Hasil Penelitian

## APLIKASI MUTAN BERFLUORESENS UNTUK MEMPELAJARI KETAHANAN HIDUP, KOLONISASI DAN PENETRASI ISOLAT Cronobacter sakazakii SELAMA PENGERINGAN JAGUNG
[Use of GFP Mutant to Study the Survival, Colonization and Penetration of Cronobacter sakazakii Isolates During Maize Drying]
Siti Nurjanah 1,2) *, Maggy T. Suhartono 1) , Ratih Dewanti-Hariyadi 1,2) dan Sri Estuningsih 3)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor, Bogor
3) Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 22 Oktober 2013 / Disetujui 05 Desember 2013

## ABSTRACT
Cronobacter sakazakii is a Gram-negative emerging pathogen regarded as causative agent of meningitis and necrotizing enterocolitis in certain groups of infants. In the previous research, thirty-two local isolates of C. sakazakii were obtained from various dried food products such as from corn starch, suggesting that they are able to survive drying. Some of the isolates were toxic. Green Fluorescent Protein ( GFP ) have been inserted to C. sakazakii and used as a marker for selective enumeration due to the ability of this protein to fluoresce under UV and to tolerate in ampicillin containing media. The objective of this study was to evaluate the survival, colonization and penetration of two isolates of C. sakazakii from dried food product during maize drying. The maize was challenged with mutants at a concentration of 10 5 -10 6 CFU/g before drying. Maize drying was performed at temperature of 40, 45 and 50ºC for 4, 6 and 8 days until the moisture content reached 14%. The totals of resistant drying mutants were  counted  every  day  onto  ampicillin  containing  media  by  observing  under  UV  light.  The  survival  rate  of  C.  sakazakii  during  drying  was determined  by  the  slope  of  linier  regression  from  C.  sakazakii  survival  curve.  Isolates  of  FWHd16,  the  toxic  strain  of  C.  sakazakii,  were  more resistant to heat treatments in comparison to isolates of YRt2a, or the non toxic strain of C. sakazakii. Following fluorescence and scanning electron microscope observation, it is concluded that both isolates were colonizing on maize surface. These mutants were able to penetrate to the inner side of the grain by entering injured surface or pores at the tip cap of maize.
Keywords: Cronobacter sakazakii, GFPuv, maize, mutant, survival

## ABSTRAK
Cronobacter sakazakii merupakan bakteri Gram negatif yang dapat menyebabkan meningitis dan necrotizing enterocolitis pada kelompok bayi tertentu. Pada penelitian sebelumnya telah diisolasi tiga puluh dua isolat C. sakazakii dari beberapa produk pangan kering termasuk maizena, yang mengindikasikan  ketahanan  bakteri  tersebut  terhadap  proses  pengeringan.  Sebagian  isolat  telah  dievaluasi  memiliki  aktivitas  toksik. Green Fluorescent Protein (GFP) telah berhasil disisipkan pada C. sakazakii dan digunakan sebagai penanda untuk perhitungan koloni secara selektif karena kemampuannya berfluoresens di bawah sinar UV dan tumbuh di media mengandung ampisilin. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi ketahanan hidup, kemampuan kolonisasi dan penetrasi dua isolat C. sakazakii selama proses pengeringan jagung menggunakan mutan berlabel GFP. Jagung diinokulasi dengan mutan pada konsentrasi 10 5 -10 6 CFU/g sebelum proses pengeringan. Pengeringan jagung dilakukan pada suhu 40, 45 dan 50ºC selama 4, 6 dan 8 hari sampai kadar air mencapai ≤14%. Jumlah koloni yang tahan terhadap pengeringan dihitung setiap hari pada media yang mengandung ampisilin melalui pengamatan di bawah sinar UV. Laju penurunan C. sakazakii selama pengeringan ditunjukkan oleh slope regresi linier dari kurva ketahanan hidup. Isolat toksik FWHd16 lebih tahan pada ke-3 suhu pengeringan dibandingkan dengan isolat nontoksik  YRt2a.  Pengamatan  dengan  mikroskop  fluoresens  dan  SEM  menunjukkan  bahwa  kedua  isolat  mampu  berkolonisasi  di  permukaan jagung. Kedua isolat dapat berpenetrasi ke dalam jagung melalui bagian yang luka atau melalui rongga-rongga di bagian tip cap .
Kata kunci: Cronobacter sakazakii , GFPuv, jagung, ketahanan hidup, mutan
PENDAHULUAN 1
Cronobacter sakazakii merupakan salah satu dari 6 spesies dalam  Genus Cronobacter spp.  (sebelumnya  dikenal  sebagai Enterobacter sakazakii ) (Iversen et al . 2008). Cronobacter spp. telah diisolasi dari berbagai sumber pangan, sumber klinis, dan
*Penulis Korespondensi: Email: siti.nrjh@gmail.com; Telp. 08128263685
lingkungan.  Bakteri  ini  telah  dilaporkan  dapat  menyebabkan necrotizing  enterocoliticus (NEC)  (Emami  dan  Mittal,  2012), meningitis dan bacterimia (Bowen dan Braden, 2006) pada bayi kelompok tertentu. Di Indonesia, C. sakazakii telah diisolasi oleh Estuningsih et al . (2006), Meutia et al. (2008), Gitapratiwi et al . (2012)  dan  Hamdani  (2012).  Semua  isolat  tersebut  diperoleh dari  produk  pangan  kering,  yaitu  susu  formula,  makanan pendamping ASI, maizena, tepung terigu, tapioka, coklat bubuk, gula halus serta rempah kering.
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Sejak  tahun  2009,  di  Indonesia  mulai  diberlakukan  SNI 7388-2009  yang  mengatur  batas  maksimum  cemaran  mikroba dalam  pangan  yang  mengatur  bahwa  cemaran Cronobacter spp.  pada  susu  formula  harus  negatif  (BSN,  2009).  Agar persyaratan  tersebut  dapat  dipenuhi  oleh  industri,  diperlukan informasi  mengenai  faktor-faktor  yang  diduga  berkontribusi pada  adanya  kontaminasi  bakteri  ini  pada  susu  formula. Menurut CAC (2008), Cronobacter spp. dapat masuk ke dalam susu formula melalui kontaminasi dari lingkungan proses pada tahapan  tertentu  selama  pengeringan,  kontaminasi  susu formula setelah kemasan dibuka, dan kontaminasi selama atau setelah  proses  rekonstitusi.  FAO-WHO  (2004)  menyebutkan bahwa  faktor  yang  berisiko  menyebabkan Cronobacter spp. mencemari produk susu bubuk dapat berasal dari ingridien yang ditambahkan  pada  tahap  pencampuran  kering  tanpa  adanya tahapan pemanasan lanjutan.
Beberapa  penelitian  terakhir  mendukung  bahwa kontaminasi dapat berasal dari ingridien yang digunakan dalam pembuatan  susu  formula  dan  makanan  pendamping  ASI. Dewanti-Hariyadi et  al. (2010)  mengisolasi C.  sakazakii dari maizena, Fiegen (2010) di Jerman juga mengisolasi 10 isolat C. sakazakii dari beberapa ingridien susu (maizena, lesitin kedelai, pati kentang, pati gandum, dan pati beras), 5 isolat diantaranya berasal dari maizena. Hasil survey FAO-WHO (2004) menunjuk- kan  bahwa  cemaran C.  sakazakii dalam  ingridien  susu  bubuk paling  banyak  berasal  dari  pati-patian.  Hal  ini  memperkuat dugaan  bahwa  kontaminasi  bakteri  pada  susu  bubuk  dapat berasal  dari  ingridien.  Permasalahan  yang  muncul  selanjutnya adalah bagaimana bakteri ini dapat berada dan bertahan dalam maizena. Sebagai tahapan awal, dalam penelitian ini dilakukan penelusuran C.  sakazakii pada  bahan  baku  maizena  yaitu jagung,  melalui  kajian  ketahanan  hidup  terhadap  proses pengeringan,  kemampuan  kolonisasi  dan  penetrasi  bakteri  ini selama pengeringan jagung.
