ISSN: 1410-8917 e-ISSN: 2597-9914
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 198 – 204

## Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi
Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolation of Phenolic Acid Compounds and Antioxidant Tests from Mindi Leaves ( Melia azedarach L.)
Andriyani Budi Listyo a , Dewi Kusrini a,* , Enny Fachriyah a
a Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: dewi.kusrini@live.undip.ac.id
https://doi.org/10.14710/jksa.21.4.198-204
A r t i c l e   I n fo

## A b s t r a c t
Article history:
Received: 6 August 2018
Revised: 26 October 2018 Accepted: 26 October 2018 Online: 31 October 2018
Keywords: Melia azearach L.;
phenolic acid; DPPH
Melia azedarach L plant categorized as traditional medicinal plant is normally used as a medicine for cough, skin diseases, drug for malaria, diabetes, colon cancer, jaundice, vaginal discharge, fever and scabies. Melia azedarach leaves contain steroid, terpenoid, alkaloid, tannin, saponin, phenolic and flavonoid compounds. The purpose of this study was  isolation  of  phenolic  acid  compounds  and  antioxidant  activity  test  from Melia azedarach L. Leaves. The method used to isolate phenolic acid using 3 ways that were alkaline  hydrolysis  (HB),  acid  hydrolysis  (HA),  and  without  hydrolysis  (TH).  The separation of phenolic acid which has Rf not the same as standard phenolic acid was undertaken by preparative TLC and characterized using UV-Vis spectrophotometer, FT- IR, and LC-MS. Moreover, antioxidant test of phenolic acid using DPPH method was also conducted. The results showed that isolation of Melia azedarach L. Leaves resulted in HB, HA  and  TH  fractions  with  the  weight  of  1.05  grams,  1.26  grams  and  1.38  grams, respectively.  The  identification  of  phenolic  acid  which  has  Rf  the  same  as  standard phenolic acids was ferulic acid. While result of phenolic acid (FA) isolates which has Rf not the same as phenolic acids standard was caffeic acid after the identifying using UV- Vis spectrophotometer, FTIR and LC-MS. Qualitative antioxidant activity test showed that FA isolate had IC 50 of 168,650 ppm. This result indicated that FA isolate is potential as antioxidant compound.

## A b s t r a k
Kata Kunci: Melia azedarach L.; asam fenolat; DPPH Tanaman
Melia azedarach L, termasuk tanaman obat tradisional, masyarakat Indonesia menggunakannya  sebagai  obat  batuk,  penyakit  kulit,  obat  malaria,  diabetes,  kanker gangguan  perut,  sakit  kuning,  keputihan,  demam  dan  kudis.  Daun Melia  azedarach mengandung senyawa golongan steroid, terpenoid, alkaloid, tannin, saponin, fenolik, dan flavonoid. Tujuan penelitian ini yaitu: isolasi senyawa asam fenolat dan uji aktivitas antioksidan  dari  Daun Melia azedarach L.  Metode  yang digunakan  untuk  isolasi asam fenolat  dengan  3  cara  yaitu  hidrolisis  basa  (HB),  hidrolisis  asam  (HA),  dan  tanpa hidrolisis (TH). Pemisahan asam fenolat yang Rf nya tidak sama dengan asam fenolat standar  dipisahkan  dengan  KLT  preparatif  dan  diidentifikasi  menggunakan spektrofotometer UV-Vis, FT-IR , dan LC-MS , serta uji antioksidan isolat asam fenolat dengan  metode  DPPH.  Hasil  isolasi  diperoleh  fraksi  HB,  HA  dan  TH  masing-masing sebesar 1,05 gram, 1,26 gram dan 1,38 gram. Identifikasi asam fenolat yang sejajar Rfnya dengan asam fenolat standar adalah asam ferulat. Sedangkan hasil analisis isolat asam fenolat (FA) yang Rfnya tidak sejajar dengan asam fenolat standar adalah asam kafeat setelah  diidentifikasi  dengan  spektrofotometer UV-Vis,  FTIR dan LC-MS .  Pada  uji aktivitas antioksidan secara kuatitatif menunjukkan bahwa isolat FA mempunyai IC 50 sebesar  yaitu 168,650  ppm.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  isolat  FA berpotensi  sebagai senyawa antioksidan.

