Jurnal Laut Khatulistiwa , Vol. 4 No. 2 (Juli, 2021), Hal. 17-21. ISSN : 2614-6142 ( Printed ), 2614-8005 ( Online) http://jurnal.untan.ac.id/index.php/lk

## Isolasi dan Karakteristik Bakteri Penambat Nitrogen dari Rizosfer Mangrove di Kuala Singkawang

## Isolation and Characterization Nitrogen-Fixing Bacteria from Mangrove Rizosphere in Kuala Singkawang
Karina Elwanda Saputri 1* , Nora Idiawati 2 , Mega Sari Juane Sofiana 2 1 Program Studi Ilmu Kelautan, FMIPA Universitas Tanjungpura, Pontianak, Indonesia 2 Laboratorium Studi Ilmu Kelautan, FMIPA Universitas Tanjungpura, Pontianak, Indonesia * E-mail : megasofiana86@gmail.com
Received : 10 Juni 2021; Accepted: 19 Juni 2021
Published: 31 July © Author(s) 2021. This article is open access

## Abstract
Nitrogen  nutrients  (N)  are  macro  nutrients  required  by  plants.  Microorganisms  that  have  the  ability  to increase the use of N available in the soil are called nitrogen-fixing bacteria. Nitrogen-fixing bacteria can be used as a source of fertilizer as a biological fertilizer. Biological fertilizers are beneficial for restoring and improving  soil  fertility.  The  purpose  of  this  study  was  to  obtain  isolates  of  nitrogen-fastening  bacteria  as ammonia excretion from mangrove rizosphers in Kuala Singkawang. Soil sampling using composite sampling method. Isolation is done directly and enrichment using the pour method on Burk's media. Isolates of nitrogen- fastening  bacteria  isolated  from  the  mangrove  rizoosphere  amount  to  16  isolates  that  have  the  ability  as nitrogen fasteners. Nitrogen fastening affirmation test results showed 2 out of 16 isolates were highly active in nitrogen tethering. The results of the ammonia excretion test showed from 16 isolates there are 5 isolates capable of producing ammonia. The genus obtained in the study led to the genus Nitrosococcus and Bacillus.
Keywords : Mangroves, rhizosphere, biofertilizer, nitrogen-fixing bacteria, ammonia

## Abstrak
Unsur hara nitrogen (N) merupakan unsur hara makro yang diperlukan oleh tanaman. Mikroorganisme yang memiliki kemampuan untuk meningkatkan penggunaan N yang tersedia dalam tanah disebut dengan bakteri  penambat  nitrogen.  Bakteri  penambat  nitrogen  ini  dapat  dijadikn  sebagai  sumber  pupuk  yang sebagai pupuk hayati. Pupuk hayati bermanfaat untuk memulihkan dan meningkatkan kesuburan tanah. Tujuan penelitian ini adalah untuk memperoleh isolat bakteri penambat nitrogen sebagai pengekskresi amonia dari rizosfer mangrove di Kuala Singkawang. Pengambilan sampel tanah menggunakan metode komposit sampling. Isolasi dilakukan secara Langsung dan pengayaaan menggunakan metode tuang pada media Burk’s. Isolat bakteri penambat nitrogen yang diisolasi dari rizosfer mangrove berjumlah 16 isolat yang  memiliki  kemampuan  sebagai  penambat  nitrogen.  Hasil  uji  penegasan  penambat  nitrogen menunjukkan 2 dari 16 isolat sangat aktif dalam penambatan nitrogen. Hasil dari uji pengekskresi amonia menunjukkan dari 16 isolat ada 5 isolat yang mampu menghasilkan amonia. Genus yang didapatkan pada penelitian yaitu mengarah pada genus Nitrosococcus dan Bacillus .
Kata kunci : Mangrove, rizosfer, pupuk hayati, bakteri penambat nirogen, amonia

