EKSTRAK ETANOLIK DAUN Gynura procumbens (Luor) Merr. MENGHAMBAT PROLIFERASI SEL KANKER PAYUDARA TIKUS PADA KARSINOGENESIS YANG DIINDUKSI DENGAN dimetilbenz(a)antrazena (DMBA)
Gynura procumbens (Luor) Merr. LEAVES ETHANOLIC EXTRACT INHIBIT BREAST CANCER PROLIFERATION ON DMBA-INDUCED RAT MAMMARY CARCINOGENESIS
Sri Tasminatun 1 , Edy Meiyanto* 2 , Sugiyanto 2 dan S. Handayani 2
1 Fakultas Kedokteran, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta
2 Cancer Chemoprevention Research Center-Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada meiyan_e@ugm.ac.id

## ABSTRAK
Penelitian  sebelumnya    menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanolik  daun Gynura  procumbens dapat  menghambat  pertumbuhan  tumor  payudara  tikus  yang  diinduksi  DMBA.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  efek  ekstrak  etanolik  daun  Sambung  nyawa  ( Gynura  procumbens (Luor) Merr) pada proliferasi sel kanker payudara tikus yang diinduksi dengan Dimetilbenz(a)antrazena  (DMBA).  Enam  puluh  ekor  tikus  betina  galur  SD  umur  6  minggu  dibagi menjadi 6 kelompok yaitu tanpa perlakuan, perlakuan DMBA saja dan empat kelompok perlakuan DMBA+ekstrak.  Inisiasi  DMBA  dilakukan  dengan  dosis  20  mg/kgBB  yang  diberikan  sebanyak  10 kali dengan frekuensi pemberian 2 kali setiap minggu. Mulai minggu ke-1 (post I) atau ke-6 (post II) kelompok  perlakuan  mendapat  ekstrak  etanolik  daun  Gynura  procumbens  dalam  CMC  0,5  % seminggu  3  kali  melalui  oral  dengan  dosis  250  mg/kgBB  dan  750  mg/kgBB.  Pada  minggu  ke-16 tikus  dikorbankan,  jaringan  payudara  diambil  untuk  dibuat  preparat  histologi  dengan  teknik pewarnaan silver (AgNOR). Mean AgNOR (mAgNOR) dihitung pada setiap preparat tiap kelompok. mAgNOR  kelompok  perlakuan  dibandingkan  dengan  mAgNOR  kelompok  tanpa  perlakuan.  Hasil penelitian  menunjukkan  ekstrak  etanolik  daun  Gynura  procumbens  dengan  dosis  250  mg/kgBB dan 750 mg/kgBB yang diberikan mulai minggu kesatu maupun ke-6 setelah inisiasi DMBA terakhir dapat  mengurangi  proliferasi  sel  kanker  payudara  tikus.  Rata-rata  mAgNOR  kelompok  tanpa perlakuan  dan  perlakuan  DMBA  saja  masing-masing  0,8  ±  0,34  dan  2,7  ±  0,41,  mAgNOR  post  I kelompok dosis 250 dan dosis 750 masing-masing 1,4 ± 0,39 dan 1,3 ± 0,09, sedangkan mAgNOR post II kelompok dosis 250 dan dosis 750 masing-masing 1,6 ± 0,47 dan 1,5 ± 0,31. Pengamatan terhadap  ekspresi  COX-2  menunjukkan  adanya  penurunan  pada  kelompok  perlakuan  ekstrak dosis  250  dan  750  mg/kgBB.  Hasil-hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanolik  daun Gynura  procumbens  dapat  menghambat  proliferasi  sel-sel  tumor  payudara  yang  kemungkinan berhubungan dengan penurunan ekspresi COX-2.
