## AKTA KIMIA

## INDONESIA
Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder dari Ekstrak Etil Asetat Daun Pulai (Alstonia scholaris (L.) R. Br.) berdasarkan Sifat Toksisitas dengan Metode BSLT (Brine
Shrimp Lethality Test)
Emil Salim 1 , Suryati 1 , Rini Ramadani 1 , Winni Sukrila 1
1 Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas, Padang, Indonesia
*alamat email korespondensi : emilsalim@sci.unand.ac.id

## Abstract
This study aims to isolate secondary metabolite from ethyl acetate extract of Alstonia scholaris leaves based  on  its  cytotoxic  properties  against  Artemia  salina.  Isolation  of  the  active  compound  was carried  out  using  column  chromatography,  petroleum  ether:ethyl  acetate  (10:0-0:10)  and  ethyl acetate:methanol (10:0–9:1) as eluents, yielded 8 fractions (F 1 -F 8 ). Fraction 6 was the most active with  LC 50 9.47  mg/L,  then  recolumn  with  petroleum  ether:ethyl  acetate  (7:3),  obtained  5  sub- fractions (F 6.1 -F 6.5 ). The highest toxicity was indicated by F 6.5 with LC 50 7,694 mg/L. F 6.5 was purified and characterized by UV and FTIR. The isolated compound is known as alkaloid compound.
Keywords: Alstonia scholaris (L.) R.Br.), toxicity, Artemia salina leach

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi senyawa metabolit sekunder dari ekstrak etil asetat daun pulai  (Alstonia  scholaris)  berdasarkan  sifat  sitotoksik  terhadap  larva  udang  Artemia  salina. Pemisahan  senyawa  aktif  dilakukan  menggunakan  kromatografi  kolom,  eluen  petroleum  eter:etil asetat (10:0-0:10) dan etil asetat:metanol (10:0–9:1), dan menghasilkan 8 fraksi (F 1 -F 8 ). Fraction 6 paling  aktif  dengan  nilai  LC 50 9,47  mg/L,  kemudian  direkromatografi  dengan  eluen  petroleum eter:etil  asetat  (7:3)  ,  diperoleh  5  sub-fraksi  (F 6.1 -F 6.5 ).  Sifat  toksisitas  tertinggi  ditunjukkan  oleh subfraksi  F 6.5 dengan  LC 50 7,694  mg/L.  Subfraksi  F 6.5 kemudian  dimurnikan  dan  dikarkterisasi dengan UV dan FTIR. Senyawa hasil isolasi diketahui merupakan senyawa alkaloid.
Kata kunci: Alstonia scholaris (L.) R.Br.), toksisitas, Artemia salina leach

## I. PENDAHULUAN
Tumbuhan  merupakan  salah  satu  sumber bahan  kimia  yang  memiliki  banyak  manfaat bagi  kehidupan  [1].  Komponen  bahan  kimia
yang  terdapat  pada  tumbuhan  menjadikan tumbuhan sebagai ramuan obat tradisional [2]. Baru-baru  ini,  adanya  fenomena  kembali  ke alam dimana masyarakat gemar

## Emil Salim, dkk., Akta Kimia Indonesia 7(2), 2022, 120-132
mengkonsumsi  dan  melakukan  pengobatan menggunakan  bahan  dari  alam  [1].  Hal  ini dikarenakan  tumbuhan  obat  yang  digunakan masyarakat  dipercaya  memiliki  keunggulan dan kelebihan dibandingkan obat hasil sintesis yang banyak memiliki efek samping terhadap kesehatan [3].
Salah  satu  tanaman  lokal  yang  sering digunakan masyarakat sebagai obat tradisional  adalah  tanaman  pulai  (Alstonia scholaris  (L).R.Br).  Pulai  termasuk  kedalam suku  Apocynaceae  yang  diketahui  memiliki khasiat sebagai  obat. Secara tradisional  daun tumbuhan  pulai  digunakan  untuk  mengobati penyakit  beri-beri  dan  sesak  hati,  sedangkan getahnya  untuk  mengobati  luka,    tumor  dan rematik [4]. Penggunaan tanaman pulai yang umumnya  berupa  daun  secara  tradisional dilakukan melalui perendaman atau ekstraksi manual oleh masyarakat, sehingga kandungan senyawa  kimia  aktif  yang  terdapat  didalam ekstrak  tersebut  memilki  efektifitas  yang masih  rendah  dan  memiliki  kandungan senyawa kimia yang banyak [5].
Dhruti (2016) melaporkan tumbuhan pulai memiliki  kandungan  kimia  seperti  alkaloid, saponin,  terpenoid,  flavonoid,  fenolik,  tanin, dan  glikosida  pada  kulit  batang,  daun  dan bunga. Senyawa-senyawa tersebut berdasarkan  beberapa  penelitian  diketahui memiliki  aktivitas  sebagai  antioksidan  dan antikanker  [6].  Berdasarkan  data  penelitian
yang  dilakukan  oleh  Annisa  Wulandari (2017),  ekstrak  daun  pulai  dengan  3  pelarut yang  berbeda  kepolaran  yaitu  metanol,  etil asetat  dan  heksana  menunjukkan  bahwa ekstrak  metanol  dan  ekstrak  etil  asetat memiliki  potensi  sebagai  senyawa  toksik dikarenakan nilai toksisitasnya lebih kecil dari 1000 mg/L, dimana metanol (883,3639 mg/L) dan etil asetat (954,7155 mg/L) [7].
Sifat Toksisitas dari suatu senyawa dapat ditentukan  menggunakan  metode  BSLT (Brine  Shrimp  Lethality  Test)  dengan melakukan  uji  pada  hewan  uji  larva  udang (Artemia  Salina  Leach).  Metode  BSLT merupakan  metode  yang  umum  digunakan sebagai  tahap  preskrining  terhadap  senyawa aktif  yang  terdapat  pada  suatu  ekstrak tumbuhan  dikarenakan  hasil  yang  didapat cukup  akurat,  pengerjaan  yang  mudah,  cepat dan  murah  [8].  Sifat  toksisitas  yang  didapat dari preskrining menggunakan metode BSLT ini  dapat  dibandingkan  dengan  uji  kultur  sel kanker yang mana dapat diasosiasikan dengan aktifitas  antikanker  [9].  Oleh  karena  itu, peneliti ingin melakukan uji toksisitas ekstrak dan fraksi hasil isolasi dari daun pulai.

