## Research Article
Perancangan Primer Spesifik Subspesies Berbasis Gen Endoglukanase untuk Deteksi Ralstonia syzygii subsp. syzygii
Development of Novel Subspecies-Specific Primers Based on the Endoglucanase Gene for Detection of Ralstonia syzygii subsp. syzygii
Bambang Trianom 1) , Triwidodo Arwiyanto 2) , & Tri Joko 2) *
1) Balai Karantina Pertanian Bandar Lampung Jln. Soekarno-Hatta km. 7, Bandar Lampung, Lampung 35241
2) Departemen Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada Jln. Flora No. 1, Bulaksumur, Sleman, Yogyakarta 55281
*Penulis untuk korespondensi. E-mail: tjoko@ugm.ac.id

## ABSTRACT
Ralstonia syzygii subsp. syzygii that belong to Ralstonia solanacearum species complex is the cause of Sumateran disease of clove. The disease was reported to cause widespread devastation on clove plantings in Indonesia . One of the control strategies is to reduce the spread of the disease through early detection on clove seedlings. The study aimed to design the specific primers based on endoglucanase ( egl ) gene of R. syzygii subsp . syzygii as a tool for early diagnosis. The analyses were conducted on development of specific primers design using egl sequences retrieved from GenBank, Polymerase Chain Reaction (PCR), primers sensitivity and specificity test. The pair of primers UGMRss-F (5’-GCT CACCATCGC CAAGGACAGCG-3’) and UGMRss-R (5’-TTCGATCGAACGCCTGGTTGAGC-3’) could amplify R. syzygii subsp. syzygii at ~378 base pairs with 0.8 ng/µl minimum concentration of DNA. The primers was specific to R. syzygii subsp. syzygii but not to other bacterial species even in the same phylotype .
Keywords: clove, endoglucanase, Ralstonia syzygii subsp . syzygii , specific primer, Sumatera disease

## INTISARI
Ralstonia syzygii subsp. syzygii merupakan bakteri yang termasuk dalam kelompok Ralstonia solanacearum species complex yang menyebabkan penyakit Sumatera pada tanaman cengkih. Penyakit ini menyebabkan kerugian yang sangat besar dan sampai saat ini belum ditemukan cara pengendalian yang efektif. Salah satu upaya pencegahan penyakit adalah melalui deteksi dini dan mencegah penyebaran penyakit melalui peredaran bibit dari areal yang endemis. Penelitian ini bertujuan untuk merancang primer spesifik berbasis gen endoglukanase ( egl ) sebagai upaya deteksi dini penyakit Sumatera. Analisis yang dilakukan  meliputi  desain primer spesifik dengan menggunakan data sekuens gen egl dari GenBank , Polymerase Chain Reaction (PCR), uji kepekaan primer dan uji kekhususan primer. Desain primer yang berhasil dirancang terdiri dari UGMRss-F (5’- GCTCACCATCGCCAAGGACAGCG-3’) dan UGMRss-R (5’-TTC GATCGAACGCCTGGTTGAGC-3’) dengan amplikon ~378 pasang basa. Pada konsentrasi DNA 0,8 ng/µl, secara peka R. syzygii subsp. syzygii masih dapat teramplifikasi dengan baik. Primer ini juga hanya dapat mendeteksi R. syzygii subsp. syzygii dan tidak untuk bakteri lain bahkan pada filotipe yang sama.
Kata kunci: cengkih, endoglukanase, penyakit Sumatera, primer spesifik, Ralstonia syzygii subsp. syzygii.
