## KARAKTERISASI  ENZIM  SELULASE  PMP  0126Y  DARI LIMBAH  PENGOLAHAN  AGAR
Characterization of PMP 0126Y Cellulase Enzyme from Agar Processing Waste
Ekowati Chasanah 1* , Isna Rahma Dini 2 , dan Nisa Rachmania Mubarik 3
1 Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengembangan  Pengolahan Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan  dan  Perikanan,  KKP. Jl. KS Tubun, Petamburan  VI, Jakarta  10260
2 Program  Studi Agroteknologi  Fakultas  Pertanian,  Universitas  Riau,  Riau
3 Program Studi Bioteknologi Pasca Sarjana IPB,  Bogor Korespondensi  Penulis:  ekowatichasanah@gmail.com
Diterima: 29 April 2013 Disetujui:  10 Oktober 2013

## ABSTRAK
Hasil  penapisan  bakteri  penghasil  enzim  selulase  terdahulu  mendapatkan  isolat  PMP  0126 sebagai  isolat  yang  berpotensi  yang  diisolasi  dari  limbah  pengolahan  agar  skala  UKM  di Pamengpeuk,  Garut.  Isolat  tersebut  ternyata  belum  merupakan  koloni  tunggal,  terdiri  dari  2  isolat bakteri yaitu PMP 0126Y dan PMP 0126W. Isolat PMP 0126Y memiliki kemampuan mendegradasi selulosa  yang  lebih  besar  dibanding  PMP  0126W.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk memproduksi  dan  mengkarakterisasi  enzim  selulase  dari  isolat  PMP  0126Y,  serta  mengidentifikasi isolat  tersebut.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  enzim  selulase  diproduksi  optimum  pada hari  ke-3  kultivasi menggunakan  medium  cair  berisi   CMC  1%.  Enzim  kasar yang  diperoleh  dapat bekerja  optimal  pada  suhu  30  °C  dan  pH  5,  dapat  ditingkatkan  aktivitasnya  dengan  ion  logam dalam  bentuk  garam  CaCl 2 dan  ZnCl 2 5  mM. . Pemurnian  dengan  sistem  penukar  anion  dapat meningkatkan  aktivitas  enzim  15x  dengan  perolehan  20%.  Dari  hasil  SDS-PAGE  terlihat  bahwa ada  3  selulase  dengan  perkiraan  berat  molekul  39,  30,  dan  14  kDa.  Enzim  kasar  ini  memiliki kemampuan  menghidrolisis  limbah  pengolahan  agar  sebaik  ketika  memecah  substrat  CMC, yang  mengindikasikan  bahwa  enzim  dari  isolat  ini  berpotensi  sebagai  kandidat  agen  sakarifikasi pada  produksi  bioetanol.  Identifikasi  bakteri  dengan  16S-rDNA  menunjukkan  bahwa  isolat  ini memiliki  kemiripan  96%  dengan  bakteri Chryseobacterium  indologenes McR-1.
KATA KUNCI: limbah pengolahan agar, selulase, karakterisasi, isolat PMP 0126Y

## ABSTRACT
From  previous  screening  study,  PMP  0126  has  been  identified  as  one  of  potentially  isolate from  medium  scale  agar  processing  industries in  Pamengpeuk,  Garut.  However,  PMP  0126  was not pure  yet, containing 2 isolates  PMP 0126 Y and PMP 0126W. PMP  0126 Y produced  higher celullase compared to the PMP 0126W. Aims of this study was to produce and characterize PMP 0126Y cellulase and identify the isolate. Result showed that the cellulase was optimally produced on  the  third  days  of  cultivation  using  1%  CMC  medium.  Crude  enzyme  worked  optimally  at temperature of 30 °C and pH 5, and the activity could be improved by addition of 5 mM CaCl 2 and ZnCl 2 . Purification  using  anion  exchanger could  improve  the  activity  15  times  with  yield  of  20%. PMP  0126Y  produced  3  cellulases  with  estimated    molecular  weight  of  39,  30  dan  14  kDa.  The crude  enzyme  could  degrade  the  agar  processing  waste  as  good  as  CMC,  indicating  that  this enzyme could be  used  as saccharification agent for bioethanol processing  from agar processing waste.  Identification  study  showed  that  this  isolate  was    96%  similar  to Chryseobacterium indologenes McR-1.
KEYWORDS: agar processing waste,  cellulase, characterization, PMP 0126Y isolate

## PENDAHULUAN
Kem enter ian  K elaut an  Perikanan  telah mencanangkan produksi hasil kelautan dan perikanan termasuk rumput laut, sebesar 353% sampai dengan
Tahun 2014. Pusat-pusat budidaya rumput laut telah dikembangkan  di  seluruh  wilayah  Indonesia  dan rencana  pengem bangan  skala  usaha  industri pengolahan rumput laut baik yang telah ada maupun yang akan dikembangkan telah direncanakan oleh
Direktorat Pengolahan Hasil Perikanan, Kementerian Kelautan dan Perikanan (Anon., 2012).
Industri  agar  dilaporkan  menghasilkan  limbah sebesar  65–75%,  yang  masih  memiliki  selulosa sebesar 19,7% (Kim et al. , 2008), selulosa merupakan jenis  karbohidrat  terbanyak  nomor  2  setelah  kitin. Salah satu alternatif pemanfaatan limbah rumput laut dari industri pengolahan rumput  laut  yaitu dengan memproses selulosa yang masih terkandung dalam limbah  dengan  jumlah  yang  cukup  besar  menjadi etanol.  Pemanfaatan  limbah  selulosa  dan  bakteri penghasil  enzim  penghidrolisis  selulosa  dapat memberikan peluang pada pengembangan bioenergi dari bahan hayati laut.
