Ekspresi gen aromatase pada pengarahan diferensiasi kelamin ikan nila ( Oreochromis niloticus Linnaeus 1758) menggunakan madu
[Aromatase gene expression of sex reversal Nile tilapia ( Oreochromis niloticus Linnaeus 1758) using honey]
Eny Heriyati 1 , Alimuddin 2 , Harton Arfah 2 , Agus Oman Sudrajat 2
1 Sekolah Tinggi Pertanian Kutai Timur. Jl. Soekarno Hatta No.2. Kalimantan Timur 57611. Surel: eny_heriyati@yahoo.com
2 Departemen Budi daya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB Bogor 16680. Surel: alimuddin_alsani@yahoo.com
Diterima: 23 Maret 2014; Disetujui: 20 Januari 2015

## Abstrak
Budi daya ikan nila dengan populasi jantan semua (monoseks) lebih memberikan keuntungan karena laju pertumbuhan- nya  lebih  cepat  dan  dapat  mencegah  pemijahan  liar.Teknik  pengarahan  diferensiasi  kelamin( sex  reversal )  digunakan untuk  mengarahkan  pembentukan  jenis  kelamin  pada  budi  daya  ikan.Penelitian ini  dilakukan  untuk  mengevaluasi  pe- ngaruh perendaman larva ikan nila menggunakan tiga sumber  madu berbeda terhadap persentase ikan jantan dan eks- presi gen aromatase. Pada percobaan satu, 30 larva ikan nila berumur 12 hari setelah menetas direndam menggunakan madu  hutan,  madu  ternak  dan  madu  bakau, dengan  dosis  10  ml  L -1 air  selama  10  jam.  Ikan  dipelihara  dalam  kondisi yang  sama  selama  dua  bulan.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  persentase  ikan  jantan  tidak  berbeda  nyata  antar perlakuan  madu  (p>0,05),  tetapi semuanya  berbeda  nyata  dengan  kontrol  (p<0,05). Pada  percobaan  kedua,  larva  ikan nila direndam dalam air mengandung dua bahan bioaktif madu, yakni chrysin dan kalium dengan dosis masing-masing 20 mg L -1 dan 0,026 g L -1 . Ekspresi gen aromatase tipe gonad (aroma-g) dan tipe otak (aroma-o) dianalisis mengguna- kan metode RT-PCR. Sampel jaringan diambil pada waktu 1, 6, 12, 24, dan 48 jam pascaperlakuan madu, chrysin , dan kalium, serta setelah ikan berumur dua bulan.Ukuran fragmen DNA aromatase pada gonad betina sekitar 200 bp. Peren- daman chrysin dan kalium meningkatkan persentase ikan jantan (p<0,1). Analisis RT-PCR menunjukkan bahwa madu, chrysin ,  dan  kalium  dapat  menekan  ekspresi  gen  aroma-g  pada  jam  ke-12  pascaperendaman.  Dengan  demikian  dapat disimpulkan bahwa madu, chrysin dan kalium dapat digunakan untuk pengarahan diferensiasi ikan nila, dan mekanis- menya seperti penghambat aromatase.
Kata kunci: diferensiasi kelamin, gen aromatase, ikan nila, madu

## Absract
In tilapia aquaculture, all male populations are preferred because they achieve higher growth rates and prevent uncon- trolled reproduction. Sex reversal techniques are largely used for the control of sex in fish farming and in  fundamental studies  on  sex  determinism  mechanisms.  The  study  was  conducted  to  determine  the  effect  of  immersion  Nile  tilapia larvae in water containing different honey source on male percentage and aromatase gene expression. In experiment I, a total of 30 tilapia larvae at 12 days post hatch were immersed in water containing honey derived from the forest,  cul- tured  and  mangrove  bees,  at  a  dose  of  10  ml  L -1 for  10  hours.  Fish  were  maintained  in  the  same  condition  for  two months. The results showed that percentage of male fish was similar among honey treatments (p>0.05), and they were significantly different with the control (p<0.05). In experiment II, fish were immersed in two bioactive compounds of honey, namely chrysin and potassium solution in a dose of 20 mg L -1 and 0.026 g L -1 , respectively, to verify the bio- active affects sex differentiation. Aroma-g expression was analyzed by RT-PCR method. Tissue was collected at 1, 6, 12, 24 and 48 hours after immersion, and 2-month-old fish. Size fragment DNA aroma-g of female 200 bp. Chrysin and potassium immersion increased male percentage (p<0.1), this indicated that both materials  were involved in  Nile tila- pia sex differentiation. RT-PCR analysis showed that honey, chrysin and potassium down-regulated aroma-g expression at 12 hours post im-mersion. Thus, honey can be used for sex reverse of Nile tilapia, and the mechanism is most likely as aromatase inhibitors.
Keywords: aromatase, honey, Nile tilapia, sex reversal

## Pendahuluan
Ikan nila jantan memiliki laju pertumbuh- an  sekitar  dua  kali  lebih  cepat  dibandingkan  de-
ngan ikan betina, sehingga tingkat produksi, dan potensi keuntungan budi daya ikan nila jantan se- mua  (monoseks)  adalah  lebih  tinggi.  Salah  satu cara untuk memproduksi populasi monoseks jan-
 Penulis korespondensi
Alamat surel : alimuddin_alsani@yahoo.com
tan adalah dengan teknologi pengarahan diferen- siasi kelamin ( sex reversal ), yakni suatu teknolo- gi  yang  mengarahkan  diferensiasi  kelamin  men- jadi  jantan,  dan  dilakukan  pada  saat  gonad  ikan belum  terdiferensiasi.  Cara  yang  umum  dilaku- kan  untuk  memperoleh  ikan  monoseks  adalah menggunakan  hormon  steroid  17α-metiltestoste- ron (MT) dan penghambat aromatase ( aromatase inhibitor ,  AI)  seperti  fadrozole.  Akan  tetapi penggunaan  hormon  MT  diduga  dapat  bersifat karsinogenik  pada  manusia  dan  AI  tidak  dijual bebas  di  pasaran,  sehingga  untuk  mengatasinya diperlukan  bahan  alternatif  lain  yang  aman  dan mudah  diperoleh.  Madu  merupakan  bahan  alami mengandung  flavonoid chrysin yang  diduga  da- pat  berfungsi  sebagai  penghambat  kerja  enzim aromatase.  Madu  bersifat  ramah  lingkungan  dan kandungan  mineralnya  tinggi,  terutama  kalium. Kalium  dalam  madu  diduga  berfungsi  sebagai pengarah  diferensiasi  kelamin  ikan  melalui  mo- dulasi  peredaran  testosteron,  dan  pengendalian tindakan androgen.
