Menara Perkebunan ,  2007,  75(1), 1- 11.

## Keragaman sekuen DNA fragmen gen penyandi ACCase subunit BCCP dari tiga tipe kelapa sawit
Variability of DNA sequence of gene fragment encoding BCCP subunit of ACCase from three types of oil palm
Asmini BUDIANI 1) , Djoko SANTOSO 1) & A.R. PURBA 2)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia
2) Pusat Penelitian Kelapa Sawit, Medan 20158, Indonesia

## Summary
Heteromeric  acetyl-CoA  carboxylase  (ht- ACCase)  is  one  of  key  enzymes  in  palm  oil biosynthesis.  Isolation  and  characterization  of the  gene  is  an  important  step  in  metabolic engineering  to  increase  palm  oil  content  and quality.  The  objective  of  this  research  was  to isolate  DNA  fragment  of  gene  encoding  biotin carboxyl carrier protein (BCCP) subunit of ht- ACCase  from  three  different  oil  palm  types (Simalungun,  Hibrida  and  Backcross)  and investigate  the  variation  of  its  DNA  sequence. Total  RNA  was  isolated  from  the  mesocarp  of oil  palm.  DNA  fragment  encoding  BCCP  was amplified  by  means  of  Reverse  Transcriptase Polymerase  Chain  Reaction  (RT-PCR)  using specific primers with total  RNA as a template. The  products  of  RT-PCR  were  then  purified from  the  gel,  cloned  and  sequenced.  The  DNA sequences  were  analyzed  for  their  homologies to  BCCP  gene  using  BlastN  and  aligned  to detect  the  sequence  variability  using  ClustalW program  from  BioEdit.  The  results  show  that one of  the  two  RT-PCR products at about 300 bp  was  highly  homologous  with  the  gene encoding  BCCP  from Glycine  max , Brassica napus and Arabidopsis  thaliana. Nucleotide sequences  of  that  BCCP  fragments  from  the three types of oil palm displayed some degrees of  variability.  Further  investigation  is  needed to analyze the variability of the DNA sequences of  the  full-length  gene  in  relation  with  oil content or other characters.
[ Keywords: Acetyl-CoA  carboxylase,  biotin carboxyl,  carrier  protein,  DNA variability, oil palm].

## Ringkasan
Asetil-CoA  karboksilase  heteromerik  (ht- ACCase)  merupakan  salah  satu  enzim  kunci dalam  biosintesis  minyak  sawit.  Isolasi  dan karakterisasi  gen  tersebut  merupakan  langkah penting  dalam  upaya  rekayasa  metabolisme untuk  peningkatan  rendemen  dan  kualitas minyak  sawit.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengisolasi  fragmen  DNA  penyandi  subunit biotin carboxyl carrier protein (BCCP) dari ht- ACCase  dari  tiga  tipe  kelapa  sawit  yang  ber- beda    (Simalungun,  Hibrida  dan  Backcross) dan  mempelajari  keragaman  susunan  nukleo- tidanya.  RNA  total  diisolasi  dari  mesokarp buah  sawit.  Fragmen  gen  penyandi  BCCP diamplifikasi  dengan Reverse  Transcriptase- Polymerase  Chain  Reaction (RT-PCR)  meng- gunakan primer spesifik dan templat RNA total. Fragmen  hasil  RT-PCR  dimurnikan  dari  gel, diklon  kemudian  disekuen.  Sekuen  DNA  yang diperoleh  dianalisis  homologinya  dengan  gen BCCP  menggunakan  BlastN  dan  disejajarkan untuk  mengetahui  keragamannya  mengguna- kan  program  ClustalW  dari  BioEdit.  Hasilnya menunjukkan  bahwa  satu  dari  dua  fragmen hasil  RT-PCR  yang  berukuran  sekitar  300  pb memiliki     homologi  yang    tinggi     dengan fragmen gen penyandi BCCP dari Glycine  max , Brassica  napus dan Arabidopsis  thaliana.

## Budiani et al.
Urutan  nukleotida  fragmen  BCCP  dari  ketiga tipe  kelapa  sawit  menunjukkan  keragaman. Perlu analisis lebih lanjut mengenai keragaman sekuen  DNA  dari  gen  lengkapnya  dan  dikaji hubungannya  dengan  akumulasi  minyak  atau karakter lain.

