Menara Perkebunan 2023, 91(1), 87-95
http://dx.doi.org/10.22302/iribb.jur.mp.v91i1.524
p-ISSN: 0125-9318/ e-ISSN: 1858-3768
Accreditation Number: 164/E/KPT/2021

## Potensi ekstrak kasar metabolit sekunder yang dihasilkan Trichoderma asperellum dan Pseudomonas fluorescens untuk pengendalian antraknosa
pada buah kakao
Potency of secondary metabolite crude extracts produced by Trichoderma asperellum and Pseudomonas fluorescens for anthracnose control in cocoa pod
Christina Oktora MATONDANG 1) , MUKLASIN 1) & Loekas SOESANTO 2*)
1) Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan, Jl. Asrama 124 Helvetia, Sei Sikambing B, Medan 20124, Indonesia
2) Fakultas Pertanian, Universitas Jenderal Soedirman, Jl. dr. Suparno, Purwokerto 53123, Indonesia
Diterima tgl 14 Jan 2023 / Perbaikan tgl 11 Apr 22 / Disetujui tgl 14 Apr 2023

## Abstract
Cocoa pod anthracnose is an important disease of cocoa and can reduce yields. Many attempts have been  made  to  control  anthracnose  rot  disease  on cocoa  pods  but  have  not  been  successful  yet.  This study  aimed  to  examine  the  potency  of  secondary metabolite crude extracts produced by Trichoderma asperellum and Pseudomonas fluorescens solely or in  combination  in  controlling  anthracnose  rot disease  of  cocoa  pods  in  the  field  at  Silo  Bonto Village, Asahan Regency, North Sumatera Province. The  secondary  metabolite  crude  extracts  was prepared  by the  form  of  conidia  or  T.  asperellum and P. fluorescens cells. A randomized block design was  used  to  assessed  four  treatments  i.e. T. asperellum + P.  fluorescens,  T.  asperellum,  P. fluorescens secondary metabolite crude extracts and control,  which  was  repeated  six  times.  The observation  parameters  were  the  percentage  of healthy  and  diseased  pods  (anthracnose  fruit  rot). The  results  showed  that  the  secondary  metabolite crude extracts of T. asperellum, P. fluorescens, and T. asperellum + P. fluorescens reduced the number of  diseased  fruits  by  94.71,  89.09,  and  92.09% compared to the control respectively. The increasing of    healthy  fruits  number  in  the  application  of secondary  metabolite  crude  extracts  of T. asperellum , P.  fluorescens ,  and T.  asperellum  + P. fluorescens was  52.68,  54.20,  and  54.18%, respectively.
[Keywords: anthracnose  pod  rot,  antagonistic microbes,  bioactive  compound,  field tests]

## Abstrak
Penyakit  antraknosa  buah  kakao  merupakan salah  satu  penyakit  penting  tanaman  kakao  dan dapat  menurunkan  hasil.  Pengendalian  penyakit busuk  antraknosa  pada  buah  kakao  telah  banyak dilakukan  tetapi  belum  berhasil  dengan  baik. Penelitian  ini  bertujuan  mengkaji  potensi  ekstrak kasar  metabolit  sekunder  yang  dihasilkan  oleh Trichoderma asperellum dan Pseudomonas fluorescens tunggal atau gabungan dalam mengendalikan  penyakit  busuk  antraknose  buah kakao  di  kebun  kakao  rakyat  di  Desa  Silo  Bonto, Kabupaten  Asahan,  Provinsi  Sumatera  Utara. Ekstrak kasar metabolit sekunder yang diaplikasikan adalah  dalam  bentuk  konidium  atau  sel T. asperellum dan P.  fluorescens .  Rancangan  acak kelompok digunakan untuk menguji empat perlakuan yaitu ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum + P.  fluorescens , T.  asperellum , P. fluorescens ,  dan  kontrol,  yang  diulang  enam  kali. Parameter pengamatan adalah persentase buah sehat dan sakit (busuk buah antraknosa). Hasil penelitian menunjukkan  bahwa  ekstrak  kasar  metabolit sekunder T.  asperellum , P.  fluorescens , dan T. asperellum  + P.  fluorescens menurunkan  jumlah buah sakit masing-masing sebesar 94,71; 89,09; dan 92,09%  dibandingkan  kontrol . Peningkatan  jumlah buah  sehat  pada  aplikasi  ekstrak  kasar metabolit sekunder T.  asperellum , P.  fluorescens ,  dan T. asperellum + P. fluorescens masing-masing sebesar 52,68; 54,20; dan 54,18%.
[Kata kunci:   busuk  buah  antraknosa,  mikroba antagonis,  senyawa  bioaktif,  uji lapangan]
0125-9318/ 1858-3768 ©2023 Authors
This is an open access article under the CC BY license ( https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ) Menara Perkebunan is DOAJ indexed Journal and accredited as Sinta 2 Journal ( https://sinta.kemdikbud.go.id/journals/profile/3125 ) How to Cite: Matondang, C. O., Muklasin,  & Soesanto, L. (2023). Potensi ekstrak kasar metabolit sekunder yang dihasilkan Trichoderma asperellum dan Pseudomonas fluorescens terhadap pengendalian antraknosa pada buah kakao. Menara Perkebunan , 91 (1), 87-95. http://dx.doi.org/10.22302/iribb.jur.mp.v90i2.511
*) Korespondensi penulis: lukassusanto26@gmail.com
Potensi ekstrak kasar metabolit sekunder yang dihasilkan Trichoderma asperellum dan …………………...(Matondang et al.)

