PROFIL EKSPRESI GEN DETERMINASI SEKS, BIOREPRODUKSI,  FENOTIPE, DAN PERFORMA LOKOMOTORI PENYU LEKANG ( Lepidochelys olivacea ) YANG DIINDUKSI PADA SUHU INKUBASI BERBEDA
EXPRESSION PROFILE OF SEX DETERMINATION GENE, BIOREPRODUCTION, PHENOTYPE, AND LOCOMOTORY PERFORMANCES OF OLIVE RIDLEY, Lepidochelys olivacea INDUCED BY DIFFERENT INCUBATION TEMPERATURE
Alfred O.M. Dima 1* , Dedy D. Solihin 2 , Wasmen Manalu 3 , dan Arief Boediono 3 1 Jurusan Biologi FST Universitas Nusa Cendana (UNDANA), Kupang; 2 Departemen Biologi FMIPA-IPB, Bogor; 3 Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi FKH-IPB, Bogor * E-mail: onny_dima@yahoo.co.id

## ABSTRACT
Sex  determination  in  turtle  species  is  not  only  based  on  genotype,  but  also  rely  on  the  incubation temperature. In addition, sexual differentiation takes place during the thermo-sensitive period (TSP). This study was conducted to determine the effects of incubation temperature on sex expression profile of  determination  gene,  bioreproduction,    phenotype,  and  locomotory  performances    of  olive  ridley turtle hatchlings. Fertile eggs incubated at two temperatures, namely feminine temperature (30-33°C), and masculine temperature (26-27°C). Value of cycle threshold (C T ) measured during TSP, i.e 23-25 embryonic development stage, and after TSP, i.e 26-27 embryonic development stage using real time PCR  techniques.  Comparison  of  gene  expression  at  both  incubation  temperatures  were  analyzed  by ANOVA,  and  Student’s t test.  Hatchling  bioreproduction  and  phenotype  measurement consist  of  the incubation  period,  embryo  growth,  morphometrics,  and  locomotori  performances  hatchlings  were analyzed  with  regression  analysis  and  Student’s  t  test.  The  results  showed  expression  of  both aromatase  and  Rspond  1  genes  (which  plays  a  role  in  ovarian  differentiation)  after  the  TSP  that incubated  at  feminine  temperature  higher  and  different  with  masculine  temperature.  In  conjunction with the  bioreproduction and phenotype, the incubation period of feminine temperature shorter than that  of  masculine.  Likewise,  growth  of  the  embryo  of  feminine  temperature  was  faster  than  that  of masculine. Incubation at feminine temperature significantly affect to carapace width, length and width of the plastron, long flippers and rear arms, long neck, and the frequency of the swing flippers.
Keywords: thermo-sensitive period (TSP), gene expression, phenotype, Lepidochelys olivacea

## ABSTRAK
Penentuan  seks  pada  penyu  tidak  hanya berdasarkan genotipe,  tetapi juga bergantung  suhu  inkubasi. Selain itu, diferensiasi seks berlangsung selama thermosensitive period ( TSP ). Penelitian ini dilakukan untuk  mengetahui  pengaruh  suhu  inkubasi  terhadap  profil  ekspresi  gen  determinasi  seks, bioreproduksi,  fenotipe,  dan  performa  lokomotori  tukik  penyu  lekang.  Telur  yang  fertil  diinkubasi pada  dua  suhu,  yaitu  suhu  feminin  (30-33°C),  dan  suhu  maskulin  (26-27°C).  Pengukuran  nilai cycle threshold (C T ) dilakukan selama TSP, yaitu stadia perkembangan embrio 23-25, dan setelah TSP , yaitu stadia  perkembangan  embrio  26-27  menggunakan  teknik real  time PCR.  Perbandingan  ekspresi  gen pada  kedua  suhu  inkubasi  dianalisis  dengan ANOVA ,  dan  dilanjutkan  dengan  uji t  student .  Hasil pengukuran  bioreproduksi  dan  fenotipe  tukik,  yaitu,  pertumbuhan  embrio,  lama  inkubasi, morfometrik,  dan  performa  lokomotori  tukik  dianalisis  dengan  analisis  regresi  dan  uji  t Student’s . Hasil penelitian menunjukkan ekspresi gen aromatase dan Rspond 1 (yang berperan dalam diferensiasi ovarium) setelah TSP dari embrio yang diinkubasi pada suhu feminin lebih tinggi dan berbeda dengan suhu  maskulin.  Berkaitan  dengan  bioreproduksi,  maka  periode  inkubasi  pada  suhu  feminin  lebih singkat dari suhu maskulin. Demikian juga pertumbuhan embrio yang lebih cepat pada suhu feminin. Inkubasi  pada  suhu  feminin  berpengaruh  nyata  terhadap  fenotipe  tukik,  yaitu  lebar  karapas,  panjang dan lebar plastron, panjang flipper dan lengan belakang, panjang leher, dan frekuensi ayunan flipper .
Kata kunci: thermo-sensitive period (TSP) , ekspresi gen, fenotipe, Lepidochelys olivacea

## I. PENDAHULUAN
Penyu  lekang  ( Lepidochelys  olive- cea ),  merupakan  salah  satu  spesies  penyu yang  menyebar  secara  luas  telah  mengalami penurunan  populasi  dalam  beberapa  tahun terakhir terutama karena faktor  antropogenik (Cornelius et  al .,  2007).  Oleh  karena  itu, penyu  lekang  tergolong  reptil  yang  dilin- dungi  dengan  kategori  Appendix  I  CITES (Convention  on  International  Trade  in  En- dangered  Species )  (Shanker et  al., 2003). Penurunan  populasi  tersebut  terlihat  dari jumlah penyu lekang betina yang mendarat di Taman  Buru  Bena,  Pulau  Timor  sebagai lokasi pengambilan sampel telur.untuk mele- takkan  telurnya  selama  5  tahun  (2010-2014) secara  berurutan  sebanyak  117,  202,  63,  28, dan  82  ekor.  Demikian  juga,  jumlah  tukik yang  dilepas  ke  laut  berturut-turut  sebanyak 12.921, 20.499, 6.618, 2.355, dan 5.418 ekor. Faktor  utama  yang  memengaruhi  penurunan populasi penyu lekang, yaitu adanya penang- kapan penyu dewasa untuk dimanfaatkan da- ging, cangkang, dan pengambilan telur penyu di sarang alami.
Penyu  termasuk  reptil  yang  perkem- bangan  gonad  dan  diferensiasi  seksnya  ber- gantung  pada  suhu  ( Temperature-dependent sex determination , TSD ). Beberapa penelitian telah  melaporkan  bahwa  suhu  berperan secara langsung selama periode inkubasi, dan memengaruhi  fenotipe  tukik.  Suhu  sarang memengaruhi  perkembangan  embrio  penyu, yaitu  nisbah  kelamin  tukik  (Standora  and Spotila,  1985;  Packard  and  Packard,1988; Maulany et  al., 2012);  kualitas  tukik  (Booth et  al. ,  2004),  dan  performa  lokomotori  tukik (Deeming, 2004; Booth, 2006; Burgess et al ., 2006;  Ischer et  al .,  2009).Adanya  variasi  fe- notipe tersebut umumnya berimplikasi terha- dap kebugaran tukik (Shine, 2004).
