Available online at: https://ejurnal.fapetkan.untad.ac.id/ index.php/agrisains

## EVALUASI PEMBERIAN CpG DNA UNTUK MENINGKATKAN EKSPRESI GEN
IMUN PADA IKAN KERAPU MACAN ( Epinephelus fuscoguttatus )
Evaluation of CpG DNA for Increasing Immune Gene Expression in Grouper (Epinephelus fuscoguttatus)
Ruqayyah Jamaluddin 1 , Sunarti 1 , Nur Fajriani Nursida 2 , Agus Suryahman 1 , Akbar Marzuki Tahya 3
1 Akuakultur, Fakultas Perikanan, Universitas Cokroaminoto, Makassar.
2 Budidaya Perairan, Stitek Balikdiwa, Makassar.
3 Akuakultur, Fakultas Peternakan dan Perikanan, Universitas Tadulako, Palu.
E-mail: ruqayyahjamaluddin4@gmail.com

## ABSTRAK
CpG  DNA  merupakan  imunostimulan  DNA  sintetik  yang  mengandung  CpG  motif,  terdiri  dari sekuen  pendek  satu  atau  lebih  motif  CpG  dan  berperan  sebagai danger  signal terhadap  sistem kekebalan imun natural maupun bawaan. Penelitian bertujuan menganalisa kemampuan CpG DNA untuk  meningkatkan  ekspresi  gen  Interleukin  1β  (IL1β)  pada  ikan  kerapu  macan  agar  dapat dijadikan sebagai imunostimulan. Analisis tingkat ekspresi gen dilakukan dengan cara mengekstrak RNA  organ  kepala  ginjal  yang  diberi  perlakuan  CpG  DNA  dan  perlakuan  PBS  sebagai  kontrol. Sintesis  DNA  komplementer  (cDNA)  dilakukan  menggunakan  kit  Ready  To  Go  You  Prime  First Strand  Beads  (GE  Healthcare)  dengan  teknik  RT-PCR.  Produk  PCR  selanjutnya  dianalisa  dengan UN SCAN IT berdasarkan ketebalan fragmen DNA. Tingkat ekspresi gen serta nilai luminescence photostimulated  dari  gen  IL1β  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  perlakuan  PBS  sebagai  kontrol. Nilai  luminescence  photostimulated  gen  IL1β  pada  perlakuan  CpG  DNA  yaitu  113684  sementara pada perlakuan PBS sebagai kontrol hanya sebesar 95610.
Kata kunci: CpG DNA, Epinephelus fuscoguttatus , imunostimulan.

## ABSTRACT
CpG DNA is a synthetic DNA immunostimulant with a CpG motif, consisting of a short sequence of one or more CpG motifs. It acts as a danger signal to the natural and innate immune system. This study  aimed  to  analyze  the  ability  of  CpG  DNA  to  increase  the  expression  of  the  Interleukin  1β (IL1β) gene in tiger grouper fish so that it can be used as an immunostimulant. The gene expression level was analyzed by extracting RNA from the kidney head, which was treated with CpG DNA and PBS  treatment  as  a  control.  Complementary  DNA  (cDNA)  synthesis  was  carried  out  using  the Ready To Go You Prime First-Strand Beads (GE Healthcare) kit  with the RT-PCR technique. The PCR products  were  then analyzed by UN SCAN IT based on the thickness of the DNA fragments. The level of gene expression and photostimulated luminescence value of the IL1β gene was higher than the PBS treatment as a control. The photostimulated luminescence value of the IL1β gene in the CpG DNA treatment was 113684, while the PBS treatment as control was only 95610.
Keywords: CpG DNA, Epinephelus fuscoguttatus, immunostimulant.

