Menara Perkebunan , 2006, 74(1), 43-51

## Keragaman morfologi selama perkembangan embrio
somatik sagu  ( Metroxylon sagu Rottb . )
Morphological variations during the development of somatic embryos of sago (Metroxylon sagu Rottb .)
Pauline Destinugrainy KASI & SUMARYONO
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia

## Summary
In  vitro culture  of  sago  ( Metroxylon  sagu
Rottb.)  on  an  agar-solidified  medium  consists  of somatic  embryos  of  different  sizes,  colors,  and developmental  stages.    One  gram  of  mostly globular  somatic  embryos  were  cultured  on  a solid  medium  to  observe  their  morphological variations with respect to embryo size, color, and developmental  stage  over  one  passage  of  six weeks  culture.    The  medium  was  a  modified-MS medium  with  half-strength  of  macronutrients containing      0.01 mg/L  ABA  and  2  mg/L  kinetin. At  the  end  of  culture  passage,  fresh  weight  of embryo  increased  by  2.3  folds.    The  embryo numbers  increased  by  more  than  two  times indicating  the  formation  of  secondary  embryos. The average size of sago somatic embryos did not change  significantly  over  the  culture  period; however,  the  embryo  size  was  already  highly varied at the start and increased gradually as the embryo  developed.    At  the  initial  of  culture, 33.7  %  of  the  embryos  were  yellowish,  64.1  % were  greenish,  and  2.2%  were  reddish.    By  the end  of  the  culture  the  composition  of  yellowish embryos  increased  to  51.2  %,  greenish  embryo decreased  to  42.5  %  and  red  embryos  increased to  6.3  %.    At  the  initial  culture,  61  %  of  the embryos were at the globular, 9 % at heart-shape and  30  %  at  torpedo  stage.    Generally  globular embryos  developed  into  later-stage  embryos  as the  culture  progressed,  although  almost  56%  of the embryos remained at the globular stage after the sixth week.
[ Keywords : Somatic embryogenesis, Metroxylon sagu ,  embryo  development, secondary embryo, embryo color ].

## Ringkasan
Kultur in  vitro sagu  ( Metroxylon  sagu Rottb.)  pada  medium  padat  terdiri  dari  embrio somatik  dalam  berbagai  ukuran,  warna,  dan  fase perkembangan.    Satu  gram  embrio  somatik  yang sebagian  besar  dalam  fase  globuler  dikulturkan pada medium padat untuk mengamati keragaman morfologi  embrio  dalam  hal  ukuran,  warna  dan fase  perkembangan  dalam  satu  periode  kultur enam  minggu.    Medium  kultur  adalah  MS modifikasi  dengan  setengah  hara  makro  serta penambahan zat pengatur tumbuh ABA 0,01 mg/L dan kinetin 2 mg/L.  Pada akhir masa kultur  bobot  embrio  segar  meningkat  2,3  kali dibandingkan  awal  masa  kultur.    Jumlah  embrio juga  mengalami  peningkatan  sebesar  lebih  dari dua kali yang menunjukkan adanya pembentukan embrio  somatik  sekunder.  Ukuran  rata-rata embrio  tidak  berubah  secara  signifikan  selama masa  kultur  akan  tetapi  ukuran  embrio  telah sangat  beragam  pada  awal  kultur  dan  terus meningkat  hingga  akhir  kultur.    Warna  embrio mengalami  perubahan  selama  periode  kultur. Pada  awal  kultur  dijumpai  33,7  %  embrio berwarna kuning, 64,1 % embrio hijau, dan 2,2 % embrio  merah.    Pada  akhir  kultur  presentase embrio  kuning  meningkat  menjadi  51,2  %, embrio hijau  menjadi 42,5  %, dan embrio  merah

## Kasi & Sumaryono
6,3 %.  Pada awal kultur, dijumpai 61 % embrio pada  fase  globuler,  9  %  fase  bentuk-hati  dan 30  %  fase  torpedo.    Umumnya  embrio  globuler berkembang  menjadi  embrio  fase  lanjut  selama kultur  berlangsung,  namun  56  %  embrio  masih tetap dalam fase globuler pada minggu keenam.

