## Potensi Bakteri Endofit Lamun Enhalus sp. dengan Aktivitas Antimikrofouling dari Perairan Lampung

## Oktora Susanti*, Maulid Wahid Yusuf, Yeni Elisdiana
Jurusan Perikanan dan Kelautan, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung Jl. Prof.Soemantri Brodjonegoro, Gedong Meneng, Bandar Lampung, Lampung 35145 Indonesia *Corresponding author, e-mail : oktorasusanti@gmail.com
ABSTRAK:  Enhalus  sp. adalah  salah  satu  jenis  lamun  dan  merupakan  tanaman  yang  sangat penting bagi organisme dan mikroorganisme laut diperairan, salah satunya adalah bakteri karena lamun menyediakan tempat hidup serta penyedia nutrisi pada bakteri.  Beberapa hasil penelitian, menyatakan  bahwa  ekstrak  lamun  memiliki  aktivitas  terhadap  bakteri  yang  membentuk  biofilm. Terjadinya proses Biofouling diawali dengan terbentuknya film oleh bakteri yang menempel pada permukaan  benda  yang  terendam  di  dalam  laut  yang  disebut  sebagai  biofilm.  Salah  satu  cara meminimalisasi  biofouling  pada  umumnya  dengan  menggunakan  bahan  beracun  yang  tidak ramah lingkungan, sehingga perlu dilakukan pencarian alternatif baru untuk menghambat bakteri biofilm. Upaya untuk mengatasi permasalahan dengan menggunakan isolat bakteri endofit lamun merupakan  salah  satu  alternatif  ramah  lingkungan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan bakteri  endofit  lamun Enhalus sp.  yang  mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri  biofouling. Pada penelitian ini, sampel didapatkan dari pantai Ketapang Pesawaran dan pantai Biha, Pesisir Barat Lampung yang diambil dari bagian akar, batang dan daun lamun. Tahapan penelitian yang dilakukan  yaitu  pengambilan  sampel,  isolasi  dan  purifikasi  bakteri  endofit  lamun  dengan  metode gores  diatas  agar,  pembentukan  bakteri  biofilm  sebagai  bakteri  uji  pada  uji  antagonisme,  isolasi bakteri  biofilm,  dan  uji  antagonis  bakteri.  Hasil  dari  isolasi  dan  purifikasi  didapatkan  53  isolat bakteri  endofit  lamun Enhalus sp.  yang  akan  diuji  pada  25  isolat  bakteri  biofilm.  Uji  antagonis bakteri  endofit  lamun  dengan  kode  LEDB2.4  dapat  menghambat  4  jenis  bakteri  biofilm.  Besar zona hambat terbesar yaitu terhadap bakteri biofilm dengan kode 3.1 sebesar 18,73 mm.
Kata kunci: Bakteri biofilm; isolasi; uji antagonis; zona hambat.

## Study of The Potential Endophite Bacterials Of Seaweed Enhalus sp. with Antimicrofouling Activities from Lampung Waters
ABSTRACT:  Seagrass  Enhalus  sp.  is  a  plant  that  very  important  for  marine  organisms  and microorganisms in waters, one of which is bacteria because seagrass provides a place to live and nutrients  for  bacteria. Some  research  results  state  that  seagrass  extracts  have  activity  against bacteria that form biofilms. The occurrence of the biofouling process begins with the formation of a film by bacteria attached to the surface of objects submerged in the sea which is called a biofilm. One  way  to  minimize  biofouling  in  general  is  to  use  toxic  materials  that  are  not  environmentally friendly,  so  it  is  necessary  to  search  for  new  alternatives  to  inhibit  biofilm  bacteria.  Efforts  to overcome the problem by using endophytic bacteria isolates from seagrass are an environmentally friendly  alternative. This  study  aims  to  obtain  the  endophytic  bacteria  of  seagrass  Enhalus  sp. which  can  inhibit  the  growth  of  biofouling  bacteria.  In  this  study,  samples  were  obtained  from Ketapang  beach  Pesawaran  and  Biha  beach,  West  Coastal  of  Lampung  tha t’s  taken  from  the roots,  stems  and  leaves  of  seagrass.  The  stages  of  the  research  carried  out  were  sampling, isolation and purification of endophytic bacteria from seagrass, formation of biofilm bacteria as test bacteria in the antagonism test, and isolation of bacterial biofilm, and bacterial antagonist test. The results of isolation and purification obtained 53 isolates of seagrass endophytic bacteria which will be tested on 25 isolates of biofilm bacteria. Antagonistic test of seagrass endophytic bacteria with code LEDB2.4 can inhibit 4 types of biofilm bacteria. The largest inhibition zone was against biofilm bacteria with code 3.1 of 18.73 mm.

