## STANDARDIZATION OF GREEN BETEL LEAF EXTRACTS (Piper betle L.) AND ANTIBACTERIAL TEST AGAINST Pseudomonas aeruginosa
STANDARISASI EKSTRAK DAUN SIRIH HIJAU ( Piper betle L.) DAN UJI

## ANTIBAKTERI TERHADAP BAKTERI Pseudomonas aeruginosa
Geraldin Ester Manarisip 1)* , Fatimawali 1) ,  Henki Rotinsulu 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115 *geraldinmanarisip@gmail.com

## ABSTRACT
This  study  aims  to  determine  the  standardization  of  betel  leaf  extracts  and  determine  the concentration of extracts that can inhibit bacteria. In this study, the extraction was carried out by the  maceration  method.  The  specific  parameters  were  identity  of  the  extracts,  organoleptic  test, levels  of  water,  ethanol  soluble  compounds,  and  chemical  content,  meanwhile,  the  non-specific parameters  were  drying  loss,  moisture  content,  and  specific  gravity.  The  results  of  the standardization of specific parameters showed the name of the Green Betel leaf extract (Piper betle L.),  organoleptic  (thick,  dark  green  color,  and  strong  betel  odor),  water-soluble  and  ethanol- soluble extracts content (68.27% and 82%), containing alkaloid compounds, steroids, and tannins. The  results  of  non-specific  parameters  showed  drying  shrinkage  (10.91%),  moisture  content (22.73%), and specific gravity (0.874 g / mL). Antibacterial test against Pseudomonas aeruginosa showed that betel leaf extracts at a concentration of 25%, 20%, and 15% experienced a decrease in Optical Density (OD) values respectively -0.192, -0.065, -0.098 while at concentrations of 10% and 5% had an increase Optical Density (OD) values were 0.512, 0.767, respectively. From the results obtained,  it  was  concluded  that  the  betel  leaf  extracts  (Piper  betle  L.)  fulfilled  specific  and  non- specific parameters and had the ability to inhibit the growth of Pseudomonas aeruginosa bacteria with an MIC value of 15%.
Keywords : Betel leaf (Piper betle L.), Standardization, Antibacterial, Pseudomonas aeruginosa.

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan  standarisasi  ekstrak  daun  sirih  hijau  dan  menentukan konsentrasi  ekstrak  yang  mampu  menghambat  bakteri.  Dalam  penelitian  ini  penyarian  dilakukan dengan metode maserasi. Parameter spesifik yaitu identitas ekstrak, uji organoleptik, kadar senyawa larut  air  dan  larut  etanol,  dan  kandungan  kimia,  sedangkan  parameter  non  spesifik  yaitu  susut pengeringan,  kadar  air,  dan  bobot  jenis.  Hasil  standarisasi  parameter  spesifik  menunjukkan  nama ekstrak etanol Daun Sirih Hijau ( Piper betle L.), organoleptik (kental, warna hijau pekat,  dan bau khas  sirih  yang  tajam),  kadar  sari  larut  air  dan  larut  etanol  masing  masing  (68,27%  dan  82%), dengan kandungan senyawa alkaloid, steroid, tanin. Hasil parameter non spesifik menunjukkan nilai susut  pengeringan  (10,91%),  kadar  air  (22,73%),  dan  bobot  jenis  (0,874  g/mL).  Uji  antibakteri terhadap Pseudomonas  aeruginosa menunjukkan  bahwa  ekstrak  daun  sirih  pada  konsentrasi  25%, 20%,  dan  15%  mengalami  penurunan  nilai Optical  Density (OD)  berturut-turut  -0,192,  -0,065,  - 0,098  sedangkan  pada  konsentrasi  10%  dan  5%  mengalami  kenaikan  nilai Optical  Density (OD) berturut-turut 0,512, 0,767. Dari hasil yang diperoleh disimpulkan bahwa ekstrak daun sirih ( Piper betle L.)  memenuhi  parameter  spesifik  dan  non  spesifik  dan  memiliki  kemampuan  menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa dengan nilai KHM 15%.
Kata kunci : Daun Sirih ( Piper betle L.), Standarisasi, Antibakteri, Pseudomonas aeruginosa .

