Jurnal Farmasi Galenika ( Galenika Journal of Pharmacy ) 2017; 3(2): 103 – 117 ISSN : 2442-7284 (print), 2442-8744 (electronic) http://jurnal.untad.ac.id/jurnal/index.php/Galenika/index DOI : 10.22487/j24428744. 2017.v3.i2.8610 Review Hepatoprotektor Rosela ( Hibiscus sabdariffa ): Aktivitas,

## Mekanisme Aksi, dan Toksisitas
(Review  of  Hepatoprotector  of  Rosela  (Hibiscus  sabdariffa)  :  Activity,  Mechanism  of Action and Toxicity)
Steffi Liem * , Jutti Levita
Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Jl. Raya Bandung, Sumedang Km 21 Jatinangor 45363
Article Info: Received: 08 Juni 2017 in revised form: 28 Juni  2017 Accepted: 30 Juli 2017
Available Online: 01 Oktober 2017

## ABSTRACT
Liver  cirrhosis  has  become  a  health  problem  in  the  world  that  caused mortality  significantly.  Treatment  used  herbs  from  various  countries  has been  widely  applied,  one  of  them  by  consuming  roselle  ( Hibiscus sabdariffa )  calyx  extract . This  review  will  be  discusse  about  the  usage  of H.sabdariffa calyx  extract  as  hepatoprotectorwhich  can  inhibit  the increasing  of  clinical  parameters,  such  as  ALT,  AST,  ALP,  and  LDH  in various  inducer,  ie  acetaminophen,  CCl4,  CdCl2,  DNPH,  and  TAA.  Its mechanism  of  action  are  as  an  antioxidant,  inhibition  of  cytochrome enzyme,  increase  liver  cell  viability  percentage,  increase  CAT,  GSH  and decrease  protein  expression  of  pJNK,  tBid  and  Bax.  Although,  the consumption  of H.  Sabdariffa calyx  extract  may  also  cause  acute, subchronic, and chronic toxicity depend on the dose.
Keywords : Hibiscus sabdariffa Roselle Hepatoprotective Toxicity
Corresponding Author: Steffi Liem Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran Jatinangor, 45363, Bandung, Indonesia Phone : +62 451-423468 Email: steffi_liem@yahoo.com
Copyright © 2017 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.

## How to cite (APA 6th Style):
Liem  S  &  Levita  J.  (2017).  Review  Hepatoprotektor  Rosela  ( Hibiscus  sabdariffa ):  Aktivitas,  Mekanisme  Aksi,  dan Toksisitas. Jurnal  Farmasi  Galenika  (Galenika  Journal  of  Pharmacy),  3 (2),  103-117.  doi:10.22487/j24428744.  2017. v3.i2.8610

## ABSTRAK
Sirosis hati telah menjadi masalah kesehatan di dunia yang menyebabkan mortalitas secara signifikan. Penangannya  menggunakan  herbal  dari  berbagai  negara  telah  lama  dilakukan,  salah  satunya  dengan mengkonsumsi  ekstrak  bunga  rosella  ( Hibiscus  sabdariffa ).  Makalah  review  ini  akan  membahas  tentang penggunaan  ekstrak  bunga H.  sabdariffa sebagai  hepatoprotektor  yang  dapat  menghambat  terjadinya peningkatan  beberapa  parameter  klinis,  seperti  ALT,  AST,  ALP,  dan  LDH  pada  berbagai  jenis  penginduksi, yakni  asetaminofen,  CCl 4 ,  CdCl 2 ,  DNPH,  dan  TAA.  Mekanisme  kerja  ekstrak  bunga H.  sabdariffa adalah dengan  berperan  sebagai  antioksidan,  inhibitor  enzim  sitokrom,  meningkatkan  persentase  viabilitas  sel, meningkatkan CAT, GSH dan menurukan ekspresi protein pJNK, tBid, dan Bax. Walaupun demikian, konsumsi ekstrak  bunga H.  sabdariffa juga  dapat  menyebabkan  toksisitas  akut,  sub  kronis,  dan  kronis  yang  bergantung dari dosis yang diberikan.
Kata Kunci : Hibiscus sabdariffa , rosela, hepatoprotektor, toksisitas.

## PENDAHULUAN
Hati merupakan organ terbesar di dalam tubuh manusia, yang berfungsi sebagai tempat untuk  metabolisme  lemak,  karbohidrat,  dan protein,  sebagai  tempat  detoksifikasi  senyawa yang  bersifat  toksin,  pembentukan  dan ekskresi  garam  empedu,  dan  fungsi  vaskular. Kerusakan  hati  ini  dapat  disebabkan  oleh infeksi,  alkohol,  autoimun,  maupun  obat- obatan(Wahyuningsih and Sutjiatmo, 2015).
Kerusakan  hati  kronis  (sirosis)  telah menjadi masalah kesehatan internasional yang terjadi  pada  31  juta  orang  dan  menyebabkan kematian  pada  1  juta  orang  atau  2%  tingkat kematian  diseluruh  dunia  pada  tahun  2010. Penyakit  sirosis hati ini  terus  meningkat  sejak tahun  1980.  Di  Indonesia  pada  tahun  1980- 2010  penderita  sirosis  terus  bertambah  dan menyebabkan mortalitas, yakni sebesar 19,8% (tahun  1980),  22,4%  (tahun  1990),  24,3% (tahun 2000), 24,8% (tahun 2010) per 100.000 kematian(Mokdad et al. , 2014).
Penanganan
kerusakan hati menggunakan  obat-obat  herbal  telah  lama dilakukan, salah satunya dengan menggunakan
bunga  rosella  ( Hibiscus  sabdariffa ).  Telah banyak  penelitian  mengenai  efektivitas  bunga H.  sabdariffa sebagai  hepatoprotektor,  yang mencegah  terjadinya  kerusakan  hati  akibat asetaminofen  (Olaleye  and  Rocha,  2008), karbon tetraklorida (Hashemi, 2014), kadmium (Al-kubaisy,  Al-groom  and  Amoush,  2016), dan 2, 4- dinitro fenil hidrazin (Olusola, 2011). Aktivitas  ini  disebabkan  oleh  kandungan bunga  rosella  yang  mengandung  antosianin, flavonoid,  tanin,  dan  asam  askorbat(Tseng et al. ,  1997).  Oleh  karena  itu,  pada  makalah review ini akan membahas mengenai aktivitas hepatoprotektor dari H. sabdariffa , baik secara in vitro maupun in vivo , mekanisme  dan studi toksisitasnya.

