## Oceana Biomedicina Journal

## UJI  POTENSI ANTI KANKER EKTRAK ETANOL BIJI KEBIUL (Caesalpinia bonduc (L) Roxb) DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)
Densi Selpia Sopianti 1* , Aina Fathkil 1 , Yesa Christine Sanuki 1
Akademi Farmasi Yayasan Al-Fathah Bengkulu. Jl. Indragiri Gang 3 Serangkai, Padang Harapan, Bengkulu
* Corresponding author: dselpias@gmail.com
ABSTRACT
Cancer becomes a global health problem which is estimated to continue to increase in number. The prevalence of cancer in Indonesia is 1.4% or around 347,792 people. Cancer treatment is currently carried out with chemotherapy, radiotherapy, and surgery. At present many active compounds from herbal plants are believed to be one of the alternatives used by the community as an anticancer, shown by several studies and the availability of active compounds from a single herbal plant isolated from plants as anticancer easily found by  the  community  and  have  minimal  side  effects.  One  of  the  potential  plants  in  Bengkulu  is  Kebiul (Caesalpinia bonduc (L.) Roxb) which, according to the Bengkulu community, is used for various diseases. The purpose of this study is that the researchers wanted to test the potential of the active compound of whistle seeds  (Caesalpinia  bonduc  (L.)  Roxb)  with  the  Brine  Shrimp  Lethality  Test  method.  The  stages  of  this research were by making dried simplicia from whistle seeds then extracted with 96% ethanol and evaporated on  a  rotary  evaporator  until  thick  ethanol  extract  was  obtained.  The  extract  was  tested  using  the  BSLT Method, calculated the number of larval deaths and measured LD 50 . The results of the probit value equation analysis showed the LC 50 value of the ethanol extract of whistle seeds was 11,1943 μg/mL, this shows that the ethanol extract of the whistle seeds was very toxic which was indicated by LC50 values <30 μg / mL. Keywords : Kebiul Seed, Anti-cancer, BSLT, LC 50 .

## ABSTRAK
Penyakit  kanker  menjadi  masalah  kesehatan  dunia  yang  diperkirakan  jumlahnya  akan  terus meningkat. Prevalensi penyakit kanker di Indonesia sebesar 1,4% atau sekitar 347.792 orang. Penanganan penyakit  kanker  saat  ini  yang  dilakukan  dengan  kemoterapi,  radioterapi,  dan  operasi.  Saat  ini  banyak senyawa  aktif  dari  tanaman  herbal  yang  dipercaya  sebagai  salah  satu  alternative  yang  digunakan masyarakat sebagai antikanker, ditunjukan dengan beberapa penelitian dan ketersediaan senyawa aktif dari tanaman herbal tunggal yang diisolasi dari tanaman sebagai antikanker mudah ditemukan oleh masyarakat dan  meiliki  efek  samping  yang  minimal.  Salah  satu  tanaman  yang  berpotensi  di  Bengkulu  yaitu  kebiul (Caesalpinia bonduc (L.) Roxb) yang mana menurut masyarakat Bengkulu bijinya digunakan untuk berbagai penyakit. Tujuan penelitian ini peneliti ingin menguji potensi senyawa aktif biji kebiul (Caesalpinia bonduc (L.) Roxb) dengan metode Brine Shrimp Lethality Test. Tahapan penelitian ini dengan membuat simplisia kering dari biji kebiul lalu diekstraksi dengan etanol 96% dan diuapkan diatas rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental etanol. Ekstrak diuji menggunakan Metode BSLT, dihitung jumlah kematian larva dan diukur LD50. Hasil dari analisis regresi linier menunjukan nilai LC 50 dari ekstrak etanol biji kebiul adalah 11,1943 μg/mL hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol biji kebiul bersifat sangat toksik yang mana ditandai dengan nilai LC 50 < 30 μg/mL. Kata Kunci : Biji Kebiul, Anti kanker, BSLT, LC 50

