## AKTIVITAS DAN STABILITAS RADICAL SCAVENGING L-ASKORBIL PALMITAT HASIL SINTESIS SECARA ENZIMATIK
[Activity and Stability of Radical Scavenging of L- Palmitate Synthesized Enzymatically]
Tri Agus Siswoyo 1)* , dan Tri Ardiyati 2)
1) Pusat Penelitian Biologi Molekul dan Jurusan Agronomi, Fakultas Pertanian Universitas Jember, Jln  Kalimantan III/23, Jember 68121
2) Jurusan Biologi,  Fakultas Matematika dan Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya
Diterima 10 Januari  2009/ Disetujui  7 Desember  2009

## ABSTRACT
L-ascorbyl  palmitate  (AsA-Pal-Enz)  was  synthesized  by  using  an  immobilized  lipase  from  Aspergillus  niger.  A  comparison  of  antioxidative  effects between L-ascorbic acid  (AsA) and AsA-Pal-Enz was determined in terms of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical–scavenging. The results indicate that the AsA-Pal-Enz was effective in preventing lipid oxidation, while the antioxidative activity in authentic AsA-Pal was lower . The activity of AsA-Pal-Enz was very stable than AsA-Pal standard during heating.
Key words : Aspergillus niger, Lipase, Antioxidant, L-Ascorbic Acid, L-Ascorbyl Palmitate

## PENDAHULUAN
Oksidasi  lipid  merupakan  reaksi  utama  terjadinya  kerusakan pada beberapa jenis pangan yang mengandung lemak atau minyak. Proses  ini  dapat  mengakibatkan  penurunan  kualitas  dengan menimbulkan perubahan seperti bau, rasa dan warna. Ketengikan pada  minyak  juga  disebabkan  oleh  reaksi  oksidasi  lipid  melalui sederetan mekanisme reaksi. Pertama, pembentukkan awal radikal bebas  (inisiasi),  lalu  terbentuknya  radikal  baru  (propagasi),  dan tahap terakhir (terminasi) yaitu pengubahan menjadi radikal bebas yang  stabil  dan  tak  reaktif  (Ishido et  al .,  2002;  Simic et  al .,  1992; Labuza,  1971).  Proses  oksidasi  lipid  dapat  dicegah  dengan menambahkan senyawa antioksidan. Dalam arti khusus antioksidan adalah  zat  yang  dapat  menunda  atau  mencegah  terjadinya  reaksi antioksidasi  radikal  bebas  atau  kemampuan  menangkap  senyawa radical  ( radical  scavenging )  dalam  oksidasi  lipid  (Kochhar  dan Rossell,  1990). Sumber-sumber  antioksidan  dapat  dikelompokkan menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh  dari  hasil  sintesa  reaksi  kimia)  dan  antioksidan  alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami) (Shui dan Leong, 2004).
Asam  askorbat  (AsA)  diketahui  mempunyai  potensi  sebagai antioksidan  atau  sebagai  agen  sinergistik  antioksidan  pada beberapa  model  dan  makanan  yang  mengadung  lipid  (Yin et  al ., 1993).  Asam  askorbat  dapat  juga  mengakibatkan  terpacunya oksidasi (pro-oksidan) pada minyak. Ion besi merupakan hal utama yang  mengakibatkan  AsA  sebagai  pro-oksidan  (Yin et  al .,  1993; * Harel dan Kanner, 1985). Beberapa jenis derivat AsA telah banyak disintesis  diantaranya  adalah  ester  askorbil  (AsA-ester)  di  mana derivat ini mempunyai kemampuan untuk dapat larut dalam minyak. Sintesis AsA-ester secara kimia telah banyak dilakukan terutama di
* Korespondensi penulis : HP. 08179607263
E-mail : siswoyo.triagus@gmail.com
negara-negara  berkembang,  akan  tetapi  metode  yang  digunakan mempunyai  beberapa  kelemahan  diantaranya  adalah  instabilitas AsA  yang  dapat  mengakibatkan  produksi  menjadi  rendah  dan adanya residu pelarut yang terikat pada produk (Chen et al ., 1994). Residu yang terikat pada produk tersebut dalam bidang pangan dan kosmetik  sangat  tidak  direkomendasikan,  karena  akan  dapat menimbulkan  efek  samping  pada  pengguna  (Humeau,  1995). Diketemukannya  lipase  sebagai  biokatalisator  pada  reaksi esterifikasi  atau  trans-esterifikasi  lipid,  membuka  suatu  wacana baru untuk memproduksi AsA-ester secara enzimatik. Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas dan stabilitas radical scavenging L-askorbil  palmitat  hasil  sintesis  secara  enzimatik  (AsA-Pal-Enz) pada media emulsi linoleat dan virgin coconut oil (VCO).

