## ISOLASI DAN IDENTIFIKASI AWAL SENYAWA INHIBITOR RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C DARI EKSTRAK BUAH MANGROVE Avicennia marina (Forsk.) Vierh
Isolation and Preliminary Identification of RNA Helicase Inhibitor for Hepatitis C Virus from Extract of Mangrove Avicennia marina (Forsk.) Vierh
A. Zaenal Mustopa 1 *, Melki 2 , Ika Sari Kusumawati 3
¹Pusat Penelitian Bioteknologi-Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia ²Program studi Ilmu Kelautan, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sriwijaya 3 Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila Diterima 7 Juni 2012/Disetujui 4 September 2012

## Abstract
Hepatitis C virus is the cause of hepatitis C disease which has high virulence. Recent therapy using combination of ribavirin and alpha interferon has short efficiency (< 80%). Thus, the discovery of new drug is needed. Antiviral drugs can be discovered through molecular target therapy by finding the inhibitor of RNA helicase that play role in viral replication. Inhibitor can be derived from chemical compound produced by mangrove. The aim of this research was to isolate the active compound groups from fruit of Avicennia marina (Forsk) which had inhibitory activity against RNA helicase. Inhibitory activity was measured by releasing of phosphate inorganic in colorimetric ATPase assay. Crude extract was fractionated using gel filtration chromatography with methanol in chloroform solvent. The result showed that fraction 2 has the highest inhibitory activity i.e. 81.78%. Phytochemical test of crude extract indicated positive result for flavonoids, alkaloids, steroid dan triterpenoid, tannin and saponins. Moreover, high performance liquid chromatography (HPLC) analysis showed absorption peak with the high abundance at the retention time of  7.250; 18.983 and 20.050 minute at 216 nm, 247 nm and 263 nm, respectively. According to the results of phytochemical, TLC, and HPLC analyses, inhibitor compound from fruit of A. marina (Forsk) was suggested it belongs to flavonoids.
Key words: Avicennia marina , flavonoid, hepatitis C virus, RNA helicase
Abstrak
Virus hepatitis C merupakan penyebab penyakit hepatitis C yang mempunyai tingkat virulensi yang tinggi.  Pengobatan  menggunakan  kombinasi  ribavirin  dan  interferon  alfa  mempunyai  efektivitas  yang rendah  (<  80%).  Penemuan  obat  yang  berperan  sebagai  antivirus  dapat  dilakukan  melalui  terapi  target molekuler  dengan  mencari  inhibitor  RNA  helikase  yang  berperan  dalam  replikasi  virus.  Penelitian  ini bertujuan mengisolasi golongan bahan bioaktif dari tanaman mangrove jenis Avicennia marina (Forsk) Vierh yang memiliki aktivitas penghambatan terhadap RNA helikase virus hepatitis C. Aktivitas penghambatan dihitung  berdasarkan  pelepasan  fosfat  anorganik  bebas  dengan  pengujian  secara  kolorimetri  ATPase. Golongan  bahan  aktif  yang  diisolasi  difraksinasi  menggunakan  kromatografi  gel  filtrasi  dengan  pelarut metanol dalam kloroform. Fraksi 2 merupakan fraksi yang mempunyai aktivitas inhibisi tertinggi sebesar 82,78%. Uji fitokimia terhadap ekstrak kasar menunjukkan positif pada flavonoid, alkaloid, steroid dan triterpenoid,  tanin,  dan  saponin.  Kromatogram  kromatografi  cair  kinerja  tinggi  menunjukkan  serapan puncak dengan kelimpahan tertinggi pada waktu retensi 7,250; 18,983 dan 20,050 menit pada 216 nm, 247 nm dan 263 nm. Hasil analisis dengan uji fitokimia, kromatografi lapis tipis, dan serapan panjang gelombang puncak pada kromatografi cair kinerja tinggi menunjukkan bahwa diperkirakan bahan aktif yang berperan sebagai inhibitor dalam fraksi tersebut merupakan senyawa golongan flavonoid.
Kata kunci: Avicennia marina , flavonoid, RNA Helikase, virus hepatitis C
*Korespondensi: Jl. Raya Bogor Km 46, Cibinong, 16911, Telp. +6281310611768 e-mail: azmustopa@yahoo.com
JPHPI 2012, Volume 15 Nomor 2
Ekstrak buah mangrove sebagai inhibitor RNA Helikase, Mustopa, AZ. et al

