## STUDI BIOINFORMASI URUTAN ASAM AMINO DAN STRUKTUR 3D PROTEIN ALDOLASE KELAS II (AldII) DARI Uncultured Acidilobus sp.
Nishia Waya Meray *1,2 , Suharti 2,3 , Akhmaloka 2
1 Program Studi Farmasi, Universitas Mulia
2 Tim Penelitian Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Bandung
3 Program Studi Kimia, Fakultas Sains dan Ilmu Komputer, Universitas Pertamina
* email : nishia@universitasmulia.ac.id
Received 1 November 2021 Accepted 9 Desember 2021

## Abstrak
Pada penelitian sebelumnya fragmen gen 1,9 kb telah berhasil diisolasi dari Kawah Domas, Jawa  Barat  melalui  pendekatan  metagenom.  Fragmen  tersebut  diketahui  mengandung daerah Open  Reading  Frame (ORF)  utuh  dari  gen  pengkode  aldolase  kelas  II  dari uncultured Acidilobus sp. yang kemudian disebut sebagai aldII. Fragmen gen aldII tersebut berhasil diekspresikan menjadi protein termostabil aldolase kelas II yang kemudian disebut sebagai AldII. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan studi bioinformasi terhadap protein AldII  tersebut.  Protein  AldII  kemudian  diketahui  memiliki  massa  molekul  ~21,2  kDa dengan  rumus  molekul  C 940 H 1539 N 261 O 281 S 8 .  Total  residu  bermuatan  negatif  (Asp  +  Glu) sebanyak 22 residu, sedangkan total residu bermuatan positif (Arg + Lys) adalah 18 residu. Nilai pI teoritis AldII sebesar 5,86. Hasil perhitungan indeks kestabilan protein ini adalah 36,61 dan diklasifikasikan sebagai protein yang stabil. Lewat penjajaran dengan homologi terdekat, ditemukan daerah lestari yang dapat menunjukan residu yang mungkin berperan dalam  pengikatan  logam  dan  sisi  aktif.  Prediksi  struktur  3D  dilakukan  secara ab  initio , menunjukan  adanya  6  struktur  β-sheet  dan  6  struktur  α-heliks.  Dengan  demikian  dapat disimpulkan bahwa protein AldII dari uncultured Acidilobus sp. diduga memiliki aktivitas enzimatik.
Kata kunci : aldolase kelas II, Acidilobus sp., bioinformasi, sisi aktif, struktur 3D

## Abstract
In  previous  research,  1.9  kb  gene  fragment  was  isolated  from  Domas  Crater,  West  Java through a metagenomic approach. These fragments are known contain Open Reading Frame (ORF) region of the coding gene for aldolase class II from uncultured Acidilobus sp . which is then referred to as aldII . The aldII gene fragment was successfully cloned and expressed into a thermostable class II aldolase protein which is then referred to as AldII. This study aims to conduct a bioinformation study of the AldII protein. AldII protein have a molecular mass of ~21.2 kDa with the molecular formula C 94 0H 1539 N 261 O 281 S 8 . The total negatively charged residues (Asp + Glu) were 22 residues, while the total positively charged residues (Arg  +  Lys)  were  18  residues.  The  theoretical  pI  value  of  AldII  is  5.86.  The  calculation result showed that, the protein stability index is 36.61 and it classified as a stable protein. By alignment with the closest homology, it was found that the conserved region could show residues that might play a role in metal binding site and the active site. Prediction of the 3D structure performed with ab initio method, showed that there were 6 β-sheet structures and 6  α-heliks  structures.  Thus,  it  can  be  concluded  that  AldII  protein  from  uncultured Acidilobus sp. is suspected to have enzymatic activity.
Keywords : class II aldolase, Acidilobus sp., bioinformation, active site, 3D structure