## Pendahuluan
Kebutuhan  akan  minyak  sawit  baik untuk  konsumsi  dalam  negeri  maupun untuk  ekspor  semakin  meningkat  sejalan dengan  peningkatan  jumlah  penduduk dunia  dan  kesadaran  akan  bahaya  koles- terol  yang  berasal  dari  lemak  hewan  dan asam  lemak  trans  dari  minyak  tumbuhan tak jenuh yang mengalami proses hidrogenasi  (Darmosarkoro,  2006).  Di samping  itu,  minyak  sawit  merupakan salah satu bahan bakar alternatif pengganti minyak bumi yang dinilai sangat prospektif,  sehingga  di  tahun  yang  akan datang permintaan akan minyak sawit juga semakin  tinggi.  Untuk  mengantisipasi  hal tersebut,  maka  upaya  peningkatan  pro- duksi minyak sawit terus dilakukan.
Meskipun  pemuliaan  konvensional telah  memberikan  kontribusi  yang  nyata terhadap  peningkatan  produktivitas  tana- man  kelapa  sawit,  namun  perbaikan genetik  yang  dihasilkan  relatif  lambat, antara  lain  karena  lamanya  siklus  seleksi, keterbatasan gene  pool dan  kebutuhan pengujian yang ekstensif (Asmono, 2006). Oleh  karena  itu  diperlukan  pendekatan alternatif  untuk  membantu  mengatasi masalah     tersebut. Marker     Assisted Selection (MAS),  yang  merupakan  kom- binasi  antara  pemuliaan  klasik  dengan penanda  DNA  dipercaya  dapat  memecah- kan  masalah  inefisiensi  dalam  program pemuliaan.  Penelitian  ke  arah  tersebut tengah  dilakukan  oleh  berbagai  institusi (Rajinder et  al. ,  2001;  Asmono et  al .,
2002;  Billotte et  al. ,  2005).  Pendekatan lain  dalam  upaya  peningkatan  produk- tivitas  adalah  melalui  rekayasa  metabo- lisme  untuk  meningkatkan  rendemen minyak.
Biosintesis  minyak  (triasil-gliserol) merupakan proses multikompartemen yang  terdiri  dari  serangkaian  reaksi  dan melibatkan  sejumlah  enzim,  sehingga enzim yang menjadi target dalam rekayasa metabolisme  minyak  adalah  enzim  kunci yang  merupakan  regulator  dalam  proses biosintesis  minyak  sawit.  Asetil-CoA Karboksilase  (ACCase)  dilaporkan  meru- pakan  salah  satu  enzim  kunci  dalam  bio- sintesis  minyak  pada  berbagai  tanaman (Jin et al ., 1998; Francki et al ., 2002. Page et  al .,  1994;  Shintani  &  Ohlrogge  1995), termasuk  pada  kelapa  sawit  (Budiani, 2005;  Budiani et  al. ,  2006)    Enzim  ini mengkatalisis  pembentukan  malonil-CoA dari  Asetil-CoA,  tahapan  pembatas  dalam biosintesis  minyak  (Lehninger et  al ., 1993).  Beberapa  hasil  penelitian  menun- jukkan  adanya  korelasi  antara  aktivitas ACCase  dengan  kecepatan  sintesis  asam lemak  maupun  dengan  akumulasi  minyak (Jin et  al .,  1998;  Francki et  al .,  2002). Pada  tanaman barley , jagung  dan  temba- kau,  ACCase  terbukti  merupakan  enzim pengendali utama arus metabolit pada alur biosintesis  lemak  (Page et  al .,  1994; Shintani & Ohlrogge 1995). Pada  tanaman  telah  diiketahui  dan diisolasi  dua  bentuk  ACCase  yang  ber- beda  secara  fisik,  yaitu  ACCase  homo- merik  (hm-ACCase)  dan  ACCase  hetero- merik  (ht-ACCase)  (Li  &  Cronan  1992; Sasaki et  al. , 1993,  1995;  Alban et  al ., 1994;  Shorrosh et  al .,  1994,  1995).  Ht-
ACCase  terdiri  dari  empat  subunit  yaitu biotin  carboxylase (BC)  yang  berfungsi mentransfer  gugus  karboksil  ke  biotin, biotin-carboxyl  carrier  protein (BCCP)
Keragaman sekuen DNA fragmen gen penyandi ACCase…
yaitu situs pengikatan biotin, dan carboxyl transferase (CT) α dan β ,  yang  men- transfer  gugus  karboksil  dari  biotin  ke senyawa  lainnya  (Li  &  Cronan,  1992). Berbeda  dengan  ht-ACCase  yang  terdiri dari  subunit  yang  dapat  dipisahkan  satu dengan  lainnya,  pada  hm-ACCase  ketiga domain  (BC,  BCCP,  dan  CT)  terdapat dalam satu polipeptida yang  tidak terpisahkan (Sasaki et al. , 1995).
Gen-gen penyandi BC, BCCP dan CT dari  ht-ACCase  telah  diklon  antara  lain dari A.  thaliana (Choi et  al .,  1995), B.  napus (Schulte et  al. ,  1994,  1997), jagung (Ashton et al ., 1994) dan tembakau (Shorrosh et al ., 1995). Demikian juga gen penyandi  hm-ACCase  (Egli et  al. ,  1993, Shorrosh et  al. , 1994,  Anderson et  al ., 1995). Budiani (2005) melaporkan adanya dua  isoform  BCCP  dengan  berat  molekul sekitar  37  dan  32  kD  dalam  mesokarp buah kelapa sawit. Ekspresi kedua protein tersebut  sangat  tinggi  pada  buah  masak yang kandungan minyaknya tinggi, sebaliknya  pada  buah  muda  yang  belum aktif  mensintesis  minyak,  ekspresinya sangat  rendah.  Hal  tersebut  menunjukkan bahwa  BCCP  mempunyai  peran  penting dalam  proses  akumulasi  minyak.  Peneli- tian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  dan mengkarakterisasi  sekuen  DNA  fragmen gen  penyandi  BCCP  dari  tiga  tipe  kelapa sawit yang berbeda rendemen minyaknya, sebagai  bagian  dari  upaya  mempelajari regulasi  ekspresi  gen  penyandi  ACCase pada mesokarp buah kelapa sawit.