## 1. Pendahuluan
Indonesia merupakan negara beriklim tropis yang di dalamnya banyak memiliki keanekaragaman hayati yang
dimanfaatkan  sebagai  sumber  obat  tradisional.  Salah satunya adalah tanaman mindi ( Melia azedarach L.) yang termasuk  tanaman  tahunan dan  tergolong dalam  famili Meliaceae.  Tanaman  ini  dapat  tumbuh  subur  di
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 198 – 204
Indonesia,  mempunyai  daun  yang  lebat  berwarna  hijau dengan  bau  yang  tidak  sedap  serta  rasanya  pahit  sekali [1].  Bagian  daun  dan  bahkan  seluruh  tanaman  telah digunakan  untuk  pengobatan  sejumlah  penyakit  oleh masyarakat  Indonsia  antara  lain,  batuk,  penyakit  kulit, obat  malaria,  diabetes  [2,  3],  kanker  gangguan  perut, sakit kuning, keputihan, demam dan kudis [3]. Penelitian sebelumnya pada ekstrak daun mindi ternyata memiliki aktivitas sebagai antioksidan, antibakteri, analgesik [4], antidiabetes, antihipertensi, antireumatik [1], insektisida,  rodentisida,  dan  fungisida  [1],  insektisida, rodentisida, dan fungisida [5].
Kandungan metabolit sekunder dalam ekstrak etanol pada daun Melia azedarach antara lain: steroid, terpenoid, alkaloid,  tannin,  saponin,  fenolik,  dan  flavonoid  serta dalam  ekstrak  ini  yang  paling  dominan  metabolit skundernya adalah senyawa fenolik [6]. Peneliti lainnya menyatakan  bahwa  ekstrak  daun Melia  azedarach L, mengandung kaemfeol, kuersetin, stigmasterol, kampesterol, β -  sitosterol,  diterpene,  3-metildekanoat, heptadekanoat, asam heksadekanoat, asam pentadekanoat, β -karoten, tokoferol [7]. Senyawa fenolik dari  ekstrak  daun Melia  azedarach yang  telah  berhasil diidentifikasi  dengan  metode  HPLC  adalah  asam protokatekat  merupakan  komponen  mayoritas  serta asam galat, asam siringat, asam ferulat, asam quinat dan asam sinapat yang merupakan golongan asam fenolat [8].
Uji  aktivitas  antioksidan  ekstrak  etanol  daun Melia azedarach L telah dilaporkan memiliki harga IC 50 sebesar 0.0054 μg/ml [7],  harga  ini menunjukkan aktivitas anti oksidan  yang  kuat,  sehingga  perlu  dicari  senyawa  yang dominan dalam aktivitas tersebut.

## 2. Metodologi Penelitian

## 2.1. Persiapan Sampel
Sampel  penelitian  berupa  daun Melia  azedarach L yang  diperoleh  dari  daerah  sekitar  Purworejo,  Jawa tengah.  Daun Melia  azedarach setelah  dibersihkan  dan dikeringkan  dengan  cara  diangin-anginkan  tanpa terkena sinar matahari selanjutnya dihaluskan sehingga menjadi serbuk

## 2.2. Pembuatan Ekstrak Etanol
Serbuk  daun Melia  azedarach L  sebanyak  1  kg dimaserasi  dengan  pelarut  etanol  96%  dengan pergantian pelarut setiap 24 jam sekali sehingga jernih, selanjutnya dipisahkan. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan rotary  evaporator sehingga  didapatkan  ekstrak kental etanol dan ditimbang.
Senyawa-senyawa non polar dipisahkan dari ekstrak etanol dengan cara diekstraksi dengan pelarut n-heksana menggunakan  corong  pisah  sehingga  membentuk lapisan  n-heksana  dan  lapisan  etanol  selanjutnya dipisahkan.

## 2.3. Penapisan Fitokimia
Untuk  identifikasi  awal  terhadap  simplisia  daun Melia azedarach dilakukan uji penapisan fitokimia untuk mengetahui kandungan golongan senyawa kimianya. Uji
yang  dilakukan  meliputi  uji  fenolik,  uji  flavonoid,  uji tanin, uji saponin, uji alkaloid, uji steroid dan triterpenoid [9].

## 2.4. Isolasi Asam Fenolat
Isolasi  asam  fenolat  dilakukan  terhadap  ekstrak etanol dengan menggunakan tiga metoda yaitu hidrolisis basa, hidrolisis asam, dan tanpa hidrolisis [10].

