## Research Article
Studi in Silico Potensi Senyawa Katekin Teh Hijau (Camellia sinensis)  sebagai  Antivirus  SARS  CoV-2  terhadap  Spike

## Glycoprotein (6LZG) dan Main Protease (5R7Y)

## Futna Naufa*, Roihatul Mutiah and Yen Yen Ari Indrawijaya
Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang, Malang, Indonesia *Corresponding author: Futna Naufa | Email: futnanau@gmail.com
Received: 10 December 2021; Revised: 13 March 2022; Accepted: 19 March 2022; Published: 28 March 2022
Abstract:  COVID-19  is  a  disease  caused  by  SARS  CoV-2  producing  structural  proteins  and  non-structural proteins. SARS CoV-2 uses a spike glycoprotein to bind ACE-2 receptors in host cells and uses the main protease to replicate. This research aims to screen green tea catechin derivates as an antiviral for SARS CoV-2 by spike glycoprotein (6LZG) and main protease (5R7Y) inhibition. In silico studies carried out are molecular docking, prediction of physicochemical properties, and prediction of toxicity. The potential inhibition was assessed based on  the binding  affinity  and  interaction  of  amino  acid  residues.  The  molecular  docking  process  showed  that epicatechin and epigallocatechin provide inhibition to spike glycoprotein are better than nafamostat indicated by  binding  affinity  of  -5.2  kcal/mol  and  -4.5  kcal/mol,  while  epigallocatechin  gallate  and  epicatechin  gallate provide inhibition to the main protease are better than lopinavir with the binding affinity of -8.7 kcal/mol and - 8.3 kcal/mol. The results of the physicochemical properties prediction showed that only epigallocatechin gallate that did not fulfill five Lipinski's rule. Based on the toxicity class LD50, the derivates of catechin belong to classes 4 and 6. In conclusion, epicatechin and epigallocatechin can be developed as an antiviral for SARS CoV-2.

## Keywords: catechin; spike glycoprotein; main protease; SARS CoV-2
Abstrak:  COVID-19  merupakan  penyakit  yang  disebabkan  oleh  SARS  CoV-2  dengan  memproduksi  protein struktural  dan  protein  non-struktural.  SARS  CoV-2  menggunakan  spike  glycoprotein  untuk  berikatan  dengan reseptor  ACE-2  dalam  sel  inang  dan  main  menunjukkan  bahwa  epicatechin  dan  epigallocatechin  memberikan penghambatan terhadap reseptor  spike glycoprotein lebih baik dari nafamostat yang ditunjukkan dengan nilai binding affinity sebesar -5.2 kkal/mol dan -4.5 kkal/mol, sedangkan epigallocatechin gallate dan epicatechin gallate memberikan penghambatan terhadap reseptor main protease lebih baik dari lopinavir dengan nilai binding affinity sebesar  -  8.7  kkal/mol  dan  -8.3  kkal/mol.  Hasil  prediksi  sifat  fisikokimia  menunjukkan  bahwa  hanya epigallocatechin  gallate  yang  tidak  protease  untuk  bereplikasi.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  skrining  senyawa turunan katekin teh hijau sebagai antivirus SARS CoV-2 melalui penghambatan spike glycoprotein (6LZG) dan main  protease  (5R7Y).  Studi  in  silico  yang  dilakukan  adalah  molecular  docking,  prediksi  sifat  fisikokimia,  dan prediksi  toksisitas.  Potensi  penghambatan dinilai  berdasarkan  nilai  binding  affinity dan  interaksi  residu asam amino.  Dari  proses  molecular  docking  memenuhi  Hukum  Lima  Lipinski.  Berdasarkan  kelas  toksisitas  LD 50 , senyawa turunan katekin tergolong dalam kelas 4 dan 6. Sebagai kesimpulan dapat diketahui bahwa epicatechin dan epigallocatechin dapat dikembangkan sebagai antivirus SARS CoV-2.
Kata kunci: katekin; spike glycoprotein; main protease; SARS CoV-2

## 1. PENDAHULUAN
Akhir  tahun  2019,  dunia  dilanda  pandemi  Coronavirus  Disease  2019  (COVID-19)  yang merupakan penyakit pernapasan akibat infeksi virus SARS CoV-2. Gejala awal timbulnya penyakit COVID-19 terjadi pada 8 Desember 2019 berupa demam, batuk, sakit tenggorokan, pilek dan sesak napas  [1—3].  Penularan  virus  tersebut  muncul  dari  pasar  hewan  hidup  di  Wuhan,  China  yang menyebar secara cepat dan global melalui perjalanan udara [4].
SARS  CoV-2  merupakan  anggota  tambahan  dari  Human  Coronavirus  (HCoV)  dengan  RNA  sense positif beruntai tunggal yang mengkode protein struktural dan protein non-struktural [5]. Masuknya SARS CoV-2 ke dalam sel inang dimediasi oleh transmembran  spike glycoprotein yang membentuk homotrimer menonjol dari permukaan virus [6]. Spike glycoprotein ini akan berikatan dengan reseptor Angiotensin Converting Enzyms 2 (ACE-2) untuk masuk ke sel inang [7]. Kemudian virus yang berhasil masuk tersebut akan mengalami proses replikasi dan transkripsi yang diperankan oleh Main protease (Mpro) [8]. Dalam hal ini kedua protein merupakan protein target spesifik pada SARS CoV-2.
Pengembangan  agen  terapi  antivirus  dapat  dilakukan  dengan  pengobatan  menggunakan bahan herbal atau tanaman obat. Tanaman herbal, selain mudah diperoleh juga diyakini memiliki efek samping yang relatif rendah dan aman untuk pemeliharaan kesehatan masyarakat, pencegahan dan  pengobatan  penyakit  [9,10].  Salah  satu  tanaman  herbal  yang  telah  diteliti  terkait  potensinya sebagai  agen  antivirus  adalah  teh  hijau  (Camellia  sinensis).  Teh  hijau  mengandung  empat  katekin utama, diantaranya 59% epigallocatechin gallate (EGCG), 19% epigallocatechin (EGC), 13,6% epicatechin gallate (ECG) dan 6,4% epicatechin (EC) dari total katekin daun teh hijau [11]. Senyawa EGCG dapat beinteraksi dengan reseptor permukaan virion atau sel, dimana akan mengganggu interaksi antara virion  dan  sel  inangnya  [12].  Selain  itu  snyawa  EGCG  juga  memiliki  aktivitas  antivirus  terhadap SARS CoV-2 dalam pemblokiran masuknya virus dan mampu mengahambat infeksi virus secara in vitro  [13].  Sebelumnya  juga  pernah  dilaporkan  bahwa  ekstrak  teh  hitam  dan  senyawa  aktifnya mempunyai  aktivitas  penghambatan  terhadap  3CLpro  dari  SARS  CoV  [14].  Hasil  penelitian Nishimura dkk dijelaskan bahwa reagen campuran katekin mampu menikativasi SARS CoV-2 pada dosis  tertentu  [15].  Berdasarkan  potensi  dan  mekanisme  yang  dimiliki  teh  hijau,  maka  dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme kerja senyawa turunan katekin dalam meghambat SARS CoV-2 melalui spike glycoprotein dan main protease secara in silico.

