## DESAIN SISTEM E. coli SEBAGAI PENGIKAT LIMBAH BESI UNTUK APLIKASI PENGOLAHAN AIR LIMBAH MENGGUNAKAN PENDEKATAN BIOLOGI SINTETIS
Indah Oktaviani 1 1 Program Studi Biologi, Jurusan Sains, Institut Teknologi Sumatera, Lampung, Indonesia

## Abstract:
The development of recombinant DNA technology and the emerging field of synthetic biology have open up a more advanced era of biotechnology. The discoveries are developed to solve the existing problems in the community.The presence of the iGEM competition initiated by the iGEM Foundation since 2003 adding  up  new  data  and  a  new  discovery  that  is  constantly  being  improved  upon,  so  that  peoples’ interest  and  concern  with  synthetic  biology  in  the  world  are  increasing  every  year,  including  in Indonesia.This paper  discusses the idea of design to  develop an expression system with  a synthetic biology approach using standard parts listed on the iGEM website.The system design uses Escherichia coli as its chassis to have the capability as an iron waste bioaccumulator agent in the waters. This idea is expected to be one of the contributions and inspiration for the future of the development of synthetic biology research and applications in handling environmental problems in Indonesia.
Keyword: synthetic biology, biotechnology, iGEM, E. coli , bioaccumulator

## 1. Pendahuluan
Biologi sintetis merupakan perancangan sistem biologis buatan yang lebih kompleks dalam menyelidiki fenomena  biologis  alami  dan  berbagai  aplikasinya  [1],  berbeda  dengan  teknik  rekayasa  klasik  yang memungkinkan  peneliti  mentransfer  unit  tertentu  dari  informasi  genetik  antar  organisme  untuk memperbaiki nilai mereka dengan menghasilkan protein atau materi yang diinginkan [2]. Sistem dalam biologi  sintetis  tersusun  dari  serangkaian  komponen  dasar  ( basic  building  blocks )  yang  secara sederhana sering diumpakan seperti penyusunan blok dalam permainan  lego. Rangkaian komponen yang  digunakan  merupakan  bagian  biologis  fungsional  pengkode  promoter,  gen,  ataupun  terminator yang bertindak sebagai saklar untuk menghasilkan biokatalis atau protein di dalam suatu sistem. Berkat evolusi teknik in vitro , penyediaan komponen dalam sistem biologi sintetis dapat dilakukan dengan cara dirakit atau diubah kemudian disintesis secara kimiawi (misalnya nukleotida dan asam amino buatan) dan diterapkan ke dalam bagian fungsional, untuk memperbaiki sifat dan struktur kimianya sehingga memiliki sifat yang baru [3].
Selain  kebutuhan  akan  tersedianya  data  dalam  sistem  biologi  yang  lebih  lengkap  untuk  mendukung inovasi  dan kebaruan dalam biologi sintetis, pengenalan pengetahuan baru mengenai biologi sintetis juga  dibutuhkan.  Pada  tahun  2003,  Yayasan International  Genetically  Engineered  Machine (iGEM ) , yang diprakarsai oleh MIT, mengadakan kompetisi baru yang disebut sebagai kompetisi iGEM. Yayasan iGEM  adalah  organisasi  nirlaba  independen  yang  berdedikasi  pada  pendidikan  dan  kompetisi, kemajuan  biologi  sintetis,  dan  pengembangan  komunitas  dan  kolaborasi  terbuka  [4].  Salah  satu program utama dari iGEM adalah mengumpulkan koleksi bagian genetik yang dapat digunakan untuk membangun perangkat dan sistem biologi yang kemudian didaftarkan ke dalam website register standar parts biologis yang disebut sebagai Biobricks dan saat ini jumlahnya telah mencapai lebih dari 20.000 parts. Database biobricks bisa diakses secara bebas melalui situs iGEM. Keterbukaan dan kemudahan dalam mengakses penelitian yang dilakukan oleh siswa SMA, sarjana, dan mahasiswa pasca sarjana dapat  membuka  wawasan  dalam menciptakan  inovasi  dan  kolaborasi  baru  dalam mengkarakterisasi sistem yang sudah ada atau benar-benar menghasilkan suatu sistem baru.
Salah  satu  contoh  yang  dapat  dilakukan  dalam  mempelajari  dan  mengembangkan  biologi  sintetis adalah dengan membuat suatu ide-ide sederhana menggunakan sekuens biobricks yang telah tersedia dan  dapat  diakses  secara  langsung  di  web  iGEM  sebagai  suatu  desain/rancangan/simulasi  dalam menangani  berbagai  macam  permasalahan  yang  ada  saat  ini.  Disini  kami  mengambil  salah  satu permasalahan  lingkungan  untuk  diselesaikan  dengan  menciptakan  suatu  rancangan  desain  ekspresi bakteri  menggunakan  pendekatan  biologi  sintetis.  Tujuan  dari  rancangan  desain  ini  adalah  untuk merekonstruksi gen sintetis dalam suatu sistem baru untuk diterapkan dalam Escherichia coli , sehingga
bakteri tersebut dapat menangkap dan mengaakumulasi limbah logam berat, yaitu besi dalam bentuk ion Ferri (Fe 3+ ) dan Ferro (Fe 2+ ) di lingkungan industri (Agen Bioakumulator). Hal ini dilakukan sebagai salah  satu  contoh  upaya  yang  dapat  dilakukan  untuk  mengatasi  pencemaran  perairan  akibat  logam berat  dengan  pengembangan  pengetahuan  berbasis  biologi  sintetis.  Parts  yang  digunakan  dalam desain ini diadopsi dari biobricks yang tersedia di website iGEM.

