## PENENTUAN KADAR TANIN DALAM PELARUT ETANOL 50% DARI KULIT BUAH
MANGGIS ( Garcinia mangostana L.) DENGAN BANTUAN SELULASE Trichoderma asperellum LBKURCC1

## Miranti, Titania Tjandrawati Nugroho, Hilwan Yuda Teruna
Laboratorium Riset Enzim, Fermentasi dan Biomolekuler, Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Riau Jln. Raya Bangkinang KM 12,5 Pekanbaru 28193 Penulis korespondensi. E-mail: miranti@grad.unri.ac.id

## ABSTRAK
Tanin merupakan senyawa turunan polifenol yang memiliki berat molekul 500-3000 yang memiliki gugus hidroksi fenolik.  Tanin  yang  terkandung  dalam  kulit  buah  manggis  ( Garcinia  mangostana L.)  dapat  dimanfaatkan  sebagai bahan aditif pada bahan industri cat, tekstil dan penyamak kulit. Penggunaan enzim selulase dalam proses ekstraksi tanin  menggunakan  alkohol  50%  diharapkan  mampu  meningkatkan  ekstrak  kadar  tanin.  Kulit  buah  manggis diekstraksi dengan dan tanpa enzim selulase Trichoderma asperellum LBKURCC1 menggunakan pelarut bufer Na- asetat  0,05  M  pH  5,5  dan  bufer-etanol  dengan  konsentrasi  etanol  50%.  Kandungan  total  tanin  dianalisis menggunakan  metoda  Folin-Denis.  Hasil  penelitian  menunjukkan  kandungan  tanin  per  gram  kulit  buah  manggis meningkat  secara  signifikan  ( p <0,05)  dengan  penambahan  etanol  50%  dibandingkan  tanpa  etanol.  Sedangkan kandungan  tanin  per  gram  kulit  buah  manggis  dengan  perlakuan  tanpa  dan  menggunakan  enzim  selulase  tidak memberikan perbedaan hasil yang nyata ( p ≥0,05).
Kata kunci: kulit buah manggis, tanin, selulase

## 1. PENDAHULUAN
Indonesia  termasuk  negara  tropis  yang mendominasi pasaran manggis di dunia bersama Thailand  dan  Malaysia.  Manggis  ( Garcinia mangostana Linn.) adalah tanaman tropis dalam family  Guttiferae.  Kulit  buah  manggis  telah digunakan sebagai agen pewarna, obat tradisional,  antidiare,  dan  antidisentri.  Manggis mengandung  beberapa  kelompok  senyawa fenolik  seperti  tanin,  flavonoid,  dan  xanton (Ho et  al., 2002;  Moongkarndi et  al .,  2004;  Jung et al ., 2006; Weecharangsan et al ., 2006; Pothitirat et al ., 2010).
Studi  aktivitas  biologis  telah  menunjukkan bahwa manggis dapat berfungsi sebagai antiinflamasi,  antikanker,  antimikroba,  dan  sifat antioksidan (Chomnawang et al., 2005). Ekstrak buah  manggis  dikonsumsi  sebagai  suplemen makanan  karena  memiliki  aktivitas  antioksidan, sementara  ekstrak  dari  buah  kulit  manggis memiliki sifat antibakteri, yang telah direkomendasikan untuk pengobatan acne vulgaris (Kumar et al., 2008). Aktivitas biologis dari  kulit  buah  manggis  didasarkan  pada kandungan  senyawa  yang  ada  didalamnya  yaitu α-mangostin, tanin, dan senyawa fenolik lainnya (Pothitirat et al ., 2010).
Kulit  buah  manggis  mengandung  selulosa yang  dapat  dihidrolisis  menggunakan  enzim selulase.  Teknik  ektraksi  senyawa  tanin  dari limbah  tanaman  dapat  dilakukan  menggunakan enzim  untuk  membantu  degradasi  dinding  sel tanaman, sehingga senyawa yang ingin diekstraksi  lebih  mudah  dijangkau  cairan pengekstrak.  Selulosa  dapat  dihidrolisis  oleh selulase menjadi monomer-monomernya.
Hidrolisis selulosa menjadi monomer- monomernya  diharapkan  dapat  meningkatkan ekstraksi senyawa tanin.
Penelitian  ini  dilakukan  untuk  menguji kemampuan enzim selulase meningkatkan ekstraksi  senyawa  tanin  yang  terkandung  dalam kulit  buah  manggis  menggunakan  etanol  50%. Enzim  selulase  yang  digunakan  adalah  selulase yang diproduksi Trichoderma asperellum LBKURCC1.

