Vol. 06 No. 1, April 2015, Hal 49-54 ISSN: 2086-8227

## ANALISIS KROMOSOM TANAMAN JATI
( Tectona grandis Lf) DENGAN METODE PEWARNAAN
Analysis of Teak (Tectona grandis Lf ) Chromosome by Staining Method

## Arum Sekar Wulandari dan Tofan Randy Wijaya
Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan IPB Kampus IPB Darmaga, Bogor-16680 rr_arum@yahoo.com

## ABSTRACT
Counting the number of chromosomes can be conducted by analysis of chromosomes with chromosome staining. The purpose of this research is to find the right method for staining chromosomes of teak, time of the mitotic phase of teak, and  the  duration  of  the  mitotic phase  of  teak.  Overall,  to  get  good  results,  chromosomal  analysis is  done  through  four stages in the sequence was (1) the early phase of treatment, (2) stage of fixation, (3) stages of maceration and (4) stage of coloration. In this study, there were seven methods of making preparations applied to the root tip mitosis, chromosomes are stained onion root (method A), modification of maceration (method B), modification without fixation and maceration (method C), modifications time to cut teak root (D method), modification of maceration without fixation (method E), the modification  of  pre-treatment  without  fixation  and  maceration  (M  method),  and  storage  of  the  root  tip  before  pre- treatments  (method  G).  Chromosome  staining  onion  roots  used  as  a  basic  for  the  staining  method  is  easy  to  get  the correct  teak’s  chromosomes.  From  this  study,  analysis  of  teak’s  chromosome  is  known  that  D  chromosome  staining method  is  appropriate  because  the  methods  and  stages  of  mitotic  chromosomes  can  be  seen,  but  the  number  of chromosomes can not be calculated because the size of chromosomes were very small. the best time to cut the teak root at 9:00 to 10:00 am, and the duration of the mitotic phase of teak is  ± 1 hour.
Key words : chromosome , chromosome staining method , mitotic , Tectona grandis

## PENDAHULUAN
Tanaman  jati  saat  ini  sudah  banyak  dibudidayakan, terutama  dengan  teknik  kultur  jaringan  (Kumari  dan Singh  2012).  Kultur  jaringan  tidak  hanya  teknik  untuk memperbanyak  tanaman  saja,  tetapi  juga  untuk mendapatkan  jenis  tanaman  yang  berbeda  dengan induknya  (Yashoda et  al .  2005).  Dengan  teknik poliploidi  (penggandaan  kromosom)  (Pereira et  al. 2014)  bisa  didapatkan  tanaman  jati  yang  ukurannya lebih besar.
Kromosom  adalah  benang-benang  yang  terdapat pada  inti  sel  yang  berfungsi  membawa  DNA  yang bersifat  bawaan  dan  berisi  tentang  sebagian  besar informasi  untuk  aktivitas  regulasi  sel  (Francis  2007). Kromosom  akan  tampak  jelas  pada  sel  yang  aktif membelah (Zamariola et al. 2014). Jumlah kromosom di dalam  inti  sel  dari  berbagai  organisme  berbeda-beda (Chung et al . 2012, Draghia et al . 2013, Kuo 2013).
Saat ini teknik penggandaan kromosom sudah mulai digunakan  pada  tanaman  jati.  Namun  hasil  seleksinya hanya  berdasarkan    penampilan  fenotipnya  saja,  masih jarang  yang  meneliti  mengenai  perubahan  genotip (Narayanan et al . 2007). Keberhasilan teknik penggandaan  kromosom  tanaman  jati  dapat  dibuktikan dengan  menghitung  jumlah  kromosom  pada  awal  dan akhir  proses  penggandaan  kromosom  (Bedini et  al. 2012). Penghitungan jumlah kromosom dapat dilakukan dengan  cara  analisis  kromosom  dengan  metode
pewarnaan (Kubik et al. 2003, She et al. 2005,  Suman dan Kaur 2013).
Tujuan penelitian ini ialah mencari (1) metode yang tepat  untuk  pewarnaan  kromosom  tanaman  jati,  (2) waktu  terjadinya  tahap  mitosis  tanaman  jati,  dan  (3) lamanya tahap mitosis tanaman jati. Hasil penelitian ini diharapkan  dapat  menambah  informasi  mengenai metode-metode pewarnaan kromosom tanaman kehutanan  dan  menjadi  sumber  informasi  dalam  teknik penggandaan kromosom khususnya untuk tanaman jati.