## Pendahuluan
Kakao  merupakan  salah  satu  produk  pertanian yang memiliki peranan yang cukup nyata dan dapat diandalkan  dalam  mewujudkan  program  pertanian. Lahan  kakao  seluas  1.492.588  ha  (98,9  %) merupakan  perkebunan rakyat dan  16.368 ha (1,07 %)  dikembangkan  perusahaan  swasta  dan  nasional (Badan Pusat Statistik, 2020). Hal ini berarti bahwa komoditas kakao tidak hanya sebagai  penyumbang ekspor, tetapi juga sebagai sumber mata pencaharian utama  petani  serta  sumber  bahan  baku  industri. Berdasarkan  data  Badan  Pusat  Statistik  (2020), produksi  kakao  Indonesia  pada  2018  tercatat 767.280  ton,  sedangkan  produksi  kakao  di  tahun 2020  menjadi  sebesar  720.660  ton  atau  terjadi penurunan sebesar 6,076%.
Penurunan  luas  lahan  akan  berimbas  kepada penurunan  produksi  kakao,  karena  sebagian  besar tanaman  kakao  rakyat  sudah  berumur  tua,  kurang terpelihara,  dan  terserang  hama  dan  penyakit, sehingga  tingkat  produktivitas  semakin  menurun. Hal  ini  dikarenakan  petani  kurang  mampu mengelola  usahatani  kakaonya  dan  terbatasnya ekonomi  serta  penyuluh  perkebunan  kakao  di Indonesia.  Salah  satu  penyakit  penting  pada tanaman  kakao  adalah  penyakit  antraknosa,  yang disebabkan oleh jamur
Colletotrichum gloeosporioide (Mohanan  et  al.,  2008).  Penyakit antraknosa merupakan penyakit yang membahayakan  kebun  kakao  petani.  Apabila menyerang  bagian  buah  pentil  akan  menyebabkan buah mengering dan akhirnya gugur (Guest, 2007). Serangan  pada  daun  dapat  menyebabkan  daun menjadi rontok dan akhirnya ranting terlihat gundul. Lebih  dari  38% buah muda yang berukuran 15 cm mengalami busuk akibat serangan C. gloeosporioides (Asare et al., 2021).
Pengendalian  penyakit  antraknosa  buah  kakao umumnya  dilakukan  dengan  aplikasi  fungisida kimia sintetis. Akan tetapi, aplikasi  fungisida yang terus  menerus  dapat  menyebabkan  dampak  negatif tidak saja terhadap lingkungan, tetapi juga terhadap kesehatan manusia, terutama petani atau pengaplikasi fungisida (Keswani et al., 2019). Oleh karenanya,  diperlukan  alternatif  pengendalian penyakit  antraknosa  buah  kakao  yang  aman  dan ramah lingkungan, salah satunya dengan pengendalian hayati.
Agensia  pengendali  hayati  yang  sering  dikaji adalah Trichoderma spp.  dan Pseudomonas fluorescens . Trichoderma spp.  telah  terbukti  dapat mengatasi beragam penyakit tanaman (Munir et al., 2013;  Kumar  et  al.,  2017;  Ghazanfar  et  al.,  2018). Sementara  itu, P.  fluorescens juga  digunakan  dan mampu  mengendalikan  secara  hayati  berbagai penyakit tanaman (Sivasakthi et al., 2014). Mikroba antagonis (Rashid et al., 2016) dan zat kimia (Muturi
et  al.,  2017),  akan  mengalami  penurunan  secara langsung  oleh  sinar  matahari  saat  diaplikasikan  di lapangan  sehingga  membatasi  kemampuannya. Salah  satu  strategi  untuk  menghindari  degradasi agensia  hayati  perlu  dikembangkan  penggunaan ekstrak kasar metabolit sekunder yang dihasilkannya  (Mutawila  et  al.,  2015).  Aplikasi ekstrak  kasar  metabolit  sekunder  dari  mikroba antagonis lebih menguntungkan daripada bentuk sel atau spora (Buddhika & Abeysinghe, 2021; Verma, et al., 2020).
Trichoderma spp . menghasilkan  metabolit sekunder yang terdiri atas beragam senyawa bioaktif (Mukherjee  et  al.,  2012b;  Vinale  et  al.,  2014). P. fluorescens menghasilkan metabolit  sekunder yang mengandung  antibiotika  dan  bersifat  PGPR  ( Plant Gowth  Promoting  Rhizobacter ), yang menghambat pertumbuhan patogen dan merangsang pertumbuhan tanaman  (Sahu  et  al.,  2018;  Alsohim,  2020). Penggunaan bakteri ini dilaporkan telah memberikan  hasil  positif  pada  pertumbuhan  dan produksi  pada  tanaman  pertanian  (Jain  &  Das, 2016). Akan tetapi, ekstrak kasar metabolit sekunder kedua  mikroba  antagonis  tersebut  baik  tunggal ataupun  gabungan  belum  pernah  diuji  untuk mengendalikan  penyakit  antraknosa  buah  kakao. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkaji potensi ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum dan P . fluorescens tunggal  atau  gabungan  dalam mengendalikan  penyakit  busuk  buah  antraknosa pada tanaman kakao.

## Bahan dan Metode

## Persiapan isolat antagonis
Dua  mikroba  antagonis  yang  digunakan,  yaitu T.  asperellum dan P.  fluorescens ,  merupakan koleksi  Balai  Besar  Perbenihan  dan  Proteksi Tanaman  Perkebunan,  Medan. T.  asperellum ditumbuhkan  kembali  pada  medium  PDA  dan diinkubasi  pada  suhu  kamar  selama  5  hari  (Yun  et al.,  2017),  sedangkan P.  fluorescens pada  medium King’s  B  dan  dinkubasi  pada  suhu  kamar  selama 3  hari  (Lamichhane  &  Varvaro,  2013).  Khusus T.  asperellum ,  antagonis  tersebut  kemudian diperbanyak pada jagung pecah dengan cara jagung pecah  dicuci  bersih  terlebih  dahulu  sampai  bersih, kemudian  dimasukkan  ke  dalam  plastik  sebanyak 50 g, disterilkan dengan autoklav pada suhu 121°C, tekanan  15  psi  selama  30  menit,  dan  didinginkan. T. asperellum sebanyak 3 plug bor gabus (diameter 6 mm) diinokulasikan ke jagung pecah steril dingin dalam plastik menggunakan spatula steril, kemudian mulut plastik ditutup dengan staples dan diinkubasi selama  6-7  hari  pada  suhu  kamar  (Soesanto  et  al., 2014).