## 2. Rancangan Desain

## 2.1 Studi Literatur dan Perancangan Sistem*
Database  yang  terkumpul  di  website  iGEM  dikaji  terlebih  dahulu  yang  dilakukan  secara  bertahap dengan kajian teori dasar dan literatur pendukung, sebelum akhirnya dilakukan pemilihan parts yang akan  digunakan  di  dalam  sistem  ekspresi E.  coli (Seperti  promoter,  gen  khusus,  dan  terminator). Sekuens parts standar yang akan digunakan dikumpulkan kemudian dirancang untuk membuat suatu sistem baru menggunakan pendekatan bioinformatika menggunakan software untuk membangun sirkuit yang  akan  memperkenalkan  atau  memodifikasi  fungsi  biologis.  Software  yang  digunakan  dalam perangkaian parts standar yang digunakan adalah snapgene[5].
*) Tahapan perancangan dalam studi ini hanya dilakukan hingga tahap perangkaian, tanpa optimasi kodon usage yang  biasa  dilakukan  dalam  tahapan  transformasi  untuk  memastikan  sistem  buatan  tidak  ditolak  oleh  vektor, tahapan selanjutnya setelah optimasi kodon usage, dalam biologi sintetik biasanya adalah pemesanan gen sintetik yang  dapat  dilakukan  menggunakan  jasa  pembuatan  gen  yang  sudah  tersedia  seperti  Integrated  DNA Technologies (IDT)

## 2. 2 Analisis
Analisis dilakukan berdasarkan studi literatur mengenai teori dan riset yang menggunakan standar part yang sama dan telah terkumpul dalam website part register iGEM yang terstandarisasi, serta website khusus tim-tim iGem yang mengembangkan parts tersebut.

## 3. Hasil dan Diskusi

## 3. 1 Desain E. coli sebagai pengikat limbah besi
Dalam  menangani  pencemaran  limbah  industri  yang  mengandung  logam  berat  besi  dengan menggunakan  pendekatan  biologi  sintetik,  dilakukan  pencarian  database  di  website  iGEM  [6]  dan konstruksi  menggunakan  software  snapgene.  Berdasarkan  hasil  pencarian  terdapat  beberapa  parts Biobricks  standar  yang  dapat  digunakan  dalam  rancangan  penanganan  limbah  besi,  yaitu  Promoter: BBa_I765000  (Promoter  sensitif  Fe;  PFe)  yang  akan  bekerja  ketika  di  lingkungan  air  sekitarnya terdapat  Fe, Coding  sequences :  BBa_K1122702  (FbPA  = Ferric  Binding  Protein )  yang  dapat mengekpresikan  kemampuan  alamiah  bakteri  dalam  menangkap  Fe  di  sekitarnya,  dengan menggunakan Backbones plasmid: psB1A3 ( Ampisilin resisten , Ori) yang memiliki resistensi ampisilin sebagai indikator seleksi bakteri rekombinan berikut dengan RBS dan terminator. Urutan sekuens dapat dilihat di gambar 1. Chasis  yang digunakan  adalah E. coli sesuai dengan standar laboratorium  yang relatif mudah ditemukan. Hasil rancangan konstruksi dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 1. Urutan sekuens yang digunakan dalam rancangan sistem, tersedia di situs website: (www. http://parts.igem.org).
Gambar 2. Desain konstruksi plasmid di dalam E. coli untuk sistem pengikatan limbah besi menggunakan database parts Biobricks yang telah terstandar, tersedia di situs website: (www.igem.org).

