Menara Perkebunan, 2008, 76(1), 11-22

## Lipase spesifik 1,3-gliserida dari fungi lokal untuk biokonversi CPO menjadi diasilgliserol
Specific lipase of 1,3-glyceride from indigenous fungi for bioconversion of CPO to produce diacylglycerol
TRI-PANJI 1) , SUHARYANTO 1) & Nining ARINI 2)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia
2) Departemen Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Indonesia, Depok, Indonesia

## Summary
Downstream industry of palm oil producing  specialty  oil  with  higher  economic value compared to that of CPO in Indonesia is less  developed  due  to  technical  obstacle  and the  availability  of  supporting  materials. Specific lipase 1,3-glyceride for example which is used for oleochemical processing of healthy oil  production  is  still  imported  with  relatively high price.  Healthy oil can be made from CPO bioconversion  using  the  enzyme  that  produces oil  rich  in  diacylglycerol  (DAG).  Although research  on  the  production  and  the  use  of lipase  has  been  well  studied,  production  of specific lipase from microbes of local source is still very limited.  This article reports one part of  the  series  of  the  research  activities  on bioprocess and genetic engineering approaches  to  produce  specific  lipase  for bioconversion  of  CPO  i.e  optimization  of  1,3- glyceride-spesific lipase production from fungi selected  from  local  sources.  Based  on  the fluorescence  zone  on  the  screening  media,  of the twenty isolates collection, it was found that P6 isolate, thereafter indentified as Neurospora sitophila ,  has  the  highest  activity  of  1,3- glyceride-specific lipase. The lipase of N. sitophila was  able  to  catalyze  glycerolysis of  triacylglycerol  (TAG)  in  CPO  to  produce DAG.  The  bioconversion  products  of  lipase yielding  ratio  of  DAG/TAG  was  higher  than ratio  of  free  fatty  acids  (FFA)/TAG  (0.12  > 0.08). The optimum condition of the enzymatic bioconversion was at 40 o C, pH 6, and 10-day incubation.  The  primary  fatty  acids  on  the
DAG  were  oleic  (56.2%),  palmitic  (40.0%), and  myristic  (2.7%)  acids.  The  decrease  of palmitic  acid  on  DAG  compared  to  on  TAG, indicated that the lipase of N. sitophila worked relatively specific at C1 or C3 of the TAG.
[ Keywords :  Lipase  optimization, Neurospora sitophila ,   fungi  producing-lipase, indigenous fungi]

## Ringkasan
Kurang  berkembangnya  industri  hilir  yang menghasilkan  minyak  khusus  yang  nilainya berlipat  dibandingkan  CPO  antara  lain  karena hambatan  teknis  dan  ketersediaan  bahan pendukungnya.  Lipase  spesifik  1,3-gliserida misalnya,  yang  digunakan  untuk  produksi minyak kesehatan, masih diimpor dengan harga relatif tinggi. Minyak kesehatan dapat diproduksi dari biokonversi CPO dengan lipase spesifik  1,3-gliserida  hingga  diperoleh  minyak yang  kaya  kandungan  diasilgliserol  (DAG). Tulisan  ini  melaporkan  optimasi  aktivitas lipase  spesifik  1,3-gliserida  dari  fungi  isolat lokal  terpilih.  Berdasarkan  zona  fluoresens pada  medium  penapis  lipase,  dari  20  isolat fungi  yang  diuji  isolat  P6  yang  kemudian diidentifikasi  sebagai Neurospora  sitophila memiliki  aktivitas  tertinggi  dan  bersifat spesifik  1,3-gliserida.  Lipase N.  sitophila mampu mengkatalisis gliserolisis triasilgliserol (TAG) dalam  CPO  untuk  menghasilkan  DAG. Lipase  tersebut  menghasilkan  nilai  perban- dingan DAG/TAG  lebih  besar  dari nilai per-
Tri-Panji et al.
bandingan      asam  lemak  bebas  (ALB)/TAG (0,12  >  0,08).      Kondisi  optimum  biokonversi enzimatis  ini  terjadi  pada  suhu  40 o C,  pH  6, dan  waktu  inkubasi  selama  10  hari.  Asam lemak utama penyusun DAG adalah asam oleat (56,2%), palmitat (40,0%), dan miristat (2,7%). Berkurangnya  asam  palmitat  pada  DAG dibanding  pada  TAG  menunjukkan  bahwa lipase N.  sitophila bekerja  secara  relatif spesifik pada C1 atau C3 dari gliserida.

