Leyn et al .: Kualitas Spermatozoa Kambing Bligon ……….

## KUALITAS SPERMATOZOA KAMBING BLIGON DALAM PENGENCER TRIS- KUNING TELUR DENGAN PENAMBAHAN BERBAGAI LEVEL EKSTRAK KULIT BUAH NAGA

## (SPERMATOZOA QUALITY OF BLIGON GOAT IN TRIS - EGG YOLK DILUENT ADDED WITH VARIOUS LEVELS OF DRAGON FRUIT PEEL EXTRACT)
Maria F. T. Leyn, Henderiana L. L. Belli, Wilmientje M. Nalley, Petrus Kune, Thomas Mata Hine *
Fakultas Peternakanan, Universitas Nusa Cendana Jl. Adisucipto, Penfui - Kupang
* Correspondent author, email: tomhin050566@gmail.com

## ABSTRAK
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji pengaruh penambahan berbagai konsentrasi ekstrak kulit buah naga (EKBN) dalam pengencer Tris–kuning telur (TKT) terhadap kualitas spermatozoa kambing bligon. Semen ditampung dua kali seminggu menggunakan metode vagina buatan dari tiga  ekor kambing bligon jantan  yang berumur tiga tahun dengan kondisi tubuh dan organ reproduksi yang normal. Pasca evaluasi secara makroskopis dan  mikroskopis,  semen  yang  berkualitas  baik  dengan  motilitas  >  70%,  konsentrasi  >  800  x  10 6 /mL,  dan abnormalitas < 15%,  diencerkan dengan TKT + EKBN pada konsentrasi: 0% (P0; kontrol), 2% (P1), 4% (P2), 6% (P3), 8% (P4), dan 10% (P5). Semen  yang  masih  memiliki  motilitas spermatozoa di atas 70% selanjutnya dipreservasi  pada  suhu  3  -  5 o C.  Evaluasi  terhadap  kualitas  spermatozoa  dilakukan  setiap  24  jam  hingga motilitasnya menurun hingga 40%. Hasil penelitian menunjukan bahwa sejak hari ke-1 hingga ke-5 preservasi, spermatozoa yang diencerkan dengan TKT + EKBN 6% (P3) memiliki motilitas dan viabilitas yang lebih tinggi (P<0,05) dibandingkan perlakuan lainnya. Abnormalitas spermatozoa yang teramati hingga hari ke-5 preservasi berada  di  bawah  6%  untuk  semua  perlakuan,  namun  terdapat  perbedaan  yang  signifikan  (P<0,05)  antara perlakuan kontrol dengan yang mendapat suplementasi EKBN. Disimpulkan  bahwa penambahan EKBN dalam pengencer  TKT  hingga  6%  dapat  mengurangi  penurunan  kualitas  spermatozoa  kambing  bligon  selama preservasi in vitro .
Kata-kata kunci: tris, kuning telur, ekstrak kulit buah naga, spermatozoa kambing bligon

## ABSTRACT
The purpose of this study was to examine the effect of adding various concentrations of dragon fruit peel extract (DFPE) in Tris-egg yolk diluent (TEY) on the quality of bligon goat spermatozoa. Semen was collected twice a week using the artificial vaginal method from three year old bligon male goats with normal body conditions and reproductive  organs.  After  the  macroscopic  and  microscopic  evaluation,  good  quality  semen  with  a  sperm motility of > 70%, a concentration of  > 800 x 10 6 mL -1 , and abnormality of < 15 %,  was diluted  with TEY + DFPE at a concentration of 0% (P0), 2% (P1), 4% (P2), 6% (P3), 8% (P4), dan 10% (P5). The semen which still had a motility ≥ 70% was then stored at a temperature of 3-5 o C. Evaluation of the quality of spermatozoa  was carried out every 24 hours until the  motility decrease to 40%. The results showed that  from day 1 to day 5 of preservation, spermatozoa preserved in TEY + 6% DFPE diluent (P3) had higher motility and viability (P<0,05) than  other  treatments.  The  abnormalities  of  spermatozoa  until  the  5  day  of  preservation  were  below  6%,  but showed  a  significant  difference  (P<0,05)  between  treatments  that  received  DFPE  suplemention  with  control (P0). It was concluded that the addition of DFPE in TEY up to 6% could reduce the decrease in sperm quality of bligon goats during in vitro preservation.
Keywords: tris, egg yolk, dragon fruit extract, spermatozoa, bligon goat

## PENDAHULUAN
Kambing bligon merupakan hasil persilangan antara kambing kacang dan kambing ettawa. Salah satu upaya untuk mempertahankan
mutu  genetik  dan  meningkatkan  populasinya adalah  dengan  melakukan  perkawinan  dengan menggunakan teknologi inseminasi buatan (IB).
Leyn et al .: Kualitas Spermatozoa Kambing Bligon ……….
Teknologi  ini  telah  diterima  secara  luas  oleh peternak  karena  merupakan  sarana  yang  efektif untuk menyebarluaskan bibit unggul.
Selama  ini  IB  banyak  menggunakan semen  beku,  akan  tetapi  karena  ketersediaan straw/semen  beku  yang  terbatas  dan  kontinuitas penyediaan  nitrogen  cair  masih  tergantung pengadaan/pengiriman dari luar wilayah penelitian, maka  upaya maksimalitas pelayanan IB  seringkali  terkendala.  Dengan  demikian, penggunaan  semen  cair  dalam  kegiatan  IB menjadi  salah  satu  solusi  yang  tepat  untuk diterapkan di Nusa Tenggara Timur. Keberhasilan penggunaan semen cair tergantung dari  bahan  pengencer  semen  yang  digunakan yaitu bahan pengencer tersebut harus menyediakan sumber nutrisi dan zat antioksidan yang  melindungi  spermatozoa  dari  kerusakan akibat radikal bebas.
Selama  pengelolaan  dan  penyimpanan pada  suhu  dingin,  sperma  akan  mengalami proses  metabolisme  untuk  mempertahankan hidupnya.  Hasil  metabolisme  sperma  selain menghasilkan  energi  juga  menghasilkan  radikal bebas yang dapat merusak membran spermatozoa  melalui  reaksi  peroksida  lipid (Zaniboni et  al .,  2006).  Kerusakan  yang diakibatkan oleh peroksida lipid pada spermatozoa  dapat  menurunkan  motilitas  dan daya  hidup  spermatozoa  (Maxwell  dan  Watson, 1996).  Upaya  untuk  meminimalkan  kerusakan membran  spermatozoa  akibat  peroksida  lipid selama  proses  pendinginan  dapat  dilakukan dengan  penambahan  antioksidan  pada  bahan pengencer.
Buah naga mengandung berbagai antioksidan, seperti flavonoid (Fitri et al ., 2016). Kulit  buah  naga  lebih  banyak  mengandung antioksidan jenis antosianin (Noor et al ., 2016). Antosianin ini yang berfungsi sebagai penetralisir  atau  penangkal  radikal  bebas (Wulandari,  2016).  Didalam  setiap  1  mg/mL kulit  buah  naga  merah  mampu  menangkal radikal bebas sebesar 83,48 ± 5,03% (Nurliyana et  al .,  2010).  Ekstrak  kulit  buah  naga  (EKBN) mampu mencegah kerusakan spermatozoa akibat pengaruh  dari  radikal  bebas  atau cold  shock (cekaman dingin).
Kulit  buah  naga  juga  mengandung vitamin  B1,  vitamin  B2,  vitamin  B3,  vitamin B6,  vitamin  B12,  vitamin  C,  protein,  lemak, karbohidrat,  serat  kasar,  flavonoid,  glukosa, fenol,  betasianin,  polifenol,  karoten,  fosfor,  zat besi dan fitoalbumin, yang beberapa diantaranya berperan  sebagai  antioksidan,  dan  lainnya berperan sebagai sumber energi dan metabolisme energi.
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dalam  penelitian  ini,  EKBN  ditambahkan sebagai  suplemen  pada  pengencer  tris-kuning telur  (TKT).  Tris  berfungsi  sebagai  penyangga pH pengencer sedangkan kuning telur mengandung  lipoprotein  dan  lecithin  yang berfungsi untuk mempertahankan dan melindungi  integritas  selubung  lipoprotein spermatozoa  selama  preservasi  (Arifiantini  dan Yusuf, 2006).

