## EFEK EKSTRAK ETHANOL DAUN MIMBA TERHADAP GONADOSOMATIC INDEX (GSI), JUMLAH DAN UKURAN
FOLIKEL ATRESIA PADA MENCIT ( Mus musculus L.) BETINA

## Nurul Hidayah, Agung Janika Sitasiwi, Siti Muflichatun Mardiati
Department of Biology Science and MathematicsFaculty, Diponegoro University, Semarang Corresponding author : nurul.h@student.undip.ac.id

## Abstract
Neem leaves contain flavonoid, triterpenoid and saponin compounds that have antifertility potential to suppress of reproduction rate of rodentia pests. The purpose of this study was to examine the effect of neem leaf ethanol extract  on  gonadosomatic  index  (GSI),  number  and  size  of  atresia  follicles  in  female  mice.  This  study  used  a Completely Randomized Design  Method  consist  of 5 treatments and 4 replications namely K + (Contraceptive Pills); K- (Aqua); P1, P2 and P3 (Treatment of neem leaf ethanol extract at dosage of 8.4 mg / kgBW, 11.2 mg / kgBW and 14 mg / kgBW). The treatment was administered orally at a volume of 0.2 ml / animal every morning for 21 days. Measurement  of body  weight  was conducted at  the beginning of treatment  and every  7 days. The ovaries  were  isolated,  weighed  and  histologically    processed  using  paraffin  method  and  H  &  E  staining.  the number and diameter of  atresia follicles were counted on ovaries. The data was analyzed using ANOVA test and DMRT test at 95% confidence level. The results showed that neem leaf ethanol extract had no significant effect GSI  and  diameter  of  atresia  follicle  but  had  significant  effect  on  the  number  of    atresia  follicle.  It  can  be concluded that neem leaf ethanol extract can increase the number of atresia follicle in mice by suppressing the synthesis and action of reproductive hormone.
Keywords: mimba leaf, atresia follicle, GSI, mice

## PENDAHULUAN
Mimba  mengandung  senyawa  yang berpotensi  sebagai  antifertilitas,  baik  pada hewan  jantan  maupun  betina  sehingga dapat digunakan untuk menekan pertumbuhan  populasi  hewan  tersebut (Suryawanshi,  2011;  Auta  dan  Hassan, 2016). Daun mimba mengandung senyawa flavonoid,  triterpenoid  dan  saponin  yang berpotensi  sebagai  antifertilitas  (Aradilla, 2009;  Suryawanshi,2011;Auta  dan  Hasan,
2016). Saponin digunakan   sebagai   bahan dasar      sintesis  beberapa  hormon  steroid untuk  bahan  kontrasepsi  oral  (Apolonia dan  Sukarjati,  2017).  Flavonoid  bersifat estrogenik  yang  dapat  menempati  reseptor
estrogen  yang  berada  di  dalam  tubuh (Satyaningtijas dkk., 2014).
Mekanisme kerja senyawa antifertilitas  dengan  cara  menghambat ovulasi dapat  diketahui  dengan  melihat perkembangan  folikel  (Rusmiati,  2010). Perkembangan  folikel  dapat  ditentukan dengan  pengukuran  diameter  folikel. Folikel  dapat  berkembang  menjadi  folikel dominan  untuk  diovulasikan  atau  menjadi folikel  non  dominan  atau  folikel  atresia (Trissatharra  dkk.,  2016).  Roop et  al.
(2005)  menyatakan  bahwa  pemberian ekstrak  biji  mimba  secara  oral  dapat mengurangi  jumlah  rata-rata  folikel  pada tikus  betina.  Penelitian  Alfian  dkk.(2017) juga menunjukkan  bahwa  pemberian
senyawa  antifertilitas  dapat  menurunkan jumlah  folikel  de  Graaf  pada  ovarium mencit betina.
Penelitian  Gbotolorun et  al .  (2008)
dan  Roop et  al. (2005)  menunjukkan
bahwa ekstrak daun mimba dapat mengurangi bobot ovarium, tingkat ovulasi,    menghambat  folikulogenesis  dan pembentukan antrum dalam folikel.
