e-issn: 2716-4608 p-issn: 2655-366X
SECONDARY METABOLITE CHARACTERISTICS OF HETEROTROFIC BACTERIA PRODUCTION AS ANTIMICROBIAL AT DIFFERENT SALINITY
Nadya Apriyola* 1 , Feliatra 2 , Yuana Nurulita 3
1 Student of the Faculty of Fisheries and Marine Universitas Riau, Pekanbaru
2 Lecturer at the Faculty of Fisheries and Marine Universitas Riau, Pekanbaru
3 Lecturer of the Faculty of Mathematics and Natural Science Universitas Riau, Pekanbaru *apriyolanadya@gmail.com

## ABSTRACT
This research was conducted from March-June 2019. The purpose of this study was to determine the characteristics of secondary metabolites prduced by of heterotrophic bacterial from sea water Sungai Kayu Ara Village, Siak Regency as an antimicrobial and to determine the  storage  time  of  these  bacteria  by  measuring  at  the  optimal  growth  time.  Five  bacterial secondary  metabolite  extracts  used  were  B,  C,  D,  and  H  ( B.  cereus )  and  J  ( V.  fluvialis ) obtained  from  the  collection  of  Marine  Microbiology  Laboratory,  Department  of  Marine Sciences,  Faculty  of  Fisheries  and  Marine  sciences,  University  of  Riau.  phytochemical  test showed  that  extracts  of  isolates  B,  D,  and  H  contained  saponin  compounds,  while  isolate J contained  flavonoid  compounds,  however,  all  extracts  contained  alkaloid  compounds. Antimicrobial  test  indicated  that  J  extract  inhibited A.  Hydrophila at  concentration  500 µg/ml but the extract could not inhibit V. algynolyticus and Pseudomonas sp concentrations determined.  In  the  bacterial  storage  time  test,  the  optimal  growth  of  each  bacterial concentration at was 7th day incubation and decreased on the 14th day.
Keywords: Heterotrophic Bacteria, Secondary Metabolites, Phytochemicals, Antimicrobials

## I. PENDAHULUAN
Perairan  Desa  Sungai  Kayu  Ara terletak  di  kawasan  Kecamatan  Sungai Apit,  Kabupaten  Siak,  Provinsi  Riau merupakan  perairan  muara  yang  terhubung dengan  perairan  laut  Selat  Malaka,  dan sangat  dipengaruhi  oleh  berbagai  aktivitas antara  lain  industri,  pelayaran,  aktivitas rumah tangga dan lain sebagainya. Aktivitas-aktivitas yang berlokasi di daerah aliran  sungai  dan  wilayah  pesisir  baik langsung maupun tidak langsung berpotensi menyumbangkan bahan organik di perairan.  Banyaknya  bahan  organik  yang terakumulasi
dapat mempengaruhi
distribusi  serta  aktivitas  organisme  begitu juga mikroorganisme seperti bakteri.
Mikroorganisme  laut  pada  dasarnya sangat beragam, sebagaimana halnya dengan  kerabat  mikroorganisme  yang  ada di darat. Organisme yang dapat dikelompokkan sebagai mikroba laut antara lain adalah protista, sianobakteri (cyanobacteria),  bakteri,  jamur  dan  virus. Mikroorganisme  tersebut  berperan  penting dalam  proses-proses  yang  berlangsung dalam  kolom-kolom  air  laut  (Afriza et  al. 2019).  Keterlibatan  mikroorganisme  di lingkungan  perairan  tidak  dapat  diabaikan salah  satunya  bakteri  heterotrofik,  bakteri ini  mampu  memanfaatkan  bahan  organik pada lingkungan tempat tumbuhnya sebagai sumber nutrisi. Bakteri heterotrofik merupakan  komponen  pada  ekosistem  laut
yang tidak hanya berperan sebagai dekomposer  bahan  organik,  akan  tetapi bakteri tersebut mampu menyerap unsur Fe di  perairan  (Adly et  al., 2015).  Bakteri heterotrofik  dapat  menghasilkan  metabolit sekunder,  dimana  hasil  metabolit  sekunder tersebut mampu menghambat  pertumbuhan bakteri  patogen  seperti  bakteri  vibrio, aeromonas, dan pseodomonas.
Metabolit sekunder merupakan senyawa  yang  dihasilkan  atau  disintesis pada  sel  dan  grup  taksonomi  tertentu  pada tingkat  pertumbuhan  atau  stress  tertentu. Senyawa  ini  diproduksi  hanya  dalam jumlah  sedikit,  tidak  terus-menerus,  untuk mempertahankan  diri  dan  tidak  berperan penting  dalam  proses  metabolisme  utama (primer).  Senyawa  metabolit  sekunder memiliki  struktur  yang  lebih  kompleks, sulit  disintesis,  dan  masih  sedikit  (15%) yang  telah  berhasil  diisolasi  sehingga memiliki  nilai  ekonomi  yang  tinggi (Mariska,  2013).  Kandungan  senyawa metabolit  sekunder  yang  termasuk  ke dalam  golongan  metabolit  telah  terbukti bekerja sebagai derivat antimikroba (Hasanah et  al., 2012).  Secara  umum metabolit  sekunder  berupa  antibiotik, inhibitor  enzim,  zat  pengatur  tumbuh, hormon dan insektisida (Purba et al., 2019). Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui karakteristik metabolit sekunder  produksi  bakteri  heterotrofik sebagai  antimikroba  dari  air  laut  Desa Sungai  Kayu  Ara  Kabupaten  Siak  dan menguji  penyimpanan  bakteri  heterotrofik dengan melihat waktu pertumbuhan optimal.

