## PENGUJIAN FITOKIMIA DAN PENENTUAN PARAMETER KINETIK ENZIM DENGAN PENAMBAHAN EKSTRAK INFUSA AIR SELEDRI

## PHYTOCHEMICAL TESTING AND DETERMINATION OF KINETIC PARAMETERS ENZYME WITH WATER INFUSION OF CELERY EXTRACTS
1 Rahma Diyan Martha*, 1 Atiqoh Zummah
# Institut Ilmu Kesehatan Bhakti Wiyata Kediri Info Artikel Abstrak Sejarah Artikel : Latar  belakang: Hiperurisemia  merupakan  kelainan  metabolisme  karena produksi  asam  urat  yang  berlebih.  Prevalensi  hiperurisemia  di  Indonesia diperkirakan antara 2,3-17,6%, sehingga penelitian mengenai obat antihiperuresemia  sangat  dibutuhkan  saat  ini. Tujuan: untuk  mengetahui aktivitas infusa batang seledri terhadap parameter kinetic enzim xantin oksidase. Metode: spektrofotometri  UV  untuk  mengukur  kadar  asam  urat. Hasil: pengujian  kandungan  senyawa  bahan  aktif  menunjukkan  hasil  positif  pada pengujian  flavonoid.  Parameter  kinetik  enzim  K m dan  V maks menunjukkan perubahan  nilai  dengan  adanya  penambahan  infusa  batang  seledri.  Nilai  K m enzim  adalah  sebesar  90,00  ppm,  dan  nilai  V maks enzim  sebesar  3,51  U/mL sebelum adanya penambahan  ekstrak air  batang  seledri dan  nilai  K m dan V maks berubah  menjadi  125,42  ppm  dan  2,97  U/mL  dengan  adanya  penambahan ekstrak  infusa  air  batang  seledri. Simpulan  dan  saran: pengujian  kandungan senyawa  bahan  aktif  menunjukkan  hasil  positif  pada  pengujian  flavonoid, sedangkan  uji  parameter  kinetik  enzim  menunjukkan  kenaikan  K m dan  V maks menunjukkan penurunan  dengan adanya penambahan ekstrak infusa air batang seledri.
Submitted: 28 Des 2017 Accepted : 27 Feb 2018 Publish Online : 16 Des 2018
Kata Kunci: Seledri, Fitokimia, Xantin Oksidase,
Infusa Air

## Keywords:
Celery, Phytochemicals, Xanthine  oxidase, Water Infuse

## Abstract
Background :  Hyperuricemia  is  a  metabolic  disorder  because  of  excessive production  of  uric  acid.  The  prevalence  of  hyperuricemia  in  Indonesia  is estimated to be between 2.3-17.6%,  so makes the research of antihyperurisemia drugs  very  needed  today. Objective: determine  the  infusuon  activity  of  celery stems  on  kinetic  parameters  of  xanthine  oxidase  enzyme.  M ethod: UV spectrophotometry  to  measure  uric  acid  levels.. Results: testing  the  content  of the  active  ingredient  showed  positive  results  on  flavonoid  testing.  Kinetic parameters of Km and Vmax enzymes showed changes in values by the addition of infusion of celery stem. The enzyme Km value was 90.00 ppm, and the enzyme Vmax  value  was  3.51  U  /  mL  before  the  addition  of  celery  stem  water  extract and  Km  and  Vmax  values  changed  to  125.42  ppm  and  2.97  U  /  mL  with  the addition of extract infusion of celery stem water. Conclusions and suggestions: testing  the  content  of  active  ingredient  showed  positive  results  on  flavonoid testing,  while  the  kinetic  parameter  test  showed  that  the  increase  of  Km  and Vmax  showed  a  decrease  with  the  addition  of  infusion  extract  of  celery  stem water.