## METODOLOGI
Bahan Lipase  kasar  dari Aspergillus  niger diperoleh  dari  Amano Pharmaceutical  Co.,  Ltd.  (Nagoya),  Celite  545  dan  asam  vinil palmitat  dari  Fluka.  Asam  askorbat  (AsA)  dan  askorbil  palmitat (AsA-Pal)  (Fluka)  ;  1,1-difenil-2-pikrilhidrazil  (DPPH)  dan  asam linoleat (Wako) dan bahan kimia lainnya yang digunakan diperoleh dari  Wako  dengan  spesifikasi  untuk  analisis  ( analytical  reagent grade ).

## Sintesis dan isolasi AsA-Pal-Enz.
Sintesis  AsA-Pal  dilakukan  secara  enzimatik  (AsA-Pal-Enz) dengan  menggunakan  lipase  dari Aspergillus  niger yang  sudah terimmobilisasi (Siswoyo et al ., 2006). Campuran reaksi yang terdiri dari AsA, lipase terimmobilisasi dan saringan molekuler (3 Å, yang telah diaktifkan dengan cara memanaskan pada suhu 250 C pada kondisi tereduksi) dalam larutan etil metil keton (EMK). Campuran
reaksi  tersebut  diinkubasikan  pada  suhu  40 C  selama  6  jam dengan  kecepatan  pengadukan  450  rpm.  Reaksi  dimulai  dengan menambahkan  asam  vinil  palmitat.  Hasil  sintesis  diisolasi mengunakan metode yang dijelaskan pada Siswoyo et al ., (2006). Isolasi hasil sintesis dianalisis secara kualitatif menggunakan TLC dan HPLC.
Analisis HPLC dan TLC .
Analisis  hasil  sintesis  AsA-Pal-Enz  dilakukan  menggunakan HPLC  dengan  jenis  kolom  Altima  C18  (4,6  ×250  mm;  Nacalai Tesque,  Kyoto).  Larutan  sampel  (10uL)  diinjeksikan  pada  kolom dengan  larutan  elusi  berupa  metanol/air/asam  fosforat  (95/5/0,1, per  vol)  dengan  kecepatan  aliran  1,0  mL/min.  Hasil  larutan  elusi dimonitor menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 245 nm.  Analisis  TLC  menggunakan  plat  gel  silika  60F240  (Merck) dengan system pengembangan menggunakan etil- asetat:metanol:air  (80:20:5,  per  vol.).  Visualisasi  spots menggunakan  pereaksi  Cer  (25  g  asam  molibdofosforat  dan  10  g Cer(IV)-sulfat dilarutkan dalam 300 mL akuades dan 80 mL H 2 SO 4 pekat dengan volume akhir  1 L, setelah itu dipanaskan pada suhu 110 C selama 5 min).
