## ISOLASI DAN IDENTIFIKASI KHAMIR PADA LARVA Cossus cossus PENGHASIL SELULASE
Maswati Baharuddin 1* , Nurul Khaerah 1 , Nurul Fadillah 1 , Sappewali 1 , Fitria Azis 1
1 Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar Jl. Sultan Alauddin No. 63, Gowa, Sulawesi Selatan, Indonesia. 92113 *E-mail: bmaswati@gmail.com
Abstrak: Larva Cossus cossus adalah serangga ordo Lepidoptera yang hidup di  pohon  menteng  ( Baccaurea  racemosa )  dari  Desa  Lejja  Soppeng.  Larva dapat  menghasilkan  selulase  untuk  menghidrolisis  selulosa  menjadi  gula sederhana  (glukosa)  dengan  memutuskan  ikatan  1,4-glikosidik  dalam selulosa. Selulase tekstil digunakan dalam industry detergen, makanan, dan kertas  yang  dapat  diproduksi  oleh  mikroba  seperti  selulolitik  ragi.  Tujuan penelitian ini untuk mengetahui jenis isolat khamir dan bakteri serta aktivitas selulase simbion khamir larva C. cossus . Metode penelitian meliputi isolasi dan  pemurnian  khamir,  identifikasi  khamir  dan  uji  aktivitas  selulase  yang dilakukan  setengah  kuantitatif  (uji  yodium  dan  uji  Congo  Red)  serta  uji kuantitatif  dengan  metode  asam  dinitrosalisilat  (DNS)  yang  diukur  dengan menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa terdapat 3 isolat bakteri dan 3 isolat jamur yang bersimbiosis dengan larva C. cossus . Isolat dari bakteri Acinotobacter , Pseudomonas dan Bacillus . Isolat dari jamur diidentifikasi secara molekuler diidentifikasi isolat memiliki kesamaan  DNA  94%  sebagai Paphiopedilum  concalor dan  kesamaan  90% sebagai strain Cyberlindnera jadinii .
Kata Kunci: Cossus cossus ; fungi; mikroba simbion; selulase
Abstract: Larvae Cossus cossus is the order Lepidoptera insects that live in the  menteng  tree  ( Baccaurea  racemosa )  from  the  Village  Lejja  Soppeng. Larvae  can  produce  cellulase  to  hydrolyze  cellulose  into  simple  sugars (glucose) by deciding 1,4-glycosidic bonds in cellulose. Textile cellulase is used in industry detergents, food, and paper that can be produced by microbes such as yeast cellulolytic. The purpose of this study to determine the species of yeast and bacteria isolates and cellulase activity of the leavened symbionts of larvae C. cossus . Stages of the study include the isolation and purification of  yeast;  identification  of  yeasts  and  cellulase  activity  test  conducted  half quantitative (test iodine and test Congo Red) and quantitative test methods dinitrosalicylic  acid  (DNS)  is  measured  by  using  a  UV-Vis spectrophotometer.  The  results  showed  that  there  were  3  isolates  from bacteria  and  3  isolates  from  fungi  which  symbionts  of  larvae C.  cossus .
Isolates  from  bacteria Acinotobacter , Pseudomonas and Bacillus .  Isolates from  fungi  were  identified  molecular  identified  isolates  have  similar  DNA 94%  as Paphiopedilum  concalor and  similarity  of  90%  as Cyberlindnera jadinii strain.
Keywords: cellulase; Cossus cossus ; fungi; symbion microbes

## PENDAHULUAN
ndonesia  terkenal  sebagai  negara  dengan  keanekaragaman  hayati  terbesar  di  dunia yang mencakup keanekaragaman tumbuhan dan hewan. Keanekaragaman ini dapat memberikan manfaat, baik berupa barang dan jasa, maupun yang berupa nilai dalam pemanfaatan  lainnya  seperti  dalam  bidang  penelitian  khususnya  hewan  dengan  kelas insekta.
Insekta (serangga) merupakan kelompok hewan dengan keragaman terbesar karena serangga  mampu mempertahankan  keberlangsungan hidupnya  pada  habitat  yang bervariasi, kapasitas reproduksi yang tinggi, kemampuan memakan jenis makanan yang berbeda serta kemampuan menyelamatkan diri dari musuhnya (Amirullah, 2014). Salah satu  insekta  yang  memiliki  jenis  terbanyak  adalah  ngengat  yang tergolong  dalam  ordo Lepidoptera (serangga bersayap sisik). Jenis ngengat yang mudah ditemukan di kawasan sumber air panas adalah ngengat kambing ( Cossus cossus ). C. cossus merupakan hewan kelas insekta yang banyak hidup di pohon dan dapat menghasilkan  selulase  karena  serat  kayu  pada  pohon  sebagian  besar  terdiri  atas komponen lignoselulase. Serangga ini memakan batang dan cabang dari berbagai pohon dan  dibutuhkan  waktu  sekitar  tiga  atau  empat  tahun  untuk  menjadi  dewasa. C.  cossus memiliki mikroba yang berperan dalam proses penguraian, berupa bakteri, protozoa yang terdapat  pada  saluran  pencernaan  larva  atau  khamir  yang  terdapat  pada  sarangnya. (Purwadaria, 2003).