## PENDAHULUAN
Virus  Hepatitis  C  (HCV)  menginfeksi hampir  170  juta  orang  di  seluruh  dunia (Yazdani et al. 2012). Virus ini menyebabkan penyakit  hepatitis  C  yaitu  peradangan pada  hati  yang  mengakibatkan  sirosis  hati (Lauer dan Walker 2001). Data Kementerian Kesehatan Republik Indonesia menunjukkan pada tahun 2010  jumlah penderita hepatitis C di Indonesia cukup tinggi yaitu sebesar 30 juta jiwa orang (DEPKES 2010).
Jumlah  penderita  yang  sangat  tinggi dikarenakan  penyebaran  virus  yang  sangat cepat.  Virus  dapat  menghasilkan  sekitar 1  milyar  virion  (partikel  virus  baru)  tiap jamnya pada tubuh penderita (Baginski et al .
2000; Sy dan Jamal 2006). Virus Hepatitis C dapat  menyebar  melalui  penggunaan  jarum suntik,  transfusi  darah,  hubungan  seksual, dan hemodialisis (Sy dan Jamal 2006). Virus ini  mengalami  perkembangan  secara  klinis selama  7  hingga  8  minggu  setelah  paparan virus  tersebut,  namun  biasanya  penderita tidak  menunjukkan  tanda-tanda  adanya gejala atau hanya gejala ringan. Gejala tersebut timbul  setelah  menjadi  kronis  dan  dalam waktu  interval  yang  sangat  lama.  Infeksi virus hepatitis C sangat sulit untuk dideteksi. Interval  antara  infeksi  hingga  fase  kronis yang menimbulkan fibrosis dan sirosis dapat meningkat setelah tiga puluh tahun.
Hepatitis  C  adalah    penyakit  yang  sulit untuk  disembuhkan  karena  belum  ada obat  maupun  vaksin  yang  spesifik.  Terapi pengobatan hepatitis C pada umumnya dengan pemberian  interferon  alfa  (PEG-IFN  α)  yang dikombinasikan dengan ribavirin yang diberikan selama 12-72 minggu, namun terapi ini hanya berhasil pada penderita yang terinfeksi hepatitis C  dengan  genotip  tertentu  saja.  Genotip  satu dan empat pada pasien yang terinfeksi hepatitis C dapat menghambat pertumbuhan virus baru sebesar 50%-80%, sedangkan pada pasien yang terinfeksi  HCV  genotipe  dua  dan  tiga  dapat menghambat  pertumbuhan  virus  kurang  dari 80%. Terapi ini juga menimbulkan efek samping seperti depresi, anemia, dan  mual (Moradpour
et al. 2007) sehingga diperlukan pencarian obat baru untuk terapi penyakit hepatitis C. Beberapa upaya pencarian obat terhadap hepatitis  C  telah  dilakukan,  salah  satunya melalui terapi target molekuler. Terapi target molekuler  dikembangkan  dengan  pencarian inhibitor enzim yang berperan dalam replikasi HCV.  Enzim  yang  berperan  dalam  replikasi HCV adalah serin protease, RNA polimerase, dan RNA helikase. Inhibitor  enzim  RNA  helikase  HCV dapat diperoleh dari hasil metabolit sekunder dari  tumbuhan  yang  dihasilkan  secara alami,  misalnya  dari  mangrove.  Mangrove merupakan  suatu  komunitas  vegetasi  pantai wilayah tropis yang didominasi oleh beberapa spesies  pohon  yang  khas  atau  semak-semak yang mampu tumbuh di perairan asin (Miles et  al .  1999).  Mangrove  memiliki  berbagai macam  manfaat  bagi  kehidupan  manusia diantaranya  dapat  digunakan  sebagai  obat- obatan  (Sharaf et  al .  2000;  Zandi et  al. 2009).  Senyawa-senyawa  bioaktif  tumbuhan mangrove  yang  telah  ditemukan  meliputi jenis Acanthus  ilicifolius ditemukan  pada ekstrak  daun  mengandung  senyawa  mirisil alkohol,  stigmasterol  dan  stigmasterol-β-D- glukopiranosid dan ekstrak akar mengandung oktakosil alkohol, benzoksazolin-2-one, stigmasterol-β-D-glukopiranosid, saponin, dan flavonoid (Nursal et al . 1998).
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh golongan bahan bioaktif yang berpotensi dalam menghambat  RNA  helikase  virus  hepatitis  C dari  ekstrak  buah  tanaman    mangrove.  Hasil penelitian sebelumnya telah dilakukan skrining terhadap  tujuh  jenis  tanaman  mangrove  di laboratorium virologi molekuler-LIPI. Avicenna marina merupakan  salah  satu dari tujuh jenis tanaman mangrove yang memiliki potensi dalam menginhibisi RNA helikase virus hepatitis C.

## MATERIAL DAN METODE Bahan dan Alat
Organ  tanaman  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah buah yang sudah masak dari tanaman mangrove jenis A. marina yang
Ekstrak buah mangrove sebagai inhibitor RNA Helikase, Mustopa, AZ. et al.