Kata kunci: Gynura procumbens , anti-karsinogenesis, proliferasi, AgNOR

## ABSTRACT
The previous study shows that G. procumbens leaves ethanolic extract inhibit breast cancer growth on DMBA-induced rat mammary carcinogenesis. The aim of the research is to examine the proliferation  effect  of G.  procumbens leaves  ethanolic  extract  on  DMBA-induced  rat  mammary carcinogenesis.  Sixty  female  Sprague-Dawley  rats  at  6  weeks  of  age  were  randomized  into  six groups  (untreated,  DMBA  treatment,  and  four  groups  with  DMBA+extract  treatment).  DMBA  (20 mg/kgBB) were given twice a week for 5 weeks. The beginning 1 week (post I) or 6 weeks (post II) post-DMBA, were administrated with 250 mg/kgBB and 750 mg/kgBB Gynura procumbens leaves ethanolic  extract  in  0.5%  CMC-Na  three  times  a  week  (po).  At  16  weeks  post-DMBA,  rats  were killed,  and  mammary  tissues  were  classified  histophatologically  with  AgNOR  staining.  Mean AgNOR  (mAgNOR)  were  determinated  from  every  sample  in  every  group,  and  then  mAgNOR  on treated groups were compared with mAgNOR on untreated group. The result shows that mean of mAgNOR  in  untreated,  DMBA,  DMBA+250  mg/kg  BB  extract  and  DMBA+750  mg/kgBB  extract group in post I and post II are 0.8 ± 0.34, 2.7 ±  0.41, 1.4 ± 0.39, 1.3 ± 0.09, 1.6 ± 0.47, and 1.5 ± 0.31 respectively. Observation of COX-2 expression  shows that 250 mg/kg BB  and  750  mg/kgBB Gynura  procumbens  leaves  ethanolic  extract  groups  decrease  COX-2  expression  compared  with DMBA group. The result shows that G. procumbens ethanolic leaves ethanolic extract inhibit breast cancer proliferation on DMBA-induced rat mammary carcinogenesis possibly related to decrease of COX-2 expression.
Key words : Gynura procumbens , anticarcinogenesis, proliferation, AgNOR

## PENDAHULUAN
Penelitian  terhadap  tanaman Gynura procumbens (Lour)  Merr  menunjukkan  bahwa ekstrak etanolik daun tanaman tersebut mampu menghambat karsinogenesis pada tahap inisiasi  hingga  menurunkan  insidensi  dan perbanyakan  nodul  tumor  payudara  tikus (Meiyanto, et  al. ,  2007 a ).  Pada  pemberian  post inisiasi  awal  ekstrak  tersebut  juga  masih menunjukkan  efek  penurunan  jumlah  nodul tumor,  sedang  pada  pemberian  post  inisiasi akhir efeknya sudah tidak bermakna (Meiyanto, et  al ,  2007 b ).  Fenomena  ini  disebabkan  oleh induksi  kanker  payudara  dengan  karsinogen DMBA  menggunakan multiple  dose yaitu  20 mg/kgBB  sebanyak  10  kali.  Dosis  DMBA  ini lebih  besar  bila  dibandingkan  dengan  dosis yang  digunakan  oleh  peneliti  sebelumnya (Singletary, et  al, 1997) yaitu single  dose 30 mg/kgBB, sehingga penghambatan karsinogenesis  oleh  ekstrak  etanolik  daun Gynura procumbens tidak dapat diamati secara makroskopis. Namun demikian dengan terlihatnya  kecenderungan  penurunan  jumlah nodul tumor pada penelitian tersebut kemungkinan terdapat perubahan fisiologi pada tingkat  seluler,  misalnya  sifat  proliferatif  sel-sel tumor yang ada.
Telah  dilaporkan  pada  penelitian  terda- hulu bahwa ekstrak etanolik daun G. procumbens mengandung flavonoid dan terbukti  mampu  menghambat  pertumbuhan  sel kanker  payudara  secara in  vitro (Sugiyanto et al, 2003;  Jenie and Meiyanto , 2007).  Ekstrak tersebut  secara in  vivo juga  menunjukkan  efek penghambatan karsinogenesis kanker paru dan payudara  yang  berarti  bahwa  ekstrak  tersebut juga mampu memberikan efek secara sistemik.
