Menara Perkebunan 2011, 79(1), 1-5
Sekuen Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA ribosomal Oncobasidium theobromae dan jamur sekerabat pembanding
Internal Transcribed Spacer (ITS) sequences of ribosomal DNA Oncobasidium theobromae and other related fungi as comparison
Agustin Sri MULYATNI 1*) , Achmadi PRIYATMOJO 2) & Agus PURWANTARA 1)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia,  Jl. Taman Kencana No.1 Bogor, 16151, Indonesia
2) Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia
Diterima tgl 15 Oktober 2010/Disetujui tgl 25 Januari 2011

## Abstract
The  objective  of  this  research  was  to  sequence  ITS region  from  ribosomal  DNA  of Oncobasidium  theobromae , and  to  compare  it  to  that  of  the  isolates  from  Vietnam  and Malaysia,  and  also  to  identify  other  related  fungi  species based on the homology of the ITS region. O. theobromae was isolated from three cocoa plantations in Indonesia that were Jember,  Kendari,  and  Makasar.  DNA  was  isolated  from  the fungal  mycelia,  and  then  amplified  using  ITS-4  and  ITS-5 primers,  resulted  in  DNA  fragments  of    600  bp  and  700  bp for  the  isolate  from  Jember,  600  bp  for  the  isolate  from Kendari, and 700 bp for the isolate from Makasar. All of the fragments  were  successfully  sequenced,  except  for  600  bp fragment of the isolate from Jember. The homology analysis using  BLAST  was  confirmed  that  ITS  sequences O.  theobromae from  Jember  was  homolog  with Rhizoctonia sp.  and Ceratobasidium sp.,  whereas  isolate  from  Kendari was    homolog  with Botryosphaeria sp.  and  isolate  from Makasar was homolog with Mycorrhizal basidiomycetes . The sequences  were  then  compared  to  the  sequences  of O.  theobromae from  Vietnam  and  Malaysia.  Phylogenetic analyses  using  Clustal  W  program  indicated  that O.  theobrome from  Indonesia  which  is  represented  by isolates  from  Jember  showed  higher  degree  of  similarity  to isolates  from  Vietnam.  On  the  contrary,  isolates  from Indonesia showed lower degree of similarity to isolates from Malaysia.
[ Keywords: Oncobasidium theobromae, homology  analysis, ITS,  rDNA, VSD]

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui sekuen daerah ITS  dari  DNA  ribosomal  jamur Oncobasidium  theobromae , dan membandingkannya dengan sekuen jamur O. theobromae yang  berasal  dari  Malaysia  dan  Vietnam,  serta  untuk mengidentifikasi  spesies  lain  yang  merupakan  kerabat  dekat O.  theobromae dengan  berdasarkan  kemiripan  sekuen ITSnya. Isolat jamur O. theobromae diisolasi dari tiga lokasi perkebunan  kakao  di  Indonesia  yaitu  Jember,  Kendari  dan Makasar.  DNA  diisolasi  dari  miselium  jamur.  Amplifikasi daerah  ITS  menggunakan  primer  ITS-4  dan  ITS-5 menghasilkan  fragmen  600  bp  dan  700  bp  untuk  isolat Jember, 600 bp untuk isolat Kendari dan 700 bp untuk isolat
Makasar.  Semua  fragmen  berhasil  disekuensing  kecuali fragmen  Jember  600  bp.  Analisis  homologi  menggunakan BLAST  menunjukkan  fragmen  isolat  Jember  700  bp memiliki  homologi  tertinggi  dengan Rhizoctonia sp.  dan Ceratobasidium sp., isolat Kendari   600 bp homolog dengan Botryosphaeria sp.,  dan  isolat  Makasar  homolog  dengan Mycorrhizal basidiomycetes . Hasil sekuen tersebut kemudian dibandingkan dengan sekuen daerah ITS O. theobromae dari Malaysia  dan  Vietnam  untuk  mengetahui  hubungan kekerabatannya. Analisis kekerabatan menggunakan program Clustal W menunjukkan O. theobromae dari Indonesia yang diwakili  oleh  isolat  Jember  berkerabat  dekat  dengan  isolat Vietnam.  Sebaliknya  isolat  dari  Indonesia  menunjukkan derajat kesamaan yang lebih rendah dengan isolat Malaysia.
[Kata kunci: Oncobasidium theobromae, analisis homologi, ITS, rDNA, VSD]

