## IMOBILISASI LIPASE PADA KITOSAN SERBUK DENGAN METODE PENGIKATAN SILANG DAN UJI AKTIVITAS TRANSESTERIFIKASINYA
Wikan Mahargyani 1 , Tri Joko Raharjo 2 , Winarto Haryadi 2
1 Stikes Jenderal Achmad Yani Cimahi
2 Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Gadjah Mada
email : wikan.mahargyani@gmail.com
Diterima: 13 April 2017. Disetujui: 19 Juli 2017. Dipublikasikan: 30 Juli 2017
Abstract  : Immobilization  lipase  on  chitosan  powder  by  cross  linking  technique  has  been carried  out.  The  research  was  purposed  to  determine  the  optimum  condition  of immobilization  process  and  catalytic  activities  of  immobilized  lipase.  Glutaraldehyde  was used as cross linking agent in immobilization lipase on chitosan powder. Immobilization was performed  under  the  optimum  conditions  such  as  solubility  pH  of  lipase,  degree  of deacetylation,  mole  ratio  of  chitosan  and  glutaraldehyde,  and  concentration  of  enzyme. Immobilized and free lipases were assayed their activity, thermal stability, reused ability, and kinetic  parameters  for  transesterification  reaction  of  palm  oil  with  methanol.  Result  of  the study showed that the optimum conditions of immobilization were occurred when lipase was dissolved in buffer phosphate at pH 6, mole ratio of chitosan and glutaraldehyde 4:1, and 5% for  concentration  of  enzyme.  The  immobilized  lipase  has  lower  thermal  stability  but  has better affinity and reused stability than the free lipase.
Key words: lipase, chitosan, immobilization, cross linking, transesterification
Abstrak : Telah dilakukan imobilisasi lipase pada kitosan serbuk dengan metode pengikatan silang.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  kondisi  optimum  proses  imobilisasi  dan aktivitas  katalitik  lipase  terimobilisasi.  Enzim  lipase  diimobilisasikan  pada  kitosan  serbuk menggunakan glutaraldehid sebagai senyawa penaut silang. Parameter yang dipelajari untuk menentukan  kondisi  optimum  imobilisasi  meliputi  pH  pelarutan  enzim,  nilai  derajat deasetilasi,  perbandingan  mol  kitosan  dengan  glutaraldehid,  dan  konsentrasi  enzim.  Enzim lipase terimobilisasi dan enzim lipase bebas diuji aktivitas, stabilitas termal, dan kemampuan penggunaan  ulangnya  melalui  reaksi  transesterifikasi  minyak  kelapa  sawit  menggunakan metanol.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  kondisi  optimum  imobilisasi  diperoleh  saat enzim  dilarutkan  pada  buffer  fosfat  pH  6,  perbandingan  mol  kitosan  dengan  glutaraldehid 4:1,  dan  konsentrasi  enzim  5%.  Enzim  lipase  terimobilisasi  mempunyai  stabilitas  termal yang lebih rendah tetapi mempunyai kemampuan penggunaan ulang yang lebih baik daripada enzim lipase bebas.
Kata kunci: lipase, kitosan, imobilisasi, pengikatan silang, transesterifikasi

## PENDAHULUAN
Lipase merupakan enzim pencernaan yang  mempunyai  aktivitas  katalitik  pada reaksi hidrolisis, alkoholisis, transesterifikasi,  dan  esterifikasi.  Salah satu  aktivitas  yang  menarik  untuk  dikaji adalah  aktivitas  transesterase.  Reaksi tersebut  merupakan  reaksi  dasar  yang digunakan  dalam  konversi  triasilgliserol menjadi  ester.  Reaksi  menggunakan katalis  enzim  menguntungkan  karena kondisi reaksinya  yang lunak, pemisahan gliserol  dapat  dilakukan  dengan  mudah, dan  tidak  menghasilkan  limbah  yang berbahaya.  Oleh  karena  itu,  reaksi enzimatis  berpotensi  untuk  diaplikasikan pada  proses  pembuatan  biodiesel  (Yücel et al ., 2013).
Secara umum enzim hanya larut pada pelarut  tertentu  dan  cenderung  sulit dipisahkan  di  akhir  reaksi  sehingga kemampuan penggunaan ulangnya terbatas  (Krajewska,  2004).  Selain  itu struktur  enzim  tidak  stabil  terhadap perubahan pH dan suhu, sehingga mudah mengalami  denaturasi.  Tingginya  harga enzim  juga  menjadikan  proses  enzimatis tidak ekonomis ketika diaplikasikan pada skala yang besar (Tan et al., 2010).
Langkah yang dapat dilakukan untuk mengatasi  beberapa  kelemahan  tersebut adalah  dengan  mengimobilisasi  enzim pada matriks pendukung yang tidak larut
dalam  air.  Enzim  terimobilisasi  mampu mempertahankan  aktivitas  dan  dapat digunakan  secara  berulang  maupun proses  kontinyu  (Jegannathan et  al., 2008). Pemilihan padatan pendukung dan metode  imobilisasi  yang  sesuai  menjadi hal  yang  penting  dan  menarik  untuk dikaji lebih lanjut.