## AKTIVITAS HEPATOPROTEKTOR SECARA IN VITRO
H.sabdariffa
memberikan berbagai aktivitas  secara in  vitro sebagai  antioksidan,
inhibitor  enzim  CYP,  dan  menghambat ekspresi  protein  proapoptosis  pada  sel  hati seperti terlihat pada tabel 1.
Tabel 1 Hasil Studi Identitifikasi Aktivitas Hepatoprotektor H. sabdariffa secara In Vitro Ekstrak Metode Hasil Referensi Etanol 30% Antioksidan DPPH dan ABTH IC 50 DPPH  (289.01  ±  16.68  µg/ml)  dan  ABTH (423.25 ± 31.38 µg/ml) (Yang et al. , 2012) Metanol Antioksidan DPPH IC 50 140,9 ± 8,2 µg/ml (Adetutu and Owoade, 2013) Etanol Inhibitor enzim CYP IC 50 untuk  masing-masing  enzim  CYP  adalah  : CYP1A2 = 306 µg/ml; CYP2A6 = 1660 µg/ml; CYP2B6  =  481  µg/ml;  CYP2C8  =  424  µg/ml;
CYP2C9 = 744 µg/ml; CYP2C19 = 621 µg/ml;
CYP2D6  =  446  µg/ml;  CYP2E1  =  506  µg/ml;
dan CYP3A4 = 633 µg/ml (Johnson et  al. , 2013) Air Menggunakan sel BALB/c  normal  liver (BNL) untuk MTT assay ,  MDA,  CAT,
GSH,  Ekspresi  protein
pJNK, tBid, dan Bax
Peningkatan % viabilitas pada MTT assay , CAT dan GSH secara signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif (asetaminofen).
Penurunan MDA serta ekspresi protein pJNK, tBid, dan Bax secara signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif (asetaminofen)
(Liu et al. , 2010)
Keterangan  :  DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ,  ABTH: 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sufonic acid) ,  CYP: cytochrome ,  MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl  tetrazolium  bromide , MDA: malondialdehyde ,  GSH: Glutahione ,  CAT: catalase ,  pJNK: phosphorylated  c-Jun  N-terminal  kinase ,  tBid  : Truncated BID (BH3 interacting-domain ) , Bax: BCL 2 associated X
Radikal bebas merupakan molekul yang tidak  memiliki  pasangan  elektron  bebas sehingga  bersifat  tidak  stabil  dan  dapat menyebabkan  kerusakan  sel  hati.  Dengan adanya  ekstrak H.  sabdariffa ,  maka  radikal bebas tersebut distabilkan oleh efek antioksidannya,  yang  dapat  dilihat  dari  nilai IC 50 yang  dihasilkan  terhadap  penghambatan DPPH dan ABTH pada tabel 3 di atas.
Penghambatan  pada  berbagai  variasi enzim  sitokrom  P450,  dapat  menurunkan metabolisme  xenobiotik  yang  bersifat  toksik dan  radikal  terhadap  sel  hati.  Sehingga kerusakan  hati  dapat  dicegah.  Sitokrom isoenzim yang dapat dihambat adalah CYP1A2,  CYP2A6,  CYP2B6,  CYP2C8,
CYP2C9,  CYP2C19,  CYP2D6,  CYP2E,  dan CYP3A4 (Johnson et al. , 2013).
Pada  peristiwa  kematian  sel  akibat induksi  asetaminofen,  terjadi  inisiasi  awal aktivasi  JNK  menjadi  pJNK  dan  translokasi Bax  dimitokondria.  Penghambatan  terhadap JNK  dapat  menyebabkan  sel  bertahan  hidup dan  mencegah  kematian  sel.  JNK  teraktivasi oleh death  receptor dan  stres  retikulum endoplasma. Aktivasi terus-menerus pada JNK menyebabkan  Bim  teraktivasi  dan  mengarah pada  disfungsi  mitokondria  atau  menginduksi kaspase 8, pelepasan Bid yang mengarah pada pelepasan sitokrom c dari mitokondria.Pelepasan  sitokrom  c  ini  diatur oleh  Bax.  Penurunan  ekspresi  protein  pJNK, tBid,  dan  Bax  setelah  pemberian  ekstrak
menunjukkan  mekanisme  penurunan  stres oksidatif  dan  apoptosis  melalui  jalur  intrinsik mitokondria (Liu et al. , 2010).

## AKTIVITAS  HEPATOPROTEKTOR SECARA IN VIVO
Aktivitas H.  sadariffa secara in  vivo dapat  terlihat  dengan  adanya  penurunan berbagai  indikator  kerusakan  hati,  seperti enzim  AST,  ALT,  ALP,  dan  LDH.  Aktivitas hepatoprotektor  dapat  dilihat  pada  tabel 2.Penginduksi kerusakan hati, seperti
asetaminofen,  CCl 4 ,  TAA,  DNPH,  dan kadmium  setelah  masuk  ke  dalam  tubuh  dan dimetabolisme di hati akan membentuk radikal bebas  yang  dapat    merusak  sel  hati  yang ditandai  dengan  peningkatan  pada  enzim- enzim tersebut dan perubahan fisiologis sel-sel hati  terhadap  biosintesis  lemak  dan  protein. Radikal  bebas  tersebut  dapat  distabilkan dengan  pemberian  ekstrak H.  sabdariffa yang diukur berdasarkan aktivitasnya sebagai antioksidan hepatik pada tabel 3.
