ISSN 2085-2916 e-ISSN 2337-3652 Tersedia daring http://jai.ipb.ac.id J. Agron. Indonesia, Desember 2020, 48(3):323-330 DOI: https://dx.doi.org/10.24831/jai.v48i3.29170 Radiosensitivitas dan Pertumbuhan In Vitro Protocorm Anggrek ‘Tien Soeharto’ ( Cymbidium hartinahianum J.B. Comber & R.E. Nasution)
Radiosensitivity and In Vitro Growth of ‘Tien Soeharto’ Orchid (Cymbidium hartinahianum J.B. Comber & R.E. Nasution) Protocorm
Elizabeth Handini 1 , Dewi Sukma 2* , Sudarsono 2 , dan Ika Roostika 3
1 Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya, LIPI Jl. Ir. H. Juanda No. 13, Paledang, Bogor Tengah, Bogor 16122, Indonesia
2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB University), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
3 Balai Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111, Indonesia
Diterima 10 Februari 2020/Disetujui 18 November 2020

## ABSTRACT
C. hartinahianum J.B. Comber & R.E. Nasution is an endemic orchid in North Sumatra. The habitat of C. hartinahianum is restricted in highland with low temperature. Most of its natural habitat has been shifted to other land use. Induced mutation using gamma-ray irradiation is an alternative method to obtain the orchid mutant with better vigor and tolerance to higher temperatures. This study aimed to evaluate C. hartinahianum protocorm’s radiosensitivity to gamma irradiation and evaluate irradiated protocorm growth in two different temperature culture rooms. The protocorms were exposed to 0, 5, 10, 15, and 20 Gy of gamma irradiation. A half number of irradiated protocorm were incubated at 16-18 o C and a half another at 22- 27 o C culture room temperature to evaluate their radiosensitivity and growth. The result showed that the LD 20 and LD 50 of protocorm cultured in 16-18 o C were 26.98 Gy and 38.24, while the LD 20 and LD 50 of protocorm cultured in 22-27 o C were at 17.08 Gy and  27.29 Gy. Protocorm-like bodies (PLBs) proliferation and shoot morphogenesis were better in the tissue culture room at 22-27 o C. This experiment suggested that the re-irradiation of PLBS could be performed at the LD 20 or LD 50 at 22-27 o C culture room (17.08 Gy and  27.29 Gy) to find a putative mutant of C. hartinahianum.
Keywords: gamma rays irradiation, in vitro mutation induction, multiplication, lethal-dose, protocorm like bodies (PLBs)

## ABSTRAK
C. hartinahianum J.B. Comber & R.E. Nasution merupakan salah satu jenis anggrek endemik di Sumatera Utara. Habitatnya terbatas di dataran tinggi dengan suhu rendah. Habitat alami tersebut sudah banyak dikonversi untuk penggunaan lainnya. Induksi radiasi sinar gamma merupakan metode alternatif untuk mendapatkan tanaman mutan toleransi terhadap kondisi  suhu  yang  tinggi.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  radiosensitivitas  protocorm  C.  hartinahianum  J.B. Comber  &  R.E.  Nasution  terhadap  iradiasi  sinar  gamma  dan  pertumbuhan  PLBs  di  suhu  ruang  kultur  yang  berbeda. Protocorm diiradiasi dalam kisaran dosis iradiasi 0, 5, 10, 15, dan 20 Gy, kemudian separoh populasi protocorm pasca iradiasi diinkubasi dalam ruang kultur dengan suhu 16-18 o C dan separoh yang lain di suhu 22-27 o C, untuk mengevaluasi radiosentitivitas  dan  pertumbuhannya.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  LD 20 dan  LD 50 protocorm  di  ruang  kultur bersuhu 16-18 o C adalah 26.98 Gy  dan 38.24, sementara LD 20 dan LD 50 protocorm pada ruang kultur bersuhu 22-27 o C adalah 17.08 Gy  dan 27.29 Gy. Proliferasi PLBs dan morfogenesis tunas C. hartinahianum lebih baik pada ruang kultur dengan suhu 22-27 o C. Hasil penelitian menunjukkan bahwa re-iradiasi sinar gamma sebaiknya dilakukan pada LD 20 atau LD 50 dari ruang kultur dengan suhu 22-27 o C yaitu sebesar 17.08 Gy dan  27.29 Gy, untuk mendapatkan mutan putatif C. hartinahianum.
Kata kunci: dosis letal, induksi mutasi in vitro, iradiasi sinar gamma, multiplikasi, protocorm like bodies (PLBs)

## PENDAHULUAN
Anggrek Cymbidium  hartinahianum J.B.  Comber  & R.E. Nasution ditemukan Comber dan Rusdi E Nasution, (peneliti dari Herbarium LBN/LIPI Bogor) pada tahun 1976. Peneliti  tersebut  memberi  nama  anggrek  tersebut dengan anggrek ‘Tien Soeharto’ dan ditetapkan sebagai salah satu jenis tumbuhan yang dilindungi berdasarkan Peraturan Pemerintah (PP) No. 7/1999. C. hartinahianum merupakan anggrek endemik dataran tinggi yang terdistribusi di daerah Siborong-borong hingga Sidikalang (Sumatera Utara) pada ketinggian sekitar 1680 m dpl dan pegunungan Leuser Aceh pada ketinggian 2600 m dpl (Comber 2001).