Proses hidrolisis selulosa dapat dilakukan dengan menggunakan asam dan suhu tinggi. Proses ini relatif mahal karena membutuhkan energi yang besar serta dapat mengakibatkan degradasi produk monosakarida yang dihasilkan sehingga produk  yang  dihasilkan rendah. Selain itu, Riyanti (2008) melaporkan efisiensi proses hidrolisis dengan asam masih rendah karena proses  y ang  dilak ukan  cukup  panjang  dan membutuhkan banyak tahapan. Kekurangan lain dari proses ini antara lain yaitu penanganan limbah asam yang  tidak  mudah.  Hidrolisis  selulosa  dengan menggunakan enzim selulase mulai dikembangkan pada tahun 1980-an (Coral et al ., 2002). Hidrolisis secara enzimatik melibatkan proses yang lebih ramah lingkungan,  efisien,  dan  m urah  karena  tidak memerlukan energi tinggi.
Enzim selulase  merupakan  sistem  enzim yang terdiri  atas  tiga  tipe  enzim  utama  yaitu endo-  - glucanase (EC 3.2.1.4), exo-  -glucanase (EC 3.2.1.91) dan  -glucosidase (EC 3.2.1.21). Endo-  -glucanase , 1,4-  -D-glucan  glucanohydrolase ,  CMCase,  Cx: “random”  memutus  rantai  pada  selulosa  dan menghasilkan  glukosa  dan  oligosakarida. Exo-  - glucanase , 1,4-  -D-glucan  cellobiohydrolase , avicelase, C1 akan menghidrolisis selulosa dari sisi non reduksi, menghasilkan selobiosa sedangkan ß- glucosidase,  cellobiase akan  m enghidrolisis cellobiosa menjadi glukosa (Crueger & Crueger, 1984; Anon., 2013). Ketiga enzim ini bekerja secara sinergis mendegradasi selulosa dan melepaskan gula reduksi (selobiosa  dan  glukosa)  sebagai  produk  akhirnya. Enzim selulase akan memutuskan ikatan glikosidik  - 1,4  di  dalam selulosa  yang  memiliki  ikatan  -1,4- glikosidik pada polimer glukosanya sehingga menjadi gula sederhana turunannya.
Penapisan selulase di Indonesia telah dilakukan di  antaranya  dari  tanah  (Meryandini et  al .,  2009; Lisdiyanti et al ., 2012). Mangunwardoyo et al. (2011) telah  melaporkan  selulase  dari  yeast  yang  telah diisolasi dari tanah, air sungai dan sedimen Taman
Nasional Gunung Halimun (TNGH). Isolasi selulase bakteri  dari lingkungan laut  dari rumput laut Ulva lactuca telah dilaporkan  oleh Trivedi et  al. (2011). Shanmunghapriya et  al .  (2010)  telah  mengisolasi selulase dari spons laut Dendrilla nigra , sedangkan Gao et al . (2010) melaporkan bakteri selulolitik dari tanah sekitar mangrove.
Dari  kegiatan  sebelumnya,  penapisan  bakteri selulolitik telah dilakukan utamanya dari rumput laut dan limbah pengolahan rumput laut (Munifah et al ., 2011). Dari kegiatan tersebut didapatkan salah satu bakteri  yang  memiliki  potensi  sebagai  bakteri selulolitik,  yaitu  isolat  PMP  0126  yang  berhasil diisolasi dari limbah pengolahan agar-agar rumput laut Glacilaria sp. dari daerah Pameungpeuk, Garut Jawa Barat (Munifah et al ., 2011). Ide dilakukannya isolasi bakteri dari limbah rumput laut ini yaitu diperolehnya bakteri selulolitik hasil  isolasi untuk mendegradasi selulosa dari limbah rumput laut ekonomis maupun rumput laut non ekonomis sebagai agen sakarifikasi untuk produksi bioetanol. Sebagaimana dilaporkan oleh  FAO  (Anon.,  2013)  bahwa  keberhasilan penggunaan  selulosa  untuk  sumber  karbon  yang bersifat  dapat  diperbaharui  (bioenergi)  sangat tergantung  dari  teknologi  proses  yang  secara ekonomis menguntungkan untuk produksi selulase. Selulase yang diproduksi secara lokal diharapkan akan banyak mengurangi beban biaya produksi bioenergi/ bioetanol.
Isolat PMP 0126 ternyata belum murni, dan hasil pemisahan lanjutan mendapatkan 2 isolat bakteri dari isolat  PMP  0126,  yaitu  isolat  bakteri  0126Y  dan 0126W. Dari hasil pengujian kualitatif menunjukkan bahwa isolat PMP 0126Y memiliki kemampuan lebih besar dalam memecah selulosa, yaitu menghasilkan indeks selulolitik sebesar 1,9 dibanding  isolat PMP 0126W yang menghasilkan indeks selulolitik sebesar 1.  Berdasarkan  hasil  pengujian  kualitatif  tersebut, maka selanjutnya isolat PMP 0126Y digunakan untuk penelitian  ini.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah memproduksi dan mengkarakterisasi enzim selulase yang  dihasilkan  oleh  isolat  PMP  0126Y  serta melakukan identifikasi bakteri tersebut.

## BAHAN DAN METODE

## Penyegaran dan identifikasi isolat PMP 0126Y
Isolat  PMP  0126Y  disegarkan  dengan  cara menumbuhkan isolat pada media padat berisi nutrient agar (NA) dan diinkubasi pada suhu 37 °C (24 jam). Identifikasi  berdasar  gen  16S-rDNA  dilakukan mengikuti  Suwanto et  al .  (2000).  Analisis Cluster
terhadap  urutan  (sekuens)  basa  pada  gen  hasil amplifikasi PCR dilakukan menggunakan European Bioinformatics  Institute (http://www.ebi.ac.uk)  dan National Center Biotechnology Information (NCBI), sedangk an  pem buatan  pohon  kekerabatan ( phylogenetic tree) dilakukan menggunakan program Treecon (Van de Peer & De Watcher, 1993).

