Isolasi dan Karakteristik Bakteri Pendegradasi Selulosa dari Limbah Pusat Industri Mebel Antang Makassar

## Fahruddin Fahruddin
Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar * Koresponden email : fahruddin_science@unhas.ac.id
Diterima: 24 Januari 2020                                                                                 Disetujui:  14 Februari 2020

## Abstract
Antang  Furniture  Center  in  Makassar  is  one  of  the  wood  industries  and  is  still  traditionally.  The  wood processing produces waste containing cellulose that is difficult to degrade. This study aims to isolate and observe  the  characteristics  of  cellulose  degrading  bacteria.  This  research  was  conducted  at  the Microbiology  Laboratory,  Faculty  of  Mathematics  and  Natural  Sciences,  Hasanuddin  University, Makassar  from  March  2019  to  November  2019.  The  method  used  was  an  experimental  laboratory consisting  of Carboxyl  Methyl  Cellulose (CMC)  media  for  bacterial  selection  and  characterization including  microscopic  morphology  with  Gram  staining  and  morphology  macroscopic  with  colony structure.  The  results  showed  that  cellulose  degrading  bacteria  were  characterized  by  the  formation  of clear zones formed on CMC media in petri dishes. Based on macroscopic and microscopic morphological characteristics, eleven types of cellulose degrading bacteria isolates were obtained. The isolates obtained can be a source of bacterial isolates for further application in wood waste or other wastes that contain of cellulose.
Keywords: bacteria, cellulose, characteristic, degradation, enzyme cellulase, wood waste

## Abstrak
Pusat  Mebel  Antang  Makassar  merupakan  salah  satu  industri  pengolahan  kayu  yang  besar  dan  masih dikelola  secara  tradisional.  Industri  pengolahan  kayu  tersebut  menghasilkan  limbah  yang  mengandung selulosa sulit terdegradasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengamati karakteristik bakteri pendegradasi  selulosa.  Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium  Mikrobiologi,  Fakultas  Matematika dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Universitas  Hasanuddin,  Makassar  dari  Maret  2019  sampai  November 2019.  Metode  yang  digunakan  adalah  eksperimental  laboratorium  yang  terdiri  atas  CMC  media  untuk seleksi dan karakterisasi bakteri (meliputi morfologi mikroskopis dengan pewarnaan Gram dan morfologi makroskopis  dengan  ciri  kolon).  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  diperoleh  bakteri  pendegradasi selulosa  ditandai  dengan  terbentuknya  zona  bening  yang  terbentuk  pada  media  CMC    di  cawan  petri. Berdasarkan  karakteristik  morfologi  secara  makroskopis  dan  mikroskopis  diperoleh  sebelas  jenis  isolat bakteri  pendegradasi  selulosa.  Isolat  yang  diperoleh  dapat  menjadi  sumber  isolat  bakteri  untuk diaplikasikan lebih lanjut pada limbah kayu ataupun limbah lainnya yang mengandung banyak selulosa. Kata Kunci: bakteri, selulosa, karakeristik, degradasi, enzim selulase, limbah kayu.

