Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2014.25.2.158
Hasil Penelitian

## PENGHAMBATAN CAJUPUTS CANDY TERHADAP VIABILITAS KHAMIR Candida albicans

## SECARA IN VITRO
[Inhibition of Cajuputs Candy Toward the Viability of Candida albicans by using In Vitro Assay]
C. Hanny Wijaya 1) *, A. Fieki Rachmatillah 1) dan Boy M. Bachtiar 2)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Departemen Biologi Oral, Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Indonesia, Jakarta
Diterima 27 April 2014 / Disetujui 01 Desember 2014

## ABSTRACT
The utilization of cajuput essential oil as a flavor in candy may produce a physiological active added value. Some compounds of cajuput plant (Melaleuca cajuputi L) have been reported for their anti-microbial activities. Candida albicans is a normal commensal organism in human mouth. However, it may become virulent and responsible for oral diseases known as oral candidiasis. This study aimed to determine the effect of cajuput and peppermint oil in cajuputs candy in inhibiting the C. albicans biofilms formation by using in vitro biofilm assay and viability assay. Furthermore, the influence of concentration of cajuput oil on the anti-microbial activities had been analyzed. All the tested concentration of cajuput oil in cajuputs candy was effective to inhibit the viability of C. albicans. The provision of flavor components of cajuput and peppermint oil could produce synergistic effects compared to a single flavor component. The addition of cajuput oil at 0.6% was able to inhibit the viability of C. albicans. The activities of the cajuput oil showed positive correlation to the concentration. The variable of plus and minus 0.1% addition of the cajuput oil concentration, however, produced no significant difference to inhibit the growth of C. albicans in biofilm. Sensory test, hedonic test, was conducted to evaluate the flavor, aroma, and overall attributes, resulting in no significant difference between 0.6 to 0.8% additions of cajuput oil upon the sensory acceptance.
Keywords: biofilm assay, cajuputs candy, cajuput oil, Candida albicans, viability assay

## ABSTRAK
Penggunaan minyak atsiri kayu putih sebagai perisa dalam permen memungkinkan memberi nilai tambah aktifitas fisiologis aktif bagi produk. Komponen yang terkandung dalam tanaman kayu putih ( Melaleuca cajuputi L) dilaporkan memiliki aktivitas antimikroba. Candida albicans adalah mikroorganisme flora normal mulut, namun pada kondisi tertentu dapat menjadi virulen dan bertanggungjawab atas terjadinya penyakit pada mulut yang dikenal sebagai kandidiasis mulut. Penelitian ini bertujuan untuk Menetapkan potensi perisa kayu putih dan peppermint yang terkandung di cajuputs candy dalam menghambat  pembentukan biofilm C.albicans berdasarkan  uji biofim dan viabilitas secara in vitro. Pengaruh konsentrasi perisa  kayu  putih  terhadap  kemampuan  penghambatan  viabilitas C.albicans juga  dianalisis  dalam  penelitian  ini.  Hasil  uji  menunjukkan  bahwa konsentrasi minyak atsiri kayu putih yang ditambahkan pada cajuputs candy efektif untuk menghambat vialibilitas C. albicans . Proporsi gabungan perisa kayu putih dan peppermint dapat memberikan efek sinergis dibandingan dengan masing-masing perisa tunggalnya.  Penambahan perisa kayu putih pada konsentrasi 0.6% dapat menghambat viabilitias C. albicans . Aktivitas perisa kayu putih berkorelasi positif dengan konsentrasinya, namun variasi penambahan dan pengurangan konsentrasi 0.1% belum memberikan hasil berbeda nyata terhadap penghambatan. Pembentukan biofilm C.albicans uji  penerimaan  sensori  permen  dengan  menggunakan  uji  hedonik  terhadap  cita-rasa,  aroma,  dan  keseluruhan  atribut menunjukkan tidak adanya perbedaan nyata terhadap kesukaan pada penambahan perisa dengan kisaran 0.6 sampai 0.8%.
Kata kunci: cajuputs candy , Candida albicans , bioavailabilitas, biofilm

## PENDAHULUAN
1
Sariawan  merupakan  salah  satu  infeksi  pada  jaringan mukosa mulut yang sering terjadi secara berulang. Penyakit ini dikenal  dengan  nama  Stomatitis  Aftosa  Rekuren  (SAR) dikalangan medis (Haikal, 2009). Salah satu pemicu terjadinya SAR  adalah  keberadaan Candida  albicans . C. albicans merupakan  flora  normal  usus,  hidup  komensal  dalam  rongga mulut dan saluran pencernaan (Juanda, 1999). Pada umumnya C. albicans berada dalam tubuh manusia sebagai flora normal, dan  infeksi  baru  terjadi  bila  terdapat  faktor  predisposisi  pada tubuh  inang.  Faktor-faktor  yang  memungkinkan  terjadinya
*Penulis Korespondensi: E-mail: hazemi@indo.net.id
infeksi  jamur Candida (kandidosis)  antara  lain  kondisi  tubuh yang  lemah  atau  keadaan  umum  seseorang  yang  buruk, dikarenakan  adanya  penyakit  tertentu,  dan  kehamilan (Tjampakasari, 2006). C. albicans dapat membentuk komunitas dengan  membentuk  koloni  yang  disebut  biofilm,  berfungsi sebagai pelindung sehingga menyebabkan C. albicans memiliki resistensi  terhadap  antimikroba  tertentu  (Nobile  dan  Mitchell, 2005).
Tanaman  kayu  putih  ( Melaleuca  cajuputi L  dan Melaleuca leucadendron )  merupakan  salah  satu  tanaman  penghasil minyak  atsiri  (Polontalo,  2009).  Minyak  atsiri  kayu  putih diperoleh melalui proses penyulingan daun tanaman kayu putih. Sifat  kimia  minyak  kayu  putih  ditentukan  oleh  komponennya, seperti sineol sebagai komponen utama (Ketaren dan Djatmiko,
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2014.25.2.158
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
1978)  dan  senyawa-senyawa  lain  seperti  Benzaldehid, Valeraldehid,  α-Terpineol,  l-α-Pinen,  l-Limonen,  Dipenten, Seskuiterpen,  Azulen  dan  Seskuiterpen  alkohol  (Guenther, 1990). Kemampuan komponen α-terpineol dan terpien-4-ol yang terkandung  dalam  minyak  atsiri  kayu  putih  dilaporkan  mampu menghambat  aktivitas  mikroba Streptococcus  spp. dan C. albicans (Jedlickova et al. 1994). Minyak atsiri peppermint yang memiliki  menthol  sebagai  komponen  utama  juga  dilaporkan mampu  menekan  aktivitas  mikroba  penyebab  kariogenik (Dwivedi et al. 2012; Galvao et al. 2012). Kariogenik merupakan suatu  keadaan  dimana  terjadi  karies  gigi  (Nishikawara et  al. 2006).
Asupan  pangan  dapan  dapat  mengubah  homeostatis mikroba pembentuk biofilm dalam mulut menjadi sesuatu yang menguntungkan  atau  merugikan  bagi  inangnya  (Kreth et  al. 2008). Penelitian  terkini  menunjukkan  bahwa  asupan  pangan dapat  memerankan  fungsi  dalam  pencegahan  penyakit  dan menjaga  keseimbangan  mikroflora  dalam  mulut  (Kazemi et  al. 2011). Cajuputs  candy merupakan  produk  konfeksioneri  yang mengandung  komponen flavor minyak  atsiri  kayu  putih  dan minyak peppermint (Wijaya et  al. 2002).  Pemanfaatan  minyak atsiri  kayu  putih  sebagai  komponen flavor pada  permen didasarkan pada pertimbangan bahwa minyak atsiri kayu putih dapat juga berfungsi obat internal, antimikroba, dan antimikotik (Agusta,  2000).  Minyak  atsiri  kayu  putih  dikenal  sebagai ingredien  perisa  alami  yang  diperbolehkan  oleh  FDA,  JEFCA dan  FEMA  (Burdock,  2010).  Menurut  Burdock  (2010),  asupan harian  yang  dimungkinkan  ( Possible  Average  Daily  Intake = PADI)  dari  minyak  atsiri  ini  sesuai  dengan  ketentuan  FEMA (1994) adalah 0.831 mg. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memastikan  kemampuan  formula  dan  konsentrasi ingredient penyusun cajuputs  candy untuk  menghambat  pembentukan biofilm dan viabilitas Candida albicans secara in vitro . Penelitian ini juga bertujuan untuk mengetahui respon penerimaan sensori produk cajuputs candy yang dihasilkan.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Minyak  atsiri  kayu  putih  diperoleh  dari  pulau  Buru  dan minyak peppermint diperoleh  dari  Brataco  Chemical  ltd. Candida  albicans ATCC  10231 diperoleh  dari  laboratorium biologi  oral  Fakultas  Kedokteran  Gigi  Univeritas  Indonesia. Sirup  glukosa  dan  pereaksi  yang  digunakan  untuk  analisis diperoleh  dari  supplier  di  Jakarta,  sedangkan  sukrosa  dibeli  di supermarket di Bogor.
