Efek dimethyl sulfoxide (DMSO) terhadap Karakteristik Sel Punca Limbal (SPL) Tikus Effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) at Limbal Stem Cells Characteristics (LSCs) of Rat Ratih Rinendyaputri 1 , Frans Dany 2 , Uly Alfi Nikmah 3 1-3 Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Balitbangkes, Kemenkes RI ratihr79@yahoo.com
Abstact :  The  number  of  donor  limbal  stem  cells  (LSCs)  is  limited  despite  their  large  demand  for management  of  LSC  deficiency-related  corneal  opacity,  requiring  propagation  of  these  cells  in  vitro. Production  of  LSCs  can  be  done  through  isolation  and  culture  of  limbal  tissue  in  vitro  and cryopreservation  of  LSCs  is  utilized  to  maintain  the  availability  of  LSCs.  Upon  cryopreservation, cryoprotectants  are  required  to  protect  cells  from  thermal  injury.  Dimethyl  sulfoxide  (DMSO)  is  a commonly used cryoprotectant for cryopreservation but the effect of its use on LSCs are still seldomly reported.  This  study  aimed  to  determine  the  effect  of  the  use  of  DMSO  in  cryopreservation  of  LSC. The study was conducted at the Stem Cell Laboratory, Center for Biomedical and Basic Technology of Health, NIHRD Ministry of Health. This research was performed by culturing and observation of  LSCs characteristic  after  cryopreservation.  Meanwhile,  level  of  LSC  proliferation  was  determined  by calculating population doubling (PD) and population doubling time (PDT) besides analyzing  their gene expression  using  markers  such  as  CD90  (Thy1)  and  Krt12.  The  results  showed  that  PD  and  PDT  in LSC control and post-cryopreservation without DMSO and cryopreservation  using DMSO accordingly are 1.33 and 143.03, 150.65 and 1.15, and 1.31 and 155. Meanwhile, CD90 (Thy1) gene expression and  Krt12  expression  in  the  cryopreserved  group  with  and  without  DMSO  compared  with  their respective  controls  are  2.7  and  4.51,  2.55  and  1:44,  respectively.  In  this  study,  DMSO  for  the cryopreservation did not affect at the LSC characteristics of rat. Key word : limbus stem cell, LSC, cryopreservation, dimethyl sulfoxide, DMSO
Abstrak :  Jumlah  donor  sel  punca  limbal  (SPL)  sangat  terbatas  padahal  kebutuhannya  cukup  besar untuk  penatalaksanaan  kekeruhan  kornea  akibat  defisiensi  sel  tersebut  sehingga  SPL  perlu diperbanyak  secara  in  vitro.  Produksi  SPL  secara  in  vitro  dapat  dilakukan  dengan  melakukan  isolasi dan  kultur  dari  jaringan  limbal,  dan  metode  simpan  beku  atau  kriopreservasi  SPL  digunakan  untuk menjaga  ketersediaan  SPL.  Pada  saat  kriopreservasi,  dibutuhkan  krioprotektan  yang  dapat melindungi  sel  dari  kerusakan  termal  saat  kriopreservasi.  Dimethyl  sulfoxide  (DMSO)  merupakan salah  satu  krioprotektan  yang  umum  digunakan  untuk  kriopreservasi  namun  efek  penggunaan  pada SPL  masih  sangat  jarang  dilaporkan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  efek  penggunaan DMSO pada kriopreservasi SPL. Penelitian dilakukan di Laboratorium Stem Cell Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Badan Litbangkes. Penelitian ini dilakukan dengan melakukan kultur SPL tikus  menggunakan  metode  eksplan  secara  in  vitro  pada  cawan  petri.  Pengamatan  terhadap karakteristik SPL pasca kriopreservasi dilakukan dengan pengamatan terhadap morfologi SPL secara mikroskopis dan mengetahui tingkat proliferasi SPL dengan menghitung population doubling (PD) dan population  doubling  time  (PDT)  serta  menganalisis  ekspresi  gen  CD90  (Thy1)  dan  Krt12  sebagai marker  SPL.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  PD  dan  PDT  pada  SPL  kontrol  dan  pasca kriopreservasi tanpa  DMSO dan kriopreservasi dengan DMSO secara berturut-turut adalah  1.33 dan 143.03, 1.15 dan 150.65 serta 1.31 dan 155. Sedangkan tingkat ekspresi gen CD90 (Thy1) dan Krt12 SPL pada penggunaan dan tanpa DMSO dibandingkan dengan kontrol masing-masing adalah 2,7 dan 4,51 serat 2,55 dan 1,44 kali. Pada penelitian ini, DMSO tidak  mengubah  karakteristik SPL tikus. Kata kunci: sel punca limbal, SPL, kriopreservasi, dimethyl sulfoxide, DMSO