Penggunaan madu untuk mengarahkan di- ferensiasi  kelamin  telah  dilakukan,  baik  melalui pakan  maupun  perendaman.  Syaifuddin  (2004) telah  melakukannya melalui pakan buatan untuk larva  ikan  nila  GIFT  dengan  dosis  200  mL  kg -1 pakan,  dan  menghasilkan  ikan  jantan  sebanyak 93,33%, sementara pada kontrol 57,78%. Soelis- tyowati et  al. (2007)  melakukan  perendaman menggunakan  madu,  terhadap  induk  ikan  gapi ( Poecillia  reticulata )  dan  menghasilkan  jantan sebesar  59,5%,  sedangkan  pada  kontrol  24,3%. Utomo  (2008)  melakukan  perendaman  menggu- nakan  larutan  madu    terhadap  larva  ikan  gapi menghasilkan  jantan  56,68%,  sedangkan  pada kontrol 47,16%. Mukti et al. (2008) memberikan madu melalui pakan pada induk lobster air tawar red claw ( Cherax quadricarinatus ) menghasilkan jantan  sebesar  60,35%,  sedangkan  pada  kontrol
50,56%. Penggunaan  madu  melalui pakan terha- dap  ikan  nila  dapat  menghasilkan  nila  jantan yang  cukup  signifikan  (Syaifuddin  2004).  Na- mun  demikian,  hal  ini  kurang  ekonomis  karena dosis  madu  yang  digunakan  relatif  tinggi  (200 mL  kg -1 pakan),  sehingga  perlu  dilakukan  uji penggunaan  madu  melalui  metode  massal  lain- nya, yakni perendaman.
Sebagian besar gen pembentuk jenis kela- min pada ikan hampir sama dengan gen Sry pada mamalia  dan  sudah  diidentifikasi  pada  sebagian ikan, tetapi tidak demikian pada ikan nila (Kiku- chi & Hamaguchi 2013). Pada spesies ini ekspre- si gen spesifik jenis kelamin yang sangat potensi- al  dalam  pengarahan  jenis  kelamin  terdapat  di gonad  (Ijiri et  al .  2008)  dan  di  otak  (Poonlaph- decha et al. 2011). Regulasi diferensiasi kelamin di  dalam  tubuh  ikan  dapat  dilihat  dari  level  aro- matase. Terdapat dua jenis aromatase,  yaitu aro- matase tipe satu (atau disebut tipe gonad) dan ti- pe  dua  (tipe  otak).  Aktivitas  enzim  aromatase berkorelasi  dengan  struktur  gonad,  yaitu  larva dengan  aktivitas  aromatase  rendah  akan  menga- rah pada terbentuknya testis, sedangkan aktivitas aromatase yang tinggi akan mengarahkan terben- tuknya ovari (Sever et al . 1999).
Dalam  penelitian  ini  digunakan  tiga  jenis madu,  yaitu  madu  hutan  (madu  yang  diperoleh dari beberapa macam nektar bunga dari lebah liar di hutan), madu ternak (madu yang diperoleh da- ri nektar tanaman tertentu oleh lebah  yang dibu- didayakan),  dan  madu  bakau  (madu  dari  nektar tanaman  bakau  oleh  lebah  di  daerah  hutan  ba- kau).  Pemilihan  tiga  jenis  madu  ini  berdasarkan cara  madu  yang  diperoleh  dari  perbedaan  nektar bunga. Analisis kandungan madu, dan pemberian chrysin dan  kalium  juga  berpotensi  besar  dapat menjelaskan  perbedaan  aktivitas  madu  uji,  dan bahan  yang  berperan  dalam  pengarahan  diferen- siasi  kelamin  ikan  nila.  Penelitian  ini  bertujuan
untuk  mengevaluasi  pengaruh  perendaman  larva ikan nila menggunakan tiga sumber madu berbe- da terhadap pengarahan diferensiasi kelamin ikan nila,  dan  menguji  bahan  aktif  dalam  madu  yaitu chrysin dan kalium yang diduga berperan penting dalam  mengarahkan  diferensiasi  kelamin  menja- di  jantan,  serta  untuk  melihat  perlakuan  peren- daman madu, chrysin dan kalium terhadap pene- kanan ekspresi gen aromatase.

## Bahan dan metode
Penelitian  dilakukan  pada  bulan  Maret hingga  Juni  2012.  Metode  yang  digunakan  ada- lah  eksperimen  yang  terdiri  atas  dua  percobaan. Percobaan  pertama  untuk  mengevaluasi  respon perlakuan perendaman larva ikan nila mengguna- kan  madu.  Percobaan  ke  dua  perendaman  larva menggunakan air  mengandung dua bahan bioak- tif  madu,  yaitu chrysin dan  kalium.  Selanjutnya menganalisis ekspresi gen aromatase yang terda- pat  pada otak  dan  gonad  ikan  pascaperendaman, serta mengidentifikasi jenis kelamin ikan.
Madu  yang digunakan terlebih dahulu di- analisis  kandungannya,  yaitu  analisis  proksimat dilakukan di Laboratorium Nutrisi Ikan, Departe- men Budi daya Perairan,  Fakultas Perikanan dan Ilmu  Kelautan  Institut  Pertanian  Bogor  (IPB). Pengukuran kadar kalium menggunakan alat ato- mic  absorbtion  spectrophotometer dilakukan  di
Laboratorium  Jasa  Analisis  Fakultas  Teknologi Pertanian (Fateta) IPB, pH madu diukur di Labo- ratorium  Instrumen  Departement  Teknologi  In- dustri  Pertanian-Fateta  IPB,  dan  kadar  total  fla- vonoid  di  Laboratorium  Biofarmaka  Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat IPB.

## Percobaan I
Penelitian satu dilakukan untuk mengeva- luasi  respons  ikan  nila  terhadap  perendaman  da- lam madu dengan sumber berbeda. Penelitian ini dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap
(RAL) dengan empat perlakuan, dan masing-ma- sing dengan tiga ulangan. Perlakuan yang diberi- kan  adalah  perbedaan  sumber  madu,  yaitu  madu hutan,  madu  ternak,  madu  bakau,  dan  kontrol (perlakuan  tanpa  pemberian  madu).  Madu  hutan diperoleh dari hutan Sono di Gunung Kidul, ma- du ternak diperoleh dari peternakan lebah di Gu- nung  Kidul,  dan  madu  bakau  dari  hutan  bakau Tanjung Jabung, Jambi.
