## Efek Pelaparan dan Akumulasi Polifosfat terhadap Biopresipitasi Uranium pada
Bacillus cereus A66
Bernadetta Octavia 1)* , Triwibowo Yuwono 2) , dan Agus Taftazani 3)
1) Jurusan Pendidikan Biologi – Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Yogyakarta, Jl. Colombo No. 1, Karangmalang, Yogyakarta
2) Fakultas Pertanian – Universitas Gadjah Mada, Jl. Flora, Bulaksumur, Sleman, Yogyakarta
3) Pusat Sains dan Teknologi Akselerator – Badan Tenaga Nuklir Nasional, Jl. Babarsari, Sleman, Yogyakarta
*) Alamat korespondensi: dettac_via@yahoo.com

## ABSTRAK
Pelaparan  dan  akumulasi  polifosfat  pada  bakteri  diduga  dapat  meningkatkan  biopresipitasi uranium.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  efek  pelaparan  dan  akumulasi  polifosfat terhadap peningkatan biopresipitasi uranium pada Bacillus cereus A66. Pada penelitian ini B. cereus A66 ditumbuhkan terlebih dahulu (prakultur) dalam Tryptone Glucose Yeast Extract (TGY), pada suhu ruang (±  28ºC)  hingga  fase  logaritmik  (±  16  jam).  Pada  perlakuan  pertama,  prakultur B.  cereus A66  diberi perlakuan  pelaparan  fosfat  dalam  medium  P- free, selanjutnya  dipindahkan  ke  medium  P- uptake untuk akumulasi  fosfat.  Untuk  mengamati  biopresipitasi  uranium,  sel  bakteri  dipindahkan  ke  dalam  larutan uranium 1 mM. Pada perlakuan kedua, prakultur B. cereus A66 langsung dipindahkan ke dalam larutan uranium  tanpa  fase  pelaparan  dan  akumulasi  polifosfat.  Sedangkan  pada  perlakuan  ketiga, B.  cereus A66 tanpa fase pelaparan dikultur dalam medium P- uptake kemudian dipindahkan ke larutan uranium. Pada  perlakuan  keempat, B.  cereus A66  dikondisikan  dengan  pelaparan  fosfat  dalam  medium  P- free , diikuti dengan pemindahan ke dalam larutan uranium. Perlakuan kedua, ketiga dan keempat dirancang untuk  mengkonfirmasi  efek  perlakuan  pertama  dalam  penelitian  ini.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa B.  cereus A66  yang  mengalami  pelaparan  fosfat  dapat  mengakumulasi  fosfat  delapan  kali  lebih banyak  ketika  dipindahkan  ke  medium  P- uptake ,  dibandingkan  dengan B.  cereus A66  yang  tidak mengalami  pelaparan  fosfat.  Selain  itu, B.  cereus A66  yang  mengakumulasi  lebih  banyak  fosfat  juga menunjukkan peningkatan biopresipitasi uranium sebesar 1,5 kali lebih banyak dibandingkan dengan B. cereus A66 yang tidak mengalami pelaparan fosfat. Fenomena ini diyakini digerakkan oleh metabolisme polifosfat  yang  dikontrol  oleh  aktivitas  gen  PPK  dan  PPX.  Secara  keseluruhan  hasil  penelitian  ini menunjukkan  bahwa  semakin  banyak  polifosfat  terakumulasi  dalam  sel,  semakin  meningkat  respon biopresipitasi  uranium  dalam  hal  jumlah  uranium  yang  diambil  dari  larutan  dan  efisiensi  waktu pengambilannya.  Strategi  ini  dapat  dikembangkan  lebih  lanjut  untuk  bioremediasi  air  dan  tanah  yang terkontaminasi uranium.