Imobilisasi enzim lipase dapat dilakukan dengan teknik pengikatan pada matriks  pendukung  ( carrier  binding ), penjebakan  ( entrapping ),  dan  taut  silang ( cross  linking ).  Metode  taut  silang memilki  kelebihan  dibanding  yang  lain yaitu  ikatan  antara  enzim  dan  padatan pendukung  stabil,  sehingga  enzim  tidak mudah lepas dan substrat dapat berinteraksi  maksimal  (Brena et  al., 2006). Glutaraldehid merupakan senyawa penaut  silang  yang  banyak  digunakan karena  preparasi  yang  mudah  dan harganya  yang  terjangkau.  Senyawa  ini memiliki  dua  gugus  aldehid  yang  dapat membentuk  taut  silang  antara  enzim dengan matriks pendukung imobilisasi.
Padatan  pendukung  yang  digunakan dapat  berupa  material  anorganik  maupun polimer  organik  (Tan et  al., 2010). Pemilihan  padatan  pendukung  harus memperhatikan  gugus  fungsional  yang berperan  dalam  ikatan  (Cahyaningrum, 2009).  Salah  satu  polimer  alam  yang sering digunakan adalah kitosan
(Amorim et al ., 2003; Chiou et al ., 2004;
Deng et  al .,  2009;    Orrego et  al .,  2010;
Romdhane et  al .,  2011;    Silva et  al .,
2012; Xie et al ., 2012, Kuo et al ., 2012).
Menurut Nasratun (2009) kitosan banyak digunakan  sebagai  matriks  pendukung imobilisasi  karena  bentuknya  dapat dimodifikasi  sesuai  kebutuhan  (serpihan, serbuk,  gel,  fiber,  membran, beads ), dapat terbiodegradasi dan penanganannya mudah. Selain itu material  kitosan  bersifat  non  toksik  dan yang terpenting mempunyai afinitas yang baik  terhadap  protein  (Pereira et  al ., 2003).
Pemanfaatan  kitosan  sebagai  matriks imobilisasi enzim lipase banyak memanfaatkan  gugus  amina,  dimana interaksi terjadi  melalui reaksi taut silang antara lipase dengan kitosan menggunakan  penaut silang  seperti glutaraldehid    (Foresti  dan  Ferreira, 2007).  Efisiensi  optimum  imobilisasi dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor  seperti pH, komposisi kitosan, glutaraldehid, dan enzim.
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui  kondisi  optimum  imobilisasi enzim  lipase  pada  kitosan  serbuk. Keberhasilan imobilisasi enzim dibuktikan  melalui  uji  aktivitas  katalitik enzim pada reaksi transesterifikasi. Selain  itu  beberapa  parameter  seperti
stabilitas termal, kemampuan penggunaan ulang, dan parameter kinetik dipelajari  untuk  mengetahui  kualitas enzim terimobilisasi pada kitosan serbuk.

## METODE
Bahan yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  kitin  (Biotech Surindo),  enzim  lipase  pankreas  babi (Merck),  minyak  kelapa  sawit  (Bimoli Spesial), kertas saring Whatman 1, bahan dari  Merck  dengan  kualitas  p.a,  yaitu  : natrium hidroksida (NaOH), asam klorida (HCl),  metanol  (CH 3 OH),  n-heksan, natrium
dihidrogen fosfat (NaH 2 PO 4 .2H 2 O), natrium hidrogen fosfat  (Na 2 HPO 4 .2H 2 O),  asam  oksalat (H 2 C 2 O 4 ), tembaga (II) sulfat (CuSO 4 .5H 2 O),  kalium  natrium  tatrat (KNaC 4 H 4 O 6 .4H 2 O),  glutaraldehid, BSA (Bovin  Serum  Albumin)  dan  indikator pp.
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  seperangkat  alat gelas  laboratorium,  botol  Falcon  50  mL, mikropipet (10, 200, 1000 μL), hot  plate (Ishtar  Hitzstir), magnetic  stirrer , shaker incubator (Seiwa  Rico  Co,  LTD,  EFM-
60), oven (WTB Binder), muffle furnace , pH  meter,  spektrometer  inframerah  (FT- IR  Prestige-21),  kromatografi  gas  (GC, Shimadzu GC-14B, Shimadzu QP 2010), kromatografi  Gas-Spektrometer  Massa
(GC-MS, Shimadzu
QP 2010S),
microplate , Elisa Reader .

## Pembuatan kitosan
Sebanyak  50  g  kitin  direaksikan dengan  500  mL  NaOH  50%  (b/v)  pada suhu 100 °C dengan variasi waktu  reaksi 1,  2,  dan  3  jam.  Setelah  dingin,  hasil reaksi  disaring  dan  dicuci  hingga  pH pencucian netral. Residu hasil penyaringan  dioven  hingga  kering  dan diperoleh kitosan yang kemudian dikarakterisasi menggunakan spektrometer  FT-IR  serta  diukur  kadar air, kadar abu, dan kadar nitrogennya.
Imobilisasi  enzim  lipase  pada  kitosan serbuk
Larutan  enzim  bebas  1%  dibuat dengan  melarutkan  50  mg  enzim  lipase dalam  5  mL  buffer  fosfat  0,05  M. Campuran dihomogenkan dengan pengadukan  selama  30  menit.  Pada  saat yang  sama  kitosan  serbuk  diaktivasi dengan glutaraldehid. Selanjutnya kitosan teraktivasi  diinteraksikan  dengan  enzim terlarut.  Setelah  perendaman  60  menit dilakukan  penyaringan.  Jumlah  enzim awal  dan  sisa  enzim  terimobilisasi dianalisis kadar proteinnya menggunakan elisa reader .