## Pendahuluan
Penyakit vascularstreak  dieback (VSD)  merupa- kan penyakit penting pada kakao yang disebabkan oleh jamur Oncobasidium  theobromae Talbot  dan  Keane. Patogen  menginfeksi  tanaman  melalui  daun  muda, kemudian  tumbuh  menyerang  ranting  dan  cabang sehingga  menyebabkan  mati  pucuk  ( dieback ). Serangan  pada  tanaman  di  pembibitan  atau  tanaman muda  dapat  mematikan  tanaman,  sedangkan  pada tanaman dewasa yang sudah menghasilkan menyebab- kan tanaman merana, produksi turun dan mati (Guest & Keane,  2007).  Kehilangan  produksi  yang  disebabkan oleh  VSD  di  Asia  mencapai  30.000  ton  (Anonim, 2006). Di Indonesia serangan VSD dapat menurunkan produktivitas  hingga  40  %  dari  1.100  kg  menjadi 660  kg/ha/tahun.  Hal  ini  mengakibatkan  kehilangan produksi  sekitar  198.000  ton/tahun  atau  setara  dengan 3,96 triliun/tahun (Anonim, 2010).
Jamur O.  theobromae dapat  diisolasi  dari  daun atau ranting tanaman sakit, tetapi sulit untuk dibiakkan dalam  bentuk  biakan  murni  yang  menghasilkan  spora di  laboratorium.  Jamur  akan  berhenti  tumbuh  setelah satu atau dua kali subkultur sehingga inokulasi buatan di laboratorium atau rumah kaca tidak dapat dilakukan
*) Penulis korespondensi: ti2n84@yahoo.com
Sekuen Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA ribosomal Oncobasidium theobromae ... (Mulyatni et al .)
untuk  menguji  patogenisitas  di  antara  isolat  dan resistensi tanaman kakao (Halimah & Sukamto, 2006). Uji resistensi selama ini tergantung pada infeksi alami di   lapangan. Hingga saat ini belum diketahui variasi dalam  patogenisitas  di  antara  isolat  dari  berbagai daerah  atau  negara,  karena  studi  ke  arah  itu  masih terkendala  oleh  kesulitan  membiakkan  patogen  di laboratorium  (Keane,  2000).  Pendekatan  yang  paling mudah  yaitu  dengan  melakukan  analisis  pada  tingkat DNA.
DNA  ribosomal  (rDNA)  adalah  daerah  penyandi genom  untuk  komponen  RNA  ribosom.  Pada  eukariot deret rDNA terletak pada nukleus/inti dan mitokondria. Daerah  rDNA  dipisahkan  antara  satu  dengan  yang lainnya  oleh  suatu  pembatas  yang  disebut spacer . Subunit  rDNA  baik  yang  besar  maupun  yang  kecil dipisahkan oleh ETS ( external transcribed spacer ) dan IGS  ( intergenic  spacer ).  Kedua  pembatas  tersebut kadang-kadang  disebut  NTS  ( nontranscribed  spacer ). Jamur  termasuk  organisme  eukariotik,  pada  rDNA jamur  terdapat  daerah  konservatif  yaitu  gen  penyandi rRNA  18S,  5.8S  dan  28S  yang  di  antaranya  terdapat daerah  ITS  ( Internal  Transcribed  Spacer )  (Gomes et al ., 2002; O'Brien et al., 2005).
ITS  adalah  suatu  urutan  RNA  dari  proses transkripsi utama yang berada antar prekusor ribosomal subunit  dan  dihilangkan  pada  proses splicing ketika RNA precursor tanda molekul yang struktural diproses ke  dalam  suatu  ribosom.  Organisme  eukaryotik mempunyai  dua  daerah  ITS;  ITS-1  terletak  di  antara 18S gen dan 5.8S gen, dan ITS-2 terletak di antara 5.8S dan 28S gen. Ketiga gen ribosom tersebut mempunyai tingkat  konservasi  yang  sangat  tinggi  (Gomes et  al ., 2002;  O'Brien et  al., 2005).  Daerah  ITS  biasanya mengalami  perubahan  atau  mutasi  sehingga  dapat berbeda atau bervariasi di antara spesies. Sekuen rDNA subunit  kecil  18S  berkembang  relatif  lambat  dan digunakan  untuk  studi  hubungan  kekerabatan  pada tingkat spesies suatu organisme sedangkan daerah ITS dan  IGS  pada  unit  pengulangan  rRNA  berkembang lebih  cepat  dan  memungkinkan  terjadinya  variasi  di antara  spesies  dan  populasi  (Jamil,  2005).  Urbez- Torres et  al. (2006)  menganalisis  daerah  ITS Botryosphaeria spp.  penyebab  penyakit  kanker  pada anggur  di  California.  Hasil  analisanya  menunjuk-kan isolat Botryosphaeria spp.  tersebut  berkerabat  dekat dengan isolat yang berasal dari Australia, Perancis dan Portugis.  Oleh  karena  itu  studi  untuk  mengetahui variasi genetik di tingkat DNA perlu dilakukan. Tujuan dari  penelitian  ini  adalah  membandingkan  sekuen  ITS rDNA O.  theobromae yang  berasal  dari  Indonesia dengan  negara  lain.  Isolat O.  theobromae dari Indonesia  berasal  dari  Jember  sedangkan  isolat O.  theobromae luar  negeri  berasal  dari  Malaysia  dan Vietnam.

