Analisis Metabolit Sekunder Kultur Pucuk, Kalus, dan Tanaman Lapang Chrysanthemum morifolium Ramat
Analysis of Secondary Metabolites of Shoot, Callus Culture and Field Plant of

## Chrysanthemum morifolium Ramat
Tia Setiawati 1*) , Alma Ayalla 1 , Mohamad Nurzaman 1 , Valentina A.Kusumaningtyas 2 , Ichsan Bari 3
1 Departemen Biologi Fakultas MIPA Universitas Padjadjaran
2 Departemen Kimia Fakultas MIPA Universitas Jenderal Ahmad Yani
3 Departemen Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Padjadjaran
* E-mail: tia@unpad.ac.id

## ABSTRACT
The  chrysanthemum  plant  (Chrysanthemum  morifolium Ramat)  contains  many  secondary metabolites  such  as  flavonoids  and  various  volatile  compounds  that  can  be  utilized  as  drugs. Tissue culture can be an alternative to enhance the production of certain secondary metabolite. The study aimed to determine the types of secondary metabolites that contained in shoot culture, callus and  field  plants  of C.  morifolium.  The  research  method  was  exploration  in  the  laboratory  to analyze  and  compare  the  content  of  secondary  metabolite  from  shoot  culture,  callus  and  field plants of C. morifolium. Callus was induced by explants of C. morifolium plantlet stems and leaves respectively on MS medium with an addition of 3 ppm 2,4-D + 2 ppm kinetin and 4 ppm 2,4-D. For  shoot  culture,  single  nodule  explants  with  one  leaf  were  planted on  MS  media  with  the addition of 1 ppm BAP. The secondary metabolite compouds were analized and identified by GC- MS  (Gas Chromatography-Mass  Spectrometry).  The  results  showed  that  various  types  of secondary metabolites contained in shoot culture, callus and field plants of C. morifolium. In callus culture from leaf explants, four compounds from groups of alcohol, acetic acid and organosilicon were  identified,  whereas  in  callus  culture  from  stem  explants  were  identified  eight  compounds from aldehydes, esters, alkanes, and carboxylic acids group. In the shoot culture, nine compounds of  alcohol,  ketone,  aldehyde,  cycloalkane  and  organosilicon  group  were  identified,  while  in  the field  plants  five  compounds  were  identified  from  the  cycloalkanes,  ketones,  organoborones  and organosilicon  group.  Some  detected  compounds  have  a  potential  as  precursors  of  alkaloid, phenolic, and flavonoid.
Keywords: chrysanthemum, culture, shoots, callus, secondary metabolites.

## PENDAHULUAN
Krisan  (Chrysanthemum  morifolium Ramat.) merupakan  bunga  potong  yang  termasuk  ke dalam komoditas penting dalam bisnis tanaman hias. Krisan dapat  juga dimanfaatkan  sebagai bahan  baku  obat.  Pada  pengobatan  tradisional China, krisan sering digunakan sebagai teh dan anti-inflamasi  (Yang et  al. 2017).  Senyawa- senyawa seperti flavonoid, alkaloid, sekuiterpen  lakton  yang  terkandung  dalam C. morifolium memiliki aktivitas  farmakologis diantaranya sebagai antibakteri, antifungal, dan antioksidan    (Kim  &  Lee 2005).  Xie et  al. (2009)  melaporkan  pula  bahwa  bunga  krisan dapat  digunakan  untuk  pengobatan  tradisional berbagai penyakit seperti demam, sakit kepala, batuk  dan  gangguan  penglihatan. Beberapa kandungan senyawa alami dalam krisan seperti flavonoid, triterpenoid dan derivat caffeoylquinic  acid telah  diisolasi  pada beberapa  penelitian  sebelumnya. Senyawa-
senyawa tersebut menunjukkan efek farmakologi  yang  sangat  luas,  diantaranya sebagai  penghambat  aktivitas  enzim  HIV-1 integrase  dan  aldose  reduktase,  serta  sebagai antioksidan,  antiradang,  anti-mutagenik  dan anti-aktivitas alergi. Selain itu, Chrysanthemum juga  berpotensi  sebagai  kosmetik  herbal, karena  dapat  menghambat  aktivitas  tyrosinase yang sering dikaitkan dengan aktivasi antioksidan, efek memutihkan
dan
melembabkan kulit (Yang et al. 2017).
Dilihat dari banyaknya manfaat krisan untuk kesehatan, maka dibutuhkan teknik perbanyakan  yang  cepat  dan  efektif  untuk menghasilkan  metabolit  sekunder.  Secara konvensional,  metabolit  sekunder  sebagai bahan  bioaktif  dapat  diperoleh  dengan  cara mengekstraksi  langsung  dari  organ  tanaman. Namun  Fejér et  al. (2018)  menyatakan  bahwa penggunaan  tanaman  secara  intensif  dapat mengurangi  keragaman genetik. Selain  itu,
dibutuhkan  budidaya  tanaman  dalam  skala besar,  disamping  proses  ekstraksi,  isolasi,  dan pemurnian  yang  memerlukan  biaya  cukup besar  (Ningsih 2014).  Teknik  kultur in  vitro sering  digunakan  sebagai  alternatif  untuk memproduksi  metabolit  sekunder.  Menurut Marchev et  al. (2014)  kultur in  vitro dapat mengubah  jalur  sintesis  metabolit  sekunder dengan  cara  memperluas  produksi  fitokimia pada tanaman.
Beberapa  penelitian  menunjukkan  bahwa kultur  pucuk  terbukti  mampu  menghasilkan metabolit  sekunder  seperti  menthofuran  pada Mentha piperita L. (Fejér et al. 2018) dan asam rosmarinik  pada Salvia  virgata (Dowom et  al. 2017).  Demikian    juga  kultur  kalus Naringi crenulata mampu menghasilkan 1,3,4,5- tetrahydroxy cyclohexane carboxylic  acid (Singh et al. 2013).
Produksi  metabolit  sekunder  dari  kultur  sel tanaman  juga  memiliki  bermacam-macam keuntungan,  termasuk  manipulasi  biosintesis senyawa bioaktif dalam kuantitas  yang banyak dari  kultur  yang  steril  dan  terkontrol  (Docimo et  al. 2015;  Dias et  al. 2016).  Selain  itu tingginya  produktivitas  metabolit  sekunder secara in  vitro tidak  dipengaruhi  musim  panen dan potensi kontaminasi silang bila dibandingkan  dengan  tanaman  yang  tumbuh secara in vivo (Murch & Saxena 2006).
Beberapa  penelitian  membuktikan  bahwa kandungan  metabolit  sekunder  pada  kultur in vitro mendekati atau lebih banyak dari tanaman yang  ditumbuhkan  secara in  vivo. Nugroho et al. (2009)  melaporkan  bahwa hasil  analisis profil kromatogram metabolit sekunder temulawak  ditemukan  83%  senyawa  yang terkandung pada kalus temulawak sama dengan yang  ditemukan  pada  tanaman  induknya.
Demikian  pula  pada  penelitian  Kristina et al. (2007),  pegagan  (Centella  asiatica) yang ditanam secara in vitro menghasilkan metabolit sekunder  yang  lebih  bervariasi  dibandingkan dengan pegagan lapang atau in vivo.
Penelitian  ini  bertujuan  menganalisis  jenis metabolit  sekunder  yang  terkandung  dalam kultur  pucuk  dan  kalus  krisan  dan tanaman lapangnya  (in  vivo)  sebagai  pembanding dengan
menggunakan GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry).