## Bahan dan Metode

## Bahan penelitian
Bahan  yang  digunakan  dalam  peneli- tian  ini  adalah  mesokarp  buah  sawit  yang sedang  aktif  mensintesis  minyak  dari  tiga tipe  kelapa  sawit,  yaitu  Simalungun,
Hibrida  dan  Backcross.  Tipe  pertama adalah  hasil  persilangan  Dura  x  Pisifera (D  x  P)  yang  termasuk  dalam  spesies E.  guineensis yang  tinggi  rendemen minyaknya.  Tipe  kedua  merupakan  hasil silangan antara Simalungun dengan E.  oleifera yang  tinggi  kandungan  oleat- nya,  tetapi  rendemen  minyaknya  rendah. Sedangkan  tipe  ketiga  adalah  hasil  silang balik Hibrida dengan Simalungun.

## Perancangan  primer  untuk  amplifikasi fragmen BCCP
Perancangan primer untuk amplifikasi fragmen  gen  penyandi  BCCP  dilakukan berdasarkan informasi sekuen gen tersebut yang  tersedia  di GenBank. Sekuen  gen yang  sama  dari  berbagai  spesies  tanaman dijajarkan  menggunakan  program BioEdit ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/), sehingga  dapat  diidentifikasi  daerah  kon- servatifnya.  Berdasarkan  sekuen  daerah konservatif tersebut didesain primer menggunakan  program  Primer3  (http:// www. biotools. umassmed.edu/).

## Isolasi  RNA  dari  mesokarp  buah  kelapa sawit
Isolasi  RNA  dari  jaringan  mesokarp dilakukan menggunakan prosedur sebagai- mana dilaporkan oleh Chaidamsari (2005). Jaringan  mesokarp  dihaluskan  dalam nitrogen cair, dihomogenkan dengan bufer ekstraksi  (Tris.HCl  0,2  M,  LiCl  0,3  M, EDTA 0,01 M, thiourea 5 mM, asam aurin trikarboksilat  1  mM,  dan β -merkapto- etanol  1%)  dengan  dikocok  kuat-kuat, kemudian  ditambahkan  satu  volume larutan fenol : kloroform : isolamil alkohol (25:24:1).  Setelah  divorteks  3x30  detik, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 15.000  rpm  selama  15  menit  pada  suhu
Budiani et al.
4 o C. Supernatan yang diperoleh dipindah- kan  ke  tabung  sentrifus  baru  kemudian dilakukan ekstraksi kembali menggunakan campuran  kloroform  :  isoamil  alkohol. Setelah  divortex  3x30  detik,  campuran disentrifus  pada  15.000  rpm  selama  15 menit pada  4 o C. Lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru, kemudian ditambahkan 1/30 volume larutan Na`asetat  3,3  M  dan  0,1  volume  etanol absolut. Setelah dikocok perlahan, campuran  disimpan  dalam  es  selama  30 menit. Endapan dipisahkan dengan disentrifugasi 15.000 rpm selama 20 menit. Ke  dalam  supernatan  ditambahkan  1/10 volume  larutan  Na`asetat  3,3  M  dan  dua volume  etanol  absolut.  Setelah  disentri- fugasi    15.000  rpm  selama  20  menit, endapan  RNA  dibilas  dengan  etanol  70% dingin  dan  disentrifugasi  pada  8.000  rpm selama  lima  menit.  Semua  sisa  etanol diuapkan  dan  endapan  RNA  dilarutkan dalam DEPC-treated H 2 O.    RNA  hasil isolasi  dimurnikan  dari  kontaminan  DNA dengan  menambahkan  8M  LiCl  sebanyak volume  tertentu  sehingga  konsentrasi akhirnya menjadi   2 M, kemudian larutan disimpan  selama    4-16  jam  dalam  lemari pendingin  (kulkas).  Setelah  disentrifugasi pada  suhu 4 o C selama   20 menit, endapan dibilas  dengan  etanol  dingin  70%  (5.000 rpm,  lima  menit)  kemudian  dilarutkan dalam DEPC-treated H 2 O.  RNA  yang diperoleh  diuji  kualitas  dan  kuantitasnya dengan  elektroforesis  pada  gel  agarosa 1%  dan  dengan  meng-ukur  absorbansinya pada λ 260, 280 dan 230 nm.

## Amplifikasi  fragmen  gen  penyandi  BCCP dengan RT-PCR
RT-PCR menggunakan primer hetero- logus  yang  dirancang  untuk  amplifikasi fragmen  daerah  konservatif  gen  penyandi
BCCP  dilakukan  dengan  templat  RNA total  mesokarp  dari  ketiga  tipe  yang dianalisis.  Sintesis  utas  pertama  cDNA dilakukan  dengan  kit Superscript  II  First Strand  cDNA  Synthesis dari  Invitrogen menggunakan  primer  oligo-dT    yang  ter- sedia  dalam  kit.  Selanjutnya  reaksi  PCR dilakukan  menggunakan  primer  spesifik heterologus yang telah dirancang sebelum- nya, dengan program sebagai berikut: satu siklus  denaturasi  awal  pada  suhu    94 o C selama  dua  menit,  35  siklus  masing- masing  terdiri  dari  denaturasi  pada  suhu 94 o C selama 15 detik, penempelan primer pada  suhu  55 o C selama  45  detik,  dan ekstensi pada suhu 70 o C selama dua menit. Selanjutnya reaksi diakhiri dengan eksten- si  pada  suhu  70 o C  selama  empat  menit. Untuk  mendapatkan  hasil  yang  terbaik dilakukan  optimasi  kondisi  PCR  terutama pada  suhu  penempelan. Hasil  PCR diverifikasi pada gel agarosa.