## Oceana Biomedicina Journal

## PENDAHULUAN
Era  globalisasi  saat  ini  penyakit  kanker  menjadi  masalah  kesehatan  dunia  yang  diperkirakan jumlahnya akan terus meningkat. Pada tahun 2012, sekitar 8,2 juta kematian disebabkan oleh kanker (WHO. 2014). Dari hasil data Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) pada tahun 2013, diketahui bahwa prevalensi penyakit kanker di Indonesia sebesar 1,4% atau sekitar 347.792 orang (KEMENKES 2015). Penanganan penyakit  kanker  saat  ini  yang  dilakukan  dengan  kemoterapi,  radioterapi,  dan  operasi.  Beberapa  obat kemoterapi yang paling sering digunakan adalah antimetabolit, senyawa interaktif DNA, senyawa antitubulin, hormon  dan  senyawa  penarget  molecular  (Nussbaumer    S,  et.al,  2011).  Namun,  penggunaan  obat-obat kemoterapi  tersebut  dapat  menimbulkan  efek  samping  seperti  rambut  rontok,  supresi  sumsum  tulang, resistensi obat, lesi gastrointestinal, disfungsi neurologi, dan toksisitas jantung Hosseini A dan Ghorbani A. 2015. Saat ini banyak senyawa aktif dari tanaman herbal yang dipercaya sebagai salah satu alternative yang digunakan  masyarakat  sebagai  antikanker,  ditunjukan  dengan  beberapa  penelitian  dan  ketersediaan senyawa aktif dari tanaman herbal tunggal yang diisolasi dari tanaman sebagai antikanker mudah ditemukan oleh masyarakat dan meiliki efek samping yang minimal (Hosseini A dan Ghorbani A. 2015). Salah satu tanaman  yang  berpotensi  di  Bengkulu  yaitu  kebiul  (Caesalpinia  bonduc  (L.)  Roxb).  Dimana  menurut masyarakat Bengkulu bijinya digunakan sebagai obat. Namun hanya sedikit sekali data yang membuktikan bahwa  biji  kebiul  (Caesalpinia  bonduc  (L.)  Roxb)  bisa  mengobati  berbagai  penyakit-penyakit  tersebut melainkan hanya wawancara secara langsung dengan masyarakat yang menggunakan tanaman ini.
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan  oleh  Sopianti,  dkk,  2016,  bahwa  ekstrak  biji  kebiul mengandung  senyawa  metabolit  sekunder  berupa  alkaloid,  flavonoid,  saponin,  dan  steroid.  Beberapa senyawa tanaman yang memiliki potensi sebagai antikanker yang telah diteliti yaitu : Alkaloid, flavonoid, saponin dan triterpenoid berkhasiat sebagai antioksidan yang mampu menangkal radikal bebas (Reynertson,

## Oceana Biomedicina Journal
Volume 4 Issue 2: July – December 2021
K. A., 2007). Adapun beberapa tanaman yang memiliki potensi sebagai anti kanker yang telah diteliti yaitu teh  hijau  (camellia  sinensis  L.(kuntze).  Senyawa  polifenol,  flavonoid  dan  tanin  yang  terdapat  teh  hijau merupakan konstituen aktif yang memberikan efek antikanker (Tabaga dkk, 2015) dan analisis melaporkan flavonoid  dari  lengkuas  (alfnia  galanga)  juga  memiliki  aktivitas  antikanker  (Imran.  M,  et.  al,  2007). Berdasarkan  penelitian  tanaman  obat  sebagai  antikanker,  ekstrak  brucea  javanica  mempunyai  senyawa alkaloid (brucamarine, yatanine) juga memiliki aktivitas antikanker payudara dengan mempunyai nilai LC50 = 2,69 𝜇/𝑚𝐿 terhadap sel kanker payudara.
Salah  satu  metode  awal  untuk  uji  sitotoksik  adalah  Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT).  BSLT merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa antikanker baru  yang berasal  dari  tanaman  (Mayer,  et.  al,  1982).  Metode  BSLT  merupakan  salah  satu  metode  untuk  skrining tanaman obat yang berpotensi, telah terbukti memiliki korelasi dengan aktivitas antikanker. Selain itu, metode ini  juga  mudah  dikerjakan,  murah,  singkat,  mudah  dikembangkan  serta  tidak  ada  aturan  etika  dalam penggunaan bahan uji, cepat, dan cukup akurat (Anderson, C. M. Goetz and J. L. McLaughlin. 1991). Nilai mortalitas ditentukan dengan menggunakan analisa probit untuk menentukan nilai toksisitas menggunakan Lethal  Consentration  (LC50).  Dari  latar  belakang  diatas,  peneliti  tertarik  untuk  melakukan  penelitian  uji potensi  antikanker  dari  ekstrak  biji  kebiul  (Caesalpinia  bonduc  (L.)  Roxb)  dengan  metode  Brine  Shrimp Lethality Test (BSLT) yang akan dihitung LC50 dari nilai mortalitas ditentukan dengan menggunakan analisa probit untuk menentukan nilai toksisitas.

