## KARAKTERISTIK SENYAWA BIOAKTIF BAKTERI SIMBION MOLUSKA DENGAN GC-MS

## CHARACTERISTIC BIOACTIVE COMPOUND OF THE MOLLUSC SYMBIOTIC BACTERIA BY USING GC-MC

## Delianis Pringgenies
Marine Science Departement, Faculty of Fisheries and Marine Science Diponegoro Univeristy, Semarang, e-mail: pringgenies@yahoo.com

## ABSTRACT
It has been discovered that mollusca produce a secondary metabolite and in the same time bear its important role in its ecosystems so became a strategic target for the development of noble bioactive substances for marine pharmacology. The current study of mollucs symbiotic bacteria showed that from species of Conus miles,  Stramonita armigera, Cymbiola vespertilo  and from  based on screening of symbiotic bacteria in the Mollusc toward some bacteria ,  3 isolates had been had good performance in inhibiting  the grow of bacteria and  to be the best  candidates for a  new antibiotic based on  result of screening consistency.  Size and character inhibiting zone resulted  toward test bacteria were TCM, TCAand TOV. The research aims to current study of characteritic of symbiotic bacteria from mollucs that produce a new anti-pathogenic bacteria  by using GC-MS method. GC- MS result showed that fraction TCM-6.1  consist of some compounds, that are Nitrogen oxide (N2O) (CAS) Nitrous oxide; Acetic acid (CAS) Ethylic acid; Propanoic acid,2- methyl-(CAS) Isobutyric acid and fraction  TOV12.16   consist of compound such as Propanoic acid,2-methyl-(CAS)Isobutyric acid; Butanoic acid, 2-methyl-(CAS) 2- Methylbutanoid acid  then fraction TSA8.7    consist of 1,2-Propadiene (CAS) Allene.  The research pointed towards the three active symbiotic bacteria seems to be  promising since this three candidates potential result for the development of a new antibiotic.
Keywords: Bacteria simbiont,  mollusc, anti-bacteria, bioaktif compound

## ABSTRAK
Keberadaan bakteri yang berasosiasi dengan moluska laut telah memungkinkan penggunaan organisme tersebut sebagai sumber utama bakteri yang baru dan sumber senyawa bioaktif termasuk senyawa antimikroba.  Hasil penelitian sebelumnya dari isolasi bakteri simbion jenis Conus miles, Stramonita armigera, Cymbiola vespertilo dan berdasarkan konsistensi hasil skrining, besar kecilnya zona hambat yang dihasilkan dan sifat penghambatannya terhadap beberapa jenis bakteri uji melalui uji sensitivitas maka dihasilkan 3 isolat bakteri simbion yang memiliki senyawa bioaktif antibakteri  yakni: TCM, TCA dan TOV. Tujuan penelitian adalah mengetahui karakteristik senyawa bioaktif bakteri yang berasosiasi dengan Moluska jenis Conus miles, Stramonita armigera, Cymbiola vespertilo dengan metode GC-MS.  Analisis GC-MS dilakukan menggunakan GCMS-QP2010S Shimadzu. Hasil analisis GC-MS menunjukkan bahwa terdapat beberapa senyawa yang terdeteksi dari fraksi isolat TCM6.1, yakni:  Nitrogen oxide (N2O) (CAS) Nitrous oxide; Acetic acid (CAS) Ethylic acid; Propanoic acid,2-methyl-(CAS) Isobutyric acid dan fraksi isolat TOV12.16.   : Propanoic acid,2-methyl-(CAS)Isobutyric acid; Butanoic acid, 2-methyl- (CAS) 2-Methylbutanoid  acid  sedang fraksi isolat TSA8.7:  1,2-Propadiene (CAS) Allene. Hasil penelitian disimpulkan bahwa i solat bakteri aktif yang diperoleh dalam penelitian ini menunjukkan hasil yang sangat menjanjikan.
Kata Kunci: Bakteri simbion,  moluska, anti-bakteri, senyawa bioaktif

