## ANTIBACTERIAL ACTIVITY TEST OF Theonella swinhoei EXTRACTS AGAINST THE GROWTH OF Escherichia coli AND Staphylococcus aureus BACTERIA
UJI AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL SPONS Theonella swinhoei TERHADAP PERTUMBUHAN BAKTERI Escherichia coli DAN Staphylococus aureus
Kevin R. Mengko 1)* , Defny S. Wewengkang 1) , Erladys M. Rumondor 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
* kevvinmengko@gmail.com

## ABSTRACT
Sponges  are  one  of  the  components  that  compose  coral  reef  which  have  a  potential  bioactive substance that has not been utilized. This test attempts to to know the antibacterial compound activity of  sponges  Theonella  swinhoei  extracts  against  the  bacterial  growth  of  Escherichia  coli  and Staphylococcus aureus. Maceration method is used for this extraction using 95% ethanol as solvent. The  antibacterial  activity  is  tested  using  the  disk  diffusion  agar  method  kirby-bauer.  The  results against Staphylococcus aureus is 12,99 mm, 12,98 mm and 12,28 mm. Escherichia coli is 11,83 mm, 11,79 mm and 11,53 mm. The results showed that the extract is effective in inhibiting the bacterias and categorized strong against both bacterias.
Keywords : Theonella swinhoei, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Extraction, Antibacterial

## ABSTRAK
Spons  merupakan  satu  biota  laut  penyusun  terumbu  karang  yang  mempunyai  potensi  bioaktif  yang belum banyak dimanfaatkan. Penelitian ini bertujuan untuk untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari ekstrak  spons Theonellala swinhoei terhadap pertumbuhan  bakteri Eschercia  coli dan Staphylococus aureus . Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 95%. Pengujian  aktivitas  antibakteri  menggunakan  metode disc  diffusion  kirby-bauer .  Hasil  yang  didapat dari  pengujian  aktivitas  antibakteri  terhadap  bakteri Staphyloccous  aureus adalah  12,99  mm,  12,98 mm dan 12,28 mm dan Escherichia coli adalah sebesar 11,83 mm, 11,79 mm dan 11,53 mm.  Hasil uji menunjukan bahwa ekstrak tergolong kuat dalam aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji.
Kata Kunci : T heonella swinhoei, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Ekstraksi, Antibakteri
PENDAHULUAN
Spons merupakan salah satu komponen  biota  penyusun  terumbu  karang yang  mempunyai  potensi  bioaktif  yang  belum banyak dimanfaatkan. Hewan laut ini mengandung  senyawa  aktif  yang  persentase keaktifannya lebih besar dibandingkan  dengan senyawa-senyawa yang dihasilkan oleh tumbuhan  darat.  Jumlah  senyawa  hasil  isolasi dari  spons  laut  sebanyak  3500  jenis  senyawa dari  475  spesies  yang  berasal  dari  dua  kelas, yaitu  Calcarea  dan  Demospongiae.  Ekstrak metabolit  dari  spons  mengandung  senyawa bioaktif  yang  diketahui  mempunyai  sifat aktifitas  seperti:  sitotoksik  dan  antitumor, antivirus, anti HIV dan antiinflamasi, antifungi, antibakteri, dan penghambat aktivitas enzim (Suparno, 2005).
Antibakteri diperlukan untuk mengobati  infeksi  yang  disebabkan  oleh bakteri.  Contoh  beberapa  bakteri  yang  dapat menyebabkan infeksi
diantaranya
Staphylococus  aureus dan Escherichia  coli . Staphylococcus  aureus merupakan  penyebab infeksi  piogenik  (menghasilkan  pus)  pada manusia. Staphylococcus aureus dapat menyebabkan  sepsis  pada  luka  bedah,  abses payudara  pada  ibu-ibu,  mata  lengket  dan  lesi- lesi kulit pada bayi (Gibson, 1996). Menanggapi  permasalahan  di  atas,  maka penelitian  ini  dilakukan  untuk  menguji aktivitas antibakteri spons Theonellala swinhoei terhadap  bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli .

## METODOLOGI PENELITIAN
Bentuk Penelitian
Bentuk penelitian ini ialah eksperimental laboratorium yang akan menguji aktivitas antimikroba ekstrak Theonella swinhoei yang diperoleh dari Teluk Manado.

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober  2020  -  April  2021  di  Laboratorium Farmakognosi  dan  Fitokimia  Program  Studi Farmasi  Fakultas  Matemarika  dan  Ilmu Pengetahuan  Alam  Universitas  sam  Ratulangi dan Laboratorium Mikrobiologi Program Studi Farmasi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam Universitas sam Ratulangi.

## Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu  masker,  sarung  tangan,  gunting,
tabung oksigen, snorkel, fins, zipper lock bag , botol  600  ml,  talenan, cool  box ,  pisau, Erlenmeyer (Pyrex), corong, rotary evaporator, timbangan  analitik,  corong  pisah, gelas  ukur,  gelas  kimia  (Pyrex),  cawan  petri, autoklaf,  pinset,  pembakar  spritus, magnetic stirrer ,  pipet  tetes, micro  tubes , hot plate, batang pengaduk, Laminar air flow, rak tabung reaksi,  tabung  reaksi,  lemari  pendingin, inkubator,  cakram  ( paper  disc) ,  mikropipet, mistar  berskala,  kertas  label  dan  spidol permanen.

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  yaitu spons Theonella swinhoei bakteri uji Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli , etanol,  akuades,  n-heksan,  kloroform , pepton, natrium  klorida , media agar  B1  ( beef extract ), agar,  kloramfenikol, paper  disc , tissue, aluminium foil , kertas saring.

## Preparasi Sampel
Sampel  spons Theonella  swinhoei diperoleh dari perairan Teluk Manado Sulawesi  Utara.  Sampel  diambil  dengan menggunakan alat bantu (masker, snorkel, fins, tabung  oksigen,  ziplok  dan  pisau),  kemudian dimasukkan  dalam  ziplok  dan  diberikan  label. Sampel yang telah didapat langsung dibersihkan dari pengotor, lalu dipotong kecil- kecil dan langsung dimasukkan kedalam botol yang  berisi  pelarut  etanol  95%.  Botol  sampel dimasukkan  kedalam  kotak  dingin  ( cool  box ) yang berisi es batu dan tidak terkena matahari secara  langsung,  di  laboratorium  sampel tersebut  diekstraksi  menggunakan  metode maserasi.
Ekstraksi Sampel direndam dengan
menggunakan  larutan  etanol  95%.  Metode ekstraksi  dilakukan  dengan  cara  merendam sampel  dengan  pelarut  selama  3  kali  24  jam pada  temperatur  kamar  yang  dilindungi  dari cahaya  dan  sesekali  dikocok,  kemudian diambil  filtratnya  dan  residu  dibuang  dan menghasilkan 3 filtrat yang kemudian dicampur  menjadi  satu.  Lalu  dievaporasi menggunakan rotary evaporator hingga kering yang  terbentuk  ekstrak  kasar  selanjutnya ditimbang  dengan  timbangan  analitik  (Ortez, 2005).

## Sterilisasi Alat
Alat-alat  gelas  yang  digunakan  dalam penelitian  aktivitas  antimikroba  ini  disterilkan terlebih  dahulu  dengan  menggunakan  autoklaf pada  suhu  121  ºC  selama  15  menit,  pinset dibakar  dengan  pembakaran  di  atas  api langsung  dan  media  disterilkan  di  autoklaf pada  suhu  121  ºC  selama  15  menit  (Ortez, 2005).

## Pembuatan Media Cair
Pepton  0,5  g,  ekstrak  daging  ( meat extract )  0,3  g,  natrium  klorida  0,3  g  dan aquades  sebanyak  100  mL  diaduk  sampai  rata kemudian  dibuat  homogen  menggunakan magnetic stirrer lalu diautoklaf pada suhu 121 ˚C  selama  15  menit,  ukur  pH  dengan menggunakan  kertas  pH.  Dipipet  1  mL  media cair  B1,  kemudian  masukkan  dalam  tabung reaksi  dan  tutup  dengan  alminium  foil.  Media cair  B1  siap  digunakan  sebagai  media  kultur bakteri (Ortez, 2005).