C. hartinahianum mempunyai potensi sebagai induk silangan  karena  morfologi  bunganya  yang  indah  dan tangkai bunga yang panjang dan tegak. C. hartinahianum dapat menghasilkan buah dan biji untuk perkecambahan in vitro (Handini  dan  Garvita,  2013) . Propagasi in  vitro dan regenerasi  planlet  juga  sudah  berhasil  dilakukan,  namun masih  terkendala  dengan  persentase  hidup  tanaman  yang rendah pada tahap aklimatisasi planlet di lingkungan dataran rendah  (Bogor)  (Handini et  al .,  2017).  Ketidakcocokan kondisi agroklimat dataran rendah di Bogor yang memiliki suhu  lebih  tinggi  dari  habitat  asli C.  hartinahianum di dataran  tinggi  bersuhu  rendah  diduga  menjadi  penyebab utama  kegagalan  aklimatisasi  planlet,  oleh  karena  itu pemuliaan tanaman untuk untuk mendapatkan varian baru C. hartinahianum yang beradaptasi di dataran rendah sangat diperlukan.
Pemuliaan  tanaman  melalui  hibridisasi  dengan C. hartinahianum sulit dilakukan karena keterbatasan jumlah tanaman  sebagai  pohon  induk.  Perbaikan  genetik  dengan mutasi  induksi  merupakan  pendekatan  pelengkap  dalam perbaikan genetik tanaman (Sinuraya et al ., 2015). Mutagen fisik merupakan radiasi pengion yang mampu melepaskan energi  ionisasi  ketika  melewati  materi.  Sensitivitas  bahan tanaman terhadap iradiasi dapat diukur dari nilai LD ( lethal dosage )  yaitu  dosis  yang  menyebabkan  kematian  dari populasi tanaman. Sensitivitas terhadap iradiasi dipengaruhi oleh  faktor  genetik  atau  jenis  anggrek  yang  diiradiasi (Kim et  al. ,  2020).  Sensitivitas  protocorm  anggrek C. hartinahianum terhadap iradiasi sinar gamma belum pernah diteliti.  Informasi  tentang  radiosensitivitas  protocorm C. hartinahianum diperlukan  untuk  penelitian  lebih  lanjut induksi  mutasi  dengan  radiasi  sinar  gamma  pada  spesies tanaman tersebut.
Mutagen fisik dengan sinar gamma adalah yang paling sering digunakan dalam induksi mutasi tanaman (Dehgahi dan  Joniyas,  2017).  Sinar  gamma  dapat  menginduksi mutasi yang menimbulkan sifat toleransi tanaman terhadap cekaman abiotik maupun biotik (Schum, 2003; Nur et al. , 2019). Mutan-mutan hasil iradiasi ini tidak memiliki efek residu seperti mutan-mutan yang diperoleh dari perlakuan kimia, sehingga dapat dikatakan produk mutan hasil iradiasi lebih aman (Tiwari et al ., 2017). Kombinasi  antara  kultur in  vitro dengan  mutasi berpotensi  menghasilkan  keragaman  genetik  yang  besar yang menjadi objek utama dalam pemuliaan tanaman hias. Hasil iradiasi gamma pada generasi ketiga planlet Celosia
cristata menunjukkan  terjadi  perubahan  morfologi  pada planlet  antara  lain  terlihat  pada  memendeknya  ruas  dan mengeritingnya daun, terutama pada dosis LD 50 , LD 30 dan LD 20 dari C. cristata yaitu 68.73 Gy, 46.68 Gy, dan 35.65 Gy (Hayati et al ., 2016). Perlakuan induksi mutasi dengan sinar gamma diharapkan dapat memunculkan karakter baru pada anggrek (Lestari et al., 2018) antara lain warna bunga, ukuran,  morfologi,  umur  simpan,  arsitektur  dan  kekuatan tanaman (vigor) (Billore et al ., 2019).
Protocorm merupakan  struktur  yang  terbentuk setelah  perkecambahan  benih  anggrek  dalam  kultur in vitro.  Protocorm  like  bodies (PLBs)  merupakan  struktur seperti  protocorm  yang  dapat  terbentuk  dari protocorm primer maupun eskplan tanaman lainnya seperti potongan daun (Lee et al ., 2013, Raynalta et al ., 2018). Protocorm merupakan materi anggrek yang ideal untuk induksi mutasi in vitro. Perbedaan morfologi akibat perlakuan iradiasi pada protocorm Spathoglottis  plicata Blume  terjadi  pada  dosis sekitar  LD 50 yaitu  munculnya  PLBs  variegata  disekitar dosis 40-60 Gy dan PLBs albino di sekitar dosis 60–70 Gy ( Romeida et  al .,  2012 ).  Indikasi  terjadinya  mutasi  dapat terlihat  dari  pertumbuhan  tanaman  seperti  pada  anggrek Dendrobium macrophyllum A. Richard, terjadi penurunan jumlah  tunas,  daun  dan  akar  pada  dosis  10  Gy  (Handini, 2019). Pemberian  iradiasi  diharapkan  dapat  menginduksi pembentukan  mutan  yang  toleran  terhadap  lingkungan bersuhu tinggi di dataran rendah. Iradiasi sinar gamma pada tanaman gandum menghasilkan galur-galur yang adaptif di lingkungan di ketinggian kurang dari 1000 m dpl (Nur et al ., 2015). Penelitian ini merupakan studi awal yang bertujuan untuk  mengetahui  radiosensitivitas protocorm anggrek C. hartinahianum terhadap iradiasi sinar gamma dan evaluasi pertumbuhan PLBs pasca induksi mutasi di dua suhu ruang kultur yang berbeda.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya-LIPI dan Badan Tenaga  Nuklir  Nasional  (BATAN),  Jakarta,  pada  Januari hingga  Desember  2016.  Bahan  tanaman  yang  digunakan adalah protocorm anggrek C. hartinahianum ‘Tien Soeharto’ hasil perkecambahan benih.
