## AKTIVITAS ANTIOKSIDAN PROTEIN HIDROLISAT DARI KASEIN SUSU KAMBING ETAWA HASIL HIDROLISIS BROMELIN DARI DAUN NANAS MADU

## Antioxidant Activity of Hydrolyzate Protein from Etawa Goat Milk Casein Hydrolysed Using Honey Pineapple Leaf Bromelain
Puji Lestari 1) dan Suyata 1)
1) Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto
Email: pujilest1974@gmail.com

## ABSTRACT
Hydrolyzed proteins are fragments of protein fragments that have certain biological activities. Some of the functions  of  hydrolyzed  proteins  that  are  known  are  as  antibacterial,  antioxidant,  antihypertensive, antithrombotic,  anti-inflammatory,  opioid,  and  immunomodulatory.  Protein  from  Etawa  goat's  milk  is  one source  of  protein  hydrolyzate.  In  this  research,  the  antioxidant  activity  of  protein  hydrolyzate  from  casein Etawa goat milk was tested. Casein is hydrolyzed with bromelain from honey pineapple leaves. The research steps  are:  bromelain  extraction,  casein  hydrolysis  of  Etawa  goat  milk,  antioxidant  activity  fraction  of hydrolyzed protein fractions by DPPH method, and hemolysis test. The results of the study were: (1) the highest degree of hydrolysis in casein hydrolyzate was achieved at 60 minutes incubation time, (2) casein hydrolyzate which had the highest antioxidant activity was incubated for 30 minutes, (3) based on the AAI value, the casein hydrolyzed activity included into the classification of weak antioxidants because AAI <0.5, (4) the results of the hemolysis test show that casein hydrolyzate does not cause hemolysis of red blood cells.
Keyword: antioxidant, bromelain, etawa goat milk, hemolysis, hydrolysate protein

## ABSTRAK
Protein hidrolisat  merupakan  fragmen  pecahan  protein yang memiliki aktivitas biologis tertentu. Beberapa fungsi  protein  hidrolisat  yang  telah  diketahui  adalah  sebagai  antibakteri,  antioksidan,  antihipertensi, antitrombosis, antiinflamatori, opioid, dan imunomodulator. Protein dari susu kambing Etawa merupakan salah satu sumber protein hidrolisat.  Pada penelitian  ini, dilakukan uji aktivitas  antioksidan  protein hidrolisat  dari kasein susu kambing Etawa. Kasein dihidrolisis dengan bromelin dari daun nanas madu. Tahap penelitian yang dilakukan adalah: ekstraksi bromelin, hidrolisis kasein susu kambing Etawa, uji aktivitas antioksidan fraksi- fraksi protein hidrolisat dengan metode DPPH, dan uji hemolisis. Hasil penelitian adalah: (1) derajat hidrolisis tertinggi  pada  kasein  hidrolisat  dicapai  pada  waktu  inkubasi  60  menit,  (2)  kasein  hidrolisat  yang  memiliki aktivitas  antioksidan  tertinggi  adalah  yang  diinkubasi  selama  30  menit,  (3)  berdasarkan  nilai  AAI,  maka aktivitas antioksidan kasein hidrolisat termasuk ke dalam klasifikasi antioksidan lemah karena AAI < 0,5, (4) hasil uji hemolisis menunjukkan bahwa kasein hidrolisat tidak menyebabkan terjadinya hemolisis terhadap sel darah merah.
Kata Kunci: antioksidan, bromelin, hemolisis, protein hidrolisat, susu kambing etawa

## PENDAHULUAN
Peptida bioaktif merupakan fragmen  pecahan  protein  dengan  urutan dan  komposisi  asam  amino tertentu yang
memiliki aktivitas biologis tertentu setelah dilepaskan  dari  proteinnya  oleh  kerja enzim.  Menurut  Mora  & Toldra (2014), peptida  bioaktif  memiliki  2-20  asam
amino dengan massa molekul kurang dari 6000  Da.  Bioaktivitas  peptida  ditentukan oleh komposisi dan urutan asam aminonya. Beberapa peptida bioaktif telah diketahui  memiliki  aktivitas  biologi  di dalam tubuh seperti antioksidan, antihipertensi, antitrombosis, antiadipogenik, antimikroba, antiinflamasi dan efek immunomodulatori (Ahn et  al .,  2015).  Peptida  bioaktif  bisa didapatkan  dari  protein  tanaman  dan hewan.  Sumber  peptida  bioaktif  dari tanaman umumnya berasal dari kelompok biji-bijian seperti gandum, beras, oats , rye , jagung,  dan  kelompok  kacang-kacangan seperti kedele, kacang polong, dan chickpeas (Martinez et al. ,
2012).    Daging,  telur,  susu,  dan  ikan adalah sumber peptida bioaktif dari hewan (Sabahelkheir et al. , 2012).
Susu merupakan salah satu sumber peptida  bioaktif  dengan  fungsi  biologis yang  sangat  luas  (Szwajkowska et  al .,
2011).  Belum  banyak  penelitian  yang melaporkan mengenai pemanfaatan protein  susu  kambing  sebagai  sumber peptida  bioaktif  (Li et  al .,  2013).  Susu kambing  memiliki  kandungan  protein yang  tinggi  yakni  sebesar  3,4  %  (Park et al. , 2007). Kandungan protein yang tinggi pada susu kambing dan hasil hidrolisisnya berupa peptida mempunyai fungsi biologis  yang  luas  (Szajkwoska et  al .,
2011).  Faktor yang sangat mempengaruhi keberhasilan dalam mendapatkan potongan-potongan peptida bioaktif adalah  sumber  protein  serta  spesifisitas enzim.  Oleh  karena  itu,  pemilihan  enzim menjadi tahap yang sangat penting karena sangat  mempengaruhi  bioaktivitas  dari potongan-potongan peptida yang dihasilkan (Kumar et al. , 2013).
Pada  penelitian  ini,  dilakukan  uji aktivitas  antioksidan  protein  hidrolisat dari kasein susu kambing Etawa. Hidrolisis kasein dilakukan dengan enzim bromelin  dari  daun  nanas  madu  dengan variasi  waktu  hidrolisis  yang  berbeda. Setiap fraksi protein hidrolisat dari kasein ditentukan  derajat  hidrolisisnya,  diuji aktivitas  antioksidan  dengan  metode DPPH,  dan  uji  hemolisis  terhadap  sel darah merah.

