Pengaruh Konsentrasi Air Kelapa Muda dan Madu dalam NaCl Fisiologis terhadap Motilitas dan Lama Hidup Spermatozoa Ikan Patin ( Pangasius pangasius )
The Effect of Concentration Young Coconut Water and Honey in 0,9% Sodium Chloride to Motility and Life Time Catfish ( Pangasius pangasius ) Spermatozoa
Laksmi Sulmartiwi, Eka Ainurrohmah dan A. Shofy Mubarak
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp. 031 - 5911451

## Abstract
Ability  nature  maturation  of  catfish  just  one  time  a  year  at  early  rainy  season  (November-March)  and nature seed population was down because catching, so to solve the probleme is storage of catfish spermatozoa and can used as need. Young coconut water and honey as thinner in storage catfish spermatozoa content glucose and fructose  result  ATP  as  energy  resources.  Destination  of  this  study  to  know  effect  of  young  coconut  water  and honey  to  catfish  spermatozoa  motility  and  live  time  in  storage  process.  Study  method  is  experiment  with Completely  Randomization  Design  as  experimental  design.  With  different  treatment  young  coconut  water  is A (0%), B (19,4%), C (39,4%), D (59,4%), E (79,4%) and F (99,4%), and add 0,6% honey at every treatment. Save the  treatment  at  5-7°C  for  36  hours  with  checked  every  4  hours.  Data  analyzed  with Anova  and  continued  by Duncan’s Multiple Range Test. Result this study shown used young coconut water with different concentration is not different significant at motility but different significant at live time catfish spermatozoa. Young coconut water with concentration 99,4% and honey 0,6% influence at catfish spermatozoa live time.
Keywords : Spermatozoa, motility, life time, catfish, young coconut water, honey

## Pendahuluan
Ikan  patin  merupakan  ikan  konsumsi  yang terus  berkembang.  Menurut  data  terakhir  dari Direktorat  Jenderal  Kelautan  dan  Perikanan menunjukkan  bahwa  kebutuhan  benih  secara nasional  mencapai  55  juta  ekor  per  bulan (Khairuman,  2007 dalam Faridah  dkk.,  2008). Jumlah  tersebut  diperlukan  untuk  mencapai  target produksi patin konsumsi sebesar 16.500 ton.
Kesinambungan  usaha  dan  peningkatan produksi  benih  patin  baik  jumlah  dan  kualitasnya perlu  dijaga  mengingat  hambatan  yang  terjadi  saat pemijahan  patin  secara  alami  hanya  terjadi  setahun sekali  dan  harus  menggunakan  hipofisa  (Saparinto, 2010).  Salah  satu  cara  yang  bisa  digunakan  untuk menyediakan benih ikan patin sepanjang tahun yaitu melalui  penyimpanan  spermatozoa.  Penyimpanan spermatozoa  diharapkan  mampu  mempertahankan motilitas  spermatozoa  yang  secara  normal  berkisar antara  1-2  menit  setelah  keluar  dari  testis  (Effendy, 1997 dalam Hidayaturrahmah, 2007).
Penyimpanan  spermatozoa  membutuhkan bahan  pengencer  yang  berfungsi  untuk  mengurangi aktifitas  spermatozoa  sehingga  menghambat pemakaian  energi  dan  dapat  memperpanjang  hidup spermatozoa (Sunarma dkk., 2007). Bahan pengencer yang  biasa  digunakan  dalam  penyimpanan spermatozoa  adalah  NaCl  fisiologis  yang  hanya berfungsi untuk menambah volume semen (Masrizal dan  Efrizal,  1997 dalam Hidayaturrahmah,  2007).