## 2. BAHAN DAN METODE

## 2.1. Bahan dan Alat
Perangkat yang digunakan adalah netbook Dell Inspiron 1122 dengan spesifikasi processor AMD E350, RAM 2 GB, dan  hard disk  500 GB. Program yang digunakan meliputi Chem Bio Draw Ultra versi 16, Chem 3D Ultra versi 16, Discovery Studio Visualizer, SwissADME, AutoDock Tools, Pymol, ProTox Online Tool, pkCSM Online Tool, dan SPSS.

## 2.2. Preparasi Ligan
Ligan  uji  merupakan  senyawa  turunan  katekin  teh  hijau  yang  berupa  epigallocatechin  gallate (EGCG), epigallocatechin (EC), epicatechin gallate (EGC), dan epicatechin (EC). Ligan pembanding yang digunakan termasuk obat dan terbukti memiliki aktivitas inhibitor spike glycoprotein (nafamostat) dan inhibitor main protease (lopinavir), sedangkan ligan natif yang digunakan merupakan ligan asli yang berikatan dengan protein target, yaitu berupa NAG (spike glycoprotein) dan JFM (main protease). Ligan
natif ini didapatkan dari protein yang telah dihapus reseptor (protein), molekul air dan ligan lain yang tidak dibutuhkan dengan menggunakan perangkat lunak Discovery Studio Visualizer. Struktur dua dimensi ligan uji dan ligan pembanding dibuat  menggunakan aplikasi Chem Bio Draw Ultra Versi 16. Kemudian dikonversi model 3D dan dioptimasi MMFF94 dengan Chem 3D Ultra Versi 16, lalu  disimpan  dalam  format  PDB  file.  Struktur  3D  tersebut  dipreparasi  dengan  AutoDock  Tools untuk dilakukan penambahan hidrogen dan muatan gasteiger. File yang sudah siap disimpan dalam format .pdbqt.

## 2.3. Preparasi Protein
Protein yang dijadikan target dalam penelitian ini adalah spike glycoprotein (PDBID: 6LZG) dan main  protease  (PDBID:  5R7Y).  Protein-protein  target  tersebut  diperoleh  dari  Protein  Data  Bank  dan dipreparasi  menggunakan  program  Discovery  Studio  Visualizer  dan  AutoDock  Tools  dengan menghilangkan bagian dari sistem yang tidak dibutuhkan termasuk ligan natif, air, menambahkan atom  H,  dan  muatan  kollman  charges.  Kemudian  disimpan  dalam  format  protein  .pdbqt  untuk dilakukan penambatan.

## 2.4. Validasi Metode
Validasi  metode  dilakukan  melalui  perangkat  lunak  AutoDock  Vina.  Validasi  ini  dilakukan dengan  cara  menambatkan  ulang  ligan  natif  pada  protein  asli  yang  telah  dipreparasi.  Metode dikatakan valid apabila memiliki nilai Root Mean Square Deviation (RMSD) < 2 Å [14]. Pada validasi dilakukan  pengaturan  grid  box  menggunakan  AutoDock  Tools,  dimana  grid  box  sebagai  ruang berinteraksinya ligan dengan residu asam amino protein target.

## 2.5. Proses Penambatan
Proses penambatan dilakukan  pada ligan uji dan ligan pembanding  terhadap masing-masing protein target melalui perangkat lunak AutoDock Vina dengan menggunakan prosedur penambatan yang telah valid. Proses penambatan berjalan dengan bantuan command prompt melalui konfigurasi vina dalam format notepad. Konfigurasi vina berisikan nama reseptor dan ligan, output, dan grid box yang telah disesuaikan. Output ini berupa hasil dari proses penambatan yang dibuat dengan nama output.pdbqt. Proses yang dijalankan oleh command prompt dikodekan dengan perintah “--config conf.txt --log log.txt”. Hasil penambatan dinyatakan dengan nilai binding affinity dan interaksi residu asam  amino.  Visualisasi  hasil  penambatan  dilakukan  dengan  menggunakan  software  Discovery Studio Visualizer dan PyMol.

