Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.222 Hasil Penelitian

## PENGARUH MEDIA KULTIVASI

## Chaetoceros gracilis TERHADAP KANDUNGAN KIMIAWI DAN POTENSI INHIBITOR PROTEASE
[Effect of Chaetoceros gracilis Cultivation Media to the Chemical Content and Protease Inhibitor Potential]

## Iriani Setyaningsih*, Tati Nurhayati dan Uzainah Aremhas
Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 28 Januari 2013 / Disetujui 09 Januari 2014

## ABSTRACT
Microalgae produce secondary metabolites with different characteristics for each genus, species or strain. A single species of microalgae can produce several bioactive compounds, including protease inhibitors which can prevent deterioration of fish. In this study, we observed the growth of Chaetoceros gracilis in the media  NPSi and  NPSi + NaHCO3 and determined the chemical  content and the potency  of protease inhibitor from Chaetoceros gracilis in both media. The culture was harvested at 8 and 15 days. Screening of protease inhibitor activity was performed by agar diffusion method. Protease inhibitor activity was tested on three pathogenic protease-producing bacteria, namely Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and Escherichia coli. The pathogenic bacteria often contaminate foodstuffs. The  results showed that media  NPSi and NPSi + NaHCO3 affected protein and lipid content of C. gracilis, but the culture age did not affect them. The protein content of C. gracilis cultivated in NPSi media (34.75  and  32.94%)  was  higher  than  in  NPSi  +  NaHCO3  media  (28.13  and  27.13%),  while  the  lipid  content  was  16.36  and  18.06,  23.86  and 25.40% respectively. Extracts of C.  gracilis grown in NPSi  and NPSi+NaHCO3  media  had inhibitory activity against  the test bacteria. Inhibitory activity against E. coli was greater than S. aureus and B. cereus.
Keywords: Bacillus cereus, Chaetoceros gracilis, chemical content, Escherichia coli, protease inhibitor, Staphylococcus aureus

## ABSTRAK
Mikroalga  menghasilkan  metabolit  sekunder  dengan  karakteristik  yang  berbeda  untuk  setiap  genus,  spesies  atau  strain.  Satu  spesies mikroalga  dapat  memiliki  beberapa  potensi  dari  senyawa  bioaktifnya,  termasuk  inhibitor  protease.  Inhibitor  protease  dapat  menghambat kemunduran mutu ikan. Pada penelitian ini diketahui pertumbuhan Chaetoceros gracilis dalam media NPSi (Nitrogen, Phosphor, Silika) dan NPSi ditambah NaHCO 3 , serta ditentukan kandungan kimiawi dan potensi inhibitor protease Chaetoceros gracilis dalam kedua media tersebut. Kultur dipanen pada umur kultur 8 dan 15 hari. Penapisan aktivitas inhibitor protease dilakukan dengan metode difusi agar. Aktivitas inhibitor protease diujikan pada tiga bakteri patogen penghasil protease, yaitu Staphylococcus aureus , Bacillus cereus dan Escherichia coli . Bakteri patogen tersebut sering  mengontaminasi  bahan  pangan.  Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan  bahwa  media  NPSi  dan  NPSi  ditambah  NaHCO 3 mempengaruhi perbedaan kandungan protein dan lipid C. gracilis , namun umur kultur tidak mempengaruhinya. Kadar protein C. gracilis dalam media NPSi (34.75 dan 32.94%) lebih tinggi dibanding dalam media NPSi ditambah NaHCO 3 (28.13 dan 27.13%), sedangkan kadar lipidnya berturut-turut 16.36 dan 18.06, serta 23.86 dan 25.40%. Ekstrak dari C. gracilis yang dikultivasi dalam kedua media tersebut memiliki aktivitas inhibitor protease yang sama terhadap E. coli . Aktivitas hambatan terhadap E. coli lebih besar dibandingkan terhadap S. aureus dan B. cereus .
Kata kunci: Bacilluscereus, Chaetoceros gracilis , Escherichia coli, inhibitor protease , kandungan kimiawi , Staphylococcus aureus

## PENDAHULUAN
1
Mikroalga memiliki banyak keunggulan, antara lain mengan- dung protein dan asam  lemak tidak jenuh tinggi. Pemanfaatan mikroalga masih terbatas sebagai pakan dan pangan. Selain itu mikroalga juga dapat dimanfaatkan sebagai bahan dasar obat- obatan  atau  farmasi.  Jenis  mikroalga  yang  banyak  ditemui  di perairan pantai Indonesia antara lain Chaetoceros gracilis yang berwarna  kuning  kecoklatan  sehingga  sering  disebut  dengan golden-brown algae.
Pemanfaatan C.  gracilis saat  ini  masih  terbatas  sebagai pakan  dalam  budidaya  udang. Chaetoceros  gracilis memiliki kandungan  lipid  yang  cukup  tinggi  ±28%  (Elias et  al. 2005).
