## PENGGUNAAN N-MERS FREQUENCY DAN ALGORITMA AGNES UNTUK PEMBENTUKAN POHON FILOGENETIK PADA VIRUS MEMATIKAN
Khoirul Umam 1)
Riad Taufik Lazwardi 2)
1,2) Fakultas Bisnis, Institut Teknologi dan Bisnis Kalbis e-mail: khoirul.umam@outlook.com

## ABSTRACT
Every organism has DNA (deoxyribonucleic acid) which carries genetic information. One of the methods for analyzing  strings  of  DNA  sequences  is  n-mers  frequency.  It  is  a  data  mining  method  on  strings  of  DNA sequences that is converted into numerical data. We studied 13 deadly viruses, consisting of Rabies, HIV, Ebola, Smallpox, Marburg, Herpes B, Lujo, Avian Influenza, Spanish Flu H1N1, Dengue, HPV, SARS-CoV, and SARS- CoV-2. This study aims to establish the phylogenetic tree and find out the genetic relationship of the deadly viruses. The first method we used are collecting viral DNA sequences from the NCBI database. Afterward, the strings  of  DNA  sequences  were  converted  into  numerical  data  using  the  n-mers  frequency.  After  that,  the dissimilarity matrix was calculated and the phylogenetic tree was established using the AGNES algorithm. Based on the phylogenetic tree, the aforementioned 13 viruses were classified into three clusters, namely cluster 1 from the realm Riboviria, cluster 2 from the realm Duplodnaviria and cluster 3 from the realm Varidnaviria. The clustering results of 13 viruses are valid because each virus is clustered based on its taxon. In addition, viruses that have the closest genetic relationship are grouped first, while viruses that have the distant genetic relationship are grouped later.
Keywords: n-mers frequency, AGNES, DNA sequences, deadly viruses

## ABSTRAK
Setiap makhluk hidup mempunyai DNA ( deoxyribonucleic acid ) yang membawa informasi genetik. Salah satu metode  untuk  menganalisis  barisan  DNA  yang  berupa  data string adalah  menggunaan n-mers  frequency . Metode ini merupakan metode data mining pada barisan DNA, dimana data barisan DNA yang merupakan data string diubah menjadi data numerik. Dalam penelitian ini dibahas studi genetik pada 13 virus mematikan, yakni virus  Rabies,  HIV,  Ebola,  Cacar,  Marburg,  Herpes  B,  Lujo,  Flu  Burung, Flu  Spanyol  H1N1,  Dengue,  HPV, SARS-CoV dan SARS-CoV-2. Penelitian ini bertujuan untuk membentuk pohon filogenetik dan mengetahui huubungan  genetik  dari  virus  mematikan  tersebut.  Proses  awal  penelitian  dimulai  dengan  mengumpulkan barisan  DNA  virus  dari  database  NCBI.  Kemudian  data  barisan  DNA  diubah  menjadi  data  numerik menggunakan n-mers  frequency .  Setelah  itu,  dihitung  matrik  disimilaritas,  dilanjutkan  pembentukan  pohon filogenetik menggunakan algoritma AGNES ( Agglomerative Nesting ). Berdasarkan hasil penelitian ini, pohon filognetik dari 13 virus tersebut terdiri dari tiga klaster, yaitu klaster 1 yang berasal dari kelompok Riboviria, klaster 2 yang berasal dari kelompok Duplodnaviria dan klaster 3 yang berasal dari kelompok Varidnaviria . Hasil clustering 13 virus tersebut adalah valid, karena setiap virus dikelompokkan berdasarkan taksonnya. Selain itu, virus-virus  yang  memiliki  kekerabatan  paling  dekat  dikelompokkan  terlebih  dahulu,  sedangkan  yang kekerabatannya jauh akan dikelompokkan kemudian.
Kata kunci: n-mers frequency , AGNES, barisan DNA, virus mematikan
Perkembangan  teknologi  yang  semakin  canggih  menyebabkan  biaya sequencing DNA  yang semakin murah. Dengan semakin murahnya biaya sequencing DNA mengakibatkan laju banyaknya data barisan  DNA  semakin  tinggi  (Chisholm  &  Wordsworth,  2016).  Pada  Gambar  1,  menunjukkan peningkatan data barisan DNA pada database GenBank dalam 30 tahun terakhir. Pada tahun 2019 terdapat dari sekitar 215 juta barisan DNA dan terus bertambah setiap tahunnya (NLM, 2021). Pada Gambar  1  juga  menunjukkan  adanya  peningkatan  banyaknya  pengguna  web  NCBI  ( The  National Center  for  Biotechnology  Information ; https://www.ncbi.nlm.nih.gov ).  Hingga  tahun  2019,  jumlah pengguna aktif web NCBI adalah sekitar 6,2 Juta orang.
Gambar 1. Pertumbuhan data barisan DNA di Genbank dan pengguna web NCBI dari tahun 1989 sampai 2019. Sejak tahun 2000, data barisan DNA di GenBank dan pengguna web NCBI meningkat secara signifikan (NLM, 2021).
