Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip https://doi.org/10.6066/jtip.2023.34.1.119 Hasil Penelitian

## Sensitivitas Real-Time Polymerase Chain Reaction dengan Primer Tanabe dalam Mendeteksi Gelatin Babi pada Confectionery

## [Sensitivity of Real-Time Polymerase Chain Reaction with Primer Tanabe for Detecting Porcine Gelatin in Confectionery]
Said Naufal Hibaturrahman 1) , Feri Kusnandar 1,2,3) , Nancy Dewi Yuliana 1,2,3)* , dan Heryani 2)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB University, Bogor, Indonesia
2) Lembaga Pengkajian Pangan Obat-obatan dan Kosmetik Majelis Ulama Indonesia, Global Halal Center, Bogor, Indonesia
3) Pusat Kajian Sains Halal, IPB University, Bogor, Indonesia
Diterima 18 November 2022 / Disetujui 29 Mei 2023

## ABSTRACT
Gelatin is commonly used as a gelling and thickening agent in confectionery products and is considered a  critical  material  in  terms  of  its  halal  status.  Real-time  Polymerase  Chain  Reaction  (real-time  PCR)  is frequently employed as an analytical tool to detect traces of pork in food items. Although the real-time PCR method  using  the  Tanabe  primer  and  Internal  Positive  Control  (IPC)  has  been  validated  effectively,  its sensitivity or Limit of Detection (LOD) for confectionery products has yet to be determined. This study aims to  determine  the  sensitivity  of  real-time  PCR  with  Tanabe  primers  and  IPC  towards  the  confectionery products  (gummy  candy,  marshmallow,  and  lozenges).  Confirmation  of  this  method  on  commercial marshmallow products known to contain porcine gelatin was also carried out. In this study, the LOD (% w/w) of porcine gelatin in bovine gelatin was initially determined. The findings revealed that the LOD (% w/w) was 0.01% with a cycle threshold (Ct) value of 39.20±1.72. The next step involved determining the LOD (% w/w) of porcine gelatin in various confectionery products such as lozenges, gummy candy, and marshmallows. The LOD (% w/w) for lozenges and gummy candy was found to be 0.1% with Ct values of 40.93±0.15 and 38.72±0.18, respectively. Marshmallows exhibited an LOD of 0.01% with a Ct value of 41.14±2.96. Finally, this method was applied to commercial confectionery products containing porcine gelatin, and the real-time PCR effectively detected porcine gelatin with high sensitivity.
Keywords: confectionery, LOD, porcine gelatin, real-time PCR

## ABSTRAK
1
Gelatin merupakan salah satu ingredien yang banyak digunakan sebagai bahan pembentuk gel dan pengental  dalam  produk confectionery dan  sebagai  bahan  kritis  dari  segi  kehalalannya. Real-time Polymerase  Chain  Reaction ( real-time PCR)  banyak  digunakan  untuk  mendeteksi  residu  babi  di  dalam produk. Sejauh ini, belum ada penelitian yang melaporkan sensitivitas atau limit deteksi (LOD) metode real- time PCR dengan primer Tanabe dan Internal Positive Control (IPC) dalam mendeteksi gelatin babi pada produk confectionery . Penelitian ini bertujuan untuk menentukan sensitivitas metode real-time PCR dengan primer  Tanabe  dan  IPC  terhadap  produk confectionery ( gummy  candy , marshmallow ,  dan  lozenges). Konfirmasi metode tersebut terhadap produk marshmallow komersial yang diketahui mengandung gelatin babi juga dilakukan. Penelitian ini diawali dengan penentuan LOD (% b/b) gelatin babi di dalam gelatin sapi. Hasilnya menunjukkan bahwa nilai LOD pada sampel tersebut adalah 0,01% dengan nilai cycle threshold (Ct) 39,20±1,72. Tahap kedua adalah menentukan LOD (% b/b) gelatin babi di dalam produk confectionery seperti lozenges, gummy candy , dan marshmallow . LOD (% b/b) gelatin babi pada lozenges dan gummy candy adalah 0,1% dengan nilai Ct masing-masing sebesar 40,93±0,15 dan 38,72±0,18, sedangkan LOD untuk  sampel marshmallow adalah  0,01%  dengan  nilai  Ct  41,14±2,96.  Tahap  terakhir  adalah mengaplikasikan  metode  tersebut  terhadap  produk confectionery komersial  yang  diketahui  mengandung gelatin babi. Hasilnya menunjukkan bahwa semua sampel dapat terdeteksi dengan baik. Hasil penelitian ini menunjukkan  bahwa  metode real-time PCR  dengan  primer  Tanabe  dan  IPC  mampu  mendeteksi  gelatin babi pada produk confectionery dengan sensitivitas yang tinggi.
Kata kunci: gelatin babi, LOD, produk confectionery , real-time PCR
*Penulis Korespondensi: E-mail: nancy_dewi@apps.ipb.ac.id

## PENDAHULUAN
Indonesia merupakan salah satu negara dengan mayoritas penduduknya beragama Islam.  Konsumsi produk  pangan  halal  di  Indonesia  dapat  mencapai 146,7  miliar  USD  (Global  Islamic  Economic  Report, 2022).  Oleh  karena  itu,  penyediaan  produk  pangan halal  sangat  penting  untuk  melindungi  masyarakat muslim  di  Indonesia.  Berdasarkan  Undang-undang Nomor 33 Tahun 2014 tentang Sistem Jaminan Halal, produk  pangan  yang  beredar  di  Indonesia  wajib disertifikasi  halal  sebagai  jaminan  status  kehalal- annya.
Salah  satu  ingredien  yang  banyak  digunakan dan sangat menentukan dari status kehalalan produk pangan  adalah  gelatin.  Gelatin  merupakan  produk turunan  protein  dari  kolagen  hewan  melalui  proses hidrolisis  parsial  (Hassan et  al., 2018).  Indonesia masih harus memenuhi kebutuhan gelatin dari impor, baik  untuk  kebutuhan  pangan  maupun  non-pangan. Berdasarkan  data  dari  Badan  Pusat  Statistik  (BPS) tahun 2020, jumlah impor gelatin mencapai 4658,966 ton.  Gelatin  dapat  diproduksi  dari  tulang  atau  kulit, seperti dari sapi, ikan, kerbau atau babi. Grand View Research (2020) melaporkan bahwa kulit babi meru- pakan  sumber  gelatin  yang  mendominasi  di  pasar gelatin dunia yang menyumbang  28,9% pada tahun 2019.