Salah  satu  indikator  penting  dalam mempelajari sifat keganasan sel kanker adalah kemampuan proliferasinya (Meiyanto and Septistyani,  2005).  Proliferasi  sel-sel  kanker sangat  dipengaruhi  oleh  perubahan  ekspresi protein  yang  ada  di  dalam  sel  (Hanahan and Weinberg , 2000). yang  salah  satunya  adalah ekspresi  COX-2  yang  berlebihan  (Meiyanto , 1999). Pada kanker payudara, ekspresi COX-2 juga  sering  dijumpai  dan  berperan  dalam peningkatan  proliferasi  dan  metastasis  (Davies et  al, 2002).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengamati  efek  ekstrak  etanolik  daun G. procumbens pada  proliferasi  (dengan  metode AgNOR)  dan  ekspresi  COX-2  sel-sel  tumor epitel  payudara  tikus  yang  diinduksi  dengan DMBA.
METODE PENELITIAN Bahan  uji  karsinogenesis. Daun  tanaman Gynura procumbens , (Lour) Merr yang diperoleh  dari  daerah  Ngaglik  Sleman  Yogya- karta  dikeringkan  pada  temperatur  tidak  lebih
dari 60 o C kemudian di ekstraksi dengan etanol 96  %  (p.a.)  hingga  di  peroleh  ekstrak  etanolik. Untuk  pembuatan  model  kanker  payudara digunakan  DMBA  (7,12-dimetilbenz(a)ntrasen) (Sigma)
Subyek  uji. Subjek  uji  yang  digunakan  adalah tikus  betina  galur  Sprague  Dawley  umur  4 minggu  dengan  berat  badan  40-60  g  yang diperoleh dari BPOM Jakarta, yang kemudian di pelihara  dalam  kandang  hewan  Laboratorium Farmakologi  dan  Toksikologi  Fakultas  Farmasi UGM, Yogyakarta hingga cukup umurnya untuk diberi perlakuan.

## Jalan Penelitian
Induksi  karsinogenesis  dengan  DMBA  dan perlakuan  dengan  ekstrak  etanol  daun Gynura procumbens , (Lour) Merr.
Enam  puluh  tikus  betina  (Female)  umur 50  hari    dibagi  menjadi  6  kelompok  secara random.  Kelompok  I  digunakan  sebagai kelompok  tanpa  perlakuan  yang  hanya  diberi makanan  kontrol  saja,  yaitu  pelet  AD2  yang diproduksi  oleh  PT  COMFED  Surabaya. Kelompok  II  (perlakuan  DMBA  saja),  III  dan  IV (perlakuan  pada  tahap  karsinogenesis  awal: post-I),  dan  V  dan  VI  (perlakuan  pada  tahap karsinogenesis  lanjut:  post-II)  diberi  DMBA  (20 mg/kgBB,  i.g.  dalam  minyak  jagung)  dan ekstrak.  Inisiasi  DMBA  dilakukan  2  kali seminggu  selama  5  minggu.  Kelompok  III  dan IV  diberi  ekstrak  masing-masing  dengan  dosis 250  mg/KgBB  dan  750  mg/KgBB  pada  minggu ke-1  setelah  DMBA  terakhir,  hingga  akhir pengamatan. Kelompok V dan VI, diberi ekstrak dengan  peringkat  dosis  yang  sama  dengan post-inisiasi  I  pada  minggu ke-6  setelah  DMBA terakhir  hingga  akhir  pengamatan.  Tikus ditimbang setiap minggunya, dan mulai minggu ke-1  setelah  pemberian  DMBA  dilakukan palpasi payudara setiap minggu untuk mengamati perkembangan tumor sampai minggu ke-16 (modifikasi dari 3 dan 11) .

