ANALISIS POLIMORFISME GEN Growth Differentiation Factor 9 ( GDF-9 ) dan HUBUNGANNYA DENGAN KEBERHASILAN INSEMINASI BUATAN pada SAPI PO
Pangesti Dimy Arta 1 , Sri Rahayu 1
1) Laboratorium Biologi Seluler dan Molekuler, Jurusan Biologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya
Jl. Veteran no. 169 Malang, Email : Pangesti10@yahoo.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  adanya  polimorfisme  gen GDF-9 pada  sapi  PO  ( Bos indicus )  dan  hubungannya  dengan  keberhasilan  inseminasi  buatan  pada  sapi  PO.  Sampel  Sapi  PO diambil  dari  Pasuruan  secara  acak.  DNA  diisolasi  dari  darah  menggunakan  metode Salting  out .  Gen GDF-9 diamplifikasi  dengan  teknik  PCR  menggunakan  primer GDF-9 forward (5’-  GCCCA CCCACACACCTAAAGTTTA-3’)  dan GDF-9 reverse (5’  GCACA  CCAACAGCTGAAAGAGGTA-3’). Polimorfisme  gen GDF-9 dianalisis  menggunakan  teknik  PCR-RFLP  dengan  enzim  restriksi Hae III. Berdasarkan hasil RFLP diperoleh dua tipe haplotip. Haplotip I terpotong dengan ukuran fragmen DNA 70 bp, 100 bp, 290 bp dan 590 bp. Haplotip II terpotong dengan ukuran fragmen DNA 70 bp, 100 bp, 120 bp, 290 bp dan 590 bp. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat polimorfisme gen GDF-9 pada sapi PO. Namun, tidak terdapat hubungan antara polimorfisme gen GDF-9 tersebut dengan keberhasilan inseminasi buatan pada sapi PO.
Kata kunci : gen GDF-9 , polimorfisme, Sapi PO

## ABSTRACT
The aim of this research was to determine the polymorphism of PO cattle GDF-9 gene and association with  success  of  artificial  insemination.    Ten  PO  cattles  were  taken  randomly  from  Pasuruan.  DNA  was isolated from blood by salting out method. DNA was amplified using primer GDF-9 forward (5’ GCCCA CCCACACACCTAAAGTTTA 3’) and GDF-9 reverse (5’ GCACA CCAAC AGCTG AAA GAGGTA 3’). The result of PCR was a specific single band with fragment DNA size of ± 900 bp. The PCR products was digested by restriction enzyme Hae III. The products of PCR-RFLP was two (2) haplotypes. Haplotype 1 with 4 fragment DNA (70 bp, 100 bp, 290 bp and 590 bp) and haplotype 2 with 5 fragment DNA (70 bp, 100  bp,  120  bp,  290  bp,  590  bp).  This  study  indicate  there  is  polymorphism  of  PO  cattle GDF-9 gene. However, no correlation between GDF-9 polymorphisms gene with success of artificial insemination of PO cattle.
Key words : GDF-9 gene , polymorphism, PO cattle

## PENDAHULUAN
Produksi  daging  sapi  dalam  negeri  perlu ditingkatkan.  Salah  satu  upayanya  yaitu  dengan meningkatkan  jumlah  populasi  sapi  lokal. Peningkatan  populasi  atau  produksi  ternak bergantung  pada  keberhasilan  reproduksi.  Jika reproduksi  tidak  teratur  dengan  baik  maka produksi akan rendah [1].
