## KARAKTERISASI EKSTRAK KASAR ENZIM POLYPHENOLOXIDASE
DARI UDANG WINDU ( Penaeus monodon )

## CHARACTERIZATION OF CRUDE EXTRACT POLYPHENOLOXIDASE ENZYME FROM BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon)
Made Suhandana 1 , Tati Nurhayati 1* , dan Laksmi Ambarsari 2
1 Departemen Teknologi Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
* Email: tnurhayati@apps.ipb.ac.id; nurhayati7870@yahoo.com
2 Departemen Biokimia, Institut Pertanian Bogor, Bogor

## ABSTRACT
Shrimp is a  very important export  commodity with  high market value world wide. However, it is  still  facing  problem  related  to  the  waste  and  deterioration  quality  as  main  issues  for  the shrimp industry. In this experiment, polyphenoloxidase from the carapace of Penaeus monodon was  extracted  and  characterized.  The  research  was  carried  out  to  obtain  the  optimum extraction condition and to evaluate the properties of enzyme i.e., pH, optimum temperature for activating enzyme, kinetic enzyme, and chelating on metal ion. The best method for PPO enzyme extraction used buffer with 1:3  proportion.  The optimum activity of enzyme was at pH 7 and temperature  of  35°C.  The  kinematic  enzyme  (Km)  value  and  the  maximum  substrate concentration  were  5.42  mM  and  7.5  mM,  respectively.    Na + ,  Ca 2+ ,  Zn 2+ ,  and  EDTA  with concentration  5  and  10  mM  inhibited  enzyme  activity.    Cu 2+ at  concentration  of  10  mM  and Mn 2+ at concentration 5 mM also inhibited enzyme activity
Keywords : carapace, characterization, polyphenoloxidase, shrimp

## ABSTRAK
Udang merupakan komoditas ekspor yang penting, namun tidak luput dari permasalahan limbah dan  kemunduran  mutu  yang  dihadapi  oleh  hasil  perikanan  lainnya.  Pada  penelitian  ini  enzim polyphenoloxidase diekstraksi  dan  dikarakterisasi  dari  karapas Penaeus  monodon .  Penelitian dilakukan  dengan  menentukan  optimasi  ekstraksi,  pH  optimum  dan  suhu  optimum  aktivitas enzim,  kinetika  enzim,  dan  pengaruh  pemberian  ion  logam.  Metode  terbaik  untuk  ekstaksi enzim PPO menggunakan perbandingan buffer 1:3 secara bertingkat. pH optimum kerja enzim PPO  adalah  7  dengan  suhu  optimum  35  °C.  Konsentrasi  substrat  untuk  memperoleh  aktivitas optimum  enzim  adalah  7,5  mM.  Penghitungan  kinetika  enzim  menunjukkan  Km  enzim  PPO sebesar 5,42 mM. Na + , Ca 2+ , Zn 2+ , serta EDTA dengan konsentrasi 5 dan 10 mM menghambat kerja enzim PPO, demikian juga dengan. Cu 2+ 10 mM dan Mn 2+ 5 mM menghambat kerja enzim PPO.
Kata kunci : karapas, karakterisasi, polyphenoloxidase , udang

