## PERUBAHAN STRUKTUR PATI GARUT (Maranta arundinaceae) SEBAGAI AKIBAT MODIFIKASI HIDROLISIS ASAM, PEMOTONGAN TITIK PERCABANGAN DAN SIKLUS PEMANASAN-PENDINGINAN
[ Structure Changes of Arrowroot ( Maranta arundinaceae ) Starch as Influenced by Acid Hydrolysis , Debranching and Autoclaving-Cooling Cycle Modifications]
Didah Nur Faridah 1)* , Dedi Fardiaz 1) , Nuri Andarwulan 1) dan Titi Candra Sunarti 2)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
2) Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Diterima 05 Agustus 2010 / Disetujui  20 Desember 2010

## ABSTRACT
The effects of lintnerization (2.2 N HCl, 2 hours), debranching with pullulanase (1.3 U/g and 10.4 U/g starch) and/or three-auctoclaving-cooling cycles  at  121 o C  for  15  minutes  on  the  changes  of  arrowroot  starch  structures  were  studied.  The  structural  modifications  of  amylose  and amylopectin  were  measured  by  Gel  Permiation Chromatography (GPC),  and  the  distribution  of  degree  of  polimerization  (DP)  was  analyzed  by Fluorophore-Assisted Capillary Electrophoresis (FACE). The GPC profile of native starch using Toyopearl HW-65S gel gave mainly two fractions. Fraction I (Fr. I) was a high molecular weight component and Fraction II (Fr. II) was a low molecular weight component. After acid modification, the carbohydrate content of Fr. II increased while that of Fr. I decreased. The amount of  DP of 6 to 8 increased in all modified arrowroot starches. The GPC and FACE analyses showed that all starch modification techniques caused the structural changes of amylopectin molecules to form short chain amyloses.
Key words :  arrowroot  starch,  degree  of  polimerization,  FACE  (Fluorophore-Assisted  Capillary  Electrophoresis)  and  GPC  (Gel  Permiation Chromatography)

## PENDAHULUAN 1
Granula pati tersusun dari dua jenis pati yaitu amilosa dan amilopektin.  Amilosa  mempunyai  struktur  lurus  dengan  ikatan -(1,4)-D-glukosa,  sedangkan  amilopektin  mempunyai  cabang dengan  ikatan -(1,6)-D-glukosa.  Struktur  amilopektin membentuk seperti klaster, dimana rantai A terikat pada rantai B  dan  rantai  B  terikat  dengan  rantai  B  lainnya  (B1-B4) tergantung  pada  panjang  rantainya.  Sebanyak  80-90%  jumlah rantai  amilopektin  terletak  pada  klaster  sedangkan  hanya  10- 20% terlibat dalam pembentukan koneksi-inter-kluster.
Amilopektin berantai pendek dapat membentuk double helix dan  menyusun  daerah  kristalin  dalam  granula  pati  sedangkan titik-titik  percabangan  amilopektin  menyusun  daerah  amorf. Amilosa berada baik pada daerah kristalin maupun amorf, tetapi sebagian besar berada di daerah amorf (Tester et al., 2004). Pati  dapat  dihidrolisis  dengan  asam  klorida  (hidrolisis asam).  Asam  kuat  akan  menghidrolisis  ikatan  glikosida  pada pati  sehingga  panjang  rantai  menjadi  lebih  pendek  dan  berat molekul pati menjadi lebih rendah (Wurzburg, 1989). Pati dapat juga dihidrolisis oleh enzim pullulanase di titik percabangan  - (1,6) pada amilopektin sehingga akan dihasilkan amilosa rantai pendek.
Salah  satu  bahan  pangan  yang  dapat  dijadikan  sebagai bahan  baku  untuk  pembuatan  pangan  fungsional  adalah  pati
*  Korespondensi penulis : E-mail : didah_nf17@yahoo.com
resisten atau Resistant Starch (RS), yaitu bagian dari pati yang tidak dapat dicerna oleh enzim dalam usus halus manusia yang sehat  tetapi  dapat  difermentasi  oleh  mikroflora  usus  untuk menghasilkan  asam  lemak  rantai  pendek  yang  bermanfaat untuk  kesehatan.  Secara  umum  RS  dapat  diperoleh  dari  pati yang  secara  fisik  terperangkap  dalam  sel-sel  tanaman  dan matriks  bahan  pangan  (RS1),  pati  yang  secara  alami  sangat resisten terhadap pencernaan oleh enzim α-amilase (RS2), pati yang  dimodifikasi  baik  secara  fisik  (RS3)  maupun  kimia  (RS4) (Champ, 2004).
RS3  diperoleh  melalui  proses  pemanasan-pendinginan secara berulang yang merupakan kombinasi proses gelatinisasi ( fraksi amilosa keluar dari granula) dan retrogradasi pati ( p roses kristalisasi amilosa yang bertanggung jawab pada pembentukan RS3) (Mun  dan  Shin,  2006;  Sajilata et  al .,  2006) .  Kadar  RS3 secara  proposional  berbanding  lurus  dengan  kandungan amilosa dalam bahan pangan (Shu et al ., 2007).
Peningkatan  kadar  RS3  dapat  dilakukan  dengan  metode modifikasi  pati:  1)  pemanasan-pendinginan  2)  hidrolisis  asam ( lintnerized  starch )  yang  dilanjutkan  dengan  pemanasan- pendinginan 3) pemotongan titik cabang amilopektin oleh enzim pullulanase  ( debranching )  dilanjutkan  dengan  pemanasan- pendinginan 4) kombinasi hidrolisis asam dan pemotongan titik cabang dengan pemanasan-pendinginan.
Proses  hidrolisis  oleh  asam  dan  pemotongan  titik  cabang dapat  mereduksi  panjang  rantai  -glukan  sehingga  derajat polimerisasi (DP) menjadi rendah. Nilai DP sekitar 10-35 adalah
nilai yang cukup optimal untuk  meningkatkan RS (Schmiedl et al., 2000).