Penentuan seks spesies penyu sensitif terhadap  suhu  inkubasi  dan  hormon  steroid eksogen selama thermo-sensitive period . TSP bervariasi  antara  spesies,  tetapi  umumnya terjadi  sekitar  sepertiga  tengah  perkembang- an embrio,  periode di  mana diferensiasi sek-
sual gonad terjadi (Lang and Andrews, 1994; Ewert et  al. ,  1994).  Jika  induksi  suhu maupun  hormon  steroid  eksogen  diberikan sebelum TSP ,  maka  akan  merubah  perkem- bangan gonad penyu, dan sebaliknya in-duksi suhu  maupun  hormon  steroid  eksogen diberikan  setelah TSP tidak  akam  merubah perkembangan dan diferensiasi gonad karena gonad telah definitif.
Penentuan  seks  pada  tukik  hingga usia  muda  masih  sulit  dilakukan,  karena  se- cara morfologi penyu tidak memiliki karakter dimorfisme dan kromosom seks heteromorfik (Wibbels et al., 1991; Yao and Capel, 2005). Saat  ini,  salah  satu  tantangan  utama  dalam studi  spesies TSD adalah  untuk  menemukan cara sederhana untuk  menentukan seks tukik yang muncul dari sarang alami dan menaksir nisbah  kelamin.  Untuk  itu,  pendekatan penentuan  seksual  pada  skala  laboratorium mesti  dicoba  untuk  ekstrapolasi  hasil  ekspe- rimen laboratorium ke habitat alami.
Induksi  suhu  inkubasi  memengaruhi ekspresi  sejumlah  gen  yang  terlibat  dalam determinasi  seks  dan  pada  akhirnya  akan memengaruhi nisbah kelamin pada tukik. Pe- nentuan  seks  pada  spesies  penyu  sensitif terhadap  suhu  dan  hormon  steroid  eksogen selama thermo-sensitive  period . TSP berva- riasi  antara  spesies,  tetapi  umumnya  terjadi sekitar  sepertiga  tengah  perkembangan  em- brio,  yaitu  periode  di  mana  diferensiasi  sek- sual  gonad  terjadi  (Wibbels et  al., 1991; Mrosovsky  and  Pieau,  1991).  Dengan  de- mikian,  jika  induksi  suhu  atau  hormon  ste- roid  sebelum TSP pada  telur  penyu  yang diinkubasi  suhu  feminin  dan/atau  maskulin, akan  berpengaruh  terhadap  seks  tukik.  Se- dangkan,  jika  dilakukan  induksi  tersebut  se- telah TSP , maka tidak terjadi perubahan seks tukik  karena  telah  memasuki  fase  perkem- bangan embrio yang bersifat defenitif.
Perubahan  cepat  ekspresi  gen-gen determinasi  seks  yang  mengikuti  perubahan suhu  inkubasi,  menegaskan  peran  gen-gen tersebut  dalam  pembentukan  gonad  dan  me- ngatur  perkembangan  organ  (Shoemaker et al., 2007).  Sampai  saat  ini,  terdapat  18  gen
yang  terlibat  dalam  determinasi  seks  pada vertebrara  dan  bersifat  konservatif  dalam perkembangan  testis  dan  ovari  dengan  level ekspresi yang bervariasi antara spesies (Pieau et al., 2001; Rhen and Schroeder, 2010).
Aromatase  dan  Rspond  1  merupakan gen  yang  terlibat  dalam  perkembangan  dan diferensiasi  ovarium.  Aromatase  adalah  en- zim  yang  mengkonversi  (androgen)  andros- tenedion  atau  testosteron  menjadi  estrone, estrogen, atau 17β-estradiol (E 2 ) (Simpson et al., 1994).  Pada  kura-kura  dan  penyu,  suhu yang  lebih  tinggi  menyebabkan  peningkatan secara eksponen aktivitas aromatase, sebalik- nya  pada  suhu  yang  lebih  rendah  aktivitas aromatase  tetap  rendah.  Perbedaan  level aromatase  tersebut  kemudian  menjadi  pe- tunjuk  perbedaan  dari  gonad  tidak  berbeda menjadi  ovarium  atau  testis.  (Pieau et  al. , 2004; Sare et al. , 2004). Demikian pula, Res- pond  1  adalah  gen  yang  ekspresinya  lebih tinggi  pada  suhu  feminin  dan  bertanggung jawab  terhadap  diferensiasi  ovari  (Smith et al. ,  2008),dengan  mekanisme  fisiologi  je- jaring  kerja  gen  determinasi  seks  seperti aromatase (Shoemaker and Crews, 2008 ).
Hasil penelusuran pustaka menunjuk- kan  belum  tersedia  informasi  secara  lengkap tentang profil ekspresi semua gen determina- si  seks  pada  penyu L.  olivacea, selain gen Dax1,  Dmrt1,  dan  Sox  9  yang  secara  simul- tan terlibat dalam diferensiasi ovari dan testis (Torres et al., 2002).
Mengingat  penelitian  dan  informasi tentang  ekspresi  gen  determinasi  seks,  bio- reproduksi,  fenotipe,  dan  performa  lokomo- tori  penyu  lekang  yang  diinkubasi  secara buatan  masih  jarang  dan  relatif  sedikit  yang dilakukan  pada  perairan  Indonesia,  maka penelitian  ini  dapat  dilakukan.  Untuk  itu pemahaman  tentang  hubungan  antara  suhu inkubasi,  ekspresi  gen  determinasi  seks selama  tahap  perkembangan  pada  embrio, bioreproduksi,  fenotipe,  dan  juga  performa lokomotori  tukik  adalah  penting  juga  se- hingga  efektif  untuk  pengelolaan  dan konservasi pada penyu.

## II. METODE PENELITIAN

## 2.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan  Mei  2013  sampai  Mei  2014  di Kawasan  Taman  Buru  Bena,  Pulau  Timor (124°13’–124° 22’ BT dan 10°4’–10°10 LS). Tahapan  inkubasi  telur  dilakukan  pada inkubator,  di  Farm.  PT.  Al  Nusa  Kranggan Cibubur.  Pengukuran  profil  ekspresi  gen dilakukan  di  laboratorium  biologi  molekuler PSSP-LPPM IPB.

## 2.2. Metode Pengambilan sampel dan Analisis Data
Pengambilan  sampel  dilakukan  di Kawasan  Taman  Buru  Bena,  Pulau  Timor, NTT  berupa  telur  penyu  lekang,  dan  dibawa (kurang  dari  3  x  24  jam)  ke  laboratorium untuk  diinkubasi  pada  dua  suhu,  yaitu  suhu feminin, yang akan menghasilkan seks betina (30-33°C)  dan  suhu  maskulin,  yang  meng- hasilkan  seks  jantan  (26-27°C).  Selanjutnya, RNA  total  diekstraksi  dari  jaringan  otak embrio  penyu  lekang  pada  stadia  perkem- bangan  embrio  23-27  untuk  masing-masing suhu  inkubasi.  RNA  total  diekstraksi  dan diisolasi  menggunakan  kit  RNeasy  Qiagen. sesuai prosedur perusahaaan. Primer gen tar- get,  yaitu  gen  aromatase:  qmAromatase forward (5′-TGGGTTACAGTGCATTGGC- 3′) dan qmAromatase reverse (5′-GAGGCCT GGACCAGACAA-3′),  dan  un-tuk  Rspond- 1: forward  ( 5'-TCGGT-GTTCGCAATCCA GAC-3'), reverse  ( 5'-TTTGTGCAAAAGTT TCGGCTG-3'). Untuk  kontrol  ekpresi, menggunakan gen ß-actin: forward : 5’GCTC GTCGT-CGACCACGGCTC-3’ dan reverse : 5’-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC- 3’.  Pengecekan  produk  RT-PCR  dilakukan dengan  menggunakan  mesin  Gel  Doc  (Bio Red)  yang  dielektroforesis  pada  1,8%  gel agarosa  dan  di running pada  tegangan  100 volt  selama  0,45  jam.  Profil  ekspresi  gen dikuantifikasi  menggunakan SYBR  Green  I dye (Invitrogen)  dan  dijalankan  dengan mesin real  time PCR iQ Real-Time  PCR Detection  System (Bio  Red).  Kondisi  PCR
dilakukan pada 55°C (Aromatase), dan 54°C (Rspond-1)  selama  30  detik  dan  kondisi amplifikasi;  denaturasi  awal  94°C:  5  menit (sekali), annealing 94°C:  15  detik,  ekstensi 72°C:  1  menit  untuk  45  siklus  dan  72°C:  1 menit  untuk  ekstensi  akhir.  Setiap  sampel dijalankan  secara  duplo  (duplikasi)  dan  nilai tengah cycle  threshold (C T )  yang  diperoleh digunakan untuk analisis.Nilai  C T yang lebih kecil  menunjukkan  bahwa  gen  target  ter- amplifikasi lebih banyak (level ekspresi lebih tinggi).