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, Vol. 22, No. 2, 2018: 124−131 DOI: 10.22146/jpti.32217

## PENDAHULUAN
Produksi cengkih dari tahun ke tahun mengalami penurunan, salah satunya karena adanya penyakit Sumatera ( Sumatra disease of clove ) yang disebab- kan oleh Ralstonia syzygii subsp. syzygii (Bennet et al. , 1985) . Tanaman cengkih yang terserang patogen tersebut daunnya gugur secara mendadak, kemudian ranting-ranting  pada  bagian  pucuk  mengalami kematian. Percabangan atau seluruh tanaman kadang-
kadang  layu  mendadak  dan  mengakibatkan  daun menjadi  kering.  Daun  pada  ujung  bagian  ranting mengalami  kerontokan  sehingga  terlihat  gundul pada  ujung–ujung  ranting,  sedangkan  daun-daun yang lebih tua tetap kelihatan segar (Danaatmadja et al ., 2009). Gugurnya daun dapat berlangsung beberapa minggu sampai beberapa bulan. Kematian tanaman cengkih akibat penyakit ini dapat berlangsung cepat yaitu  antara  3−12  bulan  atau  lambat  yaitu  antara
Diterima 18 Januari 2018; diterima untuk diterbitkan 28 Mei 2018
1−6 tahun. Umumnya pohon dewasa yang terlebih dahulu terserang (Eden-Green et al ., 1992).
Penyebaran penyakit Sumatera dari suatu daerah ke daerah lain sulit dideteksi karena gejalanya mirip dengan kekurangan air atau karena penyakit lain, sehingga pada saat musim penghujan baru diketahui bahwa tanaman terkena penyakit Sumatera. Upaya pengendalian sudah banyak dilakukan, akan tetapi belum mendapatkan hasil yang maksimal (Dwimartina et  al .,  2017).  Salah  satu  cara  pengendalian  yang dapat dilakukan antara lain mencegah pengiriman bibit dari  daerah  endemis  ke  daerah  yang  masih bebas penyakit (Widyaningsih et al ., 2017; Safni et al ., 2018). Deteksi dini R. syzygii subsp . syzygii baik di areal pertanaman yang sudah terserang maupun penyebarannya melalui peredaran bibit dari areal yang endemis penyakit ke daerah non-endemis di- harapkan dapat mencegah penyebaran penyakit.
Faktor virulensi dari bakteri patogen di antara- nya adalah produksi berbagai enzim ekstraselular seperti β-1,4-endoglukanase, poligalakturonase, pektin metil esterase, pektat liase, dan beberapa enzim lain- nya (Liu et al ., 2005; Joko et al ., 2018). Enzim ini memainkan peran penting dalam patogenitas patogen dengan peningkatan penetrasi jaringan inang melalui degradasi komponen dinding sel tanaman. Endo- glukanase dilaporkan menjadi faktor penting dalam virulensi R. solanacearum (Roberts et al ., 1988; Arwiyanto, 2013). Gen yang menyandi enzim β-1,4 endoglukanase ( egl ) telah digunakan untuk meng- klasifikasikan Ralstonia solanacearum species complex (RSCC) menjadi empat kelompok filotipe (Fegan & Prior, 2005).
Deteksi dan identifikasi bakteri patogen dapat di- lakukan menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR)  melalui  amplifikasi  gen  spesifik. Teknik PCR merupakan salah satu cara deteksi yang lebih akurat dibandingkan dengan cara konvensional atau dengan menggunakan teknik serologi (Windari et al ., 2015; Ismiyatuningsih et al ., 2016). Salah satu gen universal yang umum digunakan untuk identi- fikasi bakteri adalah gen 16S rRNA, akan tetapi gen 16S rRNA memiliki tingkat evolusi yang lambat sehingga seringkali belum dapat memisahkan takson di bawah spesies (Joko et al ., 2014; Poretsky et al ., 2014).  Penggunaan gen housekeeping telah banyak digunakan dalam analisis filogenetik bakteri patogen termasuk pada RSCC. Hubungan filogenetik dalam dan di antara empat filotipe R. solanacearum meng- gunakan analisis sekuensing kekerabatan gen yang
berbeda, termasuk egl , hrpB , gdhA , adk , gyrB , gapA, ppsA dan fliC , dan 16S-23S wilayah ITS menunjuk- kan pemisahan RSCC menjadi beberapa kelompok yang terdiri dari R. solanacearum , R. pseudosolanacearum , R. syzygii subsp. syzygii , R. syzygii subsp. celebesensi s, dan R. syzygii subsp. indonesiensis (Safni et al ., 2014). Gen egl pada RSCC memiliki homologi yang cukup variatif sehingga penggunakan gen egl sebagai marka molekular sangat menjanjikan, di antaranya untuk merancang primer spesifik . Penggunaan primer spesifik  yang  tepat  merupakan  salah  satu  faktor yang sangat penting dalam melakukan deteksi secara molekuler  dengan  PCR.  Penelitian  ini  bertujuan untuk merancang primer spesifik berbasis sekuens gen egl yang dapat membedakan kelompok bakteri di  bawah  tingkat  spesies  (subspesies),  khususnya untuk deteksi dan identifikasi R. syzygii subsp. syzygii .