Kata kunci : pelaparan polifosfat, biopresipitasi uranium , Bacillus cereus
The Effect of Starvation and Polyphosphate Accumulation on Uranium Bioprecipitation  in Bacillus cereus A66
Bernadetta Octavia 1)* , Triwibowo Yuwono 2) , dan Agus Taftazani 3)
1) Biology Education Department – Faculty of Science dan Mathematics, Yogyakarta State University,
Jl. Colombo 1, Karangmalang, Yogyakarta
2) Faculty of Agriculture –Gadjah Mada University, Jl. Flora, Bulaksumur, Sleman, Yogyakarta
3) Center of Accelerator Science and Technology – National Nuclear Energy Agency, Jl. Babarsari, Sleman, Yogyakarta
*) Email: dettac_via@yahoo.com

## ABSTRACT
Starvation and accumulation of polyphosphates in bacteria is thought to result in the improvement of  uranium  bioprecipitation.  The  purpose  of  this  study  was  to  prove  the  effect  of  starvation  and polyphosphate accumulation  in the  improvement  of  uranium bioprecipitation in Bacillus cereus A66. B. cereus A66 was precultured in Tryptone Glucose Yeast Extract (TGY), at room temperature (± 28ºC) to logarithmic  phase  (±  16  hours).  In  the  first  treatment,  preculture  of B.  cereus A66  was  subjected  to phosphate starvation in P-free medium, followed by transferring to the P-uptake medium for phosphate accumulation. To observe the uranium bioprecipitation response,  the  bacterial cell  was transferred to 1 mM uranium solution. In the second treatment, B. cereus A66 preculture was immediately transferred to the uranium solution with no  starvation phase and accumulation of polyphosphate. Whereas in the third treatment, B. cereus A66 preculture without  the  starvation  phase was cultured  in the  P-uptake  medium and  then  transferred  to  uranium  solution.  In  the  fourth  treatment, B.  cereus A66  was  conditioned  with phosphate starvation in P-free medium, followed by transferring to uranium solution. The second, third and fourth treatments were designed  to confirm the effect of the first treatment in this study. The results showed  that B.  cereus A66    subjected  to  phosphate  starvation  was  able  to  accumulate  phosphate  eight times  more  when  it  was  transferred  to  P-uptake  medium,  compared  to B.  cereus A66  which  did  not experience  phosphate  starvation.  In  addition, B.  cereus  A66 which  accumulated  more  phosphate  also demonstrated  an  increase  in  uranium  bioprecipitation  as  evidenced  by  1.5  more  uranium  precipitated from  the  solution,  compared  to B.  cereus A66  which  was  not  subjected  to  phosphate  starvation.  This phenomenon was believed driven by polyphosphate metabolism  controlled by the activity of the PPK and PPX  genes.  Overall,  it  was  also  shown    that  the  more  polyphosphate  accumulated  in  cells,  the  more responsive  uranium bioprecipitation in terms of uranium quantity being extracted from the solution and the  efficiency  of  its  uptake  time.  It  is  proposed  that  this  strategy  may  be  developed  further  for bioremediation of  uranium-contaminated water and soil.
Keywords: polyphosphate starvation, uranium bioprecipitation , Bacillus cereus

## PENDAHULUAN
Bakteri  berinteraksi  dengan  uranium melalui  mekanisme  yang  beragam  seperti bioreduksi, bioakumulasi, biosorpsi, dan biopresipitasi  [1,2].  Di  antara  mekanisme interaksi bakteri dengan uranium, immobilisasi uranium  yang  dimediasi  fosfat  merupakan strategi  yang  layak  untuk  sekuestrasi  uranium dalam  jangka  panjang.  Bioremediasi  uranium yang  dimediasi  fosfat  berkaitan  dengan aktivitas hidrolase organofosfat dan metabolisme  polifosfat  pada  bakteri  [3]. Aktivitas  hidrolase  organofosfat  merupakan proses  biomineralisasi  yang  mengandalkan
peran gen PhoN (gen fosfatase asam )  dan gen PhoK  (gen fosfatase  alkali ).  PhoN  merupakan periplasmic  acid  phosphatase ,  sedangkan PhoK merupakan extracellular alkaline phosphatase [4]. Aktivitas  enzim fosfatase ini juga telah banyak diteliti pada beberapa bakteri seperti Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , Serratia sp., dan Acinetobacter sp. Pada penelitian ini, immobilisasi uranium  lebih  diarahkan  pada  pemanfaatan metabolisme  polifosfat  bakteri.  Konsep  dasar pemanfaatan  metabolisme  polifosfat  pada bakteri untuk immobilisasi logam dan radionuklida  ini  dipelajari  melalui  sistem EBPR ( Enhanced Biological Phosphate
Removal ). Pada sistem ini terjadi degradasi dan pelepasan fosfat pada fase anaerob, sedangkan pengambilan  fosfat  dan  perakitannya  sebagai polifosfat  pada  fase  aerob  [9].  Dalam pendekatan biologis diketahui terdapat beberapa  enzim  yang  berperanan  dalam metabolisme  polifosfat  yaitu  antara  lain  : polifosfat  kinase  (PPK),  exopolifosfatase (PPX), endopolifosfatase, polifosfat glukokinase, dan polifosfat AMP fosfotransferase [10]. Pada E.coli, metabolisme polifosfat  digerakkan  oleh  gen ppk yang mengkatalisis polimerisasi ortofosfat intraselular  dan  gen ppx yang  mengkatalisis hidrolisis granula-granula polifosfat [3].
Di dalam lingkungan yang terkontaminasi logam dan radionuklida, ketersediaan nutrien rendah, serta adanya agen- agen  pengoksidasi,  dan  pH  ekstrem  yang menandakan  cekaman  kimiawi  di  lingkungan tersebut  maka  keadaan  ini  meningkatkan kesiagaan  metabolisme  mikrobia.  Sebagai tanggapan terhadap lingkungan tersebut, produksi  polifosfat  intraselular  oleh  mikrobia merupakan  salah  satu  cara  untuk  menangkap dan  menyimpan/mendepositkan  ion-ion  toksik di dalam granula-granula polifosfat sitoplasma [11,12].  Beberapa  penelitian  telah  dilakukan untuk  mengatur  metabolisme  polifosfat  agar dapat meningkatkan fungsinya dalam sekuestrasi  logam  dan  radionuklida.  Sebagai contoh  eksperimen  Van  Veen et  al [13]
dilakukan dengan menumbuhkan
Acinetobacter  johnsonii 210A  dalam  medium P i - free sehingga  ketika  dipindahkan  dalam medium  kaya  P i maka  terjadi  peningkatan akumulasi  P i .  Melalui  penelitian  ini B.  cereus A66  dimanfaatkan  untuk  mengamati  efek pelaparan  dan  akumulasi  polifosfat  terhadap peningkatan  biopresipitasi  uranium.  Bakteri gram  positif B.  cereus A66  diisolasi  dari limbah  radioaktif  cair  aktivitas  rendah  yang dihasilkan  oleh  Pusat  Sains  dan  Teknologi Akselerator,  Badan  Tenaga  Nuklir  Nasional, Yogyakarta [15].

