Gambaran histologis folikel ovarium sapi aceh pascavitrifikasi menggunakan etilen glikol
Arman Sayuti 1 , Jamilatun Hidayah 2 , Muslim Akmal 3 , Budianto Panjaitan 1, *
1 Laboratorium Klinik Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh
2 Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh
3 Laboratorium Biologi, Embriologi, dan Histologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh
ABSTRAK: Penelitian ini bertujuan mengetahui gambaran histologis folikel ovarium sapi aceh pasca vitrifikasi menggunakan etilen glikol (EG) dengan berbagai konsentrasi berbeda yaitu 10%, 20% dan 30%. Phosphate buffered saline (PBS), 0.25 M sukrosa,  0.5  M  sukrosa  dan  krioprotektan  EG  digunakan  sebagai  larutan  vitrifikasi.  Ovarium  dipaparkan  dengan  larutan mengandung  krioprotektan  EG  konsentrasi  10%,  20%,  dan  30%  selama  5  menit  masing-masing  pada  suhu  kamar,  dikemas dalam straw , lalu divitrifikasi dalam nitrogen cair (-196 ⸰C), dan thawing dalam air pada 37 ⸰C. Kondisi normal dan keutuhan folikel pascavitrifikasi diamati secara histologi. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa ovarium setelah vitrifikasi dengan EG 10%  dan  20%  memperlihatkan  presentase  keutuhan  folikel  32.83%  dan  45.04%,  sedangkan  EG  30%  memperlihatkan presentase  tertinggi  yaitu  54.96%.  Dari  hasil  penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  EG  30%  lebih  baik  dalam mempertahankan keutuhan folikel ovarium sapi aceh dibandingkan dengan EG 10%  dan 20%.
Kata kunci: krioprotektan, ethylene glycol, kriopreservasi, vitrifikasi

## ■ PENDAHULUAN
Sapi aceh merupakan salah satu jenis sapi potong lokal yang ada  di  Indonesia  selain  sapi  bali  dan  sapi  madura  hasil persilangan  antara  sapi  lokal  ( Bos  sondaicus )  dengan  sapi turunan  zebu  dari  India  ( Bos  indicus )  (Basri,  2006).  Sapi potong  lokal  memiliki  produktivitas  dan  efisiensi  ekonomi yang  maksimal  pada  kondisi  yang  terbatas  sehingga  lebih tepat  dan  ekonomis  dikembangkan  pada  pola  dan  kondisi peternakan  rakyat  (Romjali  et  al,  2007).  Salah  satu  upaya untuk  menjaga  populasi  sapi  aceh  adalah  melalui  produksi embrio dengan teknologi fertilisasi in vitro (IVF). Teknologi IVF  saat  ini  memanfaatkan  ovarium  segar,  namun  tidak dapat  disimpan  dalam  waktu  yang  lama  pada  suhu  kamar (Vieira  et  al. 2002).  Keterbatasan  waktu  simpan  ini  dapat diatasi  dengan  teknik  penyimpanan  beku  dengan  metode vitrifikasi sehingga viabilitas folikel dapat dipertahankan.
Metode  vitrifikasi  menggunakan  krioprotektan  Etilen Glikol  (EG).  Etilen  Glikol    memiliki  toksisitas  yang  lebih rendah  dibanding  DMSO,  Propilen  glikol,  atau  gliserol. Etilen  glikol  merupakan  salah  satu  krioprotektan  memiliki tingkat toksisitas paling rendah, daya permeasi cepat (Lucci et al. 2007). Mohamad (2005) menunjukkan bahwa ovarium mencit  mampu  tumbuh  setelah  vitrifikasi  menggunakan krioprotektan EG 30%. Sedangkan penggunaan konsentrasi EG  30%  dan  waktu  pemaparan  5  menit  cukup  memadai untuk  vitrifikasisel  sel  telur  domba  (Djuwita  et  al.,  2000). Kemampuan  EG  dalam  melindungi  folikel  saat  vitrifikasi ovarium sapi aceh belum dilaporkan.