Uji  Radiosensivitas  Protocorm  terhadap  Iradiasi  Sinar Gamma
Percobaan  menggunakan  rancangan  acak  lengkap dengan  satu  faktor  perlakuan  berupa  level  dosis  iradiasi. Level dosis iradiasi yang diuji sebanyak lima taraf (0, 5, 10, 15, dan 20 Gy) dengan 10 ulangan. Setiap ulangan terdiri dari  1  botol  dan  setiap  botol  terdiri  dari  lima protocorm . Protocorm diberi  perlakuan  iradiasi  sinar  gamma  yang bersumber  dari  pancaran  elemen  radioaktif  cobalt-60 ( 60 Co) (Hazekamp, 2016). Protocorm yang telah diiradiasi dipindahkan  ke  media  MS  (Murashige  dan  Skoog,  1962) ditambah dengan PVP 250 mg L -1 , gula 30 g L -1 , dan agar 7 g L -1 . Protocorm yang telah diiradiasi ditempatkan di dua
kondisi suhu yang berbeda, 5 ulangan diinkubasi di ruang kultur suhu rendah 16-18 o C dan 5 ulangan di ruang kultur dengan suhu sedang 22-27 o C. Pengamatan di dua suhu ruang tersebut dilakukan untuk menghitung radiosensitivitas yaitu dengan  cara  menghitung  jumlah protocorm yang  hidup setiap dua minggu. Radiosensitivitas pada protocorm yang diiradiasi ditentukan pada dosis yang menimbulkan reduksi daya  hidup  atau  tingkat  kematian  PLBs  sebanyak  20  dan 50 % (LD 20 dan LD 50 ) dibandingkan dengan kontrol pada siklus  vegetatif  yang  pertama  (M 1 V 1 ).  Radiosensitivitas diukur  dengan  menggunakan CurveExpert 1.3.  pada  16 minggu setelah iradiasi (MSI).
Proliferasi dan Regenerasi Protocorm Pasca Iradiasi pada Dua suhu Ruang Kultur Rendah (16-18 o C) dan Sedang (22- 27 o C) Protocorm yang hidup sesudah diiradiasi dengan sinar gamma dengan dosis 0, 5, 10, 15, dan 20 Gy dipindahkan ke  media  proliferasi  berupa  modifikasi  Knudson  C  (yang selanjutnya  disebut  sebagai  KCA)  (Puspitaningtyas  dan Handini  2014)  pada  pH  5.6  ditambah  BA  5  mg  L -1 dan NAA 0.5 mg L -1 . Protocorm diinkubasi hingga 18 MSI di kedua  ruang  seperti  pada  saat  evaluasi  radiosensitivitas. Penyinaran  ruang  inkubasi  menggunakan  lampu  neon  36 W dengan lama penyinaran 12 jam. Pengamatan dilakukan terhadap  peubah  jumlah  PLBs  dan  jumlah  tunas  yang terbentuk  hingga  18  Minggu  Setelah  Subkultur  (MSS). Selanjutnya PLBs dan tunas yang terbentuk disubkultur ke media  regenerasi  berupa    media  KCA  tanpa  zat  pengatur tumbuh, dan diamati jumlah tunas dan daun yang terbentuk hingga  18  minggu  setelah  subkultur  (MSS)  dari  media proliferasi. Analisis data menggunakan uji sidik ragam (uji F), sedangkan perbedaan respon pertumbuhan PLBs antara dua  ruang  menggunakan  uji  Beda  Nyata  Terkecil  (BNT) pada tingkat kesalahan (α) 5%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Radiosensitivitas  Protocorm  C.  hartinahianum  di  Ruang Kultur Suhu 16-18 o C dan 22-27 o C setelah Iradiasi Sinar Gamma
Persentase  hidup protocorm pasca  iradiasi  dengan sinar gamma 0-20 Gy di ruang kultur 16-18 o C dan ruang kultur  22-27 o C  pada  24  minggu  setelah  iradiasi  (MSI) disajikan pada Tabel 1. Ruang kultur dengan suhu 16-18 o C merupakan suhu yang mengacu pada suhu di habitat alami C.  hartinahianum .  Pada  ruang  kultur  16-18 o C,  terlihat tidak adanya penurunan persentase daya hidup protocorm sampai dosis iradiasi 15 Gy, namun pada dosis iradiasi 20 Gy    terjadi  penurunan  persentase protocorm yang  hidup menjadi 91.07%. Rata-rata persentase hidup protocorm di ruang 16-18 o C sebesar 98.2%. Sebaliknya di ruang kultur 22-27 o C, persentase hidup protocorm pasca iradiasi sinar gamma  nyata  lebih  rendah  pada  15  dan  20  Gy  (70.1  dan 74.3%).  Rata-rata  persentase  hidup protocorm di  ruang kultur 22-27 o C sebesar 86.8%. Radiosensitivitas protocorm C.  hartinahianum berdasarkan  persen  hidup protocorm