## 2.4.1. Hidrolisis Basa
Untuk mengisolasi asam fenolat dalam bentuk ester, maka dilakukan hidrolisis basa terhadap ekstrak etanol. Metoda  yang  dilakukan  sebanyak  100  mL  ekstrak dicampur dengan 100 mL NaOH 1 N didiamkam selama 24 jam  di  ruang  gelap.  Hasil  hidrolisis  selanjutnya ditambahkan  H 2 SO 4 10%  sampai  pH  3,  kemudian diekstraksi dengan 100 mL eter untuk memisahkan asam fenolat dengan senyawa lain. Fraksi eter yang diperoleh diuapkan dengan rotary evaporator hingga volume 80 mL dan di ekstraksi dengan NaHCO 3 20% untuk memisahkan asam fenolat dengan senyawa fenol lainnya. Lapisan air diasamkan  dengan  H 2 SO 4 10%  sampai  pH3  dan diekstraksi  dengan  eter.  Fraksi  eter  diuapkan  sampai kering,  residu  dilarutkan  dalam  1  mL  metanol  dan selanjutnya disebut fraksi HB [11].

## 2.4.2. Hidrolisis Asam
Untuk  mengisolasi asam  fenolat  dalam  bentuk glikosida,  maka  dilakukan  hidrolisis  asam  terhadap ekstrak etanol. Metoda yang dilakukan: Sebanyak 100 mL ekstrak etanol dicampur dengan 100 mL H 2 SO 4 2N di atas penangas  air  selama  2  jam  pada  suhu  60°C.  Hasil hidrolisis  selanjutnya  diekstraksi  dengan  100  mL  eter untuk  memisahkan  asam  fenolat  dengan  senyawa lainnya. Fraksi eter yang diperleh diuapkan dengan rotary evaporator sehingga  volume  tinggal  80  mL  dan diekstraksi  dengan  NaHCO 3 20%  untuk  memisahkan asam fenolat dengan senyawa fenol lainnya. Lapisan air diasamkan  dengan  H 2 SO 4 10%  sampai  pH  3  dan diekstraksi  dengan  eter.  Fraksi  eter  diuapkan  sampai kering dan residunya dilarutkan dalam 1 mL metanol dan selanjutnya disebut fraksi HA [11].

## 2.4.3. Tanpa Hidrolisis
Untuk  mengisolasi  asam  fenolat  bebas,  maka dilakukan  metoda  isolasi  terhadap  ekstrak  etanol  tanpa dihidrolisis.  Metoda  yang  dilakukan:  Sebanyak  100  mL ekstrak etanol diasamkan dengan H 2 SO 4 10% sampai pH 3,  selanjutnya  diekstraksi  dengan  100  mL  eter  untuk memisahkan  asam  fenolat  dengan  senyawa  lain.  Fraksi eter yang dihasilkan diuapkan dengan rotarry evaporator hingga  volume  80  mL  dan  di  ekstraksi  dengan  NaHCO 3 20%  untuk  memisahkan  asam  fenolat  dengan  senyawa fenol  lainnya.  Lapisan  air  kemudian  diasamkan  dengan H 2 SO 4 10%  sampai  pH  3  dan  diekstraksi  dengan  eter. Fraksi  eter  selanjutnya  diuapkan  sampai  kering  dan residunya  dilarutkan  dalam  1  mL  metanol  selanjutnya disebut fraksi TH [11].

## 2.5. Pemisahan Asam Fenolat
Asam-asam  fenolat  yang  terisolasi  ke  dalam  fraksi HA,  HB,  dan  TH  dilakukan  pemisahan  menggunakan
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 198 – 204
metoda kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fasa diam silika gel GF 254 dan eluen campuran dengan perbandingan tertentu.  Noda  yang  dihasilkan  pada  KLT  selanjutnya disemprot  dengan  pereaksi  FeCl 3 dan  dibandingkan dengan senyawa standar. Noda yang tidak sejajar dengan senyawa standar selanjutnya dipisahkan dengan metoda KLT  preparatif  menggunakan  eluen  kloroform:  etil asetat:  asam  asetat  (50:50:3).  Pita-pita  yang  terdapat pada  KLT  preparatif  selanjutnya  dikerok  untuk memperoleh isolat asam fenolat.

## 2.6. Uji kemurnian isolat asam fenolat
Uji kemurnian isolat asam fenolat dilakukan dengan metoda  KLT  menggunakan  berbagai  eluen  tunggal  dan campuran. KLT dua dimensi juga dilakukan dengan eluen campuran dan setelah diputar 90 o C digunakan eluen yang berbeda . [12].

## 2.7. Karakterisasi Isolat Asam Fenolat
Isolat  asam  fenolat  murni,  selanjutnya  di karakterisasi  untuk  mengetahui  struktur  molekulnya dengan menggunakan metode spektrofotometer UV-Vis, FT-IR , dan LC-MS.

