## Isolasi dan Identifikasi Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Selulase dari Sumber Air Panas Sila
Laury M. Ch. Huwae 1 * dan Pingkan Aditiawati 2
1 Jurusan Biologi, Fakultas Metematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pattimura, Ambon
2 Bioteknologi, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung, Bandung *e-mail korespondensi: lauryhuwae@gmail.com
INFORMASI ARTIKEL

## A B S T R A C T
Diterima Disetujui Terbit Online : 03 Mei 2020 : 05 Juni 2020 : 08 Juni 2020 Cellulose  is  included  in  the  main  polysaccharide  group  that  is  widely  available  in nature. Cellulose is a straight-chain glucose polymer that is bound by β-1,4 glucoside bonds. Cellulase  is  an  enzyme  complex  consisting  of  several  enzymes  that  work  in stages or together in breaking down cellulose into glucose, by hydrolyzing the β-1,4 glucoside  bond  in  cellulose.  Cellulase  enzymes  have  been  used  in  various industries. Industrial  applications  require  enzymes  that  are  stable  at  high temperatures. Various  types  of  thermostable  enzymes  can  be  isolated  from thermophilic bacteria, cellulase enzymes are no exception. This study aims to isolate and  identify  thermophilic  bacteria  that  produce  cellulase  enzymes  from  Sila  hot springs. The results of isolation and screening of cellulase-producing bacteria from hot water samples obtained by 7 isolates that have the ability to degrade cellulose can produce clear zones on LB-CMC agar selective medium, but CR2 isolates showed the  largest  zone  of  1.5  cm. CR2  isolates  were  Gram-positive  bacteria  and  were identified as having close relations with Bacillus aryabhattai strain B8W22 using the 16S rRNA method.
Copyright © 2020 Universitas Cenderawasih Keywords: Cellulose
Cellulase enzyme
Thermostable enzyme
Thermophilic bacteria

## PENDAHULUAN
Selulosa termasuk dalam golongan polisakarida utama yang banyak terdapat di alam. Senyawa organik ini merupakan unit-unit glukosa glukosa  rantai  lurus  yang  dihubungkan  dengan ikatan  β-1,4  glukosida  (Shuangqi  et  al.,  2011). Ikatan  β-1,4  glukosida  pada  serat  selulosa  dapat didegradasi  menjadi  glukosa  melalui  cara enzimatis, yakni dengan bantuan enzim selulase.
Selulase  (EC  3.2.1.4)  merupakan  suatu kompleks enzim yang terdiri atas beberapa enzim yang berkerja bertahap atau bersama-sama dalam menguraikan  selulosa  menjadi  glukosa,  dengan menghidrolisis ikatan β-1,4 glukosida pada selulosa (Nenci,  2012).  Enzim  selulase  terdiri  dari  tiga kelompok,  yaitu  endo-1,4-β-Dglukanase,  ekso-1,4- β-D-glukanase, dan β-D-glukosidase. Ketiga enzim tersebut bekerjasama menghidrolisis selulosa yang tidak dapat larut menjadi glukosa.
Enzim  selulase  telah  digunakan  dalam berbagai  industri.  Selulase  dimanfaatkan  dalam proses  memperhalus  bubur  kertas  pada  industri kertas,  menjaga  warna  kain  agar  tetap  cemerlang pada  industi  tekstil,  meningkatkan  kualitas  pada industri pangan, sebagai dekomposer bahan-bahan organik, meningkatkan nutrisi pakan ternak. Selain itu,  enzim  selulase  juga  berperan  penting  dalam biokonversi  selulosa  menjadi  berbagai  komoditas senyawa  kimia  dan  dapat  mengurangi  dampak
negatif  dari  polusi  limbah  terhadap  lingkungan (Hartanti, 2010).
Aplikasi dalam bidang industri membutuhkan enzim yang stabil pada suhu tinggi. Pada industri, reaksi  dengan  suhu  tinggi  sangat  diminati  karena dapat meminimalkan resiko kontaminasi, meningkatkan  laju  transfer  massa,  dan  dapat menggeser  kesetimbangan  ke  arah  pembentukan produk.  Oleh  karena  itu,  aplikasi  enzim  didalam industri  bioteknologi  semakin  menuntut  enzim yang  bersifat  tahan  terhadap  lingkungan  ekstrim. Karena  faktor  utama  yang  dapat  merusak  enzim adalah  suhu,  maka  diperlukan  suatu  enzim  yang bersifat  termostabil  (Nanda  et  al.,  2017).  Sumber air  panas  merupakan  salah  satu  habitat mikroorganisme termofilik yang dapat menghasilkan  enzim  termostabil.  Berbagai  jenis enzim  termostabil  dapat  diisolasi  dari  bakteri termofilik,  salah  satunya  yaitu  enzim  selulase. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  dan mengidentifikasi  bakteri  termofilik  penghasil enzim selulase dari sumber air panas Sila.