M e n u r u t   To e l i h e r e   ( 1 9 8 5 ) ,   p e n y i m p a n a n s p e r m a t o z o a   m e m e r l u k a n   f r u k t o s a   y a n g dimanfaatkan  sebagai  sumber  energi  bagi spermatozoa  dan  air  kelapa  muda  merupakan  bahan pengencer  yang  mengandung  fruktosa.  Penggunaan air  kelapa  muda  dalam  waktu  yang  lama  dapat menurunkan pH (Barlina, 2004) sehingga dibutuhkan buffer  untuk  mempertahankan  pH  dalam  kondisi normal  (pH  7).  Salah  satu  bahan  yang  dapat digunakan  sebagai  buffer  adalah  madu  (Suranto, 2004).  Selain  itu,  madu  juga  mengandung  fruktosa sebagai  sumber  energi  spermatozoa  (Marawali  dkk., 2001 dalam Hidayaturrahmah,  2007).  Selama  ini, penggunaan  air  kelapa  muda  sebagai  pengencer dalam  penyimpanan  spermatozoa  belum  dilakukan dengan  penambahan  madu.  Hal  ini  perlu  diketahui untuk  mendapatkan  pengencer  spermatozoa  yang mengandung  fruktosa  sehingga  dapat  meningkatkan motilitas dan lama hidup juga dapat mempertahankan pH. Penggunaan air kelapa muda diharapkan mampu menggantikan  NaCl  fisiologis  sebagai  bahan pengencer  yang  biasa  digunakan  dan  penambahan madu berfungsi untuk mempertahankan pH pada saat penyimpanan.  Tujuan  penelitian  ini  untuk mengetahui  pengaruh  air  kelapa  muda  dan  madu sebagai bahan pengencer terhadap motilitas dan lama hidup  spermatozoa  pada  proses  penyimpanan,  dan mengetahui  konsentrasi  air  kelapa  muda  dan  madu yang  dapat  mempengaruhi  motilitas  dan  lama  hidup spermatozoa.

## Metodologi
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pendidikan  Perikanan  Fakultas  Perikanan  dan Kelautan,  Universitas Airlangga,  Surabaya,  Propinsi Jawa  Timur.  Kegiatan  ini  dilaksanakan  pada  bulan Desember 2010.
Alat-alat  yang  digunakan  yaitu  mikroskop, microtube , object  glass , cover  glass ,  termometer, autoclave , erlenmeyer, stopwatch , handtally counter , timbangan  analitik,  gelas  ukur,  lap  halus,  kertas  pH, pipet,  spuit, haemocytometer , aluminium  foil , sterofoam , nampan, tisu, toples plastik dan lemari es.
Bahan yang digunakan yaitu induk jantan ikan patin yang telah matang gonad, air kelapa muda, madu, zat warna eosin, negrosin dan akuades.
Penelitian  ini  menggunakan  metode eksperimental  dengan  Rancangan  Acak  Lengkap (RAL)  yang  terdiri  dari  6  perlakuan  dan  4  ulangan.
Variasi  jumlah  pemberian  air  kelapa  muda  0%,  19,4
%,  39,4  %,  59,4  %,  79,4  %,  dan  99,4  %  kemudian masing-masing  perlakuan  ditambah  madu  sebanyak 0,6  %.  Perlakuan  kontrol  yang  digunakan  yaitu penggunaan  bahan  pengencer  NaCl  fisiologis  99,4% ditambah madu 0,6%. Berdasarkan penelitian Condro (2010) semen dan bahan pengencer (air kelapa muda dan madu) pada pH 7 dicampur dengan rasio 1:9 dan dimasukkan  dalam microtube masing-masing  1  ml kemudian  disimpan  pada  suhu  5-7  °C.  Sebelum dilakukan pengamatan, semen yang dikeluarkan dari lemari  pendingin  didiamkan  dulu  selama  5  menit untuk adaptasi suhu pada spermatozoa.