## Pendahuluan
Indonesia  merupakan  negara  dengan banyak  daerah  geotermal  dengan  kondisi ekstrim yang menjadi habitat mikroorganisme termofilik. Enzim termostabil yang dihasilkan menjadi pusat perhatian  karena  banyak  proses  industrial dilakukan  pada  temperatur  tinggi.  (Basen et  al,  2012).  Pada  penelitian  sebelumnya fragmen gen 1,9 kb telah berhasil diisolasi dari  Kawah  Domas,  Jawa  Barat  melalui pendekatan  metagenom  (Suharti  et  al, 2015). Fragmen tersebut diketahui mengandung daerah Open Reading Frame (ORF)  utuh  dari  gen  pengkode  aldolase kelas  II  yang  kemudian  disebut  sebagai aldII. Fragmen gen aldII tersebut berhasil diekspresikan menjadi protein termostabil aldolase  kelas  II  yang  kemudian  disebut sebagai  AldII.  Penelitian  lanjutan  yang dilakukan  terhadap  AldII  menunjukan bahwa  AldII  bersifat  termostabil,  karena tidak  terdenaturasi  setelah  dipanaskan pada  temperatur  60 o C  selama  30  menit (Suharti et al, 2015).
Aldolase  sendiri  merupakan  kelompok enzim  liase  yang  mengkatalisis  reaksi bolak  balik  fruktosa-1,6-bifosfat  (F-1,6- PB)  menjadi  gliseraldehid-3-fosfat  (G3P) dan dihidroksiaseton fosfat (DHAP) secara stereoselektif.  Saat  ini  aldolase  banyak diaplikasikan  dalam  industri  pembuatan turunan  fruktosa  dan  industri  farmasi. Penggunaan  aldolase  dalam  industri farmasi  dikarenakan  sifat  stereoselektif enzim aldolase salah satunya adalah untuk sintesis  statin  (obat  penurun  kolesterol). Untuk  kebutuhan  industri  dibutuhkan aldolase  yang  bersifat  termostabil,  dan aldolase yang bersifat termostabil tersebut telah  berhasil  diisolasi  dari  berbagai mikroorganisme Archaea antara  lain Bacillus cereus , Aeropyrum pernix ,
Pyrobaculum  aerophilum , Thermotoga maritima dan Hyperthermus  butylicus (Wang et al, 2010).
Artikel  ini  membahas  mengenai  studi bioinformasi protein AldII dari uncultured
Acidilobus  sp. ,  yang  meliputi  analisa homologi  urutan  asam  amino  AldII, penentuan  sifat  –  sifat  biokimia  protein AldII  dan  prediksi  struktur  3D  protein AldII.

## Metode Penelitian

## Bahan
Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  urutan  gen  dari uncultured  Acidilobus  sp. yang  telah berhasil  di sequencing dari  penelitian sebelumnya.  Urutan  gen aldII sudah  ada dalam  NCBI  dengan  nomor  identitas KP893071 (Suharti et al, 2015).
Penjajaran  Urutan  Asam  Amino  AldII dengan Homologi Terdekat
Gen aldII ditranslasi  secara in  silico menggunakan  program  BLASTp  yang disediakan  oleh National  Center  for
Biotechnology
Information
Search database (NCBI).  Urutan  asam  amino
AldII yang dihasilkan kemudian disejajarkan  dengan  homologi  terdekat yang  telah  diketahui  dari  hasil  penelitian sebelumnya, yaitu dengan spesies Acidilobus saccharovorans (Asac);
Aeropyrum  pernix (Aper); Pyrolobus fumarii (Pfum); Caldivirga maquilingensis (Cmaq); Ignisphaera aggregans (Iag)  (Suharti  et  al,  2015).
Penjajaran  urutan  asam  amino  protein AldII  dianalisis  menggunakan  program ClustalX  dan  divisualisasi  menggunakan program Genedoc.

## Penentuan  Sifat-Sifat  Biokimia  Protein AldII
Sifat-sifat  biokimia protein  AldII  yang meliputi  deduksi  urutan  asam  amino, penentuan  berat  molekul,  dan  penentuan nilai  pI  dianalisa  dengan  menggunakan progam  yang  disediakan  oleh  ProtParam pada http://www.expasy.org/tools/protparam.ht ml.

## Prediksi Struktur 3D AldII
Prediksi struktur 3D dilakukan dengan menggunakan  pendekatan ab  initio pada progam QUARK
melalui situs http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/QU
ARK/.