## Menara Perkebunan 2023, 91(1), 87-95

## Penyiapan ekstrak kasar metabolit sekunder
Dua bungkus plastik jagung pecah (@ 50 g) yang telah ditumbuhi T. asperellum dilarutkan dalam 1 L air steril. Selanjutnya diaduk hingga spora lepas dari jagung  dan  disaring.  Air  hasil  saringan  siap  untuk digunakan. Medium yang digunakan untuk memproduksi  metabolit  sekunder adalah  campuran air  cucian  beras  dan  air  kelapa  (4:1,  v/v)  dan  gula sebanyak  10  g  L -1 kemudian  dimasak  sampai mendidih,  disaring,  dan  dimasukkan  ke  dalam jeriken  steril  dan  didinginkan.  Setelah  medium tersebut dingin, larutan konidium sebanyak 100 mL L -1 ditambahkan (Soesanto et al., 2021). Selanjutnya jeriken  ditutup  rapat  dan  diinkubasi  dengan  cara digoyang  secara  manual  sampai  homogen  selama 14  hari  (Hudson  et  al.,  2021).  Setelah  diinkubasi, kepadatan konidia dihitung menggunakan haemositometer untuk menentukan tingkat pengenceran,  dan  diperoleh  kepadatan  konidia 10 6 konidia  mL -1 .  Larutan  kemudian  disaring menggunakan  kertas  saring  Whatman  no  1  untuk memisahkan  propagul  jamur  dari  supernatannya (Rauf  et  al.,  2018).  Selanjutnya  larutan  konidia disentrifus  dengan  kecepatan  9.000  rpm  selama 2  menit  untuk  memisahkan  konidia  dari  larutan ekstrak  kasar  metabolit  sekunder  (Shehata  et  al., 2019). Ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum siap untuk diaplikasikan.
Tahapan  pembuatan  ekstrak  kasar  metabolit sekunder P.  fluorescens adalah  sebagai  berikut; keong dikumpulkan, kemudian dipecah cangkangnya  dan  diambil  dagingnya.  Daging dibersihkan  dan  ditimbang  sebanyak  400  g  L -1 air ditambah  terasi  2  g  L -1 dan  direbus  sampai  lunak (Soesanto et al., 2014). Selanjutnya, kaldu disaring, dimasukkan ke dalam jeriken steril dan didinginkan. Kemudian P. fluorescens , yang dipanen dari King’s B  dengan  menambahkan  air  steril  10  mL, dimasukkan  ke  dalam  medium  kaldu  tersebut,  di- shaker selama  3  hari  pada  kecepatan      150  rpm (Soesanto  et  al.,  2014).  Setelah  inkubasi  tersebut, kepadatan spora dihitung menggunakan pengencereran  bertingkat,  menggunakan  media Nutrient  Agar  (NA)  dan  didapatkan  kepadatan 10 9 upk  mL -1 .  Supernatan  disiapkan  dengan mensentrifuse  suspensi  antagonis  pada  5.000  rpm selama  30  menit  (Decoin  et  al.,  2014).  Supernatan yang diperoleh siap untuk digunakan.

## Penyiapan tanaman kakao
Pengujian  dilakukan  di  kebun  kakao  rakyat  di Desa Silo Bonto, Kecamatan Silo Bonto, Kabupaten Asahan,  Provinsi  Sumatera  Utara  pada  Februari sampai  Desember  2019.  Varietas  tanaman  kakao yang  digunakan  adalah  klon  BCl,  yang  berumur 4-5  tahun,  dengan  jarak  tanam  2,5  m  x  3  m,  dan terserang  busuk  buah  antraknosa.  Kondisi  pohon penaungnya  adalah  pohon  kelapa.  Tanaman  kakao
sampel dipilih secara acak yang menunjukkan gejala busuk  buah  antraknosa  pada  buah  kakao  muda sampai  dewasa,  kemudian  diberi  label,  sesuai perlakuan.  Jumlah  buah  kakao  per  tanaman  kakao sebelum perlakuan antara 19-20 buah.

## Aplikasi ekstrak kasar metabolit sekunder
Aplikasi ekstrak kasar metabolit sekunder kedua mikroba  antagonis  baik  secara  tunggal  maupun gabungan  dilakukan  terhadap  bunga,  yaitu  dengan dikabutkan ke bunga kakao sampai disemprot pada buah  pentil.  Pengabutan  dilakukan  menggunakan knapsack sprayer , dengan lubang nozel paling kecil dan  penyemprotan  dilakukan  interval  1  kali  setiap 1 minggu selama 5 kali. Konsentrasi yang digunakan untuk ekstrak kasar metabolit sekunder T.  asperellum berdasarkan  kepadatan  konidia 10 6 konidia  mL -1 dan  ekstrak  kasar  metabolit sekunder P.  fluorescens berdasarkan  kepadatan spora 10 9 upk mL -1 .

## Rancangan penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  rancangan  acak kelompok dengan perlakuan ekstrak kasar metabolit sekunder T.  asperellum +  metabolit  sekunder P. fluorescens (P1), metabolit sekunder T.  asperellum (P2),  metabolit  sekunder    ekstrak kasar P. fluorescens (P3), dan kontrol (P4). Jumlah ulangan  sebanyak  enam  ulangan;  masing-masing ulangan  terdiri  atas  tiga  pohon  sampel,  sehingga total tanaman adalah 72.

## Variabel pengamatan
Pengamatan  dilakukan  dengan  menghitung jumlah buah kakao sakit (bergejala) dan sehat saat di pohon dan setelah panen, dilakukan 2 minggu sekali, sebanyak  8  atau  10  kali  pengamatan.  Pengamatan dilakukan mulai dari bunga, buah pentil, dan dewasa sampai  menjadi  buah  matang  (siap  panen). Persentase  buah  kakao  sakit  dan  buah  kakao  sehat dihitung dengan rumus (1-4).

## Analisis data
Data dianalisis dengan analisis varian pada taraf kesalahan  5%.  Apabila  berbeda  nyata  antar- perlakuan, dilanjutkan dengan BNJ taraf 5%.

