## BIOSINTESIS BIOSURFAKTAN OLEH PSEUDOMONAS AERUGINOSA MENGGUNAKAN LIMBAH CAIR INDUSTRI TAPIOKA SEBAGAI MEDIA
( BIOSYNTHESIS OF BIOSURFACTANT BY PSEUDOMONAS AERUGINOSA USING CASSAVA FLOUR INDUSTRIAL WASTEWATER AS MEDIA )
Venty Suryanti * , Sri Hastuti, Desi Suci Handayani, Windrawati
Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Sebelas Maret, Jl. Ir. Sutami 36A, Surakarta, Jawa Tengah 57126, Telp. (0271) 663375
*email: venty_s@yahoo.com
Received 21 October 2013, Accepted 23 January 2014, Published 04 March 2014

## ABSTRAK
Telah  dilakukan  biosintesis  biosurfaktan  oleh Pseudomonas  aeruginosa menggunakan  media  limbah  cair  industri  tapioka  ( manipueira ).  Penggunaan  campuran media nutrient  broth dan manipueira tanpa  sentrigusi  (NBM)  dengan  lama  fermentasi  4 hari  merupakan  kondisi  optimum  untuk  sintesis  biosurfaktan.  Analisa  spektrofotometer UV-Vis  dan  FT-IR  menunjukkan  bahwa  biosurfaktan  merupakan  rhamnolipida  yang mempunyai gugus hidroksi, ester, karboksilat dan rantai alifatik. Biosurfaktan mempunyai nilai  konsentrasi  kritis  misel  (KKM)  576  mg/L  dengan  tegangan  muka  0,045  N/m. Biosurfaktan  ini dapat  menurunkan  tegangan  muka  dan  membentuk  emulsi  dengan beberapa  senyawa  hidrokarbon  yaitu  benzena,  toluen,  premium  dan  minyak  sawit. Biosurfaktan mempunyai sistem emulsi w/o.
Kata  Kunci  : biosintesis,  biosurfaktan,  limbah  cair  industri  tapioka, Pseudomonas aeruginosa

## ABSTRACT
Biosynthesis  of  biosurfactant  by Pseudomonas  aeruginosa have  been  prepared using  cassava  flour  industrial  wastewater  ( manipueira )  as  medium.  The  optimum condition  of  the  biosurfactans  biosynthesis  was obtained  using  media containing  nutrient broth  and  manipueira  without  centrifugation  (NBM)  with  4  days  fermentation.  UV-Vis and FT-IR spectra indicated that the biosurfactant was a rhamnolipid containing hydroxyl, ester,  carbocylic  and  aliphatic  carbon  chain  functional  groups.  Biosurfactant  exhibited critical  micelle  concentration  (CMC)  value  of  576    mg/L  and  surface  tension  value  of 0.045    N/m.  The  biosurfactant  was  able  to  decrease  the  interface  tension  and  form emulsion  with  benzene,  toluene,  gasoline  and  palm  oil.  This  biosurfactant  showed  w/o emulsion system.
Keywords : biosynthesis, biosurfactant, manipueira , Pseudomonas aeruginosa

## PENDAHULUAN
Surfaktan banyak digunakan sebagai zat pengemulsi ( emulsifier ), wetting agent dan detergent dalam  dunia  industri.  Ada  dua  jenis  surfaktan  yaitu  surfaktan  sintetis  dan biosurfaktan.  Surfaktan  sintetis  sebagian  besar  dibuat  dari  petroleum  dan  memiliki  sifat tidak  dapat  terurai  secara  biologis  ( biodegradable )  sehingga  menyebabkan  masalah  bagi lingkungan.  Biosurfaktan  dibuat  dari  bahan  organik  melalui  proses  biotransformasi  oleh mikroorganisme  dan  memiliki  sifat biodegradable sehingga  ramah  bagi  lingkungan (Ghazali and Ahmad,  1997;  Kosaric,  2001).  Biosurfaktan  masih  kurang  diminati dibandingkan  surfaktan  sintetis  karena  pembuatan  biosurfaktan  memerlukan  biaya  yang tinggi.
