## Imunogenitas Ekstrak Protein Kelenjar Saliva dari
Anopheles aconitus di Daerah Endemik Malaria
Immunogenity of Protein Extract from Salivary Gland of Anopheles aconitus in Malaria Endemic Area
Mahful Septiawan, Budayatin, Hidayat Teguh Wiyono dan Kartika Senjarini *)
Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Jember University, Jember *) Email: kartika_senjarini@yahoo.com

## ABSTRACT
Although malaria had ever been virtually eradicated from Indonesia but currently malaria is recognized as a serious re-emerging threat to public health. This disease is caused by malaria parasite which is transmitted to human host by Anopheles mosquitoes as main vector. It has been widely observed that saliva of mosquito that transmits disease contains several factors that could enhance pathogen infection. Therefore, it should be possible to control pathogen transmission by vaccinating the host against the molecule(s) in saliva that potentiate the infection.  However,  immunogenic  specific  component  in  mosquitoes  vectors  of  Malaria  has  not  yet  been identified so far. The objective of this study are to analyze protein profile of SDS-PAGE and to know the immunogity the protein extract of salivary gland from potential vector of Malaria i.e. An. Aconitus . We used immunogenic reaction between salivary gland extract of these vectors against pool of human sera which were collected from endemic area. The reaction conducted by the dot-blot analyze. SDS-PAGE studies showed 15 major polypeptide bands of 284, 100, 84, 75, 66, 57, 53, 48, 45, 38, 33, 29, 15, 14, and 11 kDa. The dot-blot studies showed that the protein extract of salivary gland from An. aconitus are immunogenic.
Keywords : salivary gland, a nopheles aconitus , immunogenic protein

## PENDAHULUAN
WHO  memperkirakan  sekitar  198  juta  kasus malaria  terjadi  di  seluruh  dunia  pada  tahun 2013. Sekitar  584 000 orang telah  meninggal akibat  malaria  (WHO,  2013).  Prevalensi malaria  tahun  2013  adalah  6,0  persen.  Lima provinsi  dengan  insiden  dan  prevalensi tertinggi adalah Papua (9,8% dan 28,6%), Nusa Tenggara  Timur  (6,8%  dan  23,3%),  Papua Barat  (6,7%  dan  19,4%),  Sulawesi  Tengah (5,1%  dan  12,5%),  dan  Maluku  (3,8%  dan 10,7%).  Dari  33  provinsi  di  Indonesia,  15 provinsi mempunyai prevalensi malaria di atas angka  nasional,  sebagian  besar  berada  di Indonesia Timur (Riskesdas, 2013). Permasalahan utama malaria sampai saat ini adalah  terjadinya  peningkatan  resistensi  P. falciparum dan P. vivax terhadap obat-obat anti malaria.  Sementara  itu  pengembangan  vaksin malaria mengalami hambatan karena kompleksnya  siklus  hidup  P.falciparum, sehingga  perlu  usaha  pengembangan  multi- stage  vaccine.  Vaksin  yang  diharapkan  adalah vaksin yang mampu menginduksi respons imun yang  protektif  terhadap  setiap  tahapan  siklus hidup P. falciparum.
