## METABOLISME PREBIOTIK OLEH KANDIDAT PROBIOTIK ISOLAT ASI SEBAGAI DASAR PENGEMBANGAN PRODUK SINBIOTIK
[Prebiotics Metabolism by Probiotics Candidates Isolated from Breast Milk as a Basis for Development of Sinbiotics Product]
Lilis Nuraida 1,2) *, Nur Rita Mardiana 2) , Didah Nur Faridah 1,2) , dan Hana 1)
1) South East Asian Food and Agriculture Science and Technology (SEAFAST) Center, Institut Pertanian Bogor
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertaian Bogor
Diterima 05 Juli 2011 / Disetujui 22 November 2011

## ABSTRACT
Five Lactobacillus strains and two Pediococcus strains isolated from breast milk were evaluated for their ability to metabolite oligosaccharide known as prebiotics, i. e. inulin, FOS, GOS, FOS:GOS (1:9), and inulin:GOS (1:9). The result shows that all Lactobacillus and Pediococcus strains were able to grow in medium with prebiotics as carbon sources. The best growth was observed when GOS or FOS were used as carbon source, while  inulin  was  the  worst.  The  best  growth  in  all  oligosaccharides  was  observed  in  Lactobacillus  R23H,  followed  by  L.  rhamnosus B16,  L. rhamnosus R23, and L. rhamnosus R14. Further study on R23H (heterofermenter) and R23 (homofermenter) shows that there was no difference in metabolizing oligosaccharides between heterofermenter and homofermenter. GOS was the best prebiotic used by the both lactic acid bacteria as shown by rapid decrease of total sugar. The reducing sugar in medium containing GOS was higher than other oligosaccharides. The decrease of total sugar in medium containing inulin was the slowest, indicating that inulin was the most difficult prebiotic to be metabolized by the lactic acid bacteria. When inulin mixed with GOS in the ratio 1:9, the rate of decreasing of total sugar in the medium was similar to the medium with GOS as single carbon source, however it cannot be distinguished if the role of inulin took place after GOS disappeared. The rate of sugar metabolism was in accordance with the growth of lactic acid bacteria isolates in medium containing prebiotics. L. rhamnosus R23 was used in sinbiotic fermented milk product combine with FOS, inulin, and inulin:GOS (1:9). After fermentation, remaining sugar in skim milk with additional prebiotics was higher than  skim  milk  without  additional  prebiotics.  Remaining  sugar  on  fermented  milk  product  includes  the  amount  of  prebiotic  that  will  be  used  as carbon  source  in  colon.  Combination  of  potential  probiotic  L.  rhamnosus  R23  and  mixture  of  inulin:GOS  (1:9)  could  be  used  to  make  sinbiotic fermented milk product.
Key words: lactic acid bacteria, prebiotic, inulin, FOS, GOS

