## Aktivitas Antioksidan Ekstrak Astaxanthin dari Limbah Kulit dan Kepala Udang Dogol ( Metapenaeus ensis )
Winda Rahmalia 1* , Adhitiyawarman 1 , Dwi Imam Prayitno 2 , Yosef Novem Batistuta Lubis 1
1 Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Tanjungpura 2 Jurusan Ilmu Kelautan, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Tanjungpura Jl. Prof. Dr. H. Nawawi, Pontianak, 78124 Indonesia
Email: winda.rahmalia@chemistry.untan.ac.id
Abstract

## Antioxidant Activity of Astaxanthin Extract from Greasyback Shrimp (Metapenaeus ensis) Shell and Head Wastes
Astaxanthin is a carotenoid derivative compound with various benefits, one of which is as an antioxidant, making astaxanthin applicable in drugs and cosmetics. Astaxanthin is discoverable in various sources, with shrimp as its main source. This study aims to determine the antioxidant activity of astaxanthin extracted from shrimp shell and head wastes. Extraction was carried out using the soxhletation method, followed by saponification to obtain free astaxanthin. Astaxanthin in extract before and after saponification were identified using thin-layer chromatography (TLC) and UV-Vis spectrophotometry. Antioxidant activity assay  was  carried  out  in  five  variations  of  sample  concentrations  using  the  2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl  (DPPH)  method. Extraction of shrimp shell and head wastes resulted in an oil yield percentage of 1.02 and 3.05 % of dry mass in 60 g of shrimp shells, respectively. Identification results showed astaxanthin content in extracts after saponification were higher than that before saponification. There are three thin layer chromatography (TLC) separation spots and two UV-Vis absorption peaks in extracts  before  and  after  saponification.  Antioxidant  activity  assay  results  (IC 50 )  of  shrimp  shell  extract  before  and  after saponification showed antioxidant activity of 572.0 and 186.6 mg/L, respectively.
Keywords : shrimp, astaxanthin, saponification, antioxidant, waste

## Abstrak
Astaxanthin  merupakan  senyawa  turunan  karotenoid  dengan  beragam  manfaat,  salah  satunya  sebagai  antioksidan, sehingga membuat astaxanthin dapat diaplikasikan dalam obat-obatan dan kosmetik. Astaxanthin dapat ditemukan dalam berbagai  sumber,  dengan  sumber  utama  adalah  udang.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan  aktivitas  antioksidan astaxanthin yang diekstraksi dari limbah kulit dan kepala udang. Ekstraksi dilakukan dengan metode soxhletasi, dilanjutkan dengan  saponifikasi  untuk  mendapatkan  astaxanthin  bebas.  Hasil  ekstraksi  dan  saponifikasi  diidentifikasi  astaxanthinnya menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan spektrofotometri UV-Vis. Uji aktivitas antioksidan dilakukan pada lima variasi konsentrasi  sampel  menggunakan  metode  2,2-difenil-1-pikrilhidrazil  (DPPH).  Ekstraksi  limbah  kulit  dan  kepala  udang menghasilkan  rendemen  masing-masing  sebesar  3,05  dan  1,02%  massa  kering  dari  60  g  kulit  udang.  Hasil  identifikasi menunjukkan  kadar  astaxanthin dari ekstrak  setelah  saponifikasi lebih  tinggi  daripada  sebelum  saponifikasi. Terdapat tiga spot pemisahan kromatografi lapis tipis (KLT) serta dua puncak serapan UV-Vis pada ekstrak sebelum dan setelah saponifikasi. Hasil uji aktivitas antioksidan (IC 50 ) kulit udang sebelum dan setelah saponifikasi masing-masing adalah 572,000 dan 186,583 mg/L.
Kata kunci : astaxanthin, antioksidan, dogol. limbah udang, saponifikasi

## PENDAHULUAN
Astaxanthin ( 3,3′ -dihydroxy- β,β -carotene- 4,4′ -dione ) merupakan senyawa turunan karotenoid xantofil  dan  memiliki  beberapa  isomer  seperti trans -astaxanthin,  9- cis astaxanthin,  dan  13- cis astaxanthin (Su et al ., 2018; Song et al ., 2020).  Astaxanthin memiliki beragam manfaat yang telah ditunjukkan oleh banyak penelitian (Ambati et al ., 2014). Astaxanthin mampu meningkatkan ekspresi gen apoptosis, sehingga memiliki potensi dalam pencegahan dan pengobatan kanker (Hormozi et al .,  2019).  Manfaat  lain  dari  astaxanthin  yaitu  sebagai antiaging ,  dimana  astaxanthin  menekan pembentukan kerutan di wajah dan mempertahankan penghalang epidermal pada kulit, sehingga dapat digunakan sebagai bahan dalam produk kecantikan (Cheng et al ., 2019; Sztretye et al ., 2019).
Keunggulan lain dari astaxanthin adalah memiliki aktivitas antioksidan yang  tinggi karena struktur kimianya yang mengandung ikatan rangkap konjugasi pada pusat serta gugus hidroksil dan karbonil pada tiap cincin iononnya (Ambati et al ., 2014; Pereira et al ., 2021). Isomer geometri astaxanthin memainkan peranan penting dalam aktivitas antioksidannya (Brotosudarmo et al ., 2020).
Astaxanthin dapat ditemukan dalam alga, ragi, salmon, ikan trout, serta udang (Ambati, et al ., 2014). Udang merupakan hewan laut kaya akan astaxanthin kedua yang paling banyak dikonsumsi di dunia, dengan persentase penjualan secara internasional mencapai 16% dari total keseluruhan penjualan hewan laut (FAO, 2017). Udang sendiri merupakan salah satu komoditas perikanan yang ekonomis  dan  banyak  dikonsumsi  oleh  masyarakat  di  Kalimantan  Barat  (Hedianto et  al .,  2015; Purnamaningtyas  &  Hedianto,  2015).  Udang  dogol  ( Metapenaeus  ensis) merupakan  salah  satu udang yang paling dominan tertangkap di perairan Kalimantan Barat. Di Sungai Kakap, Kabupaten Kubu Raya, pada musim-musim tertentu, udang dogol dapat tertangkap lebih dari 100 kg per hari (Yerika et al ., 2023). Budidaya udang dogol secara luas juga telah dilakukan di beberapa negara.
