UJI TOKSISITI ASAM α-LINOLENIK RUMPUT LAUT Ulva sp. TERHADAP Chattonella marina DAN Heterosigma akashiwo
TOXICITY ASSAY OF α-LINOLENIC ACID FROM Ulva sp. SEAWEED ON Chattonella marina AND Heterosigma akashiwo
Moch. Amin Alamsjah
Fakultas Perikanan dan Kelautan - Universitas Airlangga Kampus C UNAIR Mulyorejo Surabaya 60115 Telp. 031-5911451 E-mail : alamsjah@unair.ac.id ; alamsjah_70@yahoo.com Telp./Fax. 031-5028709, 5911451

## Abstract
The higher toxicity of α-linolenic acid from Ulva sp. seaweed showed the high algicidal activity against Chattonella  marina and Heterosigma  akashiwo .  Among  six  species  tested, C.  marina and H. akashiwo was the most susceptible to this fatty acid, whereas LC 50 of  α-linolenic acid was estimated to be  3.22  and  0.58  µg/mL,  respectively.  Furthermore,    α-linolenic  acid  also  showed  algicidal  activity against Alexandrium  tamarense  and  A.  taylori . It  is suggested that α-linolenic acid  is useful  mitigation agents to Harmful Algal Bloom effect, especially on Chattonella marina and Heterosigma akashiwo.
Key words : Ulva sp.,  α-linolenic acid, Chattonella marina , Heterosigma akashiwo

## Pendahuluan
Pada tiga dasawarsa terakhir telah banyak eksplorasi penemuan bahan aktif dari organisma maupun  substansi  laut  yang  dilakukan  (Smit, 2004),  seperti  halnya  eksplorasi  bahan  aktif rumput  laut.  Suzuki  et  al.  (1998)  telah mengisolasi  bahan  aktif  algicidal  dari  crustose coralline  algae, Lithophyllum spp.,  terhadap kelulushidupan  Harmful  Algal  Bloom  (HAB) Heterosigma akashiwo dan zoospora alga coklat Laminaria  religiosa .  Perbedaan  aktifitas  bahan aktif rumput laut dari kelompok PUFA  diyakini juga memberikan perbedaan tekanan pertumbuhan  Harmful  Algal  Bloom  (HAB) species  (Alamsjah  et  al.,  2006).  Namun, keberadaan  bahan  aktif  dari  jenis  rumput  laut Ulva sp.  belum  banyak  diketahui  terhadap kelulushidupan  HAB  species  sehingga  dapat dijadikan  dasar  pengembangan  penggunaan bahan aktif rumput laut Ulva sp. lebih jauh.

## Materi dan Metode Penelitian
Koleksi rumput laut Ulva sp.
Koleksi rumput laut dari intertidal area dikumpulkan  selama  3  bulan  pertama  jangka waktu  penelitian.  Kerusakan  ekologi  selama pengambilan  sampel  diupayakan  seminimal mungkin  dengan  tidak  merusak  algal  stem. Semua  sampel  di  bawa  ke  laboratorium  dalam plastic  bag  yang  mengadung  air  laut  untuk mencegah  evaporasi,  kemudian  mencucinya dengan  distilled  water  untuk  memisahkan potential contaminant. Untuk kelayakan
penggunaan selanjutnya, sebagian koleksi rumput  laut  dikeringkan  selama  5  hari  pada temperatur  kamar  dan  digiling  menjadi  powder dengan menggunakan blender.
Skreening aktifitas algicidal Fragment  rumput  laut  diperlakukan dalam methanol dan water ekstraksi berdasarkan metoda  Jeong  et  al . (2000)  dengan  minor modifikasi.  Setiap  100  mg  sampel  kering  di rendam  dalam  5  ml  methanol  pada  temperatur kamar selama 24 jam dan di filter melalui filter paper  no.  2  (Advantec)  dengan  tekanan. Prosedur  ekstraksi  di  ulang  tiga  kali  kemudian digabung.  Residual  tissue  dikeringkan  dan selanjutnya  di  ekstraksi  dengan  distilled  water selama 24 jam pada temperatur kamar.
