## FRAKSI PEPTIDA ANTIOKSIDAN DARI KASEIN SUSU KAMBING

## [Antioxidant peptide fraction from goat’s milk casein]
Diana Lestari 1) *, Joshua Evan 1) , dan Maggy Thenawidjaja Suhartono 2)
1) Progam Studi Teknologi Pangan, Fakultas Teknobiologi, Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya, Tangerang, Banten
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB University, Bogor
Diterima 20 September 2019 / Disetujui 1 Desember 2020

## ABSTRACT
Milk  bioactive  peptides  are  derivative  of  milk  protein  produced  either  through  enzymatic  activity, digestive  processes,  or  fermentation,  that  give  functional properties.  The  study  aimed  to  obtain  bioactive peptides  fraction  derived from  goat’s  milk  casein  through  hydrolysis  by  papain,  analyze  the  profiles  of protein and peptides, and also test the antioxidative activity. The casein isolate was hydrolyzed by papain in  a  ratio  of  100:  0.5  (v/v)  at  pH  7.0  and  50ºC.  Analysis  of  protein  concentration  was  carried  out  by  the Bradford method and protein profile by SDS-PAGE. Antioxidant assay was carried out by the 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl (DPPH) method. A 1,000 ppm ascorbic acid solution was used as positive control. Peptide fractionation  was  done  by  membrane  filtration  with  a  cut  off  of  10  kD  and  30  kDa.  The  protein concentration  of  casein  hydrolysates  decreased  significantly  after  hydrolysis  process  with  papain.  The electrophoresis  results  showed  six  protein  bands  in  casein  with  molecular  weight  of  7-33  kDa.  After  the hydrolysis process,  all hydrolysates only contained two protein bands with molecular weights of 8 and 5 kDa. The hydrolysis process increased the antioxidant activity of the casein. P0 and P2 hydrolysates had the  highest  antioxidant  activity,  and  fractions  with  the  highest  antioxidant  activity  were  fraction  <10  kDa from  P0  hydrolysate  at  67.89%  and  10-30  kDa  from  P2  hydrolysate  at  73.82%.  Molecular  weight  and hydrolysis  time  affected  the  antioxidant  activity  of  the  hydrolysates.  Peptides  below  30  kDa  have antioxidant  activity,  whereas  those  above  30  kDa  do  not  have  any  antioxidant  activity.  The  antioxidant activity of the peptides decreases upon hydrolysis for more then 2 minutes.
Keywords: antioxidant, bioactive peptide, casein, fractionation, goat’s milk

## ABSTRAK
1
Peptida  bioaktif  susu  merupakan  turunan  protein  susu  yang  dihasilkan  baik  melalui  aktivitas enzimatik,  proses  pencernaan,  maupun  fermentasi  sehingga  memberikan  sifat  fungsional.  Tujuan  dari studi ini adalah untuk memperoleh peptida bioaktif yang berasal dari kasein susu kambing menggunakan papain,  menganalisis  profil  protein  dan  peptida  yang  diperoleh  serta  menguji  aktivitas  antioksidan.  Isolat kasein dihidrolisis dengan papain dengan perbandingan 100:0,5 (v/v) pada pH 7,0 dan suhu 50ºC. Analisis konsentrasi  protein  dilakukan  dengan  metode  Bradford  dan  profil  protein  dengan  SDS-PAGE.  Evaluasi aktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan  uji  2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl  (DPPH).Asam  askorbat  dengan konsentrasi  1.000  ppm  digunakan  sebagai  kontrol  positif.  Fraksinasi  peptida  dilakukan  dengan  filtrasi membran  dengan cut  off 10  kD  dan  30  kDa.  Konsentrasi  protein  dari  hidrolisat  kasein  menurun  secara signifikan  setelah  dihidrolisis  dengan  papain.  Profil  elektroforesis kasein  menunjukkan  enam pita  dengan berat molekul 7-33 kDa. Setelah proses hidrolisis, hanya diperoleh dua pita dengan berat molekul sekitar 8 dan  5  kDa  pada  semua  hidrolisat.  Proses  hidrolisis  dapat  meningkatkan  sifat  antioksidatif  dari  kasein. Hidrolisat P0 dan P2 mempunyai aktivitas antioksidan yang tertinggi, dengan fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi adalah fraksi <10 kDa pada hidrolisat P0 sebesar 67,89% dan fraksi 10-30 kDa pada hidrolisat  P2  sebesar  73,82%.  Berat  molekul  dan  waktu  hidrolisis  diketahui  memengaruhi  aktivitas antioksidan.  Peptida  dengan  berat  molekul  dibawah  30  kDa  diketahui  memiliki  aktivitas  antioksidan, sedangkan  peptida  >30  kDa  tidak  memiliki  aktivitas  antioksidan.  Aktivitas  antioksidan  menurun  pada perlakuan waktu hidrolisis lebih dari 2 menit.
Kata kunci : antioksidan, fraksinasi, kasein, peptida bioaktif, susu kambing
*Penulis Korespondensi: E-mail: diana.lestari@atmajaya.ac.id

## PENDAHULUAN
Susu  merupakan  salah  satu  minuman  yang populer  untuk  dikonsumsi,  salah  satu  yang  paling umum  adalah  susu  sapi.  Susu  lainnya  yang  tidak kalah  bernutrisi  jika  dibandingkan  susu  sapi  adalah susu  kambing.  Susu  kambing  cukup  populer  teruta- ma  bagi  seseorang  yang  mengidap  alergi  terhadap protein  susu  sapi. β-lactoglobulin  merupakan  kom- ponen  utama  dalam whey susu  sapi  yang  berperan sebagai alergen dalam susu sapi, yang tidak ditemui dalam  air  susu  ibu  (ASI).  Bayi-bayi  yang  menderita alergi  pada  susu  sapi  dilaporkan  dapat  ditangani dengan  pemberian  susu  kambing  (Park,  1994). Susu  kambing  juga  mengandung  α s1 -kasein  yang rendah, yaitu molekul protein yang sulit dicerna dan dapat menyebabkan masalah pencernaan pada bayi (Yangilar,  2013).  Selain  itu  susu  kambing  diketahui mengandung  A2  β-kasein  yang  bersifat hyppo- allergenic (Jung et al., 2017) .