Khamir  merupakan  kelompok  mikroorganisme  yang  termasuk  filum  Fungi (Noverita, 2009) yang memegang peranan penting dalam hidrolisis senyawa polisakarida (selulosa)  yang  berada  di  dalam  tanah.  (Kanti,  2003)  yang  terdapat  pada  sarang. (Purwadaria, 2003). Khamir memiliki bermacam-macam jenis yang dapat diidentifikasi baik  secara  makroskopis  maupun  molekuler.  Identifikasi  makroskopis  meliputi  warna balik,  warna  koloni,  dan  tekstur  koloni  (Yuniar,  2013).  Idetifikasi  molekuler  dapat digunakan untuk mengidentifikasi khamir hingga tingkat spesies menggunakan metode Polymerase  Chain  Reaction (PCR)  dan  analisis sequence DNA  (Ediningsari,  2008). Khamir memiliki sifat selulolitik yang dapat menghasilkan selulase.
Selulase  merupakan  enzim  yang  mampu  menghidrolisis  selulosa  menjadi  gula sederhana  atau  glukosa  dengan  memutuskan  ikatan  glikosidik  β-1,4  dalam  selulosa. Aktivitas  enzim  didefinisikan  sebagai  kecepatan  pengurangan  substrat  atau  kecepatan pembentukan  produk  pada  kondisi  optimum.  Satu  unit  aktivitas  enzim  selulase didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang  menghasilkan  satu  mikromol  gula  reduksi (glukosa) setiap menit (Syam, 2008). Berdasarkan hal tersebut, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui spesies yang dihasilkan isolat khamir dan aktivitas selulase dari khamir yang bersimbiosis dengan larva Cossus cossus.

## METODE PENELITIAN
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel larva Cossus cossus yang berasal dari kawasan permandian air panas Lejja. Prosedur kerja pada penelitian ini terdiri atas beberapa tahap.
a. Preparasi Sampel
Sampel  larva C.  cossus ditambahkan  NaCl  fisiologis  kemudian  dihomogenkan dengan menggunakan vortex hingga menghasilkan pengenceran 10 -3 . Suspensi larva C. cossus dan dimasukkan ke dalam cawan petri. Isolasi jamur menggunakan media PDA yang mengandung streptomisin dan untuk isolasi bakteri menggunakan media Nutrient
I
agar yang diinkubasi pada suhu 37 o C selama 3-5 hari. Khamir yang tumbuh kemudian dimurnikan pada medium PDA dengan metode streak kuadran dari setiap koloni yang tumbuh. Streptomisin berfungsi mencegah tumbuhnya bakteri pada media PDA.

## b. Pemunian Khamir
Pemurniaan koloni menggunakan media yang sama yaitu media PDA. Pemurnian dilakukan dengan mengambil sebanyak satu ose koloni yang memiliki karakter berbeda baik dari bentuk, warna, maupun morfologinya, selanjutnya  diinokulasikan pada media PDA miring yang baru sebagai stok isolat dan disimpan pada suhu 37 o C.
c. Identifikasi Khamir
Identifikasi khamir meliputi identifikasi makroskopis dan molekuler.
1. Identifikasi makroskopis
Identifikasi  isolat  khamir  terpilih  secara  makroskopis  dengan  diinokulasikan sebanyak  satu  ose  koloni  khamir  dengan  aktivitas  terbaik  pada  media  PDA  yang  baru secara aseptis. Tahap selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu ruang selama 48 jam dan diamati  struktur  makroskopisnya  meliputi  bentuk  koloni,  warna  koloni,  warna  balik koloni.
