## Analisa Interaksi Hidrofobik terhadap Kestabilan Termal Enzim Xilanase
Aspergillus niger

## Nya Daniaty Malau*, Manogari Sianturi
Program Studi Pendidikan Fisika, FKIP, Universitas Kristen Indonesia Jl. Mayjen Sutoyo No. 2 Jakarta Timur, 13630, Indonesia
*e-mail: malaunyadaniaty@gmail.com

## Abstract
Xylanase is one type of enzyme that has an important role in the field of industry. One way that can be done  to  improve  the  thermostability  of  an  enzyme  is  by  protein  engineering  .  Mutation  of  these proteins  can  be  done  by  studying  the  structure  of  proteins  through  molecular  dynamics  simulation approach. In this research, thermal stability analysis on the structure of  Aspergilus niger  Wild Type xylase (AnX) was performed. This study aims to study the thermal stability characteristic of Aspergilus niger  xylanase  enzyme  through  molecular  dynamics  simulation  approach.  Molecular  dynamics simulations of AnX were performed using NAMD (Not Just Another Molecular Dynamic) software at at a temperature of 300-500 K. This study focused on studying the thermal stability characteristic of the enzymes to obtain information on residues that are responsible for the characteristic. Selection of residues  to  be  mutated,  based  on  the  results  of  Hydrophobic  Interactions.  Based  on  the  analysis results, the design of mutant Xylanase enzyme that is more thermostable than the Wild Type Xilanase Enzyme,  so  it  can  provide  suggestions  a  more  stable  Xilanase  mutation  design  that  can  be implemented  into  wet  experiments  to  genetically  engineer  the  Aspergilus  niger  xylanase  enzyme. Xylanase  Aspergillus  niger  enzyme  is  unfolded  at  500  K  at  9.5  ns.  The  residues  responsible  for  the thermal stability of Xilanase Aspergilus niger enzyme based on hydrophobic interaction analysis are Alanine at residue 60. This residue is in segment / chain 3. The best mutant that can increase thermal stability is indicated by the Alanin 60 residue replaced with Methionin. The mutant Alanin 60 residue that  replaced  with  a  methionine  mutant  obtained  ΔΔGsolv  value  of  -21.10345.  Thus  the  Ala60Met mutant is the most stable mutant supposed to increase thermal stability of Aspergillus niger Xilanase Enzyme.
Keywords : enzyme, thermostability, mutation,  molecular dynamics

## PENDAHULUAN
Dewasa  ini  permintaan  penggunaan enzim dalam bidang industri telah meningkat  pesat  dan  mendapat  posisi penting  dalam  bidang  industri  (Falch, 1991).  Enzim  telah  banyak  dimanfaatkan baik  di  dalam  industri  pangan  maupun nonpangan.  Dalam  industri  pangan,  enzim digunakan  misalnya  dalam  industri  roti, keju, dan daging. Sedangkan dalam industri
non-pangan,  enzim  digunakan  misalnya dalam  industri  kertas  dan  deterjen.  Enzim xilanase adalah salah satu jenis enzim yang banyak digunakan dalam industri, enzim ini dapat menghidrolisis xilan.  (Marisa, 2013). Enzim  xilanase  banyak  digunakan  pada industri  pra  pemutihan    ( pre-bleaching ) pulp kimia    (Kirk  dan    Jeffries,    1996). Dalam    proses  pemutihan pulp ,    xilanase
bertindak  sbagai  fasilitator  agar  proses penghilangan  kompleks  lignin-karbohidrat ( lignin  carbohydrate  complex )    yang terbentuk  saat  proses pulping dipermudah sehingga  enzim  ini  mudah    bereaksi dengan    bahan    kimia    pemutih    dan meningkatkan  ekstraksi lignin  (Beg  dkk., 2001).    Xilanase  yang  digunakan  dalam industri  mampu  menurunkan    penggunaan senyawa    klorin    sampai    sekitar    20-40% dan  mampu meningkatkan  kualitas  kertas yang  diperoleh  (Dhillon  dkk.,  2000b;  Beg dkk.,    2001).    Selain    itu,    menggunakan enzim xilanase pada proses pemutihan pulp akan  mampu  menekan  biaya  menjadi lebih rendah  jika  dibandingkan  dengan  proses delignifikasi  oksigen, extended  cooking , dan substitusi  ozon,  klorin  dan  hidrogen peroksida  yang  biayanya jauh lebih tinggi. Karakteristik xilanase yang cocok digunakan pada industri salah satunya pada proses  pemutihan  adalah  tahan  suhu  tinggi yaitu  sekitar  (60-70 o C),    tahan  pH  alkali, berupa  endoxilanase  (Viikari  dkk.,  1994) dan bebas  dari aktivitas selulase.
