## ISOLASI DAN KARAKTERISASI PROTEASE DARI BAKTERI TANAH RAWA INDRALAYA, SUMATERA SELATAN

## [Isolation and Characterization of Proteases from Indralaya Soil Swamp Bacteria,South Sumatera]

## Ace Baehaki*, Rinto, dan Arief Budiman
Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya
Diterima 25 November 2009 / Disetujui 12 Agustus 2011

## ABSTRACT
In an effort of obtaining indigenous protease producing bacteria, screening for bacterial protease was conducted from samples collected from Indralaya soil swamp, South Sumatera. Three of 31 colonies showed high protease activity with proteolytic index >1.00. T1S1 produced enzyme with the highest activity. The crude enzyme activity after 48 hours of incubation was 0.391 IU/ml. The optimum pH of the extracelull proteases from T1S1, T3S2 and T3S3 were 8.0, 8.0, and 7.5, respectively. The optimum temperature of T1S1, T3S2 and T3S3 proteases were 40, 50, and 50 0 C, respectively. All metal ions tested (Na + , K + , Mn 2+ , Zn 2+ and Fe 2+ ) inhibited proteases except Fe 2+ which activatesthe T3S3 protease at 5 mM. EDTA (1  and  5  mM)  inhibited  all  proteases.  Study  on  the  effect  of  metals  ion  and  spesific  inhibitors  indicated  that  all  protease  are  metaloprotease. Molecular  weights  was  determined  using  SDS-PAGE  and  zymogram  technique.  The  molecular  weight  of  T1S1  proteases  was  121  kD,T3S2 proteaseswere 51, 71, and 119 kD whereas T3S3 proteaseswere 49, 70, and 116 kD.
Key words : Protease, isolation, characterization, bacteria

## 1 PENDAHULUAN
Protease  merupakan  satu  diantara  tiga  kelompok  enzim komersial  yang  diperdagangkan  dengan  nilai  mencapai  60% total  penjualan  enzim  yang  aplikasinya  sebagai  katalisator hayati,  digunakan  didalam  industri  pangan,  detergen  dan  kulit (Suhartono,  2000).  Protease  memegang  peran  utama  didalam banyak  fungsi  hayati,  mulai  dari  tingkat  sel,  organ  sampai organisme,  yaitu  dalam  melangsungkan  reaksi  metabolisme, fungsi  regulasi  dan  reaksi-reaksi  yang  menghasilkan  sistem berantai ( cascade ) untuk menjaga normal homeostatis maupun kondisi  patofisiologis  abnormal  serta  proses  kematian  sel terencana (Rao at al , 1998).
Dalam  dasa  warsa  terakhir  ini  terjadi  peningkatan  lebih pesat  dalam  pemakaian  enzim  karena  sifatnya  yang  efisien, selektif, mengkatalisis reaksi tanpa produk samping dan ramah lingkungan.  Salah  satu  sumber  protease  adalah  mikroba. Protease mikroba dapat diklasifikasikan sebagai protease serin (E.C.  3.4.21),  protease  sulfhydril  (E.C.3.4.22),  protease  asam (E.C.3.4.23)  dan  metaloprotease  (E.C.3.4.24).  Beberapa mikroorganisme  yang  telah  diketahui  sebagai  penghasil protease untuk aplikasi komersial adalah Bacillus, Lactobacillus, Pyrococcus,  Termonospora  Rhizopus,  Mucor,  Endothia  and Aspergillus (Rao et  al .,  1998;  Ward et  al., 2009).  Begitu pentingnya enzim ini sehingga perlu mencari enzim dari mikroba dengan habitat yang berbeda sehingga diharapkan enzim yang dihasilkan  memiliki  karakter  yang  unik  untuk  memenuhi kebutuhan  industri  baik  industri  produk  pertanian,  kimia  dan medis. Salah satu sumber enzim ini adalah mikroba dari rawa Indralaya,  Sumatera  Selatan  dimana  daerah  ini  memiliki  rawa
* Korespondensi Penulis : Email : ace76_none@yahoo.com
yang  luas  yang  memungkinkan  terdapatnya  beranekaragam mikroba yang berpotensi menghasilkan enzim.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan utama adalah tiga isolat bakteri yang memiliki indeks proteolitik  yang  tinggi  dari  hasil  pemilhan  dari  tanah  rawa Indralaya,  Sumatera  Selatan.  Bahan  kimia  penting  yang digunakan adalah kasein hammersten (merck), standar L-tirosin (merck), pereaksi elektroforesis SDS-PAGE dan zimogram.Alat utama yang digunakan adalah sentrifugasi dingin model MRX- 152,  spektrofotometer  Phramacia  LKB-Novaspec  II  dan inkubator model Certomat WR.

