Menara Perkebunan , 2006 74(2), 86-95.

## Pengembangan penanda molekuler untuk deteksi
Phytophthora palmivora pada tanaman kakao
Development of molecular marker for the detection of
Phytophthora  palmivora in cacao
T.W. DARMONO 1) , Ilyas JAMIL 2) &  Dwi Andreas SANTOSA 2)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia
2) Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Indonesia

## Summary
Pod  rot  is  one  of  the  most  important diseases in cacao. This disease could be incited by Phytophthora  palmivora,  P.  megakarya , P . capsici or P. citrophthora .  The causal agent of  pod  rot  disease  in  cacao  in  Indonesia  is known to be P. palmivora .  The success of pod rot disease management  partly depends on the success  of  efforts  in  reducing  the  quantity  and quality  of  the  disease  inoculum  above  and below  soil  surface.    Provision  of  molecular- based  detection  system  would  improve  the accuracy  of  determination  of  these  two parameters.  The  objective  of  this  experiment was to develop a pair of primers that could be used to specifically amplify rDNA fragments of P. palmivora associated with pod rot disease in cacao.    Design  of  these  primers  was  made based on the DNA sequence of rDNA fragment amplified  using  a  pair  of  universal  primers ITS4/ITS5.  Regions  showing  high  degree  of dissimilarity  among  species  of Phytophthora and  high  degree  of  similarity  within  the  same species  of P.  palmivora were  determined through  DNA  alignment.    Specific  forward primer  (DTF)  5 ′ -CTT  AGT  TGG  GGG  TCT CTT  TC-3 ′ and  reverse primer  (Ilyas1R)  5 ′ - GTT  CAC  CAA  TCA  TAC  CAC  C-3 ′ were obtained. This pair of primers had been proven to  specifically  amplify  only  rDNA  fragment, approximately  650  bp,  of P.  palmivora associated  with  pod  rot  disease  and  stem canker in cacao.
[ Keywords: Phytophthora ,   cacao,    bioinfor- matics, molecular detection].

## Ringkasan
Penyakit  busuk  buah  merupakan  salah satu  penyakit  terpenting  pada  tanaman  kakao. Penyakit  ini  dapat  disebabkan  oleh Phytoph- thora palmivora, P. megakarya, P. capsici atau P.  citrophthora .  Di  Indonesia  busuk  buah disebabkan  oleh P.  palmivora .  Keberhasilan pengendalian  penyakit  busuk  buah  salah satunya tergantung kepada keberhasilan penekanan  kuantitas  dan  kualitas  inokulum baik  yang  berada  di  atas  maupun  di  bawah permukaan  tanah.  Tersedianya  perangkat deteksi  molekuler  akan  sangat  membantu dalam  upaya  penetapan  kedua  parameter  ter- sebut.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengem- bangkan  satu  pasang  primer  yang  secara spesifik mampu mengamplifikasi hanya fragmen  rDNA P.  palmivora yang  berkaitan dengan  busuk  buah  kakao.  Desain  primer dilakukan  dengan  mengacu  kepada  sekuen rDNA  yang  diamplifikasi  dengan  pasangan primer  universal  ITS4/ITS5.  Daerah  yang menunjukkan  urutan  basa  dengan  tingkat keragaman  yang  tinggi  antar  spesies Phytoph- thora dan yang menunjukkan tingkat kesamaan tinggi  dalam  satu  spesies P.  palmivora yang sama  ditelusuri melalui penjajaran DNA. Hasil desain primer diperoleh primer forward (DTF) 5 ′ -CTT AGT TGG GGG TCT CTT TC-3 ′ dan reverse (Ilyas1R)  5 ′ -GTT  CAC  CAA  TCA TAC  CAC  C-3 ′ .  Pasangan  primer  DTF  dan Ilyas1R  ini  hanya  mampu  mengamplifikasi fragmen  rDNA  berukuran  650  bp  dari P.  palmivora penyebab  penyakit    buah    dan kanker batang kakao.
Darmono et al.

