## SITOTOKSISITAS SENYAWA HASIL ISOLASI DAUN TITHONIA DIVERSIFOLIA (HEMSLEY) A. GRAY)
TERHADAP SEL T47D, MCF7 DAN EVSA-T

## SITOTOXICITY OF COMPOUND ISOLATED FROM THE LEAVES OF
TITHONIA DIVERSIFOLIA (HEMSLEY) A.GRAY) AGAINST T47D, MCF-7 AND EVSA-T CELLS
Arfian Bela Mahardika 1) Subagus Wahyuono 2) Mae Sri Hartati Wahyuningsih 3)
1) Alumni Mahasiswa Fakultas Farmasi, UGM 2) Fakultas Farmasi, UGM
3) Fakultas Kedokteran, UGM

## ABSTRAK
Tanaman  kembang  bulan  ( Tithonia  diversifolia (Hemsley)  A.  Gray) merupakan  salah  satu  tanaman  yang  secara  tradisional  digunakan  masyarakat untuk  mengobati  berbagai  penyakit.  Penelitian  awal  menggunakan  metode Bioassay  Guided  Isolation telah  diperoleh  senyawa  aktif  (MTT  sel  HeLa;  IC 50 9,776  g/mL). Efek sitotoksik senyawa aktif terhadap sel kanker payudara belum diketahui.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  sitotoksisitas  senyawa  aktif hasil isolasi daun T. diversifolia terhadap sel kanker payudara T47D, MCF-7 dan EVSA-T  dengan  menghitung  nilai  IC 50 -nya.  Senyawa  hasil  isolasi  daun T. diversifolia diuji  aktivitas  sitotoksiknya  terhadap  sel  kanker  payudara  T47D, MCF-7  dan  EVSA-T  menggunakan  metode  MTT  dengan  seri  kadar  0,39-50 µg/mL.  Setiap  kelompok  kadar  dilakukan  triplikat  dan  dihitung  persentase penghambatan  pertumbuhan  sel  T47D,  MCF-7  dan  EVSA-T  dengan  analisis probit  untuk  menghitung  IC 50 -nya.  Hasil  uji  menunjukkan  bahwa  isolat  aktif memiliki  efek  sitotoksik  terhadap  sel  T47D,  MCF-7  dan  EVSA-T  dengan  nilai IC 50 berturut-turut  adalah  (2,44;  4,697;  3,522)  μg/mL,  sehingga  potensial dikembangkan sebagai agen antikanker khususnya kanker payudara.
Kata Kunci: Tithonia diversifolia , sitotoksisitas, sel kanker payudara, MTT

## ABSTRACT
Tithonia  diversifolia (Hemsley)  A.  Gray)  is  one  of  the  plants  that  are traditionally  used  to  treat  various  diseases.  The  previous  studies  using  Bioassay Guided  Isolation  methods  has  obtained  the  active  compound  (MTT,  HeLa  cells; IC50  9.776  g  /  mL).  The  cytotoxic  effects  of  active  compounds  against  breast cancer  cells  is  unknown.  This  study  aims  to  determine  the  cytotoxicity  of  the active compound isolated from the leaves of T. diversifolia on breast cancer cells (T47D; MCF-7 and EVSA-T). The isolated compounds from T. diversifolia tested their cytotoxicity against breast cancer cells (T47D, MCF-7 and EVSA-T), using MTT  method  with  a  series  of  concentration  of  0.39  to  50  ug/mL.  Each concentration  of  the  group  performed  triplicate  and  calculated  the  percentage  of cell  growth  inhibition  with  probit  analysis  to  calculate  the  IC 50 value.  The  test results showed that the active compound have a cytotoxic effect on T47D, MCF-7 and  EVSA-T  cells  with  IC 50 values  are  respectively  (2.44;  4.697;  3.522)  ug/mL, so  this  compound  potential  to  be  developed  as  an  anticancer  agent,  especially breastcancer.
