OPTIMASI DAN VALIDASI METODE ANALISIS DALAM PENENTUAN KANDUNGAN TOTAL FLAVONOID PADA EKSTRAK DAUN GEDI HIJAU ( Abelmoscus manihot L.) YANG DIUKUR MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER UV-VIS
Sukmawati 1) , Sri Sudewi 1) , Julius Pontoh 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
1) Jurusan Kimia FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Gedi  (Abelmoscus  manihot  L.)  is  a tropical  plant  of the  malvaceae family,  has  traditionally been  long  known  in  North  Sulawesi  as  a  vegetable.  The  purpose  of  this  research  is  to  know  the optimization of the analysis method with several parameters tested that is concentration and volume of reactant and time of incubation, to know the validation of the analytical method used so as to give the right result in determining the total flavonoid content, and to determine the total flavonoid content of green gedi flavonoid (Abelmoscus manihot L.). Quantitative analysis method of flavonoids by using UV-Vis  Spectrophotometer  was  used  in  this  study.  Optimum  result  was  obtained  that  the  optimum result was (AlCl 3 ) 2% 0,5 mL reacted with acetic acid (CH 3 COOH) 5% 5 mL with the most optimal incubation time was 20 min. The validation parameters are precision, accuracy, linearity, LOD (Limit of  Detection)  and  LOQ  (Limit  Of  Quantitation)  using  UV-Vis  Spectrophotometer  at  a  maximum wavelength  of  415  nm.  The  result  obtained  from  the  precision  test  fulfilled  the  requirement  with RSD/KV  equal  to  0,00313%,  with  accuracy  value  which  also  fulfill  the  value  (80-110%)  that  is 106,766%, the result of the correlation coefficient (r) is 0,993 and LOD value of 249,3 ppm and LOQ value  obtained  for  831  ppm.  The  total  content  of  flavonoids  in  Manado  City  was  155,83  mg  QE/g extract ± 0,0007, North Minahasa sub-district of 675,85 mg QE/g extract ± 0,049 and Tomohon City of 450,86 mg QE/g extract ± 0,032.
Keywords :  Flavonoids,  Green  Gedi  Leaves,  Optimization,  Validation,  UV-Vis  Spectrophotometer, Abelmoscus manihot L.

## ABSTRAK
Gedi  ( Abelmoschus  manihot (L.))  merupakan  tumbuhan  tropis  famili  malvaceae,  secara tradisional  telah  lama  dikenal  di  Sulawesi  Utara  sebagai  tanaman  sayuran.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengetahui  optimasi  metode  analisis  dengan  beberapa  parameter  yang  diujikan  yaitu konsentrasi  dan  volume  reaktan  serta  waktu  inkubasi  sampel  yang  digunakan,  dan  mengetahui validasi  metode  analisis  yang  digunakan  sehingga  memberikan  hasil  yang  tepat  dalam  penentuan kandungan total flavonoid, serta menentukan kandungan total flavonoid daun gedi hijau ( Abelmoscus manihot L.).  Metode  analisis  kuantitatif  flavonoid  dengan  menggunakan  Spektrofotometer  UV-Vis dipakai  dalam  penelitian  ini.  Hasil  optimasi  metode  analisis  diperoleh  bahwa  hasil  yang  paling optimal  adalah  (AlCl 3 )  2%  0,5  mL  direaksikan  dengan  asam  asetat  (CH 3 COOH)  5%  5  mL  dengan waktu  inkubasi  yang  paling  optimal  adalah  20  menit.  Parameter  validasi  metode  adalah  presisi, akurasi, linearitas, LOD dan LOQ menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum  415  nm.  Hasil  yang  diperoleh  dari  uji  presisi  memenuhi  syarat  ketentuan  dengan  nilai RSD/KV sebesar 0,00313%, dengan nilai akurasi yang juga memenuhi syarat nilai (80%-110%) yaitu 106,766%, hasil dari koefisien korelasi (r) adalah 0,993 dan nilai LOD sebesar 249,3 ppm serta nilai LOQ  yang  diperoleh  sebesar  831  ppm.  Hasil  kandungan  total  flavonoid  pada  kota  Manado  sebesar 155,83  mg  QE/g  ekstrak  ±  0,0007,  kecamatan  Minahasa  Utara  sebesar  675,85  mg  QE/g  ekstrak  ± 0,049 dan kota Tomohon sebesar 450,86 mg QE/g ekstrak ± 0,032.
Kata  kunci :  Flavonoid,  Daun  Gedi  Hijau,  Optimasi,  Validasi,  Spektrofotometer  UV-Vis, Abelmoscus manihot L.

