ISSN: 1410-8917 Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (3) (2011) : 89 – 93

## Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi

## Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Uji Antikanker Isolat Bioaktif L- asparaginase dari Kunyit ( Curcuma domestica Val) terhadap Sel Kanker Serviks
Putri Puspita Wardani a , Suprihati b , Wuryanti a
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang b Otolaryngology Department, Faculty of Medicine, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
Art ic le   Info

## Ab s t rac t
Keywords: Cervical cancer, L- asparaginase , an anticancer,
turmeric, LC 50 values
Cervical cancer is the leading cause of death in women in developing countries. Various methods of therapy of this disease have been done, among others with the use of bioactive compounds as anticancer agents, one of which is turmeric ( Curcuma domestica Val). This study aims to isolate, purify, determine the value of the highest specific  activity, LC 50 value  and potent anticancer potential  of  L- asparaginase from  turmeric  on  cervical  cancer  cell  culture  (HeLa).  The  L- asparaginase enzyme  was  isolated  by  extraction  method  then  purified  by  fractionation  and dialysis. L- asparaginase activity was tested using Nessler method, while the determination of protein content was measured by Lowry method. Specific activity was determined through the ratio of activity units to protein content. The highest enzyme L- asparaginase enzyme fraction was tested for its cytotoxicity against HeLa cells by MTT method (3- (4,5-dimethyltiazole-2- yl)  -2,5-diphenyltetrazoliumbromide)  and  its  anticancer  potential  was  determined  by calculating the LC 50 value. The results concluded that L- asparaginase enzyme could be isolated and purified from turmeric with the highest specific activity at fraction 4 of 284.04 units/mg protein. The cytotoxicity test of HeLa cells showed LC 50 value of  91.833 μg/mL, hence  the L- asparaginase fraction 4 enzyme from the turmeric was able to inhibit the growth of HeLa cells, however it was less potential as an anticancer agent based on NCI (National Cancer Institute) standard.

## Ab s t rak
Kata kunci:
Kanker serviks, L- asparaginase , antikanker, kunyit, nilai LC 50
Kanker  serviks  merupakan  penyebab  kematian  terbesar  pada  wanita  di  negara  berkembang. Berbagai metode terapi penyakit ini telah dilakukan, di antaranya dengan penggunaan senyawa bioaktif  sebagai  agen  antikanker,  salah  satunya  adalah  kunyit  ( Curcuma  domestica Val). Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, memurnikan, menentukan nilai aktivitas spesifik tertinggi, nilai  LC 50 dan potensi antikanker enzim L- asparaginase dari kunyit pada kultur sel kanker  serviks  (HeLa).  Enzim  L- asparaginase diisolasi  dengan  metode  ekstraksi  kemudian dimurnikan dengan fraksinasi dan dialisis. Uji aktivitas L- asparaginase menggunakan metode Nessler,  sedangkan  penentuan  kadar  protein  dilakukan  dengan  metode  Lowry.  Aktivitas spesifik ditentukan melalui perbandingan unit aktivitas terhadap kadar protein. Fraksi enzim L- asparaginase yang  memiliki  aktivitas  spesifik  tertinggi  diuji  sitotoksisitasnya  terhadap  sel HeLa  dengan  metode  MTT  (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromida)  dan potensi antikankernya ditentukan dengan menghitung nilai LC 50 . Hasil penelitian disimpulkan bahwa  enzim  L- asparaginase dapat  diisolasi  dan  dimurnikan  dari  kunyit  dengan  aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi 4 sebesar 284,040 unit/mg protein. Uji sitotoksisitas pada sel HeLa menunjukkan nilai LC 50 sebesar 91,833 μg/mL, sehingga isolat enzim L- asparaginase fraksi 4 dari kunyit mampu menghambat pertumbuhan sel HeLa, tetapi kurang berpotensi sebagai agen antikanker berdasarkan standar NCI (National Cancer Institute).
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (3) (2011) : 89 – 93