## Pendahuluan
Tanaman sagu ( Metroxylon sagu Rottb.) merupakan  jenis  tanaman  palma  yang tumbuh  di  sekitar  rawa dan lahan tergenang air di daerah tropis. Tanaman ini mempunyai nilai  penting  karena  merupakan  tanaman pangan  penghasil  pati  paling  produktif  (15- 25  ton  pati  kering/hektar/tahun)  dan  peng- gunaan pati sagu dalam bidang industri yang sangat  beragam  (Flach,  1997).    Kandungan pati terdapat di dalam batang tanaman dewa- sa.  Selain  dijadikan  bahan  makanan,  pati sagu  juga  dimanfaatkan  dalam  bidang industri  seperti  bioetanol,  sirup  berkadar fruktosa  tinggi,  plastik  terurai-hayati,  dan bahan perekat (Flach, 1997).
Perbanyakan  tanaman  sagu  umumnya dilakukan  secara  vegetatif,  yaitu  dengan anakan  ( sucker )  yang  tumbuh  di  sekitar batang utama (induk).  Selain itu perbanyak- an tanaman sagu dapat juga dilakukan secara generatif  dengan  biji.    Namun,  perbanyakan dengan  biji  jarang  terjadi  karena  pada umumnya  tanaman  sagu  dipanen  sebelum mencapai  fase  reproduktif.    Perbanyakan dengan  anakan  menghasilkan  tanaman  yang lebih  seragam  dibandingkan  dengan  biji, akan  tetapi  jumlah  anakan  yang  dapat disediakan sangat terbatas.  Hal ini merupa- kan salah satu hambatan utama dalam upaya pengembangan  budidaya  tanaman  sagu secara komersial skala besar (Jong, 1995).
Kultur  jaringan  sagu  telah  berhasil dilakukan,  walaupun  publikasinya  sangat terbatas  (Hisajima et  al. ,  1991;  Tahardi et  al. ,  2002;  Riyadi et  al. ,  2005).  Pada tanaman  sagu,  regenerasi  planlet  secara in vitro dapat  melalui  induksi  embrio  zigotik maupun  embrio  somatik  (Tahardi et  al., 2002 ) .    Embriogenesis  somatik  merupakan salah  satu  aplikasi  penting  dalam  propagasi tanaman  secara  vegetatif  dalam  skala  besar (Arnold et  al. ,  2002).    Tahardi et  al. (2002) telah  berhasil  menginduksi  kalus  embrio- genik  tanaman  sagu  dengan  menggunakan eksplan  berupa  jaringan  muda  dari  tunas apikal anakan.  Embriogenesis somatik sagu diawali  dengan  pembentukan  kalus  embrio- genik, yang kemudian pada fase selanjutnya membentuk  embrio  somatik  globuler.    Per- kembangan  embrio  somatik  pada  tanaman sagu menyerupai fase perkembangan embrio zigotik  yang meliputi  fase  globuler,  bentuk- hati, torpedo dan kotiledon.
Selanjutnya  Riyadi et  al. (2005)  me- neliti  komposisi  medium  untuk  induksi embrio  somatik,  pendewasaan  embrio  dan pembentukan  planlet.  Dalam  fase  perkem- bangan embrio somatik tanaman sagu Riyadi et al. (2005) melaporkan adanya keragaman morfologi  meliputi  ukuran,  bentuk  dan warna.    Keragaman  morfologi  pada  embrio somatik  juga  dijumpai  pada  kultur in  vitro tanaman  teh  (Akula  &  Dodd,  1998; Sumaryono et  al. ,  2001).  Keragaman morfologi  yang  tinggi  pada  embrio  somatik dapat  menghambat  peningkatan  propagasi tanaman  secara in  vitro untuk  skala  besar (Tautorus & Dunstan, 1995) dan merupakan kendala  dalam  pengembangan  teknologi benih  sintetik  (Attree  &  Fowke,  1993; Onishi et  al .,  1994).  Penelitian  ini  merupa- kan studi lanjut mengenai keragaman morfo-
Keragaman morfologi selama perkembangan embrio...
logi  yang  dijumpai  selama  perkembangan embrio somatik tanaman sagu.  Pemahaman mengenai keragaman morfologi pada embrio somatik  sagu  diharapkan  dapat  membantu dalam  pengembangan  prosedur  dan  kondisi kultur  dari  embriogenesis  somatik  sagu sebagai upaya untuk mendapatkan bibit sagu yang seragam dalam skala besar.

