## DETEKSI PENYAKIT BACTERIAL FRUIT BLOTCH PADA MELON MENGGUNAKAN ELISA
DETECTION OF BACTERIAL FRUIT BLOTCH OF MELON USING ELISA
Utik Windari 1) , Tri Joko 2) * , & Siti Subandiyah 2)
1) Balai Karantina Pertanian Kelas II Yogyakarta Jln. Laksda Adisucipto km 8, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta 55282
2) Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada Jln. Flora 1, Bulaksumur, Sleman, Yogyakarta 55281
*Penulis untuk korespondensi. E-mail: tjoko@ugm.ac.id

## ABSTRACT
Bacterial fruit blotch (BFB) caused  by Acidovorax citrulli is a serious seedborne disease in Cucurbitaceae causing 90 − 100% yield losses. The aim of this study was to explore BFB symptom on melon and also to detect A. citrulli infection in commercial seed and symptomatic fruits from the field in Yogyakarta Special Region province and its surrounding using DAS-ELISA method. Samples include melon from Sleman, Bantul, Kulon Progo, Gunung Kidul, Magelang, Purworejo regencies while commercial seeds i.e. Action 434, Glamour and Mai 116 were collected. DAS- ELISA detection method used reagent set from Agdia. Based on the field observation, this study found melon commercial fruit shares similar symptom with BFB, which showed discrete oily dark green spots, while the netting failed to develop over necrotic areas, resulting in smooth sunken spots. DAS-ELISA detection revealed that samples collected from Jetak village, district of Mungkid, Magelang and from Bligo village, district of Ngluwar, Magelang and in commercial seed Mai 116 were positively infected by A. citrulli.
Keywords: Acidovorax citrulli , bacterial fruit blotch, ELISA, melon

## INTISARI
Bacterial  fruit  blotch (BFB)  merupakan penyakit  penting  pada  famili  Cucurbitaceae  yang  disebabkan  oleh Acidovorax citrulli . Penyakit ini dilaporkan dapat menurunkan hasil mencapai 90-100%. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui gejala penyakit BFB pada melon dan deteksi A. citrulli pada benih komersial dan sampel buah bergejala dengan metode DAS-ELISA di DIY dan sekitarnya. Pengambilan sampel dilakukan di kabupaten Sleman, Bantul, Kulon Progo, Gunung Kidul, Purworejo dan Magelang. Selain dari lapangan, diuji pula benih melon komersial yaitu Action-434, Glamour dan Mai 116. Metode deteksi dengan ELISA menggunakan reagent set dari Agdia. Dari hasil pengamatan di lapangan ditemukan buah melon dengan gejala yang mirip dengan gejala BFB yaitu adanya becak berwarna hijau tua kebasahan  pada permukaan buah, jaring tidak terbentuk sempurna dan pada bagian daging buah di bawah becak tadi membusuk. Hasil deteksi dengan DAS-ELISAmengindikasikan bahwa A. citrulli terdeteksi pada sampel yang berasal dari desa Bligo, kecamatan Ngluwar dan desa Jetak, kecamatan Mungkid, kabupaten Magelang, serta pada benih komersial MAI 116.
Kata kunci: Acidovorax citrulli, bacterial fruit blotch, ELISA, melon
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, Vol. 19, No. 1, 2015: 1–5

## PENGANTAR
Melon ( Cucumis melo L.) merupakan salah satu tanaman hortikultura dari famili Cucurbitaceae yang potensial untuk dikembangkan dan dapat menjadi produk unggulan hortikultura di Indonesia. Menurut catatan Direktorat Jenderal Hortikultura (Anonim, 2014), nilai impor buah segar melon dan semangka pada tahun 2012 lebih besar yaitu US$ 873.237, sementara nilai ekspornya hanya US$ 521.390. Selain impor buah segar, beberapa benih Cucurbitaceae juga masih impor dari beberapa negara. Menurut data dari Badan Karantina Pertanian, benih melon diimpor dari Thailand, Taiwan, Jepang, India, Vietnam,
dan Cina. Impor benih maupun buah segar bukan tanpa  risiko,  salah  satu  risiko  besar  yang  harus dihadapi adalah masuknya patogen yang belum ada di  Indonesia. Salah  satu  penyakit  penting  pada melon  yang  sangat  merugikan  di dunia  adalah Bacterial Fruit Blotch (BFB) yang disebabkan oleh bakteri Acidovorax citrulli. Sampai saat ini belum ada laporan mengenai penyakit ini di Indonesia, namun resiko masuk dan tersebarnya A. citrulli ke Indonesia sangat besar mengingat impor buah dan benih dari negara yang sudah melaporkan adanya bakteri  ini  masih  terus  berlangsung  dan  kondisi iklim di Indonesia yang cocok bagi perkembangan bakteri ini.
