## TRANSFEKSI MERUPAKAN METODE TEKNOLOGI TRANSGENIK PENYISIPAN GREEN FLOURESCENT PROTEIN TERHADAP IKAN WILD BETTA

## Eni Kusrini
Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Ikan Hias Jl. Perikanan No. 13 Pancoran Mas, Depok 16436, Jawa Barat E-mail: ennyperikanan@yahoo.com

## ABSTRAK
Teknik transfer gen banyak dikembangkan untuk mengintroduksi molekul DNA ke dalam embrio.  Keberhasilan transfer  gen  menggunakan  metode  transfeksi  ditentukan  oleh  berbagai  faktor,  antara  lain  pemilihan  larutan transfeksi yang sesuai dengan mempertimbangkan kesediaan secara komersial, mudah diaplikasikan, keberhasilan tinggi, dan tidak bersifat toksik terhadap embrio.  Studi awal untuk mengetahui keberhasilan transfer gen terhadap embrio ikan wild betta digunakan Green Fluorescent Protein (GFP) dan juga dapat digunakan sebagai model terhadap ikan betta.  GFP merupakan gen yang mengkodekan protein dan memiliki sifat berpendar hijau.  Induk jantan dan betina dipijahkan dengan perbandingan 1:1 pada wadah baskom dengan ketinggian air ± 14 cm serta diberikan substrat.    Transfeksi  dilakukan  pada  embrio  fase  pembelahan  2  sel.    Larutan  transfeksi  dibuat  dari  campuran DNA  plasmid  pada  media  NaCl  0.9%  hingga  mencapai  konsentrasi  akhir  100  µL  media  (campuran  transfast  + DNA + NaCl).  Aktivitas gen ini dapat divisualisasikan dengan menggunakan sinar ultra violet.  Keberhasilan dari teknik transfer gen tersebut dibuktikan dengan adanya ekspresi gen atau deteksi DNA gen GFP yang dimasukkan. Ekspresi hasil korporasi DNA ke dalam telur melalui transfeksi pada wild betta dan keberhasilan transfer gen GFP dapat dibuktikan dengan analisis PCR.  Tujuan dari penulisan makalah ini adalah menguraikan tentang metode transfeksi yang efektif untuk teknologi transfer gen terhadap ikan wild betta.

## KATA KUNCI: transfeksi, GFP, wild betta
ABSTRACT: Transfection of technology transgenic method for green fluorescent protein to wild Betta fish. By: Eni Kusrini
Gene transfer technique has been developed to introduce DNA molecules into the embryo.  The success of gene transfer using transfection methods are determined by various factors, including the selection of the appropriate transfection solutions by considering the willingness of commercial, easy to apply, high efficacy, and is not toxic to the embryo.  Preliminary studies to determine the success of gene transfer to wild betta fish embryos used GFP and can also be used as a model for betta fish.  GFP is a protein and the gene that encodes green fluorescent properties.  Male and female parent breed with a ratio of 1: 1 on the container basin with water height ± 14 cm and given substrate. Transfection is done on embryonic phase 2 cell division. Transfection solution made from a mixture of plasmid DNA in 0.9% NaCl media to reach a final concentration of 100 uL of media (mixed transfast + DNA + NaCl).  The activity of this gene can be visualized using ultraviolet light. The success of gene transfer techniques is evidenced by the expression of genes or DNA detection of GFP gene is inserted. Expression of corporate results of DNA into the egg via transfection in the wild betta and the successful transfer of the GFP gene can be verified by PCR analysis.  The purpose of this paper is describing the effective transfection method for gene transfer technology to wild betta fish.
KEYWORDS: transfection, GFP, wild betta

## PENDAHULUAN
Transgenik  adalah  suatu  produk  bioteknologi melalui  teknik  rekayasa  genetika.    Pemindahan materi  genetika  (gen)  dari  suatu  organisme  untuk dikombinasikan  ke  dalam  materi  genetika  organisme lainnya  bertujuan  agar  gen  yang  dipindahkan  akan diekspresikan  oleh  organisme  yang  menerima  gen
tersebut.  Dengan  kata  lain,  pada  akhir  proses  akan dihasilkan  suatu  individu  yang  secara  genetika  telah berubah gennya karena membawa gen asing. Organisme inilah  yang  disebut  organisme  transgenik  atau  sering disebut pula genetically modified organisms (GMO).