## METODE PENELITIAN
Perlakuan  utama  (perlakuan  1). Sel bakteri  B. cereus A66  di  tumbuhkan  terlebih dahulu (prakultur)  dalam  70  ml  medium  TGY (1% bacto tryptone , 0,1% glucose , 0,5% yeast extract )  [16]  dengan  digojog  pada  temperatur 28ºC  sampai  fase  logaritmik  (±16  jam),
kemudian OD diukur pada panjang gelombang 600  nm  dan  analisis  konsentrasi  fosfat  dalam sel  dilakukan  menurut  metode  Saheki et  al [17].  Selanjutnya,  sel  dipanen  dengan  cara disentrifus  pada  kecepatan  3000  rpm  selama 30  menit  dan  peletnya  dicuci  dengan  0,5  M larutan  NaCl  lalu  disentrifus  lagi  pada kecepatan  3000  rpm  selama  30  menit  [14]. Pelet  sel  kemudian  dikultur    dalam    medium untuk  pelaparan  fosfat  menggunakan  medium P- free (CH 3 COONa  5  g,  MgSO 4 .7H 2 O  0,5  g, KNO 3 0,18 g, trace elements 0,5 ml,  /l, pH 7; Trace  elements g/l:  FeCl 3 .6H 2 O  1,5  g;  H 3 BO 3 0,15  g;  CuSO 4 .5H 2 O  0,03  g;  KI  0,18  g; MnCl 2 .4H 2 O  0,12  g;  Na 2 MoO 4 .2H 2 O  0,06  g; CoCl 2 .6H 2 O  0,12  g;  EDTA  10  g,  pH  7)  [18] . Kultur bakteri dalam 70 ml medium P- free ini dikondisikan  dalam  keadaan  statik  [16]  pada 28ºC,  sampai  tercapai  kondisi  lapar  fosfat (OD 600 =  ± 0,4)  selama  24  jam  (fase  stasioner) [14].  Nilai  OD 600 dan  kandungan  fosfat  dalam sel  kemudian  diukur.  Pemanenan  melalui sentrifugasi dilakukan lagi  kemudian pelet sel dipindahkan  ke  dalam  medium P - uptake (CH 3 COONa  5  g,  MgSO 4 .7H 2 O  0,5  g,  KNO 3 0,18  g,  KH 2 PO 4 0,25  g,  Pepton  0,5  g,  yeast extract  0,5  g,  trace  elements  0,5  ml,  /l,  pH  7) [18]  untuk  mengukur  akumulasi  fosfat. Pengkulturan  bakteri  dalam  70  ml  medium  P - uptake ini  digojog  pada  kecepatan  160  rpm, dan  28ºC  selama  24  jam  (fase  stasioner)  [19]. Selanjutnya  pengukuran  OD 600 dan  analisis konsentrasi fosfat dalam sel dilakukan sebelum pemanenan  pelet  sel  untuk  dimasukkan  ke dalam  larutan  uranil  nitrat  1  mM.  Kultur  sel dalam  larutan  uranil  nirat  1  mM    untuk eksperimen biopresipitasi uranium dikondisikan  dalam  keadaan  statik  pada  28ºC [16].  Konsentrasi  uranium  tersisa  dalam larutan,  dan  konsentrasi  uranium  di  dalam sitoplasma  sel  diukur  dengan  metode  yang telah  dimodifikasi  oleh  Appukuttan et  al [16], pada rentang waktu 0, 3 , 6 , 12  dan 24 jam.

## Perlakuan  kontrol  (tiga  perlakuan).
Pada masing-masing perlakuan ini  bakteri  B . cereus A66  ditumbuhkan  terlebih  dahulu (prakultur)  dalam  70  ml  medium  TGY  ( 1% bacto  tryptone,  0,1%  glucose,  0,5%  yeast extract )  [16]  dengan  digojog  pada  temperatur 28 o C  sampai  fase  logaritmik  (±16  jam).