## BAHAN DAN METODE

## Isolat Bakteri
Isolat R. syzygii subsp. syzygii yang diisolasi dari jaringan tanaman cengkih asal Kendal, Jawa Tengah (Trianom et  al. , in  press )  secara  rutin  dibiakkan pada medium Casamino Acid (CA) yang ditambah- kan iron salts (CA+; g/l): acid casein hydrolysate (oxoid) 7,5; sucrose, 2,0; magnesium sulphate, 0,25; di-potassium hydrogen phosphate,0,5; Bacto agar (Difco), 15,0; ferric ammonium citrate, 0,25 (Schaad et al ., 2001).  Selanjutnya kultur bakteri yang tumbuh diinkubasikan selama 5−7 hari pada suhu ruang (± 27 o C)  dan  secara  periodik  koloni  tunggalnya  di- tumbuhkan pada medium CA yang baru untuk men- jaga viabilitas dan kemurnian isolat (Joko et al ., 2000; Nurjanah et al ., 2017).
Ekstraksi DNA R. syzygii subsp. syzygii
Bakteri diisolasi DNAnya dengan teknik mini- preparation DNA isolation menurut Joko et al . (2011a). Sebanyak 1,5 ml kultur sel disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 2 menit. Pelet yang diperoleh kemudian diresuspensi dalam 540 µl TE buffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M EDTA pH 8) lalu di- tambahkan 30 µl 10% SDS dan diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 60 menit, kemudian ditambahkan 100 µl 5 M NaCl, dan 80 µl CTAB/NaCl, kemudian dihomogenkan dan diinkubasikan pada suhu 65 o C selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 750 µl chloroform : isoamylalcohol (24:1) dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas yang terbentuk dipindahkan ke tabung 1,5 ml eppendorf
Trianom et al. : Perancangan Primer Spesifik Subspesies Berbasis Gen Endoglukanase untuk Deteksi Ralstonia syzygii 125
yang baru kemudian ditambahkan 600 µl phenol : chloroform : isoamylalcohol (25:24:1) dan disen- trifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas dipindahkan ke tabung eppendorf yang baru. Selanjutnya ditambahkan 0,6× volume isopropanol dan disentrifugasi kembali pada 12.000 rpm selama 5 menit. Pelet yang terbentuk dicuci dengan etanol 70% dan dikeringanginkan kemudian diresuspensi dalam 30 µl buffer Tris-EDTA.

## Desain Primer Berbasis Gen Endoglukanase
Sebelum merancang primer spesifik, perlu di- pastikan terlebih dahulu tingkat konservasi gen endo- glukanase R. syzygii subsp. syzygii dengan gen endoglukanase bakteri lainnya. Sekuen gen endo- glukanase R. syzygii subsp. syzygii dan bakteri lain dapat diunduh dari GenBank Nucleotide database yang selanjutnya diselaraskan menggunakan program Multalin yang dapat diunduh di http://multalin. toulouse. inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl. Untuk mengetahui tingkat konservasinya digunakan program Genetix- Win Versi 4. Tingkat konservasi yang rendah antara sekuen gen endoglukanase R. syzygii subsp. syzygii dengan bakteri lainnya menunjukkan bahwa gen endo- glukanase dapat digunakan sebagai penanda molekuler yang spesifik. Primer yang dirancang terdiri dari primer forward dan reverse. Sifat primer yang di- rancang, termasuk suhu leleh (Tm), kandungan GC, potensi dimmer dan pembentukan hairpin loop di- hitung dengan menggunakan oligocalc yang dapat diakses melalui http://www.basic.northwestern.edu /biotools/oligocalc.html.
Setelah  didapat  rancangan  primernya,  lalu  di- verifikasi dengan menggunakan program genetix-Win version 4. Verifikasi diperlukan untuk mengetahui apakah primer yang dirancang juga dapat mengam- plifikasi DNA dari spesies R. syzygii lainnya.