## PENDAHULUAN
Salah  satu  mikrorganisme  flora  normal rongga  mulut  adalah Pseudomonas  aeruginosa, walaupun  sebagai  flora  normal  rongga  mulut namun pada keadaan tertentu bakteri Pseudomonas  aeruginosa dapat  berubah  menjadi patogen  karena  adanya  faktor  pendukung, misalnya  kebersihan  rongga  mulut  yang  rendah. Bakteri  ini  akan  masuk  ke  dalam  aliran  darah melalui  gigi  yang  berlubang  dan  gusi  yang berdarah atau bakterimia (Brooks et al. , 2005).
Salah  satu  jenis  tanaman  yang  dapat dimanfaatkan  sebagai  tanaman  obat  adalah  daun Sirih (Piper  betle). Daun  sirih  ( Piper  betle) banyak  digunakan  sebagai  bahan  obat  alternatif untuk  mengobati  berbagai  jenis  penyakit  seperti obat  pembersih  mata,  menghilangkan  bau  badan, mimisan,  sariawan,  pendarahan  gusi,  batuk, bronchitis ,  keputihan  dan  obat  kulit  sebagai perawatan  untuk  kecantikan  atau  kehalusan  kulit. (Bustanussalam dkk., 2015).
Peningkatan  kualitas  bahan  baku  obat dapat  dilakukan  dengan  usaha  budidaya  dan standarisasi  terhadap  bahan  baku  tersebut,  baik yang  berupa  simplisia  atau  berbentuk  ekstrak. Standarisasi adalah serangkaian parameter, prosedur,  dan  cara  pengukuran  yang  hasilnya merupakan  unsur-unsur  terkait  seperti  paradigma mutu  yang  memenuhi  standar  dan  jaminan stabilitas obat (Hariyati, 2005).
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan oleh  Najib,  dkk  (2016),  standarisasi  ekstrak tanaman obat baik secara spesifik dan non spesifik menunjukkan tanaman yang distandarisasi memenuhi  standar  mutu  bahan  baku.  Kandungan senyawa aktif dan mutu ekstrak dari tanaman obat tidak  dapat  dijamin  akan  selalu  berada  dalam jumlah yang konstan karena adanya variabel bibit, tempat  tumbuh,  iklim,  kondisi  (umur  dan  cara) panen,  serta  proses  pasca  panen  dan  preparasi akhir. Proses standarisasi ekstrak sangat diperlukan  untuk  menghasilkan  ekstrak  yang berkualitas  baik  sebelum  diproduksi  dalam  skala industri.
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan oleh  Sutasmi  dan  Natsir  (2014), Pseudomonas aeruginosa ditemukan  sekitar  5,55%  pada periodontitis  apikalis  kronis.  Bakteri  ini  juga merupakan  penyebab  utama  terjadinya  infeksi nosokomial.
Pada  penelitian  Suliantri  (2008),  ekstrak daun  sirih  hijau  yang  diperoleh  dengan  pelarut etanol  mempunyai  aktivitas  antibakteri  terhadap
beberapa  bakteri  Gram  positif  dan  Gram  negatif yang salah satunya adalah Pseudomonas aeruginosa .  Selain  itu,  pada  penelitian  Tohari (2016), menunjukan ekstrak daun sirih hijau yang diperoleh  dari  daerah  Kabupaten  Jombang,  Jawa Timur  dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri Pseudomonas  aeruginosa pada  konsentrasi  10% dan 15%.
Berdasarkan  uraian  tersebut,  peneliti tertarik  untuk  melakukan  standarisasi  ekstrak etanol  daun  sirih  hijau  ( Piper  betle L.)  dan  uji antibakteri terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa untuk  mengetahui  apakah  ekstrak yang digunakan memenuhi parameter standarisasi dan  memiliki  kemampuan  menghambat  bakteri Pseudomonas aeruginosa.

## METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan November  2019  -  Maret  2020  di  Laboratorium Farmasi Lanjut Program Studi Farmasi,
Universitas Sam Ratulangi.

## Alat dan Bahan Alat
Alat  yang  digunakan  adalah  alat-alat gelas,  neraca  analitik,  rak  tabung  reaksi,  oven, batang  pengaduk,  alumunium  foil,  timbangan digital,  autoklaf,  gelas  ukur,    kertas  saring, hotplate  magnetic  stirrer ,  beker  gelas,  lemari pendingin,  jarum  ose, laminar  air  flaw ,  rotary evaporator,  Spektrofotometri  UV-Vis,  blender, mikropipet, cawan petri, kertas label dan spritus.

## Bahan
Bahan  yang  akan  digunakan  adalah  daun sirih  hijau  yang  diambil  dari  Kabupaten Minahasa,  bakteri Pseudomonas  aeruginosa , etanol 96%, media Nutrient Agar, Nutrient Broth, aquades,  bubuk  magnesium,  larutan  Besi  (III) klorida,  etil  asetat,  kloroform,  H 2 SO 4 ,  pereaksi Mayer,  pereaksi  Wagner,  pereaksi  Dragendorff, asam  asetat  glasial,  HCl,  DMSO,  dan  antibiotik Cyprofloxacin.

## Prosedur Penelitian Penyiapan dan Pembuatan Simplisia
Daun sirih hijau sebanyak 6 kg yang telah diambil  dari  perumahan  warga  yang  ada  di  Desa Tempang,  Kabupaten  Minahasa  kemudian  dicuci dengan  air  mengalir  sampai  bersih.  Selanjutnya daun  sirih  dikeringkan  dengan  cara  diangin-
anginkan  dan  dilanjutkan  dengan  dioven  pada suhu  40 o C.  Setelah  daun  sirih  benar-benar  kering lalu  ditimbang  dan  dihancurkan  menggunakan blender  hingga  menjadi  serbuk  kemudian  diayak, dan disimpan dalam wadah tertutup.

## Sterilisasi Alat
Sebelum  alat  digunakan  harus  dilakukan sterilisasi  dengan  cara  dibungkus  menggunakan aluminium  foil  kemudian  dimasukkan  ke  dalam autoklaf  dan  disterilisasi  selama  15  menit  waktu tersebut  dihitung  setelah  suhu  mencapai  121 o C (Kapondo, 2020).

## Pembuatan Ekstrak
Simplisia  daun  sirih  sebanyak  300  gr ditimbang,  kemudian  dimasukan  ke  dalam  toples dan  ditambahkan  1500  ml  pelarut  etanol  96  %. Kemudian  biarkan  cairan  penyari  merendam serbuk  simplisia  selama  5  hari  sesekali  dilakukan pengadukan. Setelah 5 hari disaring menggunakan kertas  saring,  dihasilkan  filtrat  1  dan  residu  1. Residu  1  yang  ada  kemudian  direndam  lagi (remaserasi)  dengan  pelarut  yang  sama  selama  3 hari sambil sesekali diaduk. Setelah 3 hari, sampel disaring  sehingga  menghasilkan  filtrat  2  dan residu  2.  Filtrat  1  dan  filtrat  2  dicampurkan menjadi satu lalu diuapkan didalam oven sehingga diperoleh ekstrak kental lalu di timbang.

