VALIDATION METHOD FOR DETERMINATION OF NICLOSAMIDE MONOHIDRATE IN VETERINARY MEDICINE USING UV-VIS SPECTROPHOTOMETRY
Nurul, Dani Sujana
Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Karsa Husada Garut Jl. Subyadinata No. 9, Jayaraga, Tarogong Kidul, Kabupaten Garut, Jawa Barat
Corresponding author: Nurul Agustina (nurullagustina@gmail.com)

## ARTICLE HISTORY
Received: 11 May 2020                            Revised: 25 July 2020                     Accepted: 27 July 2020

## Abstract
There is no information related to the determination of levels of niclosamide analysis in  pharmaceutical  preparations  for  animals  by  using  the  Uv-Vis  Spectrophotometry method. The method is used with the consideration that the work principle is simpler, specific, accurate and precisely developed and validated for simultaneous estimation. This  research  was  conducted  with  the  aim  to  validate  the  analytical  method  in determining the content of niclosamide monohidrate in veterinary medicine using UV- Vis spectrofotometry. Maximum absorption in Nicolosamid monohydrate at 237.5 nm wavelength.  Obtained  a  linear  relationship  between  concentration  and  absorption, with the correlation coefficient (r)  = 0.9998 and the equation of regression line  Y = 0.0628  X-0.00543.  At  determining  the  level  of  niclosamid  in  veterinary  medicine samples  at  a  rate  of  96.94%.  Validation  tests  can  meet  the  requirements,  with  a recovery  percentage value  of  94.435%  accuracy  and  a  RSD value  for  precision  of 1.515%. With LOD and LOQ of 0.458 and 1.5270.
Key words: LOD, LOQ, Nilosamide, RSD, Validation.

## VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR NIKLOSAMID MONOHIDRAT DALAM SEDIAAN OBAT HEWAN DENGAN MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

## Abstrak
Belum ada informasi terkait analisis penetapan kadar dari niklosamid dalam sediaan farmasi untuk hewan dengan metode menggunakan Spektrofotometri Uv-Vis. Metode tersebut  digunakan  dengan  pertimbangan  prinsif  kerja  lebih  sederhana,  spesifik, akurat dan tepat dikembangkan dan divalidasi untuk estimasi simultan. Penelitia ini dilakukan dengan tujuan untuk memvalidasi metode analisis pada penetapan kadar niklosamid monohidrat  dalam  sediaan  obat  hewan  dengan  menggunakan Spektrofotometri UV-Vis. Serapan maksimum pada niklosamid monohidrat yaitu pada panjang  gelombang  237,5  nm.  Diperoleh  hubungan  yang  linier  antara  konsentrasi dan serapan, dengan koefisien korelasi (r) = 0,9998 dan persamaan garis regresi Y= 0,0628 X - 0,00543. Pada penentuan kadar niklosamid dalam sampel obat hewan di dapat kadar sebesar 96,94%. Uji presisi, didapat nilai RSD adalah 1,03%; 1,52 % dan 0,58%. Uji validasi dapat memenuhi persyaratan, dengan nilai persentase recovery
akurasi sebesar 94,435 % dan nilai RSD untuk presisi sebesar 1,515%. Dengan LOD dan LOQ sebesar 0,458 dan 1,5270.
Kata kunci: LOD, LOQ, Niklosamide, RSD, Validation

