2023 Jurnal Bahana Kesehatan Masyarakat (Bahana of Journal Public Health) Vol 7 No 2 p-ISSN: 2580-0590/ e-ISSN: 2621-380X doi: https://doi.org/10.35910/jbkm.v6i1.537

## POTENSI AKTIVITAS ANTIBAKTERI KOMBINASI EKSTRAK DAUN SIRIH HIJAU, SIRIH MERAH DAN SIRIH HITAM TERHADAP BAKTERI Propionibacterium acne
Irvan Herdiana 1* ,  Ayu Nala El Muna Haerussana 1 ,  Nizella Syahla 1 , Neneng Melawati 1 , Siti Nurfitri Diniyati 1
1 Poltekkes Kemenkes Bandung
*Korespondensi penulis: irvanherdiana_farmasi@staff.poltekkesbandung.ac.id

## ABSTRAK
Latar  belakang: Jerawat  atau acne  vulgaris merupakan  suatu  gangguan  inflamasi  yang  berasal  dari folikel  pilosebasea.  Bakteri  pemicunya  yaitu Propionibacterium  acnes, yang  sering  muncul  pada  masa remaja.  Kondisi  ini  berupa  gangguan  kulit  yang  sangat  umum  hadir  dengan  lesi  inflamasi  dan  non- inflamasi  terutama  di  bagian  wajah,  akan  tetapi  dapat  terjadi  pada  bagian  tubuh  lainnya  seperti  lengan atas dan punggung 1 . Ekstrak etanol terpurifikasi daun sirih hijau konsentrasi 20mg/mL memiliki aktivitas antibakteri  terhadap Propionibacterium  acnes dengan  kategori  sangat  kuat 2. Penelitian  lain  pada  daun sirih merah terbukti memiliki aktivitas antibakteri Propionibacterium acnes konsentrasi 10%, 15%, 20% dan  25% 2 .  Varietas  sirih  selanjutnya  yaitu  daun  sirih  hitam  memiliki  manfaat  sebagai  antibakteri Propionibacterium acnes pada konsentrasi 5%, dan zona hambat yang kuat pada konsentrasi 10% 3 . Metode: Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental. Sampel dari penelitian ini berupa daun sirih hijau,  sirih  merah  dan  sirih  hitam.  Sampel  berupa  tanaman  segar  yang  telah  disortasi,  kemudian dikeringkan dengan cara diangin-angin. Selanjutnya dilakukan ekstraksi dengan metode maserasi selama 3  x  24  jam  menggunakan  etanol  96%  dengan  pergantian  pelarut  tiap    24  jam  untuk  masing-masing varietas daun sirih. Hasil ekstraksi diuapkan pelarutnya sampai menjadi ekstrak kental. Skrining fitokimia dilakukan  untuk  identifikasi  golongan  senyawa  saja  yang  terekstraksi.  Pengujian  antibakteri menggunakan metode Disk diffusion dengan konsentrasi 5%, 10% dan 15% untuk masing-masing ekstrak dan kombinasi ekstrak dengan perbandingan (1:1) . Hasil: Hasil  skrining  menunjukan  ekstrak  etanol  96%  daun  sirih  hijau  ( Piper  betl e  L.)  dan  sirih  merah ( Piper crocatum ) positif senyawa metabolit sekunder alkaloid, terpenoid, steroid, tannin, dan flavonoid. Ekstrak  daun  sirih  hitam  ( Piper  betle  L.  var  nigra )  positif  terdapat  senyawa  positif  alkaloid,  terpenoid, steroid,  tannin,  saponin  dan  flavonoid.  Hasil  uji  antibakteri Propionibacterium  acnes menunjukan  rata- rata  zona  hambat  kontrol  positif  disk  antibiotik  clindamisin  8,67  mm  kategori  kuat,  sedangkan  untuk ekstrak  konsentrasi  15%  sirih  hijau  yaitu  8,69  mm  kategori  kuat,  sirih  merah  2,71  mm  kategori  lemah, sirih  hitam  1,8  mm  kategori  lemah,  kombinasi  sirih  hijau-merah  5,77  mm  kategori  sedang,  sirih  hijau- hitam 4,77 mm kategori sedang dan sirih hitam-merah 1,89 kategori lemah.  Uji normalitas, data normal dengan nilai p>0,05 dan Uji non parametrik Kruskall-Wallis  hasil nilai asym sip yaitu 0,0000 (p<0,05) terdapat perbedaan zona hambat yang signifikan antara dua kelompok sampel.