## Pendahuluan
Kakao merupakan salah satu tanaman perkebunan  dan  merupakan  komoditas ekspor  penting  di  Indonesia,  namun pengembangannya  secara  luas  masih menghadapi  hambatan  antara  lain  oleh adanya  serangan  hama  dan  penyakit. Beberapa  jenis  penyakit  dapat  menyerang tanaman  kakao,  akan  tetapi  yang  sangat penting  dan  penyebarannya  sangat  luas adalah  penyakit  busuk  buah  atau black pod  rot yang  disebabkan  oleh Phytoph- thora . Sekurang-kurangnya  terdapat tujuh spesies Phytophthora yang  teridentifikasi di  lapang,  akan  tetapi  ahli  mikologi sekarang      ini    mengkarakterisasi    empat spesies  utama    yang    menginfeksi  kakao yaitu P.  palmivora,  P.  megakarya, P.  capsici dan P.  citrophthora (Evan  & Priori, 1987).
Seluruh  bagian  tanaman  kakao  dapat terinfeksi  oleh  patogen    tersebut    mulai dari  akar,  batang,  bunga,  buah  dan  daun. Namun  kerugian  yang  sangat  tinggi disebabkan  oleh  serangan  pada  buah. Survei yang dilakukan di Jawa menunjuk- kan  bahwa  serangan  penyakit  busuk  buah dapat menurunkan hasil sekitar 26 – 56 % (Pawirosoemardjo  &  Purwantara    1992). Sekali patogen berhasil menginfeksi buah, maka  tidak  ada  perlakuan  apapun  yang mampu mencegah perkembangan penyakit di  dalam  buah.  Buah  yang  menjadi  busuk akan  menjadi  sumber  penularan  penyakit yang  sangat  potensial.    Oleh  karena  itu, upaya  yang  bertujuan  untuk  memperkecil peluang  terjadinya  infeksi  merupakan tindakan  utama  yang  harus  dilakukan. Peluang terjadinya infeksi dapat diperkecil dengan menekan serendah mungkin kuantitas dan kualitas sumber infeksi atau inokulum  penyakit.    Berkaitan  dengan  itu perlu  dikembangkan  perangkat  deteksi
yang  spesifik  dan  sensitif  yang  dapat digunakan untuk menetapkan atau mengukur  kuantitas  dan  kualitas  sumber infeksi.  Sumber  inokulum  tidak  hanya berasal  dari  buah,  kulit,  dan  bantalan bunga  yang  terserang,  tetapi  juga  berasal dari  tanah. Phytophthora spp.  yang menyerang  tanaman  kakao dapat bertahan beberapa  tahun  di  dalam  tanah  pada  sisa- sisa kulit buah dan bahan organik lainnya.
Cara  pendeteksian  penyakit  yang dilakukan  selama  ini  masih  bertumpu kepada  karakter  morfologis  dan  fisiologis patogen yang berhasil diisolasi. Isolasi dan penetapan  karakter  morfologis  dan  fisio- logis  sulit  dilakukan  karena  memerlukan keahlian  khusus,  dan  hanya  seorang taksonomis  yang  mampu  (Ristaino et  al ., 1998).  Karakter  fenotipik  taksonomi  bisa saling  tumpang  tindih  di  antara  spesies dan  perubahan-perubahan  yang  nyata dapat terjadi antara isolat dari spesies yang sama  (Erwin  &  Ribeiro  1996;  Ristaino et  al .,  1998).  Perkembangan  teknik molekuler  yang  sedemikian  pesat  pada tiga  dasawarsa  terakhir  memberikan peluang  yang  besar  bagi  dikembangkan- nya  perangkat  deteksi  yang  sensitif  dan spesifik dan dapat dilakukan dalam waktu yang relatif singkat. Pendekatan molekuler pada  berbagai    bidang  penelitian  semakin dipermudah dengan ditemukannya metode PCR  untuk  mengamplifikasi  DNA  secara in  vitro .  Perbedaan  profil  fragmen  DNA hasil  amplifikasi  dengan  PCR  dapat digunakan  sebagai  alat  untuk  membeda- kan  mikroba  pada  tingkat  genus,  spesies bahkan  genotipe  spesifik  dari  patogen (Edel, 1998).
Penggabungan  metode  PCR  dan perancangan  primer  untuk  mengamplifi- kasi  berbagai  daerah  yang  terdapat  pada DNA ribosom (rDNA) sangat mendukung upaya  pengembangan  perangkat    deteksi
Pengembangan penanda molekuler untuk deteksi Phytophthora palmivora...
cendawan  patogen  tanaman.  Pada  DNA cendawan  terdapat  daerah  konservatif yaitu  gen  penyandi  rRNA  18S,  5.8S,  28S yang  di  antaranya  terapit  daerah internal transcribe  spacer (ITS).  Daerah  ITS biasanya  mengalami  perubahan  atau mutasi  sehingga  dapat  berbeda  atau  ber- variasi di antara spesies. Beberapa peneliti telah  melakukan  kajian  intensif  secara molekuler  terhadap  spesies Phytophthora dengan  teknik  PCR  pada  daerah  rDNA yang  diikuti  dengan  analisis restriction fragment  length  polymorphism (RFLP) dan  atau amplified  fragment  length polymorphism (AFLP)  untuk  membeda- kan  spesies    serta  menyusun  filogenetik- nya  (Appiah et  al .,  2004;  Chowdappa et  al .,  2003;  Cooke et  al .,  2000;  Förster et al ., 2000; Ristaino et al ., 1998). Dengan menganalisis  pola  fragmen  restriksi  hasil amplifikasi  rDNA,  Ristaino et  al .  (1998) berhasil  mengelompokkan  berbagai  isolat sampel  ke  dalam  enam  group  morfologi Phytophthora . Primer spesifik untuk men- deteksi P.  capsici pada  tanaman  lada berhasil  diciptakan.  Appiah et  al .  (2004) telah  mampu  membedakan  spesies Phy- tophthora utama penyebab penyakit busuk buah  kakao  dengan  mengamplifikasi rDNA kemudian dilanjutkan dengan anali- sis  restriksi.  Penanda  molekuler  untuk deteksi P. palmivora pada tanaman kakao di  Indonesia  dengan  akurasi  yang  tinggi dan lebih sederhana perlu dikembangkan.
Perkembangan bioinformatika sebagai ilmu  baru  telah  memberikan  kemudahan dalam  menganalisis  berbagai  data  hasil penelitian  di  bidang  biologi  molekuler. Program serta data-data yang berhubungan dengan  biologi  molekuler  dengan  mudah dapat  diakses  dari  internet,  antara  lain untuk  mendapatkan  sekuen  nukleotida yang   tersimpan   dalam GenBank ,  meng-
analisis tingkat similaritas dengan multiple
Sequence alignment
menggunakan Clustal-W,  membandingkan  suatu  sekuen dengan  sekuen  yang  tersimpan  dalam Genbank menggunakan  program Basic Local  Alignment  Search  Tool (BLAST), untuk  mendesain  primer,  dan  mengetahui situs enzim restriksi dalam utas DNA. Hal tersebut menjadi sangat bermanfaat dalam merancang  primer  untuk  mendeteksi cendawan P.  palmivora pada  kakao. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  merancang primer  pada  daerah  ITS  rDNA  dan menguji  primer  tersebut  dengan  PCR untuk  mendeteksi P.  palmivora pada kakao.

