EFEK KONSUMSI MINUMAN BUBUK KAKAO ( Theobroma cacao L.)

## BEBAS LEMAK TERHADAP SIFAT ANTIOKSIDATIF LIMFOSIT SUBYEK PEREMPUAN
[The Effect of Fat Free Cocoa ( Theobroma Cacao L.) Powder Drinks Consumption on Antioxidative Activity of Lymphocyte of Women Subjects]
Erniati 1) , Fransiska R. Zakaria 2) *, dan Bambang Pontjo Priosoeryanto 3)
1) Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Malikussaleh, Lhokseumawe
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
3) Jurusan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 12 Juli 2011 / Disetujui 23 Mei 2012

## ABSTRACT
The health benefits of cocoa both in vivo and in vitro have been reported in many studies. Cocoa is a rich source of flavonoids known to have antioxidant activity, such as catechin, epicatechin and procyanidin. The aim of this research was to evaluate the effect of fat free cocoa powder drink consumption on antioxidative properties and proliferation activities of woman lymphocyte. Healthy woman subjects were divided into cocoa group (n = 9) and control group (n = 9). Cocoa powder drink containing skim milk and sugar was given to the cocoa groups every morning for 25 days. The control group received only water containing skim milk and sugar. Both cocoa and control group received physical medical checkup at the beginning and at the end of the intervention. Their peripheral blood was taken for lymphocyte antioxidant analysis. The measured antioxidant properties consisted of antiradical activity by DPPH method, malonaldehyde (MDA) and glutathione levels. The data of cocoa group showed that there  was  a  significant  increase  (p  ≤  0.05)  in  antiradical  level  from  31+11.2  to  40.19+7.42%  and  glutathione  from  48.2±10.5  to  66.7±15.9 μmol/land  a  decrease  in  MDA  level  in  the  lymphocyte  (p  <  0.05)  from  2.98±2.21  to  1.29±0.33 μmol/l as  compared  to  the  control  group  (from 25.77±6.9  to  26.79±6.12%;  34.7±20.7  to  37.8±19.2  μmol/land  3.01±1.53  to  2.069±0.707  μmol/l  respectively)  after  consumption  of  the  cocoa powder drink. The results of this research revealed that fat free cocoa powder has  a strong antioxidant activity which was manifested up to the blood cells.
Key words: cell antioxidants, fat free cocoa powder, glutathion, human lymphocyte, malonaldehyde