## Bahan dan Metode

## Bahan tanaman
Dalam  penelitian  ini  digunakan  embrio somatik  globuler  sagu  yang  berasal  dari kultur  pucuk  tunas  anakan  muda  sagu  pada medium  padat  MS  yang  telah  dimodifikasi (MMS), mengacu pada penelitian yang telah dilakukan  oleh  Riyadi et  al. (2005). Subkultur  dilakukan  secara  berkala  setiap 4-5  minggu  pada  medium  germinasi,  yaitu medium MMS dengan setengah jumlah hara makro dan penambahan zat pengatur tumbuh ABA dan kinetin.

## Medium dan kondisi kultur
Embrio  somatik  yang  sebagian  besar pada tahap globuler ditimbang sebanyak 1 g, kemudian dikulturkan pada  35 mL medium germinasi  dalam  botol  kultur  dengan diameter 6,7 cm dan tinggi 9,3 cm.  Medium germinasi  yang  digunakan  adalah  MMS dengan  penggunaan  setengah  hara  makro ditambah  ABA  0,01  mg/L,  kinetin  2  mg/L, sukrosa  20  g/L,  arang  aktif  0,5  g/L,  dan gelrite  2  g/L.  Tingkat  pH  medium  disesuai- kan  pada  skala  5,7  sebelum  medium diotoklaf  pada  suhu  121°C  dan  tekanan 1 atm selama 20 menit.  Kultur ditempatkan di  ruang  kultur  pada  suhu  25  °C  dengan intensitas  cahaya  30  µmol  foton/m 2 /detik dan periode pencahayaan 14 jam.
Pertumbuhan  dan  perkembangan  em- brio  somatik  diamati  selama  enam  minggu menggunakan  metode  destruktif  dengan memanen  lima  botol  yang  dipilih  secara acak  setiap  minggu.    Pertumbuhan  dan  per- kembangan  diamati  dengan  mengukur  pan- jang  embrio  serta  menghitung  jumlah  dan bobot  segar  embrio.  Pengamatan  juga dilakukan  terhadap  warna  dan  fase  per- kembangan  embrio  somatik.  Keragaman embrio  ditentukan  oleh  ukuran  embrio  dan koefisien  keragamannya.    Koefisien  kera- gaman  didefinisikan  sebagai  hasil  perhi- tungan  standar  deviasi  dari  sampel  dibagi dengan  angka  rata-rata  dan  dinyatakan dalam  bentuk  persentase  (Steel  &  Torrie, 1980).

## Hasil dan Pembahasan

## Pertumbuhan embrio
Bobot  segar  embrio  somatik  sagu mengalami  peningkatan  hingga  akhir  masa kultur  (minggu  keenam)  (Gambar  1).    Pada akhir  masa  kultur  bobot  segar  embrio somatik  sagu  sekitar  2,3  kali  dari  bobot segar  embrio  somatik  sagu  di  awal  kultur. Hingga  akhir  masa  kultur,  jumlah  embrio somatik pada umumnya mengalami peningkatan  sekitar dua kali dari  awal  masa kultur.    Pada  minggu  keenam  terdapat  127 embrio  somatik  memenuhi  permukaan medium  pada  botol  yang  berasal  dari  55 embrio  somatik  pada  awal  masa  kultur (Gambar 1).  Penambahan jumlah embrio ini menunjukkan  adanya  pembentukan  embrio somatik  baru  yang  dinamakan  embrio somatik  sekunder,  seperti  yang  dilaporkan sebelumnya (Riyadi et al. , 2005). Laju pertumbuhan embrio sagu (dicerminkan  oleh  pertambahan  jumlah  dan bobot  segar)  sekitar  2,0-2,6  kali  dalam
Kasi & Sumaryono 0 30 60 90 120 150 0 1 2 3 4 5 6 Periode kultur (minggu) Culture period (week) Ju m la h e m b ri o N u m b er o f em b ry o s 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 B o b o t se g ar e m b ri o ( g ) E m b ry o f re sh w ei g h t (g )
Gambar 1.   Bobot segar  dan jumlah total embrio somatik sagu per botol kultur pada  medium padat selama enam minggu periode kultur.
Figure 1.    Fresh wight and total number of sago somatic embryo per culture jar on a solid media during a six-week culture period.
waktu enam minggu.  Laju pertumbuhan ini serupa  dengan  yang  diperoleh  Riyadi et  al . (2005),  namun  lebih  rendah  dibandingkan dengan  laju  pertumbuhan  embrio  somatik tanaman  lain  seperti    pada  tanaman  teh sebesar  2,4-2,6  kali  dalam  waktu  empat minggu  (Tahardi et  al. ,  2000;  Sumaryono et al ., 2001) dan 4-8 kali dalam waktu enam minggu (Akula & Dodd, 1998).  Oleh karena itu perbaikan prosedur embriogenesis soma- tik sagu masih diperlukan untuk meningkat- kan laju pertumbuhan embrio.

