## KARAKTERISTIK ANTIBAKTERI NANOCERIA- KITOSAN YANG DISINTESIS MENGGUNAKAN METODE PRESIPITASI
Muhammad Danu Rizkia, dan Iis Nurhasanah *
Departemen Fisika, Fakultas Sain dan Matematika, Universitas Diponegoro , Semarang, Indonesia
* nurhasanah@fisika.fsm.undip.ac.id
Received 2021-10-04, Revised 2022-06-23, Accepted 2023-02-13 Available Online 2023-04-04, Published Regularly April 2023

## ABSTRACT
CeO 2 nanoparticles  (nanoceria)  is  a  material  that  posseses  antibacterial  activity.  In  this  study, nanoceria  combined  with  chitosan  to  increase  its  antibacterial  property.  The  characteristic  of nanoceria-chitosan  was  analyzed  using  X-ray  diffractometer, Fourier  Transform  Infrared  (FTIR) and UV-Vis Spectrophotometer. The antibacterial activity of nanoceria-chitosan was tested using the disc diffusion method on Escherichia coli bacteria. X-ray diffraction pattern analysis showed that nanoceria-chitosan has a cubic  fluorite structure. The incorporation of chitosan in  nanoceria was identified at a wave number of 2919 cm -1 from the FTIR spectrum. Nanoceria-chitosan showed a smaller crystallite size, a larger band gap energy and better antibacterial activity than nanoceria.
Keywords: Antibacterial; Ceria; Chitosan; Nanoparticles; Precipitation

## ABSTRAK
Nanopartikel CeO 2 (nanoceria) merupakan salah satu material yang memiliki aktivitas antibakteri. Pada  penelitian  ini  nanoceria  dikombinasikan  dengan  kitosan  untuk  meningkatkan  sifat antibakterinya.  Karakteristik  nanoceria-kitosan  dianalisis  menggunakan  difraktometer  sinar-X, Fourier Transform Infrared (FTIR) dan Spektrofotometer UV-Vis. Aktivitas antibakteri nanoceria- kitosan  diuji  menggunakan  metode  difusi  cakram  pada  bakteri Escherichia  coli .  Analisis  pola difraksi sinar-X menunjukkan nanoceria-kitosan memiliki struktur kubik fluorite.  Penggabungan kitosan  pada  nanoceria  teridentifikasi  pada  bilangan  gelombang  2919  cm -1 dari  spektrum  FTIR. Nanoceria-kitosan memiliki ukuran kristalit yang lebih kecil, celah pita energi yang lebih besar dan aktivitas antibakteri yang lebih baik dari nanoceria.
Kata kunci: Antibakteri; Ceria; Kitosan; Nanopartikel; Presipitasi.

## PENDAHULUAN
Penggunaan antibiotik yang berlebihan pada penanganan penyakit infeksi akibat bakteri patogen,  seperti Escherichia  coli dan Straphylococcus  aureus menyebabkan  peningkatan resistensi bakteri terhadap antibiotik.  Hal tersebut menjadi isu global yang mendapat perhatian serius [1-3] .  Sintesis  nanopartikel  dan  ekstraksi  senyawa  yang  potensial  sebagai  antibakteri diperlukan  untuk  mengurangi  jumlah  mikroorganisme  patogen  yang  resisten  terhadap antibiotik [1,2] . Sampai saat ini, berbagai nanopartikel logam dan oksida logam dikemukakan sebagai  antibakteri,  diantaranya  nanopartikel  Cu [3] ,  nanopartikel  Ag [4] ,  nanopartikel  ZnO, nanopartikel  TiO 2 dan  nanopartikel  CeO 2 (nanoceria) [2,5-9] .  Nanopartikel  perak  memiliki toksisitas yang tinggi terhadap sel normal meskipun pada dosis yang rendah [3] . Nanopartikel ZnO dan TiO 2 menunjukkan aktivitas antibakteri yang efektif dengan pemberian radiasi cahaya ultra violet [10,11] .