Cycle threshold adalah siklus  dimana nilai  fluorosence  mulai  meningkat  dan  ter- deteksi  pada base  line grafik  yang  menun- jukkan  jumlah  amplikon  yang  teramplifikasi pada  siklus  tersebut.  Kriteria  nilai  C T yang diperoleh pada setiap gen, yaitu nilai C T yang diperoleh  berbanding  terbalik  dengan  level ekspresi  gen.  Artinya  pada  stadia  per- kembangan embrio yang sama, level ekspresi gen aromatase dan Rspond-1 yang tinggi jika memiliki  nilai  C T yang  lebih  kecil.  Se- baliknya,  pada  stadia  perkembangan  embrio yang  sama,  nilai  C T yang  lebih  besar  me- miliki  level  ekspresi  gen  target  yang  lebih rendah pada kedua suhu inkubasi.
Pengukuran bioreproduksi terdiri dari periode  inkubasi  dan  pertumbuhan  embrio. Pengukuran  fenotipe  bobot  badan  tukik, ukuran  morfometrik,  dan  performa  loko- motori.  Pertumbuhan  embrio  diukur  dengan cara  menghitung  bobot  embrio  penyu  (g) sesuai  tahap  perkembangan  embrional. Pe- ngukuran  fenotipe,  yaitu  bobat  badan  tukik diukur  segera  setelah  tukik  menetas  (g),  dan 9  karakter  morfometrik  tukik,  yaitu  panjang karapas  (PKs),  lebar  karapas  (LKs),  panjang plastron  (PP),  lebar  plastron  (LP),  panjang lengan  depan  (PLD),  panjang  lengan  bela- kang  (PLB),  panjang  kepala  (PK),  lebar  ke- pala (LK), dan panjang leher (PL). Performa lokomotori diukur meliputi frekuensi ayunan lengan  depan  dan  kecepatan  membalikkan tubuh.
Analisis  ragam  ( ANOVA )  digunakan untuk membandingkan level ekspresi mRNA pada  berbagai  stadia  perkembangan  embri-
onal  pada  kedua  suhu  inkubasi,  yaitu  suhu maskulin  dan  suhu  feminin.  Untuk  mem- bandingkan level mRNA pada suhu inkubasi feminin  dan  maskulin  pada  berbagai  stadia perkembangan  embrional  digunakan  uji t Student .  Selanjutnya,  analisis  regresi  di- gunakan  untuk  mengukur  pengaruh  suhu  in- kubasi  terhadap  pertumbuhan  embrio  (g) pada setiap stadia perkembangan embrio. Se- dangkan  untuk  membandingan  periode  in- kubasi,  morfometrik  tukik,  frekuensi  ayunan lengan  depan  ( flipper )  dan  kecepatan  mem- balikkan  tubuh  tukik  pada  dianalisis  meng- gunakan  uji  t Student pada  suhu  maskulin dan suhu feminin. Pada hasil pengukuran ini dijadikan  sebagai  karakter  pembeda  antara tukik  yang  dinkubasi  pada  kedua  suhu  in- kubasi.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1. Hasil

## 3.1.1. Perbandingan Profil Ekspresi Gen Determinasi Seks
Profil  ekspresi  gen  aromatase,  dan Rspond-1  pada  otak  embrio  yang  diinkubasi pada kedua suhu ditunjukkan secara berturut- turut  pada  Gambar  1  dan  2.  Profil  ekspresi gen  aromatase  (110  bp)  terekspresi  pada semua  stadium  perkembangan  embrio  dan pada  kedua  suhu  inkubasi  dengan  intensitas yang  berbeda.  Pada  stadia  perkembangan embrio  selama  periode  termosensitif  ( TSP ) pada  stadia  23  dan  24  terlihat  ekspresi  gen aromase  pada  suhu  maskulin  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  suhu  feminin . Se- baliknya  pada  stadia  perkembangan  embrio 25-27, ekspresi gen aromatase suhu maskulin menunjukkan penurunan secara berturut-turut dibandingkan dengan ekspresi gen aromatase pada  suhu  feminin . Hasil  analisis  ragam menunjukkan  bahwa  ekspresi  gen  aromatase pada  kedua  suhu  inkubasi  tidak  berbeda nyata  ( ANOVA , p =  0,331).  Perbedaan  yang tidak  siknifikan  juga  terlihat  ketika  mem- bandingkan  level  mRNA  aromatase  pada periode termosensitif (stadia 23-25) terhadap periode  setelah  periode  termosensitif  (stadia
26-27)  untuk  suhu  feminin . dan  suhu maskulin  (uji  t  Student p =  0,335).  Se- baliknya,  perbedaan  siknifikan  level  mRNA aromatase  diamati  ketika  membandingkan stadia setelah periode termosensitif (stadia 26 dan  27)  pada  kedua  suhu  inkubasi  (uji  t Student, p = 0,028).
Analisis RT-PCR gen  Rspond-1 dengan  panjang  fragmen  98  bp,  menun- jukkan  intensitas  yang  hampir  sama  pada kedua suhu inkubasi.  Berdasarkan Gambar 2 terlihat  bahwa  level  ekpresi  Rspond  1  suhu maskulin  pada  stadia  perkembangan  23  dan 24  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  suhu feminin.  Sebaliknya,  ekspresi  Rspond-1  sta- dia  perkembangan  25-27  pada  suhu  feminin lebih tinggi dari suhu maskulin.
Gambar 1. Profil ekspresi gen aromatase (C T ) pada  tahapan  embrional  penyu  le- kang.
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan perbedaan  tidak  signifikan  (ANOVA, p = 0.852)  ekspresi  gen  Rspond-1  pada  kedua suhu  inkubasi.  Hasil  yang  sama  juga  terlihat ketika  membandingkan  level  mRNA  Res- pond-1 pada periode termosensitif (stadia 23- 25)  terhadap  periode  setelah  periode  ter- mosensitif (stadia 26-27) untuk suhu feminin dan suhu maskulin (uji t Student , p = 0.852). Sebaliknya,  level  mRNA  Rspond-1  pada stadia  setelah  periode  termosensitif  (26  dan
27)  pada  kedua  suhu  inkubasi  menunjukkan berbeda nyata (uji t student , p = 0,013).
Gambar 2. Profil ekspresi gen Rspond 1 (C T ) pada  tahapan  embrional  penyu lekang.