## 1 PENDAHULUAN
Probiotik  didefinisikan  sebagai  sel  mikroba  hidup  yang  jika dikonsumsi  dalam  jumlah  yang  cukup  akan  memberikan manfaat  kesehatan  (FAO/WHO,  2006).  Mikroba  yang  umum digunakan  adalah  bakteri  asam  laktat  (BAL).  Ducluzeau et  al. (1991)  menyatakan  beberapa  BAL  probiotik  yang  umum  dan aman  digunakan  antara  lain  adalah Lactobacillus  acidophilus, Lactobacillus  casei,  Sterptococcus  lactis,  Enterococcus faecium,  Bifidobacterium  adolescentis ,  dan Bifidobacterium coagulans .
Prebiotik  didefinisikan  sebagai  bahan  pangan  yang  tidak dapat  dicerna  (oleh  manusia)  dan  memiliki  manfaat  yang menguntungkan  dengan  menstimulasi  pertumbuhan  dan aktivitas  beberapa  bakteri  yang  terdapat  pada  usus  sehingga dapat  meningkatkan  kesehatan  inang  (Gibson,  Roberfroid, 1995).  Fruktooligosakarida  (FOS),  galaktooligosakarida  (GOS), dan  inulin  adalah  beberapa  jenis  prebiotik  yang  banyak digunakan  (Bouhnik et  al .,  1999).  Baik  inulin,  FOS  maupun GOS  bukan  merupakan  subtrat  bagi  enzim  hidrolitik  pada saluran  pencernaan  bagian  atas  (Macfartane et  al .,  2008; Gropper et al., 2009).
*Korespondensi Penulis : Email : lilis@seafast.org
Penggunaan  probiotik  pada  produk  pangan  fungsional seringkali  disertai  dengan  penambahan  prebiotik.  Hal  ini dilakukan untuk mendukung pertumbuhan bakteri probiotik yang digunakan  dan  sekaligus  memperoleh  manfaat  dari  prebiotik yang  ditambahkan.  Kombinasi  probiotik  dan  prebiotik  dalam suatu  produk  pangan  dikenal  dengan  istilah  sinbiotik  (Gibson dan  Roberfroid,  1995).  Shin et  al. (2000) meneliti  pengaruh beberapa jenis prebiotik komersial yaitu inulin, FOS, dan GOS terhadap  probiotik Bifidobacterium  spp. Dengan  penambahan prebiotik  pada  media,  proliferasi  sel Bifidobacterium  spp. menjadi  lebih  cepat.  Bouhnik et  al. (1999)  meneliti  pengaruh pemberian  susu  fermentasi  yang  mengandung  probiotik Bifidobacterium  sp. dan  prebiotik  FOS  terhadap  manusia. Hasilnya  menunjukkan  bahwa  terdapat  peningkatan  jumlah Bifidobacteria pada  feses  manusia  yang  mengonsumsi  susu fermentasi dibandingkan dengan yang tidak mengonsumsi susu fermentasi. Penelitian  yang  dilakukan  Moro et  al .  (2002)  juga menunjukkan  bahwa  pemberian  susu  formula  yang  difortifikasi dengan  campuran  FOS  dan  GOS  dengan  konsentrasi  0,4 g/100ml  atau  0,8  g/100ml  selama  28  hari  menunjukkan peningkatan Bifidobacteria dan Lactobacillus dalam  feses. Penambahan  campuran  prebiotik  tersebut  menghasilkan formulasi  yang  lebih  mendekati  komposisi  ASI  di-bandingkan dengan penambahan satu jenis prebiotik saja.
Pemanfaatan berbagai jenis prebiotik oleh probiotik bersifat spesifik.  Prebiotik  yang  dapat  dimanfaatkan  oleh  satu  jenis probiotik belum tentu dapat digunakan pula oleh jenis probiotik lainnya  (Manning et  al .,  2004),  tergantung  dari  kemampuan mikroorganisme  tersebut  dalam  memproduksi  enzim  yang diperlukan  untuk  memetabolisme  prebiotik.  Oleh  karena  itu kemampuan  BAL  yang  berpotensi  sebagai  probiotik  untuk menggunakan  prebiotik  sebagai  sumber  karbon  dan  energi perlu dikaji.
Beberapa BAL asal ASI memiliki potensi sebagai probiotik, penelitian yang dilakukan oleh Nuraida et al. (2007) menunjuk- kan  bahwa  beberapa  strain  BAL  yang  diisolasi  dari  ASI berpotensi sebagai probotik karena memiliki kemampuan untuk bertahan  pada  kondisi  asam  dan  resisten  terhadap  garam empedu. Dalam penelitian ini akan dikaji kemampuan isolat BAL asal  ASI  untuk  menggunakan  beberapa  jenis  prebiotik  untuk pertumbuhannya,  yaitu  inulin,  FOS  dan  GOS. European Commission (EC) telah merekomendasikan kombinasi prebiotik FOS:GOS  (1:9)  sebanyak  0,8  g/100ml  untuk  produk  susu formula (SCF, 2001a; SCF, 2001b), sehingga dalam penelitian ini  juga  dilakukan  pengujian  untuk  kombinasi  prebiotik FOS:GOS (1:9) dan inulin:GOS (1:9).
Probiotik dan prebiotik yang terdapat dalam produk sinbiotik harus sampai pada kolon untuk dapat meningkatkan kesehatan saluran pencernaan inang. Oleh karena itu, untuk memperoleh manfaat dari prebiotik dan probiotik secara optimal harus dapat dipastikan  bahwa  prebiotik  yang  ditambahkan  tidak  habis  di- gunakan  oleh  probiotik  selama  proses  fermentasi.  Dengan demikian  kejelasan  proses  dan  waktu  metabolisme  dari prebiotik yang digunakan juga menjadi penting untuk diketahui.
Pada  penelitian  ini  diseleksi  kandidat  probiotik  isolat  ASI yang  mampu  memanfaatkan  inulin,  FOS,  GOS,  kombinasi FOS:GOS, dan  kombinasi inulin:GOS  sebagai  sumber karbon, dan dipelajari metabolismenya selama pertumbuhan BAL pada media  yang  mengandung  probiotik,  serta  dipilih  kombinasi probiotik dan prebiotik terbaik untuk diaplikasikan dalam produk susu fermentasi.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan-bahan  yang  digunakan  adalah  fruktooligosakarida (QHTFOS-G50L TM ),  galaktooligisakarida  (QHTGOS-50L TM ), inulin  (Frutafit  IQ TM ),  kultur  BAL  asal  ASI  diperoleh  dari SEAFAST  Center  IPB.  Bahan  yang  digunakan  untuk  media pertumbuhan diantaranya adalah media  MRS ( deMan, Rogosa and  Sharpe ) broth ,  MRS  agar, yeast  extract (Oxoid TM ),  susu skim  (Sunlac TM ), protease  peptone (Difco TM ),  Tween  80, K 2 HPO 4 .3H 2 O,  MgSO 4 .7H 2 O,  MnSO 4 .4H 2 O  (Merck TM ),  dan sodium  asetat  (Cica TM ).  Bahan-bahan  untuk  analisis oligosakarida meliputi larutan fenol 5%, H 2 SO 4 pekat, Na 2 CO 3 , NaHCO 3 ,  KCN,  FeNH 4 (SO 4 ) 2 (Merck TM ) , dan potassium  ferric cyanide (Cica TM ).  Bahan  yang  digunakan  untuk  analisis  asam laktat  adalah  NaOH  0.1  N  (Cica TM ),  indikator  penolftalein (Merck TM ).  Alat-alat  yang  digunakan  meliputi  membran  filter steril 0,2 µm, sentrifus, spektrofotometer dan peralatan standar untuk analisa mikrobiologi.

## Persiapan kultur bakteri asam laktat
Tujuh  BAL  asal  ASI  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu Lactobacillus  rhamnosus B16, Lactobacillus  rhamnosus R14, Lactobacillus  rhamnosus R21, Lactobacillus  rhamnosus R23, Lactobacillus R23H, Pediococcus  pentosaceus  1- A22,  dan Pediococcus  pentosaceus  1- A23.  Kultur  stok  disimpan  pada suhu -20°C dengan konsentrasi gliserol dalam medium (MRSB) sebesar  20%.  Sebelum  digunakan  kultur  diaktifkan  terlebih dahulu pada medium MRSB (37°C, 24 jam).

## Seleksi BAL isolat ASI yang dapat memanfaatkan prebiotik sebagai sumber karbon
Media  uji  yang  digunakan  adalah  media  berbasis  MRSB yang  diganti  kandungan  glukosanya  dengan  beberapa  jenis prebiotik yang digunakan. Media dibuat dengan mencampurkan protease pepton (10 g), yeast extract (5 g), sodium asetat (5 g), Tween 80 (1 g), dan akuades (1 L). Kemudian pH media diatur dengan menggunakan HCl dan NaOH hingga mencapai 6,4-6,6 dan  disterilisasi  menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121°C selama  15  menit.  Sumber  mineral  yang  terdiri  dari K 2 HPO 4 .3H 2 O  (2  g/1L  media),  MgSO 4 .7H 2 O  (0,2  g/1L  media), MnSO 4 .4H 2 O (0,05 g/1L media) masing-masing dibuat terpisah dengan  membuat  larutan  stok  yang  memiliki  konsentrasi  100 kali  konsentrasi  media.  Selanjutnya  larutan  mineral  disterilkan pada suhu 121°C selama 15 menit.
Konsentrasi  prebiotik  FOS,  GOS,  inulin,  campuran FOS:GOS  (1:9)  dan  inulin:GOS  (1:9)  pada  media  berbasis MRSB adalah sebesar 5%. Terlebih dahulu dibuat  larutan stok prebiotik dengan konsentrasi 10 kali konsentrasi media, kecuali untuk  inulin  dibuat  larutan  stok  dengan  konsentrasi  2  kali konsentrasi  media.  Larutan  prebiotik  tersebut  disterilisasi dengan menggunakan filter steril 0,2 µm. Penambahan larutan prebiotik  ke  dalam  medium  steril  dilakukan  sesaat  sebelum media  digunakan.  Kemudian  sebanyak  0,1  ml  kultur  BAL  di- tambahkan pada tabung reaksi  berisi media  uji untuk selanjut- nya dilakukan inkubasi pada 37°C selama 24 jam. Analisis total BAL dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam dengan metode cawan tuang (BAM, 2001) menggunakan media MRSA.

