PEMURNIAN PROTEASE DARI BUAH DAN DAUN MENGKUDU ( Morinda citrifolia L.)
[Purification of Proteases from Fruits and Leaves of Noni ( Morinda citrifolia L.)]
Dwi Ishartani 1,2) * , Elfi 2) , Nuri Andarwulan 2,3) , dan Dahrul Syah 2,3)
1) Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanan, Institut Pertanian Bogor
3) Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center, IPB
Diterima 15 Maret 2011 / Disetujui 24 Agustus 2011

## ABSTRACT
Proteases  have  been  widely  used  in  cancer  treatment,  wounds  healing,  overcoming  digestion  disorder  and  other  modern  pharmaceutical applications . Proteases  may  be  present  in  fruits  and  leaves  of  noni  ( Morinda  citrifolia  L. )  since  the  plant  has  been  used  traditionally  in  wound healing. This research aimed to purify proteases from noni’s fruits and leaves at two maturity stages, i.e. fruits with green-yellow (TK2) and white- yellow (TK4) skin colour, also leaves from shoot and base. Proteases  were purified through several steps  consisting of extraction, precipitation using  saturated  ammonium  sulfate  and  dialysis  followed  by  electrophoresis  under  denaturing  conditions  (SDS-PAGE)  and  zymography.  The specific activity of the four extracts showed different trend during purification. The specific activity of TK2 fruit, shoot and base leaves decreased whereas  TK4  fruits  increased . TK2  crude  extract  had  a  higher  specific  activity  (3.79  U/mg)  than  the  other  crude  extracts.  SDS-PAGE  and zymogram using 12% acrylamide indicated that the dialysates were not pure proteases. The molecular weight profiles of the TK2 dialysates were similar to TK4 dialysates, while those of shoot leaves dialysates were similar to the base leaves dialysates. The SDS-PAGE separated the enzymes in the fruit dialysates into several bands of polypeptides,i.e. 24-26kDa, 14-15kDa, 12-13kDa and the smaller ones, and also separated the enzymes in the dialysates of leaves into two bands, 70kDa and 58-61.5kDa. Protease bands detected in the zymogram of fruits were estimated at ~25kDa, ~27kDa, and 37-38kDa, whereas of those of leaves were estimated at ~29kDa and ~50kDa. The ~25kDa and ~29kDa protein bands appearing in zymogram were similar to papain’s and bromelain’s molecular weight.
Keywords : purification, proteases, Morinda citrifolia L., fruits, leaves

## 1 PENDAHULUAN
Mengkudu  ( Morinda  citrifolia L.)  yang  termasuk Rubiaceae sangat  populer  di  kawasan  Asia  Tenggara,  Kepulauan  Pasifik dan  Karibia,  termasuk  salah  satunya  Indonesia.  Produksi mengkudu di Indonesia terus mengalami peningkatan dari tahun ke  tahun.  Departemen  Pertanian  Republik  Indonesia  (2008) melalui website nya  menunjukkan  bahwa  peningkatan  produksi mengkudu  sangat  pesat,  yaitu  dari  1910  ton  pada  tahun  2003 menjadi 14016 ton pada tahun 2007.
Penggunaan buah mengkudu secara tradisional antara lain untuk obat sariawan, cacing, luka, abses, infeksi mulut dan gusi, sakit gigi, memar, rematik, sakit perut, hipertensi, dan makanan darurat  saat  kelaparan  (Nelson,  2006).  Pengalaman  empiris peternak  itik  di  Brebes  menunjukkan  daun  mengkudu  segar mampu meningkatkan kekebalan ternak itik terhadap flu burung (Setiawan,  2007),  sedangkan  di  Tonga  daun  mengkudu digunakan untuk mengobati luka serta melunakkan daging dan gurita (Walter et al ., 2002).
Manfaat  mengkudu  sejauh  ini  belum  dikaitkan  dengan kandungan enzim di dalamnya. Penggunaan mengkudu secara tradisional sebagai obat luka besar kemungkinan salah satunya disebabkan  karena  adanya  aktivitas  protease  pada  buah tersebut. Sinclair dan Ryan (2007) menjelaskan bahwa protease secara  khusus  berperan  dalam  pengaturan  pendewasaan  sel,
* Korespondensi Penulis : Email : dishtani@yahoo.com
perbanyakan  sel,  serta  sintesis  dan  pergantian  kolagen  dalam proses penyembuhan luka pada kulit.
Freedonia  Group  Inc.  (Anonim a ,  2010)  memprediksi  pasar enzim  di  dunia  akan  terus  meningkat,  yaitu  pada  tahun  2013 diperkirakan  mencapai  US$  7  milyar,  dengan  peningkatan permintaan 6,3% per tahun. Illanes (2008) menyebutkan bahwa enzim  dari  tumbuhan,  misalnya  papain  dan  bromelain,  masih relevan digunakan sebagi sumber enzim komersial. Enzim dari tumbuhan  pada  tahun  2008  menempati  5%  dari  total market share enzim .
Penggunaan  buah  dan  daun  mengkudu  sebagai  obat  luka dan  pengempuk  daging  diduga  berkaitan  dengan  aktivitas protease.  Tingginya  potensi  perdagangan  enzim  protease mendorong  dilakukannya  eksplorasi  protease  dari  buah  dan daun  mengkudu.  Pengaruh  umur  buah  dan  daun  terhadap aktivitas protease diamati menggunakan buah dan daun dengan dua  tingkat  ketuaan  berbeda.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengkarakterisasi  sifat  fisik  dan  kimia,  memurnikan  protease, serta menentukan bobot molekul protease dari buah dan daun mengkudu pada dua tingkat ketuaan yang berbeda.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah buah dan daun  mengkudu  ( Morinda  citrifolia L.)  dengan  dua  tingkat ketuaan  berbeda  yang  diperoleh  dari  kebun  IPB  Darmaga.
