Deteksi antibodi trombosit spesifik anti-hpa-3 pada neonatus dengan trombositopenia
Detection of platelet antibody anti-hpa-3 specific in neonates with

## thrombocytopenia
Arum Margi Kusumawardani 1 *, Ni Ken Ritchie 2 , Pustika Amalia Wahidiyat 3
* 1 Program Magister Ilmu Biomedik, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, JL Salemba Raya No.6 Jakarta 10430 Indonesia, email: arum.margie19@gmail.com, Indonesia
2 Program Magister Ilmu Biomedik, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, JL Salemba Raya No.6 Jakarta 10430 Indonesia, email: ni.ken.ritchie@gmail.com, Indonesia
3 Departemen Ilmu Kesehatan Anak, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Rumah Sakit Dr. Cipto Mangunkusumo Jakarta, email: pa.wahidiyat@gmail.com, Indonesia

## ABSTRACT
Background: Inkompatibilitas human platelet antigen (HPA) fetomaternal occurs due to presence of antigens on platelet membrane expresses by fetus, but maternal does not express these antigens. That is mismatched between the fetus and the maternal can triger an immune response during pregnancy and produce anti-platelet alloantibodies that can destroy fetal platelets resulting in thrombocytopenia in fetus and neonate, known as FNAIT. Human platelet antigen detection has not been carried out in Indonesia, there is no known antigen on the platelets. Detection of platelet antibody anti-HPA-3 specific in neonates with thrombocytopenia is an effort to find the possibility of anti- antibodies.
Objective: The aim of this study is to find out the presence one of platelet antibody anti-HPA-3 in neonates with thrombocytopenia.
Methods: The study is descriptive observational with cross sectional design. The subject in this study were neonates  with  thrombocytopenia  according  to  the  study  criteria.  The  collected  sample  is  screened,  then identification of anti-HPA-3 antibodies.
Results: Three neonatal positive, 2 borderline and 25 negative anti-platelet antibodies. Identification of anti- platelet antibodies was performed in five samples indicating that all were negative for the anti-HPA antibody GPIIb/IIIa specific HPA-3.
Conclusion: Five samples were found to have anti-platelet antibodies, then in identification none of them were found to be specific anti-HPA -3 antibodies. Screening result of five maternal were negative platelet antibodies, it means platelet anibodies in neonates with thrombocytopenia are not alloantibodies of maternal origin.
Keywords: Fetal/  neonatal  alloimmune  thrombocytopenia  (FNAIT),  Human  platelet  antigen  (HPA), Monoclonal antibody immobillization platelet assay (MAIPA).

## PENDAHULUAN
Trombositopenia didefinisikan sebagai jumlah  trombosit  dalam  tubuh  seseorang kurang dari <150.000/µL. Salah satu masalah hematologis  yang  terjadi  pada  neonatus adalah terjadi trombositopenia. 1
Trombositopenia  pada  neonatus  dilaporkan banyak terjadi pada neonatus yang dirawat di ruang  perawatan  intensif,  dengan  kejadian berkisar antara 22-35%. Beberapa diantaranya  dilaporkan  0,1-0,5%    mengalami
trombositopenia  dengan  jumlah  trombosit <50.000/µL. 2 Gejala  klinis  trombositopenia yang dialami neonatus akhir-akhir ini menjadi perhatian bagi beberapa ahli di bidang peneliti kesehatan.  Hal  tersebut  dibuktikan  dengan banyaknya  penelitian  terkait  trombositopenia pada  neonatus,  sebagai  upaya  preventif terhadap pencegahan trombositopenia terutama  yang  disebabkan  oleh  faktor  imun, untuk  mencegah  tingkat  keparahan  pada neonatus yang lebih lanjut. 3,4
Trombosit  memiliki  peran  dan  fungsi hemostasis yang sangat penting dalam tubuh, agar hemostasis berlangsung dengan normal, trombosit harus ada dalam jumlah dan fungsi yang normal. 5 Permukaan membran trombosit terdapat glikoprotein (GP) dan turut berperan dalam fungsi hemostasis trombosit.
