## ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN ANALISIS EKSPRESI GEN PENGKODE GROWTH HORMONE PADA IKAN SIDAT ( Anguilla bicolor )
Hamdan Syakuri # , Satrio Haryu Wibowo, Anandita Ekasanti, Petrus Hary Tjahja Soedibya, Sri Marnani, Emyliana Listiowati, Dewi Nugrayani, dan Purnama Sukardi
*) Program Studi Akuakultur, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Jenderal Soedirman,
Jalan Dr. Suparno, Karangwangkal, Purwokerto, Banyumas, Jawa Tengah
(Naskah diterima: 26 April 2024; Revisi final: 28 Mei 2024; Disetujui publikasi: 28 Mei 2024)

## ABSTRAK
Gen hormon pertumbuhan ( growth hormone, GH) perlu dipelajari untuk mendukung domestikasi ikan sidat ( Anguilla bicolor ) di Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi gen pengkode GH serta menganalisis ekspresinya pada sampel ikan sidat A. bicolor . Primer untuk amplifikasi gen GH ikan sidat A. bicolor didesain berdasarkan sekuen gen GH dari beberapa spesies ikan sidat lain yang tersedia di GenBank. Sampel cDNA hipofisa dan otak ikan sidat digunakan untuk amplifikasi gen GH. Hasil amplifikasi disekuensing dan hasilnya dianalisis menggunakan analisis BLAST, multiple sequences alignment , hormon signature , dan filogenetik. Analisis ekspresi gen GH dilakukan menggunakan teknik realtime PCR dengan metode delta-delta CT pada 14 sampel ikan sidat (23,1 ± 19,6 g; 24,5 ± 4,2 cm). Fragmen DNA sepanjang 486 bp berhasil diamplifikasi dan disekuensing. Sekuen gen GH A. bicolor memiliki similaritas nukleotida sebesar 98,49-99,14% jika dibandingkan dengan gen GH ikan sidat A. anguilla , A. australis , dan A. japonica . Sekuen parsial tersebut secara in silico diketahui mengkode bagian dari protein GH sepanjang 155 asam amino (aa). Sekuen asam amino protein GH A. bicolor sangat mirip dengan sekuen spesies ikan sidat lain dengan hanya tiga perbedaan asam amino dan membentuk satu percabangan pada pohon filogenetik. Tingkat ekspresi gen GH pada sampel ikan sidat memiliki variasi yang tinggi. Hasil penelitian ini dapat menjadi dasar untuk studi selanjutnya khususnya berkaitan dengan peran gen GH dalam pertumbuhan ikan sidat A. bicolor .
KATA KUNCI: Anguilla bicolor ; ekspresi gen; hormon pertumbuhan; RT-PCR; sekuen gen
ABSTRACT : Isolation, Identification, and Analysis of Growth Hormone Coding Genes Expression in Eel ( Anguilla bicolor)
The growth hormone (GH) gene needs to be studied to support the domestication of the Anguilla bicolor eel in Indonesia. This study aimed to isolate and identify the GH coding gene and analyze its expression in samples of the eel A. bicolor . Primers for amplification of the GH gene of A. bicolor eels were designed based on GH gene sequences from several other eel species available in GenBank. Pituitary and brain cDNA samples of eel were used for GH gene amplification. The amplification results were sequenced and the results were analyzed using BLAST analysis, multiple sequence alignment, hormone signature, and phylogenetic analysis.
#Korespondensi: Program Studi Akuakultur, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,
Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto, Banyumas, Jawa Tengah Email: hamdan.syakuri@unsoed.ac.id
The GH gene expression analysis was carried out using the real-time PCR technique with the delta-delta CT method on 14 eel samples (23.1 ± 19.6 g; 24.5 ± 4.2 cm). The 486 bp DNA fragment was successfully amplified and sequenced. The GH gene sequence of A. bicolor has a nucleotide similarity of 98.49-99.14% when compared with the GH gene of other eel species A. anguilla , A. australis , and A. japonica . This partial sequence was found in silico to code 155 amino acids (aa) GH protein. The amino acid sequence of the A. bicolor GH protein is very similar to that of other eel species with only three amino acid differences and forms one branch on the phylogenetic tree. The expression level of the GH gene in eel samples had high variations. The results of this study could be a basis for further studies, especially regarding the role of the GH gene in the growth of the eel A. bicolor .
KEYWORDS: Anguilla bicolor ; expression of gene, growth hormone; RT-PCR; sequence of gene

## PENDAHULUAN
Ikan sidat ( Anguilla bicolor ) merupakan ikan yang sedang dalam proses domestikasi menjadi komoditas perikanan budidaya di Indonesia. Jenis ikan sidat ini banyak ditemukan di perairan selatan Jawa, Sumatera, dan Sulawesi (Fahmi, 2015; Fahmi & Hirnawati, 2010). Tahap budidaya ikan sidat yang sudah dapat dilakukan adalah tahap pendederan dan pembesaran. Tahap ini menggunakan benih ikan sidat yang berasal dari alam, sehingga budidaya ikan sidat sangat tergantung pada keberhasilan usaha penangkapan dan ketersediaannya di alam (Setijanto et al. , 2014). Tahap domestikasi ini berada pada level 2, di mana baru sebagian dari siklus hidup ikan yang dapat dilakukan dalam lingkungan terkontrol (Teletchea, 2021; Teletchea & Fontaine, 2014). Untuk mendukung keberhasilan domestikasi ikan sidat, beberapa aspek telah dipelajari antara lain adalah biologi reproduksi (Rachmawati et al. , 2017), infeksi parasit (Pratama et al. , 2019), teknik budidaya (Affandi et al. , 2013; Marlina & Handayani, 2022; Yolla et al. , 2020), dan pakan (Arief et al. , 2011). Kajian tersebut umumnya bertujuan untuk mempelajari perkembangan gonad, infeksi penyakit, dan pertumbuhan ikan sidat di lingkungan terkontrol. Berkaitan dengan pertumbuhan, aspek yang perlu dikaji adalah gen pengkode hormon pertumbuhan. Hormon pertumbuhan atau growth hormone (GH) memiliki peran penting dalam pertumbuhan hewan termasuk ikan, terutama melalui poros GH- insulin-like growth factor -1
(IGF-1) (Ndandala et al. , 2022). Hormon yang diproduksi dalam kelenjar pituitary (hipofisa) ini saat melekat pada growth hormone receptor (GHR) pada sel target yang akan memicu produksi dan sekresi IGF-1 (Dehkhoda et al. , 2018). Growth hormone memiliki peran penting dalam pembentukan tulang dan otot, metabolisme, dan pembentukan serta perbaikan jaringan tubuh (Dehkhoda et al. , 2018; Rotwein, 2020). Pada ikan, fungsi GH di antaranya adalah berkaitan dengan metabolisme, sistem imun, osmoregulasi, reproduksi, neuroendokrin dan neural, serta tingkah laku (Jönsson & Björnsson, 2002). Pada beberapa ikan teleostei, GH telah terbukti berkaitan dengan peningkatan laju pertumbuhan spesifik untuk panjang dan berat tubuh. Peningkatan laju pertumbuhan tersebut disebabkan karena peningkatan nafsu makan dan efisiensi konversi pakan (Jönsson & Björnsson, 2002).