2. Identifikasi molekuler Identifikasi molekuler terdiri atas beberapa tahapan yaitu meliputi tahap ekstraksi DNA, PCR, dan elektroforesis.
a) Ekstraksi DNA
Ekstraksi  DNA  dilakukan  dengan  memasukkan  tripsin  ke  dalam microsentrifuge sebanyak 1,5 mL dan sampel isolat diambil dengan menggunakan ose dan disentrifugasi selama  5  menit  dengan  kecepatan  300  rpm.  Supernatan  dibuang  dan  residu  sel ditambahkan dengan 200 µL PBS, 20 µL Proteinase K lalu diinkubasi pada suhu 60 o C selama  5  menit.  Supernatan  dibuang  dan  residu  sel  ditambah  200  µL  GBS Buffer , dihomongenkan dengan menggunakan vortex dan diinkubasi pada suhu 60 o C selama 2 menit  dan  ditambahkan  5  µL  RNase  (50  mg/mL).  Campuran  tersebut  divortex  serta diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar untuk memastikan efisien degradasi RNA. Supernatan  dibuang dan residu  sel ditambah dengan 200 µL etanol kemudian  divortex selama  10  detik.  Jika  endapan  muncul  pindahkan  ke  dalam microcup 2  mL  (termasuk endapan larutan) kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Sampel  ditambahkan  dengan  600 µL buffer  wash dan  disentrifugasi  dengan  kecepatan 14.000 rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang dan residu sel ditambahkan dengan 100 µL larutan standar elusi kemudian sampel dipindahkan ke dalam microcup . Buffer elusi (10 mM tris-HCl, pH 8,5 pada 25 o C) ditambahkan sebanyak 1,5 mL. Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) ditambahkan untuk elusi yang bermanfaat sebagai EDTA untuk  mempertahankan  DNA  agar  tahan  dalam  jangka  panjang.  Sampel  didiamkan selama 3 menit dilanjutkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 30 detik untuk mengelusi DNA dimurnikan (10 mM tris-HCl, pH 8,5 pada 25 o C).
b) Polymerase Chain Reaction (PCR) Tahap pertama pembuatan PCR mix sebanyak 25 μl volume total yang terdiri atas 1 μL DNA sampel dengan konsentrasi 25-50 ng μL; 10 x buffer 5 μL; 25 mM MgCl 2 2 μL; dNTP 10 mM 1 μL; pasangan primer ITS1 (5’ TCCGTAGG TGAACCTGCGG 3’) dan ITS4 (5’ TCCTCC GCTTATTGATATGC 3’) masing-masing 1 μL; enzim hotstar 0,25 μL; DNA 5 μL; dan ddH2O 34,75 μL. PCR mix yang telah dibuat dimasukkan ke dalam tabung PCR. Amplifikasi dilakukan dengan denaturasi awal selama 5 menit pada
suhu  94°C,  selanjutnya  sebanyak  35  siklus  melalui  tiga  tahapan  meliputi  denaturasi selama  1  menit  pada  94°C,  penempelan primer  ( annealing )  selama  1  menit  pada  suhu 55°C, sintesis selama 2 menit pada suhu 72°C, dan pada tahap akhir ditambah 10 menit pada suhu 72°C.
c) Elektroforesis
Analisis DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% dalam bufer Tris Boric EDTA (TBE 0.5x) dan visualisasi menggunakan sinar UV.
d. Uji Aktivitas Selulase
Uji  aktivitas  selulase  terdiri  atas  beberapa  pengujian  yaitu  uji  semikuantitatif penghasil selulase dan uji kuntitatif khamir penghasil selulase.
1) Uji semikuntitatif penghasil selulase
a) Metode Congo red
Hasil isolasi khamir inokulasikan ke dalam dalam media CMC plate dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 3 hari. Pengujian mikroba penghasil selulase dengan uji Congo red dengan cara meneteskan Congo red pada permukaan media yang berisi isolat. Bila terdapat zona bening mengindikasikan selulase diproduksi oleh isolat sehingga di daerah tersebut selulosa sudah dihidrolisis sedangkan yang belum terhidrolisis berwarna ungu.
b) Metode Gram Iodin
Hasil isolasi khamir diinokulasikan ke dalam media CMC plate dan diinkubasi pada suhu  30°C  selama  3  hari.  Pengujian  aktivitas  selulolitik  dengan  menambahkan  Gram Iodin.  Koloni  khamir  yang  mampu  menguraikan  CMC  ditunjukkan  dengan kemampuannya membentuk zona bening di sekeliling koloni setelah diuji dengan Gram Iodin  selama  3-5  menit.  Perbedaan  warna  media  yang  mencolok  antara  bagian  yang terhidrolisis  dan  tidak  terhidrolisis  setelah  penambahan  Gram  Iodin  pada  media dikarenakan Gram Iodin menghasilkan kompleks berwarna hitam kebiruan yang bereaksi dengan selulosa (polisakarida) sehingga zona bening terlihat lebih jelas.
