## Uji Aktivitas Bakteri Keratinolitik Sebagai Penghasil Biosurfaktan

## (Assay of Keratinolytic Bacterial Activity to Producing Biosurfactant)
Yayuk Putri Rahayu 1* , Healthy Aldriany Prasetyo 2
1* Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Nusantara Al-Washliyah, Jalan Garu II No. 93, Medan, 20147, Sumatera Utara, Indonesia
2 Program Studi Teknik Industri, Fakultas Teknik, Universitas Quality, Jl. Ngumban Surbakti No.18, Medan, 20132, Sumatera Utara, Indonesia
Email: yayukputri@umnaw.ac.id

## Abstract
The use of surfactants in various industries can cause problems in their use because it can  cause  environmental  pollution  because  it  is  difficult  to  decompose  (non- biodegradable). Based on this, it is necessary to find sources of surfactants that are safe for the environment such as biosurfactants derived from microorganisms, one of which is keratinolytic bacteria. The purpose of this study was to find biosurfactant-producing sources  of  keratinolytic  bacterial  isolates  using  oil  displacement  and  emulsification techniques. Biosurfactant activity testing techniques with the oil displacement method
were  carried  out  to  measure  the  oil  transfer  zone  to  obtain  the  value  of  the  oil  displacement  area  (ODA),  and  the emulsification method was carried out to determine the emulsification index value (IE24). The results of biosurfactant activity assay in each isolate of keratinolytic bacteria obtained a maximum ODA of 38.0 and 15.0 mm and EI24 of 20 and 15%. The biosurfactant activity obtained in the oil displacement test is in line with the results obtained in the emulsification  test.  The  results  of  this  study  it  can  be  concluded  that  keratinolytic  bacteria  are  able  to  produce biosurfactants even though their value is small
Keywords : biosurfactants, emulsification index, keratinolytic bacteria, oil displacement

## Abstrak
Penggunaan  surfaktan  dalam  berbagai  industri  dapat  menjadi  masalah  karena  dapat  menyebabkan  pencemaran lingkungan karena sifatnya yang sulit terurai ( non biodegradable ). Berdasarkan hal tersebut perlu mencari sumber surfaktan yang aman bagi lingkungan seperti biosurfaktan yang berasal dari mikroorganisme, salah satunya bakteri keratinolitik. Tujuan penelitian ini adalah untuk mencari sumber penghasil biosurfaktan dari isolat bakteri keratinolitik menggunakan  teknik  metode oil  displacement dan  emulsifikasi.  Teknik  pengujian  aktivitas  biosurfaktan  dengan metode oil  displacement dilakukan  untuk  mengukur  zona  perpindahan  minyak  untuk  mendapatkan  nilai oil displacement  area (ODA), dan  metode  emulsifikasi  dilakukan untuk  menentukan nilai  indeks  emulsifikasi (IE24). Hasil pengujian aktivitas biosurfaktan pada masing-masing isolat bakteri keratinolitik diperoleh nilai maksimal ODA sebesar  38.0  dan  15.0  mm  dan  EI24  sebesar  20  dan  15%.  Peningkatan  nilai  yang  diperoleh  pada  pengujian oil displacement relatif  sejalan  dengan  meningkatnya  nilai  yang  diperoleh  pada  pengujian  emulsifikasi.    Dari  hasil penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  bakteri  keratinolitik  mampu  menghasilkan  biosurfaktan  meskipun  nilainya kecil.