*Penulis Korespondensi: E-mail: iriani25@gmail.com
Selama  pertumbuhan Chaetoceros  gracilis, kandungan  asam lemak  golongan  SAFA  menurun  (29.53%)  dari  fase  akhir eksponensial  sampai  stasioner  dan  meningkat  lagi  pada  fase kematian  (47.38%).  Namun  asam  lemak  golongan  PUFA meningkat dari fase akhir eksponensial sampai stasioner. Asam oleat  ditemukan  pada  semua  tahap  pertumbuhan  dengan konsentrasi 17-21% dari total asam lemak (Pratiwi et al . 2009). Kandungan  lipid  ini  membuat Chaetoceros potensial  sebagai penghasil  biofuel.  Selain  komponen  kimia, Chaetoceros juga mempunyai komponen aktif. Hasil penelitian Setyaningsih et al. (2008)  menunjukkan  bahwa C.  gracilis memiliki  aktivitas antibakteri  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri patogen Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Vibrio harveyi, dan Escherichia coli.
Mikroalga  menghasilkan  metabolit  sekunder  yang  penye- barannya  terbatas  dan  memiliki  karakteristik  yang  berbeda
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.222 Hasil Penelitian
untuk setiap genus, spesies atau strain tertentu, sehingga tidak mengherankan  jika  satu  spesies  mikroalga  memiliki  beberapa potensi  dari  senyawa  bioaktifnya.  Oleh  karena  itu  perlu dilakukan penelitian mengenai potensi lain dari C. gracilis, yaitu sebagai inhibitor protease.
Inhibitor protease adalah senyawa yang dapat mengganggu aktifitas  enzim  protease  dengan  mengganggu  kerja  sel  peng- hasil  protease  (Lehninger,  2005).  Enzim  protease  atau proteolitik  adalah  enzim  yang  bekerja  sebagai  katalis  dalam reaksi  hidrolisis  protein.  Beberapa  bakteri  patogen  memiliki enzim protease ekstraseluler (pemecah protein) untuk merusak jaringan  sel  inangnya  seperti Bacillus dan E.  coli .  Penyakit seperti HIV dan kanker sangat erat hubungannya dengan enzim protease  (Hui,  2003).  Keterlibatan  enzim  protease  dalam mekanisme  patogenesis  meningkatkan  perhatian  penelitian untuk  mendapatkan  senyawa  obat  yang  dapat  menghambat enzim  protease.  Inhibitor  protease  juga  berperanan  dalam pengolahan  pangan,  salah  satunya  dapat  menghambat kemunduran mutu hasil perikanan. Hasil penelitian Nurhayati et al. (2011)  menunjukkan  bahwa  perendaman  dengan  inhibitor katepsin  dapat  memperpanjang  fase postrigor ikan  bandeng sebanyak 72 jam atau 3 hari lebih lama dibanding ikan bandeng kontrol. Beberapa inhibitor protease alami dapat dihasilkan dari hasil perikanan seperti sponge, ikan, telur ikan, telur, kentang. Masing-masing  senyawa  yang  dihasilkan  berbeda  jenis  dan potensi  aktivitasnya.  Pada  penelitian  ini  dianalisis  potensi mikroalga C. gracilis sebagai inhibitor protease.
Mikroalga  dalam  pertumbuhannya  dipengaruhi  oleh  be- berapa faktor antara lain nutrien, suhu, intensitas cahaya, umur dan sebagainya. Nutrien dapat mempengaruhi komposisi kimia seperti  protein,  lemak,  karbohidrat  mikroalga  selama  per- tumbuhan.  Saavedra  dan  Voltolina  (2006)  menyatakan  bahwa kandungan  protein  selama  pertumbuhan  mikroalga  menurun hingga akhir fase pertumbuhan.
Keberadaan sumber karbon dalam media juga dapat mem- pengaruhi  pertumbuhan  mikroalga.  Sumber  karbon  dalam media kultur dapat diperoleh dari udara yang diberikan melalui aerasi.  Tersedianya  CO 2 di  dalam  media  kultur  merupakan faktor  penting  karena  secara  langsung  dipakai  sebagai  bahan untuk  membentuk  molekul-molekul  organik  melalui  proses fotosintesis.  Karbondioksida  adalah  sumber  karbon  yang  lebih disukai  oleh  tumbuhan  akuatik  seperti  alga  dibandingkan karbonat  atau  bikarbonat.  Pada  penelitian  ini  digunakan NaHCO 3 untuk  memperbanyak  ketersediaan  sumber  karbon. Pada  penelitian  ini  mikroalga Chaetoceros  gracilis dikultivasi dalam  media  NPSi  dan  media  NPSi  yang  ditambahkan NaHCO 3, sebagai  sumber  karbon.  Kultivasi  dilakukan  di  luar ruangan dengan memanfaatkan sinar matahari sebagai sumber cahaya. Menurut Voltolina et al. (2007) cahaya, temperatur, dan komposisi  media  akan  memodifikasi  fisiologis,  pertumbuhan, dan aktivitas metabolisme mikroalga.
