Efektifitas Kinerja Pentoksifilin Terhadap Kualitas dan  Integritas Membran Plasma Utuh pada Sperma Sapi Bali Hasil Pemisahan dengan Menggunakan Albumin
(The Effectivity of Pentoxyfilon the Quality and Plasma Membrane Integrity of Bali  Bull Spermatozoa Separated Using Albumin)

## Rodiah, Enny Yuliani, Adji Santoso Dradjat, Chairussyuhur Arman
Laboratorium Reproduksi Fakultas Peternakan Universitas Mataram , Jl. Majapahit 62 Mataram Lombok 83125, Indonesia. Telephon. (0370) 633603. Faks. (0370) 640592.
E-mail: rodiah.makbul@yahoo.com
Diterima : 22 Februari  2015/ Disetujui:  27 April 2015

## ABSTRACT
The purpose of this research was  to determine the effect of Pentoxyfilline  in maintaining the quality (motility,  viability,  morphology  and  plasma  membrane  intact)  of  Bali  bull  spermatozoa  separated with albumine.  A Completely Random Block Design was used in this study with two main factors (upper layer and bottom layer), diluents with four doses of pentoxyfilline (0, 15, 20  and 25 μM) with six    replications.    Evaluation  of  spermatozoa  was  performed  by  characterizing  motility,  viability, morphology,  plasma  membrane  intact.  Result  of  the  study  showed  that  the  effect  of  four  doses pentoxyfilline  on  the  quality  of  Bali  bull  spermatozoa  was  non  significant  (p>0,05).  However,  the addition of  25μM pentoxyfilline was found to give the best effect compared to 15 μM, 20 μM and control.  Result    of  the  study  also  indicated  that  spermatozoa  separated  in  the  upper  layer  was signifiqantly  higher  (p<0,01)  than  that  of  separated  in  the  bottom  layer  with  the  average    motility, viability, morfology and  plasma membrane intact was 66,67,80,50, 6,71 and 65,61% respectively. Keywords : pentoxifillynae , quality of sperm , separating with Albumin , Bali Bull

## PENDAHULUAN
Sapi  Bali  merupakan  plasma  nutfah  poten- sial  yang  mempunyai  kualitas  tinggi  perlu dilestarikan kemurniannya dan dikem-bangkan untuk  meningkatkan  produktivitasnya  melalui penerapan  bioteknologi  reproduksi.  Biotek- nologi  reproduksi  yang  pesat  dikembangkan untuk  menciptakan  ternak  unggul  pada  masa mendatang,  yaitu  dengan  penerap-an  Inse- minasi  Buatan  dan  Transfer  embrio.  Kedua teknologi ini akan lebih berdaya guna, apabila anak  yang  dihasilkan  berjenis  kelamin  sesuai dengan tujuan peternakan.
Pemisahan  spermatozoa  adalah  upaya untuk  mengubah  perolehan  spermatozoa  yang berkromosom  jenis  X  atau  Y  dengan  metode tertentu,  sehingga  berubah  dari  proporsi normal  (rasio alamiah),  50  persen  banding  50 persen.  Beberapa  hasil  penelitian  sebelumnya telah  dilaporkan  bahwa  rata-rata  kandungan spermatozoa  X  dan  Y  dalam  semen  sapi
adalah 49,5 persen dan 50,5 persen (Garner et al. ,  1983).  Pemisahan  sperma  X  diarahkan pada peternakan sapi perah untuk memperoleh lebih  banyak  anak  sapi  betina,  sedangkan pemisahan  sperma  Y  diarahkan  pada  peter- nakan  sapi  potong  untuk  memperoleh  anak sapi  jantan.  Salah  satu  metode  pemisahan spermatozoa  berdasarkan  perbedaan  motilitas spermatozoa  X  dan  Y  adalah  metode  kolom albumin (Hafez, 1987).