Hasil  pengamatan  menggunakan  difraksi  sinar  X,  tipe kristalin  pati  garut  tergolong  tipe  A  dengan  karakteristik  rantai amilopektin  pati  garut  memiliki  DP  berkisar  9-30  dalam  jumlah yang  tinggi  (96,0%),  densitasnya  lebih  padat  pada  daerah struktur  helikal  (Wang et  al .,  1998;  Srichuwong et  al., 2005), proporsi  rantai  cabang  berukuran  pendek  pada  amilopketin lebih tinggi (Hizukuri et al ., 1983) dan jumlah rantai per klaster lebih  banyak  (Takeda et  al., 2003)  dibandingkan  dengan kristanilitas  tipe  B.  Dengan  karakteristik  tersebut,  pati  garut merupakan pati yang berpotensi untuk dijadikan alternatif dalam pembuatan RS3.
Adapun tujuan penelitian ini adalah mempelajari perubahan struktur  pati  garut  hasil  modifikasi  asam  ( lintnerization ), pemotongan  titik  cabang  ( debranching )  dan  atau  pemanasan pendinginan ( autoclaving-cooling ).

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan alat
Pada  penelitian  ini  bahan  yang  digunakan  adalah  umbi garut  yang  diperoleh  dari  Balai  Besar  Bioteknologi  dan Sumberdaya  Genetika,  Cimanggu,  Bogor.  Bahan  kimia  yang digunakan  untuk  modifikasi  pati  garut  adalah  NaOH,  HCl, pullulanase  dengan  aktifitas  >400  U/ml  (Sigma  P-2986),  Na asetat  buffer  pH  5.2.  Bahan  kimia  yang  digunakan  untuk analisis  adalah  APTS  (C 16 H 8 NNa 3 O 9 S 3, 8-Aminopyrene-1,3,6- trisulfonic  acid  trisodium),  NaBH 3 CN,  NaHCO 3 ,  aquades, deionized water, HCl, heksana,  Na 2 S 2 O 5 , Na K Tartarat,  fenol, glukosa,  HClO 4 ,  Na 2 HPO 4 ,  kuprisulfat,  Na 2 SO 4 ,  amonium molibdat,  Na 2 HPO 4 .7H 2 O  dan  Sheparose  Toyopreal  65F, Sephadex TM G-25,  butanol,  Na  asetat  buffer  pH  5.2  and  3.5, isoamylase (Haya Shibara Biochemical Laboratories.Inc), etanol dan  aseton.  Alat  yang  digunakan  selama  penelitian  ini  adalah ABI  PRISM  3100  Genetic  Analyzer  (Applied  Biosystems, Foreter  City,  CA,  USA),  Polymer  POP,  36-cm  capillary, Gel Permeation Chromatography HW  65F  (Toyopearl,  Tosoh Coorporation  Akasaka,  Minato-ku  Japan), shaker  incubator , freeze dryer (DC 800 Yamato Scientific Co, Ltd, Japan), drying incubator ,  vortex,  otoklaf,  pompa  peristaltik,  UV-Vis spektrofotometer, dan spektronik 20D +
Proses ekstraksi pati garut Umbi  garut  dibersihkan,  dikupas  dan  dicuci  dengan  air bersih, direndam 1 jam, diblender dengan perbandingan umbi : air sebesar 1 : 3.5, penyaringan, pengendapan pati, pencucian dan  pengeringan  pati  dengan  menggunakan  oven  suhu  50 o . Pati garut kering digiling dengan  menggunakan disc mill , kemu- dian  disaring  dan  diayak.  Pati  yang  dihasilkan dikemas  dan disimpan di dalam freezer -18 o C sampai digunakan.

## Modifikasi pati garut
Pemanasan-pendinginan (Lehmann et al ., 2003) Pati  garut  ( native )  dengan  konsentrasi  pati  20%  diotoklaf 121 o C selama 15 menit dan didinginkan pada suhu 4 0 C selama
24 jam.  Pemanasan pendinginan dilakukan sebanyak 3  kali (3 siklus)  kemudian  sampel  dikeringkan,  digiling  dengan menggunakan disc  mill ,  kemudian  disaring  dan  diayak.  Pati yang  dihasilkan dikemas  dan  disimpan  di  dalam freezer -18 o C sampai digunakan
Kombinasi  hidrolisis  asam  dan  pemanasan-pendinginan (Aparicio-Saguilan et al. , 2005)
Pati garut dihidrolisis oleh asam HCl dengan konsentrasi 2,2 N  selama  2  jam  pada  suhu  35 o C.  Kemudian  hasil  hidrolisis asam dinetralkan dengan NaOH sampai pH 6 dan dikeringkan dengan  oven  suhu  50 o C.  Pati  hasil  hidrolisis  asam  diberi perlakuan  sama  seperti  modifikasi  dengan  pemanasan- pendinginan
Kombinasi pemotongan titik cabang oleh enzim pullulanase dan pemanasan-pendinginan
Penentuan aktifitas enzim pullulanase (Gonzalez-Soto et al., 2004 dan Gonzales-Soto et al., 2007).
Larutan  enzim  pullulanase  (30  µl  enzim  pullulanase ditambahkan  720  µl  of  asetat  buffer,  pH  5,2  dan  0,1  M. Sebanyak 62,5 µl larutan enzim tersebut ditambahkan dengan 125  µl  larutan waxy  maize (0.4  mg/ml)  dan  62,5  µl  larutan asetat buffer pH 5,2 dan 0,1 M.
Campuran larutan tersebut kemudian diinkubasi selama 10 menit  pada  suhu  50 o C.  Reaksi  enzimatis  dihentikan  dengan penambahan  0,5  ml  larutan  0,5  M  NaOH.  Kandungan  gula pereduksi  ditentukan  dengan  menggunakan  metode  Park- Johnson (Takeda et al ., 1993)
Pemotongan  titik  cabang  pati  garut  dan  pemanasan pendinginan (Zhao dan Lin, 2009) . Pati  garut  diotoklaf  121 o C  selama  15  menit,  kemudian didinginkan  pada  suhu  4 o C.  Pati  yang  telah  mengalami modifikasi satu siklus dipanaskan sampai suhu 50 o C, kemudian ditambahkan  enzim  pullulanase  dengan  konsentrasi  1,3  dan 10,4  U/g  pati  dengan  suhu  50 o C  dan  pH  5,2  selama  24  jam. Inaktivasi  enzim  dilakukan  dengan  cara  otoklaf  pada  suhu 121 o C selama 15 menit. Kemudian diberi pelakuan pemanasan pendinginan  sebanyak  2  siklus.  Pati  yang  telah  mengalami hirolisis  dengan  enzim  pullulanase  kemudian  diberi  perlakuan sama seperti modifikasi dengan pemanasan-pendinginan.