## PENDAHULUAN
1
Saat ini pangan telah makin diandalkan sebagai pemelihara kesehatan  dan  menjaga  kebugaran  tubuh.  Berbagai  jenis tanaman dan rempah-rempah telah dilaporkan mempunyai efek fungsional  yang  baik  bagi  kesehatan.  Dari  sinilah  lahir  konsep pangan  fungsional  ( functional  foods) (Zakaria et  al. ,  2003) . Salah  satu  jenis  pangan  yang  mulai  diteliti  mempunyai  efek dapat  meningkatkan  kesehatan  adalah  kakao  ( Theobroma cacao L.)  atau  yang  dikenal  sebagai  coklat.  Indonesia  adalah produsen  kakao  terbesar  ketiga  di  dunia.  Namun  sampai  saat ini, komoditas kakao Indonesia masih diproduksi dalam bentuk biji dan di pasaran internasional dihargai rendah.
Biji  kakao  dinyatakan  sebagai  bahan  yang  kaya  dengan flavonoid  diantaranya  adalah  senyawa  polifenol  yang  erat kaitannya  sebagai  zat  yang  mempunyai  kapasitas  antioksidan dalam  menangkal  radikal  bebas.  Polifenol  dalam  kakao  di- antaranya  adalah  katekin,  epikatekin,  prosianidin  dan antosianidin  (Hammerstone et  al .,  2000).  Menurut  Lee et  al. (2003),  kakao  mengandung  total  fenol  dan  kapasitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan anggur maupun teh. Sejumlah  penelitian  telah  mempelajari  efek  kakao  terhadap kesehatan,  baik  secara in  vitro maupun in  vivo .  Rein et  al. (2000) menyatakan bahwa konsumsi kakao yang kaya flavonoid
*Korespondensi Penulis : E-mail : fransiska_z@hotmail.com
memberikan  peningkatan  aktivitas  antiradikal  bebas  dalam darah  setelah  dua  jam  mengkonsumsi  coklat.  Berdasarkan penelitian  Zairisman  (2006)  bubuk  kakao  bebas  lemak  yang berasal  dari  perkebunan  Indonesia  mempunyai  aktivitas antiradikal  bebas  pada  sel  limfosit  manusia  secara in  vitro . Penelitian  tersebut  juga  membuktikan  bahwa  bubuk  kakao bebas lemak tidak bersifat toksik terhadap sel limfosit. Dengan demikian  tidak  akan  bersifat  toksik  terhadap  sel  tubuh organisme. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian secara in vivo dengan menggunakan responden manusia. Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  menguji  kemampuan bubuk  kakao  bebas  lemak  dalam  meningkatkan  sifat  anti- oksidatif  sel  limfosit  manusia  yaitu  sel  limfosit  perempuan. Adapun parameter sifat antioksidatif yang diukur meliputi kadar malonaldehid  (MDA),  kadar  glutation  dan  aktivitas  antiradikal bebas pada sel limfosit.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan  utama  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah bubuk biji kakao bebas lemak (0,1%) yang diperoleh dari Pusat Penelitian  Kopi  dan  Kakao  Indonesia  di  Jember.  Bubuk  yang digunakan merupakan bubuk biji kakao varietas bulk masak non fermentasi yang memiliki total fenol yang tinggi berdasarkan uji in  vitro (Zairisman,  2006).  Bahan  lain  yang  digunakan  adalah
gula pasir, air panas dan  susu  bubuk  skim. Bahan  kimia  yang digunakan  adalah  larutan histopaque (1077)  ( ficoll-hypaque ) dari  Sigma,  media  RPMI-1640,  trifan  biru,  pereaksi  TBA, pereaksi  TCA,  glutamin,  antibiotik  penisilin-streptomisin, aquabides, alkohol 90%, larutan PBS, pereaksi Ellman, pelarut air bebas ion 2,2-difenil-1-pictihidrazil (DPPH) dan metanol pro analisis.

## Pembuatan minuman bubuk kakao bebas lemak
Bubuk  kakao  bebas  lemak  sebanyak  4  g  dilarutkan  dalam 100 ml air panas, ditambahkan 2 gula dan 2 g susu bubuk skim. Minuman  bubuk  kakao  akan  diminum  oleh  responden  dalam keadaan hangat.

## Persiapan responden
Responden  yang  terlibat  dalam  penelitian  ini  adalah  18 orang mahasiswa IPB yang berusia 22 – 27 tahun dan berjenis kelamin  perempuan  yang  dengan  sukarela  terliba  tdalam penelitian  ini.  Responden  dibagi  dalam  2  kelompok  dimana masing-masing  kelompok  berjumlah  9  orang.  Kelompok  per- tama  merupakan  kelompok  kakao  yang  mengkonsumsi minuman  bubuk  kakao  bebas  lemak  dan  kelompok  kedua adalah  kelompok  kontrol  yang hanya mengkonsumsi minuman yang terdiri dari 2 g susu bubuk skim ditambah 2 g gula dalam 100  ml  air  hangat.  Pemilihan  responden  berjenis  kelamin perempuan  didasarkan  pada  kemudahan  dalam  menyediakan konsumsi dan kemudahan dalam hal koordinasi dengan peneliti. Responden  yang  dipilih  adalah  mahasiswi  yang  dinyatakan sehat berdasarkan hasil pemeriksaan kesehatan oleh dokter di Klinik Falfa Kampus Darmaga IPB.

## Pelaksanaan intervensi
Intervensi  dilaksanakan  selama  25  hari  pada  jam  07.00– 08.00 WIB setiap hari. Sebelum mengkonsumsi minuman bubuk kakao  responden  akan  mendapatkan  sarapan  pagi  yang seragam  dari  peneliti  dan  juga  makan  malam.  Sarapan  pagi yang  disediakan  adalah  jenis  sarapan  pagi  yang  sering  di- konsumsi  oleh  masyarakat  Indonesia  seperti  nasi  goreng  atau nasi  putih  dengan  lauk  yang  sederhana.  Begitu  juga  dengan makan  malam  yang  disediakan  adalah  makan  malam  seperti nasi  dengan  lauk-pauk.  Makan  siang  responden  tidak  disedia- kan  dengan  asumsi  responden  akan  makan  di  kantin  dengan menu  yang  hampir  sama.  Selama  penelitian  responden  tidak diizinkan  mengkonsumsi  makanan  atau  minuman  yang  me- ngandung  antioksidan  yang  sama  dengan  kakao  seperti  kopi, teh  atau  kue–kue  yang  banyak  mengandung  coklat.  Sebelum pelaksanaan  intervensi  juga  dilakukan  penandatanganan  surat perjanjian (“ inform consent ”).

