## Ekstrak Kasar Isolat Bacillus sp Sebagai Agen Peluruh Biofilm
Mangihot Tua Gultom 1 *, William Thamrin 1 , Mariana Wahjudi 1 , Suhartono 2
1 Fakultas Teknobiologi, Universitas Surabaya, Surabaya‐Indonesia
2 Department of Biology, Faculty of Mathematics and Sciences, Syiah Kuala University, Aceh‐Indonesia
* corresponding author:  ihot_gultom@staff.ubaya.ac.id
Abstract – Biofilms  play  an  important  role  in  the  distribution  and  pathogenicity  of  bacteria.  In  our  previous  research,  we demonstrated  that  our  isolated  Bacillus  sp.  (collection  of  Microbiology  Lab,  Universitas  Surabaya)  exhibited  in  vitro  antibiofilm activity. Bacilli generally produce cellulase, which is one of the enzymes responsible for bacterial biofilm degradation. Based on this fact,  this  study  aimed  (1)  to  determine  whether  or  not  the  crude  extract  of  our  Bacillus  sp.  isolate  is  able  to  degrade  biofilms formed  by  Escherichia  coli,  Staphylococcus  aureus,  and  water‐crane  bacteria,  and  (2)  to  determine  whether  such  crude  extract contains active cellulase. The research steps began with the preparation  of  Bacillus sp. crude extract, biofilm degradation  assay, cellulase  activity  assay  on  CMC  Agar,  and  cellulase  detection  by  SDS‐PAGE  and  electrophoresis  zymogram.  The  crude  extract  of Bacillus sp. effectively degraded the biofilm 30 min after contact. The crude extract decreased biofilms of Escherichia coli 23,56%, Staphylococcus  aureus  27,78%,  and  water‐crane  bacteria  37,98%.  Based  on  the  zymogram  result,  it  was  shown  that  the  crude extract contained active cellulase, with a size of approximately 35 kDA. It was concluded that the crude extract of Bacillus sp. has potential as an anti‐biofilm agent and exhibits active cellulase activity.
Keywords: Bacillus sp., crude extract, biofilm, SDS‐PAGE, zymogram
Abstrak –Biofilm  mempunyai  peran  penting  dalam  penyebaran  dan  sifat  patogenitas  bakteri  patogen.  Pada  penelitian sebelumnya  telah  dibuktikan  bahwa  isolat Bacillus sp.  (koleksi  Laboratorium  Mikrobiologi,  Universitas  Surabaya)  mempunyai aktivitas  anti‐biofilm  secara  in  vitro. Bacillus umumnya  menghasilkan  selulase  sedangkan  selulase  diketahui  dapat  meluruhkan biofilm bakteri. Berdasarkan hal di atas, penelitian ini bertujuan (1) untuk  mengetahui apakah ekstrak kasar isolat Bacillus sp. ini dapat  meluruhkan  biofilm Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus ,  dan  bakteri  air  keran;  dan (2)  untuk  mengetahui  apakah dalam ekstrak kasar terdapat selulase. Metode penelitian ini meliputi penyiapan ekstrak kasar sel Bacillus sp., pengujian aktifitas meluruhkan biofilm, uji aktivitas selulase pada Agar CMC, dan analisis keberadaan aktivitas selulase pada ekstrak kasar Bacillus sp. menggunakan SDS‐PAGE dan elektroforesis zymogram . Hasil penelitian menunjukkan bahwa ektrak kasar isolat Bacillus sp. bekerja paling baik pada perlakuan 30 menit setelah kontak dengan biofilm bakteri. Pemberian ekstrak kasar dapat menurunkan biofilm Escherichia coli sebesar 23,56%; dan biofilm bakteri Staphylococcus aureus sebesar 27,78%, dan biofilm bakteri air keran sebesar 37,98%. Berdasarkan hasil zymogram, telihat bahwa ekstrak kasar isolat Bacillus sp. memiliki selulase aktif dengan ukuran sekitar 35 kDa. Dapat disimpulkan bahwa ekstrak kasar isolat Bacillus sp. berpotensi sebagai agen peluruh biofilm dan memiliki selulase aktif.