Pengembangan  vaksin  untuk  pencegahan malaria  meliputi  3  tipe  yaitu:  Preerithrocytic stage  vaccine,  Blood  stage  vaccine,  dan Transmission Blocking Vaccine (TBV). Vaksin pre-eritrositik  (hepatik)  dibuat  berdasarkan konsep penghambatan pelepasan tropozoit dari skizon  hati.  Vaksin  stadium  eritrositik dibedakan  menjadi  anti-komplikasi  dan  anti- invasi. TBV merupakan vaksin yang bertujuan menghambat  transmisi  patogen  dari  vektor  ke dalam tubuh manusia (Carter et al ., 2000). TBV merupakan vaksin yang mencegah dan menghentikan transmisi patogen dari vektor ke hospes  dengan  menggunakan  bagian  organ vektor  dan  atau  bagian  dari  patogen  ketika dalam siklus hidupnya di tubuh vektor (Carter et  al .,  2000).  Kelenjar  saliva  memiliki substansi protein imunomodulator antihemostatik, dan  antiinflamasi  yang memudahkan  nyamuk  dalam  proses  blood feeding. Infeksi  malaria  pada  individu  yang imunokompeten  dapat  meningkatkan  kadar berbagai  macam  antibodi  atau  imunoglobulin dalam  serum.  Hal  ini  menunjukkan  adanya keadaan hiperaktif dari sel limfosit B. Diantara berbagai antibodi tersebut hanya sebagian kecil
saja  yang  spesifik  terhadap  antigen  malaria tertentu,  sedangkan  sebagian  besar  sisanya merupakan imunoglobulin  yang  tidak spesifik. Sebagai  daerah  endemik  vektor  malaria  An. aconitus¸  di duga  penduduk  desa  Campurejo telah  terpapar  gigitan  nyamuk An.  aconitus . Selain  itu,  di  desa  Campurejo  juga  ditemukan vektor  malaria  An.  vagus.  Oleh  karena  itu, perlu  adanya  studi  imunogenitas  dan identifikasi  protein  imunogenik  dari  kelenjar saliva  An.  aconitus  dan  An.  vagus  sebagai salah satu vektor penting malaria di Indonesia. Informasi  mengenai  profil  protein  kelenjar saliva  An.  aconitus  dan  imunognitasnya merupakan informasi awal dalam pengembangan  transmission  blocking  vaccine (TBV).
Penelitian  ini selanjutnya  dapat  digunakan dalam  pengembangan  Transmission  Blocking Vaccines (TBV) malaria di Indonesia.

## METODE
Metode  penelitian  yang  digunakan  merupakan penelitian  kualitatif.  Rancangan  penelitian  terdiri atas  8  tahap  yaitu  landing  collection An.  Aconitus , preparasi  alat,  isolasi  kelenjar  saliva An.  Aconitus , ekstraksi  protein  kelenjar  saliva An.  Aconitus , preparasi  serum  darah,  analisis  SDS  PAGE,  dan analisis dot blot.
Landing Collection nyamuk dilakukan pengambilan nyamuk dewasa dengan alat aspirator.
Pengambilan  nyamuk  dewasa  dilakukan  di persawahan  Desa  Campurejo,  Kecamatan  Boja, Kabupaten  Kendal,  Jawa  Tengah.  Nyamuk  yang telah tertangkap diletakkan dalam cup tertutup kasa yang di dalamnya terdapat sukrosa 10%.
Isolasi  kelenjar  saliva  nyamuk  memerlukan identifikasi  jenis  kelamin  dan  spesies  terhadap nyamuk  yang  akan  di  isolasi.  Terdapat  perbedaan rambut  pada  antena  nyamuk  jantan  dan  betina. Nyamuk  yang  akan  diisolasi  kelenjar  salivanya adalah nyamuk betina. Identifikasi spesies dilakukan dengan  melihat  pola  sisik  garis  pada  tubuh  bagian dorsal  toraks  nyamuk.  Nyamuk  betina  yang didapatkan dibedah secara microdissection menggunakan  jarum  diseksi.  Nyamuk  diletakkan diatas gelas benda steril, kemudian diteteskan 50 µL NaCl  0,5%.  Kelenjar  saliva  nyamuk terdapat diantara  toraks  dan  kepala  nyamuk.  Jarum  diseksi diletakkan pada bagian toraks dan kepala, kemudian bagian  kepala  ditarik  hingga  terpisah  dari  bagian toraks.  Akan  tampak  lobus – lobus  kelenjar  saliva berwarna  bening.  Kelenjar  saliva  dikumpulkan dalam  eppendorf  steril  yang  telah  diisi  100  µL PMSF  dalam  PBS  steril  dan  disimpan  pada  suhu - 80ºC. Ekstraksi  Protein  Kelenjar  Saliva  Nyamuk dilakukan  dengan  menambahkan  buffer  lisis  pada
