## AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN ANALISIS KLT-BIOAUTOGRAFI  DARI
FRAKSI BIJI KOPI ROBUSTA ( Coffea canephora Pierre ex A. Froehner)
Wazhifa Andarini Paputungan 1) , Widya Astuty Lolo 1) , Jainer Pasca Siampa 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Coffee is a plant that contains compounds such as flavonoids, which have antibacterial activity. The purpose of this  study  was  to  determine  the  fraction  of  the  ethanol  extract  of  robusta  coffee  beans  whether  it  has  an antibacterial effect and know the class of compounds identified after TLC-Bioautography. The extraction method used was maceration with 96% ethanol and fractionation using liquid-liquid method with methanol, n-hexane, and ethyl acetate. Antibacterial testing using the agar diffudion  method with concentration of 10%, 20%, 30% respectively. The results of study of 30% methanol fraction for Staphylococcus aureus bacteria have a 12,58 mm inhibition zone and Escherichia coli bacteria 11,60 in the strong category. The largest fraction of the inhibition zone is the 30% methanol fraction of robusta coffee beans was carried out by TLC-Bioautography test using the mobile  phase  of  chloroform  :  n-hexane  (1:2).  Tests  for  antibacterial  activity  with  contact  bioautography methods resulted in spotting on the chromatogram, which produces a inhibitory zone. The characteristics of the spots  were  carried  out  with  the  appearance  of  AlCl 3 and  dragendorf  patches  which  were  suspected  to  be flavonoids and alkaloids.
Keywords : Fraction, Antibacterial, Coffea canephora Pierre ex  A. Froehner, TLC Bioautography.

## ABSTRAK
Kopi  adalah  tanaman  yang  mengandung  senyawa  antara  lain  flavonoid  yang  mempunyai  aktivitas  antibakteri. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui fraksi dari ekstrak etanol biji kopi  robusta apakah memiliki efek  antibakteri  dan  mengetahui  golongan  senyawa  yang  teridentifikasi  memiliki  aktivitas  antibakteri  setelah dilakukan  pengujian  KLT-Bioautografi.  Metode  ekstraksi  yang  digunakan  adalah  maserasi    dengan  pelarut etanol 96% dan dilakukan fraksinasi dengan metode cair-cair dengan pelarut metanol, n-heksan, dan etil asetat. Pada  pengujian  antibakteri  menggunakan  metode  difusi  agar  dengan  konsentrasi  10%,  20%,  30%.  Hasil penelitian  fraksi  metanol  konsentrasi  30%  untuk  bakteri Staphylococcus  aureus memiliki  zona  hambat  12,58 mm  dan  bakteri Escherichia  coli 11,60  mm  dengan  kategori  kuat.  Fraksi  yang  paling  besar  zona  hambatnya yaitu fraksi metanol konsentrasi 30% dilakukan pengujian KLT-Bioautografi menggunakan Bioautografi kontak. Aktivitas  antibakteri  terhadap  fraksi  metanol  biji  kopi  robusta  dilakukan  dengan  uji  KLT-Bioautografi menggunakan fase gerak kloroform : n-heksan (1:2). Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi kontak hasil yang diperoleh terdapat bercak pada kromatogram yang menghasilkan zona hambat. Karakteristik bercak dilakukan dengan penampak bercak AlCl 3 dan dragendorf  diduga bercak tersebut adalah flavonoid dan alkaloid.
Kata kunci : Fraksi, Antibakteri , Coffea canephora Pierre ex A. Froehner , KLT-Bioautografi.

