## IDENTIFIKASI JENIS ANOMALI PERKEMBANGAN EMBRIONAL MIMI- MINTUNO RAKSASA (Tachypleus gigas) SELAMA PERIODE ARTIFICIAL INCUBATION DI DALAM BOTOL VIAL

## EMBRYONIC DEVELOPMENTAL ANOMALY IDENTIFICATION OF GIANT MIMI- MINTUNO (Tachupleus gigas) DURING ARTIFICIAL INCUBATION PERIOD IN THE VIAL BOTTLES

## Ciptono* dan Tri Harjana
Jurusan Pendidikan Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Yogyakarta
*email: ciptono@uny.ac.id
Diterima 4 Desember 2014, disetujui 4 Maret 2015

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengungkap  fenomena  ada/tidaknya  anomali  pada  perkembangan  awal Mimi-mintuno  raksasa  (Tachypleus  gigas)  selama  inkubasi  artifisial  (artificial  incubation)  dalam  botol  vial. Sampel telur-telur Tachypleus gigas fertil 5 butir dimasukkan ke dalam botol-botol vial transparan 50 botol dan masing-masing diisi dengan media air laut yang jernih. Tahap embrio (instar) menetas, botol-botol  diberi tanda,  kemudian  media  air  laut  dibuang  digantikan  dengan  larutan  formalin  4  %  dan  gliserin  sejumlah  5  % volume,  hingga  mencapai  volume  total  ¾  bagian  botol  vial.  Standard  tahap-tahap  perkembangan  embrional Mimi-mintuno menggunakan referensi perkembangan normal Mimi-mintuno menurut Itow (1988). Penelitian mendeskripsikan jenis anomali yang terdapat dalam perkembangan pasca menetas embrio. Hasil pengamatan didokumentasikan dalam bentuk stereo-mikrofotograf. Hasil penelitian menunjukkan terdapat bentuk-bentuk anomali  embrio:  (a).  Mengalami  keterlambatan  perkembangan,  struktur  tubuh  belum  sempurna;  (b).  Pada pengamatan  embrio  menetas,  cangkang  terbuka  dan  selaput  perivitelline  telur  sudah  membuka  namun mengalami  keterlambatan  perkembangan,  struktur  tubuh  belum  sempurna;  (c).  Embrio  setelah  menetas sempurna, struktur tubuh ada kelainan morfologik berupa tonjolan tidak normal pada bagian karapaks bagian dorsal.
Kata kunci: Tachypleus gigas,  artifisial, inkubasi

## Abstract
This study aims to reveal the phenomenon of presence / absence of anomalies in the early development of Mimi-giant mintuno (Tachypleus gigas) during artificial incubation in the vial bottles. Samples 5 eggs are fertilized  incorporated  into  transparent  50  bottles  and  vials  each  filled  with  clear  sea  water  medium. Embryonic  stages  (instars)  hatch,  bottles  marked,  then  dumped  seawater  medium  was  replaced  with  4% formalin  solution  and  glycerin  amount  of  5%  by  volume,  up  to  ¾  of  the  total  volume  of  the  vial  bottles. Standard  stages  of  giant  Mimi-mintuno  embryonic  normal  development  Mimi-mintuno  according  to  Itow (1988).  The  description  type  of  anomalies  contained  in  the  post-hatching  embryo  development.  The observations are documented in the form of stereo-microphotograph. The results showed that there are forms anomalies:  (a).  Delayed  development,  the  structure  of  the  body  is  not  perfect;  (b).  In  observation  of  the embryo  hatches,  open  shell  and  egg  perivitelline  membrane  has  been  opened  but delayed  development,  the structure  of  the  body  is  not  perfect;  (c).  Embryos  after  hatched  perfectly,  abnormalities  of  morphologic structure such as abnormal protrusion on the dorsal carapace part found.
Keywords: Tachypleus gigas, artificially, incubation

