## Review Artikel: Teknik -Teknik Analisis Profil Mikrobiota Penyebab Karies
Article Review: Microbiota Causing Caries  Profile Analysis Techniques
Sukaeni Ibrahim¹, Marhaen Hardjo 2
* Email: ibrahimsukaeni@gmail.com
1 Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Bosowa
2 Departemen Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin Diterima: 12 September 2022 / Disetujui: 30 Desember 2022

## ABSTRAK
Karies  gigi  merupakan  penyakit  infeksi  kronis  yang  umum  terjadi  akibat  bakteri  kariogenik  yang melekat  pada  gigi.  Mikroorganisme  kariogenik  berperan  penting  dalam  perkembangan  karies. Streptococcus  mutan merupakan  mikroorganisme  pathogen  penting  dalam  perkembangan  lesi  karies. Perkembangan  terbaru  dalam  teknologi  sekuensing  DNA  belakangan  ini  telah  memungkinkan  untuk memetakan  profil  komposisi  mikrobioma  rongga  mulut  dan  memberikan  harapan  dalam menyelesaikan  penyakit  menular  ini.  Pada  penelitian  ini,  kami  mengumpulkan  data  penelitian mengenai  teknik  analisis  profil  mikrobioma  rongga  mulut  melalui  mesin  pencarian  online Google Scholar dan Pubmed .  Dan  didapatkan  15  jurnal  yang  membahas  mengenai  teknik  identifikasi mikrobioma  rongga  mulut.  Teknik  analisis  mikrobioma  rongga  mulut  dapat  diketahui  dengan  jelas beserta  kelebihan  dan  kekurangan  untuk  merancang  penelitian  lebih  lanjut  tentang  mikrobioma penyebab terjadinya karies.
Kata Kunci: Mikrobioma Rongga Mulut, Karies, Teknik Analisis

## ABSTRACT
Dental caries is a common chronic infectious resulting from tooth adherent cariogenic bacteria. The cariogenic microorganisms play an important part in caries development. Streptococcus mutan is an important pathogenic organism in the development of caries lesion. The development of dental caries is  highly  associated  with the  microbiota  in  the oral  cavity.  Recent  developments  in  DNA  sequencing technology have made it possible to map the compositional profile of the oral microbiome and provide hope  in  solving  the  problem  on  this  infectious  disease.  The  development  of  dental  caries  is  closely related to the microbiota in the oral cavity. Recent developments in DNA sequencing technology have made it possible to map the compositional profile of the oral microbiome and provide hope in solving this  infectious  disease  problem.  Methode:  In  this  study,  we  collected  research  data  regarding  the technique  of  analyzing  oral  microbiome  profiles  through  the  online  search  engines  Google  Scholar and Pubmed. And obtained 15 journal that discuss the identification technique of the oral microbiome Result:  The  oral  microbiome  analysis  technique  can  be  identified  clearly  along  with  its  advantages and disadvantages for design further research on the microbiome that causes caries.
Keywords : Oral Microbiome , Caries, Analysis Technique
This work is licensed under Creative Commons Attribution License 4.0 CC-BY International license

## A. PENDAHULUAN
Karies  adalah  suatu  penyakit kronik  terbanyak  yang dijumpai pada pasien anak. Penyakit ini tidak hanya mempengaruhi  kondisi  kesehatan,  namun
dapat juga berdampak kepada perkembangan kemampuan  kognisi  dan  kesehatan  mental anak  selama  masa  pertumbuhan.  Meskipun dapat dihindari dengan melakukan pencegahan  dini,  penyakit  ini  dialami  oleh
54%  anak  kelompok  usia  5-9  tahun  di Indonesia  ( Amalia et  al ,  2019) .  Penyakit  ini memiliki  risiko  rekurensi  yang  tinggi meskipun  dilakukan  intervensi  farmakologis seperti antibiotik dan edukasi untuk mengubah pola makanan setelah pencabutan atau  dengan  restorasi  karies  ( Balolong  & Mendoza,  2020) .  Oleh  karena  itu,  sangat penting untuk mengetahui dasar pathogenesis dari penyakit ini.
