UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK ETANOL DAUN KEREHAU ( Callicarpa longifolia Lam.) TERHADAP MENCIT PUTIH
Submitted : 16 Nov 2015
Edited : 15 Des 2015
Accepted : 21 Des 2015
Eka Siswanto Syamsul, Desy Nur Indah Sari, Supomo
Akademi Farmasi Samarinda Jl. A.Wahab Sjahranie No.226 Samarinda, Kalimantan Timur
Email : eka8382@gmail.com

## ABSTRACT
Leaves  kerehau  (Callicarpa  longifolia  Lam.)  is  one  of  the  plants  used  for  the  treatment  of  malaria, ulcers,  diarrhea,  treatment  after  delivery,  and  fever,  by  drinking  boiled  water.  Report  usage  and  security kerehau leaves are still very few. The purpose of this study to determine the potential for acute toxicity by determining the value of LD 50 (Lethal Dose 50) in 4 dose-rise that dose I, II, III, and IV of the ethanol extract of the leaves kerehau against this mice. The Research. Pharmacologically using experimental methods using a completely randomized design pattern is undirectional in the selection of test animals, They are 25 mice were divided into five groups (5 mice each group), with observed 4 hours to determine the toxic symptoms and continued observation every 24 hours for 7 days to see death. Results from this study show from 4 dose levels, dose group I = 16g / kg, group II = 8g / kg, group III = 4g / kg and group IV = 2g / kg and control = 0.5 ml Na-CMC. Symptoms namely the observation of behavior and neuromuscular but not on observations of the autonomic  nervous, respiratory,  gastrointestinal,  and  skin.  LD50 value  obtained is expressed by the LD 50 (16g / kg) were categorized as practically non-toxic (> 15g / kg).
Keywords : Callicarpa longifolia Lam , acute toxicity, LD 50

## PENDAHULUAN
Daun  kerehau  merupakan  salah  satu tanaman  berkhasiat  yang  tumbuh  di  kalimantan Timur. Berbentuk semak cemara atau pohon kecil, batang  dan  cabang  padat  seperti  bintang  berbulu, daun  berkelenjar,  mahkota  seperti  mawar  putih atau  berwarna  gelap,  buah  berkelenjar  merah muda, spesies yang sangat variabel dan polimorfik (1) .
Berdasarkan
pengalaman empiris masyarakat, daun kerehau memiliki khasiat sebagai obat masuk angin, malaria, ulkus, diare, pengobatan setelah persalinan, demam dengan cara direbus daun dan air secukupnya sampai mendidih kemudian  didinginkan  dan  diminum  sebanyak  3 kali sehari, dan sebagai obat bengkak dengan cara ditumbuk dan ditempelkan pada bengkak kemudian  dibalut  dan  ditutup  kain  penutup  agar tumbukan  daun  dapat  menempel  pada  bengkak. Pengobatan  tanpa  takaran  kemungkinan  besar menimbulkan  kesalahan  dosis  karena  dosis  berada
pada  sub  terapi  atau  toksik.  Tumbuhan  kerehau memiliki  metabolit  sekunder  (tanin,  saponin, flavonoid  dan  alkaloid)  yang  memiliki  aktivitas mengobati atau mengurangi inflamasi ( 2) .
Uji toksisitas dibedakan menjadi uji toksisitas  akut,  subkronik,  dan  kronik.  Uji toksisitas  akut  dirancang  untuk  menentukkan Lethal  dose atau  disingkat  LD 50 suatu  zat.  Uji toksisitas  akut  dilakukan  dengan  memberikan  zat kimia  yang  sedang  diuji  sebanyak  satu  kali,  atau beberapa  kali  dalam  jangka  waktu  24  jam ( 3) .  Uji toksisitas  akut  merupakan  uji  pra  klinik  yang bertujuan  mengukur  derajat  efek  toksik  suatu senyawa  dalam  waktu  tertentu  setelah  pemberian dosis  tunggal.  Tolak  ukur  kuantitatif  yang  sering digunakan  untuk  menyatakan  kisaran  dosis  letal pada uji toksisitas akut adalah LD 50 , Tanaman obat harus  melalui  berbagai  proses  uji  untuk  keamanan konsumsinya, salah satunya uji toksisitas akut (4) .
Penentuan  LD50  penting  untuk  menilai potensi  ketoksikan  akut  ekstrak  daun  kerehau.
Terdapat  3  metode  untuk  menghitung  nilai  LD 50 yaitu  metode  probit  grafik,  Weil  C.S  dan Farmakope Indonesia III.Uji toksisitas akut ekstrak etanol  daun  kerehau  ini  dipilih  mengingat  masih belum  adanya  informasi  ilmiah  mengenai  potensi toksisitas.

## METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian  yang  dilakukan  adalah  penelitian eksperimental  yaitu  percobaan  yang  bertujuan untuk mengetahui suatu gejala atau pengaruh yang timbul  akibat  dari  adanya  perlakuan  tertentu. Penelitian  ini  menggunakan  rancangan  acak lengkap  pola  searah  dalam  pemilihan  hewan  uji yaitu  mencit.  Penelitian  yang  dilakukan  mengenai pengujian  toksisitas  akut  ekstrak  etanol  daun kerehau dengan konsentrasi dosis I,  II,  III, dan  IV serta  tanpa  ekstrak  sebagai  kontrol  negatif. Tahapan  penelitian  meliputi  pengambilan  sampel, pengolahan sampel, pembuatan ekstrak etanol daun kerehau.  Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium Terpadu III Akademi Farmasi Samarinda.

## Sample dan Teknik Sampling
Sample yang digunakan adalah daun tua yang tumbuh  liar  di  daerah  samboja,  kemudian dibersihkan  dan  diekstraksi  dengan  menggunakan ekstrak  etanol  70%  secara  maserasi  kemudian dipanaskan  diatas  tangas  air  sampai  terbentuk ekstrak  kental.  Teknik  sampling  yang  digunakan yaitu Purposive  Sampling dimana  pengambilan sampel berdasarkan pertimbangan tertentu.

## Alat dan bahan penelitian
Alat
Seperangkat  alat  maserasi, beaker  glass 50, 100, 1000 ml, erlenmeyer 50, 100 ml, sonde/kanulla,  neraca  analitik,  timbangan  gram, timbangan  hewan,  batang  pengaduk,  gunting, cawan  porselen,  guting,  pinset,  spuit  injeksi  dan jarum  ukuran  1  ml,  Sarung  tangan,  stop  watch, penangas air, wadah pengamatan.

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  adalah  air  suling, etanol  70%,  eter,  larutan  NaCl  0,9%,  Na-CMC, simplisia  daun  kerehau,  mencit  putih  jantan, pangan mencit, ketam, alumunium foil, pasir, batu- batu, pereaksi mayer, dragendorf, bouchardat, HCl 2  N,  Mg,  amil  alkohol,  FeCl 3 1%,  kloroform  dan HCl (p).

## Prosedur Penelitian
Pengambilan Sampel dan Determinasi Tumbuhan Daun Kerehau Sampel  diambil  di  hutan  daerah  Kecamatan Samboja Kabupaten Kutai Kartanegara, Kalimantan Timur. Sampel dideterminasi kemudian  diproses  menjadi  simplisia.  Determinasi tumbuhan daun kerehau dilakukan untuk mengetahui  bahwa  tumbuhan  yang  diambil merupakan tumbuhan yang dimaksud oleh peneliti. Determinasi  dilakukan  di  Laboratorium  Fisiologi Tumbuhan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan  Alam  (F-MIPA)  Jurusan  Biologi Universitas  Mulawarman  Samarinda  Kalimantan Timur.

## Penyiapan Simplisia Daun Kerehau
Dilakukan pengumpulan daun krehau, kemudian  di  sortasi  basah  memisahkan  dari kotoran  atau  benda  asing,  daun  dicuci  untuk menghilangkan  tanah  dan  kotoran  lainnya. Kemudian  pengeringan  dengan  cara  diangin- anginkan  hingga  kering  dan  selanjutnya  simplisia dihaluskan dengan menggunakan blender.

## Ekstraksi Daun Kerehau
Daun kerehau yang telah dihaluskan dilewatkan  pada  pengayak  mesh  60,  kemudian ditimbang  sebanyak    500  g  dan  dimasukan  ke dalam  bejana  maserasi,  dimaserasi  dengan  etanol 70%,  diaduk  menggunakan  maserator.  Ekstrak yang  diperoleh  kemudian  diuapkan  sampai terbentuk ekstrak yang agak kental.

## Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid,  flavonoid,  saponin,  tanin,  steroid  dan triterpenoid (5) .

## Pembuatan Suspensi Ekstrak
Untuk  membuat  suspensi  daun  kerehau ( Calicarpa Longifolia Lam.) ditimbang 1 g ekstrak lalu  dimasukkan  kedalam  lumpang.  Kemudian digerus  sambil  ditambahkan  sedikit  demi  sedikit larutan  koloidal  Na-CMC  0,5%    b/v  hingga homogen.  Dimasukkan  kedalam  gelas  ukur  dan cukupkan  volumenya  hingga  10  ml  lumpang dibilas,  cairan  bilasan  ditambahkan  kedalam gelasukur  dan  dicukupkan  volumenya  dengan larutan koloidal Na-CMC 0,5% b/v.