## Hasil dan Pembahasan
Pengaruh  ekstrak  kasar  metabolit  sekunder T. asperellum dan P. fluorescens terhadap jumlah buah kakao sakit (bergejala antraknosa)
Hasil  penghitungan  persentase  buah  sakit sebelum  dan setelah perlakuan pada  tiap  perlakuan disajikan dalam Tabel 1. Tabel ini juga menyajikan data persentase penurunan jumlah buah kakao sakit akibat  aplikasi  perlakuan  ekstrak  kasar  metabolit sekunder agensia hayati.
Potensi ekstrak kasar metabolit sekunder yang dihasilkan Trichoderma asperellum dan …………………...(Matondang et al.)
𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑘𝑖𝑡 (%) = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑘𝑖𝑡 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑥 100% …………….(1)
𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑠𝑒ℎ𝑎𝑡 (%) = 100% − 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑘𝑖𝑡 (%) ………..(2)
𝑝𝑒𝑛𝑖𝑛𝑔𝑘𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑘𝑖𝑡 (%) = 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛  −𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑠𝑒𝑡𝑒𝑙𝑎ℎ 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 𝑥 100 % …..(3)
𝑝𝑒𝑛𝑖𝑛𝑔𝑘𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑠𝑒ℎ𝑎𝑡 (%) = 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛  −𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑠𝑒𝑡𝑒𝑙𝑎ℎ 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 𝑥 100 % …..(4)
Tabel 1.  Pengaruh aplikasi ekstrak kasar metabolit sekunder terhadap persentase buah sakit pada tanaman kakao Table 1.   Effect of secondary metabolite crude extracts application on percentage of diseased pods on cocoa
Perlakuan Treatment Persentase buah sakit (%) Percentage of diseased pods (%) Penurunan buah sakit (%) Decreasing diseased pods (%) Sebelum perlakuan Before treatment Setelah perlakuan After treatment MS Ta+ Pf 10,33 a*) 0,82 a 92,09 MS Ta 8,18 a 0,43 a 94,71 MS Pf 9,17 a 1,00 a 89,09 Kontrol 8,55 a 14,70 b - 71,93
*) Angka yang diikuti huruf sama pada kolom sama menunjukkan tidak berbeda nyata menurut BNJ taraf 5%
*) Number followed by the same letter in the same column are not significantly different according to BNJ at the 5% level
Tabel 1 menunjukkan jumlah buah sakit sebelum perlakuan pada masing-masing jenis perlakuan pada tanaman  kakao  tidak  berbeda  nyata.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  serangan  patogen  antraknosa merata  di  kebun  kakao.  Tanaman  sampel  yang digunakan mempunyai masalah penyakit antraknosa buah  kakao  yang  sama  atau  homogen.  Kondisi jumlah  buah  kakao  sakit  awal  yang  homogen berperan  penting  dalam  menentukan  keberhasilan penelitan  yang  dilakukan.  Hal  ini  sesuai  pendapat Huebner  et  al.  (2016)  bahwa  data  awal  yang homogen secara statistika memegang peran penting bagi keberhasilan penelitian.
Aplikasi  ekstrak  kasar  metabolit  sekunder mikroba  antagonis  baik  tunggal  maupun  gabungan menunjukkan  berbeda  nyata  jika  dibandingkan kontrol  (Tabel  1).  Perbedaan  tersebut  bukan disebabkan  oleh  heterogennya  ulangan  atau  blok, tetapi  disebabkan  oleh  perlakuan  yang  diberikan. Aplikasi ekstrak kasar metabolit sekunder T.  asperellum dan P.  fluorescens baik  tunggal maupun  gabungan  berpotensi  menurunkan  jumlah buah kakao sakit atau menurunkan serangan patogen antraknosa  buah  kakao  antara  89,09-94,71  % (Tabel  1).  Jumlah  buah  kakao  sakit  terlihat  lebih sedikit  pada  tanaman  kakao  yang  telah  diberi perlakuan  ekstrak  kasar  metabolit  sekunder T. asperellum dan P. fluorescens dibandingkan jumlah
buah kakao sakit pada tanaman kakao kontrol  atau pada tanaman kakao yang tidak diaplikasikan.
Hal  ini  menunjukkan  bahwa T.  asperellum dan P.  fluorescen s  berpotensi  mengatasi  penyakit antraknosa  buah    kakao.  Penetrasi  hifa  patogen melalui  pembentukan  apresorium,  produksi  enzim pendegradasi dinding sel, dan parasitisasi isi dinding sel  patogen  (Mukherjee  et  al.,  2012a).  Degradasi dinding  sel  patogen  selama  mikoparasitisme dimediasi  oleh  sekumpulan  enzim  hidrolisis termasuk  β-(1,6)-glukanase,  kitinase,  dan  protease (Adnan et al., 2019). Trichoderma sp. menghasilkan metabolit  sekunder  terdiri  atas  enzim  selulolisis, xilanolisis,  kitinolisis  dan  beta-1,3-glukanolisis (Kredics et  al., 2005), selain menghasilkan peptida non-ribosomal  seperti  peptaibiotik,  siderofor  dan gliotoxin,  dan  gliovirin  seperti  diketopiperazine, poliketida,  terpen,  piron,  dan  metabolit  isosian (Zeilinger  et  al.,  2016),  serta  beberapa  enzim  lisis (Vinale  et  al.,  2014).  Kemampuan  menghasilkan sejumlah  besar  metabolit  sekunder  tersebut membuat Trichoderma spp. berhasil sebagai agensia biokontrol.  Mikoparasit Trichoderma spp.  sebagai antagonis  dan  membunuh  jamur  patogen  dengan aksi  gabungan  dari  senyawa  bioaktif  dan  enzim hidrolisis yang melisiskan dinding sel jamur patogen (Druzhinina et al., 2011). Aplikasi metabolit