Glikoprotein  pada  permukaan  trombosit  juga mengekspresikan antigen yang disebut
Human  Platelet  Antigen (HPA).  Terdapat  33 tipe  HPA  yang  merupakan  variasi  dari  enam glikoprotein  yang  berbeda  pada  trombosit. Enam  glikoprotein  meliputi  GPIIb,  GPIIIa, GPIbα,  GPIbβ,  GPIa  dan  CD109.  Dua  belas dari 33 antigen pada trombosit dikelompokkan menjadi enam kelompok bialel, meliputi: HPA- 1,  HPA-2,  HPA-3,  HPA-4,  HPA-5,  dan  HPA- 15.  Keberadaan  glikoprotein  pada  membran trombosit  sebagai  reseptor  dalam  2  fungsi penting, yaitu adhesi ke subendotelial matriks dan agregasi. Terdapat 3 supergen family dari reseptor  adhesi  atau  yang  disebut  integrin, meliputi  reseptor  fibrinogen  (GPIIb/IIIa), Von Willebrand faktor (Ib/IX) dan kolagen (Ia/IIa). 6,7
Adapun  keberadaan  glikoprotein  pada membran  trombosit  juga  dapat  memberikan dampak  yang  tidak  sesuai  dalam  fungsi  dan perannya. Kompleks heterodimer glikoprotein juga  dapat  menjadi  faktor  imunogenik  dari glikoprotein  yang  terdapat  pada  trombosit. 8
Epitop  yang  merupakan  antigen  pada glikoprotein  merupakan  target  antibodi  yang paling sering terdeteksi pada semua gangguan trombosit imun. 9 Gangguan trombosit imun juga dapat terjadi dalam masa
kehamilan.  Ketidaksesuaian  antigen  yang diekspresikan antara fetus dan maternal dapat memicu  respon  imun  maternal  sehingga dalam tubuh maternal terbentuk antibodi. Hal ini dapat berdampak pada terjadinya trombositopenia pada fetus maupun neonatus. 10,11
Gambar 1. Struktur glikoprotein dan lokasi HPA bialel pada membran trombosit. 9

## BAHAN DAN CARA PENELITIAN
Penelitian ini merupakan studi deskriptif observasional, desain cross sectional dengan pendekatan  kuantitatif.  Tujuan  dilakukannya penelitian  ini  untuk  mengetahui  keberadaan antibodi  anti-trombosit  sebagai  penyebab imun trombositopenia pada neonatus. Sejumlah 30 sampel neonatus sesuai kriteria penelitian  didapat  dari  Ruang  Perawatan Intensif  Perinatologi,  RSUPN  Dr.  Cipto Mangunkusumo Jakarta terhitung sejak bulan Juli 2020-November 2020.
Sampel penelitian diambil dari neonatus dalam  rentang  usia  0-28  hari  dan  hasil pemeriksaan  trombosit  yang  menunjukkan angka  ≤  100.000/µL  dengan  kriteria  belum pernah  mendapat  transfusi  dalam  bentuk komponen apapun.
Skrining dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui keberadaan antibodi anti- trombosit  pada  neonatus.  Analisis  tersebut menggunakan sampel serum neonatus melalui  pemeriksaan whole  platelet  Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Pemeriksaan tersebut dilaksanakan di Laboratorium Trombosit Unit Transfusi Darah PMI  Provinsi  DKI  Jakarta.  Interpretasi  hasil berdasarkan  nilai optical  density melalui pembacaan  menggunakan  ELISA reader pada gelombang 405 nm. 8
Hasil  skrining  yang  menunjukkan keberadaan antibodi anti-trombosit dilanjutkan dengan identifikasi antibodi spesifik glikoprotein  trombosit  mengunakan  metoda indirect Monoclonal  Antibody  Immobillization Platelet  Assay (MAIPA).  Penelitian  ini menggunakan  antibodi  monoklonal  spesifik GPIIb/IIIa  untuk  mendeteksi  keberadaan antibodi anti-HPA-3. 8

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  skrining  antibodi  anti-trombosit terhadap  30  sampel  neonatus  dengan trombositopenia terdapat pada tabel berikut.