## 1. Pendahuluan
Lahan salin adalah lahan dengan salinitas tinggi.  Lahan  salin  belum  dapat  digunakan secara  langsung  untuk  lahan  pertanian (Rachman  et  al.,  2018).  Salah  satu  cara pengolahannya  adalah  dengan  pemanfaatan
bakteri  rizosfer.  Bakteri  rizosfer  merupakan bakteri  yang  terdapat  di  sekitar  perakaran tanaman.  Bakteri  ini  dapat  diperoleh  dari hutan  mangrove,  salah  satunya  adalah  hutan mangrove  di  Kuala  Singkawang,  Provinsi Kalimantan  Barat.  Daerah  ini  memiliki  lahan salin  yang  potensial  untuk  pertanian.  Bakteri
rizosfer  yang  memiliki  kemampuan  untuk meningkatkan  penggunaan  N  yang  tersedia dalam  tanah  disebut  bakteri  penambat nitrogen.
Bakteri penambat nitrogen dalam ekosistem  mangrove  ada  di  rizosfer,  serasah, pneumatofor,  kulit  mangrove  dan  sedimen (Lugomela  and  Bergman,  2002).  Nitrogen dalam bentuk N2 bebas di atmosfer tidak dapat langsung  diserap  oleh  tumbuhan.  Tumbuhan menyerap unsur nitrogen dari lingkungannya dalam bentuk senyawa amonia (NH3). Bakteri ini akan menyerap amonia dan mengubahnya menjadi  ion-ion  nitrat  (NO2)  yang  kemudian dilepaskan ke lingkungannya (Widowati et al., 2012).  Banyak  spesies  bakteri  yang  memiliki kemampuan  sebagai  penambat  nitrogen, tetapi sangat sedikit yang mampu mengekskresikan  nitrogen  dalam  bentuk amonia sehingga kontribusinya dalam menyediakan  nitrogen  bagi  tanaman  juga masih  rendah  (Dobbelaere  et  al.,  2003). Bakteri  penambat  nitrogen  dapat  dijadikan sebagai  pupuk  yang  disebut  dengan  pupuk hayati.
Pupuk  hayati  merupakan  suatu  bahan yang  mengandung  mikroorganisme  yang bermanfaat untuk memulihkan dan meningkatkan kesuburan tanah (Arfarita et al., 2019). Mikroorganisme pupuk hayati berkaitan  dengan  unsur  hara  nitrogen  (N) yang  merupakan  unsur  hara  makro  yang diperlukan oleh tanaman. Pemanfaatan pupuk hayati  dapat  mengurangi  kerusakan  dan penurunan (degradasi) sumberdaya lahan.
Degradasi  lahan  dapat  menyebabkan lahan  pertanian  Indonesia  menjadi  kurang subur yang membuat para petani menggunakan pupuk anorganik untuk mendapatkan  hasil  panen  yang  baik.
Penggunaan pupuk anorganik dapat meningkatkan unsur-unsur hara dalam tanah. Penelitian  yang  telah  dilakukan  bakteri penambat  nitrogen  genus  Azotobacter, Bacillus,  Pseudomonas  dan  Trichoderma berpotensi  untuk  digunakan  sebagai  bahan aktif pupuk hayati (Hanudin et al., 2018).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui isolat bakteri penambat nitrogen di Kelurahan Kuala  Kota  Singkawang  dan  genus  bakteri penghasil amonia.

## 2. Metodologi Penelitian

## 2.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  telah  dilakukan  pada  bulan Agustus  -  Desember  2020.    Pengambilan sampel  rizosfer  mangrove  dilakukan  di kawasan mangrove Kelurahan Kuala, Kecamatan Singkawang Barat, Kota Singkawang.  Uji  aktivitas  metabolik  dan identifikasi bakteri rizosfer mangrove dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, UPT- PMHP Provinsi Kalimantan Barat.