Kajian tentang gen GH pada ikan sidat masih sangat jarang dan umumnya terbatas pada ikan sidat Jepang Anguilla japonica , ikan sidat Eropa Anguilla anguilla , dan ikan sidat Australia Anguilla australis (Nguyen et al. , 2022; Yamaguchi et al. , 1987). Karakteristik molekuler protein GH telah dideskripsikan dari A. japonica (Yamaguchi et al. , 1987). Ekspresi gen hormon pertumbuhan pada ikan sidat tersebut telah diamati pada saat perkembangan larva dan ekspresinya terdeteksi mulai 6 hari setelah menetas (Ozaki et al. , 2006).  Selain itu tingkat ekspresi gen GH juga telah dipelajari pada perkembangan larva ikan sidat Eropa dan dilaporkan berkaitan dengan temperatur
pemeliharaan (Politis et al. , 2017). Sampai saat ini studi tentang gen GH pada A. bicolor masih sebatas pada analisis ekspresinya terkait pemberian kromium pikolinat melalui pakan (Nugrayani et al. , 2023). Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi gen pengkode GH serta menganalisis ekspresinya pada ikan sidat A. bicolor .

## BAHAN DAN METODE
Desain Primer Gen Growth Hormone Ikan Sidat
Primer gen GH ikan sidat A. bicolor dirancang berdasarkan sekuen gen GH ikan sidat yang terdapat di GenBank, yaitu dari A. japonica (M24066, AY616666), A.anguilla (AY148493), dan A. australis (HQ436341). Pensejajaran sekuen dilakukan menggunakan Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/clustalo/) untuk memperoleh daerah yang lestari ( conserve ). Primer dirancang di daerah lestari tersebut dengan  menggunakan perangkat lunak Primer 3 versi 0.4.0 (http:// bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Karakteristik primer tersebut diuji untuk mengetahui peluang terbentuknya struktur melingkar ( hairpin ), self-dimer , dan hetero-dimer menggunakan perangkat lunak OligoAnalyzer versi 3.1 (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer). Prosedur ini menghasilkan tiga primer, yaitu ghAF1: 5` GGTCTTACTGGTCAGCTTCT 3´, ghAF2: 5` GCTTTCTCAAACAGCCTGAT 3´, dan ghAR: 5` GCATCGTTCCTAAGGTGTAC 3´. Kombinasi primer ghAF1 dan ghAR memiliki target sekitar 486 bp dan kombinasi primer ghAF2 dan ghAR memiliki target sekitar 173 bp.
Sampel untuk Identifikasi Gen Growth Hormone
Sampel ikan sidat stadia elver (sekitar 15 g) diperoleh dari hasil tangkapan nelayan di wilayah Cilacap dan dibawa dalam kondisi hidup ke Laboratorium Riset, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Jenderal Soedirman.
Sampel hipofisa dan otak kemudian diambil dari ikan sidat dengan prosedur sebagai berikut: 1) ikan sidat dimatikan dengan memotong kepala; 2) bagian kepala ikan sidat dibedah secara horizontal, 3) otak dan hipofisa diambil dan dimasukkan ke microtube 1,5 mL berisi 500 µL RNA Later (Ambion), dan 4) sampel didiamkan pada temperatur ruang selama 30 menit, selanjutnya diinkubasi dalam refrigerator (4°C) selama 24 jam setelah itu disimpan dalam freezer (-20°C) sampai dilakukan isolasi RNA. Prosedur preservasi sampel menggunakan RNA later ini mengikuti protokol yang menyertai produk (Ambion).
Sampel untuk Analisis Ekspresi Growth Hormone
Sebanyak 14 ikan sidat stadia elver (23,1 ± 19,6 g; 24,5 ± 4,2 cm) diambil dari hasil pemeliharaan selama dua bulan dalam sebuah kolam terpal sirkuler dengan diameter 2 m. Kolam  berisi air dengan ketinggian 40 cm dan dilengkapi dengan aerator . Ikan sidat yang dipelihara tersebut diperoleh dari hasil tangkapan nelayan di Kabupaten Cilacap. Ikan sidat diberi pakan berupa pakan pasta dengan kandungan protein 40% pada pagi dan sore hari sebanyak 3% bobot tubuh per hari. Di akhir pemeliharaan, setiap individu ikan sidat diukur panjangnya, ditimbang beratnya, dimatikan, dan dibedah bagian kepalanya. Sampel hipofisa dari setiap ikan sidat diambil dan dipreservasi menggunakan RNA later sesuai dengan prosedur yang ada (Ambion).

## Isolasi RNA
Sampel otak (sekitar 6 mg) dan total hipofisa ikan sidat diambil dari RNA later dengan menggunakan pinset kemudian dimasukkan ke microtube volume 1,5 mL.  Sampel total RNA diisolasi menggunakan Pure Link RNA Mini- Kit sesuai dengan petunjuk pemakaiannya (Ambion). Sampel dimasukkan dalam 600 µL lysis buffer yang telah ditambahkan 6 µL β -Mercaptoethanol pada microtube volume 1,5 mL lalu sampel dihancurkan dengan micropestle dan disentrifugasi selama 15 detik dengan
Isolasi, Identifikasi, dan Analisis Ekspresi Gen Pengkode ...... (Hamdan Syakuri)
kecepatan 12.000 rpm. Supernatan sebanyak 500 µL dimasukkan dalam microtube volume 1,5 mL, lalu ditambahkan 500 µL ethanol 70%, kemudian dihomogenkan. Sampel sebanyak 500 µL dipindahkan ke dalam spin cartridges (tahap tersebut diulangi sampai semua larutan dimasukkan pada spin cartridges ) kemudian disentrifugasi selama 15 detik dengan kecepatan 12.000 rpm. Larutan pada tabung penampungan dibuang dan ditambahkan 600 µL wash buffer I kemudian disentrifugasi selama 15 detik dengan kecepatan 12.000 rpm, collective tube diganti dan ditambahkan wash buffer II sebanyak 500 µL lalu disentrifugasi kembali selama 15 detik dengan kecepatan 12.000 rpm (diulang sebanyak satu kali). Larutan yang berada pada collection tube dibuang, lalu sentrifugasi kembali. Spin catridges diletakkan pada recovery tube dan ditambahkan RNase– Free Water sebanyak 30 µL lalu diinkubasi 1 menit kemudian disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Sampel RNA kemudian disimpan pada suhu -80 o C hingga proses berikutnya.