## Uji metabolisme prebiotik oleh BAL isolat ASI
Metabolisme  prebiotik  oleh  BAL  diamati  dengan  meng- analisis  kandungan  gula  dan  asam  pada  media  pertumbuhan yang  digunakan.  Kultur  BAL  yang  terpilih  berdasarkan  seleksi pada  tahap  sebelumnya  ( L.  rhamnosus R23  dan Lactobacillus R23H),  ditumbuhkan  pada  media  berbasis  MRSB  dengan prebiotik  sebagai  sumber  karbon.  Media  berbasis  MRSB  dan kombinasi  prebiotik  yang  digunakan  sama  dengan  pengujian pada  tahap  seleksi,  kecuali  pada  tahap  ini  larutan  prebiotik dipasteurisasi pada suhu 85°C selama 30 menit.
Sebanyak  1  ml  kultur  diinokulasikan  pada  100  ml  media. Setiap 2 jam dari jam ke-0 sampai ke-12 dan selanjutnya pada jam  ke-24  dilakukan  analisis  pertumbuhan  sel  dengan  metode spektrofotometri  (Widdel,  2007),  analisis  total  gula  metode fenol-sulfat (Dubois et al., 1956), gula pereduksi metode Park- Johnson  (Takeda,  2003),  persen  asam  laktat  (AOAC,  1998), dan  pH  (AOAC,  1998).  Untuk  analisis  total  gula  dan  gula pereduksi,  persiapan  sampel  dilakukan  dengan  memisahkan BAL  dengan  cara  mensentrifusi  media  selama  10  menit  pada
kecepatan  4000  rpm.  Kemudian  sebanyak  1  ml  supernatan dipipet dan ditambahkan NaOH 1 N sampai pH netral (2 tetes). Sebelum dianalisis, sampel diencerkan terlebih dahulu dengan akuades hingga mencapai konsentrasi pada kisaran konsentrasi kurva standar.

## Aplikasi pada produk susu fermentasi
Kultur  BAL  terpilih  ( Lactobacillus R23)  sebanyak  2%  di- tumbuhkan pada media susu skim 10% yang telah disterilisasi pada suhu 100°C selama 30 menit. Media susu skim yang telah diinokulasi dengan BAL diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam  dan  digunakan  sebagai  kultur  starter.  Media  susu fermentasi  yang  digunakan  adalah  susu  skim  12%  (b/v). Kombinasi  prebiotik  yang  digunakan  adalah  FOS,  Inulin,  dan campuran  inulin:GOS  (1:9).  Prebiotik  yang  telah  dipasteurisasi pada 85°C selama 30 menit ditambahkan ke dalam media susu skim  sebanyak  5%  sesaat  sebelum  media  digunakan.  Media susu  skim  tanpa  penambahan  prebiotik  digunakan  sebagai pembanding.  Selanjutnya,  1%  kultur  starter  diinokulasikan  ke dalam media susu skim dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Analisis dilakukan pada 0, 24 dan 48 jam terhadap total BAL  dengan  menggunakan  metode  hitungan  cawan  (BAM, 2001),  analisis  total  gula  metode  fenol-sulfat  (Dubois et  al., 1956),  gula  pereduksi  metode  Park-Johnson  (Takeda,  2003), asam  laktat  (AOAC,  1998),  dan  pH  (AOAC,  1998).  Persiapan sampel  untuk  analisis  total  gula  dan  gula  pereduksi  dilakukan dengan metode yang sama seperti pada tahap sebelumnya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## BAL  isolat  ASI  yang  dapat  memanfaatkan  prebiotik sebagai sumber karbon
Hasil  perhitungan  pertumbuhan  BAL  menunjukkan  bahwa ketujuh isolat yang digunakan mampu tumbuh lebih baik pada media  dengan  prebiotik  sebagai  sumber  karbon  dibandingkan pada media kontrol yang tidak mengandung gula. Hal ini terlihat dari  jumlah  koloni  yang  tumbuh  pada  media  dengan  prebiotik lebih banyak dari pada jumlah koloni pada media kontrol (Tabel 1).  Selisih  jumlah  BAL  pada  media  kontrol  dan  media  dengan prebiotik disajikan pada Gambar 1.
Tabel  1.  Jumlah  BAL  dalam  media  berbasis  MRSB  dengan  prebiotik sebagai sumber karbon
Kode Isolat Jumlah BAL (Log CFU/ml) Kon- trol Inulin FOS GOS FOS:GOS (1:9) Inulin:GOS (1:9) A22 8,47 8,35 9,26 8,72 9,08 8,81 A23 9,19 9,45 9,64 9,40 9,35 9,28 B16 8,42 9,12 9,72 9,69 9,86 9,94 R14 8,59 9,01 9,89 9,85 9,66 9,51 R21 8,55 9,00 9,56 8,83 9,17 9,53 R23 8,83 9,54 9,84 9,93 10,00 9,89 R23H 8,19 9,54 10,02 10,72 10,04 9,94
Pada media dengan inulin sebagai sumber karbon, secara umum  pertumbuhan  seluruh  isolat  terlihat  lebih  rendah  di- bandingkan  dengan  media  yang  mengandung  jenis  prebiotik lain.  Inulin  mempunyai  derajat  polimerisasi  kurang  dari  25
dengan  rata-rata  sebesar  14  (Manning  dan  Gibson,  2004). Penelitian yang dilakukan Shin et al . (2000) menunjukkan inulin paling  tidak  efektif  dalam  menstimulir  pertumbuhan Bifido- bacterium Bf-1  dan  Bf-6  pada  media  susu  skim  dibanding-kan dengan sumber prebiotik uji lainnya yaitu FOS dan GOS yang memiliki  nilai  DP<10.  Hal  ini  disebabkan  kemampuan  BAL dalam  memfermentasi  oligosakarida  dengan  DP>10  hanya setengah  dari  kecepatan  fermentasi  oligosakarida  dengan DP<10.
Seluruh  isolat  ASI  yang  diuji  menunjukkan  pertumbuhan yang  baik  pada  media  dengan  FOS  sebagai  sumber  karbon. Pada  Gambar  1  terlihat  bahwa Lactobacillus R23H  menunjuk- kan  jumlah  pertumbuhan  tertinggi  pada  media  dengan  FOS sebagai  sumber  karbon.  FOS  lebih  mudah  difermentasi dibandingkan  dengan  inulin  karena  FOS  memiliki  nilai  DP  2-7 (Gibson  dan  Angus,  2000)  dan  FOS  juga  dapat  dihasilkan melalui  hidrolisis  inulin.  Pertumbuhan  kandidat  probiotik  isolat ASI  pada  media  dengan  GOS  sebagai  sumber  karbon menunjukkan  hasil  yang  berbeda  untuk  setiap  isolat. L. rhamnosus R14, L.  rhamnosus R23,  dan Lactobacillus R23H menunjukkan  tingkat  pertumbuhan  yang  cukup  tinggi  dan hampir sama dengan pertumbuhannya pada media FOS. Tetapi keempat  isolat  lain  menunjukkan  pertumbuhan  yang  lebih rendah dari pertumbuhan pada media FOS. Kombinasi prebiotik FOS:GOS  (1:9)  dan  inulin:GOS  (1:9)  mampu  dimanfaatkan dengan baik oleh sebagian besar isolat BAL yang diujikan yaitu L.  rhamnosus R23, L.  rhamnosus B16, L.  rhamnosus R14, L. rhamnosus R21, dan Lactobacillus R23H (Gambar 1). Kemampuan  setiap  isolat  dalam  memproduksi  enzim  yang dapat  menghidrolisis  prebiotik  merupakan  faktor  yang  sangat berpengaruh  terhadap  efektivitas  dari  prebiotik.  Penelitian Barrangou et  al. (2003)  yang  diacu  di  dalam  Saulnier et  al. (2007)  menunjukkan  adanya  peran  dari  fruktosidase  dalam hidrolisis FOS oleh L. acidophillus . Yoon (2008) meneliti peran enzim  galaktosidase  yang  dihasilkan  beberapa  strain L. curvatus dan L.  mesenteriodes dalam  memetabolisme oligosakarida  kedelai.  Hasilnya  menunjukkan  bahwa  terdapat perbedaan  aktivitas  enzim  galaktosidase  dari  masing-masing strain yang diuji.
Gambar 1.   Perbedaan nilai log BAL pada media fermentasi berbasis MRSB  dengan  prebiotik  sebagai  sumber  karbon dibandingkan dengan kontrol (tanpa gula)

