## AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETANOL TANAMAN TAPAK LIMAN (Elephantopus scaber L.) TERHADAP SEL T47D MELALUI APOPTOSIS
Panji Ratih Suci 1,2 *, Nurkhasanah 2 , Nanik Sulistyani 2
1 Akademi Farmasi Mitra Sehat Mandiri
2 Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan
*Email 1 : panjiratihsuci13@gmail.com
Email 2 : nurkhas@gmail.com , nanik.sulistyani@gmail.com
Artikel diterima: 24 September 2020; Disetujui: 25 Maret 2021 DOI: https://doi.org/10.36387/jiis.v6i1.605

## ABSTRAK
Kanker  payudara  merupakan  jenis  kanker  yang  paling  mendominasi  di Indonesia.      Pengobatan  tradisional  menggunakan  tapak  liman  ( Elephantopus scaber L.) sebagai antikanker menjadi pilihan karena mengandung senyawa seperti seskuiterpen . Tujuan penelitian ini  untuk mengetahui aktivitas sitotoksik ekstrak etanol tapak liman terhadap sel T47D melalui induksi apoptosis. Metode ekstraksi menggunakan maserasi dengan pelarut etanol 96%, dilakukan pengujian Flavonoid total  dengan  menggunakan  baku  quersetin  secara  spektrofotometri.  uji  sitotoksik menggunakan microtetrazoliom (MTT test), dan uji apoptosis menggunakan double staining  ( ethidium  bromide-acrydine  orange )  dibawah  mikroskop  fluorescence. Konsentrasi senyawa yang digunakan adalah 1000 µg/ml; 500 µg/ml; 250µg/ml; 125  µg/ml,  62,5  µg/ml;  31,25  µg/ml.  Hasil  pengujian  uji  MTT  berupa  nilai  IC 50 yang  dianalisis  menggunakan  angka  probit  dan  uji  apoptosis  dianalisis  secara deskriptif.  Hasil  penelitian  menunjukkan  persamaan  regresi  linear  y  =  0,0934x- 0,0292  dengan  kadar  flavonoid  yang  dihasilkan  sebesar  0,979%  b/b    dihitung terhadap quersetin (QE) dengan . dengan metode MTT mempunyai IC 50 sebesar 59 µg/ml,  sedangkan  pengujian  metode  double  staining  ditandai  warna  hijau  terang yang  menunjukan  mengalami  apoptosis  awal  dan  warna  orange  pada  sel    yang mengalami apoptosis  akhir. Hasil  Fragmentasi DNA menunjukkan bahwa ekstrak Tapak Liman menginduksi fragmen DNA. Kesimpulan pada penelitian ini adalah ekstrak  tapak  liman  memiliki  potensi  aktivitas  sitotoksik  terhadap  sel  kanker payudara T47D melalui induksi apoptosis.
Kata kunci: Elephantopus scaber , Sitotoksisitas, Apoptosis, Sel   T47D

## ABSTRACT
Breast cancer is the most dominant type of cancer in Indonesia.   Traditional medicine using tapak liman (Elephantopus scaber L.) as an anticancer becomes an option because it contains compounds such as sesquiterpenes. The purpose of this study was to know the cytotoxic activity of ethanolic extract of tapak liman on T47D cells through induction of apoptosis. The extraction method uses maceration with 96%.  Total  flavonoids  were  tested  using  quercetin  as  a  spectrophotometric
standard. ethanol solvent, cytotoxic test using microtetrazoliom (MTT assay), and apoptosis test using double staining test (ethidium bromide-acrydine orange) under a fluorescence microscope. The results showed the linear regression equation y = 0.0934x-0.0292  with  the  resulting  flavonoid  levels  of  0.979%  w  /  w  calculated against quercetin (QE) The concentration of the compound used was 1000 µg/ml; 500 µg/ml; 250µg/ml; 125 μg/ml, 62.5 μg/ml; 31.25 µg/ml. The MTT assay results are the values of IC 50 which are analyzed using probit analysis and apoptosis tests which are analyzed descriptively. The results of the research show that the ethanol extract  of  tapak  liman  using  MTT  method  has  IC 50 value  of  59  µg/ml,  while  the testing of double staining method shows the color of bright green which indicates early apoptosis and the color orange in the cells which undergoing final apoptosis. DNA  fragmentation  results  shows  that  Tapak  Liman  extract  induces  DNA fragments. The conclusion of this study is that tapak liman textract has the potential for  cytotoxic  activity  against  T47D  breast  cancer  cells  through  the  induction  of apoptosis.