## PENDAHULUAN
Kopi  merupakan  salah  satu  tanaman yang  mengandung  senyawa  antioksidan antaralain polifenol, flavonoid, proantisianidin  kumarin,  asam  klorogenat, trigonelin  dan  tokoferol.  Dalam  ekstrak  biji kopi  robusta  terdapat  beberapa  senyawa yang  mempunyai  aktivitas  antibakteri.  Dari penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh  Lubis (2018)  pertumbuhan Staphylococcus  aureus akan  terhambat  setelah  pemberian  10% ekstrak biji kopi robusta.
Kopi berpotensi ditarik bahan aktifnya  menggunakan  metode  ekstraksi. Ekstraksi  adalah  pemisahan  bagian  aktif sebagai  obat  dari  jaringan  tumbuhan menggunakan  pelarut  yang  sesuai  dengan prosedur  yang telah ditetapkan (Rahmadani, 2015)
Bioautografi,  berasal  dari  kata  bio yang  berarti  makhluk  hidup  dan  autografi berarti melakukan aktivitas sendiri.
Bioautografi adalah suatu metode
pendeteksian untuk menemukan suatu senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi  dengan  cara  melokalisir aktivitas  antimikroba  tersebut  pada  suatu kromatogram.  Metode  ini  memanfaatkan pengertian kromatografi lapis tipis (Lukman, 2016).
Hasil penelitian yang telah dilakukan oleh  Tanauma  (2016)  tentang  aktivitas antibakteri ekstrak biji kopi robusta terhadap bakteri Escherichia  coli menyatakan  bahwa ekstrak  biji  kopi  kopi  robusta  dapat menghambat bakteri Escherichia coli .
Penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh
Tanauma pada tahun 2016 aktivitas antibakteri  ekstrak  biji  kopi  robusta  dengan
konsentrasi  10%  menghasilkan  diameter zona hambat sebesar 22,5 mm.

## METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian    ini  dilaksanakan  pada bulan  Februari  sampai  April  2019,  di Laboratorium Biologi Dasar Jurusan Biologi,  Laboratorium  Farmasi  Lanjutan
Program  Studi  Farmasi  Universitas  Sam Ratulangi.  Lokasi  pengambilan  sampel  di Desa Modayag Kecamatan Modayag
Kabupaten Bolaang Mongondow Timur.

## Bentuk Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  dengan menggunakan metode eksperimental laboratorium  yaitu  melalui  uji  aktivitas antibakteri dan analisis KLT-Bioautografi.

## Alat dan Bahan
a. Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  ialah  pisau,  masker,  sarung  tangan,  jas lab,  erlenmeyer  ( Pyrex ),  timbangan  analitik ( Kern ),  gelas  ukur  ( Pyrex ),  gelas  kimia ( Pyrex ),  cawan  petri  ( Normax ),  corong pisah,  autoklaf  ( ALP ),  pinset,  spatula, pembakar  spritus,  pipet  tetes,  jarum  ose,  L glass, batang pengaduk, laminar air flow ( N Biotek ),  rak  tabung  reaksi,  tabung  reaksi ( Pyrex ), lemari pendingin ( Samsung ), inkubator  ( Ecocell ),  cakram  ( Paper  disc ), mikropipet  ( Ecopipette ),  vial,  pot  salep, jangka sorong.
b. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini  ialah  sampel  biji  kopi  robusta,  etanol
96%,  metanol,  n-heksan,  etil  asetat,  larutan H 2 SO 4 1%,  BaCl 2 1,75%,  NaCl    0,9%, aquades,  biakan  mikroba Escherichia  coli ATCC 25922 (gram negatif),
Staphylococcus  aureus ATCC  25923  (gram positif), Nutrien  Agar (NA),  Kloramfenikol paper disc , alkohol, wadah maserasi,   label, tissue ,  lempeng  silica  gel,  kertas  saring, alumunium foil.

## Prosedur Penelitian Ekstraksi
Sampel  ditimbang  sebanyak  600  g, diekstraksi  secara  maserasi  menggunakan etanol  96%  sebanyak  1800  ml  hingga terendam  seluruhnya.  Wadah  maserasi ditutup dengan aluminium foil dan disimpan selama 24 jam ditempat yang terlindung dari sinar  matahari  langsung  sambil  sesekali diaduk.  Maserasi  dilakukan  selama  3x24 jam.  Sampel  yang  telah  direndam  disaring dengan menggunakan kertas saring menghasilkan  filtrat  1  dan  debris  1. Selanjutnya proses remaserasi selama 2 hari dengan  merendam  debris  1  dengan  pelarut etanol  96%.  Setelah  2  hari  sampel  tersebut disaring menggunakan kertas saring menghasilkan filtrat 2 dan debris 2. Filtrat 1 dan  2  dicampurkan  menjadi  satu  kemudian disaring,  lalu  hasil  penyaringan  kemudian diuapkan  dengan  oven  hingga  diperoleh ekstrak  kental  kopi  robusta.  Ditimbang menggunakan  timbangan  analitik  diperoleh ekstrak  sebanyak  63,63  g.  Ekstrak  kental yang  sudah  di  timbang  disimpan  dalam wadah gelas tertutup untuk digunakan dalam pengujian.
Fraksinasi
Fraksinasi  dilakukan  dengan  metode cair-cair,  Ekstrak  kental  yang  diperoleh selanjutnya difraksinasi dengan menggunakan  3  pelarut  dengan  tingkat kepolaran  yang  berbeda-beda,  yaitu  n- heksan,  etil  asetat,  dan  metanol.  Proses fraksinasi  dilakukan  dengan  melarutkan sampel sebanyak 10 g ekstrak kental dengan metanol  sebanyak  100  ml  di  aduk  hingga homogen dan ditambahkan pelarut n-heksan sebanyak 100 ml selanjutnya dimasukkan ke dalam corong pisah dikocok hingga terpisah 2  lapisan,  lapisan  atas  merupakan  fase  n- heksan  dan  lapisan  bawah  merupakan  fase metanol  masing-masing  lapisan  ditampung pada  wadah  yang  berbeda.  Cara  yang  sama dilakukan untuk pelarut etil asetat.