Banyaknya data barisan DNA, mendorong kegiatan clustering barisan DNA menjadi pekerjaan rutin  dalam  dunia  biologi  molekuler,  khususnya  dalam  bidang  terapan  bioinformatika.  Kegiatan clustering menggunakan data barisan DNA bertujuan untuk melihat pengelompokan dari objek-objek berdasarkan  genomnya.  Terdapat  berbagai  macam  metode clustering .  Berdasarkan  cara membaginya,  metode clustering terdiri  dari  metode hierarchical dan  metode partitioning .  Metode hierarchical digolongkan menjadi dua kelompok, yaitu AGNES (Agglomerative Nesting) dan DIANA (Divisive  Analysis). Sedangkan  untuk  metode  partitioning  terdiri  dari Self  Organizing  Maps (SOM), Partitioning Around Medoid (PAM), Fuzzy Analysis (FANY) dan K-Means. Bagan pembagian metode clustering dapat dilihat pada Gambar 2 (Kaufman & Rousseeuw, 1990).
Pada Gambar 2, dijabarkan bahwa pada metode AGNES dibagi menjadi tiga yaitu Linkage, Variance (Ward’s) dan Centroid. Pada  metode Linkage dibagi  kembali  menjadi  tiga  yaitu Single Linkage, Complete Linkage , dan Average Linkage. Pada penelitian ini menggunakan metode AGNES dalam  melakukan clustering ,  dimana  metode  ini  mengelompokkan  dua  objek  yang  paling  mirip kedalam kelompok yang sama (Aggarwal & Reddy, 2014).
Gambar 2. Pembagian Metode Clustering berdasarkan cara membaginya, ada dua yaitu (1) metode hierarchical terdiri dari AGNES dan DIANA, dan (2) metode nonhierarchical terdiri dari SOM, PAM, FANY dan K-Means.
Penelitian ini melakukan clustering dari 13 virus mematikan. Data virus yang digunakan dalam penelitian  ini  berasal  dari  10  virus  mematikan  berdasarkan  artikel  di  cnnindonesia.com  (Juniman, 2018), yaitu: (1) Rabies, (2) HIV, (3) Ebola, (4) Cacar, (5) Marburg, (6) Herpes B, (7) Lujo (Lusaka dan Johannesburg), (8) Flu Burung H5N1, (9) Flu Spanyol H1N1, dan (10) Dengue, serta 3 virus lainnya yakni: (11) HPV yang merupakan virus mematikan bagi wanita (Gollin, 2015), (12) SARS (SARS-CoV) yang mewabah tahun 2002 (Widya Putri, 2019) dan (13) Covid-19 (SARS-CoV2) yang mewabah di akhir tahun 2019 hingga saat ini (Baskara, 2020).
Pada tahap awal penelitian, salah satu metode untuk menganalisa data barisan DNA yang berupa string adalah menggunakan n-mers frequency. Metode ini mengubah data dari bentuk string menjadi  numerik (Chor  et  al.,  2009).  Kemudian  data  yang  sudah  berupa  numerik  diubah  menjadi bentuk  matriks  disimilaritas  untuk  dijadikan  input  algoritma  AGNES  yang  outputnya  berupa  pohon filogenetik. Penelitian ini bertujuan untuk menggunakan n-mers frequency dan algoritma AGNES untuk pembentukan pohon filogenetik dari 13 virus mematikan tersebut. Pohon filogenetik yang diperoleh menggambarkan kekerabatan virus-virus tersebut berdasarkan genomnya.

## METODE
Metode  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  penggunaan n-mers  frequency untuk mengubah data string menjadi numerik, dan penggunaan algoritma AGNES untuk membentuk pohon filogenetik. Untuk pembentukan pohon filogenetik dilakukan tahapan berikut: (1) pengumpulan data barisan DNA, (2) n-mers frequency, (3) matriks disimilaritas, (4) algoritma AGNES, (5) analisis hasil dan (6) kesimpulan. Tahapan tersebut dapat dilihat pada Gambar 3. Setiap perhitungan dilakukan dengan bantuan open-source software R .
Gambar 3. Tahapan  penelitian  yang  dimulai  dengan  pengumpulan  data  barisan  DNA, n-mers frequency, matriks disimilaritas, algoritma AGNES, analisis hasil dan kesimpulan.

## Pengumpulan Data Barisan DNA
Data Barisan DNA merupakan barisan data string dari basa-basa nukleotida, yakni Adenine (A), Thymine (T), Guanine (G), dan Cytosine (C). Terdapat beberapa format barisan DNA, antara lain GenBank  oleh  NCBI (National  Center  for  Biotechnology  Information), EMBL  ( European  Molecular Biology Laboratory), GCG (Genetics Computer Sequence), ASN.1 (Abstract Syntax Notation One), NBRF (National Biomedical Research Foundation), FASTQ dan FASTA (Mount, 2004). Format barisan yang digunakan akan menentukan software yang digunakan untuk menganalisis barisan DNA tersebut.
Format FASTA adalah salah satu format yang paling sering digunakan di berbagai software analisis DNA, karena pada format FASTA hanya terdiri dari deskripsi dan kode barisan DNA saja. Selain itu, format FASTA tidak terdapat nomor atau keterangan karakter lain sehingga memudahkan untuk menduplikat barisan DNA tersebut dan menggabungkan beberapa file FASTA menjadi satu file. Setiap dat a dalam format FASTA diawali simbol “>”, satu baris deskripsi, kemudian diikuti oleh barisan basa DNA yaitu A, C, G, dan T (Mount, 2004). Contoh barisan DNA dengan format FASTA dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Contoh Barisan DNA Virus HPV ( Human papillomavirus ) tipe 16 dengan Format FASTA. Format FASTA diawali simbol “>”, deskripsi “KP212153.1 Human papillomavirus type 16 isolate  CNA34,  complete  genome”,  kemudian  barisan  basa  DNA  yaitu  A,  C,  G,  dan  T. Barisan DNA ini diperoleh dari NCBI ( The National Center for Biotechnology Information) (NCBI, 2015).