Ekstraksi,  isolasi  dan  struktural  determinasi substansi algicidal
Rumput  laut  terpilih  di  blender  dan  di ekstraksi menggunakan methanol.  Setelah melepaskan  methanol  dalam  kondisi  reduced pressure,  selanjutnya  residu  dipisahkan  antara air dan hexane. Hexane extract dikonsentrasikan dan  di  ekstrak  dengan  aqueous  HCl  dan dilanjutkan  50%  aqueous  MeOH.  Hexane  layer kemudian dikonsentrasikan sehingga meninggalkan  deep  green  oily  residue.  Tahap berikutnya  adalah  chromatographi  pada  silica gel  (63-230  m)  dan  di  elusi  dengan  gradient hexane-EtOAc.  Active  fraction  di  kromatografi pada  Octadecyl-S  (50  m)  dan  di  elusi  dengan
90%  methanol.  Kemudian  purifikasi  HPLC dengan  Cosmosil  5C18-MS-II,  20  x  250  mm, 80%  CH 3 CN,  flow  rate  5  mL  min -1 .  Active fraction  dipurifikasi  lagi  dengan  TLC  RP-18 (Merck,  20  x  20  cm,  layer  thickness  0.25  mm) menggunakan  85%  CH 3 CN  sebagai  solvent untuk menghasilkan compound akhir. Struktural determinasi  substansi  algicidal  rumput  laut terseleksi  dilanjutkan  dengan  menggunakan analisa NMR, MS dan IR spectroscopy.
Toxicity test pada red tide phytoplankton
Red tide phytoplankton species ( Chattonella  marina,  Heterosigma  akashiwo, Alexandrium tamarense, A. taylori,
Gymnodinium  impudicum dan Heterocapsa circulariscuama ) di kultur dalam  medium ESM (Erd-Schreiber  modified)  pada  pH  8,2  dalam kondisi illuminasi 40 μmol/m 2 /s dengan 40 watt fluorescent  lamps  FL40SD  (Toshiba)  dengan photoperiode  12L  :  12D.  Semua  kultur menggunakan 100 ml Erlenmeyer flask sterilized  dengan  50  ml  medium.  Uji  toxicity test pada semua jenis phytoplankton diperlakukan pada 24 well microplate
(1  ml/well)  dengan  beberapa  konsentrasi  yang berbeda  struktur  kimia  substansi  algicidal rumput  laut  terseleksi,  selama  24  jam.
Perhitungan kelulushidupan phytoplankton dilakukan dengan menggunakan haemocytometer.

## Hasil dan Pembahasan
Melalui  analisa  NMR  diperoleh  bahan aktif  dari  rumput  laut Ulva sp.  adalah  asam  α- linolenik  dengan  perincian  sebagai  berikut  : NMR H (400MHz,  CDCl 3 )  :  0,98  (t,  3H, J = 7,6 Hz,  -CH 2 C H 3 ), 1,27-1,37 (m, 8H ,  –CH 2 -  x 4),  1,59-1,67  (m,  2H,  -C H 2 -CH 2 -COOH),  2,01- 2,11 (m, 4H, CH=CH-C H 2 - x 2), 2,35 (t, 2H, J = 7,2  Hz,  -C H 2 -COOH),  2,77-2,85  (m,  4H, CH=CH-C H 2 -CH=CH x 2), 5,28-5,43 (m, 6H, - C H =C H -  x  3),  7.26  (br.  s,  1H,  -COO H ).  NMR
C (100 MHz, CDCl 3 ): 14,3 (-CH 3 ), 20,6 (- C H 2 - CH 3 ), 24,8 (CH=CH- C H 2 -CH=CH), 25,6 (CH=CH- C H 2 -CH=CH),  27,2  (- C H 2 -CH=CH), 29,1  (- C H 2 -CH 2 COOH),  29,1  (-CH 2 -),  29,2  (- CH 2 -),  29,6  (-CH 2 -),  29,7  (-CH 2 -),  34,0  (- C H 2 - COOH),  127,0  (- C H=CH-),  127,6  (- C H=CH-), 128,1  (- C H=CH-),  128,2  (- C H=CH-),  130,1  (- C H=CH-),  131,9  (- C H=CH-),  180,6  (COOH). EIMS m/z :  278  (M + ,  base),  228,  222,  108,  95, 79,  75,  67,  55.  HRMS m/z (M + ):  Perhitungan untuk  C 18 H 30 O 2 :  278,2246  dan  didapatkan 278,2229.