Meningkatnya  konsumsi  udang  diiringi  pula  dengan  meningkatnya limbah  kulit  dan  kepala udang. Terlebih di Indonesia, udang diekspor dalam keadaan beku yang juga telah terlebih dahulu dibuang kepala dan kulitnya.  Jika tidak diatasi, limbah kulit dan kepala udang yang dibuang ke lingkungan  akan  menimbulkan  masalah  baru  seperti  bau  busuk  dan  menjadi  sumber  penyakit. Padahal,  limbah  udang  merupakan  sumber  alami  esensial  dari  astaxanthin  (Sachindra  & Mahendrakar, 2010), hal ini dibuktikan dalam sebuah penelitian mengenai kandungan astaxanthin dalam  empat  jenis  udang  yaitu Penaeus  monodon , Fenneropenaeus  chinensis , Litopenaeus vannamei , dan Exopalaemon carinicauda yang memperoleh kadar astaxanthin pada bagian kulit sebesar 75,13 – 91,99% dari total keseluruhan karotenoid yang terdapat dalam udang (Sachindra & Mahendrakar, 2010; Su et al ., 2018). Dalam penelitian lain, Qu et al . (2015) melaporkan bahwa udang dogol juga mengandung karotenoid astaxanthin, namun belum dilaporkan kandungannya secara kuantitatif.
Oleh  karena  alsan-alasan  tersebut,  dalam  penelitian  ini  telah  dilakukan  ekstraksi  dan  uji aktivitas antioksidan astaxanthin dari limbah kulit dan kepala udang dogol. Astaxanthin diekstraksi dilanjutkan dengan proses saponifikasi, bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh saponifikasi pada aktivitas antioksidan astaxanthin. Saponifikasi adalah proses  pemutusan rantai asam lemak pada astaxanthin dengan penambahan alkali sehingga diperoleh astaxanthin bebas (Song et al ., 2020; Montoya et al ., 2021). Kandungan astaxanthin dalam ekstrak juga ditentukan secara kuantitatif. Uji antioksidan  astaxanthin  baik  sebelum  dan  setelah  saponifikasi  dilakukan  menggunakan  metode DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil). Metode ini merupakan metode yang telah banyak digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan karena sederhana dan cepat (Chintong et al ., 2019). Parameter yang digunakan  untuk  mengukur  aktivitas  antioksidan  dengan  metode  DPPH  adalah  IC 50 ( Inhibition Concentration 50%),  yang  merupakan  konsentrasi  efisien  antioksidan  yang  dibutuhkan  untuk mereduksi konsentrasi awal DPPH sebesar 50% (Munteanu & Apetrei, 2021).

## MATERI DAN METODE
Ekstraksi  limbah  udang  dilakukan  dengan  merujuk  pada  metode  Rahmalia et  al .  (2022). Sebanyak  60  g  limbah  kulit  udang  yang  dikeringkan  dengan vacuum  drying ,  dihaluskan,  dan dimasukkan ke dalam soxhlet. Pelarut n -heksana dimasukkan ke dalam labu leher dua yang dirakit dengan soxhlet dan kondensor. Proses ekstraksi dilakukan hingga pelarut tidak berwarna. Campuran ekstrak dan pelarut dipisahkan dengan metode destilasi pada 65 ˚ C. Ekstrak yang dihasilkan dihitung rendemennya dengan Persamaan 1.
% rendemen= Massa ekstrak yang diekstraksi Massa udang kering x 100 (1)
Kandungan  astaxanthin  dalam  ekstrak  yang  diperoleh  kemudian  ditentukan  dengan spektrofotometri UV-Vis, mengacu pada metode Goula et al . (2017) dan Corbu et al . (2020) yang dimodifikasi.  Pengukuran  absorbansi  dilakukan  dengan  spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang 400-700 nm. Larutan astaxanthin standar dengan konsentrasi 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; dan 3 mg/L disiapkan dengan melarutkan astaxanthin standar dalam aseton, kemudian diukur absorbansinya menggunakan  panjang  gelombang  maksimum  astaxanthin  untuk  memperoleh  kurva  standar astaxanthin.  Pembacaan  konsentrasi  astaxanthin  menggunakan  absorbansi  maksimum  larutan standar, dan konsentrasi astaxanthin dalam ekstrak dihitung dengan kurva standar astaxanthin.
Astaxanthin  dalam  ekstrak  dipisahkan  dari  asam  lemak  dengan  saponifikasi.  Saponifikasi ekstrak  dilakukan  menggunakan  metode  Hu et  al .  (2019)  dan  Montoya et  al .  (2021) yang dimodifikasi. Larutan KOH dalam etanol dengan konsentrasi 10% diteteskan dalam ekstrak sambil diaduk dengan magnetic stirrer . Proses saponifikasi dilakukan selama 1 jam atau hingga terbentuk campuran yang homogen. Asam klorida yang diencerkan ditambahkan ke dalam campuran dan disesuaikan hingga pH bernilai 7. Campuran ekstrak dan KOH-etanol kemudian disentrifugasi selama 30 menit. Filtrat diambil, dikeringkan, dan dianalisis menggunakan KLT dan spektrofotometer UV-Vis.