Kombinasi asam, pemotongan titik cabang dan pemanasan pendinginan (Lehmann et al., 2003)
Perlakuan  ini  merupakan  kombinasi  perlakuan  modifikasi asam  dan  pemotongan  titik  cabang  dengan  pemanasan pendinginan. Pati garut hasil hidrolisis dengan asam kemudian diberi perlakuan seperti pada tahap modifikasi pati garut dengan pemotongan titik cabang dan pemanasan pendinginan.
Analisis  distribusi  amilosa  dan  amilopektin  dengan Gel Permiation Chromatography (GPC)  (Sunarti et  al., 2001; Ozturk et al., 2009).
Sampel bebas lemak disuspensikan dalam air dan diotoklaf pada suhu 105 o C selama 1 jam, dan disentrifus (4 o C, 10000 g). Supernatan  dipisahkan  dan  dihitung  kadar  total  karbohidrat. Supernatant (10 mg/ml) diinjeksikan pada kolom gel Toyopearl
(GPC  Toyopearl  HW-65F,  Toyopearl  HW-65S  gel,  dengan ukuran kolom 2,6 cm ID x 100 cm, NaCl 50 mM sebagai eluen dan kecepatan 60 ml/jam). Sampel sebanyak 10 ml setiap fraksi ditampung  dan  diambil  0,5  ml  aliquot  untuk  dianalisis  kadar karbohidrat  totalnya  dengan  menggunakan  metode  fenol-sulfat (Dubois et al., 1956). Hasil khromatogram GPC dibagi menjadi 2 area  (Fraksi  I/Fr-I  and  Fraksi  II/Fr-II).Kurva  profil  GPC  adalah hubungan  antara  nomor  fraksi  dengan  rasio  total  karbohidrat (kadar total karbohidrat setiap fraksi dibagi dengan jumlah total kadar karbohidrat semua fraksi yang terelusi).
Analisis  distribusi  panjang  rantai  amilopektin  dan amilosa  rantai  pendek  dengan Fluorophore-Assisted Capillary  Electrophoresis (FACE)  (Srichuwong et  al., 2004)

## Persiapan sampel
Sampel  pati  ditimbang  10  mg  dan  ditambahkan  5  ml aquades ke dalam tabung sentrifuse 15 ml (konsentrasi akhir 2 mg/ml)  dan  diotoklaf  pada  suhu  105 o C  selama  1  jam.  Tahap selanjutnya divorteks dan larutan diambil 100 µl (suhu dibawah 37 o C) ditambahkan 5  µl 50 mM buffer asetat pH 3,5 dan 5 µl larutan  enzim  isoamilase  selanjutnya  divortex  dan  disimpan pada  suhu  37 o C  selama  24  jam.  Setelah  24  jam,  larutan tersebut  dididihkan  pada  suhu  100 o C  selama  5  menit  dan disentrifus 15.000 rpm 5 menit.
Supernatan  sebanyak  50  µl  dikeringkan  dengan menggunakan drying evaporator dan ditambahkan 2 µl larutan NaBH 3 CN  1  M  dan  2  µl  APTS  0.2  M  (8-aminopyrene-1,3,6- trisulfuric  acid  trisodium),  divorteks  dan  disimpan  pada  suhu 37 o C selama 24 jam. Tahap selanjutnya adalah penambahan 1 ml aquades dan divorteks kemudian disimpan pada suhu -30 o C sebelum dianalisis menggunakan Genetic Analyzer.

## Fluorophore-Assisted Capillary Electrophoresis (FACE)
Sampel dithawing ,  diencerkan  1000,  2000  dan  3000  kali kemudian diambil sebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam 96- well dan disentrifus selanjutnya sampel yang berada dalam 96- well dimasukkan ke dalam genetic analyzer dengan polimer POP-6 dan  36  cm  capillary.  Elektroforesis  dijalankan  dengan  buffer genetic  analyzer  pada  15kV  selama  2  jam  dan  data  dianalisis dengan  menggunakan  Genescan  3,7  software  dari  Applied Biosystems.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Profil pati dengan Gel Permeation Chromatography (GPC) Perubahan profil distribusi amilosa dan amilopektin dari pati garut  sebagai  akibat  dari  perlakuan  modifikasi  pati  garut dianalisis  dengan  menggunakan Gel  Permeation  Chroma- tography (GPC) dan dinyatakan sebagai rasio total karbohidrat. Kromatogram  GPC  pada  seluruh  pati  garut,  baik  sebelum maupun setelah modifikasi, memiliki dua fraksi, yaitu fraksi I (Fr- I)  dan  fraksi  II  (Fr-II).  Hasil  penelitian  terdahulu  juga memperlihatkan dua fraksi pada kromatogram GPC, yaitu pada pati  beras  (Mujoo  dan  Ali,  1999),  pati  gandum,  kentang  dan tapioka  (Singh  dan  Ali,  2000),  dan  pati  jagung  tinggi  amilosa (Ozturk et  al., 2009).  Fraksi  I  merupakan  fraksi  amilopektin
dengan  bobot  molekul  besar,  sedangkan  fraksi  II  (Fr-II) merupakan  fraksi  amilosa  dan  gula-gula  sederhana  dengan bobot  molekul  kecil.  Fraksi  I  terdapat  pada  fraksi  nomor  1 sampai  30,  sedangkan  fraksi  II  terdapat  pada  fraksi  nomor  31 sampai 48.
