Menara Perkebunan 2010, 78(1), 1-8
Kloning fragmen gen penyandi β -ketoacyl-ACP synthase II dari dua tipe kelapa sawit dengan kandungan asam oleat yang berbeda
Cloning of gene fragment encoding β -ketoacyl-ACP synthase II from  two types of oil palm with different oleic acid content
Asmini BUDIANI 1) & Abdul Razak PURBA 2)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan,  Jl. Taman Kencana No. 1, Bogor 16151, Indonesia
2) Pusat Penelitian Kelapa Sawit,  Jl. Brigjen Katamso No. 51, Medan 20158, Indonesia
Diterima tgl 24 Februari 2010/Disetujui tgl 26 Mei 2010

## Abstract
In addition to increase productivity, oil palm breeding is also aimed to increase oil quality, one of which is oleic acid content. Conventionally, the increase of oleic acid is carried out by crossing between Elaeis guineensis which is high in oil content and Elaeis oleifera which contain high oleic acid. Genetic engineering to increase oleic acid might be done by over expressing gene encoding β -Ketoacyl-ACP Synthase II
(KASII) in the mesocarp of oil palm. As a preliminary work of genetic engineering to increase oleic acid content, this research was aimed to clone DNA fragment of gene encoding KASII by using RT-PCR. Total RNA were isolated from the mesocarp of two different types of oil palms, namely Simalungun (E. guineensis ) and Hibrida (E.  guineensi  x E. oleifera ), and used for synthesis of first strand cDNA. Amplification of KASII DNA fragments was carried out using first strand cDNA as a template with specific primers. The RT-PCR product was verified by electrophoresis on agarose gel, isolated and purified from the gel, sequenced and then cloned into E. coli using pGEM-T Easy cloning vector. Analysis of the target DNA in transformed E. coli was done by colony PCR. Recombinant plasmid was isolated from recombinant E. coli followed by DNA sequencing and analysis. DNA sequences were analysed using BLASTn to test the homology with similar genes. The results show that DNA fragment of RT-PCR products from Simalungun and Hibrida types of oil palm have been cloned in E. coli , and the sequences have been confirmed as a fragment of KASII gene. Analysis of the two sequences indicated that there were differences of four nucleotides at position no of 91, 103, 115, and 148.
[ Keywords : KASII, Elaeis   guineensis , Elaeis oleifera, oleic acid, oil palm] .

## Abstrak
Selain meningkatkan produksi, pemuliaan kelapa sawit juga ditujukan untuk meningkatkan kualitas minyak sawit, salah satunya adalah meningkatkan kandungan oleat. Secara konvensional peningkatan kandungan oleat dilakukan melalui penyilangan antara Elaeis guineensis yang tinggi rendemen minyaknya dengan Elaeis oleifera yang tinggi kandungan oleatnya. Rekayasa genetika untuk peningkatan kandungan oleat dapat ditempuh antara lain dengan mening-katkan ekspresi gen penyandi β -Ketoacyl-ACP Synthase II (KASII) pada mesokarp buah sawit. Sebagai bagian dari upaya peningkatan kandungan oleat, penelitian ini bertujuan untuk mengklon fragmen gen penyandi KASII dengan pendekatan RT-PCR. RNA total diisolasi dari mesokarp dua tipe kelapa sawit yaitu Simalungun dan Hibrida (E. guineensis x E. oleifera) , kemudian digunakan dalam sintesis utas pertama cDNA. Amplifikasi fragmen DNA penyandi KASII dilakukan menggunakan primer spesifik dan templat cDNA utas pertama hasil sintesis. Produk RT-PCR diverifikasi dengan elektroforesis pada gel agarosa, diisolasi dan dimurnikan dari gel, disekuen kemudian diklon dalam E. coli menggunakan vektor kloning pGEM-T Easy. Analisis adanya fragmen DNA target dalam sel E. coli transforman dilakukan dengan PCR koloni. Plasmid rekombinan diisolasi dari sel rekombinan dan diverifikasi pada gel agarose kemudian disekuen kembali untuk mengkonfirmasi bahwa fragmen DNA terklon adalah bagian dari gen penyandi KASII. Sekuen DNA dianalisis menggunakan BLASTn untuk mengetahui homologinya dengan gen yang sama. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fragmen DNA produk RT- PCR dari kelapa sawit tipe Simalungun dan Hibrida telah terklon dalam E. coli dan sekuen DNAnya dikonfirmasi sebagai fragmen gen penyandi KASII. Hasil analisis sekuen DNA KASII dari tipe Simalungun dengan tipe Hibrida juga mengindikasikan adanya perbedaan pada empat nukleotida yaitu pada posisi ke-91,  ke-103, ke-115, dan ke-148.
[Kata kunci: KASII, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera, asam oleat, minyak sawit] .
Kloning fragmen gen penyandi β -ketoacyl-ACP synthase II dari dua tipe kelapa sawit… (Budiani & Purba)