Pengukuran  aktivitas  inhibisi  radikal  DPPH  mengacu  pada  metode  Dose et  al .  (2016)  dan Chintong et al . (2019) yang dimodifikasi. Larutan sampel berupa ekstrak kulit udang (sebelum dan sesudah  saponifikasi)  dalam  etil  asetat  dibuat  dengan  konsentrasi  sebesar  100  mg/L  kemudian diencerkan dalam lima variasi konsentrasi (10, 20, 30, 40, dan 50 mg/L) dan dimasukkan sebanyak 2 mL ke dalam tabung reaksi berbeda. Sebanyak 2 mL larutan DPPH 40 mg/L ditambahkan ke dalam masing-masing variasi konsentrasi. Campuran sampel dan DPPH diaduk, disimpan di dalam tempat gelap  dengan  suhu  ruang  selama  30  menit,  kemudian  absorbansinya  diukur  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang  516  nm.  Pengukuran  dilakukan  secara  triplo pada  masing-masing  variasi  konsentrasi.  Persentase  aktivitas  antioksidan  menggunakan  metode perendaman oleh radikal DPPH dilakukan dengan menghitung persen inhibisi DPPH, yang dihitung menggunakan Persamaan 2 (Chintong et al ., 2019).
%inhibisi DPPH = Akontrol - Asampel Akontrol x 100 (2)
A kontrol dan A sampel masing-masing merupakan absorbansi larutan DPPH dalam etil asetat dan larutan astaxanthin dalam DPPH. Persen inhibisi dan konsentrasi astaxanthin dalam DPPH kemudian diplotkan dalam persamaan linier y = ax + b yang digunakan untuk menghitung nilai IC 50 , dimana y (bernilai  50)  merupakan  penghambatan  sebesar  50%  dan  x  merupakan  nilai  IC 50 (Munteanu  & Apetrei, 2021).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Proses ekstraksi menggunakan metode sokletasi dengan pelarut n-heksana dalam penelitian ini  menghasilkan  ekstrak  kasar  kulit  dan  kepala  udang  berupa  minyak  berwarna  merah  pekat, mengindikasikan  kandungan  karotenoid  astaxanthin.  Warna  merah  tersebut  disebabkan  karena adanya  13  ikatan  rangkap  terkonjugasi  pada  astaxanthin  yang  berperan  sebagai  kromofor penangkap cahaya. Astaxanthin terikat sebagai ester dengan asam lemak dalam minyak udang (Nishida et al ., 2023). Rendemen ekstraksi terhadap kulit dan kepala udang yang dihasilkan dalam penelitian  ini  masing-masing  adalah  1,02  dan  3,05%.  Penelitian  Scurria et  al .  (2020)  yang  telah mengekstraksi minyak dari limbah kulit dan kepala udang Parapenaeus longirostris menggunakan pelarut limonena menghasilkan rendemen masing-masing 5.00 dan 1,12%. Perbedaan hasil dapat disebabkan oleh beberapa faktor diantaranya jenis udang, metode ekstraksi maupun pelarut yang digunakan (Parjikolaei et al ., 2017; Wang et al ., 2021). Habitat dan metabolisme yang berbeda pada udang juga dapat mempengaruhi rendemen ekstrak yang diperoleh (Sundalian et al ., 2021; Trianjari et al ., 2022).
Ekstrak yang diperoleh diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dan spektrofotometri UV-Vis. Analisis KLT dilakukan untuk mengetahui jumlah komponen yang terdapat pada ekstrak kulit dan kepala udang. Adapun eluen yang digunakan pada penelitian ini adalah n-heksana:aseton dengan  perbandingan  4:1.  Hasil  KLT  menunjukkan  adanya  3  spot  atau  noda  pemisahan  sampel ekstrak  kulit  dan  kepala  udang.  Setiap  noda  tersebut  dihitung  nilai Retardation  Factor (Rf)  dari perbandingan jarak yang ditempuh oleh noda dan jarak yang ditempuh oleh eluen. Nilai Rf yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan nilai Rf astaxanthin standar ( trans -astaxanthin), terdapat pada  Tabel  1.  Berdasarkan  Tabel  1,  dapat  dilihat  bahwa  pada  ekstrak  kulit  udang  terdapat kandungan  astaxanthin,  yang  ditunjukkan  pada  nilai  noda  kedua  dari  ekstrak  kulit  dan  kepala udang  hampir  sama  dengan  nilai  Rf  astaxanthin  standar.  Sedikit  perbedaan  nilai  Rf  disebabkan karena  astaxanthin  dalam  minyak  sebelum  saponifikasi  berada  dalam  bentuk  ester.  Dua  noda lainnya berasal dari isomer astaxanthin.
Identifikasi  dan  penentuan  kadar  astaxanthin  dalam  ekstrak  udang  dilakukan  dengan spektrofotometri UV-Vis menggunakan pelarut aseton. Spektra UV-Vis dari ekstrak kulit dan kepala udang serta  astaxanthin standar dapat dilihat pada Gambar  1.  Gambar 1  menunjukkan bahwa astaxanthin standar memiliki 1 puncak pada 478 nm, ekstrak kepala udang memiliki 2 puncak pada 445 dan 468 nm, dan ekstrak kulit udang memiliki 2 puncak pada 444 dan 467 nm. Terjadi pergeseran hipsokromik pada ekstrak kepala dan kulit udang, yaitu dari 478 ke 468 dan 467 nm. Hal ini dapat disebabkan  karena  astaxanthin  masih  terikat  dengan  asam  lemak  dalam  minyak,  serta kemungkinan  adanya  isomer  lain  astaxanthin  yang  terdapat  pada  ekstrak  udang.  Astaxanthin standar yang digunakan pada penelitian ini adalah trans -astaxanthin. Ekstrak udang yang diperoleh pada  penelitian  Gómez-Estaca et  al .  (2017)  mengandung cis -astaxanthin  di  samping trans - astaxanthin, dimana isomer cis -astaxantin memiliki panjang gelombang maksimum yang berbeda dengan trans -astaxanthin, yaitu pada 468 – 469 nm. Adapun puncak yang muncul pada panjang gelombang 444 nm pada ekstrak kulit udang dan 445 nm pada ekstrak kepala udang kemungkinan disebabkan  oleh  karotenoid  lain  yang  terdapat  pada  ekstrak  udang,  seperti β -karoten, cantaxanthin, lutein, dan zeaxanthin, yang memiliki panjang gelombang maksimum pada 445 – 450 nm (Gulzar et al ., 2020).
