UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN Stylissa sp. DENGAN METODE
DPPH (1,1- difenil -2- pikrilhidrazil )
Muhammad Setiawan Ikhrar 1) , Adithya Yudistira 1) , Defny S. Wewengkang 1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
This study aims to analyze the antioxidant activity of Stylissa sp., sponge. The Stylissa sp., sponge sample was obtained from the Lembeh Strait, waters Bitung. This research is  an  experimental  laboratory  by  testing  the  ethanol  extracts  of  Stylissa  sp.,  sponge  using  DPPH method (1,1-diphenil2-pikrihidrazil) to analyze antioxidant activity using a spectrophotometer. The results  of  this  study  show  the  antioxidant  levels  of  the  Stylissa  sp.,  sponge  in  the  Lembeh  Strait waters  have  antioxidant  activity  and the  higher  the  concentration  the higher  the  antioxidant  levels produced. The greatest antioxidant level is found in Stylissa sp., sponge with a concentration of 100 mg / L.
Keywords : Antioxidants, DPPH, Sponge Stylissa sp

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menganalisis  aktivitas  antioksidan  dari Stylissa sp.  Sampel  Spons Stylissa  sp di  peroleh  dari  perairan  Selat  Lembeh,  Bitung.  Penelitian  ini  merupakan  eksperimental laboratorium dengan pengujian terhadap ektrak etanol Spons Stylissa sp dengan metode DPPH (1,1- diphenil -2- pikrihidrazil ) untuk  menganalisis  aktivitas  antioksidan  dengan  menggunakan sprektrofotometer.  Hasil  penelitian  ini  memperlihatkan  kadar  antioksidan  dari  Spons Stylissa  sp di perairan  Selat  Lembeh  mempunyai  aktivitas  antioksidan  dan  semakin  tinggi  konsenstrasi  semakin tinggi  pula  kadar  antioksidan  yang  dihasilkan.  Kadar  antioksidan  yang  paling  besar  terdapat  pada Spons Stylissa sp dengan konsentrasi 100 mg/L.
Kata kunci : Antioksidan, DPPH, Spons Stylissa sp

## PENDAHULUAN
Penelitian  bahan  bioaktif  dari organisme  laut  beberapa  tahun  terakhir sangat  banyak  dilakukan,  baik  didalam maupun diluar negeri. Substansi bioaktif, terutama  terdapat  pada  biota  laut  yang tidak  bertulang  belakang  (avertebrata) seperti  spons,  koral  dan  tunikata.  Biota tersebut mengandung senyawa aktif yang lebih banyak dibanding alga dan tumbuhan  darat.  Diantara  biota  laut  tak bertulang belakang tersebut, spons menduduki tempat teratas sebagai sumber substansi aktif (Proksch, 1998).
Menurut  Apri  (2014),  substansi kimia  yang  disekresikan  karang  lunak sebagai  senyawa  metabolit  sekunder menarik  untuk  dikaji  pemanfaatannya bagi  sumber  bahan  obat-obatan  alami. Oleh  karena  senyawa  bioaktif  yang terdapat  pada  spons  sangat  dipengaruhi oleh  mikroba  simbionnya,  maka  variasi dari senyawa bioaktif spons sangat tinggi.
Adanya  radikal  bebas  didalam tubuh  manusia  berperan  dalam  patologi dari  berbagai  penyakit  degeneratif  yakni kanker,  aterosklerosis,  rematik,  jantung koroner, katarak dan penyakit degenerasi saraf seperti parkinson (Silalahi, 2006).
Penggunaan  senyawa  antioksidan juga  antiradikal  saat  ini  semakin  meluas seiring dengan semakin besarnya pemahaman masyarakat tentang
peranannya  dalam  menghambat  penyakit degeneratif  seperti  penyakit  jantung, arteriosclerosis,  kanker,  serta  gejala penuaan.  Masalah-masalah  ini  berkaitan dengan  kemampuan  antioksidan  untuk bekerja  sebagai  inhibitor  (penghambat) reaksi  oksidasi  oleh  radikal  bebas  reaktif yang  menjadi  salah  satu  pencetus
penyakit-penyakit  di  atas  (Tahir et  al ., 2003).