2) Uji kuntitatif khamir penghasil selulase
a) Pretreatment serbuk jerami padi
Jerami  padi  dijemur  selama  2  hari  dan  dipotong  kecil-kecil  selanjutnya  dioven selama  4  jam  pada  suhu  60 o C.  Sampel  jerami  padi  digerus  dan  selanjutnya  diayak mengunakan ayakan 100 mesh sehingga diperoleh serbuk jerami padi dengan ukuran 100 µm. Serbuk jerami padi sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 250 mL dan ditambahkan  dengan  natrium  hidroksida  (NaOH)  0,5  N  sebanyak  100  mL  lalu  dioven selama 24 jam pada suhu 80 o C selanjutnya disaring. Serbuk jerami padi dibilas dengan akuades hingga pH netral (diuji dengan kertas lakmus), dikeringkan dengan oven selama 2  jam  pada  suhu  105 o C,  digerus  dan  diayak  dengan  ayakan  100  mesh.  Hasil  yang diperoleh dari perlakukan ini adalah serbuk selulosa.
b) Produksi selulase
Produksi selulase dimulai dengan mencampurkan 5 gram bubuk jerami dengan 25 mL  larutan  nutrisi  di  dalam  erlenmeyer  250  mL  dan  ditutup  dengan  kapas  steril  serta dilapisi alumunium foil, kertas, dan diikat dengan benang. Campuran substrat dan media kemudian disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121 o C selama 15 menit. Media kemudian  didinginkan  hingga  suhu  ruang  sebelum  proses  inokulasi  mikroba  yang dilakukan secara aseptic. Spora yang tumbuh di dalam satu tabung reaksi disuspensikan ke dalam 1 mL larutan 0,1% tween 80 kemudian diinokulasikan secara aseptik ke dalam
media. Hasil dari proses tersebut kemudian diinkubasi selama 4, 5, 6, 7 dan 8 hari pada suhu 37 o C dengan pH pada media cair sebesar 3.
c) Pemanenan enzim
Pemanenan enzim dilakukan dengan sistem sentrifugasi menggunakan sentrifuge. Enzim di dalam erlenmeyer terlebih dahulu  dicampur dengan 10 mL larutan tween 80. 1%. Sentrifugasi dilakukan selama 30 menit dengan kecepatan 4.000 rpm pada suhu 4 o C. Cairan enzim (supernatan) yang dihasilkan kemudian disaring dengan kertas saring agar terpisah dengan residu padatan.
d) Uji aktivitas selulase ( FP-ase )
Aktivitas  enzim  diuji menggunakan  metode CMCase dalam  satuan International Unit (IU) dengan reagen Dinitosalicylic Acid (DNS). Suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi  asam  3,5–dinitrosalisilat  membentuk  senyawa  yang  dapat  diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.
1. Pembuatan kurva standar glukosa Satu (1) mL larutan standar glukosa (0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1) dan 1 mL akuades sebagai kontrol  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi.  Selanjutnya  sebanyak  1  mL  reagen  DNS ditambahkan  ke  dalam  larutan  strandar  glukosa  dan  dihomogenkan  selanjutnya dipanaskan  selama  5  menit  dan  didinginkan.  Absorbansi  larutan  diukur  dengan spektrofotometer UV-Vis.
2. Uji aktivitas selulase ( FP-ase ) pada sampel Satu (1) mL sampel (supernatan) dan 1 mL aquadest sebagai kontrol dimasukkan ke  dalam  tabung  reaski.  Sebanyak  1  mL  reagen  DNS  pada  ditambahkan  pada  larutan enzim tersebut dan dihomogenkan. Tabung reaksi yang berisi sampel dipanaskan selama 5  menit  dan  didinginkan.  Larutan  diukur  dengan  spektrofotometer  UV-Vis.  Nilai absorbansi  yang  diperoleh  diplotkan  pada  kurva  standar  untuk mengetahui  konsentrasi produk glukosa pada sampel. Satu unit aktivitas selulase dinyatakan sebagai jumlah μmol produk  glukosa  hasil  hidrolisis  selulase  tiap  satu  hari  pada  kondisi  pengujian.  Nilai aktivitas selulase ditentukan berdasarkan perhitungan sebagai berikut:
Aktivitas selulase (U/mL) = 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑥 1000
𝑉.𝑡.𝐵𝑀
Keterangan: [glukosa] = kadar glukosa (mg/mL) BM = berat molekul glukosa VE = volume enzim t = waktu inkubasi

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini, sampel yang telah diperoleh yaitu larva Cossus cossus (CCL), serbuk pohon menteng (CCP) dan Cairan pertahanan diri (CCS) dibuat inokulasi suspensi menggunakan  pengenceran  bertingkat  hingga  10 -3 .  Pengenceran  ini  dilakukan  untuk mengurangi  jumlah  mikroorganisme  yang  terdapat  pada  sampel.  Inokulasi  suspensi dilakukan dengan memasukkan sampel ke dalam tabung reaksi dan  diencerkan dengan garam  fisiologis  (NaCl  0,85%)  yang  berfungsi  sebagai  penyangga  pH  agar  sel mikroorganisme  yang  terdapat  pada  sampel  tidak  rusak  akibat  menurunnya  pH lingkungan.