## 1. Pendahuluan
Survei  kesehatan  nasional  tahun  2001  dan  sistem informasi rumah sakit tahun 2006 menunjukkan bahwa kanker  merupakan  penyebab  kematian  kelima  di Indonesia.  Kanker  serviks  (leher  rahim)  merupakan penyebab utama kematian akibat kanker pada wanita di negara  berkembang  [1].  Ada  berbagai  macam  cara penyembuhan  untuk  mengobati  kanker  serviks  yaitu dengan teknologi seperti kemoterapi [2] dan pengobatan bahan  alam  akan  tetapi  tedapat  efek  samping  dari penggunaan  kemoterapi  sehingga  merugikan  penderita [3].
Pengobatan  dengan  bahan  alam  merupakan  cara yang  efektif  sebab  tidak  ada  efek  samping  yang ditimbulkan  [4].  Ada  berbagai  macam  tumbuhan  obat bahan alam untuk kanker seperti benalu teh, temulawak, kunyit,  dan  benalu  petai  yang  berfungsi  sebagai  bahan antikanker.  Kunyit  merupakan  tumbuhan  yang mempunyai kandungan curcumin yang cukup tinggi dan berpotensi menjadi obat kanker sehingga sekarang para peneliti  mulai  meneliti  untuk  mengobati  kanker  dari tumbuhan kunyit [5].
Enzim  L- asparaginase terdapat  di  dalam  kunyit diamana kinerjanya mampu menghambat kanker. Enzim tersebut  termasuk  salah  satu  enzim  hidrolase  yang mengkatalisis  reaksi  hidrolisis  L-aspargin  menjadi  L- aspartat  dan  amonia  sehingga  kanker  tidak  dapat melakukan pembelahan sel [6], karena  L-asparagin itu sendiri  berfungsi  sebagai  sumber  nutrisi  telah  diubah dalam bentuk senyawa lain oleh enzim tersebut [7].
Penelitian  kali  ini  yaitu  mengisolasi  dan  menguji enzim  L- asparaginase dari  kunyit  ( Curcuma  domestica Val) terhadap sel kanker serviks (sel HeLa) yang mengacu pada  beberapa  penelitian  tentang  isolasi  enzim  L- asparaginase dari tumbuhan temulawak dan kunyit putih. Enzim  L- asparaginase diisolasi  menggunakan  metode ekstraksi selanjutnya dimurnikan dengan fraksinasi dan dialisis.  Uji  aktivitas  enzim  L- asparaginase dilakukan dalam kondisi optimum yaitu pada suhu 37 o C, pH 8,5 dan waktu  inkubasi  30  menit  dengan  metode  Nessler sedangkan  uji  kadar  protein  dengan  metode  Lowry. Aktivitas spesifik ditentukan melalui perbandingan unit aktivitas  terhadap  kadar  protein.  Satu  unit  aktivitas  L- asparaginase dapat  didefinisikan  sebagai  banyaknya enz im yang dapat membentuk 1 μmol amonia per menit pada kondisi optimum [8].  Fraksi enzim  L- asparaginase yang  memiliki  aktivitas  spesifik  tertinggi  diuji sitotoksisitasnya terhadap sel HeLa dengan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazoliumbromida)  dan  potensi  antikankernya ditentukan dengan menghitung nilai LC 50 .

## 2. Metodologi

## Alat & Bahan
Alat-alat  gelas  laboratorium  yang  biasa  digunakan untuk  analisis,  kertas  saring,  mikropipet,  membran selofan,  tabung  sentrifus  (Nunc),  sentrifugator ( Centrific-228 ),  inkubator  ( Memmert ),  blender  ( Philip ), neraca  analitik  ( Kern  870 ),  pHmeter  ( Orain-420A ),
magnetic  stirer ( Thermolyne  Cimarec ),  spektrofotometer UV-Vis ( Shimadzu ), freeze dryer , laminar air flow cabinet , microplate  96-wells (Nunc),  mikroskop  flouresens  dan ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay ) Reader .
Kunyit,  L-asparagin,  amonium  sulfat,  BSA ( bovine serum albumin ), merkuri (II) iodida, Folin-ciocalteau , TCA ( Trichloroacetic  acid ),  barium  (II)  klorida,  tris- hidroksimetil-aminometan,  asam  klorida,  natrium karbonat,  kalium-natrium  tartrat,  natrium  hidroksida, kalium  iodida,  tembaga  (II)  sulfat,  akuades,  sel  HeLa, tripsin,  medium  RPMI  ( Roswell  Park  Memorial  Institute ) 1640  (Sigma),  FBS  ( Fetal  Bovine  Serum )  10%  (Gibco), reagen SDS ( Sodium Dodecyl Sulfate ) 10%, MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliumbromida).