## ■ MATERI DAN METODE
Koleksi  Ovarium: Ovarium  sapi  aceh  hasil  koleksi  dari RPH  sesampai  di  laboratorium  dibersihkan  dari  jaringan lain menggunakan gunting dan pinset. Ovarium ditempatkan dalam petri dish berisi larutan garam fisiologis 0,9% yang mengandung antibiotik penisilin G 100 IU/ml.
Teknik Vitrifikasi Ovarium: Vitrifikasi ovarium dilakukan seperti  metode  vitrifikasi  sel  telur  (Djuwita  et  al.  2000) dengan  sedikit  modifikasi.  Ovarium  dipaparkan  secara berurutan  dalam  larutan  PBS  +  sukrosa  0.25  M;  PBS  + sukrosa 0.5 M; PBS + sukrosa 0.5 M + krioprotektan 10%; dan  PBS  +  sukrosa  0.5  M  +  krioprotektan  EG  10%,  20% dan 30% selama masing-masing 5 menit. Ovarium dikemas dalam straw ,  dipaparkan  pada  uap  nitrogen  cair  selama  10 detik  dan  langsung  dimasukkan  kedalam  nitrogen  cair. Ovarium  dibiarkan  di  dalam  nitrogen  cair  minimal  selama 30  menit  lalu  dilakukan  penghangatan. Straw diambil  dari nitrogen  cair,  dibiarkan  di  udara  selama  10  detik  lalu dimasukkan  kedalam  air  dengan  suhu  37  °C  sampai mencair.  Segera straw dipotong,  jaringan  ovarium dikeluarkan dan dimasukkan berturut-turut kedalam larutan PBS + sukrosa 0.5 M; PBS + sukrosa 0.25 M; dan PBS (3 kali) selama masing-masing 5 menit.
ISSN 2581-2416 DOI: http://dx.doi.org/10.29244/avl.3.1.3-4 http://journal.ipb.ac.id/index.php/arshivetlett
Diterima: 31-10-2018 | Direvisi: 29-12-2018 | Disetujui: 05-01-2019 © 2018 CC-BY-SA. Ini adalah artikel Open Access yang didistribusikan ber- dasarkan ketentuan dari Creati ve Commons Attribution ShareAlike 4.0 Inter- national License ( https://creativeco mmons.org/licenses/by-sa/4.0/ ).
Pemeriksaan  Histologi: Jaringan  ovarium  didehidrasi dalam  alkohol,  dijernihkan  dalam  silol,  dan  ditanam  dalam parafin.  Jaringan  disayat  secara  serial  dengan  ketebalan  5 μm.  Preparat  dideparafinisasi,  direhidrasi,  dan  diwarnai dengan hematoksilin-eosin (HE).
Analisis Data: Data sajikan secara deskriptif.

## ■ HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian terhadap ovarium sapi aceh pascavitrifikasi dalam penelitian ini ditampilkan pada Tabel 1. Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi EG 30% memiliki presentase  tertinggi  dalam  mempertahankan  keutuhan ovarium  sapi  aceh,  sedangkan  presentase  terendah  pada konsentrasi  EG  10%.  Konsentrasi  EG  10%  dan  EG  20% banyak ditemukan folikel yang mengalami kerusakan.