## 3. 2 Prediksi Hasil dari Desain Sistem
Berdasarkan desain konstruksi plasmid yang dibuat, bakteri E. coli akan memiliki kemampuan dalam mengikat limbah besi (Fe) seperti rancangan kerja sistem ekspresi pada gambar 3. Prinsip ini diadopsi dari kemampuan alamiah bakteri dalam mengambil besi dari lingkungan untuk pertumbuhannya. Bakteri memperoleh  zat  besi  ferri  dengan  memproduksi  dan  absorpsi  dari  siderophores  atau  melalui  sistem transpor FbpABC yang berikatan dengan reseptor membran luar khusus yang spesifik untuk mengambil sumber  zat  besi  seperti  transferin  dan  laktoferin  dari  inang  [7][8][9].  Berdasarkan  hal  tersebut  maka dilakukan penambahan sistem ke dalam sel bakteri sehingga bakteri akan memiliki kemampuan lebih tinggi dalam mengabsorpsi limbah besi ke dalam sel. Namun karena keterbatasan parts yang tersedia di website iGEM, sistem yang dirancang baru menggunakan sistem transport FbPA saja [10].
Gambar  3. Proses kerja  yang  diharapkan  dari  rancangan sistem  ekspresi E. coli dalam mengikat  limbah  besi  dari  lingkungan yang  terkontaminasi.  A)  Mekanisme  dalam  sel E.  coli rekombinan  tidak  bekerja  ketika  tidak  ada  besi  (Fe)  di lingkungan; B) & C) Promotor Fe-sensitif (Pfe) akan bekerja ketika ada Fe di lingkungan sehingga gen FbPA  akan diatur  dan  kemudian  meningkatkan  kemampuan  bakteri  E.  coli  untuk  mengikat  Fe  dari  lingkungan  ke  dalam  sel- selnya.
Hasil  rancangan E.  coli dalam  studi  ini  menggunakan  part  promoter  konstitutif  yang  sensitif  akan keberadaan  Fe  di  lingkungan,  sehingga  ketika  promoter  mendeteksi  keberadaan  Fe,  protein pengakumulasi Fe  akan terus diekspresikan. Promoter sensitif Fe diadaptasi  dari hasil  penelitian  tim iGem  Colombia-Israel  yang  dapat  diregulasi  dalam  kondisi  lingkungan  yang  mengandung  Fe  [11]. Berdasarkan gambar 3, ketika rancangan sistem berhasil bekerja dan sel E. coli memiliki kemampuan dalam mengikat besi, maka sel-sel bakteri akan berwarna merah kecoklatan sebagai hasil dari proses akumulasi besi di dalam sel (Gambar 4). Hasil prediksi ini didasarkan pada hasil eksperimen yang telah dilakukan oleh tim iGEM dari Evry [12] dan Edinburgh [10].
Kedua tim berhasil mengekspresikan proses pengikatan besi dengan menggunakan sistem FUR dan biosintesis protein yang berbeda, namun proses tersebut masih membutuhkan regulasi dari IPTG dalam menginduksi operon Lac yang terdapat dalam plasmid. Tim Evry mengembangkan E. coli yang memiliki peningkatan  kemampuan  dalam  mengikat  besi  dengan  menghasilkan  enterobacter  dan  aplikasinya ditujukan  dalam  bentuk  kapsul  dengan  target  pasien  penderita  talasemia.  Sedangkan  tim  Edinburgh mengkelat besi dengan protein A pengikat ion besi (FbpA) (yang digunakan dalam rancangan sistem ini). Protein ini berasal dari Neisseria gonorrhoeae yang mampu mengkelat berbagai ion dalam larutan seperti  Fe 3+ ,  Ti 4+ ,  Cu 2+ ,  Zr 4+ (ion  Zirkonium)  atau  Hf 4+ (Hafnium  ion)  [13].  Hasil  penelitian  kedua  tim menunjukkan adanya peningkatan aktivitas sel bakteri dalam mengakumulasi Fe. Bakteri yang dapat mengakumulasi  Fe  mengalami  perubahan  warna  sel  seperti  yang  terdapat  pada  gambar  4.  Sistem ekspresi ini merupakan pengembangan sistem sederhana  yang tidak memerlukan kontroling, karena promoter  yang  digunakan  akan  terus  tereskpresi  sehingga  Fe  kan  terus  dimasukkan  ke  dalam  sel, Bakteri  yang  telah  mengalami fase  jenuh,  kemudian  akan mengalami  kematian  dan  sel  bakteri  akan tetap berwarna merah kecoklatan seperti gambar 4.
Gambar 4. (Kanan) Koloni E. coli rekombinan dapat mengekspresikan FbPA ketika besi diletakkan di tengah cawan petri, dan warna koloni akan menjadi merah kecoklatan akibat dari proses akumulasi. (Kiri) Koloni E. coli non-rekombinan tidak dapat mengakumulasi besi dari lingkungan. (Prediksi didasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh tim iGem [11] )

## 3. 3 Rancangan Penerapan Sistem Ekspresi
Salah  satu  permasalahan  serius  yang  terjadi  akibat  meningkatnya  aktivitas  perindustrian  adalah dihasilkannya berbagai jenis limbah logam berat yang dapat menjadi permasalahan bagi kesehatan dan lingkungan  baik  untuk  manusia,  hewan,  maupun  tumbuhan.  Jenis  logam  yang  sering  ditemukan diantaranya  adalah  besi.  Besi  di  perairan  dapat  menyebabkan  berbagai  masalah  estetika  dan operasional termasuk bau, perubahan warna, pengendapan dalam distribusi sistem yang mengarah ke pada ledakan populasi dan tingginya tingkat kekeruhan [14].
Berdasarkan Peraturan Menteri Kesehatan RI Nomor: 416/ MENKES/PER/IX/90 tentang baku mutu air bersih, kadar besi (Fe) yang diizinkan untuk air bersih maksimal adalah 1,0 mg/l [15]. Pada umumnya ion  limbah  logam  limbah  cair  biasanya  dihilangkan  dengan  proses  presipitasi,  evaporasi,  ekstraksi pelarut, pertukaran ion, reverse osmosis, atau separasi membran. Namun proses presipitasi dipercaya membutuhkan bahan kimia yang besar dan menghasilkan sampah dalam jumlah besar, sehingga cara ini  dirasa  belum  optimal  [16].  Oleh  karena  itu,  dengan  menggunakan  pendekatan  biologi  sintetis dilakukanlah  perancangan  sistem  ekspresi  untuk  dikaji  dalam  skema  penerapan  yang  memiliki kemungkinan kecocokan dalam penggunaan aplikasi bakteri E. coli rekombinan. Salah satu pendekatan
yang dilakukan adalah dengan cara mengeringkan sel bakteri ( dry cell ) kemudian menaburkannya ke dalam  reservoir  air  limbah  dengan  durasi  pengontrolan  waktu,  termasuk  waktu  untuk  mengaktifkan kembali sel, hingga waktu yang dibutuhkan bakteri untuk mengakumulasi limbah besi. Setelah treatmen dilangsungkan  maka  air  kembali  dialirkan  melalui  pipa  yang  telah  diberi beberapa  lapis  filter  dengan ukuran khusus yang dapat menahan sel-sel bakteri E. coli yang telah mati agar tidak terlepas ke alam bebas (Gambar 5. B). Sebelum dilepaskan ke alam air limbah diuji terlebih dahulu meliputi keberadaan bakteri rekombinan dan kualitas air limbah yang telah diolah.
Gambar 5. Limbah industri yang mengandung logam berat tidak bisa langsung dibuang ke perairan bebas. Salah satu jenis logam berat yang sering mencemari lingkungan adalah besi (Fe). A) Limbah besi (Fe) dalam yang larut dalam air umumnya berbentuk ion ferric (Fe 3+ ) dan ferro (Fe 2+ ), tersuspensi dalam butir koloid (diameter <1 mm) atau lebih besar seperti Fe(OH) 3 [17];  B)  Urutan  rencana  penerapan  rancangan  desain E.  coli rekombinan  sebagai  pengikat  limbah  besi untuk aplikasi pengolahan air limbah.

## 4. Kesimpulan
Seiring  dengan  perkembangan  dan  pemanfaatan  bioteknologi  terdapat  solusi-solusi  yang  tersedia dalam  menangani  masalah  lingkungan,  salah  satunya  dengan  perancangan  bakteri  atau mikroorganisme  dengan  kemampuan  bioremediasi  yang  dapat  dikontrol  dan  dikendalikan  sehingga dapat  bekerja  dengan  lebih  efektif  dan  efisien.  Pendekatan  manipulasi  ekspresi  gen  dengan  biologi sintetis  menggunakan  parts  biobricks  terstandardisasi  yang  ada  saat  ini  telah  memperluas  akses pengembangan  sistem  ekspresi  yang  dapat  digunakan.  Hal  ini  tentu  mempermudah  perancangan sistem dan simulasi teori sebelum sistem buatan dalam bakteri diaplikasikan dalam kehidupan nyata. Salah satu contohnya adalah pengembangan bakteri yang memiliki kemampuan sebagai bioakumulator besi yang terdapat dalam limbah perairan. Sistem yang dirancang dalam studi ini masih memerlukan kajian mendalam dan lebih detail dalam aplikasi buatan, uji coba di lapangan, hingga pembuatan sistem kontrol  yang  lebih  efektif  dan  efisien  kedepannya.  Diharapkan  kajian  ini  dapat  menjadi  salah  satu inspirasi pengembangan sistem ekspresi organisme dengan pendekatan biologi sintetis di Indonesia.

## 5. Daftar Pustaka
[1] E. Andrianantoandro, S. Basu, D. Karig, and R, Weiss. “Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline. Molecular Systems Biology”, Molecular Systems Biology, 0028: pp. 1 – 14, May 2006.
[2] B.R. Glick, J.J. Pasternak, and C.L. Patten. “Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA”,4 th Ed., Washington DC : American Society for Microbiology (ASM) Press, 2010.
[3] S. Ausländer, D. Ausländer, and M. Fussenegger. “Synthetic Biology—The Synthesis of Biology”, Angew. Chem. Int., 56, 6396 –6419, 2017.
[4] The International Genetically Engineered Machine (iGEM) Foundation, “Synthetic Biology : based on standard parts,” 2017, http://igem.org/Main_Page.
[5] GSL Biotech, “Snapgene : Software for everyday molecular biology”, 2017, http://snapgene.com.
[6] iGEM, “Registry of Standad Biological Parts”, 2017, http://parts.igem.org/Main_Page.
[7] J. Leong, and J. B. Neilands, “Mechanisms of siderophore iron transport in enteric bacteria,” J Bacteriol. 126(2): 823 –830, 1976.
[8] C. Ferreiros, M. Criado, and J. Gomez, “The Neisserial 37kDa ferric binding protein (FbpA), “ Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 123, pp. 1-7, 1999.
[9] S. A. Tom-Yew, D. T. Cui , E. G. Bekker, and M. E. Murphy, “Anion-independent Iron Coordination by the Campylobacter jejuni Ferric Binding Protein,” The Journal of Biological Chemistry, 280, pp. 9283-9290, 2005.
[10] iGEM: The Edinburgh team, “WastED”, 2013, http://2013.igem.org/team:edinburgh/introduction [11] iGEM: The Colombian- Israeli team, “A Microbial Biosensor Device Assembled with Ion Channels for  Iron  Detection  under  UV  Irradiation  and  Different  Levels  of  Oxygen”,  2007, http://2007.igem.org/wiki/index.php/IGEM_2007_Project
[12] iGEM: The Evry team, “Iron Coli Project”, 2013,http://2013.igem.org/Team:Evry
[13]  C.  Y. Chen,  S.  A.  Berish,  S.  A.  Morse,  and  T.  A.  Mietzner,  “The  ferric  iron-binding  protein  of pathogenic Neisseria  spp. functions  as  a  periplasmic  transport  protein  in  iron  acquisition  from human transferrin, “ Mol. Microbiol, 10(2), pp. 311-8, 1993.
[14] J.T. O’Connor, “Iron and Manganese.In: Water Quality & Treatment —A Handbook of Public Water Supplies ,” New York: McGraw Hill, pp.378–396, 1971.
[15] Peraturan  Menteri  Kesehatan  RI.  Nomor:  416/  MENKES/PER/IX/90.  “Syarat-syarat  Dan Pengawasan  Kualitas  Air”,  Menteri  Kesehatan  Republik  Indonesia,  3  September  1990, http://web.ipb.ac.id/~tml_atsp/.
[16] Y.F. Shen, Y.F.Shen, J.Tang, Z.H.Nie, Y.D.Wang, Y.Ren, and L.Zuo, “Tailoring Size and Structural Distortion  of  Fe3O4  nanoparticles  for  the  purification  of  contaminated  water”,  Biosource Technology, Vol. 100 (18), pp. 4139-4146, September 2009.
[17] A.G. Tekerlekopoulou, I.A. Vasiliadou, and D.V. Vayenas, “Physico-chemical and biological iron removal from potable water”, Biochemical Engineering Journal, 31, pp. 74 –83, 2006.