## Pemeriksaan  aktivitas  proliferasi  dengan metode AgNOR
Irisan  jaringan  dari  organ  payudara  tikus yang  diperoleh  dari  proses  jaringan  direndam dalam  buffer  sodium  sitrat  (pH  6,0)  kemudian diinkubasi di dalam autoclave pada suhu 120°C selama  20  menit.  Setelah  didinginkan  sampai suhu  37 C, slide kemudian  direndam  dalam larutan  pengecatan  perak  yang  terdiri  dari  1 bagian  volume  gelatin  0,5  %  dalam  asam formiat 1% dan 2 bagian larutan perak nitrat 50 %  dan  diinkubasi  pada  suhu  37 C,  selama  11 menit. Reaksi dihentikan dengan mencuci slide menggunakan aqua bidestilata untuk menghilangkan  presipitat  perak  non-spesifik.
Selanjutnya, semua jaringan didehidrasi menggunakan  etanol  dengan  konsentrasi  yang dinaikkan secara bertingkat, dibersihkan dengan xylene dan  ditempelkan  bersama medium  sintetis  (Bankfalvi et  al, 2002). Pembuatan  preparat  AgNOR  dilakukan  di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran UGM. Preparat AgNOR digunakan untuk mengamati tingkat proliferasi sel epitel payudara  dengan  menghitung  dot  hitam  di dalam  inti  sel  dan  menghitung  jumlah  sel. Preparat  hasil  pewarnaan  AgNOR    selanjutnya diamati  dengan  mikroskop  binokuler  Olympus dengan perbesaran 1000 x dan bantuan minyak imersi.  Pemeriksaan  dilakukan  pada  3  lapang pandang  dengan  menghitung  jumlah  seluruh titik  hitam  pada  minimal  100  sel  pada  tiap lapang  pandang  kemudian  dirata-rata  dengan cara membagi jumlah seluruh titik hitam dengan jumlah sel yang diamati.  Perhitungan dilakukan terhadap  Mean  AgNOR  (mAgNOR),  yaitu jumlah  dot  dihitung  pada  setiap  100  sel  tiap preparat.    Mean  AgNOR    kelompok  perlakuan dibandingkan  dengan  mean  AgNOR  kelompok kontrol positif. Mean AgNOR  dianalisis dengan dengan  uji  statistik  Non  Parametrik  Kruskal Wallis dengan taraf kepercayaan 95% dilanjutkan dengan Man Whitney Test.

## Pemeriksaan ekspresi protein COX-2
Prosedur  pemeriksaan  ekspresi  protein COX-2  dilakukan  di  Laboratorium  Patologi Anatomi  RS  Dr.  Sardjito  Yogyakarta.  Organ payudara ‘frozen  section’ diiris  dan  difiksasi dengan  aseton.  Preparat  direndam  berturut- turut  dalam  metanol  dan  aseton  kemudian dicuci  dengan  PBS.  Selanjutnya  preparat direndam  dalam  3%  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2
dalam  metanol)  selama  20  menit,  lalu  dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali dan diinkubasikan dalam normal  mouse  serum (1:50)  selama  5 menit.  Selanjutnya normal  mouse  serum dibuang,  preparat  ditetesi  dengan  antibodi primer (Primer Antibodi Monoklonal anti COX-2- Santa  cruz)    dengan    pengenceran  1:100  dan diinkubasikan    minimal  selama    60  menit. Setelah dicuci dengan PBS, preparat diinkubasi dengan  biotin,  kemudian  dalam streptavidin- peroksidase, dan  kemudian  dalam  DAB. Ekspresi  COX-2  diamati  menggunakan  mikros- kop  cahaya  (Olympus  ®  DP  12  Microscope Digital Camera System). Ekspresi protein COX- 2  pada  jaringan  kanker  payudara  dianalisis secara kualitatif dengan membandingkan intensitas warna coklat antar kelompok perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Efek  ekstrak Gynura  procumbens pada proliferasi sel kanker.