## 1. Pendahuluan
Salah satu jenis bahan organik yang banyak terdapat di bumi adalah selulosa (sekitar 40-50% dalam tubuh  tumbuh-tumbuhan).  Selulosa  merupakan  karbohidrat  yang  tergolong  polisakarida  [1][2].  Sebagai polimer glukosa, selulosa dihubungkan oleh ikatan B-1,4-glikosida yang membentuk polimer rantai lurus. Struktur  selulosa  ini  sangat  sulit  larut  dalam  air  maupun  dalam  bahan-bahan  pelarut  yang  biasa digunakan.  Hidrolisa  selulosa  hanya  dapat  dilakukan  dengan  pelarut  asam  mineral  kuat  atau  hidrolisis asam dan dengan menggunakan enzim atau hidrolisis enzimatis [3].
Proses  degradasi  selulosa  dapat  dilakukan  secara  enzimatik  dengan  bantuan  mikroorganisme. Mikroorganisme  yang  dapat  mendegradasi  selulosa  dikenal  dengan  mikroorganisme  selulotik.  Bakteri merupakan  salah  satu  jenis  mikroorganisme  yang  mampu  mendegradasi  selulosa  dan  memiliki kelimpahan terbanyak di alam dibanding mikroorganisme lainnya [4].
Hidrolisis  enzimatis  pada  selulosa  hanya  dapat  dilakukan  oleh  enzim  yang  disebut  sebagai  enzim selulase. Enzim ini diproduksi oleh banyak spesies dari golongan jamur maupun bakteri. Adanya produksi enzim  ini  menyebabkan  banyak  jenis  jamur  dan  bakteri  dapat  hidup  pada  substrat  yang  mengandung selulosa sebagai sumber karbon [3][5].
Selulosa juga banyak terdapat pada  limbah pengolahan kayu. Kayu  mengandung kurang lebih 40- 50%  selulosa  [6].  Seiring  dengan  meningkatnya  penggunaan  kayu  untuk  kebutuhan  papan,  maka pengolahan kayu memegang peran yang sangat penting. Pengolahan ini akan menghasilkan limbah yang banyak  mengandung  selulosa,  dan  terus  meningkat  sesuai  dengan  jumlah  kebutuhan  yang  semakin meningkat pula [7]. Bahan selulosa terdapat secara alami berupa yang melimpah, bersifat biokompatibel, serta ramah lingkungan karena mudah mengalami penguraian di lingkungan. Selain itu, senyawa selulosa tidak  toksik  pada  organisme  dan  dapat  diperbaharui.  Secara  kimiawi  selulosa  merupakan  polimer hidrofilik  terdapat  tiga  gugus  hidroksil  reaktif.  Setiap  unit  hidroglukosa  terdiri  dari  ribuan  gugus anhidroglukosa yang berhubungan pada ikatan 1,4-glukosida. Hal ini akan membentuk molekul berantai yang  panjang  dan  linear  [5].  Kehadiran  selulosa  di  lingkungan  adalah  bercampur  dengan  lignin membentuk  lignoselulosa,  sehingga  terdapat  dalam  jaringan  kayu  bersamaan  dengan  hemiselulosa  pati dan lignin. Kombinasi anatara selulosa, hemiselulosa, dan lignin disebut lignoselulosa. Selulosa termasuk polisakarida  terbanyak  yang  ditemukan  pada  tanaman,  untuk  mendegradasi  selulosa  memerlukan  enzim selulase yang berasal dari mikroorganisme yang dapat menghasilkan enzim selulase [3].
Di  Makassar  terdapat  industri  mebel  yang  menghasilkan  cukup  banyak  limbah  kayu  yang mengandung  banyak  bahan  selulosa  dikenal  adalah  Pusat  Industri  Mebel  Antang.  Berdasarkan  hal tersebut,  maka  perlu  dilakukan  isolasi  terhadap  bakteri-bakteri  yang  mampu  mengurai  selulosa  secara enzimatis,  khususnya  dari  limbah  yang  banyak  mengandung  selulosa  seperti  limbah  kayu  yang  terdapat pada Pusat Mebel di Antang, Makassar.

## 2. Metodologi Penelitian

## Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksakan  di  Laboratorium  Mikrobiologi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar dari Maret 2019 sampai November 2019.

## Pengambilan Sampel
Sampel  berupa  limbah  dari  pengolahan  kayu  (serbuk  halus)  di  Pusat  Mebel  Kayu  Antang, Makassar diambil dengan menggunakan sendok steril dan kemudian dimasukkan ke dalam botol sampel yang sudah disterilkan, ditutup rapat  untuk dilakukan pemeriksaan lebih lanjut.