## 2.2. Analisis Data
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini  yaitu  autoklaf, alumunium  foil ,  bunsen, botol  vial,  cawan  petri, corring , cover  glass , beaker  glass ,  erlenmeyer, Global  Positioning
system (GPS),  jangka  sorong,  jarum  ose, kamera, laminar  airflow (LAF),  mikropipet, mikroskop,  pH  tanah,  pipet  tetes,  plastik sampel,  spatula, shaker ,  rak  tabung  reaksi, tabung  reaksi,  neraca  analitik,  tissue  dan vortex . Bahan-bahan  yang  digunakan  pada penelitian ini yaitu akuades (H 2 O), α-naphthol , agar, ammonium sulfat ((NH 4 )SO 4 ), bakto agar, besi  (II)  sulfat  (FeSO 4 .H 2 O),  dektrosa, dipotassium  fosfat  (K 2 HPO 4 ),  d(-)manitol, ekstrak  ragi,  glukosa,  hidrogen  peroksida (H 2 O 2 ),  iodin,  kalium  hidroksida  (KOH), kalsium  fosfat  (Ca(PO 4 )),  kristal  violet, magnesium sulftat hepatohidrat (MgSO 4 .7H 2 O), mangan (II) sulfat (MnSO 4 .H 2 O), methyl  red ,  natrium  sulfat (Na 2 SO 4 ), potassium dihidrogen fosfat (KH 2 PO 4 ), sampel sedimen mangrove, sodium molibdat  (Na 2 MoO 4 ), Simson’s  Citrate  Agar (SCA), Sugar  Iron  Agar (TSIA),  safranin, sukrosa, Tetra Kit , Urea Base Agar .
2.3. Pengambilan Sampel Pengambilan  sampel  rizosfer  mangrove menggunakan  Teknik  Komposit  Sampling (Emine  et  al.,  2015).  Penentuan  stasiun penelitian dilakukan dengan metode purposive sampling .  Sampel  di  ambil  sekitar  rizosfer mangrove  (10-20  cm)  menggunakan  coring dan dilakukan 10 kali ulangan pada setiap titik stasiun. Sampel kemudian dikompositkan dan disimpan  dalam  botol  vial  steril  kemudian sampel  dibawa  ke  laboratorium  untuk diisolasi.
2.4. Isolasi Bakteri Penambatan Nitrogen Isolasi bakteri dilakukan secara langsung dan  pengayaan  menggunakan  metode  tuang. Sampel  ditimbang  sebanyak  10  gr  dan dilarutkan  dalam  90  mL  akuades  steril  dan medium Burk’s cair dalam erlenmeyer. Sampel divortex  dan  dilakukan  pengenceran  10 -1 hingga  10 -5 dengan  9  mL  akuades  steril. Suspensi sampel dari masing-masing pengenceran  10 -3 ,  10 -4 dan  10 -5 diambil sebanyak 1000 µl dan ditambahkan ke cawan petri  yang  bersi  medium  Burk’s  dengan komposisi  (10  gr  dekstrosa,  0,41  gr  KH 2 PO 4 , 0,52 gr K 2 HPO 4 , 0,05 gr Na 2 SO 4 , 0,2 gr KCl, 0,1 gr MgSO 4 .7H 2 O, 0,005 gr FeSO 4 .H 2 O, 0,0025 gr Na 2 MoO 4 dan 20 gr agar) (Singh et al ., 2013).
Bakteri  yang  tumbuh  diamati  setiap  hari selama 48 jam pada suhu 32ºC (Hamza et al., 2017).

## 2.5. Uji Penambat Nitrogen
Uji  penambat  nitrogen  dilakukan  dengan mengambil sebanyak 1 ose dan diinokulasikan pada  medium  Burk’s.  Isolat  kemudian  di inkubasi  pada  suhu  30 0 C  selama  5-7  hari (Widawati  and  Suliasih,  2018).  Isolat  yang membentuk zona bening menunjukkan bakteri dapat menambat nitrogen.

