Perbandingan Antigenisitas Virus Infectious Bronchitis Strain Lokal dan Massachusetts dengan Indirect ELISA
Comparison of Antigenicity Between Local and Massachusetts Strains of Infectious Bronchitis Virus using Indirect ELISA Test
Jola Rahmahani 1* , Daniswara Irwanza Akbar 2 , Suwarno 1
1 Laboratorium Virologi dan Imunologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, 2 Pendidikan Profesi Dokter Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Kampus C Universitas Airlangga, Mulyorejo, Surabaya, Indonesia . * Corresponding author : jola_rahmahani@yahoo.co.id

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  membandingkan  antigenesitas  antara  antigen whole virus  dan  antigen protein S dari strain local I-147 dengan strain Massachusetts virus Infectious bronchitis (IB) menggunakan uji indirect ELISA. Pada penelitian ini digunakan 10 serum positif virus IB yang didapatkan dari hasil vaksinasi ayam  dengan  vaksin  IB  aktif  dan  inaktif.  Kesepuluh  serum  positif  direaksikan  dengan  antigen  yang  dibagi menjadi empat kelompok yaitu: P1) antigen protein S ( spike glycoprotein ) dari strain local virus IB; P2) antigen protein S (spike glycoprotein) dari strain Massachusetts virus IB; P3) antigen whole virus dari strain local virus IB; P4) antigen whole virus dari strain Massachusetts virus IB. Hasil yang didapatkan pada penelitian ini berupa nilai Optical Density (OD) pada masing-masing perlakuan, yang selanjutnya dianalisa menggunakan One Way ANOVA dan dilanjutkan dengan Duncan Multiple Range Test 5%. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan antigenesitas (p<0,05) antara antigen whole virus dan antigen protein S pada kedua strain virus IB . Nilai  OD  antigen whole virus  pada  kedua  strain  memiliki  perbedaan  yang  nyata  dengan  nilai  OD antigen protein S pada kedua strain. Secara spesifik antigen whole virus dari  strain Massachusetts memiliki nilai OD tertinggi dibandingkan dengan kelompok perlakuan lainnya.
Kata kunci: antigenesitas, Infectious bronchitis , strain local I-147, strain Massachusetts

## Abstract
The aim of this study was to compare the antigenicity between the whole virus and protein S of both local  strain  I-147  and Massachusetts  strain  of  Infectious  bronchitis  virus  with  indirect  ELISA.  We  used  10 positive serums from post vaccinated chickens for further reaction with four groups of antigens in this study that are: P1) S protein (spike glycoprotein) antigen of local strain IB virus; P2) S protein (spike glycoprotein) antigen of Massachusetts  strain  IB virus;  P3)  whole virus antigen of local strain  IB virus; P4)  whole virus antigen of Massachusetts strain IB virus. The results of this research are Optical Density (OD) values of each treatment, then to be analyzed using One Way ANOVA and followed by Duncan Multiple Range Test 5%. The results show that there are differences between the antigenicity of the whole virus and S protein in both local strain and Massachusetts strain of IB virus. The whole virus antigen of both strains has a significant difference (p<0.05) with the S protein antigen in both strains. Specifically, the whole virus antigen of Massachusetts strain has the highest OD among the other groups.
Keywords: antigenicity, Infectious bronchitis, local strain I-147, Massachusetts strain
Received: 26 Desember 2021 Revised: 29 Februari 2022 Accepted: 13 April 2022

## PENDAHULUAN
Kebutuhan protein hewani di Indonesia saat ini  sangat  tinggi,  seiring  dengan  meningkatnya jumlah  penduduk  serta  kesadaran  masyarakat bahwa protein hewani diperlukan dalam
memenuhi  kebutuhan  gizi  (Bahri  dkk . ,  2005). Unggas  merupakan  salah  satu  sumber  protein hewani  baik  berupa  telur  maupun  daging  untuk menunjang kebutuhan protein masyarakat Indonesia.  Peternakan  unggas,  terutama  ayam sangat berperan dan perlu ditingkatkan
kinerjanya,  agar  berproduksi  secara  optimal. Salah satu faktor yang perlu mendapat perhatian adalah  kesehatan  ternak,  karena  produksi  yang optimal hanya akan dapat dicapai apabila keadaan ternak  sehat.  Namun  demikian,  untuk  mencapai tujuan  tersebut  tidaklah  mudah,  karena  masih terdapat  kendala  berupa  penyakit,  di  antaranya adalah  penyakit  yang  disebabkan  oleh  virus seperti  penyakit Infectious  Bronchitis (IB) (Indriani dan Darminto, 2000a).