## Isolasi Enzim
Kunyit  yang  telah  dipotong-potong diambil 1000  g ditambah 500 mL buffer tris-hidroksimetil aminometan 0,2 M pH = 8,6 dan diblender hingga tercampur semua. Campuran  didiamkan  selama  1,5  jam  pada  suhu  5ºC kemudian disaring, dan filtratnya disentrifus pada 3400 rpm selama 10 menit. Filtrat yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar enzim  L- asparaginase dari kunyit.

## Fraksinasi Enzim dengan Garam Amonium sulfat
Garam amonium sulfat ditimbang untuk memperoleh  kejenuhan  secara  berturut-turut    0-20%, 20-40%,  40-60%,  60-80%,  dan  80-100%.  Amonium sulfat ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam 416 mL ekstrak enzim sedikit demi sedikit sambil diaduk sampai larut. Pengadukan dengan menggunakan magnetic stirer di  dalam  penangas  air  berisi  es.  Campuran  kemudian didiamkan  selama  1  malam  di  dalam  kulkas  dan disentrifus  pada  3500  rpm  selama  50  menit.  Endapan yang diperoleh dipisahkan dan disuspensikan ke dalam 3 mL  buffer  tris-hidroksimetil  aminometan  0,2  M  pH  = 8,6.  Suspensi  ini  mempunyai  kejenuhan  0-20%  dan disebut sebagai fraksi 1.
Secara terpisah filtrat dari fraksi 1 ditambah garam amonium sulfat fraksi 20-40%. Endapan yang diperoleh diperlakukan  sama  seperti  untuk  mendapatkan  fraksi  1 sehingga diperoleh fraksi 2, selanjutnya dilakukan secara berturut-turut  hingga  diperoleh  fraksi  3,  fraksi  4  dan fraksi 5.

## Proses Dialisis
Membran  selofan  direbus  selama  30  menit kemudian  dicuci  dengan  akuades.  Salah  satu  ujung selofan diikat dengan benang kemudian ke dalam selofan diisi enzim fraksi I setelah itu pada ujung lainnya diikat dengan  benang.  Selofan  yang  telah  terisi  enzim  fraksi  1 direndam di dalam buffer tris-hidroksimetil aminometan  0,002  M  pH  =  8,6  dan  diaduk  dengan pengaduk magnet pada keadaan dingin dan setiap 2 jam buffer  diganti  dan  diuji  kandungan  amonium  sulfatnya pada larutan di luar selofan dengan BaCl 2 0,01 M. Dialisis dihentikan  setelah  pengujian  dengan  BaCl 2 tidak membentuk  endapan  putih  BaSO 4 lagi.  Pada  tahap  ini diperoleh enzim L- asparaginase F1. Perlakuan yang sama diterapkan  untuk  mendapatkan  enzim  L- asparaginase
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (3) (2011) : 89 – 93
F2,  F3,  F4,  dan  F5.  Fraksi  yang  akan  diujikan  pada  sel kanker dikeringkan dengan menggunakan Freeze dryer .

## Penentuan Aktivitas Enzim
Sebanyak  1  mL  larutan  L-asparagin,  0,1  mL  enzim dan 0,4 mL buffer tris-hidroksimetil aminometan 0,2 M pH = 8,6 dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Campuran ini  diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  30  menit  dan ditambah  1 mL TCA 1,5 M selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 3400 rpm selama 15 menit.
Setelah itu diambil 0,5 mL filtrat ditambah akuades 8,5  mL  dan  pereaksi  Nessler  1  mL.  Campuran  ini didiamkan beberapa menit kemudian absorbansi diukur pada  panjang  gelombang  maksimum  (420  nm). Sementara itu larutan kontrol dibuat dari enzim 0,2 mL yang telah dihilangkan aktivitasnya dengan menambahkan  0,8  mL  buffer  tris-hidroksimetil aminometan  0,2  M  pH  =  8,6  dan  1  mL  L-asparagin. Aktivitas  enzim  ditentukan  berdasarkan  kurva  standar amonium sulfat.

## Uji Kadar Protein
Sebanyak 0,1 mL larutan protein hasil fraksinasi (EK, F1,  F2,  F3,  F4,  dan  F5)  ditambah  dengan  2  mL  larutan Lowry C dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37ºC. Selanjutnya  campuran  ini  ditambah  dengan  0,2  mL Lowry  D  dan  diinkubasi  pada  suhu  kamar  selama  10 menit dengan sesekali dikocok. Larutan tersebut diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum BSA (750  nm)  kemudian  ditentukan  kadar  protein berdasarkan kurva standar BSA.