Data barisan DNA yang digunakan adalah 13 barisan DNA virus mematikan. Data tersebut berformat  FASTA  yang  diperoleh  dari  GenBank  atau  NCBI,  dapat  diakses  melalui  halaman  situs www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore (NCBI, 2020). Detail data barisan DNA dari 13 virus mematikan tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.
Pengumpulan Data Barisan DNA n-mers Frequency Matriks disimilaritas Algoritma AGNES Analisis Hasil Kesimpulan
Tabel 1. Detail data barisan DNA dari 13 virus mematikan yang berasal dari GenBank, meliputi: nama virus, kode GenBank, panjang barisan DNA, lokasi dan waktu koleksi
No Nama Virus Deskripsi Kode GenBank Panjang (bp) Lokasi Waktu Koleksi 1 Rabies Rabies lyssavirus EU643590.1 11923 Hunan, China 2006 2 HIV Human immunodeficiency virus 1 MN090628.1 9056 USA 2018 3 Ebola Zaire ebolavirus MH425138.1 18937 Zaire 9-Aug-2014 4 Cacar Variola virus DQ441420.1 186293  Bangladesh 1974 5 Marburg Marburg marburgvirus KP985768.1 19113 Uganda 2014 6 Herpes B Human alphaherpesvirus 1 KJ847330.1 151024  India 2011 7 Lujo Lujo mammarenavirus NC_012777.1 7163 South Africa 2008 8 Flu Burung H5N1 Influenza A virus H5N1 AY627898.2 2341 Thailand 2008 9 Flu Spanyol H1N1 Influenza A virus H1N1 CY087030.1 2281 New York, USA 3-Jun-2009 10 Dengue Dengue virus KR919820.1 10724 Brunei 2014 11 HPV Human papillomavirus type 16 KP212153.1 7894 Barazil 18-May-2010 12 SARS-CoV Severe acute respiratory syndrome coronavirus AY864805.1 29751 Beijing, China 2004 13 SARS-CoV- 2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 MT079854.1 29897 Wuhan, China 22-Jan-2020
Pada software R, barisan DNA yang berupa data string , A, C, G dan T, dibaca menggunakan fungsi readDNAStringSet pada library “Biostrings”. Syntax untuk readDNAStringSet pada software R dengan data bernama “data13.txt” adalah sebagai berikut:
reads = readDNAStringSet ("data13.txt" , format= "fasta" ) (1)

## n-Mers Frequency
Setelah data dibaca menggunakan fungsi readDNAStringSet , tahap selanjutnya penggunaan n-mers frequency untuk mengubah data barisan DNA yang berupa data string menjadi data numerik (Han et al., 2012) . Metode n-mers frequency digunakan untuk mengetahui banyaknya kemunculan n basa  nukleotida (substring) yang  sama  dari  suatu  barisan  DNA.  Dikarenakan  ada  empat  basa nukleotida pada DNA ( A, C, G, T), maka banyaknya pola kemunculan adalah 4 n substring, dengan n = 3, maka diperoleh 4 3 = 64 subtring , yaitu: AAA, AAC, AAT, AAG, ACA, ACC, ACT, ACG, ATA, ATC, ATT, ATG, AGA, AGC, AGT, AGG, CAA, CAC, CAT, CAG, CCA, CCC, CCT, CCG, CTA, CTC, CTT, CTG, CGA, CGC, CGT, CGG, GAA, GAC, GAT, GAG, GCA, GCC, GCT, GCG, GTA, GTC, GTT, GTG, GGA, GGC, GGT, GGG, TAA, TAC, TAT, TAG, TCA, TCC, TCT, TCG, TTA, TTC, TTG, TGA, TGC, TGT, TGG, TTT (Bustamam et al., 2017).
Penentuan n = 3 didasari oleh proses pembentukan asam amino pada sintesis protein, barisan DNA dibaca dalam kelompok tiga nukleotida yang disebut kodon, kodon pada pita mRNA ( messenger ribonucleic acid ) hasil duplikasi dari barisan DNA dipasangkan dengan anti kodon yang dibawa tRNA ( transfer RNA ) untuk membentuk asam amino (Umam & Sagara, 2020) . Menurut penelitian terdahulu penggunaan n-mers frequency dengan n = 3 mempunyai akurasi yang tinggi, yaitu 100 % (Umam & Sagara, 2020) dan 95% (Mahdiyah et al., 2019).