## Pendahuluan
Pemuliaan kelapa sawit untuk menghasilkan bibit unggul berdaya hasil tinggi dengan kualitas minyak yang lebih baik secara konvensional dilakukan dengan menyilangkan tetua dari spesies E. guineensis (D x P) yang tinggi rendemen minyaknya, tetapi kandungan oleatnya relatif rendah dengan E. oleifera yang tinggi kandungan oleatnya namun rendemen minyaknya sangat rendah . Sampai saat ini belum diperoleh varietas komersial hasil persilangan tersebut yang rendemen minyaknya setinggi E. guineensis dan kandungan oleatnya setinggi E. oleifera , meskipun beberapa kemajuan telah diperoleh. Hal ini disebabkan lamanya siklus pemuliaan, keterbatasan gene pool , serta kebutuhan lahan yang sangat luas untuk pengujian. Oleh karena itu perlu dikembangkan cara   alternatif sehingga  bibit   unggul demikian dapat dihasilkan. Salah satu cara yang dipandang merupakan terobosan adalah pendekatan melalui bioteknologi molekuler.
Saat ini hampir 90% dari kebutuhan minyak sawit digunakan untuk bahan makanan seperti minyak goreng, margarin, shortening , vanaspati dan lain sebagainya (Lin, 2002). Rendahnya kandungan poly- unsaturated fatty acid (10-11 % asam linoleat) merupakan suatu kelebihan, karena dengan komposisi demikian minyak sawit bersifat stabil terhadap oksidasi maupun pemanasan tinggi. Namun, tingginya kandungan asam palmitat dalam minyak sawit (44-45 %), menjadi kendala dalam persaingan global dengan beberapa minyak nabati lain. Oleh karena itu untuk meningkatkan daya saingnya, selain penyediaan benih dengan potensi produksi yang tinggi, pemuliaan kelapa sawit juga diarahkan untuk pengembangan karakter lain, salah satunya adalah peningkatan kandungan asam oleat.
Menurut Madon et al. (2005), industri kelapa sawit diperkirakan akan menikmati nilai tambah sebesar US$ 1.500/ha/tahun  apabila  kandungan  asam  oleatnya > 65%. Meskipun belum ada laporan hasil penelitian, kandungan oleat yang tinggi juga dipercaya akan meningkatkan kualitas biodiesel minyak sawit. Minyak biji kedelai hasil rekayasa genetika yang kandungan oleatnya 85%, terbukti menunjukkan performa biodiesel yang lebih baik (Asmono, 2006). Di samping itu, minyak sawit dengan oleat tinggi juga sangat tepat untuk bahan makanan karena dipercaya dapat menurunkan risiko penyakit jantung.
Peningkatan kandungan asam oleat telah berhasil dilakukan pada berbagai tanaman, di antaranya pada kedelai, kapuk, Arabidopsis dan Brassica (Thelen & Ohlrogge, 2002). Kinney (1996) berhasil meningkat- kan kandungan asam oleat dalam kedelai hingga 86%, menurunkan kandungan asam linoleat dari 55% menjadi kurang dari 1% dan asam lemak jenuhnya diturunkan menjadi 10%, dengan cara menekan oleoyl-
Δ -12 desaturase. Melalui rekayasa genetika kandungan asam oleat pada kelapa sawit dapat ditingkatkan dengan beberapa pendekatan, diantaranya meningkat- kan aktivitas enzim β -ketoacyl-ACP synthase II (KASII) dan menekan aktivitas palmitoyl-ACP thioesterase (PAT) (Cheah et al. , 1995). Peningkatan aktivitas KASII dapat dilakukan dengan meng- overekspresikan gen tersebut dalam jaringan penghasil minyak (mesokarp), sedangkan aktivitas PAT dapat ditekan melalui mekanisme gene silencing (Singh et al. , 2000). Sebagai langkah awal dari usaha tersebut, penelitian ini bertujuan mengklon fragmen gen penyandi KASII dari mesokarp buah kelapa sawit yang berbeda rendemen minyaknya.