DNase Treatment dan Sintesis cDNA
Kontaminasi DNA pada sampel RNA dihilangkan menggunakan DNase I-RNAse Free sesuai petunjuk pemakaiannya (Thermo Scientific). Sebanyak 10 µL mix DNase treatment yang terdiri atas: 2 µL RNA; 1 µL 10x reaction buffer with MgCl2; 2 µL DNase I-RNAse Free ; 5 µL nuclease-free water dalam tabung PCR 0,2 mL diinkubasi selama 45 menit pada suhu 37°C. Inaktifasi DNase dilakukan dengan menambahkan 1 µL 50 mM EDTA dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit. Sampel RNA untuk isolasi dan identifikasi gen digunakan sebagai template sintesis cDNA, sedangkan sampel RNA untuk analisis ekspresi digunakan sebagai template dalam one step realtime RT-PCR. Sampel RNA setelah tahap DNase treatment digunakan untuk menyintesis cDNA menggunakan RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Sebanyak 4 µL 5x Reaction Buffer , 1 µL RiboLock RNAse
Inhibitor , 2 µL 10 mM dNTP mix, 1 µL RevertAid dimasukkan dalam tube PCR, lalu ditambahkan 2 µL sampel RNA produk DNase treatment , 1 µL random hexamer primer , 9 µL nuclease-free water , kemudian dihomogenisasi dengan vortex dan spin down . Sampel diinkubasi pada suhu 25°C selama 5 menit, dilanjutkan dengan suhu 40°C selama 60 menit, dan diakhiri pada 70°C selama 5 menit kemudian sampel disimpan dalam freezer (-20°C).
Amplifikasi Gen Growth Hormone dengan Teknik RT-PCR
Amplifikasi gen GH dilakukan dengan Mytaq Hot Start Red PCR Master Mix (2x) sesuai protokol (Bioline) dengan pasangan primer ghAF1 dan ghAR atau pasangan primer ghAF2 dan ghAR. Sebagai kontrol, amplifikasi juga dilakukan pada gen pengkode beta-aktin dengan primer BA-F1 (5` TGACGGACAGGTCATCACC 3`) dan BA-R1 (5` CTCATCGTACTCCTGCTTGC 3`) dengan target panjang produk 364 bp.
Amplifikasi dilakukan dengan total volume 50 µL yang terdiri atas PCR Master Mix (2x) sebanyak 25 µL: forward primer 1 µL (10 pmol/ µL); reverse primer 1 µL (10 pmol/µL); nuclease- free water 21 µL; dan template (cDNA) 2 µL. Homogenisasi dilakukan dengan vortexing dan spinning down . Setelah itu, larutan dimasukkan pada mesin PCR (Primus 25 Thermocycler, Peqlab). Siklus temperatur yang digunakan adalah suhu denaturasi awal 95°C selama 5 menit, diikuti 35 siklus: denaturasi 95°C selama 30 detik, annealing 55°C selama 30 detik, extension 72°C selama 30 detik, dan extension tambahan 72°C selama 5 menit.

## Elektroforesis Produk Amplifikasi
Elektroforesis dilakukan menggunakan gel agarose 2% yang diberi SYBR safe DNA gel stain (Invitrogen) dalam buffer TBE 1X. Sampel hasil amplifikasi dan DNA Ladder dimasukkan pada sumuran dalam agarose gel menggunakan micropipette sebanyak 5 µL. Alat elektroforesis dijalankan pada tegangan 100 volt dalam waktu sekitar 30 menit atau sampel mencapai
2/3 dari agarose gel . Hasil elektroforesis dilihat menggunakan UV-transilluminator dan diambil gambarnya.

## Analisis sekuen Gen GH
Sampel hasil PCR beserta primer ghAF1 dan ghAR dikirim ke PT. Genetika Sains Indonesia untuk dilakukan sekuensing dengan ABI dye terminator chemistry di First BASE Laboratories SDN BHD. Hasil dari sekuensing dievaluasi dan disatukan untuk memperoleh sekuen konsensus dengan menggunakan aplikasi BioEdit (Hall, 1999). Selanjutnya sekuen gen GH ikan sidat dianalisis menggunakan analisis BLAST (Altschul et al. , 1990). Sekuen gen GH diterjemahkan secara in silico ke dalam sekuen asam amino menggunakan https:// web.expasy.org/translate/ (Gasteiger et al. , 2003). Identifikasi hormone signature dilakukan menggunakan database prosite pada https:// prosite.expasy.org (Hulo et al. , 2006). Hasil yang diperoleh kemudian digunakan dalam analisis Multiple Sequences Alignment dengan Clustal Omega (Sievers & Higgins, 2014), dan analisis filogenetik menggunakan https://www. phylogeny.fr/  (Dereeper et al. , 2008).