Pada software R, perhitungan n-mers frequency menggunakan library “Biostrings” , yaitu fungsi oligonucleotideFrequency . Syntax untuk n-mers frequency dengan n = 3 dan 13 data barisan DNA virus mematikan adalah sebagai berikut:
eks = oligonucleotideFrequency(reads[ 1 : 13 ], width= 3 ) (2)

## Matriks Disimilaritas
Setelah  dilakukan n-mers  frequency ,  tahapan  selanjutnya  adalah  membentuk  matriks disimilaritas  atau  matriks  jarak.  Matriks  disimilaritas  merupakan  matriks  simetri  yang  elemen matriksnya  adalah  jarak  antar  data  ( 𝑑 𝑖𝑘 ).  Untuk  mengitung 𝑑 𝑖𝑘 digunakan  persamaan euclidean distance (Kaufman & Rousseeuw, 1990), yaitu:
𝑑 𝑖𝑘 = √∑(𝑥 𝑖𝑗 − 𝑥 𝑘𝑗 ) 2 𝑚 𝑗=1 (3)
Dengan 𝑑 𝑖𝑘 = jarak data ke - 𝑖 dan ke- 𝑘 , 𝑚 = dimensi data , 𝑥 𝑖𝑗 = nilai dari data ke - 𝑖 pada dimensi 𝑗 , dan 𝑥 𝑘𝑗 = nilai dari data ke- 𝑘 pada dimensi 𝑗 .
Dikarenakan data yang digunakan merupakan data barisan DNA, 𝑑 𝑖𝑘 juga bisa disebut jarak genetik dari data ke - 𝑖 dan ke- 𝑘 . Syntax untuk menghitung matriks disimilaritas pada software R adalah sebagai berikut:
md = dist(eks, method= ”euclidean” )
(4)

## Algoritma AGNES
Setelah  membentuk  matriks  disimilaritas,  maka  matriks  tersebut  digunakan  sebagai  input untuk algoritma AGNES (Agglomerative Nesting) . Algoritma AGNES mengelompokkan dua objek yang paling  mirip  kedalam  kelompok  yang  sama  (Aggarwal  &  Reddy,  2014).  Algoritma  AGNES  dimulai dengan setiap objek dalam satu klaster yang terpisah, artinya banyaknya klaster awal sama dengan banyaknya  objek,  kemudian  objek  yang  paling  mirip  (jaraknya  paling  dekat)  dikelompokkan. Selanjutnya, pengelompokan terjadi terus menerus sampai semua subkelompok digabungkan menjadi satu kelompok (Bustamam et al., 2017). Hasil dari pengelompokkan menggunakan algoritma AGNES adalah pohon filoginetik atau dendogram.
Terdapat  beberapa  algoritma  AGNES,  yaitu Single  Linkage,  Complete  Linkage , Average Linkage, Variance (Ward’s) dan Centroid (Kaufman & Rousseeuw, 1990) . Pada penelitian ini, algoritma AGNES yang dipilih adalah algoritma average linkage dimana algoritma ini melakukan perhitungan rata-rata jarak antara semua objek sehingga mempunyai hasil yang relatif tepat dibandingkan dengan algoritma  AGNES  yang  lain  (Kassambara,  2019).  Langkah-langkah  algoritma  AGNES- Average Linkage dapat dilihat pada Tabel 2 (Bustamam et al., 2017).
Tabel 2. Algoritma  AGNES- Average  Linkage dengan input matriks  disimilaritas  dan output Dendogram
Algoritma 3. Algoritma AGNES - Average Linkage
Input
: Matriks disimilaritas Output : Dendogram
Steps:
1) Gabungkan dua kelompok yang terdekat, misalkan jarak kelompok U dan V adalah yang paling dekat, namakan dengan d (UV) .
2) Gabungkan kelompok U dan V, namakan kelompok baru tersebut dengan (UV).
3) Hitung jarak antara (UV) dan kelompok baru (W) dengan persamaan berikut:
𝑑 ( 𝑈𝑉 ) 𝑊 = ∑ ∑ 𝑑 𝑖𝑘 𝑘 𝑖 𝑁 ( 𝑈𝑉 ) 𝑁 𝑊 ( 5 )
Keterangan:
Σ 𝑖 = penjumlahan jarak objek i dalam kelompok (UV)
Σ 𝑘 = penjumlahan jarak objek k dalam kelompok W 𝑑 𝑖𝑘 = jarak antara objek i dalam kelompok (UV) dan objek k dalam kelompok W , 𝑁 𝑈𝑉 = banyaknya data dalam kelompok (UV) 𝑁 𝑤 = banyaknya data dalam kelompok W
4) Ulangi langkah 1) sampai 3) sampai memperoleh klaster yang dikehendaki atau semua data telah berada dalam kelompok tunggal.
Syntax untuk menghitung algoritma AGNES- Average Linkage pada software R adalah sebagai berikut:
A = agnes(data, metric = "euclidean" , method = "average" ) (6)

## Analisis Hasil
Setelah  diperoleh  pohon  filogenetik  dari  algoritma  AGNES,  selanjutnya  dilakukan  analisis secara deskriptif virus mana sajakah yang mempunyai similaritas secara genetik. Kemudian, dilihat juga klasifikasi dan taksonomi dari virus yang mempunyai similaritas tersebut.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Data Penelitian
Tiga belas data barisan DNA virus mematikan yang berupa data string dibaca menggunakan software R dengan fungsi readDNAStringSet pada library “Biostrings”. Hasil readDNAStringSet berupa tabel yang memisahkan panjang barisan DNA (width), barisan DNA (seq) dan deskripsi data (name). Hasil readDNAStringSet dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil readDNAStringSet dari 13 data barisan DNA virus mematikan yang berupa panjang barisan DNA (width), barisan DNA (seq) dan deskripsi data (name) .
