KULTUR SEL OTAK IKAN KERAPU BEBEK ( Cromileptes altivelis ) DENGAN MENGGUNAKAN MEDIA L-15, MEM DAN TCM
CELL CULTURE BRAIN OF HUMPBACK GROUPER FISH (Chromileptes altivelis) WITH MEDIUM L-15, MEM AND TCM.
Hari Suprapto dan Nunik Diantiwi
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp. 031-5911451

## Abstract
Humpback grouper is high value commodity fish. The demand of domestic and foreign markets increases  every  year.  The  obstacles  of  Humpback  grouper  fish  cultivation  is  a  disease  caused  by  Viral Nervous  Necrosis (VNN).  The  virus  attacks  the  brain  leading  to  mass  death.  To  prevent  the  disease,  a research on VNN virus has to be started. The problem of the research is the lack of culture of fish tissue. Virus have specific location to tissue cell and species to be infected. Thereofore, first step must be done is growth  from  tissue  cell  which  infection  of  virus.  Cell  culture  is  a  technique  to  isolate  cell,  protoplasm, tissue or organ to be grown  in a  sterile condition with  nutrition  containing growth hormone to promote multiplication. Cell culture technique can be used in many basic applications in cell biology. The purpose of this research is to develop cell culture from Grouper fish brain for VNN research. The hope is culture can  grow  and  develop  well.Research  executed  at  June  until  Desember  2009  in  Laboratory  In  Vitro  of Veterinari  Faculty of  Airlangga University  and Laboratory Gastroenteritis Institute of Tropical Disease, Airlangga University, Surabaya. The result showed that brain cell culture of  humpback grouper fish can be grow and multiply well in all three media, media L-15 cell growth was faster compared to media MEM and TCM.
Keywords : Humpback grouper fish, VNN, Cell culture, Medium L-15, MEM, TCM

## Pendahuluan
Kerapu  bebek  merupakan  komoditas unggulan yang memiliki nilai ekonomis penting sebagai  komoditas  ekspor.  Harga  ditingkat pembudidaya  antara  Rp.  250.000  hingga  Rp. 350.000 per kg. Permintaan pasar terhadap ikan ini  sangat  tinggi  baik  di  dalam  maupun  luar negeri (Sutarmat dan Adi, 2005).
Budidaya  ikan  kerapu  bebek  sudah mulai  berkembang  sejak  tahun  1998.  Kendala yang terdapat pada budidaya ikan kerapu adalah penyakit. Penyakit utama yang sering menyerang  ikan  kerapu  adalah Viral  Nervous Necrosis (VNN)  yang  disebabkan  oleh  noda virus  (Sugama,  2003). VNN  adalah  penyakit yang sangat berbahaya karena dapat menimbulkan kematian yang tinggi pada kerapu terutama  pada  stadia  larva  dan  juvenil (Koesharyani et al. , 2005). Penyakit yang disebabkan oleh
nodavirus  ini  menyerang  sistem  syaraf  pusat dimana  biasanya  menyebabkan  nekrosis  pada sel  (Munday and Nakai,  1997).  Ikan  yang terinfeksi  telah  diperkirakan  19  spesies  dalam 10    famili  ikan  (Munday and Nakai,  1997). Laporan  terakhir  oleh  Munday et  al .,  (2002) menyatakan  lebih  dari  32  spesies  ikan  dari  16
famili  yang  telah  terinfeksi.    Di  Indonesia, infeksi  VNN  dilaporkan  pertama  kali  pada barramundi ( Lates carcarifer) di panti pembenihan  di  Jawa  Timur  pada  tahun  1997 kemudian  pada  tahun  1998  menyebar  ke  Bali dan  menyebabkan  terjadinya  kematian    massal (Zafran et al ., 1998).