## I.  PENDAHULUAN
Udang merupakan komoditas ekspor  yang  menjanjikan  bagi  Indonesia. Tingkat ekspor udang ke luar negeri  yang tinggi  menjadi  sumber  pendapatan  yang tinggi  pula  bagi  Indonesia.  Ekspor  udang Indonesia  pada  tahun  2010  mencapai volume 145.092 ton dengan nilai
mencapai  US$  1.056.399.000  (KKP, 2011).  Ekspor  udang  ke  negara-negara Eropa  dalam  beberapa  tahun  terakhir mengalami  penurunan.  Penurunan  ini disebabkan  oleh  adanya  residu  senyawa- senyawa  antibiotik  yang  ditemukan  pada udang.  Selain  adanya  bahan  kimia, penurunan  ekspor  udang  ke  luar  negeri juga  disebabkan  oleh  penurunan  kualitas
dari  udang  yang  akan  diekspor  terkait dengan kemunduran mutu.
Penampakan,  bau,  tekstur,  dan nilai  gizi  adalah  empat  parameter  yang dinilai  oleh  konsumen  dalam  memilih makanan.  Penampakan  dipengaruhi  oleh warna, dan merupakan parameter pertama yang dinilai untuk mengevaluasi makanan.  Warna  dapat  dipengaruhi  oleh beberapa  komponen,  yaitu  pembentukan pigmen,  khlorofil,  karotenoid,  antosianin, dan  lain-lain,  atau  pembentukan  warna melalui reaksi enzimatis dan nonenzimatis.  Salah  satu  reaksi  warna yang penting adalah terbentuknya browning pada buah-buahan, sayur- sayuran, dan seafood khususnya krustasea (Kim et  al .,  2000).  Pembentukan black spot pada  udang  merupakan  salah  satu contoh pembentukan warna yang
disebabkan oleh aktivitas enzim polyphenoloxidase (PPO)  (Martinez  and Whitaker, 1995).
Montero et  al .  (2001)  menyatakan bahwa  melanoisis  adalah  proses  yang dipicu  oleh  mekanisme  biokimia  akibat oksidasi  fenol  menjadi  quinon  melalui kompleks enzim yang disebut polyphenoloxidase . Proses  ini diikuti oleh polimerasi  nonenzimatik  quinon  sehingga menimbulkan  senyawa  pigmen  dengan berat  molekul  tinggi  dan  sangat  gelap. Proses  kemunduran  mutu  pada  udang terjadi  saat post  mortem .  Walaupun timbulnya  warna  tidak  berbahaya  bagi konsumen, namun secara drastis mengurangi nilai jual produk dan menyebabkan kerugian yang cukup tinggi. Penghambatan  proses  pemben-
tukan blackspot dapat dilakukan menggunakan senyawa inhibitor. Senyawa inhibitor  digunakan  saat  penanganan udang  sehingga  proses  enzimatis  sebagai tahap  awal  pembentukan  melanin  dapat dihambat.  Penentuan  senyawa  inhibitor yang  efektif  dilakukan  menggunakan  uji aktivitas  penghambatan  secara  in  vitro dengan  enzim  PPO  sebagai  substratnya.
Oleh  karena  itu  perlu  dilakukan  usaha untuk  mengekstraksi  PPO  dari  udang.
Fakta menunjukkan bahwa PPO
diperlukan  untuk  substrat  pengujian,  dan juga  merupakan  enzim  yang  penting  bagi udang  terutama  dalam  hal  pembentukan cangkang  baru.  Selain  itu  enzim  tersebut terlibat  dalam  hal  penyembuhan  luka. PPO  juga  berperan  dalam  pertahanan  diri dan  perlindungan  terhadap  serangan patogen. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menguak potensi PPO tersebut.
Polyphenoloxidase pada  udang banyak  ditemukan  pada  bagian  karapas udang  (Montero et  al. ,  2001).  Zamorano et  al .  (2009)  menyebutkan  bahwa  PPO tertinggi  ditemukan  pada  karapas,  diikuti abdominal  eksoskeleton, cephalothorax , pleopod,  dan  telson.  Berdasarkan  hasil penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, ekstraksi PPO dapat dilakukan  menggunakan  karapas  udang.
Karapas udang merupakan salah satu jenis limbah  yang  dihasilkan  dari  proses pengolahan  udang.  Berdasarkan  fakta tersebut  ekstraksi  enzim polyphenol- oxidase dapat  berperan  sebagai  alternatif pemanfaatan  limbah  udang.  Penelitian  ini bertujuan untuk mengekstraksi dan mengkarakterisasi enzim PPO yang dihasilkan dari karapas udang.

## II.  METODE PENELITIAN
2.1.  Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah karapas udang windu yang diperoleh dari pasar di daerah Bogor. Bahan-bahan  lain  yang  digunakan  adalah akuades,  buffer  sodium  fosfat  (Merck), NaCl  (Merck),  Brij  35  (Merck),  Buffer Tris-HCl  (Applichem),  L-DOPA (Sigma). Alat-alat  yang  digunakan  pada  penelitian ini adalah sentrifuse (Sorvall),
spektrofotometer  (Yamato),  pipet  mikro (Axygen),  inkubator  (Thermoline),  dan
Freezer .
2.2. Ekstraksi Enzim Polyphenoloxidase Ekstraksi dilakukan dengan mengacu  modifikasi  metode  Simpson et
al .,  (1987).  Sampel  dibuat  dalam  bentuk bubuk  menggunakan  nitrogen  cair  dalam waring  blender .  Sampel  (50  g)  dicampur dengan  150  mL  buffer  (0,05  M  buffer sodium  fosfat,  pH  7,2;  yang  mengandung 1,0 M NaCl  dan 0,2% Brij  35. Campuran diaduk  secara  kontinu  pada  suhu  4 o C selama 30 menit, diikuti dengan sentrifugasi  dengan  kecepatan  8000  x  g pada  suhu  4 o C  selama  30  menit menggunakan sentrifuse dingin.