Keywords: Tithonia diversifolia , cytotoxicity, breast cancer cells, MTT

## PENDAHULUAN
Kanker payudara berada pada urutan  ke-2  dari  sejumlah  kanker yang diderita wanita Amerika Serikat,  Indonesia,  dan  negara  lain pada  umumnya  (Medina  &  Kittrell 2003).  Di  RSUP  DR.  Sardjito Yogyakarta,  setiap  tahun  ada  250 hingga  300  kasus  baru  kanker payudara dan kecenderungan penderita  penyakit  kanker  payudara dialami perempuan dalam usia relatif lebih  muda:  antara  30  sampai  45 tahun (Anonin, 2012 ) Obat antikanker atau sitostatika  adalah  obat  yang  dapat menghentikan  pertumbuhan  sel-sel kanker. Agar supaya terapi keganasan  ini  dapat  berhasil  dengan baik,  maka  prinsip    kerja  obat antikanker harus dapat membasmi sel kanker secara total. Mekanisme kerja obat  antikanker  ini  didasarkan  atas terjadinya  gangguan  pada  salah  satu proses  sel  yang  essensial  (Nafrialdi and  Gan,  1995).  Oleh  karena  itu sangat  diperlukan  adanya  penemuan obat  baru  yang  mempunyai  efek sitotoksik yang baik pada sel kanker. Pencarian  obat  kanker  sekarang semakin  menarik  dengan  semakin tingginya  gerakan  kembali  ke  alam, yaitu dengan pemanfaatan fitofarmaka,  menggali  kandungan unsur kimiawi dalam tumbuh- tumbuhan  yang  potensial  dapat dipakai  sebagai  obat  (Ganiswara  & Nafrialdi, 1995).
Salah  satu  tanaman  yang banyak  diteliti  manfaatnya  sebagai antikanker  adalah  tanaman  kembang bulan [ Tithonia diversifolia (Hemsley)  A.  Gray].  Goffin  ( 2002) melaporkan  bahwa  ekstrak  eter kembang  bulan  mempunyai  efek sitotoksik pada sel HTC-116.
Dilaporkan juga bahwa  ekstrak ethyl asetat  dari  tanaman T.  diversifolia dapat  menghambat  proliferasi  sel kanker  kolon  (Col-2),  sedangkan ekstrak alkohol menunjukkan aktivitas sebagai antileukemia (Gu et al., 2002;  Nabin et  al., 1979). Ekstrak  terpurifikasi  dari  ekstrak kloroform T.  diversifolia memiliki efek  sitotoksik  terhadap  sel  HeLa dengan  nilai  IC 50 =3,078µg/ml  dan Indek  Selektivitas  sebesar  26.09 (Wahyuningsih et al., 2013). Senyawa aktif telah berhasil diisolasi dari ekstrak kloroform daun Kembang Bulan menggunakan metode Bioassay  Guided  Isolation (MTT pada sel Hela, IC 50 = 9,776  g/ml)  (Wahyuningsih et  al., 2008).