Prosedur  pemisahan  dapat  mengin-duksi kerusakan  membran  plasma,  akrosom  dan aglutinasi kepala sperma-tozoa sehingga dapat meng-akibatkan penurunan motilitas dan daya fertilitas  spermatozoa  (Windsor et  al .,  1993; Daniel et  al .,  1996).  Terdapat  korelasi  yang nyata  antara  motilitas  spermatozoa  dengan derajat  integritas  membran  yang  disebabkan oleh  kerusakan  ultra  struktur,  biokimia  dan fungsi  membran  (Malmgre  dan  Martinez, 1996; Soderquist et al ., 1997). Integritas fung-
sional  membran  spermatozoa  yang  baik  harus ditunjang  oleh  integritas  struktural  membran sper-matozoa.  yang  baik  pula.  Membran pada bagian kepala spermatozoa berfungsi pada saat kapasitasi,  reaksi  akrosom  dan  penetrasi  zona pelusida pada saat fertilisasi, sedangkan mem- bran  bagian  ekor  berfungsi  untuk  menda- patkan  substrat  energi  yang  digunakan  untuk pergerakan  (Pedersen  dan  Fawcett,  1976). Motilitas  spermatozoa  memegang  peranan penting  dalam  fertilisasi  yang  normal  (Sikka dan  Hellstrom,  1990)  dan  merupakan  kebu- tuhan  esensial  dalam  reproduksi  (Tournaye, 1994). Hal ini penting bagi spermatozoa untuk melakukan  penetrasi  lendir  servix,  bermigrasi melalui  uterus  ke  tuba  falopii  dan  untuk penetrasi oosit agar bisa terjadi fertilisasi, baik in vivo maupun in vitro .
Pentoksifilin  merupakan  derivat  metalxan- tin dapat meningkatkan motilitas dan memper- panjang  masa  aktif  spermatozoa  manusia (Arsyad, 1981), kapasitasi dan reaksi akrosom (Kay et  al. ,  1994),  angka  fertilisasi  oosit dengan  mengurangi  resiko  kegagalan  sepan- jang  siklus  (Yovich,  1993;  Tournaye,  1994). Selain  itu,  pentoksifilin  juga  telah  dibuktikan memacu  perkembangan  embrio  dua  sel  dan blastosis  serta  kamampuan  fertilisasi  sperma- tozoa  manusia  IVF  (Tournaye,  1994).  Namun efek  utamanya  adalah  mempertahankan  per- sentase motilitas spermatozoa (Yovich, 1993). Berkaitan  dengan  uraian  dan  fakta  tersebut, menjadi  dasar  ilmiah  untuk  dilakukan  pene- litian  tentang  analisis  kinerja  Pentoksifilin terhadap  kualitas  dan  integritas  membran sperma  sapi  Bali  hasil  pemisahan  dengan menggunakan albumin.

## MATERI DAN METODE Penampungan dan pemisahan spermatozoa
Semen  sapi  Bali  ditampung  dengan  vagina buatan.  Selanjutnya  dilakukan  evaluasi  terha- dap  semen  tersebut  secara  makroskopis (volume,  warna  dan  bau,  pH,  konsistensi semen  dan  secara  mikroskopis  (gerakan massa,  persentase  motilitas,  persentase  daya hidup,  per-sentase  abnormalitas,  persentase membran  plasma  utuh  (MPU).  Kriteria penilaian  kualitas  yang  digunakan  dalam
penelitian  ini  adalah  motilitas  sper-matozoa dari semen segar setelah penampungan >70 %.
Pemisahan  semen  dilakukan  dengan  meto- de  albumin  bertingkat  dengan  media Bovine Serum Albumin, BSA (BSA 10 % untuk fraksi atas  dan  BSA  30  %  untuk  fraksi  bawah). Semen dengan konsentrasi 300 juta sel per ml didiamkan  selama  satu  jam  di  atas  kolom albumin  bertingkat,  setiap  fraksi  semen  diko- leksi  dan  ditampung  dalam  tabung  sentrifus, kemudian dicuci dengan mengguna-kan medi- um  EBSS  ( Earle  Balance  Salt  Solution) lalu sentrifugasi  pada  kecepatan  1800  rpm selama 10  menit  pada  suhu  26−27 o C.  Fraksi atas diprediksi sebagai sperma X dan fraksi bawah sebagai  sperma  Y.  Penambahan  Pentoksifilin dilakukan sesudah dilakukan pemisahan spermatozoa  dengan  dosis  15  µM/ml,  20 µM/ml  dan  25  µM/ml.  Semen  segar  (tanpa penambahan pentoksifilin sebagai kontrol).
Semen hasil pemisahan (X atau Y) masing- masing diencerkan dengan pengencer tris yang mengandung  20%  kuning  telur  (v/v).  Para- meter  yang  diamati:  persentase  motilitas, persentase  daya  hidup,  persentase  abnor- malitas,  persentase  membran  plasma  utuh (MPU).

