NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE (NMR) AS A METHOD OF CHARACTERIZING ANTIGEN SYNTHESIS FOR SUCCESSFUL ANTIBODY PRODUCTION
Lusiani Dewi Assaat 1* , Endang Saepudin 2** , Retno Damayanti Soejoedono 3*** , Rahmat Setya Adji 4**** , Sofa Fajriah 5***** , Tribidasari Anggraningrum Ivandini 6******
1 Departemen of Chemistry Education, Faculty of Teacher Training and Education, Sultan Ageng Tirtayasa University, Banten, Indonesia.
2,6 Departement of Chemistry, Faculty of Mathematics and natural Sciences, Indonesia University, Depok,
Indonesia.
3 Departement of Animal Disease and Veterinary Public Health, Faculty of Veterinary Medicine, Bogor Agriculture University, Bogor, Indonesia.
4 Centre of Veterinary Research, Bogor, Indonesia.
5 Research Center For Chemistry, LIPI, Tangerang, Banten, Indonesia.
1 Bioengineering and Biomedical laboratory, Faculty of Engineering, Sultan Ageng Tirtayasa University, Banten, Indonesia.
E-mail: *assaatlusi@gmail.com
Received: 06 Juni 2021. Accepted: 19 Mei 2023. Published: 31 Mei 2023 DOI: 10.30870/educhemia.v8i1.15572
Abstract : Antibody production is becoming a trend, especially during a pandemic like now, although there have been many developments in antibody production in previous research. Antigen  synthesis  and  characterization  is  one  of  the  determining  factors  for  the  success  of antibody production. This research developed a method of antigen characterization using the Nuclear  Magnetic  Resonance  (NMR)  method.  The  research  conducted  in  these  4  stages begins with antigen synthesis, then continues with antigen characterization using NMR, then antibody production, and the last stage is antibody characterization using the Enzyme Linked ImmunoAssay  (ELISA)  method.  The  results  of  antigen  characterization  using  NMR  show that NAS has been perfectly conjugated with BSA and produces a NAS-BSA conjugate. This is shown by the presence of 1 methylene (CH2) olefinic at δH chemical shift of 6.27 ppm with an integral of 4 and having 1 piece of methine (CH) sp2 at δH chemical shift of 5.73 ppm  with  an  integral  of  2.  NAS-BSA  antigens  have  been  shown  to  successfully  produce antibodies.  This  is  shown  from  the  anti-NAS-BSA,  NAS,  and  Acrylamide  antibodies  that begin to appear in the second, third and fourth boosting (respectively).
Keywords: Nuclear  Magnetic  Resonance  (NMR),  characterization,  antigen,  antibody production
Abstrak  : Produksi  antibody  sedang  menjadi  trend  terutama  pada  masa  pandemi  seperti sekarang, meskipun telah banyak pengembangan produksi antibody pada riset sebelumnya. Sintesis dan karakterisasi antigen merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan produksi antibody.  Riset  ini  mengembangkan  suatu  metode  karakterisasi  antigen  menggunakan metode Nuclear  Magnetic  Resonance (NMR).  Riset  yang  dilakukan  dalam  4  tahapan  ini diawali  dengan  sintesis  antigen,  kemudian  dilanjutkan  dengan  karakterisasi  antigen menggunakan NMR, selanjutnya produksi antibody, dan tahap terakhir adalah karakterisasi antibody  menggunakan  metode Enzyme  Linked  ImmunoAssay (ELISA).  Hasil  karakterisasi antigen menggunakan NMR menunjukkan bahwa NAS telah terkonjugasi sempurna dengan BSA  dan  menghasilkan  suatu  konjugat  NAS-BSA.  Hal  ini  ditunjukkan  dengan  adanya  1 buah metilen (CH 2 ) olefinik pada pergeseran kimia δ H 6,27 ppm dengan integral sebanyak 4 dan  memiliki  1  buah  metin  (CH)  sp 2 pada  pergeseran  kimia  δ H 5,73  ppm  dengan  integral sebanyak 2. Antigen NAS-BSA yang terbukti telah berhasil menghasilkan antibody. Hal ini ditunjukkan  dari  antibody  anti  NAS-BSA,  NAS,  dan  Akrilamida  yang  mulai  muncul  pada boosting kedua, ketiga dan keempat (berturut-turut).
