Studi In  Silico Senyawa  2- amino -5-(3-(4- hydroxy -3,5- dimethoxy - benzoyl ) guanidino ) pentanoic acid dan Turunannya sebagai Inhibitor Phospodiesterase-5
Ruslin * , Syam Febriantara, Yamin
Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo, Kampus Hijau Bumi Tridharma Anduonohu Kendari 93232

## Abstrak
Perkembangan penemuan senyawa kandidat obat selama beberapa dekade memiliki perkembangan yang pesat. Salah satu teknik pengembangan  yang  efektif  adalah  metode In  Silico. Dengan  memanfaatkan  simulasi,  pengembangan  obat  inhibitor Phospodiesterase-5 dapat  dilakukan  untuk  tujuan  terapi  pada  pasien  disfungsi  ereksi.  Leonurin,  senyawa  yang  didapatkan  dari tanaman  deungdeureunam  memiliki  khasiat  afrodisiaka.  Turunan  senyawa  yang  salah  satunya 2-amino-5-(3-(4-hydroxyl-3,5- dimethoxybenzoyl)guanidino)  pentanoic  acid dikembangkan  untuk  melihat  kerjanya  dalam  menghambat Phospodiesterase-5 secara in silico . Senyawa diuji dengan membandingkannya dengan sildenafil, obat inhibitor Phospodiesterase-5 yang telah diakui WHO.  Senyawa  dibentuk  menggunakan software ChemBioDraw,  HyperChem,  kemudian  ditambatkan  dengan  ArgusLab  4.0.1 dengan molekul Phospodiesterase-5 yang didapatkan dari situs penyedia PDB. Dari studi In Silico diketahui 10 turunan senyawa memiliki  ∆G  masing-masing  sebesar  -6.95155  kcal/mol,  -7.84975,  -7.87837  kcal/mol,  -7.42338  kcal/mol,  -7.54449  kcal/mol,  - 7.94204 kcal/mol, -7.68970 kcal/mol, -8.19100 kcal/mol, -8.107 kcal/mol, -7,93392 kcal/mol. Sildenafil sendiri memiliki nilai ∆G sebesar  -8,57159  kcal/mol.  Sildenafil  masih  memiliki  kerja  yang  lebih  baik  dibandingkan  dengan  ∆G  terkecil  dari  10  turunan senyawa dengan selisih sebesar 0,38059 kcal/mol.
Kata kunci : In Silico , Penambatan Molekuler, Leonurin, Afrodisiaka, Desain Obat.

## 1. Pendahuluan
Menurut  data  dari World  Health  Organization (WHO) tahun 1995, prevalensi laki-laki yang mengalami disfungsi  ereksi  diperkirakan  mencapai  152  juta  dan pada  tahun  2025  diperkirakan  akan  mencapai  322  juta seiring  pertumbuhan  penduduk  [1].  Disfungsi  ereksi  di Indonesia  pada  tahun  1999  menurut Indonesia  Erectily Disfunction Advisory Council and Training (INAEDACT) diperkirakan sudah mencapai 6 juta pria [2]. Obat-obat oral Disfungsi Ereksi yang sudah tersedia di pasaran maupun yang masih dalam penelitian adalah inhibitor  enzim Phosphodiesterase-5 ,  yaitu  sildenafil (viagra),  tadalafil  (cialis)  dan  verdenafil  (levitra). Sildenafil  diakui  oleh  US  FDA  dengan  keberhasilan sekitar  60-70%  pada  pasien  normal.  Pada  pasien diabetes,  angka  keberhasilan  sekitar  50%.  Terapi  lain adalah injeksi obat secara intrakavernosa dapat menjadi pilihan  lain  bagi  penderita  yang  tidak  berhasil  dengan sildenafil.  Walaupun  obat  oral  mudah  penggunaannya, namun pemakaiannya perlu pertimbangan dan * KBK Farmasi Sains, Fakultas Farmasi UHO Email: mahaleo241@yahoo.co.id
diperlukan pengawasan yang ketat, karena obat oral pun dapat memberikan efek samping yang tidak terduga dan membahayakan [3].
Reseptor  phospodiesterase - 5  sendiri  merupakan enzim  tipe  hidrolase  yang  menghidrolisis  nukleotida siklik guanin 3',5'-siklik monofosfat (cGMP) dan adenin 3,5’-siklik  monofosfat  (cAMP)  menjadi  bentuk  tidak aktifnya (GMP 5'-nukleotida). Enzim phospodiesterase- 5  ini  banyak  terdapat  pada  korpus  kavernosum.  Dari letaknya  yang  spesifik,  enzim  phospodiesterase-5  yang etrdapat  pada  korpus  kavernosum  bekerja  dalam  siklus ereksi  [4].  Sehingga  bagi  dunia  farmasi,  reseptor phospodiesterase-5  dapat  dikembangkan  sebagai  acuan dasar  dalam  pengobatan  disfungsi  ereksi  yang  hingga kini  belum  memiliki  banyak  variabilitas  dalam pemilihan terapi [5].
Hasil  penelitian  Ruslin  dkk  (2014)  menunjukkan senyawa  turunan  Leonurin  (4-guanidin  butil  ester  3.5- dimetoksi  4-hidroksi  benzoat)  memiliki  khasiat
Ruslin, dkk: Studi In Silico Senyawa 2-amino-5-(3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)guanidino)pentanoic acid dan Turunannya sebagai Inhibitor Phospodiesterase-5
afrodisiaka  [6],  sehingga  dapat  dikembangkan  untuk menjadi  salah  satu  pilihan  dalam  mengobati  disfungsi ereksi.  Dengan  memanfaatkan  situs  penyedia Protein Data Bank (PDB) untuk mendapatkan molekul reseptor yang  akurat,  senyawa  Turunan  Leonurin  dilakukan  uji secara In  Silico untuk  mengetahui  keefektifannya dibandingkan  Sildenafil  (Obat  yang  telah  diakui  US FDA) [7].

