Dewi Megawati 1 , Ita M. Nainggolan 2,3 , Agung Nova Mahendra 4 , Nanis S. Marzuki 2,3
1 Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Warmadewa, Denpasar 2 Lembaga Biologi Molekuler Eijkman, Jakarta
3 Kementrian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi, Jakarta 4 Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Denpasar Email: dewimegawati.aa@gmail.com

## Abstrak
Diagnosis prenatal adalah teknik diagnostik untuk menentukan kondisi fetus yang belum lahir apakah memiliki  kelainan  genetik  ataupun  kelainan  lainnya. Teknik  ini  umumnya  dilakukan  pada  penyakit  genetik yang tidak dapat diobati di mana terminasi menjadi bahan pertimbangan. Teknik ini juga dilakukan pada kasus yang memerlukan penanganan segera pada saat prenatal dan pada kondisi yang dapat menimbulkan morbiditas atau mortalitas pada ibu. Diagnosis prenatal dapat dilakukan melalui metode invasif dan noninvasif. Metode invasif seperti amniocentesis dan biopsi villi korialis (CVS) memiliki resiko menimbulkan kecacatan bahkan kematian  fetus.  Pendekatan  nonivasif  melalui  ultrasonografi  belum  cukup  akurat  untuk  diagnosis  penyakit genetik,  sehingga  masih  memerlukan  pengambilan  sampel  fetus  untuk  menegakkan  diagnosis.  Pendekatan terbaru  pengambilan  sampel  fetus  secara  noninvasif  dilakukan  melalui  pengambilan  sel  fetus,  DNA  dan mRNA  fetus  yang  terdapat  dalam  sirkulasi  darah  maternal.  Pada  artikel  ini  dipaparkan  mengenai perkembangan riset, kendala, serta potensi aplikasi klinis ketiga metode pengambilan sampel fetus tersebut.
Kata kunci: diagnosis pr enatal nonivasif, penyakit genetik, cell-free fetal DNA/mRNA, sel fetus Abstract
[Potential Use of Fetal Genetic Material in Maternal Circulation for Prenatal Noninvasive Diagnosis of Genetic Disease]
Prenatal diagnostic technique is used to determine whether the unborn fetus is affected with a genetic disorder or other abnormality. This technique is generally carried out for a genetic disease that is not treata- ble, in which the termination should be considered. This technique is also performed in cases that require im- mediate  action  during  the  prenatal  period  and  in  conditions  that  can  lead  to  morbidity  or  mortality  of  the mother. Prenatal diagnosis can be done by invasive and noninvasive methods. Invasive methods such as amni- ocentesis  and  chorionic  villus  sampling  (CVS)  have  a  risk  of  causing disability  and  even  death  of  the  fetus. While noninvasive  approach by  ultrasound is not sufficiently accurate  for the  diagnosis of genetic  diseases, therefore further  fetal sampling is required. Noninvasive prenatal diagnosis is a new type of genetic testing done through taking fetal cells, fetal DNA and mRNA, which are found in maternal blood circulation. In this review,  we  present  development  of  research,  constraints,  and  potential  clinical  applications  of  these  three methods for noninvasive sampling of the fetus.
Keywords: noninvasive prenatal diagnosis, genetic disease, cell-free fetal DNA/mRNA, fetal cell
LATAR BELAKANG Penyakit genetik adalah suatu kondisi yang  disebabkan  oleh  kelainan  salah  satu/ lebih  gen  atau  kromosom.  Penyebab kelainan  tersebut  dapat  berupa  perubahan satu nukleotida pada gen, delesi besar pada kromosom  serta  kelainan  jumlah  atau struktur  kromosom.  Penyakit  genetik  dapat diklasifikasikan menjadi: penyakit
WMJ (WARMADEWA MEDICAL JOURNAL), Vol. 1 No. 1 Mei 2016, Hal. 1-9
Potensi Penggunaan Materi Genetik Fetus pada Sirkulasi Maternal untuk Diagnosis Prenatal Noninvasif Penyakit Genetik
monogen,  penyakit  poligen/multifaktorial, kelainan kromosom dan kelainan mitokondria. [1] Sampai  saat  ini,  belum  ada tindakan  kuratif  yang  memadai  untuk mengatasi  penyakit  genetik.  Tata  laksana penyakit  genetik  pada  umumnya  hanya bersifat  suportif  dan  simptomatik  dengan pemberian  terapi  untuk  mengurangi  gejala klinis.  Terapi  gen  pada  penderita  penyakit
WMJ (Warmadewa Medical Journal), Vol.1, No.1, Mei 2016, p-ISSN 2527-4627 DOI: 10.22225/wmj.1.1.4.1-9.
genetik  masih  belum  dapat  diaplikasikan secara  luas  karena  hasil  penelitian  masih sangat  bervariasi  dan  memerlukan  biaya yang  besar.  Metode stem  cell cukup  mahal dan  sangat  memerlukan  kecocokan human leukocyte  antigen (HLA).  Pada  pasangan yang  mempunyai  resiko  memiliki  anak dengan penyakit genetik yang membahayakan  fetus  dan  maternal,  dapat dilakukan  tindakan  preventif  baik  berupa konseling genetik pranikah maupun diagnosis prenatal. [2] Diagnosis  prenatal  dapat  dilakukan melalui  metode  invasif  dan  noninvasif.