## Penetapan Parameter Spesifik

## a. Parameter Identitas Ekstrak
Parameter  identitas  ekstrak  dilakukan dengan  tujuan  memberikan  identitas  objektif  dari nama  tumbuhan.  Deskripsi  tata  nama  mencakup nama  ekstrak,  nama  latin  tumbuhan,  bagian tumbuhan  yang  digunakan  serta  nama  Indonesia tumbuhan (Depkes RI, 2000).
b. Uji Organoleptik
Uji  organoleptik  merupakan  pengenalan awal  yang  sederhana  seobjektif  mungkin.  Uji organoleptik dilakukan dengan pengamatan terhadap bentuk, warna, bau, dan rasa (Depkes RI, 2000).
c. Uji Senyawa yang Larut Dalam Air
Ekstrak  sebanyak  5  gram  dimaserasi selama  24  jam  dengan  100  ml  air-kloroform menggunakan  labu  bersumbat  sambil  dikocok selama  6  jam  pertama  dan  kemudian  dibiarkan selama  18  jam,  kemudian  disaring.  Lapisan kloroform dan air dipisahkan. Uapkan 20 ml filtrat lapisan  air  hingga  kering  dalam  cawan  dangkal berdasar rata yang telah ditara. Residu dipanaskan pada  suhu  105  ºC  hingga  bobot  tetap.  Hitung
kadar dalam persen senyawa yang larut dalam  air terhadap berat ekstrak awal (Depkes RI, 2000).
d. Kadar  Senyawa  yang  Larut  Dalam Etanol
Ekstrak  sebanyak  5  gram  dimaserasi selama  24  jam  dengan  100  ml  etanol  (95%) menggunakan  labu  bersumbat  sambil  berkali-kali dikocok  selama  6  jam  pertama  dan  kemudian dibiarkan  selama  18  jam.  Disaring  cepat  dengan menghindari penguapan etanol, kemudian diuapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan penguap yang telah ditera, residu dipanaskan pada suhu  105ºC  hingga  bobot  tetap.  Dihitung  kadar dalam  persen  senyawa  yang  larut  dalam  etanol terhadap berat ekstrak awal (Depkes RI, 2000).

## Uji Kandungan Kimia Ekstrak Prosedur Uji Fitokimia
a. Uji Alkaloid Sampel sebanyak 4 gram diambil kemudian  ditambahkan  kloroform  secukupnya, selanjutnya ditambah 10 mL amoniak dan 10 mL kloroform.  Kemudian  larutan  disaring  ke  dalam tabung  reaksi  dan  filtrat  ditambahkan  10  tetes H 2 SO 4 2N.  Campuran  dikocok  dengan  teratur, dibiarkan  beberapa  menit  sampai  terbentuk  dua lapisan.  Lapisan  atas  dipindahkan  ke  dalam  tiga tabung  reaksi  masing-masing  sebanyak  1  mL. Kemudian masing-masing tabung tersebut ditambahkan  beberapa  tetes  pereaksi  Mayer, Wagner  dan  Dragendorff.  Apabila  terbentuk endapan  menunjukkan  bahwa  sampel  tersebut mengandung  alkaloid,  dengan  pereaksi  Mayer membentuk  endapan  putih,  dengan  pereaksi Wagner  membentuk  endapan  warna  coklat  dan pereaksi  Dragendorff  membentuk  endapan  warna jingga (Kala’Rante, 2020).
b. Uji Triterpenoid dan Steroid
Sampel  sebanyak  50-100  mg  diambil kemudian ditambahkan asam asetat glasial sampai semua  sampel  terendam,  dibiarkan  selama  15 menit  kemudian  6  tetes  larutan  dipindahkan  ke dalam  tabung  reaksi  dan  ditambahkan  2-3  tetes asam sulfat pekat. Adanya triterpenoid ditunjukkan  dengan  terjadinya  warna  merah, jingga atau ungu, sedangkan streroida ditunjukkan dengan  terbentuknya  warna  biru  (Kala’Rante, 2020).
c. Uji Tanin
Sampel  sebanyak  20  mg  ditimbang kemudian  ditambahkan  etanol  sampai  terendam semuanya.  Kemudian  ditambahkan  2-3  tetes larutan  FeCl 3 1%.  Hasil  positif  ditunjukkan
dengan  terbentuknya  warna  hitam  kebiruan  atau kehijauan (Kala’Rante, 2020).
d. Uji Flavonoid
Sampel  sebanyak  200  mg  ditimbang kemudian  diekstrak  dengan  5  mL  etanol  dan dipanaskan  selama  lima  menit  di  dalam  tabung reaksi.  Selanjutnya  ditambah  beberapa  tetes  HCl pekat.  Kemudian  ditambahkan  0,2  g  bubuk  Mg. Hasil positif ditunjukkan dengan timbulnya warna merah tua selama tiga menit (Kala’Rante, 2020).
e. Uji Saponin
Sampel  sebanyak  2  g  diambil  kemudian dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi,  kemudian ditambahkan  aquadest  hingga  seluruh  sampel terendam,  dididihkan  selama  2-3  menit,  dan selanjutnya  didinginkan,  kemudian  dikocok  kuat- kuat. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil (Kala’Rante, 2020).
Penetapan Parameter Non Spesifik a. Penetapan susut pengeringan
Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1 g sampai 2 g dan dimasukan ke dalam botol  timbang  dangkal  tertutup  yang  sebelumnya telah  dipanaskan  pada  suhu  105ºC  selama  30 menit  dan  telah  ditara.  Sebelum  ditimbang, ekstrak  diratakan  dalam  botol  timbang,  dengan menggoyangkan  botol  hingga  merupakan  lapisan setebal  kurang  5  mm  sampai  10  mm,  kemudian dimasukan  ke  dalam  ruang  pengering.  Dibuka tutupnya, keringkan pada suhu 105ºC hingga botol tetap.  Sebelum  setiap  pengeringan,  biarkan  botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar. Kemudian keringkan  kembali  pada  suhu  penetapan  hingga bobot tetap (Depkes RI, 2000).