Pembuatan sampel cajuputs candy
Permen  dibuat  dengan  mencampur  sukrosa  dan  air kemudian dipanaskan hingga suhu 110°C, kemudian ditambah- kan sirup glukosa. Pemanasan dilanjutkan hingga suhu 138°C. Setelah  tercapai  suhu  138°C  pemanasan  dihentikan  dan komponen flavor minyak  kayu  putih  (MKP)  dan  minyak peppermint (MPP)  ditambahkan,  kemudian  adonan cajuputs candy dicetak (Wijaya et al. 2002).
Pada penelitian ini dibuat permen dengan berbagai formula. Pada  uji  pendahuluan  dibuat  2  variasi  formula  MKP,  yaitu formula  A  0.7%  dan  formula  B  1.4%  untuk  mengetahui konsentrasi  MKP  dalam cajuputs  candy yang  efektif  dalam menghambat pembentukan biofilm C. albicans. Pada pengujian pengaruh  masing-masing ingredient penyusun  terhadap kemampuan penghambatan dibuat 4 formulasi yaitu formula C kontrol  (tanpa  penambahan flavor Minyak  Kayu  Putih  (MKP) dan Minyak Pappermint (MPP)), formula D (MKP 0.7%), formula E  (MPP  0.2%)  dan  formula  F  (formula  standar  lengkap  MKP 0.7%  dan  MPP  0.2%).  Pada  pengujian  untuk  mengetahui konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  yang  paling  efektif  dalam menghambat viabilitas C. albicans uji sensori hedonik, formula yang  dibuat  adalah  variasi  MKP  dengan  penambahan  dan pengurangan  0.1%  dari  konsentrasi  standar  (formula  G  MKP 0.6%, formula H MKP 0.7% dan formula I MKP 0.8%).
Pada  uji  kemampuan  penghambatan cajuputs  candy ter- hadap  pembentukan  biofilm  dan  viabilitas C. albicans ,  terlebih dahulu  dilakukan  proses  pelarutan  sampel cajuputs  candy dengan  menggunakan  aquades  dengan  perbandingan  sampel dan aquades 1:1 (v/v). Larutan ini yang selanjutnya diujikan.
Persiapan saliva (Ye et al. 2004)
Sebelum  dilakukan  pengambilan  saliva,  donor  terlebih dahulu  berkumur-kumur  menggunakan  air  dalam  kemasan kemudian saliva ditampung dalam tube 15 mL yang diletakkan di  dalam  es  selama  sepuluh  menit.  Selanjutnya  dilakukan sentrifugasi  dengan  kecepatan  12000  rpm  selama  15  menit pada  suhu  4°C,  ke  dalam  tabung  saliva  ditambahkan phenylmethylsulfonyl 1 µL (E-Merck), supernatan yang dihasil- kan  kemudian  difilter  dengan filter  sartorius yang  berdiameter 0.20  µm  dan  disterilisasi.  Saliva  dilapiskan  ke  dalam  sumur @50  µL,  dan  diinkubasi  selama  empat  jam  pada  suhu  37°C. Saliva kemudian dibuang, sehingga dihasilkan endapan protein yang  merupakan  komponen-komponen  saliva  seperti  enzim, mucins, dan proline (Ye et al. 2004). Sumur selanjutnya dicuci dengan  200  µL  Phosphate  Buffer  Saline  (PBS)  (E-Merck). Sebanyak 2 X 10^6 CFU/mL C . albicans selanjutnya diinokulasi- kan  ke  dalam  sumur.  Penggunaan  saliva  bertujuan  untuk menciptakan  kondisi  percobaan  seperti  keadaan  mulut  pada umumnya.

## Persiapan serum
Pelapisan serum pada dasar sumur bertujuan untuk meng- induksi  pembentukan  hifa C. albicans .  Serum  merupakan campuran  kompleks  albumin,  faktor  pertumbuhan,  dan  peng- hambat pertumbuhan. FBS diambil dari serum fetus hewan dan tidak  ada  tambahan  campuran  kimia  lainnya  (Hudson  and Smith, 1998). Prosedur yang dilakukan sama dengan prosedur persiapan  saliva.  Serum  dengan  konsentrasi  50%  ditampung pada  tube  15  mL  dalam  es  selama  sepuluh  menit,  kemudian dilakukan  sentrifuse  12000  rpm  selama  15  menit  pada  suhu 4°C,  dan  ditambahkan  phenylmethylsulfonyl  1  µL  (E-Merck), supernatan yang dihasilkan difilter dan disterilisasi. Selanjutnya serum sebanyak @50 µL dituangkan ke dalam sumur. Setelah diinkubasi selama empat jam pada suhu 37°C, serum kemudian dibuang  dan  dibilas  menggunakan  200  µL  Phosphate  Buffer Saline (PBS). C. albicans siap diinokulasikan kedalam sumur.
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2014.25.2.158
Hasil Penelitian
Pembenihan Candida albicans C. albicans ditumbuhkan pada media Sabourauds Dextrose Agar  (SDA) dan  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  24  jam. Hasil biakan kemudian diambil sebanyak satu ose dan dimasuk- kan ke dalam media YNB, dan diinkubasi pada shaker incubator (Memmert) pada suhu 37°C selama 24 jam. Medium kultur YNB yang  telah  ditumbuhi  oleh  mikroba  uji,  selanjutnya  diukur  nilai Optical  Density  (OD)nya  menggunakan microplate  ELISA reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Microplate ELISA reader (Bio-Rad  Laboratories,  Hercules,  CA)  adalah  alat  yang berfungsi  mengukur  tingkat  kemampuan  gelombang  cahaya untuk menembus suatu larutan atau suspensi. Apabila di dalam medium kultur YNB banyak ditumbuhi mikroba uji maka nilai OD yang  dihasilkan  akan  tinggi.  Panjang  gelombang  yang  diguna- kan  pada  pengukuran  ini  adalah  655  nm.  Untuk  mendapatkan konsentrasi  yang  sama  dalam  setiap  perlakuan  dilakukan pengukuran konsentrasi awal mikroba uji.

## Pengukuran konsentrasi mikroba uji
Medium kultur Yeast Nitrogen Base (YNB), yang ditumbuhi oleh mikroba uji diambil sebanyak 200 µL kemudian ditempat- kan  dalam  sumur  dan  dimasukan  kedalam microplate  ELISA reader (Bio-Rad  Laboratories,  Hercules,  CA)  yang  telah  diatur pada  panjang  gelombang  655  nm.  Setelah  diketahui konsentrasi  dari  mikroba  uji  dilakukan  pengenceran  untuk mendapatkan  konsentrasi  mikroba  uji  yang  seragam  meng- gunakan  larutan  Phosphate  Buffer  Saline  (PBS).  Nilai konsentrasi C. albicans yang  akan  diujikan  pada  setiap perlakuan  adalah  10 6 CFU/mL.  Untuk  mengetahui  besarnya konsentrasi  mikroba  uji  yang  harus  diinokulasikan  ke  dalam sumur, dilakukan perhitungan dengan menggunakan persama- an dibawah ini:
V 1 M 1 = V 2 M 2
Keterangan: V 1   : Volume awal mikroba uji M 1   : Konsentrasi  awal  Optical  Density  (OD)  mikroba  uji  yang  diukur  dengan microplate reader
V 2   : Volume yang dibutuhkan untuk melakukan perlakuan (96 sumur (NUNC Denmark) x 100 µL = 9.6 mL)
M 2   : Konsentrasi mikroba yang diharapkan (10 6 CFU/mL)
Penentuan  konsentrasi  efektif  MKP  dan  pengaruh komponen-komponen  penyusun  formula cajuputs  candy (Wijaya et al. 2002) C. albicans dengan konsentrasi 10 6 CFU/mL dimasukan ke dalam tissue  culture  plate 96  sumur  sebanyak  100  µL  yang telah  dilapisi  saliva  atau  serum,  kemudian  diinkubasikan  pada suhu 37°C selama 90 menit dalam shaker incubator (Memmert). Selanjutnya C. albicans dibuang sehingga meninggalkan biofilm pada  permukaan  sumur,  dan  dilakukan  pembilasan  sebanyak dua kali menggunakan larutan  Phosphate Buffer Saline (PBS). Sumur baris pertama ditambahkan medium YNB sebanyak 200 µL  tanpa  bahan  uji,  berfungsi  sebagai  kontrol  positif.  Kontrol positif  merupakan  kelompok  perlakuan  tanpa  penambahan bahan uji. Sumur baris kedua diberi perlakuan penambahan 150 µL  media  YNB  dan  50  µL  formula cajuputs  candy yang mengandung  sukrosa,  sirup  glukosa,  minyak  kayu  putih konsentrasi  0.7%,  dan  minyak peppermint (formula  A).  Sumur ketiga diberi perlakuan penambahan 150 µL media YNB dan 50
µL  formula cajuputs  candy yang  mengandung  sukrosa,  sirup glukosa,  minyak  kayu  putih  dengan  konsentrasi  1.4%  dan minyak peppermint (formula  B).  Kontrol  negatif  diperoleh dengan  menginjeksikan  medium  YNB  sebanyak  200  µL  tanpa bahan uji dan tanpa penambahan C. a lbicans ke dalam sumur ke delapan. Sampel perlakuan selanjutnya digunakan dalam uji biofilm dan uji viabilitas.