Gambar 1. Spektra UV-Vis Astaxanthin Standar ( ), Ekstrak Kepala Udang ( ), dan Ekstrak Kulit Udang ( ) sebelum Saponifikasi
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 400 450 500 550 600 650 700 A dso rb a n si
Panjang Gelombang (nm)

## Tabel 1. Nilai Rf pada Astaxanthin Standar dan Ekstrak Kulit dan Kepala Udang Sebelum Saponifikasi
Noda ke- Rf Sampel Ekstrak kulit udang Ekstrak kepala udang Astaxanthin standar 1 0,100 0,133 - 2 0,183 0,185 0,217 3 0,383 0,433 -
Penentuan  kadar  astaxanthin  dalam  ekstrak  udang  dilakukan  dengan  terlebih  dahulu menentukan  panjang  gelombang  maksimum  astaxanthin  standar  pada  rentang  400 – 700  nm. Adapun panjang gelombang maksimum astaxanthin standar dalam aseton yaitu 478 nm. Mauludia et al . (2021) dan Virchenko & Stefánsson (2023) juga melaporkan panjang gelombang yang sama untuk trans -astaxanthin  dalam  aseton,  masing-masing  477  dan  478  nm.  Panjang  gelombang  ini kemudian  digunakan  untuk  mengukur  absorbansi  astaxanthin  standar  pada  variasi  konsentrasi, untuk  memperoleh  kurva  standar  astaxanthin.  Kurva  standar  astaxanthin  dapat  dilihat  pada Gambar 2.  Kurva kalibrasi  menghasilkan persamaan linear y = 0,0922x  + 0,0003 dengan koefisien determinasi  (R 2 )  sebesar  0,998.  Persamaan  yang  diperoleh  digunakan  untuk  menghitung  kadar astaxanthin dalam ekstrak kulit dan kepala udang, dimana y merupakan kadar astaxanthin dan x merupakan absorbansi ekstrak kulit dan kepala udang yang diukur pada 478 nm.
Kadar astaxanthin dalam  ekstrak kulit udang sebesar 9,02 mg/g, dan dalam ekstrak kepala udang sebesar 4,02 mg/g. Hasil ini lebih tinggi dari penelitian Scurria et al . (2020) yang melaporkan bahwa  kandungan  astaxanthin  dalam  ekstrak  limbah  udang  yang  diekstraksi  menggunakan limonena adalah 72,42 μ g/g atau 0,072 mg/g. Penelitian Aneesh et al . (2023) yang menggunakan pelarut  superkritikal  CO 2 termodifikasi  etanol  yaitu  sebesar  0,030  mg/g,  dan  ekstrak  udang  pada penelitian Roy et al . (2020) yang menggunakan metode CO 2 superkritis dengan pelarut n-heksan yaitu sebesar 48,2 μ g/g atau 0,048 mg/g. Dave et al . (2020) melakukan ekstraksi astaxanthin dengan metode vortex dan sonikasi menggunakan aseton menghasilkan ekstrak dengan kadar astaxanthin sebesar 0,178 mg/g. Dalam kasus ini, jenis pelarut dan metode ekstraksi sangat mempengaruhi kadar astaxanthin dalam ekstrak.
Saponifikasi  merupakan  pemecahan  ester  menjadi  gliserol  dan  garam  karboksilat  dengan penambahan  alkali.  Saponifikasi  pada  penelitian  ini  menggunakan  larutan  KOH-etanol,  yang berperan sebagai alkali dalam deesterifikasi astaxanthin  (Song et al ., 2020; Montoya et al ., 2021). Mekanisme saponifikasi astaxanthin-ester disajikan pada Gambar 3. Saponifikasi dilakukan secara terpisah  pada  ekstrak  kepala  dan  kulit  udang.  Ekstrak  yang  diperoleh  diidentifikasi  dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dan spektrofotometri UV-Vis. Hasil KLT menunjukkan adanya noda yang sama pada astaxanthin standar dan ekstrak, namun baik pada ekstrak kepala dan kulit udang masih terdapat  dua  noda  lainnya  yang  berada  di  atas  dan  di  bawah  astaxanthin  standar.  Setelah saponifikasi,  noda  kedua  semakin  mendekati  kesamaan  dengan  nilai  Rf  astaxanthin  standar, mengindikasikan  saponifikasi  untuk  memecahkan  astaxanthin-ester  menjadi  astaxanthin  bebas telah berhasil. Dua noda yang lain juga mengalami sedikit pergeseran karena perubahan struktur geometrisnya.  Song et  al .  (2020)  melaporkan  bahwa  setelah  saponifikasi,  minyak  udang mengandung  3  isomer  astaxanthin  yang  dominan  yaitu all-trans ,  9- cis ,  dan  13- cis isomer  dari astaxanthin bebas.
Hasil  analisis  menggunakan  spektrofotometri  UV-Vis  menunjukkan  tidak  adanya  perubahan bentuk spektra  maupun  pergeseran panjang gelombang yang signifikan antara ekstrak sebelum dan setelah saponifikasi (Gambar 4). Hal ini terjadi karena antara astaxanthin ester dan astaxanthin bebas  tidak  memiliki  perdaan  kromofor.  Berdasarkan  pengukuran,  diperoleh  kadar  astaxanthin dalam ekstrak kulit dan kepala udang setelah saponifikasi masing-masing sebesar 12,06 dan 9,20
mg/g  dari  massa  ekstrak.  Ekstrak  setelah  saponifikasi  memiliki  kadar  astaxanthin  jauh  lebih  tinggi dibandingkan dengan sebelum saponifikasi, hal ini dapat disebabkan oleh ester astaxanthin yang mengalami  proses  pemisahan  dari  asam  lemak  sehingga  diperoleh  astaxanthin  bebas  dan meningkatkan kadar astaxanthin hasil perhitungan (Montoya et al ., 2021). Kadar astaxanthin yang diperoleh pada ekstrak hasil saponifikasi lebih besar dari hasil penelitian Hu, et al . (2019) yaitu sebesar 43,7 μ g/g dan Montoya et al . (2021) yaitu sebesar 26,7 μ g/g. Perbedaan kadar astaxanthin ini juga dipengaruhi oleh perbedaan pelarut, metode ekstraksi yang digunakan sebelum saponifikasi, serta teknik  saponifikasi.  Hu et  al .  (2019)  menggunakan  metode  ultasonikasi  dan  sentrifugasi  dengan pelarut etanol serta melakuan saponifikasi pada suhu 4°C, dan Montoya et al . (2021) menggunakan metode  ultrasonikasi  dengan  pelarut  aseton  serta  menggunakan  KOH-etanol  4%  dalam  sampel yang diencerkan kembali dalam aseton.
