Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra
# Korespondensi:  Balai  Riset  Perikanan  Budidaya  Air  Tawar  dan Penyuluhan  Perikanan.
Jl.  Sempur  No.  1,  Bogor  16129,  Indonesia Tel.  +  62  21  8313200 E-mail:  nunak.nafiqoh@kkp.go.id

## KOMBINASI  SIRIH  DAN  KIPAHIT  SEBAGAI  IMUNOSTIMULAN TERHADAP PENYAKIT Streptococcosis PADA IKAN NILA (Oreochromis  niloticus)
Nunak  Nafiqoh # ,  Septyan  Andriyanto,  Hessy  Novita,  Desy  Sugiani,  dan  Taukhid
Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan Jl. Sempur  No. 1, Bogor 16129
(Naskah  diterima:  20  Juli  2020;  Revisi  final:  22  Maret  2021;  Disetujui  publikasi:  22  Maret  2021)

## ABSTRAK
Serangan  penyakit  yang  paling  banyak  ditemui  menyerang  kegiatan  budidaya  ikan  nila  adalah  bakteri Streptococcus agalactiae sebagai salah satu agen penyakit Streptococcosis. Peningkatan sistem imun dari ikan yang  dibudidayakan  merupakan  cara  yang  efektif  untuk  menanggulangi  masalah  tersebut.  Salah  satu fungsi tanaman obat adalah sebagai imunostimulan, di mana sistem imun akan meningkat terutama saat mengalami wabah penyakit ikan. Penelitian ini di tujukan untuk mengetahui efek penggunaan kombinasi ekstrak tanaman sirih dan kipahit dengan dosis yang berbeda terhadap respons imun bawaan dari ikan nila. Dosis yang  digunakan adalah 1%, 2%,  4%, dan 8% per  kg pakan pemberian pakan  dilakukan selama empat  minggu,  diikuti  dengan  uji  tantang  menggunakan  bakteri  patogen S.  agalactiae.  Meskipun  tidak terlihat perbedaan yang nyata, namun rerata respons imun hematokrit, eritrosit, leukosit, fagositik oksidase, dan  lisosim  pada  kelompok  perlakuan  menunjukkan  nilai  yang  yang  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan kontrol. Perbedaan yang signifikan ditunjukkan oleh sintasan, di mana kelompok perlakuan mempunyai nilai sintasan yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol. Hasil tersebut diduga disebabkan oleh  kandungan  bahan  aktif  yang  terdapat  dalam  tanaman  obat.  Sehingga  penggunaannya  mampu bertindak sebagai sebagai upaya pencegahan dari infeksi bakteri patogen S. agalactiae. Perlu diketahui juga apakah kombinasi yang digunakan mampu bertindak untuk terapi (pengobatan).
KATA KUNCI: sirih; kipahit; imunostimulan; streptococcosis; Oreochromis niloticus
ABSTRACT: Effects of betel and mexican sunflower combination as immunostimulant against Streptococcosis in nile tilapia (Oreochromis niloticus). By: Nunak Nafiqoh, Septyan Andriyanto, Hessy Novita, Desy Sugiani, and Taukhid
Streptococcosis disease in nile tilapia culture is caused by Streptococcus agalactiae, a bacterium commonly found in freshwater systems. Vaccines and probiotics have been used to prevent the disease outbreaks. However, increasing the innate immune system of cultured fish is more effective in preventing the disease. Medicinal plants have immunostimulant properties, which could be used as an alternative prevention measure against Streptococcosis. This research aimed to determine the effects of betel and kipahit combination as immunostimulant against S. agalactiae in nile tilapia. The combinations consisted of four different doses of 1%, 2%, 4%, and 8% of the plants’ extracts per kg of feed. Feeding experiment was carried out for four weeks, followed by a challenge test using the pathogenic bacteria S. agalactiae. Despite no observable significant differences, haematocrit, erythrocyte, leukocyte, phagocytic oxidase, and lysozyme in the treatment group showed higher values than the control. The treatment groups also had better survival rates than the control group. These results indicate the presence of active compounds within the medicinal plants. In conclusion, supplementation of the plants’ active compounds in feed has the potential as immunostimulant agents in tilapia to prevent Streptococcosis disease caused by pathogenic bacteria S. agalactiae. Determining the capability of this plant combination as a therapeutic agent against S. agalactiaeis an interesting future research direction to be pursued.
