ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (1) (2017) : 42 – 47
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi

## Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Pengaruh Pemerangkapan Enzim Alkalin Fosfatase ke dalam Silika dari Abu Sekam Padi terhadap Aktivitas Enzimatiknya
Sriyanti a,*
a Inorganic Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: sriyanti@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords:
Alkaline phosphatase, RHA, entrapment, silica, enzyme.
Alkaline phosphatase was entrapment in silica from rice hull ash by sol-gel process. In this procedure, silica solution was exstracted from rice hull ash (RHA) by 1.5 N of sodium hydroxide. The 0.1 N of hydrochloride acid solution was added to decrease pH until 10. Alakline phosphatase (in tris-HCl buffer solution at pH: 8) was added to silica solution, placed  in  desicator  until  gel  formed.  Dry  gel  formed  was  immobilized  enzyme.  The catalytic properties and kinetic parameters both free enzyme in solution and immobilized enzyme  was  studied.  Results  showed  that  the  optimal  pH  and  temperature  for  the immobilized alkaline  phosphatase  in silica  were  9.0 and  45 ◦ C,  which  were  higher  than those of the free form ( 8.5 and 40 ◦ C). It was found, at room temperature and pH 8.5, that the  Michaelis-Menten  constant  (K m )  was  7.50  mM  and  that  specific  activity  was  0.051 U/mg  enzyme  for  entrapment  alkaline  fosfatase,  compared  to  a  K m of  0.08  mM  and specific activity 1.041 U/mg enzyme for free the alkaline phosphatase.

## A b s t r a k
Kata kunci:
Alkalin fosfatase, abu sekam padi, pemerangkapan,
silika, enzim.
Alkalin fosfatase telah diperangkap ke dalam silika dari abu sekam padi melalui  proses sol-gel. Dalam prosedur ini, larutan silika dihasilkan melalui ekstraksi abu sekam padi menggunakan larutan natrium hidroksida 1,5 N. Larutan asam klorida 0,1 N ditambahkan untuk menurunkan pH larutan silika hingga 10. Alkalin fosfatase (dalam larutan buffer tris-HCl pH:8) ditambahkan ke dalam larutan silika, didiamkan di dalam desikator hingga terbentuk  gel.  Gel  kering  merupakan  enzim  terperangkap  (terenkapsulasi).  Parameter katalitik  dan  kinetik  ditentukan  baik  untuk  enzim  bebas  dalam  larutan  maupun  untuk enzim  terimobilisasi.  Hasil  menunjukkan  bahwa  pH  dan  suhu  optimal  untuk  alkalin fosfatase  terimobilisasi  dalam  silika  adalah  9,0  dan  45 ◦ C,  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  bentuk  bebasnya  (8,5  dan  40 ◦ C).  Pada  suhu  kamar  dan  pH  8,5,  konstanta Michaelis-Menten  (K m )  adalah  7,50  mM  dan  aktivitas  spesifiknya  adalah  0,051  U/mg enzim  untuk  alkalin fosfatase  terenkapsulasi,  sedangkan  untuk  alkalin fosfatase bebas dalam larutan berturut-turut 0,08 mM dan 1,041 U/mg enzim.