## 2.      METODE PENELITIAN
Metode  penelitian  yang  digunakan yaiu metode eksperimen. Ekstrak metabolit sekunder bakteri heterotrofik diperoleh dari koleksi  Laboratorium  Mikrobiologi  Laut Jurusan  Ilmu  Kelautan  Fakultas  Perikanan dan  Kelautan  Universitas  Riau.  Hasil penelitian  yang  telah  dilakukan  sebelunya oleh  Hutasoit  (2018)  bahwa  isolat  yang
telah  teridentifikasi  merupakan  bakteri heterotrofik,  dimana  bakteri  heterotrofik menghasilkan  senyawa  metabolit  sekunder yang  mampu  menghambat  pertumhuhan bakteri patogen.
Setiap  ekstrak  bakteri  heterotrofik dilakukan pengujian mulai dari uji fitokimia, Kromatografi Lapis Tipis (KLT),
HPLC ( High Performance Liquid Crhomatography ),  analisis  MIC  ( Minimum Inhibitory Concentration ) dan MBC ( Manimum  Bactericidal  Concentration ) untuk mengetahui senyawa yang terkandung  dalam  setiap  ekstrak  yang diujikan  serta  uji  penyimpanan  bakteri dengan tiga kali pengulangan dan konsentrasi yang berbeda.
Prosedur Penelitian

## Uji Fitokimia
Kandungan senyawa metabolit sekunder  dapat  diketahui  dengan  suatu metode  pendekatan,  salah  satu  yang  dapat digunakan  adalah  metode  uji  fitokimia (Setyowati et al ., 2014).

## Pemeriksaan senyawa saponin
Ekstrak sejumlah tertentu lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian akuades yang sudah dihangatkan kemudian  dikocok  kuat-kuat  dan  diamkan selama 10 menit. Sampel positif mengandung  senyawa  saponin  apabila terbentuk  busa  dan  tidak  hilang  selama waktu 15 menit setelah ditetesi HCl.

## Pemeriksaan senyawa alkaloid
Pengujian  dilakukan  dengan  sampel sebanyak  2  ml  diekstraksi  dengan  pelarut air  dan  etanol  ke  dalam  2  buah  tabung reaksi  yang  berbeda.  Setelah  itu  masing- masing  ekstrak  ditambah  dengan  5  tetes reagen  Dragendroff.  Jika  masing-masing larutan  terbentuk  endapan  merah  jingga maka positif mengandung alkaloid. Selanjutnya  untuk  pengujian  Alkaloid dengan menggunakan reagen mayer dilakukan  dengan  cara  mengambil  masing-
masing  sebanyak  2  mL  sampel  yang  telah diekstraksi dengan pelarut air dan etanol ke dalam  2  buah  tabung  reaksi  yang  berbeda. Setelah itu masing-masing ekstrak ditambah  3  tetes  asam  klorida  pekat  dan  5 tetes  reagen  Mayer.  Jika  masing-masing larutan  terbentuk  endapan  putih,  kekuning- an  maka  sampel  positif  mengandung alkaloid.
Pemeriksaan senyawa steroid dan terpenoid
Pengujian  dilakukan  dengan  cara sampel  sebanyak  2  ml  diekstraksi  dengan pelarut  air  dan  etanol.  Setelah  itu  masing- masing ekstrak ditambahkan dengan 3 tetes HCl  pekat  dan  1  tetes  H 2 SO 4 pekat.  Jika masing-masing  larutan  terbentuk  warna hijau  maka  positif  mengandung  steroid (Ergina et al. , 2014).
Untuk uji terpenoid dilakukan dengan sampel  sebanyak  2  ml  diekstraksi  dengan pelarut  air  dan  etanol.  Setelah  itu  masing- masing  ekstrak,  ditambahkan  dengan  3 tetes  HCl  pekat  dan  1  tetes  H 2 SO 4 pekat. Jika  masing-masing  larutan  terbentuk warna  merah  atau  ungu  maka  positif mengandung  terpenoid  (Ergina et  al. , 2014).

## Pemeriksaan senyawa flavonoid
Sebagian  filtrat  dari  ekstrak  yang sudah dipanaskan dengan campuran alkohol  diambil  dan  dimasukkan  kedalam tabung  reaksi.  Kemudian  ditambahkan  1-2 butir  logam  Mg  dan  3  tetes  HCl  pekat  dan kocok  dengan  kuat,  biarkan  hingga memisah. Warna kuning kemerahan hingga merah  menunjukan  bahwa  sampel  positif mengandung senyawa flavonoid.