Menara Perkebunan 2023, 91(1), 87-95
sekunder P.  fluorescens dan T.  asperellum yang digabung dengan pupuk  organik  sebagai  perlakuan terbaik untuk meningkatkan pertumbuhan kakao dan peningkatan  jumlah  tunas  sebanyak  43,58  tunas (Simamora et al., 2021).
Aplikasi  ekstrak  kasar  metabolit  sekunder T.  asperellum dan P.  fluorescens mampu menurunkan jumlah buah sakit sebesar 92,09% pada perlakuan  ekstrak  kasar  metabolit  sekunder gabungan T. asperellum dan P. fluorescens ; 94,71% pada  perlakuan  ekstrak  kasar  metabolit sekunder T.  asperellum dan  89,09%  pada  perlakuan  ekstrak kasar  metabolit  sekunder P.  fluorescens .  Hal  ini diduga  karena  ekstrak  kasar  metabolit  sekunder tersebut mampu meningkatkan senyawa fenol pada tanaman,  sehingga  dapat  mengimbas  ketahanan kakao  terhadap  penyakit  antraknose.  Hal  ini didukung  oleh  pernyataan  Soesanto  et  al.  (2020) bahwa  perlindungan  akibat  aplikasi  metabolit sekunder adalah dari dalam jaringan tanaman, yang berfungsi  dalam  ketahanan  tanaman  terhadap serangan patogen tanaman. Oleh karenanya, aplikasi ekstrak kasar metabolit sekunder dilakukan melalui
bunga,  sehingga  dapat  masuk  ke  dalam  jaringan buah kakao(Fang et al., 2018).
Gambar  1  menunjukkan  perkembangan  jumlah buah kakao sakit semakin menurun pada perlakuan ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum dan P. fluorescens . Sementara itu, pada tanaman kontrol (tanpa  perlakuan),  jumlah  buah  kakao  sakit menunjukkan  semakin  meningkat  atau  bertambah banyak. Semua perlakuan menunjukkan penurunan jumlah  buah  kakao  sakit  pada  pengamatan  kedua, termasuk pada tanaman kontrol. Penurunan jumlah buah  kakao  sakit  berlanjut  akibat  aplikasi  ekstrak kasar  metabolit  sekunder T.  asperellum dan P.  fluorescens ,  tetapi  pada  pengamatan  III  jumlah buah  sakit  pada  tanaman  kontrol  makin  meningkat hingga  pengamatan  terakhir.  Penurunan  jumlah buah  kakao  sakit  pada  tanaman  kontrol  di pengamatan  II  tersebut  disebabkan  oleh  aplikasi pengendalian lainnya pada saat penelitian dilakukan, termasuk sanitasi dengan memusnahkan buah kakao sakit serta sisa-sisa daun dan ranting tanaman kakao sakit (Ndoumbe-Nkeng et al., 2004).
Gambar 1.  Perkembangan jumlah buah kakao sakit pada masing-masing perlakuan. Keterangan: P1 = ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum + P. fluorescens , P2 = ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum , P3 = ekstrak kasar metabolit sekunder P. fluorescens , dan P4 = kontrol
Figure 1.  The development of the number of healthy cocoa pods in each treatment. Note: P1 = secondary metabolite crude extracts  of T.  asperellum + P.  fluorescens ,  P2  =  secondary  metabolite  crude  extracts  of T.  asperellum ,  P3  = secondary metabolite crude extracts of P. fluorescens , and P4 = control
Tabel 2.   Pengaruh ekstrak kasar metabolit sekunder terhadap persentase buah sehat pada tanaman kakao Table 2.  Effect of secondary metabolite crude extracts on the percentage of healthy pods in cocoa plants
Perlakuan Treatment Persentase buah sehat (%) Percentage of healthy pods (%) Peningkatan buah sehat (%) Increasing healthy pods (%) Sebelum perlakuan Before treatment Setelah perlakuan After treatment MS Ta+ Pf 10,88 a*) 23,75 a 54,18 MS Ta 10,88 a 23,00 a 52,68 MS Pf 10,72 a 23,40 a 54,20 Kontrol 10,62 a 0,30 b -34,39
*) Angka yang diikuti huruf sama pada kolom sama menunjukkan tidak berbeda nyata menurut BNJ taraf 5%
*) Number followed by the same letter in the same column are not significantly different according to BNJ at the 5% level
0 2 4 6 8 10 12 14 16 I II III IV V Ju m lah b u ah s ak it /
Nu m b er o f d is ea sed p o d s Pengamatan ke- / Observation P1 P2 P3 P4
Potensi ekstrak kasar metabolit sekunder yang dihasilkan Trichoderma asperellum dan …………………...(Matondang et al.)
Pada  pengamatan  III,  jumlah  buah  kakao  sakit pada tanaman kontrol mulai meningkat, (Gambar 2). Hal  ini  diduga  karena  kelembapan  di  bawah  tajuk tanaman  kakao  lebih  tinggi  dan  berpengaruh terhadap  pertumbuhan    dan  perkembangan  jamur patogen antraknosa. Selain itu, kondisi kebun yang kurang  perawatan  misalnya  pemangkasan  rutin, menyebabkan  sinar  matahari  tidak  dapat  mencapai di  bawah  tajuk  (Govindaraj  &  Jancirani,  2017; Lahive  et  al.,  2019).  Kondisi  ini  menyebabkan kelembapan  lebih  tinggi  dan  berpengaruh  terhadap perkembangan  penyakit  antraknosa  pada  tanaman kakao  kontrol,  mengingat  serangan  jamur  patogen antraknosa  terjadi  sejak  bunga  sampai  terbentuk buah kakao kecil, yang terletak di permukaan batang di bawah tajuk tanaman kakao (Gautam, 2014).