## 3.1.2. Bioreproduksi, Fenotipe, dan
Performa Lokomotori Tukik Penyu
Lekang yang Diinkubasi pada Suhu

## Berbeda
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa periode inkubasi untuk  telur  yang diinkubasi pada suhu feminin berkisar 49-52 hari. Telur yang diinkubasi pada suhu maskulin berkisar 71-73  hari.  Selanjutnya  untuk  mengetahui pertumbuhan  embrional  penyu  lekang  telah dilakukan  pengukuran  bobot  embrio  pada seluruh  stadia  perkembangan  embrional. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  secara empiris  pertumbuhan  embrio  (g)  penyu lekang  yang  diinkubasi  pada  suhu  feminin lebih  besar  dari  suhu  maskulin (Gambar  3). Berdasarkan  hasil  analisis  regresi  terlihat bahwa pertumbuhan  embrio untuk  perlakuan suhu feminin  sebesar  Y f =  0,016X 2 -0,542X  + 4,.636 dengan nilai koefisien determinan (R 2 ) sebesar  96,80%.  Sedangkan  pada  perlakuan suhu  maskulin  sebesar  Y m =  0,009X 2 - 0,450X+5,441  dengan  koefisien  determinan (R 2 ) sebesar 92,20%.
Gambar  3.  Pertumbuhan  embrio  penyu lekang (g) yang diinkubasi pada dua suhu yang berbeda.
( a )

## (b)
Gambar  4.  Pertumbuhan  embrio  penyu lekang (g) yang diinkubasi pada dua  suhu  feminin  (a)  dan  suhu maskulin (b).
Pengukuran  morfometri  dan  perfor- mans  tukik  penyu  lekang  ditunjukkan  pada Tabel 1. Hasil pengujian perbandingan rataan ke-10  karakter  morfometrik  tukik  yang diinkubasi  pada  suhu  berbeda  menunjukkan adanya perbedaan nyata ( p <0,05) untuk ke-7 karakter  secara  berturut-turut,  yaitu  bobot badan  (BB),  lebar  karapas  (LKs),  panjang plastron  (PP),  lebar  plastron  (LP),  panjang lengan  depan  (PLD),  panjang  lengan  be- lakang  (PLB),  dan  panjang  leher  (PL).  Se- dangkan untuk karakter lainnya, yaitu karak- ter  panjang  karapas  (PKs),  panjang  kepala (PK), dan lebar kepala (LK), tidak berbeda ( p >0,05).
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan frekuensi ayunan tukik yang diinkubasi suhu feminin  (63,02±6,52  kali  per  menit)  berbeda nyata  ( p =0,00)  tukik  yang  diinkubasi  pada suhu  maskulin  (47,41±1,89  kali  per  menit). Sedangkan  kecepatan  membalikkan  tubuh (KB)  tukik  pada  kedua  suhu  inkubasi  me- nunjukkan tidak berbeda nyata ( p =0,48).

## 3.2. Pembahasan
3.2.1. Perbandingan Profil Ekspresi Gen
Determinan Seks
Hasil penelitian menunjukkan mRNA aromatase  yang  berasal  dari  jaringan  otak terekspresi pada semua stadia perkembangan (Gambar  1).  Analisis  statistik  menunjukkan bahwa level ekspresi mRNA aromatase pada kedua  suhu  inkubasi  untuk  semua  stadia perkembangan maupun pada periode sesnsitif suhu ( TSP ),  yaitu stadia 23-25 tidak berbeda nyata.  Sebaliknya,  level  mRNA  aromatase setelah TSP pada  embrio  yang  diinkubasi pada  suhu  feminin  lebih  tinggi  dan  berbeda nyata dengan suhu maskulin.
Berdasarkan  hasil  analisis  tersebut, menunjukkan  bahwa  induksi  suhu  inkubasi berpengaruh  terhadap  profil  ekspresi  gen aromatase  pada  periode  setelah TSP dengan level mRNA lebih tinggi (nilai C T lebih kecil) pada  tukik  yang  diinkubasi  pada  suhu feminin.  Beberapa  studi  pada  reptil  lainnya menunjukkan hasil yang sama dengan pene-
Tabel  1.  Bioreproduksi,  fenotipe,  dan  performa  lokomotori    tukik  penyu  lekang  yang diinduksi pada dua suhu inkubasi.
Variabel Suhu inkubasi Uji statistik Feminin 30-33 ° C (×±SD) Maskulin 26-27 ° C (×±SD) Lama inkubasi (hari) 50,20±0,89 71,91±0,70 p=0,00 Daya tetas (%) 83,33 61,11 - Frekuensi ayunan flipper (kali/menit) 63,02±6,52 47,41±1,89 p= 0,00 Kecepatan membalikkan tubuh (detik) 2,34±0,87 2,54±1,01 p=0,48 tn Bobot badan (g) 17,77±1,34 18,90±1,26 p=0,02 Panjang karapas (cm) 3,73 ±0,12 3,75±0,14 p=0,79 tn Lebar karapas (cm) 3,22 ±0,09 2,83 ±0,15 p=0,00 Panjang plastron (cm) 2,99 ±0,14 2,69±0,16 p=0,00 Lebar plastron (cm) 2,59 ±0,10 2,31±0,11 p=0,00 Panjang lengan depan (cm) 3,55 ±0,14 3,07 ± 0,1 p=0,00 Panjang lengan belakang (cm) 1,61 ±0,07 1,51 ±0,11 p=0,01 Panjang kepala (cm) 1,45 ±0,05 1,44±0,04 p=0,84 tn Lebar kepala (cm) 0,87 ±0,01 0,90±0,00 p=0,12 tn Panjang leher (cm) 0,93 ±0,11 0,83±0,10 p=0,02 Keterangan : tn = tidak berbeda nyata
tian ini dilaporkan pada  spesies TSD , seperti kura-kura T.  scripta (Murdock  and  Wibbels, 2003), Alligator mississipiensis (Gabriel et al., 2001), C.picta dan  spesies GSD ,  kura- kura Apolone  mutica (Valenzuela  and  Shi- kano,  2007)  menunjukkan  level  mRNA  aro- matase  yang  tidak  berbeda  antara  suhu feminin  dan  suhu  maskulin  selama  periode termosensitif,  tetapi  lebih  tinggi  pada  betina setelah periode termosensitif. Hasil penelitian ini memberikan data yang menunjukkan bah- wa suhu inkubasi dapat menekan atau meng- stimulasi  ekspresi  aromatase  pada  sejumlah reptil,  termasuk  penyu  lekang  yang  penen- tuan seks bergantung pada suhu inkubasi.