## 2.6. Prediksi Sifat Fisikokimia dan Toksisitas
Prediksi  sifat  fisikokimia  bertujuan  untuk  memprediksi  probabilitas  suatu  senyawa  menjadi obat oral secara in silico yang berdasarkan pada aspek Hukum Lima Lipinski. Prediksi fisikokimia dilakukan  dengan  menggunakan  situs  SwissADME  yang  meliputi  logP  ≤  5,  berat  molekul  ≤  500 g/mol,  jumlah  akseptor  ikatan  hidrogen  ≤10,  dan  jumlah  donor  ikatan  hidrogen  ≤5  [17].  Prediksi toksisitas dari senyawa dilakukan dengan situs pkCSM online tool dan ProTox dengan parameter berupa  LD 50 ,  ames  toxicity,  dan  hepatotoxicity.  Kelas  toksisitas  LD 50 diklasifikasikan  berdasarkan Globally Harmonized System (GHS) yang dibagi menjadi kelas toksisitas I sampai VI. Semua situs yang digunakan  dalam  prediksi  sifat  fisikokimia  dan  toksisitas  ini  menggunakan  kode  SMILES  untuk menjalankan skrining.

## 3. HASIL DAN DISKUSI

## 3.1. Validasi Metode
Tujuan  dari  validasi  metode  ini  adalah  untuk  memastikan  metode  yang  digunakan  dalam docking  ligan  natif  dapat  dipercaya  sebagai  referensi  dalam  docking.  Parameter  yang  digunakan berupa Root Mean Square Deviation (RMSD), dimana metode dikatakan valid jika RMSD < 2 Å. RMSD merupakan parameter yang digunakan untuk mengevaluasi proses docking yang dijalankan sesuai atau  tidak,  dan  menggambarkan  seberapa  besar  perubahan  konformasi  ligan  alami  sebelum  dan sesudah validasi dilakukan.
Berdasarkan  proses  validasi  diperoleh  metode  docking  yang  valid  yaitu  prosedur  dengan parameter grid box x=-34.958, y=9.037, dan z=29.957 dengan grid size 7, 11, 7 spacing 1 untuk reseptor spike glycoprotein. Sedangkan untuk reseptor main protease menggunakan parameter grid box x=10.301, y=-2.386, dan z=24.735 dengan grid size 26, 22, 30 spacing 0.375. Prosedur docking yang telah dilakukan dinyatakan valid karena dari 3 kali replikasi  docking ligan natif diperoleh RMSD kurang dari 2 Å. Nilai  rata-rata  RMSD  dari  spike  glycoprotein  sebesar  1.8865  Å  dan  main  protease  sebesar  0.9725  Å. Sehingga dapat dilakukan proses molecular docking pada masing-masing protein dengan pengaturan yang sama pada validasi.