## METODOLOGI PENELITIAN

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan Oktober  2018  -  Desember  2018  di Laboratorium  Farmasi  Lanjut  Program Studi  Farmasi,  Fakultas  Matematika  dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sam Ratulangi

## Bentuk Penelitian
Bentuk dari penelitian ini adalah eksperimental  laboratorium  yang  akan menguji  aktivitas  antioksidan  dengan menggunakan metode DPPH (1,1- difenil - 2- pikrilhidrazil ) dari ekstrak etanol spons Stylissa sp. dari perairan Selat Lembeh.

## Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini ialah Scuba diving dan juga alat-alat  gelas  seperti  gelas  500  mL (pyrex),  labu  ukur  10  mL  (pyrex),  gelas ukur  1000  mL  (pyrex),  Erlenmeyer  500 mL,  cawan  petri,  cawan  porselin,  wadah botol,  timbangan  digital  (AE  ADAM), spektrofotometer  UV-Vis  ,  aluminium foil,  rotary  evaporator,  pipet  tetes, corong, mikro pipet, pipet volume.

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu  kertas  saring,  etanol  96%, etanol, DPPH (1,1- difenil -2- pikrilhidrazil ),  ekstrak  etanol  dari  spons Stylissa sp.  dan  serbuk  vitamin  C  p.a sebagai kontrol positif.
V 1 .M 1 = V 2 .M 2

## Pengambilan Sampel
Sampel  ini  diambil  di  perairan selat  lembeh  menggunakan  alat  bantu (scuba  diving).  Sebelum  diambil  sampel di  foto  menggunakan  kamera  bawah  laut setelah  diambil  di  masukan  dalam kantong  plastik  jepit  yang  sudah  di siapkan  dan  di  simpan  dalam  kotak pendingin lalu di bawah ke Laboratorium Farmasi  Lanjut  Program  Studi  Farmasi Universitas Sam Ratulangi.

## Preparasi Sampel
Spons Stylissa sp. yang di sudah di ambil di  cuci  kembali  dan  di  potong-potong kecil  lalu  di  masukan  kedalam  wadah botol,  sampel  yang  di  dalam  botol  di  isi dengan etanol 96% sebanyak 200 mL.

## Ekstraksi Sampel
Sampel spons Stylissa sp. sebanyak 140 g di  maserasi  dengan  pelarut  etanol  96% sebanyak 200mL dengan 3 kali pengulangan  selama  24  jam  dengan sesekali  di  kocok.  Hasil  dari  maserasi kemudian  di  saring  untuk  mendapatkan hasil filtrat, kemudian hasil filtrat yang di dapatkan  dari  3  kali  pengulangan  di uapkan  menggunakan  rotary  evaporator sehingga  menghasilkan  ekstrak  kental dari  sampel,  lalu  di  taruh  di  cawan  petri dan  di  masukan  kedalam  oven  pemanas untuk  mendapatkan  ekstrak  kasar  dari sampel spons Stylissa sp .

## Pembuatan Larutan Stok
Sebanyak  100  mg  ekstrak  spons Stylissa sp. dilarutkan dalam 100 mL etanol 96%. Dengan  masing-masing  konsentrasi  100, 75,  50  dan  25  mg/L,  dihitung  dengan menggunakan rumus pengenceran, yaitu :
Dari  masing-masing  hasil  yang didapatkan  dari  hasil  V 1 dipipet  dan ditambahkan etanol 96% hingga mencapai tanda batas (10 mL), kemudian dipindahkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan ditutup  dengan  menggunakan aluminium foil untuk  digunakan  pada  perlakuan selanjutnya.

## Pembuatan Larutan DPPH
Sebanyak  4  mg  DPPH  ditimbang  dan dilarutkan  dalam  etanol  96%  sebanyak 100  mL,  dan  buat  larutan  stok  DPPH sesuai  konsentrasi  yang  sama  dengan konsentrasi pada larutan stok sebelumnya yaitu  100,  75,  50  dan  25  .  Pada  masing- masing  konsentrasi,  ditambahkan  etanol sampai  tanda  batas  (10  mL).  Selanjutnya larutan  yang  di  buat  untuk  uji  aktivitas antioksidan  yaitu  ekstrak  etanol  spons Stylissa sp.  di  pipet  sebanyak  0,5  mL dimasukan kedalam tabung reaksi dengan masing-masing  konsentrasi  100,  75,  50 dan  25  mg/L  dan  di  tambahkan  1,5  mL larutan  DPPH  kedalam  masing-masing kosentrasi  dan  divortex  selama  2  detik. Sampel dibuat sebanyak 3 kali pengulangan.