Kesimpulan: Nilai  terbesar  rata-rata  zona  hambat  terjadi  pada  ekstrak  sirih  hijau  konsentrasi  15% dengan zona hambat 8,69 mm.
Kata Kunci: Kombinasi ekstrak, sirih merah, sirih hijau, sirih hitam, Propionibacterium acne

## POTENTIAL ANTIBACTERIAL ACTIVITY COMBINATION OF GREEN LEAF EXTRACT, RED AND BLACK WARTS AGAINST THE BACTERIA Propionibacterium acne

## ABSTRACT
Background: Acne or acne vulgaris an inflammatory disorder derived from the follicle pilosebasea. The trigger bacteria is Propionibacterium acne., which often appears in adolescence. This condition is a very common skin disorder present with inflammatory and non-inflammatory lesions especially in the face, but it can happen in other parts of the body like the upper arm and the back. Purified ethanol extracts of betel green betel leaf concentration 20mg / ml has very strong antibacterial activity against Propiobacterium
acne.  Another  study  on  the  red  betel  leaf  proved  to  have  a  Propionibacterium  acne  activity  of concentration  10  %,  15  %,  20  %  and  25  %.  The  next  betel  variety  is  that  the  black  betel  leaf  has  its benefits as the Propionibacterium acne antibacterium concentration 5 %, and strong activity zones at 10 % concentrations.
Method: This research is experimental. Samples from this study are betel leaf green, Red betel and black betel. Samples of a fresh, domesticated plant, And then dried up in the wind. Next, there's an extraction of three-by-four-hour  masseration  methods  with  an  hour-to-hour  solvent  change  for  each  variety  of  betel leaf.  The  extraction  results  are  applied  to  the  solvent  until  it  becomes  a  thick  extract.  Phytochemical screening is done to ensure any group of compounds extracted .Antibacterial testing using diffusion disk methods  with  concentration  5  %,  10  %  and  15  %  for  each  extract  and  extract  combination  with comparison (1: 1 ).
Result: Screening results show an extract of ethanol 96 % green betel leaves (Piper betle L) and red betel (Piper  crocatum  )  positive  alkaloid  secondary  metabolic  compound,  terpenoid,  steroids,  tannin,  and flavonoids. Extract black betel leaf (Piper betle L. Var nigra ) positive is an alkaloid positive, terpenoid, steroids,  tannin,  saponin  and  flavonoid  compound.  Antibacterium  Propionibacterium  acne  test  results show the average positive control zone disk antibiotics clindamisin 8.67 mm strong categories, while for extracting concentration 15 % betel green is 8.69 mm strong category, Red betel 2.71 mm weak category, black  betel  1.8  mm  weak  category,  577  mm  medium  red-green  betel  combination,  477  mm  black-green betel.  medium  category  and  red-black  betel  of  1.89  weak  categories.  Normality  test  with  result  p>0,05 and  the  non  parametric  test  of  krkskall-wallis  results  asym  sip  values  are  0,0000  (p<0,05)  there  is  a significant difference between two group samples.
Conclusion: The largest average value of the clear zone occurs on a concentration of 15 % green betel extract with 8.69 mm.