## METODE

## Bahan Penelitian
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  agar  pemadat,  alkohol  70%  dan  95%, aquades,  Na 2 SO 4 ,  medium  Murashige  & Skoog
(Phyto Technology Laboratories),  spirtus,  sukrosa dan  Zat  Pengatur  Tumbuh  (3  ppm  NAA,  1  ppm BAP, 4 ppm 2,4-D, 2 ppm kinetin). Bahan tanaman yang  digunakan  adalah  planlet  dan  tanaman  lapang krisan  (C.morifolium)  kultivar  Yulimar  dari  Balai Pengembangan  Benih  Hortikultura  dan  Aneka Tanaman Pasir Banteng.

## Metode Penelitian
Penelitian dilakukan menggunakan metode eksplorasi  di  laboratorium  untuk  menganalisis  jenis metabolit  sekunder  yang  terkandung  dalam  kultur kalus,  kultur  pucuk  dan  sebagai  pembanding digunakan  tanaman  lapang  krisan.  Kalus  diinduksi menggunakan  eksplan  batang  dan  daun  planlet krisan  pada  media  MS  berturut-turut  dengan penambahan  3  ppm  2,4-D  +  2  ppm  kinetin  (Lestari 2018) dan 4 ppm 2,4-D (Purwaningsih et al. 2016). Kultur  pucuk menggunakan  eksplan  nodus  tunggal dengan  satu  daun  yang  ditanam  pada  media  MS dengan  penambahan  BAP  1  ppm  (Waseem et  al. 2011). Pengamatan  dilakukan  pada  60  hari  setelah tanam  (HST)  terhadap  parameter  tinggi  planlet, jumlah  daun,  tekstur  dan  warna  kalus  dan  ukuran kalus. Analisis  metabolit  sekunder  dilakukan menggunakan  GC-MS  sedangkan  analisis  data dilakukan  secara  deskriptif. Bagian  tanaman  lapang yang  digunakan  untuk  analisis  metabolit  sekunder adalah  daun  yang  diperoleh  dari  tanaman  krisan berusia 60 hari.

## Prosedur penelitian Sterilisasi alat
Semua  alat  yang  akan  digunakan  disterilisasi terlebih dahulu dalam autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan 15 psi lb/inc 2 selama 15 menit. Laminar air flow sebelum digunakan untuk penanaman dibersihkan  dahulu  dengan  kapas  yang  telah dibasahi  alkohol  70%  kemudian  disinari  dengan sinar UV selama 2 jam.

## Pembuatan medium
Untuk  membuat  1  L  medium  dilakukan  dengan menimbang  serbuk  MS  siap  pakai  sebanyak  4,43  g, lalu dimasukkan dalam beaker glass dan ditambahkan gula sebanyak 30 g dan agar (pemadat) sebanyak  8g.  Selanjutnya  ditambahkan  aquades hingga  mencapai    1  L.  Penambahan  ZPT  dilakukan sesuai  dengan  konsentrasi  yang  telah  ditentukan untuk  menginduksi  kultur  pucuk  dan  kalus  krisan. Pengaturan  pH  media  menggunakan  pH  meter dengan menambahkan  NaCl 0,1 N atau NaOH 1 N hingga  pH  mencapai  5,8.  Larutan  media  dimasak sampai  mendidih  lalu  dimasukkan  ke  dalam  botol kultur  sekitar  15  mL/botol  kemudian  disterilkan dalam  autoklaf  pada  suhu  121°C  dengan  tekanan 17,5 psi selama 15 menit.

## Penanaman eksplan
Penanaman  eksplan  dilakukan  secara  aseptik  di dalam laminar  air  flow  cabinet.  Kultur  pucuk diinduksi  menggunakan  eksplan  nodus  tunggal dengan  1  helai  daun  (tinggi  ±1,5  cm)  yang  ditanam pada  media  MS  +  1  ppm  BAP.  Kultur  kalus
diinduksi  dari  eksplan  batang  dan  eksplan  daun. Batang  planlet    dipotong  sepanjang  1  cm  dan ditanam  pada  media  MS  +  3  ppm  2,4-D  +  2  ppm kinetin,  sedangkan  eksplan  daun  dipotong  dengan ukuran  ±  0,5  cm 2 dan  ditanam  pada  media  MS  +  4 ppm  2,4-D.  Masing-masing  eksplan  ditanam sebanyak  4  potong  untuk  setiap  botolnya. Kultur diinkubasi  pada  temperatur  18-21°C  dengan pencahayaan ± 2000 lux selama 60 hari.