## Pemilihan dan Penyiapan Hewan Uji
Pemilihan Hewan Uji
Hewan  uji  yang  digunakan  adalah  mencit betina sehat, aktivitas gerak lincah, bulunya bersih,
dewasa,  umur  2-3  bulan  dengan  bobot  badan mencit 20-30 g.
Penyiapan dan Perlakuan hewan uji
Disiapkan  20  ekor  hewan  uji.Hewan  uji dibagi dalam 5 kelompok, yaitu 4 kelompok diberi perlakuan  dan  1  kelompok  sebagai  kontrol.Tiap kelompok terdiri atas 5 ekor hewan uji.
Kelompok:
Kontrol negatif (Na-CMC 0,5%) Ekstrak etanol daun kerehau dosis 16g/ Kg BB Ekstrak etanol daun kerehau dosis 8g/KgBB Ekstrak etanol daun kerehau dosis 4g/kgBB Ekstrak etanol daun kerehau dosis 2g/KgBB

## Pengujian
Dilakukan  pengujian  terhadap  pengamatan aktivitas  mencit  secara  umum  dan  uji  toksisitas akut.
Pengumpulan Data
Data yang diambil dari mencit memperlihatkan gejala abnormal setelah pemberian ekstrak etanol daun Krehau dibandingkan  dengan  control.Data  LD 50 diambil dari  jumlah  mencit  yang  mati  dan  masih  hidup pada setiap kelompok.

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN Determinasi Tumbuhan
Tumbuhan  di  determinasi  di  Laboratorium Fisiologi  Tumbuhan  Fakultas  Matematika  dan Ilmu  Pengetahuan  Alam  Universitas  Mulawarman Samarinda.  Hasil  determinasi  diperoleh  bahwa sampel merupakan tumbuhan daun kerehau dengan nama Callicarpa longifolia lam.

## Pembuatan simplisia Daun Kerehau
Daun  dikeringkan  secara  tidak  langsung dengan  cara  ditutup  kain  hitam  yang  dikeringkan dibawah  sinar  matahari,  agar  tidak  terpapar langsung  dengan  sinar  matahari  yang  dapat merusak  zat  aktif  pada  daun.  Daun  kerehau  segar yang digunakan sebanyak  2,8 kg kemudian setelah kering  penyusutan  menjadi  738  g  (rendemen 26,36%).  Daun  kerehau  yang  telah  kering dihaluskan  dengan  menggunakan  blender  dan diayak  menggunakan  ayakan  mesh    60  yang bertujuan  untuk  memperkecil  ukuran  serbuk  dan memperluas  permukaan  simplisia  sehingga  proses ekstraksi lebih efektif dan efisien.
Ekstraksi Daun Kerehau
Metode  ekstraksi  yang  digunakan  adalah metode  maserasi.  Sebanyak  500  g  serbuk  daun kerehau  lalu  direndam  dengan  cairan  penyari etanol  70%  sebanyak  5  L  dengan  perbandingan 1:10 kemudian diendapkan dan diambil maseratnya.  Maserat  berupa  ekstrak  cair  ini kemudian  dilakukan  pemekatan  dengan  cara ditangas  diatas  penangas  air.  Ekstrak  kental  yang diperoleh  sebanyak  102  g  (rendemen  20,49%). kemudian ekstrak kental digunakan untuk pengujian sesuai dengan jenis perlakuan.