Persiapan  sampel  uji  berikutnya  bertujuan  untuk mengetahui  pengaruh  formula  penyusun cajuputs  candy . Penempatan kontrol positif ditambahkan pada sumur baris per- tama, dan kontrol negatif pada sumur kedelapan. Sumur kedua diberi  perlakuan  penambahan  150  µL  media  YNB  dan  50  µL formula cajuputs candy yang mengandung komponen sukrosa, sirup glukosa, dan air mineral. Formula ini merupakan formula hard  candy pada  umumnya  tanpa  dilakukan  penambahan komponen flavor minyak  atsiri  kayu  putih  dan  minyak peppermint (formula C). Sumur ketiga (formula D) diberi 150 µL media YNB dan 50 µL perlakuan penambahan cajuputs candy dengan komponen penyusunnya berupa sukrosa, sirup glukosa, air  mineral,  dan  minyak  atsiri  kayu  putih.  Sedangkan  untuk sumur keempat (formula E) berisi 150 µL media YNB dan 50 µL cajuputs  candy dengan  komposisi  sukrosa,  sirup  glukosa,  air mineral,  dan  minyak  atsiri peppermint .  Sumur  kelima  diberi perlakuan penambahan 150 µL media YNB dan 50 µL cajuputs candy dengan  komponen  penyusunnya  berupa  sukrosa,  sirup glukosa,  air  mineral,  minyak  atsiri  kayu  putih  dan  minyak peppermint (formula F). Sampel perlakuan selanjutnya diguna- kan dalam uji biofilm dan uji viabilitas.
Pengaruh  variasi  konsentrasi  komponen  MKP  terhadap viabilitas C. albicans
Persiapan  sampel  uji  yang  terakhir  ini  dilakukan  untuk mengetahui  konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  yang  efektif dalam  menghambat  pembentukan  biofilm  dan  viabilitas  khamir C. albicans .  C. albicans dengan  konsentrasi  10 6 CFU/mL dimasukkan  ke  dalam tissue  culture  plate 96  sumur  sebanyak 100  µL  yang  telah  dilapisi  saliva  atau  serum,  kemudian diinkubasikan pada suhu 37°C selama 90 menit dalam shaker incubator (Memmert). C. albicans selanjutnya dibuang sehingga meninggalkan  biofilm  pada  permukaan  sumur,  dan  dilakukan pembilasan sebanyak dua kali menggunakan larutan Phosphate Buffer  Saline  (PBS).  Sumur  pada  baris  pertama  merupakan kontrol, kemudian sumur pada baris kedua ditambahkan 150 µL media  YNB  dan  50  µL  formula cajupus  candy dengan  pe- nambahan  konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  sebesar  (0.7- 0.1%) yang kemudian disebut sebagai formula G. Sumur pada baris  keempat  (formula  H)  dan  kelima  (formula  I)  masing- masing  ditambahkan  150  µL  media  YNB  dan  50  µL cajuputs candy dengan  konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  sebesar (0.7%)  dan  (0.7+0.1%).  Sebagai  kontrol  negatif  ditambahkan medium YNB sebanyak 200 µL pada sumur kedelapan. Sampel perlakuan  selanjutnya  digunakan  dalam  uji  biofilm  dan  uji viabilitas.
Uji viabilitas C. albicans dilakukan dengan dua kali ulangan perlakuan  dan  masing-masing  perlakuan  menggunakan  tiga ulangan  pengukuran. Tissue  Culture  Plate yang  sudah  terisi selanjutnya  diinkubasi  dalam  inkubator  dengan  suhu  37°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi selama 24 jam cairan yang
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2014.25.2.158
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
0.294 ± 0.013 a
0.209 ± 0.025 b 0.143 ± 0.048 c 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Kontrol MKP [0,7%] MKP [1,4%] Ab so rb an si Konsentrasi Minyak Kayu Putih
ada dalam tiap sumur dikeluarkan dengan menggunakan pipet sehingga  meninggalkan  biofilm  yang  melekat  pada  dasar sumur.  Masing-masing  biofilm  yang  dihasilkan  dicuci  meng- gunakan larutan Phosphate Buffer Saline (PBS) sebanyak 100 µL untuk membersihkan sisa setiap perlakuan.
Prosedur uji biofilm (Broschat et al. 2005) Pemberian  larutan  Crystal  Violet  (CV)  untuk  meng- kuantifikasi C. albicans yang membentuk biofilm di dasar sumur (Broschat et  al. 2005).  Ke  dalam  setiap  sumur  dimasukan crystal  violet  (CV)  0.5%  sebanyak  200  µL,  dan  setelah didiamkan  selama  15  menit,  cairan  CV  yang  ada  pada  tiap sumur dibuang. Biofilm yang tampak berwarna ungu kemudian Dicuci sebanyak 2 kali, degan menggunakan  larutan Phosphat Buffer Saline (PBS, pH 7.2) diangin-anginkan pada suhu ruang dengan  kondisi  steril.  Setelah  kering,  ke  dalam  sumur ditambahkan etanol 95% sebanyak 200 µL dengan tujuan untuk melepaskan  CV  dari  dinding  sel C. albicans .  Microplate  yang telah  berisi  suspensi  campuran  biofilm  dan  etanol  selanjutnya dimasukan  ke  dalam  microplate  ELISA  reader  (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) pada panjang gelombang 655 nm. Pengukuran menggunakan ELISA reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) akan menghasilkan nilai OD.

## Prosedur uji viabilitas (Doyle dan Griffith, 2000)
Selain  itu  dilakukan  pengukuran  viabilitas C. albicans dengan menggunakan metode uji MTT.  Metode ini merupakan metode  kolorimetrik,  dimana  pereaksi  3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl  tetrazolium  bromide  (MTT)  (E-Merck) yang merupakan  garam  tetrazolium  dapat  dipecah  menjadi  kristal formazan  oleh  sistem  suksinat  tetrazolium  reduktase  yang terdapat  dalam  jalur  respirasi  sel  pada  mitokondria  yang  aktif pada sel yang masih hidup. Kristal formazon ini memberi warna ungu yang dapat dibaca absorbansinya dengan menggunakan microplate ELISA  reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) (Doyle  dan  Griffith,  2000).  Cairan  pada  tiap  sumur  dibuang sebanyak  100  µL,  ditambahkan  pereaksi  MTT  @  50  µL  dan diinkubasi selama tiga jam pada 37°C, kemudian ditambahkan isopropanol  acidified  sebanyak  100  µL  untuk  menghentikan pereaksi MTT, lalu dibaca pada microplate ELISA reader (Bio- Rad Laboratories, Hercules, CA) pada panjang gelombang 655 nm.