Kata kunci : Bacillus sp., ekstrak kasar, biofilm, SDS‐PAGE , zymogram

## PENDAHULUAN
Biofilm  merupakan  hasil  sekresi  dari  sel  mikroorganisme,  seperti  mukopolisakarida, lipid,  protein,    bersifat  adhesif,  berada  di  suatu  permukaan  (habitat/substrat),  dan  karena karakter‐karakter  tersebut,  biofilm  menjadi  tempat  hidup  yang  baik  bagi  berbagai  jenis mikroorganisme  yang  menempel  padanya.  Pembentukan  dan  pematangan  biofilm  bakteri telah dilaporkan berbagai artikel ilmiah [1]. Dampak pembentukan biofilm adalah memberikan perlindungan yang baik pada sel mikroorganisme yang tergabung di dalam komunitas biofilm sehingga  mikroorganisme  tersebut  menjadi  sukar  untuk  dibasmi.  Tentu  saja,  bagi mikroorganisme  yang  bersifat  merugikan,  pembentukan  biofilm  merupakan  hal  yang  tidak diinginkan.
Cara  menghilangkan  biofilm  biasanya  dengan  kombinasi  cara  fisik‐kimiawi,  misalnya dengan  digosok  bersama  dengan  cairan  pembersih  (klorin,  peroksida  atau  fenol)  yang sayangnya  cara  ini  sering  dianggap  kurang  “ramah  lingkungan”.  Bioteknologi  menawarkan solusi alternatif yang lebih ramah lingkungan untuk mengatasi biofilm, misalnya menggunakan enzim  untuk  menghancurkan  struktur  kimiawi  biofilm  [2].  Namun,  semakin  murni  perolehan suatu  enzim  akan  berpengaruh  pada  mahalnya  biaya  produksi  enzim  dan  mahalnya  harga

## Original Research
“produk  penghilang  biofilm  berbahan  dasar  enzim”  ini  nantinya.  Oleh  karena  itu,  diperlukan penelitian  untuk  mengetahui  seberapa  berpengaruh  enzim  dalam  bentuk  ekstrak  kasar terhadap  peluruhan  biofilm,  serta  untuk  mengetahui  jenis  enzim  peluruh  yang  dikandung ekstrak kasar tersebut.
Penelitian yang dilakukan oleh Stiefel dkk. [3] dengan menggunakan enzim jenis baru endoscope cleaner dapat menghilangkan biofilm dari Staphylococcus aureus sebesar 95% dan Pseudomonas  aeruginosa sebesar  90%.  Johansen  dkk.  [4]  melaporkan  bahwa  dengan mencampur  oksidoreduktase  dengan  enzim  penghidrolisis  polisakarida  dapat  memberikan aktivitas bakterisidal serta penghancuran dari biofilm.
Penelitian  Kurniawan  [5]  melaporkan  kemampuan  ekstrak  kasar  isolat Bacillus sp. menghambat  pembentukan  struktur  eksopolisakarida  penyusun  biofilm Burkholderia cenocepacia H111,  dengan  penurunan  persentase  biofilm  sebesar  71%.  Hingga  dilakukan penelitian  ini,  belum  diketahui  kemampuan  ekstrak  kasar Bacillus sp.  di  atas  dalam meluruhkan  biofilm  dari  mikroorganisme  lain.  Penelitian  ini  akan  semakin  memberikan informasi potensi ekstrak kasar isolat Bacillus sp. sebagai bahan anti‐biofilm.

## METODE
Bahan
Bakteri yang dijadikan sumber ekstrak kasar enzim dalam penelitian ini adalah Bacillus sp. [5]. Bakteri pembentuk biofilm diperoleh dari air keran PDAM Laboratorium  Mikrobiologi Fakultas  Teknobiologi  Universitas  Surabaya,  serta  isolat Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus koleksi  kultur  Laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas  Teknobiologi  Universitas  Surabaya. Bahan  lainya  meliputi  tip  0,5‐10  μL  (Biologic®);  tip  10‐100  μL  (Biologic®);  tip  100‐1000  μL (Biologic®);  filter  membran  0,2  μm; mikroplate ,  Luria  Bertani Broth (Merck®),  Luria  Bertani Agar (Merck®), Gram  Staining  Kit ,  Difco™ Agar (BD),  HCl,  NaOH,  Natrium Carboxymethyl Cellulose (Na‐CMC), Triton X‐100,  Tris  (Merck®),  0,05M  Buffer  Phospahte Saline  (PBS)  pH  7,4 (NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4), 0,05M Buffer Potassium Phosphate pH 6,5 (K2HPO4, KH2PO4), Congo  Red (Sigma), Sodium  Dodecyl  Sulfate (SDS)  (Merck®),  Glycin  (Merck®),  Acrylamide/bis (Merck®),  Amonnium  Persulfat  (APS)  (Merck®),  TEMED  (Merck®), Pre‐stained  Protein  Ladder (GangNam‐STAIN™), running  buffer  SDS‐PAGE (Merck®) ,  Sample  Buffer 2X  (Merck®),  alkohol 70%, alkohol 96%, akuades.