## Motilitas
Sampel  semen  diambil    10-15  µl  dengan mikropipet,    diteteskan  pada  obyek  gelas, ditutup  dengan  cover  gelas  (20  x  20  mm). Selanjutnya  diperiksa    di  bawah  mikroskop dengan  pembesaran  400  kali.  Penilaian  dila- kukan  dengan  mengamati  gerakan  progresif yang  dibandingkan  dengan  yang  bergerak mundur,  atau  hanya  berputar  saja  mengikuti metode Garner dan Hafez (2008).

## Viabilitas
Pemeriksaan  spermatozoa  yang  hidup  dan mati  dilakukan  pada  preparat  apus  Sebanyak 10  µl  semen  diletakkan  pada  salah  satu  ujung objek  gelas,  kemudian  ditambahkan    dengan 100  µl  eosin  negrosin,  perlahanlahan  diaduk rata  lalu  dengan  bantuan  glas  slide  dibentuk apus/smear  diatas  glas  slide  pertama  lalu dikeringkan.  Pengamatan  dilakukan  di  bawah mikroskop  dengan  pembesaran  400  kali.
Jumlah Spermatozoa hidup  ditentukan dengan menghitung minimum 200 spermatozoa.

## Morfologi spermatozoa
Preparat  apus  yang  sama  juga  digunakan untuk  pengamatan  morfologi  normal  dan abnormal  seperti  kelainan  kepala,  kelainan leher  dan  bagian  tengan  serta  kelainan  ekor spermatozoa.

## Integritas membran plasma utuh (MPU)
Integritas  membran  spermatozoa  diamati dengan Metode Hipoosmotis Swelling  Test (HOS  Test)  yaitu  evaluasi respon  spermatozoa  (swelling  dan  non swelling)  pada  kondisi  hipoosmotis.  Sperma- tozoa  yang  mempunyai  membran  rusak  atau membran  yang  tidak  aktif  tidak  dapat  menye- suaikan  tekanan  osmosenya  sehingga  tidak meng-gelembung,  sedangkan    membran  yang masih berfungsi terjadi pembengkakan, penggembungan  atau  pembengkokan  ekor spermatozoa.
Analisis Data
Penelitian  ini  menggunakan  Ran-cangan Acak  Kelompok  (RAK)  pola  faktorial  yaitu  2 faktor  utama  (lapis  atas  dan  lapis  bawah), dengan  masing-masing  3  perlakuan  yaitu pemberian  pentoksifilin  3  dosis  (15  μM,  20 μM,  dan  25  μM)  dengan  6  kali  ulangan. Data  hasil  penelitian  berupa  prosentase ditransformasi  arcsin  dianalisis  menggunakan ANOVA  (Steel  dan  Torrie,  1989)  memakai program  komputer  SAS.  Rata-rata  s.e.m. untuk  persentase  progresif  motilitas  dan viabilitas,  morfologi  dan  integritas  membran (HOST),  dibandingkan  dengan  menggunakan Duncan’s Multiple Range Test.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  penilaian  rata-rata  terhadap  berbagai parameter  motilitas,  viabilitas,  morfologi  dan Integritas  membrane  (HOST)  spermatozoa semen sapi Bali demgan penambahan Pentoksifilin  hasil  pemisahan  menggunakan albumin, disajikan pada Tabel 1.