Tanaman mengkudu yang digunakan dikultivasikan mengguna- kan biji sejak tahun 2000 dan telah diidentifikasi oleh ahli botani dari  Pusat  Penelitian  Biologi  LIPI  (data  tidak  ditampilkan). Bahan  kimia  yang  digunakan  adalah  Na  asetat,  asam  asetat, EDTA,  gliserol,  Polivinilpirolidon  (PVP  K30),  β-mercaptoetanol, silika  gel  60  H,  ammonium  sulfat, protein  marker BM  rendah (Fermentas  SM-0431),  BSA,  kasein  Hammerstein, Coomassie Brilliant  Blue R-250  dan  G-250,  serta  Ag  nitrat.  Semua  bahan kimia yang digunakan mempunyai kualifikasi pro analisis.
Peralatan yang digunakan adalah stick blender Aletta A746, sentrifuse  Hermle  Z383K,  kantong  dialisis  Sigma  D9652, spektrofotometer  UV-Vis  Shimadzu  seri  UV-2450,  seperangkat alat elektroforesis gel Biorad Mini Protean 3 sel, Gel Doc/Chemi Biorad, dan alat-alat gelas.

## Karakterisasi buah dan daun mengkudu
Karakterisasi  sifat  kimia  dilakukan  melalui  analisis proksimat, yaitu meliputi kadar air (AOAC 931.04, 1999), kadar abu (AOAC 940.26, 1999), kadar protein mikro-Kjeldahl (AOAC 960.52,  1999),  kadar  lipid  (AOAC  963.15,  1999),  dan  kadar karbohidrat  ( by  difference ).  Karakterisasi  sifat  fisik  dilakukan melalui  pengamatan  visual,  meliputi  warna  kulit,  tekstur,  dan pencoklatan enzimatis, dan pembentukan bau menyengat pada suhu ruang (khusus buah).

## Pemurnian protease
Proses pemurnian enzim dilakukan pada suhu 4-6°C. Kerja ekstraksi  sampai  dengan  pengendapan  dilakukan  secara sinambung  dalam  satu  hari  untuk  meminimalkan  efek denaturasi enzim.
Pemurnian enzim dimulai dengan proses ekstraksi menurut Uchikoba et  al .  (2001)  yang  dimodifikasi  untuk  buah  serta menurut Piero, Petrone (1999) dan Thomas et al . (2009) yang dimodifikasi  untuk  daun.  Daging  buah  dan  daun  dipotong- potong  kemudian  ditambah  dengan  buffer  asetat  pH  5,0 bersuhu  4°C  (buah:buffer  asetat  =  1:5)  yang  mengandung  5 mM  EDTA,  10%  gliserol,  3%  (buah)  dan  10%  (daun) polivinilpirolidon  (PVP  K30),  serta  14  mM β-merkaptoetanol . Campuran  tersebut  kemudian  diblender  dengan  kecepatan tinggi  selama  4  x  15  detik,  dan  selanjutnya  disaring menggunakan  dua  lapis  kain  saring  dan  disentrifus  3775xg (5900rpm) selama 30 menit sehingga dihasilkan ekstrak enzim kasar. Khusus sampel daun, ekstrak enzim kasar yang didapat ditambah  dengan  silika  1,4%  dan  divorteks  selama  5  menit kemudian disentrifus pada 3775xg (5900rpm) selama 15 menit. Supernatan  yang  dihasilkan  adalah  ekstrak  hasil  penambahan silika (ekstrak silika).
Protein  pada  ekstrak  enzim  kasar  buah  dan  ekstrak  silika daun selanjutnya diendapkan menggunakan garam ammonium sulfat 100% jenuh (Bollag dan Edelstein, 1991). Endapan enzim yang didapat selanjutnya dilarutkan kembali dalam jumlah yang minimal  menggunakan  buffer  asetat  pH  5,0  dan  didialisis sehingga  diperoleh  endapan  enzim  bebas  garam.  Dialisis (Bollag  dan  Edelstein,  1991)  dilakukan  dengan  menggunakan membran selulosa Sigma seri D9652 (cut off 12kDa). Sebelum dilakukan  dialisis,  kantong  selulosa  terlebih  dahulu  dipreparasi sesuai  dengan  rekomendasi  produsen.  Dialisis  dilakukan selama  5  jam  pada  suhu  6°C  dan  setiap  satu  jam  buffernya
diganti. Dialisat yang diperoleh adalah enzim yang telah bebas garam.

## Penentuan bobot molekul protease
Enzim bebas garam dianalisis menggunakan elektroforesis, yaitu  dengan  teknik  SDS-PAGE  (Bollag  dan  Edelstein,  1991) dan  zimografi  (Copeland,  2000).  Elektroforesis  dilakukan dengan  menggunakan  gel  pemisah  12%  akrilamid  dan  gel penahan 5% pada tegangan konstan 70V. Khusus gel pemisah zimografi, gel akrilamid dikopolimerisasi dengan kasein sebagai substrat  protease. Protein  marker berbobot  molekul  rendah digunakan  sebagai  penanda,  yang  terdiri  dari  β-galaktosidase (116kDa), bovine serum albumin (66,2kDa), ovalbumin (45kDa), laktat  dehidrogenase  (35kDa),  REase  Bsp98I  (25kDa),  β- laktoglobulin (18,4kDa), dan lisosim (14,4kDa). Hasil pemetaan Rf protein penanda (marker) pada sumbu x dan log BM protein penanda pada sumbu y menghasilkan nilai R² sebesar 0,9727 dengan persamaan regresi y = -1,1502 x + 2,0701 untuk SDS- PAGE  dialisat  buah, R² sebesar  0,972  dengan  persamaan regresi y = -1,558 x + 2,007 untuk SDS-PAGE dialisat daun, dan persamaan  regresi y =  -1,0478 x +  2,1163  dengan  nilai R 2 sebesar 0,9782 untuk zimografi.