Kata kunci : bakteri keratinolitik, biosurfaktan, indeks emulsifikasi, oil displacement
Article Info: Received: 21 June 2020 Accepted:  27  August 2020
DOI: 10.33772/pharmauho.
v6i2.12533

## 1. Pendahuluan
Penggunaan  surfaktan  dalam  berbagai  industri dapat  menyebabkan  masalah  dalam  penggunaannya. Hal  ini  dikarenakan  surfaktan  dapat  menyebabkan pencemaran  lingkungan  karena  sifatnya  yang  sulit terurai atau bersifat non biodegradable . Sifat surfaktan yang  sulit  terurai  menyebabkan  perlunya  mencari sumber surfaktan yang aman bagi lingkungan seperti biosurfaktan.  Biosurfaktan  adalah  senyawa  aktif permukaan  yang  dapat  disintesis  oleh  mikroba, yang sifatnya  mampu  mereduksi  (menurunkan)  tegangan permukaan cairan, namun mudah terurai atau bersifat biodegradable sehingga ramah bagi lingkungan. Salah satu  manfaat  biosurfaktan  yaitu  dapat  digunakan sebagai  pengemulsi  agar  hidrokarbon  dapat  larut dalam  air  sehingga  dapat  digunakan  dalam  berbagai industri seperti industri  farmasi, obat-obatan, kosmetik, makanan, deterjen, formulasi herbisida dan pestisida [1].
Biosurfaktan  dapat  berasal  dari  mikroba  seperti bakteri [2]. Beberapa penelitian sebelumnya menyebutkan  bahwa  mikroorganisme  yang  dapat memproduksi  biosurfaktan  diantaranya: Bacillus subtillis A1  yang menghasilkan  biosurfaktan  sebagai pendegradasi  pencemaran  minyak  mentah  yang mencemari  lingkungan  [3], Achromobacter sp., Serratia sp., Sphingomonas sp.  dan Micrococcus sp. menghasilkan  biosurfaktan  yang  dapat  digunakan untuk Enhanced  Oil  Recovery ( EOR )  dalam meningkatkan perolehan minyak mentah [4] . Aplikasi biosurfaktan  juga  dapat  digunakan  dalam  bidang farmasi atau obat-obatan, berbagai industri perawatan tubuh, dan agen biologis. Hasil penelitian menyebutkan bahwa Pseudomonas aeruginosa ATCC-10145 menghasilkan biosurfaktan rhamnolipid yang memiliki aktivitas antimikroba terhadap berbagai spesies  bakteri  dan  jamur  sehingga  dapat  diterapkan sebagai  obat-obatan  atau  agen  biokontrol  [5]. Biosurfaktan jenis rhamnolipid yang berasal Pseudomonas aeruginosa dapat digunakan di berbagai industri seperti produk kimia, bahan tambahan untuk pengelolaan  lingkungan,  dan  agen  biologis.  Pada industri kosmetik dan perawatan kesehatan menggunakan  sejumlah  besar  biosurfaktan  untuk berbagai macam produk termasuk: penolak serangga, antasida,  jerawat,  produk  anti-ketombe,  caitan  lensa kontak,  pewarna  dan  produk  perawatan  rambut, deodoran, produk perawatan kuku, lipstik, eyeshadow, maskara, pasta gigi, pembersih gigi tiruan, antipespiran,  produk  bayi,  produk  perawatan  kaki, antiseptik,  produk  cukur  dan  obat  menghilangkan rambut,  dan  pelembab  [6].  Selain  itu,    biosurfaktan jenis  lainnya  seperti  surfactin  yang  berasal  dari Bacillus subtilis , dapat diaplikasikan untuk antivirus, antibiotik, antimikroba dan antifungi [7,8].
Bakteri  keratinolitik  merupakan  bakteri  yang mampu  mendegradasi  protein  keratin.  Keratin memiliki struktur berserat yang merupakan komponen utama dari bulu ayam, kuku, dan tanduk. Isolat bakteri keratinolitik diketahui memiliki potensi dalam aplikasi bioteknologi untuk proses yang melibatkan hidrolisis keratin,  agen  dehairing  pada  industri  penyamakan kulit, pupuk nitrogen, industri kosmetik dan deterjen. Jenis bakteri keratinolitik seperti Bacillus subtilis PF1 diketahui mampu memproduksi protease keratinolitik [9].