## Inokulasi dan Isolasi
Sampel ditimbang sebanyak 10 gram dan dilarutkan dalam 90 ml  aquades dan diencerkan hingga 10 -2 .  Kemudian  dihomogenkan  dan  dimasukkan  secara  aseptis  ke  dalam  4  tabung  reaksi  berisi  medium enrichment dengan  menggunakan  spoit  steril  sebanyak  masing-masing  1  ml  sampel.  Dari  tabung  berisi medium enrichment bakteri  yang  menunjukkan  adanya  pertumbuhan  bakteri  yang  ditandai  dengan terjadinya perubahan medium menjadi keruh  serta kerusakan pada kertas saring, diambil masing-masing satu  ose  biakan  secara  aseptis  untuk  diinkubasikan  dalam  medium enrichment dengan  menggunakan metode  taburan.  Setelah  itu  diinkubasikan  pada  suhu  37 o C  sampai  terlihat  adanya  pertumbuhan  koloni bakteri.  Komposisi  medium enrichment yaitu  (NH 4 ) 2 SO 4 ,  K 2 HPO 4 ,  MgSO 4 .7H 2 O,  CaCl 2 .2H 2 O,  FeCl 3 dalam 1000 ml akuades.

## Pemilahan Bakteri Pendegradasi Selulosa
Dari  tiap  koloni  bakteri  yang  tumbuh  dan  menunjukkan  perbedaan  pada  medium  selektif  diambil sebanyak  satu  ose  secara  aseptis  kemudian  diinkubasikan  kembali  pada  medium  selektif  dengan  cara goresan  dan  diinkubasikan  pada  suhu  37 o C  selama  1x24  jam.  Prosedur  ini  dilakukan  beberapa  kali sampai benar-benar diperoleh koloni bakteri yang terpisah dan murni. Komposisi medium selektif adalah (NH 4 ) 2 SO 4 ,  K 2 HPO 4 , MgSO 4 .7H 2 O,  CaCl 2 .2H 2 O,  FeCl 3 dan  agar  dalam  1000  akuades.  Isolat  yang pendegradasi selulosa memperlihatkan zona pertumbuhan yang bening.

## Pengamatan Morfologis
Setelah diperoleh koloni bakteri  yang terpisah dan telah murni dilakukan pengamatan morfologis, selanjutnya  tiap-tiap isolat digores  ke agar miring dan diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 1x24 jam. Selanjutnya dilakukan pewarnaan gram pada masing-masing isolat bakteri.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Perhitungan koloni bakteri dengan metode Standart Plate Count (SPC) mengacu pada Ref. [8] yang dilakukan dengan cara mengamati semua koloni yang tumbuh pada permukaan media agar. Berdasarkan hasil  pengamatan  pada  media Plate  Count  Agar (PCA),  terdapat  315  koloni  bakteri  yang  tumbuh  pada pengenceran  10 -5 ,  176  koloni  bakteri  pada  pengenceran  10 -6 ,  dan  43  koloni  pada  pengenceran  10 -7 . Berdasarkan pada perhitungan SPC dan didapatkan nilai 1,7 x 10 8 CFU/ml. Bakteri yang tumbuh tersebut bukan hanya bakteri selulolitik karena medium pertumbuhan yang digunakan adalah media umum PCA.
Hasil pengamatan koloni bakteri pada media PCA dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Pertumbuhan bakteri  selulolitik pada media agar PCA pada pengenceran: (A) 10 -5 , (B 10 -6 , dan (C) 10 -7
Sumber: Hasil penelitian (2019)