## Bahan dan Metode

## Bahan penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mesokarp buah sawit dari dua tipe kelapa sawit yang berbeda rendemen minyak dan kandungan oleatnya, yaitu  D x P Simalungun ( E. guineensis ) (S),  dengan rendemen minyak (Pabrik) 26,5% dan kandungan oleat 38,5%, dan Hibrida  (Simalungun x E. oleifera ) (H) dengan rendemen minyak 11,4% dan kandungan oleat 45,3%. Setelah dipanen, mesokarp buah sawit dipisah- kan dari kulit dan bijinya, dipotong kecil-kecil kemudian dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan dalam freezer bersuhu -40 o C, sampai pada saatnya digunakan untuk isolasi RNA.

## Perancangan primer spesifik KASII
Primer spesifik untuk mengamplifikasi fragmen KASII dirancang berdasarkan informasi urutan nukleotida dari gen yang sama yang dapat diakses dari GenBank . Perancangan primer dilakukan meng- gunakan program Primer3 yang dapat diakses   secara on line (http://www.biotools.umassmed.edu/), dengan memperhatikan beberapa parameter seperti ukuran dan posisi fragmen DNA target, titik leleh (Tm), komplementasi pada ujung 3’ dan lain sebagainya.

## Isolasi RNA total dari mesokarp buah sawit
RNA total diisolasi dari jaringan mesokarp buah sawit yang sedang aktif mensintesis minyak dengan metode Chang et al. (1993) yang dimodifikasi. Sebanyak 1 gram jaringan mesokarp dihaluskan dalam nitrogen cair, dihomogenkan dengan 10 mL bufer ekstraksi (CTAB 2%,  PVP 2%, Tris-HCl  100 mM pH 8,0; M EDTA 25 m, NaCl 2,0 M, spermidin 0,5 g/L dan β -Merkaptoetanol 2%) pada suhu 65 o C dilanjut- kan dengan  dua kali ekstraksi menggunakan campuran kloroform: isoamil alkohol (24:1). Setelah ditambah
Menara Perkebunan 2010, 78(1), 1-8
¼ x volume  LiCl 10 M,  RNA diendapkan semalam pada suhu 4 o C, kemudian disentrifugasi selama 30 menit pada 11.000 rpm. Pelet dilarutkan dalam bufer SSTE (NaCl 1%, SDS 0,5%, Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0) dan diekstrak kembali dengan kloroform: isoamil alkohol. Setelah diendapkan dalam dua kali volume etanol absolut pada suhu –20 o C selama dua jam, RNA dilarutkan dalam DEPC – treated water .
RNA hasil isolasi dimurnikan dari kontaminan DNA dengan cara berikut. Ke dalam RNA total ditambahkan 0,1 x volume LiCl 8 M. Campuran diinkubasi di es selama dua jam, kemudian disentri- fugasi 30 menit pada 13.000 rpm, dengan suhu 4 o C. Pelet dilarutkan dalam 200 μ L DEPC– treated water, ditambah 0,1 volume 3 M Na asetat dan 2 volume etanol absolut, didinginkan pada  suhu– 20 o C selama 30 menit. Setelah sentrifugasi,  pelet   dicuci  dengan 70 o C etanol dingin. RNA yang diperoleh diuji kualitas dan kuantitasnya dengan jalan elektroforesis pada gel agarose  1%.

## Amplifikasi fragmen DNA KASII dengan RT-PCR
Sintesis utas pertama cDNA dilakukan meng- gunakan kit Superscript First Strand cDNA Synthesis dari Invitrogen dengan templat RNA total mesokarp. Selanjutnya cDNA utas pertama digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi fragmen gen penyandi daerah konservatif KASII , menggunakan primer spesifik hasil rancangan. Untuk mendapatkan hasil amplifikasi terbaik, PCR dilakukan pada suhu annealing (penempelan primer) 56 o C dan 58 o C, serta konsentrasi MgCl 2 2,5 mM dan 5,0 mM. Hasil amplifikasi dicek pada gel agarose.