Perkembangan  oosit  di  dalam  ovarium seiring dengan perkembangan bobot gonad dapat meningkatkan nilai GSI (Hutagalung dkk.,  2015). Gonadosomatic  Index (GSI)
adalah  berat  relatif  gonad  terhadap  berat tubuh  yang  digunakan  untuk  memprediksi jumlah  anakan  yang  dihasilkan  (Flores et al.,
2015; Setyaningrum dan Wibowo,2016). Berlatar  belakang  masalah  tersebut
dilakukan  penelitian    tentang  pengaruh
kandungan ekstrak daun mimba
( Azadirachta indica Juss) terhadap gonadosomatic  index (GSI),  jumlah  dan ukuran  folikel  atresia  pada  mencit  betina.
Penelitian    ini  bertujuan  untuk  menguji pengaruh  ekstrak  ethanol  daun  mimba ( Azadirachta indica Juss) terhadap
gonadosomatic  index (GSI),  jumlah  dan ukuran  folikel  atresia  pada  mencit  betina. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan  informasi  ilmiah  tentang pengaruh  ekstrak  ethanol  daun  mimba terhadap  organ    reproduksi  mencit  betina
sehingga  dapat  dijadikan  rujukan  tentang manfaat  daun  mimba  untuk  menekan reproduksi hama rodentia.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  dilaksanakan  selama dua  bulan  di  Laboratorium  Biologi Universitas Diponegoro Semarang.
Rancangan  penelitian  yang  digunakan Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  yang terdiri dari 5 perlakuan dan 4 ulangan.

## Persiapan hewan uji
Mencit  betina  galur  Swiss  Webster yang  berumur  2,5  bulan  dengan  bobot badan  20-25  g  diaklimasi  pada  kondisi laboratorium selama 7 hari dalam kandang agar  dapat  beradaptasi  dengan  kondisi lingkungan  yang baru.  Kandang hewan uji berupa kotak plastik berukuran 35 cm x 25 cm yang dilengkapi dengan penutup kawat ram berukuran 40 cm x 60 cm, sekam padi, tempat pakan dan tempat minum (Saputro, 2016).  Pemberian  pakan  standar  HI-PRO- VITE Medicated 594 dan minum dilakukan secara ad libitum .

## Ekstraksi Daun Mimba
Sampel  daun  mimba  yang  akan digunakan  berupa  sampel  segar  yang diperoleh  dari  kawasan  kampus  FSM UNDIP.  Sampel  segar  dibersihkan  dan dikeringkan menggunakan oven selama ± 7 hari.    Daun  yang  sudah  kering  kemudian dihaluskan dengan blender. Metode
ekstraksi didasarkan pada penelitian
Sitasiwi et al. (2017).  Ekstraksi dilakukan dengan  mencampurkan  100  g  sampel dengan  1000  ml  etanol  70%.  Larutan diaduk  secara  teratur  dan  didiamkan  pada suhu  ruang  selama  24  jam.  Ekstrak kemudian  dipekatkan  dengan  evaporator sampai  didapatkan  hasil  akhir  dalam bentuk serbuk.

## Persiapan Bahan Uji
Dosis  ekstrak  daun  mimba  yang
diberikan mengacu pada penelitian
Sitasiwi et al. (2017) adalah 8,4 mg/kgBB,
11,2  mg/kgBB  dan  14  mg/kgBB  yang dilarutkan dalam 10 ml air hangat. Larutan diberikan  secara  oral  dengan  volume  0,2 ml/mencit  yang  mengandung  ekstrak  daun mimba  0,168  mg;  0,224  mg  dan  0,28  mg.
Pembuatan  sediaan  pil  kontrasepsi  dengan dasar  konversi  dosis  manusia  ke  mencit sebesar 0,00261 (Laurence dan Bacharach, 1964).  Berdasar  angka  konversi  tersebut, dosis untuk mencit ditentukan dengan cara mengencerkan 1 tablet (79,8 mg) ke dalam 7,16 ml akuades.