## Pengambilan darah
Pengambilan  darah  dilakukan  2  kali  yaitu  sebelum  dan sesudah intervensi. Pengambilan darah dilakukan di Klinik Falfa Kampus Darmaga IPB pada jam 07.00-08.00 pagi oleh seorang asisten  tranfusi darah. Darah diambil  secara aseptis  sebanyak 35 ml dengan menggunakan jarum Precisionglide TM steril sekali pakai.  Darah  kemudian  ditempatkan  dalam  tabung vacutainer steril  yang  mengandung  koagulan  dan  segera  dianalisa  di laboratorium.
Isolasi limfosit Limfosit  manusia  diisolasi  dari  darah  ferifer  dengan sentrifugasi  berdasarkan  perbedaan  densitas  larutan ficoll- hypaque. Sampel  darah  disentrifus  pada  1500  rpm  selama  5 menit. Suspensi limfosit dilewatkan pada larutan ficoll-hypaque dan disentrifus 30 menit pada 2500 rpm. Endapan sel limfosit, dicuci dengan media RPMI dua kali dan disentrifus pada 1500 rpm  selama  10  menit.  Pelet  sel  yang  diperoleh  ditambah medium  pertumbuhan  RPMI  kemudian  dilakukan  perhitungan jumlah  sel  dengan  menggunakan  pewarna  trifan  biru  per- bandingan  1  :  1  dengan  menggunakan  hemasitometer  pada perbesaran  mikroskop  sebesar  100  kali.  Sel  yang  akan  diuji harus dalam kondisi hidup minimal 1 x 10 6 sel/ml. Sel yang akan dikultur harus ditambahkan serum darah golongan AB 10%.
Analisis  kadar  malonaldialdehid  (MDA)  sel  limfosit (Modifikasi metode Winarsi 2003; Hong et al., 2000) Sebanyak  100  μl  suspensi  sel  limfosit  atau  standar ditambahkan 75 μl TCA 20% (dalam 0,6 mol/L HCl). Setelah itu didinginkan  dalam  es  selama  20  menit,  campuran  tersebut disentrifus  pada  5000rpm  selama  20  menit.  Seratus  μl supernatan  yang  diperoleh  ditambahkan  20  μl  pereaksi  TBA dan dididihkan selama 30 menit. Setelah didinginkan campuran tersebut dimasukkan  kedalam lempeng sumur mikro 96  sumur dan  diukur  absorbansinya  dengan  menggunakan mikroplate reader pada panjang gelombang 540 nm. Kurva standar dibuat dengan  memplot  nilai  absorbansi  dengan  konsentrasi  standar. Konsentrasi MDA sel limfosit dapat dihitung berdasarkan kurva standar.
Analisis  kadar  glutation  sel  limfosit  (Modifikasi metode Bergemeyer 1990; Zakaria et al., 2003) Sebanyak  0,5  ml  suspensi  sel  limfosit  yang  telah  dilisis ditambahkan  0,25  ml  asam  sulfosalisilat  50%  dan  disentrifus pada 2500 rpm selama 15 menit. Sebanyak 100 μl supernatan yang diperoleh kemudian dimasukkan kedalam lempeng sumur mikro  96  sumur,  lalu  ditambahkan  150  μl  PBS  dan  50  μl pereaksi  Ellman  yaitu  5,5’-ditio-bis-2-nitrobenzoat  (DTNB). Kadar  glutation  dapat  dibaca  dengan  mengukur  absorbansi menggunakan microplate  reader pada  panjang  gelombang  λ= 415  nm.  Kemudian  diukur  juga  absorbansi  standar  glutation pada  berbagai  konsentrasi.  Konsentrasi  glutation  tereduksi (GSH) limfosit dihitung berdasarkan kurva standar.
Analisis aktivitas antiradikal bebas sel limfosit dengan metode DPPH (Modifikasi Turkmen et al., 2005) Suspensi  sel  limfosit  yang  memiliki  jumlah  sel  1,1  x  10 6 sel/ml  terlebih dahulu dilisis dalam air deionisasi dan disimpan pada  suhu  -30°C.  Sebanyak  1  ml  suspensi  sel  limfosit  yang telah  dilisis  diambil  dan  ditambahkan  metanol  proanalisis  1  ml serta  DPPH  0,2  mM  sebanyak  1  ml  dan  dikocok.  Kemudian disimpan dalam  ruang gelap (tanpa  cahaya)  selama 60 menit. Sampel  diukur  dengan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang  517  nm.  Sebagai  kontrol  digunakan  campuran larutan  DPPH  dan  metanol.  Absorbansi  dari  tiap-tiap  sampel didapat  dan  aktivitas  antiradikal  bebas  sel  limfosit  dapat dihitung.
0 1 2 3 4 5 6 K 1 K 2 K 3 K 4 K 5 K 6 K 7 K 8 K 9 N ila i M D A (m ik ro m ol/ lit er ) Responden Sebelum Sesudah 0 10 20 30 40 50 60 P 1 P 2 P 3 P 4 P 5 P 6 P 7 P 8 P 9 Ak tiv ita s An tira dik al Be ba s (% ) Responden Sebelum Sesudah