Pengaruh  dari  α-linolenik  terhadap raphydophyceae C.  marina dan H.  akashiwo menunjukkan hambatan terbesar, dimana
berdasarkan nilai LC 50 dari α-linolenik  terhadap C.  marina sebesar  3,22  µg/mL,  sedangkan pengaruh  asam  α-linolenik    terhadap H. akashiwo sebesar  0,58  µg/mL  (Gambar  1  dan Tabel 1).
Tabel 1.  Nilai  LC 50 dari  asam  linoleik  dan  α- linolenik  terhadap  beberapa  HAB species dengan lama perlakuan 24 jam
Species LC 50 asam α- linolenik (µg/mL) Alexandrium tamarense Alexandrium taylori Chattonella marina Heterosigma akashiwo Heterocapsa circularisquama Gymnodinium impudicum 66,06 35,30 3,22 0,58 >1000 >1000
Kemampuan toksik dari PUFA asam α- linolenik di duga berhubungan dengan amphiphatic  property yang  dimiliki  oleh struktur  asam  lemak  tak  jenuh,  sehingga mengganggu bahkan merusak integritas membran  sel  red  tide  phytoplankton  species. Struktur  kimia  dengan  perbedaan  jumlah  dobel karbon  asam  lemak  tak  jenuh  diamati  juga berhubungan  dengan  aktifitas  biologi  yang dimilki  oleh  red  tide  phytoplankton  species H. akashiwo. Hasil  dalam  studi  ini  sesuai  dengan penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh  Suzuki et al. (1996) dan Sellem et al. (2000). Kakisawa et al. (1988) juga melaporkan bahwa PUFA sangat efektif  dalam  menekan  kelulushidupan  HAB species  yang  tidak  mengandung  dinding  sel yang  kuat.  Ikawa  (2004)  mencoba  menjelaskan tentang pengaruh hambatan yang dimilki PUFA terhadap  pertumbuhan  phytoplankton  dengan cara  mempengaruhi  lapisan  lipid  bilayer  dari membran  sel.  Murata et  al. (1989)  dan  Oda et al. (1992)  juga  melaporkan  bahwa  aktifitas toksik  PUFA  kemungkinan  disebabkan  adanya proses  oksidasi,  sedangkan  Kogteva  dan Bezuglov  (1998)  menyatakan  bahwa  aktifitas toksik  PUFA  kemungkinan  karena  peranannya sebagai  second  messenger  yang  mengatur fungsionalisasi aktifitas protein selanjutnya.
Bahan  aktif  rumput  laut Ulva sp. berupa  asam  α-linolenik  menunjukkan  sebagai substans  yang  mampu  menekan  pertumbuhan red  tide  phytoplankton,  selain  kelebihan  dari komponen  asam  lemak  tak  jenuh  yang  relatif stabil  dibandingkan  asam  lemak  jenuh.  Sargent et al. (1987) juga melaporkan bahwa penyimpanan  kandungan  asam  lemak  jenuh sangat  dipengaruhi  kondisi  lingkungan  dan sangat  berbeda  dengan  asam  lemak  tak  jenuh
yang  relatif  stabil.  Pada  akhirnya,  biosintesis PUFA  asam  α-linolenik  dari Ulva sp.
diharapkan dapat dieksplorasi lebih lanjut untuk
dijadikan  bahan  aktif  algicidal  yang  potensial dalam mengontrol keberadaan HAB species.