Berdasarkan terjadinya kematian massal  pada  kerapu  bebek  akibat  serangan virus,  maka  diadakan  kegiatan  penelitian tentang  virus  VNN.  Virus  mempunyai  sifat spesifik  terhadap  sel  jaringan  dan  spesies tertentu.  Oleh  karena  itu,  untuk  memulai penelitian  tentang  virus  yang  pertama  yang harus  dilakukan  adalah  menumbuhkan  atau mengkultur  sel  dari  jaringan  yang  terinfeksi. Kelemahan  dari  penelitian  tentang  virus  adalah karena  kurangnya  penelitian  tentang  kultur  sel dari  jaringan  ikan  (Roza,  2006).  Kultur  sel adalah  suatu  teknik  untuk  mengisolasi  sel, protoplasma, jaringan atau organ dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi yang mengandung  zat  pengatur  tumbuh  sel  pada kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat  memperbanyak  diri  dan  beregenerasi (Firman, 2009).
Teknologi  kultur  sel  dapat  digunakan untuk  bermacam-macam  aplikasi  dasar  biologi sel  (Phelan,  1998).  Menurut  Muhajir  dkk., (2007) sel yang dikultur sebenarnya dapat dibeli dari luar negeri tetapi dengan harga yang sangat mahal  dan  setiap  minggu  harus  dilakukan  sub kultur.  Di  Indonesia  kultur  sel  sendiri  masih sulit  dicari.  Diharapkan  dengan  keberhasilan pembuatan  kultur  sel  nantinya  akan  menjadi dasar  untuk  penelitian  kerapu  lainnya  misalnya mengetahui  pola  penularan  virus,  penyebaran virus,  inang  yang  terinfeksi,  daya  tahan  tubuh kerapu  di  alam  serta  pengembangan  ke  arah pencegahan penyakit terutama  yang disebabkan oleh virus.

## Metodologi
Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan Juni sampai Desember 2009  di Laboratorium In Vitro Fakultas  Kedokteran  Hewan  Universitas Airlangga  dan  Laboratorium  Gastroenteritis  di Institute  of  Tropical  Disease ,  Universitas Airlangga,  Surabaya.  Alat-alat  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  adalah petri  disk ,  gelas ukur,  botol  250  ml, aluminium  foil ,  gunting, pinset,  mikroskop,  kamera,  pipet,  timbangan, LAF  ( Laminar  Air  Flow )  dan  inkubator    CO 2. Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah  ikan  kerapu  bebek  yang  diambil bagian otaknya, alkohol,  media  L-15 ( Leibovitz 15), media  MEM ( Minimum Essential Medium ) dan  media  TCM  ( Tissue  Culture  Medium ), Penisillin  G,  Streptomycin, NaHCO 3, FBS ( Fetal  Bovin  Serum ),  DW 2 ( Diinonzed  water ) dan trypanblue . Metode yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  metode  deskriptif,  yaitu metode yang mendeskripsikan
dan menggambarkan  suatu  keadaan,  mengenai  apa dan  bagaimana,  berapa  banyak,  sejauh  mana variabel yang diteliti (menjelaskan dan menerangkan  peristiwa)  serta  penyajian  fakta secara  sistemik  agar  mudah  untuk  disimpulkan (Nazir, 1983).
Prosedur  kerja  yang  harus  dilakukan dalam  membuat  kultur  sel  otak  ikan  kerapu bebek adalah :
1. Mempersiapkan  alat  dan  bahan  yang  akan digunakan dalam penelitian. Semua peralatan  dan  bahan  yang  akan  digunakan dalam  penelitian  harus  disterilkan  terlebih dahulu  dengan  tujuan  menghilangkan  dan membebaskan  semua  alat  dan  bahan  dari gangguan organisme mikroba seperti virus, bakteri,  spora  dan  fungi.  Sterilisasi  alat- alat  yang  tahan  terhadap  panas  gelas seperti  pipet, petri  disk ,  botol  dan  gelas ukur dapat dilakukan dengan metode panas
basah  yaitu  memanaskan  alat  ke  dalam autoclave pada  suhu  121 o C  selama  15 menit.  Sterilisasi  untuk  media  kultur dilakukan  secara  mekanik  yaitu  dengan menggunakan filter (penyaring)  bakteri dengan  pori  2  µm  untuk  memisahkan bakteri . Penyaringan dilakukan menggunakan filter miliphore dengan bantuan syringe injeksi .