Karies  diketahui  terjadi  akibat  etiologi yang  bersifat  multifaktorial.  Hipotesis  plak nonspesifik  menyebutkan  bahwa  karies  gigi terbentuk akibat konsumsi gula dalam kurun waktu lama memicu spesies bakteri penghasil asam dalam rongga mulut memetabolisir  gula  menyebabkan  terjadinya demineralisasi  dari  jaringan  keras  gigi  dan membentuk  suatu  plak  karies.  Sedangkan hipotesis  spesifik  menyebutkan  bahwa  suatu bakteri spesifik, seperti Streptococcus mutants,  merupakan  kunci  dari  faktor patologis  pembentukan  karies.  Perdebatan antara  ahli  ini  disebabkan  oleh  kurang berkembangnya  penelitian  etiologi  karies gigi. Hal ini disebabkan karena kompleksitas dari  plak  gigi  yang  berjumlah  kurang  lebih 700 spesies beserta interaksi antara komunitas  bakteri.  Sehingga,  penelitian etiologi  saat  ini  berpusat  pada  profil mikrobioma karies dan hubungannya beserta
faktor  genetik  dari  penderita  ( Berkowitz et  al 2011) .
Perkembangan teknologi
metagenomik dan sequencing DNA belakangan ini memungkinkan untuk menganalisis secara langsung seluruh komposisi  spesies  dan  gen  yang  berkaitan erat  dengan  pembentukan  karies  gigi. Sehingga,  terdapat  peningkatan  suara  para ahli  yang  menyimpulkan  pembentukan karies  gigi.  Karies  disebabkan  bukan  hanya oleh  faktor  spesies  spesifik,  melainkan  juga oleh suatu faktor eksternal. Ketidakseimbangan mikrobioma dan disbiosis  dari  struktur  ekologis  sistem mikrobioma  mulut  akibat  faktor  eksternal diperkirakan  menjadi  penyebab  terjadinya plak karies. Ketidakseimbangan ini dipengaruhi  tidak  hanya  oleh  satu  jenis spesies  spesifik  tertentu,  melainkan  oleh beberapa  komunitas  spesies  bakteri.  Hingga saat ini, terdapat beberapa teknik identifikasi komposisi,  struktur  dan  informasi  lengkap mengenai  seluruh  mikroorganisme  dalam plak biofilm rongga mulut dengan kelebihan dan kekurangan masing masing (Cullen et al, 2020).  Namun,  hasil  penelitian  dari  teknik tersebut diatas masih sangat bervariasi. Oleh karena itu, penting mengetahui teknik teknik identifikasi beserta kelebihan dan kekurangan  sebelum  merancang  penelitian mikrobioma rongga mulut.
Penelitian ini bertujuan untuk meninjau  ulang  beberapa  penelitian  terakhir yang  mendeskripsikan  teknik  analisis  jenis spesies  mikroorganisme  rongga  mulut  yang bertanggung  jawab  dalam  pembentukan karies gigi.

## B. METODE PENELITIAN
Desain  penelitian  ini  adalah literature review atau tinjauan pustaka. Kami mengumpulkan  data  penelitian  mengenai teknik  analisis  profil  mikrobioma  rongga mulut  melalui  mesin  pencarian  online Google  Scholar  dan  Pubmed  pada  tanggal  8 November  2022.  Kami  mendapatkan  14 jurnal  yang  membahas  mengenai  teknik identifikasi  mikrobioma  rongga  mulut  yang berkaitan dengan tema literatur review ini

## C. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Komposisi Mikrobioma Oral:
Istilah  "mikrobioma  oral"  diciptakan untuk  menggambarkan  komunitas  mikroba yang  menghuni  rongga  mulut  dan  berperan dalam modulasi berbagai kondisi patofisiologi pada tubuh manusia. Dibandingkan  dengan  bagian  tubuh  lainnya, mikrobioma  rongga  mulut  bersifat  khas  dan mudah  diakses.  Namun,  hanya  ada  sekitar 700 taksa yang dominan: 54% dapat dikultur dan  diidentifikasi;  14%  dapat  dikultur  tetapi belum  dapat  diidentifikasi,  dan  32%  sisanya belum  dapat  dikultur.  Perkiraan  ini  didasari oleh  identifikasi  tradisional  bakteri  selama
bertahun-tahun  melalui  studi  karakterisasi kultur dan fenotipik(Do et al , 2021).