## Ukuran embrio
Ukuran  rata-rata  embrio  somatik  sagu pada awal kultur adalah 3,56 mm (Tabel 1). Ukuran  embrio  sedikit  menurun  hingga minggu ketiga (3,46 mm) kemudian mening- kat  hingga  akhir  masa  kultur  (3,93  mm).
Penurunan  ukuran  ini  dapat  dimungkinkan karena adanya pertumbuhan embrio somatik sekunder  yang  ditandai  munculnya  embrio globuler  berukuran  kecil  pada  embrio somatik  primer.    Walaupun  bobot  segar embrio  meningkat  hingga  akhir  masa  kultur menjadi  lebih  dari  dua  kali  dibandingkan awal  kultur  (Gambar  1),  tetapi  ukuran  rata- rata  embrio  somatik  tidak  berubah  secara signifikan (Tabel 1).
Keragaman ukuran embrio somatik sagu yang dinyatakan oleh nilai koefisien keraga- man  (CV)  menunjukkan  keragaman  yang sudah  tinggi  pada  awal  kultur  (40,9%). Nilai CV lebih besar dari 30% menunjukkan adanya  keragaman  yang  tinggi.    CV  dari ukuran  embrio  somatik  sagu  mengalami peningkatan  hingga  minggu  keenam  yang mencapai  63%  (Tabel  1).    Pada  akhir  masa kultur, sebagian embrio telah mencapai fase
Keragaman morfologi selama perkembangan embrio...
Tabel 1.  Ukuran embrio somatik sagu dan koefisien keragamannya (CV) dalam satu periode kultur. Table 1.  Size of sago somatic embryo and its coefficient of variance (CV) on one passage of culture.
Periode kultur (minggu) Culture period (week) Ukuran embrio (mm) Embryo size (mm) CV dari ukuran embrio (%) CV of embryo size (%) 0 3,56 40,9 1 3,18 41,5 2 3,51 40,1 3 3,46 56,5 4 3,66 44,0 5 3,68 63,9 6 3,93 63,8
kotiledon  dan  kecambah  dengan  ukuran lebih  dari    5  mm,  walaupun  masih  banyak embrio pada fase globuler dan torpedo yang berukuran  kurang  dari  3  mm  (Tabel  3). Beberapa  fase  perkembangan  embrio  dapat ditemukan  pada  saat  yang  sama,  termasuk adanya pembentukan embrio somatik sekunder (Gambar 2).  Pertumbuhan embrio somatik sekunder  juga dijumpai pada  kultur embriogenesis  somatik  tanaman  teh  (Akula & Dodd, 1998; Sumaryono et al. , 2001).

