Hasil Penelitian

## RESPON IMUN MUKOSA DAN SELULER PADA TIKUS YANG DIBERI BUBUK SUSU KAMBING DENGAN INFEKSI Salmonella Typhimurium
[Mucosal and Cellular Immune Response of Rat Given Goat Milk Powder and Infected with Salmonella Typhimurium ]
Nurliyani 1) *, Madarina Julia 2) , Eni Harmayani 3) dan Endang Baliarti 1)
1) Fakultas Peternakan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
2) Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
3) Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Diterima 11 April 2012 / Disetujui 04 Desember 2012

## ABSTRACT
Goat milk contains bioactive proteins and oligosaccharides which can act as immunomodulators and prebiotics respectively. The objectives of this  study  were  to  determine  the  effect  of  giving  goat  milk  powder  on  mucosal  immune  response  (sIgA/secretory  immunoglobulin  A),  cellular immune  response  (IFN-γ/interferon-γ)  and  the  total  number  of  lactobacilli  in  caecal  digesta  of  infected  rat  by  Salmonella Typhimurium .  Male Sprague  Dawley  rats  3  weeks  old  were  divided  into  two  groups:  1)  goat  milk  powder  treatment,  and  2)  control.  After  14  days  given  goat  milk powder, the rats were infected with Salmonella Typhimurium and after 21 days were killed. The results showed that the average concentration of sIgA in group of rats given with goat milk powder was not significantly different with the control rat (42.95 ng/ml). The concentration of IFN-γ in rat given with goat milk powder was significantly different (63.33 pg/ml) from the control (45.00 pg/m) (p<0.05). After infection, the concentration of IFN- γ of the rat given goat milk powder decreased significantly to 36.33 pg/ml (P<0.05). The number of total lactobacilli in rats given with goat milk powder was 6.91 log 10 CFU/g before infection. After infection the number of total lactobacilli reduced significantly to 6.16 log 10 CFU/g (P<0.05). In conclusion, goat milk powder could not induce mucosal and cellular immune responses after infection. However, the cellular immune response was induced in uninfected rats. Therefore, the immune system can not eliminate the pathogen which cause a decrease in lactobacilli colonization in infected rat.
Keywords : Goat Milk Powder, IFN-γ, Lactobacilli, Salmonella Typhimurium , sIgA

## ABSTRAK
Susu  kambing  mengandung  protein  bioaktif  dan  oligosakarida  yang  masing-masing  dapat  berperan  sebagai  imunomodulator  dan  prebiotik. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mempelajari  pengaruh  pemberian  bubuk  susu  kambing  terhadap  respon  imun  mukosa  (sIgA /secretory immunoglobulin  A ),  respon  imun  seluler  (IFN-γ/ interferon-γ ),  dan  jumlah  total lactobacilli dalam  caecal  digesta  tikus  yang  diinfeksi  Salmonella Typhimurium .  Tikus  jantan  Sprague  Dawley  umur  3  minggu  dibagi  menjadi  dua  kelompok:  1)  perlakuan  bubuk  susu  kambing,  dan  2)  kontrol. Setelah  pemberian  bubuk  susu  kambing  selama  14  hari  tikus  diinfeksi  dengan  Salmonella Typhimurium ,  dan  setelah  21  hari  kemudian  tikus dibunuh. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rerata konsentrasi sIgA pada tikus yang diberi bubuk susu kambing tidak berbeda dengan kontrol (42.95  ng/ml). Konsentrasi IFN- γ pada tikus yang diberi  bubuk susu kambing menunjukkan perbedaan signifikan dengan  kontrol (45.00 pg/ml) (P<0.05,  namun  setelah  infeksi  konsentrasi  IFN-γ  menurun  secara  signifikan  pada  tikus  yang  diberi  bubuk  susu  kambing  menjadi  36.33  pg/ml (P<0.05). Jumlah total lactobacilli pada tikus yang diberi bubuk susu kambing adalah 6.91 log 10 CFU/g sebelum infeksi, sedangkan jumlah total lactobacilli setelah  infeksi  menurun  secara  signifikan  menjadi  6.61  log 10 CFU/g  (P<0.05).  Kesimpulannya,  bubuk  susu  kambing  tidak  dapat menginduksi respon imun mukosa dan seluler setelah infeksi, tetapi respon imun seluler dapat diinduksi pada tikus yang tidak diinfeksi. Akibatnya sistem imun tidak dapat mengeliminasi patogen yang menyebabkan penurunan kolonisasi lactobacilli pada tikus yang diinfeksi.
Kata kunci : IFN- γ, Lactobacilli , Salmonella Typhimurium , sIgA, Susu Kambing Bubuk

## PENDAHULUAN
1
Penyakit diare karena infeksi masih tetap menjadi penyebab utama morbiditas dan mortalitas pada anak-anak. Selama bebe- rapa  dekade  terakhir,  upaya  global  telah  difokuskan  pada pencegahan  transmisi,  dan  promosi  penggunaan  terapi rehidrasi  oral  untuk  mengurangi  ancaman  tersebut.  Meskipun
*Korespondensi Penulis : E-mail : nurliyani@yahoo.com; Telp.: 0274-513363
upaya  ini  sudah  dilakukan,  penyakit  diare  pada  anak-anak masih  menjadi  penyebab  1.5-2.5  juta  kematian  per  tahun  di seluruh dunia (Rhee et al. 2005).