## 2.6. Uji Konsentrasi Amonia
Uji  konsentrasi  amonia  dilakukan  secara kualitatif  menggunakan  reagen  Tetra  Kit. Perubahan  warna  yang  terjadi  diamati  dan dibandingkan  dengan  Tetra  Kit  standar  Bar (Arfarita, et al ., 2019).

## 2.7. Karakteristik  dan  Identifikasi  Isolat Bakteri Terpilih
Isolat  bakteri  yang  memiliki  aktivitas metabolik terbaik dikarakterisasi dan diidentifikasi dengan uji biokimia berdasarkan metode  metode  Bergey’s  Manual  and Systematic of Bacteriology (Holt et al., 1994). Pengujian  biokimia  yang  dilakukan  di antaranya pewarnaan gram, oksidase, urease, katalase, sitrat, metabolisme karbohidrat, MR- VP, motilitas, oksidasi-fermentasi dan H 2 S.

## 3. Hasil dan Pembahasan 3.1. Hasil
Isolat  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini merupakan  isolat  bakteri  penambat  nitrogen yang  telah  ditumbuhkan  pada  media  bebas nitrogen  yaitu  media  Burk’s.  Media  ini  tidak mengandung  unsur  nitrogen  sehingga  hanya bakteri penambat nitrogen yang dapat tumbuh pada  media  tersebut  (Hartono  dan  Jumadi, 2014).  Hasil  isolat  bakteri  rizosfer  mangrove dengan metode cawan tuang diperoleh 5 isolat, sedangkan  dengan  pengayaan  diperoleh  11 isolat  yang  menunjukkan  morfologi  koloni bakteri yang berbeda.
Uji penambat nitrogen menunjukkan dari 16  isolat  bakteri  terdapat  2  isolat  yang membentuk  zona  bening  ( holo  zone ) disekeliling koloni seperti pada Gambar 4.1.
Adanya zona bening ( holo zone ) disekitar koloni  menunjukkan  bahwa  isolat  bakteri
memiliki  kemampuan  dalam  menambat nitrogen.  Isolat  bakteri  yang  memiliki kemampuan menambat nitrogen paling besar yaitu isolat KM206 dan KM103 (Tabel 3.1).

