Medika Kartika : Jurnal Kedokteran dan Kesehatan
ANALISIS GENETIK GEN NONSTRUKTURAL 3 DENGUE VIRUS SEROTYPE 4 STRAIN INDONESIA
(GENETIC ANALYSIS OF NONSTRUCTURAL GENE 3  DENGUE  SEROTYPE 4 VIRUS INDONESIAN STRAIN)
Linlin Haeni 1 , Beti Ernawati Dewi 2
1 Laboratorium Histologi, Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal Achmad Yani 2 Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia
Email korespondensi : linlin.haeni@gmail.com

## ABSTRAK
Demam  Berdarah  Dengue  (DBD)  adalah  penyakit  yang  disebabkan  virus  dengan  vektor nyamuk  yang  paling  cepat  menyebar  di  dunia.  Penyebab  DBD    adalah  virus  RNA  famili flaviviridae  yang  disebut  virus  dengue  (DENV).  Genom  DENV  terdiri  dari  tiga  protein struktural  yaitu  capsid  (C),  protein  membran  (prM),  dan  protein  envelop  (E)  serta  tujuh  gen protein  nonstuktural  yaitu  NS1,  NS2a,  NS2b,  NS3,  NS4a,  NS4b,  dan  NS5.  Protein    NS3 mengandung  epitop  yang  dapat  dikenali  oleh  sistem  imun  humoral  maupun  selular  oleh karena  itu  protein  NS3  merupakan  target  potensial  bagi  pengembangan  vaksin  dengue. Penelitian  ini  diawali  dengan  sekuensing  pada  gen  NS3    DENV-4  IDS  96/10.  Dari  hasil sekuensing  dilakukan  analisis  filogenetik  dan  analisis  epitop.  Analisis  filogenetik menunjukkan  gen NS3 IDS 96 /10 berada dalam satu clade dengan strain yang diisolasi dari Cina  (2010),  Singapura  (2010)  dan  Thailand  (2000).  Pada  gen  NS3  DENV-4  IDS  96/10 terdapat epitop yang dapat dikenali oleh sel limfosit T CD4 + yaitu epitop #3 pada posisi asam amino (213-227) , #9A(243-257), #4(251-265), #5(258-272), # 6(266-280), #7(273-287) yang mempunyai  urutan  asam  amino  sama  antar  strain  yang  dibandingkan.  Pada  posisi  epitop #8(281-295)  terdapat  variasi  urutan  asam  amino.  Asam  amino  pada  posisi  500-508  dikenali oleh sel  limfosit T  CD8 + mempunyai  urutan yang sama antar strain  yang dibandingkan, dan asam amino pada posisi 526-531yang dikenali oleh limfosit B mempunyai urutan asam amino yang sama antar strain yang dibandingkan. Pengenalan epitop-epitop  tersebut oleh limfosit T
DOI
DOI

## ARTIKEL PENELITIAN
dan  limfosit  B  menjadi  dasar  pengembangan  vaksin  khususnya  vaksin  yang  khusus  untuk strain Indonesia.