Saat ini jagung digunakan sebagai salah satu bahan dasar pembuatan  produk  pangan  kering.  Beberapa  produk  pangan kering  berbasis  jagung  yang  dilaporkan  terkontaminasi Cronobacter spp.  selain  maizena  adalah  yaitu gritz jagung (Iversen  dan Forsythe, 2004 a ) dan tepung jagung (Restaino et al .  2006).  Untuk  mempelajari  perilaku  bakteri  pada  bahan pangan  (dalam  hal  ini  jagung)  dengan  menggunakan  metode konvensional  ditemukan  kesulitan  dalam  membedakan  bakteri target  dengan  mikroorganisme  lainnya,  karena  jagung  me- ngandung  mikroorganisme  dengan  jumlah  dan  jenis  yang beragam.  Mikroba  yang  dapat  tumbuh  pada  jagung  sangat beragam  baik  dari  kelompok  kapang  ( Aspergillus,  Fusarium, Penicillium,  Rhizophus ),  kamir  ( Kodamaea dan Candida )  dan bakteri  ( Pediococcus dan Lactobacillus )  (Rahmawati et  al . 2013).
Teknik pelabelan menjadi salah satu alternatif penelusuran perilaku bakteri ini tanpa menekan pertumbuhan ataupun mem- bunuh  mikroba  lainnya . Penelitian  ini  menggunakan  pelabelan dengan  plasmid  yang  mengandung Green  Fluorescent  Protein (pGFPuv)  yang  disisipkan  ke  dalam C.  sakazakii .  GFP merupakan  protein Aequorin yang  berasal  dari  ubur-ubur ( Aequorea  victoria )  yang  dapat  berfluoresens  (Nifosi et  al. 2005).  Protein  ini  telah  diisolasi  pertama  kali  oleh  Shimomura tahun 1961 (Shimomura, 2005),  kemudian dikembangkan oleh
beberapa  peneliti,  disisipkan  pada  plasmid  dan  dapat  di- ekspresikan  baik  pada  inang  eukariot  maupun  prokariot (Ehrenberg, 2008). pGFPuv merupakan variasi dari pGFP yang mempunyai  intensitas  fluoresens  45  kali  lipat  melalui  proses DNA  shuffling  (Crameri et  al .  1996). C.  sakazakii terlabel menunjukkan  koloni  spesifik  berwarna  hijau  fluoresens  dan tumbuh  pada  media  mengandung  ampisilin.  Karakteristik  lain dari pGFPuv ini adalah kestabilan pada kondisi lingkungan yang asam,  NaCl  tinggi  dan  suhu  rendah  ataupun  tinggi  (Vialette, 2004), dan mempunyai stabilitas termal yang tinggi pada suhu kurang dari 100°C (Penna et al . 2004), sehingga pGFPuv dapat diaplikasikan pada perlakuan yang menggunakan panas.
Karena bakteri ini ditemukan pada beberapa produk pangan kering berbasis jagung, maka diduga bakteri ini dapat bertahan pada proses pengeringan jagung. Ketahanan Cronobacter spp. terhadap  panas  tergantung  pada  strain,  suhu,  dan  kandungan air  (Arroyo et  al .  2009).  Ketahanan  terhadap  pengeringan  ini diduga  karena  kemampuan Cronobacter spp.  berkolonisasi pada  permukaan  bahan  pangan  dan  juga  masuk  ke  dalam bahan pangan yang dapat melindunginya dari panas. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari  ketahanan hidup dua isolat C. sakazakii, kemampuan  kolonisasi  dan  penetrasi  pada  proses pengeringan  jagung  menggunakan  mutan  terlabel Green Fluorescent  Protein .  Dua  isolat C.  sakazakii yang  digunakan mempunyai  toksisitas  yang  berbeda,  isolat  YRt2a  bersifat nontoksik,  sedangkan  isolat  FWHd16  bersifat  toksik.  Hasil penelitian  ini  diharapkan  mampu  menjawab  faktor-faktor  yang berkontribusi menyebabkan adanya cemaran C. sakazakii pada produk kering berbasis jagung.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 2 isolat mutan Cronobacter sakazakii FWH d16 dan YRt2a (Nurjanah et al .  2012)  yang  disisipi  plasmid  pGFPuv  (Clontech  USA) (Gambar 1) (Tabel 1). Druggan-Forsythe-Iversen (DFI, DIFCO). Bahan segar yang digunakan adalah jagung varietas Pioneer 12 (PT. Pioneer Hibrida Indonesia).
Tabel 1. Karakteristik isolat dan plasmid yang digunakan Kode Isolat 1) /Plasmid GenBank Accession Number Sumber Aktivitas Sitotoksik Toksin 2) Referensi YRt2a/ JF800182 Susu formula Negatif Meutia et al . 2008 FWHd16/ JX535018 Lada bubuk Positif Hamdani 2012 Plasmid GFPuv Clontech, USA 1) Koleksi SEAFAST Center; 2) penelitian sebelumnya (Nurjanah et al . 2013)
Persiapan mutan C. sakazakii sebagai inokulum Isolat  yang  diinokulasikan  (inokulum)  ke  jagung  adalah isolat  mutan C.  sakazakii YRt2a  dan  FWHd16  dari  stok  beku yang diinkubasi dalam media Brain Heart Infusion (BHI, DIFCO) pada  suhu  37°C  selama  24  jam.  Pembuatan  mutan  telah dilakukan  sebelumnya  dengan  cara  pembuatan  sel  kompeten dan  transformasi.  Pembuatan  sel  kompeten  dilakukan  dengan cara  pemisahan  sel  bakteri  dari  medium  pertumbuhannya
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
dengan sentrifugasi (2600 x g, 4ºC,10 menit). Sel bakteri yang telah  terpisah  disuspensikan  dalam  10  mL  larutan  TF  (10  mM Tris.HCl,  100  mM  CaCl 2 ),  didiamkan  di  dalam  es  selama  30 menit,  kemudian  disentrifugasi  kembali  pada  kondisi  yang sama.  Pelet  disuspensikan  dalam  0.3  mL  larutan  TF. Transformasi  sel  bakteri  dilakukan  dengan  mencampurkan 40 µL sel kompeten dengan 2 µL DNA pGFPuv dalam tabung Eppendorf,  didiamkan  di  dalam  es  selama  30  menit  dan diberikan kejut panas pada suhu 42ºC selama 60 detik. Setelah itu  ditambahkan  medium recovery SOC  sebanyak  400 µL, diinkubasi selama 1 jam, 37ºC, kemudian disentrifugasi (2600 x g, 4ºC, 10 menit). Supernatan dibuang, dan pelet diresuspensi dengan Buffer  Water  Phosphate (BPW,  OXOID)  sebanyak 100 µL. Produk transformasi ditumbuhkan dalam medium TSAA dan diinkubasi pada suhu 37ºC semalam.
Mutan  dikonfirmasi  dengan  menumbuhkan  pada  media yang  disuplementasi Tryptic  Soy  Agar +  100  μg/mL Ampisilin (TSAA, OXOID), diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam dan diamati  dibawah  sinar  UV  (Desaga  Heidelberg  Min  UVIS). Koloni  fluoresens  yang  tumbuh  pada  permukaan  TSAA disuspensikan dengan pengencer BPW 15 mL, dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse 15 mL. Untuk memisahkan pelet sel, dilakukan  sentrifugasi  suspensi  sel  3500  rpm  (2.600  x  g) (HERMLE Z383K) selama 10 menit pada suhu 4ºC. Dilakukan pencucian dengan 10 mL BPW dan disentrifugasi kembali. Pelet sel  diresuspensi  dalam  BPW,  distandarisasi  konsentrasi  sel mutan  dengan  mengukur Optical  Density dengan  spektro- fotometer (Shimadzu UV-2450) pada 590 nm sampai mencapai absorbansi  0.4.  Selanjutnya,  suspensi  mutan  ini  digunakan sebagai inokulum.