Penelitian  mikrobioma  saat  ini  berada pada  tahap  modern.  Banyak  penelitian sedang  dilakukan,  dan  data  bertambah  terus menerus,  hingga  saat  ini  dengan  total  392 taksa  yang  memiliki  setidaknya  satu  genom referensi  dan  mendekati  total  1500  genom dalam  rongga  mulut.  Namun,  hasil  yang diperoleh  dari  berbagai  penelitian  tidak konsisten.  Hal  ini  mungkin  terjadi  karena teknik  yang  digunakan,  standarisasi  metode, ukuran  sampel,  dan  lain  lainnya  masih bersifat  variatif.  Penelitian  dengan  ukuran sampel  yang  lebih  besar  dengan  lokasi berbeda diperlukan untuk dapat di kembangkan  pola  yang  konsisten  agar menghasilkan  data  yang  lebih  konkret (Choubey et al ,  2021).
Bakteri  utama  yang  ditemukan  dalam rongga  mulut  yang  sehat  adalah  sebagai berikut:  Gram  Positif: Cocci-Abiotrophia, Peptostreptococcus, Streptococcus,
Stomatococcus Batang - Actinomyces, Bifidobacterium, Corynebacterium, Eubacterium, Lactobacillus, Propionibacterium, Pseudoramibacter,
Rothia .  Dan  Gram  Negatif: Cocci  -
Moraxella,  Neisseria,  Veillonella  Batang- Campylobacter, Capnocytophaga,
Desulfobacter, Desulfovibrio, Eikenella,
Fusobacterium,  Hemophilus,  Leptotrichia,
Prevotella,
Selemonas,
Simonsiella,
Treponema,  Wolinella. Sedangkan  dalam rongga mulut yang terdapat karies ditemukan ditemukan Streptococus mutans dan Lactobacillus      acidophilus dalam  jumlah yang banyak (Jaksik et al , 2015).

## 2. Fungsi Mikrobioma Rongga Mulut
Komunitas  mikroba  yang  ada  dalam tubuh  manusia  berperan  dalam  fungsi  kritis, fisiologis,  metabolisme  dan  imunologis meliputi  pencernaan  makanan  dan  nutrisi; generasi energi, diferensiasi dan pematangan mukosa  inang  dan  sistem  kekebalannya; kontrol  penyimpanan  lemak  dan  regulasi metabolisme;  pengolahan  dan  detoksifikasi bahan  kimia  lingkungan;  fungsi  penghalang kulit  dan  mukosa;  pemeliharaan  sistem kekebalan  tubuh  dan  keseimbangan  antara proses  pro-inflamasi  dan  anti-inflamasi; mempromosikan  mikroorganisme  (resistensi kolonisasi)  dan  pencegahan  invasi  dan pertumbuhan penyakit (Jaksik et al , 2015).
Fisiologi  dan  ekologi  mikrobioma rongga  mulut  berkaitan  erat  dengan  inang baik  pada  skala  mikron  maupun  skala  inang (manusia). Mikrobioma rongga mulut biasanya  ada  dalam  bentuk  biofilm.  Hal  ini memainkan  peran  penting  dalam  menjaga homeostasis  mulut,  melindungi  rongga mulut, dan mencegah perkembangan penyakit.  Mengetahui  identitas  mikrobioma dan  aspek  yang  biasa  berinteraksi  dengan
mereka diperlukan untuk pemahaman mekanistik  dari  kunci  utama  (Jaksik et  al , 2015).