## Bahan dan Metode
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Balai Penelitian  Bioteknologi  Perkebunan  Indo- nesia (BPBPI), Bogor. Isolat P. Palmivora yang digunakan adalah   P, RAP, RCP dari busuk  buah  kakao;  BAC,  BCC,  BDC1, BDC2  dari  kanker  batang  kakao  dari BPBPI.    Selain  itu  digunakan  pula  isolat cendawan  dari  genus  lain  yang  berasal dari BPBPI  yaitu Trichoderma harzianum DT038, T.  pseudokoningii DT039 dan Ganoderma  lucidum. Sedangkan  isolat P.  capsici dan P.  capsici E.901    yang diisolasi  dari  tanaman  lada  diperoleh  dari Balai  Penelitian  Tanaman  Rempah  dan Obat,  Bogor.  Perancangan  primer  dilaku- kan  dengan  mengacu  kepada  sekuen rDNA  yang  diamplifikasi  dengan  pasang- an  primer  universal  ITS4/ITS5.  Daerah yang  menunjukkan  urutan  basa  dengan tingkat  perbedaan  yang  tinggi  antar spesies Phytophthora dan yang menunjuk- kan  tingkat  kesamaan  tinggi  dalam  satu spesies P. palmivora yang sama ditelusuri melalui penjajaran DNA dari data base.
Darmono et al.

## Penyiapan kultur cendawan
Cendawan P.  palmivora,  P.  capsici dan P.  capsici E.901  ditanam  pada medium potato  dextrose  agar (PDA) (ekstrak  dari  200  g  kentang,  20  g  gula pasir,  dan  15  g  agar),  sedangkan T.  harzianum DT038 dan T.  pseudo- koningii DT039 pada medium malt extract agar (MEA) (15 g malt extract , 5 g bacto pepton dan  20  g  agar)  dan G.  lucidum pada  medium  MEA  selektif  (MEA ditambah galic  acid 0,5%, benomyl 10  ppm, phenyl  phenol 15  ppm),  yang masing-masing  disiapkan  dalam  volume satu  liter  disterilisasi  dalam  autoklaf  pada suhu  121 o C  tekanan  1  atm  selama 15  menit,  kecuali galic  acid yang  disteri- lisasi  dengan  filtrasi  0,45  µm.  Kultur diinkubasi pada suhu 27 o C. Setelah koloni cendawan  tumbuh,  umur  lima  hari, miselium  dipindahkan  ke  medium  PDB (sama  dengan  medium  PDA  tetapi  tanpa agar) dan diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan  150  rpm  selama  5  –  7  hari. Miselium disaring kemudian dibilas dengan phosphate  buffer  saline (PBS) yang terdiri atas 8,00 g NaCl; 0,20 g KCl; 1,44  g  Na 2 HPO 4 .12H 2 O;  0,24  g  KH 2 PO 4, dengan  pH  7,4.  Selanjutnya  miselium tersebut  disimpan  dalam freezer dengan suhu -20 o C atau langsung digunakan untuk ekstraksi DNA.