## PENDAHULUAN
Ikan  kerapu  macan Epinephelus  fuscoguttatus merupakan  salah  satu  jenis  ikan kerapu  yang  sangat  menguntungkan  secara  ekonomi  karena  tingginya  nilai  jual  baik  di pasar internasional maupun serta pertumbuhannya  yang cepat dan dapat diproduksi secara massal  (Kani et  al .,  2012).  Namun  demikian,  para  petani  sering  mengalami  beberapa kendala  terutama  adanya  serangan  penyakit  yang  disebabkan  oleh  bakteri,  virus,  parasit, dan  lain-lain.  Untuk  mengatasi  hal  tersebut  khususnya  yang  disebabkan  oleh mikroorganisme,  para  pembudidaya  menggunakan  berbagai  jenis  antibiotik.  Penggunaan antibiotik  kenudian  menjadi  masalah  karena  dapat  menimbulkan  bakteri  strain  baru  yang resisten sehingga tidak akan efektif sebagai upaya penanggulangan penyakit (Rantetondok, 2002).  Alternatif  lain  yang  dapat  dilakukan  adalah  penerapan  vaksin,  namun  penggunaan vaksin  disamping  harganya  yang  mahal  juga  bersifat  spesifik  terhadap  agen  penyakit tertentu.  Oleh  karena  itu  diperlukan  solusi  lain  yang  dapat  membantu  meningkatkan kekebalan  tubuh  terhadap  agen  penyakit  seperti  imunostimulan. Penggunaan imunostimulan bisa menjadi solusi yang  paling aman sebagai upaya perlindungan terhadap serangan penyakit, karena dapat meningkatkan sistem kekebalan natural ( innate immunity ) dan kekebalan bawaan ( adaptive immunity ) pada ikan (Sakai 1999; Ortuno et al ., 2002).
Salah  satu  jenis  immunostimulan  yang  sangat  potensial  dan  efektif  dalam meningkatkan kekebalan tubuh mamalia, ikan dan udang adalah berupa sekuen nukleotida spesifik  yang  disebut  motif unmethylated  cystidine  phosphate  guanosine (CpG)  (Krieg 2002;  Tassakka  dan  Sakai,  2004;  Chen et  al .,  2007).  Motif  CpG  ditemukan  pada  DNA bakteri  dengan  frekuensi  yang  sangat  tinggi  dan  tidak  termetilasi.  Sedangkan  pada  DNA mamalia  motif  CpG  ditemukan  dengan  frekuensi  yang  sangat  rendah  dan  termetilasi. Masuknya  motif  CpG  ke  dalam tubuh  diterima  oleh Reseptor  Toll-like (TLR9).  TLR9  ini hanya bisa menerima atau mengenali CpG yang tidak termetilasi sehingga motif CpG yang memungkinkan  untuk  diaplikasikan  adalah  yang  berasal  dari  bakteri  dan  bukan  dari mamalia.
Seiring dengan meningkatnya kebutuhan akan CpG yang semakin tinggi, pemenuhan dengan  cara  konvensional  tidak  mampu  mencukupi  kebutuhan.  Oleh  karena  itu, dikembangkan  imunostimulan  DNA  sintetik  yang  sekuennya  menyerupai  CpG  DNA bakteri yang disebut CpG oligodeoxynucleotides atau CpG-ODNs (Tokunaga et al ., 1984). Oligodeoxynucleotide sintetik ini mengandung CpG motif yang terdiri dari sekuen pendek yang mengandung satu atau lebih motif CpG dan berperan sebagai danger signal terhadap sistem  imun  vertebrata  sehingga  dapat  memberikan  perlindungan  terhadap  infeksi  bakteri dengan cara mengaktivasi Antigen Presenting Cells (APCs) dan menginduksi respon imun tipe Th1.