No width Seq Name 1 11923 ACGCTTAACAACCAGATCAAAGAAGAAGCAGA… EU643590.1 Rabies virus 2 9056 GACCTGAAAGCGAAAGAGAAACCAGAGGAGC… MN090628.1 HIV-1 3 18937 GAAAGAAGAATTTTTAGGATCTTTTGTGTGCGA… MH425138.1 Zaire ebolavirus
4 186293 GTGTCTAGAAAAAAATGTGTGACCCACGACTG…
DQ441420.1 Variola virus 5 19113 AGACACACAAAAACAAGAGATGATGATTTTGT…
KP985768.1 Marburg 6 151024 CAGCCCGGGCCCCCCGCGGGCGCGCGCGCG… KJ847330.1 Human herpes virus 1 7 7163 GTTAATTGGACTACTTTTCTAGTACCTCACTTC…
NC_012777.1 Lujo virus 8 2341 AGCGAAAGCAGGTCAAATATATTCAATATGGA… AY627898.2 Influenza A virus H5N1 9 2281 TTGAATGGATGTCAATCCGACTCTAATTTTCCT… CY087030.1 Influenza A virus H1N1 10  10724 AGTTGTTAGTCTACGTGGACCGACAAGAACAG… KR919820.1 Dengue virus
11  7894 AATAATTCATGTATAAAACTAAGGGCGTAACCG… KP212153.1 Human papillomavirus type 16 12  29751 ATATTAGGTTTTTACCTACCCAGGAAAAGCCAA… AY864805.1 SARS-CoV
13  29897 CGAACCTGTAAAACAGGCAAACTGAGTTGGAC…
MT079854.1 SARS-CoV-2
Hasil n-mers Frequency Untuk mengubah 13 data barisan DNA virus mematikan tersebut yang berupa data string menjadi data numerik digunakan n-mers frequency dengan n = 3. Hasil n-mers Frequency berupa matriks yang berukuran 13 x 64, dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Hasil n-mers  frequency dari  13  data  barisan  DNA  virus  mematikan  yang  membentuk matriks berukuran 13 x 64.

## Hasil Perhitungan Matriks Jarak
Untuk  membentuk  matriks  disimilaritas  digunakan  persamaan Euclidean  distance. Pada Gambar 6 merupakan hasil perhitungan matriks jarak dari 100 barisan DNA menggunakan software R, diperoleh matriks berukuran 13 x 13.
Gambar 6. Hasil perhitungan matriks disimilaritas dari 13 data barisan DNA virus mematikan yang berupa matriks berukuran 13 x 13.

## Hasil Clustering Menggunakan Algoritma AGNES
Setelah diperoleh hasil perhitungan matriks disimilaritas, tahap selanjutnnya adalah clustering atau  pengelompokan  menggunakan  algoritma  AGNES.  Hasil clustering menggunakan  algoritma AGNES  berupa  pohon  filogenetik  atau  dendogram  yang  dapat  dilihat  pada  Gambar  7.  Sebuah threshold ditentukan  untuk  membagi  dendogram  menjadi  beberapa  klaster.  Bayaknya  klaster ditentukan sebanyak 3 klaster, dan hal ini didasari oleh banyaknya jenis realm (tingkatan taksonomi virus)  pada  data  13  barisan  virus  mematikan  tersebut,  yaitu realm Riboviria,  Duplodnaviria dan Varidnaviria .
Gambar 7. Hasil algoritma AGNES yang mengelompokkan 13 data barisan DNA virus mematikan, yakni: Rabies (1), HIV (2), Ebola (3), Cacar (4), Marburg (5), Herpes B (6), Lujo (7), Flu Burung H5N1 (8), Flu Spanyol H1N1 (9), Dengue (10), HPV (11), SARS-CoV (12), dan SARS-CoV-2 (13). Dengan nilai threshold sebesar 3000, dendogram terbagi menjadi 3 klaster. Klaster 1 beranggotakan 1, 2, 10, 7, 11, 8, 9, 3, 5, 12, 13; Klaster 2 beranggotakan 6; dan Klaster 3 beranggotakan 4.

## Analisis Hasil
Pohon filogenetik pada Gambar 7 merupakan hasil pengelompokan dari 13 virus mematikan menggunakan algoritma AGNES- average lingkage dengan nilai agglomerative coefficient = 0.84. Nilai agglomerative coefficient berkisar antara 0 sampai 1, semakin dekat nilai koefisien dengan 1 artinya semakin akurat hasil pengelompokan data, sebaliknya semakin mendekati 0 artinya semakin tidak akurat hasil pengelompokannya (Kassambara, 2019). Dengan nilai agglomerative coefficient = 0.84, maka dendogram hasil pengelompokannya tergolong akurat.
