## PENYIMPANAN SPERMATOZOA PADA SUHU PRESERVASI DAN BERBAGAI PENGENCER SEMEN TERHADAP DAYA TAHAN HIDUP SPERMATOZOA
Desy Septiani 1 , E. Mulyati Effendi 2 , Moerfiah 3
1 Puslit Biologi, Lembaga llmu Pengetahuan Indonesia
2,3 Program Studi Biologi, FMIPA, Universitas Pakuan, Bogor email : desyseptiani30@gmail.com

## ABSTRACT
The  purpose  of  this  research  is  to  know  the  quality  of  diluent  which  is  stored  at  room temperature  and  temperature  of  preservation  to  survival  of  spermatozoa,  to  know  the temperature  of  cement  storage  to  survival  of  spermatozoa  and  to  know  the  type  of  cement diluent  material  to  survival  of spermatozoa.  The  study  used  local sheep cement.  The  design used  was  Randomized  Block  Design  (RAK)  Factorial  pattern  with  2  treatment  of  storage temperature  ie  S1  =  room  temperature;  S2  =  preservation  temperature;  and  with  4  diluent treatment:  P1  =  yolk  citrate;  P2  =  skim  milk;  P3  =  liquid  milk;  P4  =  tris  of  soybeans.  The observed  variables  were  the  macroscopic  and  microscopic  cement  quality  prior  to  dilution, the  progressive  movement  of  sperm  from  each  diluent  and  the  progressive  movement  of sperm  at  each  storage  temperature.  The  administration  of  yolk  citrate  diluents  affects  the survival  of  spermatozoa  compared  with  other  diluents  (P>  0.05).  The  preservation temperature  gives  optimum  results  in  suppressing  the  rate  of  decline  in  survival  of spermatozoa (P <0.05). Giving yolk citrate stored at a preservation temperature is apparent in maintaining the survival of spermatozoa with 55% motility for three days.
Keywords : survival, spermatozoa, cement diluents, storage temperature

## PENDAHULUAN
Berbagai  upaya  dilakukan  untuk melindungi  satwa,  secara  garis  besar terdapat  dua  pendekatan  yang  dilakukan, yang  pertama  ialah  melalui  konservasi secara in-situ dengan melindungi habitatnya  dan  pendekatan  yang  kedua adalah  secara ex-situ melalui  usaha pemeliharaan dan pengembangbiakan satwa. Salah satu upaya untuk meningkatkan  potensi  suatu  hewan  adalah melalui  penerapan  teknologi  inseminasi buatan  (IB).  IB  dilakukan  melalui  proses penampungan semen, penilaian, pengenceran  dan  penyimpanan  semen (Preservasi).  Teknologi  ini  dapat  menjadi model  konservasi  terhadap  hewan-hewan langka,  buas  atau  liar  yang  sedang ditangkarkan  tetapi  tidak  dapat  kawin secara  normal  yang  disebabkan  oleh berbagai  faktor.  Akan  tetapi  untuk  dapat melakukan  IB  pada  hewan  liar  tidak mudah.  Menurut  UU  No.  18  tahun  2009
tentang  peternakan  dan  kesehatan  hewan pasal  27  ayat  4  menyatakan  pemanfaatan sumber daya genetik hewan asal satwa liar mengikuti  peraturan  perundang-undangan di  bidang  konservasi  sumber  daya  alam hayati  dan  ekosistemnya.  Untuk  itu diperlukan suatu objek yang dapat dipergunakan  sebagai  objek  penelitian, yaitu  dengan  mempergunakan  hewan percobaan.
Domba  lokal  merupakan  salah  satu ternak yang potensial untuk dikembangkan menjadi bibit yang unggul dan mempunyai peran penting dalam menyediakan swasembada  daging  secara  nasional  dan meningkatkan  pendapatan  petani  ternak sehingga  populasi  dan  produksinya  perlu diperhatikan (Rudiah, 2008).
Program  IB  akan  berhasil  dengan baik  apabila  sperma  diproduksi  dengan jumlah  dan  kualitas  yang  baik  (Toelihere, 1985).  Penambahan  bahan  pengencer bertujuan  untuk  menyediakan  sumber
energi  bagi  sperma  selama  penyimpanan (preservasi). Syarat penting bahan pengencer sperma adalah mampu menyediakan  bahan  makanan  spermatozoa untuk  proses  metabolisme  aerob  dan anaerob,  memberikan  imbangan  unsur mineral,  memiliki  lipoprotein  atau  lesitin untuk  melindungi  terhadap  kejutan  dingin, menjaga  pH  dan  tekanan  osmotik  yang sama  dengan  sperma  (Salisbury  dan VanDemark, 1985).
Beberapa  bahan  pengencer  sudah banyak  digunakan  untuk  meningkatkan daya  tahan  hidup  spermatozoa.  Sitrat kuning  telur  digunakan  sebagai  media hidup  sel  spermatozoa,  karena  semen  itu sendiri  mengandung  sitrat  natricus  yang merupakan  penyanggah  bersifat  isotonis, berguna  bagi  metabolisme  sel  dan  sebagai buffer dalam  mempertahankan  pH  (Foote, 1978 dalam
Herdiawan (2004). Sebagaimana diketahui susu skim dan susu cair  menagndung  zat  nutrisi  yang  dapat dimanfaatkan  oleh  spermatozoa  sebagai sumber energi dan memelihara kelangsungan hidup spermatozoa (Salisbury dan VanDemark, 1985). Kacang kedelai menjadi bahan pengencer alternatif karena  mengandung  lesitin  nabati  yang bersifat  membran coating untuk  tetap mempertahankan konfigurasi normal phospholipid  bilayer yang  merupakan susunan  utama  membran  spermatozoa (Aires et al., 2003).