KEYWORDS: betel; kipahit; immunostimulant; streptococcosis; Oreochromis niloticus

## PENDAHULUAN
Aktivitas perikanan budidaya dewasa ini menjadi industri yang cukup menjanjikan, hal ini disebabkan karena produk budidaya telah memenuhi kebutuhan bahan pangan berupa ikan segar. Hal tersebut memicu terjadinya intensifikasi kegiatan budidaya di Indone- sia  dan  juga  di  negara  lainnya.  Intensifikasi  tanpa pengelolaan  yang  tepat  mengakibatkan  timbulnya masalah dalam kegiatan budidaya, salah satunya adalah penyakit yang menyerang kegiatan budidaya.
Penyakit  yang  cukup  menjadi  kendala  dalam kegiatan budidaya adalah penyakit yang disebabkan oleh bakteri sebagai agen. Bakteri penyebab penyakit yang mampu menyebabkan kerugian hingga 30%-40% adalah Streptococcus agalactiae, bakteri ini merupakan penyebab utama penyakit streptococcosis pada ikan (Lusiastuti  et  al.,  2016).  S.  agalactiae  adalah  bakteri gram-positif yang berbentuk bulat berantai (Strepto- cocci), bersifat non-hemolitik dan hemolitik baik al- pha ataupun beta, menyerang hewan akuatik, terres- trial dan mamalia juga manusia, beberapa jenis ikan yang sudah diketahui rentan terhadap serangan bakteri Streptococcus  antara  lain  dari  golongan  ikan  kakap, salmon, belanak,  kerapu, trout,  dan tilapia  (Amal & Zamri-Saad, 2011).
Pada proses budidaya ikan nila, bakteri Streptococ- cus merupakan penyebab penyakit utama yang mampu mengakibatkan kerugian yang cukup besar. Indonesia adalah negara kedua terbesar dalam produksi ikan nila setelah  Cina  Indonesia  (Mapfumo,  2018).  Sehingga keberadaan  penyakit  akibat  bakteri  Streptococcus menjadi perhatian yang cukup besar dari pemerintah. Beberapa cara telah dikembangkan untuk mengatasi penyakit  akibat  bakteri  Streptococcus,  antara  lain vaksinasi dan probiotik. Namun kekayaan biodiversitas berupa  tanaman yang  dapat  berfungsi sebagai  obat sangat sayang untuk tidak dimanfaatkan; selain itu, tanaman obat-obatan banyak tumbuh di sekitar kolam pemeliharaan.
Daun kipahit  adalah salah  satu tumbuhan  perdu yang  ada  di  sekitar  kolam  pemeliharaan.  Tanaman kipahit  sendiri  merupakan  tanaman  yang  jarang dimanfaatkan oleh manusia, meskipun mengandung senyawa yang dapat bertindak sebagai anti-oksidan, anti-bakteri,  dan  anti-inflamasi  (Chukwuka  &  Ojo, 2014).  Sedangkan  sirih  merupakan  obat  tradisional yang banyak digunakan di Indonesia, dikenal sebagai anti-bakteri,  anti-oksidan,  dan  mempunyai  aktivitas imunomodulasi (Pradhan et al., 2013). Kedua bahan tersebut  terbukti  sebagai  anti-bakteri  dengan  dosis berbeda  saat  diujikan  pada  bakteri  Aeromonas hydrophila (Nafiqoh et al., 2019).
Beberapa studi tentang penggunaan bahan tanaman obat  menunjukkan  bukti  efikasi  dari  tanaman  obat yang digunakan baik digunakan secara tunggal ataupun kombinasi, namun studi lanjutan menegaskan bahwa kombinasi dari tanaman obat mempunyai efikasi yang lebih baik sebagai obat (Che et al., 2013; Ji et al., 2007). Oleh karena itu, studi ini dilakukan untuk mengetahui prospek  tanaman  obat  sirih  dan  kipahit  yang dikombinasikan dengan dosis yang berbeda sebagai peningkat  sistem  imun  pada  ikan  nila  yang  diuji tantang dengan bakteri Streptococcus agalactiae.

## BAHAN DAN METODE

## Tanaman  Obat
Tanaman  obat  berupa  daun  sirih  dan  kipahit didapatkan dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (Balittro), Bogor berupa serbuk kering. Serbuk dikombinasikan dengan perbandingan daun sirih dan kipahit adalah 1:32.

