Analisis  Kualitatif  Metabolit  Sekunder  dan  Aktivitas Antioksidan  Jamur  Endofit  Cangkang  Bulu  Babi (Diadema setosum)
Widy Susanti Abdulkadir 1 , Mahdalena Sy. Pakaya 2 , Fika Nuzul Ramadhani 3 , Wiwit Zuriyati Uno 4 , Arona Salama 5
1,2,3,4,5 JurusanFarmasi,  FakultasOlahraga  Dan  Kesehatan,  Universitas  Negeri  Gorontalo,  Kota  Gorontalo, Indonesia.
* E-mail: widi@ung.ac.id
Article Info: Received: 26 Januari 2023 in revised form: 18 Maret 2023 Accepted: 15 April 2023
Available Online: 20 Mei 2023

## ABSTRACT
Endophytic  fungi  are  fungi  that  live  in  plant  tissues  for  a certain  period  and  can  form  colonies  in  the  host's  tissues without  endangering  the  host  itself.  In  addition  to  plants, endophytic fungi are also found in marine biota. Endophytic fungi that live in the internal organs or tissues of marine biota, whether  in  the  form  of  mold  or  yeast,  can  transform  the nutrients they obtain from their host animals into metabolite compounds  which  will  then  be  transferred  back  to  the  host organs so that they have the same metabolites as their hosts. This study aimed to analyze and test the antioxidant activity of the  secondary  metabolites  of  sea  urchins  in  the  Tomini  Bay area. The method used from the beginning of the research was endophytic  microbial  fermentation,  production  of  secondary metabolites, and partitioning of endophytic microbial isolates, namely  liquid-liquid;  the  method  used  to  test  antioxidant activity  was  qualitative  using  TLC  plates,  DPPH  UV-Vis spectrophotometer  method,  color  reagent,  and  thin  layer chromatography.  Two  isolates  of  endophytic  fungi  were obtained, namely (JBB1, JBB2). The isolate that was active as an antioxidant was JBB2 from sea urchins in the Tomini Bay area with an ICso 50-100 ppm, which was in the strong category. Meanwhile, JBB2 isolate was carried out at a wavelength of 517 nm with a value absorbance of 0,707 A. In accordance with the value of the linear equation, it obtained y = 0,092x+36,95 and an R2 value = 0,945 that the ethyl acetate extract in JBB2 had a moderate ICs of 87.43 µg/mL. Meanwhile, the qualitative test of  secondary  metabolites  using  thin  layer  chromatography with  n-hexane  eluent:  ethyl  acetate  (8:2)  ethyl  acetate  extract contained alkaloid and terpenoid compounds. Keywords : Diadema setosum; Secondary Metabolites; Endophytic Fungi; Tomini Bay
Corresponding Author: Widy Susanti Abdulkadir JurusanFarmasi FakultasOlahraga dan Kesehatan
Universitas Negeri Gorontalo Kota Gorontalo Indonesia E-mail: widi@ung.ac.id
Copyright © 2023  IJPE-UNG
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.
How to cite (APA 6 th Style):
Indonesian Journal of Pharmaceutical Education (e-Journal) 2023; 3 (2): 280 – 290 ISSN : 2775- 3670 (electronic) Journal Homepage: http://ejurnal.ung.ac.id/index.php/ijpe/index DOI: 10.37311/ijpe.v3i1.18063
Abdulkadir,  W.S.,  Pakaya,  M.Sy.,Ramadhani,F.N.,Uno,W.Z.,  Salama,  A.  (2023). Analisis  Kualitatif Metabolit Sekunder dan Aktivitas Antioksidan Jamur Endofit Cangkang Bulu Babi (Diadema setosum) . Indonesian Journal of Pharmaceutical  (e-Journal), 3 (2), 280-290.

## 1. Pendahuluan
Teluk Tomini merupakan  salah  satu  kawasan  perairan yang ada di Indonesia. Secara  geografis, Teluk Tomini  terletak pada  120°- 123°30' BT dan  0030'  LU  - 1°30' LS.  Perairannya  merupakan wilayah  dari  delapan Kabupaten  dan  tiga  kota  di  tiga wilayah  propinsi,  yaitu  Propinsi  Sulawesi Utara,  Propinsi  Gorontalo,  dan  Propinsi Sulawesi  Tengah. Perairan teluk ini diketahui mempunyai potensi sumber daya alam yang cukup tinggi dengan adanya ekosistem pesisir maupun laut. Salah satu sumber daya alam laut yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku pembuatan obat-obatan adalah bulu babi. Bulu babi merupakan salah satu biota laut yang memiliki cangkang keras dilapisi duri-duri yang sangat rapuh dan untuk jenis-jenis tertentu mengandung racun.  Duri  yang  dimiliki  bulu  babi  ini  digunakan  untuk  bergerak,  melindungi  diri, maupun untuk mencapit makanan.
Spesies  bulu  babi  yang  banyak  ditemukan  adalah E.  mathaei,  astenosoma, dan Diadema setosum . Penelitian Zakaria [1], menyatakan Diadema setosum merupakan salah satu  jenis  bulu  babi  yang  penyebarannya  di  seluruh  zona  terumbu  karang. Diadema setosum ini  dapat  dimanfaatkan  sebagai  sumber  pangan  bergizi.  Bulu  babi  ( Diadema setosum) diketahui memiliki kandungan bioaktif berupa flavonoid, fenol, dan alkaloid. Filum  Echinodermata  salah  satunya  Bulu  babi  ( Diadema  setosum) memiliki  potensi sebagai antimikroba alami. Sabuah studi melaporkan 43% aktivitas antimikroba berasal dari 83 spesies dari filum Echinodermata yang tidak diidentifikasi yang diperoleh dari pantai barat daya california.
Manfaat yang terdapat pada Bulu babi ( Diadema setosum) sangat beragam sehingga itu  mendorong  keinginan  masyarakat  untuk  dapat  memanfaatkannya.  Maka  untuk dapat memanfaatkannya Masyarakat akan berbondong-bondong mengambil biota laut tersebut sehingga akan terjadi penurunan pada ketersediaan hayati bulu babi ( Diadema