## diambil dari komunitas hutan mangrove Desa
Teluk  Payo,  Kabupaten  Banyuasin,  Provinsi Sumatera Selatan.
Metode Penelitian Penyediaan sampel
Buah  tanaman  mangrove  jenis A.  marina yang  sudah    masak  diambil,  kemudian dibersihkan dari kotoran menggunakan akuades dan dikeringkan. Proses pengeringan dilakukan pada oven dengan suhu 60 °C selama 3-7 hari, selanjutnya dijadikan serbuk halus dan disaring.

## Ekstraksi
Ekstraksi  dilakukan berdasarkan metode Manilal et al. (2009) secara  maserasi. Sampel mangrove yang telah ditimbang sebanyak 100 g dimaserasi selama 3 x 24 jam dengan metanol 80%. Hasil maserasi kemudian disaring dengan kertas  saring,  selanjutnya  filtrat  yang  didapat dipekatkan  menggunakan rotary  evaporator pada  suhu  40  °C  sehingga  diperoleh  ekstrak metanol dari buah A. marina .

## Ekspresi dan Purifikasi RNA Helikase
Virus Hepatitis C
Ekspresi  dan  pemurnian  RNA  helikase berdasarkan  metode  Utama et  al. 2000. Ekspresi  helikase  di E.  coli BL21(DE3) pLysS  akan  diinduksi  dengan  isopropil  β-D- thiogalaktopiranosidase  (IPTG).  Helikase dipurifikasi  dengan  kromatografi  afinitas (TALON  resin,  Novagen)  dan  dianalisis kemurniannya dengan SDS-PAGE.
Isolasi  dan  purifikasi  protein  RNA helikase HCV dimulai dengan menumbuhkan HCV pada medium LB cair yang mengandung ampicilin  100  μg/mL,  kemudian  diinkubasi semalam  pada  kecepatan  200  rpm  dan  suhu 37 °C. Kultur HCV sebanyak 10 mL ditransfer pada  400  mL  medium  LB  cair  selanjutnya diinkubasi  sampai  didapatkan  OD  0,3  pada panjang gelombang 620 nm. Setelah tercapai OD  yang  diinginkan  selanjutnya  diinduksi dengan  IPTG  dan  dinkubasikan  lagi  sampai OD  1  pada  panjang  gelombang  yang  sama. Kultur tersebut selanjutnya disentrifugasi 3500
rpm, 10 menit. Pelet yang didapat ditambahkan bufer  B  (10  mM  Tris  HCl  pH  8,5;  100  mM NaCl; 0,25% Tween 20) selanjutnya dilakukan pemecahan  sel  menggunakan  metode  freeze dengan  suhu  -20  °C  dan thawing dengan suhu  ruang,  selanjutnya  disentrifugasi  pada kecepatan 7000 rpm, dengan waktu 30 menit dan dikoleksi supernatannya.
Purifikasi  protein  RNA  helikase  dengan kromatografi afinitas (TALON resin, Novagen). Resin diresuspensi dengan cell lysate , diagitasi pada  4  °C  selama  3  jam  lalu  disentrifugasi dengan  kecepatan  3500  rpm  selama  5  menit, kemudian  dicuci  dengan  bufer  B  sebanyak  3 kali  dan  dielusi  dengan  bufer  elusi  (400  mM imidazol dalam bufer B) kemudian diinkubasi menggunakan  rotator  dalam  ruangan pendingin (4 °C) selama satu malam. Sampel disentrifugasi pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3000  rpm  selama  1  menit.  Supernatan  yang didapat adalah enzim RNA helikase HCV.

## Uji ATPase
Uji ATPase dilakukan dengan mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari adenosin trifosfat  (ATP)  menjadi  ADP  dan  fosfat (P)  yang  dihasilkan  dari  reaksi  enzim  RNA helikase  dengan  ATP.  Uji  ATPase  dilakukan sebagai  berikut:  50  µL/sumur  campuran reaksi  yang  terdiri  atas  10  mM  bufer  asam morfolinopropana  sulfonat  (MOPS)  (pH 6,5),  2  mM  ATP,  1  mM  MgCl 2 ,  dan  enzim RNA  helikase  diinkubasi  dalam  96  well microtiter  plate  pada  suhu  ruangan  selama 30  menit,  kemudian  dilakukan  pewarnaan dengan  penambahan  100  µL/sumur  larutan pewarna  (H 2 O  : malachite  green 0,081%: amonium  molibdate  5,7%  dalam  HCl  6  M: polivinylalkohol  2,3%  =  2:2:1:1,  v/v)  dan diinkubasi selama 5 menit. Reaksi pewarnaan dihentikan  dengan  penambahan  25  µL/ sumur  sodium  sitrat  30%    kemudian  diukur absorbansinya pada absorban 620 nm dengan referensi 405 nm (Utama et al. 2000).
Uji  fitokimia Uji  fitokimia  dilakukan  terhadap  ekstrak
JPHPI 2012, Volume 15 Nomor 2
Ekstrak buah mangrove sebagai inhibitor RNA Helikase, Mustopa, AZ. et al
simplisia berdasarkan “ Phytochemical screening ” Farnsworth (1966) berupa pemeriksaan golongan alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, triterponoid, tanin, kuinon, minyak atsiri dan kumarin.