Tabel  1.  Rerata  prosentase  motilitas,  viabilitas,  morfologi  dan  HOST  spermatozoa  sapi  Bali  hasil pemisahan dengan   penambahan berbagai level pentoksifilin
Perlakuan Level pentoksifilin (%) Rerata Kontrol 15 μM 20 μM 25 μM Motilitas atas 67.50 67.50 63.33 68.33 66.67 a Motilitas bawah 55.83 60.83 50.83 62.50 57.50 b Rerata 61.67 ab 64.17 a 57.08 b 65.42 a Viabilitas atas 83.67 79.17 75.17 84.00 80.50 a Viabilitas bawah 69.67 69.67 60.00 71.50 67.71 b Rerata 76.67 a 74.42 a 67.58 a 77.75 a Morfologi atas 5.83 6.17 9.83 5.00 6.71 a Morfologi bawah 18.17 18.83 13.83 13.50 16.08 b Rerata 88.83 a 88.33 a 88.17 a 90.75 a HOST atas 59.42 68.83 64.58 69.61 65.61 a HOST bawah 70.93 74.81 68.63 75.16 72.38 b Rerata 65.17 a 71.82 a 66.60 a 72.38 a ab Superskrip yang berbeda pada kolom dg parameter yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (p < 0.01)
Terlihat  bahwa  hasil  pengamatan  terhadap prosentase  progresif  motilitas  spermatozoa, viabilitas,  morfologi  mau-pun  hasil  HOST
hasil pemisahan menunjukkan perbedaan yang sangat  nyata  lebih  tinggi  antara  lapisan  atas dibanding  lapisan  bawah  (p<0,01)  untuk
semua  parameter  di  atas.  Pada  bagian  atas/ swim up yaitu memisahkan spermatozoa motil dari  ejakulat  dapat  memperbaiki  kualitas semen  sapi  Bali  (Yuliani,  2000).  Teknik tersebut  dapat  dipakai  untuk  seleksi  beberapa fungsi  normal  dan  untuk  memperbaiki  ke- mampuan  fungsional  sperma  yang  menurun. Spermatozoa  yang  berada  pada  lapisan  atas setelah  inkubasi  mempunyai  populasi  sperma motil  yang  dapat  diisolasi  (Yuliani  dan Lukman,2012).  Pada  fraksi  ini  kaya  akan spermatozoa  Y  yang  mempunyai  kemampuan bermigrasi  lebih  cepat  dibandingkan  dengan spermatozoa  X  pada  lapisan  bawah  hasil sentrifugasi  yang  cendrung  lebih  cepat  mem- bentuk endapan. Spermatozoa  Y (lapisan atas) lebih   ringan  dan   lebih  ramping   dari  pada spermatozoa  berkromosom  X  (lapis  bawah), sehingga  sangat  memungkinkan  daya  migra- sinya akan lebih cepat ke atas permu-kaan atau migrasi  ke  samping  (Jonson,  1999).  Preparasi spermatozoa  dengan  metode  swim  up  digu- nakan  untuk  memperoleh  sperma  dengan motilitas  baik  dan  memungkinkan  sperma- tozoa  yang  lebih  motil  dapat  bermigrasi  ke luar  plasma  sperma  masuk  dalam  medium pencuci. Hasil yang diperoleh adalah mening- katnya  angka  motilitas,  prosentase  sprerma hidup,  konsentrasi  spermatozoa  dan  memini- malkan  kerusakan  mekanik.  Komponen- komponen  pada  lapisan  bawah  kemungkinan masih  tercampur  dengan  cairan  seminal  dan tidak  se-muanya  dapat  melindungi  dan  mem- pertahankan motilitas dan viabilitas spermato- zoa,  melainkan  juga  mempunyai  pengaruh negatif terhadap spermatozoa sehingga dipero- leh  hasil  yang  lebih  rendah  dibanding  dengan lapisan  atas.  Teknik  preparasi  spermatozoa pada  lapisan  atas  mempunyai  keuntungan dapat  terhindar  dari  terjadinya  kontaminasi oleh  bakteri  atau  toksin  yang  terdapat  dalam plasma.