Protein  merupakan  makromolekul  yang  terdiri atas  asam  amino  yang  dihubungkan  dengan  ikatan peptida. Selain mempunyai fungsi sebagai pemben- tuk  jaringan,  fragmen  protein  mempunyai  berbagai fungsi  biologis  terhadap  kesehatan  atau  yang  lebih dikenal  sebagai  peptida  bioaktif.  Antibakteri,  anti- hipertensi,  antikolesterol,  dan  antioksidan  merupa- kan  beberapa  fungsi  bioaktif  dari  fragmen  protein (Padaga dan Aulanni’am, 2017).
Peptida  bioaktif  susu  dapat  diperoleh  dengan beberapa  cara  yaitu  dengan  melakukan  fermentasi, hidrolisis  dengan  enzim  pencernaan  ( in  vivo ),  dan hidrolisis oleh enzim proteolitik ( in vitro ) (Mohanty et al., 2016).  Salah  satu  enzim  protease  dari  tanaman dan sudah  umum digunakan  adalah  papain.  Papain merupakan kelompok sistein protease yang bersum- ber dari tanaman pepaya yang dapat menghidrolisis protein  dalam  spektrum  yang  luas  (Rawlings  dan Salvesen, 2013).
Salah satu manfaat dari peptida bioaktif adalah sebagai  antioksidan,  yaitu  senyawa  yang  mampu menangkal  radikal  bebas.  Antioksidan  dapat  men- donorkan  satu  elektronnya  kepada  senyawa  radikal bebas  sehingga  dampak  negatif  dari  radikal  bebas dapat  dihambat.  Radikal  bebas  pada  tubuh  dapat merusak  sel-sel  tubuh  jika  dibiarkan  menumpuk  se- cara terus menerus, hal ini dapat disebabkan radikal bebas  bersifat  tidak  stabil  dan  dapat  mengambil elektron  dari  molekul  lain.  Sebenarnya  tubuh  mem- punyai  kemampuan  untuk  menetralisir  radikal  be- bas, namun jumlah dihasilkannya antioksidan terse- but  terbatas  (Syukur et  al., 2011).  Sehingga  di- butuhkan  peran  antioksidan  dari  luar  untuk  me- netralkan radikal bebas tersebut (Kusumaningtyas et al., 2015a; Padaga dan Aulanni’am, 2017).
Aktivitas  antioksidan  peptida  susu  kambing ditemukan  dengan  menghidrolisis  susu  kambing dengan  protease Lactobacillus  plantarum S31  pada
fraksi  11  dengan  pH  5,0  sebesar  29%.  Fraksi  ini juga  memiliki  aktivitas  penghambatan  pertumbuhan bakteri  Entero  Pathogenic Escherichia  coli (EPEC K1.1), Staphylococcus  aureus ,  dan Listeria  mono- cytogenes (Herlina et al., 2019).
Kandungan protein susu kambing secara umum adalah  3,4%  angka  tersebut  sedikit  lebih  tinggi  dari susu  sapi  yang  hanya  3,2%  dan  lebih  rendah  dari protein  susu  domba  (6,2%)  (Yangilar,  2013).  Kam- bing  peranakan  etawa  merupakan  salah  satu  jenis kambing  yang  diternakkan  di  Indonesia.  Susu  kam- bing peranakan etawa diketahui memiliki kandungan protein  yang  tinggi  yaitu  sebesar  3,8-3,9%.  Nilai tersebut  dipengaruhi  oleh  jenis  pakan  yang  di- berikan  (Ratya et  al., 2017).  Protein  dalam  susu terdiri  dari  kasein  dan whey dengan  perbandingan 80:20  (Selvaggi et  al., 2014).  Sehingga  berpotensi untuk  menghasilkan  peptida  yang  bersifat  bioaktif dari  kasein  susu  kambing  yang  diternakkan  di Indonesia.  Data  mengenai  aktivitas  antioksidan  ka- sein susu kambing lokal belum banyak diteliti teruta- ma menggunakan enzim papain. Tujuan dari peneli- tian  ini  adalah  untuk  memperoleh  peptida  bioaktif dari  kasein  susu  kambing  menggunakan  enzim  pa- pain,  menganalisis  profil  protein  dan  peptida  yang diperoleh serta mengujinya sebagai antioksidan.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  susu  kambing  peranakan  etawa  yang  ber- asal  dari  peternak  di  Bogor,  enzim  papain  (Merck, USA),  membran  filtrasi  10  kDa  (Amicon®,  Irlandia), membran  filtrasi  30  kDa  (Sartorius,  Inggris),  LMW (Unstained  Low  Range  Protein  Ladder)  marker (PageRuler™,  Thermo  Scientific,  USA)  dan  2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Hi-Media, India).
Preparasi  dan  isolasi  kasein  susu  kambing (Bezerra et al., 2013)
Sebanyak  1  L  susu  kambing  segar  dibuang lemaknya  dengan  cara  disentrifugasi  2.000  g  pada suhu  4°C  selama  30  menit.  Kemudian  susu  di- pasteurisasi pada suhu 72°C selama 15 detik. Susu didinginkan  hingga  40°C,  lalu  ditambahkan  HCl (Merck,  Jerman)  2  N  hingga  pH  susu  menjadi  4,6 yang  merupakan  titik  isoelektrik  susu.  Susu  ke- mudian  disentrifugasi  dengan  kecepatan  7.100  g selama  30  menit.  Supernatan  yang  berisi whey dan HCl kemudian dipisahkan sehingga diperoleh kasein pada  endapan.  Endapan  kasein  yang  diperoleh  di- lakukan  pembilasan  dengan  menambahkan  akua- des  200  mL  sebanyak  tiga  kali.  Kasein  kemudian disimpan  pada  suhu  20°C  (Bezerra et  al., 2013). Proses  isolasi  kasein  ini  dilakukan  satu  kali    untuk
selanjutnya  digunakan  untuk  dua  kali  ulangan perlakuan pada masing-masing uji.