Penelitian  ini  bertujuan  melihat  pertumbuhan C.  gracilis dalam  media  NPSi  dan  NPSi  +  NaHCO 3 ,  menentukan komposisi kimia khususnya protein dan lipiddari C. gracilis pada umur  berbeda.  Selain  itu  juga  mengetahui  potensi C.  gracilis sebagai inhibitor protease, yang selama ini belum ada.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Mikroalga Chaetoceros  gracilis diperoleh  dari  Pusat Penelitian  dan  Pengembangan  Oseanografi  LIPI  Jakarta. Bakteri uji yang digunakan meliputi Staphylococcus aureus , air laut  untuk  media  dibeli  dari  toko  akuarium  di  Bogor, Bacillus cereus dan Escherichia  coli yang  diperoleh  dari  Fakultas Kedokteran Hewan, IPB.
Kultivasi Chaetoceros gracilis Proses  kultivasi  untuk  memperoleh  kurva  pertumbuhan C. gracilis dilakukan  menggunakan  tabung  kultur  transparan dengan volume kultur 2 L. Perbandingan bibit C. gracilis dengan air laut yang digunakan adalah 1:10 (v/v). Media yang diguna- kan  adalah  media  NPSi  dan  NPSi+NaHCO 3 (0.5  g/L).  Media NPSi  terdiri  atas  urea  (Petrokimia)  sebagai  sumber  nitrogen, Super Phosphat (Petrokimia) sebagai sumber fosfat dan natrium silikat  (dibeli  di  toko  kimia  Bogor)  sebagai  sumber  silika. Selanjutnya aerator dipasang dan dinyalakan non stop . Sumber cahaya  berasal  dari  sinar  matahari.  Penghitungan  jumlah  sel menggunakan  mikroskop  dan haemocytometer (Marienfeld) dilakukan setiap hari untuk memperoleh kurva pertumbuhan C. gracilis.
Setelah  diperoleh  kurva  pertumbuhan,  selanjutnya  di- lakukan  kultivasi C.  gracilis dalam  skala  besar  (14  L)  untuk memperoleh  biomassa  sel C.  gracilis lebih  banyak.  Kultur dipanen  pada  akhir  fase  log  dan  pertengahan  fase  stasioner. Biomassa C.  gracilis dipisahkan  dari  media  (cairan)  dengan sistem filtrasi menggunakan filter keramik. Biomassa C. gracilis yang didapat kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer ( Yamato ),  selanjutnya  ditimbang  untuk  diketahui  berat  kering- nya yang akan digunakan untuk tahapan penelitian selanjutnya.
Ekstraksi senyawa aktif dari C. gracilis Proses ekstraksi didahului dengan pemecahan sel terhadap biomasa sel C. gracilis kering menggunakan glass bead dengan prinsip bead milling . Biomassa yang sudah diperoleh dimasuk- kan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan  ditambah  etanol  (Merck) sebanyak  5  mL  lalu  dilakukan  pemecahan  sel  dengan glass bead selama  10  menit.  Selanjutnya  dilakukan  ekstraksi  meng- gunakan pelarut etanol (1:25) dengan metode maserasi (3 x 24 jam).  Pemisahan  filtrat  dilakukan  menggunakan  metode penyaringan,  selanjutnya  dievaporasi,  sehingga  diperoleh ekstrak kasar yang digunakan untuk uji inhibitor protease.

## Analisis kandungan kimiawi
Analisis kandungan kimiawi dilakukan terhadap kandungan protein dan lemak biomasa sel C. gracilis . Untuk analisis protein mengacu metode Lowry, sedangkan analisis lipid menggunakan metode Bligh dan Dyer (Iverson et al . 2001).

## Analisis protein
Analisis  protein  dilakukan  dengan  menimbang  4  mg biomassa  kering Chaetoceros kemudian  disuspensikan  dalam 20  mL  akuades  dan  dihomogenkan.  Kemudian  sampel  dan bovine  serum  albumin  (BSA)  dipipet  masing-masing  2  mL  ke tabung sentrifuse. Setelah itu ditambahkan 5 mL pereaksi Lowry ke  dalam  sampel  dan  BSA  lalu  dihomogenkan.  Sampel  dan
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.222 Hasil Penelitian
4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 Lo g Ju m la h Se l Hari a b c d
BSA  didiamkan  selama  satu  jam.  Kemudian  masing-masing ditambahkan  dua  kali  0.3  mL  folin  ciocalteau  phenol  (Merck) tetes demi tetes dan dihomogenkan kembali serta didiamkan 15 menit. Setelah itu sampel dan BSA disentrifugasi menggunakan sentrifus  (Hettich  universal)  dengan  kecepatan  3000  rpm selama 15 menit. Selanjutnya supernatan diukur absorbansinya dengan spektro-fotometer (Spektronic UV-VIS A 5000) panjang gelombang  660  nm  dan  didapat  kurva  standar.  Kandungan persen  protein  dalam C.  gracilis dapat  dihitung  dengan  meng- gunakan kurva standar.