Tabel 1. Hasil skrining antibodi anti-trombosit neonatus (n=30) Interpretasi Hasil Skrining n Positif 3 Borderline 2 Negatif 25 Sumber: Data primer 2020
Berdasarkan  tabel  diatas  diketahui  3 neonatus  positif  antibodi  anti-trombosit,  2
dengan  hasil  borderline  dan  25  neonatus negatif  antibodi-anti  trombosit.  Interpretasi terhadap  hasil borderline dianggap  adanya keberadaan  antibodi  anti-trombosit  namun dalam  jumlah  yang  sangat  rendah.  Hal tersebut  mengindikasikan  pula  keberadaan antibodi  anti-trombosit  pada  serum  sampel neonatus.
Analisis bivariat menunjukkan nilai p < 0,000  secara  statistik  dianggap  terdapat hubungan  yang  bermakna  antara  variabel trombositopenia  dan  antibodi  anti-trombosit. Nilai  IK  (95%)  menunjukkan  keberadaan antibodi  anti-trombosit  dapat  menyebabkan terjadinya  trombositopenia  pada  neonatus terjadi dalam rentang 45,992 sampai 62,638.
Tabel 2. Analisis bivariat trombositopenia dengan antibodi anti-trombosit
Skrining Antibodi Anti-
Trombosit (n) Trombosit openia ≤ 100.000/µl IK (95%) p Positf 3 45,992 - 62,638 0,00 Borderline 2 Negatif 25 p: kemaknaan, IK 95%: interval kepercayaan 95% Pemeriksaan dilanjutkan dengan identifikasi antibodi spesifik glikoprotein trombosit  menggunakan  metoda indirect MAIPA.  Identifikasi  antibodi  dilakukan  pada lima  sampel  serum  yang  diketahui  terdapat antibodi  anti-trombosit.  Dibutuhkan  donor trombosit  yang  telah  diketahui  memiliki  tipe HPA-3  untuk  mendeteksi  antibodi  spesifik GPIIb/IIIa,  terkhusus  antibodi  anti-HPA-3. Adapun  hasil  identifikasi  antibodi  anti-HPA-3 pada  kelima  sampel  tidak  menunjukkan keberadaan  antibodi  anti-HPA-3.  Hal  ini
terlihat  melalui  interpretasi  hasil  pembacaan berdasarkan  nilai  absorbansi  ELISA  pada gelombang 492 nm.
Tabel 3. Hasil identifikasi antibodi anti-HPA-3
neonatus (n=5) Hasil Identifikasi Anti-HPA- 3aa Anti-HPA- 3bb Positif 0 0 Negatif 5 5 Sumber: Data primer 2020
Adapun  upaya  peneliti  lebih  lanjut untuk  melakukan  konfirmasi  keberadaan antibodi  trombosit  pada  ibu  dari  kelima neonatus  yang  terdeteksi  antibodi  anti- trombosit.  Tahapan  dan  metode  yang digunakan  tidak  jauh  berbeda  dengan  yang dilakukan  pada  neonatus,  yaitu  kelima  ibu dilakukan skrining antibodi trombosit menggunakan  metoda whole  platelet ELISA.
Hasil  skrining  antibodi  trombosit  pada  lima sampel  ibu  adalah  negatif  terhadap  antibodi trombosit.
Tabel 4. Hasil skrining antibodi anti-trombosit ibu (n=5) Interpretasi Hasil Skrining n Positif 0 Negatif 5 Sumber: Data primer 2020
Antibodi  trombosit  pada  neonatus menggunakan  metode whole  platelet ELISA, menunjukkan adanya antibodi trombosit pada neonatus  yang  bereaksi  dengan  epitop  pada membran  trombosit.  Keberadaan  antibodi spesifik glikoprotein pada permukaan membran  trombosit  dapat  menjadi  penyebab destruksi  sel  trombosit  sehingga  neonatus
mengalami trombositopenia. Hasil skrining ini belum menunjukkan spesifisitas antibodi yang terdeteksi  terhadap  epitop  pada  enam glikoprotein  (GPIIb,  GPIIIa,  GPIbα,  GPIbβ, GPIa  dan  CD109)  sehingga  perlu  dilakukan identifikasi terhadap antibodi yang ditemukan melalui skrining antibodi trombosit.