Ekspresi gen aromatase dan aktivitas- nya  dapat  diatur  oleh  lingkungan,  misalnya suhu  dan  hormon  sintetik  (Orlando et  al., 2002).  Sebagai  contoh,  pada  beberapa  jenis ikan  dan  reptil,  peningkatan  suhu  air  setelah stadia  perkembangan  awal  dapat  mening- katkan  ekspresi  gen  aromatase  dan  aktivitas enzimatis  sehingga  akan  menghasilkan  seks betina,  sebaliknya,  pengaruh  suhu  tersebut dapat dihambat dengan penggunaan inhibitor aromatase  yang  akan  menekan  ekspresi  gen
aromatase  sehingga  akan  menghasilkan  seks jantan (Tsai et al., 2003; Rhen et al., 2007). Diferensiasi  seks  gonad  pada  penyu TSD berlangsung  selama TSP. Pieau et  al. (1999)  menyatakan  bahwa  aromatase  adalah kompleks  enzim  yang  merubah  androgen menjadi  estrogen.  Pada  awal TSP ,  mRNA reseptor  estrogen  diekspresikan  pada  gonad. Ketika  tahap  diferensiasi  ovarium,  transkrip mRNA  reseptor  estrogen  ditemukan  di  ba- gian  medula  dan  konteks  korda  ovarium, sebaliknya  pada  diferensiasi  testis  hanya ditemukan  pada  bagian  medula  korda  tes- tikular  (Bergeron et  al., 1998).  Saat  diferen- siasi  ovarium,  epitel  germinal  menebal  ka- rena adanya proliferasi sel epitel dan sel ger- minal  hingga  membentuk  kantong  oogonia dan  akhirnya  membentuk  ovarium  definitif. Sebaliknya, diakhir TSP tahap perkembangan embrio,  diameter  korda  testikuler  semakin menurun  sebagai  akibat  menurunnya  kan- dungan  protein  dalam  testis  (Pieau et  al. , 1999).  Crews et  al .  (1991)  dan    Bergeron et al . (1994)  menyatakan bahwa estrogen alami dan  sintetik  dapat  menginduksi  diferensiasi ovarium  pada  suhu  feminin  secara  normal
selama TSP .  Pada  ikan Oreochromis  nilo- ticus ,  level  ekspresi  mRNA  P450aromA diperlukan  untuk  diferensiasi  ovarium  dan menghambat  diferensiasi  testikuler.  Implika- sinya, suhu inkubasi dapat mengatur ekspresi dan  aktivitas  gen  aromatase  (  Kitano et  al., 2000; Pieau and Dorizzi, 2004).
Secara  keseluruhan,  hasil  penelitian ini  menunjukkan  bahwa  peningkatan  level ekspresi  gen  aromatase  yang  diinduksi  suhu selama  masa  inkubasi  meningkatkan  pro- duksi estrogen  yang berperan dalam  diferen- siasi  ovarium  selama TSP dan  memperta- hankan  struktur  ovarium  setelah TSP pada suhu  feminin,  sebaliknya  induksi  suhu  mas- kulin selama perkembangan embrio berperan dalam diferensiasi testis.
Visualisasi  gel  elektroforesis  gen Rspond-1  konsisten  muncul  di  semua  stadia perkembangan  embrio  penyu  lekang  dengan intesitas  yang  berbeda.  Demikian  pula  ana- lisis real-time PCR menunjukkan bahwa eks- presi  mRNA  Rspond  1  yang  berasal  dari jaringan  otak  terekspresi  pada  semua  stadia perkembangan  (Gambar  2).  Hasil  analisis statistik  menunjukkan  tidak  terdapat  per- bedaan  level  ekspresi  mRNA  Rspond  1 antara  yang  diinkubasi  pada  suhu  maskulin dan  suhu  feminin  pada  seluruh  stadia  per- kembangan  embrional.  Demikian  juga  per- bandingan  level  ekspresi  Rspond  1  antara periode TSP (stadia  23-25)  pada  kedua  suhu inkubasi.  Meskipun  demikian,  level  mRNA Rspond  1  setelah TSP (stadia  26-27)  pada embrio  yang  diinkubasi  pada  suhu  feminin lebih  tinggi  dan  berbeda  dengan  suhu  mas- kulin.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan bahwa  Rspond-1  berfungsi,  yaitu  memper- tahankan ekspresi gonad betina dan menekan diferensiasi dan perkembangan testis.
Smith et  al. (2008)  menjelaskan bahwa  ekspresi  Rspond-1  pada  sejumlah vertebrata, seperti tikus, ayam, dan kura-kura ( Trachemys  Scripta), menunjukkan  peranan yang konservatif dalam perkembangan ovarium.  Pada T.  Scripta ,  reptil  yang  deter- minasi  seks  tergantung  pada  suhu,  ekspresi Rspond-1  secara  siknifikan  lebih  tinggi  di
awal TSP dan  terus  meningkat  pada  suhu feminin  (31°C)  dibandingkan  suhu  maskulin (26°C).  Selanjutnya,  ekspresi  Rspond  1 menurun secara siknifikan pada embrio yang suhu  inkubasinya  diganti  dari  suhu  feminin ke suhu  maskulin.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  ekspresi  Rspond-1  dipengaruhi  oleh suhu, baik pada suhu feminin dan pergantian suhu  inkubasi.  Demikian  juga  pada  spesies ikan Oryzias latipes, Zhou et  al. (2012) menemukan tiga anggota famili Rspond (1-3) yang  menunjukkan  profil  ekspresi  dimorfik secara  seksual  pada  gonad  betina  di  semua stadium  perkembangan  embrio.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  ekspresi  Rspond  1 dipengaruhi  oleh  suhu,  baik  pada  suhu feminin dan  pergantian  suhu  inkubasi,  dan gen Rspond sangat diperlukan untuk diferensiasi  ovarium.  Kocer et  al. (2008) menyatakan  bahwa  gen  Rspond-2  berperan sebagai  gen  kandidat  untuk  diferensiasi ovarium.

## 3.2.2. Bioreproduksi, Fenotipe, dan Per- forma Lokomotori Tukik Penyu Lekang yang Diinkubasi pada Suhu Berbeda
Berdasarkan  hasil  penelitian  terlihat bahwa  telur  yang  diinkubasi  pada  suhu feminin lebih singkat periode inkubasi (49-52 hari)  dibandingkan  dengan  telur  yang diinkubasi  pada  suhu  maskulin  (71-73  hari). Hasil  penelitian  ini  sejalan  dengan  Mrosov- sky et  al. (1999)  yang  menyatakan  bahwa lama  inkubasi  menjadi  lebih  singkat  pada sarang  suhu  feminin,  sebaliknya,  lama  in- kubasi  menjadi  lebih  panjang  pada  sarang suhu  maskulin.  Durasi  embriogenesis  yang lebih  pendek  dan  laju  pertumbuhan  embrio penyu  lebih  cepat  disebabkan  tingkat  me- tabolisme  lebih  tinggi  pada  suhu  feminin dibandingkan  dengan  telur  penyu  yang  di- inkubasi  pada  suhu  maskulin  (Packard  and Packard  1988).  Adanya  pola  pertumbuhan yang  lebih  tinggi  pada  embrio  yang  di- inkubasi  pada  suhu  feminin  juga  akan memegaruhi  ukuran  morfometrik  tukik  yang akan dihasilkan.
Suhu  inkubasi  telur  penyu  yang  ideal agar  embrio  tumbuh  dengan  baik  berkisar antara  24-33°C.  Masa  inkubasi  bergantung pada  suhu  pasir  di  pantai.  Marquez  (1990) menyatakan  bahwa  suhu  optimal  untuk penetasan telur penyu sisik secara semialami adalah  28-32°C.  Jika  suhu  selama  masa inkubasi  jauh  lebih  rendah  atau  lebih  tinggi dari  suhu  optimal  tersebut  maka  hasil  pe- netasan  akan  kurang  dari  50%.  Hasil  pe- nelitian  menunjukkan  ada  korelasi  negatif antara  suhu  inkubasi  dengan  durasi  periode inkubasi.
Jayasuari et  al. (1994)  menjelaskan bahwa  penyu  terrapin  diamondback  ( Mala- clemys  terrapin )  yang  diinkubasi  pada  suhu ≥31°C  menghasilkan  tukik  betina  dengan lama inkubasi 45 hari. Telur yang diinkubasi pada  suhu  ≤27°C  menghasilkan  tukik  jantan dengan lama inkubasi 60 hari.