## Pengukuran kadar protein dan aktivitas protease
Pengukuran kadar protein dan aktivitas protease dilakukan terhadap  ekstrak  yang  didapat  dari  setiap  tahap  pemurnian. Pengukuran  kadar  protein  dan  aktivitas  protease  dilakukan menggunakan  dua  ulangan  sampel,  masing-masing  duplo. Kadar protein diukur berdasarkan metode Bradford (1976) dan aktivitas  protease  diukur  berdasarkan  metode  Bergmeyer, Grassl (1983) pada pH 8,0 dan  suhu 37°C.  Satu unit aktivitas protease  didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang  dapat menghasilkan  1µmol  produk  tirosin  per  menit  pada  kondisi pengukuran.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik sifat fisik dan sifat kimia buah dan daun mengkudu
Karakteristik fisik buah dan daun mengkudu yang digunakan pada  penelitian  ini  dapat  dilihat  pada  Tabel  1.  Jika  merujuk pada karakteristik warna kulit dan tekstur buah menurut Chan- Blanco et al. (2006), buah yang digunakan berada pada tingkat ketuaan 2 (TK2) dan tingkat ketuaan 4 (TK4).
Tabel 1. Karakteristik fisik buah dan daun mengkudu ( Morinda citrifolia
L.) Bagian tumbuhan Karakteristik fisik Warna permukaan Tekstur Pencoklatan enzimatis Pembentuk an bau menyengat (T ruang) Buah TK2 a kuning kehijauan keras sangat cepat lebih dari 24 jam TK4 b putih kekuningan agak lunak agak cepat kurang dari 24 jam Daun Pucuk hijau muda, mengkilap agak renyah agak cepat - Pangkal hijau tua, mengkilap renyah cepat -
a : Tingkat Ketuaan 2 sesuai dengan kriteria Chan-Blanco et al. (2006) b : Tingkat Ketuaan 4 sesuai dengan kriteria Chan-Blanco et al. (2006)
Komposisi  kimia  buah  mengkudu  dan  daun  dapat  dilihat pada  Tabel  2.  Hasil  analisis  komposisi  kimia  buah  mengkudu mirip  dengan  yang  dilaporkan  oleh  West et  al. (2010)  dan khusus  untuk  kadar  abu  mirip  dengan  hasil  Laterme et  al . (2006),  sedangkan  hasil  analisa  proksimat  daun  mengkudu sedikit berbeda jika dibandingkan dengan laporan Leung et al . (1972).  Perbedaan  terjadi  diduga  karena  pengaruh  jenis mengkudu,  faktor  pertumbuhan  dan  lingkungan  tanam mengkudu (Rost et al. , 2006).
Kadar padatan daun lebih tinggi dibandingkan dengan buah, serta  selama  proses  pematangan  buah  dan  penuaan  daun terjadi  penurunan  kadar  protein  (Tabel  2  dan  Tabel  3). Penurunan kadar protein diduga berkaitan dengan peningkatan aktivitas  protease.  Menurut  Gan  (2007)  protein  tanaman  pada saat  pelayuan  akan  berkurang  karena  terjadinya  degradasi protein seiring dengan meningkatnya aktivitas enzim proteolitik. Protease sistein dipercaya sebagai protease utama yang terlibat dalam hidrolisis protein Nooden (2004).
Penurunan protein pada pematangan buah dapat dijelaskan sebagai  mulai  terjadinya  proses senescence pada  buah  TK4 yang  digunakan.  Hasil  penelitian  serupa  yang  memperlihatkan total  protein  buah  meningkat  selama  pematangan  tetapi kemudian menurun ketika lewat matang dilaporkan juga terjadi pada  buah  delima  (Kulkarni  dan  Aradhya,  2005),  buah  melon kultivar Piel de Sapo (Villanueva et al ., 2004) dan buah jambu (Bashir dan Abu-Goukh, 2003).
Pemurnian protease buah dan daun mengkudu Buah dan daun mengkudu diekstrak dengan cara memecah membran  selnya  menggunakan  blender  dengan  campuran buffer Na asetat pH 5 yang berisi PVP K30, gliserol, EDTA, dan β-merkaptoetanol.  Konsentrasi  PVP  K30  yang  ditambahkan pada  daun  (10%)  lebih  tinggi  dibandingkan  pada  buah  (3%) karena  menurut  Zin et  al. (2006)  daun  mengkudu  mempunyai kandungan total fenol lebih tinggi, yaitu ± 8342 µg/g daun (buah 119,9  µg/g  dan  akar  285  µg/g).  Selama  penghancuran  dan penyaringan  terbentuk  buih  yang  diduga  berkaitan  dengan denaturasi protein (Clarkson et al. , 1999).
Buah  dan  daun  yang  telah  diblender  kemudian  disaring menggunakan dua lapis kain saring hingga diperoleh jus buah
berwarna coklat muda dan jus daun berwarna coklat kehijauan. Setelah disentrifus selama setengah jam, klorofil daun terpisah karena  pengikatan  ion  logam  Mg  yang  ada  pada  klorofil  daun oleh EDTA.
