## ANALISIS PERTUMBUHAN DAN KANDUNGAN TOTAL FLAVONOID KULTUR
KALUS KRISAN ( Chrysanthemum morifolium Ramat) DENGAN PEMBERIAN ASAM 2,4-DIKLOROFENOKSIASETAT (2,4-D) DAN AIR KELAPA
Tia Setiawati 1* , Anggita Levi Astuti 2 , Mohamad Nurzaman 3 , Nining Ratningsih 4 1,2,3,4 Departemen Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Padjadjaran
* Corresponding author: tia@unpad.ac.id

## Abstract
Chrysanthemum  morifolium  contains  flavonoids  which  have  antioxidant  properties  and  was  useful  in  treating various  diseases.  The  production  of  flavonoids  from  plants  can  be  done  in  vitro  through  callus  culture.  Auxin 2,4-D  growth  regulators  and  organic  compounds  such  as  coconut  water  added  to  the  media  can  affect  the success of callus formation and secondary metabolite synthesis. The purpose of this study was to obtain the best treatment of 2,4-D concentration and coconut water that can increase the growth and total flavonoid levels of C. morifolium  callus  cultures.  The  method  used  in  this  research  was  the  experimental  method  completely randomized design (CRD) with 8 treatments, namely 1 ppm 2,4-D + 10% coconut water (CW); 2 ppm 2,4-D + 10% CW; 3 ppm 2,4-D + 10% CW ; 4 ppm 2,4-D + 10% CW; 1 ppm 2,4-D; 2 ppm 2,4-D; 3 ppm 2,4-D; 4 ppm 2,4-D  in  4  replication.  The  results  showed  that  the  treatment  of  4  ppm  2,4-D  and  10%  CW  was  the  best treatment combination, resulting in an average callus size (1.4 cm),  fresh weight (0.19 grams), dry weight (0.16 gram) and total flavonoid content (1.873 mgQE/g).
Keywords : Zanthoxylum acanthopodium, essential oil, anti-microbial.

## PENDAHULUAN
Chrysanthemum morfolium atau yang biasa  dikenal  dengan  krisan  merupakan tanaman  hias  yang  banyak  dibudidayakan masyarakat karena bernilai ekonomi tinggi (Mufarrikha et  al., 2014).  Tanaman  krisan digunakan  pula  sebagai  obat  herbal  atau obat tradisional  yang terkenal di Tiongkok dan Thailand karena mengandung beberapa  senyawa  aktif  salah  satunya flavonoid  (Jung,  2009;  Kalia et  al. ,  2016).
Krisan mengandung 12 jenis flavonoid dan
58  senyawa  volatil  seperti  quercetin-3- galactoside, luteolin-7-glucoside, quercetin-3-glucoside, quercitrin, quercetin, myricetin, luteolin, apigenin dan
kaempferol (Sun et al., 2010).
Flavonoid  merupakan  salah  satu senyawa  antioksidan  alami  yang  berasal dari suatu  tanaman dan  menjadi  salah satu pusat perhatian penelitian karena peranannya  yang  bersifat  obat  dalam pencegahan kanker dan penyakit kardiovaskular, anti inflamasi, antihistamin, meningkatkan  efektivitas  vitamin  C,  dan mencegah  keropos  tulang  (Bharati et  al. , 2014;  Prakash et  al., 2014).  Zhong  (2001) menjelaskan  bahwa  secara  umum  masalah dalam  produksi  senyawa  aktif  metabolit sekunder  dari  suatu  tanaman  adalah dibutuhkannya upaya alternatif yang efektif.
Metode  alternatif  dalam  produksi senyawa aktif flavonoid dari suatu tanaman dapat  dilakukan  secara in  vitro melalui
Tia Setiawati et al. : Analisis Pertumbuhan dan Kandungan Total Flavonoid Kultur Kalus Krisan ( Chrysanthemum Morifolium Ramat) dengan Pemberian Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan Air Kelapa
kultur kalus. Kelebihan kultur kalus dalam produksi  metabolit  sekunder  dibandingkan dengan tanaman utuh adalah tidak memerlukan lahan yang luas, tidak adanya keterbatasan  iklim  serta  senyawa  aktif yang  diperoleh  bersifat  kontinyu  dalam keadaan terkontrol (Razavi et al., 2016).
Beberapa penelitian telah
membuktikan  bahwa  kultur  kalus  dapat meningkatkan produksi metabolit sekunder seperti saponin pada tanaman ginseng jawa ( Talinum  paniculatum )  (Wardani et  al.,
2004),  tannin  pada  tanaman  jati  belanda
( Guazuma ulmifolia ) (Syahid dan Hernani,
2010),  alkaloid,  flavonoid,  tanin,  saponin, steroid  dan  etil  para-metoksisinamat  pada tanaman  kencur  ( Kaemferia  galanga )
(Shofiyani & Damayanti, 2017)
Lestari  (2011)  menyatakan  bahwa induksi  kalus  sangat  dipengaruhi  oleh  zat pengatur  tumbuh  (ZPT)  auksin.  Auksin 2,4-D  dapat  merangsang  pembentukan kalus  karena  aktivitasnya  yang  kuat  untuk memacu proses diferensiasi sel,
organogenesis  dan  menjaga  pertumbuhan kalus  (Rivai  &  Helmanto,  2015).  Dalam induksi  kalus,  selain  ZPT  auksin  sering diperlukan  penambahan  sitokinin  (Syahid
& Hernani, 2010). Seiring dengan
kemajuan  pengetahuan  dan  teknologi tentang  biokimia,  saat  ini  telah  ditemukan beberapa  senyawa  yang  memiliki  fungsi fisiologis serupa dengan hormon tumbuhan (Yong et al., 2009), termasuk sitokinin.
