## EFEK SITOTOKSIK FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL UMBI
BIT ( Beta vulgaris L . var rubra L . ) TERHADAP SEL T47D DAN UJI

## KANDUNGAN KIMIANYA
Sri Susilowati 1) , Iga Dewinta Putri 1) , Aqnes Budiarti 1)
1) Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang

## INTISARI
Kanker payudara  merupakan  penyebab utama kematian  wanita di berbagai belahan dunia. Berbagai penelitian  untuk  mendapatkan obat kanker payudara telah banyak dilakukan. Penelitian ini  bertujuan  untuk  mengetahui  efek  sitotoksik  fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  umbi  bit  ( Beta vulgaris L . var .  rubra L . )  terhadap  sel  T47D  yang  merupakan  sel  kanker  payudara  dan  uji kandungan kimianya.
Pembuatan  senyawa  uji  dibuat  melalui  proses  maserasi  menggunakan  pelarut  etanol  dan dilanjutkan  dengan  fraksinasi  menggunakan  pelarut  etil  asetat.  Uji  sitotoksisitas  menggunakan metode MTT assay dengan konsentrasi 500; 250; 125; 62,5; 31,25 µg/ml. Pengamatan dilakukan terhadap  data  absorbansi  dari  sel  hidup  yang  diperoleh  dari  pembacaan  serapan  ELISA . Analisa data  dilakukan  terhadap  persentase  kehidupan  sel  T47D  untuk  menetapkan  nilai  IC 50. Uji kandungan  kimia  dilakukan  melalui  proses  uji  pendahuluan  dengan  pereaksi  kimia  dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis . Analisis data uji kandungan kimia dilakukan secara kualitatif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol umbi bit memiliki efek sitotoksik  terhadap  sel  T47D  dengan  nilai  IC 50 sebesar  253,86  μg/ml.  Hasil  uji  kandungan  kimia menunjukkan fraksi etil asetat ekstrak etanol umbi bit mengandung flavonoid.
Kata Kunci :  Sitotoksisitas, Fraksi etil asetat ekstrak etanol umbi bit, Beta vulgaris L. var rubra L., Sel T47D

## ABSTRACT
Breast  cancer  is  the  prime  cause  of  women  death  in  various  parts  of  the  world.  Many research  to  get  breast  cancer  drug  has  been  widely  applied.  The  aims  of    this  study  were  to determine the cytotoxic effect of ethyl acetate  fraction of ethanolic extract of the  beet root ( Beta vulgaris L . var .  rubra L . )  on  T47D  cell  line  which  was  the  breast  cancer  cell  and  test  their chemical compound.
The  extract  was  made  by macerare method,  and  than  it  was  fractionated  by  using  ethyl acetate. Cytotoxicity test using MTT assay method with concentration 500; 250; 125; 62,5; 31,25 µg/ml.  Observation  was  done  to  get  the  viability  cell  absorbance  by  using  ELISA  reader. Analytical  data  carried  out  toward  percentage  viability  T47D  cell  line  to  determine  a  value  IC 50 . The chemical compound tests done through a process of preliminary test with a chemical reagent and thin layer chromatografi. The chemical compound were qualitative analysis.
The  result  showed  that  ethyl  acetate  fraction  of  ethanolic  extract  beet  roots  had  cytotoxic effect against T47D cell line with IC 50 253,86 µg/ml. The chemical compound of the ethyl acetate fraction of ethanolic extract of beet root were flavonoids.
Keywords : Ethyl acetate fraction of ethanolic extract of beet roots, Beta vulgaris L . var . rubra L . , Cell line T47D, Flavonoids

## PENDAHULUAN
Kanker  payudara  merupakan  tumor ganas yang tumbuh dalam jaringan payudara.  Kanker  bisa  tumbuh  di  dalam kelenjar  susu,  saluran  susu,  jaringan  lemak maupun  jaringan  ikat  pada  payudara (Dowsett,  2008).  Pembedahan,  kemoterapi, radioterapi,  terapi  dengan  hormon  atau dengan terapi antibodi monoklonal merupakan  cara  pengobatan  kanker  yang selama  ini  telah  dilakukan  (Mihajlovic , 2008;  Dolinsky,  2002).  Pengobatan  yang telah  ada  tersebut  tidak  selalu  berhasil  dan cenderung  menimbulkan  efek  samping toksik  pada  jaringan  normal  serta  resistensi sel  kanker  (Tyagi  et  al ., 2004;  Davis  et  al ., 2003).