## BAHAN DAN METODE

## Persiapan larutan
Larutan  8-hidroksiquinolin  0.002  M  dibuat  dengan cara  melarutkan  0.3  gram  8-hidroksiquinolin  dalam  1 liter aquades pada suhu 70ºC. Kemudian diaduk dengan menggunakan magnetic  stirer selama  1  jam  sampai terlihat  warna  kekuningan.  Larutan  disimpan  dalam wadah tertutup di dalam lemari es.
Larutan kolkisin 0.1% dibuat dengan cara melarutkan kolkisin 1 gram dalam 1 L aquades. Larutan kemudian disimpan dalam botol pada suhu ruangan.
Aceto  orcein 2%  dibuat  dengan  cara  melarutkan  1 gram orcein dalam 50 mL asam asetat glasial 45% pada suhu  90ºC.  Kemudian  diaduk  dengan  menggunakan magnetic  stirer selama  10  menit.  Setelah  agak  dingin dilakukan  filtrasi.  Larutan  disimpan  dalam  botol  gelap pada suhu ruangan.

## Persiapan akar tanaman jati
Ujung  akar  bibit  jati  berumur  4  minggu  diambil mulai dari pukul 06.00 WIB pagi sampai dengan  05.00 WIB  pagi  keesokan  harinya  dengan  selang  waktu pengambilan  setiap  1  jam.  Akar  dimasukkan  ke  dalam botol  yang  berisi  larutan  8-hidroksiquinolin  0.002  M dan  disimpan  dalam  lemari  pendingin  selama  1  jam. Ujung  akar  yang  lain  dimasukkan  ke  dalam  botol  yang berisi  larutan  kolkisin  0.1%  dan  disimpan  pada  suhu ruangan selama 1 jam (Gunarso 1989).

## Metode A
Akar  yang  telah  direndam  dalam  larutan  8- hidroksiquinolin  0.002  M  dan  kolkisin  0.1%  dicuci dengan air dan direndam dalam asam asetat 45% selama 10 menit. Akar diangkat dan dicuci kembali dengan air. Akar  dipanaskan  dalam  larutan  HCl  1N:    asam  asetat 45% = 3:1 selama 2  menit, kemudian diletakkan dalam cawan petri yang telah ditetesi dengan  larutan pewarna orcein. Akar didiamkan selama ±1 jam setelah itu ujung akar diletakkan di atas object glass lalu dipotong dengan ukuran ±1 mm menggunakan silet, kemudian diteteskan larutan pewarna orcein lalu ditutup dengan cover glass . Object glass dilewatkan pada api pembakar bunsen, lalu diketuk  dengan  pensil  dan  ditekan  dengan  ibu  jari. Preparat siap diamati di bawah mikroskop.

## Metode B
Metode  B  sama  dengan  metode  A,  dengan modifikasi pada tahap maserasi, yaitu waktu pemanasan dalam larutan HCl 1N: asam asetat 45% = 3:1 selama 5 menit, 10 menit, 15 menit, dan 20  menit dengan tujuan untuk melunakkan jaringan akar.