Sumber  sitokinin  alami  yang  banyak digunakan dalam kultur jaringan adalah air kelapa.  Penggunaan  air  kelapa  sebagai bahan  organik  merupakan  salah  satu  cara yang efektif untuk menggantikan penggunaan  ZPT  sintesis  (Tuhuteru et  al.,
2012).  Selain  itu,  air  kelapa  memiliki kandungan  unsur  hara  makro  seperti nitrogen (N), kalium (K), magnesium (Mg), sulfur  (S)  dan  unsur  mikro  seperti  (Fe), mangan  (Mn),  seng  (Zn),  tembaga  (Cu) hingga  sumber  karbon  seperti  sukrosa, glukosa  dan  fruktosa  untuk  mendukung pertumbuhan  kalus  (Kristina  &  Syahid,
2012).  Penambahan  ZPT  2,4-D  yang dikombinasikan dengan  air kelapa terbukti dapat  meningkatkan  pertumbuhan  kalus seperti  pada  tanaman  anggur  hijau  ( Vitis vinifera L.)  (Dwi et  al., 2012),  brotowali
( Tinospora  crispa L.)  (Sukmawati et  al.,
2018).
Secara  umum  pertumbuhan  kalus yang  baik  akan  menghasilkan  kadar metabolit  sekunder  yang  tinggi  pula (Syahid  &  Hernani,  2010).  Isah et  al .
(2018)  bahwa  ketika  pertumbuhan  dan produktivitas pada suatu tanaman meningkat,  maka  akan  meningkatkan  pula produksi  metabolit  sekundernya.  Dengan
demikian dalam penelitian ini, penambahan  2,4-D  dan  air  kelapa  dalam media  induksi  kalus  krisan  diharapkan dapat  meningkatkan  pertumbuhan  kalus yang  diikuti  dengan  peningkatan  kadar
flavonoidnya.  Penelitian  diharapkan  dapat memberikan  informasi  mengenai  aplikasi kultur  kalus  dengan  penambahan  2,4-D dan  air  kelapa  sebagai  upaya  alternatif dalam  meningkatkan  produksi  metabolit sekunder  khususnya  kadar  flavonoid  total secara efektif.

## METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian  ini  adalah  air  kelapa  muda, akuades,  AlCl 3 10%,  alkohol  70%,  bubuk agar  (pemadat  media),  CH 3 COOK  1  M,
daun  planlet C.  morifolium Ramat.  Var.
Pasopati yang diperoleh dari Balai
Pengembangan Benih dan Hortikultura dan Aneka Tanaman Pasir Banteng Sumedang, detergen cair, etanol 80%, etanol 95%, HCl
1  N,  media Murashige  &  Skoog (MS),
NaOH  1  N,  standar  kuersetin,  sukrosa (gula),  dan  ZPT  2,4-Diklorofenoksiasetat
[Sigma].

## Rancangan Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 8 perlakuan  yaitu  1  ppm  2,4-D  +  10%  air kelapa  (AK);  2  ppm  2,4-D  +  10%  AK;  3 ppm  2,4-D  +  10%  AK;  4  ppm  2,4-D  + 10%  AK;  1  ppm  2,4-D;  2  ppm  2,4-D;  3 ppm 2,4-D; 4 ppm 2,4-D. Setiap perlakuan dilakukan  sebanyak  4  kali  pengulangan. Parameter  yang  diamati  adalah  waktu
munculnya kalus, warna dan tekstur kalus, ukuran kalus,  berat  basah dan berat  kering kalus,  dan  kadar  flavonoid  total.  Data warna,  tekstur,  dan  waktu  muncul  kalus dianalisis  secara  deskriptif  sedangkan  data ukuran  kalus,  berat  basah  kalus,  berat kering  kalus  dan  kadar  flavonoid  total dianalisis  secara  statistik  menggunakan
Analisis Varians (ANAVA) untuk mengetahui  pengaruh  perlakuan  dan  jika berbeda nyata dilanjutkan dengan Uji Jarak Berganda Duncan untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan.

## Prosedur Penelitian
Sterilisasi ruang tanam dan alat-alat kultur
Alat-alat    kultur  kaca  disterilisasi basah menggunakan autoclave pada tekanan  1  atm  dengan  suhu  121  C  selama
15  menit.  Alat-alat  diseksi  seperti  pinset,
scalpel ,  pisau  dan  gunting  disterilisasi kering  menggunakan  oven  pada  suhu
150  C selama 60 menit. Laminar  Air
Flow  Cabinet (LAFC) disterilkan  terlebih dahulu sebelum digunakan dengan disemprot  alkohol  70%  dan  diratakan menggunakan kapas ke seluruh permukaan yang  selanjutnya  disinari  ultraviolet  (UV) selama satu jam (Tuhuteru et al ., 2012).
Pembuatan media perlakuan dan
penanaman eksplan
Media  perlakuan  dibuat  dengan
menimbang bahan-bahan yang akan digunakan,  seperti  media  MS,  sukrosa (gula), agar (pemadat media) berturut-turut
Tia Setiawati et al. : Analisis Pertumbuhan dan Kandungan Total Flavonoid Kultur Kalus Krisan ( Chrysanthemum Morifolium Ramat) dengan Pemberian Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan Air Kelapa
sebanyak  4,43  gram,  25  gram  dan  9  gram untuk  satu  liter  media.  Penambahan  2,4-D dan air kelapa sesuai kosentrasi  yang telah ditentukan  sebagai perlakuan.  Media dihomogenkan dan keasaman media diatur pada  pH  5,6  –  5,8  lalu  dipanaskan.  Media perlakuan dituangkan ke dalam botol-botol kultur  dan  ditutup  dengan alumunium  foil , kemudian  disterilisasi  dengan  autoklaf pada  suhu  121  C  dengan  tekanan  1  atm selama 30 menit (Tuhuteru et al ., 2012).