## Isolasi dan kloning fragmen gen BCCP
Fragmen  DNA  hasil  RT-PCR  diiso- lasi dan dimurnikan dari gel menggunakan kit AxyPrep TM DNA  Gel  Extraction (Axygen),  kemudian  diklon  ke  dalam  sel E.  coli DH5α  kompeten  menggunakan vektor pGEM-T easy (Promega). Prosedur untuk  preparasi  sel  kompeten  dan  trans- formasinya  dilakukan  sesuai  petunjuk dalam buku manual (Doyle, 1996). Sel-sel transforman  ditumbuhkan  pada  medium seleksi  LB  agar  yang  mengandung  anti- biotik  amplisilin  50  mg/L  dan  IPTG 0,1 mM serta X-Gal   40 mg/L.
Pengujian  adanya  fragmen  DNA BCCP  dalam  sel  yang  tumbuh  pada medium  seleksi  dilakukan  dengan  PCR koloni.  Koloni  tunggal  berwarna  putih dihomogenkan  pada  10  µL  H 2 O,  kemu-
Keragaman sekuen DNA fragmen gen penyandi ACCase…
dian  suspensi  sel  diinkubasi  pada  mesin PCR  untuk  lisis  sel  dengan  program sebagai  berikut:  96 o C,  lima  menit;  50 o C, satu  menit  30  detik;  96 o C,  satu  menit 30 detik; 45 o C, satu menit 30 detik; 96 o C, satu  menit;  dan  40 o C,  satu  menit.  Selan- jutnya ke dalam setiap tabung mikro berisi suspensi sel yang telah dilisis dimasukkan campuran  reaksi  PCR  yang  terdiri  dari 2  µL  bufer  PCR  10x,  0,6    µL  MgCl 2 50 mM,    0,4    µL  dNTP  10  mM,  0,12  µL masing-masing  primer  50  pmol,  6,71  µL dH 2 0  dan  0,05µL  Taq  DNA  polymerase. Amplifikasi  dijalankan  dengan  kondisi PCR sebagai berikut: denaturasi pada suhu 94 o C selama 15 detik,  penempelan primer pada  suhu  55 o C  selama  45  detik  dan ekstensi DNA pada suhu 70 o C selama dua menit, dengan jumlah siklus sebanyak 35. Koloni  yang  telah  terkonfirmasi  mengan- dung sisipan DNA target dikulturkan pada medium  LB  yang  mengandung  ampisilin, kemudian  diisolasi  plasmid  rekombinan- nya  menggunakan High  Pure  Plasmid Isolation  Kit (Roche)  dengan  cara sebagaimana diuraikan dalam buku manualnya.  Plasmid  rekombinan  hasil isolasi  kemudian  didigesti  dengan  enzim restriksi Eco RI  dan  diverifikasi  pada  gel agarosa.
Analisis  sekuen  DNA  fragmen  hasil  RT- PCR
Untuk  mengetahui  susunan  nukleo- tida  dari  fragmen  DNA  terklon  dilakukan sekuensing menggunakan primer universal. Sekuensing  DNA  dilakukan  di  Lembaga Biologi  Molekuler  Eijkmann,  Jakarta. Sekuen  DNA  yang  dihasilkan  selanjutnya dianalisis homologinya menggunakan BlastN  (http://www.ncbi.nlm.nih.  gov ) dan  dianalisis  keragaman  nukleotidanya melalui  penjajaran  dengan  Clustal-W program BioEdit.

## Hasil dan Pembahasan
Amplifikasi  fragmen  gen  penyandi  BCCP dengan RT-PCR
Primer  untuk  amplifikasi  daerah kon- servatif    gen  penyandi  BCCP dirancang berdasarkan  hasil  penjajaran  gen  yang sama  dari  beberapa  tanaman  lain,  karena sampai  saat  ini  sekuen  DNA  gen  tersebut dari kelapa sawit belum pernah dilaporkan. Urutan nukleotida pasangan primer tersebut  adalah:  BCCP2-F  :  5’-  ACCTA CACCA CCACCAGCTC dan BCCP2-R : 5’-TAA  ACAGAGGCGTGT  CAACG. Pasangan  primer  tersebut  kemudian  di- gunakan  dalam  reaksi  RT-PCR  untuk mengamplifikasi  fragmen  BCCP  dengan templat  RNA  total  dari  mesokarp  buah sawit.  Dari  hasil  elektroforesis  maupun hasil  pengukuran  serapannya    mengguna- kan    alat    spektrofotometer  pada  λ  260, 280  dan    230  nm  menunjukkan    bahwa RNA    total  yang  diisolasi  dari  mesokarp buah  ketiga  tipe  kelapa  sawit  mempunyai kualitas dan kuantitas tinggi dan memenuhi  syarat  untuk  reaksi  RT-PCR (data  tidak  disajikan).  Hasil  amplifikasi menunjukkan  adanya  dua  fragmen  DNA yaitu  fragmen  BCCP(a)  dengan  ukuran sekitar  300  pb  dan  fragmen  BCCP(b) berukuran  sekitar  200  pb  (Gambar  1). Usaha   untuk    mendapatkan hasil  yang lebih  baik  dengan  mencoba  beberapa suhu  penempelan  dan  konsentrasi  Mg 2+ ternyata  tidak  memberikan  hasil  sebagai- mana  diinginkan.  Oleh  kerena  itu,  kedua fragmen  DNA  hasil  RT-PCR  tersebut masing-masing  direamplifikasi,  sehingga diperoleh fragmen DNA berukuran sekitar 300  pb  (Gambar  1,  lajur  4-6)  dan  200  pb (Gambar 1, lajur 7-9).  Untuk mengetahui fragmen  mana  yang  sesuai  dengan  target
Budiani et al.
Gambar  1. Profil  elektroforesis  hasil  RT-PCR  menggunakan  pasangan  primer  BCCP2F/R.  Lajur  1-3 berturut-turut Simalungun (S), Hibrida (H) dan Backcross (BC), lajur 4-6 hasil reamplifikasi dengan  templat  fragmen  BCCP(a)  dari  S,  H  dan  BC;  lajur  7-9  hasil  reamplifikasi  dengan templat fragmen BCCP(b) dari S, H dan BC. M : Marker DNA 1 kb ladder.
Figure  1. Electrophoretic  profile  of  RT-PCR  product  using  primer  pair  of  BCCP2F/R.  Lanes  1-3 : Simalungun,  (S), Hibrida  (H) and Backcross  (BC) respectively.  Lanes 4-6 : reamplification product using  template  of BCCP(a) fragment of S, H and  BC;  Lanes 7-9: reamplification product using template of BCCP(b) fragment of S, H and BC.
DNA  yaitu  yang  mempunyai  homologi dengan  BCCP,  maka  kedua  fragmen  ter- sebut  dimurnikan  dari  gel  kemudian disekuen.  Hasil  analisis  sekuen  ternyata menunjukkan  bahwa  hanya  fragmen BCCP(a)  yang  homolog  dengan  gen penyandi BCCP, sehingga, hanya fragmen BCCP(a)  yang  kemudian  diklon  dan dianalisis lebih lanjut.