## Kurva pertumbuhan dan waktu produksi enzim
Kurva pertumbuhan isolat PMP 0126Y dilakukan mengikuti Lee (2006) dengan cara menumbuhkan isolat ke dalam 10 ml nutrient broth (NB) dan diinkubasi selama 12–14 jam. Kultur diinkubasi pada suhu 30°C di  dalam  penangas  goyang  (Shel  Lab)  dengan kecepatan  agitasi  150  rpm.  Sampling  dilakukan selama 27 jam dengan rentang waktu sampling 3 jam untuk diukur nilai Optical Density (OD) pada panjang  600 nm. Penghitungan jumlah koloni total pada cawan (TPC) juga dilakukan untuk memperkirakan jumlah  sel  bakteri  pada  setiap  nilai  OD  yang dihasilkan.
Penentuan  waktu  produksi  enzim  selulase menggunakan starter 10% yang dilakukan pada skala 25 ml media cair yang mengandung CMC 1% dalam 250 ml erlenmeyer. Pengambilan sampel dilakukan setiap  hari  selama  6  hari  waktu  inkubasi.  Larutan sampel  disentrifugasi  pada  suhu  4  °C  dengan kecepatan 9000 xg selama 10 menit, dan supernatan yang dihasilkan berupa enzim kasar ekstraseluler yang kemudian diuji aktivitasnya.

## Pengujian aktivitas enzim
Pengujian  aktiv itas  enzim  dilakukan  dengan menggunakan metode DNS Wood (1988) dalam Arifin (2006) yang dimodifikasi. Substrat (1,8 ml) dalam 0,1 M bufer sitrat fosfat pH 5 ditambah dengan 0,2 ml enzim kasar, dikocok kuat dengan vortex, selanjutnya diinkubasi selama 30 menit pada suhu 30 °C. Reaksi enzim dihentikan dengan mencelupkan (10 menit) campuran  reaksi  ke  dalam  penangas  berisi  air mendidih.  Setelah  itu,  diambil  campuran  reaksi sebanyak  1  ml,  ditambah  dengan  1  ml  DNS,  dan dipanaskan  dalam  air  mendidih  selama  15  menit. Setelah dingin, absorbansi diukur pada  575 nm. Perlakuan  kontrol  dan  blanko  dilakukan  secara bersamaan dengan tahapan yang sama. Pada kontrol, enzim yang akan direaksikan dengan substrat telah diinaktivasi  terlebih  dahulu  dengan  memanaskan enzim  selam a  15  menit  dalam  air  mendidih. Sedangkan pada blanko, larutan enzim diganti dengan akuades untuk direaksikan dengan substrat. Aktivitas selulase dinyatakan dalam satuan internasional yaitu U/ml.  Satu  unit  merupakan  jumlah  enzim  yang dibutuhkan untuk memecah 1 µmol selulosa menjadi
gula  pereduksi  per  menit  pada kondisi  pengujian. Aktivitas enzim dihitung berdasarkan Irawan et  al . (2008).

## Pemurnian Enzim Selulase
Pemurnian  enzim  dilakukan  dengan  metode penukar ion mengikuti Li-Jung et al . (2010) dengan m odif ik asi.  Pem ur nian  dilakukan  dengan menggunakan Akta purifier. Sebagai fase diamnya adalah DEAE Sepharose TM Fast Flow (Amersham- Bioscience, Upsalla Sweden), dan buferTris-HCl 0,05 M pH 8 dengan gradien konsentrasi NaCl dalam Tris- Cl 0,05 M pH 8 sebagai fase geraknya. Elusi protein enzim target dilakukan dengan mengalirkan gradien NaCl 0-0,5M.

## Analisis Elektroforesis SDS-PAGE dan Zimogram
SDS-PAGE dilakukan menurut Bollag & Edelstein (1991)  dengan  menggunakan  10%  poliakrilamida sebagai gel pemisah dan 4% poliakrilamida sebagai gel pengumpul atau penahan. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 volt dan 50 mA di dalam piranti elektroforesis (Amersham Bioscience, Swedia).
Zimogram  dilakukan  dengan  mengembangkan metoda  Nack-Shick et  al .  (2006).  Substrat  0,1% ditambahkan pada gel, dan setelah selesai proses elektroforesis, renaturasi  dilakukan  pada  gel yang m engandung  substrat  tersebut  dengan  cara merendam gel di dalam 2,5% Triton X-100 selama satu jam sambil digoyang konstan. Gel ditiriskan dan direndam dalam 0,05 M bufer sitrat posfat pH 5 selama 1,5–2 jam sambil digoyang perlahan dalam inkubator goyang  pada  suhu  30  °C.  Kemudian  gel  diwarnai dengan 0,1% congo red selama 30 menit, selanjutnya direndam dengan 1 M NaCl selama 15 menit. Zona bening disekitar pita menunjukkan adanya aktivitas enzim.

## Pengukuran Kadar Protein
Pengukuran  kadar  protein  dilakukan  dengan menggunakan metode Bradford (1976).

## Karakterisasi Enzim
Penentuan  pH  optimum   dilakukan  dengan mereaksikan  enzim  dan  substrat  yang  memiliki berbagai tingkatan pH yaitu pH 3, 4, 5 (0,05 M bufer asetat), pH 5, 6, 7 (0,05 M buffer sitrat fosfat), dan pH 7,  8,  9  (0,05  M  bufer  Tris  HCl).  Penentuan  suhu optimum dilakukan dengan mereaksikan substrat dan enzim  pada  tingkatan  suhu  antara  30  °C  sampai dengan 90 °C dengan selang 10 °C selama 30 menit waktu inkubasi. Pengukuran stabilitas panas enzim dilakukan  dengan  memanaskan  enzim  selulase selama 15, 30, 45, 60, 90, 120, dan 240 menit pada suhu optimum enzim.
