AKTIVITAS SITOTOKSIK SENYAWA METABOLIT SEKUNDER KAPANG ENDOFIT Evodia suaveolens DENGAN METODE BSLT ( Brine Shrimp Lethality Test)
Azmi Azhari
Jurusan Pendidikan IPA Biologi,FITK, IAIN Syekh Nurjati Cirebon azmi.biochemist@gmail.com

## Abstrak
Kanker  adalah  penyakit  degeneratif  dengan  kasus  yang  makin  meningkat  setiap tahunnya.  Menurut  WHO  (World  Health  Organization)  (2003)    kasus  kanker dunia diprediksi akan mengalami peningkatan 50%  menjadi 15 juta kasus pada tahun  2020.    Oleh  sebab  itu,  diperlukan  obat  antikanker  yang  mencukupi kebutuhan  dan juga  efektif.  Evodia  suaveolens atau Zodia  adalah  tanaman khas Indonesia  timur  yang  diketahuimengandung  suatu  senyawaantikakner  yaitu evodiamin.  Evodiamin  yang  dihasilkan  dari  Zodia  tidaklah  banyak  sehingga diperlukan  inovasi  baru.Pemanfaatan  kapang  endofit  yang  diisolasi  dari  Evodia suaveolens  diharapkan  dapat  menjadi  solusi  produksi  Evodiamin  yang  kurang efektif  dari  tanamannya  langsung.  Produksi  senyawa  dengan  mikroorganisme akan  lebih  cepat  daripada  produksi  dengan  organisme  multiseluler  dan  potensi industri  skala  massalnya  terbuka.  Kapang  endofit  yang  tumbuh  dari  suatu jaringan tanaman akan lebih dari satu jenis kapang, maka perlu ada uji screening awal  untuk  memilih  kapang  terbaik,  salah  satunya  adalah  denga  metode  BSLT. Isolasi kapang endofit dari batang Evodia suaveolens menghasilkan 8 isolat. Nilai LC 50 dari  masing-masing  kapang  endofit  adalah    kapang  1  memiliki  nilai  315 ppm, kapang 3 memiliki nilai 270 ppm, kapang 5 memiliki nilai 400 ppm, kapang 7  memiliki  nilai  19.7  ppm  dan  kapang  8  memiliki  nilai  403  ppm.  Nilai  ini membuktikan  konsentrasi  tersebut  dapat  membunuh  populasi  Artemia  salina sebanyak 50%.