Nanoceria  dikembangkan  sebagai  antibakteri  dengan  keunggulan  toksisitas  rendah dibandingkan Cu [12] , Ag [13] , ZnO dan TiO 2 [14] , bahkan tidak bersifat toksik pada sel mamalia [15] .    Berbeda  dari  nanopartikel  logam  dan  oksida  logam  lainnya,  nanoceria  memiliki mekanisme  antibakteri  unik,  dan  tidak  memerlukan  aktivasi  eksternal [10,11] .    Aktivitas antibakteri nanoceria dihasilkan dari transformasi reversibel antara dua keadaan valensi (Ce 4+ → Ce 3+ → Ce 4+ )  pada  permukaanya [2,10] .   Berbagai metode  sintesis  menghasilkan nanoceria dengan aktivitas antibakteri berbeda bergantung pada parameter sintesis yang digunakan [2,10] . Selain  itu,  modifikasi  permukaan  nanoceria  dengan  biopolimer  dapat  meningkatkan  sifat antibakteri dan keamanan aplikasinya [2,5,7,16] .
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  nanoceria-kitosan  sebagai  antibakteri. Nanoceria disintesis menggunakan metode presipitasi.  Metode presipitasi dapat menghasilkan nanomaterial dengan peralatan dan proses yang sederhana.  Nanoceria-kitosan dibuat melalui pencampuran  nanoceria  dan  larutan  kitosan  pada  temperatur  80 o C.  Pembentukan nanoceria- kitosan  diidentifikasi  berdasarkan  karakteristik  struktur  kristal,  gugus  fungsi  dan  spektrum absorpsi  Uv-Vis.    Selanjutnya,  aktivitas  antibakteri  nanoceria-kitosan  dianalisis  berdasarkan zona hambat terhadap bakteri Escherichia coli .

## METODE

## Bahan
Cerium nitrate hexahydrate (99,9%) dan Chitosan (75 – 85%, deacetylated ) (Sigma Aldrich), amonium hidroksida 25%, isopropanol, asam asetat dan etanol (Merck) dan akuades.

## Sintesis nanoceria dan nanoceria-kitosan
Nanoceria  disintesis  menggunakan  metode  presipitasi  dengan  prosedur  yang dipaparkan  pada  literatur [17] .    Larutan cerium  nitrate  hexahydrate 0,08  M  dibuat  dalam campuran pelarut akuades dan isopropanol.  Proses presipitasi berlangsung dengan meneteskan amonium hidroksida sampai tercapai pH 10 sambil diaduk menggunakan pengaduk magnetik. Produk presipitasi dicuci menggunakan etanol, kemudian dikeringkan pada temperature 100 o C selama 3 jam dan dikalsinasi pada temperature 500 o C selama 2 jam.   Nanoceria-kitosan dibuat dengan mencampurkan 200 mg nanoceria ke dalam larutan kitosan.  Kitosan dilarutkan dalam asam  asetat  0,1  M.  Campuran diaduk  dengan  kecepatan  konstan  pada  temperatur  80 o C. Selanjutnya dikeringkan selama 3 jam pada temperatur 80⁰C.

## Karakterisasi nanoceria dan nanoceria-kitosan
Struktur  dan  fase  nanoceria-kitosan  dan  nanoceria  dikarakterisasi  menggunakan difraksi sinar-X (Panalytical Expert Pro) dengan Cu k α ( λ = 1,5406 Å ) sebagai sumber sinar-X dan sudut 2 θ dari 20 o sampai 70 o dengan kenaikan 0,02 o . Fourier transform infrared (Perkin- Elmer) digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada nanoceria-kitosan dan nanoceria. Spektrum  absorpsi  dari  nanoceria-kitosan  dan  nanoceria  diamati  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  (UV  mini  1240,  Shimadzu) . Sifat  antibakteri diuji  menggunakan metode difusi cakram pada bakteri Escherichia coli . Suspensi nanoceria dan nanoceria-kitosan dibuat dalam akuades dengan konsentrasi 10% dan 20%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Gambar  1  menunjukkan  pola  difraksi  sinar-X  nanoceria  dan  nanoceria-kitosan.  Pola difraksi  nanoceria  dan  nanoceria-kitosan  menunjukan  puncak-puncak  difraksi  yang mengindikasikan  pembentukan  polikristal.  Seluruh  puncak  difraksi  yang  teramati  memiliki kesesuaian dengan puncak-puncak difraksi struktur fluorite face centered cubic (JCPDS: 34- 0394) [17,18,19,20] . Intensitas puncak difraksi nanoceria-kitosan yang lebih rendah dengan lebar spektrum pada setengah intensitas maksimum yang lebih besar dari nanoceria menunjukkan pengabungan  kitosan  pada  nanoceria [16] .  Hal  ini  dapat  diamati  lebih  lanjut  dengan menganalisis  parameter  kisi  untuk  puncak  difraksi  tertinggi  bidang  (111).    Parameter  kisi dihitung menggunakan Persamaan (1).
