Profil Sel Timosit CD4 + CD8 + Pada Mencit Yang Diinfeksi Salmonella thypi Setelah Diberi Ekstrak Daun Moringa oleifera
Akhmad Fathir, Widodo, *Muhaimin Rifa’i
Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Brawijaya Malang Email: rifa123@ub.ac.id
* Corresponding author

## Abstrak
Moringa  olifera  merupakan  tumbuhan  yang  kaya  akan  kandungan  zat  gizi  maupun fitokimia.  Tujuan  dari  penilian  ini  untuk  mengetahui  profil  sel  timusit  CD4 + CD8 + mencit yang  diinfeksi  Salmonella  thypi  setelah  diberi  ekstrak  daun  M.  oleifera.  Penelitian  ini merupakan  penelitian  eksperimental  laboratorik  menggunakan  rancangan  acak  lengkap faktorial.  Mencit  dibagi  menjadi  2  grub  yaitu  grub  non  infeksi  (diberi  ekstrak  daun  M. oleifera dosis 0 mg/kg BB, 14 mg/kg BB, 42 mg/kg BB  dan 84 mg/kg BB) dan mencit yang diinfeksi S. thypi (diberi ekstrak daun M. oleifera dosis 0 mg/kg BB, 14 mg/kg BB, 42 mg/kg BB  dan 84 mg/kg BB). Hasil penelitian menunjukkan pemberian ekstrak daun M. oleifera dapat  meningkatkan  jumlah  sel  timosit  CD4 + CD8 + pada  kelompok  mencit  non  infeksi maupun pada kelompok mencit diinfeksi S. thypi. Peningkatan tertinggi jumlah sel timusit CD4 + CD8 + terlihat pada pemberian ekstrak daun M. oleifera dosis 84 mg/kg BB.
Kata kunci: CD4 + CD8 + , S. thypi, M. oleifera Lam

## Abstract
Moringa  oleifera  has  rich  nutrients  and  phytochemicals.  The  study  was  aimed  to  know profile  CD4+CD8+  thymic  cell  in  mice  infected  by  Salmonella  thypi  after  induction  with aqueous leaf extract M. oleifera. The experimental laboratory studies were conducted using completely factorial randomized design. Mice were divided into two groups, ie groups non infection  (induced  by  aqueous  leaf  extract  of  M.  oleifera.  dosage  0  mg/kg  BW,  14  mg/kg BW,  42  mg/kg  BW  and  84  mg/kg  BW)  and  groups  infection  with  S.  thypi  (induced  by aqueous leaf extract of M. oleifera. dosage 0 mg/kg BW, 14 mg/kg BW, 42 mg/kg BW). The result  showed  that  aqueous  leaf  extract  of  M.  oleifera  increasing  number  CD4+CD8+ thymic cell in all group of mice infected with S. thypi. The highest number of CD4+CD8+ cell    thymic    present  in  mice treated  with  the  leaf  extract M.  oleifera  dosage  of  84  mg/kg BW.
Key Words: CD4+CD8+, S. thypi, M. oleifera Lam