## ABSTRAK
Fungi endofit adalah fungi yang  hidup dalam  jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu  membentuk  koloni  dalam  jaringan  tanpa  membahayakan  inang  itu  sendiri,  selain pada tamanan fungi endofit juga terdapat di biota laut. Fungi endofit yang hidup di dalam organ  atau  jaringan  internal  biota  laut  baik  itu  berbentuk  kapang  maupun  khamir  dapat mentransformasikan  nutrisi  yang  diperolehnya  dari  hewan  inangnya  menjadi  senyawa- senyawa metabolit yang kemudian akan ditransfer kembali ke organ inang, sehingga memiiki metabolit  yang  sama  dengan  inangnya.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menganalisis  dan menguji aktivitas antioksidan pada metabolit sekunder Bulu babi di kawasan Teluk Tomini. Metode  yang  digunakan  dari  awal  mulai  penelitian  yaitu  fermentasi  mikroba  endofit, produksi metabolit sekunder, partisi isolat mikroba endofit yaitu partisi cair  – cair, metode uji aktivitas antioksidan secara kualitatif menggunakan plat KLT,  metode DPPH spekrofotometer Uv-Vis, pereaksi warna, dan kromatografi lapis tipis. Terdapat 2 isolat jamur endofit yang di dapatkan yaitu (JBB1, JBB2) isolat yang aktif sebagai antioksidan adalah JBB2 dari Bulu Babi di kawasan teluk tomini dengan niai Ic50 50-100 ppm yang masuk kategori kuat dimana isolat JBB2 yang diakukan pada panjang geombang 517 nm dengan nilai absorbansi 0,707 A. dapat dilihat dari nilai persamaan linear yang di dapat yaitu  y = 0,092x + 36,95 dan nilai R2 = 0,945 dimana ekstrak Etil asetat pada BBJ1 memiliki IC50  yang sedang yaitu  87,43 µg/mL dan pada uji  kualitatif  metabolit  sekunder  menggunakan  kromatografi  lapis  tipis    dengan  eluen  n- heksan : etil asetat (8:2) ekstrak Etil asetat mengandung senyawa alkaloid dan terpenoid. Kata Kunci: Diadema setosum; Metabolit sekunder; Jamur endofit; Teluk tomini
setosum) yang  dapat  menimbulkan  rusaknya  ekosistem  pesisir.  Untuk  itu  agar  dapat mengatasi  hal  tersebut  maka  pemanfaatannya  dapat  memanfaatkan  mikroba  endofit yang bersimbiosis di dalam Bulu babi ( Diadema setosum) .
Berdasarkan uraian diatas, Untuk pemanfaatan bulu babi di Teluk Tomini agar lebih optimal dilakukannya penelitian mengenai jamur endofit yang bertujuan untuk menganalisis metabolit sekunder jamur endofit pada bulu babi ( Diadema setosum) dan menguji aktivitas antioksidannya.

## 2. Metode Penelitian Alat dan Bahan
Autoklaf  (Hirayama),  Bunsen,  Cawan  petri,  Enkas,  Erlenmeyer,  Gelas  kimia, Gelas ukur, incubator shaker, Jarum  ose, Gunting steril, Mikropipet (eppendorf), Oven (memmert),  pinset,  Tabung  reaksi,  Timbangan  analitik  (neraca),  Tabung  sentrifugasi dan Sentrifugasi( centrifuge), Laminar Air Flow (LAF).
Alkohol  70%,  Aalumunium  foil,  Aqua  pro  injeksi,  Larutan  natrium  klorida (NaCl) fisiologis 0.9%, Logam magnesium, Marine Agar (media MA), Medium Potato Dextrosa  agar  Cloramfenicol (PDAC),  Medium Potato  dextrose  Broth (PDB),  Pereaksi semprot  DPPH,  Spritus,  Tisu,  Sampel  Bulu  babi  ( Diadema  setosum ),  pelarut  metanol, pelarut  etil  asetat,  pelarut  N-heksan,  pereaksi  dragendorff,  pereaksi  Lieberman- buchard, Pereaksi mayer, Pereaksi Hcl pekat.