𝑎 = 𝜆 √ℎ 2 +𝑘 2 +𝑙 2 2𝑠𝑖𝑛𝑠𝑖𝑛 𝜃 (1)
dengan h,k,l adalah indeks Miller, dan 𝜃 adalah sudut difraksi.  Penghitungan parameter kisi memberikan nilai 5,4074 Å untuk nanoceria dan  5,4301 Å untuk nanoceria-kitosan.  Parameter kisi tersebut mendekati parameter kisi ceria struktur kubik fluorite yaitu 5,4113 Å (JCPDS: 34- 0394).  Dengan demikian nanoceria-kitosan telah berhasil disintesis.
Gambar 1. Pola difraksi sinar-X
Selanjutnya puncak difraksi dari bidang tertinggi (111) digunakan untuk mengestimasi ukuran kristalit menggunakan persamaan Scherrer (Persamaan (2)).
𝐷 = 𝐾 𝜆 𝛽𝑐𝑜𝑠𝑐𝑜𝑠 𝜃
(2)
dengan D adalah ukuran kristalit, 𝜆 adalah panjang gelombang sinar-X, 𝜃 adalah sudut difraksi, 𝛽 adalah lebar spektrum pada setengah maksimum, dan K adalah konstanta [9] . Ukuran kristalit nanoceria dan nanoceria-kitosan berturut-turut adalah 33 nm dan 26 nm. Penggabungan kitosan
pada nanoceria memperkecil ukuran kristalit, sebagaimana dikemukakan untuk nanoceria yang dimodifikasi  elemen  lain [6,20] .  Kitosan  pada  permukaan  nanoceria  dapat  menghambat pertumbuhan kristalit.
Pembentukan  ceria  dapat  diidentifikasi  lebih  lanjut  berdasarkan  karakteristik  gugus fungsi yang dianalisis dari spektrum FTIR. Spektrum FTIR nanoceria dan nanoceria-kitosan ditunjukkan  Gambar  2.  Secara  umum  ikatan  anorganik  logam  terbentuk  pada  bilangan gelombang di bawah 800 cm -1 . Vibrasi Ce-O teramati pada pita sekitar 512cm -1 dan 503 cm -1 mengindikasikan  pembentukan  ceria [6-8] . Keberadaan  kitosan  pada  nanoceria  diidentifikasi dengan pita lebar di sekitar 2919 cm -1 yang menunjukan ikatan C-H [7, 17] . Identifikasi gugus- gugus fungsi membuktikan bahwa kitosan tergabung pada nanoceria.
Gambar 2 .  Spektrum transmitansi FTIR
Sifat optis nanoceria dan nanoceria-kitosan dianalisis berdasarkan spektrum absorbansi pada rentang panjang gelombang 200-800 nm seperti tampak pada Gambar 3(a).  Nanoceria maupun nanoceria-kitosan memiliki serapan yang tinggi pada rentang panjang gelombang 200- 350  nm.  Hal  ini menandakan  bahwa  nanoceria  dan  nanoceria-kitosan memiliki  kemampuan absorbsi  kuat  terhadap  sinar  ultraviolet.    Puncak  absorbsi  pada  panjang  gelombang  312  nm bersesuaian  dengan  karakteristik  puncak  absorbsi  ceria [20] .  Spektrum  absorbsi  nanoceria- kitosan yang lebih rendah dari nanoceria menunjukkan penggabungan kitosan pada nanoceria. Selanjutnya  celah  pita  energi  nanoceria  dan  nanoceria-kitosan ditentukan  menggunakan metode Tauc’s plot pada Persamaan 3.
