## S riwijaya J ournal of M edicine
Pengaruh Iskemia-Reperfusi terhadap Gambaran Seluler Tubulointerstisial Renalis, Kadar Cystatin C dan Glomerular Filtration Rate (GFR) Tikus Wistar
Ahadi Aulia Rahman 1* , Rachmat Hidayat 2 , Sri Nita 2
1 Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya, Palembang, Indonesia
2 Departemen Biologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya, Palembang, Indonesia E-mail: ahadiauliarahman@gmail.com

## Abstrak
Acute  Kidney  Injury (AKI)  merupakan  penurunan  fungsi  ginjal  secara  cepat.  Penyebab  AKI  terbesar  adalah iskemia/reperfusi  yang  memicu  respon  inflamasi  dan  menyebabkan  kerusakan  ginjal.  Inflamasi  merupakan  respon proteksi  dan  perbaikan  jaringan,  namun  dapat  menyebabkan  fibrosis  yaitu  jaringan  normal  digantikan  oleh  matriks ektraseluler seperti kolagen. Kerusakan yang terjadi pada bagian tubulointerstisial berpengaruh besar terhadap fungsi ginjal yang dapat diukur dengan GFR menggunakan cystatin C. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh durasi iskemia-reperfusi terhadap gambaran seluler tubulointerstisial, kadar cystatin C dan GFR pada tikus Wistar serta korelasi  antara  gambaran  seluler  tubulointerstisial,  kadar cystatin  C dan  GFR.  Penelitian  ini  adalah  penelitian eksperimental  dengan  desain posttest  only  with  control  group .  Penelitian  menggunakan  30  ekor  tikus  Wistar  yang dilakukan di animal house dan laboratorium biomolekuler Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya. Gambaran seluler tubulointerstisial,  kadar cystatin  C dan GFR  dinilai  dengan persentase  fraksi  area  kolagen, ELISA  dan  rumus  Larsson. Iskemia 30 menit dan reperfusi 14 hari 99,1% berpengaruh terhadap persentase fraksi area kolagen, iskemia 120 menit dan reperfusi 14 hari 98,8% berpengaruh terhadap kadar cystatin C serta 99,5% berpengaruh terhadap GFR. Terdapat korelasi  yang  signifikan  antara  persentase  fraksi  area  kolagen  dan  kadar cystatin  C (p=0,0001,  r=0,901),  serta  GFR (p=0,0001,  r=-0,834), lalu  antara  kadar cystatin  C dan GFR (p=0,0001,  r=-915). Durasi  iskemia-reperfusi  berpengaruh terhadap gambaran seluler tubulointerstisial, kadar cystatin C dan GFR serta terdapat korelasi antara gambaran seluler tubulointerstisial, kadar cystatin C dan GFR pada tikus Wistar.
Kata Kunci: AKI, Persentase Fraksi Area Kolagen, Cystatin C, GFR

## Abstract
Effect of  ischemia-reperfusion  on  tubulointerstitial  renal appearance,  levels of  cystatin c  and  glomerular  filtration rate  (GFR)  on  wistar  rats. Acute  Kidney  Injury  (AKI)  is  rapid  decline  in  renal  function.  Most  causes  of  AKI  are ischemia/reperfusion  which  triggers  an  inflammatory response  and  causes  renal  injury. Inflammation  is  a protective response and tissue repair, but it can cause fibrosis, which is the normal tissue replaced by an extracellular matrix such as collagen. Damage that occurs in the tubulointerstitial area has a significant effect on  renal function which can be measured  by  GFR  using  cystatin  C.  The  purpose  of  this  study  was  to  determine  the  effect  of  ischemia-reperfusion duration on tubulointerstitial cellular appearance, cystatin C levels and GFR and correlations between tubulointerstitial cellular appearance , cystatin C and GFR in Wistar rats. This research is an experimental research using posttest only with control group design. The study used 30 Wistar rats carried out in animal houses and biomolecular laboratories at Medical Faculty of Sriwijaya University.Tubulointerstitial cellular appearance, cystatin C levels and GFR were assessed by percentage of collagen area fraction, ELISA and Larsson formula. 30 minutes ischemia and 14 days reperfusion 99.1% affect the percentage of collagen area fraction, 120 minutes ischemia and 14 days reperfusion 98.8% affect the cystatin C level and 99.5% affect the GFR. There was a significant correlation between the percentage of collagen area fraction and cystatin C levels (p = 0,0001, r = 0,901), and GFR (p = 0,0001, r = -0,834), then between cystatin C and GFR levels (p = 0,0001, r = -915). The duration of ischemia-reperfusion affects tubulointerstitial cellular appearance, cystatin C levels and GFR and there is a correlation between tubulointerstitial cellular appearance, cystatin C levels and GFR in Wistar rats.