## Penghitungan jumlah inokulum dan kestabilan mutan
Jumlah  sel  inokulum  dihitung  menggunakan  metode  per- mukaan dengan media TSAA dan suhu inkubasi 37ºC, selama 24 jam. Penghitungan kestabilan mutan dilakukan dengan cara menumbuhkan  1  mL  suspensi  pada  permukaan  media Tryptic Soy  Agar (TSA,  OXOID)  setelah  dilakukan  pengenceran bertingkat  dengan  larutan  pengencer Buffer  Water  Phosphate (BPW,  OXOID)  sampai  tingkat  pengenceran  diperkirakan  10 8 - 10 9 CFU/mL.  Inkubasi  dilakukan  selama  24  jam  pada  suhu 37ºC. Koloni  dihitung  dengan  rumus Standard  Plate  Count (BAM, 2001). Kestabilan plasmid ditunjukkan dalam persen (%) koloni  fluoresens  terhadap  total  koloni  yang  dihitung  dengan rumus (Ma et al . 2011):
Kestabilan mutan (%) = Jumlah koloni fluoresens (log) x 100% Total koloni (log)

## Inokulasi dan pengeringan jagung
Suspensi  inokulum  terstandarisasi  dikontaminasikan  ke dalam jagung sebanyak 10 mL untuk 300 g jagung setiap per- lakuan suhu yang dibuat dalam 2 tabung gelas masing-masing 150  g.  Jagung  dipanen  pada  umur  tanam  90  hari  untuk  buah pertama (digunakan untuk ulangan 1) dan 100 hari untuk buah kedua (digunakan untuk ulangan 2). Umur panen ini dilakukan pada saat kadar air jagung mencapai 33-35%. Jagung dikupas kelobotnya, dipilih yang diameternya seragam (4 cm), kemudian dipotong dengan panjang 15 cm (berat ±150 g).
Inkubasi dilakukan dalam wadah tabung gelas silinder ber- tutup  kertas  saring.  Jagung  terinokulasi  dikeringkan  dengan inkubator pada 3 suhu pengeringan (40, 45 dan 50ºC) selama 4, 6 dan 8 hari untuk masing-masing suhu pengeringan. Dilakukan 2  kali  ulangan  untuk  setiap  perlakuan  suhu.  Digunakan  juga jagung  yang  tidak  diinokulasi  pada  setiap  perlakuan  suhu sebagai kontrol.
Analisis  kadar  air,  a w dan  total  mikroba  alamiah  selama pengeringan jagung
Analisis  kadar  air,  a w dan  total  mikroba  alamiah  (flora normal)  dilakukan  pada  kelompok  kontrol. Kadar  air  jagung dianalisis  dengan  metode  oven  pada  suhu  105ºC  selama minimal 6 jam. a w diukur selama pengeringan pada suhu 50ºC dengan menggunakan alat a w- meter (Ro-Tronic). Total mikroba alamiah  dianalisis  dengan  menggunakan  metode  tuang  dalam media Plate Count Agar (PCA, OXOID) dengan jumlah sampel yang  digunakan  sebanyak  10  g  dan  dibuat  pengenceran bertingkat (dalam BPW) sampai diperkirakan jumlah koloni 10 5 CFU/mL.  Diinkubasi  selama  24-48  jam  pada  suhu  35ºC  dan jumlah  koloni  dihitung  dengan  rumus Standard  Plate  Count (BAM,  2001).  Analisis  mikroba  alamiah  yang  tahan  terhadap ampisilin  dilakukan  dengan  metode  yang  sama,  tetapi menggunakan media pemupukan TSA yang disuplementasi 100 μg/mL ampisilin (TSAA, OXOID).
Perhitungan  jumlah C.  sakazakii di  permukaan  dan  di bagian dalam jagung
Perhitungan jumlah C. sakazakii yang tumbuh pada bagian permukaan jagung dilakukan dengan membilas 10 g biji jagung dalam  90  mL  BPW.  Perhitungan  jumlah C.  sakazakii pada bagian  dalam  jagung  dilakukan  dengan  menggunakan  biji jagung  yang  telah  dibilas  tersebut,  kemudian  direndam  dalam larutan chloramphenicol 100  ppm  dengan  waktu  kontak  yang bervariasi  (1-4  jam)  sesuai  dengan  perkiraan  jumlahnya  di permukaan dan dihancurkan dengan menggunakan stomacher selama 1 menit. Masing-masing dibuat serial pengenceran yang sesuai dan dipupuk dalam media TSAA menggunakan metode permukaan. Diinkubasi 24 jam pada suhu 37ºC, koloni dihitung di  bawah  sinar  UV . Koloni  bakteri  dihitung  adalah  koloni  yang fluoresens  dengan  rumus Standard  Plate  Count (BAM,  2001) dan  dikonversi  dalam  satuan  log.  Kurva  reduksi C.  sakazakii selama pengeringan dibuat dengan memplot jumlah koloni (log) permukaan jagung pada sumbu Y dan interval waktu (hari) pada sumbu X.
Kurva ketahanan C. sakazakii selama pengeringan jagung Kurva  ketahanan  hidup  kedua  isolat  dibuat  dengan  mem- plotkan  logaritma  perbandingan  jumlah  koloni  yang  bertahan hidup pada waktu tertentu (N t ) dengan jumlah koloni awal (N o ) pada  sumbu  Y,  dan  interval  waktu  (hari)  pengeringan  pada sumbu  X.  Laju  penurunan  jumlah  (log/hari)  selama  pengering- an, ditunjukkan oleh besarnya slope dari persamaan linier.
Pengamatan  kolonisasi  dan  penetrasi  dengan  mikroskop fluoresens dan SEM
Pengamatan  kolonisasi  secara  mikroskopis  dilakukan dengan mengamati potongan tipis kulit epidermis perikarp, kulit
Hasil Penelitian
ari tip  cap ,  dan  potongan  bagian  dalam  biji  jagung  yang  luka dengan  menggunakan  mikroskop  fluoresens  ( Olympus CH3O) pada  panjang  gelombang  395  nm  dan  emisi  509  nm.  Koloni mutan  akan  menunjukkan  warna  hijau  berfluoresens.  Pe- ngamatan  juga  dilakukan  dengan  menggunakan  mikroskop scanning  electron  microscopy (SEM  ZEISS  EVO  50)  setelah sampel  pada  bagian  tersebut  dilapisi  oleh  emas  (JAPAN  Ion Coatter).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik mutan C. sakazakii dan kestabilan mutan Isolat C.  sakazakii YRt2a  asal  susu  formula  dan  FWHd16 asal  lada  bubuk  mempunyai  karakteristik  toksisitas  yang  ber- beda yang telah diuji aktivitas sitotoksiknya secara invitro pada sel  Vero.  Isolat  YRt2a  merupakan  isolat  nontoksik,  sedangkan FWHd16 merupakan isolat toksik (Nurjanah et al . 2013). Mutan dari kedua isolat tersebut, diperoleh melalui penyisipan plasmid GFPuv  dengan  proses  transformasi  dan  tetap  stabil  setelah disimpan  beku  dan  dilakukan  subkultur.  Proses  transformasi yang dilakukan diawali dengan pembuatan sel kompeten meng- gunakan  kalsium  klorida  dan  diikuti  dengan  perlakuan heat shock (Nurjanah et al . 2012).