## Uji organoleptik (Adawiyah dan Waysima, 2009)
Uji organoleptik yang digunakan dalam pengujian ini adalah uji  rating  hedonik  yang  bertujuan  untuk  mengevaluasi  daya terima panelis terhadap produk  yang diujikan. Uji ini dilakukan oleh  70  orang  panelis  tidak  terlatih.  Panelis  diminta  untuk mencoba tiga buah sampel cajuputs candy yang disajikan dari kiri  ke  kanan  dengan  cara  mencium  dan  mengulum  sampel tersebut.  Setiap  pergantian  sampel,  panelis  diminta  untuk menetralkan mulut dengan meminum air mineral yang disedia- kan. Pada setiap sampel diberikan kode acak berupa tiga digit angka  yang  kemudian  disajikan  kepada  panelis  secara  ber- samaan.  Sampel  yang  diberikan  kepada  panelis  sebelumnya telah  dihancurkan  dengan  tujuan  untuk  mengurangi  bias terhadap  bentuk  sampel  yang  berbeda-beda.  Atribut  sensori yang  diuji  meliputi  aroma,  rasa,  dan  overall.  Analisis  data
dilakukan menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) dengan uji  lanjut  Duncan.  Uji  ini  menggunakan  taraf  signifikansi  5%. Skala  yang  digunakan  adalah  skala  kategori  7  poin  dengan deskripsi sebagai berikut: (1) sangat tidak suka, (2) tidak suka, (3)  agak  tidak  suka,  (4)  netral,  (5)  agak  suka,  (6)  suka,  (7) sangat suka. Uji rating hedonik dilakukan terhadap tiga formula cajuputs candy yaitu formula G, H dan I.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Konsentrasi  minyak  kayu  putih  dalam  formula cajuputs candy yang dapat menghambat viabilitas C. albicans Cajuputs  candy yang  dihasilkan  dari  proses  pemanasan memiliki karakteristik penampakan bening dengan tekstur yang keras.  Mengingat  uji  penghambatan  viabilitas  khamir C. albicans dilakukan  dalam  bentuk  cair,  maka  diperlukan  proses pelarutan  permen  kembali  ke  dalam  bentuk  cair  yang  dalam penelitian  ini  dilarutkan  dengan  aquades  1:1  (v/v),  sehingga semua  konsentrasi  terencerkan  satu  kali.  Nurramdhan  (2010) dalam  penelitiannya  mengenai  kemampuan  minyak  kayu  putih dan  komponen  penyusun flavor cajuputs  candy terhadap akumulasi  biofilm Streptococcus  mutans dan Streptococcus sobrinus tidak  melakukan  proses  pemanasan  hingga  menjadi permen,  formula  dalam  pengujian  yang  digunakan  adalah formula  dalam  bentuk  cair,  dan  tidak  memerlukan  pelarutan cajuputs  candy .  Dalam  penelitian  ini  dilakukan  modifikasi terhadap  penelitian  Nurramdhan  (2010)  dengan  melakukan proses  pemanasan  formula cajuputs  candy sehingga  menjadi produk  permen.  Dengan  perlakuan  ini  diharapkan  formula penyusun dalam permen lebih mendekati produk yang sebenar- nya.  Hasil  pengujian  menunjukkan  bahwa  konsentrasi  minyak kayu  putih  sebesar  0.7%  yang  ditambahkan  dalam  formula cajuputs  candy mampu  menghambat  pembentukan  biofilm C. albicans dibandingkan dengan kontrol berkorelasi positif dengan konsentrasi MKP yang ditambahkan (Gambar 1). Pelczar et al. (1993)  menyebutkan  semakin  tinggi  konsentrasi  suatu  zat antimikroba  maka  semakin  efektif  antimikroba  tersebut  meng- hambat pertumbuhan atau membunuh mikroorganisme.
Keterangan:    *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%
Gambar 1.  Penambahan  konsentrasi  minyak  kayu  putih  dalam cajuputs candy terhadap pembentukan biofilm (absorbansi menyatakan  biofilm  yang  terbentuk)  (MKP=  minyak  kayu putih )
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2014.25.2.158
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
0.294 ± 0.074 b
0.627 ± 0.057 a
0.021 ± 0.009 c 0.011 ± 0.009 c 0.005 ± 0.003 c 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 Kontrol C D E F R ata -ra ta A bs or ba ns i Formula Permen 0.062 ± 0.016 b 0.124 ± 0.030 a 0.016 ± 0.002 c 0.031 ± 0.012 c 0.023 ± 0.011 c
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 Kontrol C D E F R at a- ra ta A bs or ba ns i Formula Permen
Daya hambat terhadap pembentukan biofilm mengindikasi- kan potensi minyak kayu putih dalam menghambat aktivitas C. albicans . Dutta et al. (2007) menyebutkan bahwa minyak atsiri yang  dihasilkan  dari  tanaman Eucalyptus  citriodora memiliki aktivitas  dalam  menghambat  spesies Candida .  Daya  hambat yang  dimiliki Eucalyptus  citriodora ini  disebabkan  karena komponen  yang  terkandung  dalam  minyak  atsiri  kayu  putih dapat  menghambat  jalur  respirasi  kimia  dan  merusak  struktur sel seperti degradasi dinding sel, penghambatan aktivitas enzim protease,  dan  perusakan  membran  sel  (Burt,  2004).  Aktivitas serupa  yang  mungkin  dimiliki  oleh  MKP  mengingat  MKP mempunyai  kandungan  komponen  aktif  yang  menyerupai minyak  atsiri  dari E. citriodora .  Pada  pengujian  ini  hanya menggunakan  dua  variasi  konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih dan  konsentrasi  yang  diujikan  tidak  melebihi  1.4%.  Hal  ini didasarkan  pada  hasil  penelitian  sebelumnya  yang menunjukkan bahwa pemberian komponen flavor yang berlebih dapat  menyebabkan  rasa  pahit  pada  produk  akhir  sehingga penerimaan  konsumen  akan  rendah.  Pemilihan  konsentrasi  ini didasarkan  pada  hasil  penelitian  sebelumnya  yang  telah diterima secara organoleptik (Wijaya et al. 2002).
Data hasil uji MTT juga menunjukkan rata-rata viabilitas sel hidup  pada  perlakuan  yang  diberi  formula cajuputs  candy dengan  penambahan  minyak  kayu  putih  sebesar  1.4%  lebih rendah  dibandingkan  perlakuan  penambahan  formula cajuputs candy dengan minyak kayu putih sebesar 0.7% seperti tampak pada Gambar 1. Persentase rata-rata viabilitas C. albicans yang ditemukan  pada  pemberian  formula cajuputs  candy dengan penambahan  minyak  kayu  putih  sebesar  0.7%  mencapai  lebih dari 100%. Hasil ini dimungkinkan karena pada kondisi normal sukrosa  yang  berperan  sebagai  komponen  utama  dalam cajuputs  candy dapat  meningkatkan  viabilitas C. albicans . Menurut  Kirkpatrick et  al. (2000), C. albicans membutuhkan sukrosa  dan  glukosa  yang  terkandung  dalam  makanan  dapat mempengaruhi  pertumbuhan C. albicans di  dalam  mulut  se- seorang.  Dalam  penelitian  ini,  penambahan  minyak  atsiri  kayu putih  dalam  formula cajuputs  candy dengan  konsentrasi  0.7% dan 1.4% menghasilkan perbedaan yang nyata pada taraf sig- nifikansi  5%  terhadap  viabilitas  khamir C. albicans .  Ber- dasarkan  data  yang  didapatkan  dari  uji  biofilm  dan  uji  MTT, diperoleh  konsentrasi  yang  lebih  efektif  dalam  menghambat pembentukan  biofilm  dan  viabilitas C. albicans yaitu  formula cajuputs  candy dengan  penambahan flavor minyak  kayu  putih konsentrasi  1.4%.  Pada  penambahan  0.7%  MKP  nampak belum  sempurna  menghambat  pembentukan  biofilm  mungkin dikarenakan  komponen-komponen  penyusun  permen  seperti sukrosa dan glukosa merupakan sumber senyawa karbon dan sumber  energi  yang  dapat  digunakan  untuk  pertumbuhan  dan proses metabolisme C. albicans (Tjampakasari, 2006). Menurut Kirkpatrick et al. (2000), sukrosa dan glukosa yang terkandung dalam makanan dapat mempengaruhi pertumbuhan C. albicans di dalam mulut seseorang.