## Persiapan  Pakan  dan  Pemeliharaan  Ikan
Tanaman obat serbuk sirih dan kipahit direndam dalam akuades dengan dosis 1, 2, 3, 4, dan 8 g 100 mL -1 akuades  selama  semalam,  kemudian  disaring menggunakan  kertas  saring  Whatman  (N°41)  dan disemprotkan  pada  100  g  pakan,  pakan dikeringanginkan dan disimpan dalam wadah bersih tertutup, sedangkan pakan kontrol merupakan pakan yang tidak ditambahkan tanaman obat.
Ikan nila berukuran 10 ± 2 cm dipelihara dalam bak bervolume 40 liter dengan kepadatan 2 ekor L -1 . Ikan dipelihara selama empat minggu dengan diberikan pakan  perlakuan  sebanyak  3%  dari  biomassa.  Pada akhir pemeliharaan ikan diuji tantang menggunakan bakteri  patogen  S.  agalactiae  dan  kematian  diamati sampai hari ke-4 pasca uji tantang. Setiap kelompok perlakuan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan.

## Pengambilan  Sampel
Pengambilan sampel dilakukan pada jam ke-24 pasca uji tantang. Sampel yang diambil adalah darah yang diambil menggunakan spuit 1 cc, darah dibagi menjadi dua bagian, satu bagian dicampur dengan 3,8% natrium sitrat sebagai anti-koagulan dan satu bagian didiamkan selama  dua  jam  pada  suhu  ruang  untuk  disentrifus untuk koleksi serum, serum yang dikoleksi kemudian disimpan pada suhu -20°C untuk uji lisosim. Sedangkan darah dengan anti-koagulan digunakan untuk analisis jumlah eritrosit, leukosit,  dan fagositik oksidase.

## Eritrosit  dan  Leukosit
Jumlah  eritrosit  dan  leukosit  dilakukan  sesuai prosedur yang telah dijelaskan oleh Ngugi et al. (2015).
Untuk menghitung eritrosit, darah yang telah dicampur dengan anti-koagulan dilarutkan dengan Dacie’s fluid (1  mL  formaldehyde,  3  g  trisodium  citrate,  99  mL akuades). Sedangkan untuk menghitung leukosit darah yang telah dicampur dengan anti-koagulan dilarutkan dengan Turk’s Fluid (1 mL crystal violet; 0,5 mL asam asetat  glasial;  100  mL  akuades).  Sampel  kemudian diteteskan  pada  hemocytometer  dan  dihitung  di bawah mikroskop. Perhitungan eritrosit dan leukosit mengikuti rumus:

## Respons  Imun
Respons imun yang diukur adalah aktivitas lisosim dan  fagositik  oksidase,  aktivitas  lisosim  diukur menggunakan metode Ellis (1990). Sebanyak 10 mL serum diinkubasi dalam 190 mL suspensi Micrococcus lysodeikticus (0,05 M Na 2 H 2 PO 4 dalam akuades steril. Sampel dibaca sesaat penambahan suspensi dan lima menit setelah inkubasi pada suhu 24°C dengan panjang gelombang 530 nm.
Aktivitas fagositik oksidase diukur menggunakan nitroblue tetrazolium (NBT) diukur mengikuti metode Kumar et al. (2008). Sebanyak 20 mL darah dimasukkan dalam sumur 96-well plate dan diinkubasi selama satu jam pada suhu 27°C, sumur dicuci menggunakan phos- phate buffer saline (PBS) dan ditambahkan NBT sebanyak 20 mL dan diinkubasi selama satu jam. NBT dibuang dan ke dalam sumur dimasukkan fiksatif berupa 95% methanol  selama  tiga  menit,  diikuti  30%  metanol selama  tiga  menit.  kemudian  ke  dalam  sumur dimasukkan 70 mL DMSO dan 60 mL KOH (1 M). Sampel dibaca dengan panjang gelombang 540 nm.

## Uji  Tantang
Uji tantang menggunakan bakteri S. agalactiae yang merupakan koleksi dari Instalasi Riset Pengendalian Penyakit  Ikan  (IRPPI),  Depok.  Bakteri  ditumbuhkan dalam media tryptic soy broth (TSB, Oxoid) selama 48 jam  pada  suhu  30°C.  Kemudian  bakteri  diencerkan dalam PBS hingga mencapai kepadatan 10 5 CFU mL -1 . Sebanyak  100  mL  bakteri  yang  telah  diencerkan diinjeksikan secara intramuscular pada minggu ke-4 setelah pemberian pakan. Sintasan dan relative percent survival (RPS) dihitung sebagai berikut:

## Analisis  Statistik
Data  yang  didapatkan  diuji  ANOVA  dilanjutkan dengan  uji  Duncan  menggunakan  statistik menggunakan SPSS ver 18.