Tabel  2.Hasil  Studi  Identitifikasi  Aktivitas  Hepatoprotektor H.  sabdariffa pada  Parameter  Kimia
Darah Dosis Hewan Uji Penginduksi Kontrol Positif Hasil Referensi Ekstrak 100 mg/kg BB Mencit Asetaminofen 250 mg/kg BB - Penurunan kadar AST dan ALT yang signifikan terhadap kontrol negatif (asetaminofen saja) (Olaleye and Rocha, 2008) Ekstrak 200, 400, 600 mg/kg BB Tikus CCl 4 1 ml/kg BB - Penurunan kadar AST, ALT, ALP, TC, TG, LDL-C, dan VLDL-C. Peningkatan HDL-C, dan GSH yang signifikan dibandingkan kontrol negatif (CCl 4 ) (Hashemi, 2014) Ekstrak dan fraksi antosianin 100 mg/kg BB Kelinci   2, 4- dinitro fenil hidrazin (DNPH) 28 mg/kg BB - Penurunan kadar AST dan ALT yang signifikan dibandingkan kontrol negatif (DNPH) (Olusola, 2011) Fraksi 100 mg/kg BB Tikus Thioacetamide (TAA) 200 mg/kg BB Silymarin 50 mg/kg BB Penurunan kadar AST dan ALT yang sebanding dengan silymarin dan berbeda signifikan dengan kontrol negatif (TAA) (Ezzat et al. , 2016) Ekstrak 200 dan 300 mg/kg BB Tikus CCl 4 - Peningkatan HDL-C. Penurunan LDL-C, TG, TC, AST, ALT dan ALP yang signifikan (Usoh et al. , 2012)
dibandingkan kontrol negatif
(CCl 4 ). Fraksi 50 dan 100 mg/kg BB Tikus CCl 4 1,25 mg/kg BB - Penurunan kadar AST, ALT, ALP, dan LDH yang signifikan dibandingkan kontrol negatif (CCl 4 ) (Adetutu and Owoade, 2013) Fraksi 100 dan 200 mg/kg BB Tikus DNPH 3 mg/kg BB Silymarin 25 mg/kg BB Penurunan kadar AST, ALT, LDH, T-BIL dan D-BIL, serta peningkatan ALB yang signifikan dibandingkan kontrol negatif (DNPH) (Obouayeba et al. , 2014) Ekstrak 200, 400, dan 600 mg/kg BB Mencit Asetaminofen 1000 mg/kg BB - Penurunan kadar AST dan ALT yang signifikan dibandingkan kontrol negatif (asetaminofen) (Liu et al. , 2010)
Keterangan  AST  : aspartate  transaminase ,  ALT: alanine  transaminase ,  ALP: alkaline  phosphatase ,  TC: total cholesterol ,  TG: triglyceride ,  HDL-C: high-density  lipoprotein  cholesterol ,  LDL-C: low-density  lipoprotein cholesterol ,  VLDL-C: very  low-density  lipoprotein  cholesterol ,  CCl 4 : carbon  tertachloride ,  LDH: lactate dehydrogenase , T-BIL: total bilirubin , D-BIL: direct bilirubin , ALB: albumin
Pada  keadaan  normal  serum  AST  dan ALT  berada  di  dalam  sitosol  sel  hati  dan disintesis  dalam  jumlah  yang  sedikit.  Jika terjadi  kerusakan  hati,  maka  enzim  ini  akan meningkat dan ketika sel hati mengalami lisis, maka  AST  dan  ALT  akan  masuk  ke  dalam sistem  peredaran  darah  (Brent  and  Rumack, 1993).  ALP  adalah  enzim  yang  dibentuk  di hati dan disekresikan melalui saluran empedu. Terjadinya  gangguan  pada  saluran  empedu, seperti  pada  steatosis  hepatik  menyebabkan peningkatan enzim ini di dalam serum(Mishra, 2012). LDH merupakan enzim yang dihasilkan pada  semua  organ  dan  berada  di  dalam membran  plasma.  Peningkatan  kadar  LDH dalam darah menunjukkan terjadinya kerusakan  pada  organ.  LDH  terdiri  dari  5 isoenzim yang mengindikasikan tempat terbentuknya.  LDH-1  dan  LDH-2  terdapat  di jantung, eritrosit, otak. LDH-3 terdapat di
paru. LDH-4 dan LDH-5 terdapat di hati, otot rangka, ginjal (Drent et al. , 1996).
Penurunan kadar kolesterol total, VLDL-C, LDL-C, dan TG serta peningkatan kadar HDL-C dalam serum darah mengindikasikan  tidak  adanya  penghambatan metabolisme  kolesterol  dihati.  Dimana,  jika terjadi kerusakan pada hati, maka perombakan kolesterol  di  dalam  hati  terganggu  dan kolesterol  dalam  serum  meningkat  (Pooja  and Priscilla,  2009).  Albumin  adalah  protein  yang paling utama disintesis di hati. Sitolisis hepatik menyebabkan penghambatan produksi albumin  dan  menurunkan  kadarnya  di  dalam darah.  Albumin  berfungsi  menjaga  tekanan onkotik  serta  transport  besi,  asam  lemak, kalsium, hormon, dan bilirubin. Penghambatan produksi  albumin  menyebabkan  peningkatan bilirubin  (Douhri et  al. ,  2014).  Peningkatan albumin  dan  penurunan  bilirubin  secara
langsung memberikan gambaran bahwa pemberian ekstrak mencegah terjadinya kerusakan hati.
Tabel 3.Hasil Studi Identitifikasi Aktivitas Hepatoprotektor H. sabdariffa pada Antioksidan Hepatik
Dosis Hewan Uji Penginduksi Kontrol Positif Hasil Referensi Ekstrak 100 mg/kg BB Mencit Asetaminofen 250 mg/kg BB - PeningkatanSOD, GPx, CAT, dand-ALA-D, serta penurunan TBARSyang signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif (asetaminofen) (Olaleye and Rocha, 2008) Ekstrak 250 mg/kg BB Tikus Kadmium klorida (CdCl 2 ) 4 mg/kg BB - Penurunan MDA, peningkatan GSH, CAT, dan SOD yang signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif (CdCl 2 ) (Al-kubaisy, Al-groom and Amoush, 2016) Ekstrak 200, 400, 600 mg/kg BB Tikus Karbon tetraklorida (CCl 4 ) 1 mg/kg BB - Penurunan kadar MDA dan peningkatan GSH yang signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif (CCl 4 ) (Hashemi, 2014) Ekstrak dan fraksi antosianin 100 mg/kg BB Kelinci   2, 4- dinitro fenil hidrazin (DNPH) 28 mg/kg BB - Penurunan kadar MDA yang signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif (DNPH) (Olusola, 2011) Fraksi 100 mg/kg BB Tikus Thioacetamide (TAA) 100 mg/kg BB Silymarin 50 mg/kg BB Peningkatan SOD dan Penurunan MDA yang lebih
baik daripada silymarin.