## Prosedur Penelitian
Sterilisasi Alat dan Bahan
Untuk  sterilisasi  alat  dan  bahan  dapat  dilakukan  dengan  beberapa  cara diantaranya, untuk alat gelas seperti tabung reaksi dan cawan petri disterilkan secara panas kering dalam oven selama 1 jam pada suhu 170˚C, alat berupa jarum ose dan pinset  disterilkan  dengan  cara  pemijaran  langsung  pada  api  bunsen,  dan  media disterilkan menggunakan autoklaf dengan tekanan uap air selama 15 menit pada suhu 121ºC [2].

## Pembuatan Media
Marine Agar (Media MA)
Pembuatan  media  dilakukan  dengan  cara  menimbang  5.525  gram  MA,  kemudian dimasukan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan 100 mL aquades. Setelah itu, ditutup  menggunakan  kapas  dan  alumunium  foil  selanjutnya  disterilkan  pada autoclave selama 15 menit pada suhu 121˚C [3].
Potato Dextrosa Agar (Media PDA)
Media PDAC  dibuat dengan cara menimbang sebanyak 2,8 gram dilarutkan ke dalam 100  mL  aquades  dan  ditambahkan  0,01  ml  kloramfenikol,  kemudian  diaduk  dan dipanaskan  di  atas  hot  plate  setelah  itu  dimasukkan  ke  dalam  erlenmeyer  ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil kemudian disterilkan pada autoclav dengan suhu 121ºC selama 15 menit [3].
Potato Dextrosa Broth (Media PDB)
Media PDB dibuat dengan cara menimbang sebanyak 6 gram, kemudian dimasukan ke  dalam  Erlenmeyer  dan  dilarutkan  dengan  200  mL  aquades.  Setelah  itu,  ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil kemudian disterilkan pada autoclave selama 15 menit pada suhu 121˚C [3].

## Isolasi Jamur Endofit
Jamur endofit dilakukan isolasi dengan menggunakan metode tanam lansung, yaitu sampel yang telah dicuci dengan aquades direndam dengan etanol 70% selama 30 detik.  Selanjutnya,  potongan  sampel  tersebut  dikeringkan  diatas  kaca  steril  selama beberapa menit. Masing masing sampel dipotong kecil kemudian diletakan diatas media
Potato dextrosa agar cloramfenicol. Selanjutnya inokulasi sampel dilakukan diatas cawan petri dan dilakukan duplo. Dan kemudian inkubasi selama 2-14 hari pada suhu 37 o C [4] .

## Pemurnian Jamur Endofit
Setelah  jamur  endofit  tumbuh  pada  media  isolasi Potato  dextrosa  agar cloramfenicol. Secara  bertahap  dimurnikan  satu  persatu,  dari  masing-masing  isolat murni jamur endofit yang diperoleh dipindahkan ke dalam media Potato dextrosa agar cloramfenicol cawan  petri.  Pengamatan  morfologi  dilakukan  kembali  setelah  5-7  hari pada suhu kamar. Dan apabila masih ditemukan pertumbuhan koloni yang berbeda secara makroskopik maka harus dipisahkan kembali sampai ditemukan isolat murni. Setiap isolat murni  dibuat duplo masing masing sebagai kultur stok dan kultur untuk penelitian [5].

## Pembuatan Suspensi Mikroba Endofit
Koloni jamur endofit pada cawan petri PDA yang telah  diinkubasi selama 5-7 hari, kemudian diinokulasi menggunakan ose bulat kemudian diambil potongan biakan jamur. Potongan jamur tersebut diinokulasikan ke dalam media cair PDB sebanyak 50 mL dan diinkubasi 3-5 hari pada suhu 37 0 C, [5].

## Fermentasi Isolat Mikroba Endofit
Setelah  didapatkan  suspensi  jamur  endofit  kemudian  diambil  20  mL  dan dimasukkan  ke  dalam  Erlenmeyer  yang  berisi  medium  PDB  250  mL.  Selanjutnya dilakukan fermentasi menggunakan inkubator shaker 150 rpm (putaran/menit) pada suhu kamar selama 14 hari [5].

## Produksi Metabolit Sekunder
Dari masing-masing kultur yang telah difermentasi dimasukan kedalam tabung sentrifus ukuran 15 mL yang sebelumnya telah disterilisasi terlebih dahulu, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 90 menit [5].

## Ekstraksi Metabolit Sekunder Jamur Endofit
Hasil metabolit sekunder (supernatan) di partisi cair-cair dengan menggunakan pelarut N-heksan dengan perbandian 1 : 1,kemudian di  sentrifugasi hingga terbentuk dua lapisan dari partisi N – Heksan dengan air lalu diambil ekstrak N-Heksan dan di evaporasi    hingga  menjadi  ekstrak  kental,  kemudian  lapisan  air  di  ekstrak  kembali menggunakan etil asetat  dan methanol dengan cara kerja yang sama [6]. Hasil ekstraksi dilakukan uji bebas metanol, etil asetat, dan n-heksan.