## METODE PENELITIAN
Alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu,seperangkat  blender (sharp), oven , alat-alat gelas (cawan penguap, gelas ukur, beker glass, erlemeyer, pipet volume, corong),  rotary evaporator, kertas saring, waterbath, Sendok tandu, Timbangan digital, mikropipet, aquarium, saringan, lampu pijar (40 watt),  vial dan alumunium foil.

## Oceana Biomedicina Journal
Volume 4 Issue 2: July – December 2021
Bahan yang digunakan yaitu   biji kebiul, etanol 96%, Aquadestilata, air laut buatan (NaCl), larva udang, dan ragi DMSO.

## Penyiapan Simplisia
Pada  umumnya  simplisia  melewati  proses  pengumpulan  bahan  baku,  sortasi  basah,  pencucian, pengeringan, pemecahan sortasi kering dan penyimpanan.

## Proses Ekstraksi
Proses ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Serbuk biji kebiul sebanyak 650 gr direndam dalam etanol  96%. Di dalam botol gelap selama 24 jam sesekali dilakukan pengocokan kemudian filtrate du uapkan pada rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental.

## Uji Toksisitas Menggunakan Metode Brine Shrimp Lethality Test

## Penyiapan Larva Artemia Salina Leach
Sebanyak 100 mg telur Artemia Salina Leach, direndam dalam wadah yang berisi 500 ml air laut. buatan (NaCl) diberi penerangan dengan lampu pijar (40 watt), selama 2x24 jam.

## Pembuatan Larutan Uji
Siapkan  vial untuk tiap kelompok perlakuan dan control negative  (masing-masing reflikasi 3 kali). Buat larutan stock (induk) sebesar 100 mg sampel (ekstrak etanol) dilarutkan sampai 10 mL dengan DMSO. Pengujian dilakukan dengan mengunakan larutan uji 10 ml air laut di tambahkan 10 ekor larva Artemia salina leach dan 1 tetes ragi DMSO (0,6 mg/mL) sebagai makananya.larutan uji di buat 1, 2, 4, 6, 8 dan 10 ppm dalam air laut, maka dari larutan stok tersebut dipipet ke dalam vial masing-masing menggunakan mikropipet.

## Oceana Biomedicina Journal

## Pelaksanaan Uji
Masukkan masing-masing sampel ke dalam vial Selanjutnya vial diisi air laut 1 ml lalu dimasukkan 10 ekor Artemia salina Leach umur 48 jam yang sehat (bergerak aktif) dipilih secara acak lalu dimasukkan ke dalam vial yang berisi sampel yang bebas pelarut menggunakan pipet tetes kemudian dicukupkan air laut buatan sampai 10 ml. Tambahkan satu tetes suspensi ragi DMSO (0,6mg/10 ml air laut) ditambahkan ke dalamnya sebagai makanan Artemia salina Leach. Vial diletakkan dibawah lampu penerangan selama 24 jam. Setelah 24 jam jumlah larva yang mati dihitung.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil dari pembuatan Ekstrak Biji Kebiul didapatkan berat ekstrak 75,03 gram dan didapatkan hasil Rendemen ekstrak 11,54%. Menurut farmakope herbal Indonesia nilai suatu rendemen merupakan  standar dalam  penemuan  obat  yang  berasal  dari  bahan  alam  maupun  sintetis.  Secara  kuantitas  ada  tiga  jenis metabolit  sekunder  yaitu  sebagai  senyawa  utama  didapatkkan  lebih  besar  dari  0,01%  dari  berat simplisia(>100mg/kg  simplisia),  senyawa  minor  0,01-0,0001%  (75-20mg/Kg  simpilisa,  senyawa  kulimit 0,0001%  (5-0,5mg/kg  simplisia.  Pada  penelitian  ini  didapatkan  hasil  rendemen  11,54%  sehingga  dapat disimpulkan bahwa ekstrak biji kebiul mengandung senyawa meabolid sekunder utama (Saifudin, A, 2014).

