## ISOLASI DAN KARAKTERISASI  ENZIM SELULASE Oleh Masfufatun
Dosen Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya ABSTRAK Carboxy Methyl Cellulose (CMC) merupakan turunan selulosa yang mudah larut dalam air. Oleh karena itu CMC mudah  dihidrolisis menjadi gula-gula sederhana oleh enzim selulase. Bekicot adalah hewan lunak, mudah berkembang biak dan memanfaatkan selulosa sebagai sumber energinya serta kandungan proteinnya cukup tinggi. Oleh  karena itu  bekicot dapat dijadikan sebagai sumber enzim selulase untuk menghidrolisis Carboxy Methyl Cellulose (CMC) Peneltian  ini  bertujuan  untuk  isolasi  enzim  selulase  dari  bekicot,  Achatina  fulica    dan menentukan karakterisasinya. Kadar Glukosa yang dihasilkan dari aktivitas enzim selulosa  dianalisa dengan  menggunakan  metode  Semogy-Nelson,.  Dari  penelitian  ini ternyata  enzim  selulase  yang diisolasi dari hepatopankreas bekicot, Achatina fulica memiliki  aktivitas spesifik sebesar 2,85 U/mg protein  dan  beraktivitas  optimum  pada  suhu  50 o Cdan  pH  5,16  serta  memiliki memiliki  parameter kinetik  harga    V m sebesar    0,23mg/mL  per  menit  dan  Km  sebesar    0,53  mg/mL.  Bagian  enzim selulosa mulai jenuh pada konsentrasi 4%. Kata kunci : Carboxy Methyl Cellulose, hidrolisis, selulase

## ISOLATION AND CHARACTERIZATION cellulase
By Masfufatun
Lecturer Faculty of Medicine, University of Wijaya Kusuma Surabaya ABSTRACT Carboxy Methyl Cellulose (CMC) is a derivative of cellulose soluble in water. Therefore, CMC easily hydrolyzed into simple  sugars by  the enzyme cellulase. Snails are animals soft, easy  to  breed and utilize cellulose as a source of energy and protein content is high enough. Therefore, snails can be used as a source of cellulase enzyme to hydrolyze carboxy Methyl Cellulose (CMC) This  research aims to isolate cellulase enzyme from the  snail, Achatina fulica and determine its characterization. Glucose levels produced from cellulose enzyme activity were analyzed by using the method Semogy-Nelson. From this  research it  turns  out cellulase enzyme isolated from hepatopankreas snail, Achatina fulica has  a specific  activity of 2.85 U / mg protein and activity 50oCdan temperature optimum at pH 5.16 and have had kinetic parameters Vm price of 0.23 mg / mL per minute and Km is  0.53 mg / mL. Part enzyme cellulose getting fed at  a  concentration  of 4%. Keywords: carboxy Methyl Cellulose, hydrolysis, cellulase
Pendahuluan
Selulosa  merupakan  biomolekul yang  paling  banyak  ditemukan  di  alam dan  merupakan  unsur  utama  penyusun kerangka tumbuhan. Diperkirakan sekitar  10 11 ton  selulosa  dibiosintesis tiap tahun. Daun kering mengandung 10- 20%selulosa;  kayu  50%  dan  kapas 90%(Kolman, 2001). Selama ini limbah pertanian  maupun  kehutanan,  seperti jerami  gandum  maupun  padi,  tongkol jagung, bagas, kulit kacang dan lain-lain belum  dimanfaatkan  secara  optimal, padahal limbah-limbah tersebut merupakan  sumber  energi  yang potensial.  Kandungan  selulosanya  yang tinggi sehingga dapat dikonversi menjadi gula-gula sederhana (gula pereduksi) dan selanjutnya  difermentasi  menjadi  etanol oleh khamir atau bakteri. Carboxy Methyl Cellulose (CMC)  merupakan  turunan  selulosa, kopolimer  dua  unit  β-D  glukosa  dan  β- D-glukopiranosa  2- O -(karboksilmetil)- garam monosodium yang terikat melalui ikatan  β-1,4-glikosidik.  