TRANSFORMASI PLASMID YANG MENGANDUNG GEN mer B PADA

## Escherichia coli BL21(DE3)
Zefanya G. Bernadus 1) , Fatimawali 1) , Beivy Kolondam 2)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
2) Jurusan Biologi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
DNA  transformation  is  one  of  the  methods  for  inserting  DNA  into  bacterial  cells.  The  current transformation method is widely used to transfer plasmids containing genetic material. This study aims to evaluate  the  results  of  plasmid  transformation  containing  merB  gene  in  Escherichia  coli  BL21(DE3) bacteria.  The  stages  of  the  research  carried  out  were  preceded  by  the  microbiological  identification  of the  E.  coli  BL21(DE3)  bacteria  used  as  hosts.  Then  the  plasmid  transformation  containing  merB  gene into  the  E.  coli  BL21(DE3)  host  cell  using  the  heat  shock  method  was  carried  out.  The  transformation results were evaluated by observing at the presence of E. coli BL21(DE3) colonies on agar Luria Bertani (LB) media containing ampicillin antibiotics. Plasmids in E. coli BL21(DE3) were isolated and analyzed by 1% agarose gel electrophoresis. The results showed the success of the transformation indicated by the growth of E. coli BL21(DE3) bacteria in agar LB media containing ampicillin and the visualization on agarose gel resulted that the plasmid which carried the merB gene could be transformed in to the E. coli BL21(DE3) bacteria.
Keywords : Plasmids, merB genes, heat shock, Escherichia coli BL21(DE3)

## ABSTRAK
Transformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri. Metode  transformasi  saat  ini  dipakai  secara  luas  untuk  mentransfer  plasmid  yang  mengandung  bahan genetika. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi hasil transformasi plasmid yang  mengandung  gen mer B pada bakteri Escherichia coli BL21(DE3). Tahapan penelitian didahului dengan identifikasi secara mikrobiologi  bakteri E.  coli BL21(DE3)  yang  digunakan  sebagai  inang.  Selanjutnya  dilakukan transformasi  plasmid  yang  mengandung  gen  merB  kedalam  sel  inang E.  coli BL21(DE3)  menggunakan metode heat shock. Hasil transformasi dievaluasi dengan melihat adanya koloni E. coli BL21(DE3) pada media agar Luria Bertani (LB) yang mengandung antibiotik ampisilin. Plasmid pada E. coli BL21(DE3) diisolasi dan dianalisis dengan elektroforesis gel agarose 1%. Hasil penelitian menunjukkan keberhasilan transformasi dengan adanya pertumbuhan bakteri E. coli BL21(DE3) pada media LB yang mengandung ampisillin dan hasil visualisasi pada agarose gel terlihat bahwa plasmid yang membawa gen merB dapat ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli BL21(DE3).
Kata Kunci : Plasmid, gen merB, heat shock , Escherichia coli BL21(DE3)

## PENDAHULUAN
Pencemaran lingkungan akibat merkuri  menjadi  permasalahan  serius  di seluruh  dunia  (Wang et  al. ,  2012).  Sumber pencemaran  merkuri  dapat  berasal  dari aktivitas manusia seperti pembakaran batubara,  jenis-jenis  produk  minyak  bumi, penggunaan fungisida, katalisator merkuri dan penambangan emas  yang  menggunakan merkuri  sebagai  bahan  pengekstraksi  emas (Fatimawali, 2011).
Penambangan  emas  rakyat  saat  ini masih  menjadi  salah  satu  kegiatan  ekonomi masyarakat Sulawesi Utara. Aktivitas penambangan ini menghasilkan produk limbah  yang  banyak  mengandung  logam- logam  berat  sehingga  berpotensi  mencemari lingkungan dan juga membahayakan kesehatan  karena  adanya  efek  toksik.  Produk limbah  ini  dihasilkan  dari  sisa  pengolahan emas  dan  salah  satunya  adalah  merkuri (Bapedalda Sulut, 2002). Mengingat berbagai dampak  akibat  pencemaran  merkuri  ini  maka perlu  dipikirkan  cara  untuk  mengubah  atau menurunkan kadar merkuri.