Peningkatan GSH yang sebanding dengan silymarin. Parameter ini berbeda signifikan
dengan kontrol negatif (TAA)
(Ezzat et al. , 2016) Ekstrak 200 dan 300 mg/kg BB Tikus CCl 4 - Penurunan kadar MDA yang signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif (CCl 4 ) (Usoh et al. , 2012) Fraksi 50 dan 100 mg/kg BB Tikus CCl 4 1,25 mg/kg BB - Penurunan TBARS, peningkatan GSH, SOD, dan CAT yang signifikan dibandingkan dengan kontrol
negatif (CCl 4 ) (Adetutu and Owoade, 2013)
Fraksi 100 dan 200 mg/kg BB Tikus DNPH 3 mg/kg BB Silymarin 25 mg/kg BB Penurunan TBARS, FRAP, dan DPPH yang signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif (DNPH) (Obouayeba et al. , 2014) Ekstrak 200, 400, dan 600 mg/kg BB Mencit Asetaminofen 1000 mg/kg BB - Penurunan MDA, peningkatan GSH, CAT yang signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif (asetaminofen) (Liu et al. , 2010)
Keterangan : MDA: malondialdehyde , GSH: Glutahione , CAT: catalase , SOD: superoxide dismutase , TBARS: thiobarbituric reacting substances , GPx: gluthathione peroxidase , d-ALA-D: d-aminolevulinate dehydratase
Metabolit  reaktif  dari  penginduksi, seperti  NAPQI  (dari  asetaminofen)  dapat bereaksi  secara  langsung  dengan  gugus  –SH dari d-ALA-D menyebabkan inaktivasi enzim. Inhibisi  pada  enzim  ini  mengindikasikan penurunan  kadar  glutation  atau  peningkatan oksidasi ALA-D (Bechara, 1996). Peningkatan pada  d-ALA-D  menunjukkan  bahwa  ekstrak bunga H.  sabdariffa dapat  melindungi  enzim tersebut  dari  oksidasi.  Glutation  di  dalam  hati pada proses metabolisme senyawa toksik akan mengalami  penurunan,  pada  saat  kadar glutation  berada  sangat  rendah  di  dalam  hati, senyawa-senyawa toksik tersebut dapat berinteraksi dengan sel hati dan menyebabkan kerusakan (Hewawasam et al. , 2003).
Peningkatan kadar glutation setelah pemberian ekstrak  pada  penelitian-penelitian  di  atas mengindikasikan  bahwa  ekstrak  bunga H. sabdariffa dapat mencegah terjadinya penurunan  kadar  glutation  dan  kerusakan  sel hati lebih lanjut.
Pemberian  ekstrak  bunga H.  sabdariffa terlebih  dahulu  dapat  mencegah  terjadinya peroksidasi  lipid  akibat  proses  kerusakan  sel oleh  penginduksi,  yang  ditandai  dengan penurunan  MDA  (malonaldehida)(Guo et  al. ,
2009).  Penurunan  pada  TBARS,  FRAP,  dan DPPH berkorelasi dengan penurunan hepatotoksisitas  dari  penginduksi.  Senyawa yang  bersifat  sebagai  antioksidan  di  dalam ekstrak  dapat  menstabilkan  radikal  bebas  dan mencegah  terjadinya  kerusakan  membran  sel (Obouayeba et  al. ,  2014).  Superoksida dismutase, Katalase, dan glutation peroksidase adalah  enzim  yang  berperan  penting  sebagai antioksidan seluler dalam mendegradasi oksigen  reaktif  dan  hidrogen  peroksida endogen(Sharma et  al. ,  2012).  Enzim  ini mengalami  penurunan  yang  signifikan  setelah pemberian  penginduksi.  Pemberian  ekstrak menunjukkan  efektivitas  sebagai  antioksidan dengan meningkatkann enzim-enzim tersebut.

## STUDI TOKSISITAS
Toksisitas  adalah  segala  hal  yang memiliki  efek  berbahaya  dari  zat  kimia  atau obat  pada  organisme  target.  Uji  toksisitas adalah  suatu  uji  untuk  mendeteksi  efek  toksik suatu  zat  pada  sistem  biologi  dan  untuk memperoleh  data  dosis-respon  yang  khas  dari sediaan  uji.  Data  tersebut  digunakan  sebagai informasi  mengenai  dosis  sediaan  uji  yang aman  digunakan  dalam  terapi.  Pengujian
toksisitas  terhadap  hewan  uji  dilakukan sebagai representatif berbagai reaksi biokimia, fisiologik dan patologik pada manusia terhadap suatu sediaan uji yang digunakan(Kepala BPOM RI, 2014).
Serangkaian uji toksisitas yang dilakukan  terhadap  hewan  uji  meliputi  uji toksisitas  akut  oral,  toksisitas  subkronis  oral, toksisitas kronis oral, teratogenisitas,
sensitisasi  kulit,  iritasi  mata,  iritasi  akut dermal,  iritasi  mukosa  vagina,  toksisitas  akut dermal,  dan  toksisitas  subkronis  dermal (Kepala  BPOM  RI,  2014).Hasil  pengujian toksisitas  akut  oral,  toksisitas  subkronis  oral, dan  toksisitas  kronis  oral  pada  penggunaan ekstrak H.  sabdariffa ,  dapat  dilihat  pada  tabel 4.

