## PHARMACON– PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI

## FORMULATION AND PHYSICAL EVALUATION GEL OF AVOCADO SEED (Persea americana Mill.) AS ANTIOXIDANT USING CARBOPOL BASE CONCENTRATION

## FORMULASI DAN UJI EVALUASI FISIK SEDIAAN GEL    EKSTRAK BIJI ALPUKAT (Persea americana Mill.).) SEBAGAI  ANTIOKSIDAN DENGAN MENGGUNAKAN KOSENTRASI BASIS KARBOPOL
Maureen Regina Satolom 1)* , Paulina.V.Y.Yamlean 1) ,  Jainer Pasca Siampa 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115 *18101105053@student.unsrat.ac.id

## ABSTRACT
Avocado seeds (persea americana mill.) contain flavonoids and have strong antioxidant activity that can help protect  organs  from  toxic  agents  or  oxidative  stress.  This  study  aims  to  formulate,  evaluate  and  test  the antioxidant effectiveness of avocado seed extract gel using the DPPH method. This research was conducted experimentally in the laboratory for making avocado seed extract gel formulations (Persea americana Mill.) with a concentration of 0.5%, a concentration of 1%, and a concentration of 1.5% carbopol base. The results showed that the avocado seed ethanol extract gel had IC50 values of 46.05 ppm, 40.01 ppm, 44.80 ppm. Based on the IC50 value obtained, it can be concluded that the avocado seed ethanol extract gel has a very strong antioxidant  effectiveness.  The  SPPS  analysis  test  was  continued  to  see  a  significant  difference  but  no significant  difference  was  found,  therefore  the  preparation  with  the  lowest  concentration will  be  continued with physical evaluation testing. Physical evaluation of the preparation includes organoleptic observation, pH test, dispersion test, homogeneity test, adhesion test. The results of the physical evaluation test showed that the gel preparation met the requirements.
Keywords: Avocado Seed (persea americana mill), Gel, Antioxidant, DPPH

## ABSTRAK
Biji Alpukat ( Persea americana Mill .) mengandung flavonoid dan memiliki aktivitas antioksidan yang cukup kuat yang dapat membantu melindungi organ dari agen toksik atau stress oksidatif. Penelitian ini bertujuan untuk memformulasikan, mengevaluasi serta menguji efektifitas antioksidan sediaan gel ekstrak biji Alpukat dengan menggunakan metode DPPH. Penlitian ini dilakukan secara eksperimental di Laboratorium dengan membuat formulasi gel ekstrak biji buah Alpukat ( Persea americana Mill .) dengan basis karbopol 0,5%, 1%, dan 1,5%. Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa  gel  ekstrak  etanol  biji  Alpukat  memiliki  nilai  IC50  sebesar  46,05  ppm, 40,01 ppm, 44,80 ppm. Berdasarkan nilai IC50 yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa gel ekstrak etanol biji Alpukat  memiliki  efektivitas  antioksidan  sangat  kuat.  Dilanjutkan  pengujian  analisis  SPPS  untuk  melihat perbedaan  yang  signifikan  namun  tidak  didapatkakan  perbedaan  signifikan,  maka  dari  itu  sediaan  dengan kosentrasi terendah yang akan dilanjutkan pengujian evaluasi fisik. Evaluasi fisik sediaan meliputi pengamatan organoleptik, uji pH, uji daya sebar, uji homogenitas, uji daya lekat. Hasil pengujian evaluasi fisik menunjukkan bahwa sediaan gel memenuhi persyaratan.
Kata kunci : Biji Alpukat (Persea americana Mill), Gel, Antioksidan, DPPH