## Ekstraksi DNA genomik dan PCR
Ekstraksi  DNA  genomik  dari  cenda- wan  dilakukan  dengan  metode  Orosco- Castillo et  al. (1994)  yang  dimodifikasi dengan  penambahan  PVP  dan  β-merkap- toetanol    (Toruan-Mathius et  al .,  1997). Amplifikasi  potongan  daerah  ITS  rDNA terhadap  isolat  sampel  dilakukan  dengan
mesin  PCR  menggunakan  pasang  primer umum ITS4/ITS5 dan DTF/Ilyas1R.
Sebanyak 1 µL DNA sampel konsen- trasi  25-50  ng/µL  dimasukkan  dalam tabung  PCR  yang  berisi  17,6  µL  ddH 2 O; 1,25 µL MgCl 2 25 mM (Promega); 0,5 µL dNTP  10  mM  (Promega);  0,15  µL  enzim Taq DNA  polimerase  rekombinan  5U/µL (Invitrogen);  2,5  µL  bufer  10X Taq polimerase  (Promega);  masing-masing 1  µL  primer forward dan reverse dengan konsentrasi  50  ng/µL.  Volume  campuran reaksi  25  µL,  selanjutnya  dimasukkan dalam  mesin  PCR  tipe  T  personal  (Bio- metra)  dengan  program  : pemanasan  awal pada  suhu  94 o C  selama  lima  menit, denaturasi  pada  suhu    94 o C  selama  satu menit, penempelan primer pada suhu 55 o C selama  satu  menit,  ekstensi  DNA  pada suhu  72 o C  selama  1,5  menit.  Setelah  35 siklus  PCR  dibiarkan  pada  suhu    72 o C selama  tujuh  menit  kemudian  suhu diturunkan sampai 4 o C.

## Elektroforesis
Produk  PCR  selanjutnya  dielektro- foresis  dalam  gel  agarosa    0,9%  dalam larutan  bufer  TBE  0,5X.  Sebanyak  10  µL DNA  hasil  PCR  dicampur  dengan    2  µL loading  dye kemudian  dimasukkan  dalam sumur  yang  terdapat  pada  gel.    Elektro- foresis  dijalankan pada tegangan 100 volt selama  30  menit.  Selanjutnya  gel  hasil elektroforesis diletakkan di atas UV trans- luminator dan difoto untuk dokumentasi.

## Hasil dan Pembahasan
Selama  ini  pendekatan  molekuler untuk  mendeteksi P.  palmivora dengan PCR di Indonesia   bertumpu  pada   peng-
Pengembangan penanda molekuler untuk deteksi Phytophthora palmivora...
gunakan  pasangan  primer  ITS4/ITS5 padahal  primer  ini  bersifat  universal  yang dapat  mengamplifikasi  rDNA  berbagai cendawan.  Dengan  demikian,  apabila hanya  berdasar  kepada  ukuran  fragmen produk  PCR  hasil  amplifikasi  mengguna- kan  primer  ITS4/ITS5  dikhawatirkan terjadi  kesalahan  positif  di  mana  fragmen berukuran  sama  bukan  berasal  dari P. palmivora tetapi dari cendawan lainnya. Oleh  karena  itu  dalam  kegiatan  penelitian ini  didesain  primer  spesifik  pada  daerah ITS rDNA untuk mendeteksi P. palmivora pada  kakao . Pada  penelitian  sebelumnya, hasil amplifikasi rDNA apitan   ITS4/ITS5 dari enam   isolat P. palmivora telah ber- hasil disekuen.  Dari data sekuen yang ada keenam  isolat  tersebut  memiliki  tingkat kesamaan  yang  sangat  tinggi.    Sekuen yang  ada  selanjutnya  digunakan  untuk pembuatan  desain  primer  baik  forward maupun reverse.