## Pendahuluan
Sampai  saat  ini  telah  ditemukan  4  spesies Horseshoe  crabs  (ketam  tapal  kuda  :  Mimi- mintuno,  Jawa.)  di  dunia,  yaitu  :  Limulus polyphemus  yang  hidup  di  pantai  timur  bagian utara benua amerika. Lainnya hidup di benua asia Tachypleus  tridentatus  dapat  ditemukan  di Jepang,  China  selatan,  Vietnam  utara  dan kepulauan  sekitar  Asia  tenggara.  Tachypleus gigas  (Mimi-mintuno  raksasa)  ditemukan  di benua  Asia  sejak  dari  Vietnam  sampai  India bagian  timur  dan  kepulauan  di  wilayah  Asia tenggara. Sementara itu Tachypleus (Carcinoscorpius)  rutondicauda  dapat  ditemukan di  beberapa  wilayah  benua  Asia  sejak  dari  China selatan  sampai  India  bagian  timur  dan  Asia tenggara.  Species-species  asian  tadi  dapat ditemukan  di  zona  Asia  timur,  kecuali  di  Jepang [1].
Nenek  moyang  keempat  species  tersebut  di atas  rupa-rupanya  sama,  yaitu  Mesolimulus walchi  yang  fosilnya  ditemukan  di  Eropa  dan menunjuk  era  keberadaannya  sekitar  200  juta tahun  yang  lalu  [1].  Meskipun  saat  ini  hanya ditemukan  4  spesies  horseshoe  crabs  di  dunia, namun  dahulu  sebenarnya  terdapat  lebih  banyak lagi spesies. Seperti di Australia dapat ditemukan species  Horseshoe  crabs  yang  habitatnya  air tawar, tidak seperti pada umumnya yang hidup di perairan payau atau air laut sepenuhnya [2,3].
Lebih lanjut disebutkan juga bahwa Horseshoe  crabs    yang  ada  sekarang  ini  secara langsung  diturunkan  dari  Trilobita  (Subphylum Trilobitomorpha)  yang  berevolusi  lanjut  ke Subphylum Chelicerata, suatu Arthopoda (Phylum  :  Arthropoda)  primitif  yang  hidup  pada era Palaeozoic lebih dari 500 juta tahun yang lalu. Baik  Trilobita  dan  Scorpions  laut,  keduanya berkembang bersama sampai pada masa kepunahannya  pada  era  Paleozoic.  Hanya Horseshoe  crabs  (Subphylum  :  Chelicerata)  saja yang masih dapat bertahan keberadaannya sampai sekarang ini [4,5].
Perkembangan  normal  embrio  Limulus polyphemus pascafertilisasi hingga tahap premoulting  dapat  dibagi  menjadi  stadium  1 sampai  stadium  18.  Sampai  dengan  tahap  ini untuk  habitat  asli  di  daerah  subtropik  dapat dicapai  hingga  minggu  pertama  inkubasi  [6]. Sementara itu menurut Sekiguchi [7], perkembangan  embrio  untuk  species  yang  lain (Tachypleus  tridentatus),  tahapan  premoulting pada  inkubasi  normal  di  habitat  alami  yang
beriklim subtropik  dapat dicapai dalam waktu 23 hari.
Badan  Konservasi  Sumber  Daya  Alam (BKSDA)  telah  menetapkan  bahwa  hewan  ini termasuk  yang  dilindungi  oleh  undang-undang konservasi.  Hewan  ini  di  Indonesia  lebih  dikenal dengan nama Mimi-mintuno, yang selalu dikaitkan  dengan  budaya  Jawa,  dalam  hal  ini adalah sebagai simbol kesetiaan terhadap pasangan  hidup.  Perilaku  reproduksi  hewan  ini amat menarik, karena pasangan hewan jantan dan betina  selalu  terlihat  bersama-sama  di  habitatnya selama  masa  reproduksi  [8].  Lama  periode inkubasi  secara  artisial  di  dalam  botol  vial  untuk embrio Mimi-mintuno raksasa (Tachypleus gigas) diamati  secara  eksploratif  dalam  penelitian  ini, karena  data  yang  ada  selama  ini  bersumber  dari penelitian di daerah subtropik [9].
Upaya untuk mengungkap fenomena tersebut,  maka  peneliti  ingin  melihat  sisi perkembangan awal Mimi-mintuno raksasa (Tachypleus  gigas)  pada  periode  perkembangan telur selama inkubasi artifisial (artificial incubation) dalam botol vial, yang memungkinkan  dapat  diikuti  tahap-tahapnya secara rinci. Penelitian ini dilakukan pada kondisi normal  di  laboratorium  daerah  tropik,  yaitu diamati  ada/tidaknya  anomali  perkembangan embrio  dalam  keadaan  apa  adanya  tanpa perlakuan yang mengubah pola perkem- bangannya. Pengamatan di laboratori-um Zoologi, Jurusan Pendidikan Biologi  FMIPA UNY.
Berdasarkan latar belakang di atas, permasalahan    yang  dapat    dirumuskan  dalam penelitian  ini  adalah  jenis  anomali  apa  saja  yang terdapat dalam perkembangan awal embrio Mimi- mintuno  raksasa  (Tachypleus  gigas)  selama periode artifial incubation di dalam botol vial.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk    mengetahui lebih  rinci  jenis  anomali  apa  saja  yang  terdapat dalam perkembangan awal embrio Mimi-mintuno raksasa (Tachypleus gigas) selama periode artifial incubation di dalam botol vial.
Hasil Penelitian diharapkan dapat memberikan  gambaran  jelas  dan  rinci  jenis anomali apa saja yang terdapat dalam perkembangan awal embrio Mimi-mintuno raksasa (Tachypleus gigas) selama periode artifial incubation di dalam botol vial. Pendokumentasian  anomali  dilakukan  pada  tahap akhir embrionalnya, dalam hal ini ditandai dengan anakan  mulai  menetas  (hatching)  keluar  dari selaput telur.