Plasmid GFPuv yang digunakan didisain oleh Laboratorium Clontech  USA  dengan  karakteristik  plasmid  berukuran  3.3  kb, mengandung gen yang menyandikan Green Fluorescent Protein dari  ubur-ubur  ( Aequorea  victoria )  yang  telah  dioptimalkan untuk  menghasilkan  intensitas  fluoresensi  yang  lebih  tinggi ketika  tereksitasi  oleh  sinar  ultraviolet.  Sekuens  penyandi  gen ini berada pada daerah Multiple Cloning Site (5’MCS- 3’MCS), dengan  kodon  inisiasi  lacZ  sehingga  protein  gabungan  β- galactosidase-GFPuv  dapat  diekpresikan  dari lac-promoter secara konstitutif. Plasmid ini juga mempunyai titik ori, sehingga dapat melakukan replikasi secara mandiri. Selain itu, mengan- dung gen resisten ampisilin ( Amp r ), yang menyandikan protein β-lactamase  yang  dapat  mendegradasi  antibiotik  ampisilin sehingga memiliki sifat resisten terhadap ampisilin (Gambar 1) (Clontech, 2012).
Isolat mutan YRt2a dan FWHd16 dikonfirmasi dengan me- numbuhkannya  pada  medium  TSAA  dan  menunjukkan  koloni hijau  fluoresens.  Isolat  mutan  yang  diinokulasikan  perlu diketahui  kestabilannya,  karena  plasmid  yang  disisipkan  tidak selalu  stabil  dalam  inangnya.  Ketidakstabilan  mutan  dapat  ter- jadi  karena  proses  segregasi  pada  saat  pembelahan  sel  lebih cepat  dibandingkan  dengan  proses  propagasi  plasmid, sehingga plasmid tidak terdapat pada sel yang baru (Ma et al . 2011).  Mutan  YRt2a  dan  FWHd16  menunjukkan  rata-rata kestabilan  mutan  yang  cukup  tinggi,  yaitu  masing-masing sebesar  96  dan  95%  (Tabel  2).  Kedua  mutan  tersebut  di- inokulasikan  pada  300  gram  jagung  untuk  setiap  perlakuan suhu. Hasil perhitungan pada media TSA menunjukkan jumlah rata-rata  inokulum  masing-masing  isolat  YRt2a  dan  FWHd16 adalah  2.1  x  10 8 (8.3  log)  CFU/mL  dan  1.2  x  10 8 (8.1  log) CFU/mL (Tabel 2).
Gambar 1. Peta plasmid pGFPuv (Clontech, 2012) Gambar 1.  Peta plasmid pGFPuv (Clontech, 2012) Tabel 2. Profil mikrobiologi pada jagung dan inokulum Jagung Total mikroba (log CFU/g) 5.2 ± 0.4 Total mikroba resisten ampisilin (log CFU/g) 3.9 ± 0.04 Inokulum mutan YRt2a Jumlah mutan (CFU/mL) 8.3 ± 0.4 Kestabilan mutan (%) 96 ± 0 Inokulum mutan FWHd16 Jumlah mutan (CFU/mL) 8.1 ± 0.3 Kestabilan mutan (%) 95 ± 4.2
Nilai merupakan rata-rata ± standar deviasi

## Populasi mikroba alamiah pada jagung
Jagung  varietas  Pioneer  12  yang  digunakan  dalam penelitian ini umum digunakan sebagai bahan baku pembuatan jagung  pipil  kering  dan  tepung  jagung  oleh  industri.  Pada penelitian  ini  jagung  ini  ditanam  sendiri  di  lahan  di  Ciampea Bogor  agar  memudahkan  pengamatan  umur  panen  sesuai dengan kadar air yang diinginkan.
Jumlah  rata-rata  mikroba  alamiah  yang  ada  pada  per- mukaan jagung adalah 2.0 x 10 5 CFU/g (5.2 log CFU/mL) dan terdapat  mikroba  yang  resisten  terhadap  ampisilin  rata-rata sebesar 4.5 x 10 4 (4.4 log CFU/mL) (Tabel 2). Adanya mikroba yang resisten ampisilin ini dapat mengganggu hasil perhitungan koloni  mutan,  karena  mutan C.  sakazakii dihitung  dengan menggunakan media TSA yang mengandung ampisilin (TSAA, OXOID).  Oleh  karena  itu,  penggunaan  media  TSAA  di- kombinasikan  dengan  pengamatan  di  bawah  sinar  UV  sesuai kemampuan  mutan  untuk  berfluoresens.  Hasil  pengamatan  di bawah sinar UV, dari semua koloni mikroba alamiah yang tahan terhadap ampisilin, tidak ada koloni yang berflouresens dengan tipikal seperti koloni mutan C. sakazakii . Penggunaan kombinasi media  TSAA  dan  pengamatan  dengan  sinar  UV  menjadi metode penghitungan yang lebih spesifik dan mikroba alamiah dari jagung tidak akan terhitung. Hasil penelitian Sarah (2013) menunjukkan  bahwa  campuran  kultur  kapang,  kamir  dan  BAL yang  diperoleh  dari  fermentasi  spontan  perendaman  jagung masih  dapat  tumbuh  pada  media  TSA  yang  diberi  100  µg Ampisilin (TSAA, OXOID). Campuran kultur tersebut terdiri dari kapang  ( Aspergillus  flavus , A.  niger , Fusarium  oxysporum ), khamir  ( Kodamaea  ohmeri , Candida  krusei , C.  zeylanoides ), BAL  ( Pediococcus  pentosaceus , Lactobacillus  plantarum , L. lactis , L.brevis ).
Sap I (3330) AIw N I (2804)
pUC ori
Amp r P IaC 5’ MCS
(234-281)
GFPuv pGFpuv 3.3 kb Pvu I (1956) Aat II (1406) Nco I (455)
Bsr G I (565) Mlu I (611) Xho I (710) Bst B I (911) Sac I (996) 3’ MCS (1007-1091)
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
0 1 2 3 4 5 6 7 setelah inokulasi 1 2 3 4 5 6 7 Ju m la h YR t2 a (lo g C FU /g ) Pengeringan Hari ke- A 0 1 2 3 4 5 6 7 setelah inokulasi 1 2 3 4 5 6 7 8 Ju m la h FWH d1 6 (lo g C FU /g ) Pengeringan Hari ke- B
Perubahan kadar air dan populasi mikroba alamiah selama pengeringan jagung
Pengeringan  jagung  yang  umum  dilakukan  oleh  petani adalah dengan menggunakan panas matahari. Panas matahari suhunya  berfluktuasi  antara  40-54ºC  tergantung  pada  waktu pagi,  siang  atau  sore  hari  dan  kondisi  cuaca.  Pada  penelitian ini, pengeringan dilakukan dengan 3 suhu pengeringan yaitu 40, 45  dan  50ºC  dengan  pertimbangan  bahwa  ketiga  suhu  pe- ngeringan  tersebut  memberikan  tekstur  jagung  pipil  yang  baik dan tidak keriput. Lama pengeringan berbeda untuk ketiga suhu tergantung  kadar  air  yang  dicapai  setiap  hari.  Pengeringan  di- hentikan untuk setiap suhu setelah jagung mencapai kadar air ≤14%.  Kadar  air  menurun  selama  pengeringan  pada  ketiga suhu pengeringan. Semakin tinggi suhu pengeringan, penurun- an  kadar  air  semakin  cepat  yang  ditunjukkan  dengan  slope persamaan  linier  yang  semakin  besar,  yaitu  5.4;  3.1  dan  2.1 untuk suhu 50, 45 dan 40ºC (Gambar 2.A). Pada kadar air 14%, a w jagung berkisar antara 0.75-0.8 (Gambar 2.B). Kadar air 14% dan  nilai  a w tersebut  merupakan  kadar  air  aman  untuk penyimpanan  biji-bijian  dimana  reaksi  mikrobiologis  maupun kimia sangat minimal.