Pemakaian  enzim  xilanase  di  industri pulp dan  kertas masih sangat minim hal ini dikarenakan ketidaktersediaan enzim xilanase    komersial    yang  sesuai    dengan permintaan  industri  dalam  hal  ini  industri pemutihan  kertas    (tahan    suhu    tinggi), Sejauh ini proses  produksi  xilanase  masih
menggunakan    xilan    murni    sebagai induser  akibatnya  biaya  produksi  mahal, enzim  bersifat  eksotik  (bukan  anorganik), enzim  yang  disimpan  terlalu  lama  tanpa menggunakan  metode  penyimpanan  yang tepat  menyebabkan  menurunya  aktivitas enzim  sehingga  konsentrasi  pemakaian akan  selalu  meningkat,  dan    kurangnya transfer    teknologi    pada  penggunaan enzim    di    industri.    Karakteristik  xilanase yang ada dipasaran saat ini hanya memiliki suhu  optimum  kurang  dari  50°C (Dhillon dkk.,  2000a)    olehkarena  itu  xilanase  yang ada dipasaran tidak sesuai dengan permintaan  industri,  sehingga  dilakukan berbagai upaya untuk meningkatkan kestabilam  termal  enzim  tersebut.  Salah satu  cara  yang  dapat  dilakukan  untuk meningkatkan  termostabilitas  suatu  enzim adalah dengan merekayasa enzim.
Kestabilan  terhadap  suhu  adalah  sifat protein yang banyak diamati belakangan ini. Hal  itu  dikarenakan  sejak  proses  produksi, penyimpanan  sampai  kepada  penggunaan, semua kondisi akan selalu dipengaruhi oleh panas. Stabilitas akan mempengaruhi struktur  protein.  Sehingga  struktur  protein
(konformasi) akan mempengaruhi fungsinya.    Interaksi  hidrofobik,  jembatan garam  dan  interaksi  antara  asam  amino yang memiliki  muatan seperti lisin, arginin, asam  aspartat,  asam  glutamat  serta    asam
amino dari   ikatan peptida adalah beberapa force penting yang menjaga struktur protein.
Secara  umum,  menguatkan force tersebut, misalnya  dengan  merubah  asam  amino hydrophilic dalam lingkungan yang hydrophobic ,  akan  menaikkan  stabilitas protein tersebut.
Dalam  penelitian  ini  akan  dianalisis stabilitas termal enzim xilanase Aspergillus niger Wild  Type (ANX)  berdasarkan interaksi  hidrofobiknya  melalui  pendekatan Simulasi Dinamika Molekuler (SDM).

## BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  data  eksperimen  hasil X-Ray  Diffraction berupa  data  koordinat enzim  xilanase Aspergillus  niger (Krengel dan Dijkstra, 1996)  yang  dapat diunduh di
protein data bank (PDB)
(http://www.rscb.org/pdb/)  dengan    kode PDB 1UKR (Berman et al . 2000).
Alat
Peralatan  yang  digunakan  berupa perangkat    keras    dan    perangkat    lunak. Perangkat  keras  terdiri  atas  komputer dengan spesifikasi RAM 8 GB, Quad Core Processor (Intel  CoreI7), Graphic  Card NVIDIA Ge Force GTS 9400, 16 core GPU dan  sistem  operasi  LINUX  Ubuntu  versi 14.04.  Perangkat  lunak  yang  digunakan
untuk  proses  simulasi  adalah  NAMD  ( Not Just  Another    Molecular    Dynamics Program )  versi    2.9  (Philips  dkk.,  2005) sedangkan untuk preparasi dan analisa hasil simulasi  dilakukan  menggunakan  program VMD ( Visual Molecular Dynamics
Program ) versi 1.9.1 (Humprey dkk., 1996), untuk  pengolahan  data  digunakan  program CatDCD  versi  4.  VBA  Ms.  Excel  2010 digunakan  untuk smoothing grafik,  dan Gnuplot versi 2.6 digunakan untuk membuat grafik.