## Analisa data
Analisa  statistik  terhadap  data  yang  diperoleh  dilakukan dengan  menggunakan  uji  t  ( t-test )  perbandingan  dua  sampel untuk  melihat  adanya  pengaruh  nyata  konsumsi  minuman bubuk  kakao  bebas  lemaksebelum  dan  sesudah  intervensi antara kelompok perlakukan dan kelompok kontrol.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Keadaan umum responden
Berdasarkan  pemeriksaan  kesehatan  oleh  dokter  dinyata- kan bahwa semua responden berada dalam keadaan sehat dan tidak  menderita  penyakit  yang  serius.  Begitu  juga  setelah mereka  menjalani  intervensi,  kesehatan  mereka  tetap  baik. Hasil  pengukuran  antropometri  responden,  terjadi  kenaikan berat  badan  pada  kelompok  kakao  dan  kelompok  kontrol walaupun sangat kecil yaitu sekitar 1,23 %. Van Heerden (2006) mengemukakan  bahwa  konsumsi  coklat  bukanlah  penyebab utama  obesitas.  Dalam  penelitian  ini,  konsumsi  flavanol  kakao selama  28  hari  tidak  menyebabkan  perubahan  berat  badan secara nyata antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol.

## Sifat antioksidatif sel limfosit
Parameter  yang  diukur  untuk  menggambarkan  sifat  anti- oksidatif sel limfosit pada penelitian ini adalah nilai MDA, kadar glutation  dan  antiradikal  bebas  sel  limfosit.  Rekapitulasi  nilai rata-rata  sifat  antioksidatif  sel  limfosit  kelompok  kakao  dan kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi dapat dilihat pada Tabel 1 berikut.
Tabel  1.  Rekapitulasi  nilai  rata-rata  sifat  antioksidatif  sel  limfosit responden  yang  menerima  minuman  kakao  atau  kontrol tanpa  kakao.  Perbedaan  sebelum  dan  sesudah  konsumsi dinyatakan dalam bentuk notasi
Parameter Responden Nilai Rata-Rata ± SD Sebelum Sesudah Nilai MDA (μmol/l) Kakao Kontrol 2,98 a ± 2,21 3,01 a ± 1,53 1,29 b ± 0,328
2,069 a ± 0,707 Kadar glutation (μmol/l) Kakao Kontrol 48,2 a ± 10,5
34,7 a ± 20,7 66,7 b ± 15,9
37,8 a ± 19,2 Antiradikal bebas (%) Kakao Kontrol 31 a ± 11,2 25,77 a ± 6,9 40,19 b ± 7,42 26,79 a ± 6,12
Keterangan: Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (p ≤ 0,05)