## 2.8. Uji Antioksidan
Uji  antioksidan  terhadap  isolate  asam  fenolat, dilakukan  baik  secara  kualitatif  maupun  kuantitatif dengan  metode  DPPH.  Uji  antioksidan  secara  kualitatif menggunakan  metode  KLT  dengan  eluen  yang  cocok. Setelah  lempeng  dikeringkan  selanjutnya  disemprot dengan larutan DPPH 0,1 mM.
Uji  antioksidan  secara  kuantitatif  terhadap  isolat asam fenolat dibuat dengan berbagai konsentrasi 20, 40, 60, 80 dan 100 mg/L. Masing-masing konsentrasi isolat asam  fenolat  sebanyak  0,2  mL  dimasukkan  ke  dalam botol vial, kemudian ditambahkan 3,8 mL larutan DPPH 0,1 mM. Campuran dihomogenkan dan didiamkan selama 30  menit  dalam  ruangan  gelap.  Perlakuan  yang  sama dilakukan  terhadap  asam  galat  standar  sebagai pembanding dengan variasi konsentrasi (5, 10, 15, 20, dan 25 ppm).
Kemampuan untuk meredam radikal DPPH (inhibisi) dapat dihitung menggunakan persamaan berikut:
% inhibisi = A kontrol (DPPH)−A sampel A kontrol (DPPH) x 100%
Besarnya  konsentrasi  larutan  uji  untuk  meredam 50%  aktivitas  radikal  bebas  DPPH  ditentukan  dengan nilai  IC 50 yang  dihitung  dari  persentase  penghambatan berbagai  konsentrasi  dengan  menggunakan  persamaan yang diperoleh dari kurva regresi linier [13, 14].

## 3. Hasil dan Pembahasan
Kandungan golongan senyawa metabolit sekunder di dalam daun Melia azedarach L diketahui setelah dilakukan uji penapisan fitokimia. Hasil penapisan fitokimia dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 . Hasil uji penapisan fitokimia serbuk daun Melia azedarach L.
Uji Hasil
Alkaloid + Flavonoid +
Triterpenoid -
Steroid +
Saponin + Tanin +
Fenolik +
Dari  uji  fitokimia  serbuk  daun Melia  azedarach mengandung  senyawa  golongan:  alkaloid,  flavonoid, steroid, saponin, tannin dan fenolik. Untuk mengetahui adanya  senyawa  fenolik  dalam  daun Melia  azedarach , maka  selanjutnya  akan  dilakukan  isolasi  asam  fenolat dari  serbuk  daun Melia  azedarach serta  di  identifikasi strukturnya  menggunakan  metoda  spektrofotometer UV-Vis, FT-IR dan LC-MS.

## 3.1. Isolasi Senyawa Asam Fenolat
Isolasi  asam  fenolat  dari  ekstrak  etanol  hasil maserasi  dilakukan  dalam  tiga  metode,  yaitu  hidrolisis basa  (HB),  hidrolisis  asam  (HA),  dan  tanpa  hidrolisis (TH). Untuk mengisolasi asam fenolat dalam bentuk ester dilakukan  hidrolisis  basa.  Pada  tahap  ini  digunakan larutan  NaOH  1  N  untuk  mengisolasi  asam  fenolat  dari bentuk  ester,  dimana  gugus  ester  akan  mengalami hidrolisis dengan NaOH dan air. Untuk mengisolasi asam fenolat  dari bentuk  glikosida dilakukan  hidrolisis  asam. Pada  tahap  ini  digunakan  H 2 SO 4 2N  untuk  memutuskan ikatan  glikosida  sehingga  asam  fenolat  dapat terpisahkan.  Isolasi  asam  fenolat  dalam  bentuk  bebas dilakukan  tanpa  hidrolisis  bertujuan  untuk  mengambil asam fenolat bebas. Fraksi HB, HA, dan TH hasil hidrolisis masing-masing  sebesar  1,05  gram,  1,26  gram  dan  1,38 gram. Ketiga fraksi tersebut (HB, HA dan TH) dilarutkan dalam methanol dan dilakukan pemisahan menggunakan metoda KLT.