Berdasarkan beberapa penelitian dilaporkan adanya penguraian senyawa merkuri  oleh  bakteri  yang  menghasilkan perubahan  bentuk  merkuri  di  lingkungan. Umumnya  bakteri  ini  ditemukan  pada  area kadar  merkuri  yang  tinggi  (Nelson et  al , 1972).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  bakteri yang berada di daerah tercemar merkuri dapat menjadi  sumber  isolasi  bakteri  resisten merkuri.  Detoksifikasi  oleh  bakteri  resisten merkuri  dilakukan  secara  enzimatis.  Hal  ini dapat  terjadi  karena  bakteri  resisten  merkuri memiliki  operon  merkuri  resisten  ( mer ).  Saat ini  diketahui  ada  beberapa  jenis  bakteri resisten  merkuri  diantaranya  gen mer B  yang mengkode organomerkuri liase yang mengkatalisis  pemutusan  ikatan  merkuri- karbon  sehingga  menghasilkan  senyawa organik  dan  ion  Hg 2+ ,  kemudian  gen mer A
mengkode merkuri reduktase menjadi H 0 yang sifatnya  kurang  toksik  (Das  dan  Dash,  2015; Rojas et al., 2011 ). Penggunaan gen ini dalam detoksifikasi  perlu  diproses  lagi  sehingga detoksifikasi  dapat  dilakukan  oleh  protein, namun sebelum itu diperlukan tahap transformasi  sebelum  dilakukan  overproduksi untuk menghasilkan protein tersebut.
Kloning  dilakukan  dalam  upaya seleksi  dan  pemurnian  suatu  gen  dalam jumlah besar dan yang bebas dari kontaminasi oleh  urutan  DNA  lain.  Salah  satu  tahapan yang  harus  dilakukan  dalam  kloning  gen adalah  transformasi.  Langkah  awal  pada kloning  gen  yakni  fragmen  DNA  yang mengandung  gen  yang akan kloning diinsersi ke  dalam  vector.  Vektor  ini  dapat  menjadi media  pengantar  kepada host  cell (Brown, 2010).  Metode  transformasi  yang  paling sering  digunakan  adalah  metode heat  shock yang  umumnya  dilakukan  pada  suhu  42 ⁰ C selama  2  menit.  Prinsip  metode  ini  yaitu kejutan  suhu  tinggi  selama  beberapa  detik pada  sel  bakteri  sehingga  plasmid  dapat masuk  ke  dalam  sel  (Sambrook  dan  Russel, 2001). Hasil transformasi ini dapat dipengaruhi  oleh  waktu  dan  suhu heat  shock . Oleh  karena  itu  pada  beberapa  penelitian sebelumnya  dilakukan  transformasi  dengan variasi  waktu  dan  suhu  untuk  melihat efektivitas  transformasi  plasmid  ke  dalam  sel inang.
Adapun  penelitian  serupa  dengan penelitian ini yang telah dilakukan sebelumnya  oleh  Fatimawali  (2017),  di  mana detoksifikasi merkuri secara enzimatik dengan merkuri  reduktase mer A  (merkuri  reduktase). Merkuri reduktase digunakan untuk detoksifikasi  merkuri  anorganik,  sedangkan gen mer B  (organomerkuri  liase)  digunakan untuk  detoksifikasi  merkuri  organik  yakni dengan  pemutusan  ikatan  merkuri-karbon. Untuk  itu  penelitian  ini  dilakukan  dengan tujuan  untuk  melihat  apakah  plasmid  yang
mengandung  gen mer B  dapat  di  transformasi pada bakteri E. coli BL21(DE3).

## METODOLOGI PENELITIAN

## Alat dan Bahan Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian yaitu  cawan  petri,  lampu  bunsen,  tip, sentrifuge tube , tabung microsentrifuge (eppendorf), Incubator Shaker , labu Erlenmeyer,  timbangan  analitik,  jarum  ose, inkubator  ( Incucell ), laminar  air  flow (Biotek), autoklaf (ALP), hot plate, mikropipet (Ecopipette), kertas  label,  plastik wrap , aluminium foil , kapas, kasa, elektroforesis  ( Biometra  T-Personal ),  UV transluminator dan alat fotografi.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu Aquabidest/ ddH2O, Alkohol,    NaCl,  Tripthon,  Yeast,  Agar bakteriological ,  Ethidium  Bromide  (EtBr), TSS  ( Polyethylene  Glicol (PEG), Dimethyl sulfoxide (DMSO),  Luria  Bertani  (LB)  dan MgCl2), Antibiotik ampicilin, Agarose, TAE, kit  isolasi  DNA  bakteri  (Geneaid), loading dye , dan spiritus.