## I. PENDAHULUAN
Kemampuan  sel  punca  untuk  berdiferensiasi menjadi  berbagai  tipe  sel  ( plasticity )    dan berproliferasi  dalam  jangka  waktu  yang  lama ( self-renewal ) sangat berpotensi untuk meregenerasi kerusakan jaringan maupun organ. (Burman  S  and  Sangwan  V,  2008) Jika  terjadi kerusakan pada jaringan kornea, maka sel punca limbal  (SPL)  akan  berdiferensiasi  menjadi  sel epitel  kornea  sehingga  jaringan  kornea  kembali normal.  (Albert  R et  al ,  2009 ) Kerusakan  kornea dapat  terjadi  akibat  beberapa  penyakit  genetik seperti Stevens-Johnson Syndrome (SJS), diferensisi  SPL  parsial/total  maupu  trauma
kimiawi  (basa/asam  nukleat)  atau  trauma  kronis akibat  penggunaan  lensa  kontak.  (Lekhanont  K et  al,  2009) Untuk  mengatasi  permasalahn tersebut  transplantasi  SPL  dapat  dilakukan, namun  ketersediaan  donor  SPL  masih  sangat terbatas. Untuk itu, keberhasilan dalam memperbanyak  SPL  secara in  vitro serta kriopreservasi  dalam  menjamin  ketersediaan SPL sangat dibutuhkan.
Produksi  SPL  secara in  vitro pada  manusia maupun  hewan  coba  dan  kriopreservasi  SPL telah  berhasil  dilakukan.  (Loureiro et  al ,  2013., Sancak et  al ,  2014,  Meyer-Blazejewska et  al , 2010.,  Yeh et  al ,  2008)  Pada  saat  melakukan
kriopreservasi,  dibutuhkan  krioprotektan  dengan konsentrasi  tinggi  untuk  menarik  sebagian molekul  air  keluar  dari  dalam  sel.  Krioprotektan akan masuk ke dalam sel dan mengurangi ikatan hidrogen  air  sehingga  terbentuknya  kristal  es yang dapat merusak membran sel dapat dicegah. (El-Danasaouri  I.  and  Selaman  H , 2007, Meryman,  2007)    Namun  krioprotektan  juga memiliki sifat toksik terhadap sel, sehingga jenis, konsentrasi  dan  sifat  krioprotektan  yang  akan digunakan untuk kriopreservasi sel perlu diperhatikan. (Bagis et al , 2009) Terdapat berbagai jenis krioprotektan intraseluler seperti DMSO, gliserol, propilen glikol dan  etilen  glikol  yang  memiliki  berat  molekul kecil.  Krioprotektan  intrasel  merupakan  molekul kecil yang mudah keluar masuk melalui membran sel.  (Meryman,  2007)  Penggunaan  DMSO  untuk kriopreservasi berbagai tipe sel dengan konsentrasi rendah telah berhasil dilakukan pada SPL, haematopoetic  stem  cell (HSC)  dan embryonic  stem  cell (ESC).  (Kito et  al .  2005, Desai et al . 2010, Djuwantono et al , 2011) DMSO  merupakan  krioprotektan  intrasel dengan  berat  molekul  78,13  g/mol  sehingga secara cepat mampu melewati membran sel dan mencegah  terbentuknya  kristal  es.  (Aye et  al . 2010) Konsentrasi  DMSO  yang  tinggi  pada kriopreservasi dapat secara maksimal mencegah terjadinya kristal es sehingga kerusakan sel tidak terjadi  dan  viabilitas  sel  meningkat.  (Bakhach, 2009) Namun  pada  konsentrasi  yang  tinggi, DMSO  meliliki  sifat  toksik  terhadap  berapa  tipe sel  tertentu. Pada  sel  kanker  kolon  pemberian 10% DMSO tidak menunjukkan adanya kerusakan  pada  struktur  membran  sehingga fungsi permeabilitas membran sel tidak terganggu. (Violante et al . 2002) Meskipun menurut Food & Drug
Administration  DMSO  masih  dapat  digunakan untuk  kriopreservasi  sel,  perlu  dikaji  lebih  lanjut pengaruh penggunaan DMSO dengan konsentrasi  tinggi  terhadap  karakteristik  fenotipe maupun genotipe SPL.
Penggunaan krioprotektan  seperti  DMSO  dalam  konsentrasi 10%  pada  kriopreservasi  SPL  telah  dilaporkan dengan  hasil  viabilitas  bervariasi.  (Yeh et  al , 2008.  ,  Kito et  al .  2005) Namun  informasi  efek tingginya konsentrasi
DMSO dalam
kriopreservasi  terhadap  karakteristik  SPL  masih sangat  terbatas.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  efek  penggunaan  DMSO  pada kriopreservasi SPL.