## Uji Sitotoksisitas
Ekstrak dibuat dengan seri konsentrasi 1000 μg/mL, 500  μg/mL,  250  μg/mL,  125  μg/mL,  62,5  μg/mL,  31,25 μg/mL,  15,625  μg/mL,  7,812  μg/mL,  3,906  μg/mL,  dan 1,9 5  μg/mL  dalam  medium  RPMI.  Sel  HeLa  mula -mula dilakukan pensentrifusan selama 5 menit pada 1500 rpm, pellet  sel  tersebut  disuspensikan  dalam  4  mL  FBS  10%, dihomogenkan,  kemudian  jumlah  sel/mL  dihitung menggunakan Hemocytometer di bawah mikroskop. Sel ditambah  medium  RPMI  dimasukkan  dalam  plate sebanyak 100 μL/well dengan jumlah sel 2x104 sel/well, diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2. Sel hasil inkubasi  ditambah  100  μL/well  enzim  L - asparaginase dengan berbagai konsentrasi diinkubasi kembali selama 24 jam dalam inkubator CO2, larutan MTT ditambahkan dalam  plate  hasil  inkubasi  sebanyak  10  μL/well  dan diinkubasi  kembali  selama  4  jam.  Reaksi  dihentikan dengan  penambahan  100  μL/well  reagen  SDS  10%, didiamkan selama semalam kemudian diukur absorbansinya dengan ELISA Reader.
Hasil Analisis Data absorbansi yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dianalisis dengan menghitung % kematian sel HeLa berdasarkan rumus:
Data  diplotkan  dalam  kurva  linear  yaitu  log konsentrasi  sebagai  sumbu  x  versus  persen  kematian sebagai sumbu y, sehingga diperoleh persamaan garis:
y = mx + c
Nilai LC 50 ditentukan dengan mensubstitusi nilai 50 pada  koefisien  y  sehingga  diperoleh  nilai  x.  Log konsentrasi adalah x maka konsentrasi adalah antilog x yang merupakan nilai LC 50 .