Transformasi  plasmid  yang  mengandung gen mer B Prosedur  transformasi  dilakukan  sesuai dengan  Fatimawali et  al ., (2017)  dengan modifikasi.  Plasmid  yang  mengandung  gen mer B  di  transformasikan  pada E.  coli BL21(DE3) yaitu 5μL larutan plasmid dipipet kedalam E. coli BL21(DE3) 200 μL. Langkah ini  dilakukan  pada  3  falcon  yang  berbeda untuk  variasi  suhu  pada heat  shock .  Langkah selanjutnya  diinkubasi  pada  suhu  0 ⁰ C  (es) selama  30  menit,  kemudian  di heat  shock dengan  inkubasi  pada thermo  block dengan variasi  suhu  (1)  40 ⁰ C,  (2)  42 ⁰ C,  (3)  44 ⁰ C
masing-masing  dilakukan  selama  30  detik. Setelah  itu  diinkubasi  lagi  pada  es  selama  10 menit,  ditambahkan  800μL  media  LB  cair. Selanjutnya disentrifuge 3.670 rpm selama 10 menit  dan  sebanyak  800μL  supernatan dibuang  sehingga  tersisa  200μL.  Dipipet masing-masing  sebanyak  200  μL  dan  di spread pada media LB agar yang mengandung  ampicilin  (100μL/ml)  kemudian diinkubasi  selama  18  jam  pada  suhu  37 ⁰ C. Disamping  itu  dibuat  juga  kontrol  untuk membandingkan  pertumbuhannya,  dipipet sebanyak  200  μL  hasil  kultur E.  coli BL21(DE3)  dan  di spread pada  media  LB agar  yang mengandung  ampicilin  (100μL/ml) kemudian diinkubasi seperti hasil transformasi  yaitu  selama  18  jam  pada  suhu 37 ⁰ C.  Transformasi  dikatakan  berhasil  bila adanya  pertumbuhan  pada  media  yang engandung  ampicillin  dan  bila  terlihat  pita DNA  dengan  ukuran  639  bp  yaitu  sesuai dengan  ukuran  gen mer B  yang  telah diinsersikan pada plasmid.

## Isolasi plasmid
Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan menggunakan PrestoTM Mini Plasmid Kit (Geneaid).
Elektroforesis  hasil  transfomasi  plasmid yang mengandung gen mer B dan Visualisasi UV
Prosedur  elektroforesis  dilakukan  sesuai dengan  Langden et  al .,  (2017)  dengan modifikasi.  Agarose  1%  disiapkan  yaitu sebanyak  0,4  g  dan  dicampur  dengan  TAE 1%  sebanyak  40  ml  kemudian  dipanaskan  di hot  plate hingga  mendidih.  Sisir  dipasang pada  cetakan  gel,  kemudian  dituang  agar  dan ditunggu hingga dingin dan memadat. Sampel ditambahkan  1  μL  loading  dye  kemudian dimasukkan ke sumuran gel. Ladder (marker) juga  di  masukkan  ke  sumuran  gel  di  sisi sampel.  Elektroforesis  dilakukan  selama  50 menit.  Hasil  elektroforesis  direndam  selama
10 menit di dalam EtBr yang harus dilakukan dengan  hati-hati  dan  sebaiknya  di  lakukan diruang  asam.  Setelah  itu  hasil  elektroforesis divisualisasi dengan UV transluminator.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Pembuatan Sel Kompeten
Sebelum di transformasi, sel bakteri E. coli BL21(DE3) dibuat menjadi sel kompeten terlebih dahulu. Tahap pembuatan sel menjadi kompeten  merupakan  langkah  penting  dalam proses  transformasi  (Silitonga,  2016).  Untuk itu bakteri di subkultur selama 90 menit pada
incubator  shaker kemudian  di  cek  nilai optical  density pada  panjang  gelombang  600 nm  (OD 600 ).  OD 600 sering  digunakan  untuk mengukur pertumbuhan sel di mana pada nilai ini  sel  bakteri  tidak  akan  mati  meski  terkena cahaya  sinar  UV  yang  terlalu  banyak.  Sel kompeten  yang  paling  baik  memiliki  nilai OD 600 (0,3-0,4)  yaitu  pada  awal  fase eksponensial (Chung, 1989) atau disebut juga periode steady  state (Sezonov,  2007).  Nilai OD 600 pada  penelitian  ini  dapat  dilihat  pada tabel 2.