## Metode C
Metode  C  dilakukan  tanpa  perlakuan  fiksasi (perendaman dalam larutan 8-hidroksiquinolin 0.002 M) dan  maserasi  (perendaman  dalam  larutan  HCl  1  N  dan asam  asetat  45%).  Menurut  Gunarso  (1989)  teknik pewarnaan  kromosom  menggunakan  pewarna  orcein dengan  sampel  ujung  akar  tanaman  dilakukan  tanpa
harus  perlakuan  fiksasi,  akan  tetapi  diperlukan  tahap pra-perlakuan.  Metode  ini  dimulai  dari  membersihkan sampel  akar,  setelah  itu  bagian  ujung  akar  dipotong sepanjang 0.5−1 cm.  Tahap pra-perlakuan:  ujung akar dimasukkan dalam botol berisi kolkisin 0.1%, kemudian disimpan selama 1 jam pada suhu ruangan. Akar dicuci dengan  air,  kemudian  direndam  dalam  larutan  pewarna orcein selama 20  menit pada  suhu ± 60  ºC. Ujung akar kemudian dipotong sepanjang  ± 1 mm, diletakkan pada object  glass ,  di  atasnya  ditambahkan  dua  tetes aceto orcein 2%. Preparat ditutup dengan cover glass , setelah itu  dilewatkan  pada  api  pembakar  bunsen.    Preparat selanjutnya  diketuk  dengan  pensil  dan  ditekan  dengan ibu jari.  Preparat siap diamati di bawah mikroskop.
Hasil  pengamatan  metode  C,  penggunaan  larutan kolkisin  0.1%  memberikan  hasil  yang  lebih  baik dibandingkan dengan penggunaan larutan 8- hidroksiquinolin  0.002  M  sehingga  untuk  metode  D sampai  dengan  G  pada  tahap  pra-perlakuan  hanya digunakan larutan kolkisin 0.1%.

## Metode D
Metode  D  sama  dengan  metode  C,  dengan modifikasi  waktu  pengambilan  akar,  yaitu  pada  pukul 09.10, 09.20, 09.30, 09.40, dan 09.50 WIB.

## Metode E
Metode  E  sama  dengan  metode  C,  dengan modifikasi pada tahap maserasi, yaitu pemanasan dalam larutan HCl 1N:asam asetat glasial 45% = 3:1 selama 2 menit.

## Metode F
Metode  F  sama  dengan  metode  C,  dengan modifikasi pada tahap pra-perlakuan,  yaitu perendaman dengan larutan kolkisin selama 3, 6, 12, dan 24 jam.

## Metode G
Metode  G  sama  dengan  metode  C,  dengan modifikasi  sebelum  tahap  pra-perlakuan  yaitu  ujung akar disimpan dalam lemari pendingin selama 1 hari.
Tabel 1  Hasil pengamatan kromosom jati dengan metode A, B,dan C
Metode Waktu peng- ambilan akar Hasil Keterangan A Tiap jam selama 24 jam Kromosom tidak terlihat Sel tidak pecah Pra-perlakuan dengan 8-hidroksiquinolin 0.002 M atau  kolkisin 0.1% memberikan hasil yang sama B Tiap jam selama 24 jam Kromosom tidak terlihat Sel pecah Tahap maserasi yang tepat ialah   dengan perendaman HCl : asam asetat glasial 45% = 3:1 selama 10 menit Pra-perlakuan dengan 8-hidroksiquinolin 0.002 M atau  kolkisin 0.1% memberikan hasil yang sama C <  Pukul 09.00 WIB Kromosom tidak terlihat Sel berwarna merah Pukul  09.00 WIB Kromosom terlihat Kromosom masih berada dalam tahap profase

## Pengamatan kromosom
Setelah  mendapatkan  preparat  morfologi  akar dengan  kromosom  yang  baik  pada  mikroskop, dilakukan  pemotretan.  Pemotretan  dilakukan  dengan menggunakan kamera digital dengan perbesaran seratus kali.  Setiap  objek  yang  diamati  dilakukan  pemotretan dua kali. Pemotretan pertama, yaitu fokus pada kamera. Pemotretan  kedua,  yaitu  fokus  pada  lensa  okuler.  Hasil pemotretan  ini  memberikan  gambaran  kromosom  yang lebih  jelas.  Kromosom  diamati  secara  deskriptif. Pengamatan kromosom dibantu dengan software Adobe Photoshop .