kelenjar saliva dengan perbandingan 1:1. Kemudian dilakukan  homogenisasi  dengan  micropistille. Sampel di vortex dan di sentrifuse sebanyak 3 kali. Kemudian sampel di sonifikasi menggunakan water sonicator selama 30 menit. Sampel disentrifuse 9000 x  g  selama  15  menit  pada  suhu  4ºC.  Supernatan disimpan  pada  suhu -80ºC  dan  ditambahkan  buffer sample  dengan  perbandingan  1:1.  Sampel dipanaskan  selama  5  menit  sebelum  dilakukan analisis dot blot, SDS PAGE dan Western Blotting. Preparasi serum darah diawali dengan pengambilan sampel  darah  di  desa  Campurejo,  Kecamatan  Boja, Kabupaten  Kendal,  Jawa  Tengah.  Pengambilan sampel menggunakan inform consent yang diberikan kepada  30  warga  yang  akan  diambil  sampel darahnya.  Pengambilan  sampel  dilakukan  dari pembuluh darah vena brachial di lengan. Darah yang diambil  sebanyak  5  mL.  Darah  ditampung dalam vakutainer dan didiamkan selama 15 menit. Lapisan bening  disentrifuse  dengan  kecepatan  3200  rpm selama  10  menit  pada  suhu  27ºC.  Supernatan  yang dihasilkan  merupakan  serum  darah.  Serum  darah yang didapatkan disimpan pada suhu -80ºC. Analisis  SDS-PAGE menggunakan  Separating Gel  12%  (Akril/bis  akril  40%,  1,5  M  Tris  HCl  Ph 8,8,  10%  sds,  H 2 O  steril,  10%  APS  dan  TEMED) (b/v).  Sampel  protein  diambil  sebanyak  10  µl  dan ditambah  dengan  buffer  sampel.  Dengan perbandingan  1:1.  kemudian  dipanaskan  pada  air dengan suhu 100 o C selama 5 menit. Sampel protein dimasukkan  ke  dalam  sumuran  gel.  Kemudian  di running  selama  60  menit,  125  V,  pada  suhu  ruang dalam  buffer  elektroda  1x  pH  8,3.  Kemudian dilakukan staining pada gel hasil SDS-PAGE selama ±  2  jam  dan  dilanjutkan  dengan  destaining  3  x  30 menit dan difotoforesis.
Analisa  dot-blot  digunakan  untuk  menganalisis dan  mendeteksi  suatu  protein  melalui  adanya  suatu ikatan antara antigen dan antibodi. Analisis dot-blot dilakukan  dengan  memotong  membran  PVDF kemudian  membran direndam  dalam  methanol selama  1  menit.  Membran  kemudian  direndam dalam  TBS  selama  3  menit.  Selanjutnya  membran PVDF  dikeringkan.  Membran  PVDF  yang  telah kering,    ditambahkan  10  pasang  kelenjar  saliva nyamuk  dalam  10µl  PBSF  +  PSMF.  Membran PVDF  dibiarkan kering  dan  diinkubasi  pada  suhu 37°C  selama  1  jam  dengan  5%  skimm  milk  dalam TBS.  Membran  PVDF  dibersihkan  dengan  TBS selama 5 menit sebanyak 3 kali. Selanjutnya  ditambahkan  antibodi  primer (ekstrak  kelenjar  saliva)  dengan  perbandingan larutan 1:1000 dengan 10 ml 5% skimm milk TBS. Selanjutnya  membran  PVDF  diinkubasi  selama  2 jam,  pada  suhu 27°C.  Membran PVDF  dibersihkan dengan TBS selama 5 menit sebanyak 3 kali. Tahap selanjutnya  yaitu  menambahkan  antibodi  sekunder (goat anti human IgG) dengan perbandingan larutan 1:5000 dalam 10 ml 5% skimm milk TBS. Antibodi sekunder  yang  digunakan  adalah  goat  anti  human IgG.  Membran  kemudian  diinkubasi  selama  2  jam pada  suhu  27°C.  Membran  dicuci  menggunakan
TBS  selama  5  menit  sebanyak  3  kali.  Membran PVDF kemudian dikeringkan. Selanjutnya ditambahkan  250  µl  NBT/BCIP  sehingga  cukup menutupi  membran.  Membran  diinkubasi  selama  5 menit dan dihindarkan dari cahaya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Profil  Protein  Total  Kelenjar  Saliva An aconitus Betina
Analisis sds-page dilakukan untuk mengetahui profil  protein  dan  berat  molekul  protein kelenjar  saliva  nyamuk.  Pita  protein  yang muncul  diukur  secara  manual  menggunakan kertas  milimeter.  Ukuran  Pita  protein  yang muncul  pada An.  aconitus antara  lain  ~284,
100, 84, 75, 66, 57, 53, 48, 45, 38, 33, 29, 15,
14, dan 11 kDa. Beberapa penelitian terdahulu misalnya  penelitian  Almeras et  al ., (2010); Calvo et al ., (2009); Champagne et al ., (1995); Fontaine et al ., 2010; James et al , (1994); King et  al , (2011);  Orlandi-Pradines et  al ., (2007); Sor-Suwan et  al ., (2014);  Valenzuela et  al .,
(2002); Vijai et al ., (2014); Wasinpiyamongkol et al ., (2010); menunjukkan ukuran pita – pita protein  yang  mirip  dengan  pita  protein  hasil analisis  sds-page  pada  penelitian  ini. Pebandingan  hasil  penelitian  transkriptomik dan  proteomik  terdahulu  dapat  dilihat  pada Tabel 1.
