## PEMURNIAN PARSIAL EKSTRAK KASAR SELULASE BACILLUS CIRCULANS DENGAN METODA PENGENDAPAN ASETON

## PARTIAL PURIFICATION OF CRUDE EXTRACTS OF CELLULASE OF BACILLUS CIRCULANS WITH ACETON PRECIPITATION METHODS

## Iqbal Achmad Sabilla dan Evi Susanti*
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Malang email: evi.susanti.fmipa@um.ac.id
Received 9 May 2019
Accepted 28 June 2018

## Abstrak
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui  tingkat kemurnian hasil pengendapan ekstrak kasar  selulase Bacillus  circulans pada  berbagai  kejenuhan  aseton;      pengaruh  waktu pengendapan terhadap tingkat kemurnian hasil pengendapan pada kejenuhan aseton optimum; dan  stabilitas  waktu  penyimpanan  fraksi  optimum  pada  suhu  0°C  selama  0,1,4  dan  7  hari. Aktivitas  selulase  diukur  berdasarkan  kenaikan  kadar  gula  pereduksi  yang  dihasilkan  pada substrat kertas Whatman no 1. Penentuan kadar gula pereduksi menggunakan metode Somogy- Nelson. Kadar protein ditentukan dengan metode Lowry. Tingkat kemurnian enzim merupakan perbandingan aktivitas spesifik enzim setelah pemurnian dengan sebelum pemurnian.Tingkat kemurnian  hasil  pengendapan  ekstrak  kasar Bacillus  circulans mengalami  peningkatan  pada kejenuhan aseton ( 33 %), (41,1 %) dan (50 %) kemudian menurun pada kejenuhan (60 %) dan (67  %).  Fraksi  yang  aktivitas  spesifik  tertinggi  adalah  pada  tingkat  kejenuhan  aseton  50  %, dengan  tingkat  kemurnian  rata-rata  63,61  ±  0,141  kali  ekstrak  kasar  dan  perolehan  protein kembali  rata-rata  76,85  ±  7,99  %.  Waktu  pengendapan  tidak  berpengaruh  terhadap  tingkat kemurnian hasil pengendapan ekstrak kasar selulase Bacillus circulans pada kejenuhan aseton optimum.Selulase hasil pengendapan dengan aseton memiliki stabilitas yang kurang baik pada suhu ± 0°C karena menurun sebesar 41,1 % pada hari pertama dan 88,2 % pada hari ketujuh setelah penyimpanan. Perlu dikaji stabilitas selulase pada suhu penyimpanan yang lebih rendah untuk meningkatkan lama waktu simpannya.
Kata kunci: selulase, Bacillus circulans , pengendapan, aseton.

## Abstract
The  aims  of  this  study  were  to  determine  the  purity  level  of  precipitations  of    cellulases  of Bacillus circulans at various saturation of acetone; the effect of precipitation time on the purity level of the precipitations at optimum acetone saturation; and the stability of the storage time of the optimum fraction at 0 ° C for 0,1,4 and 7 days. The activity of cellulase was measured based on the increased of reducing sugar levels produced from hydrolysed of Whatman paper as  substrate.  The  reducing  sugar  levels  were  determined  with    the  Somogy-Nelson  method. Protein  levels  are  determined  with  the  Lowry  method.  The  purity  level  of  the  enzyme  is  a comparison  of  specific  enzyme  activity  after  and  before  purification.  The  purity  level  of
Online ISSN: 2528-0422
precipitations of cellulose of Bacillus circulans has increased in saturation of acetone (33%), (41.1%) and (50%) then decreases in saturation (60%) and (67%). The highest cellulase specific activity fraction was at 50% acetone saturation level, with an average purity level of 63.61 ± 0.141  times  crude  extract  and  yield  protein  recovery  an  average  of  76.85  ±  7.99%.  The precipitation  time  did  not  affect  the  purity  level  of  the  precipitations  at  optimum  acetone saturation. The precipitations had low storage stability at ± 0 o C because its cellulase activity decreased by 41.1% on the first day and  88.2 % on the seventh day after storage. The stability of cellulose at lower temperatures needs to be assessed to increase the storage life of cellulose.