## 3. Metode  Pembelajaran  Mikrobioma Rongga Mulut
Karena  sampel  mudah  diperoleh, mikrobioma  rongga  mulut  dapat  dikatakan sebagai  mikrobioma  manusia  yang  baik untuk  dipelajari  hingga  saat  ini.  Metode tradisional untuk identifikasi mikroba adalah metode  kultur  dari  satu  spesies  menjadi komunitas  multispesies  in  vitro  yang kompleks.  Pada  beberapa  tahun  terakhir, terjadi kemajuan besar dalam pengembangan teknik  "omics"  kultur-independen.  Metode ini  mempelajari  DNA,  RNA,  protein  atau metabolik dari seluruh komunitas mikroba.
Mikrobioma dan metagenomic merupakan  dua  bidang  penelitian  yang muncul untuk mendeteksi dan mengidentifikasi  keberadaan  mikroba  dan memahami  sifat  aktivitas  mikroba  pada kondisi sehat dan sakit. Metagenomic adalah suatu  teknik  identifikasi  bakteri  yang  tidak dapat  dibiakkan.  Metode  ini  juga  dapat mengidentifikasi keragaman genomik mikroba dengan menerapkan kekuatan analisis  genomik  ke  seluruh  komunitas mikroba. Metagenomics memberikan informasi tidak hanya tentang jenis organisme  yang  ada,  tetapi  juga  potensi fungsionalnya  melalui  analisis  gen  dan  jalur
metabolisme. Selain itu juga dapat memberikan  informasi  tentang  penggunaan database urutan pengkodean protein, mengurutkan seluruh DNA dari sampel yang diteliti ( Jian et al , 2020) .
a) Kultur dan mikroskop
Metode kultur dan mikroskop merupakan  metode  konvensional  yang  telah digunakan sejak lama
dalam mengidentifikasi taksa bakteri dan menganalasis  komposisi mikrobioma rongga mulut  melalui  motode  seperti  kultur  bakteri, uji  enzimatik,  sensivitas  antibiotik,  dan immunoassays.  Namun  pada  teknik  ini, Sebagian  besar  bakteri  rongga  mulut bertumbuh  lambat,  membutuhkan  media pertumbuhan  yang  kompleks,  persyaratan tekanan  atmosfer  yang  sangat  spesifik  dan waktu inkubasi yang lama. Mayoritas bakteri rongga  mulut  merupakan  bakteri  anaerob sehingga pengumpulan sampel harus dilakukan  oleh  tenaga  ahli,  transportasi  dan inkubasi yang ketat untuk mencegah paparan oksigen.  Media  selektif  telah  terbukti berguna  untuk  mempelajari  spesies  tertentu yang  diinginkan,  akan  tetapi  mungkin  dapat membiaskan  pemahaman  akan  etiologi karies, bila dihubungkan dengan karakteristik  penyakit  karies  dengan  spesies yang tumbuh subur di bawah kondisi kultur. sementara  spesien  lain  tidak  terdeteksi. Namun,  31%  dari  taksa  rongga  mulut  yang
diketahui masih tidak dapat dapat ditumbuhkan  secara  in  vitro,  sehingga motode  konvensional  seperti  kultur  bakteri masih penting dalam mikrobiologi ( Ibrahim et al , 2009) .
b) Teknik berbasis gel Pada beberapa teknik kultur- independen  komunitas  mikroba  sudah  dapat dilakukan analisis throughput tinggi. Terdapat  dua  jenis  teknik  berbeda  yang digunakan  yaitu Denaturing  Gradient Gel Electrophoresis  (DGGE)  dan Restriction Fragment  Length  Polymorphism (RELP) ( Ibrahim et al , 2009) .