## Kloning dan analisis fragmen DNA  hasil RT-PCR
Hasil amplifikasi dimurnikan dari gel meng- gunakan kit QIAquick Gel Extraction dari QIAGEN dan disekuen. Sekuen DNA yang diperoleh dianalisis menggunakan BLASTn untuk mengetahui homologi- nya dengan gen yang sama, kemudian  diligasi  pada vektor pGEM-T Easy (Promega). Hasil ligasi diintroduksikan ke E. coli kompeten sesuai prosedur yang direkomendasikan dalam kit. Seleksi sel transforman dilakukan pada medium padat LB yang mengandung 50 mg/L kanamisin dan 40 mg/L X-Gal. Analisis adanya fragmen terklon pada koloni putih dilakukan dengan PCR menggunakan primer spesifik yang sama dengan yang digunakan dalam RT-PCR. Plasmid rekombinan diisolasi dari koloni positif menggunakan kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN), didigesti dengan enzim restriksi Eco RI dan disekuen. Sekuen DNA dianalisis kembali homologinya dengan gen yang sama menggunakan BLASTn untuk meng- konfirmasi kembali bahwa framen DNA terklon adalah
bagian dari gen KASII . Analisis juga dilakukan untuk mendeteksi apakah terdapat perbedaan urutan basa pada sekuen DNA dari kedua tipe kelapa sawit.

## Hasil dan Pembahasan
Susunan nukleotida dan posisi primer spesifik KASII
Sekuen gen KASII dari kelapa sawit yang diperoleh dari GenBank dijadikan masukan sekuen untuk merancang primer spesifik dengan program Primer3. Luaran dari Primer3 yang menunjukkan posisi primer yang direkomendasikan disajikan pada Gambar 1. Berdasarkan  luaran Primer3, susunan nukleotida primer yang digunakan adalah KASII-F: 5’ACTACG AGAAGGCAGCGAAG 3’ dengan Tm (titik leleh) 59,78 o C untuk primer forward , dan  KASII-R: 5’GCAAATGGAACACAA AATGG 3’ dengan Tm 58,87 o C untuk primer reverse . Pasangan primer tersebut selanjutnya digunakan dalam reaksi RT-PCR pada tahap berikutnya untuk mengamplifikasi fragmen gen KASII . Sebagaimana ditunjukkan pada Gambar 1, ukuran amplikon yang diharapkan adalah 527 bp. Untuk memperoleh primer dengan spesifitas yang tinggi terhadap fragmen cDNA yang akan diampli- fikasi, dalam merancang primer telah dipertimbangkan beberapa hal yang merupakan ketentuan dalam perancangan primer yang baik di antaranya adalah panjang primer antara 18-28 nukleotida, kandungan basa guanin dan sitosin (G+C) berkisar antara 50-60%, dan kedua primer memiliki titik leleh yang sebanding.