## Isolasi mikroba rawa
Isolasi mikroba dilakukan dengan mengambil sampel tanah rawa  dari  daerah  Indralaya  Sumatera  Selatan  secara  aseptik. Sampel  sebanyak  0,1  ml  ditumbuhkan  dalam  cawan  petri dengan  media Luria  Bertani  Agar (LBA)  yang  sebelumnya dilakukan pengenceran dari 10 -1 sampai 10 -5 untuk mendapatkan biakan bakteri murni, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 0 C.

## Uji proteolitik
Uji  proteolitik  dilakukan  dengan  menggunakan  media skim milk agar (SMA) yaitu media LBA yang ditambah dengan susu skim  2%.  Isolat  ditusukkan  dalam  media  SMA,  lalu  diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Aktivitas proteolitik dari bakteri rawa  yang  ditumbuhkan  pada  media  SMA  ditunjukan  dengan terlihatnya  areal  bening  yang  muncul  di  sekitar  koloni  yang terbentuk.  Indeks  proteolitik  dihitung  dengan  cara  mengukur diameter areal bening dan diameter koloni bakteri. Perhitungan
indeks  proteolitik  adalah  perbandingan  diameter  areal  bening dengan diameter koloni bakteri.

## Penentuan waktu optimum produksi protease
Bakteri  diinokulasi  sebanyak  1-2  ose  pada  media Luria Bertani Broth (LB) dengan komposisi tripton 1%, NaCl 1% dan yeast  extract 0,5%.  Proses  diawali  dengan  penentuan  umur prekultur  produksi  protease  (dalam  media  LB).  Produksi protease  dilakukan  pada  suhu  37 0 C.  Pengamatan  dilakukan dengan  mengukur optical  density (OD)  sampai  nilai  OD  =  0,8 pada λ = 620 nm. Media LB yang sudah mempunyai OD = 0,8 diambil  10%  dari  jumlah  media  kemudian  ditambahkan  pada media  LB  yang  baru  sebagai  media  untuk  memproduksi protease.  Pengambilan  sampel  dilakukan  setiap  8  jam  selama 64  jam  dan  diukur  nilai  OD,  aktivitas  protease  dan  kadar protein.Ekstraksi  enzim  proteasedilakukan  dengan  cara sentrifugasimedia pertumbuhan bakteri dengan kecepatan 3000 rpm  selama  15  menit  pada  suhu  4 0 C.  Dengan  teknik  ini,  sel akan mengendap oleh adanya gaya gravitasi sedangkan enzim tetap  terdapat  pada  supernatan.  Supernatan  sebagai  sampel diuji aktivitas protease dan kadar proteinnya.

## Pengukuran aktivitas protease
Aktivitas  protease  diukur  dengan  metode  Bergmeyer et al. (1983)  dengan  menggunakan  substrat  kasein  Hammerstein 2%  (b/v).  Prosedur  pengujian  aktivitas  protease  adalah: mereaksikan  0,2  ml  enzim  dengan  1  ml  substrat  kasein Hammerstein dan 1 ml bufer. Campuran reaksi diinkubasi pada suhu  37 0 C  selama  10  menit,  kemudian  ditambahkan  0,2  M TCA.  Selanjutnya  larutan  diinkubasi  kembali  pada  suhu  37 0 Cselama  10  menit,  dilanjutkan  dengan  sentrifugasi  pada kecepatan 5000 rpm 10 menit. Dari campuran hasil sentrifugasi diambil  supernatan  dan  ditambahkan  ke  dalam  tabung  reaksi yang berisi Na 2 CO 3 0,4 M kemudian ditambahkan pereaksi folin Ciocalteau  (1:2)  dan  diinkubasi  pada  suhu  37 0 C  selama  20 menit.  Hasil  inkubasi  diukur  dengan  spektrofotometer  pada λ=578  nm.  Satu  unit  aktivitas  protease  didefinisikan  sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu μmol produk tirosin per menit pada kondisi optimum pengukuran.