## Pemberian Perlakuan dan Pengamatan
Perlakuan  diberikan  secara  oral dengan volume 0.2 ml/ekor setiap pagi hari
(08.00  –  10.30  WIB)  selama  21  hari.
Selama  perlakuan  dilakukan  pengamatan konsumsi  minum  (setiap  hari),  konsumsi pakan  (setiap  3  hari)  dan  bobot  badan (setiap  7  hari).  Pembedahan  mencit  dan
isolasi  organ  ovarium  dilakukan  pada  hari ke-  22,  kemudian  dilakukan  penimbangan bobot  dan  pembuatan  sediaan  histologis ovarium  mencit.  Pengamatan  preparat dilakukan  dengan  fotomikrograf  untuk menghitung  jumlah  folikel  atresia  pada perbesaran  100x  dan  diameter  folikel atresia  pada  perbesaran  400x.  Pengukuran GSI dihitung sesuai rumus menurut Naghdi et al . (2016) sebagai berikut.
Keterangan:
GSI = gonadosomatik indeks (%),
BG = bobot gonad (g),
BB = bobot tubuh (g)

## Analisis Data
Data  bobot  badan,  bobot  ovarium, GSI,  jumlah  dan  diameter  folikel  atresia dianalisis  dengan  uji  One  way  ANOVA pada taraf kepercayaan 95%.  Analisis data jumlah  folikel  atresia  dilanjutkan  dengan uji Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) pada  taraf  kepercayaan  95%. Analisis  data menggunakan  program  SPSS  ( Statistical Product  of  Service  Solution )for  Windows versi 20.0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  analisis  data  penelitian  dari pemberian  ekstrak  ethanol  daun  mimba terhadap  GSI,  jumlah  dan  folikel  atresia mencit  betina  ditunjukkan  pada  Tabel  1.
GSI = x 100
Hasil  ANOVA  gonadosomatik  indeks (GSI)  mencit  betina  menunjukkan  tidak
terdapat perbedaan yang signifikan
(p>0,05)  antara  perlakuan  ekstrak  daun mimba  dengan  kelompok  kontrol.  Rerata GSI pada masing-masing perlakuan memiliki  nilai  yang  hampir  sama.  Hasil tersebut  menunjukkan  bahwa ekstrak  daun mimba  tidak  memengaruhi  nilai  GSI  pada mencit betina.
Hasil  ANOVA  terhadap  jumlah folikel  atresia  ovarium  mencit  betina menunjukkan  terdapat  perbedaan  yang signifikan (p<0,05) antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan ekstrak daun mimba. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak daun mimba dapat menyebabkan  hambatan  perkembangan folikel  yang  dibuktikan  dengan  adanya peningkatan  jumlah  folikel  atresia.Uji lanjut  Duncan  menunjukkan  yaitu  tidak terdapat perbedaan yang signifikan (P>0,05)  antara  kelompok  K(-)  dengan perlakuan P1 dan P2, kelompok K(+) tidak terdapat perbedaan yang signifikan
(p>0,05)  dengan  perlakuan  P2  dan  P3.
Jumlah folikel atresia pada ovarium mencit betina  mengalami  peningkatan  seiring dengan  peningkatan  dosis  ekstrak  daun mimba  yang  diberikan.  Hal  ini  dapat diduga bahwa kematian folikel disebabkan oleh  senyawa  antifertilitas  dari  ekstrak ethanol daun mimba.
Hasil  ANOVA  ukuran  diameter folikel  atresia  menunjukkan  tidak  terdapat perbedaan  yang  signfikan  (p>0,05)  antara kelompok kontrol dengan perlakuan ekstrak  daun  mimba.  Berdasarkan  hasil tersebut, dapat diasumsikan bahwa pemberian  ekstrak  daun  mimba  tidak memengaruhi  ukuran  diameter  folikel atresia pada mencit betina.