Dosis  madu  yang  digunakan  (10  mL  L -1 air)  dan  lama  perendaman  (10  jam)  berdasarkan penelitian pendahuluan. Larutan madu dibuat de- ngan cara mencampurkan sebanyak 10 mL madu dengan  1  liter  air,  kemudian  dihomogenkan  de- ngan  cara  pengadukan  dan  diaerasi.  Larva  ikan nila  yang  digunakan  adalah  varietas  nirwana  di- peroleh dari Balai Benih Perikanan Budidaya Air Tawar  Sukabumi.  Larva  ikan  yang  telah  diberi perendaman,  dipelihara  dalam  akuarium  dengan volume air 30 L dan kepadatan 1 ekor L -1 sampai ikan berumur satu bulan, dan diberi pakan berupa cacing sutera ( Tubifex sp.) secara ad libitum . Pe- meliharaan ikan dilanjutkan di dalam hapa 1x1x1 m 3 yang  dipasang  di  kolam  beton  berukuran 20x10x1,5  m 3 sampai  ikan  berumur  dua  bulan. Ikan diberi pakan komersial (kadar protein 38%) secara at satiation dengan  frekuensi tiga kali se- hari.

## Percobaan II
Percobaan dua dilakukan untuk mengeva- luasi respons ikan nila terhadap chrysin dan kali- um.  Percobaan  dua  juga  menggunakan  RAL  de- ngan tiga perlakuan, dan tiga ulangan. Perlakuan yang diberikan adalah perendaman dengan chry- sin (PhysiaMuscle , USA), kalium (KH 2 PO 4 ), dan kontrol.  Perendaman  menggunakan  kalium  dila- kukan  sesuai  dengan  dosis  hasil  analisis  kan- dungan  kalium  dalam  madu  yang  digunakan  da- lam  percobaan  I,  yaitu  0,026  g  L -1 dengan  lama perendaman  10  jam.  Pada  perendaman  menggu-
nakan chrysin, dosis  yang  digunakan  adalah  20 mg  L -1 berdasarkan penelitian  yang telah dilaku- kan oleh Dabrowski et al . (2005) selama 10 jam.
Sebelum  dilakukan  perendaman  menggunakan dosis dan lama waktu tersebut, dilakukan uji pen- dahuluan untuk lama waktu perendaman 10 jam. Chrysin dilarutkan dalam dimetil sulfoksida 1%.
Metode pemeliharaan ikan pasca-perendaman sa- ma dengan yang dilakukan pada percobaan I.
Analisis  ekspresi  gen  aromatase  dan  identifikasi jenis kelamin
Identifikasi  jenis  kelamin  dilakukan  de- ngan  menganalisis  gonad  ikan  nila  setelah  beru- mur  dua  bulan  menggunakan  metode  asetokar- min  (Guerrero  &  Shelton  1974).  Ekspresi  gen aromatase  dianalisis  menggunakan  metode Re- verse  Transcriptase (RT)- Polymerase  Chain Reaction (RT-PCR).  Sampel  jaringan  diambil pada  waktu 1, 6, 12, 24, dan 48 jam pascaperla- kuan  madu, chrysin ,  dan  kalium,  serta  setelah ikan berumur dua bulan. Pada fase larva, ribonu- kleat  acid  (RNA)  total  diekstraksi  dari  setengah bagian depan badan 6 ekor larva, sedangkan pada ikan  berumur  dua  bulan  adalah  otak  dan  gonad. RNA  total  diekstraksi  menggunakan  Isogen (Nippon Gen, Japan) sesuai dengan prosedur da- lam manual. Pelet RNA dilarutkan dengan 30 µL diethylpyrocarbonate  (DEPC)  0,1%.  Konsentra- si RNA total hasil ekstraksi diukur menggunakan RNA/DNA calculator (GeneQuant)  pada  pan- jang gelombang 260 dan 280 nm.
Sintesis  cDNA  dari  RNA  total  dilakukan menggunakan  kit ready-to-go  you-prime  first strand  beads, FSRMB  (GE  Healthcare)  dengan prosedur sesuai dengan  manual.  Sebanyak 3 µg RNA  total  dilarutkan  dalam  30  µL  DEPC,  diin- kubasi pada suhu 65 o C selama 10 menit, dan ke- mudian  disimpan  di  atas  es  ( on  ice ).  Sampel RNA  dipindahkan  ke  dalam  tabung  berisi  kit
FSRMB, dan ditambahkan 3 µL primer ’ dT3’RA CE-VECT’  (5’GTAATACGACTCACTATAGG GCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT
TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)  dengan  konsen- trasi 1 µg 3 µL -1 . Larutan dihomogenkan, dan se- lanjutnya  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  1 jam.  cDNA  yang  terbentuk  ditambahkan  50  µL steril distillation water ,  dan disimpan dalam fre- ezer -20°C hingga akan digunakan.
Primer  didesain  berdasarkan  sekuen  gen aromatase tipe gonad (aroma-g) dan otak (aroma- o)  ikan  mujair  (no  akses:  AF135850  dan  AF135 851).  Primer  tersebut  adalah  tiArm1-F:  5’-ATG GATCTGATCTCTGCTTGT-3’dan tiArm1- R:5’-CAAACCAAACAGAAAGAAGG-3’  un- tuk aromatase tipe gonad, dan tiArm2-F: 5’-ATG CTCCGGTAGAGGAGCTC-3’dan tiArm2-R: 5’-CTCTCCGTTTATCCA-CCG-3’  untuk  tipe otak. Kondisi PCR yang digunakan untuk ampli- fikasi  aroma-g  adalah  pre-denaturasi  94°C  sela- ma 3 menit, 35 siklus pada denaturasi 94°C sela- ma 30 detik, annealing 54°C selama 30 detik dan ekstensi 72°C selama 30 detik, serta ekstensi ak- hir  72°C  selama  3  menit.  Kondisi  PCR  yang  di- gunakan  untuk  amplifikasi  aroma-o  adalah  pre- denaturasi  94°C  selama  3  menit,  35  siklus  pada denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 59°C selama 30 detik dan ekstensi 72°C selama 30 de- tik, serta ekstensi akhir 72°C selama 3 menit. Ha- sil  PCR  diseparasi  menggunakan  elektroforesis dengan gel agarosa 1%. DNA divisualisasi deng- an pewarna etidium bromida menggunakan caha- ya ultraviolet.