## Analisis metabolit sekunder
Preparasi ekstrak dilakukan dengan metode maserasi. Bahan kering tanaman dihaluskan kemudian    ditimbang  sebanyak  2  gram  dan direndam  dalam  metanol  selama  12  jam  dengan sesekali  diaduk.  Ekstrak  yang  telah  direndam kemudian  disaring  menggunakan  kertas  saring Whatmann  No.41.  Sebelum  disaring,  kertas  saring dibasahi  dengan  metanol  dan  ditambahkan  Na 2 SO 4 sebanyak  0,2  gram  pada  kertas  saring  untuk menghilangkan  endapan  dan  mengikat  air  pada filtrat.
Sistem  GC-MS  dioperasikan  menggunakan kolom kapiler silika (30 x 0,25 mm ID  x 1 μ Mdf). Gas  Helium  digunakan  sebagai  gas  pembawa dengan  laju    1  mL/menit,  volume  injeksi  0,5  μl, temperatur  injektor  250ºC  dan  temperatur  sumber ion 280ºC. Temperatur oven diprogram pada 110ºC, dengan laju kenaikan temperatur 10ºC/menit sampai 200ºC,  kemudian  5ºC/menit  sampai  280ºC,  diakhiri dengan  isotermal  selama  9  menit  pada temperatur 280ºC (Sun et al. 2010).
Hasil  analisis  GC-MS  berupa  kromatogram dengan  sejumlah  puncak yang  menunjukkan  jenis metabolit yang terkandung dalam sampel. dan kultur kalus  krisan  (C.  morifolium).    Interpretasi  senyawa dilakukan  berdasarkan  waktu  retensi  setiap  puncak yang  muncul  dalam  kromatogram  menggunakan pustaka standar Willey.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pertumbuhan  Kultur  Kalus  dan  Kultur Pucuk C. morifolium Ramat Kultur Kalus Eksplan  daun C.  morifolium diinduksi  pada medium MS dengan penambahan 4 ppm 2,4-D (Purwianingsih et al. 2014). Pada 1 hari setelah tanam (HST),  eksplan  mulai  mengalami elongasi  dan  pembengkakan.  Pembengkakan pada eksplan dapat disebabkan adanya pengaruh  auksin  2,4-D  yang  ditambahkan dalam media. Wahyuni et al. (2014) melaporkan  bahwa  eksplan  daun Aglaonema sp.  melengkung  dan  tulang  daun  membengkak disebabkan  adanya  pengaruh  auksin  dan tekanan  turgor.  Eksplan  daun C.  morifolium mulai  membentuk  kalus  pada  11  HST  yang ditandai  adanya  butir-butir  kecil  berwarna putih  pada  bagian  perlukaan.  Perlukaan  pada eksplan  memberikan  beberapa  sinyal  termasuk sinyal short-term dan long-term luka dan sinyal
dari lingkungannya. Sinyal awal akan memengaruhi  kemampuan  eksplan  untuk beregenerasi.  Sinyal  awal  ini  dikirim  ke berbagai  sel,  seperti  mesofil  dan  sistem vaskular  untuk  mengkonversi  sel-sel  yang rusak  (Xu  2018)  dengan  bantuan  zat  pengatur tumbuh  yang  berfungsi  dalam    menutup  luka (Utami et al. 2007).
Gambar  1. Morfologi  kalus  eksplan  daun C. Morifolium (Ket:  garis  hitam menunjukkan ukuran skala 1 cm)
Kalus asal  eksplan daun  pada  hari  ke-60 memiliki rata-rata ukuran 13 berdasarkan skala clay  models dengan  warna  kuning  kecoklatan, bertekstur remah, dan sedikit  berakar (Gambar 1).  Penelitian Purwaningsih et  al. (2016), melaporkan bahwa kalus krisan yang bertekstur remah  dan  kecoklatan  mampu  menghasilkan prekursor flavonoid quersetin, asam asetat, dan tetrahidroksikalkon.  Hasil  serupa  ditemukan pada Ricinus  communis (Abd  Elaleem et  al. 2015),  citrus  (Ramdan et  al. 2014)  yang menunjukkan  bahwa  kalus  yang  diinduksi menggunakan 2,4-D memiliki warna kecoklatan.  Dalam  induksi  kalus,  2,4-D  dalam media  diperlukan  untuk  proliferasi  sel  sebagai auksin yang penting untuk callogenesis. Dalam hal  ini  2,4-D  bertindak  sebagai  sinyal  auksin induktif  untuk  memicu  aktivitas  proliferasi eksplan (Ramdan et al. 2014).
Selain  kalus,  pada  eksplan  tumbuh  juga akar,  hal  ini  dapat  disebabkan  adanya  peran auksin  2,4-D.Auksin  berpengaruh  terhadap pembentukan  akar  sebagai  hasil  interaksi dengan  fitohormon  lain  yang  mengendalikan perkembangan  akar  (Bellini et  al. 2014; Pacurar et al. 2014). Selain auksin, Park et al. (2017)  menyatakan  bahwa  sumber  gula  pada media juga  merupakan  faktor penting terhadap induksi akar. Sukrosa sering digunakan sebagai sumber  karbon  pada  kultur  jaringan  sebagai penyedia  energi  untuk  morfogenesis,  termasuk akar  (Yaseen et  al. 2013).  Sukrosa  diketahui sebagai  penginduksi  stress  osmotik  untuk regulasi  proses  metabolik  seperti  sintesis  asam
absisat,  transportasi  auksin, dan  akumulasi karbohidrat  pada  sel  dan  jaringan  tumbuhan yang  akan  meningkatkan  atau  menurunkan pertumbuhan dan perkembangan eksplan (Huang et al. 2012, Yaseen et al. 2013). Kalus  asal  eksplan  daun  yang  terbentuk pada penelitian ini berwarna kuning kecoklatan (Gambar  1).  Serupa  dengan  hasil  penelitian
Anjusha&
Gangaprasad (2017) yang menunjukkan  bahwa Gynochthodes  umbellata yang ditanam pada medium dengan penambahan 2,4-D menghasilkan kalus berwarna  kekuningan  dan  bertekstur  remah sebagai  akibat  adanya  aktivitas  2,4-D  yang menghambat  pembentukan  klorofil.  Warna kecoklatan  pada  kalus  dapat  juga  disebabkan adanya  respon  kalus  terhadap  lingkungannya atau  kalus  telah  masuk  pada  fase  stasioner. Perubahan  kalus  menjadi  coklat  menunjukkan pertumbuhan dan perkembangan kalus memasuki  fase  stasioner  (penuaan)  yang selanjutnya  dapat  menyebabkan  kalus  menjadi mati (Purnamaningsih & Ashrina, 2011).
Kalus  asal  eksplan  batang C. Morifolium yang diinduksi pada MS dengan penambahan 3 ppm  2,4-D  +  2  ppm  kinetin  menunjukkan elongasi  dan  pembengkakan  eksplan  pada pertama  setelah  penanaman.  Eksplan  batang mulai  menghasilkan  kalus  pada  11  HST  yang dimulai  pada  kedua  ujung  batang  yang merupakan  bagian  perlukaan.  Pembentukan kalus  pada  kombinasi  ini  menunjukkan  efek sinergis  dan/atau  komplementer    auksin  dan sitokinin,  yang  lebih  lanjut  merangsang sensitivitas  jaringan,  khususnya  sel-sel  yang kompeten  selama  fase  kalus  (Ramdan et  al. 2014).
Pada  hari  ke-60    kalus  asal  eksplan  batang yang  dihasilkan  memiliki  ukuran  8  skala clay models, berwarna  hijau  muda,  bertekstur kompak,  dan  berakar.  Tekstur  kompak  pada kalus dapat terjadi disebabkan adanya pengaruh  pemberian  hormon  sitokinin  kinetin ke  dalam  media. Hasil  yang  sama  dilaporkan Castro et al. (2016) bahwa konsistensi kompak pada  kalus Byrsonima  verbascifolia dapat disebabkan  terutama  oleh  sitokinin  BAP  dan kombinasi 2,4-D dengan BAP pada konsentrasi yang tinggi.
Penelitian Dwi (2012) menunjukkan bahwa kalus  yang  diinduksi  dengan  penambahan sitokinin memiliki tekstur kompak sebagai efek dari  sitokinin  dan  auksin  yang  mempengaruhi potensial  air  dalam  sel.  Hal  ini  menyebabkan penyerapan  air  dari  medium  ke  dalam  sel
meningkat, sehingga sel menjadi lebih kaku.
Gambar  2. Morfologi  kalus  eksplan  batang C. morifolium (Ket: garis hitam menunjukkan ukuran skala 1 cm)
Warna  hijau  pada  kalus  diduga  karena adanya  akumulasi  klorofil  pada  kalus  yang terbentuk.  Klorofil  disintesis  dari  asam glutamat  melalui  reaksi enzimatik  yang kompleks  dan  beberapa  tahap  sintesisnya dipengaruh  cahaya  (Ilag et  al. 1994, Taiz & Zeiger, 2010).  Selain  cahaya,  sitokinin  dalam media juga sangat berpengaruh dalam perkembangan  dan  diferensiasi  kloroplas. Sitokinin  menstimulasi perubahan  ultrastruktur yang  khas  untuk  transisi  etioplast  ke  kloroplas (Cortleven et  al.  2016). Selain  itu  menurut Siddique  & Islam  (2015)  di  bawah  cahaya putih,  sel-sel  kalus  akan  membentuk  pigmen fotosintetik sehingga kalus dapat menghasilkan karbohidrat dan metabolit lain yang diperlukan sel untuk pertumbuhannya.