Infeksi  salmonella  biasanya  disebabkan  oleh  konsumsi pangan  yang  terkontaminasi  dan  biasanya  menyebabkan  be- berapa  penyakit  pada  manusia  seperti  demam  tipoid  dan salmonellosis  (Tellez et  al. 2011).  Salah  satu  agen  menular yang  paling  umum  dari  kasus  gastroenteritis  akut  adalah Salmonella Typhimurium . Bakteri yang berhasil masuk ke dalam saluran  pencernaan  melalui  makanan  atau  air  yang  ter-
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
kontaminasi dapat melekat dan menyerang sel-sel epitel usus, terutama sel-sel M ( microfold ) yang melapisi Peyer patch (Rhee et  al. 2005).  Oleh  karena  itu  perlu  dikembangkan  strategi preventif  yang  dapat  memperbaiki  bahaya  infeksi  salmonella. Salah  satu  cara  untuk  mengurangi  bahaya  infeksi  salmonella dengan cara peningkatan sistem imun inang (Jain et al. 2008). Komponen  bioaktif  dalam  susu  berperan  penting  untuk proteksi  perkembangan  intestinum  pada  anak  yang  baru  lahir terhadap  patogen,  dan  memodulasi  respon  imun  setelah paparan  antigen.  Berbagai  bukti  menunjukkan  bahwa  peptida hasil hidrolisis protein susu dapat meregulasi fungsi imun pada anak  yang  baru  lahir.  Peptida  dari  protein  susu  dapat  ber- aktivitas pada level sistem imun mukosa sampai fungsi sistem imun tersebut berkembang secara penuh (Baldi et al. 2005). Bubuk  susu  kambing  sangat  praktis  diaplikasikan  untuk anak-anak  di  daerah  rawan  gizi.  Bahkan  susu  kambing  juga telah  direkomendasikan  sebagai  alternatif  yang  sangat  baik untuk  rehabilitasi  anak-anak  gizi  buruk  di  Madagaskar,  karena absorpsi  lemaknya  lebih  bagus  dibanding  susu  sapi.  Hal  ini didasarkan  pada  studi  di  30  rumah  sakit  di  Madagaskar  yang merawat anak-anak gizi buruk usia 1–5 tahun, dengan periode pemberian  susu  kambing  2  minggu  (Haenlein,  2004).  Manfaat bubuk  susu  kambing  dalam  mengurangi  terjadinya  kerusakan epitel  usus  halus  telah  diteliti  oleh  Prosser et  al. (2004) pada tikus yang diinduksi stres panas. Demikian juga aktivitas growth factor susu kambing dalam kultur sel menunjukkan lebih tinggi dibanding susu sapi (Wu et al. 2006). Susu kambing kaya akan sumber prebiotik oligosakarida yang mirip oligosakarida ASI (air susu  ibu)  (Bode,  2006),  dan  berbeda  dengan  prebiotik  lain seperti inulin atau frukto-oligosakarida rantai pendek (Villoslada et  al. 2006).  Perbedaan  tersebut  dikarenakan  oligosakarida susu  dapat  menurunkan  adesi  patogen  pada  sel-sel  epitel ( antiadhesive  receptor  analogs untuk  patogen),  sehingga menghambat perlekatannya dengan sel-sel inang (Bode, 2006; Villoslada et al. 2006).
Imunoglobulin  A  sekretori  (sIgA)  banyak  dijumpai  pada saliva dan sekresi eksokrin yang lain seperti saluran pencerna- an,  pernafasan  dan  saluran  urine  (Seemann et  al. 2004). Mekanisme  utama  proteksi  terhadap  antigen  patogen  oleh imunitas mukosa adalah diperantarai lewat sel-sel penghasil IgA dan  IgA  sekretori  yang  dapat  menetralisir  dan  mencegah masuknya antigen berbahaya ke dalam inang. Stimulasi respon imun  lokal  efektif  terhadap  pencegahan  penyakit  oleh  mikro- organisme yang masuk ke dalam tubuh inang melalui jalur oral (Baldi et  al. 2005).  Imunoglobulin  A  sekretori  berfungsi  pada sekresi  mukosa  sebagai  pertahanan  garis  depan  dengan  cara membatasi invasi patogen. Proteksi barier epitelial mukosa oleh sIgA melalui berbagai mekanisme. Pertama, yaitu pembentukan kompleks dengan antigen lokal yang melapisi jaringan, diambil oleh sel fagosit, kemudian diabsorpsi ke dalam sistem vaskular atau ditransport melalui epitelium ke dalam lumen (Snoeck et al . 2006).
Interferon γ (IFN-γ) merupakan sitokin esensial dalam reaksi imun  (Aattouri et  al. 2002),  yang  diproduksi  oleh  sel  T  ter- aktivasi  maupun  sel  NK  ( natural  killer ).  Peningkatan  aktivasi imun  akan  menyebabkan  produksi  IFN-γ  dan  peningkatan fungsi APC ( antigen-presenting cells ) oleh induksi molekul klas II,  yang  berpotensi  untuk  mengaktivasi  sel  T  lebih  lanjut.
Disamping itu IFN-γ juga mengaktifkan makrofag. Sitokin IFN-γ dikenal  mempunyai  aktivitas  sebagai  imunoregulator,  berperan dalam diferensiasi sel B dan sebagai antiviral (Roitt et al. 1993). Mikrobia yang mendiami saluran pencernaan inang mempunyai fungsi-fungsi  metabolik, trophic dan  protektif  yang  penting  dan spesifik  (Guarner  dan  Malagelada,  2003).  Tikus  yang  diberi pakan  susu  formula,  menunjukkan  adanya  beberapa  jenis bakteri  di  dalam caecum antara  lain Lactobacillus,
Enterobacteria ceae, Clostridium, Enterococcus, Staphylococcus , dan
Streptococcus (Nakayama et al. 2003). Berdasarkan alasan-alasan tersebut di atas, perlu dilakukan penelitian  yang  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  pem- berian  bubuk  susu  kambing  terhadap  respon  imun  mukosa (sIgA)  dan  respon  imun  seluler  (IFN-γ)  serta  jumlah  total lactobacilli digesta caecum pada tikus yang diinfeksi Salmonella Typhimurium , yang sejauh ini informasinya masih terbatas.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah bubuk  susu  kambing  Peranakan  Ettawah  (PE)  yang  dibuat dengan  cara spray  drying ,  Salmonella Typhimurium yang diambil  dari  koleksi  kultur  Pusat  Studi  Pangan  dan  Gizi  UGM, Rat-sIgA ELISA Kit, Rat IFN-γ ELISA Kit, dan medium Rogosa Agar.

## Hewan percobaan
Hewan  percobaan  yang  digunakan  adalah  tikus  jantan Sprague  Dawley  umur  3  minggu  yang  diperoleh  dari  LPPT (Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu) UGM. Semua prosedur terkait hewan coba telah dilakukan sesuai persyaratan etik  dari  Komisi  Etik  Penelitian  Kedokteran  dan  Kesehatan Fakultas  Kedokteran  Universitas  Gadjah  Mada  ( Ethical Clearence Number : KE/FK/374/EC).