Sel T47D, MCF-7 dan EVSA-T  merupakan  contoh  dari  sel kanker  payudara.  Sel  T47D  adalah sel  kanker  payudara  manusia  yang bersifat  ER/ progesterone  receptor- positif dan berasal dari cairan pleural. Sel ini mengekspresikan suatu mutan dari  protein  p53  dan  sel  ini  sangat sensitif  terhadap  efek  stimulan  dari estradiol  (Schafer et  al., 2000).  Sel MCF-7 merupakan sel kanker payudara  yang  diambil  dari  jaringan payudara  seorang  wanita  Kaukasian berumur 69 tahun golongan darah O, dengan  Rh  positif,  berupa  sel adherent (melekat) yang dapat ditumbuhkan dalam media
penumbuh  DMEM  atau  RPMI  yang mengandung  foetal  bovine  serum (FBS)  10%  dan  antibiotik  Penicilin- Streptomycin  1%  (Anonim,  2007). Sel  MCF-7  memiliki  karakteristik antara  lain  resisten  agen  kemoterapi (Mechetner et  al .,  1998;  Aouali et al ., 2003), mengekspresikan reseptor
estrogen  (ER  +),  overekspresi  Bcl-2 (Butt et  al .,  2000;  Amundson et  al .,
2000)  dan  tidak  mengekspresikan caspase-3 (Onuki et al ., 2003; Prunet
et al ., 2005). Sel EVSA-T merupakan sel kanker payudara yang diambil  dari  asites  efusi  ganas  dari seorang  wanita  dengan  karsinoma payudara metastatik; mengekspresikan  estrogen  reseptor- negatif  dan  progesteron  reseptor- positif (ER -). Sel EVSA-T mempunyai viabilitas rendah (sekitar
50%) untuk minggu pertama penumbuhan (Anonim, 2016). Uji sitotoksik adalah perkembangan metode untuk memprediksi keberadaan obat sitotoksik  baru  termasuk  diantaranya dari  bahan  alam  yang  berpotensi sebagai antikanker. Berdasarkan sifat-sifat  toksik  senyawa  tersebut maka  sifat  sitotoksik  merupakan syarat  mutlak  dari  obat  antikanker (Burger,  1970).  Penelitian  efek sitotoksik  isolat  dari T.  diversifolia terhadap  ketiga  sel  kanker  payudara tersebut  belum  pernah  dilakukan.
Oleh  karena  itu  penelitian  ini dilakukan untuk mengkaji sitotoksisitas  senyawa  aktif  hasil isolasi T.  diversifolia terhadap  sel kanker  payudara  (T47D,  MCF7  dan EVSA-T) secara in vitro.

## METODOLOGI
Penelitian ini bersifat eksperimentatif-eksploratif in  vitro untuk mendapatkan data sitotoksisitas  senyawa  aktif  hasil isolasi  daun T.  diversifolia terhadap sel  kanker  payudara  T47D,  MCF7 dan EVSA-T.
Bahan Sel  line  kanker  payudara (T47D, MCF7 dan EVSA-T) diperoleh  dari  Prof.  Kees  Nooter (Erasmus Medical Center, the Netherlands)  dan  ditumbuhkan  di LPPT UGM. Media DMEM (Sigma),
natrium  bikarbonat  (Sigma),  dan Hepes  (Sigma).  Media  kultur  sel terdiri  dari  media  DMEM  (Sigma), Fetal  Bovine  Serum  (Sigma)  10  % (v/v)  (Gibco),  Penisilin-Streptomisin 1  %  (v/v)  (Gibco)  dan  fungison  0,5 %  (v/v)  (Gibco).  Selain  itu  juga digunakan  trypsin  0,5  %,  larutan PBS, etanol 70 % dan MTT 5 mg/ml (Sigma). Semua bahan  yang digunakan  berkualitas  pro  analisis (p.a.)  produksi  Merck  kecuali disebutkan khusus.

## Alat
Alat-alat  gelas  yang  lazim dipakai  di  laboratorium,  tabung konikal steril, sentrifuge Sigma 3K12 (B.  Braun  Biotech  International), Microplate 96 well (Nunclone), CO2 Jacketed  Incubator  (Nuaire TM IR autoflow),  tabung  conical  steril (nunclone),  scarper, tissue  culture flask (nunclone),  Laminar  airflow (Nuaire), haemocytometer (New
Bauer),  mikropipet 200 μl – 1 ml, 2
–  20  μl,  5  –  40  μl,  20  –  200  μl, yellow  tape  dan  blue  tape  steril, almari  es  4 o C  dan  -20 o C,  mesin vortex.

## CARA PENELITIAN
Preparasi  seri  konsentrasi  dari isolate aktif
Isolat  aktif  hasil  isolasi T. diversifolia ditimbang  1,0  mg  dan dilarutkan dalam Dimethyl sulphoxide (DMSO)  sebanyak  100 µl,  dibantu  dengan  alat  fortek, sehingga  diperoleh  larutan  dengan
konsentrasi 10.000 μg/mL. Selanjutnya diencerkan dengan medium  DMEM  menjadi  beberapa konsentrasi dari 0,39 s/d 50 μg/mL.