## 3.2. Pemisahan Asam Fenolat
Pemisahan  asam-asam  fenolat  dari  fraksi  HB,  HA dan  TH  dilakukan menggunakan  KLT  dengan  fase  diam silika  gel  GF 254 ukuran  10  x  10  cm  dan  eluen  campuran kloroform: etil asetat: asam asetat (50:50:3) sebagai fase gerak. Noda-noda yang terbentuk dari fraksi HB, HA dan TH  dibandingkan  dengan  noda-noda  dari  asam  fenolat standar.
Hasil KLT dari ketiga fraksi dalam gambar 1, terlihat ada satu noda yang sejajar dan memiliki R f , yang hampir sama, sehingga dapat diduga bahwa dalam ketiga fraksi tersebut mempunyai senyawa asam fenolat yang sama.
Identifikasi  selanjutnya  dengan  membandingkan noda-noda  dari  ketiga  fraksi  dengan  asam  fenolat standar (asam ferulat, asam pirogalol, asam galat, asam kafeat  dan  asam  salisilat).  Hasil  yang  diperoleh  terlihat noda-noda  yang  sejajar  dari  ketiga  fraksi  tersebut, memiliki noda yang sejajar pula dengan salah satu asam
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 198 – 204
fenolat standar yaitu asam ferulat dengan R f = 0,63. Hasil KLT dapat dilihat di gambar 1.

## I                                                 II
Gambar 1 . Hasil KLT fraksi HB, HA, dan TH dibandingkan dengan senyawa pembanding diamati pada sinar UV 254 nm (I) dan setelah disemprot pereaksi FeCl 3 (II).
Keterangan:  HB:Fraksi  Hidrolisis  Basa  (R f noda  ke- 3 : 0,65),  HA:Fraksi  Hidrolisis  Asam  (R f noda  ke-5 : 0,63), TH:Fraksi Tanpa Hidrolisis (R f noda ke-4:0,63), G: Asam Galat  (R f :  0,133),  K:  Asam  Kafeat  (R f :  0,43),  F:  Asam Ferulat (R f : 0,633), P: Asam Progalol (R f : 0,56), S: Asam Salisilat (R f : 0,683)
Pada hasil KLT di atas ada satu noda lagi dari ketiga fraksi  yang  sejajar  dan  terlihat  dominan  (konsentrasi lebih  tinggi),  tetapi  tidak  sejajar  dengan  asam  fenolat standar yaitu noda ke 2 (HB), noda ke 3 (HA) dan noda ke 3 (TH). Selanjutnya ketiga noda dari ketiga fraksi tersebut dipisahkan dengan metoda KLT.