Keywords: Nuclear  Magnetic  Resonance  (NMR),  characterization,  antigen,  antibody production

## PENDAHULUAN
Produksi  antibody  menjadi  trend beberapa  tahun  belakangan  ini.  Terlebih lagi  di  era  pandemik,  kekuatan  antibody menjadi  penentu  utama  yang  menjadi tameng ketika seseorang terpapar penyakit.  Sebetulnya,  produksi  antibody ini bukanlah suatu hal yang baru di dunia riset imunologi. Telah banyak dikembangkan  berbagai  riset  produksi antibody untuk suatu keperluan di bidang kesehatan,  baik  sebagai  deteksi  penyakit (Wu et al, 2014; Zhou et al, 2008; Hu et al,  2015) ,  atau  sebagai  peningkat imunitas.
Keberhasilan
suatu produksi antibody  tidak  terlepas  dari  beberapa faktor,  diantaranya  adalah  antigen  yang digunakan,  jalur  dan  dosis  penyuntikan,
dan  hewan  uji  yang  digunakan.  Antigen merupakan salah satu factor keberhasilan produksi antibody. Antigen dapat berupa protein,  karbohidrat,  lipid,  asam  nukleat atau senyawa kimia yang disebut sebagai hapten  (Delves et  al .,  2011).  Hapten merupakan  senyawa  organik  kecil  yang bersifat antigenik, tetapi tidak immunogenik. Hapten dapat
dikonjugasikan dengan suatu antigen agar dapat  memicu  terbentuknya  imun  di dalam  tubuh,  sehingga  konjugat  hapten- antigen  ini  dapat  bersifat  immunogen. Hapten  dapat  terkonjugasi  dengan antigen,  dikarenakan  memiliki  gugus fungsi yang bisa bereaksi spesifik dengan protein pembawa (antigen).
Antigen harus memiliki berat molekul setidaknya 10.000 Da agar dapat
memiliki  sifat  immunogenik  (Kindt,  T., J., et  al .  2007).  Oleh  karena  itu  desain dan  sintesis  antigen  merupakan  factor awal  yang  paling  menentukan  dalam produksi  antibody.  Untuk  memastikan antigen yang digunakan, setidaknya harus dilakukan  karakterisasi  terhadap  antigen yang berhasil disintesis.
Spektrofotometer  Uv-Visible,  IR  lazim digunakan  sebagai  instrumen  untuk karakterisasi antigen. Sedangkan penggunaan NMR belum banyak diaplikasikan untuk karakterisasi antigen. Pada  riset  ini,  kami  mengembangkan suatu  metode  karakterisasi  antigen, menggunakan  NMR  sebagai  penentu keberhasilan produksi antibody. Riset ini bertujuan untuk mengembangkan metode karakterisasi  antigen  hasil  sintesis menggunakan  metode  NMR  untuk keberhasilan produksi antibody.

## METODE
Bahan  yang  digunakan  meliputi N- acryloxysuccinimide (NAS), bovine serum albumin  (BSA),  phosphate  buffer  saline (PBS),  polyethylene  glycol  (PEG)  2000, 3,3ʹ,  5,5ʹTetramethylbenzidine  (TMB), Tween  20,  goat  antirabbit  IgG-HRP, Freund’s  complete dan incomplete adjuvants, protein A antibody purification  kits, dan  berbagai  bahan kimia  dari Sigma  Aldrich.  Double
distilled water (maximum conductivity of 18  MΩ),  pap  pens, dan plastic  backing sheet dari Daido Sangyo, Japan .
Peralatan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  meliputi  microDrop  ND- 1000  spectrophotometer  UV–Visible (Thermo  Scientific  Multiscan  Go.),  a vortex  mixer  (Thermo  Scientific),  an MPW-352R centrifuge (Med Instrument), a  Fourier  Transform  Infra  Red  (FTIR; Agilent)  instrument,  an  HR-transmission electron  microscopy  (TEM;  Hitachi  H- 8100).,  dan  H  NMR  JEOL  Resonance ECZ500R.