## 3.2. Pembahasan
Bakteri  dapat  mengubah  energi  menjadi bahan  organik  tanah  dalam  bentuk  yang bermanfaat  bagi  organisme.  Bakteri  pengurai memiliki  peran  penting,  terutama  dalam imobilisasi  nutrisi  dan  dapat  mencegah hilangnya  nitrogen  dari  daerah  rizosfer (Handayanto  dan  Hairiah,  2007).  Salah  satu bentuk bakteri pengurai yang dapat mencegah hilang  nitrogen  dalam  tanah  yaitu  bakteri penambat nitrogen. Bakteri penambat nitrogen  dapat  menangkap  N  dari  udara  dan mengubahnya menjadi NH 3
dengan menggunakan  enzim  nitrogenase,  kemudian NH 3 diubah  menjadi  glutamin  atau  alanin sehingga  bisa  diserap  oleh  tanaman  dalam bentuk NO 3 dan NH 4+ (Zulfarina et al ., 2017). Uji penambat nitrogen dari isolat bakteri rizosfer  mangrove  telah  banyak  dilaporkan. Beberapa diantaranya yaitu isolat bakteri dari tanah  hutan  mangrove  Sungai  Peniti, Kabupaten Mempawah (Kabul et al ., 2019) dan isolat  bakteri  dari  tanah  kawasan  mangrove Wonorejo  Surabaya  (Metasari et  al .,  2012) menunjukkan adanya aktivitas bakteri sebagai penambat nitrogen. Penelitian ini menunjukkan  bahwa  isolat  bakteri  rizosfer mangrove  dari  Kelurahan  Kuala  Kota Singkawang  berpotensi  sebagai  penambat nitrogen.
Uji  konsentrasi  amonia  dari  16  bakteri pengikat  nitrogen  dilakukan  dengan  metode kualitatif  menggunakan  Tetra  Kit.  Metode  ini digunakan  untuk  memperoleh  kemampuan isolat  bakteri  menghasilkan  amonia  dengan konsentrasi  tinggi.  Pengamatan  dilakukan dengan  melihat  perubahan  warna  dalam media  kultur.  Perubahan  warna  pada  media terjadi  karena  adanya  NH 3 yang  bersifat  basa sehingga  menyebabkan  warna  kuning  pada indikator bromothymol menghijau (Arfarita et
al .,  2019).  Kemudian  diamati  perubahan warna  pada  media  kultur  lalu  dibandingkan dengan warna pada Tetra Kit standar Bar. Uji kualitatif penghasil amonia dilakukan terhadap 16 isolat bakteri rizosfer mangrove. Hasilnya  menunjukkan  bahwa  isolat  KM104, KM201, KM202, KM206 dan KM207 memiliki kemampuan  penghasil  amonia  yang  dilihat dari warna yang berubah menjadi hijau tua.
Karakterisasi  isolat  bakteri  rizosfer mangrove  yang  memiliki  aktivitas  metabolik terbaik yaitu KM104 dan KM207. Isolat bakteri selanjutnya diidentifikasi dengan uji biokimia untuk mengetahui karakteristik isolat bakteri tersebut. Pengujian biokimia yang dilakukan di antaranya pewarnaan gram, oksidase, urease, katalase, sitrat, metabolisme karbohidrat, MR- VP,  motilitas,  oksidasi-fermentasi  dan  H 2 S.
Hasil penelitian ini secara umum menyimpulkan  jenis  isolat  yang  diperoleh mengarah  pada  genus  bakteri Nitrosococcus dan Bacillus .

## 4. Kesimpulan
Isolat  bakteri  rizosfer  mangrove  pada Kelurahan  Kuala  Kota  Singkawang  diperoleh 16  isolat.  Hasil  uji  penegasan  penambat nitrogen  menunjukkan  2  dari  16  isolat  yang mampu  menambat  nitrogen.  Hasil  dari  uji pengekskresi  amonia  menunjukkan  dari  16 isolat ada 5 isolat yang mampu menghasilkan amonia.  Genus  bakteri  yang  didapatkan  yaitu mengarah ke genus Nitrosococcus dan Bacillus .

## Ucapan Terima Kasih
Terima  kasih  kepada  Kedua  Orang  Tua dan  keluarga  yang  selalu  memberi  semangat dan  dukungan  serta  do’a  kepada  penulis  dan juga terima kasih kepada beasiswa PPA terkait yang membantu dalam menyelesaikan riset ini .

## Daftar Pustaka
Arfarita, N., A. Muhibbudin and T. Imai. 2019. Exploration  of  indigenous  free  nitrogen- fixing bacteria from rhizosphere of Vigna radiata  for  agricultural  land  treatment,

## Tabel 1. Indeks Penambat Nitrogen
Isolat Luas Holo Zone (cm) KM206 0,6 KM103 0,3
Journal  of  Degrdated  and  Mining  Lands Management. 6 (2):1617-1623
Dobbelaere, J., M.S. Gentry, R.L Hallberg dan Y. Barral. 2003. Phosphorylation-Dependent Regulation of Septin Dynamics During the Cell Cycle. Journal Dev Cell. 4(3): 345-57
Emine, S., N. Zainol, J. Salihon  and P. Convey.
2015.  Mangrove  Rhizosphere  Soils:  A Unique  Natural  Source  of  Pravastatin- Producing Penicillium Microfungi. Journal of Extensive Research. (5): 79-87 Hamza, A. T., H. Zebiba, M. Rediet, A. Petros and
B. Tesfaye. 2017. Isolation and Characterization  of  Nitrogen  Fixing Bacteria  from  Rhizospher  Soil  Isolation and  Characterization  of  Nitrogen  Fixing Bacteria  from  Rhizospher  Soil  Collected from  Shell  Mele  Agricultural.  Journal  of Agricultural Science and Food Technology.  3(7): 117–124. Handayanto, E. dan K. Hairiyah.  2007. Biologi Tanah, Yogyakarta, Pustaka Adipura.
Hanudin,  K.  Budiarto  dan  B.  Mawarto.  2018.
Potensi  Beberapa  Mikroba  Pemacu Pertumbuhan  Tanaman  sebagai  Bahan Aktif  Pupuk  dan  Pestisida  Hayati,  Jurnal Litbang Pertanian, Vol.37 (2), Hal: 59-70
Hartono  dan  O.  Jumadi.  2014.  Seleksi  dan Karakterisasi Bakteri Penambat Nitrogen Non  Simbiotik  Pengekskresi  Amonium Pada Tanah Pertanaman Jagung (Zea mays L.)  dan  Padi  (Oryza  sativa  L.)  Asal Kabupaten  Barru,  Sulawesi  Selatan, Indonesia,  Jurnal  Sainsmat,  Vol.3(2),  Hal: 143–153
Holt, J.G., N.R.  Krieg, P.H.A., Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey’s Manual of  Determinative  Bacteriology,  Ed  ke-9, Williams and Wilkins Baltimore, USA
Kabul,  S.,  Rafdinal  dan  Rahmawati.  2019. Eksplorasi  Bakteri  Penambat  Nitrogen dari Tanah Hutan Mangrove Sungai Peniti, Kabupaten Mempawah. Jurnal Protobiont, Vol. 8(1), Hal. 52–58.
Lugomela, C. and B. Bergman. 2002.  Biological N2-fixation on Mangrove Pneumatophores: Preliminary Observations  and  Perspectives.  Journal Ambio. 1(3) : 6-12. Metasari,  K.  2012.  Eksplorasi  Bakteri Penambat  Nitrogen  Non  Simbiosis  Dari Tanah Kawasan Hutan Mangrove Wonorejo  Surabaya.  Program  Studi Biologi  Fakultas  Sains  dan  Teknologi Universitas Airlangga, Jurnal, Surabaya.
Rachman,  A.,  A.  Dariah  dan  S.  Sutono.  2018.
Pengelolaan Sawah Salin Berkadar Garam Tinggi. IAARD PRESS. Jakarta.
Singh,  S.,  P.B.  Mazumder,  M.K.  Bhattacharjee, and  Sharma.  2013.    Determination  of Nitrogen  Fixing  Capacity  of    Bacteria Isolated  from  the  Rhizosphere  soil  of Crotolaria pallida from the Valley Districts of Manipur India, Journal of Pharmacy and Biological Sciences (IOSR-JPBS). 8 (4): 20- 24
Widawati, S., and Suliasih. 2018. The Effect of Plant  Growth  Promoting  Rhizobacteria (PGPR)  on  Germination  and  Seedling Growth  of  Sorghum  bicolor  L.  Moench. Journal Earth Environ. 166 : 1-11
Widowati, Asnah dan Sutoyo. 2012. Pengaruh Penggunaan  Biochar  dan  Pupuk  Kalium Terhadap Pencucian dan Serapan Kalium pada Tanaman Jagung, Jurnal Buana Sains. 12 (1): 83–90.
Zulfarina, Z., I. Rusmana, N.R. Mubarik and D.A. Santosa.    2017.  The  Abundance  of Nitrogen  Fixing,  Nitrifying,  Denitrifying and  Ammonifying  Bacteria  in  the  Soil  of Tropical  Rainforests  and  Oil  Palm Plantations  in  Jambi,  Journal  Makara  of Science. 21 (4): 187-194