## BAHAN DAN METODE
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  vagina  buatan, thermometer,  tabung  penampung  semen, tabung efendorf, haemocytometer, mikroskop, object  glass,  cover  glass, hotplate, stirrer, tabung erlenmeyer, tabung  reaksi,  timbangan  analitik,  kertas saring,  kertas  tissue,  lemari  pendingin. Bahan  yang  digunakan  adalah  asam  sitrat monohidrat, tris (hidroksimetil aminometan) ,  aquadest,  kuning  telur,  susu skim,  susu  cair  UHT  (merk  ultramilk),
kacang  kedelai,  NaCl  fisiologis,  fruktosa, antibiotik streptomisin dan penisilin, pewarna eosin negrosin dan alkohol.

## Penampungan Semen
Sebelum  melakukan  penampungan, alat-alat yang akan digunakan dipersiapkan dan dicuci bersih dan disterilisasi menggunakan  oven  dengan  suhu  170 o C. Selanjutnya bahan–bahan pengencer ditimbang  sesuai  komposisinya  masing– masing  di  dalam  pengencer.  Bahan pengencer  dibuat  satu  hari  sebelum penampungan  dan  disimpan  di  dalam lemari es.
Penampungan  semen  dilakukan  pada pagi  hari  sebanyak  tiga  kali.  Semen ditampung  menggunakan  vagina  buatan dengan  bantuan  hewan  betina  pemancing. Semen  yang  ditampung  sebanyak  tiga  kali dari tiga domba jantan kemudian dicampur menjadi satu.

## Evaluasi Semen
Pemeriksaan  semen  dilakukan  secara makroskopik dan mikroskopik untuk menentukan  kelayakan  penggunaannya. Penilaian semen menurut Afriantini (2012) adalah  sebagai  berikut:  Evaluasi  semen secara  makroskopik  dilakukan  sebagai berikut : a). Volume semen ; volume semen yang  diejakulasi  langsung  terbaca  pada tabung penampung berskala dan dinyatakan dalam mL/ejakulasi. b). Warna ;  penilaian  warna  semen  dilakukan dengan  melihat  langsung  semen  yang ditampung.  c) Konsistensi; konsistensi dari  semen  dapat  diperiksa  dengan  cara memiringkan  tabung  yang  berisi  sperma secara  perlahan-lahan.  Semen  yang  baik derajat kekentalannya akan bergerak sangat lambat mengikuti kemiringan  tabung penampung  dimana  hampir  semua  atau sedikit  lebih  kental  dari  susu.  d). pH (derajat  keasaman)  semen;  penilaian  pH semen dapat dilakukan dengan menggunakan indicator pH  atau  dengan menggunakan pH meter.
Evaluasi secara
mikroskopik dilakukan  sebagai  berikut  :  a). Gerakan massa; penilaiannya  meliputi,  (1)  melihat tebal tipisnya gelombang massa spermatozoa  dan  (2)  kecepatan  gelombang spermatozoa berpindah tempat. Nilai pergerakan  massa  ditentukan  dengan  skala +++/++/+/-. b). Gerakan
individu/
motilitas ;  penilaian  gerakan  spermatozoa secara  individual,  baik  kecepatan  atau perbandingan  antara  yang  bergerak  aktif progresif dengan gerakan–gerakan spermatozoa yang lainnya. Penilaian umumnya  dilakukan  secara  subjektif, dengan membagi kecepatan melalui penilaian  skor.  c). Konsentrasi  sperma ; diamati  menggunakan  haemocytometer Neubauer, konsentrasi spermatozoa merupakan  jumlah  spermatozoa  yang terkandung dalam setiap millimeter semen. Perhitungan  dilakukan  dari  5  kotak  besar dalam kotak hitung haemocytometer secara sistematis,  masing–masing  pada  random atau  secara  diagonal.  Untuk  menghitung jumlah  spermatozoa  per  mL  dalam ejakulat,  perhitungannya  menggunakan rumus
Jumlah spermatozoa/ mL = N X 5 X F P x 10.000.
d). Persentase  hidup  dan  spermatozoa abnormal ;  evaluasi  dilakukan  dengan menggunakan pewarnaan eosin.  Persentase sperma  yang  hidup  ditentukan  dengan rumus :
Persentase spermatozoa  hidup
=