Untuk mengetahui  tingkat proliferasi  sel  kanker payudara dilakukan pemeriksaan jumlah AgNOR.  NOR  ( Nuclear  Organizer  Region ) yaitu loop DNA pada tangan pendek kromosom akrosentrik  (13,  14,  15,  21  dan  22)  yang berhubungan  dengan  aktivitas  gen  ribosomal RNA,  sintesa  protein  dan  proliferasi    sel. Dengan  pewarnaan  silver,  NOR  akan  tampak sebagai titik hitam ( black dot ) (Gambar 1) yaitu berupa  AgNOR  yang  kemudian  dapat  dihitung (Ervin and  Elza, 2003).  Jumlah  NOR  tiap  sel pada  perlakuan  ekstrak  (Gambar  1C)  terlihat lebih  sedikit  dibanding  jumlah  NOR  pada kelompok  DMBA  (Gambar  1B).  Hal  ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak mampu  menghambat  proliferasi  sel  kanker payudara tikus.
A                                                       B

## C
Gambar  1 – Efek  pemberian  ekstrak  terhadap  jumlah  black  dot  hasil  pengecatan  AgNOR.  Pengecatan  AgNOR  dilakukan seperti  pada metodologi  terhadap  preparat  dibuat  dari  jaringan  tumor  kelenjar  payudara  tikus  pada minggu  ke-16  setelah pemberian DMBA terakhir. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x. A adalah preparat dari  kelompok  tikus  kontrol  tanpa  perlakuan;  B  adalah  preparat  tikus  perlakuan  DMBA  saja,  dan  C  adalah  preparat  tikus dengan  perlakuan  DMBA+ekstrak  post  II  dosis  250  mg/kgBB.  Titik  hitam  (tanda  panah)  menunjukkan  bagian  NOR  yang merepresentasikan aktivitas proliferasi sel.
Tabel  1 – Mean  AgNOR  kelompok  Kontrol  DMBA  dan perlakuan G.  Procumbens KELOMPOK Mean AgNOR ± SD DMBA 2.7 ±  0,41 POST I.250 1.4 ± 0,39 POST I.750 1.3 ± 0,09 POST II.250 1.6 ± 0,47 POST II.750 1.5 ± 0,31
Pemeriksaan  AgNOR  dilakukan  pada  3 lapang  pandang  dengan  menghitung  jumlah seluruh  titik  hitam  pada  minimal  100  sel  pada tiap  lapang  pandang  kemudian  dirata-rata dengan cara membagi jumlah seluruh titik hitam dengan  jumlah  sel  yang  diamati.  Rata-rata mAgNOR  kelompok  tanpa  perlakuan  dan perlakuan  DMBA  saja  masing-masing  0,8  ± 0,34 dan 2,7 ±  0,41, mAgNOR post I kelompok dosis  250  dan  dosis  750  masing-masing  1,4  ± 0,39 dan 1,3 ± 0,09, sedangkan mAgNOR post II  kelompok  dosis  250  dan  dosis  750  masing- masing  1,6  ±  0,47  dan  1,5  ±  0,31  (tabel  1). Pemeriksaan aktivitas proliferasi dengan metode  AgNOR  ini  menunjukkan  penurunan angka  mAgNOR  kelompok  DMBA+ekstrak dibanding  kelompok  DMBA  saja  hingga  40  %. Penurunan  tersebut  terjadi  pada  semua  dosis yang diberikan baik pada post I maupun post II. Analisis  statistik  non  parametrik Kruskal  Wallis dengan  taraf  kepercayaan  95%  dilanjutkan dengan Man  Whitney  Test angka  mAgNOR diperoleh hasil bahwa angka mAgNOR berbeda secara bermakna. Ini berarti pemberian ekstrak
etanolik daun Gynura procumens dapat mengurangi  tingkat  proliferasi  sel  kanker payudara.