## Pendahuluan
Pembuktian  data  dengan  cara  menguji  kinerja  suatu  instrument  untuk memastikan  bahwa  analisis  yang  dilakukan  di  laboratorium  sesuai  dengan metode serta  prosedur  yang  telah  ditetapkan,  merupakan  tujuan  dari  validasi  instrument (Ekechukwu  et  al.,  2009).  Proses  tersebut  bertujuan  untuk  memberikan  jaminan terhadap efektifitas, kualitas serta keamanan suatu produk farmasi sebelum beredar dipasaran yang merupakan bagian dari program penjaminan mutu (Ambarwati et al., 2013).
Metode  analisis  merupakan  salah  satu  jenis  validasi  yang  bertujuan  untuk membuktikan  bahwa  semua  metode  analisis  baik  cara  kerja  maupun  prosedur pengujian  yang  digunakan  dalam  berbagai  pengujian  termasuk  pengawasan  mutu agar sesuai dengan fungsi dan kegunaannya secara berkelanjutan  (Belouafa et al., 2017). Akurasi, presisi,  linearitas, batas nilai deteksi/ Limit Of Detection (LOD) dan batas  nilai  kuantitasi/ Limit  Of  Quantitation (LOQ)  merupakan  parameter  validasi metode  analisis  yang  paling  penting  dalam  penentuan  suatu  kadar  menggunakan instrumen (Taverniers et al., 2004).
Syarat  produk  farmasi  harus  memenuhi  standar  mutu  dan  kadar  yang  telah tentukan  sesuai  dengan  prosedur  analisis  yang  telah  ditetapkan,  sehingga  produk tersebut tetap stabil dan memiliki efek terapeutik yang diharapkan. Seleruh produk farmasi  sebelum  beredar  dipasaran  harus  melewati  tahap  pengawasan  dan pemeriksaan mutu (Buchanan, 2000).
Niklosamid monohidrat adalah anthelmintik yang sering dan banyak digunakan untuk membasmi parasit cacing khususnya untuk hewan (Rahmah et al., 2013). Obat ini dipakai secara oral untuk membasmi parasit usus,  diantaranya cacing pita, dan atau  keduanya  pada  manusia  dan  hewan.  Hewan  yang  biasa  diobati  diantaranya kucing,  anjing,  burung  unta  dan  unggas  (Van  Tonder  et  al.,  2004).  Obat  ini mempengaruhi  metabolisme  energi  parasit  dan  praktis  tidak  diserap  oleh  saluran usus (Pohanish, n.d.).
Telah dilaporkan hasil analisis dari niklosamid dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi  dengan menggunakan fase terbalik dengan batas dan batas kuantifikasi masing- masing adalah 0,048 μg / mL dan 0,01 μg / ml (Paghadar & Vadia, 2019). Belum  ada  informasi  terkait  analisis  penetapan  kadar  dari  niklosamid  dalam sediaan  farmasi  untuk  hewan  dengan  metode  menggunakan  Spektrofotometri  Uv- Vis. Metode tersebut digunakan dengan pertimbangan prinsif kerja lebih sederhana, spesifik, akurat dan tepat dikembangkan dan divalidasi untuk estimasi simultan (Lotfy et  al.,  2013).  Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan  untuk  memvalidasi  metode analisis  pada  penetapan  kadar  niklosamid  monohidrat  dalam  sediaan  obat  hewan dengan menggunakan Spektrofotometri Uv-Vis.

## Metode

## Alat
Dalam penelitian ini digunakan alat diantaranya timbangan digital (Shimadzu tipe AUW), spektrofotometri Uv-Vis (UV mini tipe 1240, Shimadzu), kuvet (Quaretz), labu
takar (Pyrex), pipet volume (Pyrex), pipet tetes, botol semprot, penangas air (DK-98- IIA), vial, kertas saring, gelas kimia (Pyrex) dan spatula.

## Bahan
Bahan yang digunakan adalah bahan baku niklosamid monohidrat, sampel obat hewan, aquadest, metanol dan asetonitril grade pro analisis dari MERCK ® .

## Pembuatan Larutan Induk Baku Niklosamid Monohidrat
Sebanyak 50 mg niklosamid monohidrat ditimbang, selanjutnya dimasukkan ke dalam  labu  ukur  50  mL.  Dilarutkan  dalam  metanol  sambil  dipanaskan  secara perlahan-lahan diatas penangas air sampai larut, dinginkan, kemudian tambahkan metanol sampai tanda batas. Larutan ini disebut larutan induk baku niklosamid 1000 ppm.

## Pembuatan Larutan Stok Baku Niklosamid Monohidrat
Diambil  10  mL  larutan  induk  baku  menggunakan  pipet  ukur,  selanjutnya dimasukan  ke  dalam  labu  ukur  100  mL.  Kemudian  encerkan  dengan  asetonitril sampai tanda batas. Larutan ini disebut larutan stok baku niklosamid 100 ppm.

## Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Diambil 1 mL larutan induk baku menggunakan pipet ukur, masukan ke dalam labu  ukur  20  mL.  Kemudian  diencerkan  dengan  asetonitril  sampai  tanda  batas, sehingga  didapat  konsentrasi  larutan  baku  50  ppm.  Ukur  serapan  pada  panjang gelombang 200-400 nm.