## Alat
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  mikropipet  0,5‐10  μL  (Biorad), mikropipet  10‐100  μL  (Biorad),  mikropipet  100‐1000  μL  (Biorad),  mikroskop  (Olympus), mikrosentrifugasi  (Thermoscientific),  laminar  air  flow  chamber  (Omega),  oven  (Memmert), sonikator  (Biologic),  autoklaf, shaker  incubator (LM‐420D),  set  elektroforesis  (Biorad), spektrofotometer UV‐VIS (Genesys), tabung reaksi, cawan petri, silinder cup, jarum ose, kaca preparat, bunsen, tabung mikrosentrifugasi 1,5 mL (Eppendorf), dan peralatan gelas.

## Tahapan Penelitian
Penanganan Kultur Bakteri Dan Penyiapan Ekstrak Kasar Bacillus sp Isolat Bacillus sp., E.  coli ,  dan S.  aureus koleksi  Laboratorium  diremajakan  dari  stok gliserol dan diinokulasikan pada media Luria‐Bertani (LB) agar dan diinkubasikan pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Kemudian, kultur diinokulasikan ke dalam media LB broth dan diinkubasi di dalam shaker  incubator pada  kecepatan  120  rpm  dengan  suhu  37 0 C  selama  24  jam.  Bakteri pembentuk  biofilm  diisolasi  air  keran  Laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas  Teknobiologi Universitas Surabaya, setelah diencerkan lalu diinokulasikan ke media LB agar dan diinkubasi pada  suhu  37 0 C  selama  24  jam.  Tahap  konfirmasi  semua  bakteri  dilakukan  dengan  uji pengecatan Gram dan pengamatan mikroskopis [6].
Kultur Bacillus sp. fase stasioner disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit  untuk  pemanenan  sel,  lalu  dibilas  dengan  buffer  PBS  0,1  M,  kemudian  disentrifugasi
ulang. Pelet sel kemudian disuspensikan dalam larutan buffer PBS 0,1 M dengan perbandingan volume  1:4  (gram  pelet  sel:mililiter  PBS  0,1M),  disonikasi  [7]  pada  amplitude  20‐30%  untuk mendapatkan  ekstrak  kasar  yang  tembus  cahaya,  kemudian  disentrifugasi  dengan  kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 0 C lalu disimpan pada suhu ‐20 0 C hingga digunakan.
Pembuatan Biofilm Bakteri Air Kran, E. coli, S. aureus Sebanyak 10 μL inokulum bakteri dengan nilai OD 600 sebesar 0,1 dan 90 μL media LB dimasukkan  ke  dalam microplate 96  sumur dan  diinkubasi  pada  suhu  25 0 C  selama  48  jam tanpa  agitasi.    Setelah  itu,  media  dibuang  secara  perlahan  dan  lapisan  biofilm  diberikan perlakuan 130 μL ekstrak kasar Bacillus sp. selama waktu kontak  0 menit, 15 menit, 30 menit. Sebanyak  130  μL  media  LB  digunakan  sebagai  kontrol  negatif.  Sebanyak  10  μL  sel‐sel planktonik  diambil  untuk  diukur  densitas  dan  viabilitasnya,  sedangkan  sisa  cairan  kultur dibuang.  Lapisan  biofilm  difiksasi  dengan  130  μL  metanol  dan  dibiarkan  selama  10  menit. Selanjutnya  larutan  metanol  dibuang, microplate dikeringudarakan,  diwarnai  dengan  130  μL larutan  kristal  violet  1%  dan  dibiarkan  selama  30  menit.  Sumur‐sumur microplate kemudian dibilas dengan ddH 2 O, microplate dikeringudarakan, dan absorbansi kristal violet dibaca pada panjang  gelombang  590  nm  (berdasarkan  hasil  optimasi).  Hasil  yang  didapatkan  adalah  nilai absorbansi yang menandakan seberapa besar biofilm yang terbentuk [6].