Key words: Extract combination, Red betel, Betel-green, Black betel, Propionibacterium acne

## PENDAHULUAN
Jerawat atau acne vulgaris merupakan  suatu  gangguan  inflamasi yang  berasal  dari  folikel  pilosebasea. Bakteri pemicunya
yaitu
Propionibacterium  acnes, yang  sering muncul  pada  masa  remaja.  Kondisi  ini berupa  gangguan  kulit  yang  sangat umum  hadir  dengan  lesi  inflamasi  dan non-inflamasi terutama di bagian wajah, akan  tetapi  dapat  terjadi  pada  bagian tubuh  lainnya  seperti  lengan  atas  dan punggung 1 .  Bakteri  ini  juga  berperan pada  proses  kemotaktik  inflamasi  dan pembentukan  enzim  lipolitik  pengubah fraksi  sebum  menjadi  massa  padat, sehingga  menyebabkan  penyumbatan pada saluran kelenjar sebasea 5 . Suatu  tanaman  memiliki  berbagai jenis  kandungan  kimia  baik  komponen senyawa aktif yang  menghasilkan  efek  terapi (metabolit  sekunder)  maupun  senyawa sedikit  atau  tidak  menghasilkan  efek terapi  (Metabolit  sekunder)  seperti karbohidrat, lemak dan protein 6 . Namun
dalam  sistem  pengobatan  tradisional, efek  sinergis  dari  semua  kandungan senyawa pada tanaman dapat memberikan efek terapetik yang maksimal 7 .  Sheikh  et  all.,  menyatakan bahwa  penggunaan  ekstrak  tumbuhan yang  memiliki  aktivitas  antimikroba sangat membantu dalam penyembuhan 5 . Salah  satu  tanaman  yang  memiliki kemampuan  sebagai  antibakteri  adalah Sirih  hijau  ( Piper  betle L.) 8 .  Ekstrak etanol terpurifikasi daun sirih hijau pada konsentrasi 20mg/mL memiliki aktivitas antibakteri terhadap Propionibacterium acnes
dengan kategori sangat kuat 2 .
Salah  satu  varietas  daun  sirih  lain yang  banyak  digunakan  saat  ini  yaitu daun  sirih  merah.  Daun  sirih  merah mengandung  senyawa  kimia  seperti alkaloid,  flavonoid,  tanin,  dan  minyak atsiri  yang  diduga  berpotensi  sebagai daya  antimikroban 9 .  Hasil  penelitian menyebutkan daun sirih merah memiliki aktivitas antibakteri terhadap Propionibacterium acnes pada
konsentrasi  10%,  15%,  20%  dan  25% 3 .
Varietas  sirih  selanjutnya  yaitu  daun sirih  hitam,  mengandung  senyawa alkaloid,  flavanoid,  tannin,  saponin, fenol,  steroid,  dan  triterpenoid.  Aroma khas  yang  terdapat  pada  daun  sirih hitam  disebabkan  adanya  kandungan kavikol  yang  merupakan  senyawa turunan  dari  fenol.  Daun  Sirih  Hitam memiliki  manfaat  salah  satunya  yaitu sebagai  antibakteri  karena  kandungan flavonoid,  saponin,  dan  tannin.  Zona terhadap
Propionibacterium acnes terbentuk  pada  konsentrasi  5%,  dan zona hambat yang kuat pada konsentrasi 10% 4 .
Dari  data  penelitian  uji  antibakteri ekstrak sirih hijau, sirih merah dan sirih hitam  tersebut,  hasilnya  menunjukan adanya  potensi  daya  hambat  terhadap bakteri Propionibacterium
acnes.
Pengembangan dilakukan pada penelitian  ini  dengan  menggunakan  2 (dua)  kombinasi  ekstrak  antar  varietas tanaman sirih dalam pengujian antibakteri. Kombinasi ekstrak dilakukan untuk memperkecil penggunaan jumlah ekstrak yang disebabkan  efek  sinergis  tiap  ekstrak. Pelarut  yang  dipakai  untuk  ekstraksi masing-masing  daun  sirih  disamakan yaitu menggunakan etanol 96%.

## METODE
Penelitian  ini  merupakan  penelitian eksperimental.  Sampel  dari  penelitian ini berupa daun sirih  hijau, sirih merah dan sirih hitam. Sampel berupa tanaman segar  yang  telah  disortasi,  kemudian dikeringkan  dengan  cara  diangin-angin pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan ekstraksi  dengan  pelarut  etanol  96% metode  maserasi  selama  3  x  24  jam dengan  pergantian  pelarut  tiap  24  jam untuk  masing-masing  varietas  daun sirih.
Hasil ekstraksi diuapkan pelarutnya dengan rotary vacuum evaporator  dan  diuapkan  kembali  di waterbath  sampai  menjadi  ekstrak
kental.  Skrining  fitokimia  dilakukan untuk  memastikan  golongan  senyawa apa saja yang terdapat pada ekstrak.