Penyakit IB menyebabkan kerugian ekonomi yang  signifikan  yaitu  menyebabkan  gangguan saluran  pernafasan  atas  pada  ayam  muda  dan ayam  petelur  fase  produksi.  Gangguan  saluran pernafasan atas pada ayam petelur fase produksi menyebabkan  turunnya  produksi  ayam  petelur dan  kualitas  dari  cangkang  telur.  Pada  beberapa strain virus juga dapat mengakibatkan kerusakan ginjal dan kematian (Cavanagh dan Naqi, 2003). Virus  IB  termasuk  genus coronavirus famili Coronaviridae (De  Groot,  2012).  IBV  memiliki genom  virus  RNA single-stranded yang  positif (27,6  kb)  yang  mengkodekan  empat  protein struktural: spike glikoprotein  (S),  matriks  (M), protein  amplop  dan  protein  nukleokapsid  (N) (Indriani dan Darminto, 2000a).
Spike glikoprotein  terletak  pada  permukaan virion  dan  terdapat  dalam  dua  subunit,  yaitu  S1 dan  S2.  Protein  S1  berbentuk  bulat  pada  bagian luar  peplomer,  mempunyai  peran  dalam  induksi respon  antibodi  humoral  dan  menetralkan  virus IB,  sementara  protein  S2  berbentuk  tangkai  dan berlabuh  pada  membran  virus  sebagai  pembawa epitop-epitop  reaksi  silang  antibodi  diantara serotipe  virus  IB  (Indriani  dan  Dharmayanti, 2013).  Protein  S1  juga  merupakan  bagian  dari virus  IB  yang  menentukan  strain.  Strain  baru virus  IB  terbentuk  karena  perubahan  komposisi asam  amino  pada  protein spike namun  sebagian besar genom virus tidak berubah (Cavanagh  and Gelb , 2008). Protein S1, S2, M, dan N merupakan protein yang dapat menimbulkan respon antibodi pada  tubuh  ayam  yang  terinfeksi  virus  IB (Indriani dan Darminto 2000a).
Kejadian  IB pertama kali di  Indonesia pada tahun  1977.  Frekuensi  kejadian  IB  di  Indonesia lebih sering terjadi pada layer dibanding broiler . IBV telah menyebar di Pulau Jawa dengan tingkat
prevalensi  sekitar  40-60%  (Darminto,  1995). Pencegahan penyakit IB dalam peternakan ayam dengan  melakukan  program  vaksinasi  IB  untuk mengurangi  penurunan  produksi.  Vaksin  virus infectios  bronchitis terdiri  dari  2  macam  yakni, vaksin  aktif  dan  in  aktif.  (Cavanagh  dan  Naqi, 2003; Cook et al., 2012).
Vaksinasi IB secara alami akan mengakibatkan  respon  tanggap  kebal  terhadap serangan strain virus IB yang bersifat homologus, akan  tetapi  ketahanan  terhadap  strain  virus  IB yang  bersifat  heterologus  sangat  bervariasi (Indriani  dan  Darminto,  2000b).  Vaksin  IB umumnya mengandung virus IB strain Massachusetts (Mass) dan beberapa di antaranya mengandung strain Connecticut (Conn) (Darminto, 1992). Strain Massachusetts memiliki kemampuan  melindungi  strain  IB  yang  berbeda secara antigenik (Tabbu, 2000). Strain Massachusetts  kurang  cukup  memiliki  proteksi silang  yang  maksimal  melawan  virus  IB  galur lapangan (Darminto, 1999).