## PENDAHULUAN
Kanker  merupakan  penyakit  degeneratif  yang  mematikan.  Menurut  WHO (World  Health  Organization) (2003)    kasus  kanker  dunia  diprediksi  akan mengalami peningkatan 50%  menjadi 15 juta kasus pada tahun 2020.  Sebagian besar  penyakit  kanker  disebabkan  oleh  lingkungan  dan  gaya  hidup.  Faktor
lingkungan yang menyebabkan kanker antara lain polusi, asap rokok, radiasi, dan infeksi organisme. Faktor gaya hidup yaitu kebiasaan merokok, konsumsi alkohol, makanan  yang  mengandung  bahan  tambahan  pangan  yang  karsinogenik,dan makanan  berlemak trans serta  obesitas.  (Jemal  2011).  Teknologi  untuk  terapi kanker  seperti  pembedahan,  radiasi,  terapi  hormon  dan  kemoterapi  banyak dikembangkan saat ini, namun pengobatan ini memerlukan biaya yang mahal dan memiliki efek samping yang tidak baik bagi tubuh, untuk itu perlu dikembangkan suatu  pengobatan  yang  dapat  mengobati  kanker  dengan  kemampuan  mengobati yang kuat dan tanpa efek samping.
Indonesia  merupakan  negara  yang  memiliki  kekayaan  alam  yang  sangat melimpah.  Kekayaan  sumber  tanaman  herbal  yang  beragam,  memiliki  potensi obat  yang  besar,  salah  satunya  adalah  anti  kanker.  Tanaman  yang  memiliki potensi anti kanker adalah tanaman zodia (evodia suaveolens) . Zodia merupakan tanaman asli daerah irian (papua) (Kardinan 2007), tanaman ini  biasa digunakan untuk  mengusir  nyamuk,  dengan  cara  menggosokkan  daunnya  ke  kulit.  Studi terbaru  membuktikan  bahwa  kandungan  senyawa  evodiamin  dari  zodia mempunyai  aktivitas  yang  baik  sebagai  anti  kanker.  Senyawa  aktif  evodiamin dapatmenghambat proliferation, invasion, metastasis dan mempercepat apoptosis beragam  sel  kanker  (Jiang  2009).  Namun  pengembangan  obat  yang  berbahan dasar  zodia  masih  menghadapi  kendala,  senyawa  aktif  yang  diperoleh  dari tanaman zodia tidaklah banyak, sehingga diperlukan tanaman yang banyak untuk mendapatkan  senyawa  tersebut.  Terbatasnya  sumber  daya  alam,  dan  waktu tumbuh  tanaman  yang  lama  membuat  efisiensi  produksi  obat  ini  menjadi  turun. Pengembangan  teknologi  produksi  senyawa  aktif  dari  tanaman  obat merupakan  teknologi  yang  memiliki  prospek  yang  baik.  Salah  satu  bioteknologi yang dapat digunakan untuk menghasilkan senyawa obat dalam skala besar adalah dengan  menggunakan  metabolit  sekunder  yang  diekstrak  dari  kapang  endofit. Penggunaan kapang  endofit dapat  meningkatkan efisiensi produksi senyawa anti kanker,  masa  berkembangbiak  kapang  endofit  yang  relatif  singkat  dengan  laju pertumbuhan  yang tinggi memungkinkan produksi senyawa anti kanker semakin efisien dalam jumlah besar.
Senyawa bioaktif antikanker yang akan digunakan untuk produk antikanker harus  diujikan  terlebih  dahulu  dengan  uji  sitotoksik.  Uji  sitotoksik  merupakan salah  satu  pengembangan  metode  untuk  memprediksi  keberadaan  senyawa  yang bersifat  toksik  pada  sel  (Kurnijasanti et  al .  2008).  Salah  satu  metode  uji sitotosisitas  adalah Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT)  yang  dapat  digunakan
untuk praskrining terhadap senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai anti tumor (Sukardiman et al . 2004 dalam Widyastuti 2008)
Penelitian ini akan menggunakan fraksi murni ekstrak kapang endofit yang diisolaisi  dari  daun  Zodia.  Perlakuan  dengan  menggunakan  fraksi  ini  akan  diuji dengan menggunakan beberapa perlakuan dosis untuk mendapatkan hasil induksi yang  lebih  efektif  sehingga  dapat  mendorong  pengembangan  tanaman  Zodia sebagai  produk  fitofarmaka  khususnya  dalam  upaya  terapi  pengobatan  penyakit kanker.  Diharapkan  dengan  penelitian  ini  dapat  memberikan  manfaat  dalam pemenuhan  kebutuhan  senyawa  anti  kanker  yang  murah  dan  memiliki  aktivitas yang  tinggi,  serta  dapat  menjadi  rujukan  bagi  industri  farmasi  Indonesia  untuk memproduksi senyawa bioaktif dalam skala besar.

## METODOLOGI
Penelitian  ini  terdiri  dari  5  tahapan,  yaitu  isolasi  dan  pemurnian  kapang endofit,  peremajaan  kapang  endofit,  fermentasi,  ekstraksi  senyawa  metabolit sekunder, dan uji toksisitas dengan menggunakan BSLT ( Brine Shrimp Lethality Test) dengan menggunakan LC 50 .

## Isolasi dan pemurnian kapang endofit
Batang  tanaman Evodia  suaveolens dengan  panjang  2  cm  dan  lebar  1  cm dicuci  dengan  air  mengalir,  lalu  disterilkan  dengan  etanol  70%  selama  1  menit, natrium hipoklorit 5,3% selama 5 menit, dan etanol 75% selama 0,5 menit. Bagian batang dibelah dua secara longitudinal, lalu diletakkan di atas cawan petri berisi PDA  yang  telah  dicampur  dengan  kloramfenikol  0,05  mg/mL  (Theantana  et  al. 2007).  Keduanya  diinkubasi  selama  3  hari  pada  suhu  25 o C,  kemudian  koloni dipindahkan ke PDA dalam cawan petri dan selanjutnya diinkubasi lagi pada suhu 25 o C  dan  dilakukan  pengecekan  secara  berkala  untuk  pemurnian  lebih  lanjut. Masing-masing endofit diisolasi melalui beberapa kali ditanam pada agar miring (PDA)  dan  diinkubasi  dalam  inkubator  suhu  25 o C,  selanjutnya  setiap  3  bulan sekali  diremajakan  kembali.  Sebagian  isolat  mikroba  endofit  disimpan  dalam medium PDA pada suhu -80 o C