Skrining  biosurfaktan  dapat  dilakukan  dengan metode uji oil displacement dan metode emulsifikasi. Metode oil displacement digunakan untuk memperoleh diameter zona perpindahan minyak yang dicatat  sebagai  nilai oil  displacement  area (ODA), sedangkan  metode  emulsifikasi  digunakan  untuk mendapatkan lapisan emulsi pada larutan yang dicatat sebagai  nilai  indeks  emulsifikasi  (IE24)  [10]. Penggunaan  kedua  teknik  ini  dapat  digunakan  untuk menyeleksi  bakteri  potensial  penghasil  biosurfaktan (Youssef dkk, 2004) karena mudah dan praktis untuk dilakukan,  tidak  memerlukan  peralatan  khusus  dan hanya  membutuhkan  volume  sampel  yang  sedikit (Plaza  dkk,  2006)  [11.12].  Penelitian  ini  bertujuan untuk  menguji  potensi  bakteri  keratinolitik  sebagai penghasil biosurfaktan dengan  menggunakan metode oil  displacement dan  emulsifikasi.  Diharapkan  hasil penelitian  ini  dapat  menjadi  referensi  tambahan  bagi peneliti  selanjutnya  untuk  dapat  menjadikan  bakteri keratinolitik  menjadi  salah  satu  bakteri  yang  dapat menghasilkan biosurfaktan.

## 2. Metode
2.1 Isolat Bakter i
Bakteri  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah dua isolat bakteri keratinolitik yaitu PK09 dan LU04  yang  berasal  dari  koleksi  Laboratorium Mikrobiologi,  Departemen  Biologi  FMIPA  USU Medan,  Indonesia.  Stok  kultur  kedua  isolat diremajakan  pada  media  nutrient  agar  (NA), diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam.

## 2.2 Produksi Biosurfaktan
Kedua  isolat  bakteri  yang  telah  disubkultur kemudian dibuat suspensi bakteri dengan OD 600 = 0,5. Suspensi bakteri sebanyak 5 mL diinokulasi ke dalam 100  mL  media  produksi  yang  telah  dimodifikasi berupa  mineral  cair  untuk  pertumbuhan  yang  telah ditambahkan dengan minyak zaitun dengan komposisi:  pepton  0,2%;  NH 4 H 2 PO 4 0,1%;  NaCl 0,25%;  MgSO 4 .7H 2 O  0,04%;  CaCl 2 .2H 2 O  0,04  % (b/v); minyak zaitun 2,0% (v/v), dan air aquades steril [13].  Media  produksi  yang  sudah  dikultur  oleh suspensi bakteri kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C
dalam  inkubator  shaker Vision  Scientific  Co.Ltd . kecepatan 160 rpm selama 8 hari. Pertumbuhan sel dan aktivitas produksi biosurfaktan diamati setiap hari.

## 2.3 Pemanenan Produksi Biosurfaktan
Kultur  bakteri  dalam  media  produksi  dipanen setiap  hari  dan  dilakukan  pengujian  aktivitas biosurfaktan.  Pemanenan  dimulai  dari  hari  pertama hingga  hari  kedelapan.  Sampel  kultur  bakteri  yang telah  dipanen  kemudian  disentrifugasi  pada  mesin sentrifus Thermo Scientific dengan kecepatan 13.000 rpm  selama  10  menit  pada  suhu  4  °C  sehingga diperoleh  supernatan  yang  mengandung biosurfaktan bebas sel.

## 2.4 Uji Oil Displacement
Pengujian  aktivitas  biosurfaktan  menggunakan teknik oil  displacement dilakukan  dengan  cara mengisi  cawan  petri  dengan  aquades  steril  sebanyak 50  mL,  kemudian  di  atas  permukaan  aquades ditambahkan  minyak  zaitun  secara  perlahan-lahan sebanyak  100  μL.  Pengujian oil  displacement dilakukan dengan cara cairan supernatan biosurfaktan bebas sel  sebanyak 50 μL kemudian dituang ke  atas permukaan minyak zaitun. Terbentuknya zona jernih pada permukaan minyak menunjukkan positif adanya aktivitas  biosurfaktan.  Zona  jernih  ini  disebut oil displacement  area (ODA).  Besarnya  nilai  ODA dihitung  berdasarkan  besarnya  diameter  zona  jernih yang  terbentuk  pada  permukaan  minyak  zaitun. Kontrol negatif menggunakan air aquades steril (tanpa biosurfaktan).  Diameter  zona jernih  pada  permukaan minyak  diukur  dengan  tiga  replikasi  untuk  masing- masing isolat [14].