## Parameter uji dan analisis statistik
Parameter yang diamati sebagai berikut : a. Nisbah ikan jantan =   Jumlah ikan berkelamin jantan x 100% Jumlah ikan yang diamati
b. Laju pertumbuhan bobot spesifik (LPS)
Wt=  bobot  rata-rata  pada  saat  t  (g),  Wo=  bobot  rata- rata pada saat tebar awal (g), t= lama waktu pemeliha- raan.
c. Kelangsungan Hidup (KH)
= Ikan yang hidup di akhir penelitian   x  100% Ikan awal perlakuan
d. Biomassa ikan
= bobot semua ikan yang hidup di akhir peneli- tian pada setiap perlakuan
Data  persentase  kelamin  ikan  jantan,  laju pertumbuhan bobot spesifik, tingkat kelangsung- an  hidup  dan  biomassa  ikan  dianalisis  menggu- nakan metode sidik ragam dengan bantuan prog- ram  SPSS  versi  16,  dengan  diuji  lanjut  Duncan. Kadar kandungan madu, dan tingkat ekspresi gen aromatase dianalisis secara deskriptif.
Parameter kualitas air yang diukur adalah pH  menggunakan  pH  meter,  dan  suhu  menggu- nakan  termometer.  Pengukuran  kualitas  air  dila- kukan  pada  awal  perlakuan,  saat  pemeliharaan ikan  di  akuarium,  serta  pada  saat  pemeliharaan ikan di hapa.

## Hasil
Kandungan  biokimiawi  madu  dan  respons  ikan nila
Hasil analisis  kandungan  madu  menunjuk- kan  bahwa  kadar  flavonoid  dan  kalium  tertinggi terdapat pada madu bakau, kemudian diikuti oleh madu  hutan,  dan  madu  ternak  (Tabel  1).  Madu bakau  juga  mempunyai  kandungan  mineral  dan protein  yang  relatif  tinggi  dibandingkan  madu hutan, dan madu ternak.
Perendaman larva ikan  nila  menggunakan madu  bakau  menghasilkan  jumlah  jantan  100%, madu  hutan  98,77%,  dan  madu  ternak  97,70% (Tabel 2, p>0,05), serta hasil tersebut lebih tinggi daripada  kontrol  (p<0,05).  Perlakuan  perendam- an madu meningkatkan nisbah kelamin jantan se- besar  17-19%  (rata-rata  18%)  dibandingkan  de- ngan kontrol.
Seperti ditunjukkan pada Tabel 3, persen- tase ikan nila jantan pada perlakuan perendaman chrysin (81,16%)  adalah  sama  (p>0,1)  dengan perendaman kalium (80,64%).  Hasil tersebut se- kitar 17% lebih tinggi daripada kontrol (p<0,1).
Tabel 1. Kandungan proksimat (bobot kering), mineral, total flavonoid, kalium dan pH madu hutan, madu ternak dan madu bakau Kandungan bahan Madu hutan Madu ternak Madu bakau Karbohidrat (%) Lemak (%) Protein (%) Mineral (%) Total flavonoid (%) Kalium (%) pH 98,39 0,22 1,00 0,39 0,99 0,33 3,40 97,94 0,23 0,86 0,97 0,79 0,12 3,48 96,04 0,47 2,40 1,16 1,52 0,35 3,71
Tabel 2. Nisbah ikan  jantan, laju pertumbuhan bobot spesifik (LPS), kelangsungan hidup (KH), dan bio- massa ikan hasil perlakuan madu dengan sumber berbeda Perlakuan Nisbah ikan jantan LPS KH Biomassa Kontrol 80,86 a ±1,62 10,47 a ±0,7 86,67 a ±3,33 390,56 a ±30,84 Madu ternak 97,70 b ±1,15 10,41 a ±0,7 93,33 a ±3,85 405,50 a ±18,01 Madu Hutan 98,76 b ± 1,23 10,44 a ±0,9 90,00 a ±1,92 400,57 a ±25,47 Madu Bakau 100,00 b ±0,00 10,49 a ±0,1 87,78 a ±4,00 400,57 a ±25,47
Keterangan: Huruf tika atas berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (p<0,05). Nilai ditampilkan dalam bentuk rerata ± simpangan baku. Ikan dipelihara sampai berumur 2 bulan.
Tabel 3. Nisbah ikan nila jantan, laju pertumbuhan spesifik (LPS), kelangsungan hidup (KH) dan biomassa ikan yang telah diberi perendaman chrysin dan kalium Perlakuan Nisbah ikan jantan LPS KH Biomassa Kontrol 66,84 a ±3,90 11,03 a ±0,08 70,00 a ±1,92 235,99 a ±10,81 Chrysin 81,16 b ±3,38 11,70 b ±0,05 42,22 b ±4,01 213,66 a ±25,90 Kalium 80,64 b ±5,61 11,42 c ±0,03 44,44 b ±5,09 189,12 a ±14,90
Keterangan: Huruf tika atas berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (p<0,1). Nilai ditampilkan dalam bentuk rerata ± simpangan baku. Ikan dipelihara sampai berumur 2 bulan.

## Ekspresi gen aromatase
Ekspresi gen aroma-g dan aroma-otak ber- beda (Gambar 1). Ekspresi gen aroma-g terdetek- si pada jam ke-12, 24, dan 48 pada ikan kontrol, sedangkan  pada  ikan  perlakuan  tidak  terdeteksi. Hal ini menunjukkan bahwa pada jam ke-12 pas- caperendaman,  madu  berhasil  menekan  ekspresi aroma-g.  Sementara  itu,  ekspresi  gen  aroma-o terlihat pada semua titik pada perlakuan, sedang- kan pada kontrol ekspresi gen tidak terdeteksi pa-
da jam ke-12, 24, dan 48 (Gambar 1). Pada perla- kuan chrysin dan kalium juga terlihat penurunan ekspresi  aroma-g  pada  jam  ke-12    (Gambar  2) sama  halnya  dengan  pascaperendaman  menggu- nakan  madu.  Selanjutnya,  tingkat  ekspresi  aro- ma-g  pada  K12,  K24  dan  K48  terlihat  berbeda, yaitu level ekspresi gen menurun dari K12 hing- ga K48,  sedangkan level ekspresi gen β-aktin re- latif sama (Gambar 1).
Gambar 1. Ekspresi gen aromatase tipe gonad (A),  tipe otak (B), dan  β-aktin (C). M= marka DNA; P1- P48: Perlakuan madu pada jam ke-1 sampai 48 pascaperendaman; K1-K48: Kontrol; ♂O, ♀O = sampel otak jantan dan betina; ♂G, ♀G = sampel gonad jantan dan betina; tanda panah menun- jukkan target amplifikasi.
Gambar  2.  Ekspresi  gen  aromatase  tipe  gonad  (A)  pada  perlakuan  madu  (P12),  kalium  (Kal12), chrysin (Chry12), dan kontrol pada jam ke-12 (K12) setelah perendaman. β-aktin (B).  M= marka DNA. Tanda panah menunjukkan target amplifikasi.