Keywords: AKI, Percentage of Collagen Area Fraction, Cystatin C, GFR
1. Pendahuluan
Acute  Kidney  Injury (AKI)  merupakan penurunan  fungsi  ginjal  dalam  mengatur keseimbangan komposisi cairan dan elektrolit tubuh, serta eksresi produk sisa metabolisme, yang  terjadi  secara    tiba-tiba. 1 Menurut Pernefri  (Perhimpunan  Nefrologi  Indonesia) jumlah penderita AKI di Indonesia pada tahun 2016  sebanyak  8%  dari  seluruh  pasien  yang menjalani hemodialisis di Indonesia. 2
Sekitar  70%  kasus  AKI  disebabkan iskemia/reperfusi  sehingga  terjadi  penurunan volume darah vaskular yang tergambar melalui penurunan  GFR (Glomerular  Filtration  Rate). 3 Iskemik/reperfusi  akan  memicu  repson  imun dan  inflamasi  yang  berperan  penting  dalam patofisiologi  AKI. 4 Iskemia  juga  menyebabkan penurunan produksi ATP yang mengakibatkan sel  mengalami  apoptosis  atau  nekrosis terutama di glomerulus, tubulus dan interstisium. 5 Adanya  reperfusi  aliran  darah dan reoksigenasi dapat menambah keparahan kerusakan jaringan akibat cedera iskemik serta memicu  timbulnya  respon  inflamasi  yang disebut sebagai cedera reperfusi. Selain terjadi peningkatan  aliran  oksigen,  terjadi  juga peningkatan  ROS (Reactive  Oxygen  Species) dan infiltrasi neutrofil sehingga memperparah terjadi kerusakan. 6,7
Proses  inflamasi  merupakan  respon proteksi dan perbaikan jaringan, namun proses perbaikan  yang  tidak  sempurna  dapat menyebabkan  fibrosis  yang  merupakan penggantian  jaringan  normal  oleh  matriks ektraseluler seperti kolagen. 8
Kerusakan  pada  tubulointerstisial  renal terutama yang disebabkan oleh iskemik/reperfusi berpengaruh terhadap fungsi  ginjal. 9 Untuk  mengetahui  besar kerusakan jaringan ginjal diperlukan pemeriksaan  patologi,  sedangkan  untuk mengetahui  fungsi  ginjal  dapat  dilakukan pengukuran GFR , pengukuran ini berdasarkan pada  kadar  kreatinin  atau  bisa  menggunakan cystatin  C. Kadar cystatin  C dalam  darah
menggambarkan Glomerular  Filtration  Rate (GFR). 10,11 Tujuan  penelitian  ini  adalah mengetahui pengaruh durasi iskemia-reperfusi pada Acute  Kidney  Injury (AKI)  terhadap gambaran  seluler  tubulointerstisial  renalis, kadar cystatin C dan Glomerular Filtration Rate (GFR)  serta  mengetahui  korelasi  antara gambaran  seluler  tubulointerstisial  renalis, kadar cystatin C dan Glomerular Filtration Rate (GFR) pada tikus Wistar.

## 2. Metode
Persiapan subjek penelitian. Penelitian ini merupakan  penelitian  eksperimental  dengan desain posttest only with control group. Subjek penelitian  adalah  30  tikus  Wistar  jantan  usia 10-12  minggu  dengan  berat  200-  250  gram didapatkan dari Laboratorium Eureka Palembang,  Indonesia  dengan  persetujuan Komite  Etik  Fakultas  Kedokteran  Universitas Sriwijaya Palembang, Indonesia. Tikus ditempatkan  di  kandang.  Tikus  diaklimatisasi dengan  suhu  kamar  (25-30 O C),  diberi  makan dengan  makanan  yang  telah  ditentukan  dan minum  air  sebanyak  2  kali  sehari,  lalu dihabituasi  dengan  menggunakan  siklus terang-gelap  masing-masing  12  jam  selama  7 hari. 12
Perlakuan  subjek  penelitian. Lalu  subjek penelitian  dibagi  menjadi  10  kelompok  yang masing- masing terdiri dari 3 ekor tikus.
K1 (kelompok normal/ shamed operated ) yaitu  subjek  penelitian  dilakukan  prosedur bedah saja tanpa intervensi.
 K2 (iskemia 30 menit dan reperfusi/1 hari
 K3 (iskemia 30 menit dan reperfusi 7 hari)
 K4 (iskemia 30 menit dan reperfusi 14 hari)
 K5 (iskemia 60 menit dan reperfusi 1 hari)
 K6 (iskemia 60 menit dan reperfusi 7 hari)
 K7 (iskemia  60  menit  dan  reperfusi  14 hari)
 K8 (iskemia  120  menit  dan  reperfusi  1 hari)
 K9 (iskemia 120 menit dan reperfusi 7 hari)
 K10 (iskemia 120 menit dan reperfusi 14 hari).
Selanjutnya,  subjek  penelitian  akan diinduksi  AKI  dengan  menggunakan  model Unilateral  Renal  Ischemia  Reperfusion (UIR) tanpa  nefrektomi  dengan  cara  menghentikan aliran  darah  pada  arteri  renalis  kiri  selama beberapa  waktu  yang  akan  memicu  iskemik dan  kemudian  dialirkan  kembali  sehingga terjadi reperfusi. 13 Subjek penelitian dianggap telah  mengalami  iskemik  apabila  terjadi perubahan warna pada ginjal dari kemerahan menjadi  merah  atau  ungu  kehitaman  serta reperfusi  yang  berhasil  ditandai  dengan perubahan  kembali  warna  ginjal  menjadi kemerahan. 14 Durasi  waktu  iskemia  dan reperfusi yang digunakan sesuai dengan yang telah  ditetapkan  sebelumnya.  Setelah  waktu reperfusi  selesai,  maka  akan  dilakukan pengambilan  sampel  darah  untuk  dilakukan pengukuran  kadar cystatin  C serta  akan dilakukan euthanasia pada  subjek  penelitian untuk diambil ginjal kirinya.
ELISA cystatin C. Sampel darah sebanyak 1 ml  diambil  dari  arteri  periorbital  dan dimasukkan  ke  dalam  tabung  EDTA  untuk dilakukan  analisis  menggunakan SimpleStep ELISA ® Rat Cystatin C ELISA Kit dengan prinsip menangkap antibodi terhadap cystatin C yang telah  ditandai  dengan  menggunakan  antibodi konjugasi  detektor  yang  telah  berikatan dengan  sampel cystatin  C dalam  larutan. Selanjutnya seluruh kompleks antigen- antibodi  ( capture  antibody,  analyte,  detector antibody ) akan diimobilisasi melalui imunooafinitas  yang  terdapat  di wells .  Untuk melakukan  pengujian,  sampel  atau standard ditambahkan  ke  dalam wells diikuti  dengan penambahan  antibodi.  Setelah  inkubasi wells dicuci  untuk  menghilangkan  komponen  yang tidka  terikat.  Kemudian TMB  substrate ditambahkan  dan  selama  inkubasi  akan dikatalisasi oleh HRP, yang akan menunjukkan warna  biru.  Reaksi  ini  lalu  dihentikan  dnegan menambahkan stop  solution yang  ditandai
dengan  perubahan  warna  dari  biru  menjadi kuning.