## b. Kadar Air Metode Gravimetri
Lebih kurang 1 gram ekstrak dimasukkan dan  ditimbang  seksama  dalam  wadah  yang  telah ditara.  Keringkan  pada  suhu  105ºC  selama  3-5 jam.  Setelah  itu  didinginkan  dalam  eksikator  dan kemudian ditimbang (Depkes RI, 2000).
c. Bobot jenis
Gunakan  piknometer  bersih,  kering  dan telah  dikalibrasi  dengan  menetapkan  bobot piknometer dan bobot air yang baru didihkan pada suhu  25ºC.  Atur  hingga  suhu  ekstrak  cair  lebih kurang  20ºC,  masukkan  ke  dalam  piknometer. Atur suhu piknometer yang telah diisi hingga suhu 25ºC, buang kelebihan ekstrak cair dan ditimbang. Kurangkan  bobot  piknometer  kosong  dari  bobot piknometer  yang  telah  diisi.  Bobot  jenis  ekstrak
dengan  bobot  air,  dalam  piknometer  pada  suhu 25ºC (Depkes RI, 2000).

## Aktivitas Antibakteri Penyiapan Larutan Uji dan Larutan Kontrol
Ekstrak  kental  daun  sirih  sebanyak  7,5  g ditimbang  dan  dibuat  konsentrasi  ekstrak  daun sirih dengan konsentrasi 5%, 10%, 15%, 20%, dan 25%.  Pembuatan  larutan  ekstrak  diawali  dari pembuatan larutan uji konsentrasi 25% ditimbang 2,5  g,  timbang  2  g  untuk  konsentrasi  20%, ditimbang 1,5 g untuk konsentrasi 15%, ditimbang 1 g untuk konsentrasi 10%, ditimbang 0,5 g untuk konsentrasi  5%.  Dilarutkan  dengan  sedkiti DMSO, kemudian dicukupkan sampai  volume 10 mL.
Untuk kontrol positif, tablet Ciprofloxacin 500  mg  digerus  lalu  dilarutkan  ke  dalam  akuades steril  sebanyak  25  ml  kemudian  dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml dan dicukupkan dengan aquadest  sampai  volumenya  100ml  hingga didapatkan  konsentrasi  5  mg/ml.  Kemudian diambil  1  ml  larutan  stok  ciprofloxacin  5  mg/ml dan ditambahkan akuades steril sehingga mencapai  100  ml  sehingga  didapat  konsentrasi larutan 50 µg/ml.

## Pengujian Antibakteri
Metode  yang  digunakan  pada  pengujian ini  adalah  dengan  metode  dilusi  cair.  Disiapkan dua  puluh  satu  tabung  reaksi  yang  telah disterilkan,  tiga  tabung  larutan  uji  dan  bakteri  uji sebagai  kontrol  negatif,  tiga  tabung  larutan antibiotik  (Ciprofloxacin)  dan  bakteri  uji  sebagai kontrol  positif.  Lima  belas  tabung  lainnya selanjutnya  diisi  dengan  4  ml  medium Nutrient Broth dan  ditambahkan  0,5  ml  larutan  uji  pada tabung reaksi dan di vortex (Kapondo, 2020).
Masing-masing tabung kemudian ditambahkan
0,5 ml suspensi bakteri Pseudomonas  aeruginosa dan  divortex.  Sebelum diinkubasi,  setiap  tabung  diamati  seksama  dan diukur  absorbansinya  pada  spektrofotometri  UV- Vis  dengan  panjang  gelombang  600  nm. Kemudian  seluruh  tabung  diinkubasi  pada  suhu 37 o C  selama  24  jam.  Setelah  inkubasi,  setiap tabung  diamati  seksama  dan  diukur  absorbansi kembali  pada  spektrofotometri  UV-Vis  panjang gelombang  600  nm.  Penentuan  KHM  ditentukan dengan melihat hasil inkubasi dari tabung dengan membandingkan  kekeruhan  sebelum  dan  sesudah inkubasi (Kapondo,2020).