## METODE PENELITIAN

## Materi Penelitian
Penelitian  menggunakan  semen  segar yang  ditampung  dari  tiga  ekor  kambing  jantan bligon.  Ternak  dipelihara  dalam  kandang individu  yang  dilengkapi  dengan  tempat  makan dan  minum.  Pakan  hijauan  diberikan  sesuai dengan  berat  badan  yaitu  10%  dari  berat  badan dan  penambahan  0,5  kg  konsentrat  dan  air minum secara ed libitum.

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  metode eksperimen dengan rancangan percobaan adalah Rancangan  Acak  Lengkap,  terdiri  dari  enam perlakuan  dan  lima  ulangan  sehingga  terbentuk tiga  puluh    unit  percobaan.  Keenam  perlakuan tersebut adalah: TKT + EKBN 0% (P0), TKT +
EKBN 2% (P1), TKT + EKBN 4% (P2), TKT + EKBN 6% (P3), TKT + EKBN 8% (P4), TKT + EKBN 10% (P5).

## Pembuatan Bahan Pengencer
Tris amminomethane ditimbang  sebanyak 3,634 gram, asam sitrat 1,99 gram, glukosa 0,50 gram.  Ketiga  bahan  tersebut  dimasukkan  ke dalam  tabung  erlenmeyer  dan  ditambahkan aquadest  100  mL.  Semua  bahan  tersebut dicampur hingga homogen.
Penyiapan  kuning  telur  yaitu:  (1)  telur dibersihkan dengan alkohol 70% agar bersih dan steril  lalu  dipecahkan  pada  bagian  yang  lancip dan  pisahkan  kuning  telur  dari  putih  telur dengan  cara  ditiriskan.  (2)  kuning  telur  yang tinggal  terbungkus  selaput  atau  membrane
Leyn et al .: Kualitas Spermatozoa Kambing Bligon ……….
vitelin  diletakan  pada  kertas  saring  agar menyerap  sisa  putih  telur  yang  ada.  (3)  kuning telur  dipecahkan  dengan  cara  menyobek jaringan vitelin lalu secara perlahan kuning telur dituangkan kedalam gelas ukur. (4) kuning telur siap digunakan.
Ekstrak  kulit  buah  naga  dibuat  dari  kulit buah  naga  merah  segar.  Kulit  buah  naga  dicuci dan dipotong-potong kecil, dikeringkan menggunakan  oven  pada  suhu  105 o C  hingga
kadar  air  mencapai  10%.  Kulit  buah  naga  yang sudah kering selanjutnya dihaluskan menggunakan  blender  hingga  menjadi  bubuk, dan  bubuk  tersebut  dicampur  dengan  aquabides 100  mL  hingga  homogen.  Larutan  tersebut dicentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 5  menit.  Bagian  cairan  yang  berada  di  atas tabung  dipisahkan  dengan endapan  yang  berada di bawahnya, dan selanjutnya disimpan di dalam lemari pendingin sebagai EKBN.
Tabel 1. Komposisi bahan pengencer (100 mL)
Bahan Pengencer P0 P1 P2 P3 P4 P5 Tris (mL) 80 80 80 80 80 80 Kuning telur (mL) 20 20 20 20 20 20 EKBN (%) 0 2 4 6 8 10 Penisilin (IU/mL) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Streptomisin (mg/mL) 1000 1000 1000 1000 1000 1000