CpG-ODNs  dapat  diklasifikasikan  menjadi  tiga  yaitu  tipe  D,  K,  dan  C.  Masing- masing  tipe  CpG-ODN  tersebut  tidak  hanya  mampu  menstimulasi  respon  imun  pada spesifik  organisme  tetapi  juga  memungkinkan  untuk  tipe  yang  berbeda  memberikan stimulasi  respon  imun  pada  organisme  yang  sama.  Misalnya  sekuen  motif  “TTCGTT” dapat meningkatkan respon imun pada manusia namun tidak efektif meningkatkan respon imun  pada  ikan.  Sementara  CpG-ODN  motif  “GACGTT”,  “GTCGTT”  atau  “AACGTT” memiliki  efek  kekebalan  pada  ikan  (Jorgensen et  al .  2001 a ).  Penelitian  Tasakka  (2005), menyatakan bahwa motif CpG ODN 1668 dengan sekuen “TCCATGACGTTCCTGATGCT” termasuk dalam kategori tipe D memiliki efek spesifik terhadap  ikan  mas  ( Cyprinus  carpio ).  Sementara  motif  CpG  ODN  2006  dengan  sekuen “TTCGTCGTTTTGTCGTTTGTCGTT”  masuk  dalam  kategori  tipe  K  spesifik  terhadap
udang windu ( Penaeus monodon ) (Handoyo, 2013; Nursida, 2015). Hasil penelitian terbaru mengenai  penggunaan  CpG  ODN  ini  yang  dilakukan  oleh  Kani et  al .  (2012)  adalah pemberian  CpG-ODN  1668  (TCCATGACGTTCCTGATGCT)  dan  CpG-ODN  2133 (TCGTCGTTGGTTGTCTTTTGGT)  mampu  memacu  peningkatan  kekebalan  nonspesifik pada  benih  ikan  kerapu  macan  yang  ditunjukkan  dengan  kenaikan  indeks  fagositosis  dan lisosim pada hari ke tujuh pasca injeksi. Namun demikian, masih diperlukan analisis lebih lanjut  secara  molekuler  untuk  mengetahui  ekspresi  gen-gen  apa  saja  yang  kemungkinan berperan  dan  mampu  diaktifkan  oleh  CpG  ODN  2133  pada  sistem  imun  ikan  kerapu macan.
Gen  sitokin  merupakan  salah  satu  gen  yang  sangat  berperan  penting  dalam  sistem imun.  Sitokin  adalah  polipeptida  sederhana  atau  glikoprotein  yang  bertindak  sebagai molekul  sinyal  dalam  sistem  kekebalan  tubuh.  Molekul  genetiknya  terdiri  atas  beberapa kelompok  yang  dikelas  sebagai  keluarga  gen  yaitu  interleukin,  limfokin,  faktor pertumbuhan,  interferon  serta  kemokin  (Thomson,  1994).  Sitokin  berperan  dalam komunikasi antar sel dan dapat masuk ke dalam sistem sirkulasi dan memberikan efek yang sistemik  (bagus)  pada  sel  target  secara  spesifik  (Wibawan  dan  Soejoedono,  2013).  Gen interleukin  1β (IL-1β), tumour  necrosis  factor (TNF-α1)  serta cyclooxygenase (COX-2) merupakan gen imun yang umum diamati untuk melihat tingkat ekspresi sebagai indikator (Tasakka,  2005). Interleukin  1β (IL-1β)  merupakan  mediator  kunci  dalam  menanggapi adanya serangan mikroba dan adanya jaringan yang terluka serta dapat merangsang respon sistem kekebalan tubuh dengan mengaktifkan limfosit atau dengan menginduksi pelepasan sitokin  lain  yang  dapat  mengaktifkan  makrofag,  sel  NK  dan  limfosit  serta  menyusun berbagai  respon  imun  dengan  memulai  ekspresi  gen  (Low et  al .,  2003).  Pada  tulisan  ini, kami akan melaporkan hasil analisis kemampuan CpG DNA untuk meningkatkan ekspresi gen interleukin  1β (IL1β)  pada  ikan  kerapu  macan  yang  nantinya  dapat  dijadikan  acuan dalam menentukan peranannya sebagai imunostimulan.

