## CURRENT BIOCHEMISTRY
ISSN: 2355-7877 e-ISSN: 2355-7931 Journal homepage: http://journal.ipb.ac.id/index.php/cbj Journal E-mail: current.biochemistry@gmail.com
Potency of Ethanol Extracts of Palm Seeds ( Phoenix dactylifera L.) as Antidiabetic with Inhibition Kinetics Parameter
(Potensi Ekstrak Etanol Biji Kurma (Phoenix dactylifera L.) sebagai Antidiabetes dengan Parameter Kinetika Inhibisi α-Glukosidase)
Lisa Giovanny 1* , Faliha Arinda Lestari 1 , Nurul Marfira 1 , Laksmi Ambarsari 1 , Siti Warnasih 2
1 Department of Biochemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, IPB University, Bogor 16680
2 Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Pakuan University, Bogor 16143
Received: 11 July 2019 ; Accepted: 20 December 2019
Corresponding author : Lisa Giovanny; Department of Biochemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, IPB University, Bogor 16680; Email: lisagiovanny08@gmail.com

## ABSTRACT
Date  seeds  are  one of the byproducts  of the  date  palm  juice  industry  which  has  the  potential  for further  processing.  Date  seeds  contain  active  compounds  that  are  known  to  have  ability  to  inhibit  α- Glucosidase. This study aims to measure the activity of 70% ethanol extract and the fraction of date palm seeds with a mechanism in inhibiting α-Glucosidase. The measurement of inhibitory activity was carried out by extracting date palm seeds  using water and 70%  ethanol. The extraction product was then fractionated with  nhexane,  ethyl  acetate,  nbutanol,  and  water.  Then  the  total  phenolic  and  flavonoid  contents  were calculated  for  each  extract  and  fraction.  Measurement  of  α-Glucosidase  inhibition  activity  was  performed based on reaction of substrate to enzyme by the addition of inhibitors. The results showed that the ethanol extract had the highest total phenolic and flavonoid contents, which were 76.86 mg GAE / g and 21.19 mg QE  /  g,  respectively.  The  n-hexane  fraction  exhibited  the  best  inhibitory  activity  based  on  the  IC 50 value, which  was  12.69  mg/L. The kinetics  of inhibition of 70% ethanol extract of  the date  palm seeds are mixed inhibition.
Keywords: α-Glucosidase, Date seeds, Flavonoids, Kinetic inhibition, Phenolic

## ABSTRAK
Biji  kurma  merupakan  salah  satu  hasil  samping  dari  industri  sari  kurma  yang  berpotensi  untuk diolah  lebih  lanjut.  Biji  kurma  mengandung  senyawa  aktif  yang  diketahui  mampu  menghambat  α- Glukosidase. Penelitian ini  bertujuan mengukur aktivitas ekstrak etanol 70% dan fraksi biji kurma dengan mekanisme  dalam  menginhibisi  α-Glukosidase.  Aktivitas  inhibisi  diukur  dengan  mengekstraksi  biji  kurma menggunakan pelarut air dan etanol 70%. Hasil ekstraksi kemudian difraksinasi dengan pelarut nheksana, etil asetat, nbutanol, dan air. Selanjutnya dilakukan perhitungan total fenolik dan flavonoid masingmasing ekstrak dan fraksi. Pengukuran aktivitas inhibisi α-Glukosidase diukur berdasarkan reaksi substrat terhadap enzim  dengan  penambahan  inhibitor.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  memiliki  total fenolik  dan  flavonoid  tertinggi,  yaitu  masingmasing  sebesar  76.86  mg  GAE/g  dan  21.19  mg  QE/g.  Fraksi
n-heksana  memiliki  aktivitas  inhibisi  yang  paling  baik  dilihat  dari  nilai  IC 50 ,  yaitu  sebesar  12.69  mg/L. Kinetika inhibisi ekstrak etanol 70% biji kurma adalah inhibisi campuran (mixed inhibition).
Kata kunci : α-Glukosidase, Biji kurma, Fenolik, Flavonoid, Kinetika inhibisi