Gambar 2 . Kurva Standar Astaxanthin
Gambar 3. Reaksi Saponifikasi Astaxanthin
y = 0,0922x - 0,0003 R² = 0,998 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0 0,6 1,2 1,8 2,4 3 A b so rb a n si Konsentrasi (mg/L)
Tabel 2. Nilai Rf pada Astaxanthin Standar dan Ekstrak Kulit dan Kepala Udang Setelah Saponifikasi
Noda ke- Rf Sampel Ekstrak kulit udang Ekstrak kepala udang Astaxanthin standar 1 0,100 0,133 - 2 0,200 0,200 0,217 3 0,400 0,433 -
Gambar 4. Spektrum Serapan Astaxanthin Standar ( ), Ekstrak Kepala Udang ( ), dan Ekstrak Kulit Udang ( ) setelah Saponifikasi
Pengujian  aktivitas  antioksidan  diawali  dengan  menentukan  panjang  gelombang maksimum  larutan  DPPH,  yang  mana  panjang  gelombang  maksimum  yang  diperoleh  akan digunakan  pada  tahap  selanjutnya  yaitu  pengukuran  sampel.  Hasil  pengukuran  panjang gelombang  maksimum  DPPH  terdapat  pada  Gambar  5.  Berdasarkan  hasil  pengukuran  tersebut, diperoleh panjang gelombang maksimum sebesar 516 nm. Hasil ini sesuai dengan Sirivibulkovit et al . (2018) yang menyatakan bahwa panjang gelombang maksimum DPPH berada pada rentang 515- 520 nm. Panjang gelombang ini kemudian digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan pada sampel.
Aktivitas antioksidan sampel pada metode DPPH dinyatakan dalam bentuk persen inhibisi dan IC 50 . Astaxanthin merupakan salah satu senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi. Hal  ini  dikarenakan  astaxanthin  memiliki  gugus  hidroksil  (OH)  pada  cincin  iononnya  yang  dapat menjadi donor elektron untuk bereaksi dengan radikal bebas dan mengubahnya menjadi produk lebih  stabil  dan  menghentikan  pembentukan  radikal  bebas,  sehingga  menjadikan  astaxanthin memiliki aktivitas antioksidan yang kuat (Zuluaga et al ., 2018; Donoso et al ., 2021). Tan et al . (2021) melaporkan potensi antioksidan pada astaxanthin yang diperoleh dari alga merah dengan nilai IC 50 sebesar 15,39 mg/L. Hasil uji aktivitas antioksidan pada penelitian ini terdapat pada Tabel 3.
Berdasarkan  Tabel  3,  dapat  dilihat  bahwa  terdapat  peningkatan  pada  %inhibisi  dari konsentrasi 10 mg/L hingga 50 mg/L, yang menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi sampel dapat meningkatkan kemampuan sampel sebagai antioksidan dalam menangkal radikal bebas. Nilai  %inhibisi  yang  diperoleh  kemudian  digunakan  bersama  dengan  konsentrasi  sampel  untuk membuat  grafik  dengan  persamaan  regresi  linier,  dimana  persamaan  regresi  linier  ini  digunakan lebih lanjut untuk mendapatkan nilai IC 50 dari tiap sampel  uji, dengan  hasil yang terdapat pada Tabel 4.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 400 450 500 550 600 650 700 A dso rb a n si Panjang Gelombang (nm)

## Tabel 3 . Nilai % Inhibisi Ekstrak Kulit Udang pada Variasi Konsentrasi
Sampel % Inhibisi 10 mg/L 20 mg/L 30 mg/L 40 mg/L 50 mg/L Ekstrak kulit udang sebelum saponifikasi 27,34 28,71 29,55 29,92 30,79 Ekstrak kulit udang setelah saponifikasi 25,68 26,33 28,11 28,52 31,59 Ekstrak kepala udang sebelum saponifikasi 28,18 28,36 28,66 29,33 30,08 Ekstrak kepala udang setelah saponifikasi 25,68 26,33 28,11 28,52 31,59
Tabel 4 . Nilai IC 50 pada Ekstrak Kulit Udang
Sampel IC 50 (mg/L) Astaxanthin Standar 36,5 a Ekstrak kulit udang sebelum saponifikasi 572,0 Ekstrak kulit udang setelah saponifikasi 186,6 Ekstrak kepala udang sebelum saponifikasi 470,9 Ekstrak kepala udang setelah saponifikasi 947,9
a : Dirujuk dari Kamath et al. (2008)

## Gambar 5. Spektrum Serapan DPPH dalam Etil Asetat
Aktivitas antioksidan yang diperoleh jauh lebih kecil dari aktivitas antioksidan pada standar astaxanthin yang dilaporkan oleh Kamath et al . (2008) dengan IC 50 sebesar 36,5 mg/L. Rendahnya aktivitas antioksidan yang diperoleh pada penelitian ini disebabkan adanya senyawa lain dalam ekstrak  udang  yang  tidak  memiliki  aktivitas  antioksidan.  Ekstrak  udang,  di  samping  mengandung karotenoid seperti astaxanthin, juga mengandung asam lemak, fosfolipid, dan kolestrol  (Gulzar et al .,  2020).  Gómez-Estaca et  al .  (2017)  melaporkan  bahwa  minyak  udang Litopenaeus  vannamei mengandung  kolestrol  sebesar  65  mg/g,  dimana  kolestrol  merupakan  penyebab hiperkolesterolemia, pemicu penyakit serangan jantung dan stroke, sehingga keberadaan kolestrol dalam minyak udang mempengaruhi aktivitas antioksidan. Aktivitas antioksidan pada ekstrak kulit
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 400 450 500 550
600
650 700 750 800 Abso rba nsi Panjang Gelombang (nm) λ max = 516 nm
udang setelah saponifikasi lebih kuat dibandingkan dengan sebelum saponifikasi yang ditunjukkan dengan  berkurangnya  nilai  IC 50 dan  menunjukkan  efek  sinergisme  yaitu  peningkatan  kadar astaxanthin dalam ekstrak setelah dilakukan saponifikasi (Chen et al ., 2021).