Semua  perlakuan  dalam  eksperimen  ini dilakukan dengan tiga ulangan.
a)  Perlakuan  2:  prakultur  bakteri  B. cereus A66  dalam  medium  TGY  langsung dipindahkan  ke  dalam  larutan  uranium  1 mM  untuk    analisis  konsentrasi  uranium. Pada  perlakuan  ini  prakultur  bakteri tersebut  tidak  mengalami  fase  pelaparan maupun akumulasi fosfat dalam medium P- uptake .
b)  Perlakuan  3:  prakultur  bakteri  B.cereus
A66  dalam  medium  TGY  dipindahkan  ke dalam  medium  P-uptake  tanpa  diberi  fase pelaparan.  Selanjutnya  dipindahkan  ke dalam larutan uranium 1 mM dan dilakukan analisis  konsentrasi  uranium.  Melalui perlakuan  ini  diharapkan  dapat  diketahui efek  pelaparan  baik  terhadap  akumulasi polifosfat maupun biopresipitasi uranium. c)  Perlakuan 4: prakultur bakteri B.cereus A66 dalam medium TGY kemudian dipindahkan ke  dalam  medium  P-free,  selanjutnya dikulturkan  dalam  larutan  uranium  1  mM. Perlakuan  ini  untuk  menunjukkan  peranan polifosfat  intraselular  dalam  biopresipitasi uranium.
Penyiapan  sampel  bakteri  untuk analisis SEM/EDX ( Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy ). Analisis semi kuantitatif dengan melihat sel yang mengandung uranium melalui analisis EDX untuk memberi penegasan  (konfirmasi)  terhadap  hasil  analisis kimiawi kuantitatif tersebut. EDX ini merupakan  bagian  dari  preparasi  sel  untuk SEM dan menggunakan alat yang sama dengan visualisasi  SEM.  Tahapan  kerjanya  diawali dengan  melakukan mounting pellet  sel  bakteri pada suatu holder logam. Setelah itu dilakukan pengeringan dalam suatu alat vakum ( Castable Vacuum  System ).  Setelah  sampel  kering dilakukan coating dengan  emas.  Tahap terakhir  adalah  meletakkan holder yang  berisi sampel  kering  pada  alat Analytical  Scanning Electron  Microscope (JSM-6510  LA)  yang sudah  tersambung  dengan  komputer  sehingga langsung  dapat  dilihat.  Hasilnya  berupa spektrum-spektrum yang menunjukkan elemen-elemen  yang  terkandung  dalam  sel bakteri tersebut.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Efek  pelaparan  fosfat  yang  dilakukan terhadap sel bakteri Bacillus cereus A66 untuk meningkatkan biopresipitasi uranium
ditampilkan  pada  Gambar  1a.  Bakteri  dari medium  prakultur  TGY  yang  dipindahkan  ke dalam  medium  P- free mengalami  penurunan fosfat yang drastis dalam selnya (keadaan lapar fosfat).  Hal  ini  menunjukkan  terjadinya hidrolisis  polifosfat  [(poli-P) n +  H 2 O  (poli- P) n-1 + P i ] dan selanjutnya P i dilepas ke luar sel sehingga  sel  mengalami phosphate  starvation. Sel-sel  yang  dalam  keadaan  lapar  fosfat  ini selanjutnya  dikultur  dalam  medium  P- uptake . Perlakuan  ini  memberikan  efek  peningkatan akumulasi fosfat (dari kondisi fosfat dalam sel prakultur)  sebesar  77,22%  (Gambar  1a), dibandingkan  dengan  yang  tidak  diberi perlakuan pelaparan fosfat (perlakuan 3) hanya meningkat sebesar 9,27% (Gambar 3a).
Selanjutnya pada eksperimen biopresipitasi uranium, sel bakteri (Gambar 1a) yang  pada  awalnya  mengandung  fosfat intraselular  sebesar  49,451  µg/ml  dapat mengambil uranium rata - rata sebesar ± 82,5% setelah  3  jam  dalam  larutan  uranium  1  mM. Sel bakteri mengambil uranium terbanyak pada jam  ke-6  yaitu  sebesar  0,839  mM  (83,9%), sedangkan  sel  bakteri  yang  tidak  diberi perlakuan  pelaparan  fosfat  (Gambar  3a), mengambil uranium rata - rata sebesar ± 64,3% setelah 3 jam pada eksperimen yang sama.
Gambar 1a . Perlakuan 1, biopresipitasi uranium  dalam  larutan  uranil nitrat 1 mM oleh B.cereus A66 yang  telah  dikultur  dalam urutan medium : prakultur  (TGY),  pelaparan fosfat  (P- free ),  dan  akumulasi fosfat (P- Uptake )
Gambar  1b. Spektra  EDX  dari  sel  yang mengandung uranium
Gambar  1c . Microphotographs SEM  sel bakteri yang mengandung uranium
Sel  bakteri  (Gambar  3a)  mengambil uranium  terbanyak  pada  jam  ke  6,  sebesar 0,663  mM  (66,3%),  sedangkan  bakteri  pada perlakuan  2  (Gambar  2a)  mengambil  uranium rata-rata  sebesar  ±  62,5%  dan  terbanyak  pada jam  ke-12  sebesar  0,659  mM  (65,9%). Selanjutnya, pada perlakuan 4 (Gambar 4a) sel bakteri  yang  telah  mengalami phosphate starvation dalam  medium  P- free ditransfer  ke dalam larutan uranium 1 mM. Konsekuensinya sel ini  hanya mampu mengambil uranium rata -  rata  sebesar  ±  31,2%  setelah  3  jam.  Pada perlakuan  ini  (Gambar  4a),  sel  bakteri mengambil  uranium  terbanyak  sebesar  0,383 mM (38,3%) pada jam ke-24.