Identifikasi  dilakukan  dengan  metoda MAIPA  menggunakan  antibodi  monoklonal spesifik  terhadap  GPIIb/IIIa  yang  dapat mendeteksi  keberadaan  anti-HPA-3.  Isolat trombosit  yang  digunakan  dalam  identifikasi pada  penelitian  ini  menggunakan  trombosit dengan  tipe  antigen  HPA-3aa,  HPA-3bb  dan antibodi  monoklonal  yang  spesifik  terhadap GPIIb/IIIa. Hasil identifikasi pada lima sampel neonatus  menunjukkan  tidak  ditemukan antibodi anti-HPA-3.
Fetal/ Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia (FNAIT) merupakan suatu kondisi terjadinya penurunan jumlah trombosit dibawah  normal  pada  fetus  atau  neonatus yang  disebabkan  keberadaan  aloantibodi trombosit.  Antibodi  anti-trombosit  tersebut spesifik  terhadap  glikoprotein  yang  terdapat pada  membran  sel  trombosit.  Penelitian terkait  aloimun  trombositopenia  yang  telah dilakukan pada populasi Malaysia pada tahun 2014  menunjukkan  295  sampel  ibu  dengan suspect  FNAIT  ditemukan  18  (6,10%) diantaranya  positif  aloantibodi  HPA  dengan identifikasi  menggunakan  metoda  MAIPA diketahui  anti-HPA-3,  -HPA-5  dan  -HPA-15. Adapun dalam penelitian tersebut disebutkan bahwa terdapat kemiripan distribusi alel HPA
populasi Malaysia dengan populasi Indonesia dan  menyebutkan  tiga  sistem  HPA  (HPA-3, HPA-5  dan  HPA-15)  diperkirakan  menjadi resiko  paling  potensial  terhadap  gangguan trombosit  yang  dimediasi  oleh  imun  di Indonesia.  Penelitian  lain  yang  dilakukan  di tahun  2002  menyebutkan  karakteristik  alel populasi  di  Indonesia  tersebar  pada  HPA-3 dengan frekuensi gen HPA-3a sebesar 0,505 dan  frekuensi  gen  HPA-3b  sebesar  0,495. Asmarinah, et al dalam penelitiannya melakukan  pemeriksaan  genotip  pada  500 darah donor dan disebutkan sebaran frekuensi antigen spesifik HPA pada populasi di  Indonesia terdapat  pada  HPA-3  dan  HPA- 15. 7,12
Merujuk  pada  hasil  penelitian  yang telah  dilakukan  tersebut,  maka  peneliti memutuskan  untuk  melakukan  identifikasi terhadap  anti-HPA-3,  meskipun  hasil  dari identifikasi yang telah dilakukan menunjukkan tidak  satupun  ditemukan  antibodi  yang dimaksud.
Monoclonal  Antibody  Immobillization Platelet  Assay merupakan gold  standart terhadap pemeriksaan imunologi pada trombosit  generasi  ketiga  yang  memiliki tingkat sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi, sehingga  pada  penelitian  ini  diharapkan mampu mendeteksi antibodi spesifik glikoprotein terkhusus GPIIb/IIIa. 8,13
Curtis,  B.R.  dan  McFarland,  J.G. dalam  studinya  menyebutkan  antigen  HPA-3 diekspresikan  di  GPIIb  tetapi  antibodi  anti- HPA-3a  dan  -HPA-3b  jarang  terdeteksi
meskipun  menggunakan  metoda  MAIPA. Disebutkan  alasan  tidak  terdeteksi  antibodi anti-HPA-3 karena perlakuan pada GPIIb/IIIa yang  menyebabkan  perubahan  konformasi sehingga  mengganggu  pengikatan  antibodi monoklonal spesifik HPA-3. 9
Peneliti  berpendapat  kemungkinan penyebab  imun  trombositopenia  neonatus pada  lima  sampel  yang  terdeteksi  antibodi anti-trombosit  dapat  juga  disebabkan  oleh antibodi  spesifik  terhadap  HPA  selain  HPA-3 yang  terdapat  pada  GPIIb/IIIa,  diantaranya HPA-1,  -4,  -6.  Kemungkinan  juga  terdapat antibodi spesifik glikoprotein selain GPIIb/IIIa, yaitu Gia/Iia, GP Ib/IX, GPIV dan CD109. 7,12
Konfirmasi  melalui  skrining  antibodi menggunakan  lima  sampel  ibu,  untuk memastikan  antibodi  anti-trombosit  yang terdeteksi  melalui  skrining  berasal  dari  ibu terkait dengan kemungkinan terjadinya neonatal alloimmune thrombocytopenia , namun hasil skrining ibu menunjukkan negatif dapat  diartikan  antibodi  trombosit  pada neonatus bukan berasal dari ibu.
