e- Jurnal Rekayasa dan Teknologi Budidaya Perairan
Volume I No 2 Februari 2013 ISSN: 2302-3600

## PENYIMPANAN VAKSIN INAKTIF WHOLE CELL
Aeromonas salmonicida DENGAN PENAMBAHAN GLISEROL 
Rinda Aryani Putri * , Wardiyanto † dan Agus Setyawan †,‡

## ABSTRAK
Vaksin  inaktif whole  cell  A.  salmonicida memiliki  tingkat  imunogenesitas  yang cukup  tinggi  pada  ikan  mas  ( Cyprinus  carpio ).  Untuk  menjaga  stabilitas imunogenesitas vaksin tersebut, perlu dilakukan penyimpanan yang baik. Gliserol diketahui  mampu  menjaga  keutuhan  sel  dalam  penyimpanan  dingin.  Tujuan  dari penelitian  ini  yaitu  untuk  mengetahui  dosis  gliserol  terbaik  dalam  penyimpanan vaksin whole  cell  A.  salmonicida .Vaksin  diinaktifasi  dengan  formalin  1%  dan diinkubasikan  selama  24  jam  pada  suhu  ruang.  Kepadatan  vaksin  dihitung  lalu ditambahkan  gliserol  dengan  dosis  0,25%,  0,5%,  0,75%  dan  2  perlakuan  lain sebagai  kontrol  positif  (vaksin  tanpa  gliserol)  dan  negatif  (tanpa  vaksin,  berisi PBS).  Vaksin  diujikan  pada  10  ekor  ikan  mas  per  perlakuan  dengan  cara penyuntikan intraperitoneal (10 7 sel/ikan).  Seminggu  berikutnya  dilakukan booster dengan  metode  dan  dosis  yang  sama.  Vaksinasi  dan  booster  dilakukan pada penyimpanan vaksin 0 hari dan 30 hari dengan menggunakan ikan mas yang berbeda.  Titer  antibodi  diamati  sebelum  vaksinasi,  seminggu  setelah  vaksinasi, dan  seminggu  setelah booster ,  baik  pada  penyimpanan  0  hari  dan  30  hari. Parameter  pendukung  kualitas  air  akuarium  diamati  setiap  hari  meliputi  DO,  pH dan  suhu.    Hasil  penelitian  menunjukkan  tingkat  titer  antibodi  tertinggi  pada vaksin  dengan  penambahan  dosis  gliserol  0,5%  dengan  rata-rata    256  kali pengenceran pada uji penyimpanan vaksin 30 hari. Hasil pengukuran kualitas air, secara umum masih berada dalam kisaran normal untuk kelangsungan hidup ikan mas.  Kesimpulan  dari  penelitian  ini  yaitu  dosis  gliserol  terbaik  dalam mempertahankan  tingkat  imunogenesitas  vaksin A.  salmonicida adalah  vaksin dengan penambahan gliserol 0,50%.
Kata kunci : Aeromonas salmonicida , gliserol, vaksin, titer antibodi, ikan mas
 e-JRTBP 2013
* Mahasiswa Jurusan Budidaya Perairan
† Staf Pengajar Jurusan Budidaya Perairan Fakultas pertanian Unila
‡ Alamat Korespondensi : agusu.san@gmail.com
Pendahuluan Penyakit pada ikan merupakan masalah yang umum dihadapi para pembudidaya  ikan.  Kerugian  yang diakibatkan  seperti  penurunan  kualitas ikan  bahkan  dapat  mencapai  kematian pada ikan. Cara menanggulangi permasalahan tersebut kebanyakan dilakukan  dengan  penggunaan  bahan kimia dan antibiotika. Namun penggunaan bahan tersebut secara terus menerus dapat menyebabkan timbulnya resistensi  dan  bersifat  residu  pada  ikan (Astuti et  al .,  2003).  Oleh  sebab  itu pencegahan penyakit dengan menggunakan  bahan-bahan  yang  dapat menimbulkan  kekebalan  baik  dengan menggunakan vaksin maupun imunostimulan telah banyak dilaksanakan. Vaksin inaktif whole cell A. Salmonicida memiliki tingkat imunogenesitas  yang  cukup  tinggi, ditunjukkan  dengan  titer  antibodi mencapai  2 7 pada  ikan  mas  (Setyawan et  al .,  2012).  Belum  diketahui  metode penyimpanan  vaksin  yang  tepat  untuk menghindari  kerusakan  pada  vaksin tersebut,  karena  vaksin  dapat  rusak dengan  cepat  apabila  kondisi  tempat penyimpanan  tidak  baik  (Meek,  2004). Selama ini penyimpanan vaksin dilakukan  dengan  menyimpan  dalam lemari  es  ( refrigerator )  (suhu  ±  4 o C). Namun penyimpanan yang terlalu lama dalam refrigerator dapat  menyebabkan perubahan struktur sel bakteri terutama bagian antigen karena terjadi dehidrasi. Gliserol  merupakan  salah  satu  bahan kimia yang mampu melindungi kerusakan sel dalam penyimpanan pada suhu dingin. Beberapa penelitian menunjukkan aplikasi penambahan
gliserol  dalam  penyimpanan  sperma domba  (Rizzal, et  al., 2002),  sel  darah (Areman et al., 1988) dan pengenceran
tris  semen  beku  kambing  peranakan Etawa  (Tambing et  al., 2000)  serta vaksin  polivalen Vibrio (Retmonojati, 2007).  Tujuan  dilakukannya  penelitian ini  yaitu  untuk  mengetahui  dosis gliserol  terbaik  untuk  penyimpanan vaksin Aeromonas salmonicida.