Penelitian  ini  didesain  menjadi  4 tahap berikut:

## Tahap 1: Sintesis Antigen
0,1 mL NAS (20 mg/mL NAS dalam
DMSO)  ditambahkan  ke  dalam  1  mL BSA  (1  mg/mL  BSA  dalam  bufer  fosfat pH  8)  kemudian  di  aduk  selama  3  jam pada  suhu  36 0 C.  Larutan  kemudian  di dialisis  mengunakan  0,01  mol/L  PBS pada suhu 4 0 C selama 24 jam dengan 6 kali penggantian PBS. Dialisis dilanjutkan  dengan  air  selama  48  jam dengan  8x  penggantian  air.  Larutan kemudian di liofilisasi dan disimpan pada suhu  -20 0 C.  Hasil  konjugasi  NAS-BSA selanjutnya dilakukan karakterisasi menggunakan  spektrofotometer  Uv  dan NMR.
Tahap 2: Karakterisasi Antigen menggunakan NMR Antigen yang telah disintesis dilakukan pemurnian menggunakan filtrasi 0.45 µm. Selanjutnya dimasukkan ke  dalam  instrument  H  NMR  JEOL Resonance ECZ500R.

## Tahap 3: Produksi Antibodi
Produksi  antibody  di  awali  dengan menyuntikkan  antigen  kepada  tiga  new Zealand white rabbit betina melalui jalur penyuntikan  intramuskular  untuk  primer immunization  dan  subcutan  untuk penyuntikan lanjutan.
Tahap  4:  Karakterisasi  Antibody Menggunakan Metode ELISA.
Indirect ELISA  dilakukan  sesuai prosedur  sebelumnya  dengan  sedikit modifikasi (Wu et al, 2014; Hnasko et al, 2011).  96  sumur  ( well  plates )  dilapisi dengan  lapisan  antigen  (1  mg/L, 100µL/well)  dalam  (0,05  M,  pH  9,6) karbonat  bikarbonat  buffer  pada  suhu  4 0 C selama semalam. Microplate kemudian  dicuci  sebanyak  3  kali menggunakan  PBS  Tween-20  (PBST 0,05%)  dan  di blocked menggunakan PBST-casein 2% pada suhu 37 0 C selama 1  jam. Microplate kemudian  dicuci sebanyak  3  kali  menggunakan  PBST. Kemudian  well  diinkubasi  pada  suhu ruang  selama  1  jam  menggunakan  100 µL  serum  yang  telah  dilarutkan  dalam
PBST-casein 0.2%. Microplate kemudian dicuci  sebanyak  3  kali  menggunakan PBST.  Ditambahkan  100  µL/well HRP- conjugated goat anti-rabbit IgG (pengenceran  1:5000)  untuk  serum kelinci,  sedangkan HRP-conjugated  goat anti-guinea  pig IgG  (pengenceran 1:10000)  ditambahkan  untuk  serum marmut. 100 uL larutan substrat TMB (5 mL akuades+ 2.6 mL Na 2 HPO4 + 2.4 mL citric acid + 100 uL TMB + 10 uL H 2 O 2 ) ditambahkan  ke  dalam  microplate. Microplate kemudian  diinkubasi  pada ruang  gelap  selama  2x15  menit. Ditambahkan  100  uL  stop  solution berupa  larutan  2M  asam  sulfat. Microplate dibaca absorbansinya menggunakan  ELISA  reader  dengan  λ= 450 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Sintesis Antigen
Akrilamida merupakan molekul kecil yang  memiliki  berat  molekul  sebesar 71,09  Da,  sehingga  tidak  memiliki kemampuan  untuk  dapat  menginisiasi respon  imun.  Antigen  harus  memiliki berat molekul setidaknya 10.000 Da agar dapat  memiliki  sifat  immunogenik (Kindt,  T.,  J., et  al .  2007).  Sintesis antigen  diawali  dengan  menyiapkan hapten  yang  memiliki  struktur  mirip akrilamida. Pada umumnya, gugus fungsi
pada  hapten  diaktivasi  oleh linker sehingga  dapat  berikatan  secara  kovalen dengan  gugus  amina  pada  protein membentuk  ikatan  amida.  Sedangkan pada penelitian ini tidak digunakan linker untuk  mengkonjugasi  hapten  dengan antigen.  Konjugasi  dapat  berlangsung dikarenakan  terjadi  alkilasi  gugus  –SH dan  –NH  pada  protein  sehingga  dapat kehilangan  ikatan  vinil.  Oleh  karena  itu, hapten  dapat  membentuk  ikatan  dengan protein  sehingga  terbentuk  konjugat hapten-antigen (Zhou et al, 2008).
