## BIOEDUSAINS: Jurnal Pendidikan Biologi dan Sains
Volume 5, Nomor 2, Desember 2022 e-ISSN: 2598-7453 DOI: https://doi.org/10.31539/bioedusains.v5i2.3996
KOMBINASI EKSTRAK METANOL DAUN KETEPENG CINA ( Cassia alata Linn . ) DENGAN ENAM EKSTRAK TUMBUHAN TERPILIH DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN

## BAKTERI Staphylococcus aureus
Lisna Hamni 1 , Avidlyandi Avidlyandi 2 , Charles Banon 3 , Khafit Wiradimafan 4 , Deni Agus Triawan 5 , Risky Hadi Wibowo 6 , Morina Adfa 7
Universitas Bengkulu 1,2,3,4,5,6,7
morina@unib.ac.id 7

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan  aktivitas  antibakteri  dan  efek kombinasi ekstrak metanol daun ketepeng cina ( Cassia alata Linn.) dengan enam ekstrak  tumbuhan  terpilih  terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus .  Metode  yang digunakan adalah difusi  sumuran dan metode pita kertas. Konsentrasi ekstrak uji 100  mg/mL  (1:1),  DMSO  50%  v/v  digunakan  sebagai  kontrol  negatif  dan antibiotik  clindamycin  sebagai  kontrol  positif.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  sebagian  besar  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina  ( C.  alata ) dengan  enam  ekstrak  tumbuhan  terpilih  menghasilkan  rata-  rata  diameter  zona hambat yang lebih besar daripada rata-rata diameter zona hambat masing-masing ekstrak tunggal. Namun, rata-rata diameter zona hambat kombinasi tersebut tidak lebih  besar  daripada  penjumlahan  rata-rata  diameter  zona  hambat  dari  masing- masing ekstrak tunggalnya. Simpulan, kombinasi  ekstrak metanol  daun ketepeng cina  ( C.  alata )  dengan  enam  ekstrak  tumbuhan  terpilih  memiliki  efek additive/indifferent dalam menghambat pertumbuhan S. aureus .
Kata Kunci: Antibakteri, Cassia alata Linn, Kombinasi, Staphylococcus aureus

## ABSTRACT
This  study  aimed  to  determine  the  antibacterial  activity  and  the  effect  of  the combination of methanol extract of the leaves of Chinese ketepeng (Cassia alata Linn.)  with  six  selected  plant  extracts  against  Staphylococcus  aureus  bacteria. The  method  used  is  well  diffusion  and  paper  tape  method.  The  concentration  of the  test  extract  was  100  mg/mL  (1:1),  DMSO  50%  v/v  was  used  as  a  negative control  and  the  antibiotic  clindamycin  as  a  positive  control.  The  results  showed that most of the combinations of the methanol extract of the Chinese ketepeng leaf (C. alata) with the six selected plant extracts produced an average diameter of the inhibition  zone,  which  was  greater  than  the  average  diameter  of  the  inhibition zone  of  every  single  extract.  However,  the  average  diameter  of  the  combined inhibition zones was not more significant than the sum of the average diameters of the inhibition zones of every single extract. In conclusion, the combination of the methanol  extract  of  the  Chinese  ketepeng  leaf  (C.  alata)  with  six  selected  plant extracts had additive/indifferent effects in inhibiting the growth of S. aureus.
Keywords: Antibacterial, Cassia alata Linn, Combination, Staphylococcus aureus

## PENDAHULUAN
Bakteri Staphylococcus  aureus merupakan  flora  normal  yang  dapat dijumpai pada selaput lendir dan kulit manusia, S. aureus termasuk dalam bakteri gram  positif  yang  dapat  menyebabkan  penyakit  klinis  penyebab  infeksi  atau bersifat  patogen  (Husna,  2018;  Taylor  &  Unakal,  2021).  Bakteri S  aureus dapat bersifat  patogen  karena  mempunyai  kemampuan  untuk  melakukan  pembelahan dan menyebar ke dalam jaringan tubuh (Husna, 2018). Umumnya, S aureus tidak menyebabkan  infeksi  pada  kulit  yang  sehat,  tetapi  jika  dibiarkan  memasuki jaringan  dalam  tubuh  atau  aliran  darah  maka S  aureus akan  menimbulkan berbagai infeksi yang berpotensi serius (Taylor & Unakal, 2021).
Penggunaan  obat  tradisional  di  Indonesia  telah  dilakukan  secara  turun- temurun  karena  dipercayai  lebih  aman  dan  memiliki  efek  samping  yang  relatif kecil. Pengetahuan mengenai khasiat obat tradisional tersebut kebanyakan berupa data  empiris,  oleh  sebab  itu  perlu  membuktikan  khasiat  obat  tradisional  secara ilmiah  untuk  mengetahui  ketepatan  penggunaan  obat  (Sumayyah  &  Salsabila, 2017). Bakteri Staphylococcus aureus dikenal  memiliki  kemampuan untuk kebal terhadap  berbagai  antibiotik.  Istilah Methicilin  Resistant  Staphylococcus  aureus atau  MRSA  merupakan  mutasi  dari  bakteri Staphylococcus  aureus serta  dapat menyebabkan  infeksi  serius  yang  membutuhkan  perawatan  intensif  di  rumah sakit.  Maka  dari  itu,  dibutuhkan  eksplorasi  antibiotik  atau  antibakteri  terbaru untuk menangani penyakit akibat patogen tersebut. Salah satu sumber yang dapat dimanfaatkan  untuk  eksplorasi  agen  antibakteri  yaitu  berasal  dari  tumbuhan (Gnanamani et al., 2017).
