## PENURUNAN SINTESIS NITRIC OXIDE PADA KULTUR HUVECs DALAM KONDISI HIPERGLIKEMIA AKUT

## DECREASING NITRIC OXIDE SYNTHESIS IN HUVECS CULTURE WITH ACUTE HYPERGLYCEMIA CONDITIONS

## I Putu Dedy Arjita
Fakultas Kedokteran, Universitas Islam Al-Azhar, Mataram, Nusa Tenggara Barat Korespondensi: I Putu Dedy Arjita. Email: ipdedyarjita@unizar.ac.id , iputudedyarjita@gmail.com

## ABSTRAK
Diabetes mellitus merupakan penyakit metabolik dengan hiperglikemia yang cenderung mengakibatkan disfungsi sel endotel, akibat adanya mekanisme sintesis nitric oxide (NO). Penelitian ini bertujuan untuk mengukur produksi NO dari kultur Human umbilical vein endothelial cell (HUVECs) yang terpapar glukosa pada beberapa variasi kosentrasi dengan menggunakan teknik bioassay. Penelitian ini menggunakan desain Randomized Control Trial (RCT) 3 kelompok. Kultur HUVECs yang dipaparkan glukosa selama 3 hari. Kelompoknya yaitu kelompok normal (glukosa 5 mM), keadaan hiperglikemi akut dengan variasi glukosa 22mM, dan glukosa 33 mM. Produksi NO diukur dengan membandingkan efek relaksasi pemberian larutan HUVECs terpapar glukosa pada aorta marmut pra-kontraksi  fenilefrin  (10 -6 M)  dengan  efek  isosorbid  dinitrat  pada  aorta  marmut  pra-kontraksi  fenilefrin. Kontraktilitas  dicatat  dengan  menggunakan  Mc  Lab  Computer.  Penurunan  sintesis  NO  pada  kultur  HUVECs terendah terjadi pada perlakuan dengan pemaparan konsentrasi glukosa tertinggi (33 mM) dengan nilai rata-rata 0.17 x 10 -7 ± 0.09 x 10 -7 dengan nilai signifikansi < 0,05. Sehingga dapat disimpulkan bahwa ada keterkaitan antara kondisi hiperglikemia akut dengan penurunan kultur HUVECs untuk mensintesis NO.

## Kata Kunci: Nitric Oxide, HUVECs, Hiperglikemia Akut

## ABSTRACT
Diabetes mellitus is a metabolic disease with hyperglycemia that tends to cause endothelial cell dysfunction, due to the mechanism of decreasing nitric oxide (NO) synthesis. This study aimed to measure NO production from human  umbilical  vein  endothelial  cell  (HUVECs)  cultures  exposed  to  glucose  at  various  concentrations  using bioassay  techniques.  This  study  used  a  3  group  Randomized  Control  Trial  (RCT)  design.  Culture  of  HUVECs exposed  to  glucose  for  3  days.  The  groups  were  the  normal  group  (glucose  5  mM),  acute  hyperglycemia  with variations in glucose 22 mM, and glucose 33 mM. NO production was measured by comparing the relaxing effect of glucose-exposed HUVECs solution on the aorta of pre-contracted phenylephrine guinea pigs (10-6 M) with the effect of isosorbide dinitrate on the aorta of pre-contracted phenylephrine guinea pigs. Contractility was recorded using a Mc Lab Computer. The lowest reduction in NO synthesis in HUVECs culture occurred in the treatment with the highest  glucose  concentration  exposure  (33  mM)  with  an  average  value  of  0.17  x  10-7  ±  0.09  x  10-7  with  a significance value <0.05. So it can be concluded that there was a relationship between acute hyperglycaemia with decreased NO synthesis in HUVECs culture.