## Isolasi dan kloning fragmen hasil RT-PCR
Fragmen  BCCP(a)  diisolasi  dan dimurnikan  dari  gel  kemudian  diligasikan ke  vektor  kloning  pGEM-T  easy  dilanjut- kan  dengan  kloning  ke  dalam E.  coli. Gambar  2A  menunjukkan  elektroforesis hasil  PCR  koloni  menggunakan  pasangan primer  BCCP2-F/R  dari  sel-sel  rekom- binan hasil transformasi fragmen BCCP(a) masing-masing  dari  Simalungun,  Hibrida dan  Backcross.  Nampak  bahwa  ketiga koloni  mengandung  sisipan  DNA  yang berdasarkan  ukurannya  diharapkan  adalah BCCP(a). Gambar 2B adalah hasil elektro- foresis plasmid rekombinan yang diisolasi
dari ketiga koloni, yang melaluiPCR telah terbukti mengandung sisipan DNA. Sedangkan  hasil  digesti  plasmid  rekom- binan  dengan  enzim  berasal  dari  tipe Simalungun,  Hibrida  dan  Backcross  telah terklon pada E. coli DH5α restriksi Eco RI disajikan  pada  Gambar  2C,  yang  menun- jukkan  bahwa  ketiga  fragmen  DNA  dari BCCP(a) yang masing-masing berasal dari tipe  Simalungun,  Hibrida  dan  Backcross telah terklon pada E. coli DH5α.