Keyword: Elephantopus scaber, Cytotoxicity, Apoptosis, T47D cells

## PENDAHULUAN
Kanker  merupakan  sel  yang pertumbuhan  dan  perkembangannya tidak  terkontrol  dengan  melalui proses-proses invasi ke dalam jaringan.  Kanker  payudara  terbentuk pada jaringan sekitar payudara dengan adanya kerusakan gen
BRCA1  dan  BRCA2  (King,  2000).
Adanya kerusakan tersebut mengubah kecepatan proliferasi dan
penghambatan  apoptosis  pada  sel T47D  ( Sukardiman  dkk.,  2006 ) . Sel T47D  merupakan  sel  kanker  hasil diferensiasi lanjut dari sel T-47 yang diisolasi  dari  payudara  seorang wanita  penderita  kanker.  Pada  sel T47D mutasi gen dapat
mengekspresikan p53 termutasi ( Nurani, 2011 ).
Apoptosis merupakan  program kematian sel dengan tujuan memperbaiki  sel  pada  DNA  yang sudah  tidak  bisa  diperbaiki  lagi ( Ghobrial et  al .,  2005 ).  Salah  satu pengobatan tradisional untuk aktivitas antikanker adalah tapak liman ( Elephantopus  scaber L.).  Tapak liman mengandung senyawa seskuiterpen  dan  flavonoid  yang berkhasiat sebagai antitumor.
Penelitian oleh ( King, 2000 ) menyebutkan  mengenai  beberapa senyawa  dari  senyawa  sesquiterpen ( scabertopin  (ES-2),  isoscabertopin
(ES-3), doxylephentopin, deoxyelephantopin (ES-4),
isodeoxyelephantopin  (ES-5 )  yang
diisolasi dari tapak liman
( Elephanthopus scaber L.).
Hasil penelitian tentang ekstrak etanol  fraksi  potreleum  eter  tapak liman  menunjukkan  bahwa  ekstrak tapak  liman  mempunyai  efek  toksik dan  memacu  mekanisme  apoptosis pada sel kanker serviks pada sel Hela pada  IC 50 185 µg/ml  ( Sukardiman et al , 2006 ) . Perlakuan fraksi kloroform dengan  konsentrasi  7,06  μg  /ml menyebabkan kematian sel apoptosis pada stadium akhir nekrosis ( Nurani, 2001 ).  Tujuan  penelitian  ini  untuk mengetahui  apakah  ekstrak  etanol daun  tapak  liman  ( Elephantopus scaber  L. L.)  mempunyai  aktivitas sitotoksik  pada  sel  T47D.  Selain  itu juga  menentukan  potensi  ekstrak etanol  tapak  liman  dalam  memacu apoptosis  sel  T47D    dengan  meihat profil fragmentasi DNA.

## METODE PENELITIAN
1. Penentuan  Kadar  Flavonoid

## Total
Dibuat  larutan  baku  sekunder quersetin  dengan  konsentrasi  1  ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm 5 ppm, 6 ppm dan  10  ppm  dari  larutan  baku  induk
1000  ppm.  Tiap  konsentrasi  larutan baku  sekunder  ditambahkan  3  ml metanol,  0,2  ml  aluminium  klorida (AlCl 3 )  10%,  Na  Asetat  0,2  ml  dan aquadest  ad  10  ml,  kemudian diinkubasi  pada  suhu  kamar  selama 30  menit.  Masing-masing  diukur absorbansinya  pada  spektrofotometri UV-VIS pada λ= 440 nm.