## II. METODE PENELITIAN Isolasi Sel Punca limbal
Sel  punca  limba  (SPL)  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  merupakan  SPL  tikus  strain Wistar jantan atau betina dengan umur 3-4 bulan. Tikus  dipelihara  dalam  kandang  akawat  dengan
pemberian  pakan  dan  minum  secara ad  libitum . Tikus  yang  diambil  organ  mata  diterminasi dengan melakukan anestesi dengan menggunakan  Xylasine  dosis  0,05mg/kg  BB  dan ketamin  dengan  dosis  11mg/kg  BB  kemudian dilakukan dislocatio  cervicalis. Organ  mata dibawa  ke  laboratorium  menggunakan  medium transport  (phosphate  buffer  saline/PBS  yang mengandung  1%  Penisilin-Streptomisin  atau Penstrep).  Organ  mata  dimasukkan  ke  dalam Povidone  Iodine  1%  selama  2  menit  kemudian dilakukan isolasi SPL dengan memotong jaringan di perbatasan antara konjungtiva dan kornea. Sel punca  limbal  (SPL)  yang  diperoleh  dicacah dalam  medium  kultur.  Sel  punca  limbal  yang telah  dipotong  kecil  dikultur  dengan  metode tempel  eksplan  pada plate dengan  4 well menggunakan medium kultur.

## Kultur Sel Punca Limbal
Kultur sel punca limbal dilakukan dengan metode yang  dikerjakan  oleh  Krishnan et  al (2010) 18 dengan  sedikit  modifikasi.  Medium  kultur  yang digunakan  medium  α-MEM/F12  dengan  10% FBS, dan suplementasi Penstrep 1%, ITS (insulin 0,1  mg,  transferin  55µg/ml,  selenium  5  ng/l), EGF/ epidermal  growth  factor (0,01  mg/l),  dan hidrokortison  0,1  mg/ml  pada  suhu  37 0 C,  5% CO 2 .  Penggantian  medium  kultur  dilakukan setiap  2-3  hari  kultur,  setelah  13-15  hari  kultur dilakukan pasase. Pada saat pasase, penghitungan  sel  dengan  uji  Trypan  blue dilakukan  sebelum  penanaman  kembali  sel  di cawan petri yang baru.

## Kriopreservasi Sel Punca Limbal
Sel  punca  limbal  (SPL)  yang  digunakan untuk  penelitian  ini  merupakan  SPL  pasca pasase  2.  Jenis  metode  simpan  beku  atau kriopreservasi  yang  dilakukan  adalah  vitrifikasi dengan  menggunakan  SPL  pasase  2  pasca kultur  (n=8)  berjumlah  ~5  x  10 5 sel.  Sel disentrifus  pada  1000  rpm  selama  5  menit,  dan supernatan  lalu  dibuang.  Pelet  dikriopreservasi menggunakan  2  macam  medium  yaitu  medium vitrifikasi  tanpa  dan  mengandung  15%  DMSO (A=medium  tanpa  DMSO,  B=  medium  dengan DMSO).
Pada medium A, komposisi terdiri dari  50 µl medium ekuilibrasi (20% etilen glikol/EG) selama 5  menit  dan  500µl vitrification  solution (40%  EG, 18% Ficoll 70 dan 0.3M Sucrose dalam PBS 20% FBS)  selama  40  detik.  Pada  medium  B,  pelet diresuspensi  dengan  200  µl  medium  vitrifikasi ( vitrification  solution )  komposisi  medium  kultur dengan  20%  FBS,  15%  DMSO  dan  15%  EG kemudian  dipindahkan  ke  dalam  tabung cryovial dan  segera  dimasukkan  langsung  ke  dalam nitrogen (N 2 ) cair kurang dari 15 detik.
Thawing dilakukan  setelah  1  jam  dalam nitrogen  cair  dengan  langsung  menambahkan medium  kultur (suhu  37ᵒC)  pada cryovial yang diambil dari nitrogen cair. Suspensi sel dimasukkan ke dalam conical tube yang berisi 10 ml  medium  kultur.  Sentrifugasi  sel  dilakukan pada 1300  rpm  selama  5  menit  untuk mendapatkan  pelet.  Resuspensi  pelet  dengan medium  kultur  dan  dilakukan  kultur  di  dalam cawan  petri.  Setalah  mengalami  2  pasase, dilakukan  penghitungan  PD  dan  PDT  pada  hari ke 7 kultur menggunakan uji Trypan blue.