## Pembuatan Larutan Vitamin C (p.a)
Vitamin  C  p.a  ditimbang  sebanyak  10 mg.  Kemudian,  vitamin  C  p.a  dilarutkan dalam  etanol  p.a  sebanyak  10  mL,  buat larutan  stok  dengan  konsentrasi  yang sama,  yaitu  konsentrasi  100,  75,  50  dan 25  mL  dengan  ditambahkan  masing- masing  larutan  dengan  etanol  p.a mencapai  tanda  batas  (10  mL),  dengan
pengulangan  sebanyak  3  kali  pada masing-masing konsentrasi. Sampel vitamin C p.a diuji pada spektrofotometer UV-Vis  dengan  panjang  gelombang  517 nm.

## Pengujian Larutan Kontrol DPPH dan Aktivitas Atioksidan dengan Metode DPPH
Larutan  kontrol  DPPH  diuji  pada spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang  517  nm  sebagai  absorbansi kontrol  dalam  pengujian  ini.  Sampel diinkubasi  selama  30  menit  pada  suhu 37ºC.  Untuk  mengetahui  aktivitas  dari penangkal  radikal  bebas  tersebut,  di  uji pada spektrofotometer.
Berubahnya
warna  ungu  menjadi  warna  kuning menunjukkan  efisiensi  penangkal  radikal
bebas. Diukur absorbansi pada spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang  517  nm  setelah  diinkubasi selama  30  menit  berubahnya  warna menjadi  kuning  menunjukkan  bahwa, masing-masing  konsentrasi  menunjukkan efisiensi  penangkal  radikal  bebas  di  uji dengan  spektrofotometer  UV-Vis  dengan panjang gelombang 517 nm.
Kemudian diamati perbandingannya dengan  vitamin  C  p.a  sebagai  standar. Aktivitas  penangkapan  radikal  bebas (persen inhibisi) dihitung sebagai persentase  berkurangnya  warna  DPPH dengan menggunakan rumus :