## 3.2. Analisa Hasil Molecular Docking
Hasil  dari  molecular  docking  meliputi  nilai  binding  affinity,  RMSD,  dan  interaksi  ligan  dengan residu asam amino pada protein reseptor. Perbandingan hasil dilakukan dengan membandingkan antara senyawa dengan obat pembanding sebagai kontrol. Pada penelitian ini menggunakan obat pembanding nafamostat untuk reseptor spike glycoprotein dan lopinavir untuk reseptor main protease. Obat nafamostat memiliki mekanisme kerja menghambat proses interaksi spike glycoprotein dengan reseptor target pengenalan SARS CoV-2 pada sel inang [18]. Sehingga akan mengganggu ikatan virus dengan  reseptor  sel  inang  dan  virus  tidak  berhasil  menginfeksi  sel  inang.  Sedangkan  lopinavir merupakan  antivirus  yang  bekerja  dengan  cara  menghambat  protease  (protease  inhibitor).  Protease inhibitor  yang  menghambat  replikasi  virus,  secara  selektif  akan  menghambat  pemotongan poliprotein gag dan gag-pol.
Nilai binding affinity sangat berpengaruh terhadap kestabilan interaksi antara ligan dan reseptor. Nilai binding affinity dipilih dari yang paling negatif. Nilai negatif menunjukkan energi terkecil yang digunakan oleh reseptor untuk berinteraksi dengan ligan, sehingga dapat berlansung secara spontan [19]. Semakin kecil nilai binding affinity maka interaksi antara ligan dan reseptor semakin stabil.
Berdasarkan  hasil  penambatan  terlihat  bahwa  semua  senyawa  memiliki  nilai  binding  affinity yang berbeda pada setiap reseptor dengan nilai negatif. Pada spike glycoprotein (6LZG) didapatkan hasil bahwa epicatechin memiliki nilai binding affinity terendah dengan hasil yang didapatkan yaitu - 5.2  kkal/mol,  sedangkan  pada  reseptor  main  protease  (5R7Y)  didapatkan  hasil  bahwa  senyawa epigallocatechin  gallate  memiliki  nilai  binding  affinity  terendah  sebesar  -8.7  kkal/mol. Menurut Zukhrullah, senyawa aktif diprediksi memiliki kemampuan dalam interaksi dengan reseptor target apabila memiliki nilai binding affinity yang sama atau lebih rendah dari obat pembanding [20]. Hasil nilai binding affinity disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil nilai binding affinity proses molecular docking Ligan Binding Affinity 6LZG (kkal/mol) Binding Affinity 5R7Y (kkal/mol) Ligan natif -3.1 -5.1 EGCG -3.0 -8.7 EGC -4.5 -7.3 ECG -3.3 -8.3 EC -5.2 -7.2 Ligan pembanding -3.3 -7.4
Dari  hasil  molecular  docking  dapat  diketahui  bahwa  ketika  ditambatkan  dengan  reseptor  spike glycoprotein,  binding  affinity  senyawa  epicatechin  (-5.2 kkal/mol )  dan  epigallocatechin  (-4.5 kkal/mol ) memiliki  nilai  lebih  negatif  dari  ligan  pembandingnya,  yaitu  nafamostat  (-3.3 kkal/mol ).  Berbeda dengan reseptor main protease, senyawa epigallocatechin gallate (-8.7 kkal/mol ) dan epicatechin gallate (- 8.3 kkal/mol )  memiliki  nilai  binding  affinity  yang  lebih  negatif  dibandingkan  senyawa pembandingnya lopinavir (-7.4 kkal/mol ). Penurunan nilai binding affinity menunjukkan kemudahan bioaktif  dalam  berinteraksi  pada  binding  site  target  protein  dibandingkan  ligan  pembanding  [21]. Senyawa aktif  diprediksi  memiliki  kemampuan  dalam  interaksi  dengan  reseptor  target  apabila memiliki nilai binding affinity yang sama atau lebih rendah dari senyawa pembanding. Hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa epicatechin dan epigallocatechin merupakan senyawa yang berpotensi untuk dijadikan sebagai inhibitor reseptor spike glycoprotein, sedangkan untuk senyawa epigallocatechin gallate dan epicatechin gallate berpotensi sebagai inhibitor reseptor main protease.
Pengamatan  interaksi  residu  asam  amino  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  interaksi  yang terjadi antara ligan dan reseptor. Interaksi yang terjadi berupa ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan interaksi elektrostatik. Ikatan hidrogen antara ligan uji  dengan residu asam amino yang sama pada  ligan  alami  atau  ligan  pembanding  menunjukkan  kemiripan  jenis  interaksi,  dalam  hal  ini menggambarkan  kemiripan  aktivitas  [22].  Interaksi  hidrofobik  dan  interaksi  elektrostatik  dapat meningkatkan kestabilan konformasi [23].
Pada hasil molecular docking pada spike glycoprotein menunjukkan bahwa ligan natif, ligan uji, dan ligan  pembanding  memiliki  interaksi  residu  asam  amino  berupa  ikatan  hidrogen  dan  interaksi hidrofobik.  Hasil  interaksi  ligan  dan  reseptor  hanya  didapatkan  senyawa  epigallocatechin  dan epicatechin yang memiliki kemiripan residu asam amino dengan ligan natif dan senyawa nafamostat sebagai  ligan  pembanding.  Pada  senyawa  epigallocatechin  memiliki  satu  ikatan  hidrogen  (Ser  371) yang mirip dengan ligan natif dan dua interaksi hidrofobik (Phe 342 dan Leu 368) yang mirip dengan ligan pembanding. Sedangkan pada epicatechin memiliki satu ikatan hidrogen (Ser 371) yang mirip dengan  ligan  natif  dan  satu  interaksi  hidrofobik  (Leu  368)  yang  mirip  dengan  ligan  pembanding. Residu Leu merupakan asam amino yang bersifat nonpolar yang cenderung membentuk interaksi hidrofobik. Interaksi hidrofobik merupakan interaksi yang bersifat menghindari lingkungan cair dan cenderung berkelompok di sebelah dalam struktur globular dari protein [24]. Adapun jenis interaksi residu asam amino yang terjadi ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Residu asam amino interaksi ligan-protein pada spike glycoprotein
Ligan Ikatan Hidrogen Interaksi Hidrofobik Interaksi Elektrostatik Asam Amino Jarak (Å) Ligan-Asam Amino Ligan natif Ser 371* 2.94194 O—H - - EGCG Asn 343 2.63264 O—H - - EGC Ser 371* 2.60856 O—H Phe 342** Leu 368** - ECG Asn 343 2.56703 O—H - - EC Asn 343 Ser 371* 2.87175 2.83622 O—H O—H Leu 368** - Ligan pembanding Ser 373 2.84572 N—H Phe 342** Leu 368** -
Keterangan:  *  =  asam  amino  yang  mirip  dengan  ligan  natif;  **  =  asam  amino  yang  mirip  dengan  ligan pembanding (nafamostat)
Residu  asam  amino  yang  memiliki  kemiripan  dengan  ligan  natif  menunjukkan  bahwa  ligan mampu menghambat aktivitas protein target dan berpotensi memiliki aktivitas yang sama dengan ligan natif, dimana jarak ikatan hidrogen yang sudah memenuhi syarat dengan rentang antara 2,5— 3,5 Å [24]. Jarak interaksi ini memberikan pengaruh pada kekuatan ikatan dan kestabilan interaksi ligan dan reseptor. Apabila jarak rentang kriteria terlalu dekat  atau jauh maka ikatannya menjadi tidak stabil dan mudah terlepas.
Dari  hasil  visualisasi  dapat  dilihat  bahwa  semua  residu  senyawa  epigallocatechin  gallate  yang berinteraksi  memiliki  kemiripan  dengan  ligan  natif  dan  ligan  pembanding.  Sehingga  dapat disimpulkan bahwa senyawa epigallocatechin diprediksi memiliki aktivitas antivirus yang paling baik. Visualisasi hasil molecular docking dapat dilihat pada Gambar 1.
(a)
(b)
(c)
(d)
....lanjutan Gambar 1
(e)
(f)
Gambar 1. Visualisasi interaksi (a) ligan natif (b) EGCG (c) EGC (d) ECG (e) EC (d)  nafamostat dengan spike