Analisis  Aktivitas  Selulase  Ekstrak  Kasar Bacillus sp.  Menggunakan  SDS‐PAGE  dan Elektroforesis Zymogram
Analisis  selulase  ekstrak  kasar Bacillus sp.  dilakukan  dengan  cara  membuat  media Difco™  Agar  (BD)  yang  berisi  Natrium Carboxymethyl  Cellulose (Na‐CMC)  0,1%. Cylinder  cup diletakkan  di  atas  agar  berisi  Na‐CMC.  Kemudian  sampel  ekstrak  kasar  dengan  kadar  3,677 μg/μL dan sebanyak 100 μL standar protein selulase (kontrol positif) dengan kadar 1,4 mg/ml diinokulasikan  ke  dalam silinder  cup dan  diinkubasi  pada  suhu  25 0 C  selama  24  dan  48  jam. Elektroforesis  sampel  ekstrak  kasar Bacillus sp.  dilakukan  dengan  metode  elektroforesis Zimogram,  dilakukan  dengan  menggunakan  12,5%  poliakrilamida  sebagai  gel  pemisah ( Separating  Gel) dan  3%  poliakrilamida  sebagai  gel  penahan  ( Stacking  Gel ).      Sampel  ekstrak kasar  dan  standar  protein  (kontrol  positif)  dengan  konsentrasi  dan  total  protein  yang  sudah diukur  dalam  2X buffer sampel  di  tabung  mikrosentrifus  kemudian  dimasukkan  ke  dalam sumur  gel  penahan  dengan  volume  bervariasi  (antara  1‐10  μL).  Gel  dipasang  pada  tangki elektroforesis, buffer elektroforesis 1X dituang pada tempatnya, dan elektroforesis dijalankan selama  1  jam  pada  tegangan  110V.  Setelah  selesai,  gel  dilepas  dan  jarak  migrasi  diukur  dari batas  atas  gel  pemisah.  Setelah  elektroforesis  gel  dipisahkan  dengan  dipotong  dimana sebagian  gel  akan  dilakukan  pewarnaan  menggunakan  Coommasie  Blue  R‐250  dan  sebagian lainnya  akan  digunakan  untuk  proses  zimogram,  dimana  gel  direnaturasi  dengan  merendam gel  di  dalam  2,5%  Triton  X‐100  selama  satu  jam  sambil  diaduk.  Gel  ditiriskan  dan  direndam dalam 0,05M buffer kalium fosfat pH 6,5 selama 24 dan 48 jam sambil diaduk perlahan ( shaker incubator pada  suhu  37 0 C).  Kemudian  gel  diwarnai  dengan  kongo  merah  0,3%  selama  15 menit,  direndam  dengan  NaCl  1M  selama  1  jam  (2  kali),  dan  diberikan  larutan counterstain (asam asetat 5%) hingga pita bening muncul. Zona bening di sekitar pita dibandingkan dengan penanda  berat  molekul  untuk  mengetahui  berat  molekul  protein  ekstrak  kasar Bacillus sp.. Zona  bening  tersebut  mengindikasikan  bahwa  protein  ekstrak  kasar Bacillus sp.  dapat menghidrolisis substrat sodium karboksimetilselulosa (Na‐CMC) pada gel akrilamida.

## Analisis Data
Penelitian  ini  menggunakan  sistem  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan  replikasi sebanyak  empat  kali.  Pada  penelitian  ini,  tahapan  yang  dilakukan  uji  statistika  adalah pengujian  ekstrak  kasar Bacillus sp.  terhadap  pembentukan  biofilm,  pengukuran  kuantitas biofilm berdasarkan kuantitas kristal violet yang mewarnai biofilm (absorbansi dibaca pada λ = 590  nm,  A590,  nilai  A590  menandakan  jumlah  kristal  violet  yang  menempel  pada  lapisan
biofilm  yang  terbentuk).  Uji  statistik two‐way  analysis  of  variance (ANOVA)  dilakukan menggunakan software Minitab  17,  dengan  didahului  uji  normalitas  dan  homogenitas‐nya, sesudahnya diuji lanjut dengan uji Tukey ( multiple comparisons ).

## HASIL Pembentuk Biofilm
Uji  konfirmasi  terhadap  kemurnian  dan  tipe  Gram  semua  bakteri  percobaan menunjukkan  hasil  yang  benar. Hasil  yang  unik  yaitu  pada  bakteri  air  keran  telihat  bahwa ditemukan  beberapa  bentuk  sel  seperti  monobasil,  diplobasil,  dan  streptobasil.  Bakteri  air keran juga terdiri atas bermacam‐macam sel dengan tipe Gram berbeda, hal ini menunjukkan bahwa  pada  air  keran  terdapat  berbagai  macam  bakteri  yang  membentuk  komunitas. Pewarnaan  Gram  pada E.  coli memberikan  hasil  bahwa  bakteri  ini  berbentuk  koko‐basil  dan merupakan  bakteri  Gram  negatif.  Sel S.  aureus memiliki  bentuk  kokus/bulat  dan  merupakan bakteri Gram positif, demikian pula Bacillus sp juga merupakan sel bertipe Gram positif namun berbentuk basil.
Uji peluruhan biofilm dilihat dari nilai absorbansi kultur sel bakteri pembentuk biofilm setelah  diberikan  perlakuan  ekstrak  kasar Bacillus sp.  dengan  waktu  yang  ditentukan.  Hasil pengukuran absorbansi biofilm dan densitas sel dari bakteri air kran yang didapatkan disajikan pada Tabel 1.