## Bahan dan Metode

## Isolasi dan pembiakan jamur
Jamur O.  theobromae diisolasi  dari  ranting tanaman kakao yang menunjukkan gejala VSD. Sampel berasal dari sentra produksi utama kakao yaitu Jember (Jawa  Timur),  Kendari  (Sulawesi  Tenggara)  dan Makassar (Sulawesi Selatan). Isolasi dilakukan dengan cara  ranting  dipotong  10  cm,  dikupas  kulit  luarnya kemudian  didesinfeksi  dengan  cara  direndam menggunakan  1%  Na-hipoklorit  selama    dua  menit. Setelah dicuci dengan air steril dua kali masing-masing satu menit, ranting dipotong dengan ukuran panjang 1- 3 cm dengan gunting steril, kemudian ditiriskan di atas kertas  saring  steril  dan  ditumbuhkan  di  atas  medium water  agar .  Miselia  jamur  yang  tumbuh  dipisahkan dari  agar,  kemudian  digunakan  untuk  bahan  ekstraksi DNA.
Ekstraksi DNA genomik O. theobromae dan PCR
Ekstraksi  DNA  genomik  dari O.  theobromae di- lakukan menggunakan metoda Castillo yang dimodifikasi  dengan  penambahan  PVP  dan  β- merkaptoetanol  (Toruan-Mathius et  al .,  1997). Amplifikasi potongan daerah ITS rDNA isolat sampel dilakukan  dengan  mesin  PCR  menggunakan  pasangan primer  umum  ITS4/ITS5.  Amplifikasi  dilakukan  pada campuran reaksi 25 µL yang mengandung 17,5 µL air steril, 2,5 µL 10 kali bufer PCR +MgCl 2, 1 µL  dNTPs 10  mM,  1  µL  dari  masing-masing  primer  (50  ng/µL), 0,5 µL Taq polymerase (1,5 U) dan 1 µL  DNA (10- 100 ng/µL) O. theobromae . Reaksi PCR menggunakan mesin PCR Personal Biometra dengan kondisi sebagai berikut:  denaturasi  awal  pada  suhu  94°C  selama  lima menit, 35 siklus (94°C selama satu menit, 50°C selama satu  menit,  dan  pada  suhu  72°C  selama  satu  menit 30  detik),  dan  ekstensi  akhir  pada  suhu  72°C  selama lima menit.

## Elektroforesis
Produk PCR selanjutnya dielektroforesis dalam gel agarose 1% dalam larutan TBE 0.5X. Sebanyak 10 µL DNA  hasil  PCR  dicampur  dengan  2  µL loading  dye kemudian dimasukkan dalam sumur gel elektroforesis. Elekrtoforesis  dijalankan  pada  tegangan  100  volt selama  30  menit.  Selanjutnya  gel  hasil  elektroforesis diletakkan  diatas  UV  transluminator  dan  didoku- mentasikan menggunakan GelDoc.