Uji aktivitas enzim pada reaksi transesterifikasi
Sebanyak  2,43  mL  minyak  kelapa sawit dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL lalu ditambahkan 606 μL metanol, 10 μL  air  dan  n-heksan  sampai  tanda  batas. Kemudian  campuran  dipindahkan  ke botol falcon 50 mL lalu ditambahkan 1 g kitosan  serbuk  terimobilisasi.  Dengan prosedur yang sama, kontrol reaksi dibuat dengan  penambahan  enzim  lipase  bebas yang  setara  dengan  enzim  terimobilisasi. Kedua larutan direaksikan selama 24 jam pada suhu 37 °C dalam shaker incubator . Setelah reaksi selesai, dilakukan penyaringan  untuk  memisahkan  enzim dengan  filtrat  yang  mengandung Fatty Acid Methyl Ester (FAME) dan dianalisis menggunakan GC.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembuatan
Kitosan dan Karakterisasinya
Kitosan  diperoleh  melalui  reaksi deasetilasi  kitin  menggunakan  basa  kuat. Reaksi deasetilasi dilakukan selama 1, 2, dan  3  jam  menghasilkan  produk  yang selanjutnya  disebut  sebagai  kitosan  DD- 1, kitosan DD-2, dan kitosan DD-3. Hasil karakterisasi kitosan disajikan pada Tabel 1. Kitosan yang diperoleh pada penelitian ini  memiliki  kadar  abu  dan  kadar nitrogen    yang  sesuai  dengan  parameter
standar  kitosan.  Namun  untuk  kadar airnya  sedikit  lebih  tinggi  dari  parameter standar yang ditentukan.
Tabel 1. Hasil karakterisasi kitosan
Pengukuran Hasil pengukuran (%) DD-1 DD-2 DD-3 Kadar Air 10,85 10,65 11,65 Kadar Abu 0,40 0,29 0,34 Kadar Nitrogen 2,92 3,94 4,34
Berdasarkan standar kualitas kitosan, jika  derajat  deasetilasi  <  70%  maka disebut  sebagai  kitin  dan  apabila  >  70% disebut  sebagai  kitosan.  Nilai  derajat deasetilasi  kitin  dan  kitosan  ditentukan dari spektra FTIR yang diperoleh dengan membandingkan  serapan  gugus  amida (1655 cm -1 ) dan gugus hidroksi (3450 cm -1 ). Derajat deasetilasi merupakan  nilai  yang  menunjukkan persentase  gugus  asetil  yang  hilang selama proses deasetilasi kitin.
Perhitungan derajat deasetilasi didasarkan  pada  metode base-line A
seperti  yang  dikemukakan  oleh  Domzy dan  Robets  (1985)  dan base-line B seperti  yang  dikemukakan  Baxter  dalam Hung et  al. (2002).  Kitosan  yang diperoleh  pada  penelitian  ini  memiliki nilai  derajat  deasetilasi  sebesar  82,37; 87,30;  dan  92,72%.  Adanya  perlakuan deasetilasi  pada  waktu  yang  yang  lebih
lama terbukti dapat meningkatkan penghilangan gugus asetil.
Studi  Pengaruh  pH  dan  Derajat Deasetilasi Pada Imobilisasi Enzim
Enzim lipase yang akan diimobilisasikan  pada  kitosan  serbuk dilarutkan  terlebih  dahulu  dalam  larutan buffer  fosfat  dengan  pH  yang  bervariasi. Larutan enzim digunakan untuk merendam kitosan yang sebelumnya telah diaktivasi  menggunakan  agen  penaut silang  glutaraldehid.  Semakin  banyak enzim  lipase  yang  terlarut  dalam  buffer fosfat  diharapkan  dapat  meningkatkan jumlah  enzim  yang  terimobilisasi  dalam kitosan  serbuk.  Hasil  kelarutan  enzim lipase  pada  buffer  fosfat  dengan  variasi pH  disajikan  pada  Gambar  1.  Grafik tersebut  menunjukkan  bahwa  jumlah enzim  terlarut  paling  banyak  terdapat pada  buffer  fosfat  pH  6  dan  mengalami penurunan  seiring  dengan  naiknya  pH buffer fosfat.
Gambar 1. Hubungan pH dengan Jumlah Enzim
Terlarut 031 039 028 027 027 0 10 20 30 40 50 4 5 6 7 8 9 10 Ke lar ut an e nz im ( %) pH
Enzim
terlarut selanjutnya diimobilisasikan  pada  kitosan  serbuk yang  memiliki  nilai  derajat  deasetilasi bervariasi.  Hal  ini  dilakukan  untuk mengetahui pengaruh pH pelarutan enzim dan  nilai  derajat  deasetilasi  kitosan terhadap  efisiensi  imobilisasi  enzim. Kitosan  dengan  nilai  derajat  deasetilasi yang  tinggi  mengandung  lebih  banyak gugus  –NH 2 yang  dapat  berikatan  silang dengan glutaraldehid dan enzim.
Semakin  tinggi  nilai  derajat  deasetilasi diharapkan  dapat  meningkatkan  jumlah enzim  yang  terimobilisasi  pada  kitosan serbuk.