Beberapa  penelitian  telah  dilakukan  dalam  pembuatan  biosurfaktan  dengan memanfaatkan  limbah  sebagai  substrat  dengan  tujuan  untuk  menurunkan  biaya  produksi biosurfaktan (Nitschke, 2004). Assadi et al. . (1998) menggunakan molasses sebagai media fermentasi  dalam  produksi  biosurfaktan  oleh P.  aeruginosa .  Haba and Espuny  (1999) menggunakan  limbah  minyak  goreng  sebagai  media  fermentasi  dalam  produksi biosurfaktan oleh P. aeruginosa.
Salah satu agroindustri yang berkembang di Indonesia adalah industri tapioka yang mengolah  ketela  pohon  menjadi  tepung  tapioka.  Perlu  dilakukan  penanganan  limbah tapioka  yang  tepat,  sehingga  selain  dapat  meminimalisasi  dampak  buruk  terhadap lingkungan  juga  dapat  menghasilkan  produk  yang  lebih  bermanfaat  (Adewoye and Fawale,  2005).  Limbah  cair  industri  tapioka  ( manipueira )  mengandung  bahan-bahan organik  yang  cukup  tinggi  antara  lain  karbohidrat,  amonia  dan  beberapa  bahan  organik lain dalam jumlah yang lebih kecil seperti nitrit, nitrat, sianida, fosfat dan beberapa logam yang diperlukan dalam pertumbuhan bakteri, seperti besi, tembaga, mangan dan seng oleh karena itu dapat dimanfaatkan sebagai substrat untuk pertumbuhan bakteri (Imam, 2006). Nitschke et  al. (2004)  telah  berhasil  memanfaatkan manipueira sebagai  substrat  dalam pembuatan biosurfaktan oleh Baccilus sp menghasilkan rhamnolipida.
Beberapa  penelitian  menunjukkan  bahwa  bakteri Pseudomonas  aeruginosa dapat digunakan dalam pembuatan  biosurfaktan. Patel and Desai (1997) telah  menggunakan P. aeruginosa menggunakan  limbah  tetes  tebu  ( molasses )  sebagai  sumber  karbon menghasilkan biosurfaktan jenis rhamnolipida. Anna et al. (2002) mensintesis rhamolipida secara biotransformasi menggunakan substrat gliserol, n-heksadekana, minyak parafin, dan babassu oil oleh P. aeruginosa .  Rhamnolipida  juga telah disintesis oleh  mikroorganisme
P. aeruginosa menggunakan sumber karbon premium, minyak paraffin, gliserol dan whey oleh Rashedi et al. (2005).
Pada  penelitian  ini  dilakukan  biosintesis  biosurfaktan  dengan  memanfaatkan manipueira sebagai media oleh P. aeruginosa sehingga dapat menghasilkan produk yang lebih  bermanfaat  dan  juga  dapat  meminimalisasi  dampak  negatif  limbah  terhadap lingkungan.

## METODE PENELITIAN
Limbah  cair  industri  tapioka  yang  digunakan  berasal  dari  PT.  Bumi  Karya  di Kecamatan  Selogiri,  Kabupaten  Wonogiri.  Bahan-bahan  lain  yang  digunakan  adalah nutrient  agar , nutrient  broth ,  NaCl,  HCl,  NaOH,  kloroform,  metanol,  rhamnosa,  orsinol, H 2 SO 4 , inokulum P. aeruginosa FNCC 063 yang diperoleh dari PAU UGM, minyak sawit, toluen, benzene and premium.
Alat-alat  yang  digunakan  adalah  autoclave  (Ogawa  Seiki  Co,  LTD.),  sentrifuge (Sorvall  Super  T21),  vortex  Mixer  (Gemmy  Industrial,  Corp.),  neraca  analitis  (Mettler Toledo  AT400),  spektrofotometer  UV-Vis  (Shimadzu  UV-160  1PC),  rotary  evaporator (Bibby  RE100),  konduktivitimeter  (CE  Jenway  4071),  seperangkat  alat  metode  kenaikan kapiler, seperangkat alat pengukuran indeks emulsi dan shaker (IKA Labortechnik).
Penelitian  ini  dilakukan  di  Sub  Lab.  Biologi  Lab  Pusat  MIPA  UNS  sedangkan identifikasi spektra FT-IR dilakukan di Lab Kimia FMIPA UGM Yogyakarta.