## Warna embrio
Embrio  somatik  sagu  yang  dikulturkan pada  medium  padat  terdiri  atas  beberapa warna  yang  berbeda.    Pada  awal  kultur dijumpai  33,7  %  embrio  berwarna  kuning, 64,1  %  embrio  berwarna  hijau,  dan  2,2  % embrio  berwarna  merah  (Tabel  2).    Pada minggu  ketiga  jumlah  embrio  kuning meningkat,  karena  embrio  sekunder  yang mulai terbentuk umumnya berwarna kuning. Hingga  akhir  masa  kultur,  jumlah  embrio kuning  meningkat  menjadi  sekitar  setengah dari  total  jumlah  embrio  karena  pertum- buhan  embrio  somatik  sekunder  yang  baru tetap berlanjut. Sementara persentase embrio
hijau  mengalami  penurunan  dari  64,1  % menjadi  sekitar  42,5%,  karena  adanya pertumbuhan  embrio  lebih  lanjut  yang disertai  perubahan  warna  menjadi  merah. Embrio  globuler  pada  umumnya  berwarna kuning  dan  hijau,  sementara  kotiledon  dan kecambah umumnya berwarna merah (Gambar 2).   Hal yang sama juga  dijumpai oleh  peneliti  sebelumnya  (Riyadi et  al. , 2005), dimana pada fase akhir pertumbuhan embrio  somatik  sagu  ditemukan  embrio yang  berwarna  merah.    Warna  merah  pada kecambah  sagu  merupakan  hal  yang  unik, karena  tidak  dijumpai  pada  tanaman  perke- bunan lainnya.
Warna embrio berhubungan dengan per- kembangan  embrio  somatik,  misalnya  em- brio  berwarna  putih  pada  karet  berkembang menjadi  planlet,  sedangkan  embrio  hijau akan  membentuk  kalus  dan  menghasilkan kalus  embriogenik  lewat  embriogenesis sekunder  (Veisseire et al .,  1994).    Warna embrio  somatik  telah  digunakan  dalam penilaian  mutu  benih  sintetik  wortel (Sakamoto et al ., 1992) dan potensi konversi embrio somatik dari ubi jalar (Padmanabhan et  al. ,  1998)  dan  walnut    (Deng  &  Cornu, 1992).
Kasi & Sumaryono

## A
Gambar 2.  (A) Kultur   embrio somatik    sagu  pada  medium  padat  MMS  dengan berbagai ukuran, warna, dan  fase  perkembangan  embrio  yang  ditemukan  pada  waktu  yang  sama    selama  dikulturkan;
(B). Pembentukan embrio somatik sekunder.  Bar = 1 cm.
Figure 2.   (A). Somatic embryo cultures of  sago on a solid MMS  media  where  different sizes, colors, and developmental   stages   of   embryos    found  at  any   time  during  the  culture; (B) formation of secondary somatic embryos.  Bar =1 cm.
Tabel 2.  Perubahan warna dari komposisi embrio somatik sagu dalam satu periode kultur.
Table 2. Color changes of sago embryo somatic composition over one passage of culture.
Persentase warna embrio (%) Percentage of embryo color (%)
Periode kultur (minggu) Culture period (week) Kuning Yellowish Hijau Greenish Merah Reddish 0 33,7 64,1 2,2 1 53,4 45,2 1,4 2 45,3 44,6 10,1 3 60,1 32,4 7,5 4 33,4 41,7 2,8 5 56,7 37,4 6,1 6 51,2 42,5 6,3 Embrio  somatik  sagu  yang  warnanya berbeda  mungkin  mempunyai  perbedaan kadar   cadangan   simpan   seperti  pati  dan
triasilgliserol yang diketahui berperan dalam perkecambahan  embrio  somatik  menjadi planlet  pada  tanaman  karet  (Cailloux et  al ., 1996).
A B

## Keragaman morfologi selama perkembangan embrio...
Tabel 3.  Jumlah embrio somatik sagu dari berbagai fase perkembangan dalam satu periode kultur.
Table 3.  Number of  sago  somatic  embryos  at  different  developmental  stages  over one passage  of culture.
Jumlah embrio somatik sagu Number of sago somatic embryos Periode kultur (minggu) Culture period (week) Globuler Globular Hati Heart Torpedo Torpedo Kotiledon Cotyledon Kecambah Germinant 0 33 5 16 0 0 1 56 2 20 5 0 2 44 5 28 5 2 3 57 1 18 10 10 4 59 3 22 12 4 5 83 3 29 19 9 6 71 0 36 9 9

