## KARAKTER MORFOLOGI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER DENGAN MARKA
GEN CO1 PADA MIMI ( Tachypleus gigas ) DI PERAIRAN UTARA PULAU JAWA

## MORPHOLOGICAL CHARACTER AND MOLECULAR IDENTIFICATION WITH COI GENE MARKER OF HORSESHOE CRABS (Tachypleus gigas) AT COASTAL WATERS OF NORTHERN JAVA ISLAND
Lusita Meilana 1* , Yusli Wardiatno 2 , Nurlisa A Butet 2 , dan Majariana Krisanti 2 1 Sekolah Pascasarjana, P.S. Pengelolaan Sumber Daya Perairan, IPB, Bogor
2 Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, FPIK-IPB, Bogor
* E-mail: lusitameilana@yahoo.co.id

## ABSTRACT
The  existence  of  horseshoe  crabs  Tachypleus  gigas  is  currently  on  the  threatened  condition  and  its population  status  is  also  unclear.  The  objectives  of  this  research  were  to  asses  the  horseshoe  crabs morphological characters and to identify based on molecular marker of Cytochrome Oxydase Subunit I (COI) gene. The samples were collected from five locations (Segara Menyan Subang, Ujung Kulon Banten,  Tambak  Lorok  Semarang,  Betah Walang  Demak,  and  Kenjeran  Surabaya)  in  October  2014 until June 2015. A total of 27 parameters for 62 individuals were used to determine connectivity and character identifier among populations. Data were tested using non-parametric analysis. While, the 5 individuals  from  each  sites  were  used  for  molecular  analysis  including  several  stages  of  the  DNA extraction,  DNA  electrophoresis,  amplification  and  visualization  of  DNA  fragments,  and  DNA sequencing. The results obtained based on morphological characters that T. gigas of Surabaya formed a unique group due to its body size (X1-X2 and X4-X16) was larger than the other 5 body parts (X22, X23, X26-X28) of Semarang, Demak, Subang, and Banten. According to molecular results, there were 650 bp conserve nucleotide sequences. Analysis using software MEGA 5.0 showed that there were 73 existence of specific nucleotide sites that can be used to distinguishes between T. gigas in-groups  and out-groups  (T.  gigas  from  Central  Arabian  Sea,  T.  tridentatus  from  Sweden,  and  Carcinoscorpius rotundicauda from USA).
Keywords: horseshoe crabs, Java coast, morphology, identification molecular, CO1 gene.

## ABSTRAK
Keberadaan  spesies  mimi T.  gigas saat  ini  sudah  pada  kondisi  terancam  dan  status  populasinya  juga belum  diketahui  dengan  jelas.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  meneliti  karakteristik  morfologi mimi  berdasarkan  27  karakter  morfologi  dan  mengidentifikasi  mimi  berdasarkan  marka  gen Cyto- chrome Oxydase Subunit I (COI). Sampel  diambil dari lima lokasi (Segara Menyan Subang,  Ujung Kulon Banten, Tambak Lorok Semarang, Betah Walang Demak, dan Kenjeran Surabaya) pada bulan Oktober  2014  sampai  Juni  2015.  Sebanyak  27  karakter  morfologi  dari  62  individu  digunakan  untuk mengetahui  konektivitas  dan  karakteristik  antar  populasi.  Pengujian  data  dilakukan  dengan menggunakan  analisis  non-parametrik.  Sedangkan,  5  individu  dari  masing  masing  lokasi  digunakan untuk  analisis  molekuler  yang  meliputi  beberapa  tahapan  diantaranya  yaitu  ekstraksi  DNA  genomik, elektroforesis  DNA,  amplifikasi  dan  visualisasi  fragmen  DNA,  serta  sekuensing  DNA.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa T.  gigas Surabaya  membentuk  kelompok  tersendiri  karena  memiliki ukuran tubuh (X1-X2 dan X4-X16) lebih besar dan 5 anggota tubuh (X22, X23, X26-X28) yang relatif lebih  besar  dibandingkan  Semarang,  Demak,  Subang,  dan  Banten.  Tidak  terdapat  konektivitas  antar populasi  berdasarkan  karakter  mor-fologi.  Dihasilkan  nukleotida  dengan  panjang  650  pb  bersifat conserve . Analisis  menggunakan soft-ware MEGA 5.0 menunjukkan sebanyak 73 situs spesifik yang merupakan penciri yang membedakan T. gigas in groups dengan T. gigas dari Central Arabian Sea, T. tridentatus dari Sweden dan Car-cinoscorpius rotundicauda dari USA sebagai outgroups.
Kata kunci: mimi, pesisir Pulau Jawa, morfologi, identifikasi molekuler, gen CO1.