Gambar 2a. Perlakuan 2, biopresipitasi uranium    dalam  larutan  uranil nitrat  1 mM oleh B. cereus A66 yang berasal dari medium prakultur (TGY)
Gambar 2b . Spektra EDX dari sel yang mengandung uranium
Gambar  2c . Microphotographs SEM  sel bakteri yang mengandung uranium Gambar 3a. Perlakuan 3, biopresipitasi uranium  dalam  larutan  uranil nitrat  1  mM  oleh  B .cereus A66 yang  telah  dikultur  dalam  urutan medium  :  prakultur  (TGY),  dan akumulasi fosfat (P- uptake )
Gambar  3b .  Spektra  EDX  dari  sel  yang mengandung uranium
Gambar 3c. Microphotographs SEM  sel bakteri yang mengandung uranium Secara faktual hasil perlakuan pelaparan fosfat pada sel bakteri, selain dapat meningkatkan akumulasi fosfat, juga meningkatkan  pengurangan  uranium  dari larutan. Jika pengurangan uranium ini dikaitkan  dengan  waktu  maka  perlakuan pelaparan  fosfat  pada  sel  bakteri  juga meningkatkan  efisiensi  waktu  pengambilan uranium.  Ketika  sel  ditumbuhkan  dalam medium  P- free, maka  konsentrasi  P  dalam  sel berkurang drastis (sel lapar fosfat) (Gambar 1a dan  4a).  Keadaan  ini  dapat  terjadi  karena adanya  tekanan  lingkungan  yaitu  tumbuh dalam  kondisi  tanpa  fosfat,  sehingga  terjadi pelepasan  fosfat  oleh  sel  bakteri.  Hal  ini seperti  yang  terjadi  pada  eksperimen  yang dijalankan  oleh  Gavigan et  al [20].  Dalam  hal ini  sel  bakteri  dapat  merilis  fosfat  karena dalam kondisi tekanan lingkungan tanpa fosfat ini  telah  menginduksi  PPX  sehingga  terjadi hidrolisis  cadangan  polifosfat  [21].  Dengan demikian  maka  terjadi  penurunan  konsentrasi P  dalam  sel  secara  signifikan.  Selain  memicu ekspresi  gen  PPX,  kondisi  tidak  ada  fosfat dalam  medium  (P- free )  juga  menginduksi  gen PPK.  Keadaan  ini  juga  telah  diamati  oleh Trelstad et  al [22]  dan  Geibdorfer et  al [23] pada  bakteri Acinetobacter sp.  Strain  ADP1 dalam  riset  pengembangan  sistem  EBPR. Disini  mereka  juga  mendeteksi  peningkatan jumlah  transkrip  gen  PPK.  Hal tersebut  sesuai dengan  hasil  penelitian  ini  yaitu  ketika  sel bakteri  ditumbuhkan  dalam  medium  P- uptake , gen  PPK  sudah  terinduksi  dan  mungkin  juga sudah tersedia transkrip gen PPK. Oleh karena itu,  ketika  sel  B. cereus A66  ditumbuhkan dalam medium P- uptake maka sel (Gambar 1a) dapat  mengakumulasikan  fosfat  8  kali  lipat lebih  banyak  daripada  sel  yang  tidak mengalami  pelaparan  fosfat.  Data  juga menunjukkan bahwa pada jam ke 6 (perlakuan
utama)  uranium  berkurang  1,5  kali  lipat  lebih banyak.
Fenomena  lain  yang  dapat  diamati adalah bahwa keberadaan polifosfat intraselular    memegang  peranan  kunci  dalam pengurangan  uranium  dari  larutan.  Hal  ini seperti yang dinyatakan oleh Martinez et al [3] bahwa keberadaan polifosfat sitosol memudahkan  sekuestrasi  logam-logam  seperti Cd,  Cu,  Hg,  Pb,  U,  dan  Zn  pada  beberapa strain bakteri  hasil rekayasa genetika dan juga beberapa  strain  bakteri  dan  arkhaea  di  alam ( wild  strains ).  Pembuktiannya  dapat  dilihat pada sel bakteri perlakuan 1 dengan konsentrasi  P  intraselular  tertinggi  maka pengurangan  uranium  dari  larutan  juga tertinggi  (Gambar  1a).  Sebaliknya  sel  bakteri pada  perlakuan  4  yang  mengalami phosphate starvation dan dalam larutan uranium mempunyai konsentrasi P intraselular terendah hanya  mampu  mengambil  uranium  rata  -  rata sebesar ± 31,2%,  paling  kecil  dibandingkan dengan tiga perlakuan lain (Gambar 4a).