## PENDAHULUAN
Hiperuresemia  merupakan  kelainan  metabolisme  yang  diakibatkan  mekanis  dari produksi  urat  yang  berlebihan  atau  gangguan  absolut  atau  relatif  ekskresi  asam  urat  ginjal (Wyngaarden,  1976).  Menurut  Wolf et  al .,  1999  dan Kang  et  al .,  2005  menyatakan  bahwa hiperuresemia dapat menginduksi  kerusakan  ginjal secara langsung,  tidak hanya menyebabkan insufisiensi ginjal, tetapi  juga terkait penyakit ginjal stadium akhir. Prevalensi hiperurisemia di Indonesia  diperkirakan  antara  2,3-17,6%  sedangkan  prevalensi  gout  bervariasi  antara  1,6-13,6 per seribu penduduk (Sudoyo et al ., 2006). Gout merupakan penyakit metabolik  yang ditandai oleh episode artritis akut berulang karena adanya endapan kristal monosodium urat pada sendi- sendi dan jaringan sekitarnya akibat adanya peningkatan kadar asam urat (Katzung et al ., 2012; Abdullahi et al ., 2012).
Salah  satu  tanaman  obat  yang  berkhasiat  sebagai  pengobatan  yaitu  tanaman  seledri untuk menghambat aktivitas enzim xantin oksidase. Menurut Wang et al., 2008, xantin oksidase merupakan  enzim  yang  berperan  dalam  mengkatalisis  oksidase  hipoxantin  menjadi  xantin  dan menjadi  asam  urat  yang  dapat  menghalangi  biosintesis  asam  urat.  Menurut  Wibraham  & Michael  (1992)  kosentrasi  enzim  dan  keadaan  reaksi  seperti  pH  dan  suhu  mempengaruhi aktivitas enzim. Faktor lain yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim adalah substrat, inhibitor dan activator (Lehninger, 1982).
Dalam  penelitian  sebelumnya,  ditemukan  senyawa-senyawa  yang  berpotensi  sebagai inhibitor  enzim  xantin  oksidase  antara  lain  tanin,  polifenol  dan  flavonoid  (Azmi et  al .,  2012). Menurut  Cos et  al 1998,  yang  berpotensi  sebagai  inhibitor  xantin  oksidase  adalah  flavonoid. Diduga di dalam seledri terdapat kandungan flavonoid yang dapat menghambat aktivitas enzim xantin  oksidase.  Aktivitas  penghambatan  oleh  seledri  ini  diduga  karena  adanya  kandungan flavonoid  dalam  seledri.  Daun  seledri  memang  diketahui  mengandung  banyak  senyawa metabolit sekunder diantaranya senyawa golongan flavonoid (Nadinah, 2008).
Tahap  pendahuluan  dalam  suatu  penelitian  yang  perlu  dilakukan  yaitu  skrining fitokimia  yang  bertujuan  untuk  memberikan  gambaran  tentang  golongan  senyawa  yang terkandung  dalam  tanaman.  Dalam  uji  fitokimia  dapat  dilakukan  pemeriksaan  pendahuluan terhadap senyawa aktif metabolit sekunder tersebut, sehingga potensi relatif dari masing-masing tanaman  dapat  diukur  (Tomohayu,  2014).  Iswantini  (2012)  telah  melakukan  penelitian  tentang pengujian  penghambatan  enzim  xantin  oksidase  ekstrak  seledri  secara  in  vitro  dan  hasil penelitiannya dengan parameter  kinetik enzim berupa Km dan Vmaks  yang ditentukan dengan grafik  Lineweaver-Burk  menunjukkan  ekstrak  seledri  mampu  menghambat  aktivitas  enzim xantin  oksidase.  Untuk  itu,  dalam  penelitian  ini  akan  dilakukan  penentuan  parameter  kinetik enzim dengan grafik Langmuir yang sebelumnya  belum pernah dilakukan.

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan peralatan:
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  batang  seledri  yang  sudah dipisahkan  dari  daun  nya  dan  dibersihkan,  dikeringkan  serta  dibuat  serbuk.  Dalam  tahap pembuatan ekstrak batang seledri dalam penelitian ini digunakan pelarut air. Sedangkan, untuk pengujian  aktivitas digunakan  enzim xantin  oksidase, substrat xantin, buffer fosfat pH 7,5 dan larutan HCl 0,5 M.
Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu  alat-alat  gelas  laboratorium , timbangan  analitik  (Libror  EB330  Shimadzu),  pipet  mikro,  dan  spektrofotometer  UV-Visibel (Shimadzu 1800-Series).