Hasil  analisis  regresi  pertumbuhan embrio  yang  diinkubasi  pada  kedua  suhu inkubasi  (Gambar  4)  menunjukkan  adanya perbedaan  nilai  koefisien  regresi  (bi)  pada masing-masing suhu inkubasi. Nilai koefisien regresi pada suhu feminin (0,016X 2 - 0,542X) lebih  besar  dari  koefisien  regresi  pada  suhu maskulin  (0,009X 2 -0,450X).  Hal  ini  berarti, bahwa  pertumbuhan  embrio  yang  diinkubasi pada  suhu  feminin  selama  tahap  perkem- bangan embrio lebih cepat dibandingkan em- brio yang diinkubasi pada suhu maskulin. Se- cara  biologi,  tingginya  laju  pertumbuhan embrio  pada  suhu  feminin  menunjukkan kuning  telur  sebagai  cadangan  energi  lebih cepat  dikonversi  menjadi  jaringan  selama perkembangan embrionik.
Secara  umum,  pertumbuhan  embrio yang diinkubasi  pada suhu feminin  memiliki kecenderungan  lebih  cepat  dibandingkan dengan  embrio  yang  diinkubasi  pada  suhu maskulin, terutama pada hari pengamatan 38- 50  periode  inkubasi.  Jika  dikaitkan  dengan periode  inkubasi,  terlihat  bahwa  pada  suhu feminin  (30-33°C),  pertumbuhan  embrio  le- bih cepat dengan periode inkubasi lebih pen- dek  (49-52  hari),  dan  sebaliknya  pada  suhu inkubasi  maskulin  (26-27°C),  pertumbuhan
embrio lebih lambat dengan periode inkubasi lebih  panjang  (71-73  hari).  Periode  inkubasi lebih  panjang  dan  lebih  banyak  kuning  telur dikonversi  menjadi  jaringan  tukik  sehingga menghasilkan  ukuran  tubuh  lebih  besar. Akan  tetapi,  tukik  yang  ditetaskan  memiliki performa berenang  yang lebih lambat karena cadangan  energi  yang  berasal  dari  kuning telur yang mesti disimpan justru telah dikon- versi untuk proses organogenesis (Booth and Astil 2001). Transformasi dari zigot ke tukik diperpanjang oleh kondisi dingin karena suhu mengatur  tingkat  aktivitas  kimia,  termasuk yang berkontribusi terhadap tingkat metabolisme  secara  keseluruhan  (Hoegh- Guldberg and Pearse, 1995).
Berdasarkan  pengukuran  morfometri panjang  lengan  depan  (PLD)  tukik  menun- jukkan  perbedaan  signifikan  di  antara  kedua suhu  inkubasi.  Hal  yang  sama  juga  ditun- jukkan  pada  kecepatan  mendayung  ( power stroke )  dari flipper tukik  yang  berbeda  pada kedua  suhu  inkubasi.  Rendahnya  frekuensi ayunan  lengan  depan  pada  tukik  yang  di- inkubasi pada suhu rendah (26-27°C) diduga juga  berkaitan  dengan  meningkatnya  efisi- ensi  konversi cadangan  energi  (kuning telur) pada  jaringan  akibat  lamanya  periode  in- kubasi  dan  durasi  embriogenesis  penyu lekang.  Kondisi  ini  berdampak  langsung pada  berkurangnya  ketersediaan  energi  pada tukik  yang  ditetaskan  dan  akan  mengurangi frekuensi ayunan lengan depan (Packard and Packard, 1988).
Pada  penelitian  ini  juga  dilakukan perbandingan  performa  lokomotori  tukik pada  kedua  suhu  inkubasi.  Pada  suhu  fe- minin, frekuensi ayunan flipper lebih banyak (63.02±6.52)  dibandingkan  dengan  tukik yang ditetaskan pada suhu maskulin (47.41±1.89).  Hasil  ini  sejalan  dengan  ukur- an  morfometri  panjang flipper pada  suhu  fe- minin  lebih  panjang  dengan  tukik  pada  suhu maskulin.  Gyuris  (2000)  dan  Pilcher et  al. (2000) menyatakan bahwa performa lokomo- tori  penyu  hijau  adalah  faktor  utama  dalam menentukan  peluang  penyu  untuk  bertahan hidup,  yaitu  pada  periode  saat  menetas  dan
muncul  dari  sarang  hingga  mencapai  pantai perairan yang lebih dalam. Tukik penyu hijau yang  lebih  besar  memiliki  tingkat  kelang- sungan  hidup  yang  tinggi  karena  kurang rentan  dimangsa  predator  (Gyuris,  2000). Kemampuan  berenang  yang  cepat  berkaitan dengan  ukuran flippe r,  karena  tukik  lebih besar  memiliki  tungkai  yang  lebih  panjang dan  melangkah  lebih  cepat  (Janzen et  al ., 2000).  Booth  (2006)  menyatakan  bahwa ukuran  telur  berkorelasi  dengan  ukuran flipper .  Hal  ini  disebabkan  pada  suhu  mas- kulin,  periode  inkubasi  lebih  panjang  dan lebih banyak kuning telur dikonversi menjadi jaringan  tukik,  sehingga  menghasilkan  ukur- an tubuh lebih besar. Akan tetapi, tukik yang ditetaskan memiliki performa berenang  yang lebih  lambat  karena  cadangan  energi  yang berasal  dari  kuning  telur  yang  mesti  dica- dangkan justru telah dikonversi untuk proses organogenesis  (Booth  and  Astil,  2001). Transformasi  dari  zigot  ke  tukik  diperpan- jang oleh kondisi dingin karena suhu menga- tur  tingkat  aktivitas  kimia,  termasuk  yang berkontribusi  terhadap  tingkat  metabolisme secara  keseluruhan  (Hoegh-Guldberg  and Pearse,  1995).  Berkaitan  dengan  performa berenang,  hasil  pengujian  laboratorium  pada tukik  penyu  hijau  dalam  air  laut  pada  be- berapa  suhu  inkubasi,  menunjukkan  perbe- daan  yang  nyata,  yaitu  tukik  dari  telur diinkubasi  pada  25,5°C  dan  26°C  memiliki frekuensi  kecepatan  lengan  depan  menda- yung  ( power  stroke )  dan  daya  tahan  ( survi- val )  yang  lebih  rendah  dari  tukik  yang  di- inkubasi pada 28°C dan 30°C. Perbedaan ini disebabkan  oleh  kelelahan  otot-otot  tukik yang  lebih  cepat  pada  suhu  inkubasi  rendah (Burgess et al. , 2006).
Implikasi  dari  data  bioreproduksi,  fe- notipe, dan performa lokomotori tukik penyu lekang,  dapat  membantu  dalam  iden-tifikasi jenis  kelamin  penyu  lekang,  dan  mempre- diksi nisbah kelamin tukik yang dihasilkan di sarang  alami.  Sebagai  contoh,  hasil  penga- matan  rataan  lama  inkubasi  pada  pada  inku- basi  buatan  pada  suhu  feminin  (50,20±0,89 hari), ketujuh ukuran mor-fometrik yang ber-
beda  nyata,  dan  frekuensi  ayunan flipper yang  lebih  banyak  (63,02±6,52  kali  per  me- nit) dapat dijadikan sebagai parameter dimor- fisme  seks.  Demikian  juga,  dengan  pengu- kuran  ekspresi  kedua  gen  determinasi  seks, yaitu aromatase dan Rspond 1 untuk diferen- siasi  ovarium  pada  penyu  lekang.  Berkaitan dengan pemanasan global yang akan mening- katkan  suhu  lingkungan,  maka  induksi  suhu maskulin  merupakan  langkah  mitigasi  de- ngan  melakukan restocking tukik  sebagai pengkayaan  populasi  pada  suhu  maskulin (26-27ºC)  sehingga  kelangsungan  populasi penyu di alam terjaga dengan seimbang.