Sebanyak  100  mg  ekstrak etanol  dilarutkan  dalam  10  mL methanol,  kemudian  diambil  1  mL sampel ditambahkan 3 mL methanol, 0,2  mL  AlCl3  10%,  dan    0,2  mL natrium asetat. Simpan 30 menit pada tempat  gelap  dengan  suhu  kamar, diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 440 nm. Larutan dibuat 3 kali  sebagai  ekuivalen  quersetin ( Ghobrial et al ., 2005 ).

## 2. Ekstraksi
Sebanyak    500  gram  serbuk simplisia  tapak  liman  diekstraksi menggunakan  pelarut  etanol  96%, dengan  metode  maserasi  kemudian dsaring dan dipekatkan ke dalam alat rotarv evaporator.
3. Kultur Sel
Sebanyak 10 mg ekstrak etanol tapak  liman  dilarutkan  dalam  100  µl DMSO.
4. Uji Sitotoksisitas dan Selektivitas
Sitotoksisitas  sel  T47D  diuji dengan uji MTT. Sel ditanam dengan kepadatan  5  x10 3 sel  per  sumur dengan    suhu  37 o C  dalam  suasana lembab  5%  CO 2 95%  udara  terlalu tinggi. Sel diinkubasi dengan konsentrasi  yang  berbeda  1000 µg/ml;  500  µg/ml;  250  µg/ml;  125 µg/ml,  62,5  µg/ml;  31,25  µg/ml; ekstrak  etanol  daun  tapak  liman selama  24  jam.  Setelah  inkubasi, media dibuang dan 100 μL RPMI dan 10 μL MTT (5 mg MTT/mL larutan) ditambahkan ke masing-masing sumur. Plat diinkubasi selama 4 jam. Sel  kontrol  hanya  menerima  media tanpa sampel yang diuji.
Doksorubisin digunakan sebagai kontrol positif. Kristal formazan yang terbentuk  dalam  sel  yang  layak dilarutkan  dengan  100  μl  SDS- stopper  dalam  HCl  0,1  N.  Dianalisa dengan  panjang  gelombang    595  nm diukur  dengan microplate  enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) reader.  Perbedaan  absorbansi  antara kelompok kontrol yang diberi perlakuan  dan  yang  tidak  diberi perlakuan dihitung viabilitas sel.
5. Acridine Orange-Ethidium

## Bromide Double Stanining
Sel  T47D  dimasukkan  ke microplate  24  dengan  kepadatan  5x 10 4 sel/sumuran dalam 1000 µl media RPMI  dan  diinkubasi  konfluen selama  24  jam,  sampel  uji  ekstrak etanol  tapak  liman  dimasukkan kedalam  sumuran  sebesar  nilai  IC 50, kemudian  diinkubasi  selama  24  jam, Medium diambil, dicuci dengan PBS, sel ditambahkan dengan 10µL working  solution akridin  orange- etidium  bromide .  Sel  di  analisa  di bawah  mikroskop flouresens (Zeiss MC 80), hasil intepretasi data jika sel hidup akan berfluoresensi warna hijau dan  pada  Etidium  Bromida  (EB)  sel mati  berfluoresensi  akan  berwarna merah ( Wang et al ., 2004).

## 6. Fragmentasi DNA
Fragmentasi DNA dimulai dengan memanen sel T47D kemudian diinkubasi  selama  24  jam  dalam keadaan  lingkungan  CO 2 5%  suhu 37 o C.  Ektrak  etanol  tapak  liman ditambahkan  ke  sumuran  dengan konsentrasi IC 50 dan ½ IC 50 , kemudian  sel  diinkubasi  selama  24 jam.  Sel  yang  telah  ditreatmen kemudian di  transfer ke konikel. Sel
p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-190
ditambahkan    tripsin  0.025  % sebanyak  200  µL  dan  diinkubasi selama    3  menit.  Sel  yang  tekah diinkubasi ditambahkan media kultur RPMI  sebanyak  1000  µL  kemudian sel diresuspensi dan diamati dimikroskop. Sel ditransfer kekonikel dan dicuci dengan PBS sebanyak 500 µL. sel disentrifuse dengan kecepatan 600 rpm selama 5 menit kemudian sel siap diisolasi.