2. Pembuatan media kultur. Cara  pembuatan  media  kultur  sel  dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Bahan yang dibutuhkan dalam pembuatan kultur sel otak Bahan Media kultur L-15 MEM TCM Sebanyak DW 2 penicillin G ; streptomycin NaHCO 3 FBS 4,7 g 200 ml 0,007 g 0,007 g 1,1 g 0,06 g 4,7 g 200 ml 0,007 g 0,007 g 1,1 g 0,06 g 4,7 g 200 ml 0,007 g 0,007 g 1,1 g 0,06 g
Timbang  semua  bahan  pada  Tabel  1.  lalu bahan  tersebut  dimasukkan  kedalam  botol 250  ml  kemudian  kocok  hingga  seluruh bahan  tercampur.  Setelah  itu  media disterilkan  dengan  filter miliphore ukuran 0,2 µ m.
3. Penyiapan sel otak ikan kerapu. Ikan  kerapu  bebek  yang  akan  diambil
otaknya disiapkan dan dibersihkan. Bagian kepala  dipotong  terlebih  dahulu  untuk mempermudah pengambilan
otak.
Kemudian  dengan  menggunakan  bantuan gunting  dan  pinset  yang  telah  disterilkan, gunting  di  bagian  mulut  ke  arah  atas kepala  sampai  terlihat  bagian  otak  lalu dengan  menggunakan  pinset  ambil  otak tersebut.
Siapkan 3 petri disk , dibagian bawah petri disk diberi  label  atau  keterangan  masing- masing  media  (L-15,  MEM  dan  TCM). Media yang sudah disiapkan dimasukkan ± 3  ml  kedalam petri  disk tersebut  sesuai nama pada label atau keterangan medianya.  Kemudian  otak  yang  telah diambil  dipotong  menjadi    ±  1  gram kemudian  masukan  ke  dalam petri  disk yang  telah  berisi  media  L-15,  MEM  dan TCM.
4. Kultur sel otak ikan kerapu. Otak  dalam  petri  disk  dipotong  atau digunting  menjadi  bagian  yang  lebih kecil dan  seluruh  sel  terendam  pada  media,
kemudian disimpan dalam inkubator   CO 2 5%  dengan  suhu  30 o C  selama  24  jam. Setelah  24  jam  sel  diamati  dengan menggunakan  mikroskop  cahaya  dan pengamatan  dilakukan  setiap  24  jam sekali. Pada hari ke-7 atau setelah 168 jam pertumbuhan  sel  sangat  padat  sehingga harus dilakukan subkultur.
5. Pengamatan  pertumbuhan  sel  otak  ikan kerapu.
Pengamatan  terhadap  sel  otak  dilakukan setiap  hari  menggunakan    mikroskop cahaya  dengan  pembesaran  400  kali. Pengamatan  dilakukan  di  dalam  LAF ( Laminar  Air  Flow )  untuk  mengurangi resiko kontaminasi.
6. Subkultur. Subkultur  dilakukan  untuk  mendapatkan sel  baru  dari  pembiakan  sel.  Subkultur adalah menumbuhkan sel pada media lama ke media yang baru dilakukan dengan cara mengambil  dengan  menggunakan  pipet  (± 5  ml)  media  yang  lama  dan  memasukkan kedalam  media  baru.  Subkultur  dilakukan setiap  168  jam  atau  setiap  satu  minggu sekali  selama  5  minggu,  dimaksudkan untuk  mengetahui  apakah  sel  masih  dapat tumbuh  dengan  baik  meskipun  telah dilakukan subkultur berulang kali.