Sinyal cystatin  C yang  dihasilkan sebanding  dengan  jumlah  analit cystatin  C yang terikat dengan antibodi dan intensitasnya diukur pada panjang gelombang 450nm. Selain itu pada akhir pembacaan TMB juga dapat ukur dengan menggunakan Panjang gelombang 600 nm. Cystatin C yang merupakan keluarga dari gen  cystatin  tipe  2  merupakan  inhibitor  yang potensial  terhadap  proteinase  lisosomal  yang diekspresikan  di  beberapa  organ  tubuh  serta meupakan inhibitor ektraseluler yang penting dari  protease  sistein.  Sebagai  salah  satu inhibitor  protease  sistein,  cystatin  C  memiliki peran  penting  dalam  regulasi  aktivitas  enzim tersebut.
Pengukuran  GFR. Nilai  GFR  didapatkan melalui  penghitungan  dengan  menggunakan rumus  Larsson 15 yang  menggunakan  kadar cystatin  C untuk  mengukur  GFR.  Rumusnya adalah sebagai berikut:
GFR= 77,24 x Cystatin C -1,2623
Keterangan: GFR: Glomerular Filtration Rate (mg/L/min) Cystatin C: Kadar Cystatin C pada serum (mg/L)
Gambaran seluler tubulointerstisial. Untuk  mendapatkan  sampel  ginjal  tikus, awalnya  tikus  di- euthanasia menggunakan anestesi  per  inhalasi  kloroform  hingga  tidak terdapat  respon  nyeri  dan  pergerakan  nafas, lalu dilakukan pembedahan di bagian flank kiri , kemudian ambil ginjal dan difiksasi menggunakan Neutral  Buffer  Formalin 10% selama  24-48  jam  pada  suhu  ruangan.  Ginjal yang telah difiksasi kemudian disimpan dalam wadah khusus untuk diproses dalam pembuatan  blok  parafin.  Setelah  dibuat  blok parafin,  preparat  dipotong  dan  dibuat slide untuk diwarnai menggunakan Picrosirius Red . Pengamatan fibrosis pada tubulointerstisial  renalis  dilakukan  dengan Digital  Image  Analysis menggunakan ImageJ 52.  Fraksi  area  fibrosis  dinyatakan  dalam
persentase  (%).  Preparat  yang  telah  diwarnai dengan Picro  Sirius  Red akan  diamati menggunakan  mikroskop  dan  difoto  dengan optilab  sebanyak  5  lapangan  pandang  secara acak  dengan  perbesaran  400x,  lalu  foto tersebut akan dilakukan Digital Image Analysis menggunakan ImageJ 52 dan akan didapatkan hasil  berupa  persentase  fraksi  area  fibrosis. Pada hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop  warna  kemerahan  pada  preparat menunjukkan  adanya  deposit  kolagen  serta pada hasil
Digital Image Analysis
menggunakan ImageJ 52  warna  hitam menunjukkan deposit area kolagen.
Analisis  data  statistic. Data  persentase fraksi area kolagen, kadar cystatin C dan GFR (Glomerular Filtration Rate) dianalisis
menggunakan software IBM ® Statistical Package for the Social Sciences (SPPS ® ) versi 25. Analisis  komparatif  menggunakan One-way Annova lalu  dilanjutkan  dengan Post  Hoc Bonferroni dan Games-Howell, signifikan  jika nilai p<0,05. Analisis korelasi menggunakan uji korelasi Pearson, signifikan  jika  nilai  p<0,05. Analisis pengaruh menggunakan uji multivariat Mannova , signifikan jika nilai p<0,05.

## 3. Hasil
Pada  gambar  1.  terlihat  perbandingan gamabaran  tubulointesrtisial  pada  masing- masing  kelompok  perlakukan  mulai  dari  K1 hingga K10. Pada gambar 1(a) atau kelompok normal, tubulus dan interstisial berbatas tegas, namun  pada  gambar  1(d)  atau  kelompok iskemia 30 menit dan reperfusi 14 hari, tubulus dan  interstisialnya  tidak  berbatas  tegas  lagi, disertai  dengan  pembengkakan  pada  daerah tubulus.  Warna  kemerahan  yang  terdapat  di gambar  baik  pada  gambar  1(a)  hingga  1(j) menunjukkan  adanya  deposit  kolagen  yang terdapat  di  tubulus  dan  interstisial.  Warna kemerahan  ditemukan  paling  banyak  pada gambar  1(d)  yang  merupakan  kelompok iskemia  30  menit  dan  reperfusi  14  hari.  Pada hasil digital  image  analysis menggunakan
ImageJ  52  didapatkan  hasil  persentase  fraksi area  kolagen  yang  tertinggi  ditemukan  pada kelompok K4 (iskemia 30 menit dan  reperfusi 14  hari)  dengan  persentase  46,541%  yang ditunjukkan oleh gambar 1(l), sedangkan pada kelompok  normal  (K1)  hanya  ditemukan persentase fraksi area kolagen sebesar 1,450% yang ditunjukkan oleh gambar 1(k).
Gambar 1. Gambaran Seluler Tubulointerstisial (a) K1, (b) K2, (c) K3, (d) K4, (e) K5, (f) K6, (g) K7, (h) K8, (i) K9,
(j) K10, (k) hasil digital image analysis K1(kelompok normal), (l) hasil digital image analysis K4 (iskemia 30 menit dan reperfusi 14 hari). Warna kemerahan dan tanda bintang (*) menunjukkan adanya deposit kolagen di tubulus dan interstisial, warna hitam pada digital image analysis menunjukkn deposit kolagen ( Picrosirius Red , 400x)
Pada tabel 1. menunjukkan bahwa rerata persentase  fraksi  area  kolagen  tertinggi ditemukan di kelompok K4 (iskemia 30 menit,
reperfusi  14  hari)  yaitu  sebesar  46,541%, sedangkan yang terendah ditemukan pada K1 (kelompok normal) yaitu sebesar 1,450%.