## PENDAHULUAN
Demam  tifoid  merupakan  penyakit  yang disebabkan  oleh  bakteri  S.  thypi  dan  masih menjadi  masalah  kesehatan  di  Indonesia.  Baker et al, (2008) melaporkan  kasus demam tifoid di Indonesia ditemukan sebesar 380-810 kasus per seratus  ribu  jumlah  penduduk  pertahun,  dan dianggap  sebagai  penyebab  kematian  yang cukup tinggi.
Sistem  imunitas  tubuh  yang  secara  tidak langsung  memiliki  peran  dalam  menjaga  tubuh terhadap  infeksi  bakteri  S.  thypi  adalah  sel timosit  CD4 + CD8 + .    Sel  T  CD4 + CD8 + merupakan  sel  double  positif    yang    terletak dilapisan luar timus (Verinaud et al, 2004).  Sel
T  double  positif  CD4 + CD8 + melalui  tahapan positive  selection  dan  negative  selection berkembang  menjadi  sel  single  positive  CD4 + atau CD8 + (Liu dan Remy, 2004; Schmitz, 2006; Smedt  et  al,  2011).  Abbas  dan  Andrew  (2011) menyebutkan,  sel T  CD4 + mengaktifkan  fagosit untuk  menghancurkan  mikroba  yang  berada  di vasikula,  sedangkan  sel  T  CD8 + membunuh  sel yang  terinfeksi  mikroba  yang  berada  di  dalam sitoplasma. Rifa’i (2011) menjelaskan, perkembangan  sel  T  CD4 + CD8 + dipengaruhi oleh faktor homiostasis maupun stimuli. Stimuli dapat  berasal  dari  bahan-bahan  alami  dari  luar tubuh  yang  memiliki  kemampuan  sebagai imunomodulator.  Salah  satu  tumbuhan  yang
diduga memiliki kemampuan sebagai imunomodulator adalah daun M. oleifera.
M.  oleifera  atau  biasa  disebut  kelor merupakan  tanaman  yang  dibudidayakan  di negara-negara  subtropis  dan  tropis  seperti  di Indonesia (Gaikwad et al, 2011). Tumbuhan M. oleifera  disebut  juga  dengan  tumbuhan  serba guna    atau  “the  miracle  tree  of  live”  karena bunganya,  bijinya  maupun  daunnya  memiliki kandungan  fitokimia  dan  zat  gizi  yang  sangat tinggi (Fashey 2005 dan Rajanandh dan Kavitha 2010). Hasil Penelitian Bamishaiye et al, (2011) menunjukkan  hasil  bahwa  ekstrak  daun  M. oleifera memiliki kandungan saponin, flavonoid, tanin,  caumarin  antraquinon,  alkaloid  dan  lain- lain. Kandungan saponin lebih tinggi menggunakan ekstrak air dibandingkan menggunakan  ekstrak  eter  dan  etanol.  Hasil penelitian  terbaru  Sudha  et  al,  (2010)  dan Biswas  et al, (2012) melaporkan bahwa, ekstrak daun  M.  oleifera  memiliki  peran  sebagai imunostimulan karena dapat merangsang sistem imunitas tubuh, yang dibuktikan dengan adanya peningkatan aktivitas makrofag, pelepasan nitrit oksidase  pada  sel  monosit  tikus  dan  adesi neutrofil.
Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui  profil  sel  T  CD4 + CD8 + di  timus mencit  yang  diinfeksi  S.  thypi  setelah  diberi ekstrak  daun  M.  oleifera  dan  hasil  dari penelitian  ini  diharapkan  mampu  memberikan informasi  mengenai  manfaat  daun    M.  oleifera terhadap sistem imunitas terutama perkambangan sel T CD4 + CD8 + .

## BAHAN DAN METODE

## Sampel penelitian
Penelitian  menggunakan  hewan  mencit berjenis  kelamin  betina  Galur  DDY,  diperoleh dari  Laboratorium  Penelitian  dan  Pengujian Terpadu Universitas Gajah Mada (LPPT-UGM) Yogyakarta  sebanyak  32  ekor.  S.  thypi  yang digunakan  dalam  percobaan  ini  diperoleh  dari Laboratorium
Mikrobiologi PAMKI (Perhimpunan Ahli Mikrobiologi Klinik Indonesia) Cabang Malang Fakultas Kedokteran Universitas  Brawijaya  Malang  dengan  kode strain  isolate  2016-D  dengan  nama  ilmiah  S. thypi. Adapun daun M. oleifera yang digunakan dalam  pembuatan  ekstrak  diambil  dari  daerah Karduluk Kecamatan Pragaan Kabupaten Sumenep  pada  tanggal  21  Mei  2012  (musim penghujan).
Ekstrak M. oleifera
Daun  M.  oleifera  dikering - anginkan  pada suhu ruang dan dibuat simplesia. Simplesia yang didapat  dibuat  ekstrak  menggunakan  metode infusa  dengan  cara,  simplesia  diambil  sebanyak 5  g  dicampur  dengan  aquades  50  ml  dan dididihkan  selama  15  menit,  selanjutnya disaring  menggunakan  kertas  saring.  Ekstrak yang  telah  didapat  dicampur  dengan  Na-CMC 0,5%  dan    digunakan  sesuai  dengan  desain penelitian.