## HASIL DAN BAHASAN
Hematokrit  merupakan  bagian  padat  dari  cairan darah dalam ikan, dengan komposisi terbanyak adalah eritrosit  atau  sel  darah  merah.  Hasil  menunjukkan bahwa  penambahan  kombinasi  ekstrak  sirih  dan kipahit mampu memelihara jumlah padatan (Gambar 1)  sekaligus  jumlah  eritrosit  (Gambar  2)  pada kelompok perlakuan. Meskipun nilai hematokrit dan eritrosit  tidak  menunjukkan  perbedaan  yang  nyata, namun  rerata  menunjukkan  nilai  yang  lebih  tinggi dibandingkan kelompok kontrol. Penelitian mengenai efek  infeksi  pernah  dilaporkan  oleh  Martins  et  al. (2008), di mana ikan nila yang diinfeksi menggunakan menunjukkan nilai hematokrit dan eritrosit yang lebih tinggi dibandingkan dengan ikan yang tidak diinfeksi.
Penelitian sebelumnya yang terfokus pada eritrosit manusia menemukan bahwa eritrosit mampu berperan sebagai modulator dari respons imun bawaan (Ander- son  et  al.,  2018).  Sehingga  jumlah  sel  darah  merah yang  lebih  tinggi  pada  kelompok  perlakuan mengindikasikan  bahwa  ikan  mempunyai  sistem pertahanan  yang  cukup  dibandingkan  dengan kelompok kontrol. Bakteri S. agalactiae yang digunakan merupakan  bakteri  koleksi  laboratorium  kesehatan ikan yang telah diamati, bakteri ini merupakan bakteri Streptococcus yang  bersifat non-hemolitik  atau tidak melisiskan  eritrosit  (Suhermanto  et  al.,  2019), sehingga kemungkinan jumlah eritrosit dari kelompok kontrol tidak dipengaruhi oleh adanya infeksi dari S. agalactiae  namun  dipengaruhi  oleh  tidak  adanya tanaman obat.
Naiknya jumlah leukosit merupakan respons yang terjadi hampir di setiap adanya serangan infeksi. Hal ini disebabkan bahwa fungsi sel darah putih (leukosit) adalah  pertahanan  pertama  dari  tubuh  untuk menghalau  serangan  penyakit  yang  terjadi  (Martins et  al.,  2008).  Penambahan  ekstrak  tanaman  terlihat
        10 4 hitung kamar Volume n Pengencera x sel Jumlah L 0,02 n Pengencera x sel Jumlah Eritrosit eukosit 100 x No Nt SR 
di mana:
Nt = jumlah ikan yang hidup pada akhir eksperimen No = jumlah ikan yang hidup pada awal eksperimen
100 x kontrol kelompok pada ikan % perlakuan kelompok pada ikan % (%) RPS 
memberikan  efek  positif  pada  ikan  uji  (Gambar  3), hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  sebelumnya  yang menunjukkan naiknya jumlah leukosit pada ikan nila yang menerima perlakuan pakan bersuplemen minyak esensial  dari  citrus  limon  (Baba  et  al.,  2016).  Jumlah leukosit yang naik diduga karena adanya proliferasi sel dari sel dari darah putih yang diproduksi di organ ginjal dari ikan, seperti penelitian yang menggunakan ikan lele sebagai ikan model (Nafiqoh et al., 2019).
Nilai tetrazolium  yang menggambarkan  aktivitas fagositik  oksidase  dari  ikan  nila  menunjukkan perbedaan antara perlakuan dan kontrol (Gambar 4).
Hal  ini  diduga  karena  jumlah  sel  darah  putih  dari kelompok  perlakuan  cenderung  lebih  banyak dibandingkan kontrol. Hasil yang sama diperoleh oleh penelitian Baba et al. (2016).
Demikian  juga  nilai  dari  aktivitas  lisosim  yang terdeteksi  dari  serum,  pada  kelompok  perlakuan cenderung  lebih  tinggi  dibandingkan  kelompok kontrol  (Gambar  5).  Penelitian  yang  sama menunjukkan adanya kenaikan aktivitas lisosim dari ikan  nila  yang  menerima  perlakuan.  Lisosim  adalah sistem  pertahanan  humoral  dari  ikan  yang  mampu memicu hidrolisis dari dinding sel bakteri, ditemukan
Gambar 1. Nilai  hematokrit  ikan  nila  yang  menerima  perlakuan  tanaman  kombinasi ekstrak daun sirih dan kipahit setelah uji tantang dengan bakteri S. agalactiae.