## Pendahuluan
Produk  olahan  minyak  sawit  baik untuk pangan maupun oleokimia memiliki nilai  jual  yang  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  minyak  sawit  mentah  (CPO). Produksi  olahan  CPO  dapat  dilakukan dengan  efisien  menggunakan  proses  bio- konversi  enzimatis.  Kendala  pengem- bangan  proses  biokonversi  enzimatis dalam  skala  industri  adalah  ketersediaan dan harga lipase impor yang mahal karena hanya  sedikit  produsen  lipase  di  dunia (Suzuki et al. , 1988; Elisabeth, 2003). Lipase  mikroba  dapat  diproduksi  dari bakteri ( Bacillus subtilis, Propioni-
bacterium acnes, Pseudomonas dan Streptomyces sp.) (Wingender et al. , 1987; Suzuki et  al .,  1988),  khamir  ( Candida rugosa, Candida  deformans, Pichia sp. dan Rhodotorula pilimanae )  (Muderhwa et al. , 1985), dan fungi  ( Aspergillus niger, Geotrichum  candidum,  Mucor  miehei,
Neurospora sitophila , Penicillium
citrinum, dan Rhizopus spp.) (Onion et al ., 1981; Yamane, 1987; Ibrahim et al. , 1991; Maliszewska  &  Mastalerz,  1992;  Kosugi et al., 1997). Olivia et al ., (1998) melapor- kan  bahwa  fungi  merupakan  penghasil lipase yang baik.
Keunggulan penggunaan lipase dalam industri  makanan  adalah  mengkatalis hidrolisis  secara  spesifik,  proses  dapat dilakukan  pada  suhu  rendah,  dan  relatif aman  dari  risiko  terbentuknya  produk samping  yang  tidak  dikehendaki.  Modi-
fikasi  oleh  enzim  lipase  yang  memiliki spesifitas  reaksi  1,3-gliserida  pada  CPO, menghasilkan  gliserida  dengan  produk utama  diasilgliserol  (DAG)  dan  produk samping  monoasilgliserol  (MAG)  serta asam  lemak  bebas  dan  gliserol.  Fraksi padat hasil biokonversi CPO dapat diguna- kan  untuk  pembuatan  margarin,  vanaspati dan  oleokimia.  Yasunaga et  al .  (2001) melaporkan  bahwa  minyak  kaya  DAG dapat berfungsi sebagai minyak kesehatan ( healthy  oil )  karena  antara  lain  dapat mengurangi trigliserida (TG) dalam serum darah,  mencegah  akumulasi  lemak  dalam tubuh  dan  memperbaiki  rasio  kolesterol serum darah.
Proses gliserolisis minyak sawit untuk menghasilkan  MAG  dan  DAG  dengan lipase Lipozyme  IM impor  telah  dipelajari oleh  Elisabeth et  al. (1998)  &  Elisabeth et al. (1999). Harga lipase impor dari fungi Rhizomucor  miehei ( Lipozyme  IM )  yang diproduksi oleh perusahaan Novo, Nordisk Bioindustry  Inc,  Denmark  sekitar  25  juta rupiah  per  kg  (Sigma,  2005)  sehingga kurang ekonomis untuk diaplikasikan pada skala  industri.  Pengembangan  industri dengan input bahan  baku  impor  memiliki daya saing yang rendah dan menyebabkan foot lose industry . Metode  untuk  memproduksi  lipase secara  murah  perlu  dikembangkan  untuk mengatasi  masalah  tersebut.  Salah  satu metode  yang  dinilai  memiliki  peluang yang  baik  untuk  dikembangkan  adalah dengan  cara  fermentasi  menggunakan fungi  asli  Indonesia.  Indonesia  dengan keanekaragaman  hayati  yang  tinggi  ber- peluang besar untuk  mengembangkan dan memproduksi lipase spesifik 1,3- gliserida dari fungi lokal. Penelitian bertujuan men- dapatkan  fungi  penghasil  enzim  lipase spesifik  1,3-gliserida  dan  menetapkan kondisi optimum biokonversi CPO menjadi DAG.
Lipase spesifik 1,3-gliserida dari fungi lokal untuk biokonversi CPO...