CMC  memiliki kelarutan lebih tinggi daripada selulosa, sehingga  mudah dihidrolisis.  Hidrolisis CMC    menjadi  gula-gula  sederhana dapat  dilakukan  dengan  menggunakan katalis  asam,  enzim  maupun  mikroba selulolitik. Beberapa penelitian melaporkan  bahwa  proses  hidrolisis secara  enzimatis  lebih  menguntungkan daripada  menggunakan  asam.  Selain tidak  menimbulkan  masalah  korosi  dan berlangsung  pada  kondisi mild (pH  4,8
dan  suhu  50 0 C),    ternyata  proses hidrolisais secara enzimatis menghasilkan yield lebih  tinggi daripada hidrolisis yang dikatalisis asam (Duff  and  Murray,  1996).  Enzim selulase  diproduksi  oleh  mikroba selulolitik  dari  golongan  bakteri  dan jamur . Permasalahan  yang  sering muncul dalam penelitian  adalah kurang tersedianya enzim selulase  yang murah dan  efisien.    Salah  satu  alternatif  untuk mengatasi  hal  ini  adalah  dengan memanfaatkan  bekicot  sebagai  sumber enzim  selulase.  Selama  ini  bekicot banyak  digunakan  sebagai  pakan  ternak karena  kandungan  proteinnya  yang cukup  tinggi  (75  gram/100gram  daging bekicot).  Silaban,  R.,  1999  menemukan mikroba selulolitik, Pseudomonas alcaligenes  PaAf- 18  di  dalam  tubuh bekicot.  Mikroba  selulolitik  tersebut memproduksi  enzim  selulase    untuk mencerna  makanan  (selulosa)  dan sebagian disimpan dalam hepatopankreas yang salurannya bermuara ke sistem pencernaan. Isolasi enzim  selulase  dari  hepatopankreas bekicot lebih mudah dilakukan  daripada isolasi  dari  bakteri  atau  jamur,  yakni melalui proses dekstruksi sel, homogenasi dan sentrifugasi. Dalam melakukan kerja katalitiknya, aktivitas enzim dipengaruhi oleh  beberapa  faktor  yaitu  konsentrasi substrat,  pH,  suhu,  konsentrasi  enzim dan  waktu  reaksi  (Price,  1979).  Di industri  pengungkapan  sifat  dan karakteristik  suatu  produk  enzim  sangat diperlukan  untuk  efisiensi  proses produksi  dan  lebih  jauh  akan difungsikan  untuk memperoleh  produk akhir  yang  berkualitas.  Oleh  karena  itu penelitian  ini  bertujuan  untuk  isolasi enzim  selulase  dari  bekicot, Achatina fulica dan  menentukan  karakteristiknya yang  meliputi  kondisi  suhu,  pH, konsentrasi  substrat  dan  parameter kinetik.  Dari penelitian  diharapkan glukosa  sebagai  hasil  hidrolisis  dapat dimanfaatkan  sebagai  bahan  baku pembuatan etanol.
Bahan dan Metode Bahan-bahan utama yang diperlukan  dalam    penelitian  ini  adalah bekicot, Achatina fulica sebagai sumber enzim  ,  diperoleh  dari  perladangan
mayarakat  Sidoarjo,  dipilih  yang  besar dan  cangkangnya  masih  utuh. Carboxy Methyl  Cellulose (CMC)  sebagai substrat  dalam  proses  hidrolisis diperoleh dari laboratorium Mikrobiologi  Jurusan  Biologi  FMIPA Universitas Airlangga Surabaya. A.  Isolasi  Enzim  Selulase  dari Hepatopankreas  Bekicot, Achatina fulica Sebanyak  35  gram  hepatopankreas bekicot  dihomogenisasi  dengan  500ml 1%  NaCl  dingin    (pH=7)  dalam waringblender selama 3 menit pada suhu 1-4 o C.  Homogenat yang  diperoleh kemudian  disaring  melalui  kain  pada suhu  2-4 o C  dan  filtratnya  disentrifuge selama 80 menit pada suhu 2 o C dan 4200 rpm  dalam  International  Refrigerated Centrifuge  dengan  rotor  no.  840.