## Analisis Kualitatif Metabolit Sekunder Jamur Endofit Identifikasi Kromatografi Lapis Tipis
Plat KLT diaktifkan terlebih dahulu dengan pemanasan dalam oven selama 30 menit  pada  suhu  100˚C  sebelum  digunakan.  Masing-masing  ekstrak  fermentasi dilarutkan dengan methanol, etil asetat, dan N-heksan kemudian ditotolkan pada plat KLT ukuran 6x3 cm menggunakan pipa kapiler dan diberi batas bawah 0.5 cm dan bats 0.3  cm  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  chamber.  Plat  KLT  yang  telah  ditotol kemudian dielusi dengan eluen.selanjutnya diamati di bawah lampu UV 254 dan 366 nm setelah itu dihitung nilai Rf ( Retardation factor ) nya.

## Identifikasi pereaksi warna
Uji alkaloid
Uji alkaloid dilakukan dengan menggunakan reagen Mayer dan Dragendorff. Uji reagen Mayer : menambahkan 1 mL ekstrak ke dalam tabung ditambah 1 mL HCl 2 N dan 1mL reagen Mayer. Uji reagen Dragendorff : sejumlah ekstrak ditambah dengan 1 mL reagen Dragendorf. Hasil ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih pada ekstrak  dengan  penambahan  reagen  Mayer  dan  endapan  jingga  pada  reagen Dragendorff.

## Uji terpenoid atau steroid
Sebanyak  1  ml  larutan  ekstrak  aktif  metabolit  sekunder  jamur  endofit dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi,  ekstrak  kental  diuapkan  sampai  kering, kemudian  ditambah  dengan  pereaksi  Lieberman-Burchad.  Jika  warna  berubah menjadi  biru  atau  ungu,  menandakan  adanya  senyawa  steroid.  Jika  warna  berubah menjadi merah, menunjukkan adanya senyawa terpenoid.

## Uji flavonoid
Ekstrak aktif metabolit sekunder jamur endofit dimasukan kedalam tabung reaksi, ditambahkan  logam  magnesium  dan  setetes  asam  klorida  (HCl)  pekat.  Hasil  positif mengandung  flavonoid  bila  terjadi  perubahan  warna  larutan  menjadi  kuning  atau merah muda.
Uji saponin
Saponin  dapat  dideteksi  dengan  uji  busa  dalam  air  panas  dan  dikocok  kuat. Busa yang stabil akan terus terlihat selama 5 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.

## Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode DPPH
Uji kualitatif menggunakan Metode Kromatograpi Lapis Tipis (KLT) Pembuatan Larutan DPPH 0,1 mM
Serbuk  DPPH  (BM  394,32)  2  mg  dilarutkan  dengan  methanol  p.a  kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, volumenya dicukupkan dengan methanol p.a sampai tanda batas (DPPH 0,1 mM). Larutan DPPH 0,1 mM dipipet 50 µL, dimasukkan ke dalam labu ukur 200 mL dicukupkan dengan methanol p.a hingga tanda batas (DPPH 0,5 mM) [7].

## Uji Aktivitas Antioksidan
Pada plat KLT diberikan tanda terlebih dahulu pada batas atas dan bawah, Pada batas  bawah  diberikan  jarak  antar  sampel  1  cm  dan  pada  jarak  atas  0.5  cm.  Sampel ekstrak  jamur  endofit  bulu  babi  ( Diadema  setosum) ditotolkan  pada  plat  KLT menggunakan pipa kapiler. Proses elusi dilakukan dengan cara plat KLT dimasukkan dalam  erlen  meyer  yang  telah  berisi  eluen  yakni  kloroform:etanol  (9:1)  dan  telah dijenuhkan lalu Eluen dibiarkan terelusi hingga mencapai batas plat yang telah ditandai. Setelah selesai, plat KLT dikeluarkan dari erlen meyer dan diamati dibawah  lampu UV 366 dan 254 nm. Setelah itu, plat KLT disemprotkan dengan larutan DPPH 0.1mM. Noda pada  plat  KLT  yang  memiliki  aktivitas  antioksidan  berubah  menjadi  warna  putih kekuningan [7].
Uji Kuantitatif Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis Aktivitas  antioksidan  ditentukan  berdasarkan  metode  DPPH.  Larutan  induk dibuat dengan cara melarutkan 2 mg senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dalam metanol 50 mL. Sebanyak 4 mL larutan DPPH ditambahkan dengan dengan 1 mL ekstak metabolit dalam berbagai konsentrasi (10, 20, 40, 60, dan 80 ppm. ), kemudian didiamkan selama 30 menit dalam tempat gelap. Analisis dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Vis  dilakukan  pada  panjang  gelombang  maksimum  (517,0  nm).  Kemampuan merendam radikal DPPH (inhibisi) ditentukan dari nilai serapan yang dihasilkan. Nilai IC50  merupakan  harga  yang  diperoleh  dengan  cara  memasukkan  50%  untuk  nilai  y pada masing-masing persamaan yang diperoleh untuk masing-masing sampel uji. Pembuatan Larutan DPPH 0,1 mM
Serbuk  DPPH  (BM  394,32)  2  mg  dilarutkan  dengan  methanol  p.a  kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, volumenya dicukupkan dengan methanol p.a sampai tanda batas (DPPH 0,1 mM). Larutan DPPH 0,1 mM dipipet 50 µL, dimasukkan
ke dalam labu ukur 200 mL dicukupkan dengan methanol p.a hingga tanda batas (DPPH 0,1 mM) [7].

