Gambaran histologi ovarium sapi Aceh pascavitrifikasi menggunakan dimetyl sulfoksida dengan konsentrasi berbeda
Syafruddin 1 , Arman Sayuti 1 , Rahmat Aditya Sumardi 2 , Budianto Panjaitan 1, *
1 Laboratorium Klinik, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh
2 Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh
ABSTRACT: This study aims to determine the morphology of Aceh bovine ovarian pasca vitrification, after its been exposed to  dimetyl  sulfoksida  (DMSO)  cryoprotectant.  This  study  use  a  completely  randomized  design  of  one-way  pattern  ANOVA acquire  three  replications.  Ovaries  used  in  this  study  are  Aceh  cattle  ovarian  which  collected  from  slaughter  house  (RPH) accounted as 4 organs, to the next sliced into 9 pieces. Ovarian pieces are then grouped into 3 treatment groups namely ovaries which  exposed  into  solution  containing  DMSO  10%  (P1),  20%  (P2),  and  30%  (P3).  The  results  showed  that  the  average number  of  normal  follicles  is  highest  at  P1  41,33  ±  32,51;  followed  by  P2  20,00  ±  16,09  ,  and  P3  15,66  ±  10,50.  It  was concluded that  the ovarian tissue was exposed with DMSO 10% was able to maintain of the normal follicle than DMSO 20% and 30% although statistical test results showed no significant difference between group (P>0,05).

## Keywords:
ovary, cryopreservation, vitrification, cryoprotectant, histology

## ■ PENDAHULUAN
Salah satu upaya untuk mengatasi ancaman kepunahan sapi aceh  adalah  melalui  produksi  embrio  menggunakan teknologi  fertilisasi in  vitro (IVF).  Teknologi  IVF  saat  ini, masih  memanfaatkan  oosit  segar  dengan  daya  tahan  hidup yang  sangat  terbatas  sehingga  tidak  dapat  disimpan  dalam waktu yang lama pada suhu kamar (Vieira et al ., 2002).
Waktu  simpan  yang  terbatas  dapat  diatasi  melalui penyimpanan  beku  (kriopreservasi)  pada  oosit  atau ovarium.  Terdapat  2  metode  kriopreservasi  yaitu  metode konvensional  dan  vitrifikasi  (Wahjuningsih et  al .,  2010). Kelebihan  dari  metode  vitrifikasi  adalah  proses  pemadatan cairan  tanpa  disertai  dengan  terbentuknya  kristal  es  (Shaw et  al .,  2000).  Krioprotektan  selain  dapat  melindungi  sel, bahan  tersebut  juga  dapat  menimbulkan  kerusakan  karena sifat toksisitasnya terhadap sel (Kasai, 2002). Krioprotektan yang  umum  digunakan  adalah dimetyl  sulfoksida (DMSO), etylen  glikol ,  gliserol,  dan  propilen  glikol.  Penelitian kemudian  memelajari  pengaruh  DMSO  dalam  proses vitrifikasi ovarium sapi Aceh secara histologi.

## ■ MATERI DAN METODE
Ovarium: Ovarium  sapi  Aceh  sebanyak  4  buah  diperoleh dari rumah potong hewan (RPH) Lambaro, Aceh Besar.
Vitrifikasi  Ovarium: Vitrifikasi ovarium dilakukan seperti metode  vitrifikasi  sel telur  (Djuwita et  al .,  2000).  Ovarium dipotong  menjadi  9  bagian.  Ovarium  dipaparkan  secara berurutan dalam larutan Phosphate Buffer Solution (PBS) + sukrosa  0,25  M; PBS  +  sukrosa 0,5  M; PBS  +  sukrosa  0,5 M + krioprotektan DMSO 10%; dan PBS + sukrosa 0,5 M +
krioprotektan  DMSO  10%,  20%,  dan  30%  selama  5  menit pada  masing-masing  perlakuan.  Ovarium  kemudian dikemas  dalam  pipet  ( straw ),  selanjutnya  dipaparkan  pada uap nitrogen cair selama 10 detik dan langsung dimasukkan kedalam  nitrogen  cair.  Ovarium  di  dalam  nitrogen  cair selama 30 menit. Straw diambil dari nitrogen cair, dibiarkan di  udara  selama  10  detik  lalu  dimasukkan  kedalam  air dengan  suhu  37  °C  sampai  mencair. Straw dipotong, ovarium  dikeluarkan  dan  dimasukkan  berturut-turut kedalam larutan PBS + sukrosa 0,5 M; PBS + sukrosa 0,25 M; dan PBS (3 kali) masing-masing selama 5 menit.
Pembuatan  Preparat  Histologis: Jaringan  ovarium  yang dikoleksi kemudian difiksasi dalam larutan paraformaldehid 4%  selama  4  hari.  Jaringan  kemudian  didehidrasi  dalam alkohol,  dijernihkan  dalam xylol ,  dan  ditanam  dalam parafin.  Jaringan  dipotong  secara  serial  pada  ketebalan 5μm.  Preparat  dideparafinisasi,  direhidrasi,  dan  diwarnai menggunakan pewarna hematoksilin-eosin (HE).
Analisis  Data: Data  diuji  secara  statistik  mengunakan program SPSS 16,0 for Windows dan dilanjutkan dengan uji Duncan’s Multiple Range Test (Steel & Torrie, 1993).