Pengujian  substrat  spesifik  dilakukan  dengan menguji selulase PMP 0126Y pada berbagai substrat (CMC teknis dan CMC murni, avisel, kertas Wathman filter paper No. 1, limbah rumput laut pengolahan agar PT. Agarindo, limbah rumput laut pengolahan agar Pemeungpeuk dan limbah pengolahan alginat dari rumput laut Sargassum ). Aktivitas diukur pada kondisi (suhu dan  pH) optimal  enzim  tersebut. Kestabilan enz im   pada  bahan  aditi f   dil akukan  dengan menggunakan 5 mM dan 10 mM ion logam KCl, NaCl (monov alen),  CaCl 2 . 2H 2 O,  MgSO 4 . 7H 2 O,  ZnCl 2 (divalen), dan FeSO4 . 7H 2 O (trivalen).

## HASIL DAN BAHASAN
Isolat PMP 0126Y yang digunakan pada penelitian merupakan hasil pemurnian ulang isolat PMP 0126 penghasil  enzim  selulase yang  telah  diisolasi  dari limbah  pengolahan  rumput  laut  hasil  penapisan sebelumnya  (Munifah et  al .,  2011).  Dari  2  hasil pemurnian ulang diperoleh 2 isolat yaitu PMP 0126Y dan PMP 0126P, selanjutnya isolat PMP 1026Y dipilih untuk digunakan dalam penelitian ini dan dilakukan identifikasi ulang. Dari hasil pewarnaan gram, isolat PMP 1026Y adalah bakteri Gram negatif berbentuk bat ang  pendek.  Berdasarkan  identif ik asi menggunakan primer 16S r-DNA, isolat PMP 0126Y memiliki kemiripan sebesar 96% dari 1282 nukleotida yang overlapped (bertumpang tindih) dengan 1234
nukleotida dari bakteri Chryseobacterium indologenes galur  McR-1.  Gambar  1  memperlihatkan  pohon filogenetik yang menggambarkan posisi isolat PMP 0126Y  dengan  beber apa  bakteri  genus Chryseobacterium dan  bakteri  penghasil  enzim selulase.
Yi-Tsung et al. (2010) melaporkan bahwa 6 species Chryseobacterium yang sebelumnya masuk dalam genus Flavobacterium merupakan bakteri yang non- motile ,  positif  katalase,  positif  oksidase,  positif penghasil  indol  dan  tidak  mampu  menggunakan glukosa  dalam  fermentasi. Chryseobacterium indologenes dapat ditemukan di alam secara mudah, tetapi bukan termasuk bakteri yang keberadaannya normal  dan  jarang  yang  bersifat  patogen    pada manusia, tetapi bersifat patogen di ikan. Karena itu, keberadaan bakteri  ini di  limbah  pengolahan agar bukan indikasi limbah tersebut sudah tercemar oleh kotoran ataupun penanganan manusia, tetapi lebih pada keberadaan bakteri ini yang mudah ditemukan di alam dan kebetulan sesuai dengan kondisi limbah tersebut. Sampai  dengan saat ini belum diperoleh informasi  tentang  selulase  dari  bakteri  tersebut, Chryseobacterium sp  telah  dilaporkan  Riffel  & Brandelli,  2002 dalam El-Ayouty et  al. (2012) menghasilkan keratinase.  Akan tetapi, selulase dari Flavobacterium sp. F 52 telah dilaporkan (Tsuji et al ., 2013).
Gambar 1.  Pohon filogenetik isolat PMP 0126Y. Figure 1.  Phylogenetic tree of isolat PMP 0126Y.
Hasil isolasi selulase dari tanah peat menghasilkan bakteri selulolitik Bacillus pumilus , Bacillus cereus, Paenibacillus elgii , dan Bacillus sp. lainnya, di mana selulase  yang  dihasilkan  dilaporkan  bersifat thermozyme (Lisdiyanti et al ., 2012). Dokumen FAO Corporate Document Repository tentang Renewable biological systems for alternative sustainable energy production menyebutkan bahwa fungi, Actinomycetes dan bakteri merupakan mikroorganisme penghasil selulase  yang  representatif,  dan  untuk  bakteri penghasil selulase maka jenis yang sudah tercatat adalah Clostridium  thermocellum,  Ruminococcus albus, Streptomyces sp . (Anon., 2013). Trivedi et al . (2011) melaporkan bakteri selulolitik dari rumput laut Ulva lactuca yang memiliki kemiripan dengan Bacillus lectus strain  SV6.  Shanmunghapriya et  al .  (2010) telah mengisolasi bakteri selulolitik Marinobacter sp. (MSI032) dari spons laut Dendrilla nigra , sedangkan Gao et al . (2010) melaporkan Vibrio penghasil selulase dari tanah sekitar mangrove di perairan Cina.
Ketika  ditumbuhkan  pada  media  cair  yang mengandung  CMC 1%,  isolat  PMP  0126Y  segera masuk pada fase logaritmik sampai dengan jam ke 21 (hari 1), yang dilanjutkan dengan fase stasioner dan fase declining (Gambar 2). Dari Gambar 2 terlihat bahwa  enzim  selulase  diproduksi  mulai  dari  fase logaritmik  dan  maksimum  pada  fase  stationer.  Ini mengindikasikan  bahwa  isolat  PMP  0126Y  yang diperoleh dari limbah pengolahan agar memproduksi selulase sebagai alat untuk memecah selulosa yang ada di limbah tempat hidupnya untuk mendapatkan sumber C dan N sederhana yang bisa digunakan isolat tersebut  untuk  tumbuh.  Produksi  maksimal  yang terdeteksi  pada  fase  stationer  diduga  merupakan kumulatif dari produksi sebelumnya yang selanjutnya
Akt iv it as S pe s if ik/ Spe c iific Activi ty (U/m g) Waktu/ Time (hari/ days ) Ju m lah Ba kter i/ Nu m be r o f Ba cteri a (Log 10 cfu/ ml) Aktivitas  Spesifik Log  Sel
Gambar 2.  Kurva produksi selulase dan jumlah sel bakteri PMP 0126Y selama pertumbuhan. Figure 2.  Production curve and cell number of PMP 0126Y isolate during cultivation.