Optimasi  kondisi  sintesis  biosurfaktan  dilakukan  dengan  variasi  komposisi  media fermentasi, yaitu: (1) manipuera tanpa sentrifugasi (M), (2) nutrient broth dan manipuera tanpa sentrifugasi (NBM), (3) manipuera dengan sentrifugasi (MS) dan (4) nutrient broth dan manipuera dengan  sentrifugasi  (NBMS),  sedangkan  media  (5) nutrient  broth (NB) digunakan  sebagai  kontrol. Nutrient  broth yang  digunakan  adalah  8  g/L.  Semua  media mengandung 5 g/L NaCl.  Fermentasi dilakukan  selama 12  hari pada  suhu kamar  dengan kecepatan aerasi 100 rpm.
Parameter optimasi kondisi meliputi:
1. Kepadatan sel ( Optical density )
Kepadatan  sel  ditentukan  dengan  mengukur  absorbansi  pada  panjang  gelombang 365 nm menggunakan spektroskopi UV-Vis.
2. E-24 (indeks emulsi)
E-24  ditentukan  dengan  mencampur  media  fermentasi  dengan  minyak sawit/senyawa hidrokarbon dengan perbandingan volume 1:1. Larutan tersebut kemudian
divortex  selama  1  menit  dan  dibiarkan  selama  24  jam.  Kemudian  tinggi  emulsi  yang terjadi dan tinggi total larutan diukur.
3. Tegangan muka
Tegangan  muka  ditentukan  dengan  metode  kenaikan  pipa  kapiler,  yaitu  dengan menambahkan minyak sawit dalam media fermentasi dengan perbandingan 1:1, kemudian divortex selama satu menit dan diukur kenaikan kapilernya
Biosurfaktan  hasil  biotransformasi  bersifat  ekstraseluler,  yaitu  biosurfaktan  tidak terdapat  dalam  sel  bakteri  yang  digunakan  melainkan  diekskresikan  ke  luar  sel  (Ghazali and Ahmad,  1997),  sehingga  biosurfaktan  hasil  produksi  terakumulasi  pada  media fermentasi.
Recovery biosurfaktan dilakukan dengan ekstraksi media fermentasi menggunakan pelarut kloroform dan metanol (2:1). Identifikasi biosurfaktan berdasarkan spektra UV-Vis dan  FT-IR  sedangkan  karakterisasi  biosurfaktan  meliputi  penentuan  konsentrasi  kritik misel  (KKM)  dan  sistem  emulsi.  Penentuan  KKM  dan  sistem  emulsi  dilakukan  dengan cara sebagai berikut:

## 1.   KKM
KKM ditentukan dengan pengukuran tegangan muka terhadap biosurfaktan dengan variasi  konsentrasi  dalam  pelarut  air.  Grafik  tegangan  muka vs akar  konsentrasi biosurfaktan  dibuat  untuk  mengetahui  perubahan  tegangan  muka  yang  mendadak  yang merupakan harga KKM.
2. Sistem emulsi
Biosurfaktan  ditambahkan  pada  campuran  1  mL  minyak  sawit  dan  1  mL  air kemudian  divortex  hingga  bercampur  dan  kemudian  diukur  konduktivitasnya.  Garam NaCl sebanyak 1, 2, 3 dan 4 % (b/b) ditambahkan ke dalam emulsi dan kemudian diukur konduktivitasnya.
Uji aktivitas sebagai zat pengemulsi terhadap  beberapa jenis hidrokarbon  meliputi tegangan antar muka, E-24 dan stabilitas emulsi.

## PEMBAHASAN

## Penentuan kondisi optimum dalam biosintesis biosurfaktan
Variasi  perlakuan  awal  media  adalah  dilakukan  atau  tidaknya  pemisahan amilopektin (pati  tak  larut)  dengan  cara  men-sentrifugasi manipueira yang  telah dipanaskan  terlebih  dahulu,  sehingga  yang  tersisa  dalam  media  adalah amilosa (pati terlarut).  Hal  ini  akan  berpengaruh  pada  komposisi manipueira sehingga  mempengaruhi
kandungan  nutrisi  dalam  media  fermentasi.  Selain  itu,  dilakukan  juga  variasi  komposisi, yaitu dengan atau tanpa penambahan nutrient broth .
Gambar 1 . Pertumbuhan P. aeruginosa pada berbagai media: (a) Kepadatan sel, (b) Tegangan permukaan, dan (c) Indeks emulsi.