## Menara Perkebunan 2011, 79(1), 1-5

## Purifikasi hasil PCR
DNA hasil PCR dipurifikasi menggunakan Axygen PCR  Purification  Kit. Fragmen  DNA  dalam  gel dipotong menggunakan skalpel, kemudian dimasukkan dalam  tabung  Eppendorf  2  mL  dan  ditimbang.  Bufer DE-A  (100  mg  sebanding  dengan  100  µL  volume bufer)  ditambahkan  pada  potongan  agar  di  dalam tabung,  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  75°C  selama delapan  menit  dengan  di vortex setiap  dua  menit. Campuran kemudian ditambah  0,5 volume bufer DE-B dan dikocok sampai homogen. Berturut-turut dilakukan pemindahan  larutan  800  µL  ke  dalam  tabung  dan kolom  baru  kemudian  disentrifus  11.000  rpm  selama satu menit, setelah itu cairan dalam tabung penampung dibuang.  Hal  yang  sama  dilakukan  pula  pada  larutan 500 µL bufer W1 dan  700 µL bufer W2 sampai larutan habis,  penambahan  bufer  W2  dilakukan  dua  kali. Kolom  dipindahkan  ke  tabung  Eppendorf  1,5  mL kemudian  dilakukan  elusi  DNA  menggunakan eluent 20-30 µL tepat di bagian tengah kolom, dan didiamkan satu  menit.  DNA  murni  diperoleh  setelah  kolom disentrifus  11.000  rpm  selama  satu  menit.  Hasil purifikasi diverifikasi pada gel agarosa.

## Sekuensing dan analisis BLAST
Hasil  PCR  yang  sudah  dipurifikasi  kemudian disekuen  menggunakan  sekuensing  otomatis  mesin ABI  3130xl Genetic  Analyzer di  Lembaga  Eijkman, Jakarta,  menggunakan  primer  ITS4/ITS5.  Hasilnya dianalisis  dengan  BLAST  pada  situs  http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.  Hal  ini  bertujuan  me- mastikan primer memotong tepat pada bagian ITS dan untuk  mengidentifikasi  spesies  jamur  lain  yang tersimpan dalam database NCBI yang berkerabat dekat dengan O. theobromae.

## Pembandingan sekuen
Sekuen O.  theobromae asal  Indonesia  (Jember, Makasar dan Kendari) kemudian dibandingkan dengan sekuen O. theobromae yang berasal dari Malaysia dan Vietnam.  Data  sekuen O.  theobromae dari  Malaysia dan Vietnam diperoleh dari Department of Botany, La Trobe  University,  Melbourne,  Australia.    Selain  data tersebut  sekuen  juga  akan  dibandingkan  dengan  data sekuen  jamur  spesies  lain  yaitu Rhizoctonia, Phytopthora,  Puccinia,  Fusarium dan Stachybotrys yang  ada  di  GenBank  NCBI.  Pembandingan  sekuen dilakukan  menggunakan  program  Clustal  W  secara online di alamat http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw.

## Hasil dan Pembahasan
Amplifikasi ITS O. theobromae
Amplifikasi  daerah  ITS  menggunakan  primer umum yaitu ITS4/ITS5 menghasilkan fragmen sebesar 600 bp dan 700 bp untuk isolat Jember, 700 bp untuk isolat  Makasar,  dan  600  bp  untuk  isolat  Kendari (Gambar  1).  Variasi  ukuran  fragmen  hasil  amplifikasi 600  bp  dan  700  bp  disebabkan  oleh  adanya  variasi panjang  daerah  ITS  masing-masing  rDNAnya.  Hal  ini disebabkan  daerah  ITS  sebagai  daerah  yang  tingkat konservasinya  rendah  sedangkan  daerah  subunit  kecil 18S, 5.8S, subunit besar 28S diketahui sebagai daerah yang sangat konservatif. Selain itu variasi yang sangat signifikan  dapat  terjadi  karena  adanya  delesi,  insersi, atau  substitusi  antara  spesies  dalam  ITS  (Peay et.al , 2008).  Keempat  produk  PCR  hasil  amplifikasi menggunakan primer ITS4/ITS5 yang telah dipurifikasi disajikan pada Gambar 2.
Gambar  1.  Profil  elektroforesis  hasil  PCR  menggunakan pasangan  primer  ITS4  dan  ITS5.  (lajur  1: Jember; 2: Kendari; 3: Makasar; M; Marker 100 bp)
Figure  1.    Electrophoretic  profile  of  PCR  product  using primer  pair  of  ITS4/ITS5.  (lane  1:  Jember;  2: Kendari; 3: Makasar; M: marker).
Gambar 2.  Pita-pita hasil purifikasi. (Lajur 1: Jember 600 bp;