## Nilai malonaldehida (MDA) sel limfosit
Gambaran  nilai  MDA  sel  limfosit  kelompok  kakao  dan kelompok  kontrol  masing-masing  responden  sebelum  dan sesudah intervensi dapat dilihat pada Gambar 1.
Data responden K 5 setelah intervensi tidak dapat diakses karena responden berhalangan, namun data sebelum intervensi dianggap  dapat  menambah  informasi  status  awal  responden. Penurunan nilai MDA sel limfosit kelompok kakao yang berbeda nyata  dengan  kelompok  kontrol  dapat  diduga  karena  efek konsumsi  bubuk  kakao  bebas  lemak  selama  25  hari.  Seperti diketahui  berdasarkan  penelitian  Zairisman  (2006)  ekstrak bubuk  kakao  bebas  lemak  dalam  pelarut  air  mengandung senyawa polifenol yang tinggi. Dalam hal ini senyawa polifenol
kakao  yaitu  dari  golongan  flavonoid  dapat  berfungsi  sebagai antioksidan primer. Kochhar dan Rossell (1990) mengemukakan bahwa  senyawa  polifenol  dapat  berfungsi  sebagai  antioksidan primer  karena  mampu  menghentikan  reaksi  berantai  radikal bebas  yang  terjadi  di  dalam  sel.  Polifenol  akan  bereaksi langsung  dengan  senyawa  peroksida  radikal  yang  terdapat pada  membran  sel  atau  di  dalam  sel.  Dengan  demikian  dapat menurunkan nilai MDA yang merupakan produk oksidasi asam lemak karena radikal bebas.
Gambar 1.    Nilai MDA sel limfosit kelompok perlakuan (A) dan kontrol (B)

## Antiradikal bebas sel limfosit dengan metode DPPH
Fang et  al. (2002)  mengemukakan  bahwa  dalam  tubuh manusia  secara  alami  mempunyai  antioksidan  seluler  yang dapat  menghambat  pembentukan  senyawa  radikal.  DPPH adalah  senyawa  radikal  yang  dapat  bereaksi  dengan antioksidan  sel  (Fang et  al., 2002).  Gambaran  nilai  aktivitas antiradikal bebas dari hasil penelitian disajikan pada Gambar 2.
Peningkatan  antiradikal  bebas  sel  limfosit  kelompok  kakao setelah  intervensi  disebabkan  bubuk  kakao  yang  dikonsumsi adalah  bubuk  kakao  yang  mempunyai  kandungan  polifenol yang  tinggi.  Wollgast  dan  Anklam  (2000)  mengemukakan bahwa  polifenol  dalam  biji  kakao  memiliki  aktivitas  antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas sehingga bermanfaat bagi tubuh.
Peningkatan  kemampuan  antiradikal  sel  limfosit  oleh polifenol  kakao  diduga  karena  senyawa  polifenol  yang  ter- kandung  dalam  minuman  bubuk  kakao  dapat  masuk  kedalam sirkulasi  darah.  Rein et  al. (2000)  mengemukakan  bahwa konsumsi  coklat  yang  kaya  akan  flavanol  akan  memberikan peningkatan  kapasitas  antioksidan  darah  dalam  waktu  2  jam
B
A
0 10 20 30 40 50 60 P 1 P 2 P 3 P 4 P 5 P 6 P 7 P 8 P 9 Ak tiv ita s An tir ad ik al Be ba s (% ) Responden Sebelum Sesudah 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 P 1 P 2 P 3 P 4 P 5 P 6 P 7 P 8 P 9 Ka da r G lu ta tio n (m /L ) Responden Sebelum Sesudah 0 10 20 30 40 50 60 70 K 1 K 2 K 3 K 4 K 5 K 6 K 7 K 8 K 9 Ka da r G lu ta tio n (m ol/ L) Responden Sebelum Sesudah 0 5 10 15 20 25 30 35 40 K 1 K 2 K 3 K 4 K 5 K 6 K 7 K 8 K 9 Ak tiv ita s An ti R ad ik an B eb es (% ) Responden Sebelum Sesudah
setelah  memakan  coklat.  Mekanisme  peningkatan  antiradikal bebas  sel  limfosit  diduga  bisa  terjadi  melalui  aktivitas antioksidan primer dimana senyawa polifenol dari kakao masuk dalam  sel  limfosit  akan  bereaksi  secara  langsung  dengan radikal  bebas  yang  menyerang  sel,  dalam  hal  ini  senyawa DPPH.  Semakin  banyak  DPPH  yang  bereaksi,  maka  semakin tinggi antiradikal yang dimiliki oleh sel tersebut.
Gambar 2.   Aktivitas antiradikal bebas sel limfosit kelompok perlakuan (A) dan kontrol (B)