Tabel 1. Pengaruh durasi iskemia- reperfusi terhadap persentase fraksi area kolagen tubulointerstisial renal
Durasi Iskemia- Reperfusi Rerata Persentase Fraksi Area Kolagen Mean ± SD (%) P_value* P_value β** β η p 2 K1 Shamed Operated 1,450 ± 0,127 - b 0,049 # 1,450 # 0,180 # K2 ISM 30 menit + RPF 1 hari 14,294 ± 0,974 0,009 a,b 0,000 12,844 c 0,896 d K3 ISM 30 menit + RPF 7 hari 22,297 ± 0,723 0,001 a,b 0,000 20,847 c 0,958 d K4 ISM 30 menit + RPF 14 hari 46,541 ± 0,923 0,001 a 0,000 45,091 c 0,991 d K5 ISM 60 menit + RPF 1 hari 16,329 ± 0,315 0,000 a,b 0,000 14,879 c 0,920 d K6 ISM 60 menit + RPF 7 hari 32,268 ± 1,035 0,002 a,b 0,000 30,818 c 0,980 d K7 ISM 60 menit + RPF 14 hari 34,349 ± 1,945 0,006 a,b 0,000 32,889 c 0,983 d K8 ISM 120 menit + RPF 1 hari 19,878 ± 0,674 0,000 a,b 0,000 18,428 c 0,946 d K9 ISM 120 menit + RPF 7 hari 36,920 ± 2,121 0,006 a,b 0,000 35,470 c 0,985 d K10 ISM  120  menit  +  RPF  14 hari 33,076 ± 0,845 0,003 a,b 0,000 31,626 c 0,981 d
* Uji Post Hoc Games- Howell, bermakna jika p_value <0,05, ** Uji Parameter Estimates Mannova, bermakna jika p_value <0,05, - Kelompok Normal (Shamed  Operated) ,  #  Konstanta, a Analisis Post  Hoc  Games-  Howell p<0,05 dibandingkan shamed operated , b Analisis Post  Hoc  Games-  Howell p<0,05  dibandingkan  K4, c Persentase  fraksi  area  kolagen  lebih  tinggi  dibandingkan shamed operated , d Persen pengaruh durasi iskemia- reperfusi terhadap persentase fraksi area kolagen dibandingkan shamed operated , η p 2 partial eta square Mannova
Pada  hasil  analisis Post  Hoc tabel  1. menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan  (p<0,05)  rerata  persentase  fraksi area kolagen pada kelompok perlakuan K2-K10 jika  dibandingkan  dengan  K1  (kelompok normal). Selain itu, perbedaan yang signifikan (p<0,05) rerata persentase fraksi area kolagen juga terdapat antara K4 (iskemia 30 menit dan reperfusi  14  hari)  dan  seluruh  kelompok perlakuan.
Berdasarkan  hasil  analisis  multivariat Mannova tabel  1.    didapatkan  hasil  yang signifikan  (p<0,05)  pada  semua  kelompok perlakuan yang menunjukkan bahwa terdapat pengaruh  antara  durasi  iskemia  reperfusi terhadap persentase fraksi area kolagen. Nilai
β  menunjukkan  besar  pengaruh  yang ditimbulkan  variabel  independen  terhadap dependen.  Pada  K1  (kelompok  normal) berpengaruh terhadap besar persentase fraksi area kolagen sebesar 1,450%. Nilai β tertinggi terdapat di K4 (iskemia 30 menit, reperfusi 14 hari), menunjukkan bahwa perlakuan tersebut akan  meningkatkan  persentase  fraksi  area kolagen  menjadi  45,091%  lebih  tinggi dibandingkan  kelompok  normal.  Nilai η p 2 menunjukkan  seberapa  besar  persentase variabel  independen  mempengaruhi  variabel dependen.  Pada  K1  (kelompok  normal) didapatkan  nilai η p 2 sebesar  0,180  (18%)  yang berarti  kelompok  normal mempengaruhi persentase fraksi area kolagen sebesar 18%. η p 2
terbesar  didapatkan  pada  K4  yaitu  sebesar 0,991  (99,1%)  yang  berarti  perlakuan  iskemia 30  menit  dan  reperfusi  14  hari  akan memengaruhi  peningkatan  persentase  fraksi area  kolagen  menjadi  99,1%  lebih  tinggi dibandingkan kelompok normal.