Analisis Ekspresi GH dengan One Step Realtime RT-PCR
Tingkat ekspresi gen GH pada hipofisa diukur dengan metode delta-delta Ct dengan gen beta- aktin sebagai acuan internal menggunakan one step realtime RT-PCR dengan alat Line-gene K Real-time PCR Detection System (Bioer Technology). Bahan yang digunakan adalah superscript platinum one step realtime PCR kit (Invitrogen). Prosedur PCR dilakukan dengan mengikuti petunjuk penggunaan. Master Mix (2x) sebanyak 5 µL; forward primer 0,2 µL (10 pmol/µL); reverse primer 0,2 µL (10 pmol/µL); nuclease-free water 4,2 µL; dan template (RNA) 0,4 µL dicampurkan dalam tabung PCR 0,2 mL sehingga diperoleh larutan sebanyak 10 µL. Homogenisasi dilakukan dengan vortexing dan spinning down . Setelah itu, larutan dimasukkan pada mesin realtime PCR dengan pengaturan
program: suhu sintesis cDNA 45°C selama 10 menit, denaturasi awal 95°C selama 2 menit, dan diikuti 40 siklus yang terdiri atas denaturasi 95°C selama 10 detik, annealing 54 °C selama 15 detik, dan extension 72°C selama 15 detik. Pembacaan sinyal fluorosens dilakukan di setiap siklus pada akhir tahap extension . Analisis kurva melting dilakukan dari suhu 55- 95°C. Selain itu, gen beta-aktin sebagai kontrol diamplifikasi dengan perlakuan yang sama seperti amplifikasi gen GH. Primer untuk gen GH adalah ghAF1 (5` GCTTTCTCAAACAGCCTGAT 3`) dan ghAR (5` GCATCGTTCCTAAGGTGTAC 3`) dengan panjang produk 173 bp. Primer untuk gen beta-aktin adalah BA-F1 (5` TGACGGACAGGTCATCACC 3`)  dan BA-R1 (5` CTCATCGTACTCCTGCTTGC 3`) dengan panjang produk 364 bp. Dengan sampel yang memiliki delta Ct (Ct gh - Ct actin ) terendah sebagai kalibrator, tingkat ekspresi gen GH (R gh ) dihitung menggunakan modifikasi rumus delta-delta Ct yang umum digunakan (Forlenza et al. , 2012):
∆∆Ct = (Ct gh - Ct actin ) sampel - (Ct gh - Ct actin ) kalibrator
R gh = 2 - ∆∆Ct

## Analisis Data
Data yang dihasilkan dari penelitian ini yaitu gambar visualisasi hasil PCR, sekuen  gen hormon pertumbuhan, hasil analisis BLAST, hasil penerjemahan (deduksi asam amino) gen GH, hasil analisis multiple sequences alignment , dan hasil analisis filogenetik. Data tersebut dianalisis secara deskriptif kualitatif. Data ekpresi gen GH pada ikan sidat disajikan dalam grafik box plot .

## HASIL DAN BAHASAN
Informasi mengenai GH menjadi salah satu aspek penting dalam domestikasi ikan sidat A. bicolor . Domestikasi komoditas ini ada pada tahap kedua di mana ikan sidat pada stadia glass eel dan elver hasil tangkapan sudah dapat diadaptasikan pada lingkungan terkontrol
untuk tahap pembesaran (Teletchea, 2021; Teletchea & Fontaine, 2014). Dalam tahap ini, upaya meningkatkan laju pertumbuhan menjadi salah satu tujuan utama. Hasil identifikasi gen GH pada ikan sidat A. bicolor dari penelitian ini sangat berguna dalam upaya meningkatkan pertumbuhan ikan sidat. Selain itu hasil penelitian ini juga dapat digunakan untuk mempelajari aspek lain seperti reproduksi dan daya tahan tubuh ikan sidat. Hal ini karena GH merupakan hormon yang berkaitan dengan banyak aspek biologi hewan (Daza & Larhammar, 2018; Jönsson & Bjönsson, 2002).
Dalam penelitian ini, gen pengkode GH
ikan sidat A. bicolor berhasil diamplifikasi menggunakan primer yang telah didesain berdasarkan sekuen gen GH A. japonica , A. anguilla , dan A. australis (Gambar 1). Fragmen GH-1 hanya teramplifikasi dari cDNA yang disintesis menggunakan sampel RNA dari hipofisa sebagai template . Selain dari sampel RNA hipofisa, fragmen GH-2 juga ditemukan pada sampel RNA otak dengan konsentrasi produk PCR yang jauh lebih sedikit. Namun hal ini kemungkinan terjadi karena adanya kontaminan DNA yang masih tersisa setelah tahapan DNase treatment . Hasil penelitian selama ini menunjukkan ekspresi gen hormon pertumbuhan hanya ditemukan pada hipofisa
Gambar 1. Hasil RT-PCR gen hormon pertumbuhan (GH) dan beta-aktin dari sampel RNA hipofisa (h) dan otak (o) ikan sidat Anguilla bicolor . Lane M adalah marker 100 bp DNA. GH-1 diamplifikasi menggunakan sepasang primer (ghAF1-ghAR) dengan DNA target 486 bp dan GH-2 diamplifikasi menggunakan sepasang primer (ghAF2-ghAR) dengan DNA target 173 bp. Panjang produk amplifikasi untuk beta-aktin adalah 364 bp Figure 1. RT-PCR results of growth hormone (GH) and beta-actin genes from the pituitary (h) and the brain (o) RNA samples of Anguilla bicolor eel. Lane M is a 100 bp DNA marker. GH-1 was amplified using a pair of primers (ghAF1-ghAR) with a target DNA of 486 bp and GH-2 was amplified using a pair of primers (ghAF2-ghAR) with a target DNA of 173 bp. The amplification product length for beta-actin is 364 bp
dan tidak ditemukan pada jaringan tubuh lain seperti otak (Dehkhoda et al. , 2018; Triantaphyllopoulos et al. , 2020). Keberhasilan amplifikasi gen beta-aktin menunjukkan bahwa tidak ada masalah teknis dalam RT-PCR.
Hasil analisis BLAST menunjukkan sekuen tersebut memiliki similaritas sebesar 98,49- 99,14% jika dibandingkan dengan sekuen gen GH A. Anguilla, A. australis , dan A. japonica (Tabel 1). Sekuen gen yang diperoleh juga dapat secara sempurna diterjemahkan ke dalam sekuen protein sepanjang 155 aa (Gambar 2). Hasil analisis BLAST dan hasil penerjemahan ini menunjukkan bahwa sekuen yang diperoleh terkonfirmasi sebagai sekuen gen GH A bicolor . Hasil analisis multiple sequences alignment
menunjukkan ada tiga perbedaan residu asam amino GH dari empat spesies ikan sidat yang dibandingkan (Gambar 3). Pada perbedaan pertama, protein GH A. bicolor memiliki asam amino yang sama dengan protein GH A. australis dan A. anguilla yaitu asam amino lisin dan berbeda dibandingkan protein GH A. japonica (leusin). Perbedaan kedua menunjukkan protein GH A. bicolor memiliki asam amino leusin, sedangkan protein GH tiga spesies lainnya memiliki asam amino valin. Perbedaan ketiga menunjukkan protein GH A. bicolor dalam penelitian ini memiliki asam amino yang sama dengan protein GH A. australis dan A. anguilla (lisin), yang berbeda dibandingkan asam amino protein GH A. japonica (asparagin).