Grafik yang disajikan pada
Gambar  2  memperlihatkan  bahwa  pada pH optimum pelarutannya, enzim memiliki  nilai  efisiensi  imobilisasi  yang paling  besar  pada  masing-masing  jenis kitosan.  Penutup  sisi  aktif  enzim  ( lid ) lebih mudah terbuka pada pH optimumnya, sehingga ikatan silang yang terbentuk  dan  jumlah  enzim  yang terimobilisasi semakin banyak (Nakajima et  al .,  2000).  Enzim  lipase  dan  kitosan memiliki titik isoelektrik (pI) yang sangat peka  terhadap  perubahan  pH.  Enzim lipase  memiliki  titik  isoelektrik  5,7-5,8 sedangkan  kitosan  mempunyai  titik isoelektrik sebesar 5,4. Pada pH di bawah titik  isoelektriknya  gugus  –NH 2 yang terdapat pada molekul enzim dan kitosan
mudah  terprotonasi  menjadi  –NH 3 + , sehingga  ikatan  silang  antara  kitosan- glutaraldehid-enzim sulit terjadi. Pada pH yang  lebih  tinggi  dari  titik  isoelektrik akan  menyebabkan  enzim  dan  kitosan kaya  elektron.  Sedangkan  pada  pH  yang terlampau  tinggi  efisiensi  imobilisasi akan  semakin  menurun  karena  enzim mengalami denaturasi.
Gambar 2. Hubungan pH dan derajat deasetialasi kitosan terhadap efisiensi  imobilisasi enzim
Efisiensi  imobilisasi  enzim  pada kitosan DD-1, kitosan DD-2, dan kitosan DD-3 berturut-turut sebesar 71,24; 50,36; dan 45,99%.  Berdasarkan hasil ini dapat diketahui  bahwa  kenaikan  nilai  derajat deasetilasi  tidak  berpengaruh  terhadap jumlah  enzim  yang  terimobilisasi  pada kitosan serbuk. Jumlah gugus –NH 2 yang semakin  banyak  dimungkinkan  dapat menimbulkan halangan sterik pada proses imobilisasi,  sehingga  sisi  aktif  kitosan sulit  berikatan  dengan  sisi  aktif  enzim dan mengakibatkan jumlah enzim
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 2 4 6 8 10 Ef isi ens i i m o bi lisa si ( %) pH Kitosan DD- 1 Kitosan DD- 2
terimobilisasi  semakin  sedikit.  Pada tahap selanjutnya kitosan DD-1 (82,37%) digunakan  sebagai  padatan  pendukung untuk  mempelajari  kondisi  optimum imobilisasi enzim pada kitosan serbuk.
Studi  Pengaruh  Rasio  Mol  Kitosan dengan Glutaraldehid terhadap Efisiensi Imobilisasi
Efisiensi  imobilisasi  dan  aktivitas katalitik  enzim  terimobilisasi  ditentukan oleh  proses cross-linking yang  tepat.
Reaksi  pengikatan  yang  tepat  dapat terjadi  antara  gugus  –NH 2 kitosan  secara dominan  terhadap  gugus  –CHO  pada glutaraldehid. Dengan demikian, perbandingan  kitosan  dan  glutaraldehid yang  digunakan  menjadi  salah  satu  hal yang penting untuk diperhatikan. Kitosan yang  teraktivasi  dengan  baik  akan meningkatkan  peluang  enzim  menempel pada  permukaannya.  Pada  tahap  ini imobilisasi dilakukan menggunakan kondisi  optimum  yang  telah  diperoleh pada tahap sebelumnya yaitu pH 6 untuk pelarutan  enzim  dengan  kitosan  DD-1 sebagai padatan pendukung.
Migneault et  al .  (2004)  menyatakan bahwa  belum  ada  mekanisme  pasti  yang dapat  menggambarkan  interaksi  yang terjadi  antara  glutaraldehid  dan  protein (enzim). Juang et al . (2002) mengusulkan interaksi yang terjadi antara
kitosan-glutaraldehid-enzim  melalui  dua kemungkinan.  Selama  proses  pengikatan silang  gugus  –NH 2 dari  kitosan  dapat berikatan  dengan  gugus  –CHO  dari glutaraldehid  pada  dua  perbandingan molekul  yaitu  1:1  dan  2:1.  Pengikatan silang pada rasio 1:1 berarti satu molekul –NH 2 pada kitosan akan berikatan dengan satu  molekul  –CHO  pada  glutaraldehid, sehingga  memungkinkan  gugus  –NH 2 dari  enzim  berikatan  dengan  gugus  – CHO  glutaraldehid  pada  sisi  yang  lain. Sedangkan  pada  rasio  2:1  enzim  akan terjebak pada ikatan silang yang terbentuk antara kitosan dengan glutaraldehid.  Interaksi  pada  pola  ini kurang  menguntungkan  karena  dapat menghambat  aktivitas  katalitik  enzim karena  berpotensi  mengganggu  sisi  aktif enzim.
Perbandingan kitosan dan glutaraldehid  yang  optimum  diamati melalui efisiensi imobilisasi dan aktivitas katalitik  dari  enzim  lipase  terimobilisasi. Hasil  yang  disajikan  pada  Gambar  3 memperlihatkan bahwa efisiensi imobilisasi  meningkat  seiring  dengan semakin banyaknya kitosan yang digunakan.  Hal  ini  dapat  terjadi  karena jumlah  amina  yang  tersedia  untuk berikatan silang dengan glutaraldehid dan enzim menjadi semakin banyak.
Gambar 3. Hubungan Perbandingan Mol (Kitosan: Glutaraldehid) terhadap Efisiensi Imobilisasi
Keberadaan glutaraldehid yang semakin banyak akan menginisiasi
terbentuknya  ikatan  antara  gugus  –CHO dari glutaraldehid dengan sisi aktif enzim yaitu ion alkoksida pada serin. Terjadinya interaksi  ini  akan  menyebabkan  aktivitas katalitik enzim terganggu. Pada
penelitian  ini  mekanisme cross-linking
yang terjadi diperkirakan melalui mekanisme  dimana  satu  gugus  –CHO pada glutaraldehid mengikat gugus –NH 2 pada  kitosan  dan  pada  sisi  yang  lain gugus  –CHO  berikatan  dengan  gugus –NH 2 dari enzim.
