JBP Vol. 18, No. 3, December 2016— Oktarina Surfianti

## IDENTIFIKASI KHV DENGAN UJI IMMUNOFLUORESCENCE DAN
IMMUNOCYTOCHEMISTRY BERDASARKAN UJI PCR POSITIF PADA INSANG IKAN KOI (Cyprinus carpio)
Oktarina Surfianti *1 , Soewarno 1 , Gunanti Mahasri 2
1 Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Kampys C Mulyosari-Surabaya, 60115 Telp. 031-5992785
2 Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyosari-Surabaya, 60115 Telp. 031-5911451 e-mail: *1 hr_surfi@yahoo.co.id,

## Abstrak
Koi  Herpesvirus (KHV)  menyebabkan  penyakit  parah  dan  kematian  di  segala  usia  ikan mas  dan  ikan  koi  ( Cyprinus  carpio )  dan  menyebar  dengan  cepat  di  seluruh  dunia  sebagai penyebab mortalitas yang sangat tinggi dengan perkiraan (80-95%) untuk ikan koi dan ikan mas. Identifikasi KHV ini sudah dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Tetapi, metode tersebut tidak cocok untuk pekerjaan lapangan karena belum efisien dalam hal waktu dan peralatan. Perlu  ada  pemeriksaan  berbasis  imunologis  sebagai  identifikasi  awal  (pemeriksaan dini) yang  belum banyak dilakukan dan perlu dikembangkan terutama untuk pemeriksaan KHV yaitu metode Immunofluorescence sebagai  pemeriksaan  imunologis  untuk  identifikasi  adanya antigen  atau  dengan  menggunakan  pewarnaan fluorescent dan immunocytochemistry menggunakan  metode  imuno  histo  (sito)  kimia  ensim  yang  bersifat  spesifik  dengan  pewarnaan oleh  zat  chromogen  guna  mengidentifikasi  antigen  dalam  suspensi  organ  insang  dan  darah. Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  agar  mampu  mengidentifikasi    KHV  ( Koi  Herpes  Virus )  yang menginfeksi  ikan  koi  ( Cyprinus  carpio  L )  menggunakan  metode  aplikasi Immunofluorescence serta Immunocytochemistry berdasarkan pemeriksaan menggunakan uji PCR dengan hasil positif KHV.Hasil dari kedua metode diperoleh positif untuk beberapa sampel berdasarkan positif PCR, ditandai  dengan  adanya  pendaran  oleh  zat fluorescent berwarna  hijau  pada  antigen  dengan pemeriksaan  metode Imunofluorescence dan  adanya  ekspresi  zat  chromogen  pada  antigen berwarna  coklat  kemerahan  pada  antigen  dengan  pemeriksaan Imunocytochemistry .  Sehingga dapat  disimpulkan  bahwa  kedua  metode  tersebut  mampu  mengidentifikasi  KHV  dan  dapat digunakan sebagai uji pemeriksaan dini KHV berbasis imunologis.
Kata kunci: Koi Herpesvirus, Ikan koi (Cyprinus carpio), Imunofluorescence , Immunocytochemistry
© (2016) Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia

## Abstract
Koi  Herpesvirus  (KHV)  cause  severe  disease  and  death  in  all  ages  carp  and  koi  carp (Cyprinus carpio) and spread rapidly around the world as the cause of very high mortality with estimates (80-95%) for koi and goldfish. KHV identification has been carried out by the method of  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR).  However,  these  methods  are  not  suitable  for  field  work because it is not efficient in terms of time and equipment. There needs to be examination-based immunological as early identification (primary care physician) that has not been done and needs to  be  developed  especially  for  the  examination  KHV  is  the  method  Immunofluorescence  as inspection  immunological  to  the  identification  of  the  antigen  or  by  using  a  staining  fluorescent and  immunocytochemistry  using  immuno  histo  (sito)  chemical  enzymes  specific  staining  by  the chromogen substances in order to identify the antigen in suspension gills organs and blood. The purpose  of  this  research  is  to  be  able  to  identify  KHV  (Koi  Herpes  Virus)  that  infects  koi  carp (Cyprinus  carpio  L)  using  application  methods  Immunofluorescence  and  immunocytochemistry based examination using a PCR test with positive results from both methods obtained KHV.Hasil positive  for  multiple  samples  based  on  positive  PCR,  characterized  by  the  luminescence  by  the green  fluorescent  substance  with  inspection  methods  Imunofluorescence  antigens  and  their expression  on  antigen  chromogen  substances  are  reddish  brown  in  antigen  with Imunocytochemistry  examination.  It  concluded  that  both  methods  are  able  to  identify  KHV  and can be used as an early test of KHV based immunological examination.
Keywords: Koi Herpesvirus, Ikan koi (Cyprinus carpio), Imunofluorescence , Immunocytochemistry

## 1. PENDAHULUAN
Indonesia yang mempunyai dua musim  yaitu  musim  hujan  dan  panas,  yang menambah  peluang  berbagai  biota  untuk bertahan  hidup  dan  tumbuh  subur,  baik didaratan  maupun  diperairan  (Mashuri  Masri, 2013).  Akibat  kondisi  tersebut  di  atas, berbagai jenis penyakit pada ikan dapat mudah terjadi  sebagai  akibat  adanya  interaksi  antara mikroorganisme  yaitu  parasit,  jamur,  bakteri dan  virus  yang  patogen  maupun  non  patogen dengan induk semang/inang/ host dan terutama akibat  dari  beberapa  faktor  lingkungan  yang kurang  mendukung  (Isti,2001).    Salah  satu penyakit  yang  menginfeksi  ikan  adalah  jenis Koi  Herpesvirus . Koi  Herpesvirus (KHV) adalah  penyakit  virus  yang  sangat  menular yang menyebabkan morbiditas dan  mortalitas yang  signifikan  pada  ikan  mas  ( Cyprinus carpio ) dan domestik ikan  hias (Soliman and El-Matbouli, 2005).
Koi Herpesvirus (KHV) menyebabkan penyakit  parah  dan  kematian  di  segala  usia ikan  mas  dan  ikan  koi  ( Cyprinus  carpio )  dan
menyebar  dengan  cepat  di  seluruh  dunia. Sebagai  pandangan  bahwa  KHV  adalah penyakit  terbatas  pada  perdagangan  ikan  hias sehingga dapat diminimalkan untuk mengevaluasi  dampaknya  terhadap  budidaya di Eropa (Haenen et al , 2004).
Di  Indonesia  sendiri  infeksi  paling  besar terjadi pada  tahun 2001 menyebabkan penurunan  produksi  ikan  mas  nasional  yang mengalami  penurunan  sekitar  40%  selama kurun waktu 2002-2006 (Sunarto et al . 2002). Hal ini karena banyak ikan yang  mati terkena serangan  virus  koi  herpes.  Sehingga  terjadi kelangkaan ikan hias di pasaran, terutama ikan koi (Taukhid et al , 2004).
Beberapa  pendekatan  pemeriksaan atau  identifikasi Koi  Herpesvirus (KHV) sudah dilakukan mulai tahun 2002. KHV telah didiagnosis dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).  Manfaat  besar  PCR  yaitu sebagai  deteksi  penyakit  secara  molekuler terutama  penyakit  viral  (Cobo,2012).  Salah satu  penyakit  viral  yang  dapat  dideteksi dengan  PCR  yaitu  KHV (Koi  Herpesvirus)
JBP Vol. 18, No. 3, December 2016— Oktarina Surfianti
(Ciptoroso, et  al 2012).  Metode  ini  tidak cocok  untuk  pekerjaan  lapangan  karena membutuhkan  peralatan  laboratorium  yang tidak  simpel.  Dengan  demikian,  metode  atau alat,  yang  mampu  secara  definitif  mendeteksi virus  dari  jaringan  yang  terinfeksi  sangat diperlukan, misalnya metode immuno- kromatografi  kit  dengan  monoklonal  spesifik antibodi  terutama  untuk  kasus  di  lapangan (Aoki, et al. 2011).