## Rancangan Penelitian
1. Preparasi Sistem Simulasi
Struktur kristal enzim xilanase Aspergillus  niger (kode  PDB:  1UKR) (Krengel dan Dijkstra, 1996) yang
digunakan  pada  simulasi  didapat  dari  bank data Protein Data Bank (PDB)
( http://www.pdb.org/pdb/home/home.do ).
Penentuan  struktur  kristal  1UKR  dilakukan dengan  metode  difraksi  sinar-X  dan memiliki  resolusi  2.4  Å.  Residu  asam amino penyusun Xilanase adalah 181 residu. File PSF (Protein Structure File) adalah file berisikan informasi molekul secara spesifik yang  dibutuhkan  untuk  menerapkan  medan gaya  tertentu  ke  dalam  sistem  molekul. Untuk membuat file ini NAMD menyediakan program psfgen.
Untuk  lebih  menyerupai  lingkungan selular,  protein  dilarutkan  dan  dimasukkan
kedalam  air.  Protein  itu  dilarutkan  dalam bentuk  kotak  dengan  ukuran  100Å  x  100Å x 100Å yang berisi molekul air. Molekul air yang  dipilih  sebagai  pelarut  eksplisit (solvasi) pada sistem simulasi adalah model molekul  air TIP3P dengan metode  periodic boundary  condition (PBC).  Sistem  ini dinetralkan  dengan  menambahkan  ion (NaCl) pada konsentrasi fisiologis menggunakan   VMD solvate dan autoioniz e plugin .
Dalam  simulasi  ini  dibutuhkan  file parameter medan gaya. Sebuah medan gaya adalah  ekspresi  matematis  dari  gaya potensial  yang  diperoleh  dalam  sistem. Sebuah file parameter medan gaya CHARMM  berisi  konstanta  numerik  yang diperlukan  untuk  mengevaluasi  gaya  dan energi,  mengingat  PSF  sebuah  file  struktur dan  atom  koordinat.  Parameter  CHARMM dapat  didownload  dari  website:  http : //www.charmm.org/. Untuk  menjalankan simulasi  dinamika  molekuler  dibutuhkan script . Script simulasi  adalah  program untuk menjalankan simulasi NAMD seperti yang  diinginkan.  NAMD  menjalankan  file konfigurasi dengan  menggunakan  bahasa scripting Tcl.
2. Simulasi Dinamika Molekul
Simulasi  ini  dilakukan  dengan  empat tahapan  menggunakan  program  NAMD dengan  masukan    awal    file    konfigurasi. File  ini  sebagai  pengontrol  sistem  yang berisi  parameter    dalam    menjalankan simulasi.    File    topologi    yang    digunakan adalah  par_all27_prot_na_lipid.inp.    Tahap pertama    adalah    minimisasi.    Minimisasi bertujuan untuk meminimalkan energi pada molekul. Masukan awal adalah file struktur dan  file psf  hasil  dari  preparasi  molekul. Kedua,  pemanasan,  masukan  awal  adalah hasil  dari  minimisasi.  Pada  awal  simulasi sistem  bersuhu  0  K,  suhu  akhir  akan divariasikan  menjadi  300K,  400  K,  450  K dan 500 K. Ketiga, ekuilibrasi, suhu sistem dijaga  konstan  dengan  protokol    Langevin. Kemudian tahap terakhir adalah production run .  Pada  tahap  inilah  simulasi  dinamika molekul  dijalankan.  Molekul  dibiarkan bebas  bergerak    dengan    cara  suhu  sistem tidak  dikontrol  lagi.  Tahap  ini  dilakukan selama 10 ns untuk suhu 300K, 400 K, 450 K dan suhu 500 K.