Kelebihan  teknik  DGGE  dan  RELP adalah reliabilitas, reproduktifitas, kecepatan,  dan  biaya  rendah.  Karena beberapa  sampel  dapat  dianalisis  secara bersamaan,  pelacakan  perubahan  populasi mikroba sebagai respons terhadap rangsangan  atau  kesulitan  apa  pun  dapat diperoleh  dengan  teknik  DGGE  dan  RELP. Keterbatasan  teknik  DGGE  dan  RELP termasuk bias dari PCR, penanganan sampel yang  melelahkan,  dan  efisiensi  ekstraksi DNA  yang  bervariasi.  Diperkirakan  teknik DGGE  dan  RELP  hanya  dapat  mendeteksi 1%  -2%  dari  populasi  mikroba  yang mewakili  spesies  dominan  yang  ada  dalam sampel ( Krishnan et al , 2017) .
c) Metode berbasis Quantitative Polymerase Chain Reaction
Pendekatan  PCR  kuantitatif  (Q-PCR atau real-time PCR)  sekarang  banyak diterapkan  pada  penelitian  ekologi  mikroba untuk  mengukur  jumlah  dan  ekspresi penanda  gen  taksonomi  dan  fungsional dalam  sampel.  Analisis  berbasis  Q-PCR menggabungkan  PCR  deteksi  titik  akhir 'konvensional'  dengan  teknologi  deteksi fluoresen guna merekam akumulasi amplikon  secara real  time selama  setiap siklus amplifikasi PCR. Perbandingan kuantifikasi  jumlah  gen  (atau  transkripsi) saat  ini  dengan  konsentrasi  template  awal dapat diketahui dengan mendeteksi amplikon selama  fase  eksponensial  awal  PCR  (Martín et al . 2014).
Q-PCR  telah  terbukti  menjadi  metode yang akurat,  sangat  mudah direproduksi  dan sensitif  secara  kuantitatif  untuk  melacak perubahan  filogenetik  dan  fungsional  gen. Selain  itu,  data  kuantitatif  yang  dihasilkan dapat  digunakan  untuk  menghubungkan variasi  dalam  jumlah  gen  dan  /atau  tingkat ekspresi  gen  (dalam  hal  jumlah  transkrip) dibandingkan  dengan  variasi  faktor  abiotik atau  biotik  dan/atau  aktivitas  biologis. Ketersediaan set data Q-PCR dapat menggambarkan  jumlah  bakteri  atau  gen tertentu  sehingga  dapat  melengkapi  set  data kuantitatif  lainnya.  Hal  ini  sangat  penting dalam  identifikasi  ekologi  mikroba  karena
menambah  pemahaman  akan  peran  dan kontribusi kelompok mikroba tertentu dalam ekosistem.  Selanjutnya,  analisis  transkripsi balik  (RT)  apabila  dikombinasikan  dengan metode Q-PCR dalam pengujian RT-Q-PCR, semakin  menjadi  alat  yang  ampuh  untuk mengukur  ekspresi  gen  (dalam  hal  jumlah transkrip rRNA dan mRNA) dan menghubungkan  aktivitas  biologis  dengan fungsi ekologi (Martín et al . 2014).

## d) Mikroarray DNA
Dalam  komunitas  ilmiah,  filogenetik DNA  mikro-array  telah  dikenal  sebagai  alat dengan  hasil  analisis  yang  tinggi  dan sistematis  dengan  kuantitatif  komunitas bakteri  dalam  ekosistem  mikroba  yang berbeda  termasuk  mikrobiota  rongga  mulut. Analisis  microarray  DNA  menjadi  teknik yang  ampuh  untuk  mengidentifikasi  gen yang  diekspresikan  secara  berbeda,  tetapi dalam  membedakan varian  splice dapat menjadi permasalahan (Rizal et al. 2020).
Kelemahan  yang  paling  utama  dari microarray  adalah  biaya  tinggi  untuk percobaan  tunggal,  kurangnya  kontrol  atas kumpulan  transkrip  karena  sebagian  besar platform  microarray  hanya  menggunakan satu  set  probe  yang  dirancang  dari  pabrik. Kelemahan  lain  dari  microarray  adalah akurasi,  presisi  dan  spesifisitas  yang  relatif rendah  serta  sensitivitas  tinggi  untuk pengaturan eksperimental variasi suhu
hibridisasi,  kemurnian  dan  tingkat  degradasi materi  genetik,  dan  proses  amplifikasi  yang dilalukan  bersama  dengan  faktor-faktor  lain yang dapat mempengaruhi perkiraan ekspresi gen (Rizal et al. 2020).