Sentrifugasi  jus  buah  dan  daun  menghasilkan  supernatan berwarna kuning pucat (buah) dan coklat (daun), yang disebut ekstrak kasar enzim. Pada tahap ini ekstrak kasar diukur kadar protein  dan  aktivitas  protease.  Nilai  absorbansi  pada pengukuran  kadar  protein  daun  bernilai  negatif  yang  diduga karena  penghambatan  penyerapan  warna  oleh  pigmen  coklat yang diduga diakibatkan oleh polifenol yang masih tinggi dalam ekstrak  kasar.  Menurut  Vedralova et  al. (1987)  melanin  yang terbentuk  akibat  pencoklatan  bisa  mempengaruhi  pembacaan absorbansi  hingga  40%.  Oleh  karena  itu  ekstrak  kasar  daun kemudian ditambah silika untuk mengikat polifenol yang masih ada.  Dalam  penelitian  pendahuluan,  silika  1,4%  efektif mengurangi  intensitas  warna  coklat  dan  meningkatkan pembacaan  absorbansi  pada  pengukuran  kadar  protein.  Silika gel  adalah  senyawa  polar  yang  digunakan  untuk  memisahkan komponen yang dapat dipolarkan seperti hidrokarbon aromatik dan  campuran  komponen  terlarut  yang  kurang  polar  seperti fenol, ester dan eter alifatik (Adnan, 1991).
Ekstrak kasar enzim selanjutnya diendapkan menggunakan garam  ammonium  sulfat  100%  jenuh  dan  didialisis.  Data  hasil pemurnian  enzim  protease  buah  dan  daun  mengkudu  dapat dilihat  pada  Tabel  3.  Sentrifugasi  jus  mampu  meningkatkan aktivitas  spesifik  ekstrak  kasar  enzim  buah  yang  dihasilkan, tetapi  tidak  dengan  ekstrak  kasar  daun.  Selama  proses penambahan  silika  (daun),  pengendapan  dan  dialisis, purification fold protease buah TK2, daun pucuk, maupun daun pangkal terus menurun sedangkan buah TK4 terus meningkat. Penurunan  aktivitas  spesifik  enzim  selama  permunian  diduga disebabkan  oleh  autolisis.  Meskipun  tahapan  pengendapan mampu  meningkatkan  aktivitas  spesifik  protease  buah  TK4, secara  umum  aktivitas  spesifik  tertinggi  dicapai  ekstrak  kasar enzim  buah  TK2  (3,79U/mg  protein).  Selain  itu  juga  terlihat bahwa  aktivitas  protease  buah  lebih  tinggi  daripada  protease daun,  seperti  yang  terjadi  pada  buah  dan  daun  pepaya  cv. Maradol (Thomas et al. , 2009).
Tabel 2 . Komposisi kimia buah dan daun mengkudu ( Morinda citrifolia L.) per 100g
Kadar (%) Buah Daun TK2 a TK4 b West et al. (2010) Pucuk Pangkal Leung et al. (1972) bb c bk d bb c bk d bb c bb c bk d bb c bk d bb c Air 88,95 89,16 91,63 81,33 78,06 93,70 Abu 1,08 11,44 0,91 9,66 0,54 1,83 11,31 2,31 14,10 0,70 0,98 e Protein 0,76 7,99 0,72 7,55 0,55 2,98 18,35 2,92 15,14 1,00 Lemak 0,11 1,16 0,10 1,03 0,10 0,30 1,84 0,73 3,77 0,20 Karbohidrat ( by difference ) 9,10 79,41 9,11 81,76 7,21 13,55 65,98 15,98 66,99 4,40
a : Tingkat Ketuaan 2 sesuai dengan kriteria Chan-Blanco et al. (2006) b : Tingkat Ketuaan 4 sesuai dengan kriteria Chan-Blanco et al. (2006) c  : basis basah d   : basis kering e : Laterme et al. (2006)
Tabel 3. Pemurnian protease dari buah dan daun mengkudu ( Morinda citrifolia L.) Tahap purifikasi Volume (mL) atau Berat (g) Total protein (mg) Total aktivitas (U) a Aktivitas spesifik (U/mg) a Recovery (%) Purification fold Buah TK2 b Jus* 42,25 32,98 104,54 3,17 100,00 1,00 Ekstrak kasar* 40,25 26,94 102,24 3,79 98,06 1,20 Amm, sulfat 100% jenuh** 2,95 27,39 78,99 2,88 75,71 0,91 Dialisat* 7,05 12,56 24,25 1,94 23,27 0,61 Buah TK4 c Jus* 40,00 23,37 39,06 1,68 100,00 1,00 Ekstrak kasar* 38,50 19,55 35,48 1,83 90,85 1,09 Amm, sulfat 100% jenuh** 2,61 18,40 39,08 2,11 100,02 1,27 Dialisat* 7,10 9,58 30,42 3,18 77,88 1,90 Daun Pucuk Ekstrak kasar* 46,80 11,47 4,85 0,43 100 1,00 Ekstrak silika* 42,30 11,94 4,32 0,36 89,04 0,86 Amm, sulfat 100% jenuh** 6,92 9,98 2,37 0,24 48,75 0,56 Dialisat* 17,80 9,34 0,26 0,03 5,45 0,07 Daun Pangkal Ekstrak kasar* 44,00 11,29 5,40 0,46 100,00 1,00 Ekstrak silika* 41,00 10,23 4,60 0,46 85,46 1,01 Amm, sulfat 100% jenuh** 1,25 9,24 2,22 0,24 41,55 0,53 Dialisat* 17,50 6,91 0,47 0,07 8,78 0,15
a : U singkatan dari Unit aktivitas. Satu unit aktivitas protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1µmol produk tirosin per menit pada kondisi pengukuran b : Tingkat Ketuaan 2 sesuai dengan kriteria Chan-Blanco et al. (2006) c : Tingkat Ketuaan 4 sesuai dengan kriteria Chan-Blanco et al. (2006)
*  : Konsentrasi protein dinyatakan dalam mg/mL dan aktivitas protease dinyatakan dalam U/mL **  : Konsentrasi protein dinyatakan dalam mg/g dan aktivitas protease dinyatakan dalam U/g
Tabel 4. Protease dari ekstrak kasar beberapa tanaman
Berdasarkan  pertimbangan  efektifitas  pemurnian,  waktu serta  biaya  pemurnian,  protease  dari  buah  TK2,  daun  pucuk, dan  daun  pangkal  dalam  bentuk  ekstrak  kasar  lebih  potensial untuk  diambil  secara  komersial  dibandingkan  protease  dari buah  TK4  karena  mampu  menghasilkan  protease  dengan aktivitas spesifik lebih tinggi serta waktu dan biaya pemurnian
lebih  kecil.  Pemurnian  protease  dari  buah  TK4  lebih  potensial jika  digunakan  untuk  keperluan  analisis  yang  membutuhkan enzim yang lebih murni.