Studi  Pengaruh  Konsentrasi  Enzim terhadap Jumlah Enzim Terimobilisasi
Imobilisasi enzim pada variasi konsentrasi  dilakukan  untuk  mengetahui pengaruh  konsentrasi  enzim  terhadap banyaknya  enzim  yang  terimobilisasi pada  kitosan.  Variasi  enzim  yang digunakan pada penelitian ini adalah 1, 2,
3,  4,  dan  5%  (%,  b/v)  yang  masing- masing dilarutkan dalam buffer fosfat pH 6.  Konsentrasi  yang  digunakan  hanya sampai  5%  karena  pada  konsentrasi tersebut  larutan  enzim  sangat  pekat  dan mulai  jenuh  sehingga  pelarutan  tidak optimal. Perbandingan kitosan dan glutaraldehid  yang digunakan pada tahap ini  mengacu  pada  kondisi  optimum imobilisasi  yang  diperoleh  pada  tahap sebelumnya.
Gambar 4. Hubungan konsentrasi enzim terhadap banyaknya jumlah enzim terimobilisasi
Berdasarkan  Gambar  4  dapat  dilihat bahwa  konsentrasi  enzim  yang  semakin besar  dapat  meningkatkan  jumlah  enzim yang  terimobilisasi  pada  kitosan  serbuk. Kenaikan  konsentrasi  enzim  sebanding dengan  bertambahnya  jumlah  enzim terimobilisasi,  hingga  batas  tertentu dimana  kenaikan  enzim  tidak  dapat menaikkan  jumlah  enzim  terimobilisasi. Pada  setiap  kenaikan  konsentrasi  jumlah enzim terimobilisasi mengalami kenaikan
71,429 61,714 52,571 047 044 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 4 5 6 Ef isi ens i i m o bi lisa si ( %) 011 026 023 041 044 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 2 4 6 Jum lah e nz im t er lar ut ( m g)
Konsentrasi enzim (%, b/v)
hampir  2  kali  dibanding  konsentrasi sebelumnya.  Namun  demikian,  terjadi penyimpangan  pada  konsentrasi  3% dimana  jumlah  enzim  terimobilisasi justru  mengalami  penurunan.  Hal  ini dapat  disebabkan  proses  pelarutan  yang belum sempurna, sehingga jumlah  enzim terimobilisasi menjadi lebih sedikit.
Pada  konsentrasi  enzim  5%  jumlah enzim  terimobilisasi  hanya  mengalami kenaikan  sedikit.  Hal  ini  dimungkinkan terjadi  karena  sistem  imobilisasi  telah jenuh,  dimana  kitosan  serbuk  yang  telah diaktivasi  dengan  glutaraldehid  tidak dapat lagi mengikat enzim pada konsentrasi yang lebih tinggi.
Gambar 5. Hubungan Konsentrasi Enzim terhadap Kelimpahan Relatif Metil Palmitat
Banyaknya  enzim  yang  terimobilisasi pada  kitosan  serbuk  sebanding  dengan aktivitas  katalitik  enzim  pada  reaksi transesterifikasi  minyak  kelapa  sawit dengan  metanol.  Hal  ini  dibuktikan dengan  konversi  metil  ester  dimana
semakin banyak jumlah enzim terimobilisasi memberikan aktivitas katalitik yang semakin baik pula, ditandai dengan  semakin  meningkatnya  luas  area metil  palmitat  yang  terbentuk  (Gambar 5).
Aktivitas Katalitik Enzim Lipase Terimobilisasi Keberhasilan enzim lipase
terimobilisasi dalam mengkatalisis reaksi transesterifikasi ditandai dengan terbentuknya  FAME  ( Fatty  Acid  Methyl Ester ).  Hasil  uji  aktivitas  transesterase enzim  lipase  terimobilisasi  pada  kitosan serbuk dengan derajat deasetilasi berbeda disajikan pada Gambar 6.
Gambar 6. Perbandingan aktivitas katalitik enzim lipase bebas dan enzim lipase terimobilisasi pada kitosan dengan derajat deasetilasi yang berbeda
Data  yang  diperoleh  menunjukkan bahwa  enzim  lipase  terimobilisasi  pada kitosan serbuk memiliki aktivitas katalitik  pada  reaksi  transesterifikasi. Enzim  lipase  yang  terimobilisasi  pada
0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 0 2 4 6 K e lim pahan re lat if Konsentrasi enzim 5% (b/v) - 50.000 100.000 150.000 200.000 DD-1 DD-2 DD-3 Enzim bebas Ke lim pa ha n re lat if Jenis katalis yang digunakan Metil palmitat
kitosan  DD-1  memberikan  hasil  korversi yang  lebih  baik  dibanding  kitosan  DD-2 dan  kitosan  DD-3.  Sebagai  pembanding digunakan  enzim  lipase  bebas  dengan jumlah  yang  setara  dengan  enzim terimobilisasi.  Secara  keseluruhan  enzim lipase  terimobilisasi  pada  kitosan  serbuk memiliki  aktivitas  katalitik  yang  lebih baik dibanding enzim lipase bebas.