## Kultur Pucuk
Kultur  pucuk  diinduksi  pada  medium  MS dengan  penambahan  1  ppm  BAP.  Eksplan mulai  tumbuh  pada  hari  ke-6  setelah  tanam dengan  munculnya  tunas  baru  dari  nodus. Penambahan sitokinin dalam hal ini BAP dapat berperan  dalam  menginduksi  pertumbuhan tunas.
Gambar  3.  Morfologi  kultur  pucuk C. morifolium (Ket  :  garis  hitam menunjukkan  ukuran  skala  1
cm) Rata-rata tinggi planlet pada akhir pengamatan ±5  cm.    Ghanti et al. (2004) menunjukkan bahwa sitokinin, khususnya BAP dapat  menangani  dominansi  apikal  dengan
menumbuhkan  tunas  lateral  dari  dormansinya dan  mendukung  pembentukan  pucuk  dan elongasi.  Kultur  pucuk  berwarna  hijau  dan beberapa daun mulai layu saat dipanen pada 60 HST. Hal ini dapat disebabkan  kultur  tumbuh pada  media  dengan  waktu  yang  cukup  lama, sehingga  berkurangnya  suplai  nutrisi  dari media  ke  dalam  eksplan  mengakibatkan eksplan    mengalami  kekeringan  dan  kelayuan. Minarsih et  al. (2016)  mengungkapkan  bahwa kalus  tebu  yang  disubkultur  sampai  subkultur ketiga,  menunjukkan  pertumbuhan  kalus  yang masih baik. Subkultur dilakukan untuk mempertahankan stok bahan tanaman (eksplan)
agar planlet tetap tumbuh.
Selain BAP yang digunakan dalam penelitian  ini  untuk  mendukung  pertumbuhan kultur  pucuk  krisan,  penambahan  gula  sebagai sumber karbon pada  medium  juga secara tidak langsung  memengaruhi  regenerasi  tunas.  Gula merupakan  faktor  utama  dalam  metabolisme yang  diproduksi  selama  fotosintesis  dan  akan dimanfaatkan untuk pertumbuhan secara keseluruhan  termasuk  pertumbuhan  tunas.
Konsentrasi sukrosa
pada medium mempengaruhi  kemampuan  fotosintesis  dan perkembangan  tunas  pada  konsentrasi  tertentu, sukrosa  juga  dapat  menjaga  potensial  osmotik pada dinding sel tunas, namun pada konsentrasi yang  tinggi  akan  menghambat  efisiensi fotosintesis  dengan  menurunkan  kadar  klorofil dan  enzim  untuk  fotosintesis  (Gago et  al. 2014).
Kultur  tunas  pada  penelitian  ini  diinkubasi dalam  kondisi  terang  dengan  pencahayaan  ± 3500    lux.  Intensitas  cahaya, fotoperiod,  dan kualitas spektral dapat mempengaruhi pertumbuhan,  morfogenesis,  dan  produksi senyawa bioaktif pada kultur in vitro. Menurut Chung et  al. (2010),  cahaya  menginduksi morfogenesis  tumbuhan.  Cahaya  merupakan sinyal  yang  diterima  oleh foto reseptor  yang kemudian  akan  mengatur  diferensiasi  dan pertumbuhan tanaman (Muleo & Morini 2006).
Penelitian Bello-Bello et al. (2016) menunjukkan  bahwa  vanila  yang  ditanam secara in  vitro dengan  penyinaran  lampu  LED menghasilkan  pertumbuhan  yang  baik  karena meningkatkan  proliferasi  tunas  vanila.  Lampu flourescent dapat
meningkatkan
photosynsthetic photon  flux (PPF)  pada  kultur in vitro. Semakin tinggi photosynsthetic photon flux (PPF)    yang  dihasilkan,  maka  proses fotosintesis akan semakin tinggi dan mempengaruhi  metabolisme  dan  pertumbuhan tanaman.