Beberapa  puluh  pangan  transgenik  saat  ini  telah beredar  di  pasaran.  Para  pakar Ribosomal  Deoksiribo
Transfeksi merupakan metode teknologi transgenik penyisipan green fourescent protein..... (Eni Kusrini)
Nucleic  Acid (rDNA)  telah  mampu  memotong  atau mencopot  suatu  gen  yang  dikehendaki,  dari  individu hidup apa saja ke individu yang lain. Di bidang akuakultur, telah  dilakukan  beberapa  metode  transgenik  antara lain  penggunaan  vektor  yang  dinamakan replication defective  pantropic  retroviral untuk  menginfeksi  sel lines  ikan,  kadal  air,  kodok,  dan  nyamuk.  Metode alternatif lainnya adalah transfer gen dengan bantuan sel.  Teknik ini merupakan pengembangan dari metode mikroinjeksi,  dengan  pertimbangan  bahwa  untuk menghasilkan  ikan  transgenik  membutuhkan  banyak waktu,  biaya,  fasilitas,  dan  tenaga.  Teknik  ini  telah berhasil diaplikasikan pada ikan rainbow trout dengan menggunakan  sel  bakal  gonad  yang  membawa Green Fluorescent  Protein (GFP).  Namun  demikian  teknik  ini masih memerlukan penelitian lebih lanjut untuk dapat diaplikasikan  pada  spesies  ikan  lainnya  (Alimuddin et al ., 2003).
Transgenesis  sangat  bermanfaat  dalam  berbagai macam  studi  tentang  biologi  (Meng et  al .,  1999). Misalnya  studi  mengenai  fungsi  dan  pola  ekspresi dari  gen  serta  untuk  memproduksi  produk  komersial yang diinginkan (Kinoshita & Ozato, 1995).  Di bidang perikanan budidaya, transfer DNA eksogenous umumnya ditujukan  untuk  memproduksi  galur  transgenik  yang mempunyai  nilai  komersial  yang  lebih  tinggi  (Garcia- Pozo et al ., 1998).  Perkembangan teknologi transgenik ikan  di  dunia  meningkat  dengan  cepat.    Keuntungan ekonomi  yang  potensial  dari  teknologi  transgenik ikan ini tidak diragukan lagi.  Ikan transgenik bisa juga digunakan  sebagai  bioreaktor  untuk  memproduksi bahan-bahan  yang  bersifat  komersial  maupun  yang bermanfaat bagi kesehatan (Collas et al ., 2000).
Teknik  transfer  gen  banyak  dikembangkan  untuk mengintroduksi  molekul  DNA  ke  dalam  embrio. Mikroinjeksi merupakan teknik transfer gen yang umum digunakan  pada  kegiatan  transgenesis  (Takagi et  al ., 1994; Alimuddin et al ., 2003; Kato et al ., 2007). Meskipun demikian,  elektroporasi,  mediasi  lewat  sperma,  dan transfeksi  juga  memperlihatkan  efektivitasnya  tinggi dalam  transfer  DNA  ke  genom  ikan  (Khoo,  2000). Hasil penelitian yang dilakukan oleh Sun et al . (2005)
yang  mengkaji  aplikasi  metode  transfer  gen  berbeda pada  udang,  yaitu  mikroinjeksi,  elektroporasi,  dan transfeksi.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa metode transfeksi memberikan daya tetas yang paling tinggi,  dengan  jumlah  telur  yang  diperlakukan  dapat lebih banyak.  Penelitian yang dilakukan oleh Parenrengi et al. (2011) transfeksi gen antivirus terhadap embrio udang windu tidak mempengaruhi daya tetasnya.  Hal tersebut  menunjukkan  bahwa  bahan  transfeksi  tidak bersifat  toksik.  Berdasarkan  pertimbangan  tersebut, metode transfer gen yang dipilih dalam penelitian ini adalah metode transfeksi mengingat ukuran telur ikan cupang B.  imbellis yang  relatif  kecil.    Dengan  metode tersebut  jumlah  telur  yang  diaplikasikan  relatif  lebih banyak dalam satuan waktu tertentu (Sun et al ., 2005).