Hidrolisis  kasein  susu  kambing  (Chalabi et  al., 2014)
Kasein  dilarutkan  didalam  bufer  fosfat  0,05  M pH 7,0 dengan konsentrasi 15% b/v. Hidrolisis dimu- lai  dengan melakupan preparasi larutan enzim  yaitu melarutkan  bubuk  papain  murni  (Merck,  Jerman, 30.000  USP-U/mg)  dalam  bufer  fosfat  dengan  per- bandingan 1:10 (b/v). Kemudian proses hidrolisis di- lakukan  dengan  perbandingan  larutan  kasein  dan enzim  100:0,5  (v/v)  pada  pH  7,0  dan  suhu  50°C dengan  variasi  waktu  0,  1,  2,  dan  3  menit.  Proses hidrolisis  dihentikan  dengan  pemanasan  pada  suhu 80°C  selama  15  menit.  Hidrolisat  kemudian  di- sentrifugasi  dengan  kecepatan  2.000  g  selama  5 menit  pada  suhu  4°C  untuk  mengendapkan  protein besar.  Kemudian  hidrolisat  berupa  supernatan  di- simpan pada suhu -20°C untuk dianalisis lebih lanjut (Chalabi et al., 2014).
Pengukuran  kadar  protein  hasil  hidrolisis  (He, 2011)
Uji  kadar  protein  dilakukan  dengan  metode Bradford,  dengan  kurva  standar  menggunakan Bovine  Serum  Albumin .  Sebanyak  0,4  mL  hidrolisat dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan  ditambah- kan  dengan  8  mL  reagen  Bradford.  Kemudian  la- rutan  dihomogenisasi  dan  diinkubasi  pada  suhu ruang selama 5 menit. Absorbansi diukur pada pan- jang gelombang 595 nm (He, 2011).
Fraksinasi  peptida  dengan  filtrasi  membran (Kusumaningtyas et al., 2015b)
Fraksinasi  peptida  dilakukan  dengan  cara sentrifugasi menggunakan membran filtrasi. Hirolisat hasil  hidrolisis  difraksinasi  dengan  menggunakan membran cut  off 10  kD  (Amicon®)  dan  30  kDa (Satorius) dengan kecepatan 4.000 g selama 20 me- nit.  Kemudian  diperoleh  3  fraksi  yaitu  peptida  yang berukuran <10 kDA, 10-30 kDa, dan >30 kDA.
Analisis profil peptida dengan SDS-PAGE (Singh et al., 2011) Analisis  ini  dilakukan  berdasarkan  Singh et  al. (2011)  baik  pada  sampel  sebelum  dan  sesudah fraksinasi.  Sampel  dilarutkan  di  dalam  larutan  SDS 5%  dengan  perbandingan  1:5,  lalu  campuran  di- panaskan  pada  suhu  85°C  selama  1  jam  pada waterbath  shaker (GFL  1086,  Jerman) . Campuran kemudian  disentrifugasi  dengan  kecepatan  2.000  g selama  5  menit  pada  suhu  ruang,  kemudian supernatan  dipisahkan.  Supernatan  yang  diperoleh dicampurkan  dengan  bufer  ((6%  Tris-HCl  (Merck German) 1  M  pH  6,8; 50% gliserol (Merck, Jerman) 50%;  20%  SDS  (Merck,  Jerman) 10%;  5%  β-
merkaptoetanol (Merck, Jerman); 10% bromophenol blue  (Sigma,  Jerman)  1%;  9%  akuades))  dengan perbandingan  1:1.  Campuran  kemudian  dipanaskan di  dalam  air  mendidih  selama  2  menit.  Sebanyak  6 µL  kasein,  4  µL  marker  LMW  dan  8  µL  peptida  di- masukan ke dalam sumur gel. Konsentrasi gel SDS- PAGE  yang  digunakan  untuk  gel  pemisah  adalah 18%  ((akrilamid  (Merck,  Jerman);  bis-akrilamid (Amresco,  US);  Tris  HCl  pH  8,8;  ammonium  per- sulfat  (Merck  Jerman);  TEMED  (Merck,  Jerman); dan  SDS  (Merck,  German)  10%))  dan  gel  penahan adalah 6% (akrilamid; bis-akrilamid; tris HCl pH 6,8; amonium  persulfat;  TEMED  dan  SDS  10%). Marker LMW  digunakan  sebagai  standar  protein.  Proses elektroforesis  dilakukan  selama  3  jam  dengan  te- gangan  70  V  dan  5  mA  hingga  pewarna  (bromo- phenol  blue)  bergerak  hampir  mencapai  bagian bawah gel. Gel divisualisasi dengan larutan pewarna ((0,1%  Coomasie  Brilliant  Blue  R-250  (Merck,  Jer- man);  45%  metanol  (Merck  Jerman);  44,9%  akua- des; 10% asam asetat glasial (Merck, Jerman)) dan pewarna  dilunturkan  dengan  larutan  peluntur  (10% metanol; 10% asam asetat glasial; 80% akuades).
Uji  aktivitas  antioksidan  (Kusumaningtyas et  al., 2015b)
Uji ini dilakukan baik pada sampel sebelum dan sesudah  fraksinasi.  2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)  dilarutkan  didalam  etanol  96%  (Merck, Jerman)  dengan konsentrasi 0,1 mM. Kemudian se- banyak  100  µL  hidrolisat  peptida  dicampurkan  de- ngan  100  µL  larutan  DPPH.  Etanol  96%  ditambah dengan  larutan  DPPH  digunakan  sebagai  blanko. Kontrol  positif  yang  digunakan  berupa  asam  as- korbat  1.000  ppm  (Sigma,  Jerman)  ditambah  de- ngan  larutan  DPPH.  Campuran  diinkubasi  pada suhu  ruang  dengan  kondisi  gelap  selama  30  menit. Setelah  30  menit,  nilai  absorbansi  diukur  dengan microplate  reader (Tecan  Austria  GmbH  Model Infinite 200 PRO). pada panjang gelombang 517 nm (Kusumaningtyas et  al., 2015b).  Perhitungan  akti- vitas  antioksidan  dinyatakan  dengan  persen  pe- nangkapan  radikal  bebas  (% Radical  Scavenging Activity )  dengan  rumus  (Kusumaningtyas et  al., 2015b):
Aktivitas Antioksidan ( % RSA ) =
( absorbansi blanko- absorbansi sampel absorbansi blanko ) ×100 …. (1)
Absorbansi  blanko  adalah  absorbansi  etanol teknis  yang  dicampurkan  dengan  larutan  DPPH  0,1 mM.  Absorbansi  sampel  adalah  absorbansi  hidroli- sat  peptida  atau  asam  askorbat  1.000  ppm  dicam- purkan dengan larutan DPPH 0,1 mM.