## 1. PENDAHULUAN
Diabetes  melitus  (DM)  merupakan salah  satu  masalah  kesehatan  global  terbesar pada  abad  ke21.  Diabetes  melitus  (DM) merupakan  salah  satu  penyakit  mematikan  di dunia. Menurut International Diabetes Federation (IDF)  pada  tahun  2017,  penderita DM  dunia  mencapai  425  juta  jiwa.  Indonesia sendiri  menduduki  posisi  ke6  negara  dengan penderita diabetes tertinggi di dunia. Sebanyak 325 dari 425 juta jiwa penderita diabetes dunia menderita  diabetes  melitus  tipe  2.  Diabetes adalah  penyakit  kronis  yang  terjadi  ketika pankreas  tidak  memproduksi  cukup  insulin (hormon  yang  meregulasi  gula  darah  atau glukosa),  atau  ketika  tubuh  tidak  dapat menggunakan  insulin  yang  telah  diproduksi secara efektif (WHO 2016). Menurut National Health  Service  (NHS)  pada  tahun  2014, diabetes  tipe  2  adalah  tipe  DM  yang  paling umum.  Sebanyak  88,3%  pengidap  diabetes menderita diabetes tipe 2.
Berbagai  upaya  telah  dilakukan  untuk menangani kejadian DM, salah satunya dengan menghambat kerja α-Glukosidase  yang merupakan  enzim  kunci  dalam  pencernaan karbohidrat.  α-Glukosidase  berperan  dalam mengatalisis tahap akhir pencernaan disakarida dan pati pada proses diet. Maka dari itu, proses inhibisi  α-Glukosidase  dianggap  efektif  untuk menunda  pemecahan  karbohidrat  dalam  usus halus serta mampu menurunkan kadar abnormal  glukosa  darah  pada  penderita diabetes (Kazeem et al . 2013).
Penghambatan  kerja  α-Glukosidase biasa  dilakukan  melalui  konsumsi  obat komersial  yang  beredar  di  masyarakat.  Obat komersial  yang  biasa  digunakan  untuk menginhibisi  α-Glukosidase,  di  antaranya acarbose,  viglibose,  dan  miglitol.  Namun
konsumsi obat komersial tersebut memberikan efek  samping,  seperti  mual,  muntah,  kejang perut,  serta  hepatotoksisitas.  Maka  dari  itu, pengembangan obat diabetes masih dikembangkan lebih lanjut. Beberapa inhibitor terhadap α-Glukosidase sedang dikembangkan sebagai  alternatif  bagi  penggunaan  obat komersial  yang beredar  di  masyarakat  (Lai et al .  2012).  Biji  kurma  ( Phoenix  dactilyfera L) merupakan  salah  satu  kekayaan  hayati  yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai alternatif  bagi  penggunaan  obat  antidiabetes yang  aman  dan  efektif.  Biji  kurma  memiliki berat total 5.610% dari total bobot buah kurma tergantung  tingkat  kematangan,  varietas  dan kelas.  Indonesia  merupakan  salah  satu  negara importir  buah  kurma  terbesar  di  dunia.  Impor buah  kurma  yang  dilakukan  Indonesia  pada Januari  dan  Februari  2018  mencapai  10.4  juta ton.  Impor  buah  kurma  dilakukan  untuk memenuhi  kebutuhan  lokal  dengan  berbagai jenis  pengolahan,  salah  satunya  adalah pengolahan  buah  kurma  sebagai  sari  kurma yang  digunakan  sebagai  suplemen  kesehatan. Salah  satu  produsen  sari  kurma  di  wilayah Bogor  menggunakan  15002000  Kg  buah kurma  untuk  memproduksi  7200  botol  per harinya.  Besarnya  impor  buah  kurma  di Indonesia  tentunya  juga  akan  menimbulkan limbah biji kurma yang cukup besar dan belum termanfaatkan  dengan  maksimal.  Selain  itu, kini  di  tengah  masyarakat  juga  tengah berkembang  tren  mengonsumsi  biji  kurma dalam  bentuk  sediaan  kopi  yang  dipercaya memilik efek yang baik bagi kesehatan tubuh.
Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Abiola et  al .  (2015)  menunjukkan  bahwa  biji  kurma mengandung  senyawa  metabolit  sekunder berupa  flavonoid,  saponin,  antrakuinon  dan tanin. Flavonoid, saponin, antrakuinon,
diketahui  memiliki  kemampuan  menghambat aktivitas  α-Glukosidase  (Santoni et  al .  209; Zhao et al . 2009). Selain itu, menurut Khan et al .  (2016)  ekstrak  air,  etanol,  metanol  dan aseton memiliki kemampuan dalam menginhibisi  α-Glukosidase.  Belum  ada penelitian  yang  membuktikan  bahwa  ekstrak etanol 70% biji kurma mampu menghambat α- Glukosidase  yang  berperan  dalam  penyakit diabetes.  Penelitian  ini  bertujuan  menguji  dan mengukur  aktivitas  penghambatan  esktrak etanol 70% biji kurma terhadap α-Glukosidase sebagai model penyakit diabetes secara in vitro dengan  mekanisme  inhibisi  kinetika  inhibisi terhadap α-Glukosidase.

## 2. METODOLOGI
Alat-alat yang digunakan pada penelitian  ini,  di  antaranya,  hammer  mill, evaporator  (HS  2005V),  spektrofotometer (Hitachi  tipe  U2800),  pH  meter  (Eutech Instruments),  vortex  mixer  (BI  type  37600 mixer), microplate reader (Biotek Epoch).
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian ini, di antaranya biji kurma yang diperoleh dari industri  sari  kurma  AlJazira  Bogor,  α- Glukosidase dari Aspergillus sp. (SigmaAdrich Co), paranitrofenilα-Dglukopiranosida (pNPG) (SigmaAdrich  Co),  pnitrofenol,  kuersetin, FollinCiocalteu, asam galat, alumunium foil.
Preparasi  biji  kurma  (Zubaidah  dan  Sari 2015)
Biji kurma dibersihkan terlebih dahulu, kemudian  dipanaskan  di  dalam  oven  yang telah  diatur  pada  suhu  50 o C  selama  24  jam. Setelah  kering,  biji  kurma  dihaluskan  lalu diayak dengan ayakan berukuran 40 mesh.