## 2.3. Penentuan Metode Ekstraksi Terbaik
Penentuan metode ekstraksi terbaik  dilakukan  dengan  memodifikasi perbandingan sampel dengan buffer ekstraksi  yang  digunakan.  Perbandingan yang  digunakan    antara  lain  1:1,  1:2,  1:3, dan 1:3 secara bertingkat. Metode ektraksi terbaik  ditentukan  dari  nilai  aktivitas spesifik enzim.
Aktivitas enzim ditunjukkan  dalam  satuan  U.    Nilai  1U menunjukkan peningkatan absorban
0,001/  menit.  Optimasi  assay  dilakukan dengan  menguji  waktu  inkubasi  saat pengujian.  Suhu  yang  digunakan  adalah 30  dan  35 o C.  Pengujian  aktivitas  enzim berdasarkan metode Bono et al . (2010)
2.4.  Penentuan Suhu dan pH Optimum Suhu  dan  pH  optimum  ditentukan menggunakan  metode  Bono et  al .  (2010). Sampel enzim sebanyak 0,2 mL ditambahkan  dengan  2,8  mL  0,01  M  L- DOPA  yang  dilarutkan  dalam  0,05  M buffer  fosfat  pH  6,5.  Campuran  tersebut diinkubasi  pada  suhu  30,  35,  40,  45,  50, 55 o C  selama  5  menit.  Sampel  yang  telah diinkubasi diukur pada panjang gelombang 475 nm. pH optimum ditentukan  dengan  melarutkan  sampel enzim  dalam  2,8  mL  0,01  M  L-DOPA
yang  dilarutkan  dengan  0,05  M  buffer fosfat  pH  5,  6,  7,  8,  9.  Campuran kemudian  diinkubasi  pada  suhu  optimum yang telah diperoleh sebelumnya selama 5 menit.

## 2.5.  Penentuan Kinetika Enzim
Kinetika  enzim  ditentukan  menggu- nakan  metode  Bono et  al .  (2010). Sebanyak  0,2  mL  enzim  ditambahkan dengan  2,8  mL  L-DOPA  yang  dilarutkan dalam  0,05  M  buffer  fosfat  dengan  pH sesuai pH optimum. Konsentrasi L-DOPA yng digunakan adalah 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5
mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi  pada suhu optimum  yang telah diperoleh  sebelumnya  selama  5  menit. Sampel yang telah diinkubasi diukur pada panjang  gelombang  475  nm..  Aktivitas enzim ditunjukkan dalam satuan U.  Nilai 1U  menunjukkan  peningkatan  absorban 0,001/ menit. Konstanta Michaelis- Menten  (Km)  dan  Kecepatan  maksimum (V maks) ditentukan dengan plot Lineweaver-Burk.

## 2.6.  Pengaruh Ion Logam dan Inhibitor terhadap Enzim
Pengaruh  ion  logam  dan  inhibitor terhadap  enzim  ditentukan  menggunakan modifikasi  metode  Bono et  al .  (2010). Sampel  enzim  0,2  mL  ditambahkan dengan  0,2  mL  larutan  Cu 2+ ,  Ca 2+ ,  Zn 2+ , Mn 2+ , Na, Co 2+ , ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) dilarutkan dalam 20 mM buffer Tris-HCl (pH 7,1). Masing- masing campuran diprainkubasi selama 20 menit  pada suhu ruang.  Sebanyak 2,6 mL 0,01  M  L-DOPA  yang  dilarutkan  dalam 0,05  M  buffer  fosfat  ditambahkan  ke dalam  campuran.  Campuran  kemudian diinkubasi  pada suhu optimum  yang telah diperoleh sebelumnya selama 5 menit, dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 475 nm.
2.7. Pengujian Aktivitas Enzim (Bono et al ., 2010)
Aktivitas polyphenoloxidase diten- tukan  dengan  mereaksikan  0,2  mL  enzim ditambahkan  dengan  2,8  mL  0,01  M  L- DOPA  yang  dilarutkan  dalam  0,05  M buffer  fosfat  pH  6,5.  Campuran  reaksi kemudian  diinkubasi  pada  suhu  35 o C selama  5  menit.  Kemudian  sampel  yang telah  diinkubasi  diukur  pada  panjang gelombang  475  nm.  Aktivitas  enzim ditunjukkan  dalam  satuan  U,  dengan  1U berarti peningkatan absorban 0,001/menit.

## 2.8. Penentuan Kadar Protein
Kadar  protein  ditentukan  meng- gunakan metode Bradford (1976). Coomassie blue digunakan untuk pewarna dan  bovine  serum  albumin  digunakan sebagai standar.