Kondisi  optimum  ditunjukkan  dengan  kepadatan  sel,  penurunan  tegangan  muka dan indek emulsi  yang paling besar  yang disajikan dalam Gambar 1. Uji statistik Duncan menunjukkan  bahwa  media  NBM  merupakan  media  fermentasi  yang  paling  baik  dengan lama  fermentasi  4  hari.  Media  NBM  yang  merupakan  campuran  dari nutrient  broth dan
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 2 4 6 8 10 12 14 K ep a d a tan S el Waktu (Hari) NB NBMS NBM MS M 0.04 0.045 0.05 0.055 0.06 0.065 0.07 0 2 4 6 8 10 12 14 T ega n ga n P er m u k aan ( N /m ) Waktu (Hari) NB NBMS NBM MS M 25 35 45 55 65 75 0 2 4 6 8 10 12 14 In d ek s E m u ls i (% ) Waktu (Hari) NB NBMS NBM MS M (c) (a) (b)
manipueira mempunyai  kandungan  nutrisi  yang  relatif  lebih  banyak  dan  komplit  untuk pertumbahan bakteri P. aeruginosa untuk menghasilkan biosurfaktan.

## Identifikasi biosurfaktan
a. Identifikasi rhamnolipid
Rhamnosa dan biosurfaktan mempunyai serapan maksimum yang sama yaitu pada panjang  gelombang  422  nm.  Panjang  gelombang  maksimum  rhamnosa  yang  diperoleh mendekati  panjang  gelombang  maksimum  rhamnosa  yang  diperoleh  Tahzibi dan Assadi (2004) yaitu pada 421 nm. Dari penjelasan tersebut dapat disimpulkan bahwa biosurfaktan mengandung  gugus  rhamnosa.  Sejauh  ini  dari  penelitian  biotransformasi  yang  telah dilakukan, biosurfaktan yang mengandung rhamnosa adalah rhamnolipida (Noordman and Janssen,  2002),  sehingga  biosurfaktan  hasil  biotransformasi  kemungkinan  adalah biosurfaktan jenis rhamnolipida.
b. Identifikasi gugus-gugus fungsi
Identifikasi  dengan  FT-IR  menunjukkan  bahwa  biosurfaktan mengandung  gugus- gugus  yang terdapat pada senyawa rhamnolipida.  Biosurfaktan  mempunyai  serapan  yang kuat pada 3402  cm -1 yang  merupakan serapan  OH,  yang kemungkinan  adalah gugus OH pada  rhamnopiranosil.  Biosurfaktan  juga  mempunyai  rantai  panjang  alifatik  yang ditunjukkan dengan munculnya serapan khas C-H hidrokarbon  pada 2927 dan 2854 cm -1 , yang didukung dengan munculnya serapan gugus C-H metil pada 1458 cm -1 dan gugus C- H metilen pada 1377 cm -1 .
1 .  R 1 =L- -rhamnopiranosil-,
R 2 = -asam hidroksidekanoat
2 .  R 1 =H, R 2 = -asam hidroksidekanoat
3 .  R 1 = L- -rhamnopiranosil-, R 2 =H 4 .  R 1 = H, R 2 =H

## Gambar 2 . Struktur rhamnolipida
Serapan  gugus  karbonil  (C=O)  pada  1654  cm -1 menunjukkan  bahwa  biosurfaktan merupakan  senyawa  karboksilat  yang  didukung  dengan  munculnya  serapan  C-O karboksilat  pada  1253  cm -1 .  Serapan  gugus  karbonil  tersebut  juga  menunjukkan  adanya
OH O O O OH CH 3 R 1 H C (CH 2 ) 6 C H 2 CH 3 C O O R 2
gugus ester, yang didukung dengan munculnya serapan pada  1056 cm -1 yang  merupakan serapan  gugus  C-O  ester.  Hal  ini  menunjukkan  adanya  kemungkinan  R 2 pada  struktur rhamnolipida  adalah  asam -hidroksidekanoat,  sehingga  biosurfaktan  yang  diperoleh kemungkinan adalah rhamnolipida jenis 1 atau 2 (Gambar 2).