## 2. Metode
Perangkat lunak yang digunakan adalah ChemBioDraw  Ultra  7.0  untuk  membangun  struktur turunan  senyawa,  serta  HyperChem  for  Windows digunakan  untuk  membentuk  konformasi  stabil  dari senyawa yang dibuat. ArgusLab 4.0.1 digunakan untuk
menambatkan  senyawa  turunan  Leonurin.  Perangkat keras  yang  digunakan  berupa  personal  komputer AMD FX-8800P Radeon R7 12 Comute Core 4C+8G @ 2.1 GHz; RAM : 8.00 GB (7.47 GB Usable ); tipe sistem 64- bit ; Operating System : Windows ® 8.1 Pro.
Gambar 1. Senyawa leonurin

## 2.1 Pengunduhan Target Penambatan
Target  penambatan  reseptor phospodiesterase-5 didapatkan dari situs penyedia Protein Data Bank (PDB) melalui www.rscb.org/pdb . Molekul phospodiesterase-5 dimasukkan  dalam  kolom  pencarian  pada  situs  dengan kode protein 2H42. File molekul diunduh dengan format *.PDB.

## 2.2 Pemodelan Struktur Molekul
Pemodelan  secara  dua  dimensi  (2D)  dilakukan mengguanakan software ChemBioDraw  Ultra.  Setelah itu,  semua  turunan  senyawa  disimpan  dalam  format *.mol  agar  kompatibel  dengan  semua software yang digunakan.  Kemudian software HyperChem  bertugas menentukan konformasi terstabil senyawa dan meminimalkan  energy  yang  digunakan  senyawa  untuk dapat bereaksi.

## 2.3 Validasi Metode Penambatan
Proses  validasi  dilakukan  untuk  menentukan metode  yang layak digunakan  menggunakan  ArgusLab dengan metode ArgusDock dan GADock. Metode yang layak  digunakan  adalah  metode  yang  memiliki  nilai RMSD  ( Rate  Mean  Square  Deviation )  dibawah  2,5  Å [8].  Proses  penambatan  dilakukan  untuk  melihat interaksi  yang  terjadi  pada  ligan  dan  reseptor  dengan melihat  energi  bebas  ikatan  ( binding  affinity) yang dilambangkan dengan ∆G

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1 Persiapan Ligan
Dasar  perancangan  dan  desain  untuk  turunan senyawa 2-amino-5-(3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxy benzoyl)guanidino)  pentanoic  acid dilakukan  dengan
Tabel 1. Perancangan dan desain turunan senyawa
Kode Struktur T-1 T-2
T-3 T-4
T-5
T-6 T-7 T-8 T-9
menambah  rantai  induk,  mengganti  dan  menambahkan gugus tertentu pada rantai yang kemudian menghasilkan senyawa  turunan  dalam  bentuk.  Selanjutnya  dilakukan proses optimasi dilakukan untuk mencari koordinat dari posisi  atom  agar  berada  pada  keadaan  stabil  dengan energi yang paling rendah. Proses ini dilakukan dengan menghitung konformasi saat tidak ada gaya yang bekerja antar atom.

