KELANGSUNGAN HIDUP IKAN KOI ( Cyprinus carpio koi ) YANG TERINFEKSI KHV ( Koi Herpesvirus )
THE SURVIVAL OF KOI GOLDFISH ( Cyprinus carpio koi ) WHICH INFECTED BY KHV ( Koi Herpesvirus ) 1 2 3
Ninik Setyorini , Asmaul Khusnah  dan Lilia Widajatiningrum
1 Kepala Balai Pengembangan Budidaya Air Payau (BPBAP) Bangil
2 Analis Pengujian Virus pada Laboratorium Penguji BPBAP Bangil
3 Manajer Teknis Laboratorium Penguji BPBAP Bangil

## Abstract
The research aim to know the capability of survival life of the infected KHV koi fish that proved with PCR test. The research held from 2003 until 2008, with the methode took gill sample from the same fish every 4 months. Result of PCR showed positive KHV in each analysis during 4.5 years. According to the PCR test for KHV that conducted for 4.5 years showed that the result always positive in every test.
Key words : KHV, koi, PCR

## Pendahuluan
Koi  Herpesvirus (KHV)  adalah  penyakit yang  disebabkan  oleh  virus  yang  menyerang  ikan Koi ( Cyprinus carpio koi ) dan ikan Mas ( Cyprinus carpio ). Penyakit ini telah mewabah di Israel pada tahun 1998 dan di negara-negara lainnya seperti di Amerika, Eropa dan Asia (Gilad et al ., 2004). KHV di  Indonesia  dimulai  di  Blitar  Jawa  Timur  pada bulan Maret 2002 akibat masuknya ikan koi impor yang  membawa  virus  KHV,  adapun  tingkat kematiannya  bisa  mencapai      80  %  –  85  %  yang menyebabkan  kerugian  sekitar  5  milyar  rupiah. Penyakit ini menyerang populasi ikan koi dan ikan mas  dari  berbagai  umur  dan  ukuran  baik  yang dipelihara di kolam, danau maupun karamba jaring apung  (Sunarto et al ., 2004).
Mekanisme  serangan  virus  pada  tahapan pertama  terjadinya  infeksi  adalah  penyerangan ( attachment )  dimana  reseptor  mulai  mengenali virus tersebut pada lapisan membran plasma. Proses berikutnya  adalah  penetrasi  ( penetration )  yaitu masuknya  partikel  virus  kedalam  sel  inang  ( host ) selanjutnya  virus  akan  melepas  bagian  luar  yang melapisi  tubuhnya  ( uncoating )  untuk  masuk kedalam  membran  sel  atau  saluran  lisosom. Berikutnya  terjadi  proses  transcription  yaitu  virus mulai  membuat  rekaman  untuk  mRNA  yang selanjutnya  akan  diterjemahkan  sebagai  protein. Proses selanjutnya DNA virus akan memperbanyak diri  ( replication )  untuk  kemudian  membentuk virion dan apabila telah sempurna akan melepaskan diri  keluar  dari  sel  untuk  menginfeksi  sel  yang lainnya (Roberts, 1989).
Gejala  yang  ditimbulkan  oleh  serangan KHV  yaitu  (1)  produksi  lendir  ( mucus )  berlebih
sebagai  respon  fisiologis  terhadap  kehadiran patogen,  selanjutnya  produksi  lendir  menurun drastis sehingga tubuh ikan terasa kasat; (2) insang berwarna  pucat  dan  terdapat  bercak  putih  atau coklat  yang  sebenarnya  adalah  kematian  sel-sel insang  atau  “gill  necrosis”,  selanjutnya  menjadi rusak, geripis pada ujung tepi insang dan akhirnya membusuk.    Secara  mikroskopis  menunjukkan adanya  kerusakan  jaringan  yang  serius  serta k e m a t i a n   s e l   y a n g   b e r a t ;   ( 3 )   p e n d a r a h a n ( hemorrhage )  di  sekitar  pangkal  dan  ujung  sirip serta  permukaan  tubuh  lainnya;  (4)  sering  pula ditemukan adanya kulit yang melepuh atau bahkan luka  yang  diikuti  dengan  infeksi  sekunder  oleh bakteri, jamur dan parasit; (5) hati berwarna pucat, selanjutnya  menjadi  rusak;  (6)  ginjal  ( anterior  & posterior ) berwarna pucat. Kematian terjadi antara 1  –  5  hari  setelah  gejala  awal  dan  kematian mencapai 100 % dalam   waktu singkat yaitu 5 - 7 hari pada suhu air 22 – 27 °C (Hartman et al ., 2004). Organ  yang  menjadi  target  infeksi  KHV adalah  organ  insang,  ginjal,  otak  dan  hati  karena organ tersebut diduga memiliki prevalensi (populasi virus) lebih tinggi dibandingkan dengan jenis organ lainnya (Taukhid et al ., 2005).
Diagnosis penyakit KHV dapat dilakukan dengan  melihat  gejala  klinis,  secara  histopatologi, mikroskop elektron, isolasi virus dan yang sekarang ini  banyak  dilakukan  yaitu  dengan  teknologi  PCR ( Polymerase  Chain  Reaction ).  Teknik  PCR  untuk pengujian virus KHV saat ini telah digunakan lebih dari 10 laboratorium yang ada di Indonesia karena hasilnya dapat diketahui lebih cepat yaitu sekitar 5 (lima) jam, akurat dan tingkat sensitifitasnya tinggi. Kendala yang dihadapi selama ini dalam pengujian
virus KHV dengan teknik PCR adalah pengambilan sampel  yang  akan  digunakan  yaitu  berupa  lamella (lembaran  insang)  yang  berakibat  pada  kematian Koi  sehingga  tidak  dapat  dilakukan  upaya penanganan  berikutnya,  oleh  karena  itu  sebaiknya ada  alternatif  pengambilan  sampel  selain  insang.
Menurut Taukhid et  al .  (2005)  menyatakan  bahwa hingga kini belum ditemukan teknik sampling yang paling aman ( non-lethal sampling ) untuk diagnosa KHV dengan teknik PCR.