Progresif  motilitas  spermatozoa  sapi  bali yang  diberi  penambahan  pentoksifilin  dengan level  yang  berbeda  didapatkan  hasil  berbeda nyata    (p<0,05)  yaitu  antara  level  25  μM,  15 μM,    dengan  20  μM  .  Sedangkan  antara  25 μM, 15 μM  dan kontrol (tanpa pentoksifilin) tidak  berbeda  nyata  (p>0,05).  Pada  hasil pemisahan  fraksi  atas  didapat  rata-rata
progresif  motilitas  spermatozoa  66,67%, sedangkan  pada  fraksi  bawah  rata-rata 57,50%.  Perlakuan penambahan pentok-sifilin dengan  level  15-25  μM  pada  fraksi  atas menunjukkan nilai kisaran  diatas 63% dengan nilai  tertinggi  di  dapati  pada  level  Pentok- sifilin 25 μM (68,33%). Sedangkan pada lapis bawah  didapat  progresif  motilitas  tertinggi diatas 50,83% dengan nilai tertinggi pada level 25 μM (62,50%). Menurut Sumadiase (1999), bahwa  penambahan  pentoksifilin  dapat  me- ningkatkan motilitas secara sangat nyata, yaitu 10-28 % pada perlakuan setelah simpan dingin dan  masa  aktif  spermatozoa  meningkat  12-45 menit pada perlakuan sebelum simpan dingin. Methylxanthines  yang  terdapat  dalam  pentok- sifilin  dapat  menghambat  phosphodiestrase enzim,  sehingga  cenderung  meningkat-kan konsentrasi AMP siklik (Arsyad, 1981). Selain itu  methilxanthin  dapat  mengurangi  produksi anion  superoksidase  yaitu  salah  satu  generasi dari  reactive  oxygen  species  (ROS).  Dalam konsentrasi  normal  sekitar  85-90  %  oksigen diperlukan  oleh  mitokondria  untuk  mengha- silkan  energy  dalam  bentuk  ATP  melalui fosforilasi  oksidatif  dan  sekitar  3-5  %  dari oksidan  tersebut  direduksi  secara  univalent menjadi  ROS  (Halliwell  dan  Gutteridge, 1999).  Mustofa  (2002)  mengata-kan,  bahwa dengan penambahan pentoksifilin dapat meningkatkan  prosentase  sperma-tozoa  motil pada  normozoospermia  dari  48,83%  menjadi 55,5%  dan  dari  29,5% menjadi  39,33  % pada astenozoospermia.  Mekanisme  stimulasi  pen- toksifilin  terhadap  motilitas  dan  masa  aktif spermatozoa  adalah  dengan  cara  menghambat aktivitas fosfodiesterasi untuk meme-cah siklis adenosin  monofosfat  (c-AMP)  menjadi  5’- AMP. Influk ion Ca ++ ekstraseluler menstimulir  adenilat  siklase  terikat  membran untuk  memproduksi  c-AMP  sehingga  terjadi peningkatan  konsentrasi  c-AMP  intraseluler (Wang et al ., 1993; Pang et al ., 1993; Mbizvo, 1993).  Selanjutnya  c-AMP  bersama-sama dengan ion Ca ++ merupakan regulator pergerakan spermatozoa (Mbizvo, 1993).
Demikian juga jumlah spermatozoa hidup (viabilitas ) memberikan  hasil  yang  berbeda nyata  (P<0,05)  antara  lapisan  atas  dengan lapisan  bawah  namun  tidak  berbeda  nyata
(P>0,05)  antara  level  perlakuan  penambahan Pentoksifilin.  Hasil  ini  diduga  disebabkan adanya  reaksi  positif  antara  bahan  pengencer dengan  Pentoksifilin  yang  memiliki  reaksi yang  tidak  begitu  berbeda  dalam  memperta- hankan  viabilitas  spermatozoa.  Hasil  yang diperoleh berkisar  antara 75,17% sampai 84% untuk  konsentrasi  Pentoksifilin  15  -  25  μM. Jumlah spermatozoa hidup didalam pengencer yang mengandung Pentoksifilin 25 μM (84%) memberikan  hasil  yang  terbaik    dibanding kontrol (83,67%) maupun pada level Pentoksifilin  15  μM  (79,175)  dan  20  μM (75,17%)  untuk  spermatozoa  pada  lapisan atas,    sedangkan    pada  lapisan    bawah berturut-turut  dari  nilai  tertinggi  sampai terendah  didapat  pada  25  μM  (71,50%),  15 μM  (69,67%),  kontrol  (69,67  %)  dan  20  μM (60,00%).  Penambahan  pentoksifilin  berhu- bungan dengan kemampuan antioksidan dalam menangkap  senyawa  oksigen  aktif  yang dihasilkan  oleh  spermatozoa  mati,  memutus reaksi  peroksida  dengan  cara  memutus  ion hydrogen bersama elektronnya .
Kelainan  yang  terjadi  pada  spermatozoa merupakan  penyimpangan  morfologi  dari kerangka  normal  spermatozoa.  Kelainan  ini berpengaruh terhadap fertilitas, sehingga dapat dijadikan ukuran kualitas spermatozoa.