Gambar 1.Hasil analisa sds-page, (SG) protein 10  pasang  kelenjar  saliva An. aconitus betina;  (M)  marker  (Pre- stain Intron) (Kamera: Samsung Tab 4). Tabel 1. Komparasi profil protein berdasarkan berat  molekul  (BM)  kelenjar  saliva An.  aconitus dalam  penelitian dengan penelitian terdahulu BM protein yang teridentifikasi dalam penelitian ini Nama dan berat molekul tentatif protein dari identifikasi terdahulu Fungsi tentatif protein yang sudah teridentifikasi ~ 284 kDa SGS (f) ~ 220 kDa Spesifik protein imunogenik ~ 75, 84, 100 kDa Saglin (f) ~ 72 dan 100 kDa Spesifik protein imunogenik ~ 66 kDa Putative 5’ nucleotidase/ Apyrase (a, c, h, j) 62-68 kDa Antikoagulan, antihemostatik dan antiplatelet ~ 48, 53, 57 kDa Salivary serpint putative antikoagulant (a, g) 47-50 kDa Antikoagulan ~ 45, 48 kDa the SGI family (b, i) 40,9 – 47,5 kDa Belum diketahui ~ 33 kDa 30 kDa antigen (h, i) 30-34 kDa Anti-platelet ~ 15, 29, 33, 38 kDa D7 family (a, d, e, i) 15-20 kDa 35-40kDa Vasodilator, Antikoagulan, Imunomodulato r ~ 14 kDa Mucin (b, i) 13,5 kDa Memodulasi makrofag (*) Keterangan referensi tabel: (a) Almeras et al ., 2010; (b) Calvo et al., 2009; (c) Champagne et al., 1995; (d) Fontaine et al., 2010;
(e) James et al, 1994; (f) King et al , 2011  (g) Orlandi-Pradines et al., 2007; (h) Sor-Suwan et al., 2014 (i) Valenzuela et al., 2002; (j) Vijai et al., 2014 (k) Wasinpiyamongkol et al., 2010.