## 2.5 Pengukuran Indeks Emulsifikasi (IE24)
Pengujian  aktivitas  biosurfaktan  selanjutnya adalah  mengukur  indeks  emulsifikasi  (IE24)  dengan cara  melakukan  teknik  emulsifikasi  dari  aktivitas biosurfaktan.  Pengujian  emulsifikasi  biosurfaktan dilakukan  dengan  cara  mengisi  tabung  reaksi  yang berukuran kecil dengan minyak zaitun sebanyak 2 mL, kemudian ditambahkan cairan supernatan biosurfaktan bebas sel di atas minyak zaitun sebanyak 2  mL  (perbandingan  1:1).  Selanjutnya  tabung  reaksi divortex  dengan  alat  vortex Vision  Scientific  Co.Ltd . secara maksimal selama 2 menit hingga teremulsi atau tercampur  sempurna,  dan  kemudian  disimpan  pada suhu ruangan selama 24 jam. Setelah 24 jam dilakukan pengamatan  emulsi  antara  minyak  zaitun  dengan cairan  supernatan  biosurfaktan.  Jika  masih  terbentuk emulsi  antara  minyak  zaitun  dan  cairan  supernatan biosurfaktan maka dapat dinyatakan positif supernatan tersebut  mengandung  biosurfaktan.  Nilai  indeks
emulsifikasi  ditentukan  sebagai  persentase  tinggi lapisan  emulsi  dibagi  dengan  tinggi  total  larutan. Indeks Emulsifikasi (IE24) dihitung dengan persamaan  =  (Tinggi  Lapisan  Emulsi  x  100/Total Tinggi Larutan) [15].

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1. Uji Oil Displacement
Pengujian  aktivitas  biosurfaktan  dengan  teknik uji oil  displacement dilakukan  dengan  melihat perpindahan minyak dan menghasilkan zona perpindahan  yang  terbentuk  dipermukaan  minyak, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Terbentuknya  zona  jernih  menujukkan  adanya kandungan biosurfaktan pada supernatan. Nilai ODA pada  aktivitas  biosurfaktan  merupakan  salah  satu kriteria  untuk  mendukung  pemilihan  produsen biosurfaktan yang potensial dari mirkoba [1].
Gambar  1. Pengujian  aktivitas  biosurfaktan  dengan teknik oil  displacement. Tanda  panah menujukkan terbentuknya  zona  jernih  (ODA)  pada  permukaan lapisan minyak.
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  uji oil displacement (perpindahan  minyak)  positif  dengan terbentuknya  zona  jernih  disekitar  lapisan  minyak. Terbentuknya  zona  jernih  minyak  berbanding  lurus dengan adanya senyawa aktif permukaan biosurfaktan yang  terdapat  di  dalam  larutan  [14].  Nilai  hasil pengujian oil  displacement dari  kedua  isolat  dapat dilihat pada Tabel 1. dengan nilai zona jernih tertinggi masing-masing 15,0 mm untuk isolat  PK09 dan 38,0 mm untuk isolat LU04.
Tabel. 1 Nilai  ODA  isolat  bakteri PK09 dan LU04 Hari ke- Isolat PK09 Isolat LU04 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 6,5 7,5 7,8 8,0 8,5 9,0 10,0 15,0 0 10,5 26,0 32,0 38,0 34,2 32,5 30,5 29,0 Ket: ODA = Oil Displacement Area (mm)
3.2 Pengukuran Indeks Emulsifikasi (IE24)
Pengujian  aktivitas  biosurfaktan  menggunakan metode  emulsifikasi  dilakukan  dengan  mengukur indeks  emulsifikasi  (IE24)  dari  terbentuknya  emulsi pada  larutan.  Nilai  emulsifikasi  diperoleh  dari persentase tinggi lapisan emulsi dibagi dengan tinggi total larutan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2. Terbentuknya emulsi menujukkan adanya kandungan biosurfaktan pada supernatan. Nilai indeks emulsifikasi  pada  aktivitas  biosurfaktan  merupakan salah  satu  kriteria  yang  dilakukan  untuk  mendukung pemilihan  produsen  biosurfaktan  yang  potensial  dari mirkoba [11].