## BAHAN DAN METODE

## Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain cawan petri, erlenmeyer, spatula, jarum ose,  pinset,  bunsen,  semprotan  alkohol,  lampu spirtus,  korek  api, falcon  tube ,  pembolong  media, kaliper,  termometer,  pH-meter, hot  plate dan
Vol. 3, No. 1, Hal. 32-35 DOI: 10.31957/acr.v3i1.1214 Juli 2020
magnetic  stirrer ,  neraca  analitik,  mikropipet, autoclave ,  oven,  inkubator,  mikroskop,  dan laminary air flow . Adapun bahan-bahan  yang  digunakan  yakni sampel  air  panas,  aquades,  alkohol  70%,  kapas, tissue , cling wrap , tusuk gigi steril, alumunium foil, kertas  label,  tryptone,  yeast  exract,  agar,  CMC ( Carboxymethyl cellulose ), NaCl, reagen Congo Red, crystal violet, iodin, dan safranin.
Prosedur Kerja Sampel  yang  digunakan  berasal  dari  sumber air  panas  Sila  di  Desa  Oma,  Kepulauan  Haruku, Kabupaten  Maluku  Tengah.  Sebelum  dilakukan pengambilan  sampel,  terlebih  dahulu  dilakukan pengukuran  suhu  dan  pH  air.  Sebanyak  50  µL sampel  air  panas  disebarkan  di  atas  media plate agar  yang  mengandung  0,5  g yeast  extract ,  1  g triptone ,  0,5  g  NaCl,  1  g  CMC  ( Carboxymethyl cellulose ),  1,5  g  bacto  agar  kemudian  diinkubasi pada  suhu  37°C  selama  24  jam.  Media  agar  yang ditumbuhi  bakteri  kemudian  diwarnai  dengan larutan  Congo  Red  0,1%  selama  15  menit, selanjutnya  larutan  pewarna  dibuang.  Media dibilas dengan larutan NaCl 1 M selama 15 menit. Koloni yang positif memiliki aktivitas selulase akan menghasilkan zona bening ( clear zone) pada media agar.  Koloni-koloni  positif  kemudian  dipindahkan pada media agar baru untuk proses isolasi hingga mendapatkan  isolat  murni.  Setelah  itu,  dilakukan karakterisasi  kultur  isolat  terpilih.  Pengamatan morfologi sel dan pewarnaan Gram menggunakan kristal  violet  dan  safranin  serta  uji  kepastian dengan  KOH  3%.  Identifikasi  secara  molekuler menggunakan metode 16S rRNA. Hasil sekuensing yang  diperoleh  kemudian  dilakukan  analisis bioinformatik serta konstruksi pohon filogenetik.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Air  panas  Sila  memiliki  suhu  66  °C  dengan kisaran  pH  6,87.  Menurut  penduduk  setempat, suhu  yang  relatif  tinggi  ini  dapat  merebus  telur hingga  setengah  matang  dalam  jangka  waktu perendaman 20 menit. Sumber air panas Sila masih berada di sekitar daerah pesisir dengan jarak ±1 km dari tepi pantai, hal ini ditunjukkan dengan vegetasi pantai yang mendominasi daerah ini. Pohon waru ( Hibiscus  tiliaceus ),  bakau,  kelapa  merupakan vegetasi  pantai  yang  ditemukan  mendominasi lokasi  ini.  Selain  itu,  ditemukan  pula  pohon  sagu dan lumut yang tumbuh di sekitar sumber air panas (Gambar 1).