## Pengukuran kadar protein
Kadar  protein  ditentukan  dengan  metode  Bradford  (1976) menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V sebagai standar  protein.Sebanyak  100  mg  BSA  ditimbang  dan ditambahkan 25 ml aquades. Larutan kemudian dikocok pelan- pelan, setelah larut, diencerkan sampai 50 ml. Konsentrasi akhir larutan  stok  untuk  standar  ini  adalah  2  mg/ml.  Kemudian sederetan larutan standar dibuat dengan menggunakan larutan stok  di  atas.  Langkah  selanjutnya  adalah  memipet  masing- masing larutan sampel dalam tiap tabung sebanyak 0,1 ml dan sebanyak  5  ml  pereaksi  Bradford  ditambahkan  ke  dalam masing-masing  tabung  reaksi.  Blanko  dibuat  dengan  cara mencampurkan  0,1  ml  dan  direaksikan  dengan  5  ml  pereaksi Bradford.  Setelah  sekitar  5  menit,  masing-masing  campuran reaksi diukur absorbansinya pada λ= 595 nm.

## Karakterisasi protease
Uji karakterisasi protease yang meliputi pengaruh pH(6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9), pengaruh suhu (30; 40; 50; 60; 70 0 C), ion logam (NaCl;  KCl;  MnCl 2 ;  ZnCl 2 dan  FeCl 2 )  dan  inhibitor  spesifik
(EDTA)dilakukan menggunakan buffer Tris-HCl. Konsentrasi ion logam  dan  inhibitor  spesifik  yang  digunakan  masing-masing adalah 1dan 5 mM.

## Penentuan berat molekul
Penentuan  berat  molekul  dilakukan  menggunakan  SDS PAGE (Laemmli 1970) dan zimogram (Choi et al ., 2001). Pada metode  SDS  PAGE,  pewarnaan  dilakukan  dengan silver staining yaitu  :  gel  direndam  dalam  larutan  fikasasi  (25% metanol  dan  12%  asam  asetat)  selama  1  jam  kemudian direndam dalam 50% etanol selama 20 menit, kemudian diganti dengan  30%  etanol  selama  2  x  20  menit,  larutannya  diganti dengan enhancer kemudian  dicuci  dengan  akuadestilata, setelah dicuci ditambahkan larutan silver nitrat selama 30 menit kemudian  dicuci  lagi  dengan  akuadestilata  2  x  20  detik  dan ditambahkan  larutan  campuran  Na 2 CO 3 dan  formaldehida  dan terakhir  dengan  larutan  fiksasi.  Prosedur  zimogram  adalah:gel akrilamid  8%  dikopolimerisasi  dengan  substrat  kasein  2%, selanjutnya  gel  dilakukan  elektroforesis,  gel  direndam  dengan Triton X-100 2,5% selama 1 jam dan dilakukan inkubasi dalam buffer Tris-Cl 10 mM, pH 8 selama 24 jam. Setelah diinkubasi gel diwarnai dengan pewarna comassie brilliant blue R-250.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Sifat proteolitik isolasi bakteri penghasil protease
Pada  proses  isolasi  didapatkan  31  isolat,  yang  kemudian diuji indeks proteolitiknya.  Aktivitas proteolitik dari bakteri rawa yang  ditumbuhkan  pada  media  SMA  terlihat  dari  adanyaareal bening di sekitar koloni yang terbentuk. Indeks proteolitik bakteri dari tanah (lumpur) rawa Indralaya yang mempunyai nilai lebih besar dari 1 dipilih untuk dianalisis aktivitas proteasenya(Tabel 1).

