Studi Agronomis Tanaman Padi ( Oryza sativa L.) Hasil Ko-Kultivasi Beberapa Strain Agrobacterium tumefaciens

## Pupita Deswina dan Inez H.Slamet-Loedin
Pusat Penelitian Bioteknologi - Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor
Diterima September 2010 disetujui untuk diterbitkan Januari 2011

## Abstract
The transgenic rice of Cisadane and Rajalele cultivars (cv) was obtained by co-cultivation of rice callus by 4 strain Agrobacterium tumefaciens containing 4 different binary vector (pIG 121 Hm, pCAMBIA 1301, pTOK 233 and pMOG22 BarGus). The transgenic plantlets were acclimatized and grown in the growth chamber to investigate their agronomic characteristic in comparison to control plants.  The  results  showed  that  there  was  no  difference  in  the  number  of  spikelet  and seeds/spikelet  among  different  transgenic  lines  co-cultivated  by  different  strains.  The  number  of seed/spikelet of transgenic rice cv. Rojolele and Cisadane compared to their control did not show significant difference. However, the total number of spikelet was different only for cv. Rojolele.
Key words: Co-cultivation, Agrobacterium tumefaciens, transgenic, transformation, agronomic characters

## Pendahuluan
Tanaman  padi  ( Oryza  sativa L.)  merupakan  bahan  makanan  yang  menghasilkan beras  dan  makanan  pokok  bagi  sebagian  besar  penduduk  Indonesia.  Konsumsi  beras penduduk di Indonesia mencapai 139 kg per orang per tahun (tertinggi dunia) jauh di atas rata-rata konsumsi beras dunia sebesar 60 kg per orang per tahun. Di samping rasanya yang enak, beras juga mudah diolah dan nilai energi yang terkandung didalamnya cukup tinggi.  Kandungan  zat  gizi  utama  dalam  beras  adalah  karbohidrat,  tetapi  yang  paling banyak  dalam  bentuk  pati  80-85%,  selain  itu  dalam  beras  juga  terdapat  kandungan protein (FAO, 2009).
Berbagai upaya telah dilakukan untuk meningkatkan kualitas dan kuantitas tanaman padi  mulai  dari  paket  teknologi  sederhana  sampai  pada  teknologi  rekombinan  DNA. Dengan  semakin  berkembangnya  teknologi  rekayasa  genetika,  kemajuan  di  bidang  ini telah berhasil melengkapi hasil-hasil dari pemuliaan tanaman. Teknologi transfer genetika saat  ini  menjadi  salah  satu  teknik  dasar  utama  yang  diperlukan  dalam  bebagai  aplikasi ilmu  biologi.  Salah  satu  teknik  transformasi  genetik  yang  telah  berhasil  pada  tanaman padi ialah teknik melalui Agrobacterium .
Teknik  introduksi  dengan  cara  menyisipkan  gen  asing  pada  plasmid  DNA dari bakteri Agrobacterium tumefacius memiliki keuntungan bahwa umumnya integrasi bersifat tunggal  atau  sederhana  dan  efisieni  transformasi  lebih  tinggi.  Disamping  itu,  teknik  ini relatif  lebih  mudah  untuk  diterapkan  dan  lebih  ekonomis.  Namun  demikian,  bakteri tersebut  secara  alami  hanya  menginfeksi  kelompok  tanaman  dikotil,  sehingga penggunaannya  untuk  tanaman  monokotil  memerlukan  suatu  upaya  dan  rekayasa  lebih lanjut (Slamet – Loedin, 1994).
Keberhasilan  transformasi  tanaman  monokotil  masih  sangat  terbatas.  Hiei et  al . (1994)  telah  berhasil  mentransformasi  padi  dengan  menggunakan Agrobacterium tumafeciens , tetapi keberhasilannya terbatas pada padi kelompok japonica yang banyak ditanam  di  daerah  sub  tropis.  Kelompok  ini  telah  diketahui  lebih  responsif  terhadap perlakuan kultur jaringan, sedangkan varietas–varietas padi di Indonesia termasuk dalam kelompok yang lebih rekalsitran yang disebut dengan kelompok padi javanica dan indica.