## Perbandingan  Jenis  Metabolit  Sekunder
Kultur  Kalus,  Tunas  dan  Tanaman  Lapang

## C. morifolium
Metabolit  sekunder  yang  terkandung  pada kultur kalus,  tunas  dan  tanaman  lapang diidentifikasi menggunakan GC-MS (Tabel 1).
Tabel  1  menunjukkan  senyawa-senyawa volatil  yang  teridentifikasi  pada  kalus  daun, kalus  batang,  kultur  pucuk,  dan  daun  tanaman lapang. Jumlah senyawa volatil yang terdeteksi pada  kultur  kalus  eksplan  daun,  kalus  eksplan batang dan kultur pucuk berbeda berturut-turut sebanyak  lima,  delapan  dan  10  senyawa, sedangkan  pada  tanaman  lapangnya  terdeteksi sebanyak 5 senyawa dari berbagai golongan.
Tabel  1  juga  menunjukkan  bahwa  terdapat tiga senyawa yang sama ditemukan pada kultur yang berbeda, seperti
dodekametilsikloheksasiloksan pada kultur pucuk, kultur kalus daun, dan tanaman lapang, 3-metoksi-1,2-propanadiol  pada  kultur  pucuk dan  kultur  kalus  daun,  dan  2-propanon  pada kultur  pucuk  dan  tanaman  lapang.  Hasil  ini menunjukkan  bahwa  kultur in  vitro dapat menghasilkan  senyawa  yang  sama  atau  lebih bervariasi dibandingkan dengan tanaman lapangnya.  Penelitian  Velayutham & Karthi (2015) menunjukkan bahwa tumbuhan Hybanthus enneaspermus in vivo menghasilkan jenis  metabolit  sekunder  lebih  sedikit  dari kultur in  vitro berdasarkan hasil  analisis  profil kromatogram menggunakan GC-MS.
Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  kultur in vitro dapat  dijadikan  alternatif  menggantikan penanaman  tanaman  secara  tradisional,  karena kultur in  vitro produksi  metabolit  sekundernya terkontrol, dan ketersediaan tanaman pun akan terjaga (Rout, 2006). Kultur in vitro juga dapat menghasilkan  fitokimia  yang  beragam  dan dapat  dikontrol,  serta  bebas  akan  gangguan perubahan  iklim,  kondisi  tanah,  dan  bebas mikroorganisme  dan  serangga  (Siahsar et  al. 2011).
Tabel  1. Perbandingan jenis  metabolit  sekunder  dalam  kultur  kalus  daun,  kalus  batang, kultur pucuk dan tanaman lapang C. morifolium
No. Nama Senyawa DTL KD KB KP Golongan 1. Siklobutana,1,2,2,3,3,4- heksadetero-1,4-bis (1,2,2-trideteroetil) √ Sikloalkana 2. 2-Propanon √ √ Keton (prekursor senyawa fenolik) 3. Trimetil borat √ Organoboron (prekursor alkaloid) 4. Dimetilsiloksan pentamer √ Organosilikon (prekursor alkaloid) 5. Dodekametilsikloheksas il-oksan √ √ √ Organosilikon (prekursor alkaloid) 6. 3-Metoksi-1,2- propanadiol √ √ Alkohol (prekursor senyawa fenolik) 7. 1-Metoksi-2-propil ester asetat √ Ester (prekursor senyawa fenolik) 8. Tetradekametilsiklohept asil-oksan √ Organosilikon (prekursor alkaloid) 9. 3-Metilbutanal √ Aldehid (prekursor senyawa fenolik) 10. Trans-2-Heptenal √ Aldehid (prekursor senyawa fenolik) 11. 2,3-Dimetil-2-pentanol √ Alkohol (prekursor senyawa fenolik) 12. Iso amil salisilat √ Ester (prekursor senyawa fenolik) 13. Metil palmitat √ Ester (prekursor senyawa fenolik) 14. n-Dotriakontan √ Alkana 15. n-Dotriakontan √ Alkana 16. Asam pentadesilat √ Asam karboksilat (prekursor senyawa glikosidik) 17. 2-Metilpentana √ Alkana 18. 3-Metil-1-butanol √ Alkohol (prekursor senyawa fenolik) 19. 2-Metilbutanal √ Aldehid (prekursor senyawa fenolik) 20. Metilsiklopentana √ Sikloalkana 21. Heksanaften √ Sikloalkana 22. Metilsikloheksana √ Sikloalkana
Ket : DTL : daun tanaman lapang; KD : kalus eksplan daun; KB : kalus eksplan batang; KP: kultur pucuk
Pada  Tabel  1  tampak  bahwa  terdapat perbedaan senyawa yang terdeteksi pada ketiga jenis  kultur  yang  diuji. Ali  & Tariq (2013) menunjukkan hasil penelitiannya bahwa sebagian besar metabolit sekunder dari jaringan bibit  yang  tumbuh  di  lapangan  ditemukan  di kultur  kalusnya  namun  tidak  ada  kaitan  dalam jumlah  senyawa  dan  persentasenya.  Selain  itu terdapat  perbedaan  beberapa  metabolit  yang terkandung  dalam  eksplan  dengan  yang ditemukan pada kultur kalusnya.
Hasil  analisis  pada  Tabel  1  menunjukkan bahwa sebagian besar senyawa yang terdeteksi adalah  senyawa  alkana.  Alkana  merupakan
senyawa  organik  hidrokarbon  alifatik  yang tidak memiliki  gugus  benzena  (Chang, 2004). Pada  kalus  asal  eksplan  daun dan  batang ditemukan  senyawa  golongan  ester,  aldehid, dan  organisilikon.  Senyawa-senyawa  golongan ester  dan  aldehid  ini  berpotensi  menjadi prekursor senyawa fenolik, sedangkan senyawa golongan  organisilikon  berpotensi  menjadi prekursor  senyawa  golongan  alkaloid  jika bereaksi  dan  berikatan  dengan  senyawa  yang mengandung  unsur  N  atau  senyawa-senyawa turunan asam amino. Saifudin (2014)
menyatakan bahwa alkaloid mengandung unsur nitrogen pada
kerangkanya. Alkaloid
diklasifikasikan  berdasarkan  asam  amino prekursornya  dan  di dalamnya  masih  memiliki atom  nitrogen.    Unsur-unsur  pembentuk alkaloid  adalah,  karbon, nitrogen,  dan  oksigen (Sumardjo, 2009). Terdapat satu senyawa yang sama  terdeteksi  pada  kalus  daun,  kultur  pucuk dan tanaman lapang, yaitu dodekametilsikloheksasiloksan.  Senyawa  ini merupakan  senyawa  kompleks  organosilikon yang diduga dapat menjadi prekursor pembentuk senyawa-senyawa turunan alkaloid.
Hasil  pengukuran  GC-MS  pada  penelitian ini  mendeteksi  adanya  senyawa  iso  amil salisilat, senyawa  keton, asam  karboksilat, dan alkohol  yang  berpotensi  membentuk  senyawa flavonoid. Hasil GC-MS kalus batang terdeteksi  adanya  senyawa  volatil  iso  amil salisilat,  yang  diduga  merupakan  prekursor senyawa  flavonoid  atau  senyawa  fenolik  lain, karena  memiliki  struktur  cincin  benzena  atau cincin  aromatik  (Pubchem 2018a).  Flavonoid termasuk  dalam  golongan  senyawa  fenolik dengan  struktur  kimia  C6-C3-C6.  Kerangka flavonoid  terdiri  atas  satu  cincin  aromatik  A, satu  cincin  aromatik  B,  dan  cincin  tengah berupa  heterosiklik  yang  mengandung  oksigen dan  bentuk  teroksidasi  cincin  ini  dijadikan dasar  pembagian  flavonoid  ke  dalam  sub-sub kelompoknya.  Sistem  penomoran  digunakan untuk  membedakan  posisi  karbon di  sekitar molekulnya (Cook & Samman 1996).
Prekursor-prekursor ini pada tanaman akan mengalami  reaksi  kimia  dengan  bantuan berbagai  enzim  sehingga  dapat  membentuk senyawa  metabolit  sekunder  yang  dibutuhkan oleh tanaman tersebut untuk dapat melangsungkan kehidupan dan sebagai pertahanan  diri  terhadap  berbagai  tantangan dari  lingkungan  sekitarnya.  Pembentukan metabolit  sekunder  secara  biosintesis terjadi melalui  jalur  asam  sikimat  untuk  golongan alkaloid  dan  fenolik,  sedangkan  golongan terpen melalui jalur asam mevalonat (Sumardjo 2009).
Senyawa  yang  ditemukan  pada  penelitian masih  dalam  bentuk  senyawa  dasar  ataupun prekursor.  Hal  ini  disebabkan  senyawa- senyawa  yang  terdeteksi  hanyalah  senyawa volatil.  Menurut  Drozd  (1985)  untuk  dapat mengetahui  struktur  metabolit  sekunder  lain perlu  dilakukan  derivatisasi  terlebih  dahulu untuk memisahkan molekul. Derivatisasi merupakan  proses  kimiawi  untuk  mengubah suatu  senyawa  menjadi  senyawa  lain  yang mempunyai  sifat-sifat  yang  sesuai  untuk
dilakukan  analisis  menggunakan  kromatografi gas  yang  dapat  membantu  zat-zat  yang  sulit menguap  sehingga  menjadi  lebih  mudah menguap.
Instrumen  GC-MS  dipasang  parameter spektrofotometer  massa  termasuk  ukuran massa  sampai  500  m/z.  Quersetin  dan quersitrin  yang  sering  ditemukan pada  Krisan memiliki  berat  molekul  secara  berturut-turut 302.238 g/mol  dan  448.38  g/mol  (Pubchem 2018b;  Pubchem 2018c),  tidak  terukur  dengan GC-MS ini sehingga dapat diperkirakan bahwa kedua  senyawa  tersebut  memiliki  berat molekul  yang  lebih  besar  dari 500  m/z, sehingga  kemungkinan  senyawanya  dalam bentuk  quersetin  dan  kuersitrin  terglikosilasi atau dalam bentuk dimer atau polimernya.