## Analisis lipid
Biomasa C. gracilis diekstrak dengan menambahkan 5  mL kloroform  (Merck),  metanol  (Merck),  dan  air  non  ion  (FKH) dengan  perbandingan  5:10:4  selanjutnya  sampel  disentrifugasi dengan  kecepatan  2500  rpm  selama  10  menit.  Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse lain dan ditambahkan kloroform, metanol, dan air dengan perbandingan 5:10:4  hingga  volume  menjadi  5.7  mL.  Kemudian  sampel ditambahkan  1.5  mL  kloroform  dan  1.5  mL  air  non  ion  dan disentrifuse  kembali  dengan  kecepatan  2500  rpm  selama  10 menit. Hasil sentrifuse akan terbentuk lapisan lipid dan pelarut. Lapisan  lipid  yang  berwarna  hijau  dipipet  dan  dipindahkan  ke dalam botol vial yang telah ditimbang beratnya terlebih dahulu. Kemudian  dilakukan  peniupan  dengan  gas  N 2 sampai  larutan kloroform menguap, lalu botol tersebut ditimbang sebagai berat akhir  botol  untuk  mengetahui  berat  total  lipid.  Rumus  per- hitungan lipid total adalah sebagai berikut:
Total lipid = berat akhir botol – berat awal botol
Pengujian  ekstrak C.  gracilis sebagai  inhibitor  protease (Nurhayati et al. 2004) Proses  pengujian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  potensi ekstrak C.  gracilis sebagai  inhibitor  protease.  Media  yang digunakan  adalah  media  Luria  Agar,  Sigma-Aldrich  (LA)  skim 2%.  Keempat ekstrak  yang diperoleh dari kultur C. gracilis ( C. gracilis yang  dikultivasi  dalam  medium  NPSi  dipanen  pada kultur umur 8 dan 15 hari serta C. gracilis yang dikultivasi dalam medium  NPSi+NaHCO 3 dipanen  pada  kultur  umur  8  dan  15 hari) selanjutnya disuspensikan dalam etanol sehingga konsen- trasinya  10%  (b/v).  Sebanyak  200  µL  dimasukkan  ke  dalam cawan Petri, kemudian sebanyak 10 mL LA skim 2% ditambah- kan  ke  dalam  cawan  petri  steril  tersebut  dan  diputar  atau digoyang  hingga  homogen  dan  dibiarkan  hingga  membeku. Untuk kontrol digunakan 200 µL etanol dan media LA skim 2% cair.  Bakteri  uji  ( Staphylococcus  aureus , Bacillus  cereus dan Escherichia  coli )  diambil  satu  ose  kemudian  ditusukkan  ke dalam media yang telah beku. Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Zona bening yang terbentuk diukur meng- gunakan jangka sorong dan dihitung indeks proteolitik masing- masing  bakteri  baik  dalam  medium  kontrol  maupun  medium yang mengandung ekstrak dengan menggunakan rumus:
( )
Keterangan: a = diameter zona bening (mm) b = diameter koloni (mm)
Daya  hambat  ekstrak C.  gracilis terhadap  enzim  protease bakteri dihitung dengan menggunakan rumus:
[ [ ]]
Keterangan: IPe  = Indeks proteolitik bakteri uji pada media mengandung ekstrak IPk  = Indeks proteolitik bakteri uji pada media kontrol

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kurva pertumbuhan Chaetoceros gracilis Kurva  pertumbuhan C.  gracilis yang  dikultivasi  dalam medium NPSi mengalami fase lag pada H-0 sampai dengan H-1 (Gambar  1),  sedangkan  yang  dikultivasi  dalam  medium NPSi+NaHCO 3 tidak  mengalami  fase  lag  (Gambar  2).  Hal  ini dapat  terjadi  karena  fase  lag  berjalan  cepat,  sesaat  sebelum fase log, sehingga yang nampak pada kurva hanyalah fase log (Richmond, 2004). Fase log terjadi pada H-1 sampai H-6 untuk C. gracilis yang dikultivasi dalam medium NPSi dan H-0 sampai H-4  untuk C.  gracilis yang  dikultivasi  dalam  medium NPSi+NaHCO 3 . Fase pertumbuhan C. gracilis yang selanjutnya adalah fase stasioner yang terjadi pada H-6 sampai H-30 untuk kultivasi  dalam  medium  NPSi  dan  terjadi  pada  H-4  sampai dengan  H-20  untuk  kultivasi  dalam  medium  NPSi+NaHCO 3. Fase  pertumbuhan  berikutnya  adalah  fase  kematian  mulai terjadi pada hari ke-31 untuk kultivasi dengan media NPSi dan terjadi  pada  hari  ke-21  untuk  kultivasi  dengan  media NPSi+NaHCO 3.