Gonadosomatic index (GSI)
merupakan  salah  satu  faktor  penting  yang memengaruhi  reproduksi  (Adebayo et  al.,
2009).  Penurunan  gonadosomatik  indeks akan memiliki konsekuensi pada fekunditas dan tingkat kesuburan (Oluwatoyin et  al., 2013).  Nilai  GSI  yang diperoleh dari penelitian ini adalah 0,155 – 0,207 %. Hasil penelitian Wu et al. (2015)
menunjukkan bahwa nilai GSI pada mencit betina  galur  Balb/c  yang  berumur  6  bulan kelompok kontrol adalah sekitar 0,0458 % dan hasil penelitian Singh dan Lata (2015) yang  menunjukkan  nilai  GSI  pada  mencit betina galur Parke berumur 3 bulan adalah
1,6  %.  Adebayo et  al. (2009)  menyatakan
bahwa    gonadosomatik  indeks  diukur  dari berat gonad per berat badan dan dipengaruhi  oleh  jenis  spesies,  umur  serta musim kawin.
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan peningkatan  jumlah  folikel  atresia  seiring dengan  peningkatan  dosis  ekstrak  ethanol daun mimba yang diberikan. Folikel atresia
Tabel    1. Rerata  GSI,  jumlah  dan  diameter  folikel  atresia  mencit  betina  setelah  pemberian  ekstrak daun mimba selama 21 hari
Keterangan  :  Angka  yang  diikuti  oleh  superskrip  yang  sama  pada  baris  yang  sama  menunjukkan perbedaan tidak signifikan (p>0,05). K(+): kontrol dengan sediaan pil kontrasepsi, K(-): kontrol dengan pelarut air, P1: perlakuan dengan ekstrak ethanol daun mimba dosis 8,4 mg/kgBB,  P2:  perlakuan  dengan  bahan  uji  dosis  11,2mg/kgBB,  P3:  kelompok perlakuan dengan bahan uji dosis 14 mg/kgBB.
merupakan  kondisi  folikel  yang  tidak sempurna atau rusak selama masa perkembangannya  (Mastuti  dan  Ciptono, 2017).  Hasil  penelitian  Trissatharra  dkk.
(2016)  menunjukkan  bahwa  rerata  jumlah folikel  atresia  mencit  betina  kelompok kontrol berkisar antara 1-9. Hasil penelitian  ini  menunjukkan  jumlah  folikel atresia  pada  kelompok  kontrol  negatif masih  dalam  kisaran  normal  yaitu  8.75± 5,56  dan  semakin  meningkat  seiring peningkatan  dosis  ekstrak  daun  mimba yang  diberikan.  Hal  ini  diduga  karena senyawa  antifertilitas  yang  terkandung dalam  ekstrak  ethanol  daun  mimba  dapat mengganggu perkembangan folikel sehingga terbentuk folikel atresia.
Ekstrak  daun  mimba  memiliki potensi sebagai antifertilitas (Sharma et al.,
2013).  Daun  mimba  memiliki  kandungan senyawa flavonoid, tritepenoid dan saponin (Handayani, 2011; Apolonia dan Sukarjati, 2017). Flavonoid mempunyai efek estrogenik  yaitu  dapat  bekerja  seperti estrogen  karena  dapat  berikatan  dengan reseptor  estrogen  (Satyaningtijas  dkk.,
2014).  Flavonoid  merupakan  fitoestrogen yang  paling  kuat  (Resende et  al. ,  2013).
Fitoestrogen  dapat  menyebabkan  estrogen alami  tidak  dapat  berikatan  dengan reseptornya dan akan meningkatkan jumlah estrogen bebas dalam darah (Liu et al .,  2013).  Kadar  estrogen  yang  tinggi  di dalam  darah  dapat  menyebabkan  sekresi FSH  terhambat  sehingga  perkembangan folikel  di  dalam  ovarium  juga  terhambat. Perkembangan  folikel  yang  terhambat  ini
Parameter Perlakuan K(+) K(-) P1 P2 P3 ± SD ± SD ± SD ± SD ± SD GSI (%) ±0,04 ±0,07 ±0,05 ±0,05 ±0,04 Jumlah Folikel Atresia ±8,73 ±5,56 ±8,89 ±6.93 ±8,58 Diameter Folikel Atresia (µm) ±35,09 ±30.04 ±26,49 ±12,42 ±12,58
akan  menyebabkan  terbentuknya  folikel atresia (Rejeki dkk., 2017).