Konjugat hapten-antigen yang diperoleh  berupa  larutan  yang  agak kental  dan  tak  berwarna. Yield yang diperoleh adalah 16 mL dari 2 mL larutan NAS ditambah 20 mL larutan BSA yang direaksikan  selama  3  jam  dan  didialisis. Konjugat  ini  kemudian  diberi  label antigen  NAS-BSA  dan  disimpan  pada
suhu  4 0 C  untuk  dilakukan  karakterisasi spektrofotometer Uv dan NMR.

## Karakterisasi  Antigen  menggunakan NMR
Karakterisasi dilakukan menggunakan Nuclear Magnetic Resonance  (NMR)  terhadap  antigen NAS-BSA sebagai sampel serta akrilamida  dan  NAS  komersil  sebagai standar.  Dengan  NMR  diharapkan  akan terlihat  struktur  ujung  hapten  pada antigen  NAS-BSA,  sehingga  dapat menambah  keyakinan  bahwa  antigen NAS-BSA  telah  terbentuk.  Karakterisasi ini  dilakukan  di  Kimia,  LIPI,  Serpong, Banten,  Indonesia.  JEOL  Resonance ECZ500R  digunakan  untuk  memperoleh hasil  H  NMR.  Berikut  adalah  hasil karakterisasi menggunakan NMR diberikan pada Gambar 1.
Berdasarkan  data 1 H-NMR  (D 2 O, 500  MHz),  antigen  yg  terbentuk mempunyai  1  buah  metilen  (CH 2 ) olefinik  pada  pergeseran  kimia  δ H 6,27 ppm  dengan  integral  sebanyak  4. Selanjutnya,  antigen  memiliki  1  buah metin (CH) sp 2 pada pergeseran kimia δ H 5,73  ppm  dengan  integral  sebanyak  2 yang  diduga  adanya  gugus  akrilamida yang  terbentuk.  Berdasarkan  kedua pergeseran  ini,  diduga  memiliki  struktur yang ditunjukan pada Gambar 2.
Gambar 2. Struktur antigen hasil pembacaan spektrum 1 H-NMR
Hasil karakterisasi ini juga dilakukan menggunakan  spektrofotometer  Uv-Vis, sebagai  bahan  perbandingan.  Berikut adalah data hasil spektrofotometer Uv:
Berdasarkan karakterisasi spektrofotometer Uv, BSA murni mempunyai  puncak  absorpsi  spesifik pada panjang gelombang 219 dan 275nm, ketika  BSA  dikonjugasikan  dengan hapten,  akan  menunjukkan  serapan  pada panjang  gelombang  yang  sama  dengan nilai absorbansi yang berbeda. Perbedaan absorbansi  ini  menunjukkan  sejumlah hapten  yang  terkonjugasi  pada  protein (Eleftherios, 1996). Karakterisasi
konjugat  menggunakan  spektrofotometer Uv-vis  dilakukan  untuk  membandingkan serapan  konjugat  NAS-BSA  dengan BSA.  Gambar  3  menunjukkan  spektrum absorbansi  NAS-BSA  dengan  BSA. Spektrum  absorbansi  BSA  menunjukkan absorbansi  maksimum  pada  panjang gelombang  229  dan  275nm.  Hal  yang sama  juga  ditunjukkan  oleh  spektrum absorbansi  NAS-BSA  yang  memiliki panjang  gelombang  maksimum  yang tidak  berbeda  secara  signifikan  dengan BSA. Tetapi konjugat NAS-BSA mengalami penurunan absorbansi dibandingkan  dengan  BSA.  Hal  ini menunjukkan bahwa NAS telah terkonjugasi  dengan  sebagian  dari  BSA hingga  membentuk  konjugat  NAS-BSA. Penurunan absorbansi BSA menunjukkan semakin  tinggi  konsentrasi  konjugatnya (Dixit, 1986).