## Kadar glutation sel limfosit
Gambaran  kadar  glutation  sel  limfosi  tdapat  dilihat  pada Gambar 3. Nilai glutation limfosit subjek K 5 setelah intervensi tidak  dapat  ditunjukkan  karena  subjek  berhalangan  untuk  ber- partisipasi pada hari pengambilan darah, namun nilai parameter sebelum  intervensi  dapat  menunjang  nilai  keseluruhan responden.  Peningkatan  kadar  glutation  sel  limfosit  karena konsumsi  minuman  bubuk  kakao  bebas  lemak  diduga  karena senyawa flavonoid yang terkandung dalam bubuk kakao dapat menggantikan  sebagian  dari  fungsi  glutation  sel  limfosit. Komponen  polifenol  kakao  mungkin  dapat  bekerja  secara sinergis bersama glutation sel dalam menetralisir radikal bebas. Seperti diketahui glutation merupakan sistem antioksidan primer di  dalam  sel.  Glutation  disintesis  secara  kontinyu  dalam  sel melalui  reaksi  gamma-glutamil  oleh  enzim γ-glutamylcysteine synthetase dan  enzim  glutation synthase (GSH)  yang  melibat- kan  beberapa  deret  asam  amino  (Yan  dan  Meister,  1990). Adanya  polifenol  kakao  yang  bersifat  sebagai  antioksidan
primer  dapat  menangkal  senyawa  radikal  sehingga  glutation yang disintesis oleh sel tidak akan berkurang jumlahnya.
Gambar  3.    Kadar  glutation  sel  limfosit  kelompok  perlakuan  (A)  dan kontrol (B)
Mekanisme  lain  peningkatan  kadar  glutation  sel  limfosit setelah  mengkonsumsi  minuman  bubuk  kakao  bebas  lemak diduga  bahwa  senyawa  flavonoid  dalam  bubuk  kakao  dapat menstimulir ekspresi genetika dalam sintesis glutation. Moskaug et al. (2005) mengemukakan bahwa ekstrak bawang yang kaya dengan  senyawa  flavonoid  dapat  menstimulir  enzim γ- glutamylcysteine synthetase melalui antioksidan respon elemen (AREs)  yang  merupakan  enzim  promotor  sintesis  glutation  di dalam  sel  tikus.  Dalam  penelitian  lain  dengan  menggunakan tikus percobaan diperoleh bahwa senyawa  flavonoid dari buah berry  dapat  memodulasi  ekspresi  gen γ-glutamylcysteine synthetase dalam  sintesis  glutation  (Myhrstad et  al., 2006). Winarsi  (2003) melaporkan peningkatan glutation pada limfosit manusia yang diberi flavonoid kedele. Montgomery et al. (2002), melaporkan peranan vitamin dari makanan dalam limfosit tikus. Laporan  penelitian  ini  memperlihatkan  pengaruh  antioksidan makanan  sampai pada  taraf  seluler, misalnya  sel limfosit, baik secara in vitro maupun in vivo pada manusia.

## KESIMPULAN
Konsumsi  minuman  bubuk  kakao  bebas  lemak  setiap  hari selama  25  hari  berpengaruh  nyata  dalam  meningkatkan kapasitas  antioksidan  sel  limfosit  manusia  khususnya  perem- puan  yang  meliputi  meningkatnya  antiradikal  bebas  dengan
A B A B
metode DPPH, meningkatnya kadar glutation dan menurunnya nilai  MDA  sel  limfosit.  Dengan  demikian  dapat  disimpulkan bahwa  mengkonsumsi  minuman  bubuk  kakao  bebas  lemak yang  merupakan  hasil  samping  produksi  lemak  kakao  dapat meningkatkan  kapasitas  antioksidan  sampai  kedalam  sel limfosit  sehingga  berpotensi  melindungi  sel  limfosit  dari  stress oksidatif. Dengan meningkatnya  sifat antioksidatif limfosit  yang mengindikasikan  perbaikan  sistim  imunitas  tubuh  perempuan, maka dapat dikatakan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas  lemak  dapat  berkontribusi  meningkatkan  kesehatan manusia.