Gelatin  banyak  digunakan  dalam  produk con- fectionery karena  memiliki  kemampuan  membentuk gel  dan  mengentalkan  yang  baik  (Sultana et  al., 2018). Produk confectionery yang diimpor ke Indone- sia  dapat  mencapai  5884,51  ton  pada  tahun  2020 (BPS, 2020). Produk ini memiliki peluang yang tinggi untuk  menggunakan  gelatin  babi  karena  harganya yang  relatif  murah  dan  ketersediannya  yang  melim- pah dibandingkan dengan gelatin dari sumber lainnya (Sultana et al., 2018). Gelatin  babi dapat diproduksi dalam waktu yang lebih singkat (30 hari) dibanding- kan gelatin sapi (60-80 hari). Gelatin babi juga memi- liki  kualitas  gelatin  yang  baik,  dan  biaya  produksi yang relatif rendah (Sultana et al., 2018; Kamandi et al., 2022). Mengingat kemungkinan adanya penggu- naan  gelatin  babi,  baik  sengaja  digunakan  maupun akibat tercampur oleh sumber gelatin lainnya, maka autentikasi  dan  konfirmasi  terhadap  gelatin  maupun produk confectionery penting dilakukan untuk meng- identifikasi ada tidaknya cemaran gelatin babi.
Berbagai macam metode telah dilakukan dalam menentukan  sensitivitas  berupa Limit  of  Detection (LOD) yang berdasarkan berat gelatin babi (% b/b) di dalam sampel. LOD adalah konsentrasi terkecil yang dapat  terdeteksi  di  dalam  sampel.  Metode  spektro- metri  massa  telah  digunakan  dalam  membedakan gelatin  babi  dengan  gelatin  sapi  yang  memiliki  nilai LOD kisaran 1-0,1% b/b, tergantung pada jenis meto- de  yang  digunakan  (Guo et  al., 2018;  Yang et  al., 2018;  Stahl-Zeng et  al., 2019).  Metode  SDS-PAGE
diketahui  memiliki  nilai  LOD  sebesar  5%  b/b  dalam mendeteksi  gelatin babi di  dalam gelatin sapi  (Azira et al., 2014). Rapid test berupa Lateral Flow Device (LFD) dapat mendeteksi gelatin babi di dalam gummy candy dengan nilai LOD sebesar 2,5% b/b (Masiri et al., 2016).  Suatu  sensor  berupa Surface  Plasmon Resonance (SPR)  juga  dapat  mendeteksi  cemaran gelatin  babi  di  dalam  gelatin  jeli  dengan  nilai  LOD sebesar 0,66% b/b (Wardani et al., 2019).
Metode  analisis  yang  telah  dijelaskan  merupa- kan metode yang berdasarkan pada biomarker beru- pa protein. Pada saat gelatin dilibatkan dalam proses pengolahan  seperti  pemanasan,  maka  protein  bio- marker dapat mengalami denaturasi sehingga menu- runkan sensitivitas metode (Nikzad et al. 2017; Omar et al., 2018; Kamandi et al., 2022). Berbeda dengan DNA  yang  diketahui  memiliki  sifat  yang  relatif  stabil terhadap  pemanasan,  sehingga  masih  dapat  berta- han (Nikzad et al., 2017; Omar et al., 2018; Kamandi et  al., 2022).  Hal  ini  diperkuat  oleh  penelitan  dari Karni et  al. (2013)  yang  menunjukkan  bahwa  DNA dapat terdegradasi sempurna apabila melewati suhu 190°C.  Oleh  karena  itu,  metode  yang  berdasarkan DNA seperti Polymerase Chain Reaction (PCR) da- pat digunakan sebagai metode deteksi gelatin babi di dalam  produk  olahan  yang  melibatkan  pemanasan (Kamandi et al., 2022).
PCR  adalah  teknik  analisis  dengan  amplifikasi DNA  secara in  vitro yang  terdiri  dari  tahap  yang bersiklus  dan  terjadi  duplikasi  jumlah  target  DNA untai ganda pada setiap siklusnya (Yustinadewi et al., 2018). Salah satu jenis PCR yang sudah digunakan dalam konfirmasi gelatin adalah real-time PCR. Gela- tin  babi  dapat  terdeteksi  di  dalam  campuran  gelatin sapi  dan  gelatin  babi  dengan  nilai  LOD  kisaran  5- 0,01% b/b pada metode real time PCR (Demirhan et al., 2012; Yang et al., 2020; Yayla dan Doğan, 2021). Selain  itu,  gelatin  babi  yang  ditambahkan  ke  dalam bubuk  kaldu  ramen  memiliki  nilai  LOD  kisaran  1- 0,05%  b/b  bergantung  pada  jenis  primer  yang digunakan  (Kang et  al. ,  2018).  Gelatin  babi  yang ditambahkan  ke  dalam marshmallow dan gum  drop yang  telah  menjadi  bubuk  dapat  terdeteksi  dengan nilai LOD sebesar 1% b/b (Demirhan et al., 2012). Standar  acuan  metode real-time PCR  adalah SNI  ISO  20224-3:2021  yang  menggunakan  target gen  beta  aktin  (gen  ACTB)  pada Sus  scrofa untuk produk daging dan olahannya. Heryani (2020) mem- validasi metode real-time PCR untuk autentikasi DNA babi dengan menggunakan primer dari Tanabe yang menargetkan  gen cytochrome -b  dan exogenous Internal  Positive  Control (IPC)  dengan  parameter robustness ,  spesifisitas,  LOD  DNA  babi,  efisiensi amplifikasi,  dan  linieritas.  Nilai-nilai  yang  diperoleh menunjukkan  bahwa  metode  tersebut  baik  untuk digunakan  sebagai  metode  deteksi  DNA.  Namun, sensitivitas dan LOD metode tersebut dalam mende-
teksi gelatin babi (% b/b) pada produk confectionery belum ditentukan.