Triterpenoid dan saponin juga dapat menyebabkan  efek  sitotoksik  Satriyasa
(2016). Senyawa triterpenoid yang memberikan efek sitotoksik dapat mengganggu  metabolisme  sel  germinal (Wijayanti  dkk.,  2016).  Saponin  dapat mengaktifkan jalur apoptosis secara intrinsik  maupun  ekstrinsik,  menahan siklus  sel  dan  memicu  autofagositosis (Tussanti  dkk.,  2014).Saponin  bersifat sitotoksik  terhadap  sel  terutama  yang sedang  mengalami  perkembangan  seperti pada saat oogenesis  (Nurliani, 2007;  Laili, 2016). Sifat sitotoksik  dari  ekstrak  daun
mimba  menyebabkan  struktur  dan  fungsi sel  granulosa  terganggu.  Sel  granulosa yang mengalami gangguan juga menyebabkan sintesis hormon 17-β-
estradiol terganggu (Asif, 2013; Sitasiwi et al., 2017).  Apoptosis  yang  terjadi  pada lapisan  sel  granulosa  menyebabkan  folikel tidak mencapai tahap ovulasi dan menyebabkan  terbentuknya  folikel  atresia (Li, et al., 2016).
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan bahwa  pemberian  ekstrak  ethanol  daun mimba tidak memengaruhi ukuran diameter  folikel  atresia.  Rerata  diameter folikel  atresia  yang  diperoleh  berkisar antara  101,88  –  134,17  µm.  Hasil  tersebut
menunjukkan bahwa rerata diameter folikel  atresia  memiliki  ukuran  yang  sama dengan folikel antral. Hal ini diduga karena senyawa  estrogenik  dari  ekstrak  ethanol daun  mimba  hanya  memengaruhi  folikel antral,  sedangkan  folikel  pada  masa  awal perkembangan tidak terpengaruh.
Baerwald et  al. (2009)  menyatakan  bahwa perkembangan  folikel  preantral  lebih dipengaruhi oleh nutrisi daripada gonadotropin,  sedangkan  perkembangan folikel sekunder dan tersier lebih dipengaruhi  oleh  stimulasi  gonadotropin. Hasil tersebut diperkuat dengan pernyataan Orisaka et  al. (2009)  yaitu  atresia  atau apoptosis sel granulosa tampak jelas dalam fase  preantral  dan  awal  folikel  antral. Tahap transisi dari preantral ke awal antral adalah fase folikel yang rentan mengalami atresia.
Fase  transisi  folikel  preantral  ke folikel  antral,  androgen  memiliki  peran yang  lebih  penting  daripada  estrogen (Drummond,  2006)  Androgen  berfungsi untuk  merangsang  pertumbuhan  folikel preantral  dan  mitosis  sel  granulosa, meningkatkan  kerja  FSH  di  dalam  folikel dengan cara meningkatkan ekspresi reseptor  FSH,  aktivitas  aromatase  sel granulosa yang  diinduksi FSH  dan proliferasi serta pertumbuhan folikel (Cardinas et al., 2002). Androgen
disintesis  di  sel  teka  yang  distimulasi  oleh
LH  dan  reseptor  androgen  paling  tinggi terdapat  pada  fase  preantral  dan  awal folikel antral (Orisaka et al. , 2009).

## KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa  ekstrak  ethanol  daun  mimba  dapat meningkatkan jumlah folikel atresia namun tidak  memengaruhi  GSI  dan  ukuran
diameter  folikel  atresia  pada  mencit  ( Mus musculus L.) betina.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian ini didanai oleh Fakultas
Sains dan Matematika Universitas
Diponegoro  melalui  No.042.01.2.400898  /
2016  DIPA  Research  Grant  pada  tahun
2016.

## DAFTAR PUSTAKA
Adebayo  AO,  B.O.  Oke,  dan  A.  K. Akinloye.  2009.  Characterizing  the gonadosomatic index and its relationship  with  age  in  greater  cane rat (thryonomys swinderianus,
temminck). J. Vet. Anatomy 2(2): 53 – 59.
Alfian  MAJ.,  A.J.  Sitasiwi,  dan  M.A.
Djaelani.  2017.  Efek  antifertilitas ekstrak air biji pepaya (carica papaya l.)  terhadap  jumlah  dan  diameter folikel de graaf mencit (mus musculus) betina. Jurnal Pro-Life (1) : 476-486.
Apolonia M. dan Sukarjati. 2017. Pengaruh  ekstrak  biji  pepaya  (carica papaya  l.)  dan  ekstrak  daun  mimba (azadirachta indica a.juss) dan campuran ekstrak biji pepaya (carica papaya  l.) dan  ekstrak  daun  mimba (azadirachta  indica  a.juss) terhadap diameter    tubulus    seminiferus,    sel leydig  dan  bobot  testis  mencit  (mus musculus). Stigma Journal of Science 10 (1): 5-11.
Aradilla AS. 2009. Uji efektifitas larvasida ekstrak  ethanol  daun  mimba  (a. Indica)  terhadap larva  aedes  aegypti. Semarang: Universitas Diponegoro.
Asif  M.  2013.  A  review  on  spermicidal activities  of  azadirachta  indica.
Journal  of  Pharmacognosy  and Phytochemistry 1(5): 61-80.
Auta T. and A.T. Hassan. 2016.
Reproductive  toxicity  of  aqueous wood-ash  extract  of  (neem)  –  a review. Annals of Biological
Researc. 1(2) : 108-113.
Baerwald  AR,  R.A.  Walker,  dan  R.A.
Pierson.  2009.  Growth  rates  of ovarian  follicles  during  natural menstrual  cycles,  oral  contraception cycles and ovarian stimulation cycles. Fertility  and  Sterility 91(2)  :
440-449. Cardenas H, J.R. Herrick, dan W.F.  Pope. 2002.  Increased  ovulation  rate  in gilts treated with dihydrotestosterone. Reproduction 123:527-33.
Drummond AE. 2006. The role of steroids in  follicular  growth. Reprod  Biol Endocrinol 4(16).
Flores  A,  R.  Wiff,  and  E.  Díaz.  2015.
Using  the  gonadosomatic  index  to estimate the maturity ogive: application to chilean hake (merluccius gayi gayi). ICES Journal of Marine Science , Volume 72, Issue 2, Pages 508–514.
Gbotolorun  SC,  A.A.  Osinubi,  C.C. Noronha,  dan  A.O.  Okanlawon.
2008. Antifertility potential of neem flower  extract  on  adult  female sprague-dawley  rats. African  Health Sciences 8 (3) : 168-173.
Handayani SM, M. Djatmiko, dan Y. Anas. 2011. Uji aktifitas reppelant fraksi n- heksana ekstrak etanolik daun mimba terhadap  nyamuk  aedes  aegypti. Skripsi . Universitas Sumatera Utara.
Hutagalung  RA,  M.S.  Widodo,  dan  A.R.
Faqih. 2015. Evaluasi aplikasi hormon pmsg terhadap indeks gonadosomatik dan indeks hepatosomatik  ikan  gabus. Jurnal
Akuakultur Indonesia 14(1): 24-29.
Laili  NDH,  T.  Nofianti,  dan  F.I.  Sari. 2016.  Uji antifertilitas ekstrak etanol daun  srikaya  (annona  squamosa  l.) terhadap mencit putih betina bunting galur swiss webster . Jurnal
Kesehatan Bakti Tunas Husada 13(1)
: 51-55.