## BAHAN DAN METODE

## Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan  Maret  2014  hingga  November  2014  di Laboratorium  Bioteknologi  Balai  Penelitian  dan  Pengembangan  Budidaya  Air  Payau (BPPBAP) Maros.

## Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan adalah ikan kerapu macan sebanyak 40 ekor dengan berat rata-rata 7-10 gr. Hewan uji ditampung pada bak fiber volume 1 ton untuk proses adaptasi kemudian  dipelihara  dalam  akuarium  50  L  yang  diisi  air  laut  sebanyak  20  L.  Pemberian pakan dilakukan dengan frekuensi 2 kali sehari yaitu pada pagi dan sore hari dengan dosis 5% dari biomassa. Pakan yang diberikan adalah pakan komersil dengan kandungan protein 36%.

## Preparasi CpG Oligodeoxynucleotides (CpG-ODN) 2133
Sebelum  digunakan,  CpG-ODN  2133  dipreparasi  terlebih  dahulu  sesuai  petunjuk penggunaannya,  yaitu  membuat  konsentrasi  menjadi  100  µM  dengan  cara  menambahkan 740,4  µL  akuades  steril  atau TE  buffer 1x.  Selanjutnya  dilakukan  pengenceran  untuk mendapatkan konsentrasi 50 µg/mL sebanyak 2000 µl (kebutuhan 20 ekor).

## Rancangan Penelitian
Sebanyak 10 ekor ikan kerapu dengan berat rata-rata 7-10  gr dimasukkan ke dalam akuarium.  Ada  2  perlakuan  yang  diaplikasikan  yaitu  dengan  injeksi  CpG-ODN  2133 dengan konsentrasi 10 µg/ml dan kontrol yang hanya menggunakan larutan PBS.

## Pemberian CpG DNA
Pemberian CpG-ODN pada hewan uji dilakukan melalui injeksi yaitu disuntikkan ke ikan kerapu macan dengan dosis 10 µg/ml (Kani et al ., 2012). Ikan kerapu macan kontrol diinjeksi  dengan  PBS  dengan  volume  yang  sama.  Penyuntikan  dilakukan  pada  bagian intramuscular menggunakan spoit 1 mL ( needle 26 gauge x ½” ). Pengamatan ekspresi gen imun IL-1β dilakukan pada hari ke -7 setelah injeksi.

## Ekstraksi RNA
RNA  total  diekstraksi  dari  kepala  ginjal  ikan  kerapu  macan  dengan  menggunakan RNeasy Mini Kit ( Qiagen ), sesuai instruksi perusahaan. Sebanyak 30 mg organ ginjal ikan kerapu  macan  dihaluskan  menggunakan  mortar  dan  ditambahkan  dengan  350  µl  buffer RLT.  Larutan  dimasukkan  ke  dalam  tabung  mikro  1.5  ml  bebas  RNase  kemudian dihomogenisasi  dengan syringe dan needle 20 gauge sebanyak  5  kali  dan  selanjutnya disentrifugasi  dengan  kecepatan  10.000  rpm  selama  3  menit  pada  suhu  20°C.  Supernatan dipindahkan  ke  dalam  tabung  mikro  1.5  ml  yang  baru  dan  ditambahkan  1  kali  volume ethanol  70%  yaitu  sebanyak  350  µl,  kemudian  dihomogenkan  perlahan  dengan menggunakan pipet. 500 µl sampel dipindahkan ke dalam spin column volume 2 ml bebas RNase,  kemudian  disentrifugasi  2  menit  dengan  kecepatan  10.000  rpm.  Proses  pencucian menggunakan  500  µl  buffer  RW  1,  sentrifugasi  selama  2 menit  dengan  kecepatan  10.000 rpm.  Larutan  pencuci  pada  tabung  dibuang  dan  dengan  tabung  mikro  yang  sama, ditambahkan  500  µl  buffer  RPE  ke  dalam  spin  column  kemudian  disentrifugasi  selama  3 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Pencucian dengan buffer RPE dilakukan sebanyak 2 kali  dan  selanjutnya spin  column disentrifugasi  selama  1  menit  dengan  kecepatan  10.000 rpm  untuk  memastikan  tidak  ada  buffer  RPE  yang  tersisa  di spin  column . Spin  column RNeasy  dipindahkan  ke  dalam  tabung  mikro  bebas  RNase  volume  1.5  µl  kemudian ditambahkan 80 µl air bebas RNase ke dalam spin column lalu didiamkan selama 2 menit kemudian  disentrifugasi  selama  1  menit  pada  kecepatan  10.000  rpm.  Cairan  yang tertampung pada tabung mikro merupakan hasil ekstraksi RNA yang akan digunakan untuk tahap selanjutnya.