## II. METODE PENELITIAN

## 2.1  Bahan
Sampel  ekstrak  etil  asetat  daun  pulai didapat dari penelitian terdahulu oleh Annisa Wulandari  (2017),  dengan  hasil  identifikasi

## Emil Salim, dkk., Akta Kimia Indonesia 7(2), 2022, 120-132
menunjukkan bahwa spesies daun pulai yang digunakan adalah Alstonia scholaris (L.)R.Br .
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah pelarut organik yang sudah didestilasi (n-heksana, etil asetat, dan metanol), petroleum  eter,  akuades,  asam  klorida  pekat, kloroform, kloroform-amoniak 0,05 M, asam sulfat  2  N,  bubuk  Mg  dan  pereaksi  besi  (III) klorida.  Anhidrida  asetat  dan  asam  sulfat pekat  untuk  membuat  pereaksi Liebermann Burchard (LB). Sedangkan kalium iodida dan raksa (II) klorida sebagai pembuatan pereaksi Mayer.  Fasa  diam  yang  digunakan  untuk kromatografi  kolom  yaitu  silika  gel  (0,063  - 0,200  mm).  Pada  analisis  kromatografi  lapis tipis digunakan plat KLT (silika gel 60 F 254 ).
Bahan  yang  digunakan  sebagai  penunjang percobaan,  yaitu  kapas  dan  aluminium  voil. Sedangkan bahan untuk uji aktivitas toksisitas adalah  air  laut,  larva  udang,  dan  DMSO (dimetil-sulfoksida).

## 2.2 Alat
Peralatan yang digunakan pada penelitian adalah  kolom  kromatografi  (panjang  kolom 40  cm  dan  diameter  kolom  6  cm),  botol  vial 10  mL  dan  100  mL,  plat  kromatografi  lapis tipis  (KLT),  spektrofotometer  UV  (Thermo Scientific),  spektrofotometer  FT-IR  (Parkin Elmer  “Front  Tail”),  neraca  analitik,  tabung reaksi, rak tabung reaksi, chamber, pipet tetes,
spatula, pipa kapiler, lampu UV (λ 254 nm dan 365  nm)  sebagai  penampak  noda,  dan peralatan gelas lainnya yang umum digunakan di Laboratorium. Uji toksisitas menggunakan wadah  penetesan,  wadah  pengembangbiakan larva dan lampu LED sebagai sumber cahaya.

## 2.3 Uji Profil Fitokimia Ekstrak Etil
Asetat Daun Pulai (Alstonia scholaris (L.)R.Br.
Uji profil  fitokimia  ekstrak  etil  asetat daun pulai dilakukan mengikuti prosedur oleh Sudarmi, 2017. Fraksi etil asetat sebanyak 0,1 gram  dilarutkan  dengan  pelarut  etil  asetat. Selanjutnya  ditambahkan  reagen  spesifik untuk  menguji  adanya  golongan  metabolit sekunder  berupa  flavonoid,  fenolik  dan saponin,  triterpenoid,  steroid,  alkaloid  dan kumarin [10].
2.4 Fraksinasi dan isolasi ekstrak etil asetat daun pulai
Sebanyak  380  gram  silika  gel  60  GF 254 (0,063-0,200 mm for column chromatography ) (Merck) yang telah diaktivasi  pada  suhu  110 o C  selama  ±1  jam. Setelah  itu,  didiamkan  ±  24  jam  sebelum digunakan untuk pemisahan [11].  Ekstrak etil asetat sebanyak 20 gram ditambahkan 20 gram silika gel dan digerus dalam lumpang hingga homogen.  Sampel  yang  telah  dipreadsorpsi dimasukkan kedalam kolom yang sudah berisi bubur silika menggunakan corong dan dialiri