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan sensi- tivitas real-time PCR dengan primer Tanabe dan IPC berupa  nilai  LOD  gelatin  babi  (%  b/b)  terhadap beberapa  produk confectionery yaitu gummy candy , marshmallow, dan lozenges. Konfirmasi metode ter- sebut terhadap produk marshmallow komersial yang diketahui mengandung gelatin babi juga dilakukan.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  kit  ekstrasi  DNA Kogene  Powerprep Gelatin No. E0102 (Kogene, Korea Selatan), primer forward 5’-CTTGCAAATCCTAACA  GGCCTG-3’  (Thermo Fisher  Scientific,  Amerika),  primer reverse 5’- CGTTTGCATGTAGATAGC  GAATAAC- 3’  (Themo Fisher  Scientific,  Amerika), TaqMan MGB  Probe  5’- (FAM)-ACAGCT  TTCTCATCAGTTAC-(NFQ)(MGB)- 3’  (Thermo  Fisher  Scientific,  Amerika),  TaqMan™ Exogenous  Internal  Positive  Control  Reagents (Themo  Fisher  Scientific,  Amerika),  TaqpathTM ProAmpTM  Master  Mix  (Themo  Fisher  Scientific, Amerika),  etanol  75%  pro  analis  (Smart-lab,  Indo- nesia), etanol 96% pro analis (Smart-lab, Indonesia), nuclease-free water (Themo Fisher Scientific, Ameri- ka),  gelatin  babi  komersial  (Green  Lakes,  Inggris), gelatin  sapi  komersial  (GLT,  Australia),  sukrosa (Gulaku, Indonesia), sirup fruktosa (Rosebrand, Indo- nesia),  perisa  stroberi  (Toffleco,  Indonesia),  perisa mints (Toffleco, Indonesia), maizena (Egafood, Indo- nesia), siruplus simpleks, metil paraben (Akema, Ita- lia),  dan  gliserin  (Echogreen  Oleochemicals,  Singa- pore).

## Rancangan penelitian
Penelitian diawali dengan menentukan nilai LOD (%  b/b)  terhadap  gelatin  babi  di  dalam  campuran gelatin sapi dan gelatin babi. Komposisi gelatin babi yang digunakan di dalam campuran gelatin sapi dan gelatin babi adalah 0,0025; 0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1; 0,5; 1; dan 5% b/b. Pada tahap kedua dilakukan penentuan  nilai  LOD  (%  b/b)  terhadap  produk con- fectionery yang  terdiri  dari gummy  candy , marsh- mallow , dan lozenges. konsentrasi gelatin babi yang digunakan pada gummy candy adalah 0,0025; 0,01; 0,1;  dan  0,5%,  sedangkan  marshmallow  adalah 0,0025; 0,01; dan 0,1%, serta lozenges adalah 0,01;
0,1; dan 0,5%. Tahap terakhir adalah menguji sensi- tivitas  metode  terhadap  dua  produk marshmallow komersial  yang  diketahui  mengandung  gelatin  babi pada label produk. Sampel dari semua tahap dilaku- kan ektraksi secara simplo, lalu dilakukan pengukur- an  konsentrasi  dan  kemurnian  DNA  dengan  mikro- volume  spektrofotometer  (Themo  Fisher  Scientific,
Amerika) secara duplo. Setelah itu dilakukan analisis dengan real-time PCR  (Kogene,  Korea  Selatan) dengan pengulangan  duplo untuk menentukan LOD (% b/b).

## Pembuatan marshmallow
Pembuatan marshmallow berdasarkan  Arizona et al (2021). Pada tahap pertama dilakukan pembuat- an  larutan  gelatin  dan  larutan  gula.  Gelatin  (7,21  g) dan air aquades (24,26 mL) dipanaskan hingga suhu ±70°C  selama  10-15  menit.  Pada  saat  bersamaan, dilakukan  juga  pemanasan  sukrosa  (24,26  g)  dan sirup  fruktosa  (24,26  mL)  hingga  suhu  ±110°C selama 10-15 menit. Kedua larutan tersebut kemudi- an dicampurkan dan diaduk dengan mixer selama 5- 10 menit hingga campuran merata dan mengembang. Campuran  kemudian  dituangkan  ke  wadah  yang telah  diberi  tepung  maizena  dan  didiamkan  selama ±12 jam.

## Pembuatan gummy candy
Pembuatan gummy  candy dilakukan  berdasar- kan Graboski et al. (2018). Bubuk gelatin (5 g) dicam- purkan  ke  dalam  aquades  (20  mL),  lalu  didiamkan selama 10 menit. Sampel kemudian dipanaskan pa- da  suhu  70°C  selama  10-20  menit  hingga  larut  dan tidak  terdapat  gumpalan.  Selanjutnya,  sukrosa (24,995 g) dan stroberi essens (0,005 g) ditambahkan pada  larutan  tersebut,  dan  diaduk  dengan stirrer hingga larut. Campuran lalu dituangkan pada cetakan jeli  dan  dikeringkan  pada  suhu  ruang  (25±2°C) selama 12 jam.

## Pembuatan lozenges
Pembuatan  lozenges  berdasarkan  pada  Aryani et  al. (2015). Gelatin  (6  g)  dan  aquades  (10  mL) dicampurkan dan didiamkan selama 10 menit. Cam- puran tersebut lalu dipanaskan pada suhu 70°C sela- ma 10-15 menit hingga larut dan tidak ada gumpalan. Sampel  kemudian  dilakukan  penambahan  gliserin (1,5 g) sambil terus dilakukan pengadukan. Campur- an  tersebut  lalu  dipanaskan  selama  5  menit  dan ditambahkan sirup simpleks (26,5 mL) sambil diaduk. Selanjutnya,  stroberi essens (0,11  g)  ditambahkan, lalu dipanaskan kembali selama 5 menit. Campuran kemudian  didiamkan  pada  suhu  ruang  selama  5 menit dan ditambahkan metil paraben (0,04 g) serta mint  essens (0,22  mL).  Campuran  diaduk  kembali dan  dituangkan  pada  cetakan  jeli  dan  didiamkan selama ±12 jam.