Laurence  DR.  dan  A.L.  Bacharach.  1964.
Evaluation of Drug Activities: Pharmacometrics . London:
Academic Press.
Li  J,  H.Gao,  Z.Tian,  Y.  Wu,  Y.  Wang,  Y.
Fang,  L.  Lin,  Y.Han,  S.  Wu,  I.  Haq, dan S. Zeng. 2016. Effects of chronic heat stress on granulosa cell apoptosis  and  follicular  atresia  in mouse  ovary. Journal  of  Animal Science  and  Biotechnology (2016) 7:57.
Liu T, D.  Hou, Q.  Zhao, W.  Liu, P.  Zhen,
J. Xu, K. Wang, H. Huang, X. Li, H. Zhang,  H.  Xu,  dan  W.  Wang.  2013. Phytoestrogen 𝛼 -zearalanol attenuates homocysteine-induced apoptosis  in  human  umbilical  vein endothelial  cells. BioMed  Research International 2013 : 1-12.
Mastuti RQD dan Ciptono. 2017. Pengaruh pemberian  ekstrak  kacang  merah (phaseolus  vulgaris,  l.)  terhadap perkembangan  folikel  ovarium  tikus putih  (rattus  norvegicus,  l.). Jurnal Prodi Biologi UNY 6 (3): 131-141.
Naghdi  M,  M.  Maghbool,  M.S.  Zade,  M.
Mahaldashtian,  Z.  Makoolati,  S.A.
Kouhpayeh,  A.Ghasemi,  and  N. Fereydouni. 2016. Effects of common  fig  (ficus  carica)  leaf extracts  on  sperm  parameters  and testis  of  mice  intoxicated  with formaldehyde. Hindawi  Publishing
Corporation Evidence-Based Complementary and Alternative
Medicine Vol. 2016 p : 1-9.
Nurliani  A.  2007.  Penelusuran  potensi antifertilitas  kulit  kayu  durian  (durio zibethinus  murr.)  melalui  skrining fitokimia. Journal Sains dan
Terapan Kimia 2(1): 53-58. Oluwatoyin  AO,  O.  M.  Olugbenga,  F.  A.
Peter, dan O. David. 2013.
Gonadosomatic  index  of  female wister  rats  treated  with  graded concentration  of  aloe  vera  gel.
Journal of Medicinal Plants Research 7(7) : 339-342 Orisaka M, K. Tajima, B.K. Tsang, dan F. Kotsuji.  2009.  Oocyte-granulosa-
theca cell interactions during preantral follicular development. Journal of Ovarian Research 2 ( 9): 1-
7.
Resende  FA,  A.P.S.  Oliveira,  M.S.
Camargo,  W.  Vilegas,  dan  E.A.
Varanda. 2013. Evaluation of estrogenic  potential  of  flavonoids using  a  recombinant  yeast  strain and mcf7/bus  cell  proliferation  assay. PLOS ONE 8 (10) : 1-7.
Rusmiati  R.  2010.  Pengaruh  ekstrak metanol  kulit  kayu  durian  (durio zibethinus murr) pada struktur mikroanatomi  ovarium  dan  uterus mencit  (mus  musculus  l)  betina. Sains dan Terapan Kimia , 4(1) : 29 – 37.
Roop JK, P.K.  Dhaliwal and S.S. Guraya. 2005.  Extracts  of  azadirachta  indica and  melia  azedarach  seed  inhibit folliculogenesis in albino rats.
Brazilian  Journal  of  Medical  and Biological Research 38 : 943-947.
Saputro  RW.  2016.  Respon  histologi hipokampus  tikus  wistar  stress setelah  perlakuan  suplemen  daging ikan  gabus  (channa  striata)  dalam pakan. Skripsi . Universitas Diponegoro, Semarang. Satriyasa BK. dan W. I. Pangkahila. 2010. Fraksi  heksan  dan  fraksi  metanol ekstrak biji pepaya muda menghambat  spermatogonia  mencit (mus musculus) jantan. Jurnal
Veteriner 11: 36-40.