## Perlakuan hewan coba
Mencit  yang  sudah  diaklimasi  selama  7 hari  dilakukan  pengelompokan  sesuai  dengan Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  faktorial. Mencit  dalam  percobaan  ini  dibagi  menjadi  2 kelompok,  meliputi  kelompok  non  infeksi (diberi  ekstrak  daun  M.  oleifera  1  x  sehari selama 20 hari) dan kelompok yang diinfeksi S. thypi (diberi ekstrak daun M. oleifera 1 x sehari, selama  20  hari  dan  pada  hari  ke  21  diinfeksi  S. thypi  dengan  dosis  10 8 sel  secara  intra peritonial).  Di  dalam  2  kelompok  tersebut, dibagi  lagi  menjadi  4  bagian  yaitu  sebagai kelompok    kontrol  (K-  (tanpa  diperlakuan)/  K+ (diinfeksi  S.  thypi)),  kelompok  perlakuan  P1 (diberi ekstrak daun M. oleifera dengan dosis 14 mg/kg  BB  mencit),  kelompok  perlakuan  P2 (diberi ekstrak daun M. oleifera dengan dosis 42 mg/kg  BB  mencit)  dan  kelompok  perlakuan  P3 (diberi ekstrak daun M. oleifera dengan dosis 84 mg/kg BB mencit).
Kelompok mencit yang diinfeksi S. thypi, pada  hari  ke  22  dilakukan  uji  konfirmasi  untuk mengetahui keberhasilan S. thypi dalam menginfeksi  mencit.  Uji  konfirmasi  dilakukan menggunakan  uji    pour  plate  dan  uji  katalase (Dyszel et al, 2010).
Setelah  hari  ke  26  pasca  perlakuan dilakukan  proses  pengorbanan  mencit  dengan dislokasi leher, selanjutnya dilakukan pembedahan  dan  dilakukan  pengambilan  organ timus.  Organ  timus  digerus,  disaring  dan disuspensi dengan PBS, homogenat disentrifugasi  dengan  kecepatan  2500  rpm  pada suhu  4 o C  selama  5  menit.  Pellet  diresuspensi dengan  PBS  1  ml.  Homogenat  yang  diperoleh dipindahkan  pada  tabung  mikrosentrifus  baru dan  ditambahkan  PBS.  kemudian  disentrifus pada 2500 rpm dengan suhu 4 o C selama 5 menit dan diambil pelletnya.
Sel  yang  telah  diisolasi  dalam  bentuk pellet  ditambah  antibodi  rat  anti-mouse  anti- CD4  FITC  conjugated  dan  rat  anti-mouse  anti- CD8  PE  conjugated  sebanyak  500  µl.  Sel
Profil Sel Timosit CD4 + CD8 + (47-51)
tersebut selanjutnya ditambah PBS dan dilakukan uji flow cytometry. Adapun penghitungan  jumlah  total  sel  dilakukan menggunakan  hemositometer  dengan  cara, suspensi  sel  hasil  isolasi  dalam  PBS  di  warnai dengan  larutan  pewarna  evans  blue.  Sel  yang dihitung  adalah  sel  hidup  yang  tidak  terwarnai oleh pewarna evans blue.

## Analisa data
Data  hasil  flow  cytometry  dianalisis menggunakan  perangkat  lunak  BD  cellquest Pro TM dan dilanjutnya dengan analisa menggunakan  uji  statistic  two  way  ANOVA (analysis  of  variance)  signifikansi  0,05%    pada program  SPSS  16.0    dan  apabila  terdapat perbedaan dilanjutkan dengan uji  Tukey.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  memperlihatkan  bahwa pemberian  ekstrak  daun  M.  oleifera  dapat meningkatkan  jumlah  relatif  sel    T  CD4 + CD8 + pada  kelompok  perlakuan  mencit  non  infeksi (Gambar  1)  maupun  pada  kelompok  perlakuan mencit yang diinfeksi S. thypi (Gambar 2).
Gambar 1. Jumlah relatif  sel timosit CD4 + CD8 + hasil flow cytometry pada kelompok  perlakuan  mencit  non infeksi
Gambar 2. Jumlah relatif  sel timosit CD4 + CD8 + hasil flow cytometry pada kelompok perlakuan mencit diinfeksi  S. thypi
Berdasarkan  penghitungan  jumlah  absolut  sel didapatkan hasil bahwa pemberian ekstrak daun M.  oleifera  secara  nyata  dapat  meningkatkan jumlah absolut sel T CD4 + CD8 + di timus mencit kelompok  perlakuan  non  infeksi  maupun  pada kelompok  perlakuan  mencit  yang  diinfeksi  S. thypi (Tabel 1).
84 mg/kg BB
42 mg/kg BB
0 mg/kg BB 14 mg/kg BB 0 mg/kg BB 14 mg/kg BB 42 mg/kg BB 84 mg/kg BB C D 8 + CD4+ 86.11% 85.13% 84.21% 86.21% CD4+ C D 8 +
Tabel 1. Jumlah absolut rata-rata sel T CD4 + CD8 + mencit
Dosis ekstrak Kelompok Perlakuan Non infeksi Dinfeksi 0 mg/kg BB 2703930± 154054 a 9403117± 432053a 14 mg/kg BB 6673951± 290660 b 11450470± 399660 b 42 mg/kg BB 15682482± 397674 c 21368933± 761070 c 84 mg/kg BB 21099132± 632674 d 31058347± 237667 d
Keterangan: Huruf yang sama pada kolom yang sama menyatakan tidak berbeda nyata pada taraf signifikasi 0.05%
53.67% 77.43%
78.92% 77.45%