## Uji Kualitas RNA Hasil Ekstraksi
Kualitas  hasil  ekstraksi  RNA  diuji  secara  kualitatif  untuk  mengetahui  tingkat kemurniannya dengan genequan 1000 pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. RNA dengan tingkat kemurnian baik ditunjukkan oleh rasio A260/280 lebih dari 2.0 (Sambrook et al . 1989). Selain itu RNA juga diuji secara kualitatif dengan PCR menggunakan primer β-actin .

## Sintesis cDNA dengan RT-PCR
Sintesis  DNA  komplementer  ( complementary  DNA,  cDNA ).  Konsentrasi  RNA dibuat  3  µg  dalam  30  µl  DEPC  0,1  %  kemudian  dihomogenkan  dengan  vortex  dengan kecepatan  rendah.  Tabung  mikro  berisi  RNA  dimasukkan  dalam  inkubator  dengan  suhu 65 o C selama 10 menit. Selanjutnya tabung mikro dimasukkan ke dalam es selama 2 menit, kemudian  RNA  dimasukkan  ke  dalam  tabung first  strand  reaction  mix  beads (GE Healthcare)  yang  telah  berisi  2  butir  bola  putih.  Primer  oligo  (dT)      5’-GTA  ATA  CGA ATA ACT ATA GGG CAC GCG TGG TCG ACG GCC CGG GCT GGT TTT TTT TTT TTT TTT T-3’ dengan konsentrasi 1 µg/3 µl ditambahkan sebanyak 3 µl ke dalam reaksi, kemudian  dibiarkan  selama  1  menit.  Tabung  mikro  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  1 jam, kemudian cDNA ditambahkan SDW sebanyak 50 µl.

## Analisis Semi-Quantitative
PCR  mix  menggunakan  kit Pure  Taq  Ready-To-Go  PCR  Beads (GE  Healthcare), kemudian tambahkan cDNA yang digunakan sebagai template sebanyak 1 µl, serta masing- masing 1 µl ditambahkan primer forward dan reverse kemudian ditambahkan SDW sampai mencapai  25  µl.  Amplifikasi  gen  imun  IL-1β,  menggunakan  primer  IL-1β-F  dan  IL-1β-R serta β-actin-F dan β-actin-R. Kondisi PCR untuk IL-1β-F dan IL-1β-R yaitu pre-denaturasi 95°C  selama  2 menit,  35× (95°C  50  detik,  45°C  selama  40 detik,  72°C selama  50  detik), dan 72°C selama 5 menit. Kondisi PCR untuk β-actinF dan β-actinR  yaitu pre-denaturasi 95°C selama 2 menit, 35× (90°C selama 50 detik, 45°C selama 30 detik, 72°C selama 40 detik), dan 72°C selama 5 menit.

## Elektroforesis
Untuk  melihat  keberhasilan  amplifikasi  fragmen  DNA  target,  hasil  PCR dielektroforesis  dengan  menggunakan  gel  agarose  2,0  %  serta  marker  VC  100  bp  Plus DNA  Ladder  (Vivantis)  kemudian  didokumentasikan  dengan Gel  Documentation  System (Biometra).