Hasil  suspensi  diisolasi  ke  dalam  media Patato  Dextro  Agar (PDA)  yang sebelumnya  ditambahkan  streptomisin  0,001  %  untuk  mencegah  pertumbuhan  bakteri pada media PDA. Hasil isolasi pada media PDA hari ke 3, diperoleh isolat CCL, CCP
dan CCS. Isolat CCL terdapat 3 bulatan-bulatan besar pada cawan petri yang berwarna hijau kekuningan, pada isolat CCP terdapat bulatan-bulatan kecil di dalam cawan petri yang  berwarna  putih  sedangkan  isolat  CCS  terdapat  satu  bulatan  besar  berwarna hijau kekuningan (Gambar 1).
Gambar 1. Pertumbuhan isolat khamir hari ke-3 pada pada sampel larva Cossus cossus (CCL) (A); serbuk pohon menteng (CCP) (B); dan cairan pertahanan diri (CCS) (C)
Hasil ketiga isolat tersebut kemudian dimurnikan dengan mengambil koloni khamir menggunakan ose dan diinokulasikan pada media media Patato Dextro Agar (PDA) yang terdapat di cawan petri dan tabung reaksi sebagai stok selanjutnya. Proses ini dilakukan untuk  memisahkan  atau  memindahkan  khamir  tertentu  dari  lingkungan,  sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni.
Isolat yang diperoleh pada penelitian ini dilanjutkan dengan identifikasi yang terdiri atas identifikasi makroskopis dan molekuler. Identifikasi makroskopis dilakukan selama 5 hari dengan pengamatan  warna koloni, tekstur koloni dan warna balik koloni  pada 3 isolat. Pada isolat CCL memiliki kesamaan dengan isolat CCS dimana hasil pengamatan hari pertama sampai ke lima dengan warna koloni yang dihasilkan berturut-turut adalah putih, kuning, hijau kekuningan, hijau dan hijau tua kekuningan dengan tekstur koloni permukaannya  kasar  dan  pada  warna  balik  cawan  petri  isolat  CCL  pada  hari  pertama berwarna putih sedangkan pada hari kedua sampai hari kelima berwarna kuning.
Isolat  CCL  dan  CCS  diduga  adalah Aspergillus sp.  Menurut  Samson  et  al. (Noverita, 2009), koloni Aspergillus sp. pada saat muda berwarna putih, dan akan berubah menjadi  berwarna  hijau  kekuningan  setelah  membentuk  konidia.  Kepala  konidia berwarna  hijau  kekuningan  hingga  hijau  tua  kekuningan,  berbentuk  bulat,  konidiofor berdinding  kasar,  hialin.  Hasil  pengamatan  isolat  CCP  yang  dilakukan  selama  5  hari, dengan warna koloni dan warna balik koloni berwarna putih dengan tekstur koloni licin. Isolat ini diduga Candida sp . Menurut Lodder (Noverita, 2009), pertumbuhan Candida sp.  pada  media  umumnya  berbentuk  bulat  dengan  permukaan  sedikit  cembung,  halus, licin dan kadang-kadang sedikit berlipat-lipat terutama pada koloni yang telah tua. Secara makroskopis Candida sp. berwarna putih kekuningan, dengan permukaan yang halus.
Isolat  juga  dilakukan  identifikasi  molekuler  menggunakan  teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) yang merupakan metode secara akurat sehingga diperoleh susunan dari  taksonomi  hingga  spesiesnya.  Keberhasilan  isolasi  DNA  diketahui  melalui elektroforesis gel agarosa. Gel agarosa di bawah sinar UV akan memperlihatkan adanya pita-pita  DNA  yang  menandakan  bahwa  DNA  telah  berhasil  diisolasi.  Isolasi  DNA merupakan  tahap  awal  dalam  identifikasi  molekuler.  Keberhasilan isolasi  DNA  sangat memengaruhi kualitas DNA yang diperoleh. Pita DNA hasil isolasi yang diperoleh tidak berupa pita tunggal, melainkan berbentuk noda memanjang. Pita DNA yang berbentuk noda  memanjang  pada  gel  elektroforesis  ini  disebut smear yang  disebabkan  karena polisakarida  yang  dihasilkan  oleh  fungi  tersebut  ikut  terekstraksi  saat  isolasi  DNA dilakukan (Rahayu, 2015).