Di  lain  pihak,  penurunan  jumlah  buah  kakao sakit  pada  tanaman  kakao  yang  diaplikasikan ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum dan P.  fluorescens diduga  karena  peran  penting metabolit  sekunder  dalam  ekstrak  kasar  tersebut. Seperti  diketahui  bahwa  metabolit  sekunder T. asperellum mengandung beragam senyawa bioaktif (Zeilinger  et  al.,  2016)  dan  demikian  pula  ekstrak kasar metabolit sekunder P. fluorescens (Sahu et al.,
2018).  Senyawa  bioaktif  tersebut  dapat  berfungsi sebagai antijamur, antivirus, PGPR, dan pengimbas ketahanan  sistemik,  sehingga  keberadaan  jamur patogen  antraknosa  terhambat  dan  gejala  yang ditimbulkan juga terhambat. Akibatnya, keberadaan buah kakao sakit menjadi menurun.
Pengaruh  ekstrak  kasar  metabolit  sekunder T. asperellum dan P. fluorescens terhadap jumlah buah sehat
Parameter yang diamati pada perlakuan  ekstrak kasar  metabolit  sekunder T.  asperellum dan P. fluorescens terhadap  penyakit  antraknosa  adalah
juga  jumlah  buah  sehat.  Hasil  analisis  ragam parameter jumlah buah sehat disajikan pada Tabel 2.
Aplikasi  ekstrak  kasar  metabolit  sekunder mikroba antagonis berpengaruh terhadap penghambatan pertumbuhan jamur penyebab antraknosa  pada  buah  kakao  sampai  di  atas  50  %. Ekstrak kasar metabolit sekunder mikroba antagonis mengandung  senyawa  bioaktif  yang  berfungsi sebagai antijamur, PGPR, dan pengimbas ketahanan tanaman (Zeilinger et al., 2016; Sahu et al., 2018).
Gambar  2  menunjukkan  jumlah  buah  sehat semakin bertambah pada perlakuan aplikasi ekstrak kasar metabolit  sekunder T.  asperellum dan P. fluorescens dibandingkan  dengan  kontrol,  yang terus  menurun  jumlah  buah  kakao  sehatnya. Peningkatan  jumlah  buah  kakao  sehat  ini  selaras dengan  penurunan  jumlah  buah  kakao  sakit  (Tabel 1,  Gambar  1).  Hal  ini  dikarenakan  kandungan ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum dan P. fluorescens yang beragam  senyawa bioaktif dan berperan  di  dalam  mengatasi  pertumbuhan  dan perkembangan  jamur  antraknos.  Senyawa  bioaktif bekerja  dari  dalam  jaringan  tanaman  kakao, sehingga  dapat  menjangkau  keberadaan  jamur patogen  antraknosa.  Hal  ini  sesuai  dengan pernyataan  Santra  &  Banerjee  (2020),  bahwa sejumlah  besar  senyawa  bioaktif  mulai  senyawa antimikroba  dengan  berat  molekul  rendah  yang dikenal  sebagai  fitoaleksin  hingga  metabolit sekunder  yang  mudah  menguap  dan  tidak  mudah menguap (anggota jamur dan aktinobakteri) berada di  dalam  jaringan  inang.  Produk  metabolisme mikroba  antagonis  juga  dapat  mengobati  dan seringkali  menyembuhkan  infeksi  semacam  itu. Selain beberapa enzim juga dihasilkan oleh APH ini yang terkandung di dalam  metabolit  sekunder  eks-
Gambar 2.  Perkembangan jumlah buah kakao sehat pada masing-masing perlakuan. Keterangan: P1 = ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum + P. fluorescens , P2 = ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum , P3 = ekstrak kasar metabolit sekunder P. fluorescens , dan P4 = kontrol
Figure 2.  The development of the number of healthy cocoa pods in each treatment. Note: P1 = secondary metabolite crude extracts  of T.  asperellum + P.  fluorescens ,  P2  =  secondary  metabolite  crude  extracts  of T.  asperellum ,  P3  = secondary metabolite crude extracts of P. fluorescens , and P4 = control
0 4 8 12 16 20 24 28 I II III IV V Ju m lah b u ah s ak it / Nu m b er o f d is ea se d p o d s Pengamatan ke- / Observation P1 P2 P3 P4
Menara Perkebunan 2023, 91(1), 87-95
trak kasarnya, dan peran enzim sebagai mekanisme antagonis,  yaitu  mikoparasit  atau  hiperparasit. Enzim  yang  terdapat  di  dalam  metabolit  sekunder Trichoderma spp.,  di  antaranya  protease,  selulase, selubiase, khitinase, dan 1,3-ß- glukanase (Vinale et al.,  2014).  Metabolit  sekunder P.  fluorescens mampu  merangsang  tanaman  untuk  meningkatkan produksi senyawa metabolit sekunder yang berperan menghambat  perkembangan  jamur  patogen  dan dapat merangsang ketahanan tanaman (Jain & Das, 2016; Sahu et al., 2018).
Aplikasi  gabungan  ekstrak  kasar  metabolit sekunder T.  asperellum dan P.  fluorescens menunjukkan  tidak  berbeda  nyata  dibandingkan perlakuan tunggal ekstrak kasar metabolit sekunder T. asperellum atau P. fluorscens meskipun terdapat peningkatan  (Tabel  2).  Kondisi  ini  diduga disebabkan  oleh  jumlah  atau  kuantitas  senyawa bioaktif  di  dalam  ekstrak  kasar  metabolit  sekunder gabungan  yang  tidak  banyak  atau  disebabkan sinergisme  atau  adanya  efek  saling  menetralkan antar-senyawa  bioaktif  yang  ada  di  dalam  ekstrak kasar  metabolit  sekunder gabungan. Sesuai  dengan pendapat Boik et al. (2009) bahwa adanya interaksi antar-senyawa  bioaktif  karena  gabungan  beberapa senyawa tersebut  yakni  bersifat  sinergi, aditif,  atau antagonis.