Gambar 4a. Perlakuan  4,  biopresipitasi uranium  dalam  larutan  uranil nitrat 1 mM oleh B.cereus A66 yang  telah  dikultur  dalam urutan medium : prakultur (TGY), dan pelaparan fosfat (P- free )
Gambar  4b .  Spektra  EDX  dari  sel  yang mengandung uranium
Gambar  4c. Microphotographs SEM  sel bakteri yang mengandung uranium Hasil analisis kimiawi kuantitatif tersebut  juga  terkonfirmasi  oleh  hasil  analisis EDX  terhadap  sampel  sel  bakteri  dari  semua perlakuan.  Secara  semi-kuantitatif,  analisis EDX  menunjukkan  spektrum  uranium  yang menguat  pada  perlakuan  1  (Gambar  1b)  yang diwakili  oleh  sel  bakteri  yang  mengambil uranium  terbanyak  rata-rata  sebesar  ±  82,5%. Spektrum  yang sangat lemah diwakili oleh sel bakteri  pada  perlakuan  4  (Gambar  4b)  yang mengambil uranium rata-rata sebesar ± 31,2%.
Beberapa penelitian yang dipublikasikan menyatakan bahwa P i hasil hidrolisis polifosfat akan  disekresikan  keluar  sel  sehingga  dapat mempresipitasikan logam berat pada permukaan  sel  [24,14].  Akan  tetapi  dari  hasil penelitian ini terdeteksi dalam larutan uranium sebagian besar P i masih di dalam sel (Gambar 5a,  5b,  5c,dan  5d).  Sesungguhnya  uranium tidak mempunyai fungsi biologis di dalam sel. Jadi  diduga  uranium  masuk  ke  dalam  sel karena  meningkatnya  permeabilitas  sel  yang disebabkan  toksisitas  uranium  [25].  Meskipun diduga  terjadi  peningkatan  permeabilitas membran  sel  oleh  toksisitas  uranium,  akan tetapi kemungkinan kondisi ini lebih cenderung  dikendalikan  oleh  konsentrasi  P i di dalam sel.  Oleh karena itu apabila konsentrasi P i dalam  sel  rendah  (Gambar  5d),  maka uranium  yang  masuk  ke  dalam  sel  juga  relatif sedikit. Sebaliknya kalau konsentrasi P i dalam sel  tinggi  (Gambar  5a,  5b,  dan  5c),  maka uranium  yang  masuk  ke  dalam  sel  juga  relatif banyak.  Kemungkinan  model  biokimia  jalur hubungan  antara  konsentrasi  P i dan  transport uranium  ke  dalam  sel  melintasi  membran  sel dapat  digambarkan  melalui  ilustrasi  skematik pada Gambar 6a dan 6b.
Gambar 5a .   Perbandingan antara P i di dalam sel  dan  yang  disekresikan  ke dalam  larutan  uranium  pada perlakuan 1
Gambar 5b .   Perbandingan antara P i di dalam sel  dan  yang  disekresikan  ke dalam  larutan  uranium  pada perlakuan 2
Gambar 5c. Perbandingan antara P i di dalam sel  dan  yang  disekresikan  ke dalam  larutan  uranium  pada perlakuan 3
Gambar 5d. Perbandingan antara P i di dalam sel  dan  yang  disekresikan  ke dalam  larutan  uranium  pada perlakuan 4
Dalam larutan uranium, sel dikondisikan dalam  keadaan  statik.  Selain  itu  tidak  ada sumber  karbon  dan  fosfat  (Gambar  6b).  Sel yang  ditransfer  ke  dalam  larutan  uranium  dari media  P- uptake cukup  banyak  mengandung cadangan  polifosfat.    Dengan  demikian membran  sel  ini  juga  cukup  mempunyai proton motive force yang antara lain dihasilkan oleh  ekskresi  metal-fosfat  (misal:  MgHPO 4 ) melalui symport system (Gambar 6b). Selanjutnya proton  motive  force ini  dapat menggerakkan berbagai proses yang membutuhkan energi [26].
Sangat dimungkinkan bahwa   ion uranil yang terdapat di  luar  sel  terakumulasi  di  dalam  sel  melalui mekanisme proton-symport  pump .  Jadi  mirip dengan  mekanisme  yang  dilakukan  sel  bila mengambil  elemen-elemen  yang  dibutuhkan oleh  sel.  Hal  ini  dinyatakan  oleh  Newsome et al [1]  bahwa beberapa logam dapat masuk ke dalam  sel  melalui  mekanisme  “bioakumulasi’ karena  logam-logam    tersebut  mirip  dengan logam-logam  esensial    yang  dibutuhkan  untuk fungsi seluler.
