ISSN: 2085-3653
http://jurnal.unimed.ac.id/2012/index.php/jpk
Kajian Ekspresi Gen Pretrombin-2 Manusia Sintetik pada Escherichia coli Secara In Silico Untuk Produksi Trombin Sebagai Komponen Lem Fibrin
Saronom Silaban 1* ; Iman Permana Maksum 2 ; Sutarya Enus 3 ; Khomaini Hasan 4 ; Toto Subroto 2 dan Soetijoso Soemitro 2
1 Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Negeri Medan, Medan
2 Laboratorium Biokimia, Departemen Kimia, Universitas Padjadjaran, Bandung 3 Pusat Mata Nasional, Rumah Sakit Mata Cicendo, Bandung 4 Pusat Penelitian Pangan, Kesehatan dan Obat, Institut Teknologi Bandung, Bandung *Korespondensi: saronomsilaban@unimed.ac.id
Abstrak. Pretrombin-2  merupakan  prekursor  trombin  dan  dapat  berperan  sebagai  komponen  lem fibrin  (LF).  LF  merupakan  biomaterial  perekat  yang  dapat  diaplikasikan  sebagai  pengganti  teknik jahitan  pasca  operasi.  Biomaterial  ini  terdiri  dari  trombin,  fibrinogen  dan  faktor  XIII  sebagai komponen  utamanya.  Dalam  LF,  trombin  rekombinan  berperan  sebagai  enzim  yang  mengubah fibrinogen  menjadi  fibrin  untuk  membentuk  benang-benang  fibrin  sehingga  luka  tertutup.  Kajian  ini bertujuan untuk memprediksi ekspresi gen pretrombin-2 (PT2) manusia sintetik pada Escherichia coli secara  in  silico.  Urutan  asam  amino  pretrombin-2  manusia  yang  diperoleh  dari  data  GeneBank dirubah  ke  dalam  bentuk  wild  type  urutan  nukleotida  menggunakan  software  OPTIMIZER  sesuai dengan kodon preferensi  E. coli K12, Selanjutnya dianalisis dengan  Graphical Codon Usage Analyzer dan dioptimasi secara menual berdasarkan preferensi kodon E. coli dari data Codon Usage Database. Untuk  memprediksi  tingkat  ekspresinya  pada  inang  E.  coli,  dipelajari  kajian  ekspresi  PT2  secara  in silico  menggunakan  perangkat  lunak  dalam  jaringan  OptimumGene TM .  Hasil  analisis  secara  in  silico urutan  nukleotida  PT2  hasil  optimasi  dan  wild  type  terhadap  kodon  preferensi  E.  coli  menunjukkan bahwa,  persentase  rata-rata  kandungan  GC  hasil  optimasi  sebesar  54,71%  sedangkan  wild  type 52,56%, PT2 hasil optimasi memiliki 100% kodon dengan frekuensi tinggi, sedangkan wild type hanya 67%,  dan  PT2  hasil  optimasi  memiliki  nilai  Codon  Adaptasi  Index    satu,  sedangkan  wild  type  hanya 0,89. Dengan demikian dapat diprediksi bahwa gen pretrombin-2 manusia sintetik kemungkinan akan diekspresikan tinggi di inang E. coli.
Kata kunci : pretrombin-2, trombin, kodon preferensi, kajian ekspresi, E. coli

## PENDAHULUAN
Lem  fibrin  (LF)  sebagai  bahan  bioadesif, tersusun  atas  fibrinogen,  trombin,  kalsium dan  faktor  XIII.  LF  memiliki  kemampuan untuk  merekatkan  dan  menutup  luka, sehingga  sangat  berpotensi  menggantikan teknik  jahitan.  Bahan  ini  dirancang  untuk menyerupai  tahap  akhir  koagulasi  dengan membentuk  bekuan  fibrin.  LF  digunakan sebagai bahan hemostatis yang menghentikan pendarahan  dari  celah  insisi,  matriks  untuk penyembuhan  luka  dan  perekat  jaringan (Spotnitz, 2001).
Saat  ini,  trombin  pada  LF  komersial umumnya  terbuat  dari  plasma  beku  segar sapi, yang dapat beresiko terjadinya kontaminasi  patogen.  Permasalahan  lain adalah  belum  ada  izin  khusus  dari Food  and Drug  Administration khusus  untuk  operasi mata,  terkait  transmisi  penyakit  karena
terbuat  dari  plasma  donor  (Enus  dkk.,  2011). Untuk membuat LF diperlukan sumber bahan yang lebih berlimpah dan lebih aman.