## Pembahasan
Hasil penelitian kultur sel mengunakan medium  yang  berbeda  terhadap    pertumbuhan sel  otak  ikan  kerapu  bebek,  didapatkan  bahwa medium    L-15  ( Leibovitz  15 ),  MEM ( Minimum Essenssial  Medium )  dan  TCM  ( Tissue  Cultur Medium )  memberikan    pertumbuhan  sel  yang berbeda.  Adapapun  hasil  selengkapnya  dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2.  Hasil Pertumbuhan kultur sel otak ikan kerapu pada media yang berbeda Media Hari ke- L- 15 MEM TCM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 + ++ ++ +++ +++ +++ Subkultur 1 + ++ ++ +++ +++ +++
Subkultur
2 + ++ ++ +++ +++ +++
Subkultur
3 + ++ ++ +++ +++ +++ Subkultur 4 + ++ +++ +++ +++
+ + ++ ++ +++ +++ Subkultur 1 + + ++ ++ +++ +++ Subkultur 2 + + ++ ++ +++ +++ Subkultur 3 + + ++ ++ +++ +++ Subkultur 4 + ++ ++ +++ +++
+ + ++ ++ +++ +++
Subkultur 1
+ + ++ ++
+++ +++ Subkultur 2 + + ++ ++
+++ +++ Subkultur 3 + + ++ ++
+++ +++ Subkultur 4 + ++ ++ +++ +++ 34 35 36 37 38 39 40 41 +++ Subkultur 5 + ++ +++ +++ +++ +++ +++ Subkultur 5 + ++ ++ +++ +++ +++ +++ Subkultur 5 + ++ ++ +++ +++ +++
Keterangan :
+ = Awal perkembangan sel ++ =   Lebih banyak sel
+++  =   Kepadatan sel yang tinggi
Dari Tabel 1. didapat bahwa pertumbuhan  sel  otak  ikan  kerapu  dengan menggunakan  media  L-15  lebih  cepat  daripada media MEM dan TCM.
Pertumbuhan  sel  adalah  suatu  proses pembelahan  sel  dimana  setelah  satu  sel membelah  menjadi  dua  maka  masing-masing sel  akan  mengalami pertumbuhan sel kemudian menjadi  dewasa  serta  siap  untuk  mengadakan pembelahan  kembali  (Juwono,  2000).  Sel ditumbuhkan kedalam media yang mengandung nutrisi yang  sesuai  untuk  tumbuh  dan perkembangan  sel.  Yang  harus  dikontrol  dan diperhatikan  selama  pertumbuhan  sel  meliputi nutrisi,  suhu  dan  pH.  Penggantian  media  atau subkultur  dilakukan  untuk  mencegah  terjadinya kerusakan  atau  kematian  sel  akibat  kekurangan nutrisi.  Suhu  optimum  untuk  pertumbuhan  sel otak  kerapu  secara in  vitro adalah  25 o C  -  30 o C (www.baphiq.gov.tw,  2009).  Pertumbuhan  sel yang  baik  terjadi  pada  pH  7,0  –  7,4  (Rahma, 2007).  Penambahan  NaHCO 3 berfungsi  untuk membuat/mengatur  pH  menjadi  7  dan  hasilnya adalah terbentuk larutan media berwarna merah yang menunjukkan pH 7,4.
Faktor  utama  yang  mempengaruhi pertumbuhan  sel  adalah  media  kultur  (Phelan, 1998).  Media  merupakan  tempat  hidup  dari  sel yang  dikultur  oleh  karena  itu  komposisi  media ikut  mempengaruhi  pertumbuhan  sel.  Media yang  dibutuhkan  dalam  kultur  pada  umumnya membutuhkan  komposisi  yang  sesuai  untuk  sel tertentu.  Komposisi  bahan  tersebut  antara  lain asam  amino,  vitamin,  garam-garaman,  glukosa, hormon  dan growth  factor ,  antibiotik  serta serum.  Asam  amino  merupakan  bahan  yang sangat  penting  untuk  pertumbuhan  sel  pada media tumbuh terutama untuk pertumbuhan sel. Vitamin    sangat  diperlukan  untuk  membantu asam  amino  dalam  pertumbuhan  sel  maupun untuk  membantu  metabolisme  energi  sel. Garam-garaman  untuk  menunjang  osmolaritas media  yaitu  untuk  menjaga  kestabilan  dinding sel  yang  sedang  tumbuh,  dan  mempengaruhi adhesi  sel  untuk  membentuk  agregasi  sel  atau jaringan,  serta  mempengaruhi  pH  untuk viabilitas  sel.  Hormon  dan growth  factor digunakan  untuk  membantu  meningkatkan pertumbuhan  sel  yang  dikultur.  Penambahan antibiotik  kedalam  media  bertujuan  untuk menghasilkan media yang bebas dari kontaminan.  Antibiotik  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah Penisillin G dan Streptomycin. Penisillin G merupakan antibiotik golongan betalaktam yang  dapat  menghambat pertumbuhan  bakteri  gram  positif,  sedangkan streptomisin dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri  gram  negatif  (Yati  dan  Vincent,  2007).