Kata kunci : Dengue, Epitope, NS3

## ABSTRACT
Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) are viral diseases transmitted by mosquito vector spreads fastest  in  the world. Cause of  dengue fever are RNA virus family Flaviviridae called dengue virus  (DENV).  DENV  genome  encodes  three  structural  proteins,  capsid  (C),  membrane proteins (prM), envelope protein (E) and seven nonstructural protein NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a,  NS4B,  and  NS5.  NS3  protein  contains  many  epitopes  that  can  be  recognized  by  the humoral  and  cellular  immune  system.  Therefore,  NS3  protein  is  a  potential  target  for development  of  dengue  vaccines.  This  study  begins  by  sequencing  NS3  gene    DENV-4  IDS 96/10.  Phylogenetic  analysis  and  epitope  analysis  were  done  from  the  result  of  sequencing. Phylogenetic analysis showed IDS 96/10  were in one clade  with strains isolated from China (2010),  Singapura  (2010),  and  Thailand  (2000).  NS3  gene  DENV-4  IDS  96/10  contained epitopes  recognized by CD4 + T cell that is epitope # 3 on the position  of amino acids (213- 227), # 9A (243-257), # 4 (251-265), # 5 (258-272), # 6 (266-280), # 7 (273-287) which has the same amino acid sequence comparison between strains. At position # 8 epitope (281-295) there are variation  of  amino acid  sequence. Amino acids at  positions 500-508 is recognized by  CD8 + lymphocytes  have  the  same  sequence  between  strains  were  compared,  and  the amino  acids  at  positions  526-531  which  recognized  by  has  the  same  amino  acid  sequence comparison  between  strains.  Recognition  of  these  epitopes  by  T  lymphocytes  and  B lymphocytes  can  be  the  basis  for  the  development  of  vaccines,  especially  vaccines  for  the Indonesian strain.
Keywords: Dengue, Epitope, NS3

## PENDAHULUAN
Demam  Berdarah  Dengue  (DBD) adalah  penyakit  yang  disebabkan  virus dengan  vektor  nyamuk  yang  paling  cepat menyebar  di  dunia.  Dalam  50  tahun terakhir,  insidensinya  meningkat  menjadi 30 kali lipat dengan peningkatan perluasan daerah  geografis  ke  negara-negara  baru  ,
baik daerah  pedesaan  maupun  perkotaan. Diperkirakan 50 juta orang terinfeksi virus ini  setiap  tahunnya  dan  2,5  milyar penduduk  hidup  di  daerah  endemis dengue. 1
Sekitar 1,8 milyar (lebih dari  70%) populasi yang memiliki risiko infeksi virus
dengue  di  dunia  terdapat  di  daerah  Asia Tenggara  dan  Asia  Pasifik.  Di  Asia Tenggara  sendiri  epidemi    dengue  telah menyebar  ke  daerah  baru  dan  kasusnya meningkat  pada  daerah  yang  sudah terkena.  Pada  tahun  2003    8  negara (Bangladesh,  India,  Indonesia,  Maldives, Myanmar,  Sri  Lanka,  Thailand,  Timor Leste)  melaporkan  kejadian  kasus  dengue ini.  Pada  tahun  2004,  Bhutan  melaporkan kejadian wabah pertama dengue didaerahnya  dan  pada  tahun  2005 Global Outbreak  Alert  and  Response  Network (GOARN) melaporkan  kejadian  luar  biasa dengue  di  Timor  Leste    memiliki  tingkat kematian hingga 3,55 %. 1
Penyakit  DBD  masih  merupakan salah  satu  masalah  kesehatan  masyarakat yang utama di Indonesia. Jumlah penderita dan  luas  daerah  penyebarannya  semakin bertambah  seiring  dengan  meningkatnya mobilitas  dan  kepadatan  penduduk.  Di Indonesia DBD  pertama kali ditemukan di kota  Surabaya  pada  tahun  1968,  dimana sebanyak 58 orang terinfeksi  dan 24 orang diantaranya  meninggal  dunia  (Angka Kematian  (AK)  :  41,3  %).  Dan  sejak  saat itu,  penyakit  ini  menyebar  luas  ke  seluruh Indonesia. 2 Sejak  tahun  1968  telah  terjadi peningkatan  persebaran  jumlah  provinsi dan  kabupaten/kota  yang  endemis  DBD, dari  2  provinsi  dan  2  kota,  menjadi  32