## Skrining  Fitokimia  Ekstrak  Etanol  Daun Kerehau
Hasil  skrining  fitokimia  ekstrak  etanol disajikan  pada  tabel  1.  Berdasarkan  hasil  yang diperoleh  pada  tabel  1,  dapat  dilihat  bahwa  pada ekstrak etanol daun kerehaumengandung metabolit sekunder  seperti  flavonoid,  saponin,  dan  tanin tetapitidak  mengandung  golongan  alkoloid  karena pada pereaksi mayer dan bouchardat menunjukkan hasil negatif.
Pengujian Nilai LD 50 dan Potensi Ketoksikan Pada  penelitian  ini,  pengelompokan  hewan uji dilakukan secara acak, bertujuan untuk masing- masing  kelompok  perlakuan  memiliki  kesempatan yang  sama  untuk  dijadikan  sampel.  Hewan  uji dibagi  menjadi  5  kelompok  1  kelompok  kontrol ditambah 4 kelompok untuk 4 tingkatan dosis. Tiap kelompok  terdiri  dari  5  ekor  mencit  dan ditempatkan  dalam  5  kandang  yang  memiliki  luas dan  ukuran  yang  sama.  Hewan  uji  diadaptasikan selama  14  hari  dan  ditimbang  selama  7  hari terakhir sebelum diberi perlakuan untuk mengadaptasikan  hewan  uji  pada  lingkungan  baru dan  untuk  menetahui  kesehatan  mencit  dan  dapat digunakansebagai  hewan  percobaan.  Bobot  hewan uji  selama  7  hari  sebelum  perlakuan  dapat  dilihat pada gambar 1.
Pada  gambar  1  dapat  dilihat  bahwa masing-masing  kelompok  memiliki SEM ( Standar Eror  Mean )  yang  tidak  begitu  besar  antar  varian, sehingga  antar  kelompok  memiliki  berat  badan hampir  homogen,  terjadinya  kenaikan  bobot mencit setiap harinya sehingga disimpulkan bahwa mencit  tersebut  dalam  keadaan  sehat  dan  dapat digunakan sebagai hewan percobaan.
Sebelum diberi perlakuan hewan  uji dipuasakan  selama  3  jam  sebelum  pemejanan,  4
jam    saat  pengamatan  dan  12  jam  setelah pengamatan dengan tetap diberi minum secukupnya,  hal  ini  dilakukan  agar  makanan  yang ada  di  saluran  cerna  mencit  tidak  mempengaruhi efek  dari  ekstrak  yang  dipejankan  pada  mencit. Hewan  uji  dipejankan  dengan  sediaan  uji  dalam dosis tunggal secara oral. Dengan mempertimbangkan kemudahan dalam hal pemberiaan  sediaan,  maka  sediaan  uji  diberikan dalam bentuk suspensi.
Pemilihan  dosis  yang  digunakan  diperoleh dari dosis maksimum yang diberikan secara teknis pada  hewan  uji  mencit  (16  g/kgBB)  dengan mengacu  pada  tabel  klasifikasi  toksisitas  menurut Lu  (1995)  atau  sekitar  64 kali  dosis terapi ekstrak etanol  daun  kerehau  (250  mg/kgBB)  sebagai  obat anti inflamasi pada mencit (2) .
Hasil pengamatan pada tabel 2 menunjukkan  bahwa  kelompok  kontrol  tidak  ada perilaku  mencit  yang  menunjukkan  gejala  toksik, sedangkan pada kelompok I sampai IV menunjukkan gejala-gejala toksik. Gejala tersebut adalah    ciri-ciri  yang  mempengaruhi  perilaku (menggaruk-garuk, menunduk dan ketakutan) dan syaraf  otot  (gemetar  dan  ekor  membengkok), Sedangkan ciri toksik lainya  yang  mempengaruhi syaraf  otonom,  pernafasan,  gastrointestinal,  dan kulit tidak muncul.
Uji  LD 50 terhadap  ekstrak  etanol  daun kerehau  dilakukan  untuk  mengetahui  pada  dosis berapa  ekstrak  etanol  daun  kerehau  dapat memberikan  efek  toksik.  Efek  tersebut  ditandai dengan  adanya  kematian  pada  mencit  yang  telah diberikan  ekstrak  etanol  daun  kerehau,  yang diamati  selama  4  jam    untuk  mengetahui  gejala toksik  dan  dilanjutkan  pengamatan  setiap  24  jam selama 7 hari untuk melihat adanya kematian.
Berdasarkan    tabel  3  menunjukkan  bahwa, pada semua kelompok perlakuan tidak menimbulkan gejala kematian, walaupun kelompok  I  telah  diberikan  dosis  maksimum (16g/kgBB), jika dosis maksimum tidak menimbulkan  kematian  pada  hewan  coba  maka nilai  LD 50 dinyatakan  sebagai  LD 50 semu.  Dosis tertinggi  (16g/kgBB)  yang  telah  dipejankan  tidak menimbulkan  kematian    maka  termasuk  dalam kategori praktis tidak toksik (>15g/kgBB), menurut Lu (6) ,  apabila  ketoksikan akut  (> 15g/kgBB)  maka dikategorikan praktis tidak toksik. Hasil penelitian ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  daun kerehau  dapat  dikembangkan  sebagai  bahan  obat yang  diformulasikan  dalam  bentuk  sediaan farmasi,  karena  daun  kerehau  memiliki  manfaat yang  besar  dan  memiliki  keamanan  tinggi  dalam penggunaannya.
Tabel 1. Hasil Identifikasi Golongan Senyawa Kimia Ekstrak Etanol Daun Kerehau
No. Uji Senyawa Pereaksi Hasil Pengamatan Ket 1. 2. 3. 4. Alkaloid Flavonoid Tannin Saponin Mayer Bouchardat Dragendrof Serbuk Mg + HCL pekat + amil akohol FeCl 3 1% Air panas + HCL 2 N Tidak terbentuk endapan putih Tidak terbentuk endapan orange Terbentuk endapan merah bata Warna jingga pada amil alkohol Warna hijau kecoklatan Terbentuk busa permanen (-) (-) (+) (+)
(+) (+)
Keterangan :   (+) =  mengandung golongan senyawa kimia
(-) = tidak mengandung golongan senyawa kimia
Kelompok Gejala Toksik Kontrol - Kelompok I Perilaku ( menggaruk-garuk, menunduk dan ketakutan) Syaraf otot (gemetar, ekor membengkok) Kelompok II Prilaku (menggaruk-garuk dan ketakutan) Syaraf otot (gemetar, ekor membengkok) Kelompok III Prilaku (menggaruk-garuk dan ketakutan) Syaraf otot (ekor membengkok) Kelompok IV Prilaku (menggaruk-garuk) Syaraf otot (ekor membengkok)
Gambar 1 .Grafik Penimbangan Bobot Mencit
Tabel 3 . Jumlah Kematian Hewan Uji Setelah Pemberian Ekstrak Etanol Daun Kerehau
Kelompok N Jumlah Mencit Yang Mati Respon (%) LD 50 (g/kgBB) Kontrol Kelompok I Kelompok II Kelompok III Kelompok IV 5 5 5 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 - - - - - Keterangan : Kelompok Kontrol = dosis 0 g/kg BB Kelompok I = dosis 16 g/kg BB Kelompok II = dosis 8 g/kg BB Kelompok III  = dosis 4 g/kg BB
Kelompok IV   = dosis 2 g/kg BB