## Uji flavonoid dan Senyawa fenolik
Sebanyak  2  g  bahan  ditambahkan  100 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit kemudian  disaring.  Sebanyak  5  mL  filtrat ditambahkan serbuk Mg dan 1 mL HCl pekat, selanjutnya ditambah 5 mL amil alkohol dan dikocok  hingga  kuat.  Warna  yang  terbentuk dalam  amil  alkohol  menunjukkan  adanya senyawa flavonoid.

## Uji alkaloid
Sebanyak 2 g bahan dilembabkan dengan ammonia  30%,  digerus  dan  ditambahkan 20  ml  kloroform  kemudian  disaring.  Filtrat (larutan A) diekstraksi dengan 10 mL HCl 1:10 dan  dikocok  dalam  tabung  atasnya  (larutan B).  Larutan  A  diteteskan  pada  kertas  saring dan disemprot dengan pereaksi Dragendorff, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan  terbentuknya  endapan  merah  oleh pereaksi  Dragendorff,  endapan  putih  oleh pereaksi  Meyer,  dan  endapan  coklat  oleh pereaksi Wagner.

## Uji tanin
Sebanyak 2 g serbuk bahan ditambah 100 mL  akuades  kemudian  dididihkan  selama  15 menit. Setelah dingin, campuran disaring dan filtratnya ditambah FeCl 3 1% (b/v). Warna biru tua atau hitam menunjukkan adanya tanin.

## Uji Saponin
Ekstrak sampel sebanyak 0,1 g ditambah air  secukupnya  dan  dipanaskan  selama  5 menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok.  Timbulnya  busa  selama  ±  10  menit menunjukkan adanya saponin.

## Uji Triterpenoid
Ekstrak sampel sebanyak 1 g dimaserasi dengan  20  mL  eter  selama  2  jam  kemudian disaring  dan  diambil  filtratnya.  Filtrat
sebanyak  5  mL  diuapkan  hingga  diperoleh residu. Residu kemudian ditambahkan dengan pereaksi Liebermann-Burchard (3 tetes asam asetat  anhidrida  dan  1  tetes  H2S04  pekat). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid  dan  warna  hijau  menunjukkan adanya triterpenoid.
Pemurnian Bahan Aktif dari Mangrove A. marina sebagai Inhibitor RNA Helikase HCV Silika  gel  dimasukkan  secara  perlahan ke dalam kolom kromatografi. Ekstrak kasar mangrove A. marina sebanyak 5% dari volume kolom  dimasukkan  ke  kolom  gel  filtrasi dengan fase diam silika gel (0,063 mm-0,200 mm). Sampel dielusi dengan eluen kloroform- metanol  dengan  perbandingan  6:4,  dengan laju  alir  1  mL/menit  tiap  fraksi.  Masing- masing fraksi hasil pemisahan diuji aktivitas penghambatannya  terhadap  RNA  helikase virus  hepatitis  C  dengan  uji  ATPase.  Fraksi yang  mempunyai  aktivitas  penghambatan tertinggi dilihat profilnya dengan kromatografi lapis tipis (KLT).

## Kromatografi Lapis Tipis
Purifikasi  senyawa  bahan  aktif  sampel mangrove untuk melihat metabolit sekunder dilakukan  dengan  kromatografi  lapis  tipis (KLT).  KLT  dilakukan  pada  plat  silika  gel (Merck)  pada  eluen  kloroform  dan  metanol dengan  perbandingan  60:40,  40:60,  50:50, 30:70,  20:80  dan  10:90  (Manilal et  al .  2009). Penampak  noda  yang  digunakan  adalah pereaksi serium sulfat.