## Tabel 4. Hasil Studi Toksisitas
Toksisitas Dosis Ekstrak Hewan Uji Lama Pemberian Hasil Referensi Akut Ekstrak  air  dan etanol 15 g/kg BB Mencit jantan 7 hari Tidak terdapat kematian (Reanmongkol and Itharat, 2007) Ekstrak  air,  air  : etanol  (1:1)  dan etanol 2000 mg/kg BB Tikus jantan 8 hari Kematian  dengan  penurunan berat  badan  dan  diare  pada semua hewan uji (Fakeye et  al. , 2009) Ekstrak  air  5000 mg/kg BB Tikus jantan dan betina 14 hari Tidak terdapat kematian, perubahan  berat  badan  dan organ,  serta  perlakuan  hewan uji (Sireeratawong et al. , 2013) Sub kronis Ekstrak  air  1.15, 2.30,  and  4.60 g/kg Tikus jantan 60 hari Toksisitas testikular (Orisakwe, Husaini and Afonne, 2004) Ekstrak air : etanol  (1:1)  300 mg/kg BB Tikus jantan 40 hari Kematian  pada  seluruh  hewan uji, peningkatan  kadar  AST dan  kreatinin,  tidak  terjadi perubahan histologi organ. (Fakeye et  al. , 2009) Ekstrak  air  300 mg/kg BB Tikus jantan 60 hari Kematian  pada  80%  hewan uji, peningkatan  kadar  AST dan  kreatinin,  tidak  terjadi perubahan histologi organ. (Fakeye et  al. , 2009) Ektrak  etanol  300 mg/kg BB Tikus jantan 90 hari Tidak terjadi kematian, peningkatan  kadar  kreatinin, tidak terjadi perubahan histologi organ. (Fakeye et  al. , 2009) Kronis Ektrak air 50,  Tikus 270 hari Tidak terdapat kematian,  (Sireeratawong
100, dan 200 mg/kg BB jantan dan betina perubahan berat badan, histologi  organ,  hematologi, kimia  klinik  darah, serta perlakuan hewan uji et al. , 2013) METODE PREPARASI H. sabdariffa Perbedaan
metode preparasi, penginduksi  dan  penggunaan  ekstrak  pada hewan  uji  dapat  dilihat  pada  tabel  5. Penggunaan  pelarut  dan  proses  ektraksi  yang dilakukan berpengaruh dalam penarikan senyawa  aktif  yang  terdapat  pada H. sabdariffa .
Beberapa metode juga menggunakan proses fraksinasi untuk
memisahkan  senyawa  aktif  pada  sampel, sehingga  yang  digunakan  pada  pengujian aktivitas in  vivo adalah  ekstrak H.  sabdariffa dan  hasil  fraksinasinya.  Untuk  pengujian toksisitas,  metode  preparasi  dan  lokasi pengambilan  sampel  sangat  berpengaruh terhadap  kandungan  senyawa  aktif  dan  sifat toksik  dari H.  sabdariffa seperti  terlihat  pada tabel 6.
Tabel 5. Metode Preparasi dan Penggunaan H. sabdariffa pada Pengujian Aktivitas In Vivo Metode Preparasi Ekstrak Metode Penggunaan Ekstrak terhadap hewan Uji Referensi 500 gram bunga kering diserbukkan dan direbus dengan 300 ml air selama 1 jam. Kemudian dikeringkan dengan freeze-
drying
Hewan uji diinduksi dengan asetaminofen 250 mg/kg BB, 3 jam kemudian diberikan ekstrak 100 mg/kg BB. Ekstrak kembali
diberikan sekali sehari selama 7 hari.
Kemudian hewan uji dianastesi, diambil darah dan dikorbankan setelah 24 jam
perlakuan terakhir.
(Olaleye and Rocha, 2008) 100 gram bunga kering direndam dengan
air 500 ml selama 24 jam pada 40 0 C.
Kemudian ekstrak disaring dan dikeringkan pada suhu 40 0 C.
Hewan uji diberi ekstrak 250 mg/kg BB selama 7 hari. Kemudian diberikan injeksi CdCl 2 4 mg/kg BB dalam larutan salin secara subkutan setelah 12 jam pemberian ekstrak terakhir. Kemudian hewan uji dianastesi dan dikorbankan untuk diambil
hatinya. (Al-kubaisy, Al- groom and Amoush, 2016)
100 gram serbuk bunga kering diekstraksi dengan 300 ml etanol selama 3 jam pada 50 0 C. Kemudian ekstrak cair disaring dan dievaporator pada 37 0 C , residu dilarutkan dengan 250 ml air, diaduk selama 3 jam pada 40 0 C, supernatannya
Hewan uji diberikan ekstrak 200, 400, dan 600 mg/kg BB selama 2 minggu, kemudian diinjeksikan dengan CCl 4 1 ml/kg BB dalam parafin cair (1:1 v/v) setiap 72 jam selama 2 minggu. Hewan uji dibius dengan etil eter untuk mengambil sampel darah dari retro
(Hashemi, 2014)
disaring dan diliofilisasi.
orbital plexu setelah 48 jam perlakuan terakhir. Hewan uji kemudian dikorbankan dan diambil hatinya untuk pengujian histopatologi dan antioksidan hepatik.
1 kg serbuk bunga kering diekstraksi dengan 10 liter 0,1% trifluoroacetic acid
(TFA) selama 12 jam pada 20 0 C dengan pengadukan. Kemudian disaringan dan dikeringkan untuk mendapatkan ektrak sampel. Sebagian ekstrak dimasukkan ke dalam kolom dicuci dengan 3 liter air, dielusi dengan 50% larutan etanol yang mengandung 0,1% TFA, kemudian dikeringkan untuk mendapatkan fraksi antosianin.
Ekstrak bunga dan fraksi antosianin masing- masing 100 mg/kg BB diberikan kepada hewan uji selama 23 hari. Kemudian diinjeksi dengan 2,4 DNPH 28 mg/kg BB selama 5 hari (dimulai dari hari ke-24 sampai ke-28). Darah diambil dari vena bagian telinga hewan uji dan hewan uji dianastesi lalu dikorbankan untuk diambil hati dan otaknya.
(Olusola, 2011)
1 kg serbuk bunga kering diekstraksi dengan 10 liter 0,1% trifluoroacetic acid
(TFA) selama 12 jam pada 20 0 C dengan pengadukan. Kemudian disaringan dan dikeringkan untuk mendapatkan ektrak sampel. Sebagian ekstrak dimasukkan ke dalam kolom dicuci dengan 3 liter air, dielusi dengan 50% larutan etanol yang mengandung 0,1% TFA, kemudian dikeringkan untuk mendapatkan fraksi antosianin.
Hewan uji diinduksi dengan injeksi intraperitoneal TAA 100 mg/kg BB sekali seminggu selama sebulan. Kemudian hewan uji diberikan ekstrak 100 mg/kg BB sebagai kelompok uji dan 50 mg/kg silymarin sebagai kontrol positif. Setelah 24 jam perlakuan terakhir, sampel darah diambil bersamaan dengan hewan uji dikorbankan untuk mengambil hatinya.
(Ezzat et al. , 2016)
Bunga kering diekstraksi dengan metode sokletasi menggunakan etanol 80%,
kemudian diliofilisasi.