pada fase stationer enzim tersebut akan dirombak oleh  isolat  PMP  0126Y  untuk  mempertahankan hidupnya diantaranya sebagai sumber energi. Pada waktu  puncak  tersebut,  aktiv itas  enzim   yang didapatkan  adalah  0,120  U/ml.  Penelitian  yang dilakukan  oleh  Lisdiyanti et  al. (2012)  yang mengisolasi selulase dari bakteri selulolitik dari tanah peat (gambut) menghasilkan selulase dengan aktivitas 0,021–3,082 U/ml. Jika dibandingkan dengan selulase dari  tanah peat ,  selulase  dari  limbah  pengolahan rumput laut untuk produksi agar masih dalam kisaran rendah,  meskipun  masih  dalam  kisaran  aktivitas selulase  yang  didapat  dari  tanah  gambut  ( peat) . Produksi enzim ini selain ditentukan oleh jenis sumber enzim juga sangat ditentukan oleh komposisi medium (Deswal et al . 2011) dan konsentrasi substrat (Reczey et al . 1996).
Sel anjut nya  enzim   dipr oduksi  dengan menggunakan waktu produksi 3 hari (Gambar 2), suhu kultivasi 30 °C di dalam penangas goyang (Shel Lab) dengan  k ecepatan  agitasi  150  rpm .  Enzim ekstraseluler  kasar  yang  diperoleh  kemudian dimurnikan. Pemurnian dilakukan dengan penukar ion, dengan menggunakan matriks DEAE Sepharose Fast Flow sebagai fase diam, dan gradien NaCl sebagai fase  geraknya.  Gambar  3  memperlihatkan  profil pemurnian  enzim  selulase  PMP  0126Y,  yang memperlihatkan 1 puncak protein pada fraksi 49-51 elusi NaCl 0,406M. Pengecekan dengan SDS-PAGE dan zimogram memperlihatkan bahwa hasil pemurnian fraksi  49–51, 52, dan 55 masih memiliki banyak pita protein, yang menandakan bahwa pemurnian dengan sistem tersebut masih belum mampu memurnikan secara maksimal. Secara umum, strategi pemurnian enzim melibatkan lebih dari 1 tahap pemurnian. Pada
sistem pemurnian yang dilakukan oleh Li-Jung et al . (2010),  enzim  selulase  murni  terlihat  sebagai  pita tunggal ketika digunakan 2 sistem pemurnian yaitu sistem penukar ion yang dilanjutkan dengan sistem gel filtrasi. Hasil pemurnian selulase dari isolat PMP 0126Y  telah  diringkas  pada  Tabel   1,  y ang menunjukkan  bahwa  pemurnian  dengan  tahap pemurnian  tunggal  DEAE Sepharose TM Fast  Flow tersebut  mampu  meningkatkan  aktiv itas  enzim sebesar 16x dengan perolehan 5%.
Hasil  SDS-PAGE  telah  dikonfirmasi  dengan analisis zimogram. Hasil zimogram ditandai dengan terbentuknya zona bening pada gel yang menunjukkan adanya aktivitas selulase yang dihasilkan pada gel akrilamida  yang  mengandung  0,1%  CMC.  Hasil optimasi untuk mendapatkan visualisasi yang baik
menunjukkan bahwa waktu inkubasi gel terbaik adalah 60 menit dengan menggunakan bufer sitrat fosfat pH 5, setelah tahapan renaturasi dengan larutan 2,5% Triton  X-100  selam a  1  jam .  Hasil  zim ogram menunjukkan  adanya  tiga  molekul  protein  yang memiliki aktivitas selulolitik dengan perkiraan berat molekul 39, 30, 14 kDa yang dihitung berdasarkan mobilitas relatif terhadap standar protein (Gambar 5). Hasil penelitian tentang selulase dari Bacillus subtilis YJ1 melaporkan berat molekul selulase 32,5 kDa. Selulase dari Bacillus subtilis YJ1 dilaporkan telah dimurnikan dengan sistem yang sama yaitu penukar ion,  dengan  Macro-Prep  yang  dilanjutkan  dengan sistem pemurnian dengan gel filtrasi Bio-Gel P-100 kromatografi  dan  berhasil  mendapatkan  satu  pita protein murni. Perolehan yang didapat dengan sistem tersebut adalah 9,7% (Li-Jung et al ., 2010).
Gambar 3.  Profil elusi selulase menggunakan penukar ion dengan matriks DEAE Sepharose. Figure 3.  Elution profile of cellulase using ion exchange of DEAE Sepharose matrix.

## Tabel 1. Pemurnian partial selulase PMP 0126Y
Table 1. Partial purification of PMP 0126Y Celulase
Tahap/ Steps Volume (ml) Aktivitas/ Activity (U/ml) Aktivitas Total/ Total Activity (U) Konsentrasi Protein/ Protein Concentration (mg/ml) Aktivitas spesifik/ Specific Activity (U/mg) Kemurnian/ Purity Hasil/ Yield (%) Ekstrak kasar/ Crude Extract 500 0.064 32.00 0.750 0.086 1.000 100 Ultrafiltrasi/ Ultrafiltration 50 0.112 5.60 0.822 0.136 1.581 17.5 Penukar ion/ Ion exchanger (fraksi/ fraction 49,50,51) 12 0.143 1.72 0.105 1.362 15.84 5.4
Hasil karakterisasi enzim selulase menunjukkan bahwa enzim kasar dan enzim murni dari isolat PMP 0126Y menunjukkan pH optimum yang sama yaitu pH  5 dengan  bufer yang sesuai untuk  selulase  ini adalah bufer fosfat (Gambar 6). Namun demikian, terdapat  pergeseran  suhu  optimal;  enzim  kasar memiliki  suhu  optimal  untuk  aktif  pada  30°C, sedangkan  enzim  yang  telah  dimurnikan  secara parsial dengan  kromatografi penukar anion memiliki suhu  optimum  40°C  (Gambar  7).  Perbedaan  ini disebabkan oleh masih terdapatnya materi-materi lain seperti garam, protein non enzim dan lain-lain, yang dapat berfungsi sebagai pelindung enzim.