## Hasil dan Pembahasan
Penjajaran  Urutan  Asam  Amino  AldII dengan Homologi Terdekat
Gen pengkode aldolase kelas II ( aldII )
hasil pendekatan metagenom yang
diperoleh  dari  penelitian  sebelumnya merupakan gen sepanjang 639 pasang basa yang  disisipkan  ke  dalam  vektor  ekspresi pET30-a(+).  Sekuen  dari  gen aldII sudah ada  dalam  NCBI dengan  nomor  identitas KP893071 seperti yang ada pada Gambar
1. Setelah ditranslasi menggunakan BLASTp,  menghasilkan  protein  aldolase kelas II dengan massa molekul ~21,2 kDa seperti yang ditunjukan pada Gambar 2.
.
Gambar 1. Sekuen gen aldII
10         20         30         40         50         60 LRLNESIMHE VADVARQMYA RGLTQIRGGN VSVIDRQAGV VYITPTGVPR HLINDDDVAV 70         80         90        100        110        120 VSIDGKVLVG TPSSELKMHL GIYRAIQQAK AIVHVHPINV IALYETGSI DVSLFTESMF
130        140        150        160        170        180 RVKCVAEVPP MMPGTEELAN AVSEALSRSG CNAAVLRKHG IVTYSAVSAY DALDAAEALS

## 190

## DLAYEIILLE LLKIRI
Gambar 2. Urutan asam amino AldII. Notasi asam amino dinyatakan dalam notasi 1 huruf
Berdasarkan  hasil  penelitian  terdahulu (Suharti  et  al,  2015),  gen aldII yang mengkode protein AldII memiliki homologi  terdekat  dengan  gen  aldolase
kelas  II  yang  berasal  dari  mikroba Acidilobus  sp. Diketahui Acidilobus  sp. merupakan  jenis  spesies  yang  termasuk dalam  Kingdom Archaea. Karena  hal
tersebut  maka,  penjajaran  urutan  asam amino  AldII  dilakukan  dengan  urutan asam amino protein Aldolase kelas II pada beberapa  spesies  Kingdom Archaea. Penjajaran  homologi  terdekat  dilakukan untuk  mempelajari  daerah  lestari  dan residu  yang  mungkin  berperan  dalam pengikatan logam. Hasil penjajaran menunjukkan bahwa ada tiga residu  yang
mungkin  berperan  dalam  pengikatan logam,  antara  lain  residu  Aspartat  (D)  , Glutamat  (E)  dan  Histidin  (H).  Hal  ini dikarenakan ketiga residu tersebut merupakan  asam  amino  yang  bermuatan negatif,  sehingga  dapat  berikatan  dengan logam  yang bermuatan positif. Penjajaran asam amino ditunjukan pada Gambar 3
Gambar  3. Penjajaran  urutan  asam  amino  AldII  dengan  aldolase  kelas  II  homologi terdekat.  Asac, Acidilobus  saccharovorans ;  Aper, Aeropyrum  pernix ; Pfum, Pyrolobus  fumarii ;  Cmaq, Caldivirga  maquilingensis ;  Iag, Ignisphaera aggregans . Segitiga merah menunjukkan residu yang berperan dalam pengikatan logam. Bintang menunjukan residu yang berperan dalam pengikatan Zn 2+
Penentuan  Sifat-sifat  Biokimia  Protein AldII
Hasil  deduksi  urutan  nukleotida aldII menghasilkan  protein  AldII  yang  terdiri atas  196  asam  amino  (Gambar  2). Penentuan  sifat-sifat  biokimia  AldII dilakukan  dengan  menganalisis  urutan tersebut menggunakan webserver Protparam  pada  situs  ExPASy.  Hasil analisis  menghasilkan  data  berat  molekul AldII  sebesar  ~21,2  kDa  dengan  rumus
molekul C 940 H 1539 N 261 O 281 S 8 . Total residu bermuatan  negatif  (Asp  +  Glu)  sebanyak 22 residu, sedangkan total residu bermuatan  positif  (Arg  +  Lys)  adalah  18 residu. Nilai pI teoritis AldII sebesar 5,86. Hasil  perhitungan  indeks  kestabilan protein ini adalah 36,61 dan diklasifikasikan  sebagai  protein  yang stabil. Indeks kestabilan diprediksi berdasarkan  panjang  urutan  asam  amino dan komposisi dipeptida dengan
menggunakan rumus tertentu (data mengenai  rumus  penentuan  kestabilan protein disediakan dalam
https://web.expasy.org/protparam/protpar am-doc.html). Apabila nilai indeks dibawah 40 tergolong sebagai protein yang stabil  sedangkan  nilai  indeks  diatas  40 tergolong sebagai protein yang tidak stabil (Guruprasad et al , 1990).
Prediksi  Struktur  3D  AldII  menggunakan pendekatan ab initio
Sampai  saat  ini,  hanya  sedikit  protein aldolase  dari  kingdom Archaea yang berhasil  dikristalkan.  Karena  database
mengenai  struktur  aldolase  dari  kingdom Archaea masih  sedikit  dan  urutan  asam amino  dari  AldII  tergolong  pendek  maka penentuan  struktur  3D  dilakukan  dengan menggunakan  pendekatan ab  initio yang terdapat  pada progam  QUARK  melalui http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/QU ARK.  Progam  ini  dapat  memprediksikan struktur  3D  protein  tanpa  menggunakan templat dari struktur protein yang telah ada sebelumnya.  Hasil  deduksi  protein  AldII diprediksikan  memiliki  struktur  3D  yang terdiri atas 6 struktur β-sheet dan 6 struktur α-heliks  seperti  yang  ditunjukan  pada Gambar 4.
Gambar 4. Struktur 3D protein AldII secara ab initio . Warna merah menunjukkan struktur α-heliks.  Warna  kuning  menunjukkan  struktur  β-sheet.  Warna  hijau menunjukkan loop. Dianalisis menggunakan progam Pymol.
Diketahui  aldolase  kelas  II  pada Kingdom Bacteria memiliki  struktur dimer,  dengan  setiap  monomer  mengikat satu atom logam (Berry et al, 1993; Siebers et  al,  2001).  Pada  Kingdom Archaea , struktur  tiga  dimensi  aldolase  yang berhasil  ditentukan  hingga  saat  ini  hanya aldolase kelas I. Aldolase kelas I Archaea yang  berhasil  dikristalkan  antara  lain, Sulfolobus solfataricus (tetramer),
Thermoproteus tenax (pentamer), Aeropyrum pernix (tetramer), Pyrobaculum  aerophilum (dimer)  (data mengenai struktur diperoleh lewat Protein Data Bank pada situs http://www.rscb.org/pdb/home/.