𝛼ℎ𝑣 = 𝐶(ℎ𝑣 − 𝐸 𝑔 ) 𝑛 (3)
dengan n adalah  orde  transisi,  yaitu:  ½  untuk  transisi  langsung  dan  2  untuk  transisi  tidak langsung, hv adalah energi foton, C adalah konstanta, dan 𝛼 adalah koefisien absorbsi yang dituliskan pada persamaan 4.
𝛼 = 2,303𝐷𝜌 𝑙𝑐 (4)
dengan D adalah  kerapatan  optik  ( D =  log I o / I ), c adalah  konsentrasi  suspensi  nanoceria, l adalah lintasan optik, ρ adalah kerapatan nanoceria 7,28 g/cm 3 [11] .
Gambar 3(b) menunjukkan celah pita energi nanoceria dan nanoceria-kitosan berturut- turut adalah 3,02 eV dan 3,24 eV. Celah pita energi nanopartikel dapat mengalami pergeseran ke arah energi yang lebih besar ( blue shift ) atau ke arah energi yang lebih kecil ( red shift ) dari
400 1000 1600 2200 2800 3400 4000 Tr an sm itan si (% ) Bilangan gelombang(cm -1 ) Kitosan Nanoceria Nanoceria-Kitosan O-H Ce-O C-H C-N C=O C-O
celah pita energi bulk -nya. Nanoceria-kitosan memiliki celah pita energi 3,24 eV yang lebih besar  dari  celah  pita  energi  nanoceria (3,02  eV)  dan  ceria bulk (3,19  eV) [9,  20] .    Hal  ini mengindikasikan  bahwa  penggabungan  kitosan  mengakibatkan  fenomena blue  shift pada nanoceria [7, 16] .
Gambar 3. (a) Spektrum absorpsi Uv-Vis dan (b) Grafik penentuan celah pita energi
Aktivitas  antibakteri  diuji  terhadap  bakteri Escherichia  coli menggunakan  metode difusi cakram.  Pengujian bertujuan mengamati kerentanan bakteri Escherichia coli terhadap nanoceria  dan  nanoceria-kitosan  yang  ditentukan  dari  pembentukan  zona  hambat.    Zona hambat  yang  besar  menunjukan  bahwa  bakteri  rentan  terhadap  zat  antibakteri.  Gambar  4 menunjukkan zona hambat nanoceria dan nanoceria-kitosan dengan konsentrasi 10% dan 20%. Zona  hambat  nanoceria-kitosan  lebih  besar  dari  nanoceria.    Hal  tersebut  menunjukkan penggabungan  biopolimer  kitosan  meningkatkan  aktivitas  antibakteri  nanoceria.    Selain  itu, zona  hambat  semakin  besar  dengan  penambahan  konsentrasi  nanoceria  maupun  nanoceria- kitosan.  Zona hambat sebesar 8 mm diperoleh untuk nanoceria-kitosan pada konsentrasi 20%.
Gambar 4. Aktivitas antibakteri nanoceria dan nanoceria-kitosan
Mekanisme aktivitas antibakteri nanoceria dijelaskan sebagai akibat interaksi langsung antara nanoceria dengan bakteri yang menyebabkan kerusakan membran dan kematian bakteri [7] . Selain itu, permukaan nanoceria yang bermuatan positif membentuk interaksi elektrostatik dengan  membran  bakteri  yang  bermuatan  negatif [6,9] .      Selanjutnya,  ketika  ion  Ce 4+ dari nanoceria teradsorpsi  ke  permukaan  membran  bakteri,  terjadi  perubahan  valensi  ion  Ce 4+ menjadi  ion  Ce 3+ yang  menyebabkan  stres  oksidatif  lipid  dan  protein  dan  meningkatkan
0 2 4 6 8 10 Z ona ham bat ( m m ) Konsentrasi (%) Nanoceria Nanoceria-Kitosan 10 20
permeabilitas  membrane [21] .  Permeabilitas berikatan  dengan  mesosom  dan  menganggu respirasi seluler, replikasi DNA, pembelahan sel, dan meningkatkan area permukaan membran bakteri [21] .  Kerapatan  ion  Ce 4+ pada  permukaan  nanoceria  semakin  banyak  ketika  ukuran kristalit  lebih  kecil.  Dengan  demikian  nanoceria-kitosan  dengan  ukuran  kristalit  yang  lebih kecil menunjukkan aktivitas antibakteri lebih baik dari nanoceria.

