Pengaruh Pemberian Ekstrak Tepung Kedelai Hitam ( Glycine soja) terhadap Histologi Ovarium Mencit ( Mus musculus L) Strain Swiss Webster Ovariektomi Unilateral
Effect of Black Soybean ( Glycine soja ) Extract on Ovarian Histology of Swiss Webster Mice ( Mus musculus L ) Unilateral Ovariectomy
Mahriani *) , Eva Tyas Utami, Nindita Fitria Primasari Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember * E-mail: yani_hendro@yahoo.com

## ABSTRACT
Estrogen production can be reduced due to menopause and ovariectomy. Decreased estrogen levels in the body cause physiological changes in the female reproductive system. Therefore, the intake of estrogen from outside the body is needed, in this case phytoestrogens from soy bean extract can be used  to  replace  the  role  of  endogenous  estrogen.  The  study  used  30  Swiss  Webster  mice  ( Mus musculus ) aged 90 days weighing 35 grams which were unilateral ovariectomy. Mice are ready to be used as test animals after an estrogen deficiency period of 60 days. Mice are ready to be used as test animals after an estrogen deficiency period of 60 days. Mice were divided into five groups: negative  control,  positive  control,  dose  0.21,  0.42,  and  0.63  g/mL/day  .  Data  obtained  from  the results of the study were analyzed using the One Way ANOVA test with a confidence level of 99% or α = 0.01. Based on the results of the study, the administration of black soybean flour extract in unilateral ovariectomy mice can increase the average number of primordial follicles at doses of 0.42 g/ml/day and dosage 0.63 g/ml/day, primary follicles at a dose of 0.42 g/ml/day and doses of 0.63 g / ml / day, and secondary follicles at a dose of 0.63 g/ml/day, and tend to increase the average number of  primordial  follicles  at  doses  of  0.21  g/ml/day,  follicles  primary  at  doses  of  0.21  g/ml/day, secondary follicles at doses of 0.21 g/ml/day and 0.42 g/ml/day, de Graaf follicles at doses of 0.21, 0. 42 and 0.63 g/ml/day.
Keywords: unilateral ovariectomy, phytoestrogen, ovary, black soybean.

## PENDAHULUAN
Estrogen  merupakan  salah  satu  hormon  yang berperan  penting  dalam  sistem  reproduksi betina.  Estrogen  berperan  dalam  merangsang perkembangan  kelenjar  mamae,  merangsang siklus  estrus  dan  persiapan  uterus  untuk implantasi (Hafez  &  Hafez,  2000).  Salah  satu peran  estrogen  tersebut  adalah  dalam pembentukan  dan  pematangan  ovum  atau folikulogenesis.  Folikulogenesis  merupakan proses  yang  panjang  sebelum  ovum  akan diovulasikan. Folikel dalam masa perkembangannya tergantung pada peningkatan kadar  estrogen,  khususnya  17-β  estradiol (Kolibianakis et al ., 2005). Jika terjadi kondisi penurunan  kadar  estrogen  maka  dapat berpengaruh terhadap proses pembentukan dan pematangan ovum tersebut. Kadar  estrogen  dalam  tubuh  dapat berkurang  akibat  menopause  dan  ovariektomi. Penurunan kadar  estrogen  dalam  tubuh menyebabkan  perubahan fisiologis pada sistem reproduksi    betina (Cassidy et  al., 1995) khususnya  pada  ovarium  sebagai  tempat terjadinya  folikulogenesis. Oleh  sebab  itu,
diperlukan  asupan  hormon  estrogen  dari  luar tubuh. Salah satu jenis estrogen dari luar tubuh dapat berupa fitoestrogen yang banyak dijumpai pada  jenis  kacang-kacangan.  Fitoestrogen tersebut dapat dimanfaatkan untuk menggantikan  peran  estrogen  yang  diproduksi dari dalam tubuh. Mekanisme kerja fitoestrogen dalam  jaringan  adalah  dengan  berikatan  pada reseptor estrogen (Markaverich et al ., 1995). Fitoestrogen  merupakan  suatu  senyawa fenolik  yang  yang  berasal  dari  tumbuhan  dan memiliki  sifat  estrogenik  karena  memiliki struktur  menyerupai  estrogen  pada  mamalia (Sirtori et  al. ,  2005).  