## Seleksi Bakteri Pendegradasi Selulosa
Bakteri  yang  tumbuh  pada  media Carboxyl  Methyl  Cellulose (CMC)  berwarna  merah  dan dikelilingi oleh zona bening. Zona bening tersebut dapat diindikasikan sebagai kemampuan suatu bakteri untuk  menghidrolisis  selulosa  [7].  Pada Gambar  2 ,  kultur  bakteri  yang  mempunyai  aktifitas  enzim selulase  yang  tinggi  dapat  mengurai  substrat  selulosa  menjadi  senyawa  sederhana  glukosa  dengan indikator  adanya  zona  bening  yang  terbentuk  di  sekeliling  koloni  [9].  Hal  ini  terkait  perubahan  struktur selulosa berserat menjadi glukosa mempuyai struktur non serat [10]. Media CMC yang terurai oleh enzim selulase  jika  ditetesi  oleh  indikator congo  red tak  terwarnai.  Ikatan  ini  terjadi  dengan  cara  non-kovalen. Hal ini menunjukkan ada proses degradasi β-D-glukan pada media agar. Warna merah juga menunjukan adanya sisa selulosa yang tidak terhidrolisis. Congo red adalah garam natrium dari benzidinediazo-bis-1 naphthylamine-4 asam sulfonat sehingga zat ini akan terlarut dan tercuci oleh garam natrium lain, seperti NaCl [11].
Gambar 2. Isolat bakteri selulolitik yang dikulturkan pada media CMC agar Sumber: Hasil penelitian (2019)

## Indeks aktivitas selulolitik
Uji  indeks  aktivitas  selulolitik  yang  dilakukan  dengan  menumbuhkan  kembali  koloni  bakteri terpisah  menggunakan  teknik  gores.  Pada  tahap  pemurnian  ini,  digunakan  metode  titik  dan  diinkubasi selama 3x24 jam sehingga terlihat adanya zona bening yang  terbentuk. Zona bening yang dihasilkan oleh bakteri  selulolitik  yang  berdiameter  diatas  4  cm  dapat  dikategorikan  tingkat  degradasi  yang  dihasilkan tinggi,  sedangkan  degradasi  rendah  berada  pada  kisaran  0,5-1,9  cm  dan  sedang  2,0-3,9  cm  [9]. Berdasarkan  hasil  pengamatan,  zona  bening  yang  diperoleh  untuk  isolat  A  sebesar  1,8  cm  dan  isolat  B sebesar 1,55 cm, kedua isolat ini dikategorikan memiliki tingkat degradasi yang rendah ( Gambar 3 ).
Gambar 3. Indeks aktivitas seluloliti: (a) Isolat bakteri A, (b) Isolat bakteri B Sumber: Hasil penelitian (2019)
A
A B
C
Perbedaan  nilai  indeks  aktivitas  selulolitik  yang  didapatkan  pada  isolat  A  dan  B  adalah  karena mengsekresikan  enzim  selulase  oleh  isolat  bakteri  memiliki  potensi  yang  berbeda  untuk  menghidrolisis substrat yang terdapat dalam media pertumbuhan. Indeks selulase menunjukkan besarnya indeks selulase pada isolat diikuti pula besarnya aktifitas selulolitik yang dihasilkan [12].
Adanya  bakteri  yang  mampu  tumbuh  pada  medium  ini  menunjukkan  bahwa  bakteri  tersebut mempunyai kemampuan menguraikan selulosa, sebab dalam medium enrichment yang digunakan sumber karbon  satu-satunya  adalah  selulosa.  Dengan  demikian  dapat  diasumsikan  bahwa  bakteri  yang  tumbuh pada medium enrichment tersebut adalah bakteri pendegradasi selulosa [13].