## Pengenceran dan Penyimpanan Semen
Semen  yang  mempunyai  kualitas  yang baik  dibagi  menjadi  empat  bagian  dengan volume yang sama. Bahan-bahan pengencer  yang  digunakan  yaitu  sitrat kuning  telur,  susu  skim,  susu  cair  dan  tri sari  kedelai.  Pengenceran  dilakukan  dalam tabung  Erlenmeyer  dengan  memasukkan
semen  segar  ke  dalam  larutan  pengencer dimana  jumlah  pengencer  yang  digunakan tergantung  dari  konsentrasi  dan  motilitas spermatozoa  yang  dibagi  dengan  dosis  IB (semen  cair  domba  100  juta/mL),  volume total akan didapatkan dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

## X v. IB
Volume  bahan  pengencer  akan  didapatkan dengan menggunakan rumus :
Volume total – volume semen
Sedangkan  komposisi  bahan  pengencer dapat dilihat pada tabel beikut:

## Tabel 1. Komposisi Bahan Pengencer
Komposisi Bahan Pengencer P1 P2 P3 P4 Tris - - - 2.42 g As. Sirat 2.9 g - - 1.36 g Fruktosa 0.88 g - - 0.88 g Kuning telur 20 mL - - - Susu skim - 50 g - - Susu cair - - 250 - Kedelai - - - 25 g Aquadestilata  100 mL 250 mL - 250 mL Penicillin 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL strepromycin 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL Ket erangan : P1= Sitrat kuning telur; P2= Susu skim; P3= Susu cair; P4= Tris sari kedelai
Setelah semen dinilai dan diencerkan,  semen  disimpan  pada  suhu ruang  (27 o -30 o C)  dan  suhu  preservasi  (3 o - 5 o C).
Parameter  yang  diamati  dalam penelitian  ini  adalah  kualitas  semen  secara makroskopik  dan  mikroskopik,  gerakan progresif sperma dari setiap bahan pengencer  dan  gerakan  progresif  sperma pada setiap suhu penyimpanan.
Penelitian  ini  dirancang  dengan menggunakan  Rancangan  Acak  Kelompok (RAK) pola Faktorial 2x4 dengan tiga kali ulangan perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik semen segar
Semen  segar  merupakan  semen yang  didapat  segera  setelah  penampungan. Semen  domba  hasil  penampungan  segera dievaluasi  agar  diketahui  kualitas  dan kelayakannya  untuk  dapat  diolah  lebih lanjut.  Evaluasi  terhadap  semen  segar domba  lokal  hasil  penampungan  selama penelitian dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Kualitas Semen Segar Domba Lokal.
Karakteristik Kualitas Penampungan ke- Rataan ± SD 1 2 3 Volume ejakulat dari tiga ekor domba (mL) 1.1 1.8 1.5 1.47 ±0.35 Nilai rataan Volume semen/ekor (mL) 0.37 0.6 0.5 0.49 ±0.16 pH 6.5 6.7 6.5 6.5 ±0.11 Warna Krem Krem keruh Krem Krem Konsistensi Kental Agak kental Kental Kental Gerakan massa (+++) (+++) (+++) (+++) Motilitas (%) 80% 75% 80% 78.33 ±0.02 Konsentrasi (juta spermatozoa/mL) 2.135 1.255 1.365 1.585 ±0.48 Viabilitas (%) 77 82.4% 79.3% 79.5% ±43.98 Abnormalitas (%) 7% 5% 5% 5.6 ±0.01
Hasil evaluasi semen segar ini telah memenuhi  persyaratan  minimal  yang diperlukan  untuk  proses  pengenceran  dan dilakukan pendinginan dengan menyimpan pada  suhu  ruang  (27 o -30 o C)  dan  suhu preservasi (3 o -5 o C) untuk diketahui kualitas dan  daya  tahan  hidupnya.  Raatan  volume awal  semen  dari  satu  ekor  domba  adalah berkisar  antara  0.33-0.65  mL,  nilai  derajat keasaman  (pH)  semen  dari  ketiga  ulangan berkisar antara 6.39-6.6, rataan konsentrasi spermatozoa yang didapatkan dari sembilan  ejakulat  domba  lokal  tersebut adalah  1.585  juta/mL,  rataan  gerakan motilitas  progresif  spermatozoa  adalah sebesar  78.33%  ±  0.02,  persentase  hidup
spermatozoa  dari  penelitian  ini  adalah 79.5% dan persentase abnormalitas spermatozoa  yang  didapatkan  pada  semen segar  domba  lokal  dalam  penelitian  ini sebesar 5.6% ± 0.01.