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia                                                                Vol. 19 No. 1 2
A. citrulli dilaporkan dapat menyerang berbagai spesies yang termasuk dalam famili Cucurbitaceae seperti semangka, melon, squash , labu dan timun (Burdman & Walcott, 2012). Di Israel pada tahun 1995 dilaporkan bahwa A. citrulli menginfeksi semai terong,  selanjutnya  pada  tahun  1997  dilaporkan terdapat pada biji tomat (Assouline et al. ,1997). Pada tahun  2008  dilaporkan  bahwa A.  citrulli menyerang  sirih  di  Taiwan  (Deng et  al. ,  2010). A.citrulli termasuk dalam kelas Betaproteobacteria, ordo  Burkholderiales,  famili  Comamonadaceae. Bakteri ini bersifat tular benih dan dapat menyebar melalui percikan air hujan maupun irigasi ( overhead irrigation ). Suhu yang optimal bagi perkembangan A.  citrulli adalah  24−35 o C  dengan  kelembaban relatif  >70% (Walcott, 2008). Keberadaan bakteri ini telah dilaporkan di berbagai negara antara lain Kanada, USA, Mexico, Honduras, Nicaragua, Costa Rica, Brazil, Hungaria, Italia, Yunani, Turki, Israel, Nigeria, Cina, Korea Selatan, Jepang, Taiwan, Thailand, India, Astralia, dan Mariana Island (Burdman & Walcot, 2012; Langston, 2013).
Kerusakan  akibat  bakteri  ini  dapat  mencapai 90% bahkan dapat mencapai 100%  (Walcott, 2005; Latin, 2014).  Hal ini disebabkan karena buah yang terserang A.  citrulli menjadi  tidak  menarik  dan daging buahnya rusak. Di Amerika Serikat, BFB tersebar di lebih dari 10 negara bagian. Di negara bagian  Georgia  menyebabkan  kerusakan  ribuan hektar lahan semangka. Bahkan dilaporkan kerugian personal petani mencapai US$ 100.000  (Anonim, 2015). Deteksi awal mengenai keberadaan A.citrulli baik pada buah maupun biji sangat penting di pintu- pintu pemasukan. Hal ini untuk mencegah masuk dan tersebarnya bakteri ini melalui media pembawa buah  segar  maupun  benih.  Untuk  itu  diperlukan suatu metode deteksi yang cepat dan akurat. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui gejala penyakit BFB pada melon dan deteksi A. citrulli pada benih komersial dan sampel buah bergejala dengan metode DAS-ELISA di DIY dan sekitarnya.

## BAHAN DAN METODE
Pengamatan Gejala Penyakit dan Pengambilan Sampel Pengambilan sampel dilakukan di sentra per- tanaman melon di enam kabupaten di DIY dan sekitar- nya yaitu Kabupaten Sleman, Bantul, Kulon Progo, Gunung Kidul, Magelang, dan Purworejo. Dari setiap kabupaten kemudian dipilih tiga lokasi pertanaman menggunakan metode purposive random sampling berdasarkan gejala khas dari penyakit BFB. Buah yang  bergejala  selanjutnya  diambil  bijinya  lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Untuk benih komersial dipilih kultivar yang banyak
ditanam  oleh  petani DIY  dan  sekitarnya.  Benih komersial antara lain Action 434 (PT Bisi International Tbk.), Glamour (PT Sakata), dan MAI 116 (CV Multi Global Agrindo).