## PHARMACON– PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI

## PENDAHULUAN
Radikal bebas merupakan molekul yang tidak stabil  dan  memiliki  elektron  tidak  berpasangan atau  hilangnya  elektron.  Hilangnya  elektron mengakibatkan    radikal  bebas  akan  bereaksi dengan molekul disekitarnya untuk mendapatkan pasangan elektron, radikal bebas akan menimbulkan  penyakit  seperti  penuaan  dini, kanker, lever serta penyakit degeneratif lainnya ini akan  terjadi  terus  menerus  dalam  tubuh  dan apabila  tidak.  Maka  dari  itu  peran  Antioksidan sangat  penting  dalam  mengatasi  stres  oksidatif, sifat  dari  antioksidan  tersebut  yaitu  mudah dioksidasi  sehingga  dapat  mengoksidasi  serta melindungi  molekul  terhadap  radikal  bebas. Antioksidan  dapat  menetralkan  radikal  bebas dengan  cara  mendonorkan  satu  atom  protonnya sehingga  membuat  radikal  bebas  stabil  dan tidak reaktif (Singh, 2004).
Salah  satu  tumbuhan  yang  mengandung antioksidan  yaitu  biji  dari  tumbuhan  Alpukat (Persea americana Mill.). Kebanyakan tumbuhan Alpukat hanya banyak dimanfaatkan buahnya saja dibandingkan  dengan  biji  Alpukat.  Kandungan Eksrtrak  biji  Alpukat  mengandung  kandungan kimia  seperti  flavonoid,  triterpenoid,  saponin, tanin.
Berdasarkan dari hasil penelitian yang sudah dilakukan, terbukti bahwa tumbuhan biji Alpukat (Persea  americana  Mill.) memiliki  aktivitas antioksidan.  Oleh  karena  itu,  peneliti  tertarik untuk  membuat  sediaan  gel  yang  dapat memberikan  efek  antioksidan  dari  tumbuhan tersebut. Peneliti memilih untuk membuat sediaan gel  dikarenakan  keuntungan  pada  sediaan  gel dibandingkan sediaan topikal yang lain yaitu pada sediaan  gel  mudah  merata  jika  dioleskan  pada kulit  tanpa  penekanan,  memberi  sensasi  rasa dingin,  tidak  menimbulkan  bekas  dikulit,  serta mudah digunakan. (Anggraeni et al ., 2012).

## METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Peneliatian
Penelitian  ini  dilakukan  dilaboratorium Farmasi Lanjut, Divisi Teknologi, Program Studi Farmasi Universitas Sam Ratulangi Manado, pada bulan Febuari 2022 – Mei 2022.

## Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  antara  lain:  Oven (Ecocell  MMM  Group),  blender  (Phillips), stopwatch, timbangan  analitik  (Ae  Adam®) Rotary evaporator, pot, pipet mikro
(ecopipette™),  pH-meter,  spektrofotometer  UV- VIS  (Shimadzu  UV-  1800),  dan  gelas  kaca lainnya.
Bahan  yang  digunakan,  yaitu  sampel  biji buah Alpukat (Persea americana Mill.)., aluminium  foil ,  etanol  96%,  gliserin,  karbopol, phenoxyetanol, trietanolamin, dan aquadest.

## Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel
Sampel  Biji  Alpukat  diambil  dari  Wanea, Kecamatan Wanea, Sulawesi Utara.

## Preparasi Sampel
Biji  Alpukat  yang  sudah  diambil  dicuci bersih dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran  yang  menempel,  selanjutnya  diiris  tipis dan  dikeringkan  dengan  menggunakan  oven dengan  suhu  40 o C.  Setelah  kering  biji  Alpukat dihaluskan menggunakan blender hingga menjadi serbuk kasar, setelah itu diayak agar mendapatkan serbuk halus.

## Pembuatan Ekstrak
Ditimbang  sebanyak  500  g  biji  Alpukat kemudian dimasukkan ke dalam wadah maserasi, direndam  dengan  1500  mL  etanol  96%  hingga simplisia  terendam  secara  merata.  Didiamkan selama  3  x  24  jam  sambil  sering  diaduk-aduk. Setalah 3 hari ekstrak cair yang diperoleh disaring menggunakan kertas saring sehingga menghasilkan  filtrat  1dan  debris  1.  Kemudian debris  1  yang  ada  direndam  lagi  (remaserasi) dengan  pelarut  yang  sama  selama  2  hari  sambil sesekali  diaduk  setelah  dua  hari  sampel  disaring sehingga  menghasilkan  filtrat  2  dan  debris  2. Kemudian  dicampurkan  filtrat  1  dan  filtrat  2. Kemudian  ekstrak  cair  dipekatkan  dengan evaporator  tekanan  rendah  pada  suhu  35-40°C hingga diperoleh ekstrak kental. (Anonim, 1995)