Eksplan  berupa  daun  yang  diambil dari  planlet C.  morifolium hasil  subkultur
yang  berumur  45  hari.  Eksplan  daun dipotong  dengan  ukuran  1  cm  x  1  cm, kemudian  ditanam  dalam  media  perlakuan secara  aseptik  dalam  laminar.  Botol  kultur yang  berisi  eksplan  ditutup  plastik  tahan panas  selanjutnya  diinkubasi  pada  suhu 18  C  -  27  C  dan  intensitas  cahaya  2000 lux.
Analisis flavonoid total kalus
Analisis kadar flavonoid total dilakukan  menggunakan  spektrofotometer UV-Vis.  Penyediaan  ekstrak  dilakukan dengan  menimbang  0,05  g  berat  kering kalus  dan  diekstraksi  menggunakan  5  mL etanol  95%  dengan  pengadukan  200  rpm selama  24  jam.  Ekstrak  kalus  disaring kemudian  filtrat  ditambahkan  etanol  80% hingga  25  mL  dan  diinkubasi  selama  30 menit.
Kurva kalibrasi dibuat
menggunakan  larutan  standar  kuersetin
pada  konsentrasi  20,  40,  60,  80  dan  100  g/mL.  Larutan  standar  kuersetin  yang diencerkan diambil 0,5 mL dan dicampurkan  dengan  1,5  mL  etanol  95%,
0,1  mL  AlCl 3 10%,  0,1  mL  CH 3 COOK  1
M  dan  2,8  mL  akuades  secara  terpisah. Nilai  absorbansi  total  flavonoid  diukur pada  panjang  gelombang  415  nm.  Blanko disiapkan  dengan  dipipet  0,5  mL  etanol 95%  dan  masing-masing  2,8  mL  AlCl 3
10%  dan  CH 3 COOK  1  M  (Chang et  al ., 2002).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Warna, tekstur dan waktu muncul kalus
Salah satu indikator adanya pertumbuhan dalam kultur jaringan dengan Teknik in  vitro adalah  munculnya  kalus pada eksplan. Hasil pengamatan menunjukkan  bahwa  kalus  pertama  kali terbentuk pada sayatan eksplan daun krisan yang kontak dengan media tanam. Diawali dengan pembengkakan pada eksplan kemudian  sayatan  eksplan  bergelombang ( swelling ) dan    munculnya    butiran  kecil berwarna  putih  di  sekitar  eksplan  daun yang dilukai ( Gambar 1 ).
Hal ini sesuai dengan yang diungkapkan  oleh  Iwase et  al .  (2011) bahwa  terbentuknya  kalus  diawali  pada bekas luka irisan karena sebagian sel  akan mengalami  proliferasi  pada  permukaan irisan  di  atas  medium  dan  meregenerasi organ baru atau jaringan baru.
Gambar  1. Pembentukan  kalus  pada  eksplan daun krisan ( C. morifolium Ramat) Sumber. Dokumen Penulis.
Kalus  merupakan  massa  sel  yang  tidak tidak  teratur  atau  belum  terorganisasi (amorphous)  dari  sel-sel  jaringan  yang masih membelah diri secara terus menerus.
Kalus  dapat  diproduksi  dari  satu  sel  yang berdiferensiasi  karena  seluruh  sel  kalus bersifat totipotensi (Stobbe et al ., 2002).
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pada media tanam dengan penambahan air kelapa kalus mulai muncul pada  hari  keenam  hingga  kesembilan setelah  tanam  (6-9  HST),  lebih  cepat dibandingkan  dengan  medium  tanpa  air kelapa  yang  baru  muncul  pada  hari  ke-13 hingga  hari  ke-15  setelah  tanam  (13-15 HST).  Pembentukan  kalus  pada  perlakuan dengan penambahan  air  kelapa lebih  cepat dibandingkan  tanpa  air  kelapa  disebabkan jaringan yang dikultur mendapatkan auksin dan  sitokinin  eksogen  yang  cukup  untuk membentuk  kalus  (Rahayu,  2003),  yang berasal  dari  2,4-D  sebagai  sumber  auksin dan  air  kelapa  sebagai  sumber  sitokinin. Air  kelapa  memiliki  kandungan  diphenil
urea  yang  berfungsi  sebagai  sitokinin sehingga mampu mendorong induksi kalus dan  senyawa-senyawa  organik  lainnya dalam air kelapa tersebut membantu dalam perkembangan  dan  pertumbuhan  kalus (Hidayat, 2007).
Kalus yang terbentuk pada perlakuan 2,4-D  tanpa  dan  dengan  penambahan  air kelapa memperlihatkan  perbedaan  warna kalus.  Penyebab  terjadinya  perbedaan warna  pada  setiap  perlakuan  karena perbedaan fase perkembangan kalus
(Rasud dan Bustaman, 2020).  Warna kalus krisan  dengan  penambahan  2,4-D  dan  air kelapa dapat dilihat pada Gambar 2 .
Hasil pengamatan
visual menunjukkan  bahwa  kalus  yang  terbentuk menghasilkan  warna  yang  bervariasi  dari kehijauan,  keputihan  dan  kecokelatan. Warna  kehijauan  pada  kalus  disebabkan adanya pembentukan klorofil (Leupin et al . 2000).  Air  kelapa  yang  mengandung sitokinin merangsang pembentukan klorofil sehingga terjadinya warna kehijauan  pada  kalus  (Sari et  al .  2011).
Warna  putih  pada  kalus  menunjukkan massa  sel-sel  muda  yang  sedang  aktif membelah  (Yelnititis  2012).  Kalus  yang berwarna  putih  juga  merupakan  sel embrionik  yang  memiliki  butir  pati  yang tinggi namun belum mengandung kloroplas  (Ariati et  al., 2012).  Perubahan warna pada kalus diduga sel-sel yang muda terus  aktif  membelah  (putih)  dan  adanya
Tia Setiawati et al. : Analisis Pertumbuhan dan Kandungan Total Flavonoid Kultur Kalus Krisan ( Chrysanthemum Morifolium Ramat) dengan Pemberian Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan Air Kelapa
sintesis zat-zat fenolik (Rasud & Bustaman,
2020)  yang  menyebabkan  kalus  berwarna kecoklatan (browning).
Syammiah (2006), menyatakan bahwa penyebab browning karena senyawa fenol  yang  keluar  dari  eksplan  dan  akan teroksidasi  membentuk  sebuah  larutan yang  berwarna  cokelat  ( quinon )  dan bersifat  toksik  akibat  stress  mekanik  atau pelukaan  pada  eksplan.  Proses  terjadinya browning yaitu  pada  aktivitas  enzim polifenol oksidase dan tyrosinase menghasilkan  orto-diquinon  yang  bereaksi secara spontan dengan protein dan komponen  seluler  lainnya  membentuk pigmen gelap disebut melanin (Tang et al .,
2001)  yang  mengandung  senyawa  fenolik
(Karimi et al ., 2013). Setelah beberapa hari
pelukaan  eksplan  terjadi,  kondisi  oksidatif
muncul  dan  enzim  secara  alami  disintesis untuk  mendorong  sintesis  fenol  sebagai bahan  bentuk  pertahanan  diri  sebuah tanaman (Syabana et al ., 2015).
Penambahan  2,4-D  dan  air  kelapa menghasilkan  variasi  warna  kalus  yang terbentuk,  namun  tidak  terjadi  perubahan pada  tekstur  kalus  yang  dihasilkan.  Pada semua  perlakuan  penambahan  2,4-D  dan air  kelapa  menghasilkan  kalus  bertekstur remah. Kalus remah merupakan kalus yang dapat  tumbuh  secara  terpisah  menjadi beberapa bagian kecil, mudah terputus, dan mengandung  banyak  air  (Sitorus et  al.,
2011). Menurut Yelnititis (2012), pengaruh
ZPT  2,4-D  dengan  berbagai  konsentrasi dapat  mempengaruhi  pembentukan  kalus berwarna  putih  dan  bertekstur  remah ( friable ).
1 ppm 2,4-D + 10% Air Kelapa 2 ppm 2,4-D + 10% Air Kelapa 3 ppm 2,4-D + 10% Air Kelapa 4 ppm 2,4-D + 10% Air Kelapa
1 ppm 2,4-D
2 ppm 2,4-D 3 ppm 2,4-D 4 ppm 2,4-D
Gambar 2. Warna kalus krisan ( C. morifolium Ramat) pada perlakuan penambahan 2,4-D dan air kelapa
Sumber. Dokumen penulis
Air  kelapa  juga  diduga  mempengaruhi warna  dan  tekstur  pada  kalus  karena memiliki kandungan sitokinin alami sehingga  mempengaruhi  hormon  eksogen pada kalus, seperti yang dilaporkan Latifah et  al .  (2017)  bahwa  penambahan  20%
ekstrak air kelapa mempengaruhi pertumbuhan eksplan kalus anggrek menjadi  warna  putih  dan  remah  ( friable ).
Aplikasi  kombinasi  auksin  sintetik  dan sitokinin  alami  pada  konsentrasi  2,4-D yang  tepat  mampu  menghasilkan  kalus dengan struktur remah berwarna putih.
Ukuran,  berat  basah  dan  berat  kering

## kalus
Hasil  ANAVA  menunjukkan  bahwa perlakuan 2,4-D dan air kelapa berpengaruh nyata terhadap ukuran diameter  (ukuran),  berat  basah  dan  berat kering kalus. Hasil yang didapat kemudian diuji  lanjut  dengan  Uji  Jarak  Berganda Duncan  untuk  melihat  perbedaan  antar perlakuan  terhadap  ukuran  diameter  kalus yang  dapat  dilihat  pada Tabel 1 .
Berdasarkan Tabel  1 ,  ditunjukkan  bahwa pada  perlakuan  air  kelapa,  diameter  kalus meningkat  sejalan  dengan  bertambahnya konsentrasi 2,4-D. Kombinasi 4 ppm 2,4-D +  10%  air  kelapa  menghasilkan  diameter kalus  tertinggi  yaitu  1,4  cm  yang  berbeda nyata  dengan  perlakuan  lainnya.  Menurut Hoesen et al. (2008), ZPT alami seperti air kelapa  yang  ditambahkan  ke  dalam  media kultur  berfungsi  mengatur  pertumbuhan dan  perkembangan  eksplan.  Peran  air kelapa  dalam  pembentukan  kalus  adalah untuk  memacu  pembelahan  sel  dan mendorong  proses  morfogenesis  kalus.
Penambahan auksin 2,4-D yang dikombinasikan  dengan  air  kelapa  akan memberikan pengaruh yang saling sinergis dalam pembentukan kalus. Auksin berfungsi dalam proliferasi sel (Huan et al .
2004)  dan  pemanjangan  sel  (Utami et  al .
2007)  dikenal  mampu  berperan  untuk menginduksi,  meningkatkan  pembentukan dan pertumbuhan ukuran kalus  (Rahayu et
al., 2003).