## Emil Salim, dkk., Akta Kimia Indonesia 7(2), 2022, 120-132
dengan  pelarut  petroleum  eter,  kemudian dilakukan elusi dengan meningkatkan kepolaran  pelarut  dimulai  dari  petroleum eter:etil asetat (10:0–0:10) dan etil asetat:metanol (10:0–9:1). Eluat yang diperoleh ditampung dengan botol vial 10 mL dan dikumpulkan, setiap eluat yang diperoleh dilakukan uji kromatografi lapis  tipis  (KLT). Eluat  yang  memiliki  pola  pemisahan  noda yang  sama  dari  hasil  KLT  digabung  menjadi satu  fraksi.  Fraksi  dengan  aktifitas  toksisitas tertinggi dilakukan re-kromatografi menggunakan  kromatografi  kolom  grafitasi dengan  cara  yang  sama  untuk  mendapatkan sub-fraksi.  Subfraksi  dengan  nilai  toksisitas tertinggi  dilakukan  pemurnian  dengan  cara rekristalisasi  sampai  didapatkan  senyawa murni.  Uji  kemurnian  senyawa  hasil  isolasi dilakukan  dengan  kromatografi  lapis  tipis menggunakan  penampak  noda Liebermann Burchard dibawah  cahaya  lampu  UV  pada panjang gelombang 254 nm  dan 365 nm dan juga dilakukan uji titik leleh.
2.5 Uji  toksisitas  ekstrak  etil  asetat  daun pulai
Pengujian  toksisitas  dari  ekstrak  daun pulai  menggunakan  larva  udang  (BSLT) mengacu pada prosedur kerja yang dilakukan oleh  Meyer  dengan  beberapa  modifikasi ataupun  berdasarkan  penelitian  terdahulu. Metode  ini  dilakukan  untuk  skrining  awal toksisitas  ekstrak  yang  didapatkan  [12] , [13].
Sebanyak  5  mL  dari  masing-masing  variasi konsentrasi  (1000;  500;  250;  125;  62,5  dan 31,25 mg/L) larutan uji dimasukkan ke dalam botol  vial  dan  diuapkan  pelarutnya.  Setelah menguap ditambahkan 50 μL DMSO, 3 mL air laut dan 10 ekor larva udang ke dalam masing- masing  botol  vial,  selanjutnya  volume dicukupkan  5  mL  dengan  air  laut.  Dibiarkan selama  24  jam  kemudian  larutan  sampel diamati  dengan  menghitung  jumlah  larva udang yang mati. Pengerjaan yang sama juga dilakukan  dalam  larutan  kontrol  tanpa penambahan  larutan  uji.  Jumlah  udang  yang mati pada masing-masing konsentrasi larutan uji  digunakan  untuk  menghitung  nilai  LC 50 melalui  Finney’s  probit  analysis  method analisa probit dan persamaan regresi.

## 2.6 Karakterisasi senyawa hasil isolasi
Identifikasi golongan senyawa dilakukan dengan  uji  profil  fitokimia  menggunakan pereaksi spesifik senyawa metabolit sekunder. Karakterisasi  struktur  senyawa  hasil  isolasi dilakukan  menggunakan  spektrofotometer UV-VIS ( Thermo Scientific ) dan spektrofotometer FT-IR ( Parkin Elmer
“Front Tail” ).

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1     Profil Fitokimia Ekstrak Etil Asetat

## Daun Pulai
Uji  profil  fitokimia  merupakan  cara sederhana untuk melakukan analisa kualitatif kandungan senyawa metabolit sekunder yang

## Emil Salim, dkk., Akta Kimia Indonesia 7(2), 2022, 120-132
terdapat dalam tumbuhan [14]. Hasil uji profil fitokimia ekstrak etil asetat daun  pulai tertera pada Tabel 3.1.
Berdasarkan Tabel 3.1, ekstrak etil asetat daun  pulai    positif  mengandung  senyawa metabolit  sekunder  fenolik,  tritepenoid, steroid dan alkaloid. Metabolit sekunder yang terdapat  pada  daun  pulai  ini  sesuai  dengan studi literatur yang dilaporkan oleh Dhruti et al,  2016  dan  Swasriatu  C  ,2015  yang menebutkan terdapat seyawa alkaloid, triterpenoid,  steroid  dan  fenolik  pada  daun pulai [6]; [15].