## Fase perkembangan embrio
Pada  awal  masa kultur,  terdapat  54 embrio  somatik  pada  berbagai  fase  perkem- bangan,  33  embrio  (61%)  berada  pada  fase globuler,  tiga  embrio  (9  %)  pada  fase bentuk-hati,  16  embrio  (30  %)  pada  fase torpedo,  dan  belum  ada  embrio  fase  lanjut (Tabel  3).    Hingga  minggu  ketiga  embrio pada  fase  globuler  mengalami  perkem- bangan  ke  fase  selanjutnya,  demikian  pula embrio bentuk-hati dan  torpedo  mengalami perkembangan  membentuk  kotiledon  dan kecambah.  Pada  minggu  ketiga  hingga minggu  kelima  jumlah  embrio  globuler semakin  meningkat  karena  adanya  pemben- tukan  embrio  somatik  sekunder  baru  yang berbentuk globuler (Gambar 2 dan Tabel 3).
Jumlah  embrio  somatik  sagu  bentuk- hati  yang  terbentuk  selama  periode  kultur cukup  rendah.  Hal  ini  sejalan  dengan tanaman monokotil pada umumnya memang jarang  dijumpai  embrio  bentuk-hati  (Leyser
&  Day,  2003).    Dalam  penelitian  ini,  pada akhir  masa  kultur  tidak  dijumpai  adanya embrio  yang  berada  pada  fase  bentuk-hati (Tabel  3).  Untuk  itu  perlu  dilakukan penelitian  lebih  lanjut,  dengan  mengamati struktur  anatomi  dari  embrio  somatik  sagu pada tiap fase perkembangan embrio.
Ketidakseragaman perkembangan embrio somatik  juga  dijumpai  pada  tanaman  ber- kayu  lain  (Tautorus  &  Dustan,  1995;  Akula &  Dodd,  1998;  Sumaryono et  al. ,  2001). Keragaman embrio somatik sagu yang tinggi akan  menghambat  pengembangan  produksi klonal  secara  massal  dan  produksi  benih sintetik.  Oleh  karena  itu  perlu  dilakukan upaya  untuk  meningkatkan  keseragaman perkembangan  embrio  somatik  sagu  dengan memperbaiki  medium  dan  kondisi  kultur atau  menggunakan  kultur  cair  seperti  yang telah  dilakukan  pada  tanaman  teh  (Tahardi et  al. ,  2000)  dan  kelapa  sawit  (Tahardi, 1999).

## Kasi & Sumaryono

## Kesimpulan
Embrio  somatik  sagu  yang  dikulturkan pada  medium  padat  terdiri  atas  berbagai ukuran,  warna  dan  fase  perkembangan selama satu periode kultur.  Ukuran rata-rata embrio  tidak  berubah  secara  signifikan selama  masa  kultur,  akan  tetapi  ukuran embrio telah beragam  sejak awal kultur dan terus  meningkat  hingga  akhir  kultur. Komposisi warna embrio mengalami perubahan  selama  periode  kultur.    Persen- tase  embrio  kuning  meningkat  dari  33,7  % menjadi  51,2  %,  embrio  merah  dari  2,2  % menjadi  6,3  %  sedangkan  embrio  hijau menurun  dari  64,1%  menjadi  42,5  %. Sampai  akhir  kultur,  jumlah  embrio  fase globuler  tetap  meningkat  karena  adanya pertumbuhan  embrio  sekunder,  walaupun sebagian berkembang menjadi embrio somatik  fase-lanjut.  Perlu  penelitian  lebih lanjut  mengenai  perubahan  warna  embrio tunggal  selama  masa  perkembangan  dan upaya  untuk  meningkatkan  keseragaman embrio  somatik  sagu  antara  lain  dengan menggunakan kultur cair.