## 2: Jember 700 bp; 3: Kendari 600 bp; 4: Makasar 700 bp;  M: Marker 100 bp)
Figure  2.      Fragments  as  results  of    purification.  (Lane  1:
Jember  600  bp;  2:  Jember  700  bp;  3:  Kendari 600 bp; 4: Makasar 700 bp; M: Marker  100 bp) 700 bp 1         M          2          3 700 bp 1        2       M     3       4
Sekuen Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA ribosomal Oncobasidium theobromae ... (Mulyatni et al .)
ITS dari O. theobromae
Hasil  sekuensing  daerah  ITS  kemudian  dianalisis BLAST  untuk  memastikan  bahwa  primer  memotong tepat  pada  daerah  ITS.  Hasil  BLAST  menunjukkan semua  gen  mempunyai  kesamaan  dengan  daerah  ITS spesies  jamur  lain.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  PCR berhasil  mengamplifikasi  daerah  ITS.  Namun  terdapat perbedaan  pada  hasil  BLAST  antara  ketiga  isolat tersebut.  Isolat  Jember  mempunyai  tingkat  homologi paling  tinggi  dengan  ITS Rhizoctonia sp.  Isolat Kendari  mempunyai  tingkat  homologi  paling  tinggi dengan  ITS Botryosphaeria sp,  sedangkan  isolat Makasar  mempunyai  tingkat  homologi  paling  tinggi dengan M y corrhizal  basidiomycetes .  Hasil  ini menunjukkan DNA jamur yang didapatkan dari Jember merupakan  DNA O.  theobromae karena  hasil  BLAST daerah  ITS O.theobromae yang  berasal  dari  Malaysia dan  Vietnam  juga  mempunyai  tingkat  homologi tertinggi  dengan Rhizoctonia sp. O.  theobromae dan Rhizoctonia sp.  termasuk  dalam  famili Cerato- basidiaceae .  Sedangkan O.  theobromae asal  Kendari dan  Makasar  bukan O.  theobromae melainkan  jamur endofit lain yang berasosiasi dengan jaringan tanaman terserang VSD.

## Pembandingan sekuen
Hasil  sekuen  ketiga  isolat O.  theobromae kemudian dibandingkan dan dianalisis  kekerabatannya
dengan data sekuen O. theobromae asal Malaysia, dan Vietnam  serta dengan  spesies   jamur lain dari data- base  NCBI  yaitu Puccinia  psidii (EF599768), Filobasidium capsuligenum (EF532832) , Fusarium sp. (EF611096), Stachybotrys  elegans (DQ369856),
Phytophthora1
(DQ286726) , Phytophthora2
(AY594197).  Hasil  pembandingan  dan  analisis kekerabatan  menggunakan  pohon  filogenetik  dapat dilihat  pada  Gambar  3.  Hasil  pensejajaran  sekuen  gen ITS  menggunakan  program  Clustal  W  menunjukkan tingkat  kekerabatan  antara  1%-98%.  Semakin  tinggi nilai  presentase  maka  kekerabatnnya  semakin  dekat. Tingkat kekerabatan paling tinggi adalah Ot-Viet2 dan Ot-Viet3 yaitu 98%. Kemudian Ot-Jember1 dengan Ot- Viet2,  Ot-Jember1  dengan  Ot-Viet3,  Ot-Viet2  dengan Ot-Viet4,  Ot-Viet3  dengan  Ot-Viet4  sebesar  97  %. Isolat  Ot-Jember2  yang  merupakan  hasil  isolasi  dari sampel  Jember  sangat  dekat  dengan  Ot-Viet  dengan tingkat similaritas 92 %. Hal tersebut dapat digunakan sebagai  dasar  untuk  mendesain  primer  spesifik  untuk mendeteksi  jamur  patogen  yang  menginfeksi  jaringan tanaman  secara  alami  (Utomo  &  Tambajong,  2003). Primer  spesifik  seperti  ini  sangat  bermanfaat  untuk mendetaksi O.  theobromae pada  jaringan  kakao  atau jaringan  tanaman  lain  yang  dapat  menjadi  inang alternatif.  Hal  ini  penting  dilakukan  mengingat tanaman inang alternatif O. theobromae belum pernah dilaporkan (Keane, 2000; Guest & Keane, 2007).
Gambar 3. Dendogram kekerabatan jamur Oncobasidium theobromae asal Indonesia, Malaysia, Vietnam dan spesies jamur lain berdasarkan sekuen ITS.
Figure 3.  Dendogram of Oncobasidium theobromae from Indonesia, Malaysia, Vietnam compared with other species based on ITS sequences.