Pendekatan noninvasif melalui
ultrasonografi  (USG)  masih  memerlukan prosedur  lanjutan  untuk  memastikan diagnosis  penyakit  genetik,  sehingga pengambilan  sampel  fetus  tetap  diperlukan untuk  dianalisis  lebih  lanjut  pada  level molekuler.  Sebagai  contoh:  kasus hydrops fetalis yang  terdeteksi  pada  janin  dengan USG  memerlukan  analisis  lebih  lanjut untuk  memastikan  penyebab hydrops . Pengambilan  sampel  fetus  dapat  dilakukan melalui metode invasif seperti pengambilan cairan  amnion  ( amniocentesis )  dan  biopsi vili korialis ( CVS/chorionic villus sampling ). [3, 4] Pertimbangan metode yang digunakan untuk  diagnosis  prenatal  didasarkan  pada usia kehamilan.
Seluruh
prosedur pengambilan  sampel  fetus  harus  dilakukan oleh  ahli  fetomaternal  dengan  panduan USG  kualitas  tinggi.  Biopsi  vili  korialis dilakukan  dengan  cara  transervikal  atau aspirasi  abdominal  pada  usia  kehamilan yang lebih dini, yaitu pada usia kehamilan 9 -11  minggu,  namun  biopsi  villi  korialis pada  usia  kurang  dari  10  minggu menimbulkan  risiko  terjadinya  malformasi, sehingga  WHO  menganjurkan  untuk dilakukan  setelah  usia  kehamilan  10 minggu.  Resiko  terjadinya  abortus  pada biopsi villi korialis sekitar 1-2%, sedangkan tindakan amniocentesis ,  yaitu  pengambilan cairan  amnion  yang  umumnya  efektif dilakukan  pada  usia  kehamilan  16-22 minggu, memiliki resiko abortus lebih kecil yaitu  0,5%. [3] Pengambilan  sampel  fetus melalui amniocentesis memiliki  beberapa
kendala  seperti:  letak  plasenta  di  anterior, kehamilan  ganda,  oligohidramnion  dan  ibu dengan obesitas. [3]
DNA fetus dapat diisolasi dari 20 mg villi  korialis  atau  15  mL  cairan  amnion. Kendala utama menggunakan sumber DNA dari biopsi villi korialis adalah kemungkinan adanya kontaminasi maternal, oleh  karena  itu  villi  korialis  perlu dipisahkan  terlebih  dahulu  dari  maternal desidua  menggunakan  mikroskop  bedah ( dissecting  microscope )  sebelum  dilakukan isolasi
DNA fetus. Berdasarkan pertimbangan  waktu  pelaksanaan,  teknik biopsi villi korialis lebih dipilih dibandingkan  dengan  teknik amniocentesis walaupun  memiliki  resiko  abortus  lebih tinggi.  Teknik amniocentesis diagnosis prenatal  dikerjakan  pada  trimester  kedua sehingga  diagnosis  baru  dapat  diketahui pada  usia  kehamilan  yang  lebih  lanjut. Terminasi  pada  saat  fetus  sudah  mulai bergerak  yakni  pada  trimester  kedua  dapat menimbulkan  beban  emosional  yang  berat bagi  pasien,  sehingga  diusahakan  untuk melakukan diagnosis prenatal pada trimester pertama. [2, 5] Perkembangan  diagnosis  prenatal ditujukan untuk keamanan prosedur diagnostik  dan  ketepatan  waktu  analisis sehingga  diharapkan  penegakan  diagnosis dapat  dilakukan  sedini  mungkin.  Metode amniocentesis dan  biopsi  villi  korealis memiliki  resiko  membahayakan  kesehatan fetus  dan  maternal,  sehingga  metode alternatif yang bersifat noninvasif dieksplorasi  secara  lebih  aktif.  Penemuan sel  fetus, [6] DNA  fetus  (cff-DNA/ cell-free fetal DNA ), [7] dan mRNA fetus (cff-mRNA/ fetal  messanger  RNA ) [8] pada  sirkulasi maternal  memberikan  harapan  baru  untuk diagnosis  prenatal  noninvasif.  Pengambilan sampel fetus tersebut dapat dilakukan lebih dini,  yakni  sejak usia kehamilan 7 minggu.
[9]
Setelah melalui lebih dari tiga dekade penelitian  intensif,  analisis  noninvasif terhadap  genom  fetus  melalui  pemeriksaan darah  perifer  maternal  telah  menjadi kenyataan,  dan  telah  digunakan  oleh beberapa  lembaga  di  Eropa  untuk
WMJ (WARMADEWA MEDICAL JOURNAL), Vol. 1 No. 1, Mei 2016, Hal. 2
WMJ (Warmadewa Medical Journal), Vol.1, No.1, Mei 2016, p-ISSN 2527-4627 DOI: 10.22225/wmj.1.1.4.1-9.
mendiagnosis  penyakit  genetik. [10] Pada artikel  ini  akan  dikaji  lebih  mendalam mengenai perkembangan diagnosis prenatal nonivasif  serta  kendala  dan  potensi penggunaan  sel  fetus,  DNA  fetus,  dan mRNA  fetus  untuk  mendeteksi  penyakit genetik.