Jika dibandingkan dengan protease tanaman lain (Tabel 4) maka  protease  mengkudu  cukup  potensial  untuk  dijadikan sumber  protease.  Perbaikan  proses  ekstraksi  secara  umum
Sumber protease Buffer ekstraksi Prosedur ekstraksi Aktivitas spesifik (U/mg) Referensi Morinda citrifolia L. * buah TK2 a ** buah TK4 a
*** daun pucuk **** daun pangkal
Na asetat 0,10M, pH 5,0; EDTA; PVPP;gliserol, β-ME Suhu 6°C. Daging buah segar Homogenisasi, filtrasi, sentrifugasi 3775g (5900 rpm), 30 menit. * 3,79 ** 1,83 *** 0,43 **** 0,46 Carica papaya L. cv. Maradol Na phosphat 0,05M, pH 7,0 * Buah disadap getahnya hingga berhenti dan disimpan pada suhu -20°C. Buffer ditambahkan ketika akan dianalisis
** Suhu 6-8°C. Daging buah segar Homogenisasi, sentrifugasi 2500g, 30’
*** Suhu 6-8°C. Daun kering Homogenisasi, sentrifugasi 2500g, 30’ * 5,65
** 10,00 *** 0,13 Thomas et al. (2009) Cucurbita ficifolia Tanpa buffer Suhu ruang Daging buah segar Homogenisasi, filtrasi, sentrifugasi. 25,80 Curotto et al. (1989) Benincasa hispida var. Ryukyu Na asetat 0,05M, pH 5,0 Suhu 7°C. Daging buah beku Homogenisasi, filtrasi, sentrifugasi 3000g, 15’ 65,10 Uchikoba et al. (1998) Cucumis trigonus R. Na asetat 0,05M, pH 5,0 Suhu 4°C. Daging buah beku. Homogenisasi, sentrifugasi 12000rpm selama 1 jam. 1 500,00 Asif-Ullah et al. (2006) Medicago sativa L . Kalium fosfat 50mM, pH 7,
Na 2 S 2 O 3
Daun segar. Homogenisasi, sentrifugasi 20000g selama 30 menit. 0,05 Nieri et al. (1998) Phaseolus vulgaris Daun beku. Homogenisasi, thawing, aduk. 0,0014 Popovic et al. (1998) Lactuca sativa HEPES-KOH pH 7,5, mannitol, sukrosa,EGTA,sistein Daun segar. Homogenisasi, sentrifugasi 27200g selama 30 menit, sentrifugasi 15000g selama 60 menit. 12,48 x 10 -9 Piero dan Petrone (1999)
5 6 7 A A 116kDa 45 kDa 35 kDa 25 kDa 18,4kDa Mk 1 2 66,2kDa 14.4 kDa a 116kDa 14.4 kDa a B 3 4 Mk 5 45kDa 14.4 kDa a 25kDa 14.4 kDa a 70kDa 58-61,5kDa 14,4kDa 14,4kDa Mk 1 2 3 4 45kDa 14.4 kDa a 35kDa 14.4 kDa a 18.4kDa 14.4 kDa a 18.4kDa 14.4 kDa a 66,2kDa 66,2kDa 37-38kDa ~27kDa ~25kDa B C Mk A 66,2kDa 14.4 kDa a 45kDa 14.4 kDa a 35kDa
14.4 kDa a 18.4kDa
14.4 kDa a
perlu dilakukan untuk mendapatkan aktivitas spesifik yang lebih baik dan komposisi buffer pengekstrak yang lebih aman, serta karakterisasi  lebih  lanjut  untuk  mengetahui  karakteristik protease mengkudu.

## Berat molekul protease
Hasil  SDS  PAGE  (Gambar  1)  menunjukkan  pada  sumur dialisat  buah  TK2,  buah  TK4,  daun  pucuk,  maupun  daun pangkal  terdapat  beberapa  pita  polipeptida.  Polipeptida  pada dialisat  buah  diperkirakan  ber-BM  24-26kDa,  14-15kDa,  12- 13kDa,  serta  beberapa  pita  dengan  bobot  molekul  lebih  kecil, sedangkan  pada  daun  diperkirakan  70kDa  dan  58-61,5kDa. Munculnya  beberapa  pita  polipeptida  pada  gel  SDS-PAGE menunjukkan  bahwa  dialisat  protease  yang  didapat  belum murni (Suhartono, 1989).