Pengukuran potensi aktivitas radical scavenging . Potensi  aktifitas radical  scavenging sampel  diukur menggunakan  metode DPPH  Radical–Scavenging berdasarkan jumlah  donor  hidrogen  atau  kemampuan  radical  scavenging  dari radikal berupa  DPPH yang stabil (Yamaguchi et al ., 1998; Gadow et al ., 1997). 500 μM DPPH dalam etanol disiapkan sebagai larutan stock. 0,6 mL larutan DPPH dan 2,4 mL etanol dicampurkan dalam tabung  reaksi  dan  ditambahkan  0,1  mL  larutan  metanolik  sampel. Setelah  dibiarkan  pada  suhu  ruang  selama  30  min,  penurunan absorbansi  diukur  pada  panjang  gelombang  517  nm  dengan menggunakan  Shimadzu  spectrophotometer  UV-160A  (Kyoto, Japan).  Absorbansi  larutan  DPPH  tanpa  sampel  diukur  untuk digunakan sebagai kontrol. Perhitungan  persentase reduksi DPPH dilakukan berdasarkan persamaan (Tomaino et al ., 2005):
% DPPH = (DPPH/DPPH o ) x 100%
dimana: konsentrasi DPPH diperoleh berdasarkan persamaan linier DPPH = (3,4x10 -4 )A 517 + (7,5 x10 -7 ) dan DPPH 0 adalah konsentrasi DPPH pada awal reaksi.
Aktivitas  radical  scavenging  L-askorbil  palmitat pada  emulsi asam linoleat.
Aktivitas  radical  scavenging  AsA-Pal-Enz (suatu  antioksidan) pada  emulsi  asam  linoleat  digunakan  sebagai  model  terhadap kemampuan  AsA-Pal-Enz.  Aktifitas  antioksidan  ini  diukur  dengan metode  thiosianat  (Mitsuda et  al .,  1966).  500  g  AsA-Pal-Enz dalam 0,5 mL air yang tidak berion dicampur dengan larutan asam linoleat (2,5 mL, 0,02 M, pH 7,0) dan bufer fosfat (2 mL, 0,2 M, pH 7.0). Preparasi emulsi asam linoleat dilakukan dengan mencampur 0,2804 g asam linoleat, 0,2804 g  Tween-20 sebagai emulsifier dan 50  mL  buffer  fosfat.  Selanjutnya  campuran  dihomogenkan  dan diinkubasikan  pada  suhu  37 C.  Sebanyak  0,1  mL  dari  larutan reaksi  diambil  untuk  dianalisis  pada  interval  waktu  yang  berbeda
selama  inkubasi.  Derajat  oksidasi  diukur  berdasarkan  metode thiocyanate,  perubahan  yang  terjadi  dimonitor  dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm.
Stabilitas radical scavenging L-askorbil palmitat . Sampel  antioksidan  (AsA;  AsA-Pal  dan  AsA-Pal-Enz) ditambahkan sebanyak 1% (w/w) pada tabung reaksi bertutup yang sudah  berisi  asam  linoleat  dan  virgin  coconut  oil  (VCO)  dan diinkubasikan  pada  beberapa  suhu  yang  berbeda  (suhu  ruang (28 C),  60;  80;  100  dan  120 C)  selama  3  jam.  Stabilitas radical scavenging diukur menggunakan metode DPPH (Yamaguchi et al ., 1998;  Gadow et  al .,  1997),  sedangkan  perhitungan  persentase reduksi DPPH dilakukan berdasarkan persamaan  yang disebutkan sebelumnya (Tomaino et al ., 2005).

## Analisis statistik
Analisis  statistik  menggunakan  analisis  co-variance  (ANOVA) dan  perbedaan  antar  sampel  dihitung  menggunakan  duncan’s multiple range test (Window SPSS program versi 10.05).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sintesis AsA-palmitat .