## Pembuatan panjang gelombang
Larutan DPPH 0,1 mM sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam  tabung reaksi lalu di tambahkan methanol p.a sebanyak 2,5 ml, dikocok dengan vortex hingga homogen lalu dituang ke dalam kuvet dan diukur pada panjang gelombang 400-800 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis [7].

## Penentuan larutan blanko
Larutan  blanko  yang  digunakan  adalah  2,5  mL  etanol  dimasukkan  ke  dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 mL larutan DPPH kocok hingga homogen, kemudian didiamkan di ruang gelap selama 30 menit, setelah itu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 517.0 nm [7].

## 3.  Hasil dan Pembahasan
Supernatan yang  diperoleh dari  hasil  sentrifugasi  yang  telah  mengandung metabolit  sekunder  bakteri  endofit  Bulu  Babi (Diadema  setosum) di  partisi  cair  cair menggunakan  tiga  pelarut  yaitu  N-heksan,  etil  asetat  dan  metanol.  Hasil  partisi suprnatan 240 mL memperoleh berat ekstrak yang berbeda-beda dalam tiap pelarut.
Tabel 1. Hasil partisi cair-cair jamur endofit bulu babi (Diadema setosum) Isolat Pelarut Berat ekstrak (g) JBB1 N-heksan 1,3 Etil asetat 1,2 Metanol 1,9 JBB2 N-heksan 1,4 Etil asetat 1,9 Metanol 1,7 Keterangan : JBB1 = Isolat jamur endofit 1 JBB2
= Isolat jamur endofit 2
Ekstraksi  dengan  menggunakan  partisi  cair-cair  bertingkat  dilakukan  dengan menggunakan  corong  pisah.  Tujuan  partisi  cair-cair  yaitu  untuk  memisahkan komponen  senyawa  yang  terkandung  dalam  sampel  berdasarkan  kepolaran.  Hal  ini sesuai dengan penelitian Kumala [8] yang menyatakan bahwa partisi cair-cair dilakukan untuk  memisahkan  komponen  kimia  dalam  dua  fase  pelarut  berdasarkan  tingkat kepolaran dengan perbandingan konsentrasi yang tetap. Dengan dimulai menggunakan pelarut  nonpolar  (N-heksan),  semipolar  (etil  asetat)  dan  polar  (metanol).  kemudian dikocok hingga terbentuk dua lapisan yaitu lapisan pelarut dan filtrat. kemudian hasil Filtrat tersebut di partisi menggunakan pelarut etil asetat dan metanol secara berturut- turut kemudian dievaporasi hingga diperoleh ekstrak kental.
Tabel  1  menunjukan  bahwa  jamur  endofit  bulu  babi (Diadema  setosum) pada isolat 1 menghasilkan sebanyak 240 mL supernatan yang di ekstraksi dengan metode partisi cair-cair dengan 3 pelarut yang berbeda yaitu n-heksan, etil asetat, metanol. Isolat 1  sebanyak  240  mL menghasilkan  berat  ekstrak masing-masing  pelarut, n-heksan 1,3 gram, etil aseta 1,2 gram, dan  metanol  1,9 gram. Pada isolat 2 menghasilkan 220 mL supernatan yang di partisi dengan menggunakan 3 pelarut yang sama yaitu n-heksan,
etil  asetat,  dan  metanol,  sebanyak  220  mL  menghasilkan  berat  ekstrak  n-heksan  1,4 gram, etil asetat 1,9 gram, dan metanol 1,7 gram.
Hasil dari partisi metabolit sekunder bakteri endofit bulu babi ( Diadema setosum ) dinyatakan bebas pelarut apabila telah memenuhi beberapa syarat.
Tabel 2. Hasil uji bebas pelarut Identifikasi Isolat       Hasil Keterangan Bebas Metanol JBB1 (-) Negatif Tidak ada warna permangat (coklat) JBB2 Bebas Etil asetat JBB1 (-) Negatif Tidak berbau ester JBB2 Bebas N- heksan JBB1 (-) Negatif Tidak menghasilkan api dan asap JBB2
Tujuan  dari  pengujian  bebas  pelarut  menggunakan  N-heksan,  etil  asetat,  dan metanol untuk mengetahui  apakah ekstrak tersebut masih mengandung pelarut atau tidak. Hasil yang diperoleh pada pengujian bebas pelarut yaitu ekstrak N-heksan tidak menghasilkan api dan asap setelah dibakar pada api bunsen, ekstrak dikatakan bebas dari etil asetat apabila tidak berbau ester dan tidak menghasilkan api dan asap. Esktrak dikatakan bebas metanol yaitu tidak terdapat warna permangat (coklat) [9].
Uji  aktivitas  antioksidan  metabolit  sekunder  dari  Bulu  babi (Diadema  setosum) dilakukan  dengan  cara  kualitatif  menggunakan  metode  DPPH  secara  semprot.  Hasil dari supernatan postif dari ke tiga ekstrak yang berbeda yang ditandai dengan adanya warna kuning pada noda yang disemprot pada plat KLT.
Tabel 3. Hasil uji aktivitas antioksidan secara kualitatif Ekstrak sampel JBB1 JBB2 Supernatan + + N-heksan + + Etil aseta + + Metanol + + Keterangan :
JBB1 = Isolat jamur endofit 1 JBB2 = Isolat jamur endofit 2 (+)     = Positif beraktivitas sebagai antioksidan (-)      = Negatif beraktivitas sebagai antioksidan