Pengaruh pemberian ekstrak terhadap ekspresi COX-2
Untuk mengetahui mekanisme pengham- batan  proliferasi  sel  kanker  oleh Gynura procumbens dilakukan  pemeriksaan  ekspresi protein  COX-2.  Pemeriksaan  penghambatan ekspresi  COX-2  ekstrak  etanolik Gynura procumbens dilakukan  dengan  melakukan pengecatan  menggunakan  antibodi  anti  COX-2 terhadap sel kanker payudara tikus. Sel kanker yang mengekspresikan COX-2 akan memberikan warna coklat atau gelap, sedangkan yang tidak mengekspresikan COX-2 memberikan warna ungu.
Hasil  pengamatan  menunjukkan  bahwa pada  tikus  yang  hanya  diberi  perlakuan  DMBA sel-sel  pada  jaringan  tumornya  terlihat  berwar- na  kecoklatan  yang  menunjukkan  adanya ekspresi  COX-2  yang  relatif  tinggi  (Gambar 2A). Adapun pada sel-sel tumor dari tikus yang diberi  perlakuan  ekstrak  menunjukkan  warna coklat  yang  lebih  tipis  (Gambar  2B-2C).  Hal  ini berarti ekspresi COX-2 pada sel-sel yang diberi ekstrak  tersebut  lebih  rendah  dari  pada  sel-sel yang  diberi  perlakuan  DMBA  saja.  Pemberian ekstrak  pada  kedua  dosis  terlihat  menurunkan ekspresi  COX-2  pada  sel-sel  tumor  epitel payudara tikus.
A B
C
Gambar  2 – Efek  pemberian  ekstrak  post  inisiasi  terhadap  ekspresi  protein  COX-2  pada  kanker  payudara. Pengamatan ekspresi  COX-2  pada  jaringan  payudara  tikus  dilakukan  dengan  metode  IHC  yang  dilakukan  seperti  pada  metode  dan diamati  di  bawah  mikroskop  cahaya  dengan  perbesaran  400x.  A  adalah  perlakuan  DMBA  saja,  B  adalah  perlakuan DMBA+ekstrak  Post  I.  250mg/kgBB,  dan  C  adalah  perlakuan  DMBA+ekstrak  Post  I  750  mg/kgBB.  Warna  coklat menunjukkan adanya ekspresi COX-2.
Hasil  penelitian  sebelumnya  menunjuk- kan  bahwa  ekstrak  etanolik  daun Gynura procumbens setelah  inisiasi  pada  kanker payudara  tikus  terinduksi  DMBA  mempunyai kecenderungan  menurunkan  insidensi  tumor sebesar  10-20  %  dan  menurunkan tumour multiplicity meskipun  secara  statistik  tidak memperlihatkan perbedaan yang nyata (Meiyanto et  al, 2007 b ).  Pengamatan  aktifitas proliferasi  sel  kanker  dengan  metode  AgNOR diperoleh  hasil  tingkat  aktifitas  proliferasi  sel kanker kelompok ekstrak etanolik daun Gynura procumbens mengalami  penurunan  secara bermakna  dibanding  kelompok  kontrol  DMBA.