Pengujian  antibakteri  menggunakan
metode Disk  diffusion .  Tahapannya dimulai dari peremajaan bakteri
Propionibacterium  acnes ,  pembuatan susupensi  bakteri  Mcfarland  0,5  yang setara dengan jumlah perkiraan suspensi bakteri  yaitu  1,5  x  108  CFU/ml.  Media yang  digunakan  yaitu  Muller  Hinton Agar  (MHA)  dan  kemudian  dilakukan uji  aktivias  antibakteri  dengan  difusi cakram. Kontrol negatifnya yaitu DMSO 10%, kontrol positifnya klindamisin  (1  mg/5  mL).  dilakukan pengujian ekstrak tunggal dan kombinasi  untuk  tiap  2  ekstrak  dan dipakai  perbandingannya  (1  :  1)  untuk masing-masing  kelompok  uji  pada beberapa konsentrasi dengan menggunakan kertas cakram berdiameter 6 mm.
Semua  alat  dan  dalam  tahapan  ini dilakukan  proses  sterilisasi  terlebih dahulu.Data yang diperoleh berupa data numerik  dari  beberapa  pengujian  pada ekstrak  seperti;  rendemen  dan  uji  mutu ekstrak.  Sedangkan  untuk  uji daya antibakteri  dihitung  dari  zona  bening yang  terbentuk  di  kisaran  disk  berupa diameter  menggunakan  jangka  sorong
(mm) . dan  dicari  standar  deviasi  dari masing-masing kontrol.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tahapan pengeringan simplisia dilakukan  dengan hasil simplisia kering yang  didapatkan  yaitu:  Sirih  merah 23,73%,  sirih  merah  21,66%  dan  sirih hitam  25,6%.  Pengeringan  sendiri dilakukan dengan tujuan untuk memperkecil  kandungan  air  di  dalam daun  basah.  Tingginya  kadar  air  akan menyebabkan  pertumbuhan  mikroba sehingga  bahan  akan  mudah  rusak. Selain  itu  kecilnya  kadar  air  akan mengurangi  proses  enzimatis  yang
dapat menyebabkan proses metabolisme tetap  berjalan,  sehingga  komponen senyawa-seyawa  metabolit  sekunder yang  mempunyai  aktivitas  dapat  terurai ataupun  tersubtitusi  menjadi  senyawa yang tidak aktif.
Hasil rendemen menunjukan ekstrak sirih  hijau  8.20%,  sirih  merah  17.91% dan  sirih  hitam  14.09%.  Rendemen ekstrak menggambarkan jumlah senyawa yang dapat tersari oleh pelarut, semakin besar rendemennya menunjukan  kesesuaian  pelarut  dengan senyawa  yang  ada    pada  daun  sirih. Hasil uji skrining fitokimia menunjukan bahwa ekstrak daun sirih hijau dan sirih merah  memiliki  hasil  yang  sama, sedangkan pada sirih hitam hasil positif saponin  menjadi  pembeda.  Hasil  dapat dilihat pada table 1.
Tabel 1.  Hasil Pengujian Skrining Fitokimia Ekstrak Daun Sirih No Golongan Senyawa Ekstrak Daun Sirih Hijau Ekstrak Daun Sirih Merah Ekstrak Daun Sirih Hitam 1 Alkaloid + + +
2 Tanin + + +
3 Flavonoid + + +
4 Steroid + + +
5 Terpenoid +
+ +
6 Saponin - - +
Keterangan : + : Ada,
- : Tidak ada Hasil tersebut sama dengan penelitiannya  nureza,.  Tahun  2022 terkait  hasil  skrining  fitokimia  dari berbagai  tanaman  sirih 10 .  Skrining fitokimia  dilakukan  untuk  melihat golongan-golongan senyawa yang
terdapat pada ekstrak. Beberapa golongan senyawa memiliki kemampuan  sebagai  antibakteri  seperti pada golongan tannin yang aktivitasnya disebabkan oleh adanya gugus fenol.
