MP  Biomedicals  FastDNA Spin Kit dalam mengendapkan inhibitor PCR yang terkandung  didalam  sampel  mekonium  dan  feses neonatus.
Pita-pita  pengotor  menunjukkan  kualitas  dan kuantitas yang belum terbaik pada proses ekstraksi. Selain  pita  amplikon non -spesiﬁ k,  noda  ( smear )  di bagian  bawah  gel  agarose  menunjukkan  tampilan RNA yang ada dalam sampel (25) . Munculnya pita yang bukan pita DNA target selain karena hasil ekstraksi yang tidak murni, juga dapat dipengaruhi oleh suhu annealing yang masih terlalu rendah dan siklus PCR terlalu banyak. Jika suhu annealing lebih rendah dari suhu  annealing  ideal,  sebagian  besar  primer  akan menempel  pada  urutan  DNA  target  spesiﬁ k. Tetapi ada  beberapa  primer  yang  menempel  pada  target yang tidak spesiﬁ k. Dalam kondisi tersebut, akan ada beberapa pita selain pita amplikon target yang muncul pada gel agarose (26) . Jumlah siklus PCR yang terlalu banyak  dapat  menyebabkan reannealing  template sehingga amplikon yang dihasilkan akan menyatu dan menjadi template untuk reaksi PCR berikutnya dan menyebabkan munculnya pita pengotor (27) .
Munculnya pita kontaminan juga dapat disebabkan oleh dapar TAE (1×tris-acetate-EDTA) yang digunakan
dalam  proses  elektroforesis  sudah  tidak  segar  dan baru. Akibatnya,  konsentrasi  dapar  akan  berubah selama  elektroforesis  sehingga  mengganggu  proses migrasi DNA dan menyebabkan munculnya pita DNA kontaminan. Selain itu, kemungkinan fragmen DNA sisa  proses  elektroforesis  sebelumnya  yang  belum tuntas terdegradasi berpotensi sebagai tampilan pita kontaminan ketika dapar TAE (1×tris-acetate-EDTA) yang sama digunakan kembali (28) .
Walaupun  demikian,  DNA  amplikon  yang diperoleh  pada  penelitian  ini  sudah  menunjukkan kualitas  dan  kuantitas  memadai  untuk  dilakukan langkah selanjutnya yaitu Next-Generation Sequencing (NGS), dan dianggap dapat dipertanggungjawabkan keabsahannya.  Namun,  untuk  menjamin  kualitas analisis  bioinformatik,  maka  pada  analisis  hasil NGS,  data  yang  diperoleh  tetap  akan  diterapkan tahap  pembersihan  data  sehingga  diperoleh  data bersih ( Clean Data ) (29) ; data bersih tersebut kemudian akan  diproses  dalam  beragam  program  analisis bioinformatika

## SIMPULAN
Optimasi  perolehan  sampel  DNA  yang  dilakukan menunjukkan  perolehan  paling  baik  yaitu  dengan melakukan  sebagai  berikut:  (i)  replikasi  sebanyak 2  kali,  (ii)  pelarutan  dalam  ddH 2 O  pada  tahap preparasi sampel, (iii) penggunaan sampel segar, (iv) penggunaan volume dapar elusi yang lebih sedikit, dan (v) ekstraksi menggunakan MP Biomedicals FastDNA Spin  Kit  for  Soil .  Sedangkan  sampel  terbaik  hasil perolehan  DNA  nya  adalah  sampel  mekonium  dan feses AJM. DNA yang dihasilkan dari optimasi tersebut berupa DNA dengan konsentrasi dan kemurnian yang lebih  tinggi  terutama  untuk  sampel  mekonium.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Para  penulis  menghaturkan  terima  kasih  atas dukungan dana  dparsial dari Hibah Riset  UI 2020- 2021-  Pendampingan  Publikasi  Internasional  Q1 (PPI  Q1)  dan  Hibah  Riset  UI  untuk  Publikasi Internasional  Q1  dan  Q2  2019  (No.  NKB-0194/ UN2.R3.1/HKP.05.00/5522019)  kepada AM  dan RR.  kepada A.M.  Selain  itu  penulis  juga  sangat menghargai  dukungan  teknis  perolehan  DNA yang sangat bermakna dari D. Oktaviyani.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia  182
Vol 19, 2021

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Moore  TA,  Hanson  CK,  and Anderson-Berry A. Colonization of the gastrointestinal tract in neonates: A a review’, ICAN: Infant, Child, & Adolescent Nutrition. 2011. 3(5):291–5. doi: 10.1177/1941406411421629.