## Pemeriksaan senyawa fenolik
Filtrat  dimasukkan  kedalam  tabung reaksi  dan  ditambahkan    FeCl 3 .  Jika  hasil positif dinyatakan dengan adanya perubahan  warna  larutan  menjadi  hijau gelap atau biru (Putri et al ., 2015).
Uji KLT (Kromatografi Lapis Tipis) Pengujian dengan metode KLT diawali  dengan  larutan  sampel  diteteskan pada  ujung  plat  KLT  1-2  cm  dari  ujung plat.  Plat  KLT  selanjutnya  di  masukkan kedalam  chamber  yang  berisi  eluen  yaitu campuran yang terdiri dari metanol dan etil asetat.  Pemilihan  pelarut  organik  tersebut didasarkan  atas  pendekatan  polaritas  yang paling  sesuai  untuk  pemilihan  pelarut.  Plat KLT  dibiarkan  hingga  eluen  menyentuh seluruh  permukaan  plat  secara  menyeluruh dan  dikeringkan.  Selanjutnya  plat  KLT yang  telah  kering  disinari  dibawah  lampu UV  254  dan  366    untuk  melihat  endapan hasil pemisahan pelarut dan senyawa dalam bahan. Plat KLT ini difoto dan nilai Rf dari noda ditentukan dengan rumus:
Rf = Jarak antara titik penotolan ke pusat bercak Jarak antara titik penotolan ke batas elusi
Angka  Rf  berjangka  antara  0,00  dan 1,00  dan  hanya  dapat  ditentukan  dua desimal (Umullia, 2017).
Uji  HPLC  ( High  Performance  Liquid Chromatography )
Langkah-langkah
menganalisa
menggunakan  HPLC  yaitu  mula-mula sampel diinjeksi dengan syringe . Kemudian sampel  masuk  ke injection  hall .  Dari injection  hall ini  proses  utama  cara  kerja HPLC  dimulai,  yaitu  dengan  memompa sampel  ke  kolom  oleh  LC20AT  dalam tekanan  tinggi.  Dari  kolom,  sampel dijadikan  fase  bergerak  dan  diolah  dengan fase diam yaitu biasanya H 2 SO 4 0,05 N dan CH 3 OH  berdasarkan  afinitas  elektron. Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan  matematis,  HPLC  yang  sudah disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Elusi gradien  didefinisikan  sebagai  penambahan kekuatan  fase  gerak  selama  analisis kromatografi  berlangsung.  Efek  dari  elusi gradien  adalah    mempersingkat  waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom.
e-issn: 2716-4608 p-issn: 2655-366X Uji MIC ( Minimum inhibitory concentration )  dan  MBC  ( Minimum Bactericidal Concentration ) Analisis  MIC  dan  MBC  dilakukan pada  bakteri  dan  jamur  patogen  yang menunjukkan aktivitas tertinggi dari analisis antimikroba dengam metode dilusi. Bakteri  diremajakan  di  media  NA  dan diinkubasi selama 1 hari di dalam inkubator dengan  suhu  37 0 C.  Kemudian  bakteri diinokulasikan  ke  media Muller  Hinton Broth 5  ml,  diinkubasi  selama  1  hari  dan dilakukan  pengenceran  dengan  NaCl  0,8% apabila  nilai  OD  ( Optical  density )  600  nm lebih  besar  dari  0,1.  Sampel  dilarutkan dengan  DMSO  50%  dengan  konsentrasi awal  2000  μg/ml  sampai  0,976  μg/ml menggunakan  pengenceran  bertingkat.  Hal yang sama juga dilakukan terhadap kontrol positif amoxicillin .  Kontrol  negatif  yang digunakan adalah DMSO 50%.
Microtiter  plate disiapkan  dan  di setiap  sumur  pada microtiter  plate diisi dengan  140  mg/ml  media  MHB,  kedalam sumur  pertama  (2000  μg/ml)  dimasukkan sampel sebanyak 20 μl dan bakteri patogen 20 μl, kemudian dihomogenkan. Setelah itu microtiter  plate diinkubasi  selama  1  hari, kemudian  resazurin  sebanyak  20  μl ditambahkan  ke  dalam  setiap  sumur microtiter plate untuk mendeteksi pertumbuhan  bakteri  yang  ditandai  dengan perubahan  warna  dari  biru  ke  merah  muda dan  diinkubasi  selama  1  hari.  Tiga  sumur (yang  memberikan  aktivitas  bakteriostatik) sebanyak 100 μl diinokulasi ke cawan petri dengan media NA dan diinkubasi selama 1 hari.  Kemudian  dihitung  koloni  bakteri yang  tumbuh  pada  plate  NA  untuk menentukan MBC.