Keberhasilan  transfer  gen  menggunakan  metode transfeksi  ditentukan  oleh  berbagai  faktor,  antara lain  pemilihan  larutan  transfeksi  yang  sesuai  dengan mempertimbangkan  kesediaan  secara  komersial, mudah  diaplikasikan,  keberhasilan  tinggi,  dan  tidak bersifat  toksik  terhadap  embrio.  Namun  demikian, umur  embrio  yang  digunakan  sama  dengan  metode transfer  gen  lainnya,  transfeksi  terhadap  ikan  wild betta  dilakukan  paling  lambat  fase  2  sel,  pada  ikan cupang B. imbellis adalah 4 menit. Sebagai studi awal untuk mengetahui transfer gen terhadap embrio ikan wild  betta  digunakan  GFP  dan  juga  dapat  digunakan sebagai  model  terhadap  ikan  betta.  Tujuan  dari penulisan  makalah  ini  adalah  menguraikan  tentang metode transfeksi yang efektif untuk teknologi transfer gen Green Flourescent Protein terhadap ikan wild betta.

## BAHAN DAN METODE
Induk  jantan  dan  betina  dipijahkan  dengan perbandingan 1:1 pada wadah baskom dengan ketinggian air ± 14 cm serta diberikan substrat  (Gambar 1). Ikan jantan  yang  siap  memijah  akan  membuat  sarang  busa di sekitar substrat.  Umumnya fertilisasi terjadi 23 jam setelah pemasangan induk.  Telur yang telah terfertilisasi dikoleksi  dalam  cawan  petri  kemudian  dicuci  dengan NaCl fisiologis 0.9% dan dilanjutkan dengan pencucian pada akuades.
Gambar 1. Proses pemijahan ikan wild betta Figure 1.  Spawning process wild betta fish
GFP yang diperoleh dari Prof. Dr. Yoshizaki (Tokyo Univ.  Marine  Sci.  &  Technol.).    Bakteri  pembawa  GFP akan  dikultur  dalam  media  cair  yang  mengandung Triptone  1,6%,  yeast  extract  1%,  NaCl  0,5%  dan antibiotik  kanamisin,  menggunakan  shaker  dengan kecepatan  250  rpm  pada  suhu  37°C,  selama  16-18 jam.  Plasmid DNA akan diisolasi menggunakan kit EZ 10 Spin column Plasmid DNA sesuai dengan prosedur dalam manual.  Konsentrasi DNA yang diperoleh akan dihitung  menggunakan  mesin  DNA/RNA  (Nano  Drop 2000).
Transfeksi  dapat  menggunakan  kalsium  fosfat, liposom,  dan  transfast  komersial.    Larutan  untuk transfeksi ikan wild betta digunakan transfast komersial X-tremeGENE  HP  DNA.  Keberhasilan  transfeksi ditentukan oleh konsentrasi transfektan dan konstruksi gen yang digunakan.  Pemilihan larutan X-tremeGENE disesuaikan  dengan  ukuran  dan  tingkat  pembelahan sel pada embrio ikan wild betta.  X-tremeGene adalah larutan yang terdiri atas campuran lipid dan komponen lain  yang  berupa  etanol  80%,  disaring  dengan menggunakan membran berpori berukuran 0,2 µM dan dikemas  dalam  botol  kaca  tanpa  mengandung  unsur dari manusia atau hewan.