## Metode

## Alat
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  peralatan  gelas laboratorium, freeze dryer Virtish model Benchtop  2K  XL,  oven  memmert, penangas,  mortar  porselen,  mikropipet socorex  100-1000  µL,  mikropipet socorex  5-50  µL, water  bath  precision 283,  spektrofotometer  Shimadzu UV- 1800,  pH  meter,  sentrifus  Ohaus, sentrifus 80-2, lemari pendingin, neraca
analitik,  sentrifus  TG16-W,  dan  kertas saring.

## Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada  penelitian  ini  adalah  susu  kambing Etawa dari peternak lokal Desa Purbadana Kecamatan  Kembaran  Banyumas,  daun dari  nanas  madu  asal  Desa  Beluk Kecamatan  Belik  Kabupaten  Pemalang, tirosin, kasein, Na 2 CO 3, CuSO 4 ,
NaH 2 PO 4 .2H 2 O, Na 2 HPO 4. 2H 2 O,
C 4 H 11 O 3 N,  CH 3 COOH,  metanol,  Na-K tartat, folin ciocalteu,  HCl, NaCl, NaOH, TCA, DPPH, darah ayam, Tween 80, Tris salin,  asam  oksalat,  vitamin  C  p.a,  dan akuades.

## Prosedur Penelitian
Ekstraksi bromelin (Darwis dan Sakara, 1990)
Enzim bromelin diekstraksi dengan cara menumbuk 100 gram daun nanas  madu  menggunakan  mortar  dan alu  pada kondisi dingin. Filtrat  diambil dengan cara diperas menggunakan kain muslin,  kemudian  ditambahkan  dengan 100  mL  bufer  fosfat  0,1  M  pH  7. Bagian-bagian  yang  tidak  larut  dalam filtrat, dipisahkan dengan cara sentrifugasi  dengan  kecepatan  12.000 rpm  selama  15  menit  pada  suhu  4 o C.
Supernatan  yang  diperoleh  adalah ekstrak kasar enzim bromelin.
Preparasi  susu  kambing  (Yoshida et al ., 2000; Bezerra et al ., 2013)
Susu  kambing  etawa  segar disentrifugasi  selama  15  menit  dengan kecepatan  12.000  rpm  pada  suhu  4  °C untuk  memisahkan  lemak  dari  protein susu. Pasteurisasi susu dilakukan menggunakan metode High Temperature Short Time (HTST), yaitu pemanasan  susu  selama  15  detik  pada suhu  72°C.    Isolasi  kasein  dari  protein susu kambing dilakukan dengan menambahkan HCl 2 N pada suhu 40 °C ke dalam susu yang sudah dipasteurisasi hingga  mencapai  titik  isoelektrik  (pH 4,6). Susu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit  untuk  memisahkan  kasein  dan whey .  Pellet  yang  dihasilkan  adalah kasein,  sedangkan  dari  supernatan dihasilkan  adalah whey .  Kasein  dibilas dengan  akuades  sebanyak  1  kali, kemudian dilarutkan dalam bufer fosfat 0,05 M pH 7 dengan konsentrasi kasein 10 mg/mL.
Hidrolisis susu kambing (Kusumaningtyas et al ., 2015; Lestari dan Soesilo, 2017)
Substrat kasein dari susu kambing  peranakan  etawa  dihidrolisis menggunakan  ekstrak  kasar  bromelin pada kondisi optimum (suhu 55° C dan
pH 7). Perbandingan enzim dan substrat yang  digunakan  adalah  1:4.  Hidrolisis dilakukan dengan interval waktu 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 menit. Kontrol adalah kasein yang tidak dihidrolisis. Hidrolisis dihentikan  dengan  pemanasan  pada suhu  80  °C  selama  15  menit.  Substrat kasein  yang  telah  dihidrolisis  disaring menggunakan  kertas  saring,  kemudian diuji aktivitas antioksidannya.