Keluaran  dari  tahap  akhir  simulasi dinamika    molekul    adalah    file    dcd.    File ini    divisualisasikan  pada    program    VMD.
Data yang diperoleh tersebut
menghasilkan    grafik    yang    dibutuhkan untuk   analisis   kestabilan  termal  protein.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian  pada  enzim  atau  protein termostabil  dapat  memberikan  pengetahuan baru  tentang  faktor-faktor  yang  menentukan stabilitas  termal  enzim,  maupun  aplikasi praktis  pada  bidang  industri.  Pemahaman tentang faktor penentu stabilitas termal suatu protein  atau  enzim  dapat  dijadikan  sebagai acuan  untuk  merekayasa  protein  serta menghindari  kesalahan  target  mutasi  yang dapat  berakibat  fatal  terhadap  kestabilan maupun aktivitas enzim.
Penelitian  yang  telah  dilakukan terbagi atas tiga kelompok, meliputi simulasi kestabilan  termal  enzim  xilanase Aspergilus niger wild-type yaitu simulasi yang dilakukan  untuk  menganalisis  kestabilan termal  enzim,  pemilihan  mutan  enzim xilanase Aspergilus  niger dan  simulasi  FEP untuk  menganalisis  perubahan  energi  bebas solvasi mutan yang terpilih.
1. Analisis  Kestabilan  Termal  Enzim

## Xilanase Aspergilus niger
Analisis  kestabilan  termal  Enzim Aspergilus  niger dapat  diamati  dari  proses unfolding adapun  tujuan  dilakukan  analisa kestabilan  termal  pada  enzim  Xilanase adalah  untuk  mengetahui  fleksibilitas  enzim
dan perubahan struktur yang terjadi. Adapun parameter  yang  diamati  untuk  menganalisis kestabilam  termal  Enzim antara  lain  adalah RMSF ( Root-mean-square  fluctuation).
Root-mean-square fluctuation (RMSF)    adalah    akar    kuadrat    rata-rata fluktuasi koordinat  atom  terhadap  struktur referensinya.    RMSF    merupakan    analisis fleksibilitas  residu  asam  amino  penyusun protein    yang    dihitung    berdasarkan persamaan berikut :
(1)
dimana    R j merupakan    koordinat    residu    j dan  |R j |  merepresentasikan  rata-rata posisi residu    j.    Analisis    ini    digunakan    untuk mendapatkan    informasi  mengenai  residu asam amino yang bersifat fleksibel dan yang bersifat  kaku  selama  proses  simulasi berlangsung.
Untuk  parameter  RMSF  dari  gambar 1.a, 1.b, 1.c, dan 1.d  terlihat bahwa simulasi pada  temperatur  300  K,  400  K  dan  450  K nilai  RMSF  tidak  mengalami  fluktuasi secara  signifikan.  Pola  yang  diperlihatkan juga  cenderung  sama  pada  ketiga  variasi suhu.  Ini  menandakan  bahwa  protein  masih cenderung  stabil,  walaupun  ada  beberapa puncak  yang  muncul  yang  menggambarkan
residu  yang  fleksibel,  tetapi  jumlahnya masih  tergolong  sedikit.  Sedangkan  pada temperatur  500  K  nilai  RMSF  meningkat cukup  signifikan  dan  pola  nilainya  juga sangat  berbeda  dibandingkan  variasi  suhu lainnya.  Seiring  meningkatnya  temperatur,
residu-residu  yang  semula  rigid  menjadi fleksibel,  yang  ditandai  oleh  banyaknya puncak yang muncul. Hal ini mengindikasikan  bahwa  telah  terjadi  proses
unfolding pada protein.
(a)                                                                  (b)
(c)                                                                  (d)
Gambar 1. Perubahan analisis parameter enzim pada temperatur 300 K, 400 K, 450 K dan 500 K masing-masing selama 10 ns  (a).  RMSF  Segmen 1  (b). RMSF Segmen  2  (c).  RMSF Segmen 3 (d). RMSF Segmen 4
Dari  keempat  segmen  atau  chain  yang dianalisa,  segmen  1  dan  3  memiliki  pola yang  unik  dan  fluktuasi  yang  signifikan, sehingga diduga residu – residu pada chain 1 dan  3  ini  memiliki  nilai  fluktuasi  yang tinggi,  sehingga  memiliki  potensi  untuk dimutasi,  supaya  mampu  membuat  residu menjadi rigid.