Penggunaan n-mers  frequency dalam  penelitian  ini  mempunyai  peran  penting  sehingga pengelompokan yang terbektuk akurat. Hal ini didukung oleh penelitian yang dilakukan Mahdiyah et al. yang menggunakan n-mers frequency dalam menganalisis barisan DNA, dengan n = 3 atau 3- mers diperoleh akurasi sekitar 95% (Mahdiyah et al., 2019). Hal tersebut sejalan dengan penelitian yang dilakukan Umam dan Sagara yang mengaplikasikan n-mers frequency dalam clustering data barisan DNA, yang memperoleh akurasi 100% dengan sampel 100 data barisan DNA (Umam & Sagara, 2020). Salah  satu  keunggulan  penggunaan n-mers  frequency dibandingkan  metode  klasik  pensejajaran sekuens dalam analisis barisan DNA adalah n-mers frecuency mampu untuk menganalisis berbagai data  tidak  terbatas  pada  data  yang  mempunyai  kemiripan  saja,  sehingga n-mers  frequency dapat digunakan dalam menganalisis barisan DNA antar virus, sedangkan pensejajaran sekuens terbatas untuk  data  barisan  DNA  yang  memiliki  kemiripan  saja,  sehingga  cocok  untuk  menganalisis kekerabatan untuk virus-virus yang sejenis.
Selain itu, penggunaan algoritma average linkage (Algoritma AGNES) juga berperan penting. Dibandingkan dengan algoritma DIANA (Divisive Analysis) ataupun algoritma AGNES lain, hasil dari algortima average linkage relatif lebih akurat karena algortima average linkage melakukan perhitungan rata-rata antar objek dalam melakukan pengelompokan  (Kassambara, 2019). Hal ini juga didukung oleh penelitian yang dilakukan Bustamam et al. yang melakukan pengelompokan bakteri pada air liur menggunakan algoritma single linkage, complete linkage, dan average linkage . Berdasarkan penelitian tersebut, pengelompokan dengan algoritma avegare lingkage merupakan hasil pengelompokan paling akurat, dimana hal ini ditunjukkan oleh nilai indeks Davies-Bouldin yang paling kecil (Bustamam et al., 2017).
Berdasarkan Gambar 7, pasangan virus yang pertama kali dikelompokkan adalah Flu Burung H5N1 (8) dan Flu Spanyol H1N1 (9), yang artinya kedua virus tersebut memiliki similaritas paling tinggi secara  genetik.  Jarak  genetik  kedua  virus  tersebut  adalah  68,04  yang  merupakan  jarak  genetik terdekat  diantara  13  virus  pada  penelitian  ini.  Semakin  kecil  nilai  jarak  genetik  maka  semakin similar/berkerabat, sebaliknya semakin besar nilai jarak genetik maka semakin jauh kekerabatannya. Dengan kata lain, virus Burung H5N1 (8) dan Flu Spanyol H1N1 (9) mempunyai hubungan kekerabatan paling dekat diantara 13 virus pada penelitian ini, dan  hal ini didukung oleh data dari International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) yang mengelompokkan Virus Flu Burung H5N1 (8) dan Flu Spanyol H1N1 (9) ke dalam spesies yang sama yaitu Influenza A virus (ICTV, 2020) . Kesesuaian hasil pengelompokan  dan  data  dari  ICTV,  menunjukkan  metode  yang  digunakan  untuk  pengelompokan
pada  penelitian  ini  adalah  valid.  Hal  ini  juga  dapat  dilihat  pada  pengelompokan  selanjutnya  yang mengelompokkan dari takson yang rendah ke takson yang lebih tinggi.
Pengelompokan kedua berdasarkan Gambar 7 adalah Ebola (3) dan Marburg (5) dengan jarak genetik = 337,99. Ebola dan Marburg memiliki kemiripan, keduanya menyebabkan demam hemoragik. Demam  hemoragik  adalah  demam  tinggi  yang  disertai  pendarahan,  serta  dapat  menyebabkan kegagalan organ, syok, dan kematian (Prasetyanto, 2020). Kedua virus ini berasal dari family yang sama yaitu Filoviridae (ICTV, 2020).
Pengelompokan ketiga pada Gambar 7 adalah HIV (2) dan Dengue (10) dengan jarak genetik = 434,71.  Kedua  virus  ini  berasal  dari realm yang  sama,  yaitu Riboviria (ICTV,  2020).  Sedangkan pengelompokan  keempat  adalah  SARS-CoV  (12)  dan  SARS-CoV-2  (13)  dengan  jarak  genetik  = 530,49. Kedua virus ini berasal dari kelompok yang sama, yakni Severe acute respiratory syndrome – related coronavirus (ICTV, 2020).
Pengelompokan  kelima  berdasarkan  Gambar  7  adalah  Lujo  (7)  dan  HPV  (11)  dengan  jarak genetik = 560,21. Lujo berasal dari realm Riboviria, sedangkan HPV berasal dari realm Monodnaviria (ICTV,  2020).  Kemudian  Pengelompokan  keenam  berdasarkan  Gambar  7  adalah  Rabies  (1)  yang dikempokan ke HIV (2) dan Dengue (10), sama dengan HIV dan Dengue, Rabies juga berasal dari realm Riboviria (ICTV, 2020). Pengelompokan selanjutnya adalah pengelompokan kembali pasangan- pasangan virus yang telah disebutkan sehingga menjadi kelompok yang lebih besar, yaitu kelompok (1, 2, 10) dikelompokkan dengan kelompok (7, 11), kemudian kelompok (1, 2, 10, 7, 11) dikelompokkan dengan kelompok (8, 9), selanjutnya kelompok (1, 2, 10, 7, 11, 8, 9) dikelompokkan dengan kelompok (3, 5) dan seterusnya. Pengelompokan akan selesai saat setiap virus menjadi satu kelompok atau dendogram yang utuh.