## Derajat Hidrolisis
Derajat hidrolisis ditentukan dengan  mengukur  kadar  protein  sebelum dan  setelah  dihidrolisis.  Penentuan  kadar protein  dilakukan  menggunakan  metode Lowry (Bollag et al., 1996). Sebanyak 1 mL protein hidrolisat dari kasein ditambah dengan  5  mL  reagen  Lowry  C,  dikocok dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Campuran larutan ditambah 0,5 mL reagen  Lowry  E,  diinkubasi  pada  suhu ruang  selama  30  menit  sambil  sekali- sekali dikocok.
Larutan
diukur
absorbansinya  pada  panjang  gelombang
750 nm. Kadar protein dihitung berdasarkan persamaan regresi linear dari kurva  standar  kasein.  Derajat  hidrolisis dihitung menggunakan persamaan:
Derajat  Hidrolisis  = KP awal – KP akhir
KP awal x
100%
Keterangan:
KP  awal  =  kadar  protein  kasein sebelum dihidrolisis (mg/mL) KP  akhir  =  kadar  protein  kasein setelah dihidrolisis (mg/mL)
Uji  aktivitas  antioksidan  dengan metode DPPH (Kusumaningtyas et al ., 2015)
Larutan  DPPH  0,05  mM  dibuat dengan  melarutkan  1,98  mg  DPPH  ke dalam  100  mL  metanol  99%.  Protein hidrolisat  dilarutkan  dalam  metanol dengan konsentrasi 1 mg/mL. Sebanyak 1  mL  sampel  protein  hidrolisat  dari kasein  ditambahkan  dengan  2  mL DPPH, kemudian didiamkan selama 30 menit.  Absorbansi  larutan  diukur  pada panjang  gelombang  517  nm.  Blanko yang digunakan adalah metanol sebanyak  1  mL.  Aktivitas  antioksidan dihitung dengan persamaan:
% Inhibisi  = A blanko - A sampel A blanko x 100%
Keterangan:
A  blanklo  =  Absorbansi  hasil  reaksi larutan DPPH dan metanol 99%
A  sampel  =  Absorbansi  hasil  reaksi larutan DPPH dengan protein hidrolisat
Fraksi  kasein  yang  memiliki persentase  inhibisi  tertingi  dibuat  seri konsentrasi 1; 2; 3; 4; dan 5 mg/mL untuk mendapatkan  persamaan  regresi  linear. Vitamin  C  digunakan  sebagai  standar antioksidan  dengan  seri  konsentrasi  1;  2;
3;  4;  dan  5  ppm.  Regresi  linear  yang diperoleh  dalam  bentuk  persamaan  y= bx+a  digunakan  untuk  mencari  nilai IC 50 ( Inhibition  Concentration 50%).
Caranya  dengan  menyatakan  nilai  y sebesar  50.  Nilai  x  yang  diperoleh dinyatakan  sebagai  IC 50 .  Langkah selanjutnya adalah penentuan nilai AAI ( Antioxidant  Activity  Index )  untuk mengetahui index aktivitas antioksidan. Nilai AAI ditentukan dengan persamaan:
AAI = Konsentrasi DPPH (mg/mL) IC 50 sampel (mg/mL)
Menurut  Scharer  dan  Godoy
(2009) aktivitas antioksidan berdasarkan nilai AAI dikatakan lemah jika  nilai  AAI <  0,5;  aktivitas antioksidan sedang jika 0,5 < AAI < 1,0; aktivitas antioksidan kuat jika 1,0 < AAI <  2,0;  dan  aktivitas  antioksidan  sangat kuat jika nilai AAI > 2,0.
Uji  hemolisis (Kusumaningtyas et  al ., 2015)
Darah  ayam  ditambah  asam oksalat untuk mencegah koagulasi. Darah ayam dicuci dengan 0,01 M Tris-HCl (pH 7,4)  yang  mengandung  0,15  M  NaCl (Tris-salin), kemudian disentrifugasi pada 1000  rpm.  Supernatan  dibuang  dan  pelet dicuci sebanyak 2 kali dengan bufer Tris- salin.  Suspensi  0,1  %  sel  darah  merah
dibuat dengan melarutkan pelet sel darah merah menggunakan Tris-salin. Sebanyak 1  mL  protein  hidrolisat  dari  kasein ditambahkan  dengan  1  mL  suspensi  sel darah merah 0,1%, lalu diinkubasi selama 2  jam  pada  suhu  37  °C  kemudian disentrifugasi  pada  5000  rpm  selama  5 menit.  Supernatan  diambil  dan  diukur absorbansinya  pada  panjang  gelombang 540  nm.  Tween  80  digunakan  sebagai kontrol  positif  yang  mempresentasikan hemolisis  100%  dan  Tris-salin  sebagai kontrol  negatif  yang  mempresentasikan hemolisis  0%.  Pengujian  dilakukan dengan  3  kali  ulangan.  Nilai  persentase hemolisis diperoleh dengan menggunakan persamaan berikut:
% Hemolisis  = Abs sampel - Abs kontrol (-) Abs kontrol (+) x
100%
Keterangan:
Abs kontrol (-)  =  Absorbansi  suspensi eritrosit + tris-salin
Abs  kontrol  (+)  =  Absorbansi  suspensi eritrosit + tween 80 Abs sampel =  Absorbansi  suspensi eritrosit + protein hidrolisat kasein/ whey