Menghitung Population  Doubling (PD)  dan Population Doubling Time (PDT) SPL Penghitungan dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan  (3  rangkap).  PD  merupakan  siklus penggandaan  jumlah  sel  dalam  suatu  periode yang  dihitung  dengan  rumus  (log10  (jumlah  sel panen)  -  log  10(jumlah  sel  ditanam)  /  log  10  (2). Sedangkan  PDT  merupakan  t/PD  yaitu,  waktu yang  diperlukan  sel  untuk  menggandakan jumlahnya,  dengan  t  menggambarkan  periode kultur  penghitungan  tersebut  sesuai  dengan metode  yang  dilakukan  Roy  S et  al (2014). 12 Dalam penelitian ini ∆t= 6 hari (104 jam).

## Induksi Diferensiasi menjadi Osteosit
Induksi dilakukan pada populasi SPL kontrol dan pasca  kriopreservasi.  Induksi  dilakukan  dengan medium  induksi  osteosit  (Gibco).  Sel  yang  telah mengalami  konfluensi  60%  diinduksi  dengan medium  induksi  tersebut  selama  14  hari  dengan penggantian medium 2-3 hari sekali.
Pewarnaan diawali dengan fiksasi menggunakan  4%  paraformaldehide  selama  30 menit  pada  suhu  ruang.  Larutan  fiksasi  dibuang dan  cuci  dengan  PBS  2  kali,  dilanjutkan  dengan penambahan  larutan  pewarnaan  Alizarin  untuk osteosit  selama  30  menit.  Larutan  pewarna  lalu dibuang  dan  dibilas  dengan  air  2  kali. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop inverted .

## Karakterisasi Sel Punca Limbal
Analisis
genotipe
SPL
dilakukan menggunakan  metode quantitative  real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Tahap ini diawali  dengan  tahapan  isolasi  material  genetik berupa RNA ( Ribonucleid Acid ), hal ini bertujuan untuk  melihat  ekspresi  gen  CD90  (Thy1)  dan Krt/12  pada  sampel.  Sampel  yang  dilakukan isolasi  RNA  adalah  sel  punca  limbal  kontrol  dan pasca kriopreservasi yang telah dikultur selama 7 hari.  Proses  isolasi  RNA  dilakukan  dengan menggunakan  kit  mnual  (Qiagen,  #52906).  Hasil isolasi  RNA  dilanjutkan  dengan  uji  kualitas menggunakan spektrofotometri yaitu menggunakan  Nanodrop TM ,  hal  ini  bertujuan untuk  evaluasi  hasil  isolasi  baik  konsentrasi
maupun  kemurniannya.  Pengujian  kemurnian RNA  total  dilakukan  dengan  membandingkan nilai A260 dan A280. Rasio A260/A280 yang baik adalah 1.88-2.00 artinya RNA hasil isolasi bebas dari  kontaminasi  protein.  Hasil  spektrofotometri yang positif dilanjutkan dengan proses amplifikasi.
Amplifikasi  material  genetik  RNA  dilakukan 2 tahap yaitu 1) pengubahan RNA menjadi cDNA atau RT-PCR ( Reverse
Transcriptase Polymerase  Chain  Reaction )  menggunakan  kit (Invitrogen,  12574-026)  dan  2)  amplifikasi  cDNA menggunakan  realtime  PCR  dengan  SYBR Green  PCR  Master  Mix  (AB,  #4385610).  Tahap pertama  dilakukan  denaturasi  RNA  pada  suhu 70 0 C  selama  5  menit,  kemudian  tahap  kedua adalah  sintesis  komplementari  DNA  (cDNA) dengan  inkubasi  pada  suhu  25 0 C  selama  5 menit, 42 0 C selama 60 menit dan 80 0 C selama 5 menit.  Tahap  terakhir  tambahkan  50µl nuclease- free water (NFW).
Amplifikasi  cDNA  menggunakan  mesin Applied  Biosystem 7500 fast  Realtime  PCR system (AB 7500 realtime PCR) dengan tahapan aktiv asi  enzim  95ᵒC  selama  3  menit,  denaturasi 95ᵒC  selama  1-3  detik  dan annealing /ekstensi 60ᵒC selama 20 detik (40 cycle). PCR dilakukan dengan  primer  spesifik  gen  CD90  (Thy1)  dan Krt/12.  Primer  yang  digunakan  primer  spesfik yang  didesain  dan  telah  dicek  dengan  program desain  primer  BLAST  ( Basic  Local  Alignment Search  Tool )  pada  situs gene  bank  database, yakni  www.ncbi.nlm.nih.gov  (Tabel  I1).  Metode Livak  digunakan  untuk  menganalisa  tingkat ekspresi  gen  dibandingkan  kelompok  kontrol. Selain  itu,  sistem  mesin  telah  dilengkapi  dengan kalibrator ROX pada setiap reaksi serta 18sRNA sebagai housekeeping  gene sebagai  kontrol internal.