## glycoprotein menggunakan Discovery Studio Visualizer (kiri) PyMol (kanan)
Pada hasil  molecular docking  terhadap main protease menunjukkan  bahwa ligan  natif, ligan uji, dan  ligan  pembanding  memiliki  interaksi  residu  asama  amino  berupa  ikatan  hidrogen,  interaksi hidrofobik, dan interaksi elektostatik. Dari hasil interaksi diketahui bahwa senyawa epigallocatechin gallate,  epigallocatechin,  dan  epicatechin  memiliki  ikatan  hidrogen  yang  sama  dengan  ligan pembanding  berupa  Gly  143.  Pada  senyawa  epigallocatechin  gallate  dan  epicatechin  gallate  juga memiliki  ikatan  hidrogen  yang  mirip  dengan  ligan  pembanding  berupa  Cys  145.  Selain  ikatan hidrogen,  pada  ligan  juga  terjadi  interaksi  hidrofobik  yang  mirip  dengan  ligan  natif  dan  ligan pembanding. Interaksi hidrofobik yang mirip dengan ligan natif terdapat pada senyawa  epicatechin gallate dengan residu berupa Met 165. Kemiripan interaksi hidofobik dengan ligan pembanding yang terjadi pada senyawa epigallocatechin, epicatechin gallate dan epicatechin  berupa Met 49. Penambatan ligan uji dan reseptor main protease juga menghasilkan interaksi elektrostatik. Interaski elektrostatik berperan dalam stabilitas ligan terhadap reseptor. Meskipun interaksi ini bersifat lemah dan non- kovalen yang menyebabkan mudah lepas, namun dalam jumlah banyak interaksi elektrostatik dapat berkontribusi yang besar dalam pembentukan konformasi protein. Jenis interaksi residu asam amino yang terjadi ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Residu asam amino interaksi ligan-protein pada main protease
Ligan Ikatan Hidrogen Interaksi Hidrofobik Interaksi Elektrostatik Asam Amino Jarak (Å) Ligan-Asam Amino Ligan natif His 163** 2.00334 O—H Met 165* His 163 EGCG Thr 24 His 41 Cys 44 Ser 46 Gly 143** Cys 145** Glu 166 2.46433 2.46966 1.79333 3.48765 2.37393 3.31197 3.16247 O—H O—H O—H S—O H—O O—O O—O Thr 25 His 41 Met 49 Cys 145 EGC His 41 Ser 46 Gly 143** Gln 189 2.75639 2.95111 2.14216 3.37004 O—H O—H O—H O—O His 41 Met 49** - ECG Cys 44 2.67216 O—H Thr 25 Met 49
…lanjutan Tabel 3 Ser 46 Cys 145** Gln 189 3.79131 3.244 3.06294 O—S O—O O—O His 41 Met 49** Met 165* Met 165 EC His 41 Ser 46 Gly 143** 2.69477 2.86242 2.13071 O—H O—H O—H His 41 Met 49** Cys 145 Ligan pembanding Thr 26 Gly 143** Cys 145** His 163** 2.23629 3.22784 2.31721 3.38062 O—H O—S O—H O—O Met 49** -
Keterangan:  *  =  asam  amino  yang  mirip  dengan  ligan  natif;  **  =  asam  amino  yang  mirip  dengan  ligan pembanding (lopinavir)
Hasil  interaksi  antara  ligan  dan  protein  didapatkan  dua  ikatan  hidrogen  residu  asam  amino yang  sama  antara  ligan  uji  dengan  ligan  pembanding  yaitu  Gly  143  dan  Cys  145.  Kedua  residu tersebut  berperan  pada  pengikatan  protease.  Residu  Cys  merupakan  makromolekul  protein  pada pengikatan asam nukleat yang menjadi faktor penghambatan pada transkripsi virus  [25]. Terdapat tujuh asam amino yang berperan penting dalam aktivitas Mpro dengan membentuk ikatan hidrogen yakni Gly 143, Cys 145, His 163, His 164, Glu 166, Gln 189, dan Thr 190  [8]. Dari asam amino yang berperan penting dalam aktivitas main protease terdapat tiga asam amino (Gly 143, Cys 145, dan Glu 166) yang berinteraksi dengan  epigallocatechin gallate, dua asam amino (Gly 143 dan Gln 189) yang berinteraksi dengan epigallocatechin, dua asam amino (Cys 145 dan Gln 189) yang berinteraksi dengan epicatechin  gallate  sedangkan  epicatechin  berinteraksi  dengan  satu  asam  amino  Gly143.  Visualisasi hasil penambatan dapat dilihat pada Gambar 2.
(a)
(b)
(c)
(d)
…lanjutan Gambar 2
(e)
(f)
Gambar 2. Visualisasi interaksi (a) ligan natif (b) EGCG (c) EGC (d) ECG (e) EC (d) lopinavir dengan main protease menggunakan Discovery Studio Visualizer (kiri) PyMol (kanan)
Hasil  interaksi  antara  ligan  dan  protein  didapatkan  dua  ikatan  hidrogen  residu  asam  amino yang  sama  antara  ligan  uji  dengan  ligan  pembanding  yaitu  Gly  143  dan  Cys  145.  Kedua  residu tersebut  berperan  pada  pengikatan  protease.  Residu  Cys  merupakan  makromolekul  protein  pada pengikatan asam nukleat yang menjadi faktor penghambatan pada transkripsi virus [23]. Terdapat tujuh asam amino yang berperan penting dalam aktivitas Mpro yang membentuk ikatan hidrogen yakni Gly 143, Cys 145, His 163, His 164, Glu 166, Gln 189, dan Thr 190  [8]. Dari asam amino yang berperan penting dalam aktivitas main protease terdapat tiga asam amino (Gly 143, Cys 145, dan Glu 166) yang berinteraksi dengan  epigallocatechin gallate, dua asam amino (Gly 143 dan Gln 189) yang berinteraksi dengan epigallocatechin, dua asam amino (Cys 145 dan Gln 189) yang berinteraksi dengan epicatechin gallate sedangkan epicatechin berinteraksi dengan satu asam amino Gly143.