## Metabolisme prebiotik oleh BAL isolat ASI
Pada  uji  metabolisme  prebiotik  oleh  BAL  digunakan L. rhamnosus R23  yang  bersifat  homofermentatif  dan Lactobacillus R23H  yang  bersifat  heterofermentatif. L. rhamnosus R23 dipilih karena memiliki kemampuan untuk me-
0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 0 4 8 12 Lo g O D T er hit un g Waktu (jam) kontrol FOS Inulin GOS FOS:GOS Inulin:GOS
metabolisme inulin yang relatif sama dengan L. rhamnosus B16. Selain  itu  penelitian  lain  (Hartanti,  2010)  menunjukkan  bahwa kemampuan L.  rhamnosus R23  dalam  mencegah  diare  lebih baik daripada L. rhamnosus B16.

## Pertumbuhan BAL
Secara  umum  kenaikan  nilai  OD  selama  pertumbuhan kedua isolat pada media dengan GOS sebagai sumber karbon menunjukkan  nilai  tertinggi  dibandingkan  media  dengan prebiotik  uji  lainnya  (Gambar  2-3).  Hal  ini  menunjukkan  ke- mungkinan bahwa kedua isolat mampu memproduksi enzim  - galaktosidase  yang  berperan  dalam  pemecahan  GOS.  Pada media  dengan  inulin,  nilai  OD  yang  rendah  selama  waktu inkubasi menunjukkan tingkat pertumbuhan yang paling rendah. Pertumbuhan  berlangsung  lambat  pada  masa  awal  inkubasi karena  inulin  sebagai  sumber  karbon  memiliki  rantai  yang panjang  (nilai  derajat  polimerisasi  2-60)  sehingga  BAL  sulit untuk memetabolismenya (Gibson dan Angus, 2000).
Gambar  2.  Grafik  pertumbuhan L.  rhamnosus R23  pada  media  ber- basis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon
Gambar 3.  Grafik pertumbuhan Lactobacillus R23H pada media ber- basis MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon
Perbedaan  kecenderungan  kedua  isolat  dalam  mem- fermentasi prebiotik terlihat pada media dengan GOS dan FOS. Pada  media  dengan  GOS  sebagai  sumber  karbon L. rhamnosus R23 menunjukkan tingkat pertumbuhan yang tinggi sejak  awal  sampai  akhir  inkubasi,  sedangkan Lactobacillus R23H menunjukkan pertumbuhan yang lambat di awal inkubasi dan  mengalami  peningkatan  yang  cepat  pada  akhir  waktu inkubasi (Gambar 2-3).
Sebaliknya  pada  media  dengan  FOS  sebagai  sumber karbon  tunggal, L.  rhamnosus R23  menunjukkan  tingkat  per- tumbuhan  yang  sedikit  lebih  rendah  dibanding Lactobacillus R23H.  Kombinasi  dua  jenis  prebiotik  yang  digunakan  yaitu
FOS:GOS  (1:9)  dan  inulin:GOS  (1:9)  dapat  dimanfaatkan dengan  baik  oleh L.  rhamnosus R23  dan Lactobacillus R23H. Hal  ini  terlihat  dari  tingginya  pertumbuhan  yang  ditunjukkan dengan nilai OD yang tinggi pada setiap waktu pengamatan.