Gambar 4. Hasil elekroforesis SDS PAGE enzim dari PMP 0126Y. (A: Penanda berat protein rendah, B: Ultrafiltrasi, C: Fraksi 55, D: Fraksi 49-51, E: Fraksi 52).
Figure 4. Result of SDS-PAGE of PMP 0126Y cellulase crude enzyme. (A: Protein low molecular weight marker, B: Ultrafiltrasi, C: Fraksi 55, D: Fraksi 49-51, E: Fraksi 52).
Hasil uji stabilitas pada variasi suhu 30, 40, dan 50°C yang diperlakukan pada enzim selulase PMP 0126Y memperlihatkan bahwa sampai dengan 4 jam pengamatan enzim selulase relatif stabil pada ketiga suhu tersebut yang diperlihatkan dengan hasil bahwa ketiga perlakuan panas tidak menyebabkan penurunan aktivitas dibawah 50% aktivitas awal (Gambar 8).
Dibandingkan dengan selulase dari Bacillus flexus NT yang diisolasi dari rumput laut Ulva flexus yang dibusukkan, terdapat perbedaan karakter seperti berat molekul, pH dan suhu optimal enzim. Selulase dari limbah pengolahan agar yang diproduksi dari isolat PMP 012Y memiliki pH optimal 5 dan bekerja optimal
Gambar 5. Hasil zimogram PMP 0126Y  (M: Marker protein rendah A : Enzim hasil ultrafiltrasi, B : Fraksi KPA.
Figure 5. Zymogram analysis of PMP 0126Y cellulase (Note : M = marker; A = crude enzyme; B = enzyme from partial purification).
pada suhu 30°C, mampu ditingkatkan aktivitasnya oleh Ca 2+ dan Mg 2+ pada konsentrasi 5 mM dan sedikit ditingkatkan oleh adanya Fe 2+ dalam bentuk garam klorida. Selulase dari rumput laut Ulva flexus memiliki ketahanan terhadap alkali dan garam, pH dan suhu optimal  10  dan  45°C,  serta  dapat  ditingkatkan aktivitasnya oleh ion logam Cd 2+ dan Li 2+ dan dihambat oleh  adanya  Cr 2+ ,  Co 2+ ,  Zn 2 (Trivedi et  al. 2010). Perbedaan karakter tersebut disebabkan oleh banyak hal,  diantaranya  oleh  sumber  mikrobanya,  serta lingkungan tempat mikroba tersebut diisolasi. Pada selulase yang diperoleh dari limbah pengolahan agar, tampaknya  proses  pengolahan  mempengaruhi karakter dari selulasenya. Peningkatan aktivitas oleh ion Ca diduga karena dalam proses pengolahan agar,
0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.16 3 4 5 5 6 7
7 8 9
Sitrat/ Citrate
Asetat/ Acetat Fosfat/ phosphate Ak tv itas En z im / En z y m e A c tiv ity (U /m l) pH  dan Bufer  yang  Digunakan/ pH  and  Buffer Used
Gambar 6. Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126Y. Figure 6. Effect of pH to PMP 0126Y cellulase.
Enzim  kasar/ Crude  enzyme
Enzim murni/
Pure  enzyme
Gambar 7.  Pengaruh suhu terhadap aktivitas selulase kasar dan murni dari PMP 0126Y. Figure 7.  Effect of  temperature on crude and relatively pure PMP 0126Y cellulase.
terdapat  tahapan  penambahan  CaO  (5%)  yang ditujukan sebagai agen pemucat rumput laut, yang dilakukan pada tahap awal pengolahan. Selanjutnya dalam  proses  ekstraksi  agar,  pH  yang  digunakan adalah pH 5-6 yang ditujukan untuk mempermudah proses tersebut dengan penambahan asam asetat atau fosfat. Karena itu dapat dimengerti bahwa bakteri yang  tumbuh  di  limbah  pengolahan  agar  akan beradaptasi  dengan kondisi  ini dan  mengeluarkan enzim yang bekerja yang sesuai dengan kondisi yang ada, diantaranya bekerja dengan baik pada pH 5 dan adanya ion kalsium. Selain Ca, ion Mg juga mampu meningkatkan aktivitas selulase yang diisolasi dari limbah pengolahan agar ini.
A k ti v it as S elu la se / C e ll u la s e A c ti v it y( U /ml ) Suhu/ Temperature (°C) Ultrafiltrasi/
Ultrafiltration Enzim  murni/
Pure  enzyme
Pengujian  aktivitas  selulase  PMP  012Y  pada berbagai  substrat  menunjukkan  bahwa  aktivitas tertinggi dihasilkan ketika substrat yang digunakan adalah limbah rumput laut dari pengolahan agar yang diikuti dengan limbah rumput laut dari pengolahan agar- agar PT. Agarindo, keduanya telah di pretreatment dengan  NaOH  6%  (Gambar  10).  Pre  treatment ditujukan untuk menyiapkan substrat agar lebih mudah diakses  oleh  enzim  selulase.  Dibanding  dengan biomassa  lignoselulosa  dari  limbah  pertanian,
Gambar 8. Stabilitas panas selulase PMP 0126Y pada suhu 30°C, 40°C, 50°C.