## Kesimpulan dan Saran
Faktor  pertimbangan  utama  dalam melakukan  seleksi  metoda  untuk  mengontrol HAB species adalah efektivitas, toksisitas, biaya dan cara aplikasinya. Distribusi Ulva sp. hampir dapat  ditemukan  di  seluruh  perairan  dunia sehingga  peluang  untuk  menganalisa  berbagai bahan  aktif  algicidal  yang  dimiliki  sebagai terobosan  baru  bagi  pengembangan  eksplorasi bioteknologi sumber daya perairan. Berdasarkan karakteristik  tersebut, Ulva sp. sangat  potensial sebagai  biokontrol  untuk  HAB  species,  dimana bahan  aktif  asam  α-linolenik  dari Ulva sp. mampu menekan pertumbuhan HAB species.

## Daftar Pustaka
Alamsjah  MA,  Ishibashi  F,  Kitamura  H,  Fujita Y  (2006)  The  effectiveness  of Ulva fasciata and U. pertusa (Ulvales, Chlorophyta)  as  algicidal  substances  on harmful  algal  bloom  species.  Aquacult. Sci. 54: 325-334.
Ikawa  M  (2004)  Algal  polyunsaturated  fatty acids and effects on plankton ecology and other  organisms.  UNH  Center  Freswat. Biol. Res. 6: 17-44.
Jeong JH, Jin HJ, Sohn CH, Suh KH, Hong YK
(2000)  Algicidal  activity  of  the  seaweed Corallina  pilulifera against  red  tide microalgae. J. Appl. Phycol. 12: 37-43.
Kakisawa  H,  Asari  F,  Kusumi  T,  Toma  T,
Sakurai T, Oohusa T, Hara Y, Chiharai M (1988) An allelopathic  fatty acid  from the brown  alga Cladosiphon  okamuranus . Phytochem. 27: 731-735.
Kogteva  GS,  Bezuglov  VV  (1998)  Unsaturated fatty  acids  as  endogenous  bioregulators. Biochem. (Moscow) 63: 6-15.
Murata H, Sakai T, Endo M, Kuroki A, Kimura M,  Kumanda  K  (1989)  Screening  of removal  agents  of  a  red  tide  plankton Chattonella marina with  special reference to  the  ability  of  the  free  radicals  derived from the hydrogen peroxyde and polyunsaturated fatty acids. Nippon Suisan Gakkaishi 55: 1075-1082.
Oda  T,  Ishimatsu  A,  Shimada  M,  Takeshita  S, Muramatsu  T  (1992)  Oxygen-radical- mediated  toxic  effects  of  the  red  tide flagellate Chattonella  marina on Vibrio alginolyticus . Mar. Biol. 112: 505-509.
Sargent  JR,  Parkes  RJ,  Mueller-Harvey  I,
Henderson  J  (1987)  Lipid  biomarkers  in marine  ecology.  In  Sleigh  MA  (ed) Microbes  in  the  sea.  Ellis  Horwood, Chichester, United Kingdom, 119-138.
Sellem  F,  Pesando  D,  Bodennec  G,  Abed  AE,
Girard  JP  (2000)  Toxic  effects  of Gymnodinium  cf.  mikimotoi unsaturated fatty acids to gametes and embryos of the sea  urchin Paracentrotus  lividus .  Water Res. 34: 550-556.
Smit  AJ  (2004)  Medicinal  and  pharmaceutical uses  of  seaweed  natural  products:  A review. J. Appl. Phycol. 16: 245-262.
Suzuki  M,  Wakana  I,  Denboh  T,  Tatewaki  M (1996)  An  allelopathic  polyunsaturated fatty  acid  from  red  algae.  Phytochem.  43: 63-65.
Suzuki  Y,  Takabayashi  T,  Kawaguchi  T, Matsunaga  K  (1998)  Isolation  of  an allelopathic  substance  from  the  crustose coralline  algae, Litophyllum spp.,  and  its effect  on  the  brown  alga, Laminaria religiosa Miyabe  (Phaeophyta).  J.  Exp. Mar. Biol. Ecol. 225: 69-77.