Pengobatan  kanker  yang  sering dilakukan  belum  dapat  mengatasi  kanker secara  optimal,  terutama  pada  kanker  yang telah  menyebar  ke  bagian  tubuh  lainnya. Selain  itu,  dampak  negatif  dari  pengobatan kanker memiliki efek samping yang merugikan  seperti  mual,  muntah  dan
kerontokan  rambut,  sehingga  diperlukan penelusuran  obat  anti  kanker  yang  lebih menguntungkan.  Eksplorasi  tanaman  obat merupakan  usaha  pengembangan  alternatif pengobatan  kanker  untuk  menghindari  efek samping dari berbagai cara pengobatan yang telah ada.
Umbi bit ( Beta vulgaris L . var rubra L . )  mempunyai  kandungan  betasianin  dan betasantin yang mempunyai aktivitas antioksidan  dan  antikanker  (Escribano  et  al , 1998:  Kapadia  et  al,  1996:  Winkler  et  al, 2005).  Kapadia  et  al  menyebutkan  bahwa Beta  vulgaris var. rubra memiliki  efek penghambatan secara signifikan pada terjadinya  kanker  kulit  dan  kanker  paru- paru.  Sejauh  ini  belum  pernah  dilakukan penelitian  mengenai  aktivitas  antikanker umbi  bit  secara  spesifik  pada  kanker payudara sehingga perlu dilakukan penelitian  uji  sitotoksisitas  fraksi  etil  asetat dari  ekstrak  etanol  umbi  bit    terhadap  sel kanker payudara ( cell line T47D).

## METODE PENELITIAN
Bahan Umbi  bit  (Getasan,  Kab.Semarang), etanol  dan  etil  asetat,  Sel T47D  ( Cancer Chemoprevention  Research  Center UGM), medium  RPMI  1640,  medium  penumbuh mengandung growth factor 10% FBS (Fetal Bovine Serum) (GIBCO) – 0,5% fungison  –
2%  antibiotik  penisilin  dan  streptomisin (GIPCO), DMSO (E.Merck), tripsin (Sigma), Phospat  Buffered  Saline (PBS) (Sigma),  larutan  MTT  (3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) 5 mg/mL PBS, larutan sodium dodecyl sulphat
(SDS) 10% dalam HCl 0,01 N, doksorubisin,  serbuk  Zn,  HCl  pekat,  serbuk Mg,  kloroform,  pereaksi Mayer ,  selulosa, etil  asetat,  asam  formiat,  asam  asetat, aquadest, metanol, amonia, rutin, dragendroff.
Alat
Tissue culture flask (Nunclon),
Laminar Air Flow Cabinet (Gelman Sciences),  sentrifugator  (Sarvall  MC12V), mikroskop fase contras  (Zeiss MC 80), CO 2 Incubator (Heraeus),  pipet  pasteur  steril, mikropipet  (Gilson), white tip steril, conical tube (Nunclon), haemocytometer (Neubauer), counter, kamera  digital  (Canon Power Shoot A80,4,0 mega pixels).
timbangan elektrik (Sartorius), 96-well plate (Nunclon) ,  yellow  tip dan blue  tip, ELISA reader (SLT  240  ATC),  blender  (Maspion), ayakan mesh 40, alat-alat gelas, thermostatic waterbath (Memmert),  viskosimeter  (Rion VT-04E), Moisture Balance (Ohaus), bejana kromatografi,  pipa  kapiler,  alat  penampak bercak,  lampu  UV  254  nm  dan  lampu  UV 366 nm.