## 3. Hasil dan Pembahasan
Isolasi Enzim L- asparaginase dari Kunyit
Isolasi enzim L- asparaginase ini melalui dua tahap, yaitu  ekstraksi  dan  sentrifugasi.  L- asparaginase ini diisolasi dari kunyit dengan cara pemblenderan. Sebelum diblender, dilakukan penambahan buffer tris- hidroksimetil  aminometan    0,2  M  pH  =  8,6  untuk menjaga pH larutan enzim sehingga pada saat keluar dari jaringan,  enzim  tidak  mengalami  kerusakan.  Tujuan ekstraksi adalah untuk memisahkan  L- asparaginase dari sel.  Hasil  pemblenderan  berupa  campuran,  yang  terdiri dari  bermacam-macam  komponen,  yaitu  protein  dan non-protein  dari  kunyit.  Setelah  pemblenderan, dilanjutkan  pendiaman  campuran  pada  suhu  5ºC,  pada suhu ini enzim akan menjadi tidak aktif, sehingga dalam proses selanjutnya enzim tidak mengalami kerusakan.
Tahap  berikutnya  adalah  penyaringan,  dilakukan untuk memisahkan residu dan filtrat, dimana komponen sel  akan  berada  sebagai  endapan,  sedangkan  molekul protein  dan  non-protein  terdapat  pada  filtrat.  Filtrat hasil  pemblenderan  disentrifuse  untuk  memisahkan komponen protein (enzim) dari komponen non-protein. Sentrifugasi  bekerja  dengan  prinsip  pengendapan berdasarkan gaya sentrifugal, pada kecepatan sentrifugasi sama, molekul dengan berat yang lebih besar akan  mengendap  terlebih  dahulu.  Pemisahan  ini diperoleh  endapan  yang  berisi  sisa-sisa  komponen  sel dan  filtrat  yang  berisi  protein  enzim  dan  protein  non- enzim.
Enzim  kasar  merupakan  campuran  protein  enzim dan  protein  non-enzim.  Salah  satu  pemurnian  enzim dengan  cara  fraksinasi  bertingkat  untuk  memperoleh protein  enzim.  Fraksinasi  yang  dilakukan  untuk memurnikan  enzim  menggunakan  tingkat  kejenuhan garam amonium sulfat yang berbeda sehingga diperoleh endapan protein enzim yang berbeda, yaitu F1, F2, F3, F4, dan  F5.  Proses  fraksinasi  terjadi  penurunan  kelarutan protein  akibat  naiknya  konsentrasi  garam  amonium sulfat, peristiwa ini disebut salting out . Fraksinasi diikuti dengan  sentrifugasi  untuk  memisahkan  endapan  dan filtrat.
Protein  enzim  hasil  fraksinasi  bertingkat  masih mengandung  amonium  sulfat,  maka  dilakukan pemurnian  lebih  lanjut  untuk  memisahkan  amonium sulfat  dari  protein  enzim  tersebut.  Proses  pemisahan tersebut  dengan  cara  dialisis  menggunakan  membran selofan.  Dialisis  bertujuan  untuk  memisahkan  partikel- partikel  kecil  dari  pertikel-partikel  besar  dengan menggunakan membran berdasarkan pada prinsip difusi. Pengujian  dengan  larutan  BaCl 2 untuk  mengetahui
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (3) (2011) : 89 – 93
kandungan  amonium  sulfat  pada  fraksi  tersebut,  jika dengan  penambahan  BaCl 2 pada  larutan  buffer  di  luar membran  tidak  menimbulkan  endapan  putih  berarti enzim telah terbebas dari amonium sulfat dan diperoleh L- asparaginase lebih  murni.  Enzim  yang  akan  diujikan terhadap  sel  kanker  dikeringkan  dengan  menggunakan freeze  dryer untuk  mengeringkan  enzim  dan  menjaga enzim agar tidak rusak.
Penentuan Unit Aktivitas, Kadar Protein, dan Aktivitas Spesifik Enzim L- asparaginase
Enzim  L- asparaginase ditentukan  aktivitasnya dengan  mereaksikan  enzim  tersebut  menggunakan substrat  yang  sesuai.  Substrat  yang  digunakan  pada reaksi  enzimatis  ini  adalah    L-asparagin.  Pada  reaksi enzimatis,  L-asparagin  akan  terurai  menjadi  asam aspartat  dan  amonia.  Aktivitas  L- asparaginase diukur dari  produk  yang  dihasilkan,  yaitu  amonia.  Sesuai dengan  definisi  Paul  [8]  maka  aktivitas  spesifik menunjukan  banyaknya  L-aspartat  dan  amonia  yang terbentuk  berbanding  terhadap  kadar  protein.  Uji aktivitas L- asparaginase menggunakan pereaksi Nessler yang  menghasilkan  senyawa  kompleks  berwarna  coklat kekuningan  pada  tiap  fraksinya,  sesuai  persamaan berikut
Warna  tersebut  kemudian  diukur  absorbansinya dengan  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  pada panjang  gelombang  maksimum  (420  nm),  dan  nilai absorbansi  yang  terukur  kemudian  diplotkan  terhadap kurva  standar  amonium  sulfat  untuk  mengetahui besarnya unit aktivitas yang terdapat pada ekstrak kasar dan tiap fraksi.
Aktivitas spesifik L- asparaginase dapat dihitung dari unit aktivitas enzim per mg protein. Kadar protein dapat ditentukan  dengan  metode  Lowry  berdasarkan  kurva standar  BSA.  Warna  biru  yang  dihasilkan  kemudian diukur  absorbansinya  pada  panjang  gelombang maksimum  BSA  (750  nm).  Absorbansi  yang  diperoleh kemudian  diplotkan  terhadap  kurva  standar  BSA, sehingga  didapatkan  kadar  protein  pada  ekstrak  kasar dan  tiap  fraksi.  Tingkat  kemurnian  L- asparaginase tiap fraksi  dihitung  dengan  membandingkan  aktivitas spesifik  fraksi  enzim  tersebut  dengan  aktivitas  spesifik ekstrak  kasar.  Hasil  penentuan  aktivitas  spesifik  L- asparaginase pada  EK,  F1,  F2,  F3,  F4,  dan  F5  disajikan pada tabel 1.