Hewan uji diberikan ekstrak 200 dan 300
mg/kg BB selama 7 hari dan diinduksi dengan 0,25 mg/kg BB CCl 4 dalam parafin cair (1:1) secara intraperitoneal pada hari ke-
7. Kemudian darah hewan uji diambil.
(Usoh et al. , 2012)
100 gram serbuk bunga kering diekstraksi dengan 300 ml etanol selama 3 jam pada 50 0 C. Kemudian ekstrak cair disaring dan dievaporator pada 37 0 C , residu dilarutkan dengan 100 ml air dan diekstraksi dengan 200 ml heksan untuk menghilangkan pigmen (seperti klorofil dan kareteniod). Fase air diekstraksi sebanyak 3 kali dengan 180 ml etil asetat,
Hewan uji diberikan ekstrak 50 dan 100 mg/kg BB selama 7 hari kemudian diinduksi dengan 1,25 mg/kg BB CCl 4 dalam olive oil
(1:1) intraperitoneal pada hari ke-7. Setelah 24 jam, hewan uji dianastesi dan dikorbankan untuk diambil darah dan hatinya.
(Adetutu and Owoade, 2013)
dan dievaporasi pada 37 0 C.
100 gram bunga kering diekstraksi dengan 200 ml metanol asam dengan TFA 0,1% selama 24 jam pada 4 0 C. Kemudian dievaporator pada 38 0 C untuk mendapatkan ekstrak kering. Ektrak dilarutkan dalam 200 ml air dan disaring untuk menghilangkan glukosa dan pigmen klorofil dan ditambahkan 100 ml metanol, lalu dievaporasi pada 38 0 C. Ekstrak kering dilarutkan dalam 100 ml air, kemudian diliofilisasi dengan freeze dryer .
Hewan uji diberikan ekstrak 100 dan 200 mg/kg BB sebagai sediaan uji, dan 25 mg/kg BB silymarin sebagai kontrol positif masing- masing selama 7 hari. Satu jam setelah perlakuan hari ke-7, DNPH 3 mg/kg BB diinjeksikan secara intraperitoneal dalam NaCl 0,9%. Kemudian diambil darah dan hati hewan uji.
(Obouayeba et al. , 2014)
150 gram bunga kering dimaserasi dengan 6 liter air panas (95 0 C) selama 2 jam dan dievaporasi pada vakum -85 0 C. Kemudian ekstrak cair disaring dan diliofilisasi.
Hewan uji diberikan ekstrak 200, 400, dan 600 mg/kg BB sekali sehari selama 2 minggu. Kemudian diinjeksikan asetaminofen 1000 mg/kg BB secara intraperitoneal dalam dimetil sulfoksida.
Setelah 6 jam, hewan uji dikorbankan untuk
diambil darah dan hatinya.
(Liu et al. , 2010)
Tabel 6. Metode Preparasi dan Variasi H. sabdariffa pada Pengujian Toksisitas
Metode Preparasi Asal Negara Referensi Serbuk  bunga  kering  diektraksi  dengan  air  (1:10  b/v) menggunakan  metode  refluks  selama  2  jam,  kemudian dievaporasi untuk mendapatkan ekstrak kering Abuja, Nigeria (Orisakwe, Husaini and Afonne, 2004)
Bunga  kering  diekstrak  dengan    air  panas  (70 0 C),  dan  etanol kemudian ekstrak dievaporator menggunakan untuk mendapatkan ekstrak kering Distrik  Khounmeet, Provinsi  Songkhla, Thailand (Reanmongkol and Itharat, 2007)
100 gram bunga kering diinfus selama 4 jam dengan pelarut air, air:etanol  (1:1),  dan  etanol  masing-masing  sebanyak  1  L. Kemudian  bunga  kering  kembali  diekstraksi  dengan  pelarut yang  sama.  Ekstrak  cair  yang  diperoleh  kemudian  dipekatkan untuk mendapatkan ekstrak kering
Ibadan, Nigeria (Fakeye et al. , 2009)
Bunga  kering  diekstrak  dengan    air  panas  (70 0 C),  kemudian ekstrak dievaporator menggunakan vacuum drying (40 0 C)
Distrik  Khounmeet,
Provinsi  Songkhla, Thailand (Sireeratawong et  al. , 2013)

## PEMBAHASAN
Mekanisme  kerja H.  sabdariffa sebagai hepatoprotektor  didasarkan  pada  aktivitasnya sebagai  antioksidan,  menghambatan  enzim sitokrom  P450,  menekan  ekspresi  protein proapoptosis  dan  meningkatkan  persentase viabilitas sel hati. Penginduksi kerusakan hati, seperti  asetaminofen,  CCl 4 ,  TAA,  DNPH,  dan kadmium  setelah  masuk  ke  dalam  tubuh  dan dimetabolisme di hati akan membentuk radikal bebas  yang  dapat    merusak  sel  hati.  Dengan adanya  ekstrak H.  sabdariffa ,  maka  radikal bebas tersebut distabilkan oleh efek antioksidannya.  Hal  ini  dapat  dilihat  dari penurunan  berbagai  indikator  kerusakan  hati, seperti enzim AST, ALT, ALP, LDH,TC, TG, LDL-C,  VLDL-C,  MDA,  T-BIL,  dan  D-BIL, disertai  dengan  peningkatan  kadar  HDL-C, SOD, GPx, GSH, CAT, dan d-ALA-D.
Pada review ini  digunakan  berbagai metode  ekstraksi  terhadap H.  sabdariffa yang diujikan  dengan  variasi  dosis  dan  hewan  uji. Pada  metode  ekstraksi  dengan  menggunakan pelarut  air,  dosis  minimun  yang  dapat memberikan  efek  sebagai  hepatoprotektor adalah  100  mg/kg  BB  mencit.  Sedangkan dengan  menggunakan  pelarut  etanol,  dosisnya adalah  200  mg/kg  BB  tikus.  Senyawa  yang berkhasiat  sebagai  antioksidan  pada H. sabdariffa adalah  antosianin  yang  berwarna merah, dengan dosis 50 mg/kg BB tikus.