2. Pemilihan Mutan Enzim Xilanase

## Aspergilus niger
Pemilihan  residu-residu  yang  akan dimutasi  untuk  meningkatkan  kestabilan enzim Aspergillus  niger didasarkan  pada analisis interaksi hidrofobik. Adapun interaksi hidrofobik dianggap mampu menentukan residu yang mana yang memiliki kontribusi signifikan untuk menstabilkam  protein  dalam  hal  ini  enzim. Analisa  tersebut  hanya  dilakukan  pada  suhu 500  K.  Pada  suhu  ini  protein  sudah unfolding ,  sehingga  mudah  untuk  mencari residu-residu penstabil protein.
Di  antara  sekian  banyak  faktor penentu  stabilitas  termal  protein,  interaksi hidrofobik  juga  dipertimbangkan    sebagai faktor  dominan  penentu  kestabilan  protein (Mathews  dan  van  Holde  1996).    Hal    ini didasari    atas    fenomena    bahwa    ketika protein    melipat (folded) sebagian  besar residu  non  polar  (~80%)  akan  terkubur  di
dalam  interior  protein,  terlindungi    dari pelarut    sehingga    menyebabkan    suatu protein dapat mempertahankan integritasnya    (Klapper  1971).    Fenomena tersebut    dikenal  sebagai    pengaruh hidrofobik  ( hydrophobic  effect ).
Dari hasil analisa RMSF  yang diamati hanya  pada  RMSF  segmen  1  dan  RMSF segmen  3.  Hal  ini  dikarenakan  pada  kedua segmen,  nilai  RMSF  berfluktuasi  sangat signifikan,  sehingga  diduga  residu  –  residu pada  chain  1  dan  3  ini  memiliki  nilai fluktuasi  yang  tinggi,  sehingga  memiliki potensi  untuk  dimutasi,  supaya  mampu membuat residu menjadi rigid. Pada segmen 1,  diperoleh  tiga  residu  yang  fleksibel. Residu  yang  hidrofobik,  yaitu  Pro76  dan residu  yang  hidrofilik  yaitu,  Ser22  dan Thr122.  Ketiga  residu  ini  berada  pada struktur  sekunder coil  dan  turn sehingga tidak cocok untuk dilakukan mutasi.
Pada  segmen  3,  diperoleh  lima  residu yang  fleksibel  yaitu  Ala60,  Trp30,  Gly158, Pro92  dan  Tyr75.  Residu  yang  hidrofobik, yaitu  Ala60,  Trp30,  Tyr75    dan  Pro92 sedangkan  residu  yang  hidrofilik  yaitu Gly158.  Residu  yang  berada  pada  struktur sekunder coil dan turn adalah residu Gly158, Tyr75 dan Pro92 sehingga tidak cocok untuk dilakukan  mutasi.  Sedangkan  residu  Ala60
dan  Trp30  berada  pada  struktur beta-sheet yang  merupakan  struktur  yang  memiliki kerusakan  lebih  besar  dibanding alpa-helix pada saat unfolding terjadi.
Sehingga  diduga  residu  ini  adalah residu hidrofobik yang putus akibat meningkatnya  temperatur  yang  diberikan pada  protein  tersebut.  Kedua  residu  tersebut Ala60  dan  Trp30  kemudian  dimutasi  dan diperoleh  6  variasi  mutan  yang  diberikan yaitu Ala60Ile, Ala60Met, Ala60Val, Trp30Ile,  Trp30Met  dan  Trp30Val.  Variasi mutan  ini  diberikan  untuk  mempertahankan interaksi hidrofobiknya.