Hasil  sintesis  L-askorbil  palmitat  (AsA-Pal) secara  enzimatik dengan menggunakan larutan EMK dapat dilihat pada Gambar 1 . Pada  gambar  tersebut  terlihat  adanya  spot  baru  pada  TLC dengan rate  of  flow (Rf)  sekitar 0,82  dimana  nilai  tersebut  hampir sama dengan nilai Rf dari AsA-Palmitat standard. Begitu pula hasil analisis  HPLC  kromatogram,  AsA-Pal-Enz  dan  AsA-Pal  standard menunjukkan  puncak  tunggal  dengan  waktu  retensi  yang  sama sekitar 7,7 min (Gambar 1B).
Etil metil eton (EMK) dengan nilai Log P (o/w) 0.29 (Effenberger et  al .,  1997)  mengindikasikan  terbentuknya  AsA-Pal-Enz.  Hal  ini dapat  dimungkinkan  bahwa  larutan  tersebut  mempunyai kemampuan polaritas yang sedang untuk dapat membatasi jumlah air  dalam  konfigurasi  struktur  aktif  enzim,  sedang  untuk  yang  lain tidak ditemukan. Log P ini sangat umum digunakan untuk prediksi kemampuan katalitik dan karakter enzim pada suatu larutan (Parida dan Dordick, 1991).

## Aktivitas radical scavenging
Potensi aktifitas derivat AsA (AsA-Pal dan AsA-Pal-Enz) diukur menggunakan DPPH dan emulsi linoleat.  Gambar 2 menunjukkan peningkatan  derivat  AsA  mengakibatkan  penurunan  persentase reduksi DPPH secara linier.  Penambahan konsentrasi AsA sebesar 12  g  menghasilkan  penurunan    persentase  reduksi  DPPH terendah  (48%)  diikuti  AsA-Pal-Enz  (72%)  dan  AsA-Pal  standard (78%).  Penurunan  persentase  DPPH  menunjukkan  kemampuan derivat  AsA  dalam  mereduksi  DPPH,  hal  ini  dapat  digunakan sebagai  indikator  adanya  aktivitas  suatu  senyawa  sebagai antioksidan (Tomaino et al ., 2005) .
Gambar 1. Hasil TLC (A) dan HPLC (B) kromatogram  dari L-askorbil palmitat standard (AsA-Pal) dan hasil sintesis secara enzimatik (AsA-Pal-Enz).
Gambar 2. Aktifitas antioksidan derivat L-asam askorbat (AsA) diukur menggunakan DPPH.  , AsA;  , AsA-Pal;  , AsA-Pal-Enz.
Sebaliknya  aktivitas  antioksidan AsA  dalam  menghambat pembentukan  senyawa  peroksi  pada  sistem  emulsi  linoleat menunjukkan  hasil  yang  berbeda,  seperti  terlihat  pada  Gambar 3. Penambahan  sebesar  12  g    AsA    mengakibatkan  terjadinya peningkatan nilai peroksi secara linier sampai akhir inkubasi (6 jam) atau  10  jam  lebih  cepat  dengan  kontrol,  sedangkan  untuk  AsA derivat (AsA-Pal dan AsA-Pal-Enz) dapat menghambat oksidasi 10 jam  lebih  lama  daripada  kontrol.  Menurut  Mitsuda et  al .,  (1966), terbentuknya senyawa peroksi selama oksidasi asam linoleat dapat mengakibatkan  perubahan  ion  ferro  menjadi  ion  ferri  dan  ion  ferri yang  terbentuk  akan  berikatan  dengan  ion  tiosianat  membentuk komplek  ferri  tiosianat.  Komplek  ferri  tiosianat  akan  membentuk
warna  merah  dan  dapat  diukur  intensitasnya  pada  panjang gelombang 500nm.
Gambar 3.   Pengukuran  aktifitas  antioksidan  derivat  L-asam  askorbat pada  emulsi  linoleat  menggunakan  metode  thiosianta.  ,
Kontrol;  , AsA;  , AsA-Pal;  , AsA-Pal-Enz.