Identifikasi KHV sudah banyak dikembangkan  dan  sudah  banyak  diteliti terutama  pada  ikan Cyprinids seperti  dengan menggunakan  metode  PCR.  Tetapi  dalam pemeriksaan berbasis imunologis masih belum banyak  dilakukan  dan  perlu  dikembangkan terutama untuk pemeriksaan KHV.
Pemeriksaan Immunocytochemistry (ICC)
merupakan  salah  satu  jenis  pemeriksaan imunologis, menggunakan metode imuno histo (sito)  kimia  ensim  yang  bersifat  spesifik  dan bertujuan untuk membantu mendeteksi antigen dalam  cairan  specimen  klinik  yang  terinfeksi oleh  kuman  pathogen  (Warsito,  1991). Sedangkan  pemeriksaan Immunofluorescence merupakan suatu jenis pemeriksaan imunologis  untuk  deteksi  adanya  antigen  atau mencari lokalisasi antigen dalam jaringan atau sel  specimen  klinik  dengan  menggunakan pewarnaan fluorescent dan  metode  ini  sudah telah banyak penelitian tahun-tahun sebelumnya  di  wilayah  lain  dan  ternyata memberikan korelasi positif terhadap hasilnya (Priyambodo, 2001).
Penerapan dan penggunaan uji bioteknologi  berbasis  antibodi,  yaitu  metode immunofluorescence (IF)
dan imunocytochemistry (ICC/  Imunositokimia) streptavidin  biotin dalam  mendeteksi  protein virus  KHV  pada  ikan  koi  adalah  sangat penting. Mengingat identifikasi KHV berbasis antibodi masih jarang dilakukan sementara itu masih  sering  menggunakan  uji  berbasis  DNA dengan  kebutuhan  biaya  yang  relatif  lebih mahal,  perlu  waktu  dan penanganan  serta  alat khusus.  Menurut    Warsito,  2013    bahwa  uji berbasis antibodi ini penting guna mendukung upaya  penanganan  wabah  KHV  pada  Ikan mas,  ikan  koi  selama  ini  selalu  terlambat  dan pada  kasus  infeksi  KHV,  di  lingkungan
perairan sekitar dan mampu menginfeksi ikan- ikan  lain  yang  peka.  (Warsito  dkk,  2013). Ditambahkan  lagi  oleh  Lestari  dkk,  2014 bahwa  perlu    adanya  pengembangan  teknik pemeriksaan  yang  cepat,  tepat  dan  akurat dengan mengembangkan uji immunofluorescence dan
immunocytochemistry /  imunositokimia  pada preparat  apus  darah  dan  organ  insang  sebagai salah satu pemeriksaan awal KHV.

## 2. METODE  PENELITIAN
Pelaksanaan  penelitian  ini  dilakukan pada  bulan  Nopember  2015  sampai  bulan Maret  2016  di  Laboratorium  Imunologi  Balai Karantina  Ikan  Pengendalian  Mutu  dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Surabaya I.
Bahan  penelitian  yang  digunakan adalah  ikan  koi  postif  KHV  berdasarkan pemeriksaan  uji  PCR    yang  diambil  dari berbagai  wilayah  di  sekitar  Jawa  Timur.  Ikan koi  diambil  dari  ikan  yang  diduga  terinfeksi KHV  dengan  beberapa  tanda  klinisnya  antara lain  berupa  insang  geripis,  erosi  atau  borok pada  kulit,  gerakan  tak  terkontrol,  kulit melepuh atau kadang disertai pendarahan pada sirip  ataupun  pada  ikan  koi  yang  tidak menunjukkan  tanda-tanda  gejala  klinis  atau bersifat carrier .
Bahan  untuk  uji  PCR  adalah DNAzol, Alkohol absolut, master mix, ddH2O/ Nuclease free water, Agarose 2%, Primer Mix KHV  F 292 bp dan R 292 bp, DNA template kontrol  negatif,  DNA  template  kontrol  positif KHV,  TAE  buffer  Ethidium  bromide,  6x Loading  dye  buffer,    100  bp  ladder  DNA marker.
Bahan untuk Immunofluorescence adalah methanol, larutan buffer saline, normal goat  serum,  1x  PBS,  Mouse  Anti-Koi Herpesvirus (KHV) monoclonal antibody, goat anti-mouse  Ig  G  fluorescence  conjugate, entellan  neu utuk  proses  mounting,  aquades steril.
Bahan  yang  digunakan  untuk  metode Immunocytochemistry ini antara lain methanol, larutan  buffer  saline,  10%  hydrogen  peroxide block,  normal  goat  serum,  Mouse  anti-Koi
Herpesvirus (KHV) monoclonal antibody, goat anti-mouse  IgG  biotin  conjugate,  streptavidin horseradish  peroxidase,  substrat-chomogen solution,  counter  stain  (Mayer’s  hematoxylin, serta Entellan neu untuk proses mounting. Peralatan yang digunakan untuk pemeliharaan  ikan  adalah  akuarium  yang digunakan  sebagai  tempat  penampungan sementara  ikan  koi  dari  berbagai  wilayah sebelum dilakukan uji PCR.
Peralatan  untuk  uji  PCR  adalah micropipet  (1-10  µl),  (50-200  µl),  (200-1000 µl),  sarung  tangan,  timbangan  analitik, Thermocycler (Mesin  PCR) ,  pellet  pastle,  hot plate,  Microtube  200  µl dan 1500  µl,  Pipet Tips  (1-10  µl),  (50-200  µl),  (200-1000  µl), peralatan  Elektroforesis  dan Power  Supply,
vortex, UV Trans-illuminator, camera Polaroid . Peralatan untuk uji Immunofluorescence adalah coplin  jar,  cover glass,  incubator,  mikroskop  fluorescence dan objek glass. Peralatan untuk
Immunocytochemistry adalah coplin jar, cover glass, incubator , lemari es, mikroskop cahaya, objek  glass,  timbangan  analitik,  dan  sarung tangan.
Penelitian  ini  menggunakan  metode eksperimental  uji Immunofluorescence dan Immunocytochemistry menggunakan  jaringan insang ikan koi dan menggunakan whole darah ( Cyprinus  carpio ) yang diperoleh dari berbagai  wilayah  di  Jawa  Timur  (Blitar, Malang, Kediri).
Pengujian  awal  dengan  metode  PCR sebagai  uji  konfirmasi  awal  guna  mengetahui positif KHV yang akan dilanjutkan dengan uji immunofluorescence dan Immunocytochemistry . Teknik pengambilan sampel
menggunakan simple  random  sampling yaitu mengambil  secara  acak  sampel  ikan  dari berbagai  wilayah  yang  kemudian  dilakukan pemeriksaan  dengan  metode  PCR  guna mengetahui positif KHV yang akan dilanjutkan  dengan  uji immunofluorescence dan Immunocytochemistry.
Persiapan Ikan yang Akan Diuji
Ikan koi yang digunakan untuk proses uji diperoleh dari sentra budidaya ikan Koi di berbagai  wilayah  di  Jawa  Timur.  Ikan  koi ditampung  sementara  pada  akuarium  yang telah  dibersihkan  kemudian  di  lanjutkan  uji PCR hingga ketemu positif KHV.

## Pengujian PCR
Isolasi  DNA  KHV  yang  selanjutnya digunakan  untuk  uji  PCR  untuk  menentukan ikan  yang  terinfeksi  KHV  dan  selanjutnya digunakan dalam uji utama yaitu pemeriksaan menggunakan  uji immunofluorescence dan imunositokimia. Adapun tahapan dalam proses pemeriksaan dengan metode PCR adalah yang pertama  melakukan  Ekstraksi  Tri  Reagent, persiapan amplifikasi dan persiapan dalam alat Thermal Cycler .