Uji  kualitatif  antioksidan  menggunakan  Kromatografi  lapis  tipis  (KLT) dilakukan  dengan  menyemprotkan  DPPH (1,1-difenil-2-pikrihidrazil) .  Sampel  ekstrak isolat  Bulu  babi (Diadema  setosum) pertama-tama  sebelum  ditotol  pada  lempeng kromatogram disemprot terlebih dahulu dengan DPPH, lalu kemudian dielusi dengan eluen N-heksan : etil asetat dengan perbandingan 8:2, 9:1, dan 7:3. Hasil positif ditandai dengan  pemudaran  warna  dari  warna  ungu  menjadi  putih  kekuningan,  kemudian dihitung nilai Rf pada noda yang menunjukan positif antioksidan (noda warna kuning).
Pada  pengujian  isolat    JBB1,  dan  JBB2  secara  kualitatif  ini  sampel    bulu  babi ( Diadema  setosum )    berpotensi  sebagai  antioksidan alami  yang berasal  dari  biota laut. Hasil  positif  ditandai  dengan  pemudaran  warna  dari  warna  ungu  menjadi  putih kekuningan  kemudian  dihitung  nilai  RF  pada  noda  yang  menunjukan  positif antioksidan (noda kuning), menurut Prakash [10], terbentuknya bercak kuning setelah
penyemprotan  DPPH  0,2  mM  disebabkan  oleh  adanya  senyawa  yang  dapat mendonorkan atom hidrogen di dalam ekstrak, sehingga dapat mengakibatkan molekul DPPH  tereduksi  yang  diikuti  dengan  perubahan  warna  ungu  dari  larutan  DPPH menjadi kuning bening.
Uji  aktivitas  antioksidan  hasil  ekstrak  supenatan  jamur  bulu  babi (Diadema setosum) dilakukan  dengan  menggunakan metode  penangkapan  radikal  bebas  DPPH (1,1-difenil-2-pikrihidrazil). Pengukuran  aktivitas  antioksidan  dengan  metode  DPPH memiliki  beberapa  kelebihan  yaitu  sederhana,  cepat  dan  tidak  memerlukan  ruangan kimia yang cukup banyak [11].
Tabel 4. Hasil pengukuran nilai absorbansi DPPH dengan panjang gelombang 517 nm
Bahan Panjang Gelombang Maksimum Absorbansi (A) Rata-rata Absorbansi Blanko (A) Blanko (DPPH) 517 nm 1 2 3 0,707 0,707  0,707  0,706
Hasil penelitian menunjukkan bahwa dengan bertambahnya konsentrasi ekstrak maka  absorbansi  sampel  akan  menurun  dan  tingkat  inhibisi  akan  naik.  Absorbansi sampel turun karena elektron pada DPPH menjadi berpasangan dengan electron sampel yang mengakibatkan warna larutan berubah dari ungu pekat menjadi kuning bening. Kondisi  ini  sesuai  dengan  pernyataan  Suhaling  [11]  bahwa  nilai  tingkat  inhibisi meningkat  seiring  meningkatnya  konsentrasi  sampel  dikarenakan  semakin  banyak senyawa antioksidan pada sampel yang dapat menangkal radikal bebas.
Kemudian dihitung nilai % inhibisi dari masing-masing sampel, diperoleh yaitu sampel methanol dengan konsentrasi  10, 20, 40, 60 dan 80  ppm mempunyai nilai % inhibisi berturut-turut sebesar 24,45 %; 27,01 %; 28,57 %; 29,98 %; dan  32,21 %. Sampel etil asetat dengan konsentrasi 10, 20, 40, 60 dan 80  ppm mempunyai nilai % inhibisi berturut-turut sebesar 38,04 %; 39,03 %; 39,98 %; 42,56 %; dan  44,55 %. Sampel n-heksan dengan konsentrasi  10, 20, 40, 60 dan 80  ppm mempunyai nilai % inhibisi berturut- turut  sebesar  17,39  %;  23,62  %;  25,31  %;  28,14  %;  dan  31,40  %.  Sedangkan  sampel supernatant murni dengan konsentrasi 10, 20, 40, 60 dan 80  ppm mempunyai nilai % inhibisi berturut-turut sebesar 34,93 %; 35,51 %; 37,90 %; 39,32 %; dan 43,98 %.
Hasil  perhitungan  nilai  %  inhibisi  uji  aktivitas  antioksidan  ekstrak  etil  asetat memiliki nilai % inhibisi yang baik dibandingkan dengan ekstrak, n-heksan, metanol dan  supernatant    murni.  Hal  ini    berhubungan  dengan    diduga  adanya  kandungan senyawa metabolit yang dapat mampu menghasilkan aktivitas antioksidan.
Hasil analisis menunjukkan bahwa sampel fraksi  etil asetat  mampu menangkap radikal  bebas  sebesar    87,43  µg/mL  dalam  kategori  aktif  dari  pada  fraksi,  n-heksan methanol dan supernatant murni yaitu sebesar 129,94 µg/mL; 138,47µg/mL dan 136,991 µg/mL.  Nilai  IC50  menggambarkan  kekuatan  aktivitas  antioksidan  yang  dihasilkan oleh jamur    endofit  dalam  menghasilkan  senyawa  bioaktif  yang  mampu  menangkap radikal bebas sebesar 50%..
Berdasarkan  data  diatas  Pemanfaatan  jamur  endofit  bulu  babi  pada  aktivitas antioksidan  sangatlah  baik  dibandingkan  dengan  komponen  bulu  babi  yang  hanya memiliki aktivitas antioksidan sangat rendah. Sehingga itu pemanfaatan jamur endofit lebih  baik  daripada  pemanfaatan  komponen  bulu  babi  ( Diadema  setosum )  itu  sendiri, selain bisa mencegah eksploitasi bulu babi ( Diadema setosum ) yang berlebihan dapat juga bermanfaat sebagai antioksidan yang sangat kuat.