## III.  HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1.  Ekstraksi Enzim

## Polyphenoloxidase
Tahapan  ekstraksi  enzim  kasar dilakukan melalui beberapa tahap
optimasi.
Tahapan ini merupakan modifikasi  dari  metode  yang  dilakukan oleh  Simpson et  al .  (1987).  Metode tersebut menggunakan perbandingan sampel  banding  buffer  sebesar  1:3.  Pada penelitian ini dilakukan beberapa modifikasi  perbandingan  buffer,  yaitu menggunakan  perbandingan  1:3  secara bertingkat (SP1), 1:1 (SP2), 1:2 (SP3), 1:3 (SP4).
Hasil  penelitian  menggambarkan ekstrak  dengan  perbandingan  sampel  : buffer  sebesar  1:3  yang  dilakukan  secara bertingkat menghasilkan aktivitas spesifik yang  lebih  besar  dibandingkan  dengan yang  lain  (Gambar  1).  Hal  ini  diduga karena  dengan  metode  bertingkat  jumlah protein  yang  terekstrak  lebih  banyak dibandingkan  yang  lain.  Diduga  pelet hasil  ekstraksi  tahap  pertama  masih menyisakan  protein  dan  protein  ini  yang terekstrak pada tahap ekstraksi berikutnya.
Gambar 1. Aktivitas spesifik dari beberapa ekstrak enzim polyphenoloxidase menggunakan perbandingan buffer yang berbeda
Ekstrak  enzim polyphenoloxidase
SP1  selanjutnya  diuji  untuk  mengetahui aktivitas  spesifik  dari  masing-masing ekstrak.  Ekstraksi  bertingkat  pada  sampel SP1  dilakukan  sebanyak  3  kali  ekstraksi. Hasil  uji  ini  memperlihatkan  bahwa  dari masing-masing  tahap  ekstraksi  aktivitas spesifik  yang  diperlihatkan  masih  tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa pada ekstraksi  tahap  pertama  belum  terekstrak seluruh  protein  dalam  hal  ini  enzim  pada sampel.  Sehingga  pada  ekstraksi  tahap kedua  dan  ketiga  masih  ditemukan aktivitas enzim.

## 3.2.  Optimasi Assay
Optimasi  assay  dilakukan  untuk mengetahui  waktu  konversi  substrat  L- DOPA  menjadi  produk.  Pada  tahap  ini juga diberikan perbandingan suhu inkubasi  antara  suhu  30  dan  35  °C.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  semakin lama  waktu  inkubasi  nilai  absorban  akan semakin  besar.  Namum  rasio  perubahan absorbansi dengan waktu (dA/dt) semakin lama  semakin  menurun,  yang  berarti bahwa jumlah substrat yang bisa dikonversi menjadi produk semakin kecil.
Gambar 2.  Peningkatan absorbansi sampel yang diinkubasi pada suhu 30 °C.
Gambar 3.  Peningkatan absorbansi sampel yang diinkubasi pada suhu 35 °C.
Suhu inkubasi berpengaruh
terhadap  peningkatan  absorbansi  sampel. Suhu 35 °C memberikan laju peningkatan yang  lebih  besar  dibandingkan  suhu  30 °C.  Laju  peningkatan  absorbansi  di  dua menit  pertama  untuk  suhu  35  °C  adalah 0,004 sedangkan pada suhu 30 °C sebesar 0,003.  Suhu  yang  lebih  tinggi  akan meningkatkan  gerakan  rotasi,  vibrasi, translasi  ataupun  bentuk  gerakan  lain, sehingga terjadi transfer elektron (Suhartono, 1989). Hal ini yang menyebabkan inkubasi menggunakan suhu  35  °C  memberikan  laju  perubahan substrat  yang  lebih  besar.  Montero et  al . (2001)  menyebutkan polyphenoloxidase menunjukkan  aktivitas  tertinggi  antara  40 dan 60 o C, tetapi stabil pada suhu 35 o C. Semakin  lama  waktu  inkubasi  laju peningkatan  absorbansi  akan  semakin kecil. Hal ini terjadi karena laju perubahan substrat  akan  menurun  seiring  dengan penambahan  waktu  inkubasi.  Kecepatan pembentukan  kompleks  enzim  substrat sama  dengan  kecepatan  penguraiannya. Kecepatan  ini  sama  dengan  kecepatan maksimum  reaksi  enzim  yang  dicapai pada konsentrasi substrat tertentu (Suhartono, 1989). Ketika jumlah substrat mengalami  penurunan  selama  waktu
inkubasi,  maka  jumlah  produk  yang dihasilkan juga akan semakin menurun.