## Pengolahan Data
Data  yang  diperoleh  dari  data  diameter hambat dan variasi konsentrasi pengujian aktivitas antibakteri  di  lakukan  pengolahan  data  dengan menggunakan  model  penyajian  dalam  bentuk tabel, gambar dan analisis secara deskriptif.
Untuk  mengetahui  rata-  rata  absorbansi digunakan Rumus :
Untuk  mengetahui optical  density Konsentrasi  Hambat  Minimum  (KHM)  /
Minimal Inhibitory Concentration (MIC) digunakan Rumus : OD Setelah Diinkubasi– OD Sebelum Diinkubasi
(Kapondo, 2020).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Keuntungan  utama  metode  ekstraksi maserasi  yaitu  prosedur  dan  peralatan  yang digunakan  sederhana,  metode  ekstraksi  tidak dipanaskan  sehingga  bahan  alam  tidak  menjadi terurai.  Ekstraksi  dingin  memunginkan  banyak senyawa terekstraksi, meskipun beberapa senyawa memiliki kelarutan terbatas dalam pelarut ekstraksi  pada  suhu  kamar  (Nurhasnawati.,  dkk, 2017). Proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan  pelarut  Etanol  96%  karena  pelarut ini  menyari  hampir  keseluruhan  kandungan simplisia baik non polar, semi polar maupun polar (Anshori, dkk., 2009). Pelarut ini bersifat selektif, tidak  beracun  dan  bersifat  universal  yang  cocok untuk  mengekstrak  semua  golongan  senyawa metabolit sekunder (Kristanti dan Novi, 2008).
Hasil  pengujian  standarisasi  parameter spesifik  ekstrak  etanol  daun  Sirih  dapat  dilihat pada Tabel 1:
Hasil identifikasi tanaman menunjukkan  bahwa  benar  tanaman  yang digunakan  yaitu  Sirih  Hijau  ( Piper  betle L.). Berdasarkan  dari  hasil  identifikasi  tanaman, Identitas  ekstrak  yang  digunakan  diperoleh  hasil nama  ekstrak  etanol  daun  sirih  ( Piper  betle L) dengan bagian tanaman yang digunakan adalah bagian daun. Parameter identitas ekstrak dilakukan  dengan  tujuan  untuk  memberikan identitas objektif dari nama tumbuhan.
Pengujian  organoleptik  meliputi  warna, bau,  dan  bentuk  menunjukkan  bahwa  ekstrak etanol  daun  Sirih  memiliki  warna  hijau  pekat dengan bau yang khas tanaman sirih, dan berkon-
Tabel 1. Hasil Standarisasi Parameter Spesifik
Daun Sirih No  Pengujian Hasil 1 Identitas Ekstrak Nama latin : Piper betle L.
Nama Indonesia :
Ekstrak Etanol Daun Sirih Hijau Bagian tanaman: Daun 2 Uji Organoleptik Kental, warna hijau pekat, bau khas sirih yang tajam 3 Kadar sari larut air 68, 27% 4 Kadar sari larut etanol 82% 5 Kandungan kimia Alkaloid, Steroid, Tanin
sistensi  kental.  Parameter  organoleptik  ekstrak bertujuan  untuk  memberikan  pengenalan  awal terhadap ekstrak dengan menggunakan pancaindra (Depkes RI., 2000).
Pengujian  senyawa  yang  larut  dalam  air pada ekstrak daun sirih didapati kadar sari larut air sebesar 68,27%, sedangkan untuk kadar sari larut etanol  sebesar  82%. Hasil  penetapan  kadar senyawa  larut  air  dan  kadar  senyawa  larut etanol  ini  bertujuan  sebagai  perkiraan banyaknya kandungan senyawa-senyawa aktif bersifat  polar  (larut  dalam  air)  dan  bersifat polar-nonpolar (larut dalam etanol) (Saifudin, dkk.,  2011). Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan besarnya  kadar  sari  larut  air  sebesar  68,27%  dan kadar  sari  larut  etanol  sebesar  82%.  Hal  ini menunjukkan bahwa kadar senyawa yang terkandung  dalam  ekstrak  terdiri  dari  senyawa polar  dan  non  polar  dengan  perbandingan senyawa polar lebih banyak dibandingkan dengan senyawa  nonpolar  dilihat  dari  besarnya  nilai persen  senyawa  yang  larut  dalam  air  dan  larut dalam etanol.
Uji  kandungan  kimia  bertujuan  untuk memberikan gambaran awal komposisi kandungan kimia pada sampel (Depkes RI, 2000). Hasil uji kandungan kimia terhadap ekstrak etanol daun sirih menunjukkan bahwa ekstrak daun sirih mengandung  senyawa  Alkaloid,  Steroid,  dan Tanin. Alkaloid sebagai antibakteri dapat mengganggu  komponen  penyusun  peptidoglikan pada  sel  bakteri,  sehingga  lapisan  dinding  sel tidak  terbentuk  secara  utuh  dan  menyebabkan kematian  sel  tersebut.  Steroid  dalam  mekanisme
antibakteri berhubungan dengan lipid dan sensitivitas  terhadap  komponen  steroid  yang menyebabkan  kebocoran  pada  liposom.  Tanin memiliki  aktivitas  antibakteri  yang  berhubungan dengan  kemampuannya  untuk  menginaktifkan adhesin  sel  mikroba  sehingga  bakteri  tidak  dapat berikatan dengan reseptor sel inang, menginaktifkan enzim, dan mengganggu transport protein pada lapisan dalam sel (Cowan, 1999).