Namun demikian, ekstrak kepala udang setelah saponifikasi mengalami penurunan aktivitas antioksidan. Hal ini kemungkinan disebabkan  karena  pada saat saponifikasi  kemungkinan  terjadi hidrolisis asam lemak menjadi asam lemak bebas (ALB) yang bersifat oksidan. Hidrolisis asam lemak menjadi  ALB  dipicu  karena  adanya  kandungan  air  dalam  sampel.  Dalam  penelitian  ini,  sampel kepala  udang  setelah  pengeringan  mengandung  air  dengan  jumlah yang  lebih  tinggi  daripada sampel  kulit  udang,  dimana  masing-masing  adalah  15,51  dan  1,25%.  Pada  ekstrak  kulit  udang dengan kandungan air yang jauh lebih kecil memicu terbentuknya astaxanthin bebas dan sabun asam  lemak.  Sementara  pada  ekstrak  kepala  udang  dengan  kandungan  air  yang  tinggi,  selain membentuk  astaxanthin  bebas  dan  sabun  asam  lemak,  juga  membentuk  ALB.  Fenomena  ini menjadi alasan menurunnya aktivitas antioksidan dari ekstrak kepala udang setelah saponifikasi.

## KESIMPULAN
Limbah kulit dan kepala udang dapat diolah menjadi produk yang lebih bermanfaat karena mengandung astaxanthin yang memiliki aktivitas antioksidan. Proses saponifikasi tanpa kehadiran air  dapat  meningkatkan  kandungan  astaxanthin  dalam  ekstrak  diiringi  dengan  meningkatnya aktivitas  antioksidan.  Dalam  penelitian  ini,  limbah  kulit  udang  setelah  saponifikasi  menunjukkan aktivitas  antioksidan  yang  lebih  tinggi  daripada  limbah  kepala  udang  dengan  perlakuan  yang sama.  Selanjutnya  untuk  meningkatkan  aktivitas  limbah  kulit  kepala  udang,  perlu  dilakukan pengeringan lebih lama untuk meminimalisir kandungan air sehingga mencegah terjadinya hidrolisis asam  lemak  menjadi  asam  lemak  bebas.  Pemurnian  astaxanthin  bebas  dari  ekstrak  juga  perlu dilakukan pada penelitian selanjutnya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  dibiayai  melalui  Hibah  Penelitian  Inovasi  Universitas  Tanjungpura  Tahun Anggaran 2023 Nomor 3919/UN22.10/PT.01.03/2023.

## DAFTAR PUSTAKA
Ambati, R.R., Moi, P.S., Ravi, S., & Aswathanarayana, R.G., (2014). Astaxanthin: Sources, Extraction, Stability, Biological Activities and Its Commercial  Applications - A Review, Marine Drugs , 12(1), 128 – 152. doi: 10.3390/md12010128
Aneesh, P.A., Anandan, R., Kumar, L.R.G., Ajeeshkumar, K.K., Kumar, K. A., & Mathew, S., (2023). A Step  to  Shell  Biorefinery — Extraction  of  Astaxanthin-Rich  Oil,  Protein,  Chitin,  and  Chitosan  from Shrimp Processing Waste, Biomass Conversion and Biorefinery , 13, 205-214. doi: 10.1007/s13399- 020-01074-5
Brotosudarmo, T.H.P., Limantara, L., Setiyono, E., & Heriyanto,  (2020). Structures of Astaxanthin and Their Consequences for Therapeutic Application, International Journal of Food Science , 2020, 1- 16. doi: 10.1155/2020/2156582
Donoso, A., González-Durán, J., Muñoz, A.A., González, P.A., & Agurto-Muñoz, C., (2021). Therapeutic Uses  of  Natural  Astaxanthin:  An  Evidence-based  Review  Focused  on  Human  Clinical  Trials, Pharmacological Research , 166, 1 – 12. doi: 10.1016/j.phrs.2021.105479
Chen, X., Li, H., Zhang, B., & Deng, Z., (2021). The Synergistic and Antagonistic Antioxidant Interactions of Dietary Phytochemical Combinations, Critical Reviews in Food Science and hyhh , 62(20), 5658 – 5677. doi: 10.1080/10408398.2021.1888693
Cheng, X.Y., Xiong, Y.J., Yang, M.M., & Zhu, M.J., (2019). Preparation of Astaxanthin Mask from Phaffia rhodozyma and  Its  Evaluation, Process  Biochemistry ,  79,  195 – 202.  doi:  10.1016/j.procbio. 2018.12.027
Chintong,  S.,  Phatvej,  W.,  Rerk-Am,  U.,  Waiprib,  Y.,  &  Klaypradit,  W.,  (2019).  In  Vitro  Antioxidant, Antityrosinase, and Cytotoxic Activities of Astaxanthin from Shrimp Waste, Antioxidants , 8(5), 1 – 11. doi: 10.3390/antiox8050128
Corbu, A.R., Rotaru, A., & Nour, V., (2020). Edible Vegetable Oils Enriched with Carotenoids Extracted from  By-Products  of  Sea  Buckthorn  ( Hippophae  rhamnoides ssp.  sinensis):  The  Investigation  of Some Characteristic Properties, Oxidative Stability and The Effect on Thermal Behaviour, Journal of Thermal Analysis and Calorimetry , 142(2), 735 – 747. doi: 10.1007/s10973-019-08875-5 Dave, D., Liu, Y., Pohling, J., Trenholm, S., & Murphy, W., (2020). Astaxanthin Recovery from Atlantic Shrimp ( Pandalus borealis ) Processing Materials, Bioresource Technology Reports , 11, 1 – 9. doi: 10.1016/j.biteb.2020.100535
Dose, J., Matsugo, S., Yokokawa, H., Koshida, Y., Okazaki, S., Seidel, U., Eggersdorfer, M., Rimbach, G.,  &  Esatbeyoglu,  T.,  (2016).  Free  Radical  Scavenging  and  Cellular  Antioxidant  Properties  of Astaxanthin, International Journal of Molecular Sciences , 17(1), 1 – 14. doi: 10.3390/ijms17010103 FAO,  (2017). Fisheries  and  Aquaculture  Statistics  Year  Book  of  2015 ,  Food  and  Argiculture Organization of the United Nations, Rome.