## 1. Pendahuluan
Enzim  adalah  biokatalis  yang  diproduksi  oleh jaringan  hidup  untuk  meningkatkan  laju  reaksi  yang terjadi  dalam  jaringan.  Enzim  mengkatalisis  hampir semua  reaksi-reaksi  biologis  penting.  Dewasa  ini penggunaan  enzim  sebagai  biosensor  untuk  uji  klinik
dalam  mendeteksi  berbagai  penyakit  semakin  banyak digunakan, selain di bidang industri [1]
Alkalin  fosfatase  (E.C.  3.1.3.1)  atau  Ortofosforik monoester fosfohidrolase adalah enzim yang mengkatalisis  perubahan  fosfat  organik  menjadi  fosfat anorganik. Dalam bidang kedokteran digunakan sebagai biosensor untuk mendiagnosa penyakit liver dan tulang
[1].  Dalam  bidang  industri  digunakan  untuk  menguji produk susu dan air minum [2].
Permasalahan  umum  yang  timbul  pada  pemakaian enzim adalah ketidakstabilan enzim yaitu mudah rusak selama  penyimpanan  dan  tidak  tahan  terhadap  panas maupun  kondisi  keasaman  (pH)  tertentu.  Selain  itu, sebagai  katalis  reaksi  yang  akan  terbentuk  kembali bersama produk, ternyata tidak mudah untuk dipisahkan dari  produknya  sehingga  tidak  dapat  digunakan  secara berulang.  Untuk  menjaga  kestabilan  enzim,  biasanya dilakukan  dengan  mengimobilkan  pada  media  tertentu seperti membrane, selulose atau silika [1].
Imobilisasi enzim melalui pemerangkapan (enkapsulasi)  sol-gel  ini  berkembang  dengan  pesat. Silika banyak digunakan sebagai prekursor karena stabil dalam  berbagai  kondisi,  mempunyai  kestabilan  termal yang  tinggi,  tidak  mengembang  ( swelling),  inert  dan transparan  secara  optis  [3].  Enzim  Kloroperoksidase telah  berhasil  diperangkap  dalam  TEOS  dengan mempertahankan aktivitasnya [4]. Natrium silikat dapat digunakan  sebagai  prekursor  dalam  proses  sol-gel karena  mudah  mengalami  hidrolisis  dan  kondensasi pada  keadaan  tertentu  [5]  Natrium  silikat  dapat dihasilkan dari ekstraksi abu sekam padi menggunakan natrium hidroksida atau karbonat [6]
Sebagai  negara  agraris,sejak  tahun  1999  Indonesia dapat  memproduksi  padi  sekitar  50  juta  ton  pertahun. Padi sejumlah itu dapat menghasilkan abu sekam sekitar 1-3 juta ton, yang sejauh ini belum dapat dimanfaatkan secara optimal. Ekstraksi silika dari abu sekam padi dapat dilakukan  dengan  metode  basah  menggunakan  larutan natrium  hidroksida  mendidih  [6].  Hasil  ekstraksi  yang berupa natrium silikat telah digunakan sebagai prekursor dalam pembuatan silika xerogel dengan kemurnian yang tinggi  melalui  metode  sol-gel  [6,  7].  Metode  sol-gel diawali  dengan  reaksi  hidrolisis  fasa  sol  untuk selanjutnya mengalami kondensasi membentuk polimer menuju gel [8].
Dalam penelitian ini dikaji pengaruh imobilisasi sol- gel  alkalin  fosfatase  ke  dalam  natrium  silikat  hasil ekstraksi  dari  abu  sekam  padi  terhadap  sifat-sifat katalitik dan kinetiknya.

## 2. Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Bahan  yang  digunakan  terdiri  dari:  Alkalin fosfatase(ALP)  dari bovine  intestinal  mucosa  ,  para- Nitrofenil  fosfat,  para-Nitrofenol,  buffer  Tris-HCl (Sigma),  magnesium  klorida,  natrium  hidroksida  dan Asam klorida (Merck), sedangkan peralatan utama yang digunakan  adalah  hotplate,  sentrifuge,  shaker, spektronic-20, FTIR dan XRD.

## Ekstraksi silika dari abu sekam padi
Sekam  padi  dari  daerah  Sragen,  Jawa  Tengah, dikeringkan  di  bawah  matahari  dan  dibersihkan  dari kotoran-kotoran pengikut seperti daun-daun padi, pasir dan  kerikil.  Selanjutnya  dipanaskan  di  atas  kompor hingga  membentuk  arang  yang  berwarna  hitam.  Arang
dimasukkan ke dalam cawan porselen untuk selanjutnya dipanaskan  dalam  tungku  pemanas  ( furnace)  selama  4 jam  dengan  temperatur  700 o C.  Abu  yang  dihasilkan digerus kemudian diayak hingga lolos ayakan 200 mesh.
Larutan  natrium  silikat  dibuat  dengan  melarutkan abu  sekam  dengan  larutan NaOH  mendidih  (ekstraksi  ) mengikuti metode terdahulu [6]. Dibuat larutan NaOH 1,5 N dari NaOH pelet yang ada. Enampuluh mililiter larutan NaOH  1,5  N  ditambahkan  ke  dalam  10  g  abu  sekam, kemudian  dididihkan  sambil  diaduk.  Setelah  dingin disaring, dan residu ditambah lagi dengan 60 mL larutan NaOH  1,5  N  dan  kembali  dididihkan  setelah  dingin, disaring dan filtratnya disatukan dengan fitrat pertama sebagai larutan natrium silikat dan disimpan dalam botol plastik.