## Hasil dan Pembahasan
Derajat Hidrolisis Fraksi Kasein

## Hidrolisat
Hidrolisis  protein  menggunakan enzim  adalah  cara  yang  efisien  untuk memperoleh  protein  hidrolisat  karena dapat  menghasilkan  protein  hidrolisat
yang terhindar dari kerusakan asam amino tertentu,  seperti  triptofan  dan  glutamin. Menurut  Suhartono  (2008),  hidrolisis protein  secara  enzimatis  merupakan metode  yang  umum  digunakan  untuk menghasilkan  peptida  bioaktif  karena memiliki  beberapa  kelebihan  yaitu:  tidak mengakibatkan  kerusakan  asam-asam amino,  peptida  rantai  pendek  yang dihasilkan lebih bervariasi (dipeptida dan tripeptida),  dan  tidak  menyebabkan dekomposisi  asam  amino.  Hidrolisis enzimatik merupakan metode yang paling umum digunakan untuk memecah protein sehingga  diperoleh  peptida  bioaktif.
Enzim-enzim  tersebut  memecah  protein pada  sisi  tertentu  yang  menentukan sekuens,  panjang  dan  bioktivitas  peptida yang dihasilkan. Hidrolisis protein menggunakan enzim protease dipengaruhi oleh  beberapa  faktor  seperti  suhu,  pH, waktu hidrolisis, konsentrasi, dan perbandingan  enzim  dengan  protein. Protease  menguraikan  protein  menjadi molekul  yang  lebih  kecil.  Setiap  enzim protease  memiliki  kemampuan  berbeda dalam menghidrolisis ikatan peptida.
Hidrolisat  protein  adalah  produk yang  dihasilkan  dari  penguraian  protein menjadi peptida dan asam amino melalui proses  hidrolisis  (Pasupuleti  dan  Demain 2010). Derajat hidrolisis merupakan rasio jumlah  peptida  yang  dipecah  selama
hidrolisis  terhadap  jumlah  ikatan  peptida yang  terkandung  dalam  protein.  Derajat hidrolisis  dapat  mempengaruhi  sifat fungsional  dari  protein  hidrolisat  yang dihasilkan (Baharrudin et al ., 2016).  Data derajat  hidrolisis  protein  hidrolisat  dari kasein  susu  kambing  etawa  ditampilkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Derajat Hidrolisis Kasein Hidrolisat
Waktu  hidrolisis (menit) Derajat hidrolisis kasein (%) Tanpa hidrolisis 0 10 32,53 20 34,86 30 40,29 40 42,06 50 49,13 60 52,23
Hasil  penelitian  yang  ditampilkan pada  Tabel  1  menunjukkan  bahwa semakin  lama  waktu  hidrolisis  oleh bromelin  maka  semakin  besar  persentase derajat  hidrolisis.  Derajat  hidrolisis tertinggi  dicapai  pada  waktu  inkubasi  60 menit. Haslaniza et al . (2010) menyatakan bahwa  semakin  lama  waktu  hidrolisis, aktivitas  proteolitik  meningkatkan  proses degradasi  protein,  sehingga  diperoleh derajat hidrolisis yang lebih tinggi. Waktu hidrolisis  yang  berbeda  menghasilkan jenis peptida dan asam amino bebas yang
berbeda, yang dinyatakan dengan besarnya  persentase  derajat  hidrolisis. Derajat hidrolisis merupakan suatu parameter yang menunjukkan kemampuan protease dalam menghidrolisis  protein.  Semakin  tinggi tingkat pemecahan protein menjadi senyawa berantai pendek, derajat hidrolisisnya semakin tinggi. Dewi (2016) dalam  penelitiannya  menyatakan  bahwa hidrolisis protein ikan kayu dengan enzim papain  1%  pada  suhu  50  °C  selama  60 menit menghasilkan nilai derajat hidrolisis tertinggi dengan nilai 5,420±0,574%.
Aktivitas Antioksidan Kasein

## Hidrolisat
Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan mereaksikan fraksi kasein hidrolisat dengan larutan DPPH 0,05 mM, kemudian  diukur  absorbansinya  pada panjang  gelombang  517  nm.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  semua fraksi  kasein  hidrolisat  yang  diuji menyebabkan menurunnya intensitas warna larutan DPPH, sehingga absorbansinya menurun. Persentase inhibisi fraksi kasein hidrolisat
ditampilkan pada Gambar 1.