## Pembuatan Gel
Timbang  masing-masing  bahan  sesuai  dengan perhitungan bahan. Pembuatan gel diawali dengan Karbopol yang dikembangkan dengan menggunakan  aquadest  dan  diaduk  hingga homogen dan mengembang. Selanjutnya tambahkan  Trietanolamin,  Phenoxyethanol,  dan DMDM  Hydantoin  ke  dalam  basis  gel  di  aduk sampai  homogen, tambahkan gliserin, dan ekstrak biji  Alpukatdan  aquadest  ad  100  diaduk  hingga terbentuk gel homogen. (Ningsih et al ., 2016)

## PHARMACON– PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI
Tabel 1. Formulasi Sediaan Gel
No Nama Bahan Konsentrasi (%b/b) F1 F2 F3 1 Ekstrak etanol biji Alpukat 1 1 1 2 Karbopol 0,5 1 1,5 3 Gliserin 25 25 25 4 TEA 1 1 1 5 Phenoxyethanol 0,5 0,5 0,5 6 DMDM Hydantoin 0,5 0,5 0,5 7 Aquadest Ad 100 Ad 100 Ad 100

## Pembuatan Gel
Timbang  masing-masing  bahan  sesuai  dengan perhitungan  bahan.  Pembuatan  gel  diawali  dengan Karbopol yang dikembangkan dengan menggunakan aquadest dan diaduk hingga homogen dan mengembang. Selanjutnya tambahkan  Trietanolamin,  Phenoxyethanol,  dan DMDM  Hydantoin  ke  dalam  basis  gel  di  aduk sampai  homogen, tambahkan gliserin, dan ekstrak biji  Alpukatdan  aquadest  ad  100  diaduk  hingga terbentuk gel homogen. (Ningsih et al ., 2016)

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil Pengujian Aktivitas Antioksidan (DPPH)
Pengujian Aktivitas Antioksidan bertujuan untuk  mengetahui  ada  tidaknya  penghambatan suatu  sampel  terhadap  radikal  bebas  (DPPH).  Uji efektivitas  antioksidan  ini  dilakukan  pada  semua konsentrasi  gel  dengan  menggunakan  alat spektrofotometri UV-Vis.
Pada penelitian ini bertujuan untuk memformulasikan  ekstrak  biji  Alpukat  dalam sediaan  gel.  Biji  Alpukat  sebanyak  4,9kg dikumpulkan kemudian dicuci bersih menggunakan  air  mengalir,  setelah  kering  biji Alpukat diblender hingga menjadi  serbuk  setelah itu  diayak,  tujuan  dilakukanya  penyerbukan serbuk  agar  memperluas permukaan sampel yang berinteraksi dngan pelarut agar senyawa yang larut lebih  banyak.  Untuk  mendapatkan  ekstrak  kental dipilih  ekstraksi  metode  maserasi,  metode maserasi merupakan proses perendaman simplisia
yang  telah dihaluskan  dengan  mentrum  sampai meresap  dan  melunakkan  susunan  sel, sehingga zat-zat  yang  mudah  terlarut  akan  mudah  larut (Ansel,  1989).  Proses  maserasi  dilakukan  dengan cara  merendam  500  gram  simplisia  biji  Alpukat kedalam  cairan  etanol.  Digunakan  etanol  96% sebagai  pelarut  karena  relatif  tidak  toksik dibandingkan  dengan  aseton  dan  metanol,  biaya murah,  dapat  digunakan  pada  berbagai  metode ekstraksi,  serta  aman  untuk  ekstrak  yang  akan dijadikan  obat-obatan dan makanan. (Chen et al., 2020).  Hasil  akhir ekstraksi  diperoleh  ekstrak kental berwarna  coklat  tua,  dan  memiliki  aroma khas biji Alpukat. Rendemen ekstrak 13,49 %.
Sediaan  gel  ekstrak  etanol  biji  Alpukat menggunakan  basis  gel  karbopol.  Basis  karbopol dipilih  karena  mempunyai  kestabilan  terhadap suhu,  mempunyai  kejernihan  paling  baik  dan merupakan  gelling  agent  dengan  kekuatan  yang tinggi  serta  mudah  terdispersi  dalam  air  dan dalam  kosentrasi  kecil  dapat  berfungsi  sebagai basis gel dengan kekentalan yang cukup (Rowe et al., 2009).  Pembuatan  gel  ekstrak  biji  Alpukat menggunakan  karbopol  sebagai  basis  gel, Trietanolamin  (TEA)  sebagai  pemberi  basa, Gliserin  sebagai  humektan,  Phenoxyethanol  dan DMDM  Hydantoin  sebagai  pengawet,  serta aquadest sebagai pelarut .
Penentuan  nilai  aktivitas  antioksidan  pada penelitian  ini  menggunakan  metode  DPPH. Metode  uji  aktivitas  antioksidan  dengan  DPPH (2,2-difenil- 1pikrilhidrazil) dipilih karena metode ini  adalah  metode  sederhana,  mudah,  cepat  dan
Sediaan Persamaan Regresi IC 50 F1 y = 0,2183x + 39,946 R² = 0,921 46,05 ppm F2 y = 0,2239x + 40,144 R² = 0,9219 44,01 ppm F3 y = 0,2245x + 39,942 R² = 0,9405 44,80 ppm