Dari  hasil  tersebut  (Gambar  3),  menunjukkan  bahwa  AsA memacu  terjadinya  oksidasi  pada  emulsi  linoleat  (pro-oksidan) sedangkan  AsA-Pal  dan  AsA-Pal-Enz  bersifat  menghambat oksidasi  (antioksidan).  Menurut    Frankel  (1995)  derivat  L-asam askorbat mempunyai sifat yang bertentangan (antioksidan dan pro- oksidan)  tergantung  kondisi  reaksi,  bentuk  derivat  dan kosentrasinya.  Selanjutnya  Beddow et  al .,  (2001),  Marinova  dan Yanishliva  (1992)  menjelaskan  bahwa  proses  oksidasi  lipid  pada kondisi normal AsA derivat berfungsi sebagai antioksidan jika dalam reaksinya  berfungsi  sebagai  donor  hidrogen  pada  peroksil  radial, selanjutnya  dapat  diasumsikan  bahwa  AsA  memotong  rantai
Jumlah derivat L-asam askorbat ( g) DP PH (% ) 0 2 4 6 8 10 12 14 AsA-Pal AsA-Pal-Enz EthylMetylketon 0 2 4 6 8 10 12 14 AsA-Pal AsA-Pal-Enz EthylMetylketon Waktu (min) AB S 2 45 nm (A U) B A AsA-Pal-Enz AsA-Pal AsA Ab so rb an si 50 0 n m (AU ) Waktu inkubasi (jam)
oksidasi  dalam  pembentukan  lipid  peroksil  dan  alkosil  radikal. Sedangkan  pada  proses  pro-oksidasi  AsA  tidak  dapat  menjadi donor hidrogen pada peroksi radikal dikarenakan AsA membentuk askobil  radikal  secara  cepat  pada  kondisi  kelarutan  yang  rendah, hal ini berbeda dengan  AsA yang teresterkan (AsA-Pal dan AsA- Pal-Enz) (Cort, 1982; Takahashi et al ., 1986) dan berpengaruh juga penyembaran  secara  isometrik  dalam  pembentukan  formasi hidroperoksi (Porter et al ., 1980; Porte, 1986).

## Stabilitas radical scavenging
Stabilitas  aktifitas  derivat  AsA  (AsA-Pal  dan  AsA-Pal-Enz) dalam emulsi linoleat  (LA) dan virgin coconut oil (VCO) pada suhu yang berbeda dapat dilihat pada Tabel 1. Pada suhu ruang aktifitas radical  scavenging -nya  tidak  menunjukkan  perbedaan  nyata, perbedaan mulai terlihat nyata terjadi pada perlakuan suhu 120 C, dimana  kemampuan  aktifitasnya  mengalami  penurunan  terutama untuk AsA-Pal baik pada media LA atau VCO.
Dari  data  tersebut  juga  menunjukkan  bahwa  kemampuan stabilitas  AsA-Pal-Enz  relatif  lebih  baik  khususnya  pada  suhu 120 C, sedangkan pada suhu 80 C yang baik justru AsA-Pal pada sistem  LA  atau  VCO.  Sedangkan  perbedaan  nilai  stabilitas  L- askorbil palmitat pada sistem emulsi, VCO lebih tinggi daripada LA. Hal  ini    kemungkinan  disebabkan  oleh  adanya  suatu  sinergistik antioksidan  antara  L-askorbil  palmitat  dengan  endogenous antioksidan dari VCO. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Wang et  al., (2002)  dan  Gordon et  al .,  (1991)  pada  coconut  oil diketemukan  beberapa  senyawa  yang  berpotensi  sebagai antioksidan seperti phytosterol, tocopherol dan tocotrienol.

## DAFTAR PUSTAKA
Beddows CG, Jagait C, Kelly MJ. 2001 Effect of ascorbyl palmitate on the preservation of α-tocopherol in sunflower oil, alone and with herbs and spices. Food Chem .73:255-261.