Berdasarkan latarbelakang tersebut penelitian  ini  dimaksudkan  untuk  melihat perbedaan antigenisitas protein S dan whole virus dari  virus  IB  strain  lokal  I-147  dengan  strain Massachusetts  menggunakan  teknik Indirect ELISA.

## METODE PENELITIAN

## Antibodi Terhadap Virus IB
10 ekor ayam petelur divaksin menggunakan vaksin aktif dan inaktif produksi PT. Sanbe yang mengandung virus IB strain I-269. Pemeliharaan ayam  dilaksanakan  di  peternakan  ayam  petelur dan pengujian anibodi dilaksanakan di Laboratorium  Virologi,  Fakultas  Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga.

## Antigen Sampel
Penelitian ini menggunakan 4 jenis antigen, yaitu: (1) Antigen Protein S ( Spike Glycoprotein ) virus  IB  strain  lokal  (I-147),  (2)  Antigen whole virus IB strain lokal (I-147), (3) Antigen Protein S ( Spike Glycoprotein ) virus IB strain Massachusetts,  dan  (4)  antigen whole  virus IB strain Massachusetts.

## Kelompok Perlakuan
Perlakuan  mengunakan  uji indirect ELISA yang  mereaksikan  10  sampel  serum  darah  ayam yang  telah  divaksinasi  oleh  vaksin  aktif  dan inaktif virus IB yang direaksikan dengan antigen whole virus dan protein S virus IB strain lokal (I- 147)  dan  strain  Massachusetts  pada  masing- masing perlakuan. Pada setiap perlakuan terdapat satu kontrol positif dan kontrol negatif. Perlakuan yang  diberikan  adalah  sebagai  berikut:  (P1) Kelompok serum ayam yang direaksikan dengan antigen  protein  S  ( Spike  Glycoprotein )  virus  IB strain lokal (I-147), (P2)  Kelompok  serum  ayam yang direaksikan dengan antigen protein S ( Spike Glycoprotein ) virus IB strain Massachusetts, (P3)
Kelompok serum ayam yang direaksikan dengan antigen whole virus  IB  strain  lokal  (I-147),  (P4) Kelompok serum ayam yang direaksikan dengan antigen whole virus IB strain Massachusetts.
Uji Indirect ELISA
Pemeriksaan antigenisitas dilakukan dengan mengujikan  4  sampel  antigen  yang  direaksikan dengan  10  antibodi  positif  IB.  Prosedur indirect ELISA  diawali  dengan coating  antigen virus  IB dengan konsentrasi 2 𝜇 g/ml dan dilapisi sebanyak 100 µl/sumuran mikroplate yang sudah
diencerkan
dengan pengenceran
1/100
menggunakan coating buffer dan diinkubasi pada suhu 4º C selama kurang lebih 18 jam. Mikroplate dicuci  dengan washing  buffer (NaCl  fisiologis dan triton 0,5 ml) 200 µl/sumuran sebanyak 3 x 1 menit. Mikroplate kemudian di blok dengan milk blocking 4%  sebanyak  100  µl/  sumuran  dan diinkubasi  pada  suhu  37º  C  selama  1  jam. Selanjutnya  mikroplate  dicuci  dengan washing buffer (NaCl  fisiologis  dan  triton  0,5  ml)  200 µl/sumuran sebanyak 3 x 1 menit. Antibodi hasil vaksinasi  virus  IB  diencerkan  1/500  dengan blocking buffer , selanjutnya dimasukkan sebanyak  100  µl/sumuran  dan  diinkubasikan selama  1  jam  pada  suhu  37º  C,  setelah  itu mikroplate  dicuci  dengan washing  buffer (NaCl fisiologis  dan  triton  0,5  ml)  200  µl/sumuran sebanyak  3  x  1  menit  kemudian  diikuti  dengan penambahan  konjugat  ( Anti  Chicken Ig  G  yang dilabel  dengan  enzim alkalin  fosfatase )  yang diencerkan  dengan  blocking  buffer  dengan
pengenceran 1: 10000 sebanyak 100 µl/sumuran dan diinkubasi selama satu jam pada suhu 37º C. Berikutnya  mikroplate  dicuci  kembali  dengan washing buffer (NaCl fisiologis dan triton 0,5 ml) 200 µl/sumuran sebanyak 3 x 1 menit, kemudian ditambahkan  substrat  p-NPP  sebanyak  100  µl pada semua sumuran, ditutup dengan alumunium foil kemudian  didiamkan  selama  30  menit  di ruang  gelap,  segera  ditambahkan  NaOH  3N sebanyak  50  µl  pada  tiap  sumuran  untuk menghentikan  reaksi.  Hasilnya  kemudian  dibaca dengan ELISA reader dengan panjang gelombang  405  nm.  Nilai Optical  Density (OD) diamati sebagai hasil pada penelitian ini.