Salah  satu  faktor  yang  berpengaruh  terhadap kualitas  reproduksi  adalah  ovulasi,  ovulasi diawali  dengan  proses  folikulogenesis,  yang melibatkan beberapa hormon dan gen didalamnya, salah satunya yaitu gen GDF-9 [2]. Growth  Differentiation  Factor ( GDF-9 ) terletak  pada  kromosom  autosomal,  yakni kromosom 5 dan terdiri atas 2 exon dan 1 intron
dengan  panjang  sekitar  5644  bp  [3]. GDF-9 merupakan molekul polipeptida famili dari TGF- β Growth  Factor. GDF-9 berperan  dalam pendewasaan  dan  pematangan  oosit  [4]. Growth Differentiation  Factor juga  berfungsi  sebagai stimulator pada  saat  perkembangan  folikel primer. GDF-9 diekspresikan pada oosit dan sel- sel  granulosa,  dapat  merangsang  proliferasi  sel granulosa  serta  mengatur  fungsi  sel  kumulus sejak  masa  preovulasi  sampai  terjadinya  ovulasi [5]. Gen GDF-9 berhubungan dengan peningkatan  laju  tingkat  ovulasi  dan litter  size pada ternak [6].
Menurut  penelitian  Dong  dkk.,  [7]  diketahui bahwa  jumlah  gen GDF-9 dalam  proses folikulogenesis  pada  tahap  folikel  primer
semakin  besar,  dibuktikan  karena  adanya  blok dalam tahap folikel primer tersebut.
GDF-9 disintesis oleh sel somatik ovum yang berperan  pada  pertumbuhan  dan  fungsi  oosit. Keberadaan  dan  peran GDF-9 pada  oosit  sangat dibutuhkan pada proses maturasi dan folikulogenesis [8]. GDF-9 dapat  berikatan  dengan  reseptor  sel kumulus untuk meningkatkan sintesis progesterone  tanpa  pemberian  FSH.  Sehingga GDF-9 dapat bekerja sinergis seperti FSH untuk perkembangan  oosit  [9]. Adanya mutasi  gen
GDF-9 pada pertumbuhan oosit dapat meningkatkan  ovulasi  pada  domba  heterozigot dan  menyebabkan  kemandulan  pada  domba homozigot [2].
Sapi  PO  merupakan  salah  satu  sapi  potong yang memiliki kualitas baik. Namun sampai saat ini  penelitian  tentang  polimorfisme  gen GDF-9 pada sapi PO belum dilakukan [10].
Penelitian  ini  bertujuan  untuk    mengetahui polimorfisme  gen GDF-9 pada  sapi  PO  serta mengetahui  hubungan  polimorfisme GDF-9 terhadap performa reproduksi sapi PO.

## METODE PENELITIAN

## Pengambilan Sampel
Sampel  darah  diambil  secara  acak  dari  10 ekor  sapi  PO  pada  bagian  ekor.  Darah dimasukkan tabung  vacutainer berisi  EDTA. Data  keberhasilan  inseminasi  buatan  (IB) diperoleh secara deskritif berdasarkan inseminasi buatan  atau  nilai service  per  conception (S/C) yang dimiliki oleh masing-masing sapi PO. DNA diisolasi  menggunakan  metode Salting  out. Kuantitas  DNA  hasil  isolasi  diukur  dengan menggunakan spektrofotometri, sedangkan kualitas  DNA  hasil  isolasi  dapat  diketahui dengan  elektroforesis  menggunakan  gel  agarosa dengan konsentrasi 1%.

## PCR-RFLP
DNA  diamplifikasi  dengan  menggunakan pasangan  primer  yaitu:  primer GDF-9  forward (5’  GCCCAC  CCACAC  ACCTAA  AGTTTA 3’).  Primer GDF-9  reverse (5’  GCACAC CAACAG  CTGAAA  GAGGTA  3’).  Program PCR  meliputi  beberapa  tahap,  yaitu  denaturasi awal  95 o C  selama  5  menit,  diikuti  dengan amplifikasi  34  siklus,  yang  setiap  siklusnya terdiri  dari  tahap  denaturasi  95 o C,  45  detik, annealing  61 o C,  45  detik  dan  ekstensi  72 o C,  45
detik  lalu  dilanjutkan  dengan  ekstensi  akhir 72 o C,  10  menit.  Hasil  PCR  dielektroforesis dengan  1,5%  gel  agarosa.  PCR-RFLP  dilakukan menggunakan enzim restriksi Hae III. Hasil PCR- RFLP dielektroforesis menggunakan Gel Poliakrilamida  10%  dan  dilakukan  pewarnaan menggunakan metode perak nitrat.