## Sterilisasi dan Pembuatan Media Sterilisasi Alat
Alat-alat  gelas  yang  digunakan dalam  penelitian  aktivitas  antibakteri  ini disterilkan terlebih dahulu dengan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121 ⁰ C selama  15  menit.  Sedangkan  pinset,  jarum ose dan L glass dipijarkan diatas api bunsen.
Pembuatan Media Nutrient Agar
Nutrien  Agar  sebanyak  10,08  g ditimbang dan ditambahkan dengan aquadest  sampai  360  mL  dan  dilarutkan hingga homogen. Media yang telah homogen  kemudian  disterilkan  dengan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121 ⁰ C selama  15  menit,  dan  dibiarkan  sampai media  cukup  dingin.  Selanjutnya  media nutrien  Agar  yang  masih  cair  dituang  ke dalam  18  cawan  petri  masing-masing sebanyak  20  mL.  dan  dibiarkan  hingga memadat.

## Pembuatan Media Agar Miring
Pembuatan  agar  miring  dilakukan dengan  memasukkan  10  mL  media  yang telah  disterilkan  dalam  tabung  reaksi kemudian  disumbat  dengan  kapas  steril  dan dimiringkan  sekitar  45 ⁰ C.  Didiamkan hingga  memadat  pada  suhu  ruangan.  Media agar  miring  digunakan  sebagai  peremajaan bakteri.

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pembuatan  Larutan  standar  Mc  Farland 0,5
Larutan  H 2 S04  1%  sebanyak  9,95 mL  dicampurkan  dengan  larutan  BaCl 2. 2H 2 O  1,75%  sebanyak  0,05%  mL  dalam Erlenmeyer.  Kemudian  dikocok  sampai terbentuk larutan yang keruh sebagai standar kekeruhan suspense mikroba uji.

## Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Bakteri  uji  yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia  coli yang  telah diinokulasi  diambil  kurang  lebih  1  ose kemudian  disuspensikan  ke  dalam  tabung yang  berisi  10  mL  larutan  NaCL  0,9%. Selanjutnya  dibandingkan  dengan  standar kekeruhan larutan Mc Farland 0,5.

## Kontrol Positif dan Kontrol Negatif
Kontrol  Positif  untuk  pengujian aktivitas antibakteri ini menggunakan Kloramfenikol paper disc dan untuk kontrol negatif menggunakan akuades.
Pembuatan Larutan Uji
Dibuat larutan stok untuk konsentrasi 100%  dengan  cara  menimbang  1  g  fraksi metanol,  fraksi  etil  asetat,  fraksi  n-heksan,
masing-masing  dilarutkan  dengan  aquadest hingga 1 ml. Larutan uji fraksi metanol, etil asetat,  n-heksan  10%,  20%,  30%,  dibuat dengan  cara  mengambil  masing-masing sebanyak 0,1 mL, 0,2 mL, dan 0,3 mL untuk setiap  konsentrasi  dan  dicukupkan  dengan aquadest hingga 1 mL.

