## ANALISIS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) DAN AKTIVITAS
PENANGKAPAN RADIKAL BEBAS (PRB) EKSTRAK ETANOL LEMPUYANG EMPRIT ( Zingiber americans ) HASIL MASERASI

## SEKALI DAN MASERASI BERULANG
ANALYSIS OF THIN LAYER CHROMATOGRAPHY AND RADICAL SCAVENGING ACTIVITIY ETHANOL EXTRACTS OF LEMPUYANG EMPRIT (ZINGIBER AMERICANS) THE RESULT OF A MACERATION AND REMACERATION
Susi Indah Lestari, Broto Santoso Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta Email korespondensi: Broto.Santoso@ums.ac.id

## ABSTRAK
Metode  ekstraksi  menjadi  penting  dan  dapat  mempengaruhi  ekstrak  yang  diperoleh.  Rendemen  hasil metode  maserasi  berulang  didapatkan  lebih  tinggi  dibandingkan  maserasi.  Penelitian  ini  ditujukan  untuk membandingkan  hasil  analisis  kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  dan  aktivitas  penangkapan  radikal  bebas  (PRB) ekstrak  etanol  rimpang  lempuyang  emprit  (Zingiber  americans)  hasil  maserasi  sekali  dan  maserasi  berulang. Simplisia  diekstraksi  dengan  pelarut  etanol  96%  (rasio  10:75)  menggunakan  metode  maserasi  dan  maserasi berulang  masing-masing  sebanyak  empat  kali  replikasi.  Setiap  ekstrak  dilakukan  analisis  kromatografi  lapis tipis  silika  gel  GF 254 menggunakan  eluen  heksana:etil  asetat  (9:1),  dan  dilanjutkan  dengan  uji  penangkapan radikal  bebas  DPPH.  Rendemen  hasil  maserasi  dan  maserasi  berulang  adalah  4,37%  dan  6,83%  (p<  0,05) berturut-turut,  sedangkan  persen  PRB-nya  21,63%  dan  32,68%  (p>  0,05)  secara  berturut-turut.  Hasil kromatogram menampakkan perbedaan intensitas bercak dan nilai R f .  Bercak yang tidak terelusi menunjukkan kemampuan  dalam  menangkap  radikal  bebas,  dimana  sebagian  bercak  menunjukkan  bahwa  ekstrak mengandung golongan senyawa terpenoid, flavonoid, dan alkaloid, namun tidak fenolik. Kesimpulan penelitian ini  bahwa  maserasi  dan  masersi  berulang  memiliki  aktivitas  PRB  yang  tidak  berbeda,  dengan  kandungan terpenoid, flavonoid, dan alkaloid yang lebih tinggi pada maserasi berulang.
Kata  Kunci: Lempuyang  Emprit,  Maserasi,  Maserasi  Berulang,  Aktivitas  Penangkapan  Radikal  Bebas, Kromatografi Lapis Tipis

## ABSTRACT
Extraction  method  is  important  because  has  high  impact  to  the  final  result  of  extract.    The  repeated maceration yield (rMAC) is higher than maceration (MAC) method. The aim of the research was to compare the results  of  chromatogram  profile  and  free  radical  scavenging  activity  of  ethanol  extracts  of  lempuyang  emprit (Zingiber americans) between both of methods. Crude material was extracted using 96% ethanol (ratio 10:75) four times for each method. Extracts were analyzed using TLC plate of silica gel GF 254 as stationary phase and hexane-ethyl  acetate  (9:1)  as mobile  phase.  Their  radical  scavenging  activity  were  done  using  DPPH  method. The yield of maceration repeated maceration results was 4.37% and 21.63% (p <0.05), respectively, while the percentage  of  PRB  was  6.83%  and  32.68%  (p>  0.05),  respectively.  The  chromatogram  results  showed  the difference in spot intensity and the Rf value. The uneluted spots showed the activity of radical scavenging. The spots  reveal  that  terpenoid,  flavonoid,  and  alkaloid  groups  but  not  phenolic  were  found  in  both  of  extract. Further purification needed to be done to confirm the% PRB value that did not differ from the two extracts
Keywords: Lempuyang  Emprit,  Maceration,  Repeated  Maceration,  Radical  Scavenging  Activity,  Thin  Layer Chromatography
How  To  Cite : Lestari,  S.,  &  Santoso,  B.  (2021). ANALISIS  KROMATOGRAFI  LAPIS  TIPIS  (KLT)  DAN AKTIVITAS  PENANGKAPAN  RADIKAL  BEBAS  (PRB)  EKSTRAK  ETANOL  LEMPUYANG  EMPRIT (Zingiber americans) HASIL MASERASI SEKALI DAN MASERASI BERULANG. Biomedika, 13(1), 76-82. doi:https://doi.org/10.23917/biomedika.v13i1.11439
DOI : https://doi.org/10.23917/ biomedika.v13i1.11439