## Perancangan primer
Analisis  primer forward mengguna- kan  sekuen  daerah  ITS  rDNA P.  palmi- vora dengan  urutan  basa  5 ′′′′ -CTT  AGT TGG  GGG  TCT  CTT  TC-3 ′′′′ .  Berpatokan pada  sekuen  tersebut  maka  dapat  dilihat banyak  perbedaan  basa  antara P.  palmi- vora dengan    spesies Phytophthora lain- nya  dari GenBank .  Pada  Tabel  1  terlihat bahwa  sekuen P.  palmivora memiliki kesamaan  dengan  sekuen P.  arecae. Hal ini  disebabkan  isolat P.  arecae ( GenBank nomor  aksesi  AF266781)  sebenarnya adalah P.  palmivora yang  berasal  dari Indonesia  yang  diisolasi  dari  kelapa (Appiah et  al .,  2004,  dan  Cooke et al ., 2000),  demikian  pula P.  arecae bersifat konspesifik ( conspecific ) dengan P. palmi- vora (Erwin  &  Ribeiro  1996).  Setelah dilakukan   analisis   dengan   www.cyber
gene.se   maka primer dengan urutan basa 5 ′ -CTT AGT TGG GGG TCT CTT TC-3 ′
hasilnya tidak ditemukan struktur
palindrom dan jepit rambut, dengan Tm = 55,6 o C,  Ta  =  50,6 o C  dan  rasio  G/C sebanyak 50,0%.
Untuk merancang primer reverse pada daerah  ITS  rDNA P. palmivora maka dipilih  sekuen  yang  tinggi  keragamannya dibandingkan  dengan  spesies Phytoph- thora lainnya  dari GenBank. Sekuen primer reverse yang  dianalisis  adalah    5 ′′′′ - GGT  GGT  ATG  ATT  GGT  GAA  C-3 ′′′′ pada P. palmivora , kemudian dikomple- mentasi menjadi 3 ′′′′ -CCA CCA TAC TAA CCA  CTT  G-5 ′′′′ setelah  itu  di reverse menjadi  5 ′ -GTT  CAC  CAA  TCA  TAC CAC  C-3 ′ . Pada  primer  ini  nampak banyak  perbedaan  basa  antara P.  palmi- vora dengan spesies Phytophthora lainnya yang  dapat  diakses    dari GenBank (Tabel 2.).  Hasil  analisis  menunjukkan  bahwa pada  sekuen  tersebut  tidak  terdapat  struk- tur palindrom dan  jepit  rambut,  dengan Tm=54,2 o C serta Ta= 49,2 o C dengan rasio G/C  sebanyak  47,4%.  Hasil  perancangan primer  pada  daerah  ITS  rDNA P.  palmi- vora ditetapkan primer forward adalah 5 ′ - CTT  AGT  TGG  GGG  TCT  CTT  TC-3 ′ yang diberi nama DTF dan primer reverse 5 ′ -GTT  CAC  CAA  TCA  TAC  CAC  C-3 ′ yang diberi nama Ilyas1R.

## Amplifikasi daerah  rDNA
Pasangan  primer  DTF/Ilyas1R  di- gunakan  untuk  mengamplifikasi  rDNA terhadap  semua  isolat  sampel.  Sebagai pembanding  amplifikasi  dengan  primer umum yaitu ITS4 5 ′ -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3 ′ dan ITS5 5 ′ -GGA AGT AAA  AGT  CGT  AAC  AAG  G-3 ′ juga dilakukan.