Pemeriksaan
ekspresi COX-2 juga menunjukkan adanya penurunan ekspresinya. Penelitian Iskander et al (2002)
menyimpulkan  bahwa  ekstrak  etanolik  daun Gynura procumbens mempunyai efek antiinflamasi. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa fitokimia yang mempunyai efek antiinflamasi berpotensi sebagai agen kemopreventif.  Beberapa  diantaranya  adalah curcumin    dalam Curcuma  longa L.,  gingerol dalam Zingiber  officinale dan  capsaicin  dalam Capsicum  annuum (Surh et  al, 2002)  yang bekerja dengan menghambat enzim siklooksigenase atau cyclooxygenase (COX). Dua  isoform  siklooksigenase  yang  telah diidentifikasi  adalah  siklooksigenase-1  (COX-1) dan  siklooksigenase-2  (COX-2).  Keduanya mengkatalisis  sintesa  prostaglandin  dari  asam arakidonat.  COX-1  diekspresikan  pada  seluruh jaringan  mamalia  dan  berperan  penting  pada proses fisiologis. Adapun COX-2 berperan pada proses  inflamasi,  induksi  enzim  dan  terlibat pada  beberapa  kasus  penyakit  (Dubois et  al, 1998). Pada sejumlah kanker termasuk payudara,  kolon,  pankreas  dan  prostat  terjadi over ekspresi COX-2. Kelebihan ekspresi COX- 2 dan sintesis PGE 2 memperantarai transformasi  sel  epitel  neoplasma  dengan
meningkatkan  laju  proliferasi  dan  metastasis (Davies et al , 2002). Penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak  etanolik  daun Gynura  procumbens mampu  menekan  ekspresi  protein  COX-2. Penghambatan proliferasi sebagai akibat menurunnya  ekspresi  COX  -2  didukung  oleh hasil  penelitian  terjadinya  penurunan  angka mean  AgNOR  kelompok  yang  diberi  ekstrak etanolik  daun G.  procumbens yang  berarti terjadi penurunan tingkat aktifitas proliferasi sel kanker.  Mekanisme  penghambatan  ekspresi COX-2  dapat  tejadi  melalui  penghambatan fosforilasi  I B  oleh  IKK.  Protein  IKK  termasuk golongan
protein kinase sehingga memungkinkan dihambat oleh senyawa flavonoid  (Sukla and Gupta,  2004).  Dengan tidak  terfosforilasinya  Ik-B  maka  NF- B  yang berikatan  dengan  I B  tidak  dapat  menginduksi ekspresi  COX-2.  Flavonoid  dalam Gynura Procumbens diduga  menghambat  fosforilasi I B.  Hal  ini  perlu  dibuktikan  dengan  penelitian lebih lanjut.

## KESIMPULAN
Ekstrak etanolik
daun Gynura procumbens yang  diberikan  seminggu  3  kali dengan  dosis  250  mg/kgBB  dan  750  mg/kgBB pada  kanker  payudara  tikus  terinduksi  DMBA dapat  menurunkan  tingkat  aktifitas  proliferasi sel  kanker  secara  signifikan  dengan  rata-rata mAgNOR  kelompok  tanpa  perlakuan  dan perlakuan  DMBA  saja  masing-masing  0,8  ± 0,34 dan 2,7 ±  0,41, mAgNOR post I kelompok dosis  250  dan  dosis  750  masing-masing  1,4  ± 0,39 dan 1,3 ± 0,09, sedangkan mAgNOR post II  kelompok  dosis  250  dan  dosis  750  masing- masing  1,6  ±  0,47  dan  1,5  ±  0,31.  Secara kualitatif, ekstrak etanolik daun Gynura procumbens juga mampu menurunkan ekspresi COX-2.