## Keywords: Nitric Oxide, HUVECs, Acute Hyperglycemia
How To Cite: Arjita, I. (2022). PENURUNAN SINTESIS NITRIC OXIDE PADA KULTUR HUVECs DALAM KONDISI HIPERGLIKEMIA AKUT. Biomedika, 14(1), 1-9. doi:https://doi.org/10.23917/biomedika.v14i1.13279
DOI : https://doi.org/10.23917/ biomedika. v14i1.13279

## PENDAHULUAN
World  Health  Organization  (WHO)  telah melaporkan bahwa ada sekitar 422 juta orang di seluruh dunia menderita diabetes mellitus (DM), mayoritas penderita tinggal di negara berpenghasilan rendah dan menengah, dan 1,6 juta kematian telah secara langsung dikaitkan dengan diabetes setiap tahun (WHO, 2020).
Peningkatan  ini  terjadi  pada  DM  tipe  1  dan tipe  2.  Secara  global,  menurut  International Diabetes Federation (IDF), terdapat 352 juta orang dewasa dengan gangguan toleransi glukosa yang berisiko  tinggi  terkena  diabetes  pada  tahun 2045 (Bommer et al., 2018).
Diabetes mellitus adalah sekelompok penyakit metabolik  yang  ditandai  dengan  hiperglikemia akibat  cacat  sekresi  insulin,  kerja  insulin,  atau keduanya.  Hiperglikemia  kronis  pada  DM dikaitkan  dengan  kerusakan  jangka  panjang, disfungsi, dan kegagalan berbagai organ, terutama mata, ginjal, saraf, jantung, dan pembuluh darah (American Diabetes Association, 2010).
Komplikasi diabetes dibagi menjadi komplikasi makro  vaskuler yaitu penyakit arteri koroner, penyakit vaskuler perifer dan stroke serta komplikasi  mikro  vaskular  yaitu  nefropati diabetikum, retinopati dan neuropati (Adela et al.,
2015).  Jika  dibandingkan  dengan  semua
komplikasi,  disfungsi  endotel  adalah  masalah umum  pada  pasien  diabetes. Sel  endotel mengeluarkan  mediator  yang  berbeda  seperti vasodilator:  oksida  nitrat  dan  vasokonstriktor (endotelin-1). Hiperglikemia dan perubahan metabolisme lainnya dapat menyebabkan gangguan produksi oksida nitrat (NO) (Avogaro et al ., 2011).
Salah  satu  penelitian  meta-analisis  telah melaporkan bahwa adanya peningkatan konsentrasi  NO  pada  pasien  DM  tipe  1  dan  2, meningkatkan  kejadian  klinis  merugikan  yang diamati  pada  pasien  diabetes,  seperti  disfungsi endotel,  resistensi  insulin  dan  beta  pankreas. disfungsi  sel  (Assmann et  al. ,  2016).  Pada umumnya  pasien  DM  dan  hiperglikemia  kronis menyebabkan munculnya gangguan produksi dan aktivitas oksida  nitrat  (NO) (Avogaro et  al. , 2011). NO  adalah  gas  tidak  berwarna  dan  tidak berbau yang larut dalam pelarut berair dan organik dan merupakan produk dekomposisi dari banyak senyawa nitro dan nitro yang tidak stabil (Ignarro, 2014).
Nitric  Oxide  (NO)  kemungkinan  memiliki efek  yang  menguntungkan  dan  merugikan tergantung  pada  konsentrasinya (Adela et  al. , 2015). Di  satu  sisi,  NO  menyebabkan  relaksasi pembuluh  darah  sehingga  menurunkan  tekanan
darah,  mencegah agregasi  dan  adhesi  platelet, membatasi  timbulnya  oksidasi  kolesterol  LDL, menghambat  proliferasi  sel  otot  polos,  dan menurunkan  ekspresi  gen  proinflamasi  yang berhubungan dengan aterogenesis. Di sisi lain, NO berinteraksi  dengan  O 2 menyebabkan  inaktivasi NO dan produksi peroxynitrite, yang dimodifikasi pasca-transkripsi ,  yang  menyebabkan  kondisi patologis  (Förstermann,  2010;  Pacher et  al .,
2007),  diantaranya  menyebabkan  disfungsi endotel  dengan  merangsang  produksi  mediator inflamasi  dan  peroksidasi  lipid  sehingga  terjadi peningkatan permeabilitas sel (Ishii et al., 2001).