## 3.2 Hasil Fraksinasi dari Ekstrak Etil Asetat Daun Pulai
Ekstrak  etil  asetat  daun  pulai  dilakukan KLT  pendahuluan  dengan  tiga  perbandingan eluen  heksana:etil  asetat  dan  petroleum eter:etil  asetat  yaitu  (8:2;  7:3;  6:4)  dan  pola noda  pemisahan  dilihat  pada  lampu  UV
dengan 𝜆 254  nm  dan  365  nm.  Pada perbandingan  eluen petroleum eter:etil asetat (8:2;  7:3;  6:4),  terdapat  pola  noda  dengan pemisahan  yang  lebih  baik  dari  pada  eluen heksana:etil asetat. Oleh karena itu pemisahan ekstrak  dilakukan  dengan  metoda  SGP  ( Step Gradient  Polarity )  dengan  eluen  petroleum eter:etil asetat (10:0-0:10) dan etil asetat:metanol  (9:1)  untuk  mendapatkan pemisahan senyawa yang lebih baik. Sebanyak  20  gram  ekstrak  etil  asetat difraksinasi dengan kolom kromatografi silika gel  dan  didapatkan  eluat  sebanyak  552  vial menggunakan  volume  total  eluen  yaitu  6000 mL. Berdasarkan pola noda dan nilai Rf yang sama  pada  plat  KLT  di  dapatkan  8  fraksi. Penggabungan  hasil  kolom  berdasarkan  pola noda  yang  hampir  sama  pada  plat  KLT. Jumlah  masing-masing  fraksi  dapat  dilihat pada Tabel 3.2.
Tabel 3.1. Hasil uji profil fitokimia ekstrak etil asetat daun pulai No. Kandungan Kimia Pereaksi Hasil 1 Fenolik Besi (III) klorida + 2 Flavonoid Sianidin Tes (HCl/bubuk Mg) - 3 Saponin HCl - 4 Triterpenoid Liebermenn-Burchard + 5 Steroid Liebermenn-Burchard + 6 Alkaloid Mayer + 7 Kumarin Natrium hidroksida 1% -
Keterangan :       (+) Ada        (-) Tidak ada
Tabel 3.2 Hasil fraksinasi dari ekstrak etil asetat daun pulai
Fraksi Nomor Vial Massa (gram) F.1 1-16 3,2532 F.2 17-28 1,1473 F.3 29-42 0,2234 F.4 43-76 9,0388 F.5 77-135 1,4611 F.6 136-340 6,4747 F.7 341-420 1,3106 F.8 421-552 0,7837
Gambar 3.1 Kurva regresi penentuan nilai LC 50

## 3.3.Hasil Uji Toksisitas Ekstrak Etil Asetat Daun Pulai
Uji toksisitas dari ekstrak etil asetat daun pulai  ( Alstonia  scholaris (L.)R.Br.)  dilakukan dengan  metode Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT) secara duplo (dua kali pengulangan). Pada  metode  BSLT  ini    sifat    toksisitas masing-masing  fraksi  ditentukan    melalui penentuan  nilai  LC 50 pada  beberapa variasi konsentrasi larutan uji, yaitu jumlah dosis atau konsentrasi ekstrak uji yang dapat
menyebabkan kematian larva udang sejumlah 50% setelah masa inkubasi 24 jam. Persamaan regresi  diperoleh  dari  grafik    hubungan    log konsentrasi  sampel  dengan  nilai  probit  yang dapat  dilihat  pada Gambar 3.1.
Berdasarkan  Gambar  3.1  terlihat  bahwa terjadi  peningkatan  kematian  seiring  dengan meningkatnya  konsentrasi.  Kedua  variabel (nilai  probit  dan  log  konsentrasi)  memiliki korelasi satu sama lain hal ini terlihat dari nilai koefisien  determinasi  (R 2 )  yang  mendekati
y = 1.0156x + 2.4376 R² = 0.9489 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 N ilai p ro b it
Log konsentrasi (mg/L)
satu.  Nilai  LC 50 diperoleh  dari  presentase kematian  larva  udang  dari  berbagai  variasi konsentrasi yang dikonversikan menjadi nilai probit berdasarkan persentase kematian. Nilai LC 50 dihitung  berdasarkan  nilai  persamaan regresi  antara  log  konsentrasi  dengan  nilai probit. Nilai LC 50 dari ekstrak etil asetat daun pulai tertera pada Tabel 3.3.
Tabel 3.3 Hasil uji toksisitas ekstrak etil asetat daun pulai
Sampel Uji LC 50 (mg/L) Ekstrak etil asetat 333,529 Berdasarkan nilai toksisitas dalam tumbuhan dapat dikatakan tidak toksik apabila nilai LC 50 di atas 1000 mg/L, LC 50 dari 500 - 1000  mg/L  merupakan  toksik  rendah,  nilai LC 50 dari  100  -  500  mg/L  bersifat  toksik sedang,  sedangkan  nilai  LC 50 dari  0  -  100 mg/L sangat toksik. Hasil dari nilai LC 50 yang didapatkan  dari  fraksi  etil  asetat  daun  pulai dapat  disimpulkan  bersifat  toksik  sedang. Sifat toksik ini diduga karena adanya potensi dari  senyawa  metabolit  sekunder  yang terdapat  pada  ekstrak  etil  asetat  daun  pulai. Senyawa  toksik  yang  berdifusi  kedalam  sel Artemia salina leach menyebabkan perubahan konsentrasi  didalam  dan  luar  sel,  sehingga merusak  membran  sel  dan  menyebabkan kerusakan  fungsional  dan  metabolisme  sel. Efek  yang  ditimbulkan  terjadi  secara  cepat
dalam  waktu  24  jam,  hingga  menyebabkan 50% kematian larva udang [13] .