## SIMPULAN
1. Nilai  LD 50 semu  (16g/kgBB),  dengan  potensi ketoksikan  kategori  praktis  tidak  toksik (>15g/kgBB).
2. Ekstrak  etanol  daun  kerehau  pada  kelompok kontrol  tidak  ada  perilaku  mencit  yang
menunjukkan  gejala  toksik,  sedangkan  pada kelompok  I,  II,  III,  dan  IV  menunjukkan gejala-gejala  toksik.  Gejala  tersebut  adalah ciri-ciri yang mempengaruhi perilaku (menggaruk-garuk,  menunduk  dan  ketakutan) dan syaraf otot (gemetar dan ekor
20 21 22 23 24 25 26 27 28 1 2 3 4
5 6 7 Kelompok I Kelompok II Kelompok III Kelompok IV Kontrol
membengkok),  Sedangkan  ciri  toksik  lainya yang mempengaruhi syaraf otonom, pernafasan,  gastrointestinal,  dan  kulit  tidak muncul.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Quattrocchi,  U.2012.  CRC  World  Dictionary Of Medicinal And Poisonous Plants: Common Names, Scientific Names, Eponyms, Synonyms,  And  Etymology  (5  Volume  Set) CMC Pres, P.P 730-731
2. Semiawan,  F.  Ahmad,  I  dan  Masruhim,  M.A. 2015.    Aktivitas  Antiinflamasi  Ekstrak  Daun Kerehau (Callicarpa  longifolia  L.) Jurnal Sains  dan  Kesehatan.  2015.  Vol  1.  No  1.  p- ISSN:2303-0267, e-ISSN: 2407-6082
3. Harmita  dan  Radji,  M.  2008.Buku  Ajar Analisis  Hayati  Edisi  3.  Penerbit  Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
4. Nurlaila,  Donatus,  IA.  Sugiyanto,  Wahyono, D.  Suhardjono,  D.  Petunjuk  Praktikum
Toksikologi. 1 st ed. Yogyakarta: Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Fakultas
Farmasi, Universitas Gajah Mada; 1992. P. 3 –
5, 16 – 30 5. Harborne,  J.  B.  1987.  Metode  Fitokimia:
Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung: Institut Teknologi Bandung.
6. Lu,  F.C.,  1995,  ToksikologiDasar : Asas, Organ, Sasaran, dan Penilaian Risiko. Edisi II.
Jakarta: UI Press