## I. PENDAHULUAN
Lautan merupakan sumber dari kelompok besar kimia bahan hayati laut dengan struktur yang unik, yang terutama terakumulasi pada hewan-hewan aver- tebrata yang banyak terdapat pada ekosistem terumbu karang, seperti, sponge, tunikata, bryozoa, karang lunak dan moluska. Beberapa metabolit sekunder yang dimiliki avertebrata laut tersebut menunjukkan adanya aktifitas farmakologi dan merupakan kandidat- kandidat baru untuk bahan obat-obatan. Sejumlah senyawa bioaktif yang diper- oleh dari hewan  avertebrata  diduga dihasilkan juga oleh mikroorganisme yang berasosiasi dengannya. Seperti dinyatakan oleh Watermann, 1999; Burgess et al. (2003)  bahwa mikro- organisme  yang berasosiasi dengan organisme laut akan mensistesa metabolit sekunder seperti organisme inangnya.
Keberadaan bakteri yang ber- asosiasi dengan moluska laut telah memungkinkan penggunaan organisme tersebut sebagai sumber utama bakteri yang baru. Bukti-bukti ilmiah menunjukkan bahwa bakteri yang berasosiasi dengan avertebrata  filum Moluska  jenis Conus miles, Stramonita armigera, Cymbiola vespertilo mem- punyai peranan dalam produksi senyawa bioaktif, sehingga menjadi pemacu dalam pencarian senyawa antimikroba dari bakteri yang berasosiasi dengan Moluska (Pringgenies et al . , 2008).  Penanganan bakteri patogen di dalam bidang kesehatan serta pemanfaatan senyawa antibiotik yang ramah lingkungan yang dihasilkan oleh bakteri yang berasosiasi dengan Moluska telah menjadi pekerjaan rumah yang harus segera ditangani secara multidisiplin (Hunt and Vincent, 2006).
Secara geografis perairan Ternate merupakan pertemuan lempeng antara benua Australia dan Indonesia dan  biota di tempat tersebut memiliki potensi yang
sangat spesifik terutama sebagai bahan farmasi bahari, maka sampel bakteri yang berasosiasi dengan Moluska  dikoleksi dari perairan Ternate.
Tujuan penelitian adalah menge- tahui karakteristik senyawa bioaktif bakteri yang berasosiasi dengan Moluska jenis Conus miles, Stramonita armigera, Cymbiola vespertilo dengan metode GC- MS.

## II. METODE  PENELITIAN
Sampling  Moluska  jenis Conus miles,  Stramonita armigera, Cymbiola vespertilo dikoleksi dari  perairan pulau Bastiong Kepulauan Ternate, Maluku. Selanjutnya dilakukan isolasi bakteri, skrining bakteri penghasil senyawa anti- MDR,  uji antibakteri  moluska, isolasi bakteri patogen klinik (MDR) jenis Klebsiella, E. coli, Coagulase Negatif Staphylococcus (CNS), Enterobacter 5, Enterobacter 10 dan Pseudomonas, uji sensitifitas antibakteri, uji kepekaan terhadap kuman antimikroba.  Hasil seleksi dari 12 isolat bakteri moluska jenis Conus miles, Stramonita armigera, Cymbiola vespertilo yang sudah dilakukan sebelumnya memperlihatkan bahwa ada 3 isolat yang dianggap paling berpotensi untuk dijadikan sebagai sumber antibiotik baru berdasarkan konsistensi hasil skrining, besar kecilnya zona hambat yang dihasilkan dan sifat penghambatannya terhadap beberapa jenis bakteri uji yakni isolat bakteri TCM,  TCA dan TOV  digunakan untuk studi selanjutnya.  Selanjutnya dilakukan ekstraksi DNA, amplifikasi DNA dengan metode PCR,  Sekuensing DNA.  Hasil sekuen 16S rDNA selanjutnya dianalisis dan diedit dengan menggunakan program GENETYX  dan Analisis sekuen 16S rDNA.
Amplifikasi DNA dari ke 3 isolat bakteri moluska yakni: TCM,  TCA dan TOV  yang sudah dilakukan sebelumnya
menunjukkan bahwa semua isolat menghasilkan single band (pita tunggal) dengan ukuran sekitar 1500 bp sesuai dengan pembandingan menggunakan marker DNA. Analisis homologi menggunakan BLAST searching menun- jukkan bahwa  isolate TOV12.16 memiliki prosentase kesamaan  tertinggi dengan genus Vibrio alginolyticus strain VM341 (96%). Sedangkan isolat TCM memiliki prosentase kesamaan tertinggi dengan genus Pseudoalteromonas sp. (99%), dan isolate TCA memiliki tertinggi dengan Vibrio sp. AC1 (99 %). Hasil identifikasi bakteri diketahui bahwa isolat TCM   memiliki kekerabatan terdekat dengan Pseudoalteromonas sedangkan  isolat  TCA dan TOV memiliki kekerabatan yang dekat isolat yang sama-sama berada dalam genus Vibrio .  Hasil penelitian ini dilajutkan untuk mengetahui karakteristik senyawa bioaktif Moluska sampel isolat TCM, TCA dan TOV dengan analisis Gas Chromatography-Mass Spectrometer (GC-MS).