Untuk memperkuat dugaan bahwa bakteri yang tumbuh adalah bakteri pendegradasi selulosa, maka bakteri  tersebut  diisolasi  kembali  pada  medium  selektif  padat  yang  komposisinya  sama  dengan  medium enrichment akan  tetapi  sumber  selulosa  yang  digunakan  adalah Carboxy  Methyl  Cellulosa (CMC)  1%. Medium  ini  mempunyai  formulasi  yang  dimodifikasi  sehingga  selektif  untuk  bakteri  pengguna  selulosa sebagai  sumber  karbon.  Pertumbuhan  pada  medium  selektif  ini  ditunjukkan  oleh  adanya  koloni-koloni yang mempunyai beberapa ciri yang berbeda berdasarkan pada ciri morfologinya.
Substrat Carboxyl  Methyl  Cellulose (CMC)  yang  terkandung  dalam  media  pertumbuhan  bakteri selulolitik dapat diurai melalui bioakatalisator  yaitu  enzim selulase  atau disebut CMCase. Bakteri yang memiliki  kemampuan  tumbuh  pada  media  tersebut  membuktikan  isolat  bakteri  tersebut  adalah  bakteri selulolitik.  Media  CMC  mengandung  selulosa  yang  dumanfaatkan  oleh  bakteri  selulolitik  untuk  sumber karbon  pada  pertumbuhannya.  CMC  merupakan  turunan  selulosa  yang  memiliki  peran  penting  dan berguna sebagai agen pengemulsi, agen pensuspensi, dan sebagai pengikat dalam pembuatan tablet. Oleh karena  itu,  CMC  telah  banyak  digunakan  bidang  industri  seperti  tekstil,  obat-obatan,  makanan,  elemen listrik dan pembuatan kertas. Struktur Carboxyl Methyl Cellulose (CMC) merupakan rantai polimer yang terdiri dari unit molekul selulosa. Setiap unit anhidroglukosa memiliki tiga gugus hidroksil dan beberapa atom hidrogen dari gugus hidroksil tersebut disubstitusi oleh carboxymethyl [3]. Adanya  bakteri  yang  tumbuh  pada  medium enrichment maupun  medium  selektif,  menunjukkan bahwa  bakteri-bakteri  tersebut  mampu  menggunakan  selulosa  sebagai  sumber  karbon,  dengan  demikian mampu  mendegradasi  selulosa.  Hal  ini  disebabkan  karena  selulosa  merupakan  senyawa  polimer kompleks  yang  tidak  dapat  langsung  digunakan  oleh  mikroorganisme  sehingga  harus  diuraikan  terlebih dulu menjadi molekul-molekul yang lebih sederhana [14].
Proses  perombakan  selulosa  tersebut  melalui  mekanisme  bahwa  enzim  selulase  yang  dihasilkan dalam  sel  tetapi  merupakan  enzim  ekstrakseluler  selanjutnya  pada  pada  media  pertumbuhannya dikeluarkan.  Enzim  selulase  dapat  merombak  ikatan  β-1,4-glikosidik.  Berdasarkan  hal  ini,  maka  enzim selulase  dapat  dibagai  menjadi  tiga  komponen,  yaitu  endo-1,4-β-D-glukanase,  ekso  -1,4-β-D-glukanase, dan  β-D-glukosidase.  Ketiga  pada  kelompok  enzim  tersebut  dapat  terjadi  sinergisme  dalam  mengurai substrat  selulosa  menjadi  glukosa.  Adapun  mekanisme  kerja  enzim  selulase  dalam  merombak  selulosa, terlihat  dari  terjadinya  perubahan  komposisi  karbohidrat  (nilai  gula  total,  gula  pereduksi,  derajat polimerisasi dan dekstrosa ekuivalen) dalam substrat selama waktu tertentu [3].