Semakin  kecil  nilai  IC50  maka  senyawa  uji  tersebut  mempunyai  keefektifan sebagai  penangkap  radikal  bebas  yang  lebih  baik  [12].  Menurut  Ika,  et  al.,  [13] menyatakan bahwa suatu senyawa dinyatakan sangat aktif apabila memiliki nilai IC50 < 10 bpj dan aktif jika memiliki nilai IC50 < 100 bpj serta tidak aktif bila nilai IC50 > 100 bpj.
Analisis senyawa metabolit sekunder Jamur endofit Bulu babi (Diadema setosum) menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan plat KLT dengan ukuran 5 x 1 cm dan uji perubahan warna.
Tabel 5. Hasil uji  perubahan warna jamur endofit bulu babi (Diadema setosum)
Komponen Bioaktif Ekstrak Aktif Alkaloid Flavonoid  Steroid Terpenoid   Saponin SJBB2 + + - + - HJBB2 + - - + - EJBB2 + - - + - MJBB2 + + - - - Keterangan : SJBB2= Superntan murni HJBB2 = Ekstrak Heksan
EJBB2 = Ekstrak Etil Asetat MJBB2= Ekstrak Metanol (+)  = Positif (-)   = Negatif Tabel 5 menunjukan bahwa isolat 2 jamur endofit bulu babi (Diadema setosum) positif  mengandung  senyawa  alkaloid  pada  pereaksi  Dragendroff,  flavonoid  dan terpenoid pada pelarut supernatan, sedangkan untuk komponen senyawa bioaktif lain seperti tanin, saponin dan steroid diperoleh hasil negatif. Pada ekstrak N-heksan positif mengandung  senyawa  alkaloid  pada  pereaksi  Dragendroff  dan  terpenoid,  etil  asetat positif mengandung senyawa alkaloid pada pereaksi Dragendroff dan terpenoid, dan pada methanol mengandung senyawa alkaloid, flavonoid dan terpenoid.
Uji terpenoid menunjukan hasil positif dengan adanya perubahan warna merah, sedangkan uji alkaloid dengan menggunakan pereaksi meyer dikatakan positif dengan adanya endapan putih hingga kekuningan, pada pereaksi dragendorff  adanya merah bata,  jingga  atau  cokelat  oranye.  Pada  uji  flavonoid  Jika  maisng-masing  larutan terbentuk warna kuning jingga sampai merah, maka positif mengandung flavonoid [14].
Tabel 6 . Hasil Analisis Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Metabolit Sekunder Jamur
Endofit Bulu Babi (Diadema setosum) Ekstrak Fase Gerak N-heksan : Etil asetat Nilai Rf 254 nm 366 nm 254 mm 366 mm SJBB2 7:3 0,8 0,8 Rf=0,8 Rf=0,5 Rf=0,8 Rf=0,5 Rf=0,3 0,5 0,5 - 0,3
HJBB2 9:1 - 0,8
Rf=0,4
Rf=0,8
Rf=0,4
0,4 0,4 EJBB2 8:2 0,8 0,8
Rf=0,8 Rf=o,8 Rf=0,3 - 0,3
MJBB2
5:5
- 0,6 Rf=0,6
Rf=0,4 - 0,4
Metode kromatografi lapis tipis dilakukan dengan prinsip  trial and error dimana prinsip ini digunakan untuk mencari eluen dengan perbandingan  yang sesuai   agar memberikan  pemisahan  yang  baik.  Identifikasi  kromatografi  lapis  tipis  dilakukan menggunakan fase diam plat KLT kiesel G 60 F 254 dengan fase gerak menggunakan beberapa perbandingan eluen.
Tabel  6  menunjukkan  bahwa  perbandingan  eluen  yang  baik  untuk mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder pada  jamur endofit Bulu babi (Diadema setosum) yaitu dengan perbandingan eluen  n-heksan : eti asetat  ( 7 : 3) pada supernatan dengan  nilai  Rf  yang  diperoleh    yaitu  0,5  ;  0,3  dan  0,8    dan  ekstrak  methanol mendapatkan nilai Rf 0,6 ; dan 0,4, sedangkan pada perbandingan n-heksan : etil asetat ( 8 : 2 ) pada ekstrak etil asetat memperoleh nilai Rf  0,8, 0,4 untuk ekstrak n-heksan pada perbandingan n-heksan : etil asetat ( 9 : 1 ) memperoleh nilai Rf 0,8 dan 0,4. Menurut Harborne [15] nilai Rf masuk dalam kisaran 12 alkaloid yang paling umum yaitu 0,07- 0,62  dengan warna noda merah atau ungu. Menurut  Gandjar & Rohman [16], nilai Rf senyawa flavonoid yang baik memiliki range 0,2-0,8 dengan warna tampak lampu UV ungu tua, biru dan jingga.
4.   Kesimpulan
Analisis  kualitatif metabolit  sekunder isolat jamur endofit Bulu Babi (Diadema setosum) positif mengandung alkaloid, terpenoid, dan flavonoid dengan nilai Rf yang diperoleh secara berurutan 0,8, 0,6, 0,8, 0,4 dan 0,3 ; 0,3, 0,4 dan 0,5, 0,3.
Potensi  antioksidan    pada  jamur  endofit  Bulu  babi    tergolong  dalam  kategori kuat ditunjukan pada hasil IC50 < 100  pada isolat JBB1, pada SJ1 (136,991 µg/mL), pada HJ1 (129,94 µg/mL), pada EJ2 (87,43 µg/mL) pada MJ1 (138,47µg/mL) dan dapat dilihat dari nilai IC50 ekstrak Etil asetat pada BB1 menghasilkan antioksidan tinggi.