## Pembuatan silika gel dari silika terlarut hasil ekstraksi dari abu sekam padi
Dibuat silika gel dengan menambahkan ( 0,5-5 mL) HCl 0,1 N pada (3,4 mL) silikat terlarut hingga terbentuk gel.  Setelah  dikeringkan  diuji  tingkat  kekristalannya dengan  XRD  dan  jenis-jenis  gugus  fungsinya  dengan FTIR.

## Imobilisasi sol-gel alkalin fosfatase dalam silika terlarut
Mengacu pada metode Wei dkk. [9] dengan berbagai penyesuaian. Setelah penambahan HCl 0,1 N pada silikat terlarut  dengan  perbandingan  tertentu,  selanjutnya ditambahkan 0,04 mL enzim ALP yang sudah dilarutkan dalam  buffer  Tris-HCl  (2  mg  ALP  dalam  40  mL  buffer, pH: 8). Sesudah terbentuk gel, ditutup dengan parafilm yang  diberi  beberapa  lobang  untuk  menguapkan pelarutnya  dan  dibiarkan  semalam.  Sampel  kemudian diletakkan dalam desikator vakum dan disimpan selama beberapa  hari  hingga  dipeoleh  berat  konstan.  Sampel dibuat  puder  dan  selanjutnya  disimpan  dalam  freezer. Karakterisasi  meliputi  uji  fisik,  yaitu  identifikasi  gugus fungsional dengan FTIR , dan tingkat kekristalan dengan XRD,  sedangkan  uji  kimiawi  meliputi  uji  aktivitas enzimatik  baik  ALP  bebas  dalam  larutan  maupun  ALP terenkapsulasi.

## Uji aktivitas ALP bebas [10]
Satu mililiter larutan enzim (mengandung 2 µg ALP) dicampur  dengan  1,46  mL  buffer  Tris-HCl  dan  0,3  mL MgCl 2 dalam  mixer  vortex.  Sesudah  30  menit ditambahkan 0,24 mL paranitrofenil fosfat (pNPP) 0,1 M sebagai  substrat  untuk  memulai  reaksi.  Pembentukan produk  para  nitrofenol  ditandai  dengan  perubahan warna diukur dengan spektronik-20. Selanjutnya dicatat perubahan  absorbansi  terhadap  waktu.  Uji  kinetika dilakukan  dengan  membuat  plot  terhadap  persamaan Lineweaver-Burk  ,  dengan  memvariasi  konsentrasi pNPP antara 1-15 mM:
1 V = K m V maks 1 [ S ] + 1 V maks diperoleh  harga Vmaks  dan  Km  dari  ALP,  yang selanjutnya  digunakan  untuk  menghitung  aktivitas spesifik enzim dengan persamaan:
V maks = kpEo

## Uji aktivitas ALP terenkapsulasi [9]
Dua-sepuluh (2-10) miligram sampel yang biasanya mengandung  0,08  unit  ALP  diekstraksi  dengan  5  ml aquabides  selama  1  jam  kemudian  diikuti  dengan sentrifugasi  dan  pemisahan  dari  fasa  air.  Selanjutnya dilakukan  uji  seperti  ALP  bebas  dengan  mengganti larutan enzim dengan 1 mL H 2 O.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Penelitian  ini  diawali  dengan  pembuatan  larutan natrium  silikat  melalui  ekstraksi  dengan menggunakan larutan  NaOH  1,5  N.  Secara  keseluruhan  pembuatan larutan  natrium  silikat  (silikat  terlarut)  tersebut kemungkinan melibatkan reaksi kimia berikut:
Pengabuan [11]:
Senyawa C, H, dan Si + O 2 → CO 2 (g) + H 2 O(g) + SiO 2 (p)
Dimungkinkan juga terjadi kondensasi gugus silanol ( ≡ Si-OH) seperti penjelasan Iler [12]:
2 ≡ Si-OH → ≡ Si-O-Si ≡ + H 2 O
Pada  ekstraksi  silika  dari  abu  sekam  hingga terbentuk  larutan  natrium  silikat  mengikuti  reaksi sebagai berikut:
SiO 2 + 2 NaOH → Na 2 SiO 3 + H 2 O
Sebelum  digunakan  sebagai  matriks  atau  padatan pendukung  dalam  imobilisasi  sol-gel  (enkapsulasi) enzim ALP, dilakukan terlebih dahulu pembuatan gel dari natrium  silikat  hasil  ekstraksi  ini  untuk  melihat karakteristik  gel  yang  dihasilkan.  Pada  umumnya, penambahan  asam  terhadap  natrium  silikat  akan menyebabkan  pembentukan  gel  secara  langsung  [13]. Peristiwa  ini  tidak  dikehendaki  karena  dimungkinkan akan  merusak  enzim  yang  dienkapulasikan.  Untuk  itu dilakukan  variasi  volume  HCl  0,1  N  yang  digunakan hingga  diperoleh  gel  yang  tidak  langsung  terbentuk. Pengaruh volume HCl terhadap waktu pembentukan gel (gelasi) ditampilkan dalam tabel 1.