## Deteksi Patogen dengan ELISA
Untuk mendeteksi bakteri A. citrulli pada buah yang bergejala khas penyakit BFB digunakan metode serologi  yaitu double  antibody  sandwich (DAS- ELISA) menggunakan antiserum spesifik A. citrulli dan conjugate Goat anti-Rabbit (IgG-AP)(Clark & Adams, 1977). Adapun langkahnya adalah microplate dilapisi dengan capture antibody sebanyak 100 µl lalu diinkubasi selama 4 jam pada suhu ruang atau 4 o C selama semalam. Setelah itu microplate dicuci dengan bufer PBST. Sampel biji digerus dengan perbandingan 1:10 yaitu untuk 1 g sampel digerus dalam 10 ml general extract buffer 2. Enzim (alkalin fosfatase) konjugat dilarutkan dalam enzim RUB3, perbandingan dapat dilihat pada kemasan. Selanjutnya enzim konjugat tadi dituang ke dalam microplate sebanyak 100 µl, 5 menit kemudian sampel, kontrol negatif,  kontrol  positif  dan  bufer  dituang  dalam microplate tadi  lalu  dihomogenkan. Microplate diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang atau pada suhu 4 o C selama semalam. Setelah itu disiapkan p-PNP (p -nitrophenylphosphate ) tablet substrat yang dilarutkan dalam bufer PNP substrat, lalu microplate tadi  dicuci  dengan  bufer  PBST  hingga  bersih. Setelah itu, PNP substrat dimasukkan sebanyak 100 µl ke dalam microplate lalu diinkubasi selama 1 jam dalam kondisi gelap. Selanjutnya diamati perubahan warna. Hasil dikatakan benar bila terjadi perubahan warna  pada  kontrol  positif  dari  bening  menjadi kuning, sedangkan bufer dan kontrol negatif tetap bening. Pembacaan  hasil  juga  dilakukan  secara kuantitatif  dengan ELISA  reader pada  panjang gelombang 405 nm. Pembacaan absorbansi terhadap sampel dinyatakan positif apabila nilai absorbansi ELISA (NAE) sampel uji lebih besar atau sama dengan 2 kali rata-rata NAE kontrol negatif (Djikstra & de Jager, 1998).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Gejala Penyakit
Hasil survei di lapangan terhadap melon menunjukkan ada dua tipe kerusakan pada buah. Kerusakan tipe pertama buah retak hingga pecah, retakan buah berwarna hitam (Gambar 1A). Buah yang mengalami kerusakan seperti  ini  sudah  tidak  dapat  dikonsumsi  karena daging buah busuk kering. Kerusakan pada buah seperti  ini  terjadi  secara  luas pada  lokasi-lokasi penanaman yang diamati. Kerusakan tipe kedua, terdapat becak berwarna hijau tua kebasahan  pada
Windari et al. : Deteksi Penyakit Bacterial Fruit Blotch pada Melon Menggunakan ELISA
permukaan buah (Gambar 1B). Pada tingkat lebih lanjut becak-becak tersebut bertambah banyak dan dapat menyebabkan daging buah hancur. Kerusakan tipe kedua ini terjadi secara sporadik pada lokasi pertanaman yang diamati. Buah yang mengalami kerusakan tipe dua tidak dapat dikonsumsi karena daging buah hancur. Menurut Walcott (2005), gejala penyakit  BFB  pada  buah  melon  akan  nampak sebelum panen yaitu berupa becak hijau tua. Becak ini tidak bertambah besar namun akan masuk ke dalam daging buah sehingga daging buah menjadi busuk. Pada jenis melon yang membentuk jaring, jika terdapat becak ini akan menyebabkan jaring tidak  terbentuk  pada  permukaan  buah. Menurut Walcott (2008), A. citrulli dapat menyerang semua fase pertumbuhan. Gejala awal dapat diamati pada permukaan bawah kotiledon, yaitu berupa becak lesi kebasahan yang kemudian menyatu memanjang di sepanjang tulang daun. Lama-kelamaan lesi ini mengering berwarna cokelat kemerahan. Namun gejala  pada  daun  ini  sulit  diamati  karena  rancu dengan gejala karena infeksi jamur. Dari deskripsi di atas, kerusakan tipe kedua yang mendekati gejala BFB. Untuk tanaman melon yang terserang BFB menunjukkan daun tetap terlihat hijau dan segar, sehingga dari jauh tetap terlihat sehat.
Deteksi Acidovorax citrulli dengan ELISA Deteksi menggunakan metode serologi dan varian- nya umum digunakan untuk mendeteksi A.citrulli di lapangan karena sederhana, murah, dan tidak memerlukan peralatan yang mahal, selain itu tidak memerlukan isolasi patogen. Spesifitas dan sensitivitas metode ini tergantung dari antibodi yang digunakan. Antigen disiapkan dengan menggerus biji atau kecambah, hal ini dilakukan karena A. citrulli terletak pada permukaan kulit biji dan endosperm. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Himananto et al . (2011), bahwa maserasi biji memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan pencucian biji.