Uji  Sitotoksik  dengan  metode MTT (Moosman, 1983)
Menggunakan microplate 96 sumuran. Setiap sumuran diisi dengan 100 μl medium DMEM, FBS 0,5%  yang  mengandung  sel  T47D, MCF-7 dan EVSA-T dengan kepadatan 2 x 10 3 sel/well, selanjutnya  diinkubasikan  selama  24 jam. Keesokan harinya media dibuang  dan  diganti  dengan  seri konsentrasi  sampel  (0,39  s/d  50) μg/mL  dalam  media  DMEM  dan
FBS  10%.  Setiap  konsentrasi  dibuat triplikat.
Kultur sel tersebut diinkubasi selama 24 jam pada 37°C, 5% CO 2 . Setelah 24 jam ditambahkan  larutan  MTT  (5mg/ml PBS)  (10  µl/sumuran).  Kultur  sel diinkubasi  selama  4  jam  pada  37°C,
5% CO 2 . Stop solution (100
µl/sumuran)  ditambahkan  pada  sel
diinkubasi  selama  semalam  pada 37°C,  5%  CO 2 ,  kemudian optical density diukur pada λ 540 nm dengan ELISA plate reader.

## Persentase penghambatan sel
Persentase  penghambatan  sel dari  tiap-tiap  konsentrasi  sampel yang diperoleh dihitung dan dianalisis menggunakan rumus:
Keterangan: A = rata-rata absorbansi media sel B = rata-rata absorbansi media C = rata-rata absorbansi sampel uji

## Analisis Hasil
Efek  sitotoksik  isolat  aktif hasil  isolasi T.  diversifolia terhadap sel  T47D,  MCF7  dan  EVSA-T dianalisis dengan menghitung persentase  penghambatan  sel  seperti rumus  di  atas,  selanjutnya  nilai  IC 50 diperoleh  dengan  analisis  regresi probit dari SPSS 15 For Windows .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Parameter  sitotoksik  yang digunakan adalah kemampuan konversi substrat 3-(4,5- dimetilthiazol-2-il)-2,5-
dipheniltetrazolium  bromid  (MTT) menjadi  formazan  ungu  oleh  enzym suksinat  dehidrogenase  pada  sel hidup.  Pengujian  efek  sitotoksik dilakukan  dengan  triplikat,  yakni masing-masing  konsentrasi  diujikan pada tiga sumuran untuk
menghindari  bias  dalam  penelitian
ini. Sifat sitotoksik merupakan langkah utama dalam usaha
penemuan  obat  antikanker  baru  dari bahan alam (Nooter, 1997; Nooter et al., 1999). Penelitian antikanker  yang bertitik berat pada bagaimana mekanisme  sel  kanker  terbunuh  oleh obat-obat sitotoksik, merupakan ilmu yang baru berkembang saat ini. Data persentase penghambatan masing masing konsentrasi  isolat  aktif  hasil  isolasi dari T.  diversifolia seperti  terlihat pada tabel I.
% penghambatan = (A-B) – (C-B)  x 100%
(A-B)
Tabel I. Rerata persentase penghambatan isolat aktif terhadap sel T47D, MCF7 dan  EVSA-T
Absorbansi  hasil  pembacaan ELISA reader kemudian  dihitung persentase  penghambatannya.  Hasil penghitungan rerata persentase penghambatan  dapat  dilihat  pada Tabel  1.  Secara  umum,  terlihat adanya peningkatan persentase penghambatan  sel  seiring  dengan bertambahnya konsentrasi isolat yang  diberikan,  hal  ini  dinamakan dengan fenomena dose dependent. Untuk mengetahui efek sitotoksik  dari  isolat  perlu  dilakukan penghitungan  IC 50 dari  persentase penghambatan  tersebut.  Nilai  IC 50 merupakan besarnya konsentrasi suatu  senyawa  yang  menimbulkan penghambatan kehidupan dari 50%
sel atau hewan yang diuji (Sieuwerts et  al., 1995).  Nilai  IC 50 tersebut dapat  dihitung  dengan  analisa  probit menggunakan program SPSS 16.0 for Windows .  Data  IC 50 tiap  sel  yang diperoleh dari analisa probit disajikan dalam gambar 1. Dari tabel 1 terlihat bahwa nilai IC 50 isolat aktif hasil  isolasi T.  diversifolia pada  sel T47D, MCF7 dan EVSA-T berturut- turut  adalah  (2,44;  4,697;  3,522) ug/mL.