## Gambar 1. Grafik aktivitas antioksidan kasein hidrolisat
Hasil  menunjukkan  bahwa  waktu hidrolisis  yang  berbeda  menghasilkan persentase inhibisi yang berbeda. Persentase  inhibisi  dari  waktu  hidrolisis 10 menit sampai 30 menit meningkat, dan menurun setelah 30 menit. Hal ini berarti bahwa waktu hidrolisis 30 menit menghasilkan persentase inhibisi tertinggi sebesar  6,  85%.  Aktivitas  antioksidan tertinggi dihasilkan oleh kasein hidrolisat pada waktu hidrolisis 30 menit. Hasil yang berbeda  didapatkan  oleh  Dewi  (2016) dalam  penelitiannya  yang  menyatakan bahwa  aktivitas  antioksidan  protein hidrolisat  ikan  kayu  menurun,  sejalan dengan  bertambahnya  waktu  hidrolisis; aktivitas  antioksidan  tertinggi  dihasilkan pada waktu hidrolisis 15 menit.
Samaranayaka (2010) menyatakan bahwa menurunnya  aktivitas  antioksidan  sejalan dengan  bertambahnya  waktu  hidrolisis, karena rusaknya urutan peptida antioksidatif  yang  terbentuk  pada  tahap
0 2 4 6 8 10 20 30 40 50 60 % in h ib is i Waktu hidrolisis (menit)
awal  proses  hidrolisis.  Klompong et  al . (2007)  menyatakan  bahwa  perubahan ukuran peptida yang semakin kecil seiring dengan  bertambahnya  waktu  hidrolisis bertanggung jawab  terhadap menurunnya aktivitas antioksidan protein hidrolisat.
Antioksidan  merupakan  senyawa yang mampu menetralisir atau menstabilkan  radikal  bebas  dengan  cara melengkapi  kekurangan  elektron  pada radikal bebas (Kikuzaki & Nobuji, 1993). Aktivitas antioksidan dalam suatu
senyawa  dapat  dideteksi  dengan  metode DPPH ( 1,1-Difenil-2-pikrilhidrazin) . Prinsip uji aktivitas antioksidan menggunakan DPPH yaitu adanya
pendonor  atom  hidrogen  pada  senyawa antioksidan yang bereaksi dengan radikal bebas  DPPH  (Shon et  al .  2003).
Reynertson  (2007)  menyatakan  bahwa DPPH  merupakan  senyawa  organik dengan  kandungan  nitrogen  yang  tidak stabil.  Senyawa  ini  memiliki  absorbansi kuat  pada  λ  maksimum  517  nm  dan memiliki  warna  ungu  gelap.  Molyneux (2004) menyatakan bahwa adanya senyawa  yang  dapat  mendonorkan  atom hidrogen  menyebabkan  perubahan  warna DPPH  dari  ungu  menjadi  warna  kuning pucat.
Kasein  hidrolisat,  hasil  hidrolisis dengan  waktu  30  menit,  selanjutnya digunakan  untuk  menentukan  nilai  IC 50 .
Nilai IC 50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50%. Vitamin C digunakan sebagai  standar  antioksidan  dengan konsentrasi 1; 2; 3; 4; dan 5 ppm.  Kurva penentuan  nilai  IC 50 kasein  hidrolisat hidrolisis  30  menit  ditampilkan  pada Gambar  2,  sedangkan  kurva  penentuan nilai  IC 50 vitamin  C  ditampilkan  pada Gambar 3.
Gambar 2. Grafik penentuan IC 50 kasein hidrolisat
Hasil diperoleh persamaan regresi linier y =  0,672x  +  2,146.  Nilai IC 50 didapat dengan  memasukkan  nilai  persentase inhibisi 50% pada persamaan regresi linier tersebut.  Hasil perhitungan diperoleh nilai IC 50 sebesar 71,21mg/mL.
y = 0,672x + 2,146 R² = 0,9341 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 % I n h ib is i
Konsentrasi kasein hidrolisat (mg/mL)
Gambar 3. Grafik penentuan IC 50 vitamin C
Hasil diperoleh persamaan regresi linier y =  6,325x  –  1,2426.  Hasil  perhitungan diperoleh nilai IC 50 sebesar 0,008 mg/mL.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa persentase inhibisi semakin meningkat dengan semakin meningkatnya konsentrasi  kasein  hidrolisat  yang  diuji. Pada  konsentrasi  kasein  hidrolisat  yang semakin tinggi terdapat peptida atau asam amino  yang  bersifat  antioksidan  dengan jumlah  lebih  banyak,  sehingga  jumlah donor  hidrogen  dari  peptida  semakin banyak dan bereaksi dengan radikal DPPH membentuk DPPH non-radikal (Hanani et al . 2005). Demikian juga pada vitamin C,