Dengan  struktur  yang menyerupai  estrogen,  fitoestrogen  dapat berikatan  dengan  reseptor  estrogenik di  dalam sel  sehingga  dapat  bersifat  estrogenic  atau antiestrogenik  (Hwang  &  Choi, 2015). Fitoestrogen  dapat  digolongkan  menjadi isoflavon,  stilbene,  koumestan    dan  lignin (Moon et al ., 2006). Isoflavon merupakan salah satu  jenis  senyawa  flavonoid  yang  banyak dijumpai pada famili Leguminaceae antara lain pada  kacang  kedelai.  Diantara  jenis-jenis kacang  kedelai,  kedelai  hitam  memiliki
kandungan  senyawa  tanin,  antosianin  dan isoflavon  serta  memiliki  aktivitas  antioksidan lebih  tinggi  dibanding  kedelai  kuning  (Xu  &
Chang, 2007).  Kadar  flavonoid  total  yang tekandung dalam kedelai hitam sebesar 1,78 mg RE/g  sedangkan  kadar  flavonoid  total  yang terkandung  pada  kedelai  kuning  sebesar  0,57 mg RE /g (Ren et al ., 2011). Dengan kandungan flavonoid  yang  tinggi  tersebut,  kedelai  hitam dapat  dimanfaatkan  sebagai  salah  satu  sumber fitoestrogen  dari  luar  tubuh yang  berpengaruh terhadap sistem reproduksi betina. Salah  satu  organ  reproduksi  betina  yang dapat  dipengaruhi  oleh  fitoestrogen  adalah ovarium.  Ovarium  berfungsi  sebagai  tempat terjadinya pematangan sel telur melalui proses folikulogenesi  dan  menghasilkan  hormon reproduksi yaitu estrogen dan progesteron.

## METODE
Tempat penelitian Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium  Zoologi  dan Laboratorium  Botani  Jurusan  Biologi,  Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember.  Pembuatan  preparat  histologi  ovarium dilakukan di Balai Besar Penelitian Veteriner, Bogor.

## Alat dan bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  terdiri atas kandang  mencit  dan  penutup  dari  ram  kawat  besi, timbangan  analitik,  jarum  sonde  lambung  ujung tumpul,  botol  minum  mencit,  papan  bedah, spuit injection , silet, ekskavator, jarum sutura, klem arteri, needle  holder ,  pinset,  gunting, beaker  glass ,  botol scott , corong plastik kecil, pipet tetes, spatula, cawan porselen, rotary  evaporator,  waterbath,  rotary microtome ,  oven,  botol  reagen,  mikroskop,  optilab, staining jar , flakon, oven. Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  terdiri atas  mencit  ( Mus  musculus) ,  pakan  pellet  Turbo, aquades  steril,  ketamine  10%, xyla ,  benang  silk, benang catgut , sekam padi steril, serbuk gergaji kayu steril, betadine , alkohol 70%, antibiotik, cairan infus , kasa  steril, tissue , gloves ,  masker,  kedelai  hitam, chloroform ,  larutan  fiksatif  PBS  formalin,  parafin, gliserin  dan  albumin, alkohol  bertingkat,  alkohol absolut, pewarna Hematoxylin dan Eosin (HE), xylol, dan entelan.

## Ovariektomi mencit
Ovariektomi  adalah  pengambilan  ovarium  melalui pembedahan.  Prosedur  ovariektomi  dilakukan  pada mencit betina yang dibius dengan ketamil 10% dan xyla. Selanjutnya  dilakukan  pembedahan  secara perlahan  hingga  lapisan  muskulus  daerah  abdomen terbuka. Semua bagian organ reproduksinya diambil untuk  mencari  ovarium  kemudian  dijepit  dengan klem  arteri  dan  diikat  bagian  ujung  oviduk  dengan silk.  Salah  satu ovarium  dipotong  dan  arteri  klem arteri  dilepas.  Organ  yang  telah  dikeluarkan
direposisi kembali dalam abdomen dan diberi larutan Sodium Chloride 0,9 %. Proses  penutupan  dilakukan  pada  bagian muskulus dengan  cara  dijahit  menggunakan  jarum sutura.  Luka  akibat  pembedahan  diolesi  dengan betadin  pada  daerah  insisi.  Dilakukan  injeksi antibiotik (Levofloxacin )  pada  mencit serta paracetamol selama 1 minggu (Strom et al ., 2012).