## 3.3. Prediksi Sifat Fisikokimia dan Toksisitas
Prediksi sifat fisikokimia dilakukan untuk mengetahui probabilitas suatu senyawa menjadi obat oral  atau  menyerupai  obat  oral.  Parameter  yang  digunakan  untuk  melakukan  prediksi  sifat fisikokimia yaitu berat molekul (BM), logaritma koefisien partisi oktanol/air (Log P), Hydrogen Bond Acceptors  (HBA), dan  Hydrogen Bond Donor  (HBD) yang  berdasarkan pada  Hukum Lima Lipinski. Prediksi sifat fisikokimia ditentukan dengan melihat nilai parameter yang dilanggar tidak lebih dari satu [26]. Hasil skrining sifat fisikokimia pada senyawa turunan katekin dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil skrining sifat fisikokimia senyawa turunan katekin
Ligan BM (g/mol) Log P HBA HBD Kesesuaian Hukum Lima Lipinski Ligan natif 458.37 1,00 11 8 Tidak EGCG 306,27 0,42 7 6 Iya EGC 442,37 1,37 10 7 Iya ECG 290,27 0,85 6 5 Iya EC 347,37 2,11 4 4 Iya Ligan pembanding 628,80 4.53 5 4 Iya
Dari  Tabel  4  menunjukkan  bahwa  senyawa  epigallocatechin,  epicatechin  gallate,  epicatechin, lopinavir  dan  nafamostat  memenuhi  aspek  Hukum  Lima  Lipinski,  sehingga  kemungkinan  aktif
secara klinis bila diberikan secara oral karena absorbsi dan permeabilitasnya yang baik. Sedangkan senyawa epigallocatechin gallate melanggar aspek Hukum Lima Lipinski. Hal ini disebabkan karena senyawa  epigallocatechin  gallate  memiliki  lebih  dari  satu  nilai  parameter  yang  tidak  memenuhi Hukum  Lima  Lipinski,  yaitu  jumlah  ikatan  hidogen  donor  yang  >  5  dan  jumlah  ikatan  hidrogen aseptor > 10. Nilai dari hidrogen donor dan hidrogen aseptor berkaitan dengan aktivitas biologis dari suatu molekul senyawa. Jumlah ikatan hidrogen donor dan aseptor ini juga akan berpengaruh pada proses absorbsi senyawa, dimana jumlah ikatan hidrogen donor dan ikatan hidrogen aseptor yang terlalu  besar  akan  membuat  energi  yang  dibutuhkan  semakin  besar  sehingga  memperlambat senyawa  mencapai  target  [27].  Sehingga  dapat  diprediksi  bahwa  senyawa  epigallocatechin  gallate mempunyai absorbsi dan permeabilitas yang rendah, dimana menurut Lipinski, senyawa akan sulit diabsorbsi dan memilki permeabilitas yang buruk jika melanggar kesesuaian Hukum Lima Lipinski [26].
Pada Tabel 4 juga dapat diketahui bahwa semua senyawa memiliki nilai log P yang memenuhi rentang  parameter  Hukum  Lima  Lipinski.  Nilai  log  P  berhubungan  dengan  hidrofobisitas  atau lipofilisitas  suatu  senyawa.  Jika  nilai  log  P  lebih  dari  lima  maka  suatu  senyawa  akan  lebih  lama tinggal  di  lipid  bilayer  dan  terdistribusi  lebih  luas  di  dalam  tubuh,  sehingga  selektivitas  ikatan terhadap target berkurang dan menyebabkan toksisitasnya menjadi lebih tinggi  [28]. Namun nilai log P yang terlalu negatif juga tidak baik karena molekul tersebut tidak dapat melewati membran lipid bilayer dan memungkinkan akan cepat terjadi interaksi dengan pelarut air [23].
Senyawa  yang  berat  molekulnya  tidak  memenuhi  rentang  parameter  Hukum  Lima  Lipinski adalah  lopinavir.  Berat  molekul  ini  berhubungan  dengan  proses  distribusi  senyawa.  Senyawa dengan berat molekul lebih dari 500 g/mol akan sulit untuk menembus membran biologis dan proses absorbsi senyawa membutuhkan waktu yang lama menembus membran biologis [23].
Prediksi  toksisitas  bertujuan  untuk  memprediksi  tingkat  toksisitas  dari  senyawa  bagi  tubuh manusia.  Prediksi  toksisitas  senyawa  dilakukan  dengan  uji  LD 50 ,  ames  toxicity,  dan  hepatotoxicity. Parameter toksisitas LD 50 diklasifikasikan berdasarkan Globally Harmonized System (GHS) yang dibagi menjadi kelas toksisitas 1 sampai VI. Keenam kelas toksisitas tersebut menggunakan ambang batas LD 50 dari 5, 50, 300, 2000, dan 5000 mg/kg berat badan dengan rincian sebagai berikut: kelas I (fatal jika tertelan) dengan rentang nilai LD 50 ≤ 5 mg/kg, kelas II (fatal jika tertelan) dengan rentang nilai 5 < LD 50 ≤ 50 mg/kg, kelas III (beracun jika tertelan) dengan rentang nilai    50 < LD 50 ≤ 300 mg/kg, kelas IV (berbahaya jika tertelan) dengan rentang nilai 300 < LD 50 ≤ 2000 mg/kg, kelas V (bisa berbahaya jika tertelan) dengan rentang nilai 2000 < LD 50 ≤ 5000 mg/kg, dan kelas VI (tidak beracun) dengan rentang nilai LD 50 >5000 mg/kg [29,30]. Adapun hasil dari prediksi toksisitas ditunjukkan pada Tabel 5.
Tabel 5. Hasil prediksi toksisitas Ligan LD 50 Kelas Toksisitas Ames toxicity Hepatotoxicity Ligan natif 1000 mg/kg IV Ya Tidak EGCG 10.000 mg/kg VI Ya Tidak EGC 1000 mg/kg IV Ya Tidak ECG 10.000 mg/kg VI Tidak Tidak EC 3.050 mg/kg V Tidak Tidak Ligan pembanding 5000 mol/kg V Tidak Ya
Berdasarkan Tabel 5 didapatkan hasil bahwa senyawa epigallocatechin gallate dan epigallocatechin memiliki  nilai  LD 50 sebesar  1000  mg/kg  dan  diklasifikasikan  masuk  pada  kelas  toksisitas  IV  yang berarti berbahaya jika tertelan. Kedua senyawa tersebut dapat menimbulkan toksisitas pada bakteri namun tidak menimbulkan efek toksik pada hepar. Senyawa yang termasuk dalam kelas toksisitas V  adalah  nafamostat  dan  lopinavir,  dimana  memiliki  kemungkinan  bisa  berbahaya  jika  tertelan. Nafamostat  ini  tidak  menimbulkan  toksiksisitas  pada  bakteri  maupun  hepar,  sedangkan  untuk lopinavir dapat menimbulkan toksik pada hepar. Senyawa yang termasuk dalam kelas tosisitas VI, dimana tidak menimbulkan toksik pada hewan coba (rodent) adalah epicatechin gallate dan epicatechin. Dari keenam senyawa yang diprediksi, senyawa epicatechin adalah senyawa yang paling baik dengan hasil prediksi toksisitas tidak beracun pada 50% populasi hewan coba (rodent) yang diujikan, tidak menimbulkan tokisisitas pada pada  bakteri mutagenik AMES, dan tidak menimbulkan kerusakan terhadap hati.
Prediksi yang dilakukan oleh peneliti memberikan hasil bahwa secara umum senyawa katekin mampu memberikan aktivitas penghambatan terhadap spike glycoprotein dan main protease dari SARS CoV-2 tanpa efek toksik yang serius. Senyawa  katekin dapat  berikatan dengan  lebih kuat dengan protein target pada virus maupun sel inang daripada senyawa pembandingnya. Dengan demikian, senyawa  katekin  akan  menciptakan  sebuah  blokade  sehingga  menghambat  perkembangan  virus untuk  menginfeksi  sel  inang  maupun  mereplikasi  diri.  Sehingga  senyawa  katekin  sangat direkomendasikan untuk diteliti lebih lanjut potensinya menjadi obat bahan yang atau bahkan bisa mencegah infeksi virus masuk ke dalam tubuh manusia.
Dalam penelitian lain juga dijelaskan bahwa reagen campuran katekin dapat menikativasi SARS CoV-2 pada dosis tertentu  secara  in vitro  [15]. Senyawa  katekin ini dapat diperoleh dari daun teh hijau. Untuk itu, jika ingin memperoleh kandungan katekin peneliti menyarankan dengan konsumsi teh hijau yang diolah dengan baik dan benar. Katekin merupakan senyawa semipolar yang bisa larut dalam air panas, sehingga dapat dikatakan pada seduhan teh hijau telah mengandung katekin yang berpotensi sebagai terapi preventif dari SARS CoV-2.