Figure 8.  Heat stability of PMP 0126Y cellulase on 30 ° C, 40 ° C, 50 ° C.
Akti v itas Re lati f / Re la tive A ctivity (%) Ion logam/ Metal ion 5 mM Akt iv itas Re lat if / Re lativ e Act ivi ty (%) Perlakuan Pemanasan/ Heat Treatment (menit/ minute)
30 40 50
10 mM
Gambar 9. Penambahan ion logam (5 mM dan 10 mM) dan pengaruhnya terhadap aktivitas relatif selulase kasar dari  isolat PMP 0126Y.
Figure 9. Addition of ion metal (5 mM dan 10 mM) and its effect to relative activity crude PMP 0126Y cellulase.
biomasa dari makroalga atau rumput laut memiliki keuntungan  dengan  rendahny a  lignin  dan hemiselulosa . Dalam  penelitian  ini  terlihat  bahwa selulase PMP 0126Y mampu menggunakan limbah rumput laut yang telah diperlakukan dengan NaOH 6% sebagai substrat sebaik CMC murni dan teknis (Gambar 10).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa selulase PMP 0126Y ini memiliki potensi untuk menjadi agen pendegradasi substrat limbah pengolahan rumput laut,
yang terlebih dulu di perlakukan dengan NaOH 6%. Aplikasi enzim ini dalam skala lebih besar diperlukan untuk pengecekan efisiensi enzim tersebut sebagai agen biologi dalam proses sakarifikasi limbah rumput laut pengolahan agar.

## KESIMPULAN
Dari isolat PMP 0126Y yang memiliki kemiripan 96%  dengan Chryseobacterium  indologenes galur McR-1 telah didapatkan enzim selulase yang dapat bekerja optimal pada  pH 5 dan suhu 30°C. Enzim selulase tersebut mampu ditingkatkan aktivitasnya oleh Ca 2+ dan Mg 2+ pada konsentrasi 5 mM dalam bentuk garam klorida. Keberadaan ZnCl 2 baik pada konsentrasi 5 maupun 10 mM dapat menghambat aktivitas  enzim.  Isolat  PMP  0126Y  memproduksi paling  sedikit  3  selulase  dengan  perkiraan  berat molekul 39, 30, dan 14 kDa yang dapat dideteksi dari analisis zimogram. Selulase PMP 0126Y ini memiliki potensi sebagai agen sakarifikasi selulosa yang ada pada limbah pengolahan rumput laut karena mampu menghidrolisis  limbah  rumput laut  sebaik  substrat CMC.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim.  2012. Roadmap  Rumput  Laut .  Dirjen  P2HP, KKP.
Anonymous. 2013. FAO Corporate document Repository on Renewable  biological  s ystems  for  alternative
Akti v itas Selu las e/ Ce lu lla se Act ivi ty (U /ml) Substrat Selulosa/ Cellulosa Substrate
Gambar 10. Aktivitas selulase PMP 0126Y pada berbagai substrat (a. CMC murni, b. CMC teknis, c. Avisel, d. kertas Whatman No.1, e. limbah agar-agar PT Agarindo NaOH 6%, f. limbah alginat, g. limbah agar-agar Pameungpeuk NaOH 4%, h. limbah agar-agar Pameungpeuk NaOH 6%, dan i. limbah agar-agar Pameungpeuk H 2 SO 4 1%). Figure 10. PMP 0126Y cellulase activity toward various substrate (a. pure CMC, b. technical CMC, c. Avisel, d. Whatman No.1, e. PT Agarindo waste treated with NaOH 6%, f. Alginat processing waste, g. Waste from Pameungpeuk agar processing treated with NaOH 4%, h. Waste from Pameungpeuk agar processing treated with NaOH 6%, dan i. Waste from Pameungpeuk agar processing treated with H 2 SO 4 1%).
sustainable energy production. http : www. Publikasir/ 2013/bioethanol/3.2%20Cellulase%20production. htm.  Diakses  pada  tanggal  26  Juli  2013.
Arifin, H. 2006. Bacterial  Cellulase  from  A  Local  Isolate Bac illus  pumilus  EB3 .  Tesis . Universitas  Putra Malaysia,  Kuala  Lumpur. Bollag,  M.D.  and  Edelstein,  S.J.  1991. Protein  Method . New  York:  W iley-Liss.
Bradford, M.M.  1976. A Rapid and sensitive methode for the  quantitation  of  micogram  quantitaties  of  protein in utilizing the principle of protein-dye Binding. J. Anal Biochem. 72:  248–254.
Choi,    Chung,  N.S.D.M.,  Ryu, C.H., Yoon,  K.S.,  Maeng,
P.J.,  and  Kim,  S.H.  2006.  Identification  of  Three Extracellular  Proteases  from Bacillus  subtilis KCTC 3014. J.  Microbiol.  Biotechnol .  16(3):  457–464. Coral, G., Arikan, B., Nisa, U.M.,and Guvenmez, H. 2002. Some  properties  of  crude  carboxylmethyl  cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain. Turk. J. Biol.
26:  209–213.
Crueger, W. and Crueger,  A. 1984. Biotechnology . In Brock T.D.  (ed.). Textbook  of  Industrial  Microbiology . Sunderland:  Minuaer Associates.  267–276  pp.
Deswal,  D.,  Khasa,  Y.P.,  and  Kuhad,  R.C.  2011 .
Optimization  of  cellulase  production  by  a  brown  rot fungus Fomitopsis sp.  RCK2010  under  solid  state fermentation. Bioresour.  Technol .  102:  6065–6072. Gao, Z., Ruan, L., Chen, X., Zhang, Y., and Xu, X. 2010. A novel  salt-tolerant  endo-beta-1,4-glucanase  Cel5A in Vibrio sp.  G21  isolated  from  mangrove  soil. Appl. Microbiol.  Biotechnol. 87(4):  1373–1382.