## I. PENDAHULUAN
Mimi  atau  Belangkas  merupakan  he- wan  dari  famili  Limulidae  yang  dikenal sebagai living fossils dan phylogenetic relicts (Selander et  al .,  1970).  Hewan  ini  telah  me- ngalami  diversifikasi  sejak  zaman  paleogene (65-23 Mya) (Obst et al., 2012) dan di Indo- nesia  merupakan salah  satu sumber daya ge- netik  yang  dilindungi  sesuai  dengan  SK Menteri  Kehutanan  No.  12/Kpts-II/1987  dan Peraturan Pemerintah RI No. 7/1999 (Mulya, 2004;  Rubiyanto,  2012).  Hingga  saat  ini, empat spesies mimi yang masih ada di dunia, yaitu Limulus  polyphemus (Linnaeus,  1758) hanya  terdapat  di  pantai  Atlantik  Amerika Utara  (Walls et  al., 2002),  dan  ke-3  lainnya merupakan spesies Asia, yaitu Tachypleus gi- gas (Muller,  1785) ,  Tachypleus  tridentatus (Leach, 1892), dan Carcinoscorpius rotundi- cauda (Lattreille,  1802)  (Christianus  and Saad, 2007; Lee and Morton, 2005). Kebera- daan  ketiga  spesies  Asia  tersebut  dinyatakan near  threatened oleh  IUCN  (2010), threate- ned (2014)  dan data deficient (2015),  se- dangkan  untuk L.  polyphemus adalah lower risk/near threatened (IUCN, 2015).
Mimi  merupakan  hewan  yang  memi- liki  peranan  penting,  baik  secara  ekonomi maupun  ekologi.  Secara  ekonomi,  mimi  di- manfaatkan sebagai hewan umpan untuk me- nangkap  ikan  sembilang  ( Euristhmus  micro- ceps )  di  Perairan  Kuala  Tungkal  Jambi  (Ru- biyanto,  2012),  belut  ( Anguilla  rostrata ),  si- put  besar  (Ferari  and  Targett,  2003),  dan whelk ( Busycon carica dan B.canaliculatum ) (Novitsky et  al., 2002 ) . Ratusan  mimi  setiap minggunya  ditangkap  di  Sadeli  Kechil  dan Johor pantai timur Malaysia dan diekspor ke Thailand  (Christianus  and  Saad,  2007). T. tridentatus di  Hongkong  menjadi  makanan dijual di restoran (Shin et al., 2009), sedang- kan di Thailand dan Malaysia, ketiga spesies mimi  Asia  ini  dikonsumsi  sebagai  makanan eksklusif (Christianus and Saad, 2007). Pera- nan mimi di bidang medis yaitu haemolymph dari C.  rotundicauda dapat  menetralisir tetrodotoxin  (TTX)  (Yeo et  al., 1996).  Sel
darah L. polyphemus digunakan oleh industri medis  untuk  mensterilkan  produk  medis  dan farmasi  (Hurton,  2003)  karena  dalam  darah- nya  mengandung Limulus  Amebocyte  Lysate (LAL)  yang  dapat  mendeteksi  endotoksin pada  darah  manusia  begitu  juga  dengan  ge- nus Tachypleus menghasilkan Tachyplesin Amoebocyt Lysate (TAL) yang dapat mende- teksi  endotoksin  bakteri  Gram  negatif,  men- deteksi endotoksin darah manusia, dan meng- uji obat bahwa bebas dari bakteri patogen se- belum  dikonsumsi  oleh  manusia  (Novitsky, 1994).  Sel  darah C.  rotundicauda sebagai imun  aktif  saat  terjadi  infeksi  (Ding et  al., 2005)  dan  menghasilkan Carcinoscorpius Amoebocyt Lysate (CAL) (Novitsky, 1994). Secara ekologi, mimi memiliki peran- an  dalam  penyeimbang  rantai  makanan  dan sebagai  sumber  protein  bagi  setidaknya  20 spesies burung pantai yang bermigrasi (Dietl et al., 2000; Harrington, 2001; Beekey et al., 2013).  Mimi  juga  berperan  sebagai  biotur- bator  dan  mengendalikan  hewan  bentik  in- vertebrata  (Smith,  2007;  John et  al., 2012). Selain  itu,  mimi  juga  dikonsumsi  oleh  mo- nyet  mangrove  ( Macaca  fascicularis )  (Rubi- yanto, 2012).
Mimi  mempunyai  risiko  kepunahan yang  tinggi  akibat  adanya  degradasi  habitat, reklamasi,  pencemaran,  perburuan  komersial (Mishra, 2009), hilangnya habitat dan sumber makanan,  perubahan  kondisi  air,  serta  pe- ningkatan  predasi  (Hu et  al., 2009).  Seperti yang  terjadi  di  India,  Hongkong  dan  Singa- pura  (Shin et  al., 2009;  Taylor et  al., 2011). Tahun  1990  populasi  mimi T.  gigas di  Bal- ramgari India tercatat sebanyak 306 individu yang  didapat  dalam  transek  sepanjang  200 meter (Chatterji et al., 1992) dan pada tahun 1996  jumlah  populasinya  menurun  menjadi 220  individu.  Begitu  pula  di  Hongkong,  pe- ngamatan  pada  bulan  Mei-Desember  2002 tercatat densitas juvenil T. tridentatus di Pak Nai  adalah  1,97  individu  /100  m 2 dan  dua lokasi  di  Hak  Pak  Nai  adalah  1,55  individu/ 100  m 2 dan  1,14  individu/100  m 2 (Chiu  and Morton,  2004)  dan  pada  September  2004- Februari  2005  tercatat  densitasnya  adalah
0,08 individu /100 m 2 , 0,16 individu /100 m 2 dan  0,23  individu  /100  m 2 (Li,  2008).  Kate- gori  rendahnya  kepadatan  mimi  juga  terjadi di salah satu perairan Indonesia yaitu di Per- airan  Kuala  Tungkal,  kepadatan  mimi C. rotundicauda dan T. gigas terhitung  masing- masing  0,62  individu/100  m 2 dan  0,02  indi- vidu/100 m 2 (Rubiyanto, 2012).
Penelitian  terkait  mimi  telah  banyak dilakukan di berbagai negara, namun di Indo- nesia  penelitian  mengenai  keanekaragaman genetik  mimi  masih sangat jarang dilakukan. Penelitian terkait mimi di Indonesia diantara- nya aspek biologi reproduksi (Fachrul, 1989; Eidman,  1992;  Purnomo,  1992;  Eidman, 1997;  Mulya,  2004;  Muslihah,  2004),  per- kembangan  embrio  (Santoso,  1992;  Balisa- ni, 1994; Ismurwanti, 1994; Rahmalia, 1995; Vauziyah,  1995),  morfometrik  (Suparta, 1992),  dan  studi  populasi  mimi  (Rubiyanto, 2012).
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  di- lakukan  oleh  Suparta (1992)  mengenai  kera- gaman  sifat-sifat  morfometrik T.  gigas & C. rotundicouda di  perairan  pantai  Kabupaten Pandeglang  dan  perairan  pantai  Kabupaten Rembang  bahwa  terdapat  mimi  yang  tidak teridentifikasi  secara  morfologi  dan  telah  di- duga merupakan spesies baru sehingga dibu- tuhkan analisis  secara genetik.  Genetika  mo- lekuler  dibutuhkan  terkait  dengan  ketepatan mengidentifikasi spesies dan mendukung ha- sil  identifikasi  berdasarkan  sifat  morfologi. Identifikasi  suatu  organisme  mulai  spesies hingga subspesies secara akurat terhadap ber- bagai  spesies  yang  sulit  dibedakan  secara morfologi  dapat  menggunakan  DNA barco- ding (Hebert et al., 2003). Salah satu kelom- pok gen  yang dapat dijadikan  sebagai  marka molekuler  untuk  penentuan  spesies  adalah gen Cytochrome  Oxydase subunit I (COI) pada DNA mitokondria (Solihin, 1994). COI pada  mitokondria  merupakan  gen  yang  ber- evolusi  cepat  dibandingkan  gen  12S  rRNA dan 16S rRNA. Gen tersebut memiliki variasi yang  sedikit sehingga dapat digunakan seba- gai  DNA barcoding serta  sedikit  mengalami delesi  dan  insersi  dalam  sekuennya  (Hebert
et  al., 2003).  Oleh  karena  itu,  dibutuhkan data mengenai karakter morfologi yang didu- kung oleh ketepatan identifikasi secara mole- kuler  mimi  dalam  penelitian  ini  yaitu T.  gi- gas yang  ada  di  Indonesia  sebagai  implikasi konservasi  dan  manajemen  serta  informasi pembanding  negara  lain.  Tujuan  penelitian ini  adalah  untuk  mengkaji  karakteristik morfologi  mimi  berdasarkan  27  karakter morfologi  dan  mengidentifikasi  mimi  berda- sarkan  marka  gen Cytochrome  Oxydase Subunit I (COI).

## II. METODE PENELITIAN

## 2.1. Lokasi Pengambilan Sampel
Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan Oktober  2014  sampai  Juli  2015  dengan  pe- ngambilan  sampel  mimi  spesies T . gigas pada lima  lokasi di Pulau Jawa,  yaitu Segara Menyan Subang, Ujung Kulon Banten, Tam- bak Lorok Semarang, Betah Walang Demak, dan  Pantai  Kenjeran  Surabaya  (Gambar  1). Analisis  morfometrik  dilaksanakan  di  Labo- ratorium  Biologi  Makro  1,  Departemen Manajemen Sumber Daya Perairan, Fakultas Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,  Institut Pertanian  Bogor  dan  di  lapangan  langsung. Sedangkan  analisis  molekuler  dilakukan  di Laboratorium Biologi Molekuler Departemen Manajemen  Sumber  Daya  Perairan  dan Laboratorium  Terpadu  Fakultas  Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

## 2.2. Pengambilan Sampel 2.2.1. Morfologi
Pengambilan  sampel  menggunakan metode random  sampling ,  contoh  mimi  di- ambil dengan menggunakan jaring yang dija- lankan  oleh  kapal  nelayan  atau  langsung  di- ambil  dengan  tangan.  Mimi  yang  tertangkap jaring  dibawa  kedaratan  dan  diukur  secara hidup-hidup.  Setelah  dilakukan  pengukuran mimi  kemudian  dikembalikan  ke  habitatnya. Sebanyak  62  individu  digunakan  untuk  ana- lisis  morfologi.  28  karakter  morfometrik mimi  diukur  pada  tiap  sampel  (Gambar  2). Begitu juga dengan 14 karakter fenotipe
Gambar 1. Peta lokasi pengambilan Tachypleus gigas pada daerah Banten, Subang,
Semarang, Demak, dan Surabaya.
Gambar  2.  Karakter  morfometrik  mimi.  Keterangan:  1=panjang  total,  2=panjang  telson,  3= panjang  badan,  4=panjang  prosoma,  5=panjang  median  ridge,  6=panjang  depan occeli,  7=panjang  ophistoma,  8=tebal  ventral  messel,  9=lebar  maksimum prosoma, 10=jarak antar mata majemuk, 11=jarak antar auriculata spine, 12=jarak antar marginal process, 13=jarak antar sudut posterior, 14=jarak antar sudut anal, 15= tinggi pertengahan telson, 16=lebar pertengahan telson, 17=panjang marginal spine 1, 18=panjang marginal spine II, 19=panjang marginal spine III, 20=panjang marginal spine IV, 21=panjang marginal spine V, 22=panjang marginal spine VI, 23=diameter capit chelicera, 24=diameter capit pedipalpi, 25=diameter capit kaki jalan  I,  26=diameter  capit  kaki  jalan  II,  27=diameter  capit  kaki  jalan  III,  28= diameter capit kaki jalan IV.
(warna  badan, bentuk frontal  prosoma, ben- tuk  duri  prosoma,  duri  ophistoma  dan  pro- soma,  ukuran  sudut  anal,  bentuk  sudut  anal, bentuk  telson,  duri  marginal,  gerigi  pada telson,  bagian  depan  operkulum,  pedipalp  1, pedipalp  2,  ukuran  duri  marginal,  dan  tebal lapis cangkang).
Karakter  morfometrik  mimi  yang  te- lah  diukur  diantaranya  yaitu  XX1:  (1.  Pan- jang  total  (X1),  2.  Panjang  telson  (X2),  3. Panjang  badan  (X3),  4.  Panjang  prosoma (X4),  5.  Panjang  median  ridge  (X5),  6.  Pan- jang depan occeli (X6), 7. Panjang ophistoma (X7), 8. Tebal  ventral  messel (X8), 9. Lebar maksimum  prosoma  (X9),  10.  Jarak  antar mata  majemuk  (X10),  11.  Jarak  antar  auri- culata  spine  (X11),  12.  Jarak  antar  marginal process (X12), 13. Jarak antar sudut posterior (X13),  14.  Jarak  antar  sudut  anal  (X14),  15. Tinggi  pertengahan  telson  (X15),  16.  Lebar pertengahan  telson)  (X16).  XX2:  (17.  Pan- jang  marginal  spine  1  (X17),  18.  Panjang marginal  spine  II  (X18),  19.  Panjang  mar- ginal  spine  III  (X19),  20.  Panjang  marginal spine  IV  (X20),  21.  Panjang  marginal  spine V  (X21),  22.  Panjang  marginal  spine  VI (X22),  23.  Diameter  capit  chelicera  (X23), 24. Diameter capit pedipalpi (X24), 25. Dia- meter  capit  kaki  jalan  I  (X25),  26.  Diameter capit  kaki  jalan  II  (X26),  27.  Diameter  capit kaki  jalan III (X27), 28. Diameter capit kaki jalan  IV  (X28)).  Jantan  dan  betina  dapat  di- lihat  dari  karakter  capit  pedipalpi  dan  capit kaki  jalan  I.  Ciri  pada  jantan  yaitu,  capit pedipalpi dan capit kaki jalan I membengkok dan  besar,  sedangkan  pada  betina  sama dengan  kaki  jalan  yang  lainnya  kecil  dan lurus.  Setelah  dilakukan  pengukuran  mimi kemudian dilepaskan kembali.

## 2.2.2. Molekuler
Satu  sampel  dari  tiap  lokasi  diambil darahnya untuk keperluan analisis molekuler. Tahapan analisis molekuler meliputi ekstraksi  DNA  genomik,  elektroforesis DNA,  amplifikasi  dan  visualisasi  fragmen DNA,  dan  sekuensing  DNA.  Sebanyak  satu contoh  dari  masing-masing  lokasi  diambil
sampel darah sebanyak 250 µl darah yang te- lah  diawetkan  dengan  alkohol  absolut  (1:2). Pencucian  dilakukan  dengan  akuades  seba- nyak 3 kali untuk menghilangkan kandungan alkohol.  Ekstraksi  DNA  dilakukan  meng- gunakan  kit  komersial  ( Gene  Aid, Taiwan) berdasarkan  prosedur  manual  pabrik  dengan beberapa  modifikasi.  Hasil  isolasi  kemudian dilakukan pengujian kualitas DNA total yaitu dengan elektroforesis. Pembacaan DNA total pada gel agarosa 1,2% menggunakan  larutan buffer TAE1x dan pewarnaan dengan  meng- gunakan  etidium  bromida 5  μl.  Berdasarkan hasil elektroforesis, DNA  yang  memiliki ku- alitas  baik  (pita  DNA  terlihat  jelas)  dapat dilanjutkan  ke  tahap  amplifikasi  fragmen DNA gen  CO1.  Amplikasi ruas gen COI di- lakukan  menggunakan  kit  komersial Kapa Ekstra  HotStart dengan  teknik  PCR  ( Poly- merase  Chain  Reaction ).  Primer  yang  digu- nakan adalah primer universal (primer F for- ward dan F riverse ) yang didesain oleh Butet (2013, unpublished  data ).  Tahapan  amplifi- kasi  yang  digunakan  adalah  predenaturasi (suhu 95 ° C selama 3 menit), denaturasi (suhu 95 ° C selama 1  menit), annealing (suhu 52 ° C selama 1 menit), elongasi (suhu 72 ° C selama 1 menit) sebanyak 35 siklus, post PCR (suhu 72 ° C  selama  5  menit),  dan storeage (suhu 15 ° C  selama  10  menit).  Kemudian  produk PCR  divisualisasikan  pada  gel  aragosa  1.2% dengan  metode  elektroforesis.  Produk  PCR yang  memiliki  kualitas  baik  kemudian  dila- kukan sekuensing yaitu untuk mengetahui ru- nutan basa-basa nukleotida penyusun gen tar- get.  Sekuensing  dilakukan  di  Singapura  de- ngan metode sanger.

## 2.3. Analisis Data 2.3.1. Morfologi
Analisis data karakter morfologi dian- taranya membentuk konstruksi pohon fenetik berdasarkan  14  karakter  morfologi  dengan aplikasi  PAUP.  Analisis  statistik  yang  digu- nakan  yaitu  uji  Kruskal-Wallis  untuk  kom- parasi  karakter  morfometrik  di  semua  wila- yah  dengan  aplikasi  SPSS  17,  uji  Mann- Whitney untuk  menentukan  karakter  penciri
bagi masing-masing populasi  mimi antar po- pulasi dengan SPSS 17, analisis Multinomial logistic yaitu  untuk  menguji  konektivitas antar lokasi dengan SPSS 16. Analisis kluster untuk  melihat kelompok-kelompok  yang ter- bentuk  berdasarkan  karakter  morfometrik yang diukur dengan SPSS 16.

## 2.3.2. Molekuler
Analisis  data  molekuler  diantaranya jarak  genetik  yaitu  untuk  mengetahui  besar perbedaan basa nukleotida mimi dari masing- masing  wilayah  dengan  MEGA  5.0  dan  po- hon  filogeni  untuk  mengetahui  hubungan kekerabatan antarspesies dengan MEGA 5.0.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1. Hasil
3.1.1.  Morfologi T. gigas
Dari  sampel  yang  diambil  secara acak,  diperoleh  sebanyak  62  individu  dari lima  lokasi  yaitu,  6  ekor  jantan  dari  Banten, 19 ekor betina dari Subang, 1 ekor jantan dan 2  betina  dari  Semarang,  10  jantan  dan  13 betina dari Demak, 7 jantan dan 4 betina dari Surabaya  (Tabel  1).  Ketidak-seimbangan kelimpahan, antara  jantan dan betina, diduga adanya masa dimana mimi  jantan yang tidak memiliki  pasangan  berkumpul  di  pantai  dan bertindak  sebagai  satelit  untuk  menunggu giliran memijah.
Dendogram  yang  terbentuk  berdasar- kan kemiripan dan perbedaan 14 sifat fenotip mimi    didapatkan  informasi  bahwa T.  gigas Banten,  Subang,  dan  Surabaya  memiliki  ka- rakter  yang  hampir  sama,  sedangkan  Sema- rang  dan  Demak  memiliki  karakter  berbeda dengan  lokasi  lain  (Gambar  3).  Perbedaan karakter  ini  diduga  dipengaruhi  oleh  faktor lingkungan yang berbeda.
Hasil  uji  Kruskal  Wallis  berdasarkan 27  karakter  morfometrik T.  gigas yang  telah dirasiokan secara keseluruhan diperoleh hasil sebanyak  13  karakter  yang  tidak  berbeda nyata  ( p >0,05)  pada  lokasi  Semarang,  De- mak, Surabaya, Subang, dan Banten. Namun, pada uji ini tidak dapat diketahui secara spe-
sifik karakter mana yang memiliki beda nya- ta antar lokasi, sehingga dilakukan uji Mann- Whitney  untuk  mengetahui  karakter  yang berbeda nyata ( p <0,05) antar lokasi. Hasil uji Mann-Whitney disajikan pada Tabel 2.
Tabel  1.  Rincian  jumlah Tachypleus gigas jantan  dan  betina  yang  tertangkap selama penelitian. Lokasi sampling T. gigas Jantan Betina Banten 6 - Subang - 19 Semarang 1 2 Demak 10 13 Surabaya 7 4
Gambar  3.  Konstruksi  pohon  fenetik Tachy- pleus  gigas berdasarkan  14  karak- ter  morfologi  (keterangan:  TG= Tachypleus gigas ,  BTN=  Banten, SBG=  Subang,  SRB=  Surabaya, DMK= Demak, SMG= Semarang).
Sebanyak 14 karakter morfometrik T. gigas dari  ke-5  lokasi  tersebut  memiliki  hu- bungan  sifat  beda  nyata  ( p <0,05)  antar  lo- kasi.  Sebanyak  15  karakter  tubuh,  Surabaya memiliki ukuran tubuh (X1-X2 dan X4-X16) lebih  besar  dan  5  anggota  tubuh  (pan-jang marginal spine VI (X22), diameter capit che- licera  (X23),  diameter  capit  kaki  jalan  II (X26),  diameter  capit  kaki  jalan  III  (X27), diameter  capit  kaki  jalan  IV  (X28))  yang relatif  lebih  besar  dibandingkan  daerah  Se- marang,  Demak,  Subang,  dan  Banten. T. gigas Semarang  dan  Demak  memiliki  uku- ran  relatif  sama,  begitu  juga  dengan  Subang dan Banten.
Tabel  2.  Perbandingan  karakter  morfometrik Tachypleus  gigas pada  lokasi  Semarang,  De- mak, Surabaya, Subang, dan Banten.
Karakter (rata-rata±SD) Lokasi Semarang Demak Surabaya Subang Banten XX1 1 (mm) X1/X3 1,9974±0,029 1,9589±0,1597 2,1519±0,3688 1,9685±0,1287 1,9362±0,1920 X2/X3 0,9974±0,0299 0,9561±0,2616 a 1,1546±0,2311 b 0,9955±0,1438 1,0003±0,2036 X4/X3 0,5751±0,0051 0,5504±0,0636 0,5984±0,0945 0,5590±0,0519 0,5664±0,0080 X5/X3 0,3168±0,0103 0,2973±0,0154 b 0,3379±0,0477 a 0,3171±0,0232 ac 0,3216±0,0276 ad X6/X3 0,2606±0,0019 0,2589±0,0229 0,2715±0,0516 0,2546±0,0220 0,2547±0,0141 X7/X3 0,4249±0,0051 bd 0,3554±0,1144 b 0,4922±0,0757 c 0,4479±0,0233 ad 0,4420±0,0199 de X8/X3 0,2137±0,0076 0,2065±0,0144 0,2149±0,0345 0,2072±0,0109 0,2071±0,0053 X9/X3 0,9370±0,0353 0,9440±0,1330 1,0267±0,1536 0,9721±0,0736 0,9898±0,0307 X10/X3 0,5142±0,0136 0,4913±0,0300 0,5430±0,1123 0,4954±0,0233 0,4974±0,0283 X11/X3 0,5329±0,0007 0,5303±0,0230 0,5972±0,1318 0,5399±0,0313 0,5620±0,0477 X12/X3 0,6152±0,0189 0,6047±0,0386 a 0,6876±0,1374 b 0,6134±0,0384 0,6508±0,0437 db X13/X3 0,7862±0,0142 0,7767±0,0704 a 0,8594±0,1460 0,8184±0,0368 b 0,8191±0,0358 X14/X3 0,2606±0,0019 0,2537±0,0316 a 0,2892±0,0624 0,2777±0,0143 b 0,2798±0,0200 X15/X3  0,0429±0,0035 abd 0,0421±0,0070 b 0,0581±0,0123 ce 0,0471±0,0043 d 0,0508±0,0034 ed X16/X3  0,0381±0,0011 abd 0,0388±0,0055 b 0,0516±0,0115 ce 0,0432±0,0053 d 0,0456±0,0017 ed XX2 2 (mm) X17/X3 0,1106±0,0254 0,1092±0,0189 0,1200±0,0341 0,1201±0,0093 0,1269±0,0145 X18/X3 0,1085±0,0486 0,1160±0,0263 a 0,1291±0,0292 0,1366±0,0152 b 0,1349±0,0198 X19/X3 0,0990±0,0418 ab 0,1023±0,0385 b 0,1247±0,0512 0,1447±0,0128 c 0,1504±0,0295 X20/X3  0,0308±0,0239 abc 0,0780±0,0560 b 0,1114±0,0637 cd 0,1436±0,0118 d 0,1519±0,0251 ade
X21/X3 0,0378±0,0207 ab 0,0718±0,0578 b 0,1068±0,0651 0,1456±0,0158 cd 0,1475±0,0184 ad X22/X3  0,0308±0,0239 abc 0,0700±0,053 b 0,1388±0,0134 bc 0,1388±0,0134 d 0,1322±0,0152 cde X23/X3 0,0249±0,0019 0,0233±0,0026 ac 0,0274±0,0062 b 0,0226±0,0042 c 0,0247±0,0043 X24/X3  0,0357±0,0001 abc 0,0443±0,0100 b 0,0569±0,0178 cd 0,0529±0,0059 d 0,0584±0,0033 ade
X25/X3 0,0250±0,0133 ab 0,0425±0,0103 b 0,0561±0,0167 cd 0,0522±0,0057 d 0,0568±0,0027 ade X26/X3 0,0337±0,0017 0,0328±0,0021 ac 0,0376±0,0064 bd 0,0317±0,0032 c 0,0350±0,0010 d X27/X3 0,0337±0,0018 0,0329±0,0020 abc 0,0358±0,0066 bd 0,0314±0,0030 c 0,0356±0,0015 d X28/X3 0,0456±0,0080 0,0440±0,0028 ad 0,0517±0,0114 b 0,0388±0,0044 c 0,0388±0,0023 cd Keterangan:  Huruf  superskrip  yang  berbeda  pada  lajur  yang  sama  menunjukkan  sifat  beda  nyata berdasarkan hasil uji Mann-Whitney ( p <0,05), X1-X28 (Gambar 1), 1 XX1: tubuh dan 2 XX2: bagian anggota tubuh .

## 3.1.1.1.  Analisis  Kluster  Morfometrik T. gigas
Analisis  kluster  disajikan  dalam  ben- tuk dendrogram. Analisis ini bertujuan untuk mengetahui  tingkat  kesamaan  karakter  mor- fometrik  antar  populasi  setiap  lokasi  berda- sarkan  27  karakter  morfometrik  yang  telah dirasiokan  (Gambar  4).  Diperoleh  hasil  bah- wa  daerah  Semarang  dan  Demak  memiliki tingkat  kemiripan  karakter  yang  tinggi  se- hingga membentuk satu kluster, dengan ting- kat  kemiripan  sebesar  66,11%.  Subang  dan Banten  memiliki  tingkat  kemiripan  sebesar 51,66%,  sedangkan  Surabaya  membentuk karakter  tersendiri  dengan  tingkat  kemiripan sebesar 20,01%.
T. gigas Surabaya membentuk kelom- pok  terpisah  berdasarkan  karakter  morfo- metrik karena pada daerah ini memiliki ukur- an tubuh dan anggota tubuh yang relatif lebih besar  dibandingkan  daerah  lainnya. T.  gigas Semarang dan Demak memiliki ukuran tubuh dan  anggota  tubuh  relatif  sama  sehingga keduanya  membentuk satu kelompok, begitu juga dengan Subang dan Banten.

## 3.1.1.2.  Pengelompokan T. gigas
Analisis logistik dilakukan untuk me- lihat  adanya  konektivitas  antar  lokasi  berda- sarkan  27  karakter  yang  telah  dirasiokan (Tabel 3). Berdasarkan analisis tersebut dipe- roleh  R 2 sebesar  93,8%  hal  ini  berarti  varia-
Gambar 4.  Dendrogram karakter morfometrik Tachypleus gigas pada daerah  Semarang, De- mak,  Subang,  Banten, dan Surabaya.
Tabel 3. Konektivitas antar lokasi Tachypleus gigas berdasarkan 27 karakter yang telah dira- siokan.
Observed Predicted Semarang Demak Surabaya Subang Banten Percent Correct Semarang 2 100,0% Demak 0 21 100,0% Surabaya 0 0 11 100,0% Subang 0 0 0 18 100,0% Banten 0 0 0 0 5 100,0% Overall Percentage 3,5% 36,8% 19,3% 31,6% 8,8% 100,0%
bel  morfometrik  antar  tiap  daerah  dan  6,2% dijelaskan  oleh  variable  di  luar  model.  Ber- dasarkan tabel classification , model memiliki kemampuan  untuk  membedakan  antar  ke- lompok populasi sebesar 100% yaitu individu diklasifikasikan  sebagai  individu  asli  yang berasal dari Semarang (n=2), Demak (n=21), Surabaya  (n=11),  Subang  (18),  dan  Banten (n=5). Percent correct dapat mencapai hing- ga 100% diduga karena jumlah individu yang ditemukan sangat sedikit di setiap daerahnya.
3.1.2. Molekuler T. gigas
3.1.2.1.  Amplifikasi  Fragmen  DNA  Gen CO1 Mimi
Panjang  urutan  basa  nukleutida  yang berhasil  teramplifikasi  yaitu  500-750  bp (Gambar 5). Panjang produk PCR yang dipe- roleh  berkualitas  baik  sehingga  dapat  dilan- jutkan pada tahap pemurnian dan sekuensing.
3.1.2.2. Sekuensing DNA dan Pensejajaran Urutan Basa Nukleotida Gen COI
Mimi
Sebanyak lima sampel berhasil di sekuensing.  Hasil  sekuensing  disejajarkan dengan  primer forward dan reverse .  Me- ngacu pada Tamura et  al . (2011)  analisis di- lakukan  dengan  menggunakan  MEGA  5.0, diperoleh hasil rata-rata komposisi basa nuk- leotida T. gigas terdiri atas 33,9% basa timin (T), 27,1 % basa adenin (A), 23,2% basa  si- tosin  (C)  dan  15,8%  basa  guanin  (G). Dengan demikian gen COI pada T. gigas di- kategorikan  sebagai  kelompok  kaya  akan  A- T.  Penjajaran  sekuen  nukleotida  gen  COI T. gigas menghasilkan  nilai conserved sebesar 83,2% (452/  543) ,   variabel sebesar  12,3  %
(4/543) , dan singleton 12,3 % (4/ 543) . Nilai ini  menunjukkan  variasi  basa  nukleotida berupa karakteristik pembeda antar spesies.
Gambar  5.  Visualisasi  DNA  hasil  pre-test produk  PCR  pada  gel  agarosa 0,8%.  Kolom  kiri  sampai  ka- nan:  marker  1  kb,  1)  Tg  BTN, 2)  Tg  SBG,  3)  Tg  SMG,  4) Tg DM,  5)  Tg  SRB.  (keterangan: TG= Tachypleus gigas ,  BTN  = Banten, SBG = Subang, SRB = Surabaya, DMK= Demak, SMG = Semarang).

## 3.1.2.3. Jarak Genetik dan Konstruksi Po- hon Filogeni Mimi
Jarak  genetik  digunakan  untuk  meli- hat kedekatan hubungan genetik antar indivi- du.  Jarak  genetik  fragmen  gen  CO1  pada  ke tiga  spesies  ditampilkan  dalam  bentuk  mat- riks. Jarak genetik antara spesies T. gigas In- donesia dibandingkan dengan spesies ( C. Ro-
tundicauda, T. tridentatus, dan T. gigas ) dari Negara  lain  ( outgroups )  dari  GenBank,  dan diperoleh hasil seperti pada Tabel 4. Nilai ja- rak genetik terendah T. gigas dengan spesies outgroups, yaitu  0,015  pada  Tg  BTN,  Tg DMK,  Tg  SBG,  Tg  SMG  dengan  Tg  KJ825 849, sedangkan jarak tertinggi adalah pada T. gigas dengan Cr AF370828 (>0,1).
Jarak  genetik  digunakan  untuk  mem- bentuk  pohon  filogeni,  lalu  dari  pohon  ini dapat diketahui hubungan kekerabatan antar- spesies.  Pohon  filogeni  dikonstruksi  berda- sarkan metode p-distance . Hasil analisis filo- geni  diperoleh  pemisahan  yang  nyata  antara spesies  Indonesia  dengan  spesies outgroups (Gambar 6).

## 3.1.2.4.  Nukleotida  Spesifik  dan  Mutasi Gen COI Mimi
Sekuen  nukleotida  gen  COI  diseja- jarkan  dan  diperoleh  sebanyak  4  situs  spe- sifik antar spesies. Ke-4 situs spesifik ini me- rupakan  penciri  yang  membedakan T.  gigas antar  lokasi. T.  gigas Indonesia  dengan out- groups sebanyak  73  situs  spesifik.  Ke-73  si- tus  spesifik  ini  merupakan  penciri  yang membedakan T. gigas dengan outgroups . Hal ini menunjukkan adanya evolusi spesifik dari ketiga spesies tersebut.
Tabel 4. Matriks jarak genetik fragmen gen CO1 pada spesies C. rotundicauda, T. tridentatus, dan T. gigas Indonesia dibandingkan dengan spesies dari Negara lain ( outgroup ) dari GenBank.
Spesies_lokasi Tg 1 BTN 4 Tg 1 SBG 5 Tg 1 DMK 6 Tg 1 SMG 7 Tg 1 SRB 8 Cr 3 AF370828 9 Tt 2 HQ588752 10 Tg 1
KJ825849 11 Tg 1 BTN 4
Tg 1 SBG 5 0,000
Tg 1 DMK 6 0,007 0,007 Tg 1 SMG 7 0,007 0,007 0,000 Tg 1 SRB 8 0,009 0,009 0,002 0,002 Cr 3 AF370828 9 0,107 0,107 0,112 0,112 0,114 Tt 2 HQ588752 10 0,088 0,088 0,088 0,088 0,090 0,114 Tg 1 KJ825849 11 0,015 0,015 0,015 0,015 0,018 0,107 0,086 1 Tg= T. gigas , 2 Tt= T. tridentatus , 3 Cr= C. rotundicauda , 4 BTN=Banten, 5 SBG=Subang,
6 DMK=Demak, 7 SMG=Semarang, 8 SRB=Surabaya, 9 AF370828=USA, 10 HQ588752=Sweden,
11 KJ825849= Central Arabian Sea
T. gigas Semarang
T. gigas Surabaya T. gigas Demak T. gigas Banten T. gigas Subang KJ825849 T. gigas HQ588752 T. tridentatus AF370828 C. rotundicauda 100 90 93 96 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
Gambar 6.  Konstruksi pohon  filogeni  berdasarkan gen  CO1 pada  spesies T. gigas Indonesia dibandingkan  dengan  spesies  dari  Negara  lain  ( outgroups )  dari  GenBank ( outgroups :  AF370828=USA,  HQ588752=Sweden,  KJ825849=  Central  Arabian Sea).
Berdasarkan  hasil  penjajaran  sekuen nukleotida  gen  CO1  diperoleh  situs  mutasi. Situs  mutasi  ditemukan  pada  spesies T.  gigas yaitu  delesi  sebanyak  1  pada  situs  ke  107, sedangkan insersi tidak ditemukan.

## 3.2. Pembahasan
Sebanyak  5  lokasi  penelitian  dipero- leh  jumlah  jantan  dan  betina  masing  masing spesies  berbeda.  Terjadi  ketidakseimbangan antara  spesies  jantan  dan  betina  pada T.  gi- gas , betina lebih banyak ditemukan. Menurut Johnson  and  Brockmann  (2010)  perbedaan perbandingan  komposisi  jantan  dan  betina disebabkan  adanya  masa  di  mana  mimi  jan- tan yang tidak memiliki pasangan berkumpul di  pantai  dan  bertindak  sebagai  satelit  untuk menunggu giliran memijah.
T. gigas Surabaya membentuk kelom- pok  terpisah  berdasarkan  karakter  morfo- metrik karena pada daerah ini memiliki ukur- an tubuh dan anggota tubuh yang relatif lebih besar  dibandingkan  daerah  lainnya.  Peruba- han ukuran tubuh mimi dipengaruhi oleh ke- padatan  populasi,  ketersediaan  pangan,  dan pengaruh kondisi lingkungan (Chatterji et al., 2000;  Zadeh et  al., 2011).  Penelitian  yang telah  dilakukan  oleh  Chatterji et  al., (2000) diperoleh  hasil  bahwa  pertambahan  panjang dan  lebar  karapas  dipengaruhi  oleh  keter- sediaan pakan dan kepadatan populasi.  Mimi memiliki  ukuran  karapas  yang  berbeda  pada
habitat yang berbeda seperti karapas populasi mimi yang ada di Malaysia memiliki karapas yang  lebih  besar  dibandingkan  dengan  ka- rapas  yang  ada  di  India  dan  Thailand  (Chat- terji, 1999; Srijaya et al., 2010).
Pada  penelitian  ini,  Demak  dan  Su- bang  merupakan  lokasi  dengan  jumlah  tang- kapan  mimi  terbanyak,  dalam  sehari  seba- nyak  23  ekor  dan  19 T.  gigas telah  tertang- kap. Sebanyak 378 ekor mimi tertangkap se- lama 10 bulan Maret – Desember 2003 pene- litian  yang  telah  dilakukan  oleh  Muslihah (2004)  di  Mayangan  Subang.  Kepadatan  po- pulasi,  umur,  ketersediaan  pangan,  dan  pe- ngaruh kondisi lingkungan mempunyai hubu- ngan  yang  signifikan  dengan  perubahan  di- mensi  tubuh  mimi  (Chatterji et  al .,  2000; Zadeh et  al., 2011).  Di  Balramgari,  Orissa pertambahan  panjang  dan  lebar  karapak T. gigas dipengaruhi  oleh  kepadatan  dan  keter- sediaan pakannya. Makanan mimi tersedia di banyak  tempat,  jenis  makanan  mimi  dianta- ranya ikan mati, polycaeta, bivalvia, moluska, serta alga (Chatterji et al ., 2000).
Basa T.  gigas didominasi  oleh  basa adenin  (A)  dan  timin  (T).  Jusuf  (2001)  me- nyatakan  bahwa  A-T  memiliki  ikatan  hidro- gen  yang  terdiri  dari  dua  ikatan  dan  bersifat lemah dibandingkan dengan G-C yang memi- liki tiga ikatan hidrogen. Sehingga, A-T lebih mudah terpisah dan menyebabkan spesies  ini memiliki kemungkinan terjadi mutasi. Urutan
nukleotida  bersifat conserve pada  tingkat spesies, hal ini ditunjukkan oleh sekuen nuk- leotida pada gen CO1 T. gigas . Keberadaan 4 situs nukleotida spesifik menjadi penciri spe- sies T. gigas , yang menunjukkan adanya evo- lusi spesifik pada spesies ini.
Konstruksi  pohon  filogeni  spesies T. gigas dengan outgroups ( T. gigas, C.  Rotun- dicauda, dan T.  tridentatus Negara  lain), menunjukkan adanya pemisahan secara jelas. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  ketiga  spesies tersebut  memiliki  karakter  nukleutida  yang berbeda  dibandingkan  dengan outgroups (Negara  lain).  Menurut penelitian  yang telah dilakukan  oleh  Obst et  al. (2012)  dengan menggunakan  fragmen  gen  16S,  228S,  dan CO1 diperoleh hasil bahwa konstruksi pohon filogeni C. rotundicuada terpisah dengan ge- nus Tachypleus , hal ini juga berkaitan dengan perbedaan ekologi. C. rotundicuada merupa- kan  spesies  yang  memiliki  keragaman  gene- tik  paling  tinggi  dibandingkan  dengan  genus Tachypleus dan Limulus ,  hal  ini  disebabkan oleh  perbedaan  faktor  ekologi C.  Rotundi- cuada yang  berhabitat  di  estuari  dan  mang- rove.  Wilayah  ini  merupakan  wilayah  yang sedikit  terpapar  oleh  air  dari  lautan  terbuka, sehingga gene  flow antara  populasi  spesies ini lebih terbatas.
Identifikasi  molekuler  dari  penelitian ini  telah  menunjukan  kepastian  taksonomi ( taxonomy certainty ). Sehingga dapat dijadikan sebagai  acuan  untuk  kajian  genetika  populasi, kajian  stok,  hingga  tercapai  data  yang  cukup untuk  melakukan  tindakan  pengelolaan  sum- berdaya mimi melalui  konservasi. Berdasarkan hasil  penelitian  ini,  sangat  penting  untuk  di- lakukan  pelarangan  tegas  terhadap  reklamasi pantai, dan dilakukannya konservasi mimi.

## IV. KESIMPULAN
T.  gigas Surabaya  memiliki  ukuran tubuh (X1-X2 dan X4-X16) lebih besar dan 5 anggota  tubuh  (panjang  marginal  spine  VI (X22),  diameter  capit  chelicera  (X23),  dia- meter capit kaki  jalan II (X26), diameter ca- pit  kaki  jalan  III  (X27),  diameter  capit  kaki jalan  IV  (X28))  yang  relatif  lebih  besar  di-
bandingkan  daerah  Semarang,  Demak,  Su- bang, dan Banten.  Dihasilkan nukleotida de- ngan panjang 650 pb bersifat conserve . Ana- lisis  menggunakan software MEGA  5.0  me- nunjukkan  sebanyak  73  situs  spesifik  yang merupakan  penciri  yang  membedakan T.  gi- gas in-groups dengan T.  gigas dari Central Arabian  Sea, T. tridentatus dari Sweden dan Carcinoscorpius  rotundicauda dari  USA  se- bagai outgroups.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  ke- pada  staf  Laboratorium  Biologi  Molekuler MSP,  Biologi  Makro  MSP,  dan  Laborato- rium  Terpadu,  FPIK,  IPB  atas  fasilitas  dan bantuan yang diberikan. Penulis juga mengu- capkan  terima  kasih  kepada  para  reviewer yang telah banyak memberikan masukan dan komentar untuk memperbaiki paper ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Balisani, S.L. 1994. Studi perkembangan em- brio blangkas Carcinoscorpius  rotun- dicauda (Latreille)  hasil  pemijahan semi  alami  dan  buatan.  Skrpisi.  Ins- titut Pertanian Bogor. 67hlm.
Beekey,  M.A.,  J.H.  Mattei,  and  B.J.  Pierce. 2013.  Horseshoe  crab  eggs:  A  rare resource for predators  in  Long Island Sound. J.  of  Experimental  Marine
Biology and Ecology, 439:152-159.
Cartwrigt-Taylor,  L.,  J.  Lee,  and  C.C.  Hsu. 2009.  Population  structure  and  bree- ding  pattern  of  the  mangrove  hor- seshoe  crab Carcinoscorpius  rotun- dicauda in  Singapore. Aquatic  Bio- logy, 8:61-69.
Cartwrigt-Taylor,  L.,  Y.V.  Bing.,  H.C.  Chi., and  L.S.  Tee.  2011.  Distribution  and abundance of  horseshoe crabs Tachy- pleus  gigas and Carcinoscorpius  ro- tundicauda around  the  main  island Singapore. Aquatic  Biology, 13:127- 136.
Chatterji, A., R. Vijayakumar, and A.H. Pa-
Crulekar.  1992.  Spawning  migration of the horseshoe crab, Tachypleus gi- gas (Muller),  in  relation  to  lunar cycle. Asian Fisheries Science, 5:123- 128.
Chatterji,  A.,  1999.  New  record  of  the  sym- patric  distribution  of  two  Asian  spe- cies  of  the  horseshoe  crab. Indian  J. of Marine Science, 77(6):43-48. Chatterji, A., A.H. Parulekar, and R. Vijaya- kumar. 2000. Morphometric characte- ristics  in  the  horseshoe  crab Tachy- pleus  gigas (Artropoda:  Merostoma- ta). Indian  J.  of  Marine  Science, 29: 333-335.
Christianus,  A.  and  C.R. Saad.  2007. Horse- shoe crabs in Malaysia and the world. Fishery Mail, 16:8-9.
Chiu, H.M.C.  and  B. Morton. 2004. The be- havior of juvenil horseshoe crabs, Ta- chypleus  tridentatus (Xiphosura),  on nursery  beach  at  Shin  Hau  Wan, Hongkong. Hydrobiologia, 523:29-35. Dietl,  J.,  C.  Nascimento,  and  R.  Alexander. 2000.  Influence  of  ambient  flow around  the  horseshoe  crab Limulus polyphemus on  the  distribution  and orientation  of  selected  epizoans. Estuaries, 23:509–520.
Ding,  J.L.,  K.C.  Tan,  S.  Thangamani,  N. Kusuma,  W.K.  Seow,  T.H.H.  Bui,  J. Wang,  and  B.  Ho.  2005.  Spatial  and temporal  coordination  of  expression of  immune  response  genes  during Pseudomonas  infection  of  horseshoe crab, Carcinoscorpius  rotundicauda .
Nature  Publishing  Group ,  6(7):557- 574.
Eidman, M., Mayunar, dan S. Redjeki. 1997.
Pematangan  gonad  mimi  ranti, Car- cinoscorpius  rotundicauda (Latreil- le)  dan  mimi  bulan Tachypleusgigas (Muller) dengan berbagai jenis pakan. J. Ilmu-Ilmu Perairan dan  Perikanan Indonesia, 5(1):1-6.
Eidman,  M.,  A.M.  Samosir,  dan  U.  Aktani. 1992.  Studi  biologi  mimi/belangkas
(subkelas  Xi-phosura)  dalam  rangka perngembangan dan pemanfaatan sumberdaya  hayati  laut  untuk  kebu- tuhan  industri  farmasi  di  Indonesia. Laporan  penelitian  tahun  I.  Proyek pengembangan  pendidikan  ilmu  ke- lautan.  Direktorat  Jenderal  Pendi- dikan  Tinggi.  Fakultas  Perikanan. IPB, Bogor. 56hlm.
Fachrul,  M.F.  1989.  Aspek  biologi  mimi (Xilphosura).  Term  paper.  Fakultas Pasca  Sarjana  Institut  Pertanian  Bo- gor. 15hlm.
Ferari,  K.M.,  and  N.M.  Targett.  2003.  Che- mical  attractants  in  horseshoe  crab,
Limulus  polyphemus ,  eggs:  the  po- tential for an artificial bait. J. of Che- mical Ecology, 29:477-496.
Hu,  M.,  Y.  Wang,  Y.  Chen,  S.G.  Cheung, P.K.S.  Shin,  and  Q.  Li.  2009.  Sum- mer distribution and abundance of ju- venile  Chinese  horseshoe  crabs Ta- chypleus  tridentatus along  an  inter- tidal zone in Southern China. Aquatic Biologi, 7:107-112.
Hurton,  L.,  2003.  Reducing  post-bleeding mortality of horseshoe crabs ( Limulus polyphemus )  used  in  the  biomedical industry. Thesis. Virginia Polytechnic Institute and State University. 80hlm.
Harrington,  B.A.  2001.  Red  Knot  ( Calidris canutus ). In :  A.  Poole  and  F.  Gill ( eds. ).  The  birds  of  North  America. The  birds  of  North  America,  Inc., Philadelphia, Pennsylvania. 24pp.
Hebert,  P.D.N.,  S.  Ratnasingham,  and  J.R.
De  Waard.  2003.  Barcoding  animal life:  cytochrome  c  oxidase  subunit  1 divergences  among  closely  related species. Proc R Soc., 270:96-99.
IUCN  (International  Union  for  Conservation of  Nature).  2015.  Red  list  of  threa- tened  species.  http://www.  Iucnre- dlist.org. [Retrieved on Mei 2015].
Ismurwanti,  C.  1994.  Studi  awal  pengaruh konsentrasi  diazinon-60  ec  terhadap perkembangan  embrio  dan  penetasan telur  mimi  ranti Carcinoscorpius  ro-
tundicauda (Latreille).  Skripsi.  Insti- tut Pertanian Bogor. 64hlm.
John,  B.A.,  B.Y.  Kamaruzzaman,  K.C.A. Jalal,  and  K.  Zaleha.  2012.    Feeding ecology and food preferences of Car- cinoscorpius  rotundicauda collected from  the  pahang  nesting  grounds. Sains Malaysiana , 41(7): 855-861.
Johnson,  S.L.  and  H.J.  Brockmann.  2010.
Costs  of  multiple  mates:  an  experi- mental study in horseshoe crabs. Ani- mal Behaviour, 80:773-782. Jusuf, M. 2001. Genetika I: struktur dan eks- presi  gen.  Sagung  Seto.  Jakarta.  285 hlm.
Lee,  C.N.  and  B.  Morton.  2005.  Experi- mentally  derived  estimates  of  growht by  juvenile Tachypleus  tridentatus and Carcinoscorpius  rotundicauda (Xiphosura)  from  nursery  beaches  in Hong  Kong. J.  Marine  Biology  Eco- logy, 318:39-49.
Li,  H.Y.  2008.  The  conservation  of  horse- shoe  crabs  in  Hong  Kong.  Thesis. University of Hong Kong. 312p.
Muslihah.  2004.  Beberapa  aspek  biologi reproduksi mimi bulan Tachypleus gi- gas di  Perairan  Mayangan,  Kabupa- ten  Subang,  Jawa  Barat.  Skripsi.  Ins- titut Pertanian Bogor. Bogor. 63hlm.
Mishra,  J.K.  2009.  Horseshoe  crabs,  their ecobiological  status  along  the  nort- heast coast of India and the  necessity for  ecological  conservation. Dalam : Tanacredi  J.T. et  al. ( eds. ).  Biology and  conservation  of  horseshoe  crabs.
Springer  Science  &  Business  Media, Heidelberg.  89-96pp.
Mulya,  M.B. 2014. Pelestarian,  pemanfaatan sumberdaya  genetika  mimi  ranti ( Carcinosscorpius  rotundicauda ,  L) dan  mimi  bulan  ( Tachypleus  gigas , M).  Skripsi.  Universitas  Sumatera Utara. 9hlm.
Novitsky, T.J., Thomas, Dawson, E. Michael, Paus,  and  J.  Erik.  2002.  Artificial bait . United  States  Patent.  United States. 1295p.
Novitsky,  T.J.  1994.  Limulus  amebocyte lysate  (LAL)  detection  of  endotoxin in  human  blood. J.    of Endotoxin  Re- search, 1(4):253-263.
Obst,  M.,  S.  Faurby,  S.  Bussarawit,  and  P. Funch. 2012. Molecular phylogeny of extant  horseshoe  crabs  (Xiphosura, Limulidae) indicates Paleogene diver- sification of Asian species. Molecular Phylogenetics  and  Evolution ,  62(1):
21-26.
Purnomo,  Y.A.  1992.  Biologi  reproduksi mimi  ranti Carcinoscorpius  rotundi- cauda (Latreille)  betina  yang tertang- kap  di  Perairan  Rembang,  Jawa Tengah.  Skripsi.  Institut  Pertanian Bogor. Bogor. 64hlm.
Rahmalia,  E.  1995.  Pembuahan  buatan  dan studi awal pengaruh konsentrasi sapo- nin  terhadap  perkembangan  emrio dan  larva  mimi  bulan Tachypleus  gi- gas (Muller). Fakultas Perikanan. Ins- titut Pertanian Bogor. Bogor. 66hlm. Rubiyanto,  E.  2012.  Studi  populasi  mimi (Xiphosura)  di  Perairan  Kuala  Tung- kal,  Kabupaten  Tanjung  Jabung  Ba- rat, Jambi. Tesis. Universitas Indone- sia. 66hlm.
Santoso,  A.R.  1992.  Pemijahan  dan  perkem- bangan  embrio  Mimi Tachypleus  gi- gas (Muller).  Skripsi.  Institut  Perta- nian Bogor. 47hlm.
Selander,  R.K.,  S.Y.  Yang,  R.C.  Lewontin, and  W.E.  Johnson. 1970. Genetic  va- riation  in  the  horseshoe  crab  ( Limu- lus polyphemus ),  a  phylogenetic  ‘‘re- lic’’. Evolution , 24(2):402-414. Shin,  P.,  H.Y.  Li,  and  S.G.  Cheung.  2009. Horseshoe  crabs  in  Hongkong:  Cur- rent  population  status  and  human  ex- ploitation. In :  Tanacredi et  al. ( eds. ).
Biology  and  conservation  of  horse- shoe crabs.  Springer Science & Busi- ness Media, Heidelberg. 347-360pp.
Smith,  D.R.  2007.  Effect  of  horseshoe  crab spawning density on nest disturbance and exhumation of eggs: a simulation study. Estuaries, 30:287-295.
Solihin, D.D. 1994. Peran DNA mitokondria (mtDNA)  dalam  studi  keragaman  ge- netik  dan  biologi  populasi  pada  he- wan. Hayati, 1(1):1-4.
Suparta.  1992.  Keragaman  sifat-sifat  morfo- metrik mimi, Tuchypleus gigas (MULLER)  dan Carcinoscorpius  ro- tundicauda (LATREILLE)  di  perair- an  pantai  Kabupaten  Pandeglang,  Ja- wa  Barat  dan  perairan  pantai  Kabu- paten Rembang, Jawa Tengah. Skrip- si. Institut Pertanian Bogor. 69hlm.
Srijaya,  T.C.,  P.J.  Pradeep,  S.  Mitun,  A. Hasan, F. Shaharom, and A. Chatterji. 2010.  A  new  record  on  the  morpho- metric  variation  in  the  population  of horseshoe  crab  ( Carcinoscorpius  ro- tundicauda Latreille)  obtained  from two  different  ecological  habitats  of Peninsular Malaysia. Our Nature , (8): 204-211.
Taylor, L.C., J. Lee, and C.C. Hsu. 2011. Po- pulation  structure  and  breeding  pat- tern  of  the  mangrove  horseshoe  crab Carcinoscorpius  rotundicauda in  Si- ngapore. Aquatic Biology , 8(1):61-69.
Vauziyah,  C.  1995.  Perkembangan  embrio mimi  bulan Tachypleus gigas (Mul- ler)  dari  perairan  Teluk  Banten  pada berbagai  salinitas  media.  Institut  Per- tanian Bogor. 64hlm.
Walls,  E.L.,  J.  Berkson,  and  S.A.  Smith. 2002.  The  horseshoe  crab, Limulus polyphemus :  200  million  years  of existence, 100 years of study. Review Fisheries Sciences, (10):39-73.
Yeo,  D.S.A.,  J.L.  Ding,  and  B.  Ho.  1996. Neuroblastoma  cell  culture  assay shows  that Carcinoscorpius  rotundi- cauda haemolymph  neutralizes  tetro- dotoxin. Pergamon , 34(9):1054-1057. Zadeh,  S.S.,  A.  Christianus,  C.R.  Saad,  P. Hajeb,  and  M.S.  Kamarudin.  2011. Comparations  in  prosomal  width  and body  weight  among  early  instar  sta- ges  of  Malaysian  Horseshoe  crabs, Carcinoscorpius  rotundicauda and Tachypleus  gigas in  the  laboratory. In :  Tanacredi et  al. ( eds. ).  Biology and conservation of hor-seshoe crabs . Springer  Science  &  Business  Media. Heidelber. 267-274pp.
Diterima           : 7 Agustus 2015 Direview          : 23 Mei 2016 Disetujui          : 25 Mei 2016