## Jalannya Penelitian Pembuatan Senyawa Uji
Senyawa  uji  berupa  fraksi  etil  asetat ekstrak  etanol  umbi  bit.  Pembuatan  ekstrak dilakukan dengan metode maserasi menggunakan  pelarut  etanol  dari  bahan simpisia  umbi  bit.  Fraksinasi  terhadap ekstrak  etanol  dilakukan  berulang  kali hingga  jernih  dengan  menggunakan  pelarut etil  asetat,  kemudian  pelarut  diuapkan hingga diperoleh fraksi kental.
Uji Sitotoksisitas Uji  sitotoksisitas  dilakukan  dengan metode  MTT assay .  Suspensi  sel  T47D dalam  medium  PRF  RPMI  1640  sebanyak 100  μl  (kepadatan  1,5  x  10 4 sel/sumuran) dimasukkan  ke  dalam plate 96  sumuran berbeda dan plate diinkubasi  selama 24 jam dalam  inkubator  CO 2 5%.  Kemudian ditambahkan larutan senyawa uji dengan seri konsentrasi  500;  250;  125;  62,5;  31,25
µg/ml  (sebanyak  3  replikasi)  selanjutnya plate diinkubasi  dalam  inkubator  CO 2 5% selama  24  jam  pada  suhu  37 o C.  Pada  akhir inkubasi,  medium  pada  masing-masing sumuran  dibuang  dan  dicuci  dengan  PBS kemudian ditambahkan 100 μl medium baru dan  10  μl  MTT  0,5%  dalam  PBS. Plate
diinkubasi  lagi  selama  2,5  jam  pada  suhu 37 o C. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk  formazan  yang  berwarna  ungu. Formazan  dilarutkan  dalam  larutan  SDS, lalu  diinkubasi  selama  12  jam  pada  suhu kamar.  Serapan  dibaca  dengan  ELISA reader gelombang 595 nm (CCRC, 2010).
Uji Kandungan Senyawa Kimia Uji kandungan senyawa kimia dilakukan hanya terhadap senyawa
flavonoid  yang  diduga  memiliki  aktivitas sitotoksik,yaitu  melalui  uji  pendahuluan dengan pereaksi kimia kemudian dilanjutkan dengan  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT). Pada uji pendahuluan pemeriksaan flavonoid dilakukan dengan cara  fraksi  uji ditambah 2 ml  etanol  95%  ditambah  serbuk  Mg  dan  2 ml  HCl  2N  dan  didiamkan  selama  1  menit kemudian  ditambah  dengan  HCl  dan terbentuk  warna  merah  dalam  waktu  2-5 menit. Terbentuknya
warna merah menandakan  adanya  flavonoid  dalam  fraksi etil  asetat  ekstrak  etanol  umbi  bit  (Depkes RI,  1995).  Uji  KLT  dilakukan  terhadap golongan  senyawa  yang  terdapat  dalam fraksi etil asetat dari ekstrak etanol umbi bit
setelah  uji  pendahuluan,  yaitu  flavonoid. Fase  diam  yang  dipakai  adalah  Selulosa, dengan  fase  gerak  Etil  Asetat–Asam Formiat–Asam Asetat–Air(100-11-11-27), dan reagen untuk deteksi bercak adalah Uap Amonia.
Analisis Data Uji Sitotoksisitas Data yang didapat dari hasil pembacaan ELISA reader berupa absorbansi masing-masing sumuran dikonversikan dalam persentase kehidupan sel.
Data  persentase  kehidupan  sel  T47D ini  digunakan  untuk  menghitung  nilai  IC 50 yang  merupakan  potensi  ketoksikan  fraksi etil asetat ekstrak etanol umbi bit menggunakan program SPSS 16 for windows melalui analisis probit
Persentase kehidupan sel :

## Analisis Kandungan Kimia
Analisis  dilakukan  secara  kualitatif dengan  membandingkan  warna  bercak  yang timbul  pada  KLT    dengan  yang  terdapat
pada  literatur.  Pengamatan  dilakukan  di bawah  sinar  UV  λ 254 ,  UV  λ 366 dan  pereaksi semprot.