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Metode A
Hasil  yang  diperoleh  dengan  menggunakan  metode A  ialah  kromosom  tidak  terlihat  dan  terwarnai  dengan baik. Hal ini terjadi pada tahap pra-perlakuan dengan 8- hidroksiquinolin 0.002 M maupun dengan kolkisin 0.1% (Tabel  1).  Dari  hasil  pengamatan,  diketahui  bahwa  sel akar  jati  lebih  kecil  dibandingkan  dengan  sel  akar bawang  (metode  kontrol).  Dengan  sel  yang  lebih  besar dan  jumlah  kromosom  diploid  (2n  =  16)  (Foschi et  al . 2013)  yang  lebih  sedikit,  maka  dapat  diduga  bahwa kromosom  bawang  merah  ukurannya  lebih  besar dibandingkan  dengan  kromosom  jati.  Hal  inilah  yang diduga menjadi penyebab kromosom tanaman jati tidak
terlihat  dengan  menggunakan  metode  pewarnaan kromosom bawang merah (metode A).

## Metode B
Hasil  yang  diperoleh  dengan  menggunakan  metode B  ialah  tahap  maserasi  yang  baik  dengan  perendaman selama  10  menit  karena  sel  akar  pecah  dan  menyebar sangat  baik,  tetapi  kromosom  masih  belum  terlihat (Tabel 1). Hal ini mungkin disebabkan oleh (1) lamanya perendaman  dalam  larutan  pra-perlakuan,  (2)  terlalu cepatnya proses fiksasi,  (3)  tahap  maserasi  yang terlalu lama,  (4)  tahap  pewarnaan  yang  terlalu  cepat,  dan  (5) kurang  tepatnya  konsentrasi  bahan  kimia  yang digunakan.

## Metode C
Hasil  yang  diperoleh  dengan  menggunakan  metode C ialah kromosom terlihat, namun masih sulit dilakukan penghitungan  jumlah  kromosom  karena  kromosom sangat kecil dan masih berada pada tahap profase (Tabel 1).  Waktu  pengambilan  sampel  terbaik  yang  diperoleh untuk  pengambilan  sampel  akar  jati  ialah  pukul  09.00 WIB  karena  pada  waktu  ini  kromosom  dapat  terlihat. Pada sel-sel organisme multiseluler, proses pembelahan sel memiliki tahap-tahap tertentu yang disebut siklus sel (Francis  2007).  Berdasarkan  informasi  tersebut  dapat diketahui  bahwa  tahap  mitosis  untuk  tanaman  jati dimulai  sekitar  jam  9  pagi  dan  lamanya  tahap  mitosis tanaman jati sekitar 1 jam.
Tabel 2   Hasil pengamatan kromosom jati dengan metode D, E,  dan G
Metode Waktu peng- ambilan akar Hasil Keterangan D Pukul 09.10 WIB Kromosom terlihat Sel berwarna merah Kromosom yang terlihat sangat kecil dan masih berada dalam tahap profase Pukul 09.20 WIB Kromosom terlihat Sel berwarna merah Kromosom yang terlihat sangat kecil dan masih berada dalam tahap profase Pukul 09.30 WIB Kromosom terlihat Sel berwarna merah Kromosom yang terlihat sangat kecil dan masih berada dalam tahap profase Pukul  09.40 WIB Kromosom terlihat Sel berwarna merah Kromosom yang terlihat sangat kecil dan masih berada dalam tahap profase dan tampak buram Pukul  09.50 WIB Kromosom terlihat dan tampak buram Sel berwarna merah Kromosom yang terlihat sangat kecil dan masih berada dalam tahap profase dan tampak buram E Pukul 09.00−10.00 WIB Kromosom tidak terlihat Sel berwarna merah muda Ada bercak menyerupai kromosom di tengah-tengah sel Diduga kromosom rusak pada saat tahap maserasi G Pukul 09.00 WIB Kromosom tidak terlihat Sel berwarna merah muda Sel tidak berada pada kondisi yang sama seperti waktu pengambilan akar.