## Penentuan kadar air (AOC 2007)
Penentuan  kadar  air  sampel  biji  kurma dilakukan dengan pengeringan di  dalam oven. Cawan  porselin  mulamula  dikeringkan  pada suhu
105 0 C selama 30 menit kemudian didinginkan di  dalam  desikator  selama  15  menit. Selanjutnya  porselin  yang  telah  dingin ditimbang  pada  neraca  analitik.  Sebanyak  3  g sampel  dimasukkan  ke  dalam  cawan  porselin yang  telah  dikeringkan  lalu  dipanaskan  pada suhu  105 0 C  selama  3  jam  kemudian didinginkan  di  dalam  desikator  selama 15 menit lalu ditimbang. Pemanasan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan.
Ekstraksi Biji Kurma (Modifikasi Lumempouw et al . 2012)
Ekstraksi  diawali  dengan  membuat ekstrak  etanol  biji  kurma.  Sebanyak  125  g simplisia  biji  kurma  dimasukkan  ke  dalam labu Erlenmeyer 500 mL, kemudian dimaserasi  menggunakan  250  mL  etanol  70% dengan  kecepatan  130  rpm  pada  suhu kamar  selama  24  jam.  Setelah  itu,  maserat disaring.  Selanjutnya,  ampas  diremaserasi (sebanyak  dua  kali  ulangan)  menggunakan pelarut dan  kecepatan  yang  sama  selama  24 jam,  lalu  maserat  kembali  disaring  sehingga diperoleh  filtrate  hasil  maserasi.  Selanjutnya dilakukan  pembuatan  ekstrak  air  biji  kurma. Sebanyak 50 g simplisia dimasukkan ke dalam labu  Erlenmeyer  500  mL  lalu  direfluks menggunakan 100 mL akuades pada suhu  90  °C  selama  1  jam.  Setelah  itu campuran  disaring.  Ampas  digunakan  untuk proses  refluks  kembali  dengan  kondisi  yang sama. Setelah itu, campuran disaring sehingga diperoleh  filtrat  hasil  refluks.  Ekstraksi dilakukan  secara  triplo.  Filtrat  hasil  ekstraksi dipekatkan dengan evaporator pada suhu  50  °C  hingga  menjadi  pasta.  Ekstrak disimpan  dalam  wadah  tertutup  pada  suhu  4 °C.
Fraksinasi  ekstrak  etanol  biji  kurma (Firdausi et al . 2015 dengan modifikasi) Fraksinasi  ekstrak  etanol  biji  kurma dilakukan  melalui  beberapa  tahap.  Pertama, sebanyak  10  gram  ekstrak  etanol  biji  kurma
dilarutkan  dalam  50  ml  nheksana  dan  50  mL akuades  secara  bergantian  sehingga  ekstrak larut seutuhnya. Kemudian, campuran dipisahkan  dengan  corong  pisah.  Selanjutnya campuran  didiamkan  hingga  terlihat  lapisan antara  nheksana  dengan  air.  Fraksi  nheksana dengan fraksi air kemudian dipisahkan. Fraksi air  yang  diperoleh  kemudian  difraksinasi kembali  dengan  50  ml  nheksana.  Proses  ini dilakukan  secara  triplo  dengan  pelarut  yang sama.  Namun,  pelarut  nheksana  diganti dengan pelarut etil asetat lalu pelarut nbutanol sehingga  pada  tahap  akhir  akan  diperoleh  4 jenis  fraksi,  yaitu  fraksi  nheksana,  fraksi  etil asetat,  fraksi  nbutanol  dan  fraksi  air.  Fraksi fraksi  yang  diperoleh,  yaitu  fraksi  nheksana, fraksi  etil  asetat  dan  fraksi  nbutanol, dipekatkan  dengan  evaporator.  Fraksifraksi yang diperoleh dihitung persentase rendemennya  lalu  disimpan  dalam  wadah tertutup  dan  disimpan  di  dalam  lemari  es dengan suhu ≤ 4 °C.
Penentuan Kandungan Total Fenolik (Javanmardi et al . 2003 dengan modifikasi)
Penentuan kandungan fenolik
menggunakan reagen FollinCiocalteu.
Sebanyak  0.2  mL  ekstrak  dan  masingmasing fraksi  (nheksana,  nbutanol,  etil  asetat  dan  air) secara triplo dengan konsentrasi 200 mg/L, 2.5 ml  reagen  FollinCiocalteu  10%  dan  2  ml Na 2 CO 3 7.5%  dicampurkan  dan  diinkubasi selama 30 menit.
Absorban larutan diukur dengan menggunakan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang  765  nm.  Total  fenolik  ekstrak  biji kurma  diekspresikan  sebagai  milligram  (mg) asam  galat  ekuivalen  per  gram  bobot  ekstrak kering  (mg  GAE/g  ekstrak  biji  kurma).  Asam galat pada konsentrasi (0, 25, 50, 75, 100, 125 mg/L) digunakan sebagai standar.
Penentuan  Total  Flavonoid  (Chang et  al . 2002 dengan modifikasi)
Penentuan kadar total flavonoid ekstrak biji kurma menggunakan metode spektrofotometri  UVVis.  Kuersetin  digunakan dalam  pembuatan  kurva  kalibrasi.  Sebanyak 10  mg  kuersetin  dilarutkan  dalam  80% metanol, kemudian diencerkan menjadi 25, 50 dan  100  mg/L.  Masingmasing  standar  dan ekstrak sebanyak 0.5 mL ditambahkan 1.5 mL etanol  95%,  0.1  mL  alumunium  klorida  10%, 0,1  mL  kalium  asetat  1  M  dan  2.8  mL  air suling.  Campuran  diinkubasi  pada  suhu  ruang selama 30 menit, kemudian dibaca absorbansinya pada λ 415 nm.
Uji  Aktivitas α-Glukosidase (Sancheti et  al . 2009)
Campuran  reaksi  terdiri  atas  10  μL sampel  (konsentrasi  10005000  mg/L),  50  μL larutan  buffer  fosfat  0.1  M  (pH  7),  25  μL substrat  pNPG  (pnitrofenilaDglukopiranosida) 10 mM dan reaksi diinisiasi dengan penambahan  25  µl  enzim  α-Glukosidase dengan  konsentrasi  0.1  U/mL  dalam  bufer fosfat  (pH  7.0).  Campuran  reaksi  diinkubasi pada  suhu  37  °C  selama  30  menit.  Reaksi dihentikan  dengan  penambahan  100  µl Na 2 CO 3 200  mM.  Hasil  reaksi  diukur  dengan microplate  reader  pada  panjang  gelombang 410  nm.  Larutan  akarbose  (konsentrasi  0.110 µg/mL)  digunakan  sebagai  kontrol  positif. Percobaan dilakukan secara triplo. Selanjutnya dilakukan  perhitungan  %  inhibisi  untuk menentukan  nilai  IC 50 .  Sistem  reaksi  dapat diketahui pada Tabel 1.
Kinetika Inhibisi α-Glukosidase (Kazeem et al . 2013)
Penentuan kinetika inhibisi α Glukosidase dilakukan dengan membuat kurva standar  pnitrofenol  terlebih  dahulu.  Sebanyak 0.6995  g  Pnitrofenol  dilarutkan  dengan  buffer fosfat 0.1 M pH 7. Kemudian stok p nitrofenol tersebut  diencerkan  ke  berbagai  konsentrasi dan  diukur  menggunakan  spektofotometer UVVis  pada panjang  gelombang  400  nm.
Selanjutnya,  penentuan  kinetika  inhibisi  α- Glukosidase  dilakukan  dengan  menggunakan dua set reaksi, yaitu reaksi dengan inhibisi dan reaksi tanpa inhibisi.
Set reaksi dengan inhibisi berisi 10  μL sampel  dengan  inhibisi  terbaik  (IC 50 terbaik) yang dicampur dengan 50 μL buffer fosfat 0,1 M  pH  7,  25  μL  substrat  pNPG  (pnitrofenila Dglukopiranosida)  pada  berbagai  konsentrasi. Kemudian reaksi diinisiasi dengan menambahkan  25  μL  enzim  α-Glukosidase. Selanjutnya  campuran  diinkubasi  selama  30 menit.  Reaksi  dihentikan  dengan  penambahan Na 2 CO 3 20 mM sebanyak 100 μL.
Set  reaksi  tanpa  inhibisi  berisi  10  μL pelarut  yang  dicampur  dengan  50  μL  bufer fosfat  0,1  M  pH  7,  25  μL  substrat  pNPG  ( p - nitrofenilaDglukopiranosida)  pada  berbagai konsentrasi. Reaksi diinisiasi dengan menambahkan  25  μL  enzim  α-Glukosidase. Selanjutnya  campuran  diinkubasi  selama  30 menit.  Reaksi  dihentikan  dengan  penambahan Na 2 CO 3 20 mM sebanyak 100 μL.