## Tabel 1
Hasil Pengukuran Absorbansi Biofilm dan Densitas Sel dari Bakteri Air Kran
Jenis Perlakuan Waktu Inkubasi 0 Menit 15 Menit 30 Menit Uji Biofilm Kontrol Negatif 1,230 + 0,046 a 0,953 + 0,034 bc 0,787 + 0,039 d Ekstrak Kasar 1,040 + 0,052 b 0,872 + 0,041 cd 0,645 + 0,014 e Uji Viabilitas dan Densitas Sel Densitas Sel (kontrol negatif) 0,145 + 0,022 e 0,294 + 0,008 d 0,382 + 0,019 c Densitas Sel (ekstrak kasar) 0,397 + 0,031 c 0,509 + 0,032 b 0,590 + 0,009 a
Keterangan:  Perbedaan  signifikan  dilihat  dari  perbedaan  dari  huruf  abjad  yang  tertera  di sebelah atas nilai angka.
Dapat  dilihat  dari  hasil  Tabel  1  bahwa  semakin  lama  waktu  inkubasi  absorbansi semakin menurun yang menandakan bahwa biofilm telah diluruhkan. Perlakuan ekstrak kasar terlihat  lebih  banyak  meluruhkan  daripada  kontrol  negatif,  yakni  esktrak  kasar  memiliki  nilai absorbansi  sebesar  1,040  pada  perlakuan  0  menit  sedangkan  kontrol  negatif  memiliki  nilai absorbansi  lebih  besar  yaitu  1,230.  Kemudian  hasil  analisis  viabilitas  dan  densitas  sel  pada  0 menit menunjukkan bahwa ekstrak kasar memiliki nilai OD 600 yang lebih besar daripada kontrol negatif  dengan  nilai  OD 600 sebesar  0,397,  pada  kontrol  negatif  sebesar  0,145.  Hal  ini menandakan  bahwa  sel  planktonik  biofilm  perlakuan  ekstrak  kasar  lebih  banyak  terlepas daripada sel planktonik biofilm kontrol negatif yang cenderung stabil formasi biofilm‐nya. Dari perlakuan  waktu  kontak  0 menit,  15  menit, dan  30  menit dapat dilihat  bahwa  waktu terbaik adalah pada pemberian ekstrak kasar selama 30 menit pada bakteri air kran.
Untuk  hasil  pengukuran  absorbansi  biofilm  dan  densitas  sel  dari  bakteri E.  coli yang didapatkan disajikan pada Tabel 2.

## Tabel 2
Hasil Pengukuran Absorbansi Biofilm dan Densitas Sel dari Bakteri E. Coli
Jenis Perlakuan Waktu Inkubasi 0 Menit 15 Menit 30 Menit Uji Biofilm Kontrol Negatif 1,820 + 0,045 a 1,740 + 0,058 a 1,416 + 0,073 b Ekstrak Kasar 1,719 + 0,108 a 1,691 + 0,066 a 1,314 + 0,104 b Uji Viabilitas dan Densitas Sel Densitas Sel (kontrol negatif)  0,078 + 0,004 d 0,384 + 0,007 c 0,481 + 0,010 b Densitas Sel (ekstrak kasar) 0,381 + 0,026 c 0,492 + 0,027 b 0,567 + 0,040 a
Keterangan:  Perbedaan  signifikan  dilihat  dari  perbedaan  dari  huruf  abjad  yang  tertera  di sebelah nilai angka.
Tabel 2 menunjukkan bahwa pada E. coli ekstrak kasar pada perlakuan 0 menit lebih meluruhkan daripada kontrol negatif dengan nilai  absorbansi 1,719 yang  lebih kecil daripada nilai  absorbansi  kontrol  negatif  yaitu  1,820.  Hasil  uji  viabilitas  dan  densitas  sel  pada  0  menit juga  menunjukkan  bahwa  ekstrak  kasar  lebih  banyak  meluruhkan  biofilm  sehingga  sel planktonik yang terlepas lebih banyak, dengan nilai OD 600 yaitu 0,381. Kontrol negatif memiliki nilai OD600 sebesar  0,078, lebih kecil daripada ekstrak kasar.  Dengan demikian,  pada E. coli , perlakuan waktu kontak sel dengan ekstrak kasar yang terbaik adalah 30 menit .