## 2.1. Analisis Gas Chromatography- Mass Spectrometer (GC-MS)
Analisis GC-MS dilakukan meng- gunakan GCMS-QP2010S Shimadzu dengan kondisi analisis sebagai berikut : kolom Rtx-5MS 30 meter, diameter 0,25 mm, suhu terprogram dari 80 o C sampai 300 o C dengan kenaikan suhu  10 o C/menit, dan gas pembawa Helium, sedangkan untuk tekanannya sebesar 22 kPa.    Jumlah senyawa yang terdapat dalam ekstrak ditunjukkan oleh jumlah puncak (peak) pada kromatogram, sedangkan nama/jenis senyawa yang ada diinterpretasikan berdasarkan data spektra dari setiap puncak tersebut dengan menggunakan metode pendekatan pustaka pada database GC/MS (Hendayana, 1994).

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Skrining terhadap isolat bakteri simbion pada moluska jenis Conus miles,  Stramonita armigera, Cymbiola vespertilo dari perairan pulau  Bastiong
Kepulauan Ternate, Maluku telah dilakukan. Hasil penelitian dapat disim- pulkan bahwa i solat bakteri aktif yang diperoleh dalam penelitian ini menunjukkan hasil yang sangat menjanjikan karena ketiga isolat mampu menghambat bakteri MDR lebih dari satu jenis yang meliputi Klebsiella, Pseudomonas, Staphylococcus, E.coli dan Enterobacter. Hasil penelitian disimpulkan bahwa isolat TCM  memiliki kekerabatan terdekat dengan Pseudo- alteromonas sedangkan  isolat  TCA dan TOV  memiliki kekerabatan yang dekat isolat yang sama-sama berada dalam genus Vibrio .
Dari 3 isolat yang paling aktif dan menjanjikan yang berasosiasi dengan moluska dalam penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa isolat-isolat tersebut tersebut termasuk genus Vibrio dan Pseudoaltermonas . Anggota dari Alteromonadales dan Vibrionales dalam Proteobacteria dikenal sebagai produser dominan antibiotic (Long and Azam, 2001; Grossat et al ., 2004).  Lebih lanjut Radjasa et al .  (2007a), melaporkan aktivitas antibakteri dari bakteri Pseudoalteromonas luteoviolacea TAB 4.2 yang berasosiasi dengan karang keras Acropora sp. aktif menghambat pertumbuhan bakteri karang dan pathogen. Bakteri Pseudoalteromonas flavipulchra BSP5.1 yang merupakan simbion sponge Haliclona sp. yang diperoleh dari perairan Bandengan, Jepara mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri pathogen Alteromonas hydrophila dan Vibrio parahaemolyticus (Radjasa et al ., 2007c). Penelitian lain (Radjasa et al ., 2007d), melaporkan aktivitas antibakteri dari  3 isolat bakteri
dari sponge Aaptos sp. termasuk Pseudoalteromonas luteoviolacea  SPA21 yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri MDR Escherichia coli dan Proteus sp. Bakteri genus Pseudo- alteromonas diketahui memiliki fragmen gen Non-ribosomal peptide syntehase (NRPS) yang diketahui menghasilkan siderophore Alterobactin (Deng et al ., 1995).
Genus Vibrio diketahui  sebagai sumber potensial antibiotika,  Radjasa et al (2007c) menyatakan bahwa  bakteri Vibrio BSP1.12 yang diisolasi dari sponge Haliclona sp. mampu meng- hambat pertumbuhan bakteri pathogen Alteromonas hydrophila yang merupakan causative agent pada penyakit Motile Aeromonas Septicemia  (MAS) yang menyerang ikan mas. Bakteri Vibrio MJ.11 yang diisolasi dari karang lunak Porites lutea juga diketahui mampu menghambat bakteri pathogen Bacillus subtilis dan Staphylococcus sp. (Radjasa, tidak dipublikasikan).
Hasil skrining menunjukkan bahwa bakteri simbion moluska sangat potensial dalam menghambat pertumbuhan bakteri MDR. Hal ini menjadi poin penting karena selama ini masalah suplai bahan baku menjadi kendala dalam pengembangan senyawa bioaktif dari avertebrata  laut (Proksch et al ., 2002), karena senyawa yang dihasilkan sangat terbatas sehingga dapat mengancam keberadaan avertebrata laut itu sendiri.