Peneliti  menganalisis  kemungkinan terjadinya drug-induced immune thrombocytopenia sebagai faktor lain penyebab  terjadinya  trombositopenia  pada neonatus.  Peneliti  mencoba  menelusuri kembali beberapa obat yang pernah diberikan kepada neonatus sebelum mengalami trombositopenia. Merujuk pada hasil pemeriksaan  klinis  yang  disebutkan  oleh salah satu jurnal, diketahui neonatus mendapat  beberapa  obat  yang  disebutkan
dalam  jurnal  penelitian  tersebut.  Beberapa obat  yang  diketahui  diantaranya  golongan penicillin, dexamethasone dan ondansentron. Diketahui  lima  sampel  neonatus  dengan skrining  positif  antibodi  anti-trombosit,  dua diantaranya  pernah  mendapat  viccillin,  dan dua diantaranya pernah mendapat ampicillin, diketahui  kedua  obat  tersebut  termasuk golongan  penicillin  yang  merupakan  molekul hapten-induced  antibody. Diketahui  hapten dengan berat molekul yang sangat kecil yaitu 2-5  kDa,  kecil  kemungkinan  untuk  dapat membangkitkan  respon  imun.  Dalam  hal  ini hapten mampu mencetuskan respon imun jika berikatan  dengan  protein  lain,  dalam  hal  ini berikatan  dengan  glikoprotein  yang  terdapat pada membran trombosit. Terkait dengan hal tersebut  perlu  dibuktikan  melalui  penelitian lebih lanjut. 14-15

## KESIMPULAN DAN SARAN
Ditemukan  lima  neonatus  dengan trombositopenia terdapat antibodi anti- trombosit, dan setelah kelima sampel tersebut dilakukan identifikasi tidak satupun teridentifikasi antibodi anti-HPA-3.
Keberadaan  antibodi  anti-trombosit  pada neonatus  tidak  berasal  dari  ibu,  dikarenakan tidak  satupun  ditemukan  antibodi  trombosit pada lima sampel ibu.
Peneliti yang tertarik dengan penelitian terkait hendaknya dapat melakukan identifikasi antibodi anti-trombosit menggunakan panel suspensi trombosit yang telah  diketahui  tipe  HPA-1,  3,  -4,  -6  yang
merupakan  HPA  yang  diekspresikan  di GPIIb/IIIa.  Agar  melakukan  identifikasi  panel menggunakan  antibodi  monoklonal  spesifik glikoprotein  selain  GPIIb/IIIa,  misalnya  Mab spesifik  CD109  yang  dapat  mengidentifikasi HPA-15,  dimana  diketahui  frekuensi  gen populasi  Indonesia  juga  tersebar  pada  HPA- 15.  Diperlukan  optimasi  ulang  pada  antibodi monoklonal  yang  akan  digunakan  pada identifikasi  metoda  MAIPA  dengan  harapan konsentrasi  yang  tepat  dapat  mendeteksi keberadaan antibodi yang diidentifikasi.

## TERIMA KASIH
1.  RSUPN Dr. Cipto Mangunkusumo Jakarta. JL. Pangeran Diponegoro No.71, RW.5,  Kenari,  Kec.  Senen,  Kota  Jakarta Pusat, DKI Jakarta 10430.