## Keywords: Biofilm bacteria; isolation; antagonism test; inhibition zone

## PENDAHULUAN
Biofouling  merupakan  penempelan  dan  pertumbuhan  organisme  pada  permukaan  substrat abiotik maupun biotik yang berada di bawah permukaan air. Biofouling terdiri dari mikrofouling dan makrofouling.  Mikrofouling  adalah  kolonisasi  mikroorganisme  yang  terbawa  arus  sehingga menempel  pada  permukaan  benda  padat.  Makrofouling  merupakan  akumulasi  penempelan organisme  berukuran  besar  seperti  teritip,  alga  hijau,  cacing  kapal,  kerang,  dan  tunikata  yang menempel pada material padat seperti badan kapal dan juga pada bangunan pantai (Costerton et al ., 1995).
Biofouling  sering  kali  mengakibatkan  masalah  pada  industri  maritim  yaitu  transportasi  laut seperti  perkapalan  dan  struktur  pelabuhan.  Biofouling  pada  badan  kapal  mengakibatkan peningkatan kekasaran dan semakin menambah beban daya tarik kapal sehingga konsumsi bahan bakar semakin meningkat. Hal ini menunjukkan semakin pentingnya penelitian untuk menemukan sumber antibiotik baru yang mampu mengatasi bakteri bifouling dimana sumber antibiotik tersebut dapat berasal dari bakteri endofit lamun Enhalus sp.
Beberapa  penelitian  telah  membuktikan  adanya  bahan  aktif  yang  dihasilkan  oleh  beberapa jenis lamun yang mempunyai aktifitas antifouling seperti pada jenis Zostera marina (Jensen et al . 1998), Thalassia testudinum (Armstrong et al ., 2000; Maxey, 2006), Syringodium filiforme (Maxey 2006), Enhalus  acoroides,  Cymodocea  serrulata dan Syringodium  isoetifolium (Mayavu et  al ., 2009). Enhalus sp. merupakan salah satu jenis lamun yang ekstraknya memiliki aktivitas sebagai penghambat bakteri yang membentuk biofilm (Arlyza,2009), sehingga  besar kemungkinan bahwa bakteri  endofit  lamun  juga  mampu  menghasilkan  metabolit  sekunder  yang  dapat  digunakan sebagai antifouling.

## MATERI DAN METODE
Pengambilan  sampel  dilakukan  di  dua  tempat  yaitu  pantai  Ketapang  Pesaaran  dan  pantai Biha, Pesisir Barat Lampung. Sampel diambil pada bagian akar, daun, dan batang menggunakan cutter , kemudian dimasukkan ke dalam plastik dan disimpan sementara dalam cool  box . Sampel selanjutnya disemprot dengan air laut steril untuk membersihkan bakteri perairan yang menempel pada  permukaannya  (Trianto et  al .,  2019).  Isolasi  bakteri  dilakukan  di  Laboratorium  Budidaya Perikanan Jurusan Perikanan dan Kelautan Fakultas Pertanian Universitas Lampung.