Supernatan  yang  diperoleh  merupakan preparat  enzim  selulase  selanjutnya dilakukan    uji  aktivitas  dan  kandungan proteinnya. (Soedigdo, dkk., 1980) B. karakterisasi enzim selulase  Menentukan  kondisi  optimum aktivitas enzim selulase pH Optimum pH  optimum  ditentukan  dengan cara  sebagai  berikut:  disediakan beberapa larutan  CMC  2%  dalam  bufer asetat dengan pH berbeda 4,5; 5,0; 5,16,
5,25  dan  5,5.    Masing-masing  larutan diambil 40 ml dan dimasukkan ke dalam labu  erlenmeyer  100  ml  yang  berbeda. Ke dalam masing-masing labu erlenmeyer  ditambahkan  10  ml  larutan enzim  kemudian  diinkubasi  pada  suhu optimum  selama  1  jam  dengan kecepatan  160  rpm..  Reaksi  dihentikan dengan  pemanasan  selama  10  menit. Kadar  Gula  reduksi  dalam  hidrolisat selulosa ditentukan dengan menggunakan metode Semgy-Nelson. Suhu Optimum Suhu optimum dilakukan dengan cara sebagai berikut: Ke dalam 6 buah labu erlenmeyer 100ml dimasukkan masing-masing 40 ml CMC 2% dalam larutan buffer asetat pH 5  dan ditambahkan  10  ml  enzim  selulase.
Campuran  dalam  labu  diinkubasi  pada suhu  berbeda  (30 o C,    40 o C,  50 o C  dan 60 o C) dan      kecepatan  160  rpm  selama 60  menit..  reaksi  dihentikan  dengan pemanasan selama 10 menit. Kadar Gula
reduksi  dalam  hidrolisat Carbokxy Methyl  Cellulose (CMC)  ditentukan dengan  menggunakan  metode  Semgy- Nelson.
Konsentrasi Susbstrat optimum Konsentrasi substrat  optimum ditentukan  dengan  cara  sebagai  berikut: disediakan  larutan  CMC    dalam  larutan buffer  asetat  pH  5  dengan  konsentrasi yang berbeda dan dimasukkan ke dalam labu  erlenmeyer  100ml  masing-masing sebanyak 40ml. Selanjutnya ditambahkan  10ml  larutan  enzim. Campuran  diinkubasi  pada  suhu  50 0 C selama 1 jam. Sesudah reaksi enzimatik dihentikan dengan pemanasan, ditentukan kadar gula reduksinya dengan menggunakan metode Somogy-Nelson.  Menentukan  Parameter  Kinetik Reaksi Enzimatis Parameter kinetik reaksi enzimatis  adalah  laju  reaksi  maksimum (V m )  dan  tetapan Michaelis-Menten (Km),  ditentukan  dengan  menggunakan persamaan Michelis  Menten atau persamaan Lineweaver Burk. Persamaan Michelis  Menten diperoleh  dengan membuat kurva hubungan [S] dengan V, sedangkan  persamaan Lineweaver  Burk diperoleh  dengan  membuat  kurva hubungan  1/[S]  dengan  1/V.  Data  laju reaksi  (V)  diperoleh  dari  percobaan optimasi substrat.

## C. Metode Analisis
Uji aktivitas Selulase Pada  tabung  reaksi  betutup diisi  dengan  1,0ml  larutan  buffer  asetat pH  4,8  dan  0,5ml  larutan  enzim  dalam buffer  asetat.  Selanjutnya  campuran tersebut  dipanaskan.  Pada  saat  suhu mencapai  50 O C,  ke  dalam  tabuing
tersebut  dimasukkan  kertas  saring berukuran  1,0  x  6,0  cm  (  50  mg)  lalu diaduk (NB. Semua bagian kertas saring Whatman  No  1  harus  tercelup  dalam cairan).  Setelah  1 jam  reaksi  dihentikan dengan  pemanasan  dalam  air  mendidih selama  10  menit  dan  selnjutnya dilakukan uji gula reduksi pada filtratnta dengan  menggunakan  metode  Somogy- Nelson. (Ghose,1987) Analisa Kadar Gula Reduksi Pengambilan  sampel  dilakukan dengan  menggunakan  pipet  mikro sebanyak  200  l,  dimasukkan  secara kuantitatif  ke  dalam  tabung  ependorf.
Kemudian  disentrifugasi  kecepatan tinggi selama 5 menit. Dipisahkan antara residu  dan  filtratnya.  Filtrat  ditentukan kadar  glukosanya  dengan  metode Semogyi-Nelson.Absorbansi  sampel  (y) diekstrapolasikan pada persamaan regresi  linier  yang  telah  didapat,  dari kurva  standar  glukosa,  sehingga  setiap kadar glukosa dapat ditentukan..