## Tabel 3  Hasil pengamatan kromosom jati dengan metode F
Metode Waktu peng- ambilan akar Lama peren- daman dalam kolkisin 0.1%
Hasil Keterangan
F
09.00 WIB 3 jam Kromosom terlihat Sel berwarna merah muda Kromosom yang terlihat sangat kecil dan masih berada dalam tahap profase 09.00 WIB 6 jam Kromosom tidak terlihat Sel berwarna merah muda Ada bercak menyerupai kromosom di tengah-tengah sel Diduga kromosom rusak 09.00 WIB 12 jam Kromosom tidak terlihat Sel berwarna merah muda Ada bercak menyerupai kromosom di tengah-tengah sel Diduga kromosom rusak 09.00 WIB 24 jam Kromosom tidak terlihat Sel berwarna merah muda Ada bercak menyerupai kromosom di tengah-tengah sel Diduga kromosom rusak

## Metode D
Hasil  yang  diperoleh  dengan  menggunakan  metode ini  sama  seperti  metode  C,  yaitu  tidak  ditemukannya kromosom  yang  berada  pada  tahap  metafase  (Tabel  2). Hal  ini  disebabkan  tidak  tepatnya  waktu  pemotongan akar  jati  yang  digunakan  untuk  membuat  slide  preparat kromosom.  Menurut Zheng et al. (2014) tahap metafase hanya terjadi dalam waktu yang singkat (1−2 menit).

## Metode E
Sel-sel  pada  metode  E  terlihat  lebih  jernih dibandingkan  dengan  sel-sel  pada  metode  C  karena pengaruh dari tahap maserasi (Tabel 2). Tahap maserasi adalah  tahap  melunakkan  jaringan  akar  sehingga  sel menjadi lebih  mudah lepas, dan  sitoplasma lebih jernih dari  komponen-komponen  sel  yang  tidak  dikehendaki. Pelaksanaan  tahap  maserasi  yang  kurang  tepat  dapat mengakibatkan  terjadinya  kerusakan  sel  (Chirino et  al . 2014) dan penundaan waktu mitosis (Gudowska-Nowak et al . 2005).

## Metode F
Kromosom  yang  terlihat  pada  metode  F  masih berada  dalam  tahap  profase  (Tabel  3).  Hal  ini  diduga disebabkan  oleh  (1)  waktu  pengambilan  akar  yang kurang  tepat,  dan  (2)  lama  perendaman  akar  dalam kolkisin  0.01%  yang  kurang  optimal.  Pada  beberapa jenis  tanaman,  waktu  pengambilan  akar  yang  tepat sangat diperlukan untuk memperoleh kondisi kromosom berada  pada  tahap  metafase,  karena  sedikitnya  waktu yang  dibutuhkan  sel  untuk  melakukan  tahap  metafase. Contohnya pada tanaman Halodule sp. (Kuo 2013).
Belum  ada  standar  untuk  tingkat  konsentrasi kolkisin yang digunakan, dan lamanya waktu perendaman.  Pada  umumnya  kolkisin  akan  bekerja dengan  efektif  pada  konsentrasi  rendah,  yaitu  pada kisaran  konsentrasi  0.001%−1.00%,  dengan  lama perendaman  3−24  jam  (Suryo  1995).  Draghia et  al . (2013) menggunakan kolkisin dengan konsentrasi 0.5% selama 30 menit untuk preparasi kromosom Allium spp. dan Silene spp,  sedangkan  Foschi et  al .  (2013) menggunakan  kolkisin  dengan  konsentrasi  625–1250 µM  selama  24–48  jam  untuk  preparasi  kromosom
Allium  cepa L.    Pereira et  al. (2014)  menggunakan kolkisin  dengan  konsentrasi  0.1–0.5%  dengan  lama perendaman  1.5–24  jam  untuk  preparasi  kromosom Lolium multiforum Lam.