Berdasarkan  data  nama  dan  berat  molekul protein  pada  Tabel 1,  protein  D7  family merupakan  protein  yang  memiliki  fungsi sebagai vasodilator, antikoagulan dan immunomodulator. Protein D7 family menurunkan  permeabilitas  kapiler  darah sehingga  mengurangi  jumlah  sel  darah  putih dan  protein – protein  sistem  imun  yang dikeluarkan.  Dengan  demikian,  sistem  imun inang  dapat  dimodulasi  sehingga  parasit  dapat masuk ke dalam darah dengan mudah. Protein SGS (Salivary Gland Surface) berperan sebagai reseptor  plasmodium  pada  permukaan  basal kelenjar  saliva.  Protein  ini  dihasilkan  hanya pada  kelenjar  saliva  nyamuk  betina.  Protein SGS  adalah  protein  yang  paling  imunogenik diantara protein lainnya dalam  kelenjar saliva. Protein ini memiliki kisaran berat molekul 300 kDa dan berperan penting dalam proses blood feeding (King et al ., 2011). Sedangkan protein Saglin berperan memfasiltasi sporozoit dengan mudah  masuk  ke  dalam  darah  (Jiuling,  2013). Protein  Saglin  dalam  penelitian  ini  memiliki berat  molekul  ~  75,  84,  100  kDa.  Protein dengan  berat  molekul  ~66  kDa  merupakan
protein Putative 5’ nucleotidase/ Apyrase yang merupakan protein antikoagulan, antihemostatik dan antiplatelet. Protein dengan berat molekul ~48, 53, dan 57 kDa merupakan protein  Salivary  serpint  putative  antikoagulant merupakan  protein  yang  berperan  sebagai antikoagulan.  Protein  dengan  berat  molekul ~45, 48 kDa merupakan protein the SGI family yang  belum  diketahui  fungsinya.  Protein dengan  berat  molekul  ~33  kDa  merupakan protein  30  kDa  antigen  merupakan  protein antiplatelet. Protein dengan berat molekul ~15, 29,  33,  38  kDa  merupakan  protein  D7  family yang berperan sebagai vasodilator, antikoagulan dan immunomodulator. Sedangkan  protein  dengan  berat  molekul  ~14 kDa  merupakan protein Mucin  yang berfungsi untuk memodulasi makrofag.
Analisis  dot  blot  Total  Protein  Kelenjar Saliva An. aconitus Kelenjar  saliva  nyamuk  yang  telah  diekstrak kemudian  dianalisis  menggunakan  analisis  dot blot.  Analisis  dilakukan  untuk  mengetahui adanya  reaksi  antigen  dan  antibodi.  Analisis dot blot  dilakukan juga sebagai langkah awal pemeriksaan  adanya  protein  kelenjar  saliva nyamuk yang dapat berikatan dengan beberapa protein sampel darah manusia. Analisis dot blot dilakukan  untuk  analisis  keberadaan  protein imunogenik.  Analisis ini  menunjukkan adanya ikatan  protein  kelenjar  saliva  dengan  serum darah  manusia.  Reaksi  ekstrak  kelenjar  saliva nyamuk dengan serum darah manusia endemik, dan  neonatus  menunjukkan  adanya  lingkaran abu – abu,  maka  protein  kelenjar  saliva An. aconitus bersifat  immunogenik  terhadap antibodi manusia. Hasil analisis dot blot dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini.
Gambar 2. Hasil  analisis dot  blot, membran PVDF  diinkubasi  dengan  serum darah  (a)  orang  sehat  endemik  (b) neonatus (c) kontrol negatif (kamera: Samsung Tab 4).

## KESIMPULAN
Pita  protein  hasil  analisis  sds-page  memiliki berat molekul antara lain ~284, 100, 84, 75, 66, 57, 53, 48, 45, 38, 33, 29, 15, 14, dan 11 kDa. Hasil  dot  blot  menunjukkan  bahwa  antibodi dalam  serum  darah  manusia  yang  tinggal  di daerah  endemik  mengenali  protein  kelenjar saliva An.  aconitus
ditunjukkan  dengan munculnya lingkaran abu – abu pada membran PVDF. Perlu adanya analisis dot blot terhadap serum  darah  orang  sehat  non-endemik  dan neonatus  sehingga  terdapat  perbedaan  jelas reaksi antigen dan antibodi malaria.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Proyek  Penelitian  Hibah  Pascasarjana  sesuai SPK  Dikti  Nomor  230/UN25.3.1/LT/2015 yang telah membiayai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Almeras,  L.,  Fontaine,  A.,  Belghazi,  M., Bourdon,  S.  2010. Salivary  Gland  Protein Repertoire  from  Aedes agypti  Mosquitos .
Vector Borne and Zoomatic Diseases. Vol.
10 (4):391-402
Carter, Mendis, Miller, Molineaux, Saul. 2000.
Malaria  Transmission  Blocking  Vaccine: How Can Their Development be Supported . Amerika: Nature America Inc. Calvo, E., Mans, B. J., Andersen, J. F., Ribeiro,
J.  M.  2006. Function  and  Evolution  of  a Mosquito  Salivary  Protein  Family .  J  Biol Chem. Vol. 281 (4): 1935-1942.