## Identifikasi  Fraksi Teraktif dengan KCKT
Identifikasi  lebih  lanjut  dilakukan terhadap  fraksi  yang  paling  aktif  dari hasil  KLT  preparatif  menggunakan  KCKT (Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi). Instrumen  yang  digunakan  adalah  KCKT KNAUER menggunakan kolom 4,6 x 150 mm Eurospher  100-5C-18  diameter  5  μm.  Fase gerak  menggunakan  metanol  (A)  :  air  (B) dengan berbagai perbandingan. Perbandingan yang  digunakan  adalah  0%  A  pada  0  menit,
100% A pada 22 menit, 100% A pada 30 menit, 0% A pada 33 menit, dan 0% A pada 40 menit. Volume yang diinjeksikan sebanyak 20 μL dan laju  alir  sebesar  1  mL/menit.  Detektor  yang digunakan  adalah  photo  diode  array  (PDA) panjang gelombang 254 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekspresi dan Pemurnian RNA Helikase Virus Hepatitis C
Ekspresi  dan  pemurnian  RNA  helikase HCV  dilakukan  untuk  memperoleh  RNA helikase  HCV  murni  yang  dapat  digunakan sebagai  target  dalam  menentukan  aktivitas inhibisi  ekstrak  buah  mangrove A.  marina terhadap  aktivitas  ATPase.  Ekspresi  RNA helikase HCV dilakukan pada bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS dalam plasmid pET 21b. Enzim  diisolasi  dengan  pemecahan sel  terlebih  dahulu.  Pemecahan  sel berlangsung  secara  mekanik,  yaitu  dengan cara  pengeringbekuan  ( freeze  thawing )  dan sonikasi. Pada saat sonikasi ditambahkan bufer B yang mengandung 10 mM Tris HCl pH 8,5; 100  mM  NaCl,  dan  0,25%  Tween  20.  Hasil sonikasi selanjutnya disentrifugasi dan diambil supernatannya.  Pemurnian  menggunakan kromatografi  afinitas  metal  amobilisasi. Metode  pemurnian  ini  menggunakan  resin TALON  afinitas  logam    ( metal  affinity )
yang  secara  spesifik  dapat  mengikat  RNA helikase  yang  terlabel  dengan  6xHis-Tag pada  N  terminalnya.  RNA  helikase  yang telah  diikat  oleh  resin  TALON  dipisahkan dengan  metabolit  intraseluler  lainnya  melalui sentrifugasi. Bufer elusi (imidazola dalam bufer B) ditambahkan untuk menghilangkan protein selain  enzim  RNA  helikase.  Imidazola  yang terdapat dalam bufer elusi dapat memutuskan ikatan  antara  RNA  helikase  dengan  resin TALON  afinitas  logam.  Sentrifugasi  pada kecepatan 5000 g  selama 1 menit digunakan untuk memisahkan imidazola dengan enzim yang  telah  murni.  Setiap  hasil  sentrifugasi pada  tahap  pemurnian  enzim  dikoleksi untuk  dianalisis  dengan  metode  SDS-PAGE. Analisis ini bertujuan mengetahui kemurnian enzim. Elektroforegram SDS-PAGE (Gambar 1)  menunjukkan  lajur  1  berupa  marker yang  digunakan.  Lajur  2  adalah  supernatan hasil  sentrifugasi  yang  terdapat  banyak  pita protein yang belum dimurnikan. Lajur 3 dan 4  merupakan  supernatan  hasil  pencucian. Pada  lajur  W1  dan  W2  tidak  terdapat  pita protein karena supernatan hanya berisi bufer B. Enzim RNA helikase berhasil diisolasi yang ditunjukkan  dengan  hasil  SDS-PAGE  pada lajur 5 berupa pita protein (E) dengan bobot molekul  54  kDa  (Gambar  5).  Ukuran  pita protein  tersebut  hasilnya  sama  dengan  yang dilaporkan oleh Utama et al. (2000).
Uji Fitokimia Analisis kualitatif ini bertujuan mengetahui senyawa metabolit sekunder yang terdapat  dalam  ekstrak  metanol  80%  buah mangrove A. marina . Kandungan metabolit sekunder yang dianalisis dalam ekstrak kasar mangrove  antara  lain  alkaloid,  flavonoid, tanin,  saponin,  kumarin,  triterpenoid,  dan steroid.  Uji  fitokimia  pada  ekstrak    buah mangrove A.  marina menunjukkan  hasil positif  terdapat  flavonoid,  alkaloid,  saponin, tanin, steroid dan triterpenoid (Tabel 1). Hal ini  sesuai  dengan  Stobiecki  dan  Kachlicki (2006)  bahwa  flavonoid  akan  larut  dalam pelarut  polar,  seperti  metanol  dan  air.  Hasil
Gambar  1  Elektroforegram  SDS-PAGE  RNA  helikase  virus  hepatitis  C  (1: marker, 2: inner volume ; 3: washing 1; 4: washing 2; E1: enzim).
54 kDa 50 kDa- 75 kDa- 100 kDa- 150 kDa- 250 kDa- 1        2        3         4       5
Gambar  1  Elektroforegram  SDS-PAGE  RNA helikase virus hepatitis C (1: marker, 2:  inner  volume;  3:  washing  1;  4: washing 2; 5: enzim).
Ekstrak buah mangrove sebagai inhibitor RNA Helikase, Mustopa, AZ. et al
negatif  ditunjukkan  terhadap  kumarin, kuinon, dan minyak atsiri. Kumarin, kuinon, dan  minyak  atsiri  diduga  tidak  terekstrak dalam pelarut polar seperti metanol 80%.