## Analisis sekuen DNA fragmen BCCP dari ketiga varietas
Sekuen  DNA  fragmen  BCCP(a)  dari tipe  Hibrida  disajikan  pada  Gambar  3, sedangkan  Tabel  1  adalah  rangkuman hasil  analisis  BlastN  sekuen  DNA  dari fragmen  tersebut.  Seperti  halnya  sekuen DNA  dari  tipe  Hibrida,  sekuen  DNA  dari Simalungun  dan  Backcross  juga  menun- jukkan  homologi  dengan  gen  penyandi BCCP  dari G.  max,  B.  napus dan A. thaliana (data tidak ditampilkan).
M      1       2        3       4       5         6       7        8        9 250- BCCP(a) BCCP(b ) 500- 750- 1,000- 1,500- 2,000- 3,000- 4,000- 10,000 8,000- pb
Keragaman sekuen DNA fragmen gen penyandi ACCase…
Gambar  2.  Hasil  elektroforesis  dari  (A)  PCR  koloni  transforman  yang  mengandung  sisipan  DNA fragmen BCCP(a); (B) plasmid rekombinan yang diisolasi dari koloni transforman; (C) hasil digesti plasmid rekombinan dengan Eco RI. (lajur 1: Simalungun; 2: Hibrida; 3: Backcross; M: marker DNA 1 kb ladder).
Figure 2.   Electrophoretic product of  (A) colony PCR  of the  transformants  containing DNA  fragment of BCCP(a); (B) recombinant plasmids isolated from the transformant colonies; (C) Digestion product of recombinant plasmid with EcoRI. ( lane 1: Simalungun; 2: Hibrida; 3: Backcross; M: 1-kb DNA ladder).
Hasil  penjajaran  sekuen  fragmen BCCP(a) menunjukkan adanya variabilitas pada  sekuen  DNA  dari  ketiga  sampel (Gambar  4).  Variabilitas  yang  tinggi  ( less conserved  region )  terdapat  pada  nukleo- tida ke 1 - 110 dan nukleotida diatas 187. Sebaliknya  nukleotida  ke  111  –  187  me- nunjukkan  tingkat  keragaman  yang  lebih rendah  ( conserved  region ).  Perbedaan pada susunan nuleotida ini sangat menarik terutama  mengingat  bahwa  ketiga  tipe kelapa  sawit  yang  dianalisis  mempunyai karakteristik  yang  berbeda.  Simalungun ( E. guineensis ) adalah tipe komersial yang rendemen  minyaknya  tinggi  (sekitar  58- 60  %)  tetapi  kandungan  oleatnya  rendah, sedangkan Hibrida (Simalungun x
E.  oleifera )  mempunyai  karakter  antara E. guineensis dan E. oleifera. Rendemen minyak  pada  Hibrida  lebih  tinggi  diban- dingkan  dengan E.  oleifera yaitu  sekitar 33%,  demikian  juga  kandungan  oleatnya lebih tinggi dibandingkan dengan
Simalungun.  Karakter  lain  yang  berbeda adalah  kecepatan  tumbuh  batang.  Pada umur  yang  sama,  tinggi  batang  dari  tipe Hibrida  lebih  kurang  setengah  dari  tinggi batang  dari  tipe  Simalungun.  Pada Backcross,  karakter  rendemen  minyak yang  dimiliki  hampir  sama  dengan Simalungun,  kandungan  oleatnya  lebih tinggi  sedangkan  pertumbuhan  batangnya lebih lambat dibandingkan dengan Simalungun.
Sebagai  salah  satu  subunit  dari  ht- ACCase,  BCCP  tidak  mempunyai  akti- vitas  katalitik  namun  berperan  penting dalam  sintesis  malonil-CoA  dari  asetil- CoA.  Gugus  karboksil  (CO 2 )  dari  bikar- bonat  diikat  oleh  molekul  biotin  yang terdapat  pada  BCCP  kemudian  ditransfer ke  asetil-CoA  sehingga  menjadi  malonil- CoA.  Adanya  lebih  dari  satu  jenis  BCCP telah  dilaporkan  pada  beberapa  tanaman. Pada A.  thaliana telah  diidentifikasi adanya dua isoform BCCP (AtBCCP1 dan
A M       1        2      3 M       1       2      3 M       1       2       3 B C 250- 500- 750- 1,000- 1,500- 2,000- 3,000- 4,000- 10,000- 6,000- pb 6,000-
Budiani et al.
Gambar 3. Sekuen DNA fragmen BCCP(a) dari varietas Hibrida.
Figure 3.  DNA sequence of BCCP (a) fragment of Hibrida variety.