## Pembuatan ekstrak tepung kedelai hitam
Biji kedelai hitam ditumbuk kemudian ditimbang dan dioven pada suhu 44-46ºC selama tiga hari kemudian digiling  dengan menggunakan grinder  hingga menjadi  tepung. Tepung  kedelai  hitam  yang diperoleh  diberi    pelarut  alkohol  70%.  Larutan dihomogenkan  dan  dimaserasi  selama  2  x  24  jam untuk memisahkan supernatan dan pelet. Supernatan disaring dengan kain saring dan kertas saring untuk mendapatkan  filtrat.  Filtrat  yang  diperoleh dimasukkan  ke  dalam rotary  evaporator dengan suhu  90 º C  hingga  diperoleh  filtrat  murni  tanpa alkohol,  kemudian  filtrat  dimasukkan  dalam waterbath untuk  mendapatkan  filtrat  murni  dalam bentuk pasta.

## Perlakuan hewan uji
Pada penelitian ini digunakan 30 ekor mencit betina strain  Swiss  Webster  yang  telah  diovariektomi unilateral dan dipelihara selama 60 hari untuk masa defisiensi estrogen. Mencit kemudian dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok kontrol dan kelompok perlakuan  ekstrak  tepung  kedelai  hitam.  Kelompok kontrol terdiri atas kontrol negatif yaitu mencit tanpa ovariektomi  unilateral  dan  tanpa  ekstrak  tepung kedelai  hitam  dan  kontrol  negatif  yaitu  mencit ovariektomi  unilateral  tanpa  ekstrak  tepung  kedelai hitam. Sedangkan kelompok perlakuan yaitu mencit ovariektomi unilateral diberi ekstrak tepung kedelai hitam  secara  oral (gavage) dengan  dosis  0,21 g/ml/hari,  0,42  g/ml/hari dan 0,63  g/ml/hari  selama 10  hari. Dosis  ini  diberikan  berdasarkan  hasil penelitian  Lestari  (2018)  yang  menunjukan  bahwa pemberian  ekstrak  tepung  kedelai  hitam  pada  masa implantasi  mencit  dengan  dosis  0,31  mg/mL meningkatkan  jumlah  implantasi  sedangkan pemberian  ekstrak  dengan  dosis  0,63 mg/mL menurunkan jumlah implantasi.
Mencit  dibedah  pada  hari  ke-11 untuk pengambilan  organ  ovarium,  dilanjutkan  dengan pembuatan preparat ovarium sehingga dapat diamati, pengamatan  meliputi  jumlah  folikel  primordial, folikel primer, folikel sekunder, dan folikel de Graaf.

## Pembuatan preparat histologi ovarium
Pengambilan sampel dilakukan dengan pembedahan pada  bagian  medial  perut  untuk  mengambil  organ ovarium. Selanjutnya metode yang digunakan untuk pembuatan  preparat  histologi  ovarium  dengan metode parafin dan pewarnaan Haemotoxylin Eosin . Metode  parafin  dilakukan  dengan  urutan  fiksasi, dehidrasi, clearing, infiltrasi, embedding, sectioning, affixing dan mounting (Suntoro,1983)

## Parameter yang diamati
Parameter  yang  diamati  adalah  jumlah  folikel primordial,  folikel  primer,  folikel  sekunder  dan folikel de Graaf menggunakan tiga kali pengulangan. Pengamatan  dilakukan menggunakan  mikroskop perbesaran 400x dan optilab.

## Analisis data
Data berupa  rata-rata jumlah  folikel  primordial, primer,  sekunder,  dan  de  Graaf dianalisis menggunakan  uji One  Way ANOVA  dengan  taraf kepercayaan  99  %  atau  α  =  0,01 kemudian dilanjutkan  dengan  Uji  Duncan untuk  melihat  beda nyata  antar  kelompok  perlakuan  (Steel & Torrie, 1993).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  penelitian  ini  dilakukan  pengamatan terhadap  jumlah  folikel  ovarium  mencit  strain Swiss  Webster  yang  diovariektomi  secara unilateral  pasca  pemberian  ekstrak  tepung kedelai  hitam.  Jumlah  folikel  ovarium  yang diamati  meliputi  rata-rata  jumlah  folikel primordial, folikel primer, folikel sekunder, dan folikel de Graaf.