Untuk  menganalisis    efek    mutasi terhadap    stabilitas    termal    enzim    secara kuantitatif,  dilakukan    perhitungan    nilai perubahan    energi    bebas    ( Gsolv  )
melalui pendekatan
free energy
perturbation (FEP).  Jika  perhitungan  nilai G solv positif  mengindikasikan  bahwa mutan  lebih  tidak  stabil  dibandingkan wild- type nya  dan  sebaliknya  jika  perhitungan G solv negatif  mengindikasikan  bahwa mutan  lebih  stabil  dibandingkan wild-type nya (Kollman 1993; Ghoufi et al. 2004).

## 3. Analisis Perubahan Energi Bebas Solvasi
Keluaran  simulasi  FEP  adalah  nilai ΔG    (Kcal/mol)    untuk    setiap    nilai.  Nilai
ΔG yang dihasilkan akan digunakan sebagai penentu  apakah  mutasi  yang  dilakukan mampu meningkatkan kestabilan atau malah menurunkannya.  Nilai  ΔΔGsolv  tersebut diperoleh dari selisih ΔG dari simulasi  tanpa pelarut    (vacuo)    dan    simulasi    dengan pelarut    (aqua)    didefinisikan  sebagai ΔΔGsolv  (Kcal/mol)    atau    perubahan energi    bebas    solvasi.    Nilai    tersebut menyatakan  jumlah  energi  yang  dibutuhkan melakukan  mutasi.  Mutan  yang  memiliki nilai  ΔΔGsolv  yang  negatif    artinya  mutan tersebut  mampu  meningkatkan  kestabilan dari protein yang disimulasikan dan sebaliknya  jika  bernilai  positif,  artinya mutan  menurunkan  kestabilan  dari  protein yang  dimutasi.  Simulasi  FEP  juga  bisa menjadi  tidak  stabil,  kondisi  ini  tidak merusak  fungsi  protein  sehingga  tidak disarankan  dilakukan  mutasi  jika  sistem menjadi unstable .
Dari  tabel  1  memperlihatkan  nilai ΔΔGsolv  pada  semua  calon  mutan.  Untuk mutan  Ala60Ile,  Ala60Met  dan  Ala60Val adalah  mutan  yang  diperoleh  berdasarkan analisis interaksi hidrofobik. Ketika dilakukan simulasi Free Energy
Perturbation (FEP)  maka  sistem  menjadi stabil.  Ini  dapat  kita  amati  dari  hasil  total
energi  yang  dihasilkan  yaitu  semakin
menuju negatif.
Tabel 1. Pemilihan Mutan dan Nilai Gsolv Analisa Pemilihan Mutan Residu yang akan dimutasi Mutan Gsolv (Kkal/mol) Interaksi Hidrofobik Ala 60 Ile -14.6198 Met -21.10345 Val -11.605178 Trp 30 Ile Unstable Met Unstable Val Unstable Chain 1 Chain 4 Chain 2 Trp30 Ala60 Chain 3
Gambar 2.  Posisi calon mutan berdasarkan Ikatan Hidrofobik : Trp 30 (Merah) – Ala 60 (Hitam)
Jika  energi  semakin  minimum  maka sistem  menjadi  semakin  stabil  dari  kondisi wild-type nya.  Hal  ini  berarti  mutasi  yang dilakukan  pada  Ala60Ile,  Ala60Met  dan Ala60Val sangat berpengaruh pada
peningkatan kestabilan termal protein Xilanase Aspergilus niger . Ketika dilakukan mutasi  nilai  ΔΔGsolv  pada  Ala60Ile,    yang dihasilkan  negatif  artinya  sistem  menjadi lebih  stabil  dari  kondisi  awalnya.  Besarnya ΔΔGsolv  yaitu  sebesar  -14.6198  sedangkan mutan  Ala60Met  memiliki  nilai  ΔΔGsolv yang  juga  negatif  yaitu  sebesar  -21.10345. Pada  mutan  Ala60Val  juga  memiliki  nilai ΔΔGsolv  yang  juga  negatif  yaitu  sebesar  - 11.605178. Dari nilai ΔΔGsolv mutasi Ala60 diatas maka dapat disimpulkan bahwa ketiga mutan mampu meningkatkan kestabilan dari protein  Xilanase Aspergilus  niger hanya mutan  terbaik  adalah  dihasilkan  oleh  mutan Ala60Met.  Karena  nilai  mutan  Ala60Met lebih  negatif  dibandingkan  kedua  mutan lainnya,  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa mutan  Ala60Met  menjadi  mutan  terbaik untuk  mutasi  residu  Ala60.  Ketiga  mutasi diatas  memang  ditujukan  untuk  tetap mempertahankan interaksi hidrofobik.