## Kultur Bakteri Uji
Media  cair  yang  sudah  disiapkan sebelumnya,  ditambahkan  dengan  masing- masing bakteri yang sudah dikultur ( Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli ) dipipet  sebanyak  100  µL  kedalam  tabung reaksi  yang  berbeda,  tutup  dengan  aluminium foil  tiap  tabung  reaksi  dan  dimasukkan kedalam inkubator selama 1x24 jam pada suhu 37 ˚C (Ortez, 2005).

## Pembuatan Media Agar B1
Pepton  0,5  g,  ekstrak  daging  ( meat extract )  0,3  g,  natrium  klorida  0,3  g,  nutrien agar 1,5  g  dan  aquades  sebanyak  100  mL diaduk  sampai  rata  kemudian  dibuat  homogen menggunakan magnetic  stirrer lalu  diautoklaf pada suhu 121 ˚C selama 15 menit. Pengujian pH  dilakukan  dengan  kertas  pH.  Media  agar B1  siap  digunakan  untuk  uji  aktivitas antibakteri (Ortez, 2005).

## Kontrol Positif dan Kontrol Negatif
Kontrol positif dalam pengujian antibakteri  ini  menggunakan  kloramfenikol paper  disc. Kontrol  negatif  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  yaitu  menggunakan pelarut  etanol,  dengan  cara  membuat  larutan stok  etanol  dengan  mengambil  sebanyak  200 µL  etanol  kemudian  ditotolkan  pada  kertas cakram (Silap dkk ., 2020).

## Pembuatan Media Agar B1
Pepton  0,5  g,  ekstrak  daging  ( meat extract )  0,3  g,  natrium  klorida  0,3  g,  nutrien agar 1,5  g  dan  aquades  sebanyak  100  mL diaduk  sampai  rata  kemudian  dibuat  homogen menggunakan magnetic  stirrer lalu  diautoklaf pada suhu 121 ˚C selama 15 menit. Pengujian pH  dengan  kertas  pH  dilakukan.  Media  agar B1  siap  digunakan  untuk  uji  aktivitas antibakteri (Ortez, 2005).

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Metode  yang  akan  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  metode  difusi  agar  (disc diffusion  Kirby and  Bauer). Pengujian aktivitas  antibakteri  ini  memerlukan  cakram ( paper  disc )  yang  digunakan  berukuran  6  mm dengan daya serap 50 µL tiap cakram. Sampel yang  telah  ditentukan  kosentrasinya  (250 µg/50  µL)  ditotolkan  pada  masing-masing cakram  dengan  menggunakan  mikropipet. Media  agar  B1  yang  sudah  diautoklaf  pada suhu  121  ˚C  selama  15  menit,  kemudian dinginkan sampai suhu 40 ˚C. Tuangkan media agar  B1  ke  cawan  petri,  ambil  sebanyak  100 µL  bakteri  yang  telah  di  kultur  dalam  tabung reaksi, dipipet dan diinokulasi pada media agar B1  dan  tunggu  sampai  media  agar  B1 mengeras.  Masing-masing  cawan  petri  diberi label  dan  nomor  sampel  yang  sesuai.  Kertas cakram yang telah ditotolkan sampel uji spons Theonella  swinhoei dengan  pinset  diletakan kedalam  cawan  petri  lalu  diinkubasi  selama 1x24 jam (Ortez, 2005).

## Pengamatan dan Pengukuran
Pengamatan  dapat  dilakukan  setelah 1x24  jam  masa  inkubasi.  Daerah  pada sekitaran  cakram  menunjukkan  kepekaan bakteri    terhadap  antibiotik  atau  bahan antibakteri  yang  digunakan  sebagai  bahan  uji yang  dinyatakan  dengan  diameter  zona hambat.  Diameter  zona  hambat  diukur  dalam satuan  millimeter  (mm)  menggunakkan  mistar berskala  dengan  cara  diukur  diameter  total zona  bening  cakram.  Diameter  zona  hambat tersebut  kemudian  dikategorikan  kekuatan daya antibakterinya (Davis and Stout, 1971).

## HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi
Sampel  spons  T heonella  swinhoei yang  diambil  dari  perairan  Teluk  Manado, dipotong  kecil-kecil,  setelah  itu  di  masukkan ke  dalam  wadah,  hal  ini  bertujuan  untuk
memperluas  permukaan  yang  berinteraksi dengan pelarut sehingga lebih banyak senyawa yang  dapat  ditarik  oleh  pelarut.  Untuk mendapatkan  penyarian  yang  maksimal,  agar senyawa  kimia  di  dalam  sampel  dapat terekstrak  secara  menyeluruh  maka  dilakukan remaserasi atau pengulangan dengan pergantian pelarut selama tiga kali menggunakan  pelarut  etanol.  Proses  ekstraksi sampel  spons menggunakan  larutan  etanol 95%,  pemilihan  pelarut  merupakan  salah  satu faktor  yang  menentukan  keberhasilan  proses ekstraksi.  Pelarut  yang  digunakan  dalam proses  ekstraksi  adalah  pelarut  polar  yaitu etanol,  selain  bersifat  polar  etanol  juga memiliki  gugus  C 2 H 5 yang  relatif  berperan sebagai  senyawa  non  polar.  Sifat  dan  gugus tersebut membuat etanol hampir dapat melarutkan  semua  produk  metabolit  sekunder dan  pelarut  etanol  yang  bersifat  selektif,  tidak beracun,  dan  bersifat  universal  yang  cocok untuk  mengekstrak  semua  golongan  senyawa metabolit sekunder (Kristanti et al ., 2008).
Filtrat  hasil  maserasi  didapat  setelah itu  kemudian  dilakukan  teknik  evaporasi  atau penguapan dengan menggunakan rotary evaporator .  Penggunaan rotary evaporator ini bertujuan  untuk  menguapkan  pelarut  dan memperoleh  senyawa  hasil  ekstraksi  yang diinginkan. Suhu yang digunakan dalam proses ini  adalah  37°C  dengan  tujuan  agar  tidak merusak  senyawa  bioaktif  yang  terdapat  pada filtrat  apabila  menggunakan  suhu  yang  tinggi. Hasil  dari  proses  ini  adalah  mendapat  ekstrak kasar dari pelarut (Aditya et al ., 2016).