## Tabel 1. Hasil uji proteolitik bakteri dari tanah rawa
Isolat Indeks proteolitik T1S1 1,1 T3S3 1,5 T3S2 2,0

## Waktu optimum produksi protease
Hasil  waktu  optimum  produksi  protease  dari  isolat  bakteri tanah rawa ini dapat dilihat pada Gambar 1.
Produksi  protease  dari  bakteri  air  rawa  memiliki  waktu produksi  optimum  untuk  isolat  T1S1  dan  T3S2  adalah  48  jam dan untuk isolat T3S3 adalah 56 jam pada suhu 37 0 C. Protease isolat  T1S1  memiliki  aktivitas  tertinggi  (0,391  U/ml)  setelah diinkubasi selama 48 jam dalam media LB, protease diproduksi seiring  dengan  pertumbuhan  sel  dan  mencapai  aktivitas tertinggi pada fase stasioner.
Gambar  1  menunjukkan  bahwa  protease  isolat  T3S2 memiliki  aktivitas  tertinggi  (0,385  U/ml)  setelah  diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0 C, protease diproduksi pada fase menjelang  penurunan  sel  bakteri.  Untuk  protease  isolat  T3S3 memiliki  waktu  produksi  optimum  selama  56  jam  pada  37 0 C dengan aktivitas tertinggi 0,320 U/ml.
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 6.5 7 7. 8 8.5 9 pH Ak tiv ita s P ro te as e ( U /m ) T1S1 T3S2 T3S3
Gambar 1.  Waktu produksi optimum protease dari isolat bakteri tanah rawa (A= isolat T1S1, B=T3S2 dan C=T3S3)
Penelitian  lain  pada  produksi  protease  bakteri  didapatkan bakteri  dengan  waktu  produksi  protease  optimum  yang  sama dengan protease isolat T1S1 dan T3S2 (48 jam) adalah Bacillus subtilis PE-11  (Adinarayana et  al. ,  2003)  dan Bacillus licheniformis Lbbl-11 (Olajuyigbe, Ajele, 2008).

## Karakter ekstrak kasar protease

## Pengaruh pH
Profil  aktivitas  pH  dari  suatu  enzim  menggambarkan  pH pada  saat  gugus  pemberi  atau  penerima  proton  yang  penting pada  sisi  katalitik  enzim  berada  dalam  tingkat  ionisasi  yang diinginkan.  Gambar  2  memperlihatkan  pH  optimum  aktivitas protease isolat bakteri tanah rawa.
Gambar 2.  Pengaruh  pH  pada  aktivitas  protease  dari  isolat  bakteri tanah rawa
Proteasedari isolat T1S1 dan T2S3 memiliki pH optimum 8 sedangkan isolat T3S3 memiliki pH optimum 7,5. Vazquez et al. (2008)  melaporkan  protease Psudoalteromonas sp  strain  P96- 47  yang  berasal  dari  laut  Antartik  memiliki  pH  optimum  7  -  9. Protease dari bakteri laut Alteromonas sp strain O-7 memiliki pH optimum  10  (Miyamoto et  al .,  2002).  Protease  bakteri Pseudomonas aeruginosa memiliki pH yang sama dengan isolat T1S1  dan  T3S2  yaitu  pada  pH  8  (Baehaki et  al .,  2008). Diperkirakan  perubahan  keaktivan  enzim  diakibatkan  oleh ionisasi pada gugus ionik enzim, pada sisi aktifnya atau sisi lain yang secara tidak langsung mempengaruhi sisi aktif.
Gugus  ionik  berperan  dalam  menjaga  konformasi  sisi  aktif dalam mengikat substrat dan dalam mengubah substrat menjadi produk.Ionisasi juga dapat dialami oleh substrat atau kompleks enzim-substrat, yang juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim (Muchtadi et  al. ,  1996).  Perubahan  pH  yang  ekstrim,  enzim dapat  mengalami  denaturasi  akibat  gangguan  terhadap  ber- bagai interaksi non kovalen yang menjaga kestabilan struktur 3 dimensi enzim (Hames, Hooper, 2000).