## 2. METODOLOGI PENELITIAN
Bahan  hidup:  Isolat  jamur Trichoderma asperellum LBKURCC1 yang merupakan koleksi laboratorium Biokimia, FMIPA, Universitas Riau, yang telah diisolasi dari tanah hutan  gambut  biosfer  Giam  Siak  Kecil  Bukit
Batu,  Riau  dan  dipelihara  pada  media Potato Dextroxe Agar dari penelitian terdahulu.
a. Peremajaan  isolat  jamur Trichoderma asperellum LBKURCC1 pada media PDA Isolat jamur Trichoderma asperellum LBKURCC1  diambil  dengan  menggunakan  ose secara  aseptis  dan  diinokulasikan  ke  media PDA.  Media  PDA  yang  telah  diinokulasikan isolat jamur Trichoderma asperellum LBKURCC1 diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari atau hingga spora hijau tumbuh subur.

## b. Inokulasi jamur Trichoderma asperellum LBKURCC1 pada media cair
Spora jamur Trichoderma asperellum LBKURCC1  yang  diremajakan  pada  media PDA  dibilas  dengan  larutan  salin  steril  (NaCl 0,8%)  dan  dilepaskan  dari  media  dengan menggunakan  ose  secara  aseptis.  Larutan disaring menggunakan glasswoll sehingga diperoleh  suspensi  spora.  Sebagian  suspensi spora diukur
ODnya
menggunakan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  660 nm  (OD660nm  =  0,34  ~  7  x  10 12 ).  Suspensi spora  diinokulasikan  pada  media  cair  produksi selulase dan diinkubasi pada suhu ruang dengan pengadukan  menggunakan rotary  shaker pada kecepatan putaran 150 rpm selama 72 jam.
c. Produksi enzim selulase
Produksi selulase dilakukan dengan menginokulasi  1,5  x  10 15 spora  dari  isolat  pada 300 mL media produksi cair selulase. Kultur cair ini kemudian diinkubasi pada suhu ruang dengan kecepatan  pengocokan  150  rpm  selama  72  jam. Selulase  yang  telah  diproduksi  dalam  media produksi dipisahkan dari miselia jamur menggunakan sentrifugasi dalam keadaan dingin pada  suhu  5-10 0 C  dan  kecepatan  putaran  9500 rpm selama 10 menit. Filtrat disaring menggunakan  kertas  Whatman  GF/C  sehingga diperoleh  ekstrak  kasar  enzim.  Ekstrak  kasar enzim  ditambahkan  NaN3  hingga  konsentrasi 0,02% dan disimpan dalam lemari pendingin.

## d. Pemekatan enzim selulase
Enzim diendapkan dari ekstrak kasar dengan penambahan  padatan  (NH 4 ) 2 SO 4 anhidrat  secara perlahan  dalam  keadaan  dingin  (5ºC-10 o C) sambil distirer hingga mencapai tingkat kejenuhan  80%.  Larutan  dibiarkan  selama  30 menit  sambil  distirer  dalam  keadaan  dingin. Endapan disentrifugasi dingin selama 10 menit.
Endapan  yang  diperoleh  dimasukkan  ke dalam tabung mikro dan disentrifugasi menggunakan mikrosentrifuga dengan kecepatan 13.000  rpm  selama  5  menit.  Filtrat  dibuang. Endapan ditambahkan dengan larutan buffer Na- asetat  0,05  M  pH  5,5  hingga  terjadi  pemekatan yang  diperkirakan  mencapai  140×  volume semula.  Jadi  misalnya  volume  awal  adalah  140 mL,  penambahan  buffer  pada  endapan  adalah  1 mL.  Enzim  pekat  yang  diperoleh,  dihilangkan garamnya  dengan  mikrofiltrasi  menggunakan membran  ultrafiltrasi  corning  Spin-X ® UF6  10 kDa MWCO (Cat.No.CLS431483-25EA).