## Penampungan dan Evaluasi Semen
Penampungan  semen  dilakukan  dua  kali seminggu  menggunakan  metode  vagina  buatan dari  tiga  ekor  kambing  jantan  bligon  yang berumur  tiga  tahun  dengan  kondisi  tubuh  dan organ  reproduksi  yang  normal.  Semen  yang diperoleh  dievaluasi  kualitasnya  baik  secara makroskopis maupun mikroskopis
Evaluasi  secara  makroskopis  meliputi:1) warna dan volume semen dapat dilihat langsung di  dalam  gelas  penampungan    semen,  2) konsistensi  dinilai  dengan  memiringkan  tabung yang  berisi  semen  dan  mengembalikan  pada posisi  semula.  Jika  pergerakan  semen  dalam tabung gerakannya lambat maka semen memiliki konsistensi kental dan jika gerakannya cepat  maka  semen  memiliki  konsistensi  encer, 3)  derajat  keasaman  semen  dapat  diketahui dengan  cara  meneteskan  semen  diatas  kertas indikator  pH  berskala  1-14.  Perubahan  warna pada  kertas  pH  tersebut  disesuaikan  dengan standar warna pada kertas indikator pH.
Evaluasi kualitas semen secara mikroskopis meliputi:1) gerakan masa spermatozoa,  2)  konsentrasi  spermatozoa,  3) motilitas spermatozoa, 4) viabilitas spermatozoa, dan  5)  abnormalitas  spermatozoa.  Gerakan massa  spermatozoa  dikategorikan  dalam  3 golongan,  yaitu  pergerakan  masa  spermatozoa menyerupai  awan  tebal  dan  bergerak  cepat (+++), pergerakan masa spermatozoa awan tebal dan  bergerak  agak  lambat  (++)  dan  pergerakan masa  spermatozoa  menyerupai  awan  tipis  dan bergerak lambat (+). Amati di bawah mikroskop
dengan  pembesaran  10x10  dengan  cahaya dikurangi.
Konsentrasi  spermatozoa  menunjukkan jumlah  sel  spermatozoa  tiap  satuan  volume semen. Konsentrasi spermatozoa dihitung menggunakan alat haemocytometer. Perhitungan konsentrasi:  konsentrasi  spermatozoa  =  X  × volume  spermatozoa  ×  10 6 sperma/mL.  X  = jumlah spermatozoa hasil perhitungan. Konsentrasi  spermatozoa  menunjukan  jumlah sel  spermatozoa  tiap  satuan  volume  semen dengan cara diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 40×10. Persentase motilitas spermatozoa  ditentukan  melalui  pengamatan spermatozoa dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran  lensa  objektif  40×10.  Penilaian terhadap  persentase  spermatozoa  motil  adalah spermatozoa yang bergerak progresif ditentukan secara  subjektif  pada  sepuluh  lapang  pandang yang  berbeda,  nilai  yang  diberikan  berkisaran antara 0% dan 100% dengan skala 5%.
Viabilitas  spermatozoa  dilakukan  dengan menggunakan  pewarnaan  diferensial  eosin- negrosin,  spermatozoa  hidup  ditandai  dengan spermatozoa  tidak  menyerap  warna  merah (bening  atau  putih),  sedangkan  spermatozoa mati akan terlihat penyerapan warna merah ungu dari  eosin-negrosin.  Pengamatan  dilakukan menggunakan  mikroskop  dengan  pembesaran 40×10,  hitung  spermatozoa  dengan  total  200 spermatozoa atau pada 10 lapang pandang yang berbeda.  Perhitungan  nilai  viabilitas  diperoleh sesuai rumus: viabilitas =
Leyn et al .: Kualitas Spermatozoa Kambing Bligon ……….
.
Abnormalitas spermatozoa sama dengan evaluasi  viabilitas  dapat  diketahui  dengan  cara semen diwarnai dengan melihat bentuk morfologi  spermatozoa  yang  tidak  normal  baik abnormalitas primer maupun sekunder. Abnormalitas =

## Pengenceran dan Penyimpanan Semen
Semen  yang  berkualitas  baik  (motilitas  > 70%, konsentrasi > 800 × 10 6 , dan abnormalitas < 15%; Johnson et al ., 2000), diencerkan dengan TKT  yang  ditambahkan  dengan  EKBN  pada konsentrasi 0, 2, 4, 6, 8, atau 10%.. Semen yang telah  diencerkan,  disimpan  dalam  lemari pendingin  dengan  suhu  3-5 o C  dan  dilakukan evaluasi  setiap  24  jam  terhadap  motilitas, viabilitas, dan abnormalitas spermatozoa.
Variable Penelitian
Variabel yang diukur dalam penelitian ini adalah: (1) motilitas spermatozoa (%), ditentukan  melalui  pengamatan  spermatozoa dibawah  mikroskop  cahaya  dengan  pembesaran 40×10. Penilaian terhadap persentase spermatozoa  motil  adalah  spermatozoa  yang bergerak  progresif    ditentukan  secara  subjektif pada  5  lapang  pandang  yang  berbeda;  (2) Viabilitas  spermatozoa  (%),  dengan  pewarnaan eosin-negrosin  dan  lihat  dengan  pembesaran 40×10.  Sperma  yang  mati  akan  menyerap  zat warna  (berwarna  merah)  sedangkan  sperma yang  hidup  tidak  menyerap  zat  warna.  Hitung total sperma ≥ 800% spermatozoa atau pada 10 lapang pandang yang berbeda; (3) Abnormalitas spermatozoa  (%),  dilihat  dengan  mikroskop pembesaran  40×10  berdasarkan  abnormalitas primer dan sekunder.