Untuk  memperjelas  nilai  IC 50 dari  isolat  aktif  hasil  isolasi  daun T. diversifolia pada  sel  T47D,  MCF7 dan  EVSA-T  dapat  dilihat  dari
Gambar 1. Kadar (µg/mL) Rerata persentase penghambatan (%) T47D MCF7 EVSA-T 50 90,17 84,83 94,18 25 84,72 80,06 92,61 12,5 82,97 89,33 95,59 6,25 65,07 79,21 84,43 3,125 53,49 33,43 24,37 1,562 47,16 25,56 31,45 0,78 22,49 5,62 8,33 0,39 22,27 0 2,99 IC 50 2,44 4,697 3,522
Sumber : primer untuk data sel T47D (Mahardika, 2010)
Gambar 1. Grafik Nilai IC 50 isolat aktif hasil isolasi T. diversifolia terhadap sel T47D, MCF7 dan EVSA-T 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 T47D MCF7 EVSA-T 2.44 4.697 4 IC50 (ug/mL) T47D MCF7 EVSA-T
Kuantifikasi  konsentrasi  toksik pada  penelitian  ini  menggunakan kriteria National  Cancer  Institute
(NCI).  Menurut  kriteria National Cancer Institute (NCI), suatu senyawa  dikatakan  memiliki  efek sitotoksik yang poten bila mempunyai nilai IC 50 lebih kecil dari 30  μg/ml  (Suffness  &  Pezzuto,1990) atau kurang dari 20 μg/ml (Benzivin, 2003).  Semakin  kecil  nilai  IC 50 , semakin  poten  senyawa  tersebut dalam menghambat pertumbuhan sel. Berdasarkan  kriteria  tersebut,  isolate aktif  yang  diisolasi  dari  daun kembang bulan ( T. diversifolia (Hemsley)  A.  Gray)  memiliki  efek sitotoksik  <  20  μg/mL,  terhadap ketiga  sel  kanker  payudara  tersebut artinya  senyawa  tersebut  sangat potensial dikembangkan sebagai agen  antikanker  khususnya  untuk
kanker  payudara.  Selain  itu,  perlu juga  dilakukan  pengujian  terhadap sel normal untuk menilai selektivitas isolat  dalam  membasmi  sel  kanker payudara. Penelitian lanjut oleh Mardihusodo et  al. (2013)  tentang mekanisme kerja senyawa aktif hasil isolasi daun T.
diversifolia disimpulkan  bahwa  senyawa  aktif tersebut dapat menghambat siklus sel WiDr serta ekspresi VEGF sel WiDr. Senyawa  aktif  hasil  isolasi  dari T. diversifolia teridentifikasi  sebagai
Tagitinin C berdasarkan data spektroscopi dan dibandingkan dengan  data  literatur.  Tagitinin  C paling  aktif  dan  selektif  pada  sel kanker kolon (WiDR, IC 50 = 0,585±0.08 ug/ml) (Wahyuningsih et al., 2015).

## KESIMPULAN
Senyawa  aktif  hasil  isolasi  daun kembang bulan ( T. diversifolia (Hemsley)  A.  Gray)  memiliki  efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D, MCF7 dan EVSA-T
berturut-turut  mempunyai  nilai  IC 50
(2,44;  4,697;  3,522)  ug/mL.  Dapat dikatakan bahwa isolat aktif  tersebut sangat potensial dikembangkan sebagai agen antikanker payudara.