## Amplifikasi fragmen gen penyandi KAS II dengan RT- PCR
Elektroforesis pada gel agarose menunjukkan bahwa RNA total hasil isolasi bebas dari kontaminasi DNA (Gambar 2A), sedangkan hasil pengukuran absorbasi menggunakan spektrofotometer menunjuk- kan bahwa konsentrasi dan kemurnian kedua sampel cukup memadai untuk analisis akumulasi transkrip dengan RT-PCR. Konsentrasi dan kemurnian RNA yang  diperoleh,  masing-masing  adalah  sebesar 740 ng/µL dan 1,457, untuk sampel Hibrida, serta 1000 ng/µL dan 1,938 untuk sampel Simalungun.
Gambar 2B menunjukkan hasil RT-PCR. Adanya satu fragmen DNA berukuran antara 500-600 bp sesuai dengan perkiraan produk amplifikasi menggunakan pasangan primer yang direkomendasikan dari luaran program primer3. Dari Gambar tersebut nampak bahwa suhu annealing dan konsentrasi MgCl 2 sangat ber- pengaruh terhadap intensitas hasil amplifikasi. Kondisi yang lebih baik diperoleh pada suhu annealing 58 o C dengan konsentrasi MgCl 2 2,5mM. Berdasarkan hasil tersebut, maka pada RT-PCR selanjutnya untuk amplifikasi fragmen KASII dari kedua tipe kelapa sawit, digunakan suhu annealing 58 o C dan  konsentrasi
Kloning fragmen gen penyandi β -ketoacyl-ACP synthase II dari dua tipe kelapa sawit… (Budiani & Purba)
301 gggatccagg ggctgatgag ctcctgcctc gccttcgagc cctgcgcgga gttctacggc tctaagggcg cgtcggcttt cttcggagag agtggcttct ccctctttgg gacgtcgaag gcggag acta cgagaaggca gcgaag ggcc gcgcgcgcct cttgcgtctc gggcaaagca atggcagtag ctgtgcagcc tgctaaggaa attgcagaaa agaagagaac ccatacaaag aagaggagag tggtcgtgac agggatgggt gtggtgactc cactgggcgt tgatcctggt atcttctaca ataaccttct tgatggtgtc agtggtataa gtcaaattga aacatttgac tgtaccaact atccaacaag aattgcagga gaaattaaat ctttttcaac agatggattg gtggcaccta aattatctaa acgaatggac aaattcatgc tctatttact tattgctgga aagaaagcat tagccaatgg tggggttact gaagaggtca tgagtcagct tgacaaggca aaatgcggag tgctcatagg ctctgcgatg ggtggaatga aggtttttaa tgatgccatc gaagctttaa gggtctcata taagaagatg aat ccatttt gtgttccatt tgc aacgaca
Gambar 2.   (A) RNA total hasil isolasi dari mesokarp buah tipe Simalungun (S) dan Hibrida (H). (B) Hasil RT-PCR dari sampel Simalungun pada suhu annealing 58 o C (lajur 1 dan 2) dan 56 o C (3 dan 4) dengan konsentrasi MgCl 2 2,5 mM (1, 3) dan 5 mM (2,4); (C). Hasil RT-PCR pada suhu annealing 58 o C dan konsentrasi  MgCl 2 2,5 mM dari sampel Simalungun (lajur 1), dan sampel Hibrida (lajur 2). M: 1 kb plus DNA ladder
Figure 2.     (A) Total RNA isolated from fruit mesocarp of Simalungun (S) and Hibrida (H). (B) RT-PCR product of Simalungun at annealing temperature 58 o C (lanes 1 and 2) and 56 o C (lanes 3 and 4) with concentration of MgCl 2 2.5 mM (lanes 1 and 3) and 5.0 mM (lanes 2 and 4). (C) RT-PCR product at annealing temperature 58 o C and MgCl 2 2.5 mM of Simalungun (lane 1) and Hibrida (lane 2). M: 1 kb plus DNA ladder.
MgCl 2 2,5 mM (Gambar 2C). Dari Gambar 2C nampak bahwa akumulasi transkrip KASII pada tipe Hibrida lebih tinggi dibandingkan dengan pada Simalungun. Perbedaan ini diduga terkait dengan perbedaan kandungan oleat pada kedua tipe kelapa sawit tersebut, yaitu pada Hibrida kandungan oleatnya 45,3%, lebih tinggi dibandingkan dengan pada Simalungun (38,5%).

## Kloning produk RT-PCR
Hasil PCR koloni menunjukkan bahwa lima koloni dari 10 koloni hasil transformasi menggunakan produk RT-PCR dari tipe Simalungun mengandung sisipan DNA dengan ukuran yang lebih kurang sesuai dengan fragmen gen target. Demikian pula dengan PCR koloni hasil transformasi menggunakan produk RT-PCR dari tipe Hibrida (Gambar 3). Meskipun demikian terdapat variasi ukuran fragmen yang dihasilkan, misalnya
ukuran fragmen hasil PCR dari koloni nomor 6 sedikit lebih  tinggi dibandingkan dengan koloni nomor 7. Oleh karena itu untuk memastikan bahwa fragmen DNA terklon adalah fragmen gen KASII , perlu dilakukan analisis sekuen DNA. Untuk itu dilakukan isolasi plasmid rekombinan terhadap dua dari lima koloni yang teruji positif pada analisis PCR untuk masing-masing sampel. Gambar 4 menyajikan hasil isolasi plasmid dari sel-sel rekombinan yang mengandung fragmen hasil RT-PCR untuk Simalungun dan Hibrida, serta digestinya dengan enzim restriksi. Nampak bahwa digesti dengan Eco RI dari keempat plasmid rekombinan  menghasilkan fragmen dengan ukuran yang sama dan sesuai dengan prediksi ukuran fragmen yang diinginkan. Berdasarkan ukuran fragmen produk PCR koloni maupun fragmen hasil digesti menggunakan Eco RI, maka hampir dapat dipastikan bahwa fragmen terklon adalah fragmen gen KASII .
Gambar 1. Posisi primer yang paling direkomendasikan dari luaran program primer3 dan  digunakan dalam RT-PCR (warna merah : primer KASII-F; warna biru:  primer KASII-R)
Figure 1.   Position of primers recommended by primer3 program and used in RT-PCR (Red:KASII-F primer; blue: KASII-R primer)
M       1        2 M        1          2              3           4 A B S            H C
1    2    3     4    5     6    7    8    9    10  M  11  12   13  14  15 16     M    17    18    19    20
Gambar 3 . Profil elektroforesis hasil PCR koloni rekombinan hasil transformasi E. coli menggunakan konstruk pGEM-T/ KASII. (1-10 : Simalungun; 11-20 : Hibrida) menggunakan primer M13.
Figure 3.  Electrophoretic profile of PCR using M13 primer pair of recombinant colonies produced from E. coli transformed with pGEM-T/KASII construct. (1-10 : Simalungun; 11-20 : Hibrida)
Menara Perkebunan 2010, 78(1), 1-8
Konfirmasi untuk hal tersebut baru dapat diperoleh setelah sekuensing menggunakan templat plasmid rekombinan dilanjutkan dengan analisis sekuen DNAnya.