## Analisis Data
Keseluruhan data yang terkumpul dianalisis  dengan analysis  of  variance (Anova) dan  dilanjutkan  dengan  uji  Duncan  dengan program software SPSS 22.0 for windows .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Semen Segar Sebelum melakukan pengenceran,
kualitas semen dievaluasi melalui uji makroskopis dan uji mikroskopis. Hasil pengamatan  semen  segar  setelah  penampungan dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Karakteristik semen segar kambing bligon
Karakteristik semen Rerata Volume semen (mL) 1,00 ± 0,22 Warna semen Krem Konsistensi semen Kental pH semen 6,46 ± 0,13 Gerakan Massa sperma +++ Konsentrasi sperma(X 10 6 sel/mL) 1667 ± 187,13 Motilitas sperma (%) 79,00 ± 2,23 Viabilitas sperma(%) 85,70 ± 0,85 Abnormalitas sperma (%) 3,00 ± 0,56
Hasil penelitian menunjukan bahwa rerata volume semen segar kambing bligon adalah 1,00 ±  0,22  mL  dengan  kisaran  0,7  -  1,3  mL.  Hafez (2000)  mengemukakan  bahwa  karakteristik semen  kambing  yang  normal  yaitu  memiliki volume 0,8 – 1,2 mL. perbedaan volume semen dipengaruhi  oleh  individu  ternak,  umur,  bangsa ternak,  metode  koleksi  dan  frekuensi  ejakulasi (Toelihere, 1993).
Warna  semen  yang  diperoleh  pada penelitian ini adalah krem. Pada ternak kambing, warna  semen  krem  termasuk  warna  yang normal,  dan  warna  semen  ada  kaitan  dengan konsentrasi spermatozoa. Semakin tinggi konsentrasi  sperma  maka  warna  semen  akan semakin krem.
Konsistensi semen kambing dalam penelitian ini dapat digolongkan menjadi kental. Tingkat  kekentalan  semen  dapat  digunakan
Leyn et al .: Kualitas Spermatozoa Kambing Bligon ……….
untuk penafsiran konsentrasi spermatozoa dalam satu  milliliter  semen.  Hafez  (2000)  menyatakan bahwa  tingkat  kekentalan  semen  memiliki korelasi  positif  dengan  jumlah  spermatozoa. Semen  yang  berkonsistensi  kental  memiliki konsentrasi spermatozoa yang tinggi, sebaliknya yang  berkonsistensi  encer  memiliki  konsentrasi spermatozoa  yang  rendah.  Salah  satu  faktor penting  yang  mempengaruhi  kualitas  semen adalah derajat keasaman (pH). Tinggi rendahnya pH  semen  akan  menyebabkan  kematian  pada spermatozoa.  Hasil  penelitian  ini  menunjukan bahwa  pH  semen  kambing  bligon  yaitu  6,46  ± 0,13%.  Nilai  yang  diperoleh  masih  dalam kisaran  normal  pH  semen  kambing  6  –  7 (Suwarso, 1999; Tambing et al ., 2000).
Rataan  gerakan  massa  semen  kambing bligon  yang  diperoleh  dalam  penelitian  dari pemeriksaan  secara  mikroskopis  adalah  +++. Nilai gerakan massa spermatozoa ini sesuai yang dilaporkan oleh  Yusuf et al . (2005) yaitu (+++) dan  Setiadi et  al .  (2000)  yaitu  (++)  dan  (+++). Gerakan  massa  dalam  penelitian  ini  dinilai cukup  baik  atau  memenuhi  syarat  untuk pelaksanaan  IB  yaitu  (++)  dan  (+++)  (Siregar dan Hamdan, 2007).
Konsentrasi  spermatozoa  adalah  jumlah spermatozoa per milliliter semen yang merupakan  salah  satu  parameter  kualitas spermatozoa  dalam  menentukan  jumlah  betina yang  dapat  di  IB.  Konsentrasi  spermatozoa kambing  bligon  dalam  penelitian  ini  adalah 1.667  ±  187,13  x  106/mL.  Nilai  konsentrasi spermatozoa hasil penelitian ini lebih tinggi dari penelitian  Partama  (2000)  yaitu  1471,11  x 106/mL. Perbedaan konsentrasi spermatozoa ini dipengaruhi  oleh  umur,  bangsa  ternak,  bobot badan,  frekuensi  penampungan  dan  waktu penampungan  (Yotov et  al .,  2011).  Konsentrasi spermatozoa  juga  dipengaruhi  oleh  manajemen dan  pemberian  pakan  yang  pada  akhirnya  akan berpengaruh pada konsistensi semen.
Motilitas  adalah  daya  gerak  spermatozoa yang  dapat  dijadikan  sebagai  acuan  dalam penilaian kualitas spermatozoa untuk inseminasi buatan  (Bintara,  2011).  Menurut  Siregar  dan Hamdan  (2007)  persentase  spermatozoa  yang motil  minimal  mencapai  70%.  Persentase motilitas  spermatozoa  semen  kambing  bligon dalam penelitian ini adalah 79,00 ± 2,23%. Nilai motilitas  ini  lebih  tinggi  dari  penelitian sebelumnya  pada  kambing  PE  yaitu  70% (Setiadi et al ., 2000) dan 72,2% (Konstaman dan Sutama,  2004).  Perbedaan  persentase  motilitas spermatozoa  dipengaruhi  oleh  volume  ejakulat,
umur, bangsa ternak, dan perubahan temperature (Shukla et al ., 1992).
Jumlah spermatozoa kambing bligon yang hidup, hasil penelitian ini adalah 85,70 ± 0,85%. Hasil  penelitian  ini  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  Yustendi  (2013)  sebesar  79,4  ±  3,13%. Nilai  spermatozoa  abnormal  yang  diperoleh dalam penelitian ini adalah 3,00 ± 0,56, nilai ini masih  dalam  kisaran  normal  sesuai  pernyataan Garner  dan  Hafez  (2000)  dimana  abnormalitas spermatozoa tidak boleh melebihi 20%.

