## Pengaruh Protein RPGRIP1L pada Pembentukan Silia Primer sebagai Kandidat Target Terapi Gen Penyakit Siliopati

## Ivanna Williantarra
Program Studi Bioteknologi, Indonesia International Institute for Life Sciences, Jakarta Timur, Indonesia

## ABSTRAK
Silia primer yang pada mulanya dianggap sebagai organel tanpa fungsi khusus, ternyata saat ini diketahui merupakan pusat koordinasi berbagai jalur transduksi sinyal sel. Salah satu penyakit siliopati dengan manifestasi klinis terberat adalah sindrom Meckel (MKS) dan sindrom Joubert (JBTS). Kedua sindrom ini disebabkan oleh absennya protein RPGRIP1L pada zona transisi silia primer. Penelitian ini bertujuan melihat pentingnya peran RPGRIP1L dalam ciliogenesis . RPGRIP1L diredam ekspresinya dan diperiksa pengaruhnya terhadap: (1) frekuensi ciliogenesis , (2) tingkat ekspresi protein pada jalur sinyal Hedgehog, dan (3) lokalisasi protein silia primer lainnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa absennya RPGRIP1L menurunkan frekuensi ciliogenesis hingga 46%. Turunnya frekuensi ciliogenesis ini bukan disebabkan karena turunnya tingkat ekspresi protein silia primer, melainkan kesalahan lokalisasi; hanya protein yang terlibat pada proses awal ciliogenesis sebelum pembentukan zona transisi yang terlokalisasi dengan tepat tanpa adanya RPGRIP1L. Tidak terekrutnya protein di silia primer mengindikasikan fungsi RPGRIP1L sebagai perancah bagi  protein-protein  silia  primer  lainnya.  Selain  itu,  tanpa  adanya  RPGRIP1L,  aksonema  tidak  dapat  tumbuh  dari  sentriol  walaupun  protein selubung sentriol, CP110, telah dilepaskan oleh TTBK2.
Kata kunci: RPGRIP1L, siliopati, silia primer, zona transisi.

## ABSTRACT
Primary cilia, which has been long considered as a vestigial organelle of little functional importance, is now known as a coordination hub for many signal transduction pathways. Two worst clinical manifestations of ciliopathies are the Meckel (MKS) and Joubert (JBTS) syndrome; Both are caused by the absence of RPGRIP1L protein at the transition zone of primary cilia. This research aims to check the role of RPGRIP1L in ciliogenesis. The effect of RPGRIP1L knockdown towards (1) ciliogenesis frequency, (2) Hedgehog signaling protein expression and (3) localization of other primary cilia proteins were checked using qRT-PCR and immunostaining techniques. It was found that knockdown of RPGRIP1L has caused a 46% reduction of ciliogenesis frequency. The reduction is not due to a lower expression of primary cilia protein, but mis-localization of the proteins; only the proteins which are involved in the early phase of ciliogenesis were correctly localized after RPGRIP1L knockdown, indicating the anchoring function of RPGRIP1L. Moreover, despite the removal of CP110 by TTBK2, the axoneme was not elongated in the absence of RPGRIP1L. Ivanna Williantarra. The Role of RPGRIP1L in the Formation of Primary Cilia as Target Candidate for Gene Therapy in Ciliopathies.
Keywords: Ciliopathies, primary cilia, RPGRIP1L, transition zone.