semakin  tinggi  konsentrasinya  maka semakin tinggi pula persentase inhibisinya,  artinya  semakin  tinggi  pula aktivitas  antioksidannya.    Nilai  IC 50
kasein hidrolisat dan vitamin C ditampilkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Nilai IC 50 Kasein Hidrolisat dan Vitamin C
Berdasarkan hasil yang ditampilkan  pada  Tabel  2,  diketahui bahwa  nilai  IC 50 kasein  hidrolisat  lebih besar daripada nilai IC 50 vitamin C. Hal ini berarti  kemampuan  antioksidan  dari kasein  hidrolisat  lebih  rendah  daripada vitamin  C.  Nilai  IC 50 digunakan  untuk menentukan  nilai  AAI  ( Antioxidant Activity  Index )  agar  dapat  diketahui klasisifikasi  antioksidannya.  Nilai  AAI ditentukan  untuk  mengetahui  indeks aktivitas antioksidan dari protein hidrolisat  kasein  dan whey .  Nilai  AAI diperoleh  dengan  menghitung  rasio konsentrasi DPPH yang digunakan dalam uji  terhadap  nilai  IC 50 kasein  hidrolisat. Nilai  AAI kasein hidrolisat susu kambing etawa  dan  vitamin  C  ditampilkan  pada Tabel 3.
Tabel 3.  Nilai AAI Vitamin C dan Kasein Hidrolisat
Berdasarkan  data  pada  Tabel  3 tersebut, nilai AAI  vitamin C lebih besar daripada  AAI  kasein  hidrolisat.  Scharer dan  Godoy  (2009)  mengklasifikasikan aktivitas  antioksidan  berdasarkan  nilai AAI  ke  dalam  4  kelompok.    Aktivitas antioksidan lemah jika nilai AAI < 0,5, aktivitas  antioksidan  sedang  jika  0,5  < AAI  <  1,0,  aktivitas  antioksidan  kuat jika  1,0  <  AAI  <  2,0,  dan  aktivitas
y = 6,325x - 1,2426 R² = 0,996 0 10 20 30 40 1 2 3 4 5 % I nh ib is i Konsentrasi vitamin C (ppm)
Perlakuan
Nilai IC 50 (mg/mL) Kasein hidrolisat 71,21 Vitamin C 0,008
Perlakuan Nilai AAI Kasein hidrolisat 0,278 Vitamin C 2,475
antioksidan sangat kuat jika nilai AAI > 2,0.    Berdasarkan  hasil  tersebut,  maka vitamin  C  diklasifikasikan  sebagai antioksidan sangat kuat, karena memiliki  AAI  di  atas  2,0,  sedangkan kasein  hidrolisat,  tergolong  sebagai antioksidan lemah karena nilai AAI nya di bawah 0,5.
Chalamaiah et al . (2015) menyatakan  semakin  rendah  nilai  IC 50 semakin baik nilai aktivitas antioksidannya.  Nilai  IC 50 yang  tinggi menunjukkan  aktivitas  antioksidan  yang rendah, karena untuk menghambat radikal bebas  DPPH  sebesar  50%  dibutuhkan konsentrasi yang lebih tinggi.
Dewi  (2016)  dalam  penelitiannya terhadap protein hidrolisat ikan kayu yang dihidrolisis  dengan  papain  1%  (w/w) selama  15  menit,  memperoleh  nilai  IC 50
sebesar  0,159  mg/mL.  Sila  dan  Bougatef (2016)  menyatakan  bahwa  spesifisitas enzim  yang  digunakan  dalam  proses proteolisis  merupakan  salah  satu  faktor paling  penting  dalam  memproduksi peptida antioksidan. Bordbar et al . (2013) menyatakan  bahwa  aktivitas  antioksidan sebagai penangkal radikal DPPH dipengaruhi  oleh  ukuran  peptida  dan kelarutannya.
Uji Hemolisis Kasein Hidrolisat
Uji  hemolisis  adalah  uji  untuk mengetahui  toksisitas  peptida  karena sensitivitasnya dalam mengevaluasi kerusakan membran sel eukariot (Kusumaningtyas et al ., 2015). Hemolisis adalah  pecahnya  sel  membran  eritrosit sehingga  hemoglobin  bebas  ke  dalam medium  sekelilingnya  (Kahar,  2017). Prinsip uji hemolisis adalah reaksi antara suspensi eritrosit dengan kasein hidrolisat untuk  melihat  efek  ketahanan  eritrosit terhadap kemungkinan terjadinya hemolisis.  Tris-salin  sebagai  kontrol negatif  dan  Tween  80  sebagai  kontrol positif. Hasil reaksi diukur absorbansinya pada  panjang  gelombang  540  nm.    Hasil uji hemolisis ditampilkan pada Tabel 4.