Amplifikasi DNA R. syzygii subsp. syzygii
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan primer spesifik yang telah dirancang. Reaksi PCR meng- gunakan Master Mix Go Taq Green (Promega) dengan komposisi 12,5 µl Master mix 1 µl primer forward, 1 µl primer reverse, 1 µl DNA dan 9,5 µl Nuclease Free Water (NFW). Selanjutnya dilakukan ampli- fikasi dengan mesin PCR (Biorad T100, Jerman) pada suhu 96 o C selama 5 menit untuk denaturasi awal. Amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus dengan tahapan sebagai berikut: proses denaturasi pada suhu
94 o C selama 15 detik, proses penempelan ( annealing ) pada  suhu  59 o C  selama  30  detik,  dan  proses  pe- manjangan pada suhu 72 o C selama 30 detik. Kemudian dilanjutkan dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 o C selama 10 menit. Akhir siklus dipertahankan pada suhu 4 o C (Joko et al., 2007a; Handiyanti et al ., 2018).
Hasil amplifikasi dianalisis untuk melihat fragmen DNA melalui elektroforesis menggunakan gel agarose 1% dalam buffer TBE (Tris-HCL, boric acid, EDTA) 1× pada tegangan 50 Volt DC selama 50 menit. Peng- ukuran fragmen DNA menggunakan penanda 100 bp DNA ladder (Promega). Sampel disiapkan dengan mencampurkan 5 µl DNA, 2 µl gel red 1% kemudian diisikan dalam sumuran gel sebanyak 7 µl. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan gel doc (Bio- Rad) (Mahfut et al ., 2016; Suharti et al ., 2017).
Pengujian Kekhususan ( Specivity ) dan Kepekaan ( Sensitivity ) Primer
Untuk  menguji  kekhususan  primer  UGMRss dalam mendeteksi R. syzygii subsp. syzygii, pasangan primer ini diuji terhadap beberapa spesies bakteri lainnya yang berbeda  antara lain R. syzygii subsp. celebesensis, R. pseudosolanacearum, Acidovorax citrulli , Xanthomonas citri , Pantoea stewartii , Dickeya chrysanthemi, dan Pectobacterium carotovorum.
Uji  kepekaan  diperlukan  untuk  mengetahui seberapa peka primer dalam mendeteksi konsentrasi DNA bakteri target, dalam hal ini dengan mengguna- kan DNA kontrol. Pengujian dilakukan dengan serangkaian pengenceran, yaitu:  DNA kontrol (suspensi DNA tanpa pengenceraan), pengenceran 5×, 10×, 20×, 50×, 100×, 200×, dan 500×.  Sebelum dilakukan pengenceran, konsentrasi DNA kontrol harus diukur terlebih dahulu menggunakan spektrofotometer (Genesys 10S UV-vis, Thermo Scientific). Pengukuran dilakukan pada OD 260 /OD 280 (Joko et al ., 2007b).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Desain Primer Berdasarkan Gen Endoglukanase
Desain primer dilakukan dengan menyejajarkan terlebih dahulu urutan basa gen egl agar dapat dilihat perbedaan  pada  bagian  tertentu R.  syzygii subsp. syzygii dengan bakteri lainnya (Gambar 1). Dari hasil alignment tersebut terlihat banyak terdapat kemiripan urutan basanya dari kesembilan bakteri pembanding kecuali Xanthomonas  campetris ( out  of  grup ).
Menurut Frank et al . (2008) bahwa semakin banyak bagian yang bervariasi dalam suatu urutan gen maka kelompok filogeninya juga berbeda sedangkan urutan gen yang lestari ( conserved ) dapat dijadikan sebagai primer PCR yang bersifat universal. Tingkat evolusi molekuler sekuen gen egl lebih cepat dari sekuen gen 16S rRNA (Yamamoto & Harayama, 1995).