Gambar 1.   Hasil SDS-PAGE ekstrak enzim bebas garam. (a) buah; (b) daun. Marker (Mk); buah TK2 (1); buah TK4 (2); daun pucuk (3,4); daun pangkal (5)
Zona  bening  pada  zimogram  yang  diinkubasi  1  jam  (pada Gambar 2 ditunjukkan dengan garis hitam di tengah zimogram) menunjukkan  pita  polipeptida  dengan  aktivitas  protease (kaseinolitik)  pada  buah  diperkirakan  berbobot  molekul  37- 38kDa, ~27kDa, dan ~25kDa, sedangkan pada daun 50kDa dan 29kDa.  Zimogram  pada  Gambar  2  dicetak  invert  untuk mempertajam  kontras  tampilan.  Inkubasi  zimogram  selama semalam menunjukkan hidrolisis kasein yang berlebih sehingga zona  bening  yang  terbentuk  menjadi  meluas.  Umumnya semakin  lama  waktu  inkubasi  maka  deteksi  zona  bening semakin  jelas,  namun  selain  itu  juga  meningkatkan  difusi protease  dan  substrat  sehingga  zona  bening  hasil  hidrolisis
enzim  yang  berdekatan  sulit  dibedakan  (Lantz,  Ciborowski, 1994).
Gambar 2.   Zimogram ekstrak enzim bebas garam. a. tampilan normal; Marker  (Mk).  b,c  tampilan  invert  (zona  bening  menjadi zona  hitam);  buah  TK4  (1,2);  buah  TK2  (3,4);  daun pangkal (5,6); daun pucuk (7).

## Protease mengkudu
Protease dari tumbuhan Morinda citrifolia L. atau mengkudu sampai  dengan  laporan  penelitian  ini  ditulis  belum  ada  dalam database MEROPS,  BRENDA,  maupun  UniProt.  MEROPS merupakan online  database untuk  peptidase,  sedangkan BRENDA  dan  UniProt  merupakan online  database untuk protein.  Pencarian  berdasarkan  organisme  sumber  protease pada  MEROPS  (Anonim b ,  2010)  menggunakan hint “morinda”, “indian  mulberry”,  atau  “noni”  tidak  berhasil.  Sejauh  ini  enzim dari tumbuhan mengkudu yang telah diarsipkan oleh BRENDA (Anonim c ,  2010)  adalah cinnamyl-alcohol  dehydrogenase,  1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate  synthase,  geranyltranstrans ferase,  isopentenyl-diphosphate  DELTA-isomerase, dan isochorismate  synthase ,  sementara  UniProt  (Anonim d ,  2011) mengarsipkan  enzim Deoxy-D-xylulose-5-phosphate  synthase, Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase, NADH dehydrogenase, Phosphoenolpyruvate carboxylase, dan 3-deoxy-D- arabinoheptulosonate 7-phosphate synthase . Dengan demikian, pemurnian  protease  dari  buah  mengkudu  pada  penelitian  ini nampaknya  merupakan  hal  baru  dalam  eksplorasi  enzim hidrolase pada tumbuhan mengkudu, khususnya protease.
~50kDa ~29kDa 24-26kDa 14-15kDa 12-13kDa 116kDa 35kDa 116kDa
Dugaan  adanya  protease  pada  buah  dan  daun  mengkudu berawal  dari  pengalaman  empiris  masyarakat  Polinesia  yang menggunakan mengkudu dalam pengobatan nematoda (sejenis parasit)  dan  luka  (Nelson,  2006).  Penggunaan  mengkudu sebagai antelmintik (anti parasit) didukung oleh hasil penelitian Satrija et  al. (2001)  yang  menunjukkan  buah  mengkudu  yang dikeringkan  dapat  membunuh  parasit  ternak H.  contortus sebesar  73,6–88,8%.  Mengkudu  sebagai  obat  luka  dibuktikan oleh Rasal et al. (2008), yaitu ekstrak air daun mengkudu yang dipekatkan  mampu  menurunkan  waktu  epitalisasi  kulit  yang terluka secara signifikan dibandingkan dengan kontrol.
Efek  antelmintik  mengkudu  diduga  berkaitan  dengan protease berdasarkan hasil penelitian terdahulu yang menunjuk- kan  bahwa  beberapa  protease  sistein  dari  tanaman  memiliki efek  tersebut.  Efek  antelmintik  protease  secara in  vitro dan in vivo telah  diamati  pada  ekstrak  kasar  papain,  papain  murni komersial,  ekstrak  kasar  bromelain  dan  ekstrak  kasar  ficin terhadap P. muricola (Stepek et al. , 2007) dan T. muris (Stepek et  al. ,  2006).  Aktivitas  protease  sistein  dari  tanaman  tersebut meningkat  secara in  vivo ketika  dikombinasikan  dengan pemberian awal simetidin untuk menetralkan asam lambung.
Papain  sendiri  menurut  ulasan  Salas et  al., (2008)  juga berfungsi  sebagai  antitumor,  debridemen  pada  luka,  serta antiinflamasi dan peredam gangguan lambung. Sementara hasil penelitian  yang  dihimpun  Maurer  (2001)  menunjukkan bromelain,  yang  juga  termasuk  dalam  kelas  protease  sistein, dapat  berfungsi  sebagai  zat  antiinflamasi,  penghambat aggregasi platelet, serta efek fibrinolitik dengan cara mengatur reaksi  bertingkat  yang  dimediasi  oleh  protease.  MEROPS (2010)  menempatkan  protease  papain  dan  bromelain  dalam subfamili yang sama, yaitu subfamili C1A, bersama dengan ficin dari  getah  fig,  ananain  dari  batang  nanas  dan  aktinidain  dari buah  kiwi.  Penentuan  kelas  atau  famili  protease  mengkudu perlu  diteliti  lebih  lanjut,  salah  satunya  dengan  uji  peng- hambatan inhibitor seperti yang telah dilakukan oleh Pereira et al. (2001),  Uchikoba et  al. (2001),  Dubey  dan  Jagannadham (2003), serta Sidrach (2005).