pada 24 MSI pada ruang 16-18 o C menunjukkan LD 20 pada dosis iradiasi gamma 26.98 Gy dan  LD 50 pada dosis 38.24
Gy (Gambar 1A). Sementara itu, di ruang kultur 22-27 o C, diperoleh  LD 20 pada  iradiasi  gamma  17.08  Gy  dan  LD 50 pada 27.29 Gy (Gambar 1B). LD 20 dan LD 50 yang dihasilkan berada  diluar  rentang  dosis  yang  diuji,  sehingga  perlu dilakuan iradiasi protocorm dengan dosis iradiasi yang lebih tinggi  sehingga  didapatkan  LD 20 dan  LD 50 dalam  rentang dosis  yang  diuji.  Radiosensitivitas  pada  PLBs  berbagai jenis  anggrek Cymbidium hibrida  RB001ditemukan  LD 50 pada dosis iradiasi 40 Gy (Lee et al., 2016), RB003 sebesar 30 Gy dan pada RB012 sebesar 29.0 Gy, berdasarkan berat relatif PLBs (Kim et al ., 2020). Persentase protocorm hidup pada kedua ruang kultur tidak berbeda nyata. Namun pada dosis iradiasi 15 dan 20 Gy, persentase hidup protocorm pada suhu ruang kultur 22- 27 o C, nyata lebih rendah yaitu sebesar 70.1% dan 74.3% (Tabel 1). Kondisi ruang kultur yang bersuhu dingin diduga menurunkan  cekaman  terhadap  protocorm  pasca  iradiasi, sehingga  persen protocorm hidup  lebih  tinggi  (>90%). Sebaliknya  suhu  ruang  kultur  22-27 o C,  kemungkinan memberikan  cekaman  terhadap protocorm pasca  iradiasi, sehingga persen protocorm hidup menurun terutama pada dosis iradiasi yang lebih tinggi (15 dan 20 Gy). Meskipun demikian, belum ada laporan penelitian pada tanaman lain yang  menunjukkan  bahwa  suhu  ruang  kultur  yang  lebih rendah  dapat  mengurangi  efek  cekaman  iradiasi  terhadap pertumbuhan tanaman in vitro .
Proliferasi  dan  Regenerasi  Tunas  M1V1  Pasca  Iradiasi Sinar Gamma
Tabel  2  menunjukkan  pertumbuhan  atau  proliferasi protocorm  (M1V1)  membentuk  PLBs  dalam  media proliferasi  (media  KCA  di  tambah  BAP  5.0  mg  L -1 dan NAA 0.5 mg L -1 ) pada 18 Minggu Setelah Subkultur (MSS). Multiplikasi PLBs diamati dengan menghitung pertambahan jumlah PLBs dari 1 protocorm awal sehingga membentuk clump PLBs,  dan  jumlah  PLBs  dari  setiap  clump  yang membentuk tunas. Pada ruang kultur 16-18 ᵒC, jumlah PLBs yang terbentuk cenderung meningkat dengan bertambahnya dosis iradiasi.  Jumlah PLBs pada kontrol rata-rata sebanyak 1.4  PLBs,  sedangkan  pada  perlakuan  iradiasi  3-5  PLBs. Rata-rata  jumlah  PLBs  pada  ruang  kultur  16-18 o C,  pada semua  dosis  iradiasi,  nyata  lebih  tinggi  dari  kontrol. Sedangkan pada ruang kultur 22-27 o C, jumlah PLBs  nyata lebih tinggi dari kontrol adalah pada dosis iradiasi 10 dan 15 Gy.  Pada  tahap  proliferasi, pada ruang kultur 16-18 o C, jumlah    PLBs    yang  beregenerasi  membentuk  tunas  pada kontrol tidak berbeda nyata dengan berbagai dosis iradiasi, yaitu sebanyak 1-2 tunas. Sebaliknya pada ruang kultur suhu (22-27 ᵒC), rata-rata jumlah PLBs pada perlakuan iradiasi sebanyak 3-7 tunas, lebih tinggi dibanding kontrol. Jumlah PLBs terbanyak dihasilkan pada perlakuan iradiasi 10 Gy, pada  ruang  kultur  22-27 o C,  yaitu  sebanyak  7.2  PLBs. Meskipun  demikian,  uji  t  menunjukkan  jumlah  tunas  dan PLBs antara kedua ruang kultur tidak berbeda nyata.
