## IDENTIFIKASI SECARA BIOMOLEKULER DAN UJI DAYA REDUKSI BAKTERI RESISTEN MERKURI YANG DIISOLASI DARI AIR DI WILAYAH BEKAS TAMBANG EMAS RAKYAT DESA TANOYAN UTARA
Wanti Tandi Payung 1) , Fatimawali 1) , Novel S. Kojong 2)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
2) Program Studi Farmasi FMIPA UKI Tomohon

## ABSTRACT
Contamination  of  heavy  metal  such  as  mercury  (Hg)  in  the  water  is  very  harmful  to  the environment  and human health. Many  gold  miners  used  mercury to  extracting gold  and  dispose the mercury  waste  freely  into  the  environment  causing  contamination  to  the  water.  Mercury-resistant bacteria  can  reduce  inorganic  mercury  and  organic  mercury  into  volatile  and  less  toxic  form  of mercury. This study aims to isolate, and to identify microbiologically also to carry out biomolecular identification  using  the  16S  rRNA  gene  of  the  mercury  resistant  bacteria,  and  analyze  its  ability  to reduce  mercury.  The  sample  was  isolated  from  the  river  water  in  the  villagers’  gold  mine  area  in North Tanoyan which were then be tested the bacteria reducing power to HgCl 2 and phenyl mercury, microbiology  identification  including  Gram  staining,  motility  test,  H 2 S  test,  carbohydrate fermentation  test,  citrate  test,  lysine  test,  indole  test  and  catalase  test,  biomolecular  identification using 16S rRNA gene as well as mercury reduction test of mercury resistant bacteria using CV-AAS method.  The  result  of  this  study  shows  that  there  are  2  isolates  of  mercury  resistant  bacteria  that could  live  on  medium  containing  HgCl 2 and  phenyl  mercury  with  concentration  of  40  mg/L,  Gram negative  bacteria  with  bacil  form  based  on  microbiology  identification  is  a  member  of Enterobacteriaceae family, and based on biomolecular identification using 16S rRNA gene isolate 1.A is    Proteus  mirabilis  bacteria,  that  capable  of  reducing  HgCl 2 and  phenyl  mercury  by  22.7%  and 0.2% within 12 hours, 52.2% and 52.7% within 24 hours, respectively.
Keywords: Mercury-Resistant Bacteria, Gen 16S rRNA, HgCl 2 , Phenyl Mercury, Mercury-Reduction Test .

## ABSTRAK
Pencemaran  logam  berat  merkuri  (Hg)  pada  air  sangat  membahayakan  lingkungan  dan kesehatan  manusia.  Banyak  penambang  emas  yang  menggunakan  merkuri  untuk  mengekstrak  emas dan membuang limbah merkuri secara bebas ke lingkungan sehingga air dapat terkontaminasi. Bakteri resisten merkuri dapat mereduksi merkuri anorganik maupun merkuri organik menjadi logam merkuri yang mudah menguap dan kurang toksik. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengidentifikasi bakteri  resisten  merkuri  secara  mikrobiologi  dan  biomolekuler  menggunakan  gen  16S  rRNA  serta menganalisis  kemampuannya  dalam  mereduksi  merkuri.  Sampel  diisolasi  dari  air  sungai  di  wilayah tambang emas rakyat desa Tanoyan Utara yang selanjutnya dilakukan uji resistensi bakteri terhadap HgCl 2 dan fenil merkuri, identifikasi secara mikrobiologi meliputi pewarnaan gram, uji motilitas, uji H 2 S,  uji  fermentasi  karbohidrat,  uji  sitrat,  uji  lisin,  uji  indol  dan  uji  katalase,  identifikasi  secara biomolekuler  menggunakan  gen  16S  rRNA  serta  uji  daya  reduksi  bakteri  resisten  merkuri  dengan metode CV-AAS. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat 2 isolat bakteri resisten merkuri tinggi yang dapat hidup pada media yang mengandung HgCl 2 dan fenil merkuri dengan konsentrasi 40 mg/L,  bakteri  Gram  negatif  dengan  bentuk  basil,  berdasarkan  identifikasi  secara  mikrobiologi termasuk  famili Enterobacteriaceae dan  berdasarkan  identifikasi  secara  biomolekuler  menggunakan gen 16S rRNA isolat 1.A merupakan bakteri spesies Proteus mirabilis , yang mampu mereduksi HgCl 2
dan fenil merkuri berturut-turut 22,7% dan 0,2% dalam waktu 12 jam, 52,2% dan 52,7% dalam waktu 24 jam.
Kata kunci : Bakteri Resisten Merkuri, Gen 16S rRNA, HgCl 2 , Fenil Merkuri, Daya Reduksi Mekuri