Pada  beberapa  kajian  yang  diacu pada  penelitian  ini  melaporkan  bahwa enzim  terimobilisasi  memiliki  aktivitas yang  lebih  rendah  dibandingkan  dengan enzim  bebas.  Penurunan  aktivitas  ini dapat  disebabkan  oleh  hambatan  sterik yang ditimbulkan oleh matriks
pendukung  imobilisasi.  Selain  itu  dapat juga  karena  faktor  perubahan  struktur enzim  yang  terjadi  selama  proses imobilisasi sehingga menghambat aktivitas  katalitik enzim  mengingat struktur  enzim  sangat  sensitif  terhadap perubahan  kondisi  lingkungan.  Namun demikian,  memungkinkan  bagi  enzim terimobilisasi  memiliki  aktivitas  katalitik yang  lebih  baik  dibanding  dengan  enzim bebasnya.
Aktivitas  enzim  terimobilisasi  yang lebih  baik  dibanding  enzim  bebasnya dapat  terjadi  jika  ikatan  yang  terbentuk selama  proses  imobilisasi  berada  pada sisi  yang  tepat,  sehingga  ikatan  yang terbentuk dapat memperbesar luas
permukaan enzim. Luas permukaan  yang semakin besar dapat memperbesar peluang terjadinya interaksi antara enzim dan  substrat,  sehingga  pada  rentang waktu  yang  sama  enzim  terimobilisasi dapat mengkonversi produk lebih banyak dibandingkan  dengan  enzim  bebasnya. Selain  itu  enzim  berbentuk  serbuk  dapat membentuk  agregat  pada  medium  reaksi yang  minim  air,  sehingga  menghambat interaksinya  dengan  substrat  Shah  and Gupta (2007). Ketepatan matriks pendukung  imobilisasi  yang  tepat  juga menjadi penentu keberhasilan imobilisasi enzim.
Stabilitas Termal Enzim Lipase Terimobilisasi Aktivitas enzimatik sangat dipengaruhi  oleh  lingkungan  yang  salah satunya  adalah  suhu.  Enzim  memiliki aktivitas optimum pada suhu tertentu dan akan  kehilangan  aktivitas  ketika  berada di atas suhu optimumnya.  Hal ini terjadi karena struktur enzim rusak atau mengalami denaturasi. Pengujian stabilitas  termal  dilakukan  terhadap enzim  lipase  bebas  dan  enzim  lipase terimobilisasi untuk membandingkan kemampuan keduanya dalam mempertahankan  aktivitas  katalitiknya setelah pemanasan pada suhu tertentu.
Enzim lipase bebas  dan enzim lipase terimobilisasi  dipanaskan  pada  variasi suhu  35,  40,  45,  dan  50  °C  sebelum digunakan  untuk  mengkatalisis  reaksi transesterifikasi  minyak  kelapa  sawit dengan  metanol.  Pengaruh  pemanasan terhadap  aktivitas  katalitik  enzim  lipase terimobilisasi  dan  enzim  lipase  bebas disajikan pada Gambar 7.
Gambar 7. Pengaruh pemanasan terhadap aktivitas katalitik (a.) enzim lipase terimobilisasi,
(b) enzim lipase bebas
Pada  Gambar  7  menunjukkan  bahwa aktivitas  enzim  lipase  bebas  dan  enzim lipase terimobilisasi mengalami penurunan  pada  setiap  suhu  pemanasan. Pada  suhu  35-45  °C  penurunan  aktivitas rata-rata  enzim  lipase  bebas  lebih  kecil
yaitu  16,25-32,92%,  sedangkan  enzim lipase terimobilisasi mengalami penurunan sebesar 36,01-47,86%. Namun demikian  stabilitas  termal  enzim  lipase terimobilisasi pada suhu 50 °C lebih baik dibandingkan dengan enzim lipase bebas. Besarnya  penurunan  aktivitas  enzim lipase bebas dan enzim lipase terimobilisasi berturut-turut sebesar
64,86% dan 61,94%.
Berdasarkan  hasil  pengujian  ini diketahui bahwa enzim lipase terimobilisasi  memiliki  stabililitas  termal yang  hampir  sama  dengan  enzim  lipase bebasnya.  Hal  ini  ditandai  dengan perbedaan  yang  tidak  signifikan  dari persentase  penurunan  rata-rata  pada setiap kenaikan suhu. Persentase penurunan  rata-rata  untuk  reaksi  yang dikatalisis  enzim  lipase  bebas  dan  enzim lipase terimobilisasi berturut-turut sebesar  38%  dan  48%.  Enzim  lipase bebas  masih  dapat  mempertahankan aktivitasnya  di  setiap  kenaikan  5  °C dengan  penurunan  yang  cenderung  lebih rendah dibandingkan enzim lipase terimobilisasi kecuali pada suhu pemanasan 50 °C.
Struktur  tiga  dimensi  enzim  sangat rentan  terhadap  perubahan  suhu,  dimana perubahan struktur atau konformasi dapat mempengaruhi  aktivitas  katalitik  enzim. Bahkan  dapat  menyebabkan  inaktivasi
0 200.000 400.000 600.000 800.000 1.000.000 1.200.000 30 35 40 45 50 K e lim pahan re lat if Suhu pemanasan (°C) (a) 0 10.000 20.000 30.000 40.000 30 35 40 45 50 K e lim pahan re lat if Suhu pemanasan (°C) (b)
jika  enzim  berada  pada  lingkungan  yang ekstrim  rendah  atau  ekstrim  tinggi dibanding  suhu  optimumnya.  Enzim terimobilisasi  yang  dihasilkan  pada penelitian  ini  memiliki  stabilitas  termal yang  tidak  terlalu  baik.  Hal  ini  mungkin terjadi  karena  ikatan  silang  antara kitosan-glutaraldehid-enzim  mengalami pemutusan  selama  pemanasan,  sehingga sebagian  enzim  terlepas  dari  sistem imobilisasi.