Hasil  pengujian  standarisasi  parameter non  spesifik  ekstrak  etanol  daun  Sirih  dapat dilihat pada Tabel 2:
Tabel 2. Hasil Standarisasi Parameter Non Spesifik Daun Sirih No Nama Kandungan (%) Standar Acuan (%) 1. Penetapan Susut Pengeringan 10,91 <11,00 2. Pengujian Kadar Air 22,73 10 3. Bobot Jenis 0,874
Susut  pengeringan  dilakukan  dengan tujuan  untuk  memberikan  batasan  maksimal (rentang)  besarnya  senyawa  yang  hilang  pada proses  pengeringan.  Standar  besarnya  nilai  susut pengeringan  suatu  ekstrak  adalah  <  11,00% (Depkes  RI,  2008).Hasil  penentuan  parameter susut  pengeringan  ekstrak  etanol  daun  sirih diperoleh nilai sebesar 10,91%. Massa yang dapat hilang  selama  proses  pemanasan  dapat  meliputi minyak  atsiri,  pelarut  etanol,  dan  air.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  ekstrak  yang  diperoleh memenuhi syarat yaitu tidak lebih besar dari 11%.
Kadar  air  merupakan  parameter  yang digunakan  untuk  menentukan  residu  air  setelah proses pengeringan. Metode yang digunakan pada pengujian  kadar  air  adalah  metode  gravimetri. Prinsipnya  yaitu  dilakukan  penguapan  dengan cara  dipanaskan.  Metode  ini  dipilih  karena Ekstrak  kental  memiliki  kadar  air  antara  5-30% (Voight, 1994). Hasil yang diperoleh untuk kadar air  pada  ekstrak  etanol  daun  sirih  adalah  sebesar 22,73%. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak yang diperoleh belum memenuhi standar yang diperbolehkan yaitu tidak melebihi 10% (Farmakope  Herbal  Indonesia,  2008).  Kadar  air yang terlalu tinggi (>10%) menyebabkan tumbuhnya  mikroba  yang  akan  menurunkan stabilitas  ekstrak  (Saifudin,  dkk.,  2011).  Ekstrak yang  digunakan  merupakan  ekstrak  kental sehingga  kemungkinan  disebabkan  oleh  proses pengeringan  yang  kurang  optimal  (Prasetyo  dan Inoriah,  2013).  Kadar  air  yang  tinggi  juga  dapat
disebabkan  karena  adanya  pelarut  yang  ikut terhitung pada perhitungan kadar air ekstrak.
Penentuan bobot jenis ini bertujuan untuk memberikan  gambaran  kandungan  kimia  yang terlarut  pada  suatu  ekstrak  (Depkes  RI,  2000). Ekstrak  yang  digunakan  adalah  ekstrak  yang sudah  diencerkan  5%  dengan  etanol.  Hasil  yang diperoleh  besarnya  nilai  bobot  jenis  pengenceran ekstrak daun sirih adalah 0,874 g/mL, dibandingkan  dengan  penelitian  yang  dilakukan oleh  (Utami.,  dkk,  2017),  nilai  bobot  jenis  yang diperoleh  dari  pengenceran  ekstrak  daun  leilem adalah  sebesar  1,0479  g/mL.  Bobot  jenis  alkohol adalah  0,81,  artinya  bobot  jenis  alkohol  0,81  kali bobot volume air yang setara (Ansel, 2006). Nilai bobot  jenis  yang  diperoleh  mendekati  nilai  bobot jenis  alkohol  dikarenakan  digunakan  pelarut etanol dalam proses pengenceran. Perbedaan nilai bobot  jenis  dengan  hasil  dari  penelitian  (Utami., dkk,  2017)  dikarenakan  pelarut  yang  digunakan pada  proses  pengenceran  berbeda.  Pengenceran yang dilakukan menggunakan pelarut air.
Pada pengujian aktivitas antibakteri dengan  metode  dilusi  cair  diperoleh  hasil  yang dapat dilihat pada Tabel 3.
Prinsip  metode  dilusi  adalah  senyawa antimikroba diencerkan sehingga diperoleh beberapa  konsentrasi.  Oleh  karena  itu  ekstrak etanol daun sirih dibuat beberapa seri konsentrasi yang  digunakan,  yaitu  5%,  10%,  15%,  20%,  dan 25%  untuk  mengetahui  pada  konsentrasi  berapa ekstrak  daun  sirih  ini  menunjukkan  kemampuan menghambat  pertumbuhan  bakteri.  Metode  dilusi cair  pada  dasarnya  digunakan  untuk  menentukan Kadar  Hambat  Minimum  (KHM)  dan  dilanjutkan penentuan  Kadar  Bunuh  Minimum  (KBM) (Pratiwi, 2008).
Bakteri  uji  yang  digunakan  adalah Pseudomonas aeruginosa yang merupakan bakteri Gram  negatif,  sedangkan  untuk  kontrol  positif yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah Ciprofloxacin. Ciprofloxacin aktif terhadap bakteri  Gram  positif  dan  terutama  aktif  terhadap kuman  Gram  negatif  termasuk Salmonella, Shigella, Campilobakter, Neisseria , dan Pseudomonas (BPOM,  2008).  Pelarut  yang digunakan  adalah  DMSO  10%.  DMSO  memiliki kemampuan  untuk  menembus  membran  sel, namun  pada  penggunaan  DMSO  sebagai  pelarut, konsentrasi  akhir  DMSO  tidak  boleh  melebihi 10%  karena  dapat  menyebabkan  pecahnya membran  sel.  Pelarut  DMSO  10%  merupakan pelarut  organik  dan  tidak  bersifat  bakterisidal (Reynolds,  1996).  Selain  itu  pelarut  ini  dapat