## PENDAHULUAN
Merkuri  merupakan  unsur  logam yang  sangat  berbahaya  dan  beracun. Merkuri  dapat  menimbulkan  masalah serius  bagi  kesehatan  manusia,  seperti bioakumulasi  merkuri  dalam  otak  dan ginjal  yang  pada  akhirnya  mengarah  pada penyakit neurologis serta dapat menyebabkan  kematian  (Selid et  al ., 2009).
Pencemaran  logam  berat  merkuri pada air sangat membahayakan lingkungan dan kesehatan manusia. Senyawa  merkuri  dalam  bentuk  Hg 2+ dapat  terikat  pada  residu  sistein  protein manusia sehingga protein akan kehilangan aktivitasnya. Selain Hg 2+ , senyawa merkuri  yang  paling  berbahaya  bagi kesehatan manusia adalah senyawa merkuri organik, khususnya metil merkuri dan  fenil  merkuri.  Senyawa  ini  sangat reaktif  dan  mempunyai  mobilitas  yang tinggi  jika  dibandingkan  dengan  Hg 0 dan Hg 2+ .  Selain  itu,  senyawa  ini  juga  dapat menyerang saraf manusia melalui peredaran darah (Rasmussen et al ., 2008).
Pencemaran  merkuri  dapat  berasal dari aktivitas manusia seperti pembakaran batubara, jenis-jenis produk minyak bumi, penggunaan fungisida, katalisator merkuri dan penambangan emas yang menggunakan  merkuri  sebagai  bahan pengekstraksi  emas  (Fatimawali et  al ., 2011).
Detoksifikasi  merkuri  merupakan salah  satu  cara  yang  dapat  dilakukan untuk  mengurangi  pencemaran  merkuri. Detoksifikasi ini dilakukan dengan menggunakan  mikroorganisme  resisten merkuri  seperti  bakteri  resisten  merkuri. Penelitian  yang  dilakukan  Fatimawali et al. (2011) menyatakan bahwa bakteri yang diketahui  resisten  terhadap  merkuri  yaitu
Klebsiella  pneumoniae ,  yang  mampu mereduksi HgCl 2 75% dalam waktu 1 jam, 92%  dalam  waktu  12  jam  dan  99,4% dalam  waktu  24  jam.  Apabila  bakteri tersebut dapat beradaptasi pada lingkungan  dengan  tingkat  kontaminasi logam berat yang tinggi, maka penggunaan bakteri tersebut sangat efektif dalam  meningkatkan  reduksi  logam  berat (Pratiwi,  2012).  Merkuri  anorganik  dapat didetoksifikasi  menggunakan  gen merkuri reduktase  (merA).  Tetapi  karena  terbatas untuk  detoksifikasi  merkuri  anorganik oleh  sebab  itu,  organomerkuri  liase (merB)  diperlukan  untuk  melengkapi proses  detoksifikasi  untuk  mengubah merkuri  anorganik  dan  organik  menjadi bentuk  yang  mudah  menguap.  Dalam penelitian  yang  dilakukan  Fatimawali et al .  (2017)  menyatakan  bahwa  protein merA  yang  diisolasi  dari  bakteri  resisten merkuri K. pneumonia dapat mendetoksifikasi merkuri anorganik.
Metode analisis yang dikenal untuk analisis  logam  berat  merkuri  adalah Cold Vapor–Atomic Absorption Spectrophotometry (CV-AAS).  Metode analisis merkuri dengan CV-AAS merupakan  metode  analisis  merkuri  yang sesuai  dengan  Standar  Nasional  Indonesia (SNI).  Metode  CV-AAS  ini  memiliki beberapa keunggulan yaitu memiliki selektivitas  dan  sensitivitas  yang  tinggi untuk  analisis merkuri total  dalam sampel.
Pada  analisis  merkuri  dengan  CV-AAS, ion  Hg 2+ dalam  sampel  direduksi  menjadi uap Hg 0 (Kristianingrum, 2009).
Salah  satu  metode  yang  dapat digunakan  untuk  mengidentifikasi  bakteri yaitu dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Teknik ini digunakan untuk  menelaah profil DNA gen 16S rRNA. Identifikasi bakteri dengan
gen  16S  rRNA  telah  digunakan  sebagai parameter  sistematik  molekuler  universal, representatif, dan praktis untuk mengkonstruksi  kekerabatan  filogenetik pada  tingkat  spesies  (Rychlic,  1995). Identifikasi dengan analisis sekuensing gen 16S  rRNA  dinilai  memberikan  hasil  yang sangat  akurat  dan  dapat  dijadikan  sebagai metode  diagnosis  dalam  aplikasi  klinis. Analisis  sekuensing dapat menjawab berbagai  permasalahan  yang  berkaitan dengan  identifikasi  berbasis  mikrobiologi konvensional,  diantaranya  yaitu  dapat digunakan  pada  mikroorganisme  yang tidak dapat dikultur serta menunjukan hasil yang  dapat  digolongkan  pada  genus  atau spesies tertentu (Clarridge, 2004).
Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengisolasi, mengidentifikasi bakteri resisten  merkuri  secara  mikrobiologi  dan identifikasi  secara  biomolekuler  dengan menggunakan  gen  16S  rRNA  serta menguji  daya  reduksi  bakteri  resisten merkuri dengan metode CV-AAS.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian  dilakukan  pada  bulan Januari  -  Maret  2018,  di  Laboratorium Mikrobiologi  di  Program  Studi  Farmasi dan  Laboratorium  Bioteknologi  di  Jurusan Biologi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sam Ratulangi.