## Uji BSLT (Brine Shirmp Lethality Test)
Telur  larva  udang  yang  telah  berubah  menjadi    Nauplii  bdimasukan  dalam  vial  dengan  masing- masing berisi 10 naupli dan konsentrasi 1, 2, 4, 6, 8, 10 ppm dan diamati jumlah kematian selama 24 jam. Adapun data pengamatan kematian Larva udang dapat dilihat pada tabel I.

## Oceana Biomedicina Journal
Volume 4 Issue 2: July – December 2021
Tabel  1  Data  Hasil  Pengamatan  Kematian  Larva  Udang  Artemia  Salina  Leach  Dengan  Menggunakan Metode BSLT (Brine Shirmp Lethality Test) Setelah 24 Jam Perlakuan
Sampel Uji Replikasi Jumlah Larva Udang Yang Mati Tiap Konsentrasi ppm μg/ml (10 Ekor) Kontrol (-) 1 ppm 2  ppm 4 ppm 6ppm  8 ppm 10ppm Ektrak Etanol 1 1 1 2 3 3 5 0 2 0 1 1 3 4 5 0 3 0 1 2 3 4 6 0 Total Kematian 1 3 5 9 11 16 0 % Kematian 3,3% 10% 16,6% 30% 36,6% 53,3% 0
Dari data di atas, di analisis  menggunakan SPSS one way ANOVA. Uji shapiro-wilk dapat digunakan jika sampel kita kurang dari 50. Hasil uji normalitas  didapan  nilai signifikan  P> 0,05 maka data terdistribusi normal.  Dilanjutkan dengan  uji  homogenitas  didapatkan    nilai  signifikan 0,074 P>  0,05  disimpulkan  data homogen. Langkah  selanjutnya  Uji  One  Way Anova  untuk  melihat  apakah  ada  perbedaan  rata-rata  dari konsentrasi ppm data yang diperoleh. Dari hasil uji anova ada perbedaan yang bermakna  ditunjukkan nilai signifikansi 0,023 P <0,05 diantara perlakuan konsentrasi. Tahap terakhir dengan uji Duncan untuk melihat konsentrasi mana yang paling baik atau berkhasiat. Uji ini menunjukkan pada setiap perlakuan konsentrasi 10 ppm menyebabkan persen kematian larva tertinggi, sedangkan pada konsentrasi 1 ppm menyebabkan persen  kematian  larva  terendah.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  ekstrak  maka semakin tinggi juga jumlah kematian larva.
Perhitungan  persentasi  dianalisis  dengan  menggunakan  persamaan  regresi  linear  dengan membandingkan data konsentrasi dan persen kematian ke bentuk logaritma serta mengubah nilai persen kematian larva kedalam satuan probit. Di dapatkan persamaan garis Y = 5,2855x+ 2,3416 dengan  nilai R² =0,9841.  Hubungan  antara  nilai  konsentrasi    dengan  nilai  %  kematian  dapat  dilihat  pada  gambar  grafik dibawah ini.