Tabel 1.  Protein BCCP dan spesies tanaman asalnya, diambil dari  hasil  analisis BlastN  dengan sekuen entri fragmen BCCP (a) varietas Hibrida.
Table 1.   BCCP protein and its plant sources, adopted from the output of BlastN analysis with an  entry sequence of  the BCCP (a) fragment of Hibrida variety.
No.  aksesi bank gen Protein homolog Spesies Skor (bit) E- value gi|1143318|gb|U40666.1|GMU40666 BCCP precursor (accB-1) G. max 73,8 2e-10 gi|1070009|emb|X90732.1|BNPBP7 BCCP mRNA (pBP7) B. napus 69,9 4e-09 gi|44190487|gb|AY538674.1 BCCP mRNA (pBP6) B. napus 67,9 1e-08 gi|1070005|emb|X90730.1|BNPBP4 BCCP mRNA (pBP4) B. napus 67,9 1e-08 gi|12006164|gb|AF271071.1|AF271071 BCCP precursor (accB-2) G. max 58,0 1e-05 gi|30685405|ref|NM_121557.2| BCCP2 mRNA A. thaliana 54,0 2e-04 gi|8886868|gb|AF223948.1|AF223948 BCCP2 mRNA A. thaliana 54,0 2e-04
GCAACCAAGCATATGGGAAGCCATCGCTCTTGCTCCTTTCAGCCCCCCGA  50
TGGCCGGAACATTTTACCGCCGCCCACCACCTGGGGGCCCCCCTTCTCGA 100
GGGTTGGAGACAAGGGGCACCCTGGCCAGGTTGTTTGCATCATTGAGGCT 150 ATGAAATTGATGAATGAGATTGAGGCTGATCACTCTCCTCTTCCTCTGAG 200
ATATCGCAGAAGATGGAAAAGCAGTTAGCGTTGACACGCCTCTGTTTAAG 250 TTAACCTGCTTGAACGACACACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTT 300 TGGCACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGAT 350 CCTT.............................................. 354
Keragaman sekuen DNA fragmen gen penyandi ACCase…
Gambar 4. Hasil penjajaran sekuen fragmen BCCP-a ketiga tipe. 1A : Simalungun; 2A: Hibrida; 3A: Backcross.
Figure  4. Alignment of the sequences of the BCCP-a fragment of the three types. 1A : Simalungun; 2A Hibrida; 3A: Backcross.
AtBCCP2) (Thelen et al ., 2001).
AtBCCP1(37  kD)  terdapat  pada  semua organ  sedangkan  AtBCCP2  (25  kD)  lebih dominan  pada  biji.  Pada  biji  yang  sedang berkembang dari tanaman rapeseed, dideteksi empat BCCP dengan ukuran 22, 25,  35  dan  37  kD.  Selain  pada  biji  yang sedang  berkembang,  protein  37  kD  juga terdapat pada daun, sedangkan tiga protein lainnya  tidak  (Thelen et  al .,  2001). Pada mesokarp  buah  kelapa  sawit,  adanya    dua isofarm  BCCP  dan  peran  penting  kedua- nya  dalam  akumulasi  minyak  telah  ditun- jukkan  oleh  hasil  penelitian  sebelumnya (Budiani, 2005).
Perbedaan sekuen DNA ketiga fragmen  BCCP  yang  berasal  dari  tipe kelapa  sawit  yang  berbeda  memberikan harapan  kemungkinan  dapat  dikembang- kannya  suatu  pelacak  yang  dapat  menjadi pembeda  antar  varietas  dengan  karakter tertentu  seperti  rendemen  minyak  tinggi, kecepatan  pertumbuhan  batang,  ataupun
kandungan  oleat.  Namun  karena  sekuen DNA  yang  dianalisis  pada  penelitian  ini hanya  sebagian  dari  sekuen  gen  lengkap- nya,  maka  belum  dapat  ditarik  suatu korelasi  antara  keragaman  sekuen  yang ada  dengan  karakter  tertentu  terutama rendemen minyak.  Untuk itu berdasarkan informasi  sekuen  yang  telah  diperoleh pada  penelitian  ini  dapat  dilakukan analisis    lebih  lanjut  terhadap  keragaman sekuen  DNA  BCCP  yang  lebih  panjang, dan  apabila  memungkinkan  dari  gen lengkapnya,  maupun  dari  daerah  5’- flanking gennya.  Selanjutnya  dapat  dikaji hubungan  sekuen  DNA  yang  dihasilkan dengan karakter tertentu, seperti rendemen minyak,  menggunakan  teknik-teknik  yang telah  berkembang  seperti  RFLP  maupun PCR  genomik.,  serta memanfaatkan  peta pautan  ( high  density  linkage  map )  yang telah  disusun  oleh  Billotte et  al. (2005) dan data kuantitatif rendemen minyak.
Budiani et al.