## Bahan dan Metode
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan
Maret  sampai  dengan  Mei  2012  di Laboratorium Budidaya Perikanan Fakultas Pertanian Universitas Lampung. Pembuatan  Vaksin A.  salmonicida
dengan Penambahan Gliserol
Isolat  bakteri A.  salmonicida dikultur pada    media  cair  TSB,  lalu  diinkubasi selama  24  jam  pada  suhu  ruang. Pengkayaan dilakukan dengan memindahkan inokulum A. salmonicida dari  media  TSB  ke  TSA lalu  diinkubasi  selama  24  jam  pada suhu  ruang.  Kemudian  bakteri A. salmonicida dipanen  dan  dimasukkan ke dalam erlenmeyer . Vaksin diinaktifasi dengan formalin 1%
kemudian  diinkubasi  selama  24  jam pada  suhu  ruang.  Uji  viabilitas  bakteri dilakukan  pada  medium  spesifik  GSP dan  diinkubasi  selama  24  jam  pada suhu  ruang.  Jika  bakteri  sudah  tidak tumbuh,  formalin  dicuci  menggunakan PBS  dengan  cara  disentrifuse  dengan kecepatan  3500  rpm  selama  30  menit. Sentrifuse dilakukan  sebanyak  3  kali, setiap  kali sentrifuse,  supernatant
dibuang.  Kepadatan  vaksin  inaktif dihitung dengan spektrofotometer (λ=625  nm)  mengacu  pada  standar
McFarland.  Gliserol  ditambahkan  ke dalam vaksin sesuai perlakuan,
kemudian  vaksin  disimpan  dalam refrigerator selama 30 hari.
Penelitian menggunakan gliserol yang ditambahkan ke dalam vaksin inaktif A.
salmonicida dalam 5 perlakuan yaitu, 3 perlakuan penambahan gliserol dan 2 perlakuan sebagai kontrol. Setiap perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Dosis pemberian vaksin mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Retmonojati (2007). Perlakuannya adalah sebagai berikut : Perlakuan  A  :  Kontrol  negatif  tanpa pemberian  vaksin  maupun  gliserol (berisi PBS) Perlakuan B : Kontrol positif pemberian vaksin tanpa gliserol Perlakuan  C  :  Penambahan  vaksin dengan gliserol 0,25%
Perlakuan  D  :  Penambahan  vaksin dengan gliserol 0,50%
Perlakuan  E  :  Penambahan  vaksin dengan gliserol 0,75%
Pemeliharaan Ikan Uji Ikan  mas  ( Cyprinus  carpio )  berasal dari  Pagelaran,  Kabupaten  Peringsewu dengan  ukuran  ±  30  gr  sebanyak  200 ekor,  berat  total  ±  6000  gr  .  Ikan  mas diadaptasikan  selama  1  minggu  di  bak terkontrol.  Ikan  mas  lalu  dimasukkan ke  dalam  akuarium  berukuran  60  x  40 x 40 cm dengan kepadatan 10 ekor per akuarium.  Ikan  dipelihara  dan  diberi aerasi serta diberi pakan pelet 2–3 kali sehari dengan pelet komersial secara ad libitum .  Selama  masa  pemeliharaan dilakukan  penyiponan  dan  pergantian air setiap hari.

## Vaksinasi
Vaksin  diberikan  untuk  setiap  ikan  uji dengan  metode  penyuntikan  secara intraperitoneal (i.p) dengan dosis pemberian  vaksin  0,1  ml/ikan  dengan kepadatan bakteri 10 7 sel/ikan (Kamiso, et  al .,  2005).  Vaksinasi dilakukan 2 periode yaitu pada penyimpanan vaksin 0 hari dan 30 hari.
Masing-masing periode vaksinasi menggunakan  ikan  uji  yang  berbeda.
Vaksinasi II ( booster ) dilakukan seminggu setelah vaksinasi I, baik pada penyimpanan  0  hari  maupun  30  hari.
Pengambilan  sampel  darah  untuk  uji titer antibodi dilakukan sebelum vaksinasi, seminggu setelah vaksinasi I, dan  seminggu  setelah  vaksinasi  II ( booster ),  baik  periode  0  hari  maupun 30  hari.  Pengambilan  darah  ikan dilakukan  dengan  menggunakan  spuit 1ml, ½ in 26 G (Therumo TM ) yang telah dibilas  dengan  larutan  EDTA  10%. Darah  diambil  dari vena  caudalis .
Darah dimasukkan ke dalam eppendorph 1,5  ml  lalu  disentrifuse pada  kecepatan  3500  rpm  selama  15 menit  untuk  mendapatkan  serumnya. Serum  disimpan  dalam freezer (suhu  - 10 o C)  untuk  digunakan  dalam  uji  titer antibodi.
Pengamatan
Titer Antibodi Pengujian  titer  antibodi  dilakukan dengan metode mikro aglutinasi mengacu pada prosedur standar mikroaglutinasi (Robersson, 1990)
dengan  modifikasi.  Prosedur  secara lengkap yaitu 25 ml serum dimasukkan ke  dalam  sumuran  1  dan  2.  Kemudian PBS  25  ml  dimasukkan  ke  dalam sumuran  2  -  12.  Pada  sumuran  2 sampai 11 di repipeting untuk mengencerkan serum. Selanjutnya antigen  25  ml  dimasukkan  ke  dalam sumuran  1-12, mikrodilution  plate digoyang  selama  3  menit  dengan membentuk  pola  angka  8.  Hasil  titer diinkubasi  dalam refrigerator selama 24  jam.  Keesokan  harinya  dilakukan pengamatan  reaksi  aglutinasi  pada masing–masing  sumur.  Adanya  kabut berwarna  putih  yang  menyebar  ke seluruh  sumuran  berarti  antibodi  telah terbentuk

## Analisis Kualitas air
Parameter  pendukung  kualitas  air meliputi  DO,  pH,  dan  suhu  diukur setiap  hari  untuk  mengetahui  bahwa kisaran kualitas air masih berada dalam kisaran strandar kehidupan ikan mas. Parameter Uji Parameter  utama  yang  diamati  dalam penelitian ini adalah pengaruh
penambahan  gliserol  yang  dilihat  dari titer antibodi dan parameter pendukung berupa kualitas air (suhu, DO, dan pH).

## Analisis Data
Data titer antibodi dan kualitas air akan disajikan dalam bentuk grafik dan tabel kemudian dianálisis secara deskriptif.

## Hasil dan Pembahasan
Pemilihan  gliserol  sebagai  bahan  yang ditambahkan dalam penyimpanan vaksin A.  salmonicida dikarenakan gliserol  dapat  masuk  ke  dalam  sel (permeating  agent) ,  berbeda  dengan bahan  lainnya  yang  tidak  dapat  masuk ke  dalam  sel  ( non  permeating  agent ) seperti  sukrosa  dan  gula  alkohol (manitol,  sorbitol). Gliserol merupakan bahan  yang  biasa  digunakan  untuk memelihara  keutuhan  membran  dan meningkatkan  potensi  osmotik  media sehingga  cairan  di  dalam  sel  mengalir keluar dan terjadi dehidrasi (Tambunan dan Ika, 2003).