Hanya  saja,  residu  Ala60  melalui  preferensi konformasi
(Biological
magnetic resonance  data)
yang  terlampir  (Lampiran  3)  residu  ini memiliki  karakteristik Weak  former dalam membentuk  konformasi β-sheet dengan kemampuan  sebesar  0.97,  sedangkan  residu 60Met memiliki kemampuan sebagai Strong former  β-sheet sebesar  1.67  sehingga  residu
Metionin (60Met) lebih stabil jika dibandingkan  dengan  residu  Alanin.  Begitu juga  untuk  residu  mutan  60Ile,  residu  ini memiliki kemampuan sebagai Strong former β-sheet sebesar  1.60  sehingga  residu
Isoleusin (60Ile) lebih stabil jika
dibandingkan  dengan  residu  Alanin.  Untuk mutan  60Val juga sama, residu  ini  memiliki kemampuan  sebagai Strong  former  β-sheet sebesar  1.65  sehingga  residu  Isoleusin (60Ile) lebih stabil jika dibandingkan dengan residu Alanin. Hanya saja jika dibandingkan ketiga mutan pengganti kemampuan sebagai Strong  former  β-sheet yang  paling  besar dimiliki  oleh  residu  metionin  (60Met) sehingga  mutanAla60Met  adalah  mutan terbaik  untuk  meningkatkan  kestabilan protein  Xilanase Aspergilus  niger jika dianalisis dari ikatan hidrofobiknya.
Untuk  mutan  Trp30Ile,  Trp30Met  dan Trp30Val adalah mutan  yang juga diperoleh berdasarkan  analisis  Ikatan  Hidrofobik. Ketika  dilakukan  simulasi Free  Energy Perturbation (FEP)  maka  sistem  menjadi
tidak  stabil.  Hal  ini  berarti  residu  Triptofan (Trp30)  tidak  cocok  untuk  dimutasi.  Karena menyebabkan  sistem  menjadi  tidak  stabil. Sehingga  Hal  ini  berarti  mutasi  yang dilakukan  pada  Trp30Ile,  Trp30Met  dan Trp30Val tidak berpengaruh pada
peningkatan kestabilan termal protein Xilanase Aspergilus niger dan tidak disarankan dilakukan mutasi karena
menyebabkan  protein  menjadi  rusak  dan kehilangan fungsinya.

## KESIMPULAN
Enzim  Xilanase Aspergilus  niger mengalami unfolding pada temperatur 500 K saat 9.5 ns. Residu-residu yang bertanggung jawab  terhadap  kestabilan  termal  enzim Xilanase Aspergilus  niger berdasarkan analisa  interaksi  hidrofobik  yaitu  Alanin pada residu 60. Kedua residu ini berada pada segmen/ chain 3.
Pemilihan  mutan  enzim  Xilanase Aspergilus  niger yang  didasarkan  pada interaksi  hidrofobik  maka  variasi  mutan yang  diperoleh  yaitu  Ala60Ile,  Ala60Met, Ala60Val, Trp30Ile, Trp30Met dan Trp30Val. Variasi mutan ini diberikan untuk mempertahankan interaksi hidrofobiknya.