Serum merupakan  pendukung  penyediaan nutrisi  dan  hormon  untuk  pertumbuhan  sel. Serum  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah  FBS  ( Fetal  Bovin  Serum ) . Menurut Florence et  al. (1992)  FBS  merupakan  serum yang  paling  baik  untuk  digunakan  untuk pertumbuhan  sel.  Langkah  pertama  yang  harus dilakukan  pada  pembuatan  media  adalah menyemprotkan tangan, meja kerja dan peralatan  dengan  alkohol  70%.  Bahan-bahan ditimbang dengan neraca analitik untuk memperoleh  komposisi  dan  ukuran  bahan  yang tepat.  Air  yang  digunakan  untuk  melarutkan bahan  adalah  DW  ( Diionized  water )  yaitu  air yang  dimurnikan  dengan  melewati  berbagai macam  proses  untuk  menghilangkan  kotoran dan  ion,  sehingga  dapat  menghasilkan  bahan terlarut yang steril.
Pertumbuhan  sel  pada  ketiga  media yaitu  media  L-15,  MEM  dan  TCM  mengalami perbedaan  pertumbuhan  karena  setiap  media mempunyai  kandungan  yang  berbeda.  Hasil yang  didapat  setelah  dilakukan  kultur  sel  otak ikan kerapu bebek adalah pertumbuhan sel yang dikultur  pada  media  L-15  lebih  cepat  tumbuh dibandingkan  dengan  sel  yang  dikultur  dengan media  MEM  dan  TCM.    Dapat  dilihat  pada Gambar  4.  bahwa  pada  media  L-15  di  hari pertama  kultur,  sel  tumbuh  lebih  banyak dibandingkan  dengan  media  MEM  dan  TCM. Pada hari ketiga pertumbuhan sel di media L-15 sudah memenuhi sepertiga luas petri, sedangkan pada media MEM dan TCM sel baru memenuhi sepertiga petri pada hari keempat. Pertumbuhan sel di  hari keempat pada media L-15, sel  sudah memenuhi  seluruh  bagian  petri  dan  pada  hari kelima  media  mulai  terlihat  keruh,  hal  tersebut disebabkan  oleh  pertumbuhan  sel  yang  sangat padat  sehingga  sudah  tidak  ada  lagi  tempat  sel untuk  tumbuh  sehingga  sel  saling  menumpuk antara  yang  satu  dengan  yang  lain,  sedangkan pada media MEM dan TCM sel baru memenuhi seluruh petri pada  hari kelima dan  media  mulai keruh baru terlihat pada hari keenam.
Media  L-15  memberikan  pertumbuhan yang  lebih  cepat  dibandingkan  dengan  media lainnya  karena  komposisi  yang  terkandung dalam  media  L-15  sesuai  dengan  komposisi yang  dibutuhkan  oleh  sel  otak  ikan  kerapu bebek.  Komposisi  pada  media  L-15  selain mengandung  asam  amino,  vitamin,  garam- garaman,  L-15  juga  menggandung  Glukosa, arginin,  cistin,  histidin,  dan  tirosin  dalam konsentrasi  tinggi  (Florence et  al, 1992). Komposisi  media  L-15  dapat  dilihat  pada Lampiran 1. Tirosin, arginin, cistin dan  histidin merupakan  asam  amino  yang  sangat  penting untuk  pembentukan  protein.  Protein  berperan
dalam perbaikan jaringan dan pemeliharaan sel, juga sebagai penyusun hormone, enzim, dan  zat antibodi  untuk  menunjang  pertumbuhan    dan perkembangan sel. Media MEM dan TCM juga mengandung  asam  amino  seperti  asam  amino yang  terkandung  pada  media  L-15  namun kurang optimal untuk pertumbuhan sel otak ikan kerapu  kerena  pada  pertumbuhan  sel  otak memerlukan  kandungan  asam  amino  yang lengkap  dengan  konsentrasi  tinggi  seperti sebagaimana yang terkandung pada media L-15. Komposisi media MEM dan TCM dapat dilihat pada Lampiran 2 dan 3.