## Ra ncangan penelitian
Tikus  dibagi  menjadi  dua  kelompok  perlakuan,  yaitu kelompok yang diberi bubuk susu kambing dan kelompok yang tidak  diberi  bubuk  susu  kambing/kontrol  (akuades).  Masing- masing  kelompok  dibagi  menjadi  dua  yaitu  sebelum  dan sesudah  infeksi.  Setiap  kelompok  perlakuan  sebelum  dan sesudah  infeksi  digunakan  ulangan  6  ekor  tikus.  Percobaan dilakukan selama 21 hari, pada hari ke 15 tikus diinfeksi secara oral  dengan  Salmonella Typhimurium dengan  konsentrasi  10 5 CFU/ml.  Pengambilan  sampel  cairan  intestinum,  limpa  dan digesta caecum tikus  dilakukan  pada  hari  ke  14  (sebelum infeksi) dan hari ke 21 (setelah infeksi). Selama percobaan tikus mendapat  pakan  standar  AIN-93G  (Reeves et  al. 1993).  Susu kambing  diberikan  sebanyak  0.36  g/ekor/hari  secara gavage yang setara dengan konsumsi susu 200 ml untuk manusia.
Koleksi cairan intestinum (Modifikasi Yun et al. 2000) Pengambilan cairan intestinum tikus diambil secara flushing menggunakan 4 ml PBS ( phosphate-buffered saline ) dingin pH 7,  yang  mengandung  2  mM  PMSF  ( phenylmethyl  sulfonyl fluoride ), 10 μg TPCK ( tosylphenylalanine chloromethyl ketone ),
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
0.02%  NaN 3 ,  5  mM  EDTA  ( ethylene  diamine  tetra  acetic ). Cairan flushing ditampung  dalam  tabung conical steril  15  ml kemudian disentrifugasi pada 926 x g (Sorval, Biofuge primo R), supernatan  diambil  dan  disimpan  dalam  suhu  -20°C  sampai dianalisis.
Prosedur  koleksi  supernatan  dari  kultur  limfosit  limpa (modifikasi Jain et al. 2008)
Limpa diambil secara aseptis dan ditempatkan dalam 5 ml medium  RPMI  (Gibco)  yang  mengandung  10%  FBS  ( fetal bovine  serum )  dan  2%  penisilin-streptomisin.  Limpa  dicuci dengan PBS, kemudian ditempatkan pada medium RPMI yang mengandung  FBS  dan  penisilin-streptomisin  (Gibco).  Limpa dirobek dengan spet dan disemprot menggunakan ujung spet 1 ml  dengan  bantuan  pinset.  Setelah  limfosit  terlepas,  suspensi didiamkan sebentar agar sisa–sisa jaringan limpa mengendap. Bagian supernatan diambil dengan pipet Pasteur dan dipindah dalam tabung conical steril lalu disentrifugasi 5 menit pada 148 x g. S upernatan dibuang kemudian, endapan disentrifugasi lagi dalam  medium  FBS.  Endapan  yang  didapat  ditepatkan konsentrasi selnya sebanyak 5x10 5 /ml, kemudian ditumbuhkan dalam  medium  RPMI  yang  mengandung  FBS  dan  penisilin- streptomisin, lalu dimasukkan ke dalam plate 96 well . Mitogen PHA  ( phytohaemagglutinine )  ditambahkan  ke  setiap well dengan konsentrasi 5 µg/ml. Plate dimasukkan dalam ikubator 5%  CO 2 (inco  2  Memmert)  selama  72  jam,  suhu  37 ο C.  Kultur limfosit dikeluarkan dari inkubator, supernatan diambil sebanyak 50 µl untuk analisis sitokin.

## Analisis sIgA (sesuai instruksi dalam ELISA Kit,  Uscn Life Science Inc., Wuhan)
Imunoglobulin A sekretori (sIgA) cairan intestinum dianalisis menurut instruksi pada Rat sIgA ELISA Kit (Uscn Life Science Inc.,  Wuhan) sebagai  berikut: Larutan  standar,  sampel  dan blanko sebanyak 100 µl masing-masing dimasukkan ke dalam well yang ada pada plate , kemudian plate ditutup dengan plate sealer dan  diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  2  jam.  Larutan dibuang  kemudian  ditambahkan  100  µl  larutan  D etection Reagent A  ( biotin-conjugated  polyclonal  antibody  specific  for sIgA )  ke  dalam  setiap well dan  diinkubasikan  selama  1  jam pada  suhu  37ºC.  Larutan  pada well dibuang  kemudian plate dicuci sampai tiga kali dengan Wash Solution 1 X. Selanjutnya ditambahkan  100  µl  larutan Detection  Reagent B  ( Avidin conjugated to Horseradish Peroxidase/HRP) dan diinkubasikan selama  30  menit  pada  suhu  37ºC.  Plate  dicuci  lima  kali, kemudian  ditambahkan  90  µl Substrate  Solution ( Tetramethyl benzidine) ke dalam setiap well dan diinkubasikan selama 15- 25 menit pada suhu 37ºC pada  ruang gelap (cairan akan ber- warna  biru). Stop  Solution ( sulphuric  acid) sebanyak  50  µl ditambahkan ke dalam setiap well (cairan akan berubah warna menjadi  kuning),  selanjutnya  dibaca  pada microplate  reader (Model 680 XR, Bio-RAD) panjang gelombang 450 nm.
Analisis  IFN-γ  (sesuai  instruksi  dalam  ELISA  Kit,  Bender MedSystems, Austria)
Analisis  IFN-γ  pada  supernatan  kultur  limfosit  limpa dilakukan menurut instruksi pada Rat IFN- γ ELISA Kit (Bender Med  Systems,  Austria),  yang  garis  besarnya  sebagai  berikut:
Microplate dicuci dua kali dengan Wash Buffer . Standar IFN- γ direkonstitusi dengan 750 µl aquabidest, kemudian dibuat 7 seri pengenceran  dengan  kisaran  konsentrasi  larutan  standar tertinggi 4000 pg/ml dan terendah 31.3 pg/ml. Sebanyak 100 µl larutan standar, sampel dan blanko masing-masing dimasukkan ke dalam setiap well. Larutan Biotin Conjugate ditambahkan ke dalam setiap well kemudian plate ditutup dengan film adesif dan diinkubasikan  selama  2  jam  pada  suhu  ruang.  Film  adesif dibuka  dan plate dicuci  tiga  kali  dengan Wash  Buffer .  Larutan Streptavidin-HRP  sebanyak  100  μl  ditambahkan  ke  dalam setiap well kemudian plate ditutup  lagi  dan  diinkubasikan selama  1  jam  pada  suhu  ruang.  Plate  dicuci  tiga  kali  dan  di- tambahkan  100  μl  substrat tetramethyl-benzidine (TMB)  ke dalam setiap well . Plate diinkubasikan pada suhu ruang selama 10 menit di tempat gelap. Reaksi enzimatik dihentikan dengan penambahan  100  μl Stop  Solution ke  dalam  setiap well . Absorbansi  larutan  pada  setiap well dibaca  dengan microplate reader (Model 680 XR, Bio-RAD) pada panjang gelombang 450 nm.