Hasil  penghitungan  rata-rata  jumlah  folikel primordial, folikel primer, folikel sekunder dan folikel  de  Graaf  pada  mencit  strain  Swiss Webster  ovariektomi  unilateral  setelah  diberi perlakuan  ekstrak  tepung  kedelai  hitam  dapat dilihat pada Tabel 1. Berdasarkan hasil analisis One Way Anova pada  folikel  primordial  diperoleh  nilai signifikansi  p=0,000<0,01dan  pada  folikel primer diperoleh nilai signifikansi p=0,000<0,01.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa pemberian  ekstrak  tepung  kedelai  hitam berpengaruh  terhadap  rata-rata  jumlah  folikel primordial  dan  folikel  primer  mencit ovariektomi unilateral. Sedangkan pada folikel sekunder diperoleh nilai signifikansi p=0,014>0,01  dan  pada  folikel  de  Graaf diperoleh  nilai  signifikansi  p=0,034>0,01.  Hal ini  menunjukkan  bahwa  pemberian  ekstrak tepung  kedelai  hitam  tidak  berpengaruh terhadap  rata-rata  jumlah  folikel  sekunder  dan folikel de Graaf mencit ovariektomi unilateral. Hasil  uji  Duncan terhadap  rata-rata  jumlah folikel  primordial  dan  folikel  primer  pada kelompok  kontrol  negatif  dan  kontrol  positif terdapat perbedaan yang signifikan, namun pada rata-rata jumlah folikel sekunder dan folikel de Graaf terdapat perbedaan yang tidak signifikan tetapi  jumlahnya  cenderung  mengalami penurunan.  Pada  kelompok  kontrol  positif diduga terjadi defisiensi hormon estrogen akibat ovariektomi  unilateral yang  berpengaruh  pada
folikel primordial dan  folikel primer. Menurut Berkalani  (2013),  folikel  primordial dapat berkurang  jumlahnya  karena  mengalami degenerasi. Ovariektomi unilateral menyebabkan  penurunan  jumlah  folikel primordial  karena  folikel  primordial  akan mengalami atresi lebih banyak sehingga hanya sedikit  yang akan berkembang  menjadi folikel primer  (Meredith et al., 1992).  Penurunan jumlah  folikel  primer  akan  mengakibatkan penurunan jumlah folikel sekunder dan folikel de Graaf. Estrogen merupakan salah satu hormon yang berperan penting dalam perkembangan folikel. Berdasarkan  penelitian  Findlay et  al .  (2009), mencit  yang  mengalami  defisiensi  estrogen maupun  kerusakan  reseptor  estrogen  akan mengalami  hambatan  dalam  folikulogenesis, terutama  pada  perkembangan  folikel  sebelum matang.  Dalam  penelitian  ini  diketahui  bahwa dengan  adanya  ovariektomi  terjadi penurunan rata-rata  jumlah  folikel  primordial  dan  folikel primer  secara  signifikan.  Dengan  demikian ovariektomi  unilateral  yang  dilakukan  diduga mengakibatkan  penurunan  kadar  estrogen  di dalam tubuh yang berakibat pada perkembangan folikel  primordial  dan  folikel  primer.  Pada Tabel  1,  tampak  bahwa  penurunan  kadar estrogen  akibat  ovaiektomi  unilateral  tidak berpengaruh  secara  signifikan  pada  folikel sekunder dan folikel de Graaf.
Hasil uji Duncan menunjukkan bahwa pada penambahan ekstrak tepung kedelai dosis 0,21 g/ml/hari belum berpengaruh secara signifikan pada rata-rata jumlah folikel primordial, primer, sekunder  dan  de  Graaf.  Peningkatan  dosis ekstrak  tepung  kedelai  yang  diberikan  pada dosis 0,42 g/ml/hari mampu meningkatkan rata- rata  jumlah  folikel  primordial  dan  primer dibandingkan  K + namun  tidak  berbeda  nyata dengan pemberian ekstrak tepung kedelai pada dosis 0,21 g/ml/hari. Peningkatan dosis ekstrak yang diberikan tersebut juga tidak berbeda nyata terhadap  rata-rata  jumlah  folikel  sekunder  dan de  Graaf.  Pemberian  ekstrak  tepung  kedelai dosis 0,63 g/ml/hari  mampu meningkatkan rata- rata jumlah folikel primordial, primer, sekunder dan  de  Graaf.  Namun  demikian  peningkatan dosis yang diberikan tersebut tidak berpengaruh secara  signifikan  dibandingkan  pemberian ekstrak  tepung  kedelai  dosis  0,42  g/ml/hari pada  folikel  primordial  dan  folikel  primer. Bahkan  pada  folikel  sekunder  dan  folikel  de Graaf,  pemberian  ekstrak  pada  dosis  tertinggi tersebut  tidak  signifikan  dengan  pemberian
ekstrak  tepung  kedelai  pada  dosis  0,21 mg/ml/hari.