Dengan  melakukan    simulasi free energy perturbation (FEP) diperoleh mutan
terbaik  dan  yang  paling  mungkin  dilakukan yaitu  pada  mutan  residu  Alanin  60  yang diganti  dengan  mutan  Metionin.    Mutan residu Alanin 60 yang diganti dengan mutan metionin memperoleh nilai Gsolv sebesar -21.10345.  Sehingga  Ala60Met  adalah mutan  yang  paling  stabil  yang  diduga mampu  meningkatkan  kestabilan  termal Enzim Xilanase Aspergillus niger.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  rasa  syukur  dan terimakasih  yang  tak  terhingga  kepada Tuhan  Yang  Maha  Kuasa,  karena  akhirnya penulis  dapat  merampungkan  penelitian  ini. Penulisan  ini  dapat  terlaksana  karena bantuan  dana  dari  Universitas  Kristen Indonesia; untuk itu penulis ingin mengucapkan terimakasih. Ucapan terimakasih  juga  ingin  penulis  sampaikan kepada bapak Dekan dan Wakil dekan FKIP UKI, kepada Kaprodi Pendidikan Fisika dan kepada  koordinator  penelitian  FKIP  UKI serta  teman  sejawat  dosen-dosen  yang berhomebase di FKIP UKI. Terimakasih atas dukungan  baik  doa  dan  tenaga  yang diberikan  untuk  membantu  terselesaikannya penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Beg, Q. K., M. Kapoor, L. Mahajan, and G.S.
Hoondal.  2001.  Microbial  xylanases and  their  industrial    applications:    a review. Applied  Microbiology  and Biotechnology . 56, 326-338
Berman  HM,    Westbrook  J,    Feng  Z,
Gilliland  G,    Bhat  TN,    Weissig  H, Shindyalov  IN,    Bourne  PE.    2000. The    Protein    Data    Bank. Nucleic Acids  Res. 28:  235-242.  Betz  SF.
1993.  Disulfide  bonds  and  the stability of globular proteins. Protein
Science. 2, 1551-1558.
Dhillon,  A.,  J.  K.  Gupta,  and S.  Khanna.
2000a. Enhanced production,
purification  and characterization of a novel  cellulase-poor  thermostable, alkalitolerant  xylanase  from  Bacillus circulans    AB    16. Process Biochemistry .  35, 849- 856
Falch,    E.A.  1991.  Industrial    Enzymes Developments    in    Production    and Application. Biotech  Adv .  9,  643- 658
Ghoufi  A,  Bonal  C,  Morel  JP,  Morel-
Desrosiers  N,    Malfreyt    P.    2004.
Gibbs    Free    Energy    Perturbation Calculations,    An    Application    to the  Binding    of    Alkylammonium
Cations by Water-Soluble Calixarene .    J.  Phys.  Chem.  B. 108,
11744-11752.
Humphrey W,  Dalke A,  Schulten K. 1996.
VMD:  visual  molecular dynamics. J.
Mol. Graph. 14(1),  27 – 38.
Kirk,  T.  K.,  and T.W. Jeffries. 1996. Roles for  microbial enzymes  in  pulp  and paper    processing,  1996  dalam Jeffries,  T.W.,  Viikari,  L.  (ed). Enzymes for Pulp and Paper
Processing. Washington. USA.
Kollman    P.    1993.    Free    energy calculations:    Applications    to chemical and biochemical
phenomena. Chem  Rev. 93,  2395- 2417
Krengel, U. and B.W. Dijkstra. 1996. Three- dimensional  structure  of  Endo-1,4- beta-xylanase  I  from  Aspergillus niger: molecular basis for its low pH optimum . J.Mol.Biol. 263, 70-78
Marisa  A.  Lima.  2013.  Aspergillus  nigerβ- Glucosidase  Has  a  Cellulase-like Tadpole Molecular Shape. The Journal of Biological Chemistry. 288, 32991-33005
Mathews,  CK,  van  Holde  KE.  1996.
Biochemistry. 2 nd . The
Benjamin/Cummings
Publishing
Company, Inc.
Phillips  JC,  Braun  R,  Wang  W,  Gumbart  J,
Tajkhorshid  E,  Villa  E,  Chipot  C, Skeel  RD,  Kale L, Schulten K. 2005.
Scalable    molecular    dynamics  with NAMD. J. Comput. Chem.
26(16) ,1781-1802.
Viikari,   L.,   A.   Kantelinen,  J.  Sundquist,
and  M.  Linko.    1994.    Xylanases    in
bleaching:  from    an    idea    to    the industry.
FEMS Microbiology
Reviews . 13, 335- 350