Sampel akar, daun, dan batang direndam dalam alkohol 70% selama 30 detik, dikeringkan, kemudian  direndam  kembali  selama  30  detik.  Perendaman  dilakukan  untuk  menghindari kontaminasi  bakteri  epifit.  Bagian  permukaan  akar,  daun,  dan  batang  dihilangkan  menggunakan cutter ,  kemudian  dipotong  kecil-kecil  dan  diletakkan  pada  media  Zobell  2216E  (Strobel  dan Daisy,2003;  Kumala  dan  Siswanto,  2007).  Media  Zobell  adalah  media  yang  umum  digunakan untuk  menumbuhkan  bakteri  laut  (Radjasa et  al .,  2007;  Fajarningsih et  al .,  2012).  Simpan  pada suhu  ruang  untuk  menumbuhkan  mikroba.  Setelah  1×24  jam  akan  terlihat  pertumbuhan  bakteri disekitar  sampel  yang  diletakkan  pada  media  Zobell.  Bakteri  yang  telah  tumbuh  kemudian dimurnikan  satu-persatu  menggunakan  jarum  ose  dan  dipindahkan  ke  media  agar  steril  pada cawan petri lainnya, kemudian diinkubasi pada suhu ruangan.Bakteri biofilm diambil dari potongan kayu yang direndam pada pasang surut perairan laut Ketapang kecamatan Padang Cermin yang bertujuan  pembentukan  bakteri  biofilm.  Perendaman  kayu  berlangsung  selama  7  hari,  kemudian diisolasi  menggunakan  media  zobell  dengan  cara  pengenceran  sebesar  10 -2 ,10 -3 ,  10 -4 ,  10 -5 ,  dan 10 -6 dan  di  inkubasi  selama  24jam  selanjutnya  diamati  morfologi,  bentuk  dan  warna  bakteri.  Uji antagonis  antibakteri  dilakukan  dengan  menggunakan  metode overlay (Terkina et  al., 2006; Trianto et al., 2019). Setiap koloni mikroba endofit lamun ditanam pada media padat Zobell 2216E laut  dan  dibentuk  menjadi  bulatan  kecil.  Selanjutnya  cawan  petri  diinkubasi  pada  suhu  kamar selama 1-2 hari. Bakteri uji yang digunakan yaitu bakteri biofilm. Bakteri uji yang telah ditanam dan ditumbuhkan  hingga  kepadatan  10 8 CFU/ml  pada  media  cair  tawar  atau  laut.  Setelah  dilakukan overlay kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 1x24 jam. Isolat mikroba endofit yang aktif terlihat dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni yang kemudian diukur diameternya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Mikroorganisme hidup membentuk komunitas sesil lebih banyak daripada hidup sebagai sel planktonik.  Mikrokoloni  merupakan  kumpulan  komunitas  sesil  bakteri  pada  semua  permukaan  di lingkngan  perairan  (Donlan,  2002;  Munn,  2004).  Hal  ini  juga  serupa  dengan  hasil  penelitian dimana  setelah  perendaman  kayu  pada  kolom  air  selama  satu  minggu.  Pembentukan  biofilm terjadi  setelah  bakteri  menempel  di  permukaan  kayu  dan  sel  bakteri  membentuk  suatu  lapisan ekstraseluler polimer substansi (EPS). Biofilm terbentuk saat mikroorganisme melekat pada suatu permukaan  benda  di  perairan  dan  memproduksi  eksopolisakarida  yang  membantu  dalam  proses pelekatan  pada  permukaan.  Proses  pelekatan  memberikan  keuntungan  bagi  bakteri  untuk  hidup dalam  kumpulan  biofilm,  termasuk  untuk  berlindung  dari  zat  antimikroba.  Salah  satu eksopolisakarida  yang  diproduksi  oleh  bakteri  pembentuk  biofilm  adalah glycocalyx (Lappin  scott et al. , 1992). Jumlah bakteri biofilm yang didapatkan sebanyak 25 jenis bakteri Gambar 1. dengan berbagai  jenis  bentuk  morfologi  dan  tekstur  yang  berbeda.  Pada  pengenceran  10 -2 didapatkan jumlah  bakteri  sebanyak  2  jenis  koloni,  pengenceran  10 -3 didapatkan  jumlah  koloni  sebanyak  7 koloni,  pengenceran  10 -4 didapatkan  jumlah  koloni  seabanyak  8  koloni,  pengenceran  10 -5 didapatkan  jumlah  koloni  sebanyak  5  koloni,  dan  pengenceran  10 -6 didapatkan  jumlah  koloni sebanyak  3  koloni.  Struktur  bakteri  biofilm  sangat  beragam  dan  dinamis  (Callow    Callow  2002; Fleming 2009).