## 3. HASIL
Kadar air, rendemen ekstrak dan fraksi biji kurma
Kadar air simplisia biji kurma diperoleh dengan menggunakan metode gravimetri sebanyak tiga kali ulangan
mengacu  pada  AOAC  2007.  Metode  ini dilakukan  dengan  mengeringkan  simplisia pada  oven  dengan  suhu  105 0 C  selama  3 jam. Kadar air yang diperoleh dalam penelitian ini  sebesar  0.13  %  (Tabel  1).  Rendemen ekstrak  air  biji  kurma  diperoleh  dengan menggunakan  metode  refluks.  Rendemen ekstrak air biji kurma diperoleh sebesar 0.96%. Rendemen  ekstrak  etanol  70%  diperoleh dengan  menggunakan  metode  maserasi,  yaitu dengan  cara  melarutkan  simplisia  biji  kurma ke dalam pelarut etanol 70% selama 3x24 jam menggunakan shaker pada kecepatan 130 rpm dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator.  Rendemen  ekstrak  etanol  70% diperoleh  sebesar  2.82%  (Tabel  1).  Ekstrak etanol  70%  kemudian  difraksinasi  secara bertingkat menggunakan empat pelarut dengan derajat  kepolaran  yang  berbeda.  Fraksinasi ekstrak  etanol  70%  dilakukan  menggunakan empat  pelarut  berdasarkan  urutan  derajat ketidakpolarannya,  yaitu  nheksana  untuk pelarut  nonpolar,  etil  asetat  untuk  pelarut semipolar,  nbutanol  untuk  pelarut  semipolar dan  air  untuk  pelarut  polar.  Keempat  fraksi kemudian  dipekatkan  menggunakan  rotary evaporator.  Fraksi  air  memiliki  rendemen tertinggi,  yaitu  sebesar  0.94%  dan  fraksi  n- heksana  memiliki  rendementerendah,  yaitu 0.01% (Tabel 1).
Tabel 1 Kadar air, rendemen ekstrak dan fraksi  kurma Pengujian Hasil rerata ( %) Kadar air simplisia biji kurma 0.13 Rendemen ekstrak air 0.96 Rendemen ekstrak etanol 70% 2.82 Rendemen fraksi dan simplisia n-heksana 0.01 Etil asetat 0.03 n-butanol 0.22 Air 0.4

## Total fenolik ekstrak dan fraksi biji kurma
Penentuan  kadar  total  fenolik  biji kurma  dilakukan  menggunakan  reagen  Follin- Ciaocalteu. Pengukuran total fenolik menggunakan  standar  asam  galat.  Persamaan garis  yang  diperoleh  dari  data  Absorbansi standar  adalah  Y  =  0.003x  +  0.006  dengan nilai R 2 sebesar 0.996. Ekstrak etanol memiliki nilai total fenolik tertinggi, yaitu sebesar 76.86 mg  GAE/g  sedangkan  fraksi  nheksana memiliki  nilai  total  fenolik  terendah,  yaitu sebesar 0.25 mg GAE/g.