Chen ST, Chen SY, Chen SJ, Wang KT. 1994 Vinyl Carboxylate, an acylating  reagent  for  selective  acylation  of  amines  and  diols. Tetrahedron Lett . 35:3583-3584.
Cort WM. 1982 Antioxidant properties of ascorbic acid in foods. In :Ascorbic acid: Chemistry, Metabolism, and Uses. P.A.Seib and B.M.Tolbert  (eds.),  533-550.American  Chemical  Society, Washington
Effenberger    F,  Graef  BW,  Bwald  S.    1997  Preparation  of  (S)- naproxen  by  enantioselective  hydrolysis  of  racemic  naproxen amide  with  resting  cells  of Rhodococcus  erythropolis MP50  in organic solvents. Tetrahedron: Asymmetry, 16: 2749-2755 Frankel EN. 1995 Natural and biological antioxidants in foods and biological systems. Their mechanism of action, applications and implications. Lipid Tech .7:77-80.
Gadow  A,  Joubert  E,  Hansmann  CF.  1997  Comparison  of  the antioxidant activity of aspalathin with that of other plant phenols of  Rooibos  Tea  ( Aspalathus  linearis ),  α-tocopherol,  BHT,  and BHA. J. Agric.Food Chem. , 45, 632-638.
Gordon  MH,  Rahman  IA.  1991 Effect  of  processing  on  the composition and oxidative stability of coconut oil, JAOC .68:574- 576.
Tabel 1.Stabilitas radical scavenging L-askorbil palmitat (AsA-Pal dan AsA-Pal-Enz) dalam emulsi linoleat (LA) dan virgin coconut oil (VCO) pada suhu yang berbeda selama 3 jam*
RT Sisa DPPH (%) 60 C 80 C 100 C 120 C LA-AsA-Pal 54,3 3,0a** 52,7 3,9a 52,9 3,9a 69,8 2,2b 84,3 2,5c LA-AsA-Pal-Enz 57,5 2,4a 59,8 2,5b 62,4 2,0b 66,8 1,7ab 72,2 0,3a VCO- AsA-Pal 58,2 1,4a 58,0 2,3b 53,2 3,9a 62,9 5,2a 78,2 2,9b VCO-AsA-Pal-Enz 58,0 3,2a 59,2 0,7b 63,5 0,8b 67,5 1,1ab 69,8 1,0a
*Data merupakan hasil dari rata-rata  SD dari tiga kali pengulangan. **Notasi yang berbeda untuk setiap kolom menunjukkan berbeda nyata (p<0,05).

## KESIMPULAN
Dari  hasil  penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  L-askorbil palmitat  hasil  sintesis  secara  enzimatik  mempunyai  kemampuan sebagai  antioksidan.  Pemanasan  berpengaruh  nyata  terhadap penurunan  aktifitas  antioksidan  L-askorbil  palmitat.  L-askorbil palmitat  hasil  sintesis  secara  enzimatik  menunjukkan  kemampuan yang relatif lebih tahan panas baik pada sistem emulsi linoleat atau virgin coconut oil dibandingkan dengan L-askorbil palmitat standard.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  dibiayai  dari  dana  hibah  bersaing  XII (DIKTI/DP2M)  untuk  disampaikan  terima  kasih  kepada  Direktorat Pendidikan  Tinggi  Departemen  Pendidikan  Nasional  Republik Indonesia yang telah mendanai penelitian ini.
Harel  K,  Kanner  J.  1985  Muscle  membranal  lipid  peroxidation initiated by H 2 O 2 -activated metmyoglobin. J. Agric. Food Chem . 33: 1188-1192.
Humeau C, Girardin M, Rovel B, Miclo A. 1998 Enzymatic synthesis of fatty acid ascobyl esters. J. Mol Catal B. B: Enzymatic 5:19- 23.
Ishido  E,  Adachi  A,  Minemoto  Y,  Matsuno,  R.  2002  Kinetic expression  for  the  oxidation  of  linoleic  and  arachidonic  acid esters  in  their  mixed  system. Biosci.  Biotechnol.  Biochem ., 66:73-77.