## KESIMPULAN
Kandungan  protein  buah  TK2  lebih  tinggi  daripada  buah TK4,  dan  daun  pucuk  lebih  tinggi  dari  daun  pangkal,  yang diduga  disebabkan  oleh  proses  pematangan/penuaan.  Ekstrak kasar  protease  dari  buah  TK2  (3,79U/mg  protein)  memiliki aktivitas  spesifik  paling  tinggi,  diikuti  ekstrak  kasar  buah  TK4 (1,83U/mg protein), daun pangkal (0,46U/mg protein), dan daun pucuk  (0,42U/mg  protein).  Selama  proses  pemurnian, purification  fold protease  buah  TK2,  daun  pucuk,  dan  daun pangkal terus menurun sedangkan buah TK4 terus meningkat. Protease  dari  ekstrak  kasar  buah  TK2,  daun  pucuk,  dan  daun pangkal  lebih  potensial  untuk  diambil  secara  komersial sedangkan  protease  dari  ekstrak  kasar  TK4  lebih  potensial diambil untuk keperluan analisis.
Hasil SDS-PAGE dan zimografi menunjukkan dialisat yang diperoleh  belum  murni.  Terdapat  beberapa  polipeptida  yang mampu dipisahkan dengan SDS-PAGE, yaitu dengan perkiraan bobot molekul 24-26 kDa, 14-15 kDa, 12-13 kDa, dan beberapa pita dengan bobot molekul lebih kecil pada dialisat buah, serta
70kDa  dan  58-61,5kDa  pada  dialisat  daun.  Protease  yang terdeteksi diperkirakan berbobot molekul ~25kDa, ~27kDa, dan 37-38kDa  pada  buah,  sedangkan  pada  daun  diperkirakan ~29kDa dan ~50kDa.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih  kepada  SEAFAST  Center  IPB  atas  bantuan dana dan fasilitas laboratorium selama penelitian, serta  Bapak Sawaluddin atas hibah PVP K30.

## DAFTAR PUSTAKA
Adnan  M.  1997.  Teknik  Kromatografi  untuk  Analisis  Bahan Makanan. Edisi Pertama. Penerbit Andi, Yogyakarta.
Anonim a .  2010.  World  Enzymes  to  2013  :  Demand  and  Sales Forecasts,  Market  Share,  Market  Size,  Market  Leaders. http://www.freedoniagroup.com/World-Enzymes.html. [16 Juni 2010].
Anonim b .  2010.  Family  C1.  http://merops.sanger.ac.uk/cgi- bin/famsum? family=C1. [4 Oktober 2010].
Anonim c .  2010.  Search  Result.  http://www.brenda  - enzymes.info/  php/search__result.php4?a=  20&T[0]=1.  [4 Oktober 2010].
Anonim d .  2011.  Morinda  AND  Citrifolia  in  UniProtKB. http://www.uniprot.org/uniprot/?query=morinda+AND+citrifoli a&sort=score. [4 Januari 2011].
AOAC. 1999. Official Methods of Analysis of AOAC International Edisi ke-16. AOAC, Maryland.
Asif-Ullah  M,  Kim  KS,  Yu  YG.  2006.  Purification  and characterization of a serine protease from Cucumis trigonus Roxburghi. Phytochem 67:870–875.
Bashir  HA,  Abu-Goukh  ABA.  2003.  Compositional  changes during guava fruit ripening. J Food Chem 80:557-563.
Bergmeyer  HU,  Grassl  M.  1983.  Methods  of  Enzymatic Analysis. (2). Verlag Chemie, Weinheim.
Beynon  RJ.  1989.  Prevention  of  uncontrolled  proteolysis.  Di dalam:  Haris  ELV,  Angal,  editor.  Protein  Purification Methods. IRL Oxford University Press, New York.
Bolag  DM,  Edelstein  SJ.  1991.  Protein  Methods.  John  Wiley and Sons, Inc. Pub., New York.
Bradford  MM.  1976.  A  rapid  dan  sensitive  method  for quantitation  of  microgram  quantities  of  protein  utilizing  the principle of protein dye-binding. Anal Biochem 72:234-254.
Chan-Blanco Y, Vaillant F, Perez AM, Reynes M, Brillouet JM, Brat P. 2006. The noni fruit (Morinda citrifolia L.): A review of  agricultural  research,nutritional  and  therapeutic properties. J of Food Comp and Anal 19:645–654.
Clarkson JR, Cui ZF, Darton RC. 1999. Protein denaturation in foam:  I.  Mechanism  study.  J  of  Colloid  and  Interface Science 215: 323-332. [abstrak].
Copeland  RA.  2000.  Enzymes:  A  Practical  Introduction  to Structure,  Mechanism,  and  Data  Analysis.  Wiley-VCH, Toronto.
Curotto E, Gonzales G, O’Reilly S, Tapia G. 1989. Isolation and partial characterization of a protease from Cucurbita ficifolia. FEBS 243:363-365.
Departemen  Pertanian,  Direktorat  Jenderal  Hortikultura.  2008.
Produksi tanaman biofarmaka di Indonesia periode 2003  – 2007. http://www.hortikultura.deptan.go.id/index.php?ption =comcontent&task=view&id=124&Itemid=160. [8 Juni 2009].
Dubey  VK,  Jagannadham  MV.  2003.  Procerain,  a  stable cysteine  protease  from  the  latex  of  Calotropis  procera. Phytochem. 62:1057-1071.
Gan  S.  2007.  Senescene  Processes  in  Plants.  Blackwell Publishing, Australia.
Illanes A. 2008. Enzyme production. Di dalam: Illanes A, editor.
Enzyme Biocatalysis: Principles and Applications. Springer, Valparaiso.
Kulkarni  AP,  Aradhya  SM.  2005.  Chemical  changes  and antioxidant  activity  in  pomegranate  arils  during  fruit development. Food Chem 93(2):319-324.
Lantz  MS,  Ciborowski  P.  1994.  Zymographic  techniques  for detection  and  characterization  of  microbial  proteases. Methods in Enzymol. 235: 563-594.