Figure 1. Hematocrit value of tilapia fed with a combination of betel and kipahit leaf extract treatment after challenged with S. agalactiae.
Gambar 2. Jumlah  eritrosit  ikan  nila  yang  menerima  perlakuan  tanaman  kombinasi ekstrak daun sirih dan kipahit setelah uji tantang dengan bakteri S. agalactiae.
Figure 2. Erythrocyte  of  tilapia  fed  with  a  combination  of  betel  and  kipahit  leaf  extract treatment after challenged with S. agalactiae.
a a a a a 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0% 1% 2% 4% 8% H em at o kr it ( H em at oc ri t) ( % ) Perlakuan (Treatments) a a a a a 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0% 1% 2% 4% 8% E ri tr o si t (E ry th ro cy te s) (1 0 6 .m m -1 )
Perlakuan (Treatments)
pada serum dan lender (mucus) (Vallejos-Vidal et al., 2016). Naiknya aktivitas lisosim akibat penambahan tanaman obat diduga akibat adanya interaksi antara kandungan  tanaman  obat  berupa  flavonoid  dengan lisosim,  perlu  dicatat  bahwa  interaksi  ini  sangat tergantung pada posisi hydrogen dan glikosil (Yang et al., 2012).
Pada  pengukuran  pertumbuhan  ikan  yang menerima perlakuan menunjukkan tidak adanya efek negatif yang biasa terlihat dari pakan yang suplemen
tanaman obat, hal ini diduga karena yang digunakan adalah ekstrak dari tanaman sirih dan kipahit di mana serat  dari  tanaman  sudah  dieliminasi.  Meskipun pertumbuhan panjang dari kelompok perlakuan terlihat tidak  berbeda  dibandingkan  kelompok  kontrol (Gambar  6);  namun  pada  pertumbuhan  berat, kelompok  perlakuan  cenderung  lebih  baik dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 7). Penambahan tanaman obat tertentu memang diketahui mampu meningkatkan pertumbuhan seperti penelitian
Gambar 4. Nitroblue  tetrazolium  ikan  nila  yang  menerima  perlakuan  tanaman kombinasi ekstrak daun sirih dan kipahit setelah uji tantang dengan bakteri
S. agalactiae.
Figure 4. Nitroblue tetrazolium value of tilapia fed with a combination of betel and kipahit leaf extract treatment after challenged with S. agalactiae.
Gambar 3. Jumlah  leukosit  ikan  nila  yang  menerima  perlakuan  tanaman  kombinasi ekstrak daun sirih dan kipahit setelah uji tantang dengan bakteri S. agalactiae.
Figure 3. Leukocyte value of tilapia received a combination of betel and kipahit leaf extract treatment after challenged with S. agalactiae.
a a a a a 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0% 1% 2% 4% 5% N it ro b lu e te tr az o li u m ( OD 5 4 0 n m ) Perlakuan (Treatments) a ab ab ab b 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0% 1% 2% 4% 8% Le u ko si t (L eu ko cy te s) (1 0 5 .m m -1 )
Perlakuan (Treatments)
Abdel-Tawwab  et  al.  (2010)  yang  menggunakan suplementasi daun teh pada ikan nila. Pertumbuhan yang  lebih  baik  dari  kelompok  perlakuan  diduga naiknya feed intake dari ikan yang menerima perlakuan.
Banyak  penelitian  yang  menunjukkan  adanya kenaikan sintasan (Gambar 8) dari ikan yang menerima perlakuan  tanaman  obat.  Kenaikan  ini  tentu  saja dipengaruhi  oleh  peningkatan  respons  imun  yang menunjukkan adanya kenaikan dibandingkan dengan kelompok kontrol.
Relative  percent  survival  (Tabel  1),  menunjukkan bahwa  ikan  yang  menerima  perlakuan  mempunyai
persentase  bertahan hidup  lebih baik  dibandingkan dengan kelompok kontrol. Penelitian menggunakan tanaman daun sirih dan kipahit secara tunggal mampu meningkatkan  sintasan  relatif  hingga  79%,  dengan kedua  tanaman  tersebut  dikombinasikan  sintasan relatif yang dihitung mampu naik hingga 96% (Nafiqoh et al., 2019).