melarutkan hampir semua senyawa polar maupun non polar. Kontrol negatif yang digunakan adalah media nutrien broth . Penentuan KHM pada pengujian antibakteri  ini  dilakukan  menggunakan  metode dilusi  cair.  Keuntungan  penggunaan  metode  ini adalah  penggunaan  media  yang  lebih  efisien. Parameter yang digunakan adalah kekeruhan (ada pertumbuhan  bakteri)  dan  kejernihan  (tidak  ada pertumbuhan  bakteri),  yang  dapat  dilihat  setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu  37 o C.  Namun,  hal  ini  cenderung  bersifat subjektif,  sehingga  digunakan  nilai  absorbansi sebelum  dan  sesudah  inkubasi  untuk  membantu menentukan  ada  atau  tidaknya  pertumbuhan bakteri  dengan  menggunakan  Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 nm.
Sebelum  diinkubasi,  terlebih  dahulu diukur  serapannya  kemudian  diinkubasi  dalam inkubator  selama  24  jam  pada  suhu  37 o C.  Suhu 37 o C  dipilih  untuk  menyesuaikan  dengan  suhu tubuh manusia. Setelah diinkubasi selama 24 jam,
semua tabung kembali diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm dengan Spektrofotometer UV-Vis, kemudian dibandingkan  dengan  nilai  absorbansi  sebelum inkubasi. Hasil
penelitian menggunakan Spektrofotometer UV-Vis melalui nilai absorbansi menunjukkan bahwa pada konsentrasi 15%, 20%, dan  25%  terjadi  penghambatan  pertumbuhan bakteri ditandai dengan penurunan nilai absorbansi  setelah  inkubasi.  Namun,  pada konsentrasi  yang  lebih  kecil,  yaitu  5%  dan  10% terjadi  kenaikan  nilai  absorbansi  seperti  yang ditunjukkan  dalam  Tabel  3.  Hal  ini  dikarenakan pada  konsentrasi  ini  ekstrak  daun  sirih  tidak  lagi mampu  menghambat  dan  membunuh  bakteri. Tingginya  nilai  absorbansi  yang  diperoleh disebabkan karena selain kekeruhan yang dihasilkan  oleh  bakteri  yang  ditambahkan  juga dipengaruhi oleh banyaknya larutan uji yang di-
Tabel 3. Hasil Pengukuran Daya Hambat dengan Metode Dilusi
Konsentrasi
(mg/mL) Nilai Rata-Rata OD KHM Ket. Sebelum inkubasi Sesudah inkubasi ΔOD 25% 2,257 2,065 -0,192 Turun 20% 2,116 2,051 -0,065 Turun 15% 2,978 2,879 -0,098 Turun 10% 1,426 1,928 0,512 Naik 5% 0,810 1,577 0,767 Naik K(+) 0,073 0,325 0,252 Naik K(-) 0,065 0,621 0,554 Naik
Ket: “Naik”  menunjukkan nilai absorbansi setelah inkubasi > nilai absorbansi sebelum inkubasi,  yang berarti bahwa terdapat pertumbuhan bakteri; sedangkan “Tetap” atau “Turun” menunjukkan nilai absorbansi setelah inkubasi ≤ nilai absorbasi  sebelum  inkubasi,  yang  berarti  bahwa  pertumbuhan  bakteri  terhambat. OD= Optical  Density tambahkan. Keuntungan utama metode spektrofotometri  adalah  bahwa  metode  ini memberikan  cara  sederhana  untuk  menetapkan kuantitas  zat  yang  sangat  kecil.  Selain  itu,  hasil yang  diperoleh  cukup akurat,  dimana  angka  yang terbaca langsung dicatat oleh detektor dan tercetak dalam  bentuk  angka  digital  ataupun  grafik  yang sudah  diregresikan  (Yahya,  2013).  Kekurangan metode  dilusi  dengan  spektrofotometri  UV-Vis dalam  selektivitas  untuk  membedakan  sampel dengan  partikel-partikel  lain  yang  menyerap cahaya  dalam  panjang  gelombang  yang  sama,
untuk  itu  konsentrasi  sampel  berpengaruh terhadap  serapan  densitas  optik  ( Optical  Density ) atau  tingkat  kekeruhannya  sehingga  semakin tinggi konsentrasi serapannya juga tinggi (Geisler, 2015).
Pada kontrol negatif terjadi kenaikan nilai absorbansi yang menunjukkan bahwa media yang digunakan  tidak  menghambat  bakteri,  sedangkan pada  kontrol  positif  juga  terjadi  kenaikan  nilai absorbansi,  hal  ini  dapat  disebabkan  karena pengenceran yang dilakukan menyebabkan Ciprofloxacin  menjadi  tidak  stabil  dan  terjadi
penurunan  efektivitas.  Hal  ini  dapat  berkaitan dengan  proses  disolusi  yaitu  proses  larutnya molekul  obat  dari  bentuk  padat  ke  dalam  suatu larutan  medium  (Abdou,  1989).  Perbandingan banyaknya pelarut yang digunakan untuk melarutkan  obat  dan  lamanya  penyimpanan menyebabkan  terjadinya  penurunan  kestabilan obat.