Ekstraksi TRI Reagent yang dilakukan pertama  kali  yaitu  sampel  ikan  pada  organ insang  sebanyak  50-100  mg  dipotong  kecil- kecil/  digerus  halus  dengan  pisau  bedah  atau gunting steril. Untuk menghindari kontaminasi,  setiap  sampel  harus  diproses dengan  menggunakan  tempat  dan  alat  yang berbeda. Selanjutnya sampel tersebut diekstrak DNA-nya.
Pendeteksian  DNA  KHV  dengan teknik  PCR  dilakukan  dengan  menggunakan primer  spesifik  menurut  Gray et  al ,  (2002) yang  telah  dimodifikasi  oleh  Kurita, et  al (2009).  Primer  Sphl-5  (5’GAC  ACC  ACA TCT  GCA  AGG  AG  3’)  dan  (5’GAC  ACA TGT  TAC  AAT  GGT  CGC  3’)  akan menghasilkan amplikon seberat 292 bp.
Persiapan amplifikasi dengan menambahkan RTG PCR Bead 1 butir, Primer F290  (20  pMol)  sebanyak  2  µl  dan  primer R290  (20  pMol)  sebanyak  2  µl.  Ditambahkan template  DNA  sebanyak  2  µl.  Kemudian dengan menambahkan Aquades steril sebanyak  19  µl.  Adapun  siklus  amplifikasi yang digunakan yaitu dengan 1 suklus   pada suhu  95 O C  selama  5  menit;  30  siklus  pada suhu  95 O C  selama  30  detik,  50 O C  selama  30 detik dan 72 O C selama 30 detik; serta 1 siklus pada suhu 72 O C selama 30 detik, 72 O C selama
7 menit.
Produk  PCR  ( amplicon )  dipisahkan dengan  elektroforesis  gel. Elektroforesis
JBP Vol. 18, No. 3, December 2016— Oktarina Surfianti
dilakukan  pada  voltase  120  volt  hingga indikator warna loading dye buffer bergerak ¾ bagian  dari  panjang  gel.  Selanjutnya  gel agarosa dimasukkan ke dalam larutan pewarnaan  (0.05% ethidium  bromida )  dalam wadah  plastik  sampai  terendam  selama  10 menit. Gel diamati dengan UV transilluminator dan dokumentasi. Pengujian Immunocytochemistry / Imunositokimia Metode Immunocytochemistry / imunositokimia dilakukan dengan
menggunakan  sampel  darah  untuk  apusan dengan  urutan  kerja  yaitu  dengan  mengambil darah menggunakan spuit 1cc. Satu tetes darah diletakkan  diatas  objek  gelas  dan  diulas  tipis. Sediaan  hasil  olesan  darah  tipis  ini  kemudian difiksasi  kedalam  larutan  methanol  selama  10 menit.
Sediaan  selanjutnya  ditetesi  dengan normal  goat  serum dan  diinkubasi  pada  suhu kamar  selama  30  menit.  Sediaan  ditetesi dengan  antibody  primer  yang  berupa  anti- KHV Monoklonal antibody lalu inkubasi pada suhu  37 O C  selama  20  menit.  Kemudian sediaan  dicuci  dengan  larutan  PBS  selama  10 menit,  selanjutnya  ditiriskan  diatas  kertas tissue.
Sediaan  ditetesi  dengan  antibody sekunder dan ditambah dengan cairan biotinylated  secondary  antibody selama  10 menit.  Sediaan  dicuci  menggunakan  PBS selama  10  menit,  kemudian  ditiriskan  diatas kertas  tissue.  Sediaan  kemudian  diinkubasi dengan streptavidin-peroxidase conjugate selama  5  menit.  Selanjutnya  sediaan  dicuci lagi dengan PBS selama 10 menit, lalu tiriskan diatas kertas tissue.Selanjutnya sediaan diinkubasi  dengan  substrat- chromogen pada suhu  kamar  selama  15  menit.  Kemudian sediaan  dicuci  dengan  aquades  selama  10 menit. Sediaan kemudian dilakukan counterstain hematoxylin selama 10 menit.
Dicuci dengan aquadesh dan mounting dengan entellan  neu untuk  pengamatan  di bawah mikroskop cahaya. Hasil positif apabila dalam sediaan yang telah dilakukan pewarnaan  menggunakan streptavidin-biotin akan terlihat warna coklat kemerahan/keemasan. Pengujian Immunofluorescence
Pemeriksaan
imunofluorescence adalah  suatu  jenis    pemeriksaan  imunologis untuk mendeteksi adanya antigen atau mencari lokalisasi  antigen  dalam  jaringan  atau  sel specimen  dengan  pewarnaan  florescence. Prinsip dasar pemeriksaan KHV pada ikan koi adalah  dengan  membuat  preparat  ulas  dari organ  insang,  hati  dan  ginjal,  yang  kemudian ditetesi  dengan  anti-KHV  fluorescent  dan diinkubasi  pada  suhu  37 0 C  selama  30  menit. Setelah  dilakukan  pencucian  dengan  larutan buffer  fosfat,  selanjutnya  dibuat  sediaan  pada objek glass kemudian dilihat dengan menggunakan mikroskop fluorescence . Apabila  dalam  ulasan  tersebut  mengandung antibodi yang menyelubungi KHV maka akan tampak  warna  fluoresensi  kehijauan.  Untuk membuat kesimpulan hasil pemeriksaan KHV, maka  perlu  diperhatikan  adalah  KHV  dan intensitas  fluoresensi.  Hasil  pemeriksaan memberikan  penilaian    positif  atau  negatif (Matuscak et  al .,  1982;  Ardana,  1987;  Kunin, 1997).
Teknik  pewarnaan  dalam  mendeteksi protein  virus  KHV  dilakukan  berdasarkan metode indirect labeling immunofluorescence. Sebelumnya  dilakukan  pengambilan  organ insang. Kemudian insang digerus dengan pelet pastel.  Selanjutnya  dengan  penambahan  PBS 1x  sebanyak  500  µl  dilakukan  sentrifuge 10.000  rpm  selama  5  menit.  Pelet  yang  telah diperoleh dari hasil ekstraksi tersebut kemudian  di  smear  pada  objek  glass  secara merata  dan  setelah  itu  di  fiksasi  dengan methanol dengan tujuan membloking antigennya.
Fiksasi dilakukan dalam larutan methanol  selama  30  menit  pada  suhu  -20 0 C. Berikutnya  antigen  diikat  dengan  antibody spesifik  yang  tidak  dilabel  ( unlabeled  spesific antibody )  sebagai  antibody  primer    (mouse anti-KHV monoclonal antibody ) dan diinkubasi  sebagai  ikatan  antibody  pertama. Sediaan  kemudian  diinkubasikan  dengan antibody sekunder yang berlabel ( Fluorochrome secondary antibody ). Antibodi ini  mengandung  antiboi  anti  imunoglobulin
JBP Vol. 18, No. 3, December 2016— Oktarina Surfianti
hewan.  Antibodi  sekunder  ini  akan  mengikat antibodi primer.
Hasil  preparat  positif  didapatkan akibat  dari  reaksi  antigen-antibodi  kompleks (WHO 1996) yang berwarna hijau fluorescence dengan  ukuran  bervariasi.  Hasil negatif jika tidak memberikan warna fluorescence (Dean et al , 1996).

## Analisa Data
Data  yang  akan  didapatkan  dianalisa dengan menggunakan metode deskriptif kualitatif yaitu suatu cara dengan menggambarkan  atau  memaparkan  dengan kata-kata  secara  jelas  dan  terperinci  tentang sebuah kegiatan yang dilakukan dan dibandingkan dengan literature dengan
menganalisa hasil berdasarkan tingkat ekspresi dari ikan uji
berdasarkan metode
Immunofluorescence
dan
Immunocytochemistry .