Uji  kandungan  fitokimia  pada  ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina  oleh Asmah  et  al.,  (2020)  menunjukkan  bahwa  daun  ketepeng  cina  mengandung senyawa-senyawa  metabolit  sekunder  diantaranya,  tanin,  flavonoid,  alkaloid, saponin,  fenol,  antrakuinon,  terpenoid  dan  steroid.  Senyawa-senyawa  metabolit sekunder  tersebut  memiliki  kemampuan  bioaktifitas,  salah  satunya  aktivitas antibakteri  yaitu  dengan  cara  menekan  atau  membasmi  pertumbuhan  bakteri patogen (Sadeek & Abdallah, 2019).
Pencampuran  ekstrak bahan  alam  perlu  diketahui  mengenai  keefektifannya untuk  menghambat  atau  membunuh  bakteri.  Penentuan  efek  yang  ditimbulkan dari kombinasi tersebut dapat ditentukan berdasarkan daya hambat dari kombinasi ekstrak tumbuhan terhadap bakteri uji. Ekstrak etanol daun ketepeng cina ( Cassia alata Linn.)  dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri Staphylococcus  aureus, Pseudomonas  aerugenosa dan Klebsiella  pneumonia pada  konsentrasi  uji  10%,
30%,  50%,  70%  dan  90%  (Lathifah  et  al.,  2021).  Adfa  et  al.,  (2021)  telah melakukan uji aktivitas antibakteri kombinasi ekstrak metanol daun ketepeng cina ( C.  alata )  dengan  ekstrak  metanol  biji  alpukat  terhadap Staphylococcus epidermidis . Konsentrasi kombinasi ekstrak yang diuji adalah 4 mg/mL, 8 mg/mL dan 12 mg/mL. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi  ekstrak metanol biji alpukat dan daun ketepeng cina terjadi efek additive/indifferent , dimana tidak terjadinya peningkatan aktivitas yang lebih besar dari penjumlahan kedua aktifitas secara  tunggal,  maupun  tidak  terjadinya  penurunan  aktivitas  setelah dikombinasikan.  Perlu  dicari  kombinasi  ekstrak  lainnya  dengan  ekstrak  metanol ketepeng cina untuk mendapatkan efek kombinasi yang lebih baik.
Ekstrak  tumbuhan  terpilih  yang  akan  dikombinasikan  dengan  ekstrak metanol  daun  ketepeng  cina  ( C.  alata )  telah  dilaporkan  memiliki  aktivitas
antibakteri  dengan  berbagai  jenis  bakteri.  Ekstrak  daun  sambang  darah ( Excoecaria  cochinchinensis L.)  memiliki  daya  hambat  terhadap  patogen tumbuhan  padi, Xanthomonas  oryzae pv  (Hai  et  al.,  2018).  Ekstrak  daun  ruku- ruku  ( Ocimum  tenuiflorum L.) menghasilkan  daya  hambat  terhadap  bakteri S. aureus , Proteus vulgaris , dan Escherichia coli (Adhikari et al., 2020). Ekstrak biji alpukat  ( Persea  americana Mill.)  menghasilkan  daya  hambat  terhadap S. epidermidis (Adfa  et  al.,  2021).  Ekstrak  metanol  daun  pacar  air  ( Impatiens balsamina L.,)  dilaporkan  dapat  menghambat  pertumbuhan S.  epidermidis dan Propiobacterium acnes (Dermawan et al., 2015). Ekstrak daun bungli ( Oroxylum indicum (L.)  Benth.  ex  Kurz)  memiliki  daya  hambat  terhadap  bakteri  penyebab infeksi  saluran  kemih,  salah  satunya  pada  bakteri S.  aureus (Dubey  et  al.,  2021) dan ekstrak daun sungkai memiliki zona hambat terhadap pertumbuhan bakteri S. aureus (Pradito et al., 2022).
Berdasarkan  penelitian  terdahulu  6  ekstrak  tumbuhan  terpilih  yaitu  ekstrak daun  sambang  darah,  daun  ruku-ruku,  biji  alpukat,  daun  pacar  air,  daun  bungli, dan  daun  sungkai  memiliki  aktivitas  antibakteri  yang  dapat  dimanfaatkan  dalam bidang  farmakologi,  namun  sejauh  ini  belum  ada  laporan  aktivitas  antibakteri kombinasi enam ekstrak tumbuhan terpilih dengan ekstrak metanol daun ketepeng cina  dalam  menghambat  pertumbuhan S.  aureus .  Studi  ini  bertujuan  untuk menentukan  efek  kombinasi  yang  ditimbulkan  dari  penggunaan  ekstrak  metanol daun  ketepeng  cina  dengan  6  ekstrak  tumbuhan  terpilih  guna  mengetahui keefektifannya  dalam  menghambat  atau  membunuh  bakteri S.  aureus jika digunakan bersama-sama (kombinasi) didalam penggunaan obat herbal.