Gambar 1.  Kurva kehidupan Chaetoceros gracilis dalam media NPSi (a  =fase  lag,  b  =fase  log,  c  =fase  stasioner  dan  d  =fase kematian)
Chaetoceros  gracilis yang  dikultivasi  dalam  medium  NPSi memiliki kurva pertumbuhan yang lebih panjang serta kepadat- an sel yang lebih tinggi dibandingkan C. gracilis yang dikultivasi dalam medium NPSi+NaHCO 3 . Komposisi kimia yang berbeda dan  perubahan  kondisi  lingkungan  memberikan  pengaruh  ter- hadap  metabolisme  sel  mikroalga  (Voltolina et  al. 2007). Penambahan NaHCO 3 pada awalnya meningkatkan kepadatan sel, namun seiring berjalannya waktu kultivasi terjadi perubahan kondisi  lingkungan  kultur,  perubahan  kondisi  lingkungan  mem- berikan  pengaruh  terhadap  metabolisme  sel  mikroalga,
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.222 Hasil Penelitian
5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Lo g Ju m la h Se l Hari b c d 0 10 20 30 40 NPSi NPSi+NaHCO3 Ka nd un ga n (% ) Media protein 8 hari lipid 8 hari protein 15  hari lipid 15 hari 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 S. aureus B. cereus E. coli In de ks P ro te oli tik (I P) Bakteri Patogen
sehingga  jumlah  karbon  yang  berlebihan  dari  penambahan NaHCO 3 menyebabkan autoinhibition .
Gambar 2.  Kurva  kehidupan Chaetoceros  gracilis dalam  media NPSi+NaHCO 3 (b =fase log, c =fase stasioner dan d =fase kematian)
Komposisi kimia biomasa C. gracilis Kandungan  protein C.  gracilis yang  dikultivasi  dalam medium NPSi dipanen pada umur 8 dan 15 hari sebesar 34.75 dan  32.94%,  sedangkan  yang  dikultivasi  dalam  medium NPSi+NaHCO 3 dipanen pada umur 8 dan 15 hari sebesar 28.13 dan 27.13%. Kandungan lipid C. gracilis yang dikultivasi dalam medium  NPSi  umur  panen  8  dan  15  hari  adalah  16.36  dan 18.06%,  sedangkan  yang  dikultivasi  dalam  medium  NPSi +NaHCO 3 umur panen 8 dan 15 hari adalah 23.86 dan 25.40% (Gambar 3).
Gambar 3.  Kandungan  lipid  dan  protein Chaetoceros  gracilis pada umur panen 8 dan 15 hari
Media NPSi dan NPSi + NaHCO 3 mempengaruhi perbedaan kandungan protein dan lipid C. gracilis , sedangkan umur kultur tidak  mempengaruhi.  Kadar  protein C.  gracilis dalam  media NPSi lebih tinggi dibanding dalam media NPSi + NaHCO 3. Hal ini  sesuai  dengan  laju  pertumbuhan C.  gracilis dalam  media tersebut.  Laju  pertumbuhan C.  gracilis yang  dikultivasi  dalam media NPSi pada hari ke-8 adalah 0.332 pembelahan sel/hari, sedangkan yang dikultivasi dalam media NPSi+NaHCO 3 adalah 0.293  pembelahan  sel/hari.  Laju  pertumbuhan C.  gracilis yang dikultivasi  dalam  media  NPSi  lebih  tinggi  dibandingkan C. gracilis yang  dikultivasi  dalam  medium  NPSi+NaHCO3.  Hal  ini dapat  terjadi  karena  penambahan  NaHCO 3 yang  berlebihan menjadi autoinhibition atau  penghambat  pertumbuhan.
Richmond  (2004)  menyatakan  bahwa  karbon  selama  fase  log diutamakan untuk sintesis protein. Hal ini disebabkan mikroalga cenderung mensintesis struktur fungsional terlebih dahulu untuk bereplikasi dan tumbuh.
Selain  faktor  nutrisi,  meningkatnya  kandungan  lipid  juga dipengaruhi oleh fisiologis C. gracilis . Sel C. gracilis cenderung mensintesis lipid pada fase stasioner sebagai cadangan energi untuk  mempertahankan  kelangsungan  hidupnya  karena  laju pertumbuhan sel telah menurun.
Potensi inhibitor protease dari C. gracilis Pengujian inhibitor protease ini bertujuan untuk mengetahui potensi  inhibitor  protease  dari C.  gracilis dengan  mengukur daya  hambat  ekstrak C.  gracilis terhadap  enzim  protease bakteri  uji  yang  ditandai  dengan  mengecilnya  atau  tidak  ter- bentuknya zona bening di sekeliling koloni bakteri. Zona bening yang  terbentuk  pada  media  kontrol  menunjukkan  indeks proteolitik  bakteri  uji.  Indeks  proteolitik  disajikan  pada  Gambar 4, sedangkan daya hambat ekstrak C. gracilis terhadap enzim protease disajikan pada Tabel 1.