Suatu  saat  potensi  vaksin  akan  hilang terutama  bila  terpapar  panas,  sinar matahari  dan  beberapa  kasus  terpapar oleh  suhu  dingin  (Kristini,  2008). Sejauh  ini  vaksin  memang  disimpan dalam refrigerator untuk mempertahankan  imunogenesitasnya. Namun disisi lain dampak penyimpanan dalam
refrigerator
terhadap sel akan mempengaruhi struktur  dan  fungsi  seluler,  misalnya penurunan  proses  metabolisme  (Gazali dan  Tambing,  2002).  Apabila  struktur
selnya  mengalami  perubahan  maka tingkat  imunogenesitas  vaksin  akan menurun. Sehingga diperlukan penanganan tertentu untuk meminimalisir  terjadinya  kerusakan vaksin, salah satu caranya yaitu dengan penambahan  gliserol.  Gliserol  dapat mencegah  kerusakan  vaksin  yang disimpan dalam refrigerator karena sel yang  terdapat  dalam  vaksin  akan terlapisi  oleh  gliserol,  sehingga  sel akan  menjadi  lebih  elastis  dan  tidak mudah pecah (Retmonojati, 2007).
Vaksin yang ditambahan gliserol disuntikkan  ke  dalam  tubuh  ikan  akan masuk  ke  ginjal  bagian  depan  dan dapat menghasilkan respon imun
bawaan  dalam  meningkatkan  respon imun  adiktif  terhadap  vaksin.  Dalam ginjal  bagian  depan  vaksin  yang  telah masuk difagosit oleh makrofag dan neutropil kemudian  dibawa  menuju timus  yang  mengandung  sel  T.  Sel  T merespon  antigen  tersebut  ke  reseptor khusus yang dikenali sebagai kompleks histokompatibilitas utama Major Histocompatibility  Sitokinin  Complex (MHC).  Lalu  antigen  tersebut  dibawa menuju limpa terjadi pelepasan sitokinin membentuk  sel  B.  Sel  B sebagian  melakukan  poliferasi  atau memperbanyak  diri  dan  sebagian  lagi berdeferensiasi menjadi sel plasma dan sel B memori sebagai sistem kekebalan humoral.  Antibodi  akan  terbentuk apabila  sel  penghasil  antibodi  yaitu  sel limfosit  (sel  B)  telah  berfungsi  dengan baik (Firdaus, 2004).
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan
menunjukkan bahwa kecenderungan  hasil  titer  antibodi semua  perlakuan  penambahan  gliserol pada  awal  penyimpanan  vaksin  tinggi. Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa penambahan  gliserol  dengan  dosis 0,25%,  0,5%  dan  0,75%  tidak  akan
mengganggu  aktivitas  vaksin  untuk merespon pembentukan antibodi dalam tubuh hewan yang divaksinasi (Retmonojati, 2007).
Hasil  titer  antibodi  pada  penyimpanan vaksin  setelah  30  hari  menunjukkan peningkatan  hasil  titer  antibodi  yang relatif  stabil  berada  pada  perlakuan  D yaitu  vaksin  dengan  penambahan gliserol  0,5%  (Gambar  1).  Sel  yang disimpan  dalam  suhu  dingin  akan mengalami  dehidrasi.  Gliserol  dapat mencegah  terjadinya  dehidrasi  karena memilik  daya  ikat  yang  kuat  terhadap air  (Supriatna  dan  Pasaribu,  1992) sehingga  sel  akan  memerlukan  waktu
yang  cukup  lama  untuk  mengeluarkan air. Gliserol masuk ke dalam membran plasma dengan menyesuaikan konsentrasi intraseluler dan ekstraseluler.  Sehingga  air  yang  keluar dari  membran  akan  masuk  kembali  ke dalam  membran  dan  selanjutnya  akan menyeimbangkan kandungan air intraseluler  dan  ekstraseluler.  Jadi respons membran plasma setelah terkena gliserol adalah terjadi pengeluaran  air  dari  dalam  sel  terlebih dahulu, terjadi pengkerutan sel, kemudian  gliserol  masuk  ke  dalam  sel sehingga  ukuran  sel  dapat  kembali normal (Tambing et al ., 2000).
Gambar 1. Grafik Titer Antibodi Penyimpanan Vaksin Selama 0 Hari sampai 30 Hari
Hasil  titer  antibodi  pada  perlakuan  C yaitu  vaksin  dengan  penambahan gliserol  0,25%  dan  perlakuan  E  yaitu vaksin  dengan  penambahan  gliserol 0,75%  meningkat  tinggi  pada  awal penyimpanan vaksin dan setelah dilakukan penyimpanan selama 30 hari hasil  titer  antibodinya  mengalami penurunan.
Hal
ini mungkin
disebabkan  karena  gliserol  pada  dosis 0,25%  belum  mampu  mengurangi terjadinya  dehidrasi  karena  konsentrasi molekul  di  luar sel  tinggi,  sehingga air di dalam sel keluar untuk mengencerkan  molekul  di  luar  sel (Rusiyantono et  al., 2000).  Pada  dosis 0,75%  mungkin  disebabkan  karena konsentrasi  molekul  di  dalam  sel  lebih
tinggi sehingga air masuk dengan cepat ke  dalam  sel  yang  mengakibatkan  sel akan mengembung dan pecah (Mclaughlin et al ., 1992).
