Fraksi Alkaloid Daun Ubi Jalar Ungu (Ipomoea batatas var Ayumurasaki) Sebagai Inhibitor  α-Glukosidase
Alkaloid Fraction of Purple Sweet Potato (Ipomoea batatas var Ayumurasaki) as α-Glucosidase Inhibitor

## ABSTRAK
Diah Daru Asih Pamungkas 1 ,Irmanida Batubara 2 , Irma Herawati Suparto 1 .
1) Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam IPB 2) Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB Jl Taman Kencana No.3 Bogor, 16151 email : ime@apps.ipb.ac.id
Ubi jalar ungu ( Ipomoea batatas var Ayumurasaki ) dilaporkan dapat membantu diet harian bagi penderita diabetes melitus tipe 2 karena memiliki kadar glikemik yang rendah. Salah satu mekanisme menurunkan kadar gula darah pada penderita diabetes adalah dengan menghambat enzim α-glukosidase. Potensi fraksi alkaloid dari daun dan fraksi antosianin dari umbi ubi jalar ungu dievaluasi sebagai inhibitor enzim α- glukosidase. Ubi jalar ungu yang digunakan dari Ciampea, Bogor, Jawa Barat. Fraksi alkaloid daun ubi jalar ungu pada konsentrasi 2,00% aktif menghambat kerja enzim sebesar 61,88%, sedangkan fraksi antosianin umbi ubi jalar ungu tidak aktif (0,25%). Fraksi  alkaloid  daun  ubi  jalar  ungu  dipisahkan  lebih  lanjut  menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dan kloroform sebagai eluen. Fraksi yang  mengandung  alkaloid  dengan  semprotan  Dragendorf,  yakni  F10,  kemudian dipisahkan kembali dengan kromatografi lapis tipis preparatif. Fraksi F10.15 positif mengandung alkaloid dan dapat menghambat enzim  - glukosidase sebesar 18,07% pada konsentrasi 1,25%, yang berarti pemisahan menyebabkan penurunan aktivitas. Spektrum  inframerah  transformasi  Fourier  fraksi  memperlihatkan  gugus  fungsi  – NH−, –OH, dan –CH 2 – dan diduga mengandung alkaloid.
Kata kunci: Inhibitor  -glukosidase, ubi jalar ungu ( Ipomoea batatas var Ayumurasaki ), alkaloid Keywords:
Inhibitor  -glukosidase, purple sweet potato ( Ipomoea batatas var
Ayumurasaki ), alkaloid
Purple  sweet  potato  ( Ipomoea  batatas var Ayumurasaki )  has  been  reported  as  a component  of  daily  diet  for  type  2  diabetes  mellitus  patient  because of  it  has  low glycemic  index.  A  mechanism  for  decreasing  blood’s  sugar  content  in  diabetic patients is by inhibiting α-glucosidase. In this study, the potencies of alkaloid fraction from  leaves  and  anthocyanin  fraction  from  tuberous  of  purple  sweet  potato  were investigated  as  an  inhibitor  of  α-glucosidase.  The  sample  used  was  purple  sweet potato from Ciampea, Bogor, West Jawa. The 2.0% alkaloid fraction could inhibit α- glucosidase  activity  (61.88%),  whereas  anthocyanin  fraction  was  inactive  (only inhibited  0.25%).  The  alkaloid  fraction  from  purple  sweet  potato  leaves  was  then fractionated  by  column  chromatography  with  silica  gel  as  stationary  phase  and chloroform  as  eluent.  Fraction  containing  alkaloid  with  Dragendorf  spraying  was F10, which was further separated by preparative thin layers chromatography. F10.15 fraction contained alkaloid and had inhibition activity of 18.07% at concentration of 1.25%, which means separation decrease the activity of fraction. Fourier transform infrared spectrum of this fraction showed –NH−, –OH, and – CH 2 – functional groups and was predicted as containing alkaloid.