## Bahan dan Metode

## Isolasi dan identifikasi fungi
Sampel  untuk  isolasi  dan  penapisan fungi  lipolitik  adalah  tandan  buah  sawit dan  minyak  sawit  mentah  (CPO)  dari kebun  kelapa  sawit,  Kertajaya,  PTPN VIII,  Banten.  Buah  sawit  disimpan  dalam karung  plastik  dan  CPO  disimpan  dalam jerigen.    Fungi  juga  diisolasi  dari  sampel tempe  segar  yang  diperoleh  dari  berbagai pasar  tradisional  di  Bogor,  Jakarta  dan Kebumen,  Jawa  Tengah.  Fungi  koleksi Balai  Penelitian  Bioteknologi  Perkebunan Indonesia (BPBPI) seperti Rhizopus oryzae dan Absidia  corymbifera juga digunakan  untuk  penapisan.    Medium untuk isolasi adalah medium mineral yang mengandung 3%  CPO  (Steele  & Stowers, 1991) atau potato dextrose agar (PDA).
Isolasi fungi lipolitik dilakukan dengan cara direct plating (Tomita, 1985). Sampel  padat  dipotong  ±  1  cm 2 ,  sedang- kan  sampel  cair  (CPO)  diambil  lima  tetes kemudian  diletakkan  di  atas  permukaan medium  dan  diinkubasikan  pada  suhu ruang  (26-30 o C)  selama  empat  hari. Koloni  fungi  yang  tumbuh    disubkultur sampai  diperoleh  isolat  murni.    Isolat dipelihara  dalam  PDA  miring  dan disimpan  pada  suhu  ruang.    Identifikasi fungi  dilakukan  terhadap  isolat  potensial berdasarkan  ciri  morfologi  sel  dan  koloni dengan acuan Domsch et al. (1980).

## Penyiapan inokulum
Isolat  murni diremajakan setiap  enam bulan.  Untuk pembuatan inokulum, kultur ditanam dalam PDA miring dan diinkubasikan  pada  suhu  ruang  (26-30 o C)
selama  tiga  hari.  Akuades  steril  (5  mL) ditambahkan  ke  dalam  kultur  dan  spora dikerik kemudian diaduk dengan
pengaduk  vorteks    hingga  diperoleh suspensi spora.

## Penapisan fungi
Isolat  yang  diperoleh  dari  berbagai sumber diuji kemampuannya dalam meng- hasilkan  enzim  lipolitik  menggunakan medium  Hou  &  Johnston  (1992)  dengan komposisi 1 g KH 2 PO 4 , 1 g MgSO 4 .7H 2 O, 50  g  pepton,  dan  20  g  agar,  yang dilarutkan dalam 1000 mL akuades sambil dipanaskan  hingga  homogen.  Medium disterilisasi  dalam  autoklaf  pada  suhu 121 o C,  tekanan  1,2  kg/cm 2 selama 20  menit.    Medium  steril  ditambahkan 2  mL  rhodamin  B  steril  0,1%  sambil diaduk  kemudian  dituang  ke  cawan  Petri (Ө10  cm)  sebanyak  15  mL  dan  dibiarkan mengeras.    Permukaan  medium  kemudian ditutup  dengan  kertas  saring  steril  ber- diameter  sama  dengan  cawan  Petri  yang telah  ditetesi  dengan  1  mL  CPO  secara merata.   Bulatan kertas saring steril diameter  2  cm,  dimasukkan  ke  dalam suspensi  spora  kemudian  diletakkan  pada permukaan medium penapisan dan diinkubasikan  pada  suhu  ruang  (26-30 o C) selama  48  jam.  Pengamatan  aktivitas lipolitik  dilakukan  dengan  mengukur diameter  zona  fluoresens  yang  terbentuk di sekitar koloni.

## Produksi lipase spesifik 1,3-gliserida
Produksi  lipase  dilakukan  dengan kultur  permukaan  menggunakan    medium basal  menurut  Ibrahim et  al .  (1991) mengandung  (%,  b/b)  1  CPO;  0,5  NaCl; 0,01  CaCl.  2  H 2 O;  1  ekstrak  khamir,  pH 7,0.  Kultur  film  permukaan  dilakukan dalam  fermentor  film  permukaan  volume 600  mL  dengan  ketebalan  2-3  cm, diinokulasi  dengan  suspensi  spora fungi
Tri-Panji et al.
dan  diinkubasikan  dalam  kondisi  suhu ruang  selama  72  jam.  Kultur  filtrat mengandung  lipase  kasar  dipisahkan  dari biomassa  miselium  dengan  sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama 15  menit,  kemudian  diendapkan  dengan menambahkan  aseton  dingin  1  :  2.    Pelet dicuci  dan  dilarutkan  kembali  dengan bufer sitrat-fosfat  untuk mendapatkan pH 4 dan 5, bufer fosfat pH 6 dan 7, dan Tris- HCl  pH  8,0.  Lipase  tersebut  selanjutnya diuji  aktivitasnya  dan  kemampuannya dalam  biokonversi  TAG  pada  CPO menjadi DAG.

## Optimasi proses gliserolisis
Reaksi  gliserolisis  dilakukan  dengan mencampurkan  CPO,  heksana,  gliserol serta  lipase  dalam  bufer  Tris-HCl  50  mM pH 5,0. Rangkaian tahapan reaksi glisero- lisis  menggunakan  metode  Mappiratu (1999). Optimasi proses gliserolisis dilakukan  meliputi  variasi  pH,  suhu,  dan waktu inkubasi, yaitu pH 6,7, dan 8; suhu 30,  40,  dan  50 o C;  dan  waktu  5,  7,  dan  10 hari (Mappiratu, 1999).