Dosis gliserol optimun yang didapatkan dari  hasil  penelitian  sesuai  dengan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya dengan menggunakan vaksin  polivalen Vibrio .  Hasil  yang didapatkan  pada  penelitian  tersebut rata-rata titer antibodi semua perlakuan penambahan gliserol pada awal penyipanan vaksin tinggi dan mengalami penurunan setelah memasuki  bulan  kedua,  ketiga,  dan keempat.  Penurunan  kualitas  vaksin
yang  relatif  stabil  berada  pada  vaksin dengan  penambahan  dosis  gliserol 0,5% pada suhu
refrigerator (Retmonojati, 2007).
Faktor  lingkungan  dalam  penelitian  ini yang diamati yaitu kualitas air. Kualitas air  media  budidaya  merupakan  salah satu  faktor  yang  berperan  penting  bagi timbulnya  suatu  penyakit  pada  ikan. Beberapa  parameter  kualitas  air  yang diamati  yaitu  suhu,  DO  dan  pH. Semakin  tinggi  temperatur  suhu  maka semakin  cepat  produksi  antibodi  dan tingginya reaksi antibodi yang dihasilkan,  begitu  juga  sebaliknya (Firdaus, 2004). Tabel 1. Data Kualitas Air Selama Penelitian Perlakuan Parameter DO (ppm) Suhu ( 0 C) pH A 3,86 – 6,72 28 – 30 6 – 7 B 3,44 – 6,15 28 – 30 6 – 7 C 3,47 – 6,13 28 – 30 6 – 7 D 4,21 – 6,81 28 – 30 6 – 7 E 4,7 – 7,01 29 – 30 6 – 7 Baku Mutu *) > 3 25 – 30 7 – 8 *) Menurut Cholik, et al., 1986
Hasil  pengukuran  kualitas  air  selama penelitian  secara  umum  masih  dalam kisaran  optimum  untuk  kelangsungan hidup  ikan  mas  (Tabel  1).  Data  yang didapatkan  antara  lain  kisaran  pH antara  6  -  7,  kisaran  DO  3  -  7,01  dan suhu air berkisar antara 28 - 30 o C. Hal ini  sesuai  dengan  Cholik, et  al (1986) yang  menyebutkan  bahwa  kisaran optimum  pH  7  -  8,  DO  >  3  dan  suhu optimum  25  -  30 o C.  Sesuai  dengan pernyataan  yang  dikemukakan  oleh Firdaus (2004) bahwa produksi antibodi  akan  tinggi  pada  suhu  yang tinggi  pula.  Pengukuran  pH  dari  hasil penelitian  berkisar  6-7  sedikit  dibawah kisaran  optimum  hidup  ikan  mas  6,5-9 ( Tossin et  al .,  2008)  namun  tidak
menimbulkan  efek  negatif  bagi  ikan mas selama masa pemeliharaan.

## Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian disimpulkan bahwa penambahan gliserol  0,50%  dalam  vaksin  inaktif A. salmonicida merupakan  dosis  terbaik dalam  penyimpanan  pada  lemari  es ( refrigerator ) selama 30 hari. Berdasarkan penelitian ini kami menyarankan agar dilakukan penelitian lanjut  dengan  waktu  yang  lebih  lama untuk  penyimpanan vaksin  dan dengan metode penyimpanan yang berbeda.

## Daftar Pustaka
Areman,  E.M.,  Simonis,  T.B.,  Carter,
C.S.,  Read, E.J.,  dan  Klein, H.G. 1988.  Bulk  Cryopreservation  of Lymphocytes in Glycerol. Transfusion 28(2): 151 – 156. Astuti,  P.,  Alam,  G.,  Pratiwi,  S.U.T.,
Hertiani,  T.,  dan  Wahyuono,  S.
2003.  Skrining  senyawa  anti infeksi  dari  spons  yang  dikoleksi dari  Bunaken,  Manado. Biota. 127: 47-52.
Cholik, F., Artati dan Arifudin R. 1986. Pengelolaan Kualitas Air Kolam. INFIS  Manual  Seri  Nomor  36. Dirjen Perikanan. Jakarta. 52 hal.