## Daftar Pustaka
Akula, A. & W. A. Dodd (1998). Direct somatic embryogenesis  in  a  selected  tea  clone,‘TRI- 2005’ ( Camellia  sinensis (L.)  O.  Kuntze) from  nodal  explants. Plant  Cell  Rep., 17 , 804-809.
Arnold,  S.,  van,  I.  Sabala,  P.  Bozhkov, J.  Dyachok  &  L.  Filonova  (2002). Development  pathways  of  somatic  embryo- genesis. Plant  Cell  Tiss.  &  Org.  Cult., 69 , 233-249.
Attree,  S.  M.  &  L.  C.  Fowke    (1993).    Embryo- geny of gymnosperms: advances in synthetic
seed  technology  of  conifers. Plant  Cell, Tiss. & Org.  Cult ., 35 , 1-35.
Cailloux,  F.,  J.  Julien-Guerrier,  L.  Linossier  &
A.  Coudret  (1996).  Long-term  somatic embryogenesis  and  maturation  of  somatic embryos  in Hevea  brasiliensis.    Plant  Sci., 120 , 185-196.
Deng,  M.  D.  &  D.  Cornu    (1992).    Maturation and germination of walnut somatic embryos. Plant Cell Tiss. & Org. Cult ., 28 , 195-202.
Flach,  M.  (1997). Sago  Palm. Metroxylon  sagu Rottb.  Promoting the Conservation and Use of  Underutilized  and  Neglected  Crops .13. Institute of  Plant Genetics  and  Crop  Plant Research, International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy. 76p.
Hisajima,  S.,  F.  S.  Jong,  Y.  Arai  &  E.  S.  Sim
(1991).    Propagation  and  breeding  of  sago palm  ( Metroxylon  sagu Rottb.)  plant in vitro :  1.  Embryo  culture  and  induction  of multiple  shoots  from  sago  embryo in  vitro . J. Trop. Agric., 35 (4), 259-267
Jong, F. S. (1995). Research for the Development of  Sago  Palm  ( Metroxylon  sagu Rottb.) Cultivation  in  Sarawak ,  Malaysia.  Sadong
Press Sdn. Bhd. 139p.
Leyser, O. & S. Day (2003). Mechanism in Plant Development . Blackwell Publishing. 231p.
Onishi, N., Y. Sakamoto & T. Hirosawa  (1994). Synthetic  seeds  as  an  application  of  mass production of somatic embryos. Plant Cell, Tiss.  & Org. Cult ., 39 , 137-145.
Padmanabhan, K., D. J. Cantliffe, R. C. Harrel &
J.  Harrison  (1998).    Computer  vision analysis  of  somatic  embryo  of  sweet  potato ( Ipomoea  batatas [L.]  Lam.)  for  assessing their  ability  to  convert  to  plants. Plant  Cell Rep., 17 , 681-684.
Riyadi,  I.,  J.  S.  Tahardi  &  Sumaryono  (2005). The  development  of  somatic  embryos  of
Keragaman morfologi selama perkembangan embrio...
sago palm ( Metroxylon sagu Rottb.) on solid media. Menara Perkebunan, 73 (2), 35-43.
Sakamoto,  Y.,  T.  Mashiko,  A.  Suzuki  & H. Kawata (1992). Development of encapsulation technology for synthetic seed. Acta Hort., 319 , 71-76.
Steel, R. G. D. & J. H. Torrie (1980). Principles and Procedures of Statistics : A Biometrical Approach ,  2 nd ed.  New  York,  McGraw-Hill Inc. 633p.
Sumaryono,  I.  Riyadi  &  J.  S.  Tahardi    (2001). Morphological variations during the development    of  somatic  embryos  of  tea ( Camellia  sinensis L.) in  vitro.  Menara Perkebunan, 69 (2), 46-57.
Tahardi,  J.S.  (1999).    Growth  characteristics  of embryogenic  cells  of  oil  palm  in  bioreactor cultures. J.  Bioteknol. Pertanian, 4 (2), 49- 55.
Tahardi,  J.S.,  T.  Raisawati,  I.  Riyadi  & W.A. Dodd  (2000).  Direct somatic embryo-
genesis  and  plant  regeneration  in  tea  by temporary liquid immersion. Menara
Perkebunan, 68 (1), 1-9.
Tahardi,  J.S.,  N.  F.  Sianipar  &  I.  Riyadi  (2002).
Somatic    embryogenesis   in     sago   palm ( Metroxylon  sagu Rottb.). In K.Kainuma et al. (eds.). New  Frontiers  of  Sago  Palm Studies .  Tokyo-Japan,  Universal  Academy Press. p. 75-81.
Tautorus, T. E. & D. J. Dunstan (1995).  Scale-up of embryogenic plant suspension cultures in bioreactors. In S.  Jain,  P.  Gupta  & R. Newton (eds.) Somatic Embryogenesis in Woody Plants, Vol. 1, p. 265-292.
Veisseire,  P.,  L.  Linossier  &  A.  Coudret  (1994). Effect  of  absisic  acid  and  cytokinins  on  the development  of  somatic  embryos  in Hevea brasiliensis . Plant Cell. Tiss.  &  Org.  Cult.,
39 , 219-223.