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas  dari  penangkal  radikal  bebas,  di uji pada spektrofotometer. Hasil pengujian disajikan pada tabel dibawah ini :
Tabel 1. Hasil perbandingan pengujian Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Stylissa
Spons  merupakan  biota  laut  yang hidup    menetap    di  dasar  perairan,  yang memiliki  peran  yang  cukup  penting  di dalam  ekosistem  terumbu  karang.  Selain itu spons merupakan salah satu komponen  biota  penyusun  terumbu karang  yang  mempunyai  potensi  bioaktif yang belum banyak dimanfaatkan. Hewan  laut  ini  mengandung  senyawa aktif  yang  persentase  keaktifannya  lebih besar  dibandingkan  dengan  senyawa- senyawa  yang  dihasilkan  oleh  tumbuhan darat  contohnya  pada  biota  laut  spons Stylissa sp.  (Rachmaniar, 1998).
Ekstraksi  pada  spons Stylissa sp. menggunakan  proses  maserasi,  dimana sediaan  cair  yang  dibuat  dengan  cara mengekstraksi bahan nabati yaitu direndam menggunakan pelarut bukan air (pelarut  nonpolar)  atau  setengah  air, misalnya etanol encer, selama periode
waktu tertentu, waktu yang digunakan untuk perlakuan ini selama 24 jam  untuk  3x  pengulangan  dengan sampel  sebanyak  180  g.  Kelebihan  dari ekstraksi dengan metode maserasi adalah Unit  alat  yang  dipakai  sederhana,  hanya dibutuhkan  bejana  perendam Biaya operasionalnya  relatif  rendah  Prosesnya relatif hemat penyari dan tanpa pemanasan.
Pembuatan  larutan  stok  dimana pada umumnya dinyatakan dalam kelipatan  konsentrasi  media  yaitu  10x, 20x,  100x,  bahkan  1000x  konsentrasi media.  Pada    penelitian  ini  dilakukan pengujian dengan pengulangan konsentrasi  25,  50,  75,  dan  100  mg/L. Pada  pembuatan  larutan  stok  harus memperhatikan  daya  simpan  larutan karena  larutan  yang  apabila  sudah mengalami  pengendapan  tidak  dapat
digunakan lagi. Pengendapan larutan stok umumnya  terjadi  bila  kepekatan  larutan terlalu tinggi.
Tujuan dari pembuatan larutan stok sendiri ialah untuk menghindari penimbangan  yang  berulang-ulang  setiap kali membuat media dimana penimbangan  berulang-ulang  ini  lebih membutuhkan  banyak  waktu.  Dengan adanya  larutan  stok  lebih  memudahkan karena  pembuatan  media  selanjutnya tinggal  mengencerkan  larutan  stok  saja larutan stok dibuat hanya untuk satu jenis bahan.  Langkah  ini  bertujuan  untuk menghindari pengendapan larutan.
Metode  yang  digunakan  pada penelitian ini adalah DPPH (1,1- difenil -2- pikrilhidrazil ). karena merupakan metode yang  paling  sering  digunakan  untuk menguji  aktivitas  antioksidan  tanaman obat adalah metode uji dengan menggunakan  radikal  bebas  DPPH. Tujuan  metode  ini  adalah  mengetahui parameter  konsentrasi  yang  ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan  (IC50).  Hal  ini  dapat  dicapai dengan  cara  menginterpretasikan  data eksperimental  dari  metode  tersebut.
DPPH  merupakan  radikal  bebas  yang dapat  bereaksi  dengan  senyawa  yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan  komponen  tertentu  dalam suatu ekstrak.
Sebanyak  4  mg  DPPH  ditimbang dan  dilarutkan  dalam etanol  96% sebanyak  100  mL,  dan  buat  larutan  stok DPPH  sesuai  konsentrasi  yang  sama dengan  konsentrasi  pada  larutan  stok sebelumnya  yaitu  100,  75,  50  dan  25  . Pada masing-masing konsentrasi, ditambahkan  etanol  sampai  tanda  batas
(10 mL). Selanjutnya larutan yang di buat untuk  uji  aktivitas  antioksidan  yaitu ekstrak  etanol  spons Stylissa sp.  di  pipet sebanyak  0,5  mL  dimasukan  kedalam tabung  reaksi  dengan  masing-masing konsentrasi 100, 75, 50 dan 25 mg/L dan di  tambahkan  1,5  mL  larutan  DPPH kedalam  masing-masing  kosentrasi  dan divortex  selama  2  detik.  Sampel  dibuat sebanyak 3 kali pengulangan.
Pada  penelitian  ini  menggunakan vitamin C p.a sebagai Pembanding untuk kontrol  positif  sampel  spons Stylissa sp. karena  berfungsi  sebagai  antioksidan sekunder yaitu menangkap radikal bebas, mencegah  terjadinya  reaksi  berantai, aktivitas  antioksidannya  sangat  tinggi, mudah  diperoleh  dan  vitamin  C  lebih polar  dari  vitamin  yang  lain.  Vitamin  C mempunyai  gugus  hidroksi  bebas  yang bertindak  sebagai  penangkap  radikal bebas.