## 4. KESIMPULAN
Senyawa  katekin  yang  diprediksi  berpotensi  sebagai  antivirus  dengan  mekanisme menghambat spike glycoprotein (6LZG) yang ditunjukkan dengan nilai afinitas lebih baik dari ligan pembanding  nafamostat  adalah  epicatechin  dan  epigallocatechin,  sedangkan  untuk  senyawa  katekin yang diprediksi berpotensi sebagai antivirus dengan mekanisme menghambat main protease (5R7Y) yang  ditunjukkan  dengan  nilai  afinitas  lebih  baik  dari  ligan  pembanding  lopinavir  adalah epigallocatechin gallate dan epicatechin gallate.
Pendanaan: Penelitian ini tidak menerima pendanaan eksternal.
Ucapan terima kasih: Peneliti mengucapkan terima kasih kepada dosen pembimbing Prof. Dr. apt. Roihatul  Mutiah,  S.F.,  M.Kes.  dan  apt.  Yen  Yen  Ari  Indrawijaya  M.Farm.Klin.  yang  telah membimbing peneliti untuk menyelesaikan penelitian ini.
Konflik kepentingan: Pada penelitian ini tidak ada konflik kepentingan.

## Referensi
1. Chen, N.; Zhou, M.; Dong, X.; Qu, J.; Gong, F.; Han, Y.; Qiu, Y.; Wang, J.; Liu, Y.; Wei, Y.; Xia, J.; Yu, T.; Z hang, X.;  Zhang, L.  Epidemiological  and  Clinical  Characteristics  of  99  Cases  of  2019  Novel  Coronavirus Pneumonia in Wuhan, China: A Descriptive Study. The Lancet 2020, 395(10223), 507—513.
2. Ren, L.  L.;  Wang, Y.  M.; Wu, Z.  Q.;  Xiang, Z.  C.; Guo, L.; Xu, T.; Jiang, Y.  Z.; Xiong, Y.; Li, Y.  J.; Li, X. W.; Li, H.; Fan, G.  H.; Gu, X.  Y.; Xiao, Y.; Gao, H.; Xu, J.  Y.; Yang, F.; Wang, X.  M.; Wu, C.;  Wang, J.  W. Identification of a Novel Coronavirus Causing Severe Pneumonia in Human: A Descriptive Study. Chinese Medical Journal 2020, 133(9), 1015—1024.
3. Zhu, N.; Zhang, D.; Wang, W.; Li, X.; Yang, B.; Song, J.; Zhao, X.; Huang, B.; Shi, W.; Lu, R.; Niu, P.; Zhan, F.; Ma, X.; Wang, D.; Xu, W.; Wu, G.; Gao, G.  F.;  Tan, W. A  Novel  Coronavirus  from  Patients  with Pneumonia in China, 2019. The New England Journal of Medicine 2020, 382(8), 727—733.
4. Bogoch, Isaac I; Alexander Watts; Andrea Thomas-Bachli; Carmen Huber; Moritz U.G. Kraemer; Kamran Khan.  Pneumonia  of  Unknown  Aetiology  in  Wuhan,  China:  Potential  for  International  Spread  via Commercial Air Travel. Journal of Travel Medicine 2020.
5. Salman,  Saad;  Fahad  H  Shah;  Jawaria  Idrees;  Fariha  Idrees;  Shreya  Velagala;  Johar  Ali;  Abid  A  Khan. Virtual Screening of Immunomodulatory Medicinal Compounds as Promising anti-SARS CoV-2 Inhibitors. Future Virology 2020, 15(5).
6. Tortorici M. A.; Veesler, D. Structural Insights into Coronavirus Entry. Adv. Virus Res 2019, 105, 93-116.
7. Zhang  T.;  Wu  Q.;  Zhang  Z.  Probable  Pangolin  Origin  of  SARS  Cov-2  Associated  with  The  COVID-19 Outbreak. Curr Biol 2020, 30, 1—6.
8. Jin,  Z.;  Du,  X.;  Xu,  Y.;  Deng,  Y.;  Liu,  M.;  Zhao,  Y.;  Duan,  Y.  Structure  of  Mpro  from  SARS  CoV-2  and Discovery of Its Inhibitors. Nature 2020, 1—5.
9. Sari, Lusia Oktora RK. Pemanfaatan Obat Tradisional dengan Pertimbangan Manfaat dan Keamanannya. Majalah Ilmu Kefarmasian 2006, 3(1).
10. Setiawati,  Agustina;  Handik  Immanuel;  Mery  Tri  Utami.  The  Inhibitor  of  Typhonium  flagelliforme  Lodd. Blume  Leaf  Extract  on  COX-2  Expression  of  WiDr  Colon  Cancer  Cells.  Asian  Pasific  Journal  of  Tropical Biomedicine 2016.
11. Jin, S. Therapeutic Potential of Natural Catechins in Antiviral Activity. JSM Biotechnol Biomed Engineer 2013, 1:1002.