Ekstrak C.  gracilis yang  memiliki  aktivitas  terbaik  dalam menghambat enzim protease S. aureus, yaitu ekstrak C. gracilis yang ditumbuhkan dalam media NPSi umur panen 15 hari, yaitu sebesar 40.17%.
Tabel 1.  Daya  hambat  ekstrak Chaetoceros  gracilis terhadap  enzim protease bakteri patogen
Ekstrak Chaetoceros gracilis Daya Hambat terhadap Bakteri Uji (%) Staphylococcu s aureus Bacillus cereus Escherichia coli A 39.8 37.78 100 B 40.17 34.92 64.67 C 15.18 40.08 100 D 32.14 17.14 66 Keterangan: C. gracilis yang dikultivasi pada (A) media NPSi panen 8 hari, (B) media NPSi panen 15 hari, (C) media NPSi+NaHCO 3 panen 8 hari, (D) media NPSi+NaHCO 3 panen 15 hari
Gambar 4.  Indeks  proteolitik  bakteri  patogen  yang  didasarkan  pada diameter zona bening terhadap diameter koloni bakteri
Indeks  proteolitik  (IP)  merupakan  nilai  yang  menunjukkan kemampuan  bakteri  patogen  memproduksi  enzim  protease secara ekstra seluler. Hasil penelitian memperoleh nilai IP dari Staphylococcus aureus ( S. aureus ), Bacillus cereus ( B. cereus ) dan Escherichia coli ( E. coli ) masing-masing adalah 2.33; 1.75 dan  1.5.  Kemampuan  memecah  protein  ini  dapat  terlihat  dari terbentuknya zona bening di sekitar koloni.
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.222 Hasil Penelitian
Hasil  uji  aktivitas  inhibitor  protease  menunjukkan  bahwa ekstrak C.  gracilis yang  dikultivasi  dalam  media  NPSi  dan NPSi+NaHCO 3 memiliki  aktivitas  inhibitor  protease  terhadap bakteri  uji Staphylococcus  aureus,  Bacillus  cereus dan Escherichia coli . Daya hambat ekstrak terhadap bakteri uji tidak sama,  karena  setiap  bakteri  mempunyai  sensitivitas  terhadap komponen  aktif  yang  berbeda.  Secara  umum  ekstrak  dari C. gracilis yang  ditumbuhkan  dalam  media  NPSi  dan NPSi+NaHCO 3 tidak menunjukkan perbedaan aktivitas inhibitor protease  yang  terlalu  besar.  Hal  ini  sesuai  dengan  pola  per- tumbuhan C. gracilis dalam kedua media yang digunakan juga tidak  menunjukkan  perbedaan.  Penambahan  NaHCO 3 tidak terlalu  mempengaruhi  komponen  aktif  yang  diduga  berperan sebagai inhibitor protease.
Daya  hambat  ekstrak  terhadap S.  Aureus lebih  kecil dibandingkan E.  coli .  Hal  ini  diduga S.  Aureus menghasilkan aureocin yang merupakan protease yang stabil. Staphylococcus aureus merupakan  bakteri  Gram  positif  dan  memiliki  struktur kristal  protein  yang  melindungi  serin  proteasenya.  Antara substrat dengan sisi aktif protease membentuk ikatan hidrofobik yang  lengkap  membentuk  rantai  polar  pada  sisi  aktifnya (Popowicz et  al. 2006).  Kestabilan,  kristal  pelindung  protease dan  ikatan  enzim-substrat  yang  kuat  diduga  membuat  ekstrak C.  gracilis sulit  untuk  menghambat  enzim  proteasenya. Pengujian  terhadap B.  cereus menunjukkan  bahwa  ekstrak C. gracilis memiliki aktivitas inhibitor protease lebih kecil dibanding terhadap E.  coli .  Nasaimento  dan  Martins  (2004)  melaporkan bahwa enzim protease Bacillus bersifat stabil pada suhu tinggi 30-60°C dan aktivitas proteolitiknya dapat bekerja pada kisaran pH yang panjang yaitu 6 sampai 8.5. Kestabilan enzim protease B. cereus membuat aktivitasnya sulit dihambat oleh ekstrak. Ekstrak C.  gracilis dapat  menghambat  enzim  protease E. coli dengan baik. Media pertumbuhan C. gracilis yang diguna- kan tidak mempengaruhi aktivitas inhibitor protease terhadap E. coli .  Ekstrak C.  gracilis yang  ditumbuhkan  dalam  media  NPSi dan  media  NPSi+NaHCO 3 dipanen  pada  umur  8  hari  mampu menghambat enzim protease E. coli secara sempurna (100%). Hal  ini  diduga  ekstrak C.  gracilis mampu  berikatan  dengan substrat  sehingga  menghambat  produksi  enzim  protease  dan proses  proteolisis.  Aktivitas  hambatan  terhadap E.  coli lebih besar dibandingkan S. aureus dan B. cereus . Aktifitas inhibitor protease dari setiap biota tidak sama. Hal ini berkaitan dengan komponen  aktif  yang  dihasilkan.  Nurhayati et  al. (2004)  me- laporkan  bahwa  hasil  penapisan  ekstrak  dari  10  jenis  sponge memiliki  daya  hambat  terhadap  bakteri P.  aeruginosa berkisar 2.03-27.74%.