Pengaruh  formula  penyusun Cajuputs  candy terhadap viabilitas C. albicans Hasil  uji  formula  penyusun cajuputs  candy terhadap viabilitas C. albicans dengan  penambahan  saliva  dan penambahan serum dapat dilihat pada Gambar 2 dan 3. Hasil
yang diperoleh dari uji biofilm dengan penambahan saliva dan serum menunjukkan hard candy tanpa penambahan komponen MKP (formula C) memiliki nilai absorbansi yang lebih tinggi bila dibandingkan  dengan  kontrol.  Hasil  ini  menunjukkan  formula hard  candy tanpa  penambahan  komponen flavor mampu meningkatkan pembentukan biofilm C. albicans . Ye et al. (2004) menyebutkan  komponen  glukosa  mampu  meningkatkan  per- tumbuhan C. albicans.
Keterangan  :  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%
C  : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, dan air
D : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, minyak kayu putih (MKP) 0.7%, dan air
E  : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, minyak peppermint (MPP) 0.2%, dan air
F  :  Formula perlakuan  terdiri  dari  sukrosa,  sirup  glukosa,  MKP  0.7%,  MPP 0.2%, dan air
Gambar 2.  Pengaruh  ingredien  penyusun cajuputs  candy terhadap viabilitas C.  albicans pada  uji  biofilm  (absorbansi  me- nyatakan  biofilm  yang  terbentuk)  dengan  penambahan saliva
Keterangan:  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%
C : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, dan air
D :  Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, minyak kayu putih (MKP) 0.7%, dan air
E : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, minyak peppermint (MPP) 0.2%, dan air
F  :  Formula perlakuan  terdiri  dari  sukrosa,  sirup  glukosa,  MKP  0.7%, MPP 0.2%, dan air
Gambar 3.  Pengaruh ingredien cajuputs candy terhadap viabilitas C. albicans pada  uji  biofilm  (absorbansi  menyatakan  biofilm yang terbentuk) dengan penambahan serum
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2014.25.2.158
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
58.26 ± 11.65 b 49.79 ± 14.97 b 45.24 ± 4.92 b 0 20 40 60 80 100 120 140 C D E F R at a- ra ta V ia bil ita s Formula Permen 122.45 ± 19.98 a
Sukrosa  dan  sirup  glukosa  merupakan  komponen  utama dalam pembuatan permen minyak kayu putih. Cummings (1995) menyebutkan  dalam  produk high  boiled  sweet umumnya mengandung  95-98%  komponen  sukrosa  dan  sirup  glukosa. Karbohidrat  seperti  sukrosa  dan  glukosa  yang  tersedia  di lingkungan  dapat  dimanfaatkan  oleh C. albicans untuk melakukan  metabolisme  sel  dengan  cara  mengubahnya menjadi  CO 2 dan  H 2 O  dalam  suasana  aerob,  dan  dalam suasana  anaerob  dihasilkan  asam  laktat  atau  etanol  dan  CO 2 (Tjampakasari,  2006).  Menurut  Mayo  dan  Ritchie (2009), sukrosa  dan  glukosa  adalah  sumber  karbon  yang  baik  bagi pertumbuhan mikroba pembentuk biofilm. Hasil pengujian hard candy dengan penambahan minyak atsiri kayu putih (formula D) menunjukkan absorbansi yang jauh lebih rendah bila dibanding- kan dengan kontrol dan formula C. Hasil ini menjelaskan bahwa penambahan  MKP  pada  permen  mampu  menghambat  pem- bentukan  biofilm  C. albicans .  Komponen  fenolik  yang  ter- kandung  dalam  MKP  dapat  berperan  sebagai  antimikotik (Agusta, 2000).
Hasil pengujian kombinasi MKP dengan MPP menunjukkan nilai  absorbansi  yang  paling  rendah,  baik  pada  penambahan serum  maupun  saliva.  Hasil  uji  ini  menunjukkan  adanya sinergitas  aktivitas  antara  MKP  dan  MPP.  Efek  sinergistik didapatkan  bila  penghambatan  yang  dihasilkan  dari  peng- gabungan  komponen  menghasilkan  efek  penghambatan  yang lebih  besar  bila  dibandingkan  dengan  efek  penghambatan komponen yang ditambahkan secara tunggal (Burt, 2004).
Hasil  uji  biofilm  dengan  komponen  saliva  terhadap hard candy dengan  penambahan  MPP  saja  menunjukkan  nilai absorbansi  yang  lebih  rendah  bila  dibandingkan  dengan  nilai absorbansi formula hard candy dengan penambahan MKP saja. Namun  hal  sebaliknya  terjadi  pada  hasil  uji  biofilm  dengan komponen  serum.  Formula hard  candy dengan  penambahan MPP memiliki nilai absorbansi yang lebih tinggi bila dibanding- kan dengan formula hard candy dengan penambahan MKP saja Penambahan  komponen  saliva  dalam  pengujian  sangat dipengaruhi oleh kualitas saliva yang digunakan. Kualitas saliva meliputi  kualitas  kesehatan  pendonor,  dan  waktu  pengambilan saliva. Saliva berperan dalam membersihkan mukosa mulut dari mikroorganisme.  Saliva  mengandung  beberapa  komponen antimikroba  seperti  laktoferrin,  sialoperoxidase,  lysozyme, histidine-rich polypeptides, dan antibodi yang spesifik melawan spesies Candida (Wyk,  2011).  Sebaliknya  komponen  serum digunakan  untuk  mengidentifikasi  pembentukan  germ  tube C. albicans ,  yaitu  dengan  menginkubasikan  isolat C.  albicans dalam  serum  pada  suhu  37°C.  Germ  tube  merupakan  bentuk awal  transisi  hifa  dari C. albicans yang  mengindikasikan viabilitas jamur tersebut.
Pada  pengujian  menggunakan  senyawa  MTT  juga  terlihat bahwa penambahan MKP (formula D) menghasilkan persentase viabilitas  yang  lebih  rendah  bila  dibandingkan  dengan hard candy tanpa  penambahan  MKP  (formula  C)  pada  uji  dengan penambahan saliva (Gambar 4). Ye et al. (2004) menyebutkan bahwa  glukosa  yang  termasuk  dalam dietary  sugar dapat meningkatkan  viabilitas C. albicans .  Glukosa  dapat  mengubah komponen  pada  permukaan  dinding  sel,  dan  menghasilkan peningkatan  sintesis  adhesin.  Peningkatan  adhesin  akan merangsang pembentukan biofilm C. albicans (Ye et al. 2004).
Tanpa  MKP  viabilitas  dan  pembentukan  biofilm C. albicans akan tidak terhambat.
Keterangan  :  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%
C : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, dan air
D : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, minyak kayu putih (MKP) 0.7%, dan air
E : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, minyak peppermint (MPP) 0.2%, dan air
F  :  Formula perlakuan  terdiri  dari  sukrosa,  sirup  glukosa,  MKP  0.7%, MPP 0.2%, dan air
Gambar 4.  Pengaruh ingredien cajuputs candy terhadap viabilitas C. albicans (absorbansi menyatakan biofilm yang terbentuk) menggunakan uji MTT dengan penambahan saliva
Perlakuan  penambahan  minyak  atsiri peppermint (MPP) dan minyak kayu putih (MKP) secara bersamaan menghasilkan viabilitas  yang  paling  rendah  bila  dibandingkan  dengan perlakuan  lainnya.  Efek  penghambatan  ini  diduga  karena senyawa  yang  terkandung  dalam  komponen  MKP  bersinergi dengan senyawa yang terdapat pada MPP. Pelczar et al. (1993) menyebutkan  bahwa  pangan  dapat  mengandung  beberapa komponen antioksidan dan antimikroba yang saling berinteraksi dan  saling  bersinergi  yang  dalam  hal  ini  disebabkan  oleh adanya  kandungan  senyawa  kimia  dalam  minyak  atsiri  kayu putih  dan  minyak peppermint .  Agarwal et  al. (2010)  me- nyebutkan  bahwa  minyak  kayu  putih  yang  dihasilkan  dari penyulingan  tanaman Eucalyptus  globulus dan  minyak peppermint yang  dihasilkan  dari  hasil  penyulingan  daun tanaman Mentha  piperita memiliki  sifat  fungistatik,  fungisidal dan  antibiofilm.  Minyak  atsiri peppermint (MPP)  mengandung bermacam-macam  senyawa  terpenoids  terutama  senyawa derivat p-menthanes seperti limonene, menthol, menthone, dan pulegone  dengan  menthol  sebagai  kandungan  terbesar (Dwivedi et al. 2012; Galvao et  al. 2012). Kandungan menthol dalam  minyak  atsiri peppermint sebesar  59%  (Bakkali et  al. 2008).  Burt  (2004)  melaporkan  bahwa  senyawa  menthol  dan limonene  memiliki  aktivitas  antimikroba. Peppermint ( Mentha piperita )  juga  dilaporkan  dapat  menghambat  pertumbuhan mikroba pembentuk biofilm secara in vitro (Sandasi et al. 2011). Minyak  atsiri  kayu  putih  (MKP)  mengandung  komponen  sineol sebagai  komponen  utamanya.  Sineol  merupakan  komponen tertinggi  yang  ditemukan  pada  komposisi  minyak  asiri  kayu putih  (Ketaren  dan  Djatmiko,  1978).  Komponen  ini  berperan melawan  patogen  seperti S.  aureus,  F.  solani,  E. coli ,  dan B.