## ■ HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  jumlah  folikel  utuh  pada setiap  kelompok  perlakuan  tidak  berbeda  nyata  (P>0,05).
ISSN 2581-2416 DOI: http://dx.doi.org/10.29244/avl.2.4.77-78 http://journal.ipb.ac.id/index.php/arshivetlett
Diterima: 31-10-2018 | Direvisi: 21-11-2018 | Disetujui: 26-11-2018 © 2018 CC-BY-SA. Ini adalah artikel Open Access yang didistribusikan ber- dasarkan ketentuan dari Creative Commons Attribution ShareAlike 4.0 Inter- national License ( https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/ ).
Hasil  pemeriksaan  jumlah  folikel  utuh  pada  setiap kelompok  perlakuan  penggunaan  konsentrasi  DMSO  10%, 20%, dan 30% ditampilkan pada Tabel 1.
Tabel 1 Jumlah folikel yang utuh pada jaringan ovarium setelah divitrifikasi kedalam N 2 cair Kelompok Jumlah Folikel Utuh P1 (DMSO 10%) P2 (DMSO 20%) P3 (DMSO 30%) 41,33±32,51 a 20,00±16,09 a 15,66±10,50 a
a superskrip yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata (P>0,05)
Jumlah  folikel utuh  dapat diamati  melalui  pewarnaan  HE dan  dapat  diketahui  bahwa  folikel  primer  mempunyai selapis  sel  granulosa  yang  berbentuk  kuboid,  folikel sekunder  mempunyai  dua  lapis  sel  granulosa  dan  folikel tersier  mempunyai  lebih  dari  2  lapis  sel  granulosa  dan memiliki  antrum.  Jumlah  folikel  utuh  tertinggi  pada konsentrasi  DMSO  10%,  sedang  jumlah  folikel  utuh terendah pada konsentrasi DMSO 30%. Jumlah folikel utuh yang  terdapat  pada  konsentrasi  DMSO  10%  tidak  berbeda nyata  dibandingkan  dengan  jumlah  folikel  utuh  pada konsentrasi 20% dan 30% (P>0,05).

## Morfologi Folikel Setelah Divitrifikasi
Semua  perlakuan  ditemukan  folikel  dengan  morfologi normal  dan  tidak  normal.  Kerusakan  yang  terjadi  pada ovarium  berupa  pecahnya  sel-sel  folikel,  piknotik  inti  sel telur,  kerobekan  sel-sel  granulosa,  dan  oosit.  Kerusakan morfologi  yang  sering  terjadi  adalah  pecahnya  zona pelusida,  desintegrasi  membran  plasma,  kerusakan  bahan serta  organel  sitoplasma  seperti  skeleton  sel,  kromosom, butir-butir  korteks,  dan  butir-butir  lemak  (Fukui et  al ., 1993).  Morfologi  folikel  primer  utuh  dan  folikel  primer yang mengalami pengkerutan disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1 Perwarnaan HE folikel primer dengan morfologi utuh (A) dan folikel yang mengalami pengkerutan (krenasi) (B).
Proses  vitrifikasi  menurunkan  persentase  folikel  normal. Integritas morfologi sejumlah besar folikel-folikel preantral secara  keseluruhan  dapat  dipertahankan  selama  proses vitrifikasi.  Proses  penetrasi  krioprotektan  melalui  sel-sel stroma  menuju  oosit  sangat  diperlukan  dalam  proses vitrifikasi, namun pada saat yang sama harus dipertimbangkan  adanya  efek  toksisitas  dari  krioprotektan yang digunakan (Donnez et al ., 2006). Newton et al . (1998) melaporkan  bahwa  laju  dan  suhu  difusi  berpengaruh terhadap  toksisitas  krioprotektan,  pembentukan  kristal  es juga  harus  diminimalkan  dengan  memilih  laju  pembekuan dan thawing optimal.
DMSO  digunakan  karena  memiliki  kapasitas  penetrasi yang  baik  dan  toksisitas  yang  lebih  kecil  dibandingkan krioprotektan  lainnya  pada  jaringan  ovarium  (Lucci et  al ., 2007). Penggunaan DMSO dengan konsentrasi 10% mampu mempertahankan  keutuhan  morfologi  folikel  dibandingkan dengan  konsentrasi  20%  dan  30%.  Hal  ini  sesuai  dengan pendapat  Pamungkas  (2010),  bahwa  semakin  tinggi  laju pendinginan semakin rendah krioprotektan yang diperlukan.