(97%) dan 382 (77%) kabupaten/kota pada tahun 2009. 2
Pada  tahun  2009  provinsi  DKI Jakarta  merupakan  provinsi  dengan  angka insidensi  DBD  tertinggi  (313  kasus  per 100.000 penduduk) sedangkan Nusa Tenggara  Timur merupakan provinsi dengan  angka  insidensi  DBD  terendah  (8 kasus per 100.000 penduduk). Terdapat 11 provinsi  termasuk  dalam  daerah  risiko tinggi  (Angka  insidensi  >  55  kasus  per 100.000 penduduk). 2
Virus  dengue  diklasifikasikan  ke dalam  genus  Flavivirus  bersama Yellow Fever Virus (YFV), West Nile virus (WNV), Japanese  encephalitis  virus  (JEV ),  dan Tick-Borne  Encephalitis  Virus  (TBEV) . 3 Genom  virus  dengue  merupakan  untai RNA  tunggal  linier  yang  berukuran  ±  11 Kb.  Genom  virus  dengue  terdiri  dari  tiga protein  struktural  yaitu  capsid  (C),  protein membran  (prM),  dan  protein  envelop  (E) serta  tujuh  gen  protein  nonstuktural  yaitu NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b  dan NS5. 3,4
Virus Dengue ditularkan dari orang ke  orang  melalui  gigitan  nyamuk Aedes (Ae).  Ae  aegypti merupakan  vektor epidemi yang paling utama, namun spesies lain seperti Ae.albopictus, Ae.polynesiensis, dan Ae.  niveus juga dianggap sebagai vektor sekunder. Nyamuk  penular  dengue  ini  terdapat
hampir  di  seluruh  pelosok  Indonesia, kecuali di tempat-tempat dengan ketinggian  lebih  dari  1000  meter  di  atas permukaan laut. 5
Program  pengendalian  vektor  di Indonesia  belum  berjalan  dengan  baik, terbukti  dengan  kenaikan  kasus  DBD setiap tahun. 2 Oleh karena itu dikembangkan  penelitian  vaksin  dengue. Berbagai macam vaksin dengue berdasarkan  jenisnya  dan  sedang  dalam penelitian  diantaranya  adalah recombinant subunit vaccines , purified inactivated virus vaccines , live  attenuated  vaccine dan vaksin  DNA. 6-10 Vaksin  DNA    dapat menginduksi    respon  imun  humoral maupun seluler, relatif stabil, aman, mudah dan cepat dalam konstruksi dan produksinya. 9
Penelitian  terdahulu  tentang  vaksin DNA  berbasis  gen  NS3  diantaranya penelitian yang dilakukan Costa et al tahun 2011. 11 Penelitian  tersebut  diawali  dengan pengklonaan    gen  NS3  DENV-2  strain New  Guinea  C  (NGC  DENV2)  ke  dalam vektor  pcDNA3.  Plasmid  rekombinan tersebut diimunisasikan pada mencit Balb/c untuk dievaluasi derajat morbiditasnya serta dilakukan pemeriksaan kadar  interferon  (IFN)-γ.  Hasil  penelitian menunjukkan vaksin DNA yang mengkode gen  NS3  utuh  mampu  memberikan proteksi pada mencit Balb/c serta
menginduksi  respons  imun  seluler  dengan produksi IFN-γ. 11
Protein  NS3  mempunyai  epitop yang  dapat  menginduksi  respon  imun seluler  yaitu  aktivasi  sel  limfosit  T  CD8 + dan  limfosit  T  CD4 + .  Penelitian  tentang epitop  yang  dapat  menginduksi  respon imun  sel  limfosit  T  CD4 + salah  satunya adalah  penelitian  yang  dilakukan  oleh Okamoto et  al .  pada  tahun  1998. 12