Isolasi  sel  dimulai  dengan menambahkan  150  µL  RBC  lisis Buffer  kedalam  pellet  sel  dan resuspensi.  Sel  ditambahkan  200  µL FABG  Buffer  kemudian  vortex dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5  menit  dan  dinkubasi  10  menit dengan suhu 70 0 C.  sel ditambahkan 250  µL  etanol  absolut  dan  divortex selama  10  menit  kemudian  sel dipindahkan  ke filter tube kemudian disentrifuse dengan kecepatan  10.000 selama 1 menit. Sel ditambahkan 600 µL  wash  buhher  sentrifuse  10.000 rpm selama 1 menit. Sel di tambahan elution  buffer  sebanyak  100  µL kemudian  inkubasi  pada  suhu  37 0 C selama  10  menit,  kemudian  Sel disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm  selama  1  menit.  Sel  dianalisa
dengan nanodrop ( Nurkhasanah,
2013 ).  Sampel  DNA  yang  diperoleh dianalisis dengan 1% agarose kemudian  di  elektroforesis.  Setelah elektroforesis  ,  gel  diwarnai  dengan SYBER  Green  saya  Nucleic  Acid
Stain (Invitrogen)
dan divisualisasikan (Tris - HCl 10 mM , pH  7,4  Dan  EDTA  1  mM)  dan dideteksi dengan sinar UV
( Nurkhasanah, 2013 ).

## PEMBAHASAN
1. Pembuatan Ekstrak Etanol
Tapak  Liman  dengan  Metode Maserasi
Hasil ekstrak tapak liman yang didapatkan    berupa  ekstrak  kental yang berwarna hitam pekat dengan % rendemen  sebesar  8,5%.  Rendemen ini  sesuai  dengan  standart  baik rendemen tapak liman sebesar 2,7% . 2. Uji senyawa Flavonoid Total Nilai absorbansi larutan  standar kuersetin pada masing-masing konsentrasi diperoleh persamaan garis linear yang nantinya digunakan untuk penetapan kadar flavonoid total pada  sampel  ekstrak  etanol  tapak liman berupa grafik kurva konsentrasi versus absorbasi.
p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-190
Gambar 1. Kurva kalibrasi larutan standar kuersetin
Dapat  dilihat  bahwa  kurva kalibrasi  dengan  persamaan  regresi untuk  absorbasi  kuersetin    pada
konsentrasi  2, 3, 4, 5, 6, dan 10 ppm sebesar  y  =  0,0934x-0,0292  larutan standar  senyawa  fenol  dan  flavonoid diperoleh hubungan yang linier antara absorbansi  dengan  konsentrasi.  Pada pengukuran  flavonoid  total  dibuat sebanyak tiga replikasi untuk keperluan akurasi data. Sehingga dari hasil penelitian ini diperoleh pengukuran  kadar  flavonoid  total ekstrak  etanol  tapak  liman    sebesar 0,979%  b/b    dihitung  terhadap quersetin (QE).