## Pengolahan dan analisis data
Analisis data dalam penelitian ini  dilakukan de- ngan  analisis  statisik  dengan  aplikasi  IBM SPSS Statistic 24.  Hasil  dari  analisis  konsentrasi  protein dan  aktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan  dua  kali pengulangan  perlakuan,  data  yang  diperoleh  kemu- dian dianalisis dengan uji ANOVA satu arah dengan uji lanjut Duncan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Konsentrasi protein setelah hidrolisis
Substrat  kasein  susu  kambing  dihidrolisis  de- ngan enzim papain. Hidrolisat P0 merupakan hidroli- sat  yang  dihidrolisis  selama  0  menit,  P1  selama  1 menit, hidrolisat P2 selama 2 menit dan P3 selama 3 menit. Tabel 1 menunjukkan bahwa semua hidrolisat memiliki konsentrasi protein yang tidak berbeda nya- ta  jika  dibandingkan  antar  hidrolisat  ( P >0,05).  Jika dibandingkan  dengan  kasein,  kasein  memiliki  kon- sentrasi  protein  yang  lebih  tinggi  dari  semua  hidro- lisat  secara  nyata  ( P <0,05).  Perbedaan  yang  tidak signifikan  antar  hidrolisat  mungkin  disebabkan  oleh konsentrasi  enzim  papain  yang  digunakan  sudah mampu  menghidrolisis  kasein  sejak  menit  pertama, sehingga  pertambahan  waktu  inkubasi  sudah  tidak lagi mengurangi konsentrasi protein secara nyata.
Tabel 1. Konsentrasi protein setiap hidrolisat
Jenis Hidrolisat Konsentrasi Protein (mg/mL) P0 1,05±0,21 a P1 1,12±0,11 a P2 1,06±0,02 a P3 1,10±0,14 a Kasein 2,27±0,19 b
Hidrolisis  kasein  dengan  papain  yang  dilapor- kan  oleh  Lestari  dan  Soesilo  (2017)  selama  tiga menit  juga  menunjukkan  penurunan  konsentrasi protein sampai dengan 50%. Penurunan konsentrasi protein pada hidrolisat dapat disebabkan oleh waktu inkubasi  enzim  yang  digunakan  cukup  untuk menghidrolisis  kasein  dan  menghasilkan  fragmen- fragmen  peptida  yang  lebih  kecil.  Metode  Bradford yang  digunakan  pada  penelitian  ini  merupakan metode  pengukuran  konsentrasi  protein  total,  pada metode  ini coomasie  brilliant  blue (CBB)  akan  ber- ikatan  dengan  protein  dengan  residu  asam  amino dengan  rantai  samping  triptofan,  tirosin,  fenilalanin, arginin, histidin dan leusin pada sampel pada suasa- na  asam  dan  menghasilkan  warna  biru  (Purwanto, 2014;  Utami et  al., 2016).  Metode  Bradford  diguna- kan karena kemurnian reagen yang tinggi, reaksinya yang  cepat  dan  sensitifitasnya  yang  tinggi.  Pada proses  hidrolisis,  protein  dipecah  oleh  enzim  men- jadi  peptida  maupun  asam  amino.  Peptida  maupun asam  amino  tidak  dapat  membentuk  kompleks
dengan  CBB  sehingga  tidak  menghasilkan  warna biru  (Utami et  al., 2016),  yang  mengakibatkan  pe- nurunan nilai absorbansi ketika diukur pada panjang gelombang  595  nm.  Hal  tersebut  menyebabkan  di- peroleh  penurunan  konsentrasi  protein  pada  hidro- lisat  jika  dibandingkan  dengan  kasein  yang  tidak dihidrolisis.  Selain  mengetahui  konsentrasi  protein, uji ini dapat berguna untuk mengetahui keberhasilan proses hidrolisis.

## Profil  peptida  dengan  elektroforesis  SDS-PAGE sebelum proses fraksinasi
Berdasarkan  hasil  elektroforesis  SDS-PAGE, terdapat  enam  pita  protein  pada  kasein  dengan berat molekul sebesar 33; 29; 22; 14; 18 dan 7 kDa. Semua hidrolisat (P0, P1, P2, dan P3) menunjukkan protein-protein  besar  pada  kasein  sudah  terdegra- dasi dan menghasilkan 2 pita dengan berat molekul kecil  pada  bagian  bawah  yaitu  8  dan  5  kDa. Meskipun  pada  hidrolisat  P0  reaksi  enzim  langsung dihentikan  setelah  substrat  dan  enzim  bertemu, namun  dari  hasil  SDS-PAGE  menunjukkan  reaksi enzim  sudah  berjalan  (Gambar  1).  Hal  ini  mungkin disebabkan  reaksi  enzim  yang  berjalan  cepat  pada pH  dan  suhu  optimum  enzim  papain  yaitu  pH  7,0 dan  suhu  50°C  (Kusumadjaja  dan  Dewi,  2010). Selain  itu  proses  pemanasan  yang  dilakukan  untuk menghentikan  reaksi  enzim  juga  dapat  mende- naturasi  protein  kasein  sehingga  dapat  meme- ngaruhi  konsentrasi  protein  dan  profil  SDS-PAGE protein.
Gambar  1  menunjukkan  bahwa  pada  sampel kasein  (K)  terdapat  total  enam  pita  protein  dengan tiga  pita  utama  dan  tiga  pita  tambahan.  Ketiga  pita utama  tersebut  dapat  terlihat  secara  jelas  dan mempunyai  berat  molekul  sekitar  33,  29,  dan  22 kDa.  Tiga  pita  tersebut  merupakan α-kasein,  β- kasein, dan κ-kasein secara berurutan (Wang et al., 2013; Costa et al., 2014).  Terdapat tiga pita lainnya pada  kasein  dengan  berat  molekul  14,  18,  dan  7 kDa  dengan  intensitas  yang  lebih  rendah  jika  di- bandingkan  dengan  tiga  pita  sebelumnya.  Ketiga pita  tersebut  dapat  berupa  protein  tambahan  yang terbentuk  saat  proses  pemisahan  kasein  dengan whey maupun  saat  proses  pasteurisasi.  Panas dapat  mendenaturasi  protein,  sehingga  dapat  me- mutus  ikatan  hidrogen  pada  protein  sehingga struktur  akan  berubah,  namun  panas  tidak  dapat merusak  struktur  primer  protein  (Matsuura et  al. , 2015). Oleh karena itu memungkinkan diperoleh pita dengan  berat  molekul  yang  lebih  kecil  dari  berat molekul kasein.