## PHARMACON– PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI
peka serta hanya memerlukan sedikit sampel untuk evaluasi aktivitas antioksidan dari senyawa bahan alam  sehingga  digunakan  secara  luas  untuk menguji  kemampuan  senyawa  yang  berperan sebagai pendonor elektron. Pengujian antioksidan sediaan  gel  ekstrak  etanol  biji  Alpukat  dengan metode DPPH dan menggunakan alat spektrofotometer  UV-Vis  di  lakukan  3  kali pengulangan  pada  konsentrasi  0,5%,  1%,  dan 1,5%. Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui  %  inhibisi  dan  nilai  dari  sampel sediaan  gel  ekstrak  etanol  biji  Alpukat  sehingga dapat dilihat sediaan gel ekstrak etanol biji  Alpukat berpotensi  sebagai  antioksidan.  Larutan  ekstrak yang direaksikan dengan larutan DPPH selama 30 menit,  menghasilkan  warna  ungu  memudar perubahan  warna  terjadi  dikarenakan  terjadinya penghambatan  radikal  bebas DPPH oleh sediaan gel  ekstrak  biji  Alpukat.  Berdasarkan  hasil  yang diperoleh gel ekstrak etanol biji Alpukat memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat dengan nilai IC 50  yaitu sebesar 46,05 ppm, 40,01 ppm, 44,80 ppm. Menurut Blois (1985), aktivitas antioksidan berdasarkan  nilainya,  yaitu  dapat  dikelompokkan dalam  beberapa  kategori  sangat  kuat  <50  ppm, kuat (50 -100 ppm), sedang (101-250 ppm), lemah (250-500  ppm)  dan  tidak  kuat  >500  ppm. Selanjutnya  dilakukan  pengujian  statistika  untuk melihat  ada  dan  tidaknya  perbedaan  signifikan dengan menggunakan uji spss independent sample t-test, hasil yang didapatkan pada pengujian dalam statistika  bahwa  nilai  sig  lebih  dari  0,05  yang artinya tidak ada perbedaan yang signifikan. Maka dari  itu  Sediaan  gel  dengan  kosentrasi  paling rendah  0,5%  yang  akan  dilanjutkan  dengan pengujian sifat fisik sediaan.
Pengujian  organoleptik  bertujuan  untuk mengamati  warna,  bau  dan  bentuk  sediaan  gel. Secara  pengujian  organoleptik  menunjukan  gel ekstrak etanol  biji  Alpukat  dengan  konsentrasi 0,5%  menghasilkan  sediaan  gel  berwarna  coklat kemerah-merahan,  memiliki  bau  khas  ekstrak etanol biji Alpukat dengan bentuk semi padat dan tidak ada endapan.
Pengamatan  pH  menggunakan  pH  meter, pengujian dilakukan untuk mengetahui sediaan gel nyaman untuk digunakan maka dari itu pH sediaan harus  sesuai  dengan  pH  yaitu  4,5-6,5.  Karena sediaan  gel  merupakan  sediaan  topikal  maka penting  dilakukan  uji  pH.  Sediaan  harus mempunyai  tingkat  keasaman  atau  pH  dalam rentang  pH  dari  permukaan  kulit,  karena  jika  pH suatu sediaan terlalu asam <4,5 akan menyebabkan kulit  iritasi,  sedangkan  jika  terlalu  basa  >6,5 dapat  menyebabkan  kulit  bersisik  (Rahmawaty, dkk, 2015) Hasil dalam pengujian gel biji Alpukat yaitu  5,93  yang  berarti  gel  tersebut  aman  untuk digunakan .
Pengujian daya sebar dilakukan untuk melihat kemampuan menyebar sediaan gel pada permukaan kulit  saat  pemakaian.  Daya  sebar  gel  yang  baik antara  5-7cm.  Semakin  besar  daya  sebar  yang diberikan,  maka  kemampuan  zat  aktif  untuk menyebar  dan  kontak  dengan  kulit  semakin  luas. Menurut Megawati et al (2020) sediaan semi padat pada  sediaan  topikal  diakatakan  memiliki  daya sebar  yang baik  jika berkisar 3-5 cm, sedangkan pada  daya  sebar  5-7  cm  menunjukan  konsistensi semi padat yang sangat nyaman pada penggunaannya.  Hasil  dari  pengujian  daya  sebar gel ekstrak etanol biji Alpukat memiliki daya sebar sebesar  4,98  cm  dengan  demikian  daya  sebar sediaan  Gel  ekstrak  biji  Alpukat  aman  untuk digunakan.
Hasil uji homogenitas menunjukkan hasil dari sediaaan  gel  ekstrak  biji  Alpukat  menggunakan kaca  objek  bahwa  gel  tersebut  bagus  tidak  ada partikel-partikel  yang  kelihatan  secara  kasat  mata sehinggah kelihatan jernih dan homogen.
Uji daya lekat yaitu kemampuan gel melekat pada kulit saat digunakan. Gel yang baik memiliki daya lekat yang tinggi. Semakin tinggi daya lekat dinyatakan semakin baik untuk sediaan gel. Hasil pengujian daya lekat gel ekstrak etanol biji Alpukat memiliki  rata-rata  1,99  detik  .  Tidak  ada persyaratan  khusus  mengenai  daya  lekat,  namun sebaiknya  daya  lekat  sediaan  semi  padat  adalah lebih dari 1 detik (Zats & Gregory, 1996).