Penghitungan total lactobacilli (modifikasi Nakayama et al. 2003) Total lactobacilli dari digesta caecum dihitung menggunakan metode  TPC  ( total  plate  count )  pada  media  selektif  Rogosa Agar  (Merck).  Sampel  digesta  ditimbang  dan  dibuat  seri  pe- ngenceran  menggunakan  NaCl  fisiologis,  kemudian  pada  pe- ngenceran tertentu diinokulasikan pada media agar. Plate agar yang telah diinokulasi, diinkubasi selama 48-72 jam pada suhu 37°C,  kemudian  koloni  yang  tumbuh  dihitung,  dan  hasilnya dinyatakan dalam log 10 CFU/g berat basah digesta.

## Analisis data
Data  hasil  penelitian  dianalisis  dengan  ANOVA  dua  arah (perlakuan  bubuk  susu  kambing  dan  kontrol  untuk  tikus sebelum  dan  sesudah  diinfeksi  Salmonella Typhimurium ) dengan p < 0.05.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Imunoglobulin A sekretori (sIgA) cairan intestinum
Rerata sIgA cairan usus pada tikus yang diberi bubuk susu kambing  ternyata  tidak  ada  bedanya  dengan  kontrol  (Tabel  1) baik sebelum maupun sesudah infeksi Salmonella Typhimurium . Hal  ini  berarti  bubuk  susu  kambing  yang  diberikan  sebanyak 0.36  g/ekor  hari  (setara  dengan  konsumsi  pada  manusia  20 g/hari  atau  200  ml  susu),  belum  mampu  menginduksi  respon imun mukosa di intestinum.
Tabel 1.  Rerata sIgA (ng/ml) cairan usus pada tikus yang diiberi bubuk susu  kambing  sebelum  dan  sesudah  diinfeksi  Salmonella Typhimurium
Perlakuan Rerata sIgA (ng/ml) Cairan Usus pada Tikus Sebelum Infeksi Sesudah Infeksi Rerata Bubuk susu kambing 46.39 44.65 45.52 Kontrol 50.73 38.57 40.65 Rerata 48.56±42.91 41.60±18.17 45.08±32.41 ns
Keterangan: ns= non significant
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Menurut  Debbabi et  al. (1998),  dosis  dan  jalur  pemberian serta  sifat  protein  antigen  merupakan  faktor  penting  untuk mendapatkan  respon  lokal  dan  periferal  maupun  besarnya modulasi  respon  imun.  Konsumsi  bubuk  susu  kambing  dalam penelitian  ini  relatif  sedikit  untuk  dapat  menimbulkan  respon antibodi,  karena  kandungan  senyawa  bioaktif  yang  terkadung juga relatif sedikit. Oleh karena itu dosis pemberian bubuk susu kambing  perlu  ditingkatkan  atau  dimodifikasi  dengan  penam- bahan  komponen  susu  yang  berpotensi  besar  sebagai imunostimulator.
Timbulnya  respon  sIgA  di  cairan  intestinum  dimungkinkan memerlukan dosis pemberian antigen yang lebih tinggi, apabila jalur  pemberian  antigen  dilakukan  secara  oral.  Hal  ini  dapat dimengerti  karena  sIgA  di  dalam  cairan  gastrointestinum  ter- papar  dengan  enzim  proteolitik  yang  dapat  mempengaruhi aktivitas biologisnya (Brown et al. 1970). Walaupun sIgA relatif resisten  terhadap  digesti  tripsin  (Brown et  al. 1970),  namun protease  IgA1  yang  merupakan  endopeptidase  dari  beberapa spesies  bakteri  mampu  memecah  IgA1  pada  daerah  engsel, termasuk dalam bentuk sekretori (sIgA). Daerah atau sisi yang rentan  terhadap  protease  IgA1  terletak  pada  ikatan  peptida prolil-seril  atau  prolil-threonil,  yaitu  pada  sekuen  –Pro-Ser-Thr- Pro-Pro-Thr-Pro-Ser di daerah engsel IgA1, tetapi tidak terdapat pada  IgA2  (Kilian et  al. 1988).  Protease  IgA1  tersebut diproduksi  secara  konstitutif  oleh  sejumlah  patogen  maupun beberapa flora residen (Reinholdt dan Kilian, 1997).
Hasil  penelitian  ini  sejalan  dengan  penelitian  sebelumnya, yang  menunjukkan  bahwa  mencit  yang  diberi  susu  kerbau selama  7  hari,  setelah  hari  ke  5  pascainfeksi Salmonella enteridis, tidak terjadi peningkatan sIgA dalam cairan intestinum (Jain et  al. 2008).  Menurut  hasil  penelitian  Markwick et  al . (2005),  mencit  yang  diberi  susu  bubuk  dalam  susunan ransum/pakannya  juga  tidak  menunjukkan  peningkatan  respon antibodi  spesifik  terhadap  ovalbumin  dan  toksin  kolera  dalam cairan  intestinum.  Namun  demikian  apabila  pakan  tikus dimodifikasi  dalam  bentuk  MMP  ( modified  milk  powder yang mengandung  bubuk whey dan  konsentrat  protein whey ( whey protein  concentrates /WPC)  sekaligus  merupakan  ransum  gizi seimbang untuk anak usia 1-3 tahun, maka terjadi peningkatan respon antibodi yang signifikan.
Berdasarkan  hal  tersebut  dapat  dimengerti  bahwa  untuk dapat  menimbulkan  respon  antibodi  dalam  cairan  intestinum, diperlukan  ransum  dengan  gizi  seimbang  yang  mengandung komponen  imunostimulator.  Komponen  bahan  makanan  yang dikonsumsi berpotensi untuk mencapai dan berinteraksi dengan sel-sel  imunokompeten  di  sepanjang  saluran  pencernaan, sehingga dapat menimbulkan respon imun. Interaksi komponen bahan makanan dengan sel-sel imunokompeten tersebut salah satunya  ditentukan  oleh  faktor  bentuk  makanan  seperti  padat atau cairan (Sfeir et al. 2004).