Gambar 2. P engujian aktivitas biosurfaktan dengan teknik  emulsifikasi.  Adanya  aktivitas  produksi biosurfaktan  ditunjukkan  dengan  terbentuknya lapisan emulsi.
Ket: A = tinggi emulsi
B = tinggi larutan
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dari uji emulsifikasi yang positif ditandai dengan terbentuknya lapisan emulsi pada larutan. Terbentuknya lapisan emulsi berbanding lurus dengan adanya  senyawa  aktif  permukaan  biosurfaktan  di dalam  larutan.  Nilai  indeks  emulsifikasi  (IE24)  dari kedua isolat yang diuji memberikan hasil positif (tabel 2). Nilai indeks emulsifikasi tertinggi masing-masing 15% untuk isolat PK09 dan 20% untuk isolat LU04.
Tabel. 2 Nilai indeks emulsifikasi (IE24) isolat bakteri
PK09 dan LU04 Hari ke- Isolat PK09 Isolat LU04 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2,0 4,0 6,0 6,0 8,0 10,0 10,0 15,0 0 4,0 8,0 14,0 20,0 19,0 18,0 17,0 17,0
Ket: IE24 = Indeks Emulsifikasi (%)
Nilai  indeks  emulsifkasi  merupakan  metode sederhana  yang  dapat  digunakan  untuk  menyeleksi mikroba penghasil biosurfaktan. Jika supernatan bebas sel  mampu  mengemulsi  hidrokarbon  yang  ada  pada
larutan maka dapat dipastikan mengandung biosurfaktan. Seperti penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya  bahwa  dengan  menggunakan  teknik emulsifikasi  diperoleh  nilai  nilai  indeks  emulsifikasi sebesar 87% pada Bacillus dan 15% pada E. coli yang menunjukkan  bahwa  adanya  aktivitas  produksi biosurfaktan [16].
Gambar 3. Grafik nilai oil displacement area (ODA) dan  indeks  emulsifikasi  (IE24)  dari  isolat  bakteri PK09 dan LU04
Gambar  3.  menujukkan  grafik  perolehan  nilai ODA dan IE24 pada kedua isolat bakteri. Grafik nilai ODA relatif sejalan untuk kedua isolat. Demikian juga dengan  nilai  indeks  emulsifikasi  pada  kedua  isolat bakteri.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pengujian oil displacement dan emulsifikasi dapat dijadikan pilihan untuk metode dalam mendeteksi produksi biosurfaktan  pada  bakteri.  Pada  studi  lain  juga digunakan  metode  pengujian oil  displacement dan emulsifikasi seperti perolehan zona jernih sebesar 24 mm  dan  indeks  emulsifikasi  sebesar  76%  untuk Bacillus subtilis A1. Adanya aktivitas dari perpindahan  minyak  dan  emulsifikasi  menunjukkan adanya  keberadaan  biosurfaktan  dalam  supernatan bebas sel [3].
Mikroorganisme menghasilkan senyawa
biosurfaktan untuk mengemulsi minyak atau hidrokarbon lainnya yang sulit teremulsi. Mikroorganisme mensintesis biosurfaktan untuk dapat mengemulsi senyawa yang tidak larut dalam air [17]. Biosurfaktan  dihasilkan  oleh  reaksi  metabolisme sekunder  dengan  fungsi  sel  adhesi  dan  motilitas, diferensiasi dan aksesibilitas ke substrat dan molekul penyimpanan karbon dan energi [18].