Hasil yang didapatkan diduga dipicu oleh bahan aktif yang terkandung pada tanaman obat yang digunakan. Kandungan  utama  dari  daun  kipahit  adalah  asam klorogenat  dan  sesquiterpenes  lactones,  keduanya mempunyai  aktivitas  yang  mirip  dengan  obat  anti- inflamasi dan antioksidan (Chagas-paula et al., 2011;
Gambar 5. Aktivitas  lisosim  ikan  nila  yang  menerima  perlakuan  tanaman  kombinasi ekstrak daun sirih dan kipahit setelah uji tantang dengan bakteri S. agalactiae.
Figure 5. Lysosyme activity of tilapia fed with a combination of betel and kipahit leaf extract treatment after challenged with S. agalactiae. a a a a a 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0% 1% 2% 4% 8% A kt ivi ta s lis o si m
Ly so sy m e ac ti vi ty (I U /m in /m L) Perlakuan (Treatments) Gambar 6. Pertumbuhan panjang ikan nila yang menerima perlakuan tanaman kombinasi ekstrak daun sirih dan kipahit. Figure 6. Growth  length  of tilapia  received  a  combination  of  betel and  kipahit  leaf  extract treatment.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0% 1% 2% 4% 8% Pa n ja n g ( Le ng ht ) (c m ) Perlakuan (Treatments) L0 Lt
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0% 1% 2% 4% 8% Bo b o t (We ig th ) (g ) Perlakuan (Treatments) W0 Wt
Gambar 8. Analisis sintasan dari ikan nila yang menerima perlakuan tanaman kombinasi ekstrak  daun  sirih  dan  kipahit  setelah  uji  tantang  dengan  bakteri
S. agalactiae.
Figure 8. Survival rate of tilapia fed with a combination betel leaf and kipahit extract after challenged with S. agalactiae bacteria.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 Si n ta sa n /S ur vi va l ra te (% ) Hari ke- setelah uji tantang (Days post injection) 0% 1% 2% 4% 8% a b
Tabel 1. Relative  percent  survival  (RPS)  dari  ikan  nila  yang  menerima  perlakuan  kombinasi ekstrak daun sirih dan kipahit setelah uji tantang dengan bakteri S. agalactiae
Table  1. Relative  percent  survival  (RPS)  of  tilapia  fed  with  a  combination  betel  leaf  and  kipahit extract  after  challenged  with  S.  agalactiae  bacteria
Gambar 7. Pertumbuhan bobot ikan nila yang menerima perlakuan tanaman kombinasi ekstrak daun sirih dan kipahit.
Figure  7. Growth  weight  of  tilapia  fed  with  a  combination  of  betel  and  kipahit  leaf extract  treatment.
Perlakuan (Treatments ) Persentase kelangsungan hidup relatif Relative percent survival  (RPS) 0% - 1% 87.9182 2% 96.33885 4% 86.03532 8% 80.13287
Husniati & Sari, 2021). Sedangkan kandungan utama dari daun sirih adalah eugenol yang bersifat sebagai anti-bakteri  dan  anti-jamur  (Prakash  et  al.,  2010; Saxena  et  al.,  2014).  Kombinasi  anti-oksidan  dan antibakteri  pada  sirih  dan  kipahit  diduga  mampu memberikan  efek  meningkatnya  sintasan  pada  ikan uji, melalui mekanisme naiknya respons imun bawaan dari ikan.

## KESIMPULAN
Penambahan tanaman kombinasi ekstrak daun sirih dan  kipahit  mempunyai  prospek  yang  cukup  baik sebagai imunostimulan pada ikan nila sebagai upaya pencegahan dari infeksi bakteri patogen Streptococcus agalactiae. Semua dosis yang digunakan (1%, 2%, 4%, dan  8%)  menunjukkan  adanya  pengaruh  terhadap respons imun bawaan dari ikan yang diamati melalui parameter  jumlah  eritrosit,  leukosit,  aktivitas fagositik  oksidase,  dan  aktivitas  lisosim,  meskipun tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Tanaman herbal yang diberikan mampu meningkatkan sintasan dari  ikan  uji.  Perlu  dilakukan  penelitian  tentang prospek  kombinasi  sirih  dan  kipahit  untuk pengobatan pada ikan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima kasih  pada  Setiadi, Edy Farid Wadjdy, Johan Afandi, Ardea Kumarasetya, Ahmad Wahyudi,  Agung Mulya, dan  Hernritzka atas bantuannya selama penelitian berlangsung. Penelitian ini  dibiayai  oleh  DIPA  2019  Balai  Riset  Perikanan Budidaya  Air  Tawar  dan  Penyuluhan  Perikanan (BRPBATPP) Sempur, Bogor.