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2014.25.2.158
Hasil Penelitian
119.57 ± 45.16 a 25.00 ± 26.09 c
61.07 ± 1.27 b 59.94 ± 16.84 b 0 20 40 60 80 100 120 140 C D E F R at a- ra ta V ia bi lit as Formula Permen 0.151 ± 0.005 a 0.096 ± 0.013 b 0.088 ± 0.029 b 0.084 ± 0.008 b 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 Kontrol G H I R at a- ra ta A bs or ba ns i Formula Permen 0.134 ± 0.015 a
0.082 ± 0.005 b 0.088 ± 0.024 b 0.083 ± 0.003 b 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 Kontrol G H I R at a- ra ta A bs orb an si Formula Permen
subtilis .  Sineol  termasuk  dalam  golongan  terpenoid  yang memiliki  aktivitas  antibakteri  (Conner,  1993).  Mekanisme antimikroba  golongan  terpenoid  umumnya  dengan  merusak membran sel mikroba. Komponen membran sel mikroba terdiri dari  fofolipid  dan  protein.  Mekanisme  sineol  dalam  merusak membran  sel  mikroba  dimungkinkan  dengan  mengganggu lapisan fosfolipid membran sel yang menyebabkan peningkatan permeabilitas  dan  kehilangan  unsur  pokok  penyusun  sel (Hamoud et al. 2012). Selain komponen mayor atau komponen dominan  yang  memiliki  aktivitas  antimikroba,  komponen  minor yang  terkandung  dalam  minyak  atsiri  juga  memiliki  aktivitas antimikroba  (Hamoud et  al. 2012).  Komponen  minor  dapat menyumbangkan  efek  sinergistik  dalam  menghambat pertumbuhan  mikroba.  Bakkali et  al. (2008)  menyebutkan bahwa  γ-terpinene,  p-cymene,  α-pinene  dan  α-terpineol merupakan komponen minor tanaman E. globules , dan memiliki aktivitas  sebagai  antimikroba.  Pada  studi  ini  diketahui  bahwa cajuputs candy dengan komponen flavor lengkap memiliki efek penghambatan  pembentukan  biofilm  yang  paling  baik dibandingkan pemberian komponen flavor secara tunggal. Hasil pengujian dengan penambahan komponen serum dapat dilihat pada Gambar 5.
Keterangan  :  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%
C : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, dan air
D : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, minyak kayu putih (MKP) 0.7%, dan air
E  : Formula perlakuan terdiri dari sukrosa, sirup glukosa, minyak peppermint (MPP) 0.2%, dan air
F  :  Formula perlakuan  terdiri  dari  sukrosa,  sirup  glukosa,  MKP  0.7%,  MPP 0.2%, dan air
Gambar 5.  Pengaruh cajuputs  candy terhadap  viabilitas C. albicans (absorbansi  menyatakan  biofilm  yang  terbentuk)  meng- gunakan uji MTT dengan penambahan serum
Hard  candy tanpa  komponen flavor (formula  C)  meng- hasilkan  viabilitas  yang  paling  tinggi,  sedangkan  penambahan MKP menghasilkan penghambatan viabilitas yang paling rendah bila dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Penambahan MKP dan  MPP  bersamaan  akan  memberikan  efek  sinergisme daripada  hanya  penambahan  MPP  saja,  namun  berbeda dengan hasil pada saliva, aktivitas penambahan MKP dan MPP tidak sekuat penghambatan MKP saja (Gambar 5). Fenomena yang serupa dengan hasil uji uii biofilm (Gambar 3).
Pengaruh  konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  terhadap viabilitas Candida albicans
Penelitian  selanjutnya  dilakukan  untuk  mengetahui  pe- ngaruh perbedaan konsentrasi minyak atsiri kayu putih terhadap pembentukan  biofilm  dan  viabilitas  khamir C. albicans . Pengujian  dilakukan  dengan  menggunakan  tiga  konsentrasi minyak  atsiri  kayu  putih  berdasarkan  penelitian  sebelumnya yang dilakukan (Wijaya et al. 2002) yaitu 0.7%  yang ditambah dan  dikurangi  0.1%.  Hasil  pengujian,  menunjukkan  bahwa pemberian  formula cajuputs  candy dengan  penambahan  MKP pada konsentrasi 0.6% telah mampu menghambat viabilitas C. albicans (Gambar 6 dan 7).
Keterangan:  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%. Formula Uji :
G = MKP 0.6% & MPM 0.2%            H   = MKP 0.7% & MPM 0.2%
I  = MKP 0.8% & MPM 0.2%
Gambar 6.  Pengaruh  konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  dalam formula cajuputs  candy terhadap  viabilitas C. albicans menggunakan  uji  biofilm  (absorbansi  menyatakan  biofilm yang terbentuk) dengan penambahan saliva
Keterangan:  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%. Formula Uji :
G  = MKP 0.6 % & MPM 0.2% H  = MKP 0.7% & MPM 0.2% I  = MKP 0.8% & MPM 0.2%
Gambar 7.  Pengaruh  konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  dalam formula cajuputs  candy ,  terhadap  viabilitas  C. albicans menggunakan  uji  biofilm  (absorbansi  menyatakan  biofilm yang terbentuk) dengan penambahan serum
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2014.25.2.158
Hasil Penelitian
46.944 ± 6.667 a 45.925 ± 13.632 a 38.362 ± 4.323 a 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 G H I R at a- ra ta V ia bil ita s Formulasi Permen 40.214 ± 5.111 a
39.771 ± 5.188 a 39.476 ± 2.388 a 39 39.2 39.4 39.6 39.8 40 40.2 40.4 G H I R at a- ra ta V ia bil ita s Formula Permen 4.91 ± 1.35 a 4.80 ± 1.28 a 4.89 ± 1.31 a 4.74 4.76 4.78 4.80 4.82 4.84 4.86 4.88 4.90 4.92 Sampel A Sampel B Sampel C R at a- ra ta S ko r Sampel Cajuputs Candy
Konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  0.8%  menghasilkan kemampuan  penghambatan  biofilm C. albicans paling  tinggi. Perbedaan konsentrasi MKP yang ditambahkan dalam formula cajuputs  candy menghasilkan  perbadaan  yang  nyata  dalam penghambatan  dibandingkan  dengan  kontrol  pada  taraf signifikansi 5% namun uji lanjut DUNCAN menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan nyata antar konsentrasi yang diujikan pada taraf  signifikansi  5%.  Hal  ini  menunjukkan  tidak  ada  pengaruh nyata  dari  penambahan  MKP  pada  rentang  konsentrasi  0.6 sampai 0.8%
.
Keterangan:  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%. Formula Uji : G  = MKP 0.6%) & MPM 0.2% H  = MKP 0.7% & MPM 0.2% I  = MKP 0.8%) & MPM 0.2%
Gambar 8.  Pengaruh  konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  penyusun cajuputs candy terhadap viabilitas C. albicans (absorbansi menyatakan  biofilm  yang  terbentuk)  menggunakan  uji MTT dengan penambahan saliva
Keterangan:  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikan 95%. Formula Uji :
G  = MKP 0.6% & MPM 0.2% H  = MKP 0.7 % & MPM 0.2% I  = MKP 0.8 % & MPM 0.2%
Gambar 9.  Pengaruh  konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  dalam cajuputs candy terhadap viabilitas C. albicans (absorbansi menyatakan  biofilm  yang  terbentuk)  menggunakan  uji MTT dengan penambahan serum
Fenomena  yang  serupa  diperlihatkan  oleh  data  yang diperoleh  dari  uji  MTT  dengan  penambahan  komponen  saliva dan  serum.  Konsentrasi  MKP  sebesar  0.8%  menghasilkan penghambatan  viabilitas  yang  paling  tinggi  (Gambar  8  dan  9).