A B C
Isolat DNA fungi dari larva C. cossus berhasil diamplikasi pada daerah ITS1 dan rDNA menggunakan pasangan primer ITS4. Keberhasilan amplikasi diketahui dengan adanya pita-pita DNA pada gel agarosa setelah dilakukan elektroforesis. Hal ini sesuai dengan hasil amplifikasi yang diperoleh, yaitu berat molekul DNA hasil amplifikasi PCR adalah sebesar 600 pb (Gambar 2), terlihat pita DNA yang diperoleh berupa pita tunggal. Hal ini menandakan bahwa DNA hasil amplifikasi sudah cukup murni yang memiliki pita DNA berukuran 600 bp dari hasil amplifikasi dari 3 isolat . Urutan pita DNA tersebut sesuai dengan  yang  diharapkan  dari  ketiga  isolat  dapat  digunakan  untuk  analisis  lebih  lanjut karena hasil perunutan yang baik.
Gambar 2. Hasil elektroforesis amplifikasi DNA
Hasil BLAST urutan fragmen isolat yaitu dari 2 isolat dapat diidentifikasi jenisnya. Isolat  CCP  memiliki  kesamaan  DNA  dengan  persentase  kemiripan  90%  yaitu Cyberlindnera  jadinii strain .  C.  jadinii strain  juga  dikenal  dengan  nama C.  utilis (Environment Canada, 2015) yang merupakan genus Candida dengan jenis khamir. Isolat CCL diidentifikasi sebagai Paphiopedilum concolor dengan persentase kemiripan DNA sebesar 94 %.
Pada  penelitian  ini  juga  dilakukan  uji  aktivitas  selulase  yang  terdiri  atas  uji semikuantitatif  khamir  selulase  dan  uji  kuntitatif  khamir  penghasil  selulase.  Uji semikuantitatif pada isolat bertujuan untuk mengetahui adanya aktivitas enzim selulolitik dari isolat. Uji semikuantitatif yang digunakan adalah melalui uji iodin dan pewarnaan dengan menggunakan Congo red 0,1%. Uji ini dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada  media  agar  yang  mengandung  karbosilmetil  selulosa  (CMC)  kompleks  dan diinkubasi  selama  7  hari  serta  dilakukan  pengamatan  zona  bening  tiap  harinya. Karbosilmetil selulosa (CMC) merupakan suatu polimer anionik yang umum digunakan pada pengujian aktivitas enzim. Enzim pendegradasi CMC akan ditahan pada permukaan dinding  sel  atau  dilepaskan  ke  luar  sel  dan  membuat  selulase  yang  disekresikan  akan berdifusi  ke  dalam  permukaan  media  agar.  Selulase  merupakan  senyawa  metabolit sekunder yang bersifat ekstraseluler yang menyebabkan enzim tersebut akan disekresikan dalam media tumbuh isolate (Hasanah, 2015).
Tahap pewarnaan dilakukan dalam media agar CMC dan pewarna Congo red akan mendeteksi zona yang mampu dihidrolisis oleh selulase. Prinsip pewarnaan ini adalah zat pewarna  akan  berdifusi  ke  dalam  media  agar  dan  hanya  akan  diabsorbsi  oleh  rantai panjang polisakarida yang memiliki ikatan β-D-glukan. Media yang kelebihan Congo red dibilas dengan larutan garam NaCl 1% sebagai pencuci. Pencucian dengan larutan NaCl akan  membuat  zona  hasil  hidrolisis  selulase  akan  tampak  lebih  jelas.  Uji  kualitatif
terhadap  3  isolat  yaitu  CCL,  CCP,dan  CCS  yang  diisolasi  dari  larva Cossus  cossus menunjukkan bahwa pada hari 1 dan ke 2 ke 3 isolat ini belum  menghidrolisis selulase atau tidak menghasilkan zona bening dan pada hari ke 3 sampai dengan hari ke 7 hanya isolat  CCP  yang  menghidrolisis  selulase  dengan  terbentuknya  zona  bening  sedangkan pada  isolat  CCL  hanya  hari  ke  5  yang  mempunyai  zona  bening.  Zona  bening menunjukkan  zona  tempat  terputusnya  ikatan  β-1,4-glikosidik  yang  menghubungkan monomor D-glukosa pada CMC. Isolat yang memiliki zona bening merupakan isolat yang memiliki kemampuan dalam mendegradasi selulosa (Hasanah, 2015).
Tiga  isolat  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini  menunjukkan  hanya  2  isolat  yang memiliki  potensi  selulase  untuk  menghidrolisis  ikatan  β-1,4-glikosidik  pada  CMC. Selulase  yang  digunakan  untuk  proses  hidrolisis  ini  bersifat  ekstraseluler.  Sifat  enzim ekstraseluler  terlihat  dari  zona  bening  yang  terbentuk  di  sekitar  koloni. Congo  red berinteraksi kuat dengan ikatan β-1.4-glikosidik. Metode ini dipilih karena proses seleksi dapat  berlangsung  cepat,  mudah,  dan  sensitif.  Pewarnaan  dengan Congo  red dapat menentukan  mikroba  selulolitik  dalam  konsentrasi  selolusa  yang  rendah  pada  substrat dan  dapat  mempersingkat  waktu  inkubasi.  Berbagai  jenis  selulase  diperlukan  dalam mendegradasi sempurna struktur selulosa yang kompleks (Hasanah, 2015).