## KESIMPULAN
Nanoceria-kitosan  berhasil  disintesis  dengan  mencampurkan  nanoceria  produk presipitasi ke dalam larutan kitosan dan dikeringkan pada temperatur 80 o C. Nanoceria-kitosan memiliki stuktur kubik fluorite dengan ukuran kristalit 26 nm dan celah pita energi 3,24 eV. Penggabungan  kitosan  pada  nanoceria  meningkatkan  aktivitas  antibakteri  nanoceria  dengan zona hambat 8 mm terhadap Escherichia coli .

## DAFTAR PUSTAKA
1.   Liu, J., Wu, D., Zhu, N., Wu, Y., & Li, G. 2021. Antibacterial mechanisms  and applications of metal-organic frameworks and their derived nanomaterials. Trends in Food Science & Technology , 109, 413–434. https://doi.org/10.1016/ j.tifs.2021.01.012
2.   Alpaslan,  C.,  Geilich,  B.M.,  Yazici,  H.,  &  Webster,  T.J.  2017.  pH-Controlled  Cerium  Oxide Nanoparticle  Inhibition  of  Both  Gram-Positive  and  Gram-Negative  Bacteria  Growth. Scientific Reports , 7, 45859. DOI: 10.1038/srep45859
3.   Usman, M.S., Ezzat el Zowalaty, M., Shameli, K., Zainuddin, N., Salama, M., & Ibrahim, N.A. Synthesis,  characterization,  and  antimicrobial  properties  of  copper  nanoparticles. International Journal of Nanomedicine , 8, 4467-4479. doi: 10.2147/IJN.S50837
4.   Viet, P. Van, Sang, T.T., Ho, N., Bich, N. & Thi, C.M. 2018. An improved green synthesis method and  Escherichia  coli  antibacterial  activity  of  silver  nanoparticles. Journal  of  Photochemistry  & Photobiology B: Biology , 3, 23-30. https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2018.04.002
5.   Latif, M.M, Anwar-ul- Haq, Amin, F., Ajaz-un-Nabi, M., Khan, I.U., & Sabir, N. 2021. Synthesis and  antimicrobial  activities  of  Manganese  (Mn)  and  iron  (Fe)  co-doped  Cerium dioxide (CeO 2 ) Nanoparticles. Physica B , 600, 412562. https://doi.org/10.1016/j.physb.2020.412562 6.   Khadar,  Y.A.S.,  Balamurugan,  A.,  Devarajan,  V.P.,  Subramanian,  R.  &  Kumar,  S.D.  2019.
Synthesis,  characterization  and  antibacterial  activity  of  cobalt  doped  cerium  oxide  (CeO 2 :Co) nanoparticles by using hydrothermal method. Journal of Materials Research and Technology , 8(1), 267-274. https://doi.org/ 10.1016/j.jmrt.2017.12.005
7. Senthilkumar,  R.P.,  Bhuvaneshwari,  V.,  Ranjithkumar, R.,  Sathiyavimal,  S.,  Malayaman, V., & Chandarshekar, B. 2017. Synthesis, characterization and antibacterial activity of hybrid chitosan- cerium  oxide  nanoparticles-as  a  bionanomaterials . International  Journal  of  Biological Macromolecules , 16, 34-41. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.03.139
8.   Surendra,  T.  V.,  &  Roopan,  S.M.  2016.  Photocatalytic  and  antibacterial  properties  of phytosynthesized  of  CeO 2 NPs  using  Moringa  oleifera  peel  extract. JPB ,  16,  67-71. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2016.05.019
9.   Arumugam, A. Karthikeyan, C., Hameed, A.S.H., Gopinath, K., Gowri, S. & Karthika, V. 2015. Synthesis of cerium oxide nanoparticles using Gloriosa superba L. leaf extract and their structural, optical  and  antibacterial  properties. Materials  Science  and  Engineering  C ,  49,  408–415. https://doi.org/10.1016/j.msec.2015.01.042
10.  Zhang, M., Zhang, C., Zhai, X., Luo, F., Du, Y., & Yan, C. 2019. Antibacterial mechanism and activity of cerium oxide nanoparticles. Science China Materials , 62(11), 1727-1739.