Dalam mendesain pasangan primer spesifik, dipilih urutan basa pada sekuens R. syzygii subsp. syzygii yang unik dan memiliki perbedaan dengan sekuens DNA  yang  lain.  Perbedaan  urutan  basa  ini  akan mengkode protein yang berbeda. Selain itu perlu juga diperhatikan panjang primer. Spesifitas primer biasanya  dipengaruhi  oleh  suhu  penempelan  dan panjang primer. Panjang primer antara 16–28 basa (Chuan et al. , 2013) dengan perbedaan antara primer forward dan reverse tidak lebih dari 3 basa adalah optimal untuk PCR.
Primer yang berhasil dirancang pada penelitian ini terdiri dari sepasang primer dengan urutan basa 5’-GCTCACCATCGCCAAGGACAGCG-3’  dan 5’-TTCGATCGAACGCCTGGTTGAGC-3’.
Primer ini selanjutnya disebut UGMRss-F ( forward ) dan  UGMRss-R  ( reverse ).  Karakteristik  primer UGMRss-F/UGMRss-R antara lain memiliki kan- dungan GC: 65% (UGMRss-F) dan 57% (UGMRss-R), suhu leleh (Tm): 62,4°C (UGMRss-F) dan 58,8°C (UGMRss-R) dan tidak ada terjadi secondary structures (hairpin-dimmer), complementary dan mismatch . Sifat-sifat tersebut di atas menunjukkan bahwa primer UGMRss  ini  bisa  digunakan  sebagai  kandidat primer spesifik yang ideal untuk deteksi gen target (Dieffenbach et al ., 1993).
Amplifikasi DNA R. syzygii subsp. syzygii
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer spesifik yang telah didesain berdasarkan gen endo- glukanase dari R. syzygii subsp. syzygii yang diunduh dari GenBank. Walaupun telah diketahui gambaran tentang suhu penempelan, untuk mengoptimalkan suhu penempelan yang tepat, maka dilakukan PCR gradian.  Pengujian  dilakukan  dengan  melakukan PCR dengan beberapa suhu penempelan yang berbeda yaitu:  65,5°C;  64,7°C;  63,4°C;  61,4°C;  59,0°C; 57,0°C; 55,7°C; dan 55,0°C. Dari hasil PCR gradian
Gambar 1. Alignment data urutan basa beberapa spesies Ralstonia dan subspesies Ralstonia syzygii menggunakan program Multalin
Trianom et al. : Perancangan Primer Spesifik Subspesies Berbasis Gen Endoglukanase untuk Deteksi Ralstonia syzygii 127
ini pada semua suhu yang digunakan dapat tervisu- alisasi sehingga yang diambil merupakan hasil yang terbaik yaitu pada suhu 59°C. Setelah dilakukan PCR dengan primer spesifik ini (UGMRss-F/UGMRss-R) mampu mendeteksi R. syzygii subsp. syzygi dengan amplikon berukuran ~378-bp (Gambar 2).
Dalam proses amplifikasi, suhu penempelan merupakan faktor yang sangat penting dalam terjadinya proses penempelan antara primer dengan cetakan ( template ). Suhu penempelan yang terlalu rendah akan menyebabkan terjadinya penempelan primer pada DNA di tempat yang tidak spesifik sedangkan suhu yang terlalu tinggi menyebabkan sulitnya terjadi ikatan primer. Selain itu konsentrasi DNA cetakan
juga memengaruhi proses penempelan primer (Joko et al. , 2011b).

## Uji Kekhususan dan Kepekaan Primer
Pada  uji  kekhususan  primer,  UGMRss-F/ UGMRss-R  mampu  secara  spesifik  mendeteksi hanya R. syzygii subsp. syzygii dengan tidak terampli- fikasinya DNA dari spesies bakteri lain (Gambar 3). Menurut Yuwono  (2006),  urutan  basa  nukleotida pada primer dapat berupa urutan basa nukleotida yang  dapat  berhibridisasi  secara  spesifik  dengan molekul DNA cetakan. Primer yang didesain berdasar- kan sekuens nukleotida yang unik pada R. syzygii subsp. syzygii menyebabkan  primer  UGMRss-F/ UGMRss-R  hanya  dapat  mendeteksi R.  syzygii subsp. syzygii. Menurut Van Pelt-Verkuit et al. (2008), primer merupakan rangkaian basa nukleotida yang berasal dari cetakan atau DNA target dan primer yang baik adalah rangkaian basa nukleotida yang unik pada cetakan tersebut, sehingga tidak terdapat pada sekuens atau lokasi lain pada cetakan.