Gambar 2. Sekuen nukleotida dan deduksi asam amino hormon pertumbuhan ikan sidat, Anguilla bicolor
Figure 2. Nucleotide sequences and amino acid deduction of the growth hormone of Anguilla bicolor
Tabel 1. Similaritas sekuen nukleotida gen pengkode hormon pertumbuhan ikan sidat Anguilla bicolor dibandingkan gen yang sama dari jenis ikan sidat lain
Table 1. Similarity of the nucleotide sequence of the gene encoding growth hormone of the eel Anguilla bicolor compared to the same gene from other eel species
Spesies ikan sidat Eel species Nomor akses Accession number Similaritas (%) Similarity (%) Anguilla australis HQ436341.1 99,14 Anguilla anguilla AY148493.1 99,14 Anguilla japonica M24066.1 98,49
Gambar 3. Multiple sequences alignment sekuen asam amino hormon pertumbuhan ikan sidat Anguilla japonica, Anguilla bicolor, Anguilla australis, dan Anguilla anguilla . Tanda panah menunjukkan posisi asam amino yang berbeda
Figure 3. Multiple sequences alignment of amino acid sequences of growth hormone eels Anguilla japonica , Anguilla bicolor , Anguilla australis , and Anguilla anguilla . The arrows indicate the positions of the different amino acids

## Gambar 4. Filogenetik sekuen asam amino hormon pertumbuhan beberapa jenis ikan sidat dan ikan lainnya
Figure 4. Phylogenetic of growth hormone amino acid sequences of several species of eels and other fish
Gambar 4 menunjukkan hasil analisis filogenetik sekuen asam amino protein GH beberapa spesies ikan dan manusia. Berdasarkan sekuen asam amino GH, semua jenis ikan sidat termasuk A. bicolor membentuk satu percabangan yang berbeda dibandingkan jenis ikan lain. Percabangan kelompok
ikan sidat lebih dekat dengan percabangan kelompok ikan seperti Acipencer stellatus dan Atractosteus spatula dan terpisah lebih jauh dengan percabangan kelompok ikan air tawar yang umum dibudidayakan di Indonesia, yaitu Oreochromis niloticus , Osphronemus goramy ,
Cyprinus carpio , dan Clarias gariepinus .

## 1
23
Analisis multiple sequences aligment dalam penelitian ini digunakan untuk membandingkan sekuen asam amino GH dari 13 spesies ikan, termasuk GH A. bicolor yang diperoleh dalam penelitian ini. Seperti halnya hasil analisis filogenetik, hasil analisis multiple sequences aligment juga menunjukkan bahwa GH memiliki variasi yang sangat tinggi berdasarkan urutan
asam amino (Gambar 5). Dari sekuen asam amino yang secara sempurna tersejajarkan, sekuen GH yang dibandingkan hanya memiliki 24 asam amino yang sama. Selain itu, Gambar 5 juga menunjukkan bahwa GH dari semua spesies yang diuji memiliki dua penanda dengan letak dan panjang yang konsisten antarspesies. Penanda pertama sepanjang 34
Gambar  5. Multiple sequences alignment sekuen asam amino hormon pertumbuhan ikan sidat, beberapa spesies ikan lain, dan manusia. Highlight hijau dan tanda * menunjukkan jenis asam amino yang sama. Huruf merah menunjukkan somatotropin, prolactin and related hormones signature 1 (kelompok pertama) dan 2 (kelompok kedua)
Figure 5. Multiple sequences alignment of amino acid sequences of eel growth hormone, several other fish species, and humans. Green highlights and * mark indicate the same type of amino acid. Red letters indicate somatotropin, prolactin and related hormones signature 1 (first group) and 2 (second group)
asam amino dan penanda kedua sepanjang 18 asam amino. Secara khusus berdasarkan sekuen parsial GH A. bicolor (155 aa) yang diperoleh dalam penelitian ini, penanda pertama GH A. bicolor terletak pada asam amino nomor 58-95. Fragmen gen GH ikan sidat A. bicolor yang berhasil teridentifikasi adalah bagian coding region sepanjang 465 bp yang mengkode 155 aa dan telah dideposit di GenBank dengan kode akses OQ694817. Sebagai pembanding dan sekaligus dasar pembuatan primer adalah sekuen lengkap coding region gen GH A. anguilla dan A. japonica . Coding region gen GH pada kedua ikan sidat tersebut memiliki panjang 627 bp yang mengkode 209 aa (Degani et al. , 2003). Fragmen yang diperoleh dalam penelitian ini diyakini sebagai bagian gen GH dengan dasar: 1) memiliki similaritas yang sangat tinggi yaitu sekitar 98,49-99,14% dibandingkan sekuen gen GH ikan sidat lainnya, 2) secara filogenetik menjadi bagian dalam cabang gen GH ikan sidat, 3) secara tepat dapat diterjemahkan menjadi urutan asam amino tanpa adanya gap , dan 4) sekuen asam amino yang diperoleh meliputi hormon signature pertama dari protein GH. Gen GH A. bicolor belum dapat terisolasi secara lengkap dalam penelitian ini karena keterbatasan metode yang digunakan. Identifikasi gen dalam penelitian ini dilakukan dengan metode RT-PCR konvensional menggunakan tiga primer dengan dua kombinasi pasang primer yang didesain berdasarkan coding region gen GH jenis ikan sidat lain. Isolasi gen secara utuh umumnya dilakukan dengan metode Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) berdasarkan sekuen parsial yang sudah diketahui (Yeku & Frohman, 2011). Sebagai contoh, metode ini banyak digunakan untuk memperoleh sekuen utuh gen GH ikan seperti dari Pangasianodon hypophthalmus (Sekar et al. , 2014), Arapaima gigas (Lima et al. , 2023), dan Epinephelus akaara (Yuan et al. , 2020). Hasil analisis multiple sequences alignment menunjukkan bahwa protein GH dari berbagai hewan memiliki urutan asam amino yang sangat beragam. Namun demikian protein GH memiliki sedikit residu asam amino yang sangat conserve khususnya asam amino
cysteine di daerah hormone signature . Residu cysteine ini memiliki peran penting dalam memfasilitasi ikatan antara GH dan GH receptor (Brooks, 2012). Hal ini kemungkinan yang menyebabkan penggunaan GH rekombinan dari suatu spesies hewan dapat meningkatkan pertumbuhan spesies hewan lain yang secara taksonomi jaraknya jauh. Sebagai contoh adalah pemberian rekombinan bovine GH yang mampu meningkatkan pertumbuhan gilthead sea-bream Sparus aurata (Blasco et al. , 2021), dan coho salmon Oncorhynchus kisutch (Muttray et al. , 2019). Lebih lanjut, coho salmon yang diberi bovine GH menunjukkan laju pertumbuhan yang sama dibandingkan ikan yang diberi GH rekombinan dari sockeye salmon Oncorhynchus nerka , yang secara taksonomi sangat dekat (Muttray et al. , 2019).