## KESIMPULAN
Pada kultur pucuk
C. morifolium. teridentifikasi sembilan senyawa dari golongan alkohol,  keton,  aldehid,  sikloalkana,  dan organosilikon. Organosilikon berpotensi menjadi  prekursor  alkaloid. Pada  kultur  kalus asal eksplan daun C. morifolium. teridentifikasi empat  dari  golongan  alkohol,  asam  asetat,  dan organosilikon. Organosilikon berpotensi menjadi  prekursor  alkaloid  sedangkan  pada kalus  asal  eksplan  batang  terdeteksi delapan senyawa  dari  golongan  aldehid,  ester,  alkana, dan asam karboksilat. Ester berpotensi menjadi prekursor senyawa fenolik dan asam karboksilat berpotensi menjadi prekursor flavonoid. Pada tanaman lapang C. morifolium terdeteksi lima senyawa dari golongan sikloalkana, keton, organoboron, dan organosilikon. Keton berpotensi menjadi prekursor  flavonoid,  sedangkan  organosilikon dan organoboron berpotensi menjadi prekursor alkaloid.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  terselenggara  atas  dana Hibah Internal  Universitas  Padjadjaran Skema  Riset Fundamental  Unpad dengan  kontrak  No. 2403/UN6.D/KS/2018. Ucapan terima kasih yang  sebesar-besarnya disampaikan  kepada Rektor Universitas Padjadjaran.