Spermatozoa  diperoleh  dengan  mengurut bagian  perut  ikan  ke  arah  anal.  Spermatozoa  yang telah  didapatkan  lalu  ditampung  dan  dilakukan pemeriksaan  secara  makroskopis  dan  mikroskopis. Pengamatan  makroskopis  berupa  pengamatan terhadap  volume,  warna  dan  pH  spermatozoa. Pengamatan  mikroskopis  berupa  penentuan konsentrasi  spermatozoa  ikan,  penentuan  persentase hidup  spermatozoa  dan  pengamatan  lama  gerak.
P e n g u k u r a n   M i k r o s k o p i s   b e r u p a pengamatan  konsentrasi  spermatozoa  ikan  dengan cara  thoma  dan  menggunakan  pengencer  berupa larutan eosin 2%. Semen segar diambil dengan pipet thoma  hingga  angka  0,5,  selanjutnya  eosin  diambil hingga  angka  1,01.  Ujung  karet  penghisap  ditekuk, kemudian pipet dikocok dengan gerakan membentuk angka 8 hingga larutan homogen. Penghitungan pada papan thoma, dengan menghitung spermatozoa yang terdapat  pada  5  kotak  besar,  yaitu  4  kotak  di  sudut dan 1 kotak di tengah. Dihitung di bawah mikroskop pembesaran  400x.  Jika  jumlah  spermatozoa  dalam  5
kotak  adalah  X,  maka  konsentrasi  dalam  cairan tersebut adalah X x 106 sel/ml (Toelihere, 1985).
Pengamatan  persentase  spermatozoa  hidup dengan  menghitung  minimal  100  spermatozoa  di bawah  mikroskop  dengan  pembesaran  400x (Toelihere,  1985;  Zilli et  al .,  2008).  Spermatozoa yang  mati  akan  menyerap  zat  warna  negrosin sehingga  akan  tampak  berwarna  biru  kehitaman terutama pada bagian ujung kepala spermatozoa, dan spermatozoa  yang  hidup  akan  tetap  berwarna transparan  (Toelihere,  1985).  Penghitungan persentase hidup spermatozoa yaitu dengan membagi jumlah  spermatozoa  hidup  dengan  jumlah  total spermatozoa  kemudian  dikalikan  dengan  100%. Sedangkan  untuk  pengamatan  lama  gerak  dilakukan menggunakan  satu  tetes  cairan  spermatozoa  (±  0,01 ml)  diletakkan  di  atas object  glass cekung  ditambah satu tetes akuades (± 0,01 ml), dan diamati di bawah m i k r o s k o p   d e n g a n   p e m b e s a r a n   1 0 0 x . Penghitungannya  menggunakan stop  watch dan dihitung  dari  mulai  spermatozoa  bergerak  hingga berhenti bergerak. Pengamatan lama hidup dilakukan dengan  mengamati  lama  gerak  spermatozoa.
Pengamatan  lama  gerak  dinyatakan  dalam  detik. Pemeriksaan  terhadap  spermatozoa  dilakukan  baik pada spermatozoa segar maupun perlakuan (Condro, 2010).

## Hasil dan Pembahasan
Semen  yang  diperoleh  dengan  mengurut bagian perut ikan patin jantan ke arah anal kemudian ditampung  dan  dilakukan  pemeriksaan  secara makroskopis  dan  mikroskopis.  Pemeriksaan  secara makroskopis  meliputi  warna,  volume  dan  pH, sedangkan  pemeriksaan  mikroskopis  meliputi penghitungan  konsentrasi  spermatozoa,  lama  gerak dan  persentase  hidup  spermatozoa.  Hasil  evaluasi pada  semen  ikan  patin  diperoleh  warna  semen  putih susu, volume semen 1,5 ml yang diperoleh dari satu ekor  ikan  patin,  pH  semen  7  (netral),  konsentrasi spermatozoa  10,6  x  109  sel/ml,  kemampuan spermatozoa  untuk  bergerak  hingga  tidak  bergerak lagi  yaitu  selama  2  menit  48  detik,  dan  persentase hidup spermatozoa adalah 90%.