## Uji Penyimpanan Bakteri
Uji  penyimpanan  bakteri  heterotrofik dilakukan untuk mengetahui tingkat pertumbuhan  bakteri  dengan  penambahan konsentrasi  gula  enau  1%,  3%,  dan  5% diuji atau diamati dalam waktu 0, 7, dan 14 hari. Pengujian dilakukan dengan
menyiapkan  air  laut  salinitas  27  ppt sebanyak  2L  disterilkan  ±  15  menit ( autoclave ), gula anau diencerkan sebanyak 5 gr/L, kemudian disiapkan 10 botol uji dan dimasukkan  air  laut  200  ml  yang  telah disterilkan kesetiap botol, tuang gula aren 1 gram  dalam  200  ml  ditambah  dengan konsentrasi yang telah ditentukan (1%, 3%, dan 5%) dan putih telur 5% dari volume air (10 ml/botol) tambahkan bakteri heterotrofik  ( V.  fluvialis )  yang  sudah dikultur  sebanyak  2  ose.  Perhitungan bakteri dengan menggunakan spektrofotometer.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Uji Fitokimia
Komponen  yang  terdapat  dalam ekstrak  dianalisis  golongan  senyawanya dengan  tes  uji  warna  dengan  beberapa pereaksi  untuk  golongan  senyawa  saponin, flavonoid,  fenolik,  alkaloid,  steroid  dan terpenoid.  Pereaksi-pereaksi  spesifik  yang digunakan kebanyakan bersifat polar sehingga  bisa  berinteraksi  dengan  sampel berdasarkan prinsip like dissolve like . Hasil skrining fitokimia menunjukkan bahwa  ke- 5  ekstrak  mengandung  alkaloid,  hanya ekstrak  B,  D,  dan  H  mengandung  saponin, serta hanya ekstrak J mengandung flavonoid.  Flavonoid  merupakan  senyawa yang  mengandung  dua  cincin  aromatik dengan  gugus  hidroksil  lebih  dari  satu. Penambahan  Mg  dan  HCl  pekat  akan mereduksi  flavonoid  sehingga  menghasil- kan larutan yang berwarna kuning kemerahan, hingga merah.
Senyawa  bahan  aktif  flavonoid  yang merupakan senyawa polar yang mempunyai gugus  hidroksil  atau  gula,  sehingga  dapat larut  dalam  pelarut  polar  seperti  etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dan  air  (Ergina et  al .,  2014).  Flavonoid mempunyai  banyak  manfaat  dibidang kesehatan  diantaranya  sebagai  antioksidan, antidermatosis, kemopreventif, dan antikanker (Saraswati, 2015). Hasil analisis
e-issn: 2716-4608 p-issn: 2655-366X kandungan kimia ekstrak bakteri heterotrofik dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 . Uji Fitokimia metabolit sekunder produksi bakteri heterotrofik Senyawa
Metabolit
Sekunder Ekstrak Keterangan B C D J H Saponin + - + - + (+) bila terbentuk busa selama ± 15 menit Flavonoid - - - + - (+)  bila  terbentuk  warna  kuning  kemerahan hingga merah Fenolik - - - - - (-) tidak terbentuk warna biru-ungu Steroid dan Terpenoid - - - - - (-)  untuk  senyawa  steroid  tidak  terbentuk  warna hijau dan untuk senyawa terpenoid tidak terbentuk warna merah atau ungu Alkaloid (Dragendorff) - - - - - (-) tidak terbentuk endapan jingga (Mayer) + + + + + (+) bila terbentuk endapan putih
Pada  hasil  penelitian  uji  alkaloid ekstrak  bakteri  heterotofik  menunjukkan hasil  negatif  dengan  menggunakan  uji Dragondroff  namun  menunjukkan  hasil positif  menggunakan  uji  Mayer.  Hal tersebut  sesuai  dengan  Skrining  fitokimia secara  kualitatif  yang  dilakukan  oleh  Naz dan Bano (2013), untuk menguji keberadaan  alkaloid  pada  tanaman  saliara menunjukkan hasil negatif dengan menggunakan uji Dragondroff dan menunjukkan hasil uji positif menggunakan uji  Mayer.  Perbedaan  hasil  skrining fitokimia  dapat  disebabkan  oleh  perbedaan kepekaan  metode  uji  yang  digunakan terhadap  jumlah  kandungan  kimia  dari bahan  alam  yang  diuji.  Alkaloid  berfungsi sebagai antibakteri dengan cara mengganggu  penyusun  peptidoglikan  pada sel  bakteri,  sehingga  lapisan  dinding  sel tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan kematian sel (Cushnie et al ., 2014).
Uji kualitatif saponin positif
ditandai  dengan  terbentuknya  busa  yang
dapat  bertahan  selama  5  menit.  Busa  yang ditimbulkan saponin karena adanya kombinasi  struktur  senyawa  penyusunnya yaitu  rantai  sapogenin  nonpolar  dan  rantai samping  polar  yang  larut  dengan  air. Sehingga  busa  yang  ditimbulkan  dapat bertahan  selama  kurang  lebih  5-10  menit (Khotimah, 2016). Saponin dikenal sebagai senyawa  nonvolatil  yang  larut  dalam  air dan alkohol tapi tidak dalam eter  (Illing et al ., 2017). Mekanisme kerja antibakteri dari saponin dengan cara meningkatkan permeabilitas membran sel sehingga membran menjadi tidak stabil dan mengakibatkan  hemolisis  sel  (Dewi  dan Hertriani, 2015).