## Metode Penelitian
Populasi  dalam  penelitian  ini  adalah  telur- telur  fertil  Mimi-mintuno  raksasa  (Tachypleus gigas)    yang  diambil  dari  induk  dewasa  dari habitat  aslinya.  Sampel  dalam  penelitian  ini  200 butir  telur  Mimi-mintuno  raksasa  (Tachypleus gigas)  yang  telah  difertilisasi  secara  in  vitro diharapkan  berkembang  lebih  lanjut  menjadi embrio dalam botol-botol vial. Media pemeliharaan  embrio  adalah  air  laut  habitat  asli. Pemeliharaan  dilakukan  inkubasi  secara  artifisial hingga  mencapai  tahap  akhir  embrional.  Bahan penelitian  menggunakan  air  laut  yang  jernih  dari habitat  aslinya,  formalin  4  %  dan  gliserin  5% volume.
Penelitian  ini  bersifat  eksploratif  deskriptif, sehingga  tidak  ada  perlakuan  terhadap  bahan penelitian.  Perkembangan  embrio  Mimi-mintuno raksasa  (Tachypleus  gigas)  diikuti  dalam  pola perkembangan  yang  apa  adanya  dan  tahap-tahap perkembang-annya didokumentasikan dalam bentuk  stereo-mikrofotograf.  Status  perkem- bangan  dideskripsikan  dengan  standard  deskripsi perkembangan  Horseshoe  crabs  menurut  Itow [3], sebagai berikut :
- Telur-telur  fertil  disiapkan  mulai  jam  ke  0 (nol).  Telur-telur  matang  gonad  diambil  dari induk betina Mimi-mintuno raksasa (Tachypleus  gigas),  kemudian  dilakukan fertilisasi secara in vitro dengan sperma yang diambil dari pejantan dewasa.
- Penginkubasian  di  dalam  nampan  plastik yang berisi media air laut jernih
- Observasi  viabilitas  telur  yang  benar-benar fertil.  Telur  yang  fertil  dan  dapat  berlanjut perkembangannya  ditandai  dengan  tidak adanya  perubahan  pigmentasi  telurnya.  Telur yang  tidak  terbuahi  akan  tampak  lebih  putih daripada keadaan normal/fertil
- Telur-telur  fertil  diambil  masing-masing  5 butir  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  botol- botol  vial  transparan.  Jumlah  botol  yang disediakan  sejumlah  50  botol  dan  masing- masing diisi dengan media air laut yang jernih
- Setelah  sampai  pada  tahap  perkembangan menetas, botol pertama diberi tanda, kemudian  media  air  laut  dibuang  digantikan dengan  larutan  fiksatif  berupa  formalin  4  % dan  gliserin  sejumlah  5  %  volume,  hingga mencapai volume total ¾ bagian botol
- Perlakukan  pada  botol-botol  ke  dua  dan seterusnya dengan prosedur yang sama seperti langkah  sebelumnya,  sehingga  nantinya
didapatkan  sampel-sampel  perkembangan embrio  menetas  yang  diinkubasi  secara artifisial dalam botol vial.
- Standard tahap-tahap perkembangan embrional Mimi-mintuno raksasa (Tachypleus gigas)  di  sini  adalah  dengan  menggunakan referensi dari  standard  perkembangan  normal Mimi-mintuno.
- Orientasi  fokus  pengamatan  dalam  penelitian ini  adalah  mendeskrepsikan  jenis  anomali yang terdapat di antara perkembangan normal embrio.
- Hasil  pengamatan  didokumentasikan  dalam bentuk stereo-mikrofotograf
Data  yang  diperoleh  dari  penelitian  ini berupa data kualitatif-deskriptif. Deskripsi anomali  berdasar  pada  dokumentasi  foto  stereo- mikrofotograf  embrio  Mimi-mintuno  raksasa (Tachypleus gigas) tahap menetas.