Transfeksi dilakukan pada embrio fase pembelahan 2  sel.    Larutan  transfeksi  dibuat  dari  campuran  DNA plasmid  pada  media  NaCl  0,9%  hingga  mencapai konsentrasi  akhir  100  µL  media  (campuran  transfast +  DNA  +  NaCl).    Campuran  tersebut  dimasukkan  ke dalam tabung mikro 600 µL diaduk dengan mikropipet dan  dihomogenkan  menggunakan  vorteks  sebelum diperlakukan.    Selanjutnya  larutan  tersebut  diambil menggunakan mikropipet dan dicampurkan ke embrio yang  telah  dikoleksi  didalam  cawan  petri  tersebut diaduk  sampai  semua  terendam  dan  diinkubasi dalam  suhu  ruang  selama  30  menit  pada  suhu  ruang (28°C-29°C)  dapat  dilihat  pada  Gambar  2.  Telur diinkubasi dalam wadah berupa styrofoam berdiameter 10 inci dengan volume air 1 L.
Keberhasilan  dari  teknik  transfer  gen  tersebut dibuktikan  dengan  adanya  ekspresi  gen  atau  deteksi
DNA gen GFP yang dimasukkan. Ekspresi hasil korporasi DNA ke dalam telur melalui transfeksi pada wild betta dan  keberhasilan  transfer  gen  GFP  dapat  dibuktikan dengan analisis PCR.

## HASIL DAN BAHASAN
Metode  dalam  transgenik  di  antaranya  adalah mikroinjeksi, electroporation, sperm delivery, particle bombardment,  dan  lipofection.  Namun  metode yang  umum  digunakan  adalah  metode  mikroinjeksi. Dengan  metode  ini,  gen  asing  diintroduksikan  ke dalam embrio ikan menggunakan sebuah jarum injeksi dengan  diameter  yang  sangat  kecil  sekitar  5-7  µm. Penggunaan  mikroskop  sangat  diperlukan  selama proses mikroinjeksi berlangsung.
Perkembangan metode transfer semakin mempertimbangkan analisis biaya, waktu, dan efisiensi yang lain.  Adapun metode yang telah berkembang juga dan dapat diaplikasikan terhadap ikan adalah metode transfeksi.  Metode  ini  tidak  memerlukan  alat  yang spesifik,  yaitu  melalui  perendaman  embrio  atau  telur ikan.  Metode ini sangat cocok untuk ikan-ikan maupun udang yang memijah secara alami.  Berdasarkan hasil penelitian  Sun et  al. (2005)  dengan  melakukan  tiga metode  terhadap  udang  memberikan  hasil  terbaik pada metode transfeksi.
Teknik  transfeksi  dengan  menggunakan  reagen sebagai  bahan  transfeksi  yang  umumnya  JetPEI, X-treme  Gene,  lipid,  dan  transfas.    Larutan  transfeksi yang dipilih sebaliknya tersedia luas secara komersial, mudah  diaplikasikan,  memiliki  kemampuan delivery yang tinggi, dan tidak bersifat toksik terhadap embrio maupun pengguna.
Prinsip  kerja  dari  transfer  gen  dengan  metode transfeksi  antara  lain  sebagai  contoh  sebuah  plasmid dapat  ditransfer  dengan  menggabungkan  protoplas bakteri  dengan  sel  yang  akan  ditransfeksikan. Penggabungan  DNA  secara in-vitro dengan  berbagai molekul  yang  membentuk  suatu  kompleks  yang memasuki sel bersifat efesien.  Salah satu molekul yang biasa digunakan adalah kalsium klorida.  Gugus fosfat
Gambar 2. Proses transfeksi selama 30 menit
Figure 2.  Transfection process for 30 second
Transfeksi merupakan metode teknologi transgenik penyisipan green fourescent protein..... (Eni Kusrini)
DNA terikat ke kalsium menghasilkan suatu kompleks tidak larut, yang berpresipitasi jika kelebihan kalsium dan  fosfat  ditambahkan  ke  DNA.  Campuran  tersebut ditambahkan ke dalam medium kultur. Sejumlah kecil kompleks tidak larut yang melingkupi sel kemudian di endositosis secara spontan. DNA kemudian dilarutkan ulang  di  dalam  sitoplasma  sel.  Sebagian  besar  DNA yang  masuk  didegradasi  dan  sisanya  bisa  mencapai nukleus, di mana DNA tersebut kemudian ditranskripsi.