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap    Kualitas Spermatozoa
Kualitas spermatozoa dalam penelitian ini diukur  dengan  menggunakan  variabel  motilitas, viabilitas,  dan  abnormalitas.  Motilitas  individu spermatozoa  merupakan  salah  satu  faktor kualitas  semen  yang  perluh  diperhatikan  dalam inseminasi  buatan.  Motilitas  dan  viabilitas spermatozoa  kambing  bligon  dalam  pengencer TKT  pada  berbagai  level  EKBN  dapat  dilihat pada Tabel 3.
Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa penambahan  EKBN  6%  dalam  pengencer  TKT menghasilkan motilitas dan viabilitas spermatozoa  yang  lebih  tinggi  dari  perlakuan lainnya (P<0,05) setelah penyimpanan selama 5 hari  (Tabel  3).  Hingga  hari  ke-5  preservasi, abnormalitas spermatozoa pada semua perlakuan  berada  di  bawah  6%,  namun  secara statitistik, abnormalitas spermatozoa pada perlakuan  yang  mendapat  EKBN  secara  nyata lebih  rendah  (P<0,05)  daripada  kontrol  (Tabel 4).
Berdasarkan persentase motilitas, viabilitas  dan  abnormalitas  spermatozoa  yang diukur dalam penelitian ini menunjukkan bahwa suplementasi  EKBN  6%  dalam  pengencer  TKT efektif untuk mempertahankan kualitas spermatozoa kambing bligon.
Kandungan nutrisi yang ada dalam EKBN seperti  karbohidrat,  protein  dan  lemak  berperan sebagai  sumber  energi  untuk  pergerakan spermatozoa  (Hafez,  2000).  Selain  itu  EKBN juga banyak mengandung vitamin  C, vitamin E, alkaloid,  terpenoid,  flavonoid  dan  karoten  yang dapat bersifat sebagai antioksidan. Sebagaimana dilaporkan  oleh  Manuhuruk  (2016),  kapasitas antioksidan  kulit  buah  naga  adalah  321,78  ± 6,29  mg/100g.  Antioksidan  yang  terkandung dalam  EKBN  pada  pengencer  dapat  mengikat radikal bebas yang terdapat dalam sel, sehingga dapat  mencegah  peroksida  lipid  yang  dapat menurunkan motilitas spermatozoa.
Leyn et al .: Kualitas Spermatozoa Kambing Bligon ……….
Tabel 3.  Rataan motilitas dan viabilitas (%) spermatozoa kambing bligon
Hari penyimpanan 0 1 2 3 4 5 Motilitas (%) P0 79.47 ± 2,17 a 68,53± 1,65 b 58,39 ± 4,22 b 49,02 ± 3,13 b 39,82 ± 1,13 b 30,19 ± 0,87 b P1 79,59 ± 2,39 a 68,80 ± 2,12 b 58,72 ± 4,88 b 50,66 ± 2,91 b 40,53 ± 0,59 b 31,72 ± 1,78 b P2 79,53 ± 2,35 a 69,90 ± 2,28 b 61,06 ± 3,76 b 52,70 ± 3,89 b 41,57 ± 1,89 b 33,53 ± 2,53 b P3 79,79 ± 2,25 a 75,03 ± 3,04 a 67,86 ± 2,30 a 61,82 ± 2,16 a 52,83 ± 3,27 a 43,30 ± 3,08 a P4 79,31± 2,09 a 67,47± 2,14 bc 57,08 ± 3,06 b 41,15 ± 4,85 c 34,30 ± 5,98 c 25,23 ± 5,12 c P5 79,25± 2,06 a 64,59 ± 3,56 c 52,10 ± 2,60 c 37,71 ± 3,24 c 29,08 ± 2,67 d 20,05 ± 2,27 d Viabilitas (%) P0 85,85 ± 0,88 a 72,67 ± 1,76 b 62,03 ± 4,38 b 52,64 ± 2,97 b 41,69± 4,17 bc 34,41 ± 0,69 b P1 85,57 ± 0,95 a 73,03 ± 2,06 b 62,88 ± 4,61 b 54,49 ± 2,90 b 44,58 ± 0,57 b 35,77 ± 1,67 b P2 85,79 ± 0,73 a 74,47 ± 2,22 b 65,88 ± 4,15 b 57,56 ± 4,07 b 46,57 ± 2,13 b 38,26 ± 2,88 b P3 85,76 ± 0,95 a 81,80 ± 2,50 a 74,69 ± 1,97 a 68,49 ± 2,86 a 59,32 ± 2,95 a 50,16 ± 2,71 a P4 85,65 ± 0,91 a 71,44 ± 1,72 b 60,94 ± 3,13 b 45,06 ± 4,98 c 38,42 ± 6,56 c 29,68 ± 5,23 c P5 85,84 ± 1,04 a 67,00 ± 3,58 c 54,74 ± 2,26 c 40,51 ± 3,28 c 32,43 ± 2,51 d 23,80 ± 2,01 d Superskrip yang sama  pada kolom yang sama menunjukan perbedaan yang tidak nyata (P>0,05).
Tabel 4. Rataan abnormalitas (%) spermatozoa kambing bligon
Perlakuan Hari penyimpanan 0 1 2 3 4 5 P0 2,55 ± 0,58 a 3,00 ± 0,48 a 3,48± 0,36 ab 3,61± 0,33 b 3,76 ± 0,28 b 4,45 ± 0,39 b P1 2,63 ± 0,55 a 2,91 ± 0,47 a 3,49± 0,27 ab 3,76± 0,46 b 3,92 ± 0,44 b 4,32 ± 0,43 b P2 2,62 ± 0,56 a 3,05 ± 0,56 a 3,42± 0,23 b 3,55± 0,25 b 3,79 ± 0,34 b 4,34 ± 0,35 b P3 2,79 ± 0,56 a 2,75 ± 0,65 a 3,51± 0,25 ab 3,64± 0,27 b 3,88 ± 0,41 b 4,23 ± 0,21 b P4 2,66 ± 0,52 a 2,76 ± 0,54 a 3,64± 0,38 ab 3,94± 0,35 ab 4,42 ± 0,36 a 4,66 ± 0,38 b P5 2,46 ± 0,44 a 2,83 ± 0,48 a 3,89± 0,36 a 4,35± 0,52 a 4,86 ± 0,24 a 5,22 ± 0,20 a
Superskrip yang sama  pada kolom yang sama menunjukan perbedaan yang tidak nyata (P> 0,05).
Selain  nutrisi  dan  antioksidan  dalam EKBN  juga,  terdapat  lipoprotein  dan  lecitin yang  terkandung  didalam  kuning  telur  yang berfungsi untuk mempertahankan dan melindungi  integritas  selubung  lipoprotein spermatozoa.  Selain  itu  tris  mengandung  zat nutrient  yang  lengkap  dan  konsentrasi  yang cukup  dalam  melindungi  spermatozoa.  Didalam tris juga mengandung asam sitrat yang berfungsi sebagai  zat  penyanggah.  Zat  penyanggah diperluhkan  untuk  mencegah  penurunan  pH medium secara drastis, sehingga berdampak baik terhadap  daya  hidup  sperma.  Foote  (1980) mengemukakan  bahwa  didalam  pengencer  tris terdapat  bahan-bahan  yang  dapat  mencegah perubahan pH, mempertahankan tekanan osmotik,  menjaga  keseimbangan  elektrolit, mengikat  butir-butir  lemak,  sebagai  sumber energi,  melindungi  spermatozoa  terhadap  cold shock.