## 3.2 Docking ligan dengan reseptor
Docking dilakukan dengan ligan 2-amino-5-(3-(4- hydroxyl-3,5- dimethoxy benzoyl) guanidino) pentanoic acid dan  turunannya  (yang  sudah  dioptimasi)  terhadap
enzim phospodiesterase-5 menggunakan ArgusLab sistem GaDock dengan  pengaturan calculate  size X=21.665432,  Y=  20.672000  dan  Z=  26.103233  dan resolusi grid 0,4 Å pada kondisi ligand fleksibel (Tabel 2). Docking dilakukan  untuk  mendapatkan  prediksi posisi  dan  orientasi  ligan  ketika  terikat  pada  reseptor protein  yang  kemudian  dari  proses docking akan diperoleh best  ligan  pose (posisi  terbaik  ligan)  sebagai nilai  energi  ikatan  (∆G)  yang  merupakan  parameter kestabilan konformasi antara ligan dengan reseptor.
Docking merupakan  interaksi  penambatan  antara ligan dan protein yang digunakan untuk prediksi posisi dan  orientasi  ligan  ketika  terikat  pada  reseptor  protein [9].  Dari  proses docking akan  diperoleh  energi  ikatan
Tabel 2. Hasil Docking Antara Ligan dan Phospodiesterase-5 Ligan Hasil Docking Ligan Hasil Docking Ligan Induk T-6 T-1 T-7 T-2 T-8
T-3 T-9
T-4
T-10 T-5
Pembanding Sildenafil
Ruslin, dkk: Studi In Silico Senyawa 2-amino-5-(3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)guanidino)pentanoic acid dan Turunannya sebagai Inhibitor Phospodiesterase-5
(∆G) yang merupakan parameter kestabilan konformasi antara ligan dengan reseptor. Ligan-reseptor yang saling berinteraksi akan cenderung berada pada kondisi energi yang  paling  rendah,  kondisi  tersebut  menyebabkan molekul akan berada pada keadaan yang stabil sehingga semakin kecil harga ∆G interaksi ligan dengan reseptor akan semakin stabil [10].

## 3.3 Visualisasi Hasil Docking
Hasil  visualisasi  tiga  dimensi  (3D)  pada  area penambatan ligan dan reseptor hanya dapat menunjukkan ikatan hidrogen. Nilai donor dan akseptor ikatan  hidrogen  berhubungan  dengan  aktivitas  biologis dari suatu molekul obat.
Tabel 3. Visualisasi Hasil Docking Kode ligan ∆G(kcal/mol) Ikatan hidrogen Jarak(Å) L-i -7.64531 662ASN(O) 40HOH(O) 662ASN(N) 86HOH(O) 86HOH(O) 612TYR(O) 2.134 2.522 2.956 2.372 2.812 2.812 T-1 -6.95155 816MET(O) 820PHE(N) 662ASN(O) 2.352 2.628 2.889 T-2 -7.84975 662ASN(O) 816MET(O) 820PHE(N) 2.236 2.095 2.969 T-3 -7.87837 86HOH(O) 817GLN(O) 817GLN(O) 779ALA(O) 2.908 2.201 2.928 2.643 T-4 -7.42338 817GLN(N) 816MET(O) 820PHE(N) 819GLY(O) 2.288 2.990 2.500 2.638 T-5 -7.54449 817GLN(N) 817GLN(O) 2.890 2.817 T-6 -7.94204 817GLN(N) 816MET(O) 820PHE(N) 2.920 2.796 2.697 T-7 -7.68970 817GLN(O) 613HIS(N) 45HOH(O) 102HOH(O) 40HOH(O) 2.991 2.900 2.933 2.802 2.936 T-8 -8.19100 816MET(O) 817GLN(N) 779ALA(O) 2.505 2.904 2.909 T-9 -8.10700 817GLN(O) 816MET(O) 816MET(O) 2.814 2.674 2.990 T-10 -7,93392 813ILE(O) 817GLN(O) 2.905 2.874 P/S -8,57159 GLN817(O) 2.392
Interaksi  elektrostatik  juga  berperan  dalam stabilitas ligan terhadap reseptor. Interaksi ini termasuk
interaksi yang lemah dan bersifat non kovalen sehingga mudah  lepas,  tetapi  karena  jumlahnya  yang  banyak interaksi  elektrostatik  memiliki  kontribusi  yang  besar dalam  pembentukan  konformasi  protein.  Interaksi elektrostatik  berupa  jembatan  garam  ( salt  bridge )  dan gaya van der Waals . Jembatan garam merupakan ikatan garam  antara  gugus  yang  bermuatan  berlawanan  pada rantai  samping  asam  amino  maupun  gugus  ligan  [11]. Interaksi  hidrofobik  juga  berperan  dalam  menentukan stabilitas  ligan  terhadap  reseptor.  Pembentukan  ikatan hidrofobik  meminimalkan  interaksi  residu  nonpolar dengan air [12].
Pembanding  atau  sildenafil  (P/S)  mengalami interaksi  membentuk  ikatan  hidrogen  dengan  asam amino GLN817(O), dengan jarak ikatan 2.392 Å. Ikatan antara  ligan  (P/S)  pada  gugus  NH  dari  sildenafil  yang membentuk ikatan hidrogen dengan bagian O dari residu asam amino GLN yang merupakan sisi aktif dari enzim PDE5.
Berdasarkan data diatas diperoleh nilai ∆G terkecil pada  ligan  pembanding/sildenafil  (P/S)  yaitu  sebesar  - 8,57159  kcal/mol.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa sildenafil  memiliki  afinitas  yang  lebih  baik  dari  semua ligan  turunan  senyawa 2-amino-5-(3-(4-hydroxy-3,5- dimethoxybenzoyl) guanidino)pentanoic acid .