## e. Penentuan aktivitas enzim selulase
Analisis  aktivitas  enzim  selulase  dilakukan menggunakan  substrat Carboxymethyl  cellulose (CMC).  Aktivitas  enzim  diuji  sebelum  dan setelah  proses  pemekatan.  Sebanyak  500  µL substrat CMC 2% dalam bufer Na-asetat 0,05M pH  5,5  diinkubasi  selama  5  menit  dalam waterbath suhu  40 0 C.  Kedalam  larutan  substrat ditambahkan  500  μL larutan  enzim  dalam  bufer 0,05M  Na-asetat  dan  pH  5,5,  dan  diinkubasi selama  30  menit  dalam waterbath suhu  40 0 C. Aktivitas enzim  dihentikan  dengan  penambahan 1  mL  reagen  Nelson-Somogyi.  Tabung  berisi larutan  ini  dipanaskan  dalam  penangas  air selama  20  menit.  Setelah  larutan  didinginkan hingga suhu kamar, ke dalam larutan ditambahkan  1  mL  reagen  arsenomolibdat, dihomogenkan,  dan  didiamkan  selama  5  menit. Kedalam  larutan  ditambahkan  7  mL  akuades, dihomogenkan, dan didiamkan selama 30 menit. Absorbansi diukur pada λ=540 nm.
Sebagai kontrol, tabung diisi dengan 0,5 mL larutan  selulase  dalam  bufer  Na-asetat  0,05  M pH 5,5 dan diinkubasi selama 30 menit. Setelah 30 menit sebanyak 1 mL larutan reagen Nelson- Somogyi ditambahkan ke dalam tabung kontrol,
vortex dan ditambahkan 0,5 mL larutan substrat 2% CMC dalam bufer Na-asetat 0,05 M pH 5,5. Tabung  kontrol  kemudian  dipanaskan  dalam penangas  air  selama  20  menit  dan  didinginkan hingga suhu kamar. 1 mL reagen arsenomolibdat ditambahkan  pada  tabung  blanko,  diamkan selama  5  menit.  Setelah  5  menit,  tambahkan  7 mL akuades, vortex hingga tercampur sempurna lalu  didiamkan  selama  30  menit.  Pengukuran absorbansi dilakukan menggunakan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  540 nm  dan  dilakukan  dua  kali  pengulangan  untuk analisis.  Satu  unit  aktivitas  enzim  selulase didefinisikan  sebagai  banyaknya  enzim  yang melepaskan  1  μmol  gula  pereduksi  per-menit.
Kadar protein ditentukan dengan metode Lowry (Boyer, 1993).

## f. Persiapan kulit buah manggis bubuk
Kulit  dipisahkan  dari  daging  buahnya  dan dipotong  kecil-kecil. Kulit manggis  dikeringkan menggunakan  oven  suhu  50 0 C  selama  72  jam. Kulit  manggis  yang  sudah  kering  kemudian dihaluskan  menggunakan  blender  dan  diayak menggunakan  ayakan  berukuran  200  mesh. Bubuk  kulit  manggis  disimpan  dalam  plastik yang kedap udara.

## g. Persiapan ekstrak sampel
Ekstrak dipersiapkan untuk penentuan kadar tanin.  Sebanyak  2,5  gram  bubuk  kulit  buah manggis  dimasukkan  ke  dalam  25  mL  etanol 50%  (dalam  bufer  Na-asetat  0,05  M  pH  5,5) tanpa dan dengan enzim selulase. Enzim selulase yang  ditambahkan  adalah  sedemikian  rupa sehingga  konsentrasi  akhir  selulase  dalam larutan pengekstrak menjadi 0,13 U/mL. Sebagai kontrol  dilakukan  perlakuan  yang  sama  tetapi hanya menggunakan bufer Na-asetat 0,05 M pH 5,5  tanpa  etanol.  Larutan  tersebut  kemudian diinkubasi  selama  8  hari  dalam shaking incubator pada suhu 40 0 C dengan kecepatan 100 rpm.  Ekstrak  sampel  disaring  menggunakan kertas  saring  biasa.  Filtrat  dimasukkan  kedalam labu uap untuk di vacum rotary evaporator 50ºC hingga didapat ekstrak kulit manggis.
Pengeringan  dilanjutkan  menggunakan  oven pada  suhu  50ºC  dan  ditimbang  setiap  30  menit
hingga konstan. Ekstrak yang didapat selanjutnya  dianalisis  kadar  taninnya.  Semua perlakuan diulang sebanyak tiga kali.