3. Karakterisasi Biosurfaktan
a. KKM
Nilai  KKM  yang  diperoleh  adalah  sebesar  576  mg/L  dengan  tegangan  muka sebesar  0,045  N/m.  Nilai  ini  mendekati  nilai  yang  diperoleh  Tahzibi and Assadi  (2004) yang  menunjukkan  bahwa  biosurfaktan  yang  dihasilkan  oleh P.  aeruginosa dapat mempunyai tegangan permukaan  sebesar 0,03-0,06 N/m dengan  nilai  KKM  sebesar 500- 1000 m/L.
b. Sistem Emulsi
Sistem emulsi  biosurfaktan ditentukan dengan pengukuran nilai daya hantar listrik (DHL) emulsi yang dibuat antara air, minyak sawit dan biosurfaktan sebelum dan sesudah penambahan zat elektrolit NaCl (Lestari, 2003).
Sebagai kontrol, air mengalami kenaikan DHL setelah penambahan NaCl dan terus meningkat dengan  meningkatnya konsentrasi NaCl. Sedangkan untuk  minyak sawit, nilai DHL adalah nol baik sebelum maupun setelah penambahan NaCl karena NaCl tidak dapat larut  dalam  minyak  sawit.  Untuk  sistem  emulsi  tanpa  penambahan  biosurfaktan  juga menunjukkan nilai DHL nol baik sebelum maupun setelah penambahan NaCl, yang berarti nilai DHL tetap, begitu juga untuk sistem emulsi dengan penambahan biosurfaktan hal ini dimungkinkan minyak sawit sebagai fasa pendispersi, dimana fasa pendispersi inilah yang nantinya  akan  berinteraksi  dengan  NaCl.  Karena  NaCl  tidak  larut  dalam  minyak  sawit, maka  tidak  ada  kenaikan  nilai  DHL  setelah  penambahan  NaCl.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  sistem  emulsi  yang  terbentuk  adalah  air  dalam  minyak  (w/o),  dimana  gugus hidrofiliknya  mengarah  ke  dalam  dan  berinteraksi  dengan  air  yang  merupakan  fase terdispersi  sedangkan  gugus  hidrofobiknya  mengarah  ke  luar  karena  fase  pendispersinya adalah minyak.
Untuk mengetahui sistem emulsi, biosurfaktan juga dibandingkan dengan surfaktan komersial  yaitu  Triton  X-100  (o/w)  dan  Span-60  (w/o).  Emulsi  yang  diperoleh  diuji dengan cara yang berbeda untuk o/w dan w/o. Pada w/o diteteskan minyak kemudian air, pada  saat  ditetesi  minyak  tidak  berubah  sedangkan  saat  ditetesi  air  berubah.  Pada  sistem emulsi o/w dilakukan uji dengan meneteskan air kemudian minyak. Saat ditetesi air tidak
berubah  sedangkan  saat  ditetesi  dengan  minyak  terjadi  perubahan.  Dalam  uji  ini didapatkan bahwa biosurfaktan memiliki perubahan yang sama dengan Span-60, sehingga didapatkan bahwa sistem emulsi dari biosurfaktan adalah w/o seperti pada Span-60.
c. Uji aktivitas sebagai zat pengemulsi terhadap beberapa jenis hidrokarbon
Biosurfaktan  mempunyai  kemampuan  menurunkan  tegangan  antarmuka  air  dan beberapa  senyawa  hidokarbon,  yaitu  benzen,  toluen, premium dan    minyak sawit  sebesar antara  10-51  %.  Penurunan  tegangan  antarmuka  tertinggi  diperoleh  pada  emulsi  air  dan minyak sawit, yaitu sebesar 51 %.
d. E-24 dan Kestabilan Emulsi
Penambahan  biosurfaktan  menunjukkan  adanya  indeks  emulsi  yang  relatif  besar untuk minyak sawit (sebesar 50 %), premium (sebesar 45 %), toluen (42 %) dan benzena (sebesar  32  %).  Emulsi  premium  mampu  bertahan  (stabil)  hingga  30  hari,  minyak  sawit hingga  22  hari  sedangkan  untuk  toluen  dan  benzena  masing-masing  bertahan  hingga  14 dan 5 hari.

## KESIMPULAN
1. Manipuera dapat digunakan sebagi  media dalam  sintesis  biosurfaktan dengan kondisi optimum media NBM ( nutrient broth dan manipuera tanpa sentrifugasi) dengan  lama fermentasi 4 hari.