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengambilan ikan yang terinfeksi  di  beberapa  wilayah  yaitu  Blitar,
Malang  dan  Kediri  didapatkan  beberapa  ikan terinfeksi  KHV  dengan  dibuktikan  adanya beberapa insang telah mengalami nekrosis dan
beberapa  gejala  klinis  lainnya  dapat  dilihat pada Tabel 1.
Tabel  3.1 Pemeriksaan  gejala  klinis  dan patologis anatomis pada beberapa ikan  koi  yang  diperoleh  dari beberapa daerah
Ikan  koi  yang  digunakan  selama penelitian  merupakan  ikan  sehat  sebagai kontrol  negatif  setelah  melalui  konfirmasi awal  dengan  uji  PCR  dapat  dilihat  pada Gambar 3.1 dan ikan sakit yang menunjukkan gejala  patologis  anatomis  sebagai  kontrol positif dapat dilihat pada Gambar 3.2.
Gambar  3.1 Ikan  koi  sehat  dengan kondisi insang berwarna merah  segar,  sisik  lengkap, mata  cembung,  digunakan sebagai kontrol negatif.
A Kondisi Ikan sehat dengan mata cembung, tidak terdapat  luka,  sisik  lengkap. B.  Insang  tampak  berwarna merah cerah. No Asal Daerah Gejala  Klinis  dan patologis anatomis 1. Blitar Erosi sirip, sisik banyak yang terlepas, mata cekung  dan  nekrosis serta terdapat nodule putih pada insang 2. Malang Erosi sirip ekor, kongesti di sirip dada,  dan  nekrosis serta terdapat nodule putih pada insang 3. Kediri Kongesti  sirip  dada dan  hemoragi  area punggung
Gambar  3.2 Ikan  koi  terinfeksi  KHV yang  digunakan  sebagai kontrol  positif.        A.  mata cekung  dan  adanya  infeksi sekunder  yaitu ulcer daerah kepala, nekrosis pada lamella  insang,  B.  sisik rontok, Pengujian Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction
Ikan  koi  untuk  sampel  penelitian dilakukan  setelah  ikan  koi  dipingsankan dengan  larutan  cengkeh  dosis  1-5  cc/10  liter air. Satu persatu ikan diuji dengan pengambilan  organ  insang.  Insang  diletakkan didalam  tube  untuk  proses  PCR.  Prosedur Pemeriksaan  KHV  berdasarkan  metode  PCR dengan  beberapa  tahapan  mulai  dari  proses ekstraksi,  amplifikasi  hingga  elektroforesis dapat dilihat pada Lampiran 4.
Berdasarkan sampel yang diambil dari 3  kolam  masing  masing  10  ekor  ikan  sampel yang  masih  hidup,  kemudian  dipilih  dan diambil  untuk  pemeriksaan  PCR.    Hasil pemeriksaan  KHV  berdasarkan  metode  PCR dapat dilihat pada Gambar 5.3.
Gambar  3.3 Elektroforesis  gel  agarosa  dari PCR diamplifikasi pada fragmen 292
bp  dari  KHV  DNA  yang  diperoleh dari  insang    koi  yang  hampir  mati. Primer yang digunakan untuk amplifikasi  dipilih  sesuai  dengan OIE. Lane 1: Marker (100 bp DNA). Hasilnya,  Lane  2  dan  13:  kontrol positif;  Lane  3  dan  12:  kontrol negatif,  Lane  4-8  hasil  positif;  Lane
9,10 hasil negatif Identifikasi Menggunakan Metode Immunofluorescence
Hasil  ekspresi  positif  virion  KHV terlihat  adanya  pendaran    pada  daerah  selnya. Hasil  ekspresi  negatif  virion  KHV  tidak terlihat pendaran dari zat fluorophore.
Gambar  3.4 Identifikasi  KHV  menggunakan monoclonal  antibody  anti-KHV dengan    pewarnaan  oleh    zat fluorophore. Terlihat pendaran pada apusan suspensi organ insang, perbesaran  40x,  (A)  asal  Malang. (B)  asal  Blitar.  (C)Tidak  terlihat pendaran  pada  apusan  suspensi organ    insang,  perbesaran  40x. Terlihat  pendaran  pada  apusan suspensi  organ  insang,  perbesaran 100x, (D) sampel asal Malang, (E) sampel  asal  Blitar,  (F)  sampel  asal Kediri (Mikroskop ultraviolet merk Zeiss).
JBP Vol. 18, No. 3, December 2016— Oktarina Surfianti
Gambar  3.5 Identifikasi  KHV  menggunakan monoclonal antibody anti-KHV dengan pewarnaan menggunakan zat fluorophore.  A-C:  Terlihat  pendaran pada  apusan  darah;  perbesaran  40x. D-F:  Terlihat  pendaran  pada  apusan darah;  Perbesaran 100x (Mikroskop ultraviolet merk Zeiss)
Identifikasi Menggunakan Metode Immunocytochemistry / Imunositokimia Pengujian dilakukan dengan mendeteksi  ada  atau  tidaknya  protein  KHV pada  ikan  koi  dalam  darah  dan  organ  insang. Berdasarkan  hasil  pengujian  yang  telah dilakukan menggunakan metode ini, ditemukan  hasil  positif    KHV  pada      gerusan insang  dan whole  blood  sel. Hasil  positif pemeriksaan  Imunositokimia  berwarna  coklat keemasan  dengan  inti  biru.  Sedangkan  Hasil negatif pemeriksaan Imunositokimia berwarna biru.
Gambar  3.7 Identifikasi  KHV  berdasarkan PCR  positif  menggunakan  metode imunocytochemistry streptavidin
biotin pada  sediaan  apus  suspensi organ  insang  ikan  koi.  B,D,E,F: Terlihat  ekspresi  sampel  positif KHV  berwarna  coklat  keemasan. Perbesaran 100x. Mikroskop Olympus BX 51. Gambar  3.8 Identifikasi  KHVberdasarkan
PCR  positif  menggunakan  metode imunocytochemistry streptavidin biotin pada  sediaan  apus  darah  ikan koi.  A  dan  C:  Sampel  dengan  hasil Positif KHV terdapat ekspresi berwarna coklat keemasan. D, E dan F : Sampel dengan hasil Positif KHV terdapat  ekspresi  berwarna  coklat keemasan;  Perbesaran  100x.  B: Sampel  dengan  hasil  negatif  tidak ada ekspresi; perbesaran.  Mikroskop Olympus BX 51
Hasil  pemeriksaan  KHV  dengan  uji PCR sebagai konfirmasi awal diperoleh positif KHV  sebanyak  5  sampel  dari  jumlah  10 sampel  yang  diambil  yang  selanjutnya dilakukan pemeriksaan dengan metode Immunofluorescence dan Immunocytochemistry asal  Blitar dapat  dilihat pada Tabel 2. Tabel  3.2 Hasil  uji  KHV  berdasarkan  PCR positif dengan metode Immunofluorescence dan Immunocytochemistry asal  Blitar, Malang dan Kediri
© (2016) Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
Ikan  yang  memiliki  beberapa  gejala klinis terinfeksi KHV, asal Blitar, Malang dan Kediri tersebut dilakukan uji PCR Polymerase Chain  Reaction (PCR)  merupakan  suatu teknik  sintesis  dan  amplifikasi  DNA  secara invitro  yaitu  menggunakan  mesin  yang bernama Thermalcycler. Alat  ini  dengan setting  suhu  dan  siklus  yang  sesuai  mampu melipat  gandakan  DNA.  Jumlah  siklus  yang digunakan  untuk  proses  PCR  KHV  adalah  30 siklus yang mana diharapkan mampu memperbanyak  DNA  secara  eksponensial. Seperti yang telah dungkapkan oleh Handoyo, D et  al tahun  2000  bahwa  umumnya  jumlah siklus  yang  digunakan  pada  proses  PCR adalah  30  siklus.  Penggunaan  jumlah  siklus lebih  dari  30  siklus  tidak  akan  meningkatkan jumlah  amplicon  secara  bermakna  dan memungkinkan  peningkatan  jumlah  produk yang non-target. Perlu diingat bahwa di dalam proses PCR, effisiensi amplifikasi tidak terjadi 100  %,  hal  ini  disebabkan oleh  target  templat terlampau  banyak,  jumlah  polimerase  DNA terbatas  dan  kemungkinan  terjadinya re- annealing untai target.