## Aktivitas Penghambatan Terhadap RNA Helikase HCV
Ekstrak kasar yang diperoleh merupakan kumpulan  dari  berbagai  senyawa  yang terekstrak  dalam  metanol  80%,  oleh  karena itu,  perlu  dimurnikan  untuk  mendapatkan senyawa kimia yang berperan sebagai inhibitor. Pemurnian  ekstrak  kasar  menggunakan teknik  kromatografi,  yaitu  kromatografi  gel filtrasi  dan  kromatografi  lapis  tipis.  Ekstrak kasar  terlebih  dahulu  difraksinasi  dengan kromatografi  kolom  gel  filtrasi.  Fraksinasi ini  menghasilkan  20  fraksi  yang  ditampung
masing-masing sebanyak 1 mL. Kromatografi gel  filtrasi  merupakan  teknik  umum  yang digunakan  untuk  memisahkan  senyawa berdasarkan  ukuran  partikel  dan  polaritas analit.  Ukuran  analit  yang  cocok  akan terperangkap  dalam  pori  gel  (fase  diam) dan terelusi oleh fase gerak yang digunakan. Pemisahan ini menggunakan silika gel sebagai fase  diamnya.  Fase  gerak  yang  digunakan merupakan  campuran  kloroform-metanol dengan perbandingan 60:40. Penentuan  aktivitas  penghambatan  RNA helikase  HCV  menggunakan  uji  kolorimetri ATPase.  Hasil  uji  terhadap  20  fraksi  hasil kromatografi  gel  filtrasi  menunjukkan  bahwa fraksi  2  mempunyai  aktivitas  penghambatan tinggi sebesar 82,785% (Gambar 2). Pengujian tersebut menggunakan kontrol negatif (metanol 80%). Kontrol negatif ini diuji untuk mengetahui pengaruh dari pelarut yang digunakan terhadap penghambatan  enzim.  Pengujian  ini  tidak menggunakan  kontrol  positif  dikarenakan belum  ditemukannya  obat  atau  vaksin  yang sesuai untuk infeksi virus hepatitis C.

## Profil Kimiawi Fraksi Teraktif sebagai Inhibitor RNA Helikase HCV
Hasil uji ATPase tiap fraksi yang memiliki aktivitas  penghambatan  tinggi  dianalisis menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) untuk  melihat  pemisahan  senyawanya.  Hasil percobaan menunjukkan bahwa fraksi 2 hasil
Tabel 1 Hasil uji fitokimia ekstrak buah mangrove A. marina Golongan Senyawa Ekstrak 80% metanol Alkaloid + Flavonoid + Tanin + Saponin + Kumarin - Steroid dan triterpenoid + Kuinon - Minyak Atsiri - Keterangan: (-) reaksi negatif; (+) reaksi positif
Gambar 2 Aktivitas penghambatan fraksi kromatografi gel filtrasi terhadap RNA helikase HCV . Gambar 2 Aktivitas penghambatan fraksi kromatografi gel filtrasi terhadap RNA helikase HCV.
kromatografi  gel  filtrasi  memiliki  aktivitas penghambatan  tertinggi.  Kromatogram  KLT terlihat  bahwa  fraksi  2  mempunyai  1  noda pemisahan  dengan  nilai  Rf  sebesar  0,83 (Gambar 3). Pemurnian  lanjutan  dengan  KLT preparatif dilakukan terhadap fraksi 2 karena fraksi  inilah  yang  mempunyai  aktivitas penghambatan  tertinggi  terhadap  RNA helikase HCV. Eluen yang digunakan adalah kloroform  :  metanol  (6:2).  Fase  gerak  ini dipilih  karena  kemampuan    metanol  dalam meningkatkan polaritas kloroform (Stoddard et al . 2007). Noda yang terbentuk kemudian dikerok dan dilarutkan dengan metanol 80%. Pemisahan senyawa yang terikat dengan silika gel dilakukan dengan teknik sentrifugasi.
Kromatogram  dideteksi  pada  sinar  UV dengan  panjang  gelombang  254  nm.  Pada panjang  gelombang  ini,  plat  silika  gel  akan berpendar  dan  analit  akan  terlihat  sebagai noda  berwarna  hitam.  Hasil  deteksi  dengan sinar UV menunjukkan noda pemisahan yang sama  dengan  hasil  penyemprotan  lempeng silika gel dengan serium sulfat.