## Pengujian Aktivitas Bakteri
Pengujian aktivitas senyawa
antimikroba  dari  ekstrak  etanol,  dari  spons
Theonella swinhoei diuji
terhadap Staphylococcus  aureus yang  mewakili  gram positif, Escherichia coli mewakili gram negatif dengan  menggunakan  metode  difusi  agar. Metode  difusi  agar  dipilih  karena  memiliki kelebihan dapat digunakan untuk senyawa non polar,  cepat,  mudah  dan  sederhana.  Metode difusi  agar  ini  dilakukan  dengan  cara  kertas cakram  yang  berisi  senyawa  antimikroba, kemudian  diletakkan  pada  media  padat  yang telah diinokulasi mikroba. Senyawa antimikroba  akan  berdifusi  ke  dalam  media padat yang diinokulasi mikroba dan menghambat  pertumbuhan  mikroba  yang ditandai  dengan  terbentuknya  daerah  jernih  di sekeliling kertas cakram (Brooks et al ., 2005).
Penggunaan  mikroba  uji  ini  bertujuan  untuk mengetahui  bahwa  apakah  ekstrak  dari Theonella  swinhoei ini  dapat  berasosiasi memiliki  aktivitas  sebagai  antimikroba,  serta apakah  mempunyai  spektrum  luas  yaitu  dapat membunuh  bakteri  gram  positif  dan    bakteri gram  negatif,  atau  mempunyai  spektrum sempit yaitu hanya dapat membunuh salah satu dari  bakteri  Gram  positif  atau  Gram  negatif. Uji  aktivitas  antimikroba  ini  diperoleh  hasil melalui  pengamatan  yang  dilakukan  selama 1x24  jam  masa  inkubasi  dengan  3  kali pengulangan  untuk  masing-masing  bakteri terhadap spons Theonella swinhoei .
Pengulangan  ini  dilakukan  untuk  lebih mengakuratkan  hasil  yang  akan  diperoleh. Terbentuknya  zona  hambat  (daerah  bening) disekeliling  cakram  berukuran  ±  6  mm  (paper disk) menunjukkan kepekaan mikroba terhadap  bahan  antimikroba  atau  antibiotik yang digunakan sebagai positif kontrol (Valgas et al ., 2007).
Kontrol  positif  dan  kontrol  negatif digunakan dalam penelitian ini. Kontrol positif berfungsi  sebagai  kontrol  dari  zat  uji,  dengan membandingkan diameter daerah hambat yang terbentuk.  Kontrol  negatif  pada  penelitian  ini menggunakan  etanol.  Kontrol  positif  yang digunakan pada penelitian ini adalah kloramfenikol. Kloramfenikol merupakan antibiotik bakteriostatik berspektrum luas yang aktif  terhadap  mikroorganisme  aerobik  dan anaerobik,  bakteri  gram  positif  maupun negatif. Kloramfenikol aktif terhadap Escherichia coli , Staphylococcus aureus (Noviana, 2004).
Tabel 1. Standar Kekuatan Daya Antimikroba Menurut Davis dan Stout (1971) Diameter Zona Bening (mm)        Kategori
>20 Sangat kuat 10 - 20 Kuat 5 - 10 Sedang <5 Lemah
Tabel 2. Hasil diameter daya antimikroba.
Bakteri    Ulangan (mm)     Kontrol (mm)
( + )          ( - ) I 11,83 II 11,79          34,55         - E. coli III       11, 53 I 12,99 II 12,98          37,65 - S. aureus III 12,28
Diameter  zona  hambat  dari  kontrol positif kedua bakteri uji lebih besar dibandingkan  dengan  ekstrak  dan  kontrol negatif.  Diameter  zona  hambat  dari  bakteri Escherichia  coli yaitu  sebesar  34,55  mm  dan bakteri Staphylococcus  aureus sebesar  37,65 mm. Untuk kontrol negatif tidak memperlihatkan  adanya  daya  hambat  untuk kedua  mikroba  uji.  Hal  ini  mengindikasikan bahwa kontrol yang digunakan tidak berpengaruh  pada  uji  antimikroba,  sehingga daya hambat yang terbentuk tidak dipengaruhi oleh  pelarut  melainkan  karena  aktivitas senyawa  yang  ada  pada  spons Theonella swinhoei .
Kontrol negatif berfungsi untuk memperlihatkan  apakah  metanol  berpengaruh pada  ekstrak  atau  tidak.  Kontrol  negatif menunjukkan  perbedaan  terhadap  ekstrak sampel uji. Kontrol negatif tidak menunjukkan adanya  zona  hambat  pada  skrining  antibakteri terhadap  bakteri Escherichia  coli dan  bakteri Staphylococcus  aureus. Ini  mengindikasikan bahwa  kontrol  negatif  tidak  berpengaruh  pada skrining antibakteri beberapa ekstrak spons.
Kriteria  pada  tabel  1  adalah  kriteria yang  di  gunakan  dalam  penelitian  untuk menggolongkan  daya  hambat  kontrol  dan bahan  uji  sampel  ekstrak.  Maka  hasil  yang didapatkan menunjukkan bahwa diameter zona bening yang terbentuk pada bakteri Escherichia  coli yaitu  11,83  mm,  11,79  mm dan  11,53  mm,  tergolong  kategori  kuat, sedangkan pada bakteri Staphylococcus aureus yaitu  12,99  mm,  12,98  mm  dan  12,28  mm tergolong  kategori  kuat.  Hal  ini  menunjukkan bahwa ekstrak etanol spons Theonella swinhoei memiliki  daya  hambat  yang  lebih peka  pada  bakteri  gram  positif  dibandingkan gram negatif.
Hasil yang berbeda disebabkan karena kemampuan  setiap  bakteri  dalam  melawan aktivitas  antibakteri  berbeda-beda  bergantung ketebalan  dan  komposisi  dinding  selnya. Bakteri gram negatif mengandung lipid, lemak atau  substansi  seperti  lemak  dalam  persentasi lebih  tinggi  dari  pada  yang  dikandung  bakteri gram  positif.  Dinding  sel  bakteri  gram  negatif lebih  tipis  dibanding  bakteri    gram  positif. Struktur  bakteri  gram  negatif  memiliki membran  lapisan  luar  yang  menyelimuti lapisan  tipis  peptidoglikan,  struktur  luar peptidoglikan  ini  adalah  lapisan  ganda  yang mengandung fosfolifid, protein dan lipopolisakarida. Lipopolisakarida terletak
pada  lapisan  luar  dan  merupakan  karakteristik bakteri  gram  negatif  .  Sementara  sel  bakteri gram  positif  memiliki  dinding  sel  yang  terdiri atas  lapisan  peptidoglikan  yang  tebal  dimana di dalamnya mengandung senyawa teikoat dan lipoteikoat  (Pelczar,  1986).  Penelitian  ini menunjukkan  adanya  bioaktivitas  ekstrak spons Theonella  swinhoei yang  berpotensi membunuh bakteri.