## PENDAHULUAN
Gedi  ( Abelmoschus  manihot (L.)) merupakan tumbuhan tropis famili malvaceae,  secara  tradisional  telah  lama dikenal di Sulawesi Utara sebagai tanaman sayuran.  Tumbuhan  ini  memiliki  efek farmakologis untuk membantu penyembuhan  berbagai  macam  penyakit (Mamahit dan Sukamto, 2010).
Masyarakat memanfaatkan daun gedi yang direbus  tanpa  diberi  bumbu  sebagai  obat tradisional untuk menurunkan kadar kolesterol,  hipertensi  dan  juga  sebagai antidiabetes (South et al , 2013).
Kemampuan flavonoid sebagai antioksidan telah banyak diteliti belakangan  ini  (Purmorad et  al ,  2006).
Sebagai  antioksidan  flavonoid  memiliki kemampuan untuk mengubah atau mereduksi  radikal  bebas  dan  juga  sebagai anti radikal bebas (Zuhra, 2008). Senyawa flavonoid  adalah  senyawa  polifenol  yang mempunyai 15 atom karbon yang tersusun dalam  konfigurasi  C 6 -C 3 -C 6 ,  yaitu  dua cincin  aromatik  yang  dihubungkan  oleh  3 atom  karbon  yang  dapat  atau  tidak  dapat membentuk  cincin  ketiga.  Flavonoid terdapat  dalam  semua  tumbuhan  hijau sehingga  dapat  ditemukan  pada  setiap ekstrak  tumbuhan  (Markham,  1988). Golongan  flavonoid  dapat  digambarkan sebagai deretan senyawa C 6 -C 3 -C 6 , artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C 6 (cincin benzena tersubstitusi) disambungkan  oleh  rantai  alifatik  tiga karbon (Robinson, 1995).
Pada  monografi  simplisia  dan ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia terdapat beberapa    kelemahan  pada  teknik  analisis yang  dipakai.  Diantara  kelemahan  itu adalah  tidak  adanya  optimasi  dalam penyiapan  sampel,  padahal  penyiapan sampel sangat berpengaruh pada perolehan
zat  aktif  dan  hasil  analisis  yang  akan diperoleh (Gaedcke et al , 2003). Optimasi metode analisis adalah cara untuk menoptimalkan  metode  yang  dipakai dalam  suatu  analisis  agar  hasil  penelitian yang diperoleh dapat diandalkan. Berdasarkan  hal  tersebut  maka  penulis tertarik  untuk  menggunakan  optimasi metode analisis sebagai salah satu langkah untuk  mengoptimalkan  hasil  penelintian dalam penetapan kandungan total flavonoid  pada  ekstrak  daun  gedi  hijau dengan  cara  mengoptimasikan  volume pelarut,  konsentrasi  pelarut  dan  waktu inkubasi sampel.
Metode yang digunakan di laboratorium kimia analitik harus dievaluasi  dan  diuji  untuk  memastikan bahwa metode tersebut mampu menghasilkan  data  yang  valid  dan  sesuai dengan  tujuan    (Torbeck  L.D,  2007). Validasi  metode  analisis  adalah  suatu tindakan penilaian terhadap suatu parameter  tertentu,  berdasarkan  percobaan laboratorium  untuk  memastikkan  bahwa parameter tersebut memenuhi syarat untuk penggunaannya  (Effendy,  2004).  Validasi ulang  perlu  dilakukan  karena  meskipun validasi  sebelumnya  menghasilkan  data yang  sesuai  dengan  kriteria  penerimaan, dan  metode  yang  dinyatakan  valid  dalam kondisi  tertentu    belum  tentu  valid  pada kondisi  lain  karena  peralatan  dan  pereaksi yang digunakan (Alwi H, 2017). Beberapa parameter  validasi  yang  biasa  diujikan adalah Limit Of Detection (LOD), Limit Of Quantitation (LOQ),  presisi,  akurasi  dan linearitas.
Analisis kuantitatif flavonoid dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Spektrum serapan  ultra  violet  dan  serapan  tampak merupakan  cara  tunggal  yang  paling
bermanfaat untuk mengidentifikasi struktur flavonoid (Markham, 1988).
Hasil  penelitian  Pine et  al ,  (2010) menyatakan  bahwa  daun  gedi  memiliki kandungan  flavonoid  yang  cukup  tinggi (23-41%)  dan  berpotensi  sebagai  sumber antioksidan.  Aktivitas  antioksidan  ekstrak etanol daun gedi meningkat sejalan dengan peningkatan  konsentrasi  total  flavonoid, dan  aktivitas  tertinggi  terdapat  pada ekstrak  etanol  96%  dengan  nilai  IC 50 sebesar 0,575 mg g -1 .
Berdasarkan hal-hal diatas mendorong  penulis  untuk  melakukan penelitian  tentang  Optimasi  dan  Validasi metode
Analisis dalam Penentuan
Kandungan  Total  Flavonoid  pada  Ekstrak daun Gedi Hijau yang diukur menggunakan  Spektrofotometer  UV-Vis.
Flavonoid  mengandung  sistem  aromatis yang terkonjugasi sehingga dapat menunjukkan  pita  serapan  kuat  pada daerah UV-Vis (Rohyami, 2008).