Hasil  penelitian  ini  memperlihatkan bahwa  hasil  persentase  motilitas  spermatozoa setelah  penambahan  EKBN  10%  (P5)  lebih rendah dibandingkan dengan penambahan EKBN  6%  (P3).  Hal  ini  diduga  terjadi
perubahan  pH  pada  pengencer  semen  yang diberikan  EKBN.  Pemberiam  EKBN  dengan dosis  yang  tinggi  diduga  menyebabkan  pH pengencer  menjadi  terganggu  karena  pH  pada kulit  buah  naga  5,5  (Abdullah  dan  Abdullah, 2011).
Rataan  persentase  motilitas  spermatozoa hasil penelitian ini sebesar 43,30 ± 3,08% lebih tinggi dibandingkan dengan penelitian Siswandoko et  al. (2017)  yaitu  41±  4,18%.  Hal ini  mungkin  disebabkan  oleh  perbedaan  level EKBN  yang  digunakan  yang  selanjutnya  akan berkorelasi dengan konsentrasi antioksidan serta zat nutrisi yang terkandung di dalamnya. Selain itu, adanya perbedaan karakteristik yang berbeda antara semen segar dan semen beku menyebabkan  perbedaan  dalam  level  EKBN yang optimal dalam kedua penelitian ini.
Berdasarkan  uraian  tersebut  maka  dapat diketahui  bahwa  penambahan  EKBN  ke  dalam medium  TKT  memberikan  nilai  motilitas  lebih baik  dibandingkan  tanpa  penambahan  EKBN. Kandungan  antioksidan  pada  EKBN  mampu mempertahankan  motilitas  spermatozoa  lebih baik  dibandingkan  tanpa  penambahan  EKBN
Leyn et al .: Kualitas Spermatozoa Kambing Bligon ……….
(Imansih,  2014).  Penambahan  EKBN  pada pengencer  TKT  mampu  memberikan  motilitas lebih  tinggi  serta  meningkatkan  gerak  progresif spermatozoa  (Munawaroh,  2014).  Sehingga penambahan antioksidan berperan penting dalam menghambat reaksi peroksida lipid yang mampu merusak membran spermatozoa akibat penyimpanan.  Membran  plasma  spermatozoa kaya akan asam lemak tak jenuh oleh karena itu rentan  terhadap  kerusakan  peroksida  (Rizal  dan Herdis,  2010).  Antioksidan  juga  berperan mencegah kerusakan membran plasma spermatozoa  yang  disebabkan  oleh  cekaman dingin (cold shock) dan memberikan perlindungan terhadap spermatozoa.
Viabilitas  merupakan  salah  satu  indikator penentu  kualitas  semen  karena  berhubungan dengan  daya  hidup  spermatozoa.  Evaluasi persentase  viabilitas  spermatozoa  biasanya ditentukan  berdasarkan  penyerapan  zat  warna eosin  yang  dicampurkan  pada  spermatozoa. Spermatozoa yang mati tampak berwarna merah sedangkan  spermatozoa  yang  hidup  tampak bening  transparan  atau  tidak  berwarna  (Zhou et al ,  2004).  Viabilitas  spermatozoa  tergantung pada  keutuhan  membran  spermatozoa  dan kerusakan  membran  spermatozoa  yang  akan menyebabkan terganggunya proses metabolisme intraseluler  spermatozoa  sehingga  spermatozoa akan  melemah  dan  bahkan  bisa  menyebabkan kematian (Ihsan, 2008).
Viabilitas  spermatozoa  untuk  pembuatan semen  yang  diencerkan  minimal  memiliki  60% sampai dengan 75% spermatozoa hidup (Garner dan Hafez, 2000). Persentase hidup spermatozoa ditentukan oleh membran plasma utuh. Membran  plasma  spermatozoa  berfungsi  untuk melindungi  organel  spermatozoa  dan  transport elektrolit  untuk  metabolisme  spermatozoa. Membran plasma yang rusak dapat berpengaruh fungsi  fisiologis  dan  metabolisme  spermatozoa sehingga  menyebabkan  spermatozoa  mati. Metabolisme  spermatozoa  dapat  mempengaruhi daya hidup spermatozoa karena pada spermatozoa yang memiliki aktivitas metabolisme  yang  tinggi  menghasilkan  asam laktat  yang  tinggi  yang  dapat  membunuh spermatozoa (Varasofiari et al ., 2013). Membran plasma  yang  utuh  memiliki  korelasi  dengan motilitas spermatozoa, semakin banyak membrane plasma spermatozoa yang utuh maka semakin  banyak  spermatozoa  yang  motil (Azzahra et  al .,  2016).  Kualitas  spermatozoa dikatakan baik jika memiliki jumlah
spermatozoa yang hidup tinggi dan spermatozoa mati <15% (Bintara, 2011).
Rataan  persentase  viabilitas  spermatozoa pada  penelitian  ini  adalah  50,16  ±  2,71%  lebih rendah  daripada  hasil  penelitian  Siswandoko et al .,  (2017)  yaitu  74,6%.  Nalley et  al (2007) menyatakan  bahwa  nilai  persentase  viabilitas spermatozoa  biasanya  sedikit  lebih  tinggi  dari persentase  motilitas.  Hal  ini  disebabkan  karena spermatozoa  yang  tidak  motil  progresif,  tetapi sebenarnya  masih  hidup  sehingga  tidak  akan menyerap  warna  dari  larutan  eosin  yang digunakan.