## Pengaruh suhu
Pada  umumnya  setiap  enzim  memiliki  aktivitas  maksimum pada  suhu  tertentu,  aktivitas  enzim  akan  semakin  meningkat dengan  bertambahnya  suhu  sampai  suhu  optimum  tercapai. Setelah  itu  kenaikan  lebih  lanjut  akan  menyebabkan  aktivitas enzim menurun. Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease dari isolat bakteri tanah rawa terdapat pada Gambar 3.
Gambar 3.  Pengaruh suhu pada aktivitas protease dari isolat bakteri tanah rawa
Suhu optimum protease isolat T1S1dan T3S3 adalah 50 0 C, sedangkan  isolat  T2S3  memiliki  suhu  optimum  40 0 C.Hasil tersebut menunjukkan bahwa protease yang berasal dari isolat T1S1  dan  T3S3  bersifat  tahan  panas  sehingga  dapat
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0 8 16 24 32 40 48 56 64 O ptic al de ns ity Ak tiv ita s Pr ot ea se (U /m l) Jam ke Aktivitas Protease (U/ml) Optical density 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0 8 16 24 32 40 48 56 64 O pt ic al D en sit y Ak tiv ita s Pr ot ea se (U /m l) Jam ke Aktivitas Protease (U/ml) Optical Density 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0 8 16 24 32 40 48 56 64 O pt ic al D en sit y Ak tiv ita s Pr ot ea se (U /m l) Jam Ke Aktivitas Protease (U/ml) Optical Density Gambar A Gambar B Gambar C 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 30 40 50 60 70 Suhu( 0 C) Ak tiv ita s Pr ot ea se (U /m l) T1S1 T3S2 T3S3
diaplikasikan  pada  proses  produksi  yang  menggunakan  suhu 50 0 C. Penelitian protease bakteri lain menujukkan bakteri yang berasal  dari  perairan  memiliki  suhu  optimum  yang  tinggi,  yaitu protease  bakteri  laut Alteromonas sp  strain  O7  memiliki  suhu optimum  60 0 C  (Miyamoto et  al., 2002),  protease Chromohalobacter memiliki suhu optimum 75 0 C (Vidyasagar et al .,  2009),  dan  protease Pseudoalteromonas sp  strain  P96-47 dari laut Artartik yang memiliki suhu optimum 45 0 C (Vazquez et al., 2008).
Gambar  3  menunjukkan  aktivitas  protease  semakin meningkat  dengan  bertambahnya  suhu  sampai  suhu  optimum tercapai,  setelah  itu  kenaikan  lebih  lanjut  akan  menyebabkan aktivitas protease menurun. Pada suhu yang lebih rendah dari suhu optimum, aktivitas enzim juga rendah, hal ini disebabkan rendahnya energi aktivasi yang tersedia.
Energi  tersebut  dibutuhkan  untuk  menciptakan  kondisi tingkat  kompleks  aktif,  baik  dari  molekul  enzim  maupun  dari molekul substrat.Peningkatan suhu juga berpengaruh terhadap perubahan  konformasi  substrat  sehingga  sisi  aktif  substrat mengalami  hambatan  untuk  memasuki  sisi  aktif  enzim  dan menyebabkan turunnya aktivitas enzim.
Kedua, peningkatan energi termal molekul yang membentuk struktur  protein  enzim  itu  sendiri  menyebabkan  rusaknya interaksi-interaksi non kovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der walls,  ikatan  hidrofobik  dan  interaksi  elektrostatik)  yang menjaga  struktur  3D  enzim  secara  bersama-sama  sehingga enzim mengalami denaturasi.
Denaturasi  menyebabkan  struktur  lipatan  enzim  membuka pada  bagian  permukaannya  sehingga  sisi  aktif  enzim  berubah dan mengakibatkan terjadi penurunan aktivitas enzim (Hames, Hooper, 2000).

## Pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik
Beberapa enzim membutuhkan ion logam sebagai kofaktor untuk  mendukung  efisiensi  katalitik  enzim.  Logam  tersebut membantu reaksi katalitik dengan cara mengikat substrat pada sisi pemotongan.
Selain  berperan  dalam  pengikatan  enzim  dengan  substrat, beberapa  logam  juga  dapat  mengikat  enzim  secara  langsung untuk  menstabilkan  konformasi  aktifnya  atau  menginduksi formasi situs pengikatan atau situs aktif suatu enzim. Gambar 4 memperlihatkan  pengaruh  ion  logam  terhadap  aktivitas protease isolat bakteri tanah rawa.
Semua  ion  logam  yang  yang  ditambahkan  berfungsi inhibitor  kecuali  Fe 2+ (5  mM)  sebagai  aktivator  terhadap protease  T3S3  (Gambar  4C).  Sebagian  besar  ion  logam  yang ditambahkan  dapat  menghambat  aktivitas  protease.  Adanya penghambatan  ion  logam  terhadap  aktivitas  protease  pada konsentrasi  tertentu  berkaitan  dengan  kekuatan  ion,  dimana kekuatan ion itu sendiri mempengaruhi konformasi atau struktur tiga dimensi dari protein enzim atau protein substrat (Suhartono 1989).  Dari  pengaruh  ion  logam  terhadap  aktivitas  protease hanya  ion  logam  Fe 2+ (5  mM)  sebagai  aktivator  terhadap protease T3S3.
Gambar 4.  Pengaruh  ion  logam  pada  protease  dari  isolat  bakteri tanah rawa (A= isolat T1S1, B=T3S2 dan C=T3S3)
Adanya  peningkatan  keaktivan  karena  penambahan  logam tertentu  menunjukkkan  bahwa  ion  logam  diperlukan  sebagai komponen dalam sisi aktif enzim. Mekanisme ion logam dapat memperbesar  aktivitas  enzim  yaitu  a)  menjadi  bagian  integral dari sisi aktif, b) merubah konstanta kesetimbangan dari reaksi enzimatis, c) merubah muatan listrik, d) mengusir ion inhibitor, e)  menukar  ion  yang  kurang  efektif  pada  sisi  aktif  enzim  atau substrat.  Pada  konsentrasi  tertentu  ion  logam  tertentu  dapat bertindak sebagai inhibitor, tetapi dapat juga bertindak sebagai aktivator pada konsentrasi lain (Richardson, Hyslop, 1985).
Berdasarkan  mekanisme  reaksi  yang  dikatalisis, endopeptidase  dapat  dikelompokkan  menjadi  empat  yaitu: protease serin, protease aspartat, protease sistein dan protease logam.  Dalam  penelitian  ini  penggolongan  protease  hasil produksi dilakukan dengan cara mereaksikan dengan senyawa- senyawa  inhibitor  spesifik.  Adapun  pengaruh  inhibitor  spesifik EDTA  pada  protease  isolat  bakteri  tanah  rawa  terdapat  pada Tabel 2.
0 20 40 60 80 100 120 Kontrol FeCl2 KCl MnCl2 ZnCl2 Ak tifi ta s Pr ot ea se Re la tif (% ) Ion Logam Gambar A 1 mM 5 mM 0 20 40 60 80 100 120 Kontrol FeCl2 KCl MnCl2 ZnCl2 Ak tif ita s Pr ot ea se R ela tif (% ) Ion Logam Gambar B 1 mM 5 mM 0 20 40 60 80 100 120 140 Kontrol FeCl2 KCl MnCl2 ZnCl2 Ak tiv ita s Pr ot ea se R ela tif (% ) Ion Logam Gambar C 1 mM 5 nM
Tabel 2. Pengaruh inhibitor spesifik pada protease isolat bakteri tanah rawa Jenis bakteri Aktivitas residu (%) EDTA (mM) 1 5 Kontrol 100 100 Isolat T1S1 16,4 10,2 Isolat T3S2 19,8 0 Isolat T3S3 22,9 0
Tabel  2  menunjukkan  EDTA  (1  dan  5  mM)  dapat menghambat  protease  dari  isolat  bakteri  tanah  rawa  hal  ini dimungkinkan  karena  EDTA  mengkelat  logam-logam  yang berperan penting menjaga stabilitas serta logam yang berperan sebagai kofaktor enzim protease. Hal ini juga diperkuat dengan pemberian ion logam yang menunjukkan dengan pemberian ion logam dapat mempengaruhi aktivitas protease. Karena protease dari  bakteri  tanah  rawa  ini  dipengaruhi  oleh  ion  logam  dan dihambat  oleh  EDTA,  protease  ini  digolongkan  sebagai metaloprotease.Protease  bakteri  lain  dari  perairan  yang termasuk  metalloprotease  adalah Aeromonas  hydrophilla (Baehaki et al ., 2004) dan Alteromonas sp O-7 (Miyamoto et al., 2002).