2.  Hu  J,  Nomura Y,  Bashir A,  Fernandez-Hernandez H,  Itzkowitz  S,  Pei  Z,  et  al.  Diversiﬁed  microbiota of meconium is aﬀ ected by maternal diabetes status. PLoS  ONE  8:e78257.  2013.  doi:  10.1371/journal. pone.0078257
3.  Browne PD and Cabana MD. Microbiota: in health and disease:  from  pregnancy  to  childhood. Wageningen Academic Publishers. 2017.
4.  Oktaviyani D, Alawiyyah RZ, Nusaiba P, Malik A. a review: composition of neonatal meconium microbiota and  its  role  for  potential  probiotic.  Pharmaceutical Science and Research (PSR). 2021. 8(1):15-29.
5.  Stinson LF, Keelan JA, and Payne MS. Comparison of  meconium  DNA  extraction  methods  for  use  in microbiome studies’, Frontiers in Microbiology. 2018. p. 1–14. doi: 10.3389/fmicb.2018.00270.
6.  Ardissone AN,  Cruz  DM,  Davis-Richardson AG, Rechcigl  KT,  Li  N,  Drew  JC,  et  al.  Meconium microbiome analysis identiﬁ es bacteria correlated with premature birth’, PLoS ONE. 2014. 9(3). doi: 10.1371/ journal.pone.0090784.
7.  Jiménez  E,  Marín  ML,  Martín  R,  Odriozola  JM, Olivares M, Xaus J, et al. Is meconium from healthy newborns  actually  sterile?  Res.  Microbiol.  2008. 159:187–193.
8.  Gosalbes  MJ,  Llop  S,  Valles Y,  Moya A,  Ballester F,  and  Francino  MP.  Meconium  microbiota  types dominated  by  lactic  acid  or  enteric  bacteria  are diﬀ erentially  associated  with  maternal  eczema  and respiratory problems in infants. Clin. Exp. Allergy 43. 2013. p. 198–211. doi: 10.1111/cea.12063
9.  Del Chierico F, Vernocchi P, Petrucca A, Paci P, Fuentes S, Pratico G, et al. Phylogenetic and metabolic tracking of  gut  microbiota  during  perinatal  development. PLoS ONE 10:e0137347. 2015. doi: 10.1371/journal. pone.0137347
10.  Collado  MC,  Rautava  S, Aakko  J,  Isolauri  E,  and Salminen S. Human gut colonisation may be initiated in  utero  by  distinct  microbial  communities  in  the placenta and amniotic ﬂuid. Sci. Rep. 6:23129. 2016. doi: 10.1038/srep23129
11.  Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. PCR inhibitors  -  occurrence,  properties  and  removal’, Journal  of Applied  Microbiology,  113(5).  2012.  p. 1014–1026. doi: 10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x. 12.  Albertsen M, Karst SM, Ziegler AS, Kirkegaard RH, Nielsen PH. Back to basics – the inﬂ uence of DNA extraction and primer choice on phylogenetic analysis of activated sludge communities’, PLoS One. 2015. p. 1–15. doi: 10.1371/journal.pone.0132783.
13.  Jonathan KJT, Ong G, Prasetyaningsih FA, Amandito
R, Rohsiswatmo R, Malik A.  Clinical characteristics influence  cultivable-bacteria  composition  in  the meconium of Indonesian neonates.  Heliyon 6. 2020. ttps://doi.org/10.1016/j.heliyon.2020.e05576 14.  Videnska  P,  Smerkova  K,  Zwinsova  B,  Popovici  V,
Micenkova  L,  Sedlar  K,  et  al.  Stool  sampling  and DNA isolation kits aﬀ ect DNA quality and bacterial composition  following  16S  rRNA  gene  sequencing using  MiSeq  Illumina  platform’,  Scientiﬁ c  Reports. 2019. 9(1):1–14. doi: 10.1038/s41598-019-49520-3. 15.  Bürgmann  H,  Pesaro  M, Widmer  F,  and  Zeyer  JA. strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods 45. 2001.p. 7–20.