## 3.3. Pemisahan senyawa fenolat dengan metoda
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Pemisahan noda ke-2 fraksi HB, noda ke-3 fraksi HA, dan  noda  ke-3  fraksi  TH  menggunakan  metoda  KLT preparatif dengan eluen campuran kloroform: etil asetat: asam  asetat  (50:50:3).  Setelah  dilakukan  elusi  terlihat pita-pita  asam  fenolat  yang  terkandung  dalam  fraksi (HB, HA, TH) yang sejajar selanjutnya disebut fraksi (FA) terlihat pada gambar 3.
Gambar 3. Hasil KLT preparatif fraksi HB (A), HA (B), dan TH (C) dengan eluen kloroform: etil asetat: asam asetat (50:50:3) diamati pada sinar UV 254 nm.
Selanjutnya  isolat  FA  dikerok  dan  dilarutkan kedalam  pelarut  metanol,  kemudian  disaring  dan diuapkan  selanjutnya  dilakukan  uji  kemurnian  dengan metoda  KLT  menggunakan  berbagai  eluen  tunggal, campuran, seperti yang terlihat pada gambar 4.
Gambar 4. Hasil uji kemurnian isolat (FA) dengan berbagai eluen tunggal dan campuran.
Keterangan:
✓ Fasa gerak (A) = etanol
✓ Fasa gerak (B) = etil asetat
✓ Fasa gerak (C) = etanol: etil asetat (1:1)
✓ Fasa gerak (D) = kloroform: etil asetat:  asam asetat (50:50:3)
✓ Fasa gerak (E) = kloroform: etil asetat: asam asetat (30:50:3)
Isolat  FA  dilakukan  juga  uji  kemurnian  dengan metode KLT 2 dimensi yang ditunjukkan pada gambar 5.
Gambar 5. Uji kemurnian isolat FA dengan metode KLT 2 dimensi.
Keterangan:
✓ Fasa  gerak  1:  kloroform:  etil  asetat:  asam  asetat (40:50:3)
✓ Fasa  gerak  2:  kloroform:  etil  asetat:  asam  asetat (50:40:6)
Uji  kemurnian  yang  dilakukan  dengan  metoda  KLT menggunakan  eluen  yang  berbeda  yang  hasilnya  dapat dilihat  pada  gambar  4  dan  5,  ternyata  dari  setiap  hasil KLT  hanya  ada  satu  noda  yang  berwarna  biru,  hal  ini menunjukkan  bahwa  isolat  FA  hanya  ada  satu  senyawa sehingga diduga bahwa isolat FA yang didapatkan sudah murni. Selanjutnya untuk mengetahui struktur dari isolat FA, maka dilakukan identifikasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis, FT-IR dan LC-MS. 3.4. Identifikasi Struktur Isolat FA Hasil analisis isolat FA menggunakan
spektrofotometer UV-Vis, dapat dilihat pada gambar 6.
Gambar 6. Spektrum UV-Vis isolat asam fenolat (FA) dalam metanol.
Hasil  analisis  menggunakan  UV-Vis  didapatkan panjang gelombang maksimum isolat FA adalah 217 nm, 295  nm  dan  320  nm.  Isolat  asam  fenolat  (FA)  diduga merupakan golongan asam fenolat yaitu asam kafeat . Hal ini  sesuai  dengan  Harbone  (1987)  bahwa  panjang gelombang maksimum ( λ maks) asam kafeat yaitu 243 nm dan  326  nm  [10].  Selain  itu  menurut  Robbins  (2003), panjang  gelombang  maksimum  ( λ maks)  asam  kafeat yaitu 220 nm, 294 nm dan 326 nm [15].
Selanjutnya isolate FA dianalisis menggunakan FT- IR,  untuk  mengetahui  gugus  fungsinya,  spektranya terlihat pada gambar 7.
Gambar 7. Spektogram FTIR isolat FA
Hasil  spektrogram  analisis  FTIR  isolat  FA  di  atas, menunjukkan adanya gugus O-H stretch (bebas) terlihat adanya serapan pada bilangan gelombang 3428,35 cm -1 , sedangkan  serapan  pada  bilangan  gelombang  3025,45 cm -1 menunjukkan  adanya  =C-H  aromatik,  dan  adanya gugus  C=C  aromatik  ditunjukkan  pada  serapan  1523,33 cm -1 dan  1449,76  cm -1 ,  gugus-gugus  inilah  yang menunjukkan adanya senyawa fenol.
Serapan  pada  bilangan  gelombang  3236.63  cm -1 menunjukkan  adanya  gugus  O-H  dari  asam  karboksilat dan  serapan  1645.95  cm -1 menunjukkan  adanya  gugus C=O  dari  asam  karboksilat,  serta  serapan  pada  1617,27 cm -1 adanya gugus C=C alkena yang menunjukkan adanya rantai karbon.
Adanya  gugus  C-O  dari  asam  karboksilat  dan  C-O alkohol  ditunjukkan  pada  serapan  1279.70  cm -1 dan 1133,50 cm -1 . Sedangkan gugus-gugus yang tersubstitusi pada  benzena  ditunjukkan  pada  bilangan  gelombang 973.53  cm -1 ,  901,41  cm -1 dan  802,38  cm -1 .  Hasil  analisis dari  FT-IR  menunjukkan  bahwa  gugus-gugus  yang diperoleh sesuai dengan gugus-gugus dari senyawa asam kafeat.
Isolat FA dianalisis lebih lanjut menggunakan Liquid Chromatography – Mass  Spectroscophy ( LC – MS )  untuk mengetahui kemurnian dan berat molekul senyawa asam fenolat. Hasil kromatogram hasil LC-MS isolat FA dapat dilihat pada gambar 8.
Gambar 8 . Kromatogram isolat asam fenolat murni (FA)
Kromatogram di atas menunjukkan bahwa isolat FA memiliki satu puncak dengan waktu retensi 2,057 menit. Munculnya satu puncak pada kromatogram menunjukkan  bahwa  isolat  FA  yang  didapatkan  murni. Spektogram massa isolat FA ditunjukkan pada gambar 9.
Gambar 9. Spektogram massa isolat asam fenolat (FA)
Hasil dari spektogram pada gambar 9 menunjukkan bahwa  muncul  puncak  pada  massa 179.  Puncak  ini diperoleh  dari  molekul  senyawa  asam  fenolat  yang cenderung  melepas  proton  pada  ES  (-)  dengan deprotonasi ion molekul [M-H] - . Ionisasi molekul selain penambahan  spesies  muatan  negative  Cl-  juga  dapat melepaskan proton untuk menghasilkan ion [M-H] - [16], sehingga  diduga  berat  molekul  isolate  FA  sebesar  180 g/mol.
Berdasarkan hasil analisis dengan LC-MS menunjukkan  bahwa  isolat  FA  merupakan  isolat asam kafeat dengan berat molekul sebesar 180 g/mol. Dugaan ini didukung dengan hasil analisis spektrofotometer UV- Vis , dan analisis FTIR yang menunjukkan bahwa isolat FA merupakan  asam  kafeat.  Pola  fragmentasi  asam  kafeat ditunjukkan pada gambar 10.
Gambar 10. Pola fragmentasi asam kafeat
Hasil isolasi asam fenolat dari daun Melia azedarach dari  daerah  Purwarejo,  Jawa  Tengah  diperolah  senyawa
golongan  asam  fenolat  yaitu  asam  ferulat  dan  asam kafeat.  Sedangkan  asam-asam  fenolat  yang  sudah ditemukan  peneliti  sebelumnya  dari  Bangladesh (8) tidak ditemukan  adanya  senyawa  fenolat  golongan  asam kafeat.