Hasil  uji  kepekaan  menunjukkan  bahwa  nilai pengenceran berbanding terbalik dengan nilai kon- sentrasi DNA. Hasil ini nampak sama dengan visu- alisasi  intensitas  DNA  pada  Gambar  4.  Semakin besar pengenceran DNA, intensitas DNA pada gel elektroforesis semakin kecil (tipis). Pada konsentrasi DNA dengan pengenceran hingga 500× (konsentrasi 0,8 ng/ml) masih bisa teramplifikasi dengan primer UGM-Rss (Gambar 4). Pada uji kepekaan primer, target akan tetap pada produk amplikon DNA pada ukuran yang sama akan tetapi berbeda pada ketebalan
Gambar 2. Visualisasi hasil amplifikasi DNA isolat Ralstonia syzygii subsp. syzygii menggunakan teknik PCR dengan primer spesifik (UGMRss-F/UGMRss-R) dengan amplikon berukuran ~378 pasang basa (M: Marker 100-bp, 1: DNA R. syzygii subsp. syzygii)
Gambar 3. Visualisasi hasil uji spesifisitas pasangan primer  UGMRss-F/UGMRss-R untuk mendeteksi Ralstonia syzygii subsp. syzygii dengan beberapa spesies bakteri pembanding; (1) R. syzygii subsp. syzygii , (2) R. syzygii subsp. celebesensis , (3) R. pseudosolanacearum , (4) Acidovorax citrulli , (5) Xanthomonas citri , (6) Pantoea stewartii , (7) Dickeya chrysanthemi , (8) Pectobacterium carotovorum
Vol. 22 No. 2                                                               Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia
dan kejelasan dari hasil visualisasi. Ketebalan band pada amplikon juga memperlihatkan jumlah primer yang berhasil menempel ataupun jumlah cetakan yang berhasil ditempeli oleh primer (Joko et al. , 2012).

## KESIMPULAN
Dengan menggunakan data sekuens gen endo- glukanase  ( egl )  dari GenBank dapat  dirancang sepasang primer spesifik dan sensitif untuk deteksi R. syzygii subsp. syzygii yaitu: UGMRss-F (5’-GCT CACCATCGCCAAGGACAGCG-3’) dan UGMRss-R (5’-TTCGATCGAACGCCTGGTTGAGC-3’) dengan amplikon sebesar ~378-bp.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada PT Perkebunan Tjengkeh dan Badan Karantina Pertanian, Kementerian Pertanian Republik Indonesia yang telah membiayai sebagian dari penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Arwiyanto, T. 2013. Ralstonia solanacearum , Biologi Penyakit yang Ditimbulkan dan Pengelolaannya. Gadjah Mada University Press,Yogyakarta. 99 hlm.
Bennet, C.P.A., P. Hunt, & A. Asman. 1985. Association of  a  Xylem-Limited  Bacterium  with  Sumatra Disease of Cloves in Indonesia. Plant Pathology 34: 487–494.
Chuan, L.Y., Y.H. Cheng, & C.H. Yang. 2013. Specific Primer Design for the Polymerase Chain Reaction.
Biotechnology Letter 35: 1541–1549.
Danaatmadja, Y., S. Subandiyah, T. Joko, & C.U. Sari. 2009. Isolasi dan Karakterisasi Ralstonia syzygii. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia 15:7–12.
Dieffenbach, C.W., T.M. Lowe, & G.S. Dveksler. 1993. General Concepts for PCR Primer Design. Genome Research 3: S30-S37.
Dwimartina, F., T. Arwiyanto, & T. Joko. 2017. Potential of Endophytic and Rhizobacteria as an Effective Biocontrol for Ralstonia syzygii subsp. syzygii . Asian Journal of Plant Pathology 11: 191–198.
Eden-Green,  S.J.,  R.  Balfas,  &  T.  Sutarjo.  1992. Characteristics of the Transmission of Sumatra Disease of Cloves by Tube-Building Cercopoids,
Hindola spp. Plant Pathology 41: 702–712.