## Hasil Analisis  dengan KCKT
Analisis  kualitatif  senyawa  terhadap fraksi 2 menggunakan  KCKT. Kromatogram KCKT berupa puncak-puncak yang memiliki serapan  pada  panjang  gelombang  tertentu. Kromatogram  fraksi  2  menunjukkan  tiga puncak  yang  memiliki  kelimpahan  tertinggi pada waktu retensi (Rt, retention time) menit 7,250;  18,983  dan  20,050.  (Gambar  4).  Tiga puncak  terpilih  pada  fraksi  2  selanjutnya dianalisis  dengan  detektor  PDA  untuk mengetahui  serapan  panjang  gelombangnya. Fraksi  2  untuk  puncak  dengan  Rt  7,250 menit  mempunyai  serapan  pada  panjang gelombang 216 nm, Rt 18,983 serapannya 246 nm    sedangkan  pada  Rt  20,050  serapannya adalah  263  nm.  Berdasarkan  Harborne (1987),  ketiga  serapan  puncak  tersebut merupakan  golongan  senyawa  flavonoid. Hasil KLT yang memperlihatkan adanya noda yang  terdeteksi  pada  panjang  gelombang
254  juga  mengindikasikan  bahwa  senyawa yang  berhasil  diisolasi  merupakan  golongan flavonoid.  Analisis  dengan  KCKT  juga sesuai dengan penapisan awal fitokimia yang menunjukkan hasil positif terhadap flavonoid. Hasil  analisis  dengan  uji  fitokimia,  KLT, dan  KCKT  menunjukkan  bahwa  golongan senyawa  yang  diperkirakan  sebagai  inhibitor RNA helikase HCV adalah flavonoid.  Flavonoid telah  banyak  diteliti  sebagai  agen  antivirus terhadap virus herpes, HIV, virus parainfluenza, dan adenovirus (Tapas et al. 2008). Flavonoid menghambat  siklus  hidup  virus  pada  waktu replikasi.  Mekanisme  penghambatan  dari flavonoid  yang  melibatkan  enzim  replikasi virus diperkirakan melalui interaksi flavonoid dengan  kofaktor  enzim.  Enzim  replikasi, misalnya  RNA  helikase  yang  aktivitasnya bergantung  pada  ATP,  sangat  membutuhkan kofaktor (Mg 2+ ) untuk membantu interaksinya dengan  substrat.  Apabila  keberadaan  dari kofaktor  tersebut  digantikan  oleh  flavonoid maka aktivitas enzim replikasi akan terhambat (Narayana et al. 2001).
.
.
(a)                 (b)
Gambar 3  Kromatogram KLT fraksi 2; (a) hasil deteksi spot pada sinar UV 254. (b) hasil deteksi   spot dengan penampak noda
Gambar  3    Kromatogram  KLT  fraksi  2;  (a)  hasil deteksi  spot  pada  sinar  UV  254.  (b) hasil deteksi   spot dengan penampak noda.
a b

## KESIMPULAN
Hasil  penapisan  fitokimia  terhadap ekstrak  buah  mangrove A.  marina menunjukkan  adanya  senyawa  golongan flavonoid,  alkaloid,  steroid  dan  triterpenoid, tanin  dan  saponin.  Fraksinasi  menggunakan kromatografi  gel  filtrasi  dengan  pelarut metanol  dalam  kloroform  menunjukkan bahwa  fraksi  2  mempunyai  aktivitas  inhibisi tertinggi sebesar 82,785%. Identifikasi bahan bioaktif  yang  berperan  sebagai  inhibitor dalam  fraksi  tersebut  merupakan  senyawa golongan flavonoid.