## Total  Flavonoid  Ekstrak  dan  Fraksi  Biji Kurma
Penentuan  kadar  total  flavonoid  biji kurma dilakukan menggunakan metode spektorfotometri  UVVis.  Pengukuran  total flavonoid  menggunakan  standar  kuersetin. Persamaan  garis  yang  diperoleh  dari  data absorbansi  standar  adalah  Y  =  0.0047x  + 0.001  dengan  nilai  R2  sebesar  0.999.  Kadar total flavonoid dihitung berdasarkan satuan mg
QE/g.  Ekstrak  etanol  memiliki  nilai  total flavonoid  tertinggi,  yaitu  sebesar  21.19  mg QE/g  sedangkan  fraksi  nheksana  memiliki nilai  total  fenolik  terendah,  yaitu  sebesar  0.04 mg QE/g.

## Aktivitas  Inhibisi  α-Glukosidase  Ekstrak dan Fraksi Biji Kurma
Kemampuan  ekstrak  dan  fraksi  biji kurma  dalam  menghambat  α-Glukosidase dapat  ditentukan berdasarkan  persen  inhibisi (Gambar  38)  dan  nilai  IC 50 masingmasing sampel  (Tabel  2).  IC 50 merupakan  bilangan yang  menunjukkan  konsentrasi  ekstrak  atau fraksi  biji  kurma  yang  mampu  menghambat aktivitas  αglukosidase  sebesar  50%.  Data penelitian  menunjukkan  bahwa  semua  sampel baik  ekstrak  dan  frkasi  memiliki  aktivitas inhibisi terhadap  α-Glukosidase.  Fraksi nheksana  memiliki  nlai  IC 50 tertinggi,  yaitu sebesar  12.69  µg/mL,  sedangkan  ekstrak  air memiliki  nilai  IC 50 terendah,  yaitu  sebesar 7480.09 µg/mL (Tabel 2).
Tabel 2 Nilai IC 50 ekstrak dan fraksi biji kurma Sampel IC 50 (µg/mL) Ekstrak air 7480.090 Ekstrak etanol 70% 15.425 Fraksi n-heksana 12.690 Fraksi etil asetat 13.220 Fraksi n-butanol 141.457 Fraksi air 186.606 Akarbose 0.004

## Kinetika Inhibisi αGlukosidase
Penentuan  tipe  inhibisi  dilakukan menggunakan  dua  macam  set  reaksi,  yaitu  set reaksi inhibisi dan set reaksi non inhibisi yang direaksikan  dengan  berbagai  konsentrasi substrat. Inhibitor (esktrak etanol 70%) dengan konsentrasi 1000 mg/L ditambahkan ke dalam set  inhibisi,  sehingga  diperoleh  plot  yang berbeda  antara  aktivitas  enzim  tanpa  inhibitor dan  aktivitas  enzimdengan  inhibitor.  Analisis
kinetika  inhibisi  ditentukan  melalui  kurva LineweaverBurk (Gambar 10). Data penelitian menunjukkan  bahwa  jenis  inhibisi  yang bekerja  adalah  inhibisi  campuran  ( mixed inhibition ). Hal ini dilihat dari penurunan kecepatan maksimum (Vmaks) dan kenaikan  tetapan  MichaelisMenten  (Km) (Tabel  3)  akibat  penambahan  ekstrak  etanol 70% biji kurma.