Laterme P, Buldgen A, Estrada F, Londono AM. 2006. Mineral content  of  tropical  fruits  and  unconventional  foods  of  the Andes and the rain forest of Colombia. Food Chem 95: 644- 652.
Leung WTW, Butrum RR, Chang FH, Rao MN, Polachi W. 1972. Food  Composition  Table  for  Use  in  East  Asia. http://www.fao.org/docrep/003/X6878E/X6878E00.htm#TOC [ 9 September 2010].
Maurer HR. 2001. Bromelain: biochemistry, pharmacology, and medical use. Cell. Mol. Life Sci. 58:1234-1245.
Nelson SC. 2006. Some Tradisional and Modern Uses of Noni. http://www.ctahr. hawaii.edu/noni/uses.asp. [7 Juli 2010].
Nieri  B,  Stefania  C,  Raffaela  V,  Amedeo  A.  1998.  Purification and  characterization  of  an  endoprotease  from  alfalfa senescent leaves. Phytochem 49: 643 649.
Nooden LD. 2004. Plant Cell Death Process. Elsevier Academic Press, London.
Pereira  MT,  Lopes  MTP,  Meira  WO,  Salas  CE.  2001. Purification  of  a  cysteine  proteinase  from  Carica candamarcensis  L.  and  cloning  of  a  genomic  putative fragment  coding  for  this  enzyme.  Protein  Expression  and Purification 22: 24-257.
Piero  ARL,  Petrone  G.  1999.  Purification  and  partial characterization of an ATP-hydrolyzing serine protease from lettuce leaves. Phytochem. 51:349-356.
Popovic  T,  Marjetka  K,  Vida  P,  Joie  B.  Purification  and characterization of two cysteine proteinases from Phaseolus vulgaris leaves. 1998. Plant Physiol. Biochem 36: 637-645.
Rasal  VP,  Arulmozhi  S,  Purnima  A,  Shridar  Y.  2008.  Wound healing  and  antiooxidant  activities  of  Morinda  citrifolia  leaf extract in rats. Iranian J of Pharmacol. and Therapeutics, 7: 49-52.
Rost  TL,  Michael  GB,  Stocking  CR,  Terence  MM.  2006.  Plant Biology. Thomson Corporation, Canada.
Salas CE, Gomes MTR, Hernandez M, Lopes MTP. 2008. Plant cysteine  proteinases:  Evaluation  of  the  pharmacological activity. Phytochem. 69:2263–2269.
Satrija F, Retnani EB, Ridwan Y, Tiuria R. 2001. Potential use of herbal  anthelmintics  as  alternative  antiparasitic  drugs  for small  holder  farms  in  developing  countries.  Copenhagen: Proceedings  of  the  10th  Conference  of  the  Association  of Institutions for Tropical Veterinary Medicine.
Setiawan  B.  2007.  Peternak  Itik  Gunakan  Ramuan  Dedaunan. http://suaramerdeka.com/harian/0701/pan05.htm  [27  Mei 2009].
Sidrach  L,  Garcia-Canovas  F,  Tudela  J,  Rodriguez-Lopez  JN. Purification  of  cynarases  from  artichoke  (Cynara  scolymus L.):  enzymatic  properties  of  cynarase  A.  Phytochem.  66: 41–49.
Sinclair  RD,  Ryan  TJ.  2007.  Proteolytic  enzymes  in  wound healing  :  the  role  of  enzymatic  debridement.  Aust.  J  Derm 35(1): 35-41.
Stepek G, Lowe AE, Buttle DJ, Duce IR, Behnke JM. 2006. In vitro  and  in  vivo  anthelmintic  efficacy  of  plant  cysteine proteinases  against  the  rodent  gastrointestinal  nematode, Trichuris muris. Parasitol. doi:10.1017/
S003118200500973X.
Stepek  G,  Lowe  AE,  Buttle  DJ,  Duce  IR,  Behnke  JM.  2007.
Anthelmintic action of plant cysteine proteinases against the rodent  stomach  nematode,  Protospirura  muricola,  in  vitro and in vivo. Parasitol. 134:103–112.
Suhartono  MT.  1989.  Enzim  dan  Bioteknologi.  Bogor:  Institut Pertanian Bogor.
Thomas  GE,  Rodolfo  HG,  Juan  MD,  Georgina  SF,  Luis  CG, Ingrid  RB,  Santiago  GT.  2009.  Proteolytic  activity  in enzymatic  extracts  from  Carica  papaya  L.cv.Maradol harvest by-products. Process Biochem 44:77-82.
Uchikoba T, Hosoyamada  S, Onjyo M, Arima K, Yonezawa H,
Kaneda M. 2001. A serine endopeptidase from the fruits of Melothria japonica (Thunb.) Maxim Phytochem 57:1-5
Walter,  Annie,  Sam.  2002.  Fruits  of  Oceania.  ACIAR Monograph, Canberra.
Vedralova  E,  Jan  B,  Ji  D.  Protein  determination  in  materials containing  melanin.  J  Biochem  and  Biophysic  Method  14: 343-348.
West BJ, Deng S, Jensen CJ. 2010. Nutrient and phytochemical analyses  of  processed  noni  puree.  Food  Res  Int. doi:10.1016/j. foodres. 2010.09.038.
Villanueva MJ, Tenorio MD, Esteban MA, Mendoza MC. 2004. Compositional  changes  during  ripening  of  two  cultivars  of muskmelon fruits. Food Chem 87:179–185.
Zin MZ, Hamid AA, Osman A, Saari N. 2006. Antioxidative activities of chromatographic fractions obtained from root, fruit and leaf of Mengkudu (Morinda citrifolia L.). Food Chem 94: 169–178.