Virus KHV dengan komponen utamanya  adalah  protein  yang  diselubungi oleh  kapsid  masuk  melalui  insang  sebagai pernapasan  ikan.  KHV  akan  menempel  pada sel  insang  sebagai  reseptor  spesifik  guna replikasi  virus  selanjutnya.  Beberapa  tahapan setelah  tahap  absorbsi,  KHV  juga  akan melakukan tahap penetrasi, sintesis, pematangan  yang  selanjutnya  tahap  lisis  yang dapat  berlangsung  secara  cepat.  Virus  KHV dalam  hal  ini  sebagai  pathogen  dapat memasuki  aliran  darah  dan  menyebar  ke bagian  lain  dari  tubuh  ikan  seperti  dapat mengendap  di  ginjal  dan  tertelan  lewat  mulut masuk  melalui  sistem  pencernaan  yang akhirnya  mengendap  dan  berkembangbiak  di
usus.  Virus  akan  berenang  mengikuti  aliran darah selama ikan masih hidup dan mengikuti system  aliran  darah  yang  berfungsi  sebagai alat  transport. Virion  dalam  darah  inilah  yang diteliti  guna  melihat  keberadaannya  sebagai bentuk  ekspresi  melalui  kedua  metode  yang ingin  dikembangkan  sebagai  konfirmasi  awal pemeriksaan  sehingga    mampu  memberikan kontribusi dalam identifikasi virus KHV.
Dari beberapa jenis protein KHV yang bersifat antigenik mampu direaksikan berdasarkan  ikatan  antigen-antibodi.  Antibodi yang digunakan bersifat spesifik dan komplemen terhadap antigen yang direaksikan.  Monoklonal  antibody  memiliki binding  site  yang  akan  mengenali  antigen tertentu  dari  beberapa  jenis  protein  KHV tersebut.  Dimana  kedua  interaksi  ini  akan membentuk  suatu  ikatan  yang  kuat  ketika direaksikan.
Menurut Warsito, et al . 2013 mengungkapkan  bahwa  identifikasi  KHV berdasarkan  isolasi  virus  dan  uji  PCR mempunyai keterbatasan dalam hal sensitivitas sehingga  diperlukan    metode  pendekatan diagnosis yang baru untuk peneguhan diagnosis  KHV,  yaitu  uji  imunopatologi imunositokimia dan imunofluorescence. Alasan utama mencoba
dikembangkannya  metode  ini  adalah  karena bersifat  efektif  dari  segi  waktu  dan  biaya, diakui secara internasional, mudah diaplikasikan  pada  masyarakat  dan  menurut Warsito, et  al ,2016    bahwa  hal  ini  sangat diperlukan  dalam rangka program kontrol dan pengendalian  ,  termasuk  pencegahan  dan eradikasi KHV di Indonesia. Denga demikian, diharapkan  akan  mampu  mengoptimalisasi kualitas  dan  peningkatan  produksi  hasil perikanan.
Sampel  uji  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  insang  dan  whole  blood sel  dari  masing  masing  10  sampel  ikan  koi yang  berasal  dari  3  wilayah  berdasarkan anamnesis  pernah  mengalami  wabah  koi herpes virus. Meskipun ke tiga tempat tersebut pernah mengalami wabah KHV dengan angka morbiditas  dan  mortalitas  yang  relatif  tinggi,
JBP Vol. 18, No. 3, December 2016— Oktarina Surfianti
tetapi sampai saat ini belum ada laporan belum ada wabah lagi didaerah tersebut.
Sampel yang
didapatkan diharapkan  mampu  memenuhi  persyaratan dalam  uji  berbasis  imunologis.  Sampel  uji dalam  kondisi  hidup  ketika  sampai  di laboratorium  diupayakan  sedemikian  rupa, Dalam  hal  ini  tidak  ada  sampel  yang  mati diperjalanan  karena  penambahan  oksigen secara periodik guna mempertahankan kondisi ikan. Hal ini diperkuat dengan  alasan Wirata, et  al.  2014  bahwa  sampel  rusak  tidak  dapat dilakukan uji imunokimia karena
dikhawatirkan berpeluang
meningkatkan kemungkinan hasil negatif palsu.
Suatu  pemeriksaan  darah  sangatlah perlu  pada  keadaan  patologis  dan  kita  bisa mendapatkan pelengkap
pemeriksaan. Susunan darah ikan merupakan faktor pemeriksaan  penting,  sehingga  perubahan gambaran  darah  banyak  digunakan  untuk menilai  status  kesehatan  ikan  (Amrullah, 2004).  Lestari, et  al (2014)  mengungkapkan bahwa  darah  merupakan  salah  satu  media pembawa  virus  yang  dapat  menjangkau seluruh system organ, seperti saluran pencernaan, system pernafasan melalui sirkulasi darah. Darah sebagai alat transportasi
hemoglobin komponennya yaitu trombosit dan plasma darah sebagai pertahanan pertama dari serangan penyakit yang masuk ke dalam tubuh (Aria,  2008).  Salah  satu  fungsi  darah  yaitu sebagai media transportasi dalam mengangkat/mengeluarkan  zat-zat  yang  tudak berguna bagi tubuh untuk dikeluarkan melalui ginjal  termasuk  sumber  penyakit,  seperti bakteri, virus, maupun parasit.
Menurut  Playfair, et  al (2009) menyatakan  bahwa  insang  sebagai  reseptor spesifik  KHV.  Sedangkan  kunci  infeksi  virus KHV bersasal dari replikaasi intra seluler yang dapat atau tidak dapat menimbulkan kematian sel.  Oleh  karena  itu  homogenisasi  organ insang  perlu  dilakukan  sehingga  diperoleh antigen  dalam  bentuk  suspense.  Suspensi organ  inilah  yang  kemudian  didiagnosa dengan metode imunokimia.
Uji immunofluorescence
Uji Utama berdasarkan metode Immunofluorescence tak  langsung  sebagai pemeriksaan  imunologis  guna  mendeteksi adanya antigen atau mencari lokalisasi antigen dalam jaringan insang dan dalam sel darah (sel specimen  yang  merupakan  sekumpulan  dari satu  bagian  atau  lebih  bahan  yang  diambil langsung dari suatu sistem  dengan pewarnaan florescence. Dengan menggunakan metode tak langsung, imunofluoresensi menggunakan dua antibodi;  yang  berlabel  pertama  (primer) antibodi  khusus  mengikat  molekul  target setelah  proses  fiksas,  antibodi  sekunder  yang dikonjugasikan dengan zat fluorophore t ersebut  akan  mengikat  antibodi  primer tunggal.  Hal  ini  akan  memperkuat  pengikatan jumlah  molekul  fluorophore  per  antigen.  .
Menurut Kresna, 2011
metode
Immunofluorescence ini  memiliki  beberapa keunggulan  antara  lain  bahwa  metode  ini merupakan metode yang cukup sederhana dan cepat untuk dilakukan dengan tingkat kepercayaan  yang  tinggi.  Uji  ini  merupakan suatu  metode  untuk  memeriksa  adanya antibody  atau  antigen  dengan  menggunakan label fluorosence yang  akan  berpendar  jika dilihat dibawah mikroskop ultraviolet.