Sumber  air  panas  Sila  dikelilingi  dengan pepohonan.  Banyak  dedaunan  busuk,  bunga, serbuk sari, biji yang gugur, dan bangkai serangga yang ditemukan pada permukaan sumber air panas tersebut.  Selulosa  merupakan  komponen  utama penyusun   dinding   sel   tumbuhan   dan   termasuk
polimer  yang  ditemukan  paling  banyak  di  alam. Keberadaan  selulosa  pada  sumber  air  panas menyebabkan  mikrooganisme  termofilik  dapat memanfaatkan  limbah  tersebut  sebagai  sumber karbon  untuk  pertumbuhannya.  Faktor  ini memberikan peluang yang besar bagi mikroorganisme  termofilik  menghasilkan  enzim hidrolitik  ekstraseluler  seperti  selulase  dalam sumber air panas tersebut.
Berdasarkan  tahapan  isolasi  yang  dilakukan terhadap sampel sumber air panas Sila, diperoleh 7 koloni  bakteri  yang  tumbuh  pada  media  LB-CMC agar. Hasil pengujian aktivitas selulolitik terhadap koloni-koloni  bakteri  tersebut  menunjukkan  1 koloni dengan diameter zona bening terbesar yakni 1,5  cm  (Gambar  2).  Terbentuknya  zona  bening mengindikasikan  terputusnya  ikatan  β-1,4- glikosidik  yang  menghubungkan  monomer  D- glukosa  pada  CMC.  Berdasarkan  hasil  tersebut dapat diketahui bahwa isolat sumber air panas Sila memiliki  potensi  menghasilkan  selulase  untuk menghidrolisis  ikatan  β-1,4-glikosidik  pada  CMC. Proses  hidrolisis  selulosa  oleh  bakteri  dilakukan dengan  bantuan  enzim  ekstraselular  endo-β-1,4- glukanase, ekso-β-1,4-glukanase dan β- glukosidase.  Enzim  endo-β-1,4-glukanase  bekerja aktif  memecah  secara  acak  selulosa  dengan  sifat kekristalan  rendah  dan  menghasilkan  molekul selulosa  sederhana.  Enzim  ekso-β-1,4-glukanase aktif  pada  bentuk  kristal  selulosa  dan  memecah bagian selulosa yang  tidak tereduksi menjadi unit selobiosa.  Kemudian  enzim  β-1,4-glukosidase berperan  memecah  selobiosa  menjadi  glukosa (Mussatto dan Teixeira, 2010).
Media  CMC  yang  terhidrolisis  oleh  enzim selulase  jika  digenangi  oleh  pewarna congo  red tidak  akan  terwarnai.  Interaksi  ini  berlangsung secara non-kovalen. Congo red dijadikan indikator degradasi β-D-glukan dalam media agar (Hartanti, 2010). Congo red berinteraksi kuat dengan ikatan β-1,4-glikosidik  dalam  CMC.  Metode  ini  dipilih karena  proses  seleksi  dapat  berlangsung  cepat, mudah, dan sensitif.