Uji  KLT  (Kromatografi  Lapis Tipis)
Eluen  yang  digunakan  pada  uji  ini terdapat  beberapa  perbandingan  yaitu  etil asetat  :  metanol  (1:1),  etil  asetat  :  metanol (1:2),  etil  asetat  :  metanol  (2:1),  dapat dilihat  pada  Gambar  1  dan  nilai Rf dapat dilihat pada Tabel 2..
a b c
Gambar 1. Uji KLT ekstrak B, C, D, H dan J pengamatan pada sinar UV 254 nm.
Keterangan: a). 1:1 (Etil : Metanol), b). 1:2 (Etil : Metanol) dan c). 2:1 (Etil : Metanol)
Pada Gambar a dan c dari noda yang terdapat  menunjukkan  senyawa  cenderung bersifat  semi  polar,  dan  pada  Gambar  b
noda  yang  terdapat  menunjukkan  bahwa senyawa  bersifat  polar  yang  mana  eluen bergerak naik hingga mengenai batas elusi.
Tabel 2. Nilai Rf dari setiap ekstrak yang diujikan
Ekstrak Nilai Rf Keterangan Etil asetat : Metanol (1:1) Etil asetat : Metanol (1:2) Etil asetat : Metanol (2:1) B C D H J 0.26 0.32 0.32 0.26 0.31 0.93 0.92 0.00 0.91 0.98 0.26 0.23 0.21 0.16 0.00 Fluoresensi biru muda Fluoresensi biru muda Fluoresensi hijau muda Fluoresensi hijau muda
Fluoresensi biru muda
Berdasarkan nilai Rf dengan beberapa eluen,  senyawa  yang  dihasilkan  cenderung dari  semi  polar  hingga  polar.  Terlihat  dari eluen  yang  cenderung  polar  menghasilkan senyawa  dengan Rf tinggi  yang  memiliki nilai di atas 0,9.
Uji  HPLC  ( Hight  Performance Liquid Chromatography )
Hasil HPLC pada ekstrak B, C, D, H, dan J menunjukkan  keluarnya puncak pada masing-masing  ekstrak  memiliki  waktu yang  berbeda-beda  dapat  dilihat  pada Gambar 2, 3, 4, 5 dan 6.
Gambar 2. Hasil HPLC sampel B
Keterangan: Det.A Ch1= 254nm, tR = 22.396 menit , Det.A Ch2= 366nm, tR = 3.283 menit
Pada  ekstrak  B  terdapat  1  puncak senyawa  dimana  senyawa  keluar  pada  fase diam  bersifat  non  polar  karena  senyawa tertahan  pada  fase  gerak  (Gambar  3).  Pada ekstrak  C  terdapat  1  puncak  senyawa  pada
waktu  retensi  23.387  menit,  dimana senyawa keluar pada fase diam bersifat non polar  karena  senyawa  tertahan  pada  fase gerak (Gamabr 4).
Gambar 3. Hasil HPLC sampel C Keterangan: Det.A Ch1= 254nm, t R = 23.387 menit, Det.A Ch2= 366nm, t R = 23.638 menit
Gambar 4. Hasil uji kemurnian menggunakan HPLC sampel D Keterangan: Det.A Ch1= 254nm, t R = 23.810 menit, Det.A Ch2= 366nm, t R = 23.810 menit ekstrak D terdapat 1 puncak senyawa pada  waktu  retensi  23.810  menit,  dimana senyawa keluar pada fase diam bersifat non polar  karena  senyawa  tertahan  pada  fase gerak  (Gambar  5).  Sedangkan  ekstrak  H
terdapat  1  puncak  senyawa  pada  waktu retensi  23.810  menit,  dimana  senyawa keluar  pada  fase  diam  bersifat  non  polar karena  senyawa  tertahan  pada  fase  gerak (Gambar 6).
Gambar 5. Hasil HPLC sampel H Keterangan: Det.A Ch1= 254nm, t R = 23.868 menit , Det.A Ch2= 366nm, t R = 3.912 menit
Gambar 6 . Hasil HPLC sampel J Keterangan: Det.A Ch1= 254nm, t R = 3.281 menit , Det.A Ch2= 366nm, t R = 18.079 menit
Pada  ekstrak  J  terdapat  1  puncak senyawa  pada  waktu  retensi  3.281  menit, dimana  senyawa  bersifat  polar  akan  keluar terlebih  dahulu  karena  tidak  tertahan  pada fase diam yang bersifat non polar.