Tabel  I. Urutan  Basa  (Sekuen)  Primer  Krt12, CD90(Thy1) dan 18sRNA
Primer Sekuen (Urutan Basa) Panjang target PCR (bp) Krt12 Forward Reverse CTA CCC GCT GAT TGA GGA CC TCT GAG CTC TCC GCT CTT GG 367 CD90/Thy- 1 Forward Reverse AGA CCC AGG ACG GAG CTA TT ACA CTT GAC CAG CTT
GTC TCT
416 18sRNA Forward Reverse CAT TCG AAC GTC TGC CCT AT GTT TCT CAG GCT CCC TCT CC 109

## Pengolahan dan Analisis Data
Data  dari  ekspresi  gen  Krt12  dan  CD90  (Thy1) akan  dianalisis  secara  deskriptif  dan  data
kuantitatif  PD,  PDT  dan  PD/hari  dianalisis dengan uji one way ANOVA menggunakan SPSS 16.

## III.  HASIL
Populasi  SPL  masih  dapat  menempel  pada cawan  dan  memiliki  morfologi fibroblast-like  cell pascavitrifikasi  dengan  DMSO  maupun  tanpa DMSO.  Sementara  tingkat  kepadatan  SPL  pada kelompok  kontrol  dan  pascavitrifikasi  telah mencapai  konfluen  pada  kultur  hari  ke-7 (Gambar 1).
Gambar 1. Kultur sel punca limbal (SPL). SPL pada hari ke 5 kultur pada kelompok kontrol (A), pasca vitrifikasi tanpa DMSO (B) dan dengan DMSO (C).
Populasi  SPL  yang  telah divitrifikasi dengan dan  tanpa  DMSO  masih  dapat  mengalami diferensiasi  menjadi  osteosit.  Setelah  14  hari diinduksi  dengan  medium  diferensiasi  ostesoit, sel diwarnai menggunakan Alizarin (Gambar 2).
Gambar 2. Kemamuan sel punca limbal (SPL)  tikus diferensiasimenjadi osteosit dengan pewarnaan Alizarin. Kelompok kontrol (A), pasca simpan beku (vitrifikasi) tanpa DMSO (B) dan menggunakan DMSO (C ) .
Tabel II . Tabel population doubling (PD) dan population doubling time (PDT) SPL tikus kontrol dan pascavitrifikasi.
PD PDT (jam) Koy tntrol 1,33±0,68 143,03±96,5 Vitrifikasi (-DMSO) 1,15±0,70 150,65±68,62 Vitrifikasi (+DMSO) 1,31±0,73 155,45±117,8
Tingkat  proliferasi  sel  punca  limbal  tikus secara in  vitro pasase  ke-2  pada  SPL  grup kontrol dan pascavitrifikasi menunjukkan
population doubling (PD) dan population doubling time (PDT) yang sama (Tabel 2). Pada hari ke-6, kultur  SPL  grup  kontrol  maupun  pascavitrifikasi telah mengalami konfluensi.
Tabel III. Ekspresi relatif gen Krt12 dan CD90
Kelompok 2- ΔΔCt Krt12 CD90 Kontrol 1 1 Vitrifikasi (-DMSO) 4,51 2,7 Vitrifikasi (+DMSO) 1,44 2,55
Ekspresi gen Krt12 yang merupakan penanda sel epitel  kornea  pada  populasi  SPL  pascavitrifikasi tampak  lebih  tinggi  dibandingkan  kontrol  (Tabel 3).  Demikian  pula  ekspresi  gen  CD90  atau  Thy1 yang  merupakan  penanda  progenitor  epitel/SPL yang meningkat dua kali lipat pascavitrifikasi.