## Materi dan Metode Penelitian
Ikan Uji
Ikan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan koi terinfeksi KHV berasal dari Jepang yang dibawa oleh pihak Karantina ke laboratorium Penguji  BPBAP  Bangil  pada  tahun  2003.  Ikan  ini secara visual tidak menunjukkan gejala klinis KHV (kulit melepuh, ekses lendir, insang pucat dan putih kemudian membusuk).
Wadah penelitian dan pemeliharaan ikan uji Wadah penelitian berupa 3 akuarium kaca dengan berukuran 90 cm x 40 cm x 60 cm masing- masing  diisi  1(satu)  ekor  ikan  koi  yang  terinfeksi KHV  dan    dilengkapi  dengan  aerasi.  Akuarium ditempatkan  pada  ruang  tertutup  sehingga  suhu o dapat dipertahankan dengan kisaran  antara 27  C – o 29  C.
Penanganan ikan uji Selama  penelitian  ikan  koi  diberi  pakan berupa  pellet  dosis  5%  x  berat  badan  per  hari dengan frekwensi 2 kali sehari. Kualitas air dijaga dalam  kondisi  optimal  melalui  penyiponan  dan penggantian  air  dengan  jumlah  sesuai  kebutuhan. Untuk  keperluan  pengujian,  Ikan  koi    diambil sedikit  insang (bagian ujing) untuk diuji PCR KHV.
Setelah  ikan  uji  diambil  insangnya,  ikan  yang terluka  karena  pengguntingan  insang  dimasukkan pada  wadah  tersendiri  untuk  diberi  iodium  dan diaerasi  kuat  untuk  menyembuhkan  luka.  Setelah ikan  kembali  normal  dikembalikan  lagi  ke  tempat pemeliharaan / akuarium semula.
Ikan  uji  secara  berkala  4  bulan  sekali diambil  sebagian  insangnya  untuk  bahan  uji. Pembuktian  adanya  virus  pada  ikan  koi  dilakukan dengan  menggunakan  metode  PCR  KHV,  Insang diekstraksi  menggunakan  DTAB-CTAB  Solution (IQ  2000)  untuk  mendapatkan  pellet  DNA  dan menggunakan  primer  spesifik  menurut  Gray  et  al (2002)  yang  telah  dimodifikasi  oleh  Sunarto  et  al
( 2 0 0 2 ) .   K e m u d i a n   d i a m p l i f i k a s i   d e n g a n menggunakan  master  mix  (Promega).  Selanjutnya produk  PCR  dielektrophoresis  pada  gel  agarose, kemudian  perendaman  dalam  ethidium  bromide sehingga  dapat  diamati  di  atas  UV  dan  diabadikan dengan kamera digital.