## Analisis Data
Pendaran  pita  pada  gel  elektroforesis  kemudian  dianalisis  menggunakan  software UN  SCAN  IT  berdasarkan  ketebalan  fragmen  gen IL-1β ,  dan  gen β-aktin sebagai  kontrol internal  untuk  menilai  perbedaan  tingkat  ekspresi  pada  ikan  kerapu  macan.  Hasil  yang diperoleh kemudian dilakukan uji statistik menggunakan uji T student.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Ekstraksi RNA Kepala Ginjal Ikan Kerapu Macan ( E. fuscoguttatus )
Berdasarkan hasil amplifikasi dengan primer β-aktin menggunakan  PCR, diperoleh amplikon gen β-aktin ikan kerapu berukuran sekitar 500 bp yang terlihat jelas pada semua sampel baik pada perlakuan CpG maupun pada perlakuan PBS sebagai kontrol (Gambar 1). Hasil  tersebut  mengindikasikan  bahwa  proses  ekstraksi  RNA  berhasil  mengisolasi  total RNA  pada  sampel.  Gen  β-aktin  dijadikan  sebagai  indikator  keberhasilan ekstraksi  karena sifatnya yang diekspresikan secara terus menerus di dalam sel (Sunarti et al ., 2016).
Gambar 1 . Amplifikasi PCR ß-aktin cDNA HK E. fuscoguttatus . Keterangan: Sumur 1 (M); marker 100 bp, sumur 2-6 (C1-C5); perlakuan CpG, sumur 7-11 (P1-P5); perlakuan PBS sebagai kontrol.

## Ekspresi Gen Imun Interleukin 1β (IL-1β)
Visualisasi gel elektroforesis memperlihatkan pendaran pita cDNA interleukin IL- 1β pada  ukuran  400  bp  (Gambar  3).  Pendaran  pita  yang  tampak  jelas  pada  semua  sampel mengindikasikan adanya ekspresi gen imun interleukin IL-1β sebagai target. Pendaran pita cDNA terlihat lebih tebal pada sumur C1−C5 yaitu pada sampel yang mendapat perlakuan CpG.  Sementara  pada  sumur  P1−P5  yang  merupakan  perlakuan  kontrol  PBS memperlihatkan  pendaran  pita  cDNA  dengan  intensitas  yang  lebih  rendah.  Hal  tersebut sejalan  dengan  nilai  ekspresi  RNA  IL-1β  yang  diperlihatkan  oleh  pengukuran  ketebalan pendaran pita menggunakan software UN-SCAN IT (Tabel 1). Nilai tertinggi terlihat pada sampel  P4  sebesar  25302  kemudian  disusul  oleh  sampel  P2  sebesar  24519,  P5  sebesar 23868,  P3  sebesar  20814  dan  terakhir  adalah  P1  sebesar  19181.  Sementara  pada  sampel kontrol PBS, nilai tertinggi terlihat pada sampel C4 sebesar 21358 kemudian disusul oleh sampel C5 sebesar 21289, C2 sebesar 19099, C1 sebesar 17708 dan terakhir pada sampel C3 sebesar 16156. Perbedaan nilai antara perlakuan injeksi CpG-ODN dengan kontrol PBS tersebut  dimana  perlakuan  injeksi  CpG-ODN  menunjukkan  nilai  yang  lebih  tinggi dibanding sampel kontrol menjadi indikator bahwa injeksi CpG-ODN mampu merangsang peningkatan  ekspresi  gen  IL-1β  pada  kerapu E.  fuscoguttatus .  Unmetil  CpG  DNA  dari DNA  bakteri  maupun  oligonukleotida  sintetis  (ODN)  dapat  mengaktifkan  sel  imun (Tassakka dan Sakai, 2003).
Gambar 2 . Amplifikasi cDNA gen IL-1ß E. fuscoguttatus . Sumur 1 (M); marker 100 bp, sumur 2-6 (C1-C5); perlakuan CpG, sumur 7-11 (P1-P5); perlakuan PBS sebagai kontrol.
Hasil uji T menunjukkan adanya pengaruh  yang nyata pada perlakuan injeksi CpG- ODN  pada  ikan  kerapu E.  fuscoguttatus (*P<0.05).  Hasil  yang  diperoleh  tersebut  sejalan dengan  hasil  penelitian  yang  dilaporkan  oleh  Tassakka  (2005);  Kono et  al .  (2001)  bahwa terjadi  peningkatan  ekspresi  gen  IL-1β  setelah  injeksi  CpG  DNA  1668  pada  ikan  mas Cyprinus carpio . Peningkatan ekspresi IL-1β juga terdeteksi pada ikan Atlantic salmon dan Rainbow trout yang diinjeksi oleh CpG DNA (Jorgensen et al ., 2001).
IL-1β  merupakan  salah  satu  sitokin  yang  memberikan  respon  awal  yang  cukup penting  dan  memungkinkan  organisme  untuk  merespon  invasi  mikroba  dan  peradangan pada  ikan rainbow  trout dan sea  bass (Buonocore et  al .,  2004).  Penyuntikan  CpG-ODN 2133  yang diberikan pada ikan kerapu macan terbukti mampu meningkatkan ekspresi gen imun  interleukin  IL-1β.  Pelepasan  sitokin  ini  kemudian  akan  mengaktifkan  makrofag,  sel NK  dan  limfosit  serta  menyusun  berbagai  respon  imun  (Low et  al .,  2003).  Kani  et  al.
(2012)  juga  melaporkan  adanya  peningkatan  indeks  pagositosis  pada  penyuntikan  CpG- ODN  1668  dengan  dosis  0.1  μg/ml  sebesar  76%  pada  hari  pertama  injeksi.  Sementara aktifitas lisosim tertinggi ditunjukkan oleh perlakuan penyuntikan CpG-ODN sekuen 2003 dengan  dosis  10  μg/ml  pada  hari  ke  7  sebesar  349  unit  pada  ikan  kerapu  macan E. fuscoguttatus.