B A 200 bp 300 bp
Tabel 4. Kualitas air pada perlakuan menggunakan madu
Pemeliharaan ikan Perlakuan pH Suhu (˚C) Saat perendaman Kontrol Madu ternak Madu hutan Madu bakau 7,8 7,0 6,9 6,0 28 28 28 28 Saat di akuarium Kontrol Madu ternak Madu hutan Madu bakau 7,2 6,8 7,3 6,9 28 28 28 28 Saat di hapa Kontrol Madu ternak Madu hutan Madu bakau 6,0 6,0 6,0 6,0 27 27 27 27
Tabel 5. Nilai pH dan suhu air pada perlakuan chrysin dan kalium Pemeliharaan ikan Perlakuan pH Suhu o C Saat perendaman Kontrol Chrysin Kalium 7,8 7,7 6,9 28 28 28 Saat di akuarium Kontrol Chrysin Kalium 5,9 5,9 5,9 28 28 28 Saat di hapa Kontrol Chrysin Kalium 6,5 6,5 6,5 28 28 28

## Kualitas air
Nilai  pH  dan  suhu  air  selama  perlakuan dan pemeliharaan semua ikan perlakuan dan kon- trol berada pada kisaran 27-28˚C dan pH 5,9-7,8 (Tabel 4 dan 5).

## Pembahasan
Madu  merupakan  salah  satu  bahan  alter- natif  untuk  percobaan  pengarahan  kelamin  yang mengandung beberapa macam  mineral, diantara- nya kalium dan juga mengandung beberapa jenis flavonoid seperti chrysin . Hasil analisis kandung- an  madu  menunjukkan  bahwa  kadar  total  flavo- noid  dan  kalium  tertinggi  terdapat  pada  madu bakau,  diikuti  berturut-turut  madu  hutan  dan madu ternak.
Ferreres et  al .  (1991)  mengatakan  bahwa madu  mengandung  16  flavonoid,  diantaranya adalah chrysin yang besarnya 13% dari total fla- vonoid.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kandungan chrysin dalam  madu  bakau  juga  relatif  paling tinggi  dibanding  dua  madu  lainnya  dan  berdam- pak terhadap hasil persentase jantan (100%). Na- mun  demikian  secara  statistik  perlakuan  ketiga sumber madu menunjukkan pengaruh yang sama terhadap  nisbah  jenis  kelamin  jantan.  Hal  ini mengindikasikan  bahwa  kadar  kalium  dan  total flavonoid  minimal  seperti  pada  madu  ternak  da- pat  mengarahkan  diferensiasi  kelamin  ikan  nila, dengan peningkatan  nisbah  kelamin jantan  sebe- sar 17-19% (rata-rata 18%) dibandingkan dengan kontrol.
Pengaruh  perendaman  madu  terhadap  pe- ningkatan jenis kelamin jantan, diduga pada saat perendaman larva,  madu  masuk  ke dalam tubuh, kemudian masuk ke peredaran darah dan menca- pai organ target, dikarenakan larva masih bersifat semipermeabel  sehingga  air  mengandung  madu secara  difusi  masuk  ke  dalam  tubuh  larva.  Kan- dungan  kalium  dalam  madu  yang  masuk  ke  da- lam  larva  dapat  mengubah  lemak  menjadi  pre- negnelon,  yang  kemudian  akan  mengubah  estro- gen  menjadi  progesteron.  Dengan  berubahnya estrogen  menjadi  progesteron,  maka  ikan  yang awalnya  akan  menjadi  betina  kemudian  diarah- kan  menjadi  ikan  jantan  (Syaifuddin  2004).  Ma- du  juga  mengandung chrysin yang  merupakan salah  satu  jenis  flavonoid  yang  diakui  sebagai salah  satu  penghambat  enzim  aromatase  yang berperan dalam memengaruhi regulasi pengarah- an  jenis  kelamin  (Dean  2004),  sehingga  akan mengarah  pada  terbentuknya  ikan  berkelamin jantan pada saat larva.
Hasil  penelitian  ini  membuktikan  bahwa madu  cukup  efektif  untuk  mengarahkan  diferen- siasi  kelamin  ikan  nila  pada  periode  labil  dan berpotensi  tinggi  untuk  menggantikan  hormon sintetis  MT  yang  selama  ini  biasa  digunakan. Menurut Matty (1985), diferensiasi kelamin pada ikan  merupakan  proses  yang  relatif  labil  diban- dingkan vertebrata yang lebih tinggi, dan kondisi ini memungkinkan untuk dilakukan rekayasa ke- lamin.
Peningkatan  persentase  ikan  nila  kelamin jantan  hasil  perendaman  dengan chrysin dan  ka- lium  menunjukkan  bahwa  kedua  bahan  tersebut berperan  penting  dalam  pengubahan  arah  dife- rensiasi kelamin ikan nila. Hal ini sejalan dengan yang dilaporkan oleh Howell et al. (1994) bahwa bahan  fitokimiawi  seperti chrysin,  daidzein ,  dan asam caffeic dapat mendorong ketidakseimbang- an  hormon  yang  diperlukan  dalam  diferensiasi
kelamin ikan, dan secara in vitro telah dibuktikan bahwa beberapa bahan fitokimiawi mampu mem- blok  biosintesis  estrogen  (Le  Bail et  al. 1998).
Mekanisme tersebut diduga juga terjadi pada pe- nelitian ini.
Berdasarkan kandungan kalium dalam ma- du (Tabel 1), kalium berpotensi dalam mengarah- kan  jenis  kelamin  jantan  pada  ikan  nila.  Hal  ini sejalan  dengan  yang  dilaporkan  oleh  Capelo et al . (1993) bahwa kalium berfungsi sebagai peng- arah diferensiasi kelamin  melalui modulasi pere- daran testosteron, dan pengendalian tindakan an- drogen. Selanjutnya, analisis RT-PCR menunjuk- kan  bahwa  tingkat  ekspresi  gen  aroma-g  pada ikan yang direndam madu menurun pada jam ke- 12 (Gambar 1), sama halnya dengan pascaperen- daman menggunakan chrysin , dan kalium (Gam- bar  2).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  perlakuan madu menurunkan ekspresi aromatase tipe gonad dan mengakibatkan pengarahan diferensiasi kela- min ikan nila menjadi jantan. Selanjutnya, perla- kuan chrysin dan  kalium  menunjukkan  bahwa bahan bioaktif madu yang berperan dalam meng- arahkan  diferensiasi  kelamin  adalah chrysin dan kalium.