## Tabel 1 Presentase folikel utuh pascavitrifikasi
Kelompok Perlakuan Folikel Utuh (%) EG 10% 32.83 EG 20% 45.04 EG 30% 54.96
Kerusakan folikel dapat disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu:  Pertama,  konsentrasi  krioprotektan  yang  digunakan tidak  memadai  untuk  mencegah  pembentukan  kristal  es intraseluler dan melindungi ovarium dari kerusakan selama proses  pembekuan.  Kristal  es  intraseluler  secara  mekanis dapat merusak organel sel, sehingga menyebabkan kematian sel  (Gao  &  Critser  2000).  Kedua,  waktu  pemaparan  yang kurang lama sehingga krioprotektan yang masuk (penetrasi) ke  dalam  jaringan  ovarium  tidak  mencukupi.  Ketiga, penggunaan  kemasan straw meningkatkan  volume  larutan dan  barier  antara  larutan  dengan  nitrogen  cair  sehingga mengurangi  kecepatan  penurunan  suhu  saat  vitrifikasi  dan kecepatan  pencairan  kembali  saat warming .  Kecepatan penurunan suhu dan pencairan kembali saat warming sangat mempengaruhi keberhasilan vitrifikasi (Vajta et al. 1998).
Hasil  pemeriksaan  histologis  ovarium  sapi  aceh  yang divitrifikasi  dengan  kriopotektan  EG  konsentrasi  10%  dan 20%  tampak  mengalami  kerusakan  dan  lisis  pada  sel-sel folikel  (Gambar  1A,B)  serta  30%  memiliki  kualitas  yang lebih  baik  (Gambar  1C,D).  Morfologi  ovarium  setelah vitrifikasi  mengalami  kerusakan  pada  jaringan  ovarium berupa  pecahnya  sel-sel  folikel,  piknotik  inti  sel  korteks, robeknya  sel-sel  granulosa  dan  oosit.  Kerusakan  robeknya sel-sel  granulosa  yang  mengelilingi  sel  telur.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  vitrifikasi  menggunakan  EG  10%  dan EG  20%  menurunkan  kualitas  ovarium  sapi  aceh.  Hal tersebut  mungkin  dikarenakan  konsentrasi  krioprotektan yang digunakan tidak memadai untuk mencegah pembentukan  kristal  es  intra  seluler  dan  melindungi ovarium  dari  kerusakan  selama  proses  pembekuan.  Secara mikroskopis ovarium sapi aceh yang divitrifikasi menggunakan  EG  30%  dapat  dilihat  seperti:  sel  teka eksterna,  sel  teka  interna,  sel-sel  granulosa,  zona  pelusida dan  oosit  masih  dalam  keadaan  normal  tidak  mengalami lisis dan kematian pada sel-sel folikelnya.
Gambar 1 Histologis folikel ovarium sapi aceh pasca vitrifikasi menggunakan EG 10% (A), 20% (B), dan 30% (C-D). (A-B) Folikel sekunder (tanda panah) mengalami kerusakan dan lisis pada sel-sel folikel, (C)  Folikel sekunder, (D) Folikel tertier, (C- D) Folikel dan sel telur terlihat normal (tanda panah).

## ■ SIMPULAN
Bahan  krioprotektan  etilen  glikol  dalam  media  preservasi konsentrasi  30%  yang  sangat  baik  untuk  kriopreservasi ovarium sapi aceh dengan metode vitrifikasi.

## ■ INFORMASI PENULIS

## Penulis untuk Korespondensi
*BP: budi@unsyiah.ac.id Laboratorium  Klinik Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh

## ■ PUSTAKA ACUAN
Basri  H.  2006.  Penelusuran  Arah  Pembibitan  Sapi  Aceh.  Jurusan Peternakan  Fakultas  Pertanian  Universitas  Syiah  Kuala Darussalam, Banda Aceh.
Djuwita  I,  Boediono  A,  Sukra  Y.  2000.  Morphology  and fertilization rate  of  vitrified ovine oocytes matured in  vitro.  14th International Congresson Animal Reproduction. Stockholm, July 2-6. Abst. 2:202.
Gao D, Critser JK. 2000. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J, 41: 187-196.
Lucci  CM,  Schreier  LL,  Machado  GM,  Amorim  CA,  Bao  SN,
Dobrinsky  JR.  2007.  Effects  of  storing  pig  ovaries  at  4  or  20oC for  different  periods  of  time  on  the  morphology  and  viability  of pre-antral follicles. Reprod Dom Anim, 42: 76–82.
Mohamad K, Djuwita I, Boediono A, Supriatna I. 2005. Vitrifikasi ovarium  mencit  menggunakan  etilen  glikol  dan  DMSO  sebagai krioprotektan  dan  viabilitasnya  pasca  auto  transplantasi  di subkapsula ginjal. Media Kedokteran Hewan, 21:23-27.
Romjali  E,  Mariyono  W,    Hartati  DB.  2007.  Rakitan  Teknologi Pembibitan  Sapi  Potong.  Loka  Penelitian  Sapi  Potong,  Grati  – Pasuruan. Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Jawa Timur.
Vajta  G,  Holm  P,  Kuwayama  M,  Booth  PJ,  Jacobsen  H,  Greve  T, Callesen  H.  1998.  Open  pulled  straw  (OPS)  vitrification:  a  new way  to  reduce  cryoinjuries  of  bovine  ova  and  embryos.  Mol Reprod Dev, 51: 53-58.
Vieira  AD, Mezzalira  A, Barbieri DP,  Lehmkuhl RC, Rubin MIB, Vajta  G.  2002.  Calves  born  after  open  pulled  straw  vitrification of immature bovine oocytes. Cryobiology, 45:91-94.