Hasil skrining terhadap isolat bakteri simbion pada moluska yang diambil dari wilayah Maluku Utara menunjukkan bahwa bakteri simbion moluska sangat potensial dalam menghambat pertumbuhan bakteri MDR. Hal ini menjadi poin penting karena selama ini masalah suplai bahan baku menjadi kendala dalam pengembangan senyawa bioaktif dari invertebrate laut (Proksch et al ., 2002), karena senyawa
yang dihasilkan sangat terbatas sehingga dapat mengancam keberadaan avertebrata laut itu sendiri. Jadi dalam konteks pemanfaatan sumber daya laut yang berkelanjutan hasil penelitian ini sangat menjanjikan untuk ditindak lanjuti lebih lanjut.
Analisis GC-MS dilakukan  pada isolat aktif TCM6.1, TCA8.7 dan TOV12.sebagai fraksi yang memiliki aktivitas anti bakteri terbaik. Pendugaan senyawa dengan menggunakan Gas Chromatography menunjukkan terdapat beberapa senyawa yang terdeteksi dari fraksi TCM, yakni:  Nitrogen oxide (N2O) (CAS) Nitrous oxide; 1,3- Dioxolane, 2-(6-octynyl)-(CAS); Acetic acid (CAS) Ethylic acid; Propanoic acid,2-methyl-(CAS) Isobutyric acid; Iso-VALERIC ACID; Butanoic acid, 2- methyl-(CAS) 2-Methylbutanoic acid; 1- Pentadecanol (CAS) Pentadecanol; 1,2- Benzenedicarboxylic acid, dioctyl ester (CAS) Dioctyl phthalate; Tetradecane,1- iodo-; Cholastane, 3-thiocyanato, (3.aplpha,.5.alpha.)-(CAS) Thiocyanic acid,5.alp. Sedang fraksi TOV terdekteki senyawa Propanoic acid,2-methyl- (CAS)Isobutyric acid; Butanoic acid, 2- methyl-(CAS) 2-Methylbutanoid acid dan fraksi TSA terdekteksi senyawa: 1,2- Propadiene (CAS) Allene  seperti yang tertera pada Gambar 1, 2 dan 3.
Hasil    GC-MS  pada sampel fraksi TCM memperlihatkan bahwa pada fraksi terdeteksi 10 puncak senyawa, tapi hanya 3 senyawa yang lebih dominan, yakni senyawa  Nitrogen oxide (N2O) (CAS) Nitrous oxide; Acetic acid (CAS) Ethylic acid; Propanoic acid,2-methyl-(CAS) Isobutyric acid dan fraksi isolat TOV terdeteksi senyawa Propanoic acid,2-methyl-(CAS)Isobutyric acid; Butanoic acid, 2-methyl-(CAS) 2- Methylbutanoid acid  sedang fraksi isolat TSA  terdeteksi senyawa 1,2-Propadiene (CAS) Allene.
Gambar 1.  Kromatogram GC-MS  TCM  memperlihatkan bahwa senyawa yang dominan      adalah Acetic acid (CAS) Ethylic acid
Gambar 2.  Kromatogram GC-MS TOV memperlihatkan bahwa Propanoic acid,2- methyl-(CAS) Isobutyric acid

## Gambar 3.  Kromatogram GC-MS  TSA  memperlihatkan bahwa Propadiene (CAS)
Allene
Senyawa acid memperlihatkan senyawa yang yang potensi sebagai anti bakteri dengan cara menghancurkan dinding sel dan menghambatan sintesis dinding sel (Mutchler, 1991). Diduga senyawa acid tersebutlah yang berperan memiliki kemampuan antibakteri (Kim et al ., 2004).  Seperti yang dinyatakan oleh Hillenga et al . (1995), bahwa Asam Benzenasetat digunakan dalam pem- buatan Penicilin G. Asam Benzen-asetat mempunyai kemampuan untuk menem- bus membran plasma pada sel.
Dapat diasumsikan bahwa mekanisme kerja dari TCM, TOV dan TSA dari bakteri simbion Moluska adalah melalui penghambatan sintesis dinding sel seperti mekanisme kerja penisilin melalui penghambatan sintesis dinding sel ( Jawetz et al, 2001). Ditambahkan pula oleh Katzung (2004), bahwa antibiotik beta-laktam melintasi membran luar dan memasuki organisme- organisme gram negatif melalui saluran protein membran luar. Jadi dalam konteks pemanfaatan sumber daya laut
yang berkelanjutan hasil penelitian ini sangat menjanjikan untuk ditindak lanjuti lebih lanjut.