## Menara Perkebunan 2011, 79(1), 1-5

## Kesimpulan
Primer  ITS4  dan  ITS5  dapat  mengamplifikasi daerah ITS jamur O. theobromae . O. theobromae dari Jember  homolog  dengan Rhizoctonia , O.  theobromae dari Kendari homolog dengan Botryosphaeria sp., dan O.  theobromae dari  Makasar  homolog  dengan Mycorrhizal  basidiomycetes. O.  theobromae yang berasal  dari  Indonesia  yang  diwakili  isolat  Jember berkerabat  dekat  dengan O.  theobromae yang  berasal dari Vietnam.

## Daftar Pustaka
Anonim (2006). The World’s Cocoa Problems . Taken from: http://www.dropdata.org/cocoa/cocoa_prob.htm. [24 Juli 2006].
Anonim  (2010).  Lebih  fokus  dengan  gernas  kakao. Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman 32(2), 1-12.
Guest D & P Keane (2007). Vascular-streak dieback: A new encounter  disease  of  cacao  in  Papua  New  Guinea  and Southeast  Asia  caused  by  the  obligate  basidiomycete Oncobasidium  theobromae . Phytopathol 97,  1654- 1657.
Gomes  EA,  MC  Kasaya,  EG  deBarros,  AC  Borgs  & EF  Araujo  (2002).  Polymorphism  in  the  internal transcribed  spacer  (ITS)  of  the  ribosomal  DNA  of  26 isolates of ectomycorrhizal fungi. Genet Mol Biol 25(4), 477-483
Halimah D & S Sukamto (2006). Sejarah dan perkembangan penyakit  vascular  streak  dieback  (VSD)  di  Indonesia. Warta Pusat Penelitian Kopi dan Kakao 22(3), 107-119.
Jamil  I  (2005).  Analisis  sekuen  daerah  its  DNA  ribosom (rDNA)  dan  desain  primer  untuk  mendeteksi Phytophthora  palmivora Butl  pada  kakao.  Bogor, Institut Pertanian Bogor. Tesis.
Keane  PJ  (2000).  Biology  control  and  methods  for  study  of vascular streak dieback. In: Selection for Resistance and Quality  in  Cocoa  in  Indonesia. Project  Handbook ACIAR 2001-2004. p. 60-67.
O'Brien  HE,  JLParrent,    JA  Jackson,  JM  Moncalvo  & R  Vilgalys  (2005).  Fungal  communities'  analysis  by large-scale  sequencing  of  environmental  samples. Environ. Microbiol 71, 5544-5550.
Peay  KG,  PG  Kennedy  &  TD  Bruns  (2008).  Fungal community  ecology:  a  hybrid  beast  with  a  molecular master. BioSci 58, 799–810.
Toruan-Mathius  N,  T  Hutabarat  &  D  Suhendi  (1997).  The use  of  RAPD  to  evaluate  genetic  variability  of  hybrid parent  in Theobromae  cacao L.  plants. Menara Perkebunan 65 (2), 53-63.
Urbez-Torres  JR,  GM  Leavitt,  TM  Voegel  &  WD  Gubler (2006). Identification and distribution of Botryosphaeria spp.  associated  with  grapevine  cankers  in  California. Plant Diseases 90, 1490-1503.
Utomo  C  &  D  Tambajong  (2003).  Desain  primer  spesifik untuk  deteksi  ganoderma  penyebab  penyakit  busuk pangkal batang pada tanaman kelapa sawit. J Penelitian Kelapa Sawit 11,  23-37.