## Jenis Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode deskriptif  eksploratif  untuk  menemukan ada  atau  tidaknya  bakteri  resisten  merkuri pada  air  sungai  di  wilayah  tambang  emas rakyat kemudian mendeskripsikannya.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian  yaitu  :  Sarung  tangan  steril,
erlenmeyer, gelas ukur, gelas kimia, tabung reaksi,  rak  tabung  reaksi,  pipet  tetes, timbangan  analitik,  batang  pengaduk, cawan  petri,  jarum  ose,  lampu  spritus, tabung eppendorf ,  inkubator  ( Incucell ), laminar  air  flow (Biotek), autoklaf  (ALP), mikropipet
(Ecopipette) , mikroskop ( Olympus ),  kertas  label,  plastik wrap , aluminium  foil ,  kapas,  kasa,  seperangkat alat  PCR  ( Biometra  T-Personal )  dan elektroforesis  ( Biometra  T-Personal ),  dan alat fotografi.

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  :  Sampel  air,  aquades,  natrium klorida  (NaCl), nutrient  broth , yeast extract , tryptone ,  agar bakteriological , triple  iron  agar (TSIA), nutrient  agar , Simmon’s  citrate  agar , lysine  iron  agar , reagen covac’s, fenil  merkuri,  merkuri klorida (HgCl 2 ), hidrogen peroksida (H 2 O 2 ), asam sulfat (H 2 SO 4 ), a lkohol 70%, kit  isolasi  DNA  bakteri  (Geneaid),  primer set  (untuk  bakteri),  2x  Master  Mix  (Taq Polimerase, MgCl 2 , dNTPS) untuk amplifikasi  DNA  (Bioline),  ddH 2 O, gel agarosa , dan bufer TBE 0,5X.
Uji Resistensi Bakteri Terhadap Merkuri
Pengujian resistensi bakteri terhadap HgCl 2 dan fenil merkuri pada  media cair nutrient broth dengan  masing-masing  konsentrasi yaitu 0, 10, 20, dan 40 mg/L.

## Identifikasi Bakteri Secara Morfologi, Fisiologi dan Biokimia
Uji  morfologi  dilakukan  dengan pewarnaan  Gram,  sedangkan  uji  fisiologi dilakukan dengan uji motilitas.  Identifikasi bakteri  secara  biokimia  dilakukan  dengan uji  H 2 S,  uji  fermentasi  karbohidrat,  uji sitrat, uji lisin, uji indol dan uji katalase.

## Isolasi DNA Genomik
Isolasi  DNA  Genomik  dari  kultur  bakteri dilakukan  dengan  metode Genomic  DNA Mini  Kit (Geneaid).  Sampel  kultur  bakteri diambil  dari  media  miring  kemudian disuspensikan ke dalam tabung Eppendorf .
Amplifikasi  gen  16S  rRNA  dengan Teknik Polymerase  Chain  Reaction (PCR)
Amplifikasi
dilakukan dengan
menggunakan  mesin  PCR  ( Biometra  T- Personal ).  Primer  yang  digunakan  untuk proses PCR yaitu pasangan primer BKXF ( forward )  dan  BKXR  ( reverse ).  Cetakan yang  digunakan  untuk  amplifikasi  gen 16S  rRNA  yaitu  DNA  genomik  bakteri yang telah diisolasi.

## Elektroforesis dan Visualisasi
DNA  yang  telah  diamplifikasi kemudian diseparasi dengan elektroforesis gel  agarosa 1%  di  dalam  larutan  bufer TBE 0,5X ( Tris-Boric EDTA). Visualisasi dilakukan  dengan  sinar  UV  pada  UV- transiluminator. Hasil deteksi didokumentasikan.

## Sekuensing gen 16S rRNA
Sekuensing dilakukan untuk menentukan urutan nukleotida pada fragmen  DNA  yang  teramplifikasi  dalam proses  PCR  dan  terdeteksi  dari  hasil visualisasi  DNA  menggunakan  mesin sekuensing DNA otomatis. Hasil PCR dan primer  dikirim  ke  1 st BASE  Malaysia.
Hasil  sekuensing  DNA  dibuka  dengan menggunakan aplikasi
Geneious
kemudian dianalisis menggunakan metode BLAST  melalui  media  online  Gen  Bank (NCBI),  untuk  mencari  kesamaan  urutan nukleotida gen 16S rRNA dalam menentukan spesies bakteri resisten merkuri.