Sensitifitas bakteri terhadap ekstrak dapat pula dipengaruhi oleh  dinding  selnya  seperti  adanya  reseptor,  pori  dan kandungan  lipid.  Bakteri  Gram  positif  lebih  sensitif  terhadap ekstrak  non  polar  karena  dinding  selnya  tersusun  dari peptidoglikan, salah satunya adalah asam amino D-alanin yang bersifat  hidrofobik.  Bakteri  Gram  negatif  memiliki  lapisan tambahan  pada  dinding  selnya  yang  tersusun  dari  lipo- polisakarida,  porin  matriks  dan  lipoprotein.  Adanya  selaput khusus  berupa  molekul  protein  memudahkan  difusi  senyawa hidrofilik. Escherichia  coli merupakan  bakteri  Gram  negatif diduga  sensitifitas  terhadap  ekstrak  etanol  dari C.  gracilis me- nyebabkan enzim proteasenya dapat dihambat dengan mudah.
Perbedaan  sisi  aktif,  berat  molekul  dan  kestabilan  enzim protease  bakteri  menyebabkan  masing-masing  ekstrak C. gracilis memiliki  daya  hambat  yang  berbeda-beda  terhadap enzim protease bakteri patogen.
Hasil pengujian ekstrak C. gracilis sebagai inhibitor protease menunjukkan bahwa ekstrak dari C. gracilis yang dipanen pada umur  8  hari  memiliki  aktivitas  penghambatan  yang  cukup  baik terhadap  protease  bakteri  uji. Chaetoceros  gracilis yang dipanen  pada  umur  8  hari  berada  pada  akhir  fase  log, kandungan protein pada biomassa selnya cukup tinggi sehingga diduga  pada  fase  ini  protein  yang  disekresikan  memiliki  efek inhibitor  protease.  Penelitian  Nurhayati et  al. (2006)  mengenai inhibitor  protease  dari  bakteri  yang  berasosiasi  dengan  spons menunjukkan  bahwa  selama  waktu  inkubasi  inhibitor  protease mencapai  nilai  maksimum,  terjadi  peningkatan  konsentrasi protein sehingga diduga bahwa inhibitor protease adalah suatu protein.
Proses pembentukan senyawa aktif dalam tubuh mikroalga dipengaruhi  oleh  kondisi  lingkungannya.  Pada  kultivasi C. gracilis di  luar  ruangan,  baik  intensitas  cahaya  maupun  suhu kultivasi  berubah-ubah.  Meskipun  intensitas  cahaya  dan  suhu yang  sampai  masih  dalam  batas  intensitas  cahaya  dan  suhu pertumbuhan C.  gracilis ,  namun  perubahan  intensitas  cahaya dan suhu dari waktu ke waktu dapat menyebabkan kondisi yang kurang  nyaman  bagi C.  gracilis .  Berkaitan  dengan  hal  ini Richmond  (2004)  menyatakan  bahwa  pada  saat  kondisi  tidak nyaman  atau  mendekati  stress,  mikroalga  melakukan  respon fisiologis antara lain dengan memodifikasi genetik atau dengan mensintesis  metabolit  sekunder. Chaetoceros  gracilis diduga merespon  perubahan  intensitas  cahaya  dan  suhu  dengan mensintesis  senyawa  metabolit  diantaranya  asam  amino, alkaloid  dan  peptida  yang  diduga  memiliki  efek  inhibitor protease. Kemampuan suatu inhibitor protease terhadap enzim protease  dapat  dipengaruhi  oleh  kesesuain  sisi  aktif,  protein penyusun, berat molekul enzim protease, dan mekanisme peng- hambatan yang terjadi (Yandri, 2008).
Aktivitas inhibitor protease dari C. gracilis berbeda dengan sponge.  Nurhayati et  al. (2004)  melaporkan  bahwa  ekstrak sponge  dengan  pelarut  akuades  mempunyai  potensi  daya hambat  erhadap E.  coli dan S.  Aureus berkisar  antara  0.00- 100.00%.

## KESIMPULAN
Pertumbuhan  mikroalga Chaetoceros  gracilis yang dikultivasi dalam media NPSi tidak jauh berbeda dengan yang dikultivasi  dalam  media  NPSi+NaHCO 3 .  Media  NPSi  dan NPSi+NaHCO 3 mempengaruhi  kandungan  protein  dan  lipid C. gracilis .  Kandungan  protein C.  gracilis yang  dikultivasi  dalam media NPSi lebih besar dibanding dalam media NPSi+NaHCO 3, namun kadar lipidnya lebih rendah.