The keywords: cellulose, Bacillus circulans , precipitation, aceton

## Pendahuluan
Selulase merupakan enzim yang menghidrolisis ikatan β -1,4-glikosidik dalam  rantai  selulosa  menjadi gula pereduksi,  dikelompokkan  menjadi    endo- β -glukanase  atau  CMCase(EC  3.2.1.4) adalah  selulase  yang  memutus  secara  acak bagian  dalam  rantai  selulosa;  ekso- β - glukanase  atau  avicelase  (EC  3.2.1.91) mengkatalisis  pemutus  rantai  selulosa  dari ujung  rantai  selulosa,  baik  ujung  reduksi maupun  non-reduksi;  dan β -glukosidase (EC  3.2.1.21)  mengkatalisis  hidrolisis selobiosa dan rantai pendek selooligosakarida menjadi glukosa (Lian et al. , 2014).
Selulase  menjadi  enzim  industri  yang memiliki  nilai  komersial  tinggi  karena banyak digunakan dalam berbagai industri, antara lain  tekstil, kertas dan pulp , makanan serta  pakan  ternak.  Selulase  juga  sangat dibutuhkan  dalam  proses  produksi  energi alternatif yaitu biokonversi selulosa menjadi bioetanol (Mendenez et al ., 2015). Selulase dapat diisolasi dari mikroorganisme,  hewan,  dan  tumbuhan. Mikroorganisme  terutama  bakteri  dapat memproduksi  selulase  secara  cepat  dan dalam  jumlah  yang  banyak.  Hal  ini  sesuai dengan  pernyataan  Aruwajoye dkk (2014)
&  Menendez dkk (2015)  bahwa  selulase yang  diisolasi  dari  bakteri  memiliki beberapa keuntungan, yaitu
pertumbuhannya  cepat,  biaya  yang  murah, memiliki  keberagaman  gen  dan  mampu beradaptasi terhadap variasi kondisi produksi  sehingga  isolasi  selulase  dari bakteri merupakan  salah satu strategi yang terbaik  untuk  meningkatkan    produksi selulase.
Salah  satu  bakteri  penghasil  selulase adalah spesies Bacillus khususnya Bacillus circulans. Susanti  (2011)  melaporkan bahwa  kondisi  optimum  produksi  selulase dari Bacillus circulans dalam media garam Berg    adalah  pH  =  9,0,  konsentrasi  avicel sebagai  induser  sebesar  0,5  %,  dan  waktu inkubasi 5 hari dengan kecepatan pengocokan  85  rpm  dalam shaker  water bath .  Pada  kondisi  tersebut  aktivitas CMCase  dan  avicelase  yang  dihasilkan sebesar 111,11 Unit/mL dan 55,56 Unit/mL. Penggunaan    0,5  %  ampas  tebu  sebagai sumber karbon dan induser dalam medium produksinya mampu menghasilkan aktivitas CMCase  dan  avicelase  sebesar  405,48 Unit/mL  dan  309,39  Unit/mL  (Rahmadani & Susanti, 2012).
Stabilitas  ekstrak  kasar  dan  aktivitas enzim  akan  meningkat  seiring  dengan meningkatnya  tingkat  kemurnian  enzim. Proses  pemurnian  terhadap  ekstrak  kasar enzim  penting  untuk  dilakukan.  Ekstrak kasar selulase umumnya memiliki stabilitas yang  rendah  karena  masih  mengandung
kontaminan  berupa  protein  lain,  salah satunya  adalah  protease  yang  dapat mendegradasi  selulase  yang  diinginkan. Pemurnian suatu enzim dapat memanfaatkan  sifat-sifat  enzim  sebagai protein.Tahap awal pemurnian yang umum dilakukan  adalah  pemekatan  ekstrak  kasar enzim.  Tahap  ini  dapat  dilakukan  dengan beberapa  metode yakni  pengendapan amonium  sulfat,  pelarut  organik,  dan  pada titik isoelektrik (Rosenberg, 1996).