Metode HPLC yang digunakan adalah  fase  terbalik  dengan  sistem  gradien elusi,  yaitu  fase  diam  bersifat  non  polar (oktadesil silika atau ODS) sedangkan fase geraknya  bersifat  polar  dengan  gradien elusi  asetonitril  larut  dalam  air  70-90  dan dirunning selama 20 menit. Pada ekstrak B, C,  D,  H  dan  J  diberi  perlakuan  yang  sama dalam  pengujian  ini  untuk  mendapatkan perbandingan  hasil  antara  semua  ekstrak uji.  Hasil  yang  didapat  dari  semua  ekstrak yaitu  B,  C,  D,  H  dan  J  memiliki  waktu retensi yang berbeda-beda sehingga
kemungkinan dapat dikatakan bahwa setiap senyawa memiliki panjang gelombang yang berbeda-beda dan ada yang tidak terdeteksi pada detektor.
Uji MIC ( Minimum Inhibitory Concentration )  dan  MBC  ( Minimum Bactericidal Concentration )
Konsentrasi  yang  digunakan  pada  uji aktivitas  antimikroba V.  fluvialis dimulai dari 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625,  7.812,  3.062,  1.953  dan  0,976 µg/ml dengan menggunakan metode dilusi. Mikroba  yang  digunakan  pada  uji  ini  ialah dari  bakteri  patogen  yaitu A.  hydrophila, Pseudomonas sp  dan V.  alginolyticus. Dapat dilihat pada Tabel  3.
Tabel 3. Hasil uji antimikroba metode dilusi ekstrak J bakteri V. fluvialis Senyawa A. hydrophila Pseudomonas sp V.  alginolyticus MIC (µg/mL) MBC (µg/mL) MIC (µg/mL) MBC (µg/mL) MIC (µg/mL) MBC (µg/mL) Ekstrak J 500 >2000 >2000 >2000 >2000 >2000 Amoxisilin 31,25 >2000 >2000 >2000 >2000 >2000 DMSO >2000 >2000 >2000 >2000 >2000 >2000
Hasil  uji  MIC  pada  Tabel  3 menunjukkan  bahwa  ekstrak  J  memiliki aktivitas menghambat pada konsentrasi 500 µg/ml,  pada  konsentrasi  2000  µg/ml  dan 1000  µg/ml  tidak  ada  aktivitas  hambat terhadap A.  hydrophila dan  kontrol  positif amoxisilin sebesar  31,25  µg/ml.  Hal  ini dapat  saja  disebabkan  ekstrak  memiliki aktivitas optimum pada konsentrasi
tertentu. Ekstrak masih mengandung banyak senyawa yang aktivitasnya bisa saja berbeda-beda.  Rimporok et  al .  (2015), menyatakan bahwa semakin tinggi konsentrasi  ekstrak  yang  diberikan,  maka akan semakin besar kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri.
Sedangkan  pada Pseudomonas sp  dan V. alginolyticus tidak terdapat aktivitas
menghambat.  Sementara  pada  uji  MBC tidak terdapat aktivitas membunuh terhadap semua  patogen  yang  diujikan.  Maryani (2013)  mengatakan  bahwa  konsentrasi ekstrak  semakin  pekat  maka  senyawa metabolit  sekunder  yang  terkandung  di dalamnya  akan  semakin  banyak  sehingga memberikan pengaruh terhadap aktivitas.
Perbedaan  zona  hambat  berbagai volume  ini  disebabkan  selain  faktor volume,  metode  dilusi,  jenis    bakteri,  jenis bahan antimikroba juga menentukan kemampuan  menghambat  pertumbuhan bakteri, adanya
perbedaan
jumlah kandungan senyawa aktif (Febrianti, 2019).

## Uji Penyimpanan Bakteri
Hasil  pengamatan  uji  penyimpanan bakteri  pada  ekstrak  J  ( V.  fluvialis )  yang sudah diberi penambahan gula aren dengan konsentrasi  1%,  3%  dan  5%  serta  putih telur ayam ras sebanyak 5% dari volume air laut yang digunakan dan diinkubasi selama 0,  7  dan  14  hari  serta  dispektrofotometer hingga  menyamai  kepadatan  10 8 .  Jumlah pertumbuhan  koloni  bakteri  dapat  dilihat pada  Tabel  4,  grafik  pertumbuhan  bakteri V.  fluvialis dapat  dilihat  pada  Gambar  7.
Tabel 6. Jumlah bakteri heterotrofik (CFU/ml)
Kode isolat H0 10 8 CFU/ml H7 10 8 CFU/ml H14 10 8 CFU/ml J1U1 20,5 x 10 8 87,9 x 10 8 63,2 x 10 8 J1U2 36,4 x 10 8 83,7 x 10 8 79,6 x 10 8 J1U3 21,7 x 10 8 63,1 x 10 8 60,7 x 10 8 J3U1 29,5 x 10 8 86,1 x 10 8 67,9 x 10 8 J3U2 10,8 x 10 8 97,6 x 10 8 75,8 x 10 8 J3U3 15 x 10 8 99,1 x 10 8 78,1 x 10 8 J5U1 20,5 x 10 8 132,1 x 10 8 83,1 x 10 8 J5U2 15,2 x 10 8 127,1 x 10 8 64,2 x 10 8 J5U3 15,6 x 10 8 96,1 x 10 8 68,7 x 10 8 Kontrol J 37,2 x 10 8 113,2 x 10 8 77,3 x 10 8
Tabel  6  menunjukkan  perhitungan jumlah  bakteri  heterotrofik  tertinggi  pada kode isolat J5U1 pada hari ke-7 yaitu 132,1 x  10 8 CFU/ml  dan  terendah  pada  kode isolat J3U2 pada hari ke-0 yaitu 10,8 x 10 8 CFU/ml.