## Darmono et al.
Tabel 1. Perbedaan  sekuen  rDNA  beberapa   spesies Phytophthora dari GenBank untuk analisis primer forward disesuaikan dengan Clustal-W.
Table 1. Ribosomal  DNA (rDNA)  sequence  variation in Phytophthora species  determined  from GenBank for the analyses of  forward  primer based on Clustal-W.
No Spesies Phytophthora Phytophthora species Sekuen basa Base sequence 1. P. parasitica 684915 AAT AGT TGG GGG TCT TAT TT 2. P. nicotianae 467087 AAT AGT TGG GGG TCT TAT TT 3. P. cactorum 552099 AAT AGT TGG GGG TCT TGT CT 4. P. arecae 266781 CTT AGT TGG GGG TCT CTT TC 5. P. palmivora 517463 CTT AGT TGG GGG TCT CTT TC 6. P. palmivora 467089 CTT AGT TGG GGG TCT CTT TC 7. P. megakarya 467096 TTT AGT TGG GGG TCT TTT TC 8. P. katsurae 266771 AAT AGT TGG GGG CGA GTT TG 9. P. megasperma 41380 TTA AAT TGG GAG CTT TCG TC 10. P. erythroseptica 228082 TTA AAT TGG GGG CTT CCG TC 11. P. cinnamomi 684914 ATT AGT TGG GGG CCT GCT CT 12. P. meadii 25164 9 TTT AGT TGG GGG TGT TGC TT 13. P. colocasiae 266786 TTT AGT TGG GGG TGT TGC TT 14. P. botryosa 266784 TTT AGT TGG GGG TGT TGC TT 15. P. citrophthora 467086 TTT AGT TGG GGG TGT TGC TT 16. P. capsici 467084 TTT AGT TGG GGG TCT TGT AC 17. P. capsici 208129 TTT AGT TGG GGG TCT TGT AC 18. P. boehmeriae 204921 TTT AGT TGG GGA CTC CTC GT 19. P. haveae 416484 AAT AGT TGG GGG CGA GTT TG
.
Gambar 1 memperlihatkan bahwa pa- sangan  primer  ITS4/ITS5  dapat  meng- amplifikasi daerah ITS rDNA semua isolat sampel.  Hal  ini  disebabkan  pasangan primer tersebut adalah primer umum yang dirancang untuk mengamplifikasi sebagian sub  unit  kecil   18S,  keseluruhan  daerah ITS1  dan  ITS2  serta  5.8S,  dan  sebagian sub  unit  besar  28S  rDNA  berbagai  jenis cendawan (White et al ., 1990).
Ukuran  fragmen  DNA  hasil  ampli- fikasi  pasangan  primer  ITS4/ITS5  pada isolat P.  palmivora,  P.  capsici dari  lada dan P.  capsici E.901  dari  terong  nampak- nya  sama  dengan  yang  diperkirakan sekitar  900  bp.  Akan  tetapi  berdasarkan penelitian  Ristaino et  al .  (1998)  bahwa
ukuran  fragmen  hasil  amplifikasi  dengan primer  ITS4/ITS5  pada P.  Palmivora diperkirakan  sekitar  950  bp  sedangkan P.  capsici berukuran  sekitar  900 bp.  Pada penelitian  yang  dilakukan  di  Indonesia terhadap  isolat Phytophthora dari  kakao menunjukkan  bahwa  amplifikasi  dengan primer ITS4/ITS5 menghasilkan pita tung- gal berukuran sekitar 900 bp (Darmono & Purwantara  2001;  Umayah  2004).  Ber- dasarkan  ciri  morfologi  dan  molekuler yang  ditunjukkan  disimpulkan  bahwa beberapa  isolat Phytophthora yang  diiso- lasi  dari  buah  yang  terserang  dan  dari kanker  batang  pada  perkebunan  kakao  di Indonesia  adalah P.  palmivora (Butl.) (Umayah, 2004).
Pengembangan penanda molekuler untuk deteksi Phytophthora palmivora...
Gambar 1. Amplifikasi dengan PCR pada rDNA menggunakan pasangan primer ITS4/ITS5. Lajur 1 & 14:  marker  1  Kb  plus  DNA  ladder;  lajur  2  –  13  berturur-turut  adalah  , P.  palmivora P; P. palmivora RCP; P. palmivora BAC; P. palmivora BDC1; P. palmivora BDC2; P. capsici dari lada 1; P. capsici dari lada 2; P. capsici E.901 dari terong 1; P. capsici E.901 dari terong
2; T. harzianum DT038; T. pseudokoningii DT039 dan G. lucidum .
Figure 1. PCR amplification of rDNA region using primer pair ITS4/ITS5. Lanes 1 & 14 : 1 kb marker plus DNA ladder; Lanes 2 – 13 are P. palmivora P; P. palmivora RCP; P. palmivora BAC; P. palmivora BDC1; P. palmivora BDC2; P. capsici from pepper 1; P. capsici from pepper 2; P. capsici E.901 from egg plant 1;  P. capsici E.901 from egg plant 2; T. harzianum DT038; T. pseudokoningii DT039 and G. lucidum respectively.
Tabel 2.  Perbedaan sekuen rDNA  beberapa spesies Phytophthora dari GenBank untuk analisis primer reverse disesuaikan dengan Clustal-W.