Tabel 2. Nilai absorbansi sel kompeten (1) 40 ⁰ C, (2) 42 ⁰ C, (3) 44 ⁰ C
Nilai OD 600
(1)
Nilai OD 600 (2) Nilai OD 600 (3)
0,38 0,32 0,42
Selanjutnya  sel  bakteri  disentrifugasi kemudian  peletnya  ditambahkan  TSS.  TSS terdiri  dari Polyethylene  Glicol (PEG), Dimethyl  sulfoxide (DMSO),  Luria  Bertani (LB) dan MgCl2. Penambahan TSS dilakukan agar  sel  menjadi  kompeten.  Selain  itu penambahan  unsur  garam  dapat  membuat lebih  efisien  dalam  transformasi  (Liu et  al ., 2014).  Dengan  adanya  kation  bivalen  Mg 2+ , fusi  membran  akan  meningkat  sehingga  akan mempercepat interaksi DNA dengan permukaan E. coli (Sato et al ., 2005) .
Transformasi
Pada penelitian ini transformasi menggunakan  metode heat  shock dilakukan pada  beberapa  suhu  untuk  melihat  suhu  yang paling  optimal  untuk  transformasi.  Suhu heat shock mempengaruhi  efisiensi  transformasi (Inoue, 1990). Tahapan heat shock merupakan salah satu hal yang mempengaruhi
keberhasilan transformasi. Dengan metode ini dapat  membuat  DNA  mampu  melewati dinding  sel  inang  (Li et  al. ,  2010).  Hasil transformasi  plasmid  yang  mengandung  gen mer B  pada E.  coli BL21(DE3)  dengan  3 variasi suhu heat shock (1) 40 ⁰ C, (2) 42 ⁰ C, (3)  44 ⁰ C  ditumbuhkan  masing-masing  pada media LB (Luria Bertani) agar yang diberikan antibiotik  kemudian  diinkubasi.  Hal  ini dilakukan  untuk  melihat  keberhasilan  hasil transformasi  yaitu  dengan  seleksi  antibiotik (Jang  dan  Magnuson,  2013).  Begitupun kontrol  yang  digunakan  pada  penelitian  ini yakni E.  coli BL21(DE3)  yang  belum ditansformasi  (sel  inang)  ditumbuhkan  juga pada  media  yang  mengandung  antibiotik. Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa transformasi  plasmid  berhasil  dilakukan karena E.  coli BL21(DE3)  rekombinan tumbuh pada media yang diberikan ampicillin (Gambar  4)  sedangkan E.  coli BL21(DE3)
tidak  tumbuh  (Gambar  5).  Hal  ini  dapat terjadi  karena  bakteri E.  coli BL21(DE3) rekombinan  telah  mengandung  plasmid  yang membawa  sifat  resisten  terhadap  antibiotik dan  jenis  plasmid  yang  digunakan  pada penelitian ini resisten terhadap antibiotik jenis ampicilin sehingga bakteri E. coli BL21(DE3) rekombinan  hanya  akan  tumbuh  pada  media
yang diberikan ampicillin (100 μL/ml) (Casali dan  Preston,  2003).  Media  yang  digunakan pada penelitian ini adalah LB yang terdiri dari Trypthon, Yeast  extract, NaCl  dan  air. Media ini sangat sering digunakan karena memungkinkan  pertumbuhan  yang  cepat  dan hasil  pertumbuhannya  baik  untuk  banyak spesies (Sesonov et al , 2007).
(1) (2) (3)
Gambar 4. E. coli BL21(DE3) rekombinan setelah diinkubasi;
Keterangan : transformasi dengan suhu heat shock (1)40 ⁰ C, (2) 42 ⁰ C, (3) 44 ⁰ C
Gambar 5. E. coli BL21(DE3) setelah diinkubasi (Kontrol)
Metode heat  shock adalah  metode transformasi  yang  paling  sering  digunakan. Prinsip  metode  ini  yakni heat  shock (kejutan panas)  selama  beberapa  waktu  sehingga plasmid  dapat  masuk  kedalam  sel  inang (Sambrook  dan  Russel,  2001). Heat  shock mengubah struktur membran bakteri sehingga membantu  DNA  masuk  ke  dalam  sel  dengan cepat.
Pada penelitian sebelumnya transfomasi  plasmid  pTA7002- AtRKD4 pada E.  coli BL21(DE3)  berhasil  dilakukan  pada suhu heat  shock 44 ⁰ C  selama  30  detik (Tanio,  2017).  Selain  itu  adapun  penelitian lain  yang  menyatakan  transformasi  yang efisien  pada  suhu  42 ⁰ C  selama  30  detik (Singh,  2010).  Oleh  karena  itu  dapat  dilihat bahwa  belum  ada  suhu  pada  saat heat  shock yang optimum untuk transformasi.
Pada    penelitian  ini  dapat  dilihat bahwa perlakuan transformasi dengan metode heat  shock berhasil  dilakukan  pada  3  variasi suhu heat  shock (1)  40 ⁰ C,  (2)  42 ⁰ C,  (3)
44 ⁰ C. Meskipun
demikian, efisiensi transformasi  tidak  hanya  dipengaruhi  pada suhu heat  shock, melainkan  ada  juga  faktor- faktor  lain  seperti  ukuran  plasmid,  bentuk plasmid  yang  digunakan,  dan  juga  jenis larutan  garam  pada  saat  pembuatan  sel kompeten yang akan menjadi sel inang (Liu et al , 2014).

## Isolasi Plasmid
Pada  penelitian  ini  dilakukan  isolasi plasmid  menggunakan  Genomic  DNA  Mini Kit  (Geneaid).  Pada  prinsipnya  isolasi plasmid  ini  dilakukan  untuk  memisahkan DNA dari protein dan RNA dan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom.
Elektroforesis  hasil  transfomasi  plasmid dan Visualisasi UV
Hasil  isolasi  plasmid  dilanjutkan dengan uji konfirmasi yaitu dengan elektroforesis  gel  agarose  1%  kemudian  di visualisasi  UV.  Visualisasi  gel  agarosa dilakukan menggunakan
UV- transillluminator . Visualisasi UV hasil transformasi  dapat  dilihat  pada  Gambar  6. Hasil  elektroforesis  ini  terlihat  dengan munculnya  pita  ( band) DNA yang  berada pada  ukuran  antara  600  bp  dan  700  bp. Ukuran gen mer B adalah 639 bp (Fatimawali, komunikasi  pribadi).  Hal  ini  membuktikan bahwa transformasi plasmid
berhasil
dilakukan pada bakteri E. coli BL21(DE3).
Gambar 6. Electrophoregram hasil transformasi plasmid: Line 1 : marker; Line 2 : E.coli BL21 (DE3) rekombinan (1) 40 ⁰ C; Line 3 : E.coli BL21 (DE3) rekombinan (2) 42 ⁰ C; Line 4 : E.coli BL21 (DE3) rekombinan 44 ⁰ C ; Line * : E.coli TOP10

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian,  dapat disimpulkan bahwa gen mer B dapat ditransformasikan kedalam sel inang Escherichia  coli BL21(DE3),  sehingga  dapat menjadi  dasar  untuk  penelitian  selanjutnya pada  proses  detoksifikasi  merkuri  organik menggunakan enzim mer B.

## DAFTAR PUSTAKA
Bapedalda  Sulut,  2002.  Penelitian  Tentang Limbah  Merkuri  di  Propinsi  Sulawesi Utara  Selang  2002  sampai  2001. Sub.Bidang  Pengendalian  Pencemar Air, Bapedalda, Manado
Brown,  T.  A.  2010. Gene  cloning  and  DNA analysis . Blackwell Publishing, Oxford. Casali,  N.  dan  Preston,  A.  2003. E.  coli plasmid vectors: methods and applications .  Humana  Press,  New
Jersey.
Chung, C., Suzanne, L., Niemela., dan Miller,
R.  1989.  One-step  preparation  of
competent Escherichia coli: Transformation  and  storage  of  bacterial cells  in  the  same  solution  (recombinant DNA). Biochemistry (86) : 2172-2175.
Das,  S.  dan  Dash,  H.  R.  2015. Microbial biotechnology –a laboratory manual for bacterial systems . Springer, New Delhi.
Fatimawali.,  Kepel,  B.,  dan  Tallei,  T.  2017. Overproduction  of  mercuric  reductase protein  expressed  by  synthetic  merA gene  and  reduction  of  inorganic mercury  HgCl2. Bioscience  Research .
(4)14 : 1253-1260.
Fatimawali,  F.,  Badaruddin,  F.,  Yusuf,  I. 2011.  Isolasi  dan  identifikasi  bakteri resisten  merkuri  dari  muara  Sungai Sario  yang  dapat  digunakan  untuk detoksifikasi  limbah  merkuri. Jurnal Ilmiah Sains . (2)11 , 282-288.
Inoue,  H.,  Nojima,  H.,  Okayama,  H.  1990. High efficiency transformation of Escherichia  coli with  plasmids. Gene 96. (1) : 23- 28.
Jang,  C  dan  Magnuson,  T.  2013.  A  Novel Selection  Marker  for  Efficient  DNA Cloning and Recombineering in E. coli .
PLoS ONE. (2)8 :1-7.
Liu, X., Liu, L., Wang, Y., Wang, X, Ma, Y., dan  Li,  Y.  2014.  The  study  on  the
factors affecting transformation efficiency of Escherichia coli competent cells. Pakistan journal of pharmaceutical  sciences (3)27 :  679-
684.
Langden,  S.,  Budiharjo,  A.,  Wijanarka.,  dan Kusharyoto,  W.  2017.  Transformasi Dan Kloning Plasmid Pj804:77539 Pada E. coli Top’10. Jurnal Biologi . ( 1 ) 6 : 65- 70
Nelson., J., Blair, W., Brinckman, F., Collwel, R.,  Iverson,  W. 1973.  Biodegradation of Phenylmercuric Acetate by Mercury- Resistant Bacteria. Applied Microbiology. ( 26 ) 3 : 321-326
Rojas, L.A., Yanez, C., Gonzalez, M., Lobos, S.,  Smalla,  K.  dan  Seeger,  M.  2011.
Characterization  of  the  metabolically modified heavy metal-resistant Cupriavidus metallidurans strains MSR33 generated for mercury bioremediation. PLoS ONE , 6 : 1-1
Sambrook,  J  dan  Russel,  I.,  2001. Molecular Cloning,  A  Laboratory  Manual,  Third Edition,  Volume  2. Cold  Spring  Harbor Laboratory Press, New York.
Sezonov, G., Joseleau, D dan D’Ari, R. 2007. Escherichia coli Physiology in Luria- Bertani Broth. Journal of Bacteriology .
(189)23 : 8746–8749
Sato, Y., Kumazawa, N., Yoshikawa, K., dan Kurusu,  Y.  2005.  Transformation  of Escherichia  coli Mediated  by  Natural Phospholipids.
Silitonga,  Y.  2016.  Resistensi Cronobacter
Sakazakii Terhadap  Ampisilin  dan Hubungannya  dengan  Stabilitas  dan Ekspresi Gfpuv [tesis]. Sekolah Pascasarjana IPB, Bogor. Tanio,  E.  2017.  Efisiensi  transformasi plasmid pTa7002- AtRKD4 pada Escherichia  coli  BL21(DE3) dengan metode kejutan panas [skrpisi]. Universitas Atmajaya, Yogyakarta.
Wang,  J.,  Feng,  X.,  Anderson,  C.,  Xing,  Y., Shang,  L.  2012.  Remediation  of mercury  contaminated sites  -  A review. Journal  of  Hazardous  Materials .  ( 221- 222) : 1-18