## Pendahuluan
Diabetes  melitus  (DM)  tipe  2  dapat  diobati dengan  cara  menghambat  kerja  enzim  α- glukosidase.  Enzim  ini  berada  di  permukaan membran sel usus dan merupakan enzim kunci
dalam  metabolisme  karbohidrat.  Inhibitor  α- glukosidase  akan  menghalangi  aktivitas  enzim tersebut sehingga membatasi perubahan oligosakarida dan disakarida menjadi monosakarida, terutama untuk serapan gastrointestinal (Malathi et al. 2010).
Salah  satu  usaha  untuk  mengatasi  DM  adalah dengan  menggunakan  bahan  alam  seperti  ubi jalar.  Ubi  jalar  ungu ( Ipomoea  batatas var Ayumurasaki ) dilaporkan memiliki kadar glikemik yang rendah, yakni 40 per 100 g saji (Foster et al . 2002)  sehingga  digunakan  sebagai  diet  harian bagi  penderita  DM  tipe  2.  Ubi  jalar  yang digunakan  merupakan  varietas I.  batatas berwarna  ungu,  karena  memiliki  kandungan antosianin  (turunan  flavonoid)  tertinggi  (Fan et al. 2007) dan umbi ini telah dilaporkan memiliki aktivitas  antihiperglisemik  (Suda et  al. 2003). Selain  itu,  menurut  Lien et  al. (2010),  fraksi fraksi  etil  asetat  daun  ubi  jalar  dapat mempercepat aktivitas
heksokinase,
merangsang  sekresi  insulin,  dan  menghambat glukoneogenesis  sehingga  dapat  memberikan efek  hipoglisemia.  Pochapski et  al .  (2011) menyatakan  bahwa  fraksi  kasar  daun  ubi  jalar mengandung  senyawa  alkaloid.  Fraksi  alkaloid dalam fraksi etanol dan fraksi tak larut air pada Acacia  catechu dapat  bersifat  antihiperglisemik pada tikus (Jarald E et al . 2009).
Menurut  Takikawa et  al. (2010),  pemberian asupan fraksi kasar antosianin dari buah bilberry pada tikus juga dapat menurunkan kadar glukosa darah  dan  meningkatkan  sensitivitas  insulin. Oleh  karena  itu,  pada  penelitian  ini  dapat diperoleh  fraksi  alkaloid  daun  dan  fraksi antosianin umbi ubi jalar ungu sebagai inhibitor enzim  α-glukosidase.  Bagian  daun  dan  umbi diteliti karena kedua bagian ini lazim dikonsumsi oleh masyarakat.

## Bahan dan Metode

## Bahan
Daun  dan  ubi  jalar  ungu ( Ipomoea  batatas var Ayumurasaki ) diperoleh dari  Ciampea,  Bogor, Jawa  Barat,  sementara  enzim  α-glukosidase didapatkan dari Sigma-Aldrich.

## Kadar Air (AOAC 2006)
Sebanyak 2 g sampel daun dan umbi dimasukkan masing-masing  dalam  cawan  dan  dipanaskan pada suhu 105 o C selama 5 jam hingga diperoleh bobot konstan. Selanjutnya ditentukan kadar air.

## Kadar Abu (AOAC 2006)
Sebanyak 2 g sampel daun dan umbi dimasukkan masing-masing  dalam  cawan  dan  dipanaskan pada suhu 600 o C selama 2 jam
hingga  diperoleh  bobot  konstan.  Selanjutnya ditentukan kadar abu.

## Fraksi Alkaloid (Berkov et al. 2007)
Serbuk sampel dimaserasi dengan perbandingan 1:10  dengan  pelarut  etanol  sampai  tidak berwarna.  Residu  dibuang,  fraksi  etanol diuapkan  pelarutnya  di  bawah  kondisi  vakum. Fraksi  pekat  etanol  dilarutkan  kembali  dalam H 2 SO 4 2%  kemudian  ditambahkan  dietil  eter untuk  menghilangkan  lemak.  Fraksi  dietil  eter dibuang,  fraksi  asam  (air)  dibasakan  dengan NH 4 OH 25%  sampai  pH  9−10  dan  alkaloid difraksi  si  dengan  kloroform  sampai  tidak berwarna. Rendemen fraksi dihitung.

## Fraksinasi Antosianin (Fan et al. 2007)
Serbuk  umbi  dimasukkan  ke  dalam  Erlenmeyer kemudian ditambahkan campuran pelarut etanol- asam (HCl 1.5 M) dengan nisbah 1:32. Suspensi dipanaskan dalam penangas air dengan suhu 80
o C selama 1 jam, kemudian disentrifugasi selama 50  menit  dengan  kecepatan  2500 g .  Rendemen supernatan antosianin dihitung.

## Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom
Sebanyak  0.5  g  fraksi  pekat  aktif  dilarutkan dalam  eluen  terbaik  kemudian  dipisahkan komponen-komponennya  dalam  kolom  dengan elusi  gradien  di  antara  kedua  komponen  eluen terbaik.  Eluat  ditampung  setiap  3  mL  dalam tabung reaksi. Eluat dengan warna dan pola KLT yang sama digabungkan menjadi satu fraksi dan diuji  aktivitas  α-glukosidase  hingga  diperoleh fraksi teraktif.

## Uji Inhibisi α-Glukosidase (Sugiwati et al. 2009)
Sebanyak  1.0  mg  α-glukosidase  dilarutkan dalam  10  mL  bufer  fosfat  100  mM  (pH  7.0) kemudian ditambahkan 200 mg BSA yang juga telah  dilarutkan  dalam  bufer  fosfat.  Sebelum digunakan,  10  mL  larutan  enzim  tersebut diencerkan  25  kali  dengan  bufer  fosfat. Campuran reaksi terdiri atas 25 μL pNG 20 mM sebagai substrat, 50 μL bufer fosfat, dan 50 μL larutan sampel dengan konsentrasi 2.00% dalam DMSO.  Campuran  diinkubasi  selama  5  menit pada suhu 37 ºC, ditambahkan 25 μL larutan α- glukosidase,  kemudian  diinkubasi  kembali selama  15  menit.  Reaksi  enzim  dihentikan dengan  penambahan  100  μL  Na 2 CO 3 200  mM. Hasil  reaksi  adalah  senyawa p -nitrofenol  yang kemudian dibaca absorbansnya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang  400  nm.  Larutan  blangko  (tanpa sampel)  dibuat  dengan  perlakuan  sama  seperti sampel.  Tablet  akarbosa  (Glucobay)  dilarutkan dalam  bufer  fosfat  dan  HCl  2N  (1:1)  dengan konsentrasi  1.00%  (b/v)  digunakan  sebagai kontrol  positif  (larutan  stok).  Pengenceran dilakukan bila diperlukan. Endapan dikumpulkan dengan sentrifugasi dan supernatan sebanyak 50 μL dimasukkan ke dalam campuran reaksi  seperti  pada  sampel.  Hasil  reaksi  diukur dengan  spektrofotometer  UV  pada  panjang gelombang  400  nm.  Data  kontrol  positif (akarbosa)  digunakan  sebagai  pembanding sampel yang diuji.

## K−S
Inhibisi α-glukosidase (%) = K × 100%
Keterangan: K : absorbans blangko (enzim+substrat) S : absorbans sampel
(sampel+substrat+enzim)

## Identifikasi Senyawa dengan FTIR
Sebanyak  0.8  mg  sampel  (fraksi  teraktif  yang telah dikeringkan) dihaluskan bersama 0.2004 g KBr  dalam  mortar  agate.  Setelah  halus  dan bercampur,  dimasukkan  ke  dalam  alat  pencetak pelat KBr dan ditekan hingga diperoleh lempeng transparan.  Lempeng  dimasukkan  ke  dalam spektrofotometer  FTIR  Brucker,  dan  spektrum digambarkan  dalam  bentuk  kurva  transmitans pada bilangan gelombang  4000−400 cm -1 .