Persentase ikan nila jantan pada perlakuan perendaman chrysin (81,16%)  dan  kalium (80,64%) adalah sekitar 17% lebih tinggi daripa- da kontrol (p<0,1). Nilai tersebut relatif sama de- ngan  hasil  perlakuan  perendaman  dengan  madu pada percobaan satu (rata-rata 18%). Namun de- mikian,  pada  perendaman  madu,  persentase  ikan jantan pada kontrol relatif tinggi (80,86%). Sum- ber larva ikan nila pada kedua percobaan tersebut adalah  berbeda,  dan  hal  ini  diduga  menjadi  pe- nyebab perbedaan persentase ikan kelamin jantan pada kontrol.
Teknik  pengarahan  diferensiasi  kelamin juga digunakan untuk melihat peranan faktor ge- netik dan endokrin da-lam mekanisme pengarah-
an  dan  pembentukan  jenis  kelamin  (Gennotte et al. 2014). Ekspresi aroma-g pada K12, K24, dan K48  terlihat  berbeda,  yaitu  level  ekspresi  gen menurun  dari  K12  hingga  K48,  sedangkan  level ekspresi  gen  β-aktin  relatif  sama  (Gambar  1). Hasil  ini  berbeda  dengan  pernyataan  Ijiri et  al .
(2008)  bahwa  ekspresi  gen  aromatase  akan  me- ningkat  pada  saat  diferensiasi  kelamin  di  gonad XX mulai dari hari ke-5 sampai 15 setelah mene- tas  dan  tetap  tinggi  setelah  itu.  Hal  ini  diduga karena  RNA  berasal  dari  kumpulan  enam  larva dan  dijadikan  satu  sampel.  Dari  enam  larva  ter- sebut  tidak  diketahui  mana  yang  berdiferensiasi menjadi  jantan  dan  betina,  sehingga  tingkat  eks- presi  gen  aromatase  pada  K12,  K24,  dan  K48 tidak bisa menunjukkan peningkatan.
Ekspresi gen aroma-o terlihat pada semua titik pada perlakuan, sedangkan pada kontrol eks- presi  gen  tidak  terdeteksi  pada  jam  ke-12,  24, dan 48 (Gambar 1). Hal ini menunjukkan ekspre- si  gen  aroma-o  terdeteksi  sebelum  diferensiasi kelamin  terjadi.  Akan  tetapi,  saat  diferensiasi ovari  terjadi,  otak  tidak  mengekspresikan  gen aromatase lagi. Hal ini sejalan dengan pernyataan Diotel et  al .  (2010)  bahwa  estrogen  yang  dipro- duksi  di  otak  mengarahkan  beberapa  tindakan pada satu set fungsi besar, tetapi belum tentu ter- kait  dengan  reproduksi.  Banyak  penelitian  telah dilakukan mengenai ekspresi gen aromatase pada pengarahan  kelamin ikan  nila, tetapi  masih sedi- kit  kontribusi  pengetahuan  aromatase  yang  ber- hubungan dengan variasi individu dalam perilaku pembentukan kelamin (Diotel et al . 2010)
Ekspresi  gen  aroma-g  hanya  terlihat  pada gonad  betina,  sedangkan  ekspresi  gen  aroma-o terlihat  pada  otak,  dan  gonad  jantan  dan  betina. Namun demikian, ada perbedaan ukuran fragmen DNA antara aromatase pada kontrol, yaitu sekitar 300 bp, dan pada gonad betina sekitar 200 bp un- tuk  aroma-g.  Perbedaan  ukuran  fragmen  DNA
tersebut  diduga  karena  adanya alternative  spli- cing  ( Brett et  al. 2001),  yaitu  pada  saat  proses transkripsi,  terjadi  loncatan  intron  sehingga mRNA hanya terdiri atas ekson. Alternative spli- cing intron ini juga bisa menyebabkan perbedaan protein yang terbentuk (Brett et al. 2001).
Pertumbuhan  bobot  spesifik,  kelangsung- an hidup, dan biomassa ikan antar perlakuan ma- du  dengan  kontrol  adalah  tidak  berbeda  nyata (p>0,05; Tabel 2). Tidak adanya perbedaan nilai pertumbuhan dan biomassa antara perlakuan dan kontrol dapat dikatakan bahwa madu tidak mem- berikan efek yang berbeda terhadap pertumbuhan sampai  pada  akhir  penelitian.  Peranan  madu  da- lam  penelitian  ini  lebih  berdampak  terhadap  pe- ngarahan  kelamin,  dan  tidak  terhadap  pertum- buhan. Bwanika et al . (2007) menyatakan bahwa ikan  nila  mempunyai  perbedaan  dalam  pertum- buhan  yang  cukup  signifikan  antara  jantan  de- ngan betina. Ikan nila jantan tumbuh lebih cepat, lebih besar, dan lebih seragam dibandingkan ikan nila  betina.  Menurut  Popma  &  Masser  (1999), dalam kondisi optimum, ikan nila akan mencapai matang gonad di kolam budi  daya pada usia 5-6 bulan  (150-200  g).  Perbedaan  pertumbuhan  ikan nila  mulai  tampak  ketika  ikan  mulai  matang  go- nad,  sementara  lama  waktu  pemeliharaan  ikan pada penelitian adalah dua bulan. Oleh karena itu penelitian  ini belum bisa menggambarkan perbe- daan pertumbuhan.  Hal ini  menunjukkan adanya peluang pertumbuhan yang lebih tinggi pada ikan hasil perlakuan dibanding ikan kontrol, jika ikan dipelihara  lebih  lanjut  sampai  mencapai  matang gonad.
Peningkatan  pertumbuhan  pada  ikan  per- lakuan chrysin dan  kalium  diduga  disebabkan oleh kepadatan ikan lebih rendah akibat dari ke- langsungan  hidup  yang  lebih  rendah  (p<0,1)  di- bandingkan  dengan  kontrol  (Tabel  3).  Selanjut- nya, kelangsungan hidup  yang lebih rendah pada
perlakuan chrysin dan  kalium  diduga  karena  ke- dua  bahan  kimiawi  tersebut  pada  kadar  yang  di- uji, tidak bisa ditoleransi oleh larva. Hal ini juga terjadi  pada  penelitian  perendaman  larva  ikan nila berumur 17 hari setelah menetas mengguna- kan chrysin dengan  dosis  20  mg  L -1 selama  24 jam, hasilnya larva mati 100%  (Dabrowski et al.
2005),  namun  penyebabnya  belum  diketahui  de- ngan jelas.
Kualitas  air  yang  diukur  dalam  penelitian ini adalah suhu dan pH. Menurut  Baroiller et al.
(2009a),  faktor  lingkungan  dapat  memengaruhi rasio jenis kelamin banyak spesies ikan dan dapat menentukan  diferensiasi  kelamin.  Suhu  adalah isyarat lingkungan yang paling umum memenga- ruhi jenis kelamin disamping pH. Baroiller et al.