Kemudian ditentukan threshold untuk membagi dendogram menjadi 3 klaster. Untuk membagi dendogram menjadi 3 klaster ditentukan nilai threshold antara 2884,41 sampai 22080,91. Nilai 2884,41 merupakan nilai rata-rata dari jarak antara kelompok (1, 2, 10, 7, 11, 8, 9, 3, 5) dan (12, 13), sedangkan nilai 22080,91 merupakan nilai rata-rata dari jarak antara kelompok (1, 2, 10, 7, 11, 8, 9, 3, 5, 12, 13) dan (6). Dengan demikian, ditentukan nilai threshold sebesar 3000 untuk membagi dendogram menjadi 3 klaster.
Berdasarkan penelitian ini, klaster 1 berasal dari realm Riboviria beranggotakan: Rabies (1), HIV (2), Dengue (10), Lujo (7), HPV (11), Flu Burung H5N1 (8), Flu Spanyol H1N1 (9), Ebola (3), Marburg (5), SARS-CoV (12), dan SARS-CoV-2 (13). Pengecualian untuk  HPV (11), HPV (11) berasal dari realm Monodnaviria yang merupakan realm baru, perluasan dari realm Riboviria (Walker et al., 2020) . Realm Riboviria merupakan tingkatan taksonomi yang mencakup semua virus RNA, yakni virus yang memiliki RNA sebagai materi genetiknya. Virus pada kelompok ini memiliki enzim RNA-dependent RNA polymerases (RdRp) untuk proses replikasinya (Gorbalenya et al., 2018). Sementara itu, klaster 2 berasal dari realm Duplodnaviria yang beranggotakan Herpes B (6). Realm Duplodnaviria merupakan tingkatan taksonomi yang mencakup semua virus DNA, yakni virus yang memiliki materi genetik berupa DNA dan bereplikasi menggunakan DNA polimerase. Pada siklus hidup kelompok virus ini, DNA untai ganda menyandikan protein kapsid utama HK97(HK97-MCP) dan subunit terminase kecil yang diperlukan untuk pengemasan DNA menjadi kapsid (Koonin et al., 2019a). Dan  terakhir,  Klaster  3  berasal  dari realm  Varidnaviria beranggotaan  Cacar  (6) atau Variola  virus . Realm  Varidnaviria merupakan  tingkatan  taksonomi  yang  mencakup  semua  virus  DNA  yang mengkode protein kapsid utama jelly roll vertikal (Koonin et al., 2019b). Dari penjelasan diatas, dapat disimpulkan bahwa clustering 13 virus mematikan menggunakan n-mers  frequency dan  algoritma  AGNES  pada  penelitian  ini,  menghasilkan  pohon  filogenetik  yang
dibagi menjadi 3 klaster. Hasil pengelompokan menggunakan n-mers frequency dan algoritma AGNES ini adalah valid. Hal ini dapat dilihat dari 13 virus tersebut mengelompok berdasarkan taksonnya, dan juga  virus-virus  yang  mempunyai  kekerabatan  yang  paling  dekat  dikelompokan  terlebih  dahulu, sebaliknya  yang  mempunyai  kekerabatan  yang  lebih  jauh  dikelompokkan  kemudian.  Hal  tersebut sesuai dengan penelitian terdahulu oleh Bustamam dkk. tentang penggunaan n-mers frequency dan algoritma  AGNES  dalam  pengelompokkan  bakteri  pada  air  liur  (Bustamam  et  al.,  2017).  Metode pengelompokan menggunakan n-mers frequency dan algoritma AGNES ini bisa digunakan sebagai alternatif dalam pengelompokan virus, bakteri atau makhluk hidup lain berdasarkan genetiknya.

## SIMPULAN
Berdasarkan  hasil  pengelompokan  menggunakan n-mers  frequency dan  algoritma  AGNES pada 13 virus mematikan, didapat pohon filogenetik yang terbagi menjadi 3 kluster. Klaster 1 terdiri dari 11 virus yang berasal dari realm Riboviria , yaitu virus Rabies, HIV, Dengue, Lujo, HPV, Flu Burung H5N1, Flu Spanyol H1N1, Ebola, Marburg, SARS-CoV, SARS-CoV-2. Sedangkan Klaster 2 terdiri dari virus Herpes B yang berasal dari realm Duplodnaviria, dan terakhir Klaster 3 terdiri dari virus Cacar atau Variola virus yang berasal dari realm Varidnaviria . Hasil pengelompokan ini valid, karena setiap virus  mengelompok  berdasarkan  dengan  taksonnya  dan  virus-virus  yang  mempunyai  kekerabatan terdekat  dikelompokkan  terlebih  dahulu,  sedangkan  yang  kekerabatannya  jauh  dikelompokkan kemudian. Dengan demikian, penggunaan n-mers frequency dan algoritma AGNES dalam membentuk pohon filogenetik pada penelitian ini berpotensi untuk dapat digunakan juga dalam pengelompokkan virus atau organisme lainnya.

## REFERENSI
Aggarwal, C. C., & Reddy, C. K. (2014). Data Clustering Algorithms and Applications. In CRC Press . Baskara,  B.  (2020,  April  18).  Rangkaian  Peristiwa  Pertama  Covid-19. Kompas.Com . https://bebas.kompas.id/baca/riset/2020/04/18/rangkaian-peristiwa-pertama-covid-19/
Bustamam, A., Fitria, I., & Umam, K. (2017). Application of Agglomerative Clustering for Analyzing Phylogenetically on Bacterium of Saliva . 030126 , 030126 – 1. https://doi.org/10.1063/1.4991230 Chisholm, S. J., & Wordsworth, S. (2016). Annual Report of the Chief Medical Officer 2016 .