Table 2. Ribosomal   DNA  (rDNA)  sequence  variation   in Phytophthora species  determined   from GenBank for the analyses of  reverse primer based on Clustal-W.
No Spesies Phytophthora Phytophthora species Sekuen basa Base sequence 1. P.  parasitica 684915 GCG TGA TGG ACT GGT GAAC 2. P. nicotianae 467087 GCG TGA TGG ACT GGT GAAC 3. P. cactorum 552099 GCG TGA TGG ACC GGT GAAC 4. P. arecae 266781 GGT GGT ATG ATT GGT GAAC 5. P. palmivora 517463 GGT GGT ATG ATT GGT GAAC 6. P. palmivora 467089 GGT GGT ATG ATT GGT GAAC 7. P. megakarya 467096 GCG GTA TGA AGT AGT GAAC 8. P. katsurae 266771 GCG GTA ATG GCT GGT GTAC 9. P. megasperma 41380 GTA GTA TGG ACT GGT GAAC 10. P. erythroseptica 228082 GCT GGA TGG ACT GGT GAAC 11. P. cinnamomi 684914 GCG GTA CGG ATC GGT GAAC 12. P. meadii 251649 GCG TGA TGG GCT GGT GAAC 13. P. colocasiae 266786 GCG TGA TGG GCT GGT GAAC 14. P. botryosa 266784 GCG TGA TGG GCT GGT GAAC 15. P. capsici 467084 GCG TGA TGG GCT GGT GAAC 16. P. capsici 208129 GCG TGA TGG GCT GGT GAAC 17. P. citrophthora 467086 GCG TGA TGG GCT GGT GAAC
1    2   3    4    5   6   7   8   9   10 11 12 13 14 900 pb 800 pb 700 pb
Darmono et al.
Dari  hasil  amplifikasi  daerah  ITS rDNA  dengan  primer  ITS4/ITS5  terlihat bahwa  isolat T.  harzianum DT038  dan T.  pseudokoningii DT039 memiliki  frag- men  berukuran  sekitar  800  bp  sedangkan pada G.  lucidum berukuran  lebih  pendek sekitar  700  bp  (Gambar  1).  Perbedaan ukuran fragmen antara Phytophthora spp., Trichoderma spp.  dan Ganoderma sp. disebabkan  oleh  adanya  variasi  panjang pendeknya  daerah  ITS  pada  masing- masing  rDNA  cendawan.  Daerah  ITS sebagai daerah yang tingkat konservasinya rendah  sedangkan  daerah  sub  unit  kecil 18S,  5.8S,  sub  unit  besar    28S  dan  5S diketahui  sebagai  daerah  yang  sangat konservatif  pada  rDNA  yang  mempunyai sekuen  hampir  pasti  sama  di  antara organisme  (Darmono,  2001;  White et  al .,
1990).  Variasi  yang  signifikan  dapat terjadi  karena  adanya  delesi,  insersi  atau substitusi antara spesies dalam daerah ITS terutama  pada  ITS1,  namun  demikian beberapa  daerah  yang  konservasinya tinggi terdapat pula pada sekuen ITS1 dan ITS2  rDNA.  Umumnya    bagian  ujung    5 ′′′′ dan 3 ′′′′ pada sekuen ITS1 dan ITS2 adalah daerah  yang  konservasinya  tinggi  pada semua  spesies Phytophthora dengan variasi  sangat  sedikit  terbatas  hanya perubahan  beberapa  basa  (Appiah et  al ., 2004).  Demikian  pula  daerah  ITS  dan Intergenic Sequence (IGS) pada unit peng- ulangan  rDNA  berkembang  paling  cepat dan    memungkinkan   terjadinya  variasi  di antara spesies dan populasi (White et al ., 1990).
Gambar 2. Amplifikasi dengan PCR pada rDNA menggunakan pasangan primer DTF/Ilyas1R. Lajur 1- 16 berturut-turut adalah: marker 1 Kb plus DNA ladder; P. palmivora P1; P. palmivora P2; P.  palmivora BAC; P.  palmivora BCC; P.  palmivora BDC1, P.  palmivora BDC2; P. palmivora RAP; P. palmivora RCP; P. capsici dari lada 1; P. capsici dari lada 2; P. capsici E.901 dari terong 1; P. capsici E.901 dari terong 2; T. harzianum DT038; T. pseudokoningii DT039 dan G. lucidum.
Figure  2 . PCR  amplification  of  rDNA  region  using  primer  pair  DTF/Ilyas1R.  Lanes  1-16  are:  marker 1 Kb plus DNA ladder; P. palmivora P1; P. palmivora P2; P. palmivora BAC; P. palmivora BCC; P.  palmivora BDC1; P.  palmivora BDC2; P.  palmivora RAP; P.  palmivora RCP; P.  capsici from  pepper  1; P.  capsici from  pepper  2; P.  capsici E.901  from  egg  plant  1; P. capsici E.901  from  egg  plant  2; T.  harzianum DT038; T.  pseudokoningii DT039  and G. lucidum, respectively.
650 bp 1  2   3  4   5  6   7  8   9 10 11 12 13 14 15 16