## Prosedur kerja: Metode Pembuatan Ekstrak
Seberat  20  gram  serbuk  kering  batang  seledri  dimasukkan  ke  dalam  kertas  saring  dan diikat rapat. Kemudian dimasukkan ke dalam panci infusa yang berisi 100 ml air selama 1 jam
pada suhu 105 ºC. Hasil rebusan kemudian disaring dengan kertas saring dan disimpan didalam lemari es.

## Metode Uji Fitokimia
Alkaloid
Ekstrak  batang  seledri  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan  ditambah  dengan  10% ammonia  dan  CHCl 3 10  ml  yang  kemudian  dikocok.  Diambil  lapisan  CHCl 3 dan  ditambahkan H 2 SO 4 yang  kemudian  dibagi  menjadi  tiga  bagian.  Masing-masing  ditambah  dengan  pereaksi Dragendrof,  pereaksi  Meyer  dan  pereaksi  Wegner.  Hasil  uji  positif  mangandung  alkaloid  jika terbentuk endapan.

## Flavonoid
Ekstrak  batang  seledri  ditambah  dengan  bubuk  Mg  dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi.  Kemudian  ditambahkan  beberapa  tetes  HCl  pekat.  Hasil  uji  positif  flavonoid  jika terjadi perubahan warna larutan.

## Saponin
Residu dari saringan batang seledri dimasukkan ke dalam beaker dan ditambahkan 5 ml akuades. Kemudian dipanaskan selama 5 menit  sampai mendidih. Setelah itu, didinginkan dan dikocok  dengan  arah  vertikal  sampai  membentuk  busa,  ditambahkan  HCl  2N  dan  didiamkan selama  10  menit.  Hasil  uji  positif  mengandung  saponin  jika  terbentuk  busa  atau  buih  pada larutan.

## Metode Uji Aktivitas
Aktivitas  inhibisi  enzim  xantin  oksidase  diuji  menggunakan  prosedur Sigma  quality control  test  procedure (1994).  Sebanyak  0,4  ml  infusa  batang  seledri  ditambah  larutan  buffer fosfat  dengan  konsentrasi  50  mM  pH 7,5  sebanyak  1,5  ml  ke  dalam  tabung  reaksi.  Kemudian campuran  tersebut  ditambahkan  1  ml  substrat  xantin  0,15  mM  dan  1  ml  larutan  enzim  xantin oksidase dan diinkubasi pada suhu 25 ºC selama 45 menit. Ditambahkan 1 ml HCl 0,5 M yang bertujuan  untuk  menghentikan  reaksi  yang  terjadi  dan  di  ukur  pada  gelombang  290  nm. Perhitungan aktivitas enzim menggunakan persamaan:
Metode Penentuan Nilai K m dan V maks Dalam penentuan nilai Km dan Vmaks digunakan kosentrasi larutan substrat yaitu 10, 20,  40,  80,  160,  320,  640,  1280,  2560,  dan  5120  ppm  yang  kemudian  hasilnya  dibuat  grafik hubungan [S]/V terhadap [S] dengan persamaan kurva Langmuir.

## HASIL PENELITIAN
Pengujian  fitokimia  yang  dilakukan  meliputi  pengujian  adanya  flavonoid, alkaloid,  dan  saponin.  Pengujian  untuk  menentukan  nilai  parameter  kinetik  enzim  berupa  Km dan  Vmaks  dilakukan  lebih  lanjut  dengan  menggunakan  metode  grafik  Langmuir  (Gambar  1). Tabel 1 menunjukkan kandungan senyawa metabolit sekunder dari infusa batang seledri.
) 1 , 0 )( 2 , 12 ( ) )( 3 ( tan tan ) / ( 290 290 df blanko laru Absorbansi uji laru Absorbansi mL unit enzim Aktivitas 

Tabel 1. Uji Fitokimia Infusa Batang Seledri
Infusa Batang Seledri Senyawa metabolit sekunder Flavonoid Alkaloid Saponin ++ - - Keterangan: ++ = ada kandungan zat yang dianalisis - = tidak ada kandungan zat yang dianalisis
Gambar 1. Grafik Langmuir hubungan [S]/V terhadap [S]