## IV.  PEMBAHASAN

## Kultur sel punca limbal (SPL) tikus
Pada penelitian ini populasi SPL merupakan populasi sel yang diperoleh dari eksplan jaringan limbus  pasca  pasase  3.  Populasi  SPL  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  tidak  dilakukan tahap  pemisahan  sel  sehingga  populasi  SPL yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  tidak  hanya mengekspresikan  gen  ABCG2  dan  p63  (data tidak  ditampilkan)  tetapi  juga  mengekspresikan gen  CD90  (Thy1)  dan  gen  Krt12  (Tabel  3). Penanda  tersebut  sesuai  dengan  populasi  SPL yang  dilaporkan  oleh  Krishnan et  al (2010) bahwa pada kultur sel epitel kornea dari jaringan limbus,  terdapat  beberapa  tipe  sel  yang  akan tumbuh,  yaitu  sel  epitel  kornea  (penanda  gen Krt12), SPL (penanda gen ABCG2 dan p63) dan populasi sel  progenitor epitel/SPL  (penanda gen ABCG2,  p63  dan  CD90/Thy1).  (Sancak et  al . 2014, Krishnan et al . 2010, Li et al. 2012) Secara mikroskopis
morfologi SPL
berbentuk  kuboid  dengan  membentuk  klon  dan menunjukkan  adanya  migrasi  menjadi  sel  epitel kornea. (Meyer-Blazejewska et al. 2010, Loureiro et al. 2013) Namun ada populasi progenitor SPL yang  memiliki  morfologi fibroblast-like  cell dan pada  kondisi  kultur  tertentu  akan  berdiferensiasi menjadi sel epitel kornea. (Sancak et al . 2014, Li et  al .  2012,  Polisetty et  al .  2012)    Populasi progenitor  epitel/SPL  merupakan mesenchymal stem  cell (MSC)  yang  berada  pada  jaringan limbus  sehingga  dalam  lingkungan  kultur  dapat berproloferasi  dan  berdiferensiasi  menjadi  SPL. (Li et al . 2012, Polisetty et al . 2012)
Pada  penelitian  ini  populasi  progenitor epitel/SPL ditunjukkan dengan morfologi fibroblast-like  cell ,  kemampuan  sel  tersebut
A B C A B C
berdiferensiasi  menjadi  osteosit  serta  positif terhadap penanda CD90 atau Thy1 (Gambar 1, 2 dan  Tabel  3).  Selain  itu  kemampuan  proliferasi yang  tinggi  dengan  PDT  ±  6  hari  (Tabel  2) menunjukkan  bahwa  sel  progenitor  epitel/SPL pada  penelitian  ini  sangat  tinggi  dibandingkan dengan  kemampuan  proliferasi  SPL yang dilaporkan  oleh  Loureiro et  al. (2013). Hal  ini dapat  disebabkan  karena  populasi  SPL  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  telah  mengalami beberapa pasase sehingga SPL telah berdiferensiasi spontan menjadi sel epitel kornea. Sedangkan proliferasi progenitor SPL yang tinggi akan mendominasi populasi sel yang dikultur.
Karakteristik  sel  punca  limbal  (SPL)  tikus pasca  kriopreservasi  dengan  dan  tanpa DMSO
Pascavitrifikasi  dengan  medium  tanpa  dan dengan  DMSO,  populasi  SPL  tetap  memiliki morfologi fibroblast-like cell . Hal ini menunjukkan bahwa  penggunaan  DMSO  dengan  konsentrasi tinggi  tidak  mempengaruhi  fenotipe  dan  tingkat proliferasi populasi SPL (Gambar 1 dan Tabel 2). Metode  simpan  beku  pada  penelitian  ini menggunakan  DMSO  dengan  konsentrasi  15%, namun  keterpaparan  SPL  dengan  DMSO  pada suhu  ruang  sangat  cepat  (<  15  detik)  sehingga efek  toksik  tidak  mempengaruhi  kualitas  SPL. Menurut Bagis et al. (2009) metode kriopreservasi akan mempengaruhi sifat toksisitas  krioprotektan  karena  pada  suhu  ruang DMSO  bersifat  toksik  namun  tidak  toksik  pada suhu yang sangat rendah (- 196ᵒC).
Pada  penelitian  ini,  metode  kriopreservasi yang  digunakan  adalah  metode  vitrifikasi. Meskipun konsentrasi krioprotektan yang digunkan cukup tinggi, pelet sel segera dimasukkan dalam nitrogen cair (- 196ᵒC) sehingga  tidak  terjadi  proses  dehidrasi  pada  sel (El-Danasaouri  I.  and  Selaman  H.  2007) Krioprotektan intasel seperti DMSO akan membentuk  ikatan  hidrogen  dengan  molekul  air di  dalam  sel  sehingga  pengumpulan  molekul  air yang membentuk kristal es saat penurunan suhu tidak terjadi. (Jain J K and Paulson RJ. 2006) Populasi progenitor SPL dari jaringan limbal tikus  pasca  kriopreservasi  dengan  konsentrasi 15%  DMSO  pada  penelitian  ini  masih  memiliki sifat  multipoten  secara  fenotipe  (Gambar  2  dan Tabel  3).  Secara  fenotipe  dapat  ditunjukkan dengan kemampuan diferensiasi menjadi osteosit pasca  induksi  dan  positif  terhadap  pewarnaan Alizarin  yang menunjukkan proses kalsifikasi sel. Selain itu ekspresi imunofenotipe seperti penanda CD90 atau Thy1 merupakan salah satu ciri  multipotensi  progenitor  SPL.  (Li  et  al.  2012., Polisetty et al. 2008., Naaldijk etal. 2012)
Secara  genotipe,  populasi  progenitor  SPL ditunjukkan  dengan  tingginya  ekspresi  CD90
atau  Thy1  pada  pemeriksaan  qRT-PCR,  bahkan lebih  tinggi  dua  kali  lipat  dibandingkan  kontrol pada  penelitian  ini.    Hal  ini  senada  dengan populasi  progenitor  SPL  yang  diisolasi  dari jaringan  limbus  pada  penelitian  lain.  (Sancak et al .  2014,  Polisetty et  al .  2008)  Sehingga penggunaan  15%  DMSO  pada  kriopreservasi dengan  metode  vitrifikasi  untuk  progenitor  SPL masih  aman.  Namun,  pada  20%  DMSO  sangat toksik    untuk  sel  progenitor  SPL  hewan  pada kriopreservasi  dengan  metode  konvensional kriopreservasi. (Ock S and Rho G, 2011)
Pada  kultur  progenitor  SPL  pascavitrifikasi, ekspresi  gen  Krt12  pada  medium  kriopreservasi tanpa  DMSO  menunjukkan  4  kali  lebih  tinggi dibandingkan  kontrol  dan  menggunakan  DMSO. Data  ini  menunjukkan  bahwa  DMSO  tidak mengurangi  potensi  diferensiasi  progenitor  SPL menjadi  epitel  kornea.  Pada  studi  ini,  proses pembuangan DMSO saat thawing dapat mengurangi  konsentrasi  DMSO  ketika  dilakukan kultur  sel.  Terjadinya  diferensiasi  progenitor  SPL menjadi  sel  epitel  kornea  dapat  dipicu  oleh kondisi  lingkungan  seperti  medium  kultur. (Loureiro et al. 2013, Sancak et al . 2014)

## V. SIMPULAN
Penggunaan  DMSO  pada  kriopreservasi populasi  SPL  tidak  mempengaruhi  karakteristik sel tersebut.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  terima  kasih  kepada Kepala  Badan  Litbangkes  dan  Kepala  Pusat Biomedis  dan  Teknologi  Dasar  Kesehatan (PBTDK)  atas  pemberian  dana  penelitian, masukan  dan  nasehat  selama  melakukan penelitian  dengan  dana  DIPA  2014.  Teman- teman  tim  di  Laboratorium Stem  Cell PBTDK Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan  Litbankes  yang  telah  membantu  dalam proses  penelitian,  menyediakan  bahan  untuk penelitian  serta  berdiskusi  selama  menjalankan penelitian, penulis mengucapkan terima kasih.

## DAFTAR  PUSTAKA
Burman  S  and  Sangwan  V,  H  2008, ‘Cultivated limbal  stem  cell  transplantation  for  ocular surface  reconstruction ’, Clin  Opthal, vol. 2, no. 3,hh. 489-502.
Albert R, Vereb Z, Csomos K, Moe MC, Johnsen EO, Oldstad OK, et al., H 2011, ‘Cultivation and  characterization  of  corneal  limbal ephitelial  stem  cell  on  lens  capsule  in animal  material-free  medium ’, PLoS  ONE , vol. 7, no. 10, hh. 1-11.
Lekhanont  K,  Choubtum  L,  Chuck  RS,  Sa- ngiampornpanit  T,  Chuckpaiwong  V  and Vongthongsri  A.  H  2009. ‘A  Serum-and feeder-free  technique  of  culturing  human
corneal  epitheliual  stem  cells  on  amniotic membrane ’, Mol  Vis ,  2009,  vol.  15,  no.  1, hh. 294-302.
Loureiro  RR,  Cristovam  PC,  Martins  CM,  Covre
JL, Sobrinho JA, Ricardo JRS, Hazarbassanov  RM,  et  al ,  H  2013,  ‘ Comparison  of  culture  media  for  ex  vivo cultivation  of  limbal  epithelial  progenitor cells ’, Mol Vis, vol. 19, hh. 69-77. Sancak İG,    Ozen  A,  Pinarli  FA,  Tiryaki  M, Ceylan  A,  Acar  U  and  Delibasi  T,  H  2014, ‘Limbal  stem  cells  in  dogs  and  cats.  Their identification,  culture  and  differentiation into  keratinocytes ’, Kafkas  Univ  Vet  Fak Derg, , vol. 6, hh. 909-914.
Meyer-Blazejewska  E.A,  Kruse  F.E,  Bitterer  K, Meyer C, Hofmann-Rummelt C, Peter H, H 2010, ‘ Preservation  of  the  limbal  stem  cell phenotype
by
appropriate culture techniques ’, IOVS, vol.  51,  no.  2,  hh.  765- 774.