## Tabel 1. Pengaruh volume HCl terhadap pH larutan dan
waktu gelasi
No. Volume Silikat terlarut (mL) Volume HCl 0,1 N (mL) pH Waktu gelasi 1. 5 5 2 Langsung terbentuk gel 2. 5 4 3 Langsung terbentuk gel 3. 5 3 10 1 menit
4.
5 2 10 4 jam 5. 5 1 11 Tidak terbentuk gel 6. 5 0,5 12 Tidak terbentuk gel 7. 5 0,25 12 Tidak terbentuk gel
Dari  tabel  1  terlihat  bahwa  variasi  keempat  (  5  mL silikat  terlarut dengan  2 mL HCl  0,1  N) membentuk  gel dalam  waktu  relatif  lama  serta  pH  relatif  tinggi. Selanjutnya  komposisi  ini  digunakan  pada  enkapsulasi enzim.
Secara umum reaksi sol-gel (pada pembentukan gel) terdiri dari dua langkah, yaitu hidrolisis logam alkoksida untuk  memproduksi  gugus  hidroksil,  diikuti  dengan polikondensasi  gugus  hidroksil  dengan  sisa  gugus alkoksida untuk membentuk jaringan tiga dimensi [8].
Gambar 1. Reaksi hidrolisis dan kondensasi pada proses sol-gel
Jika  pada  saat  gel  terbentuk  ditambahkan  molekul organic  maupun  biomolekul,  maka  molekul  tersebut akan terperangkap di dalam gel. Untuk tujuan imobilisasi diharapkan pemerangkapan tersebut tidak menghilangkan  keaktifan  dari  biomolekul  yang terperangkap.
Pengaruh  enkapsulasi  ALP  ke  dalam  silika  diamati secara  fisik  maupun  kimiawi.  Secara  fisik  silika  diuji tingkat  kekristalannya  dengan  XRD  (gambar  2)  dan gugus-gugus  fungsinya  dengan  FTIR  (  Gambar  3).  Dari gambar  2  terlihat  bahwa,  silika  dari  abu  sekam  padi bersifat amorf. Sifat amorf ini yang menyebabkan silika bersifat reaktif, sedangkan dari gambar 3 terlihat bahwa spektra FTIR dari silika gel dari abu sekam padi maupun SG-ALP  tidak  menunjukkan  pola  yang  berbeda,  hal  ini kemungkinan  mengindikasikan  bahwa  enzim  hanya terperangkap secara fisik, tidak membentuk suatu ikatan kimia.
Gambar 2. Difraktogram XRD dari silika gel yang dihasilkan pada (a) pH=7 (b) pH=5 dan (c) pH=3
Si OR Si OH Si O Si + H 2 O hidrolisis Si OH + ROH esterifikasi Si OR + Si HO Si HO kondensasi alkohol
alkoholisis Si O Si + ROH + kondensasi air hidrolisis + H 2 O
X-ray diffraction pattern of pure RHA silica produced at pH: 7 (A), 5(B) and 3(C) by second methode
Gambar 3. Spektra FTIR dari silika gel: A. Avidin (protein), B. Silika gel dari abu sekam padi, C. Silika gel- ALP.
Uji secara kimiawi meliputi sifat katalitik dan kinetik dari  enzim  alkalin  fosfatase.  Sifat  katalitik  dari  ALP diamati dari reaksi substrat para nitrofenil fosfat (pNPP) yang  akan  berubah  menjadi  fosfat  anorganik  dan  para nitrofenol. Aktivitas enzimatik diukur dari terbentuknya produk  paranitrofenol  yang  berwarna  kuning  dengan panjang gelombang 405 nm, seperti reaksi berikut:
Gambar 4. Reaksi katalitik ALP [14] ]
Pengaruh  enkapsulasi  terhadap  stabilitas  enzim diamati  dari  pengaruh  suhu  reaksi  (gambar  5)  dan  pH sistem (gambar 6).
a.