## Peremajaan Kapang Endofit dari Isolat (Pelczar dan Chan 2008)
Inokulasi  isolat  kapang  endofit  dilakukan  secara  aseptis  di  dalam  laminar. Laminar terlebih dahulu disterilkan dengan penyinaran sinar ultraviolet selama 1
jam  kemudian  seluruh  bagian  dalam  laminar  dan  bagian  luar  kaca  disemprot dengan etanol teknis. Isolat kapang endofit dari agar miring diinokulasi ke dalam media PDA kemudian diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar.

## Fermentasi Kapang Endofit (Modifikasi Kumala dan Muhamad 2008)
Isolat  kapang  yang  telah  diremajakan  masing-masing  diinokulasikan  ke dalam  tabung  Erlenmeyer  berisi  50  ml  media  PDB.  Tiap  tabung  Erlenmeyer difementasi  dengan  metode  statik  pada  suhu  kamar  selama  12  hari.  Metode selanjutnya akan diekstrak dengan kloroform.

## Ekstraksi Metabolit Sekunder (Kumala dan Muhamad 2008)
Tiap  bagian  diekstrak  dengan  pelarut  masing-masing  sebanyak  tiga  kali ekstrak dan pada tiap ekstraksi digunakan pelarut sebanyak 50 ml.  Fase pelarut ditampung  dalam  botol  yang  telah  diketahui  bobot  kosongnya.  Hasil  ekstraksi diuapkan  dibawah  kipas  angin  hingga  tertinggal  residunya.  Bobot  ekstrak diperoleh  dari  selisih  antara  bobot  botol  kosong  dan  bobot  botol  berisi  ekstrak. Ekstrak  didalam  botol  dipindahkan  ke  vial  yang  lebih  kecil  dengan  dilarutkan terlebih  dahulu  dengan  pelarutnya.  Untuk  membantu  melarutkan  kerak  yang tertinggal, digunakan alat sonikator.