## Analisis Data
Data  hasil penelitian  yang diperoleh berupa nilai  OD  yang  dianalisis  dengan  uji One  Way ANOVA  dan  dilanjutkan  uji Duncan  Multiple Range  Test 5%  yang  membandingkan  nilai  OD hasil  pengujian  antibodi  ayam  terhadap  virus  IB strain  Massachusetts  dan  lokal  I-147. Software yang  digunakan  adalah Statistic  Product  and Service Solution 21 (SPSS 21).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil rerata uji ELISA pada masing-masing perlakuan  disajikan  pada  Tabel  1. Dari  hasil tersebut  dapat  diketahui  bahwa  Kelompok  P4 yaitu  kelompok  yang  mereaksikan  serum  yang mengandung  antibodi  IB  dengan whole  virus Massachusetts  memiliki  nilai  rata-rata  OD tertinggi yang diikuti selanjutnya secara berurutan yaitu  Kelompok  P3  dengan  mereaksikan whole virus strain lokal (I-147), Kelompok P2 protein S strain Massachusetts dan Kelompok P1 protein S strain lokal (I-147).
Perlakuan dengan whole virus virus IB strain Massachussets  (P4)  memiliki  perbedaan  yang nyata dengan perlakuan dengan protein S virus IB strain  Massachusetts  (P2)  dan  perlakuan  dengan whole virus virus IB strain lokal I-147 (P3) yang memiliki perbedaan yang nyata dengan perlakuan dengan protein S virus IB strain lokal I-147 (P1) (p<0,05). Pendapat yang sama disampaikan pada penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan  Indriani dan  Darminto  (2000)  yang  menyatakan  bahwa
tidak hanya antigen protein  S saja yang bereaksi dengan antibodi pada tubuh ayam yang terinfeksi virus IB tetapi juga antigen protein S1, S2, M, dan N  dapat  bereaksi  dengan  antibodi  pada  tubuh ayam  yang  terpapar  virus  IB  (Indriani  dan Darminto, 2000).
Tabel 1. Rata-rata dan simpangan baku nilai OD Perlakuan Rata-rata ± Simpangan Baku P1 0,15930 a ± 0,02 P2 0,16250 a ± 0,02 P3 0,21300 b ± 0,04 P4 0,24760 b ± 0,06
Superskrip  berbeda  pada  kolom  yang  sama menunjukkan perbedaan signifikan (p<0,05).
Perbedaan  nilai  OD pada  perlakuan  dengan whole virus dan protein S virus IB strain lokal I- 147  dan  strain  Massachusetts  kemungkinan terjadi karena antibodi spesifik pada serum pasca vaksinasi  cocok  dengan  epitop  antigen whole virus dibandingkan protein S virus IB strain lokal I-147  dan  strain  Massachusetts.  Ikatan  antara antibodi  spesifik  dan  antigen  membentuk  sel-sel imun memori. Sel-sel memori akan menghasilkan antibodi  yang  cepat  dengan  titer  tinggi  pada paparan selanjutnya yang menyebabkan perbedaan nilai OD pada perlakuan dengan whole virus dan protein S virus IB strain lokal I-147 dan strain Massachusetts (Tizard, 2009).