2. Biosurfaktan  yang  diperoleh  merupakan  suatu  rhamnolipida  yang  mempunyai  gugus hidroksi, ester, karboksilat, metil dan metilen.
3. Biosurfaktan mempunyai nilai KKM sebesar 576 mg/L dengan tegangan muka sebesar 0,045 N/m serta mempunyai sistem emulsi minyak dalam air (w/o).
4. Biosurfaktan  mempunyai  kemampuan  menurunkan  tegangan  antarmuka  emulsi benzen,  toluen, premium  atau    minyak  sawit sebesar antara 10-51  %. Emulsi  minyak sawit  mempunyai  indeks  emulsi  terbesar  yaitu  sebesar  50  %,  sedangkan  kestabilan emulsi hingga 30 hari diperoleh pada emulsi minyak premium.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terimakasih  kepada  Dinas  Pendidikan  dan  Kebudayaan Propinsi  Jawa  Tengah  melalui  Program  Fasilitasi  Penelitian  Terapan  tahun  2005  yang telah memberikan dana untuk penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Adewoye,  S.O.,  and  Fawale,  O.O.,  2005, Toxicity  of  Cassava  Wastewater  to  African Catfish , Faculty of Science, Addis Abba, Ethiopia.
Anna,  L.M.S.,  Sebastian,  G.V.,  Menezes,  E.P.,  Alves,  T.L.M.,  Santos,  A.S.,  Pereira,  N., and  Freire,  D.M.G.,  2002,  Production  of  Biosurfactants  from P.  aeruginosa PA1 Isolated in Oil Environments, Brazilian Journal of Chemical Engineering , vol. 19, pp. 159-166.
Assadi,  M.M.,  Rashedi,  H.,  Bonakdapour,  B.,  Jashmidi,  E.,  and  Levin,  M.,  1998, Biosurfactant Production by P. aeruginosa, Biotechnology Center , Iranian.
Ghazali, R., and Ahmad, S., 1997, Biosurfactants : A Review. Palm Oil Research Institute of Malaysia , Kuala Lumpur, pp. 34-35.
Haba,  E.,  and  Espuny,  M.J.,  2000,  Screening  and  Production  of  Rhamnolipids  by  P. aerugenosa 47T2 NCIB 40044 from  Waste Frying Oils, Spain  of  Journal  Applied Microbiology , vol. 88, pp. 379-387.
Imam,  A.,  2006, Produksi  Hidrosilat  Pati  dan  Serat  Pangan  dari  Singkong  dengan Hidrolisis Asam Klorida , Departemen Industri Pertanian.
Kosaric,  N.,  2001,  Biosurfactants  and  Their  Application  for  Soil  Bioremediation, Food Technol. Biotechnol. , vol. 39, pp. 295-296.
Lestari, A., 2003, Identifikasi Senyawa Fosfolipida pada Soya Lesitin Komersial dan Soya Lesitin  Hasil  Isolasi  dari  Santan  Kelapa ,  Skripsi,  Jurusan  Kimia,  Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Nitschke,  M.,  2004,  Selection  of  Microorganism  for  Biosurfactant  Production  using Agroindustrial Wastes, Brazilian Journal of Microbiology , vol. 35, pp. 81-85.
Noordman,  W.H.,  and  Janssen,  D.B.,  2002,  Rhamnolipid  Stimulates  Uptake  of Hydrophobic  Compounds  by P.  aeruginosa, Applied  and  Environmental  Biology, vol. 68, pp. 4502-4508.
Patel,  R.M.,  and  Desai  A.J.,  1997,  Biosurfactant  Production  by  P.  aeruginosa  GS3  from Molasses, Letter in Applied Microbiology , vol 25, pp. 91-94.
Rashedi,  H.,  Jamshidi,  E.,  Assadi,  M.M.  and  Bonakdarpour,  B.,  2005,  Isolation  and Production  of  Biosurfactant  from  Pseudomonas  aeruginosa  Isolated  from  Iranian Southern Wells Oil, Int. J. Environ. Sci. Tech , vol.2, pp. 121-127.
Tahzibi,  A.K.  and  Assadi,  M.M.,  2004,  Improved  Production  of  Rhamnolipids  by  a P. aeruginosa Mutant, Iranian Biomedical Journal , vol. 8, pp. 23-31.