Pada tabel 2. menunjukkan bahwa rerata kadar cystatin  C tertinggi  ditemukan  di kelompok K10 (iskemia 120 menit, reperfusi 14 hari) yaitu sebesar 1,47 mg/L, sedangkan yang terendah ditemukan pada K1 (kelompok
Tabel 2. Pengaruh durasi iskemia- reperfusi terhadap kadar Cystatin C Durasi Iskemia- Reperfusi Rerata Kadar Cystatin C Mean ± SD (mg/L) P_value* P_value β** β η p 2 K1 Shamed Operated 0,47 ± 0,01 - 0,000 # 0,470 0,973 K2 ISM 30 menit + RPF 1 hari 0,85 ± 0,04 0,000 a 0,000 0,380 0,922 K3 ISM 30 menit + RPF 7 hari 1,11 ± 0,02 0,000 a 0,000 0,640 0,971 K4 ISM 30 menit + RPF 14 hari 1,34 ± 0,043 0,000 a 0,000 0,870 0,984 K5 ISM 60 menit + RPF 1 hari 0,89 ± 0,02 0,000 a 0,000 0,420 0,936 K6 ISM 60 menit + RPF 7 hari 1,12 ± 0,01 0,000 a 0,000 0,650 0,972 K7 ISM 60 menit + RPF 14 hari 1,38 ± 0,036 0,000 a 0,000 0,910 0,986 K8 ISM 120 menit + RPF 1 hari 0,97 ± 0,036 0,000 a 0,000 0,500 0,954 K9 ISM 120 menit + RPF 7 hari 1,21 ± 0,026 0,000 a 0,000 0,740 0,978 K10 ISM 120 menit + RPF 14 hari 1,47 ± 0,036 0,000 a 0,000 1,000 0,988
* Uji Post Hoc Games- Howell, bermakna jika p_value <0,05, ** Uji Parameter Estimates Mannova, bermakna jika p_value <0,05, - Kelompok Normal (Shamed  Operated) , #  Konstanta, a Analisis Post Hoc Games-  Howell, p<0,05  dibandingkan shamed operated , b Analisis Post  Hoc  Games-  Howell, p<0,05  dibandingkan  K4, c Persentase  fraksi  area  kolagen  lebih  tinggi  dibandingkan shamed operated , d Persen pengaruh durasi iskemia- reperfusi lebih tinggi terhadap persentase fraksi area kolagen dibandingkan shamed operated , η p 2 partial eta square Mannova
normal) yaitu sebesar 0,47 mg/L. Hasil analisis Post  Hoc tabel  2.  menunjukkan  bahwa terdapat  perbedaan  yang  signifikan  (p<0,05) rerata  kadar cystatin  C pada  kelompok perlakuan K2-K10 jika dibandingkan dengan K1 (kelompok normal).
Berdasarkan  hasil  analisis  multivariat Mannova tabel  2.    didapatkan  hasil  yang signifikan  (p<0,05)  pada  semua  kelompok perlakuan yang menunjukkan bahwa terdapat pengaruh  antara  durasi  iskemia  reperfusi terhadap kadar cystatin C . Nilai β menunjukkan besar  pengaruh  yang  ditimbulkan  variabel independen  terhadap  dependen.  Pada  K1
(kelompok  normal)  berpengaruh  terhadap kadar cystatin  C sebesar  0,47  mg/L.  Nilai  β tertinggi  terdapat  di  K10  (iskemia  30  menit, reperfusi  14  hari),  menunjukkan  bahwa perlakuakn tersebut akan meningkatkan kadar cystatin  C menjadi  1  mg/L  lebih  tinggi dibandingkan  kelompok  normal.  Nilai η p 2 menunjukkan  seberapa  besar  persentase variabel  independen  mempengaruhi  variabel dependen.  Pada  K1  (kelompok  normal) didapatkan nilai η p 2 sebesar 0,973 (97,3%) yang berarti kelompok normal mempengaruhi kadar cystatin  C sebesar  97,3%. η p 2 terbesar didapatkan  pada  K10  yaitu  sebesar  0,988
(98,8%)  yang  berarti  perlakuan  iskemia  30 menit dan reperfusi 14 hari akan memengaruhi peningkatan  kadar cystatin  C menjadi  98.8% lebih tinggi dibandingkan kelompok normal.
Pada tabel 3. menunjukkan bahwa rerata GFR (Glomerular  Filtration  Rate) tertinggi ditemukan di kelompok K1 (kelompok normal)
yaitu  sebesar  200,42  mg/L/min,  sedangkan yang terendah ditemukan pada K10 (kelompok normal)  yaitu  sebesar  47,52  mg/L/min.  Hasil analisis Post Hoc tabel 3. menunjukkan bahwa terdapat  perbedaan  yang  signifikan  (p<0,05) rerata kadar cystatin C pada kelompok
Tabel 3. Pengaruh durasi iskemia-reperfusi terhadap GFR (Glomerular Filtration Rate)
Durasi Iskemia- Reperfusi Rerata Glomerular Filtration Rate (GFR) Mean ± SD (mg/L/min) P_value* P_value β** β η p 2 K1 Shamed Operated 200,42 ± 5,386 - 0,000 # 200,420 # 0,998 # K2 ISM 30 menit + RPF 1 hari 95,03 ± 5,652 0,000 a 0,000 -105,390 b 0,988 c K3 ISM 30 menit + RPF 7 hari 67,73 ± 1,540 0,000 a 0,000 -132,690 b 0,993 c K4 ISM 30 menit + RPF 14 hari 53,43 ± 2,240 0,000 a 0,000 -146,983 b 0,994 c K5 ISM 60 menit + RPF 1 hari 89,52 ± 2,535 0,000 a 0,000 -110,897 b 0,990 c K6 ISM 60 menit + RPF 7 hari 66,95 ± 0,755 0,000 a 0,000 -146,983 b 0,994 c K7 ISM 60 menit + RPF 14 hari 51,46 ± 1,679 0,000 a 0,000 -148,953 b 0,994 c K8 ISM 120 menit + RPF 1 hari 80,37 ± 3,707 0,000 a 0,000 -120,050 b 0,991 c K9 ISM 120 menit + RPF 7 hari 60,75 ± 1,699 0,000 a 0,000 -139,670 b 0,993 c K10 ISM 120 menit + RPF 14 hari 47,52 ± 1,457 0,000 a 0,000 -152,900 b 0,995 c
* Uji Post Hoc Games- Howell, bermakna jika p_value <0,05, ** Uji Parameter Estimates Mannova, bermakna jika p_value <0,05, - Kelompok Normal (Shamed Operated) , # Konstanta, a Analisis Post Hoc Bonferroni p<0,05 dibandingkan shamed operated , b GFR lebih rendah dibandingkan shamed operated , c Persen pengaruh durasi iskemia- reperfusi terhadap GFR dibandingkan shamed operated , η p 2 partial eta square Mannova
perlakuan K2-K10 jika dibandingkan dengan K1 (kelompok normal). Berdasarkan hasil analisis multivariat Mannova tabel 3.  didapatkan hasil yang  signifikan  (p<0,05)      pada        semua kelompok  perlakuan  yang  menunjukkan bahwa  terdapat  pengaruh  antara  durasi iskemia  reperfusi  terhadap  GFR.  Nilai  β menunjukkan besar pengaruh yang ditimbulkan  variabel  independen  terhadap dependen.  Pada  K1  (kelompok  normal) berpengaruh  terhadap  GFR sebesar  200,420 mg/L/min.  Nilai  β  tertinggi  terdapat  di  K10 (iskemia  30  menit,  reperfusi  14  hari), menunjukkan bahwa perlakuan tersebut akan
menurunkan  GFR  menjadi  152,90  mg/L/min lebih rendah  dibandingkan kelompok normal. Nilai η p 2 menunjukkan  seberapa  besar persentase variabel independen mempengaruhi  variabel  dependen.  Pada  K1 (kelompok normal) didapatkan nilai η p 2 sebesar 0,998  (99,8%)  yang  berarti  kelompok  normal mempengaruhi  GFR  sebesar  99,8%. η p 2 terbesar  didapatkan  pada  K10  yaitu  sebesar 0,995  (99,5%)  yang  berarti  perlakuan  iskemia 30  menit  dan  reperfusi  14  hari  akan memengaruhi penurunan GFR menjadi  98.8% lebih rendah dibandingkan kelompok normal.