## Berat molekul dengan SDS PAGE dan Zimogram
Penentuan  berat  molekul  dilakukan  dengan  teknik  SDS- PAGE  ( Sodium  dodesil  sulfat-Poliakrilamide  gel  elektroforesis ) dan  Zimogram  merupakan  metode  yang  sudah  digunakan secara  luas.  Hasil  SDS-PAGE  dan  Zimogram  protease  isolat bakteri tanah rawa dapat dilihat pada Gambar 5.
M T1S1 T2S3 T3S3

## Gambar A

## M T1S1 T2S3 T3S3

## Gambar B
Gambar 5.  Hasil  SDSPAGE  dan  Zimogram  protease  isolat  bakteri tanah rawa (M=marker, A=SDS-PAGE, B=Zimogram)
Analisis  SDS-PAGE  pada  protease  ekstrak  kasar didapatkan  protease  isolat  T1S1  memiliki  7  pita  dengan  berat molekul  19-127  kD,  isolat  T3S2  memiliki  9  pita  dengan  berat molekul antara 18 kD sampai dengan 119 kD dan isolat T3S3 memiliki 8 pita dengan berat molekul 18 kD sampai dengan 119 kD. Analisis zimogram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat T1S1 memiliki 1 pita dengan berat molekul 121 kD,  isolat  T3S2  memiliki  3  pita  dengan  berat  molekul  masing- masing 51, 71 dan 119 kD dan isolat T3S3 juga memiliki 3 pita dengan  berat  molekul  masing-masing  49,  70  dan  116  kD. Bakteri  TPS-2  yang  diisolasi  dari  kawah  Tangkupan  Perahu memiliki  2  pita  dengan  berat  molekul  80  kD  dan  45  kD (Wahyuntari et  al., 2000).  Berat  molekul  dari  metaloprotease dari bakteri Alteromonas sp strain O-7 adalah 56 kD (Miyamoto et al., 2002) dan metaloprotease dari Heliobacter pyori memiliki berat  molekul  yang  tinggi  yaitu  200  kD  (Windle  dan  Kelleher, 1997).

## KESIMPULAN
Protease  isolat  T1S1  dan  T3S2  memiliki  waktu  produksi optimum  protease  adalah  48  jam,  sedangkan  waktu  produksi optimum  protease  isolat  T3S3  adalah  56  jam.  pH  optimum protease  isolatT1S1  dan  T3S2  adalah  8,  sedangkan  T3S3 adalah  7,5.  Suhu  optimum  protease  T1S1  adalah  40 0 C sedangkan  isolatT3S2  dan  T3S3  adalah  50 0 C.  Pengaruh  ion logam  terhadap  aktivitas  protase  menunjukkkan  semua  ion logam  yang  yang  ditambahkan  berfungsi  inhibitor  kecuali  Fe 2+ (5 mM) terhadap protease isolat T3S3. Karena dipengaruhi ion logam maka protease digolongkan metaloprotease. EDTA dapat menghambat  protease  isolat  bakteri  tanah  rawa  ini  sehingga memperkuat  hasil  pengaruh  ion  logam  bahwa  protease  isolat bakteri  tanah  rawa  termasuk  metaloprotease.  Analisis  SDS- PAGE pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat T1S1  memiliki  7  pita  dengan  berat  molekul  19-127  kD,  isolat T3S2 memiliki 9 pita dengan berat molekul antara 18 - 119 kD dan isolat T3S3 memiliki 8 pita dengan berat molekul 18 - 119 kD. Analisis Zimogram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat T1S1 memiliki 1 pita dengan berat molekul 121 kD, isolat T3S2 memiliki 3 pita dengan berat molekul 51, 71 dan 119  kD  dan  isolat  T3S3  juga  memiliki  3  pita  dengan  berat molekul 49, 70 dan 116 kD.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Peneliti  berterima  kasih  kepada  Direktorat  Jenderal Pendidikan  Tinggi  Depdiknas  yang  telah  membiayai  penelitian ini melalui program Hibah Bersaing XVI tahun 2008.