## 4. PEMBAHASAN
Kadar air, rendemen ekstrak dan fraksi biji kurma
Penentuan  kadar  air  dilakukan  untuk mengetahui  batasan  maksimal  kandungan  air pada  suatu  bahan.  Beberapa  metode  yang dapat digunakan dalam penentuan kadar air, di antaranya  destilasi,  titrasi  dan  gravimetri. Metode  yang  digunakan  dalam  penentuan kadar  air  pada  penelitian  ini  adalah  metode gravimetri.  Penentuankadar  air  simplisia sangat penting untuk dilakukan guna menentukan  daya  simpan,  karena  kadar  air akan  memengaruhi  cepat  lambatnya  proses pembusukan dan ketengikan suatu bahan yang diakibatkan oleh proses mikrobiologis,
kimiawi,  maupun  enzimatik.  Semakin  kecil kadar air pada suatu bahan, maka daya simpan simplisia  jugaakan  semakin  lama  serta  akan semakin  baik  dalam  mempertahankan  sifat senyawa  yang  terkandung  dalam  simplisia tersebut. Penentuan kadar air juga penting  dilakukan  untuk  suatu  bahan  yang akan  dimanfaatkan  sebagai  obat  tradisional. BPOM (2014) menyatakan bahwa suatu bahan dapat  dikatakan  memenuhi  persyaratan  mutu obatobatan  tradisional  apabila  memiliki  kadar air  ≤  10%.  Kadar  air  bahan  lebih  dari  10% akan menyebabkan terjadinya proses enzimatik dan kerusakan oleh mikroba (Manoi 2006).
Gambar 1 Kadar total fenolik ekstrak dan fraksi biji kurma
Gambar 2 Kadar total flavonoid ekstrak dan fraksi biji kurma
Gambar 4 Aktivitas penghambatan ekstrak etanol 70%
Gambar 5 Aktivitas penghambatan fraksi n-heksana
Gambar 6 Aktivitas penghambatan fraksi etil asetat
Gambar 7 Aktivitas penghambatan fraksi nbutanol
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa kadar  air  simplisia  biji  kurma  mencapai
0.13%.  Nilai  kadar  air  tersebut  termasuk  ke dalam  kategori  nilai  kadar  air  yang  rendah,
Gambar 8 Aktivitas penghambatan fraksi air
Gambar 9 Aktivitas penghambatan akarbosa
Gambar 10 Tipe inhibisi α-Glukosidase oleh ekstrak etanol 70% biji kurma ( Phoenix dactylifera L.) 1000 ppm
sesuai  dengan  persyaratan  yang  dinyatakan oleh  BPOM  (2014).  Besarnya  nilai  kadar  air dipengaruhi  juga  oleh  metode  pengeringan yang  dilakukan  pada  suatu  penelitian. Menurut  Manoi  (2006),  pengeringan  yang dilakukan  dengan  metode  kering  angina menghasilkan simplisia dengan kadar air yang masih  tinggi,  sedangkan  pengeringan  dengan cara  kombinasi  sinar  matahari  dan  blower memberikan  hasil  mutu  simplisia  terbaik dalam penelitiannya.
Setelah  penentuan  mutu  dan  kualitas melalui  pengukuran  kadar  air,  sampel kemudian  diekstrasi.  Ekstraksi  merupakan langkah  awal  dalam  proses  isolasi  senyawa kimia (Mangal 2012). Terdapat beberapa jenis teknik  umum  dalam  proses  ekstraksi,  namun penelitian  ini  menggunakan  metode  refluks untuk ekstraksi air dan metode maserasi untuk ekstrak  etanol  70%.    Refluks  merupakan metode  ekstraksi  dengan  cara  pemanasan (Siregar  2009).  Maserasi  merupakan  metode umum  dalam  pengerjaan  ekstraksi,  karena cukup  mudah  untuk  dilakukan  dan  peralatan yang  dibutuhkan  juga  cukup  sederhana (Prasetyo  2015).  Pemilihan  etanol  70% sebagai  pelarut  banyak  disarankan,  karena kemampuannya mengekstrak senyawa polifenol dan aman bagi manusia (Al Hashmi 2012). Metode refluks menggunakan akuades untuk mengekstraksi sampel. Ekstraksi dilakukan selama 3x24 jam untuk meningkatkan  rendemen  yang  diperoleh.
Tabel  1  menunjukkan  bahwa  perbedaan metode ekstraksi akan menghasilkan rendemen  ekstrak  yang  berbeda.  Rendemen ekstrak etanol 70% lebih tinggi dibandingkan rendemen  ekstrak  air.  Ada  beberapa  faktor yang  menyebabkan  perbedaan  persentase rendemen,  yaitu  jenis  pelarut,  lama  waktu ekstraksi,  ukuran  partikel,  temperatur,  serta proses  pengadukan  (Hidayat et  al .  2016; Maulida  dan  Guntarti  2015;  Pambayun et  al . 2007). Etanol 70% bersifat semipolar. Derajat kepolaran tersebut diharapkan mampu
mengekstrak lebih banyak metabolit sekunder yang  larut  dalam  pelarut  semipolar,  seperti katekin, epikatekin, prosianidin B3, prosianidin B4 (Zhao et al . 2009).
Ekstrak  kasar  etanol  70%  difraksinasi secara bertingkat menggunakan pelarut dengan  derajat  kepolaran  yang  berbeda bertujuan  memisahkan  campuran  dengan memanfaatkan  perbedaan  kelarutan  zat  yang akan  dipisahkan  antara  larutan  asal  dengan pelarut  pengekstrak.  Metode  ini  melibatkan suatu larutan antara dua fase yang tidak saling tercampur  (Mirwan  dan  Arriono  2010). Fraksinasi  hanya  dilakukan  terhadap  ekstrak etanol  70%.  Menurut  Zhao et  al .  (2009) ekstrak etanol yang difraksinasi akan menghasilkan  senyawa  metabolit  sekunder yang  mampu  menginhibisi  α-Glukosidase. Penelitian ini menggunakan metode fraksinasi caircair  dengan  corong  pisah,  dengan  prinsip like dissolve like (Mirwan 2013). Pelarut yang digunakan  pada  proses  fraksinasi  ekstrak etanol  70%  biji  kurma  adalah  nheksana,  etil asetat,  nbutanol  dan  air.  Pemilihan  keempat pelarut  tersebut  dikarenakan  masingmasing pelarut  mampu  mewakili  tingkat  kepolaran yang  berbedabeda,  sehingga  diharapkan mampu  memisahkan  komponen  senyawa kimia sesuai dengan sifatnya (Septiani 2017). Rendemen fraksi terbesar terdapat pada fraksi air,  sedangkan  rendemen  fraksi  terkecil terdapat  pada  fraksi  nheksana  (Tabel  1). Menurut  Septiani  (2017)  nilai  rendemen fraksi menunjukkan jumlah metabolit sekunder  yang  terekstrak  di  dalam  pelarut berdasarkan derajat kepolarannya.