## Kemampuan Penggunaan Ulang Enzim Lipase Terimobilisasi
Secara  umum  enzim  bebas  memiliki stabilitas  penggunaan  ulang  yang  rendah karena  mudah  terlarut  dalam  sistem reaksi,  sehingga  kurang  menguntungkan jika  diaplikasikan  pada  reaksi  berulang. Imobilisasi  enzim  dilakukan  sebagai upaya  untuk  mengatasi  kelemahan  ini. Pada  proses  imobilisasi,  enzim  diikatkan
pada padatan pendukung yang tidak larut sehingga proses pemisahan setelah reaksi lebih  mudah  dan  enzim  terimobilisasi masih  dapat  digunakan  ulang.  Pengujian kemampuan  penggunaan  ulang  enzim lipase  terimobilisasi  menghasilkan  grafik yang disajikan pada Gambar 8.
Hasil yang disajikan pada Gambar  8  memperlihatkan  bahwa  enzim lipase bebas dan enzim lipase terimobilisasi mengalami penurunan aktivitas  pada  setiap  siklus  reaksi.  Pada siklus  kedua  penurunan  aktivitas  cukup signifikan  dimana  penurunan  aktivitas rata-rata  untuk  enzim  lipase  bebas  dan enzim  lipase  terimobilisasi  berturut-turut sebesar  98,06%  dan  72,35%.  Hal  ini berarti  perbandingan  konversi  minyak kelapa sawit menjadi estermya pada awal dan akhir reaksi untuk enzim lipase bebas dan  enzim  lipase  terimobilisasi  berturut- turut  sebesar  1,94%  dan  27,65%.
Gambar 8. Perbandingan Luas Area Metil Palmitat Dan Metil Oleat Pada Uji Stabilitas Penggunaan Ulang
0 100.000 200.000 300.000 400.000 500.000 1 2 3 K e lim pahan re lat if Suklus reaksi Metil palmitat enzim bebas Metil oleat enzim bebas Metil palmitat enzim imobil Metil oleat enzim imobil
Pada siklus ketiga enzim lipase terimobilisasi masih dapat mempertahankan  aktivitas  katalitiknya dengan  penurunan  aktivitas  rata-rata sebesar  2,19%.  Hal  ini  berarti  enzim lipase terimobilisasi masih dapat mengkonversi  reaktan  sebesar  97,81% dibandingkan  dengan  metil  ester  yang dihasilkan pada siklus reaksi kedua.
Hasil  pengujian  ini  menunjukkan bahwa enzim lipase terimobilisasi memiliki  stabilitas  penggunaan  ulang yang  lebih  baik  dibanding  dengan  enzim lipase  bebas.  Enzim  lipase  terimobilisasi masih dapat mempertahankan aktivitasnya  hingga  tiga  siklus  reaksi meskipun mengalami penurunan konversi hasil  yang  signifikan  pada  siklus  reaksi kedua.  Sedangkan  enzim  lipase  bebas hanya dapat digunakan hingga dua siklus reaksi.  Hasil  ini  mengindikasikan  bahwa ikatan  silang  yang  terjadi  dalam  sistem enzim  terimobilisasi  tidak  mengganggu sisi  aktif  enzim,  sehingga  enzim  masih dapat mempertahankan aktivitas katalitiknya.

## KESIMPULAN
Enzim  lipase  dapat  diimobilisasikan pada  kitosan  serbuk  dengan  metode pengikatan  silang.  Kondisi  optimum
imobilisasi  ditandai  dengan  semakin banyaknya jumlah enzim yang terimobilisasi pada kitosan serbuk. Semakin  besar  nilai  derajat  deasetilasi kitosan  tidak  berpengaruh  signifikan terhadap  jumlah  enzim  terimobilisasi. Imobilisasi  optimum  diperoleh  pada kondisi pH 6 untuk pelarutan enzim, nilai derajat  deasetilasi  82,27%,  perbandingan mol  kitosan  dengan    glutaraldehid sebesar  4:1,  dan    konsentrasi  enzim  5%. Banyaknya enzim yang terimobilisasikan pada  kitosan  serbuk,  sebanding  dengan aktivitas katalitiknya pada reaksi transesterifikasi minyak. Imobilisasi enzim  mampu  meningkatkan  stabilitas penggunaan ulang dari enzim.
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh pada  penelitian  ini,  lipase  terimobilisasi dapat  digunakan  sebagai  katalis  pada reaksi  transesterifikasi  yang  merupakan reaksi  dasar  untuk  produksi  biodisel. Lipase  terimobilisasi  memiliki  stabilitas penggunaan  ulang  yang  lebih  baik dibanding  lipase  bebas,  sehingga  dapat mengefisienkan penggunaan katalis. Selain  itu,  penggunaan  kitosan  sebagai matriks  imobilisasi  dapat  meningkatkan nilai  guna  dan  ekonomi  dari  limbah cangkang kepiting.

## DAFTAR RUJUKAN
Amorim, R. V. S., Melo E. S., Carneiro- daChunha,  M.  G.,  Ledingham,  W. M.,  and  Campos-Takaki,  G.  M.,
2003, Chitosan from Syncephalastrum resemosum Used as
a Film Support for Lipase Immobilization, Bioresour.  Technol ., 89, 35-39.