Tabel  3  menunjukkan  pertumbuhan  PLBs  setelah dipindah  ke  media  regenerasi  (Media  KCA  tanpa  ZPT).
Dosis iradiasi gamma (Gy) Jumlah protocorm sebelum iradiasi Jumlah protocorm setelah iradiasi % daya hidup Ruang kultur suhu 16-18 o C 0 62 62 100.0 5 70 70 100.0 10 71 71 100.0 15 55 55 100.0 20 56 51 91.1 Rata-rata 62.8 61.8 98.2 Ruang kultur suhu 22-27 o C 0 58 56 96.6a 5 71 66 93.0a 10 65 65 100.0a 15 87 61 70.1b 20 70 52 74.3b Rata-rata 70.2 60.0 96.5 Uji t dua ruang tn tn tn
Tabel 1.  Pengaruh dosis iradiasi terhadap persentase daya hidup protocorm C. hartinahianum sebelum diiradiasi dan setelah diiradiasi di ruang kultur suhu 16-18 o C dan suhu 22-27 o C pada 16 MSI
Keterangan: Standarisasi presentase protocorm hidup (%) pada setiap dosis iradiasi diperoleh dengan rumus: persentase protocorm hasil iradiasi/persentase protocorm kontrol (0 Gy) x 100%. Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama pada masing-masing ruang kultur tidak berbeda nyata pada uji BNT dengan α = 5%
Jumlah PLBs yang beregenerasi membentuk tunas cenderung menurun dengan meningkatnya dosis iradiasi. Jumlah tunas terbanyak  dihasilkan  pada  kontrol,  sebanyak  3  tunas  dan terendah  pada  iradiasi  20  Gy  yaitu  0.9  tunas.  Pada  ruang kultur suhu 16-18 ᵒC, rata-rata jumlah tunas yang terbentuk dari  PLBs  tidak  berbeda  nyata  antara  kontrol  dan  semua perlakuan  iradiasi,  yaitu  sekitar  1-2  tunas.  Namun  tunas- tunas yang terbentuk pada dosis iradiasi yang lebih tinggi (10, 15, dan 20) memiliki jumlah daun yang lebih rendah dan berbeda nyata dengan kontrol. Sebaliknya pada ruang kultur suhu 22-27 ᵒC, jumlah tunas pada dosis iradiasi sinar gamma 10 Gy paling tinggi (8 tunas), namun tidak berbeda
nyata dengan kontrol. Jumlah daun pada kontrol dan iradiasi 5,  10,  dan  15  Gy  tidak  berbeda  nyata,  sedangkan  jumlah daun  pada  dosis  iradiasi  20  Gy  nyata  lebih  rendah  dari kontrol.
Hasil uji t menunjukkan bahwa rata-rata jumlah PLBs dan jumlah tunas  pada media proliferasi tidak tidak berbeda nyata  antara  dua  ruang  kultur,  sebaliknya  berbeda  nyata pada  media  regenerasi.  Perbedaan  multiplikasi  PLBs  dan regenerasi tunas diduga bukan karena mutasi, karena dosis iradiasi pada kedua ruang masih dibawah LD 50 . Perbedaan tersebut diduga disebabkan pengaruh iradiasi dan suhu ruang kultur  terhadap  fisiologi  sel.  Dosis  iradiasi  hingga  level
Gambar 1. Radiosensitivitas protocorm terhadap iradiasi sinar gamma 0-20 Gy : A. pada ruang kultur A (16-18 ᵒC) dan B (22-27 ᵒC). Nilai LD 20 dan LD 50 pada  ruang  kultur 16-18 ᵒC diperoleh  pada  dosis  iradiasi  26.98 Gy dan 38.24 Gy, dan pada ruang kultur 22-27 ᵒC pada 17.08  Gy dan 27.29  Gy
y = -0.0509x 2 + 0.6611x + 99.237 R² = 0.8571 90 92 94 96 98 100 102 0 5 10 15
Dosis iradiasi gamma (Gy) y = -0.0609x 2 - 0.1329x + 97.257 R² = 0.6561 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15
20
% D ay a hi du p Dosis iradiasi gamma (Gy) A B
Dosis iradiasi gamma (Gy) Jumlah PLBs Perbedaan dengan kontrol Jumlah tunas Perbedaan dengan kontrol Ruang  kultur suhu 16-18 ᵒC 0 1.4 - 2.2 - 5 3.6 2.2** 1.7 -0.5tn 10 4.4 2.9** 1.6 -0.6tn 15 4.7 3.3** 1.5 -0.7tn 20 5.0 3.64** 1.5 -0.7tn Ruang kultur suhu 22-27 ᵒC 0 1.5 - 3.0 - 5 3.6 2.0tn 2.6 -0.4tn 10 7.2 5.6** 2.9 -0.1tn 15 5.6 4.1** 1.5 -1.5** 20 4.1 2.6tn 0.9 -2.2** Hasil uji t dua ruang tn tn
Tabel 2. Jumlah PLBs dan tunas C. hartinahianum hasil iradiasi sinar gamma di media diproliferasi KCA  ditambah BA 5 mg L -1 dan NAA 0.5 mg L -1 pada 18 minggu setelah subkultur (MSS) di dua ruang kultur in vitro dengan suhu berbeda