## h. Penentuan tanin
Total tanin diukur dengan metode Saxena et al., (2013). Sebanyak 0,1 mL ekstrak kulit buah manggis  dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  yang mengandung  7,5  mL  air,  lalu  ditambahkan  0,5 mL  Folin-Denis  dan  1  mL  Na 2 CO 3 0,5%. Larutan  diaduk  dan  dibiarkan  selama  30  menit dan absorbansinya diukur pada panjang gelombang  760  nm.  Standar  yang  digunakan yaitu standar asam tanin.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak  kulit  manggis  diekstraksi  dengan  4 perlakuan  menggunakan  pelarut  bufer  Na-asetat 0,05  M  pH  5,5  dan  pelarut  etanol  50%  dalam bufer  Na-asetat  0,05  M  pH  5,5  dengan  atau tanpa  menggunakan  proses  enzimatis.  Pelarut etanol dipilih karena merupakan pelarut organik yang  memiliki  kepolaran  yang  sama  dengan senyawa  tanin.  Proses  enzimatis  pada  ekstraksi senyawa tanin dari kulit buah manggis bertujuan untuk  menghidrolisis  selulosa  dan  hemiselulosa yang  terdapat  pada  dinding  sel  kulit  buah manggis.  Sehingga  diharapkan,  senyawa  tanin dapat  terekstraksi  lebih  banyak  karena  selulosa dan  hemiselulosa  yang  melingkupi  dinding  sel tumbuhan telah terdegradasi membentuk molekul  yang  lebih  sederhana.  Berdasarkan beberapa  penelitian  yang  telah  dilakukan menunjukkan bahwa kandungan senyawa polifenol  meningkat  ketika  diberi  perlakuan enzimatik  selama  ekstraksi  (Gomez-Garcia et al., 2012).  Hal  ini  dapat  membuktikan  bahwa ekstraksi menggunakan enzim merupakan teknik yang  sangat  efektif  untuk  meningkatkan  hasil ekstraksi  fenol  dari  limbah  industri  pertanian. Ekstraksi  menggunakan  enzim merupakan alternatif  menarik  untuk  ekstraksi  senyawa bioaktif  dari  kulit  buah  manggis. Tabel  1 . menunjukkan  hasil  berat  kering  ekstrak  dari kulit  buah  manggis  dengan  empat  perlakuan ekstraksi.
Tabel 1 . Berat sampel kulit buah manggis Perlakuan  Rerata berat ekstrak kering (g) P1 0,0364±0,001 d P2 0,0871±0,0004 c P3 0,4796±0,011 b P4 0,6193± 0,096 a
P1=Ekstrak dalam bufer Na-asetat 0,05 M pH 5,5 P2=Ekstrak dalam bufer Na-asetat 0,05 M pH 5,5 dan selulase P3=Ekstrak dalam etanol 50%-bufer Na-asetat 0,05 M pH 5,5 P4=Ekstrak dalam etanol 50%-bufer Na-asetat 0,05 M pH 5,5 dan selulase
Harga  rata-rata  dengan  pangkat  huruf  yang berbeda  adalah  berbeda  secara  nyata  pada tingkat  5%  (P<0,05)  berdasarkan  uji  Duncan jarak berganda.
Hasil  analisis  kadar  tanin pada ekstrak  kulit buah manggis dengan empat perlakuan dinyatakan  sebagai  Asam  Tanin  Ekuivalen (ATE) dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 . Hasil analisis kandungan total tanin ekstrak kulit buah manggis Perlakuan RerataTotal Tanin per gram ekstrak (mg TAE) Rerata Total Tanin terekstraksi per gram kulit manggis (mg TAE) P1 (67,10 ± 2,35) a 0,98 ± 0,03 b P2 (62,93 ± 11,95) a 1,48 ± 0,57 b P3 (19,13 ± 2,47) b 3,64 ± 0,49 a P4 (17,26 ± 4,69) b 3,86 ± 0,39 a
P1 = Ekstrak dalam bufer Na-asetat 0,05 M pH 5,5 P2 = Ekstrak dalam bufer Na-asetat 0,05 M pH 5,5 dan selulase P3 = Ekstrak dalam etanol 50%-bufer Na- asetat 0,05 M pH 5,5 P4 = Ekstrak dalam etanol 50%-bufer Na-asetat 0,05 M pH 5,5 dan selulase ATE = Asam tanin ekuivalen
Harga rata-rata dengan notasi huruf yang sama, tidak berbeda secara nyata pada tingkat 5% ( p≥ 0,05). Sedangkan harga rata-rata dengan notasi huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan secara nyata pada tingkat 5% ( p <0,05) berdasarkan uji Duncan jarak berganda.
Tabel  2 .  menunjukkan  bahwa  secara signifikan  ( p< 0,05)  terdapat  peningkatan  total tanin  terekstraksi  per  gram  kulit  buah  manggis pada  penambahan  etanol  50%  dibandingkan tanpa etanol (Bandingkan P3 terhadap P1 dan P4 terhadap  P2).  Hal  ini  berhubungan  dengan pelarut  etanol  yang  digunakan  untuk  ekstraksi yang dapat mempengaruhi kandungan total tanin terekstraksi.
Kandungan  total  tanin  dengan  perlakuan tanpa dan menggunakan enzim tidak memberikan  perbedaan  hasil  yang  nyata  pada ( p≥ 0,05).  Penambahan  enzim  selulase  pada proses  ekstraksi  dengan  etanol  ternyata  tidak mengubah total tanin yang terekstraksi dari kulit buah  manggis.  Temuan  ini  berbeda  dengan temuan  Gomez-Garcia et  al., (2012),  yang menemukan bahwa penambahan enzim pektinase,  selulase  atau  β-glukosidase  mampu meningkatkan ekstraksi senyawa fenolik antioksidan dari limbah anggur.

## 4. KESIMPULAN
Dari  hasil  ekstraksi  kulit  buah  manggis dapat  disimpulkan:  Kandungan  total  senyawa tanin ekstrak kulit buah manggis dengan pelarut etanol  50%  dalam  bufer  Na-asetat  0,05  M  pH 5,5  dengan  bantuan  enzim  selulase  per  gram kulit  manggis  adalah  3,86±0,39  mg  ATE.  Nilai ini  tidak  berbeda  nyata  dari  ekstraksi  dalam
ekatrak  etanol  50%  tanpa  penambahan  selulase ( p≥ 0,05).

## DAFTAR PUSTAKA
Boyer, R. 1993. Modern Experimental Biochemistry. 3 rd edition . Benjamin Cummings, San Francisco.
Chomnawang,  T.M.,  Surassmo,  S.V.,  and Gritsanapan,  W.  2005.  Antimicrobial effects  of  Thai  medicinal  plants  against acne-inducing bacteria. Journal of Ethnopharmacol . 101: ,330-333.
Gomez-Garcia,  R.,  Martinez-Avila,  G.  C.  G., and Aguilar, C. N. 2012. Enzyme-assisted extraction of antioxidative phenolics from grape ( Vitisvinifera L.) residues. 3 Biotech. 2:297-300.
Ho, C. K., and Huang, C. . 2002. Garcinone E, a Xanthone Derivative, Has Potent Cytotoxic  Effect  Against  Hepatocellular Carcinoma  Cell  Lines. Planta  Med ,  68,
975-979.
Jung, H. A., Su, B. N., Keller, W. J., Mehta, R. G., and Kinghorn, A. D. 2006. Antioxidant Xanthones from The Pericarp of  Garcinia  mangostana  (Mangosteen). J Agric. Food. Chem. 54, 2077-2082.
Kumar,  A.,  Baboota,  S.,  Agarwal,  S.P.,  Ali,  J., and  Ahuja,  A.  2008.  Treatment  of  acne with special emphasis on herbal remedies.
Expert  ReviewofDermatology .  3:  111–
122.
Pothitirat,  W.,  Chomnawang,  M.  T.,  and Supabphol, R. 2010. Free radical scavenging  and  anti-acne  activities  of mangosteen fruit rind extracts prepared by different
extraction methods.
Pharmaceutical Biology ; 48(2): 182-186. Saxena,  V.,  Mishra,  G.,  Saxena,  A.,  Kamlesh Kr.,  and  Vishwakarma,  K.  Kr.  2013.  A comparative study on quantitative estimation of tannins in Terminalia
chebula , Terminalia belerica , Terminalia arjuna
and Saracaindica
using
spectrophotometer. Asian  Journal  of Pharmaceutical and Clinical Research . 6: 148-149.
Weecharangsan, W., Opanasopit, P., Sukma, M., Ngawhirunpat, T., Sotanaphun, U.,
Siripong,  P.  2006.  Antioxidative  and Neuroprotective  Activities  of  Extracts from  The  Fruit  Hull  of  Mangosteen (Garcinia  mangostana  Linn.). Med  Princ Pract. 15,281-28.