Gambar 6a. Model  mekanisme  transport  P i dan ion uranil melintasi membran  sel  bakteri  dalam medium P- free dan P- uptake
Gambar 7b .   Model  mekanisme  transport  P i dan ion uranil melintasi membran  sel  bakteri  dalam larutan uranil nitrat
Cadangan  polifosfat  yang  tinggi  juga mengakibatkan lebih banyak P i yang disekresikan ke dalam larutan uranium. Sekresi P i melalui proton-symport  system akan meningkatkan  gradient  proton  transmembran [21].  Keadaan  ini  diduga  dapat  meningkatkan transport  ion  uranil  ke  dalam  sel . Dengan demikian  apabila  cadangan  polifosfat  dalam sel makin banyak maka makin banyak pula ion uranil  yang  dapat  ditransport  ke  dalam  sel melalui  mekanisme proton  symport  pump . Fenomena  akumulasi  uranium  dalam  sel  ini mungkin juga berkaitan dengan ABC transport systems yang  terdapat  baik  pada  bakteri  Gram negatif maupun bakteri Gram positif [27]. ABC transport  systems ini  terdiri  dari periplasmic binding  proteins , membrane  transporter dan ATP-hydrolyzing  proteins . ABC  transport systems dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7. Mekanisme  pengambilan  substrat melalui ABC transporter [23].
Keberadaan ABC  transporter berfungsi untuk  mengambil  senyawa-senyawa  organik seperti  gula,  asam  amino,  nutrien  anorganik seperti  sulfat  dan  fosfat,  juga  berbagai trace metal .  Protein-protein ABC  transporter ini paling  sedikit  dikode  oleh  tiga  macam  gen. Gen-gen ini mungkin terekspresi oleh keberadaan  P i di  dalam  sel.  Aktivasi ABC transporter ini  oleh  meningkatnya  konsentrasi P i intraselular  makin  mempermudah  uranium untuk  masuk  ke  dalam  sel  dengan  melalui mekanisme  yang  mirip  dengan  masuknya elemen-elemen  yang  diperlukan  oleh  sel. Kedua  mekanisme  transport  tersebut  yang diduga  merupakan  model  mekanisme  yang mendasari    fenomena  penelitian  ini  yaitu bahwa  sel  yang  banyak  mengakumulasikan fosfat  juga  banyak  mengurangi    uranium  dari larutan.  Sebaliknya  yang  sedikit  mengandung
fosfat  dalam  selnya  juga  hanya  sedikit mengambil uranium dari larutan.

## KESIMPULAN
Sel  bakteri B.  cereus A66  yang mengalami
pelaparan fosfat mengakumulasikan  lebih    banyak  fosfat daripada  yang  tidak  dilaparkan  fosfat  dan berdampak terhadap peningkatan biopresipitasi uranium. Metode ini cukup layak dikembangkan  untuk  bioremediasi  air  dan tanah  yang  terkontaminasi  uranium  dengan beberapa perbaikan.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]   Newsome,  L.,  K.  Morris,  and  J.R. Lloyd.  2014.  The  Biogeochemistry  and Bioremediation  of  Uranium  and  Other Priority Radionuclids. Journal Chemical Geology , 363:164-184
[2]   Merrour,  M.L.  and  S.  Selnska-Pobell.
2008. Bacterial Interaction With Uranium : An Environmental
Perspective. Journal  of  Contaminant Hydrology , 102:285-295
[3]   Martinez,  R.J.,  M.J.  Beazley,  and  P.A. Sobecky.  2014.  Review  Article  : Phosphate  –  Mediated  Remediation  of Metals  and  Radionuclide, Advance  in
Ecology
2014:1-14. http; //dx.doi.org/10.1155/2014/7869 29).
[4]   Kulkarni,  S.,  C.S.  Misra,  A.  Gupta,  A. Ballai,  and  S.K.  Apte.  2016.  Interaction of Uranium with Bacterial Cell Surfaces: Inferences  from  Phosphatase-Mediated Uranium  Precipitation. Applied  and Environmental  Microbiology .  82(16): 4965 -4974
[5]   Macaskie,  L.E.,  R.M.  Empson,  A.K Cheetham,  C.P.  Grey,  A.I.  Skarmulis. 1992.  Uranium  Bioaccumulation  by  A Citrobacter sp as a Result of
Enzymically  –  Mediated  Growth  of Polycrystalline HUO2PO4. Journal
Science . 257:782-784
[6]   Macaskie,  I.E.  and  A.C.R.  Dean.  1982.
Cadmium Accumulation by Microorganisms. Environmental Technology Letters . 3(2):49-56
[7]   Macaskie,  I.E.  and  A.C.R.  Dean.  1985.
Strontium
Accumulation by
Immobilized  Cells  Of  A  Citrobacter  sp. Biotechnology Letters . 7(9):627-630.
[8]   Jeong, B.C., P.S. Poole, A.C.Willis, and I.E.  Macaskie.  1998.  Purification  and Characterization of Acid Type
Phosphatases  from  a  Heavy  Metal  – Accumulating  Citrobacter  sp. Archives of Microbiology. 169(2): 166-173
[9]   Mino,  T.  2000.  Microbial  Selection  Of Polyphosphate – Accumulating Bacteria in  Activated  Sludge  Waste  Water Treatment  Processes  for  Enhanced Biological Phosphate Removal. Biochemistry . 63(3): 341-348
[10]   Miyake,  T.,  T.  Shiba,  A.  Kameda,  Y. Ihara,  M.  Munekata,    K.  Ishige,  and  T Noguchi.  1999.  The  Gene  for  an Exopolyphosphatase  of  Pseudomonas aeruginosa. DNA Research . 6: 103-108
[11]   Seufferheld,  M.J.,  H.M.  Alvarez,  and M.F. Farias. 2008.