Gómez-Estaca,  J.,  Calvo,  M.M.,  Álvarez-Acero,  I.,  Montero,  P.,  &  Gómez-Guillén,  M.C.,  (2017).
Characterization and Storage Stability of A staxanthin Esters, Fatty Acid Profile and α -Tocopherol of Lipid Extract from Shrimp ( L. vannamei ) Waste with Potential Applications as Food Ingredient, Food Chemistry , 216, 37 – 44. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.08.016
Goula,  A.M.,  Ververi,  M.,  Adamopoulou,  A.,  &  Kaderides,  K.,  (2017).  Green  Ultrasound-Assisted Extraction  of  Carotenoids  from  Pomegranate  Wastes  Using  Vegetable  Oils, Ultrasonics Sonochemistry , 34, 821 – 830. doi: 10.1016/j.ultsonch.2016.07.022
Gulzar, S., Raju, N., Chandragiri Nagarajarao, R., & Benjakul, S., (2020). Oil and Pigments from Shrimp Processing  By-Products:  Extraction,  Composition,  Bioactivities  and  Its  Application-  A  Review,
Trends in Food Science and Technology , 100, 307 – 319. doi: 10.1016/j.tifs.2020.04.005
Hedianto, D.A., Purnamaningtyas, S.E., & Riswanto, R., (2015). Sebaran Dan Habitat Juvenil Udang Penaeid di Perairan Kubu Raya, Kalimantan Barat, BAWAL Widya Riset Perikanan Tangkap , 6(2), 77-88. doi: 10.15578/bawal.6.2.2014.
Hormozi,  M.,  Ghoreishi,  S.,  &  Baharvand,  P.,  (2019).  Astaxanthin  Induces  Apoptosis  and  Increases Activity of Antioxidant Enzymes in LS-180 cells. Artificial Cells, Nanomedicine and Biotechnology , 47(1):891 – 895. doi: 10.1080/21691401.2019.1580286
Hu, J., Lu, W., Lv, M., Wang, Y., Ding, R., & Wang, L., (2019). Extraction and Purification of Astaxanthin from  Shrimp  Shells  and  The  Effects  of  Different  Treatments  on  Its  Content, Revista  Brasileira  de Farmacognosia , 29(1), 24 – 29. doi: 10.1016/j.bjp.2018.11.004
Kamath, B.S., Srikanta, B.M., Darmesh, S.M., Sarada, R., & Ravishankar, G.A., (2008). Ulcer Preventive and Antioxidative Properties of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis , European Journal of Pharmacology , 590, 387 – 395. doi: 10.1016/j.ejphar.2008.06.042
Mauludia, Usman, T., Rahmalia, W., Prayitno, D.I., Nurbaeti, S.N., (2021). Ekstraksi, Karakterisasi dan Uji Aktivitas  Antioksidan  Astaxanthin  dari  Produk  Fermentasi  Udang  (Cincalok), Jurnal  Kelautan Tropis , 24(3), 311-322. doi: 10.14710/jkt.v24i3.10497
Montoya, J.M., Mata, S.V., Acosta, J.L., Cabrera, B.E.H., Valdez, L.G.L., Reyes, C., & Cureño, H.J.B., (2021). Obtaining of Astaxanthin from Crab Exosqueletons and Shrimp Head Shells, Biointerface Research in Applied Chemistry , 11(5), 13516 – 13523. doi: 10.33263/BRIAC115.1351613523 Munteanu, I.G., & Apetrei, C., (2021). Analytical Methods Used in Determining Antioxidant Activity: A Review, International Journal of Molecular Sciences , 22(7), 1 – 30. doi: 10.3390/ijms22073380
Nishida,  Y.,  Berg,  P.C.,  Shakersain,  B.,  Hecht,  K.,  Takikawa,  A.,  Tao,  R.,  Kakuta,  Y.,  Uragami,  C., Hashimoto, H.,  Misawa,  N., &  Maoka, T.,  (2023).  Astaxanthin: Past,  Present, and Future,  Marine Drugs, 21(10), 1-156, doi: 10.3390/md21100514
Parjikolaei, B.R., Errico, M., Bahij El-Houri, R., Mantell, C., Fretté, X.C., & Christensen, K.V., (2017). Process Sesign and Economic Evaluation of Green Extraction Methods for Recovery of Astaxanthin from Shrimp  Waste, Chemical  Engineering  Research  and  Design ,  117,  73 – 82.  doi: 10.1016/j.cherd.2016.10.015
Pereira, C.P.M., Souza, A.C.R., Vasconcelos, A.R., Prado, P.S., & Name, J.J., (2021). Antioxidant and Anti-Inflammatory  Mechanisms  of  Action  of  Astaxanthin  in  Cardiovascular  Diseases  (Review), International Journal of Molecular Medicine , 47(1), 37 – 48. doi: 10.3892/ijmm.2020.4783
Purnamaningtyas, S.E., & Hedianto, D.A., (2015). Food Habit and Tropic Level of Some Penaid Shrimp and  Fish  Species  in  Muara  Kakap  Coastal,  West  Kalimantan, BAWAL  Widya  Riset  Perikanan Tangkap , 7(2), 95 – 102. doi: 10.15578/bawal.7.2.2015.95-102
Qu  J.H.,  Cheng,  J.H.,  Sun,  D.W.,  Pu,  H.,  Wang,  Q.J.,  &  Ma,  J.,  (2015).  Discrimination  of  Shelled ( Metapenaeus ensis ) Among Frresh, Frozen-Thawed and Cold-Stored by Hyperspectral Imaging Technique, LWT-Food Science and Technology, 62(1), 202-209. doi: 10.1016/j.lwt.2015.01.018