11.  Bazhukovaa, I.N, Sokovnina, S.Y., Ilvesb, V.G., Myshkinaa, A.V., Vazirova, R.A., Pizurovac, N., dan Kasyanovaa, V.V. 2019.  Luminescence and optical properties of cerium oxide nanoparticles. Optical Materials , 92, 136–142. https://doi.org/10.1016/j.optmat.2019.04.021
12.  Ingle,  A.P.,  Duran,  N.,  &  Rai  M.  2014.  Bioactivity,  mechanism  of  action,  and  cytotoxicity  of copper-based nanoparticles: A review. Applied Microbiology and Biotechnology , 98, 1001–1009. DOI 10.1007/s00253-013-5422-8
13.  Asharani,  P.V.,  Low  Kah  Mun  G,  & Hande M.P. 2008.  Cytotoxicity  and  genotoxicity  of silver nanoparticles in human cells. ACS Nano , 3, 279–290. https://doi.org/10.1021/nn800596w
14. George, S. Pokhrel, S., Xia, T., Gilbert, B., Ji, Z. Schowalter, M., Rosenauer, A., Damoiseaux, R., Bardley, K.A., Madler, L., & Nel, A.E. 2010. Use of a rapid cytotoxicity screening Approach to engineer  a  safer  Zinc  Oxide  nanoparticle  through  Iron  doping. ACS  Nano ,  4,  15–29. https://doi.org/10.1021/nn901503q
15.  De  Marzi,  L.,  Monaco,  A.,  &  De  Lapuente,  J.  2013. Cytotoxicity  and  genotoxicity  of  ceria nanoparticles  on  different  cell  lines in  vitro . International  Journal  of  Molecular  Sciences ,  14, 3065–3077. doi: 10.3390/ijms14023065
16. Fang, X. & Song, H., 2018. Synthesis of cerium oxide nanoparticles loaded on chitosan for enhanced auto-catalytic regenerative ability and biocompatibility for the spinal cord injury repair. Journal of Photochemistry & Photobiology,
B: Biology , 18, 74-87.
https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2018.11.016
17.  Nurhasanah, I., Safitri, W., Arifin, Z., Subagio, A., & Windarti, T. 2018. Antioxidant activity and dose  enhancement  factor  of  CeO 2 nanoparticles  synthesized  by  precipitation  method. IOP Conference  Series:  Materials  Science  and  Engineering ,  432,  012031. doi:10.1088/1757- 899X/432/1/012031
18 . Sifontes, A.B., Gonzales, G., Ochoa, J.L., Tovar, L.M., Zoltan, T., & Canizales, E. 2011. Chitosan as template for the synthesis of ceria nanoparticles. Materials Research Bulletin , 46. 1794-1799. https://doi.org/10.1016/ j.materresbull.2011.07.049.
19. Zhang, L., Zhu, T., Liu, X., & Zhang, W. 2016.  Simultaneous oxidation and adsorption of As(III) from  water  by  cerium  modified  chitosan  ultrafine  nanobiosorbent . Journal  of  Hazardous Materials , 308, 1–10. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2016.01.015
20.  Truffault, L., Ta, M.T., Devers, T., Konstantinov, K., Harel, V., Simmonard, C., Andreazza, C., Nevirkovets,I.P., Pineuau, A., Veron, O., & Blondeau, J.P. 2010. Application of nanostructured Ca  doped  CeO 2 for  ultraviolet  filtration. Materials  Research  Bulletin ,  45,  527-535. https://doi.org/10.1016/j.materresbull.2010.02.008
21.   Rajan, A.R., Vilasb, V., Rajanc, A., Johna, A., & Philipa, D. 2020. Synthesis of nanostructured CeO 2 by  chemical  and  biogenic  methods:  Optical  properties  and  bioactivity. Ceramics International , 46(9), 14048-14055. https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2020.02.204