Pengaruh  GH  rekombinan  yang tidak  spesifik spesies membuka peluang penggunaannya untuk meningkatkan produktivitas akuakultur ikan sidat A. bicolor . Hasil penelitian menunjukkan pemberian GH rekombinan dari A. japonica dapat meningkatkan pertumbuhan larva ikan sidat tersebut (Sudo et al. , 2022). Sampai saat ini belum tersedia GH rekombinan dari A. bicolor . Salah satu GH rekombinan yang dapat digunakan untuk meningkatkan produktivitas budidaya ikan sidat adalah bovine GH. Hal ini karena bovine GH banyak tersedia di pasaran dan terbukti mampu meningkatkan pertumbuhan ikan (Muttray et al. , 2019). Selain itu upaya peningkatan pertumbuhan ikan sidat Indonesia juga dapat dilakukan menggunakan GH rekombinan dari jenis ikan budidaya yang sudah banyak diteliti di Indonesia seperti dari ikan mas C. carpio (Utomo et al. , 2011) dan ikan kerapu bebek Cromileptes altivelis (Faizal et al. , 2012). Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian rGH yang dikombinasikan dengan pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) dan anti-dopamine (AD) selain memacu perkembangan gonad juga meningkatkan pertumbuhan ikan sidat A. bicolor (Ahlina et al. , 2015).
Hasil analisis ekspresi gen dengan metode delta-delta CT menunjukkan tingkat ekspresi
mRNA GH yang sangat bervariasi. Tingkat ekspresi mRNA GH pada ikan sidat yang tertinggi memiliki nilai 1.105 kali dibandingkan tingkat ekspresi yang paling rendah (Gambar 6). Variasi ekspresi mRNA GH sidat A. bicolor yang tinggi juga diperoleh pada penelitian sebelumnya (Nugrayani et al. , 2023).
Keberhasilan isolasi gen GH dalam penelitian ini menjadi tahap penting dalam penelitian selanjutnya mengenai peran hormon ini pada ikan sidat A. bicolor . Hasil penelitian ini salah satunya dapat digunakan
untuk merancang real time RT-PCR untuk kajian ekspresi gen hormon pertumbuhan pada ikan sidat A. bicolor . Dalam penelitian ini, salah satu kombinasi primer telah berhasil digunakan untuk mengukur ekspresi gen GH menggunakan teknik real time RT-PCR dengan metode delta-delta Ct dengan gen beta- aktin sebagai acuan internal. Metode yang sama telah digunakan untuk mengevaluasi ekspresi gen GH A. bicolor yang diberi pakan mengandung kromium pikolinat (Nugrayani et al. , 2023). Metode delta-delta Ct termasuk
Gambar 6. Ekspresi mRNA gen GH ikan sidat Anguilla bicolor Figure 6. mRNA expression of the GH gene of Anguilla bicolor eels samples
metode analisis ekspresi gen secara semi kuantitatif. Hasil penggunaan metode ini tidak menunjukkan secara langsung jumlah molekul mRNA GH yang diproduksi dalam hipofisa ikan sidat. Hasil metode ini dapat menunjukkan angka kelipatan banyaknya mRNA suatu sampel relatif terhadap mRNA beta-aktin dan relatif terhadap sampel yang digunakan sebagai kalibrator (Forlenza et al. , 2012). Sampel yang digunakan sebagai kalibrator dalam penelitian ini adalah sampel yang memiliki nilai delta Ct (Ct GH -Ct Actin ) yang paling rendah.
Hasil analisis ekspresi gen GH menggunakan metode delta-delta Ct menunjukkan variasi yang tinggi. Hal ini kemungkinan berkaitan dengan peran GH terhadap pertumbuhan somatik (Blasco et al. , 2021; Ndandala et al. , 2022; Rotwein, 2020; Sudo et al. , 2022). Perbedaan ekspresi gen GH pada ikan sidat A. anguilla juga ditemukan pada jenis kelamin yang berbeda, di mana ikan sidat betina memiliki ekspresi gen GH yang lebih tinggi dibandingkan ikan sidat jantan. Hal tersebut juga berkaitan dengan pertumbuhan ikan sidat betina yang lebih cepat dibandingkan pertumbuhan ikan sidat jantan (Degani et al. , 2003). Tingkat ekspresi GH pada individu betina yang lebih tinggi dibandingkan pada individu jantan juga ditemukan pada ikan lain, yaitu Scatophagus argus (Deng et al. , 2014).
Selanjutnya metode delta-delta Ct dengan primer yang dirancang dalam penelitian ini dapat digunakan untuk mengkaji regulasi ekspresi GH pada ikan sidat A. bicolor . Regulasi ekspresi GH menjadi kajian yang penting untuk dilakukan dalam rangka meningkatkan produktivitas akuakultur ikan sidat A. bicolor . Kajian ekspresi gen GH ikan sidat A. anguilla dapat diarahkan untuk mempelajari perannya dalam beberapa aspek seperti pertumbuhan, daya tahan tubuh, dan reproduksi. Tiga aspek tersebut merupakan bagian dari aspek penting dalam domestikasi ikan (Teletchea, 2021; Teletchea & Fontaine, 2014) dan secara umum diketahui berkaitan erat dengan gen GH (Jönsson & Bjönsson, 2002; Ndandala
et al. , 2022). Ekspresi GH dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti nutrisi, pemuasaan, dan kondisi lingkungan. Pemuasaan ikan dilaporkan meningkatkan ekspresi GH diiringi dengan penurunan IGF-I (Triantaphyllopoulos et al. , 2020). Peningkatan kadar protein pada pakan meningkatkan ekspresi GH Oncorhynchus mykiss (Triantaphyllopoulos et al. , 2020). Tingkat ekspresi gen GH pada larva A. anguilla meningkat pada temperatur hangat (20-22°C) dan menurun pada temperatur dingin (16°C) (Politis et al. , 2017).