## Akhmad Fathir
Peningkatan  jumlah  absolut  sel  tersebut paling  tinggi  terlihat  pada  pemberian  dosis ekstrak  daun  M.  oleifera  84  mg/kg  BB  yaitu dengan  jumlah  sel  sekitar  21×10 6 sel/ml  untuk kelompok  perlakuan  mencit  non  infeksi  dan untuk kelompok perlakuan mencit yang diinfeksi  S.  thypi  dengan  jumlah  sel  sekitar  31 ×10 6 sel/ml.
Adapun  peningkatan  jumlah  absolut  sel tersebut,  paling  rendah  terlihat  pada  dosis  14 mg/kg  BB  dengan  jumlah  sel  sekitar  66  ×10 5 sel/ml  untuk  kelompok  perlakuan  mencit  non infeksi  dan  pada  kelompok  perlakuan  mencit diinfeksi  S.  thypi  jumlah  sel  sekitar  11×10 6 sel/ml .
Terjadinya peningkatan jumlah absolut sel timosit  tersebut  pasca  pemberian  ekstrak  daun M.  oleifera  diduga  karena  di  dalam  ekstrak tersebut terdapat senyawa aktif berupa flavonoid dan  saponin  yang  mampu  menstimuli  sel  untuk berdiferensiasi  menjadi  sel  T  CD4 + CD8 + . Bertolini  et  al,  (1995)  dan  Messaoudene  et  al, (2011) menjelaskan bahwa, pemberian flavonoid secara in vivo dapat meningkatkan jumlah IL-12 dan  penambahan  IL-12  secara  in  vitro  dapat memicu CD34 + untuk berproliferasi menjadi sel T CD4 + CD8 + .
Tingginya peningkatan jumlah absolut sel T  CD4 + CD8 + pada  kelompok  perlakuan  mencit yang  diinfeksi  S.  thypi  dibandingkan  dengan kelompok  perlakuan  mencit  non  infeksi  (Tabel 1),  diduga  karena  adanya  stimuli  dari  IL-12 untuk  memicu  peningkatan  jumlah  sel  T CD4 + CD8 + di timus, disebabkan karena sel yang mengalami  infeksi  lebih  banyak  membutuhkan sel  T  CD4 + CD8 + dalam  mengeliminasi  S.  thypi yang  berada  di  dalam  tubuh.  Hasil  penelitian Koebernick  et  al,    (2002)  menyatakan  bahwa, tikus  yang  terinfeksi  S.  thypi  menunjukkan kecenderungan  peningkatan  produksi  IL-12. Abbas  dan  Andrew  (2011)  menyebutkan,  pada kasus  infeksi  terjadi  peningkatan  jumlah  sel-sel efektor, sel-sel efektor tersebut dihasilkan untuk memerangi infeksi.