Perlakuan dengan whole virus virus IB strain Massachussets  (P4)  tidak  memiliki  perbedaan yang nyata dengan perlakuan dengan whole virus virus IB strain lokal I-147 (P3). Hasil yang sama juga  didapat  pada  perlakuan  dengan  Protein  S virus  IB  strain  lokal  I-147  (P1)  yang  juga  tidak memiliki perbedaan yang nyata dengan protein S virus IB strain Massachussets (P2) (p<0,05). Hal ini  sependapat  dengan  penelitian  sebelumnya yang  dilakukan  Dharmayanti  dkk ., (2005)  yang menyatakan  bahwa  hal  tersebut  disebabkan  oleh persamaan tingkat homologi kedekatan genetik.
Respon  tanggap  kebal  dapat  dilakukan dengan  pemberian  antigen  dari  agen  suatu penyakit  tertentu  atau  yang  disebut  vaksinasi. Antigen  adalah  senyawa  yang  mampu  bereaksi terhadap  antibodi  atau  produk  respon  imun.
Antigenisitas adalah sifat antigen untuk mengikat secara  spesifik  dengan  produk-produk  respon imun. Antigen yang dapat menginduksi terbentuknya  respons  imun  disebut  sebagai imunogen  atau  antigen  imunogenik  (Rantam, 2003).  Antigen  yang  masuk  pada  tubuh  akan ditangkap oleh makrofag yang berfungsi sebagai antigen  presenting  cell (APC).  Sebagian  kecil antigen  akan  diekspresikan  pada  permukaan  sel melalui MHC dan mengaktifkan sel T helper. Sel T  helper  yang  teraktivasi  akan  mengaktifkan  T sitoksik  dan  limfosit  B,  selanjutnya  limfosit  B yang teraktivasi akan berdeferensiasi menjadi sel plasma dan menghasilkan antibodi yang spesifik. Semua  sel  limfosit  baik  T  maupun  B  yang teraktivasi  akan  berproliferasi  menjadi  salah satunya  sel  memori  dan  menghasilkan  sitokin (Rahmawati dkk., 2018). Sitokin yang dihasilkan akan memberikan perlindungan dan memungkinkan  sel  memori  untuk  hidup  lebih lama,  Sel  memori  bersifat  memberikan  respon yang  cepat  dan  segera  pada  paparan  berikutnya dengan antigen yang sama sehingga antibodi yang dihasilkan  bersifat  tinggi  dan  cepat  (Tizard, 2009).
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  nilai OD  pada  perlakuan  dengan whole  virus Massachusetts lebih tinggi dibandingkan perlakuan  lainnya  dapat  dilihat  pada  Tabel  1. Nilai  OD  lebih  tinggi  pada whole  virus Massachusetts disebabkan adanya ikatan antigen dan  antibodi  yang  paling  kuat  dan  dapat disimpulkan bahwa perlakuan dengan whole virus Massachusetts  memiliki  sifat  antigenik  paling tinggi dibanding perlakuan lainnya. Penyebab hal ini  dapat  terjadi  karena  urutan  nukleotida  pada daerah  hipervariabel  virus  IB ( Cavanagh et  al., 1992) . Perubahan  kecil  pada  epitop  S1 kemungkinan akan menghasilkan perubahan dan terbentuknya  serotipe  baru.  Perubahan  pada sekuens epitop mengakibatkan perubahan antibodi  dalam  mengenal  virus  (Cavanagh  dan Naqi, 1997).

## KESIMPULAN
Uji  antigenesitas  dengan  menggunakan ELISA menunjukkan bahwa penggunaan antigen
whole virus IB memiliki antigenesitas yang lebih tinggi  dibandingkan  dengan  antigen  protein  S pada  kedua  strain  baik  local  I-147  maupun Massachusetts.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kami  sampaikan  pada  pihak terkait  yang  telah  berkontribusi  pada  penelitian ini diantaranya Peternakan Ayam di Jawa Timur dan  Fakultas  Kedokteran  Hewan  Universitas Airlangga.

## DAFTAR PUSTAKA
Bahri,  S.,  Masbulan,  E.,  &  Kusumaningsih,  A.
(2005).  Proses  Praproduksi  sebagai  Faktor
Penting dalam Menghasilkan Produk Ternak yang Aman untuk Manusia. Deptan RI. Hal:
4.