Pada semua sampel hidrolisat, diperoleh 2 pita pada  pada  bagian  bawah  gel  dengan  berat  molekul 8  dan  5  kDa.  Sehingga  dapat  diketahui  bahwa  pro- ses  hidrolisis  menghasilkan  peptida  dengan  ukuran kecil.
M            P0          P0           P1           P1          P2         P2         P3          P3           K             HB
100 kDa 30 kDa 15 kDa 20 kDa 10 kDa 5 kDa 3,4 kDa
Keterangan: M= Marker; P0= Hidrolisat 0 menit; P1= Hidrolisat 1 menit; P2= Hidrolisat 2 menit; P3= Hidrolisat 3 menit; K= Kasein; HB= Hidrolisat susu kambing oleh bromelin (Kusumaningtyas et al., 2015b)
Gambar 1.  Hasil elektroforesis SDS-PAGE kasein dan hidrolisat kasein sebelum proses fraksinasi
Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  yang  dilaku- kan  Chalabi et  al. (2014),  hasil  hidrolisis  kasein  de- ngan  papain  akan  menghasilkan  hidrolisat  dengan ukuran  dibawah  14  kDa.  Selain  itu  hasil  ini  menun- jukkan keberhasilan dari proses hidrolisis oleh enzim papain,  kasein  yang  berukuran  sekitar  19-32  kDa terhidrolisis  menjadi  peptida  dengan  ukuran  lebih kecil. Papain dapat menghidrolisis secara sempurna protein  yang  berukuran  66-88  kDa  (Lestari  dan Soesilo, 2017). Selain itu proses hidrolisis yang dila- kukan  pada  kondisi  optimum  papain  yaitu  pH  7,0 dan  suhu  50°C,  menyebabkan  proses  hidrolisis  ter- jadi secara cepat dan optimum sehingga menghasil- kan  peptida  dengan  berat  molekul  yang  sama  pada semua  perlakuan  waktu  hidrolisis  yang  diberikan. Hal  ini  menandakan  proses  hidrolisis  telah  selesai. Hidrolisis  susu  kambing  segar  menggunakan  enzim bromelin selama 60 menit  juga menghasilkan pepti- da  dengan  ukuran  12-35  kDa  (Kusumaningtyas et al., 2015b) (Gambar 1).

## Aktivitas antioksidan sebelum proses fraksinasi
Gambar  2  menunjukkan  bahwa  kasein  (sebe- lum  proses  hidrolisis)  tidak  memiliki  aktivitas  anti- oksidan  sedangkan  semua  hidrolisat  hasil  hidrolisis kesein  menggunakan  enzim  papain  memiliki  aktivi- tas  antioksidan.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  proses hidrolisis  dapat  mengaktifkan  atau  membuat  sifat antioksidan  dari  protein  yang  sebelumnya  tidak  ada menjadi muncul.  Hidrolisat  P0  dan  P2  memiliki  akti- vitas  antioksidan  tertinggi  masing-masing  dengan nilai % RSA sebesar 63,4 dan 63,2%. Nilai tersebut tidak  berbeda  nyata  dengan  kontrol  positif  (asam
askorbat 1.000 ppm). Hidrolisat P1 memiliki aktivitas antioksidan  dengan  nilai  %  RSA  sebesar  42,0% lebih  rendah  dari  P0  dan  P2,  namun  dengan  per- bedaan yang tidak signifikan ( P >0,05). Aktivitas anti- oksidan  hidrolisat  P3  sebesar  23,3%,  merupakan aktivitas  antioksidan  terendah  diantara  seluruh hidrolisat.  Hal  ini  menandakan  bahwa  waktu  hidro- lisis yang lebih panjang cenderung merusak aktivitas antioksidan yang sudah terbentuk.
Hasil  tersebut  dapat  disebabkan  karena  faktor utama yang memengaruhi aktivitas antioksidan pep- tida adalah komposisi dan susunan asam aminonya, yaitu peptida mempunyai sekuens asam amino yang banyak  mengandung  asam  amino  hidrofobik,  aro- matik dan yang mempunyai gugus sulfur. Asam ami- no  yang bersifat hidrofobik antara lain adalah glisin, alanin,  valin,  leusin  dan  prolin.  Asam  amino  yang memiliki  gugus  sulfur  antara  lain  adalah  sistein  dan metionin.  Asam  amino  aromatik  antara  lain  adalah fenilalanin,  tirosin  dan  triptofan.  Asam  amino hidrofobik dan aromatik mempunyai cincin imidazole yang dapat berguna sebagai transfer elektron terha- dap  radikal  bebas.  Selain  itu  pada  asam  amino triptofan  dan  proline  terdapat  cincin pyrrolidine dan indol  yang  dapat  mendonorkan  hidrogen  terhadap radikal  bebas  (Zou et  al., 2016).  Hal  ini  yang  dapat memengaruhi aktivitas antioksidan dari peptida. Pro- ses  hidrolisis  memengaruhi  aktivitas  antioksidan, proses  hidrolisis  dapat  memunculkan  maupun menghilangkan aktivitas antioksidan  dari suatu pep- tida (Costa et al., 2012).  Pada penelitian ini, proses hidrolisis  memunculkan  aktivitas  antioksidan  dari kasein.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 P0 P1 P2 P3 Kasein AS
1000 ppm
Ak ti v ita s An ti o k s id a n % RS A Sampel d cd bc cd ab a
Keterangan:  P0=  Hidrolisat  0  menit;  P1=  Hidrolisat  1 menit;  P2=  Hidrolisat  2  menit;  P3=  Hidrolisat  3  menit; AS 1.000 ppm= kontrol positif asam askorbat
Gambar 2.  Aktivitas antioksidan (dinyatakan dengan %  RSA  terhadap  DPPH)  kasein  dan hidrolisat  kasein  sebelum  proses  fraksi- nasi
Perbedaan  lama  waktu  hidrolisis  memengaruhi aktivitas  antioksidan  secara  nyata.  Hidrolisis  kasein lebih  dari  dua  menit  dapat  menurunkan  aktivitas
antioksidan. Hal ini dapat dikarenakan semakin lama waktu  hidrolisis  maka  proses  pemecahan  protein yang terjadi semakin banyak, sehingga memungkin- kan  peptida  yang  telah  terbentuk  dan  mempunyai aktivitas  antioksidan  menjadi  terdegradasi  kembali. Selain  waktu  hidrolisis,  jenis  protease  yang  diguna- kan, jenis substrat, dan suhu hidrolisis juga turut me- mengaruhi  jenis  peptida  yang  terbentuk,  sehingga dapat  berpengaruh  terhadap  aktivitas  antioksidan yang  dihasilkan.  Herlina et  al. (2019)  melaporkan aktivitas  antioksidan  ditemui  pada  hidrolisat  susu kambing  yang  dihidrolisis  oleh  protease  fraksi  11 Lactobacillus  plantarum S31  dengan  suhu  37°C  se- lama 18 jam sebesar 29,3±0,005 (susu kambing pH 5,0) dan 24,08% ± 0,027 (susu kambing pH 7,0).