## Hasil dan Pembahasan
Identifikasi adanya anomali dilakukan dengan pengamatan morfologik pada perkembangan  pasca  embrio,  yaitu  setelah  instar menetas (pada hari inkubasi ke 69 – 84). Kondisi perkembangan  dengan  beberapa  anomali  dapat dilihat di bawah ini :
1. Embrio mengalami
keterlambatan perkembangan, struktur tubuh belum sempurna  (Gambar  1).  Status  perkembangan embrio  pada  waktu  yang  seharusnya  telah menetas  semestinya  sudah  memperlihatkan kelengkapan  struktur  anakan  Mimi-Mintuno muda yang sempurna. Pada hasil pengamatan, ditemukan  status  perkembangan  yang  masih terlalu  dini  untuk  kesiapan  menetas,  dan  ini terjadi  karena    keterlambatan  perkembangan embrio.
2. Embrio menetas, selaput telur sudah membuka  namun  mengalami  keter-lambatan perkembangan, struktur tubuh belum sempurna. Status perkembangan embrio pada waktu  yang  seharusnya  telah  menetas semestinya sudah memperlihatkan kelengkapan  struktur  anakan  Mimi-Mintuno muda yang sempurna. Pada hasil pengamatan, ditemukan status perkembangan masih terlalu dini  untuk  kesiapan  menetas,  meskipun membran  vitellina  pembungkus  embrio  telah terlarut  sehingga  embrio  terbuka,  dan  ini dimungkinkan  oleh  adanya  keterlambatan perkembangan embrio (Gambar 2).
A B
Gambar 1. Morfologi embrio pada hari ke 69, embrio belum menetas. Tampak terjadi keterlambatan perkembangan dengan ditandai masih bertahannya selaput atau membran perivitellina telur. Gambaran struktur tubuh belum sempurna. (A. Tampak Dorsal, B. Tam-pak Ventral. Skala garis = 1mm)
A

## B
Gambar 2. Morfologi embrio pada hari ke 76, embrio belum menetas. Tampak terjadi keterlambatan perkembangan ditandai  dengan struktur tubuh yang belum sempurna bentukannya pada usia inkubasi ini. Selaput atau membran perivitellina telur sudah larut atau terlepas ke media air inkubasi. (A. Tampak Dorsal, B. Tampak Ventral. Skala garis = 1mm)