e) 16S rRNA Sequencing
Pendekatan  sekuensing  DNA  dasar telah  banyak  diterapkan  untuk  mempelajari komunitas  mikroba  rongga  mulut  adalah analisis sekuens 16S rRNA. Dengan metode ini  memungkinkan  (1)  sekuensing  pada hampir semua bakteri, kadang sebagai family yang  multigen;  (2)  Fungsi  gen  16S  rRNA tidak  berubah  dari  waktu  ke  waktu,  yang menunjukkan  bahwa  perubahan  acak  dalam urutan  merupakan  ukuran  waktu  yang  lebih tepat (evolusi) dan (3) gen 16S rRNA (1500 bp)  cukup  besar  untuk  tujuan  informatika. Dengan  metode  ini  gen  menjadi  sangat terkonservasi, dengan referensi yang cenderung  tidak  berbeda  dari  gen  pada bakteri  yang  terkumpul  pada  sampel. Namun, urutan 16S rRNA hanya menentukan  keberadaan  atau  jumlah  spesies bakteri (Rosier et al , 2014).
f) Teknik  Next  Generation  Sequencing (NGS)
Teknik sekuensing generasi berikutnya telah  merevolusi  studi  keanekaragaman mikroba  dalam  dekade  terakhir.  Teknik  ini memungkinkan  proyek  pengurutan  skala besar dapat diselesaikan dalam beberapa hari atau  bahkan  dalam  hitungan  jam.  Untuk
interpretasi  yang  bermakna,  analisis  NGS membutuhkan  kemampuan  bio-informatika ekstensif  yang  melibatkan  kontrol  kualitas data,  penyelarasan  dan  pemetaan  ke  genom referensi  yang  baik,  penyaringan  untuk pembacaan  berkualitas  baik,  menghilangkan chimera  dan  mendukung  normalisasi  di seluruh  sampel  dan  populasi.  Teknologi NGS utama adalah sebagai berikut:
 454 pirosequencing
 Biosistem Terapan
 ilumina
 Biosains Pasifik
 Oxford Nanopori.
Dengan  alat-alat  ini,  memungkinkan bagi  para  peneliti  untuk  membuat  profil mikrobioma  dan  metagenom  yang  belum pernah terjadi sebelumnya. Hasil luaran yang tinggi  dan  fakta  bahwa  taksa  tertentu  tidak perlu  ditargetkan  adalah  kelebihan  utama teknik NGS (Yang et al , 2012)

## D. KESIMPULAN DAN SARAN
Hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwakaries  merupakan  penyakit  rongga mulut  yang infeksius dan sekaligus penyakit yang  bisa  dicegah.  Penyebab  terjadinya karies dikarenakan oleh sejumlah microbiota rongga  mulut.  Mikrobiota  rongga  mulut merupakan  hal  selalu  menarik  perhatian peneliti  untuk  digali  lebih  dalam  dan  sudah berkembang pesat. Terdapat beberapa teknik analisis  mikrobiota  rongga  mulut  seperti
teknik  kultur  dan  mikroskop,  teknik  dengan berbasis gel, metode reaksi berantai polymerase,  microarray  DNA,  16S  rRNA sequencing,  dan  teknik  sequencing  generasi berikutnya.  Saat  ini  teknik  yang  paling  baik digunakan adalah Next Generation Sequencing (NGS).

## DAFTAR PUSTAKA
Amalia  R,  Chairunisa  F,  Alfian  MF,  Supartinah
A.  (2019).  Indonesia:  Epidemiological Profiles  of  Early  Childhood  Caries.  Front
Public Health. 6,7, 210. doi: 10.3389/fpubh.2019.00210. PMID: 31448251; PMCID: PMC6691044. Balolong,  M.  P.,  &  Mendoza,  M.  A.  F.  (2020). Understanding  Oral  Diseases:  Exploring Opportunities from Filipino Oral Microbiome  Research.  In  (Ed.),  Dental Caries. IntechOpen. Berkowitz RJ, Amante A, Kopycka-
Kedzierawski  DT,  Billings  RJ,  Feng  C. (2011). Dental caries recurrence following clinical treatment for severe early childhood  caries.  Pediatr Dent,  33(7):510- 4. PMID: 22353412.