## 3.3.  Penentuan Suhu Optimum
Pengaruh suhu pada reaksi enzimatis  merupakan  suatu  fenomena yang  kompleks.  Bertambahnya  suhu sampai  dengan  suhu  tertentu  akan menyebabkan  kenaikan    kecepatan  reaksi enzim karena bertambahnya energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi dan  rotasi  enzim  serta  substrat,  sehingga memperbesar  peluang  keduanya  untuk bereaksi. Suhu  yang lebih besar dari suhu maksimum  akan  menyebabkan  protein enzim  mengalami  perubahan  konformasi yang  bersifat  detrimental.  Substrat  juga dapat  mengalami  perubahan  konformasi sehingga  gugus  reaktifnya  mengalami hambatan  dalam  memasuki  sisi  aktif enzim (Suhartono, 1989).
Suhu  inkubasi  berpengaruh  pada enzim polyphenoloxidase .  Peningkatan aktivitas  enzim  terlihat  ketika  suhu dinaikkan  menjadi  35  °C.  Penurunan aktivitas  terlihat  ketika  enzim  diinkubasi diatas suhu 35 °C (Gambar 4). Hal senada juga  disebutkan  oleh  Benjakul et  al . (2005)  yang  menyebutkan phenoloxidase (PO)  dari cephalothorax  kuruma  prawn memiliki  aktivitas  maksimum  pada  suhu 35 o C.
Gambar 4.  Suhu optimum aktivitas enzim polyphenoloxidase.
Penelitian  lain  menyebutkan  suhu optimum  beberapa  enzim  PPO  dari sumber  yang  berbeda.  Gimenez et  al . (2010)  menyatakan  aktivitas polypheno- loxidase yang  ditemukan  pada  karapas dan  ekstrak  jeroan Norway  lobster meningkat  sebanding  dengan  peningkatan suhu  hingga  60 o C.  Ekstrak  karapas menunjukkan kestabilan pada suhu 45 o C. Zamorano et  al .  (2009)  melaporkan  tidak ada  kisaran  maksimum  yang  jelas  pada suhu 15-60 o C tetapi stabilitas yang tinggi dicapai  pada  suhu  30-35 o C.  Cong et  al. (2005)  menyatakan phenoloxidase dari hemolymph Ruditapes philippinarum memiliki  aktivitas  tertinggi  pada  suhu  40 °C.  Fan et  al .  (2011)  menyatakan  PO Artemia  sinica optimal  pada  suhu  50  °C. Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Manheem et al . (2012) menunjukkan bahwa
kehilangan aktivitas PPO tertinggi
ditemukan  ketika  enzim  dipanaskan  pada suhu  80  °C  dan  90  °C.  Ketika  suhu  yang digunakan  berkisar  antara  50-70  °C penurunan  aktivitas  yang  terjadi  tidak berbeda nyata. Namun peningkatan aktivitas  terjadi  ketika  enzim  dipanaskan pada suhu 40 °C.