Cavanagh,  D.,  Davis,  P.  J.,  Cook,  J.  K.,  Li,  D.,
Kant,  A.,  &  Koch.  (1992).  Location  of  the amino  acid  differences  in  the  S1  spike glycoprotein  subunit  of  closely  related serotypes  of  infectious  bronchitis  virus.
Avian Diseases , 21, 33-43.
Cavanagh,  D.,  &  Gelb,  J.  (2008).  “Infectious Bronchitis,”  in  Diseases  of  Poultry.  Wiley- Blackwell, 12th edition. Pp: 117–135.
Cavanagh,  D.,  &  Naqi  S.  (2003).  Infectious
Bronchitis. In: Saif YM, Barnes HJ, Glisson JR,  et  al.,  eds.  Diseases  of  Poultry.  11 th ed. Ames,  IA:  Iowa  State University Press. Pp: 101–119.
Cavanagh,  D.,  &  Naqi,  S.  (1997).  Infectious bronchitis. In B.W. Calnek (Ed.). Diseases of Poultry,  10th  ed.  Iowa  State  University, Ames, IA. Pp: 511-526.
Cook,  J.  K.  A.,  Jackwood,  M.,  &  Jones,  R.  C. (2012).  The  Long  View:  40  Years  of Infectious  Research. Avian  Pathology ,  41, 239-50
Darminto.  (1992).  Serotyping  of  Infectious Bronchitis  Viral  Isolates. Penyakit  Hewan ,
24(44), 76-81.
Darminto.  (1995).  Diagnosis  Epidemiologi  and Control  of  Two  Mayor  Avian  Viral Respiratory Disease in Indonesia: Infectious Bronchitis  and  Newcastle  Diseases.  Thesis (Ph.D). JCU Univ.
De  Groot,  R.,  (2012).  Family  Coronaviridae.  In:
King,  A.M.Q.,  Adams,  M.J.,  Carstens,E.B., Lefkowitz, E.J. (Eds.), Virus Taxonomy, the 9th Report of the International Committee on Taxonomy  of  Viruses.  Elsevier  Academic Press, San, Diego. Pp: 806–828.
Dharmayanti , N. L. P. I., Indriani, R., Darminto.
(2005). Hubungan Kekerabatan Virus Infectious Bronchitis Isolat Lapang
Indonesia. Jurnal  Bioteknologi  Pertanian , 10(1), 15-23.
Indriani,  R.,  &  Darminto.  (2000a).  Penyakit Infectious  Bronchitis pada  Ayam  dan  Cara Mengendalikannya. Wartazoa , 5(2), 65-72.
Indriani,  R.,  &  Darminto.  (2000b).  Variasi
Serotipe Isolat-Isolat Virus Infectiuos Bronchitis yang  Berasal  dari  Beberapa Daerah  di  Pulau  Jawa. Jurnal  Ilmu  Ternak Veteriner, 5(4), 234-240.
Indriani,  R.,  &  Dharmayanti,  N.  L.  P.  (2013).
Development of an Enzyme-linked Immunosorbent  Assay  for  Detection  of Infectious  Bronchitis  Antibody  in  Chicken Using Local Isolate Virus. JBI , 9(2).
Rahmawati, A., Wijaya, N. S., Purnama, M. T. E., Rahmahani,  J.,  Yudhana,  A.,  &  Yunita,  M. N.  (2018).  Pengaruh  Ekstrak  Kulit  dan  Jus Buah  Delima  Putih  ( Punica  granatum  L. )
Terhadap  Titer  Antibodi  Ayam  Kampung Super  yang  Divaksin  Newcastle  Disease. Jurnal Medik Veteriner , 1(3), 68-73.
Rantam,  F.  A.  (2003).  Metode  Imunologi. Airlangga  University  Press.  Surabaya.  Hal: 79-81.
Tabbu,  C.  R.  (2000).  Penyakit  Ayam  dan Penangulangannya.Penyakit Bakterial, Mikal  dan  Viral.  Volume  1.  Penerbit Kanisus, Yogayakarta. Hal: 32. Tizard, I. R. (2009). Veterinary Immunology: An Introduction (Eight Edition). Departement of
Veterinary  Pathobiology.  Texas.  Viruses:  a WHO Memorandum. Pp: 52.
***