Metode  pengendapan  pelarut  organik didasarkan  pada  perbedaan  kelarutan protein  dalam  pelarut  organik.  Pemilihan pelarut  organik  sebagai  agen  presipitasi karena prosesnya sederhana, sangat efektif, dan murah (Rosenberg, 1996; Trentini dkk , 2015). Penambahan pelarut organik
umumnya menurunkan konstanta dielektrik larutan  sehingga  gaya  elektrostatik  yang melindungi  gugus  fungsi  yang  polar  dan bermuatan  pada  protein  menurun  dan interaksi  tarik  menarik  antar  molekul protein  meningkat  yang  mengakibatkan protein  mengendap.  Metode  pengendapan pelarut  organik  dipengaruhi  oleh  beberapa faktor,  diantaranya  yaitu  konsentrasi  atau kejenuhan  pelarut,  pH  dan  waktu  inkubasi setelah  penambahan  pelarut  (Trentini dkk , 2015; Burgess & Deuthcher, 2009; Scopes, 1987).  Pemekatan  ekstrak  kasar  selulase dari Bacillus  circulans menggunakan metode  pengendapan  pelarut  organik khususnya  aseton  belum  pernah  dilakukan sehingga  pada  penelitian  ini  dipelajari bagaimana  pengaruh    %  kejenuhan  dan waktu  pengendapan    terhadap  tingkat kemurnian  dan  perolehan  protein  kembali dan stabilitas hasil pemurniannya pada suhu 0 ℃ .

## Metoda Penelitian

## Alat dan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan terdiri dari bahan kimia berderajat p.a dan ampas tebu. Alat–alat yang digunakan  dalam penelitian
terbagi  menjadi  peralatan  gelas  dan  non gelas.  Peralatan  gelas  terdiri  dari  cawan petri,  tabung  reaksi,  gelas  arloji,  batang pengaduk,  pipet  tetes,  pipet  ukur  1  mL, gelas  ukur  10  dan  100  mL,  corong  kaca, gelas  beaker  50,  250  dan  500  ml, Erlenmeyer  50  dan  250  ml,  labu  takar 50,100, 200, 250 dan 500 mL. Peralatan non gelas terdiri dari indikator universal, jarum ose, microtube ,  magnetik  stirer,  neraca analitik (ACIS), enkase , autoklaf,
incubator (Eyela  tipe  SLI-600ND),  Uni Termo Shaker (EyelaNTS-1300), refrigerator  centrifuge (Dynamica),  lemari pendingin (SHARP VR-D180) dan spektrofotometer (Spekronik-20).

## Peremajaan Bacillus cirulans
Peremajaan biakan murni bakteri Bacillus circulans dilakukan secara aseptis ke  dalam  medium  nutrien  agar  (NA)  dan diinkubasi  pada  suhu  37 0 C  selama semalam.

## Produksi  ekstrak  kasar  selulase  Bacillus circulans
Sebanyak  5  ose Bacillus  circulans dari medium  nutrien  agar  diinokulasikan  ke dalam  10  ml  medium  nutrien  cair  secara aseptis,  diinkubasi  semalam  pada  suhu  37
o C dan 100 rpm hingga mencapai OD≈0,344 dan  diperoleh  biakan  starter.  Sebanyak  2 mL starter diinokulasikan secara aseptis ke dalam  100  mL  medium  produksi.  Kultur biakan  diinkubasi  pada  37 o C  dan  85  rpm selama  5  hari,  disentrifugasi  3000  rpm selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar selulase.
Pengendapan  Ekstrak  Kasar  Selulase  dari Bacillus circulans pada Berbagai Kejenuhan Aseton Pemurnian parsial ekstrak kasar selulase dengan metode pengendapan aseton berdasarkan  kejenuhan  aseton  dilakukan dengan cara ekstrak kasar selulase Bacillus
circulans yang  telah  ditambah  EDTA hingga  konsentrasi  total  5  mM  dialikuot dengan  volume  yang  sama  menjadi beberapa bagian, masing-masing ditambahkan  aseton  absolut  dingin  sedikit demi  sedikit  dengan  konsentrasi  atau kejenuhan  aseton  (perbandingan  volume ekstrak kasar dengan volume aseton absolut dingin) sebesar 33 % (1:0,5), 41,1 % (1:0,7), 50  %  (1:1),  60%  (1:1,5),  dan  67  %  (1:2) sambil  diaduk  secara  perlahan  dalam penangas es  menggunakan  pengaduk magnet. Campuran dibiarkan selama semalam  dalam freezer lemari  pendingin untuk memaksimalkan pengendapan. Enzim yang mengendap dipisahkan dengan cara  sentrifugasi  dingin  selama  30  menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Residu atau pelet    yang  dihasilkan  dari  masing-masing fraksi dilarutkan dengan buffer fosfat 0,2 M pH  7,0  sehingga  suspensi  yang  dihasilkan adalah  fraksi  I  (33  %),  fraksi  II  (41,1  %), fraksi III (50 %), fraksi IV (60%) dan fraksi V  (67  %).  Tiap  fraksi  ditentukan  aktivitas selulase dan kadar protein.