Penelitian ini didahului dengan pengambilan  PBMC  dari  donor  yang terinfeksi  virus  dengue.  Lima  klon  sel limfosit  T  CD4 + yang  khusus  berikatan dengan  HLA-DPw2direaksikan  dengan epitop overlaping berupa  peptida  sintesis yang didesain dari DENV-4. Hasil penelitian  menunjukkan  adanya  epitop yang  dapat  mengenali  dan  memberikan respon  terhadap5    klon    Limfosit  T  CD4 + yang khusus berikatan dengan HLA-DPw2 diantaranya    epitop  #3  pada  posisi  asam amino (213-227), #9A (243-257), #4 (251- 265), #5 (258-272), # 6 (266-280), #7(273- 287), #8(281-295). 12 Penelitian oleh Kurane et al. pada tahun 1993 menunjukkan    epitop  dengan  pada    posisi amino 255-264 dapat dikenali dan menginduksi  respon  imun    sel  limfosit  T CD4 + apabila  epitop  tersebut  berikatan dengan    HLADP-w2. 13 Penelitian  Zivny pada  tahun  1995  menunjukkan  epitop dengan  urutan  asam  amino  TPEGIIPTL
pada  posisi  500-508    dapat  dikenali  dan dapat  menginduksi  klon  limfosit  T  CD8 +
apabila  epitop  tersebut    berikatan  dengan HLA-B3501. 14
Penelitian  tentang  protein  NS3 yang  dapat  menimbulkan  respon  imun humoral diantaranya penelitian yang dilakukan Tan et al tahun 1990 menemukan  adanya  monoklonal  antibodi yang  ditimbulkan  oleh  respon  imun terhadap  protein  NS3  dengue  virus serotype  1  strain  Hawaiian.  Monoklonal antibodi  tersebut  disuntikkan  pada  mencit Balb/c.  Hasil  penelitian  menunjukkan monoklonal  antibodi  tersebut  mampu meningkatkan  ketahanan  mencit  Balb/c ketika  diinfeksi  virus  dengue  serotype1 strain  Hawaiian  dengan  dosis  yang mematikan. 15
Penelitian  Moreland  et  al  tahun 2010 menunjukkan adanya antibodi monoklonal Fab 3F8 yang dapat mengenali epitop  pada  NS3  pada  posisi  526  –  531 dengan  urutan  asam  amino  RGExRK. 16
Berdasarkan  beberapa  penelitian    di  atas, maka dilakukan penelitian untuk mempelajari karakteristik molekuler protein  NS3  DENV-4  strain  Indonesia, sehingga dapat dikembangkan vaksin DNA berbasis protein NS3 tersebut.

## BAHAN DAN METODE
1. Penentuan serotipe IDS 96/10
Dilakukan terlebih dahulu isolasi RNA dari kultur virus IDS 96/10, penyiapan cDNA    IDS  96/10  dengan  transkripsi balik, kemudian dilakukan cek serotipe IDS 96/10.
2. Analisis  karakteristik  genetik  NS34 IDS 96/10 .
Dilakukan  amplifikasi  gen  NS3 DENV-4    IDS  96/10  menggunakan primer whole  gen dan  primer overlapping . Hasil amplifikasi dikirimkan untuk dilakukan sekuensing.  Pada  hasil  sekuensing dilakukan analisis homologi nukleotida, analisis filogenetik,
analisis  homologi  asam  amino  dan analisis epitop.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan serotipe IDS 96/10
Penelitian  diawali  dengan  isolasi RNA    IDS96/10.    RNA    hasil    isolasi kemudian  disintesis    menjadi  cDNA dengan  metode  re verse  transcription , kemudian cDNA tersebut di cek serotipenya dengan cara amplifikasi cDNA tersebut menggunakan metode Lanciotti  et al    tahun  1992  dengan  menggunakan primer    Lan  D1  dan  TS4  yang  mengenali daerah antara  capsid dan prM dari DENV- 4. Visualisasi    hasil    amplifikasi    cDNA menunjukkan pita DNA bermigrasi diantara petanda DNA 300 pb dan 400  pb
(392    pb).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa pembuatan    cDNA  IDS  96/10  telah berhasil  dan  diduga  IDS  96/10  adalah DENV-4.

## Karakteristik  gen  NS3  DENV-4  IDS
96/10
a. Amplikasi  gen  NS3  DENV-4  IDS 96/10 untuk sekuensing. Setelah
mendapatkan    cDNA    DENV-4  IDS
96/10, selanjutnya dilakukan
amplifikasi  keseluruhan  gen  NS3.