Sel dapat tumbuh dan berkembang dari nutrisi  yang  tersedia  pada  masing-masing media, oleh karena itu setelah sel terlihat penuh maka  perlu  dilakukan  subkultur  agar  sel  tidak mati  akibat  kekurangan  nutrisi.  Subkultur dilakukan  dengan  cara  mengambil  sebagian kultur  sel  pada  media  yang  lama  dan memindahkannya  kedalam  media  yang  baru. Tujuan  dilakukan  subkultur  adalah  untuk mempertahankan  sel  agar  tetap  hidup  dan berkembang.  Subkultur  dilakukan  sebanyak lima  kali  setiap  satu  minggu  atau  tujuh  hari sekali. Sel otak yang di subkultur di media L-15 mengalami pertumbuhan yang lebih cepat, dapat dilihat  pada  Tabel  2.  pada  hari  kedua  pada media  L-15  sudah  lebih  banyak  sel  yang tumbuh sedangkan pada media MEM dan TCM sel  baru terlihat tumbuh  lebih  banyak pada  hari ketiga, dan di hari keempat pada media L-15 sel sudah  tumbuh  dengan  padat  sedangkan  pada media  MEM  dan  TCM  sel  baru  tumbuh  padat pada  hari  kelima.  Hasil  yang  didapat  setelah subkultur adalah sel  Kultur sel otak tetap dapat hidup dan  berkembang  biak pada ketiga  media, namun pertumbuhan kultur sel otak yang paling cepat  tetap  terjadi  pada  media  L-15  kemudian MEM dan TCM.
Kontaminasi  yang sering terjadi dalam kultur  sel  biasanya  disebabkan  oleh  virus, bakteri dan jamur. Ciri-ciri terjadinya kontaminasi  dapat  ditandai  dengan  terjadinya perubahan  pH  yang  diikuti  dengan  perubahan warna  pada  media,  dan  jika  dilihat  dengan mikroskop  pada  perbesaran  400  kali  bentuk  sel terlihat  cocus  dan  basil.  pH  optimum  pada media kultur bekisar antara 7,0 - 7,4 hal tersebut diikuti dengan terbentuknya larutan media yang berwarna  merah.  Namun,  pada  penelitian  yang telah  dilakukan  tidak  ditemukan  adanya kontaminasi.  Cara  yang  dilakukan  untuk mencegah terjadinya kontaminasi adalah dengan melakukan  serangkaian  proses  kultur  dengan cara  aseptik  seperti  mensterilkan  seluruh  alat dan bahan yang akan digunakan, menyemprotkan  tangan  dan  meja  dengan
alkohol sebelum dan sesudah bekerja dilaboratorium  dan  melakukan  pengamatan  sel didalam LAF ( Laminar Air Flow ).

## Kesimpulan
Sel  otak  ikan  kerapu  dapat  tumbuh  di media  L-15,  MEM  dan  TCM.  Pertumbuhan kultur  sel  otak  yang  paling  cepat  di  dapat  pada media L-15 dan pada hari keenam pertumbuhan sel di ketiga media sudah sangat padat.
Ketiga  media  bisa  digunakan  untuk  kultur  sel otak ikan kerapu namun bila ingin mendapatkan hasil  pertumbuhan  sel  yang  lebih  cepat  dapat menggunakan media L-15. Apabila media sudah terlihat memenuhi  petri  perlu  dilakukan subkultur  untuk  mencegah  terjadinya  kematian sel  karena  kekurangan  nutrisi.  Untuk  menjaga agar  sel  otak  ikan  kerapu  dapat  bertahan  hidup dalam  waktu  yang  lama  tanpa  harus  dilakukan subkultur  setiap  minggu  maka  perlu  dilakukan penelitian  lanjutan  mengenai  penyimpanan kultur sel.

## Daftar Pustaka
Alisianti,  T.,  B.  Slamet,  dan  G.  S.  Prasetya. 2004.  Aplikasi  Budidaya  Kerpu  Bebek,
Cromileptes  altivelis  di  Teluk  Ekas Kabupaten Lombok Timur. http:// www.ntb.litbang.deptan.go.id. 15/Agustus/2009. 5 hal Firman. 2009. Kultur Jaringan. http : //gurungeblog.wordpress.com. 14 September 2009. 2 hal.