## METODOLOGI PENELITIAN

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan  Januari  sampai  Maret  2018  di Laboratorium  Kimia  Farmasi,  Program Studi  Farmasi  Fakultas  Matematika  dan Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Universitas  Sam Ratulangi Manado.

## Alat dan Bahan
a. Alat Alat-alat ukur analitis yang
digunakan  untuk  penelitian  ini  adalah Spektrofotometri  UV-VIS  (Shimadzu 00780),  Komputer  pengolah  data  (Acer Aspie  ES  11),  Alat-alat  gelas,  Vortex (Mixer  Hwashin),  Blender  (Phillips), Rotary  Evaporator (RV  10  digital  V), corong pisah, rotary shacker.
b. Bahan
Bahan-bahan  yang  dipakai  ialah simplisia  kering  daun  Gedi  dari  3 tempat  tumbuh  yang  berbeda  yaitu Daerah pesisir pantai (Manado), Daerah dataran  rendah  (Minahasa  Utara),  dan Daerah  dataran  tinggi  (Tomohon). Etanol  p.a,  etanol  96%,  almunium klorida  (AlCl 3 )  (Merck),  asam  asetat (CH 3 COOH)  (Merck),  kuersetin  p.a, pelarut  n-heksana  (Merck),  etil  asetat (Merck), dan aquadest (Merck).

## Prosedur Kerja
Pengambilan Sampel Sampel daun Gedi Hijau
( Abelmoschus  manihot L . )  diambil  dari tiga  tempat  yaitu  Daerah  pesisir  pantai tepatnya  di  Kota  Manado,  Dataran  rendah tepatnya  di  Kecamatan  Minahasa  Utara dan  Dataran  tinggi  tepatnya  di  Kota Tomohon. Selanjutnya setiap sampel daun gedi  hijau  ( Abelmoschus  manihot L . ) dibuat menjadi bentuk simplisia.
Kemudian  setiap  sampel  dari  masing- masing  daerah  akan  diukur  kandungan total flavonoid menggunakan
spektrofotometer UV-Vis.

## Ekstraksi
Sebanyak 250 gram serbuk simplisia  dimasukkan  ke  dalam  maserator 500 mL dan kemudian ditambahkan etanol 96%.  Ekstraksi  dilakukan  dengan  cara maserasi  selama  24  jam  dan  pengadukan dibantu  dengan  alat rotary  shacker . Ekstrak hasil maserasi kemudian diuapkan dengan rotary evaporator hingga terbentuk ekstrak kental.

## Uji Optimasi Metode Analisis
Sampel  ekstrak    daun  gedi  hijau 1000  ppm  dipipet  sebanyak  0,5  mL ditambahkan  aluminium  klorida  (AlCl 3 ) dengan  beberapa  rentang  volume  0,5  mL; 0,10  mL;  dan  0,15  mL  dan  beberapa
rentang  konsentrasi  AlCl 3 yaitu  2%;  5%; dan  10%  kemudian  ditambahkan  asam asetat  (CH 3 COOH)  pada  rentang  volume 5mL  ;8  mL;  dan  12mL  dan  rentang konsentrasi asam asetat (CH 3 COOH) yaitu 5%;  7%  dan  12%  kemudian  ditambahkan 2,80  mL  aquadest.  Campuran  dikocok homogen  lalu  didiamkan  selama  beberapa rentang waktu inkubasi yaitu 20; 30 dan 40 menit. Kemudian diukur serapannya menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis pada  panjang  gelombang  maksimum. Setiap  perolehan  optimasi  diukur  pada pengukuran  yg berbeda-beda atau masing- masing  dalam  penetapan  kandungan  total flavonoid ekstrak daun gedi hijau ( Abelmoscus manihot L.).