## Perubahan pH selama pertumbuhan BAL
Perubahan pH selama pertumbuhan L. rhamnosus R23 dan Lactobacillus R23H  pada  media  kontrol  menunjukkan perubahan yang tidak signifikan selama waktu inkubasi (p<0,05) (Gambar  4  dan  5).  Pada  media  lain  dengan  prebiotik  sebagai sumber  karbon  penurunan  pH  yang  signifikan  terjadi  selama pertumbuhan  kedua  isolat  (p<0,05).  Media  dengan  GOS sebagai sumber karbon mangalami penurunan pH paling tinggi, sedangkan  media  dengan  inulin  sebagai  sumber  karbon mengalami penurunan pH yang paling rendah.
Gambar  4. Grafik  perubahan  pH  selama  pertumbuhan L.  rhamnosus
R23  pada  media  berbasis  MRSB  dengan  prebiotik sebagai sumber karbon
Gambar  5.    Grafik  perubahan  pH  selama  pertumbuhan Lactobacillus
R23H  pada  media  berbasis  MRSB  dengan  prebiotik sebagai sumber karbon

## Perubahan  jumlah  konsentrasi  asam  laktat  selama  per- tumbuhan BAL
Hasil  pengukuran  TAT  (%  asam  laktat)  sebanding  dengan hasil  pengukuran  pH  (Gambar  6  dan  7).  Pada  media  kontrol jumlah asam laktat selama waktu inkubasi cenderung konstan, sedangkan  pada  kelima  media  uji  yang  mengandung  prebiotik terjadi  peningkatan  nilai  TAT  yang  signifikan  (p<0,05)  selama pertumbuhan L.  rhamnosus R23  dan Lactobacillus R23H. Peningkatan  nilai  TAT  yang  paling  tinggi  selama  pertumbuhan kedua  isolat  dicapai  pada  media  yang  memanfaatkan  GOS sebagai sumber karbon.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 A22 A23 B16 R14 R21 R23 R23H Pe rb ed aa n ju m la h BA L (L og C FU /m l) Kode Isolat
Inulin FOS GOS FOS:GOS Inulin:GOS 0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 0 4 8 12 Lo g O D T er hit un g Waktu (jam) kontrol FOS Inulin GOS FOS:GOS Inulin:GOS 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 4 8 12 N ila i p H Waktu (jam) Kontrol FOS Inulin GOS FOS:GOS Inulin:GOS 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 4 8 12 N ila i p H Waktu (jam) Kontrol FOS Inulin
GOS FOS:GOS Inulin:GOS
Gambar 6.  Grafik perubahan TAT selama pertumbuhan L. rhamnosus R23  pada  media  berbasis  MRSB  dengan  prebiotik sebagai sumber karbon
Gambar 7.  Grafik perubahan TAT selama pertumbuhan Lactobacillus
R23H  pada  media  berbasis  MRSB  dengan  prebiotik sebagai sumber karbon

## Perubahan total gula selama pertumbuhan BAL
Selama pertumbuhan L. rhamnosus R23 dan Lactobacillus R23H terjadi penurunan total gula  pada keseluruhan media uji yang mengandung prebiotik sebagai sumber karbon (Gambar 8 dan  9).  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  prebiotik  sebagai sumber  gula  tunggal  yang  terdapat  dalam  media  dapat dimanfaatkan oleh BAL untuk pertumbuhannya.
Penurunan total gula tercepat teramati pada media dengan GOS sebagai sumber karbon. Nilai DP GOS yang tidak terlalu tinggi yaitu berkisar antara 2-7 menyebabkan GOS lebih mudah untuk difermentasi. Pada media dengan inulin sebagai sumber karbon, penurunan total gula selama pertumbuhan kedua isolat berlangsung  lambat  (Gambar  8-9).  Inulin  yang  memiliki  rantai lebih panjang dibandingkan FOS dan GOS sehingga lebih sulit untuk  dimetabolisme  oleh  BAL.  Kemampu-an  BAL  dalam memetabolisme  inulin  terkait  dengan  keberadaan  enzim inulinase  yaitu  enzim  yang  dapat  menghidrolisis  inulin (Nakamura et al ., 1995). Enzim ini akan diproduksi ketika BAL tumbuh pada media atau lingkungan yang mengandung inulin. Mula-mula L.  rhamnosus R23  dan Lactobacillus R23H  tidak mampu  menggunakan  inulin  sehingga  pertumbuhan  di  masa awal  inkubasi  cenderung  lambat.  Setelah  fase  adaptasi  maka enzim diproduksi dan selanjutnya enzim dapat digunakan untuk memecah inulin selama pertumbuhan kedua isolat.
Penurunan  total  gula  pada  media  dengan  FOS  sebagai sumber  karbon  lebih  besar  dibandingkan  media  inulin.  FOS dapat dipecah oleh enzim  -fruktosidase menghasilkan molekul glukosa dan fruktosa. Enzim ini merupakan enzim ekstraseluler yang bersifat induktif. Jadi enzim hanya akan diproduksi ketika
substrat yang sesuai yaitu FOS ada di lingkungan pertumbuhan BAL.  Pada  media  dengan  kombinasi  inulin:GOS  (1:9),  me- nunjukkan penurunan total gula yang lebih besar jika dibanding- kan dengan media dengan inulin saja. Pada media yang berisi kombinasi  FOS:GOS  (1:9),  penurunan  total  gula  selama pertumbuhan  sedikit  lebih  lambat  dibandingkan  dengan  media yang  hanya  menggunakan  FOS  secara  tunggal.  Selama  per- tumbuhan L.  rhamnosus R23  dan Lactobacillus R23H, penurunan total gula pada kedua media dengan kombinasi dua jenis  prebiotik  tidak  terlalu  berbeda  satu  sama  lain.  Gambar  8 dan  menunjukkan  bahwa  kombinasi  prebiotik  lebih  cepat dimetabolisme daripada inulin tetapi lebih lambat jika dibanding- kan dengan FOS dan GOS. Kondisi tersebut diharapkan pada aplikasi  produk  sinbiotik,  yaitu  prebiotik  tidak  akan  habis dipecah  oleh  BAL  dan  akan  dimanfaatkan  sebagai  sumber karbon oleh probiotik di dalam kolon setelah produk dikonsumsi.
Gambar  8.  Grafik  perubahan  total  gula  selama  pertumbuhan L. rhamnosus R23  pada  media  berbasis  MRSB  dengan prebiotik sebagai sumber karbon
Gambar  9.  Grafik  perubahan  total  gula  selama  pertumbuhan Lactobacillus R23H  pada  media  berbasis  MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon

## Perubahan konsentrasi gula pereduksi
Penurunan  gula  pereduksi  selama  pertumbuhan L. rhamnosus R23  dan Lactobacillus R23H  pada  media  dengan inulin  terjadi  secara  lambat  (Gambar  10-11).  Hal  ini  berkaitan dengan  monosakarida  utama  penyusun  inulin  yaitu  fruktosa yang  bukan  merupakan  gula  pereduksi.  Nilai  gula  pereduksi yang  terukur  selama  pertumbuhan  berasal  dari  gugus  glukosa yang terdapat pada setiap ujung struktur inulin.
Penurunan  jumlah  gula  pereduksi  pada  media  dengan FOS  lebih  besar  jika  dibandingkan  dengan  media  yang mengandung  inulin  (Gambar  10-11).  Jumlah  awal  gula pereduksi  pada  media  dengan  FOS  juga  menunjukkan  nilai yang  lebih  tinggi  daripada  inulin.  Hal  ini  terjadi  karena  FOS
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 4 8 12 % A sa m L ak ta t Waktu (jam) kontrol FOS Inulin GOS 0 1 2 3 4 5 6 0 4 8 12 Ko ns en tra si To ta l G ula (% ) Waktu (jam) FOS GOS Inulin FOS:GOS Inulin:GOS 0 1 2 3 4 5 6 0 4 8 12 Ko ns en tra si To ta l G ula (% ) Waktu (jam) FOS GOS
Inulin FOS:GOS Inulin:GOS
memiliki  rantai  yang  lebih  pendek  sehingga  pada  konsentrasi yang sama molekul FOS lebih banyak daripada inulin sehingga gugus  gula  pereduksi  pada  FOS  juga  lebih  banyak  daripada inulin.  Nilai  gula  pereduksi  berasal  dari  ujung  rantai  glukosa yang memiliki gugus -OH bebas pada struktur FOS yang telah dipecah oleh bakteri.
Gambar 10. Grafik perubahan gula pereduksi selama pertumbuhan L. rhamnosus R23  pada  media  berbasis  MRSB  dengan prebiotik sebagai sumber karbon
Gambar  11.      Grafik  perubahan  gula  pereduksi  selama  pertumbuhan Lactobacillus R23H  pada  media  berbasis  MRSB dengan prebiotik sebagai sumber karbon
Hasil pengukuran gula pereduksi pada media dengan GOS sebagai  sumber  karbon  menunjukkan  bahwa  GOS  memiliki kandungan  gula  pereduksi  terbanyak  dibandingkan  sumber prebiotik uji lainnya. Selama pertumbuhan kedua isolat, jumlah gula  pereduksi  mengalami  perubahan  yang  fluktuatif  tetapi cederung  menurun  (Gambar  10-11).  Hasil  pengukuran  yang fluktuatif  ini  menunjukkan  pada  awal  inkubasi  GOS  terus dipecah  oleh  isolat  sehingga  jumlah  gula  pereduksi  sempat meningkat. Namun kemudian gula pereduksi ini dimetabolisme sehingga  jumlahnya  semakin  menurun  selama  waktu  per- tumbuhan.
Pada  Gambar  10  dan  11  terlihat  grafik  perubahan  kadar gula pereduksi pada media yang mengandung FOS:GOS (1:9) dan inulin:GOS (1:9) juga menurun, walaupun nilainya fluktuatif. Kombinasi  antara  inulin  yang  memiliki  DP  tinggi  dengan  GOS yang memiliki kandungan gula pereduksi tinggi dan DP rendah ternyata  dapat  dimanfaatkan  mendukung  pertumbuhan  BAL lebih baik.

## Aplikasi pada produk susu fermentasi
Susu  fermentasi  digunakan  untuk  mengaplikasikan  konsep sinbiotik  dalam  penelitian  ini  dengan  menggunakan L. rhamnosus R23.  Dalam  penelitian  ini  diketahui  bahwa  ke- mampuan Lactobacillus R23H  untuk  memetabolisme  prebiotik
lebih baik dari L. rhamnosus R23, namun karena Lactobacillus R23H  bersifat  heterofermentatif  maka Lactobacillus R23H kurang  sesuai  digunakan  untuk  produk  susu  fermentasi  yang menyerupai  yogurt,  sehingga  pada  tahap  ini  dipilih L. rhamnosus R23.  Hasil  analisis  total  BAL  selama  proses fermentasi susu disajikan pada Tabel 2.
Tabel  2.  Jumlah L.  rhamnosus R23  pada  media  susu  skim  dengan penambahan prebiotik Waktu inkubasi (jam) Jumlah BAL (Log CFU/ml) Skim Skim+FOS Skim+Inulin Skim+ Inulin:GOS (1:9) 0 8,35 8,29 8,35 8,42 24 9,92 10,15 10,05 10,11 48 9,60 9,49 9,79 9,92
Total  BAL  meningkat  hingga  hari  pertama  inkubasi, kemudian jumlahnya sedikit menurun pada hari kedua inkubasi. Pada  jam  ke-24  menunjukkan  terjadi  peningkatan  jumlah  BAL pada  keempat  media.  Peningkatan  jumlah  BAL  pada  keempat media tersebut tidak berbeda nyata satu sama lain (p<0,05).
Pengukuran total BAL pada jam ke-48 menunjukkan terjadi- nya penurunan pada keempat media susu skim. Hasil analisis menunjukkan  bahwa  jumlah  akhir L.  rhamnosus R23  pada keempat media tidak berbeda nyata secara signifikan (p<0,05). Tabel  2  menunjukkan  bahwa  jumlah  akhir L.  rhamnosus R23 telah memenuhi syarat jumlah  minimal BAL pada produk susu fermentasi yaitu berkisar antara 10 8 -10 9 CFU/ml (Kurmann dan Rasic, 1991).
Secara  umum  total  gula  pada  keempat  media  susu  skim mengalami  penurunan  selama  waktu  fermentasi.  Hal  ini menunjukkan L.  rhamnosus R23  telah  memfermentasi  gula yang terdapat dalam media menjadi asam laktat (Gambar 12).
Gambar  12. Grafik  perubahan  total  gula  selama  proses  fermentasi susu  skim  dengan  kultur L.  rhamnosus R23  dengan penambahan prebiotik
Total  gula  yang  terukur  pada  media  skim  tanpa  prebiotik merupakan  laktosa  yang  terkandung  dalam  susu,  sedangkan pada  ketiga  media  lainnya  total  gula  menunjukkan  kandungan laktosa  dan  prebiotik  yang  ditambahkan,  sehingga  total  gula yang tersisa pada media kontrol paling sedikit dibanding ketiga media lainnya.
Jumlah  awal  gula  pereduksi  pada  media  skim  dengan  pe- nambahan  FOS  dan  inulin:GOS  (1:9)  lebih  tinggi  dibanding media  uji  lainnya.  Tingginya  jumlah  gula  pereduksi  ini  karena FOS  dan  GOS  yang  ditambahkan  pada  masing-masing  media memiliki kandungan gula pereduksi yang  cukup tinggi. Selama
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 0 4 8 12 Ko ns en tra si G ula P er ed uk si (% ) Waktu (jam) FOS GOS Inulin
FOS:GOS
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 0 4 8 12 Ko ns en tra si G ula P er ed uk si (% )
Waktu (jam) FOS GOS Inulin FOS:GOS 0 2 4 6 8 10 12 0 24 48 Ko ns en tra si To ta l G ula (% ) Waktu (jam) Skim Skim+FOS
Skim+Inulin Skim+Inulin:GOS
proses  fermentasi  berlangsung,  terjadi  penurunan  total  gula pereduksi  pada  keempat  media  (Gambar  13).  Inulin  sebagai sumber  prebiotik  tunggal  difermentasi  secara  lambat  oleh L. rhamnosus R23.
Gambar  13.  Grafik  perubahan  gula  pereduksi  selama  proses fermentasi susu skim dengan kultur L. rhamnosus R23 dengan penambahan prebiotik
Sementara itu, dengan mengkombinasikan inulin dan GOS (1:9),  kemampuan L.  rhamnosus R23  untuk  tumbuh  dengan memetabolisme  prebiotik  menjadi  lebih  baik.  Dengan  meman- faatkan kombinasi tersebut, sumber prebiotik tidak terlalu cepat dicerna sehingga tidak akan habis dipecah oleh BAL selama di dalam produk.