## Sekuensing dan analisis DNA fragmen terklon
Sekuensing dua plasmid rekombinan yang diharapkan mengandung fragmen gen KASII asal Simalungun  dan KASII asal  Hibrida dilakukan dua arah, menggunakan primer M13F dan M13R. Hasil sekuensing kemudian dibersihkan dari kontaminan vektor menggunakan BLAST VecScreen. Penjajaran sekuen DNA hasil sekuensing menggunakan M13F dan M13R yang telah dibersihkan dari kontaminasi vektornya menghasilkan sekuen fragmen KASII sebagaimana disajikan pada Gambar 5 dan Gambar 7. Untuk memastikan bahwa fragmen DNA tersebut
adalah fragmen gen KAS II dilakukan analisis BLASTn. Hasil analisis BLASTn masing-masing sekuen mengkonfirmasi kembali bahwa fragmen produk RT- PCR dari Simalungun dan Hibrida yang telah diklon pada E. coli adalah fragmen gen KASII sebagaimana ditunjukkan oleh E- value dan Max Score untuk sekuen tersebut (Gambar 6 & 8).
Untuk mendeteksi ada tidaknya perbedaan sekuen antara Simalungun dan Hibrida, sekuen DNA kedua tipe kelapa sawit dijajarkan dan dianalisis mengguna- kan program BLAST2seq alignmen t. Hasil analisis menunjukkan adanya perbedaan antara kedua sekuen pada empat nukleotida. Pada Simalungun nukleotida ke-91 adalah ‘G’, ke-103 adalah ‘C’, ke-115 adalah ‘A’ dan nukleotida ke-148 adalah ‘C’, sedangkan pada Hibrida  masing-masing berturut-turut adalah  ‘A’, ‘G’, ‘G’ dan ‘T’ (Gambar 9).
Gambar 4.  (A) Profil  elektroforesis  hasil  isolasi  plasmid  rekombinan, dan (B)  digestinya dengan Eco RI (lajur 1 & 2 : Simalungun; lajur 3 & 4 : Hibrida)
Figure 4.   (A) Electrophoretic  profile of  isolated recombinant plasmid,  and (B) its digestiont using Eco RI (lanes 1 & 2: Simalungun; lanes 3 & 4 : Hibrida)
M        1        2          3        4         M     1       2        3        4 B A
Kloning fragmen gen penyandi β -ketoacyl-ACP synthase II dari dua tipe kelapa sawit… (Budiani & Purba)
Accession Description Score
E value
FJ940767.1 Elaeis oleifera beta-ketoacyl-ACP synthase II (KAS- II) mRNA, complete cds 961 0.0 AF220453.2 Elaeis guineensis beta-ketoacyl-ACP synthase II mRNA, complete cds 955 0.0 FJ358425.1 Arachis hypogaea beta-ketoacyl-ACP synthetase II- like (KASII) mRNA, complete sequence 163 8e-37
CTACGAGAAGGCAGCGAAGGGCCGCGCGCGCCTCTTGCGTCTCGGGCAAAGCAATGGCAG TAGCTGTGCAGCCTGCTAAGGAAATTGCAGAAAAGAAGAGAAGCCATACAAAGAGGAGGA GAGTGGTCGTGACAGGGATGGGTGTGGTGACTCCACTGGGCGTTGATCCTGATATCTTCT ACAATAACCTTCTTGATGGTGTCAGTGGTATAAGTCAAATTGAAACATTTGACTGTACCA ACTATCCAACAAGAATTGCAGGAGAAATTAAATCTTTTTCAACAGATGGATTGGTGGCAC CTAAATTATCTAAACGAATGGACAAATTCATGCTCTATTTACTTATTGCTGGAAAGAAAG CATTAGCCAATGGTGGGGTTACTGAAGAGGTCATGAGTCAGCTTGACAAGGCAAAATGCG GAGTGCTCATAGGCTCTGCGATGGGTGGAATGAAGGTTTTTAATGATGCCATCGAAGCTT TAAGGGTCTCATATAAGAAGATGAATCCATTTTGTGTTCCATTTGC
Gambar  6. Hasil analisis BLASTn dari sekuen DNA produk RT-PCR  terklon asal Simalungun.
Figure  6.  Result of BLASTn analysis of the DNA sequence of cloned RT-PCR product from Simalungun.
CTACGAGAAGGCAGCGAAG GGCCGCGCGCGCCTCTTGCGTCTCGGGCAAAGCAATGGCAG TAGCTGTGCAGCCTGCTAAGGAAATTGCAGGAAAGAAGAGAACCCATACAAAGAAGAGGA GAGTGGTCGTGACAGGGATGGGTGTGGCGACTCCACTGGGCGTTGATCCTGATATCTTCT ACAATAACCTTCTTGATGGTGTCAGTGGTATAAGTCAAATTGAAACATTTGACTGTACCA ACTATCCAACAAGAATTGCAGGAGAAATTAAATCTTTTTCAACAGATGGATTGGTGGCAC CTAAATTATCTAAACGAATGGACAAATTCATGCTCTATTTACTTATTGCTGGAAAGAAAG CATTAGCCAATGGTGGGGTTACTGAAGAGGTCATGAGTCAGCTTGACAAGGCAAAATGCG GAGTGCTCATAGGCTCTGCGATGGGTGGAATGAAGGTTTTTAATGATGCCATCGAAGCTT TAAGGGTCTCATATAAGAAGATGAAT CCATTTTGTGTTCCATTTGC
Gambar 5. Susunan DNA produk RT-PCR dari tipe Simalungun (S) terklon Figure 5 . DNA sequence of the cloned RT-PCR product of Simalungun (S)
Gambar 7. Susunan DNA produk RT-PCR dari tipe Hibrida (H) terklon
Figure 7.  DNA sequence of the cloned RT-PCR product of Hibrida (H)