## Profil  peptida  dengan  elektroforesis  SDS-PAGE setelah proses fraksinasi
Hidrolisat P0 dan P2 yang mempunyai aktivitas antioksidan  tertinggi  dilanjutkan  dengan  proses fraksinasi.  Hasil  SDS-PAGE  pertama  (Gambar  1), telah  menunjukkan  bahwa  hidrolisat  kasein  susu kambing  yang  dihidrolisis  oleh  enzim  papain  hanya menunjukkan  pita  protein  dengan  berat  molekul kecil, sehingga  proses fraksinasi ini lebih mengarah kepada  pemekatkan  protein  dengan  berat  molekul kecil yang diduga memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi. Gambar 3 menunjukkan terdapat pita yang te- bal pada fraksi <10 kDa baik pada hidrolisat P0 dan P2 yang menunjukkan protein dengan berat molekul kecil telah terpisah dan terkonsentrasi.
Ketarangan:  P0>30  kDa=  Fraksi  Hidrolisat  0  menit  dengan  BM>30kDa;  P0  10-30  kDa=  Fraksi  Hidrolisat  0  menit dengan  BM  10-30kDa;  P0<10  kDa=  Fraksi  Hidrolisat  0  menit  dengan  BM<10kDa;  P2>30  kDa=  Fraksi  Hidrolisat  2 menit  dengan  BM>30kDa;  P2  10-30  kDa=  Fraksi  Hidrolisat  2  menit  dengan  BM  10-30kDa;  P2<10  kDa=  Fraksi Hidrolisat 2 menit dengan BM<10kDa
Gambar 3.  Hasil elektroforesis SDS-PAGE hidrolisat P0 dan P2 setelah proses fraksinasi
100 kDa 30 kDa 15 kDa 20 kDa 10 kDa 5 kDa 3,4 kDa
M           P0>30 kDa   P0 10-30 kDa   P0<10 kDa    P2>30kDa    P2 10-30kDa    P2<10kDa
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 P0 >30 kDa P0 10-30 kDa P0 <10 kDa P2 >30 kDa
P2 10-30 kDa P2 <10 kDa AS 1000 ppm
Ak ti v ita s An ti o k s id a n ( % RSA ) Sampel a b c a d c e
Pita  tersebut  adalah  dengan  ukuran  9  dan  5 kDa.  Pita  protein  pada  fraksi  10-30  kDa  terutama hidrolisat  P2 ditemukan pita dengan intensitas  yang rendah  dengan  ukuran  16  dan  5  kDa,  yang  me- nunjukkan  hidrolisat  P0  dan  P2  tidak  banyak  me- ngandung protein dengan berat molekul sedang dan tidak  semua  protein  kecil  melewati  membran  filter. Hal  ini  juga  dapat  terjadi  karena  membran  filtrasi yang  digunakan  sudah  penuh  dengan  kerak  tapis (substansi  dengan  berat  molekul  lebih  besar  yang menyumbat membran). Kerak tapis yang memenuhi membran  dapat membuat  peptida  yang  seharusnya dapat  melewati  membran,  menjadi  tertahan  pada membran (Janson, 2012).
Hidrolisat  P0  fraksi>30  kDa  juga  diketahui  me- miliki  pita  dengan  intensitas  rendah  yang  mempu- nyai  ukuran  9  kDa.  Sama  seperti  penjelasan  sebe- lumnya,  hal  tersebut  terjadi  karena  penumpukan pada  kerak  tapis.  Protein  dengan  berat  molekul besar juga tidak ditemui pada fraksi ini, seperti yang sudah  dibahas  sebelumnya  bahwa  hidrolisat  kasein susu  kambing  yang  dihidrolisis  oleh  enzim  papain hanya  menunjukkan  pita  protein  dengan  berat molekul kecil (Gambar 1).
Hidrolisat P0 fraksi 10-30 kDa, dan hidrolisat P2 fraksi >30 kDa tidak diperoleh pita yang jelas. Kete- balan  pita  menunjukkan  konsentrasi  protein,  sema- kin  tebal  pita  maka  konsentrasi  protein  akan  sema- kin tinggi (Sintae et al., 2015). Proses fraksinasi me- nyebabkan  peptida-peptida  dengan  berat  molekul kecil  terkonsentrasi  pada  fraksi  <10  kDa,  sehingga
ditemui  pita  protein  yang  tebal  pada  fraksi  <10  kDa (baik hidrolisat P0 dan P2) dibandingkan fraksi-fraksi lainnya dan juga dibandingkan sebelum fraksinasi.