## Daya Tahan Hidup Spermatozoa setelah Perlakuan
Daya  tahan  hidup  spermatozoa yang dimaksud adalah kemampuan spermatozoa  untuk  bertahan  hidup  selama penyimpanan  yang  diperlihatkan  melalui sanggupnya  bergerak  progresif.  Namun daya  tahan  hidup  spermatozoa  yang diamati  dalam  penelitian  ini  adalah kemampuan  spermatozoa  untuk  bertahan hidup selama motilitas spermatozoa tersebut  masih  berada  di  atas  motilitas spermatozoa  yang  layak  untuk  inseminasi buatan,  yakni  lebih  dari  50%  gerakan progresif  atau  maju  ke  depan.  Sedangkan persentase  hidup  di  bawah  50%  tidak  lagi dilakukan pengamatan.
Evaluasi daya tahan hidup spermatozoa dari pengaruh perlakuan  suhu diamati  setiap  harinya  dengan  10  kali pengamatan. Nilai rataan gerakan progresif spermatozoa setelah dilakukan pengenceran dengan beberapa bahan pengencer  dan  disimpan  pada  dua  suhu penyimpanan,  Data  tersebut  dapat  dilihat pada Tabel 3.

## Tabel 3. Rataan Daya Tahan Hidup Spermatozoa dalam Kombinasi
Perlakuan. Kombinasi Perlakuan Hari ke- Total Rataan 1 2 3 P1S1 72 58 48 178 59.33 b P2S1 67 55 0 122 40.67 ab P3S1 60 55 0 115 38.33 ab P4S1 58 35 0 93 31.00 a P1S2 80 70 55 205 68.33 b P2S2 67 58 42 167 55.67 ab P3S2 73 60 50 183 61.00 b P4S2 62 33 0 95 31.67 a Total 539 424 195 1158
Keterangan : Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama memperlihatkan perbedaan yang nyata (P<0.05). (P1=  Pengencer  sitrat  kuning  telur;  P2=  Pengencer  susu skim;  P3=  Pengencer  susu  cair;  P4=  Pengencer  tris  sari
kedelai; S1= Penyimpanan suhu ruang; S2= Penyimpanan suhu preservasi).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa  secara  umum  penambahan  sitrat kuning telur (P1) yang disimpan pada suhu preservasi  (S2)  mampu  memperpanjang daya  tahan  hidup  spermatozoa  selama  tiga hari  dengan  persentase  gerakan  progresif spermatozoa  yaitu  sebesar  55%  dibanding dengan kombinasi  perlakuan  yang lainnya. Dengan  demikian,  pengenceran  semen dengan  menggunakan  bahan  pengencer sitrat kuning telur yang disimpan pada suhu preservasi (3 o -5 o C) dapat digunakan untuk program  inseminasi  buatan  karena  nilai gerakan
motilitas
progresif
spermatozoanya  masih  lebih  besar  dari 50%.  Sedangkan  pengenceran  semen dengan  bahan  pengencer  lainnya  hanya bertahan  pada  hari  kedua  (P2S1  55%  P; P3S1 55% P dan P2S2 58% P) yang masih dapat  digunakan  untuk  IB.  Sedangkan untuk  kombinasi  perlakuan  P4S1  dan P4S2,  spermatozoa  hanya  betahan  selama satu hari saja.
Hasil  uji  statistik  menunjukkan bahwa  perlakuan  bahan  pengencer  dan suhu  penyimpanan,  masing  –  masing memperlihatkan  pengaruh  perbedaan  yang tidak nyata (P > 0.05) terhadap daya  tahan hidup  spermatozoa.  Namun,  bila  dilihat pada  Tabel  9,  bahwa  penambahan  bahan pengencer sitrat kuning telur (P1) memperlihatkan  pergerakan    progresif spermatozoa  lebih  tinggi  dari  bahan pengencer  lainnya  yaitu  sebesar  63.83%. Demikian juga pengaruh suhu penyimpanan  preservasi  (S2)  lebih  baik dalam  mempertahankan  daya  tahan  hidup spermatozoa,  yang  diperlihatkan  dengan gerakan  motilitas  progresif  spermatozoa yaitu  sebesar  54.17%.  Untuk  melihat pengaruh  antar  perlakuan  pengencer  dan antar  perlakuan  suhu  penyimpanan  maka pengujian
dilanjutkan
dengan menggunakan uji Duncant.
Dari hasil uji Duncant, menunjukkan  bahwa  perlakuan  bahan