## PEMBAHASAN
Pengujian  fitokimia  dilakukan  untuk  memeriksa  kandungan  senyawa  metabolit sekunder  yang  terkandung  dalam  infusa  batang  seledri.  Uji  fitokimia  meliputi  meliputi  uji flavonoid, uji alkaloid dan uji saponin.   Berdasarkan  hasil yang ditunjukkan Tabel 1 diperoleh hasil  positif  adanya  flavonoid  pada  infusa  batang  seledri,  dan  diperoleh  hasil  negatif  untuk  uji alkaloid  dan  saponin.  Pada  uji  alkaloid,  sampel  yang  telah  ditambahkan  reagen  meyer  dan didiamkan  tidak  menunjukkan  adanya  endapan.  Hal  ini  menunjukkan  hasil  negatif  untuk  uji alkaloid. Pengujian saponin dilakukan dengan cara mengocok ekstrak batang seledri  kemudian didiamkan, jika terdapat busa menunjukkan uji positif saponin. Jumlah kadar busa menunjukkan kadar  saponin  yang  ada  pada  ekstrak  tersebut.  Sukandar  (2006)  juga  pernah  melakukan pengujian  fitokimia  terhadap  ekstrak  daun  seledri  menggunakan  pelarut  etanol  dan  metode refluks. Hasil yang diperoleh Sukandar (2006) juga menunjukkan positif adanya flavonoid dan negatif untuk uji adanya alkaloid dan saponin.
Tujuan selanjutnya pada penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas infusa batang seledri  terhadap  parameter  kinetic  enzim  xantin  oksidase.  Metode  yang  digunakan  untuk mengukur  aktivitas  enzim  xantin  oksidase  adalah  metode  Spektroskopi  UV-VIS.  Hasil pengukuran  dari  UV-VIS  kemudian  dianalisis  lebih  lanjut  berdasarkan  rumus  empiris  dari persamaan  Langmuir.  Pengujian  untuk  menentukan  nilai  parameter  kinetik  enzim  berupa  Km dan Vmaks dilakukan lebih lanjut dengan menggunakan metode grafik Langmuir. Pengujian ini dilakukan  dengan  menggunakan  beberapa  variasi  konsentrasi  substrat.  Nilai  parameter  kinetik Km dan Vmaks pada metode Langmuir diperoleh dari grafik hubungan [S] terhadap [S]/V.
Berdasarkan  grafik Langmuir (Gambar 1) diperoleh persamaan y = 0,28x + 25,64 dari hubungan  [S]/V  terhadap  [S]  dan  hasil  parameter  kinetik  enzim  K m dan  V maks menunjukkan perubahan  nilai  dengan  adanya  penambahan  ekstrak  infusa  air  batang  seledri.  Nilai  K m enzim adalah  sebesar  90,00  ppm,  dan  nilai  V maks enzim  sebesar  3,51  U/mL  sebelum  adanya penambahan ekstrak air batang seledri dan nilai K m dan V maks berubah menjadi 125,42 ppm dan
2,97  U/mL  dengan  adanya  penambahan  infusa  batang  seledri.  Hal  ini  menunjukkan penambahan infusa batang seledri berpengaruh terhadap parameter kinetik enzim. Menurut Lai (2014)  metode  grafik  langmuir  lebih  akurat  digunakan  untuk  menentukan  parameter  kinetik enzim berupa Km dan Vmaks. Pernyataan tersebut juga sesuai dengan yang dikemukakan oleh Wilkinson  (1961)  dan  Ranaldi  (1999)  yaitu  metode  grafik  Langmuir  hanya  memperngaruhi kemiringan  ( slope )  dalam  derajat  yang  sangat  kecil  sehingga  lebih  akurat  untuk  digunakan dalam menentukan nilai parameter enzim berupa Km dan Vmaks.

## SIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pengujian  kandungan  senyawa bahan  aktif  menunjukkan  hasil  positif  pada  pengujian  flavonoid,  sedangkan  uji  parameter kinetik  enzim  K m dan  V maks menunjukkan  perubahan  nilai  dengan  adanya  penambahan  infusa batang  seledri.  Nilai  K m enzim  adalah  sebesar  90,00  ppm,  dan  nilai  V maks enzim  sebesar  3,51 U/mL  sebelum  adanya  penambahan  ekstrak  air  batang  seledri  dan  nilai  K m dan  V maks berubah menjadi 125,42 ppm dan 2,97 U/mL dengan adanya penambahan infusa batang seledri.