## DAFTAR PUSTAKA
Amundson, S.A., Myers, T.G., Scudiero,  D.,  Kitada,  S., Reed, J.C., and Fornace, A.J., 2000, An Informatics Approach Identifying Markers  of  Chemosensitivity in  Human Cancer Cell  Lines, Cancer Res, 60:6010-6110 Anonim,  2007,  ATCC  Cell  Biology, available from http://www.atcc.org/common/ catalog/numSearch/numResul ts.cfm?atcc Num=HTB-22 ,
cited in 25 June 2007.
Anonim,2012,from http://winners4lifeindonesia. com/transfer-factor-untuk- penyakit-  kanker  -  payudara. pdf. Akses Juni 2016. Anonim 2016, from (https://www.dsmz.de/catalog ues/details/culture/ACC- 433.html). Akses Juli 2016
Aouali,  N.,  Morjani,  H.,  Trussardi,
A., Soma, E., Giroux, B., and Manfait,  M.,  2003,  Enhanced Cytotoxicity and Nuclear Accumulation of Doxorubicin-loaded Nanospheres in Human Breast  Cancer  MCF-7  Cells Expressing MRP1,
International Journal of Oncology, 23:1195-1201. Benzivin,  C.  Devehat.  Tomasi,  S. Boustie,  J.,  2003.  Cytotoxic
Activities  of  some  Lischen Extracts  on  Murine  and Humasn  Cancer  Cell  Lines. Phytomedicine 10:499-503. Burger, A., 1970, Medicinal Chemistry, 3 th ed., p. 681 -
694,      Wiley  Interscience
Publication, New York.
Butt,  A.J.,  Firth,  S.M.,  King,  M.A., and  Baxter,  R.C.,  2000,
Insulin-Like  Growth  Factor- Binding  Protein-3  Modulates Expression  of  Bax  and  Bcl-2 and Potentiates P53- Independent Radiation- Induced Apoptosis In Human Breast Cancer Cells, J.
Biol  Chem, 275  (50)  :  39174 – 39181.
Freshney,  I.R.  2000. Culture  of Animal Cells Manual of Basic Technique .  New  York  :  A
John Wiley and Sons Ltd. Goffin, E.,  Ziemons, E., De Mol,  P., de Madureira Mdo, C., Martins, AP., da Cunha, AP., Philippe, G., Tits, M., Angenot,  L.,  and  Frederich, M., 2002, In vitro antiplasmodial activity of Tithonia diversifolia anf identification  of  its  main active constituent:Tagitinin
C, Planta Medica , 68(6);543- 545.
Gu, J. Q., Gills, JJ., Park, EJ., Mata-
Greenwood,  E.,  Hawthorne, ME.,  Axelrod,  F.,  Chavez, PI.,  Fong,  HH.,  Mehta,  RG., Pezzuto,  JM.  and  Kinghorn, AD.,  2002,  Sesquiterpenoids from  Tithonia  diversifolia
with potencial care chemopreventive  activity, J Nat Prod , 65(4),532-536. Mahardika, A.B., 2010, Efek Sitotoksik  Senyawa  Hasil Isolasi  Daun Kembang Bulan ( Tithonia diversifolia (Hemsley)  A.  Gray)  terhadap Sel  Kanker  Payudara  T47D [Skripsi],  Fakultas  Farmasi,
UGM
Mardihusodo,  HR.,  Wahyuningsih,
MSH.,  Astuti  I.,  2013,  The effect  of  active  compound isolated  from  the  leaves  of Kembang bulan ( T. diversifolia (Hemsley) A. Gray)  on  cell  cycle  and angiogenesis  of  WiDR  cell line, Journal  of  the  Medical Sciences, 45 (3), 101-111.
Medina, D., Kittrell, F. S., 2003. p35 function is required for hormone  –  mediated  protein of mouse mamary tumorigenesis. Canc  Res. 63: 6140-6143.