Pada pasien diabetes, hiperglikemia merangsang  produksi advancedgGlycation  end
(AGEs), dan meningkatkan poliol, protein kinase C (PKC)  dan hexosamine    jalur,  yang  dapat menyebabkan stres  oksidatif  (Brownlee,  2005; Pitocco et al. , 2010). Kemudian, spesies oksigen reaktif berlebihan (ROS), seperti anion superoksida (O 2 - ), bereaksi cepat dengan radikal NO,  membentuk  anion  peroksinitrit,  yang merupakan oksidan toksik yang mampu merusak beberapa  molekul-molekul  biologis,  sehingga terjadi  kerusakan  jaringan (Beckman  and  Crow, 1993;  Förstermann,  2010;  Honing et al .,  1998).
Penelitian ini bertujuan untuk mengukur produksi NO pada kultur Human umbilical vein endothelial
cell (HUVECs)  yang  telah  diinduksi  glukosa dengan  variasi  kosentrasi  menggunakan  teknik bioassay.

## METODE
Penelitian  ini  menggunakan Randomized Control Trial rancangan acak lengkap pada kultur sel  HUVECs  yang  diinkubasi  dengan  3  variasi konsentrasi glukosa.
Penelian  pendahuluan  dose-response  curve antara isosorbide dinitrate dengan phenylephrine 10 6 M  untuk  mengetahui  dan  mengkuantifikasi sintesa NO pada kultur HUVECs kondisi normal maupun kultur HUVECs yang diperlukan dengan paparan berbagai konsentrasi glukosa dilakukan sebelum penelitian utama.
Pemaparan  kondisi  hiperglikemia  biasanya dilakukan selama 48 jam (Curcio, 1992; Parzer, 1995; Sharpe, 1998), peneliti memilih 3 hari (72 jam),  dengan  3  kelompok  penelitian,  yaitu: kelompok  normal  (konsentrasi  glukosa  5  mM), kelompok  perlakuan  I  (kosentrasi  Glukosa  22 mM),  dan  kelompok  perlakuan  II  (konsentrasi glukosa 33 mM).
Penggukuran  sintesis  nitric  oxide  dilakukan dengan  cara:  kultur  HUVECs  yang  telah  dalam keadaan monolayer di dalam flask 25 cm 2 , dicuci dua kali dengan menggunakan medium serum free dengan volume setiap pencucian masing-masing
adalah 2 mL, kemudian kultur HUVECs ditambah larutan Kreb’s 400 uL sebagai larutan fisiologis, kemudian  digoyangkan  untuk  sebaran  yang merata.  Kemudian  ditambahkan  dengan  10  uL super  oxide  dismutase (SOD)  konsentrasi  15 units/mL Diinduksi dengan neurohumoral adenosin diphospate (ADP) 10 -8 M (dalam pelarut
Kreb's) dengan volume 600 uL, untuk mencapai volume  akhir  l  mL.  Digoyang  dan  diratakan, kemudian  diinkubasi  selama  3  menit.  Larutan dipipeting  dengan pipet  volume ,  kemudian diteteskan secara perlahan ke dalam jaringan aorta marmut  yang  sudah  terpisah,  yang  sebelumnya telah dikontraksikan dengan phenylephrine 10 -6 M,
selanjutnya  dicatat  responnya.  Setelah  pipeting larutan  dari  flask  kultur  HUVECs,  kultur  sel segera diberi medium serum free sebanyak 2 mL, kemudian dikembalikan untuk inkubasi selama 25 menit. Selanjutnya langkah percobaan ini diulangi sebanyak 3 kali ulangan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hilangnya kemampuan respon relaksasi aorta marmut  terhadap  asetilkolin  10 -6 M  yang  di- prekontraksikan  dengan  phenylephrine  10 -6 M setelah HUVECs dipermukaan intima dihilangkan ( rubbed endothelial ). Kemampuan respon tersebut disajikan dalam grafik pada Gambar 1 D.
Gambar 1 . A, B, dan C merupakan kultur HUVECs selama 3 hari dengan kondisi normal glukosa 5mM (A), kondisi konsentrasi glukosa 22 mM (B), dan kondisi konsentrasi glukosa 33 mM (C). Gambar 1 D merupakan grafik yang menunjukan hilangnya respon realksasi aorta martmut tanpa endotel terhadap asetil kolin
Gambar  1  A.  menunjukan  Kultur  HUVECs dalam kondisi normal memiliki bentuk sel cable stone dengan spesifisitas sel pada bagian tengah tampak  bulat  dan  jelas.  Bentuk  sel  pipih,  jarak aniar  sel  teratur  dan  permukaan  sel  smooth ditandai oleh kejelasan inti sel, membran plasma, sitoplasma dan extra cellular matrix (ECM).
Dijelaskan  Sumitro  (2001)  bahwa  terdapat hubungan antara bentuk yang dalam hal ini adalah struktur sel dan fungsi, artinya setiap perubahan ke  arah  perbedaan  struktur  dapat  diterjemahkan sebagai  perubahan  sifat  dan  fungsi  sel.  Hal  ini berkaitan  dengan  struktur  dan  fungsi  HUVECs normal.
Gambar  1  B.  menunjukan  Kultur  HUVECs kondisi konsentrasi glukosa 22 mM selama 3 hari menunjukkan adanya ECM dan sitoplasma yang jelas,  permukaan  sel  mulai  kurang  rata, sitoskeleton nampak memendek dan sel menjadi memadat  dan  rapat.  Disamping  itu juga  tampak terjadi beberapa membran blebbing dan shrinkage. Sepintas terlihat tidak jauh berbeda dengan kultur HUVECs kondisi normal.
Gambar  1  C.  menunjukan  Kultur  HUVECs dalam kondisi konsentrasi glukosa 33 mM selama 3 hari tampak ditandai dengan adanya kerusakan pada  struktur  membran  plasma  yang  diawali dengan membran blebbing yang semakin banyak, peningkatan  shrinkage  dan  permukaan  sel  yang menjadi semakin kasar (tidak rata). Disamping itu juga  terjadi  pemendekan  sitoskeleton  dan kerusakan pada ECM sehingga nampak menjadi sangat kasar.
Dari dose-response  curve didapatkan  suatu persamaan  regresi  kemudian  selisih  antara peningkatan kontraksi oleh phenylephrine 10 -6 M dengan besarnya relaksasi yang ditimbulkan oleh kultur  HUVECs  dengan  konsentrasi  masing- masing  perlakuan  diukur  sehingga  kuantifikasi sintesa NO dapat diukur.
Selanjutnya  dilakukan  uji Analysis  of Variance dan  uji  lanjut  dengan  Uji  Beda  Nyata Terkecil dengan confidence interval 95%. Tabel 1. menunjukan  hasil  yang  diperoleh  yaitu  bahwa sintesa NO pada kultur HUVECs terendah terjadi pada  perlakuan  dengan  pemaparan  konsentrasi glukosa 33 mM dengan nilai rata-rata 0.17 x 10 -7 ±
0.09 x 10 -7 dan tertinggi pada perlakuan dengan pemaparan konsentrasi glukosa 22 mM selama 3 hari, dengan nilai rata-rata 2.91 x 10 -7 ± 0.20 x 10 - 7 .  Sedangkan  nilai  rata-rata  sintesa  NO  pada kondisi normal adalah 1.45 x 10 -7 ± 0.30 x 10 -7 .
Tabel 1. Hasil Pengukuran Sintesa NO Pada Kultur HUVECs
Perlakuan Mean ± SD p Normal 1.45 x 10 -7 ± 0.30 x 10 -7 <0.05 Perlakuan I 2.91 x 10 -7 ± 0.20 x 10 -7 Perlakuan II 0.17 x 10 -7 ± 0.09 x 10 -7
Berdasarkan  analisa  statistik,  didapatkan bahwa  kondisi  konsentrasi  glukosa  tinggi  pada kultur  HUVECs  yang  diperlakukan  dengan pemaparan  glukosa  konsentrasi  tinggi.  Hal  ini membuktikan  bahwa  ada  keterkaitan  antara tingginya konsentrasi glukosa dengan kemampuan sintesa NO pada kultur HUVECs.
Pada penelitian ini, hasil pengukuran sintesa NO  pada  kultur  HUVECs  kondisi  normal distimulasi dengan menggunakan neurohormonal adenosin  diphospat (ADP)  untuk  mengetahui sintesa  NO  yang  secara  teknik  bioassay  dapat merelaksasikan aorta marmot terpisah. Sintesa NO yang  diperoleh  dapat  dilihat  seperti  pada penggunaan adenosin diphosphat untuk menginduksi sintesa NO dari HUVECs didasarkan pada pertimbangan ketersediaan di laboratorium relatif murah dan mudah diperoleh. Disamping itu kemampuan  untuk  merangsang  sintesis  NO dengan  kandungan  substansi  P-nya  juga  relatif
tidak  berbeda  dengan  mediator  neurohumoral lainnya.
Dalam  kondisi  konsentrasi  glukosa  normal kultur HUVECs memperlihatkan bentuk sel cable stone dengan  membran  sel  yang  nampak  nyata, smooth dan  teratur,  yang  menunjukkan  bahwa belum  terjadi  kerusakan  struktur  maupun fungsinya secara fisiologis.
Pada kondisi konsentrasi glukosa tinggi yang memicu proses stres oksidatif melalui jalur reaksi glukosa  autooksidasi,  sorbitol-myoinositol  dan glikasi  non-enzimatik,  ternyata  memberikan pengaruh nyata terhadap sintesa dan release NO.
Hal  ini  terlihat  pada  perlakuan  dengan  adanya pemaparan glukosa konsentrasi 33 mM selama 3 hari.    Proses  stress  oskidatif  yang  dipicu  oleh meningkatnya  generasi  radikal  bebas  pada keadaan  konsentrasi  glukosa  tinggi,  khusunya melalui polyol-pathway dan glukosa autooksidasim  diduga  menyebabkan  rusaknya molekul reseptor membran sel.
Penelitian  lainnya  meneliti  pelepasan  NO diperiksa  dengan  kontrol  (5,5  mM)  dan  level glukosa tinggi menunjukkan bahwa glukosa tinggi meningkatkan  ekspresi  protein  eNOS,  tetapi akhirnya menurunkan pelepasan NO. Penurunan bioavailabilitas  NO  tampaknya  terkait  dengan kelebihan produksi superoksida dan L- defisiensi- arginine. Hal  ini  memperjelas  dasar  molekuler dari  mekanisme  dimana  peningkatan  glukosa menyebabkan ketidak seimbangan antara NO dan superoksida yang mengakibatkan gangguan fungsi dari  setiap endotel. Selain  itu,  pemulihan fungsi NO  dengan  administrasi L -arginine  dan  asupan antioksidan yang memadai menunjukkan pengobatan suportif potensial untuk pasien dengan nefropati diabetic (Hoshiyama et al., 2004).
Perlakuan pemaparan glukosa dengan konsentrasi 22 mM pada HUVECs selama 3 hari ternyata justru menimbulkan peningkatan sintesa NO yang lebih tinggi  bila dibandingkan dengan keadaan glukosa normal (5 mM). Meningkatnya sintesa  NO  pada  HUVECs  yang  diperlakukan dengan  pemaparan  konsentrasi  glukosa  22  mM selama  3  hari  diduga  terjadi  sebagai  proses kompensasi  atas  terjadinya  deaktivasi  NO  oleh adanya  peningkatan  dari  pembentukan  generasi radikal bebas superoksida.  Demikian pula, kultur primer HUVECs yang diperoleh dari kehamilan
diabetes  gestasional  menunjukkan  peningkatan sintesis  NO  (Di  Fulvio et  al. ,  2006).  Hasil  ini berbeda karena kultur HUVECs yang digunakan diperoleh  dari  kehamilan  diabetes  gestasional, bukan  HUVECs  yang  dibiakkan  dalam  glukosa tinggi.
Berdasarkan  pengamatan  struktur  pada kondisi konsentrasi glukosa 22 mM selama 3 hari, sepintas tampak relatif tidak jauh berbeda dengan kultur  HUVECs  kondisi  normal.  Namun  pada perlakuan  ini  terjadi  pemendekan  sitoskeleton, jarak antar sel semakin rapat, beberapa shrinkage dan  sedikit  membran blebbing .  Terbentuknya radikal superoksida pada perlakuan ini akan dapat berinteraksi dengan NO membentuk peroksinitrit (ONOO).  Pada  konsentrasi  rendah  peroksinitrit dapat bersifat dan berfungsi seperti NO, sehingga tampak  terjadi  peningkatan  sintesa  NO  akibat vasodilatasi yang ditimbulkannya (Ridnour et al.,
2004).  Di  samping  itu,  peningkatan  sintesa  NO diduga pula sebagai akibat meningkatnya aktivitas protein kinase-C.

## SIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulannya, terjadi penurunan sintesa NO sebagai  proses  kompensasi  terhadap  deaktivasi NO  oleh  generasi  radikal  bebas  pada  kultur HUVECs yang terpapar glukosa konsentrasi tinggi (hiperglikemia  akut).  Penelitian  lebih  lanjut
diharapkan dapat mengamati kemampuan sintesis NO dengan melihat variasi lama induksi glukosa tinggi pada kultur HUVECs.

## DAFTAR PUSTAKA
Adela, R., Nethi, S. K., Bagul, P. K., Barui, A. K., Mattapally,  S.,  Kuncha,  M.,  Patra,  C.  R., Reddy,  P.  N.  C.,  &  Banerjee,  S.  K.  2015. Hyperglycaemia  Enhances  Nitric  Oxide Production in Diabetes: A Study from South Indian Patients. PLoS One , 10 (4), e0125270.
Available at: https://doi.org/10.1371/journal.pone.012527 0
American Diabetes Association. 2010. Diagnosis and  classification  of  diabetes  mellitus.  In Diabetes Care (Vol. 33, Issue SUPPL. 1, p.
S62).  American  Diabetes  Association. Available  at:  https://doi.org/10.2337/dc10- S062
Assmann, T. S., Brondani, L. A., Bouças, A. P., Rheinheimer, J., de Souza, B. M., Canani, L. H., Bauer, A. C., & Crispim, D. 2016. Nitric oxide  levels  in  patients  with  diabetes mellitus:  A  systematic  review  and  meta- analysis. Nitric  Oxide  -  Biology  and Chemistry , 61 , 1–9. Available at:
https://doi.org/10.1016/j.niox.2016.09.009
Avogaro,  A.,  Albiero,  M.,  Menegazzo,  L.,  De Kreutzenberg,  S.,  &  Fadini,  G.  P.  2011.
Endothelial dysfunction in diabetes: The role of reparatory mechanisms. In Diabetes Care (Vol. 34, Issue SUPPL. 2, pp. S285–S290). American  Diabetes  Association.  Available at: https://doi.org/10.2337/dc11-s239
Beckman,  J.  S.,  and  Crow,  J.  P.  1993.
Pathological  implications  of  nitric  oxide, superoxide  and  peroxynitrite  formation.