## PHARMACON– PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan
1. Hasil  uji  efektivitas  antioksidan  sediaan  gel ekstrak etanol buji Alpukat dengan kosentrasi 0,5%,  1%,  dan  1,5%  diperoleh  IC50  yang sangat  kuat  sebesar  46,05  ppm,  40,01  ppm, 44,80 ppm. .
2. Sediaan  Gel  Antioksidan  Ekstrak  Etanol  Biji Alpukat dengan konsentrasi Karbopol terendah 0,5% memenuhi syarat evaluasi fisik berupa  pengujian  organoleptik,  pH,  daya sebar, homogenitas, dan daya lekat.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk sediaan  gel  ekstrak  etanol  biji  Alpukat  untuk  uji viskositas dan Uji Iritasi.
.

## DAFTAR PUSTAKA
Anggraeni,Y.,  Hendradi,  E.,  Purwanti  T.  2012.
Karakteristik Sediaan Dan  Pelepasan Natrium Diklofenak  Dalam  Sistem  Niosom  Dengan Basis Gel. Pharmascientia. Vol. 1(2)
Abdullah,  S.  S.,  Antasionasti,  I.,  Rundengan,  G., Abdullah,  R.  P.  I.  (2022). Aktivitas Antioksidan  Ekstrak  Etanol  Biji  Dan  Daging Buah  Pala  ( Myristica  fragrans )  Dengan Metode  DPPH. Chemistry  Progress, 15(2) , 70–75
Abdullah,  S.  S.,  Putra,  P.  P.,  Antasionasti,  I., Rundengan, G., Suoth, E. J., Abdullah, R. P. I.,  &  Abdullah,  F.  (2021).  Analisis  Sifat Fisikokimia, Farmakokinetik dan Toksikologi Pada  Pericarpium  Pala  ( Myristica  fragransa ) Secara  Artificial  Intelligence.  Chemistry Progress, 14(2) , 81–92.
Abdullah,  S.S.,  Djide,  N.,  Natsir,  S.  (2021). KLT Bioautografi  Hasil  Partisi  Ekstrak  Etanol Herba  Bandotan  ( Ageratum  conyzoides  L. ) Terhadap Shigella  dysentriae . Chem.  Prog. 14(1) .15-17
Antasionasti I, Jayanto I, Abdullah S S, and Siampa
J P. Karakterisasi Nanopartikel Ekstrak Etanol
Kayu Manis ( Cinnamomum burmanii )
Dengan Kitosan Sodium Tripolifosfat Sebagai Kandidat  Antioksidan.  Chemistry  Progress, 2020, 13(2) : 77-85.