## PENUTUP
Penggunaan  CpG  DNA  2133  mampu  meningkatkan  ekspresi  gen  imun  IL1β  pada  ikan kerapu macan, dengan demikian, penggunaan CpG DNA 2133 memiliki potensi yang baik sebagai imunostimulan maupun adjuvan vaksin pada ikan kerapu macan.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis hanturkan kepada Ibu Asmi Citra Malina, M.Agr,  Ph.D.  yang  telah  membimbing  penulis  baik  dalam  penelitian  maupun  penyusunan  naskah ilmiah ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Buonocore, F., Mazzini, M., Forlenza, M., Randelli, E., Secombes, C. J., Zou, J., & Scapigliati, G.
(2004).  Expression  in Escherchia  coli and  purification  of  sea  bass  ( Dicentrarchus  labrax ) interleukin-1β, a possible immunoadjuvant in aquaculture. Journal of marine biotechnology (NY) , 6, 53-59.
Chen,  Y.,  Xiang,  L.  X.,  &  Shao,  J.  Z.  (2007).  Construction  of  a  recombinan  plasmid  containing multi-copy CpG motifs and its effects on the innate immune responses of aquatic animals. Fish and Shell. Immunol , 23, 589-600.
Handoyo.  (2013).  Pengaruh  pemberian  CpG  DNA  terhadap  sistem  kekebalan  tubuh  udang  windu ( Penaeus  monodon Fibricus)  dan  ketahanannya  terhadap  serangan  bakteri Vibrio  harveyi. Tesis tidak diterbitkan. Makassar: Universitas Hasanuddin .
Jorgensen, J. B., Johansen, A., Stenersen, B., & Sommer, A. I. (2001). CpG oligodeoxynucleotides and  plasmid  DNA  stimulate  atlantic  salmon  ( Salmon  salar L.)  Leucocytes  to  produce supernatants with antiviral activity. Dev Comp Immunol , 25, 313-321.
Jorgensen,  J.  B.,  Zou,  J.,  Johansen,  A.,  &  Secombes,  C.  J.  (2001).  Immunostimulatory  CpG oligodeoxynucleotides  stimulate  expression  of  IL-1β  and  interferon-like  cytokines  in rainbow  trout  macrophages  via  a  chloroquine-sensitive  mechanism. Fish  and  Shellfish Immunol . 1, 673-682.
Kani,  R.  A.,  Rantetondok,  A.,  &  Malina,  A.  C.  (2012).  Pengaruh  pemberian  CpG-ODN  terhadap sistem  kekebalan  tubuh  ikan  kerapu  macan  ( Epinephelus  fuscoguttatus FORSSKAL, 1775). Tesis tidak diterbitkan. Makassar: Universitas Hasanuddin . Kono, T., & Sakai, M. (2001). The analysis of expressed genes in the kidney of Japanese flounder, Paralichthys olivaceus , injected with the immunostimulant peptidoglycan. Fish Shellfish Immunol , 11, 357-366.
Krieg,  A.  M.  (2002).  CpG  motifs  in  bacterial  DNA  and  their  immune  effects. Annual Review of Immunology , 20, 709-760.