## Referensi
[1]. Zakaria,  I.  J.  (2013). Komunitas  Bulu  Babi  (Echonoidea)  di  Pulau  Cingkuak,  Pulau Sikuai dan Pulau Setan. Sumatera  Barat. Prosiding  SEMIRATA  2013, 1(1).
[2]. Indrawati, A., Nur, A.H. & Muyassara. (2019). Isolasi dan Uji Potensi Fungi Endofit Kulit  Batang  Langsat  (Lansium  domesticum  corr.)  Penghasil  Antibakteri  terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Media Farmasi, 15(1).
[3]. Siregar T. 2018. Pembuatan Media Pertumbuhan Jmur. Yogyakarta : UGM Press [4]. Febrina O, Nurhayati T. 2015. Isolasi Dan Karakterisasi Antibakteri Dari Bulu Babi.
Bogor : Ilmu Kelautan Institut pertanian Bogor
[5]. Laode  R,  Ahmad  I.  2015. Isolasi  Jamur  Endofit  Dan  Produjsi  Metabolit  Sekunder Antioksidan  dari  Daun  Pacar  (Laosonia  inermis). Samarinda  :  Universitas Mulawarman
[6]. Abubakar L, Wangi C, Uku J, Ndirangu S.  2012. Antimicrobial activity of various extracts  of  the  sea  urchin    Tripneustes  gratilla  (Echinoidea). African  Journal  of Pharmacology and Therapeutics  1(1), pp19- 23.
[7]. Rahmi W. 2019. Uji Aktivitas antioksidan ekstrak etanol kulit buah mundar (Garcinia forbeesi  king)  menggunakan  metode  DPPH. Banjarbaru  :  Sekolah  tinggi  ilmu kesehatan borneo lestari.
[8]. Kumala, S. (2014). Mikroba Endofit . Jakarta: PT. ISFI Penerbitan.
[9]. Wulandari, E. 2017. Isolasi dan penentuan Struktur Senyawa Metabolit Sekunder dari fraksi  n-heksana  Daun  Aglaia  minahassae  Koord. Kalimantan  Timur  :  Fakultas Farmasi
[10]. Prakash, A., 2001, Antioxidant Activity, Medallion Laboratories Analytical Progress, vol. 19, No.2.
[11]. Suhaling,  S.,  2010,  Uji Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Metanol  Kacang  Merah (Phaseolus  vulgaris  L)  dengan  Metode  DPPH ,  Skripsi,  Fakultas  Kedokteran  dan Ilmu Kesehatan,Universitas Islam Negeri Alauddin, Makassar.
[12]. Cholisoh, Z dan Dedi, H., 2006, Aktivitas Antiradikal Ekstrak Etanol Daun, Bunga, dan  Biji  Selasih  (Ocimim  sanctum)  serta  Hubungannya  dengan  Karakteristik Kandungan  Polifenol, PHARMACON,  7(1),  Fakultas  Farmasi  Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta.
[13]. Ikka. 2013. Oxidative Stress a Role Of Antioxidant in Normal and Abnormal Sperm Function. Frountiers in Bioscience. Omm
[14]. Mustikasari,  K  dan  Ariyani,  D.  (2010). Skrining  Fitokimia  Ekstrak  Metanol  Biji Kalangkala (Litsea Angulata). Jurnal Sains dan Terapan Kimia. Vol.4, No.2, Hal. 131-136.
[15]. Harborne,  J.  B.,  1987, Metode  fitokimia,  penuntun  cara  modern  menganalisis tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih Padwawinata, ed. V, Penerbit ITB, Bandung. [16]. Gandjar, I. G. dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis . Yogjakarta: Pustaka Pelajar.