## Karakterisik Bakteri Pendegradasi Selulosa
Berdasarkan karakteristik morfologi  yang meliputi warna, tepi, elevasi, struktur dalam, sifat gram, dan bentuk sel koloni, didapatkan 11 jenis isolat ( Tabel 1 ). Dari ke-11 isolat yang didapatkan, isolat B, C, dan  I  memperlihatkan  pertumbuhan  yang  lebih  cepat  pada  medium  selektif  dibandingkan  dengan  isolat yang lain, yaitu kurang dari 24 jam, sedangkan isolat yang lain memperlihatkan pertumbuhannya setelah lewat dari 24 jam.
Berdasarkan  hasil  pengamatan  morfologi  pada Tabel  1 menunjukkan  bahwa  ke-11  isolat  yang diperoleh  mempunyai  bentuk  koloni  yang  sama  yaitu  bentuk  bulat  ( circular ),  sedangkan  warna  koloni bervariasi  yaitu  kuning  muda  untuk  isolat  A,  B,  E,  H,  dan  J,  warna  putih  untuk  isolat  C,  F  dan  G, berwarna putih kekuningan untuk isolat  I dan ada koloni yang tidak menampakkan  warna pada medium (bening) didapatkan pada isolat D dan L. Pengamatan pada tepi koloni menunjukkan bahwa untuk isolat A, B, D, E, J, dan K mempunyai tepi koloni yang rata ( entire ), isolat C, F, G, dan I tepi koloninya bersilia ( ciliate )  sedangkan  pada  isolat  H  tepi  koloninya  bergelombang  ( lacerate ).  Untuk  elevasi  koloni, didapatkan  koloni  yang  elevasinya  cembung  ( convex )  yaitu  pada  isolat  B  dan  F,  agak  cembung  ( low convex ) pada isolat A, C, D, E, I, J dan K, sedangkan untuk isolat G dan H elevasi koloninya rata ( effuse ).
p-ISSN : 2528-3561 e-ISSN : 2541-1934
Tabel 1. Ciri morfologi isolat bakteri pendegradasi selulosa Isolat Bentuk Koloni Warna Koloni Tepi Koloni Elevasi Koloni Struktur Dalam Gram Bentuk Sel A bulat km rata AC TC neg. bulat B bulat km rata C TTC neg. btpd C bulat pth bsl AC TTC neg. btpd D bulat bng rata AC TC neg. bulat E bulat km rata AC TCS neg. bulat F bulat pth bsl C Flmt. neg. bulat G bulat pth bsl RT TCS neg. bulat H bulat km bglb RT TCS neg. bulat I bulat pk bsl AC TTC neg. bulat J bulat km rata AC TCS neg. bulat K bulat bng rata AC TC neg. btpd Sumber: Hasil penelitian (2019)
Ada beberapa struktur dalam koloni yang didapatkan, yaitu pada isolat A, D, dan K adalah tembus cahaya ( transparant ), isolat G, H, dan J adalah tembus cahaya  sebagian ( translucen t), isolat B, C, dan I adalah tidak tembus cahaya ( opaque ) dan untuk isolat F struktur dalamnya adalah filamen ( filamentous ). Pengamatan  bentuk  sel  bakteri  yang  dilakukan  dengan  menggunakan  mikroskop,  didapatkan  2 (dua)  bentuk  sel  yaitu  bentuk  batang  pendek  untuk  isolat  B,  C,  dan  K,  dan  bentuk  sel  bulat  didapatkan pada  isolat  A,  D,  E,  F,  G,  H,  I,  dan  J.  Sedangkan  hasil  pengamatan  pada  pengecatan  gram  didapatkan bahwa  semua  koloni  yang  didapatkan  menunjukkan  sifat  gram  negatif  yaitu  bahwa  dinding  sel  bakteri tidak  mampu  mengikat  zat  warna  kristal  violet  tetapi  mampu  mengikat  (menyerap)  zat  warna  safranin [15].