Gambar 2.  (A) Grafik penurunan kadar air ♦  40 ºC; y=-2.07x + 32 ■ 45 ºC; y-3.12x + 32 ▲50ºC; y=-5.36x + 31; dan (B) Grafik penurunan a w pada pengeringan suhu 50 ºC; ● kadar air; ■ a w
Perubahan  populasi  mikroba  alamiah  pada  jagung  diamati selama pengeringan untuk mengetahui ketahanan mikroba ter- sebut  terhadap  pengeringan.  Perubahan  populasi  mikroba alamiah  ini  berbeda  pada  ketiga  suhu  pengeringan.  Mikroba alamiah  relatif  tahan  terhadap  pengeringan  suhu  40ºC  yang ditunjukkan  oleh  grafik  jumlah  koloni  yang  mendatar  bahkan cenderung meningkat pada akhir pengeringan. Pada pengering- an  suhu  45ºC  terjadi  penurunan  jumlah  mikroba  alamiah  yang lambat  dan  penurunan  jumlah  mikroba  secara  cepat  terjadi
pada  pengeringan  suhu  50ºC  (Gambar  3).  Mikroba  alamiah yang bertahan pada akhir pengeringan sebagian besar merupa- kan kelompok kapang.
Gambar 3. Perubahan  jumlah  mikroba  alamiah  selama  pengeringan jagung. ♦ suhu 40 ºC ■ suhu 45ºC ▲suhu 50ºC
Ketahanan hidup C. sakazakii selama pengeringan jagung Kedua  isolat C.  sakazakii mengalami  penurunan  jumlah selama  pengeringan  (Gambar  4). Kedua  isolat  tersebut  masih bertahan  pada  proses  pengeringan  sebelum  kadar  air  jagung mencapai 14%. Setelah kadar air jagung mencapai 14%, isolat YRt2a tidak ditemukan lagi pada akhir pengeringan, sedangkan isolat FWHd16 masih ditemukan pada ketiga suhu pengeringan walaupun jumlahnya di bawah 10 CFU/g.
Gambar 4.  Penurunan  jumlah  (A) C.  sakazakii YRt2a  dan  (B) C. sakazakii FWHd16  selama  pengeringan;  ♦  suhu  40 ºC  ■ suhu 45 ºC ▲suhu 50ºC
Penurunan  jumlah C.  sakazakii pada  pengeringan  suhu 40ºC terjadi sangat lambat, yang menunjukkan bahwa suhu pe- ngeringan  tersebut  tidak  efektif  untuk  mereduksi C.  sakazakii, seperti  halnya  tidak  efektif  untuk  mereduksi  mikroba  alamiah jagung  di  atas.  Selain  karena  suhu  pengeringan  yang  terlalu rendah,  penurunan  jumlah  yang  sangat  lambat  tersebut  ber-
R2 = 0.9473 R2 = 0.9705 R2 = 0.9677 0 5 10 15 20 25 30 35 0 2 4 6 8 10 Ka da r A ir (% ) Pengeringan Hari ke- A 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Awal 0 1 2 3 4 5 6 7 8 To ta l M ik ro ba A la m ia h (lo g C FU /g ) Pengeringan Hari ke-
0 5 10 15 20 25 30 35 0 1 2 3 4 5 Pengeringan Hari ke- Ka da r A ir (%) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 aw B
Hasil Penelitian
y = -1.3427x R² = 0.9278 y = -1.1347x R² = 0.9678 -4.5 -4 -3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0 1 2 3 4 Pe rb an din ga n Ju m la h N t / N o (lo g) Pengeringan Hari ke- C
kaitan  dengan  penurunan  kadar  air  yang  juga  lambat.  Pada suhu tersebut laju penurunan kadar air hanya terjadi 2% setiap hari.
Berbeda dengan suhu 40ºC, pada suhu pengeringan 45 dan 50ºC  kedua  isolat C.  sakazakii yang  digunakan  menunjukkan adanya  penurunan  jumlah  yang  relatif  cepat  selama pengeringan. Selain karena paparan suhu, penurunan viabilitas tersebut terjadi karena penurunan kadar air jagung yang cepat. Pada suhu 45 dan 50ºC, laju penurunan kadar air terjadi 3 dan 5% setiap hari. Namun demikian, suhu pengeringan 50ºC belum efektif  untuk  membunuh  semua C.  sakazakii FWHd16  jika kontaminasi awal dalam  jumlah  yang tinggi. Pada jumlah awal C. sakazakii FWHd16 sebesar 10 7 log CFU/mL, masih terdapat koloni  sejumlah  10 1 CFU/g  pada  akhir  pengeringan  suhu tersebut.
Ketahanan  hidup C.  sakazakii FWHd16  dan  YRt2a  dapat dibandingkan  dengan  membandingkan  laju  penurunan  jumlah keduanya  selama  pengeringan.  Laju  penurunan  jumlah C. sakazakii per  hari  ditunjukkan  oleh  besarnya slope yang diperoleh  dari  persamaan  linier  kurva  ketahanan.  Pada  ketiga suhu  pengeringan,  laju  penurunan  jumlah  isolat  YRt2a  lebih cepat dibandingkan dengan isolat FWHd16. Hal ini ditunjukkan dengan nilai slope dari persamaan linier YRt2a yang selalu lebih tinggi  dibandingkan  dengan  nilai slope dari  persamaan  linier FWHd16  (Gambar  5).  Pada  suhu  40ºC,  laju  penurunan  YRt2a dan  FWHd16  masing-masing  sebesar  0.8  dan  0.7  siklus log/hari.  Pada  suhu  45ºC,  laju  penurunan  untuk  YRt2a  dan FWHd16  masing-masing  sebesar  1.1  dan  0.9  siklus  log/hari. Pada  suhu  50ºC  terjadi  laju  penurunan  paling  tinggi,  untuk YRt2a dan FWHd16 masing-masing sebesar 1.3 dan 1.1 siklus log/hari.
Belum  ada  publikasi  mengenai  ketahanan C.  sakazakii terhadap  panas  selama  pengeringan  jagung  atau  pengeringan biji-bijian lainnya. Ketahanan bakteri ini terhadap panas banyak dilaporkan dalam proses spray drying susu formula (Arku et al . 2008, Dewanti-Hariyadi et al . 2012), dalam proses pemanasan pada  menstruum  susu  formula  (Iversen et  al .  2004 b ,  Seftiono 2012),  pada  media  pertumbuhan  (Iversen et  al .  2004 b )  dan rekonstitusi susu formula (Meutia et al . 2009).  Pada penelitian sebelumnya,  suhu  40°C  disimpulkan  tidak  efektif  untuk  me- reduksi C.  sakazakii pada  proses  rekonstitusi  susu  formula (Meutia et al . 2009).
Ketahanan  bakteri  terhadap  panas  terkait  dengan  paparan suhu dan lama pemanasan yang pernah diterima sebelumnya. Paparan  suhu sublethal atau  beberapa  derajat  di  atas  suhu optimum  pertumbuhannya  dapat  meningkatkan  ketahanan panas  bakteri  tersebut.  Pemanasan  di  media  TSB  pada  suhu 47ºC  selama  15  menit,  meningkatkan  ketahanan  hidup C. sakazakii terhadap  pemanasan  (Chang et  al .  2009 a ),  kondisi kering  (Chang et  al .  2009 b )  dan spray  drying (Wan-Ling et  al . 2010),  tetapi  ketahanan  hidup  ini  menurun  jika  paparan  suhu yang diterimanya lebih dari 48ºC (Chang et al . 2009 a ).