Adanya bagian polar dan non-polar dari molekul yang  terbentuk  pada  biosurfaktan  merupakan  sifat surfaktan yang dapat disintesis dari metabolisme lipid dan  karbohidrat  [17].  Mono  dan  digliserida  adalah biosurfaktan yang dapat dibentuk oleh aktivitas lipase yang  menghidrolisis  trigliserida.  Oleh  karena  itu komponen yang memiliki bagian polar dan non-polar yang sama menunjukkan bahwa biosurfaktan memiliki sifat aktif permukaan ( surface active ) [19].
Aktivitas biosurfaktan yang terjadi pada minyak di  dalam  air,  dimana  bagian  molekul  surfaktan  non- polar  yang  hidrofobik  berikatan  dengan  minyak  dan bagian polar yang hidrofilik berikatan dengan air [20]. Dengan Adanya kedua gugus hidrofilik dan hidrofobik membuat  biosurfaktan  menjadi  dapat  berinteraksi dengan  berbagai  jenis  hidrokarbon.  Bagian  lipid hidrofobik  membentuk  ekor  ( non-polar  tail )  pada molekul biosurfaktan hampir mirip pada semua jenis mikroba.  Bagian  polar  hidrofilik  ( polar  head )  pada molekul  biosurfaktan  digambarkan  seperti  kepala yang  merupakan  kelompok  beragam  yang  sebagian besar  terdiri  dari  berbagai  glycan,  protein,  dan  zat polimer lainnya dari mikroba.

## 4. Kesimpulan
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mencari sumber  penghasil  biosurfaktan  dari  isolat  bakteri keratinolitik  menggunakan  teknik  metode oil displacement dan  emulsifikasi.  Berdasarkan  hasil penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  kedua  isolat bakteri  keratinolitik  yang  diuji  memiliki  aktivitas biosurfaktan,  dan  dapat  dijadikan  sebagai  sumber referensi bahwa bakteri keratinolitik dapat menghasilkan senyawa biosurfaktan.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih kepada Universitas Muslim Nusantara  (UMN)  Al-Washliyah  atas  dukungan  dan bantuannya dalam pelaksanaan penelitian ini.

## Daftar Pustaka
[1] Shoeb,  E.,  Akhlaq,  F.,  Badar,  U.,  Akhter,  J., Imtiaz,  S.  2013.  Classification  and  industrial applications of biosurfactants. Academic Research International 4: 243–252.
[2] Tabatabaee,  A.,  Assadi,  M.  M.,  Noohi,  A.  A., Sajadian,  V.  A.  2005.  Isolation  of  Biosurfactant Producing Bacteria from Oil Reservoirs. Iranian J ENV Health Sci Eng , 2(1): 6-12.
[3] Parthipan,  P.,  Preetham,  E.,  Machuca,  L.  L., Rahman, P. K. S. M., Murugan, K., Rajasekar, A. 2017.  Biosurfactant  and  Degradative  Enzymes Mediated  Crude  Oil  Degradation  by  Bacterium
Bacillus  subtilis A1. Front.  Microbiol , 8:  193. Doi: 10.3389/fmicb.2017.00193.
[4] Ibrahim, M. L., Ijah, U. J. J., Manga, S. B., Bilbis, L.  S.,  Umar,  S.  2013.  Production  and  Partial Characterization  of  Biosurfactant  Produced  by Crude  Oil  Degrading  Bacteria. Int.  Biodeterior. Biodegrad , 81: 28-34.
[5] El-Sheshtawy,  H.  S.,  Doheim,  M.  M.  2014. Selection  of Pseudomonas  aeruginosa for Biosurfactant  Production  and  Studies  of  Its
Antimicrobial  Activity. Egyptian  Journal  of Petroleum , 23: 1-6.
[6] Maier, R., Soberon-Chavez, G. 2000. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis  and  potential  applications. Appl Microbiol Biotechnol ; 54: 625–33.
[7] Vollenbroich, D., Ozel, M., Vater, J. et al . 1997.
Mechanism  of  inactivation  of  enveloped  viruses by  the  biosurfactant  surfactin  from Bacillus subtilis . Biologicals ; 25: 289–97.