Metode  difusi  cakram  digunakan untuk menentukan aktivitas agen antimikroba.  Disk    yang  berisi  agen antimikroba  diletakkan  pada  media MHA yang telah
ditanami mikroorganisme  yang  akan  berdifusi
pada  media  tersebut.  Area  jernih mengidentifikasikan  adanya  hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba  pada  permukaan  media 11 . Hasil  ativitas  daya  hambat  antibakteri Propionibacterium  acnes dengan  3 (tiga)  kali  pengulangan dapat  dilihat pada tabel berikut ini:
Tabel  2.  Hasil  Uji  Aktivitas  Ekstrak Daun Sirih Terhadap Propionibacterium acnes Sampel Konsen trasi Diameter Zona Hambat (mm) Rata-Rata Disk Clindamycin (Kontrol +) 8,67 DMSO (Kontrol -) 100% 0 Ekstrak Sirih Hijau 5% 3,32 10% 6,44 15% 8,69 Ekstrak Sirih Merah 5% 1,65 10% 2,25 15% 2,71 Ekstrak Sirih Hitam 5% 0,99 10% 1,49 15% 1,86 Kombinasi Sirih Hijau Merah 5% 2,88 10% 3,96 15% 5,77 Kombinasi Sirih Hijau Hitam 5% 2,30 10% 3,56 15% 4,77 Kombinasi Sirih Hitam Merah 5% 0,62 10% 1,46 15% 1,89 Aktivitas ekstrak sebagai antibakteri dapat  diamati  dari  kemampuan  ekstrak dalam menghambat pertumbuhan bakteri.  Semakin  kecil  konsentrasi ekstrak yang digunakan dalam menghambat pertumbuhan bakteri, maka  semakin  besar  potensi  ekstrak tersebut  sebagai  antibakteri.  Ekstrak
dengan konsentrasi kecil yang mempunyai  aktivitas  besar,  disebut efektif sebagai antibakteri 12 . Uji aktivitas  dilakukan  pada  konsentrasi 5%, 10%, dan 15%, hal ini berdasarkan penelitian  sebelumnya  bahwa  aktivitas antibakteri  ada  pada  konsentrasi  diatas > 5% penambahan konsentrasi dilakukan  berdasarkan  rumus  n (+5) , konsentrasi  terbesar  yang  dipakai  yaitu 15%,  dengan  anggapan  bahwa  aktivitas antibakteri  yang  terjadi  diatas  >15% kurang  efektif  karena  memakai  ekstrak lebih  banyak  dan  pemakaian  jadi  tidak efesien jika diaplikasikan pada penggunaan simplisi secara klinis. Tujuan  dilakukan  kombinasi  paralel
yaitu untuk mengetahui aktivitas antibakteri  antara  sirih  hijau,  sirih merah  dan  sirih  hitam  dilakukan pengujian  secara  Tunggal.  Pada  sirih hijau  DDH  masuk  kategori  kuat, sedangkan  pada  sirih  merah  dan  hitam masuk  kategori  lemah.  Hasil  kombinasi secara  paralel  menghasilkan  diameter daerah  hambat  kategori  sedang,  namun memiliki  Nilai  DDH  lebih  kecil  dari pada konsentrasi tunggalnya, yaitu pada ekstrak  daun  sirih  hijau,  hal  ini menunjukan  bahwa  kombinasi  ekstrak tidak  memiliki  aktivitas  yang  sinergis atau  antagonis.  Menurut  G.  Adwan  dan M.  Mahanna  (2008)  berkurangnya aktivitas  antibakteri  pada  kombinasi ekstrak  dapat  disebabkan  ekstrak  kasar yang  mengandung  banyak  komponen fitokimia  yang  kemungkinan  memiliki mekanisme  kerja  yang  berbeda 13 .  Uji normalitas,  data  normal  dengan  nilai p>0,05 dan Uji non parametrik Kruskall-Wallis    hasil  nilai  asym  sip yaitu 0,0000 (p<0,05) terdapat perbedaan zona hambat  yang signifikan antara dua kelompok sampel.

## KESIMPULAN
Hasil
uji antibakteri
Propionibacterium  acnes menunjukan
rata-rata  zona  hambat  kontrol  positif disk  antibiotik  clindamisin  8,67  mm kategori  kuat,  sedangkan  untuk  ekstrak konsentrasi  15%  sirih  hijau  yaitu  8,69 mm kategori kuat, sirih merah 2,71 mm kategori  lemah,  sirih  hitam  1,8  mm kategori  lemah,  kombinasi  sirih  hijau- merah  5,77  mm  kategori  sedang,  sirih hijau-hitam  4,77  mm  kategori  sedang dan  sirih  hitam-merah  1,89  kategori lemah.  Uji  normalitas,  data  normal dengan  nilai  p>0,05  dan  Uji  non parametrik  Kruskall-Wallis    hasil  nilai asym sip yaitu 0,0000 (p<0,05) terdapat perbedaan zona hambat  yang signifikan antara dua kelompok sampel.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Sutaria  AH  dan  Schlessinger  J. (2017). Acne  Vulgaris. Gujarat University: Pubmed.