Pada  awal  perkembangannya  teknik  transformasi  yang  berhasil  digunakan  pada padi  ialah  teknik  protoplas.  Datta et  al .  (1992)  melaporkan  keberhasilan  transformasi  IR 72  dengan  teknik  protoplas,  tetapi  tanaman  dari percobaan  tersebut  bersifat  steril  (pers.
comm.).  Keuntungan  dari  sistem  transformasi  dengan Agrobacterium  tumefaciens ,  ialah tahapan  kultur  jaringannya  lebih  sedikit,  integrasi  gen  bersifat  sederhana  (satu  atau sedikit  salinan  gen),  relatif  lebih  ekonomis  dan  lebih  reprodusible.  Pada  penelitian  ini, tingkat produksi tanaman hasil transformasi Agrobacterium yang diperoleh dibandingkan dengan  tanaman  kontrol  untuk  mengetahui  pengaruh  transformasi  pada  fertilitas tanaman.

## Materi dan Metode
Kalus  yang  telah  diinfeksi  ditanam  pada  media  MS  dengan  tambahan  50  mg/1 hygromicin selama 2 minggu. Kalus yang tumbuh pada media seleksi yang mengandung hygromicin diregenerasikan pada media yang mengandung 0,3 mg/1 BAP dan 0,5 mg/1 IAA. Planet yang diperoleh ditransfer ke media MS.
DNA diisolasi dari planlet tanaman transgenik dan diuji dengan teknik PCR dengan menggunakan  primer  hpt  5’–GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3’  dan  5’  – GCACTCCCCGCCTGCAC-3’
Planlet yang dihasilkan diseleksi dan dikeluarkan dari dalam botol dengan hati-hati dan  ditanam  dalam  media  tanah  steril  pada  pot  plastik  yang  ditutup  dengan  sungkup plastik selama 7 - 15 hari di dalam ‘ruang tumbuh’. Plastik secara berkala dilubangi pada hari ke-10, 12, 15 sebelum diangkat seluruhnya. Selanjutnya, tanaman dipindah ke ember dengan  diameter  30  cm.  Tanaman  dipelihara  dan  disiram  secara  teratur  dan  diamati pertumbuhannya sampai tanaman berproduksi dan menghasilkan benih.
Pemupukan  dilakukan  dua  kali  dengan  pemberian  pupuk  NPK  sebanyak  5  g/pot. Pemupukan  pertama  dimulai  15  hari  setelah  tanaman  dipindah  ke  ‘ruang-tumbuh’  dan pemupukan kedua pada saat pembentukan primordial (bakal malai) dimulai.

## Hasil dan Pembahasan
Keberhasilan  ko-kultivasi  tanaman  padi  indica  dan  javanica  Indonesia  dengan menggunakan Agrobacterium  tumefaciens telah  dilaporkan  oleh  Slamet-Loedin et  al. (1994 dan 1996). Rangkuman hasil regenerasi dan aklimatisasi tanaman transgenik yang telah  diperoleh  dari  berbagai  ko-kultivasi  dapat  dilihat  pada  tabel  1.  Secara  rata-rata, kultivar  Rojolele  memiliki  tingkat  regenerasi  yang  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan kultivar Cisadane. Tingginya regenerasi tanaman kultivar Rojolele dibandingkan Cisadane diduga karena Rojolele berasal dari kelompok varietas javanica yang secara genetik lebih dekat dengan  japonica, sedangkan Cisadane berasal dari kelompok indica. Studi tentang kelompok  javanica  masih  sangat  terbatas,  tetapi  telah  diketahui  bahwa  varietas  dari kelompok  japonica  jauh  lebih  responsif  terhadap  perlakuan  kultur  jaringan  maupun transformasi  tanaman dibandingkan  dengan  kelompok  indica  (Christou, 1994).  Kesulitan yang  sering  dialami  dari  transformasi  padi  kelompok  indica  adalah pencoklatan  jaringan (browning) setelah perlakuan dengan antibiotik, sehingga jumlah kalus yang beregenerasi sangat  sedikit.  Keberadaan  gen  penanda  (marker  gene)  dalam  setiap  transformasi tanaman  sangat  diperlukan  sebagai  indikasi  keberadaan  gen  target  didalam  jaringan (Brasileiro, 2001)
Oka  (1964)  menyatakan bahwa  javanica adalah tropical  japonica.  Pengelompokan yang  dilakukan  oleh  Glaszmann et  al .  (1987)  berdasarkan  hasil  analisis  isoenzim memasukan  varietas-varietas  indica  pada  kelompok  1  dan  2,  japonica  pada  kelompok  6 dan javanica pada kelompok 5.