## 3.4.Hasil Uji Toksisitas Fraksi Daun Pulai
Uji toksisitas dari fraksi ekstrak etil asetat daun  pulai  ( Alstonia  scholaris (L.)R.Br.) dilakukan  dengan  metode Brine  Shrimp Lethality Test (BSLT) secara duplo (dua kali pengulangan).  Fraksi  F.1,  F.2,  F.3,  F.4,  dan F.7  dibuat  dengan  variasi  konsentrasi  1000; 500;  250;  125;  62,5;  31,25  mg/L.  Fraksi  F.5 dan F.8 dibuat dengan variasi konsentrasi 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,6 mg/L,  dan fraksi F.6  dibuat  dengan  variasi  konsentrasi  125; 62,5; 31,25; 15,6; 7,8; 3,9 mg/L serta kontrol negatif  dengan  konsentrasi  0  mg/L  yaitu hanya  DMSO  dan  tanpa  sampel.  Nilai  LC 50 diperoleh  dari  presentase  kematian  larva udang  dari  berbagai  variasi  konsentrasi  yang dikonversikan menjadi nilai probit berdasarkan  persentase  kematian.  Nilai  LC 50 dihitung  berdasarkan  nilai  persamaan  regresi antara  log  konsentrasi  dengan  nilai  probit dapat dilihat pada Tabel 3.4.
Dari  nilai  LC 50 yang  didapatkan  pada fraksi  hasil  isolasi,  fraksi  F.1,  F.3  dan  F.4 tidak bersifat toksik sedangkan untuk F.2, F.5, F.6,  F.7,  dan  F.8  bersifat  toksik  terhadap hewan  uji  larva Artemia  salina  leach karena memiliki  nilai  LC 50 kurang  dari  1000  mg/L .
Fraksi  F.6  merupakan  fraksi  yang  paling toksik dengan nilai LC 50 9,391 mg/L sehingga

## Emil Salim, dkk., Akta Kimia Indonesia 7(2), 2022, 120-132
dilakukan  pemisahan  kembani  menggunakan kromatografi kolom [16].

## 3.5.Hasil Rekromatografi Kolom dari Fraksi F.6
Fraksi  F.6  sebanyak  6  g  diisolasi kembali  menggunakan  kromatografi  kolom silika gel dengan sistem isokratik menggunakan eluen petroleum eter:etil asetat (7:3).  Isolasi  fraksi  F.6  menghasilkan  eluat sebanyak 163 vial dengan total volume eluen yang dialirkan sebanyak 1700 mL.
Berdasarkan pola noda dan nilai Rf yang sama pada plat KLT di dapatkan 5 subfraksi dengan massa  yang  tertera  pada  Tabel  3.5.  Masing- masing  subfraksi  yang  didapatkan  dilakukan uji toksisitas.

## 3.6.Hasil Uji Toksisitas Subfraksi F.6.-
F.6.5
Uji  toksisitas  pada  subfraksi  F.6.1-6.5 dilakukan  dengan  metode Brine  Shrimp
Lethality Test (BSLT) secara duplo (dua kali pengulangan).  Subfraksi  F.6.1,  F.6.2,  F.6.3, F.6.4 dibuat dengan variasi konsentrasi 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,2 mg/L. Dan subfraksi F.6.5  dibuat  dengan  variasi  konsentrasi  250; 125; 62,5; 31,2; 15,6; 7,8 mg/L serta kontrol negatif  [17].  Hasil  penentuan  nilai  LC 50 subfraksi tertera pada Tabel 3.6.
Hasil  dari  nilai  LC 50 yang  didapatkan pada  subfraksi  F.6.1  tidak  bersifat  toksik dikarenakan  nilai  LC 50 yang  lebih  dari  1000 mg/L, sedangkan subfraksi F.6.2, F.6.3, F.6.4 dan  F.6.5  bersifat  toksik  terhadap  hewan  uji larva Artemia salina leach dengan nilai LC 50 kurang  dari  1000  mg/L.  Dan  dari  subfraksi diatas  yang  memiliki  aktivitas  sitotoksik tertinggi  adalah  subfraksi  F.6.5  dengan  nilai LC 50 7,694 mg/L dan dilanjutkan pemurnian.
Tabel 3.5 Hasil kromatografi kolom fraksi 6
Subfraksi Nomor Vial Massa (gram) F.6.1 1-2 0,0125 F.6.2 3-25 1,8712 F.6.3 26-55 3,8947 F.6.4 56-100 4,6585 F.6.5 101-163 0,3025 Tabel 3.6 Hasil penentuan nilai LC 50 masing-masing subfraksi Subfraksi Persamaan R 2 LC 50 (mg/L) F.6.1 y = 0,9667x + 1,842 0,9202 1848,811 F.6.2 y = 0,9833x + 2,6168 0,9784 265,279 F.6.3 y = 1,0972x + 2,7475 0,9399 112,977 F.6.4 y = 0,9206x + 3,1609 0,9708 99,449 F.6.5 y = 0,7859x + 4,407 0,9542 7,694