## KESIMPULAN
Pemberian  ekstrak  daun  M.  oleifera dapat meningkatkan jumlah sel T CD4 + CD8 + .

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas,  K.A  dan  Andrew  H.  Lichman.  2011. Basic  Immunology  3e  Updated  Edition. Philadelphia. Elsevier. 84-128.
Bertolini, F., D. Soligo., Lorenza L.,  Chiara C.,
Federica S.,  dan Girolamo S. 1995. The Effect of Interleukin-12 In Ex- Vivo Expansion Of Human Haemopoietic Progenitors. Britsh Journal Of Hematology. 4: 935.
Baker S., K. Holt., E. Vosse. dan P. Roumagnac. 2008.  High-Throughput  Genotyping  of Salmonella enteric Serovar Typhi Allowing  Geographical  Assigment  of Haplotypes  and  Pathotypes  Within  an Urban  District  of  Jakarta,  Indonesia. Journal  Clinical  Microbial.  46  (5): 1741-1746.
Bamishaiye,  E.I.  F.F.,  Olayemi,  E.F.,  Awagu dan    O.M.  Bamshaiye.  2011.  Proximate and  Phytochemical  Composition  of Moringa  oleifera    Leaves  at  Three Stages  of  Maturation.  Journal  of  Food Science and Technology. 3(4): 233-237. Biswas,  S. K.,  A.  Chowdhury.,  Joysre  D.,  Ajoy R  dan  Zahid  H.  2012.  Harmacological Potentials  of  Moringa  oliefera  Lam. International  Journal  Pharmaceutical Sciences and Research. 3(2): 305-310.
Dyszel,  J L., J N Smith., Darren E L., Jitesh A S., Matthew C S., Mathew A V., Glenn M  Y.,  dan  Brian  M.M.A.  2010. Salmonella Enterica Serovar Typhimurium Can Detect Acyl Homoserine  Lactone  Production  By Yersinia enterocolitica In Mice. Journal Of Bacteriology. 192:  29-37.
Fashey J W. 2005. Moringa oleifera: A Review Of  The  Medical  Evidence  For  Its Nutritional, Therapeutic and Prophylactic  Properties.  Journal  Tress For Live 1: 1-5.
Gaikwad,  Switi  B.,  G.  Krishna  M.,  Kavitha  J., dan  Reddy.  2011.  Moringa  Oleifera Leaves: Moringa oleifera Leaves: Immunomodulation  In  Wistar  Albino Rats. International Journal of Pharmacy and  Pharmaceutical  Sciences.  3:  426- 430.
Schmitz  I.,  C.  Meyer  dan    K  Schulze  O.  2006.
CD95 Ligand Mediates T-Cell Receptor-Induced Apoptosis Of A CD4 + CD8 + Double Positive Thymic
Lymphoma.  Original Article Oncogene 25: 7587–7596.
Koebernick  H.,  Leander  G.,  John  R.  D.,
Wolfgang  R.,  Michael  S.  R.,  Hans  W. M.  C  dan  Stefan  H.E.K.  2002. Macrophage Migration Inhibitory Factor
Profil Sel Timosit CD4 + CD8 + (47-51)
(MIF) Plays a Pivotal Role In Immunity Against
Salmonella typhimurium. PNAS. 99 (21): 13681-13686. Liu, X., dan R. Bosselut. 2004. Duration of TCR Signaling  Controls  CD4-CD8  Linage Differentiation  in  Vivo.  Article  Natura Immunology. 5: 280-288. Messaoudene,  D.,  H.  Belguendouz.,  Mohamed L.  A.,  Tarek  B.,  Fifi  O.,  Malika  T., Pierre  Y  dan    Chafia  T.  B.  2011.  Ex
Vivo  Effects  of  Flavonoïds  Extracted From Artemisia Herba Alba On Cytokines  and  Nitric  Oxide  Production in Algerian Patients With Adamantiades Ehcet’s Disease. Journal of Inflammation. 8: 35.
Rajanandh  M.G  dan    Kavitha  J.  2010.
Quantitative  Estimation  of β -Sitosterol,
Total Phenolic and Flavonoid Compounds  in  the  Leaves  of  Moringa oleifera. International Journal of PharmTech Research. 2(2): 1409-1414.
Rifa’i,  M.  2011.  Autoimun  dan  Bioregulator. Malang. UB press. Sudha  P.,  S.  Mohammed.,  Basheeruddin  A., Sunil  S.D.    dan    Gowda  K.C.  2010.
Immunomodulatory Activity of Methanolic  Leaf  Extract  of    Moringa oliefera    in  Animals.  Indian  J  Physiol
Pharmacol. 54 (2): 133–140.
Smedt,  M.  D.,  Georges  L.,  Bart  V.,  Tessa  K., Tom T., and Jean P. 2011. T-Lymphoid Differentiation  Potential  Measured  In Vitro  is  HIGHER  In  CD34 + Cd38 -/I0
Hematopoietic Stem Cell From Umbilical Cord Blood Than From Bone Marrow and Is An Intrinsic Property Of The CELL. Hematologica. 5: 98.
Verinaud  L.,  Paula  C.,  De  Souza  S  dan    Vania N. B. 2004. Review Thymic Atrophy In Infectious  Diseases.  Braz.  J.  morphol. Sci. 21(2): 111-116.