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pada penelitian ini digunakan metode difusi agar. Aktivitas penghambatanya di uji terhadap
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang digunakan sebagai mikroorganisme uji. Digunakan  kertas  cakram  yang  berukuran  6 mm  untuk  pengujian  aktivitas  antibakteri. Media NA dituang masing-masing sebanyak 20  mL  kedalam  18  cawan  petri  hingga memadat.  Pada  permukaan  media  yang sudah memadat dimasukkan suspensi bakteri uji. Sampel yang telah ditentukan konsentrasinya  ditotolkan  pada  masing- masing cakram dengan menggunakan mikropipet sebanyak 50 µL. Masing-masing cakram diberi label sesuai dengan komponen  pengujian.  Kertas  cakram  yang telah  ditotolkan  larutan  uji  terdiri  dari kontrol  positif,  kontrol  negatif,  dan  yang mengandung larutan uji diletakkan ke dalam cawan  petri  dan  disesuaikan  jaraknya dengan pinset lalu diinkubasi selama 24 jam.
Pengamatan dan Pengukuran Zona Bening
Pengamatan  dilakukan  setelah  1x24 jam  dalam  inkubasi.  Daerah  pada  sekitaran cakram  menunjukkan  kepekaan  bakteri terhadap  antibiotik  atau  larutan  uji  yang digunakan.  Diameter  zona  bening  diukur dalam  satuan  milimeter  (mm)  menggunkan
jangka  sorong  dengan  cara  diukur  diameter zona bening horizontal ditambahkan dengan diameter  zona  bening  vertikal  lalu  dibagi dua.

## Pengujian Fraksi Teraktif dengan Metode KLT-Bioautografi
Fraksi  yang  memiliki  zona  bening yang paling besar dilanjutkan pada pemantauan KLT. Hasil pemantauan KLT di uji  aktivitas  antibakterinya  dengan  metode KLT-Bioautografi.

## Persiapan Plat KLT
Pemisahan  senyawa  dari  fraksi teraktif dilakukan dengan menggunakan plat silika  sebagai  fase  diam  dengan  ukuran  1  x 10  cm.  Selanjutnya  diberi  tanda  garis  pada tepi  atas  dan  bawah  plat  dengan  jarak  1  cm untuk  menunjukkan  posisi  awal  totolan  dan tepi  atas  sebagai  tanda  batas  dari  proses elusi.  Selanjutnya  plat  diaktifkan  dengan cara dipanaskan pada suhu 105 0 C selama 10 menit  untuk  menghilangkan  kadar  air  yang terdapat pada plat KLT.

## Persiapan Fase Gerak (Eluen)
Sebelum dilakukan pengelusian, eluen  yang  digunakan  yaitu  fraksinat metanol  menggunakan  eluen  kloroform  dan n-heksan  dengan  perbandingan  (1:2)  eluen yang  berada  di  dalam  bejana  dijenuhkan terlebih  dahulu,  setiap  campuran  fase  gerak dimasukkan  dalam  chamber  lalu  ditutup rapat  dan  dilakukan  penjenuhan  dengan menggunakan kertas saring selama 10 menit. Penjenuhan ini dilakukan untuk menyamakan  tekanan  uap  pada  seluruh bejana.

## Penotolan Sampel Fraksi
Fraksi  metanol  dengan  konsentrasi 30%  ditotolkan  pada  tiga  lempeng  yang berbeda  dengan  jarak  1  cm  dari  tepi  bawah plat  dengan  menggunakan  pipa  kapiler. Kemudian dikeringkan dengan cara diangin- anginkan. Lempeng pertama diamati dengan lampu  UV  254  nm  dan  lampu  UV  366  nm. Lempeng kedua disemprotkan reagen Aluminium  Klorida  AlCl 3 untuk  melihat senyawa  flavonoid  dan  dragendorf  untuk melihat  senyawa  alkaloid.  lempeng  ke  tiga digunakan untuk uji bioautografi.