Biochemical  Society  Transactions , 21 (2), 330–334. Available
at: https://doi.org/10.1042/bst0210330
Bommer,  C.,  Sagalova,  V.,  Heesemann,  E., Manne-Goehler, J., Atun, R., Bärnighausen, T., Davies, J., & Vollmer, S. 2018. Global Economic  Burden  of  Diabetes  in  Adults: Projections  From  2015  to  2030. Diabetes Care , 41 (5),  963–970.  Available  at:
https://doi.org/10.2337/dc17-1962
Brownlee, M. 2005. The pathobiology of diabetic complications:  A  unifying  mechanism. Diabetes , 54 (6),  1615–1625.  Available  at: https://doi.org/10.2337/diabetes.54.6.1615
Di  Fulvio,  P.,  Formoso,  G.,  Di  Silvestre,  S.,  Di Tomo, P., Giardinelli, A., La Sorda, R., Di Pietro,  N.,  Piantelli,  M.,  Consoli,  A.,  & Pandolfi,  A.  2006.  Mo-W2:5  Increased vascular  wall  endothelial  nitric  oxide synthase (ENOS) levels in umbilical cords from gestational diabetic women.
Atherosclerosis  Supplements , 7 (3),  14. Available at: https://doi.org/10.1016/s1567- 5688(06)80034-6
Förstermann, U. 2010. Nitric oxide and oxidative stress in vascular disease. In Pflugers Archiv European Journal of Physiology (Vol. 459, Issue 6, pp. 923–939). Springer. Available at: https://doi.org/10.1007/s00424-010- 0808-2
Honing, M. L. H., Morrison, P. J., Banga, J. D., Stroes,  E.  S.  G.,  &  Rabelink,  T.  J.  1998. Nitric oxide availability in diabetes mellitus. In Diabetes/Metabolism  Reviews (Vol.  14,
Issue 3, pp. 241–249). John Wiley & Sons,
Ltd. Available at: https://doi.org/10.1002/(SICI)1099- 0895(1998090)14:3<241::AID- DMR216>3.0.CO;2-R
Hoshiyama,  M.,  Li,  B.,  Yao,  J.,  Harada,  T.,
Morioka, T., & Oite, T. 2004. Effect of High
Glucose  on  Nitric  Oxide  Production  and Endothelial  Nitric  Oxide  Synthase  Protein
Expression in Human Glomerular
Endothelial  Cells. Nephron  Experimental Nephrology , 95 (2),  e62–e68.  Available  at: https://doi.org/10.1159/000073673
Ignarro,  L.  J.  2014.  Nitric  Oxide.  In Reference Module  in  Biomedical  Sciences .  Elsevier. Available at: https://doi.org/10.1016/B978- 0-12-801238-3.00245-2
Ishii,  N.,  Patel,  K.  P.,  Lane,  P.  H.,  Taylor,  T., Bian,  K.,  Murad,  F.,  Pollock,  J.  S.,  & Carmines,  P.  K.  2001.  Nitric  Oxide Synthesis and Oxidative Stress in the Renal Cortex  of  Rats  with  Diabetes  Mellitus.
Journal  of  the  American  Society  of
Nephrology , 12 (8).
Pacher, P., Beckman, J. S., & Liaudet, L. 2007. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. In Physiological Reviews (Vol. 87, Issue 1, pp. 315–424). American Physiological Society. Available at: https://doi.org/10.1152/physrev.00029.2006
Pitocco, D., Zaccardi, F., Di Stasio, E., Romitelli,
F., Santini, S. A., Zuppi, C., & Ghirlanda, G.
2010.  Oxidative  stress,  nitric  oxide,  and diabetes. In Review of Diabetic Studies (Vol. 7,  Issue  1,  pp.  15–25).  Available  at: https://doi.org/10.1900/RDS.2010.7.15
Ridnour,  L.  A.,  Thomas,  D.  D.,  Mancardi,  D., Espey, M. G., Miranda, K. M., Paolocci, N., Feelisch,  M.,  Fukuto,  J.,  &  Wink,  D.  A. 2004.  The  chemistry  of  nitrosative  stress induced by nitric oxide and reactive nitrogen oxide  species.  Putting  perspective  on stressful biological situations. In Biological Chemistry (Vol. 385, Issue 1, pp. 1–10). Biol Chem. Available at: https://doi.org/10.1515/BC.2004.001 WHO. 2020. Diabetes . World Health Organization. Available at: https://www.who.int/health- topics/diabetes#tab=tab_1  (Accessed:  28 December 2020)