Kemudian  untuk  hasil  pengukuran  absorbansi  biofilm  dan  densitas  sel  dari  bakteri S. auerus yang didapatkan disajikan pada Tabel 3. Pada S.aureus , ekstrak kasar lebih meluruhkan biofilm  dengan  nilai  absorbansi  1,735  sedangkan  kontrol  negatif  memiliki  nilai  absorbansi sebesar 1,982 pada perlakuan 0 menit. Pada hasil uji viabilitas dan densitas sel yang juga sama pada 0 menit, menunjukkan nilai OD 600 pada ekstrak kasar lebih besar daripada kontrol negatif dengan nilai 0,372 dan 0,166. Dengan demikian dapat dilihat bahwa perlakuan waktu kontak sel dengan ekstrak kasar terbaik pada S. aureus adalah pada waktu perlakuan 30 menit.

## Tabel 3
Hasil Pengukuran Absorbansi Biofilm dan Densitas Sel dari Bakteri S. auerus
Jenis Perlakuan Waktu Inkubasi 0 Menit 15 Menit 30 Menit Uji Biofilm Kontrol Negatif 1,982 + 0,024 a 1,763 + 0,066 b 1,432 + 0,104 c Ekstrak Kasar 1,735 + 0,078 b 1,565 + 0,056 c 1,253 + 0,043 d Uji Viabilitas dan Densitas Sel Densitas Sel (kontrol negatif)  0,166 + 0,009 d 0,369 + 0,019 c 0,480 + 0,006 b Densitas Sel (ekstrak kasar) 0,372 + 0,004 c 0,477 + 0,009 b 0,538 + 0,027 a
Keterangan: Perbedaan signifikan dilihat dari perbedaan dari huruf abjad yang tertera di sebelah nilai angka.
Analisis Keberadaan Aktivitas Selulase Pada Ekstrak Kasar Bacillus sp. Menggunakan SDS‐ PAGE dan Elektroforesis Zymogram
Uji  awal  untuk  mendeteksi  dari  keberadaan  selulase  dalam  ekstrak  kasar Bacillus sp. adalah  mengetes  kerja  ekstrak  kasar  pada  media  Difco™  Agar  (BD)  berisi  Na‐CMC  sebesar 0,1%.  Kontrol  positif  dan  ekstrak  kasar  diinokulasikan  ke  dalam  silinder  cup  dan  setelah diinkubasi selama 24 dan 48 jam, hasil tampak pada Gambar 1.
Gambar 1 . Hasil uji awal keberadaan dari enzim selulase pada ekstrak kasar Bacillus sp. menggunakan agar berisi Na‐CMC.
Keberadaan selulase dibuktikan dengan membesarnya zona bening setelah inkubasi 24 jam  dan  48 jam. Ekstrak  yang segar  (baru  dibuat), B, memiliki  diameter zona  bening sebesar 1,25 cm setelah inkubasi 24 jam dan setelah inkubasi 48 jam diameter zona bening menjadi 2 cm. Kemudian pada ekstrak yang telah disimpan, C,  pada inkubasi 24 jam memiliki diameter zona bening sebesar 0,9 cm dan setelah inkubasi 48 jam diameter zona bening menjadi 1,2 cm. Pada  D  waktu  inkubasi  24  jam  memiliki  diameter  zona  bening  sebesar  1  cm  dan  setelah inkubasi 48 jam diameter zona bening menjadi 1,5 cm (Gambar 1).
Kemudian  untuk  hasil  SDS‐PAGE  dan  zimogram,  sebagian  gel  yang  sudah dielektroforesis  diberi  pewarnaan  oleh  Coomassie  Blue  R‐250  dan  sebagian  lagi  diberikan perlakuan  dengan  pewarnaan  oleh  Kongo  Merah  0,3%  terlebih  dahulu  sebelum  proses zimogram. Berikut pada Gambar 2 merupakan hasil yang didapatkan.
Gambar 2 . Hasil SDS‐PAGE dan zimogram dari ekstrak kasar Bacillus sp dengan inkubasi selama 24 dan 48 jam. Keterangan : Dari kiri hingga kanan adalah hasil zimogram inkubasi 48 jam:  K+ (kontrol positif), EB (Ektrak Kasar baru), EL (Ekstrak kasar lama), gambar ditengah adalah hasil zimogram inkubasi 24 jam yaitu : K+ (kontrol positif), EB (Ektrak Kasar baru), EL (Ekstrak kasar lama).