## Kesimpulan
Ekstrak  kasar  metabolit  sekunder Trichoderma asperellum + Pseudomonas fluorescens berpengaruh nyata  dalam  peningkatan  jumlah  buah  sehat  dan penurunan  buah  sakit  (terserang  antraknose)  pada tanaman kakao. Peningkatan jumlah buah sehat dan penurunan  jumlah  buah  sakit  masing-masing sebesar  54,18  dan  92,09% pada  perlakuan  ekstrak kasar  metabolit  sekunder T.  asperellum dan P.  fluorescens; diikuti  52,68  dan  94,71% pada perlakuan ekstrak  kasar metabolit  sekunder T. asperellum dan 54,20 dan 89,09% pada perlakuan ekstrak kasar metabolit sekunder P. fluorescens.

## Daftar Pustaka
Adnan, M.,  Islam,  W.,  Shabbir,  A.,  Khan,  K.  A.,
Ghramh, H. A., Huang, Z., Chen, H. Y. H., & Lu, G.  D.  (2019).  Plant  defense  against  fungal pathogens by antagonistic fungi with Trichoderma in  focus. Microbial  Pathogenesis 129 , 7–18.  10.1016/j.micpath.2019.01.042
Alsohim,  A.  S.  (2020).  Influence  of Pseudomonas fluorescens mutants  produced  by  transposon mutagenesis  on in  vitro and in  vivo biocontrol and  plant  growth  promotion. Egyptian Journal Biological Pest Control 30 (19).
10.1186/s41938-020-00220-5
Asare, E.  K., Avicor, S. W., Pobee, P., Bukari, Y., &  Amoako-Attah,  I.  (2021). Colletotrichum gloeosporioides s.l.  causes  an  outbreak  of anthracnose  of  cacao  in  Ghana. South  African Journal  of  Plant  and  Soil 38 (2),  107–115.
10.1080/02571862.2020.1863485
Badan  Pusat  Statistik  (2020). Statistika  Kakao Indonesia .  Badan  Pusat  Statistik,  Jakarta.  82 hlm.
Bock, C. H., Chiang, K. S, & Ponte, E. M. D. (2022). Plant  disease  severity  estimated  visually:  a century  of  research,  best  practices,  and opportunities  for  improving  methods  and practices to  maximize accuracy. Tropical Plant Pathology 47 ,  25–42.  10.1007/s40858-021- 00439-z
Boik, J., Kirakosyan, A., Kaufman, P. B., Seymour, E.  M.,  &  Spelman,  K.  (2009).  Interactions  of bioactive plant metabolites: Synergism, antagonism, and additivity. In: Recent Advances in  Plant  Biotechnology. Springer,  Boston,  MA. 10.1007/978-1-4419-0194-1_10.
Buddhika,  U.  V.  A.,  &  Abeysinghe,  S.  (2021). Secondary Metabolites from Microbes for Plant Disease  Management.  In:  K.  P.  Singh,  S. Jahagirdar, B. K. Sarma (Eds.), Emerging Trends in  Plant  Pathology .  Springer,  Singapore. 10.1007/978-981-15-6275-4_15.
Decoin,  V.,  Barbey,  C.,  Bergeau,  D.,  Latour,  X., Feuilloley,  M.  G.  J.,  Orange,  N.,  Merieau,  A. (2014). A Type VI secretion system is involved in Pseudomonas fluorescens bacterial competition. PLoS ONE 9 (2): e89411. 10.1371/journal.pone.0089411
Druzhinina,  I.  S.,  Seidl-Seiboth,  V.,  Herrera- Estrella,  A.,  Horwitz,  B.  A.,  Kenerley,  C.  M., Monte,  E.,  Mukherjee,  P.  K.,  Zeilinger,  S., Grigoriev,  I.  V.,  &  Kubicek,  C.  P.  (2011). Trichoderma :  the  genomics  of  opportunistic success. Nature  Reviews  Microbiology 9 ,  749– 759. 10.1038/nrmicro2637
Evans,  H.  C.,  &  Prior,  C.  (1987).  Cocoa  pod diseases: Causal agents and control. Outlook on Agriculture 16 (1), 35–41. 10.1177/003072708701600106
Fang, F., Oliva, M., Ehi-Eromosele, S., Zaccai, M., Arazi, T., & Oren-Shamir, M. (2018). Successful floral-dipping  transformation  of  post-anthesis lisianthus  ( Eustoma  grandiflorum )  flowers. Plant Journal. 96 (4), 869-879. DOI: 10.1111/tpj.14076
Potensi ekstrak kasar metabolit sekunder yang dihasilkan Trichoderma asperellum dan …………………...(Matondang et al.)
Gautam, A. K. (2014). Colletotrichum gloeosporioides : Biology, pathogenicity
andmanagement  in  India. Journal  of  Plant Physiology  &  Pathology 2 (2).  10.4172/2329- 955X.1000125
Ghazanfar, M. U., Raza, M., Raza, W., & Qamar, M. I.  (2018). Trichoderma as  potential  biocontrol agent,  its  exploitation  in  agriculture:  A  review. Plant Protection 02 (03), 109–135.
Govindaraj,  K.,  &  Jancirani,  P.  (2017).  Effect  of pruning  on  cocoa  ( Theobroma  cacao L)  on morphological, flowering  and  yield  and  quality of  cocoa  beans. International  Journal  of Agricultural  Science  and  Research (IJASR)
7 (6), 113–118.
Guest, D. (2007). Black pod: diverse pathogens with a global impact on cocoa yield. Phytopathology 97 (12),  1650–1653.  10.1094/PHYTO-97-12- 1650
Hudson,  O.,  Waliullah,  S.,  P,  Ji.,  &  Ali,  M.  d.  E. (2021). Molecular characterization of laboratory mutants  of Fusarium  oxysporum f.  sp. niveum resistant  to  prothioconazole,  a  demethylation inhibitor  (DMI)  fungicide. Journal  of  Fungi ,
7 (9), 704. 10.3390/jof7090704
Huebner,  M.,  Vach,  W.,  &  Cessie,  S.  I.  (2016).  A systematic  approach  to  initial  data  analysis  is good research practice. The Journal of Thoracic and  Cardiovascular  Surgery 151 (1),  25–27. 10.1016/j.jtcvs.2015.09.085
Jain,  A.,  &  Das,  S.  (2016).  Insight  into  the interaction  between  plants  and  associated fluorescent Pseudomonas spp. International Journal of Agronomy . 10.1155/2016/4269010
Keswani,  C.,  Sing,  H.  B.,  Hermosa,  R.,  García- Estrada, C., Caradus, J., He, Y. W., Mezaache- Aichour, S., Glare, T. R., Borriss, R., Vinale, F.,
&  Sansinenea,  E.  (2019).  Antimicrobial secondary  metabolites  from  agriculturally important  fungi  as  next  biocontrol  agents. Applied  Microbiology  and  Biotechnology 103 , 9287–9303. 10.1007/s00253-019-10209-2
Kredics,  L.,  Antal,  Z.,  Szekeres,  A.,  Hatvani,  L., Manczinger,  L.,  Vágvölgyi,  C.,  &  Nagy,  E. (2005).  Extracellular  proteases  of Trichoderma species. Acta  Microbiologica  et  Immunologica Hungarica 52 (2), 169–84.
10.1556/AMicr.52.2005.2.3
Kumar, G.,  Maharshi,  A.,  Patel,  J.,  Mukherjee,  A.,
Singh,  H.  B.,  &  Sarma,  B.  K.  (2017). Trichoderma :  A  potential  fungal  antagonist  to
control  plant  diseases. SATSA  Mukhapatra Annual Technical Issue 21 , 206–218.