## Oceana Biomedicina Journal
Volume 4 Issue 2: July – December 2021
Gambar 8 Hubungan Antara Nilai Log Konsentrasi  Dengan Nilai Probit Kematian
Nilai Y tersebut digunakan untuk mencari nilai LC50. Dengan memasukkan nilai Y = 5, maka akan diperoleh nilai X = 1,0495 Untuk menghitung nilai LC 50 yaitu antilog X yaitu sebesar  11,1943 μg/mL.
Menurut Doyle et al. (2000) dalam uji BSLT suatu ekstrak dikatakan aktif jika LC 50 (ekstrak dapat menyebabkan kematian 50% hewan uji ) bila LC 50 kurang dari 1000 μg/mL. Penelitian Meyer et al. (1982) juga melaporkan bahwa suatu ekstrak menunjukkan aktivitas ketoksikan Sangat toksik <30, Toksik 30-1000, Tidak  toksik  >1000.  Berdasarkan  nilai  LC 50 yang  diperoleh  dapat  dikatakan  ekstrak  etanol  biji  kebiul (Caesalpinia bonduc (L)Roxb)  pada percobaan ini bersifat toksik karena hasil yang didapatkan tidak lebih besar  (>1000)  dan  tidak  lebih  kecil  (<30)  terhadap  larva  artemia  salina  leach  sehingga  memiliki  potensi sebagai senyawa antikanker.
y = 1.8152x + 3.0949 R² = 0.97 0 1 2 3 4 5 6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 N IL A I PROB IT KONSENTRASI GRAFIK KONSENTRASI DAN NILAI PROBIT Series1 Linear (Series1)

## Oceana Biomedicina Journal

## KESIMPULAN
Hasil dari analisis regresi linier menunjukan nilai LC 50 dari ekstrak etanol biji kebiul adalah 11,1943 μg/mL hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol biji kebiul bersifat sangat toksik yang mana ditandai dengan nilai LC 50 < 30 μg/mL.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Peneliti mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Riset dan Pengabdian Masyarakat Direktorat Jenderal Penguatan Riset dan Pengembangan Kementrian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi Atas Dana Penelitian Dosen Pemula Sesuai dengan DIPA Deputi Bidang Penguatan Riset dan Pengembangan Kementerian Riset, Teknologi/ Badan Riset dan Inovasi Nasional SP-DIPA-042.06.1.401516/2020 tanggal 12 November 2019, Akademi Farmasi Al-Fatah Bengkulu dan semua pihak yang membantu dalam proses penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Anderson, C. M. Goetz and J. L. McLaughlin. 1991. A Blind Comparison of Simple Bench-top Bioassays and Human Tumour Cell Cytotoxici ties as Antitumor Prescreens . Phytochemical Analisis. vol. 2, (107) I-II.
Hosseini A dan Ghorbani A. 2015. Cancer therapy  with  phytochemicals: evidence  from  clinical  studies. Avicenna J Phytomed. 5 (2): 84-97.
Imran M, Talpur FN, Jan MS, Khan A, Khan I. Analysis of nutritional components of some wild edible plants. J Chem Soc Pak. 2007;29(5):500–508.
Kementrian  Kesehatan  RI  Pusat  Data  dan Informasi  Kesehatan.  2015.  Stop Kanker.infodatin-Kanker. Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E., dan McLaughin, J.L., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituent, Planta Medica. 45:31-34. Nussbaumer  S,  Bonnabry  P,  Veuthey  JL, Sandrine  F.  2011.  Analysis  of anticancer  drugs:  A  review. Talanta, 85: 2265-2289.
Reynertson,  K.  A.,  2007,  Phytochemical  Analysis  of  Bioactive  Constituens  from  Edible  Myrtaceae  Fruit, Dissertation, The City University of New York, New York.
Saifudin,  A,  2014,  Senyawa  Alam  Metabolit  Sekunder  Teori,  Konsep  dan  Teknik  Pemurnian,  Depublish,
Yogyakarta.
Sopianti DS, Herlina, Aulikha NP. 2017. Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder Dari Ekstrak Etanol Biji Kebiul (Caesalpinia bonduc (L). Roxb), Proseding Seminar Nasional Herbal Medicine November 2017, Kerjasama Antara Akademi Farmasi Al-Fatah Bengkulu dan Vokasi D3 Farmasi Universitas Bengkulu. Halaman 101-109.

## Oceana Biomedicina Journal
Tabaga, K. D., Durry, M. F., & Kairupan, C. (2015). Efek Seduhan Teh Hijau (Camellia Sinensis) Terhadap Gambaran Histopatologi Payudara Mencit Yang Diinduksi Benzo (α) pyrene. eBiomedik, 3(2). WHO. 2014. Cancer. Fact Sheet No. 2971. Geneva:  Switzerland. http://www.who.int.[Diakses  pada  28 Juli 2019].