## DAFTAR PUSTAKA
Bankfalvi A., Giuffre G., Öfner D., Diallo R., Poremba C., Buchwalow  I. B., Barresi V., Bocker W., and  Tuccari G. Relationship between HER2 status and proliferation rate in breast cancer assessed by  immunohistochemistry,  fluorescence in  situ hybridisation  and  standardised  AgNOR  analysis. International J. Of Onc. 2002. 23 :1285 –1292
Davies,  G.,  Martin,  L.A.,  Sacks,  N.  and  Dowsett,  M.  Cyclooxygenase-2(COX-2),  Aromatase  and Breast  Cancer:  A  Possible  Role  in  for  COX-2  Inhibitors  in  Breast  Cancer  Chemoprevention. Ann Oncol . 2002. 13 :669 –678
Dubois,  R.N.,  Abramson,  S.B.,  Crofford,  L.,  Gupta,  R.A.,  Simon,  L.S.,  Van  de  Putte,  L.B.,  and Lipsky, P.E. Cyclooxygenase in Biology and Disease. FASEB J. 1998. 12 :1063 –1073
Hanahan, D. and Weinberg, R.A. The Hallmarks of Cancer. Cell . 2000. 100 :57 –70
Iskander  MN.,Song  Y.,Coupar  IM  and  Jiratchariyakul  W.  Antiinflammatory  screening  of  the medicinal plant Gynura procumbens. J Plant Foods Hum Nutr . 2002. 57 (3-4):233 –244
Jenie,  R.I.  and  Meiyanto,  E.  Aplikasi  ko-kemoterapi  ekstrak  etanolik  daun Gynura  procumbens (Lour.) Merr. pada sel kanker payudara. Maj.Farmasi Indon. , 2007. 18 (2):81 –87
Meiyanto E., Susilowati S., Tasminatun S, Murwanti R., dan Sugiyanto. Efek kemopreventif ekstrak etanolik  daun Gynura  procumbens (Lour.)  Merr.  pada  karsinogenesis  kanker  payudara  tikus. Maj.Farmasi Indon. 2007. 18 (3):154 –161
Meiyanto  E.,  Susilowati  S.,  Tasminatun  S,  Murwanti  R.,  dan  Sugiyanto.  Penghambatan karsinogenesis  kanker  payudara  tikus  terinduksi  DMBA  pada  fase  post  inisiasi  oleh  ekstrak etanolik daun Gynura procumbens (Lour.) Merr. MFI . 2007. 18 (4):169 –175
Rizali  Ervin  dan  Auerkari  Elza  I.  Teknik  Pewarnaan  Silver  (AgNOR)  Sebagai  Salah  Satu  Cara Menentukan  Aktivitas  Proliferasi  Sel  Tumor  dan  Apoptosis. Jurnal  Kedokteran  Gigi  Indonesia . 2003. 10 (3):41 –45
Singletary,K.,  Macdonald,C.,  and  Wallig,M.  The  Plasticizer  Benzyl  Butyl  Phtalate  (BBP)  Inhibits 7,12-dimethylbenz( α)anthracene  (DMBA)-induced  rat  Mammary  DNA  Adduct  Formation  and Tumorigenesis. Carsinogenesis . 1997. 18 (8):1669 –1673
Sugiyanto, Sudarto, B., Meiyanto, E., Nugroho,AE dan Jenie,U.A., 2003,  Aktivitas antikarsinogenik senyawa yang berasal dari tumbuhan, Maj.Farmasi Indon. , 14 (4):216 –225
Meiyanto, E., and Septistyani, E.P. Efek antiproliferatif dan apoptosis fraksi fenolik ekstrak etanolik daun Gynura procumbens terhadap sel HeLa. Artocarpus . 2005. 5 (2):74 –80
Meiyanto,  E.  Kurkumin sebagai anti-kanker: menelusuri mekanisme aksinya (Review). MFI . 1999. 10 (4 ):224 –23
Surh, Y. Anti-tumor promoting potential of selected of spice ingredients with antioxidative and anti- inflammatory activities: a short review. Food and Chem. Tox . 2002. 40 :1091 –1097
Sukla,  S.,  and  Gupta,  S.  Suppression  of  Constitutive  and  Tumor  Necrosis  Factor  κ-Induced Nuclear  Factor  (NF)- κB  Activation  and  Induction  of  Apoptosis  by  Apigenin  in  Human  Prostate Carcinoma  PC-3  Cells:  Correlation  with  Down-Regulation  of  NF- κB-Responsive  Genes. Clinical Cancer Research . 2004. 10 :3169 –317.