## Ekstraksi DNA
Metode  ekstraksi  DNA  dilakukan  dengan Powerprep  gelatin extraction kit  cat.  No.  E0102 (Kogene, Korea Selatan).  Sebanyak 400 mg gelatin atau 200 mg produk olahan ditimbang dan dimasuk- kan ke dalam tabung 2 mL lalu ditambahkan premiks lisis  untuk  sampel  gelatin  yang  terdiri  dari  3,2 μ L
dithiothreitol ,  16 μ L  RNAse,  16 μ L  proteinase,  dan 320 μ L buffer lisis. Pada sampel produk confectionery , volume  premiks  yang  digunakan  adalah  sebanyak dua  kali  lipat  dari  sampel  gelatin.  Campuran  kemu- dian  diinkubasi  pada  suhu  65°C  selama  90  menit dengan thermoshaker (Ditabis, Jerman). Selanjutnya, 320 μ L buffer pengikat ditambahkan pada campuran, diinkubasi kembali pada 65°C selama 10 menit, lalu ditambahkan  320 μ L  etanol  96%  pro  analisis  dan divorteks.  Sebanyak  600 μ L  dari  larutan  sampel tersebut dipindahkan ke tabung DNA binding-column . Sampel kemudian disentrifugasi selama 3 menit pada 12000  rpm.  Filtrat  yang  ada  di  tabung  tersebut  di- buang, lalu ditambahkan 500 μ L buffer pencuci tanpa mengenai dinding. Sentrifugasi kemudian dilanjutkan selama 2 menit pada 12000 rpm. Filtrat pada tabung dibuang  kembali,  dan  ditambahkan  500 μ L  etanol 75%,  kemudian  disentrifugasi  kembali  selama  2 menit (12000 rpm). Filtrat yang ada di tabung dibuang dan  disentrifugasi  kembali  selama  4  menit  pada 12000 rpm. Isi tabung kemudian ditransfer ke tabung 1,5  mL  dan  ditambahkan  100 μ L buffer elusi,  dan disentrifugasi selama 4 menit pada 8000 rpm. Sam- pel  tersebut  dilakukan  pengukuran  konsentrasi  dan kemurnian  DNA  dengan  mikrovolume  spektrofoto- meter  dengan  melihat  perbandingan  nilai Optical Density (OD) pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (OD 260/280). Jika nilai OD 260/280 berada di antara 1,8-2,0 maka sampel tersebut memiliki ke- murnian  tinggi  dan  tidak  ada  indikasi  kontaminasi. Nilai di bawah 1,8 mengindikasikan kontaminasi pro- tein,  sedangkan  nilai  di  atas  2,0  mengindikasikan kontaminasi RNA (Yayla dan Doğan, 2021; Salamah et  al. ,  2021).  Sampel  DNA  tersebut  disimpan  pada freezer bersuhu -20°C hingga waktu analisis.

## Amplifikasi real-time PCR
Amplifikasi real-time PCR  berdasarkan  pada Heryani (2020).  Tahap  pertama  adalah  melakukan pembuatan larutan reaksi campuran untuk satu sam- pel yang terdiri  dari  1 μ L primer forward (7,5 μ M), 1 μ L primer reverse (7,5 μ M), 1 μ L probe (5 μ M), 12,5
μ L taqpath (2X), 2,5 μ L IPC mix (10x), dan 0,5 μ L IPC DNA  (50x).  Sebanyak  18,5 μ L  campuran  tersebut dimasukkan ke dalam tabung PCR. Sebanyak 6,5 μ L sampel DNA dimasukkan ke dalam tabung PCR ter- sebut sehingga diperoleh total volume 25 μ L. Selan- jutnya, tabung  PCR berisi larutan sampel campuran dimasukkan ke dalam real-time PCR. Kondisi reaksi pada real-time PCR  adalah  sebagai  berikut:  tahap inisiasi  dilakukan  selama  2  menit  pada  suhu  50°C dan  10  menit  pada  suhu  95°C,  lalu  dilanjutkan dengan  44  siklus  pada  suhu  95°C  selama  15  detik dan suhu  60°C selama 1  menit.  Pada penelitian  ini, DNA  dari  daging  babi  digunakan  sebagai  kontrol positif,  sedangkan nuclease-free  water digunakan sebagai kontrol negatif.
Hasil real-time PCR dinyatakan dalam nilai cycle threshold (Ct),  yaitu  nilai  yang  menunjukkan  jumlah siklus  yang  dibutuhkan  hingga  sinyal  fluoresens melewati  ambang  yang  menandakan  terdeteksinya DNA  target.  Nilai  Ct  pada  semua  sampel  dalam penelitian  ini  dinyatakan  dalam  rata-rata  ±  standar deviasi.  Konsentrasi  terkecil  yang  terdeteksi  pada semua pengulangan duplo dinyatakan sebagai  LOD (%  b/b).  Pada  penelitian  ini  didapatkan  konsentrasi terkecil/LOD  gelatin babi di dalam  campuran gelatin babi dan gelatin sapi sebesar 0,01% b/b, sedangkan pada  produk confectionery didapatkan pada kisaran 0,1-0,01% b/b.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Nilai  LOD  gelatin  babi  (%  b/b)  di  dalam  gelatin sapi
Hasil penentuan nilai LOD gelatin babi di dalam gelatin  sapi  dapat  dilihat  pada  Tabel  1.  Beberapa sampel (0,0025; 0,01; 0,025; 1; dan 5% b/b) memiliki nilai  OD  260/280  di  atas  2,0  yang  menandakan adanya  kontaminasi  protein  pada  sampel-sampel tersebut.  Sampel  0,05;  0,1;  dan  0,5%  b/b  memiliki nilai  kermunian  tanpa  kontaminasi  protein  karena berada di kisaran 1,8-2,0.