## Pembuatan Larutan Baku Kuersetin
Dibuat  larutan  induk  1000  ppm dengan  cara  menimbang  dengan  seksama 10 mg kuersetin p.a dan dilarutkan dengan etanol p.a 10 mL. Kemudian dibuat larutan standar  kuersetin  100;  200;  300;  400;  dan 500  ppm  dari  pengenceran  larutan  baku kuersetin 1000 ppm.
Penentuan
Panjang Gelombang

## Maksimum Kuersetin
Panjang  gelombang  maksimum ditentukan  dengan  cara  membuat  larutan standar  kuersetin  400  ppm  kemudian sebanyak 1 mL larutan kuersetin 400 ppm tersebut  direaksikan  dengan  1  mL  AlCl 3 2%  di  dalam  tabung  reaksi.  Kemudian ditambahkan  8  mL  asam  asetat  5%  ke dalam  larutan  dan  dilakukan  pembacaan pada  rentang  panjang  gelombang  400-500 nm  menggunakan  Spektrofotometer  UV- Vis.
Penetapan Operating Time Kuersetin
Penentuan operating
time dilakukan  dengan  mengambil  sebanyak  1
mL larutan kuersetin 200 ppm dimasukkan dalam  tabung  reaksi,  lalu  direaksikan dengan  1  mL  AlCl 3 2%,  dan  ditambahkan 8  mL  asam  asetat  5%  ke  dalam  larutan. Larutan diukur absorbansinya pada panjang  gelombang  maksimum  yang  telah diperoleh  dengan  interval  waktu  1  menit sampai diperoleh absorbansi yang stabil.

## Uji validasi metode analisis Ketepatan (akurasi)
Ke dalam sampel ekstrak daun gedi hijau ditambahkan kuersetin baku sebanyak 50; 100 ; dan 150 ppm dari rerata kadar kuersetin yang terdapat pada sampel, kemudian dianalisis dengan prosedur yang sama seperti pada sampel. Hasil dinyatakan dalam persen perolehan kembali  (% recovery ).  Persen  perolehan kembali  dihitung  dengan  menggunakan rumus sebagai berikut.

## Ketelitian (Presisi)
Larutan kuersetin 100 ppm di pipet 1  mL  dari  larutan  stok  kemudian dimasukkan  kedalam  labu  terukur  10  mL. Dipipet  1  mL  dari  konsentrasi  100  ppm hingga  kadarnya  10  ppm.  Kemudian larutan  baku  kuersetin  dengan  konsentrasi 10  ppm  tersebut  didiamkan  selama  waktu operating time kemudian dibaca absorbansinya  pada  panjang  gelombang maksimum.  Uji  ketelitian  ini  dilakukan sebanyak  5  kali  pengulangan. Uji  presisi (keseksamaan) ditentukan dengan parameter RSD ( Relative Standard
Deviasi ) Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)
Batas  deteksi  dan  batas  kuantitas dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi  linear  dari  kurva  kalibrasi  dengan membuat  larutan  baku  kerja  dengan
konsentrasi   100;  200;  300;  400;   dan 500 ppm  lalu  lalu  dipipet  1  mL  kemudian ditambahkan 1 mL AlCl 3 5% setelah itu dii nkubasi selama 20 menit, absorbansi dari larutan pembanding diukur menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis pada  panjang  gelombang  maksimum. Setelah  diukur  absorbansi  dari  larutan baku kerja dicari persamaan regresi antara kadar  (konsentrasi)  dengan  absorbansi. Kemudian  dihitung  harga Limit  Of Detection dan Limit Of Quantitation .

## Linearitas (kurva baku)
Linieritas  dilakukan  dengan  cara membuat larutan baku kuersetin 1000 ppm kemudian dibuat larutan baku kerja dengan konsentrasi  100;  200;  300;  400  dan  500 ppm lalu dipipet 1 ml kemudian ditambahkan 1 ml aluminium (III)  klorida 5%,  1  ml  larutan  CH 3 COOH  5%,  Setelah itu diinkubasi selama 20 menit, absorbansi dari larutan pembanding diukur menggunakan  spektrofotometer  UV  Vis pada  panjang  gelombang    maksimum. Kurva  hubungan  antara  kadar  vs  serapan dibuat  kemudian  ditentukan  persamaan regresi  linier  serta  koefisien  kolerasi  (x) dan  kefisien  kolerasi  dari  fungsi  (Vxo) untuk  mengevaluasi  lineritas.  Berdasarkan nilai  koefisien  kolerasi  dapat  diketahui linieritasnya  baik  atau  tidak.  Koefisien kolerasi  dikatakan  baik  apabila  r  ≥  0,98 dan koefisien fungsi regresi (Vxo) ≤ 5%.