Setiap  satu  kalus  yang  mampu  beregenerasi  umumnya  diperoleh  lebih  dari  satu planlet.  Sebagian  planlet  dari  setiap  perlakuan  diaklamatisasi  untuk  ditumbuhkan  lebih lanjut di ruang tumbuh. Persentase keberhasilan aklimatisasi yang disajikan pada Tabel 1 menunjukkan  bahwa  keberhasilan  berkisar  antara  38  -  100%.  Rendahnya  keberhasilan aklimatisasi  pada  beberapa  varietas  karena  perakaran  yang  dihasilkan  tidak  seluruhnya berkembang  dengan  baik  dan  keterbatasan  tempat,  sehingga  tanaman  terlambat dipindahkan  dari  botol.  Kemungkinan  perlu  dilakukan  kultur  air  lebih  dahulu  untuk mengembangkan  perakaran  tanaman.  Pada  percobaan  pendahuluan  telah  dilakukan
teknik  aklimatisasi  seperti  yang  dikembangkan  di  IRRI  dengan  menggunakan  media Yoshida, namun terjadi kontaminasi jamur.
Tabel 1. Persentase regenerasi kalus dan keberhasilan aklimatisasi tanaman  transgenik hasil ko-kultivasi beberapa strain Agrobacterium
Table 1. The  percentage  of  callus  regeneration  and  acclimatization  of  transgenic  plants resulted from various Agrobacterium strains co-cultivation Varietas Strain Agrobacterium Jumlah kalus resisten Persentase kalus yang beregenerasi Persentase keberhasilan aklimatisasi Rojolele PIG 121 Hm 19 10.0 48 PCAMBIA 1301 10 40,0 100 PTOK 233 20 30,0 100 PMOGBarGus 10 30,0 68 Cisadane  PIG 121 Hm 20 10,0 67 PCAMBIA 1301 29 10,0 38 PMOGBarGus 20 20,0 50 IR 64 PIG 121 Hm 27 11,1 67 PCAMBIA 1301 30 3,3 100 PMOGBarGus 28 0 0
Hasil  pengamatan  terhadap  produksi  gabah  isi,  gabah  hampa  dan  jumlah  malai yang dihasilkan tanaman padi transgenik kultivar Rojolele dan Cisadane yang telah di ko- kultivasi dengan beberapa strain Agrobacterium yang berbeda dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Rata-rata jumlah gabah dan malai yang di hasilkan tanaman transgenik hasil ko- kultivasi dengan beberapa strain Agrobacterium yang berbeda
Table 2. The  mean  of  grains  and  stems  of  transgenic  plants  resulted  from  various Agrobacterium strains co-cultivation Varietas Strain Agrobacterium Rata-rata jumlah gabah isi/malai Rata-rata jumlah gabah hampa/malai Jumlah malai rata- rata/tanaman Rojolele Kontrol 67,2 ± 16 23,6 ± 8,1 14 ± 2 PIG 121 Hm 53,4 ± 13,7 54,2 ± 19,5 9 ± 2 PCAMBIA 1301 64,7 ± 19,7 9,7 ± 5,8 7 ± 0 PTOK 233 43,2  ± 22,6 7,3 ± 5,3 8 ± 1 PMOGBarGus 82,7  ± 33,3 14,6 ± 4,3 7 ± 1 Cisadane Kontrol 88,1 ± 5,5 21,1 ± 12,9 11± 2 PIG 121 Hm 94,3 ± 23,4 61,0 ± 23,7 8 ± 1 PCAMBIA 1301 84,9 ± 26,9 74,1 ± 24,2 8 ± 0
Produksi gabah yang dihasilkan oleh tanaman transgenik hasil ko-kultivasi tersebut diatas,  varietas  IR  64  dan  Cisadane  pMOGBarGus  yang  semula  berhasil  diaklimatisasi, kemudian  mati  karena  terserang  jamur,  sehingga  yang  bisa  diamati  dan  dihitung produksinya  adalah  kultivar  Rojolele  yang  diinfeksi  oleh  4  strain  berbeda  dan  Cisadane oleh 2 strain bakteri yang berbeda.