Pada  pengujian  toksisitas  akut,  ekstrak air  dan  etanol H.  sabdariffa relatif  aman dengan  dosis  15  g/kg  BB  tidak  menyebabkan kematian  pada  mencit  (Reanmongkol  and Itharat,  2007).  Akan  tetapi,  hal  ini  berbeda dengan  penelitian (Fakeye et  al. ,  2009)  yang
menyatakan  bahwa  ekstrak  air,  air  :  etanol (1:1),  dan  etanol  pada  dosis  2000  mg/kg  BB dapat menyebabkan kematian dengan penurunan  berat  badan  dan  diare  pada tikus. Pengujian
toksisitas subkronis menunjukkan  bahwa  ekstrak  air H.  sabdariffa menyebabkan  toksisitas  testikular  dengan dosis  1,15  g/kg  BB  tikus  yang  diberikan selama 60 hari. Sedangkan pada penelitian lain menunjukkan adanya kematian pada hewan uji dengan  pemberian  ekstrak  air  :  etanol  (1:1) dan  ekstrak  air  dosis  300  mg/kg  BB  tikus selama  40  dan  60  hari.  Untuk  pengujian toksisitas  kronis  selama  270  hari  dengan ekstrak  air  dosis  50,  100,  dan  200  mg/kg  BB tikus tidak menunjukkan adanya kematian dan perubahan terhadap parameter lainnya. Sehingga  ekstrak H.  sabdariffa lebih  aman dikonsumsi dengan dosis di bawah 300 mg/kg BB  dengan  menggunakan  pelarut  air  atau etanol.
Perbedaan  hasil  pada  setiap  pengujian toksisitas (tabel 6) dapat dikarenakan 2 faktor, yakni  metode  ekstraksi  (pelarut  dan  metode administrasi)  dan  varietas  dari H.  sabdariffa yang digunakan berdasarkan tempat pengambilannya.  Hal  ini  mengakibatkan perbedaan  kadar  antosianin  pada  tiap  sampel yang  berakibat  pada  perbedaan  efek  toksik yang  dihasilkan .  Kadar  maksimum  antosianin terdapat  pada  ekstrak  hidroalkohol,  kemudian ekstrak  air  dan  ekstrak  etanol  (Fakeye et  al. , 2009).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada
Fakultas Farmasi Universitas
Padjadjaran  yang  telah  memfasilitasi  dalam pembuatan review ini.  Terima  kasih  juga kepada  Prof.  Dr.  Anas  Subarnas,  M.Si.,  Apt. yang telah membantu dalam proses pembuatan review ini  sehingga  dapat  terselesaikan  tepat pada waktunya.

## DAFTAR PUSTAKA
Adetutu,  A.  and  Owoade,  A.  O.  (2013)
‘Hepatoprotective and Antioxidant Effect  of  Hibiscus  Polyphenol  Rich Extract (HPE) Against Carbon Tetrachloride (CCl4) – Induced Damage in Rats’, British Journal of  Medicine  & Medical Research , 3(4), pp. 1574–1586.
Al-kubaisy,  K.  N.,  Al-groom,  R.  M.  and Amoush, A. A.- (2016) ‘Changes in the Oxidative  Stress  Biomarkers  in  Rat Liver  Tissue  Exposed  to  Cadmium  and Protect with Hibiscus sabdariffa L . ( Ro `  ssle  )  Flower  Extract’,  5(8),  pp.  818–
824.
Bechara,  E.  J.  H.  (1996)  ‘Oxidative  Stress  in Acute  Intermittent  Porphyria  and  Lead Poisoning  may  be  Triggered  by  5- Aminolevulinic  Acid’, Brazil  J  Med Biol Res , 29, p. 841.
Brent,  J.  A.  and  Rumack,  B.  H.  (1993)  ‘Role of Free Radicals in Toxic Hepatic Injury II’, Clin Toxicol , 31, pp. 173–196.
Douhri,  B.,  Idaomar,  M.,  Senhaji,  N.  S., Ennabili,  A.  and  Abrini,  J.  (2014) ‘Hepatoprotective  Effect  of  Origanum elongatum Against carbon Tetrachloride (CCl4) Induced Toxicity in Rats’, Eur J Med Plants , 4, pp. 14–28.
Drent, M., Cobben, N. a M., Henderson, R. F., Wouters,  E.  F.  M.  and  Van  Dieijen- Visser, M. (1996) ‘Usefulness of lactate Dehydrogenase  and  Its  Isoenzymes  as Indicators of Lung Damage or Inflammation’, European  Respiratory Journal ,  9(8),  pp.  1736–1742.  doi: 10.1183/09031936.96.09081736.
Ezzat, S. M., Salama, M. M., El-Din, S. H. S.,
Saleh, S., El-Lakkany, N. M., Hammam,
O.  A.,  Salem,  M.  B.  and  Botros,  S.  S.
(2016) ‘Metabolic Profile and Hepatoprotective Activity of the
Anthocyanin-Rich  Extract  of  Hibiscus sabdariffa  Calyces’, Pharmaceutical Biology ,  0209(September),  pp.  1–10. doi: 10.1080/13880209.2016.1214739.
Fakeye,  T.  O.,  Pal,  A.,  Bawankule,  D.  U., Yadav,  N.  P.  and  Khanuja,  S.  P.  S. (2009) ‘Toxic
Effects of Oral
Administration  of  Extracts  of  Dried Calyx  of  Hibiscus  sabdariffa  Linn. (Malvaceae)’, Phytotherapy  Research ,
23(2009), pp. 412–416. doi: 10.1002/ptr.
Guo, H., Sun, J., He, H., Yu, G. C. and Du, J. (2009)  ‘Antihepatotoxic  Effect  of  corn Peptides Against Bacillus Calmetteguerin/ Lipopolysaccharide-
Induced  Liver  Injury  in  Mice’, Food Chem.Toxicol , 47, pp. 2431–2435.
Hashemi,  J.  M.  (2014)  ‘Hibiscus  Sabdariffa Calyx  Extract  Alleviate  Hepatotoxicity Induced  by  Carbon  Tetrachloride  on Male Albino Rats.’, 12(6), pp. 111–120.
Hewawasam,  R.  P.,  Jayatilaka,  K.  A., Pathirana,  C.  and  Mudduwa,  L.  K.
(2003) ‘Protective Effect of Asteracantha  longifolia  Extracts  in Mouse  Liver  Injury  Induced  by  CCl4 and Paracetamol’, J. Pharm.
Pharmacol , 55(10), pp. 1413–1418.