## Uji  Kandungan  Protein  pada  Enzim Selulase
Enzim  selulase  yang  diisolasi dari  hepatopankreas  bekicot  ditrentukan kadar  proteinnya  dengan  cara  sebagai berikut:  ke  dalam  tabung  reaksi  yang berisi  7  mL  ekstrak  kasar  enzim ditambahkan 3 ml reagen Bradford, lalu diinkubasi  selama  5  menit.  Setelah waktu  inkubasi,  absorbansi  larutan enzim  diukur  pada  panjang  gelombang maksimum  595  nm.  Absorbansi  yang diperoleh  diplotkan  pada  persamaan regresi linier kurva standar protein

## D. Diagram Alir Percobaan
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Eksatraksi  Enzim  Selulase  dari
Hepatopankreas  Bekicot, Achatina fulica Bekicot ( Achatina fulica ) memiliki  ciri  khas  warna  garis-garis pada  tempurung/cangkangnya  tidak begitu  mencolok  sebagaimana  gambar 4.1.  Hewan ini  menggantungkan hidupnya  pada  selulosa  sebagai  sumber energinya.  Oleh  karena  itu  banyak ditemukan  mikroba  selulitik  di  dalam sistem  pencernaanya.  Enzim  selulase merupakan  enzim  ekstrasellular  yang diproduksi  di  dalam  sel  mikroba selulolitik  dan  kemudian dikeluarkan dari  sel    masuk  ke  dalam  sistem pencernaan  untuk  mencerna  selulase. Dengan  demikian  enzim  selulase diisolasi    dari  hepatopankreas  bekicot ( Achatina  fulica )  yang  bermuara  pada sistem pencernaan. Sel  hewan  tidak  memiliki dinding  sel  sehingga  proses  isolasi enzim berlangsung lebih mudah.  Proses isolasi enzim selulase dari hepatopankreas melalui tahapan dekstruksi sel yaitu pelepasan enzim dari matriks  sel.  Enzim  selulase  dipisahkan dari  matriks  sel  dengan  cara  merusak membran sel melalui pengaturan tekanan osmosa  larutan  diluar  sel  dengan menggunakan  larutan  NaCl  dan homogenisasi  dengan  menggunakan waringblender (Palmer,  1995).      Homogenat yang  diperoleh  dari  proses  dekstruksi disaring  dan  disentrifus  dengan  tujuan untuk  memisahkan  enzim  selulase  dari matriks sel yang lain . Supernatan yang diperoleh  merupakan  ekstrak  kasar enzim  selulase,  berwarna  coklat muda(gambar  2)  dan  sebanyak  470  mL
dihomogenisasi dalam waringblender pada suhu 1 – 4 o C selama 3 menit
35 g Hepatopankreas Bekicot 500 mL 1% NaCl dingin  (pH=7) Campuran dicampur homogenat disentrifus dingin pada suhu 2°C, 4200 rpm selama 80 menit Supernatan ekstrak selulase Karakterisasi Uji aktivitas Residu Residu disaring suspensi
dari    500  mL  homogenat  (35  gram hepatopankreas) dan pH 5,2. Selanjutnya ekstrak  kasar  tersebut  diuji  kadar proteinnya dengan menggunakan metode Bradford .    Metode  ini  didasarkan  pada reaksi antara  reagen Bradford dengan protein  sehingga  terbentuk senyawa kompleks berwarna biru menurut reaksi berikut:
H + (H 3 PO 4 ) Coomassie Blue + Protein Kompleks berwarna biru Larutan  kompleks  biru  ini  diukur absorbansinya  dengan  menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang  595  nm. Semakin  tinggi Absorbansi  yang  terukur  maka semakin tinggi  kadar  proteinnya  .Kandungan protein  dalam  ekstrak  kasar  enzim selulase sebesar 1,72 mg per mL ekstrak enzim  selulase.  Kandungan  protein  ini jauh  lebih  rendah  dibandingkan  hasil penelitian  yang  dilaporkan  Saryono (1991),  bahwa  enzim  selulase yang
diekstrak  dari  bekicot  ( Achatina  fulica)
memiliki kandungan protein sebesar  4,4 mg/mL  ekstrak.  Hal  ini  kemungkinan karena  ekstrak  enzim  yang  dihasilkan pada  penelitian  ini  terlalu  encer (gambar.2)  dan  tidak  dilakukan  proses pemekatan  sebagaimana  yang telah dilakukan  Saryono  (1991).  Pemekatan ekstrak  enzim  dilakukan  melalui  proses liofilisasi dengan tujuan untuk mengurangi pelarut pada kondisi suhu - 87 o C dan tekanan 1,3 bar.