## KESIMPULAN
Ekstrak  etanol  Spons Theonellala swinhoei    memiliki  aktivitas anti bakteri terhadapa  bakteri Eschericia  coli dan Staphylococus  aureus dengan  daya  hambat yang dikategorikan kuat.

## SARAN
Perlu di lakukan penelitian lebih lanjut untuk  mengetahui  senyawa  yang  terkandung dalam  Spons Theonella swinhoei yang mungkin bisa di gunakan dalam bidang medis.

## DAFTAR PUSTAKA
Aditya,  A.,  A.  Trianto  &  Santoso,  A.  2016. Eksplorasi Jamur Simbion Pada Spons Demospongiae  yang  Dikoleksi  dari Perairan  Kupang  Penghasil  Bahan
Antimikroba Multidrug Resistent (MDR). Jurnal ilmu Kelautan.
Universitas Diponegoro . 5 : 511-518.
Brooks,  G.  L., J.S.  Butel &  S.A  Morse.  2005. Mikrobiologi  Kedokteran  Ed.  23, Translation  of  Medical  Microbiology, 23th  Ed.  Alih  Bahasa  oleh  Hartanto, Salemba  Medika,  Jakarta.  Davis,  W. W.,  T.R.  Stout.  1971.  Disc  plate method  of  microbiological  assay. Journal of microbiology. 22 : 659-665.
Gibson, J.M. 1996, Mikrobiologi dan Patologi Modern  Untuk  perawatan .  Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Kristanti, A. N., N.S. Aminah., M. Tanjung &
B. Kurniadi. 2008. Buku Ajar Fitokimia . Unair Press, Surabaya.
Noviana,  H.  2004.  Isolasi  Salmonella  typhi dari  Penderita  Demam  Tifoid, Jurnal Kedokteran Yarsi. 12 : 54-60.
Ortez,  J.  H.  2005. Disk  Diffusion  testing  in manual  of  antimicrobial  susceptibility testing . Marie B.
Pelczar,  M.J.  &  E.C.S.  Chan.  1986. Dasar- Dasar Mikribiologi. Penerbit UI Press, Yogyakarta.
Suparno.  2005. Kajian  Bioaktif  spons  laut
(Porifera: Demospongiae) Suatu Peluang Alternative Pemanfaatan Ekosistem  Karang  Indonesia  Dalam Bidang  Farmasi.  Makalah  Pribadi. Bogor:  Institute  Pertanian  Bogor . Universitas Islam Negeri Sunan
Ampel, Surabaya.
Silap,  G.E.,  Wewengkang,  D.,  Rotinsulu,  H. 2020.  Uji  Aktivitas  Antimikroba
Karang  Lunak Dendronephtya  Sp.,
Yang  Dikoleksi  Dari  Desa  Tumbak Kecamatan Pusomaen, Kabupaten Minahasa Tenggara Terhadap Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Dan Candida Albicans . Jurnal Pharmacon UNSRAT. 9 (1).
Valgas, C., S.M. de Souza, E. F. A. Smania & A.  Smania.  2007.  Screening  Methods to Determine Antibacterial Activity Of Natural Products. Brazilian Journal of Microbiology . 38 : 369-380.