## Uji Bioautografi
Nutrien  Agar  sebanyak  0,56  g ditimbang dan ditambahkan dengan aquadest  sampai  20  mL  dan  dilarutkan hingga homogen. Media yang telah homogen  kemudian  disterilkan  dengan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121 0 C selama  15  menit,  dan  dibiarkan  sampai media  cukup  dingin.  Selanjutnya  media nutrien  Agar  yang  masih  cair  dituang  ke dalam cawan petri masing-masing sebanyak 20  mL.  dan  dibiarkan  hingga  memadat. Kromatogram  hasil  pemisahan  senyawa secara  KLT  diletakkan  diatas  medium  yang memadat.  Didiamkan  selama  30  menit dilemari  pendingin,  lempeng  kromatogram diangkat  dan  dikeluarkan  dari  medium. Selanjutnya  diinkubasi  selama  1  x  24  jam pada suhu 37 0 C.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi dan Fraksinasi
Sampel  biji  kopi  robusta Coffea canephora diambil  di  Desa  Modayag Kecamatan  Modayag  Bolaang  Mongondow Timur  dilakukan  sortasi  basah  untuk
memisahkan  kotoran-kotoran  atau  bahan asing  lainnya  dari  tumbuhan  sebelum pencucian  dengan  cara  membuang  bagian- bagian yang tidak perlu sebelum pengeringan.  Selanjutnya  dicuci  di  bawah air    mengalir  untuk  menghilangkan  tanah dan pengotor lainnya yang melekat pada biji kopi  kemudian    ditiriskan.    Dilakukan sortasi kering untuk menghilangkan sisa-sisa kotoran  yang  masih  ada  dan  tertinggal proses  ini  dilakukan  secara  manual.  Sampel dikeringkan  dengan  menggunakan  oven, pengeringan  dengan  oven  dianggap  lebih menguntungkan karena akan terjadi pengurangan  kadar  air  dalam  jumlah  besar dalam waktu yang singkat (Wahyuni, 2014).
Maserat  yang  diperoleh  dari  proses maserasi selanjutnya dipekatkan menggunakan  oven  pada  suhu  40 ⁰ C  untuk memperoleh  ekstrak  kental  selanjutnya digunakan  dalam  fraksinasi.  Ekstrak  kental yang  diperoleh  selanjutnya  difraksinasi dengan  metode  fraksinasi  cair-cair.  Metode fraksinasi  ini  menggunakan  variasi  pelarut yang  memiliki  kepolaran  yang  berbeda- beda, yaitu metanol, etil asetat dan n-heksan, pemilihan  ini  di  karena  ketiga  pelarut  ini sudah  mewakili  kepolaran  yang  berbeda- beda  dimana  metanol  bersifat  polar,  etil aseat  bersifat  semi  polar  dan  n-heksan bersifat  non  polar  sehingga  senyawa- senyawa  yang  memiliki kepolaran  berbedah dapat terpisah kedalam pelarut yang sesuai.