Deteksi  sementara  pada  hasil  korporasi  DNA  ke dalam embrio melalui transfeksi ikan wild betta dapat dilihat pada Gambar 3. Pada Gambar 3 benih ikan wild betta berumur sekitar tiga bulan yang sudah dapat dilihat bahwa gen GFP yang disisipkan jelas terdeteksi positif. Untuk  membuktikan  dan  memastikan  keberadaan  GFP (DNA)  pada  benih  ikan  wild  betta  tersebut  dilakukan PCR  terhadap  sirip  ekor  yang  diambil  sekitar  0,45  g. Hasil dari PCR jaringan sirip menunjukkan semua positif membawa gen, tetapi harus dianalisis lebih lanjut untuk masing-masing individu.
Ekspresi gen sementara berhubungan erat dengan ketahanan  dari  DNA  yang  dimasukkan  (Lyengar, et al .,  1996).    Tingginya  ekspresi  yang  terjadi  pada  fase gastrula  kemungkinan  sebagai  hasil  dari  akumulasi DNA yang diinjeksikan yang berlanjut pada peningkatan replikasi pada fase pembelahan ( cleavage ) dan akumulasi dari  enzim  (RNA  polymerase  II)  yang  menyebabkan dimulainya  transkripsi  pada  saat  MBT  ( mid-blastula transition ).  Lebih  lanjut  dijelaskan  bahwa  degradasi dari DNA pada saat fase lanjutan pada pembelahan sel diperkirakan  akan  menyebabkan  penurunan  bertahap dari jumlah DNA sehingga ekspresi sementara gen GFP akan semakin melemah.
Ekspresi sementara umumnya muncul setelah MBT, tergantung promoter yang digunakan.  Pada penelitian ini,  ekspresi  sementara  gen  GFP  pada  larva  mulai
muncul pada saat tumbuhnya sirip.  Sebenarnya pada fase gastrula sudah mulai muncul tetapi waktu itu tidak diamati,  karena  kekhawatiran  ikan  mengalami  stres. Akhirnya  pengamatan  secara  deskriptif  dilakukan bertahap mulai umur tiga minggu sampai sirip sudah mulai panjang dan kemungkinan dapat dipotong untuk dilakukan PCR.
Keberhasilan masuknya gen yang ditransfeksi dapat dianalisis dengan sintesis cDNA embrio maupun benih. Untuk selanjutnya apabila ingin mengetahui gen GFP yang ditransfeksikan  diturunkan  atau  tidak  dapat  dilakukan dengan verifikasi tehadap gonad calon induk ikan wild betta (F0). Apabila dalam gonad ternyata terekspresi gen tersebut, maka ikan wild betta hasil transfeksi nantinya akan disilangkan dengan ikan yang tidak diberi perlakuan dan sebaliknya.  Hal tersebut dilakukan dengan maksud untuk mendapatkan F1, apakah ekspresi gen GFP yang diijeksikan dapat diwariskan, dan seberapa persen nilai pewarisannya,  serta  ekspresi  tersebut  terdapat  pada jaringan apa.  Perlakuan tersebut berlangsung seterusnya F2, F3, dan seterusnya, dengan demikian hasil penelitian ini merupakan penelitian dasar yang baru dapat melihat ekspresi gen pada benih ikan wild betta.
Keuntungan secara ekonomi dari rekayasa genetika ini  sangat  menjanjikan  dibandingkan  dengan  teknik pemijahan  selektif,  waktu  yang  dibutuhkan  sangat singkat  untuk  mencapai  hasil  yang  sama.    Sehingga tujuan  dari  transgenik  adalah  untuk  mendapatkan sifat  yang  diinginkan  dan  peningkatan  produksi. Meskipun  teknologi  transgenik  ini  memungkinkan untuk diaplikasikan dalam bidang akuakultur (budidaya perikanan), namun masih perlu dilakukan penelaahan khusus untuk mengetahui teknologi tersebut.