## b.
Gambar 5. Pengaruh suhu terhadap aktivitas (a) ALP bebas (b) ALP terenkapsulasi dalam silika
Dari  gambar  5  terlihat  bahwa  enkapsulasi menyebakan pergeseran suhu optimum reaksi enzimatik maupun daya katalitikya.
a.
b.
Gambar 6. Pengaruh pH pada aktivitas enzim (a) ALP bebas (b) ALP terenkapsulasi dalam silika
Pengaruh  enkapsulasi  terhadap  range  pH  kerja enzim  relative  tidak  berubah,  sedangkan  pH  optimum sedikit bergeser kea rah yang lebih tinggi (dari 8 ke 9), seperti  terlihat  pada  gambar  6.  Dari  hasil  tersebut mengisyaratkan  bahwa  enzim  terenkapsulasi  dalam silica kemungkinan lebih stabil disbanding enzim bebas dalam larutan.
Sifat  kinetik  enzim  ALP  diamati  melalui  variasi konsentrasi  substrat  pNPP,  sehingga  diperoleh  kurva Michaelis-Menten (gambar 7).
O 2 N OP O O - O - + H 2 O ALP (pH: 10,3)
O 2 N O - + HPO 4 2- + H +
para Nitrofenil Fosfat (pNPP) para Nitrofenol
a.
b.
Gambar 7. Kurva Michaelis-Menten dalam larutan (a) ALP bebas (b) ALP terenkapsulasi dalam silika
Dari  gambar  7  terlihat  bahwa  baik  ALP  bebas maupun  terenkapsulasi  dalam  silica  mengikuti  kurva Michaelis-Menten,  sehingga  dengan  mengubah  kurva tersebut  menjadi  kurva  linear  Lineweaver-Burk, diperoleh  parameter-parameter  kinetika  enzim  seperti ditampilkan pada tabel 2.

## Tabel 2. Parameter-parameter kinetika enzim ALP
No. Enzim ALP Km (mM) Vmaks (µM/menit) Aktv. spesifik U/mg enzim 1. Bebas 0,08 7,077 1,041 2. Terenkapsulasi 7,50 0,775 0,051
Dari  tabel  2  terlihat  bahwa  enkapsulasi  berhasil dilakukan,  namun  ALP  mengalami  penurunan  aktivitas yang  cukup  drastic  dan  reaksi  enzimatik  juga berlangsung relative lebih lambat. Hal ini kemungkinan disebabkan  adanya  hambatan  dalam  interaksi  antara substrat dengan enzim. Hambatan tersebut kemungkinan  disebakan  oleh  matriks  silica  yang terbentuk  dari  silikat  terlarut  tidak  cukup  porous sehingga difusi substrat terhambat, atau terjadi interaksi antara  permukaan  silica  dengan  enzim  sehingga mengubah konformasi gugus aktif enzim yang berakibat menurunkan aktivitasnya.

## 4. Kesimpulan dan Saran

## Kesimpulan
Silikat  terlarut  yang  dihasilkan  dari  ekstraksi  abu sekam  padi  dapat  digunakan  sebagai  matriks  pada imobilisasi  alkalin  fosfatase  melalui  proses  sol-gel, sedangkan  pengaruh  dari  enkapsulasi  tersebut  adalah sebagai berikut:
Proses  enkapsulasi  ALP  ke  dalam  silika  dari  abu sekam  padi  tidak  merubah  struktur  silika,  tetapi menambah gugus aktif dari silica gel yang dihasilkan.
Enkapsulasi  ALP  menurunkan  aktivitas  enzimatik ALP  dari  1,041  U/mg  enzim  untuk  enzim  bebas  dalam larutan  menjadi  0,051  U/mg  enzim  untuk  ALP terenkapsulasi,  dan  reaksi  berlangsung  lebih  lambat (Vmaks 7,077 µM/menit turun menjadi 0,775 µM/menit).
Enkapsulasi  ALP  meningkatkan  kestabilan  enzim, sehingga  range  suhu  kerja  enzim  dan  pH  kerja  enzim bergeser  lebih  tinggi  (suhu  optimum  meningkat  dari 40 ◦ C menjadi 45 ◦ C, dan pH optimum meningkat dari 8,5 menjadi 9).