## Metode G
Hasil  yang  diperoleh  dengan  menggunakan  metode G  sama  dengan  metode  B.  Sel  berwarna  merah  muda dan  tidak  terlihat  ada  bercak  kromosom  (Tabel  2).  Hal ini  diduga  disebabkan  perendaman  akar  dalam  kolkisin selama  1  hari  yang  dilakukan  dalam  lemari  pendingin (suhu  ±  4 o C),  menyebabkan  kolkisin  tidak  dapat bekerja  dengan  baik  untuk  melunakkan  jaringan  akar. Perendaman  yang  dilakukan  di  dalam  lemari  pendingin biasanya  dilakukan  untuk  tahap  maserasi  yang menggunakan  larutan  larutan  HCl  1N  dan  asam  asetat 45%  (Draghia et  al .  2013);  sedangkan  yang menggunakan  kolkisin,  perendaman  dilakukan  pada suhu ruangan (Foschi et al . 2013).

## Kromosom Jati
Upaya  perakitan  bibit  unggul  dapat  dilakukan melalui  kegiatan  pemuliaan  pohon.  Faktor  penentu keberhasilan  program  perakitan  bibit  unggul,  salah satunya  adalah  tersedianya  keragaman  genetik.  Teknik yang biasanya digunakan untuk menghasilkan keragaman  genetik  ialah  poliploidisasi  (Foschi et  al . 2013),  dan  mutasi  (Mao et  al .  2005). Beberapa  metode dapat digunakan untuk menganalisis keragaman genetik yang  dihasilkan,  salah  satunya  dengan  analisis berdasarkan  susunan  kromosom  (Bedini et  al. 2012). Temuan-temuan  baru  di  bidang  sitogenetika  dapat berguna untuk mendukung program pemuliaan tanaman, baik  secara  tidak  langsung  yaitu  berupa  peningkatan pengetahuan  susunan  genetik  suatu  jenis  tanaman  (Cai dan  Zhang  2014,  Prancl et  al. 2014)  maupun  secara langsung  yang  berupa  penerapan  teknik  sitogenetika untuk  perbaikan  sifat  tanaman  (Orhan et  al .  2010, Peruzzi 2012).
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  dari  keenam metode  pewarnaan  yang  digunakan,  hanya  metode  C yang  menghasilkan  gambaran  kromosom  yang  terlihat jelas,  walaupun  jumlah  kromosom  tanaman  jati  yang
dihasilkan  belum  dapat  dihitung  karena  berukuran sangat  kecil.  Jumlah  kromosom  (2n)  setiap  makhluk hidup  berbeda-beda,  tidak  bergantung  pada  ukuran genom  (Chung et  al .  2012).  Tanaman  jati  mempunyai jumlah  kromosom  yaitu  2n  =  36  (Fofana et  al .  2008). Perubahan  jumlah  kromosom  organisme  biasanya dihasilkan  dari  mutasi  genom.    Jumlahnya  bisa bertambah,  melalui  proses  poliploidi,  yang  merupakan fenomena  penting  dalam  evolusi  vaskular  tanaman (Bedini et  al .  2012).  Jumlah  kromosom  juga  dapat berkurang  karena  terjadinya  beberapa  kali  translokasi (da  Silva et  al .  2005).    Kromosom  juga  dapat  rusak karena  radiasi  yang  dapat  menyebabkan  tertundanya proses mitosis (Gudowska-Nowak et al. 2005).
Kromosom  yang  dihasilkan  pada  penelitian  ini masih  berada  pada  tahap  profase.  Profase  merupakan tahap  paling  lama  dalam  mitosis.    Pada  proses  awal, kromosom  mulai  tampak  lebih  pendek  dan  menebal. Selanjutnya, pada sel tumbuhan, benang-benang spindle (mikrotubul) terbentuk tanpa  terikat pada sentriol (Mao et  al. 2005).  Mikrotubul  ini  berkontribusi  dalam menentukan posisi poros profase bipolar, dan orientasinya  (Ambrose  dan  Cyr  2008).  Pada  tahap profase  akhir,  masing-masing  kromosom  terlihat  terdiri dari  dua  kromatid  yang  terikat  pada  sentromer. Selanjutnya,  nukleolus  hilang  dan  membran  nukleus hancur.  Pada  tahap  ini  kromosom  terletak  bebas  di dalam sitoplasma (Zamariola et al. 2014).