## Kesimpulan
Hasil  studi  bioinformasi  menunjukan bahwa  protein  AldII  meupakan  protein yang  stabil.  Temuan  daerah  lestari  dapat menunjukan residu yang mungkin berperan dalam pengikatan logam dan sisi aktif. Prediksi struktur 3D yang dilakukan secara ab  initio menunjukan  adanya  6 struktur  β-sheet  dan  6  struktur  α-heliks.
Dengan  demikian  dapat  disimpulkan bahwa  protein  AldII  dari uncultured Acidilobus  sp. diduga  memiliki  aktivitas enzimatik.

## Daftar Pustaka
Basen, M., Sun, J. dan Anne, M. W. W. A.,
2012. Engineering a Hyperthermophilic Archaeon for Temperature-Dependent Product Formation, mBio , 3, 1-8
Suharti,  Meray  N.  W.,  Nurbaiti  S., Akhmaloka.,  2015.  Cloning  and Expression of A Novel Gene Encoded Thermostable Archaea l Aldolase Class  II  from  Natural  Sample, Bioscience  Biotechnology  Research Asia, 12 (2), 1023-1029.
Wang, Q., Chen, R., Du, P., Wu, H., Pei, X.,  Yang,  B.,  Yang,  L.,  Huang,  L., Liu, J. dan Xie, T., 2010. Cloning and
Characterization  of  Thermostable- deoxy-D-ribose-5-phosphate Aldolase
from Hyperthermus butylicus, African Journal of
Biotechnology , 9, 2898-2905.
Guruprasad, K., Reddy, B.V.B. and Pandit, M.W.,  1990.  Correlation  Between Stability of a Protein and its Dipeptide Composition:  A  Novel  Approach  for Predicting  In  Vivo  Stability  of  a Protein  from  its  Primary  Sequence . Protein Eng . 4,155-161.
Berry,  A.  dan  Marshall,  K.  E.,  1993. Identification of Zinc-Binding
Ligands  In The Class II Fructose-1,6- Bisphosphate Aldolase of Escherichia coli. Federation    of  European Biochemical Socteties , 318, 11-16.
Siebers,  B.,  Brinkmann,  H.,  Dorr,  C., Tjaden,  B.,  Lilie,  H.,  Oost,  J.  dan Verhees,  C.  H.,  2001. Archaea l Fructose-1,6-bisphosphate  Aldolases Constitute a New Family of Archaea l Type Class I Aldolase. The Journal of Biological  Chemistry ,  276,  28710  – 28718