## Menara Perkebunan 2010, 78(1), 1-8
Accession Description Score
E- value
FJ940767.1 Elaeis oleifera beta-ketoacyl-ACP synthase II (KAS-II) mRNA, complete cds 961 0.0 AF220453.2 Elaeis guineensis beta-ketoacyl-ACP synthase II mRNA, complete cds 955 0.0 FJ358425.1 Arachis hypogaea beta-ketoacyl-ACP synthetase II- like (KASII) mRNA, complete sequence 169 2e-38
Gambar 9. Hasil  BLAST2seq sekuen DNA fragmen gen KASII kelapa sawit Simalungun dan Hibrida.
Figure 9. Result of BLAST2seq of the KASII gen fragments DNA sequences from oil palm types Simalungun and Hibrida.
Gambar  8. Hasil analisis BLASTn dari sekuen DNA produk RT-PCR   terklon asal Hibrida.
Figure  8.  Result of BLASTn analysis of the DNA sequence of cloned RT-PCR product from Hibrida.
Query (S)  1   CTACGAGAAGGCAGCGAAGGGCCGCGCGCGCCTCTTGCGTCTCGGGCAAAGCAATGGCAG  60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct (H)  1   CTACGAGAAGGCAGCGAAGGGCCGCGCGCGCCTCTTGCGTCTCGGGCAAAGCAATGGCAG  60 Query (S) 61   TAGCTGTGCAGCCTGCTAAGGAAATTGCAGGAAAGAAGAGAACCCATACAAAGAAGAGGA 120
|||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| ||||||||||| |||||
Sbjct (H) 61   TAGCTGTGCAGCCTGCTAAGGAAATTGCAGAAAAGAAGAGAAGCCATACAAAGAGGAGGA 120
Query (S) 121  GAGTGGTCGTGACAGGGATGGGTGTGGCGACTCCACTGGGCGTTGATCCTGATATCTTCT 180
||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct (H) 121  GAGTGGTCGTGACAGGGATGGGTGTGGTGACTCCACTGGGCGTTGATCCTGATATCTTCT 180
Query (S) 181  ACAATAACCTTCTTGATGGTGTCAGTGGTATAAGTCAAATTGAAACATTTGACTGTACCA 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct (H) 181  ACAATAACCTTCTTGATGGTGTCAGTGGTATAAGTCAAATTGAAACATTTGACTGTACCA 240
Query (S) 241  ACTATCCAACAAGAATTGCAGGAGAAATTAAATCTTTTTCAACAGATGGATTGGTGGCAC 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct (H) 241  ACTATCCAACAAGAATTGCAGGAGAAATTAAATCTTTTTCAACAGATGGATTGGTGGCAC 300
Query (S) 301  CTAAATTATCTAAACGAATGGACAAATTCATGCTCTATTTACTTATTGCTGGAAAGAAAG 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct (H) 301  CTAAATTATCTAAACGAATGGACAAATTCATGCTCTATTTACTTATTGCTGGAAAGAAAG 360
Query (S) 361  CATTAGCCAATGGTGGGGTTACTGAAGAGGTCATGAGTCAGCTTGACAAGGCAAAATGCG 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct (H) 361  CATTAGCCAATGGTGGGGTTACTGAAGAGGTCATGAGTCAGCTTGACAAGGCAAAATGCG 420
Query (S) 421  GAGTGCTCATAGGCTCTGCGATGGGTGGAATGAAGGTTTTTAATGATGCCATCGAAGCTT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct (H) 421  GAGTGCTCATAGGCTCTGCGATGGGTGGAATGAAGGTTTTTAATGATGCCATCGAAGCTT 480 Query (S) 481  TAAGGGTCTCATATAAGAAGATGAATCCATTTTGTGTTCCATTTGC  526 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct (H) 481  TAAGGGTCTCATATAAGAAGATGAATCCATTTTGTGTTCCATTTGC  526
Kloning fragmen gen penyandi β -ketoacyl-ACP synthase II dari dua tipe kelapa sawit… (Budiani & Purba)