Amplifikasi gen NS3 dengan menggunakan primer  4092sDEN4 dan
6572cDEN4 sehingga panjangnya berkisar  2480  pb.  Setelah  dilakukan amplifikasi, kemudian dianalisis
dengan elektroforesis. Selanjutnya dielektoforesis    didapatkan  pita  yang sejajar dengan marker Hind III dengan ukuran    di  atas  2322  pb  (  berkisar 2480 pb). Adanya pita yang berukuran 2480  pb  tersebut  menyatakan  bahwa gen NS3 sudah berhasil diamplifikasi.
Gambar 1 Hasil Amplifikasi cDNA DENV-4 IDS 96/10 dengan Menggunakan Metode Lanciotti.  Lajur 1. Marka 100pb; 2. DENV-4 IDS 96/10
b. Analisis  nukleotida  NS3 DENV-4
IDS  96/10.  Hasil  amplifikasi  kemudian dilakukan  sekuensing,  kemudian  hasil sekuensing-sekuensing dianalisis
menggunakan software Genetyx  2.0  dan
Bioedit  7.0.    Nukleotida  hasil    sekuensing menghasilkan  runutan  nukleotida  gen NS2b, NS3 dan NS4a.  Runutan nukleotida yang akan dianalisis  adalah sekuen NS3.
1 2 300pb 392pb 400pb
Sekuen NS3 DENV-4 IDS 96/10 diurutkan ( alignment )  dengan  NS3  DENV-4  yang berasal  dari  negara  lain  menggunakan software Bioedit  7.0,  untuk  mengetahui tingkat  homologi  dan  untuk  mengetahui perubahan  yang  terjadi  dari  setiap  isolat. Data  strain  DENV-4    yang  diteliti  dan strain  negara  lain  yang  diunduh  dari GenBank.
c. Homologi  nukleotida NS3 DENV- 4  IDS  96/10.  Hasil  homologi  nukleotida NS3 DENV-4  IDS 96/10 tertinggi  dengan semua    strain  yang  dibandingkan  dengan persentase 97 %  adalah dengan strain dari Thailand tahun 2000.
d. Analisis  homologi  asam  amino. Sekuen  asam  amino  diperoleh  dengan mengkonversi  sekuen  nukleotida  yang didapat sebelumnya.

## Analisis filogenetik
Analisis filogenetik merupakan suatu analisis untuk  mengetahui hubungan kekerabatan berdasarkan  kemiripan  dan perbedaan  karakteristik  genetik.  Pada penelitian ini analisis filogenetik berdasarkan  atas  karakteristik    nukleotida gen NS3 DENV-4 IDS 96/10 dibandingkan strain  negara  lain  yang  diunduh  dari GenBank.
Gambar 2 Pohon Filogenetik dengan Metode Kimura-2 Parameter
Analisis  filogenetik  IDS  96/10    menurut gen  NS3  yang  dilakukan  dalam  penelitian ini digunakan metode  kimura-2 parameter.
Konstruksi pohon filogenetik menggunakan  metode  UPGMA    yang terdapat  dalam software  Genetyx .  Hasil analisis  filogenetik  menunjukkan  IDS 96/10    membentuk    satu clade dengan strain  yang  berasal  dari  Cina  (2010), Singapura (2010), dan Thailand (2000).
Dalam  penelitian  sebelumnya  yang dilakukan    Dewi,  et  al  diketahui  bahwa IDS  96/10    termasuk  dalam    genotipe    II bersama strain yang  berasal dari Dominica (1981),  Jamaica(1983), Tahiti(1979,1985), Honduras(2007), Thailand(2000) dan strain  lain  dari  Indonesia.  Dari  analisis filogenetik  tersebut  dapat  dilihat  strain yang  diisolasi  pada  tahun  yang  sama membentuk clade yang  sama  yaitu  strain
dari Cina tahun  2010, Singapura 2010 dan Indonesia 2010.