Berdasarkan  pemeriksaan  pada  semen diperoleh  konsentrasi  spermatozoa  ikan  patin  10,6  x 109  sel/ml.  Konsentrasi  tersebut  dinyatakan  normal karena  menurut  Kwantong  (2009)  konsentrasi spermatozoa  yang  dihasilkan  ikan  patin  ( Pangasius hypophthalmus )  berkisar  antara  6,9  x  107  sampai 6,94  x  1010  sel/ml.  Pemeriksaan  persentase  hidup spermatozoa  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini
adalah  90%.  Menurut  Stoss  (1983) dalam Condro (2010)  persentase  hidup  minimal  semen  segar  yang akan  digunakan  untuk  penyimpanan  yaitu  70%.  Hal ini  menunjukkan  bahwa  spermatozoa  yang digunakan dalam penelitian adalah layak.
Penelitian  ini  menggunakan  air  kelapa muda  sebagai  bahan  pengencer  pada  penyimpanan spermatozoa.  Penggunaan  air  kelapa  muda  tersebut didasarkan  atas  banyaknya  ketersediaan  kelapa  di negara tropis seperti Indonesia sehingga ditinjau dari segi  ekonomi,  penggunaan  air  kelapa  sebagai  bahan pengencer  dibandingkan  dengan  NaCl  fisiologis tergolong  lebih  murah.  Air  kelapa  muda  mampu memenuhi  syarat  sebagai  bahan  pengencer  yang murah,  sederhana  dan  praktis  untuk  penyimpanan spermatozoa  ikan  patin.  Selain  itu  air  kelapa  muda mengandung  glukosa  dan  fruktosa  yang  juga terkandung  dalam  semen.  Toelihere  (1985) menyatakan  bahwa  suatu  pengencer  harus mengandung  unsur-unsur  yang  hampir  sama  dengan semen  dan  tidak  mengandung  zat  yang  bersifat racun. Dengan demikian, air kelapa muda diharapkan mampu menggantikan NaCl fisiologis sebagai bahan pengencer  dalam  penyimpanan  spermatozoa  ikan patin.
Menurut  Suranto  (2004),  madu  memiliki sifat  sebagai  penyangga  pH.  Hal  tersebut  dapat dimanfaatkan  untuk  mempertahankan  pH  agar  tetap dalam  kondisi  normal  (pH  7)  selama  proses penyimpanan  spermatozoa  ikan  patin.  Madu  dapat menstabilkan  kondisi  pH  selama  penyimpanan spermatozoa  akibat  pembentukan  asam  laktat. Menurut Toelihere  (1985),  pembentukan  asam  laktat merupakan  hasil  dari  metabolisme  spermatozoa sehingga dengan kestabilan pH, spermatozoa mampu mempertahankan  hidupnya.  Penelitian  ini  juga menambahkan  madu  pada  bahan  pengencer.  Madu diketahui mengandung zat antibiotik (Rasyidi, 2010).
Toelihere  (1985)  menyatakan  antibiotik  yang ditambahkan  ke  dalam  semen  yang  telah  diencerkan akan meningkatkan daya tahan hidup spermatozoa.
Tabel 1. Rata-rata  persentase  hidup  spermatozoa ikan patin
Tabel  1.  menunjukkan  persentase  hidup spermatozoa  selama  penyimpanan  dengan  berbagai konsentrasi  air  kelapa  muda  yaitu  70,97%-75,02%. Hal  ini  menunjukkan  persentase  hidup  spermatozoa lebih  baik  dibandingkan  dengan  hasil  penelitian Sunarma (2007) yang menggunakan madu 0,5% dan dimethyl  sulfoxide  15%  pada  ikan  nilem  dengan persentase  hidup  spermatozoa  sebesar  63,33%. Perlakuan  menggunakan  air  kelapa  muda  maupun tanpa  penambahan  air  kelapa  muda  tidak mempengaruhi persentase hidup spermatozoa, diduga semen yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas yang baik.