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Ekstrak  etanol    umbi  bit  hasil ekstraksi adalah 79,34 gram dengan rendemen  sebesar  7,96  %  dan  viskositas sebesar  70  cPas.  Ekstrak  etanol  umbi  bit berwarna  kemerahan  dan  baunya  wangi seperti  gula.  Fraksi  kental  yang  didapatkan sebesar  2,1162  gram  dengan  rendemen 6,02%,  dan  kekentalan  sebesar  30  cPas. Fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  umbi  bit berwarna  coklat  kekuningan  dan  baunya wangi seperti gula. Rendemen yang diperoleh sangat kecil karena adanya zat-zat lain  yang  memiliki  polaritas  yang  berbeda dengan  etanol  sehingga  tidak  ikut  tersari. Dalam penelitian ini digunakan metode
maserasi  karena  aman  untuk  ekstraksi  dan terhindar dari proses pemanasan sehingga tidak  merusak  senyawa  yang  terkandung dalam  umbi  bit,  kekurangan  maserasi  yaitu pengerjaan  lama  dan  penyarian  kurang sempurna.  Proses  fraksinasi bertujuan  untuk mendapatkan  zat  yang  yang  lebih  spesifik, dan  senyawa-senyawa  pengganggu  lebih sedikit  sehingga  dapat  memberikan  efek sitotoksik yang lebih besar.
Hasil uji sitotoksisitas fraksi etil asetat ekstrak etanol umbi bit terhadap  sel
T47D
Perlakuan  senyawa  uji  fraksi  etil asetat dari ekstrak etanol umbi bit pada cell line T47D dapat menginduksi kematian sel dan  berpengaruh  terhadap  morfologi  sel.
Absorbansi sel dengan perlakuan-Absorbansi kontrol media Absorbansi kontrol pelarut-Absorbansi kontrol media x 100%
Sel yang hidup tampak berbentuk memanjang  seperti  daun  sedangkan  sel yang mati tampak berbentuk bulat (Gambar 1). Uji sitotoksik bertujuan untuk mengetahui potensi ketoksikan suatu
senyawa  yang  dinyatakan  dalam  parameter IC 50 .
Pengaruh  fraksi  etil  asetat  dari ekstrak  etanol  umbi  bit  terhadap cell  line T47D menunjukkan adanya fenomena dose dependent. Semakin  tinggi  konsentrasi fraksi etil asetat dari ekstrak etanol umbi bit yang  diberikan  maka  semakin  kecil persentase  kehidupan  sel  T47D  dan semakin besar sifat sitotoksisitasnya (Tabel I.).  Berdasarkan  data  persentase  kehidupan sel T47D akibat perlakuan fraksi etil asetat ekstrak etanol umbi bit diperoleh  nilai IC 50 sebesar  253,861  μg/ml  (Tabel  II.).  Grafik hubungan  antara  konsentrasi  fraksi  etil asetat  dari  ekstrak  etanol  umbi  bit  dengan nilai  probit  dapat  dilihat  pada  gambar  2. Suatu ekstrak poten jika memiliki nilai IC 50 kurang dari 20 μg/ml (Skehan et al ., 1990). Berdasarkan  standar  tersebut  maka  dapat disimpulkan  bahwa  fraksi  etil  asetat  dari ekstrak  etanol  umbi  bit  memiliki  efek sitotoksik  terhadap cell  line T47D  tetapi potensi sitotoksiknya kecil.
Uji Kandungan Kimia dari fraksi etil asetat ekstrak etanol umbi bit 1. Uji Pendahuluan
Untuk  dapat  mengetahui  golongan senyawa  yang  terdapat  dalam  fraksi  uji maka  dilakukan  uji  pendahuluan  secara kualitatif.  Pengujian  dilakukan  terhadap golongan  senyawa  flavonoid,  saponin  dan alkaloid. Hasil uji pendahuluan dapat dilihat pada Tabel III. Hasil penelitian menunjukkan  bahwa  fraksi  etil  asetat  dari ekstrak  etanol  umbi  bit  positif  mengandung senyawa golongan flavonoid yang ditunjukan  terbentuknya  warna  merah  pada penambahan serbuk Zn dan Mg.