## Penentuan  Kandungan  Total  Flavonoid Ekstrak Daun Gedi
Sampel  ekstrak  etanol  daun  gedi hijau  1000  ppm  dipipet  sebanyak  1  mL ditambahkan  dengan  volume  aluminium klorida  (AlCl 3 )  hasil  optimasi  dengan konsentrasi dari hasil optimasi yang paling optimal. Tambahkan volume hasil optimasi  asam  asetat  (CH 3 COOH)  dengan
konsentrasi  hasil  optimasi  yang  paling optimal.  Campuran  dikocok  homogen  lalu dibiarkan  selama  waktu  inkubasi  yang paling  optimal  dari  hasil  optimasi  waktu inkubasi.  Kemudian  diukur  serapannya menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis pada  panjang  gelombang  maksimum. Penentuan  nilai  flavonoid  akhir  dilakukan berdasarkan  formula  yang  dikembangkan oleh Pan et al . (2012), yaitu:
Flavonoid Total = ( m g ) = x   x V
Keterangan :
Y  =  konsentrasi  flavonoid  contoh  yang dihitung  dengan  menggunakan  persamaan kurva standard (mg g -1 ) N = nilai pengenceran. V = volume hasil ekstraksi (mL). W = berat serbuk daun gedi (g).

## Fraksinasi
Sebanyak  5  g  ekstrak  kental  dari masing-masing  sampel  dilarutkan  dengan 25 mL air. Larutan selanjutnya difraksinasi dengan  50  mL  n-heksan.  Dikocok  dalam labu  pemisah  dan  dan  didiamkan  selama 10-15  menit  hingga  terdapat  dua  lapisan air  (air  pada  lapisan  bawah  dan  n-heksan pada  lapisan  atas).  Kedua  lapisan  yang terbentuk  kemudian  dipisahkan.  Proses penambahan n-heksan pada lapisan bawah (air)  yang  sudah  dipisahkan  diulangi  dua kali. Lapisan atas (n-heksan) yang terbentuk  selama  tiga  kali  fraksinasi digabungkan  dan  disebut  dengan  fraksi  n- heksan.  Bagian  air  sisa  dari  proses fraksinasi yang terjadi sama dengan proses fraksinasi  n-heksan  kemudian  difraksi lebih lanjut dengan etil asetat. Proses yang terjadi  sama  dengan  proses  fraksinasi  dari n-heksan. Lapisan etil asetat yang nantinya akan  terbentuk  selama  tiga  kali  fraksinasi digabungkan dan disebut sebagai fraksi etil
asetat  dan  sisa  lapisan  aquadest  disebut sebagai fraksi aquadest.
Penetapan  Kandungan  Total  Flavonoid dari Fraksi Pelarut
Fraksi kemudian ditentukan kandungan  total  flavonoid  yaitu  sebanyak 0,1  mL  dari  masing-masing  fraksi  1000 ppm  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi, lalu  ditambahkan  0,1  mL    AlCl 3 2% campuran tersebut divortex selama 2 menit lalu  tambahkan  2  mL  larutan  CH 3 COOH 5%.  Selanjutnya  campuran  diinkubasi selama 20 menit diruang gelap.
Absorbansimya  dibaca  pada  panjang gelombang maksimum
dengan Spektrofotometer UV-Vis Kandungan total flavonoid  dinyatakan  sebagai  ekivalen kuersetin mg/kg ekstrak.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil Ekstraksi
Setiap  sampel  sebanyak  250  gram serbuk simplisia daun gedi hijau dimasukkan  ke  dalam  maserator  500  ml dan  di  tambahkan  etanol.  Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi selama 24 jam  menggunakan    alat  bantu  pengaduk ( rotary  shacker ).  kemudian  disaring  dan didapatkan  filtrat.  Filtrat  yang  diperoleh akan  diuapkan  dengan rotary  evaporator . Proses  ekstraksi  dengan  metode  maserasi dikombinasikan dengan alat vaccum rotary evaporator yang bertujuan untuk mendapat hasil  pemisahan  yang  maksimal. Vaccum rotary  evaporator merupakan  alat  yang dirancang  untuk  memindahkan  pelarut yang  mudah  menguap  dalam  jumlah  yang besar dari larutan pada penurunan tekanan, meninggalkan komponen yang tidak mudah menguap. Perbedaan utama pekerjaan  ini  dengan  kerja  distilasi  adalah dilakukannya  pemutaran  labu  distilasi
selama  pemindahan  pelarut.  Pemutaran memiliki  fungsi  penting  yakni  dapat menghindari resiko bumping dan
meningkatkan kecepatan pemindahan pelarut (Firdaus, 2011). Hasil evaporasi di pindahkan pada cawan petri dan dimasukan  kedalam  oven  dengan  suhu maksimal  40 0 C  agar  tidak  merusak senyawa  yang  terkandung  dalam  ekstrak, hingga diperoleh ekstrak kental.
Berdasarkan  hasil  ekstraksi  250  gram daun  gedi  hijau  maka  diperoleh  jumlah hasil rendemen dari masing-masing ekstrak  adalah  kota  manado  sebesar 13,24%,  Minahasa  Utara  sebesar  4,18% dan Kota Tomohon sebesar 5,63%.