## Total Fenolik dan Total Flavonoid Ekstrak dan Fraksi Biji Kurma
Pengukuran  total  fenolik  bertujuan untuk mengetahui jumlah keseluruhan senyawa  golongan  fenolik  yang  berada  di dalam  ekstrak  maupun  fraksi  biji  kurma. Metode  yang  digunakan  dalam  penentuan total  fenolik  adalah  FoliinCiocalteu.  Reagen
FollinCiaocalteu memiliki peran sebagai agen pengoksidasi  (Chen et  al .  2012).  Asam  galat merupakan  standar  yang  secara  umum digunakan dalam penentuan total fenolik (Dai dan Mumper 2010).
Data  dari  penelitian  ini  menunjukkan ekstrak  etanol  70%  memiliki  total  fenolik yang  paling  tinggi,  sedangkan  total  fenolik terendah  terdapat  pada  fraksi  nheksana (Gambar  1).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa penggunaan pelarut yang berbeda memengaruhi kandungan total fenolik. Ekstrak etanol 70% memiliki kandungan total fenolik  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan pelarut  lainnya.  Senyawa  fenolik  tergolong senyawa polar (Andriani et  al .  2011). Pelarut etanol  bersifat  semipolar  (Nanik  dan  Eka 2011) sehingga senyawa fenolik lebih banyak terjerap pada ekstrak etanol.
Penentuan  kandungan  total  flavonoid bertujuan  untuk  mengukur  jumlah  senyawa bioaktif  golongan  flavonoid  yang  terdapat dalam  ekstrak  dan  fraksi  biji  kurma.  Metode yang digunakan pada penentuan total flavonoid  adalah  aluminium  klorida.  Prinsip kerja  metode  ini  adalah  aluminium  klorida akan  membentuk  kompleks  asam  tidak  stabil dengan  gugus  ortohidroksil  pada  cincin  A atau  B  dari  flavonoid  (Chang et  al .  2002).
Kompleks tersebut kemudian akan membentuk  warna  kuning  (Purnama  2015).
Penggunaan kuersetin sebagai standar
dikarenakan senyawa tersebut mampu mencapai absorbansi maksimum pada panjang  gelombang  415  nm  sehingga  tepat untuk  dijadikan  standar  dalam  pengukuran flavonoid (Chang et al . 2002).
Data  dari  penelitian  ini  menunjukkan ekstrak etanol 70% memiliki kandungan total flavonoid  yang  paing  tinggi  sedangkan  fraksi nheksana memiliki kandungan total flavonoid terendah.  Ekstrak  etanol  70%  memiliki kandungan total flavonoid tertinggi dibandingkan  dengan  pelarut  lainnya.  Hal  ini dikarenakan  senyawa  flavonoid  merupakan
senyawa  yang  bersifat  nonpolar,  yang  mana ekstrak  dengan  pelarut etanol bersifat semipolar  (Nanik  dan  Eka  2011)  sehingga senyawa flavonoid lebih banyak terjerap pada ekstrak etanol.

## Kinetika Inhibisi αGlukosidase
Sebagian  besar  enzim  memiliki  sifat kinetik  tertentu  yang  sama.  Ketika  enzim ditambahkan ke substrat, reaksi  dengan cepat menyeimbangkan  laju  yang  dirusaknya. Ketika substrat [S] meningkat, aktivitas enzim meningkat secara hiperbolik untuk mendekati laju  maksimum  Vmax).  Selain  Vmaks, parameter  kinetika  enzim  lainnya  adalah tetapan MichaelisMenten (Km). Km merupakan konsentrasi substrat saat kecepatan  enzim  mencapai  setengahnya (Nelson dan Cox 2012).
Hasil  pengukuran  kinetika  enzim  α- Glukosidase  dipetakan  pada  plot  Lineweaver Burk.  Data  penelitian  menunjukkan  adanya penambahan inhibitor mengakibatkan penurun  Vmaks  dan  terjadi  peningkatan konstanta  Michaelis-Menten  (Km)  (Tabel  3). Menurut  Crown et  al .  (2017)  proses  inhibisi enzim  campuran  (mixed  inhibition)  ditandai dengan  kenaikan  konstanta  MichaelisMenten dan  penurunan  Vmaks.  Jika  dibandingkan, akarbosa  sebagai  inhibitor  komersial  α- Glukosidase memiliki jenis inhibisi kompetitif.
Enzim  dapat  mengalami  dua  jenis penghambatan sekaligus, yakni gabungan dari inhibisi kompetitif dan inhibisi nonkompetitif. Jenis  inhibisi  gabungan  ini  disebut  dengan inhibisi campuran ( mixed inhibition ) (Strelow et  al .  2012).  Inhibitor  kompetitif  tidak mengakibatkan perubahan dalam nilai Vmaks namun meningkatkan nilai konstanta Michaelis-menten (Km). Inhibitor nonkompetitif  dapat  mengikat  enzim  bebas maupun kompleks enzim substrat, yang mana akibat pengikatan ini mengakibatkan penurunan  nilai  Vmax  secara  jelas  namun
tidak menyebabkan perubahan pada nilai Km. Sehingga, inhibisi campuran dapat terjadi jika
terjadi  peningkatan  nilai  Km  yang  diikuti dengan penurunan nilai Vmaks Tabel 3 Hasil perhitungan Vmaks dan Km berdasarkan persamaan LineweaverBurk Reaksi A b R 2 Vmaks (µmol/menit)    Km (mM) Inhibisi 0.074 0.210 0.993 13.510 2.840 Non Inhibisi 0.010 0.018 0.979 100.000 1.800

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  Program  Kreativitas  Mahasiswa (PKM) DIKTI.