Biofouling  yang  terjadi  disebabkan  adanya  nutrient  pada  permukaan  kayu,  sehingga tersedianya  sumber  makanan  danmenarik  mikroorganisme  menempel  pada  permukaan  kayu. Penumpukan  dan  hasil  reproduksi  mikroorganisme  yang  tejadi  pada  permukaan  kayu  menjadi sumber  nutrisi  dan  dapat  menarik  organisme  multiseluler  untuk  ikut  tinggal  di  tempat  tersebut. Perbedaan jenis kayu akan mempengaruhi penempelan organisme fouling karena  elastisitas dan kandungan  kimia  pada  masing-masing  jenis  kayu  berbeda  (Railkin,  2004).  Menurut  Boesono (2008)  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan  kayu  jenis  jati  memiliki  kecepatan  pertumbuhan organisme  fouling  lebih  cepat.  Menurut  Nagabushanam  dan  Alam  (1988)  ada  jenis  kayu  yang resisten  terhadap  organisme  fouling  dibandingkan  jenis  kayu  yang  lain.  Tingkat  resisten  ini dipengaruhi  oleh  perbedaan  lokasi,  jenis  organisme  penempel,  kualitas  kayu  dan  kondisi  fisik lingkungan.
Penelitian  ini  mendapatkan  hasil  bakteri  yang  diisolasi  dari  jenis  endofit  (akar,  batang  dan daun) lamun Enhalus sp. dapat berkembang dengan baik pada media Zobell 2216E. Bakteri yang tumbuh dapat dilihat pada Gambar 2. Sampel lamun diambil di dua tempat yaitu pantai Biha dan pantai Ketapang. Pada isolasi bakteri endofit pantai biha ditemukan sebanyak 24 koloni bakteri,
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5
10^-6
Jumla h K ol on i B ak teri
Journal of Marine Research Vol 10, No.4 November 2021, pp. 589-594
terdiri dari bagian akar 11 koloni, bagian batang 6 koloni dan bagian daun 7 koloni. Bakteri endofit yang  tumbuh  memiliki  warna,  morfologi  dan  tekstur  yang  berbeda-beda.  Mikroorganisme  endofit akan  menjadi  sumber  yang  ramah  lingkungan/konservatif.  Hal  ini  karena  mikroorganisme merupakan organisme yang mudah dikultur, memiliki siklus hidup lebih singkat daripada tanaman dan dapat menghasilkan senyawa bioaktif dalam jumlah besar.
Sampel  lamun  yang  diambil  pada  pantai  ketapang  didapatkan  isolasi  bakteri  endofit sebanyak  29  koloni  bakteri,  terdiri  dari  bagian  akar  7  koloni,  bagian  batang  7  koloni  dan  bagian daun 15 koloni. Bakteri endofit yang tumbuh memiliki warna, morfologi dan tekstur yang berbeda- beda Gambar 3. Pengujian awal bakteri endofit lamun yang aktif terhadap bakteri biofilm dilakukan supaya  mengetahui  bakteri  yang  memiliki  sifat  paling  kuat  sebagai  antimikroba.  Semakin mengembangkan penemuan untuk penelusuran bahan bioaktif dari laut yang berasal dari bakteri simbion  (Kumala  dan  Siswanto,  2007).  Dari  hasil  uji  antagonis  bakteri  endofit  lamun  LEDB2.4 dapat menghambat empat jenis bakteri biofilm dengan kode 3.1, 3.7, 4.2, dan 5.2 dengan diameter zona  hambat  sebesar  18,73  mm,  16,83  mm,  5,2  mm,  dan  3,3  mm.  Dari  hasil  tersebut  dapat disimpulkan bahwa bakteri endofit lamun memiliki senyawa bioaktif yang aktif menghambat aktivitas
Gambar 2 . Hasil Isolasi bakteri Lamun yang berasal dari pantai Biha Pesisir Barat
Gambar 3. Hasil Isolasi bakteri Lamun yang berasal dari pantai Ketapang
0 2 4 6 8 10 12 14 batang Akar Daun Jumla h Isol at B ak teri Pantai Biha Pesisir Barat 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 batang akar daun Jumla h Isol at B ak teri
Journal of Marine Research Vol 10, No.4 November 2021, pp. 589-594
bakteri biofilm. Terdapatnya zona hambat ini, dikarenakan bakteri memiliki sifat metabolit sekunder yang mungkin identik dengan tumbuhan lamun sebagai inangnya. Lamun mengandung ester sulfat yang  memiliki  aktivitas  antifouling,  memungkinkan  ester  sulfat  dapat  mencegah  biota  penempel termasuk organisme pembentuk biofilm (Zimmerman et al ., 1997).
Menurut  Prihatiningtias  (2006),  simbiosis  bakteri  endofit  dengan  cara  bakteri  endofit memperoleh nutrisi dari inangnya dan inang memperoleh keuntungan karena adanya endofit akan memperkuat pertahanan terhadap gangguan dari luar seperti patogen dan organisme fouling. Jadi Senyawa  antifoulant  yang  dihasilkan  oleh  bakteri  endofit  ini  diduga  digunakan  oleh  bakteri  untuk mencegah penempelan yang terjadi pada lamun yang menjadi inang bagi bakteri endofit tersebut. Hal ini juga sesuai dengan Marhaeni et al ., (2011), yang menyatakan bahwa mikroba endofit yang diisolasi dari tumbuhan yang menghasilkan bahan bioaktif diketahui memiliki aktivitas yang  sama bahkan  dapat memiliki  aktivitas  yang  lebih  besar  dibandingkan  aktivitas  tumbuhan  inangnya.  Hal ini  sangat  efisien  dan  menguntungkan  karena  siklus  hidup  mikroba  endofit  lebih  singkat  dan mudah dikultur dibandingkan siklus hidup inangnya.

## KESIMPULAN
Lamun memiliki bakteri endofit dengan morfologi koloni bakteri yang beragam bentuk, warna serta  teksturnya.  Bakteri  endofit  lamun  isolat  LEDB2.4  mampu  menghambat  aktivitas  bakteri biofilm  dengan  diameter  18,73  mm.  Dapat  disimpulkan  bahwa  isolat  LEDB2.4  bakteri  endofit lamun Enhalus sp. dari perairan Lampung memiliki potensi sebagai antimikrofoulant.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terima  kasih  disampaikan  kepada  Lembaga  Penelitian  dan  Pengabdian  Masyarakat Universitas Lampung melalui Program Hibah Penelitian Dosen Pemula UNILA 2019 dengan nomor kontrak penelitian: 2618/UN26.21/PN/2019

## DAFTAR PUSTAKA
Arlyza,  I.S.  2009.  Ekstrak  Lamun  Sebagai  Sumber  Alternatif  Antibakteri  Penghambat  Bakteri Pembentuk Biofilm. Pusat Penelitian Oseanografi, LIPI: Jakarta.
Armstrong,  E.,  Boyd,  G.    Burgess,  J.  2000.  Prevention  of  marine  biofouling  using  natural compounds from marine organisms. Biotechnology Annual Review . Elsivier Science.246p Boesono,  H.  2008.  Pengaruh  lama  perendaman  terhadap  organism  penempel  dan  modulus elastisitas pada kayu. Ilmu Kelautan: Indonesian Journal of Marine Science .13(3):177 –180. Callow, M.E.  Callow, J.A. 2002. Marine Biofouling : a Sticky Problem. Biologist , 49(1):1-5. Costerton,  J.W.,  Lewandowski,  Z.,  Caldwell,  D.E.,  Korber,  D.R.    Lappinscott,  H.M.  1995.
Microbial Biofilm. Annual Review of Microbiology, 49:711-745.
Donlan,  R.M.  2002.  Biofilm  :  Microbial  Live  in  Surface. Emerging  Infectious  Diseases. 8(9):881- 890.
Fajarningsih  N.D,  Pratitis,  A.,  Wikanta,  T.    Chasanah,  E.  2012.  Bioprospeksi  Kapang  yang Berasosiasi Dengan Biota Laut Asal Kepulauan Seribu sebagai Antitumor T47D dan HepG2. Jurnal Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, 7(1):21-30.
Fleming, H.C. 2009. Why microorganisms live in biofilm and the problem of biofouling. Marine and Industrial Biofouling. Springer Berlin Heidelberg.
Jensen,  R.,  Jenkins,  K.M.,  Porter,  D.    Fenicall, W. 1998.  Evidence  that  a  new  antibiotic flavone glcoside chemically Defends the lamun Thalassia testudinum against zoosporic fungi. Scripps Institute  of  Oceanography,  Center  for  Marine  Biotechnolghy  and  Biomedicane,  University  of California-  San  Diego,La  jolla,  California. Applied  and  Environmental  Microbiology ,  64(4): 1490-1496
Kumala, S.  Siswanto, E.B. 2007. Isolation and Screening of Endophytic Microbes from Morinda ciliforia  and  their  Ability  to  Produce  Anti-Microbial  Substance. Microbiology  Indonesia, 1(3): 145 –148.
Lappin, H., Scott, Costerton, J.W.  Marrie, T.J. 1992. Encyclopedia of Microbiology: Biofilm and Biofouling. London: Acedemy Press, Inc.pp.277-284.
MaMarhaeni,  B.,  Radjasa,  O.K.,  Khoeri,  M.M.,  Sabdono,  A.,  Bengen,  D.G.    Sudoyo,  H. 2011. Antifouling  Activity  of  Bacterial  Symbionts  of  Seagrasses  against  Marine  Biofilm-Forming Bacteria. Journal of Environmental Protection , 2(9):1245-1249.
Maxey,  IV.C.E.  2006.  Occurrence  and  Distribution  of  Irganol  1051  and  its  Natural  Metabolites  in Biotic  and  Abiotic  Marine  Samples,  having  been  approved  in  respect  to style  and  intellectual content, is referred to you for judgment. Florida International University.
Mayavu, C., Sugesh, S.  Ravindran, V.J. 2009. Antibacterial Activity of Seagrass species against biofilm forming bacteria. Research Journal of Microbiology 4(8):314-319.
Munn,C.B.  2004.  Marine  Microbiology,  Ecology  and  Aplication.  Garland  Science/BIOS  Scientific Publishers.
Nagabushanam,  R.    Alam,  S.M.  1988.  An  overview  of  research  on  marine  biodeteroaration  in Indian  waters;  in:  Marine  Biodeteriaration  (Thompson,  M.F.  and  Nagabushanam,  R.,  Eds), Oxford  IBH Publishig Co. Pvt. Ltd., New Dehli.13-32pp.
Prihatiningtyas,  W.  2006.  Mikroba  Endofit,  Sumber  Penghasil  Antibiotik  yang  Potensial.  Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta.
Radjasa,  O.K.,  Salasia,  S.I.O.,  Sabdono,  A.,  Wiese,  J.,  Imhoff,  J.F.,  Lämmler,  C.    Risk,  M.J. 2007.  Antibacterial  activity  of  marine  bacterium  Pseudomonas  sp.  associated  with  soft  coral Sinularia polydactyla against Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. International Journal of Pharmacology, 3(2): 170-174.
Railkin, A.I. 2004. Marine Biofouling; Colonization Processes and Defence. CRC Press. Florida. Strobel,  G.A.    Daisy,  B.  2003.  Bioprospecting  for  Microbial  Endophytes  and  Their  Natural Products. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(4): 491-502.
Terkina,  I.A.,  Parfenova,  V.V.    Ahn,  T.S.  2006.  Antagonistic  activity  of  actinomycetes  of  Lake Baikal. Applied Biochemistry and Microbiology, 42:173 –176.
Trianto, A., Nirwani., Susanti, O., Maesaroh, D.  Radjasa, O.K. 2019. The bioactivity of bacterium and  fungi  living  associate  with  the  sponge  Reniera  sp.  against  multidrug-resistant Staphylococcus aureus and Escherichia coli . Jurnal Biodiversitas , 4(8):2302- 2307.
Zimmerman,  R.C.,  Alberte,  R.S.,  Todd,  J.S.    Crews,  P.  1997.  Phenolic  Acid  Sulfate  Esters  for Prevention of Marine Biofouling. United State Patent 56077441