## DAFTAR PUSTAKA
Abd Elaleem KG, Ahmed MM & Noor MKM. 2015. Effect  of Explants  and Plant Growth Regulators  on Callus Induction  in Ricinus communis L. Res.  J.  Pharmaceutical  Sci. 4(1): 1-6.
Ali S & Tariq A. 2013. Analysis of Secondary Metabolites in Callus Cultures of Momordica  charantia cv.  Jaunpuri.  59  (1):
23-32 .
Anjusha  S&  Gangaprasad  A.  2017.  Callus
Culture And In Vitro Production  of Anthraquinone  in Gynochthodes  umbellata (L.)  Razafim.  &  B.  Bremer  (Rubiaceae).
Industrial Crops and Products. 95:608-614 Bellini  C,  Pacurar  DI  &  Perrone  I. 2014. Adventitious Roots And Lateral Roots: Similarities And Differences. Annu.  Rev. Plant Biol. 65: 639 – 666.
Bello-Bello  JJ, Martínez-Estrada E, Caamal- Velázquez JH  & Morales-Ramos V.  2016. Effect  of  LED Light Quality  on in  vitro Shoot Proliferation  and Growth  of Vanilla (Vanilla  planifolia Andrews). Afr.  J. Biotechnol. 15(8) : 272-277. Castro  AHF,  de  Queiroz  Braga  K,  de  Sousa FM,  Coimbra  MC  & Chagas  RCR.  2016. Callus Induction  and Bioactive Phenolic Compounds Production  from Byrsonima verbascifolia (L.)  DC.  (Malpighiaceae). Revista  Ciência  Agronômica. 47(1):  143- 151.
Chang, R. 2004. Kimia Dasar: Konsep-konsep Inti. Ed. ke-3. Jakarta: Penerbit Erlangga. Chung  JP,  Huang  CY  &    Dai  TE. 2010. Spectral Effects  on Embryogenesis  and Plantlet Growth  of Oncidium ‘Gower Ramsey’. Sci. Hortic. 124, 511 – 516. Cook  NC  & Samman S .1996.  Flavonoids- Chemistry, Metabolism, Cardioprotective Effects,  and Dietary Sources. Nutritio Biochem. 7: 66- 76.
Cortleven  A, Marg I, Yamburenko MV, Schlicke H, Hill K, Grimm B, Schaller GE & Schmülling T. 2016. Cytokinin Regulates The Etioplast-chloroplast Transition Through The Two-Component Signaling System  and Activation  of Chloroplast-related Genes. Plant  Physiol. 172(1): 464 – 478.
Dias MI, Sousa MJ,RC Alves & Ferreira ICFR.
2016.  Exploring Plant Tissue Culture  to
Improve The Production  of Phenolic
Compounds:  A  review. Industrial  Crops and Prod. 82  : 9 – 22.
Docimo  T, Davis AJ, Luck K, Fellenberg C, Reichelt M, Phillips M, Gershenzon J  & Auria JCD.2015. Influence of Medium and Elicitors  on The Production  of Cocaine, Amino Acids  and Phytohormones  by Erythroxylum  coca calli. Plant  Cell  Tissue
Organ Cult. 120(3):1061 – 1075.
Dowom  SA, Abrishamchi P  &Radjabian R. 2017. Enhanced Phenolic Acids Production in Regenerated Shoot Cultures  of Salvia virgata Jacq. After Elicitation With Ag+ions, Methyl Jasmonateand Yeast Extract. Industrial  Crops  and  Products. 103 : 81 – 88.
Drozd  J. 1985 Chemical Derivatization  in Gas Chromatography. J. Chrom Library.19. Dwi  NM,    Waeniati,  Muslimin & Suwastika IN.  2012.  Pengaruh Penambahan Air Kelapa  dan Berbagai Konsentrasi Hormon 2,4-D Pada Medium MS Dalam Menginduksi Kalus Tanaman Anggur Hijau (Vitis vinifera L.). J. Natural Sci. 1.(1) : 53- 62.
Fejér  J, Gruľová D, Feo VD, Ürgeová E,
Obert B & Preťová A. 2018. Mentha×piperita L. Nodal Segments Cultures and Their Essential Oil Production. Industrial  Crops  &  Prod.
112 :  550 – 555.
Gago J, Martínez-Núñez L, Landín M, Flexas
J & Gallego PP. 2014. Modeling The Effects  of Light  and Sucrose  on  in  vitro
Propagated Plants: A Multiscale System Analysis Using Artificial Intelligence Technology. PLoS One. 9(1): e85989. Ghanti  K,  Kaviraj  CP,  Venugopal  RB,  Jabeen FTZ & Srinath R. 2004. Rapid
Regeneration of Mentha x pipperita L. from Shoot Tip  and Nodal Explants. Indian J.Biotechnol. 3: 594 – 598.
Huang WL, Lee CH & Chen YR. 2012. Levels of Endogenous Abscisic Acid Andindole-3- acetic Acid Influence Shoot Organogenesis in Callus Cultures  of Rice Subjected  to Osmotic Stress. Plant  Cell  Tissue  Organ Cult. 108 : 257 – 263.
Ilag LL,  Olson NH,  Dokland T,  Music CL, Cheng RH,  Bowen Z,  McKenna R,
Rossmann MG, Baker TS & Incardona NL. 1994.  DNA Packaging Intermediates  of Bacteriophage  fX174. Structure. 3:  353 –
363. Kim HJ & Lee YS. 2005. Identification of New Dicaffeoylquinic Acids From Chrysanthemum  morifolium and Their
Antioxidant Activities. J.  Planta  Med. 71:
871 – 876.
Kristina NN,  Kusumah ED  & Lailani PK. 2009.  Analisis Fitokimia  dan Penampilan
Polapita Protein Tanaman Pegagan (Centella  asiatica) Hasil Konservasi in
vitro. Bul. Littro. 20 (1) : 11 - 20. Lestari  AW.  2018.  Induksi Kalus Eksplan
Batang Krisan (Chrysanthemum morifolium
Ramat  cv.  Yulimar)  dengan Kombinasi
Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Asam 2,4-diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan Kinetin. Laporan  Kerja  Praktik. Program Studi Biologi. FMIPA. Unpad.
Marchev  A,  Haas  Ch  Schulz S,  Georgiev V,
Steingroewer J,  Bley T  & Pavlov A. 2014. Sage  in  vitro Cultures: A Promising Tool For The Production  of Bioactive Terpenes and Phenolic Substances. Biotechnol.  Lett. 36: 211 – 221.
Minarsih H, Suharyo, Riyadi I & Ratnadewi D. 2016.  Pengaruh Jumlah Subkultur  dan Media Sub-optimal Terhadap Pertumbuhan dan Kemampuan Regenerasi Kalus Tebu (Saccharum officinarum L.). Menara Perkebunan. 84(1): 28-40.