2.  Unit  Transfusi  Darah,  Palang  Merah Indonesia,  Provinsi  DKI  Jakarta.  JL. Kramat Raya RT.3/RW.4, Kramat, Senen, Kota Jakarta Pusat. DKI Jakarta 10450.

## KEPUSTAKAAN
1. Kiswari,  R.  Hematologi  &  Transfusi. Editor: Carolina S, Astikawati R. Jakarta:
Erlangga; 2014. h.252-5.
2. Roberts,  I,.  Murray,  N.A.  Neonatal thrombocytopenia: causes and
management. Arch  Dis  Child  Fetal Neonatal Ed. 2003; Hal. 359-64.
3. Roganović,  J.  Review  article  neonatal thrombocytopenia:  a  common  clinical problem classification and pathogenesis immune–mediated neonatal thrombocytopenia. Pediatrics  Today.
2015;11, (2), Hal.115-25.
4. Espinoza,  J.P.,  Caradeux  J,  Norwitz, E.R.,  Illanes,  S.E.  Fetal  and  neonatal alloimmune  thrombocytopenia. Medical Review. 2013; 6, (1), Hal. 15-21.
5. Purba,  J.,  Mulatsih,  S.,  Nurani,  N., Triyono,  T.  Faktor  risiko  refrakter trombosit  pada  anak.  Sari  Pediatri. 2013; 15, (3), Hal. 190-4.
6. Greer, J.P., Arber, D.A., Glader, B., List, A.F., Means, R.T., Paraskevas, F., et al.
Editors:  Greer,  J.P.,  Arber,  D.A.,  List,
A.F., Means, R.T., Paraskevas, F., et al.
Wintrobe’ s clinical hematology. Part III transfusion medicine. Edisi:3 . USA;
Library of Congress Cataloging; 2014.
7. Asmarinah,  Dharma,  R.,  Ritchie,  N.K.,
Rahayu, S., Putricahya, E., Santoso, S. Human
platelet-specific antigen frequencies  in  Indonesian  population.
Transfusion  Medicine. 2013;  23,  Hal. 250-3.
8. Matsuhashi, M., Tsuno, N.H. Laboratory testing  for  the  diagnosis  of  immune- mediated thrombocytopenia. Ann Blood .
2018; 41, (3), Hal. 1-10.
9. Curtis,  B.R.,  Mcfarland,  J.G.  Human platelet antigens – 2013. Vox Sanguinis . 2014; Hal. 93-102.
10.  Lieberman,  L., Greinacher,  A., Murphy,
M.F., Bussel, J., Bakchoul, T., Corke, S., et  al.  Fetal  and  neonatal  alloimmune thrombocytopenia: recommendations for evidence-based practice, an international approach. British Journal of Haematology. 2019; (185), Hal. 549-62. 11.  Regan,  F.,  Lees,  C.C.,  Jones,  B.,
Nicholaides, K.H., Wimalasundera, R.C.,  Mijovic,  A.,  et  al.  Prenatal Management of Pregnancies at Risk of Fetal Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia (FNAIT). BJOG. 2019; 126, (61), Hal. 173-85. 12.  Armawai, M.I., Hassan, A., Wihadmadyatami,  H.,  Santoso,  S. Platelet reactive alloantibodies responsible for immune
thrombocytopenia  in  Malay  population.
Med J Indones. 2014; 23, (3), Hal. 158- 62.
13.  Kiefel,  V.  MAIPA  standard  protocol  for platelet  antibody  detection  Description of the procedure. 2019.
14.  Visentin,  G.P.,  Liu,  C.Y.  Drug-induced thrombocytopenia. Hematol  Oncol  Clin
N Am . 2007; 21, Hal. 685-96
15. Knoll,  B.M.,  Ahmed,  J.,  Karass,  M., Mchale, P., Aujla, A., Kretschmer, P., et
al.  Drug-induced  thrombocytopenia : 2019  Update  of  clinical  and  laboratory data. American  Journal  Hematology . 2018; Hal. E76-8