## Kesimpulan dan Saran
Fragmen  gen  penyandi  BCCP  telah diisolasi dari  mesokarp  buah  kelapa  sawit tipe  Simalungun,  Hibrida  dan  Backcross. Sekuen  DNA  fragmen  gen  penyandi BCCP  dari  ketiga  tipe  kelapa  sawit tersebut  menunjukkan  variabilitas  tinggi. Analisis  lebih  lanjut  terhadap  sekuen lengkap dari gen penyandi BCCP memberikan  harapan  dapat  dirakitnya suatu pelacak/marka rendemen  minyak.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian  ini  merupakan  bagian  dari penelitian yang didanai RUT XII berjudul “Regulasi  ekspresi  gen  penyandi  ACCase dalam  produksi  minyak  pada  mesokarp buah kelapa sawit sebagai dasar perakitan
Marka Rendemen minyak tinggi”. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kementerian  Negara  Riset  dan  Teknologi RI  atas  pembiayaan  penelitan  RUT  XII yang telah diberikan.

## Daftar Pustaka
Alban,  C.,  P.  Baldet  &  R.  Douce  (1994). Localization  and  characterization  of  two structurally different forms of acetyl-CoA carboxylase in young pea leaves, of which one  is  sensitive  to  aryloxy-phenoxypro- prionate herbicides. Biochem. J., 30 , 557- 565.
Anderson,  J.V.,  S.M.  Lutz,  B.G.  Gengenbach
&  J.W.  Gronwald  (1995).    Genomic sequence  for  a  nuclear  gene  encoding acetyl-Coenzyme A carboxylase
(Accession no. L42814) in soybean. Plant Physiol., 109 , 338-340.
Ashton,  A.R.,  C.L.  Jenkins  &  P.R.  Whitfeld. (1994).    Molecular  cloning  of  two
different  cDNAs  for  maize  acetyl-CoA carboxylase. Plant Mol. Biol., 24, 35-49 .
Asmono,  D.,  N.  Toruan-Mathius,  Subronto, D.P.  Komalaningttyas,  T.  Hutabarat,
Subardjo (2002). Pemetaan genom pengendali  produktivitas  minyak  pada kelapa  sawit. Laporan  Riset  Unggulan Terpadu VII Bidang Bioteknologi . Jakarta,
Kementerian  Riset  dan  Teknologi  RI  dan Lembaga  Ilmu  Pengetahuan  Indonesia, 2002.
Asmono,    D.  (2006).  Penelitian  dan  Pengem- bangan  teknologi  genomik  dan  rekayasa genetika  kelapa  sawit:  Status  saat  ini  dan permasalahannya. Focus Group
Discussion  Agenda  Riset  Penguatan Industri Hulu Kelapa Sawit, MAKSI PPS- IPB. Bogor, 20 April 2006.
Billotte,  N.,  N.  Marseillac,  A.M.  Risterucci,
B  Adon,  P.  Brottier,  F.C.  Baurens, R. Singh, A. Herran, H. Asmady, C. Billot,
P. Amblard, T. Durran-Gasselin, B.  Courtois,  D.  Asmono,  S.C.  Sheah,
W.  Rohde,  E.  Ritter,  A.  Charrier  (2005). Microsatellite-based  high  density  linkage map in oil palm ( Elaeis guineensis Jacq.). Theor. Appl. Genet., 110 (4), 754-765.
Budiani  A.  (2005).  Ekspresi  protein  spesifik dalam biosintesis minyak dan Kloning gen penyandi ht-ACCase subunit biotin karboksilase  dan  enoil-ACP  reduktase dari  mesokarp  kelapa  sawit  ( Elaeis guineensis Jcaq). Disertasi  S3 .  Bogor. Program  Pascasarjana,  Institut  Pertanian Bogor.
Budiani,  A.,  D.  Santoso,  H.  Aswidinnoor  & A.  Suwanto    (2006).  Aktivitas  ACCase mesokarp  kelapa  sawit  dan  kloning fragmen  gen  penyandi  ACCase  subunit biotin karboksilase . Menara Perkebunan ,
74 (1), 33-43.
Chaidamsari,  T.  (2005).  Biotechnology  for cocoa pod borer. Ph.D. Thesis Wageningen,   Wageningen University.
Keragaman sekuen DNA fragmen gen penyandi ACCase…
Choi, J-K, F. Yu, E.S. Wurtele & B.J. Nikolau (1995). Molecular cloning and characterization  of  the  cDNA  coding  for the  biotin-containing  subunit  of  the chloroplastic  acetyl-CoA  carboxylase.
Plant Physiol ., 109, 619-626.
Darmosarkoro,  W. (2006).  Toward  sustainable oil  palm  industry  in  Indonesia .  In:  Proc. International  Oil  Palm  Conference  IOPC 2006. Bali, Indonesia 19 – 23 June 2006.
Doyle  K.  (1996). Promega  Protocols  and Aplication  Guide. 3 rd ed.  Madison, Promega Corporation, p. 41-54.
Egli, M.A., B.G. Gengenbach, J.W. Gronwald, D.A.  Somers  &  D.L.  Wyse  (1993). characterization of maize acetyl- coenzyme A carboxylase. Plant Physio.,. 101, 499-506.
Francki,  M.G.,  P.  Whitaker,  P.M.  Smith  & C.A. Atkins (2002). Differential expression  of  a  novel  gene  during  seed triacylglycerol  accumulation  in  lupin species  ( Lupinus  angustifolius L.  and L. mutabilis L.). Functional & Intregative Genomics , 26, 292-300.
Jin,  E.S.,  J.H.  Orf  &  J.W.  Gronwald  (1998). Oil accumulation and acetyl-CoA carboxylase activity in developing soybean  seed.  TEKTRAN  US  Dept  of Agriculture. Agricultural Research Service.
Lehninger,    AL,  D.L  Nelson  &  M.M  Cox. (1993). Principles of Biochemistry 2 nd ed. New York, Worth Publishers.
Li,  S-J  &  Je.  Jr.  Cronan  (1992).      The  gene encoding the biotin carboxylase subunit of Escherichia  coli acetyl-CoA  carboxylase. J. Biol. Chem., 267, 855-863.
Page,  R.A.,  S.  Okada  &  J.L.  Harwood  (1994). Acetyl-CoA  carboxylase  exerts strong flux control over lipid synthesis in plants. Biochim. Biophysic. Acta., 1210, 369-372. Rajinder,  S.,  S.C.  Cheah,  M.  Madon, L.C.L.  Ooi  &  A.R.  Rahimah  (2001) Genomic  Strategies  for  enhancing  the
value of oil palm. In Proc. of the PIPOC 2001  International  Palm  Oil  Congress . Agriculture Conference. pp. 3-17.
Sasaki,  Y.,  K.  Hakamada,  Y.  Suama,
Y.  Nagano,  I.  Furusawa  &  R.Matsuno
(1993).    chloroplast-encoded  protein  as  a subunit  of  acetyl-CoA  carboxylase  in  pea plant. J.  Biol.  Chem., 268, 25118-25123.
Sasaki,  Y.,  T.  Konishi  &  Y.  Nagano  (1995).
The compartementation of acetyl- coenzyme  A  carboxylase  in  plants. Plant Physiol., 108, 445-449.
Schulte,  W.,  J.  Schell  &  R.  Topfer  (1994).    A gene encoding acetyl-coenzyme A carboxylase  from Brassica  napus. Plant Physiol., 106 , 793-794.
Schulte, W., R. Topfer, R. Srracke, J. Schell & N.  Martini    (1997).    Multi-functional acetyl-CoA  carboxylase  from Brassica napus is  encoded  by  multi-gene  family  : indication  for  plastidic  localization  of  at least  one  isoform. In  :  Proc.  Natl.  Acad Sci., 94, 3465-3470.
Shintani,  D.K.  &  J.B.  Ohlrogge  (1995). Feedback inhibition of fatty acid synthesis in  tobacco  suspension  cells. Plant  J., 7,
577-578.
Shorrosh,  B.  S.,    R.  A.  Dixon    &    J.B.
Ohlrogge1994). Molecular cloning, characteri-zation and  elicitation  of  acetyl- CoA  carboxylase  from  alfalfa. In: Proc.
Natl. Acad. Sci., 91, 4323-4327.
Shorrosh,  B.S.,  K.R.  Roesler,  D.  Shintani,
F.J.  van  de  Loo  &  J.B.  Ohlrogge  (1995). Structural  analysis,  plastid  localization and  expression  of  the  biotin  carboxylase subunit of acetyl-coenzyme A carboxylase from  tobacco. Plant  Physiol., 108, 805  – 812.
Thelen,  J.J.,  S  Mekhedov  &  J.B.  Ohlrogge (2001).  Brassicaceae  express  multiple isoform  of  biotin  carboxyl  carrier  protein in  tissue-specific  manner. Plant  Physiol.,
125, 2016 - 2028.