## METODE PENELITIAN
Ekstrak  tanaman  yang  akan  diuji  aktivitas  antibakterinya  diperoleh  dari koleksi ekstrak herbal ibu Morina Adfa. Sampel-sampel tersebut disimpan dalam lemari pendingin di laboratorium organik, Kimia FMIPA UNIB. Ekstrak tersebut adalah ekstrak metanol daun ketepeng cina ( C. alata ), ekstrak metanol biji alpukat ( P.  americana ),  ekstrak  metanol  daun  sambang  darah  ( E.  cochinchinensis ), ekstrak metanol daun ruku-ruku ( O. tenuiflorum ), ekstrak metanol daun pacar air ( I.  balsamina ),  ekstrak  etanol  daun  sungkai  tua  ( P.  canescens )  dan  ekstrak metanol daun bungli ( O. indicum ). Spesimen  uji  adalah  bakteri S.  aureus. Bahan–bahan  pada  penelitian  ini adalah Nutrient  Broth (NB)  (Merck), Nutrient  Agar (NA)  (Merck),  dimetil sulfoksida  (DMSO)  (Merck),  akuades,  etanol  96%  (Brataco),  antibiotik clindamycin, plastic  wrap ,  dan  etanol  70%.  Peralatan  yang  digunakan  adalah spektronik 20D, inkubator (Froilabo), autoklaf (AIP), oven (Philips), laminar air flow (Telster  AV-100),  neraca  analitik  (aeADAM), rotamixer (Hati  vortex), hot plate (Salton),  cawan  petri  (Normax,  diameter  luar  100  mm  x  20  mm), mikropipet, lampu spritus, jarum ose, spluit, dan peralatan gelas lainnya.
Sterilisasi  basah  dilakukan  pada  Media  NB  dan  NA  dengan  autoklaf  pada suhu 121°C selama 15 menit. Alat-alat gelas disterilkan di dalam oven pada suhu 160°C  selama  2  jam.  Jarum  ose  dan  pinset  disterilkan  dengan  cara  pemijaran langsung di atas nyala api setiap kali pemakaian.

## Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Sumuran
Sebanyak  15  mL  Media  NA  yang  telah  steril  dituangkan  ke  dalam  cawan petri,  lalu  dipipet  1  mL  suspensi  bakteri  ya n g   s e t a r a   d e n g a n   k e k e r u h a n M c . F a r l a n   0 , 5   ke  dalam  cawan  petri.   C ampuran  dihomogenkan  dan dibiarkan  sampai  memadat.  Setelah  media  memadat,  dibuat  6  sumuran  pada media  menggunakan cork  borer berdiameter  6  mm.  Sumuran  diisi  dengan masing-masing  10  µL  larutan  6  ekstrak  terpilih  secara  tunggal  (100  mg/mL),  10 µL  masing-masing  ekstrak  (100  mg/mL)  yang  dikombinasi  pada  satu  sumuran dengan  perbandingan  1:1,  10  µL  larutan  kontrol  positif  clindamycin  (0,25 mg/mL),  10  µL  larutan  kontrol  negatif  DMSO  (50%v/v),  lalu  diinkubasi  selama 24  jam  pada  suhu  37 ○ C.  Setelah  24  jam,  maka  dilakukan  pengukuran  diameter zona  bening  disekeliling  sumuran  menggunakan  jangka  sorong  (mm).  Uji dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.

## Penentuan Pola Efek Kombinasi Menggunakan Metode Pita Kertas
Penentuan  pola  efek  kombinasi  ekstrak  dapat  ditentukan  dengan pengamatan secara visual pola zona hambat pada kertas Whatman (No.3) dengan ukuran 3 x 0,5 cm  yang dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan. Penentuan efek kombinasi  dilakukan  dengan  cara,  kertas  yang  telah  ditetesi  ekstrak  uji  pada konsentrasi  100  mg/mL  (30  µL)  masing  masing  ditempatkan  membentuk  sudut 90 ○ pada  cawan  petri  yang  telah  berisi  media  uji.  Efek  kombinasi  ekstrak  uji diamati  secara  visual.  Efek  kombinasi  dapat  diketegorikan  berdasarkan  zona hambat  yang  terbentuk  pada  pertemuan  kedua  pita  kertas  pada  sudut  90 ○ .  Efek kombinasi dikatakan bersifat sinergis jika adanya peningkatan zona hambat yang signifikan (lebih besar dari penjumlahan efek secara tunggal), efek antagonis jika terjadi pengecilan zona hambat pada sudut 90 ○ pada pertemuan kedua pita kertas, sedangkan additive / indifferent ketika efek  yang  ditimbulkan  saling  tidak mempengaruhi satu sama lainnya.

## Analisis Data
Analisis  dilakukan  dengan  cara  merata-ratakan  hasil  pengukuran  diameter daya  hambat  pertumbuhan S.  aureus pada  metode  sumuran yang  dilakukan dengan  3  kali  pengulangan.  Data  penentuan  efek  kombinasi  ekstrak  sampel dengan  metode  pita  kertas  diamati  secara  visual  dan  dibandingkan  dengan  pola efek  kombinasi  laporan  Laishram  yang  dapat  berupa  efek  sinergis, indifference/additive atau antagonis.

## HASIL PENELITIAN
Zona  bening/zona  hambat  pertumbuhan  bakteri S.  aureus setelah penambahan  ekstrak  tunggal  dan  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina ( Cassia  alata L.)  dengan  enam  ekstrak  tumbuhan  terpilih  pada  konsentrasi  100 mg/mL  dengan  perbandingan  1:1  dapat  dilihat  pada  Gambar  1  dan  Gambar  2. Terlihat  penambahan  ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina  ( C.  alata )  dan  enam ekstrak  tumbuhan  terpilih  (daun  sambang  darah,  daun  ruku-ruku,  biji  alpukat, daun  pacar  air,  daun  bungli,  dan  daun  sungkai)  dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri S. aureus baik secara tunggal maupun setelah dikombinasi.