Champagne D. E., Smartt C. T ., Ribeiro J. M., James  A.  A.  1995.  The  salivary glandspesific  apyrase  of  the  mosquito Aedes aegypti  is  a  member  of  the  5’- nucleotidase  family .  Proc.  Natl.  Acad.  Sci. USA. Vol.92: 694-698 Data  Kesehatan  Republik  Indonesia. Laporan Hasil  Riset  Kesehatan  Dasar  Indonesia
(Riskesdas). 2013 Fountaine,A.,  Diouf.,  Ibrahima,  Bakkali.,
Misse D., Pages F., Fusai, Thieery; Rogier, Christophe;  and  Almeras,  Lionel.  2011. Implication of Haematophagous Arthropod Salivary Proteins in Host-Vector Interaction . J Parasite & Vectors. 4: 187.
James, A.A. 1994. Molecular and biochemical analysis  of  the  salivary  gland of  vector mosquitoes . Bull Inst Pateur. Vol. 92: 113-
150 Jiuling  Wang1,  Yue  Zhang,  Yang  O.  Zhao, Michelle  W.  M.  Li,  Lili  Zhang,  Srdjan Dragovic,  Nabil  M.  Abraham  and  Erol Fikrig.    2013. Anopheles  gambiae Circumsporozoite  Protein–Binding  Protein Facilitates  Plasmodium  Infection  of Mosquito  Salivary  Glands.  Department  of Applied  Genomics ,  Bristol-Myers  Squibb, Pennington, New Jersey. King,  J.  G.,  K.  Vernic,  J.  F.  Hilyer.  2001.
Members  of  The  Salivary  Gland  Surface Protein  Family  (SGS)  are  Major Immunogenic  Components  of  Mosquito Saliva .  The  American  Society  for Biochemistry  and  Molecular  Biology,  Inc. JBC Papers in Perss. Orlandi,  P.E.,  Almeras,  L.,  Senneville,  D.  L., Barbe,  S.,  Remoue,  F.,  Villard,  C., Cornelie,  S.,  Penhoat,  K.,  Pascual,  A., Bourgouin,  C.,  Fontenille,  D.,  Bonnet,  J., Corre-Catelin,  N.,  Reiter,  P.,  Page’s,  P.,
Laffite, D., Boulanger, D., Simondon, F.O., Pradines,  B.,  Fusa,  T.,  Rogier.,  C.  2007.
Antibody Response Againts Saliva Antigens of Anopheles gambiae and Aedes aegypti in Travellers in Tropical Africa. Microbes and
Infection . Vol. 9: 1454-1462.
Sor-suwan  S,  Jariyapan  N,  Roytrakul  S, Paemanee  A,  Phumee  A,  Phattanawiboon B,  Intakhan  N,  Chanmol  W,  Bates  PA,
Saeung  A,  Choochote  W.  2014. Identification  of  salivary  gland  proteins depleted after blood feeding in the malaria vector Anopheles campestris-like mosquitoes (Diptera: Culicidae) . PloS One. Vol 9(3) Valenzuela J. G., Charlab, R., Gonzalez, E. C.,
Miranda-Santos,  I.K.F.,  Marinotti,  O.,
Francischetti, I. M., Ribeiro, J. M. C. 2002. The D7 family of salivary proteins in blood sucking  Diptera .  Insect  Mol  Biol.  Vol.  11
(2): 149-155. Vijay S, Rawal R, Kadian K, Raghavendra K, Sharma  A.  2015. Annotated  differentially expressed  salivary  proteins  of  susceptible and  insecticide-resistant  mosquitoes of Anopheles stephensi . PloS One.Vol 10(3) Wasinpiyamongkol, L., Patramol, S., Luplertlop,  N.,  Surasombatpattana,  P., Doucourse,  S.,  Mounchet,  F.,  Seveno,  M., Remoue,  F.,  Demettre,  E.,  Blizard,  J.P., Jouin,  P.,  Biron,  D.  G.,  Thomas,  F.,  F., Misse,  D.  2010. Blood-Feeding  and Immunogenic  Aedes  aegypti  Saliva Proteins . Proteomic. Vol. 10: 1906-1916.