## Uji Imunositokimia
Pemeriksaan  imunopatologi  dengan  metode imunositokimia  yang  diaplikasikan  dalam peneguhan  diagnosis  penyakit  KHV  ini menggunakan  teknik  streptavidin  biotin  ini dengan  alasan  streptavidin  ini  memiliki kemampuan mengikat biotin yang sangat kuat yaitu  memiliki  berat  molekul  sebesar  60.000 dalton  dan  terdiri  dari  4  subunit  yang  identik dengan setiap sub unit mempunyai satu bagian ikatan  untuk  biotin.(Warsito, et  al .  2013). Hasil  uji  imunositokimia  positif  diamati  di bawah mikroskop cahaya  dan didasarkan pada analisis deskriptif terlihat adanya warna coklat keemasan setelah pada saat staining digunakan senyawa pembawa warna (kromogen) diamino-benzidine  (DAB).  Hal  ini  dipertegas oleh  hasil  penelitian  Warsito  dan  Wuryastuti, 2011  menyatakan  bahwa  hasil  akhir  positif sediaan  berwarna  coklat  muda  sampai  coklat
tua  ataupun  berwarna  coklat  kemerahan/ keemasan.

## 4.KESIMPULAN DAN SARAN

## KESIMPULAN
1. Metode Immunofluorescence yang diaplikasikan dalam penguatan identifikasi  KHV  dapat  mendeteksi antigen  KHV  pada  darah  dan  insang ikan  koi ( Cyprinus carpio ).
2. Metode Immunocytochemistry yang
diaplikasikan dalam penguatan identifikasi  KHV  dapat  mendeteksi antigen  KHV  pada  darah  dan  insang ikan koi ( Cyprinus carpio ).

## SARAN
Perlu  dikembangkan  penelitian  lebih lanjut  tentang  sensitifitas  dan  spesifitasnya serta  pengujian  terhadap  suspensi  organ  lain seperti  usus  dan  ginjal  sebagai host  spesifik lainnya menggunakan metode Immunofluorescence dan Immunocytochemistry.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  haturkan    terima  kasih    yang tidak  terhingga  kepada :
1. Sekolah Pascasarjana Universitas
Airlangga  yang  telah  memberi  saya kesempatan untuk menempuh pendidikan S2 Bioteknologi Perikanan dan Kelautan. 2. Ibu  Prof.  Dr.  Hj.  Sri  Iswati,  S.E., M.Si.,  Ak.  selaku  Direktur  Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga.
3. Bapak  Prof  Dr.  Ir.  Hari  Suprapto,
M.Agr. selaku koordinator ProgramStudi S2 Bioteknologi Perikanan dan Kelautan.
4. Bapak  Prof.  Dr.  Suwarno,   M.Si,  drh selaku  ketua  Pembimbing  Pertama Sekolah  Pasca  Sarjana,  Surabaya, yang  telah  membimbing  dan  telah memberikan  arahan,  perhatian  dan motivasi  selama  pengerjaan  dan
penyusunan  tesis  ini  dengan  penuh kesabaran.
5. Dr. Gunanti Mahasri, Ir., M.Si selaku pembimbing kedua yang telah memberikan arahan, bimbingan, petunjuk,  saran  serta  motivasi  penuh atas terselesainya tesis ini. 6. Dosen Penguji yang telah memberikan  dukungan  dan  masukan atas terselesaikannya tesis ini. 7. Kantor Balai Karantina Ikan
Pengendalian  Mutu  dan  Keamanan Hasil  Perikanan  Kelas  I  Surabaya  I yang telah menyediakan tempat untuk penelitian.
8. Kedua orang tuaku, Almarhum bapak Soermadji yang telah lama meninggal dan almarhumah ibu Sofia yang telah memberikan  semangatnya  serta  do’a dan  kepercayaan  kepada  penulis ketika  dalam  keadaan  sakit  selama proses tesis.
9. Suamiku  Dandi,  anak  anak  tercinta Helmi  dan  Randy,  adik  Irma  yang bersedia  membagi  waktunya  demi kelancaran tesis ini.
10. Teman-teman di Laboratorium
Imunologi  dan  Biologi  Molekuler yang penuh perhatian dan selalu setia mendengar keluh kesah penulis.
11. Teman-teman  S2  Biotek  Almira, Lina,  Widya,  Akbar,  mas  Anggi, Mbak  Ayu,  Rahma  Umami,  Mbak Myrna,  Mba  Ica,  Pak  Laode,  Pak Ricat  dan  Pak  Ferry  yang  selalu membantu dan memotivasi penulis.
12. Semua  pihak  yang  telah  mendukung hingga selesainya Tesis ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Ariel,  E.  2005 . Ornamental  fish  as  trans- boundary  vectors  of  viral  diseases. In P.  Walker,  R.  Lester  and  M.G. Bondad-Reantaso(eds).  Diseases  in Asian  Aquaculture  V,  pp.  103-112. Fish  Health  Section,  Asian  Fisheries Society, Manila.
Bachtiar. 2002. Mencemerlangkan Warna Koi. Tim Lentera. Agro Media Pustaka. 74 hal.
Bercovier  H,  Fishman  Y,  Nahary  R,  Sinal  S,
Ziotkin  A,  Eyngor  M,  Gilad  O,  Eldar A,  Hedrick  RP  2005.  Cloning  of  the Koi Herpesvirus (KHV)Gene Encoding  Thymidine  Kinase  and  Its Use for a Highly Sensitive PCR Based Diagnosis. BMC Microbiol 5:13-19. Berti  Anina,  dkk.  2014.  Laporan  Praktikum Kuliah Lapangan Taksonomi Vertebrata di LIPI. Pendidikan Biologi Fakultas  Tarbiyah  dan  Keguruan Institut  Agama  Islam  Negeri  Raden
Intan. Lampung.
Boenich,T.,  A.J  Farmilo,  Ronald  H.  Stead, Marc Key, Rosanne Welcher, Richard Harvey,  Keren  N.  Atwood.  2001. Hand  Book  Immunochemical  staining
Method  Edisi-3.  Daco  Dytomation,
Carpinteria. California.
Breeder  Koi.  2009.  Bentuk  Badan  Ikan  Koi.
http://www.Solat-Aid.org. Diakses pada 31 Juli 2015, jam 08.00 WIB Cahyono,  B.  2000.Budidaya  Ikan  Air  Tawar Ikan Gurami, Ikan Nila, Ikan Mas.Kanisius.Yogyakarta.113 hlm. Campbell , Mitchell, Reece (2002). Biology : Edisi  V  Jilid  3 ,  Jakarta: Erlangga.
Cobo  F.  2012.  Application  of  Molecular Diagnostic  Techniques  for  Viral Testing. The  Open  Virology  Journal .
Vol. 6: 104-114.
Departemen Budidaya. 2005. Biologi Reproduksi  dan  Pengendalian  dalam Upaya Pembenihan Ikan Koi
(Cyprinus  carpio) .  Institute  Pertanian
Bogor.
Dishon A, Davidovich M, Ilouze M, Kotler M.
(2007). Persistence of cyprinid
herpesvirus 3 in infected cultured carp cells.J Virol81: 4828–4836.
D. POKOROVA, T. VESELY, V.
PIACKOVA,  S.  RESCHOVA  ,  J. HULOVA.  2005.  Current  Knowledge on Koi Herpesvirus (KHV). Vet. Med.
– Czech, Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic.University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Research Institute of Fish Cultureand Hydrobiology  in  Vodnany,  Czech Republic.