Florence,  G.  B.,  T.  M.  Ghambers,  and  D.  L.
Wiedhrauk.  1992.  Virologi  a  laboratory
Manual.  Harcourt  Brace  Jovanovich, publisher.  San  diego,  New  York,  Boston, London, Sidney, Tokyo, Toronto. 15 pp.
Juwono  dan  A.  Z.  Juniarto.  2000.  Biologi  sel.
Penerbit  Buku  Kedokteran  EGC.  Jakarta.
1- 30 hal.
Koesharyani,  I.,  D.  Roza,  K.  Mahardika,  F.
Johnny,  Zafran  and  K.  Yuasa.  2005. Manual  for  Fish  Diseases  Diagnosis  II. Marine  Fish  and  Crustacean  Diseases  in Indonesia.  Gondol  Research  Institute  for
Mariculture and Japan International Cooperation Agency. p. 5-15
Kompas.  2008.  Pasar  perikanan  Indonesia  di Amerika Serikat  meningkat. www.kompas .com. 16/Desember/2009. 2 hal.
Muhajir,  Kusyairi,  dan  Sumaryam.  2007.
Pembuatan Kultur Sel Kerapu Cromileptes altivelis  untuk  Replikasi  Viral  Nervous Necrosis  (VNN)  dan  Virus  lain  Serta Penyimpangan dan Cryopreservasi. http://lppm.unitomo.ac.id. 12/Agustus/2009. 48 hal.
Munday,  B.  L  and  Nakai.  1997.  Special  Topic Review  :  Nodavirus  as  Pathogen  in  Larva and  Juvenil  Marine  Finfish.  World  Jurnal Microbiology and Biotechnology 13 : 375- 381.
Munday, B. L., J. S. Langdon, A. Hyatt and D.
Humprey.  2002.  Mass  morality  associated with a Viral-induced vacuolating encepalotathy and retinopathy of larva and juvenile  barramundi,  Lates  Carcarifer Bloch. Aquaqulture 103 : 197-211.
Nazir,  R.  1988.  Metode  Penelitian.  Ghalia Indonesia. Jakarta.
Phelan,  C.  M.  1998.  Basic  Technique  for Mammalian  Cell  Tissue  Culture.  Current Protocols in Cell Biology 1.1.1-1.1.10.
Rahma.  2007.  Kultur  sel  dan  pertumbuhan virus.  http  :  //  rahma02.wordpress.com. 3/Agustus/2009. 3 hal.
Roza,  D.,  F.  Johnny  dan  Tridjoko.  2006. Peningkatan  Respon  Imun  Non  Spesifik Benih Kerapu Bebek ( Cromileptes altivelis )  dengan  Imunostimulan  dan Bakterin  Terhadap  Infeksi  Viral  Nervous Necrosis (VNN). Jurnal Perikanan Fakultas  Pertanian  Universitas  Gajah
Mada. Yogyakarta. 15 hal.
Sugama,  K.  2003.  Manual  for  humpback grouper  culture  ( Cromileptes  altivelis )  in floating  net  cages.  Gondol  Research Institute  for  mariculture  and  Japan International Cooperation Agency. P. 1-3. Sutarmat, T., dan A. Hanafi. 2005. Pembesaran Ikan Kerapu Bebek dalam Keramba Jaring Apung  di  Teluk  Pegametan  Kecamatan Gerokgak,  Bali. Prosiding Seminar  Riptek Kelautan Nasional : 213-217.
Trubus. 2007. Pembesaran Kerapu Bebek. http : //trubus-online.co.id.  8/Agustus/2009.    16 hal.
Zafran, D. Roza, I. Koesharyani, F. Johnny and K. Yuasa. 1998. Manual for Fish Diseases Diagnosis.  Marine  Fish  and  Crustacean Diseases  in  Indonesia.  Gondol  Research Institute  for  Coastal  Fisheries  and  Japan International  Cooperation  Agency.    P.  17- 18.