## KESIMPULAN
Metode  pewarnaan  kromosom  tanaman  jati  yang tepat  ialah  metode  C  karena  dengan  metode  ini kromosom  dapat  dilihat  tetapi  jumlah  kromosom tanaman  jati  masih  belum  bisa  dihitung  karena kromosom  masih  berada  pada  tahap  profase.  Waktu pengambilan  sampel  terbaik  yang  diperoleh  untuk pengambilan  sampel  akar  jati  ialah  pada  pukul  09.00 WIB, dan lamanya tahap mitosis tanaman jati ± 1jam.

## DAFTAR PUSTAKA
Ambrose  JC,  Cyra  R.  2008.    Mitotic  spindle organization  by  the  preprophase  band  mitotic spindle organization by the preprophase. Molecular Plant 1(6): 950–960.
Bedini    G,  Garbari  F,  Peruzzi  L.    2012.    Does chromosome  number  count?  Mapping  karyological knowledge  on  Italian  flora  in  a  phylogenetic framework. Plant  Syst  Ev ol  (2012)  298:739–750. DOI 10. 1007/s00606-011-0585-1.
Cai  J,  Zhang  G.  2014.    The  novel  methods  of development of the maintainer and cytoplasmic male sterile  lines  with  different  cytoplasms  based  on chromosome  single-segment  substitution  lines  in rice. Turk J Agric For . 38:441-446.
doi:10.3906/tar-1308-75.
Chirino  MG,  Rossi  LF,  Bressa  MJ,  Luaces  JP  Merani MS.    2014.    Dipteran  chromosomes:  a  simple method  for  obtaining  high  quality  chromosomal preparations. Cur-rent Science 107:1792-1794.
Chung  K,  Hipp  AL,  Roalson  EH.  2012.    Chromosome number  evolves  independently  of  genome  size  in  a clade  with  non  localized  centromeres  ( Carex :  Cy-
peraceae).
Evolution 66(9):2708-2722 . doi:10.1111/j.1558.5646.2012.01624.x. da  Silva  CRM,  González-Elizondo  MS,  Vanzela  ALL. 2005.  Reduction  of  chromosome  number  in Eleocharis-subarticulata (Cyperaceae)  by  multiple translocations. Botanical  Journal  of  the  Linnean Society 149:457–464.
Draghia  L,  Chelariu  EL,  Sîrbu  C,  Brânzà  M,  Sandu Miculschi  C.  2013.    Analysis  of  chromosome number in some Allium and Silène wild species with ornamental  use. Not  Bot  Horti  Agrobo 41  (1):294- 300.
Fofana  IJ,  Lidah  YJ,  Diarrassouba  N,  N’guetta  SPA,
Sangare  A,    Verhaegen  D.    2008.  Genetic  structure and  conservation  of  Teak  ( Tectona  grandis ) plantations in Côte d’Ivoire, revealed by site specific recombinase  (SSR). Tropical  Conservation  Science 1(3):279-292.
Foschi  ML,  Martínez  LE,  Ponce  MT,  Galmarini  CR, Bohanec  B.  2013.      Effect  of  colchicine  and amiprophos-methyl  on  the  production  of in  vitro doubled  haploid  onion  plants  and  correlation assessment  between  ploidy  level  and  stomatal  size. Rev FCA UNCUYO 45(2):155-164.
Francis D. 2007. The plant cell cycle-15 years on. New
Phytologist 174:261–278. doi 10.1111/j.1469-
8137.2007.02038.x.
Gudowska-Nowak  E,  Kleczkowski  A,    Nasonova  E, Scholz  M,  Ritter  S.    2005.    Correlation  between mitotic  delay  and  aberration  burden,  and  their  role for  the  analysis  of  chromosomal  damage. Int  J Radiat Biol . 81(1): 23-32. Gunarso  W.  1989. Mikroteknik .  Bogor:  Departemen Pendidikan  dan  Kebudayaan  Direktorat  Jendral Pendidikan  Tinggi  Pusat  Antar  Universitas  Ilmu Hayat Institut Pertanian Bogor.
Mao  G,  Chan  J,  Calder  G,  Doonan  JH,  Lloyd  CW. 2005.    Modulated  targeting  of  GFP-AtMAP65-1  to central  spindle  microtubules  during  division. The Plant  Journal 43:469–478.    doi:  10.1111/j.  1365- 313X.2005.02464.x.
Narayanan  C,  Wali  SA,  Shukla  N,  Kumar  R,  Mandal AK, Ansari  SA. 2007.  RAPD and ISSR markers for molecular characterization of teak ( Tectona grandis ) plus  trees. Journal  of  Tropical  Forest  Science 19(4):218–225.
Orhan    I,  Demirci  B,  Omar  I,  Siddiqui  H,  Kaya  E, Choudhary  MI.  2010.    Essential  oil  compositions and  antioxidant  properties  of  the  roots  of  twelve Anatolian Paeonia taxa  with  special  reference  to chromosome  counts. Pharmaceutical  Biology 48(1):10–16.
Kubik  TJ,  Hawkins  GP,  Stringam  GR.    2003.    A modified  mordant  technique  for  staining  plant chromosomes. Genome 46:527-528.    doi: 10.1139/G03-021.
Kumari S, Singh N. 2012.  Multiplication of desert teak Tecomella undulata under in vitro conditions. J Trop Med Plants 13(2):137-143.
Kuo J.  2013.  Chromosome  numbers of the  Australian Cymodoceaceae .  Plant Syst Evol. 299:1443–1448. Prancl  J, Kaplan Z, Travnıcek P, Jarolımova  V.  2014. Genome  size  as  a  key  to  evolutionary  complex aquatic  plants:  polyploidy  and  hybridization  in Callitriche (Plantaginaceae). Plos One 9(9):1-16. Pereira  RC,  Ferreira  MTM,  Davide  LC,  Pasqual  M, Mittelmann  A,  Techio  VH.  2014.    Chromosome duplication  in Lolium  multiflorum Lam. Crop Breeding and Applied Biotechnology 14:251-255. Peruzzi L,  Góralski G, Joachimiak AJ, Bedini G.  2012. Does  actually  mean  chromosome  number  increase with latitude in vascular plants? An answer from the comparison  of  Italian,  Slovak  and  Polish  floras.
CompCytogen 6(4): 371–377.
doi: 10.3897/CompCytogen. v6i4.3955.
She  CW,  Liu  JY,  Song  YC.    2005.    CPD  staining:  an effective technique for detection of NORs and other
GC-rich chromosomal regions in plants . Bio-technic
Histochemistry 81(1): 13-21. doi:10.1080/ 10520290600661414.
Suman  V,  Kaur  H.    2013.    First  report  on  C-banding, fluorochrome  staining  and  NOR  location  in holocentric chromosomes of
Elasmolomus
( Aphanus ) sor-didus Fabricius,  1787  (Heteroptera, Rhyparochromidae. ZooKeys 319:  283–291.      doi:
10.3897/zookeys.319.4265.
Suryo.  1995. Sitogenetika .  Yogyakarta:  Gadjah  Mada University Press.
Yasodha R, Sumathi R, Gurumurthi K. 2005.  Improved micropropagation  methods  for  teak. Jountal  of Tropical Forest Science 17(1):63-75.
Zamariola  L,  Tiang  CL,  De_Storme  N,  Pawlowski  W, Geelen  D.  2014.  Chromo-some  segregation  in  plant meiosis. Plant Science 5:1-20.
Zheng J, Sun C, Zhang S, Hou X.  2014.  Karyotype of mitotic  metaphase  and  meiotic  diakinesis  in  non- heading  Chi-nese  cabbage. Plant  Syst  Evol . 300:295–302.    DOI  10.1007/s00606-013-0882-y.