Yeh  HJ,  Yao  CL,  Chen  HI,  Cheng  HC,  Hwang SM,  H  2008, ‘Cryopreservation  of  human limbal  stem  cell  ex  vivo  expanded  on amniotic membrane ’ Cornea, vol. 27, no. 3, hh. 327-333.
El-Danasaouri  I.  and  Selaman  H.  ,  H  2007,
‘Vitrification versus conventional
cryopreservation  technique ’, Middle  East Fertlity  Society  Journal, vol.  10,  no.  3,  hh. 205-206.
Meryman  HT. ,  H  2007,  ‘Cryopreservation  of living  cells:  principles  and  practice ’,
Transfusion ,vol. 47, hh. 935-945.
Bagis H, Akkoc T, Taskin C and Arat S, H 2009, ‘Comparison  of  different  cryopreservation techniques: Higher
survival and implantation  rate  of  frozen-thawed  mouse pronuclear  embryos  in  the  presence  of beta-mercaptoethanol in post-thaw culture ’, Reprod Dom Anim , Doi:
10.1111/j.1439-0531.2009.01570.x
Kito  K,  Kagami  H,  Kobayashi  C,  Ueda  M,
Terasaki H ,  H  2005,  ’  Effect  of cryopreservation  on  histology  and  viability of  cultured  corneal  epithelial  cell  sheets  in rabbits ’, Cornea ,  vol.  24,  no.  6,  hh.  735- 741.
Desai N, Xu J, Tsulata T, Lawson JS, Hafez AF, Goldfarb  J  and  Falcone  T,  H  2010, ‘Vitrification of mouse embryo-derived ICM cells:  a  tool  for  presering  embryonic  stem cell potential? ’, J Assist reprod Genet , DOI 10.1007/s10815-010-9500-x.
Djuwantono  T, Wirakusumah  F  F,  Achmad T  H, Sandra  F,  Halim  D,  Faried  A.,  H  2011, ‘Comparison  of  cryopreservation  methods: slow-cooling  vs.  rapid-cooling  based  on cell  viability,  oxidative  stress,  apoptosis, and CD34+ enumeration of human umbilical  cord  blood  mononucleated  cells, BMC  Research  Notes, vol.  11,  no.  4,  hh. 371.
Aye  M, Giorgio C D, Mo M D, Botta A, Perrin J, Courbiere  B.,  H  2010. ‘Assessment  of genotoxicity  of  three  cryoprotectants  used for  human  oocyte  vitrification:  dimethyl sulfoxide,  ethylene  glycol  and  propylene glycol ’ Food  Chem  Toxicol ,  vol.  48,  hh. 1905-12.
Bakhach  J. ,  H  2009,  ‘The  cryopreservation  of composite  tissues:  principles  and    recent advancement on cryopreservation of different type of tissues ’,
Organogenesis, vol. 5, no.3, hh. 119-126. Violante  GD,  Zerrouk N,  Richard I,  Provot  G, Chaumeil  JC and  Arnaud  P.,  H  2002, ‘Evaluation  of  the  cytotoxicity  effect  of dimethyl  sulfoxide  (DMSO)  on  Caco2/TC7 colon  tumor  cell  cultures ’, Biol  Pharm Bull,, vol. 25, no. 12, hh. 1600-3.
Krishnan  S,  Iyer  GK  and  Krishnakumar  S.,  H 2010, ‘Culture  and  characterisation  of limbal  epithelial  cells  and  oral  mucosal cells ’, Indian  J  Med  Res, vol.13,  no.1,  hh.
422-8.
Li G, Zhu Y, Xie H, Chen S, Tseng S. , H 2012, ‘ ‘Mesenchymal  stem  cells  derived  from human  limbal  niche  cells ’, Cornea ,  vo.  12, no. 53, hh. 5686-97.
Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS
and Vemuganti GK., H 2008,
‘Mesenchymal stem cell from limbal stroma of human eye ’, Mol Vis vol. 14, hh. 431-42. Jain  J  K  and  Paulson  RJ. H  2006,  ‘Oocytes cryopreservation ’, Fertility  and  Sterility , vol.86, hh. 1037-46.
Naaldijk  Y,  Staude  M,  Fedorova  V  and  Stolzing A., H 2012, ‘Effect of different freezing rate during cryopreservation
of rat mesenchymal  stem  cell  using  combination of hydroxyethyl strach
and dimethylsulfoxide ’, BMC  Biotechnology, vol. 12, no.49. DOI:10.1186/1472-6750-12- 49.
Ock  S  and  Rho  G. ,  H  2011,  ‘Effect  of  dimethyl sulfoxide  (DMSO)  on  cryopreservation  of porcine  mesenchymal  stem  cell  (pMSC) ’, Cell Transplantation, vol. 20, hh. 231-9.