Uji  kuantitatif  dilakukan  untuk  mengetahui  aktivitas  selulase.  Uji  ini  dilakukan dengan  membuat  selulosa  menggunakan  jerami  padi  dengan  metode  delignifikasi. Perlakuan delignifikasi substrat jerami padi dengan menggunakan Natrium hidroksida 0,5 N  dapat  memberikan  aktivitas  enzim  endoglukanase  tertinggi.  Hal  ini  disebabkan semakin  tinggi  konsentarsi  larutan  NaOH,  kemampuan  untuk  melarutkan  lignin  dan merusak  struktur  selulosa  akan  semakin  bertambah,  yang  mengakibatkan  serat-serat selulosa  akan  semakin  longgar  sehingga  semakin  mudah  dihidrolisis  oleh mikroorganisme baik untuk pertumbuhannya maupun untuk produksi selulase (Gunam, 2011).
Serbuk selulosa  yang telat dibuat  kemudian ditambahkan  dengan isolat CCP dan CCL dengan waktu fermentasi selama 8 hari untuk mengetahui aktivitas selulase yang dihasilkan. Pengujian diukur berdasarkan jumlah gula pereduksi menggunakan metode asam  dinitrosalisilat  (DNS)  dan  glukosa  sebagai  kurva  standar.  Pengukuran  aktivitas enzim  dilakukan  menambahkan tween  80 . Tween  80 digolongkan  dalam  surfaktan anionik  dimana  bagian  alkilnya  tidak  bermuatan.  Penggunaan tween  80 dimaksudkan sebagai  surfaktan  sehingga  dapat  mempersatukan  campuran  yang  terdiri  dari  air  dan minyak pada hasil fermentasi. Hasil reduksi gula pada hidrolisis selulosa menggunakan enzim selulase dari mikroorganisme dengan surfaktan tween 80 meningkat 2x lipat karena surfaktan tween 80 mampu menaikkan stabilitas enzim dan mencegah penguraian enzim selama hidrolisis, memengaruhi struktur substrat dan membuatnya dapat lebih dijangkau oleh  enzim.  Sehingga  mempengaruhi  interaksi  antara  enzim  dan  substrat.  Selanjutnya, pengukuran  aktivitas  enzim  menggunakan  metode  asam  dinitrosalisilat  (DNS)  yang didasarkan  pada  jumlah  gula  pereduksi  sebagai  hasil  hidrolisis  selulase.  Pada  proses degradasi selulosa menjadi glukosa, enzim endo-1,4-β-glukanase, ekso-1,4-β-glukanase, dan β-glukosidase bekerja secara sinergis (Hasanah, 2015).
Konsentrasi gula pereduksi ditentukan berdasarkan kurva standar glukosa. Kurva standar yang diperoleh memiliki persamaan y = 0,9253x – 0,0753 dengan nilai R 2 sebesar 0.9797. Konsentrasi gula pereduksi digunakan untuk menghitung aktivitas enzim. Satu unit aktivitas enzim dinyatakan sebagai jumlah mikromol glukosa yang dihasilkan oleh satu mL enzim setiap menit. Hasil uji kuantitatif  isolat dengan variasi waktu fermetasi yang memiliki nilai aktivitas selulase pada hari ke-4 isolat CCL yaitu sebesar  0,18460
mU/mL  sedangkan  isolat  CCP  nilai  aktivitas  selulase  0,29427  mU/mL.  Nilai  aktivitas isolat CCL dan CCP pada hari ke-5 adalah 0,11226 mU/mL dan 0,42901 mU/mL. Pada hari ke-6, nilai aktivitas selulase isolat CCL 0,14628 mU/mL dan CCP 0,54816 mU/mL. Sedangkan  pada  hari  ke-7  memiliki  nilai  aktivitas  selulase  tertinggi.  Isolat  CCL  yaitu sebesar  0,21142 mU/mL  dan  isolat  CCP  sebesar  0,63596  mU/mL.  Pada  hari  ke-8 mengalami penurunan nilai aktivitas selulase isolat CCL yaitu 0,12099 mU/mL dan isolat CCP sebesar 0,52064 mU/mL.