Tabel 1.  Hasil uji penentuan nilai LOD gelatin babi (% b/b) di dalam campuran gelatin sapi dan gelatin babi Table 1 . LOD value of porcine gelatin (% w/w) in bovine gelatin and porcine gelatin mixture
Konsentrasi Gelatin Babi (% b/b) Porcine Gelatin Concentration (% w/w) Ct Konsentrasi DNA (ng/ μ L) (DNA Concentration
(ng/ μ L)) Kemurnian DNA (OD 260/280) ( DNA Purity (OD 260/280)) IPC 0.0025 ND 6.10±2.23 2.23±0.21 + 0.01 39.20±1.72 6.45±0.07 2.32±0.17 + 0.025 38.51±2.07 4.65±0.07 2.82±0.00 + 0.05 37.75±0.43 2.95±0.21 1.87±0.08 + 0.1 36.47±0.35 4.55±0.35 1.80±0.04 + 0.5 35.62±0.01 2.25±0.21 1.97±0.17 + 1 33.95±0.10 3.55±0.07 2.26±0.26 + 5 31.57±0.12 4.6±0.14 2.12±0.05 + Kontrol positif ( Positive control ) 16.21±0.24 10 1.8 + Kontrol negatif ( Negative control ) ND - - +
Keterangan: ND = Not Detected Note: ND = Not Detected
Walaupun  terdapat  sampel  yang  terindikasi mengalami kontaminasi, kurva amplifikasi pada real- time PCR dapat diamati sehingga dapat dikonfirmasi- kan  bahwa  ekstraksi  DNA  berjalan  dengan  lancar. IPC  pada  tiap  sampel  terdeteksi  yang  menandakan tidak ada inhibitor yang mengganggu proses amplifi- kasi real-time PCR. Konsentrasi DNA yang diperoleh memiliki nilai yang bervariasi, namun dapat terdeteksi kurva amplifikasinya. Berdasarkan Tabel 1, pada saat konsentrasi 0,0025% b/b, gelatin babi di dalam cam- puran  gelatin  sapi  dan  gelatin  babi  tidak  terdeteksi oleh  metode real-time PCR,  sedangkan  konsentrasi gelatin  babi  5-0,01%  b/b  dapat  terdeteksi.  Konsen- trasi terkecil yang dapat terdeteksi adalah 0,01% b/b dengan  nilai  Ct  sebesar  39,20±1,72.  Nilai  tersebut adalah nilai LOD (% b/b) gelatin babi di dalam gelatin sapi pada metode real-time PCR ini.
Beberapa peneliti melaporkan nilai LOD (% b/b) gelatin babi di dalam gelatin sapi yang menunjukkan bahwa  primer  atau  metode real-time PCR  yang berbeda  dapat  memberikan  nilai  LOD  (%b/b)  yang berbeda.  Penelitian  dari  Nikzad et  al. (2017)  meng- gunakan  metode duplex dan simplex real-time PCR dengan primer target gen cytochrome -b (149 dan 212 bp amplico n), yaitu metode simplex atau duplex real- time PCR dengan kedua primer tersebut dapat men- deteksi  gelatin  babi  sebesar  0,1%  b/b.  Menurut Demirhan et al. (2012), real-time PCR dengan meng- gunakan komersial kit dapat mendeteksi gelatin babi di  dalam  campuran  gelatin  sapi  dan  gelatin  babi sebesar  1%  b/b.  Penelitian  dari  Yayla  dan Doğan (2021)  menunjukkan  bahwa real-time PCR  meng- gunakan  primer  95  bp amplicon dengan  target  gen MPRE42  memiliki  nilai  LOD  (%  b/b)  gelatin  babi sebesar  0,01%  (metode  Tube  Gel),  0,1%  (metode Biotecon),  dan  di  atas  5%  (metode  R-Biopharm),
yang  dipengaruhi  oleh  metode  ekstraksi  yang  digu- nakan.
Penelitian ini menggunakan primer Tanabe yang menargetkan gen cytochrome -b. Brezna dan Piknova (2013) telah mengindentifikasi beberapa jenis primer dari  berbagai  macam  penelitian  melalui review . Berdasarkan review tersebut primer Tanabe memiliki sensitivitas yang paling tinggi yang dapat mendeteksi DNA  babi  pada  konsentrasi  0,01-0,1  pg/ μ L. Cyto- chrome -b sebagai salah satu gen DNA dari mitokon- dria  yang  paling  umum  digunakan  dalam  analisis PCR.  Gen  tersebut  sering  digunakan  dalam  peneli- tian  terkait  filogenik  dan  memiliki  variabilitas  inter- spesies  yang  tinggi  (Mohamad et  al .  2013).  Gen  ini memiliki  urutan  nukleotida  yang  terkonservasi  tinggi yang diketahui spesifik terhadap spesies (Posik et al. 2016).  Dalam  penelitian  ini,  metode real-time PCR memberikan nilai LOD (% b/b) yang lebih kecil diban- dingkan  dengan  penelitian  yang  telah  disebutkan  di atas.  Hal  ini  menandakan  bahwa  metode  dalam penelitian  ini  memiliki  sensitivitas  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  metode real-time PCR  lain dalam  mendeteksi  gelatin  babi  di  dalam  campuran gelatin sapi dan gelatin babi.
Nilai  LOD  gelatin  babi  (%  b/b)  di  dalam  produk confectionery
Tabel 2 menunjukkan hasil uji nilai LOD (% b/b) gelatin  babi  di  dalam gummy candy , marshmallow , dan  lozenges  dengan  konsentrasi  gelatin  babi  yang berbeda.  Pada  nilai  kemurnian  DNA  terlihat  bahwa sebagian besar sampel melebihi nilai 2 yang menan- dakan  adanya  kontaminasi  protein.  Selain  itu,  nilai konsentrasi DNA yang diperoleh bervariasi tiap kon- sentrasi dari tiap sampel.