## DAFTAR PUSTAKA
[AOAC]  Association  of  Official  Analytical Chemist. 2007. Official Methods of Analysis  Ed.18.  Washington  DC: Association  of  Official  Analytical Chemist.
Abiola M, Adeosun, Sarah O, Oni, Osasenaga
M, Ighodaro, Okikiola HD, Omotayo MO. 2015. Phytochemical,  minerals  and  free radical  scavenging  profiles  of
Phoenix dactylyfera L. seed extract.
J. Taibah University Medical Science:1-6.
AlHashimi  AG.  2012.  Antioxidant  and antibacterial  activities  of Hibiscus sabdariffa L  extract.  Afri  J.  Food Sci.  6(21):506511.  [BPOM]  Badan
Pengawasan  Obat  dan  Makanan.
2010. Acuan Sediaan
Herbal Volume 5 Edisi 1. Jakarta: BPOM. Chang  CC,  Yang  MH,  Wen  HM,  Chem  JC. 2002.  Estimation  of  total  flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods.  J.  Food  and  Drug Analysis. 10(3): 178-182. Chen  CM,  Lin  CY,  Lin  LC,  Wan
TC.  2012.  Antioxidant  activity  and total  phenolic  content  of  various
Toona  sinensi extracts.  African Journal  of  Biotechnology.  11(73):
1383113837. DOI: 10.5897/AJB12.2086.
Crown  OO,  Olayeriju  OS,  Kolawole  AO,
Akinmoladum  AC,  Olaleye  MT, Akindahunsi  AA.  2017. Mobola plim seed  methanolic  extracts exhibit  mixed  type  inhibition  of angiotensis  iconverting  enzyme in vitro .  Asian  Pacific  J.  of  Tropical Biomedicine. 7(12): 1079-1084.
Dai  J,  Mumper  RJ.  2010.  Plant  phenolics: extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties. J. Molecules. 15: 7313-- 7352. DOI: 10.3390/ molecules15107313.
Firdausi  I,  Retnowati  R,  Sutrisno.  2015. Fraksinasi  ekstrak  metanol  daun mangga  kasturi  ( Mangifera  casturi Kosterm)  dengan  pelarut  nbutanol. Kim Stud J. 1(1): 785-790.
Hidayat  N,  Dewi  IA,  Hardani  DA.  2016. Ekstraksi minyak melati ( Jasminum sambac )  (kajian  jenis  pelarut  adan lama ekstraksi). J.  Indust.  4(2):  82- 88.
International  Diabetes  Federation  [IDF]. 2015.  IDF  diabetes  atlas  (7th  ed.). IDF.
Javanmardi J, Stushnoff C, Locke E, Vivanco JM.  2003.  Antioxidant  activity  and total  phenolic  content  of Iranian
Ocimum accessions. J. Food
Chemistry. 83:547-550.
Kazeem  MI,  Adamson  JO,  Ogunwande  IA. 2013.  Modes  of  inhibition  of amylase and glucosidase by
aqueous  extract  of Morinda  lucida benth  leaf.  J.  BioMed  Res  Inter. 2013:  16.  DOI:  10.1155/2013/527- 570.
Lai  YC,  Chen  CK,  Tsai  SF,  Lee  SS.  2012.
Triterpenes as αglucosidase
inhibitors  from Fagus  hayatae .  J.
Phytochemistry. 74:206- 211.
Lumempouw  LI,  Suryanto  E,  Paendong  JJE. 2012.  Aktivitas  anti  UVB  ekstrak fenolik  dari  tongkol  jagung  ( Zea mays L.).  J.  MIPA  Unsrat  Onl:
1(1): 1-4.
Maulida  R,  Guntarti  A.  2015.  Pengaruh ukuran  partikel  beras  hitam  ( Oryza sativa L.) terhadap rendemen
ekstrak dan kandungan total
antosianin. J. Pharmaciana. 5(1): 9- 16.
National  Health  Service  [NHS].  2014. Scottish diabetes survey 2014.
Pambayun  R,  Gardjito  M,  Sudarmadji  S, Kuswanto  KR.  2007.  Kandungan fenol  dan  sifat  antibakteri  dari berbagai  jenis  ekstrak  produk gambir  ( Uncaria  gambir Roxb).  J. Maj Farm Indones. 3:141-146.
Sancheti  S,  Sandesh  S,  Seo  SY.  2009.
Chaenomelos  sinensis :  a  potent  a and ß glucosidase inhibitor.
American Journal of Pharmacology and Toxicology.4(1): 8-11.
Septiani  R.  2017.  Ekstrak  dan  fraksi  daun sirih  merah  ( Piper  crocatum Ruiz
& Pav) sebagai antioksidan dengan metode  2,2difenil1  pikrilhidrazil [skripsi].  Bogor:  Institut  Pertanian Bogor.
Strelow J, Dewe W, Iversen PW, Brooks HB, Radding  JA,  McGee  J,  Weidner  J. (2012).  Mechanism  of  Action Assays  for  Enzymes.  In  J.  McGee &  J.  Weidner  (Eds.),  Assay
Guidance Manual.
Zubaidah  E  dan  Sari  DP.  2015.  Pengaruh penambahan  kacang  hijau  pada media  beras  IR36  terhadap  pigmen
dan lovastatin angkak. Jurnal Pangan  Agroindustri.  (3).  3:  962- 971.