Fegan, M. & P. Prior. 2005. How Complex is The ‘‘ Ralstonia solanacearum Species Complex’’, p. 449–461. In C. Allen, A.C. Hayward & P. Prior (eds.), Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex . American Phyto- pathological Society, St Paul.
Frank, J.A, C.L. Reich, S. Sharma, J.S. Weisbaum, B.A. Wilson, & G.J. Olsen. 2008. Critical Evaluation of Two Primers Commonly Use for Amplification of  Bacterial  16S  rRNA  Genes. Applied  and Enviromental Microbiology 74: 2461–2470.
Handiyanti, M., T. Joko, & S. Subandiyah. 2018.
Deteksi Molekuler Burkholderia glumae , Penyebab Penyakit Hawar Malai Padi. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia 22: 98−107
Ismiyatuningsih, T. Joko, & S. Hartono. 2016. Survey and Detection of Pectobacterium atrosepticum in Major Potato-Growing Areas in Central Java Province, Indonesia. Ilmu Pertanian 1: 1−6.
Gambar 4. Visualisasi hasil uji kepekaan pasangan primer UGMRss-F/UGMRss-R untuk mengamplifikasi DNA Ralstonia syzygii subsp. syzygii pada berbagai seri pengenceran; 1–7: seri pengenceran 5×, 10×, 20×, 50×, 100×, 200×, dan 500×
Trianom et al. : Perancangan Primer Spesifik Subspesies Berbasis Gen Endoglukanase untuk Deteksi Ralstonia syzygii 129
Joko, T., S. Subandiyah, & S. Somowiyarjo. 2000. The Role of Extracellular Protein on the Pathogenicity of Xanthomonas campestris pv. citri . Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia 6: 32−38.
Joko, T., H. Hirata, & S. Tsuyumu. 2007a. Sugar Transporter  (MfsX)  of  Major  Facilitator Superfamily is Required for Flagella-Mediated Pathogenesis  in Dickeya  dadantii 3937. Journal  of  General  Plant  Pathology 73: 266−273.
Joko, T., H. Hirata, & S. Tsuyumu. 2007b. A Sugar Transporter (MfsX) is Also Required by Dickeya dadantii 3937 for in Planta Fitness. Journal of General Plant Pathology 73:
274−280.
Joko, T., D. Kiswanti, S. Subandiyah, & Hanudin. 2011a. Occurence of Bacterial Soft Rot of Phalaenopsis Orchids in Yogyakarta and West Java, Indonesia, p. 255–265. In Y. Koentjoro (ed.), Proceeding of International Seminar on“Natural Resources, Climate Change, and Food Security in Developing Countries” ,
June 27−28, 2011. Surabaya, Indonesia.
Joko, T., N. Kusumandari, & S. Hartono. 2011b. Optimasi  Metode  PCR  untuk  Deteksi Pectobacterium  carotovorum ,  Penyebab Penyakit  Busuk  Lunak  anggrek. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia 17: 54−59.
Joko,  T.,  M.P.  Koentjoro,  S.  Somowiyarjo, M.S. Rohman, A. Liana, & N. Ogawa. 2012. Response of Rhizobacterial Communities in Watermelon  to  Infection  with  Cucumber Green Mottle Mosaic Virus as Revealed by Cultivation-Dependent RISA. Archives of Phytopathology  and  Plant  Protection 45:
1810−1818.
Joko,  T.,  A.  Subandi,  N.  Kusumandari,  A. Wibowo, & A. Priyatmojo. 2014. Activities of Plant Cell Wall-Degrading Enzymes by Bacterial  Soft  Rot  of  Orchid. Archives  of
Phytopathology  and  Plant  Protection 47:
1239−1250.
Joko, T., M. Umehara, T. Murata, H. Etoh, K. Izumori, & S. Tsuyumu. 2018. Hyperinduction of Pectate Lyase in Dickeya chrysanthemi EC16 by Plant-Derived Sugars. Journal of Plant Interactions 13: 141−150.
Liu, H., S. Zhang, M.A. Schell, & T.P. Denny. 2005. Pyramiding Unmarked Deletions in Ralstonia solanacearum Shows that Secreted Proteins in Addition to Plant Cell-Wall- Degrading Enzymes Contribute to Virulence. Molecular Plant Microbe Interactions 18: 1296−1305.