## Hasil Optimasi
Berdasarkan  pengujian  optimasi  yang dilakukan hasil yang paling optimal adalah larutan  standar  kuersetin  1000  ppm  yang ditambahkan  almunium  klorida  (AlCl 3 )
2% 0,5 mL direaksikan dengan asam asetat (CH 3 COOH)  5%  5  mL  dengan  waktu inkubasi  yang  paling  optimal  adalah  20 menit  dimana  menghasilkan  nilai  serapan optimum sebesar 0,807.
Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Kuersetin
Pada  penelitian  ini  penentuan panjang  gelombang  maksimum  dilakukan dengan  menggunakan  Spektrofotometer UV-Vis  pada  daerah  panjang  gelombang 400-500  nm  dan  konsentrasi  yang  dipakai adalah  400  ppm  sehingga  diperoleh panjang  maksimum  gelombang  415  nm.
Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  yang dilakukan  oleh  Irvan et  al (2016)  dimana panjang  gelombang  maksimum  yang diperoleh adalah 415 nm. Tujuan penentuan  panjang  gelombang  maksimum agar  mengetahui  daerah  serapan  yang dapat  dihasilkan  berupa  nilai  absorbansi
dari  larutan  baku  kuersetin  yang  diukur serapannya menggunakan alat
spektrofotometer  UV-Vis  pada  rentang
panjang  gelombang  400-500  nm.  Data hasil panjang gelombang maksimum dapat dilihat pada gambar 1. Gambar 1 . Kurva Panjang Gelombang Maksimum Kuersetin
Penentuan Operating Time Operating  time ditentukan  dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang maksimum dari data yang telah dihasilkan pada penentuan panjang gelombang  maksimum  yaitu  415  nm dengan konsentrasi yang digunakan adalah 200 ppm dengan rentang waktu 1-20 menit dengan hasil absorbansi yaitu 0,42.

## Validasi Metode Analisis Uji Presisi (Ketelitian)
Hasil  pengujian  presisi  menunjukan bahwa nilai dari hasil perhitungan simpangan  baku  dari  data  yang  diperoleh dengan  replikasi  sebayak  5  kali  yaitu  SD ( Standar  Deviation )  sebesar  0,0169  pada konsentrasi  kadar  analit  100  ppm  dengan nilai  RSD  ( Relative  Standar  Deviation ) atau  KV  ( Koefisien  Variansi )  adalah 0,00313%  dan  ketelitian  alat  sebesar 99,996%.  Berdasarkan  hasil  uji  tersebut menunjukan  bahwa  pengujian  presisi dengan  metode  Spektrofotometri  yang digunakan  adalah  baik  dimana  menurut Hermita  (2004)  metode  dikatakan  baik apabila  presisi  yang  dihasilkan  memenuhi persyaratan dengan KV ≤ 2%.

## Uji Akurasi (Ketepatan)
Dalam  metode  penambahan  baku pada  penelitian  yang  pertama  kali  diukur adalah  absorbansi  dari  ekstrak  daun  gedi 1000  ppm  pada  satu  daerah  yaitu  Kota Tomohon  kemudian    dilakukan  metode penambahan baku kuersetin dengan menambahkan    tiga  seri  konsentrasi larutan  baku  kuersetin  yaitu  50;  100  dan 150  ppm  kemudian  diukur  absorbansinya pada  masing-masing  konsentrasi  tersebut dan  dilakukan  pengulangan  sebanyak  3 kali.  Kemudian  hasil  absorbansi  dirata- ratakan dari tiga kali pengulangan tersebut dan dilakukan perhitungan sehingga menghasilkan % recovery sebesar 106,766% dimana persen perolehan kembali ini dapat diterima karena memenuhi  syarat  akurasi  yaitu  pada rentang rata-rata persen perolehan kembali 80-110% (WHO,1992).

## Kurva  Kalibrasi  Kuersetin  dan  Uji Linearitas
Berdasarkan hasil pembuatan kurva kalibrasi  dengan  menggunakan  metode Spektrofotometri  yang  menghubungkan konsentrasi  dengan  absorbansi,  diperoleh
0,65 0,7 0,75 0,8 400 405 410 415 420 425 430 435 Abso rb an si (y ) Panjang gelombang (nm) λ maksimum Series1
persamaan  linear  y  =  0,001x  +  0,191 dengan  koefisien  korelasi  r  =  0,993.  Hasil koefisien  korelasi  diatas  telah  memenuhi
kriteria penerimaan yaitu ≥ 0,98 (Hermita, 2004).
Gambar 2. Kurva Kalibrasi Kuersetin
Batas  Uji  Deteksi  dan  Batas  Uji Kuantitas Dalam  penelitian  ini  batas  deteksi  (LOD) yang  diperoleh  adalah  249,3  ppm  dan batas kuantitas yang diperoleh sebesar 831 ppm. Hasil Kandungan  Total Flavonoid
Kadar  flavonoid  awal  (x)  yang dihitung  menggunakan  persamaan  regresi linier  kurva  baku  yaitu  y  =  ax  +  b menghasilkan  kandungan  flavonoid  pada Kota  Manado  sebesar  155,83  mg  QE/g ekstrak  ±  0,0007,  Minahasa  Utara  sebesar 675,85 mg QE/g ekstrak ± 0,049 dan Kota Tomohon sebesar 450,86 mg QE/g ekstrak ±  0,032.  Dan  data  menunjukan  bahwa Hasil kandungan flavonoid tertinggi diperoleh  oleh  daerah  Minahasa  Utara (Dataran  rendah)  dengan  nilai  kandungan flavonoid sebesar 675,85 mg QE/g ekstrak. Berdasarkan  letak  geografisnya,  dataran
rendah  adalah  dataran  yang  berada diantara  0  -  200  meter  atau  500  meter  di atas  permukaan  laut.  Hal  ini  membuat suhu  di  dataran  ini  berkisar  antara  23- 28 o C.  Secara  geografis  keadaan  tanah  di daerah  ini  cukup  mendukung  untuk bercocok  tanam  karena  tanahnya  sangat subur, tanah di dataran ini merupakan hasil sedimentasi  tanah  alluvial.  Tanah  alluvial ini  merupakan  tanah  hasil  erosi  dari gunung  berapi  atau  dataran  tinggi  yang hanyut bersama air sungai (Sunarto, 2016). Dan  daerah  Minahasa  Utara  merupakan daerah
dataran  rendah  yang  sangat  cocok  untuk ditanami  tanaman  gedi  yang  merupakan tumbuhan  tropis  karena  daerah  dataran rendah  memiliki  suhu  yang  optimum  dan kondisi  lingkungan  yang  sesuai  dengan habitatnya  pada  kondisi  inilah  tumbuhan
akan  tumbuh  dan  berkembang  dengan baik.

## Hasil Fraksinasi
Dari hasil penelitian yang diperoleh bahwa  fraksi  etil  asetat  memiliki  nilai kandungan flavonoid tertinggi
y = 0,001x + 0,191 R² = 0,993 0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 200 400 600 ab sor b an si ( y) konsentrasi (x) Kurva Kalibrasi Kuersetin Series1 Linear (Series1)
dibandingkan  dengan  fraksi  n-heksan  dan aquadest.  hal  ini  terjadi  karena  senyawa flavonoid  yang  berada  didalam  daun  gedi lebih  banyak  terlarut  pada  pelarut  etil asetat.  Demikian  pula  hasil  penelitian Chatarina et al (2017)  yang  menunjukan
bahwa ekstraksi senyawa flavonoid menghasilkan kadar flavonoid total tertinggi  pada  pelarut  etil  asetat.  Leoufoid (2014)  juga  menyatakan  bahwa  senyawa flavonoid  lebih  larut  dalam  pelarut  etil asetat.