## A

## B
Gambar 3. Morfologi embrio pada hari ke 84, embrio sudah menetas. Tampak selaput atau membran perivitellina telur sudah terbuka sepenuhnya. Gambaran struktur tubuh sudah sempurna, namun terdapat anomali pada bagian dorsal karapaks yaitu berupa tonjolan abnormal. (A. Tampak Dorsal, B. Tampak Ventral. Skala garis = 1mm)
3. Embrio  menetas,  struktur  tubuh  ada  kelainan morfologik. Terdapat tonjolan  abnormal pada bagian dorsal karapaks (Gambar 3).
Adanya anomali morfologik maupun struktur internal  embrio  (instar)  sangat  menentukan kelolos-hidupan  pada saat nantinya akan menjadi anakan  Mimi-mintuno  muda.  Perkembangan dalam  keadaan  tanpa  perlakuan  dengan  zat-zat yang  mempengaruhi  perkembangan  embrio  pun ternyata  memungkinkan  terjadinya  anomali  pada kasus-kasus tertentu seperti pada paparan di atas. Anomali  dapat  terjadi  oleh  adanya  kualitas perairan,  salinitas,  kandungan  logam  berat, terutama  Cu  dan  Zn  dan  sebagainya.  Kelolos- hidupan  pasca  menetas  sangat  ditentukan  oleh kualitas perkembangan tahap embrional sebelumnya,  sehingga  kemampuan  hidup  anakan muda  Mimi-mintuno  berikutnya  akan  sangat dipengaruhi [10].
Pengaruh jangka pendek dan jangka panjang dari tembaga (Cu) dan seng (Zn) pada embrio dan larva instar pertama Limulus polyphemus dari dua muara  sungai  di  New  Jersey,  Delaware  Bay  dan Sandy  Hook  Bay  yang  terkena  konsentrasi  dari 0,01  sampai  1.000  mg/L  selama  24  jam,  48  jam, 72  jam,  menunjukkan  toleransi  yang  lebih  besar dari  Cu  dan  Zn  dari  embrio.  Embrio  dan  larva mampu bertahan hingga konsentrasi 100 mg/L Cu atau  Zn.  Kemampuan  embrio  dan  larva  untuk bertahan  hidup  dengan  logam  berat  menyiratkan potensi  kontaminan  ini  untuk  diteruskan  kepada organisme  tertentu    seperti  burung  pantai  dan predator lainnya [11].
Anomali  yang  diidentifikasi  antara  lain terdapat individu-individu yang mengalami retardasi  perkembangan,  ditandai  status  stadium perkembangan  yang  sudah  seharusnya  menetas namun  pada  instar  yang  bersangkutan  belum kelihatan  tanda-tanda  akan  menetas.  Menetas dalam  hal  ini  ditandai  dengan  mulai  pecahnya selaput transparan telur (peri vitellina) dan keluar instar  kecil  yang  telah  lengkap  morfologinya. Anomali  diamati  pada  tahap  akhir  inkubasi hingga tanda-tanda menetas muncul.
Seperti  yang  dikemukakan  oleh  Itow  [12], bahwa  kelainan  perkembangan  pada  embrio Mimi-mintuno  bisa  disebabkan  oleh  paparan logam  berat.  Embrio  pada  tahapan  yang  berbeda terkena  baik  terus  menerus  atau  selama  24  jam menyebabkan  terjadinya  kelainan  termasuk  cacat segmen  struktur  tubuh  embrio,  embrio  ganda,
embrio  dengan  perkembangan  daerah  mata  tidak normal,  dan  tidak  ada  mata  posterior  embrio. Dalam  hal  kemampuan  untuk  mempengaruhi perkembangan,  peringkat  pengaruhnya  adalah sebagai berikut: Hg > Organotin > Cr > Cd > Cu > Pb > Zn.
Bentuk  anomali  yang  lain  tidak  ditemukan dalam  penelitian,  namun  menurut  Chen  [13] disebutkan  bahwa  anomali  dapat  berupa  telson yang  spiral  atau  pendek,  cekung  parsial  bagian batas tepi prosoma, dan degradasi pada salah satu mata.  Anomali  yang  teramati  pada  penelitian  ini tidak  dapat  dikaitkan  dengan  adanya  mutasi genetik  atau  penyakit,  karena  semua  gejala  yang diamati  hanya  dalam  masa  perkembangan  tahap instar.
Salinitas  air  laut  berpengaruh  terhadap pertumbuhan  Tachypleus  gigas,  pada  salinitas  40 permil  terjadi  pertumbuhan  yang  lebih  tinggi (P>0,05),  namun  tidak  mempengaruhi  terjadinya anomali struktur tubuh embrio [14]. Sementara itu menurut  Faizul  [15]  disebutkan  bahwa  pengairan dengan  salinitas  23  -  25%  dan  pemeliharaan dalam  pasir  basah  tertentu  terhadap  induk Tachypleus  gigas  berpengaruh  terhadap  besar telur  yang  dihasilkan    induk-induk    betina (P<0,05).

## Simpulan
Bentuk-bentuk  anomali  embrio  Tachypleus gigas  selama  inkubasi  secara  artificial  dalam botol  vial  di  antaranya  mengalami  keterlambatan perkembangan,  struktur  tubuh  belum  sempurna. Embrio  ada  yang  sudah  menetas,  cangkang terbuka  dan  selaput  perivitelline  telur  juga  sudah membuka  namun  mengalami  keterlambatan perkembangan,  struktur  tubuh  belum  sempurna. Ada  embrio  yang  sudah  menetas  sempurna, struktur tubuh memiliki kelainan morfologik yaitu terdapat  tonjolan  tidak  normal  pada  bagian karapaks bagian dorsal.

## Ucapan Terima Kasih
Peneliti  pada  kesempatan  ini  mengucapkan terimakasih  dan  penghargaan  yang  sebesar- besarnya kepada segenap jajaran Dekanat FMIPA UNY  dan  pihak  penyandang  dana  DIPA  UNY Tahun  2014,  atas  segenap  upayanya  sehingga penelitian  ini  dapat  terdanai.  Harapan  peneliti semoga  penelitian  ini  hasilnya  dapat  bermanfaat bagi kita sekalian.