## 2. Kromatografi Lapis Tipis
Penegasan  terhadap  hasil  identifikasi golongan  senyawa  yang  terkandung  dalam fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  umbi  bit dilakukan uji kromatografi lapis tipis, dalam hal  ini adalah  flavonoid.  Identifikasi flavonoid  menggunakan  fase  diam cellulose dan  fase  gerak  etil  asetat–asam  formiat– asam  asetat–air    (100-11-11-27).  Pereaksi dan  pembandingnya  menggunakan  uap ammoniak  dan  rutin.  Hasil  pengamatan dilakukan di bawah sinar UV 254 nm,  sinar UV  365  nm  dan  secara  visibel.  Pada pengamatan  secara  visibel,  bercak  sampel positif  mengandung  flavonoid,  dengan ditandai  adanya  bercak  berwarna  kuning. Munculnya  warna  kuning  ini  disebabkan oleh  pembentukan  garam  dan  terbentuknya struktur  kuinoid    cincin  B  pada  flavonoid karena  adanya  uap  ammonia  yang  bersifat basa.  Beberapa  glikosida  salah  satunya flavonoid  dalam  larutan  netral  atau  asam tidak berwarna,  tetapi akan menjadi kuning terang  atau  jingga  dalam  larutan  atau suasana basa (Robinson, 1995). Bercak pada visible  berwarna  kuning  dengan  nilai retardation  factor  (Rf) sebesar  0,95.  Nilai retardation factor yang tinggi ini menunjukkan  bahwa  kelarutan  sampel  pada fase  gerak  sangat  tinggi  sehingga  terbawa sampai  mendekati  batas  elusi.  Kelarutan sampel  pada  fase  gerak  yang  tinggi dimungkinkan oleh adanya etil asetat dengan jumlah  yang  besar  pada  fase  gerak.  Nilai retardation  factor lebih  rendah  jika  pelarut yang  digunakan  dalam  fraksinasi  tidak digunakan  sebagai  fase  gerak.  Sehingga  uji KLT  yang  dilakukan  membuktikan  bahwa fraksi etil asetat dari ekstrak etanol umbi bit mengandung  flavonoid,  yang  dapat  dilihat pada (Gambar 3). Senyawa-senyawa flavonoid  memiliki  aktifitas  antioksidan, penghambatan topoisomerase, aktivitas antimitosis  dan  penghambatan  estrogen sehingga  dapat  menghambat  pertumbuhan sel  kanker  (Huryn  dan  Wipf,  2007).
A B C
Gambar 1. Efek sitotoksik Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Umbi Bit terhadap Cell Line T47D. Keterangan:    A. Kontrol sel T47D. B. Cell Line T47D pada perlakuan dengan doksorubisin dosis 100 µg/ml
C.  Perlakuan  fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  umbi  bit  dengan  konsentrasi  250  μg/ml terhadap cell line T47D
Tabel I. Hasil Uji Sitotoksisitas Fraksi Etil Asetat dari Ekstrak Etanol Umbi bit terhadap Sel T47D.