Tabel 4. Korelasi persentase fraksi area kolagen, kadar Cystatin C dan GFR (Glomerular Filtration Rate)
Persentase Fraksi Area Kolagen GFR r P_value* r P_value* Kadar Cystatin C 0,901 0,000 -0,915 0,000 GFR -0,834 0,000
* Uji Korelasi Pearson, bermakna jika p_value <0,05
Pada tabel 4. Didapatkan bahwa terdapat korelasi  yang  bermakna  signifikan  (p<0,05) antara  kadar cystatin  C dan  persentase  fraksi area kolagen dengan arah korelasi positif yang berarti  semakin  tinggi  kadar cystatin  C maka semakin  tinggi  persentase  fraksi  kolagen tubulointerstisial renal serta kekuatan korelasi yang  sangat  kuat  (r=  0,901). Kemudian, terdapat  korelasi  yang  signifikan  (p<0,05) antara  kadar cystatin  C dan  GFR (Glomerular Filtration Rate) (p<0,05), dengan arah korelasi negatif  yang  berarti  semakin  tinggi  kadar cystatin  C maka  semakin  rendah  GFR  serta kekuatan korelasi yang sangat kuat (r= -0,915). Lalu,  terdapat  korelasi  yang  bermakna signifikan (p<0,05) antara GFR dan persentase fraksi  kolagen  dengan  arah  korelasi  negatif yang berarti semakin tinggi GFR maka semakin rendah persentase fraksi kolagen tubulointerstisial renal serta kekuatan korelasi yang sangat kuat (r= -0,834).

## 4. Pembahasan
Gambaran  seluler  dari  tubulointerstisial renalis  menunjukkan  bahwa  pada  kelompok K1,  bagian  –  bagian  yang  terdapat  di  ginjal masih  jelas  baik  itu  glomerulus,  tubulus maupun  interstisialnya,  namun  pada  K10 bagian-  bagian  tersebut  sudah  susah  untuk didapatkan  dengan  jelas.  Walaupun  fibrosis merupakan  respon  terhadap  kerusakan  yang secara  normal  terjadi  dan  merupakan  proses perbaikan yang bersifat selflimiting dan untuk membatasi  kerusakan  yang  terjadi,  fibrosis dapat  bersifat  patologis  dan  dapat  bersifat merusak. Setelah kerusakan jaringan,
fibroblast  akan  menggunakan  sinyal  dan program  genetik  maupun  epigenetik  untuk berproliferasi  dan  membuat  jaringan  ikat tetapi  setelah  itu  berubah  menjadi  jaringan parut dewasa dan permanen. Kerusakan pada tubulus berkaitan dengan fibrosis yang terjadi disekitarnya. Kerusakan endotel dan hilangnya kapiler selama kerusakan dapat menghasilkan hipoksia  yang  dapat  mencegah  proses perbaikan dari bagian tubulus yang cedera dan menyebabkan  tubulus  atrofi.  Fibrosis  hanya berkembang disekitar tubulus yang mengalami atrofi  dan  tubulointerstisium  disekitarnya tetap  normal.  Namun  pada  beberapa penelitian  tentang  AKI  dimana  tubulus  gagal untuk  kembali  normal,  strukturnya  akan mengalami atrofi dan fibrosis akan berkembang disekitarnya dan akan mempengaruhi tubulus lain yang sebelumnya mengalami  proses  perbaikan  yang  sempurna atau tidak mengalami kerusakan. Episode AKI yang  berat  atau  terjadinya  iskemia  reperfusi yang  berulang  dalam  periode  waktu  tertentu dapat  menyebabkan  terbentuknya  fibrosis tubulointerstisial yang parah dan menimbulkan dampak pada sistem hemodinamik yang diakibatkan karena adanya pengurangan  massa  ginjal  oleh  adanya kerusakan sebelumnya, kerusakan yang terjadi biasanya diawali di nefron dan akan menyebar ke lingkungan sekitarnya seperti interstisial. 16
Cystatin C pertama kali digunakan sebagai prediktor  fungsi  ginjal  pada  tahun  1985  dan merupakan  protein  dasar  nonglikosilasi dengan  berat  13kDa  serta  merupakan  bagian dari  keluarga  besar cystatin  C yang  termasuk ke  dalam  sistein  protease  inhibitor  dan diproduksi  oleh  semua  sel  yang  memiliki  inti. Cystatin  C difiltrasi  oleh  glomerulus  dan selanjutnya akan direabsorbsi secara sempurna  oleh  tubulus  dan  dikatabolisme tanpa  di  skresikan  kembali. Cystatin  C tidak dipengaruhi oleh jenis kelamin, massa otot dan makanan. Secara klinis cystatin C yang diukur di  darah  dan  di  urin  dapat  digunakan  untuk
pemeriksaan pada AKI. Banyak penelitian yang telah  menggunakan  kadar cystatin  C dalam serum untuk mengetahui kerusakan yang ada di  ginjal.    Salah  satu  faktor  penting  yang memepengaruhi  penggunaan cystatin  C sebagai penanda untuk AKI adalah perubahan kadar cystatin  C yang  cepat  di  dalam  darah dapat menggambarkan perubahan pada GFR. 17 Konsentrasi normal cystatin C urin adalah <120 μg/L,  konsentrasi cystatin  C akan  meningkat pada  pasien  dengan  gangguan  pada  tubulus dibandingkan  dengan  pasien  yang  memiliki gangguan di glomerulus, hal ini  menunjukkan bahwa pengukuran cystatin C dapat mendeteksi  gangguan  fungsi  tubulus  yang diakibatkan oleh murni penyakit tubulus atau karena penyakit lain. 18