Berdasarkan  Gambar  1.  grafik  persentase hidup  spermatozoa  ikan  patin  diketahui  persentase hidup spermatozoa yang tinggi pada pengamatan jam
Perlakuan Rata-rata presentase hidup (%) A B C D E F a
70,97 ± 6,30 a 75,02 ± 2,63 a 72,63 ± 3,57 a
71,89 ± 4,49 a
71,77 ± 4,17 a 71,27 ± 4,65
Keterangan : Superskrip yang sama dalam satu kolom menunjukkan tidak berbeda nyata (p>0,05). A = Perlakuan dengan pengencer NaCl fisiologis dan
0,6% madu
B = Perlakuan dengan pengencer 19,4% air kelapa muda dan 0,6% madu
C = Perlakuan dengan pengencer 39,4% air kelapa muda dan 0,6% madu
D = Perlakuan dengan pengencer 59,4% air kelapa muda dan 0,6% madu
E = Perlakuan dengan pengencer 79,4% air kelapa muda dan 0,6% madu F = Perlakuan dengan pengencer 99,4% air kelapa muda dan 0,6% madu
Gambar 1. Grafik presentase hidup spermatozoa ikan patin
ke-4,  jam  ke-8  dan  jam  ke-12  diduga  pada  awal penelitian  sumber  energi  yang  tersedia  masih  cukup untuk  mempertahankan  persentase  hidup.  Terjadi penurunan  persentase  hidup  spermatozoa  pada pengamatan  jam  ke-16  hingga  jam  ke-24  diduga a k i b a t   b e r k u r a n g n y a   s u m b e r   e n e rg i   b a g i spermatozoa.  Hal  ini  juga  sejalan  dengan  pendapat K u s u m a   ( 1 9 9 0 ) d a l a m H a s i b u a n   ( 2 0 0 9 ) , metabolisme  spermatozoa  yang  menyebabkan cadangan  makanan  berkurang  dan  elektrolit  larutan menjadi  tidak  seimbang  sehingga  spermatozoa mengalami kelelahan dan mati.
Soehartojo  (1995) dalam Hidayaturrahmah (2007) menyatakan, bahan utama yang dimanfaatkan spermatozoa  sebagai  sumber  energi  dari  luar  testis adalah  fruktosa  yang  mampu  mengurangi  kecepatan rusaknya  permeabilitas  spermatozoa,  sehingga kebutuhan  akan  nutrisi  dan  energi  yang  berupa ATP tidak terhambat sehingga spermatozoa dapat bertahan lama. Dalam keadaan normal energi yang dilepaskan dapat  dipakai  sebagai  energi  mekanik  (pergerakan) atau  sebagai  energi  kimiawi  (biosintesa),  jika  tidak dipergunakan  akan  menghilang  sebagai  panas. Apabila  persediaan  energi  habis,  maka  kontraksi fibril-fibril  spermatozoa  akan  terhenti  dan spermatozoa  tidak  bergerak.  Untuk  melangsungkan pergerakan  kembali,  ATP  dan  ADP  harus  dibangun kembali  dengan  penambahan  gugusan  phosphoryl yang membutukan sumber energi dari luar.
Tabel 2. Rata-rata lama gerak spermatozoa ikan patin
Pengamatan  lama  gerak  dimulai  dari bergeraknya  spermatozoa  pada  media  air  hingga spermatozoa  berhenti  bergerak.  Berdasar  Tabel  2. lama  gerak  spermatozoa  tertinggi  pada  perlakuan 99,4% air kelapa muda (F) yaitu 108,25 detik. Hal ini diduga  karena  perlakuan  F  mengandung  konsentrasi air  kelapa  muda  lebih  banyak  dibanding  kandungan air  kelapa  muda  pada  perlakuan  A,  B,  C,  D  dan  E. Fruktosa yang terkandung dalam air kelapa muda dan madu dijadikan sebagai sumber energi dimanfaatkan oleh  spermatozoa  untuk  bergerak.  Sehingga  saat sumber  energi  spermatozoa  pada  perlakuan  lainnya telah  habis  namun  pada  perlakuan  F  sumber  energi masih  tersedia  sehingga  spermatozoa  masih  dapat bertahan hidup.