## Kesimpulan dan Saran
Pasangan primer spesifik untuk KASII telah dirancang dan digunakan untuk amplifikasi fragmen gen KASII . Dengan pendekatan RT-PCR, fragmen DNA KAS II telah  berhasil  diisolasi  dari mesokarp kelapa sawit tipe Simalungun dan Hibrida dan telah diklon dalam E.coli serta terkonfirmasi sekuennya sebagai bagian dari daerah penyandi KASII. Terdapat perbedaan antara kedua sekuen DNA dari kedua tipe kelapa sawit tersebut, yaitu pada posisi nukleotida ke- 91,  ke-103, ke-115, dan ke-148.

## Daftar Pustaka
Asmono D (2006). Penelitian dan pengembangan teknologi genomik dan rekayasa genetika kelapa sawit: status saat ini dan permasalahannya. Dalam : Penyusunan Agenda Riset Penguatan Industri Hulu Kelapa Sawit Bogor, 20 April 2006. Kementrian Negara Riset dan Teknologi RI dan Masyarakat Perkelapasawitan Indonesia. p. 7.
Chang S, J Puryear & J Cairney (1993). A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Plant Mol Biol Rep 11 , 98-100.
Cheah  S  C,  R  Sambanthamurthi,  A  Siti  Nor  Akmar,
O  Abrizah,  MAA  Manaf,  R  Umi  Salamah  & G K A Parveez (1995). Toward genetic engineering of oil palm ( Elaeis guineensis Jacq.) In: JC  Kader  &
P Mazliak (eds.). Plant Lipid Metabolism . Netherlands, Kluwer Academic Publishers. p.570-572.
Kinney A J (1996). Development of genetically engineered soybean oils for food applications. J Food Lipids 3, 273- 292.
Lin S W (2002). Palm oil. In: FD Gunstone (ed.) Vegetable Oils in Food Technology Composition, Properties and Uses. USA, CRC Press  p. 81.
Madon M, I Maizura, R Singh & GKA Parveez (2005) Oil Palm improvement : MPOB’s experience. In: Proc. PIPOC 2005 . Petaling Jaya, 25-29 Sept. 2005.
Singh S, A Green, P Stoutjesdijk & Q Liu (2000). Inverted repeat DNA: a new gene silencing tool for seed lipid modification. Biochem  Soc  Trans 28 , 925-927.
Thelen J J & Ohlrogge (2002). Metabolic engineering of fatty acid biosynthesis in plants. Metabolic Engin 4, 12-21.