Gambar 1. Bekicot, Achatina fulica Gambar 2. Ekstrak Kasar Enzim Selulase Keberhasilan  isolasi  enzim selulase  ditentukan  melalui  uji  aktivitas enzim  dengan  menggunakan  substrat kertas  saring  whatman  no  1.  Aktivitas yang  terukur  merupakan  aktivitas selulosa  total  (FP-ase).  Kadar  glukosa sebagai  hasil  aktivitas  enzim  selulase ditentukan  dengan  metode  Somogyi- Nelson. Metode  ini  didasarkan  pada reaksi  reduksi  tembaga  (II)  menjadi tembaga  (I)  dalam  larutan  yang mengandung  K-Na  tartrat,  yang kemudian oleh adanya reagen arsenomolibdat  hasil  ini  membentuk senyawa  kompleks  berwarna  biru. Larutan  kompleks  biru  ini  diukur absorbansinya  dengan  menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang  540  nm.  Ekstrak  enzim selulase  dari  bekicot  memiliki  aktivitas selulase total ( Filter Paper Ase ) sebesar 0,020  mol  glukosa  /mL substrat  per menit  atau 0,02  Unit dan  aktivitas spesifik sebesar 0,023 Unit/mg protein. 1  Unit  Aktivitas  :  banyaknya enzim yang dapat menghasilkan 1  mol glukosa  per mililiter substrat tiap menit pada kondisi percobaan. Hasil  Aktivitas  enzim  selulase ini berbeda dengan hasil penelitian yang telah  dilaporkan  Saryono  (1991),bahwa aktivitas  enzim  selulase  terhadap selulase  ampas  nanas  mencapai  3,4 mg/mL  per  menit  dan  aktivitas  spesifik sebesar 0,7727 Unit/mg protein. Hal ini terjadi karena Saryono (1991) melakukan  tahap  pemurnian  terhadap ekstrak  enzim  selulase  setelah  tahap liofilisasi.  Pemurnian  dilakukan  melalui tahap  fraksinasi  dan  dialisis  dengan tujuan  untuk  menghilangkan  semua komponen  non  protein  yang  masih tersisa dalam larutan.
Oleh  karena itu  perlu  dilakukan tahap  liofilisasi  dan  pemurnian  terlebih dahulu  terhadap  ekstrak  kasar  enzim selulase  sebelum  melakukan  proses hidrolisis selulosa secara enzimatis.

## B. Karakterisasi Enzim Selulase
 Penentuan  Kondisi  Optimum Aktivitas Enzim Selulase
Aktivitas  enzim  dipengaruhi oleh  beberapa  faktor,  antara  lain  pH, temperatur  dan  konsentrasi  substrat. Untuk  mengetahui  aktivitas  optimum, maka  dilakukan  pengukuran  aktivitas dengan kondisi yang bervariasi.
pH Optimum
Enzim  memiliki  pH  optimum yang  karakteristik,  yaitu  pH  yang  dapat menghasilkan  aktivitas  maksimal  dalam mengkatalisis  suatu  reaksi.  Perubahan pH berpengaruh terhadap aktivitas enzim melalui  pengubahan  struktur  atau muatan  residu  asam  amino yang berfungsi dalam pengikatan substrat pH  yang  bervariasi  juga  dapat menyebabkan  perubahan  konformasi enzim.  Hal  ini  terjadi  karena  gugus bermuatan  (-NH 3 + atau –COO - )  yang jauh dari daerah terikatnya substrat, yang mungkin diperlukan untuk mempertahankan struktur  tersier,  akan mengalami  perubahan  muatan  pada  pH yang berbeda. Hal ini akan menyebabkan terganggunya ikatan ionik dan  terputusnya  folding  maksimum enzim  sehingga  konformasi  enzim berubah.  Perubahan  konformasi  enzim akan  menyebabkan  aktivitas  enzim menjadi menurun.