Terdapat  perbedaan  pada  absorbansi NAS-BSA  dengan  BSA.  Perbedaan absorbansi  ini  menunjukkan  sejumlah hapten  telah  terkonjugasi  pada  protein, sehingga  diperoleh  konjugat  NAS-BSA yang tunjukkan pada Gambar 3.
Dengan  demikian,  berdasarkan  hasil analisis  spektrum  Uv  dapat  disimpulkan bahwa NAS-BSA telah berhasil dikonjugasi. Konjugat yang telah dikonjugasi  memiliki  memiliki  ujung hapten  yang  struktur  nya  mirip  dengan
O NH- Protein δ = 6.27 δ = 5 .73
struktur  akrilamida.  Gambaran  hapten ditunjukkan pada Gambar 4.
Gambar 3. Spektrum UV-Visible BSA dan NAS-BSA
Gambar 4. Struktur kimia akrilamida, NAS, dan konjugat NAS-BSA
Baik hasil karakterisasi menggunakan  NMR  ataupun  Uv-Vis menunjukkan bahwa NAS yang terkonjugasi  sempurna  dengan  BSA, akan  menghasilkan  konjugat  NAS-BSA sebagai antigen (Zhou et al, 2008).

## Produksi Antibodi
Produksi  antibody  dilakukan  setelah antigen berhasil disintesis yang dibuktikan dengan karakterisasi
menggunakan NMR dan Uv Vis. Antigen kemudian  disuntikkan  kepada  tiga  new Zealand white rabbit betina melalui jalur penyuntikan  intramuskular  untuk  primer immunization  dan  subcutan  untuk penyuntikan  lanjutan.  Pemilihan  jalur penyuntikan  ini  memberikan  pengaruh
yang  sangat  kuat  terhadap  organ  mana yang akan dilibatkan di dalam
pembentukan  respon  imun  (Kindt,  T.,  J., et  al .  2007).  Identifikasi  titer  antibody setiap tahapan boosting diguided menggunakan  ELISA  (Wu  et  al,  2014;
Akter  et  al,  2017;  Hnasko  et  al,  2011; Kong et al, 2016).

## Karakterisasi  Antibody  Menggunakan Metode ELISA.
Karakterisasi  antibody  dilakukan menggunakan  metode Indirect ELISA.
Metode Indirect ELISA  dilakukan terhadap  serum  kelinci  untuk  setiap boosting.  Tahap  ini  dilakukan  untuk mengetahui  perolehan  titer  antibodi kelinci  untuk  setiap  boosting.  Adapan sampel  kontrol  positif  yang  digunakan adalah  serum  kelinci  yang  disuntik antigen,  sampel  kontrol  negatif  yang digunakan  berupa  larutan  aquades,  dan antigen yang digunakan berupa akrilamida. Berikut  adalah  diagram  OD hasil pembacaan ELISA reader pada λ = 450 nm  yang  ditunjukkan  pada  Gambar  5  dan Tabel 1.
Gambar 5. Diagram OD ELISA untuk setiap boosting
Akrilamida (N- acryloxysucciniimide) Antigen NAS-BSA
Tabel 1 . Nilai OD, S/P ratio , dan titer serum
untuk setiap boosting
Boosting OD S/P titer 1 0.499 0.286 28.634 2 0.448 0.249 24.927 3 0.548 0.322 32.195 4 0.841 0.535 53.488 5 0.952 0.616 61.555 6 1.14 0.752 75.218 7 1.141 0.753 75.291
Hasil Indirect ELISA  menunjukkan bahwa mulai boosting ke 4 menunjukkan reaksi  yang  positif  untuk  antibodi  yang spesifik  terhadap  akrilamida,  diagram terus  menunjukkan  kenaikan  hingga
boosting  ke  7.  Hal  ini  ditunjukkan dengan  nilai  titer  yang  naik  secara signifikan  mulai  boosting  ke  4  (tabel 4.25). Oleh karena itu, panen darah untuk tahap  produksi  antibody  dapat  dilakukan mulai boosting ke 4 hingga ke 7.