## 3.4.  Penentuan pH Optimum
Penentuan  pH  optimum  dilakukan menggunakan  variasi  pH  buffer  yang berbeda  (Gambar  5).  Buffer  merupakan salah  satu  komponen  penting  pada  reaksi enzimatis  karena  kemampuannya  untuk menjaga  pH.  pH  buffer  yang  digunakan bervariasi  mulai  dari  pH  5-9.  Pengujian aktivitas  enzim  pada  rentang  pH  tersebut menunjukkan  bahwa  aktivitas  optimum enzim polyphenoloxidase berada  pada nilai  pH  7.  Ketika  pH  dinaikkan  dari  5-7 aktivtas  enzim  mengalami  peningkatan, namun  ketika  pH  dinaikkan  lagi  diatas  7 aktivitas  enzim  mengalami  penurunan. Benjakul et  al .  (2005)  menyebutkan phenoloxidase (PO)  dari cephalotho- raxkuruma  prawn memiliki  aktivitas maksimum  pada  pH  6,5.  dan  stabil  pada kisaran pH 3-10.
Semua  reaksi  enzim  dipengaruhi oleh  pH  medium  tempat  reaksi  terjadi. Oleh  karena  itu  pada  setiap  percobaan dengan  enzim  diperlukan  buffer  untuk mengontrol  pH  reaksi.  Percobaan  yang menggunakan  enzim  murni  hasil  isolasi, biasanya  dipergunakan  buffer  buatan  atau buffer  artifisial  misalnya  buffer  fosfat, asetat, buffer tris dan HEPES.
Gambar 5.  pH optimum aktivitas enzim polyphenoloxidase.
Pada  umumnya  enzim  aktif  pada pH  netral,  yaitu  pada  pH  cairan  makhluk hidup.  Akan  tetapi  kisaran  keaktifan enzim dapat mencapai pH 5-9 (Suhartono, 1989).
Montero et  al .  (2001) polypheno- loxidase menunjukkan  aktivitas  spesifik yang  berbeda  pada  beberapa  lokasi  di tubuh tiger  prawn serta  aktif  pada  pH  5 dan 8. Zamorano et al . (2009) melaporkan karakterisasi dan distribusi jaringan polyphenoloxidase (PPO)  pada deepwater pink  shrimp ( Parapenaeus  longirostris ) setelah  mati.  Enzim  memiliki  aktivitas tertinggi pada pH 4,5 serta stabil pada pH 4,5  dan  9,0.  Cong et  al. (2005) menyatakan phenoloxidase dari hemolymph Ruditapes philippinarum optimum  pada  pH  7.  Fan et  al .  (2011) menyatakan  PO Artemia  sinica optimal pada pH 7.
3.5  Kinetika Enzim Polyphenoloxidase
Aktivitas enzim PPO diuji menggunakan  konsentrasi  substrat  (L-
DOPA)  yang  berbeda  mulai  dari  2,5  mM sampai  dengan  12,5  mM.  Aktivitas ditunjukkan  dalam  satuan  aktivitas  relatif (%). Konsentrasi substrat yang memberikan  aktivitas  enzim  optimum adalah  sebesar  7,5  mM.  Konsentrasi enzim  dibawah  7,5  mM  menunjukkan aktivitas  enzim  yang  terus  meningkat, namun ketika konsentrasi substrat dinaikkan    diatas  konsentrasi  7,5  mM aktivitas  enzim  mengalami  penurunan (Gambar 6).
Pembentukan kompleks enzim substrat  membatasi  kecepatan  reaksi enzimatis.  Kecepatan  maksimum  reaksi enzim  dicapai  pada  tingkat  konsentrasi substrat  yang  sudah  mampu  mengubah seluruh  enzim  menjadi  kompleks  enzim substrat  pada  keadaan  lingkungan  yang memungkinkan. Konsentrasi substrat dibawah  konsentrasi  ini,  reaksi  enzim tergantung pada konsentrasi  substrat  yang ditambahkan,  sedangkan  pada  konsentrasi
substrat diatas konsentrasi tersebut kecepatan reaksi menjadi tidak tergantung pada  konsentrasi  substrat  (Suhartono, 1989).
Substrat  yang  digunakan  untuk pengujian kinetika enzim adalah L-DOPA dengan  berbagai  konsentrasi.  L-DOPA memiliki  kemampuan  berikatan  yang lebih  baik  dibandingkan  dengan  substrat lain.  Cong et  al .  (2005)  menyebutkan bahwa  afinitas  L-DOPA  dengan  enzim lebih tinggi  dibandingkan dengan substrat lain,  yaitu  tirosin.  Hal  ini  dibuktikan  dari nilai  Km  untuk  substrat  L-DOPA  lebih kecil dibandingkan dengan tirosin.
Polyphenoloxidase (1,2-benzene- diol  :  Oxygen  Oxidoreductase;  EC. 1.10.3.1) merupakan enzim yang mengandung  Cu,  yang  juga  dikenal dengan catechol  oxidase , catecholase , diphenol oxidase , o-diphenolase , phenolase ,  dan tyrosinase (Martinez  dan Whitaker, 1995). Polyphenoloxidase
bertanggung  jawab  untuk  mengkatalis terjadinya  dua  reaksi  dasar.  Enzim mengkatalis  hidroksilasi ke posisi  O  yang berdekatan  dengan  hidroksil  yang  lain menggunakan  substrat  berupa  fenol  dan O 2 .  Reaksi  kedua  adalah  oksidasi  dari diphenol  menjadi  o- benzoquinon ,  yang selanjutnya  teroksidasi  menjadi  melanin (produk berwarna coklat) biasanya melalui mekanisme non enzimatis (Kim et al ., 2000). Kinetika enzim berdasarkan persamaan  Lineweaver-Burk  menunjukan bahwa  Km  enzim  PPO  dari Penaeus monodon sebesar  5,42  mM  (Gambar  7). Nilai  K m ini  masih  lebih  rendah dibandingkan  dengan  beberapa  penelitian lain,  seperti  enzim  pada Ruditapes philippinarum sebesar  2,2  mmol/L  (Cong et  al .,  2005), Charybdis  japonica sebesar 2,90  mM  (Fan et  al .,  2009), Penaeus vannamei sebesar  1,47  mM  (Garcia- Carreno et  al .,  2008), Parapenaeus longirostris sebesar  1,85  mM  (Zamorano et al ., 2009). Nilai K m yang rendah ini
disebabkan  karena  ekstrak  enzim  PPO masih  kasar  sehingga  diduga  pengotor  di dalamnya masih
banyak.
Metode
pemurnian dapat digunakan untuk meningkatkan  aktivitas  spesifik  enzim PPO.
Gambar 6.  Konsentrasi substrat optimum untuk aktivitas enzim polyphenoloxidase.
Gambar 7. Kinetika enzim polyphenoloxidase.