Johnson,  S.  S.,  Oyelola,  F.  T.,  Ari,  T.  and Juho,  H.  (2013)  ‘In  vitro  Inhibitory Activities  of  the  Extract  of  Hibiscus sabdariffa  L.,  (Family  Malvaceae)  on Selected  Cytochrome  P450  Isoforms’, 10, pp. 533–540.
Kepala  BPOM  RI  (2014) Peraturan  Kepala Badan  Pengawas  Obat  dan  Makanan Republik  Indonesia  Nomor  7  Tahun 2014  tentang  Pedoman  Uji  Toksisitas Nonklinik secara In Vivo .
Liu, L. C., Wang, C. J., Lee, C. C., Su, S. C., Chen,  H.  L.,  Hsuf,  J.  D.  and  Lee,  H.  J.
(2010)  ‘Aqueous  Extract  of  Hibiscus sabdariffa L. Decelerates Acetaminophen-Induced  Acute  Liver Damage  by  Reducing  Cell  Death  and
Oxidative Stress in Mouse Experimental Models’, Journal of the Science of Food and  Agriculture ,  90(2),  pp.  329–337. doi: 10.1002/jsfa.3821.
Mishra,  S.  (2012)  ‘Serum  and  Hepatocyte Enzyme’, 1(3), pp. 1–4.
Mokdad,  A.  a,  Lopez,  A.  D.,  Shahraz,  S., Lozano,  R.,  Mokdad,  A.  H.,  Stanaway, J.,  Murray,  C.  J.  L.  and  Naghavi,  M. (2014) ‘Liver Cirrhosis Mortality in 187
Countries  between  1980  and  2010:  A Systematic  Analysis.’, BMC  medicine , 12(1), p. 145. doi: 10.1186/s12916-014- 0145-y.
Obouayeba, A., Boyvin, L., MBoh, G., Diabat,
S.,  Kouakou,  T.,  Djaman,  A.  and
NGuessan,  J.  (2014)  ‘Hepatoprotective and  Antioxidant  Activities  of  Hibiscus sabdariffa  Petal  Extracts  in  Wistar Rats’, International  Journal  of  Basic  &
Clinical  Pharmacology ,  3(5),  p.  774. doi: 10.5455/2319-2003.ijbcp20141034.
Olaleye,  M.  T.  and  Rocha,  B.  T.  J.  (2008) ‘Acetaminophen-Induced Liver Damage in  Mice:  Effects  of  Some  Medicinal Plants  on  the  Oxidative  Defense System’, Experimental  and  Toxicologic Pathology ,  59(5),  pp.  319–327.  doi:
10.1016/j.etp.2007.10.003.
Olusola,  A.  O.  (2011)  ‘Evaluation  of  the
Antioxidant
Effects of Hibiscus Sabdariffa  Calyx  Extracts  on  2  ,  4- Dinitrophenylhydrazine-Induced Oxidative Damage in Rabbits’, WebmedCentral  BIOCHEMISTRY ,  pp. 1–11. Available
at:
http://www.webmedcentral.com/article_ view/2283.
Orisakwe,  O.  E.,  Husaini,  D.  C.  and  Afonne, O. J. (2004) ‘Testicular Effects of Sub- Chronic  Administration  of  Hibiscus sabdariffa  Calyx  Aqueous  Extract  in Rats’, Reproductive  Toxicology ,  18(2),
pp. 295–298.
doi: 10.1016/j.reprotox.2003.11.001.
Pooja,  C.  O.  and  Priscilla,  D.  M.  (2009) ‘Antioxidant and Hyperlipidemic
Activity  of  Hibiscus  sabdariffa  Leaves and Calyces Extracts in Rats’, Indian J. of Exp. Biol. , 47(3), pp. 276–282.
Reanmongkol,  W.  and  Itharat,  A.  (2007) ‘Antipyretic  Activity  of  the  Extracts  of Hibiscus  sabdariffa  L.  Calyces  in Experimental Animals’, Songklanakarin Journal  of  Science  and  Technology ,
29(SUPPL. 1), pp. 29–38.
Sharma,  P.,  Jha,  A.  B.,  Dubey,  R.  S.  and
Pessarakli, M. (2012) ‘Reactive Oxygen
Species, Oxidative Damage, and
Antioxidative  Defense  Mechanism  in Plants  under  Stressful  Conditions’, Journal of Botany , 2012, pp. 1–26. doi: 10.1155/2012/217037.
Sireeratawong,  S.,  Itharat,  A.,  Khonsung,  P., Lertprasertsuke,  N.  and  Jaijoy,  K. (2013)  ‘Toxicity  Studies  of  the  Water Extract  from  the  Calyces  of  Hibiscus sabdariffa  L.  in  Rats’, Afr  J  Tradit Complement  Altern  Med. ,  10(4),  pp. 122–127.
Tseng, T., Kao, E., Chu, C., Chou, F., Wu, H. L.  and  Wang,  C.  (1997)  ‘Protective Effects  of  Dried  Flower  Extracts  of
Hibiscus sabdariffa L. Against
Oxidative Stress  in  Rat Primary Hepatocytes’, Food  Chem  Toxicol ,  35, pp. 1159–1164.
Usoh, I. F., Ekaidem, I. S., Etim, O. E., Akpan, H.  D.,  Akpan,  E.  J.  and  Fakoya,  A.
(2012) ‘Antioxidant and
Hepatoprotective Effects of Dried Flower  Extracts  of  Hibiscus  sabdariffa L.  on  Rats  Treated  with  Carbon Tetrachloride’, Journal  of  Applied Pharmaceutical  Science ,  2(8),  pp.  156– 159. doi: 10.7324/JAPS.2012.2832.
Wahyuningsih, S. and Sutjiatmo, A. B. (2015) ‘Uji  Aktivitas  Hepatoprotektor  Ekstrak Air  Akar  Kuning  (Fibraurea  tinctoria
Lour)  Pada  Tikus  Putih  Betina  Galur Wistar’, Aristoteles , 4(1).
Yang,  L.,  Gou,  Y.,  Zhao,  T.,  Zhao,  J.,  Li,  F., Zhang, B. and Wu, X. (2012)
‘Antioxidant  Capacity  of  Extracts  from calyx  Fruits  of  Roselle  (Hibiscus sabdariffa  L.)’, African  Journal  of Biotechnology ,  11(17),  pp.  4063–4068. doi: 10.5897/AJB11.2227.