Low,  C.,  Wadsworth,  S.,  Burrells,  C.,  &  Secombes,  C.  J.  (2003).  Expression  of  immune genes  in  turbot  ( Scophthalmus  maximus )  fed  a  nucleotide-supplemented  diet. Aquaculture , 221, 23-40.
Nursida,  N.  F.  (2015).  Pengaruh  pemberian  CpG  DNA  terhadap  ekspresi  gen  imun  pada udang  windu  ( Penaeus  monodon ). Tesis  tidak  diterbitkan.  Makassar:  Universitas Hasanuddin.
Ortuno,  J.,  Cuesta,  A.,  Rodrigues,  A.,  Esteban,  M.  A.,  &  Meseguer,  J.  (2002).  Oral administration  of  yeast,  Saccharomyces  Cerevisiae,  enhances  the  celluler  innate immune  respone  of  gilthead  seabream  ( Sparus  Aurata L.). Immunopathol .  85, 41- 50.
Rantetondok,  A.  (2002).  Pengaruh  imunostimulan  β-glukan  dan  lipopolisakarida  terhadap respon  imun  dan  sintasan  udang  windu  ( Penaeus  monodon  fabricius ). Tesis  tidak diterbitkan.  Makassar: Program Pasca Sarjana Universitas Hasanuddin.
Sakai, M. (1999). Current research status of fish immunostimulants . Aquaculture . 172, 63- 92.
Sambrook,  J.,  Fritsch,  E.  F.,  &   Maniatis,  T.  ( 1989). Molecular  cloning.  a  laboratory manual . Cold Spring Harbor Laboratory.
Sunarti,  Y.,  Soejoedono,  R.  D.,  Mayasari,  N.  L.  P.,  &  Tahya,  A.  M.  (2016).  RNA expression of farnesoic acid O-methyl transferase in mandibular organ of intermolt and premolt mud crabs Scylla olivacea . AACL Bioflux , 9(2), 270-275.
Tassakka.,  ACMAR., & Sakai, M. (2003). The invitro effect of CpG-ODNs on the  innate immune response of common carp, Cyprinus carpio L. Aquaculture . 220(1-4), 27- 36.
Tassakka.,  ACMAR.,  &  Sakai,  M.  (2004).  Expression  of  immune-related  genes  in  the common carp ( Cyprinus carpio L) after stimulation by CpG oligodeoxynucleotides. Aquaculture , 242, 1-12.
Tassakka., & ACMAR. (2005). CpG oligodeoxynucleotides stimulate the immune system of common carp (Cyprinus carpio L) . Kagoshima University. Thomson, A. (1994). The cytokine handbook . Academic Press.
Tokunaga,  T.,  Yamamoto,  H.,  Shimada, S.,  Abe,  H.,  Fukuda,  T.,  Fujisawa,  Y.,  Furutani, Y.,  Yano,  O.,  Kataoka,  T.,  &  Sudo,  T.  (1984).  Antitumor  activity  of deoxyribonucleic  acid  fraction  from  mycobacterium  bovis  BCG:  isolation, physicochemical  characterization,  and  antitumor  activity. J  Natl  Cancer  Inst ,  72, 955-962.
Wibawan,  I.  W.  T.,  &  Soejoedono,  R.  D.  (2013). Intisari  imunologi  medis .  Institut Pertanian Bogor.