## Saran
Untuk  memperkecil  penurunan  aktivitas  enzim sebagai akibat dari enkapsulasi perlu diupayakan untuk memodifikasi  matriks  dengan  tujuan  mengatasi hambatan difusi substrat.
Untuk pengembangan lebih lanjut ke arah biosensor perlu diuji pemakaian secara berulang ( recycle).

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Trevor  Palmer,  Understanding  enzymes,  4  ed., Prentice Hall/Ellis Horwood, 1995.
[2]  F.  Sharmin,  S.  Rakshit,  H.  Jayasuriya,  Enzyme Immobilization  on  Glass  surfaces  for  the development  of  Phosphate  detection  Biosensors, Agricultural  Engineering  International:  the  CIGR Ejournal, 9, (2007) 1-12
[3]  Rosaria  Ciriminna,  Mario  Pagliaro,  Recent  Uses  of Sol−Gel  Doped  Catalysts  in  the  Fine  Chemicals  and Pharmaceutical Industry, Organic Process Research & Development, 10, 2, (2006) 320-326 http://dx.doi.org/10.1021/op050211u
[4]  Tuan  Le,  Selina  Chan,  Bassem  Ebaid,  Monika Sommerhalter,  Silica  Sol-Gel  Entrapment  of  the Enzyme Chloroperoxidase, Journal of Nanotechnology, 2015, (2015) 10
http://dx.doi.org/10.1155/2015/632076
[5] Sriyanti, Taslimah, Nuryono, Narsito, Sintesis Bahan Hibrida  Amino-Silika  dari  Abu  Sekam  Padi  Melalui Proses Sol-Gel, Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi, 8, 1, (2005) 1-10
[6] U. Kalapathy, A. Proctor, J. Shultz, A simple  method for  production  of  pure  silica  from  rice  hull  ash, Bioresource  Technology,  73,  3,  (2000)  257-262 http://dx.doi.org/10.1016/S0960-8524(99)00127-3
[7]  U.  Kalapathy,  A.  Proctor,  J.  Shultz,  An  improved method  for  production  of  silica  from  rice  hull  ash, Bioresource  Technology,  85,  3,  (2002)  285-289 http://dx.doi.org/10.1016/S0960-8524(02)00116-5
[8] C. Jeffrey Brinker, George W. Scherer, Sol-gel Science: The  Physics  and  Chemistry  of  Sol-gel  Processing, Academic Press, 1990.
[9] Yen Wei, Jigeng Xu, Qiuwei Feng, Hua Dong, Muduo Lin, Encapsulation of enzymes in mesoporous host materials  via  the  nonsurfactant-templated  sol – gel process,  Materials  Letters,  44,  1,  (2000)  6-11 http://dx.doi.org/10.1016/S0167-577X(99)00287-6
[10]  M.  H.  Ross,  J.  O.  Ely,  J.  G.  Archer,  Alkaline phosphatase  activity  and  pH  optima,  Journal  of Biological Chemistry, 192, 2, (1951) 561-568
[11]  Nuryono,  Kajian  Perbandingan  Silika  termodifikasi gugus  sulfonat  and  iminodiasetat  pada  pemisahan logam alkali tanah dengan kromatografi ion, in: The First  National  Seminar  of  Ecotoxicology  and Environmental Chemistry, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 1998.
[12]  Ralph  K.  Iler,  The  Chemistry  of  Silica:  Solubility, Polymerization,  Colloid  and  Surface  Properties  and Biochemistry of Silica, Wiley, 1979.
[13]  Sriyanti,  Taslimah,  Nuryono,  Narsito,  Selektivitas Silika Gel Termodifikasi Gugus Tiol untuk Adsorpsi kadmium(II)  dan  Tembaga(II),  Seminar  Nasional Hasil Penelitian MIPA 2004, Semarang, (2004).
[14] George N. Bowers, Robert B. McComb, Measurement of  total  alkaline  phosphatase  activity  in  human serum, Clinical chemistry, 21, 13, (1975) 1988-1995