Pengaruh  Waktu  Pengendapan  Terhadap Tingkat  Kemurnian  Hasil    Fraksinasi Ekstrak  Kasar    Selulase  dari  Bacillus Circulans pada Kejenuhan Aseton Optimum Pengamatan  pengaruh  waktu  terhadap proses  pengendapan  ekstrak  kasar  protein menggunakan aseton dilakukan dengan cara ekstrak  kasar  selulase Bacillus  circulans yang  telah  ditambah  EDTA  hingga konsentrasi  total  5  mM  dialikuot  dengan volume  yang  sama  menjadi  beberapa bagian, masing-masing ditambahkan aseton absolut  dingin  sebanyak  volume  tertentu (fraksi optimum dari percobaan sebelumnya)  sedikit  demi  sedikit  sambil diaduk  secara  perlahan  dalam  penangas  es menggunakan pengaduk magnet. Campuran dibiarkan  dalam freezer lemari  pendingin selama  variasi  waktu  1,  3,  dan  23  jam. Enzim yang mengendap dipisahkan dengan
cara  sentrifugasi  dingin  selama  30  menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Residu atau pelet    yang  dihasilkan  dari  masing-masing fraksi  dilarutkan  dengan  0,2  M  buffer sodium  fosfat  pH  7,0  dingin.  Tiap  fraksi ditentukan  aktivitas  selulase    dan  kadar protein.
Uji stabilitas penyimpanan hasil pengendapan ekstrak kasar selulase Bacillus circulans pada suhu ± 0° C Hasil  pengendapan  disimpan  dalam freezer lemari pendingin SHARP VR-D180 (± 0 °C) selama 7 hari. Ditentukan aktivitas selulase  total  dan  kadar  protein  selama penyimpanan pada hari ke 0, 1, 4, dan 7 hari.

## Uji aktivitas selulase
Penentuan  aktivitas  enzim  merujuk Susanti  (2011)  dengan  modifikasi  waktu inkubasi dari 120 menjadi 60 menit. Berikut langkah  kerja  yang  dilakukan  yaitu disiapkan  4  tabung  reaksi,  masing-masing diisi 2 mL enzim, 2 mL substrat 1 % dalam bufer  fosfat pH 7 dan 1 mL buffer  fosfat pH  7,  diinkubasi  pada  45 o C  selama  60 menit.  Jumlah  substrat  yang  terhidrolisis menjadi gula pereduksi  ditentukan dengan metode Somogyi-Nelson. Aktivitas selulase ditentukan  dengan  cara  yang  dijelaskan  di atas  dengan  menggunakan  substrat  kertas saring Whattman No.1. Pembuatan kontrol reaksi enzimatis dilakukan dengan mematikan  enzim  sebelum  diinkubasi dengan  substrat.  Sebanyak  2  mL  enzim dipanaskan selama 5 menit pada suhu 95 o C, ditambahkan 2 mL substrat 1 % dalam bufer fosfat  pH  7  dan  1  mL  buffer    fosfat  pH  7, diinkubasi  pada  45 0 C  selama  60  menit. Perlakuan  kontrol  dan  sampel  dilakukan bersamaan.  Aktivitas  selulase  dinyatakan sebagai  Unit/mL.  Unit  aktivitas  enzim selulase  adalah jumlah glukosa yang lepas (µg) per mL enzim (U/mL) per jam waktu inkubasi  enzim  substrat  pada  kondisi percobaan.  Pengukuran  aktivitas  enzim
dilakukan  dengan  mengkonversi  nilai absorbansi  pada  penentuan  kadar  glukosa ke kurva standar glukosa sehingga diperoleh konsentrasi. Data tersebut dimasukkan ke persamaan berikut.