Tabel 1. Pengukuran kadar flavonoid total ekstrak etanol tapak liman dihitung terhadap quersetin (QE). Sampel Rata- rata Abs Kandungan flavonoid awal (μg/mL) Faktor pengenceran (10X) Kandungan flavonoid total (mgQE/g eks) Rata-rata flavonoid total (%) Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 0,060 0,064 0,063 0,9586 0,9943 0,9836 9,5860 9,9429 9,8358 0,00959 0,00994 0,00984 0,979 3. Uji  Sitotoksisitas  Tapak  Liman terhadap  Sel  Kanker  Payudara

## T47D dengan Metode MTT
Pengujian  sitotoksisitas  pada
ekstrak etanol tapak liman
( Elephanthopus  scaber L.)  bertujuan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak  uji  tapak  liman  terhadap  sel kanker  payudara  T47D.  Parameter yang digunakan pada uji sitotoksisitas adalah  IC 50 yang    merupakan
konsentrasi ekstrak etanol yang dapat menghambat  sel  sebesar  50%  dari populasi  sel.  Pengujian  sitotoksik menggunakan  metode  MTT,  dimana Ekstrak  etanol  akan  mengabsorsi reagen  MTT  dan  dipecah  melalui reaksi  reduksi  oleh  sistem  reduktase suksinat tetrazolium dalam  rantai respirasi mitokondria menjadi formazan  yang  berwarna  ungu  dan tidak larut air tetapi larut dalam SDS
y = 0,0934x - 0,0292 R² = 0,9955 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 5 10 15 A B S OR B A NSI KONSENTRASI (ppm)
p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-190
10%. Pengujian Sitotoksik
menggunakan  pelarut  DMSO  karena baik  digunakan  untuk  senyawa organik  maupun  anorganik,  pelarut ini  juga  dapat  membuat  kotoran  dan racun  terserap  ( Ahmad et  al ,  2014 ). Pengujian MTT harus terdapat kontrol  sel  yang  digunakan  untuk mengetahui  besarnya  suatu  besarnya absorbansi yang dihasilkan kehidupan sel dengan sebesar 100%.
Gambar 2. Kristal formazan yang terbentuk hasil reaksi MTT  (1); Kontrol Sel (2); kadar terendah 31,25 µg/ml (3); kadar tertinggi 1000 µg/ml
Hasil    tabel  2  menunjukkan bahwa semakin besar kadar senyawa
uji  yang  diberikan  pada  suspensi  sel maka  semakin  besar  pula  persentase kematian sel yang dihasilkan sebaliknya  semakin  rendah  ekstrak etanol  tapak  liman  maka  persentase kematian  sel  juga  akan  semakin rendah. Hasil penelitian menunjukkan nilai  IC 50 yang  diperoleh  adalah 59µg/mL.  Berdasaran  kriteria  yang ditetapkan oleh NCI ( National Cancer  Institut )  menyatakan  bahwa
suatu ekstrak dinyatakan aktif memiliki aktivitas antikanker apabila memiliki  nilai  IC  IC 50 <  30µg/mL, moderate aktif apabila memiliki nilai
IC 50 = 30µg/mL dan IC 50 <
100µg/mL,  dan  dikatakan tidak aktif apabila nilai IC 50 >100 µg/mL, sehingga  dapat  disimpulkan  ekstrak etanol tapak liman memiliki aktivitas sitotoksik dengan klasifikasi moderate aktif..
Tabel 2. Persen kematian ekstrak etanol tapak liman terhadap sel T47D dengan metode MTT dengan seri kadar 1000 µg/ml sampai 31,25 mg/mL
No Kadar μg/ml Log kadar %Kematian Probit R1 R2 R3 R1 R2 R3 1 2 3 4 5 6 1000 500 250 125 62,5 31,25 3,000 2,699 2,398 2,097 1,796 1,495 99,44 97,27 86,58 58,96 55,04 39,61 99,17 98,08 83,06 60,99 35,14 45,02 99,30 98,22 83,60 60,18 52,47 44,48 7,5364 6,268 6,1077 5,2533 5,1257 4,7363 7,3954 7,0706 5,9581 5,2767 4,6174 4,8704 7,4373 7,1015 5,9782 5,2585 5,0627 4,8617
4. Uji  Apoptosis  Tapak  Liman
terhadap  Sel  Kanker  Payudara T47D  dengan  Metode  Double Staining
Metode  ini  digunakan  untuk mendeteksi  apoptosis  secara  cepat.