## Analisis epitop
Pada penelitian ini dilakukan pensejajaran  asam    amino  IDS  96/10 dengan  asam  amino  NS3  strain  lain  yang terdapat pada GenBank. Penelitian Okamoto et  al(1998)  menunjukkan epitop overlapping yang  dapat  mengenali  dan memberikan  respon  terhadap  5    klon limfosit  T  CD4 + yang  khusus  berikatan dengan HLA-DPw2 diantaranya  epitop #3 pada  posisi  asam  amino  (213-227)  , #9A(243-257),  #4(251-265),  #5(258-272),
# 6(266-280),#7(273-287),#8(281-295).
Hasil penelitian menunjukkan sekuen asam amino pada epitop  #3, epitop  #9A,  epitop #4,  epitop  #5,  epitop  #6,  epitop  #7  sama pada  semua  sekuen  strain  NS3    yang dibandingkan. Dengan adanya epitop yang sama pada semua strain yang dibandingkan diharapkan klon sel  limfosit T CD4 + yang merupakan  respon  imun  terhadap  epitop tersebut  memiliki    afinitas  yang  sama, sehingga  pembuatan  vaksin  berdasarkan epitop  ini  dapat  menjadi  vaksin  yang universal.
Pada  epitop  #8  (pada  posisi  asam amino  292)    terdapat  perbedaan  asam amino  antar  strain.  Pada  posisi  asam amino 292 terdapat  asam amino sistein (C) pada  strain  dari    Indonesia  2010  (strain yang  diteliti),  Thailand  2000,  Singapura
2005,  Singapura  2010  dan  Cina  2010 sedangkan  pada  strain  dari  India  2009, Dominica  1981,  Thailand  1991,  Thailand 2001,  Singapura  1995,  Venezuela  1995, dan  Pakistan  2009  terdapat    asam  amino yang  berbeda  yaitu  asam  amino  serin  (S). Perbedaan ini menjadi dasar pengembangan  vaksin  karena  epitop  virus dengue  cenderung  mengalami  perubahan meskipun  dalam  satu  negara  yang  sama. Contohnya  di  negara  Singapura,  asam amino  pada  epitop    #8    berbeda  antara strain  yang  diisolasi  pada  tahun  1995 dengan  strain  yang  diisolasi  pada  tahun 2005  dan  2010.  Perbedaan  ini  mungkin akan  menyebabkan  perbedaan  afinitas  sel limfosit  T  CD4 + sehingga  diperlukan vaksin  yang berbeda. Hal  ini juga menjadi dasar  perlunya  dikembangkan  vaksin dengue  secara  terus  menerus  yang  khusus untuk  isolat  dari  Indonesia    karena  vaksin yang  dikembangkan  di  negara  lain  belum tentu  dapat  menanggulangi  infeksi  dengue yang terjadi di Indonesia. Hal ini berkaitan dengan  epitop  dan  pengenalan  oleh  sel TCD4+ yang berbeda.
Penelitian yang lainnya   dilakukan oleh  Kurane  et  al.(1993),  penelitian  ini bertujuan  untuk  mengidentifikasi  HLA yang berikatan dengan epitop (posisi  asam amino  255-264)  yang  dapat  mengaktivasi sel limfosit T CD4+ . HLADP  pada donor pada penelitian ini adalah HLA DPA1* 01,
HLADPB1*0201, secara serologis didefinisikan  sebagai  HLADPw2. 13 Pada penelitian  ini  epitop  pada  posisi  asam amino  255-264 conserve pada  semua strain yang diteliti  dan pada semua  strain dari  berbagai  negara    yang  dibandingkan. Jadi  dapat  disimpulkan  HLADPw2  dapat mengikat  epitop  pada  posisi  asam  amino 255-264    pada  strain  yang  diteliti    dan pada  semua    strain    dari  berbagai  negara yang  dibandingkan  dan  ikatan  epitop  dan HLADPw2 tersebut dapat mengaktivasi sel limfosit TCD4 + .