Aktivitas selulase = 𝑥 𝑞 ∙   𝑓 𝑝
Dimana: x   = konsentrasi gula pereduksi (ppm) 𝑓 𝑝 = faktor pengenceran yaitu perbandingan volume  total  reaksi  dalam  tabung dengan volume enzim sebesar 2,5
q   = waktu reaksi (jam)
Penentuan  kadar  gula  pereduksi  dengan metode Somogy-Nelson
Sebanyak  1  mL  sampel  dan  masing- masing  1  mL  larutan  glukosa  yang mengandung  0  (blanko),  50,  100,  150  dan 200 ppm glukosa, ditambah 1 mL pereaksi Nelson, diaduk hingga homogen,
dipanaskan  dalam  penangas  air  mendidih selama 20 menit. Setelah dingin (pada suhu ruang) ditambah 1 mL perekasi arsenomolibdat,  dan  7  mL  aquades  untuk mengurangi  kepekatan.  Absorbansi  larutan diukur  pada  panjang  gelombang  540  nm. Data  konsentrasi  larutan  gula  standar  dan absorbansinya  digunakan  untuk  membuat kurva  standar  glukosa.  Kadar  glukosa ditentukan dengan menginterpolasikan nilai absorbansi  yang  diperoleh  ke  persamaan linier kurva standar glukosa.

## Pengukuran  kadar  protein  dengan  metode Lowry
Sebanyak  0,5  larutan  protein  standar yang    mengandung  0  (blanko),  20,  40,  60, 80,  100  µg  BSA  ( Bovine  Serum  Albumin ),
ditambah  2,5  mL  pereaksi  biuret,  diaduk hingga  homogen.  Campuran  diinkubasi pada  suhu    kamar    tepat  10  menit.  Setelah itu  campuran  ditambahkan  0,25  mL  Folin Ciocalteu,  dihomogenkan  dengan  vortex, dan  diinkubasi  pada  suhu  kamar  tepat  30 menit. Nilai absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 750 nm. Data konsentrasi BSA dan absorbansinya digunakan  untuk  membuat  kurva  standar protein.  Kadar  protein  ditentukan  dengan menginterpolasikan  nilai  absorbansi  yang diperoleh ke persamaan linier kurva standar protein.

## Hasil dan Pembahasan
Tingkat kemurnian selulase Bacillus circulans pada kejenuhan aseton 33 %, 41,1 %, 50 %, 60 %, dan  67 %.
Hasil  pemurnian  parsial  ekstrak  kasar Bacillus  circulans menunjukkan  semakin tinggi  tingkat  kejenuhan  aseton  yang digunakan maka semakin besar total protein yang diperoleh (Tabel  1). Semakin banyak jumlah  aseton  absolut  yang  ditambahkan dalam  larutan  protein  akan  menurunkan nilai konstanta dielektrik larutan, akibatnya gaya  elektrostatik  yang  melindungi  gugus fungsi  yang  polar  dan  bermuatan  pada protein menurun dan interaksi tarik menarik antar  molekul  protein  meningkat  sehingga terbentuk  agregat  protein.  Namun,  tidak terjadi  pola  yang  sama  pada  aktivitas selulase  hasil  pemurnian  (Tabel  1). Aktivitas  selulase  meningkat  pada  tingkat kejenuhan aseton 33 % (fraksi I) hingga 50 % (fraksi III), tetapi pada tingkat kejenuhan etanol 60 % (fraksi IV) dan 67 % (fraksi V) aktivitas selulase mengalami penurunan.
Tabel 1. Tingkat Kemurnian Fraksi Selulase dari Bacillus circulans Hasil Pengendapan pada Berbagai Tingkat Kejenuhan Aseton.