Peningkatan  rata-rata  jumlah  folikel  pada penelitian ini diduga karena adanya pemberian ekstrak  kedelai  hitam.  Kedelai  hitam mengandung  isoflavon  yang  strukturnya  mirip dengan estrogen endogen sehingga menyebabkan isoflavon dapat berikatan dengan reseptor  estrogen  (Mazur et  al., 1998). Peningkatan  rata-rata  jumlah  folikel  primer disebabkan karena adanya senyawa fitoestrogen dalam  ekstrak  tepung  kedelai  hitam  yang mampu  berikatan  dengan  reseptor  estrogen endogen  dalam  ovarium  (Couse  & Korach, 1999).  Estrogen  berperan  meningkatkan ekspresi  reseptor  FSH  sehingga  FSH  akan berikatan  dengan  reseptor  untuk  merangsang pertumbuhan dan perkembangan folikel (Rul et al .,  2016).  Menurut  Dewatiningrum  (2008), hormon estrogen berperan dalam meningkatkan jumlah  reseptor  FSH  pada  sel-sel  granulosa sehingga folikel ovarium mengalami perkembangan. Pemberian  dosis  ekstrak  tertinggi  tidak berpengaruh  signifikan  terhadap  rata-rata jumlah folikel primordial, primer, sekunder, dan de  Graaf  dibandingkan  dengan  pemberian ekstrak  dosis  0,42  g/ml/hari. Hal  ini diduga karena pengaruh fitoestrogen dalam menimbulkan  aksi  estrogenik  membutuhkan ketepatan dosis pemberian.
Menurut  Berkalani  (2013),  fitoestrogen bekerja  dengan  cara  berikatan  pada  reseptor estrogen  dan akan  menyebabkan  timbulnya aktivitas  estrogenik. Ketika  supply  estrogen dalam  tubuh  menurun,  dan  banyak  reseptor estrogen  tersedia  maka  adanya senyawa fitoestrogen  dapat  berikatan  dengan  reseptor estrogen tersebut meskipun afinitasnya rendah. Pada  perkembangan  folikel, fitoestrogen memiliki  kemampuan  dalam  menekan perkembangan  folikel,  sehingga  folikel  tetap berada pada tahap primer dan tidak berkembang menjadi  folikel  pada  tahap  selanjutnya (Mardiati & Sitasiwi, 2008). Menurut Markaverich et  al . (1995), mekanisme  kerja  fitoestrogen  dalam  jaringan adalah  dengan  berikatan  dengan  reseptor estrogen.  Namun  fitoestrogen  yang  berikatan dengan reseptor estrogen memiliki afinitas lebih rendah  daripada  estrogen  endogen  sehingga menyebabkan gangguan pada sistem neuroendokrin.  Selanjutnya  gangguan  pada sistem  neuroendokrin  tersebut  menyebabkan tertekannya perkembangan folikel ovarium. Tabel 1 Rata-rata jumlah folikel primordial, folikel primer, folikel sekunder dan folikel de Graaf mencit  strain  Swiss  Webster  ovariektomi  unilateral  setelah  pemberian  ekstrak  tepung kedelai hitam Perlakuan (g/ml/hari) x ∑ folikel primordial ( x ±SD) x ∑ folikel primer ( x ±SD)
x ∑ folikel sekunder
( x ±SD) x ∑ folikel de Graaf
( x ±SD)
K- 15,00±1,00 c 15,00±1,00 c 5,00±1,00 ab 2,66±0,76 a K+ 7,00±1,00 a 4,00±1,00 a 1,00±1,00 a 0,83±0,76 a 0,21 10,33±2,51 ab 6,66±1,32 ab 1,83±0,76 ab 1,00±0,50 a 0,42 14,00±1,00 bc 10,0±2,64 bc 1,83±0,76 ab 1,16±0,76 a 0,63 17,33±2,08 c 15,0±3,00 c 5,16±2,75 b 2,00±0,50 a
Keterangan:  Angka  yang  diikuti  huruf  berbeda  menunjukkan  berbeda  sangat  nyata  antar  dosis perlakuan (p<0,01). K-; mencit tanpa ovariektomi, tanpa pemberian eksktrak tepung kedelai. K+: mencit ovariektomi, tanpa pemberian eksktrak tepung kedelai