pengencer  P1  tidak  berbeda  nyata  dengan bahan  pengencer  P2,  P3  dan  P4  dalam mempertahankan daya tahan hidup spermatozoa. Demikian pula dengan perlakuan  suhu  penyimpanan,  perlakuan suhu  penyimpanan  menunjukkan  adanya perbedaan yang nyata dimana penyimpanan  pada  suhu  S2  nyata  dalam mempertahankan  daya  hidup  spermatozoa. Data tersebut dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Pengaruh Bahan Pengencer dan Suhu Penyimpanan terhadap Rataan Motilitas Progresif Spermaozoa selama Tiga Hari.
Suhu Bahan Pengencer Rataan P1 P2 P3 P4 S1 59.33 40.67 38.33 31 42.33 a S2 68.33 55.67 61 31.67 54.17 b Rataan 63.33 a 48.17 a 49.66 a 31.33 a
Keterangan  :  Superskrip  yang  berbeda  pada  kolom yang  sama  memperlihatkan  perbedaan  yang  nyata (P<0.05).
Kombinasi  perlakuan  penambahan bahan  pengencer  pada  suhu  penyimpanan memperlihatkan  pengaruh  yang  nyata (P<0.05) terhadap ketahanan hidup spermatozoa.  Hal  ini  dapat  dilihat  pada Tabel  3  yang  menunjukkan  bahwa  nilai rataan  pemberian  bahan  pengencer  sitrat kuning telur (P1) yang disimpan pada suhu preservasi (S2) memperlihatkan daya tahan hidup  spermatozoa  yang  lebih  lama  (tiga hari)  dengan  gerakan  motilitas  progresif spermatozoa sebesar 55%. Hal ini memberikan  indikasi  bahwa  kuning  telur yang  memiliki  kandungan  lipoprotein  dan lesitin  memegang  peranan  yang  penting dalam  melindungi  spermatozoa  terhadap pengaruh  kejutan  dingin (cold  shock) dan dengan penambahan natrium sitrat berfungsi  sebagai  buffer  untuk  mengatasi peningkatan  pH.  Selain  itu  juga  terdapat fruktosa  yang  berfungsi  sebagai  cadangan energi  yang  sangat  dibutuhkan  dalam proses  metabolisme  sehingga  daya  tahan spermatozoa  dalam  pengencer  ini  lebih baik  dibandingkan  dengan  pengencer  lain.
Namun,  bila  dilihat  pada  Tabel  4 spermatozoa  yang  telah  diencerkan  yang disimpan  pada  suhu  preservasi  ketahanan hidup  spermatozoanya  lebih  lama  bila dibandingkan  dengan  penyimpanan  pada suhu ruang. Hal ini disebabkan karena pada suhu  3 o -5 o C  kecepatan  metabolisme  dan motilitas  spermatozoa  akan  menurun. Sedangkan  cepatnya  penurunan  motilitas pada  suhu  ruang  disebabkan  karena  pada suhu ruang metabolisme berlangsung cepat sehingga perombakan glukosa dan fruktosa yang  dibutuhkan  sebagai  sumber  energi untuk  pergerakan  spermatozoa  cepat  habis dan  hasil  sampingan  dari  metabolism  ini adalah asam laktat yang dapat meningkatkan pH pengencer. Hal ini sesuai dengan  pendapat  Bearden  dan  Fuquay (2000).
Rendahnya  persentase  spermatozoa hidup  pada  pengencer  susu  skim  dan  susu cair  kemungkinan  disebabkan  karena pemanasan  yang  urang  sempurna  atau belum  mencapai  suhu  98 o C  sehingga menyebabkan  spermatozoa  mati  dalam waktu dua sampai tiga hari. Susu cair yang dipakai  mempunyai  kandungan  lemak tinggi  yaitu  13%,  ini  menjadikan  gerakan spermatozoa terhambat. Salisbury dan Van Demark  (1985)  mengemukakan  bahwa kecepatan  gerak  spermatozoa  dipengaruhi oleh konsentrasi spermatozoa, umur spermatozoa,  dan  tingkat  viskositas  media pengencer.  Pengencer  tris  sari  kedelai memberikan  ketahanan  hidup  spermatozoa yang  paling  kecil  dengan  pengencer lainnya.  Hal  ini  diduga  disebabkan  pH pada pengencer tris sari kedelai terlalu basa (pH 8) diakibatkan pemanasan sari kedelai yang kurang sempurna.

## SIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian,  dapat disimpulkan bahwa : Pemberian pengencer sitrat  kuning  telur  memberikan  hasil  yang efektif  dibandingkan  dengan  pengencer susu  skim,  susu  cair  dan  tris  sari  kedelai dalam  memperpanjang  daya  tahan  hidup,
walaupun  pengaruhnya  tidak  nyata.  Suhu preservasi 3 o – 5 o C memberikan hasil yang optimum  dalam  menekan  laju  penurunan daya  tahan  spermatozoa  yang  diencerkan dalam berbagai bahan pengencer, walaupun  pengaruhnya  nyata.  Pemberian bahan  pengencer  sitrat  kuning  telur  yang disimpan  pada  suhu  preservasi,  nyata dalam  mempertahankan  daya  tahan  hidup spermatozoa  dengan  gerakan  motilitas progresif  sebesar  55%  pada  hari  ketiga, sehingga  masih  layak  untuk  digunakan inseminasi buatan.

## DAFTAR PUSTAKA
Aires V.A., K.D. Hinsch, F.M. Schloesser, F.M.  Schloesser,  K.  Bogner,  S.M. Schloesser  and  E.  Hinsch,  2003. In vitro and in  vivo comparison  of  egg yolk-based  and  soybean  lecithin based  extenders  for  cryopreservation of  bovine  semen. Theriogenology 60(2): 269-279.
Afriantini,  R.  I.  2012. Teknik  Koleksi  dan Evaluasi Semen pada Hewan. Institut Pertanian Bogor Press. Bogor Bearden,  H.J.  dan  J.W.  Fuquay.  2000.
Applied Animal Reproduction. 4 th ed.
Prentice  Hall, Upper  Saddle  River,
New Jersey. pp: 158−171.
Herdiawan. 2004. Pengaruh Laju Penurunan Suhu dan Jenis
Pengencer terhadap Kualitas Semen  Beku  Domba  Priangan. JITV Vol. 9 No 2 Th. 2004 Rudiah. 2008. Pengaruh Metode Perkawinan Terhadap Keberhasilan   Kebuntingan Domba  Lokal  Palu. J.  Agroland
15(3) : 236 – 240.
Toelihere,  M.R.  1985. Inseminasi  Buatan pada Ternak . Angkasa Bandung.
Salisbury,  G.  W.  Dan  N.  L.  VanDemark. 1985.  Fisiologi  Reproduksi  dan Inseminasi Buatan pada Sapi.
Terjemahan  R.  Djanuar.  Fakultas Peternakan Universitas
Gadjah Mada. Yogyakarta.