(2009a), mengatakan bahwa ikan nila merupakan salah  satu  spesies  ikan  yang  memiliki  kepekaan yang  tinggi  terhadap  faktor  lingkungan  terutama suhu  dan  pH.  Suhu  dalam  penelitian  ini  berada pada  kisaran  27-28 o C  (Tabel  4  dan  5),  dan  nilai ini  masih dalam batas  normal untuk pemelihara- an ikan nila seperti yang  dinyatakan oleh Popma & Masser (1999) bahwa suhu optimum ikan nila adalah 25-28 o C. Hal ini menunjukkan bahwa su- hu  dalam  penelitian  ini  tidak  berpengaruh  terha- dap pengarahan kelamin jantan, sehingga penga- ruh pengarahan kelamin jantan hanya disebabkan oleh  perlakuan.  Hal  ini  didukung  pula  oleh  pen- dapat  yang  menyatakan  bahwa  suhu  merupakan faktor eksternal yang dapat berpengaruh terhadap perubahan  fenotip  betina  menjadi  jantan  pada ikan  yang  memiliki  genotip  betina  (XX),  dan ikan tilapia akan  memiliki fenotip jantan apabila pada saat larva diberi perlakuan suhu 35 o C (Baro- iller & D’Cotta 2001) atau di atas 32 o C (Tessema et al . 2006, Wessel & Horstgan-Schwark 2007 in
Baroiller et  al .  2009b).  Selain  itu  suhu  juga mempunyai  peranan  dalam  diferensiasi  kelamin ikan pada stadia larva, seperti yang dikemukakan
oleh  Kitano et  al .  (2000)  dan  D’cotta et  al .
(2001),  bahwa  penghambatan  aromatase  bisa  di- karenakan oleh faktor fisik, seperti suhu. Hal ini dapat  dianggap  bahwa  penghambatan  tindakan aromatase oleh faktor fisik dan kimiawi bisa me- niru  efek  pembalikan  kelamin  oleh  pemberian androgen  pada  beberapa  spesies  ikan  (Kwon et al . 2000).
Menurut  Reddon  &  Hurd  (2013),  pH  me- mengaruhi  rasio  jenis  kelamin  jantan  dan  betina pada  periode  awal  perkembangannya.  Nilai  pH air  selama  perlakuan  dan  pemeliharaan  dari  se- mua  ikan  perlakuan  dan  kontrol  berada  pada  ki- saran yang dapat ditoleransi oleh ikan nila, yaitu 5,9-7,8  (Tabel  4  dan  5).  Kondisi  ini  masih  pada kisaran  optimum  bagi  ikan  nila  bahwa  nilai  pH untuk  ikan  nila  adalah  6-9  (Popma  &  Masser 1999). Oleh karena itu persentase jantan yang di- hasilkan  dalam  perendaman  larva  nila  menggu- nakan  madu,  kalium,  dan chrysin bukan  karena pengaruh pH air selama penelitian. Pengaruh pH air sebesar 4-5 pada ikan kribensis ( Pelvicachro- mis  pulcher), menghasilkan  jantan  90%,  dan menghasilkan  betina  90%  pada  keadaan  pH  ne- tral  (Oldfield 2005]. Pada kasus ikan Apistogra- ma  caetei (Chiclids),  jumlah  populasi  jantan dengan  betina  hampir  seimbang  terjadi  pada  pH asam  (4,5-5,5),  yang  menghasilkan  betina  40- 47%,  dan  pada  pH  6,5  yang  menghasilkan  ham- pir semuanya betina sebesar 96% (Baroiller et al . 2009a). Sementara perbedaan  kelangsungan  hi- dup  pada  perlakuan chrysin dan  kalium  dengan kontrol bukan disebabkan oleh kualitas air, kare- na  nilai  suhu  dan  pH  selama  perlakuan  mempu- nyai kisaran nilai yang masih dalam kondisi opti- mum.

## Simpulan
Madu  hutan,  madu  ternak,  dan  madu  ba- kau  dapat  digunakan  untuk  pengarahan  kelamin
jantan  ikan  nila.  Ketiganya  memiliki  efektivitas yang  sama,  dengan  peningkatan  jantan  sebesar rata-rata 18%.
Chrysin dan  kalium  yang  merupakan  ba- han  aktif  dalam  madu,  berperan  penting  dalam mengarahkan diferensiasi kelamin ikan nila men- jadi jantan.  Analisis RT-PCR  menunjukkan bah- wa  madu, chrysin ,  dan  kalium  dapat  menekan ekspresi  gen  aroma-g  pada  jam  ke-12  pascape- rendaman, sehingga  menyebabkan  nila  mengala- mi perubahan kelamin menjadi jantan.
Nilai  kisaran  suhu  dan  pH  dalam  peneli- tian  ini  tidak  memengaruhi  perubahan  kelamin ikan menjadi jantan.

## Persantunan
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  ke- pada tim beasiswa Kaltim Cemerlang yang mem- biayai  penelitian  ini,  dan  Ibu  Anna  Octavera, S.Pi.,  M.Si,  yang  telah  membantu  penelitian  ini secara teknis.

## Daftar pustaka
Baroiller JF, D’Cotta H. 2001. Environment and sex determination in farmed fish. Compara- ti ve Biochemistry  and  Physiology  Part  C:
Toxicology  &  Pharmacology, 130(4):  399- 409
Baroiller JF, D’Cotta H, Saillant E. 2009a. Envi- ronmental effects on fish sex determination and  differentiation. Sexual  Development , 3(2-3): 118-135
Baroiller  JF,  D’Cotta  H,  Bezavlt  E,  Wessel  S,
Hoerstgen-Scwark  G,  2009b.  Tilapia  sex determination: Where temperature and ge- netics  meet. Comparative  Biochemistry and  Physiology-Part  A : Molecular  and Integrative Physiology , 151(1):30-38
Brett D, Pospisil H, Valcárcel J, Reich J, Bork P. 2001.Alternative  splicing  and  genome complexity. Nature Genetics , 30(1): 29-30 Bwanika  GN,  Murie  DJ,  Chapman  LJ.  2007.
Comparative  age  and  growth  of  Nile  tila- pia  ( Oreochromis  niloticus L.)  in  lakes Nabugabo  and  Wamala,  Uganda. Hydro- biologia , 589(1): 287-301
Capelo AS, Cremades A, Tejada F, Teodomiro F, Penafiel R. 1993. Potassium regulates pla- sma testosterone and renal ornithinedecar- boxylase in mice. Federation of European Biochemical  Societies  Letters ,  333(1-2): 32-34
Dabrowski K, Gustavo R, Mary AGA. 2005. Use of  phytochemicals  as  an  environmentally friendly method to sex reverse Nile tilapia.