Hasil  uji  serologi DAS-ELISA menunjukkan bahwa benih komersial MAI 116 dan sampel buah yang berasal dari 2 lokasi di Kabupaten Magelang yaitu Desa Bligo, Kecamatan Ngluwar dan Desa Ngrajek, Kecamatan Mungkid, terindikasi positif terinfeksi A.  citrulli yang  ditunjukkan  dengan perubahan warna pada sampel uji lebih besar dan buffer tetap tidak berwarna (Gambar 2).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pada sentra produksi melon di DIY dan sekitarnya yaitu Kabupaten Sleman, Gunung Kidul, Kulon Progo, Bantul, Magelang, dan Purworejo telah ditemukan penyakit yang gejalanya mirip dengan BFB pada melon. Akan tetapi, berdasarkan analisis serologi dengan metode DAS-ELISA diketahui hanya sampel yang  berasal  dari  Kabupaten  Magelang  yang terdeteksi adanya A. citrulli , sedangkan pada sampel yang  dikoleksi  dari  Kabupaten  Sleman,  Gunung Kidul, Kulon Progo, Bantul, dan Purworejo tidak terdeteksi adanya A. citrulli (Tabel 1). Sampel positif yang berasal dari Desa Ngrajek, Kecamatan Mungkid, Kabupaten  Magelang  memiliki  nilai  absorbansi ELISA  (NAE)  sebesar  2,847  dan  kontrol  positif 3,141, sedangkan sampel yang diambil dari Desa Bligo, Kecamatan Ngluwar memiliki NAE sebesar 3,88  dan  kontrol  positif  3,205. Untuk  benih komersial, MAI 116 terindikasi positif terinfeksi A. citrulli ditunjukkan dengan nilai absorbansi sampel sebesar 3,065 (Tabel 2). Nilai absorbansi sampel yang tinggi menunjukkan konsentrasi antigen pada sampel tinggi. Kontrol positif adalah larutan yang telah diketahui konsentrasi antigen, sehingga  hasil absorbansi yang diperoleh dari kontrol positif ini dijadikan sebagai tolok ukur. Intensitas warna yang terbentuk berkorelasi dengan jumlah antigen yang ada pada sampel (Goulter & Randles, 2015).
A.citrulli merupakan bakteri tular benih. Bakteri ini terakumulasi pada embrio dan lapisan perisperm endosperm (Duta et al ., 2012). Bakteri ini dapat masuk ke dalam biji melalui bunga, buah, stomata
Gambar 1. Kerusakan pada buah melon yang banyak dijumpai di lahan (tanda panah): buah retak hingga pecah, retakan buah berwarna hitam (A);terdapat becakberwarna hijau tua kebasahan pada permukaan buah (B)
Tabel 1. Hasil deteksi dengan DAS-ELISA sampel melon dari beberapa kabupaten di DIY dan Jawa Tengah
No. Komoditas Kabupaten Lokasi Hasil 1 Melon Sleman 1. Wukirsari, Cangkringan 2. Ambarketawang, Gamping 3. Pendowoharjo, Sleman - - - 2 Gunung Kidul 1. Kemadang, Tanjung Sari 2. Logandeng, Playen 3. Siraman, Wonosari - - 3 Kulon Progo 1. Kalidengen, Temon 2. Plumbon, Temon 3. Demen, Temon - - - 4 Bantul 1. Trirenggo, Bantul 2. Pendowoharjo, Sewon 3. Guwosari, Pajangan - - - 5 Magelang 1. Jetak, Mungkid 2. Bligo, Ngluwar 3. Ngrajek, Mungkid + + - 6 Purworejo 1. Tegal Kuning, Banyu Urip 2. Wingko Mulyo, Ngombol 3. Bagelen, Bagelen - - - Tabel 2. Hasil deteksi dengan DAS ELISA sampel melon benih komersial No. Varietas Produksi Hasil 1 Action 434 PT Bisi International Tbk. - 2 Glamour PT Sakata - 3 MAI116 CV Multi Global Agrindo +
Gambar 2. Pengujian DAS-ELISA pada sampel benih komersial dan sampel yang diambil dari enam kabupaten di DIY dan sekitarnya: Action 434 (1); MAI116 (2); Glamour (3); sampel melon Sleman 1 (4); sampel melon Bantul 1 (5); sampel melon Kulon Progo 3 (6);  sampel melon Gunung Kidul 1 (7); sampel melon Magelang 1 (8); sampel melon Purworejo 1 (9); kontrol positif (10); bufer (11); kontrol negatif (12)
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia                                                                Vol. 19 No. 1 4
1 2 3 6 5 4 7 10 8
11
12
9
daun atau luka. Hasil penelitian Walcott et al. (2003), menunjukkan  bahwa  infeksi  yang  terjadi  ketika berbunga menghasilkan buah yang tidak bergejala meskipun biji telah terinfeksi. Mekanisme seperti ini dapat memberikan penjelasan terhadap adanya biji yang terkontaminasi berdasarkan pemeriksaan visual di lapangan. Biji yang terkontaminasi ini adalah sumber inokulum bagi penyebaran BFB. Sampai saat ini belum ada perlakuan yang dapat mengeliminasi bakteri ini pada biji (Walcott, 2005; Feng et al. , 2009) dan kemampuan bakteri ini bertahan pada biji yang  disimpan  cukup  lama  mencapai  7,5  tahun (Walcott, 2008).