Tabel  di  atas  menunjukkan  nilai  aktivitas  spesifik enzim L- asparaginase setiap fraksi berbeda-beda, hal ini disebabkan oleh dua faktor, yaitu unit aktivitas dan kadar protein.  Suatu  fraksi  dengan  nilai  unit  aktivitas  besar belum tentu memiliki aktivitas spesifik besar, tergantung pada  kadar  proteinnya.  Enzim  merupakan  protein, sehingga dengan mengetahui kadar protein keseluruhan maka  dapat  diketahui  besarnya  protein  yang  berfungsi sebagai enzim melalui kemampuannya dalam mengubah substrat  menjadi  produk  yang  diinginkan,  jadi  aktivitas spesifik  ditentukan  oleh  perbandingan  unit  aktivitas
terhadap kadar protein. Nilai aktivitas spesifik  tertinggi terdapat  pada  F4  dengan  tingkat  kemurnian  yang tertinggi  pula  dibanding  ekstrak  kasar  dan  di  antara fraksi-fraksi lainnya, oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa L- asparaginase sebagian besar terdapat pada F4.
Tabel 1. Hasil Penentuan Aktivitas Spesifik Enzim L- asparaginase dari Kunyit Fraksi Unit Aktivitas (Unit/mL) Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik (Unit/mg protein) Tingkat Kemurnian EK 3437,428 13,717 250,596 1,000 F 1 4692,979 99,433 47,197 0,188 F 2 1985,077 25,550 77,694 0,310 F 3 2480,346 12,300 201,654 0,805 F 4 2594,134 9,133 284,040 1,133 F 5 1871,846 7,240 258,542 1,032
Uji Sitotoksik Enzim L- asparaginase Terhadap Sel HeLa
Fraksi yang telah diketahui nilai aktivitas tertinggi, selanjutnya  di  uji  terhadap  sel  HeLa  dengan menggunakan  metode  MTT  yang  mana  pembacaan dilakukan  dengan  ELISA Reader .  Sel  HeLa  ditumbuhkan pada medium RPMI 1640 dan serum untuk memberikan nutrisi  yang  cukup  pada  sel  agar  tetap  bertahan  hidup dan memperbanyak diri (Freshney, 1986). Sampel enzim L- asparaginase fraksi  4  dari  kunyit  yang  telah  dibuat pada berbagai konsentrasi selanjutnya diujikan terhadap sel  HeLa  pada  sumuran/ plate . Plate diinkubasi  dalam inkubator  CO 2 selama  24  jam  dengan  pengaturan  suhu 37ºC, 95% CO 2 dan 5% O 2 untuk mengetahui aktivitasnya, pengkondisian ini dilakukan sesuai dengan kondisi pada tubuh manusia.
Uji aktivitas antikanker ini dilakukan dengan metode MTT  untuk  menentukan  viabilitas  sel  sehingga  bisa digunakan  untuk  mengetahui  efek  sitotoksiknya. Prinsipnya  adalah  dengan  adanya  pemecahan  garam tetrazolium
MTT
(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5difeniltetrazoliumbromida)  oleh  sistem  enzim tetrazolium suksinat reduktase (atau suksinat dehidrogenase)  yang  terdapat  di  dalam  mitokondria  sel hidup sehingga terbentuklah kristal formazan berwarna ungu (Freshney, 1986). Semakin tinggi intensitas warna ungu  yang  terbentuk  maka  sel  yang  hidup  semakin banyak,  selanjutnya  dapat  dibaca  dengan  ELISA Reader dan  diperoleh  data  berupa  absorbansi.  Semakin  banyak kristal  formazan  yang  terbentuk  maka  semakin  tinggi nilai  absorbansi  yang  diperoleh  dan  mengindikasikan kematian yang rendah.
Data  hasil  uji  sitotoksisitas  enzim  L- asparaginase terhadap  sel  HeLa  diplotkan  dalam  kurva  regresi  linear yaitu  log  konsentrasi  enzim  L- asparaginase sebagai sumbu x versus kematian sel HeLa sebagai sumbu y dapat dilihat pada gambar di bawah ini:
Gambar 1: Grafik persentase kematian sel HeLa oleh adanya enzim L- asparaginase dari kunyit
Besarnya  penghambatan  oleh  L- asparaginase pada sel  HeLa  ditunjukan  oleh  besarnya  nilai  LC 50 ,  adalah konsentrasi enzim L- asparaginase yang dapat menyebabkan kematian 50% populasi sel HeLa. Grafik di atas  diperoleh  suatu  persamaan  regresi  linier  yaitu  y  = 34,53  x – 17,79,  dari  persamaan  tersebut  selanjutnya digunakan  untuk  menghitung  nilai  LC 50 dengan  cara mensubstitusi nilai 50 (50% kematian sel) pada koefisien y  sehingga  didapatkan  nilai  x  yang  merupakan  log konsentrasi, sedangkan antilog dari x adalah konsentrasi yang  merupakan  nilai  LC 50 .  Berdasarkan  hasil perhitungan  diperoleh  nilai  LC 50 sebesar  91,833  µg/mL yang  menunjukkan  bahwa  isolat  enzim  L- asparaginase pada  konsentrasi  tersebut  mampu  mematikan  sel  HeLa sebesar 50% dari populasi awal.
Berdasarkan  standar  NCI  (National  Cancer Institute),  suatu  senyawa  dikatakan  berpotensi  untuk dikembangkan  lebih  lanjut  sebagai  antikanker  apabila memiliki  nilai  LC 50 ≤  20  µg/mL .  Nilai  LC 50 enzim  L- asparaginase fraksi  4  dari  kunyit  sebesar  91,833  µg/mL, dengan demikian dapat disimpulkan bahwa isolat enzim L- asparaginase fraksi 4 dari kunyit mampu menghambat pertumbuhan sel HeLa tetapi kurang berpotensi sebagai agen antikanker.