## Analisis Data
Data  hasil  PCR-RFLP  dianalisis  secara deskriptif  berdasarkan  pola  pita  DNA  yang didapatkan  dan  dikorelasikan  dengan  performa reproduksi sapi PO.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Amplifikasi gen GDF-9 pada 10 sampel sapi  PO  diperoleh  1  pita  DNA  yang  spesifik dengan ukuran ± 900 bp (gambar 1).
Gambar 1. Hasil Amplifikasi Gen GDF-9 sapi PO;  M:  DNA ladder 10000  bp.1- 10:  sampel  dengan  fragmen  DNA gen GDF-9 hasil amplifikasi.
Ukuran pita DNA hasil amplifikasi gen GDF- 9 yang  diperoleh  pada  penelitian  ini  mendekati ukuran  gen GDF-9 pada  Bovidae  yang  terdapat di  GenBank  (nomer  akses  AF078545.2).  Primer GDF-9 yang digunakan mengacu pada penelitian yang  dilakukan  oleh  Santos  dkk.,  [11]  yang diperoleh  dari Bos  taurus .  Posisi  primer  yang digunakan  pada  penelitian  ini  terletak  pada urutan basa sekitar 1671 bp – 2557 bp. Sehingga diperoleh  amplikon  berupa  fragmen  gen GDF-9 yang  berukuran  ±  886  bp.  Adanya  perbedaan ukuran fragmen DNA pada penelitian yang telah dilakukan  dengan  penelitian  Santos  dkk.,  [11] adalah  karena  jenis  sapi  yang  digunakan  dalam
kedua penelitian tersebut berbeda, pada penelitian  yang  telah  dilakukan  menggunakan sapi PO. Sedangkan pada penelitian Santos dkk ., [11] menggunakan sapi Holstein. Berdasarkan  hasil  PCR-RFLP  gen GDF-9 menggunakan enzim Hae III, didapatkan dua tipe haplotip,  yaitu  haplotip  1  dan  haplotip  2.  Tipe haplotip  tersebut  ditentukan  berdasarkan  jumlah situs restriksi dan ukuran fragmen DNA (Gambar 2 dan Tabel 1).
Pada  sampel  nomer  1-10  nampak  bahwa semua  DNA  hasil  amplifikasi  terpotong  oleh enzim Hae III. Haplotip  1  dengan  ukuran fragmen DNA 70 bp, 100 bp, 290 bp dan 590 bp. Haplotip  2  dengan  ukuran  fragmen  DNA  70  bp, 100  bp,  120  bp,  290  bp  dan  590  bp.  Variasi haplotip tersebut menunjukkan adanya polimorfisme gen GDF-9 pada sapi PO (Gambar 2 dan Tabel 1).
Gambar 2. Hasil  PCR-RFLP  gen GDF-9 menggunakan  Enzim Hae III;  M: DNA ladder 10000  bp.  1-10  : DNA hasil PCR-RFLP.
Enzim Hae III  merupakan  enzim  yang mengenali sisi pemotongan pada sekuen GG*CC dengan  tipe  pemotongan blunt  end ,  yaitu  tipe pemotongan  yang  menghasilkan  sekuen  dengan ujung  tumpul  karena  pemotongannya  bersifat simetris [12].
Terjadinya  polimorfisme  gen GDF-9 pada sapi PO, dikarenakan adanya perbedaan susunan gen GDF-9 pada  sapi  PO,  yang  ditunjukkan dengan  ukuran  fragmen  DNA  pada  haplotip kedua.
Polimorfisme  gen  terjadi  karena  adanya perubahan  susunan  nukleotida  pada  suatu  gen. Perubahan  susunan  tersebut  dipengaruhi  oleh beberapa  faktor,  antara  lain  yaitu  perkawinan, mutasi  dan  seleksi  alam  maupun  buatan. Perubahan  tersebut  juga  sangat  berpengaruh
terhadap  perubahan  fenotip  suatu  organisme [13].
Tabel 1. Haplotip  gen GDF-9 pada  sapi  PO menggunakan  enzim  restriksi Hae- III Haplotip Jumlah Situs Restriksi Ukuran Fragmen No Sampel 1 4 70 bp 100 bp 290 bp 590 bp 1,2,3,4,5,6, 7,8,9
2 5
70 bp
100 bp 120 bp 290 bp 590 bp 10
Beberapa  penelitian  mengenai  polimorfisme gen GDF-9 juga  pernah  dilakukan  pada  hewan lain,  seperti  mencit  dan  kerbau. Penelitian  Dong dkk.,  [7]  yang  berjudul  Growth  differentiation factor  9  is  required  during  early  ovarian folliculogenesis  mengatakan  bahwa  adanya mutasi  gen GDF-9 pada  tikus  memiliki  efek besar  pada  produksi GDF-9 .  Hal  ini  sangat berpengaruh  dalam  reproduksi,  karena GDF-9 diperlukan  untuk  proses  follikulogenesis.  Pada penelitian  Ghaffari  dkk.,  [2]  gen GDF-9 dapat dijadikan sebagai gen kandidat yang memungkinkan  untuk  meningkatkan  litter  size (angka  kelahiran)  pada  domba. GDF-9 juga dapat  mengatur  jumlah  folikel  yang  berovulasi pada  domba  dan  pada  mamalia  yang  memiliki tingkat ovulasi rendah [14].
Terjadinya  polimorfisme  pada  suatu  gen, menandakan  adanya  perbedaan  sekuen  DNA pada  hewan  dengan  spesies  yang  berbeda maupun  sama.  Perbedaan  sekuen  DNA  tersebut disebabkan oleh  adanya peristiwa delesi,  insersi, rekombinasi,  perkawinan  acak  yang  rendah  dan seleksi dalam populasi tersebut [15].
Hubungan  haplotip  gen GDF-9 dengan performa reproduksi menunjukkan bahwa polimorfisme  gen GDF-9 pada  sapi  PO  tidak berhubungan  dengan  performa  reproduksi  sapi PO (tabel 2).
Tabel 2. Hubungan Haplotip gen GDF-9 dengan Performa Reproduksi sapi PO No Sampel Haplotip Performa Reproduksi 1 1 Bunting 2 1 Bunting 3 1 Tidak Bunting 4 1 Tidak Bunting 5 1 Bunting 6 1 Bunting 7 1 Bunting 8 1 Bunting 9 1 Bunting 10 2 Bunting
Data  performa  reproduksi  (tabel  2)  diperoleh berdasarkan  data  inseminasi  buatan  atau  nilai S/C  (service  per  conception)  pada  masing- masing  sampel  sapi  PO.  Berdasarkan  tabel  2 terdapat dua sampel Sapi PO yang tidak bunting dan delapan sapi PO yang bunting. Data tersebut belum  konsisten,  ditunjukkan  adanya  tipe haplotip  1  dengan  performa  reproduksi  yang bervariasi. Sehingga adanya variasi tersebut tidak berhubungan  dengan  keberhasilan  inseminasi buatan pada sapi PO.
Performa  reproduksi  sapi  akan  dipengaruhi oleh  beberapa  faktor  antara  lain  yaitu  faktor genetik  [16].  Salah  satu  faktor  keberhasilan proses reproduksi pada suatu individu khususnya betina,  yaitu  terletak  pada  performa  reproduksi yang  akan  ditentukan  oleh  proses  ovulasi  pada suatu  individu  tersebut  [17].  Ekspresi GDF-9 berpengaruh  terhadap  perkembangan  sel-sel spesifik  pada  ovarium  dalam  tahapan  folikuler normal,  perkembangan  sel  granulosa dan
perkembangan  oosit.  Adanya GDF-9 dapat meningkatkan  proses  ovulasi  pada  individu betina [2]. Gilchrist dkk ., [6] melaporkan bahwa beberapa  mutasi  pada  gen GDF-9 berhubungan dengan peningkatan laju tingkat ovulasi dan litter size (angka kelahiran) pada ternak. Ghaffari dkk.,
[2]  juga  mengatakan  bahwa  gen GDF-9 dapat dijadikan sebagai gen kandidat yang memungkinkan  untuk  meningkatkan litter  size pada  domba.  Mutasi  gen GDF-9 pada  (S395F) terkait  dengan  peningkatan  ovulasi  pada  domba heterozigot sedangkan kemandulan pada homozigot  pada  domba  Cambridge  dan  Belclare Karena  mutasi  gen GDF-9 pada  domba homozigot  menyebabkan  perkembangan  folikel tidak sempurna [18].
GDF-9 pertama  kali  terdeteksi  pada  awal tahap  folikel  primer,  sedangkan  pada  ovarium domba  dan  sapi, GDF-9 terdeteksi  lebih  awal pada  tahap  folikel  primordial. GDF-9 juga diekspresikan  di  dalam ovarium  tikus.  Pada penelitian  yang  dilakukan  oleh  Sophie  dkk.,  [9] ditemukan  bahwa  tikus  betina  yang kekurangan GDF-9 mengalami  infertilitas  akibat  adanya sebuah  blok  dalam proses  folikulogenesis pada tahap  folikel  primer.  Pada  tikus, GDF-9 sangat penting  untuk  perkembangan  folikel  normal  dan kemungkinan  terlibat  dalam  pengembangan  sel kumulus [7].
Menurut  Bodensteiner  dkk., [3]  gen GDF-9 sangat penting dalam tahap  folikulogenesis. Gen GDF-9 ini  diekspresikan  pada  oosit  dan  sel-sel granulosa  ovarium  sejak  tahap  folikel  primer sampai oosit diovulasikan.
GDF-9 telah terbukti penting untuk pertumbuhan folikel normal. Hal ini ditunjukkan oleh peran gen GDF-9 dalam pengaturan jumlah folikel  yang  berovulasi  pada  mamalia  yang memiliki tingkat ovulasi rendah [14].
Adanya  alel-alel  mutasi  gen GDF-9 di  ruas promotor  pada  Kambing  Kacang  dan  PE  dapat menambah  temuan  identifikasi  keragaman  gen GDF-9 untuk keperluan seleksi calon induk yang lebih baik pada ternak [19].

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan,  dapat  disimpulkan  bahwa  terdapat  2 haplotip  gen GDF-9 pada  sapi  PO  berdasarkan analisis dengan metode
PCR-RFLP
menggunakan  enzim Hae III , yang  menunjukkan
adanya  polimorfisme  gen GDF-9 pada  sapi  PO. Namun, polimorfisme tersebut tidak ada hubungannya  dengan  keberhasilan  inseminasi buatan pada sapi PO.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  penulis  ucapkan  kepada penyandang  dana  penelitian  juga  fasilitas  yang telah  diberikan  oleh  Laboratorium  Biologi Seluler dan Molekuler, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas Brawijaya, Malang yang telah sangat membantu  dalam  proses  pengerjaan  penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Putra,  E.E.  2009.  Performans  Reproduksi Sapi Pesisir dan Sapi Bali.
[2]  Ghaffari, M., A. N. Javaremi & G. R. Mianji. 2009.  Lack  of  polymorphism  in  the  oocyte derived  growth  factor  ( GDF-9 )  gene  in  the Shal  breed  of  sheep. South  African  Journal of Animal Science , 39:4.
[3]  Bodensteiner, K.J., C.M. Clay, C.L. Moeller &  H.R. Sawyer. 1999. Molecular cloning of the  ovine  growth  differentiation  factor  9 gene and expression of growth differentiation  factor  9  in  ovine  and  bovine ovaries. Biol . Reprod . 60:381-386.
[4]  McGrath,  S.A.,  A.F.  Esquela  &  S.J.  Lee. 1995.  Oocyte  specific  expression  of  growth differentiation  factor  9. Mol . Endocrinol . 9:131-36.
[5]  Tamer,  S.H.  &  A.  David.  2005.  Oocytes prevent  cumulus  cell  apoptosis  maintaining a  morphogenic  paracrine  gradient  of  bone morphogenetic proteins. Journal of Science. 10:5257-5267.
[6] Gilchrist, R.B., R.J. Ritter & D.T. Armstrong. 2005. Oocyte-somatic cell interaction during  follicle  development  in  mammals.
Anim . Reprod . Sci . 82:341-377.
[7]  Dong,  J.W.,  D.F.  Albertini,  K.  Nishimori, T.R.  Kumar,  N.  Lu  &  M.M.  Matzuk.  1996. Growth  differentiation  factor  9  is  required during early ovarian folliculogenesis. Nature . 383:531-535.
[8]  Mazerbourg,  S.,  C.  Klein,  A.  J.  Hsueh,  N. Kaivo-Oja,  O.  Ritvos,  D.  G.  Motterhead  & O. Korchynsky. 2003.
Growth
differentiation factor-9 signaling is mediated
by  type  I  receptor,  activin  receptor-like kinase 5. J . Mol . Endoc . 18:653-655.
[9]  Sophie  P.,  S.  Uzbekova,  C.  Perreau,  P. Papillier,  P.  Mermillod  &  R.  Dalbie”s. 2004.  Spatio-temporal  expression  of  the germ  cell  marker  genes  MATER,  ZAR  1, GDF-9 ,  BMP  15,  and  VASA  in  adult bovine tissues, oocytes, and preimplantation embryos 1. Science Direct . 71:1359-1366.
[10] Murtidjo, B.A. 1993. Beternak Sapi Potong. Kanisius . Yogyakarta.
[11]  Santos-Biase,  W.K.F.,  J.  Buratini,  J. Balieiro, Y.F. Watanabe, M.F. Accorsi, C.R. Ferreira,  P.  Stranieri,  A.R.  Caetano  &  F.V. Meirelles. 2012. Single nucleotide polymorphisms  in  the  bovine  genome  are associated  with  the  number  of  oocytes collected  during  ovum  pick  up. Elsevier . Animal Reproduction Science . Brazil. 134:141–149.
[12] Becker, W.M & L.J. Kleinsonth. 2000. The World  of  The  Cell  fourth  edition. The Benjamins Cummings Publishing Company . New York.
[13]  Frankham,  R.,  J.D.  Ballou  &  D.A.  Briscoe. 2002. Introduction to conservation genetics. Cambrigde University Press . 100-105p.
[14]  Juengel,  J.L.,  N.L.  Hudson,  D.A.  Heath,  P. Smith,  K.L.  Reader,  S.B.  Lawrence,  A.R. O’Connell,  M.P.  Laitinen,  M.  Cranfield, N.P.  Groome,  O.  Ritvos  &  K.P.  McNatty. 2002.  Growth  differentiation  factor  9  and bone morphogenetic protein 15 are essential for ovarian follicular development in sheep. Biol . Reprod . 67:1777-1789.
[15]  Schleif,  R.  1993.  Genetics  and  Molecular Biologi 2thedition. The John Hopkins Press Ltd . London.
[16]  Aryogi.  2005.  Kemungkinan  Timbulnya  In genetik  dan  Ketinggian  Lokasi  Terhadap Performans  Sapi  Potong  Peranakan  Ongole di Jawa. Yogyakarta.
[17] Bearden, H.J & J.W. Fuquay. 1980. Applied animal  reproduction .  Reston  publishing company,  inc.  A  prentice  hall  company. Reston. Virginia. 286-290.
[18]  Hanrahan,  J.P.,  S.M.  Gregan,  P.  Mulsant, M.  Mullen,  G.H.  Davis,  R.  Powell&  S.M. Galloway. 2004. Mutations in the genes for oocyte-derived  growth  factors  GDF9  and BMP15  are  associated  with  both  increased ovulation  rate  and  sterility  in  Cambridge
and  Belclare  sheep  ( Ovis  aries ). Biol . Reprod . 70:900-909.
[19]  He,  Y.Q.  2010.  Candidate  genes  poly- morphism  and  its  association  to  prolificacy in Chinese goats. J Agric Sci . 2:1.