GFR dapat didefinisikan sebagai volume plasma yang secara sempurna dapat dibersihkan dari partikel- partikel yang terlarut di  dalamnya  oleh  ginjal  dalam  satuan  waktu tertentu. 19 Cedera iskemia- reperfusi  ditandai dengan  adanya  keterbatasan  aliran  darah  ke organ yang diikuti dengan pengembalian aliran darah  dan  reoksigenasi.  Hal  tersebut  dapat menyebabkan  kerusakan  di  jaringan  oleh karena adanya kaskade inflamasi seperti stress oksidatif,  sitokin,  kemokin  dan  aktivasi leukosit.  Di  ginjal,  cedera  iskemia-  reperfusi berperan  dalam  timbulnya  kondisi  patologis yang disebut AKI. Adanya berbagai mekanisme yang terlibat menyebabkan terjadinya kerusakan di hampir semua bagian dari ginjal baik  di  sistem  vaskularisasi,  glomerulus, tubulus maupun interstisial, kerusakan tersbeut  meliputi  terjadinya  edema,  nekrosis maupun apoptosis. Adanya kerusakan tersebut dapat  mempengaruhi  fungsi  ginjal  dalam menyaring  darah  yang  akan  tergambar  dari perubahan nilai GFR. 20
Fibrosis  dan  sklerosis  merupakan  suatu mekanisme  umum  yang  berperan  dalam penyakit  ginjal  yang  bersifat  progresif. Perkembangan  dari  fibrosis  ginjal  akan menyebabkan  terbentuknya  akumulasi  yang
berlebihan jaringan  ikat, kolagen primer yang mengalami  ekspresi  berlebihan  terutama  di vascular  renal,  glomerulus,  kompartemen tubulointerstisial  sebagai  respon  terhadap rangsangan patologis atau inflamasi. 21 Berbagai  jenis  sub  tipe  kolagen  akan terakumulasi selama proses ini termasuk yang di  interstisial  (kolagen  I,  III  dan  V)  dan membrane  dasar  (kolagen  IV).  Fibrosis sebenarnya melibatkan beberapa jenis kolagen  dan  menggambarkan  keseimbangan antara kolagen sintesis dan degradasi. Fibrosis kolaps  disebabkan  oleh  hilangnya  parenkim ginjal  yang  secara  teori  tidak  melibatkan sintestis kolagen. Hal ini sangat berhubungan dengan ginjal, dimana tubulus yang melingkupi hampir  sebagian  besar  masa  ginjal  dan  atrofi tubulus  yang  biasanya  diikuti  oleh  kondisi patologis  di  interstisial. Picrosirius  red biasa digunakan  untuk  mengidentifikasi  serat kolagen  yang  berbentuk  fibril  baik  secara histologi  maupun  biokimia.  Analisis  secara kuantitatif  terhadap  fibrosis  tubulointerstisial dapat  digambarkan  oleh  luas  area  jaringan yang ditutupi oleh pewarna yang spesifik atau yang  disebut  sebagai  persentase  fraksi  area fibrosis. 22

## 5. Kesimpulan
Durasi iskemia 30 menit dan reperfusi 14 hari  99,1%  berpengaruh  terhadap  gambaran seluler tubulointerstisial renalis yang tercermin dari persentase fraksi area kolagen. Durasi iskemia 120 menit dan reperfusi 14 hari 98,8% berpengaruh terhadap kadar cystatin C . Durasi iskemia 120 menit dan reperfusi 14 hari 99,5%  berpengaruh  terhadap Glomerular Filtration Rate (GFR). Terdapat korelasi positif antara  gambaran  seluler  tubulointerstisial renalis  yang  tercermin  dari  persentase  fraksi area kolagen dan kadar cystatin C dengan nilai korelasi 0,901 (sangat kuat) yang berarti ketika persentase  fraksi  area  kolagen  meningkat maka  kadar cystatin  C juga  akan  meningkat. Terdapat  korelasi  negatif  antara  antara
gambaran  seluler  tubulointerstisial  renalis yang  tercermin  dari  persentase  fraksi  area kolagen  dan Glomerular  Filtration  Rate (GFR) dengan nilai korelasi -0,834 (sangat kuat) yang berarti  ketika  persentase  fraksi  area  kolagen meningkat maka GFR akan menurun. Terdapat korelasi  negatif  antara  kadar cystatin  C dan Glomerular  Filtration  Rate (GFR)  dengan  nilai korelasi  -0,915  (sangat  kuat)  yang  berarti ketika  kadar cystatin  C meningkat  maka  GFR akan menurun.

## Ucapan Terima Kasih
Terima kasih disampaikan kepada seluruh pihak yaitu staf laboratorium biomolekuler dan animal house serta, dosen pengajar di Fakultas Kedokteran  Universitas  Sriwijaya  yang  telah membantu penyelesaian penelitian ini.