## DAFTAR PUSTAKA
Baginski  SG,  Pevear  DC,  Seipel  M,  Sun  SCC, Benetatos  CA,  Chunduru  SK,  Rice  CM, Collett MS. 2000. Mechanism of action of Pest virus antiviral compound. PNAS 97: 14. [DEPKES]  Departemen  Kesehatan.  2010. Masyarakat  Dunia  Peringati  Hari Hepatitis. http://www.depkes.go.id/ index.php/berita/press-release/1156- masyarakat-dunia-peringati-hari- hepatitis.html.
Farnsworth  NR.  1966.  Biological  and phytochemical screening of plant. Journal of Pharmaceutical Sciences 55(3): 225-76. Harborne  JB.  2006. Metode  Fitokimia:
Penuntun  Cara  Modern  Menganalisa Tumbuhan. Ed  ke-2.  Padmawinata  K, Soediro  I,  penerjemah;  Mansoor  S, editor. Bandung: Penerbit ITB Bandung. Terjemahan dari: Phytochemical Methods Lauer GM, Walker BD. 2001. Review article: hepatitis  c  virus  infection. The  New England Journal of Medicine 1: 41-50. Manilal A, Sujith S, Seghal K. 2009. Biopotensial of mangroves collected from the Southwest Coast of India. Journal Biotechnology and Biochemistry 4(1): 59-65. Miles  DH,  Kokpol  U,  Chittawong  V,  Tip- Pyang  S,Tunsuwan  K,  Nguyen  C.  1999. Mangrove  forest:  The  importance of  conservation  as  a  bioresource  for ecosystem  diversity  and  utilization  as a  source  of  chemical  constituents  with potential  medicinal  and  agricultural value. IUPAC 70(11): 1-9. Moradpour  D,  Penin  F,  Rice  CM.  2007.
Replication  of  hepatitis  C  virus. Nature Reviews Microbiology 5: 453-463. Narayana  KR,  Sripal  R,  Chaluvadi,  Khrisna. 2001. Bioflavonoids classification, pharmacological,  biochemical  effect  and therapeutical  potentials. Indian  Journal Pharmacology 33: 2-16. Nursal M, Sutisna, Ngaro NR. 1998. Pengaruh
BH 4.1.2
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 m AU -25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 m AU -25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 0. 917 8 230 1. 05 0 20 479 1. 55 0 48 29 1. 66 7 11 834 2. 16 7 51 768
3. 05 0 41 72 3. 300 674 0 4. 66 7 35 475 5. 10 0 25 360 5. 35 0 14 838 5. 917 175605 6. 70 0 68 462 7. 250 1 694972 7. 88 3 10391 7 8. 38 3 35 021 9. 067 234 2 9. 45 0 48 682 9. 850 1 04366 10. 367 3 6116 10 .833 44259 11. 30 0 18092 11. 66 7 96 13 0 12. 083 1 5167 12 .483 109044 13 .233 90720 13. 567 2 60661 13. 98 3 13 2236 14 .3 67 1 72 940 14. 91 7 11 1686 15 .350 189407 16 .400 647272 16 .550 579002 17. 10 0 12 6616 17. 483 1 011648 18. 28 3 54 988 18. 633 9 7446 18 .983 29675 35 20. 050 18 12 350 20. 667 1 37761 20. 900 1 31014
21. 717 1 38716 21. 96 7 39 896 22 .4 33 1 06 148 23 .350 576719 24 .3 83 1 00 132 25 .083 25748 25. 40 0 27 461 25. 81 7 40 884 26 .567 33556 27 .4 17 3 09 14 29 .0 17 2 12 65 K-2800 [1] IPB Name Retention Time Area
Gambar 4 Hasil kromatografi cair kinerja tinggi pada fraksi 2
Gambar 4 Hasil kromatografi cair kinerja tinggi pada fraksi 2.
Ekstrak buah mangrove sebagai inhibitor RNA Helikase, Mustopa, AZ. et al.
Ekstrak  Mangrove Acanthus  ilicifolius
terhadap Pertumbuhan Bakteri Vibrio sp. Prosiding Seminar Nasional VI Ekosistem
Mangrove,  Pekanbaru,  15-18  Sept  1998.
14 hlm.
Sharaf  M,  El-Ansari  MA,  Saleh  NAM.  2000. New  flavonoids  from Avicennia  marina .
Fitoterapia 71: 274-277.
Stobiecki M, Kachlicki P. 2006. The Science of Flavonoids . Erich Grotewold, editor. New York: Springer Science. Stoddard  JM ,  Nguyen L ,  Mata-Chavez H,
Nguyen K. 2007.  TLC plates as a convenient platform  for  solvent-free  reactions. Chemical  Communication 12: 1240-1241
Sy T, Jamal MM. 2006. Epidemiology of hepatitis C  virus  (HCV)  infection. International
Journal of Medical Sciences 3: 41-46.
Tapas  AR,  Darkarrar  DM,  Kakde  RB.  2008.
Flavonoids  as  nutraceuticals. Tropical
Journal Pharmaceutical 7: 1089-1099. Utama A, Shimizu H, Morikawab S,  Hasebe F,  Morita  K,  Igarashi  A,    Hatsu  M,
Takamizawa  K,  Miyamura  T.  2000. Identification  and  characterization  of the  RNA  helicase  activity  of  Japanese enchepalitis  virus  NS3  protein. FEBS
Letters 456: 74-78.
Yazdani MR, Kassaian N, Ataei B, Nokhodian
Z,  Adibi  P.  2012.  Hepatitis  C  virus infection  in  patients  with  hemophilia in  Isfahan,  Iran. International  Journal  of
Preventive Medicine Special issue : S89-93
Zandi  K,  Taherzadeh  M,  Yaghoubi  R,
Tajbakhsh  S,  Rastian  Z,  Fouladvand M,  Sartavi  K.  2009.  Antiviral  activity of Avicennia  marina against  herpes simplex virus type 1 and vaccine strain of poliovirus (an in vitro study). Journal of Medicinal Plants Research 3(10): 771-775.