Chor, B., Horn, D., Goldman, N., Levy, Y., & Massingham, T. (2009). Genomic DNA k-mer spectra: Models and modalities. Genome Biology , 10 (10). https://doi.org/10.1186/gb-2009-10-10-r108 Gollin, S. M. (2015). Epidemiology of HPV-Associated Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma. In Human  Papillomavirus  (HPV)-Associated  Oropharyngeal  Cancer (pp.  1 – 23).  Springer International Publishing. https://doi.org/10.1007/978-3-319-21100-8_1
Gorbalenya, A. E., Krupovic, M., Siddell, S., Varsani, A., & Kuhn, J. H. (2018). Riboviria: establishing a single taxon that comprises RNA viruses  at the basal rank of virus taxonomy . International Committee  on  Taxonomy  of  Viruses  (ICTV).  https://talk.ictvonline.org/taxonomy/p/taxonomy- history?taxnode_id=202007095
Han, J., Kamber, M., & Pei, J. (2012). Data Mining: Concepts and Techniques Third Edition . Morgan Kaufmann Publishers.
ICTV. (2020). International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) . https://talk.ictvonline.org/taxonomy/
Juniman,  P.  T.  (2018,  February  21).  10  Virus  Paling  Mematikan  di  Dunia. CNN  Indonesia . https://www.cnnindonesia.com/gaya-hidup/20180220211154-255-277570/10-virus-paling-

## mematikan-di-dunia
Kassambara,
A. (2019). Hierarchical Clustering in R: The Essentials . https://www.datanovia.com/en/lessons/agglomerative-hierarchical-clustering/ Kaufman, L., & Rousseeuw, P. J. (1990). Finding groups in data : an introduction to cluster analysis . Wiley.
Koonin, E., Dolja, V., Krupovic, M., Varsani, A., Wolf, Y., Yutin, N., Zerbini, M., & Kuhn, J. (2019a). Create  a  megataxonomic  framework,  filling  all  principal/primary  taxonomic  ranks,  for  dsDNA viruses  encoding  HK97-type  major  capsid  proteins .  International  Committee  on  Taxonomy  of Viruses (ICTV). https://talk.ictvonline.org/taxonomy/p/taxonomy-history?taxnode_id=202007117 Koonin, E., Dolja, V., Krupovic, M., Varsani, A., Wolf, Y., Yutin, N., Zerbini, M., & Kuhn, J. (2019b). Create  a  megataxonomic  framework,  filling  all  principal  taxonomic  ranks,  for  DNA  viruses encoding vertical jelly roll-type major capsid proteins . International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). https://talk.ictvonline.org/taxonomy/p/taxonomy-history?taxnode_id=202008702 Mahdiyah,  U.,  Wahyuniar,  L.  S.,  Rochana,  S.,  Informatika,  T.,  Teknik,  F.,  &  Kediri,  K.  (2019). KLASIFIKASI DNA MENGGUNAKAN FITUR N-MERS DENGAN INTEGRASI. JOUTICA , 4 (2), 225 – 228. Mount, D. W. (2004). Bioinformatics : sequence and genome analysis . Cold Spring Harbor Laboratory Press.
NCBI.  (2015). Human  papillomavirus  type  16  isolate  CNA34,  complete  genome . https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KP212153.1/ NCBI. (2020). Nucleotide - National Center for Biotechnology Information . https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore
NLM.  (2021). Congressional  Justification  FY  2021  -  Department  of  Health  and  Human  Services National Institutes of Health National Library of Medicine (NLM) . https://www.nlm.nih.gov/about/2021CJ.html
Prasetyanto,  A.  (2020,  April  20).  12  Virus  Paling  Mematikan  di  Dunia:  Corona  hingga  Ebola.
Kumparan.Com . https://kumparan.com/kumparansains/12-virus-paling-mematikan-di-dunia- corona-hingga-ebola-1tFSaC1xXwG/full
Umam, K., & Sagara, R. (2020). Penggunaan N-mers Frequency pada Analisis Barisan DNA. Jambura Journal of Mathematics , 2 (2), 73 – 86. https://doi.org/10.34312/jjom.v2i2.4320 Walker, P. J., Siddell, S. G., Lefkowitz, E. J., Mushegian, A. R., Adriaenssens, E. M., Dempsey, D. M., Dutilh,  B.  E.,  Harrach,  B.,  Harrison,  R.  L.,  Hendrickson,  R.  C.,  Junglen,  S.,  Knowles,  N.  J., Kropinski, A. M., Krupovic, M., & Kuhn, J. H. (2020). Changes to virus taxonomy and the Statutes ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses ( 2020 ). Archives of Virology , 165 (11), 2737 – 2748. https://doi.org/10.1007/s00705-020-04752-x Widya Putri, A. (2019, November 16). Sejarah Epidemi SARS: Bukti Wabah Virus yang Tak Pernah Berakhir. Tirto.ID . https://tirto.id/sejarah-epidemi-sars-bukti-wabah-virus-yang-tak-pernah- berakhir-elth