Brena, B.M., and Batista-Viera, F., 2006,
Imobilization  of  Enzymes ,  Humana Press, Spanyol.
Cahyaningrum,  S.E.,  2009,  Peranan Jembatan  Kation  Logam  dalam Imobilisai  Papain  pada  Kitosan ,
Disertasi ,  Jurusan  Kimia  FMIPA
UGM, Yogyakarta.
Chiou,  S.H.,  and  Wu,  W.T.,  2004,
Immobilization  of Candida  Rugosa Lipase  on  Chitosan  with  Activation
of The Hyroxyl Groups,
Biomaterials , 25, 197-204.
Deng,  H.T.,  Wang,  J.J.,  Ma,  M.,  Liu,
Z.Y., and Zheng, F., 2009,
Hydrophobic Surface Modiﬁcation of Chitosan Gels by Stearyl for Improving the Activity of Immobilized  Lipase, Chinese  Chem.
Lett. , 20, 995–999.
Domzy, J.G., and Roberts, G.A.F., 1985, Evaluation  of  Infrared  Spectroscopic Technique  for  Analyzing  Chitosan, Makromol. Chem ., 186, 1671-1677.
Foresti,  M.L.,  and  Ferreira,  M.L.,  2007, Chitosan-immobilized  Lipases  for The Catalysis of Fatty Acid Esterifications, J.  Enzyme  Microb. Tech. , 40, 769–777.
Hung,  S.,  Peh,  K.K.,  and  Khan,  T.A.,
2002,
Reporting Degree of Deacetyllation  Value  of  Chitosan  : The Influence of Analytical Methods,
J.  Pharm.  Pharmaceut.  Sci., 5(3),
202-212.
Jegannathan,  K.R.,  Abang,  S.,  Poncelet,
D.,  Chan,  E.S.,  and  Ravindra,  P., 2008,  Production  of  Biodiesel  using
Immobilized
Lipase-a
Critical
Review, Crit.  Rev.  Biotechnol .,  28,
253–64.
Krajewska,  B.,  2004,  Application  of Chitin  and  Chitosan-Based  Materials for Enzyme Immobilizations : A  Review. Enz.  Microb.  Technol ., 35, 126-139.
Kuo,  C.H.,  Liu,  Y.C.,  Chang,  C.M.J., Chen J.H., Chang C., and Shieh, C.J., 2012, Optimum Conditions for Lipase  Immobilization  on  Chitosan- Coated Fe 3 O 4 Nanoparticles, J. Carb.
Pol., 87, 2538-2545.
Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand,
M.J.,  and  Waldron,  K.C.,  2004, Glutaradehyde : Behavior in Aqueous  Solution,  Reaction  with
Protein  and  Aplication  to  Enzym Crosslinking, BioTechnique , 37, 790-
802.
Nakajima,  M.,  Ichikawa,  S.,  Nabetani, H.,  Maruyama,  T.M.,  Furusaki,  S., and  Seki,  M.,  2000,  Oil-Water Interfacial  Activation  of  Lipase  for Interesterification of Triglyseride and Fatty  Acid, J.  Am.  Oil  Chem.  Soc .,
77, 1121-1126.
Nasratun,  M.,  Said,  H.  A.,  Noraziah,  A., and  Adl  Alla, A.  N.,  2009,
Immobilization of Lipase from
Candida  rugosa on  Chitosan  Beads for  Transesterification, Am.  J.  Appl.
Sci. , 6 (9), 1653-167.
Orrego, C.E., Salgado, N., Valencia, J.S.,
Giraldo,  O.H.,  and  Cardona,  C.A., 2010, Novel Chitosan Membranes as Support for Lipases Immobilization : Characterization  Aspects, J.  Carb.
Pol ., 79, 9-16.
Pereira,  E.B.,  Zanin,  G.M.,  and  Castro,
H.F.,  2003,  Immobilization  and Chatalytic  Properties  of  Lipase  on
Chitosan for Hydrolysis and Esterification  Reaction, Braz.  J. Chem. Eng ., Vol.20 (4), 343-355.
Romdhane,  I.B.B.,    Romdhane,  Z.B.,
Gargouri, A., and Belghith, H., 2011,
Esteriﬁcation  Activity  and  Stability of Talaromyces  thermophilus Lipase
Immobilized  onto  Chitosan, J.  Mol. Cat. B: Enzym. , 68, 230–239.
Shah,  S.,  and  Gupta,  M.N.,  2007  Lipase Catalyzed  Preparation  of  Biodiesel from  Jatropha  Oil  in  a  Solvent  Free Sistem, Process  Biochem .,    42,  409–
14.
Silva,  J.  A.,  Macedo,  G.P.,  Rodrigues,
D.S., Giordano, R.L.C., and Goncalves, L.R.B., 2012,
Immobilization of Candida antartica lipase  B  by  Covalent  Attachment  on
Chitosan-Based Hyrogels Using Different Support Activation
Strategies, J.  Biochem.  Eng. ,  60,  16- 24.
Tan,  T.,  Lu,  J.,  Nie,  K.,  Deng,  L.,  and Wang, F., 2010, Biodiesel Production with Immobilized Lipase : A Review,
J. Biotech. Adv., 28, 628-634.
Xie W., and Wang J., 2012, Immobilized Lipase on Magnetic Chitosan Microspheres  for  Transesterification of  Soybean  Oil, J.  Biom.  Bioe.. ,  36, 373-380.
Yücel,  S.,  Terzioğlu,  P.,  and  Özçimen, D.,  2013,  Lipase  Application  in Biodiesel Production, Lecensee InTech , 210-250.