## 3.6 .  Pengaruh Ion Logam terhadap Enzim
Ion logam mempengaruhi aktivitas enzim polyphenoloxidase (PPO).  Ion logam dapat meningkatkan atau menurukan aktivitas enzim setelah berinteraksi  dengan  enzim.  Ion  logam yang meningkatkan aktivitas enzim disebut  dengan  aktivator  sedangkan  yang menurunkan  aktivitas  enzim  disebut dengan inhibitor. Ion logam yang mempengaruhi  kerja  aktivitas  enzim  PPO dapat dilihat pada Gambar 8.
Kontrol  menunjukkan  aktivitas PPO  yang  tidak  ditambahkan  ion  logam, ditunjukkan dengan aktivitas relatif 100%. Gambar  menunjukkan  bahwa  Na + ,  Ca 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , dan EDTA dengan konsentrasi 10 mM menurunkan aktivitas enzim PPO. Demikian halnya dengan Na + , Ca 2+ , Mn 2+ , Zn 2+ ,  dan  EDTA  dengan  konsentrasi  5 mM.  Namun  Cu  dengan  konsentrasi  5 mM,  Mn 2+ dengan  konsentrasi  10  mM, dan  Co  dengan  konsentrasi  5  dan  10  mM meningkatkan aktivitas enzim PPO.
Penelitian  yang  dilakukan  oleh Cong et  al .  (2005)  menyebutkan  bahwa
logam  Cu 2+ ,  Zn 2+ ,  Ca 2+ menghambat aktivitas kerja enzim PO. Zn 2+ menghambat  aktivitas  PO Ruditapes
tertinggi pada konsentrasi 1 mM.
Demikian halnya dengan EDTA menghambat  aktivitas  PPO  sebesar  100% pada  konsentrasi  10  mM.  Penelitian  yang dilakukan  oleh  Fan et  al .,  (2009) menyatakan  bahwa  Cu,  Zn,  Ca,  Mg,  dan EDTA  juga  menghambat  enzim  PPO. EDTA  dengan  konsentrasi  10  mM menghambat  enzim  sampai  100%.  Hasil tersebut menyatakan bahwa PPO
merupakan jenis metaloenzim.
Selain  beberapa  ion  logam,  enzim PPO  juga  bisa  dihambat  oleh  beberapa inhibitor  protease.  Protease  sendiri  bisa dihambat oleh beberapa ion logam. Ferrer et al . (1989) menyatakan ekstrak PO kasar umumnya memiliki aktivitas yang rendah. Semua protease inhibitor mencegah aktivasi phenoloxidase .  Benjakul et  al .
(2006) menyatakan sistein dan glutathione menunjukkan aktivitas penghambatan pada PO kuruma prawn .
Gambar 8.  Pengaruh beberapa logam terhadap enzim polyphenoloxidase konsentrasi logam 5 mM   konsentrasi logam 10 mM

## IV.  KESIMPULAN
Metode  terbaik  untuk  mengeks- traksi enzim adalah menggunakan perbandingan buffer 1:3 secara bertingkat.
Suhu  untuk  pengujian  enzim  adalah  35 °C.  pH  optimum  kerja  enzim PPO  adalah 7 dengan suhu optimum 35 °C. Konsentrasi  L-DOPA  yang  digunakan untuk  memperoleh  aktivitas  optimum enzim  adalah  7,5  mM.  Penghitungan kinetika  enzim  menunjukkan  bahwa  nilai Km  enzim  PPO  sebesar  5,42  mM. Beberapa  ion  logam  digunakan  untuk melihat  pengaruh  enzim  terhadap  ion logam.  Na + ,  Ca 2+ ,  Cu 2+ ,  Zn 2+ ,  dan  EDTA dengan  konsentrasi  10  mM  menghambat aktivitas enzim PPO. Selain itu Na + , Ca 2+ , Mn 2+ , Zn 2+ , dan EDTA dengan konsentrasi 5 mM juga menghambat kerja enzim PPO.