Mahfut,  T.  Joko,  &  B.S.  Daryono.  2016.  Molecular Characterization of Odontoglossum Ring Spot Virus (ORSV) in Java and Bali, Indonesia. Asian Journal of Plant Pathology 10: 9−14.
Nurjanah,  N.,  T.  Joko,  &  S.  Subandiyah.  2017. Characterization  of Pantoea  ananatis Isolated from  Garlic  and  Shallot. Jurnal  Perlindungan Tanaman Indonesia 21: 120−126.
Poretsky, R., L.M. Rodriguez-R, C. Luo, D. Tsementzi, & K.T. Konstantinidis. 2014. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing  in  Revealing  Temporal  Microbial Community Dynamics. PLoS ONE 9: e93827.
Roberts,  D.P., T.P.  Denny,  &  M.A.  Schell.  1988. Cloning  of  the  egl  Gene  of Pseudomonas solanacearum and  Analysis  of  Its  Role  in Phytopathogenicity. Journal of Bacteriology 170:
1445−1451.
Schaad, NW, J.B. Jones, & W. Chun. 2001. Laboratory Guide  for  Identification  of  Plant  Pathogenic Bacteria. 3 rd ed.  American  Phytopathological Society, St Paul. 373 p.
Safni, I., I. Cleenwerck, P.D. Vos, M. Fegan, L. Sly,
&  U.  Kappler.  2014.  Polyphasic Taxonomic Revision of the Ralstonia solanacearum Species Complex: Proposal to Emend the Descriptions of Ralstonia solanacearum and Ralstonia syzygii and  Reclassify  Current R.  syzygii strains  as Ralstonia syzygii subsp. syzygii subsp. nov., R. solanacearum Phylotype IV Strains as Ralstonia syzygii subsp. indonesiensis subsp. nov., Banana Blood Disease Bacterium Strains as Ralstonia syzygii subsp. celebesensis subsp. nov. and R. solanacearum Phylotype I and III Strains as Ralstonia  pseudosolanacearum sp.  nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64: 3087–3103.
Safni, I., S. Subandiyah, & M. Fegan. 2018. Ecology, Epidemiology  and  Disease  Management  of Ralstonia  syzygii in  Indonesia. Frontiers  in Microbiology 9: 1–11.
Suharti, T., T. Joko, & T. Arwiyanto. 2017. Deteksi Bakteri Patogen Terbawa Benih Akor ( Acacia auriculiformis A. Cunn. ex Benth.). Jurnal Hama dan Penyakit Tumbuhan Tropika 17: 19–36.
Trianom, B., T. Arwiyanto, & T. Joko. Morphological and  Molecular  Characteri-  zation  of  Sumatra Disease  of  Clove  in  Central  Java,  Indonesia. Tropical Life Sciences Research ( In Press ).
Van Pelt-Verkuil, E., A. Van Belkum, & J.P. Hays. 2008. Principals and  Technical Aspects of PCR Amplification . Springer, Netherland. 30 p.
Widyaningsih,  S.,  S.N.H.  Utami,  T.  Joko,  &  S. Subandiyah. 2017. Development of Disease and Growth on Six Scion/Root Stock Combinations of Citrus Seedlings under Huanglongbing Pressure. Journal of Agricultural Science 9: 229−238.
Windari, U., T. Joko, & S. Subandiyah. 2015. Deteksi Penyakit Bacterial  Fruit  Blotch pada  Melon Menggunakan ELISA. Jurnal Perlindungan
Tanaman Indonesia 19: 1−5.
Yamamoto, S. & S.Harayama. 1995. PCR Amplification and  Direct  Sequencing  of  gyrB  Genes  with Universal Primers and Their Application to the Detection and Taxonomic Analysis of Pseudomonas putida Strains. Applied  and  Environmental Microbiology 61: 1104−1109.
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction . Penerbit Andi, Yogyakarta. 246 hlm.
Trianom et al. : Perancangan Primer Spesifik Subspesies Berbasis Gen Endoglukanase untuk Deteksi Ralstonia syzygii 131