Perkembangan Diagnosis Prenatal Noninvasif Berbanding terbalik dengan
pengetahuan  yang  mengatakan  bahwa plasenta  merupakan  sawar  impermeabel antara  ibu  dan  fetus,  beberapa  studi membuktikan  keberadaan  sel  fetus,  DNA fetus  dan  mRNA  fetus  dalam  sirkulasi maternal (Gambar 1). [11] Penemuan sel fetus pada  sirkulasi  maternal  pertama  kali dilaporkan  oleh  Schmorl,  seorang  ahli patologi  dari  German  pada  tahun  1893. Schmorl menemukan trofoblas yang berasal dari plasenta pada 17 paru-paru wanita yang meninggal  akibat  komplikasi  eklampsia. [12] Pada  tahun  1959,  Douglas et  al .  juga menemukan  trofoblas  pada  sirkulasi maternal menggunakan mikroskop. [13] Perkembangan  yang  pesat  pada  bidang diagnosis prenatal noninvasif dimulai sejak Lo et al . mengidentifikasi keberadaan DNA fetus  (cff-DNA/ cell  free  fetal  DNA )  pada plasma  maternal  pada  tahun  1997. [7] Selanjutnya, mRNA fetus (cff-mRNA) juga ditemukan  terdapat  dalam  plasma  maternal oleh Poon et al . pada tahun 2000. [8]
serum atau plasma maternal (Gambar atas perkenaan Grup Peneliti Kelainan Darah Lembaga Eijkman).
Walaupun  keberadaan  sel  fetus  pada sirkulasi  maternal  sudah  diketahui  sejak abad  ke-19,  penggunaan  sel  fetus  tersebut untuk deteksi penyakit genetik belum dapat dilakukan.  Selain  jumlah  sel  fetus  yang sangat  sedikit  pada darah maternal,  metode khusus  juga  diperlukan  untuk  memurnikan sel fetus dari sel-sel lain yang terdapat pada sirkulasi  maternal.  Penemuan  DNA  fetus dan  mRNA  fetus  pada  sirkulasi  maternal yang  tanpa  memerlukan  pengayaan  sangat menjanjikan bagi  bidang diagnosis prenatal noninvasif  penyakit  genetik.  Keberadaan sekuen spesifik kromosom-Y dalam sirkulasi maternal yang sedang mengandung fetus laki-laki dapat dijadikan marker untuk deteksi  penyakit  genetik  pada  fetus. Penyakit genetik yang sudah dapat dideteksi melalui  metode  ini  antara  lain  penyakit X - linked seperti Duchenne muscular dystrophy (DMD) dan  penyakit  hemofilia. Duchenne muscular dystrophy yaitu penyakit bersifat letal yang menyerang laki- laki  karena  tidak  berfungsinya  protein distrofin  pada  otot.  Penyakit  hemofilia disebabkan oleh defisiensi faktor VIII yang berperan  dalam  pembekuan  darah.  Prinsip kerja  metode  noninvasif  untuk  penyakit X - linked yaitu  dengan  cara  mendeteksi keberadaan  sekuen  spesifik  kromosom-Y. Jika  sekuen  spesifik  kromosom-Y  tidak terdeteksi  pada  DNA/RNA  dalam  sirkulasi maternal,  diagnosis  prenatal  dengan  cara invasif  tidak  dibutuhkan  untuk  konfirmasi.
[14] Penggunaan  metode  noninvasif  untuk menentukan  jenis  kelamin  fetus  pada kehamilan  yang  memiliki  resiko  tinggi penyakit X -linked sudah  dilakukan  di Inggris. Sejak diaplikasikan dari tahun 2006 hingga 2011 terjadi peningkatan penggunaan  DNA  fetus  pada  sirkulasi maternal  untuk  deteksi  penyakit  ini  dari sekitar  50  kasus  menjadi  lebih  dari  400 kasus. [15] Metode  ini  juga  sudah  dapat mendeteksi jenis aneuploidi  terutama kasus sindrom  Down  yang  disebabkan  oleh trisomi kromosom 21. [16]
Metode  diagnosis  prenatal  noninvasif juga  dilaporkan  dapat  digunakan  untuk
WMJ (WARMADEWA MEDICAL JOURNAL), Vol. 1 No. 1, Mei 2016, Hal. 3
Gambar 1: Sel fetus, DNA dan mRNA fetus pada sirkulasi maternal. Diagnosis pr enatal noninvasif dapat  dilakukan  dengan  kehadiran  sel  fetus,  DNA fetus,  mRNA  fetus  pada  sirkulasi  maternal.  DNA dan  mRNA  fetus  yang  dideteksi  terdapat  dalam
WMJ (Warmadewa Medical Journal), Vol.1, No.1, Mei 2016, p-ISSN 2527-4627 DOI: 10.22225/wmj.1.1.4.1-9.
penentuan  jenis  kelamin  pada  kasus ambiguitas  seperti congenital  adrenal hyperplasia (CAH) yaitu hiperplasia adrenal yang mengakibatkan defisiensi 21- hidroksilase.  Enzim  tersebut  berperan dalam jalur normal biosintesis glukokortikoid.  Defisiensi  21-hidroksilase menyebabkan akumulasi
prekursor glukokortikoid  yang  akan  diubah  menjadi androgen.  Peningkatan  kadar  androgen menyebabkan  virilisasi  genital  pada  janin wanita  dan  dapat  menimbulkan  infertilitas. Pencegahan  manifestasi  klinis  CAH  yang berat  dapat  dilakukan  dengan  pemberian dexametason  lebih  dini  bagi  janin  melalui ibu. [15] Selain  itu,  keberadaan  DNA  fetus dapat digunakan untuk mendeteksi penyakit tanatophoric  dysplasia yang  bersifat  letal, diturunkan  secara  autosomal  dominan,  dan akibat mutasi de novo . [16, 17]
Pada  penerapannya,  analisis  materi genetik  fetus  pada  sirkulasi  maternal  untuk deteksi penyakit genetik memerlukan teknik PCR  yang  sama  dengan  pengerjaan  DNA fetus yang diperoleh dari amniocentesis dan biopsi  villi  korialis.  Namun  terdapat beberapa  kendala  yang  perlu  diselesaikan terlebih  dahulu  sebelum  materi  genetik fetus  pada  sirkulasi  maternal  dapat digunakan sebagai sarana untuk mendeteksi jenis penyakit genetik dengan cakupan yang lebih  luas.  Salah  satu  kendala  yang  perlu diatasi  adalah  penemuan  metode  yang efektif  untuk  memisahkan  materi  genetik fetus dari materi genetik maternal.