Metode Indirect ELISA  juga  dilakukan untuk  antigen  lainnya  yang  mirip akrilamida, diantaranya adalah NAS, dan NAS-BSA.  Hal  ini  dilakukan  untuk melihat  spesifisitas  antibody  terhadap antigen  yang  disuntikannya.  Berikut adalah  diagram  OD  hasil  pembacaan ELISA  reader  pada  λ  =  450  nm  yang ditunjukkan pada Gambar 6.
Gambar 6. Diagram OD ELISA setiap boosting untuk antigen yang mirip akrilamida
OD hasil pembacaan ELISA
menunjukkan hasil yang cukup signifikan terutama  untuk  senyawa  senyawa  kimia yang memiliki struktur mirip akrilamida. Berdasarkan  diagram  4.27,  Diagram antigen  NAS  yang  berwarna  biru
menunjukkan  kenaikan  yang  cukup signifikan  untuk  antibodi  terhadap  NAS mulai pada boosting ke 2 dan 3, dan terus menunjukkan  kenaikan  hingga  boosting ke  7.  Hal  yang  sangat  berbeda  terlihat untuk  antigen  NAS-BSA,  diagram
𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑓 𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜 = 𝑂𝐷𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 − 𝑂𝐷𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓
𝑂𝐷𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑓 − 𝑂𝐷𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓
𝑇𝑖𝑡𝑒𝑟 = 𝑆 𝑃 𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜 𝑥 100
menunjukkan  kenaikan  yang  sangat signifikan  pada  awal  boosting  ke  2, tetapi,  setelah  boosting  ke  2  tidak  ada kenaikan lagi, dan stabil hingga boosting ke  7.  Hal  ini  diduga  dikarenakan  NAS merupakan  bahan  utama  pembentuk antigen NAS-BSA, maka dengan mudahnya sistem imun kelinci mengenali dan  mencetak  NAS  sebagai  benda  asing di  dalam  tubuhnya  sehingga  dihasilkan antibodi anti terhadap NAS.
Begitu  juga  untuk  antibodi  NAS- BSA,  yang  mulai  terbentuk  dengan drastis  pada  boosting  ke  2.  Hal  ini menunjukkan bahwa,
NAS-BSA
merupakan  kandungan  utama  yang
kelimpahannya  sangat  banyak  di  dalam antigen yang disuntikkan pada kelinci.Selain  itu,  antigen  NAS-BSA memiliki  bobot  molekul  yang  sangat besar yaitu >60.000 Dalton, sehingga hal ini  sangat  mudah  dikenali  oleh  tubuh kelinci sebagai antigen, karena salah satu persyaratan  antigen  adalah  memiliki bobot molekul >10.000 Dalton (Wibawan et al., 2013). Oleh karena itu, berdasarkan data Indirect ELISA  antibody  yang disuntikan  menggunakan  antigen  NAS- BSA  menghasilkan  antibody  yang  anti terhadap  akrilamida,  NAS,  dan  NAS- BSA.

## KESIMPULAN
Kesimpulannya, kami telah melakukan
karakterisasi antigen menggunakan  NMR  yang  menunjukkan bahwa NAS telah terkonjugasi sempurna dengan  BSA  dan  menghasilkan  suatu konjugat  NAS-BSA.  Hal  ini  ditunjukkan dengan  adanya  1  buah  metilen  (CH 2 ) olefinik  pada  pergeseran  kimia  δ H 6,27 ppm  dengan  integral  sebanyak  4  dan memiliki  1  buah  metin  (CH)  sp 2 pada pergeseran  kimia  δ H 5,73  ppm  dengan integral sebanyak 2. Spektrofotometer Uv Vis kemudian digunakan untuk
memperkuat  data  ini.  Selanjutnya, konjugat NAS-BSA yang telah disintesis memenuhi  persyaratan  sebagai  antigen yang  mampu  menghasilkan  antibody yang  spesifik.  Hal  ini  ditunjukkan  dari antibody  anti  NAS-BSA,  NAS,  dan Akrilamida  yang  mulai  muncul  pada boosting  kedua,  ketiga  dan  keempat (berturut-turut).