## PENDAHULUAN
Peran  silia  primer  dalam  transport  protein  di dalam sel menyebabkan silia primer menjadi organel kunci untuk berbagai jalur transduksi sinyal  sel  seperti  jalur  Hedgehog,  Wnt  dan Notch; jalur-jalur transduksi sinyal sel tersebut sangat  penting  dalam  perkembangan  sel kanker.  Silia  primer  dapat  ditemukan  pada hampir semua sel mamalia yang berada dalam fase G1 dan gangguannya akan menyebabkan siliopati,  yaitu  gangguan  perkembangan  sel akibat gangguan pada silia primer. Beberapa contoh  penyakit  siliopati  adalah  sindrom Bardet-Biedl,  sindrom  Joubert,  dan  sindrom Meckel. 1
Sindrom  Meckel  (MKSS)  dan  Jouberts  (JBTS) merupakan  sindrom  dengan  manifestasi klinis  terberat  di  antara  penyakit  siliopati lainnya  ( Gambar 1 ).  Sebagian  besar  janin yang  mengidap  sindrom  Meckel  tidak  dapat bertahan  setelah  dilahirkan.  Sindrom  Meckel ini  disebabkan  oleh  tidak  adanya  protein RPGRIP1L ( Retinitis Pigmentosa GTPase Interacting Protein-1 Like ). RPGRIP1L (homolog dari  MKS-5  dan  NPHP-8)  merupakan  salah satu  protein  pada  zona  transisi  silia  primer. Inaktivasi  gen  RPGRIP1L  menyebabkan kematian tikus pada masa midgestasi dan hal yang  sama  juga  ditemukan  pada  janin  MKS manusia.  Kematian  janin  ini  disebabkan  oleh
kelainan perkembangan otak, hati, ginjal, alat gerak, dan mata. 2
Melihat  besarnya  pengaruh  RPGRIP1L terhadap  manifestasi  klinis  pasien  siliopati, peneliti  berhipotesis  bahwa  protein  ini merupakan  salah  satu  protein  kunci  dalam arsitektur silia primer. Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi pengaruh peredaman ekspresi (knockdown) RPGRIP1L  terhadap frekuensi  pembentukan  dan  perekrutan protein silia primer.

## METODE
Silia  primer  pada  sel  RPE (retina pigment

## HASIL PENELITIAN
ephitelial) digunakan  sebagai  model in vitro pada  penelitian  ini.  Secara  garis  besar, penelitian  dilakukan  dengan  meredam ekspresi  RPGRIP1L  menggunakan  siRNA,  lalu memeriksa  pengaruh  peredaman  tersebut terhadap frekuensi pembentukan silia primer ( ciliogenesis ),  ekspresi  protein  pada  jalur transduksi  Hedgehog,  dan  lokalisasi  protein- protein struktural silia primer ( Gambar 2 ).

## A. Peredaman RPGRIP1L
Peredaman
RPGRIP1L dilakukan
dengan  transfeksi  siRNA  menggunakan Lipofectamine®  RNAiMAX  Reagent  ( Thermo Fisher Scientific ).  Keberhasilan  peredaman dikonfirmasi  dengan  Western  blot  dan  qRT- PCR.  Protein  untuk  Western  blot  diekstrak menggunakan  RIPA buffer dan  dideteksi menggunakan  antibodi  dari  Proteintech®. Ekstraksi  RNA  untuk  RT-PCR  dilakukan menggunakan BCP – phase separation reagent .  RNA  kemudian  ditranskripsi  balik menggunakan reverse transcriptase kit dari Invitrogen.  RT-PCR  dilakukan  menggunakan SuperScript®  qRT-PCR  kit  dengan SYBR green dari  Invitrogen  menggunakan  mesin  RT-PCR dari applied biosystem .
B. Pengaruh peredaman terhadap frekuensi ciliogenesis
Frekuensi ciliogenesis diperiksa menggunakan
mikroskop fluorosensi. Protein GT335 sebagai  penanda  silia  primer  diwarnai  pada sel  dengan  ekspreksi  RPGRIP1L  yang  telah diredam.  Sebagai  penanda  lokasi  sel,  inti  sel diwarnai dengan DAPI. Visualisasi sel dilakukan menggunakan  peranti CellF Imaging System . Hasil  visualisasi  dianalisis  menggunakan peranti  ImageJ  dan  dianalisis  statistik menggunakan peranti GraphPad Prism.

## C. Pengaruh peredaman terhadap ekspresi protein pada jalur transduksi Hedgehog
Analisis  ekspresi  protein  dilakukan  dengan mengekstraksi total RNA menggunakan BCP – phase separation reagent . Total RNA kemudian ditranskripsi  balik  menggunakan reverse transcriptase kit dari  Invitrogen.  qRT-PCR dilakukan  menggunakan  SuperScript®  qRT- PCR kit dengan SYBR green dari Invitrogen dan mesin  dari applied biosystem .  Protein-protein yang diperiksa tingkat ekspresinya adalah Shh, Smo, Patched1, Gli1, Gli2, dan Rab8a. Hasil qRT- PCR  diperiksa  kemaknaannya  secara  statistik menggunakan peranti GraphPad Prism.

## D. Pengaruh peredaman terhadap lokalisasi protein struktural silia primer
Analisis lokalisasi protein struktural silia primer juga  dilakukan  menggunakan  mikroskop fluoresensi,  sama  seperti  analisis  frekuensi ciliogenesis .  Protein-protein  yang  diperiksa
adalah:  TCTN2,  NPHP4,  dan  TMEM67  yang mewakili  protein  struktural  zona  transisi; ARL13B dan IFT88 yang mewakili protein pada membran  silia;  CEP162,  CEP164,  dan  CEP290 yang mewakili protein pada tubuh basal ( basal body) ; TTBK2 dan CP110 yang merupakan dua protein penting pada awal proses ciliogenesis .

## HASIL
Baik  hasil  Western  blot  maupun  qRT-PCR mengkonfirmasi  keberhasilan  peredaman ekspresi  RPGRIP1L  pada  sel  RPE (Gambar 2a) .  Hasil  Western  blot  menunjukkan  tidak ada  pita  yang  terdeteksi  pada  sel  yang diredam  ekspresinya,  sedangkan  kontrol menggunakan  sel  galur  murni  menunjukkan pita  dengan  ukuran  130-170  kDa,  sesuai dengan  berat  RPGRIP1L,  yaitu  151  kDa.  Hasil qRT-PCR  mengkonfirmasi  lebih  jauh  hasil peredaman ekspresi secara kuantitatif bahwa ekspresi RPGRIP1L teredam hingga 65% lebih rendah dibandingkan kontrol.
Gambar 2b menunjukkan  hasil  analisis frekuensi ciliogenesis. Didapatkan  bahwa peredaman  ekspresi  RPGRIP1L  menurunkan jumlah  silia  primer  pada  sel  RPE  secara signifikan.  Frekuensi ciliogenesis menurun hingga  46%  apabila  ekspresi  RPGRIP1L diredam.  Hal  ini  menunjukkan  pentingnya ekspresi  RPGRIP1L  terhadap  pembentukan silia primer.
Setelah  mengetahui  dampak  peredaman ekspresi  RPGRIP1L  terhadap  pembentukan struktural  silia  primer,  dampak  peredaman RPGRIP1L  terhadap  fungsi  silia  primer  turut diselidiki.  Silia  primer  diketahui  merupakan lokasi  terjadinya  berbagai  jalur  transduksi sinyal sel, salah satunya adalah jalur Hedgehog. Karena  itu,  pengaruh  peredaman  RPGRIP1L terhadap  ekspresi  protein-protein  jalur transduksi Hedgehog turut diperiksa. qRT-PCR digunakan  untuk  memeriksa  tingkat  ekspresi protein  Hedgehog.  Seperti  ditunjukan  pada Gambar 3, peredaman protein RPGRIP1L tidak berpengaruh terhadap level ekspresi protein- protein pada jalur Hedgehog.
Pengaruh  peredaman  RPGRIP1L  terhadap lokalisasi  protein  silia  primer  juga  turut diperiksa  pada  penelitian  ini.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  peredaman  RPGRIP1L mempengaruhi  lokalisasi  sebagian  besar protein penyusun silia primer, kecuali protein-
Gambar 1 . Manifestasi klinis berbagai penyakit siliopati. (a) Pembengkakan ginjal yang disebabkan tumbuhnya kista pada parenkim ginjal (3), (b) Tumbuhnya struktur ‘gigi geraham’ pada otak, (c) Pembengkakan ginjal pada sindrom NPHP, (d) Pergeseran otak posterior atau occipital encephalocele , dan (e) Gangguan perkembangan alat gerak.
protein pada tubuh basal yang terletak pada dasar silia primer; sebelum zona transisi tempat RPGRIP1L  seharusnya  berada.  Peredaman RPGRIP1L juga tidak mempengaruhi lokalisasi protein TTBK2, protein kinase penting dalam ciliogenesis yang  berfungsi  melepaskan protein  CP110  dari  sentriol  agar  akhirnya sentriol  dapat  berkembang  menjadi  silia primer.  Sesuai  hasil  TTBK2,  hanya  terdeteksi
satu  sinyal  CP110  yang  mengindikasikan protein  tersebut  telah  terlepas  dari  sentriol. Walaupun  CP110  telah  dilepaskan,  proses ciliogenesis tetap tidak berlanjut tanpa adanya RPGRIP1L.  Hasil  pemeriksaan  pengaruh peredaman  RPGRIP1L  terhadap  lokalisasi protein silia primer ditunjukkan pada gambar 4.
Gambar 3 . Dampak peredaman RPGRIP1L terhadap tingkat  ekspresi  protein  pada  jalur  Hedgehog. Protein yang diperiksa adalah Shh, Smo, Patched1, Gli1, Gli2, dan Rab8a relatif terhadap kontrol. Tidak ada  perbedaan  tingkat  ekspresi  yang  signifikan antara sel teredam dan sel galur murni (N=3, n=3, P>0.05 ANOVA).

## PEMBAHASAN
Berdasarkan  rangkaian  eksperimen  ini,  dapat disimpulkan  bahwa  RPGRIP1L  memegang peranan penting dalam proses pembentukan silia  primer  atau ciliogenesis .  Peredaman RPGRIP1L  terbukti  menurunkan  frekuensi ciliogenesis secara  signifikan.  Hasil  penelitian juga  menunjukkan  bahwa  RPGRIP1L  bukan mempengaruhi  ekspresi  gen-gen  protein silia  primer,  melainkan  mempengaruhi transport  protein  menuju  silia  primer.  Hal ini  disimpulkan  berdasarkan  hasil  qRT-PCR yang  tidak  menunjukkan  adanya  perbedaan tingkat  ekspresi  gen  yang  signifikan  untuk protein kunci pada jalur Hedgehog antara sel galur murni dan sel yang teredam. Walaupun tingkat  ekspresi  tidak  berubah,  namun protein-protein silia primer tidak terlokalisasi di sekitar silia primer tempat mereka seharusnya berada.
Tidak  semua  protein  terganggu  lokalisasinya oleh peredaman RPGRIP1L. Lokalisasi protein- protein yang terletak pada dasar silia primer, tepatnya  sebelum  area  zona  transisi,  tidak terganggu,  sedangkan  seluruh  protein  yang berlokasi  pada  dan  setelah  zona  transisi, tempat  seharusnya  RPGRIP1L  berada,  tidak ditemukan berada pada lokasi terkait di mana mereka seharusnya berada.
Silia  primer  merupakan  organel  non-motil yang tumbuh pada sel-sel di fase G1. Arsitektur pada dasar silia primer tersusun atas beberapa bagian:  tubuh basal (atau basal body )  dan zona transisi yang dikelilingi oleh pericentriolar
Gambar 2 .  (a)  Peredaman  RPGRIP1L  dikonfirmasi  dengan  Western  blot  dan  qRT-PCR.  RPGRIP1L  diredam menggunakan  siRNA,  dan  dihantarkan  ke  sel  menggunakan lipofectamine .  TIdak  ada  sinyal  yang  muncul pada perlakuan peredaman RPGRIP1L dibandingkan dengan kontrol peredaman menggunakan siRNA acak yang memunculkan sinyal pada 151 kDa, sesuai dengan berat RPGRIP1L. Hasil ini dikonfirmasi lebih lanjut menggunakan qRT-PCR yang menunjukkan tingkat ekspresi RPGRIP1L relatif lebih rendah hingga 65% antara sel teredam dan sel galur murni (N=4, n=3, P=0,0176, t-test analysis ). (b) Peredaman RPGRIP1L menunjukkan dampak  pada  frekuensi ciliogenesis .  Protein  GT335  (merah;  pemarka  silia  primer)  dan  asam  nukleat  (biru; pemarka inti sel) diwarnai pada sel RPE yang telah teredam dan dibandingkan dengan sel RPE galur murni. Hasil  pewarnaan  sel  galur  murni  ditunjukkan  pada  panel  atas,  sedangkan  sel  teredam  pada  panel  bawah dengan perbesaran 40x. Panah putih mengindikasikan keberadaan silia primer. Peredaman RPGRIP1L telah mengurangi frekuensi ciliogenesis hingga 46%. (N=3, n=10, P<0.0001, t-test analysis ).

## HASIL PENELITIAN
matrix dengan  lebih  dari  250  protein diperkirakan  terlibat  dalam  pembentukan silia primer. Zona transisi tersusun atas modul MKS dan NPHP. Aksonema yang tersusun atas
mikrotubulus  tumbuh  dari  dasar  silia  primer membentuk kerangka silia primer. 7 Aksonema ini  merupakan  jalur  bagi  berbagai  protein motor,  seperti  kinesin  dan dynein, lalu  lalang
mentransport  protein  di  dalam  sel. 8 Gambar 5 menunjukkan arsitektur silia primer pada sel mamalia. 1
Tidak  terekrutnya  protein-protein,  kecuali protein  yang  berlokasi  pada  tubuh  basal silia  primer,  mengindikasikan  pentingnya peran  RPGRIP1L  dalam  perekrutan  protein ke  silia  primer.  RPGRIP1L  diduga  memiliki fungsi  penjangkaran  atau anchoring yang berinteraksi dan merekrut protein-protein lain menuju  silia  primer.  Dalam  hal  ini,  RPGRIP1L diduga berfungsi sebagai perancah ( scaffold ) bagi  protein  silia  primer.  Karena  itulah,  tidak terekrutnya  RPGRIP1L  menyebabkan  tidak terlokalisasinya  protein-protein  silia  primer lainnya  dengan  tepat  dan  menyebabkan manifestasi klinis terparah apabila dibandingkan kehilangan protein silia primer lainnya.
Hal  menarik  lainnya  ditemukan  saat memeriksa  pengaruh  peredaman  RPGRIP1L terhadap  protein  TTBK2  dan  CP110.  CP110 merupakan protein yang melekat pada ujung distal sentriol, baik sentriol ibu maupun anak ( mother dan daughter centriole). Adanya CP110 pada ujung sentriol menyebabkan aksonema tidak  dapat  tumbuh  dari  sentriol  untuk membentuk  silia  primer.  TTBK2  merupakan protein  kinase  yang  mampu  memfosforilasi CP110  agar  terlepas  dari  sentriol  dan memungkinkan aksonema bertumbuh membentuk silia primer. Karena itu, fosforilasi CP110  oleh  TTBK2  merupakan  proses  yang kritikal dalam ciliogenesis . 10 Hasil  penelitian  menunjukkan  peredaman RPGRIP1L tidak berpengaruh pada
perekrutan  TTBK2  ke  sentriol.  Yang  menarik, hanya  ditemukan  satu  sinyal  CP110  yang mengindikasikan  CP110  telah  terfosforilasi oleh  TTBK2  dan  terlepas  dari  sentriol  ibu. Walaupun  demikian,  aksonema  tetap  tidak tumbuh  tanpa  adanya  RPGRIP1L.  Hal  ini mengindikasikan  adanya checkpoint atau intermediate state yang  penting  setelah pelepasan CP110 yang perlu terjadi sebelum akhirnya  aksonema  dapat  memanjang membentuk  silia  primer  dan  proses  ini memerlukan  RPGRIP1L.  Fungsi  RPGRIP1L diperkirakan  tidak  hanya  menjadi  perancah dalam  proses  perekrutan  protein-protein silia  primer,  namun  juga  memungkinkan aksonema untuk bertumbuh dari sentriol.
Gambar 4 .  Peredaman  RPGRIP1L  mengganggu  lokalisasi  protein-protein  zona  transisi  dan  membran  silia primer. Protein centrin and tubulin terasetilasi diwarnai sebagai pemarka silia primer (merah), kecuali untuk pewarnaan TCTN2, IFT88, dan ARL13B di mana IFT88 digunakan sebagai pemarka silia primer. Protein target ditunjukan terwarna hijau. Peredaman RPGRIP1L menyebabkan kesalahan lokalisasi protein pada modul NPHP (diwakili oleh NPHP4) dan modul MKS (diwakili oleh TMEM67) zona transisi. TCTN2, NPHP4, dan TMEM67 tidak ditemukan pada zona transisi. Sementara itu, peredaman RPGRIP1L tidak menunjukkan dampak pada lokalisasi protein pada tubuh basal ( distal appendage ) (diwakilkan oleh CEP164, CEP164, dan CEP290). Protein membran ARL13B tidak ditemukan pada sel teredam, sementara protein IFT88 masih terdeteksi pada dasar silia primer, namun  tidak  terelongasi  yang  kemungkinan  disebabkan  karena  tidak  adanya  membran  silia  primer.  Yang menarik, sesuai dengan hasil pewarnaan yang mendeteksi keberadaan TTBK2, CP110 telah dilepaskan dari sentriol, namun ciliogenesis tetap tidak terjadi pada sel RPE dengan RPGRIP1L yang teredam.v
Gambar 5. Struktur silia primer. Silia primer tumbuh dari kantong silia (silia poket) dari sentriol induk ( basal body ). Silia primer tersusun dari intraflagellar transport (IFT) dari tubuh basal. Insert atas menunjukkan hasil mikroskop  elektron  transmisi  (TEM)  pemotongan  longitudinal  silia  primer  dari  fibroblas  embrio  tikus  yang menunjukkan susunan 9 mikrotubulus luar ganda (9+0). 9 Insert bawah menunjukkan hasil TEM pemotongan longitudinal fibroblas manusia. BB: tubuh basal ( basal body ) [140], AX: aksonema ( axoneme ), CP: ciliary pocket. 1
SIMPULAN
RPGRIP1L  merupakan  protein  yang  berperan penting dalam ciliogenesis . Ketiadaan RPGRIP1L tidak  mengganggu  tingkat  ekspresi  protein
silia  primer,  namun  mengganggu  transport protein  menuju  silia  primer.  Diperkirakan, RPGRIP1L  berperan  sebagai  perancah  bagi protein-protein silia primer lainnya. Selain itu,
RPGRIP1L  juga  memegang  peranan  penting dalam memungkinkan aksonema bertumbuh dari sentriol pada fase sel G1.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Veland IR, Awan A, Pedersen, Yoder BK, Christensen ST. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiology 2009;111(3):39-53. doi: 10.1159/000208212.
2.  Delous M, Baala L, Salomon R, Laclef C, Vierkotten J, Tory K, et al. The ciliary gene RPGRIP1L is mutated in cerebelo-oculo-renal syndrome (Joubert syndrome type B) and Meckel syndrome. Nat Genet. 2007;39(7):875-81.
3.  Boucher C, Sanford R. Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD, MIM173900, PKD1 and PKD2 genes, protein products known as polycystin-1 and polycystin-2). Eur J Hum Genet. 2004;12:347-54.
4.  Parisi M. Clinical and molecular features of Joubert syndrome and related disorders. Am J Med Genet C: Semin Med Genet. 2009;151:326-40.
5.  Bergmann  C,  Fliegauf  M,  Brüchle  NO,  Frank  V,  Olbrich  H,  Kirschner  J,  et  al.  Loss  of  nephrocystin-3  function  can  cause  embryonic  lethality,  Meckel-Gruber-like syndrome, situs inversus and renal-hepatic-pancreatic dysplasia. Am J Hum Genet. 2008;82:959-70.
6.  Kumari N. Post -mortem examination of prenatally diagnosed fatal renal malformation. J Perinatal. 2008;28:736-42.
7.  Gerdes JM, Davis EE, Katsanis N. The vertebrate primary cilium in development, homeostasis and disease. Cell. 2009;137:32-45. doi: 10.1016/j.cell.2009.03.023
8.  Lu QL, Insinna C, Ott C, Stauffer J, Pintado PA, Rahajeng J, et al. Early steps in primary cilium assembly require EHD1/EHD3-dependent ciliary vesicle formation. Nature Cell Biology 2015;17(3):228-40. doi: 10.1038/ncb3109.
9.  Kiprilov EN, Awan A, Desprat R, Velho M, Clement CA, Byskov AG, et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 2008;180:897-904.
10.  Oda T, Chiba S, Nagal T, Mizuno K. Binding to Cep164, but not EB1, is essential for centriolar localization of TTBK2 and its function in ciliogenesis. Genes Cells. 2014;19(12):927-40. doi: 10.1111/gtc.12191.