## 3.5. Uji Antioksidan

## 3.5.1. Uji antioksidan secara kualitatif
Hasil  aktivitas  antioksidan  isolat  FA  (asam  kafeat) yang  dilakukan  menggunakan  KLT  dengan  eluen campuran  kloroform:  etil  asetat:  asam  asetat  (50:50:3) setelah  disemprot  dengan  DPPH  0,1  mM  menunjukkan perubahan  warna  dari  violet menjadi  kuning  pada noda dari isolate FA, ini menandakan bahwa isolate FA dapat meredam radikal DPPH.
Hasil  uji  aktivitas  antioksidan  secara  kualitatif ditunjukkan pada gambar 11.
Gambar 11. Hasil KLT peredaman radikal DPPH pada isolat FA
Pada  gambar  di  atas  merupakan  hasil  uji  aktivitas antioksidan secara kualitatif dengan metode DPPH yang menunjukkan bahwa isolat FA aktif sebagai anti oksidan.

## 3.5.2. Uji antioksidan secara kuantitatif
Penentuan  aktivitas  antioksidan  secara  kuantitatif dilakukan  dengan  DPPH  (1,1-difenil-2-pikrilhidrasil) terhadap  isolat  FA  dan  asam  galat  standar  sebagai pembanding.  Asam  fenolat  secara  sinergis  akan menghambat  aktivitas  radikal  bebas  karena  memiliki kemampuan untuk mendonorkan radikal protonnya yang akan menyebabkan terjadinya reduksi membentuk DPPH nonradikal
Parameter  uji  antioksidan  secara  kuantitatif  adalah konsentrasi efisien atau Efficient Concentration (EC 50 ) atau Inhibition Concentration (IC 50 ) yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan  yang  menyebabkan  50  %  DPPH  kehilangan karakter  radikal.  Hasil  aktivitas  antioksidan  secara kuantitatif dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3. Aktivitas Antioksidan (IC 50 ) Isolat FA dan Asam Galat Standar Senyawa IC 50 (mg/L) Isolat FA 168.650 Asam Galat Standart 46,647
Pada tabel di atas isolat FA menghasilkan IC 50 sebesar yaitu  168,650  mg/L  dan  asam  galat  standar  sebesar 46,647  mg/L.  Secara  spesifik,  suatu  senyawa  dikatakan
sebagai antioksidan bernilai < 200 ppm [12], maka isolat FA memiliki aktivitas antioksidan yang lemah. Aktivitas pada  isolat  FA  lebih  lemah  dibandingkan  dengan  asam galat  standart,  hal  ini  disebabkan  asam  galat  yang digunakan  merupakan  asam  galat  murni  dan  memiliki empat  gugus  -OH  sehingga  mempunyai  kemampuan yang  lebih  besar  untuk  mendonorkan  protonnya.  Isolat FA  diduga  merupakan  asam  kafeat  yang  diketahui mempunyai  aktivitas  antioksidan  yang  lebih  rendah dibanding asam galat karena hanya memiliki tiga gugus - OH.  Struktur  asam  galat  ditunjukkan  pada  gambar  12 berikut:
Gambar 12. Stuktur asam galat