Pada  penelitian  ini  sumber  nutrisi yang  digunakan  adalah  gula  aren  (gula merah)  dan  putih  telur  ayam  ras.  Menurut Lempang  (2012),  gula  aren  mengandung glukosa  yang  cukup  tinggi,  kekhasan  gula aren  dari  segi  kimia  yaitu  mengandung sukrosa  kurang  lebih  84%  dibandingkan dengan gula tebu dan gula bit yang masing- masing hanya 20% dan 17% sehingga gula aren  mampu  menyediakan  energi  lebih tinggi dari gula bit dan gula tebu.
Semakin  lama  waktu  penyimpanan maka  presentase  viabilitas  bakteri  semakin
menurun.  Hal  ini  berkaitan  dengan  daya tumbuh  bakteri  yang  dipengaruhi  oleh faktor  lingkungan  terutama  suhu  dan medianya.
Rendahnya tingkat kelangsungan hidup  bakteri  yang  didapatkan  pada penelitian  ini  dipengaruhi  oleh  faktor nutrisi,  kadar  atau  konsentrasi  bahan preservasi (penyimpanan) dan suhu.
Waluyo  (2012),  menyatakan  bahwa  sel sangat memerlukan nutrien untuk mensintesis  protoplasma  sebagai  sumber karbon, sumber nitrogen, metabolit penting (vitamin)  dan  juga  asam  amino.  Bakteri tumbuh  pada  lingkungan  yang  sesuai, apabila  lingkungannya  tidak  optimal  maka pertumbuhan  bakteri  akan  berjalan  lambat, tidak tumbuh atau bahkan mati.

## 4. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan
Hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan dapat  disimpulkan  bahwa  karakteristik metabolit sekunder produksi bakteri heterotrofik  dari  uji  fitokimia  pada  5 ekstrak  bakteri  heterotrofik  mengandung senyawa  saponin  diantaranya  pada  ekstrak B,  D  dan  H,  senyawa  flavonoid  pada ekstrak  J  dan  senyawa  alkaloid  ada  pada kelima ekstrak yaitu B, C, D, H dan J. Pada uji antimikroba metode dilusi menunjukkan ekstrak  J  dapat  menghambat  bakteri patogen A.  hydrophila pada  konsentrasi 500µg/ml  sementara  pada V.  algynolyticus
dan Pseudomonas sp belum dapat menghambat aktivitas pertumbuhan bakteri pada konsentrasi yang ditentukan, dan pada uji  penyimpanan  bakteri,  pertumbuhan optimal  setiap  konsentrasi  bakteri  pada waktu  inkubasi  hari  ke  7  dan  mengalami penurunan pada hari ke 14.

## Saran
Perlu  dilakukannya  penelitian  lebih lanjut  dengan  pemisahan  dan  fraksinasi lebih  lanjut  untuk  mendapatkan  senyawa murni  dan  mengetahui  struktur  senyawa potensial  dengan  analisis  spektroskopi NMR dan MS.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Adly,  CL.,  JE.  Tremblay,  RT.  Powell,  E.  Armstrong,  G.  Peers,  and  NM.  Price.  (2015). Response  of  Heterotrophic  Bacteria  in  a  Mesoscale  Iron  Enrichment  in  the  Northeast Subarctic Pacific Ocean. Limnology and oceanography , volume 60 pages 136-148.
2. Afriza, D., I. Effendi, YI. Siregar. (2019). Isolation, Identification and Antagonism Test of  Heterotrohic  Bacteria  in  Mangrove  Plants  Againts  Pathogenic  Bacteria  ( Vibrio alginolyticus,  Aeromonas  hydrophila, and Pseudomonas sp.). Jurnal  Perikanan  dan Kelautan, volume 24(1), pages 61-68.
3. Cushnie,  TP.,  B.  Cushnie,  and  AJ.  Lamb.  (2014).  Alkaloids:  an  Overview  of  their Antibacterial, Antibioticenhancing and Antivirulence Activities. International Journal of Antimicrobial Agents , volume 44(5) pages 377-386.
4. Dewi,  ZY.,  A.  Nur,  dan  T.  Hertriani.  (2015).  Efek  Antibakteri  dan  Penghambatan Biofilm Ekstrak Sereh ( Cymbopogon nardus L) terhadap Bakteri Streptococcus mutans . Artikel penelitian. Maj Ked Gi Ind , volume 1(2) pages 136-141.
5. Ergina.,  S.  Nuryanti,  dan  ID.  Pursitasari.  (2014).  Uji  Kualitatif  Senyawa  Metabolit Sekunder  pada  Daun  Palado  ( Agave  angustifolia )  yang  Diekstraksi  dengan  Pelarut  Air dan Etanol. Jurnal Akademik Kimia . Volume 3(3) pages 165- 172.