## DAFTAR PUSTAKA
Bergmeyer  HU.  1990. Methods  of  Enzymatic  Analysis . Germany: VCH Verlagsgesellschaft Gmbh.
Fang YZ, Yang S, Wu G. 2002. Free radicals, antioxidants, and nutrition. Nutr 18: 872 – 879.
Hammerstone JF, Lazarus SA, Schmitz HH. 2000. Procyanidin content and variation in some commonly consumed foods. J Nutr 130: 2086S–2092S.
Hong  YL,  Yeh  SL,  Chang  CY,  Hu  ML.  2000.  Total  plasma malonaldehyde  levels  in  16  Taiwanese  College  Students determined by various thiobarbituric acid test and improved high  performance  liquid  chromatography  based  method. Clin Biochem 33: 619-625.
Kochhar  SP,  Rossel  JB.  1990.  Detection,  estimation  and evaluation of antioxidant in food system. Di dalam: Hudson BJF  (ed). Food  Antoxidant . London: Elsevier App Scip 19- 64.
Lee  KW,  Kim  YJ,  Lee  HJ,  Lee  CY.  2003.  Cocoa  has  more phenolic  phytochemical  and  a  higher  antioxidant  capacity than teas and red wine. J Agric Food Chem 51: 7292–7295.
Montgomery  BA,  Murphy  J,  Chen  JJ,  Desai  VG,  McGarrity  L,
Morris  SM,  Casciano  DA,  Aidoo  A.  2002.  Mutagenicity  of food-derived  carcinogens  and  the  effect  of  antioxidant vitamins. Nutr Cancer 43:103-10.
Moskaug  J,  Carlsen  H,  Myhrstad  MCW,  Blomhoff  R.  2005. Polyphenols and glutathione synthesis regulation. Am J Clin Nutr 81(Suppl): 277S-283S.
Myhrstad MCW, Carlsen H, Dahl LI, Ebihara K, Glemmestad L,
Haffner  K,  Moskaug  JO,  and  Blomhoff  R.  2006.  Bilberry extracts  induce  gene  expression  through  the  electrophile response element. Nutr and Cancer 54: 94-101.
Rein  D,  Lotito  S,  Holt  RR,  Keen  CL,  Schmitz  HH,  Fraga  GG.
2000.  Epicatechin  in  human  plasma:  in  vivo  determination and effect of chocolate consumption on plasma antioxidant capacity. Am J Clin Nutr 72: 30 – 35.
Turkmen N, Ferda S, Velioglu YS. 2005. The effect of cooking methods  on  total  phenolics  and  antioxidant  activity  of selected green vegetables. Food Chem 93: 713–718.
Van  Heerden  IV.  2006.  Chocolate  update  for  Easter.  http:// www.health24.com/dietnfood/Weight_Centre/15-51- 736,1867. Asp. [27 April 2006].
Winarsi  H.  2003.  Respon  imunitas  dan  hormonal  wanita premenopause  terhadap  minuman  susu  fungsional  yang disuplementasi  dengan  isoflavon  kedelai  dan  difortifikasi dengan  seng.  [Desertasi].  Prog  Studi  Ilmu  Pangan  Prog Pascasarjana IPB, Bogor.
Wollgast J, Anklam E. 2000. Polyphenols in chocolate: is there a contribution to human health?. J Food Res Intern 33: 449– 459.
Yan N, Meister A. 1990. Amino acid sequence of rat kidney γ- glutamylcysteine synthetase. J Biol Chem 265: 1588-1593.
Zairisman  SZ.  2006.  Potensi  imunomodulator  bubuk  kakao bebas  lemak  sebagai  produk  sub  standar  secara in  vitro pada  sel  limfosit  manusia.  [Skripsi].  Jurusan  Ilmu  dan Teknologi Pangan, IPB, Bogor.
Zakaria  FR,  Nurrahman,  Prangdimurti  E,  Tejasari.  2003. Antioxidant  and  immunoenhancement  activities  of  ginger ( Zingiberofficinale Roscoe) extracts and compounds in vitro and  in  vivo  mouse  and  human  system.  Nutraceuticals  and Food 8: 96-104.