## Darmono et al.
Gambar  2  memperlihatkan  bahwa pasangan  primer  DTF/Ilyas1R  hanya mampu  mengamplifikasi  isolat P.  palmi- vora dari  kakao  baik  yang  berasal  dari busuk  buah  maupun  kanker  batang  (lajur 2-9) berukuran sekitar 650 bp. Sesuai pula perhitungan  jumlah  basa  di  antara  primer DTF/Ilyas1R  pada  sekuen  rDNA  ber- jumlah sekitar 640bp, berarti sama dengan perkiraan  ukuran  fragmen  hasil  elektro- foresis  (Gambar  2).  Isolat P.  capsici , T.  harzianum DT038, T.  pseudokoningii DT039 dan G. lucidum (lajur 10-16) tidak teramplifikasi. Primer DTF/Ilyas1R diran- cang  untuk  mengamplifikasi  sebagian daerah  ITS1  dan  ITS2  serta  keseluruhan sub unit 5.8S rDNA P. palmivora . Primer ini  diturunkan  dari  sekuen  yang  tingkat perbedaan  basanya  tinggi  antara  isolat P. palmivora dengan sekuen Phytophthora lainnya yang diambil dari GenBank .

## Kesimpulan
Primer ITS4/ITS5 dapat meng- amplifikasi  semua  isolat  sampel  dengan ukuran  fragmen  yang  berbeda.  Isolat P.  palmivora dan P.  capsici memiliki ukuran  fragmen  sama  yang  diperkirakan 900  bp.  Sedangkan  isolat T.  harzianum DT038  dan T.  pseudokoningii DT039 berukuran  sekitar  800  bp. G.  lucidum berukuran  lebih  pendek  sekitar  700  bp. Hasil  rancangan  primer  pada  daerah  ITS rDNA P.  palmivora diperoleh  pasangan primer forward (DTF) 5 ′ -CTT AGT TGG GGG  TCT  CTT  TC-3 ′ dan reverse (Ilyas1R)  5 ′ -GTT  CAC  CAA  TCA  TAC CAC  C-3 ′ .  Pasangan  primer  DTF/Ilyas1R hanya  mampu  mengamplifikasi  isolat P. palmivora yang berasal dari busuk buah maupun  kanker  batang  kakao  menghasil- kan  fragmen  dengan  ukuran  panjang
sekitar 650 bp. Dengan demikian pasangan  primer  DTF/Ilyas1R  dapat  di- gunakan  untuk  mendeteksi P.  palmivora pada  kakao  menggantikan  primer  umum yang dipakai selama ini.

## Daftar Pustaka
Appiah,  A.A.,  J.  Flood,  S.A.  Archer  & P.D. Bridge (2004). Molecular analysis of the major Phytophthora species on cocoa.
Plant Pathol ., 53, 209-219.
Chowdappa, P., D. Brayford, J. Smith, J. Flood (2003). Molecular discrimination of
Phytophthora isolat  on  cocoa  and  their relationship  with  coconut,  black  pepper and  bell  pepper  isolates  based  on  rDNA repeat  and  AFLP  fingerprints. Curr  Sci.,
84 (9), 1235-1238.
Cooke,  D.E.L.,  A.  Drenth,  J.M.  Duncan, G.  Wagels  &  C.M.  Brasier  (2000).  A molecular phylogeny of Phytophthora and related  Oomycetes. Fungal  Genet.  Biol.,
30, 17-32.
Darmono,  T.W.  (2001) . Development  of molecular  and  serological  technique  for the  detection  of  fungal  pathogens  in woody  plants. In Training  Course  on Early  Detection  of  Woody  Plant  Diseases with Latent Infection . Bogor, 20 February
-  2  March  2001.  Bogor:  SEAMEO- BIOTROP.
Darmono,  T.W.  &  A.  Purwantara  (2001). Practical work on detection of
Phytophthora . In  Training  Course  on Early  Detection  of  Woody  Plant  Diseases with  Latent  Infection .  Bogor,  Indonesia:
Biotechnology  Research  Unit  for  Estate Crops.
Edel,  V.  (1998).  Polymerase  chain  reaction  in mycology:  an  overview. In Bridge  PD et  al .  (editor). Applications  of  PCR  in Mycology. United Kingdom: CAB
Intenational. p. 1-20.
Pengembangan penanda molekuler untuk deteksi Phytophthora palmivora...
Erwin, D.C. & O.K. Ribeiro (1996). Phytophthora Di sease Worldwide .  St. Paul, Minnesota, APS Press.
Evan,  H.C.  &  C.  Priori  (1987).  Cocoa  pod diseases.  Causal  agents  and  control. Outlock on Agricul., 16, 35-41.
Förster,  H.,  M.P.  Cummings  &  M.D.  Coffey (2000).  Phylogenetic  relationship  of Phytophthora species  based  on  ribosomal ITS1  DNA  sequence  analysis  with emphasis on waterhouse groups V and VI. Mycol.  Res., 104 (9), 1055-1061.
Orosco-Castillo,  C.,  K.J.  Chalmers,  R.  Waugh & W. Powell (1994). Detection of genetic diversity  and  selective  gene  in  coffea using  RAPD  markers. Theor.  Appl. Genet., 87, 332-339.
Pawirosoemardjo,  S.  &  A.  Purwantara  (1992). Laju  infeksi  dan  intensitas  serangan Phytophthora palmivora pada buah kakao dan  batang  pada  beberapa  varietas  kakao. Menara Perkebunan, 60 (2), 67-72.
Ristaino,  J.B. , M.  Madritch,  C.L.  Trout  & G.  Parra  (1998).  PCR  amplification  of ribosomal  DNA  for  species  identification in the plant pathogen genus Phytophthora . Appl.  Environ.  Microbiol., 64 (3),  948- 954.
Toruan-Mathius, N., T. Hutabarat & D.  Suhendi  (1997).  The  use  of  RAPD  to evaluate  genetic  variability  of  hybrid parent  in Theobroma  cacao L.  Plants. Menara Perkebunan , 65 (2), 53-63. Umayah,  A.  (2004).  Analisis  keragaman genetik
Phytophthora palmivora
penyebab busuk buah kakao di Indonesia. Disertasi .    Bogor,  Sekolah  Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor.
White,  T.J.,  T.  Bruns,  S.  Lee  &  J.  Taylor (1990). Amplification and direct sequencing  of  fungal  ribosomal  RNA genes  for  phylogenetics. In Innis  MA, et al. (editor). PCR  Protocols:  A  Guide  to Methods  and  Application .  San  Diego, Academic Press. p, 315-322.