## Hasil dan Pembahasan
Serbuk  sampel  hasil  preparasi  diperoleh  data kadar  air  daun  dan  umbi  masing-masing 10.95±0.28% dan 12.86±0.87% (b/b). Kadar abu  sampel  diperoleh  sebesar  5.95±0.01  dan 2.33±0.05%  (b/b)  bobot  basah  masing-masing untuk daun dan umbi. Rendemen antosianin yang diperoleh lebih besar daripada alkaloid (Tabel 1). Kandungan fitokimia terdapat pada kedua fraksi alkaloid dan  antosianin ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 1 Rendemen fraksi alkaloid dan antosianin yang diperoleh dari daun dan umbi ubi jalar ungu Fraksi Rendemen (%b/b) Basah Kering Alkaloid (*) 0.15±0.03 0.16±0.03 Antosianin (**) 48.19±2.59   55.30±2.97 Ket :  *    = fraksi dari daun
**  = fraksi dari umbi
Fraksi  antosianin  umbi  yang  diperoleh  ternyata belum  murni  karena  masih  mengandung alkaloid,  flavonoid,  saponin,  dan  antosianidin. Uji  antosianidin  tidak  dilakukan  pada  fraksi alkaloid  karena  tidak  memperlihatkan  warna antosianin,  yakni  merah,  ungu,  dan  biru. Antosianidin  adalah  aglikon  antosianin  yang terbentuk  jika  antosianin  dihidrolisis  dengan asam (Harborne 1987) dan  antosianidin merupakan pemberi warna antosianin. Meskipun sedikit berbeda dengan Owusu (2008),
kandungan  fitokimia  dalam  daun  ubi  jalar  yang diteliti  mengandung  beta  karoten,  polifenol flavonoid, antosianin, isoflavon, asam klorogenat, likopen, alfa karoten.
Aktivitas inhibisi α-glukosidase fraksi  diperoleh hasil  awal,  yakni  fraksi  alkaloid  menginhibisi aktivitas  enzim  -glukosidase  sebesar  61.88% sedangkan fraksi antosianin hanya menghambat 0.25%  (tidak  aktif)  pada  konsentrasi  2.00%. Reaksi  pNG  (Gambar  1)  dapat  dihambat  oleh fraksi sehingga tidak  terjadi pengubahan bentuk pNG menjadi  -D- glukosa yang ditandai dengan pembentukan warna kuning p-nitrofenil. Semakin    pudar  warna  kuning  maka  semakin tinggi daya inhibisi fraksi. Hal ini menunjukkan bahwa  fraksi  alkaloid  aktif  sebagai  inhibitor  - glukosidase.  Oleh  karena  itu,  untuk  tahap selanjutnya  digunakan  fraksi  alkaloid  dari  daun ubi jalar ungu.
Tabel 2  Fitokimia Fraksi kasar Senyawa Fraksi alkaloid Fraksi antosianin Alkaloid +++ +++ Flavonoid +++ ++++ Saponin ++++ +++ Terpenoid − − Steroid ++++ − Tanin − − Antosianidin Tidak diujikan ++ Keterangan : ++++ = intensitas warna tinggi +++ = intensitas warna cukup tinggi
++ =    intensitas warna sedang
+ =    intensitas warna rendah
− = tidak ada warna
Fraksinasi  terhadap  fraksi  alkaloid  lebih  lanjut dilakukan  menggunakan  kromatografi  kolom dengan  silika  gel  sebagai  fase  diam  dan  elusi gradien  dilakukan  dengan  fase  gerak  berturut- turut kloroform 100%; (kloroform:metanol) 9:1;
HO HO OH
8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6; 3:7; 2:8; 1:9; dan metanol
100%. Berdasarkan pola kromatografi lapis tipis (KLT) kesamaan warna, bentuk, jumlah dan nilai
R f digabung  menjadi  12  fraksi.  Penanda
fraksi  alkaloid  dilakukan  dengan  pewarnaan fraksi  alkaloid  (F1−F12)  dengan  pereaksi Dragendorf  memperlihatkan  noda  yang  positif mengandung alkaloid pada F10.
O
O . O . O + enzim OH  - glukosidase HO OH OH HO
p-nitrofenil-  - D-Glukopiranosa (pNG) p-nitrofenil kuning