## DAFTAR PUSTAKA
Benjakul,  S.,  W.  Visessanguan,  and  M. Tanaka. 2005. Properties of phenoloxidase isolated from theCephalothorax of kuruma prawn  ( Penaeus  japonicus ). J.  of Food Biochem ., 29:470–485 Benjakul,  S.  W.  Visessanguan,  and  M.
Tanaka.  2006.  Inhibitory  effect  of cysteine and glutathione on phenoloxidasefrom  kuruma  prawn ( Penaeus japonicus ). Food Chem ., 98:158–163.
Bono,  G.,  C.  Badalucco,  A.  Corrao,  S.
Cusumano, L. Mammina, and G.B. Palmegiano. 2010. Effect of temporal variation, gender and size on  cuticle polyphenol  oxidase activity  in  deep-water  rose  shrimp ( Parapenaeus  longirostris ). Food Chem ., 123:489–493.
Bradford,  M.M.  1976.  A  rapid  and sensitive method for quantification of  microgramquantities  of  protein utilizing  the  principle  of  protein dye  binding. Anal.  Biochem.,
72 :234-254.
Cong,  R,  W.  Sun,  G.  Liu,  T.  Fan,  X.
Meng,  L.  Yang,  and  Zhu.  2005. Purification and characterization of phenoloxidasefrom clam Ruditapes philippinarum . J. FSI., 18:61-70. Fan,  T.,  Y.  Zhang,  L.  Yang,  X.  Yang,  G. Jiang,  M.  Yu,  and  R.  Cong.  2009. Identification  and  characterization of  a  hemocyanin-derived  phenol- oxidase  from  the  crab Charybdis japonica . J.CBPB ., 152:144–149.
Fan,  T.,  J.  Zhao,  X.  Fan,  M.  Yu,  and  G.
Jiang.  2011.  Purification  and characterization  of  phenoloxidase from  brine  shrimp Artemia  sinica .
Acta  Biochim  Biophys  Sin .,43: 722–728
Ferrer,  O.J,  J.A.  Koburger,  W.S.  Otwell, R.A.  Gleeson,  B.K.  Simpson,  and M.R.  Marshall.  1989.  Phenol- oxidase  from  the  cuticle  of  florida spiny  lobster  ( Panulirus  argus ): mode  of  activation  and  characteri- zation. J. of Food  Science,
54(1):63-67
Garcia-Carreno,  F.L.,  K.  Cota,  and
M.A.N.D.  Toro.  2008.  Phenol- oxidase  activity  of  hemocyanin  in whiteleg shrimp Penaeus vannamei :  conversion,  characteri- zation  of  catalytic  properties,  and role  in Postmortem  melanosis . J. Agric.  Food  Chem .,  56:6454– 6459.
Kim, J., M.R. Marshall, and C.Wei. 2000.
Polyphenoloxidase. Dalam :  Haard
N.F.  and  B.K.  Simpson  (eds.). Seafood  enzymes:    utilization  and influence  on  postharvest  seafood quality. New  York:  Marcel Dekker, Inc. hlm.:271-316.
[KKP] Kementerian Kelautan dan Perikanan.  2011.  Statistik  ekspor hasil perikanan. Pusat Data, Statistik,  dan  Informasi,  Sekre- tariat Jenderal, Kementerian Kelautan dan Perikanan. Jakarta. Manheem,  K.,  S.  Benjakul,  K.  Kijroong-
rojana,  and  W.  Visessanguan. 2012.  The  effect  of  heating conditions  on polyphenol  oxidase ,
proteases  and  melanosisin  pre- cooked Pacific white shrimp during  refrigerated  storage. Food Chem ., 131:1370–1375
Martinez,  M.V.  and  J.R.  Whitaker.  1995. The  biochemistry  andcontrol  of enzymatic browning . Trends  in Food  Science  &  Technology,
6:195-200.
Montero,  P,  A.  Avalos,  and  M.  Perez-
Mateos.  2001.  Characterization  of polyphenoloxidase of prawns ( Penaeus  japonicus ).  Alternatives to  inhibition:  additives  and  high- pressure  treatment. Food  Chem .,
75:317–324. Simpson  B.K.,  M.R.  Marshall,  and  W.S. Otwell.  1987.  Phenoloxidase  from shrimp ( Penaeus setiferus ): purification and some properties. J.
Agric. Food Chem ., 35:918-921
Suhartono,  M.T.  1989.  Enzim  dan bioteknologi.  Bogor:  Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat  Jenderal  Pendidikan Tinggi Antar Universitas Bioteknologi,  Institut  Pertanian Bogor. Zamorano,  J.P.,  O.  Martinez-Alvarez,  P.
Montero, and M.C.Gomez-Guillén. 2009.  Characterisation  and  tissue distribution  of polyphenol  oxidase of  deepwaterpink  shrimp  ( Parape- naeus longirostris ). Food Chemistry , 112:104–111.
Diterima  :7 Oktober 2013 Direvisi   :8 Desember 2013 Disetujui :17 Desember 2013