## DAFTAR  ACUAN
Abdel-Tawwab,  M.,  Ahmad,  M.H.,  Seden,  M.E.A.,  & Sakr,  S.F.M.  (2010).  Use  of  green  tea,  Camellia sinensis L., in practical diet for growth and protec- tion of nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.), against Aeromonas hydrophila infection. Journal of the World Aquaculture  Society,  41,  203-213.  https://doi.org/ 10.1111/j.1749-7345.2010.00360.x.
Amal,  M.  &  Zamri-Saad,  M.  (2011).  Streptococcosis in tilapia (Oreochromis niloticus): A review. Pertanika J. Trop. Agric. Sci., 34(2), 195-206.
Anderson,  H.L.,  Brodsky,  I.E.,  &  Mangalmurti,  N.S. (2018). The evolving erythrocyte: Red blood cells as modulators of innate immunity. The Journal of Immunology,  201(5),  1343-1351.  https://doi.org/ 10.4049/jimmunol.1800565.
Baba, E., Acar, Ü., Öntaº, C., Kesbiç, O.S., & Yýlmaz, S. (2016). Evaluation of citrus limon peels essen- tial oil on growth performance, immune response of  Mozambique  tilapia  Oreochromis  mossambicus
challenged  with  Edwardsiella  tarda.  Aquaculture, 465,
13-18.
https://doi.org/10.1016/
j.aquaculture.2016.08.023.
Chagas-paula, D.A., Barbosa, R., Oliveira, D., Cristina, V., Gobbo-neto,  L., Helena, T., Paula,  A., Helena, L., Batista, F., & Costa, D. (2011). Chlorogenic acids from Tithonia diversifolia demonstrate better anti- inflammatory  effect  than  indomethacin  and  its sesquiterpene lactones. Journal of Ethnopharmacology,  136(2),  355-362.  https:// doi.org/10.1016/j.jep.2011.04.067.
Che,  C.T., Wang,  Z.J.,  Sing, M.,  Chow,  S.,  Wai, C.,  & Lam, K. (2013). Herb-herb combination for thera- peutic  enhancement  and  advancement:  Theory, practice  and  future  perspectives.  Molecules,  18, 5125-5141. https://doi.org/10.3390/mol- ecules18055125.
Chukwuka,  K.S.  &  Ojo,  O.M.  (2014).  Extraction  and characterization  of  essential  oils  from  Tithonia diversifolia  (Hemsl.)  A.  Gray.  American  Journal  of Essential Oils and Natural Products, 1(4), 1-5.
Ellis, A.E. (1990). Lysozyme assay. In Stolen, J.S. (Ed.),
Techniques in Fish Immunology: Fitc 1 (p. 101-103). Sos  Publications.  https://books.google.co.id/ books?id=yHIWAQAAIAAJ.
Husniati, H. & Sari, M.Y. (2021). Kajian: Karakterisasi senyawa aktif asam lorogenat dalam kopi robusta sebagai  antioksidan.  Majalah  Teknologi  Agro Industri, 12(2), 7.
Ji, S.C., Takaoka, O., Jeong, G.S., Lee, S.W., Ishimaru, K., Seoka, M., & Takii, K. (2007). Dietary medici- nal herbs improve growth and some non-specific immunity of red sea bream Pagrus major. Fisheries Science, 73(1), 63-69. https://doi.org/10.1111/j.1444- 2906.2007.01302.x.
Kumar, R., Mukherjee, S.C., Ranjan, R., & Nayak, S.K. (2008).  Enhanced  innate  immune  parameters  in Labeo rohita (Ham.) following oral administration of Bacillus subtilis enhanced innate immune para- meters in  Labeo  rohita  (Ham.) following  oral  ad- ministration of Bacillus subtilis. Fish & Shellfish Im- munology,  24,  168-172.  https://doi.org/10.1016/ j.fsi.2007.10.008.
Lusiastuti,  A.M.,  Purwaningsih,  U.,  &  Sumiati,  T. (2010). Isolasi bakeri anti Streptococcus agalactiae dari  ikan  nila  (Oreochromis  niloticus).  Jurnal  Riset Akuakultur, 5(2), 237-243. DOI:  http://dx.doi.org/ 10.15578/jra.5.2.2010.237-243.