Penelitian epitop yang dikenali oleh limfosit  T  CD8 + diantaranya  penelitian oleh  Zivny  tahun  1995.  Penelitian  ini menunjukkan  epitop  TPEGIIPTL  pada posisi  500-508    dapat  dikenali  dan  dapat menginduksi  klon  limfosit  T  CD8+ apabila  epitop  tersebut    berikatan  dengan HLA-B3501. Epitop tersebut dapat dikenali  oleh  berbagai  klon  sel  limfosit  T dari  serotipe virus dengue berbeda. 14 Pada penelitian    ini  terdapat  epitop  dengan urutan  asam  amino  yang  sama.  Urutan asam  amino  tersebut  identik  pada    semua strain  yang  dibandingkan,  artinya  epitop tersebut  bersifat conserve pada  semua strain  yang  dibandingkan  dan  dapat dijadikan  dasar  untuk  pembuatan  vaksin universal.
Penelitian epitop yang dapat mengenali  limfosit  B  dilakukan  oleh
Moreland et al. Antibodi monoklonal pada penelitian  ini  adalah  antibodi  monoklonal Fab3F8.  Antibodi  monoklonal  tersebut mengenali  epitop  pada  posisi  526  –  531 yaitu RGExRK.  Posisi  asam  amino 526  – 531  adalah  domain  III  Helikase  yang mempunyai  fungsi  untuk  replikasi  virus. Inhibisi oleh antibodi monoklonal  Fab3F8 dapat  menurunkan  replikasi  virus.  Pada penelitian  ini    x  adalah  asam  amino  Q. Urutan  asam  amino  tersebut  sama  pada semua  strain  yang  dibandingkan  artinya epitop  tersebut  bersifat conserve dan dijadikan dasar pembuatan vaksin universal.

## KESIMPULAN
Dari  penelitian  ini  telah  didapatkan amplikon  gen  NS3  DENV-4  IDS  96/10 berukuran  1854  pb.  Data  hasil  sekuen selanjutnya digunakan untuk analisis filogenetik    dan  analisis  epitop.  Hasil analisis  filogenetik  menunjukkan  IDS 96/10    membentuk    satu clade dengan strain  yang  berasal  dari  Cina  (2010), Singapura  (2010)  dan  Thailand  (2000). Analisis  epitop  menunjukkan  gen  NS3 DENV-4  IDS  96/10  memiliki  epitop  yang dapat  dikenali  sel  limfosit  T  CD4 + pada posisi  asam  amino  (213-227)  ,  (243-257), (251-265),  (258-272),  (266-280),  (273- 287),  epitop-epitop  tersebut  bersifat  lestari ( conserve) pada  semua  gen  NS3  di  dunia
yang  dibandingkan.  Pada  epitop  #8  (pada posisi  asam  amino  292)    terdapat perbedaan  asam  amino  antar  strain  yang diteliti.    Pada  posisi  asam    amino  292 terdapat    asam  amino  sistein  (C)    pada strain  dari    Indonesia  2010  (strain  yang diteliti),  Thailand  2000,  Singapura  2005, Singapura 2010, dan Cina 2010 sedangkan pada  strain  dari  India  2009,  Dominica 1981,  Thailand  1991,  Thailand  2001, Singapura  1995,  Venezuela  1995,  dan Pakistan  2009  terdapat  asam  amino  yang berbeda  yaitu  asam  amino  serin  (S). Analisis epitop juga menunjukkan gen NS3 DENV-4 IDS 96/10  memiliki epitop yang dapat dikenali oleh sel T CD8 + pada posisi 500-508  yang  bersifat conserve pada semua negara yang dibandingkan. Analisis epitop  juga  menunjukkan  bahwa  gen  NS3 DENV-4 IDS 96/10  memiliki epitop yang dapat  dikenali  oleh  limfosit  B  yaitu  pada posisi asam amino 526-531.