## ■ SIMPULAN
Penambahan  bahan  DMSO  pada  media  tidak  berpengaruh terhadap jumlah  folikel  utuh  pada  ovarium  sapi  Aceh  yang dibekukan  dengan  metode  vitrifikasi  (P>0,05).  Rataan folikel utuh tertinggi adalah pada konsentrasi DMSO 10%.

## ■ INFORMASI PENULIS

## Penulis untuk Korespondensi
*BP: budi@unsyiah.ac.id Laboratorium  Klinik Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh

## ■ PUSTAKA ACUAN
Djuwita  I,  Boediono  A,  Rusiyantono  Y,  Mohamad  K, Herliatien. 2000.  Perkembangan  oosit  kambing  setelah  maturasi,  fertilisasi dan kultur in vitro. Media Veteriner. 7(4):11-17.
Donnez  J,  Martinez-Madrid  B,  Jadoul  P,  Van  Langendonckt  A, Demylle  D.  2006.  Ovarian  tissue  cryopreservation  and transplantation: a review. Hum. Reprod. Update. 12(5):519-535.
Fukui  EJ,  Xia  L,  Downey  BR.  1993.  Ultrastructural  changes  in bovine  oocyte  cryopreserved  by  vitrification.  Cryobiology. 32(2):139-156.
Kasai  M.  2002.  Advances  in  the  cryopreservation  of  mammalian oocytes  and  embryos:  development  of  ultra  rapid  vitrification. Rev. 1:1-9.
Lucci CM, Scheier LL, Machado GM, Amorim CA, Bao SN. 2007.
Effect of storing pig ovaries at 4 or 20°C for different periods of time  on  the  morfology  and  viability  of  pre-antra  follicles.
Reprod. Dom. Anim. 42:76-82.
Newton H, Fisher J, Arnold JR, Pegg DE, Faddy MJ, Gosden RG. 1998.  Permeation  of  human  ovarian  tissue  with  cryoprotective agents  in  preparation  for  cryopreservation.  Hum.  Reprod. 13:376-380.
Pamungkas  FA.  2010.  Pemanfaatn  metode  vitrifikasi  untuk kriopreservasi oosit mamalia. Wartazoa. 20(3):112-116.
Shaw  JM,  Oranratnachai  A,  Trounson  AO.  2000.  Fundamental cryobiology  of  mammalian  oocytes  and  ovarian  tissue. Theriogenology. 53:59-72.
Steel  RGD,  Torrie  JH.  1993.  Prinsip  dan  Prosedur  Statistik. (Diterjemahkan oleh: Soemantri). Gramedia: Jakarta.
Vieira AD, Mezzalira A, Barbieri DP, Lehmkuhl RC, Rubin MIB, Vajta  G.  2002.  Calves  born  after  open  pulled  straw  vitrification of immature bovine oocytes. Cryobiology. 45:91-94.
Wahjuningsih  S,  Hardjopranjoto  S,  Sumitro  SM.  2010.  Pengaruh konsentrasi  etilen  glikol  dan  lama  paparan  terhadap  tingkat fertilitas  in  vitro  oosit  sapi.  Jurnal  Kedokteran  Hewan.  4(2):61- 64.