## Uji  Daya  Reduksi  Bakteri  Resisten Merkuri
Diambil  masing-masing  bakteri resisten  merkuri  tinggi  dari  media  agar miring.  Selanjutnya  ditanam  dalam  media nutrient  broth yang  mengandung  400  µL HgCl 2 dan fenil merkuri dengan konsentrasi  40  mg/L.  Diinkubasi  pada suhu 35-36 °C selama 12 jam dan 24 jam. Pada  akhir  inkubasi,  ditambahkan  asam sulfat  (H 2 SO 4 ) pekat  2  tetes  untuk membunuh  bakteri.  Sampel  dikirim  ke Balai
Riset dan Standarisasi (BARISTAND),  Manado  untuk  dianalisis kadar  merkurinya  dengan  metode  analisis CV-AAS.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi  dan  Uji  Resistensi  Bakteri Terhadap Merkuri
Sampel  air  diambil  dari  sungai  di wilayah  tambang  emas  rakyat  desa Tanoyan  Utara,  Kecamatan  Lolayan, Kabupaten  Bolaang  Mongondow,  pada kedalaman  5  cm  dari  dasar  sungai.  Isolat ditumbuhkan  pada  media nutrient  broth yang mengandung HgCl 2 dengan konsentrasi  yang  berbeda  yaitu  0,  10,  20 dan  40  mg/L.  Masing-masing  suspensi bakteri  diinokulasi  ke  dalam  media luria bertani (LB) agar plate untuk menumbuhkan bakteri. Selanjutnya dilakukan
pemurnian dengan menginokulasi  bakteri  yang  tumbuh  pada media LB dengan cara digores zig-zag dan terbagi  dalam  tiga  kuadran.  Hal  ini dilakukan untuk memisahkan bakteri yang satu dengan bakteri lainnya agar didapatkan isolat bakteri murni yang akan digunakan  untuk  pengujian  selanjutnya. Dari  hasil  pemurnian  didapatkan  2  isolat bakteri  yang  tumbuh  pada  konsentrasi  40 mg/L.  Hasil  isolasi  bakteri  dapat  dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil Pengamatan Bentuk Koloni, Permukaan dan Warna
Kode Bakteri Bentuk Koloni Permukaan Koloni Warna Koloni 1.A Bulat Licin Putih Kekuningan 2.A Bulat Licin Putih
Suatu  bakteri  digolongkan  bakteri resisten  merkuri  apabila  bakteri  tersebut dapat  bertahan  pada  konsentrasi  merkuri 10 mg/L atau lebih (Anne, 2006).  Bakteri yang dapat hidup atau bertahan pada kadar merkuri  ≥  20  ppm,  digolongkan  sebagai bakteri resisten merkuri tinggi (Rehman et al .,  2007).  Bakteri  resisten  merkuri anorganik  (HgCl 2 ),  diuji  resistensinya terhadap  merkuri  organik  (fenil  merkuri) dengan cara isolat bakteri murni ditumbuhkan  pada  media nutrient  broth yang  mengandung  fenil  merkuri  dengan
konsentrasi  berbeda  yaitu  0,  10,  20,  dan 40  mg/L  dan  diperoleh  hasil  seperti  pada Tabel 2. Bakteri resisten merkuri anorganik  juga  resisten  terhadap  merkuri organik  karena  bakteri  dapat  bertahan pada  konsentrasi  merkuri  sampai  dengan 40  mg/L.  Hal  ini  berarti  bakteri  tersebut memiliki  gen  merkuri  reduktase  (merA) dan  juga  organomerkuri  liase  (merB) sehingga  dapat  resisten  baik  terhadap merkuri anorganik maupun merkuri organik. Tabel 2. Hasil Uji Resistensi Bakteri Terhadap Fenil Merkuri Kode Bakteri Konsentrasi Fenil Merkuri (mg/L) 0 10 20 40 1.A + + + + 2.A + + + +

## Uji Morfologi dan Fisiologi
Uji  morfologi,  uji  fisiologi  dan  uji biokimia merupakan kriteria  efektif untuk mengidentifikasi bakteri. Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), harus dilakukan pewarnaan Gram terlebih dahulu  agar  dapat  diamati  dengan  jelas. Tujuan  dari  pewarnaan  Gram  ialah  untuk mempermudah  pengamatan  bentuk  sel bakteri,  memperluas  ukuran  bakteri, mengamati  struktur  dalam  dan  luar  sel bakteri,  dan  melihat  reaksi  bakteri terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat  fisik  atau  kimia  bakteri  dapat diketahui  (Hadioetomo,  1990).  Dalam  uji pewarnaan  Gram,  bakteri  Gram  positif akan berwarna ungu disebabkan kompleks zat  berwarna  kristal  violet  tetap  terikat pada  dinding  sel  bakteri  meskipun  diberi
alkohol,  sedangkan  bakteri  Gram  negatif berwarna merah karena kompleks tersebut larut  sewaktu  pemberian  alkohol  dan kemudian  menyerap  zat  warna  safranin yang  berwarna  merah.  Perbedaan  hasil pewarnaan  ini  disebabkan  karena  adanya perbedaan  struktur  dinding  sel  bakteri. Dinding sel bakteri Gram negatif memiliki kandungan  lipida  yang  lebih  tinggi dibandingkan dengan bakteri Gram positif sehingga  lipida  ini  akan  larut  dalam alkohol, jadi pori-pori dinding sel membesar  dan  meningkatkan  daya  larut kompleks kristal violet pada bakteri Gram negatif (MacFaddin, 2000), dalam penelitian  ini  ditemukan  bakteri  dengan Gram  negatif.  Bakteri  terdiri  dari  tiga bentuk  dasar  yaitu  bentuk  bulat  atau kokus,  bentuk  batang  atau  basil,  dan
bentuk  spiral  (Dwidjoseputro,  1985), dalam  penelitian  ini  ditemukan  1  bentuk bakteri  yaitu  bentuk  batang  atau  basil.
Hasil uji morfologi dan uji fisiologi dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil Uji Morfologi dan Uji Fisiologi
Kode Isolat Uji Morfologi Uji Fisologi Pewarnaan Gram Uji Motilitas (+)/(-) Bentuk Gram (+)/(-) 1.A Basil - - 2.A Basil - - Data  uji  biokimia,  uji  morfologi dan uji fisiologi yang diperoleh dibandingkan  dengan  buku Bergey’s
Manual  Determinative  of  Bacteriology . Hasil uji biokimia dapat dilihat pada Tabel 4.

## Tabel 4. Hasil Uji Biokimia
Kode Isolat Uji Biokimia Uji H 2 S Uji Fermentasi Karbohidrat Uji Sitrat Uji Lisin Uji Indol Uji Katalase Glu Lak Gas 1.A + - - - + + - - 2.A + - - - + + - - Dari  Tabel  3.  dan  Tabel  4.  Isolat bakteri 1. A dan 2. A menunjukkan bakteri yang termasuk
dalam famili Enterobacteriaceae .  Bakteri Klebsiella pneumonia, Enterobacter sp., Proteus sp.,
Escherichia coli, Salmonella dan Citrobacter termasuk dalam famili Enterobacteriaceae (Carrol et  al .,  2004;
Harti,  2012).  Bakteri  yang  teridentifikasi dapat dilihat dalam Tabel 5.

## Tabel 5. Hasil Identifikasi Bakteri Secara Mikrobiologi
Kode Bakteri Famili 1.A Enterobacteriaceae 2.A Enterobacteriaceae

## Identifikasi Bakteri dengan Gen 16S
rRNA
Berdasarkan  identifikasi  secara mikrobiologi, isolat 1.A dan 2.A termasuk dalam  famili Enterobacteriaceae .  Oleh sebab  itu,  dipilih  salah  satu  dari  kedua isolat  tersebut  dan  yang  dipilih  untuk identifikasi  bakteri  dengan  menggunakan gen  16S  rRNA  adalah  isolat  1.  A.
Identifikasi  bakteri  dilakukan  dengan mengekstraksi DNA bakteri dengan metode Genomic DNA Mini Kit (Geneaid) yang telah dimodifikasi.
Hasil ekstraksi DNA bakteri dianalisis dengan metode PCR ( Polymerase Chain Reaction ) untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer BKXF ( forward ) 5’-
GCYTAAYACATGCAAGTCG-3’ dan BKXR ( reverse ) 5’-
TTGACGTCATCCCCACCTTCC-3’ yang  dapat  mengamplifikasi  gen  16S rRNA  sepanjang  1200  bp  (Kolondam  in Press).
DNA  yang  telah  teramplifikasi kemudian  dielektroforesis  dengan  gel agarose 1% dan divisualisasi dengan sinar UV,  terlihat  pada  Gambar  1.  Proses
elektroforesis  merupakan  uji  kualitatif untuk  mengukur  konsentrasi  DNA  yang diperoleh.  Berat  molekul  suatu  fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan  laju  migrasinya  dengan laju migrasi fragmen DNA standar (marka DNA) (Rahayu dan Nugroho, 2015). Hasil menunjukkan  adanya  pita  gen  16S  rRNA pada 1200 bp.

## Gambar 1. Elektroforegram  Fragmen  Gen  16S rRNA Hasil  Amplifikasi  DNA dengan PCR.
Untuk  melihat  spesies  bakteri, maka dilakukan proses sekuensing.
Sekuensing  dilakukan  untuk  menentukan urutan  nukleotida  pada  fragmen  DNA yang  terdeteksi  dari  hasil  visualisasi  yang teramplifikasi  dalam  proses  PCR.  Proses sekuensing  dilakukan  dengan  mengirim hasil  PCR  dan  primer  ke  1 st BASE Malaysia.  Data  hasil  sekuensing  dibuka dengan  menggunakan  aplikasi  Geneious. Tampilan pick kromatogram yang diperoleh dari hasil sekuensing memperlihatkan  urutan  basa  nukleotida dari  produk  PCR.  Kualitas  kromatogram diperlihatkan oleh tingginya peak
kromatogram.  Semakin  tinggi  peak  maka semakin baik kualitas kromatogram.
Urutan  nukleotida  yang  diperoleh kemudian  disalin  untuk  diproses  dengan BLAST  ( Basic  Local  Alignment  Search Tool )  yang  diakses  secara  online  melalui: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Hasil  BLAST  menunjukkan  kesamaan urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  isolat yang  diperoleh  dengan  urutan  nukleotida gen 16S rRNA bakteri yang ada pada Gen Bank  yaitu  mempunyai  kesamaan  99% dengan Proteus  mirabilis dan  secara filogenetik  paling  dekat  dengan  spesies bakteri  tersebut.  Bakteri  ini  berbentuk batang  atau  basil  dan  merupakan  bakteri

## 1200 bp
Gram negatif  yang termasuk dalam famili Enterobacteriaceae .  Hasil  identifikasi  ini sesuai  dengan  hasil  identifikasi  yang dilakukan secara mikrobiologi. Bakteri ini dapat  ditemukan  bebas  di  air  atau  tanah. Berdasarkan  penelitian  Utari et  al .  (2015)
bakteri Proteus mirabilis berhasil diisolasi dari tanah pada industri tekstil dan bakteri tersebut  berperan  dalam  pengolahan  air limbah.  Hasil  BLAST  ditunjukkan  pada Tabel 6.

## Tabel 6. Spesies Bakteri yang Diperoleh dari Identifikasi dengan Gen 16S rRNA
Kode Isolat Bakteri Deskripsi Spesies Max. Identity Query Cover 1.A Proteus mirabilis 99% 100%
Analisis Daya Reduksi Bakteri Resisten
Merkuri Menurut  Vetriani et  al .  (2004), bakteri resisten merkuri tinggi mangandung  operon mer yang  menyandi flavoenzim,  merkuri  reduktase  (merA) yang  dapat  mereduksi  ion  Hg 2+ menjadi Hg 0 yang  kurang  toksik.  Selain  memiliki merkuri  reduktase  (merA),  beberapa bakteri  resisten  merkuri  tinggi  juga memiliki  organomerkuri  liase  (merB) yang  dapat  mengaktalisis  pemutusan ikatan merkuri-karbon sehingga dihasilkan senyawa organik  dan ion Hg 2+ (Osborn et al .,  1997).  Pada  penelitian  ini  telah dilakukan uji daya reduksi bakteri resisten
merkuri  tinggi  yaitu  isolat  1.A.  Kultur bakteri  ditumbuhkan  pada  media nutrient broth (NB)  yang  mengandung  HgCl 2 dan fenil  merkuri  masing-masing  400  µL dengan konsentrasi 40 mg/L selama 0 jam, 12  jam  dan  24  jam.  Sampel  dikirim  ke Balai Riset dan Standarisasi
(BARISTAND),  Manado  untuk  dianalisis kadar  merkurinya  dengan  metode  analisis CV-AAS.
Hasil  analisis  menunjukkan  bahwa isolat  bakteri  resisten  merkuri  anorganik dan  organik  1.A  dapat  menurunkan  kadar Hg  dalam  waktu  12  dan  24  jam.  Hasil analisis daya reduksi merkuri dapat dilihat pada Tabel 7. dan Tabel 8.
Tabel 7. Hasil Analisis Kadar Merkuri dalam HgCl 2 dengan Metode CV-AAS Perlakuan Kadar Hg dalam HgCl 2 (mg/L) 0 jam % 12 jam % 24 jam % Kontrol Media NB 0 0 0 0 0 0 Isolat 1.A 40 100 30,92 77,3 19,12 47,8 Tabel 8. Hasil Analisis Kadar Merkuri dalam Fenil Merkuri dengan Metode CV-AAS Perlakuan Kadar Hg dalam Fenil Merkuri (mg/L) 0 jam % 12 jam % 24 jam % Kontrol Media NB 0 0 0 0 0 0 Isolat 1.A 40 100 39,92 99,8 18,93 47,3
Hasil  analisis  pada  Tabel  7.,  Tabel  8.  dan Gambar  2.  menunjukkan  bahwa  isolat bakteri resisten merkuri dapat menurunkan kadar  merkuri  dalam  merkuri  anorganik dan  organik  dalam  waktu  12  dan  24  jam. Persentase  merkuri  anorganik  (HgCl 2 ) yang  tersisa  untuk  12  jam  dan  24  jam berturut-turut  yaitu 77,3% dan 47,8% jadi isolat  bakteri  resisten  merkuri  dapat menurunkan kadar merkuri sebesar 22,7% dan 52,2%, sedangkan, persentase merkuri organik  (fenil merkuri)  yang tersisa untuk 12  jam  dan  24  jam  berturut-turut  yaitu 99,8%  dan  47,3%  jadi  isolat  bakteri resiten  merkuri  dapat  menurunkan  kadar merkuri  sebesar  0,2%  dan  52,7%.  Pada penelitian  ini,  penurunan  kadar  HgCl 2 lebih  cepat  dibandingkan  dengan  fenil merkuri . Hal  ini  disebabkan  karena  pada merkuri  anorganik  (HgCl 2 )  merA  yang bertindak  sebagai  gen  merkuri  reduktase dengan  cepat  mereduksi  Hg 2+ menjadi Hg 0 ,  sedangkan  pada  merkuri  organik (fenil merkuri), merB terlebih dahulu akan mengkatalisis  pemutusan  ikatan  Hg-C sehingga  dihasilkan  senyawa  organik  dan ion  Hg 2+ .  Hg 2+ tersebut  akan  direduksi oleh  gen  merA  menjadi  bentuk  yang kurang  toksik  dan  mudah  menguap (Osborn et al ., 1997).
Tingkat  resistensi  bakteri  ini  lebih tinggi  daripada  yang  ditemukan  oleh Amelia et  al .  (2016),  yang  menemukan  1 isolat  bakteri  resisten  merkuri  yaitu bakteri  spesies Bacillus  subtilis dari  air
sungai  Musi.  Bakteri  ini  hanya  dapat hidup  pada  HgCl 2 dengan  konsentrasi  0,2 mg/L. Selain itu, Fatimawali et  al . (2011) yang mengisolasi bakteri Klebsiella pneumonia dari  air  sungai  Sario,  yang dapat tumbuh pada HgCl 2 dengan konsentrasi 20 mg/L. Perbedaan resistensi ini  juga  berhubungan  dengan  mekanisme respon  terhadap  merkuri.  Terdapat  3 mekanisme respon terhadap merkuri  yaitu pertama, dengan cara menghambat metabolisme  sel  sehingga  pertumbuhan sel  lambat  atau  sel  mati.  Kedua, menginduksi sistem operon resisten merkuri  untuk  bekerja  sehingga  sel  tetap hidup  walau  dalam  kondisi  stres.  Ketiga, adanya  plasmid  yang  mengandung  gen resisten merkuri yang masuk ke dalam sel. Isolat  bakteri  yang  dapat  hidup  pada media dengan kadar merkuri 10 mg/L, 20 mg/L dan 40 mg/L kemungkinan menggunakan  mekanisme  respon  yang kedua  bahkan  yang  ketiga  sehingga bakteri  dapat  hidup  pada  media  dengan kadar  merkuri  yang  tinggi.  Selain  itu, faktor  lain  yang  berpengaruh  terhadap penurunan  konsentrasi  merkuri  dalam kultur  yaitu  perbedaan  jumlah  sel  bakteri yang  tumbuh  dalam  media,  perbedaan jumlah  sel  ini  dapat  disebabkan  karena adanya  perbedaan  kondisi  pertumbuhan optimum  seperti  pH  dan  suhu  dari  setiap jenis  bakteri  (Smit et  al .,  2004  dalam Fatimawali, 2016).
100 100 100 100 77,3 47,8 100 99,8 47,3 0 20 40 60 80 100 120 0 jam 12 jam 24 jam Per se nt as e (% ) waktu (jam) Persentase (%) Hg vs Waktu (jam) Kontrol HgCl2
Fenil Merkuri

## Gambar 2. Grafik Hubungan konsentrasi Hg dalam media vs waktu.
Bakteri  resisten  merkuri  sejauh  ini telah  digunakan  untuk  bioremediasi. Sistem detoksifikasi bakteri resisten merkuri  terhadap  merkuri  sangat  efektif pada limbah kloalkil dan tingkat penghilangan  merkuri  dapat  mencapai 98% (Canstein et al ., 2002). Isolat bakteri resisten  merkuri  yang  diperoleh  pada penelitian  ini  dapat  digunakan  untuk detoksifikasi  merkuri  karena  walaupun kurang  cepat  dalam  merespon  penurunan merkuri  tetapi  dalam  waktu  24  jam  lebih dari 50% merkuri hilang dari media.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang telah  dilakukan  dapat  disimpulkan  bahwa diperoleh 2 isolat  bakteri  resisten merkuri yaitu isolat 1.A dan 2.A yang diisolasi dari air sungai di wilayah tambang emas rakyat desa  Tanoyan  Utara.  Berdasarkan  hasil identifikasi  secara  mikrobiologi  bakteri resisten  merkuri  isolat  1.A  dan  2.A termasuk dalam famili Enterobacteriaceae dan  berdasarkan  analisis  gen  16S  rRNA, bakteri  resisten  merkuri  isolat  1.A  adalah bakteri  spesies Proteus  mirabilis .  Bakteri spesies Proteus mirabilis dapat mereduksi HgCl 2 sebanyak  22,7%  dalam  waktu  12 jam,  52,2%  dalam  waktu  24  jam,  dan dapat  mereduksi  fenil  merkuri  sebanyak
0,2%  dalam  waktu  12  jam,  52,7%  dalam waktu 24 jam. Bakteri yang teridentifikasi dapat  digunakan  untuk  detoksifikasi merkuri  sehingga  dapat  mengurangi  efek berbahaya  yang ditimbulkan oleh merkuri pada air sekitar pertambangan.

## SARAN
Dengan  hasil  penelitian  ini  perlu dilakukannya penelitian lebih lanjut untuk analisis  gen yang  bertanggungjawab terhadap  reduksi  merkuri  yaitu  gen mer A dan merB untuk mendapatkan enzim yang dapat digunakan dalam proses detoksifikasi merkuri.

## DAFTAR PUSTAKA
Amelia,  T.  F.,  Ace,  B.,  Herpandi.  2016.
Aktivitas  Reduksi  Merkuri  pada Bakteri yang   Diisolasi dari Air dan  Sedimen  di  Sungai  Musi. Jurnal  Teknologi  Hasil  perikanan .
5(1) :94-106.
Anne,  O.  2006 .  Interaction  of  Human Commensal Bacteria with Amalgam-Derived Mercury:The Science  and  Its  Implications  for Infectious Disease and Neurotoxicology . Georgia University, Athens (GA).
Canstein,  V.  H.,  Li,  Y.,  Leonhauser  J.,
Haase  E.,  Felske  A.,  Deckwer  W. D. and Wagner- Dobler. 2002. Spatially  Oscillating Activity and Microbial  Succession of Mercury- Reducing  Biofilms in a Technical-Scale Bioremediation System. Appl. Environ. Microbiol . 68(4) : 1938-1946.
Carrol,  K.  C.,  Butel,  J.  S.,  Morse,  S.  A.
2004. Jawetz,  E.,  Melnick  & Adelberg’s Medical
Microbiology  24 th edition . Mc.
Graw-Hill Medical, USA.