Irawan,  B.,  Sutihat,  dan  Sumardi.  2008.  Uji  aktivitas selulase  dan  lipase  pada  mikrofungi  selama  proses
dekomposisi  limbah  c air  k elapa  sawit  dengan pengujian  kultur  murni. Prosiding  Seminar  Hasil Penelitian  dan  Pengabdian  kepada  Masyarakat . Lampung:  Universitas  Lampung.  284–291  pp.
Kim, G.S., Myung, K.S., Kim, Y.J., Oh, K.K., Kim, J.S., Ryu, H.J.,  and  Kim,  K.H.  2008. Methode  of  Producing Biofuel  Using  Sea  Algae .  World  Intelectual  Property Organization,  Seoul.
Lee,  Y.K.  2006.  Bioprocess  technology In Microbial Biotechnology: Principles  and  Application , Edited  by Yun  Kun  Lee.  W orld  Scientific  Publishing,  sec.ed. 23–72  pp.
Li-Jung Yin,  Lin, H.H., and Xiao, Z.R. 2010. Purification and  Characterization  of  A  Cellulase  from Bacillus Subtilis Yj 1. J ournal  of  Marine  Scienc e  and Technology. 18(3):  466–471 . Lisdiyanti, P.,  Suyanto, E., Gusmawati, N.F., and Rahayu, W.  2012.  Isolation  and  characterization  of  cellulase produced  by  cellulolytic  bacteria  from  peat  soil  of Ogan  Komering  Ilir,  South  Sumatera. International Journal  of  Environment  and  Bioenergy .  3(3):  145– 153.
Mangunwardoyo,  W.,  Aprilismulan,  Oetari,  A.,  and Sjamsuridzal  W.  2011.  Screening  Cellulose  Activity of  Yeast  Isolated  from  Soil,  Sediment  and  W ater Riverfrom  Taman  Nasional  Gunung  Halimun,  West Java,  Indonesia. Malaysian  Journal  of  Microbiology . 7(4):  210–216.
Meryandini, A., Widosari, W., Maranatha, B., Sunarti, T.C., Rachmania  N.,  dan  Satria,  H.  2009.  Isolasi  bakteri selulolitik  dan  karakterisasi  enzimnya. Makara  Sains. 13(1):  33–38.
Munifah,  I.,  Chasanah,  E.  and  Fawzya,  Y.N.  2011. Screening  of  cellulolytic  bacteria  from  Indonesia’s marine  environment.  Di  dalam: Prosiding  Seminar ISISM  (International  Seminar  of  Indonesian  Society for Microbiology ); Bogor, 26 Juni 2011.  Perhimpunan Mikrobiologi  Cabang  Bogor,  Bogor.
Choi, N.S., Chung, D.M., Ryu, C.H., Yoon, K.S.,  Maeng, P.J.,  and  Kim,  S.H.  2006.  Identification  of  three extracellular  proteases  from Bacillus  subtilis KCTC 3014. J.  Microbiol.  Biotechnol .  16(3):  457–464
Reczey, K., Szengyel, Z., Eklund, R., and Zacchi, G. 1996.
Cellulase  produc tion  by Tric hodermareesei . Bioresour.  Technol .  57:  25–30.
Riyanti,  E.I.  2008.  Biomassa  sebagai  bahan  bak u
Bioetanol. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan  Biotek nologi  dan  Sumberdaya Genetika  Pertanian,  Institut  Pertanian  Bogor,  Bogor. Shanmunghapriya, S., Kira, G.S., Selvin, J., Thomas, T.A., and  Rani  C.  2010.  Optimization,  Purification,  and Characterization  of  Extracellular  Mesophilic  Alkaline Cellulase  from  Sponge-Associated Marinobacter sp. MSI032. Applied  Biochemistry  &  Biotechnology . 162(3):  625–640.
Suwanto, Yogiana, Suryanto, D., Tan, I., and Puspitasari, E.  2000. Selectes  Protocols  Training  Course  on Advances in Molecular Biology Techniques to Asses Microbial Diversity . Bogor: SEAMEO-BIOTROP. p. 22– 31.
Trivedi, N., Gupta, V., Kumar, M., Kumari, P., Reddy, CRK., and Jha, B. 2011. An alkali-halotolerant cellulase from Bacillus  flexus isolated  from  green  seaweed Ulva lactuca . Carbohyd  Polym. 83:  891–897.
Tsuji,  A.,  Tominaga,  K.,  Nishiyama,  N.,  and  Yuasa,  K. 2013.  Comprehensive  enzymatic  analysis  of  the cellulolytic  system  in  digestive  fluid  of  the  sea  hare Aplysia  kurodai .  Efficient Glucose  Release  from  Sea Lettuc e  by  Synergistic  Ac tion  of  45  k Da Endoglucanase  and  210  kDa  ß-Glucosidase. Plos One Journal .  8(6): e65418.
Van  de  Peer  Y.  and  De  Watcher.  1993.  TREECON:  a software  package  for  the  construction  and  drawing of evolutionary trees. Comput.  Applic  Biosci. 9: 177– 182.
Yassin, M., El-Ayouty, Amira EL-said, and  SaLama, A.M. 2012. Purification and characterization of a keratinase from  the  feather-degrading  cultures  of Aspergillus flavipes . African  Journal  of  Biotechnology. 11(9): 2313–2319.
Lina,  Yi-Tsung.,  Jeng,  Yuan-Yu.,  Lin,  M.L.,  Yua,  K.W., W ang,  F.D.,  and  Liu,  C.Y.  2010.  Clinic al  and microbiological  characteristics  of Chryseobacterium indologenes bacteremia. J.  Microbiol  Immunol  Infect 43(6):  498–505.