Cullen  CM,  Aneja  KK,  Beyhan  S,  Cho  CE, Woloszynek S, Convertino M, McCoy SJ, Zhang  Y,  Anderson  MZ,  Alvarez-Ponce D,  Smirnova  E,  Karstens  L,  Dorrestein PC,  Li  H,  Sen  Gupta  A,  Cheung  K, Powers  JG,  Zhao  Z,  Rosen  GL.  (2020).
Emerging Priorities for Microbiome Research. Front  Microbiol, 19;11:136. doi:  10.3389/fmicb.2020.00136.  PMID: 32140140; PMCID: PMC7042322. Do  T,  Dame-Teixeira  N,  Deng  D.  (2021). Editorial: Applications of Next Generation
Sequencing (NGS) Technologies to Decipher the Oral Microbiome in
Systemic  Health  and  Disease.  Front  Cell Infect  Microbiol,  22;11:801122.  doi: 10.3389/fcimb.2021.801122. PMID: 35004359; PMCID: PMC8727447.
Ibrahim  S,  Nishimura  M,  Matsumura  S,  Rodis O.M.M,  Nishida  A,  Kariya  N,  Yamanaka K, Shimono T. (2009). Microbial screening  of  cariostat-inoculated  plaque
samples  from  low  and  high  caries  risk (vol. 19, pp: 181-186). Dental Journal.
J. Choubey, J.K. Choudhari, B.P. Sahariah, M.K.
Verma,  A.  Banerjee.  (2021)  Chapter  25  - Molecular  Tools:  Advance  Approaches  to
Analyze Diversity of Microbial Community. (pp:507-520).  Elsevier.
Jaksik  R,  Iwanaszko  M,  Rzeszowska  Wolny  J,
Kimmel M. (2015). Microarray experiments and factors which affect their reliability. Biol Direct, doi: 10.1186/s13062-015-0077-2. PMID:
26335588; PMCID: PMC4559324.
Jian  C,  Luukkonen  P,  Yki-Järvinen  H,  Salonen A,  Korpela  K.  (2020).  Quantitative  PCR provides  a  simple  and  accessible  method for quantitative microbiota profiling. PLoS One,  doi:  10.1371/journal.pone.0227285. PMID: 31940382; PMCID: PMC6961887. Krishnan  K,  Chen  T,  Paster  BJ.  (2017).  A practical guide to the oral microbiome and its relation to health and disease. Oral Dis,
doi: 10.1111/odi.12509
Martín  R,  Miquel  S,  Langella  P,  Bermúdez- Humarán  LG.  (2014).  The  role  of metagenomics in understanding the human microbiome in health and disease. Virulence, doi: 10.4161/viru.27864.
Muhamad Rizal NS, Neoh HM, Ramli R, A/L K Periyasamy PR, Hanafiah A, Abdul Samat MN,  Tan  TL,  Wong  KK,  Nathan  S, Chieng  S,  Saw  SH,  Khor  BY.  (2020). Advantages and Limitations of 16S rRNA Next-Generation Sequencing for Pathogen Identification in the Diagnostic Microbiology  Laboratory:  Perspectives from a Middle-Income Country. Diagnostics (Basel), doi: 10.3390/diagnostics10100816. PMID:
33066371; PMCID: PMC7602188.
Rosier  BT,  De  Jager  M,  Zaura  E,  Krom  BP.
(2014).  Historical  and  contemporary hypotheses  on  the  development  of  oral diseases:  are  we  there  yet?.  Front  Cell
Infect Microbiol, doi: 10.3390/diagnostics10100816. PMID: 33066371; PMCID: PMC7602188.
Yang, F., Zeng, X., Ning, K. et al (2012). Saliva microbiomes distinguish caries-active from  healthy  human  populations. ISME  J 6, 1–10