Fraksi Volume Total Protein (mg) Aktivitas Total (Unit) Aktivitas Spesifik (Unit/mg) Perolehan Kembali (%) Tingkat Kemurnian EK 20 3,726 ± 0,033 200,00 ± 0,000 53,69 ± 0,961 100,00  ±  0,000 1 (33%) 3 0,043 ± 0,002 116,25 ± 15,909 2732,015 ± 56,160 58,10  ±  7,919 51 (41,1%) 3 0,044 ± 0,003 135 ± 21,213 3062,5 ± 88,380 67,50 ± 10,606 57 (50%) 3 0,045 ± 0,0028 153,75 ± 15,90 3421 ± 76,36 76,85 ± 7,990 64 (60%) 3 0,103 ± 0,0014 48,75 ± 5,303 472,77 ± 38,50 24,35 ± 2,616 9 (67%) 3 0,133 ± 0,0049 33,75 ± 5,303 255,945 ± 58,92 16,85 ± 2,616 5
*Nilai yang tertera diatas merupakan nilai rata-rata .± SD dari dua ulangan
Penurunan aktivitas selulase pada fraksi IV  dan  V  diduga  karena  sebagian  selulase mengalami  perubahan  konformasi  menjadi terdenaturasi  dan  kehilangan  aktivitasnya. Perubahan konformasi baik struktur sekunder, tersier, maupun kuaterner dikenal  dengan  denaturasi  protein  pada penelitian  ini  terjadi  karena  perubahan kepolaran  lingkungan  disekitar  protein. Sebelum  penambahan  aseton  lingkungan protein adalah lingkungan hidrofilik sehingga residu-residu dengan rantai samping  gugus  hidofilik  mendominasi permukaan protein dan residu-residu dengan  rantai  samping  gugus  hidrofobik terdapat di bagian dalam. Setelah penambahan  aseton  berlebih  lingkungan menjadi nonpolar yang memicu terbukanya struktur  protein  sehingga  residu-residu dengan  rantai  samping  gugus  hidrofobik yang  awalnya  terdapat  di  bagian  dalam menjadi  terbuka  sehingga  struktur  protein yang  awalnya  globular  berubah  menjadi acak.
Peningkatan total protein dan penurunan aktivitas total selulase pada fraksi IV dan V menurunkan juga nilai aktivitas spesifik dan tingkat kemurniannya.
Maka dapat disimpulkan  bahwa  pemurnian  parsial
ekstrak  kasar Bacillus  circulans dengan metoda pengendapan aseton optimum pada tingkat  kejenuhan  aseton  50  %  dengan tingkat  kemurnian  64  kali  dibandingkan ekstrak  kasar  dan  nilai  perolehan  protein kembali 76,85±7,99 %.
Pengaruh  waktu  pengendapan  terhadap tingkat kemurnian fraksi selulase optimum Burgess & Deuthcher (2009:297) menyatakan  bahwa  setelah  penambahan pelarut  organik  dalam  larutan  protein, selanjutnya  campuran  dibiarkan  sedikitnya 15 menit agar mencapai kesetimbangan dan protein  mengendap  secara  maksimal. Dalam  penelitiannya,  Gemili et  al (2007) melaporkan bahwa penerapan waktu inkubasi yang tepat dalam proses pemurnian menggunakan metode pengendapan  aseton  berpengaruh  terhadap banyaknya hasil pemurnian yang diperoleh. Maka pada penelitian ini dilakukan variasi waktu  pengendapan  setelah  penambahan aseton  yaitu  1,  3,  dan  23  jam.  Pemilihan waktu tersebut untuk mengetahui pengaruh waktu inkubasi pada waktu singkat (1 jam), sedang (3 jam), dan lama (23 jam).
Tabel 2. Pengaruh Waktu Pengendapan Terhadap Tingkat Kemurnian Hasil Fraksinasi Selulase dari Bacillus circulans pada Kejenuhan Aseton Optimum
Jam ke- Aktivitas Total Total Protein (mg) Aktivitas Spesifik (Unit/mg) Perolehan Kembali (%) Tingkat Kemurnian EK 150,0 3,530 42,49 100 1 1 90,0 0,038 2368,42 60 56 3 112,5 0,041 2743,90 75 65 23 112,5 0,040 2812,50 75 66
Hasil  penelitian    menunjukkan  bahwa aktivitas  spesifik,  perolehan  kembali,  dan tingkat  kemurnian  enzim  antara  waktu inkubasi  pengendapan  1,  3,  dan  23  jam hampir  sama  (Tabel  2),  sehingga  dapat dikatakan  bahwa  waktu  inkubasi  tidak berpengaruh terhadap peningkatan kemurnian selulase yang dimurnikan dengan pengendapan aseton.