Rahmalia, W., Dasilia, C., Usman, T., Prayitno, D.I., & Nurbaeti, S.N., (2022). Astaxanthin and Omega- 3-Rich  Oil  from  Fermented Acetes (Cincalok)  and  Its  Application  as  Bioactive  Additive  and Sunscreen in Lotion, Oilseeds and Fats, Crops and Lipids , 29, 1 – 8. doi: 10.1051/ocl/2022012 Roy, V.C., Getachew, A.T., Cho, Y.J., Park, J.S., & Chun, B.S., (2020). Recovery and Bio-Potentialities of Astaxanthin-Rich Oil from Shrimp ( Peneanus monodon ) Waste and Mackerel ( Scomberomous niphonius ) Skin Using Concurrent Supercritical CO 2 Extraction, Journal of Supercritical Fluids , 59,
1 – 10. doi: 10.1016/j.supflu.2020.104773
Sachindra, N.M., & Mahendrakar, N.S., (2010). Stability of Carotenoids Recovered from Shrimp Waste and Their Use as Colorant in Fish Sausage, Journal of Food Science and Technology , 47, 77 – 83. doi: 10.1007/s13197-010-0019-z
Scurria,  A.,  Fabiano  Tixier,  A.S.,  Lino,  C.,  Pagliaro,  M.,  D’Agostino,  F.,  Avellone,  G.,  Chemat,  F.,  & Ciriminna,  R.,  (2020).  High  Yields  of  Shrimp  Oil  Rich  in  Omega-3  and  Natural  Astaxanthin  from Shrimp Waste, ACS Omega , 5(28), 17500 – 17505. doi: 10.1021/acsomega.0c01978 Sirivibulkovit, K., Nouanthavong, S., & Sameenoi, Y., (2018). Paper-based DPPH Assay for Antioxidant Activity Analysis, Analytical Sciences, 34(7), 795 – 800. doi: 10.2116/analsci.18P014
Song, R., Jia, Z., Xu, Y., Zhang, X., Wei, R., & Sun, J., (2020). Saponification to Improve the Antioxidant Activity of Astaxanthin Extracts from Penaeus sinensis ( Solenocera crassicornis ) By-Products and Intervention Effect on Paracetamol-Induced Acute Hepatic Injury in Rat, Journal of Functional Foods , 73 , 1 – 12. doi: 10.1016/j.jff.2020.104150
Su,  F.,  Huang,  B.,  &  Liu,  J.,  (2018).  The  Carotenoids  of  Shrimps  (Decapoda:  Caridea  and Dendrobranchiata)  Cultured  in  China, Journal  of  Crustacean  Biology ,  38(5),  523 – 530.  doi: 10.1093/jcbiol/ruy049
Sundalian, M., Sri Gustini, S.G., & Rishadi, F.F., (2021). Kajian Metode Ekstraksi dan Analisis Senyawa Astaxanthin  yang  Terkandung  dalam  Udang, Jurnal  Sains  dan  Kesehatan ,  3(4),  601 – 610.  doi: 10.25026/jsk.v3i4.337
Sztretye,  M.,  Dienes,  B.,  Gönczi,  M.,  Czirják,  T.,  Csernoch,  L.,  Dux,  L.,  Szentesi,  P.,  &  Keller-Pintér,  A, (2019). Astaxanthin: A Potential Mitochondrial-Targeted Antioxidant Treatment in Diseases and with Aging, Oxidative Medicine and Cellular Longevity , 2019, 1 – 14. doi: 10.1155/2019/3849692 Tan, Y., Ye, Z., Wang, M., Manzoor, M.F., Aadil, R.M., Tan, X., & Liu, Z., 2021, Comparison of Different Methods for Extracting the Astaxanthin from Haematococcus pluvialis : Chemical Composition and Biological Activity, Molecules , 26 (12), 1 – 13. doi: 10.3390/molecules26123569
Trianjari, N., Amiruddin, A., & Ardiana, S., (2022). Pengaruh Species Udang terhadap Rendemen yang Dihasilkan, Jurnal Pendidikan Teknologi Pertanian , 8(2), 145 – 152. doi: 10.26858/jptp.v8i2.28054 Virchenko, O., & Stefánsson, T., (2023). Light Increases AstaxanthinAbsorbance in Acetone Solution through Isomerization Reactions, 28(847), 1-15. doi: 10.3390/molecules28020847
Wang, J.L., Yu, Z. L., Yin, F. W., Li, D. Y., Liu, H.L., Song, L., & Zhou, D.Y., (2021). Comparison of Different Solvents for Extraction of Oils from By-Products of Shrimps Penaeus vannamei and Procambarus clarkia , Journal of Food Processing and Preservation , 45(9), 1 – 9. doi: 10.1111/jfpp.15754 Yerika, V., Soetignya, W.P., & Hadinata, F.W., (2023). Status Stok Udang Dogol ( Metapenaeus ensis ) yang  Didaratkan  di  TPI  Sungai  Kakap  Kabupaten  Kubu  Raya,  12(4),  1243-1255.  doi: 10.26418/jspe.v12i4.69624
Zuluaga, M., Gueguen, V., Letourneur, D., & Pavon-Djavid, G., (2018). Astaxanthin-Antioxidant Impact on Excessive Reactive Oxygen Species Generation Induced by Ischemia and Reperfusion Injury, Chemico-Biological Interactions , 279, 145 – 158. doi: 10.1016/j.cbi.2017.11.012