Gambar 1. Zona hambat pertumbuhan bakteri S. aureus setelah diaplikasikan dengan  ekstrak  tunggal  dan  kombinasi  ekstrak  metanol  daun ketepeng  cina  ( C.  alata )  (KC)  dengan  SD=  ekstrak  metanol  daun sambang  darah  ( E.  cochinchinensis ),  RK=  ekstrak  metanol  daun ruku-ruku  ( O.  tenuiflorum ),  BA=  ekstrak  metanol  biji  alpukat  ( P. americana ).  K+  =  kontrol  positif  clindamycin  0,25  mg/mL,  K-  = kontrol negatif DMSO 50% (v/v)
Gambar 2. Zona hambat pertumbuhan bakteri S. aureus setelah diaplikasikan dengan  ekstrak  tunggal  dan  kombinasi  ekstrak  metanol  daun ketepeng  cina  ( C.  alata )  (KC)  dengan  BU=  ekstrak  metanol  daun bungli  ( O.  indicum ),  PA=  ekstrak  metanol  daun  pacar  air  ( I. balsamina ),  ST  =  ekstrak  etanol  daun  sungkai  tua  ( P.  canescens ). K+ = kontrol positif clindamycin 0,25 mg/mL, K- = kontrol negatif DMSO 50% (v/v)
Diameter  zona  hambat  rata-rata  pertumbuhan  bakteri S.  aureus setelah penambahan  ekstrak  tunggal  dan  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina ( C. alata ) dengan SD= ekstrak metanol daun sambang darah ( E. cochinchinensis ), RK= ekstrak metanol daun ruku-ruku ( O. tenuiflorum ), dan BA= ekstrak metanol biji  alpukat  ( P.  americana )  dapat  dilihat  pada  Gambar  3.  Sedangkan  diameter zona hambat rata-rata pertumbuhan bakteri S. aureus setelah penambahan ekstrak tunggal  dan  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina  ( C.  alata )  dengan
K- KC KC-BA SD K+ BA KC-SD KC-RK RK
BU= ekstrak metanol daun bungli ( O. indicum ), PA= ekstrak metanol daun pacar air  ( I.  balsamina ),  ST  =  ekstrak  etanol  daun  sungkai  tua  ( P.  canescens )  beserta kontrol positif dan kontrol negatif dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar  3.  Grafik  rata-rata  diameter  zona  hambat  pertumbuhan  bakteri S. aureus setelah  diaplikasikan  dengan  ekstrak  tunggal  dan kombinasi  ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina  ( C.  alata )  (KC) dengan  SD=  ekstrak  metanol  daun  sambang  darah  ( E. cochinchinensis ),  RK=  ekstrak  metanol  daun  ruku-ruku  ( O. tenuiflorum ),  BA=  ekstrak  metanol  biji  alpukat  ( P.  americana ). K+ = kontrol positif clindamycin 0,25 mg/mL, K- = kontrol negatif DMSO 50% (v/v)
Gambar 4.  Grafik  rata-rata  diameter  zona  hambat  pertumbuhan  bakteri S. aureus setelah diaplikasikan dengan ekstrak tunggal dan kombinasi ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina  ( C.  alata )  (KC)  dengan  BU= ekstrak  metanol  daun  bungli  ( O.  indicum ),  PA=  ekstrak  metanol daun pacar air ( I. balsamina ), ST = ekstrak etanol daun sungkai tua ( P. canescens ). K+  =  kontrol positif clindamycin 0,25  mg/mL, K- = kontrol negatif DMSO 50% (v/v)
Gambar 5. Hasil  penentuan  efek  kombinasi  menggunakan  metode  pita  kertas pada kombinasi ekstrak metanol daun ketepeng cina dengan enam ekstrak tumbuhan terpilih terhadap bakteri Staphylococcus aureus . A) KC-SD= kombinasi ekstrak metanol daun ketepeng cina dengan ekstrak  metanol  daun  sambang  darah;  B)  KC-PA=  kombinasi ekstrak metanol daun ketepeng cina dengan  ekstrak metanol daun pacar  air;  C)  KC-BA=  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  ketepeng dengan  ekstrak  metanol  biji  alpukat;  D)  KC-ST=  kombinasi ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina  dengan  ekstrak  etanol  daun sungkai  tua;  E)  KC-RK=  kombinasi  ekstrak  metanol  daun ketepeng  cina  dengan  ekstrak  metanol  daun  ruku-ruku;  F)  KC- BU=  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina  dengan ekstrak metanol daun bungli
KC SD KC BA BU KC ST KC RK KC PA A) B) C) D) E) F) KC
Penentuan  pola  efek  kombinasi  menggunakan  metode  pita  kertas  yang diperoleh  dari  pengamatan  secara  visual  dapat  dilihat  hasilnya  pada  Gambar  5. Pada  Gambar  5  terlihat  variasi  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina dengan enam ekstrak terpilih tidak menunjukkan peningkatan maupun penurunan zona  hambat  yang  signifikan  pada  pertemuan  pita  kertas  yang  berhimpit membentuk sudut 90 0 .