Anonim. 1995. Materia Medika Indonesia, Jilid ke- 6. Departemen Kesehatan Republik Indonesia Direktorat  Jendral  Pengawasan  Obat  dan Makanan Direktorat Pengawasan Obat Tradisional, Jakarta. Ansel,  H.C.  1998.  Pengantar  Bentuk  Sediaan Farmasi. Edisi 4. Jakarta. Universitas Indonesia. Hal 105,401.
Blois,  M.S.  1985.  Antioxidant  Determination  by The  Use  of  Stable  Free  Radical.  Journal  of nature. 181(4617) : 1191 – 1200.
Chen,  H.,  Xiao,  H.,  &  Pang,  J.  (2020).  Parameter Optimization and Potential Bioactivity
Evaluation  of  a  Betulin  Extract  from  White Birch Bark. Plants. 9(3) : 392. Karamoy, NYF., Yamlean, P. V. Y. , Abdullah , S. S.
(2022), Formulation And Test Of Antioxidant Activity Lotion Ethyl Acetate Fraction Of Corn Silk ( Zea Mays L.), Pharmacon, 11(4).
Legi,  A.P.,  Edy,  H.J.,  Abdullah ,  S.  S.,  (2021), Formulasi  Dan  Uji  Aktivitas  Antibakteri Sediaan  Sabun  Cair  Ekstrak  Etanol  Daun Sirsak  ( Annona  Muricata Linn)  Terhadap Bakteri Staphylococcus ,    Pharmacon, 10(3) , 1058–1065.
Ningsi,  S.,  D.W.  Leboe.,  dan  S.  Armaya.  2016. Formulasi dan Uji Stabilitas Fisik Gel Ekstrak Daun Binahong (Andredera cordifolia). Jurnal farmasi UIN Alauddin Makassar. 4(1) : 21-27 Rahmawaty,  Dina.,  Nita.  Yulianti,  dan  Mia. Fitriana. 2015. Formulasi dan Evaluasi masker wajah  pell  off  mengandung  kuersetin  dengan variasi kosentrasi gelatin dan gliserin. “Media Farmasi. 12(1) : 17-32. Research (5) : 33-336 Rowe,  Raymond  C.,  Paul  JS,  Marian  EQ.  2009. Handbook of Pharmaceutical Excipients Sixth Edition. USA : The Pharmaceutical Press. Hal 110.
Singh,  R.P.,  Sharad.  S.,  Kapur.  S.  2004.  Free
Radicals and
Oxidative Stress in Neurodegenerative  Diseases.  Relevance  of Dietary Antioxidants. 5 : 218-25.
Zats, J.L & Gregory, P.K., 1996, Gel, in Liebermen, H.A., Rieger, M.M., Banker, G.S., Pharmaceutical  Dosage  Forms:  Disperse Systems,  2,  400  -  403,  405  –  415,  Marcel Dekker Inc, New York.