 -D-glukosa
Gambar 1 Mekanisme reaksi penguraian pNG oleh enzim  -glukosidase.
Dilakukan  pemisahan  lebih  lanjut  pada  F10  (fraksi positif  alkaloid)  menggunakan  KLT  preparatif  dan menghasilkan  2  noda  yang  diberi  nama  F10.16  dan F10.15.  Rendemen  masing-masing  sebesar  14.24% dan  7.75%  terhadap  fraksi  yang  dipisahkan  dengan kolom.  Aktivitas  inhibisi  enzim  α-glukosidase  F10 pada  konsentrasi  1.25%  sebesar  48.64%.  Fraksi F10.16  memberikan  hasil  negatif  (tidak  aktif), sedangkan  fraksi  F10.15  memiliki  aktivitas  inhibisi 18.07%.  Aktivitas  F10  yang  lebih  besar  daripada F10.16 dan F10.15 diduga karena kandungan senyawa selain  alkaloid  pada  F10  juga  berperan  dalam menghambat kerja enzim α-glukosidase.
Kemampuan  inhibisi  sampel  sebelum  dan  setelah pemisahan  lebih  lanjut  dengan  KLT  preparatif  masih jauh  lebih  kecil  dibandingkan  dengan  akarbosa  yaitu hanya dengan konsentrasi 0.0383 ppm sudah mampu menghambat 50% populasi (IC 50 ). Akarbosa digunakan  sebagai  kontrol  positif  inhibitor  enzim  α- glukosidase. Fraksi yang memberikan potensi inhibisi positif  (F10.15)  selanjutnya  diidentifikasi  dengan FTIR. Identitas senyawa dilakukan uji spektrum  FTIR fraksi F10.15 (Gambar 2) menunjukkan  gugus –NH 2 −, –OH−, dan −CH 2 − berdasarkan perbandingan dengan  rujukan  (Tabel  3).  Karena  itu,  F10.15  dapat diduga mengandung alkaloid.
Tabel 3 Absorpsi inframerah fraksi 10.15 atau  F10.15
cincin  heterosiklik  (Harborne  1987).  F10.15  diduga mengandung gugus amina (–NH−) yang memberikan serapan  bertumpang  tindih  dengan  gugus  –OH  pada bilangan  gelombang  3433.44  cm -1 .  Intensitas  puncak yang kurang tajam diduga menggambarkan kandungan alkaloid  yang  sedikit  pada  fraksi  F10.15.  Cincin heterosiklik diduga ditunjukkan oleh serapan ulur kuat –CH 2 − pada 2924.16 cm -1 , meskipun terdapat dugaan –CH 2 − alifatik. Tidak adanya serapan aromatik –CH− pada 3100−3000 cm -1 dan C=C pada 1650−1430 cm -1 menunjukkan  bahwa  F10.15  bukan  jenis  alkaloid aromatik,  melainkan  alkaloid  alisiklik  seperti  cincin pirolidina (C 4 H 9 N), piperidina (C 5 H 11 N), dan pirolizidina  (C 7 H 13 N)  (Pavia et  al. 2001).  Alkaloid alisiklik polihidroksi Convolvuceae (famili I . batatas ) seperti  kalistegin  telah  dilaporkan  dapat  digunakan sebagai inhibitor α-glukosidase (Molyneux et al. 1993) (Gambar 3).
OH OH OH HO
OH OH OH (a) (b) OH OH OH Sumber: Pavia et al. (2001)
Alkaloid secara umum mengandung sedikitnya 1 atom N yang bersifat basa dan merupakan bagian dari
HO (c)
Gambar  2 Struktur kalistegin A 3 (a), B 2 (b), dan B 1 (c).
HO OH N Bilangan gelombang (cm −1 ) Literatur * Gugus fungsi 3433.44 3500−3200 –NH− 3700−3000 –OH− 2924.16 3000−2800 –CH 2 –
Struktur alkaloid polihidroksi yang mirip dengan gula membuat  mekanisme  inhibisi  yang  terjadi  adalah kompetitif.  Fraksi  alkaloid  (F10.15)  yang  berwarna kuning  pucat  dapat  berlomba  dengan  substrat  (pNG) untuk  berikatan  dengan  tapak  aktif  enzim  α- glukosidase, namun setelah terikat F10.15 tidak dapat diubah oleh enzim tersebut untuk membentuk produk.
Gambar 3 Spektrum FTIR F10.15

## Simpulan
Fraksi  alkaloid  kasar  dari  daun  ubi  jalar  ungu  pada konsentrasi  2,00%  dapat  menginhibisi  enzim  α- glukosidase sebesar 61,88%. Nilai aktivitas inhibisi ini jauh  lebih  besar  dibandingkan  hasil  inhibisi  pada fraksi alkaloid F10 dan F10.15 masing-masing sebesar 48,64%  dan  18,07%  pada  konsentrasi  1,25%.  Fraksi F10.15 diduga mengandung alkaloid mirip senyawaan gula  dan  berpotensi  sebagai  inhibitor  enzim  α- glukosidase.

## Pustaka
[AOAC] Association of Official Analytical Chemists.
2006. Official  Methods  of  Analysis  of  AOAC International . Ed ke-18. Washington DC: AOAC International.
Berkov S, Chilpa R, Codina C, Viladomat F, Bastida
J.  2007.  Revised  NMR  data  for  incartine:  an alkaloid  from Galanthus  elwesii . Molecules 12:1430-1435.
Fan  G,  Han  Y,  Gu  Z,  Chen  D.  2007.  Optimizing conditions for anthocyanins extraction from
purple  sweet  potato  using  response  surface methodology (RSM). Swiss Soc Food Sci  Technol 41:155-160.
Foster K, Powell, Holt SHA, Brand JC, Miller. 2002.
Revised  International  Table  of  Glycemic  Index (GI) and Glycemic Load (GL) Values-2002. Am J Clin Nutr 7:5-56.
Harborne  JB.  1987. Metode  Fitokimia .  Ed  ke-2. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Niksolihin S,  editor.  Bandung:  ITB.  Terjemahan  dari: Phytochemical Methods .
Jarald E, Joshi SB, Jain DC. 2009. Biochemical study on  the  hypolycaemic  of  extract  and  fraction  of acacia  catechu  willd  in  alloxan-induced  diabetic rats. J Diabetes & Metabolism 1 69.
Lien  DN,  Phuc  DV,  Lien  PQ,  Trang  NT,  Kien  TT,
Lien TTP, Tien KD. 2010. Effect of sweet potato ( Ipomoea  batatas (L . )  Lam)  leaf  extract  on hypoglycemia,  blood  insulin  secretion,  and  key carbohydrate metabolic enzymes in experimentaly obese and STZ−inuced diabetic mice . VNU J Sci , Nat Sci Technol 27:118-124.
Malathi  V,  Devi  SS,  Revathi  K.  2010.  Anti  diabetic activity  by  the in  vitro alpha  amylase  and  alpha- glucosydase inhibitory activity of Catharanthus
–NH− –OH− –CH 2 –
September 2016, 4(2) ; 16-21 ; ISSN: 2337-8433
roseus . Int Quarterly J Life Sci The Bioscan 5(4):655-659.
Molyneux  RJ,  Pan  YT,  Goldmann  A,  Tepfer  DA, Elbein  AD.  1993.  Calystegins,  a  novel  class  of alkaloid  glycosidase  inhibitors. Arch  Biochem Biophys 304(1):81-88.
Owusu  D.  2008.  Nutritional  Potential  of  two  leafy vegetables: Moringa oleifera and Ipomoea batatas leaves. Sci Res and Essay 3(2):057-060.
Pavia, DL, Lampman GM, Kris GS, Vyvyan JR. 2001. Introduction to Spectroscopy : A Guide for Student of  Organic  Chemistry .  Ed  ke-3.  Philadelphia: Saunders Coll.
Pochapski  MT,  Fosquiera  EC,  Esmerino  LA,  dos Santos  EB,  Farago  PV,  Santos  FA,  Groppo  FC. 2011.  Phytochemical  screening,  antioxidant,  and antimicrobial activities of the crude leaves extract from Ipomoea  batatas  (L.)  Lam . Pharmacognosy Magazine 26:165-190.
Suda I, Oki T, Masuda M, Kobayashi M, Nishiba Y, Furuta  S.  2003.  Physiological  functionality  of purple-fleshed sweet potatoes containing anthocyanins  and  their  utilization  in  foods [review]. Japan  Agric  Res  Quarterly 37(3):167- 173.
Sugiwati S, Setiasih S, Afifah E. 2009. Antihyperglycemic  activity  of  the  mahkota  dewa [ Phaleria  macrocarpa  (scheff.)  Boerl. ]  leaf extracts as an alpha-glucosidase inhibitor. Makara Kesehatan 13:74-78.
Takikawa M, Inoue S, Horio F, Tsuda T. 2010. Dietary anthocyanin-rich bilberry extract ameliorates hyperglycemia and insulin sensitivity via activation of AMP-activated protein kinase in diabetic mice. J Nutr Dis 140:527-533.