## IV. KESIMPULAN
Induksi  suhu  inkubasi  memberikan pengaruh  terhadap  ekspresi  gen  determinasi seks,  aromatase  dan  Rspond  1  pada  stadia perkembangan  embrio  setelah  periode  ter- mosensitif  ( TSP )  dengan  level  ekspresi  yang lebih  tinggi  pada  suhu  feminin.  Hasil  yang sama  juga  terlihat  pada  pengukuran  periode inkubasi,  pertumbuhan  embrio,  ketujuh  ka- rakter  morfometrik,  dan  frekuensi  ayunan flipper tukik  penyu  lekang  yang  menun- jukkan  suhu  feminin  merupakan  suhu  inku- basi  yang  terbaik  penyu  lekang  sebagai  spe- sies TSD dan dapat digunakan sebagai untuk dimorfisme seks pada sarang alami.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih penulis ucapkan kepada Kepala  Balai  Besar  Konservasi  Sumber Daya  Alam  Wilayah  I  NTT  beserta  staf, Direktur  dan  staf  PT.  Al  Nusa  Farm. Kranggang,  Cibubur,  dan  Kepala  dan  staf Pusat  Studi  Satwa  Primata-LPPM  IPB Bogor  yang  bersedia  membantu  selama  pe- nelitian berlangsung.

## DAFTAR PUSTAKA
Bergeron,  J.M.,  M.  Gahr,  K.  Horan,  T. Wibbels, and D. Crews. 1998. Clon- ing and in situ hybridization analysis
of  estrogen  receptor  in  the  develop- ing  gonad  of  the  redeared  slider turtle,  a  species  with  temperature- dependent  sex  determination. Dev- elopment,  Growth  and  Differen- tiation . 40(2):243-254. Doi :10.1046
/j.1440-169X.1998.00013. x.
Booth,  D.T.  2006.  Influence  of  incubation temperature  on  hatchling  phenotype in  reptiles. Physiol.  Biochem. Zool , 79:274–281. doi:10.1086/499988. Booth,  D.T.  and  K.  Astill.  2001.  Incubation temperature, energy expenditure and hatchling  size  in  the  green  turtle ( Chelonia  mydas ),  a  species  with temperature-sensitive  sex  determi- nation. Aust.  J.  Zool .  49:389–396. doi:10.1071/ZO01006.
Burgess,  E.,  D.T.  Booth,  and  J.M.  Lanyon. 2006.  Swimming  performance  of hatchling green turtles is affected by incubation temperature. Coral Reefs,
25:341-349.
Cornelius,  S.E.,  R.  Arauz,  J.  Frete,  M.H.
Godrey,  R.  Ma´rquez,  and  K.
Shanker. 2007. Effect  of land-based harvest of Lepidochelys. In : Plotkin,
P.T. ( ed. ). Biology and conservation of ridley sea turtles. The Johns Hop- kins  University  Press,  Baltimore. 231-251pp.
Deeming, D.C. 2004. Post hatching phenoty- pic  effects  of  incubation  in  reptiles, In :  Deeming,  D.C.  ( ed. ).  Reptilian incubation:  environment,  evolution and  behavior.  Nottingham  Universi- ty Press, Nottingham. 229-252pp.
Eckrich,  C.E.  and  D.W.  Owens.  1995.  Soli- tary  versus  arribadas  nesting  in  the olive  ridley  sea  turtles  ( Lepidoche- lys  olivacea ):  a  test  of  the  predator- satiation  hypothesis. Herpetologica , 51:349-354.
Ewert, M.A., D.R. Jackson, and C.E. Nelson. 1994.  Pattern  of  temperature  depen- dent  sex  determination  turtles. The  J. of. Experimental Zoology, 270:3-15.
Gabriel, W.N., B. Blumberg, S. Sutton, A.R. Place,  and  V.A.  Lance.  2001.  Alli- gator  aromatase  cDNA  sequence and  its  expression  in  embryos  at male  and  female  incubation  tem- peratures. J.  of  Experimental  Zoo- logy , 290:439-448.
Gyuris,  E.  2000.  The  relationship  between body  size  and  predation  rates  on hatchlings  of  the  green  turtle  ( Che- lonia  mydas ):  is  bigger  better. In : Pilcher et  al. ( eds. ).  Sea  turtles  of the  Indo  Pacific:  research  manage- ment  and  conservation.  Academic Press, New York, 143-147pp.
Hoegh-Guldberg,  O.  and  J.S.  Pearse.  1995.
Temperature,  food  availability,  and the  development  of  marine  inver- tebrate  larvae. Am.  Zool., 35:415-
425.
Honarvar,  S.,  M.P.  O’Connor,  and  J.R. Spotila.  2008.  Density  dependent effects  on  hatching  success  of  the olive  ridley  turtle, Lepidochelys  oli- vecea . Oecologia , 157:221-230. Ischer, T., K. Ireland, and D.T. Booth. 2009. Locomotion  performance  of  green turtle  hatchlings  from  the  Heron Island  Rockery,  Great  Barrier  Reef. Marine Bio , 156:1399-1409.
Janzen,  F.J.,  J.F.  Tucker,  and  G.L.  Paukstis.
2000.  Experimental  analysis  of  an early  life-history  stage:  selection  on size  of  hatchling  turtles. Ecology , 81:2290-2304.
Jeyasuriya,  P.,  W.M.  Roosenburg,  and  A.R.
Place.  1994.  Role  of  P-450  aroma- tase in sex determination of the dia- mondback terrapin, Malaclemys ter- rapin . J. Exp. Zool . 270:95-111.
Kitano, T., K. Takamune., Y. Nagahama, and S.I.  Abe.  2000.  Aromatase  inhibitor and  17  alpha-methyltestosterone  ca- use  sex-reversal  from  genetical  fe- males to  phenotypic males and sup- presion  of P450 aromatase  gene ex- pression  in  Japanese  flounder  ( Pa-
ralichthys  olivaceus ). Mol.  Reprod. Devel , 56:1-5.
Kocer,  A.,  I.  Pinheiro,  M.  Pannetier,  L. Renault,  P.  Parma,  O.  Radi,  K.A. Kim, G. Camerino, and E. Pailhoux.
2008.  R-spondin-1  and  FOXL2  act into  two  distinct  cellular  types  du- ring  goat  ovarian  differentiation. BMC  Dev . Biol, 8:36.  doi:10.1186/ 1471-213X-8-36.
Lang, J.W. and H.V. Andrews. 1994. Tempe- rature  dependent  sex  determination in  Crocodilians. The  J.  of  Experi- mental Zoology , 270:28-44.
Marquez, M.R. 1990. Sea turtles of the world an annotated and illustrated catalogue of  sea  turtle  species  known  to  date. FAO Species Catalog, FAO Fisheries Syn. 81p.
Maulany,  R.I.,  D.T.  Booth,  and  G.S.  Baxter. 2012.  Emergence  success  and  sex ratio  of  natural  and  relocated  nests o:f  olive  ridley  turtles  from  Alas Purwo  National  Park,  East  Java,
Indonesia. Copeia, 4:738-747.
Moreno-Mendoza N., V. Harley, and H. Mer- chant-Larios.  1999.  Differential  ex- pression  of  SOX9  in  gonads  of  the sea  turtle Lepidochelys  olivacea at male  or  female-promoting  tempera- tures. J. Exp Zool., 284:705-710.