6. Febrianti,  DR.  (2019).  Aktivitas  Antibakteri  Minyak  Atsiri  Kulit  Jeruk  Siam  Banjar ( Citrus  reticulate )  Terhadap  Pertumbuhan Pseudomonas  aeruginosa . Jurnal Pharmascience , volume 6(1) pages 10-17.
7. Hasanah,  NF.,  D.  Pringgenies,  Y.  Sri,  dan  Wulandari.  (2012).  Karakterisasi  Metabolit Sekunder  Bakteri  Simbion  Gastropoda Conus  miles dengan  Metode  GC-MS  sebagai Antibakteri  MDR  (Multi  Drug  Resistant). Journal  of  Marine  Research ,  volume  1(2) pages 197-202.
8. Hutasoit,  AY.  (2018).  Uji  Metabolit  Sekunder  Bakteri  Heterotrofik  dari  Air  Laut  Desa Sungai  Kayu  Ara  Kabupaten  Siak  Terhadap  Bakteri  Patogen.  [Skripsi].  Fakultas Perikanan dan Kelautan. Universitas Riau. Riau.
9. Illing,  I.,  W.  Safitri,  dan  Erfiana.  (2017).  Uji  Fitokimia  Ekstrak  Buah  Dengen. Jurnal. Dinamika , Volume 8(1) pages 66-84.
10. Khotimah,  K.  (2016).  Skrining  Fitokimia  dan  Identifikasi  Metabolit  Sekunder  Senyawa Karpain  pada  Ekstrak  Metanol  Daun Carica  pusbencens Lenne and K.  Koch dengan
LC/MS  (Liquid  chromatograph-tandem  Mass  Spectrometry).  [Skripsi].  Jurusan  Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim. Malang.
11. Lempang,  M.  (2012).  Pohon  Aren  dan  Manfaat  Produksinya.  Info. Teknis  EBONI , volume 9(1) pages 37-54.
12. Mariska.  I.  (2013). Metabolit  Sekunder  Jalur  Pembentukan  dan  Kegunaannya. BB Biogen. Bogor
13. Maryani,  C.  (2013).  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Jarak  Tintir  ( Jatropha  multifida L.)  terhadap  Pertumbuhan  ( Staphylococcus  aureus )  Secara  In  Vitro.  [Skripsi]. Universitas Sanata Dharma. Yogyakarta.
14. Naz, R., and A. Bano. (2013). Phytochemical Screening, Antioxidants and Antimicrobial Potential of Lantana camara in Different Solvents. Asian Pacific J Trop Dis , volume 3(6) pages 480- 486.
15. Purba,  TMT.,  I.  Effendi,  Feliatra.  (2019).  Effectiveness  Test  of  Nipah  Extract  as Larvacide  on  mosquito  Larvae  ( Aedes  aegpti ). Asian  Journal  of  Aquatic  Sciences , volume 2(1), pages 72-78
16. Putri, WS., NK. Warditiani, dan LPF. Larasanty. (2015). Skrining Fitokimia Ekstrak Etil Asetat  Kulit  Buah  Manggis  ( Garcinia  mangostana L.).  [Skripsi].  Fakultas  Matematika dan IPA. Universitas Udayana. Jimbaran.
17. Rimporok,  S.,  BJ.  Kepel,  dan  KV.  Siagian.  (2015).  Uji  Efektivitas  Ekstrak  Daun Binahong  ( Anredera  cordifolia  Steenis ),  Terhadap  Pertumbuhan Streptococcus  mutans Secara In-vitro. Pharmacon , volume 4(4) pages 15-21.
18. Saraswati,  FN.  (2015).  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Etanol  96%  Limbah  Kulit Pisang  Kepok  Kuning  ( Musa  balbisiana )  Terhadap  Bakteri  Penyebab  Jerawat ( Staphylococcus  epidermidis , Staphylococcus      aureus ,  dan Propionibacterium  acne ). [Skripsi]. UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta
19. Setyowati.  WAE.,  SRD.  Ariani,  Ashadi,  B.  Mulyani,  dan  CP.  Rahmawati.  (2014). Skrining  Fitokimia  dan  Identifikasi  Komponen  Utama  Ekstrak  Metanol  Kulit  Durian ( Durio zibethinusmurr ) Varietas Petruk. Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia VI. Prodi Pendidikan Kimia Jurusan FMIPA FKIP Universitas Surakarta. Surakarta.
20. Umullia,  HF.  (2017).  Bioaktivitas  Fungi  Kode  Sal  6  Asosiasi  Spons Stylissa Flabelliformis dari  Perairan  Pulau  Menjangan,  Taman  Nasional  Bali  Barat.  [Skripsi]. Universitas Gajah Mada. Yogyakarta.
21. Widiastuti.  (2014).  Kemampuan  Metabolit  Sekunder  Bakteri  Laut  Menghambat Pertumbuhan Vibrio  parahaemolyticus dan Staphylococcus  aureus.  Agritech ,  volume 21(3) pages 104-107.
22. Waluyo, L. (2012). Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang.