## PERENDAMAN EKSTRAK Spirulina plantesis TERHADAP Ig-M, JARINGAN LIMPA DAN DIFERENSIAL LEUKOSIT IKAN MAS SETELAH DIINFEKSI Aeromonas hydrophila
Deeping Of Extract Spirulina plantesis To Ig-M, Spleen Tissue And Diferential Leucocyte Of Carp After Infected By Aeromonas hydrophila.
Widya Pratiwi *1 , Lucia Tri Suwanti dan Woro Hastuti Satyantini
Prodi S2 Bioteknologi Perikanan dan Kelautan, Sekolah Pascasarjana, Universitas Airlangga, Surabaya e-mail: w.pratiwi91@yahoo.com * 1 ,

## Abstrak
Penyakit  yang  sering  menyerang  ikan  mas  yaitu  bakteri Aeromonas  hydrophila , bakteri  ini  penyebab  penyakit  bercak  merah  atau Haemerrhagic  Septicaemia pada  ikan  air tawar.  Salah  satu  bahan  alami  yang  dapat  digunakan  untuk  pengendalian  sistem  tubuh terhadap  penyakit  yaitu Spirulina  platensis .    Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menganalisis pengaruh  ekstrak  etanol Spirulina  platensis terhadap  respon  Ig-M,  diferential  leukosit, histopatologi  limpa  yang  diinfeksi  bakteri  Aeromonas  hydrophila.  Penelitian  ini  dilakukan dalam dua tahap uji, yaitu uji in vitro dan uji in vivo. Pada uji in vivo metode yang digunakan adalah  eksperiment  laboratoris  dengan  menggunakan  5  perlakuan  yaitu  kontrol  positif  (ikan diinfeksi  A.  hydrophila),  kontrol  negatif  (ikan  diberi Phospate  Buffer  Saline ),  perendaman ekstrak  dosis  50  ppm,  dosis  100  ppm,  dosis  200  ppm.  Ikan  mas  diinfeksi  terlebih  dahulu dengan  cara  menyuntikkan  0,1  ml  suspense A.  hydrophila sebanyak  10 6 cfu/ml  secara intramuskular.  Setelah  menunjukkan  gejala  klinis  selama  2  hari,  ikan  direndam  dengan ekstrak  etanol S.  platensis selama  30  menit.  Perendaman  dilakukan  dua  kali,  pada  hari  ke 2 dan  ke  5.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ekstrak  S.  platensis  memberikan  pengaruh yang  berbeda  nyata  (p<0.05)  terhadap  kondisi  jaringan  limpa,  diferensial  leukosit  dan konsentrasi  Ig-M.  Ekstrak  S.  platensis  dapat  meningkatkan  sistem  kekebalan  tubuh  denga adanya  peningkatan  konsentrasi  Ig-M  dibentuk  oleh  proliferasi  limfosit  sel  B.  Dosis perendaman yang sudah dapat meningkatkan sistem kekebaln tubuh adalah 100 ppm dengan tingkat kelangsungan hidup tertinggi 88,8%.
Kata kunci : S. platensis , A. hydrophila , histopatologi, Ig-M, diferensial leukosit

## Abstract
Bacterium of disease that often attack of carp is Aeromonas hydrophila , these bacteria causative agent of Haemerrhagic Septicemia in freshwater fish. One of the natural ingredients that  can  be  used  to  control  of  the  body  system  against  disease  is Spirulina  platensis .  This study  have  a  purpose  to  analyze  the  effect  of  ethanol  extract  of Spirulina  platensis on  the
response of Ig-M, diferential leukocytes, spleen histopathology infected bacteria Aeromonas hydrophila . This research have two test steps, are in vitro and in vivo test. In vivo test method used was a laboratory experiment using five treatments, a positive control (fish infected with A. hydrophila), negative control (fish given Phosphate Buffer Saline), immersion extract dose of 50 ppm, a dose of 100 ppm, 200 ppm dose. Carp fish was infected firstly by injection 0.1 ml  suspension  of A.  hydrophila were  10 6 cfu  /ml  in  intramuscularly.  After  have  showed clinical symptoms for 2 days, deeping fish with ethanol extract of S. platensis for 30 minutes. Deeping  performed  twice,  on  day  of  2  and  7.  The  results  showed  that  the  extract  of S. platensis provide  a  significantly  different  effect (P  <0.05)  on  the  condition  of  spleen tissue, leukocyte differential and concentration of Ig-M. S. platensis extracts can boost the immune system  premises  the  increased  concentration  of  Ig-M  formed  by  the  proliferation  of lymphocytes  B.  Dose  immersion  would  enhance  the  body  immunity  system  was  100  ppm with the highest survival rate of 88.8%.
Keywords : S. plantesis , A. hydrophila , histopatology, Ig-M, diferential leucocyte.

## 1. Pendahuluan
Pembudidaya ikan sering menjumpai masalah dalam budidaya, terutama  budidaya  ikan  secara  intensif. Budidaya  intensif  dilakukan  agar  produksi yang  didapat  cepat  dan  banyak,  tetapi kendala  satu-satunya  yang  dijumpai  yaitu penyakit.  Penyakit  yang  menyerang  ikan mas  antara  lain  disebabkan  oleh  virus, bakteri,  jamur,  protozoa,  dan  metazoa. Bakteri merupakan penyebab kedua kematian  pada  ikan  baik  ikan  air  tawar, payau dan laut (Cipriano, 2001).
Motile  Aeromonad  Septicemia (MAS) adalah  penyakit  bakterial  yang  sering menyerang  ikan  air  tawar.  Didalam  tubuh bakteri A.  hydrophila terdapat  Gen  Aero yang bertanggung jawab dalam memproduksi racun aerolysin dan hemolysin dimana Aerolisin merupakan protein extraseluler  yang  diproduksi  oleh  beberapa strain A.  hydrophila .  Racun  tersebut  masuk kedalam  aliran  darah,  menyerang  organ visceral,  pernapasan  dan  menyebabkan infeksi  sekunder  pada  kulit  (Pratheepa  dan Sukarman, 2014). Alternatif dalam melawan  bakteri  biasanya  menggunakan berbagai  macam  zat  kimia  seperti  antibiotik oxytetracyclin dan erythromycin .  Namun penggunaan  zat  kimia  seperti  obat-obatan mempunyai  efek  samping  dan  beberapa kelemahan  yaitu  dalam  jangka  waktu  lama bakteri akan menjadi resisten dan
menimbulkan pencemaran lingkungan. Salah satu  bahan  alternatif  dari  hasil  laut  yang dapat dikembangkan yaitu Spirulina
platensis . Mikroalgae ini
ditemukan
memiliki  senyawa  fenol  dan  flavonoid.
Dimana  hasil  uji  secara  in  vitro  dari golongan flavones dan fenol telah menunjukkan  adanya  respon  imun  (Lantapi dkk., 2011). Beberapa penelitian, menyebutkan  bahwa Spirulina juga  dapat digunakan sebagai zat antioxidan,
imunomodulator    dan  anti-inflamasi      (Wu
Qinghua et  al .,  2016).  Ekstraksi  senyawa aktif  dari  mikroalga S.  plantesis dibantu dengan  menggunakan  pelarut  bertujuan untuk  memperoleh  hasil  yang  optimal  baik jumlah  ekstrak  maupun  senyawa  aktif  yang dikandung  ekstrak.  Pada  umumnya  pelarut yang  sering  digunakan  adalah  etanol  karena etanol  mempunyai  polaritas  yang  tinggi, tidak beracun dan cenderung aman.
Pengobatan terhadap ikan yang terserang A.  hydrophila dapat  dilakukan dengan berbagai cara yaitu, melalui penyuntikan,  perendaman,  pengolesan  dan melalui  pakan.  Pengobatan  dengan  sistem perendaman merupakan cara aplikatif dibanding  dengan  aplikasi  lainnya,  karena dapat  mempermudah  proses  pengobatan terutama  untuk  ikan  yang  berukuran  kecil dalam skala banyak.  Penelitian ini bertujuan untuk    melihat  kondisi  tingkat  kekebalan tubuh  pada  tubuh  dengan  melihat  jaringan organ  limpa,  kadar  Ig-M  dan  diferensial leukosit    pada  ikan  Mas  setelahdiinfeksi A. hydrophila maupun sesudah direndam dengan S. plantesis .
2. Materi dan Metode
Penelitian pemeliharaan ikan dilaksanakan  di  Fakultas  Perikanan  dan Kelautan,  Universitas  Airlangga.  Uji     Ig-M dengan  ELISA  dilakukan  di  Institute Tropical  Desease  Universitas,  Airlangga Surabaya,  Jawa  Timur.  Ektrasi  etanol
Spirulina plantesis
dilakukan di Laboratorium  Kering  Fakultas  Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Surabaya.  Pembuatan  preparat  histopatologi dilakukan di Laboratorium
Histologi Fakultas  Kedokteran  Universitas  Airlangga Surabaya.
Penelitian  ini  terdiri  dari  dua  tahap yaitu  tahapan  uji  pendahuluan  dan  tahapan uji  utama.  Uji  pendahuluan  terdiri  dari ekstraksi S.  plantesis menggunakan  etanol 95%  untuk  mendapatkan  ekstrak,  analisa komposisi  kimia  secara  kualitatif  dan revirulensi A. Hydrophila dan untuk mengaktifkan  kembali  bakteri  tersebut.. Tahapan awal yang dilakukan yaitu menimbang S. platensis bubuk sebanyak 100 gram.  Kemudian  taruh  dalam  wadah beaker glass steril.  Metode  ekstraksi  merupakan modifikasi  penelitian  El-Baz et  al., (2013), dengan  metode  maserasi.  Bubuk  Spirulina dimaserasi  dengan  etanol  95%  dengan volume  (ml)  empat  kali  berat  sampel  (gr). Ekstraksi dilakukan pada suhu ruang selama sehari  kemudian  disaring.  Etanol  kemudian dipisah dengan rotary evaporator pada suhu 50 ᵒ C.  Hasil  ekstrak  berbentuk  pekat  dan padat.
Identifikasi senyawa metabolit dilakukan  dengan  uji  kualitatif,  uji  ini menggunakan  metode  Kromatografi  Lapis Tipis  (KLT).  Penentuan  fenol  dimulai dengan  penimbangan  sampel  bubuk S. platensis sebanyak 10µg dilarutkan dengan 1 ml  etanol  96%,  selanjutnya  ektrak  tersebut ditotolkan pada pelat KLT. Untuk fase gerak menggunakan  kloroform  :  metanol  (9:1). Setelah ditotolkan pelat tersebut dimasukkan pada  bak  yang  berisi  larutan  fase  gerak  dan ditunggu sampai totolan pada pelat bergerak. Diamkan pelat tersebut setelah terjadi reaksi dan  kemudian  disemprotkan  FeCl 3 pada pelat KLT. Setelah itu, tunggu reaksinya dan amati  pada  KLT visualiser .  Lihat  reaksi noda, jika timbul warna hitam menunjukkan adanya fenol dalam ekstrak tersebut (Robinson, 1995). Penentuan flavonoid yaitu menimbang  ekstrak Spirulina sebanyak 10µg  dilarutkan  dengan  1  ml  etanol  96%, selanjutnya  ektrak  tersebut  ditotolkan  pada pelat  KLT.  Fase  gerak  yang  digunakan untuk  uji  flavanoid  juga  menggunakan kloroform : metanol (9:1). Setelah dititolkan pelat  tersebut  dimasukkan  pada  bak  yang berisi  larutan  fase  gerak  dan  ditunggu sampai totolan pada pelat bergerak. Diamkan  pelat  tersebut,  setelah  terjadi reaksi, kemudian disemprotkan H 2 SO 4 10%. Setelah  itu  plat  KLT  dipanaskan  di  TLC plate  heater dengan  suhu  105 o C  dan ditunggu  selama  5  menit.  Flavanoid  akan tampak  berwarna  hijau  kebiruan  dibawah sinar  UV  366  nm  dan  untuk  secara  visual tampak  noda  berwarna  kuning  kecoklatan (Saravanakumar et al., 2009).
Revirulen  bakteri  digunakan  untuk pengaktifan bakteri sebagai patogen, dimana injeksi  bakteri A.  hydrophila 10 6 CFU/ml disuntikkan ke ikan mas dan ditunggu selang dua  hari,  setelah  itu  organ  target  seperti limpa  dan  ginjal  di  screeping.  Hasil screeping  di  kultur  di  media  agar  TSA  dan disimpan  di  ruang  inkubator  selama  24  jam agar  tumbuh.  Dan  diujikan  kembali  dengan uji  biokimia,  setelah  itu  diidentifikasi dengan acuan Faddin (1980).
Ikan yang digunakan untuk penelitian  adalah  benih  ikan  mas  ukuran  7- 8cm  sebanyak  120  ekor.  Setiap  penelitian, akuarium  uji  diisi  dengan  6  ekor  ikan  dan sebelum diberi perlakuan ikan uji diadaptasikan  selama  7  hari.  Ikan  diinfeksi terlebih  dahulu  dengan  dosis  10 6 cfu/ml. Perendaman  ektrak S.  platensis dilakukan setelah  bakteri A.  hydrophila diinfeksikan pada  ikan  Mas.  Perendaman  dilakukan selama  30  menit,  perendaman  ekstrak  juga dilakukan  2x,  yaitu  hari  kedua  setelah diinfeksi dan selanjutnya hari ke lima. Untuk konsentrasi  dosis  perlakuan  perendaman adalah sebagai berikut:
Kontrol negatif : Ikan disuntik dengan PBS  tanpa direndam ekstrak. Kontrol positif : Ikan diinfeksi bakteri A. hydrophila tanpa direndam ekstrak etanol S. Platensis Perlakuan C :Ikan Mas yang diinfeksi A.hydrophila ,
kemudian direndam ekstrak etanol S. platensis dengan dosis 50 ppm. Perlakuan D : Ikan Mas yang diinfeksi A.hydrophila , Kemudian direndam ekstrak etanol S. platensis dengan dosis 100 ppm. Perlakuan E : Ikan Mas yang diinfeksi A. hydrophila , kemudian direndam ekstrak etanol S. platensis dengan dosis 200 ppm.
Parameter  utama  dalam  penelitian ini  yaitu mortalitas ikan mas,  histopatologi organ  limpa,  uji  Ig-M  dengan  ELISA  dan diferensial  leukosit  sebelum  diberi  ekstrak serta  maupun  sesudahnya.  Pengamatan mortalitas  dilakukan  selama  14  hari  dengan parameter  yang  diamati  baik  parameter utama maupun pendukung
2.1 Histopatologi Limpa
Ikan segar ukuran 8 cm dibedah dan diambil  organ  limpa,  kemudian  direndam dalam  larutan Buffered  Neutral  Formalin (BNF)  10%  dengan    perbandingan  1:20 selama  48  jam.  Metode  histopatologi menggunakan  metode  yang  sesuai  dengan metode  Meyers  (2000)  yaitu  dehidrasi, clearing,  infiltrasi  paraffin,  embedding, pembuatan preparat dan pewarnaan.
Setelah pembuatan preparat, dilakukan  pemeriksaan  dan  skoring.  Untuk menilai tingkat kerusakan jaringan ditentukan  dengan  analisis  skoring  sebagai berikut. Tabel  1.  Skoring  jaringan  limpa  (Pantung
et al., 2008) Param eter yang diamat i Skor 0 (Norm al) Skor 1 (ringa n) Skor 2 (seda ng) Skor 3 (berat) Konge sti Tidak ada sama sekali Kuran g dari 30% dari luas bidang panda ng 30%- 70% dari luas bidan g pand ang Lebih dari 70% dari luas bidang pandan g Haem osideri n Tidak ada sama sekali Kuran g dari 30% dari luas bidang panda ng 30%- 70% dari luas bidan g pand ang Lebih dari 70% dari luas bidang pandan g Melan o macro phage center Tidak ada sama sekali Kuran g dari 30% dari luas bidang panda ng 30%- 70% dari luas bidan g pand ang Lebih dari 70% dari luas bidang pandan g 2.2 Uji konsentrasi Ig-M dengan Elisa Uji  Ig-M  mengguna  kit  ELISA  dari Bioassay  Technology  Laboratory.  Sampel uji  yang  digunakan  untuk  uji  Ig-M  diambil dari serum ikan mas. Alur kerja Elisa sesuai dengan  operational  manual  yang  ditetapkan oleh  Bioassay  Technology  Laboratory  yang nantinya setiap lubang diukur absorbansinya (OD)  dengan  ELISA reader .  Setelah diketahui absorbansinya, dilakukan perhitungan  regresi  dan  dihitung  kemudian akan  terkalkulasi  nilai  konsentrasi  setiap perlakuan. 2.3 Uji Diferntial Leukosit Kaca  objek  dibersihkan  dengan alkohol, teteskan darah ikan uji sekitar 1 cm dari ujung sebelah kiri kaca objek, kemudian digeser  kearah  kanan  sehingga  darah
tersebut  akan  menyebar  sepanjang  sisi  kaca pemulas.  Selanjutnya  dikeringkan  dan  siap untuk  diwarnai.  Preparat  apus  tersebut difiksasi  dengan  metanol  selama  3-5  menit dan  dibiarkan  kering.  Preparat  kemudian diwarnai  dengan  larutan  giemza  selama  30 menit.  Selanjutnya  preparat  dicuci  dengan aquades dan dibiarkan mengering di atas rak. Setelah  kering  preparat  diperiksa  di  bawah mikroskop dengan perbesaran 400x dihitung setiap  jenis  leukosit  menggunakan blood counter . Sel yang dihitung paling sedikit 100 sel  dan  dilakukan  perhitungan  persentase jenis leukosit.

## 2.4 Kelulushidupan
Kelulushidupan  dapat  dihitung  dengan rumus (Effendi, 1997):
SR   =   Nt     x 100%
No Keterangan: Nt :  jumlah  total  ikan  yang  hidup pada akhir penelitian (ekor) No :  jumlah  total  ikan  pada  awal penelitian (ekor) Parameter pendukung penelitian
adalah  pengukuran  kualitas  air  berupa  DO terlarut, pH dan suhu. Parameter pendukung dilakukan  untuk  melengkapi  data  dari parameter utama.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Hasil  identifikasi  senyawa  ekstrak  etanol S. platensis dapat ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil identifikasi golongan senyawa metabolit sekunder ekstrak etanol S.
platensis Bahan (Spesie s) Uju fitokimi a Marliana dkk, 2005 Hasil Spirulin a platensi s Fenol Biru tua/ hitam kehijauan (+)  Hijau kehitama n Flavonoi d Fluoresen si kecoklata n intensif (+) Kecoklata
n
Sedangkan  hasil  uji  kromatografi lapis  tipis  pada  gel  silica  ditunjukkan  pada gambar dibawah ini
Gambar 1. Hasil uji pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT), (a) Positif fenol (b) Positif  flavonoid Ikan Mas yang terserang A.hydrophila menunjukkan  gejala  hemoragi pada  kulit,  warna  kulit  menjadi  pucat  serta mengalami  geripis  pada  sisik.  Untuk  organ dalam  seperti  limpa,  organ  tersebut  terlihat berwarna  merah  pucat.  Ikan  nampak mengalami  gejala  klinis  secara  merata sekitar  1  hari.  Setelah  itu  ikan  uji  diberikan perlakuan perendaman dengan menggunakan ekstrak  etanol S.  platensis selama  30  menit. Dibawah  ini  merupakan  Gambar  2.  ikan normal  dan  ikan  yang  setelah  diinfeksi bakteri A.hydrophila.
(a)
(b)
Gambar 2. Ikan Mas. (a) Ikan Mas Normal atau sehat, (b) Ikan Mas yang terinfeksi A. hydrophila (h) Haemoragi.

## 3.1 Kadar IgM
Pada  penelitian  ini,  pengambilan sampel  untuk  uji  IgM  yang  diambil  adalah serum  darah  ikan.  Pengukuran  kadar  IgM dilakukan setelah perendaman kedua ekstrak S.  platensis ,  yaitu  pada  hari  ke-8.  Hasil penelitian  pengukuran  Ig-M  pada  ikan  mas menunjukkan,  bahwa  konsentrasi  Ig-M paling  tinggi  pada  perlakuan  dosis 100  ppm (1463,89 µg/ml), yang berbeda nyata dengan perlakuan dosis 50 ppm (963 µg/ml), kontrol positif  (843,72),  perlakuan  dosis  200  ppm (672,046 µg/ml) dan kontrol negatif
(617,247  µg/ml).  Konsentrasi  IgM  paling rendah  pada  perlakuan  kontrol  negatif (617,247  µg/ml).    Dibawah  ini  adalah gambaran  grafik  konsentrasi  Ig-M  antar perlakuan penelitian.
Gambar  3.  Grafik  konsentrasi  Ig-M  antar perlakuan setelah rendam kedua, pada hari ke-8.
3.2 Histopatologi Limpa
Limpa  merupakan  salah  satu  organ yang  berperan  dalam  sistem  kekebalan tubuh.  Limpa  yang  normal  berwana  merah- ungu karena kandungan darahnya. Gambar 2 menunjuukkan  histopatologi  limpa  kontrol positif dan kontrol negatif.
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
Gambar 4. Histopatologi Limpa Ikan Mas (Pembesaran 400x)
Keterangan : i. Kontrol negatif a. Hemosiderin ii. Kontrol positif b. Kongesti
iii. Dosis 50 ppm
c. Melanomakrofag
iv. Dosis 100 ppm
WP.   White pulp
v. Dosis 200 ppm RP.     Red pulp Hasil  skoring  tingkat  kerusakan jaringan antar perlakuan dijumlah kerusakannya  dan  dirata-rata,  kemudian dilakukan  analisis  dengan  uji  Kruskal
Wallis.  Dibawah ini adalah hasil  skoring  uji Kruskal  Wallis  yang  dilanjutkan  dengan  uji Mann Whitney
. Tabel 3. Rata-rata scoring Histopat Limpa Perlakuan Mean Rank Kontrol - Kontrol + Dosis 50 ppm Dosis 100 ppm Dosis 200 ppm 3.17 (cd) 14.00 (a) 9.50 (b) 8.17 (bc) 4.33 (c)
Hasil Tabel 2 menunjukkan perlakuan K+ berbeda nyata dengan perlakuan  dosis  50  ppm,  dosis  100  ppm, dosis  200  ppm  dan  K-.  Perlakuan  K+ mempunyai  nilai  kerusakan  yang  paling tinggi  dari  perlakuan  lainnya,  sementara perlakuan  dosis  50  ppm  dan  100  ppm menunjukkan  tingkat  kerusakan  yang  tidak berbeda  nyata,  diikuti  dengan  perlakuan dosis  200  ppm.  Perlakuan  kontrol  negatif berbeda juga  dengan  perlakuan  lainnya,  dan perlakuan ini menunjukkan tingkat kerusakan yang paling rendah. 3.3 Diferensial Leukosit Berdasarkan granulasi sitoplasmanya,  leukosit  dibedakan  menjadi granuler  meliputi  basofil,  eosinofil,  dan neutrofil,  serta  agranuler  meliputi  limfosit dan  monosit.  Berikut  ini  adalah  gambaran grafik  hasil  pengamatan  limfosit  setelah perendaman kedua.
Gambar 5. Grafik rata-rata nilai limfosit setelah perendaman kedua
Limfosit  adalah  sel  yang  kompeten secara  imunologik  dan  membantu  fagosit dalam pertahanan tubuh terhadap infeksi dan invasi  asing  lainnya.  Hasil  rata-rata  jumlah limfosit  paling  tinggi  ditunjukkan  pada perlakuan  dosis  100  ppm  (83,33%)  yang berbeda  nyata  dengan  perlakuan  K-,  K+, 50 ppm dan 200 ppm. Jumlah limfosit terendah pada perlakuan K- (75,67%).
Gambar  6.  Grafik  rata-rata  nilai  monosit
setelah perendaman kedua
Monosit  merupakan  salah  satu leukosit yang berinti besar dengan ukuran 2x lebih  besar  dari  eritrosit  dan  diproduksi  di jaringan
limpatik. Pada Gambar 6 menunjukkan  kontrol  positif  (17,33%)  tidak berbeda  nyata  dengan  perlakuan  dosis  50 ppm  (16,67%).  Jumlah  monosit  tertinggi pada  kontrol  positif  yaitu  perlakuan  yang diinfeksi  tanpa  diobati.  Perlakuan  dosis  100 ppm  (11,67%)  berbeda  nyata  dengan perlakuan lainnya, dimana jumlah monositnya sangat rendah dibanding dengan perlakuan lainnya.
Gambar  7.  Grafik  rata-rata  nilai  neutrofil setelah perendaman kedua.
Neutrofil merupakan sel-sel pertama yang  meninggalkan  pembuluh  darah  yang penting  karena  mengandung  vakuola  yang berisi enzim untuk menghancurkan organisme yang dihancurkannya.  Gambar 7.
menunjukkan  jumlah  neutrofil  ikan  Mas dengan  nilai  yang  bervariasi  dan  tiap perlakuan  terlihat  berbeda  nyata.  Nilai
neutrofil  pada  perlakuan  K-  (8,33%)  dan dosis 200 ppm (7,67%) tidak berbeda nyata, dan perlakuan kontrol positif  (6,00%), dosis 50 ppm (6,00%) juga tidak berberbeda nyata antar  perlakuan.  Perlakuan  dosis  100  ppm (5,00%)  juga  mempunyai  nilai  rata-rata neutrofil paling kecil dari perlakuan lainnya.

## 3.4 Kelulushidupan
Kelulushidupan  ikan  dalam  suatu proses  budidaya  merupakan  parameter keberhasilan  dalam  berbudidaya.  Dibawah ini  adalah  gambar  2,  yaitu  grafik  gambar kelulushidupan ikan mas selama penelitian.
Gambar 8. Grafik tabel rata-rata kelulushidupan ikan mas selama penelitian. Pada  Gambar  8,  data  menunjukkan persentase  kelulushidupan  hidup  benih  ikan mas  tertinggi  dicapai  pada  perlakuan  dosis 200  ppm  dan  kontrol  negatif  (100%), perlakuan dosis 100 ppm (88,8%) dan dosis 50  ppm  (83,33%),  tidak  berbeda  nyata dengan perlakuan dosis 200 ppm dan kontrol negatif.  Tetapi  perlakuan  dosis  50  ppm  dan 100  ppm  berbeda  nyata  dengan  perlakuan kontrol positif (72,16%).

## 3.5 Kualitas air
Beberapa  parameter  kualitas  air yang  diukur  dalam  penelitian  ini  adalah suhu, pH dan oksigen  terlarut (DO). Berikut ini  adalah  hasil  range  pengukuran  kualitas air selama penelitian.
Tabel 4. Kualitas air selama penelitian
Data pengukuran kualitas air menunjukkan  nilai  parameter  kualitas  air yaitu: suhu 29°C, pH 7, dan DO 6 mg/L.

## 3.6 Pembahasan
Perlawanan  terhadap  benda  asing, tubuh  memiliki  sistem  pertahanan  yang saling mendukung, baik sistem imun spesifik maupun  non  spesifik.  Apabila  sistem  imun non  spesifik   tidak  mampu  mengeliminasi agen  penyakit,  maka  immunoglobulin  akan membantu  sistem  tubuh  sebagai  pertahanan kedua (Nagael et al., 1994). Pada penelitian ini,  hasil  konsentrasi  IgM  yang  diuji merupakan konsentrasi
IgM secara keseluruhan pada tubuh ikan Mas. Konsentrasi  IgM  pada  penelitian  paling tinggi  pada  perlakuan  dosis  100  ppm (1463,89  µg/ml),  hal  ini  dikarenakan  ektrak tersebut  memacu  peningkatan  proliferasi limfosit.  Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan Jose et  al., (2014) bahwa  kandungan
flavonoid berpotensi meningkatkan proliferasi limfosit, meningkatkan jumlah sel T serta sel B dan meningkatkan aktivitas IL- 2.
Dengan adanya peningkatan
immunoglobulin,  antibodi  IgM  berusaha untuk  melawan  antigen  yang  terdapat  pada tubuh  ikan.  Peningkatan  limfosit  akan mengalami  pembelahan  atau  diferensiasi menjadi  sel  plasma,  dan  sel  plasma  akan memproduksi dan melepaskan ribuan antibodi yang nantinya memasuki peredaran darah  yang  siap  untuk  menempel  pada antigen (Uribe et al., 2011). Perlakuan dosis 50  ppm  (963  µg/ml),  berbeda  nyata  juga dengan perlakuan Kontrol positif. Perlakuan konsentrasi  paling  rendah  pada  kontrol negatif  (617,247  µg/ml).  Pada  perlakuan
kontrol  negatif,  konsentrasi  IgM  pada  ikan Mas  dengan  ukuran  benih  menunjukkan pada  kisaran  normal  yaitu  sekitar  600-800 µg/ml  (Abedi et  al., 2013).  Perlakuan  dosis 200  ppm  (672  µg/ml)  juga  menunjukkan kisaran  IgM  normal,  kemungkinan  karena perendaman ekstrak S. platensis kedua dapat mengembalikan  kekebalan  tubuh  ikan  yang terserang bakteri, sehingga hanya sistem non spesifik  yang  bekerja  dalam  tubuh  apabila masih terdapat antigen.
Analisis  histopatologi  ini  bertujuan untuk  mengetahui  tingkat  kesembuhan dengan  melihat  tingkat  kerusakan  jaringan pada  organ  limpa  setelah  perendaman  yang dibandingkan  dengan  histolopatologi  limpa ikan  sehat  dan  ikan  sakit.  Hasil  skoring pengamatan menunjukkan, tingkat kerusakan  tertinggi  pada  perlakuan  kontrol positif.  Perlakuan  Kontrol  positif  tampak pada pengamatan banyak mengalami kongesti,  pecahnya  protein  sel  darah  merah (hemosiderin) dan mengalami melano makrophag. Pembentukan melano makrophag  karena  racun  toksin  yang dikeluarkan  bakteri Aeromonas  hydrophila mengalir  masuk  ke  dalam  sel  endotel pembuluh  darah  yang  akan  menyebabkan kerusakan  pada  jaringan  endotel  sehingga akan merangsang pembentukan MMC (David and Kartheek, 2015). Perlakuan yang memperlihatkan  jumlah  skoring  paling rendah  ada  pada  perlakuan  kontrol  negatif. Pemberian  dosis  perandaman  200  ppm ekstrak S.  plantesis pada  benih  ikan  mas yang diinfeksi bakteri A.  hydrophila mengalami  penyembuhan  yang  baik  dengan memperlihatkan kondisi histopatologi jaringan  limpa  yang  mempunyai  jumlah MMC  sedikit  dan  kondisi  mendekati  limpa ikan  normal.  Senyawa  fenol  berfungsi sebagai antibakteri dan antioksidan, sehingga  dapat  melindungi  jaringan  tubuh dari  radikal  bebas.  Menurut  Wu  Qinghua et al., (2016)  bahwa S.  platensis mempunyai kandungan  senyawa  fenol  dan  flavanoid, sebagai  immunomodulatot,  antiinflamation dan  antioksidan  sehingga  dapat  menjaga sistem  tubuh  dan  jaringan  tubuh  ikan  dari adanya patogen.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa  nilai  rataan  limfosit  paling  tinggi pada  perlakuan  dosis  100  ppm  (83,33%) berbeda  nyata  dengan  perlakuan  kontrol negatif,  kontrol  positif,  50  ppm  dan  200 Perlakuan Suhu ( o C) pH DO (mg/l) Kontrol (+) 29,6 7,33 6,2 Kontrol (-) 29,8 7,33 6,15 Dosis 50 ppm 29,4 7,27 6,2 Dosis 100 ppm 29,6 7,21 6,16 Dosis 200 ppm 29,7 7,15 6,2 Kisaran 25-30 6,5- 8,5 >5
ppm.  Peningkatan  dosis  ektrak S.  plantesis dalam  perendaman  meningkatkan  poliferasi dari sel-sel limfosit. Karena pada perendaman pertama, ektrak belum melindungi  dan  menstimulasi  sistem  tubuh dengan  baik,  sehingga  pada  perendaman kedua, ekstrak
dapat membantu
meningkatkan sel limfosit dalam memfagosit bakteri.  Hal  ini  juga  sesuai  dengan pengamatan  yang  dilakukan  Rustikawati
(2012),  tentang  titer  antibodi  dan  indeks fagositos,  dimana  ikan  yang  diuji  setelah diberi ektrak
Sargasum sebagai immunomodulator  mempumyai  nilai  indeks fagosit  dan  titer  antibodi  yang  lebih  tinggi dibanding  dengan  ikan  kontrol  yang  tanpa diberi apapun.
Hasil penelitian nilai monosit menunjukkan  perlakuan  kontrol  positif (17,33%)  tidak  berbeda  nyata  dengan perlakuan  dosis  50  ppm  (16,67%).  Jumlah monosit  tertinggi  pada  kontrol  positif  yaitu perlakuan  yang  diinfeksi  tanpa  diobati. Meningkatnya  jumlah  monosit  karena  ikan masih mengalami infeksi bakteri A. hydrophila dengan  tampak  luka  pada  kulit. Perlakuan  dosis  200  ppm  (16,00%)  juga tidak  berbeda  nyata  dengan  kontrol  negatif (16,00%). Perlakuan dosis 100 ppm (11,67%)  berbeda  nyata  dengan  perlakuan lainnya,  dimana  jumlah  monositnya  sangat rendah dibanding dengan perlakuan lainnya, hal ini dikarenakan adanya respon keseimbangan  darah  terhadap  peningkatan proporsi  jenis  sel  leukosit  yang  lainnya (limfosit  dan  neutrofil).  Persentase  monosit hasil pengamatan ini masih berada di dalam kisaran  nilai  normal  pada  semua  perlakuan. Hasil  rata-rata  nilai  absolut  monosit  pada penelitian  ini  menunjukkan  3.700-5.300 sel/mm 3 .
Nilai rata-rata neutrofil paling tinggi tampak  pada  perlakuan  kontrol  negatif (10,66%). Tingginya jumlah neutrofil, kemungkinan  karena  pengambilan  sampel darah  pada  hari  ke-8.  Ikan  kontrol  negatif tidak diinfeksi oleh bakteri, tetapi tubuh ikan mas  membentuk  sistem  pertahanan  tubuh non  spesifik  sehingga  neutrofil  tetap diproduksi  oleh  limfa  untuk  dikirim  ke tempat adanya antigen yang masuk.
Perlakuan dosis 100 ppm (5,00%)
mempunyai  nilai  rata-rata  neutrofil  paling kecil  dari  perlakuan  lainnya.  Kecilnya  nilai
neutrofil diperkiran karena berkurang infeksi akibat  serangan  antigen.  Hal  ini  sesuai dengan  pendapat  Cahyaningsih  dkk.,  (2007) yaitu  setelah  proses  infeksi,  jumlah  sel neutrofil  dapat  ditekan,  sel-sel  mati  dan jaringan  nekrotik  yang  salah  satunya mengandung neutrofil yang telah mati secara bertahap mengalami autolisis dalam beberapa hari.
Persentase  kelulushidupan  ikan  mas tertinggi  diperoleh  pada  perlakuan  Kontrol negatif    dan  dosis  200  ppm  (100%),  diikuti perlakuan  dosis  100  ppm  (88,8%)  dan  50 ppm  (83,33%).  Perlakuan  Kontrol  positif mempunyai  nilai  kelangsungan  hidup  yang rendah dari yang lain, karena pada perlakuan ini ikan diinfeksi bakteri dan tidak direndam dengan  ekstrak  etanol S.  platensis .  Nilai kelangsungan  hidup  ikan  mas  dari  masing- masing perlakuan penelitian setelah perendaman  dianggap  cukup  baik  yaitu berkisar  antara  72-100%.  Hal  ini  sesuai dengan penelitian Retnoningsih., dkk (2009) bahwa tingkat kelangsungan hidup ikan Mas yang diinfeksi A. hydrophila dan diberi obat kanamycin yaitu sekitar 80 %. Perlakuan K- dan  dosis  200  ppm  tidak  mengalami kematian, karena pada dosis 200 ppm, ektrak dapat  membunuh  dan  menjaga  sistem  tubuh benih  ikan  mas  dari  serangan  bakteri. Adanya  kandungan  senyawa  fenol  pada ekstrak S.  platensis ,  juga  dapat  membantu membunuh  bakteri  patogen.  Hal  ini  sesuai dengan pernyataan El Baz et al., 2003 bahwa senyawa  fenol  bekerja  sebagai  antibakteri. Ikan  uji  pada  perlakuan  dosis  150  ppm  dan 50  ppm  menurun  kelulushidupannya  karena kemungkinan perlakuan perendaman kurang membunuh  bakteri A.  hydrophila sehingga belum menyembuhkan luka pada tubuh ikan, sehingga ikan tidak bisa bertahan lama.
Menurut Bachtiar (2002), suhu yang optimal untuk ikan mas yaitu sekitar 25 o -30 o
C.  Suhu  yang  terdapat  pada  media pemeliharaan  berkisar  antara  28 o C  -  30 o C dan  masih  dalam  kisaran  optimal,  sehingga mendukung  kehidupan  ikan  Mas  selama penelitian.  Derajat  keasaman  (pH)  selama penelitian berkisar antara 7-8. Dalam kondisi ini  derajat  keasaman  (pH)  dalam  media pemeliharaan  masih  dibawah  batas  tertinggi yaitu  11  (Zonneveld  dkk.,  1991),  sehingga ikan dalam media pemeliharaan masih dapat
hidup  dengan  normal.  Biasanya  angka  pH dalam  perairan  air  tawar  dapat  dijadikan indikator  dari  adanya  keseimbangan  unsur- unsur  kimia  dan  dapat  mempengaruhi ketersediaan  unsur-unsur  kimia  dan  unsur- unsur  hara  yang  sangat  bermanfaat  bagi kehidupan  organisme  akuatik.  Kandungan oksigen  terlarut  (DO)  selama  penelitian berkisar  antara  6,1-6,2  mg/L.  Menurut Bachtiar  (2002),  kandungan  oksigen  yang baik  untuk  ikan  Mas  yaitu  sekitar  5  –  7 mg/L.

## Kesimpulan
Pemberian ekstrak etanol S.
platensis pada ikan mas memberikan respon imun  non-spesifik  dan  imun  spesifik  yang lebih  baik  dibandingkan  dengan  kontrol. Pemberian  ekstrak  etanol S.  platensis telah meningkatkan  jumlah  Ig-M  ikan  mas  pada perendaman  terakhir  dengan  dosis  terbaik yaitu  100  ppm  dengan  kenaikan  konsentrasi sebesar  1463  (µg/ml),  nilai  prosentase limfosit,  monosit  dan  neutrofil  juga  lebih baik  pada  ikan-ikan  yang  direndam  ekstrak dibandingkan  ikan  kontrol.  dan  keadaan struktur  jaringan  limpa  ikan  mas  terlihat seperti kontrol negatif.. Sedangkan
kelangsungan  hidup  ikan  selama  penelitian menunjukkan  bahwa  peningkatan  dosis ekstrak  etanol S.platensis yang  diberikan, memberikan  proteksi  yang  lebih  baik  pada ikan ditandai dengan peningkatan kelulushidupan ikan mas.
Saran
Kandungan  senyawa  ekstrak  etanol S.platensis dapat dilakukan penelitian lanjutan  untuk  perendaman  pada  bakteri selain A.  hydrophila yang  menyerang  ikan, baik ikan air tawar maupun air laut.

## Daftar Pustaka
Abdel,D.M.M.,  S.M  Farouk  and  F.F. Madkour.2015. Anti-inflammatory and  imunomodulatory  effects  of Spirulina  platensis in  comparison  to Dunaliella  salina  in  acetic  acid- induced  rat  experimental  colitis.
Immunopharmacol Immunotoxicol. 37(2):126–139.
Abedi,  Z.,  M.K.Khalesi  and  S.K,Eskandari. 2013. Biochemical and Hematological Profiles  Of  Common  Carp  ( Cyprinus carpio )  under  Sublethal  Effects  of Trivalent  Chromium.  Departement  of
Fisheries,  Faculty  of  Animal  Science and  Fisheries,  SANRU,  Iran.  Iranian Journal of Toxicology. Vol 7, No 20. Amrullah. 2004. Penggunaan Immunostimulan Spirulina  platensis Untuk Meningkatkan Ketahanan Tubuh  Ikan  Koi  Terhadap  Virus Herpes. Sekolah Pascasarjana IPB.
Azizah,  R.  2013.  Uji  Efektivitas  Ekstrak Daun  Teh  Tua  (Camellia  sinensis) terhadap  Penyakit  Motile  Aeromonas Septicemia  pada  Benih  Ikan  Mas. Thesis.  Universitas  Padjajaran.  Hal 31-32.
Bachtiar,  Y.  2002.  Pembesaran  Ikan  Di Kolam Pekarangan. Jakarta : AgroMedia Pustaka. Hal 23. Cahyaningsih,U.,  Hanik,  M  Dan  Y.E Hedianto.2007.  Diferensial  Leukosit Pada Ayam Setelah Diinfeksi Eimeria Tenella Dan Pemberian Serbuk Kunyit  (Curcuma  Domestica)  Dosis Bertingkat. Seminar Nasional Teknologi  Peternakan  dan  Veteriner. Fakultas  Kedokteran  Hewan  Institut Pertanian Bogor. hal 1-7.
Cipriano,C.R. 2001. Aeromonas Hydrophila and Motile Aeromonad Septicemias Of Fish. United States Departement Of The Interior Fish and Wildlife Service Division of Fishery Research Washington. USA.
David,  M  and  R.M.  Kartheek.  2015. Histopathological alterations in spleen of  freshwater  fish  Cyprinus  carpio exposed  to  sublethal  concebtration  of sodium  cyanide.  Environmental  and Molecular  Toxicology  Laboratory, Department  of  PG  Studies  and Research in Zoology, India. Veterinary Journal. Vol 5 (1) : 1-5.
Effendie,  M.I.  1997.  Biologi  Perikanan.
Yayasan Pustaka Nusatama. Yogyakarta. hal 45. El-Baz,F.K., El-Senousy,W.M.,El- Sayed,A.B  and  Kamel.  2013.  In  vitro antiviral and antimicrobial activitie of Spirulina plantesis extract. Journal Of
Applied  Pharmaceutical  Science.  Vol 3(12),pp 52-56.
Faddin,M.  J.F.1980.  Biochemical  Tests  for Identification  of  Medical  Bacteria. Second  Edition.  Williams  &  Wilkins.
Baltimore/London. Jose,J.,S.  Sudhakaran.,  S.  Kumar  T.M2.,  S. Jayaraman and J. Variyar. 2014. Study of  In  vitro  Immunomodulatory  Effect of Flavonoid Isolated from Phyllanthus  niruri  on  Human  Blood Lymphocytes  and  Evaluation  of  its Antioxidant  Potential.  International Journal of Pharmacognosy and
Phytochemical  Research  Vol;  6(2); 284-289. Hernawati, R.D., Triyanto dan Murwantoko. Studi Pengaruh Karboksimetil Kitosan Terhadap  Sistem  Pertahanan  Tubuh Non Spesifik Pada Ikan Mas (Cyprinus  carpio).  Jurusan  Perikanan.
Universitas  Gajah  Mada.  Jurnal  Sains
Veteriner. ISSN :0126-0421.
Lantapi, N.C., M.A. Manggau dan G. Alam. 2011.    Uji  Efek  Jus  Buah  Mengkudu ( Morinda  Citrifolia Linn.)    Terhadap Aktivitas  Imunoglobulin  M  (IgM) Dan  Imunoglobulin  G  (IgG)  Pada Mencit  ( Mus  Musculus ).  Majalah Farmasi  dan  Farmakologi,  Vol.  15, No. 2. hal. 99 – 104.
Mangunwardoyo,  W.,  R.  Ismayasari  dan  E. Riani.  2010.  Uji  Patogenisitas  dan
Virulensi Aeromonas
hydrophila Stanier  pada  Ikan  Nila (Oreochromis  niloticus Lin.)  melalui Postulat Koch. J. Ris. Akuakultur Vol.
5 Tahun 2010: 245-255.
Marliana,S.D.,Venty,S.  dan  Suyono.  2005. Skrining  Fitokimia  dan  Analisis
Kromatografi  Lapis  Tipis  Komponen Kimia  Buah  Labu  Siam  (Sechium edule  Jacq.  Swartz.)  dalam  Ekstrak Etanol. Jurusan Kimia FMIPA Universitas  Sebelas  Maret  (UNS) Surakarta. Biofarmasi,Vol 26-31. Meyers,T.R.Ph.D.  2000.  Fish  Pathology Section  Laboratory  Manual.  Alaska Departement  Of  Fish  and  Game Commercial Fisheries Division. Juneau. Alaska. Pp 159-164. Muralidharan,  L.  2014.  Haematological Alterations  In  Fresh  Water  Fish Cyprinus  Carpio  (Linn)  Exposed  To Organophosphorous Pesticide Fenthion. P.G. Department of zoology, University of Mumbai., V.K. Krishna  Menon  college  of  commerce and  Sharad  Dighe  college  of  science,
Bhandup, India. ISSN: 2348 – 604.
Nagael,M.,  H.  Fuda.,  K.  Ura  .,  H. Kawamura., S. Adachi.,  A. Hara and K.  Yamauchil.  1994.  The  effect  of cortisol  administration  on  blood plasma  immunoglobulin  M  (IgM) concentrations in masu salmon (Oncorhynchus masou). Fish Physiology  and  Biochemistry  vol.  13 no. 1 pp 41-48.
Pantung.,  N.,  K.G.  Helander.,  H.  F.
Herlander.  and  V.  Cheevaporn.  2008. Histopathological Alterations of Hybrid  Walking  Catfish  ( Clarias macrocephalus x Clarias  gariepinus ) in  Acute  and  Sub  acute  Cadmium Exposure.  Environment  Asia  1  :  page 22-27.
Pratheepa  and  Sukumaran.  2014.  Effect  of Euphorbia  hirta plant  leaf  extract  on immunostimulant response of Aeromonas hydrophila infected Cyprinus  carpio .  Peer  J  Journal.  Vol
2.pp 671-688.
Retnoningsih,S., Kamiso,H.N., K.Lanadimulya., Suprayogi., Supardi.,D. Darmantani.,I .P.Panca.,Hasnah dan Milis. Efektivitas Kanamycin Terhadap Furunculosis  Pada  Karper,  Cyprinus carpio.  Jurnal  Perikanan.  192-200 ISSN: 0853-6384.
Robinson,  T.  1995. Kandungan  Organik
Tumbuhan  Tinggi ,  edisi  keenam, Departement of Biochemistry University of Massachussetts, diterjemahkan oleh Kosasih, P.Penerbit  ITB.  Bandung.  Hal  :  157- 198.
Rustikawati,I.  2012.  Efektivitas  Ekstrak
Sargassum  sp.  Terhadap  Diferential Leukosit  Ikan  Nila  (Orechromis niloticus) Yang Diinfeksi Streptococcus iniae. Universitas Padjajaran. Jurnal Akuatika, Vol 3.No
2.hal 125-134.
Saravanakumar,  A.,  Venkateshwaran,  K., Vanitha,  J.,  Ganesh,  M.,  Vasudevan, M., and Sivakumar, T., 2009.
Evaluation  of  Antibacterial  Activity, Phenol  and  Flavonoid  Contents  of Thespesia  populnea  Flower  Extracts. Pak.  J.  Pharm.  Sci.,  Vol.  22(3):  282- 286.
Wu Qianghua, Lian,L.,Anca,M., Blanka,K.,· Dan,W  and  K,  Kuc.  2016.  The antioxidant,  immunomodulatory,  and anti ‑ inflammatory activities of Spirulina:  an  overview. University  of Hradec Králové. Springer. Pp 1-27.
Uribe,C.  H.  Folch.,  R.  Enriquez  and  G. Moran.  2011.  Innate  and  adaptive immunity  in  teleost  fish:  a  review. Veterinarni  Medicina  Journal.Vol  56. pp 486–503.
Zonneveld,  N.E.A.  Huisman  dan  J.H.  Bon. 1991. Prinsip-Prinsip  Budidaya  Ikan. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama.