## PENENTUAN KADAR PROTEIN PADA SPIRULINA PLATENSIS MENGGUNAKAN METODE LOWRY DAN KJELDAH

## Muyassaroh1)*, Rini Kartika Dewi2), Faidliyah Nilna Minah3)
Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, ITN Malang Jl. Bendungan Sigura-gura No.2 Malang, 56145, Telp 0341-551431, Fax 0341-553015 * Penulis Korespondensi : muyassaroh@lecturer.itn.ac.id

## Abstrak.
Kadar  protein  yang  sangat  tinggi  pada  spirulina  platensis  atau  ganggang  hijau  kebiruan  ini  bisa dimanfaatkan sebagai sumber protein untuk bahan baku  industri makanan. Untuk memperoleh kandungan protein yg  tinggi,  terlebih  dahulu  dilakukan  kultivasi  spirulina  menggunakan  air  laut  yg  dicampur  dg  air  RO  dg  media pupuk walne Adapun untuk menentukan  kandungan protein yg terdapat pada spirulina platensis hasil kultivasi bisa digunakan  metode Lowry dengan spektrofotometer UV-VIS, panjang gelombang 650 nm, reagen folin dan larutan yg  lain  sehingga    diketahui  kadar  protein.nya  menggunakan  larutan  BSA  (Bovine    Serum  Albumin).  dan  sebagai pembanding digunakan metode Kjeldahl, karena pada metode ini biasa digunakan secara Internasional dan masih merupakan metode standar untuk perbandingan terhadap semua metode lainnya.  Pada metode ini presisinya tinggi dan  biasa  digunakan  untuk  estimasi  protein.  Sebagai  pelarut  digunakan  HCl  karena    jenis  pelarut  ini    memiliki tekanan  osmotik  cukup  tinggi    sehingga  dapat  dengan  mudah  memisahkan  protein  terhadap  komponen  yg  lain. Dalam penelitian ini digunakan variabel kecepatan sentrifugal, kecepatan magnetic stirer dan lamanya pengadukan pada  magnetic  stirer,  dan  hasil  penelitian  menunjukan  bahwa  kadar  protein  tertinggi  diperoleh  menggunakan metode  Lowry.pada  kecepatan  sentrifugal  6000  rpm,  kecepatan  magnetic  stirrer  500  rpm  dan  waktunya  15  menit sebesar 37,5144 %
Kata kunci : Spirulina Platensis; Metode Lowry; Metode KJeldahl; Spektrofotometer.

## ESTIMATION OF PROTEIN CONTENT IN SPIRULINA PLATENSIS UNDER LOWRY’S AND KJELDAHL’S METHOD
Abstract .
High protein content found in spirulina platensis or blue-green algae ranks among the best protein source for raw  materials  of  food  industry.  To  obtain  this  high  protein  content,  cultivation  process  of  spirulina  was  done  by dipping  spirulina  into  sea  water  which  had  previously  mixed  with  RO  water  and  walne  fertilizer.  In  this  study, protein content was estimated by applying Lowry’s Method with spectrophotometer UV-VIS, with wave length of 650 mm,  folin  reagent  and  other  solvents  into  the  cultivation  results,  and  also  with  the  aids  of  BSA  (Bovine  Serum Albumin)  solvent.  Kjeldahl  method  was  used  as  the  comparative  variable,  as  this  method  has  been  widely  and internationally used, and long-time claimed as the standard method to estimate the protein content. HCl was used as the  solvent  for  the  reason  that  this  short  of  solvent has  considerably  high  osmotic  pressure,  the,  it  can  effortlessly detach protein  from other  ingredients.  This  study  employed  centrifugal  speed  variable, magnetic  stirrer  speed  and length of  stirring  on  magnetic  stirrer.  The  research  result  showed  that  Lowry’s  method could  result  in  the highest protein content by setting the centrifugal speed at 6000 rpm, magnetic stirrer speed at 500 rpm in 15 minutes, the content of which was found to be 37,5144%
Keywords: Spirulina platensis; Lowry Method; Kjeldahl Method; Spectrophotometer .

## PENDAHULUAN
Di zaman modern ini, manusia mulai menyada- ri  pentingnya  hidup  sehat  sehingga  mengalami peningkatan  perhatian  terhadap  makanan  fungsional (Kotilainen,et  al.2006,  Robertford,  2000),  makanan fungsional  dapat  diproduksi  dengan  cara  menambahkan bahan-bahan  yang  memberikan  efek  baik  untuk kesehatan  (Mollet  dan  Rowland,  2002,  Young,  2000), dapat  memberikan  system  kekebalan  bagi  tubuh  dan meningkatkan  system  antibody,  serta  sebagai  sumber energy dan gizi (Roberfroid, 2000).
Spirulina sp ( cyanobacteria) merupakan sumber  pangan  fungsional  potensial  yang  banyak dimanfaatkan    sebagai  bahan  baku  industri  makanan karena    mengandung  protein  60–71%,  lemak  8%, karbohirdrat  16%,  dan  vitamin  serta  1,6% Chloro- phyll-a ,  18% Phycocyanin ,  17%  β- Carotene, dan 20 – 30 % γ-linoleaic acid dari  total asam lemak (Jongkon P.,  Siripen  T  and  Richard  D.  L.2008).  Kandungan nutrisi  mikroalga  jenisini  memiliki potensi yang besar  untuk    dimanfaatkan  sebagai  sumber  protein. Mikroalga  jenis  ini  tidak  hanya  bertindak  sebagai sumber  protein  sel  tunggal  (PST),  tetapi  juga memberikan  beberapa  manfaat  lainnya  antara  lain: makanan pelengkap  atau suplemen, sumber karotenoid, klorofil  dan  sumber  mikronutrien  (Phang,  et.al,  2000). Dalam  perkembangannya,  Spirulina  sp  digunakan sebagai  bahan  tambahan  untuk  pembuatan  biscuit,  roti dan minuman, bahkan oleh International Association of Applied  Microbio-logy.menyatakan  bahwa  spirulina  sp merupakan  sumber  makanan  masa  depan.  Di  negara Jepang,  Amerika,  Eropa,  Australia  dengan  perkem- bangan bioteknologi telah  meluncurkan produk pangan yang dikenal  dengan makanan kesehatan. Di Indonesia suplemen  yang  bahan  dasarnya  diperoleh  dari mikroalga  diberi  nama  dengan  Hi-Liena  dari    jenis spirulina,  sp.  (Kabinawa,  2001).  Colla  et  al.  (2004) melaporkan  bahwa  pengolahan  Spirulina  yang  dijual dalam  bentuk  kapsul    atau  di  dalam  makanan  seperti aneka  minuman dan pasta telah menunjukkan  khasi-at pengobatan  dalam  perlakuan  kondisi  seperti  hiperko- lesterolemia dan aterosklerosis.
Untuk  mendapatkan  kadar  protein  yang  tinggi dalam spirulina dikenal dengan berbagai macam metode untuk memisahkan protein dengan kandungan yang lain yang  terdapat  dalam  spirulina  platensis,  diantaranya adalah metoda Kjeldahl dan metode Lowry.

## Metode Kjeldahl
Analisis  protein  dalam  bahan  pangan  dapat dilakukan  dengan  dua  metode  yaitu  metode  kuantitatif dan  kualitatif.  Kadar  protein  yang  ditentukan  berda- sarkan  cara  Kjeldahl    disebut  sebagai  kadar  protein kasar (crude protein) karena terikut senyawaan N bukan
protein.  Prinsip  kerja  dari  metode  Kjeldahl  adalah protein  dan  komponen  organik  dalam  sampel  dides- truksi  dengan  menggunakan  asam  sulfat  dan  katalis. Hasil  destruksi  dinetralkan  dengan  menggunakan larutan  alkali  dan  melalui  destilasi.  Destilat  ditampung dalam  larutan  asam  borat.  Selanjutnya  ion-ion  borat yang  terbentuk  dititrasi  dengan  menggunakan  larutan HCl.  Metode  Kjeldahl  merupakan  metode  yang sederhana  untuk  penetapan  nitrogen  total  pada  asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel  didestruksi  dengan  asam  sulfat  dan  dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan  amonium  sulfat.  Setelah  pembebasan dengan  alkali  kuat,  amonia  yang  terbentuk  didistilasi secara  kuantitatif  ke  dalam  larutan  penyerap  dan ditetapkan  secara  titrasi.  Metode  ini  telah  banyak mengalami  modifikasi.  Metode  ini  cocok  digunakan secara  semimikro,  sebab  hanya  memerlukan  jumlah sampel  dan  pereaksi  yang  sedikit  dan  waktu  analisa yang  pendek.  Cara  Kjeldahl  digunakan  untuk  meng- analisis  kadar  protein  kasar  dalam  bahan  makanan secara  tidak  langsung,  karena  yang  dianalisis  dengan cara  ini  adalah  kadar  nitrogennya.  Dengan  mengalikan hasil  analisis  tersebut  dengan  angka  konversi  6,25, diperoleh nilai protein dalam bahan makanan itu. Untuk beras,  kedelai,  dan  gandum  angka  konversi  berturut- turut  sebagai  berikut:  5,95,  5,71,  dan  5,83.  Angka  6,25 berasal  dari  angka  konversi  serum  albumin  yang biasanya mengandung 16% nitrogen.(Kurniawan, 2013)
Kadar protein (%)= (A−B ) x N x 14,007x6,25x100% (1) Berat sampel Keterangan :
A : Volume (ml) HCl untuk mentitirasi larutan dalam contoh
B : Volume (ml) HCl larutan blanko N : Normalitas HCl standar yang digunakan 14,007 : Berat atom Nitrogen 6,25 : Faktor konversi protein

## Metode Lowry
Pemilihan  metode  yang  baik  dan  tepat  untuk suatu  pengukuran bergantung  pada  beberapa  faktor seperti,  banyaknya  material  atau  sampel  yang  tersedia, waktu  yang  tersedia  untuk  melakukan  pengukuran,  alat spektrofotometri  yang  tersedia  (VIS  atau  UV).  Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen folin dan ciocalteu  telah  digunakan  dalam  penentuan  konsentrasi protein  oleh  Lowry  (1951)  yang  kemudian  dikenal dengan  metode  Lowry.  Dalam  bentuk  yang  paling sederhana  reagen  folin  ciocalteu  dapat  mendeteksi residu tirosin (dalam protein) karena kandungan fenolik dalam  residu  tersebut  mampu  mereduksi  fosfotungsat dan  fosfomolibdat,  yang  merupakan  konstituen  utama
reagen folin ciocalteu, menjadi tungsten dan molibdenum yang berwarna biru.

## Penentuan Kadar Protein Metode Lowry
Beberapa pereaksi yang digunakan dalam metode Lowry Pereaksi A: 2 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100 ml Na mL NaOH Pereaksi B: 5mLCuSO4.5H2O1%  ditambahkan ke  dalam  3  mL  larutan  Na/K  tartarat 1%
Pereaksi C: 2  mL  pereaksi  B+100  ml pereaksi A Pereaksi D: Reagen folin cioceleau diencer- kan  dengan  aquadest  (1:1) Larutan  Standar:  Larutan  BSA  (Bovine  Serum Albumin).
Gambar 1. Kurva Standar BSA
Metode  dalam penentuan konsentrasi protein: Filtrat  hasil  ekstraksi  diambil  sebanyak  1  ml  lalu ditambahkan  aquadest  hingga  volumenya  4  ml. Dicampurkan  dengan  5  mL  pereaksi  C  dan  campuran diaduk  rata  kemudian dibiarkan    selama  15  menit  pada suhu  kamar.  Setelah  itu  ditambahkan  dengan  cepat  0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar.   Serapannya diukur menggunakan  Spektrofotometer  Uv-vis  pada  panjang gelombang  650  nm.  Untuk  menentukan  konsentrasi protein  pada  mikroalga  Spirulina  sp.  Digunakan  kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin). Larutan standar BSA  dibuat  dengan  konsentrasi  0;  20;  40;  60; 80;  100; 120; 140; 160; 180; 200; 220; 240; 260; 280; 300 ppm

## METODE PENELITIAN

## Metode Lowry
Ekstraksi
• Spirulina  sp.  Hasil  kultivasi  dengan  metode miquel allen degan pencahayaan matahari yang sudah  kering  (serbuk)  ditimbang  sebanyak  50 mg  kemudian  dilarutkan  dengan  50  ml  buffer fosfat pH 7.
• Dilakukan pengadukan dengan Magnetic stirrer pada  suhu  kamar,  selama  (15,  20,  25,  30,  35 menit)  dengan  kecepatan  bervariasi  250,  500, 750, 1000, 1250 rpm.
• Dicentrifuse  untuk  memisahkan  filtrate  dan endapan  pada  suhu  kamar  selama  30  menit dengan kecepatan bervariasi 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 rpm,
• filtrate terpisah dari endapan, filtrate digunakan untuk  menentukan  kadar  protein  dan  endapan digunakan untuk uji karbohidrat.

## Metode Kjeldahl
Analisis kadar protein metode mikrokjeldahl. Prinsip kerjanya adalah sejumlah sampel ditimbang, lalu dimasukkan  ke  dalam  tabung  kjeldahl  30  ml. Kedalamnya ditambahakan 1, gram K2SO4, 40mg HgO dan  20  ml  H2SO4.  Jika  sampel  lebih  dari  15  mg kemudian  di  tambahkan  0,1ml  H2SO4  untuk  setiap  10 mg  bahan  organik.  Selanjutnya  sampel  di  didihkan selama 1-1,5 jam sampai cairan jernih dan di dinginkan. Isi labu kjeldahl di pindah kan  dalam alat destilasi.labu di cuci dan dibilas 1-5 kali dengan 1-2 ml air.Air cucian di masukan dalam alat destilasi kemudian di tambahkan 8-10  ml  larutan  NaOH-Na 2 S 2 O 3 .  Erlemeyer  125  ml yang  berisi  5  ml  H 3 BO 3 dan  2-4  tetes  indikator  di letakan  di  bawah  kondensor.  Ujung  tabung  kodensor harus  terendam  di  bawah  larutan  H 3 BO 3 .  setelah  itu  di lakukan  destasi  sampai  di  peroleh  kira  kira  15  ml destilasi  dalam  erlenmeyer.  Tabung  kondensor  dibilas air  dan  bilasanya  di  tampung  dalam  erlenmeyer  yang sama.  Isi  erlenmeyer  di  encerkan  sampai  50  ml kemudian  dititrasi  dengan  HCI  0,02  N  sampai  terjadi perubahan  warna  menjadi  abu-abu.  Hal  ini  di  lakukan terhadap blanko

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kurva Standar BSA
Kurva  standar  BSA  perlu  dilakukan  karena  menjadi dasar  penentuan  konsentrasi  kadar  protein  di  dalam larutan . Sebagai  kurva  standar  yang  menghubungkan antara  konsentrasi  dan  absorbansinya . Konsentrasi standar  BSA  sebelumnya  didapatkan  dari  nilai  absorban panjang  gelombang  maksimum  BSA.  Setelah  itu, pada  nilai  panjang  gelombang  650  nm  dapat  digu- nakan  untuk  mengukur  konsentrasi  BSA . Selanjutnya, kurva  standar  digunakan  untuk  menghitung  konsentrasi sampel  yang  konsentrasinya  belum  diketahui.  Kurva standar  BSA  dibuat  meng-gunakan  larutan  BSA dengan  variasi  konsentrasi  0;  20;  40;  60;  80;  100;  120; 140;  160;  180;  200;  220;  240;  260;  280;  300  ppm. Sebagai  blanko  digunakan  aquades  dan  didapatkan kurva standar BSA sebagai berikut
Dari  kurva  standart  BSA,  diperoleh  persamaan  regresi linier  y  =  0,0008X  –  0,0179  dimana  x  sebagai konsentrasi dan y absorbansi. Koefisien korelasi 0,9905. Persamaan  tersebut  digunakan  untuk  menentukan  nilai konsentrasi protein pada spirulina sp. Hal ini bisa dilihat pada Tabel 1, 2 dan 3
Tabel 1. Kadar protein Spirulina sp dengan variasi kecepatan Magnetic stirrer bervariasi
Tabel 2 . Kadar protein Spirulina sp dengan variasi kecepatan sentrifuse
Tabel 3. Kadar protein Spirulina sp dengan variasi waktu Magnetic stirrer
Sampel (rpm) Rata-rata Absorban si Konsen trasi (ppm) Total N % protein (lowry) %protein (kjeldahl) 15 0,00443 27,912 0,0187 37,5144 23,48 20 0,004 27,363 0,0172 34,3235 15,38 25 0,003 26,467 0,0167 33,3480 16,95 30 0,004 27,358 0,0172 34,4715 19,28 35 0,003 26,675 0,0168 33,6105 16,43

## Persentase protein dengan variabel kecepatan Magnetic Stirer
Dalam  penentuan  kadar  protein pada spirulina sp,  variasi  kecepatan magnetic  stirrer  dibutuhkan  untuk menghomogenkan  suatu  larutan  antara  spirulina  sp dengan  buffer  fosfat,  jika  kecepatannya  kurang mengakibatkan  kurang  homogen  dan  menyebabkan kadar  proteinnya  terpisah  tidak  sempurna  dan  hasilnya jadi kecil.
Gambar  2. Hubungan  antara  kecepatan  Magnetic Stirer dengan kadar protein
Kadar  protein  spirulina  sp  dengan  menggunakan metode Kjedahl nilainya lebih tinggi jika dibandingkan dengan metode lowry untuk variasi kecepatan Magnetic stirrer terlihat pada Gambar 2 hal ini disebabkan karena dalam  metode  kjeldahl  yang  di  analisa  adalah  kadar protein  kasar  (crude  protein)  yaitu  senyawaan  N  bukan protein, prosedurnya  lebih  panjang  sehingga  memung- kinkan  terjadi  kesalahan  karena  kurang  teliti  yang dapat  mempengaruhi  hasil  akhir.  Sedangkan  untuk metode  Lowry  prosedur  lebih  sederhana  dan  hanya tergantung  dari  keakuratan  alat  spektrofotometer.dan kadar  protein  tertinggi  dicapai  angka  37,5144  %  pada kecepatan magnetic stirrer 500 rpm.

## Kecepatan Centrifuse
Kecepatan  centrifuse  mempengaruhi  terpi- sahnya antara filtrate dan endapan, jika endapan terpisah sempurna  dengan  filtrate  akan  menghasilkan  analisa kadar  protein  yang  sempurna,  dimana  filtratnya  akan digunakan  untuk  uji  kadar  protein  dan  endapan.nya untuk  uji  karbohidrat.  Semakin  tinggi  kecepatannya tentunya membutuhkan waktu yang relative singkat.
Gambar.3 Hubungan  antara  kecepatan  Centrifuse dengan kadar protein
Sampel (rpm) Rata-rata Absorban si Konsen trasi (ppm) Total N % protein (lowry) %protein (kjeldahl) 250 0,0030 26,150 0,0167 33,3151 20,55 500 0,0044 27,913 0,0188 37,5144 23,48 750 0,0032 26,346 0,0159 31,7204 22,50 1000 0,0030 26,121 0,0146 29,2553 23,48 1250 0,0034 26,654 0,0168 33,5843 20,85 Sampel (rpm) Rata-rata Absorban si Konsen trasi (ppm) Total N % protein (lowry) %protein (kjeldahl) 2000 0,002 25,025 0,0151 30,1301 27,08 3000 0,003 25,929 0,0167 33,3242 24,98 4000 0,004 26,825 0,0146 29,2929 23,48 5000 0,004 27,271 0,0179 35,8121 28,65 6000 0,004 27,913 0,0188 37,5144 24,15
Pada  Gambar  3,  kadar  protein  tertinggi  diperoleh 37,5144%  pada  kecepatan  centrifuse  6000  rpm menggunakan  metode  Lowry  dan  terendah  23,48  rpm pada  kecepatan  centrifuse  4000  rpm  menggunakan metode  Kjeldahl.  Pada  variasi  kecepatan  centrifuse  ini dihasilkan  kadar  protein  tertinggi  juga  dihasilkan  dari metode Lowry hal ini disebabkan pada metode Kjeldahl kurang  akurat  bila  diperlukan  pada  senyawa  yang mengandung atom nitrogen yang terikat secara langsung ke  oksigen  atau  nitrogen  dan  spirulina  sp  termasuk  ke dalam golongan ini.

## Lamanya pengadukan dalam Magnetic stirrer.
Waktu  pengadukan  dalam  magnetic  stirrer bertujuan  untuk  mencampur  spirulina  sp  dengan  buffer fosfat  agar  tercampur  secara  merata  yang  dapat mempengaruhi  proses  berikutnya  yang  pada  akhirnya dapat  menentukan  hasil  dari  kadar  protein.  Jika  proses pemisahan  antara  protein  dengan  komposisi  lainnya misalnya  karbohidrat  dan  yang  lainnya  terpisah  secara sempurna,  maka  akan  diperoleh  kadar  protein  yang tinggi  yang  dapat  dimanfaatkan  untuk  keperluan  yang lain,  misalnya  sumber  protein  dalam  makanan fungsional, kecantikan dan yang lain.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 12.5 15 17.5 20 22.5 25 27.5 30 32.5 35 % p r o te in waktu Magnetic Stirer (menit) metode Lowry metode Kjedahl
Gambar 4. Hubungan antara waktu Magnetic Stirer dengan kadar protein
Dalam  variasi  waktu  magnetic  stirrer  dihasilkan  kadar protein  tertinggi  yaitu  37,5144%  terjadi  pada  waktu pengadukan  15  menit,  waktu  yang  tidak  lama  karena jika  diaduk  terlalu  lama  menyebabkan  larutan  menjadi terpisah  yang  menyebabkan  kadar  protein  akan berkurang.

## SIMPULAN
Metode  Lowry  menghasilkan  kadar  protein yang lebih tiggi dibanding dengan metode kjeldahl baik untuk  variasi  waktu  pengadukan  dengan  magnetic stirrer,  kecepatan  magnetic  stirrer  dan  kecepatan centrifuse.  Kadar  protein  tertinggi  yang  dihasilkan  dari penelitian  ini  yaitu  37,5144%  terjadi  pada  waktu pengadukan  dengan  magnetic  stirrer  15  menit, kecepatan  magnetic  stirrer  500  rpm  dan  kecepatan sentrifuse  6000  rpm  menggunakan  metode  Lowry. Metode  kjeldahl  kurang  baik  digunakan  untuk pemisahan protein terhadap komponen lainnya khususnya untuk spirulina sp.

## DAFTAR PUSTAKA
Borowitzka,  A.M.,  dan  Lesly  B.  J.  1988.    Microalgal Biotechnology.    Cambridge  University  Press, Australia
Colla  LM,  Bertolin  TE,  Costa  JAV.  2004.    Fatty  acids profile  of  Spirulina  platensis  grown  under different  temperatures  and  nitrogen  concen- trations. Z. Naturforsch 59c:  55-59.
Jongkon  P.,  Siripen  T  and  Richard  D.  L.    2008.
Phytoremediation  of  Kitchen  Wastewater  by Spirulina  platensis    (Nordstedt)  Geiteler:  Pigment content,  Production Variable Cost and Nutritonal Value. Maejo International Journal of  Science and Technology. 2 (2): 159– 171
Kabinawa,I.N.K.2001.  Mikroalga  sebagai  sumber  daya hayati  perairan  dalam  perspektif  bioteknologi Puslitbang Bioteknologi Lembaga Ilmu
Pengetahuan Bogor.
Kotilainen,L.,R.Rajalahti,C  Ragasa,E  2006  Health enhancing  foods  opportunities  for  strengthening the sector in developing countries Agriculture and Rural Development discussion paper 30
Kurniawan,  Gigih  2013  Protein  Analysis  Kjeldahl Method,http://chemistryinorganic.blogspot.com/01 3/03/Protein-Kjeldahl.html  (online).  Diakses  pada tanggal 31 Oktober 2013
Lowry  HO,  Rosenbrough,  NJ,  Farr  AL,  Randall  RJ. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.  Journal  of  Biology  and  Chemistry. 193:265-275
Miftahur  Rohman  dan  Andi  Setiawan  Jurusan  Kimia, FMIPA Universitas Lampung, Bandar Lampung.
Mollet,B.,&  I.Rowland.2002.Functional  food;  At  the frontier beween food and pharma current opinion in biotechnology, 13;483-485.
Roberfroid,  M.B.2000  a  Concepts  and  strategy  of functional fod science : The European perspective. The  American  Journal  of  Clinical  Nutrition,
71:S660-S1664.