Gambar 5.  Kurva ketahanan C. sakazakii pada suhu pengeringan (A) 40 o C, (B) 45 o C dan (C) 50 o C; ♦ YRt2a ■ FWHd16
Isolat  YRt2a  merupakan  isolat  asal  susu  formula, sedangkan isolat FWHd16 berasal dari lada bubuk. Pembuatan susu  formula  menggunakan  pengeringan  semprot  pada  suhu yang tinggi (160-170ºC) tetapi dalam jangka waktu yang singkat (1-2  detik),  sedangkan  pembuatan  lada  bubuk  dilakukan dengan  pengeringan  sinar  matahari  (suhu  relatif  rendah  35- 45ºC)  dalam  jangka  waktu  relatif  lama  (3-7  hari).  Dengan demikian,  paparan  panas  yang  diterima  oleh  FWHd16  lebih lama  dibandingkan  dengan  YRt2a  dan  berada  pada  kisaran suhu sublethal yang  masih  cukup  untuk  mempertahankan viabilitas sel.
Jika dihubungkan dengan toksisitas kedua isolat, penurunan jumlah isolat nontoksik YRt2a lebih cepat dibandingkan dengan isolat toksik FWHd16 pada ketiga suhu pengeringan. Walaupun demikian, belum banyak laporan mengenai hubungan toksisitas dengan ketahanan panas. Kajian keterkaitan gen toksik vapBC ( virulence-associated  protein )  pada  bakteri  thermofilik Sulfolobus  solfataricus menunjukkan  bahwa  gen  tersebut  ber- peran  dalam  stress  response  terhadap  panas  (Cooper et  al . 2009).
y = -0.8038x R² = 0.9269
y = -0.667x R² = 0.8773 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 2 4 6 8 Pe rb an din ga n Ju m la h N t / N o (lo g) Pengeringan Hari ke- A y = -1.0579x R² = 0.9569 y = -0.8893x R² = 0.9056 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 2 4 6 8 Pe rb an di ng an J umla h N t / N o (lo g) Pengeringan Hari ke- B
Hasil Penelitian
100 µmL |───| 100 µmL |───| B 100 µmL |───|

## Kolonisasi di permukaan jagung
Keberadaan bakteri pada produk kering juga dapat disebab- kan  karena  kemampuan  bakteri  melakukan  penempelan  atau kolonisasi  di  permukaan  bahan  pangan.  Hasil  pengamatan mikroskopis  dengan scanning  electron  microscopy (SEM)  me- nunjukkan  adanya  kolonisasi  isolat  YRt2a  dan  FWHd16  pada permukaan jagung di bagian perikarp dan tip cap (Gambar 6 A dan  B). C.  sakazakii secara  alami  merupakan  bakteri  yang berkolonisasi pada tanaman.  Bakteri ini telah ditemukan dapat berkolonisasi  pada  akar  tanaman  tomat  dan  akar  tanaman jagung (Schmid et al . 2009) dan juga sebagai mikroba endofitik dari  kedelai  (Kuklinsky-Sobral et  al .  2004).  Kemampuan kolonisasi  disebabkan  karena  adanya  komponen  hetero- polisakarida  pada  permukaan  sel  bakteri  yang  disebut  EPS ( extracelluler  polymeric  substances )  yang  dapat  membentuk lapisan baik pada permukaan abiotik maupun biotik (Jung et al . 2013).
Setelah  dua  hari  pengeringan,  kolonisasi  isolat  FWHd16 masih  dapat  diamati  dengan  mikroskop  fluoresens  pada  suhu pengeringan 40, 45 maupun 50ºC (Gambar 7 A dan B), sedang- kan kolonisasi  isolat  YRt2a  hanya  teramati  pada  suhu pengeringan  40ºC.  Kemampuan  kolonisasi  ini  dapat  menjadi salah  satu  penyebab  ketahanan  panas  isolat  FWHd16  lebih tinggi  dari  pada  isolat  YRt2a.  Kolonisasi  isolat  FWHd16  lebih mudah  ditemukan  pada  bagian tip  cap jagung  dibandingkan pada  bagian  perikarp . Hal  ini  dikarenakan tip  cap merupakan bagian  tersembunyi  yang  melekat  pada  kernel  yang  tidak terpapar suhu pengeringan secara langsung.

## Penetrasi ke bagian dalam jagung
Selain berada di permukaan biji jagung, kedua isolat ini juga ditemukan  di  bagian  dalam  jagung  (Tabel  3).  Selama  pe- ngeringan, jumlah  koloni  di  bagian  dalam  jagung  ini  tidak menunjukkan  adanya  penurunan  atau  peningkatan  yang  jelas. Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  penetrasi  terjadi  secara  acak atau  tidak  merata  pada  setiap  biji  jagung  dalam  satu  tongkol. Pada suhu 40ºC, C. sakazakii di bagian dalam masih terdeteksi sampai  hari  ke-4  pengeringan,  sedangkan  pada  suhu pengeringan 45 dan 50ºC bakteri ini sudah tidak terdeteksi lagi setelah  hari  ke-3.  Sama  dengan  jumlahnya  di  permukaan jagung,  jumlah  isolat  FWHd16  di  bagian  dalam  jagung cenderung ditemukan lebih banyak dibandingkan dengan isolat YRt2a.
Kedua  isolat  ini  ditemukan  pada  bagian  biji  jagung  yang luka (Gambar 7 C), yang menunjukkan bahwa bagian yang luka menjadi  salah  satu  titik  masuk bakteri  ini  ke  dalam  jagung. Selain melalui bagian yang luka, penetrasi bakteri ini ke dalam biji  jagung  diduga  terjadi  melalui  rongga-rongga  yang  terdapat di bagian ujung tip cap jagung. Hasil analisis SEM (Gambar 6 C) menunjukkan  jumlah  rongga  ini  cukup  banyak  pada  bagian tersebut  dan  mempunyai  ukuran  cukup  besar  (>  10  μm)  yang dapat  dijadikan  sebagai  titik  masuk  untuk  bakteri  yang  hanya berukuran  1-5  μm.  Dengan  demikian,  adanya  kerusakan  pada biji  dan  kemampuan  penetrasi  bakteri  ini  pada  jagung  dapat menjadi  faktor  adanya  cemaran  bakteri  pada  produk  jagung kering.
Penelitian lain menunjukkan bahwa C. sakazakii dapat ber- penetrasi  ke  dalam  akar  tanaman  jagung  dan  berkolonisasi  di jaringan  pembuluh  (Feigen,  2010),  dapat  berpenetrasi  pada akar  tanaman  tomat  (Schmid et  al .  2009),  dan  menjadi penyebab busuk kuning pada bagian dalam pepaya (Keith et al. 2008). Kemampuan penetrasi ke dalam bagian tanaman melalui rongga  juga  ditunjukkan  oleh  bakteri  lainnya  yaitu Pseudomonas yang berpenetrasi ke bagian dalam daun melalui stomata (Spinelli et al . 2010).