Lama  gerak  spermatozoa  pada  perlakuan  F tidak berbeda nyata dengan perlakuan B, C, D dan E yang menggunakan bahan pengencer air kelapa muda dengan  konsentrasi  19,4%  -  99,4%  ditambah  madu 0,6%  akan  menghasilkan  lama  gerak  spermatozoa yang  sama.  Sedangkan  perlakuan  A  berbeda  nyata dengan  perlakuan  B,  C,  D,  E  dan  F.  Lama  gerak spermatozoa perlakuan tanpa penambahan air kelapa muda  (A)  yaitu  80,86  detik.  Terbatasnya  kandungan monosakarida  pada  perlakuan A  yang  menggunakan pengencer NaCl fisiologis mengakibatkan rendahnya pemanfaatan  sumber  energi  untuk  pergerakan spermatozoa.  Menurut  Tilman  (1985) dalam Nugroho  (2007),  kekurangan  sumber  energi  pada bahan  pengencer  dapat  mengurangi  pergerakan spermatozoa,  daya  membuahi  dan  jumlah spermatozoa  yang  hidup.  Musrinsalila  (2009) dalam Condro (2010) menyatakan glukosa maupun fruktosa dalam  proses  glikolisis  memerlukan  magnesium (Mg)  sebagai  kofaktor  pada  beberapa  tahap  proses glikolisis  untuk  menghasilkan  ATP  dan  ADP  bagi spermatozoa.  Magnesium  terkandung  dalam  air kelapa muda dan madu.
Berdasarkan  Gambar  2.,  lama  gerak spermatozoa ikan patin pada jam ke 4, 8, 12, 16, 20, 24,  28,  32  dan  36  yaitu  99,67  detik,  110,83  detik, 91,67  detik,  83,33  detik,  92,67  detik,  97  detik,  98,3 detik,  103,3  detik  dan  113  detik.  Hasil  penelitian tersebut  menunjukkan  lama  gerak  spermatozoa berada  dalam  kisaran  normal  karena  menurut Effendy (1997) dalam Hidayaturrahmah (2007) lama gerak spermatozoa secara normal berkisar antara 1-2 menit.  Berdasarkan  pengamatan  diketahui  lama gerak  mulai  mengalami  penurunan  pada  jam  ke-12 dan  jam  ke-16  dan  lama  gerak  kembali  meningkat pada  pengamatan  jam  ke-20  hingga  jam  ke-36. Penurunan  lama  gerak  tersebut  diduga  karena  pola pemanfaatan energi oleh spermatozoa.
Perlakuan Rata-rata presentase hidup (%) A B C D E F
0 0
0 0 0 0 b 80,86 ±  8,89 a 103,5 ± 15,67 a
92,11 ±  7,42 a
104,46 ± 10,62 a
104,03 ±  9,90 a
108,25 ±  5,32
Keterangan : Superskrip yang sama dalam satu kolom menunjukkan tidak berbeda nyata (p>0,05).
A = Perlakuan dengan pengencer NaCl fisiologis dan 0,6% madu
B = Perlakuan dengan pengencer 19,4% air kelapa muda dan 0,6% madu
C = Perlakuan dengan pengencer 39,4% air kelapa muda dan 0,6% madu
D = Perlakuan dengan pengencer 59,4% air kelapa muda dan 0,6% madu E = Perlakuan dengan pengencer 79,4% air kelapa muda dan 0,6% madu F = Perlakuan dengan pengencer 99,4% air kelapa muda dan 0,6% madu

## Kesimpulan
Penggunaan  air  kelapa  muda  dan  madu sebagai  pengencer  tidak  berpengaruh  terhadap motilitas spermatozoa  ikan  patin  ( Pangasius pangasius) .