Firdaus, A. 2004. Pengaruh Pemberian Vitamin  C  Dalam  Percobaan Imunoprofilaksis Terhadap Infeksi Bakteri Streptococcus iniae Pada Ikan Nila (Oreocromis  niloticus  Linne). Program  Studi  Teknologi  Dan Managemen Akuakultur. Departemen Budidaya Perikanan. Fakultas Perikanan Dan Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Gazali,  M.  dan  Surya,  N.  T.  2002. Kriopreservasi  Sel  Spermatozoa. Jurnal Hayati 9(1): 27-32.
Kamiso, N. H., Isnansetyo, A., Triyanto.,  Murdjani,  M.  dan Sholichah,  L.  2005.  Efektifitas vaksin polivalen untuk pengendalian vibriosis pada kerapu tikus ( Cromileptes
altivelis ).  Jurnal  Perikanan  7(2): 95-100. Kristini,  T.  D.  2008. Faktor-Faktor Risiko Kualitas Pengelolaan Vaksin  yang Buruk di  Unit Pelayanan  Swasta  (Studi  Kasus di  Kota  Semarang). Universitas
Diponegoro. Semarang. Mclaughlin,  E.A.,  Ford,  W.C.L.,  dan Hull, M.G.R. 1992. The contribution  of  the  toxicity  of  a glycerol-egg yolkcitrate cryopreservative to the decline in human  sperm  motility  during cryopreservation . J. Reprod.
Fert., 95 : 749-754.
Meek.  2004. Effect  of  Heat  and  Cold on  Vaccines .  Proceding  of  The National Vaccine Storage Whorkshop. Brisbane. < http://www.pdfio.com/k- 292092.html >.  Diakses  tanggal  9
Desember 2011.
Retmonojati,  K.  2007. Penyimpanan Vaksin  Polivalien  Vibrio  dengan Penambahan Adjuvant dan Gliserol . Skripsi Jurusan Perikanan.  Fakultas  Pertanian, Universitas Gajahmada, Yogyakarta. Rizzal  M.,  Toelihere.  M.R.,  Yusuf, T.L.,  Purwantara,  B.    dan
Situmorang,  P.  2002.  Kualitas Semen Beku Domba Garut dalam Berbagai  Konsentrasi  Gliserol.  J. Ilmu Ternak dan Veteriner 7 (3): 194-199.
Robersson,  B.S.  1990. Bacterial
Agglutination . In: J. S. Stolen, T.
C. Fletcher, D.P. Anderson, B. S. Roberson,  and  W.  B.  Van Muiswinkle  (eds).  Techniques  In Fish Immunology. SOS Publication,  Fair  Heaven,  New
Jersey. Hal 81-86.
Rusiyantono, Y., Ahmad, B. Y., Sukra, M.R. Toelihere, Supriatna, dan B.
Purwantara,  2000. Pemakaian Etthylen  Glicol  dan  Glicerol untuk Vitrifikasi Embrio Kambing  In  Vitro. Direktorat Pembinaan Penelitian dan
Pengabdian Pada Masyarakat Dirjen Dikti Diknas, Bogor. Setyawan  A.,  Siti  H.,  Zulfikar  S.,  dan Sumino. 2012. Imunogenesitas Vaksin Inaktif Whole Cell Aeromonas  salmonicida  Pada Ikan  Mas  (Cyprinus  carpio).
Aquasains 1(1) : 18-21. Supriatna,  I.  dan  Pasaribu,  F,H.  1992. In Vitro  Fertilisasi,  Transfer
Embrio  dan  Pembekuan  Embrio. Pusat  Antar  Universitas,  Institut Pertanian Bogor, Bogor. Tambing,  S.N.,  Mozes,  R.T.,  Tuty, L.Y., Dan I-K. S. 2000. Pengaruh gliserol  dalam  pengencer  Tris terhadap  kualitas  semen  beku kambing Peranakan Etawah.

## Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner
5 (2) : 1-8 Tambunan,  I.  R.,  dan  Ika,  M. 2003.  Pemanfaatan Teknik Kriopreservasi dalam Penyimpanan Plasma Nutfah Tanaman . Buletin Plasma Nutfah
9 (2): 10-18.
Tossin,  M.  R.,  Sunarto  dan  Sabariah. 2008.  Pengaruh  Dosis  Pakan Berbeda  Terhadap  Pertumbuhan Ikan  Mas  ( Cyprinus  carpio )  dan Ikan  Baung  ( Macrones sp.) dengan  Sistem  Cage-Cum-Cage. J. Akuakultur Indonesia 7(1): 59- 64.