Eksktrak  dari  biomasa C.  gracilis memiliki  aktivitas  peng- hambatan  terhadap  enzim  protease  bakteri  patogen.  Secara umum C.  gracilis yang  ditumbuhkan  dalam  media  NPSi  dan media  NPSi+NaHCO 3 tidak  menunjukkan  perbedaan  aktivitas inhibitor  protease  yang  terlalu  besar.  Perbedaan  media  per- tumbuhan C.  gracilis yang  digunakan  tidak  mempengaruhi
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.222 Hasil Penelitian
aktivitas  inhibitor  proteaseterhadap E.  coli .  Aktivitas  inhibitor protease terhadap bakteri E. coli lebih besar dibanding terhadap bakteri B. cereus dan S. aureus .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  dibantu  dari  penelitian  Hibah  Bersaing  yang didanai  DIKTI  2009/2010  dengan  Nomor  28/I3.24.4/SPK/BG- PD/2009.

## DAFTAR PUSTAKA
Elias  JAL,  Voltolina  D,  Ocana  FE,  Simental  GG.  2005.  Indoor and  outdoor  mass  production  of  the  diatom Chaetoceros muelleri in a Mexican commercial hatchery. J Aqua Eng 33:
Hui  DY.  2003.  HIV  protease  inhibitors  and  atherosclerosis.  J Clin Invest 111:3 17-318. DOI: 10.1172/JCI17746.
Iverson  SJ,  Lang  SL,  Cooper  MH.  2001.  Comparison  of  the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipid 36: 1283-1287. DOI:
Lehninger  AL.  2005.  Dasar-dasar  Biokimia  Jilid  I.  Suhartono MT,  penerjemah.  Penerbit  Erlangga.  Jakarta.  Terjemahan dari Principles of Biochemistry,p. 382.
Nasaimento  WCA,  Martins  MLL.  2004.  Production  and properties  of  an  extracellular  protease  from  thermophilic Bacillus sp. Brazilian J Microbiol 35: 91-96. DOI:  10.1590/
S1517-83822004000100015.
Nurhayati  T,  Suptijah  P,  Suhartono  MT,  Febrian  I.  2004. Penapisan  inhibitor  protease  yang  dihasilkan  oleh  sponge asal  Kepulauan  Seribu.  Bul  Teknol  Hasil  Perikanan  8:  45- 58.
Nurhayati  Y,  Suhartono  MT,  Nuraida  L,  Poerwanto  SB.  2006. Karakterisasi  awal  inhibitor  protease  dari  bakteri  yang berasosiasi dengan spons asal Pulau Panggang, Kepulauan Seribu. Hayati 13: 58-64.
Nurhayati  T,  Salamah  E,  Tampubolon  K,  Aprilan  A.  2011 Peranan  inhibitor  katepsin  dari  ikan  patin  ( Pangasius hypophthalmus ) untuk menghambat kemunduran mutu ikan bandeng  ( Chanos  chanos Forskal).  J  Pengolahan  Hasil Perikanan Indonesia 17: 495-553.
Popowicz  GM,  Dubin  G,  Niemczyk  JS,  Czarny  A,  Dubin  A,
Potempa  J,  Holak  TA.  2006.  Functional  and  structural characterization  of  SpI  protease  from Staphylococcus aureus .  J  Mol  Biol  358:  270-279.  DOI:  10.1016/j.jmb.2006.
01.098.
Pratiwi  AR,  Syah  D,  Hardjito  L,  Panggabean  LMG,  Suhartono MT.  2009.  Fatty  acid  synthesis  by  Indonesian  marine diatom, Chaetoceros  gracilis .  Hayati  16:  151-156.  DOI:
Richmond  A.  2004.  Handbook  of  Microalgal  Culture: biotechnology  and  applied  phycologi.  Iowa  State  Press. Blackwell Publishing, p. 566.
Saavedra  MPS,  Voltolina  D.  2006.  The  growth  rate  biomass production and composition of Chaetoceros sp. grown with different  light  sourch.  J  Aqua  Eng  35:  161-165.  DOI:
Setyaningsih I,  Hardjito L, Monintja DR, Sondita MFA,  Bintang M,  Lailati  N,  Panggabean  L.  2008.  Ekstraksi  senyawa antibakteri  dari  diatom Chaetoceros  gracilis dengan berbagai metode. J Biol Indo 5: 23-33.
Voltolina  D,  Saavedra  MPS,  Rodriguez  LMT  2007.  Outdoor mass  microalgae  production  in  bahia  kino,  Sonora,  New Mexico. J Aqua Eng 38: 96-96.
Yandri,  Tati  S,  Dian  H,  Sutopo  H.  2008.  The  chemical modification  of  protease  enzyme  isolated  from  locale bacteria  isolate, Bacillus  subtilis ITBCCB148  with  cyanuric chloride-polyethylenglycol. J Sci Res 23: 177-186.
10.1007/s11745-001-0843-0.
181-191. DOI: 10.1016/j.aquaeng.2005.01.001.
10.1016/j.aquaeng.2005.12.001.
10.4308/hjb.16.4.151.