## Gambar 1. Sumber air panas Sila
Gambar 2. Skrining kemampuan selulolitik terhadap ketujuh koloni (CR1-CR7) pada media CMC menggunakan congo red 0,1% dan NaCl 1M. Tanda panah: zona bening yang dihasilkan
Hasil  pengamatan  morfologi  terhadap  isolat CR2  menunjukkan  bentuk  koloni  sirkuler,  tepian koloni mulus, cembung, tidak lengket dan berwarna krem.  Isolat  CR2  termasuk  Gram  positif  dengan bentuk  sel  oval.  Hal  ini  dipastikan  melalui pewarnaan  Gram  dan  uji  KOH  3%.  Hasil  negatif pengujian  KOH  3%  mengindikasikan  suatu  isolat bakteri  tergolong  bakteri  Gram  positif,  ditandai dengan  tidak  terbentuknya  lendir  saat  isolat
bakteri  direaksikan  dengan  KOH  3%  (Standards Unit,  2019).  Hasil  yang  sama  ditunjukkan  oleh isolat  CR2,  dimana  tidak  terbentuk  lendir  ketika apusan bakteri direaksikan dengan KOH 3%. Tidak terbentuknya  lendir  pada  bakteri  gram  positif karena  dinding  sel  bakteri  Gram  positif  lebih resisten terhadap KOH sehingga  dinding sel tidak pecah. Kuatnya dinding sel ini yang membuat DNA tetap berada di dalam sel. Dinding sel bakteri Gram positif lebih sederhana, dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Hasil identifikasi terhadap gen 16S rRNA isolat CR2  menggunakan  primer  785F  dan  907R menunjukkan kesamaan dengan Bacillus aryabhattai strain  B8W22  sebesar  100%.
Konfirmasi  kedua  dilakukan  dengan multiple sequence alignment dari sekuen 16S semua spesies Bacillus yang  ditemukan  di  NCBI  menggunakan program ClustalX 2.1. Konfirmasi ketiga dilakukan dengan konstruksi pohon filogenetik menggunakan program Mega 6 dengan metode Neighbor Joining dan  nilai  bootsrap  1000  terhadap  hasil multiple sequence  alignment .  Hasil  konstruksi  pohon filogenetik  menunjukkan  isolat  CR2  berada  pada cabang  yang  sama  dengan Bacillus  aryabhattai strain  B8W22  dengan  bootsrap  91%  (Gambar  3). Genus Bacillus umumnya  memproduksi  berbagai enzim  ekstraseluler  termasuk  selulase ( Alnahdi, 2012).
Gambar 3. Pohon filogenetik berdasarkan analisis gen 16S rRNA dari isolat bakteri CR2 menggunakan metode Neighbor Joining dengan nilai bootstrap 1000

## KESIMPULAN
Telah  berhasil  diisolasi  bakteri  penghasil selulase  dari  sampel  air  panas,  diperoleh  7  isolat namun  1  isolat,  yakni  CR2  memiliki  aktivitas selulolitik  yang  lebih  besar  sebesar  1,5  cm  dan hubungan kekerabatan yang dekat dengan Bacillus aryabhattai strain B8W22.

## DAFTAR PUSTAKA
Alnahdi,  H.S.  2012.  Isolation  and  screening  of extracellular  proteases  produced  by  new isolated Bacillus sp.  Journal  of  Applied Pharmaceutical Science, 2(9), 071–074.
Hartanti.  2010.  Termofilik  dari  Kawah  Air  Panas.
Skripsi. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Mussatto, S.I., and Teixeira, J.A. 2010.
Lignocellulose as Raw Material in Fermentation Processes. In : Villas, A.M. (ed.), Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. Formatex Research Center, pp.
897–907.
Nanda, P.T., Siregar, S.A., Kurniawan, R., Hairuidin, Meriyanti, dan Yatno. 2017. Isolasi, Karakterisasi  dan  Uji  Potensi  Bakteri Penghasil  Enzim  Termostabil  Air  Panas Kerinci. Chempublish Journal, 2(1), 26–31.
Nenci. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Selulase dari
Trichoderma  viride Strain  T051  dengan Substrat Jerami. Skripsi. Universitas Indonesia, Depok.
Shuangqi,  T.,  Zhenyu  W.,  Ziluan  F.,  Lili  Z.,  and Jichang,  W.  2011.  Determination  methods  of cellulase  activity.  African  Journal  of Biotechnology , 10(37), 7122–7125. Standards  Unit.  2019. UK  Standards  for Microbiology  Investigations.  Bacteriology- Test Procedures, TP 30, Issue no. 4, 1–13.