## Clarridge, J. E. 2004.  Impact of 16S rRNA
Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Clin. Microbiol. Rev . 17(4) : 840-862.
Dwidjoseputro, D. 1985. Pengantar Fisiologi  Tumbuhan .  Gramedia,
Jakarta.
Fatimawali, Fatmawaty B., dan Irawan Y.
2011.  Isolasi  dan  Identifikasi
Bakteri Resisten Merkuri  dari Muara  Sungai  Sario  yang  Dapat Digunakan  Untuk  Detoksifikasi Limbah Merkuri. Jurnal Ilmiah Sains . 11(2) : 282-288.
Fatimawali.  2016. Buku  Ajar
Toksikologi:   Detoksifikasi
Merkuri . Unsrat Press, Manado.
Fatimawali,  Billy  K.,  Trina  T.  2017.
Overproduction of Mercuric Reductase Protein Expressed by  Synthetic  merA  gene  and reduction  of  inorganic  mercury
HgCl 2 . Bioscience Research .
14(4) : 1253-1260.
Hadioetomo.  1990. Mikrobiologi  Dasar
Dalam Praktek . PT. Gramedia, Jakarta. Harti, A. S. 2012. Dasar-Dasar Mikrobiologi  Kesehatan .  Nuha
Medika, Yogyakarta.
Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A.,
Staley,  J.  T.,  and  William,  S.T.
1994. Bergey’S Manual of
Determinative  Bacteriology  9 th
Edition .  William  and  Wilkins, Baltimore.
Kristianingrum, S. 2009. Kajian Berbagai Proses  Destruksi  Sampel  dan
Efeknya .  Jurnal  Pendidikan  dan
Penerapan MIPA Universitas Negeri Yogyakarta, Yogyakarta.
MacFaddin,  F.  J.  2000. Biochemical  Test for Identifications of Medical Bacteria, Williams and Wilkins (eds.) . Baltimore, 2 nd edition. Pp. 527.
Osborn, A. M., Bruce, K. D., Strike, P and Ritchie,  D.  A.  1997.  Distribution, Diversity and Evolution of the Bacterial Mercury Resistance (mer)
operon. FEMS  Microbiol.  Rev . 19(4) :   239-262.
Pratiwi,  Arena  Yogi.  2012.  Penapisan Bakteri  Resisten  Terhadap  Merkuri Sebagai Agen
Bioremediasi  Pada  Pencemaran Tanah  Pertambangan  [ Skripsi ].  IPB,
Bogor.
Rahayu, D. A., dan Nugroho, E. D. 2015.
Biologi Molekuler dalam Perspektif  Konservasi .  Plantaxia, Yogyakarta.
Rasmussen,  L.  D.,  C.  Zawadsky,  S.  J.,
Binnerup,  G.  Oregaard,  S.  J. Sorensen,  and  N.  Kroer.  2008. Cultivation  of  Hard-To-Culture Subsurface Mercury-Resistant
Bacteria  and  Discovery  of  New
merA Gene Sequences, Department of Environmental Chemistry and Microbiology, National  Environmental    Research Institute,  University  of  Aarhus, Frederiksborgvej 399, 4000 Roskilde,  Denmark,  Institute  of Biology, University of Copenhagen,Solvgade  83H,  1307 Copenhagen  K,  Denmark.  App. Environ.  Microbiol . 74(12) :3795- 3803.
Rehman,  A.,  Ashfaq,  A.,  Bushra  M.,  and
Abdul  R.  S.  2007.  Resistance  and
Biosorption of Mercury by Bacteria  Isolated  from  Industrial Effuents. Department of Microbiology and Molecular
Genetics  and  School  of  Biological Scinces,  University  of  the  Punjab, New  Campus,  Lahore,  Pakistan.
Pakistan  Journal  Zoology . 39(3) :
137-146.
Rychlic, W. 1995. Selection of Primer for
Polymerase  Chain  Reaction. Mol. biotechnol . 3(2) : 129-134.
Selid,  Paul  D.,  Hanying  Xu,  Michael Collins, Marla Striped and Julia Z. 2009. Sensing  Mercury  for
Biomedical  and  Environmental Monitoring. Journal  of  Chemistry .
9(7) : 5446-5459.
Utari,  S.  A.  S.  T.  L.,  Ida,  B.  G.  D.,  I Wayan,  B.  S.  2015.  Isolation, Identification  and  Test  Potential
Bacteria  That  Play  a  Role  on Waste Water Treatment Containing  Rhodamin  B  in  Plant
Biosystem. Journal  Symbiosis . 3
(1) : 301-312.
Vetriani,  C.,  Y.  S.  Chew,  S.  M.  Miller,  J.
Yagi,  J.  Coombs,  R.  A.  Lutz,  and
T. Barkay. 2004. Mercury Adaptation among Bacteria from a Deep-sea Hydrothermal Vent. Appl.  Environ.  Microbiol . 71(1) :
220-226.