Tabel II. Data Konsentrasi Senyawa Uji dan Nilai Probit
Gambar  2.  Grafik  Konsentrasi  fraksi  etil  asetat  ekstrak  etanol  umbi  bit  (µ/ml)  vs  Probit
Konsentrasi senyawa uji (μg/ml) Persentase Kehidupan   Sel T47D (%) 500 10,109 250 38,714 125 116,771 62,5 115,047 31,25 119,200 Konsentrasi senyawa uji (μg/ml) Probit IC 50 500 0,54 253,861 µg/ml 250
5,15 125 9,54 0 5 10 15 1 10 100 1000 Pr o b it Konsentrasi (µg/ml)
Uji  aktivitas  antikanker  terhadap  sel murinee  leukemia  P388  dari  senyawa flavonoid hasil isolasi menunjukkan aktivitas  yang  mencolok  dengan  nilai  IC 50 2,4  μg/ml.  Nilai  ini  menunjukkan  bahwa senyawa  flavonoid  sangat  aktif  sebagai antikanker (Fitrya dan Anwar, 2009). Hasil penelitian  lain  menunjukkan  pada  dosis 2,44  mg/0,2  ml,  isolat  flavonoid  herba benalu  mangga  ( Dendropthoe  petandra )
mampu  menghambat  pertumbuhan  kanker pada  mencit  (Sukardiman  et  al.,  1999). Penelitian-penelitian  tersebut  menunjukkan aktivitas  antikanker  dari  flavonoid.  Hasil identifikasi  kandungan  kimia  fraksi  etil asetat  ekstrak  etanol  umbi  bit  adalah flavonoid.  Maka  efek  sitotoksisitas  fraksi uji  terhadap  sel  T47D  disebabkan  oleh adanya flavonoid.
Tabel III. Hasil Uji Pendahu luan Terhadap Fraksi Etil Asetat dari Ekstrak Etanol Umbi Bit
UV 254 nm UV 365 nm visibel
Gambar 3. Kromatogram Fraksi Etil Asetat Dari Ekstrak Etanol Umbi Bit (S) Dibandingkan Dengan Baku Pembanding Rutin (P) Keterangan : Fase Diam : Selulosa Fase Gerak : Etil Asetat–Asam Formiat–Asam Asetat–Air P : Pembanding Rutin, S : Fraksi Etil Asetat dari Ekstrak Etanol Umbi Bit

## KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
1. Fraksi etil asetat dari ekstrak etanol umbi bit    memiliki  efek  sitotoksik  terhadap cell line T47D dengan nilai IC 50 sebesar 253,861 μg/ml .
2. Fraksi etil asetat dari ekstrak etanol umbi bit  mengandung  senyawa  golongan flavonoid.
Saran 1. Perlu  dilakukan  isolasi  senyawa  aktif yang  terkandung  dalam  umbi  bit  yang berefek sitotoksik.
2. Perlu dilakukan uji sitotoksisitas terhadap  fraksi  etil  asetat  dari  ekstrak etanol umbi bit secara i n vivo.
Golongan Senyawa Pengujian Hasil Flavonoid  Fraksi uji+serbuk Zn+HCl  Fraksi uji+serbukMg+HCl Terjadi perubahan warna merah (positif) Saponin Fraksi uji digojog selama 30 detik + HCl Tidak ada buih > 3 cm (negatif) Alkaloid Fraksi uji + campuran eter dan klorofrom  + pereaksi mayer Tidak ada endapan (negatif)
P S P S
P S

## DAFTAR PUSTAKA
Burdall,  E.S.,  Hanby  M.A.,  Landsdown, R.J.M.,  and  Speirs,  V.,  2003,  Breast Cancer  Cell  Line, Breast  Cancer Research : Vol 5 (2): 89-95. CCRC, 2010, Standard Operating Procedure, Cancer  Chemoprevention Research Center Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Davis,  J.M.,  Navolonic,  P.M.,  Weinstein, C.R.,  Steelman,  L.S.,  Hu,  Konovlepa, M.,  Blagosklonny  M.V  and  McCubrey,
J.A.,  2003,  Raf-1  and  Bcl-2  Induce Distinct Comomn Pathway That Contribute  to  Cancer  Drug  Resistance, Clinical Cancer Research , 9 :1161-1170. Depkes RI,1995, Materia Medika Indonesia, jilid keenam, Jakarta, 336-337.