Jumlah rata-rata gabah isi terbanyak diperoleh dari varietas Cisadane yang diinfeksi dengan bakteri strain p IG 121 Hm sebesar 94,3  ±  23,4, sedangkan jumlah yang paling sedikit  adalah  varietas  Rojolele dengan  bakteri  strain  p TOK 233  sebesar  43,2    ±    22,6. Besarnya standar deviasi dari benih yang diperoleh pada malai berbeda mengakibatkan tidak  berbeda  nyatanya  seluruh  perlakuan,  tetapi  untuk  rata-rata  jumlah  gabah  hampa yang  paling  sedikit  juga  diperoleh  dari  varietas  Rojolele  dengan  strain  p TOK 233 sebanyak 7,3  ±  5,3 buah.
Apabila  dibandingkan  dengan  perlakuan  kontrol,  nampak  jumlah  gabah  yang dihasilkan  baik  gabah  isi  maupun  gabah  hampa  tidak  berbeda  nyata,  sedangkan persentase gabah isi yang didapat berkisar antara 50 - 87 % dan gabah hampa antara 13 - 50 % (Tabel 3, Gambar 1).
Gambar 1. Presentase gabah isi dan hampa kultivar Cisadane dan Rajalele Figure 1. The percentage of grains of Cisadane and Rajalele cultivars
Salah satu produksi padi ditentukan oleh jumlah malai per rumpun dan persentase gabah  isi  (Deptan,  1977).  Dilihat  dari  jumlah  malai  yang  dihasilkan  antar  tanaman transgenik hasil ko-kultivasi vector berbeda, tidak nampak perbedaan nyata, tetapi apabila dibandingkan  dengan  kontrol  (14  ±  2  malai)  jumlah  malai  yang  dihasilkan  lebih  sedikit. Jumlah malai/tanaman untuk kultivar Rojolele kontrol dan transgenik terdapat perbedaan. Malai  yang  di  hasilkan  oleh  tanaman  transgenik  Rojolele  lebih  sedikit  dibandingkan dengan kontrol, sedangkan pada kultivar Cisadane antara tanaman transgenik dan kontrol tidak  terdapat  perbedaan  nyata.  Secara  umum,  tanaman  transgenik  yang  diperoleh bersifat  fertil,  introduksi  gen  penanda  dan  penyeleksi  tidak  mempengaruhi  karakter agronomis  dari  tanaman  padi.  Padi  dapat  dijadikan  sebagai  sistem  model  dari  riset genomik saat ini, karena ukuran genom padi lebih kecil (Zhang & Wu, 1988).
Tabel 3. Persentase gabah yang dihasilkan tanaman transgenik hasil ko-kultivasi  dengan strain Agrobacterium yang berbeda.
Table 3. The  percentage  of  grains  resulted  from  transgenic  plants  of  various Agrobacterium strains co-cultivation
Perlakuan Persentase Gabah( % ) Kultivar Plasmid gabah isi gabah hampa Rajalele Kontrol 74 26 pIG 121Hm 50 50 pCAMBIA 1301 87 13 pTOK 233 86 14 pMOG BarGus 85 15 Cisadane Kontrol 81 19 pIG 121Hm 61 39 pCAMBIA 1301 53 47
Dari  tanaman-tanaman  yang  berhasil  diaklimatisasi  diseleksi  dua  tanaman transgenik independen yang telah diuji terlebih dahulu dengan analisis PCR. Hasil analisis PCR  pada  keduanya  menunjukkan  bahwa  tanaman-tanaman  tersebut  adalah  tanaman transgenik yang mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik higromisin. Hasil analisis PCR dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Analisis PCR menggunakan primer hpt Figure 2. PCR analysis using hpt primer
Keterangan: a     maker Hind III 5-6   Rajalele (pTOK 233) b     control (+) 7-8   Rajalele (pMOGBarGu) c-d  control (-) 9-10 Cisadane (pIG 121) 1-2  Rajalele (pIG 121Hm) 11-12  Cisadane (pCamb 130)
3-4  Rajalele (pCamb 1301)