Menurut Bearden dan Fuquay (1980), mening- katnya  jumlah spermatozoa abnormal menye- babkan progresif motilitas menurun. Tidak ada perbedaan  yang  nyata  antara  level  pentoksi- filin  namun  ada  perbedaan  yang  nyata  antara spermatozoa  lapisan  atas  (6,71%)  dan  lapisan bawah  (16,08%).  Secara  umum  prosentase abnormalitas  pada  keempat  perlakuan  masih tergolong  rendah  dan  masih  dalamm  kisaran normal,  karena  masih  di  bawah  20%.  Hasil tersebut  sesuai  dengan  pendapat  Toelehere (1981),  bahwa  kelainan  morfologi  di  bawah 20% masih dianggap normal.
Hasil  pengamatan  terhadap  keutuhan membrane  plasma  spermatozoa  dengan  meto- de hypoosmotic swelling test (HOST ) menunjukkan, bahwa pengaruh level Pentoksi- filin  terhadap  prosentase  spermatozoa  yang menunjukkan ekor menggelembung (swelling) tidak  ada  perbedaan  (p>0,05),  namun  penga- ruh  pemisahan  spermatozoa  terhadap  uji
HOST terdapat perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan  nilai  tertinggi  pada    lapisan  bawah  ( 72,38%)  dibanding  lapisan  atas  (65,61%). Menurut  Rizal  dan  Herdis  (2008),  bahwa spermatozoa yang menunjukkan ekor mengge- lembung  dan  melingkar  akibat  dari  uji  HOST mengindikasikan  bahwa  spermatozoa  dalam keadaan  baik.  Hal  ini  disebabkan  membrane plasmanya  masih  utuh.  Sebaliknya  pada spermatozoa  yang  menunjukkan  gambaran ekor  yang  lurus  adalah  pertanda  spermatozoa tersebut  keadaanya  tidak  baik  (rusak).  Hal  ini disebabkan oleh  spermatozoa yang terexposur di dalam larutan dengan tekanan osmotic yang rendah  akan  mengakibatkan  molekul  air masuk  ke  sel  untuk  menyeimbangkan  perbe- daan  tekanan  osmotic intra  dan  ekstra  seluler. Pada  spermatozoa  yang membrane plasmanya utuh,  air  yang  masuk,  akan  tertahan  di  dalam sel,  sampai  batas  waktu  tertentu.  Ini  menye- babkan  meningkatnya  tekanan  mekanik  di dalam  sel  sehingga  mengakibatkan  ekor menggembung,  sementara  jika  menbran  plas- ma sel sudah rusak (bocor), air yang masuk ke sel  akan  keluar  kembali  dan  tidak  menyebab- kan peningkatan tekanan mekanik di dalam sel sehingga ekor tetap dalam keadaan lurus.

## SIMPULAN
Penambahan  Pentoksifilin  dengan  level 25μM    memberikan  hasil  yang  lebih  baik dibanding  penambahan  15  μM,  20  μM maupun  tanpa  penambahan  pentoksifilin (kontrol)  pada  seluruh  parameter  (motilitas, viabilitas,  morfologi  dan    membrane  plasma utuh) spermatozoa
Dari  hasil  pemisahan  spermatozoa  dengan albumin didapat lapisan atas memberikan hasil terbaik  kecuali  pada  membrane  plasma  utuh dengan  rata-rata  angka    motilitas  (66,67%), viabilitas  (80,50%),  morfologi  (6,71%)  dan HOST (65,61%).

## DAFTAR PUSTAKA
Arsyad, K.M. 1981. Spermatogenesis. Prosiding  Seminar.  Penerbit  Pengurus Besar  Perkumpulan  Andrologi    Indonesia (PANDI), Surabaya.
Bearden, J.H. and W.J. Fuquay.1980. Applied animal  Reproduction.  Missisippi  State

## University. Resto publishing Company, Inc
A Prentice Hall Company Reston Virginia. Daniel,  C.,  L.  Denise,  and    G.  Jean.  1996.
Nuclear  maturity  of  human  spermatozoa selected  by  swim–up  or  by  percol  gradient centrifugation  procedures.  Fertility  and Sterility, 65(1)160-164.
Garner,  D.L.  and  E.S.E.  Hafez.  2000.
Spermatozoa and Seminal Plasma  In:Hafez B E.S.E. Hafez (ed). Reproduction in Farm Animal.  7  th  ed  Philadelphia  (US);
Lippincot    Willi-ams  and  Wilkins.  P.  96- 109.
Hafez,  E.S.E.  1987.  Reroduction  in  Farm
Animal.  Hafes  E.S.E.  and  5  th  ed  Lea  & Febiger, Philadelphia.