Kochhar SP, Rossell JB. 1990 Detection, estimation and evaluation of  antioxidant  in  food  system.  In:  Food  Antioxidants.  Hudson, BJF (eds). Elsevier. Applied Science. London and New York.
Labuza  TP.  1971  Kinetics  of  lipid  oxidation  in  foods. Crit.  Rev.  in Food Technol . 2:355-404.
Marinova EM, Yanishlieva NV. 1992 Inhibited oxidation of lipids III: On  the  activity  of  ascorbyl  palmitate  during  the  autoxidation  of two types of lipid systems in the presence of α -tocopherol. Fat Sci.Technol .94:448-452.
Mitsuda  H,  Yasumoto  K,  Iwami  K.  1966  Antioxidative  action  of indole compounds during the autoxidation of linoleic acid. Eiyo to Shokuryo , 19 , 210-214.
Parida  S,  Dordick  JS. 1991  Substrate  structure  and  solvent hydrophobicity  control  lipase  catalysis  and  enantioselectivity  in organic media. J. Am. Chem. Soc. , 113 : 2253–2259
Porter  NA,  Weber  BA,  Weenen  H,  Khan  JA.  1980  Autoxidation  of polyunsaturated lipids. Factors controlling the stereochemistry of product hydroperoxides. J.Am.Chem.Soc .102:5597-5601.
Porter  NA.  1986)  Mechanisms  for  the  autoxidation  of polyunsaturated lipids. Acc.Chem. Res .19: 262-268.
Shui G, Leong LP. 2004 Residue from star fruit as valuable source for  functional  food  ingredients  and  antioxidant  nutraceuticals. Free Radical Biology and Medicine 36: S132-S132 Suppl. 1 Simic  MG,  Jovanovic  SV,  and  Niki,  E.  1992  Mechanismes  of  lipid oxidative process and their inhibition. In “Lipid Oxidation in Food (ACS  Symposium  Series  500),”  ed.  By  St.  Angelo,  A.J., American Chemical Society, Washington D.C., pp. 14-32.
Siswoyo  TA,  Ardyati,  T  Miswar  2006  Optimalisasi  Sintesa  Vitamin C-ester  Secara  Enzimatik  Menggunakan  Immobilisasi  Lipase dari Aspergillus niger . Jurnal Ilmu Dasar , 7 (1) 6-12.
Takahashi  M,  Niki  E,  Kawakami  A,  Kumasaka  A,Yamamoto,  Y, Kamiya Y. and Tanaka K. 1986 Oxidation of lipids.XIV.Inhibition of oxidation of methyl linoleate by fatty acid esters of L-ascorbic acid. Bull.Chem.Soc.Jpn . 59:3179-3183.
Tomaino  A,  Cimino  F,  Zimbalatti    V,  Venuti    V,  Sulfaro  V,  De Pasquale  A,  Saija  A.  2005  Influence  of  heating  on  antioxidant activity  and  the  chemical  composition  of  some  spice  essential oils. Food Chemistry . 89:549-554.
Wang  T,  Hicks  KB,  Moreau  R.  2002.  Antioxidant  activity  of phytosterols, oryzanol, and other phytosterol conjugates, J. Am. Oil Chem. Soc . 79: 1201-1206.
Yamaguchi  T,  Takamura  H,  Matoba    T,  Terao  J.  1998  HPLC method for  evaluation of the free radical-scavenging activity of foods by using 1,1,-diphenyl-2-picrylhydrazyl. Biosci. Biotechnol. Biochem . 62: 1201-1204
Yin  M  C,  Faustman  C,  Rıesen  JW,  Wıllıams  SN.  1993 -
Tocopherol and ascorbate delay oxymyoglobin and phospholipid oxidation in vitro. J. Food Sci. 58:1273-1276, 1281.