Tabel 1. Rata-rata berat basah dan berat kering kalus krisan ( C. morifolium Ramat) Perlakuan Ukuran Kalus (cm) Berat Basah (gram) Berat Kering (gram) 1 ppm 2,4-D + 10% AK 1,05 b 0,10 bc 0,05 a 2 ppm 2,4-D + 10% AK 1,10 bc 0,12 cd 0,09 b 3 ppm 2,4-D + 10% AK 1,17 c 0,15 de 0,11 c 4 ppm 2,4-D + 10% AK 1,44 d 0,19 e 0,16 d 1 ppm 2,4-D 0,93 a 0,05 a 0,04 a 2 ppm 2,4-D 0,93 a 0,05 a 0,03 a 3 ppm 2,4-D 0,90 a 0,06 a 0,05 a 4 ppm 2,4-D (k 0 d 4 ) 0,96 a 0.07 a 0.06 a
Keterangan:  Angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama  pada  kolom  yang  sama  menunjukkan  tidak  berbeda  nyata menurut Uji Jarak Berganda Duncan taraf 5%
Tia Setiawati et al. : Analisis Pertumbuhan dan Kandungan Total Flavonoid Kultur Kalus Krisan ( Chrysanthemum Morifolium Ramat) dengan Pemberian Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan Air Kelapa
Tabel  1 menunjukkan  pula  bahwa rata-rata  berat  basah  dan  berat  kering tertinggi  terdapat  pada  perlakuan  4  ppm 2,4-D  +  10%  air  kelapa  berturut-turut sebesar  0,19  gram  dan  0,16  gram  yang berbeda  nyata  dengan  perlakuan  lainnya.
Berat basah yang tinggi dengan penambahan  air  kelapa  disebabkan  kalus memiliki  kandungan  air  yang  tinggi  serta kecepatan sel-sel nya dalam membelah diri, memperbanyak  diri  dan  membesarnya kalus sangat efektif (Rahayu et al., 2003).
Peningkatan  berat kering  kalus disebabkan  oleh  meningkatnya  aktivitas metabolisme sel penyusun kalus (Wardani,
2004).  Berat  kering  kalus  tergantung  pada kecepatan  sel-sel  tersebut  membelah  diri, memperbanyak  diri yang  dilanjutkan dengan  pembesaran  sel.  Kecepatan  sel membelah diri dapat dipengaruhi kombinasi  2,4-D  dan  air  kelapa  yang ditambahkan  dalam  media.  Penambahan ZPT  dapat  diduga  dapat  mempengaruhi metabolisme  RNA  yang  berperan  dalam
sintesis  protein  melaui  proses  transkripsi molekul RNA. Peningkatan sintesis protein sebagai  sumber  tenaga  dapat  digunakan untuk pertumbuhan sehingga dapat meningkatkan berat kering kalus (Gunawan et al ., 1992). Pada medium yang digunakan  pada  penelitian  memperoleh cukup  bahan  untuk  membentuk  biomassa berat  kering  disebabkan  air  kelapa  yang mengandung karbohidrat (sukrosa, fruktosa  dan  glukosa)  yang  menyebabkan sel-sel  kalus  aktif  membelah  sehingga kalus  dapat  membentuk  biomassa  lebih banyak selama pertumbuhan

## (Suskendriyati, 2003).
Kadar  flavonoid  total  kultur  kalus krisan
Hasil  ANAVA  menunjukkan  bahwa
2,4-D  dan  air  kelapa  berpengaruh  nyata terhadap  kadar  flavonoid  total.  Hasil  yang didapat  kemudian  diuji  dengan  Uji  Jarak Berganda Duncan untuk melihat perbedaan antar perlakuan yang hasilnya dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Rata-rata kadar flavonoid total kalus krisan ( C. morifolium Ramat) Perlakuan Kadar Total Flavonoid (mgQE/g BK) 1 ppm 2,4-D + 10% AK 0,954 ab 2 ppm 2,4-D + 10% AK 1,332 bc 3 ppm 2,4-D + 10% AK 1,569 cd 4 ppm 2,4-D + 10% AK 1,873 d 1 ppm 2,4-D 0,778 a 2 ppm 2,4-D 0,710 a 3 ppm 2,4-D 0,850 a 4 ppm 2,4-D 0,980 a
Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata menurut Uji Jarak Berganda Duncan taraf 5%
Pada Tabel  2 menunjukkan rata-rata tertinggi  kadar  flavonoid  total  pada  kalus dengan  perlakuan  4  ppm  2,4-D  +  10%  air kelapa  yaitu  sebesar  1,873  mgQE/g  BK sampel  yang  berbeda  nyata  dengan perlakuan  lainnya.  Pertumbuhan  kalus dengan  dosis  auksin  dan  sitokinin  dengan dosis  yang  optimal  baik  endogen  maupun eksogen,  diikuti  oleh  produksi  metabolit sekunder  yang  tinggi  pula  (Indah  dan Ermavitalini,  2013).  Air  kelapa  sebagai sumber  sitokinin  berkontribusi  dalam meningkatkan biosintesis metabolit sekunder. Hal ini dapat terlihat pada Tabel
2 bahwa  kandungan  flavonoid  pada
perlakuan air kelapa lebih tinggi
dibandingkan  tanpa  air  kelapa  pada konsentrasi  2,4-D  yang  sama.  Hal  ini disebabkan air kelapa pada media mengandung sukrosa, fruktosa dan glukosa sehingga nutrisi media memperoleh sumber  energi  untuk  proses  metabolisme dari  gula  yang  ditambahkan  ke  dalam media dan dapat meningkatkan kandungan metabolit  sekunder  (Miyanaga et  al .,
2000).
Orihara et  al .  (2002)  melaporkan bahwa  air  kelapa  dapat  meningkatkan metabolit  sekunder  diterpenoid  kultur
Torreya nucifera . Penelitian lain menunjukkan bahwa peningkatan
biosintesis  senyawa  metabolit  sekunder dengan  2,4-D  yang  dikombinasikan  air kelapa  dilaporkan  terjadi  pula  pada
Tinospora  crispa L.  (Sukmawati et  al.,
2018).
Selain  itu,  kalus  yang  memiliki pertumbuhan  yang  baik  akan  diikuti produksi  metabolit  sekunder  yang  baik pula.  Pertumbuhan  kalus  yang  baik  pada perlakuan  4  ppm  2,4-D  menghasilkan kadar  flavonoid  tertinggi  ( Tabel  1 dan 2 ).
Sesuai  pernyataan  Rahayu et  al. (2003), penambahan  2,4-D  dan  air  kelapa  dalam dosis yang optimal pada media kultur akan merangsang  pembelahan  dan  pembesaran sel  pada  eksplan  sehingga  dapat  memacu pembentukan dan pertumbuhan kalus serta meningkatkan  produksi  senyawa  kimia pada kalus.
Kandungan metabolit sekunder berkorelasi  dengan  berat  kering  jaringan yang  dikultur.  Berdasarkan Tabel  2 , perlakuan  4  ppm  2,4-D  +  10%  air  kelapa menghasilkan berat kering tertinggi.  Berat kering  dapat  menunjukkan  produktivitas tanaman  karena  90%  hasil  metabolit tanaman  terdapat  dalam  bentuk  berat kering (Solichatun et al ., 2005). Akumulasi
metabolit sekunder sejalan dengan
akumulasi  biomassa  berat  kering  pada tanaman. Proses metabolisme pertumbuhan tanaman  yang  tinggi  akan  menghasilkan metabolit  primer  dalam  jumlah  yang berlebih  sehingga  dapat  digunakan  untuk sintesis  metabolit  sekunder  (Jain et  al .,
2012).  Hal  yang  sama  diperoleh  pada kultur  sel  Perilla  (Lu et  al .,  2017), Salvia
Tia Setiawati et al. : Analisis Pertumbuhan dan Kandungan Total Flavonoid Kultur Kalus Krisan ( Chrysanthemum Morifolium Ramat) dengan Pemberian Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan Air Kelapa
santolinifolia (Bosis) (Jan et al ., 2015) dan
Sericostoma pauciflorum (Jain et al ., 2012)
yang memiliki produksi metabolit sekunder  tinggi  karena  memiliki  berat kering yang tinggi juga. Hal ini disebabkan pada  kondisi  medium  yang  memiliki nutrisi optimal, sel-sel kalus dapat menggunakan nutrisi dalam media tersebut untuk  meningkatkan  pertumbuhan  dan pembentukan  metabolit  sekunder  (Pan et al .,  2020),  sehingga  pada  penelitian  ini dapat  diperoleh  biomassa  (berat  kering) yang  besar  serta  diikuti  kadar  flavonoid yang tinggi pula.

## SIMPULAN
Berdasarkan  pembahasan  di  atas, maka simpulan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut.
1. Perlakuan  2,4-D  +  10%  air  kelapa menghasilkan  pembentukan  kalus  lebih cepat  yaitu  pada  hari  ke-6  hingga  ke-9 setelah  tanam  dibandingkan  tanpa  air kelapa  yaitu  pada  hari  ke-13  hingga  ke-15 setelah tanam.
2. Kombinasi  perlakuan  4  ppm  2,4-D
+ 10% air kelapa menghasilkan pertumbuhan  kultur  kalus  krisan  ( C. morifolium Ramat)  terbaik  dengan  ukuran kalus  sebesar  1,4  cm,  berat  basah  kalus sebesar  0,19  gram  dan  berat  kering  kalus sebesar  0,16  gram  serta  kadar  flavonoid total  tertinggi  sebesar  1,873  mgQE/g  BK sampel.

## DAFTAR PUSTAKA
Ariati  SN,  W  Waeniati,  Muslimin,  &  IN Suwastika.  2012.    Induksi  tanaman kakao  pada  medium  MS  dengan penambahan  2,4-D. Jurnal  Natural Science, 1(1): 74-84.
Chang  CC,  MH  Yang,  HM  Wen,  &  JC Chern.  2002.  Estimation  of  total flavanoid  content  in  propolis  by  two complementary  colorimetric  methods. J. Food Drug Anal, 10 (3): 178-182. Dwi  NM,  Waenati,  Muslimin,  &  IN
Suwastika. 2012. Pengaruh penambahan  air  kelapa  dan  berbagai konsentrasi hormon 2,4-D pada medium MS dalam menginduksi kalus tanaman  anggur  hijau  ( Vitis  vinifera L.). Jurnal  Natural  Science. 1(1):  53-
62. Gunawan  LW.  1992.  Teknik  Kultur Jaringan. Laboratorium Kultur Jaringan  Tanaman  PAU  Bioteknologi IPB, Bogor. Hidayat  H.  2007.  Induksi  pertumbuhan eksplan  endosperm  ulin  dengan  IAA dan Kinetin. Agritop, 26(4):147-152. Hoesen DSH, Witjaksono dan LA Sukamto.  2008.  Induksi  kalus  dan organogenesis kultur in vitro Dendrobium  lineale Rofle. Berita Biologi , 9(3): 333-341.
Huan  LVT,  T  Takamura,  &  M  Tanaka. 2004.  Callus  formation  and  plant regeneration  from  callus  through somatic embryo structures in Cymbidium orchid. Plant  Science , 166(6): 1443-1449.
Indah PN & D Ermavitalini. 2013. Induksi
Kalus Daun Nyamplung ( Calophyllum inophylum Linn.)  pada  Beberapa Kombinasi Konsentrasi 6- Benzylaminopurine  (BAP)  dan  2,4- Dichlorophenoxyacetic  acid  (2,4-D).
Jurnal  Sains  dan  Seni  POMITS ,  2(1):
2337-352
Isah T, S Umar, M Mujib, MP Sharma, PE Rajasekharan,  N  Zafar,  &  A  Frukh. 2018. Secondary metabolism of pharmaceuticals  in  the  plant  in  vitro cultures:  strategies,  approaches  and
limitations to achieving higher yield. J. Plant Cell Tiss Organ Cult, 132: 239- 265.
Iwase A, M Ohme-Takagi, & K Sugimoto.
2011.  WIND1:  A  key  molecular switch  for  plant  cell  dedifferentiation plant signal. Behav . 6 (12): 1943-1945.
Jain  SM.  2012.  Date  palm  biotechnology: current  status  and  prospective-an overview. Emir. J. Food Agric , 24 (5): 386-399.
Jan  T,  B  Naqvi,  R  Qadri,  &  M  Nisar.  M. 2015.  Effect  of  age  of  cultures  and hormones on the synthesis of secondary  metabolites  from  callus  of Salvia santolinifolia (Boiss), a medicinal  herb. European  Journal  of Biotechnology  and  Bioscience ,  3(11): 19-22.
Jung EK. 2009. Chemical composition and antimicrobial  activity  of  the  essential oil of Chrysanthemum indicum against oral  bacteria. J.  Bacteriol ,  19(2):  61- 69.
Kalia R, JK Katnoria, & AK Nagpal. 2016. Antitumor  activity  of  aqueous  leaf extract  of  different  cultivars  of Chrysanthemum R.  using  potato  disc tumor  assay. Journal  Pharmacuetical
Sciences  and  Research, 8(11):  1262- 1265.
Karimi N, HR Ghasmpour, & M Yari 2014.
Effect  of  different  growth  regulators on callus induction and plant regeneration of satureja species. Annual Research & Review in Biology , 4(16): 2646-2654.
Kristina NN & SF Syahid. 2012. Pengaruh air  kelapa  terhadap  muliplikasi  tunas in  vitro,  produksi  rimpang,  dan kandungan  xanthorizol  temulawak  di lapangan. Jurnal  Littri ,  18(3):  125- 134.
Latifah  R,  T  Suhermiatin,  &  N  Ermawati. 2017.  Optimasi  pertumbuhan  plantlet Cattleya  melalui  kombinasi  kekuatan media  Murashige-Skoog  dan  bahan organik. Jurnal  Agriprima ,  1(1):  59- 68.
Lestari  EG.  2011.  Peranan  Zat  Pengatur
Tumbuh dalam Perbanyakan Tanaman melalui Kultur Jaringan. Jurnal AgroBiogen , 7(1): 63-68. Leupin  E.  2000.  Somatic  embryogenesis from leaf callus devired from maturetress  of  the  cycad Ceratozamia hildae (Gymnospermae). Journal Plant Cell, Tissue and Organ Culture ,
40: 25- 31.
Lu N, EL Bernardo, C Tippayadarapani, M Takagaki,  N  Kagawa,  &  W  Yamori, W.    2017.  Growth  and  accumulation of  secondary  metabolites  in  perilla  as affected by photosynthetic photon flux density  and  electrical  conductivity  of the  nutrient  solution. Frontiers  in Plant Science Plant Breeding , 8: 1-12. Miyanaga K, M Seki, & S Furusaki. 2000. Analysis of pigmentation in individual cultured  plant  cells  using  an  image processing system. Biotechnology Letters , 22: 977-981.
Mufarrikha L, N Herlina, & E Widaryanto 2014.  Respon  dua  kultivar  tanaman krisan  ( Chrysanthemum  morifolium ) pada  berbagai  lama  penambahan cahaya buatan. Jurnal Produksi Tanaman, 2(1): 10-16.
Orihara Y, JW Yang, N Komiya, K Koge,
&  T  Yoshikawa.  2002.  Abietane diterpenoid  from  suspension  cultured cells of Torreya nucifera var. radicans.
Phytochemistry , 59(4): 385-389.
Pan Y, L Lin, S Xiao, Z Chen, S Sarsaiya,
S  Zhang,  YS  Guan,  H  Liu,  &  D  Xu. 2020.  Callus  growth  kinetics  and accumulation of secondary
metabolites  of Bletilla  striata Rchb.f. using  a  callus  suspension  culture. PLoS ONE, 15(2).
Prakash NKU, S Bhuvaneswari, N Sripriya,
R  Arulmozhi,  K  Kavitha,  R  Aravitha,
&    B  Bharathiraja.  2014.  Studie  on phytochemistry, antioxidant,
antibacterial,  larvicidal,  and  pesticidal activities  of  aromatic  plants  from Yelagiri hills. International Journal of Pharmacy and Pharmacetical Sciences , 6(5): 1-4.
Tia Setiawati et al. : Analisis Pertumbuhan dan Kandungan Total Flavonoid Kultur Kalus Krisan ( Chrysanthemum Morifolium Ramat) dengan Pemberian Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan Air Kelapa
Rahayu  B,  Solichatun,  &  E  Anggarwulan. 2003. Pengaruh asam 2,4- Diklorofenoksiasetat  (2,4-D)  terhadap pembentukan  dan  pertumbuhan  kalus serta  kandungan  flavonoid  kultur kalus Acalypha  indica L. Jurnal Biofarmasi , 1(1): 1-6.
Rasud Y & B Bustaman, B. 2020. Induksi kalus  secara  in  vitro  dari  daun cengkeh  ( Syizigium  aromaticum L.) dalam media dengan berbagai konsentrasi auksin. Jurnal  Ilmu Pertanian Indonesia , 25 (1): 67-72. Razavi RM, H Arshneshin, & A
Ghasemian.  2016.  In  vitro  callus induction and isolation  of  volatile compounds in callus culture
Lallemantia  iberica (M.  Beib.)  Fisch.
& C.A. Mey. Journal of Plant Process and Function , 5(18): 65-68.
Rivai  RR  &  H  Helmanto.  2015.  Induksi kalus Chrysanthemum  indicum untuk meningkatkan keragaman genetik dari sel  somatik.  Pros  Sem  Nas  Masy Biodiv Indon , 1(1): 167-170.
Sari  YP,  H  Manurung,  &  Asipah.,  2011. Pengaruh pemberian air kelapa terhadap pertumbuhan anggrek kantong semar ( Paphiopedilum supardii Braem  &  Loeb)  pada  media Knudson secara in vitro. Mulawarman Scientifie, 10(2): 219-231. Shofiyani  A  &  N  Damayanti.  2017. Pengaruh 2,4-D (Asam Diklorofenoksi  Asetat)  dan  BAP (Benzyl Amino Purin) terhadap proliferasi kalus dan produksi metabolit  sekunder  dari  kalus  kencur ( Kaemferia  galangal L.). Jurnal  Ilmu Kefarmasian  Indonesia, 15(2):  180- 185.
Sitorus EN, ED Hastuti, & N Setiari. 2011.
Induksi kalus binahong ( Basella rubra L.)  secara in  vitro pada  media Murashige and Skoog dengan konsentrasi  sukrosa  yang  berbeda. J.
Bioma, 13(1): 1-7.
Solichatun  EA  &  E  Anggarwulan.  2005 Pertumbuhan  dan  produksi  reserpin kalus pule pandak (Rauvolfia
serpentine (L.)  Bentham  ex.  Kurz.) pada pemberian metil jasmonat secara in vitro. Bioteknologi . 2(2): 28-66. Stobbe  H,  U  Schmitt,  D  Eckstein,  &  D Jujesiefken. 2002. Developmental
stages  and  fine  structure  of  surface callus formed after debarking of living lime  trees  ( Tilia sp.).  Annals  of Botany . 89(6): 773-782.
Sukmawati  D,  H  Herlina,  M  Muslimin,  & IN Suwastika. 2018. Induksi kalus dan metabolit sekunder tanaman brotowali ( Tinospora  crispa L.)  pada  medium MS  dengan  penambahan  ZPT  2,4-D dan air kelapa secara in vitro. Natural Science. 7(2): 268-273.
Sun QL, S Hua, JH Ye, XQ Zheng, & YR Liang.  2010.  Flavonoids  and  volatiles in Chrysanthemum  morifolium Ramat flower  from  Tongxiang  country  in China. African Journal of Biotechnology , 9(25): 3817-382. Suskendriyati  H.  2003.  Pertumbuhan  dan Produksi Saponin Kultur Kalus Talinum  paniculatum  Gaertn.  dengan Variasi  Pemberian  Sumber  Karbon.
Skripsi. Jurusan Biologi, FMIPA UNS, Surakarta.
Syabana MA, I Rohmawati, & EP Ningsih. 2015.  Pertumbuhan  tanaman  marasi
(Curculigo latifolia ) dengan perbedaan konsentrasi NAA
(Naphthalene  Acetic  Acid)  dan  BAP (Benzyl Amino Purine) secara in vitro . Jurnal Agroteknologi . 7(1): 6-15.
Syahid  SF  &  Hernani.  2010.  Pengaruh  zat pengatur tumbuh terhadap
pembentukan  dan  pertumbuhan  serta kandungan  sinensetin  dalam  kalus pada tanaman kumis kucing ( Orthosiphon  aristatus ). Jurnal  Littri . 7(4): 99-103.
Syammiah S. 2006. Jenis senyawa organik suplemen  pada  medium  Knudson  C untuk  pertumbuhan  protocorm  like bodies Dendrobium Bertacong  Blue  x Dendrobium  undulatum . J.  Floratek , 2(2): 86 - 92.
Tang W, Z Guo, & F Ouyang. 2001. Plant regeneration from embryogenic
cultures initiated from mature loblolly pine  zygotic  embryos. In  Vitro  Cell. Dev. Biol.- Plant. 37: 558-563.
Tuhuteru  S,  L  Raharjo,  &  SHT  Raharjo.
2012. Pertumbuhan dan
perkembangan  anggrek dendrobium anosmum pada  media  kultur in  vitro dengan  beberapa  konsentrasi air kelapa. J. Agrologia . 1(1): 1-12. Utami  ESW,  I  Sumardi,  Taryono,  &  E
Semiarti. 2007. Pengaruh α- naphtaleneacetic acid (NAA) terhadap embriogenesis  somatik  anggrek  bulan Phalaenopsis amabilis (L.) Bl.
Biodiversitas. 8(4): 295-299.
Wardani DP, Solichatun, & AD Setyawan. 2004.  Pertumbuhan  dan  produksi saponin kultur kalus talinum paniculatum gaertn.  pada  variasi penambahan asam diklorogenoksi
asetat  (2,4-D)  dan  kinetin.  Jurnal Biofarmasi. 2 (1): 35-43
Yelnititis,  Y.  2012.  Pembentukan  kalus remah dari eksplan daun rami ( Gonystylus  bancanus (Miq)  Kurz.). Jurnal  Pemuliaan  Tanaman  Hutan. 6(3): 181 – 194.
Yong JWH, L Ge, YF Ng, & SN Tan. 2009. The chemical composition and
biological properties of coconut ( Cocos nucifera L.) water. Molecules. 14(12): 5144–5164.
Zhong  JJ.  2001.  Biochemical  Engineering of  the  Production  of  Plant  Specific Secondary Metabolites by Cell Suspension  Culture.  In:  Advances  in Biochemical
Engineering/Biotechnology, vol.72, ed.  Th.  Scheper,  Springer-Verlag Berlin Heidelberg.