Hasil SDS‐PAGE pada kanan yaitu: M (Marker), EL (Ekstrak kasar lama), EB (Ektrak Kasar baru),  K+  (kontrol  positif).  Hasil  yang  didapatkan  adalah  pada  kode  A,  dimana  terdapat  pita dengan  zona  bening  pada  hasil  zimogram  inkubasi  48  jam  di  dalam  ekstrak  kasar  baru  (EB)
M EL EB K+ EL EB K+ K+ EB EL 25 35 48 63 75kDA 100kD 135kD 180kD 245kD A B Inkubasi 48 Jam Inkubasi 24 Jam Hasil SDS-PAGE 35 kDa (A)
35 kDa (A) & 40 kDa (B)
dengan  ukuran  pita  sekitar  35  kDA.  Kontrol  positif  (selulase  murni)  memberikan  hasil  yang sama pada sekitar 35 kDa namun terdapat zona bening kedua yaitu pada sekitar 40kDa (kode B). Sedangkan ekstrak kasar lama (EL) tidak didapatkan pita dengan zona bening.

## BAHASAN
Uji konfirmasi menunjukkan Bacillus sp., E. coli , S. aureus , hasil pengecatan Gram‐nya sesuai  dan  benar,  sedangkan  bakteri  air  kran  menunjukkan  hasil  adanya  campuran  bakteri Gram negatif dan positif namun sel Gram negatif sepertinya lebih dominan. Maryanti dkk. [8] melaporkan hasil penelitiannya bahwa air kran dapat mengandung bermacam bakteri seperti S. aureus , Bacillus sp., E. coli , dan Klebsiella sp., yang diketahui bahwa jenis yang  disebutkan terakhir  (dan  juga  kebanyakan  genus  anggota  Enterobacteriaceae  lainnya)  diketahui  adalah salah satu bakteri yang efektif membentuk biofilm. Biofilm di toilet dan kamar mandi, seperti dilaporkan  Mori  dkk.  [9]  tersusun  dari  ratusan  jenis  bakteri  yang  secara  bertahap mengolonisasi dan spesies yang mendominasi dapat berganti‐ganti.
Peluruhan biofilm yang dilakukan pada suhu ruang 21 0 C selama 30 menit pada bakteri air  keran  memberikan  hasil  pengurangan  biofilm  sebesar  37,98%.  Nagraj  dan  Gokhale  [10] menggunakan isolat Penicillium janthinellum EU2D‐21 yang menghasilkan enzim ekstraseluler kompleks  yang  dapat  meluruhkan  biofilm E.  coli sebesar  85.5%, Salmonella  enterica sebesar 79.72%, Pseudomonas aeruginosa sebesar 88.76%, dan S. Aureus sebesar 87.42% dalam waktu inkubasi  1  jam  pada  suhu  50 0 C.  Stiefel et  al [3]  yang  menggunakan  enzim  novel endoscope cleaner yang  dapat  menghilangkan  biofilm  dari S.  Aureus sebesar  95%  dan P.  Aeruginosa sebesar 90%. Persentase peluruhan yang dilakukan oleh ekstrak kasar isolat Bacillus sp. tidak terlalu tinggi dibandingkan dengan hasil penelitian oleh Nagraj dan Gokhale dan Stiefel et al . Ekstrak  kasar  isolat Bacillus sp.  pada E.  Coli meluruhkan  biofilm  sebesar  23,56%  sedangkan Nagraj  dan  Gokhale  menggunakan  enzim  ekstraseluler  kompleks  yang  meluruhkan  biofilm E. Coli sebesar  85,5%.  Perlakuan  ekstrak  kasar Bacillus sp.  pada S.  Aureus hanya  memberikan peluruhan  sebesar  27,78%  sedangkan  enzim  ekstraseluler  kompleks  Nagraj  dan  Gokhale meluruhkan sebesar 87,42% dan enzim novel endoscope cleaner Stiefel et al dapat meluruhkan biofilm S.  Aureus sebesar  95%.  Lebih  rendahnya  kemampuan  peluruhan  biofilm  oleh  ekstrak Bacillus sp  pada  penelitian  ini  dapat  disebabkan  keragaman  enzim  ekstraseluler  yang dikandung  lebih  sedikit  dan  juga  mungkin  dikarenakan  aktivitas  selulase  yang  tidak  optimal. Walaupun  ekstrak  kasar  isolat Bacillus sp.  tidak  memiliki  tingkat  peluruhan  sebesar  hasil penelitian  lainya,  ekstrak  kasar  tersebut  memiliki  potensi  untuk  dibuat  menjadi  “bahan  anti‐ biofilm” namun masih memerlukan penelitian dan pengembangan lebih lanjut.