Berdasarkan  hasil  tersebut  diketahui  bahwa  waktu  fermentasi  juga  memengaruhi aktivitas  selulase.  Waktu  fermentasi  terbaik  dalam  menghasilkan  selulase  dengan aktivitas enzim yang tertinggi adalah 7 hari. Aktivitas selulase akan semakin meningkat seiring  dengan  bertambahnya  waktu  fermentasi.  Peningkatan  aktivitas  selulase  yang terjadi  pada  hari  ke-4  hingga  hari  ke-8  menunjukkan  bahwa  terjadi  interaksi  antara selulase  dengan  selulosa  yang  tinggi.  Interaksi  antara  selulase  dengan  selulosa  akan membentuk  kompleks  enzim-substrat  yang  menghasilkan  glukosa  sebagai  produk. Penurunan aktivitas selulase yang terjadi pada hari ke-8 hingga hari ke-10 menunjukkan bahwa interaksi antara selulase dengan selulosa mulai menurun. Hal ini disebabkan oleh akumulasi  produk  yang  terbentuk  pada  hari  sebelumnya  menyebabkan  penghambatan bagi  selulase.  Produk  dari  hidrolisis  selulosa  dapat  menjadi  inhibitor  bagi  aktivitas selulase.

## KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa isolat khamir  yang  bersimbion  dengan  larva Cossus  cossus adalah  spesies Paphiopedilum concolor dari isolat CCL dan Cyberlindnera jadinii strain yang juga dikenal dengan nama Candida  Utilis dari  isolat  CCP.  Nilai  aktivitas  selulase  dari  khamir  yang  bersimbion dengan larva C. cossus yang tertinggi terjadi pada hari ke-7 dengan nilai aktivitas sebesar 0,21142 mU/ dari isolat CCL dan 0,63596 mU/mL dari isolat CCP .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  tim  peneliti  Laboratorium  Biokimia, Jurusan  Kimia,  Fakultas  Sains  &  Teknologi,  UIN  Alauddin  Makassar.  Penelitian  ini didukung dan disponsori oleh UIN Alauddin Makassar melalui dana BOPTN.

## DAFTAR PUSTAKA
Amirullah, A., Ariani, C., & Suriana, S. (2014). Keanekaragaman Kumbang Cerambycidae ( Coleoptera ) di  Kawasan  Gunung  Mekonggan  Desa  Tinukari  Kecamatan  Wawo  Kabupaten  Kolaka  Utara Provinsi Sulawesi Tenggara. Jurnal Biowallacea , 1(1).
Ediningsari, A. R. (2008). Identifikasi Khamir Dari Perairan Mangrove dan Laut Cagar Alam Pulau Rambut berdasarkan Daerah Internal Transcribed Spacer (ITS). Skripsi . Depok: Universitas Indonesia. Environment Canada, Health Canada. (2015). Draft Screening Assessment for Candida Utilis ATCC 9950. Canada: Environment Canada, Health Canada.
Gunam, I. B. W., Buda, K., & Guna, I. M. Y. S. (2010). Pengaruh Perlakuan Delignifikasi dengan Larutan NaOH  dan  Konsentrasi  Substrat  Jerami  Padi  terhadap  Prosuksi  Selulase  dari Aspergillus  niger NRRL A-II, 264. Jurnal Biologi, 14(1), 55-61.
Hasanah,  N.,  &  Saskiawan,  I.  (2015).  Aktifitas  Selusase  Isolat  Jamur  dari  Limbah  Media  Tanah  Jamur Merang. Prosiding Seminar Nasional Masyarakat Biodiversitas Indonesia , 1(5), 1110-1115. Kanti,  A.,  &  Sudiana,  I.  M.  (2003).  Aktifitas  CMC-ase  Khamir Candida sp.  yang  Diisolasi  dari  Tanah Kebun Biologi Wamena, Papua. Berita Biologi , 6(5), 655-660.
Noverita, N. (2009). Identifikasi Kapang dan Khamir Penyebab Penyakit Manusia pada Sumber Air Minum Penduduk pada Sungai Ciliwung dan Sumber Air Sekitarnya. Vis Vitalis , 2(2), 12-22.
Purwadaria, T., Marbun, P. A., Sinurat, A. P., Ketaren, P. P. (2003). Perbandingan Aktivitas Selulase Dari Bakteri dan Kapang Hasil Isolasi Dari Rayap. Balai Penelitian Ternak , 8(4), 213-219. Rahayu, F., Saryono, S., & Nugrho, T. T. (2015).  Isolasi DNA dan Amplifikasi PCR Daerah ITS rDNA Fungi Endofit Umbi Tanaman Dahlia ( Dahlia variabilis) LBKURCC69. Jurnal JOM MIPA , 2(1), 100-106.
Syam, K. A. (2008). Optimasi Produksi dan Aktivitas Enzim Selulase dari Mikroba Selulolitik Asal Rayap. Skripsi . Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Yuniar,  W.  (2013).  Skrining  dan  Identifikasi  Kapang  Selulolitik  pada  Proses  Vermikomposting Tondan Kosong Kelapa Sawit (TKKS). Skripsi . Jember: Universitas Jamber.