Whey merupakan  cairan  hasil  samping  pembuatan  keju yang mengandung protein penting baik dari aspek gizi maupun sifat-sifat biologisnya, terutama untuk meningkatkan kesehatan dan mencegah penyakit (Marshall, 2004; Madureira et al. 2007). Stimulasi sistem imun, antimikrobia dan sifat-sifat metabolik lain banyak  terkait  dengan  protein whey seperti  α-lactalbumin,  β- laktoglobulin,  laktoferrin,  laktoperoksidase,  dan bovine  serum albumin (BSA)  (Madureira et  al. 2007).  Dibanding  sumber
protein yang lain, whey mengandung asam amino esensial dan asam amino bercabang dalam konsentrasi tinggi seperti leusin, isoleusin  dan  valin.  Asam  amino  bercabang  terutama  leusin merupakan  asam  amino  kunci  dalam  metabolisme  protein selama inisiasi translasi pada sintesis protein (Marshall, 2004). Oleh karena itu apabila kekurangan asam amino tersebut dapat terjadi gangguan sintesis protein termasuk sintesis antibodi.
Penelitian  lain  juga  memperkuat  bahwa  protein whey mempunyai peran penting dalam regulasi sistem imun. Seperti penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh  Nurliyani et  al .  (2010), bahwa  pemberian whey susu  kambing  tidak  menunjukkan adanya  reaksi delayed-type  hypersensitivity (DTH)  pada  tikus yang  disensitisasi dinitrochlorobenzene (DNCB),  sedangkan tikus  yang  diberi  kasein  susu  kambing  menunjukkan  positif DTH. Protein whey kaya akan asam amino yang mengandung sulfur  seperti  sistein  dan  metionin,  yang  dapat  meningkatkan fungsi  imun  melalui  konversi  intraseluler  menjadi  glutathion (Marshall,  2004).  Sintesis  glutathion  memerlukan  prekursor sejumlah  asam  amino  glutamilsistein  yang  banyak  dijumpai pada protein whey . Glutathion tersebut berperan penting dalam stabilitas lisosomal dan membran sel serta memproteksi sel dari pengaruh  radikal  bebas,  sehingga  sangat  penting  dalam menjaga kondisi fungsional atau aktivasi berbagai sel termasuk sel T dan B (Wong dan Watson, 1995).
Laktoferin  yang  terkandung  dalam whey juga  dapat menstimulasi  sistem  imun  mukosa  melalui  aktivasi  sel-sel imunokompeten  (limfosit  B  atau  T)  (Debbabi et  al. 1998). Kemampuan  laktoferin  berikatan  dengan  limfosit  dan monosit/makrofag  dapat  dikaitkan  dengan  pengaruhnya  ter- hadap  berbagai  aspek  sistem  imun  termasuk  respon  imun humoral,  pematangan  sel  T  dan  sel  B  serta  proliferasi  limfosit (Debbabi et al. 1998), aktivasi komplemen, regulasi pelepasan sitokin  dan  regulasi  produksi  antibodi  (Naidu,  2002).  Reseptor laktoferin  ternyata  diekspresikan  dalam  berbagai  jaringan mamalia, termasuk usus, jantung, limpa, liver, monosit, limfosit, platelet dan kelenjar saliva. Reseptor laktoferin yang didapatkan pada Peyer  patch epitel  intestinum  mempunyai  kemampuan pengikatan  spesifik  yang  paling  tinggi  dibanding  dengan reseptor laktoferin pada sisi yang lain (Wolf et al. 2007).
Respon  imun  di  mukosa  juga  dapat  dipengaruhi  oleh konsumsi  prebiotik.  Kandungan  prebiotik  yang  berupa oligosakarida  susu  kambing  pada  penelitian  ini  terlalu  sedikit untuk  dapat  menstimulasi  respon  sIgA,  sehingga  tidak  dapat meningkatkan  sIgA  di  cairan  intestinum  tikus.  Hasil  penelitian sebelumnya  menunjukkan  frukto-oligosakarida  (FOS)  yang diberikan  pada  mencit  dapat  meningkatkan  total  IgA  dalam ekstrak  jaringan  usus  halus  dan colon .  Peningkatan  IgA tersebut  dikarenakan  FOS  dapat  meningkatkan  ekspresi  pIgR (polymeric immunoglobulin receptor), dan meningkatkan isotype switching dari IgM ke IgA dalam sel-sel Peyer’s patches (PP).

## IFN- γ supernatan kultur limfosit
Tikus  yang  diberi  bubuk  susu  kambing  selama  14  hari (sebelum diinfeksi), ternyata mampu meningkatkan respon IFN- γ.  Namun  setelah  diinfeksi  Salmonella Typhimurium pada  hari ke 15, pemberian bubuk susu kambing sampai hari ke 21 tidak mampu meningkatkan respon IFN- γ (Tabel 2).
Hasil Penelitian
Interferon-γ  merupakan  sitokin  yang  penting  dalam  respon inang  terhadap  infeksi  salmonella , dan  juga  mikrobia  patogen mencit  lainnya.  Kemampuan  sitokin  tersebut  adalah  me- modulasi  aktivitas  bakterisidal  makrofag.  Sitokin  tersebut diproduksi pada fase awal infeksi Salmonella Typhimurium yang sangat  penting  untuk  kelangsungan  hidup  inang  (Tellez et  al. 2011).
Tabel 2.  Rerata  IFN-γ  (pg/ml)  supernatan  kultur  limfosit  limpa  pada tikus yang diberi bubuk susu kambing sebelum dan sesudah diinfeksi Salmonella Typhimurium Perlakuan Rerata Rerata IFN-γ (pg/ml) Supernatan Kultur Limfosit Limpa pada Tikus Sebelum Infeksi Sesudah Infeksi Rerata Bubuk susu kambing 63.33 a 37.00 b 50.16 Kontrol 36.83 b 35.66 b 36.25 Rerata 50.08±20.06 36.33±4.65 43.20±15.87
Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom atau baris yang sama menunjukkan perbedaan nyata (p ≤ 0.05)
Susu  kambing  mengandung  protein  laktoferin  sebagai imunomodulator  dan  mempunyai  reseptor  di  makrofag.  Oleh karena itu laktoferin yang resisten terhadap degradasi proteolitik di saluran pencernaan dapat mencapai sel-sel imunokompeten dan menimbulkan respon imun. Konsumsi bubuk susu kambing sebanyak 0.36 g/hari selama 14 hari pada penelitian ini hanya dapat  meningkatkan  produksi  sitokin  pada  tikus  yang  tidak diinfeksi,  terbukti  produksi  IFN-γ  menurun  secara  signifikan setelah diinfeksi Salmonella . Hal ini berarti bubuk susu kambing tersebut belum mampu meningkatkan kemampuan mikrobisidal makrofag  terhadap  salmonella  atau  tidak  dapat  meningkatkan fungsi  makrofag  sebagai  APC.  Hasil  penelitian  ini  sejalan dengan penelitian sebelumnya, bahwa mencit yang diberi susu kerbau selama 7 hari tidak meningkatkan produksi sitokin IFN-γ oleh  limpa  setelah  2;  5  dan  8  hari  dari  infeksi Salmonella enteridis (Jain et al. 2008).