2. Widyaningtias,  N.  M.  S.  R.,  P.  S. Yustiantara,  and  N.  L.  P.  V.
Paramita.  (2014).  "Uji  Aktivitas Antibakteri  Ekstrak  Terpurifikasi Daun  Sirih  Hijau  ( Piper  betle  L .) Terhadap Bakteri Propionibacterium acnes ." Jurnal Farmasi  Udayana 3.1:
279875.
3. Syafriana, Vilya, and Rabitha Rusyita. (2017). "Uji aktivitas antibakteri  ekstrak  etanol  daun  sirih merah  ( Piper  crocatum )  terhadap pertumbuhan
Propionibacterium acnes ." Sainstech Farma 10.2: 9-11.
4. Aprillia,  Falencia  Ega,  Mirhansyah Ardana,  and  Hadi  Kuncoro.  (2021). "Pengaruh Lama Penyimpanan Ekstrak  Etanol  Daun  Sirih  Hitam ( Piper  betle  L .  var  Nigra)  Terhadap Aktivitas  Antibakteri: The  Effect  of Storage  Time  Extract  Etanol  Black Betel Leaf ( Piper betle L. var Nigra ) To Antibacterial Activity ." Proceeding of Mulawarman Pharmaceuticals  Conferences .  Vol. 13.
5. Sheikh,  M.,  Abdullah  R.M.,  M.K.,

## Meghavanshi and  Irshad, M. (2012),
Studies  on  Some  Plant  Extract  for Their Antimicrobial Potential Against Certain Pathogenic Microorganisms.  American  Journal of Plant Sciences . 3. 209-213. 6. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pasca Panen Pertanian  Tt.  Tanaman  Obat  Bogor: Teknologi  Pasca  Panen  Tanaman Obat.
7. Ulrich-Merzenich  G.,  Panek,  D.
Zeitler,  H.,  Vetter  et  all.  (2010). Drug  Development  From  Natural Products:  Exploiting  Synergistics Effects. Indian Journal of Experimental Biology . 48: 208-219.
8. Hoque,  M.M.,  S.  Ratttila,  M.A., Shishir, M.L., Bari, Y. Inatsu, dan S. Kawamoto.  (2011). Antibacterial
Activity  of  Ethanol  Extract  of  Betel
Leaf  (Piper  betle  L.).  Againts  Some
Food Borne Pathogens .
9. Parfati,  N.  &  Windono  T.  (2016). Sirih merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav.)  kajian  Pustaka  aspek  botani, kandungan  kimia,  dan  aktivitas farmakologi. Media  Pharmaceutica Indonesia , 1 (2): 106 – 115.
10. Nureza, A. (2022). Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol 96% Daun Sirih  Hijau  (Piper  betle  L.),  Daun Sirih Merah (Piper crocatum), Daun Sirih  Hitam  (Piper  betle  L.  var nigra) (Doctoral dissertation,
Akademi Farmasi Surabaya).
11. Pratiwi,  S.T.  (2008).  Mikrobiologi Farmasi,  Airlangga,  Jakarta.  hal.
150-171.
12. Herdiana,  I.,  Setyahadi,  S.,  &
Partomuan,  S.  (2017).  Isolasi  Dan
Identifikasi  Senyawa  Kimia  Dari
Ekstrak Etil Asetat Daun Sirsak Dan Uji  Bakteri Streptococcus  Mutans ATCC 31987. Buletin Media
Informasi, 13 (2), 16-22.
13. G. Adwan dan M. (2008). Mahanna. Synergistic  Effects  of  Plant  Extraxct and  Antibiotics  on Sthapilococcus
aureus Strain  Isolated  from  Clinical
Specimens. Middle-East J of Scientific Reaserch 3 (3). p 137.