Penggunaan  air  kelapa  muda  dan  madu sebagai  pengencer  berpengaruh  terhadap  lama  hidup spermatozoa ikan patin ( Pangasius pangasius) .
Bahan pengencer dengan konsentrasi 99,4% a i r   k e l a p a   m u d a   d a n   0 , 6 %   m a d u   d a p a t mempengaruhi  lama  hidup  spermatozoa  ikan  patin ( Pangasius pangasius).
Bahan  pengencer  yang  berasal  dari  air kelapa  muda  dengan  konsentrasi  99,4%  dan  madu 0,6%  dapat  dimanfaatkan  oleh  pembudidaya  ikan patin  untuk  meningkatkan  lama  hidup  spermatozoa selama penyimpanan.
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut u n t u k   m e n g e t a h u i   k e m a m p u a n   f e r t i l i s a s i spermatozoa  yang  telah  disimpan  menggunakan bahan pengencer air kelapa muda dan madu.

## Daftar Pustaka
Barlina,  R.  2004.  Potensi  Buah  Kelapa  Muda  Untuk Kesehatan  dan  Pengolahannya.  Balai Penelitian  Tanaman  Kelapa  dan  Palma Lain, Manado, Perspektif, III (2) : 46-60. Condro,  H.  S.  2010.  Pengaruh  Penambahan  Madu Pada  Media  Pengencer  NaCl  Fisiologis Dalam  Proses  Penyimpanan  Sperma
Terhadap  Kualitas  Sperma  Ikan  Komet ( Carassius  auratus ).  Skripsi.  Fakultas Perikanan  dan  Kelautan.  Universitas Airlangga. Surabaya.
Faridah, N., Astiawan., A. Kurniawan., V. Yuniar., W. C.  Pamungkas.  2008.  Pertumbuhan  Ikan Patin Yang  Diberi  Pakan  Keong  Mas  Hasil Pelunakan  Dengan  Ekstrak  Daun  Pepaya Sebagai Sumber Protein Tambahan. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Hidayatullah. 2010. Sperma. http://www.bdp45.co.cc . 09/10/2010. 2 hal.
Hidayaturrahmah.  2007.  Waktu  Motilitas  dan Viabilitas Spermatozoa Ikan Mas ( Cyprinus carpio ) Pada Beberapa Konsentrasi Larutan Fruktosa. Bioscientiae, 4 (1) : 9-18.
Saparinto,  C.  2010.  Usaha  Ikan  Konsumsi  di  Lahan 100 m2. Penebar Swadaya. Jakarta.
Sunarma, A.,  D. W.  B.  Hastuti  dan Y.  Sistina.  2007.
P e n g g u n a a n   e k s t e n d e r   m a d u   y a n g dikombinasikan  dengan  krioprotektan berbeda  pada  pengawetan  sperma  ikan nilem  ( Osteochilus  hasseltii ).  Konferensi aquaculture Indonesia. 10 pp.
Suranto,  Adji.  2004.  Khasiat  dan  Manfaat  Madu Herbal.  Agromedia  Pustaka.  Jakarta.  hal. 25-36.
Toelihere,  M.  R.  1985.  Inseminasi  Buatan  Pada Ternak. Angkasa. Bandung.
Zilli,  L.,  R.  Schiavone.,  C.  Storelli  and  S.  Vilella.
2008.  Effect  of  Cryopreservation  on Phosphorylation  State  of  Proteins  Involved in  Sperm  Motility  Initiation  In  Sea  Bream. Cryobiology, 57 : 150-155.

## Gambar 1. Grafik lama gerak spermatozoa ikan patin