## PEMBAHASAN
Aktivitas  Antibakteri  Kombinasi  Ekstrak  Menggunakan  Metode  Difusi Sumuran
Uji aktivitas antibakteri kombinasi ekstrak metanol daun ketepeng cina ( C. alata )  dengan  enam  ekstrak  tumbuhan  terpilih  dilakukan  sebanyak  3  kali pengulangan,  semua  ekstrak  kasar  yang  diuji  pada  konsentrasi  100  mg/mL menunjukkan adanya respon hambatan terhadap pertumbuhan S. aureus . Aktivitas antibakteri  diperlihatkan  dengan  terbentuknya  zona  bening  disekeliling  sumuran (Gambar 1 dan 2). Sebagian besar dari kombinasi ekstrak menghasilkan rata-rata diameter  zona  hambat  yang  lebih  besar  daripada  rata-rata  diameter  zona  hambat masing-masing ekstrak tunggal.
Respon hambatan yang terjadi tergantung kepada kandungan kimia masing- masing  ekstrak  dan  interaksi  antara  komponen  kimia  tersebut  ketika  pemberian ekstrak dikombinasi. Dari Gambar 3, terlihat diameter zona hambat KC = 4,53 ± 0,3 mm; SD = 8,69 ± 0,21 mm; KC-SD = 9,28 ± 0,96 mm; RK = 1,9 ± 0,40 mm; KC-RK  =  5,97  ±  0,82  mm;  BA  =  1,92  ±  0,58  mm;  KC-BA  =  5,29  ±  0,64  mm. Sedangkan  Gambar  4  memperlihatkan  diameter  zona  hambat  KC  =  5,21  ±  0,56 mm;  BU = 1,37 ±  0,08  mm; KC-BU = 4,52 ± 0,44  mm;  PA = 1,56 ±  0,38 mm; KC-PA  =  6,06  ±  0,28  mm;  ST  =  3,44  ±  0,29  mm;  KC-ST  =  5,96  ±  0,16  mm, berturut-turut.  Diameter  zona  hambat  ekstrak  uji  lebih  kecil  dari  pada  kontrol positif clindamycin 0,25 mg/mL (16,37-17,04 mm). Kontrol negatif (DMSO 50%) pada  penelitian  ini  tidak  memperlihatkan  aktivitas  menghambat  pertumbuhan bakteri S.  aureus (0,0  ±  0,00  mm),  sehingga  dapat  diketahui  bahwa  aktivitas penghambatan  tidak  dipengaruhi  oleh  pelarut  DMSO  50%  yang  dipakai  untuk melarutkan ekstrak uji.
Kombinasi KC (ekstrak metanol daun ketepeng cina) dengan 5 jenis ekstrak yaitu SD (ekstrak metanol daun sambang darah ( E. cochinchinensis )), RK (ekstrak metanol  daun  ruku-ruku  ( O.  tenuiflorum )),  BA  (ekstrak  metanol  biji  alpukat  ( P. americana )), PA (ekstrak metanol daun pacar air ( I. balsamina )), dan ST (ekstrak etanol  daun  sungkai  tua  ( P.  canescens ))  menghasilkan  zona  hambat  yang  lebih besar  dari  pada  masing-masing  ekstrak  tunggalnya  yang  dikombinasikan,  namun tidak  lebih  besar  dari  pada  penjumlahan  zona  hambat  dari  kedua  ekstrak  secara tunggal,  sedangkan  kombinasi  KC  (ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina)  dengan BU  (ekstrak  metanol  daun  bungli  ( O.  indicum ))  menghasilkan  diameter  zona hambat yang lebih besar dari BU, namun lebih kecil dari KC secara tunggal. Dari data  uji  menggunakan  metode  sumuran  dapat  diketahui  efek  penghambatan ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina  ( C.  alata )  dengan  enam  ekstrak  tumbuhan terpilih adalah efek additive / indifferent sejalan dengan laporan yang disampaikan oleh  Yang  (2017).  Ketika  kedua  ekstrak  dikombinasikan  terjadi  sedikit peningkatan  zona  hambat  meskipun  tidak  sebesar  efek  sinergis.  Efek  kombinasi keenam  ekstrak  tidak  dikatakan  antagonis  karena  saat  kedua  ekstrak
dikombinasikan  tidak  menunjukkan  penurunan  zona  hambat  yang  lebih  rendah dari zona hambat kedua ekstrak secara individual (Cheesman et al., 2017).
Senyawa  metabolit  sekunder  pada  tumbuhan  seperti  senyawa  fenolik, alkaloid,  terpenoid,  karotenoid  dan  lain-lain  memiliki  kemampuan  untuk menghambat  pertumbuhan  maupun  membunuh  bakteri  patogen  (Sadeek  & Abdallah,  2019).  Efek  kombinasi  yang  terjadi  tidak  lepas  dari  peranan  metabolit sekunder dalam ekstrak tumbuhan yang dikombinasikan. Jenis metabolit sekunder pada  ekstrak  tumbuhan  memiliki  mekanisme  kerja  yang  berbeda-beda. Antibakteri  secara  umum  memiliki  mekanisme  kerja  dengan  cara  mengganggu sintesis  dinding  sel,  mengganggu  sintesis  DNA  dan  RNA,  penghancuran  (lisis) membran  sel,  menghambat  sintesis  protein,  menghambat  jalur  metabolisme  dan lain-lain (Chandra et al., 2017).