12. Xu, Jun; Zhao Xu; Wenming Zheng. A Review of the Antiviral Role of Green Tea Catechins. Molecules 2017, 22(8), 1337.
13. Chen CN.; Lin C; Huang KK. Inhibition of SARS CoV 3C-like Protease Activity by Theaflavin-3,3- digallate (TF3). Evidencebased Complementary and Alternative Medicine 2005, 2(2), 209—215.
14. Henever  K.  E.;  Zhao  W.;  Ball  D.  M.;  Babaoglu  K.;  Qi  J.;  White  S.  W.  Validation  of  Molecular  Docking Programs  for  Virtual  Screening  Againts  Dihydropteroate  Synthase.  Journal  Chem  Inf  Model  2009,  49(2), 444—60.
15. Lipinski, C, A. Drug Discovery Today. Technologie 2004, 1(4).
16. Lisi  L.;  Lacal  BM.;  Barbaccia  ML.;  Graziani  G.  Approaching  Coronavirus  Disease  2019:  Mechanisms  of Action  of  Repurposed  Drugs  with  Potential  Activity  Againts  SARS  CoV-2.  Biochem  Pharmacol  2020, 180:114169.
17. Adriani.  Prediksi  Senyawa  Bioaktif  dari  Tanaman  Sanrego  (Lunasia  amara)  sebagai  Inhibitor  Enzim Siklooksigenase-2 (COX-2) melalui Pendekatan Molecular Docking. Jurnal Ilmiah Pena 2008, 1(1).
18. Zukhrullah,  M.;  Aswad  M.;  Subehan.  Kajian  Beberapa  Senyawa  Antiinflamasi  :  Docking  Terhadap Siklooksigenase-2 Secara in Silico. Majalah Farmasi dan Farmakologi 2012, 16(1).
19. Kellenberger,  E.;  Foata  N.;  Rognan  D.  Ranking  Targets  in  Structure  Based  Virtual  Screening  of  Three Dimensional Protein Libraries: Methods and Problems. Journal of Chemical Information and Modelling 2008, 48(5).
20. Nursamsiar; Maya M. Mangande; Akbar Awaluddin; Syamsu Nur; Aiyi Asnawi. In Silico Study of Aglycon Curculigoside A and Its Derivates as α -Amilase Inhibitors. Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Tevhnology 2020, 7(1).
21. Syahputra, G.; L. Ambarsari; T. Sumaryada. Simulasi Docking Kurkumin Etanol, Bisdemetoksi Kurkumin dan Analoginya sebagai Inhibitor Enzim 12-Lipoksigenase. Jurnal Biofisika 2014, 10(1).
22. Lins L; Brasseur R. The Hydrophobic Effect in Protein Folding. J. Faseb 1995, 9, 535—540.
23. Casini, A.; Scozzafava, A.; Supuran, C. T. Cysteine-Modifying Agents: A Possible Approach for Effective Anticancer  and  Antiviral  Drugs.  Environmental  Health  Perspectives  2002,  110(SUPPL.  5). https://doi.org/10.1289/ehp.02110s5801
24. Lipinski;  Christopher  A.;  Lombardo;  Franco;  Dominy;  Beryl  W.;  Feeney;  Paul  J.  Experimental  and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings. Elsevier: Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 46.
25. Patrick, G.; Instant Notes in Medicinal Chemistry. BIOS Scientific Publisher: Oxford, 2001.
26. Widianti,  Tri.  Docking  dan  Modifikasi  Struktur  Senyawa  Baru  Turunan  Senyawa  Baru  Tanaman Paracetamol. Berkala Ilmiah Kimia Farmasi 2013, 2(1).
27. Drwal,  M.N.;  Banerjee,  P.;  Dunkel  M.;  Wettig  M.  R.;  Preissner  R.  ProTox:  a  Webserver  for  The  In  Silico Prediction of Rodent oral Toxicity. Nucleic Acids Res 2014, 42, 53—58.
28. El  Din;  H.,  Loutfy  S.;  Fathy,  N.;  Elberry;  Mayla  A.M.;  Kassem  S.;  Naqvi  A.  Molecular  Docking  based Screening of Compounds Againts VP40 from Ebola Virus. Bioinformation 2016, 12(3).
© 2022 by the authors. Submitted for possible open access publication under the terms and  conditions  of  the  Creative  Commons  Attribution  (CC  BY)  license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).