Sebelum memasuki pengujian dengan  alat  spektrofotometer  UV-Vis, sampel  spons Stylissa sp.  dan  larutan sampel  vitamin  C  p.a  diinkubasi  terlebih dahulu  dengan  cara  menutup  sampel dengan  aluminium  foil  selama  30  menit. Spektrofotometer umum digunakan karena kemampuannya
dalam
menganalisa  begitu  banyak  senyawa kimia  serta  kepraktisannya  dalam  hal preparasi  sampel  apabila  dibandingkan dengan beberapa metode analisa.
Spektrofotometri UV/Vis melibatkan energi  elektronik  yang  cukup  besar  saat analisis, sehingga spektrofotometer UV/Vis  lebih  banyak  dipakai  untuk analisis  kuantitatif  dibanding  kualitatif. Spektrofotometri UV-vis adalah pengukuran  serapan  cahaya  di  daerah ultraviolet  (200  –350  nm)  dan  sinar
tampak  (350  –  800  nm)  oleh  suatu senyawa.
Pada konsentrasi 25, 50, 75 dan 100 mg/L Hasil pengukuran aktivitas antioksidan  pada  larutan  sampel  spons
Stylissa sp.  menunjukkan  bahwa  spons Stylissa sp. memiliki aktivitas antioksidan  yang  cukup  tinggi  hal  ini dapat  dilihat pada  (Tabel  1) dengan rata- rata  65,90%  di  konsentrasi  25  mg/L, 66,30%  di  konsentrasi  50  mg/L,  69,30% di  konsentrasi  75  mg/L  dan  yang  paling besar  di  konsentrasi  100  mg/L  yaitu sebesar  70,26%  berbanding  dengan aktivitas  pada  konsentrasi  sampel  spons Stylissa sp.  dengan  kontrol  positif  dari sampel  vitamin  C  yang  tinggi  hal  ini dapat  dilihat  pada  (tabel  1)  dengan  rata- rata  93,90  %  di  konsentrasi  25  mg/L, 93,30 % di konsentrasi 50 mg/L, 69,30% di konsentrasi.
75  mg/L  dan  yang  paling  besar  di konsentrasi  100  mg/L  yaitu  sebesar 93,80%. Berdasarkan hasil yang diperoleh  pada  (Tabel  1)  menunjukkan bahwa  pengukuran  persen  inhibisi  pada ekstrak etanol spons Stylissa sp. memiliki aktivitas  antioksidan  dan    mengalami peningkatan  dari  konsentrasi  25  mg/L sampai  dengan  100  mg/L.Pada  ekstrak etanol spons Stylissa sp. dengan konsentrasi  100  mg/L    memiliki  persen inhibisi  rata-rata  paling  tinggi  yaitu sebesar 70,26% Penigkatan persen inhibisi pada ekstrak etanol spons Stylissa sp.  menandakan  bahwa  konsentrasi ekstrak yang ditambahkan mempengaruhi kemampuan  ekstrak  dalam  merendam radikal  bebas.Hal  ini  didukung  oleh penelitian yang dilakukan oleh Hanani et al .,  (2005)  sebagai  jurnal  pembanding yang  menyatakan  bahwa  presentasi
penghambat atau persen inhibisi terhadap aktivitas radikal bebas akan ikut
meningkat  seiring  dengan  meningkatnya konsentrasi. Hasil pengujian perbandingan aktivitas antioksidan
ekstrak  spons Stylissa sp.  dan  vitamin  C (Tabel  1)  juga  menukjukkan  bahwa aktivitas antioksidan ekstrak etanol spons Stylissa sp.  lebih  rendah  dibandingkan dengan vitamin C.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  dari  hasil  penelitian yang  telah  dilakukan  dapat  disimpulkan bahwa  ekstrak  etanol  spons Stylissa sp. dari  Perairan  Selat  Lembeh,  Kota  Bitung memiliki aktivitas antioksidan.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut  untuk  mengetahui  senyawa  aktif yang terkandung dalam spons Stylissa sp. dan  pengujian  aktivitas  antioksidan dengan  metode  lain  dan  sebaiknya membandingkan hasilnya dengan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Apri,  R.  2014. Kandungan  Senyawa
Bioaktif Dan Uji Fitokimia Sinularia  sp  dan  Lobophytum  sp Dari  Perairan  Pulau  Pongkok
Bangka  Selatan.  Thesis. Sekolah Pascasarjana  Institut  Pertanian Bogor, Bogor. 50 hal.
Hanani  E,  Mun’im  B,  Sekarini  R.  2005 . Identifikasi  senyawa  antioksidan dalam spons Callispongia sp. dari Kepulauan  Seribu. Jurnal  Ilmu Kefarmasian2  (3)  :  127-133. Jurnal (Endang Hanani).
Proksch,  P.  1998. Pharmacologically Active  Natural  Product  from Marine Invertebrates and Associated Microorganisms. Prosiding Seminar Bioteknologi I, Ed. Rachmaniar  et  al.,  Puslit Oseanologi LIPI, Jakarta.
Rachmaniar.  2003. Produk  Alam  Laut Sebagai  Lead  Compound  Untuk Farmasi Dan Pertanian,
Dibawakan  Pada  Seminar  Sehari Perfektif  Baru  Dalam  Drug,
Discovery,  Makassar,  26  Oktober 2003.
Silalahi,  J.  2006. Makanan  Fungsional .
Kanisius. Jogjakarta.
Tahir,  I.,  Wijaya,  K.,  dan  Widianingsih,
D. 2003. Terapan Analisis Hansch Untuk Aktivitas Antioksidan  Senyawa  Turunan Flavon/Flavonol . Artikel  Seminar Chemometrics-  Chemistry.  Dept Gadjah Mada University, Yogyakarta.