## IV. KESIMPULAN
Isolat bakteri aktif yang diperoleh dalam penelitian ini menunjukkan hasil yang sangat menjanjikan karena ketiga isolat mampu menghambat bakteri MDR.
Hasil  GC-MS pada sampel fraksi TCM memperlihatkan bahwa pada fraksi terdeteksi 10 puncak senyawa, senyawa yang lebih dominan  yakni senyawa Acetic acid (CAS) Ethylic acid dan fraksi isolat TOV terdeteksi senyawa yang lebih dominan  yakni Propanoic acid,2-methyl- (CAS) sedang fraksi isolat TSA
terdeteksi senyawa
1,2-Propadiene (CAS) Allene.
Isolat fraksi TCM ber potensi memberikan kontribusi sebagai sumber alternatif  baru metabolit sekunder  dari bahan farmasi bahari dalam meng- hasilkan produk  sebagai desinfektan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dibiayai oleh Direktorat  Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan Nasional, Hibah Kompetensi  2010.  Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. Ocky K Radjasa dan Dr. Adus Sabdono  MSc  Jur. Ilmu Kelautan FPIK UNDIP Semarang.

## DAFTAR PUSTAKA
Burgess J.G., K.G. Boyd, E. Amstrong, Z. Jiang, L. Yan, M. Berggren, U. May, T. Pisacane, A. Granmo, and D.R. Adams,  2003.  Development of a marine natural product-based antifouling paint. Biofouling, 19:197- 205
Hunt, B., and A.C.J. Vincent. 2006. Scale and sustainability of marine bioprospecting for pharmaceu- ticals. Ambio , 35(2):57-64.
Kim TK, MJ Garson., and J A Fuerst.
2005. Marine actinomycetes related to the Salinospora group from the Great Barrier Reef sponge Pseudoceratina clavata . Environ. Microbiol ., 7:509-518.
Long R, and F. Azam, 2001. Antagonistic interactions among marine pelagic bacteria. Appl
Environ Microb ., 67:4975-4983
Pringgenies. D, O.K.  Radjasa,  dan A. Sabdono. 2008. Bioprospeksi
Moluska dan Bakteri Simbionnya
Dalam Rangka Penanganan Strain MDR (Multi Drug Resistant. Program Intensif Riset Dasar 2007/2008.. LembagaPenelitian Universitas Diponegoro. Novem- ber 2008. Laporan Penelitian. 40 Hal. Proksch, P., R.A.  Edrada, and R.  Ebel. 2002. Drugs  from the sea-current status and microbiological impli- cations. Appl. Microbiol. Bio- technol ., 59:125-134.
Sukarmi dan O.K.  Radjasa.  2007. Bioethical Consideration in the Search for Bioactive Compounds from Reef’s Invertebrates. J. Appl. Sci ., 7(8):1235-1238
Rajasa, O.K.  2003. Marine invertebrata- associated bacteria in coral reef ecosystems as a new source of bioactive compounds. J. Coast.
Dev ., 7: 65-70 Radjasa, O.K. and A.Sabdono. 2003.
Screening of secondary metabo- lite-producing bacteria associated with corals using 16S rDNA-based approach. J. Coast. Dev ., 7:11-19. Radjasa, O.K . , A. Sabdono,  Junaidi, and E.  Zocchi. 2007c. Richness of secondary metabolite-  producing marine bacteria associated with sponge Haliclona sp. Int. J. Pharmacol ., 3(3):275-279.
Radjasa, OK, H Urakawa, K Kita- Tsukamoto, and K Ohwada. 2001. Characterization of psychrotro-phic bacteria in the surface and deep-sea waters from north-western Pacific Ocean based on 16S ribosomal DNA approach. Mar. Biotechnol.,
3:454-462.
Hunt, B., and A.C.J. Vincent. 2006. Scale and sustainability of marine bioprospecting for pharmaceuti- cals. Ambio , 35(2):57-64.
Olivera,  B.M.  2000. Conotoxin MVIIA: From marine snail venom to analgesic drug. In: Fusetani (ed.) Drugs from the sea. Karger, 74– 85pp.
Watermann, B. 1999. Alternative anti- foulant techniques present and future. Limno. Mar ., 1(6):6-7.