Acridine
Orange memberikan pewarnaan  baik  pada  sel  hidup maupun pada sel yang mati. Akridine Orange akan  menembus  semua  sel dan  membuat  inti  sel  tampak berwarna  hijau.  Ethidium bromide (EB) akan memberikan warna merah yang  menandakan  kematian  sel karena  sel  kehilangan  integritas membran  sitoplasmanya.  Pengujian double staining menggunakan kadar pengujian  IC 50 sebesar  59  µg/ml dengan  kontrol  sel.    Sel  hidup  akan berfluoresensi hijau terang dalam inti sebagai  kondensasi  kromatin  dan fragmentasi pada inti. Sel yang diberi perlakuan ekstrak etanol tapak liman
dengan konsentrasi IC 50 memperlihatkan karateristik
apoptosis  pada  tahap  akhir  yang ditandai  dengan  warna  orange    (sel mati)  ini  dikarenakan  ada  interaksi dengan ethidium bromide.
Gambar 3. Hasil Pengecatan sel T47D dengan acridine orange dan ethidium bromide (AO-EB). Keterangan: a. Kontrol sel, b. senyawa tapak liman 59 µg/ml
Berdasarkan  hasil  pengamatan dengan  metode  acridin  orange  dan ethidium  bromide  (AO-EB)  kontrol sel  hanya  terlihat  fluoresensi  hijau karena  hanya  menyerap  acridine orange, ethidium bromide tidak dapat masuk  pada  kontrol  sel  karena integritas  membran  sel  masih  baik. Sedangkan  pada  kontrol  DMSO terlihat  fluoresensi  hijau  dengan sedikit  fluoresensi  merah  hal  ini menandakan  bahwa  pelarut  DMSO tidak  bersifat  sitotoksik  terhadap  sel. Selain itu pada sel dengan perlakuan juga  terlihat  adanya  fragmentasi  inti sel  yang  kemudian  menjadi  badan- badan apoptosis. Hal ini menunjukan bahwa  perlakuan  ekstrak  etanol. terhadap sel T47D. Sel yang mengalami  apoptosis  menyebabkan perubahan permeabilitas membran sel ( Nurkhasanah et al ., 2015 ).
A B

## 5. Pengujian Fragmentasi DNA
Analisis  pengujian  fragmentasi DNA  oleh  eksrak  etanol  daun  tapak liman terlihat dari elektroforesis yang ditunjukkan  pada  media  gel  agarose. terbentuknya pita DNA pada agarose menunjukkan gambaran dari spesifikasi  pengamatan  apoptosis yang terlihat pada gambar 2 Gambar tersebut  menunjukkan  bahwa  pada tiap  konsentrasi  pada  ekstrak  etanol mengalami fragmentasi DNA.
Adanya  pita  DNA  pada  gambar tersebut  karena  adanya  aktivitas pembelahan  sebagai  karakteristik utama dalam mekanisme apoptosis.
Gambar 4. Hasil Fragmentasi DNA ekstrak etanol Tapak liman ( Elephanthopus scaber L.) dengan
kadar ekstrak (1) Kontrol sel; (2) 1/8
IC50; (3) Marker; (4) ¼ IC 50 ;(5) ½
IC 50
Fragmentasi  DNA  merupakan tanda  khas  pada  proses  apoptosis, yang  terjadi  karena  pengaktifan caspase  (terutama  caspase-3)  atau
DFF45 ( DNA Fragmentation Factor- 45 )  oleh  senyawa  apoptotik  yang kemudian diikuti oleh aktivasi endonuklease.  Pengaktifan  DFF45 terjadi  dengan  pemotongan  pada residu  D  yang  kemudian  memacu aktivitas  DFF40  nuclease,  penyebab fragmentasi  DNA.  Proses  apoptosis berbeda  dengan  nekrosis.  Nekrosis merupakan kematian sel yang  terjadi pada  organisme  hidup  yang  dapat disebabkan  oleh  injury  maupun infeksi. Pada nekrosis terjadi perubahan  pada  inti  yang  pada akhirnya  dapat  menyebabkan  inti menjadi  lisis  dan  membrane  plasma menjadi  rupture.  Pada  apoptosis terjadi kematian sel yang terprogram dan  membran  inti  tidak  ruptur  ,  dan inti  mengalami  fragmentasi  yang kemudian mengirimkan sinyal kepada sel  yang  berada  didekatnya  untuk difagosit.  Fagositosis  oleh  makrofag maupun sel di sekelilingnya mengakibatkan  fragmentasi  DNA menjadi apoptotic body (jisim apoptotik)  sehingga  Fragmen  DNA ini  terlihat    pada  elektroforesis  gel agarose (Sharif-Askari, et al., 2001).