Gambar  3.  menunjukkan  bahwa aktivitas  optimum  ekstrak  kasar  enzim selulase berlangsung pada pH optimum, yaitu  pH  5,2  dengan  aktivitas  sebesar 0,053  Unit dan  aktivitas  spesifik  0,003 U/mg dengan kadar glukosa sebesar 0,57 mg/mL  susbtrat  (28  mg  glukosa/g CMC).  pH  optimum  ini  sesuai  dengan hasil  penelitian  yang  telah  dilaporkan Saryono(1999), bahwa aktivitas optimum enzim selulase dalam menghidrolisis limbah nanas berlangsung  pada  pH  5,2.  Enzim selulase masih bisa beraktivitas pada pH diatas dan  dibawah  pH  5,2  tetapi aktivitasnya  lebih  rendah.  Hal  ini kemungkinan  karena  terjadi  perubahan muatan  gugus fungsi residu asam amino pada  enzim,  terutama  asam  amino  jenis asam  glutamat(Bhat,  1997).  Disamping itu  konformasi  enzim  dimungkinkan juga  telah  mengalami  perubahan konformasi (denaturasi) akibat perubahan pH yang bervariasi. Gambar 3. Kurva Pengaruh pH terhadap Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim

## Selulase
Temperatur Optimum Pada temperatur optimum reaksi enzimatis  berlangsung  paling  cepat karena  aktivitas  enzim  maksimum.
Peningkatan  temperatur  menyebabkan aktivitas ekstrak kasar enzim meningkat.
Hal ini disebabkan oleh temperatur yang makin  tinggi  akan  meningkatkan  energi kinetik,  sehingga  menambah  intensitas tumbukan antara substrat dengan enzim. Pada  temperatur  optimum,  tumbukan
antara enzim dan substrat sangat efektif, sehingga pembentukan kompleks enzim- substrat  makin  mudah  dan  produk  yang terbentuk meningkat. Di atas temperatur optimum  enzim  akan  mengalami denaturasi  dan  kehilangan  aktivitas katalitiknya (inaktivasi). Proses inaktivasi  enzim  pada  temperatur  yang sangat  tinggi  berlangsung  melalui  2 tahap  yaitu  diawali  dengan  pembukaan parsial struktur sekunder, tersier dan atau
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Ak tiv its S pe si fik S el ul as e( U/ g) 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 pH
kuartener  molekul  enzim  akibat putusnya  ikatan-ikatan  kovalen  maupun ikatan hidrofobik dan selanjutnya terjadi perubahan struktur primer enzim karena adanya  kerusakan  asam-asam  amino tertentu oleh pemanasan. Gambar  4. Kurva Pengaruh Temperatur terhadap Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Selulase Gambar 4  menunjukkan bahwa aktivitas  optimum  ekstrak  kasar  enzim selulase    dicapai  pada  temperatur  50 o C, dengan aktivitas 0,053 Unit (0,053  mol glukosa/mL  substrat  per  menit)  dan aktivitas  spesifik  0,0031  U/mg  dengan kadar glukosa sebesar 56,77 mg/100mL (28,39 mg glukosa/g CMC). Temperatur optimum  ini    sesuai  dengan  penelitian yang  dilakukan  oleh  Sreenath  (2002), yang  melaporkan  bahwa  aktivitas optimum enzim selulase dari Trichoderma  viridae dan Aspergilus niger dalam  menghidrolisis Carboxy Methyl  Cellulose (CMC)  berlangsung pada  suhu  50 o C.  Kondisi  ini  berbeda dengan  hasil  penelitian  yang  telah dilaporkan Saryono (1991) dan maisaroh (2009).  Aktivitas  optimum  selulase terhadap selulosa ampas nanas berlangsung  pada  temperatur  optimum 37 o C  (Saryono,  1991)  sedangkan terhadap  selulosa  ampas  tebu  (bagas) pada temperatur 40 o C (Maisaroh, 2009). Perbedaan  temperatur  optimum  ini kemungkinan  karena Carboxy Methyl Cellulose (CMC)  memiliki  viskositas yang  lebih  tinggi  dibandingkan  selulosa yang lain pada konsentrasi yang sama (2 %), sehingga enzim selulosa membutuhkan energi  yang cukup tinggi untuk  membentuk  kompleks  dengan substrat Carboxy  Methyl  Cellulose
(CMC).  Oleh  karena  itu  untuk memperoleh  data  yang  akurat    perlu dilakukan  penelitian  tentang  pengaruh
variasi  substrat  terhadap  temperatur optimum aktivitas enzim selulase.