Lahive,  F.,  Hadley,  P.,  &  Daymond,  A.  J.  (2019). The  physiological  responses  of  cacao  to  the environment  and  the  implications  for  climate change  resilience.  A  review. Agronomy  for Sustainable Development 39 (5).
10.1007/s13593-018-0552-0
Lamichhane,  J.  R.,  &  Varvaro,  L.  (2013).  A  new medium for the detection of fluorescent pigment production  by  pseudomonads. Plant  Pathology 62 , 624–632.
Mohanan,  R.  C.,  Kaveriappak,  M.,  &  Nambiar, K. N. (2008). Epidemiological studies of Colletotrichum  gloeosporioides disease  of cocoa. Annals of Applied Biology 114 (1), 15–22. 10.1111/j.1744-7348.1989.tb06783.x
Mukherjee, P. K., Buensanteai N., Morán-Diez, M. E.,  Druzhinina,  I.,  &  Kenerley,  C.  M.  (2012). Functional  analysis  of  non-ribosomal  peptide synthetases  (NRPSs)  in Trichoderma  virens reveals  a  polyketide  synthase  (PKS)/NRPS hybrid enzyme involved in the induced systemic resistance response in maize. Microbiology 158, 155–165. 10.1099/mic.0.052159-0
Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., & Kenerley, C. M.
(2012). Secondary metabolism in Trichoderma – a  genomic  perspective. Microbiology 158 ,  35– 45. 10.1099/mic.0.053629-0
Munir,  S.,  Jamal,  Q.,  Bano,  K.,  Sherwani,  S.  K., Bokhari, T. Z., Khan, T. A., Khan, R. A., Jabbar, A.,  &  Anees,  M.  (2013).  Biocontrol  ability  of
Trichoderma. International Journal of Agriculture Crop Sciences 6 (18), 1246–1252.
Mutawila, C., Vinale, F., Halleen, F., Lorito, M., & Mostert, L. (2015). Isolation, production and in vitro  effects  of  the  major  secondary  metabolite produced  by Trichoderma species  used  for  the control  of  grapevine  trunk  diseases. Plant Pathology 65 (1), 104–113. 10.1111/ppa.12385
Muturi, E. J., Donthu, R. K., Fields, C. J., Moise, I. K., & Kim, C. H. (2017). Effect of pesticides on microbial  communities  in  container  aquatic habitats. Scientific Reports . 7, 44565. 10.1038/srep44565
Ndoumbe-Nkeng, M., Cilas, C., Nyemb, E., Nyasse, S.,  Bieysse,  D.,  Flori,  A.,  &  Sache,  I.  (2004). Impact  of  removing  diseased  pods  on  cocoa black  pod  caused  by Phytophthora  megakarya and  on  cocoa  production  in  Cameroon. Crop Protection 23 (5),  415-424.  10.1016/j.cropro. 2003.09.010
Menara Perkebunan 2023, 91(1), 87-95
Rashid,  M.  I.,  Mujawar,  L.  H.,  Shahzad,  T., Almeelbi, T., Ismail, I. M. I., & Oves, M. (2016). Bacteria  and  fungi  can  contribute  to  nutrients bioavailability  and  aggregate  formation  in degraded soils. Microbiol Research 183 , 26–41.
10.1016/j.micres.2015.11.007Rauf,  S.,  Ali,  Y., Hussain,  S.,  Ullah,  F.,  &  Hayat,  A.  (2018). Design of a novel filter paper based construct for rapid  analysis  of  acetone. PLOS  ONE 13 (7), e0199978. 10.1371/journal.pone.0199978
Sahu,  B.,  Singh,  J.,  Shankar,  G.,  &  Pradhan,  A. (2018) Pseudomonas fluorescens PGPR bacteria as  well  as  biocontrol  agent:  A  review.
International Journal of Chemical Studies 6 (2), 01–07.
Santra,  H.  K.,  &  Banerjee,  D.  (2020).  Natural products  as  fungicide  and  their  role  in  crop protection. Natural  Bioactive  Products  in Sustainable Agriculture. 131–219. 10.1007/978- 981-15-3024-1_9
Shehata,  M.  G.,  Badr,  A.  N.,  El  Sohaimy,  S.  A., Asker, D., & Awad, T. S. (2019). Characterization  of  antifungal  metabolites produced by novel lactic acid bacterium and their potential  application  as  food  biopreservatives. Annals  of  Agricultural  Sciences 64 (1):  71-78. 10.1016/j.aoas.2019.05.002
Simamora, M., Basyuni, M., & Lisnawati, L. (2021).
Potency of secondary metabolites of Trichoderma  asperellum and Pseudomonas fluorescens in  the  growth  of  cocoa  plants affected by vascular streak dieback.
Biodiversitas 22 (5), 2542–2547. 10.13057/biodiv/d220511 Sivasakthi, S., Usharani, G., & Saranraj, P. (2014).
Biocontrol potentiality of plant growth promoting  bacteria  (PGPR)  - Pseudomonas fluorescens and Bacillus  subtilis :  A  review. African Journal of Agricultural Research 9 (16), 1265–1277. 10.5897/AJAR2013.7914
Soesanto,  L.,  Mugiastuti,  E.,  &  Rahayuniati,  R.  F. (2014).  Aplikasi  formula  cair Pseudomonas fluorescens P60  untuk  menekan  penyakit  virus cabai  merah. Jurnal  Fitopat  Indonesia 9 (6), 179–185. 10.14692/jfi.9.6.179
Soesanto,  L.,  Mugiastuti,  E.,  Suyanto,  A.,  & Rahayuniati,  R.  F.  (2020).  Application  of  raw secondary  metabolites  from  two  isolates  of Trichoderma harzianum against anthracnose on red  chili  pepper  in  the  field. Jurnal  Hama  dan Penyakit  Tumbuhan  Tropika 20 (1),  19–27. 10.23960/j.hptt.12019-27
Soesanto,  L.,  Mugiastuti,  E.,  &  Manan,  A.  (2021). The  use  of  alternative  liquid  media  for propagation of pathogenic fungi and their effect on  weeds. Biodiversitas 22 (2),  719–725. 10.13057/biodiv/d220224
Verma, C., Jandaik, S., Gupta, B. K., Kashyap, N., Suryaprakash, V. S., Kashyap, S., & Kerketta, A. (2020).  Microbial  metabolites  in  plant  disease management:  Review  on  biological  approach. International Journal of Chemical Studies 8 (4): 2570-2581. 10.22271/chemi.2020.v8.i4ad.10026
Vinale, F., Sivasithamparam, K.,  Ghisalberti, E. L., Woo, S. L., Nigro, M., Marra, R., Lombardi, N., Pascale,  A.,  Ruocco,  M.,  Lanzuise,  S., Manganiello,  G.,  &  Lorito,  M.  (2014). Trichoderma secondary  metabolites  active  on plants  and  fungal  pathogens. The  Open Mycology Journal 8 (Suppl-1, M5), 127–139.
Yun, H. G., Kim, D. J., Gwak, W. S., Shin, T. Y., & Woo, S. D. (2017). Entomopathogenic fungi as dual  control agents against  both the pest Myzus persicae and  phytopathogen Botrytis  cinerea . Mycobiology 45 (3), 192– 198. 10.5941/MYCO.2017.45.3.192
Zeilinger, S., Gruber, S., Bansal, R., & Mukherjee,
P.  K.  (2016).  Secondary  metabolism  in Trichoderma Chemistry meets genomics. Fungal Biology Reviews 30 (2), 74-90. 10.1016/j.fbr.2016.05.001