Ada  beberapa  metode  yang  dapat  digunakan untuk mendeteksi A.citrulli antara lain diagnostik agar, uji perkecambahan, serologi dan molekuler. Namun dengan adanya biji yang terinfeksi A. citrulli namun tidak menimbulkan gejala pada buah, maka metode deteksi yang sensitif menjadi sangat perlu dilakukan.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2014. Nilai Impor dan Ekspor Buah Tahun 2012 .  Direktorat  Jenderal  Hortikultura,  diakses 1/2/14.
Anonim. 2015. Acidovorax citrulli (Fruit Blotch)- Crop Protection Compendium. CAB International. Oxfordshire.
Assouline, I., H. Milshtein, M. Mizrahi, E. Levy, & I.S. Ben-Ze’ev. 1997. Acidovorax avenae subsp. citrulli Transmitted by Solanaceous Seeds. Phytoparasitica 25: 117−118.
Burdman, S. & R. Walcott. 2012. Acidovorax citrulli : Generating Basic and Applied Knowledge to Tackle a Global Threat to the Cucurbit Industry. Molecular Plant Pathology 13: 805−815.
Clark, M.F. & A.N. Adams. 1977. Characterization of the Microplate Method of Enzyme-Linked Immuno sorbent Assay for the Detection of Plant Viruses. Journal of General Virology 34: 475−483.
Deng, W.L., T.C. Huang, & Y.C. Tsai. 2010. First Report of Acidovorax avenae subsp. citrulli as the Causal Agent of Bacterial Leaf Blight of Betelvine in Taiwan. Plant Disease 94: 1065−1065.
Dijkstra, J. & C.P. de Jager. 1998. Practical Plant Virology Protocols and Exercises . Springer, Berlin, Heidelber, New York. 459 p.
Dutta, B., U. Avci, M.G. Hahn, & R.R. Walcott. 2012. Location of Acidovorax citrulli in Infested Watermelon Seeds is Influenced by the Pathway of Bacterial Invasion. Phytopathology 102: 461−468. Feng, Z.T., A. Sechler, P. Randhawa, J. Li, & N.W. Schaad. 2009. An Improved Assay for Detection of Acidovorax citrulli in Watermelon and Melon Seed. Seed Science and Technology 37: 337−349.
Goulter, K. & J. Randles. 2015. Serological and Molecular Techniques to Detect and Identify Plant Pathogenes. http://www.appsnet.org/Publications/ Brown_Ogle/11identification of pathogens KCG& JWR.pdf, diakses 23/5/15.
Himananto, O., P. Thummabenjapone, P.  Luxananil, M. Kumpoosiri, R. Hongprayoon, W. Kositratana, & O. Gajanandana. 2011. Novel and Highly Specific Monoclonal Antibody to Acidovorax citrulli and Development of ELISA-Based Detection in Cucurbit Leaves and Seed. Plant Disease 95: 1172−1178. Langston, D.B. 2013. Acidovorax citrulli Bacterial Fruit Blotch of Cucurbit. European and Mediterranean Plant Protection Organization.
Latin, R.X. 2000. Bacterial Fruit Blotch of Cucurbit. Plant Health Progress, doi:10.1094/PHP-2000-0602-01- HM.
Latin, R.X. & D.L. Hopkins. 1995. Bacterial Fruit Blotch of Watermelon The Hypothetical Exam Question Become Reality. Plant Disease 79: 761−765.
Latin, R.X. 2014. Diseases and Pests of Muskmelons and Watermelons. Cooperative Extension Service. Purdue University, West Lafayette.
Walcott, R.R. 2005. Bacterial Fruit Blotch of Cucurbits. The Plant Health Instructor, DOI: 10.1094/PHI-I- 2005-1025-02.
Walcott, R.R., Gitaitis, R.D., & A.C. Castro. 2003. Role of Blossom in Watermelon Seed Infestation by Acidovorax avenae subsp. citrulli. The American Phytopathology Society.  Publication no. P-2003- 0227-01R.
Walcott, R.R. 2008. Integrated Pest Management of Bacterial Fruit Blotch of Cucurbits in Integrated Management  of  Diseases  Caused  by  Fungi,  p. 187−205. A. Ciancio & K.G. Mukerji (eds.), Phytoplasma and Bacteria. Springer, Netherland.
Windari et al. : Deteksi Penyakit Bacterial Fruit Blotch pada Melon Menggunakan ELISA