Tingginya  viabilitas  spermatozoa  pada perlakuan  EKBN  6%  dibandingkan  dengan perlakuan  yang  lain  terjadi  karena  adanya ketersediaan  antioksidan  dalam  EKBN  yang mampu mempertahankan nilai viabilitas spermatozoa.  Kandungan  antioksidan  pada EKBN  mampu  mencegah  dan  mengurangi peroksida  lipid  akibat  radikal  bebas  sehingga mampu menekan efek peroksidasi pada spermatozoa yang dapat menyebabkan penghambatan fruktolisis dan respirasi, pengikatan  enzim  intraseluler  dan  kerusakan struktur  membran  plasma  terutama  pada  bagian akrosom dan mampu mempertahankan viabilitas semen.  Penambahan  zat  antioksidan  pada pengencer  memiliki  manfaat  yang  cukup  baik diantaranya  mencegah  aktivitas  radikal  bebas terhadap  kerusakan  membran  sel  spermatozoa yang  berpengaruh  terhadap  viabilitas  dan fertilitas  spermatozoa,  berperan  sebagai  sumber energi untuk mempertahankan viabilitas spermatozoa, disamping itu juga untuk memperbaiki  komposisi  dan  kondisi  fisiologis dari  pengencer  tersebut  (Aslam et  al .,  2014; Lubis et al ., 2013).
Terjadinya peningkatan persentase viabilitas  spermatozoa  kambing  bligon  dari semen segar dan pasca pengenceran menggunakan  pengencer  TKT  ditambahkan dengan  EKBN,  kemungkinan  disebabkan  oleh aktivitas  kandungan  bahan  bioaktif  dalam EKBN yang dibutuhkan oleh spermatozoa untuk mempertahankan stabilitas dan permeabilitas sel seperti karbohidrat, protein, kalsium, vitamin C, vitamin  E,  flavonoid  dan  karoten.  Menurut Putranti et  al .  (2010),  protein  berperan  dalam kestabilan  dan  permeabilitas  membran  plasma spermatozoa. Protein akan membungkus membran plasma spermatozoa, sehingga fosfolipid  membran  plasma  spermatozoa  hanya sedikit yang mengalami proses peroksidasi yang akan merusak membran sel spermatozoa.
Leyn et al .: Kualitas Spermatozoa Kambing Bligon ……….
Kandungan  mineral  dalam  EKBN  seperti natrium,  kalium  dan  klorida  sangat  diperluhkan untuk  menjaga  integritas  fungsional  membran plasma  spermatozoa  dan  bikarbonat  berperan sebagai  agen  penyanggah  untuk  mencegah penurunan pH semen selama proses penyimpanan (Purdy, 2006). Kandungan  EKBN seperti  vitamin  C,  vitamin  E,  flavonoid  dan karoten, yang berperan penting dalam mengoptimalisasi  laju  fruktolisis  sehingga kebutuhan  energi  untuk  kelangsungan  hidup spermatozoa  selama  penyimpanan  terpenuhi. Vitamin  C,  vitamin  E,  flavonoid  dan  karoten sebagai  antioksidan  dapat  mengikat  oksigen radikal yang terdapat didalam sel sehingga dapat mencegah  terbentuknya  peroksida  lipid  yang dapat menghambat glikolisis.
Abnormalitas  merupakan  kelainan  bentuk yang dialami oleh spermatozoa. Bentuk spermatozoa  yang  normal  terdiri  dari  kepala, leher  bagian  tengah  (badan)  dan  ekor  yang sesuai  dengan  bentuk  morfologinya.  Morfologi abnormal pada spermatozoa berhubungan dengan fertilitas ternak (Susilawati, 2011).
Berdasarkan hasil analisis statistik menyatakan bahwa penambahan EKBN berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap abnormalitas spermatozoa. Abnormalitas terendah  terdapat  pada  pada  perlakuan  6% (4,23%) yang disimpan selama lima hari. Hal ini menunjukan  bahwa  kandungan  flavonoid  dari EKBN mampu mempertahankan nilai abnormalitas. Rizal & Herdis (2010) menyatakan  bahwa  penambahan  antioksidan mampu  menghentikan  reaksi  yang  ditimbulkan oleh radikal bebas. Siswandoko (2017) menambahkan  bahwa  pemberian  antioksidan dengan  dosis  yang  tepat  memberikan  hasil
maksimal  untuk  mencegah  dan  mengurangi reaksi  peroksida  lipid  akibat  aktivitas  radikal bebas  pada  membran  plasma  spermatozoa, dimana  bagian  tersebut  kaya  akan  asam  lemak tak  jenuh  sehingga  rentan  terhadap  reaksi peroksida  lipid.  Berkurangnya  reaksi  peroksida lipid  akan  berdampak  pada  rendahnya  nilai abnormalitas spermatozoa. Kandungan flavonoid  dalam  EKBN  berguna  sebagai antioksidan  yang  akan  menetralkan  radikal bebas  sehingga  mencegah  kerusakan  pada spermatozoa (Khaki et al., 2011).
Persentase  spermatozoa  sangat  penting untuk diketahui karena abnormalitas yang tinggi hingga  20%  dari  jumlah  spermatozoa  akan mengganggu  fertilitas  pejantan  secara  umum (Hidayati et  al .,  2015).  Nilai  persentase abnormalitas  dari  penelitian  ini  masih  dapat digunakan  untuk  IB.  Kusumawati et  al .  (2017) menyatakan bahwa standar persentase abnormalitas  spermatozoa  kambing  yang  layak digunakan  untuk  IB  tidak  lebih  dari  15%. Sedangkan  menurut  Susilawati  (2011)  nilai abnormalitas  yang  dapat  digunakan  untuk  IB adalah  kurang  dari  20%  morfologi  spermatozoa abnormal.  Menurut  Hafez  (2000)  menyatakan bahwa  abnormalitas  spermatozoa  pada  semen kambing  sebesar  8-10%  tidak  berpengaruh terhadap  fertilitas,  tetapi  apabila  abnormalitas melebihi  25%  dari  total  ejakulasi  maka  akan berpengaruh pada fertilitas. Kemudian Partodhiardjo  (2002)  juga  menyatakan  bahwa abnormalitas  yang  lebih  dari  20%  menunjukan kualitas  spermatozoa  yang  jelek.  Spermatozoa yang  abnormal  biasanya  dapat  membuahi  sel telur,  tetapi  biasanya  akan  menyebabkan kematian anak sebelum lahir.