## SARAN
Saran-saran yang perlu ditindaklanjuti yaitu perlu diteliti lagi terkait ekstrak tanaman lain (bahan alam) yang berpotensi sebagai alternatif obat asam urat.

## REFERENSI
Azmi,  S.,  Jamal,  P.,  &  Amid,  A.  (2012).  Xantine  Oxidase  inhibitor  activity  from  potential Malaysian  medicinal  plant  as  remedie  for  gout. International  Food  Research  Journal , 19(1), 156-159.
Cos,  P.,  Callome,  M.,  Hu,  J.,  Cimanga,  K.,  Van  Poel,  B.,  Pieters,  L.,  et  al.  (1998).  Structure
Activity  Relationship  and  Classification  of  as  Inhibitors  of  Xanthine  Oxydase  and Superoxide cavengers. Journal of Natural Products , 61-76.
Iswantini, D.  Ramdhani, T.H. dan Darusman, L.K. 2012. In Vitro Inhibition Of Celery (Apium graveolens L.) Extract on The  Activity of Xanthine Oxidase And Determination of Its Active Compound, Indo. J. Chem., 12(3), 247-254.
Kang  G.,  Kelly  L.,  &  Irris  Y.  Epidemiological  Profile  of  Rotaviral  Infection  in  India  : Challenges for 21st Century. The Journal of Infectious Diseases; Sep 1, 2005;192. Katzung,B.G.,  Masters,  S.B.  &  Trevor,  A.J.  2012.  Basic  &  Clinical  Pharmacology,  12  Ed.,
New York: McGraw-Hill.
Lai, L.W. Teo, C.L. Wahidin, S. dan Annuar, M.S.M. 2014. Determination of Enzyme Kinetic Parameters  on  Sago  Starch  Hydrolysis  By  Linearized  Graphical  Methods.  The Malaysian Journal of Analytical Sciences. 18(3) 527-533.
Lehninger,  Albert.  (1982).  Dasar-dasar  Biokimia  (Ahli  bahas:  Dr.  Ir.  Maggy  Thenawidjaja).
Jakarta : Penerbit Erlangga.
Nadinah.  2008.  Kinetika  Inhibisi  Ekstrak  Etanol  Seledri  (Apium  graveolens  L.)  dan  fraksinya Terhadap  Enzim  Xantin  oksidase  Serta  Penentuan  Senyawa  Aktifnya.  Tesis.  Bogor: Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Ranaldi,  F.  Vanni,  P.  dan  Giachetti,  E.  1999.  What  Students  Must  Know  About  The
Determination of Enzyme Kinetic Parameters. Biochem. Educ.27:87-91.
Sudoyo,  A.,  Satiyohadi,  B.,  Alwi,  I.,  K,  M.,  &  Setiati,  S.,  2006, Ilmu  PenyakitDalam (4  ed.),
Jakarta: Departemen Ilmu Penyakit Dalam FakultasKedokteran Universitas Indonesia. Tomohayu,  R.T.  2014.  Identifikasi  Senyawa  Aktif  dan  Uji  Toksisits  Ekstrak  Daun  Binahong
( Anredera cordifolia Ten Steenis ) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
Thesis. Universitas Negeri Gorontalo.
Wang,  S.,  Liaob,  J.,  Zhena,  W.,  Chuc,  F.,  &  Chang,  S.  (2008).  Essential  oil  from  leaves Cinnamomum  osmophloem acts  as  a  xanthine  oxidase  inhibitor  and  reduces  tes  serum uric acid levels in oxonate induced mice. Journal of Phytomedicine , 15, 940-945.
Wilkinson, G.N. 1961. Statistical Estimations In Enzyme Kinetics. Biochem. J. 80:324-332.
Wolf,  G.,  Hegewisch-Becker,  S.,  Hossfeld,  D.K.,  et  al.,  1999,  Hyperuricemia  and  renal insufficiency  associated  with  malignant  disease:  urate  oxidase  as  an  efficient  therapy. Am. J. Kidney Dis. 34: E20.
Wyngaarden,  J.B.,  Kelley,  W.N.,  1976,  Gout  and  Hyperuricemia,  Grune  and  Stratton,  New York.