## Daftar Pustaka
1.   Melyda. Diagnosis dan Tatalaksana Acute Kidney  Injury  (  AKI  )  pada  Syok  Septik. 2017;44(12):907–11.
2.   PERNEFRI. 9 th Report Of Indonesian Renal Registry 2016. 2016;1–46.
3.   Awdishu  BL,  Wu  SE.  Acute  Kidney  Injury. 2nd ed. CCSAP; 2017. 7-26 p.
4.   Devarajan  P.  Update  on  mechanisms  of ischemic  acute  kidney  injury.  J  Am  Soc Nephrol. 2006;17(6):1503–20.
5.   Makris K, Spanou L. Acute Kidney Injury : Definition  ,  Pathophysiology  and  Clinical Phenotypes. 2016;37(2):85–98.
6.   Eltzschig  HK,  Eckle  T.  Ischemia  and reperfusion—from mechanism to translation. Nat Med [Internet]. 2011 Nov 7;17:1391. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nm.2507 7.   Lee  JA,  Choi  JW,  In  JH,  Jung  HS,  Kim  YS,
Jeon  YS,  et  al.  Hepatic  ischemic preconditioning provides protection against  distant  renal  ischemia  and reperfusion  injury  in  mice.  J  Korean  Med Sci. 2012;27(5):547–52.
8.   Meng  X,  Nikolic-paterson  DJ,  Lan  HY.
Inflammatory  processes  in  renal  fibrosis.
Nat  Publ  Gr  [Internet].  2014;10(9):493– 503. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrneph.2014.1 14
9.   Widiana  IGR.  Penyakit  Tubulointerstisial. In:  Setiati  S,  Alwi  I,  Sudoyo  AW, Simadibrata  M,  Setyohadi  B,  Syam  AF, editors. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. VI. Jakarta: Interna Publishing; 2014. p. 2114– 22.
10.  Journal  O,  Society  I.  KDIGO  2012  Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management  of  Chronic  Kidney  Disease. 2013;3(1).
11.  Meinardaniawati D, Effendi SH, Rahayuningsih SE. Kadar Cystatin-C Serum Sebagai  Penanda  Fungsi  Ginjal  Bayi Prematur. 2013;15(1):17–22.
12.  Lempiäinen  J.  Ischaemia-Reperfusion- Induced Kidney Injury. Helsinski: Institute of  Biomedicine  Pharmacology  Faculty  of Medicine  and  Doctoral  Programme  in Drug  Research  University  of  Helsinki; 2014. 1-77 p.
13.  Clef N Le, Verhulst A, Haese PCD, Vervaet BA. Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion as  a  Robust  Model  for  Acute  to  Chronic Kidney Injury in Mice. 2016;
14.  Whalen H, Shiels P, Littlejohn M, Clancy M. A  novel  rodent  model  of  severe  renal ischemia  reperfusion  injury.  Ren  Fail. 2016;38(10):1694–701.
15.  Mousavinasab  N,  Jalalzadeh  M.  A comparison  of  estimated  GFRs  based  on formulas  of  serum  cystatin  C  and  serum creatinine. Nephrourol Mon. 2017;9(3):0– 7.
16.  Venkatachalam MA, Weinberg JM, Kriz W, Bidani  AK.  Failed  Tubule  Recovery,  AKI- CKD  Transition,  and  Kidney  Disease Progression. J Am Soc Nephrol [Internet]. 2015;26(8):1765–76. Available from: http://www.jasn.org/cgi/doi/10.1681/AS N.2015010006
17.  Koyner JL, Bennett MR, Worcester EM, Ma
Q, Raman J, Jeevanandam V, et al. Urinary cystatin  C as an early biomarker  of acute kidney injury following adult
cardiothoracic surgery. Kidney Int. 2008;74(8):1059–69.
18.  Conti M, Moutereau S,  Zater M, Lallali K, Durrbach  A,  Manivet  P,  et  al.  Urinary cystatin C as a specific marker  of tubular dysfunction.  Clin  Chem  Lab  Med. 2006;44(3):288–91.
19.  Heymsfield  SB,  Arteaga  C,  McManus  C, Smith J, Moffitt S. Measurement of muscle mass  in  humans:  validity  of  the  24-hour urinary creatinine method. Am J Clin Nutr.
1983;37(3):478–94.
20.  Malek  M,  Nematbakhsh  M.  Renal ischemia/reperfusion injury; from pathophysiology  to  treatment.  J  Ren  Inj Prev [Internet]. 2015;4(2):20–7. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articl erender.fcgi?artid=4459724&tool=pmcen trez&rendertype=abstract 21.  Hewitson  TD.  Renal  tubulointerstitial fibrosis: common but  never simple. Am J Physiol Physiol. 2009;296(6):F1239–44.
22.  Hewitson  TIMD,  Smith  ER,  Samuel  CS. Qualitative  and  quantitative  analysis  of fibrosis  in  the  kidney  ABSTRACT :  Renal fibrosis results from an excess accumulation  of  connective  tissue  ,. 2014;19:721–6.
23.  Wahdaningsih  S,  Untari  EK.  Pengaruh Pemberian Fraksi Metanol Kulit Buah Naga
Merah  (Hylocerecus  polyhizus)  Terhadap Kadar  Malondialdehid  Pada  Tikus  (Rattus novergicus) Wistar Yang Mengalami Stres
Oksidatif. Res Artic Nomor. 2016;3(1):45–
55.
24.  Ho E, Karimi Galougahi K, Liu C-C, Bhindi R, Figtree GA. Biological markers of oxidative stress:  Applications  to  cardiovascular research  and  practice.  Redox  Biol.  2013
Oct;1(1):483–91.
25.  In  S,  Wresdiyati  T,  Suprayogi  A.  Respon Stres  Oksidatif  dan  Pemberian  Isoflavon terhadap  Aktivitas  Enzim  Superoksida Dismutase dan Peroksidasi Lipid pada Hati Tikus. JITV Th. 2013;18(2):146–52