## SIMPULAN
Penambahan  EKBN  dalam  pengencer TKT  hingga  6%  dapat  mengurangi  penurunan
kualitas  spermatozoa  kambing  bligon  selama preservasi in vitro .

## DAFTAR PUSTAKA
Abdullah  A,  Abdullah  N.  2011.  Quality characteristics  and  acceptability  of  three types  of  pitaya  fruit  in  a  consumer acceptance  test. Journal  of  Tourism Hospitality & Culinary Arts 3(1): 89-98.
Arifiantini  RI,    Yusuf  TL.  2006.  Keberhasilan menggunakan  tiga  bahan  pengencer dalam  dua  jenis  kemasan  pada  proses
pembekuan  semen  sapi  frisien  holstein. Majalah Ilmiah Peternakan 9(3): 89-93. Aslam,  Dasrul  HA,  Rosmaidar.  2014.  Pengaruh penambahan  vitamin  C  dalam  pengencer andromed  terhadap  persentase  motilitas dan  membrane  plasma  utuh  spermatozoa sapi  Aceh  setelah  pembekuan. Jurnal Medika Veterinaria 8(1): 20-26.
Leyn et al .: Kualitas Spermatozoa Kambing Bligon ……….
Azzahra  FY,  Setiatin  ET,  Samsudewa  D.  2016. Evaluasi  motilitas  dan  presentase  hidup semen  segar  sapi  PO  kebumen  pejantan muda. Jurnal Sains Peternakan Indonesia 2: 99-107.
Bintara S. 2011. Rasio X:Y dan kualitas sperma pada  kambing  kacang  dan  peranakan ettawa. Sains Peternakan 9(2): 65-71.
Fitri  NL,  Susetyarini  RE, Waluyo  L.  2016. The effect  of  ciplukan  (Physalis  angulata  L) fruit  extract  on  SGPT  and  SGOT  levels against  white  male  mice  (Mus  Musculus) hyperglycemia  induced  by  alloxan  as biology  learninf  reso  urces. Jurnal Pendidikan  Biologi  Indonesia 2(2):  180- 187.
Foote  RH.  1980.  Artificial  insemination.  In: E.S.E.  Hafez  (Ed.)  Reproduction  in  Farm Animals  4th  Ed.  Lea  and  Febiger, Philadelphia.
Garner DL, Hafez ESE. 2000. Spermatozoa and Seminal Plasma . In Farm Animals. Edited by  E.S.E.  Hafez.7th  edition.  Lippincott Williams and Wilkins. Maryland, USA. Hafez  ESE.  2000. Reproduction  In  Farm Animal. 7th  ed.,  Lippincott  Williams  and Wilkins, Philadelphia.
Hidayati  N,  Arifiantini  RI,  Sajuthi  D.  2015. Preservasi  semen  kambing  peranakan ettawa  dalam  pengencer  tris  dan  sitrat kuning  telur  dengan  penambahan  sodium dodecyl  sulphate. Jurnal  Veteriner 16(3): 334-342.
Ihsan MN. 2008. Upaya peningkatan konsentrasi spermatozoa hasil pemisahan dengan sentrifugasi gradient densitas percoll pada sapi  friesien  holstein  (FH).      Disertasi. Program Pascasarjana, Universitas Brawijaya, Malang.
Kartusudjana  R.  2001. Ciri-ciri  atau  Tanda Keabnormalitasan  pada  Semen  Kambing Peranakan  Ettawa (PE).  Departemen Pendidikan Nasional. Jakarta.
Khaki  A,  Fathiazad  F,  Nouri  M,  Amir  AK.
2011.  Effect  of  Ocimum  basilicum  on apoptosis in testis if rats after exposure to electromagnetic  field. Afr  J  Pharm Parmacol. 5(1): 1534-1537.
Kusumawati  DE,  Utomo  KN,  Krisnaningsih AJN,  Syam  R.    2017.  Kualitas  semen kambing  Kacang  dengan  lama  simpan yang berbeda pada suhu ruang menggunakan pengencer tris
aminomethan  kuning  telur.  In  Seminar
Nasional  Hasil  Penelitian. JITRO 4(2): 42-51.
Lubis TM,  Dasrul, Thasmi  CN,  Akbar T.  2013. Efektivitas  penambahan  vitamin  C  dalam pengencer  susu  skim  kuning  telur terhadap  kualitas  spermatozoa  kambing boer  setelah  penyimpanan  dingin. Jurnal S. Pertanian 3(1): 347-361.
Manuhuruk  FM.  2016.  Efektivitas  penambahan ekstrak kulit buah naga merah (Hylocereus polyrhizus) sebagai pewarna, antioksidan,  dan  antimikroba  pada    sosis daging  sapi  selama  penyimpanan  dingin. Tesis. Institut Pertanian Bogor.
Maxwell  WMC,  Watson  PF.  1996.  Recent progress in the preservation of ram semen.
J. Anim. Reprod. Sci. 42(10): 55-65.
Munawaroh.  2014.  Penambahan  ekstrak  buah naga (Hylocereus ondotus) untuk pengawetan spermatozoa kambing peranakan  boer  pada  suhu  5 o C. Scripta Biologica 4(4): 223-247.
Nalley  WM,  Handarini  R,  Purwantara  B.  2007.
Viabilitas spermatozoa rusa Timor (Cervus  timorensis)  di  dalam  pengencer tris kuning telur dengan sumber karbohidrat  yang  berbeda  yang  disimpan pada suhu ruang. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner 12(4): 311-317.
Noor MI, Yufita EY, Zulfalina. 2016.
Identifikasi  kandungan  ekstrak  kulit  buah naga    merah  menggunakan  fourier transform infrared (FTIR) dan phytochemistry. Journal  of  Aceh  Physics Society 5(1):14-16.
Nurliyana  R,  Zahir  IS,  Suleiman  KM,  Aisyah MR, Rahim KK. 2010. Antioxidant study of  pulpl  and  peels  of  dragon  fruids:  a comparave  study. International  Food Research Journal 17(1):367-375.
Partama  IBG.  2000.  Kebutuhan  energi  dan protein kambing peranakan ettawah calon pejantan. Disertasi . Program
Pascasarjana,  Institut  Pertanian  Bogor. Bogor.
Partodihardjo S. 2002. Ilmu Reproduksi Hewan . Penerbit Mutiara Sumber Widya. Jakarta. Purdy  PH.  2006.  A  review  on  goat  sperm cryopreservation. Small  Rumin  Research 63(3): 215-225.
Putranti  OD,  Kustono,  Ismaya.  2010.  Pengaruh penambahan  crudetannin  pada  sperma cair  kambing  peranakan  ettawa  yang disimpan  selama  14  hari  terhadap
Leyn et al .: Kualitas Spermatozoa Kambing Bligon ……….
viabilitas
spermatozoa.
Buletin Peternakan 34(1): 1-7.
Rizal  M,  Herdis  M.  2010.  Peranan  antioksidan dalam meningkatkan kualitas semen beku. Jurnal Wartazoa 20(3):139-146.
Setiadi  B,  Sutama  IK,  Situmorang  P,  Supriyati, Adiati  U,  Budiarsa  IGM,  Kostaman  T,
Maulana,  Mulyawan.  2000.  Evaluasi karakteristik  semen  kambing  calon  bibit.
Laporan Bagian Proyek Rekayasa
Teknologi  Peternakan  ARMP-II:  74-87.
Balai Penelitian Ternak.
Shukla SN, Singh BB, Tomarand NS, Misra BS.
1992.  Factors  affecting  spermatozoa motility in preserved semen. Indian Vet. J.
69 (2): 856-857. Siregar TN, Hamdan. 2007. Teknologi
Reproduksi  Pada  Ternak .  CV.  Mita Mulia, Banda Aceh.
Siswandoko  B,  Zaenab  S,  Husamah.  2017.
Penambahan  ekstrak  kulit  buah  naga  ke dalam  pengencer  tris  kuning  telur  untuk meningkatkan kualitas semen beku kambing peranakan ettawa. Jurnal Scripta biologica 4(4): 247-251. Susilawati  T.  2011. Spermatology. UB  Press. Malang.
Sutiyono, Riyadi S, Kismiati S. 2006. Fertilisasi
dan daya tetas telur dari ayam petelur
hasil  inseminasi  buatan  menggunakan semen ayam kampong
yang diencerkan  dengan  bahan  berbeda. J .
Pengembangan  Peternakan  Tropis. 31 (1): 36-40.
Suwarso. 1999. Peranan ranifosa dalam pengencer tris sitrat kuning telur terhadap kualitas  semen  beku  kambing  peranaakn ettawah. Thesis. Program  Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Tambing SN, Toelihere MR, Yusuf TL, Sutama IK.  2000.  Pengaruh  gliserol  dalam pengencer  tris  terhadap  kualitas  semen beku  kambing  peranakan  ettawa. JITV 5(1): 84-91.
Toelihere  MR.  1993. Inseminasi  Buatan  Pada Ternak . Angkasa. Bandung.
Varasofiari  LN,  Setiatin  ET,  Sutopo.  2013. Evaluasi semen segar sapi jawa   brebes berdasarkan lama waktu penyiapan.
Animal Agriculture 2(1): 201-208. Wulandari R, Budiyanta MAK, Waluyo L. 2016.
The influence of various  concentration of red  roses  (Rosa  damascene  mill)  flower extract to anthocyanin color stability jelly as  biology  learning  source. Jurnal Pendidikan Biologi Indonesia 2(1): 40-48. Yotov S, Fasulkov I, Vassilev N. 2011. Effect of ejaculation  frequency  on  spermatozoa survival in diluted from pleven blackhead rams. Turk.  J.Vet.  Anim.  Sci .  2(2):  117- 122.
Yustendi  D.  2013.  Penambahan  tepung  daun katuk  (Saurupus  androgynus  L.  merr) dalam  ransum  kambing  jantan  peranakan ettawa terhadap konsumsi pakan, pertambahan berat badan, lingkar scrotum dan kualitas spermatozoa. Thesis. Program  Pascasarjana.  Universitas  Syiah Kuala, Banda Aceh.
Yusuf  TL,  Arifiantini  RI,  Rahmiwati  N.  2005. Daya tahan semen cair kambing peranakan  ettawa  dalam  pengenceran kuning  telur  dengan  kemasan  dan konsentrasi  spermatozoa  yang  berbeda.  J. Indon. Trop. Anim. Agric. 30(4): 217-223. Zaniboni  L,  Rizzi  R  and  Cerolini  S.  2006. Combined  effect  of  DHA  and 𝛼 tocopherol  enrichment  on  sperm  quality and fertility in the turkey. Theriogenology 65(1): 1813-1827.
Zhou  JB,  Yuek  KZ,  Luo  MJ,  Chang  ZL,  Liang H,  Wang  ZY,  Tan  JH.  2004.      Effect  of extender  and  temperatures  on  sperm viability  and  fertility  capacity  of  harbin white boer semen during long-term liquid storage. Asian-Au  J.  Sci 17(11):1501- 1508.