## KESIMPULAN
Fragmen DNA sepanjang 486 bp berhasil diisolasi, disekuensing, dan teridentifikasi sebagai bagian dari gen hormon pertumbuhan. Sekuen gen hormon pertumbuhan A. bicolor memiliki similaritas tinggi jika dibandingkan dengan gen yang sama dari A. anguilla, A. australis , dan A. japonica . Ikan sidat dalam penelitian ini memiliki tingkat ekspresi gen hormon pertumbuhan yang sangat bervariasi.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM) Universitas Jenderal Soedirman telah menfasilitasi pendanaan penelitian ini melalui skema Riset Institusi  (SK Nomor : Kept. 3715/UN23.14/PN.01.00/2018). Terima kasih juga disampaikan atas fasilitas laboratorium dari Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan dan Laboratorium Terpadu, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.

## DAFTAR ACUAN
Affandi, R., Budiardi, T., Wahju, R. I., & Taurusman, A. A. (2013). Pemeliharaan ikan sidat dengan sistem air bersirkulasi. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia , 18 (1), 55–60.
Ahlina, H. F., Sudrajat, A. O., Budiardi, T., & Affandi, R. (2015). Induksi pematangan
gonad secara hormonal pada ikan sidat, Anguilla bicolor bicolor McClelland 1844 dengan penggunaan pregnant mare serum gonadotropin , anti dopamin, dan recombinant growth hormone . Jurnal Iktiologi Indonesia , 15 (3), 209–221. https://doi. org/10.32491/jii.v15i3.57
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology , 215 (3), 403–410. https://doi. org/10.1016/S0022-2836(05)80360-2
Arief, M., Pertiwi, D., & Cahyoko, Y. (2011).
Pengaruh pemberian pakan buatan, pakan alami, dan kombinasinya terhadap pertumbuhan, rasio konversi pakan dan tingkat kelulushidupan ikan sidat ( Anguilla bicolor ). Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan ,
3 (1), 61–66.
Blasco, J., Vélez, E. J., Perelló-Amorós, M., Azizi, S., Capilla, E., Fernández-Borràs, J., & Gutiérrez, J. (2021). Recombinant bovine growth hormone-induced metabolic remodelling enhances growth of gilthead Sea-bream ( Sparus aurata ): insights from stable isotopes composition and proteomics. International Journal of Molecular Sciences , 22 (23). https://doi. org/10.3390/ijms222313107
Brooks, C. L. (2012). Molecular mechanisms of prolactin and its receptor. Endocrine Reviews , 33 (4), 504–525. https://doi. org/10.1210/er.2011-1040
Daza, D. O., & Larhammar, D. (2018). Evolution of the growth hormone, prolactin, prolactin 2 and somatolactin family. General and Comparative Endocrinology , 264 , 94–112. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j. ygcen.2018.01.007
Degani, G., Tzchori, I., Yom-Din, S., Goldberg, D., & Jackson, K. (2003). Growth differences
and growth hormone expression in male and female European eels [ Anguilla anguilla (L.)]. General and Comparative Endocrinology , 134 (1), 88–93. https://doi.org/https://doi. org/10.1016/S0016-6480(03)00238-7
Dehkhoda, F., Lee, C. M. M., Medina, J., & Brooks, A. J. (2018). The growth hormone receptor: mechanism of receptor activation, cell signaling, and physiological aspects. Frontiers in Endocrinology , 9 , 35. https://doi.org/10.3389/fendo.2018.00035
Deng, S.-P., Wu, B., Zhu, C.-H., & Li, G.-L. (2014). Molecular cloning and dimorphic expression of growth hormone (gh) in female and male spotted scat Scatophagus argus . Fisheries Science , 80 (4), 715–723. https://doi.org/10.1007/s12562-014-0763- 5
Dereeper, A., Guignon, V., Blanc, G., Audic, S., Buffet, S., Chevenet, F., Dufayard, J.-F., Guindon, S., Lefort, V., Lescot, M., Claverie, J.-M., & Gascuel, O. (2008). Phylogeny.fr: robust phylogenetic analysis for the non- specialist. Nucleic Acids Research , 36 (2),
W465-469. https://doi.org/10.1093/nar/ gkn180
Fahmi, M. R. (2015). Konservasi genetik ikan sidat tropis ( Anguilla spp.) di perairan Indonesia. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia , 21 (1), 45–54. https:// doi.org/http://dx.doi.org/10.15578/ jppi.21.1.2015.45-54
Fahmi, M. R., & Hirnawati, R. (2010). Keragaman ikan sidat tropis (Anguilla sp.) di perairan Sungai Cimandiri, Pelabuhan Ratu, Sukabumi. Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur , 2010 , 1–10.
Faizal, I., Aliah, R. S., Amarullah, M. H., Megawati, N., Sutanti, S., & Alimuddin, A. (2012). Produksi protein rekombinan hormon pertumbuhan ikan kerapu. Jurnal Riset Akuakultur , 7 (2), 231–235.  http:// dx.doi.org/10.15578/jra.7.2.2012.231-235
Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F. J., & Wiegertjes, G. F. (2012). The use of real-
time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. In M. De Ley (Ed.), Cytokine Protocols. Methods in Molecular Biology, volume 820 (pp. 7–23). Humana Press. https://doi.org/10.1007/978-1- 61779-439-1
Gasteiger, E., Gattiker, A., Hoogland, C., Ivanyi, I., Appel, R. D., & Bairoch, A. (2003). ExPASy: The proteomics server for in- depth protein knowledge and analysis.
Nucleic Acids Research , 31 (13), 3784–3788.
Hall, T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series , 41 , 95–98.
Hulo, N., Bairoch, A., Bulliard, V., Cerutti, L., De Castro, E., Langendijk-Genevaux, P. S., Pagni, M., & Sigrist, C. J. A. (2006). The PROSITE database. Nucleic Acids Research , 34 (1), D227–D230. https://doi. org/10.1093/nar/gkj063
Jönsson, E., & Bjönsson, B. (2002). Physiological functions of growth hormone in fish with special reference to its influence on behaviour. Fisheries Science , 68 (1), 742– 748. https://doi.org/10.2331/fishsci.68. sup1_742
Lima, E. R., Freire, R. P., Suzuki, M. F., Oliveira, J. E., Yosidaki, V. L., Peroni, C. N., Sevilhano, T., Zorzeto, M., Torati, L. S., Soares, C. R., Lima, I. D., Kronenberger, T., Maltarollo, V. G., & Bartolini, P. (2023). Isolation and characterization of the Arapaima gigas growth hormone (ag-GH) cDNA and three- dimensional modeling of this hormone in comparison with the human hormone (hGH). Biomolecules , 13 (1). https://doi. org/10.3390/biom13010158
Marlina, E., & Handayani, M. (2022). Efektifitas rekayasa media budidaya terhadap respon pertumbuhan pada ikan sidat ( Anguila bicolor ). Jurnal Riset Rumpun Ilmu Hewani ,
1 (2), 66–75.