Menurut  Roitt et  al .  (1993),  IFN-γ  dapat  meningkatkan fungsi  APC  yang  akan  mengaktifkan  sel  T  lebih  lanjut,  dan mengaktifkan  makrofag.  Proteksi  terhadap  bakteri  intraseluler yang  dimediasi  sel  tergantung  pada  perkembangan  respon imun tipe 1 yang dicirikan oleh ekspansi sel T spesifik terhadap patogen yang mensekresikan sitokin IFN- γ dan TNF-α. Sitokin tersebut dapat memerangi bakteri intraseluler dengan berbagai mekanisme, seperti menstimulasi makrofag untuk meningkatkan ekspresi nitric  oxide  synthase-2 (NOS2),  sehingga  mening- katkan  kapasitasnya  dalam  memproduksi  antimikrobia  NO2 (Parent et al. 2006).
Total lactobacilli Bubuk  susu  kambing  yang  diberikan  selama  14  hari  pada tikus,  tidak  dapat  meningkatkan  jumlah lactobacilli dalam digesta caecum atau  sama  dengan  kontrol.  Setelah  tikus diinfeksi  salmonella jumlah lactobacilli menurun  secara signifikan (Tabel 3). Hal ini dimungkinkan bubuk susu kambing yang  diberikan  sebanyak  0.36  g/hari  pada  penelitian  ini kandungan  oligosakaridanya  terlalu  sedikit  untuk  dapat berikatan dengan reseptor di sel-sel epitel usus halus. Dengan demikian  patogen  Salmonella  menang  dalam  berkompetisi
dengan lactobacilli untuk menempel pada sel-sel epitel tersebut. Beberapa spesies bakteri (Shigella, Salmonella, Yersinia) dapat ditangkap oleh sel-sel epitel, kemudian patogen akan masuk ke dalam  jaringan  inang  melalui  sel  –M  dan  akan  menggunakan reseptor  integrin  pada  sel  inang  untuk  berikatan  (Herich  dan Levkut,  2002).  Menurut  Villoslada et  al. (2006),  oligosakarida susu  dapat  beraktivitas  sebagai soluble  homologues terhadap reseptor  permukaan  sel-sel  epitel  yang  merupakan  target spesifik  patogen.  Jumlah  total lactobacilli dalam  penelitian  ini lebih  rendah  (6.91  log 10 CFU/g)  dibanding  hasil  penelitian Nakayama et  al. (2003)  yang  menunjukkan  jumlah  total lactobacilli sebanyak 9.20 log 10 CFU/g pada caecum tikus yang diberi  pakan  susu  formula.  Hal  ini  dimungkinkan  karena  susu formula  yang  diberikan  berbeda  dalam  jumlah  pemberian maupun  komposisinya  dengan  susu  kambing.  Walaupun demikian, level lactobacilli dalam caecal tikus yang diberi susu formula juga tidak ada perbedaan dengan tikus yang menerima susu  dari  induknya,  tetapi  level Enterobacteriaceae yang  yang terdeteksi pada usus halus tikus yang diberi susu formula lebih tinggi  daripada  tikus  yang  menerima  susu  dari  induknya (Nakayama et al. 2003).
Penelitian sebelumnya  juga menunjukkan tikus yang diberi pakan  dengan  kandungan  oligosakarida  dari  susu  kambing  20 g/kg  pakan  dan  rerata  konsumsi  20  g/hari,  ternyata  tidak meningkatkan  jumlah lactobacilli maupun  bifidobacteria  dalam colon , tetapi dapat menurunkan bacteroides, entreobacteria dan coliform.  Oligosakarida  tersebut  dapat  memproteksi  tikus terhadap  toksisitas dextran  sodium  sulfate (DSS)  yang  dapat diamati dari berkurangnya gejala klinis seperti diare dan bloody stool (Villoslada et  al. 2006).  Selanjutnya  tikus  yang  diberi oligosakarida  dari  susu  kambing  0.5  g/kg  berat  badan  /hari dapat  memproteksi  dari  inflamasi colon yang  diinduksi  oleh trinitrobenzenesulfonic  acid (TNBS),  sehingga  oligosakarida tersebut sangat berguna sebagai alternatif terapi untuk penyakit radang usus ( inflammatory bowel disease /IBD) (Daddaoua et al. 2006).
Tabel 3.  Rerata lactobacilli (log 10 CFU/g)  digesta caecum pada  tikus yang  diberi  bubuk  susu  kambing  sebelum  dan  sesudah diinfeksi Salmonella Typhimurium Perlakuan Rerata Lactobacilli (log 10 CFU/g) Digesta Caecum pada Tikus Sebelum Infeksi Sesudah Infeksi Rerata Bubuk susu kambing 6.91 a 6.16 b 6.53 Kontrol 7.61 a 7.14 a 7.38 Rerata 7.26±0.63 6.65±0.84 6.95±0.78 Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom  atau baris yang sama menunjukkan perbedaan nyata (p ≤ 0.05)
Konsentrasi oligosakarida ASI (air susu ibu) sebanyak 5-8 g/l, sedangkan oligosakarida susu kambing lebih rendah dibanding ASI  yaitu  0.25-0.30  g/l,  namun  lebih  tinggi  daripada  susu  sapi (0.03-0.06  g/l)  (Daddaoua et  al. 2006).  Oligosakarida  ber- pengaruh  pada  stimulasi  pertumbuhan  bifidobacteria  dalam saluran pencernaan yang melindungi terhadap patogen enteric. Oligosakarida  mirip  prebiotik,  yang  berpotensi  menstimulasi secara  selektif  pertumbuhan  mikrobia  menguntungkan  dalam
Hasil Penelitian
saluran  pencernaan.  Oleh  karena  struktur  oligosakarida  ASI mirip dengan glikolipid dan glikoprotein dalam sel-sel intestium (Daddaoua et al. 2006), dan oligosakarida susu kambing mirip oligosakarida ASI (Bode, 2006), maka dapat berfungsi sebagai reseptor  untuk  mikrobia  yang  merupakan  mekanisme  per- tahanan tambahan (Daddaoua et al. 2006).