## KESIMPULAN
Ketujuh  BAL  isolat  ASI  yaitu L.  rhamnosus B16, L. rhamnosus R14, L.  rhamnosus R21, L.  rhamnosus R23, Lactobacillus R23H,  dan P.  pentosaceus 1-A22  dan P. pentosaceus 1-A23 dapat memanfaatkan inulin, FOS, dan GOS sebagai  sumber  karbon  untuk  pertumbuhannya.  Isolat R23H, R23, B16, dan R14 tumbuh lebih baik dibandingkan isolat BAL lainnya. Uji metabolisme prebiotik oleh BAL yang diwakili oleh L. rhamnosus R23  dan Lactobacillus R23H  secara  umum  me- nunjukkan  tidak  ada  perbedaan  antara  isolat  homofermentatif dan  isolat  heterofermentatif  dalam  memetabolisme  probiotik. Kedua  isolat  BAL  tersebut  paling  mudah  tumbuh  pada  media dengan GOS dan paling sulit tumbuh pada media dengan inulin. Pada kombinasi prebiotik inulin:GOS (1:9),  kemampuan kedua isolat  dalam  memfermentasi  prebiotik  menjadi  lebih  baik daripada  penggunaan  inulin  saja  sebagai  sumber  karbon. Penelitian  ini  mengkonfirmasi  bahwa  semakin  tinggi  DP  yang dimiliki oleh prebiotik, kemampuan BAL dalam memfermentasi- nya semakin berkurang.
Pada  aplikasi  produk  sinbiotik  berbasis  susu  fermentasi, hasil analisis total gula menunjukkan sisa gula yang jauh lebih tinggi  pada  ketiga  media  susu  skim  dengan  penambahan prebiotik  (FOS,  inulin,  dan  kombinasi  inulin  dan  GOS)  setelah proses  fermentasi  berlangsung  dibandingkan  dengan  media susu  skim  tanpa  prebiotik.  Perpaduan  jenis  prebiotik  berantai panjang  seperti  inulin  dan  prebiotik  berantai  pendek  seperti GOS  serta L.  rhamnosus R23  yang  merupakan  BAL  kandidat probiotik  dapat  digunakan  pada  produk  susu  fermentasi sinbiotik.  Dengan  memanfaatkan  kombinasi  tersebut,  sumber prebiotik  tidak  terlalu  cepat  dicerna  sehingga  tidak  akan  habis
dipecah  oleh  BAL  selama  di  dalam  produk  sehingga  setelah produk  dikonsumsi  sisa  prebiotik  dapat  dimetabolisme  oleh probiotik di kolon.