Akan tetapi pengujian dengan  ANOVA menunjukkan tidak ada perbedaan  nyata  pada  taraf  signifikansi  5%.  Hal  ini menunjukkan  perbedaan  konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih yang  diujikan  tidak  memberikan  pengaruh  yang  signifikan terhadap penghambatan viabilitas khamir C. albicans.

## Nilai organoleptik dengan uji rating hedonik
Uji  rating  hedonik  (Adawiyah  dan  Waysima,  2009)  diguna- kan  untuk  mengetahui  respon  penerimaan  atau  tingkat kesukaan  panelis  terhadap  beberapa  formula cajuputs  candy yang  diujikan  aktifitas  penghambatannya.  Pemilihan  atribut sensori  aroma  dan  rasa  didasarkan  pada  karakteristik  MKP yang  memiliki  aroma  khas  sehingga  penggunaannya  dalam formula cajuputs  candy akan  memberikan  cita  rasa  yang spesifik  dan  berbeda  dengan flavor lainnya.  Hasil  penelitian sebelumnya menunjukkan atribut aroma dan rasa dianggap hal yang  paling  kritis  dalam  penerimaan  produk  oleh  konsumen (Nurramdhan,  2010).  Pengujian  sensori  terhadap  keseluruhan atribut  mutu  produk cajuputs  candy juga  diperlukan  guna memperoleh mutu sensori dari cajuputs candy secara utuh. Hasil  uji  rating  hedonik  dapat  dilihat  pada  Gambar  10-12. Gambar  10  menunjukkan  nilai  respon  kesukaan  panelis  ter- hadap  atribut  aroma.  Hasil  pengujian  mengindikasikan kesukaan  panelis  terhadap  aroma cajuputs  candy cukup  baik (netral  sampai  dengan  agka  suka)  dan  tidak  ada  perbedaan nyata di antara ketiga konsentrasi (hasil uji ANOVA pada taraf signifikansi 5%).
Keterangan:  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%. Skor rata-rata hedonik : (1) Sangat tidak suka, (2) Tidak suka, (3) Agak tidak suka, (4) Netral, (5) Agak suka, (6) Suka, (7) Sangat suka. Formula Uji :
MKP 0.8% (sampel A), H : MKP 0.7% (sampel B), G : MKP 0.6% (sampel C)

## Gambar 10.  Tingkat  kesukaan  panelis  terhadap  atribut  aroma cajuputs candy
Gambar  11  menunjukkan  tingkat  penerimaan  konsumen terhadap  atribut  rasa.  Rata-rata  panelis  juga  memberikan respon  netral  (4)  hingga  agak  suka  (5).  Hasil  pengujian menunjukkan  sampel  C  yaitu  formula  dengan  penambahan konsentrasi  MKP  sebesar  0.8%  memiliki  skor  kesukaan  yang paling  rendah.  Akan  tetapi,  pengujian  menggunakan  ANOVA menunjukkan  penambahan  MKP  dengan  ketiga  konsentrasi yang diujikan tidak memberikan perbedaan yang nyata terhadap
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2014.25.2.158
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
4.80 ± 1.39 a 5.16 ± 1.27 a 5.19 ± 1.25 a 4.60 4.70 4.80 4.90 5.00 5.10 5.20 5.30 Sampel A Sampel B Sampel C R at a- ra ta S ko r Sampel Cajuputs Candy 4.99 ± 1.31 a 5.04 ± 1.21 a 5.24 ± 1.10 a 4.85 4.9 4.95 5 5.05 5.1 5.15 5.2 5.25 5.3 Sampel A Sampel B Sampel C R at a- ra ta S ko r Sampel Cajuputs Candy
tingkat  penerimaan  atribut  rasa  panelis  ( p >0.05).  Hal  ini menunjukkan  tingkat  kesukaan  panelis  tidak  terpengaruh  oleh perbedaan konsentrasi MKP minyak kayu putih yang ditambah- kan dalam pengujian.
Keterangan:  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%. Skor rata-rata hedonik: (1) Sangat tidak suka, (2) Tidak suka, (3) Agak tidak suka, (4) Netral, (5) Agak suka, (6) Suka, (7) Sangat suka. Formula Uji : MKP 0.8% (sampel A), H : MKP 0.7%  (sampel B), G : MKP 0.6% (sampel C)
Gambar 11.  Tingkat kesukaan panelis terhadap atribut rasa cajuputs candy
Keterangan:  *Huruf  yang  berbeda  di  tiap  balok  data  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%. Skor rata-rata hedonik : (1) Sangat tidak suka, (2) Tidak suka, (3) Agak tidak suka, (4) Netral, (5) Agak suka, (6) Suka, (7) Sangat suka. Formula Uji :
MKP 0.8% (sampel A), H : MKP 0.7% (sampel B), G : MKP 0.6% (sampel C)

## Gambar 12.  Tingkat kesukaan panelis terhadap  keseluruhan  atribut cajuputs candy
Gambar 12 menunjukkan nilai respon panelis terhadap nilai kesukaan keseluruhan atribut. Seperti yang diprediksi rata-rata panelis  juga  memberikan  respon  yang  netral  (4)  hingga  agak suka (5). Hasil pengujian menunjukkan sampel C yaitu formula hard candy dengan penambahan konsentrasi minyak atsiri kayu putih 0.6% memiliki skor kesukaan terhadap keseluruhan atribut mutu cajuputs candy yang paling tinggi, sedangkan penambah- an konsentrasi minyak atsiri kayu  putih sebesar 0.8% memiliki skor  kesukaan  yang  paling  rendah.  Akan  tetapi  setelah  hasil ANOVA  menunjukkan  bahwa  penambahan  MKP  dengan
beberapa konsentrasi yang diujikan tidak memberikan perbeda- an  yang  nyata  terhadap  tingkat  kesukaan  panelis  pada keseluruhan  sensori  produk  ( p >0.05).  Fenomena  ini  mungkin disebabkan  dengan  sebaran  nilai  ekstrim  dari  hasil  tingkat penerimaan  yang  diperoleh,  mengingat  untuk  kasus cajuputs candy ada  kecenderungan  panelis  terpisah  antara  yang menyukai dan tidak menyukai.
Berdasarkan  uji  penghambatan  menunjukkan  bahwa peningkatan  penambahan  MKP  hingga  0.1%  masih  belum dapat menunjukkan hasil peningkatan kapasitas penghambatan yang  nyata,  walau  ada  tendensi  kuat  bahwa  peningkatan konsentrasi  MKP  akan  memberikan  aktivitas  yang  lebih.  Hasil pengujian  organoleptik  pun  menunjukkan  bahwa  penambahan MKP  masih  dapat  dilakukan  tanpa  mengubah  penerimaan sensori  terutama  atribut  rasa  dan  aroma.  Pada  penelitian selanjutnya  perlu  dilakukan  perlakuan  penambahan  pada kisaran  yang  lebih  lebar.  Tingkat  penerimaan  sensori  yang masih berkisar antara netral dan agak suka perlu juga diperbaiki pada  tahapan  pengembangan  selanjutnya.  Bagi  panelis  yang kurang suka cita-rasa yang kuat dari MKP dan MPP maka cita- rasa harus dimodifikasi dengan penambahan flavor yang “ mild ” dan “ fruity ”.

## KESIMPULAN
Konsentrasi  minyak  atsiri  kayu  putih  sebesar  0.7%  yang ditambahkan  pada  formula cajuputs  candy yang  dilarutkan kembali dengan aquades dengan perbandingan 1:1 (v/v) dapat menghambat  pembentukan  biofilm  dan  menurunkan  viabilitas C. albicans secara in  vitro .  Penambahan flavor minyak  atsiri kayu putih dan minyak peppermint secara bersamaan memiliki efek  penghambatan  pembentukan  biofilm  yang  lebih  baik  bila dibandingkan  dengan  penambahan flavor secara  tunggal. Peningkatan maupun penurunan konsentrasi minyak atsiri kayu putih  sebesar  0.1%  dari  konsentrasi  standar cajuputs  candy tidak  memberikan  pengaruh  yang  nyata  baik  terhadap  peng- hambatan pembentukan biofilm maupun penurunan viabilitas C. albicans ,  maupun  tingkat  penerimaan  sensori  terhadap  atribut rasa,  aroma,  dan  keseluruhan  atribut cajuputs  candy .  Perlu dilakukan  penambahan  minyak  atsiri  kayu  putih  pada konsentrasi  yang  lebih  besar  serta  perbaikan  mutu  sensori atribut  rasa  dan  aroma  agar  penerimaan  permen  dapat ditingkatkan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didanai  melalui  Hibah  Kompetensi  (HIKOM) 2010-12, DIKTI-Mendikbud.