## KESIMPULAN
Ekstrak  etanol  Tapak  Liman
( Elephantopus scaber L. L.)
mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap  sel  kanker  payudara  T47D dengan  nilai  IC 50 59  μg/μl.,  dengan mekanisme induksi apoptosis.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terima kasih  kepada  Kementrian Riset
Teknologi  dan Pendidikan  Tinggi ataspendanaan Hibah Penelitian Produk Terapan 2016.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad,  A.R..  Sakinah.,  Wisdawati., Waode  Asrifa,  2014,  Study  of Antioxidant activity and determination  of  Phenol  and Flavonoid  content  of  Pepino’s Leaf extract (Solanum muricatum Aiton), International Journal of PharmTech Research, 6, 2: 600-606. Ghobrial, I. M., Witzig, T. E., Adjei, A. A., 2005, Targeting Apoptosis  Pathways  in  Cancer Therapy, CA: A Cancer. Journal for Clinicians, 55: 178– 194.
King, R.J.B.,2000, Cancer Biology, 2 nd ed.,  Pearson  Education  Limited,
London. Nurani, Laela Hayu, 2011. Uji Sitotoksitas  dan  Antiproliferatif
Sel  Kanker  Payudara  T47D  dan Sel  Vero  Biji  Nigella  Sativa,  L.,
Jurnal  Ilmiah  Kefarmasian,  2,  1, 17 – 29. Nurkhasanah, 2013, Efek Sitotoksik Dan Pemacuan Apoptosis Fraksi Petroleum  Eter  Ekstrak  Etanol Daun Tapak Liman (Elephantopus scaber  Linn)  terhadap  sel  Hela, Pharmaciana,  3, 2, 1 – 7. Nurkhasanah, Trisnamurti, K.C., Gunaryanti,  R.D.,  Widyastuti,  T., 2015,      The  Screening  Of Cytotoxic Fraction From Elephantopus  scaber  Linn  against Human  Cervical  Cancer  (  Hela  ) Cells.  Int.  J.  Pharma  Sci.  Res,  6, 1011–1014.
Nurkhasanah,  Sulistyani  N.,  Mahdi
L,2017,  Chloroform  fraction  of ethanolic  extract  of  Elephantopus scaber  Linn.  increase  the  p53
expression on human breast cancer (T47D)  cell  line,  Pharmaciana:  7,
2.
Sukardiman.,  Ekasari,  W.,  Hapsari ,P.P., 2006, Aktivitas Antikanker dan Induksi Apoptosis  Fraksi  Kloroform Daun  Pepaya  (Carica  papaya L.) terhadap Kultur Sel Kanker Mieloma,  Media  Kedokteran
Hewan, 22, 2.
Wang  J,  Wei  Q,  Wang  CY,  Hill  D, 2004, Minocycline Up Regulates And Protects Against Cell  Death  In  Mitochondria,  J
Biol Chem, 279, 199 48-54.
Wang., Nan, S.J.P., Zhong ,Y., 2004, Chemical  Composition  of  the Essential  Oil  of  Elephantopus scaber from Southern China. Z., Naturforsch. 59, 327-329.