Tabel 2.  Hasil uji penentuan nilai LOD gelatin babi (% b/b) di dalam produk confectionery Table 2.  LOD value of porcine gelatin in confectionery products
Konsentrasi Gelatin Babi pada Produk
Confectionery (% b/b)
( Porcine Concentration in Confectionery Products (% w/w )) Ct Konsentrasi DNA (ng/ μ L) (DNA Concentration
(ng/ μ L))
Kemurnian DNA (OD 260/280) ( DNA Purity (OD 260/280)) IPC Gummy Candy 0.0025 ND 2.45±0.07 2.08±0.09 + 0.01 ND 6.65±0.07 2.76±0.16 + 0.1 38.72±0.18 3.10±0.14 2.27±0.18 + 0.5 36.84±1.05 5.85±0.35 2.21±0.01 + Marshmallow 0.0025 ND 3.90±0.28 2.30±0.41 + 0.01 41.14±2.96 3.25±0.35 2.54±0.45 + 0.1 39.19±0.19 2.40±0.14 1.60±0.08 + Lozenges 0.01 ND 4.05±0.21 2.14±0.28 + 0.1 40.93±0.15 3.85±0.21 2.20±0.08 + 0.5 37.13±0.12 3.95±0.07 2.12±0.05 + Kontrol positif ( Positive control ) 18.06±0.18 10 1.8 + Kontrol negatif ( Negative control ) ND - - +
Keterangan: ND = Not Detected Note: ND = Not Detected
Walaupun  konsentrasi  bervariasi  dan  nilai kemurnian melebihi nilai  2,  namun kurva  amplifikasi dapat  terlihat  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa proses  amplifikasi  maupun  ekstraksi  DNA  berjalan lancar. Hal ini juga diperkuat  dengan  nilai IPC yang diperoleh  semua  sampel  terdeteksi  sehingga  tidak ada  inhibitor  yang  mengganggu  proses  amplifikasi. Pada  produk gummy  candy dan  lozenges diketahui bahwa nilai Ct  pada konsentrasi  di  bawah  0,1% b/b sudah  tidak  terdeteksi.  LOD  kedua  produk  adalah 0,1% dengan nilai Ct masing-masing 38,72±0,18 dan 40,93±0,15. Pada produk marshmallow , nilai LOD (% b/b)  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  produk  lain, yaitu 0,01% b/b dengan nilai Ct 41,14±2,96. Perbeda- an nilai LOD (% b/b) ini dapat disebabkan oleh perbe- daan waktu pada pemanasan. Lozenges dan gummy candy memiliki  waktu pemanasan yang relatif sama yaitu sekitar 30 menit, sedangkan waktu pemanasan marshmallow lebih pendek yaitu sekitar 15 menit.
Pemanasan  dapat  menyebabkan  DNA  meng- alami  fragmentasi  yang  dapat  memengaruhi  hasil analisis real-time PCR  (Mano et  al .,  2017). Bitskinashvili et al. (2019) menyatakan bahwa salah satu  faktor  kritis  yang  mempengaruhi  analisis real- time PCR dalam identifikasi ingredien pangan adalah waktu  kontak  pemanasan.  Pada  penelitian  tersebut dijelaskan  bahwa  DNA  mengalami  degradasi  pada saat  sampel  dipanaskan  pada  suhu  121°C,  yang intensitasnya  tergantung  pada  waktu  pemanasan. Hal ini mengindikasikan semakin lama durasi pema- nasan, maka sensitivitas/LOD metode real-time PCR semakin menurun.
Penelitian  kuantitatif  yang  berkaitan  dengan penentuan  LOD  gelatin  babi  di  dalam  produk con- fectionery masih terbatas. Selain itu, LOD gelatin babi di dalam produk confectionery pada metode real-time PCR  dengan  primer  Tanabe  dan  IPC  masih  belum diketahui.  Berdasarkan  penelitian  dari  Demirhan (2012), marshmallow dan gum drop yang ditambah- kan  gelatin  babi  dapat  terdeteksi  dengan real-time PCR  yang  menggunakan  kit  komersial  sebesar  1% (b/b).  Penelitian  lain yang  menggunakan  LFD dapat mendeteksi  gelatin babi di  dalam gummy candy de- ngan nilai LOD sebesar 2,5% b/b (Masiri et al., 2016). Pada  penelitian  ini  LOD  (%  b/b)  pada  produk confectionery adalah 0,1-0,01% b/b yang menunjuk- kan metode ini memiliki sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan  dengan  kit  komersial real-time PCR dan rapid test .
Sensitivitas  yang  tinggi  pada  metode real-time PCR  dalam  penelitian  ini  dapat  digunakan  dalam mendeteksi  indikasi  pelabelan  palsu  pada  produk confectionery .  Pelabelan palsu pada produk pangan menjadi  isu  yang  umum  terjadi  di  seluruh  dunia (Supiah,  2018).  Beberapa  penelitian  menunjukkan bahwa  terdapat  produk confectionery komersial  de- ngan  indikasi pelabelan palsu  yang terdeteksi subs- tansi babi dengan analisis real-time PCR (Sultana et al ., 2020; Sultana et al., 2018; Demirhan et al ., 2012). Metode  pada  penelitian  ini  juga  dapat  digunakan dalam  mendeteksi  kontaminasi  silang  pada  produk confectionery . Kontaminasi silang dapat terjadi pada peralatan  produksi  yang  digunakan  maupun  pada jalur produksi. Adanya substansi babi di bawah 0,1% pada  produk  dapat  dipertimbangkan  sebagai  konta- minasi silang pada jalur produksi dari pada adulterasi. Konsentrasi  rendah  tersebut  tidak  menguntungkan secara finansial bagi industri (Al-Kahtani et al ., 2017). Oleh karena itu, metode real-time PCR pada peneli- tian ini dapat dijadikan metode alternatif untuk men- deteksi pelabelan palsu dan kontaminasi silang pada produk confectionery bagi laboratorium halal.