Kay,  V.J.,  J.R.  Coutts,  and    L.  Robertson.
1994. Effect of pentoxifylline and progersteron  on  human  sperm  capacitation and acrosom reaction. Human
Reproduction  9(12):2318-2323. Malmgre, L. and H.R. Martinez. 1996. Change in  sperm  motility  and  plasma  membran integrity  in  equine  spermatozoa  after storage under different conditions. Presented by 13 th international congress on animal  reproduction  poster  session.  pp  24- 26.
Mbizvo,  M.T.,  R.C.  Johnson,  and  G.H.W.
Baker.  1993.  The  effects  of  the  motility stimulants,  cafein,  pentoxifyllin,  and  2- deoxiadenosine  on  hyperactivation  of cryopreserved  human  sperm.  Fertility  and Sterility,  59 :1112 -1117.
Mustofa,  M.S.2002.  In  Vitro  Effect  of  the Administration of Pentoxifylline on
Activating  Factor  the  ATPase  Activity  of semen of Normozoospermia
and Astenozoospermia. Department of Biology, Yarsi  University  School  of  Medicine.
Jakarta
Pang, S.C., P.J.Chan, and A. Lu .1993. Effects of  fentoxifyllin  on  sperm  motility  and hyperactivation  in  normozoospermic  and normokinetic  semen.  Fertility  and  Sterility 60: 336 -343
Pedersen,  J.A  and  D.W.  Fawcet.  1976. Functional anatomy of human spermatozoa in  Hafez  E.S.E  eds.  Human  semen  and
fertility regulation in Man St Louis The CV Mosby, 65-74.
Sikka  S.C.  and  Hellstrom.  1990.  Functional evaluation  and  motility  parameters  of pentoxifylline  stimu-lated  cryopreserved human sperm. Arta 1 :309-319.
Soderquist  L,  Madrid-Bury  N,  Rodriques- Martinez  H.  1997.  Asses-ment  of  ram sperm membran integrity following different-thawing  procedures.  Theriogeno- logy. Vol 48. No 7, pp 115-1126.
Steel,  R.G.D.  dan  J.H.  Torrie.  1989.  Prinsip dan Prosedur Statistika (Terjemahan), Edisi Kedua, Penerbit P.T Gramedia, Jakarta.
Sumadiasa,  L.  1999.  Peran  Pentoksifilin  dan atau vitamin E terhadap Motilitas dan Masa Aktif  Spermatozoa  Kambing  PE  sebelum dan  setelah  simpan  dingin  dan  simpan Beku.  Theseis.  Universitas  Airlangga Surabaya.
Tournaye, H. 1994. The effect of pentoxifylline  on  sperm  function  and embryonic  development  and  its  use  in  the treatment  of  male-factor  infertility.  Thesis. Vrije Universiteit Brussel, Belgium.
Wang,  R.,  S.C.  Sikka,  K.  Veeraragavan,  M. Bell,  and  W.J.G.  Hellstorm.  1993.  Platelet activating  factor  and  pentoxifylline  as human  sperm  cryopretectans.  Fertility  and Sterility.  60:711–715.
Windsor,  D.  P.,  G.  Evans,  and  I.G.  White,
1993.  Sex  predetermination  by  separation of X and Y chromosome-bearing sperm:  A Review.    Reproduction,  Fertility  and Development 5: 155-171.
Yovic, J.L. 1993.  Pentoxyfylline : Action  and aplication  in  assisted  reproduction.  Human reproduction  8: 1786-1791.
Yuliani,  E.  2000.    Pemisahan  spermatozoa dengan  metode  Swim  up  dan  kombinasi Swim up dengan Aside migration pengaruhnya terhadap rasio kromosom seks (Studi  eksperimental  untuk  menghasilkan embrio  sapi  Bali  jantan).  (Disertasi).
Program Pasca sarjana Universitas Airlangga. Surabaya. Yuliani, E., A. Eddy, dan HY. Lukman. 2012. Skim Penelitian Prioritas Nasional Masterplan Percepatan dalam Mewujudkan Nusa  Tenggara  Barat  Bumi  Sejuta  Sapi

## (NTB-BSS).  2011.  Laporan  Penelitian
Perluasan Pembangunan Ekonomi Indonesia 2011-2025 (PENPRINAS
MP3EI 2011-2025)