Metabolit  sekunder  yang  diduga  mempunyai  aktivitas  antibakteri  pada  7 jenis  tumbuhan  yang  diuji  adalah  sebagai  berikut,  daun  ketepeng  cina  ( C.  alata ) dilaporkan  kaya  akan  antrakuinon,  fenolik,  tanin,  saponin,  flavonoid,  alkaloid, steroid dan karbohidrat (Meenupriya et al., 2014). Hasil uji fitokimia biji alpukat ( P.  americana )  menunjukkan  adanya  kandungan  flavonoid,  tanin,  alkaloid, antosianin, polifenol, triterpenoid, kuinon, saponin dan steroid (Ekom et al., 2022; Leite  et  al.,  2009).  Penelitian  sebelumnya  juga  melaporkan  bahwa  37  senyawa telah  diisolasi  dari  daun  sambang  darah  ( E.  cochinchinensis ),  sebagian  besar adalah  diterpenoid  teroksigenasi,  sementara  yang  lain  adalah  loliolide,  glukosida megastigmane, flavonoid, triterpenoid, sterol, dan fenolat (Hieu et al., 2020). Ekstrak  daun  sungkai  ( P.  canescens )  yang  dikoleksi  dari  Bengkulu mengandung  7  senyawa  diterpenoid baru  tipe  clerodane bernama peronemin  B2, peronemin  A2, peronemin B1, peronemin  C1, peronemin  B3, peronemin  A3, dan peronemin D1 dan tiga flavonoid glikosida yaitu akteosida, isomer akteosida, dan 3',4’,5-trihidroksi-7-metoksi  flavon-3-O-glukopiranosilara-binosida (Kitagawa  et al.,  1994;  Simanjuntak,  1996).  Daun  pacar  air  ( I.  balsamina )  juga  mengandung senyawa  polifenol,  flavonoid,  kuinon  dan  steroid.  Dilaporkan  juga  bahwa senyawa  kuinon  yang  berperan  dalam  aktivitas  antibakteri  pada  daun  pacar  air adalah  naftakuinon,  salah  satunya  2-metoksi-1,4-naftakuinon  (Ismarani  et  al., 2014).  Serta,  menurut  Yamani  et  al.,  (2016)  minyak  atsiri  daun  ruku-ruku  ( O. tenuiflorum )  mengandung  senyawa  volatil  yang  terdiri  dari  monoterpena  dan seskuiterpena  dengan  kandungan  utamanya  adalah  metil  eugenol.  Eswari  et  al., (2018) melakukan uji fitokimia pada daun bungli ( O. indicum) dan menunjukkan bahwa  ekstrak  metanol  bungli  mengandung  senyawa  metabolit  sekunder flavonoid,  fenol  dan  tanin.  Keberadaan  senyawa-senyawa  metabolit  sekunder tersebut  diduga  mempunyai  peranan  terhadapa  aktivitas  antibakteri  ke-7  ekstrak tanaman  yang  diuji,  dimana  interaksi  senyawa-senyawa  tersebut  ketika dikombinasikan juga berbeda-beda.

## Penentuan Pola Efek Kombinasi Menggunakan Metode Pita Kertas
Pola efek kombinasi diamati secara visual menggunakan metode pita kertas dan  pola  hambat  kombinasi  ekstrak  yang  terbentuk  dibandingkan  dengan  pola efek  kombinasi  oleh  Laishram  et  al.,  (2017)  (Gambar  6).  Kombinasi  ekstrak utama KC (ekstrak metanol daun ketepeng cina)  dengan enam ekstrak tumbuhan terpilih  dari  pengamatan  secara  visual  dapat  dikategorikan additive / indifferent . Keenam  variasi  kombinasi  KC (ekstrak metanol daun ketepeng cina) dengan SD
(ekstrak metanol daun sambang darah), RK (ekstrak metanol daun ruku-ruku), BA (ekstrak  metanol  biji  alpukat),  PA  (ekstrak  metanol  daun  pacar  air),  ST  (ekstrak etanol  daun  sungkai  tua),  dan  BU  (ekstrak  metanol  daun  bungli)  tidak menunjukkan peningkatan maupun penurunan zona hambat  yang signifikan pada bagian daerah pita kertas yang berhimpit membentuk sudut 90 0 , dimana pola yang terlihat  hampir  sama  dengan  pola  yang  dilaporkan  oleh  Laishram  et  al.,  (2017) pada Gambar 6c.
(a) (b) (c) (d)
Gambar 6.  Pola Efek Kombinasi. (a) Sinergis; (b) Sinergis;
(c) Additive/Indifferent ; (D) Antagonis
Secara  kuantitatif  efek  kombinasi  2  ekstrak  dalam  menghambat pertumbuhan  bakteri  dapat  ditentukan  dengan  menghitung  indeks Fractional Inhibitory  Concentration (FIC)  yang  didapat  dengan  menentukan  Minimum Inhibition Concentration (MIC) kombinasi ekstrak dan MIC ekstrak tunggal. Efek sinergis jika FIC ≤ 0,5; additive jika FIC > 0,5-1; Indifferent jika FIC > 1 atau < 2, dan antagonis jika FIC ≥ 2 (EUCAST of the ESCMID, 2000).

## SIMPULAN
Pengamatan  efek  kombinasi  secara  visual  pada  pita  kertas  memberikan indikasi  bahwa  kombinasi  ekstrak  metanol  daun  ketepeng  cina  ( Cassia  alata L.) dengan  enam  ekstrak  tumbuhan terpilih  (daun  sambang  darah,  biji  alpukat,  daun ruku-ruku, daun pacar air, daun bungli, dan daun sungkai tua) menghasilkan efek additive / indifferent .