## Konfirmasi pada produk marshmallow komersial yang mengandung gelatin babi
Tabel 3 menunjukkan hasil uji coba metode real- time PCR  terhadap  produk marshmallow komersial yang telah diketahui mengandung gelatin babi pada label  produk.  Nilai  konsentrasi  DNA  pada  semua sampel  bervariasi  dengan  kisaran  7-7,05  ng/ μ L. Berdasarkan  pembacaan  dari  mikrovolume  spektro- fotometer,  kemurnian  DNA  pada  sampel marshmal- low 2  terindikasi adanya kontaminan berupa protein karena nilai kemurniannya melebihi 2. Walaupun nilai konsentrasi  DNA  bervariasi  dan  beberapa  sampel terindikasi  terkontaminasi,  namun  kurva real-time PCR dapat teramplifikasi dengan baik. Selain itu, nilai IPC semua sampel terdeteksi positif yang menanda- kan  tidak  ada  kontaminan.  Oleh  karena  itu,  proses amplifikasi real-time PCR  pada  metode  ini  berjalan dengan  baik  dan  lancar  tanpa  adanya  gangguan kontaminasi. Berdasarkan hasil pembacaan real-time PCR, semua sampel dapat terdeteksi dengan kisaran nilai Ct 34,49±0,198 hingga 35,64±0,02. Metode real- time PCR  dengan  primer  Tanabe  dan  IPC  dapat mendeteksi  gelatin  babi  pada  produk confectionery komersial dengan tepat.
Tabel 3.  Hasil uji real-time PCR terhadap produk marshmallow komersial yang mengandung gelatin babi Table 3.  Real-time PCR analysis of commercial marshmallow products which are contained porcine gelatin
Produk ( Product ) Konsentrasi DNA (ng/ μ L) ( DNA Concentration (ng/ μ L)) Kemurnian (OD 260/280) ( DNA Purity (OD 260/280)) Ct IPC Marshmallow 1 7.05±5.16 1.73±0.75 34.49±1.98 + Marshmallow 2 7.00±2.26 2.05±0.03 35.64±0.02 +

## KESIMPULAN
Metode real-time PCR  dengan  primer  Tanabe dan IPC memiliki sensitivitas yang tinggi dalam men- deteksi  gelatin  babi  di  dalam  produk confectionery . Nilai LOD gelatin babi di dalam campuran gelatin sapi dan  gelatin  babi  pada  metode  penelitian  ini  adalah 0,01% b/b, sedangkan nilai LOD gelatin babi di dalam produk confectionery berada pada kisaran 0,1-0,01% b/b.  Metode real-time PCR  yang  digunakan  dapat mendeteksi gelatin babi di dalam produk confection- ery komersial seperti marshmallow .

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Lem- baga Pengkajian Pangan, Obat-obatan dan Kosmetik Majelis  Ulama  Indonesia  (LPPOM  MUI)  yang  telah mendanai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Al-Kahtani  HA,  Ismail  EA,  Ahmed  MA.  2017.    Pork detection  in  binary  meat  mixtures  and  some commercial  food  products  using  conventional and real-time PCR techniques. Food Chem 219:
54-60. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016. 09.108
Aryani D, Saifullah S, Bayu Murti Y. 2015. Pembuatan chewable  lozenges ekstrak daun  legundi ( Vitex trifolia L.) dengan variasi proporsi basis gliserin- gelatin. Trad Med J 20: 98-104.
Arizona  K,  Laswati  DT,  Rukmi  KSA.  2021.  Studi pembuatan marshmallow dengan  variasi  kon- sentrasi gelatin dan sukrosa. Agrotech 3: 11-17. https://doi.org/10.37631/agrotech.v3i2.279
Azira TN, Man YBC, Hafidz RNRM, Aina MA, Amin I. 2014.  Use  of  principal  component  analysis  for differentiation  of  gelatine  sources  based  on polypeptide molecular weights. Food Chem 151: 286-292. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.201 3.11.066
Bitskinashvili  K,  Gabriadze  I,  Kutateladze  T, Vishnepolsky  B,  Mikeladze  D,  Datukishvili  N. 2019.  Influence  of  heat  processing  on  DNA degradation  and  PCR-based  detection  of  wild- type  and  transgenic  maize.  J  Food  Qual  2019: 5657640. https://doi.org/10.1155/2019/5657640
[BPS]  Badan  Pusat  Statistik.  2020.  Statistik  Perda- gangan  Luar  Negeri  Impor  2020  Jilid  I.  Badan Pusat Statistik, Jakarta.
[BSN]  Badan  Standardisasi  Nasional.  2021.  Analisa biomarker  molekuler −  Deteksi  bahan  turunan hewan  pada  pangan  dan  bahan  pakan  meng-
gunakan real-time PCR − Bagian 3: Metode de- teksi DNA babi.  Badan Standardisasi Nasional, Jakarta.
Brezna B, Piknova L. 2013. Real-time PCR methods for  identification  of  animal  or  plant  species. Caister  Academic  Press,  Burgos.  253-271. https://doi.org/10.21775/9781910190159
Demirhan Y, Ulca P, Senyuva HZ. 2012. Detection of porcine DNA in gelatine and gelatine-contain-ing processed  food  products −Halal/Kosher  authen- tication. Meat Sci 90: 686-689. https://doi.org/10. 1016/j.meatsci.2011.10.014
Global  Islamic  Economic  Report.  2022.  State  of  the global islamic economy report unlocking oppor- tunity.  New  York:  Dinarstandard. https://www. dinarstandard.com/post/state-of-the-global-isla mic-economy-report-2022 [20 April 2022].
Guo  S,  Xu  X,  Zhou  X,  Huang  Y.  2018.  A  rapid  and simple  UPLC-MS/MS  method  using  collagen marker  peptides  for  identification  of  porcine gelatin.  RSC  Adv  8:  3768-3773. https://doi.org/ 10.1039/C7RA12539A
Graboski  AM,  Galvagni  E,  Manzoli  A,  Shimizu  FM, Zakrzevski  CA,  Weschenfelder  TA,  Steffens  J, Steffens  C.  2018.  Lab-made  electronic-nose with polyaniline sensor array used in classifica- tion of different aromas in gummy candies. Food Res  Int  113:  309-315. https://doi.org/10.1016/ j.foodres.2018.07.011
Grand  View  Research.  2020.  Gelatin  market  size, share  &  trends  analysis  report  by  raw  material (pig skin, bovine hide, cattle bones), by function (thickener, stabilizer, gelling agent), by applica- tion,  by  region,  and  segment  forecasts,  2020- 2027. California: Grand View Research. https:// www.grandviewresearch.com/press-release/glo bal-gelatin-market [20 April 2021].