## Alat dan Bahan
Disetting  set (gunting  +  pinset), glass ware , Mikropipet, tube, Mikrotube, tip mikropipet, penggerus,  sentrifuge,  Vortex,  timbangan  analitik, hot  plate, waterbath , thermalcycler , Encluser, elektrophoresis  horizontal,  UV  transilluminator, kamera digital.
D TA B   S o l u t i o n ,   C TA B   S o l u t i o n , Dissolving  Solution ,    Alkohol  95  %  dan  70  %,
Chloroform,  DEPC  ddH O,  primer  KHV  290  bp,
2 PCR Master Mix, Kontrol Positif KHV 290 bp, 6X Loading  Dye ,  DNA Marker 100  bp),  agarose, ethidium  bromide  (10  mg/ml),    larutan  TAE  (tris acetate), tris base , glacial acetic acid , EDTA 0,5 M (pH 8,0), akuades steril.

## Tahapan ekstraksi DNA
I n s a n g   d i g u n t i n g   s e b a n y a k   2 0   m g selanjutnya dimasukkan ke dalam test tube ukuran 2 ml  yang  didalamnya  sudah  dimasukkan  0.6 mLDTAB  Solution  dan  dihancurkan  hingga
o homogen.  Diinkubasikan  pada  suhu  75 C  pada waterbath  selama  5  menit.  Kemudian  didinginkan pada  suhu  ruang,  setelah  itu  vortex  sebentar  dan ditambahkan 0.7 ml Chloroform lalu vortex kembali selama  20  detik  dan  disentrifugasi  12000  rpm selama  5  menit.  Supernatan  dipindahkan  kedalam tube  baru    ukuran  2  ml  dan  ditambahkan  100    l CTAB  solution  dan  900    l  ddH2O,  lalu  divortex
o kemudian  diinkubasi  pada  suhu  75  C  selama  5 menit  pada  waterbath,setelah  itu  didinginkan  pada suhu  ruang  dan    disentrifugasi  pada  kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Kemudian supernayant dibuang,  lalu  pellet  dilarutkan  dengan  150    l Dissolve Solution. Lalu diinkubasikan pada suhu 75 o C  selama  5  menit.  Didinginkan  pada  suhu  ruang dan  sentrifugasi  dengan  kecepatan  12000  rpm selama 5 menit. Supernatant dipindahkan pada tube ukuran  0.5  ml  dan  ditambahkan  300      l    alkohol 95%,  kemudian  divortex    dan  disentrifugasi  pada kecepatan  12000  rpm  selama  5  menit,  kemudian alkohol dibuang, pellet dicuci dengan 200  l  alkohol 70%, lalu diputar pada kecepatan 10000 rpm selama 5  menit.  Alkohol  dibuang  dan  pellet  dikering anginkan  setelah  itu  larutkan  pellet  dengan  DEPC ddH2O  sebangak  50    l  .DNA  siap  digunakan,
apabila  tidak  langsung  digunakan  maka  harus disimpan pada  kondisi beku.

## Tahapan amplifikasi
Sebelum  mencampur  reagen,  pastikan reagen  dalam  keadaan  cair  (jangan  sampai  ada cairan  yang  menggumpal/beku)  yaitu  dengan  cara divortex.  Komposisi  larutan  PCR  untuk  deteksi KHV  (25    l/reaksi)  dibuat  dengan  mencampurkan bahan-bahan sebagai berikut :
Setelah  semua  bahan  dicampur  (kecuali template DNA), bagikan ke dalam mikrotube 0,2 ml dengan  volume  masing-masing  24  l.  Tambahkan template DNA, termasuk kontrol positif (dna positif KHV) dan kontrol negatif (ddH2O), masing-masing sebanyak 1  l.  Vortex sebentar sebelum dimasukkan ke  dalam    mesin  PCR  ( Thermalcycler )  .  Pastikan bahwa progam yang akan dijalankan adalah KHV.
Tabel 1. Suhu pada Themalcycler PCR
Tahapan elektrophoresis
Ta b u n g   y a n g   s u d a h   d i a m p l i f i k a s i disiapkan dan ditambahkan 5 l 6X Loading dye pada m a s i n g - m a s i n g   t a b u n g   d a n   m e n g g a n t i   t i p mikropipet  untuk  tiap-tiap  pengambilan  loading d y e .   L a r u t a n   d i c a m p u r   h i n g g a   h o m o g e n . Sebelumnya  gel  yang  sudah  dicetak  diletakkan  di atas tangki elektrophoresis lalu tangki diisi dengan larutan  TAE  1X  sebanyak  500  ml  (sampai  gel terendam).  produk  PCR  yang  sudah  dicampur d e n g a n l o a d i n g   d y e d i m a s u k k a n   d e n g a n mikropipiet ke dalam sumuran gel sebanyak 5 – 10 --L. Marker atau  penanda  DNA  yang  sudah diketahui  berat  molekulnya  (  848  bp,  630  bp,  333 bp)  juga  dimasukkan  sebanyak  5    l.  Marker diletakkan  di  awal  atau  di  akhir  deretan  sumuran gel.  Setelah  semua  sampel  disuntikkan  dalam sumuran, tutup electrophoresis dipasang dan listrik dihidupkan dengan voltage diatur 120 V selama  30 menit.
Tahapan pengamatan dan dokumentasi S e t e l a h   s e l e s a i   p r o s e s   d a l a m electrophoresis,  gel  diangkat  dari  electrophoresis. Selanjutnya gel direndam dalam larutan   Ethidium Bromide (EtBr) 0,05 % selama 4 menit. Setelah itu gel direndam dalam akuades steril selama 10 menit. Terakhir gel diamati di atas UV transilluminator dan dokumentasikan dengan kamera digital.
Pembacaan hasil
- Hasil positif  KHV  bila terlihat garis perpendaran pita DNA (band) dengan ukuran  290 bp.
- Hasil negatif bila tidak  terlihat  garis perpendaran pita DNA (band) pada 290 bp.
Jurnal Perikanan dan Kelautan Vol. 1, No. 2, November 2009 Ilmiah
Reaksi 0 Suhu( C) Waktu Jumlah Siklus

## Hasil dan Pembahasan
Tanggal Organ Kondisi Ikan Hasil Uji PCR 24 sep 03 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV 5. Sampel (Ak.2) Positif KHV 1      2     3   4     5   6       6. Sampel (Ak.3) Positif KHV 14 Jan 04 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV
1       2     3       4
1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.2) Positif KHV
1       2       3       4
1. Marker 100 bp
2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.3) Positif KHV 1      2        3        4 12 Mei 04 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV
1    2    3   4   4
1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.2) Positif KHV
1     2      3     4    4
1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.3) Positif KHV 1     2    3            4 15 Sep 04 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV
1   2    3    4     4
Tabel 2. Hasil uji PCR untuk masing-masing sampel ikan koi
17 Jan 05 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Kontrol Positif KHV 290 bp 2. Kontrol Negatif 3. Sampel (Ak.1) Positif KHV 1       2       3               4 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.2) Positif KHV
1  2  3                 4
1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 1     2     3     4               4. Sampel (Ak.3) Positif KHV 1      2        3    4 15 Mei 05 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV
1     2        3         4
1. Marker 100 bp
2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.2) Positif KHV
1       2   3        4
1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.3) Positif KHV 1       2      3    4 15 Sep 05 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV
1       2        3     4
1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.2) Positif KHV
1       2       3     4
1. Kontrol positif KHV 290 bp
2. Kontrol negatif
3. Sample (AK.3) Positif KHV
15 Jan 06 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV
1       2      3      4
1. Marker 100 bp
2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.2) Positif KHV
1       2       3      4
1. Marker 100 bp
2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.3) Positif KHV 1       2    3      4 15 Mei 06 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV
1      2       3     4
1. Marker 100 bp
2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.2) Positif KHV
1       2             3     4
1. Kontrol Positif KHV 290 bp 2. Kontrol Negatif 3. Sampel (Ak.3) Positif KHV 1        2           3 15 Sep 06 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV
1   2  3                   4    4
1. Kontrol Positif KHV 290 bp
2. Kontrol Negatif
3. Sampel (Ak.2) Positif KHV
1      2          3
1. Marker 100 bp
2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.3) Positif KHV
1    2     3   4
Kelangsungan Hidup Ikan Koi ......
Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan Vol. 1, No. 2, 2009 November 15 Jan 07 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV
1    2       3    4
1. Marker 100 bp
2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.2) Positif KHV
1     2        3       4
1. Kontrol Positif KHV 290 bp 2. Kontrol Negatif 3. Sampel (Ak.3) Positif KHV 1     2                  3 15 Mei 07 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Kontrol Positif KHV 290 bp 2. Kontrol Negatif 3. Sampel (Ak.1) Positif KHV 1            2      3 1. Marker 100 bp
2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak2) Positif KHV
1    2   3    4
1. Marker 100 bp
2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.3) Positif KHV 1    2   3    4 15 Sep 07 insang Ikan tidak menunjukkan gejala klinis KHV 1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp 3. Kontrol Negatif 4. Sampel (Ak.1) Positif KHV
1      2    3    4
1. Marker 100 bp 2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.2) Positif KHV
1   2     3         4
1. Marker 100 bp
2. Kontrol Positif KHV 290 bp
3. Kontrol Negatif
4. Sampel (Ak.3) Positif KHV
1   2     3          4
Dari  hasil  diatas  menunjukkan  bahwa ketiga ekor ikan koi uji sejak awal penelitian tgl 24 September 2003 hingga akhir penelitian  pada tgl 15 Februari 2008  menunjukkan positif terinfeksi KHV meskipun  secara  visual  tidak  menunjukkan  gejala klinis.

## Kesimpulan
Pada  kondisi  kualitas  air  optimal (terkontrol)  dengan  perlakukan  pemberian  pakan pellet  yang  teratur  ikan  koi  yang  terinfeksi  KHV mampu  bertahan  hidup  selama    4,5  tahun  bahkan mungkin lebih.
Ikan  koi  terinfeksi  KHV  tidak  selalu menunjukkan  gejala  klinis  KHV  (kulit  melepuh, ekses  lendir,  insang  pucat  dan  putih  kemudian membusuk).
Tetap waspada dengan KHV, karena ikan koi yang telah terinfeksi KHV dapat bersifat carier tetapi secara fisik tidak menampakkan gejala klinis, sehingga dapat menularkan penyakit KHV pada ikan lain dan keturunannya.

## Daftar Pustaka
Gray, W.L., Mullis, L., LaPatra, S.E., Groff. J.M. and Goodwin,  A.  2002.  Detection  of  Koi Herpesvirus DNA in Tissues of Infected Fish, Journal of Fish Diseases. 25:171-178.
Hartman, K. H., Yanong, R.P.E, Petty, B.D, Floyd,
R.F,  and  Riggs,  A.C.  2004.  Koi  Herpesvirus (KHV)  Disease,  Journal  KHV-PCR/  Koi Herpesvirus (KHV) Disease.
Roberts, R.J. 1989. Fish Patology.   Second Edition. Wyvern Typesetting Ltd, Bristol British.
Sunarto, A. Rukyani, A., Cameron, A., Reantaso, M. dan Subasinghe, R. 2004. Outbreak of Disease Causing  Mass  Moratlity  in  Koi  and  Common Carp  (Cyprinus  carpio)  in  Indonesia.paper presented in the international Workshop on Koi Herpesvirus, 12 – 13 February 2004, London, England.
Taukhid,  A.,  Komarudin,  O.,  Supriyadi,  H.  dan Bastiawan,  D.  2005.  Strategi  Pengendalian Penyakit  pada  Budidaya  Ikan  Air  Tawar. Kumpulan  Makalah  Strategi  Pengelolaan  dan Pengendalian  Penyakit  KHV.  Pusat  Riset Perikanan Budidaya. Jakarta.
Kelangsungan Hidup Ikan Koi ......
15 Peb 08 insang Insang tampak putih dan mengeluarka banyak lendir 1. Kontrol Positif KHV 290 bp 2. Kontrol Negatif 3. Sampel (Ak.1) Positif KHV 4. Sampel (Ak.2) Positif KHV 1          2    3    4     5    5. Sampel (Ak.3) Positif KHV
Feb