Gambar  1  secara  umum  memperlihatkan  perubahan  rasio total  karbohidrat  pada  fraksi  I  dan  fraksi  II  untuk  setiap perlakuan modifikasi, baik dibandingkan dengan pati garut alami maupun  pati  yang  diberikan  perlakuan.  Seberapa  besar perubahan tersebut terjadi, dianalisis secara kuantitatif sebagai jumlah  persentase  rasio  total  karbohidrat  pada  masing-masing fraksi sebagaimana dapat dilihat pada  Tabel  1. Tabel tersebut juga  memperlihatkan  perubahan  persentase  peningkatan  total karbohidrat  pada  fraksi  II  untuk  menunjukkan  seberapa  besar perubahan fraksi amilosa dengan bobot molekul rendah sebagai akibat perlakuan modifikasi. Data-data tersebut memperlihatkan adanya peningkatan rasio total karbohidrat pada fraksi II (yang menunjukkan  peningkatan  fraksi  amilosa  dan  gula  sederhana) yang  selalu  diikuti  dengan  penurunan  rasio  total  karbohidrat pada fraksi I (yang menunjukkan penurunan fraksi amilopektin).
Rasio  total  karbohidrat  fraksi  amilopektin  (Fr-I)  dari  pati garut yang diberi perlakuan pemanasan-pendinginan sebanyak 3 siklus mengalami penurunan, sedangkan pada fraksi amilosa (Fr-II)  mengalami  peningkatan  sebesar  13,33% Hal  ini menunjukkan bahwa telah terjadi degradasi molekul amilopektin terutama  rantai  luar  pada  daerah  kristalin  menjadi  molekul amilosa rantai pendek selama proses pemanasan dibandingkan dengan pati garut  alami ( native ) (Mahadevamma et al., 2003). Proses autoclaving dengan  suhu  tinggi  memicu  terjadinya depolimerisasi  parsial  pati  singkong  yang  menyebabkan pembentukan  molekul  dengan  bobot  yang  lebih  rendah (Mutungi et  al., 2009),  sama  seperti  pada  sampel  pati  jagung tinggi amilosa hasil penelitian Ozturk et al . (2009) dan pati sagu (Leong et al., 2007).
Perlakuan hidrolisis asam dengan hanya menggunakan HCl 2,2N  selama  2  jam  menyebabkan  peningkatan  Fr-II  hingga 164,84%,  sedangkan  yang  dikombinasikan  dengan  siklus pemanasan-pendinginan  meningkat  hingga  208,03%  diban- dingkan  pati  garut  alaminya  (Tabel  1  dan  Gambar  1b). Peningkatan  Fr-II  pada  pati  garut  yang  mengalami  hidrolisis tersebut  disebabkan  oleh  terjadinya  degradasi  molekul amilopektin  dan  amilosa  pada  daerah  amorf.  Kehilangan puncak  terjadi  pada  Fr-I  dan  peningkatan  komponen  berbobot molekul rendah (Fr-II) (Singh dan Ali, 2000; Franco et al ., 2002; Ferrini et  al .,  2008),  yang  berkolerasi  terhadap  peningkatan pembentukan RS3 (Aparicio-Saguilan et al ., 2005).
Fraksi  II  mengandung  fraksi  amilosa,  amilopektin  dan amilosa  hasil  hidrolisis  oleh  asam.  Degradasi  daerah  amorf terjadi  karena  asam  berdifusi  ke  dalam  granula  pati  dan menyerang  atom  oksigen  pada  ikatan  glikosidik  yang  terdapat pada 1,4  atau 1,6  sehingga  menghasilkan  senyawa intermediet  karbokationik  yang  tidak  stabil  dan  dapat  bereaksi dengan  air  dalam  granula  pati  (Chung  dan  Lai,  2007).  Hal  ini disebabkan  amilopektin  dan  amilosa  pati  garut  mengalami degradasi  selama  proses  hidrolisis  asam  dan  siklus pemanasan-pendinginan.  Selama  sampel  mengalami  proses autoclaving ,  depolimerasi  amilopektin  dan  amilosa  menjadi amilosa rantai pendek menjadi lebih mudah apabila pati sudah
mengalami  hidrolisis  asam.  Hal  ini  sesuai  dengan  yang dinyatakan oleh Mujoo dan Ali (1999), (Mutungi et al., 2009) dan (Leong et al., 2007) sebagaimana telah dijelaskan di atas. Aktifitas enzim pullulanase sebesar 416,04 U/ml atau PUN dapat  menghidrolisis  percabangan  (1,6)  pada  amilopektin (pemotongan  titik  cabang),  sehingga  dihasilkan  fraksi  molekul berantai lurus (amilosa rantai pendek). Hidrolisis pati oleh enzim pullulanase  menghasilkan  amilosa  rantai  pendek  yang diharapkan dapat menghasilkan DP yang optimal untuk proses pembentukan  RS3  yang  merupakan  pati  hasil  retrogradasi (Pongjanta et  al., 2009a).  Semakin  banyak  fraksi  amilosa berantai  pendek,  maka  semakin  banyak  kemungkinan  untuk meningkatkan  pembentukan  RS3  selama  proses  pemanasan- pendinginan (Pongjanta et al., 2009a; Ozturk et al., 2009). Analisis  GPC  menunjukkan  bahwa  masih  ditemukan puncak  pada  Fr-I  baik  pada  penggunaan  konsentrasi pullulanase 1,3 U/g pati maupun pada konsentrasi 10,4 U/g pati (Gambar  1c).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  tidak  semua amilopektin  terhidrolisis  sempurna  dan  menghasilkan  fraksi amilosa  rantai  pendek.  Pada  penggunaan  konsentrasi  enzim pullulanase  konsentrasi  rendah,  puncak  pada  Fr-I  lebih  tinggi dibandingkan dengan puncak yang terbentuk pada penggunaan enzim  pullulanase  konsentrasi  tinggi.  Hal  ini  mengakibatkan peningkatan Fr-II pada sampel dengan pullulanase 1,3 U/g pati lebih rendah (120,67%) dibandingkan pullulanase 10,4 U/g pati (214,40%)  (Tabel  1).  Pati  dengan  pullulanase  10,4  U/g mengalami  penurunan  puncak  pada  Fr-I  dan  mengalami peningkatan puncak pada Fr-II. Hasil ini berkesesuaian dengan hasil  penelitian  Ozturk et  al., (2009)  pada  pati  jagung  Hylon  7 dan Hylon 5, yaitu semakin lama waktu hidrolisis dengan enzim pullulanase  (0-48  jam)  maka  semakin  rendah  puncak  Fr-I  dan semakin meningkat puncak Fr-II (Gambar 1c).
Pengaruh  kombinasi  perlakuan  asam,  pemotongan percabangan  dan  pemanasan-pendinginan g terhadap  profil GPC dapat dilihat pada Gambar 1d. Pada Fr-I tidak ditemukan adanya  puncak  karena  pati  garut  sudah  mengalami  hidrolisis asam.  Namun,  rasio  total  karbohidrat  pada  Fr-I  pada  setiap nomor  fraksi  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  perlakuan hidrolisis  asam  dengan  pemanasan-pendinginan.  Pada  Fr-II terjadi peningkatan raso total karbohidrat yang lebih tinggi baik pada  konsentrasi  enzim  pullulanase  1,3  U/g  pati  (222,96%) maupun  pada  konsentrasi  10,4  U/g  pati  (214,60%)  diban- dingkan  dengan  perlakuan  modifikasi  lainnya.  Peningkatan
rasio  karbohidrat  Fr-II  mengindikasikan  lebih  banyak  fraksi amilosa rantai pendek yang terbentuk.

## Distribusi panjang rantai amilopektin dan amilosa rantai pendek dengan FACE
Panjang  rantai    amilopektin  dan  amilosa  rantai  pendek dengan  DP  6-30  dapat  diketahui  dengan  menggunakan Fluorophore-Assited Capillary Electrophoresis (FACE). Amilopektin  pada  pati  garut  baik  yang  alami  dan  yang mengalami  proses  modifikasi,  dihidrolisis  secara  sempurna dengan  menggunakan  enzim  isoamilase  sehingga  semua  titik percabangan  -1,6  terputus  dan  menghasilkan  rantai  glukan dengan  ujung  pereduksi.  Semakin  banyak  yang  terhidrolisis maka semakin tinggi kadar gula pereduksinya. Ujung pereduksi kemudian  diderivatisasi  dengan  APTS  ( 8-amino-pyrene-1,3,6- trisulfuric acid trisodium ) sehingga pati dapat dianalisis dengan menggunakan  FACE.  Ujung  pereduksi  rantai  glukan  dapat diperoleh  baik  dari  hasil  hidrolisis  amilopektin  maupun  dari degradasi  amilosa.  Analisis  DP  rantai  glukan  dengan menggunakan FACE tidak dapat membedakan ujung pereduksi rantai  glukan  hasil  hidrolisis  amilopektin  atau  hasil  degradasi amilosa.  Namun,  kenaikan  persentase  distribusi  rantai  glukan merupakan indikasi telah terjadinya degradasi amilosa menjadi amilosa rantai pendek.
Profil distribusi DP baik pada pati garut alami atau pati garut termodifikasi dapat dilihat pada Gambar 2 dengan puncak yang banyak  pada  DP  11-13.  Srichuwong et  al. (2005)  juga melaporkan  bahwa  pati  garut  memiliki  DP  yang  paling  banyak pada  11-13  dan  DP  16-26  secara  positif  berkorelasi  dengan tingginya pembentukan RS3. Pada Tabel 2. dapat dilihat bahwa semua sampel memiliki proposi yang paling tinggi pada DP 13- 24 (44.65-56.04%).
Persen  distribusi  amilopektin  dan  amilosa  rantai  pendek pada  pati  garut  dengan  perlakuan  pemanasan-pendinginan adalah sebagai berikut: DP 6-8 (6,68%), DP 9-12 (32,09%), DP 13-24  (54,91%)  dan  DP  25-30  (6,32%).  Dibandingkan  dengan pati garut alami, maka persen distribusi pada DP 6-8, 9-12 dan 25-30 meningkat sedangkan DP 13-24 menurun.
Hal  ini  menunjukkan  bahwa  proses  pemanasan- pendinginan  dapat  meningkatkan  rantai  amilosa  rantai  pendek yang  kemungkinan  berasal  dari  depolimerisasi  amilosa  rantai panjang.  Hal  ini  telah  dijelaskan  pada  sub-bab  mengenai pengaruh  pemanasan-pendinginan  terhadap  profil  amilopektin dan amilosa dengan menggunakan GPC.
Tabel 1. Rasio total karbohidrat pati garut pada fraksi I dan II sebelum dan setelah perlakuan modifikasi dari hasil analisis GPC
Perlakuan % Fraksi I (nomor fraksi 1-30) % Fraksi II (nomor fraksi 31-48) % Peningkatan fraksi II Pati garut alami 70,80 29,20 Pemanasan pendinginan 3 siklus 66,91 33,09 13,33 Hidrolisis asam 2 jam 22,67 77,33 164,84 Hidrolisis asam 2 jam + pemanasan pendinginan 10,06 89,94 208,03 Pemotongan titik cabang 1,3 U/g pati + pemanasan pendinginan 35,56 64,44 120,67 Pemotongan titik cabang 10,4 U/g pati + pemanasan pendinginan 8,20 91,80 214,40 Hidrolisis asam 2 jam + pemotongan titik cabang 1,3 U/g pati + pemanasan pendinginan 5,70 94,30 222,96 Hidrolisis asam 2 jam + pemotongan titik cabang 10,4 U/g pati + pemanasan pendinginan 8,13 91,87 214,64
Tabel 2.  Persentase distribusi panjang rantai pada amilopektin dan amilosa rantai pendek dari hasil pengukuran dengan FACE
Perlakuan Distribusi Panjang rantai (%) Panjang rantai 6-8 Panjang rantai 9-12 Panjang rantai 13-24 Panjang rantai 25-30 Pati garut alami 5,98 31,77 56,04 6,21 Pemanasan pendinginan 3 siklus 6,68 32,09 54,91 6,32 Hidrolisis asam 2 jam 6,69 30,66 55,31 7,33 Hidrolisis asam 2 jam + pemanasan pendinginan 3 siklus 7,08 30,86 55,34 6,72 Pemotongan titik cabang 1,3 U/g pati + pemanasan pendinginan 8,13 31,52 53,68 6,67 Pemotogan titik cabang 10,4 U/g pati + pemanasan pendinginan 16,81 33,37 44,65 5,17 Hidrolisis asam 2 jam + pemotongan titik cabang 1,3 U/g pati + pemanasan pendinginan 7,59 30,53 54,80 7,08 Hidrolisis asam 2 jam + pemotongan titik cabang 10,4 U/g pati + pemanasan pendinginan 14,79 31,55 47,92 5,75
Kemungkinan yang lain adalah terjadinya degradasi amilopektin dengan DP 13-24 sehingga persen distribusi DP 13-24 menurun dibandingkan  dengan  pati  garut  alami.  Penurunan  DP  13-24 kemungkinan disebabkan oleh degradasi amilopektin pada  DP tersebut dan membentuk amilosa rantai pendek dengan DP 6-8 atau  9-12.    Semua  sampel  dengan  perlakuan  pemanasan- pendinginan mengalami peningkatan DP 6-8 bila dibandingkan dengan  pati  garut  alami.  Hal  ini  disebabkan  oleh  degradasi amilosa rantai panjang atau amilopketin rantai medium (Gambar 2 dan Tabel 2).
Profil  distribusi  panjang  rantai  amilopektin  dan  amilosa rantai pendek pada pati garut yang dihidrolisis dengan HCl 2,2 N  selama  2  jam  dan  dilanjutkan  dengan  proses  pemanasan- pendinginan  dapat  dilihat  pada  Gambar  2  dan  Tabel  2. Dibandingkan  dengan  pati  garut  alaminya,  pati  yang  diberi perlakuan  tersebut  mengalami peningkatan  persentase  distri- busi  panjang  rantai  dengan  DP  6-8  dan  25-30  dan  penurunan pada DP 9-12 dan 13-24.
Peningkatan persentase panjang rantai dengan DP 6-8 dan 25-30  pada  perlakuan  hidrolisis  asam  disebabkan  oleh terjadinya  depolimerisasi  amilosa  rantai  panjang  membentuk amilosa  rantai  pendek.  Hidrolisis  asam  terjadi  pada  daerah amorf  yang  umumnya  banyak  mengandung  amilosa  dan  titik percabangan  ,1-6  pada  amilopektin.  Kemungkinan  lainnya adalah hidrolisis  panjang rantai   medium amilopektin  sehingga persentase distribusi panjang rantai dengan DP 9-12 dan 13-24 menurun dan dihasilkan rantai glukan dengan DP 6-8.
Proses  pemotongan    titik  percabangan  amilopektin  meng- hasilkan banyak rantai glukan dengan DP 6-8, 9-12, 13-24 dan 25-30  (Tabel  2).  Rantai  glukan  hasil  pemotongan    titik percabangan  kemudian  dipanaskan  dengan  otoklaf  pada  suhu 121 o C selama 15 menit.
Proses  pemanasan  pada  rantai  glukan  hasil  pemotongan titik  percabangan  amilopektin  menyebabkan  depolimerisasi rantai glukan lebih mudah dibandingkan dengan dalam bentuk struktur  amilopektinnya.  Hal  ini  menyebabkan  panjang  rantai
Pemotongan titik cabang 1,3 U/g pati + pemanasan pendinginan
Pemotongan titik cabang 10,4 U/g pati
+ pemanasan pendinginan Alami Alami Hidrolisis asam 2 jam + Pemotongan titik cabang 10,4 U/g pati + pemanasan pendinginan Hidrolisis asam 2 jam + Pemotongan titik cabang 1,3 U/g pati + pemanasan pendinginan R asi o Ka rbo hidr at T ot al ( % ) Nomor Fraksi
Gambar 1. Profil GPC pati garut dan termodifikasi pada Sheparose Toyopreal HW-65F
Pemanasan pendinginan Hidrolisis asam 2 jam Hidrolisis asam 2 jam + pemanasan pendinginan
Alami Alami
glukan dengan DP 6-8 pada pati garut yang dimodifikasi dengan pemotongan    titik  percabangan dan  pemanasan-pendinginan menjadi lebih tinggi dibandingkan dengan modifikasi lainnya.
Peningkatan  persentase  panjang  rantai  glukan  dengan  DP 6-8  dapat  juga  disebabkan  oleh  depolimerisasi  amilosa  rantai panjang  sebagai  akibat  proses  pemanasan-pendinginan . Pada konsentrasi  enzim  pullulanase  1,3  U/g  pati,  peningkatan persentase  panjang  rantai  dengan  DP  6-8  lebih  rendah dibandingkan dengan pada konsentrasi enzim 10,4 U/g pati. Hal ini  karena  penggunaan  konsentrasi  enzim  pullulanase  yang rendah  belum  menyebabkan  semua  titik  percabangan  ,1-6 terhidrolisis  sehingga  peluang  untuk  depolimerisasi  rantai glukan  hasil  pemotongan  titik  percabangan  amilopektin ( debranching ) lebih rendah.
Peningkatan  persentase  panjang  rantai  dengan  DP  6-8 pada penggunaan enzim pullulanase konsentrasi rendah diikuti dengan penurunan pada rantai glukan dengan DP 13-24. Hal ini menjelaskan  kemungkinan  terjadinya  depolimerisasi  rantai glukan  dengan  DP  13-24  sebagai  akibat  proses  pemanasan- pendinginan . Peningkatan  panjang  rantai  dengan  DP  25-30 disebabkan  oleh  depolimerisasi  amilosa  rantai  panjang  akibat proses pemanasan-pendinginan. Penggunaan enzim
pullulanase  konsentrasi  tinggi  menyebabkan  peningkatan persentase  distribusi  rantai  glukan  dengan  DP  6-8  dan  9-12 lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  perlakuan  pada  konsentrasi rendah.  Semakin  tinggi  konsentrasi  enzim  pullulanase,  maka semakin  banyak  titik  percabangan  ,1-6  amilopektin  yang terputus  sehingga  peluang  terhidrolisisnya  rantai  glukan  hasil pemotongan titik percabangan amilopektin meningkat pada saat proses  pemanasan-pendinginan dan  menyebabkan  penurunan panjang rantai glukan dengan DP 25-30.
Chung et al. (2009) melaporkan bahwa pati singkong yang mengalami  proses  hidrolisis  oleh  enzim  pullulanase dan pemanasan-pendinginan  memiliki  DP  5-48,  yaitu  jumlah  yang tinggi  terdapat  pada  DP  10-24  (58,9%)  dan  DP  >24  (31,2%), sedangkan  DP  <10  hanya  sekitar  8%.  Pati  jagung  yang dimodifikasi dengan HMT ( Heat Moisture Treatment ) baik yang dikombinasikan  dengan  modifikasi annealing maupun  tanpa annealing ternyata  dapat  meningkatkan  DP  6-8  dan menurunkan  DP>37  (Chung et  al., 2009).  Dari  hasil  tersebut maka  dapat  disimpulkan  bahwa  proses  pemanasan  dapat memutuskan  ikatan  kovalen  pada  rantai  glukan  sehingga terbentuk  rantai  glukan  yang  lebih  pendek  baik  pada amilopektin maupun pada amilosa (Chung et al., 2009).
Gambar 2. Distribusi panjang rantai pada amilopektin dan amilosa rantai pendek.
Pemanasan pendinginan
Hidrolisis asam 2 jam + pemotongan titik cabang 1,3 U/g pati + pemanasan pendinginan Alami Hidrolisis asam 2 jam
Hidrolisis asam 2 jam + pemotongan titik cabang 10,4 U/g pati + pemanasan pendinginan Pemotongan titik cabang 10,4 U/g pati + pemanasan pendinginan Pemotongan titik cabang 1,3 U/g pati + pemanasan pendinginan Hidrolisis asam 2 jam + pemanasan pendinginan
Derajat Polimerisasi
D is tribu si (%)
Gambar  3.  Persentase  panjang  rantai  pada  pati  garut  termodifikasi dibandingkan dengan pati garut alami

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Hasil  analisis  GPC  memperlihatkan  perlakuan  modifikasi pati  garut,  baik  dengan  pemanasan-pendinginan,  hidrolisis asam, kombinasi hidrolisis asam dan pemanasan-pendinginan, kombinasi  hidrolisis  oleh  enzim  pullulanase  (pemotongan  titik percabangan)  dan  pemanasan-pendinginan,  serta  kombinasi hidrolisis asam, pemotongan titik percabangan dan pemanasan- pendinginan  menyebabkan  penurunan  fraksi  amilopektin  dan peningkatan fraksi amilosa (degradasi amilokpektin dan amilosa menjadi fraksi amilosa rantai pendek).
Distribusi  rantai  linear  baik  dari  hasil  pemotongan  titik percabangan amilopektin maupun hidrolisis amilosa yang diukur dengan  menggunakan  FACE  menunjukkan  empat  rentang derajat  polimerisasi  (DP),  yaitu  6-8,  9-12,  13-24,  dan  25-30. Perlakuan  modifikasi  pati  garut  dengan  pemanasan- pendinginan,  kombinasi  hidrolisis  asam  dan  pemanasan- pendinginan,  kombinasi  pemotongan  titik  cabang  dan pemanasan-pendinginan  serta  kombinasi  hidrolisis  asam, pemotongan  titik  cabang  dengan  kosentrasi  pullulanase  (1,3 U/g  pati)  meningkatkan  DP  25-30  yang  kemungkinan    besar berkontribusi pada pembentukan RS3. Semua sampel memiliki proposi yang paling tinggi pada DP 13-24 (44,65-56,04%).
Proses  pemanasan-pendinginan  meningkatkan  DP  6-8 dengan  peningkatan  yang  cukup  besar  terutama  bila dikombinasikan  dengan  pemotongan  titik  percabangan  pada konsentrasi enzim pullulanase tinggi (10,4 U/g pati).

## Saran
Analisis  kadar  pati  resisten  diperlukan  untuk  mengetahui bagaimana  pengaruh  semua  modifikasi  pati  garut  terhadap peningkatan  kadar  pati  resisten  sehingga  dapat  ditentukan modifikasi pati garut yang dapat dikembangkan lebih lanjut.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih kepada  DIKTI melalui program Hibah Bersaing, Sandwich-like dan Indofood Riset Nugraha 2008 yang telah  membiayai  penelitian  ini  juga  kepada  Prof.  Makoto Hisamatsu  dan  Dr.  Naoto  Isono  yang  telah  memberikan kesempatan  melakukan  penelitian  di Food  Chemistry
Derajat polimerisasi Alami Δ D is tr ibus i (%) Derajat polimerisasi Hidrolisis asam 2 jam Δ D is tr ibus i (%) Derajat polimerisasi Hidrolisis asam 2 jam + pemanasan pendinginan Δ D is tr ibus i (%) Pemotongan titik cabang 1,3 U/g pati + pemanasan pendinginan Derajat polimerisasi Δ D is tr ibus i (%) Pemotongan titik cabang 10,4 U/g pati + pemanasan pendinginan Derajat polimerisasi Δ D is tr ibus i (%) Derajat polimerisasi
Hidrolisis asam 2 jam + pemotongan titik cabang 1,3 U/g pati + pemanasan pendinginan
Δ D is tr ibus i (%)
Hidrolisis asam 2 jam + pemotongan titik cabang 10,4 U/g pati + pemanasan pendinginan Derajat polimerisasi Δ D is tr ibus i (%)
Laboratory,  Department  of  Sustainable  Resource  Science, Faculty of Bioresources , Mie University, Tsu-shi Jepang.

## DAFTAR PUSTAKA
Aparicio-Saguilan, Flores-Huicochea E, Tovar J, García-Suárez F,  Gutiérrez-Meraz  F,  Bello-Pérez  LA.  2005.  Resistant starch-rich  powders  prepared  by  autoclaving  of  native  and lintnerized  banana  starch:  partial  characterization. Starch/Starke 57: 405-412.
Champ  M.  2004.  Resistant  Starch.  In  Starch  in  Food. Woodhead  Publishing  Limited,  CEC  Press  LLC.  Boca Raton. USA.
Chung  HJ,  Liu  Q,  Hoover  R.  2009.  Impact  of  annealing  and heat-moisture  treatment  on  rapidly  digestible,  slowly digestible  and  resistant  starch  levels  in  native  and gelatinized corn, pea and lentil starches. Carbohydrate Poly- mers 75: 436-447.
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956.
Calorimetric method for determination of sugars and related substance. Anal.Chem. 28:350-356.
Franco  CML,  Cabrala  RAF,  Tavares  DQ.  2002.  Structural  and physicochemical  characteristics  of  lintnerized  native  and sour cassava starches. Starch/Stärke 54: 469–475.
Gonzales-Soto  RA,  Agama-Acevedo  E,  Solorza-Feria  J, Rendón-Villalobos  R,  Bello-Pérez  LA.  2004.  Resistant starch  made  from  banana  starch  by  autoclaving  and debranching. Starch/Stärke 56:495–499.
Gonzales-Soto RA, Mora-Escobedo R, Herna’ndez-Sa’nchez H, Sanchez-Rivera M,  Bello-Pe’rez LA. 2007. The influence of time and storage temperature on resistant starch formation from autoclaved debranched banana starch. Food Research International 40:304–310.
Hizukuri  S,  Takeda  Y,  Yasuda  M,  Suzuki  A.  1981.  Multi- branched nature of amylose and the action of debranching enzymes. Carbohydrates. Res 94:209-214.
Lehmann  U,  Rossler  C,  Schmiedl  D,  Jacobash  G.  2003. Production  and  physicochemical  characterization  of resistant  starch  type  3  derived  from  pea  starch. Food/Nahrung 47(1):60-63.
Leong YH, Karim AA, Norziah MH. 2007. Effect of pullulanase debranching  of  sago  ( Metroxylon  sagu )  strach  at subgelatinization  temperature  on  the  yield  of  resistant starch. Starch/Starke 59: 21-32.
Mahadevamma  MS,  Harish  KVP,  Tarathanan  RN.  2003. Resistant  starch  derived  from  processed  legumes: purification  and  structural  characterization. Journal  of Carbohydrate Polymers 54: 215-219
Miao  M,  Jiang  B,  Zhang  T.  2009.  Effect  of  pullulanase debranching  and  recrystallization  on  structure  and digestibility  of  waxy  maize  starch.  Carbohydrate  Polymers 76:214–221.
Mujoo  R,  Ali  SZ.1999.  Molecular  degradation  of  rice  starch during processing to flakes. Journal of the Science of Food and Agriculture 79:941-949.
Mun SH, Shin M. 2006. Mild hydrolysis of resistant starch from maize. Food Chemistry 96:115–121.
Mutungi C, Rosta F, Onyangob  C, Jarosa D,  Rohma H. 2009. Crystallinity,  ther-mal  and  morphological  characteristics  of resistant starch type III Produced by hydrothermal treatment of debranched cassava starch. Starch/Starke 61: 1-12.
Ozturk S, Koksel H, Kahraman  K. 2009. Effect of debranching and heat treatments on formation and functional properties of resistant starch from high-amylose corn starch. European Food Research and Technology 229(1) :1 15-125.
Pongjanta  J,  Utaipattanaceep  O,  Naivikul,  Piyachomkwan  K. 2009.  Effect  of  preheated  treatments  on  physicochemical physicochemical  properties  of  resistant  starch  type  iii  from pullulanase  hydrolysis  of  high  amylose  rice  KW  starch. American Journal of Food Technology 4(2):79-89.
Sajilata MG, Singhal RS, Kulkarni PR. 2006. Resistant starch-a review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 5:1-17.
Schmiedl  D,  Bauerlein  M,  Bengs  H,  Jacobasch  G.  2000. Production  of  heat-stable,  butyrogenic  resistant  starch. Carbohydrate Polymers 43: 183-193.
Singh V, Ali SZ. 2000. Acid degradation of starch. The effect of acid and starch type. Carbohydrate Polymers 41: 191–195.
Shu X Jia L, Gao J, Sing Y, Zhao H, Nakamura Y, Wu D. 2007.
The  influence  of  chain  length  of  amilopectin  on  resistant starch in rice ( Oryza sativa l). Starch/Starke 59 : 504-509 .
Slijestrom  M,  Elliason  AC,  Bjork  I.  1989.  Characterization  of resistant starch from autoclaved wheat starch. Starch/Starke 41(4): 147-151.
Sunarti TC, Nunome N, Yashio, Hisamatsu M. 2001. Study on outer chains from amilopectin between immobilized and free debranching enzymes.  Journal of Applied  Glycoscience 48 (1):1-10.
Srichuwong  S, Sunarti TC, Mishima T, Isono N, Hisamatsu M. 2005.  Starches  from  different  botanical  sources  I: Contribution  of  amylopectin  fine  structure  to  thermal properties and enzyme digestibility. Carbohydrate Polymers 60: 529-538.
Takeda Y, Guan HP, Preiss J, 1993. Branching of amylose by the  branching  isoenzymes  of  maize  endosperm. Carbohydrate Research 240:253–263.
Takeda Y, Hanashiro M. 2003. Examination of the structure of amylase  and  amylopectin  by  fluorescent  labeling  terminal. Journal of Applied Glycoscience 48: 123-130.
Tester RF, John K, Xin Q. 2004. Review. Starch—composition, fine  structure  and  architecture.  Journal  of  Cereal  Science 39:151–165.
Wang TL, Bogracheva TY, Hedley CL. 1998. Starch: As simple as A, B, C?. Journal of Experimental Botany 49:481-502.
Zhao  XH,  Lin  Y.  2009.  The  impact  of  coupled  acid  or pullulanase debranching on the formation of resistant starch from  maize  starch  with  autoclaving–cooling  cycles. European Food Research Technology 230(1):179–184.