## Emil Salim, dkk., Akta Kimia Indonesia 7(2), 2022, 120-132
3.7 Hasil Pemurnian Subfraksi F.6.5
Subfraksi  F.6.5  (0,3025  g)  dimurnikan menggunakan  2  pelarut  yang  tidak  saling melarutkan,  dimana  pelarut  yang  digunakan adalah  heksana  dan  metanol.  Kedua  lapisan pelarut  dipisahkan  dengan  metode  dekantasi dan  dikeringkan,  pada  lapisan  metanol didapatkan  senyawa  6.5  berupa  padatan berwarna  putih  kekuningan  dengan  massa 0,2542 g.

## 3.7.1 Uji Kemurnian

## Uji kromatografi lapis tipis
Uji    kemurnian  senyawa    hasil    isolasi berupa  padatan  berwarna  putih  kekuningan diuji dengan KLT yang dielusi menggunakan    berbagai    perbandingan pelarut.  Hasil  KLT  dilihat  dibawah  lampu UV  dengan  panjang  gelombang  254  nm  dan 365 nm. Hasil  uji  KLT  senyawa hasil  isolasi dengan  berbagai perbandingan pelarut tertera pada Tabel 3.7.
Pengujian senyawa hasil isolasi menggunakan eluen dengan tingkat kepolaran yang  berbeda  dilakukan  untuk  menentukan kemurnian  senyawa  yang  diperoleh  dengan tampaknya  noda  tunggal.  Berdasarkan  Tabel 3.7 menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi telah murni yang ditandai dengan adanya pola noda  tunggal  pada  perbandingan  eluen  yang berbeda. Hasil uji KLT dapat dilihat Gambar 3.2.

## Uji titik leleh
Titik  leleh  suatu  senyawa  padatan  dapat memberikan  petunjuk  derajat  kemurnian suatu  senyawa.  Senyawa  dapat  ditentukan kemurniannya  berdasarkan  jarak  titik  leleh yang  sempit  (≤2°C)  [18].  Berdasarkan  hasil pengujian, senyawa hasil isolasi terdekomposisi pada suhu 227°C-228°C, dan hal ini mengindikasikan bahwa senyawa hasil isolasi yang didapatkan sudah murni dikarenakan memiliki range suhu 1°C.
Tabel 3.7 Hasil monitor senyawa hasil isolasi dengan berbagai perbandingan pelarut
No
Perbandingan Eluen
Rf Jumlah Noda Petroleum eter Heksana Etil asetat 1 0 8 2 0,5 1 2 8 0 2 0,35 1 3 5 0 5 0,875 1

## Emil Salim, dkk., Akta Kimia Indonesia 7(2), 2022, 120-132
Identifikasi  Golongan  Senyawa  Hasil Isolasi
Identifikasi  golongan  senyawa  hasil isolasi dilakukan untuk menentukan golongan senyawa  metabolit  sekunder  yang  terdapat pada senyawa hasil isolasi. Hasil uji fitokimia terhadap  senyawa  hasil  isolasi  positif menunjukkan  terbentuknya  endapan  putih dengan  penambahan  pereaksi  Mayer,  yang mengindikasikan  bahwa  golongan  senyawa metabolit  sekunder  senyawa  hasil  isolasi merupakan  alkaloid,  yang  dapat  dilihat  pada Gambar 3.3.
Gambar  3.3 .  Hasil  uji  profil  fitokimia senyawa hasil isolasi
Karakterisasi senyawa dengan spektroskopi UV digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya ikatan rangkap berkonjugasi  pada  senyawa  hasil  isolasi  dan menganalisis senyawa organik yang mengandung  gugus  kromofor  dan  ausokrom. Prinsip dasar dari spektrofotometer UV adalah
penyerapan sinar tampak atau ultra violet oleh suatu  molekul  yang  dapat  menyebabkan terjadinya  eksitasi  molekul  tersebut  dari tingkat  energi  dasar  ketingkat  yang  lebih tinggi.  Hasil  karakterisasi  senyawa  dengan spektrofotometer  UV-Vis  dapat  dilihat  pada Gambar 3.4.
Berdasarkan  Gambar  3.3,  dari  hasil analisis  spektrum  Ultraviolet  (UV)  senyawa hasil isolasi menunjukkan serapan maksimum pada  panjang  gelombang  219  nm.  Serapan pada  panjang  gelombang  219  nm  diduga menunjukkan  adanya  ikatan  rangkap  dan elektron  bebas  yang  berkonjugasi  dengan kemungkinan strukturnya adalah (-C=N-), hal ini  dikarenakan  terjadinya  transisi  elektron dari  n → π * yang  mengabsorbsi  cahaya  pada panjang gelombang 200-400 nm [19].