A B A A A B B B

## DAFTAR PUSTAKA
Adfa,  M.,  Gusatyana,  N.  M.  C.,  Mudyanto,  A.,  Avidlyandi,  A.,  Oktiarni,  D.,  & Yudha  S.,  S.  (2021).  Combined  Effect  of  Methanol  Extract  of Persea americana Seeds  and Cassia  alata Leaves  against Staphylococcus epidermidis . Proceedings of the International Seminar on Promoting Local Resources for Sustainable Agriculture and Development (ISPLRSAD 2020) , 13 , 36–40. https://doi.org/10.2991/absr.k.210609.006
Adhikari, N., Rana, A., Oli, S., Neupane, S., Bhandari, R., & Joshi, D. R. (2020). Study of  In-vitro Antioxidant and Antibacterial  Activity of  Leaf Extract  of Azadirachta indica and Ocimum sanctum in Different Organic Solvents and Cow  Urine. Journal  of  Drug  Delivery  &  Therapeutics , 10 (1-S),  90–95. https://doi.org/10.22270/jddt.v10i1-s.3908
Asmah,  N.,  Halimatussakdiah,  H.,  &  Amna,  U.  (2020).  Analisa  Kandungan Senyawa  Metabolit  Sekunder  Ekstrak  Daun  Ketepeng  Cina  ( Cassia  alata L.) dari Bireum  Bayeun, Aceh Timur. QUIMICA: Jurnal Kimia Sains Dan Terapan , 2 (2), 7–10. https://doi.org/10.33059/jq.v2i2.2646
Chandra, H.,  Bishnoi,  P., Yadav,  A., Patni, B.,  Mishra, A. P., &  Nautiyal,  A. R. (2017).  Antimicrobial  Resistance  and  the  Alternative  Resources  with Special  Emphasis  on  Plant-Based  Antimicrobials  -  A  Review. Plants
(Basel.) , 6 (2), 457–462. https://doi.org/10.3390/plants6020016
Cheesman,  M.  J.,  Ilanko,  A.,  Blonk,  B.,  &  Cock,  I.  E.  (2017).  Developing  New Antimicrobial  Therapies :  Are  Synergistic  Combinations  of  Plant
Exctracts/Compounds  with  Conventional  Antibiotics  the  Solution? Pharmacognosy Reviews , 11 (22), 57–72. https://doi.org/10.4103/
phrev.phrev_21_17
Dermawan,  A.  M.,  Pratiwi,  L.,  &  Kusharyanti,  I.  (2015).  Efektivitas  Krim
Antijerawat  Ekstrak Metanol  Daun Pacar  Air ( Impatiens balsamina Linn.). Traditional Medicine Journal , 20 (3), 127–133.
https://doi.org/10.22146/tradmedj.8851
Dubey,  D.,  Sahu,  M.  C.,  &  Naik,  P.  K.  (2021).  Evaluation  of  the  Antibacterial Activity  of  the  Leave  Extract  of Oroxylum  indicum Against  Multidrug Resistant Bacteria Causing Urinary Tract Infection. International Journal of Current Research and Review , 13 (15), 133–138.
https://doi.org/10.31782/ijcrr.2021.131525
Ekom, S. E., Tamokou, J. D. D., & Kuete, V. (2022). Methanol Extract from the Seeds  of Persea  americana Displays  Antibacterial  and  Wound  Healing Activities  in  Rat  Model. Journal  of  Ethnopharmacology , 282 ,  1–14. https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.114573
EUCAST  of  the  ESCMID.  (2000).  Terminology  Relating  to  Methods  for  the Determination  of  Susceptibility  of  Bacteria  to  Antimicrobial  Agents.
Clinical Microbiology and Infection , 6 (9), 503–508.
https://doi.org/10.1046/j.1469-0691.2000.00149.x
Eswari, J. S., Dha-Gat, S., Naik, S., & Dibya, S. (2018). Oroxylum indicum Leaf Extracts  for  Screening  of  Antimicrobial  Properties  and  Phytochemicals. Pharmaceutical Bioprocessing , 6 (1), 7–14. https://www.openaccessjournals.com/articles/phytochemical-and- antimicrobial-studies-of-oroxylum-indicum-extracts.pdf Gnanamani,  A.,  Hariharan,  P.,  &  Paul-Satyaseela,  M.  (2017). Staphylococcus
aureus :  Overview  of  Bacteriology,  Clinical  Diseases,  Epidemiology,
Antibiotic Resistance and Therapeutic Approach. Frontiers in Staphylococcus aureus . IntechOpen . https://doi.org/10.5772/67338
Hai, N. T., Trang, D. H., & Ha, N. T. T. (2018). Herbal Extracts in Combination with Nanosilver Inhibit Blight Disease Caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae  in  Rice. Vietnam  Journal  of  Agricultural  Sciences , 1 (4),  270–280. https://doi.org/10.31817/vjas.2018.1.4.03
Hieu, L. H., Thao, N. P., Anh, D. H., Hong Hanh, T. T., Cong, N. D., Cuong, N. T., Van Thanh, N., Cuong, N. X., Nam, N. H., Quang, N. D., & Van Minh, C. (2020). Metabolites from Excoecaria cochinchinensis Lour. Phytochemistry Letters , 37 (8), 116–120. https://doi.org/10.1016/j.phytol.2019.08.003
Husna,  C.  A.  (2018).  Peranan  Protein  Adhesi  Matriks  Ekstraseluler  dalam
Patogenitas  Bakteri Staphylococcus  aureus . Averrous :  Jurnal  Kedokteran dan Kesehatan Malikussaleh , 4 (2), 99–100 https://doi.org/10.29103/averrous.v4i2.1041 Ismarani,  D.,  Pratiwi,  L.,  &  Kusharyanti,  I.  (2014).  Formulasi  Gel  Pacar  Air ( Impatiens  balsamina Linn.)  terhadap Propionibacterium  acnes dan Staphylococcus epidermidis . Pharmaceutical Sciences and Research (PSR) , 1 (1), 30–45. https://doi.org/10.7454/psr.v1i1.3504
Kitagawa, I., Simanjuntak, P., Hori, K., Nagami, N., Mahmud, T., Shibuya, H., & Kobayashi,  M.  (1994).  Indonesian  Medicinal  Plants.  VII . Seven  New Clerodane-Type  Diterpenoids,  Peronemins  A 2 ,  A 3 ,  B 1 ,  B 2 ,  B 3 ,  C 1 ,  and  D 1 , from  the  Leaves  of Peronema  canescens (Verbenaceae). Chemical  and Pharmaceutical Bulletin , 42 (5), 1050–1055. https://doi.org/10.1248/cpb.42.1050 Laishram,  S.,  Pragasam,  A.  K.,  Bakthavatchalam,  Y.  D.,  &  Veeraraghavan,  B.