Tabel 3. Jumlah koloni mutan penetrasi
Suhu Pengeringan Ulangan Jumlah Koloni pada Pengeringan Hari ke- (CFU/g) 1 2 3 4 YRt2a 40ºC 1 na 1) 33 7 94 2 16 0 2) 0 0 45ºC 1 4400 16 1 0 2 3 0 0 0 50ºC 1 88 3 3 0 2 3 0 0 0 FWHd16 40ºC 1 na 110 410 150 2 22 na 0 na 45ºC 1 4300 120 3 0 2 90 200 0 na 50ºC 1 na na 25 0 2 21 50 12 0
1) na : not applicable ; hasil analisis tidak dapat digunakan karena kontrol negatif mengandung koloni fluoresens; 2) 0 berarti di bawah limit deteksi
Gambar 6.  Pengamatan SEM (500x), (A) Kolonisasi C. sakazakii pada permukaan pericarp jagung (B) Kolonisasi C. sakazakii pada permukaan tip cap jagung, (C) Rongga pada bagian tip cap jagung; sel C. sakazakii; rongga
A C
Hasil Penelitian
100 μm A B 100 µm C 100 µm
Gambar 7.  Pengamatan mikroskop fluoresens (1000x) (A) Kolonisasi C. sakazakii pada pemukaan jagung suhu 40 o C, (B) Kolonisasi C. sakazakii pada pemukaan jagung suhu 50 o C, (C) Kolonisasi C. sakazakii pada bagian yang luka
Dengan  demikian  faktor  yang  berkontribusi  terhadap  ada- nya  cemaran C.  sakazakii pada  produk  jagung  kering  adalah suhu pengeringan yang rendah,  jumlah kontaminan awal yang tinggi  dan  kadar  air  akhir  jagung  yang  masih  tinggi. Kemampuan C. sakazakii berkolonisasi pada permukaan bahan pangan dan memasuki bahan pangan melalui luka atau rongga juga menjadi faktor pendukung terjadinya kontaminasi.

## KESIMPULAN
Isolat  mutan C.  sakazakii YRt2a  dan  FWHd16  berlabel Green  Fluorescent  Protein dapat  diaplikasikan  untuk  mem- pelajari ketahanan panas, kemampuan kolonisasi dan penetrasi bakteri  tersebut  selama  pengeringan.  Kedua  isolat  mengalami penurunan  jumlah  selama  pengeringan  jagung  pada  suhu  40, 45  dan  50ºC  dan  masih  terdapat  koloni  sebelum  kadar  air jagung  mencapai  14%.  Suhu  pengeringan  40ºC  tidak  efektif untuk  mereduksi  jumlah C.  sakazakii. Isolat  toksik  FWHd16 lebih tahan pada ke-3 suhu pengeringan dibandingkan dengan isolat  nontoksik  YRt2a  dengan  laju  penurunan  untuk  masing- masing  suhu  adalah  0.7,  0.9  dan  1.1  siklus  log/hari.  Kedua isolat  mampu  berkolonisasi  di  permukaan  jagung  dan  ber- penetrasi  ke  dalam  jagung  melalui  bagian  yang  luka  atau melalui  rongga-rongga  di  bagian tip  cap .  Suhu  pengeringan yang  rendah,  kadar  air  jagung  >14%,  adanya  kolonisasi  dan penetrasi C.  sakazakii pada  jagung  dapat  berkontribusi  pada adanya kontaminasi bakteri tersebut pada produk jagung kering.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada  Direktorat Jenderal  Pendidikan  Tinggi  atas  pendanaan  penelitian  ini melalui skema Hibah Kompetensi tahun 2012.

## DAFTAR PUSTAKA
Arku  B,  Mullane  N,  Fox  E,  Fanning  S,  Jordan  K.  2008 . Enterobacter  sakazakii survives  spray  drying. Int  J  Dairy Technol 61: 102-108.  DOI: 10.1111/j.1471-0307.2008.
00375.x.
Arroyo  C,  Condon  S,  Pagan  R.  2009.  Thermobacteriogical characterization of Enterobacter sakazakii . J Food Microbiol 136: 110-118. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2009.09.013.
[BAM]  Bacteriological  Analytical  Manual.  2001.  Chapter  3: aerobic  plate  count. http://www.cfsan.fda.gov/.  [26  Mei 2010].
Bowen  AB, Braden CR. 2006. Invasive Enterobacter sakazakii diseases in infants. Emerg Infect Dis 12: 1185-1189. DOI: 1 0.3201/eid1208.051509.
[BSN]  Badan  Standardisasi  Nasional.  2009.  SNI  7388-2009: Batas Maksimum Cemaran Mikroba dalam Pangan.
[CAC] Codex Alimentarius Commission. 2008. Code of Hygienic Practice  for  Powdered  Formulae  for  Infants  and  Young Children. Cac/Rcp 66 – 2008.
Chang  CH,  Chiang  ML,  Chou  CC.  2009 a .  The  effect  of temperature  and  length  of  heat  shock  treatment  on  the thermal tolerance and cell leakage of Cronobacter sakazakii BCRC  13988.  Int  J  Food  Microbiol    134:  184–189.  DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2009.06.005.
Chang  CH,  Chiang  ML,  Chou  CC.  2009 b .  The  effect  of  heat shock  on  the  response  of Cronobacter  sakazakii to subsequent  lethal  stresses.  Foodborne  Path  Dis  7:  71-76. DOI: 10.1089/fpd.2009.0345.
Clontech.  2012.  Certificate  of  Analysis  pGFPuv.  http://www. clontech. com [2 Februari 2012].
Cooper  CR,  Daugherty  AJ,  Tachdjian  S,  Blum  PH,  Kelly  RM.
2009.  Role  of vapBC toxin–antitoxin  loci  in  the  thermal stress  response  of Sulfolobus  solfataricus. Biochem  Soc Trans 37: 123–126. DOI: 10.1042/BST0370123. Crameri A,  Whitehorn EA,  Tate E,  Willem  PC,  Stemmer WPC. 1996.  Improved green  fluorescent  protein by  molecular evolution using DNA shuffling. Nat Biotechnol 14: 315–319. DOI: 10.1038/nbt0396-315.
Dewanti-Hariyadi  R,  Gitapratiwi  D,  Meutia  YR,  Hidayat  SH, Nurjanah  S.  2010.  Isolation  of Enterobacter  sakazakii ( Cronobacter spp.)  from  Powdered  Infant  Formula  and Other  Dried  Foods  Obtained  from  Bogor  Area.  In: International Seminar on Current Issues and Challenges in Food  Safety:  science-based  approach  for  food  safety management.  October  3-4,  IPB  International  Conference Center,  Bogor,  Indonesia.  Southeast  Asian  Food  and
Hasil Penelitian
Agricultural  Science  and  Technology  (SEAFAST)  Center, Bogor, Indonesia.
Dewanti-Haryadi  R,  Larasati  F,  Nuraida  L.  2012.  Survival  of Cronobacter  sakazakii in  skim  milk  during  spray  drying, storage and reconstitution. J Teknol dan Industri Pangan 13: 186-192. DOI: 10.6066/jtip.2012.23.2.186.
Ehrenberg M. 2008. Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry:  The Green  Fluorescent  Protein :  discovery, Expression and Development. The Royal Swedish Academy of Sciences, Stockholm, Sweden. p. 1-15.
Emami  CN,  Mittal  R.  2012.  Role  of  neutrophils  and macrophages  in  the  pathogenesis  of  necrotizing enterocolitis caused by Cronobacter sakazakii. J Surg  Res 172: 18–28. DOI: 10.1016/j.jss.2011.04.019.
Estuningsih S, Kress C, Hassan AA, Akineden Ö, Schneider E, Usleber  E.  2006. Enterobacteriaceae in  dehydrated powdered  infant  formula  manufactured  in  Indonesia  and Malaysia. J Food Prot 69: 3013-3017.
[FAO-WHO] Food and Agriculture Organization – World Health Organization.  2004. Enterobacter  sakazakii and  other microorganisms in powdered infant formula: meeting report, MRA series6. WHO, Geneva, Switzerland.
Fiegen  M.  2010.  Untersuchungen  zum  Vorkommen  und  zur Tenazität  von Cronobacter spp.  [Dissertation].  Hamburg: Universität Hamburg Fachbereich Chemie.
Gitapratiwi  D,  Dewanti-Hariyadi  R,  Hidayat  SH.  2012.  Genetic relatedness  of Cronobacter spp.  ( Enterobacter  sakazakii ) isolated from dried food products in Indonesia. Int Food Res J 19: 1745-1749.
Hamdani FW. 2012. Evaluasi Keragaman Genetika Isolat Lokal Cronobacter spp.  ( Enterobacter  sakazakii )  yang  diperoleh dari  Produk  Pangan  Kering.  [Tesis]  Bogor:  Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Iversen  C,  Forsythe  SJ.  2004 a .  Isolation  of Enterobacter sakazakii and  other Enterobacteriaceae from  powdered infant formula milk and related products. Food Microbiol 21: 771-777. DOI: 10.1016/j.fm.2004.01.009.
Iversen  C,  Lane  M,  Forsythe  SJ.  2004 b .  The  growth  profile, thermotolerance  and  biofilm  formation  of Enterobacter sakazakii grown  in  infant  formula  milk.  Lett  Appl  Microbiol 38: 378–382. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2004.01507.x.
Iversen C, Mullane N, McCardell B, Tall BD, Lehner A, Fanning S,  Stephan  R,  Joosten  H.  2008. Cronobacter gen.  nov.,  a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii , and proposal of Cronobacter sakazakii gen. nov., comb. nov., Cronobacter malonaticus sp. nov., Cronobacter turicensis sp.  nov.,  C ronobacter  muytjensii sp.  nov., Cronobacter dublinensis sp. nov., Cronobacter genomospecies 1,  and  of  three  subspecies, Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis subsp.  nov., Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis subsp. nov .  and Cronobacter  dublinensis subsp. lactaridi subsp. nov .  Int  J Syst  Evol  Microbiol  58:  1442-1447.  DOI:  1  0.1099/ijs.0. 65577-0.
Jung  JH,  Choi  NY,  Lee  SY.  2013.  Biofilm  formation  and exopolysaccharide  (EPS)  production  by Cronobacter
sakazakii depending  on  environmental  conditions.  Food Microbiol 34: 70-80.  DOI: 10.1016/j.fm.2012.11.008
Keith  RC,  Hilo  M,  Nishijima  KA,  Keith  LM,  Nishijima  WT,  Wall MM.  2008.  Atypical  internal  yellowing  of  papaya  fruit  in Hawaii  caused  by Enterobacter  sakazakii. Plant  Dis 92:
487.1-487.1. DOI: 10.1094/PDIS-92-3-0487A.
Kuklinsky-Sobral J, Araújo WL, Mendes R, Geraldi IO, Pizzirani- Kleiner  AA,  Azevedo  JL.  2004.  Isolation  and characterization  of  soybean-associated  bacteria  and  their potential  for  plant  growth  promotion.  Environ  Microbiol  6: 1244–1251 DOI: 10.1111/j.1462-2920.2004.00658.x.
Ma  L,  Zhang  G,  Doyle  MP.  2011. Green  Fluorescent  Protein labeling  of Listeria,  Salmonella ,  and Escherichia  coli O157:H7  for  safety-related  studies.  PLoS  ONE  6:  e18083. DOI: 10.1371/journal.pone.0018083.
Meutia  YR,  Dewanti-Hariyadi  R,  Estuningsih  S.  2008. Characterization  of  16S  rRNA  gene  of Enterobacter sakazakii Isolated  from  Powdered  Infant  Formula.  Dalam  : Abstrak  Seminar  Nasional  PATPI.  14-16  Oktober, Palembang, Indonesia. Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia, Jakarta, Indonesia.
Meutia YR, Dewanti-Hariyadi R, Estuningsih S. 2009. Pengaruh suhu  rekonstitusi  terhadap  isolat  lokal Enterobacter sakazakii ( Cronobacter spp.)  asal  susu  formula  dan makanan bayi. Warta Industri Hasil Pertanian 26: 22-30.
Nifosi R, Tozzini V, Beltram F. 2005. Fluorescent Proteins. pp.
235–244.  Dalam:  Encyclopedia  of  Condensed  Matter Physics. Bassani F, Liedl GL, Wyder P (eds). Elsevier .
Nurjanah S, Suhartono MT, Dewanti-Hariyadi R, Estuningsih S.
2012. Construction of GFPuv-labeled Cronobacter sakazakii and Cronobacter  muytjensii . International  Seminar  of  Food Factors, SEAFAST Center. Jakarta, 3-4 Oktober. SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Nurjanah S, Dewanti-Hariyadi R, Estuningsih S, Suhartono MT. 2013.  Cytotoxic  activity  of  food  isolates Cronobacter sakazakii and Cronobacter  muytjensii from  Indonesia.  13 th Asean  Food  Conference  2013,  Meeting  Future  Food Demands:  Security  and  Sustainability.  Singapore,  9-11 September.  Singapore  Institute  of  Food  Science  and Technology, Singapore.
Penna  TCV,  Ishii  M,  Junior  AP,  Cholewa  O.  2004.  Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various  pH  values.  Appl  Biochem  Biotech  114:  469-483. DOI: 10.1385/ABAB:114:1-3:469.
Rahmawati, Dewanti-Hariyadi R, Hariyadi P, Fardiaz D, Richana N.  2013.  Isolation  and  identification  of  microorganisms during  spontaneous  fermentation  of  maize.  J  Teknol  dan Industri Pangan 24: 33-39. DOI: 10.6066/jtip.2013.24.1.33.
Restaino  L,  Frampton  EW,  Lionberg  WC,  Becker  RJ.  2006.  A chromogenic  plating  medium  for  the  isolation  and identification  of Enterobacter  sakazakii from  foods,  food ingredients,  and  environmental  sources.  J  Food  Prot  69: 315–322.
Sarah  TS.  2013.  Kajian  Pembuatan  Maizena  dari  Jagung Kuning  dan  Sintas  Mutan Cronobacter spp.  selama
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Pembuatan  Maizena.  [Skripsi].  Fakultas  Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Schmid  M,  Iversen  C,  Gontia  I,  Stephan  R,  Hofmann  A, Hartmann  A,  Jha B,  Eberl  L,  Riedel  K,  Lehner  A.  2009. Evidence  for  a  plant-associated  natural  habitat  for Cronobacter spp.  Res  Microbiol  160:  608-614.  DOI: 10.1016/j.resmic.2009.08.013.
Seftiono  H.  2012.  Ketahanan  Panas Cronobacter spp. (Enterobacter  sakazakii )  dalam  Susu  Formula  dan  Sistem Buffer  dengan  Berbagai  aw  dan  pH.  [Tesis].  Fakultas Teknologi Pertanian. Bogor : Institut Pertanian Bogor.
Shimomura  O.  2005.  The  discovery  of  aequorin  and  green fluorescent protein. J Microscopy 217: 3–15. DOI: 10.1111/j. 0022-2720.2005.01441.x.
Spinelli F, Donati I, Vanneste JL, Costa M, Costa G. 2010. Real
Time Monitoring of the Interaction Between P. syringae pv.
Actinidiae and Actinidia species.  In:  VII  International Symposium on Kiwifruit/ Acta Horticulturae 913. September 12-17,  Faenza,  Italy.  International  Society  for  Horticultural Science, Brussels, Belgium.
Vialette M, Jandos-Rudnik AM, Guyard C, Legeay O, Pinon A, Lange  M.  2004.  Validating  the  use  of  green  fluorescent- marked Escherichia  coli O157:H7  for  assessing  the organism  behaviour  in  foods.  J  Appl  Microbiol  96:  1097– 1104. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2004.02245.x.
Wan-Ling H, Chang CH, Chou CC. 2010. Heat shock effects on the viability of Cronobacter sakazakii during the dehydration, fermentation,  and  storage  of  lactic  cultured  milk  products. Food Microbiol 27: 280-285. DOI: 10.1016/j.fm.2009.10.011.