Penggunaan yang luas dari E. coli sebagai inang  dalam  produksi  protein  rekombinan disebabkan  oleh  sifatnya  yang  dapat  tumbuh cepat  dengan  siklus  hidup  pendek,  informasi dan  karakter  genom  yang  sudah  lengkap sehingga mudah dimanipulasi, biaya produksi relatif  murah,  tingkat  ekspresi  protein  target tinggi,  cepat,  dan  teknologinya  sudah  mapan (Cabrita et  al .,  2006).  Namun,  dibalik keuntungan yang disebutkan di atas, inang ini juga  memiliki  kelemahan,  seperti  bias penggunaan  kodon  (Sorensen  &  Mortensen, 2005),  dan  potensi  menghasilkan  protein agregat  kompleks  tidak  aktif  yang  lazim dikenal sebagai badan inklusi (Freydell et al ., 2007). Untuk  memprediksi  tingkat  keberhasilan ekspresi  protein  pada  inang Escherichia  coli ,
dapat  dipelajari  kajian  ekspresi  protein  pada E.  coli secara in  silico menggunakan perangkat lunak dalam jaringan
( OptimumGene TM ).  Kajian  ekspresi  secara in silico bertujuan sebagai prediksi awal ekspresi protein pada E. coli .

## BAHAN DAN METODE
Bahan dan alat Penelitian ini menggunakan bahan utama berupa urutan asam amino pengode pretrombin-2  (PT2)    manusia  yang  diperoleh dari  data GeneBank dengan  nomor  seri:
NM_000506.3  (http://ncbi.nih.gov/).  Untuk merubah  urutan  asam  amino  PT2  ke  dalam bentuk urutan nukleotida, digunakan Pangkalan data OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER) (Puigbo et al ., 2007). Urutan nukleotida PT2 dianalisis menggunakan perangkat lunak dalam jaringan Graphical  Codon  Usage  Analyzer ) (http://gcua.schoedl.de/)  (Mclnerney,  1998).
Sedangkan untuk memprediksi tingkat ekspresi  gen  PT2  sintetik  pada E.  coli digunakan  secara in  silico digunakan pangkalan data OptimumGene
TM (https://www.genscript.com /cgi-bin/tools/rare_codon_analysis).
Desain dan optimasi gen pengode pretrombin-2 manusia
Urutan  asam  amino  PT2  manusia  terdiri dari  308  residu  asam  amino  ( GeneBank : NM_000506.3). Urutan asam amino tersebut dirubah  ke  dalam  urutan  nukleotida  dengan perangkat lunak
OPTIMIZER yang disesuaikan  dengan  kodon  preferensi E.  coli K12.  Selanjutnya  dianalisis  dengan Graphical Codon Usage Analyzer (GCUA) dan dioptimasi secara menual berdasarkan
preferensi  kodon E.  coli yang  diperoleh  dari data Codon Usage Database .
Kajian ekspresi PT2 pada E. coli secara in silico Untuk  mengetahui  kisaran  persentase kandungan nukleotida GC, persentase distribusi  kodon,  dan  distribusi  frekuensi penggunaan  kodon, wild  type urutan nukleotida  PT2  dan  hasil  optimasi  dianalisis menggunakan pangkalan data OptimumGene TM (https://www.genscript.com /cgi-bin/tools/rare_codon_analysis).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Desain dan optimasi gen pengode pretrombin-2 manusia
Urutan  asam  amino  PT2  manusia  yang diperoleh  dari  data GeneBank telah  dirubah ke  dalam  urutan  nukleotida  menggunakan software OPTIMIZER. Urutan nukleotida PT2 manusia  yang  diperoleh  berukuran  924 pasang  basa  dan  selanjutnya  dianalisis menggunakan  perangkat  lunak  GCUA.  Hasil analisis GCUA penggunaan urutan kodon PT2 manusia  pada E.  coli menunjukkan  beberapa asam  amino  dikode  oleh  kodon-kodon  yang tidak menjadi preferensi bagi E. coli (Gambar 1). Terdapat sembilan jenis residu asam amino PT2  (149  asam  amino  keseluruhan)  dikode oleh  kodon  yang  tidak  preferens  (kesesuaian relatif  kurang  dari  100%).  Asam  amino  PT2 yang  dikode  oleh  kodon  yang  tidak  preferens bagi E.  coli berdasarkan  hasil  analisi  GCUA adalah  arginin/R  (cgt)  22,  asam  aspartat/D (gac)  19,  valin/V  (gtt)  17,  histidin/H  (cac)  5, isoleusin/I  (atc)  17,  serin/S  (tct)  18, fenilalanin/F  (ttc)  13,  glisin/G  (ggt)  26,  dan tirosin/Y (tac) 12.
Gambar  1. Analisis  GCUA wild  type urutan  nukleotida  PT2.  Asam  amino  PT2  dikode  oleh beberapa kodon dengan kesesuain relatif kurang dari 100%.