## UJI BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) (Meyer et al 1982)
Telur  udang Artemia  salina L  sebanyak  1  sudip  dilrutkan  dalam  250 ml  air  laur  dalam  sebuah  labu  Erlenmeyer,  dimasukan  aerator,  dan didiamkan  selama  1x24  jam  agar  menjadi  larva  udang.  Selanjutnya disampakan  larutan  sampel  dengan  konsentrasi  masing-masing  500  ppm, 100  ppm,  50  ppm,  dan  10  ppm.  Perhitungan  larva  yang  masih  hidup  dan yang mati dilakukan setelah 24 jam untuk menentukan nilai LC 50 .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kapang  endofit  adalah  kapang  yang  hidup  pada  tumbuhan,  dan  bersifat menguntungkan (saprofit) bagi inangnya. Kapang endofit yang digunakan berasal dari  batang  Zodia.  Tahapan  pertama  adalah  proses  isolasi.  Tujuan  utama  dari tahapan  ini  adalah  untuk  mengisolasi  kapang  yang  ada  di  dalam  batang  Zodia tersebut.
Penelitian ini dimulai dengan pencucian batang Zodia dengan dialirkan air
selama  10  menit  untuk  menghilangkan  kotoran.  Setelah  itu,  batang  dipotong, dilakukan  sterilisasi  dan  diletakkan  pada  media  PDA  ( Potatos  Dextrose  Agar) yang  telah  dibuat.  Proses  sterilisasi  berurutan  dengan  menggunakan  etanol, sodium  hipoklorit  (NaOCl),  dan  etanol  dengan  perbandingan  waktu  pencelupan 1:5:0.5  menit.  Hal  ini  dimaksudkan  untuk  membunuh  kapang  dan  bakteri  yang berasal  dari  permukaan  batang,  sehingga  yang  diisolasi  hanya  kapang  yang berasal  dari  jaringan  tanaman.  PDA  sebelumnya  telah  ditambahkan  dengan kloramfenikol dengan tujuan sebagai  antibakteri.  Setelah  itu,  media PDA berisi batang tanaman diinkubasi selama 1-2 minggu.
Banyaknya  isolat  yang  akan  dihasilkan  bergantung  pada  media  yang digunakan. Penggunaan media yang berbeda akan menghasilkan kekayaan spesies yang berbeda. Pada tahapan isolasi ini dihasilkan kapang isolat sebanyak 8 kapang yang disajikan pada gambar 1.
Kapang 1 Kapang 2 Kapang 3 Kapang 4 Kapang 5 Kapang 6 Kapang 7 Kapang 8 Gambar 1 Isolat kapang endofit Evodia suaveolens
Tahapan  kedua  adalah  proses  fermentasi.  Proses  ini  bertujuan  untuk menumbuhkan dan menghasilkan produk senyawa metabolit sekunder. Isolat yang dihasilkan, ditumbuhkan lagi pada media PDB ( Potato Dextrose Broth) yang telah disterilisasi.  Setelah  itu,  dilakukan  fermentasi  selama  12  hari  pada  suhu  ruang yang  dilakukan  dengan  statis.  Adapun  maksud  dilakukannya  fermentasi  statis adalah  agar  senyawa  yang  dihasilkan  lebih  banyak.  Namun,  fermentasi  dinamis tetap  dilakukan  dengan  maksud  untuk  mengetahui  perbandingan  hasil  metabolit sekunder yang dihasilkan. Fermentasi dinamis dilakukan pada suhu 28 o C dengan agitasi  170  rpm.  Setelah  fermentasi,  dilakukan  ekstraksi  dengan  menggunakan kloroform  dengan  tujuan  mengekstrak  senyawa  alkaloid  yaitu  evodiamin (Winarno 2006).
Pada  tabel  1  diperlihatkan  bobot  residu  hasil  ekstrak  dari  kloroform  yang telah diuapkan.
Tabel 1 Bobot Ekstrak Kloroform dari Kapang Endofit Evodia suaveolens. Nomor Kapang Bobot Ekstrak (Gram) Fermentasi Dinamis Bobot Ekstrak (Gram) Fermentasi Statis Kapang 1 Kapang 2 Kapang 3 Kapang 4 Kapang 5 Kapang 6 Kapang 7 Kapang 8 0.03 0.03 0.02 0.02 0.03 0.03 0.03 0.02 0.41 0.21 0.10 0.11 0.06 0.05 0.08 0.10
Dari tabel diatas, diperlihatkan pada fermentasi statis hasil yang diperoleh lebih banyak dari pada fermentasi dinamis.Produksi dengan fermentasi statis lebih banyak  dibandingkan  dinamis,  disebabkan  kemungkinan  produk  digunakan kembali oleh kapang tersebut.
Tahapan  yang  terakhir  dilakukan  adalah  pengujian  dengan  menggunakan metode BSLT ( Brine Shrimp Lethality Test) dengan menguji LC 50 . Tujuan utama dari tahapan ini adalah untuk mengetahui konsentrasi yang dapat membunuh dari setengah  populasi Artemia  salina. Nilai  tersebut  menggambarkan  bioaktifitas metabolit yang dihasilkan. Semakin kecil nilai konsentrasi yang dapat membunuh setengah  populasi  larva  maka  akan  semakin  tinggi  bioaktivitasnya,  begitu  pula sebaliknya.  Pada  uji  ini  akan  dipilih  kapang  yang  memiliki  bioaktivitas  yang terbaik.
Gambar 2 Aktivitas Sitotoksik dari isolat kapang endofit Evodia suaveolens.
0 100 200 300 400 500 Nilai LC50 Nilai LC 50
Dari  gambar  2  diperlihatkan  bahwa  kapang  1  memiliki  nilai  315  ppm, kapang  3  memiliki  nilai  270  ppm,  kapang  5  memiliki  nilai  400  ppm,  kapang  7 memiliki  nilai  19.7  ppm  dan  kapang  8  memiliki  nilai  403  ppm.  Nilai  tersebut menunjukan  konsentrasi  yang  dapat  membunuh  dari  setengah  populasi Artemia salina. Sedangkan  untuk  kapang  2,  kapang  4,  dan  kapang  6  tidak  memiliki bioaktifitas  dan  daya  toksik  pada  konsentrasi  500,  100,  50  dan  10  ppm. Kemungkinan  kapang  2,  4,  6  daya  bioaktif  diatas  500  ppm.  Kapang  yang memiliki  bioaktivitas  tertinggi  terdapat  pada  kapang  7.  Kapang  ini  diperkirakan mempunyai  aktivitas sitotoksik  yang cukup tinggi dan dapat diuji untuk tahapan selanjutnya,