## Tabel 4. Persentase hemolisis sel darah
merah
Berdasarkan  Tabel  4,  Tween  80 sebagai kontrol positif mempunyai persentase  hemolisis  tertinggi  sebesar 100%.  Tantradwitiya  (2009)  menyatakan bahwa  nilai  absorbansi  yang  tinggi mengindikasikan semakin banyaknya eritrosit  yang  mengalami  hemolisis. Hemolisis  menyebabkan  pecahnya  sel darah  merah  dan  keluarnya  hemoglobin dari membran eritrosit, sehingga
Perlakuan % Hemolisis Kasein hidrolisat 5,66 Tween 80 100 Tris salin 0
meningkatkan intensitas warna merah dan nilai  absorbansinya  semakin  tinggi.  Tris- salin  sebagai  kontrol  negatif  mempunyai persentase  hemolisis  sebesar  0%.  Hal  ini mengindikasikan  bahwa  Tris-salin  tidak menyebabkan  hemolisis  pada  sel  darah merah.
Kasein hidrolisat memiliki persentase  hemolisis  sebesar  5,66%. Persentase  hemolisis  yang  kecil  pada kasein hidrolisat bermakna tidak menyebabkan hemolisis terhadap eritrosit dan  aman  untuk  diaplikasikan  sebagai antioksidan. Hal ini berarti bahwa kasein hidrolisat  dari  susu  kambing  etawa  yang dihidrolisis  dengan  enzim  bromelin  dari daun  nanas  madu  berpotensi  untuk dikembangkan  sebagai  antioksidan  di masa  depan.  Kusumaningtyas et  al .,
(2015) dalam hasil penelitiannya menyatakan bahwa hidrolisat protein dari susu  kambing  menghasilkan  persentase hemolisis  sebesar  3,33%.  Zhu et  al . (2002)  menyatakan  bahwa  keberadaan suatu  senyawa  antioksidan  di  dalam plasma darah dapat mengurangi terjadinya proses kerusakan oksidatif pada sel darah merah.  Kekurangan  senyawa  antioksidan dalam  eritrosit  merupakan  salah  satu penyebab tingginya proses oksidasi.