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa Enzim L- asparaginase dapat diisolasi dan  dimurnikan  dari  kunyit.  Enzim  L- asparaginase dari kunyit memiliki aktivitas spesifik tertinggi pada kondisi optimum  terdapat  pada  fraksi  4  yaitu  sebesar  284,040 unit/mg  protein.  Nilai  LC 50 isolat  enzim  L- asparaginase fraksi  4  dari  kunyit  sebesar  91,833  µg/mL  mampu menghambat  pertumbuhan  sel  HeLa  tetapi  kurang berpotensi sebagai agen antikanker berdasarkan standar NCI ( National Cancer Institute ).

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Satmoko  Budi  Santoso,  Buku  pintar  kanker, Yogyakarta: power books (Ihdina) , (2009)
[2]  Idania Rodeiro, Yack Magarino, Omar Ocejo, Gabino Garrido,  Rene  Delgado,  Use  of  natural  products  in anti-cancer alternative therapy: risk of interactions with  conventional  anti-cancer  drugs, Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas , 7, 6, (2008)
[3]  FR  Carvalho,  RC  Vassão,  MA  Nicoletti,  DA  Maria, Effect  of  Curcuma  zedoaria  crude  extract  against tumor progression and immunomodulation, Journal of  Venomous  Animals  and  Toxins  including  Tropical Diseases , 16, 2, (2010) 324-341 http://dx.doi.org/10.1590/S1678- 91992010000200013
[4]  Maksum  Radji,  Atiek  Sumiati,  Nuning  Indani,  Uji Mutagenisitas  dan  Anti  Kanker  Ekstrak  Aseton  dan n-Heksana  dari  Kulit  Batang  Sesoot  ( Garcinia picrorrhiza Miq.), Majalah  Ilmu  Kefarmasian ,  1,  2,
(2004) 69-78
[5]  Reema  F.  Tayyem,  Dennis  D.  Heath,  Wael  K.  Al- Delaimy,  Cheryl  L.  Rock,  Curcumin  content  of turmeric and curry powders, Nutrition and cancer , 55, 2, (2006) 126-131 http://dx.doi.org/10.1207/s15327914nc5502_2
[6]  Anastassios  C  Papageorgiou,  Galina  A  Posypanova, Charlotta  S  Andersson,  Nikolay  N  Sokolov,  Julya Krasotkina,  Structural  and  functional  insights  into Erwinia carotovora l ‐ asparaginase, The FEBS journal , 275, 17, (2008) 4306-4316
http://dx.doi.org/10.1111/j.1742-4658.2008.06574.x
[7]  Maloy  Kumar  Sahu,  K  Sivakumar,  E  Poorani,  T Thangaradjou, L Kannan, Studies on L-asparaginase enzyme  of  actinomycetes  isolated  from  estuarine fishes, Journal of Environmental Biology , 28, 2, (2007)
465
[8]  JH  Paul,  Isolation  and  characterization  of  a Chlamydomonas L-asparaginase, Biochemical Journal , 203, 1, (1982) 109-115 http://dx.doi.org/10.1042/bj2030109