Konsentrasi Substrat Optimum Konsentrasi  substrat  merupakan salah satu faktor yang dapat mempengaruhi  aktivitas  enzim.  Gambar 4.5.  menunjukkan  bahwa  konsentrasi substrat  sebanding  dengan  aktivitas ekstrak  kasar  enzim.  Pada  konsentrasi substrat  rendah,  aktivitas  ekstrak  kasar enzim  juga  rendah,  karena  sisi  aktif enzim  hanya  sedikit  mengikat  substrat, sehingga  produk  gula  pereduksi  yang dihasilkan  juga  sedikit.  Demikian  juga dengan konsentrasi substrat yang  makin tinggi, maka sisi aktif enzim akan makin banyak  mengikat  substrat,  sehingga produk  glukosa  yang  dihasilkan  juga makin  banyak.  Penambahan  substrat lebih lanjut hanya sedikit meningkatkan aktivitas  ekstrak  kasar  enzim,  karena hampir  semua  enzim  telah  membentuk kompleks enzim-substrat, sehingga tidak terdapat lagi sisi aktif enzim yang bebas.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Ak tiv ita s Sp es ifi k Se lu la se (U /g ) 30 40 50 60
Temperatur ( o C)
Gambar 5.  Kurva Hubungan Konsentrasi Substrat  terhadap Aktivitas Ekstrak Kasar Selulase
Pada konsentrasi substrat di atas
4%  ternyata      mulai  terjadi  penurunan kecepatan  reaksi  enzimatis.  Hal  ini terjadi karena semakin tinggi konsentrasi Carboxy Methyl Cellulose (CMC) maka makin  tinggi  viskositasnya  sehingga probabilitas  substrat  berikatan  dengan sisi  aktif  enzim  semakin  kecil.  Dengan demikian aktivitas optimum berlangsung pada konsentrasi substrat 4%. Data yang diperoleh  dari  optimasi  substrat  ini digunakan  untuk  menentukan  parameter kinetik enzim selulase yang meliputi V m (Kecepatan Reaksi Maksimum) dan Km (Konstanta Michaelis- Menten )
 Penentuan  Parameter  Kinetika
Reaksi Enzimatis V m merupakan kecepatan maksimum  yaitu  kecepatan  yang berangsur-angsur dicapai pada konsentrasi  substrat  tinggi  (enzim  telah jenuh  dengan  substrat)  sedangkan  Km merupakan  konstanta  yang  menyatakan konsentrasi substrat pada saat kecepatan reaksi mencapai setengah kali kecepatan maksimum. Harga  Vm  dan  Km  dapat ditentukan  dengan  membuat  grafik antara 1/V dengan 1/[S].
Persamaan Michaelis- Menten :
] [ ] [ . S Km S V V m m  
Dapat dinyatakan sebagai berikut: ] [ . ] [ 1 S V S Km V m   atau m m V S V Km V 1 ] [ 1 . 1  
Dari  persamaan  di  atas  terlihat bahwa  1/V  adalah  fungsi  dari  1/[S]. Dengan  demikian  jika  dibuat  kurva hubungan antara 1/V dengan 1/[S], akan terbentuk garis lurus (gambar 6).