Gambar 1. Struktur histologi folikel primordial (A), folikel primer (B), folikel sekunder (C) dan folikel de Graaf (D) setelah pemberian ekstrak tepung kedelai hitam dengan pewarnaan
Haematoxylin Eosin (HE) perbesaran 400x
Whitten  dan  Patisaul  (2001)  membuktikan bahwa isoflavon dan lignan merupakan inhibitor bagi  5α-reduktase  dan  aromatase.  Enzim 5α- reduktase  berperan  dalam  proses  sintesis testosteron, sedang aromatase merupakan enzim yang berperan dalam pembentukan estron dari androstenedion.  Isoflavon  yang  menghambat aromatase  untuk  membentuk  estron  akan menyebabkan  tidak  terbentuknya  hasil  akhir berupa  estradiol  17β  sehingga  menekan perkembangan  folikel  ovarium,  selain  itu isoflavon mempengaruhi ketersediaan estrogen dengan  menghambat  17β  hidroksisteroid dehidrogenase  I  yang  juga  berperan  dalam pembentukan  estrogen.  Penghambatan  dalam pembentukan  estrogen  akan  menyebabkan perkembangan folikel ovarium terhambat. Hasil  uji Duncan terhadap rata-rata jumlah folikel  primordial,  folikel  primer,  folikel sekunder  dan  folikel  de  Graaf  menunjukkan bahwa pada perlakuan antar dosis 1, dosis 2, dan dosis 3 mengalami peningkatan. Semakin tinggi dosis yang diberikan maka semakin meningkat jumlah  rata-rata  folikel.  Menurut  Mardianti & Sitasiwi  (2008),  korelasi  antara  jumlah  folikel dengan  konsentrasi  estrogen  ternyata  terdapat korelasi positif yaitu semakin tinggi konsentrasi estrogen  semakin  meningkat  rata-rata  jumlah folikel.  Struktur  histologi  folikel  primordial, folikel  primer,  folikel  sekunder  dan  folikel  de Graaf  pada  pemberian  ekstrak  tepung  kedelai hitam  dapat  dilihat  pada  Gambar  1.  Pada
struktur  histologi ovarium  tidak  dijumpai kerusakan  struktur  jaringan  ovarium  maupun struktur  pada  folikel  primordial,  primer, sekunder,  maupun  folikel  de  Graaf  akibat ovariektomi  unilateral  maupun  pemberian ekstrak tepung kedelai hitam.

## KESIMPULAN
Kesimpulan  penelitian  ini adalah  pemberian ekstrak  tepung  kedelai  hitam  pada  mencit ovariektomi  unilateral  meningkatkan  rata-rata jumlah folikel primordial, folikel primer, namun tidak  berpengaruh  terhadap  rata-rata  jumlah folikel sekunder dan folikel de Graaf.

## DAFTAR PUSTAKA
Berkalani  YK.  2013. Pengaruh  Pemberian Infusa Biji Adas ( Foeniculum vulgare Mill.)
Terhadap  Perkembangan  Folikel  Ovarium Tikus  Putih  (Rattus  norvegicus)  Produktif Dan  Premenopouse .  Skripsi.  Fakultas
Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Cassidy A,  Bingham  S &  Setchell  K.  1995. Biological  Effects  of  Isoflavones  In  Young Women:  Importance  of  The  Chemical Composition  of  Soyabean  Products. British Journal of Nutrition. 74 : 587-601. Couse  JK  & Korach  KS.1999.  Estrogen Receptor Null Mice: What Have We Learned and  Where  Will They  Lead  Us? Endocrine Review . 20 (3): 358-417.
Dewantiningrum, J. 2008. Perbedaan Pengaruh
Clomiphene  Citrate  dan  Letozole  Terhadap Folikel,  Endometrium  dan  Lendir  Serviks.
Tesis .  Semarang:  Program  Pendidikan Dokter Spesialis I Universitas Diponegoro. Findlay JK. Kerr JB, Britt K, Liew SH, Simpson
ER,  Rosairo  D  &  Drummond  A.  2009.