Keterangan: ** = berbeda nyata dibandingkan kontrol pada taraf 5 % berdasarkan uji F dan BNT; tn = tidak berbeda nyata dibandingkan kontrol berdasarkan uji F dan BNT
Tabel 3. Jumlah tunas dan jumlah daun C. hartinahianum pasca iradiasi sinar gamma di media regenerasi berupa media KCA tanpa ZPT pada 18 minggu setelah subkultur (MSS) di dua ruang kultur in vitro dengan suhu berbeda
Keterangan: ** = berbeda nyata dibandingkan kontrol pada taraf 5 % berdasarkan uji F dan BNT; tn = tidak berbeda nyata dibandingkan kontrol berdasarkan uji F dan BNT
Dosis iradiasi gamma (Gy) Jumlah tunas Perbedaan dengan kontrol Jumlah daun Perbedaan dengan kontrol Ruang kultur suhu 16-18 ᵒC 0 1.7 - 2.5 - 5 1.2 -0.5tn 1.5 -1.0tn 10 1.7 -0.1tn 0.4 -2.1** 15 1.3 -0.4tn 0.5 -2.0** 20 1.2 -0.4tn 0.9 -1.6** Ruang kultur suhu 22-27 ᵒC 0 4.3 - 6.3 - 5 4.1 -0.3tn 4.3 -2.0tn 10 8.0 3.7tn 7.0 0.7tn 15 4.7 0.3tn 3.9 -2.4tn 20 3.3 -1.1** 0.4 -5.9** Uji t dua ruang * *
tertentu di bawah LD 50 dan peningkatan suhu ruang diduga dapat  menginduksi  metabolisme  tanaman  menjadi    lebih aktif  dalam  menyerap  hara  dari  media  untuk  mendorong multiplikasi PLBs. Multiplikasi PLBs mulai terjadi setelah protocorm mengalami pemulihan dari cekaman iradiasi. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Romeida et al. (2012) pada
S.  plicata yang  juga  menunjukkan  adanya  pembentukan PLBs baru beberapa waktu setelah iradiasi dan pertumbuhan PLBs menjadi plantlet pada proses pemulihan.
Keragaan  kultur C.  hartinahianum pada  media proliferasi  dan  regenerasi  seperti  terlihat  pada  Gambar  2. Regenerasi  tanaman  anggrek  dari  PLBs  menjadi  planlet
diawali dengan pembentukan meristem apical pada bagian terminal  PLBs,  yang  selanjutnya  muncul  tunas  lalu  daun. Jika tanaman dapat membentuk akar, maka diperoleh planlet yang  selanjutnya  dapat  di  aklimatisasi.  Menurut  Cahyo dan  Dinarti  (2015),  serta  Suwarno et  al. (2013),  semakin tinggi dosis iradiasi maka kemampuan setiap biakan untuk membentuk daun akan semakin rendah. Sementara itu dari hasil  penelitian Aloysius et  al. (2017)  dinyatakan  bahwa, iradiasi  sinar  gamma  pada Spathoglottis  plicata dapat menyebabkan kegagalan pembelahan sel dan pertumbuhan primordia  daun  hanya  melalui  pemanjangan  sel,  tanpa adanya  pembelahan  sel  maka  pertumbuhan  daun  menjadi abnormal  sehingga  daun  menjadi  kerdil  dan  batang  juga memendek. Pada C. hartinahianum di dalam penelitian ini, morfogenesis daun mulai terhambat pada dosis iradiasi 10
Gy di ruang kultur 16-18 ᵒC dan 20 Gy di ruang kultur B 22-27 ᵒC. Hingga 24 MSI di media proliferasi, tunas pada semua perlakuan belum membentuk akar. Menurut Ali et al . (2016),  gangguan  diferensiasi  sel  dalam  membentuk  akar adalah  merupakan  efek  dari  mutasi  DNA  akibat  iradiasi sinar  gamma.  Namun  dalam  penelitian  ini,  dosis  iradiasi masih  dibawah  LD 20 dan  LD 50 ,  sehingga  penghambatan pertumbuhan  akar  kemungkinan  karena  efek  fisiologis iradiasi,  suhu  ruang  kultur  dan  media  yang  mengandung BA  yang  dapat  menekan  pertumbuhan  akar  pada  semua perlakuan.  Handini et  al. (2017)  melaporkan  bahwa  akar planlet  dari protocorm C.  hartianahianum terbentuk  pada media  tanpa  zat  pengatur  tumbuh,  tidak  berbeda  nyata dengan  penambahan  auksin  NAA  ataupun  IBA,  namun tidak terbentuk akar pada media yang mengandung BA.