Hasil  isolasi  oligosakarida  susu  kambing  dijumpai  paling banyak  berupa  N-asetil-glukosil-laktosa,  galaktosil-laktosa,  N- asetilneuraminil-laktosa, 3-sialil-laktosa dan 6-sialil-laktosa yang merupakan 77% dari total oligosakarida (Villoslada et al. 2006). Glikan  yang  tersialisasi  ( sialylated  glycans )  adalah  bagian  dari oligosakarida ASI, sementara tempat perlekatan patogen pada epitelium  inang  juga  merupakan  seyawa  glikan  tersialisasi (Bode,  2006).  Oligosakarida  susu  kambing  mungkin  sangat cocok digunakan untuk suplementasi susu formula, yang dapat diisolasi dari hasil samping dalam produksi keju (Bode, 2006). Dengan  demikian  susu  kambing  sangat  potensial  untuk  di- kembangkan sebagai pangan fungsional, dan apabila diberikan pada dosis yang tepat dimungkinkan sangat bermanfaat untuk mengatur keseimbangan mikrobia usus, yang akan berimplikasi pada peningkatan sistem imun mukosa. Jumlah bakteri patogen tidak boleh lebih banyak daripada bakteri yang menguntungkan, namun  keberadaan  patogen  tersebut  sangat  penting  untuk menimbulkan respon imun di mukosa, karena respon imun yang ditimbulkan oleh bakteri komensal relatif kecil dibanding respon imun yang ditimbulkan oleh patogen (Brandtzaeg, 2002).

## KESIMPULAN
Bubuk  susu  kambing  yang  diberikan  sebanyak  0.36  g/hari selama  21  hari  belum  mampu  menginduksi  respon  imun mukosa maupun respon imun seluler pada tikus yang diinfeksi, namun  respon  imun  seluler  dapat  diinduksi  pada  tikus  yang sehat  (tidak  diinfeksi).  Dengan  demikian  sistem  imun  tidak dapat  mengeliminasi  patogen,  yang  akan  menyebabkan penurunan  kolonisasi lactobacilli pada  tikus  yang  diinfeksi Salmonella Typhimurium. Hasil penelitian ini dapat memberikan gambaran  bagi  penelitian  selanjutnya  akan  pentingnya  dosis pemberian  senyawa  bioaktif  yang  tepat  dalam  bubuk  susu kambing  pada  hewan  coba,  sehingga  senyawa  bioaktif  dapat mencapai dan berinteraksi dengan sel-sel imunokompeten atau menunjukkan  aktivitas  bioaktifnya.  Disamping  itu  potensi  susu kambing sebagai pangan fungsional masih perlu digali, melalui berbagai  penelitian  yang  dapat  dikonfirmasi  dari  komponen bioaktif  atau  modifikasi  produk  susu  kambing  untuk  diujikan secara in vitro maupun in vivo pada individu sehat (normal) atau individu yang dibuat tidak sehat.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  diucapkan  kepada  Lembaga  Penelitian  dan Pengabdian  kepada  Masyarakat  (LPPM)-UGM  atas  bantuan dana  penelitian  ini  melalui  Program  Penelitian  Hibah  Klaster Kesehatan 2009.

## DAFTAR PUSTAKA
Aattouri N, Bouras M, Tome D, Marcos A, Lemonnier D. 2002. Oral  ingestion  of  lactic-acid  bacteria  by  rats  increases lymphocyte  proliferation  and  interferon-γ  production.  Brit  J Nutr 87: 367-373. DOI: 10.1079/BJN2001527.
Baldi A, Ioannis P, Chiara P, Eleonora F, Roubini C, Vittorio DO. 2005.  Biological  effects  of  milk  proteins  and  their  peptides with  emphasis  on  those  related  to  the  gastrointestinal ecosystem.  J  Dairy  Res  72:  66-72. DOI:  10.1017/S002 202990500110X.
Bode L. 2006. Recent advances on structure, metabolism, and function of human milk oligosaccharides. J Nutr 136: 2127- 2130.
Brandtzaeg  P.  2002.  Current  understanding  of  gastrointestinal immunoregulation  and  its  relation  to  food  allergy.  Ann  NY Acad  Sci  964:  13-45. DOI:  10.1111/j.1749-6632.2002. tb04131.x.
Brown  WR,  Newcomb  RW,  Ishizaka  K.  1970.  Proteolytic degradation  exocrine  and  serum  immunoglobulins.  J  Clin Invest 49: 1374-1380. DOI: 10.1172/JCI106354.
Daddaoua A, Puerta  V,  Requena P, Martínez-Férez A, Guadix E,  Sanches  de  MF,  Zarzuelo  A,  Suarez  DM,  Boza  JJ, Martinez-Augustin O. 2006. Goat milk oligosaccharides are anti-inflammatory in rats with hapten-induced colitis. J Nutr 136: 672-676.
Debbabi  H,  Dubbary  M,  Rautureau  M,  Tome  D.  1998.  Bovine lactoferrin  induce  both  mucosal  and  systemic  immune response in mice. J Dairy Res 65: 283-293.
Guarner  F,  Malagelada  JR.  2003.  Gut  flora  in  health  and disease.  Lancet  361:  512-519. DOI:  10.1016/S0140- 6736(03)12489-0 .
Haenlein  GFW.  2004.  Goat  milk  in  human  nutrition.  Small Ruminant  Res  51:  155-163. DOI:  10.1016/j.smallrumres. 2003.08.010.
Herich  R,  Levkut  M.  2002.  Lactic  acid  bacteria,  probiotics  and immune system. Vet Med–Czech 47: 169–180.
Jain  S,  Yadav  H,  Sinha  PR,  Naito  Y,  Marotta  F.  2008.  Dahi containing  probiotic Lactobacillus  acidophilus and Lactobacillus  casei has  a  protective  effect  against Salmonella  enteridis infection  in  mice.  Int  J  Immunopathol Pharmacol  21: 1021-1029.