Edi,  S.  dkk.  2010.  Identifikasi  Infeksi  Koi Herpes  Virus  (KHV)  pada  Ikan  Koi (Cyprinus  carpio)  dengan  Metode Polymerase  Chain  Reaction  (PCR), Imunositokimia  dan  Imunohistokimia. Indonesian  Journal  of  Veterinary Science  &  Medicine.  Vol  I  Nomor  2: 17-22.
Effendy,  Hersanto.  1993.  Mengenal  Beberapa Jenis Koi. Kanisius. Yogyakarta.
Efik  Yuli  Peryuni. 2013.  Ikan  Koi, jenis-jenis dan  daftar  harga.  http://ikanhias- yuli.blogspot.com/2014/02/ikan- koi.html.  Journal  of  Virologi.  2007 May;  81(10):  5058–5065.  Published online 2007 Feb 28. doi: 10.1128/JVI.00146-07PMCID: PMC1900211
Euis  Laelawati.  2008.  Respon Tanggap  Kebal Ikan  Mas (Cyprinus  carpio) Terhadap Vaksin Koi Herpesvirus yang diberikan  melalui  Injeksi  dengan Dosis Berbeda. Program Studi Teknologi  Manajemen  Akuakultur, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB. 2008
Fauzi Faruza. 2015. Teknik Diagnosa Penyakit Ikan. http://www.academia.edu/4876626/TE KNIK_DIAGNOSA_PENYAKIT_IK AN. Diakses tanggal 17 April 2015.
JBP Vol. 18, No. 3, December 2016— Oktarina Surfianti
Handoyo  E  dan  Rudiretna  A.  2001.  Prinsip Umum  dan  Pelaksanaan  Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas. Vol. 9. No. 1.
Hatem  Soliman  and  Mansour  El-Matbouli. 2005.An Inexpensive and Rapid Diagnostic Method of Koi Herpesvirus (KHV)  Infection  by  Loop-Mediated Isothermal Amplification Virology.Journal Open Access Methodology.Published:  17  October 2005.  This  article  is  available  from: http://www.virologyj.com/content/2/1/
83  ©  2005  Soliman  and  El-Matbouli; licensee BioMed Central Ltd.
Isti  Koesharyani,  dkk.  2001 . Manual  For  Fish Disease Diagnosis- II. Gondol Research.  Research  Institute  For Mariculture and JICA. Jean-Christophe Avarrea, Jean-Paul Madeiraa, Ayi  Santikab,  Zakki  Zainunb,  Marine Baudc,  Joëlle  Cabonc,  Domenico Carusoa,  Jeannette  Castric  c,  Laurent Bigarréc. 2011. Investigation of Cyprinid herpesvirus-3 genetic diversity  by  a  multi-locus  variable number  of  tandem  repeats  analysis. Journal  of  Virological  Methods  173 (2011) 320–327. Journal of Virological Methods. Journal homepage:
www.elsevier.com/locate/jviromet.
Keputusan  Menteri  Kelautan  dan  Perikanan. 2013. Penetapan Jenis-Jenis Hama dan Penyakit  Ikan  Karantina,  Golongan, Media  Pembawa  dan  Sebarannya.
Keputusan  Menteri  Kelautan  dan Perikanan Nomor 26/Kepmen- KP/2013.
Khairruman,  Dodi  S.  dan  Bambang  G. 2008.Budidaya  Ikan  Mas  Secara Intensif.  Agromedia  Pustaka.  Jakarta. 100 hlm.
Kimiko Uchii, Arndt Telschow, Toshifumi Minamoto, Hiroki Yamanaka, Mie N Honjo, Kazuaki Matsui and Zen'ichiro Kawabata. 2010. Transmission dynamics of an emerging infectious disease in wildlife through host reproductive cycles.Correspondence: K Uchii, Department of General Systems Studies,  University  of  Tokyo,  3-8-1 Komaba,  Meguro,  Tokyo  153-8902, Japan.  E-mail:  c-uchii@mail.ecc.u- tokyo.ac.jp. Current address: H Yamanaka, Department of Environmental  Solution  Technology, Ryukoku University, Otsu, Japan. KKP. 2012. Industrialisasi Perikanan Budidaya.  Arsib  Berita  Perikanan. Umm.ac.id. Universitas Muhammadiyah Malang. 2 hlm
Koi4u.  2008.    Stability  of  colours.  Published on Monday, 24 November 2008 12:16 .  Website  Last  Modified:  Saturday  31 January 2015.
Konishi  Koi  Farm.  2015.  Koi  Herpes Virus.Konishi Koi Farm. http://www.konishikoi.com/kh/index.p hp
Kunin  CM.  1997.  Detection,  prevention  and management  of  urinary  tract  infection 3th. Ed. Lea. Febiger, Philadelphia.
Lestari, Artanti Tri dan Putu Eka Sudaryatma. 2014. Studi Imunositokimia Darah dan Suspensi Organ Kerapu Macan (Ephinephelus  fuscoguttatus)  yang Diinfeksi Virus Isolat Lapang Penyebab  Viral  Nervous  Necrosis. Jurnal  Sain  Veteriner  ISSN  :  0126-
0421.
Lio-Po,  G.,  et.  al.  2009.  Surveillance  of Emerging  Fish  Viral  Pathogens  in Some  Southeast  Asian  Countries.  The
Israeli Journal of Aquaculture- Bamidgeh 61(3): 208-214.
Malole.2005.  Bahan  Teori  dan  Praktikum Apresiasi  Teknik  Virologi  dan  PCR
© (2016) Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
Penyakit  Hewan  Aquatik.  Balai  Besar Karantina Ikan Soekarno-Hatta. Jakarta. Mashuri  Masri  Dosen  pada  Jurusan  Biologi Fakultas Sains. DETEKSI KOI HARPES  VIRUS  (KHV)  PADA IKAN MAS KOI ( Cyprinus carpio L) DENGAN MENGGUNAKAN METODE  APLIKASI Polymerase Chain  Reaction (PCR).  Teknologi UIN Alauddin Makassar. Jurnal
Teknosains,Volume  7  Nomor  2,  Juli 2013, hlm: 189  - 200.
Michel,  Leroy,  Stalin  Raj,  Liefrigg,  J.Mast, Wattiez,  A.F  Vanderplasschen  and  B.
Costes. 2010. The Genome of Cyprinid  Herpesvirus  3  Encodes  40
Proteins Incorporated in Mature Virions.  Journal  of  General  Virilogy:
452-462. Belgium
Mohammad, F. 2009. Histopathological
Studies  on  Tilapia  zilli  and  Solea vulgaris  from  Lake  Qarun,  Egypt. Journal  of  Fish  and  Marine  Science  1 (1):29-39,2009.
Narbuko,  C  dan  Achmadi.  2001.  Metode Penelitian. Bumi Aksara. Jakarta.
Narisah,  Putri.  2015.  Koi  Herpes  Virus (KHV). http://www.academia.edu/4777446/Ko i_Herpes_Virus.  Diakses  tanggal  20 November 2015.
Nazir,  M.  1985.  Metodologi  Penelitian. Ghalia. Jakarta.
O.L.M. Haenen, K. Way, S.M. Bergmann and E. Ariel. 2004.  The Emergence of Koi Herpesvirus  and  Its  Significance  to European Aquaculture. Bull. Eur. Ass. Fish Pathology.
O.L.M. Haenen, K. Way, S.M. Bergmann and E.  Ariel.  2004.The  emergence  of  koi herpesvirus  and  itssignificance  to European  aquacultureBull.  Eur.  Ass. Fish Pathol.
Perelberg,  A.,  M.  Smirnov,  M.  Huttoran,  A. Diamant,  I.  Bejerano,  and  M.  Kotler. 2003.  Epidemiologycal  Description  of an  New  Viral  Disease  Afflivting Cultured  Cyprinus  Carpio  in  Israel. The  Israel  Journal  of  Aquaculture Bamidgeh 55:5-12.