## Aktivitas antioksidan setelah proses fraksinasi
Peptida  dengan  ukuran  di  atas  30  kDa  pada kedua  hidrolisat  tidak  memiliki  aktivitas  antioksidan. Aktivitas  antioksidan  tertinggi  hidrolisat  P0  ditemu- kan pada fraksi <10 kDa, sedangkan pada hidrolisat P2,  aktivitas  antioksidan  tertinggi  terdapat  pada fraksi  10-30  kDa  (Gambar  4).  Hidrolisat  P0  dan  P2 dengan  berat  molekul  diatas  30  kDa  tidak  memiliki aktivitas antioksidan sedangkan hidrolisat P0 dan P2 dengan berat molekul dibawah 30 kDa memiliki akti- vitas  antioksidan.  Fraksi  dengan  berat  molekul  di bawah  30  kDa  pada  kedua  hidrolisat  diduga  me- ngandung  asam  amino  yang  mampu  mendonorkan hidrogen  maupun  melakukan  transfer  elektron  se- perti  asam  amino  hidrofobik,  aromatik  ataupun  me- ngandung gugus sulfur (Zou et al., 2016).
Hidrolisat  P0  dengan  berat  molekul  <10  kDa memiliki  aktivitas  antioksidan  sebesar  67,8%.  Nilai ini meningkat  dari aktivitas antioksidan hidrolisat  P0 sebelum difraksinasi  yaitu  sebesar 63,4%. Hal  yang sama  juga  terjadi  pada  hidrolisat  P2  dengan  berat molekul  10-30  kDa  yang  memiliki  aktivitas  antioksi- dan  sebesar  73,8%  dan  hidrolisat  P2  dengan  berat molekul <10 kDa dengan aktivitas antioksidan 66%, keduanya  lebih  tinggi  dari  aktivitas  hidrolisat  P2  se- belum difraksinasi yaitu sebesar 63,3%.
Keterangan: P0>30 kDa= Fraksi Hidrolisat 0 menit dengan BM>30kDa; P0 10-30 kDa= Fraksi Hidrolisat 0 menit dengan BM  10-30kDa;  P0<10  kDa=  Fraksi  Hidrolisat  0  menit  dengan  BM<10kDa);  P2>30  kDa=  Fraksi  Hidrolisat  2  menit dengan BM>30kDa; P2 10-30 kDa= Fraksi Hidrolisat 2 menit dengan BM 10-30kDa, P2<10 kDa= Fraksi Hidrolisat 2 menit dengan BM<10kDa; AS 1.000 ppm= kontrol positif asam askorbat
Gambar 4.  Aktivitas antioksidan (% RSA) hidrolisat P0 dan P2 setelah proses fraksinasi
Proses  penyaringan  dapat  memekatkan  kon- sentrasi  protein,  seperti  yang  sudah  dibahas  se- belumnya  sehingga  aktivitas  antioksidan  yang  di- hasilkan  pun  meningkat.  Proses  penyaringan  dapat menyebabkan protein besar yang tidak memiliki akti- vitas  antioksidan  tertahan  pada  membran  sehingga diperoleh  peptida  yang  lebih  murni  dengan  aktivitas antioksidan  lebih  tinggi.  Hal  ini  menyebabkan  ter- jadinya  kenaikan  aktivitas  antioksidan  sesudah  pro- ses penyaringan (Kusumaningtyas et al., 2015b). Hidrolisat  susu  kambing  menggunakan  enzim bromelin (suhu 50°C selama 60 menit) diketahui me- miliki  aktivitas  antioksidan  dengan  aktivitas  pada fraksi <10 kDa (14%) lebih besar daripada fraksi >10 kDa (4%) (Kusumaningtyas et al., 2015b). Nilai yang lebih  rendah  tersebut  ini  mungkin  disebabkan  pada susu  kambing  utuh  masih  banyak  mengandung komponen lain seperti lemak dan pengotor lain yang dapat  mengurangi  aktivitas  antioksidan. Rekomen- dasi untuk penelitian lebih lanjut dapat dilakukan se- kuensing  asam  amino  dari  fraksi  <10  kDa  hidrolisat P0  dan  fraksi  10-30  kDa  hidrolisat  P2  dengan  akti- vitas  antioksidan  tertinggi  untuk  mengetahui  susun- an  dan  komposisi  asam  amino  yang  memberikan aktivitas antioksidan.

## KESIMPULAN
Peptida  bioaktif  antioksidan  berhasil  diperoleh dari kasein dan papain dengan waktu hidrolisis 0, 1, 2,  dan  3  menit.  Kasein  susu  kambing  menunjukkan 6  pita  protein  dengan  berat  molekul  7-33  kDa, sedangkan  hidrolisat  yang  diperoleh  memiliki  berat molekul  sekitar  8  dan  5  kDa.  Hidrolisat  P0  dan  P2 mempunyai  aktivitas  antioksidan  yang  tinggi,  de- ngan  fraksi  yang  memiliki  aktivitas  antioksidan  ter- tinggi  adalah  fraksi  <10  kDa  pada  hidrolisat  P0  dan 10-30  kDa  pada  hidrolisat  P2.  Dapat  disimpulkan bahwa  peptida  dengan  aktivitas  antioksidan  yang berasal dari kasein susu Kambing peranakan etawa merupakan  peptida  dengan  berat  molekul  maksi- mum adalah <30 kDa.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  ucapan  terima  kasih kepada  LPPM  Unika  Atma  Jaya  yang  telah    men- danai  penelitian  ini  melalui  dana  hibah  Penelitian Fakultas.

## DAFTAR PUSTAKA
Bezerra  VS.  2013.  Biotechnological  richness  of  the northeastern  semi-arid  region:  Antioxidant  acti- vity  of  casein  hydrolysates  from  Moxoto  goat
milk  ( Capra  hircus Linnaeus)  obtained  by  pa- pain  action.  Food  Sci  Technol  33:  513-520. DOI: 10.1590/S0101-20612013005000074.
Chalabi M, Khademi F, Yarani R, Mostafaie A. 2014.
Proteolytic activities of kiwifruit actinidin ( Actini- dia  deliciosa cv.  Hayward)  on  different  fibrous and  globular  proteins:  A  comparative  study  of actinidin  with  papain.  Appl  Biochem  Biotechnol 172:  4025-4037.  DOI:  10.1007/s12010-014-08 12-7.
Costa WKA, Souza EL, Beltrao-Filho EM, Vasconce- los GKV, Santi-Gadelha T, Gadelha CAA, Fran- co  OL,  Queiroga  RCRE,  Magnani  M.  2014. Comparative  protein  composition  analysis  of goat  milk  produced  by  the  Alpine  and  Saanen breeds  in  Northeastern  Brazil  and  related antibacterial  activities.  PLos  One  9:  e93361. DOI: 10.1371/journal.pone.0093361.