Proliferasi 18 MSI Regenerasi 18 MSI Proliferasi 18 MSI Regenerasi 18 MSI 0 Gy 5 Gy 10 Gy 15 Gy 20 Gy A                                                                            B Proliferasi 18 MSI
Regenerasi 18 MSI Proliferasi 18 MSI Regenerasi 18 MSI 0 Gy 5 Gy 10 Gy 15 Gy 20 Gy A                                                                            B
Proliferasi 18 MSI
Regenerasi 18 MSI Proliferasi 18 MSI Regenerasi 18 MSI 0 Gy 5 Gy 10 Gy 15 Gy 20 Gy A                                                                            B
Proliferasi 18 MSI
Regenerasi 18 MSI Proliferasi 18 MSI Regenerasi 18 MSI 0 Gy 5 Gy 10 Gy 15 Gy 20 Gy A                                                                            B
Proliferasi 18 MSI
Regenerasi 18 MSI Proliferasi 18 MSI Regenerasi 18 MSI 0 Gy 5 Gy 10 Gy 15 Gy 20 Gy A                                                                            B Gambar 2.  Pertumbuhan PLBs C. hartinahianum pada tahap proliferasi dan tahap regenerasi pada 5 taraf dosis iradiasi di ruang kultur A (16-18 ᵒC) dan B (22-27 ᵒC) sampai 18 MSI
A
B

## KESIMPULAN
Radiosensitivitas protocorm C.  hartinahianum terhadap iradiasi  sinar  gamma  (0,  5,  10,  15,  dan  20  Gy)  pada  dua suhu  ruang  kultur  yang  berbeda  (16-18 o C  dan  22-27 o C) menunjukkan nilai LD 20 dan LD 50 yang berada di luar dosis yang diuji dalam perlakuan, yaitu 26.98 Gy dan 38.24 Gy pada ruang kultur kultur 16-18 o C, dan  17.08 Gy dan 27.29 Gy ruang kultur suhu 22-27 o C. Untuk mendapatkan mutan putatif, PLBs C. hartinahianum sebaiknya diiradiasi pada kisaran  LD 20 dan  LD 50 dari ruang  kultur  bersuhu  22-27 o C (17.08 Gy dan 27.29 Gy). Namun pengujian radiosensitivitas disarankan diulang kembali pada rentang dosis iradiasi di atas  15  Gy-50  Gy.  Proliferasi  PLBs  dan  regenerasi  tunas pasca iradiasi lebih baik pada suhu ruang kultur 22-27 o C.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didanai oleh Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun  Raya-LIPI.  Terima  kasih  kami  ucapkan  kepada Bapak Prof Rist. Dr. Didik Widyatmoko, MSc selaku kepala PKT. Kebun Raya-LIPI.

## DAFTAR PUSTAKA
Ali, H., Z. Ghori, S. Sheikh, A. Gul. 2016. Effects of gamma radiation on crop production. p. 27-78. In KR. Hakeem ( Ed .),  Crop  Production  and  Global  Environmental Issues. Springer Publishing. Switzerland (NZ).
Aloysius, S., A. Purwantoro, K. Dewi, E. Semiarti. 2017.
Improvement  of  genetic  variability  in  seedlings Spathoglottis plicata orchids thrugh X-ray irradiation. Biodiversitas 18:20-27.
Billore,  V.,  S.  J.  Mirajkar,  P.  Suprasanna,  M.  Jain.  2019. Gamma irradiation induced effects on in vitro shoot cultures  and  influence  of  monochromatic  light regimes on irradiated shoot cultures of Dendrobium sonia orchid.  Biotechnology  Reports  22(2019) e00343.  https://doi.org/10.1016/j.btre.2019.e00343. [2 Februari 2020].
Cahyo,  F.A.,  D.  Dinarti.  2015.  Pengaruh  iradiasi  sinar gamma terhadap pertumbuhan protocorm like bodies anggrek Dendrobium lasianthera (JJ. Smith) secara in vitro .  J. Hort. Indonesia 6:177-186.
Comber,  J.B.  2001.  Orchids  of  Sumatra.  Kew  (GB):  the Royal Botanic Gardens.
Dehgahi,  R.,  A.  Joniyas.  2017.  Review  of  research  on
Dendrobium  sonia- 28,  a  hybrid  from  Orchidacea family and mutation as somaclonal variation. Int. J. Biosci. 10:29-47.
Handini,  E.,  D.  Sukma,  Sudarsono,  I.  Roostika.  2017. Regenerasi protokorm secara in vitro dan aklimatisasi
planlet  anggrek Cymbidium  hartinahianum J.B. Comber & Nasution. J. AgroBiogen 13:91-100.
Handini, E. 2019. Iradiasi akut dengan sinar gamma pada protokorm  anggrek Dendrobium  macrophyllum A.
Richard dan Dendrobium undulatum M. A. Clem &
D. L. Jones,” Buletin Kebun Raya 22:13-20.
Handini, E., V. Garvita. 2014. In vitro culture of propagation Cymbidium  hartinahianum.  hal.  702-708. Dalam J.G.  Kartika, W.B.  Suwarno,  S.W. Ardhie,  C.P.  El- Sanura,  F.N.  Fitriana  ( Eds. ).  Prosiding  Seminar Ilmiah Perhorti ‘Membangun Sistem Baru Agribisnis Hortikultura  Indonesia  pada  Era  Pasar  Global’. Malang 5-7 November 2014.
Hayati, D., S. I. Aisyah, Krisantini. 2016. Radiosensitivity levels of in vitro cultured Celosia cristata planlets by γ - ray irradiation. J. Trop Crop Sci. 3:61-65.