## PENDAHULUAN
Kandungan  senyawa  dengan  aktivitas penangkap radikal bebas dalam ekstrak berperan aktif  dalam  pengobatan,  dimana  konsentrasi senyawa  akan  dipengaruhi  dari  teknik  ekstraksi yang  merupakan  kunci  dalam  memperoleh semua  senyawa  aktif  target    (Ghasemzadeh et al .,  2010).    Pemilihan  teknik  ekstraksi mempengaruhi hasil jumlah dan jenis kandungan  senyawa  dalam  ekstrak  (Yusnawan, 2018).  Yeshak et  al. (2012)  membuktikan bahwa  terdapat  perbedaan  sepersepuluh  bagian untuk  besar  rendemen  ekstrak  pada  1  dari  4 siklotida  yang  digunakan,  dimana  sebagian besar  perlakuan  didapati  penambahan  9% rendemen.  Famili Zingiberaceae diketahui sebagai tanaman  sumber  antioksidan, salah satu spesiesnya  adalah  lempuyang  emprit  ( Zingiber americans) (Da’i et al. 2018).
Salah satu sesquiterpen, yaitu zerumbon,  merupakan  kandungan  terbesar lempuyang  emprit  dapat  larut  dalam  heksana atau  etanol  (Sukari et  al. ,  2008).  Nilai half maximal inhibitory concentration (IC 50 ) penangkapan  radikal  bebas  zerumbon  sebesar 105,08  μg/mL,  namun  nilai Ferric  Reducing Antioxidant  Power (FRAP)  lebih  rendah  3,6
kalinya  dibandingkan  dengan  vitamin  C (Sidahmed et al. , 2015; Da’i et al. , 2018). Profil kromatogram  dari  hasil  maserasi  dan  perkolasi terdapat  perbedaan  dalam  jumlah  bercak  yaitu berturut-turut  tiga  dan  lima  bercak,  karena kandungan  kimia  dalam  ekstrak  hasil  maserasi memiliki  konsentrasi  yang  kecil  sehingga  tidak dapat terdeteksi.
Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan  hasil  kromatografi  lapis  tipis dan aktivitas penangkapan radikal bebas ekstrak etanol  lempuyang  emprit  ( Zingiber  americans) hasil maserasi sekali dan maserasi berulang.

## METODE

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu  alat-alat  gelas  (pyrex),  neraca  analitik OHAUS  Pioneer,  labu  alas  datar,  kondensor allihn, magnetic  stirrer , hot  plate (Cimarec thermo  scientific), vacuum  rotary  evaporator (Heidolph), waterbath (Memmert),  mikropipet (Socorex),  spektrofotometer  UV-Vis  Shimadzu UV  mini-1240, microtube ,  kuvet  (Hellma), sonicator (Branson),  lampu  UV  portable,  pipa kapiler, bejana komatrografi lapis tipis (KLT).
Bahan  yang  digunakan  yaitu  rimpang lempuyang  emprit  yang  diperoleh  dari  Dusun Pijenan,  Desa  Bakalan,  Kecamatan  Jumapolo,
Kabupaten Karanganyar, etanol 96%, etanol p.a (Agung  Jaya),  air  suling,  larutan  pereaksi anisaldehid-asam sulfat, feri klorida, dragendorff, sitroborat,
2,2
Difenil-l- pikrilhidrazil (DPPH), dan lempeng KLT GF 254

## Preparasi Simplisia
Rimpang  yang  telah  dideterminasi  di Laboratorium  FKIP  UMS  disortir  berdasarkan ukuran,  warna,  dan  bau.  Rimpang  terpilih dicuci,  dikupas,  dirajang,  dan  dikeringkan  di bawah  sinar  matahari  dengan  pembatas  kain hitam.  Rimpang  kering  diserbuk  menggunakan blender lalu disimpan dalam wadah tertutup.

## Ekstraksi Rimpang Lempuyang Emprit
Metode  maserasi  sekali  dilakukan dengan  cara  merendam  100  gram  serbuk  dalam etanol  96%  selama  3  jam  dengan  pengadukan manual  pada  jam  ke  0,  1,  dan  2.  Hasil dipisahkan antara filtrat dan residu menggunakan Buchner. Filtrat diuapkan dengan rotary  evaporator pada  suhu  60 0 C  lalu dikentalkan di atas waterbath sehingga didapatkan  ekstrak  kental.    Ekstrak  disimpan pada  kulkas.  Maserasi  dilakukan  dengan orientasi dan replikasi tiga kali.
Maserasi  berulang  dikerjakan  dengan cara  melarutkan  100  gram  serbuk  dalam  etanol 96%  menggunakan  labu  alas  datar  yang
terhubung  kondensor  Allihn  dengan  kecepatan pengadukan  350  rpm  yang  dihentikan  setelah  1 jam.  Hasil  dipisahkan  antara  filtrat  dan  residu dengan  Buchner.  Proses  ini  diulangi  hingga  4 kali.  Total  filtrat  diuapkan  dengan rotary evaporator pada  suhu  60 0 C  lalu  dikentalkan  di atas waterbath. Ekstrak  kental  yang  didapatkan disimpan  pada  kulkas.  Maserasi  berulang dilakukan  dengan  orientasi  dan  replikasi  tiga kali.

## Penentuan  Aktivitas  Penangkapan  Radikal Bebas
Penentuan panjang gelombang
maksimal  dilakukan  dengan  mengambil  500,0 µL  larutan  DPPH  0,8  mM  dan  ditambahkan etanol  p.a  hingga  volume  akhirnya  adalah  2,5 mL di dalam mikrotube dan diukur absorbansinya pada rentang panjang gelombang 400-800  nm  dengan  blanko  etanol  p.a.  Panjang gelombang maksimal DPPH secara teoritis yaitu 517  nm.  Larutan  stok  dibuat  dalam  konsentrasi 1200  µg/mL,  diencerkan  menjadi  200  µg/mL lalu  ditambahkan  etanol  dan  larutan  DPPH masing-masing  sebanyak  500,0  µL.  Campuran diinkubasi  dalam  kondisi  terhindar  cahaya selama  45  menit  dan  dilakukan  pengukuran. Apabila dari hasil pengujian skrining 200 µg/mL
menunjukkan  nilai  %  PRB≥  50%  maka pengujian dilanjutkan dengan IC 50 .

## Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Kromatogram ekstrak diperoleh dengan  cara  KLT  dengan  kadar  sampel  0,1 μg/mL  pada  lempeng    silika  gel  GF 254 dan menggunakan  fase  gerak  heksana:etil  asetat (9:1)  dan  bercak  yang  terbentuk  diamati  pada sinar UV254 nm dan 366 nm. Dalam identifikasi senyawa,  plat  KLT  disemprot  dengan  pereaksi anisaldehid-H 2 SO 4 , FeCl 3 , sitroborat, dragendorff, dan DPPH yang kemudian dibandingkan dengan kontrol positif 1,0 mg/mL. Kontrol  positif  yang  digunakan  yaitu  mentol, kuercetin, asam galat, vitamin E, dan piperin.

## Analisis Data
Analisis data secara statistika dilakukan  uji  distribusi  data  dengan  uji  Shapiro Wilk. Data terdistribusi normal dilanjutkan uji T independent.  Data  terdistribusi  tidak  normal dilanjutkan uji Mann Whitney.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak yang didapatkan berupa ekstrak kental berwarna coklat kehitaman untuk kedua  metode.  Rendemen  maserasi  berulang lebih  tinggi  1,6  kalinya  dibandingkan  maserasi sekali  (tabel  1)  yang  berbeda  signifikan  (uji  T, p<  0,05).  Selain  faktor  pengadukan,  adanya
perbedaan rendemen dikarenakan jumlah pelarut yang  digunakan  berbeda,  pengaruh  efektivitas dan total lama penyarian.
Tabel 1. Rendemen Dan Persen Penangkapan Radikal Bebas Maserasi Dan Maserasi Berulang Ekstrak Etanol Rimpang Lempuyang Emprit (n=
4) Metode Rendemen (rerata±SD) % PRB (rerata±SD) Maserasi 4,37±0,14 21,63±5,89 Maserasi Berulang 6,83±1,15 32,68±6,99
Hasil  skrining  awal  untuk  uji  PRB ekstrak  pada  kadar  200  ppm  diperoleh  nilai kurang  dari  50%  (tabel  1)  yang  tidak  terdapat perbedaan  secara  signifikan  (uji  T,  p>  0,05). Kadar  200  ppm  dipilih  karena  batas  tertinggi suatu  sampel  dapat  dinyatakan  masih  aktif sebagai antioksidan (Da’i et al , 2018).

## Profil Kromatografi Lapis Tipis
Kromatogram  hasil  maserasi  dan maserasi berulang menunjukkan perbedaan pada intensitas  bercak  dan  nilai  R f (tabel  2  dan gambar 1). Perbedaan tersebut karena kandungan  kimia  dalam  ekstrak  hasil  maserasi kemungkinan  memiliki  konsentrasi  yang  lebih kecil sehingga tidak dapat terdeteksi , sedangkan nilai  R f yang  diperoleh  digunakan  untuk mengidentifikasi senyawa.
Uji KLT dilakukan untuk mengidentifikasi suatu senyawa dalam rimpang. Identifikasi golongan senyawa metabolit
dilakukan menggunakan larutan pereaksi penyemprot. Kromatogram menunjukkan
bahwa  kelompok  senyawa  pada  bercak  yang tidak terelusi memiliki kemampuan penangkapan radikal bebas dikarenakan memiliki polaritas yang mirip dengan fase diam silika  yang  mempunyai  gugus  hidroksil  sebagai pengikatnya. Sebagian bercak lainnya menampakkan  kandungan  senyawa  golongan
terpenoid,  flavonoid,  dan  alkaloid  tetapi  tidak ditemukan adanya senyawa fenolik.
Hasil  uji  KLT  pada  penyemprotan lempeng  menggunakan  pereaksi  anisaldehid menampakkan bercak yang sama dengan kontrol positif  (mentol)  yaitu  berwarna  biru  violet  dan kuning  pada  sinar  tampak  (gambar  1  dan  tabel 2),  sehingga  kemungkinan  ekstrak  mengandung terpenoid.
Gambar 1. Hasil KLT ekstrak etanol lempuyang emprit menggunakan fase diam silika gel GF 254 dan fase gerak n-heksan:etil asetat (9:1), (1) maserasi, (2) maserasi berulang, lempeng disemprot dengan pereaksi (A)
Anisaldehid, (B) Sitroborat, (C) FeCl 3 , (D) DPPH, (E) Dragendorff, (F) Sinar UV 254nm, (G) Sinar UV 366nm , (H)
Sinar tampak: (1) Orientasi, (2-3) Replikasi 1-3. (a-e) Kontrol positif.
Bercak  keempat  menampilkan  nilai  R f yang tinggi,  sehingga  dimungkinkan  mengandung senyawa yang bersifat non polar.
Identifikasi  senyawa  flavonoid  dilakukan dengan  pereaksi  semprot  sitroborat  yang
hasilnya muncul bercak berwarna berfluoresensi kuning kehijauan pada sinar UV 366 sama seperti kontrol positif (kuersetin), sehingga kemungkinan  ekstrak  mengandung  senyawa flavonoid.  Bercak  totolan  setelah  disemprot
tidak mengalami pemisahan, sehingga dimungkinkan golongan senyawa bersifat polar.
Pereaksi  FeCl 3 yang  disemprotkan  pada lempeng  KLT  menampakkan  bercak  warna coklat  pada  sinar  tampak,  sedangkan  pada kontrol  positif  (asam  galat)  menampakkan warna abu-abu biru, sehingga ekstrak dimungkinkan tidak mengandung fenolik karena tidak    berwarna  seperti  kontrol  positif.  Bercak pada  lempeng  maserasi  berulang  memiliki intensitas  warna  yang  lebih  pekat  dibandingkan lempeng maserasi dilihat pada sinar tampak dan tidak mengalami pemisahan, sehingga
dimungkinkan  bersifat  polar  karena  tertahan  di fase  diam.  Analisis  kualitatif  untuk  uji penangkapan radikal bebas menggunakan pereaksi  semprot  DPPH  yang  menunjukkan bercak  berwarna  kuning  dengan  latar  belakang berwarna  ungu  sama  seperti  kontrol  positif (vitamin  E),  sehingga  kemungkinan  adanya senyawa  yang  bertanggung  jawab  atas  aktivitas penangkapan radikal bebas pada ekstrak. Bercak pemisahan  yang  terbentuk  berada  di  bawah sehingga dimungkinkan bersifat polar. Senyawa alkaloid diidentifikasi dengan pereaksi Dragendorff.
Tabel 2. Hasil Identifikasi Kandungan Senyawa Ekstrak Etanol Lempuyang Emprit, (I-IV) Totolan
Ekstrak, (1-4) Nilai Rf Dari Bercak Yang Tampak Identi- fikasi Perlakuan (nilai R f ) Kelom- pok se- nyawa Maserasi Maserasi Berulang UV 254 I: 0,4 (1); 0,56 (2); II: 0,4 (1); 0,64 (2) III, IV: 0,36 (1); 0,56 (2) I, II, IV: 0,44 (1); 0,64 (2); III: 0,44 (1); 0,68 (2) - UV 366 I: - II: 0,64 (1); III: 0,52 (1) IV: 0,52 (1); 0,68 (2) I: - II: 0,48 (1); 0,6 (2); III: 0,52 (1); 0,68 (2) IV: 0,4 (1); 0,68 (2) - Anisal- dehid I: 0,16 (1); 0,36 (2); 0,48 (3); 0,92 (4); II: 0,16 (1);  0,40 (2); 0,56 (3); 0,92 (4) III, IV: 0,16 (1); 0,32 (2); 0,48 (3); 0,92 (4) I, II: 0,16 (1); 0,32 (2); 0,44 (3); 0,88 (4); III: 0,16 (1);0,36 (2);0,52 (3);0,88 (4); IV: 0,16 (1);0,36 (2); 0,44 (3); 0,88 (4) Terpenoi d DPPH I-III: 0,16(1) IV: - I-III: 0,16(1) IV: - Aktivi- tas PRB Dragendor ff I, II, IV: 0,4 (1) III: 0,44 (1) I, II: 0,56 (1) III, IV: 0,52 (2) Alkaloid Sinar tampak; sitroborat; FeCl 3 - - - - - - - Flavo- noid Fenolik
Perubahan warna lempeng KLT setelah  disemprot  menunjukkan  warna  kuning oranye sehingga dimungkinkan ekstrak mengandung  senyawa  alkaloid.  Bercak  yang muncul  pada  lempeng  maserasi  berulang memiliki  intensitas  lebih  tebal dibandingkan lempeng maserasi dan berada di tengah lempeng sehingga dimungkinkan bersifat semi polar.