[8] Vollenbroich, D., Pauli, G., Ozel, M. et al . 1997. Antimycoplasma  properties  and  applications  in cell  culture  of  surfactin,  a  lipopeptide  antibiotic from Bacillus  subtilis . Appl  Environ  Microbiol ; 63: 44–9.
[9] Bhange,  K.,  Chaturvedi,  V.,  Bhatt,  R.  2016. Simultaneous  production  of  detergent  stable keratinolytic protease, amylase and biosurfactant by Bacillus  subtilis PF1  using  agro  industrial waste. Biotechnology Reports, 10: 94–104.
[10] Shoeb,  E.,  Ahmed,  N.,  Akhter,  J.,  Badar,  U., Siddiqui, K., Ansari, F. A., Waqar, M., Imtiaz, S., Akhtar,  N.,  Shaikh,  Q.  A.,  Baig,  R.,  Butt,  S., Khan,  S.,  Khan,  S.,  Hussain,  S.,  Ahmed,  B., Ansari, M. A. 2015. Screening and Characterization of Biosurfactant-Producing Bacteria Isolated from The Arabian Sea Coast of Karachi. Turk J Biol , 39: 210-216.
[11] Youssef,  N.  H.,  Duncan,  K.  E.,  Nagle,  D.  P., Savage,  K.  N.,  Knapp,  R.  M.,  McInerney,  M.  J. 2004.  Comparison  of  Methods  to  Detect
Biosurfactant Production by Diverse Microorganisms. J  Microbiol  Methods ,  56:  339- 347.
[12] Plaza,  G.,  Zjawiony,  I.,  Banat,  I.  2006.  Use  of Different Methods for Detection of Thermophilic Biosurfactant-Producing
Bacteria from
Hydrocarbon-Contaminated Bioremediated Soils. J Petro Science Eng , 50: 71-77.
[13] Saravanan,  V.  and  Vijayakumar,  S.  2012. Isolation and screening of biosurfactant producing microorganisms from oil contaminated soil. J. Acad. Indus. Res. Vol. 1(5).
[14] Morikawa, M., Diado, H., Takao, T., Murata, S., Shimonishi,  Y.,  Imanaka,  T.  1993.  A  new lipopeptide biosurfactant produced by Arthrobacter sp.  strain  MIS38. J  Bacteriol 175: 6459–6466.
[15] Asfora  Sarubbo,  L.,  Moura  de  Luna,  J.,  de Campos-Takaki,  G.  M.  2006.  Production  and stability  studies  of  the  bioemulsifier  obtained from a new strain of Candida glabrata UCP 1002. Electron J Biotechnol , 9: 4.
[16] Nayarisseri, A., Singh, P., and Singh, S. K. 2018. Screening,  Isolation  and  Characterization  of
Biosurfactant  Producing Bacillus  subtilis strain ANSKLAB03. Bioinformation , 14(6):304-314.
[17] Desai,  J.D.  and  Banat,  I.  M.  1997.  Microbial Production  of  Surfactant  and  Commercial
Potential. J. Microbiology and Molecular Review , 61: 47-64.
[18] Van  Hamme,  J.  D.,  Singh,  A.  and  Ward,  O.  P. 2006.  Physiological aspects – part 1 in a series of papers devoted to surfactants in microbiology and biotechnology. Biotechnol. Adv ., 24:604-620.
[19] Colla, L. M., Rizzardi, J., Pinto, M. H., Reinehr, C.  O.,  Bertolin,  T.  E.  and  Costa,  J.  A.  V.  2010. Simultaneous Production of Lipases and
Biosurfactants  by  Submerged  and  Solid-state Bioprocesses. Bioresource
Technology , 101:8308-8314.
[20] Santos,  D.  K.  F.,  Rufino,  R.  D.,  Luna,  J.  M., Santos, V. A., Sarubbo, L. A. 2016.
Biosurfactants:  Multifunctional  Biomolecules  of the 21st Century. Int. J. Mol. Sci , 17: 401.