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pengujian  aktivitas  antibakteri  fraksi metanol,  fraksi  etil  asetat  dan  fraksi  n- heksan  pada  bakteri  uji Staphylococcus aureus untuk  mewakili  bakteri  golongan
Gram  positif  dan Escherichia  coli untuk mewakili bakteri golongan Gram negatif.
Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan  metode  difusi  agar (disc diffusion  Kriby  and  Bauer ).  Metode  ini dilakukan  dengan  menggunakan  kertas cakram  yang  berisi  senyawa  antibakteri, kemudian diletakkan pada media padat yang telah diinokulasi bakteri. Senyawa antibakteri  akan  berdifusi  ke  dalam  media padat yang diinokulasi bakteri dan menghambat  pertumbuhan  bakteri  yang ditandai dengan terbentuknya daerah bening di  sekeliling  kertas  cakram  (Brooks et  al., 2005). Metode ini dipilih karena pengerjaan yang sederhana, mudah dikerjakan, ketelitian,  tidak  memerlukan  peralatan  yang khusus,  metode  serbaguna  bagi  semua bakteri  patogen  yang  tumbuh  cepat  dan sering  digunakan  dalam  uji  kepekaan antibiotik  dalam  program  pengendalian mutu.
Tabel  1. Hasil  rata-rata  diameter  zona hambat terhadap bakteri uji
Staphylococcus aureus .
Fraksi Rata-rata diameter zona bening (mm) pada setiap konsentrasi 10% 20% 30% Fraksi metanol 9,16 11,33 12,58 Fraksi etil asetat 8,16 10,00 11,00 Fraksi n- heksan 8,00 9,66 10,75 Kontrol positif 15,33 11,66 13,16 Kontrol negatif 0 0 0
Tabel  2. Hasil  rata-rata  diameter  zona hambat terhadap  bakteri uji Escherichia coli
Fraksi Rata-rata diameter zona bening (mm) pada setiap konsentrasi 10% 20% 30% Fraksi methanol 9,33 10,33 11,60 Fraksi etil asetat 8,33 9,25 9,66 Fraksi n- heksan 8,50 9,00 9,16 Kontrol positif 19,41 19,33 19,66 Kontrol negatif 0 0 0 Hasil  yang  diperoleh  dari  fraksi metanol, n-heksan dan etil asetat menunjukan  diameter  zona  hambat  yang lebih  besar  pada  konsentrasi  30%  terhadap bakteri Staphylococcus aureus hal ini karena menurut Pelczar (1998), menyatakan bahwa bakteri  Gram  positif  memiliki  struktur dinding sel yang lebih banyak peptidoglikan, sedikit  lipid  dan  tidak  mempunyai  lapisan lipopolisakrida sehingga senyawa antibakteri  yang  bersifar  hidrofilik  maupun hidrofobik  dapat  dengan  mudah  melewati dinding  sel.  Kerusakan  sel  bakteri  yang terjadi  pada  dinding,  membran  dan  bagian internal sel akan menyebabkan bakteri tidak dapat  menahan  tekanan  osmotik  tinggi  dari dalam  sel  sehingga  mengakibatkan  sel menjadi lisis. Sedangkan struktur dinding sel bakteri  Gram  negatif  lebih  kompleks  dan berlapis  tiga,  yaitu  lapisan  luar  berupa lipoprotein, lapisan tengah berupa petidoglikan dan lapisan dalam lipopolisakrida  (Placzar  dan  Chan,  1986). Struktur  dinding  sel  yang  relatif  kompleks ini  menyebabkan  antibakteri  lebih  sukar masuk kedalam sel.
Kontrol positif menunjukkan perbedaan yang nyata, Karena menghasilkan aktivitas  antibakteri  yang  paling  besar terhadap  bakteri  uji  dibandingkan  dengan kontrol negatif, ekstrak maupun fraksi bahan uji.  Untuk  pengujian  ini  antibiotik  yang digunakan  yaitu  kloramfenikol.  Kontrol positif berfungsi sebagai pembanding antara antibakteri yang sudah terstandarisasi dengan  larutan  fraksi  dalam  hal  ini Coffea canephora.
Hasil penelitian ini menunjukkan diameter zona hambat kloramfenikol  yang  terbentuk,  lebih  besar pada  bakteri  gram  negatif Escherichia  coli dibandingkan  gram  positif Staphylococcus aureus.
Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan diameter zona hambat bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang  terbentuk  pada  konsentrasi  fraksi  30% lebih besar dibandingkan dengan konsentrasi fraksi  10%  dan  20%.  Hal  ini  membuktikan bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  larutan uji, maka semakin besar pada diameter zona hambat yang terbentuk.
Hasil  uji  statistik  menggunakan anova two way untuk bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli . Dari data tabel ANOVA ( Test Of Between- Subjects Effects ) Menunjukkan bahwa setiap pelarut  memiliki  kemampuan  yang  berbeda terhadap  daya  hambat  bakteri.  Hal  ini menunjukkan  perbedaan  bermakna  dengan nilai  0.00  (p<0,05).  Hasil    yang  diperoleh fraksi  dengan  penggunaan  pelarut  metanol adalah yang paling baik.
Pengujian Fraksi Teraktif Dengan Metode KLT-Bioautografi KLT-Bioautografi
merupakan pengujian  lanjutan  yang  berfungsi  untuk mengetahui  komponen  kimia  apa  yang memberikan  aktivitas  antibakteri  dari  fraksi metanol biji kopi robusta dengan fraksi yang terpilih  yaitu  metanol  30%.  Eluen  yang digunakan  adalah  kloroform  dan  n-heksan dengan perbandingan (1:2), Pemilihan eluen sebaiknya dimulai dari pelarut organik  yang non polar dan peningkatan kepolaran dengan pelarut  yang  lebih  polar  lainnya  (Gritter, 1991).
Metode yang digunakan dalam KLT- Bioautografi  ialah  metode  kontak  yaitu dengan  menempelkan  lempeng  KLT  diatas medium  agar  yang  telah  diinokulasikan dengan  bakteri  uji.  Terdapat  zona  bening yang  terbentuk  pada  titik  bawah  yang menjadi tempat totolan ekstrak namun tidak terdapat  zona  bening  pada  bagian-bagian spot  yang  naik  hal  ini  kemungkinan  terjadi karena kekurangan dari metode kontak yaitu penyerapan  oleh  permukaan  agar  dan kesulitan  untuk  mendapatkan  kontak  yang optimal  antara  agar  dan  kromatogram sehingga  matriks  lempeng  melekat  dan tertinggal pada agar ketika lempeng kromatogram  di  angkat  kembali.  Beberapa senyawa  dapat  berikatan  dengan  matriks lempeng  kromatogram  terutama  matriks berbasis  silica  sehingga  beberapa  senyawa tidak perna berdifusi ke dalam agar (Pakata, 2013).
Identifikasi komponen kimia dilakukan  untuk  mengetahui  golongan senyawa  yang  terkandung  dalam  ekstrak menggunakan  lempeng  KLT  yang  telah disemprotkan  dengan  pereaksi.  Pereaksi
AlCl 3 menunjukkan  senyawa  flavonoid  jika noda  yang  tampak  berwarna  kuning  dan pereaksi  dragendorf  menunjukkan  senyawa alkaloid  jika noda tampak berwarna orange. Berdasarkan  warna  yang  ditunjukkan  pada pereaksi  maka  ekstrak  diduga  mengandung senyawa  flavonoid  dan  alkaloid.  Beberapa penelitian  sebelumnya  telah  menunjukkan kandungan  senyawa  yang  terdapat  pada  biji kopi robusta  diantaranya  mengandung senyawa flavonoid dan alkaloid.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa : 1. Fraksi  biji  kopi  robusta  memiliki aktivitas
antibakteri terhadap
Staphylococcus  aureus dan Escherichia coli dengan kategori kuat.
2. Komponen kimia aktif yang memberikan  aktivitas  antibakteri  secara KLT-bioautografi  pada  fraksi  terpilih yaitu  methanol  diduga  adalah  golongan flavonoid dan alkaloid.