Kilian M, Mestecky J, Russell MW. 1988. Defense mechanisms involving  Fc-dependent  functions  of  immunoglobulin  A  and their  subversion  by  bacterial  immunoglobulin  A  proteases. Microbiol Rev 52: 296-303.
Madureira  AR,  Pereira  CI,  Gomes  AMP,  Pintado  ME,  Malcata FX.  2007.  Bovine  whey  proteins  –  Overview  on  their  main biological  properties.  Food  Res  Int  40:  1197-1211. DOI: 10.1016/j.foodres.2007.07.005.
Markwick  KJR,  Johnson  D, Cross ML, Gill HS. 2005. Modified milk  powder  supplemented  with  immunostimulating  whey protein concentrate (IMUCARE) enhances immune function in  mice.  Nutr  Res  25:  197–208. DOI:  10.1016/j.nutres. 2004.12.004.
Hasil Penelitian
Marshall  K.  2004.  Therapeutic  applications  of  whey  protein. Altern Med Rev 9: 136-156.
Naidu AS. 2002. Activated lactoferrin. A new approach to meat safety. Food Technol 56: 40-45.
Nakayama M, Yajima M, Hatano S, Yajima T, Kuwata T. 2003. Intestinal  adherent  bacteria  and  bacterial  translocation  in breast-fed and formula-fed rats in relation to susceptibility to infection.  Pediatr  Res  54:  364–371. DOI:  10.1203/01. PDR.0000077482.28990.2D.
Nurliyani,  Harmayani  E,  Soesatyo  MHNE.  The  Effect  of  Goat Milk Supplementation on Th1 and Th2 Responses of Peyer Patch  Lymphocyte  Culture  in  Dinitrochlorobenzene Sensitized Rat. Proceedings of International Conference on Agricultural,  Food  and  Animal  Science.  Paris,  July  28-30, 2010.  World  Academy  of  Science,  Engineering  and Technology.  Academic  Science  Research.  Issue  67,  ISSN 2070-3724.
Parent  MA,  Wilhelm  LB,  Kummer  LW,  Zaba  FM,  Mullarky  IK, Smiley  ST. 2006. Gamma interferon, tumor necrosis factor alpa,  and  nitric  oxide  synthase  2,  key  elements  of  cellular ilmmunity, perform critical protective fuctions during humoral defense  againts  lethal  pulmonary Yersinia  pestis infection. Infect immun 74: 3381-3386. DOI: 10.1128/IAI.00185-06.
Prosser C, Stelwagen K, Cummins R, Guerin P, Gill N, Milne C. 2004.  Reduction  in  heat-induced  gastrointestinal hypermeability  in  rats  by  bovine  colostrum  and  goat  milk powder.  J  Appl  Physiol  96:  650-654. DOI:  10.1152/jappl physiol.00295.2003.
Reeves  PG,  Nielsen  FH,  Fahey  GC  Jr.  1993.  AIN-93  purified diets  for  laboratory  rodents:  final  report  of  the  American Institute  of  Nutrition  ad  hoc  writing  committee  on  the formulation  of  the  AIN-76A  rodent  diet.  J  Nutr  123:  1939- 1951.
Reinholdt  J,  Kilian  M.  1997.  Comparative  analysis  of immunoglobulin  A1  protease  activity  among  bacteria representing  different  genera,  species,  and  strains.  Infect Immun 65: 4452-4459.
Rhee  SJ,  Walker  WA,  Cherayil  BJ.  2005.  Developmentally regulated intestinal expression of IFN-γ and its target genes and  the  age-specific  response  to  enteric Salmonella Infection. J Immunol 175: 1127-1136.
Roitt  I,  Brostoff  J,  Male  D.  1993.  Immunology.  P.  7.9.  Mosby- Year Book Europe Ltd. London.
Seemann  R,  Hägewald  SJ,  Sztankay  V,  Drews  J,  Bizhang  M, Kage  A.  2004.  Levels  of  parotid  and  submandibular/ sublingual  salivary  immunoglobulin  A  in  response  to experimental  gingivitis  in  humans.  Clin  Oral  Invest  8:  233- 237. DOI: 10.1007/s00784-004-0280-5.
Sfeir RM, Dubarry M, Boyaka PN, Rautureau M, Tome D. 2004.
The mode of oral bovine lactoferrin administration influences mucosal  and  systemic  immune  responses  in  mice.  J  Nutr 134: 403-409.
Snoeck  V,  Peters  IR,  Cox  Eric.  2006.  The  IgA  system:  a comparison  of  structure  and  function  in  different  species. Vet Res 37: 455-467. DOI: 10.1051/vetres:2006010.
Tellez A, Corredig M, Turner PV, Morales R, Grffiths M. 2011. A peptidic  fraction  from  milk  fermented  with Lactobacillus helveticus protects  mice  against  S almonella infection.  Int Dairy J 21: 607-614. DOI: 10.1016/j.idairyj.2011.03.011.
Villoslada FL, Debras E, Nieto A, Concha A, Galvez J, Huertas EL,  Boza  J,  Obled  C,  Xaus  J.  2006.  Oligosaccharides isolated  from  goat  milk  reduce  intestinal  inflammation  in  a rat model of dextran sodium sulfate-induced colitis. Clin Nutr 25: 477-488. DOI: 10.1016/j.clnu.2005.11.004.
Wolf  JS,  Li  G,  Varadhachary  A,  Petrak  K,  Schneyer  M,  Li  D, Ongkasuwan  J,  Zhang  X,  Taylor  RJ,  Strome  SE,  O’Malley BW  Jr.  2007.  Oral  lactoferrin  results  in  T  cell-dependent tumor inhibition of head and neck squamous cell carcinoma in  vivo .  Clin  Cancer  Res  13:  1601-1610. DOI:  10.1158/ 1078-0432.CCR-06-2008.
Wong  CW,  Watson  DL.  1995. Immunomodulatory  effects  of dietary  whey  proteins  in  mice.  J Dairy  Res  62:  359-368. DOI: 10.1017/S0022029900031058.
Wu  FY,  Tsao  PH,  Wang  DC,  Lin  S,  Wu  J,  Cheng  YK.  2006.
Factors affecting growth factor activity in goat milk. J Dairy Sci  89:  1951-1955.  DOI:  10.3168/jds.S0022-0302(06)72 262-7.
Yun CH, Lillehoj HS, Zhu J, Min W. 2000. Kinetics differences in intestinal  and  systemic  interferon-  and  antigenic-specific antibodies in chickens experimentally infected with Eimeria maxima . Avian Dis 44: 305-312.