Kodon-kodon  PT2  manusia  yang  belum preferens,  dirubah  dengan  kodon E.  coli K12 pengode  asam  amino  yang  sama  dari  data GCUA  (Gambar  2).  Tujuan  pengubahan  ini adalah  agar  diperoleh  asam  amino  PT2 dengan kodon pengode yang preferens dengan E. coli (kesesuaian relatif 100%). Urutan asam
amino PT2 yang telah dioptimasi, selanjutnya dianalisis  kembali  menggunakan  perangkat lunak  GCUA,  hasil  analisis  menunjukkan bahwa semua asam amino PT2 manusia telah dikode oleh kodon-kodon yang preferens bagi E.  coli dengan  kesesuaian  relatif  100% (gambar tidak ditampilkan).
Gambar 2. Kodon E. coli K12 dari data GCUA. Pasangan kodon warna merah  adalah kodon manusia dan pasangan kodon warna biru adalah kodon E. coli .
Mengingat  inang  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  mikroorganisme E.  coli , artinya protein tertentu akan diekspresikan ke organisme lain (heterolog), sehingga memungkinkan  terjadinya  berbagai  masalah pada  ekspresi  protein.  Penelitian  sebelumnya melaporkan  bahwa,  gen-gen  manusia  yang banyak mengandung kodon jarang, tidak akan diekspresikan  secara  efisien,  dan  dapat menghambat  laju  translasi  (Gustafsson et  al ., 2004).  Optimasi  kodon  perlu  dilakukan karena pada wild type nukleotida PT2 banyak terdapat  kodon  yang  tidak  preferens  dengan genom inang. Xiong et al . (2008) menjelaskan bahwa  kodon  yang  jarang  diekspresikan, diotimasi  sehingga  kodon  diekspresikan dengan frekuensi tinggi.
Kajian ekspresi PT2 pada E. coli secara in silico
Untuk  memprediksi  ekspresi  PT2  pada inang E.  coli ,  dipelajari  kajian  ekspresi  PT2 pada  inang E.  coli secara in  silico menggunakan perangkat lunak dalam
jaringan  ( OptimumGene TM ).  Hasil  analisis secara in  silico wild  type urutan  nukleotida PT2  dan  hasil  optimasi  terhadap  kodon preferensi E.  coli menunjukkan  bahwa, persentase  rata-rata  kandungan  GC  pada urutan  nukletida  PT2  hasil  optimasi  adalah sebesar  54,71%,  sedangkan  persentase  rata- rata  kandungan  GC wild  type PT2  sebesar 52,56%  (Gambar  3).  PT2  hasil  optimasi memiliki 100% kodon yang digunakan dengan frekuensi  tinggi  (Gambar  4  dan  Gambar  5), sedangkan wild  type PT2  hanya  67%  kodon yang  frekuensi  penggunaannya  tinggi.  Hasil ini membuktikan bahwa optimasi kodon yang dilakukan  oleh  Silaban  dkk.  (2014)  dapat meningkatkan  penggunaan  kodon  sebesar 33% yang sering digunakan pada inang E. coli .
PT2 hasil optimasi tidak memiliki kodon yang digunakan dengan frekuensi rendah, sedangkan wild type PT2 memiliki 5% kodon dengan  frekuensi  rendah.  PT2  hasil  optimasi memiliki  nilai Codon  Adaptasi  Index (CAI) satu, sedangkan nilai CAI wild type PT2 hanya 0,89 (Gambar 5).
Gambar  3. Perbandingan  kisaran  persentase  kandungan  nukleotida  GC.  (A)  Kisaran persentase  kandungan  nukleotida  GC  pada wild  type PT2  dengan  kandungan GC  rata-rata  52,56%;  (B)  Kisaran  persentase  kandungan  nukleotida  GC  pada PT2 hasil optimasi dengan kandungan GC rata-rata 54,7.
Gambar 4. Persentase  distribusi  kodon  yang  dikelompokkan  berdasarkan  kualitas  kodon. Nilai 100 adalah kodon dengan frekuensi penggunaan tinggi pada inang E. coli . (A) wild type ; (B) PT2 dengan kodon hasil optimasi.
Gambar 5. Distribusi frekuensi penggunaan kodon. (A) wild type dan nilai CAI 0,89; (B) PT2 dengan kodon hasil optimasi dan nilai CAI 1,00.
Berdasarkan  kajian in  silico persentase GC  rata-rata  PT2  hasil  optimasi  berada  pada kisaran persentase GC E. coli K12. Persentase kandungan  GC  PT2  hasil  optimasi  adalah 54,71%, sedangkan E. coli K12 adalah 52,35%.
Perbedaan persentase GC rata-rata antara gen target dengan inang ekspresi dapat menyebabkan  bias  kodon.  Kandungan  GC yang  tinggi  pada  suatu  urutan  nukleotida dapat  menurunkan  tingkat  ekspresi,  karena diperkirakan  dapat  menterminasi  transkripsi (Gustafsson et  al .,  2004).  Kodon  bias merupakan  fenomena  yang  merujuk  pada perbedaan  frekuensi  kodon  sinonim  diantara gen  yang  berbeda.  Model  seleksi  translasi, seleksi  alam  dianggap menjadi  penyebab bias kodon,  karena  penggunaan  kodon  yang diekspresikan tinggi cenderung ke penggunaan kodon optimal, yaitu kodon yang sesuai  dengan  tRNA  dan  paling  melimpah pada  organisme  (Roymondal et  al .,  2009). Gen  yang  diekspresikan  dengan  tinggi  dalam spesies  tertentu,  akan  menjadi  bias  terhadap
penggunaan kodon yang dikenali oleh molekul tRNA  yang  paling  melimpah  (Buchberger, 2009).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  kajian  ini,  dapat disimpulkan  bahwa:  (1)  optimasi  kodon  gen pengode  PT2  sesuai  dengan  preferensi  kodon inang,  diprediksi  akan  berpengaruh  terhadap ekspresinya;  (2)  hasil  analsis  kondon  PT2 secara in  silico menunjukkan  bahwa  gen  PT2 sintetik  akan  diekspresikan  tinggi  di  inang E. coli .

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dirjen  Penguatan  Riset  dan  Pengembangan Kemristekdikti  atas  bantuan  dana  melalui penelitian unggulan strategis nasional (PUSNAS)  T.A  2013-2015  dan  penelitian disertasi doktor (PDD) T.A 2015.

## DAFTAR PUSTAKA
Buchberger, J. 2009. What is codon bias, and why  is  it  species  specific? http://www. hhmi.org/askascientist/answers/what_is _codon_bias_and_why_ is_it_species_specific.html. Cabrita,  L.  D.,  Weiwen,  D.,  &  Stephen,  P.  B. 2006.  A  family  of E.coli expression vectors  for  laboratory  scale  and  high throughput  soluble  protein  production. BMC Biotechno , 6 :12.
Enus,  S.,  Natadisastra,  G.,  Shahib,  M.  N.,  & Sulaiman,  R.  2011.  Peran  lem  fibrin otologus pada penempelan tandur konjungtiva  bulbi  mata  kelinci  terhadap ekspresi  gen  fibronektin  dan  integrin. MKB , 43 :183-188.
Freydell,  E.  J.,  Ottens,  M.,  Eppink,  M.,  van Dedam,  G.,  &  van  der  Wielen,  L.  2007. Efficient  solubilization  of  inclusion bodies. Biotechnol J , 2 :678-684.
Gustafsson, C., Govindrajan, S., & Minshull, J. 2004.  Codon  bias  and  heterologous protein expression. Trends in Biotechnol ,
22 :346-353. Mclnerney, J. O. 1998. GCUA: General Codon Usage Analysis. Bioinformatics Applications  Note. Oxford  University Press , 14 :372-373.
Puigbo, P., Guzma, E., Romeu, A., & Vallve, S. G.  2007.  OPTIMIZER:  a  web  server  for optimizing  the  codon  usage  of  DNA sequences. Nucleic.  Acids . Research , W126-W131.
Roymondal,  U.,  Das,  S.,  &  Sahoo,  S.  2009. Predicting  gene  expression  level  from relative  codon  usage  bias:  an  application to Escherichia  coli genome. DNA Research , 16 :13-30. Silaban,  S.,  Maksum,  I.  P.,  Gaffar,  S.,  Hasan, K.,  Enus,  S.,  Subroto,  S.,  &  Soetijoso,  S. 2014. Codon optimization and chaperonee  assisted  solubilization  of recombinant human prethrombin-2 expressed in Escherichia coli . J. Microbiolgy Indonesia , 8 :177-182. Sorensen,  S.  P.,  &  Mortensen,  K.  K.  2005. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia  coli . J  Biotechnol , 115 :113- 128.
Spotnitz,  W.  D.  2001.  Commercial  fibrin sealants    in    surgical  care. Am  J    Surg , 182 :8S-14. Xiong, A. S.,  Peng, R. H., Zhuang, J., Gao, F., Li,  Y.,  Cheng,  Z.  M.,  &  Yao,  Q.  H.  2008. Chemical  gene  synthesis:  strategies, softwares, error corrections, and applications. FEMS.Microbiol , 32 :522- 540.