## DAFTAR PUSTAKA
Adawiyah  DR,  Waysima.  2009.  Buku  Ajar  Evaluasi  Sensori Produk  Pangan.  Ed  ke-1.  Departemen  Ilmu  dan  Teknologi Pangan,  Fakultas  Teknologi  Pertanian,  Institut  Pertanian Bogor, Bogor.
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2014.25.2.158
Hasil Penelitian
Agarwal  V,  Lal  P,  Pruthi  V.  2010.  Effect  of  plants  oils  on Candida  albicans. J  Microbiol  Immunol  Infect  43:  447-451. DOI: 10.1016/S1684-1182(10)60069-2.
Agusta  A.  2000.  Minyak  Atsiri  Tumbuhan  Tropika  Indonesia.
Bandung: ITB Press.
Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D, Idaomar M. 2008. Biological effects  of  essential  oils-A  review.  Food  Chem  Toxicol 46: 446-475. DOI: 10.1016/j.fct.2007.09.106.
Broschat SL, Call DR, Kuhn EA, Loge FJ. 2005. Comparison of the reflectance and crystal violet assay for measurement of biofilm formation by Enterococcus . Biofilms 2: 177-181. DOI: 10.1017/S1479050505001948.
Burt  S.  2004.  Essential  oils:  their  antibacterial  properties  and potential applications in foods. Int J Food Microbiol 94: 223– 253. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2004.03.022.
Burdock GA. 2010. Fenarolli’s Handbook of Flavor Ingredients. Sixth Ed. Boca Raton: CRC Press Taylor & Francis Group.
Conner  DE.  1993.  Naturally  Occurring  Compounds.  In: Davidson  P.M.,  Branen  A.L.  (Ed.)  Antimicrobials  in  Foods. Marcel Dekker. New York.
Cummings  CS.  1995.  Manufacture  of  High  Boiled  Sweets. Didalam:  Sugar  Confectionery  Manufacture.  Jackson  E.B. (Ed). Blackie Academic & Professional, London.
Dutta  BK,  Karmakar  S,  Naglot  A,  Aich  JC,  Begam  M.  2007. Anticandidal  activity  of  some  essential  oils  of  a  mega biodiversity hotspot in India. Mycoses 50: 121-124.
Doyle A, Griffiths JB. 2000. Cell and Tissue Culture for Medical Research. John Willey & Sons LTD, England.
Dwivedi  D,  Khandelwal  G,  Patidar  RK,  Singh  V.  2012.
Antimicrobial  activity  of Mentha  arvensis against  clinical isolates  of  human  cariogenic  pathogens-  an in  vitro study. Int J Pham Sci Res 3: 1355-1360.
Galvao LCC, Furletti VF, Bersan SMF, Cunha MG, Ruiz ALTG, Carvalho  JE,  Sartoratto  A,  Rehder  VLG,  Figueira  GM, Duarte  MCT,  Ikegaki  M,  Alencar  SM,  Rosalen  PL . 2012. Antimicrobial activity of essential oils against Streptococcus mutans and  their  antiprolifrative  effects.  Evidence-Based Comp Alt Med 1-12. DOI: 10.1155/2012/751435.
Guenther.  1990.  Minyak  Atsiri.  IV  B.  Terjemahan.  UI-Press.
Jakarta.
Haikal  M.  2009.  Aspek  Imunologi  Stomatitis  Aftosa  Rekuren. [Skripsi]. Medan: Fakultas Kedokteran Gigi, USU Medan.
Hamoud R, Sporer F, Reichling J, Wink M. 2012. Antimicrobial activity of a traditionally used complex essential oil distillate (Olbas® Tropfen) in comparison to its individual essential oil ingredients.  Phytomedicine  19:  969-975.  DOI:  10.1016/j. phymed.2012.05.014.
Hudson S, Smith C. 1998. Polysaccharide : Chitin and Chitosan: Chemistry  and  Technology  of  Their  Use  as  Structural Material In : Kaplan DL (Ed). Biopolymers From Renewable Resources. New York : Springer-Verlag.
Jedlickova  Z,  Ery  V,  Motto  O,  Nguyen  DC.  1994.  Antibacterial Properties  of  Cajuput  Oil.  [Proceeding]  European Symposium  on  Ethnopharmacology  and  the  11 th
International  Conference  on  Ethnomedicine.  Medicaments
et  Aliments:  L’Approche  Ethnopharmacologique  p.293, Heidelberg.
Juanda  A.  1999.  Ilmu  Penyakit  Kulit  dan  Kelamin.  3 nd ed. Jakarta: FKUI 103-106.
Kazemi  S,  Savabi  G,  Khazei  S,  Esmaillzadeh  A,  Keshteli  AH,
Adibi  P.  2011.  Association  between  food  intake  and  oral health in elderly: SEPAHAN systematic review no.8. Dental Res J (Isfahan ) . 8: S15 S20.
Ketaren  S,  Djatmiko  B.  1978.  Minyak  Atsiri  Bersumber  Dari Daun. Departemen Teknologi Hasil Pertanian. FATEMETA. IPB. Bogor.
Kirkpatrick  WR,  Lopez-Ribot,  Mcatee  RK,  Patterson  TF.  2000. Growth  competition  between Candida  dubliniensis and Candida  albicans under  broth  and  biofilm  growing conditions. J Clin Microbiol 32: 902-904.
Kreth  J,  Zhang  Y,  Herzberg  MC.  2008.  Streptococcal antagonism  in  oral  biofilms: Streptococcus  sanguinis and Streptococcus  gordonii interference  with Streptococcus mutans .  J  Bacteriol  190:  4632-4640.  DOI:  10.1128/ JB.00276-08.
Mayo JA, Ritchie JR. 2009. Acidogenic potential of “sugar-free” cough  drops. Open  Dentistry  J  3:  26-30.  DOI: 10.2174/1874210600903010026.
Nishikawara F, Katsumura S, Ando A, Tamaki Y, Nakamura Y, Sato  K,  Nomura  Y,  Hanada  N.  2006.  Correlation  of cariogenic  bacteria  and  dental  caries  in  adults.  J  Oral  Sci 48: 245–251.
Nobile CJ, Mitchell AP. 2005. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.  Curr  Biol  15:  1150-1155.  DOI:  10.1016/j.cub. 2005.05.047.
Nurramdhan  IF.  2010.  Daya  Hambat  Minyak  Kayu  Putih  dan Komponen  Penyusun  Flavor Cajuputs  candy Terhadap Akumulasi Biofilm Streptococcus mutans dan Streptococcus sobrinus secara In Vitro [Skripsi]. Bogor: Ilmu dan Teknologi Pangan. FATETA. IPB.
Pelczar MJ, Chan ECS, Krieg NR. 1993. Microbiology: Concept and Application. International Edition. USA: McGraw-Hill.
Polontalo.  2009.  Minyak  atsiri  Indonesia.  http://minyakatsiri indonesia.wordpress. com/. [25 Januari 2011].
Sandasi  MCM,  Leonard,  Vuuren  SFV,  Viljoen  AM.  2011. Peppermint ( Mentha piperita )
inhibits microbial
biofilms in  vitro .  South  Afr  J  Botany  77:  80-85.  DOI: 10.1016/j.sajb.2010.05.011 .
Tjampakasari CR. 2006. Karakteristik Candida albicans . Cermin Dunia Kedokteran 151: 33-36.
Wijaya  CH,  Halimah,  Kindly,  Taqi  FM.  2002.  Penemu: Komposisi  Permen  Cajuput  untuk  Pelega  Tenggorokan. Institut Pertanian Bogor. Paten Indonesia ID 0000385S.
Wyk  CV,  Steenkamp  V.  2011.  Host  factors  affecting  oral candidiasis. South Afr J Epidemiol Infect 26: 18-21.
Ye  J,  Laksman  P,  Samaranayake,  Samaranayake  Y,  Yip  HK.
2004.  Biofilm  formation  of Candida  albicans is  variably affected by saliva and dietary sugars. Arc Oral Biol 49: 789- 798. DOI: 10.1016/j.archoralbio.2004.04.011.