Sel fetus pada sirkulasi maternal Pengetahuan mengenai keberadaan sel -sel fetus pada sirkulasi maternal membuka lahan  baru  untuk  diagnosis  prenatal noninvasif.  Terdapat  beberapa  jenis  sel fetus yang sudah dilaporkan terdapat dalam sirkulasi maternal seperti: trofoblas, leukosit,  dan  eritrosit  fetus  berinti  (NRBC/ Nucleated  Red  Blood  Cell ).  Keuntungan menggunakan  sel  fetus  sebagai  sumber DNA  untuk  tes  genetik  diagnosis  prenatal adalah  DNA  yang  diperoleh  merupakan DNA murni fetus tanpa perlu menghawatirkan kemungkinan adanya kontaminasi DNA maternal, jika dibanding-
kan  dengan  sampel  DNA  fetus  yang diperoleh  dari  amnion  ataupun  biopsi korialis  yang  memiliki  kemungkinan adanya  kontaminasi  DNA  maternal. [12] Keberadaan  kedua  alel  yang  berasal  dari genom  maternal  dan  paternal  pada  DNA fetus  yang  berasal  dari  sel  amnion  maupun villi korialis perlu dipastikan terlebih dahulu sebelum  dilakukan  pendeteksian  mutasi untuk menghindari kesalahan diagnosis. Hal ini  dilakukan  dengan  memeriksa variable vumber  tandem  repeat (VNTR)  atau short tandem  repeat (STR)  sebagai  penanda untuk  menyingkirkan  kemungkinan  adanya kontaminasi DNA maternal. [3]
Penggunaan  sel  fetus  pada  sirkulasi maternal  untuk  tes  diagnostik  pelayanan genetik  belum  rutin  dilakukan.  Kendala utamanya adalah keberadaan sel fetus  yang sangat jarang yaitu satu sel fetus dalam satu mililiter  darah  maternal. [12] Oleh  karena sangat  tidak  mudah  untuk  mengisolasi  satu sel  fetus  diantara  jutaan  sel  maternal sehinggga diperlukan suatu pengayaan.
Pada tahun 2002, National Institute of Child  Health  and  Human  Development Fetal  Cell  Isolation  Study  (NIFTY) berusaha  mengatasi  masalah  ini  dengan menggunakan metode magnetic cell sorting (MACS)  dan fluorescent-activated  cell sorting (FACS) untuk mengisolasi sel fetus. Prinsip  dasar  kedua  teknik  tersebut  adalah pengenalan  antigen-antibodi  menggunakan antibodi monoklonal yang spesifik terhadap eritrosit  fetus  berinti. [12] Kelompok  peneliti ini  menggunakan  antibodi  monoklonal untuk  mengenali  CD71  etritrosit  fetus berinti  dan  melakukan  PCR  untuk mengamplifikasi sekuen spesifik kromosom -Y.  Hasil  penelitian  menunjukkan  sekuen spesifik kromosom-Y terdeteksi hanya pada 75% wanita yang sedang mengandung janin laki-laki  dan  kemurnian  eritrosit  berinti fetus  rendah.  Kemurnian  sel  fetus ditingkatkan  dengan  menggunakan  MACS seleksi  negatif  CD45  untuk  mengurangi eritrosit  berinti  maternal.  Prosedur  ini dilakukan  sebelum  mendeteksi  eritrosit berinti fetus CD71.
Pendeteksian menggunakan  MACS  menunjukkan  hasil yang lebih baik,  namun  sensitivitas metode
WMJ (WARMADEWA MEDICAL JOURNAL), Vol. 1 No. 1, Mei 2016, Hal. 4
WMJ (Warmadewa Medical Journal), Vol.1, No.1, Mei 2016, p-ISSN 2527-4627 DOI: 10.22225/wmj.1.1.4.1-9.
ini hanya 50%. [13]
Setelah isolasi DNA berhasil dilakukan,  masih  terdapat  kendala  dalam deteksi  mutasi  akibat  tingginya  tingkat allelic  drop  out . [11] Alellic  drop  out adalah suatu  kondisi  dimana  salah  satu  alel  tidak dapat  diamplifikasi  (baik  alel  maternal ataupun  paternal).  Hal  ini  berpotensi menimbulkan  negatif  palsu  jika  digunakan sebagai  tes  genetik.  Menurut  Hahn et  al . minimal  dibutuhkan  5-6  sel  untuk mengimbangi kemungkinan terjadinya allelic drop out . [10] Kendala  lain  dalam  penggunaan  sel fetus  pada  sirkulasi  maternal  adalah terjadinya  apoptosis  pada  sel  fetus  saat memasuki  sirkulasi  maternal.  Hal  ini diperkirakan  terjadi  karena  eritroblas  fetus memasuki  lingkungan  yang  kaya  akan oksigen pada sirkulasi maternal. [11] Walaupun  menemui  banyak  kendala,  riset tentang  sel  fetus  ini  masih  berlangsung. Para  ahli  berpendapat  bahwa  riset  kedepan lebih ditujukan pada metode isolasi sel fetus dari  sirkulasi  maternal  terlebih  dahulu sebelum  mencari  metode  yang  relevan untuk ektraksi materi genetik.
DNA Fetus (cff-DNA/cell-free fetal DNA) Riset  tentang  DNA  fetus  pada  serum maternal  berkembang  setelah  ditemukan cell-free  tumor  DNA pada  plasma  dan serum  pasien  kanker.  Dasar  pemikiran penelitian  ini  adalah  perkembangan  fetus dan  plasenta  yang  cepat  diumpamakan seperti  perkembangan  tumor.  Lo et  al . [7] pada  tahun  1997  menemukan  keberadaan DNA fetus laki-laki pada plasma dan serum maternal. Amniocentesis dan  pengambilan sampel  darah  perifer  dilakukan  pada  43 wanita  hamil  dengan  usia  kehamilan  12-40 minggu.  Melalui amniocentesis diketahui bahwa 30 orang mengandung janin laki-laki dan 13 orang mengandung janin perempuan.  DNA  fetus  diekstraksi  dari kedua sampel tersebut, kemudian dilakukan PCR  untuk  mendeteksi  sekuen  spesifik kromosom-Y  (DYS14).  Hasil  positif terdeteksi  pada  24  dari  30  sampel  plasma, dan pada 21 dari 30 sampel serum maternal yang  mengandung  fetus  laki-laki.  Hasil  ini
diperoleh  hanya  dengan  menggunakan 10µL supernatan serum/plasma maternal.
Terdapat beberapa hipotesis mengenai asal  DNA  fetus  dalam  sirkulasi  maternal antara lain: sel hematopoetik fetus, trofoblas pada  plasenta,  dan  ditransfer  secara langsung dari maternal. Pada awalnya DNA fetus  diperkirakan  berasal  dari  sel  fetus yang  berada  dalam  sirkulasi  maternal. Namun  mengingat  keberadaan  sel  fetus yang  sangat  jarang  (1  sel  fetus  per  1  mL darah),  tentunya  konsentrasi  DNA  fetus juga  akan  sangat  kecil.  Salah  satu penjelasan yang dapat diajukan adalah DNA fetus berasal dari  sel fetus yang mengalami kerusakan saat mencoba memasuki sirkulasi maternal. Hipotesis lain menyatakan bahwa konsentrasi  DNA  fetus  yang  cukup  tinggi diperkirakan  berasal  dari  trofoblas  plasenta yang  mengalami  apoptosis,  sehingga konsentrasi  DNA  fetus  meningkat  seiring dengan  perkembangan  plasenta  pada  masa kehamilan.  DNA  fetus  juga  dideteksi terdapat pada cairan tubuh maternal lainnya seperti  amnion,  urin,  cairan  serebrospinal dan  cairan  peritoneal.  Konsentrasi  DNA fetus  pada  amnion  200  kali  lebih  banyak dari  pada  plasma  maternal  sehingga diperkirakan  DNA  fetus  ditransfer  secara langsung  dari  sirkulasi  fetus  ke  sirkulasi maternal. [11]
Menurut  Lench et  al .  Konsentrasi DNA fetus pada serum maternal ditemukan lebih  tinggi  secara  signifikan  dibandingkan dengan  konsentrasi  DNA  yang  diperoleh dari DNA sel fetus yang diambil dari darah maternal. [15] Pada awal kehamilan, konsentrasi  DNA  fetus  0,014-0,54%  dalam serum  maternal  dan  0,39-11,9%  dalam plasma  maternal.  Konsentrasinya  akan bertambah  seiiring  dengan  perkembangan fetus,  pada  akhir  kehamilan  konsentrasi DNA  fetus  0,032-3,97%  dalam  serum maternal dan 2,33-11,4% dalam plasma.
Prosedur  analisis  DNA  fetus  dari serum/plasma  maternal  lebih  mudah daripada analisis DNA dari sel fetus karena tidak  memerlukan  pengayaan  sel  fetus. Namun,  berdasarkan  studi  dengan next- generation  sequencing diketahui  bahwa DNA fetus merupakan DNA terfragmentasi
WMJ (WARMADEWA MEDICAL JOURNAL), Vol. 1 No. 1, Mei 2016, Hal. 5
WMJ (Warmadewa Medical Journal), Vol.1, No.1, Mei 2016, p-ISSN 2527-4627 DOI: 10.22225/wmj.1.1.4.1-9.
dengan  ukuran  sekitar  160bp  dan  sebagian kecil  sekitar  340bp.  Hal  ini  menyebabkan implementasi
diagnosis prenatal menggunakan  DNA  fetus  terbatas  pada pendeteksian  mutasi  pada  segmen  DNA tertentu.  Pada  pendeteksian  mutasi  titik pada  DNA  fetus,  perlu  didesain  primer untuk  menghasilkan  fragmen  DNA  yang pendek  (<150bp)  agar  amplifikasi  berjalan dengan  efisien.  Beberapa  jenis  penyakit seperti fragile-X syndrome yang disebabkan oleh  ekspansi  triplet  nukleotida  (CGG) n>1kb  pada  gen FMN 1  tidak  dapat dideteksi dengan menggunakan metode ini.
Pengulangan  triplet  nukleotida  40-60  kali mungkin masih dapat terdeteksi menggunakan  DNA  fetus,  seperti  pada Huntington  disease yang  disebabkan  oleh ekspansi  triplet  nukleotida  (CAG)n  pada exon-1  gen HTT >40  kali,  sedangkan pengulangan  triplet  nukleotida  dengan ukuran  lebih  besar  tidak  akan  terdeteksi dengan metode ini. [5, 15] Chitty et  al . [17] melaporkan  diagnosis prenatal menggunakan kombinasi USG dan DNA  fetus  pada  kasus tanatophoric dysplasia . Tanatophoric  dysplasia adalah penyakit  skeletal  yang  bersifat  autosomal dominan  dan  letal.  Pemeriksaan  USG  pada tiga  wanita  hamil  memperlihatkan  ciri-ciri displasia  skeletal  seperti:  fetus  sangat pendek,  femur  melengkung, cloverleaf skull ,  jari  tangan  pendek, frontal  bossing dan  polihidramnion.  Lengan  pendek  mulai dapat terlihat dengan USG sejak 13 minggu masa gestasi.
Hasil  pemeriksaan  dengan  USG  ini perlu  dikonfirmasi secara  molekuler mengingat  tampilan  klinis  ini  dapat disebabkan oleh akondroplasia, tanatophoric  dysplasia ,  hipokondroplasia dan  displasia  akromesomelik.  Diagnosis prenatal menggunakan DNA fetus mengkonfirmasi  adanya  mutasi  penyebab tanatophoric dysplasia c.742C>T (p.Arg248Cys) dan c.1948A>G (p.Lys650Glu)  pada  gen fibroblast  growth factor receptor 3 (gen FGFR3 ) pada ketiga sampel tersebut.
Diagnosis prenatal menggunakan DNA fetus
untuk akondroplasia  juga  sudah  dilakukan,
mengingat  akondroplasia  diturunkan  secara autosomal  dominan  dan  98%  kasus akondroplasia  diakibatkan  oleh  mutasi  titik nt1138  G>A  (p.Gly380Arg)  pada  gen FGFR3. [15]
Diagnosis  prenatal  menggunakan DNA fetus terbatas hanya pada mutasi yang diturunkan secara paternal. Keterbatasan ini disebabkan oleh belum adanya teknik untuk memisahkan  DNA  fetus  dengan  DNA maternal pada plasma. Teknik elektroforesis pernah  dimanfaatkan  untuk  pengayaan DNA  fetus.  Ukuran  DNA  fetus  yang  lebih pendek dibandingkan dengan DNA maternal memungkinkan dilakukan elektroforesis  untuk  kemudian  DNA  fetus tersebut  dapat  dimurnikan,  namun  metode ini  menyebabkan  DNA  fetus  banyak  yang terdegradasi  dan  terdapat  peluang  terjadi kontaminasi DNA lain. Penggunaan analisis DNA  fetus  untuk  penyakit  genetik  yang diturunkan  secara  autosomal  resesif  dapat dilakukan  dengan  adanya  teknik digital PCR  dan next-gen  sequencing . [18] Metode tersebut  memungkinkan  amplifikasi  satu DNA  untai  ganda  dengan  cara  mempartisi sampel DNA pada ratusan ribu kolom, hasil PCR dianalisis secara kuantitatif dan mutasi pada satu untai DNA dapat dideteksi secara akurat. [10]
mRNA  Fetus  (cff-mRNA/cell-free  fetal mRNA)
Keterbatasan  penggunaan  DNA  fetus pada  beberapa  kasus  membuat  penelitian dilakukan  untuk  mencari  alternatif  lain. Poon et  al .  pada  tahun  2000  meneliti tentang mRNA fetus pada plasma maternal.
[8] Poon et  al .  mendeteksi  keberadaan mRNA Y -chromosome-specific  zinc  finger protein (ZFY) pada semua plasma maternal pada  ibu  yang  mengandung  janin  laki-laki. Keberadaan  mRNA  fetus  pada  sirkulasi maternal  sangat  tidak  terduga  mengingat mRNA  adalah  molekul  yang  labil  dan mudah terdegradasi. Stabilitas mRNA fetus dalam  plasma  mungkin  disebabkan  oleh suatu  partikel  yang  mampu  melindungi mRNA dari RNAse. [12]
WMJ (WARMADEWA MEDICAL JOURNAL), Vol. 1 No. 1, Mei 2016, Hal. 6
WMJ (Warmadewa Medical Journal), Vol.1, No.1, Mei 2016, p-ISSN 2527-4627 DOI: 10.22225/wmj.1.1.4.1-9.
Keunggulan  mRNA  fetus  dibanding- kan dengan DNA fetus adalah dimungkinkannya untuk memperoleh mRNA  spesifik  plasenta  yang  tidak diekspresikan pada jaringan maternal. Dasar pemikiran  ini  adalah  jika  DNA  fetus  yang terdapat  dalam  sirkulasi  maternal  berasal dari  trofoblas,  maka  kemungkinan  mRNA yang  diekspresikan  secara  spesifik  pada trofoblas  dapat  ditemukan  dalam  sirkulasi maternal. [10] Lo et  al .  menggunakan  gen PLAC4 ( placenta  specific  4 )  untuk mendeteksi  aneuploidi  karena  gen  ini terletak  pada  kromosom  21  dan  hanya diekspresikan  pada  plasenta.  Analisis mRNA  fetus  secara  kuantitatif  dapat digunakan  untuk  mendeteksi  trisomi  21, dengan  cara  mendeteksi  fetus  yang memiliki SNP heterozigot pada gen PLAC4
menggunakan mass spectrometry .
Transkrip  mRNA  fetus  pada  orang  normal akan  memperlihatkan  rasio  1:1,  sedangkan pada  trisomi  21  rasio  akan  menjadi  2:1. Dari  10  kasus  sindrom  Down,  trisomi  21 pada  fetus  dapat  dideteksi  dengan sensitivitas  96%  dan  spesifisitas  96%. Kelemahan  metode  ini  adalah  tidak  semua fetus  memiliki SNP  heterozigot  pada  lokus tersebut  sehingga  memerlukan  SNP  lain yang dapat dijadikan marker . [18]
Potensi pengembangan diagnosis prenatal noninvasif
Penggunaan  sel  fetus,  DNA  fetus, mRNA fetus pada sirkulasi maternal sangat menjanjikan untuk penyakit yang diturunkan  secara  paternal  dan  bersifat autosomal  dominan  pada  janin  laki-laki. Pada  penyakit  genetik  yang  diturunkan secara  autosomal  resesif  pemeriksaan  ini sulit  dilakukan  saat  mutasi  ayah  dan  ibu berbeda karena perlu dilakukan pemeriksaan  dua  jenis  mutasi  pada  janin. Deteksi  bahkan  lebih  sulit  pada  kasus  di mana  mutasi  ayah  dan  ibu  sama,  karena belum ada teknologi yang dapat memisahkan DNA fetus dari DNA maternal dalam plasma/serum. [2] Pendeteksian mutasi jenis  autosomal  resesif  dapat  dilakukan untuk  mendeteksi  mutasi  yang  diturunkan dari  paternal.  Jika  jenis  mutasi  autosomal
resesif  paternal  tidak  ditemukan  pada sampel  janin,  metode  prenatal  diagnosis invasif tidak perlu dilakukan. [19] Pendekatan utama  berupa  pendeteksian  keberadaan sekuen  spesifik  kromosom-Y  pada  serum/ plasma  hanya  untuk  wanita  hamil  yang mengandung  bayi  laki-laki. [20] Penemuan suatu  teknik  pemisahan  DNA  fetus  dan DNA  maternal  akan  sangat  membantu pengembangan diagnosis prenatal noninvasif sehingga dapat  digunakan untuk mendeteksi  penyakit  genetik  dengan cakupan  jenis  penyakit  genetik  yang  lebih luas pada masa mendatang.
Pendekatan lain yang dapat dilakukan seperti  analisis  pola  metilasi  janin  dan maternal. Metilasi DNA merupakan modifikasi DNA dengan penambahan gugus metil  pada  basa  sitosin  terutama  pada daerah promoter yang  menyebabkan  gen tidak  dapat  diakses  faktor  transkripsi sehingga tidak dapat diekspresikan. Metilasi DNA  disebut  perubahan  epigenetik  karena modifikasi ini tidak menyebabkan perubahan  urutan  DNA  pada  gen  (sekuen DNA  tetap),  tetapi  mempengaruhi  ekspresi gen. [1] Eksplorasi pola metilasi gen lain oleh Chim  et  al .  mendapatkan  promoter  gen SERPINB5 pada  plasenta  mengalami hipometilasi  sedangkan  pada  jaringan maternal mengalami hipermetilasi. [21] Perbedaan ini dimanfaatkan untuk mendeteksi  trisomi  18  dengan  cara mengubah  sitosin  yang  tidak  termetilasi menjadi  urasil  menggunakan  bisulfida, sedangkan  sitosin  yang  termetilasi  tidak mengalami  perubahan.  Pada  analisis  ini, digunakan  -156  SNP  A/C  pada promoter gen SERPINB5. Perbedaan  satu  basa nukleotida  dapat  dideteksi  dengan mass spectrometry .  Pada  orang  normal  yang memiliki dua kromosom 18 akan ditemukan rasio  1:1,  sedangkan  pada  trisomi  18  rasio akan  menjadi  2:1.  Kelemahannya,  metode ini  hanya dapat mendeteksi trisomi 18 jika SNP  yang  dijadikan marker pada  maternal homozigot (C/C) sehingga tidak mengganggu analisis. Selain
itu, penggunaan  bisulfida  dapat  merusak  DNA fetus.
WMJ (WARMADEWA MEDICAL JOURNAL), Vol. 1 No. 1, Mei 2016, Hal. 7
WMJ (Warmadewa Medical Journal), Vol.1, No.1, Mei 2016, p-ISSN 2527-4627 DOI: 10.22225/wmj.1.1.4.1-9.
Kelemahan  metode  tersebut  dapat diminimalkan  jika  didapatkan marker epigenetik  gen  yang  hipermetilasi  pada DNA  fetus  dan  hipometilasi  pada  DNA maternal  sehingga  dapat  dideteksi  dengan enzim  restriksi  yang  sensitif  terhadap metilasi,  yaitu  memotong  DNA  maternal yang  hipometilasi  dan  meninggalkan  DNA fetus yang hipermetilasi. Syarat ini dipenuhi oleh  gen RASSF1A yang  mengalami hipermetilasi  pada  janin,  sedangkan  pada jaringan  maternal  mengalami  hipometilasi. Namun, karena gen RASSF1A terletak pada kromosom  3,  maka  tidak  dapat  dijadikan sebagai marker untuk mendeteksi aneuploidi  yang  relatif  umum  yaitu  pada kromosom 13, kromosom 18 dan kromosom 21. [19] Keberadaan  DNA  fetus  dan  mRNA fetus  serta  riset  yang  sudah  dilakukan selama ini memberikan harapan baru untuk diagnosis  prenatal  noninvasif.  Eksplorasi gen-gen  yang  dapat  dijadikan marker diagnosis  penyakit  genetik  perlu  dilakukan agar  aplikasi  klinis  metode  diagnosis prenatal  noninvasif  menggunakan  DNA fetus dan mRNA fetus dapat direalisasikan.