(2017).  An  Update  on  Technical,  Interpretative  and  Clinical  Relevance  of Antimicrobial  Synergy  Testing  Methodologies. Indian  Journal  of  Medical Microbiology , 35 (4), 445–468. https://doi.org/10.4103/ijmm.IJMM_17_189 Lathifah,  Q.  A.,  Turista,  D.  D.  R.,  &  Puspitasari,  E.  (2021).  Daya  Antibakteri Ketepeng  Cina  ( Cassia  alata L.)  terhadap Staphylococcus  aureus , Pseudomonas  aerugenosa ,  dan Klebsiella  pneumonia . Jurnal  Analis Kesehatan , 10 (1), 29–34. http://dx.doi.org/10.26630/jak.v10i1.2718
Leite, J. J. G., Brito, É. H. S., Cordeiro, R. A., Brilhante, R. S. N., Sidrim, J. J. C., Bertini,  L.  M.,  De  Morais,  S.  M.,  &  Rocha,  M.  F.  G.  (2009).  Chemical Composition,  Toxicity  and  Larvicidal  and  Antifungal  Activities  of Persea americana (Avocado)  Seed  Extracts. Revista  Da  Sociedade  Brasileira  de Medicina Tropical , 42 (2), 110–113. https://doi.org/10.1590/S0037- 86822009000200003
Meenupriya,  J.,  Vinisha,  A.  S.,  &  Priya,  P.  (2014). Cassia  alata and Cassia auriculata –  Review  of  Their  Bioactive  Potential. World  Journal  of Pharmaceutical Sciences , 2 (12), 1760–1769.
http://www.academia.edu/download/35883193/021226-PS0387.pdf Pradito,  S.  A.,  Muthmainah,  N.,  &  Biworo,  A.  (2022).  Perbandingan  Aktivitas Antibakteri  Sediaan  Ekstrak  Daun  Sungkai  ( Peronema  canescens Jack) terhadap  Bakteri Staphylococcus  aureus . Homeostatis :  Jurnal  Mahasiswa Pendidikan Dokter , 5 (1), 135–144.
https://ppjp.ulm.ac.id/journals/index.php/hms/article/view/5212/3568 Sadeek,  A.  M.,  &  Abdallah,  E.  M.  (2019).  Phytochemical  Compounds  as
Antibacterial  Agents:  A  Mini  Review. Global  Journal  of  Pharmacy  & Pharmaceutical Sciences , 7 (4), 1–6. https://doi.org/10.19080/GJPPS.2019.07.555720
Simanjuntak,  P.  (1996).  Studi  Kimia  Senyawa  Glikosida  Tumbuhan  Sungkei,
Peronema  canescens (Verbenaceae). Jurnal  Kimia  Terapan  Indonesia (Indonesian Journal of Applied Chemistry , 6 (1–2), 8–12. https://doi.org/10.14203/jkti.v6i1-2.229 Sumayyah, S., & Salsabila, N. (2017). Obat Tradisional: Antara Khasiat dan Efek Sampingnya. Majalah Farmasetika , 2 (5), 1–4.
https://doi.org/10.24198/farmasetika.v2i5.16780
Taylor,  T.,  &  Unakal,  C.G.  (2021). StatPearls:  Staphylococcus  aureus .  National Center for Biotechnology Information. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK441868/ Yamani, H. A., Pang, E. C., Mantri, N., & Deighton, M. A. (2016). Antimicrobial Activity  of  Tulsi  ( Ocimum  tenuiflorum )  Essential  Oil  and  Their  Major Constituents  against  Three  Species  of  Bacteria. Frontiers  in  Microbiology , 7 , 1–10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00681
Yang, S.-K., Yusoff, K., Mai, C.-W., Lim, W.-M., Yap, W.-S., Lim, S.-H. E., & Lai,  K.-S.  (2017).  Additivity  vs.  Synergism:  Investigation  of  the  Additive Interaction of Cinnamon Bark Oil and Meropenem in Combinatory Therapy. Molecules , 22 (1), 1–14. https://doi.org/10.3390/molecules22111733