## Pustaka
[1]. Botton  ML,  Johnson  K,  Helleby  L.  (1998). Effects  of  copper  and  zinc  on  embryos  and larvae  of  the  horseshoe  crab,  Limulus polyphemus. Arch  Environ  Contam  Toxicol.
1998 Jul;35(1):25-32.
[2]. Chatterji  A.,  S.  Kotnala  and  R.  Mathew. (2004). Effect of salinity on larval growth of horseshoe  crab,  Tachypleus  gigas  (Müller), Current  Science,  Vol.  87,  No.  2,  25  July 2004.
[3]. Chen, Yan, C. W. Lau, S. G. Cheung, C. H. Ke,  Paul  K.  S.  Shin.  (2010).  Enhanced growth  of  juvenile  Tachypleus  tridentatus
(Chelicerata: Xiphosura) in the laboratory: a step  towards  population  restocking  for conservation  of  the  species.  AQUATIC BIOLOGY.  Published  online  November  10.
Vol. 11: 37–46, 2010.
[4]. Ciptono  (2006).  Identifikasi  Tahap-tahap Embrional  Premoulting  ‘Horse-shoe  Crab’ (Limulus polyphemus) Menurut Pola
Perkembangan  Normal.  Laporan  Penelitian.
FMIPA UNY.
[5]. Faizul  M.I.M.,  M.M.  Faizal,  A.  Christianus and  S.M.N.  Amin.  (2013).  Incubation  and Hatching of Tachypleus gigas (Muller, 1785)
Eggs  in  Sand  and  Water  Media.  Asian Journal of Animal and Veterinary Advances, 8:333-340.
http://scialert.net/abstract/?doi=ajava.2013.3
33. 340
[6]. Itow, T. (1986). Inhibitors of DNA synthesis change  the  diferentiation  of  body  segments and  increase  the  segment  number  of horseshoe crab embryos (Chelicerata,
Arthropoda).  Roux’s  Arch.  Dev.  Biol.  195  :
323-333.
[7]. ----------. (1988). Biology of horseshoe crabs. Treatments  with  chemical  reagents.  Edited by  Sekiguchi,  K.  Science  House  Co.,  Ltd.
Tokyo.
[8]. ----------.  (1997).  The  pollution  of  coastal waters  and  malformations  of  horseshoe  crab
embryos.  Natural  Sciences  Series  No.  48. Shizuoka Univ. Press.
[9]. Itow,  T.,  Kenmochi,  S.,  and  Mochizuki. (1991).  Induction  of  secondary  embryos  by intra  and  interspecific  grafts  of  center  cells under  the  blastopore  in  horseshoe  crabs.
Develop. Growth & Differ., 33 (3). 251-258.
[10]. Itow,  T.,  Nozawa,  S.,  Igarashi,  T.,  and Okamura, M. (1996). Embryonic center cells of  Arthropoda  induce  secondary  embryos  in Vertebrata.  Natural  Sciences  Series  No.  47. Shizuoka Univ. Press.
[11]. Itow  T  ,  Loveland  RE,  Botton  ML.  (1998). Developmental  abnormalities  in  horseshoe crab  embryos  caused  by  exposure  to  heavy metals. Arch Environ Contam Toxicol. 1998
Jul;35(1):33-40.
[12]. Itow,  T.,  Igarashi,  T.,  Botton,  M.L.,  and Loveland, R.E. (1998). Heavy  metals inhibit limb  regeneration  in  horseshoe  crab  larvae. Arch.  Environ.  Contam.  Toxicol.  35  :  457- 463.
[13]. Itow,  T.,  Kato,  H.,  and  Kato,  K.  (2003). Horseshoe  crabs  in  Australia.  Natural Sciences  Series  No.  53.  Shizuoka  Univ.
Press.
[14]. Laurie, Kevin., (2013). Understanding Horseshoe  Crab  Palaeoecology.  Fossil  CSI. Thursday,  January  3,  2013.  City  University, Hongkong.
[15]. Pechenik,  JA.  (2010).  Biology  of  the Invertebrates.  Sixth  Edition.  Mc-Graw  Hill Higher Education,  New York
[16]. Sekiguchi,  K. (1973).  A  normal  plate  of the development of the Japanese horseshoe crab :  Tachypleus  tridentatus.  Sci.  Rep.  Tokyo Kyoiku Daigaku, B. Vol 15 (229) : 152-162 .