Menchetner,  E.,  Kyshtoobayeva,  A., Zonis,  S.,  Kim,  H.,  Stroup,
R.,  Garcia,  R.,  Parker,  R.J., and  Fruehauf,  J.P.,  1998, Levels of Multidrug Resistance (MDR1) P- Glycoprotein  Expression  by Human Breast Cancer Correlate with in Vitro
Resistance  to  Taxol  and
Doxorubicin, Clinical Cancer Research , 4:389-398. Mosman,T., 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application  to  proliferation and  cytotoxicity  assay. J Immunol Methods 65,55-63. Nabin, C., Baruah., Ram P, Sharma., Madhusudanan, K.P., and Go palakrishna, T., 1979, Sesquiterpene lactone of Tithonia diversifolia. Stereochemistry of the Tagitinins and related compounds, J.  Org.Chem ,
44(11);1831.
Nafrialdi  dan  Gan,  S.,  1995,  Dalam farmakologi dan Terapi, Edisi IV,  Ganiswara,  S.G.,  Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran  UI,  jakarta,  48, 702 Nooter  K,  1997,  the  Role  Of  P 53 In Resistance To Cytotoxic Therapy  Of  Human  Cancer. South  West  Cancer  News.  4, 12-13 Nooter  K,  Burger  H,  Schenk  P, Stoter  G,  1999,  Molecular mechanisms of drug resistance and sensitivity. Oncological  Research  at  the Erasmus University Rotterdam-University Hospital Rotterdam, 39-40 Onuki,  R.,  Kawasaki,  H.,  Baba,  T.,
dan Taira, K., 2003, Analysis of A Mitochondrial Apoptotic Pathway  Using  Bid-Targeted
Ribozymes  in  Human  MCF7 Cells  in  the  Absence  of  A Caspase-3-Dependent Pathway, Antisense and Nucleic Acid Drug Development , 13 (2): 75-82. Prunet, C., Lemaire-Ewing,  S., Ménétrier,  F.,  Néel,  D.,  dan Lizard,  G.,  2005,  Activation of  Caspase-3-Dependent  and -Independent Pathways During 7-Ketocholesterol- and  7β-Hydroxycholesterol- Induced Cell Death: A
Morphological and Biochemical  Study, Journal of Biochemical and Molecular Toxicology , 19 (5): 311-326. Sieuwerts,  A.  M.,  Klijn,  J.  G.  M., Peters, H. A., and  Foekens, J. A., 1995, The MTT Tetrazolium salt assay scrutinized:  How  to  use  this assay  reliably  to  measure metabolic  activity  of  cell cultures  in  vitro  for  the assessment of growth characteristics, IC 50 -values
and cell survival, Eur. J. Clin. Chem.  Clin.  Biochem., 33, 813-823.
Suffness,  M.,  dan  Pezzuto,  J.M.,
1990, Assay Related to Cancer  Drug  Discovery.  In: K. Hostettmann (Ed.): Methods in Plant Biochemistry. Vol.6.  Assays
for  Bioactivity.  Academic
Press. London. pp: 71-133. Wahyuningsih  MSH.,  Syarif  RA., Rakhmawati R., 2008. Isolasi Senyawa Berpotensi Antikanker  dari  Fraksi  Aktif Tithonia diversifolia (Hemsley)  A.  Gray  dan Penelusuran Mekanisme Apoptosisnya [Laporan Penelitian  Dana  Masyarakat], Fakultas Kedokteran UGM Wahyuningsih  MSH.,  Syarif  RA., Suharmi S., Murini T., Saputra  F.,  Adiguno  Suryo
W.,  2013,  Selectivity  of
Purified  Extract  from  the leaves of Tithonia diversifolia
(Hemsley)  A.Gray)  against Hela  Cells, Trad.  Med.  J. , 18(1), 22-28
Wahyuningsih, MSH., Wijayanti MA., Budiyanto A., Muhammad  Hanafi,  2015, Isolation and Identification of Potential Cytotoxic Compound  from  Kembang bulan  [ Tithonia  diversifolia
(Hemsley)  A.  Gray]  Leaves, Int.  J.  Pharm.  Pharm.  Sci. 7 (6), 298-301.