Prihartono, Eko. 2004. Permasalahan Ikan Koi dan  Solusinya.  Penebar  Swadaya. Jakarta.
Pikulkaew S. et a l.2009. The Outbreak of Koi Herpesvirus  (KHV)  in  Koi  ( Cyprinus carpio  koi )  /Thai  J.  Vet.  Med.  39(1):
53-58.  53  from  Chiang  Mai  Province, Thailand.
Pikarsky,  E.,  Ronen,  A.,  Abramowitz,  J.,
Levavi-Sinan, B., Hutoran, M., Shapira,  Y.,  Steinetz,  M.  Perelberg, A.,  Soffer,  D.,  and  Koller,  M. 2004.Pathogenesis  of  Acute  Viral
Disease  Induced  in  Fish  by  Carp Interstitial Nephritis and Gill Necrosis Virus.  Journal  of  Virology,  78:9554- 9551.
Playfair,  J.H.L.  dan  B.M.  Chain.  2009.  At  a
Glance  Imunologi.  Edisi  Kesembilan.
Penerbit Erlangga.
Priyambodo.2001. Deteksi Bakteri Berselubung Antibodi Dalam Sedimen Air  Kemih  Dengan  Uji  Streptavidin Biotin. Program Pascasarjana Universitas Airlangga. Surabaya. Rantam,Dr.  Fedik.A,  drh.  2003.  Metode Imunologi. Airlangga University Press. Surabaya. Raden  Wasito,  Hastari  Wuryastuti,  Bambang Sutrisno. 2013. Identifikasi Koi Herpesvirus dengan Uji Imunopatologi Imunohistokimia Streptavidin  Biotin  pada  Ikan  Mas Karier  (IDENTIFICATION  OF  KOI HERPESVIRUS USING IMMUNOPATHOLOGIC IMMUNOHISTOCHEMISTRY OF STREPTAVIDIN  BIOTIN  IN  THE
COMMON CARP CARRIERS). Bagian Ilmu Penyakit Dalam, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah  Mada.  Jurnal  Veteriner  Maret 2013.  Vol.  14  No.  1:  37-44.  ISSN: 1411 - 8327 Ragam Fauna. 2015. Ini 13 Gambar Jenis Ikan Koi. http://www.duniaq.com/ini-13- gambar-jenis-ikan-koi/. Diakses
tanggal20 Nopember 2015.
Subagyo,  M.  1991.  Metode  Penelitian  dalam Teori  dan  Praktek.  Bumi  Aksara. Jakarta.
Suryabrata.  1997.  Metode  Penelitian.  Raya Grafindo Persada. Jakarta
Susanto,  Heru.  2000.  Koi.  Penebar  Swadaya. Cipondoh.
Suprapto,  H.  2011.  Histologi  Ikan.  Fakultas Perikanan  dan  Kelautan  Universitas Airlangga. Surabaya. Hal 6-13.
Sano, M. Crane, M., komar, C. 2004. Infection With  Koi  herpesvirus-Disease  Carp, Developed To Support the NACA/FAO/OIE  regional  quarterly aniamal  disease  reporting  system  in NACA. Bangkok. Thailand. 11 pp.
Savni. 2014. Histopatologi Ikan Mas ( Cyprinus carpio ) . Laporan Praktikum ke-13 mata kuliah Penyakit Organisme Akuatik. Departemen Budidaya  Perairan  Fakultas  Perikanan dan  Ilmu  Kelautan  Institut  Pertanian Bogor. Sunarto, A., Taukhid, Rukyani, A.,
Koesharyani, I., Supriyadi, H., Huminto,  H.,  Agungpriyono,  D.R., Pasaribu, F.H., Widodo, Herdikiawan, D.,  Rukmono,  D.,  Prayitno,  S.B., 2002. Field investigations on a serious disease  outbreak  among  koi  and common  carp  ( Cyprinus  carpio )  in Indonesia.  In:  5th  Symposium  on Diseases  in  Asian  Aquaculture  ,  Gold
Cost, Australia.
Takashi  Aoki,  Ikuo  Hirono,Ken  Kurokawa, Hideo Fukuda,Ronen Nahary,Avi Eldar,  Andrew  J.  Davison,Thomas  B. Waltzek,Herve  Bercovier,and  Ronald P.  Hedrick . 2012.  Genome  Sequences of  Three  Koi  Herpesvirus  Isolates Representing the Expanding
Distribution  of  an  Emerging  Disease Threatening  Koi  and  Common  Carp Worldwide. This article has been cited by  other  articles  in  PMC.  Manual  of Diagnostic  Tests  for  Aquatic  Animals 2012
Taukhid,  A.,  Sunarto,  A.,  Koesharyani,  I.,
Supriyadi, H., Gardenia. 2004. Strategi  Pengendalian  Penyakit  Koi Herpesvirus (KHV). Balai Riset
Budidaya Air Tawar.
Takashi  Aoki,Tomokazu  Takano,  Sasimnanas Unajak,  Madoka  Takagi,  Young  Rim Kim,  Seong  Bin  Park,  Hidehiro Kondo,  Ikuo  Hirono,  Tatsuo  Saito- Taki, Jun-ichi Hikima, Tae Sung Jung . 2010.  Generation  of  Monoclonal Antibodies Specific for ORF68 of Koi Herpesvirus.  Laboratory  of  Genome Science,  Tokyo  University  of  Marine
Science and Technology, 4-5-7 Konan,  Minato,  Tokyo  108-8477, Japan.  Department  of  Microbiology, School  of  Allied  Health  Science, Kitasato University, Sagamihara, Kanagawa  228-8555,  Japan.  Aquatic Biotechnology  Center,  College  of Veterinary Medicine,  Gyeongsang National University, 900 Gajwa-dong, Jinju,  Gyeongnam  660-710,  South Korea.
Takashi  Aoki,  Ikuo  Hirono,  Ken  Kurokawa, Hideo  Fukuda,  Ronen  Nahary,  Avi Eldar, Andrew J. Davison,  Thomas B. Waltzek, Herve Bercovier, and Ronald P.  Hedrick.  2007.  Genome  Sequences of  Three  Koi  Herpesvirus  Isolates Representing the
Expanding
Distribution  of  an  Emerging  Disease Threatening.  Koi  and  Common  Carp Worldwide. JOURNAL OF
JBP Vol. 18, No. 3, December 2016— Oktarina Surfianti
VIROLOGY,  May  2007,  p.  5058– 5065  Vol.  81,  No.  10.  Copyright  ©
2007, American
Society for Microbiology. All Rights Reserved. Uchii K, Telshow A, Minamoto T, Yamanaka H, Honio MN, Matsui K, Kawabata Z.
.2010.  Transmission  Dynamics  of  an
Emerging Infectious Disease in
Wildlife  Through  Host  Reproductive
Cycles. The  ISME  Journal (2011)  5,
244–251; doi:10.1038/ismej.2010.123; published online 26 August 2010.
Wirata,K., Ketut Berata dan Ketut Puja. 2014. Sensitifitas  dan  Spesifisitas  Teknik Imunohistokimia  Rabies.  Balai  Besar Veteriner  Denpasar.  Jurnal  Ilmu  dan Kesehatan.
Warsito,  R.,  Hastari,  W.,  Bambang,  S.  2013.
Identifikasi KHV Dengan Uji Imunopatologi Imunohistokimia Streptavidin  Biotin  Pada  Ikan  Mas Karier. Jurnal Veteriner 14. No. 1: 37-
44.
Warsito,  R  dan  Hastari  Wuryastuti.  2014. Antibodi dan Imunohistokimia. Rapha Publishing. Yogyakarta.
Yunasfi. 2006. Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Perkembangan Penyakit Dan Penyakit Yang Disebabkan  Oleh  Jamur .  Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.