## 4. Kesimpulan
Dari  hasil  penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  pada  limbah  industri  kayu  di  Antang  Makassar terdapat  bakteri  pendegradasi  selulosa  berdasarkan  hasil  pemilahan  menggunakan  medium Carboxy Methyl Cellulose (CMC) ditandai dengan terbentuknya zona bening. Berdasarkan karakteristik morfologi secara makroskopis dan mikroskopis diperoleh sebelas jenis isolat bakteri pendegradasi selulosa.
5. Singkatan
km kuning muda pth putih bng bening pk putih kekuningan bsl bersilia bglb bergelombang C cembung AC agak cembung RT rata TC tembus cahaya TCS tembus cahaya sebagian Flmt. filamen btpd batang pendek neg. gram negatif

## 6. Referensi
[1] S.  R.  Adawiyah,  Fahruddin,  dan  K.  Mustari,  “Aplikasi  isolat  bakteri  dari  TPA  Tamangapa Makassar dalam proses pengomposan sampah organik rumah tangga,” Celebes Biodiversitas , vol. 1, pp. 40 – 44, 2017.
[2] A.  Andriany,  F.  Fahruddin,  dan  A.  Abdullah,  “Pengaruh  jenis  bioaktivator  terhadap  laju dekomposisi  seresah  daun  jati Tectona  grandis L.f.,  di  wilayah  Kampus  Unhas  Tamalanrea,” Bioma: Jurnal Biologi Makassar , vol. 3, pp. 31–42, 2018.
[3] P. Bajpai,“Application of enzymes in the pulp and paper industry,” Biotechnol. Prog. , vol. 15, pp. 147–157, 1999.
[4] K.  Septiningrum,  dan  I.  Pramuaji,  “Aplikasi  enzim  di  industri  pulp  dan  kertas:  I.  bidang  pulp,” Jurnal Selulosa, vol. 7, pp. 1–16, 2017.
[5] S.  A.  Yogyaswari,  M.  I.  Rukmi,  dan  B.  Raharjo,  “Ekplorasi  bakteri  selulolitik  dari  cairan  rumen sapi Peranakan Fries Holland (PFH) dan Limousine Peranakan Ongole (Limpo),” Jurnal Biologi , vol. 5, pp. 70–80, 2016.
[6] D.  Fengel,  dan  G.  Wejener, Kayu:  Kimia,  Ultrastruktur  dan  Reaksi-reaksi .  Yogyakarta:  Gajah Mada University Press, 1995.
[7] H. R. Gohel, C. N. Contractor, S. K. Ghosh, and V. J. Braganza, “A comparative study of various staining  techniques  for  determination  of  extra  cellular  cellulase  activity  on  Carboxy  Methyl Cellulose (CMC) agar plates,” Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci., vol. 3, pp. 261–266, 2014.
[8] A. Margarida, S.  Idalina, M.  Ana,  N. Maria, O. Pereira, “Improvements on  colony morphology identification towards bacterial profiling,” J. Microbiol. Methods. Vol. 95, pp. 327-335, 2013.
[9] H.  Setyoko,  dan  B.  Utami,  “Isolasi  dan  karakteristik  enzim  selulase  cairan  rumen  sapi  untuk hidrolisis biomassa,” Proceeding Biology Education Conference , vol. 13, pp. 863–867, 2016.
[10] D. Monariqsa, N. Oktora, A. Azora, D. A. N. Haloho, L. Simanjuntak, A. Musri, A. Saputra, dan A. Lesbani, “Ekstraksi selulosa dari kayu gelam ( Melaleuca leucadendron Linn ) dan kayu serbuk industri mebel,” Jurnal Penelitian Sains , vol. 15, pp. 96–101, 2012.
[11] J.  Hegner,  K.  C.  Pereira,  B.  DeBoef,  and  B.  L.  Lucht,  “Conversion  of  cellulose  to  glucose  and levulinic acid via solid-supported acid catalysis,” Tetrahedron Lett ., vol. 51, pp. 2356–2358, 2010.
[12] H. Murtiyaningsih, dan M. Hazmi, “Isolasi dan uji aktivitas enzim selulase pada bakteri selulolitik asal tanah sampah,” Agritrop , vol. 15, pp. 293–308, 2017.
[13] P. N. Trisanti, S. Setiawan, E. Nura’ini, dan  S. Sumarno, “Ekstraksi selulosa dari  serbuk  gergaji kayu  sengon  melalui  proses  delignifikasi  alkali  ultrasonik,” Jurnal  Sains  Materi  Indonesia ,  vol. 19, pp. 113–119, 2018.
[14] N. Kamal, “Pengaruh bahan aditif CMC ( Carboxyl Methyl Cellulose ) terhadap beberapa parameter pada larutan sukrosa,” Jurnal Teknologi , vol. 1, pp. 78–84, 2010.
[15] H. G. Schlegel, and K. Schmidt. 1994. Mikrobiologi Umum . Yogyakarta: Gajah Mada University Press, 1994.