## 4. Kesimpulan
Hasil  isolasi  asam  fenolat  diperoleh  fraksi  (HB), (HA), dan (TH) masing-masing sebesar 1,05 gram, 1,26 gram,  dan  1,38  gram.  Hasil  analisis  dengan spektrofotometri UV-Vis, FTIR dan LC-MS diperoleh isolat FA merupakan asam kafeat. Hasil uji aktivitas antioksidan secara  kualitatif  maupun  kwantitatif  isolat  FA  aktif meredam  radikal  DPPH  dengan  IC50  sebesar  yaitu 168,650 mg/L.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Deepika  Sharma,  Yash  Paul,  Preliminary  and pharmacological  profile  of  Melia  azedarach  L.:  An overview, Journal of Applied Pharmaceutical Science , 3, 12, (2013) 133-138
[2]  Earha  Arakkaveettil  Kabeer,  Remani  Prathapan, Phytopharımacological  Profile  of  Elephantopus scaber, Pharmacologia ,  5,  8,  (2014)  272-285 http://dx.doi.org/10.5567/pharmacologia.2014.272.2 85
[3]  M.  M.  Azam,  A.  N.  M.  Mamun-Or-Rashid,  N.  M. Towfique,  M.  K.  Sen,  Nasrin.  S.,  Pharmacological potentials of Melia azedarach L. - A review, American Journal  of  BioScience ,  1,  2,  (2013)  44-49 http://dx.doi.org/10.11648/j.ajbio.20130102.13
[4]  Md Asadujjaman, Abu Saed, Md Aslam Hossain, Utpal Kumar  Karmakar,  Assessment  of  bioactivities  of ethanolic  extract  of  Melia  azedarach  (Meliaceae) leaves, Journal  of  Coastal  Life  Medicine ,  1,  2,  (2013) 118-122 http://dx.doi.org/10.12980/JCLM.1.2013C548
[5]  Garima Mishra, Sunil Jawla, Vikas Srivastava, Melia Azedarach:  A  Review, International  Journal  of Medicinal Chemistry & Analysis , 3, 2, (2013) 53-56
[6]  Mohammed  Fazil  Ahmed,  A  Srinivasa  Rao,  Shaik Rasheed Ahemad, Mohammed Ibrahim,
Phytochemical  studies  and  antioxidant  activity  of Melia  azedarach  Linn  leaves  by  DPPH  scavenging assay, International  Journal  of  Pharmaceutical Applications , 3, 1, (2012) 271-276
[7]  Antara Sen, Amla Batra, Evaluation of antimicrobial activity  of  different  solvent  extracts  of  medicinal
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (4) (2018): 198 – 204 204
plant:  Melia  azedarach  L, International  Journal  of
Current Pharmaceutical Research , 4, 2, (2012) 67-73
[8]  Maroua  Akacha,  Karima  Lahbib,  Néziha  Ghanem Boughanmi,  Phytochemically  evaluation  and  net anti-oxidant  activity  of  Tunisian  Melia  azedarach leaves  extract  from  their  ProAntidex  parameter, Bangladesh Journal of Pharmacology , 11, 2, (2016) 301-
307 http://dx.doi.org/10.3329/bjp.v11i2.25981
[9]  Eka  Vany  Anggraeni,  Khairul  Anam,  Identifikasi Kandungan  Kimia  dan  Uji  Aktivitas  Antimikroba Kulit  Durian  (Durio  zibethinus  Murr.), Jurnal  Kimia
Sains dan Aplikasi , 19, 3, (2016) 87-93
http://dx.doi.org/10.14710/jksa.19.3.87-93
[10] Jeffrey B. Harborne, Phytochemical Methods: A Guide to  Modern  Techniques  of  Plant  Analysis,  Springer Netherlands, 2012.
[11]  R.  Zadernowski,  M.  Naczk,  H.  Nowak-Polakowska, Phenolic  acids  of  borage  (Borago  officinalis  L.)  and evening  primrose  (Oenothera  biennis  L.), Journal  of the American Oil Chemists' Society , 79, 4, (2002) 335- 338 http://dx.doi.org/10.1007/s11746-002-0484-8
[12] Edwin Fadhly, Dewi Kusrini, Enny Fachriyah, Isolasi, Identifikasi  Senyawa  Alkaloid  dari  Daun  Rivina humilis L. serta Uji Sitotoksik Menggunakan Metode BSLT  (Brine  Shrimp  Lethality  Test), Jurnal  Kimia
Sains dan Aplikasi , 18, 2, (2015) 67-72
http://dx.doi.org/10.14710/jksa.18.2.67-72
[13] Retno Sariningsih, Meiny Suzery, Bambang Cahyono, Uji  Aktivitas  Antioksidan  dengan  DPPH  fraksi  Etil Asetat  Daun  Bidens  pilosa  L, Jurnal  Kimia  Sains  dan
Aplikasi , 19, 3, (2016) 83-86 http://dx.doi.org/10.14710/jksa.19.3.83-86
[14] Marsden S. Blois, Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical, Nature , 181, (1958) 1199 http://dx.doi.org/10.1038/1811199a0
[15] Rebecca  J.  Robbins,  Phenolic  Acids  in  Foods:   An Overview  of  Analytical  Methodology, Journal  of Agricultural and Food Chemistry , 51, 10, (2003) 2866-
2887 http://dx.doi.org/10.1021/jf026182t
[16] Robert  E.  Ardrey,  Liquid  Chromatography  -  Mass Spectrometry: An Introduction, Wiley, 2003.