Muttray, A. F., Donaldson, E. M., & Devlin, R. H.
(2019). Effects of recombinant salmon type II growth hormone and bovine growth hormone on growth of coho salmon ( Oncorhynchus kisutch ). Fish Physiology and Biochemistry , 45 (3), 1083–1090. https://doi. org/10.1007/s10695-019-00620-x
Ndandala, C. B., Dai, M., Mustapha, U. F., Li, X., Liu, J., Huang, H., Li, G., & Chen, H. (2022). Current research and future perspectives of GH and IGFs family genes in somatic growth and reproduction of teleost fish. Aquaculture Reports , 26 , 101289. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j. aqrep.2022.101289
Nguyen, A. T., Damsteegt, E. L., Chia, J. H. Z., Kazeto, Y., & Lokman, P. M. (2022). Effects of gonadotropins, 11-ketotestosterone, and insulin-like growth factor-1 on target gene expression and growth of previtellogenic oocytes from shortfinned eels, Anguilla australis , in vitro. Fish Physiology and Biochemistry , 48 (4), 853–867. https://doi. org/10.1007/s10695-022-01090-4
Nugrayani, D., Ekasanti, A., Syakuri, H., Listiowati, E., Soedibya, P. H. T., Marnani, S., Santoso, M., Wijaya, R., Sukardi, P., & Kasprijo, K. (2023). Performa pertumbuhan dan ekspresi gen hormon pertumbuhan sidat ( Anguilla bicolor bicolor) stadia elver yang diberi pakan mengandung kromium pikolinat. Jurnal Akuakultur Sungai dan Danau , 8 (1), 13–20.
Ozaki, Y., Fukada, H., Tanaka, H., Kagawa, H., Ohta, H., Adachi, S., Hara, A., & Yamauchi, K. (2006). Expression of growth hormone family and growth hormone receptor during early development in the Japanese eel ( Anguilla japonica ). Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology ,
145 (1), 27–34. https://doi.org/https://doi. org/10.1016/j.cbpb.2006.05.009
Politis, S. N., Mazurais, D., Servili, A., Zambonino- Infante, J.-L., Miest, J. J., Sorensen, S. R., Tomkiewicz, J., & Butts, I. A. E. (2017). Temperature effects on gene expression and morphological development of European eel, Anguilla anguilla larvae. PloS One , 12 (8), e0182726. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0182726
Pratama, I., Prayitno, S. B., & Syakuri, H. (2019). Identification and pevalence of parasites in eel ( Anguilla bicolor ) captured along migration pathway at Serayu River, Central Java. Omni-Akuatika , 15 (1), 81–92.
Rachmawati, F. N., Susilo, U., & Muslih. (2017). Karakteristik reproduksi ikan sidat Anguilla bicolor McClelland , 1844 yang diinduksi GNRH- analog. Jurnal Iktiologi Indonesia , 17 (2), 155–163.
Rotwein, P. (2020). Regulation of gene expression by growth hormone. Molecular and Cellular Endocrinology , 507 , 110788. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j. mce.2020.110788
Sekar, M., Singh, S. D., & Gupta, S. (2014). Cloning and characterization of Pangasianodon hypophthalmus growth hormone gene and its heterologous expression. Applied Biochemistry and Biotechnology , 173 , 1446–1468. https:// doi.org/10.1007/s12010-014-0946-7
Setijanto, S., Sulistyo, I., & Eko, B. (2014).
Penentuan waktu pengambilan benih dan diet ikan sidat (Anguilla bicolor Mc Clelland) di Sungai Serayu. Universitas Jenderal Soedirman.
Sievers, F., & Higgins, D. G. (2014). Clustal omega. Current Protocols in Bioinformatics , 48 , 3-13. https://doi.org/10.1002/0471250953. bi0313s48
Sudo, R., Kawakami, Y., Nomura, K., Tanaka, H., & Kazeto, Y. (2022). Production of recombinant Japanese eel ( Anguilla japonica ) growth hormones and their effects on early-stage larvae. General and Comparative Endocrinology , 317 , 113977. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j. ygcen.2022.113977
Teletchea, F. (2021). Fish domestication in aquaculture: 10 unanswered questions. Animal Frontiers , 11 (3), 87–91. https://doi. org/10.1093/af/vfab012
Teletchea, F., & Fontaine, P. (2014). Levels of domestication in fish: Implications for the sustainable future of aquaculture. Fish and Fisheries , 15 , 181–195. https://doi. org/10.1111/faf
Triantaphyllopoulos, K. A., Cartas, D., & Miliou, H. (2020). Factors influencing GH and IGF-I gene expression on growth in teleost fish: how can aquaculture industry benefit? Reviews in Aquaculture , 12 (3), 1637–1662. https://doi.org/https://doi.org/10.1111/ raq.12402
Utomo, D., Alimuddin, A., Sudrajat, A., & Faizal, I. (2011). Produksi dan uji bioaktivitas protein rekombinan hormon pertumbuhan ikan mas. Jurnal Akuakultur Indonesia , 10 (1), 44–50.
Yamaguchi, K., Yasuda, A., Kishida, M., Hirano, T., Sano, H., & Kawauchi, H. (1987). Primary structure of eel ( Anguilla japonica ) growth hormone. General and Comparative Endocrinology , 66 (3), 447–453. https://doi.org/ https://doi.org/10.1016/0016-6480(87)90256-5
Yeku, O., & Frohman, M. A. (2011). Rapid amplification of cDNA ends (RACE). In H. Nielsen (Ed.), RNA. Methods in molecular biology, volume 703 (pp. 107–122). Humana Press. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-248-9_8
Yolla, A., Linggi, Y., & Dahoklory, N. (2020).
Pengaruh perbedaan substrat terhadap pertumbuhan ikan sidat ( Anguilla bicolor bicolor ) di dalam wadah budidaya. Jurnal Aquatik , 3 (1), 51–58.
Yuan, X., Lin, Y., Qin, J., Zhang, Y., Yang, G., Cai, R., Liao, Z., Sun, C., & Li, W. (2020). Molecular identification, tissue distribution and in vitro functional analysis of growth hormone and its receptors in red-spotted grouper ( Epinephelus akaara ). Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology , 250 , 110488. https://doi.org/https:// doi.org/10.1016/j.cbpb.2020.110488