## DAFTAR  PUSTAKA
1. World  Health  Organization  (WHO). Dengue Guideline for diagnosis, treatment,  prevention  and  control .  Ed 2nd. 2009.
2. Pusat  data dan Survailans Epidemiologi Kementrian  Kesehatan  RI. Demam Berdarah Dengue . Jakarta.2010.
3. Liedenbach  B.D,  Thiel  H.J,  Rice  C.M.
Flaviviridae:  the  viruses  and  their
replication .  Fundamental  virology.  5 rd ed.  Lippincott  Williams  &  Wilkins. Philadelphia. 2007: 589 – 639.
4. Perera  R  &  Kuhn  RJ.  Structural proteomics  of  dengue  virus .  Curr  op Microbiol . 2008; 11(4): 369-377.
5. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia Direktorat Jenderal Pengendalian  penyakit  dan  penyehatan lingkungan. Modul pengendalian Demam  Berdarah  Dengue .  Jakarta. 2011
6. Murphy B.R & Whitehead S.S. Immune Response to Dengue Virus and Prospects  for  a  Vaccine. Ann    Rev  of Immunologi. 2011; 29:587–619 .
7. Schmitz J, Rohrig J, Barret A, Hombach J.  Next  generation  dengue  vaccines:  A review  of  candidates  in  preclinical development. Vaccine. 2011; 29 : 7276– 84
8. Ishikawa T, Yamanaka A, Konishi E. A Review of succesful  flavivirus vaccines and  the  problem  with  those  flavivirus for which vaccines are not yet available. Vaccine . 2014; 12: 1-11
9. Liu M.A. DNA Vaccine a review . J. int med . 2003; 253: 402 -410.
10. Mateen  I,  Saba  I.  A  review  on  DNA vaccines. J  of Health Sci . 2011; 1(1):1- 7.
11. Costa S.M, Yorio A.P, Goncalves A.J.S, Vidale M.M, Costa E.C.B, Borges R.M
et al. Induction of a Protective Response in  Mice  by  the  Dengue  Virus  NS3 Protein  using  DNA  Vaccine. Plos  one . 2011; 6 (10): e25685.
12. Okamoto  Y,  Kurane  I,  Leporati  AM, Ennis  F.A.  Definition  of  the  Region  on NS3  which  Contains  Multiple  Epitopes Recognized by Dengue Virus Serotype- Cross-Reactive  and  Flavivirus-cross- reactive, HLA-DPw2-restricted CD4 + T cell clones. J. Virol . 1998; 79: 697-704.
13. Kurane I, Dai LC, Livingston PG, Reed E,  Ennis  F.A.Definition  of  an  HLA- DPw2-restricted epitopeon NS3, recognized  by  a  dengue  virus  serotype- cross-reactive  human  CD4+  CD8- cytotoxic T-cell clone. J. Virol . 1993; 67 (10): 6285.
14. Zivny J, Kurane I, Leporati AM, Ibe M,
Takiguchi  M,  Zeng  L  et  al.    A  Single Nine-amlno    acid    Peptide    Induces Virus-specific,    CD8  +    Human Cytotoxic    T    Lymphocyte    Clones    of Heterogeneous  Serotype    Specificities. J.  Exp. Med . 1995; 182: 853-63.
15. Tan C.H.C, Yap E.H, Singh  M, Deubel V, Chan YC. Passive Protection Studies in  Mice  with  Monoclonal  Antibodies Directed  Agains  the  Nonstruktural Protein  NS3  of  Dengue  1  Virus. J. Virol. 1990; 71:745-748
16. Moreland  NJ,  Tay  MYF,  Lim  E, Paradkar PN, Doan DNP. High Affinity Human  Antibody  Fragments  to  Dengue Virus  Non-Structural  Protein  3. PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4(11): e881