## Penentuan Kadar Niklosamid dalam Sediaan Obat Hewan
Sebanyak 58,8 mg sediaan obat itimbang, selanjutnya dimasukan ke dalam labu ukur  50  mL.  Dilarutkan  dalam  metanol  sambil  dipanaskan  secara  perlahan-lahan diatas  penangas  air  sampai  larut,  dinginkan  kemudian  tambahkan metanol  sampai tanda  batas.  Larutan  ini  disebut  larutan  induk  sampel  niklosamid  1000  ppm. Mempipet  1  mL  larutan  induk  sampel,  kemudian  encerkan  dengan  asetonitril  ke dalam labu ukur 10 mL sampai tanda batas. Larutan ini disebut larutan sampel 100 ppm. Mempipet 1 mL larutan induk sampel, kemudian encerkan dengan asetonitril ke dalam labu ukur 10 mL sampai tanda batas. Larutan ini disebut larutan  sampel 10 ppm. Pengukuran sampel dengan spektrofotometri uv-vis pada panjang gelombang 230 nm. Kemudian hitung kadarnya.
Uji  Validasi  dengan  Parameter  Akurasi,  Presisi,  Batas  Deteksi,  dan  Batas Kuantisasi

## Uji Akurasi
Uji  akurasi  dilakukan  dengan  metode  penambahan  baku  ( Standar  Addition Methode )  yaitu  dengan  membuat  tiga  konsentrasi  analit  sampel  dengan  rentang spesifik  90%,  100%,  110%.    Persen  perolehan  kembali  (% recovery )  dihitung menggunakan rumus (Harmita, 2004) :

## % 𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 = Kadar yang diperoleh
Kadar yang sebenarnya × 100%

## Uji Presisi
Uji  presisi  ditentukan  dengan  parameter Relative  Standar  Deviasi (RSD) dengan rumus (Sudewi & Pontoh, 2018) :
𝑅𝑆𝐷 = 𝑆𝐷 𝑋 x 100%
Keterangan RSD  : Relative Standar Deviation SD :  Standar Deviasi
X :  Kadar rata-rata niklosamid dalam sampel

## Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ)
Untuk menentukan batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) digunakan rumus (Sugihartini et al., 2014):
𝑆𝐵 =   √ (𝑌 − 𝑌𝑖)²
𝑛 − 2 𝐿𝑂𝐷 = 3  × 𝑆𝐵 𝑆𝑙𝑜𝑝𝑒 𝐿𝑂𝑄 = 10 𝑥 𝑆𝐵 𝑆𝑙𝑜𝑝𝑒 Keterangan SB :  Simpangan Baku
LOD  :  Batas Deteksi LOQ  :  Batas Kuantifikasi

## Hasil dan Pembahasan
Dari  hasil  penelitian,  dapat  diketahui  serapan  absorpsi  maksimum  niklosamid monohidrat yaitu pada panjang gelombang 237,5 nm. Namun pada penelitian kali ini digunakan serapan absorpsi yang terdapat pada literatur farmakope obat hewan yaitu pada  panjang  gelombang  230  nm.  Hal  ini  dikarenakan  pada  percobaan  untuk penentuan serapan absorpsi maksimum tidak dilakukan perhitungan penentuan nilai absorpsivitas molar dari literatur. Jadi pada penelitian ini dilakukan pada konsentrasi secara acak yaitu pada konsentrasi 50 ppm.

## Gambar 1. Panjang Gelombang Maksimum Niklosamid Monohidrat
Karena panjang gelombang suatu senyawa dapat berbeda bila ditentukan pada kondisi  dan  alat  yang  berbeda,  maka  senyawa  yang  akan  diuji  kemudian
dibandingkan  dengan  data  pada  literatur  sebagai  parameter.  Uji  ini  dilakukan penentuan  panjang  gelombang  maksimum  niklosamid  monohidrat  pada  daerah ultraviolet yaitu 230 nm sesuai yang dilakukan Maltas, E (2014). Dalam penelitian ini dilakukan  penetapan  kadarnya  dengan  menggunakan  spektrofotometri  UV-Vis dengan pelarut metanol untuk larutan induk dan pengenceran dengan asetonitril. Dari data tersebut  serapan maksimum pada niklosamid monohidrat yaitu pada panjang gelombang 237,5 nm.
Gambar 2. Serapan Maksimum Niklosamid Monohidrat

## Pembuatan Kurva Kalibrasi
Hasil  penentuan  linieritas  kurva  kalibrasi  niklosamid  monohidrat  dalam  pelarut asetonitril dengan konsentrasi 5, 10, 15, 20 dan 25 ppm pada panjang gelombang 230 nm dengan menggunakan asetonitril sebagai blangko dapat dilihat pada tabel 1.