Mrosovsky,  N.  and  C.L.  Yntema.  1980.
Temperature  dependence  of  sexual differentiation  in  sea  turtles:  impli- cations  for  conservation  practices. Biological  Conservation ,  18:271- 280.
Mrosovsky,  N.,  C.  Baptistotte,  and  M.H. Godfray.  1999.  Validation  of  incu- bation  duration  as  an  index  of  the sex  ration  hatchling  sea  tyrtle. Can.
Journal Zoology, 77:831-835.
Murdock,  C.  and  T.  Wibbels.  2003.  Cloning and  expression  of  aromatase  in  a turtle  with  temperature  dependent sex  determination. General  and Comparative  Endocrinolog, 130: 109-119.
Orlando, E.F., W.P. Davis, and L.J. Guillette. 2002. Aromatase activity in the ova- ry  and  brain  of  the  eastern  mos- quitofish  ( Gambusia  holbrooki )  ex- posed  to  paper  mill  effluent. Envi- ronmental  Healt  Perpectives ,  4(3):
429-433.
Packard,  G.C.  and  M.J.  Packard.  1988.  The physiological  ecology  of  reptilian eggs  and  embryos. In: Ecology  B. Gans, et  al .  (eds.).  Biology  of  the reptilian.  Alan  R.  Liss  Press,  New York. 523-605pp.
Pilcher, N.J., S. Enderby, T. Stringell, and L.
Bateman.  2000.  Nearshore  turtle hatchling distribution and predation. In : Pilcher et al. (eds.). Sea turtles of the  Indo-Pacific:  research,  manage- ment  and  conservation.  Academic Press,  New  York.http://www.arbec. com.my/sea-turtles/art.htm.[Retrie- vet on 10 April 2013]. 113-119pp. Pieau,  C.,  M.  Dorizzi,  and  N.R.  Mercier. 1999.  Temperature  dependent  sex determination  and  gonadal  differen- tiation  in  reptiles. Cell.  Mol.  Life Sci. , 55:887-900.
Pieau,  C.,  M.  Dorizzi,  and  N.R.  Mercier. 2001.  Temperature  dependent  sex determination  and  gonadal  differen- tiation in reptiles. EXS., 91:117-141. Pieau,  C.  and  M.  Dorizzi.  2004.  Oestrogens and  temperature  dependent  sex  de- termination  in  reptiles:  all  is  in  the gonads. J. Endocrin. , 181:367-377.
Rhen,  T.,  K.  Metzger,  A.  Schroeder,  and  R. Woodward. 2007. Expression of pu- tative  sex-determining  genes  during the  of  gonad  development  in  the Snapping  Turtle, Chelydra  serpen- tina . Sexual  Development ,  1:255- 270. doi: 10.1159/000104775.
Rhen, T. and A. Schroeder. 2010. Molecular mechanisms of sex determination in reptiles. Sexual  Development, 4:16-
28.
Sarre, S.D., A. Georges, and A. Quinn. 2004. The  ends  of  a  continuum:  genetic
and  temperature-dependent  sex  de- termination  in  reptiles. BioEssays, 26:639-645.
Shanker,  K.,  B.  Pandav,  and  B.C.  Chou- dhury.  2003.  An  assessment  of  the olive ridley turtle ( Lepidochelys oli- vecea )  nesting  population  in  Orissa, India. Biological Conservation , 115: 149-160.
Shine,  R.  2004.  Adaptive  consequences  of developmental  plasticity, In :  Deem- ing D.C. (ed.). Reptilian incubation: environment,  evolution  and  behavi- our,  Nottingham  University  Press, Nottingham. 187-210pp.
Shoemaker,  C.M.,  J.  Queen,  and  D.  Crews. 2007. Temperature-responsive genes involved  in  gonadogenesis. Mole- cular  Endocrinology ,  21(11):1-15. doi:10.1210/me.2007-0263.
Shoemaker,  C.M.  and  D.  Crews.  2008.
Analyzing  the  coordinated  gene network  underlying  temperature- dependent  sex  determination  in  re- ptiles.  Seminars  in  Cells and  Deve- lopmental Biology . 20(3):293-303. Simpson,  E.R.,  M.S.  Mahendroo,  G.D. Means,  M.M.  Kilgore,  M.M.  Hins- helwood,  S.  Graham-Lorence,  B. Amarneh,  Y.  Ito,  C.R.  Fisher,  M.D. Michael,  C.R.  Mendelson,  and  S.E. Bulun. 1994. Aromatase cytochrome P450,  the  enzyme  responsible  for estrogen  biosynthesis. Endocrinol. Rev. , 15:342-355.
Smith,  C.A.,  C.M.  Shoemaker,  K.N.  Roes- zler1, J. Queen, D. Crews, and A.H. Sinclair.  2008.  Cloning  and  expres- sion of RSpondin-1 in different ver- tebrates suggests a conserved role in ovarian  development. BMC  Deve- lopmental Biology , 8:72 doi:10.1186 /1471-213X-8-72.
Standora,  E.A.  and  J.R.  Spotila.  1985.  Tem- perature  dependent  sex  determina- tion  in  sea  turtles. Copeia, 3:711–
722.
Torres-Maldonado, L., A.L. Piedra, N. More- no-Mendoza,  A.M.  Valencia,  A.M. Martinez,  and  H.  Merchant-Larios. 2002.  Expression  profiles  of  Dax1, Dmrt1, and Sox9 during temperature sex  determination  in  gonads  of  the sea  turtle Lepidochelys  olivacea . Gen. Comp. Endocrinol. , 129:20-26. Tsai,  M.J. and B.W. O’Malley. 1994. Mole- cular mechanism of action of steroid /thyroid  receptor  superfamily  mem- bers .  Ann.  Rev.  Biochem. ,  63:451- 489.
Valenzuela,  N.  and  T.  Shikano.  2007.  Em- bryological  ontogeny  of  aroma-tase gene  expression  in Chrysemys picta and Apalone mutica turtles:  compa- rative  patterns  within  and  across temperature-dependent  and  genoty- pic  sex  determining  mecha-nisms; Dev. Genes. Evol., 217:55-62.
Wallace,  B.P.,  P.R.  Sotherland,  J.R.  Spotila, R.D.  Reina,  B.F.  Franks,  and  F.V. Paladino.  2004.  Biotic  and  abiotic factors  affect  the  nest  environment of  embryonic  leatherback  turtles, Dermochelys coriacea. Physiol. Biochem. Zool. , 77:423-432.
Wibbels,  T.,  J.J.  Bull,  and  D.  Crews.  1991.
Chronology  and  morphology  of temperature  dependent  sex  deter- mination. J. Exp Zool. , 260:371-381. Yao,  H.H.C.  and  B.  Capel.  2005.  Tempera- ture,  genes,  and  sex:  a  comparative view  of  sex  determination  in Tra- chemys  scripta and Mus  musculus . J. of Biochemistry , 138:5-12.
Zhou,  L.,  T.  Charkraborty,  X.Yu,  L.Wu,  G.
Liu, S. Mohapatra,  D.Wang, and Y. Nagahama.  2012.  R-spondins  are involved  in  the  ovarian  differen- tiation in a teleost, medaka ( Oryzias latipes ). BMC  Dev.  Biol. ,  12:36. doi:10.1186/1471-213X-12-36.
Dierima : 11 Maret 2015 Direview : 1 Juni 2015 Disetujui : 23 Juni 2015