## ACKNOWLEDGEMENT
Terimakasih penulis ucapkan kepada Kimia, LIPI atas kesempatannya menggunakan NMR untuk penelitian ini.

## DAFTAR RUJUKAN
Akter  T,  Atanelishvili  I,  Noguchi  A,
Silver RM, Bogatkevich GS.
Establishment  of  an  indirect  ELISA for detection of the novel antifibrotic peptide  M10.  PLoS  One  2017; 12(11):e0188588;
https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0188588
Arora  S,  Ayyar  BV,  O’Kennedy  R.
Affinity chromatography for antibody  purification.  Methods  Mol Biol 2014;4 1129:497–516;
https://doi.org/10.1007/978-1-62703-

## 977-2_35
Choe  W,  Durgannavar  T,  Chung  S.  Fc- binding  ligands  of  immunoglobulin G:  an  overview  of  high  affinity proteins  and  peptides.  Materials
2016;
9(12):994; https://doi.org/10.3390/ma9120994
Delves, P. J., Martin, S. J., Burton, D. R.,
Roitt,  I.  M.  2011. Essential Immunology .  Twelfth  edititon.  New York: John Wiley & Sons, pp: 54-36.
Dixit R., Das M., Seth P. K., Mukhtar H. (1986).  Interaction  of  Acrylamide with  Bovine  Serum  Albumin. Environmental  Research ,  40,  365-
371.
Eleftherios, P., Diamandis. Theodore, K., Christopoulos.  1996.  Immunoassay. Academic Press. 1st Edition.
Hnasko R, Lin A, McGarvey JA, Stanker LH.  A  rapid  method  to  improve protein  detection  by  indirect  ELISA. Biochem  Biophys  Res  Commun 2011;
410(4):726–31;
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2011.0 6.005
Ji  F,  Mokoena  MP,  Zhao  H,  Olaniran AO,  &  Shi  J.Development  of  an immunochromatographic  strip  test for the rapid detection of zearalenone in  wheat  from  Jiangsu  province,
China. PLoS One 2017; 12(5):e0175282;
https://doi.org/10.1371/journal.pone.
0175282
Kindt,  T.,  J.,  Goldsby,  R.,  A.,  Osborne, B.,  A.  (2007).  Immunology.  W.H.
Freeman and Company
Kong  D,  Xie  Z,  Liu  L,  Song  S,  Kuang H,Cui  G,  Xu  C.  Development  of indirect  competitive  ELISA  and lateral- flow immunochromatographic  assay  trip for  the  detection  of  sterigmatocystin in  cereal  products.  Food  Agric Immunol 2016; 28(2):260–70;
https://doi.org/10.1080/09540105.20
16.1263985
Putri  DD,  Handharyani  E,  Soejoedono RD,  Setiyono  A,  Poetri  ON. Production  and  characterization  of
Newcastle  disease  antibody  as  a reagent to develop a rapid immunodiagnostic  test  tool.  Vet World 2018; 11:895–901;
https://doi.org/10.14202/vetworld.20
18.895-901
Tam  JO,  de  Puig  H,  Yen  C,  Bosch  I,
Gómez-Márquez J, Clavet C, et al. A comparison  of  nanoparticle-antibody conjugation  strategies  in  sandwich immunoassays. J Immunoassay Immunochem  2016;  38(4):355–77;
https://doi.org/10.1080/15321819.20
16.12693 38 Wu J, Shen YD, Lei HT, Sun YM, Yang
JY, Xiao ZL, et al. Hapten synthesis and  development  of  a  competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay for acrylamide in food samples. J Agric Food Chem 2014; 62(29):7078–84; https://doi.org/10.1021/jf5015395 Zhou  S,  Zhang  C,  Wang  D,  Zhao  M. Antigen  synthetic  strategy  and immunoassay development for detection  of  acrylamide  in  foods. Analyst 2008; 133(7):903–9; https://doi.org/10.1039/b716526a