0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 [S]% A kt iv ita s sp es ifi k Se lu la se (U /g ) y = 2.2857x + 4.2836 R 2 = 0.9927 0 50 100 150 200 250 -20 0 20 40
60 80 100 120 1/[S] 1/ V
Ekstrak  kasar  enzim  selulase yang  diisolasi  dari  bekicot  ( Achatina fulica ) memiliki harga V m sebesar 0,002 mg/mL per menit dan Km sebesar 0,005 mg/mL.  Parameter  kinetik  ini  berbeda dengan  hasil  penelitian  yang  telah dilaporkan  Saryono  (1991),  bahwa enzim  selulase  dari  bekicot  dengan menggunakan  substrat  suspensi  ampas nanas  dalam  buffer  asetat  pH  5,2 mempunyai  harga  Km  0,014  mg glukosa/mL  dan  nilai  V m sebesar  0,025 mg/mL/menit. Perbedaan nilai parameter kinetik  ini  dimungkinan  karena  substrat yang  digunakan  berbeda.  Setengah kecepatan  maksimum  enzim  selulase dari  bekicot  ( Achatina  fulica )  tercapai pada  konsentrasi  substrat Carboxy Methyl  Cellulose (CMC)  lebih  tinggi dibandingkan substrat ampas nanas.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan Dari  penelitian  yang  telah  dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa 1. Enzim  selulase  yang  diisolasi    dari bekicot  ( Achatina  fulica )  bekerja optimum  pada pH  5,2,  temperatur 50 o C, dan konsentrasi substrat 4%
2. Aktivitas enzim selulase dari bekicot ( Achatina fulica )  terhadap Carboxy Methyl  Cellulose (CMC)  sebesar
0,02  mol/mL per menit (0,02 Unit) sedangkan  kandungan  proteinnya 1,72  mg/mL  enzim  sehingga aktivitas  spesifiknya    sebesar  0,023 Unit/mg protein 3. Karakterisasi  enzim  selulase  dari bekicot dengan menggunakan substrat  CMC    dalam  buffer  asetat pH  5,2  mempunyai  harga    V m sebesar    0,23mg/mL  per  menit  dan Km sebesar  0,53 mg/mL
Saran 1. untuk  meningkatkan  kandungan protein  dan  aktivitas  ekstrak  kasar enzim  selulase  dari  bekicot ( Achatina fulica )maka perlu dilakukan  tahapan  liofilisasi  dan pemurnian. 2. perlu  dilakukan  penelitian  lanjut mengenai pengaruh variasi substrat terhadap  temperatur  optimum aktivitas enzim selulase.. DAFTAR PUSTAKA Bhat, M.K., (1997), Cellulose Degrading  Enzymes  and Their  Potential Industrial Applications , Food Macromolecul Science Departement,  Institute  pf Food Research. Biotechnology Advances. Vol.15. 583-620 Bradford  MM,  1976.  A  Rapid  and Sensitive  Method  for  the Quantitation  of  Microgram Quantities of Protein Utilizing the  Principle  of  Protein-Dye Binding.  Anal.  Biochem.  72: 248–254 Ghose,  T.K.,  (1987), Measurement  of Cellulase  activities, Pure  and Applied  Chemistry,  59,  257- 268 Indra,  D.,  K.Ramalingam,  and  Mary Babu.,  (2005), Isolation, Purification and Characterization of Collagenase from Hepatopancreas  of  The  Snail Achatian  fulica ,  Comparative Biochemistry  and  Physiology 142, 1-7 Koolman, J. dan Rohm, K.(2001), Atlas Berwarna dan Teks Biokimia ,
Terjemahan Septelia, Penerbit Hipokrates , Jakarta
Lee,Y.J., et al. (2008), “Purification and Characterization  of  Cellulase Produced by Bacillus amyoliquefaciens DL-3 Utilizing Rice Hull”, Bioresource  Technology, vol. 99 hal. 378–386 Soedigdo,  P.,  L.S.Nio,  A.  Soekeni,R.C. Barnett,  (1970),  Cellulase from  The  Snail  Achatina fulica  (Fer),  Physial  Zoology, 43,2,139-144 Soedigdo,  P.,  Muliawati,    M. Wirahadikusumah, (1980), Penuntun  Praktikum  Biokimia Dasar, edisi kedua , Departemen  Kimia  FMIPA ITB, Bandung.
Silaban,  Ramlan.,  (1999),
Enzim Selulolitik pada Bakteri
Pseudomonas alchaligenes PaAf-18 ,  PhD  Theses  from JBPTITBPP, Bandung
Sudarmadji,  S.,  Haryono,B.,  Harsono., (1984), Prosedur  Analisa untuk  Bahan  Makanan  dan Pertanian , Liberti, Yogyakarti Duff,  S.J.B.,  Murray,  W.D.,  (1996), Bioconvertion of forest products  industry  waste cellulosics  to  fuel  ethanol :  a review.  Bioresour.  Technol.
55, 1 – 33.