Stabilitas  waktu  penyimpanan  hasil  fraksi optimum pada suhu 0 o C Ekstrak kasar selulase memiliki stabilitas yang rendah apabila disimpan dalam waktu yang  lama  sehingga  perlu  dilakukan pemekatan atau pemurnian awal. Penelitian ini  menggunakan  metode  pengendapan aseton  untuk  memurnikan  ekstrak  kasar selulase Bacillus  circulans sehingga  dapat diperoleh  enzim  selulase  dengan  tingkat kemurnian tinggi  dan diharapkan memiliki stabilitas  yang  baik.  Fraksi  optimum  hasil pemurnian  (pelet  hasil  pengendapan  yang diresuspensi  dalam  buffer  fosfat  pH  7) dengan metode pengendapan aseton disimpan selama variasi waktu 0, 1, 4, dan 7 hari  dalam freezer lemari  pendingin SHARP  VR-D180.  Hasil  uji  stabilitas menunjukkan  bahwa  aktivitas  total  enzim
menurun  41,1% pada hari pertama dan 47% pada  hari  keempat  setelah  penyimpanan, dan pada hari ketujuh  menurun menjadi 88 %  jika  dibandingkan  dengan  aktivitas selulase  pada  awal  penyimpanan.  Hal  ini diduga  karena  terjadi  degradasi  dan/atau denaturasi  selulase  selama  penyimpanan. Degradasi  selulase  diduga  karena  aktivitas protease,  yang  juga  terendapkan  selama proses pengendapan, selama proses penyimpanan maupun selama proses resuspensi pelet sebelum pengujian stabilitas penyimpanan dilakukan.
Denaturasi  selulase  diduga  berasal  dari  air yang  ditambahkan  sebelum  penyimpanan. Molekul air dapat mempengaruhi konformasi  protein  selama  dalam  proses pembekuan  ( freeze )  dan  pencairan  sampel ( thawing ) sehingga menyebabkan denaturasi. Denaturasi selulase juga kemungkinan terjadi karena adanya perubahan  konformasi  atau  folding  akibat perubahan lingkungan sekitar enzim. Hal ini disebabkan  karena  pelet  enzim  hasil sentrifugasi  belum  benar-benar  bebas  dari aseton sehingga ketika diresuspensi dengan larutan  buffer  fosfat  pH  7  lingkungan sekitar  enzim  berubah  dari  hidrofobik menjadi hidrofilik
.
Tabel  3. Aktivitas  Fraksi  Selulase  Optimum  selama  Penyimpanan  dalam freezer Lemari Pendingin SHARP VR-D180
Variasi Waktu (hari) Aktivitas Total  (U) % penurunan Peneliti Islami (2016) Peneliti Islami (2016) 0 127,5 375 0 0 1 75 75 41,1 80,0 4 67,5 75 47,0 80,0 7 15 37,5 88,2 90,0
Uji  stabilitas  penyimpanan  hasil  fraksi optimum pengendapan dengan aseton lebih baik dibandingkan dengan stabilitas penyimpanan fraksi optimum hasil pemurnian selulase dengan metode pengendapan  etanol  dalam  kondisi  yang sama  (Islami,  2016).  Fraksi  optimum  hasil pengendapan  dengan  etanol  mengalami penurunan sebesar 80 % pada hari pertama, 80 % pada hari keempat dan 90 % pada hari ketujuh  (Tabel  3).  Maka  dapat  dikatakan bahwa  kestabilan  fraksi  optimum  selulase hasil pemurnian dengan metode pengendapan aseton lebih baik
dibandingkan  dengan  hasil  pemurnian dengan metode pengendapan etanol. Pendapat  ini  juga  didukung  oleh  data lainnya yaitu perolehan kembali dan tingkat
kemurnian  pada  masing-masing  fraksi optimum.  Fraksi  optimum  aseton  (fraksi dengan  tingkat  kejenuhan  aseton  50  %) memiliki  perolehan  kembali  dan  tingkat kemurnian  enzim  rata-rata  yaitu  76,85% dan  64  kali  ekstrak  kasar  selulase, sedangkan  fraksi  optimum  etanol  (fraksi dengan  tingkat  kejenuhan  etanol  50%) perolehan  kembali  dan  tingkat  kemurnian enzim  rata-rata  hanya  65,14%  dan  49  kali ekstrak kasar selulase (Tabel 4).
Berdasarkan  uraian  di  atas  menunjukkan bahwa  metode  pengendapan  aseton  cukup berpotensi  sebagai  metode  pemurnian enzim, akan tetapi perlu dicari suatu kondisi atau perlakuan untuk meningkatkan stabilitas fraksi optimumnya.