Hassan N, Ahmad T, Zain NM. 2018. Chemical and chemometric methods for halal authentication of gelatin: An overview. J Food Sci 83: 2903-2911. https://doi.org/10.1111/1750-3841.14370
Heryani.  2020.  Validasi  metode  analisis  DNA  babi pada  produk  pangan  dengan  primer  terseleksi dan exogenous  internal  positive  control pada real-time PCR  [Tesis].  Bogor:  Institut  Pertanian Bogor.
Kamandi N, Dana MG, Ghavami M. 2022. Molecular identification of gelatin origin in pastilles and jelly products collected from tehran markets. J Food Biosci Technol 12: 11-18.
Kang SSN, Lee HG, Kim H. 2018. Development and comparison  of  a  porcine  gelatin  detection  sys- tem  targeting  mitochondrial  markers  for  Halal authentication.  LWT-Food  Sci  Techol  97:  697- 702. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2018.07.062
Karni M, Zidon D, Polak P, Zelevsky Z, Shefi O. 2013. Thermal degradation of DNA. DNA Cell Biol 32: 298-301. https://doi.org/10.1089/dna.2013.2056
Mano  J,  Nishitsuji  Y,  Kikuchi  Y,  Fukudome  S, Hayashida T, Kawakami H, Kurimoto Y, Noguchi A, Kondo K, Teshima R, Takabatake R, Kitta K. 2017.  Quantification  of  DNA  fragmentation  in processed  foods  using real-time PCR.  Food Chem  226:  149-155. https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2017.01.064
Masiri  J,  Benoit  L,  Barrios-Lopez  B,  Thienes  C, Meshgi  M,  Agapov  A,  Dobritsa  A,  Nadala  C, Samadpour  M.  2016.  Development  and  vali- dation of a rapid test system for detection of pork meat and collagen residues. Meat Sci 121: 397- 402. https://doi.org/10.1016/j.meatsci.2016.07.0 06
Mohamad  NA,  Sheikha  AFE,  Mustafa  S,  Mokhtar NFK. 2013. Comparison of gene nature used in real-time PCR  for  porcine  identification  and quantification:  A  review.  Food  Res  Int  50:  330- 338. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2012.10.0
47
Nikzad  J,  Shahhosseini  S,  Tabarzad  M,  Nafissi- Varcheh  N,  Torshabi  M.  2017.  Simultaneous detection of bovine and porcine DNA in pharma- ceutical  gelatin  capsules  by  duplex  PCR  assay for Halal authentication. DARU J Pharm Sci 25: 3. https://doi.org/10.1186/s401 99-017-0171-3
Omar  S,  Hasan  M,  Abu-Romman  S,  Ramadan  H,
Qatatsheh  AA,  Al-Dmoor  H.  2018.  Design  and validation  of  short-amplicon  length  PCR  assay for the detection of porcine gelatin in commercial candy and marshmallow products. Curr Res Nutr Food Sci J 6: 742-747. https://doi.org/10.12944/ CRNFSJ.6.3.16
Posik DM, Bustamante AV, Lyall V, Peral GP, Padola NL, Giovambattista G. 2016. Species identifica- tion of a suspected bone found in blood sausage. Forensic  Sci  Criminol  1:  1-2. https://doi.org/10. 15761/FSC.1000103
Salamah N, Erwanto Y, Martono S, Rohman A. 2021. The employment of real-time polymerase chain reaction  using  species-specific  primer  targeting on D-loop mitochondria for identification of por- cine  gelatin  in  soft  candy.  Indones  J  Chem  21: 852-859. https://doi.org/10.22146/ijc.60413
Stahl-Zeng J, Sage A, Taylor P, Netto JD, Zhang T. 2019.  Advances  in  LC −MS/MS  methods  for allergen  testing,  meat  speciation,  and  gelatin speciation. J AOAC Int 102: 1309-1315. https:// doi.org/10.5740/jaoacint.19-0059
Sultana  S,  Hossain  MAM,  Azlan  A,  Johan  MR, Chowdhury  ZZ,  Ali  ME.  2020.  TaqMan  probe based  multiplex  quantitative  PCR  assay  for determination of bovine, porcine and fish DNA in gelatin  admixture,  food  products  and  dietary supplements. Food  Chem  325: 126756. https:// doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.126756
Sultana S, Hossain MAM, Zaidul ISM, Ali ME. 2018.
Multiplex  PCR  to  discriminate  bovine,  porcine, and  fish  DNA  in  gelatin  and  confectionery products.  LWT-Food  Sci  Technol  92:  169-176. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2018.02.019
Supiah  K.  2018.  Preparation  and  processing  of religious and cultural foods. Woodhead Publish- ing  Series  in  Food  Science,  Technology  and Nutrition, Cambridge. 310-321. https://doi.org/10. 1016/B978-0-08-101892-7.00016-X
Wardani  DP,  Arifin  M,  Abraha  K.  2019. The  revised method of quantitative detection of animal-origin bovine and porcine gelatin difference using sur- face  plasmon  resonance-based  biosensor. Mater Sci Forum 948: 146-152. https://doi.org/10. 4028/www.scientific.net/MSF.948.146
Yang  CT,  Ghosh  D,  Beaudry  F.  2018.  Detection  of gelatin adulteration using bioinformatics, proteo- mics  and  high-resolution  mass  spectrometry. Food  Addit  Contam  Part  A  Chem  Anal  Control Expo  Risk  Assess  35:  599-608. https://doi.org/ 10.1080/19440049.2017.1416680
Yayla MEA, Doğan CE. 2021. Development of a new and  sensitive  method  for  the  detection  of  pork adulteration in gelatin and other highly process- ed  food  products.  Food  Addit  Contam  Part  A Chem  Anal Control Expo  Risk Assess 38: 881- 891. https://doi.org/10.1080/19440049.2021.19 02574
Yustinadewi  PD,  Yustiantara  PS,  Narayani  I.  2018. Teknik  perancangan  primer  untuk  sekuen  gen MDR-1  varian  1199  pada  sampel buffy  coat pasien  anak  dengan  LLA.  Metamorfosa:  J  Biol Sci  5:  105-111. https://doi.org/10.24843/meta morfosa.2018.v05.i01.p16