## SIMPULAN DAN SARAN
Isolasi  kapang  endofit  dari  batang Evodia  suaveolens menghasilkan  8 isolat.  Aktivitas  sitotoksik  tertinggi  terdapat  pada  kapang  7.  Penelitian  ini  perlu dilanjutkan  dengan  penelitian  lanjutan  untuk  menguji  lebih  lanjut  senyawa  yang dihasilkan dari kapang tersebut dan aktivitas terhadap sel kanker. Dengan adanya penelitian  ini,  diharapkan  senyawa  antikanker  dapat  diproduksi  lebih  murahdan memenuhi kebutuhan.

## DAFTAR PUSTAKA
Jemal  A,  Bray    F,  Center  MM,  Ferlay  J,  Ward  E,  Forman  D  .  2011.  Global  cancer statistics. CA: a cancer journal for clinicians 61 (2): 69–90.
Jiang,  J,  Hu,  C.  2009.Evodiamin:  A  Novel  Anti-Cancer  Alkaloid  from Evodia rutaecarpa . Molecules 14 , 1852-1859
Kardinan, Agus. 2007. Tanaman Pengusir Dan Pembasmi Nyamuk. Agromedia Pustaka.
Jakarta.
Kumala  Shirly,  Muhammad  Gembong.  2005. Isolasi  dan  Penapisan  Kapang Endofit  Tanaman  Secang  (Caesalpinia  sappan  L.)  sebagai  Penghasil Senyawa  Antibakteri. MEDICINUS(Scientific  Journal  of  Pharmaceutical Development  and  Medical  Application)  21  :15  [terhubung  berkala] http://lib.atmajaya.ac.id/default.aspx?tabID=61&id=129265&src=a [28 September 2011].
Kurnijasanti  Rochmah,  Hamid  Iwan  Sahrial,  Rahmawati  Kadek.  2008.  Efek
Sitotoksis in  vitro dari  Ekstrak  Buah  Mahkota  Dewa  ( Phaleria macrocarpa) terhadap  Kultur  Sel  Kanker  Mieloma.  J.  Penelit.  Med. Eksakta 7 ( 1) : 48-54.
Mayer,  A.,  Gustafson,  K.  2008.  “Marine  Pharmacology  in  2005–2006: Antitumour and Cytotoxic Compounds”. EuropeanJournal Of Cancer 44 ( 2008 ) 2357–2387
Melliawati et  al.  2006. Pengkajian Bakteri Endofit  Penghasil  Senyawa  Bioaktif untuk Proteksi Tanaman . Biodiversitas 7(3): 221-224.
Meyer  BN  et  al.  1982.  Brine  shrimp:  a  convenient  general  bioassay  for  active plants constituent . J Medical Plant Res 45:31-34.
Michael lam. 2003. Beating cancer with natural medicine .bloomington: USA.
Pelczar JR, Han ES. 1996. Dasar-dasar Mikrobiologi . Jakarta: UI Pr.
Theantana  T.,  K.O.  Hyde  and  S.  Lurnyong.  2007.  Asparaginase  production  by endophytic fungi isolated from some thai medical plants. KMITL Science Technology· Joumc;~L 7 (1): 13-18
Widyastuti,  Shanti.  2008.  Uji  Toksisitas  Ekstrak  Daun  Iprih  ( Ficus  glabella Blume) terhadap Artemia  salina Leach  dan  Profil  Kromatografi  Lapis  Tipis.  Jurusan Farmasi Universitas Muhamadiyah Surakarta
Winarno EK. 2006.Produksi Alkaloid oleh Mikroba Endofit  yang Diisolasi dari Batang Kina Cinchona  Ledgeriana Moens dan  Cinchona Pubescens Vahl (Rubiaceae). Jurnal Kimia Indonesia. (2):8-15