Hazekamp,  A.  2016.    Evaluating  the  effects  of  gamma- irradiation  for  decontamination  of  medicinal Cannabis. Frontiers in Pharmacology 7:1-12.
Kim,  S.H.,  Y.D.  Jo,  J.  Ryu,  M.J.  Hong,  B.C.  Kang,  J.B.
Kim. 2020. Effects of the total dose and duration of γ-irradiation  on  the  growth  responses  and  induced SNPs  of  a Cymbidium hybrid.  Int.  J.  Radiat.  Biol. 96:545-551.
Kim, S.H., S.W. Kim, J.W. Ahn, J. Ryu, S.J. Kwon, B.C. Kang,  J.B.  Kim.  2020.  Frequency,  spectrum,  and stability  of  leaf  mutants  induced  by  diverse  γ-ray treatments in two Cymbidium hybrids. Plants 9:546. Doi:10.3390/plants9040546.
Lee,  Y.,  S.  Hsu,  E.  Yeung.  2013.  Orchid  protocorm-like bodies are somatic embryos. Am. J. Bot. 100:2121- 2131.
Lee, Y. M., H.J. Lee, Y.S. Kim, S.Y. Kang, D.S. Kim, J.B. Kim, J.W. Ahn, B.K. Ha.S.H. Kim. 2016. Evaluation of  the  sensitivity  to  ionising  γ-radiation  of  a Cymbidium hybrid,  The  J.  Hortic.  Sci.  Biotechnol. 91:109-116.
Lestari, E.P., A. Yunus, Sugiyarto. 2018. Diversity induction of Dendrobium  sylvanum orchid  through in  vitro irradiation of gamma ray. Biosaintifika 10:691-697.
Murashige,  T.,  F.  Skoog.  1962.  A  Revised  Medium  for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum 15:473-497.
Nur,  A.,  K.  Syahruddin,  M.J.  Mejaya.  2015.  Perbaikan genetik  gandum  tropis  toleran  suhu  tinggi  dan permasalahan pengembangannya pada daerah dataran rendah. J. Litbang Pert. 34:19 - 30.
Puspitaningtyas, D.M., E. Handini. 2014. Penyimpanan biji anggrek Coelogyne spp.  untuk  konservasi ex  situ.
Buletin Kebun Raya 17:101-112.
Raynalta, E., J. Elina, Sudarsono, D. Sukma. 2018. Clonal fidelity  of  micro-propagated Phalaenopsis planlets based  on  assessment  using  eighteen  Ph-Pto  SNAP marker loci. Agrivita J. Agric. Sci. 40:390-402.
Romeida,  A.,  S.H.  Sutjahjo,  A.  Purwito,  D.  Sukma, Rustikawati.  2012.  Induksi  mutasi Protocorm  Like Body (PLB)  anggrek Spathoglottis  plicata Blume. Aksesi Bengkulu pada sebelas taraf dosis iradiasi sinar gamma. hal. 381-387. Dalam Melati M., S.A Aziz, D. Efendi, N.M. Armini, Sudarsono, N. Ekana’ul, S. A. Tapsi. ( Eds. ). Prosiding Simposium dan Seminar Bersama PERAGI-PERHORTI-PERIPI-HIGI. Mendukung  Kedaulatan  Pangan  dan  Energi  yang
Berkelanjutan. Bogor, 1-2 Mei 2012. Sari,  L.,  A.  Purwito,  D.  Soepandie,  R.  Purnamaningsih,
E.  Soedarmonowati.  2015.  Pengaruh  iradiasi  sinar gamma pada pertumbuhan kalus dan tunas tanaman gandum  ( Triticum  aestivum L.).  Ilmu  Pertanian 18:44-50.
Schum,  A.,  2003.  Mutation  breeding  in  ornamental:  An efficient breeding method? p. 47-60. In G. Forkmann et  al .  ( Eds .).  Proc.  21’ st IS  on  Classical/Molecular Breeding. Acta Hort. 612.  July 2003.
Sinuraya,  M.,  Rosmayati,  Hasanuddin,  D.  S.  Hanafiah. 2015. Radiosensitivity and the influence of gamma rays  irradiation  on  local  Samosir  shallots.  p.  228- 231. In Proceeding  of  the  5 th annual  International Conference Sylah Kuala University (AIC Unsylah) 2015  In  conjunction  with  The  8 th International Conference of Chemical Engineering in Science and Applications (ChESA) September 9-11, 2015, Banda Aceh. Indonesia.
Suwarno,  A.,  N.A.  Habibah,  L.  Herlina.  2013.  Respon pertumbuhan planlet anggrek Phalaenopsis amabilis L. var. Jawa Candiochid akibat radiasi sinar gamma. Life Sci. 2:78-84.
Tiwari,  A.,  A.K.  Singh,  V.K.  Jain,  N.  Kanth,  T.S.  Hada,
S.  Pal.  2017. Application  of  nuclear  technology  in horticulture. p. 14-20. In Shukla, R.P., R.S. Mishra, A.D. Tripathi, A.K. Yadav, M. Tiwari, R.R. Mishra. ( Eds .).  New  perspective  in  agriculture  and  human health. Bharti Publication, New Delhi.