Satyaningtijas  AS,  H.  Maheswari,  P.
Achmadi,  W.A.  Pribadi,  S.  Hapsari, D.  Jondriatno,  I.  Bustaman,  dan  B. Kiranadi.  2014.  Kinerja  reproduksi tikus  bunting  akibat  pemberian ekstrak  etanol  purwoceng. Jurnal Kedokteran Hewan 8(1) : 35-37. Setyaningrum  N. dan E.S. Wibowo. 2016. Potensi  reduksi  ikan  air  tawar sebagai  baby  fish. Biosfera 33  (2)  : 85-91.
Sharma  P,  A.  Sharma,  M.Agarwal,  dan
S.C.  Joshi.  2013.  A  review  on antifertility  efficacy  of  plants  in males. Int J Pharm Bio Sci 4(4): 413 – 428.
Singh  S.  dan  S.  Lata.  2015.  Effect  of exposure  to  di-butyl  phthalate  on reproductive  physiology  in  adult female  mouse. IJPSR 6(11):  4788- 4795.
Sitasiwi  AJ,  S.  Isdadiyanto,  dan  S.M. Mardiati.  2017.  The  estradiol  17-β concentration  in  mice  after  treated with  ethanolic  leaf  extract  of azadirachta indica (neem). Proceeding of International Conference  on  Global  Resource  and Conservation. Sitasiwi  AJ.  2018.  Bobot  badan  mencit (mus  musculus  l.)  setelah  pemberian ekstrak ethanol daun nimba (azadirachta  indica)  secara  oral
selama 21 hari. Buletin Anatomi dan Fisiologi 3 (1) : 133-139.
Suryawanshi  JAS.  2011.  Neem-  natural contraceptive for male and female an overview. Int.J.Biomol  and  Biomed 1:1-6.
Resende  FA,  A.P.S.  Oliveira,  M.S. Camargo,  W.  Vilegas,  dan  E.A.
Varanda. 2013. Evaluation of estrogenic  potential  of  flavonoids using  a  recombinant  yeast  strain and mcf7/bus  cell  proliferation  assay. PLOS ONE 8 (10) : 1-7.
Rejeki  RT,  T.  Harjana  dan  Sukiya.  2013. Pengaruh ekstrak daun kenari (canarium  indicum,  l.)  terhadap perkembangan  folikel  ovarium  tikus putih  betina  (rattus  norvegicus,  l.). Jurnal  Prodi  Biologi  UNY 6  (3)  : 194-203.
Trissatharra  A,  S.R.  Dwiningsih  dan  R.S.
Munir.  2016.  Pengaruh  monoklonal antibodi  bovine  zona  pelusida  3 (bzp3)  terhadap  diameter  dan  atresia folikel ovarium mencit (mus musculus). Majalah  Obstetri  &
Ginekologi 24(1): 37-42.
Tussanti  I,  A.  Johan  dan  Kisdjamiatun. 2014.   Sitotoksisitas in vitro ekstrak etanolik  buah  parijoto  (medinilla speciosa,  reinw.ex  bl.)  terhadap  sel kanker  payudara  t47d. Jurnal  Gizi Indonesia 2(2): 53-58.
Wijayanti  DN,  S.Muslichah  dan  E.
Puspitasari.  2016.  Pengaruh  ekstrak metanol  biji  pepaya  tua  dan  ekstrak metanol  biji  pepaya  muda  (carica papaya  l.)  terhadap  kualitas  dan kuantitas  spermatozoa  tikus  putih jantan  (rattus  norvegicus). Jurnal Pustaka Kesehatan 4(3) :495-500. Wu  J,  M.  Yuan,  Y.  Song,  F.Sun  and  X. Han.  2016.  Mc-lr  exposure  leads  to subfertility  of  female  mice  and induces  oxidative  stress  in  granulosa cells. Toxins 5(7): 5212–5223.