## Kesimpulan
Hidrolisis  kasein  dari  protein  susu kambing  Etawa  dengan  bromelin  dari daun nanas madu pada kondisi optimumnya menghasilkan fraksi kasein hidrolisat  dengan  aktivitas  antioksidan tertinggi pada waktu hidrolisis 30 menit. Berdasarkan  nilai  AAI,  fraksi  kasein hidrolisat  tersebut  tergolong  ke  dalam antioksidan  lemah.  Hasil  uji  hemolisis menunjukkan  bahwa  fraksi  kasein hidrolisat  tidak  menyebabkan  lisis terhadap  sel  darah  merah,  sehingga potensial  untuk  dikembangkan  sebagai antioksidan.

## Daftar Pustaka
Ahn  CB,  Cho  YS,  and  Je  JY.    2015 . Purification  and  anti-inflammatory action  of  tripeptide  from  salmon pectoral  fin  by-product  protein hydrolysate. Food  Chemistry.168: 151-156.
Baharrudin NA, Halim NRA, and Sarbon NM.  2016. Effect  of  Degree  of Hydrolysis  (DH)  on  The  Functional Properties and Angiotensin I- Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Activity  of  Eel  (Monopterus  Sp) Protein  Hydrolysate .  International Food  Research  Journal  23(4):  1424- 1431.
Bezerra  VS.  2013.  Biotechnological Richness  of  The  Northeastern  Semi- Arid Region: Antioxidant Activity of Casein  Hydrolysates  from  Moxotó Goat  Milk  (Capra  Hircus  Linnaeus, 1758)  Obtained  by  Papain  Action.
Food Sci Technol 33(3): 513-520.
Bollag  DM,  Rozycki  MD,  and  Edelstein ST.  1996.  Protein  Methods  Second Edition.  John  Wiley  &  Sons.  New York. USA.
Bordbar  S,  Ebrahimpour  A.,  Hamid  AA, and Saari N. 2013. The Improvement of  The  Endogenous  Antioxidant Property  of  Stone  Fish  (Actynoyga Lecanora)  Tissue  Using  Enzymatic Proteolysis.  Biology  and  Medical Research International 9(1): 15-18.
Chalamaiah M, Jyothirmayi T, Diwan PV, and  Kumar  BD.  2015.  Antioxidant Activity and Functional Properties of Enzymatic Protein Hydrolysates from Common  Carp  (Cyprinus  Carpio) Roe (Egg). Journal Food Science and Technology 52(9): 5817-5825.
Darwis  AA  dan  Sakara  E.  1990.  Isolasi Pemurnian dan Karakterisasai Enzim.
IPB Press. Bogor
Dewi    NM.  2016.  Peptida  Antioksidatif dari  Hidrolisat  Protein  Ikan  Kayu. Skripsi.  Institut  Pertanian  Bogor. Bogor.
Hanani  E,  Munim,  A  dan  Sekarini  R. 2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam Spons Callyspongia  Sp  dari  Kepulauan
Seribu.  Majalah  Ilmu  Kefarmasian.
2(3): 127-133.
Haslaniza H, Maskat MY, Wan Aida WM, and  Mamot  S.  2010.  The  effects  of enzyme  concentration,  temperature and  incubation  time  on  nitrogen content  and  degree  of  hydrolysis  of protein  precipitate  from  cockle (Anadara  granosa)  meat  wash  water. International  Food  Research Journal. 17: 147-152.
Kahar  H.  2017.  Pengaruh  Hemolisis Terhadap  Kadar  Serum  Glutamate
Pyruvate Transaminase (SGPT) Sebagai Salah Satu Parameter Fungsi Hati. The Journal Of
Muhammadiyah  Medical Laboratory
Technologist 1(2): 38-46.
Kikuzaki  H,  and  Nobuji  N.  1993. Antioxidant  Effect  of  Some  Ginger Constituents. Food Scince. 58: 1407- 1410.
Klompong V,  Benjakul S, Kantachote D, and  Shahidi  F.  2007.  Antioxidative Activity and Functional Properties of Protein Hydrolysate of Yellow Stripe Trevally  (Selaroides  Leptolepis)  As Influenced  by  The  Degree  of Hydrolysis  and  Enzyme  Type.  Food Chemistry 102(7): 1317-1327.
Kumar  S,  Chouhan  S,  Sanghi  A,  and Teotia  UVS.  2013.  Antioxidative Effect  of  Yak  Milk  Caseinate Hydrolyzed  with  Three  Different Proteases. Vet World 6: 799-802.
Kusumaningtyas E, Widiastuti R,
Kusumaningrum  HD,  dan  Suhartono
MT.  2015.  Aktivitas  Antibakteri  dan Antioksidan Hidrolisat Hasil
Hidrolisis  Protein  Susu  Kambing dengan  Ekstrak  Kasar  Bromelin.
Jurnal Teknologi dan Industri Pangan 26(2) :179-188.
Lestari D dan Soesilo VV. 2017. Aktivitas Antibakteri  Peptida  Kasein  Susu Kambing  Hidrolisis  oleh  Papain terhadap  Pseudomonas  Aeruginosa. Jurnal  Ilmu  Pangan  dan  Hasil Pertanian 1(2): 81-92.
Li Z, Jiang A, Yue T, Wang Y, and Su, J. 2013.  Purification  and  Identification of  Five  Novel  Antioxidant  Peptidas from Goat Milk Casein Hydrolysates. J Dairy Sci. 96: 4242-4251.
Martínez  R,  Torres  P,  Meneses  MA, Figueroa JG,  Álvarez JAP,  dan and Martos VM. 2012. Chemical, technological and in vitro antioxidant properties of mango, guava, pineapple  and  passion  fruit  dietary
fibre  concentrate.  Journal  Food Chemistry. 135: 1520–1526.
Molyneux P. 2004. The Use of The Stable
Free  Radical  Diphenylpicrylhydrazil (DPPH)  for  Estimating  Antioxidant Activity. Journal Science and Technology. 26(2): 211-219.
Mora  L,  and  Toldrá  F.  2014.  Proteomic identification  of  antioxidant  peptides from  400  to  2500  da  generated  in
Spanish dry-cured ham contained in a size-exclusion chromatography
fraction. Journal Food Res. Int.56 : 68– 76.
Park  YW,  Ju´arez  M,  Ramos  M,  and Haenlein  GFW.  2007.  Physico- chemical Characteristics of Goat and Sheep Milk. Small Ruminant Res 68:
88-113.
Pasupuleti  VK  and  Demain  AL.  2010. Protein Hydrolysates in Biotechnology.  Springer  Publishing. Inggris Reynertson  KA.  2007.  Phytochemical Analysis  of  Bioactive  Constituens from Edible Myrtaceae Fruit.
Dissertatio.  The  City  University  Of
New York. New York.
Sabahelkheir MK, Faten MM, and Hassan AA. 2012. Amino  acid  composition of      human    and    animal’s  milk (camel,    cow,    sheep    and    goat). ARPN  J  Sci Technol. 2: 32-34.
Samaranayaka  AGP.2010.  Pacific  Hake (merluccius  productus)  Fish  Protein Hydrolysates  With  Antioxidative Properties.  Thesis.  Vancouver  (CA): Faculty  of  Graduate  Studies  (Food Science). University of British
Columbia. Columbia.
Scharer  R    and  Godoy  HT.  2009.
Antioxidant Activity Index (AAI) by the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl.
Method. Food Chem 112: 654-658.
Shon  MY,  Kim  TH,  and  Sung  NJ.  2003. Antioxidants and Free Radical Scavenging  Activity  of  Phenllinus baumii (Phellinus of Hymenochaetaceae)  extracts.  Food Chemistry. 82(4): 593-597.
Sila A and Bougatef A. 2016. Antioxidant Peptides  from  Marine  by-Products: Isolation, Identification and
Application  in  Food  Systems.  A Review. Journal of Functional Foods 21: 10-26.
Suhartono M T. 2008. Protease. IPB Press.
Bogor. Szwajkowska M, Wolanciuk A,
Barlowska J, Krol J, and Zygmunt L.
2011.  Bovine  Milk  Proteins  as  The Source of Bioactive Peptidas Influencing  the  Consumers  Immune
System. Anim Sci Pap Rep. 29: 269-
280.
Tantradwitiya K. 2009. Hemolisis
Eritrosit  In  Vitro  serta  Kapasitas Antioksidan Pepes Ikan Mas Riadiasi dan  Non  Iradiasi.  Skripsi.  Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Yoshida    S,  Wei  Z,  Shinmura  Y,  and Fukunaga  N.  2000.  Separation  of Lactoferrin-a  and  -b  from  Bovine Colostrum.  J  Dairy  Sci.  83:  2211- 2215.
Zhu  QY,  Holt  RR,  Lazarus  SA,  Orozco TJ,  and  Kenn  CL.  2002.  Inhibitory Effect  of  Cocoa  Flavanols  and Procyanidin  Oligomers  on  Free Radical-Induced
Erythrocyte
Hemolysis.  Experimental  Biology
Medicine. 22(5): 321-329.