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  pendekatan in  silico ,  dengan  metode molecular  docking senyawa 2-amino-5-(3-(4-hydroxyl- 3,5-dimethoxybenzoyl)guanidino)pentanoic  acid dan turunannya  dapat  dijadikan  sebagai  inhibitor  enzim phospodieterase-5 (PDE5)  dengan  hasil  terbaik  yang didapatkan  pada  ligan  turunan  8  dengan  nilai  ∆G terendah yaitu sebesar -8.19100 kcal/mol.

## Daftar Pustaka
1. Samekto,  W.,  &  Abdul,  G.,  2005, Disfungsi  Ereksi . Pustaka Cendekia Press Yogyakarta., Yogyakarta
2. Boyke,  D.N., 2014. Impotensi,  lemah  sahwat,   disfungsi ereksi  atau  ejakulasi  dini .  Seminar  keluarga  sehat Indonesia. Jakarta
3. Lie,T.,  2007, Sildenafil  Dalam  Penatalaksanaan Disfungsi Ereksi , Jurnal histologi fakultas kedokteran .
4. Beavo, J.A., 2000. Multiple Phosphodiesterase Isoenzymes: Background, Nomenclature, And
Implications,  In:  Cyclic  Nucleotide  Phophodiesterases: Structure, Regulation And Drug Action, Chichester , 1(2) . 5. Fiorito, J., Zhang, H., Staniszewski, A., Feng, Y., Francis, Y.  I.,  2013. Synthesis  Of  Quinoline  Derivatives: Discovery Of A Potent And Selective Phosphodiesterase 5 Inhibitor For The Treatment Of Alzheimer's Disease , Eur J Med Chem, Vol. 60 .
6. Ruslin.,  Kartasasmita  R.E.,  Wibowo,  M.S.,  Ibrahim., 2014, Pharmacokinetic  Propertis  And  Binding  Affinity
Ruslin, dkk: Studi In Silico Senyawa 2-amino-5-(3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)guanidino)pentanoic acid dan Turunannya sebagai Inhibitor Phospodiesterase-5
Prediction  Of  Lonurine  And  Its  Derivatives  Design  On Phospodiesterase-5 ,  International  journal  of  neserch  in pharmaceutical science , 5(1).
7. Cockrill, B., & Waxman, A. B., 2013. Phosphodiesterase- 5 Inhibitors. Handbook of Experimental Pharmacology.
8. Akaho,  E.,  Fujikawa,  C.,  Runion.,1999. A  Study  On Binding  Models  Of  Nasteroidal  Antiinflamasi  Drugs  To COX1 And COX2 As Obtaned B Dock 4.0 , Present Based Drug Design University Of California, Sanfransisco
9. Girija  CR,  Karunakar  P,  Poojari  CS,  Begum  NS,  Syed AA.,  2010, Molecular  docking  studies  of  curcumin derivative with multiple protein targets for procarcinogen activating enzyme inhibition. J Proteomics Bioinform. 3(6)
10. Leach,  A.  R.,  Shoichet,  B.  K.,  &  Peishoff,  C.  E.,  2006, Prediction Of Protein Ligand Interactions. Docking And Scoring:  Successes  And  Gaps .  Journal  of  Medicinal Chemistry , 49(20) .
11. Bosshard  HR,  Marti  DN,  Jelesarov  I.  2004. Protein Stabilization  By  Salt  Bridges:  Concepts,  Experimental Approaches And Clarification Of Some Misunderstandings . J. Mol. Recogn. 17(1).
12. Nelson,  D.,  &  Cox,  M.,  2001, Lehninger  Principles  of Biochemistry  4th  Edition. Wisconsin  W.H  Freeman Company.