## SIMPULAN
Penggunaan
metode diagnosis prenatal noninvasif menggunakan DNA dan mRNA  fetus  mengurangi  kebutuhan  akan metode invasif secara
signifikan. Implementasi  penggunaan  DNA  dan mRNA  fetus  pada  sirkulasi  maternal  untuk diagnosis  prenatal  pada  beberapa  jenis penyakit  genetik  sudah  dapat  dilakukan walaupun  perkembangannya  cukup  lambat. Validasi  diperlukan  agar  metode  ini  dapat diaplikasikan  untuk  pelayanan  tes  penyakit genetik dengan cakupan yang lebih luas.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Hartwell  LH.  Genetics:  From  Genes to Genomes: Mcgraw Hill Companies; 2003. 2.  Old  J,  Henderson  S.  Molecular diagnostics  for  haemoglobinopathies.
Expert  Opin  Med  Diagn.  2010;4 (3):225-40.
3.  Old J, Traeger-Synodinos J, Galanello R,  Petrou  M,  Angastiniotis  M. Prevention of Thalassemias and other Hemoglobin  Disorder:  Thalassemia
International Federation; 2004. 4.  Leung WC, Leung KY, Lau ET, Tang MH,  Chan  V.  Alpha-thalassaemia. Semin  Fetal  Neonatal  Med.  2008;13 (4):215-22.
5.  Harteveld CL, Kleanthous M, Traeger -Synodinos  J.  Prenatal  diagnosis  of hemoglobin  disorders:  present  and future  strategies.  Clin  Biochem.
2009;42(18):1767-79. 6.  Schmorl G. Pathologisch-anatomische Untersuchungen über Puerperal- Eklampsie: Vogel; 1893. 7.  Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW, et al.
Presence  of  fetal  DNA  in  maternal plasma  and  serum.  Lancet.  1997;350
(9076):485-7. 8.  Poon  LL,  Leung  TN,  Lau  TK,  Lo YM.  Presence  of  fetal  RNA  in maternal plasma. Clin Chem. 2000;46 (11):1832-4.
9.  Eason  J.  Prenatal  diagnosis  of  single gene  disorders.  Obstet  Gynaecol Reprod Med. 2010; 20(5):155-60
10.  Hahn  S,  Zhong  XY,  Holzgreve  W.
Recent  progress  in  non-invasive prenatal  diagnosis.  Semin  Fetal Neonatal Med. 2008;13(2):57-62.
11.  Bianchi  DW.  Circulating  fetal  DNA: its  origin  and  diagnostic  potential-a review.  Placenta.  2004;25  Suppl A:S93-s101.
12.  Litton  C,  Stone  J,  Eddleman  K,  Lee MJ.  Noninvasive  prenatal  diagnosis: past,  present,  and  future.  Mt  Sinai  J Med. 2009; 76(6): 521-8.
13.  Purwosunu Y, Sekizawa A, Koide K,
Okazaki S, Farina A, Okai T. Clinical potential  for  noninvasive  prenatal diagnosis  through  detection  of  fetal cells  in  maternal  blood.  Taiwan  J Obstet Gynecol. 2006;45(1):10-20.
14.  Bustamante-Aragones  A,  Rodriguez de Alba M, Perlado S, Trujillo-Tiebas MJ, Arranz JP, Diaz-Recasens J, et al. Non-invasive  prenatal  diagnosis  of
WMJ (WARMADEWA MEDICAL JOURNAL), Vol. 1 No. 1, Mei 2016, Hal. 8
WMJ (Warmadewa Medical Journal), Vol.1, No.1, Mei 2016, p-ISSN 2527-4627 DOI: 10.22225/wmj.1.1.4.1-9.
single-gene  disorders  from  maternal blood. Gene. 2012;504(1):144-9. 15.  Lench  N,  Barrett  A,  Fielding  S, McKay  F,  Hill  M,  Jenkins  L,  et  al. The  clinical  implementation  of  non- invasive prenatal diagnosis for single- gene  disorders:  challenges  and progress made. Prenat Diagn. 2013;33 (6):555-62.
16.  Hill  M,  Barrett  AN,  White  H,  Chitty
LS.  Uses  of  cell  free  fetal  DNA  in maternal  circulation.  Best  Pract  Res Clin Obstet Gynaecol. 2012;26(5):639
-54.
17.  Chitty  LS,  Khalil  A,  Barrett  AN, Pajkrt E, Griffin DR, Cole TJ. Safe, accurate,  prenatal  diagnosis  of thanatophoric dysplasia using ultrasound  and  free  fetal  DNA. Prenat Diagn. 2013;33(5):416-23. 18.  Lo YM, Lun FM, Chan KC, Tsui NB, Chong  KC,  Lau  TK,  et  al.  Digital
PCR  for  the  molecular  detection  of fetal  chromosomal  aneuploidy.  Proc Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2007;104
(32):13116-21.
19.  Norbury G, Norbury CJ. Non-invasive prenatal  diagnosis  of  single  gene disorders:  how  close  are  we?  Semin Fetal  Neonatal  Med.  2008;13(2):76- 83.
20.  Lo YM, Chiu RW. Prenatal diagnosis: progress  through  plasma  nucleic acids. Nat Rev Genet. 2007;8(1):71-7. 21.  Chim  SS,  Tong  YK,  Chiu  RW,  Lau TK,  Leung  TN,  Chan  LY,  et  al. Detection  of  the  placental  epigenetic signature  of  the  maspin  gene  in maternal  plasma.  Proc  Natl  Acad  Sci U S A. 2005;102(41):14753-8.
WMJ (WARMADEWA MEDICAL JOURNAL), Vol. 1 No. 1, Mei 2016, Hal. 9