Muleo R  &  Morini S.  2006.  Light Quality Regulates Shoot Cluster Growth  and
Development  of  MM106 Apple Genotype in in vitro Culture. Sci. Hortic. 108(4): 364- 370.
Murch SJ  & Saxena PK.  2006.  A Melatonin- Rich Germplasm Line  of  St  John's Wort (Hypericum  perforatum L.). J.  Pineal  Res. 41(3): 284-287.
Ningsih  IY.  2014.    Pengaruh Elisitor Biotik dan Abiotik Pada Produksi Flavonoid Melalui Kultur Jaringan Tanaman. Pharmacy.11(02) : 117-132. Nugroho LH,  Sumardi I,  Wisnu  M. & Anggraeny RN. 2007. Distribusi dan Profil Kromatogram Minyak Atsiri Pada Temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) Yang Ditumbuhkan Secara in  vitro dan in vivo. Berkala Ilmiah Biologi. 6(2): 87-95. Pacurar DI, Perrone I & Bellini C. 2014. Auxin is A Central Player  in The Hormone Crosstalks That Control Adventitious Rooting. Physiol. Plant. 151 : 83 – 96.
Park SH, Elhiti M, Wang H, Xu A, Brown D & Wang A.  2017.  Adventitious Root Formation  of in  vitro Peach Shoots  is Regulated by Auxin and Ethylene. Sci Hort.
226 :250 – 260. Pubchem. 2018a. Quercetin. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compoun d/quercetin#section=Top [23 Juli 2018]. Pubchem. 2018b. Quercitrin. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compoun d/quercitrin#section=Top [23 Juli 2018].
Pubchem. 2018c. Isoamyl Salicylate. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compoun
d/Isoamyl_salicylate#section=Top [23  Juli
2018].
Purnamaningsih  R  & Ashrina M.  2011. Pengaruh BAP dan NAA Terhadap Induksi Kalus  dan Kandungan Artemisinin  dari
Artemisia annua L. J. Berita Biologi .10(4). Purwianingsih  W, Febri S  & Kusdianti.  2016. Formation Flavonoid Secondary Metabolites in Callus Culture of Chrysanthemum cinerariefolium as Alternative Provision Medicine. AIP ConferenceProceedings.1708,  030005. doi: 10.1063/1.4941150.
Ramdan  R,  Handaji  N,  Beyahia H  & Ibriz  M.
2014.  Influence  of Growth Regulators  on Callus Induction  from Embryos  of Five Citrus Root Stocks. Journal  of  Applied Biosciences. 73: 5959 – 5965.
Rout  GR.  2006.  Effect  of Auxins  on Adventitious Root Development From Single Node Cuttings  of Camellia  sinensis (L.)  Kuntze  and Associated Biochemical Changes. Plant  Growth  Regul.  48:  111 – 117.
Saifudin Azis.  2014. Senyawa  Alam  Metabolit
Sekunder:  Teori,  Konsep,  dan  Teknik Pemurnian. Yogyakarta: Penerbit Deepublish. Siahsar B, Rahimi M, Tavassoli A & Raissi A.
2011.  Application  of Biotechnology  in Production  of Medicinal Plants.  American- Eurasian J.  Agric.  &  Environ.  Sci.11  (3): 439-444.
Siddique  AB  & Islam  SMS.  2015.  Effect  of Light  and Dark  on Callus Induction  and Regeneration in Tobacco (Nicotiana tabacum L.). Bangladesh  J.  Bot.  44(4): 643-651.
Singh  N, Meena MK  & Patni V.  2013.
Phytochemical Profiling and GC-MS Analysis  of Bioactive Constituents  of Callus  of Naringi  Crenulata (Roxb.) Nicolson. Int.  J.  Pharm.  Sci.  Rev.  Res. 24(1) :  29-34.
Sun  QL, Hua S,  Jian HY,  Xin QZ  &Yue RL. 2010. Flavonoids and Volatiles in
Chrysanthemum  morifolium Ramat Flower from  Tongxiang  County  in  China. Afr.J.
Biotech. 9(25) :  3817-3821.
Sumardjo  D.  2009. Pengantar  Kimia. Buku Panduan  Kuliah  Mahasiswa  Kedokteran dan  Program  Strata  1  Fakultas  Bioeksakta.
Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Taiz L & Zeiger E. 2010. Plant physiology. 3rd
Edition. Sinauer Associates Inc. Sunderland MA. Utami ESW, Sumardi I, Taryono & Semiarti E.
2007.  Pengaruh  α - Naphtaleneacetic  Acid (NAA) Terhadap Embriogenesis Somatik Anggrek Bulan Phalaenopsis amabilis (L.) Bl. J. Biodiversitas. 8(4) : 295- 299.
Velayutham  P  &  Karthi  C.  2015.  GC-MS Profile  of In Vivo, In Vitro and Fungal Elicited In Vitro Leaves  of Hybanthus enneaspermus (L.)  F.  Muell. Int  J.  Pharm Pharm Sci. 7(10) : 260-267. Wahyuni DK, Prasetyo D & Hariyanto S. 2014. Perkembangan Kultur Daun Aglaonema sp. Dengan Perlakuan Kombinasi Zat Pengatur Tumbuh NAA  dan  2,4-D  dengan  BAP. J. BIOSLOGOS. 4 (1) : 10-16
Waseem  K, Jilani MS, Khan MS, Kiran M  & Khan G. 2011. Efficient in vitro
Regeneration of Chrysanthemum (Chrysanthemum  morifolium L.) Plantlets
From Nodal Segments. Afr  J.  Biotech. 10(8): 1477-1484.
Xie  YY,  Yuan  D,  Yang  JY,  Wang  LH  &  Wu CF. 2009. Cytotoxic Activity of Flavonoids From The Flowers  of Chrysanthemum morifolium on Human Colon Cancer Colon 205  cells. J.  Asian  Nat.  Prod.  Res. 11(9):
771-778.
Xu L. 2018. De novo Root Regeneration From Leaf Explants: Wounding, Auxin,  and Cell Fate Transition. Current  Opinion  in  Plant Biology. 41: 39 – 45.
Yang  L,  Aobulikasimu  N,  Ping  C,  Jin  HW, Hong L.  2017. Analysis  of Floral Volatile Components  and Antioxidant Activity  of Different Varieties  of Chrysanthemum morifolium. Molecules Article. 22: 1970.
Yaseen M, Ahmad T, Sablok G, Standardi A &
Hafiz  IA. 2013.  Review: Role  of Carbon Sources For in  vitro Plant Growth  and Development. Mol.  Biol.  Rep. 40  :  2834- 2849.