Analisis  keberadaan  selulase  ekstrak  kasar Bacillus sp.  terlihat  dari  adanya  aktivitas selulase  pada  ekstrak  kasar,  berukuran  di  sekitar  35  kDa  (inkubasi  48  jam),  munculnya  zona bening ini pada sampel ekstrak kasar yang baru. Hal sebaliknya terjadi pada ekstrak kasar yang telah lama diekstrak zona bening tidak nampak. Pada hasil zimogram dengan inkubasi 24 jam masih tidak terlihat aktivitas selulase pada kontrol positif, ektrak kasar baru dan ekstrak kasar lama, hal tersebut dikarenakan kinerja dari enzim/ekstrak kasar yang masih belum tampak. Hal ini dibuktikan dengan hasil uji coba awal ketika zona bening lebih besar setelah inkubasi 48 jam daripada 24 jam pada media Difco™ agar Na‐CMC.

## SIMPULAN
Ekstrak  kasar  isolat Bacillus sp.  meluruhkan  biofilm  dari  bakteri  air  kran  sebesar 37,98%, E. coli sebesar 23,56% dan S. aureus sebesar 27,78%. Perlakuan ekstrak kasar terbaik tersebut adalah dengan waktu kontak 30 menit. Terdapat aktivitas enzim selulase pada ekstrak kasar  isolat Bacillus sp.,  yang  terlihat  pada  ukuran  berat  molekul  sekitar  35  kDa,  yang  dapat dilihat dengan munculnya zona bening pada sekitar pita yang muncul.

## PUSTAKA ACUAN
1. Srinivasan,  R.,  Santhakumari,  S.,  Poonguzali,  P.,  Getha,  M.,  Dyavaiah,  M.  2021.  Bacterial Biofilm  Inibition:  A  Focused  Review  on  Recent  Theurapetic  Strategies  for  Combating  The Biofilm Mediated Infection. Fronti in Microbiol. 12 Article 676458.
2. Clayton,  G.E.,  Thorn,  R.M.S.,  Reynolds,  D.M.  2021.  The  Efficacy  of  Chlorine‐Based Disinfectants  Against  Planctonic  And  Biofilm  Bacteria  For  Decentralised  Point‐Of‐Use Drinking Water. Nat. Portof.J. Article 48.
3. Stiefel, P., Mauerhofer, S., Schneider, J., Maniura‐Weber, K., Rosenberg, U., Ren, Q. 2016. Enzymes  enhance  biofilm  removal  efficiency  of  cleaners.  Antimicrob  Agents  Chemother 60:3647–3652.
4. Johansen,  C.,  Falholt,  P.,  Gram,  L.  1997.  Enzymatic  Removal  and  Disinfection  of  Bacterial Biofilms. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 63, No. 9, p. 3724–3728.
5. Kurniawan,  W.D.  2017.  Penghambat  Sistem  Quorum  Sensing  Burkholderia  cenocepacia H111 Oleh Ekstrak Kasar Dari Isolat Bakteri Lingkungan. Surabaya: Universitas Surabaya.
6. Wahyudi, M., Murugappan, S., Van Merkerk, R., Eissens, A.C., Visser, M.R., Hinrichs, W.L.J., Quax,  W.J.  2013.  Development  of  A  Dry,  Stable,  And  Inhalable  Acyl‐Homoserine‐Lactone‐ Acylase  Powder  Formulation  For  The  Treatment  of  Pulmonary  Pseudomonas  aeruginosa Infections. Eur. J. Pharm. Sci. 48: 637‐643.
7. Conceicao,  D.P.,  Dos  Passos,  C.T.,  Jaques,  R.D.S.,  Bento,  F.M.,  Simonetti,  A.B.,  Camargo, F.A.O.  2009.  A  Novel  Chromate  Reductase  From Bacillus sp  ES29:  Characterisation  And Partial Purification. Rev. Cien. Ex. E. Nat. 11 (2), p. 237‐256.
8. Maryanti, R., Suharti, N., Amir, A. 2019. Gambaran Bakteri pada Kran Air dan Tombol Flush Kloset  Duduk  di  Toilet  Umum  Lingkungan  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Andalas  Tahun 2018. Jurnal Kesehatan Andalas. 8. 33. 10.25077/jka.v8i2S.956.
9. Mori, M., Gomi, M., Matsumune, M., Niizeki, K., Sakagami, Y. 2013. Biofilm‐Forming Activity of bacteria Isolated From Toilet Bowl Biofilms And The Bactericidal Activity Of Disinfectants Against The Isolates. Biocontrol Sci. 18 (3) 129‐35.
10. Nagraj,  A.K.  and  Gokhale,  D.  2018.  Bacterial  Biofilm  Degradation  Using  Extracellular Enzymes  Produced  by  Penicillium  janthinellum  EU2D‐21  under  Submerged  Fermentation. Advances in Microbiology, 8, 687‐698.