Martins,  Ml.,  Mouriño,  Jlp.,  Amaral,  Gv.,  Vieira,  Fn., Dotta,  G.,  Jatobá,  Amb.,  Pedrotti,  Fs.,  Jerônimo, Gt.,  Buglione-Neto,  Cc.,  &  Pereira-Jr.,  G.  (2008). Haematological  changes  in  Nile  tilapia  experi- mentally  infected  with  Enterococcus  sp.  Brazilian
Journal of Biology, 68(3), 657-661. https://doi.org/ 10.1590/S1519-69842008000300025.
Mapfumo, B. (2018). Tilapia Trade: Global and Regional Trends.  FAO/ASTF  GCP/RAF/510/MUL:  Enhaching capacity/risk reduction of emerging Tilapia Lake Virus (TiLV) to African tilapia aquaculture. http:// www.fao.org/fi/static-media/MeetingDocuments/ TiLV/dec2018/p13.pdf.
Nafiqoh,  N.,  Sukenda,  S.,  Zairin  Jr.M.,  Alimuddin, Lusiastuti,  A.M.,  &  Avarre,  J.-C.  (2019).  Status kesehatan  ikan  lele  (Clarias  gariepinus)  yang menerima  pakan  bersuplemen  kombinasi  daun sirih, (Piper betler leaf), jambu biji (Psidium guajava leaf), dan kipahit (Tithonia diversifolia leaf). Jurnal Riset  Akuakultur,  13(4),  357-365.  https://doi.org/ 10.15578/jra.13.4.2018.357-365.
Nafiqoh,  N.,  Sukenda,  Zairin,  M.,  Alimuddin, Lusiastuti, A.M., Sarter, S., Caruso, D., & Avarre, J.-C.  (2019).  Antimicrobial  properties  against Aeromonas hydrophila and immunostimulant effect on Clarias gariepinus of Piper betle, Psidium guajava, and Tithonia diversifolia plants. Aquaculture Interna- tional.  https://doi.org/10.1007/s10499-019- 00439-6.
Ngugi, C.C., Oyoo-Okoth, E., Mugo-Bundi, J., Orina, P.S.,  Chemoiwa, E.J.,  &  Aloo,  P.A. (2015).  Effects of dietary administration of stinging nettle (Urtica dioica) on the growth performance, biochemical, hematological, and immunological parameters in juvenile and adult Victoria Labeo (Labeo victorianus) challenged  with  Aeromonas  hydrophila.  Fish  and Shellfish  Immunology,  44(2),  533-541.  https:// doi.org/10.1016/j.fsi.2015.03.025.
Pradhan, D., Suri, K.A., Pradhan, D.K., & Biswasroy, P. (2013). Golden heart of the nature: Piper betle L . Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 1(6),
147-167.
Prakash,  B., Shukla,  R.,  Singh,  P., Kumar,  A.,  Mishra, P.K., & Dubey, N.K. (2010). Efficacy of chemically characterized  Piper  betle  L.  essential  oil  against fungal  and  aflatoxin  contamination  of  some edible  commodities  and  its  antioxidant  activity. International Journal of Food Microbiology, 142(1-2), 114-119.  https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro. 2010.06.011.
Saxena, M., Khare, N.K., Saxena, P., Syamsundar, K.V., &  Srivastava,  S.K.  (2014).  Antimicrobial  activity and  chemical composition  of  leaf  oil in  two  va- rieties of Piper betle from northern plains of India. Journal  of  Scientific  and  Industrial  Research,  73(2), 95-99.
Suhermanto, A., Sukenda, S., Zairin, Jr.M., Lusiastuti, A.M.,  &  Nuryati,  S.  (2019).  Characterization  of Streptococcus  agalactiae  bacterium  isolated  from tilapia (Oreochromis niloticus) culture in Indonesia. AACL Bioflux, 12(3), 11.
Vallejos-Vidal,  E.,  Reyes-López,  F.,  Teles,  M.,  & MacKenzie,  S.  (2016).  The  response  of  fish  to immunostimulant  diets.  Fish  &  Shellfish  Immu- nology,  56,  34-69.  https://doi.org/10.1016/ j.fsi.2016.06.028.
Yang, R., Yu, L., Zeng, H., Liang, R., Chen, X., & Qu, L. (2012). The interaction of flavonoid-lysozyme and the relationship between molecular structure of flavonoids and their binding activity to lysozyme. Journal of Fluorescence, 22(6), 1449-1459. https:// doi.org/10.1007/s10895-012-1082-9.