## SIMPULAN DAN SARAN
Ekstrak  hasil  maserasi  dan  maserasi berulang  pada  pengujian  aktivitas  penangkapan radikal  bebas  menunjukkan  %  PRB  yaitu 21,63%  dan  32,68%  yang    tidak  terdapat perbedaan  secara  signifikan,  sedangkan  hasil kromatogram menampakkan perbedaan intensitas bercak dan nilai R f .  Bercak yang tidak terelusi menunjukkan kemampuan dalam menangkap  radikal  bebas,  sedangkan  sebagian bercak menunjukkan bahwa ekstrak mengandung  golongan  senyawa  terpenoid, flavonoid, dan alkaloid.

## DAFTAR PUSTAKA
Da’i, M., Setiawan, D. and Melannisa, R. 2018. Potency  of  Radical  Scavenging  Activity and  Determination  of  Total  Phenolic
Content  of  Five  Ethanolic  Extract  of Rhizome  Zingiberaceae  Family. Indones. J.  Cancer  Chemoprevent .  4(1).  p:  457. doi:
10.14499/indonesianjcanchemoprev4iss1 pp457-462.
Ghasemzadeh, A., Jaafar, H. Z. E. and Rahmat,
A.  2010.  Antioxidant  Activities,  Total Phenolics and Flavonoids Content in Two Varieties  of  Malaysia  Young  Ginger (Zingiber  officinale  Roscoe). Molecules . 15(6). Pp: 4324–4333. doi: 10.3390/molecules15064324.
Sidahmed,  H.  M.  A.  Hashim,N.M.,  Abdulla,M. A., Ali,H.M., Mohan, S., Abdelwahab, S. I., Taha, M.M.E., Fai,L.M., and Vadivelu, J.  2015.  Antisecretory,  Gastroprotective, Antioxidant  and  Anti-Helicobcter  Pylori Activity  of  Zerumbone  from  Zingiber
Zerumbet  (L.)  Smith. PLoS  One .  10(3). Pp: 1–21. doi: 10.1371/journal.pone.0121060.
Sukari, M. A., Mohd Sharif, N.W., Yap, A.L.C., Tang,  S.W.,  Neoh,  B.K.,  Rahmani,  M.,
Ee, G.C.L., Taufiq-Yap, Y.H., and Yusof, U.K. 2008. Chemical Constituents Variations  of  Essential  Oils  From
Rhizomes of Four Zingiberaceae Species . Diversity . 12(3). Pp: 638–644.
Yeshak,  M.Y.,  Burman,  R.,  Eriksson,  C.,  and Goransson, 2012, Optimization of cyclotide extraction parameters.
Phytochem. Lett. 5. Pp: 776–81.
Yusnawan,  E.  2018.  Effects  of  Different Extraction  Methods  on  Total  Phenolic Content  and  Antioxidant  Activity  in Soybean Cultivars. IOP Conf. Ser.: Earth Environ.  Sci .  102.  p:  12039.  doi: 10.1088/1755-1315/102/1/012039.