Teknologi  manipulasi  gen  untuk  meningkatkan laju  pertumbuhan  ikan  potensial  untuk  diaplikasikan dalam  industri  akuakultur.    Dengan  perbaikan  teknik
Gambar 3. Deteksi DNA gen GFP yang ditransfeksi pada embrio ikan wild betta (M= Marker; 1,2,3,4,5= sampel uji; K-= Kontrol negatif; K+= Kontrol positif)
Figure 3.  Detection of gene GFP DNA by transfected to wild betta fish embrio (M=
Marker; 1,2,3,4,5= sample; K-= Control negative; K+= Control positive)
dan  penambahan  pengalaman  dalam  metode  insersi gen,  telah  diproduksi  berbagai  spesies  ikan  yang pertumbuhannya  cepat.  Keberhasilan  penerapan teknologi  transgenik  ini  bergantung  kepada  transfer gen  yang  diekspresikan  dan  diwariskan  dengan  cara yang  stabil  serta  dapat  diprediksi.  Sedangkan  untuk metode  transfeksi  dapat  berpotensi  dikembangkan dalam  transgenesis  terhadap  ikan  wild  betta  karena reagen  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  tidak bersifat  toksik  pada  individu  target  (Prasetio et  al. , 2013).

## KESIMPULAN
Metode penyisipan (induksi) gen pemendar warna (GFP) dapat dilakukan menggunakan metode transfeksi pada embrio ikan wild betta.
Gen  pemendar  warna  (GFP)  yang  diinsersikan  ke dalam  telur  telah  diidentifikasi  pada  embrio  secara massal dengan PCR

## DAFTAR ACUAN
Alimuddin, Yoshizaki, G., Carman, O., & Sumantadinata, K.  (2003).  Aplikasi  transfer  gen  dalam  akuakultur. Jurnal Akuakultur Indonesia , 2(1), 41-50.
Collas,  P.,  Husebeye,  H.,  &  Alestrom,  P.  (2000).
Transferring  foreign  genes  into  zebrafish  eggs  by microinjection. Transgenic  Animal: Generation  and Use , p. 119-122.
Garcia-Pozo,  S.,  Bejar,  J.,  Shaw,  M.,  &  Alvarez,  M.C.
(1998). Effect of exogenous DNA microinjection on early development response of the seabream Sparus aurata.  Molecular  Marine  Biology  and  Biotechnology , 7(4), 248-257.
Kato, K., Takagi, M., Tamaru, Y., Akiyama, S., Konishi, T., Murata, O., & Kumai, H. (2007). Construction of an expression vector containing a ß-actin promoter region for gene transfer by microinjection in red sea bream Pagrus major. Fisheries Science , 73, 440-445.
Khoo, H.W. (2000). Transgenesis and its applications in aquaculture. Asian Fish Sci ., 8, 1-25.
Kinoshita,  M.,  &  Ozato,  K.  (1995).  Cytoplasmic microinjention  of  DNA  into  fertilized  medaka ( Oryzias latipes ) eggs. The Fish Biology Journal Medaka , 7, 59-64.
Kobayashi,  S.I.,  Alimuddin,  Morita,  T.,  Miwa,  M.,  Lu, J.,  Endo,  M.,  Takeuci,  T.,  &  Yoshikazi,  G.  (2007). Transgenic  nile  tilapia  ( Oreochromis  niloticus ) over-expressing  growth  hormone  show  reduced ammonia excretion. Aquaculture , 270, 427-435.
Meng,  A.,  Jessen,  J.R.,  &  Lin,  S.  (1999).  Transgenesis: methods  in  cell  biology. In Detrich,  H.W.  III, Westerfield, M., & Zon, L.I. (Eds.). 60, 133-148.
Parenrengi,  A.,  Tenriulo,  A.,  Tonnek,  S.,  &  Lante,  S. (2011).  Transfer  gen  antivirus  pada  embrio  udang windu, Penaeus monodon dalam berbagi konsentrasi DNA. J. Ris. Akuakultur , VI(93), 353-361.