## SARAN
Perlu dilakukan penelitian lagi untuk mengidentifikasi  golongan  senyawa  lain yang  ada  pada  biji  kopi  robusta Coffea canephora dengan  menggunakan  metode KLT-Bioautografi langsung.

## DAFTAR PUSTAKA
Brooks, G. L., J.S. Butel. S.A Morse. 2005. Mikrobiologi  Kedokteran  Ed.  23 . Jakarta : Salemba Medika.
Gritter,  R.  1991.  Pengantar  Kromatografi edisi  2.  Alih  bahasa  oleh  Kosasih Padmawinata, Bandung: ITB
Lubis, M. R. R. 2018. Pengaruh Konsentrasi Ekstrak  Biji  Kopi  Robusta  ( Coffea canephora )  Terhadap  PH  Saliva  dan Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus (IN  VITRO)  (ATCC  29213).
[ Skripsi ]. Medan : Universitas Sumatera Utara
Lukman, A. 2016.  Uji  Aktivitas Antibakteri Ekstrak  Biji  Kopi  Robusta  ( Coffea canephora )    terhadap  PH  saliva  dan
Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus (ATCC  29213)  (in  vitro).
[ Skripsi ]. Medan : Universitas Sumatera Utara.
Pakata,  iin.  2013.  Uji  Aktivitas  Antiikroba Dari  Ekstrak  dan  Fraksi  Aktif  Buah
Cabai  Katokkon  ( Capsium annum L.
var. chinensis ) Secara KLT-
Bioautografi.  Makassar.  Universitas Hasanuddin.
Pelczar, M. J., Chan, E. C. S., 1986. Dasar-
dasar Mikrobiologi . Terjemahan
Hadioetomo,  R.S.  Imas,  T.S.S.,
Tjitrosomo. Jakarta : UI Press.
Rahmadani, Fitri.2015. Uji Aktivitas
Antibakteri  dari  Ekstrak  Etanol  96% Kulit  Batang  Kayu  Jawa  ( Lannea coromandelica )  Terhadap  Bakteri
Staphylococcus  aureus , Escherichia coli, Helicobacter pylori , Pseudomonas  aeruginosa .  [ Skripsi ]. Jakarta  :  Fakultas  Kedokteran  dan
Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah.
Tanauma,  H.  2016.  Aktivitas  Antibakteri
Ekstrak  Biji  Kopi  Robusta  ( Coffea canephora ) Terhadap Bakteri Escherichia  coli . Jurnal  Ilmiah
Farmasi. 5(4) : 244-251.
Wahyuni, R. 2014. Pengaruh Cara
Pengeringan Dengan Oven, Kering
angin dan Cahaya Matahari
Langsung  Terhadap  Mutu  Simplisia Herba  Sambiloto. Jurnal  Farmasi Higea . 6 (2) : 127 – 132.