## 3.2 Spektrofotometer FTIR (Fourier

## Transform Infrared)
Karakterisasi  senyawa  hasil  isolasi dengan  spektrofotometer  FTIR  bertujuan untuk mengetahui gugus fungsi yang terdapat pada senyawa hasil isolasi. Hasil pengukuran spektrofotometer  FTIR  pada  senyawa  hasil isolasi  berupa  spektrum  dapat  dilihat  pada Gambar 3.5.

## Emil Salim, dkk., Akta Kimia Indonesia 7(2), 2022, 120-132
Gambar 3.4 Spektrum UV-Vis senyawa hasil isolasi
Gambar 3.5 Spektrum FTIR senyawa hasil isolasi ekstrak etil asetat daun pulai Berdasarkan  spektrum Infrared dapat diketahui  bahwa  senyawa  hasil  isolasi memilki  serapan lemah  pada daerah 3400,16 cm -1 menunjukan NH strech sekunder. Puncak serapan pada daerah 2925,03 cm -1 menunjukkan daerah serapan C-H strech pada metil  dan  2870,06  cm -1 menunjukkan  C-H strech pada metilen  (-CH 2 -). Puncak serapan pada daerah 1686,87 cm -1 adanya vibrasi C=C strech ,  serapan  pada  daerah  1456,37  cm -1 menunjukkan vibrasi C-H bending , dan pada daerah  1029,13  cm -1 menunjukkan  daerah serapan  C-N strech .  Hal  ini  menunjukkan adanya  kemungkinan  besar  senyawa  yang terdapat pada sampel adalah senyawa alkaloid
yang  sesuai  dengan  uji  fitokim  sampel  hasil isolasi [20].

## 4. KESIMPULAN
Berdasarkan  dari  penelitian  yang  telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa senyawa hasil  isolasi  ekstrak  etil  asetat  daun  pulai, yaitu  senyawa  6.5  merupakan  senyawa golongan  alkaloid  (titik  leleh  227-228  °C) yang  menunjukkan  hasil  positif  dengan penambahan pereaksi Mayer dimana menunjukkan adanya endapan putih. Karakterisasi  struktur  senyawa  hasil  isolasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis menunjukkan  bahwa  senyawa  hasil  isolasi mengandung  ikatan  π  berkonjugasi  dengan