## Tabel 1. Hasil Pembuatan Kurva Kalibrasi
Dari hasil pembuatan kurva kalibrasi niklosamid monohidrat diperoleh hubungan yang  linier  antara  konsentrasi  dan serapan,  dengan  koefisien  korelasi  (r)  =  0,9998 dan  persamaan  garis  regresi  Y=  0,0628  X=  0,00543.  Kriteria  penerimaan  untuk korelasi  adalah  r ≥ 0,995  (Ti  Zhang,  Shuang  Cai,  Wai  Chee  Forrest,  Eva  Mohr, Qiuhong Yang, 2011).

## Penentuan Kadar Niklosamid dalam Sediaan Obat Hewan
Hasil penentuan kadar niklosamid monohidrat dalam sediaan obat hewan dapat dilihat dalam tabel 2.

## Tabel 2. Hasil Pengukuran Sampel Niklosamid Monohidrat
No  Konsentrasi (ppm)  Absorban 1 10,675 0,662 2 10,683 0,663 3 10,679 0,662
Pada  penentuan  kadar  niklosamid  dalam  sampel  obat  hewan  di  dapat  kadar sebesar  96,94%.  Ini  tidak  memenuhi  persyaratan  dalam  monografi  yang  terdapat
No  Konsentrasi (ppm) Absorban 1 5,100 0,300 2 10,200 0,640 3 15,300 0,960 4 20,400 1,282 5 25,500 1,588
dalam literatur farmakope Indonesia obat hewan yaitu sebesar 98%-100,5%. Hal ini terjadi dikarenakan tidak menggunakan standar niklosamid sebagai pembandingnya. Pada  percobaan,  niklosamid  dengan  kadar  kemurnian  sebesar  95,75%  sebagai pembanding.

## Uji Validasi
Pada  uji  presisi,  dilakukan  menggunakan  larutan  baku  niklosamid  dengan konsentrasi  5ppm,10ppm,  20ppm  diukur  pada  hari  yang  berbeda  selama  3  hari,  dan dihitung sebagai Relative Standar Deviasi (RSD).
Tabel 3. Hasil Pengujian Presisi Bahan Baku Niklosamid Monohidrat
Pengujian Konsentrasi Sampel (ppm) 5 10 20 Hari ke 1 4,57 9,80 19,66 Hari ke 2 4,67 9,51 19,83 Hari ke 3 4,62 9,62 19,61 Rata-Rata 4,62 9,64 19,70 Standar Deviasi 0,05 0,15 0,11 Relative standar deviasi (%RSD) 1,03 1,52 0,58
Berdasarkan tabel 3, didapat nilai RSD yaitu 1,03%; 1,52; 0,58%.   Berdasarkan data tersebut, maka dapat memenuhi persyaratan yaitu RSD ≤ 2%. Kemudian pada penelitian ini dilakukan uji validasi dengan metode penambahan bahan baku ( standar addition methode ) terhadap sampel obat hewan niklosamid yang meliputi uji akurasi dengan  parameter  persen  perolehan  kembali  (% recovery ),  uji  presisi  dengan parameter  RSD  ( Relative  Standar  Deviasi ),  batas  deteksi  (LOD)  dan  batas kuantifikasi (LOQ). Uji akurasi dengan parameter persen perolehan kembali dilakukan dengan membuat  3 konsentrasi  analit  dengan  rentang spesifik  90%,  100%, 110%. Data  hasil  pengujian  perolehan  kembali  niklosamid  dengan  metode  penambahan bahan baku ( standar addition methode ) dapat dilihat pada tabel 4.
Tabel 4. Hasil Uji Validasi Dengan Metode Adisi
Konsentrasi Kadar yang diperoleh (ppm) Kadar yang Sebenarnya (ppm) Recovery (%) 90% 19,344 20,290 95,338 19,344 20,290 95,338 19,344 20,290 95,338 100% 20,376 21,358 95,402 20,391 21,358 95,472 20,384 21,358 95,440 110% 20,762 22,448 92,489 20,779 22,448 92,565 20,771 22,448 92,529 Kadar rata-rata ( % recovery) 94,435 Standar deviasi (SD) 1,431 Relative standar deviasi 1,515
Berdasarkan  data  pada  tabel  4,  didapatkan  rata-rata  perolehan  kembali  (% recovery )  adalah  sebesar  94,435  %,  dan  standar  deviasi  1,431.  Persen  perolehan kembali ini dapat diterima karena memenuhi syarat akurasi dimana rentang rata-rata hasil persen perolehan kembali adalah 80-110% (Sudewi & Pontoh, 2018).
Sedangkan  dari  hasil  uji  presisi  dengan  parameter Relative  Standar  Deviasi (RSD) adalah 1,515 %. Untuk nilai RSD yang diizinkan adalah  ≤ 2%  (Rivai et al., 2018).  Maka  dapat  disimpulkan  bahwa  metode  tersebut  memiliki  nilai  akurasi  dan presisi yang cukup baik. Untuk nilai batas kuantifikasi (LOQ) adalah 1,5270 dan batas deteksi (LOD) adalah 0, 458.