## DAFTAR PUSTAKA
AOAC [Assotiation of Official Analytical Chemist]. 1998. Official Methods  of  Analysis  of  AOAC  International.  AOAC International Virginia, USA.
BAM  [Bacteriological  Analytical  Manual].  2001.  Bacteriological Analytical  Manual  Chapter  3:  Aerobic  Plate  Count. U.S.Food  and  Drug  Administration.  http://www.fda.gov/- Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/Bacteriologyc alAnalyticalManualBAM/ucm063346.htm [15 Juni 2010].
Bornet FRJ. 1994. Undigestible sugars in food products. Am J Clin Nutr 59:763S-769S.
Bouhnik  Y,  Kvahedi,  Achou  L,  Attar  A,  Salfat  J,  Pochart  P, Marteau  P,  Flourie  B.  1999.  Short  chain fructooligosaccharide  administration  dose  dependently increases faecal bifidobacteria in healthy humans. J Nutr 129: 113-116.
Dubois  M,  Gilles  K,  Hamilton  J,  Roberts  P,  Smith  F.  1956. Colorimeteric method for determining sugars and related substances. Analytical Chemistry 28:350-354.
Ducluzeau  RP,  Gouet  P,  Williams  PEV.  1991.  Probiotics  in Ruminants.  Di  dalam Jouany  JP  (ed.).  Rumen  Microbial Metabolism and Ruminant Digestion. INRA, Paris.
FAO/WHO  [Food  and  Agriculture  Organization/World  Health Organization].  2006.  Probiotics  in  food:  Health  and nutritional  properties  and  guidelines  for  evaluation. FAO/WHO, Roma.
Franck A. 2008. Food applications of prebiotics. Dalam Gibson GR,  Roberfroid  MR  (eds).  Handbook  of  Prebiotics.  P. 437-448. CRC Press, Boca Raton.
Franz  Z,  Jane  AW,  Hanz  K.  1998.  Bacteriocins  of  Lactic  Acid Bacteria. Marcel Dekker, Inc., New York.
Gibson  GR,  Angus  F.  2000.  LFRA  Ingredients  Handbook  of Prebiotics  and  Probiotics.  Leatherhead  Food  RA Publishing Limited, UK.
Gibson  GR,  Roberfroid  M.  1995.  Dietary  modulation  of  human colonic microbiota – introducingthe concept of prebiotics. J Nutr 125: 1401-1412.
Gropper SS, Smith JL, Groff JR. 2009. Advanced Nutrition and Human Metabolism. Wadsworth Publishing, USA.
Hartanti  WH.  Evaluasi  Aktivitas  Antidiare  Isolat Lactobacillus dari Air Susu Ibu. Tesis. Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
Kurmann  JA,  Rasic  JL.  1991.  The  health  potential  of  products containing  bifidobacteria.  Di  dalam  Robinson  RK  (ed). Therapeutic Properties of Fermented Milks. Elsevier Appl Sci., London.
Loo JV, Vancraeynest D. 2008. Prebiotics and animal nutrition. Di  dalam  Gibson  GR  dan  Roberfroid  MR  (Eds.). Handbook of Prebiotics. CRC Press, Boca Raton, USA.
0 1 2 3 4 5 6 7 0 24 48 Ko ns en tra si G ula P er ed uk si (% ) Waktu (jam) Skim Skim+FOS
Skim+Inulin Skim+Inulin:GOS
Macfartane  GT,  Steed  H,  Macfartane  S.  2008.  Bacterial metabolism  and  health  related  effects  of  galactooligo- saccharides amd other prebiotics. J of Appl Microbiol 104: 305-344.
Manning  TS,  Gibson,  GR.  2004.  Prebiotics.  Best  Practice Clinical Gastroenterology 18(2): 287-298.
Manning  TS,  Rastall  R,  Gibson  G.  2004.  Prebiotics  and  lactic acid bacteria. Dalam Salminen S, Wright AV, Ouwehand A (Eds). Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects 3 th Edition, Revised and Expanded. P. 419-430. Marcel Dekker, Inc., New York.
Mitsuoka  T,  Hidaka  H,  Eida  T.  1987.  Effect  of  fructo- oligosaccharides  on  intestinal  microflora.  Food/Nahrung, 31: 427–436.
Moro G, Minoli I, Mosca M, Fanaro S, Jelinek J, Stahl B, Boehm G.  2002.  Dosage–related  bifidogenic  effects  of  galacto and fructo-oligosaccharides in formula-fed term infants. J Pediatric Gastroenterol Nutr 34: 291-295.
Nakamura T, Ogata Y, Shitasa A, Nakamura A, Ohta K. 1995. Continuous  production  of  fructose  syrups  from  inulin  by immobilized inulinase from Aspergillus niger Mutan 817. J of Fermentation and Bioeng 80(2): 164-169.
Nuraida L, Hana, Dwiari SR, Faridah DN. 2008. Pengujian sifat prebiotik  dan  sinbiotik  produk  olahan  ubi  jalar  secara in vivo . J Teknol dan Industri Pangan 19(2): 89-96.
Nuraida L, Susanti, Hartanti AW. 2007. Lactic acid bacteria and Bifidobacteria profile  of  breast  milk  and  their  potency  as probiotics.  10 th ASEAN  Food  Conference.  Food  for Mankind-Contribution  of  Science  and  Technology  21-23 August. Kuala Lumpur, Malaysia.
Pedreschi  R,  Campos  D,  Noratto  G,  Chirinos  R,  Cisneros- Zevallos  L.  2003.  Andean  yacon  root  ( Smallanthus sonchifolius Poepp.  Endl)  fructooligosaccharides  as  a potential  novel  source  of  prebiotics.  J  Agric  Food  Chem 51(8): 5278-5284 .
Saulnier DMA, Molenaar D, de Vos WM, Gibson GR, Kolida S.
2007.  Identification  of  prebiotic  fructooligosaccharide
metabolism  in Lactobacillus plantarum  WCFSI  trough microarrays. J Appl and Env Microbial 73: 1753-1765.
SCF [Scientific Committee on Food]. 2001a.  Statement on the use  of  resistant  short  chain  carbohydrates  (oligofructose and  oligogalactose)  in  infant  formulae  and  in  follow-on formulae.  Opinion  expressed  on  26  September  2001. http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf-out103-en.pdf  [20  Juli 2010].
SCF  [Scientific  Committee  on  Food].  2001b.  Additional statement  on  the  use  of  resistant  short  chain carbohydrates  (oligofructosyl-saccharose  and  oligo- galactosyl-lactose)  in  infant  formulae  and  in  follow-on formulae.  Opinion  expressed  on  13  December  2001. http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf-out109-en.pdf  [20  Juli 2010].
Semjonovs  P,  Danilevics  A,  Upite  D,  Kaminska  E,  Runca  E, Marauska  M,  Bekers  V.  2008.  Synbiotic  properties  of functional food additive from jerusalem artichoke tubers in regard to lactic acid bacteria starter cultures for fermented foods.  Proceeding  "The  3rd  Baltic  Conference  on  Food Science  and  Technology"  17-18  April  2008,  Jelgava, Lithuania.  http://llufb.llu.lv/conference/foodbalt/Foodbalt- Proceedings-2008.pdf. [6 Februari 2011].
Shin  SH,  Lee  JH,  Pestika  JJ,  Ustunol  Z.  2000.  Growth  and viability  of  commercial  Bifidobacterium  spp  in  skim  milk containing oligosaccharides and inulin. J Food Sci 65(5): 884-887.
Takeda Y, Hanashiro M. 2003. Examination of the structure of amylase  and  amylo-pectin  by  fluorescent  labeling terminal. J Appl Glyco-science 48: 123-130.
Widdel F. 2007. Theory and measurement of bacterial growth. Di  dalam  Grundpraktikum  Mikrobiologie,  4  Sem  (B.Sc). Universitat Bremen.
Yoon  MY,  Hwang  HJ.  2008.  Reduction  of  soybean oligosaccharides  and  properties  of  α-D-galactosidase from L. curvatus R08 and L. mesenteriodes JK55. J Food Microbiology 25: 815-823.