## Emil Salim, dkk., Akta Kimia Indonesia 7(2), 2022, 120-132
serapan  maksimum  pada  daerah 𝜆 219  nm.
Untuk  hasil  karakterisasi  menggunakan spektrofotometer  FTIR,  didapatkan  puncak serapan  untuk  gugus  fungsi:  N-H  (3400,16 cm -1 ), C-H strech pada metil (2925,03 cm -1 ),
C-H strech pada metilen (-CH 2 -) (2870,06 cm - 1 ),  C=C  (1686,87  cm -1 ),  C-H bending (1456,37 cm -1 ), dan C-N (1029,13 cm -1 ). Hasil uji  toksisitas  senyawa  hasil  isolasi  dengan metode  BSLT  menunjukkan  bahwasanya senyawa  hasil  isolasi  F.6.5  bersifat  toksik dengan nilai LC 50 5,68 mg/L.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis menyampaikan terimakasih kepada Universitas  Andalas  yang  telah  mendanai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA [1]  M. T. El-Saadony et al. , “Nutritional Aspects and
Health  Benefits  of  Bioactive  Plant  Compounds against  Infectious  Diseases:  A  Review”, Food Rev. Int. , vol 00, no 00, bll 1–23, 2021.
[2]  A.  S.  Alqahtani,  R.  Ullah,  en  A.  A.  Shahat, “Bioactive  Constituents  and  Toxicological Evaluation  of  Selected  Antidiabetic  Medicinal Plants  of  Saudi  Arabia”, Evidence-based Complement. Altern. Med. , bl 23, 2022.
[3]  G.  Mustafa,  R.  Arif,  A.  Atta,  S.  Sharif,  en  A. Jamil,  “Bioactive  Compounds  from  Medicinal Plants and Their Importance in Drug Discovery in Pakistan”, Matrix Sci. Pharma , vol 1, no 1, bll 17–
26, 2017, doi: 10.26480/msp.01.2017.17.26.
[4]  S. Arulmhozi, P. Mazumder, S. Lohidasan, en P. Thakurdesai, “Antidiabetic and
Antihyperlipidemic  Activity  of  Leaves  of
Alstonia  scholaris  L.R.Br.”, Eur.  J.  Integr.
Madicine , vol 2, no 1, bll 23–32, 2010.
[5]  Pankti,  K.,  G.  Payal,  C.  Manodeep,  en  K. Jagadish,  “A  Phytopharmacological  Review  of Alstonia scholaris: a Panoramic Herbal Medicine”, IJRAP , vol 3, no 3, bll 367–371, 2012.
[6]  M. Dhruti, P. Bhavika, en P. Meonis, “Studies on Phytochemical  Constituents  and  Antioxidant Activity of Alstonia scholaris”, Int. J. Life Sci. , vol 4, no 4, bll 529–538, 2016.
[7]  A.  Wulandari,  “Toksisitas  dan  Kandungan Fenolik  Total  dari  Ekstrak  Daun  Pulai  (Alstonia scholaris (L.)R.Br.)”, Universitas Andalas, 2017.
[8]  P.  Astuti,  G.  Alam,  A.  Tahir,  en  S.  Wahyuno, “Toxicity  Studies  of  Sponges  Collected  from Barrang  Lompo  Island  Against  Artemia  salina Leach”, J,Trand  Med ,  vol  7,  no  21,  bll  19–23, 2002.
[9]  S. Wahyuni, F. Zakaria, A. Witarto, D. Syah, en M.  Suhartono,  “Aktifitas  Antikanker  Senyawa- senyawa Kitooligomer”, Teknol. dan Ind. Pangan , vol 18, no 1, 2006.
[10]  K. Sudarmi, I. B. G. Darmayasa, en I. K. Muksin, “Uji  Fitokimia  Dan Daya Hambat  Ekstrak Daun Juwet (Syzygium cumini) Terhadap Pertumbuhan Escherichia  coli  Dan  Staphylococcus  aureus ATCC”, SIMBIOSIS J. Biol. Sci. , vol 5, no 2, bl 47, 2017.
[11]  Frengki,  Roslizawaty,  en  D.  Pertiwi,  “Toxicity Test  of  Ethanol  Extract  Ant  Plant  Local  Aceh (Mymercodia Sp) Method of Bslt Larvae Shrimp Artemia salina leach”, J. Med. Vet. , vol 8, no 1, bll 60–62, 2014.
[12]  Parwati  en  Ni  Kadek  Fina,  “Uji  Aktivitas Antioksidan  Ekstrak  Daun  Binahing  (Anredera cordifolia (Tenore) steenis) dengan 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil (DPPH)
Menggunakan
Spektrofotometer UV-VIS”, J. Akad. Kim. , vol 3,
no 3, bll 143–149, 2014.
[13]  A. Ningdyah, A. Alimuddin, en A. Jayuska, “Uji
Toksisitas  dengan  Metode  BSLT  (Brine  Shrimp Lethality Test) Terhadap Hasil Fraksinasi Ekstrak
Kulit  Buah  Tampoi  (Baccaurea  macrocarpa)”,
Univ. Tanjungpura , vol 4, no 1, bll 75–83, 2015.
[14]  Abd.Malik,  E.  Ferawati,  en  W.  Risda,  “Skrining Fitokimia  dan  Penetapan  Kandungan  Flavonoid Total Ekstrak M etanolik Herba Boroco (Celosia argentea L.) Laboratorium Farmakognosi Fitokimia”, J. Fitofarmaka Indones. , vol 1, no 1, bll 1–5, 2014.
[15]  C.  Swastiratu,  “Inhibisi  Ekstrak  Pulai  (Alstonia Scholaris)  terhadap  Aktivitas  Siklooksigenase-2 secara In Vitro”, Institut Pertanian Bogor, 2015.
[16]  N.  Haryati,  C.  Saleh,  en  Erwin,  “Uji  Toksisitas dan  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Daun  Merah
Tanaman  Pucuk  Merah  (Syzygium  myrtifolium
Walp.)  terhadap  Bakteri  Staphylococus  aureus dan Escherichia coli”, J.  Kim.  Mulawarman ,  vol 13, no 1, bll 35–40, 2015.
[17]  M.  Moshi et  al. , “Brine shrimp toxicity of some plants  used  as  traditional  medicines  in  Kagera Region,  north  western  Tanzania”, Tanzan.  J.
Health Res. , vol 12, no 1, bll 7–63, 2010.
[18]  Firdaus, Teknik  dalam  Laboratorium  Kimia Organik . Makassar: Unhas, 2011.
[19]  C.  J.  Creswel,  A.  R.  Olaf,  en  M.  C.  Malcolm, Analisis  Spektrum  Senyawa  Organik .  Bandung: ITB, 2005.
[20]  Y.  .  Sharma, Elementry  Organic  Spectroscopy Principles and Chemical Application Multicolour Edition. S.Chand and Company LTD . New Delhi, 2007.