Ovarian  Physiology:  Follicle  Development,
Oocyte  and  Hormone  Relationship. Anim. Reprod . 6 (1): 10-19. Hafez,  B.  &  Hafez,  E.  2000. Reproduction  in
Farm  Animal  7 th Edition .  USA.  Lippincott
William & Wilkins : Baltimore.
Hwang  KA  & Choi.  2015.  Endocrine-
Disrupting  Chemicals  with  Estrogenicity Posing  the  Risk  of  Cancer  Progression  in Estrogen-Responsives  Organ. Advances  in
Molecular Toxycology . 9.
Kolibianakis EM, Papanikolau EG, Fatemi HM &  Devroy  P.  2005.  Estrogen  and Folliculogenesis: Is One  Necessary for The Other? Curr.Opin.Obstet.Gynecol . 17 : 249- 253. Lestari  DW. 2018.  Efek  Pemberian  Ekstrak Tepung  Kedelai Hitam  ( Glycine  soja) terhadap Implantasi Mencit ( Mus musculus )
Strain Balb/C Pasca Ovariektomi Unilateral.
Skripsi.  Program Studi  S1-Biologi.  Jurusan Biologi FMIPA Universitas Jember. Mardianti  SM  &  Sitasiwi  AJ.  2008.  Korelasi Jumlah Folikel Ovarium dengan Konsentrasi Hormon  Estrogen  Mencit  ( Mus  musculus ) setelah  Konsumsi  Harian  Tepung  Kedelai selama  40  Hari. Buletin  Anatomi  dan Fisiologi . XVI (2). Markaverich  BM,  Webb  B,  Densmore  CL  &
Gregory RR. 1995. Effect of Coumestrol on
Estrogen    Reseptor  Function  and  Uterin Growth  in  Ovarietomized  Rats.
Environ
Health Perspect , 103 (6): 574-581. Mazur  WM,  Duke  JA,  Wahala  K,  Rasku  S  & Adlercretutz  H.  1998.  Isoflavonoids  and Lignans  in  Legumes:  Nutritiol  and  Health Aspect in Humans. Research
Communications
. 9 : 193-200. Meredith S, Dudenhorffer G, Butcher RL, Lener S P & Walls T. 1992. Unilateral Ovariectomy Increases Loss of Primordial Follicles and is Associated  with  Increased  Metestrus Concentration  of  Follicles  Stimulating Hormone  in  Old  Rats.
Biology  of Reproduction .
47 : 162-168.
Moon YJ, X Wang & Morris ME. 2006. Dietary flavonoids:  Effects  of  Xenobiotic and Carcinogen  Metabolism. Toxicol.  In  Vitro . 20 : 187-210.
Ren S-C,  Liu  ZL  & Wan, P. 2011. Proximate Composition and Flavonoids Content and In Vitro Antioxidant Activity of 10 Varieties of Legume Seeds Grown in  China. Journal of Medicinal Plants Research. 6 (2): 301-308. Rul  AS,  Soejono  SK,  Meiyanto  E  & Wahyuningsih MSH. 2016. Efek Kurkumin Terhadap  Estradiol  dan  Ekspresi  Reseptor Estrogen β Kultur Sel Granulosa Babi Folikel Sedang. Jurnal  Kedokteran  Brawijaya .
29 (1): 32-38. Sirtori  CR,  Arnoldi  A  &  Johnson.  2005. Phytoestrogens:  End  of  a  Tale?. Ann.Med .
37 : 423-438.
Strom JO, Theodorsson A, Ingberg E, Isaksson
IM & Theodorsson E.2012. Ovariectomy and 17  β-estradiol  Replacement  in  Rats  and Mice:  a  Visual  Demonstration. Journal  of Visualized Experiments . 64 : 1-4. Whitten  PL  &  Pattisaul  HB.  2001. Cross- species  dan  interassay  Comparison  of Phytoestrogen Action. Environmental Health Perspectives  Supplements. 109 .  Departmen Anthropology  and  Center  for  Behavioural Neuroscience  Emory  University.  Atlanta. Georgia USA.
Xu  BJ  &  Chang  SKS.    2007.  A  Comparative Study on Phenolic Profils and Antioxidant of Legums as Affected by Extraction Solvents.
J. Food Sci . 72 (2): 159-166.