Dolinsky,  C.,  2002,  Breast  Cancer:  The Basics ,  http :/www.onkolonk.org/ types / article.cfm?
c=3&s=5&ss=33&id=8320 ,  diakses  15 Mei 2010. Dowsett, M., 2008, Introduction to Sessions on  ‘Predicting  personal  risk  for breastcancer, Breast  Cancer  Research, 10, London, UK. Escribano,  J.,  Pedreno,  M.A.,  Carmona, F.G.,  Munoz,  R.,  1998,  Characterization
Of The Antiradical Activity Of Betalains From Beta
vulgaris
L. roots, Phytochemical  Analysis :  Vol 9 (3):  124- 127.
Fitrya  dan    Anwar,  L.,  2009,  Uji  Aktivitas Antikanker  Secara  In  Vitro  dengan  Sel Murine  P-388  Senyawa  Flavonoid  dari
Fraksi Etilasetat Akar Tumbuhan Tunjuk Langit (Helmynthostachis Zeylanica (Linn)  Hook), Jurnal  Penelitian  Sains : 12.
Gandjar,I.G.,  dan  Rohman,  A.,  2008, Kimia Farmasi  Analisis ,  Cetakan  III,Pustaka Pelajar, Yogyakarta, 353-355.
Huryn,  D.M.,  Wipf,  P.,  2007,  Natural
Product  Chemistry  and  Anticancer  Drug Discovery,  dalam  Neidle,  S., Cancer Drug  Design  and  Discovery ,  AP, London, 110-111.
Kapadia,  G.J.,  Tokuda,  T.,  Konoshima  and Nishino,  H.,  1996,  Chemoprevention  of Lung  and  Skin  Cancer  by Beta  vulgaris (Beet)  Root  Extract. Cancer  Lett ., 100 :
211-214.
Mihajlovic M. L., 2008, Recent Advances in Radiation  Therapy  of  Cancer  Cells:  A Step  towards  an  Experimental  dan Systems  Biology  Framework,  Current Radiopharmaceuticals, Bentham  Science Publishers Ltd., 1 :22-29, Yugoslavia.
Mosmann,  T.,  1983,  Rapid  Colorimetric Assay  for  Cellular  Growth  &  Survival: Application to Proliferation & Cytotoxicity Assays, Journal of
Immunological Method : 65 (1-2):55-63. Nafrialdi,  dan  Ganiswarna,  S.,  2007, Antikanker  ,  dalam  Ganiswara,  S., Setiabudy R., Suyatna, F.D., Purwantyastuti, Nafrialdi (eds), Farmakologi  dan  Terapi ,  edisi  ke-5, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran UI, Jakarta : 732. Robinson,  T.,  1995, Kandungan  Organik Tumbuhan Tinggi , edisi keenam, Penerbit ITB, Bandung, 209. Schick, Y.K., 2009, Beet, http://en.wikipedia.org/wiki/Beet , diakses
11 Januari 2010
Skehan,  P.,  Storeng,  R.,  Scudiero,  D., Monks,  A.,  McMahon,  J.,  Vistica,  D., Warren,  J.T.,  Bokesch,  H.,  Kenney,  S., Boyd,  M.R.,  1990,  New  Colorimetric Cytotoxicity  Assay  for  Anticancer-Drug Screening, Journal  of  The  National Cancer Institute , 82 (13):1107-1112
Sukardiman, Santa, I. G. P., and Rahmadany,  1999,  Efek  Anti  Kanker Isolat  Flavonoid  dari  Benalu  Mangga (Dendrophtoe  petandra), Cermin  Dunia Kedokteran , 122 : 7-8.
Tyagi,  A.K.,  Agarwal,  C.,  Chan,  D.C.F  dan
Agarwal,  R.,  2004,  Synergistic  Anti Cancer  Effects  of  Silibinin    with Conventional Cytotoxic Agents Doxorubicin,  Cisplatin  dan  Carboplatin against  Human  Breast  Carcinoma  MCF-
7  dan  MDA-MB468  Cells, Oncology Reports , 11 :493-499.
Weinberg,  R.A.,  1996,  How  Cancer  Arises, Scientific American : Vol 18 : 62-70. Winkler, C., Wirleitner, B., Schroecksnadel, K., Schennach,  H., and  Fuchs, D., 2005, In  vitro  Effects  of  Beet  Root  Juice  on Stimulated  and  Unstimulated  Peripheral Blood  Mononuclear  Cells, American Journal of Biochemistry and Biotechnology , 1:4.