## KESIMPULAN
1. Hasil yang paling optimal dari optimasi metode  analisis  adalah  (AlCl 3 )  2%  0,5 mL  direaksikan  dengan  asam  asetat (CH 3 COOH)  5%  5  mL  dengan  waktu inkubasi  yang paling optimal adalah 20 menit.  Sehingga  hasil  ini  dipakai  untuk penentuan  kandungan  total  flavonoid dan  juga  dipakai  pada  saat  melakukan validasi metode analisis.
2. Dari  hasil  validasi  dihasilkan  dapat dilihat  bahwa  parameter  yang  diuji memenuhi kriteria penerimaan yaitu uji ketelitian  mendapatkan  hasil  RSD sebesar  0,00313%  yaitu  ≤  2%  dengan SD sebesar 0,0169, kemudian hasil dari uji  ketepatan  mendapatkan  hasil  % Recovery sebesar  106,766% yang masih  dalam  rentang  penerimaan  yaitu 80-110%,  dan  hasil  dari  koefisien korelasi  (r)  0,993  yang  memenuhi kriteria  penerimaan  yaitu  ≥  0,98, dengan  nilai  LOD  sebesar  249,3  ppm dan  nilai  LOQ  yang  diperoleh  sebesar
831 ppm.
3. Kandungan  total  flavonoid  dari  ekstrak etanol  daun  gedi  hijau  ( Abelmoscus manihot L .) untuk  kota  Tomohon  adalah sebesar 450,86 mg QE/g ekstrak ± 0,032, daerah  Minahasa  Utara  adalah  sebesar
675,85  mg  QE/g  ekstrak  ±  0,049,  dan untuk  kota  Manado  adalah  sebesar 155,83 mg QE/g ekstrak ± 0,0007

## DAFTAR PUSTAKA
Chang, C.C, Yang M.H, Wen H.M, Chern JC.,  2002 . Estimation  of  total flavonoid content in propolis by two Estimation of total flavonoid content in  propolis  by  two  complementary colorimetric  methods. J  Food  Drug Analysis ; 10 (1) (178-182).
Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia.
Edisi IV . Departemen Kesehatan
R.I., Jakarta.
Gaedcke,  F.,  Steinhoff,  B.  H.,  2003.
Herbal medicine products: Scientific and Regulatory basis for development.  Quality  Asssurance and Marketing Authorisation, Stuttgart: Medpharm Scientific
Publisher.
Guether.  (1987). Minyak  Atsiri  Tumbuhan Tropika . UI Press. Jakarta.
Harmita,  2004. Petunjuk  Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu
Kefarmasian  [ serial  on  internet ].
vol.1  No.3  ].  [Dikutip  23  maret 2018].
Mamahit  L.P.  &  Soekarno,N.H.,  2010. Satu senyawa organik yang diisolasidari daun gedi ( Albemoschus manihot L .  Medik )  Asal  Sulawesi
utara . Jurnal  Kimia .  Vol.3,  No.1, Hal. 45.
Markham.  (1988). Cara  Mengidentifikasi Flavonoid . ITB Press. Bandung.
Pine  ATD,  G  Alam  and  F  Attamin.  2010.
Standardisasi  Mutu  Ekstrak  Daun Gedi  (Abelmoschus  manihot L .)
Medik)  Dan  Uji  Efek  Antioksidan dengan  Metode  DPPH. [diakses  12 oktober 2017]
Irvan,  Liling  T,  Budi  Prayitno.  2016.
Penentuan Kandungan Total Flavonoid  dan  aktivitas  antioksidan ekstrak etanol daun kajajahi ( Leukosyke capitellata
Wedd.).
Jurnal  Pharmascience .  Vol.3  No.1. Hal. 95-96.
Riyanto,  2014 .  Validasi  dan  Verifikasi metode  uji. CV.  Budi  Utama. Yogyakarta.
Rohman. A, 2007. Kimia Farmasi Analisis . Pustaka Pelajar. Yogyakarta.
Rohyani,  Y.  2008.  Penentuan  flavonoid dari  ekstrak  metanol  daging  buah mahkota dewa ( Phaleria macrocarpa  Scheff  Boerl ). Jurnal
Sains .  Yogyakarta  :  Universitas
Islam Indonesia. Vol. 5 No.1.
South, E., H. Kaempe dan A. Tampi. 2013.
Evaluasi  Kandungan  Total  Polifenol dan Isolasi Senyawa Flavonoid Pada Daun  Gedi  Merah  ( Abelmoscus manihot L.). Chemistry Progress . 6 :
86.
Sunarto,  T.  2016. Laporan  Praktikum Tanaman  Dataran  Rendah .  Fakutas Pertanian UNEJ, Jakarta.
Suryanto,  E.  2012. Fitokimia  Antioksidan . CV. Putra Media Nusantara, Surabaya. Torbeck L.D., editor, 2007. Pharmaceutical And Medical Decice Validation By Eksperimental Design. Informa healthcare . New York. P.4.
WHO. 1992. The International Pharmacopeia. Edisi ke-empat .
Electronic  Version  Geneva:  World Health Organization.
Zuhra  CF,  Tarigan  JB,  Sitohang  H.  2008.
Aktivitas antioksidan senyawa flavonoid dari daun katuk ( Sauropus androgunus (L) Merr). Jurnal
Biologi Sumatera . Vol. 3, No.1. Hal.
7-10.