Role of
Polyphosphates in Microbial Adaptation to  Extreme  Environments. Applied  and Environmental  Microbiology .  74(19):
5867-5874
[12]   Suzuki,  Y.  and  J.F.  Banfield.  2004. Resistance and Accumulation Of Uranium  By  Bacteria from  a  Uranium  - Contaminated Site. Journal Geomicrobiology . 21: 113-121 [13]   Vanveen, H.W., T. Abee, G.J.J.
Kortstee,  W.N.  Konings,  and  A.J.B. Zehnder. 1993. Characterization of Two Phosphate Tramsport Systems in Acinetobacter  johnsonii  210A. Journal of Bacteriology . 175(1): 200-206
[14]   Renninger,  N.,  R.  Knopp,  H.  Nitsche,
D.S.  Clark,  and  J.D  Keasling.  2004. Uranyl  Precipitation  by  Pseudomonas aeruginosa Via Controlled Polyphosphate Metabolism. Applied and
Environmental  Microbiology .  12(12):
7404-7412
[15]   Octavia,  B.,  T.  Yuwono,  and  A. Taftazani.  2018.  Isolasi  dan  Identifikasi Molekuler  Bakteri  Toleran  Uranium yang  Berpotensi  dalam  Biopresipitasi Uranium. Ganendra  Journal  of  Nuclear Science and Technology . 21(1): 45-53
[16]   Appukuttan,  D.,  A.S.  Rao,  and  S.K. Apte. 2006. Engineering of Deinococcus radiodurans  R1  for  Bioprecipitation  of Uranium  from  Dilute  Nuclear  Waste.
Applied and Environmental Microbiology. 72(12): 7873-7878
[17]   Saheki,  S.,  A.  Takeda,  and  T.  Shimazu. 1985.  Assay  of  Inorganic  Phosphate  in the  Mild  pH  Range,  Suitable  for Measurement of Glycogen Phosphorylase Activity. Analytical
Biochemistry. 14: 277-281
[18]   Aravind, J., T.Saranya, and P. Kanmani. 2015.  Optimizing  the  production  of polyphosphate from Acinetobacter towneri. Global  Journal  Environmental Science Manage . 1(1): 63-70.
[19]   Rustrian,  E.,  J.P.  Delgenes,  and  R. Moletta.  1997.  Phosphorus  Release  by Pure  Cultures  of  Acinetobacter  sp.  : Effect  of  the  Growth  Stage  with  Cells Cultivated  on  Various  Carbon  Sources. Letters In Applied Micrbiology . 24: 144- 148
[20]   Gavigan,  J.A.,  L.M.  Marshall,  and A.D.W.  Dobson.  1999.  Regulation  Of
Plyphosphate  Kinase  Gene  Expression In Acinetobacter baumanii 252. Microbiology . 145: 2931-2937
[21]   Keasling,  J.D.,  S.J.  Van  Dien,  P. Trelstad,  N.  Renninger,  and  K.  Mc. Mahon.  1999.  Review:  Application  of Polyphosphate
Metabolism to Environmental  and  Biotechnological Problems. Biochemistry . 65(3): 324-331
[22]   Trelstad, P.L., P. Purdhani, W. Geibdorfer, W. Hillen, and J.D.
Keasling,.  1999.  Polyphosphate  kinase
of  Acinetobacter  sp.  Strain  ADP1: Purification  and  Characterization  of  the Enzyme  and  its  Role  during  changes  in extracellular  phosphate  levels. Applied and Environmental Microbiology . 65(9):
3780-3786
[23]   Geibdorfer,W.,  A.  Ratajczak,  and  W. Hillen.  1998. Transcription  of  ppk  from
Acinetobacter sp. Strain ADP1,
Encoding  a  Putative  Polyphosphate Kinase is induced by Phosphate Starvation. Applied  and  Environmental Microbiology . 64(3): 896-901
[24]   Kulkarni,S.,  Misra,  C.S.,  Gupta,A., Ballai, A., and Apte, S.K.2016. Interaction  of  Uranium  with  Bacterial Cell Surfaces: Inferences from Phosphatase-Mediated Uranium Precipitation. Applied and Environmental  Microbiology .  82(16):
4965-4974
[25]   VanVeen,  H.W.,  Abee,  Tj,  Kortstee, G.JJ.,  Pereira,  H.,  Konimgs,  W.N.,  and Zehnder,  A.J.B.  1994.  Generation  of  a Proton Motive Force by the Excretion of Metal-Phosphate  in  the  Polyphosphate- accumulating Acinetobacter  johnsonii Strain  210A. The  Journal  of  Biological Chemistry. 269(47): 29509-29514.
[26]   Gavigan,  J.A.,  Marshall,  L.M.,  and Dobson,  A.D.W.  1999.  Regulation  Of Plyphosphate  Kinase  Gene  Expression In Acinetobacter baumanii 252. Microbiology . 145: 2931-2937