## KESIMPULAN
Ekstrak  daun  sirih  ( Piper  betle L.)  yang diperoleh  dari  Desa  Tempang,  Kabupaten Minahasa,  memenuhi  semua  parameter  spesifik dan  non  spesifik  kecuali  kadar  air  sehingga memenuhi standar suatu obat.
Ekstrak  daun  sirih  ( Piper  betle L.) memiliki  kemampuan  menghambat  pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa ditandai dengan terjadinya  penurunan  nilai Optical  Density (OD) pada konsentrasi 15%, 20%, dan 25% dan terjadi kenaikan  nilai Optical  Density (OD)  pada konsentrasi 5% dan 10%, sehingga diperoleh nilai KHM pada konsentrasi 15%.

## SARAN
Untuk  penelitian  selanjutnya  disarankan untuk  melakukan  formulasi  suatu  obat  dengan bahan aktif ekstrak daun sirih ( Piper betle L.) dan menguji aktivitasnya sebagai suatu obat, menggunakan  bagian  lain  dari  tanaman  sirih untuk  dilakukan  standarisasi,  pembuatan  larutan uji  dilakukan  dengan  menggunakan  larutan  stok, dan menggunakan pelarut lain serta kontrol positif yang sesuai pada uji aktivitas antibakteri.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdou,  H.  M.  1989. Dissolation,  Bioavaibility and  Bioequivalence .  Mack  Publishing Company,  Ezzton-Pennsylvania,  hlm  56, 151-153
Ansel,  H.C.,  dan  Prince,  S.J.  2006. Kalkulasi Farmasetik . Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC Anshori,  M  dan  Iswanti,  S.  2009. Buku  Ajar: Metodologi Penelitian Kuantitatif . Surabaya: Airlangga University Press BPOM  RI.  2000. Parameter  Standar  Umum Ekstrak Tumbuhan Obat .
Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
BPOM  RI.  2008. Informatorium  Obat  Nasional Indonesia .  Jakarta  :  Badan  Pengawas  Obat dan Makanan Republik Indonesia
Brooks, G. .F., Carroll, K. C., Butel, J. S., Morse, S.  A.,  dan  Mietzner,  T.  A.  2005. Mikrobiologi  Kedokteran  Jawets,  Melnick &  Adelberg’s  Edisi  XXII ,  diterjemahkan oleh  Mudihardi,  E.  Jakarta:  Penerbit Salemba Medika
Bustanussalam,  Apriasi,  D.,  Suhardi,  E.,  dan Jaenudin,  D.  2015.  Efektivitas  Antibakteri Ekstrak  Daun  Sirih  ( Piper  betle Linn) terhadap Staphylococcus  aureus ATCC 25923. Fitofarmaka . 5 (2) : 58-64.
Cowan, M.M. 1999. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology Reviews. 12:564-582
Depkes  RI.  2008. Farmakope  Herbal  Indonesia .
Jakarta:  Departemen  Kesehatan  Republik Indonesia
Geisler  J,  Thompson  T.  Choosing  the  best detection method: Absorbance vs. Flourescence. Biocompare, 2015. Available from:  https://www.biocompare.com/Bench- Tips/173963-Choosing-the-Best-Detection- Method-Absorbance-vs-Fluorescence/
Hariyati, S. 2005. Standarisasi Ekstrak Tumbuhan Obat  Indonesia,  Salah  Satu  Tahapan Penting  dalam  Pengembangan  Obat  Asli Indonesia. InfoPOM . 6 (4) : 1-5
Kala’Rante.,  T.R,  Simbala.,  H.E.I,  Mansauda.,
K.L.R.  2020.  Skrining  Fitokomia  dan Potensi  Antioksidan  Dari  Ekstrak  Daun Tumbuhan  Ekor  Tikus  ( Stachytarpheta jamaicensis L.)  dengan  Metode  1.1 Diphenyl-2-Picrylhydracyl  (Dpph). Jurnal MIPA . 9 (2): 91-96
Kapondo.,  G.L,  Fatimawali,  Jayanti.,  M.  2020. Isolasi,  Identifikasi  Senyawa  Alkaloid  Dan Uji Efektivitas Penghambatan Dari Ekstrak Daun  Sirih  ( Piper  betle L.)  Terhadap Bakteri
Staphylococcus epidermidis . eBiomedik . 8 (1): 172-178
Kristanti.,  Novi,  A.  2008. Buku  Ajar  Fitokimia . Surabaya: Universitas Airlangga Press
Najib,  A.,  Malik,  A.,  Ahmad,  A.,  Handayani,  V., Syarif,  R.,  Waris,  R.  2016.  Standarisasi Ekstrak  Air  Daun  Jati  Belanda  dan  Teh Hijau. Jurnal Fitofarmaka Indonesia . 4 (2): 241-243
Nurhasnawati,  H.,  Sukarmi,  Handayani,  F.  2017.
Perbandingan  Metode  Ekstraksi  Maserasi dan Sokletasi terhadap Aktivitas Antioksidan  Ekstrak  Etanol  Daun  Jambu
Bol  ( Syzygium  malaccense L.).  Jurnal Kimia Manuntung. 3 (1) : 91-95
Prasetyo,  MS,  Inoriah,  E.  2013. Pengelolaan Budidaya  Tanaman  Obat-Obatan  (Bahan Simplisia). Bengkulu:  Badan  Penelitian Fakultas UNIB
Pratiwi,  S.,  T.  2008 .  Mikrobiologi  Farmasi . Penerbit Erlangga:Jakarta
Reynolds,  J.E.F.  1996. Martindale,  The  Extra Pharmacopeia  31 th Edition .  London:  The Royal Pharmaceutical Society Press
Saifudin, A., Rahayu., Teruna. 2011. Standarisasi Bahan Obat Alam . Yogyakarta: Graha Ilmu
Suliantri. 2008. Aktivitas antibakteri ekstrak sirih hijau  ( Piper  betle L)  terhadap  bakteri patogen  pangan. Jurnal teknol  dan industri pangan . Vol 1 (1)
Sutasmi, Nurhayati, N,. 2014. Identifikasi Bakteri pada  Saluran  Akar  Gigi  Dengan  Diagnosis Periodontitis Apikalis Kronis . Jurnal
Dentofasial . 13 (3) : 183-184
Tohari,  C.  2016.  Gambaran  Uji  Daya  Hambat Ekstrak  Daun  Sirih  Hijau  ( Piper  betle L) terhadap Bakteri Pseudomonas aeruginosa. Artikel Ilmiah .
Utami,  Y.P,  Umar,  A.H,  Syahruni,  R.,  dan
Kadulla, I. 2017. Standarisasi Simplisia dan Ekstrak Etanol Daun Leilem (Clerodendrum  minahassae  Teisjm.  & Binn.). Journal  of  Pharmaceutical  and
Medicinal Sciences . 2 (1) :32-39
Voight,  R.  1994. Buku  Pengantar  Teknologi Farmasi ,  572-574,  diterjemahkan  oleh
Soedani, N., Edisi V. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada Press
Yahya,  S.  2013. Spektrofotometri  UV-Vis. Jakarta: Erlangga