He  F.  2011.  Bradford  Protein  Assay. Bio-101:  e45. DOI: 10.21769/BioProtoc.45.
Herlina  N,  Mustopa  AZ,  Surachma  RS,  Triratna  L, Kartina  G,  Alfisyahrin  WN.  2019.  Aktivitas  anti- bakteri  dan  antioksidan  peptida  susu  kambing hasil  hidrolisis  dengan  protease Lactobacillus plantarum S31. J Biol Indonesia 15: 23-31. DOI:
10.47349/jbi/15012019/23.
Janson  JC.  2012.  Protein  Purification:  Principles, High Resolution Method And Application.  4-21. John Willey and Sons, London.
Jung TH, Hwang HJ, Yun SS, Lee WJ, Kim JW, Ahn JY,  Jeon  WM,  Han  KS.  2017.  Hypoallergenic and physicochemical properties of the a2 β-ca- sein fraction of goat milk. Korean J Food Sci An 37:  940-947.  DOI:  10.5851/kosfa.2017.37.6. 940.
Kusumadjaja  AP,  Dewi  RP.  2010.  Determination  of optimum  condition  of  papain  enzyme  from  pa- paya  var  java  (C arica  papaya ).  Indonesian  J Chem 5: 147-151. DOI: 10.22146/ijc.21822.
Kusumaningtyas  E,  Widiastuti  R,  Kusumangingrum HD,  Suhartono  MT.  2015a.  Antimicrobial  and antioxidative  activities  of  peptides  from  goat milk  hydrolyzed  with  various  protease.  J  Ilmu Ternak dan Veteriner 20: 175-183. DOI: 10.143 34/jitv.v20i3.1184.
Kusumaningtyas  E,  Widiastuti  R,  Kusumangingrum HD, Suhartono  MT. 2015b. Aktivitas antibakteri dan  antioksidan  hirolisat  hasil  hidrolisis  protein susu kambing dengan ekstrak kasar bromelin. J Teknol  Industri  Pangan  26:  179-188.  DOI:  10. 6066/jtip.2015.26.2.179.
Lestari  D,  Soesilo  VV.  2017.  Aktivitas  antibakteri peptida kasein susu kambing hidrolisis oleh pa- pain terhadap Pseudomonas aeruginosa . J Ilmu
Pangan Hasil Pertanian 1: 81-92. DOI: 10.2687 7/jiphp.v1i2.1914.
Matsuura  Y,  Takehira  M,  Joti  Y,  Ogasahara  K, Tanaka  M,  Ono  N,  Kunishima  N,  Yutani  K. 2015.  Thermodynamics  of  protein  denaturation at temperatures over 100°C: CutA1 mutant pro- teins substituted  with hydrophobic and charged residues.  Scientific  Reports  5:  15545.  DOI:  10. 1038/srep15545.
Mohanty DP, Mohapatra S, Misra S, Sahu PS. 2016. Milk derived bioactive peptides and their impact on human health-a review. Saudi J Biol Sci 23: 577-583. DOI: 10.1016/j.sjbs.2015.06.005.
Padaga MC, Aulanni’am. 2017. Susu sebagai nutra- setika  untuk  penyakit  gangguan  metabolik.  26- 35. Universitas Brawijaya Press, Malang.
Park  YW.  1994.  Hypo-allergenic  and  therapeutic significance  of  goat  milk.  Small  Ruminant  Res 14:  151-159.  DOI:  10.1016/0921-4488(94)9010 5-8.
Purwanto  MGM.  2014.  Perbandingan  analisa  kadar protein  terlarut  dengan  berbagai  metode spektroskopi UV-visible. Tekno Sains 7: 1-71.
Ratya N, Taufik E, Arief II. 2017. Karakteristik kimia, fisik dan mikrobiologis susu kambing peranakan etawa  di  bogor.  J  Ilmu  Produksi  Teknol  Hasil Peternakan  5:  1-4.  DOI:  10.29244/jipthp.5.1.1- 4.
Rawlings  ND,  Salvesen  G.  2013.  Handbook  of Proteolytic  Enzymes.  Chapter  419  Papain. 1858-1861.  Academic  Press  is  an  imprint  of Elsevier, London.
Selvaggi  M,  Laudadio  V,  Dario  C,  Tufarelli  V.  2014. Major  proteins  in  goat  milk:  an  updated  over- view  on  genetic  variability.  Mol  Biol  Rep  41: 1035-1048. DOI: 10.1007/s11033-013-2949-9.
Singh  P,  Benjakul  S,  Masqsood  S,  Kishimura  H. 2011. Isolation and characterization of collagen extracted  from  skin  of  stripped  catfish  ( Panga- sianodon hypopthalamus ). Food Chem 124: 97- 105. DOI: 10.1016/j.foodchem.2010.05.111.
Sintae RN, Suwiti NK, Suardana IW. 2015. Karakte- ristik  protein  dan  asam  amino  daging  sapi  bali dan wagyu pada penyimpanan suhu dingin 4°C. Buletin Veteriner Udayana 7: 146-156.
Syukur  R,  Alam  G,  Mufidah,  Rahim  A,  Tayeb  R. 2011. Aktivitas antiradical bebas beberapa eks- trak tanaman familia Fabaceae. JST Kesehatan 1: 61-67.
Utami P, Lestari S, Lestari SD. 2016. Pengaruh me- tode pemasakan terhadap komposisi kimia dan asam  amino  ikan  seluang  ( Rasbora  argyro- taenia ).  Fish  TecH-J  Teknol  Hasil  Perikanan  5: 73-84.
Wang  J,  Su  Y,  Jia  F,  Jin  H.  2013.  Characterization of  casein  hydrolysates  derived  from  enzymatic hydrolysis.  Chem  Cent  J  7:  1-8.  DOI:  10.1186/ 1752-153X-7-62.
Yangilar  F.  2013.  As  a  potentially  functional  food:
Goat milk and products. J Food Nutr Res 1: 68- 81.
Zou  TB,  He  TP,  Li    HB,  Tang  HW,  Xia  EQ.  2016.
The structure-activity relationship of the antioxi- dant  peptides  from  natural  proteins.  Molecules 21: 1-14. DOI: 10.3390/molecules21010072.