## Kesimpulan
Dari  hasil  penelitian  tersebut,  dapat  diketahui  serapan  absorpsi  maksimum niklosamid monohidrat yaitu pada panjang gelombang 237,5 nm. Untuk uji linieritas didapat  persamaan  regresi  linier  yaitu  Y=  0,0628  X=  0,00543  dengan  koefisien korelasi r= 0,9998. Pada penentuan kadar niklosamid dalam sampel obat hewan di dapat kadar sebesar 96,95%. Uji presisi, didapat nilai RSD adalah 1,03%; 1,52 % dan 0,58%. Pada uji validasi dapat memenuhi persyaratan yaitu dengan nilai persentase recovery akurasi  sebesar  94,435%  dan  nilai  RSD  untuk  presisi  sebesar  1,515%. Dengan LOD dan LOQ sebesar 0,458 dan 1,5270.

## Ucapan Terima Kasih
Terima kasih diucapakan kepada pihak institusi Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Karsa Husada Garut, khususnya LP4M yang telah memfasilitasi penelitian ini.

## Daftar Pustaka
1.  Ekechukwu  A,  Hendricks W, White  KT,  Liabastre  A, Archuleta  M,  Hoover  MD. Validation of analytical methods and instrumentation for beryllium measurement: Review and summary of available guides, procedures, and protocols. J Occup Environ Hyg. 2009;6(12):766 –74.
2.  Ambarwati,  Ariyani  N,  Palupi  MF.  Validasi  Metode  Spektrofotometri  pada  Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat Hewan Enrofloksasin. J Sain Vet. 2013;31(2):266 – 73.
3.  Belouafa  S,  Habti  F,  Benhar  S,  Belafkih  B,  Tayane  S,  Hamdouch  S,  et  al. Statistical tools and approaches to validate analytical methods: Methodology and practical examples. Int J Metrol Qual Eng. 2017;8.
4.  Taverniers I, De Loose M, Van Bockstaele E. Trends in quality in the analytical laboratory. II. Analytical method validation and quality assurance. TrAC - Trends Anal Chem. 2004;23(8):535 –52.
5.  Buchanan  EC.  Ashp  guidelines  on  quality  assurance  for  pharmacy-prepared sterile products. Am J Heal Pharm. 2000;57(12):1150 –69.
6.  Van Tonder EC, Maleka TSP, Liebenberg W, Song M, Wurster DE, De Villiers MM. Preparation and physicochemical properties of niclosamide anhydrate and two monohydrates. Int J Pharm. 2004;269(2):417 –32.
7. Pohanish  RP.  (2014).  C.  Sittig’s  handbook  of  pesticides  and  agricultural chemicals. William Andrew. 2.
8.  Harmita. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode Dan Cara Perhitungannya. Ther Hung. 2004;1(ISSN: 1693-9883):117 –35.
9.  Sudewi S, Pontoh J. Optimasi dan Validasi Metode Analisis Dalam Penentuan Kandungan Total Flavonoid Pada Ekstrak Daun Gedi Hijau (Abelmoscus Manihot L.)  yang  Diukur  Menggunakan  Spektrofotometer  Uv-Vis.  Pharmacon. 2018;7(3):32 –41.
10.  Sugihartini  N,  Fudholi  A,  Pramono  S,  Sismindari  S.  Validasi  Metode  Analisa Penetapan Kadar Epigalokatekin Galat Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Pharmaciana. 2014;4(2).
11.  Ti Zhang, Shuang Cai, Wai Chee Forrest, Eva Mohr, Qiuhong Yang and MLF. Development  and  Validation  of  an  Inductively  Coupled  Plasma  Mass Spectrometry (ICP-MS) Method for Quantitative Analysis of Platinum in Plasma, Urine, and Tissues. Physiol Behav. 2011;176(1):139 –48.
12.  Rivai  H,  Nofera  NS,  Azizah  Z.  Development  and  Validation  of  Dimenhydrinate Analysis Method in Tablet with Absorbance Method and Method of Area under Curve  with  Ultraviolet  Spectrophotometry.  Sch  Acad  J  Pharm  [Internet]. 2018;7(3):155 –63. Available from: http://saspublisher.com/sajp/