16.  Bollmann-Giolai A, Giolai M, Heavens D, Macaulay I, Malone J, Clark MD. A low-cost pipeline for soil microbiome  profiling.  MicrobiologyOpen.  2020. 9:e1133. https://doi.org/10.1002/mbo3.1133
17.  Wu WK, Chen CC, Panyod S, Chen RA, Wu MS, Sheen LY, et al. ‘Optimization of fecal sample processing for microbiome study — The journey from bathroom to bench’. Journal of the Formosan Medical Association. 2018. doi:10.1016/j.jfma.2018.02.005 18.  Panek M, Paljetak HC, Barešić A, Perić M, Matijašić M, Lojkić I, et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota – eﬀ ects of collection, storage, DNA  extraction  and  next  generation  sequencing technologies. Sci. Rep. 2018. 8, 5143.
19.  Qiagen.  n.d.  Considerations  for  isolation  and quantiﬁ cation  of  both  genomic  DNA  and  plasmid DNA.  Diambil  dari:  https://www.qiagen.com/us/ service-and-support/learning-hub/molecular-biology- methods/dna/. Diakses 03 April 2020
20.  Thermo  Fischer.  n.d.  Detergents  for  cells  lysis and  protein  extraction.  Diambil  dari:  https://www. thermofisher.com/id/en/home/life-science/protein- biology/protein-biology-learning-center/protein- biology-resource-library/pierce-protein-methods/ detergents-cell-lysis-protein-extraction.html. Diakses 03 April 2020.
21.  New England Biolabs, Inc. Monarch ® Genomic DNA Puriﬁ cation  Kit  Table  of  Contents.  2020.  pp.  1–24. Diambil  dari:  https://www.neb.com/-/media/nebus/ ﬁ les/manuals/manualt3010.pdf?rev=358a9c46ee4141 809ebfddacfddadd9b&hash=7220E4FECD910D7F0E 1690DAD01735E8. Diakses 06 April 2020.
22.  Bychinski A. and Wieczorek D. The eﬀ ects of decreasing elution volumes on plasmid DNA concentration and yield  using  Eluator™  Vacuum  Elution  Device’. Promega Corporation Web  site. 2009. Diambil dari: https://worldwide.promega.com/resources/pubhub/ the-eﬀ ects-of-decreasing-elution-volumes-on-plasmid- dna-concentration-and-yield/. Diakses 07 April 2020.
23.  Pachchigar  KP,  Khunt  A,  Hetal  Bhilocha.  DNA quantiﬁ cation.  ICAR  Sponsored  summer  school  on Allele  mining  in  crops:  Methods  and  Utility,  18th July-7th August, 2016.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
183   MALIK ET AL.
24.  Therm o  Sci entific.   Inter pre ti ng  Nanodro p (Spectrophotometric)  Results.  2016.  Diambil dari:  https://tools.thermofisher.com/content/sfs/ manuals/3091-NanoDrop-One-Help-UG-en.pdf. Diakses 04 April 2020.
25.  Genetic Education. n.d. A complete guide for analysing and interpreting gel electrophoresis results. Diambil dari: https://geneticeducation.co.in/a-complete-guide- for-analysing-and-interpreting-gel-electrophoresis- results/. Diakses 07 April 2020
26.  Shenghe C, Wei S, Zhaoxi Z, Jingyang L, Minjie D, Haiyan S. A weird DNA band in PCR and its cause. Journal  of  Plant  Science  and  Molecular  Breeding. 2016. 5(1):2. doi: 10.7243/2050-2389-5-2.
27.  Suzuki  MT  and  Giovannoni  SJ.  Bias  caused  by template  annealing  in  the  ampliﬁ cation  of  mixtures of  16S  rRNA  genes  by  PCR’,  Journal Applied  and Environmental  Microbiology.    1996.  Doi:  10.1128/ aem.62.2.625-630.1996
28.  Chauhan  T. A  complete  guide  for  analysing  and interpreting gel electrophoresis results. 2018.  Diambil dari:  https://geneticeducation.co.in/a-complete-guide- for-analysing-and-interpreting-gel-electrophoresis- results/. Diakses 07 April 2020.
29.  Zhang  M,  Sun  H,  Fei  Z,  Zhan  F,  Gong  X  and  Gao S, “Fastq_clean: An optimized pipeline to  clean the Illumina sequencing data with quality control,” 2014 IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine (BIBM), 2014, pp. 44-48, doi: 10.1109/ BIBM.2014.6999309.