Tabel  4. Perbandingan  Hasil  Pemurnian  Ekstrak  Kasar  Selulase Bacillus  circulans dengan Metode Pengendapan Aseton dan Metode Pengendapan Etanol
Fraksi Optimum Perolehan Kembali (%) Tingkat Kemurnian Peneliti Islami (2016) Peneliti Islami (2016) Fraksi optimum 76,85 % 65,14 % 63.61 49,17 Kesimpulan Tingkat kemurnian hasil pengendapan ekstrak kasar Bacillus circulans mengalami  peningkatan  pada kejenuhan  aseton  (33%),    (41,1%),  dan (50%)  kemudian  menurun  pada  kejenuhan aseton  (60%)  dan  (67%) . Fraksi  yang memiliki  aktifitas  spesifik  tertinggi  adalah pada tingkat kejenuhan aseton 50 % dengan
tingkat  kemurnian  rata-rata  63,61 ± 0,141 kali  ekstrak  kasar  dan  perolehan    kembali rata-rata  76,85 ± 7,99  %.  Waktu pengendapan  tidak  berpengaruh  terhadap tingkat  kemurnian  hasil  fraksinasi  ekstrak kasar  selulase Bacillus  circulans pada kejenuhan  aseton  optimum.  Selulase  hasil pengendapan  dengan  aseton  memiliki stabilitas  yang  cukup  baik  dalam  lemari
pendingin  SHARP  VR-D180  pada  suhu  ±
0°C  (freezer).  Aktivitas  selulase  menurun
sebesar 41,1 % pada hari pertama dan 88,2 % pada hari ketujuh setelah penyimpanan.

## Daftar Pustaka
Aruwajoye,  G.  S.,  Omoboye,  O.  O.,
Daramola,  I.  O.,  &  Agboola,  K.  F. 2014. Extracellular cellulase production  by Bacillus  circulans isolated from decayed wood.
International  Journal  of  Academic Research in Applied Science, 3 (2): 1-
8.
Burgess,  R.  R.  &  Deutscher,  M.  P.  2009.
Methods  in  Enzymology:  Guide  to Protein  Purification,  2 nd . London:
Academic Press.
Gemili, S., Umdu, E. S., Yaprak, N., Ustok,
F. I., Yener, F. Y. G., Gucbilmez, C. M., Altinkaya, S. A., & Yemenicioglu,  A.  2007.  Partial
Purification  of  Hen  Egg  White
Lysozyme  by  Ethanol  Precipitation Method  and  Determination  of  the Thermal  Stability  of  Its  Lyophilized Form. Turk J Agric For , 31 : 125-134. Islami,  Lila  S.  2016. Pengaruh  Tingkat Kejenuhan  dan  Waktu  Inkubasi Terhadap  Kemurnian  Selulase  dari Bacillus  Circulans  yang  Dimurnikan dengan  Pengendapan  Etanol  Serta Stabilitasnya  Selama  Penyimpanan . Skripsi  tidak  diterbitkan.  Malang: Jurusan Kimia FMIPA UM.
Lian, P., Guo, H. B., Smith, J. C., Wei, D. Q.,  &  Guo,  H.  2014.  Catalytic mechanism and origin of high activity of  cellulase  TmCel12A  at  high
temperature:
a quantum mechanical/molecular mechanical study. Cellulose , 21 : 937-949.
Menendez,  E.,  Fraile,  P.  G.,  &  Rivas,  R. 2015.  Biotechnological  applications of bacterial cellulases. AIMS Bioengineering , 2 : 163-182.
Rahmadani,  A.  H.  &  Susanti,  E.    2012.
Pemilihan  dan  Optimasi  Konsentrasi
Induser Alamiah serta Analisis Potensi Sistem Selulase dari Bacillus circulans untuk Mendegradasi Substrat Lignoselulosa. Jurnal Valensi , 3 (2).
Rosenberg,  I.  M.  1996. Protein  Analysis and Purification: Benchtop Technique : Birkhauser.
Scopes,  R.  K.  1987. Protein  Purification Principle  and  Practice,  2 nd ed. New York:  Springer-Verlag  New  York, Inc.
Susanti,  E.  2011.  Optimasi  Produksi  dan Karakterisasi  Sistem  Selulase  dari Bacillus circulans strain Lokal dengan Induser Avicel. Jurnal ILMU DASAR , 12 (1): 40-49. Trentini,  M.  M.  S.,  Toniazzo,  G.,  Zeni,  J., Pili, J., Luccio, M. D. dan Valduga, E. 2015. Purification of Pectinases from Aspergillus  niger  ATCC  9642  by Ethanol  Precipitation. Biocatalysis and  Agricultural  Biotechnology,  4 :
315-320