Fish  Nutrition  and  Feed  Technology  Re- search, 3 (11) : 287-303
D’cotta  H,  Fostier  A,  Guiguen  Y,  Govoroun  A, Baroiller JF. 2001. Aromatase plays a key role  during  normal  and  temperature-indu- ced sex differentiation of tilapia Oreochro- mis niloticus . Molecular Reproduction and Development , 59(3): 265-276.
Dean W. 2004. Chrysin: is it an effective aroma- tase inhibitor? Vitamin Research Products News, 18(4): 4-5
Diotel N, Page YL, Mouriec, Sok-Keng T, Pelle- grini  E,  Vaillant  C,  Anglade  I,  Brion  F, Pakdel  F,  Bonchu  C,  Kah  O.  2010.  Re- view.  Aromatase  in  the    brain  of  teleost fish:  Expression,  regulation  and  putative functions. Frontiers in Neuroendocrinology 31 (2):  172–192
Ferreres  F,  Tomáas-Barberáan  FA,  Gil  MAI, Francisco  Tomáas-Lorente  F.  1991.  An HPLC technique for flavonoid  analysis in honey. Journal of the Science of Food and Agriculture , 56(1): 49-56.
Guerrero  RD,  Shelton  WL.  1974.  An  acetocar- mine squash technique for sexing juvenile fishes. The  Progressive  Fish-Culturist,
36(1): 56
Gennotte  V,  Kinkela  PM,  Ulysse  B,  Djetouan DA, Sompagnimdi FB, Tomson T, Melard C,  Rougeot  C.  2014.  Brief  exposure  of embryos to steroids or aromatase inhibitor induces Sex Reversal in Nile Tilapia ( Ore- ochromis  niloticus ). Journal  of  Experi- mental  Zoology  Part  A:  Ecological  Gene- tics and Physiology, 323(1): 31-38
Howell  WM,  Hunsinger  RN,  Blanchard  PD. 1994.  Paradoxical  masculinization  of  fe- male mosquito fish during exposure to spi- ro nolactone. The Progressive Fish-Cultu- rist , 56(1) : 51-55.
Ijiri  S,  Kaneko  H,  Kobayashi  T,  Wang  De-Shou W,  Sakai  F,  Paul-Prasanth  B,  Nakamura
M,  Nagahama  Y.  2008.  Sexual  dimorphic expression of genes in gonads during early differentiation of a teleost fish, the Nile ti-
lapia Oreochromis  niloticus . Biology  of Reproduction, 78(2) : 333–341
Kikuchi K, Hamaguchi S. 2013. Novel sex-deter- mining genes in fish and sex chromosome evolution. Developmental  Dynamics ,  242 (4): 339-353
Kitano  T,  Takamune  K,  Nagahama  Y,  Abe  S. 2000.  Aromatase  inhibitor  and  17  alpha- methyltestosterone cause sex-reversal from  genetical  females  to  phenotypic males  and  suppression  of  P450  aromatase gene expression in Japanese flounder ( Pa- ralichthys  olivaceus ). Molecular  Repro- duction and Development 56(1): 1-5.
Kwon  YJ,  Haghpanah  V,  Kogson-Hurtado  LM, McAndrew BJ, Penman DJ. 2000. Mascu- linization  of  genetic  female  Nile  tilapia ( Oreochromis niloticus ) by dietry adminis- tration  of  an  aromatase  inhibitor  during sexual  differentiation. Journal  of  Experi- mental Zoology 287(1): 46-53.
Le  Bail  JC,  Laroche  T,  Marre-Fournier  F, Habrioux  G.  1998.  Aromatase  and  17β- hydroxysteroid  dehydrogenase  inhibition by  flavonoids. Cancer  Letters ,  133(1): 101-106.
Matty  AJ.  1985. Fish  Endocrinology .  Timber Press Portland. USA. 267 p
Mukti  AT, Mubarak AS, Ermawan  A. 2008. Pe- ngaruh penambahan madu dalam pakan in- duk  jantan  lobster  air  tawar red  claw ( Cherax  quadricarinatus )  terhadap  rasio jenis  kelamin  larva. Jurnal  Ilmiah  Peri- kanan dan Kelautan , 1(1): 37-42
Poonlaphdecha S, Pepey E, Huang SH, Canonne M, Soler L, Mortaji S, Morand S, Pfennig F,  Melard  C,  Baroiller  JF,  D’cotta  H. 2011. Elevated amh gene expression in the brain  of  male  tilapia  ( Oreochromis  niloti-
cus )  during  testis  differentiation. Sexual Development, 5 (1): 33–47.
Popma  T,  Masser  M.  1999.  Tilapia  life  history and  biology. Southern  Regional  Aquacul- ture Center Publication, No. 283: 1-4
Reddon  AR,  Hurd  PL.  2013.  Water  pH  during early development influences sex ratio and male morph in a West African cichlid fish, Pelvicachromis pulcher. Zoology , 116 (3):
139-143
Oldfield  RG.  2005.  Genetic,  abiotic  and  social influences  on  sex  differentiation  in  cichlid fishes  and  the  evolution  of  sequential  her- maphroditism. Fish  and  Fisheries ,  6(2):
93–110.
Sever DM, Halliday T, Waight V, Brown J, Da- vies  HA,  Moriarty  EC.  1999.  Sperm  sto- rage in female of the smoth new ( Triturus v. vulgaris L.): I. ultrastructure of the spe- mathecae  during  the  breeding  season. Jo- urnal  of  Experimental  Zoology ,  283(1): 51-70.
Soelistyowati  DT,  Martati  E,  Arfah  H.  Efektivi- tasmadu  terhadap  pengarahan  kelamin ikan gapi ( Poecilia reticulata Peters). Jur- nal Akuakultur Indonesia, 65(2): 155-160
Syaifuddin  A.  2004.  Pengaruh  pemberian  suple- men  madu  pada  pakan  larva  ikan  nila ( Oreochromis niloticus ) GIFT terhadap ra- sio jenis kelaminnya. Skripsi . Fakultas Pe- rikanan. Universitas Brawijaya. 69 hlm
Utomo  B.  2008.  Efektivitas  penggunaan  aroma- tase inhibitor dan  madu  terhadap  nisbah kelamin ikan gapi ( Poecilia  reticulata Pe- ters). Skripsi .  Program  Studi  Teknologi dan Manajemen Perikanan Budi daya, Fa- kultas  Perikanan dan Ilmu Kelautan. Insti- tut Pertanian Bogor.48 hlm.