## DAFTAR PUSTAKA
Adinarayana  K,  Sllaiah  P,  Prasad  DS.  2003.Production  and partial  characterization  of  thermostable  serine  alkaline protease  from  a  newly  isolated Bacillus  subtilis PE-11. AAPS Pharm Sci., Tech 4:E56-64.
66 KDa 45 KDa 24 KDa 97 KDa 97 KDa 66 KDa 45 KDa 24 KDa
Baehaki  A,  Suhartono  MT,  Palupi  NS,  Nurhayati  T.  2008. Purifikasi  dan  karakterisasi  protease  dari  bakteri  patogen Psudomonas  aeruginosa .  J  Teknol  dan  Industri  Pangan, 19(1): 80-86.
Baehaki  A,  Suhartono  MT,  Nurhayati  T.  2004.  Karakterisasi Protease dari bakteri patogen ikan Aeromonas hydrophilla . Buletin Teknol Hasil Perikanan 8(2):60-72.
Bergmeyer  HU,  Bergmeyer  J,  Graβl  M.  1983.  Methods  of Enzymatic Analysis. Ed.ke-2. Weinheim : Verlag Chemie.
Bradford  MM.  1976.  A  rapid  and  sensitive  methodfor quantitation  of  microgram  quantities  of  protein  utilizing  the principle of protein dye-binding. Anal Biochem 72:234-254.
Choi  NS,  Yoon  KS,  Lee  JY,  Han  KY,  Kim  SH.  2001, Comparision of three substrates (casein, fibrin, and gelatin) in zimographic gel. J Biochim Mol Biol 34:531-536.
Hames BD, Hooper NM. 2000. Biochemistry: The Instant Notes. Ed.ke-2. Hongkong:Springer-Verlag.
Laemmli  UK.  1970.  Cleavage  of  structural  protein  during  the assembly of the heat of bacteriophag T4. Nature, 227:680- 685.
Miyamoto K, Tsujibo  H, Nukui E, Itoh H,  Kaidzu Y, Inamori Y. 2002. Isolation and characterization of the genes encoding two  metalloproteases  (MprI  and  MprII)  from  a  marine bacterium, Alteromonas sp.  strain  O-7.  Biosci  Biotecnol Biochem 66(2):416-21.
Muchtadi D, Palupi NS, Astawan M. 1996. Enzim dalam Industri Pangan. Bogor: PAU Pangan dan Gizi IPB.
Olajuyigbe FM, Ajele JO. 2008. Some properties of extracelullar protease  from Bacillus  licheniformis Lbbl-1  isolated  from
’iru’, a traditionally fermented African locust bean condiment. Glob. J Biotechnol Biochem 3 (1): 42-46.
Rao  MM,  Tanksale  AM,  Gatge  MS,  Desphande  VV.  1998. Molecular  and  biotechnological  aspects  of  microbial proteases. Microbiol And Mol Biol Rev 62(3):597-635.
Richardson  T,  Hyslop  DB.  1985.  Enzyme.Didalam:  Fennema, O.R (Ed). Food Chemistry. New York: Mac Kerel Bekker.
Suhartono  MT.  1989.  Enzim  dan  Bioteknologi.Bogor:  Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB-Depdikbud.
Suhartono MT. 2000. Pemahaman Karakteristik Biokimia Enzim Protease  dalam  Menunjang  Industri  Berbasis  Bioteknologi. Buku  Orasi  Ilmiah  Guru  Besar  Ilmu  Dasar-Dasar  Biokimia Dasar. Fateta IPB. Bogor.
Vázquez SC, Hernández E, Cormack WPM. 2008. Extracellular proteases from the Antarctic marine Pseudoalteromonas sp. P96-47 strain. Revista Argentina de Microbiologia 40:63-71. Vidyasagar M, Prokash S, Mahajan V, Shouche YS, Screermulu K.  2009.Purification  and  Characterization  of  an  extreme halothermophilic  protease  from  a  halophilic  bacterium Chromohalobacter sp TVSP101. Braz. J Microbiol 40(1).
Wahyuntari  B,  Suhartono  MT,  Pyun  Y.  2000.  Properties  of extracelullar  protease  from  an  extreme  thermophilic microorganism  isolated  from  Tangkupan  Prahu  crater. Hayati 7(1): 6-10.
Ward  OP,  Rao  MB,  Kulkarni  A.  2009.  Proteases  production. Appli.Microbiol. Industrial 495-511.
Windle HJ, Kelleher D. 1997. Identification and characterization of a metalloprotease activity from Helicobacter pylori . Infect Immun 65(8): 3132 - 3137.