## Kesimpulan
Hasil studi agronomis terhadap tanaman padi transgenik hasil ko-kultivasi beberapa strain  yang  berbeda  ini  menunjukkan  bahwa  persentase    keberhasilan  aklimatisasi berkisar antara 38 - 100%, sedangkan jumlah rata-rata gabah isi terbanyak diperoleh dari varietas Cisadane yang diinfeksi dengan bakteri strain pIG 121 Hm sebesar 94,3 ± 23,4. Jumlah  yang  paling  sedikit  adalah  varietas  Rojolele  dengan  bakteri  strain  pTOK  233 sebesar  43,2  ±  22,6.  Besarnya  standar  deviasi  dari  benih  yang  diperoleh  pada  malai berbeda  mengakibatkan  tidak  berbeda  nyatanya  seluruh  perlakuan.  Jumlah malai/tanaman  untuk  kultivar  Rojolele  kontrol  dan  transgenik  terdapat  perbedaan.  Malai yang  dihasilkan  oleh  tanaman  transgenik  Rojolele  lebih  sedikit  dibandingkan  dengan kontrol,  sedangkan  antara  tanaman  transgenik  kultivar  Cisadane  dan  kontrol  tidak terdapat  perbedaan  nyata.  Penambahan  gen  asing  dalam  hal  ini  adalah  gen  penanda penyeleksi  gus  A  dan  higromisin  tidak  mempengaruhi  karakter  agronomis  dari  tanaman padi sesuai dengan yang diharapkan.

## Ucapan Terimakasih
Penulis  mengucapkan  terimakasih  atas  bantuan  teknis  dari  sdr.  D.  Purwaganda, S.Si, sdri. Yenny Andriyani dan Sri Indriyani beserta anggota group peneliti padi lainnya. Penelitian  ini  didanai  oleh  Riset  Unggulan  Terpadu  ( RUT  IV )  dan  The  Rockefeler Foundation.

## Daftar Pustaka
Brasileiro  ACM,.  Aragao  FJL.  2001.  Marker  genes  for in  vitro selection  of      transgenic plants. J Plant Biotech., 3 (3), 113-121
Christou, P., 1994.Genetic engineering of crop legumes and cereals. Current Status and Research Advances. Nedherlands.
Datta,  S.K.,  Datta  K., Soltanifar  N.,  Donn  G.,  and  Potryskus  I.,  1992.  Herbicide  resisten Indica  Rice  from  IRRI  breeding  line  IR  72  after  PEG-mediated  transformation  of protoplasts. Plant Mol. Biol., 20, 619 – 629.
Deptan.,  1977.  Pedoman  bercocok  tanam  padi,  palawija,  sayur-sayuran.  Departemen Pertanian. Badan Pengendali Bimas, Jakarta.
FAO. 2009. FAOSTAT database. (on line). http://faostat.fao.org.
Glaszmann.,  J.C.,  1987.  Isozymes  and  clasification  of  Asian  rice  varieties.  Theor.  Appl.
Genet., 74, 21 - 30.
Hiei,Y.,  Ohta,  S.,  Komari,  T.,  and  Kumashiro.,  T.,1994.  Efficient  transformation  of  rice ( Oryza sativa L.) analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal, 6, 271 - 282.
Oka.,  1964.  Pattern  of  interspecific  relationship  and  evolutionary  dynamics  in  Oryza. American–Elsevier Rice Genetics and Cytogenetics. New York.
Slamet – Loedin, Rahayu, I.H.,W., Hutajulu, S., dan Wibowo, L.J., 1994. Penggunaan dua strain Agrobacterium  tumafaciense super  virulen  untuk  ko-ultivasi  tanaman  padi kultivar Cisadane dan Rojolele. Pros. Kongres I dan Seminar Ilmiah PBPI.
Slamet  –  Loedin,  I.H.  ,  Rahayu,  W.  dan  Prana.,  M.S.,  1996.  Transformation  of  javanica rice  using Agrobacterium  tumefaciens. Proc.  Of  3 rd Asia  Pacific  Conference  on Agricultural Biotechnology : Issue and Choices. Philippine.
Zhang W and Wu R, 1988. Efficient regeneration of transgenic plants rice protoplasts and corretly regulated expression of the foreign gene in the plants. Theor Appl. Genet., 76, 835-840.