## Analisis fraksi minyak
Fraksi  TAG,  DAG,  MAG  dan  ALB dalam  produk  reaksi  dan  hasil  pemisahan ditentukan menggunakan metode kromato- grafi  lapis  tipis  (KLT)  preparatif  (AOAC, 1995).  Plat KLT dari gel silika G 60 F254 ketebalan 0,25 mm, berukuran 20 x 20 cm diaktifkan dalam oven suhu 100 o C selama 60 menit. Sampel bebas pelarut, ditotolkan pada  plat  KLT,  kemudian  dimasukkan  ke dalam  larutan  pengembang  yang  berisi 30 mL eluen campuran heksana: dietileter :  asam  formiat  yaitu  80:20:2  (v/v/v)  dan telah  dijenuhkan selama satu  jam. Pewarnaan  noda  dilakukan  dengan  uap iodin.  Noda  TAG,  DAG,  MAG  dan  ALB
dikerik  dan  ditampung  dalam  labu Erlenmeyer.  Hasil  kerikan  setiap  fraksi diekstrak  tiga  kali  dengan    5  mL  pelarut heksana  untuk  noda  TAG,  campuran heksana/dietil  eter  1:1  (v/v)  untuk  noda DAG,  sedangkan  noda  MAG  dan  ALB dengan  pelarut  dietil  eter.  Ekstrak  yang diperoleh diuapkan  pelarutnya dengan gas nitrogen,  kemudian  disempurnakan  dalam oven dengan suhu 100 o C.

## Analisis  kadar  DAG  dan  komposisi  asam lemak
Analisis  kadar  DAG  dalam  produk reaksi  dilakukan  menggunakan  metode kromatografi  kolom  florisil  (AOAC, 1995).  Kolom  kromatografi  (panjang 50  cm,  diameter  2,5  cm)  diisi  dengan 10 mL pelarut heksana. Kolom selanjutnya  diisi  dengan  serbuk  florisil berukuran  partikel  60-80  mesh  sebanyak 60  g.  Florisil  dalam  kolom  dipadatkan, kemudian  dilapisi  kertas  saring  pada permukaannya, yang diikuti dengan natrium  sulfat  anhidrat  dalam  jumlah terbatas. Produk reaksi bebas pelarut (2 g) dipindahkan  ke  dalam  kolom  secara kuantitatif  tepat  pada  permukaan  adsor- ben.  Kolom  dielusi  dengan  eluen  cam- puran  dietileter  :  heksana  yaitu  1:4  (v/v), kemudian diikuti dengan eluen dietileter.
Untuk  mengetahui  akhir  proses  elusi, komponen  dalam  eluat  dideteksi  meng- gunakan  metode  kromatografi  lapis  tipis. Pada deteksi tersebut diperoleh keterangan komponen TAG + DAG terelusi sempurna pada  penggunaan  eluen  campuran  dietil eter  :  heksana  yaitu  1  :  4  (v/v)  sebanyak 500  mL,  sedangkan  komponen  MAG terelusi  sempurna  setelah  penggunaan eluen  dietil  eter  sebanyak  300  mL.    Eluat yang mengandung DAG diuapkan pelarut- nya dengan gas nitrogen sampai diperoleh
Lipase spesifik 1,3-gliserida dari fungi lokal untuk biokonversi CPO...
berat yang tetap, kemudian dihitung kadar DAG  dalam  produk  reaksi.  Komposisi asam  lemak  DAG  dan  CPO  ditentukan menggunakan  kromatografi  gas  dengan kolom FFAP (25 mm x 0,25 mm) menurut Tri Panji (1997).

## Hasil dan Pembahasan

## Isolasi dan penapisan fungi
Isolasi  menghasilkan  empat  isolat fungi  dari  CPO,  16  isolat  fungi  dari  buah sawit  dan  6  isolat  fungi  dari  tempe ( Rhizopus sp.).  Dari  26  isolat  fungi tersebut  20  isolat  menghasilkan  zona fluoresens  pada  medium  penapisan  yang disertai  dengan  adanya  pertumbuhan koloni  (Tabel  1).  Menurut  Hou  & Johnston (1992) terbentuknya zona fluoresens menunjukkan kemampuan isolat  menghasilkan lipase yang  memecah TAG pada CPO menjadi DAG, MAG atau ALB  dan  berikatan  dengan  rhodamin  B membentuk  senyawa  berpendar.  Lima isolat  dari  buah  sawit  dan  satu  isolat  dari CPO  tumbuh  pada  medium  penapisan tetapi  tidak  menghasilkan  lipase  Hasil isolasi  menunjukkan  tidak  seluruh  isolat memiliki  kemampuan  lipolitik  karena kemungkinan  merupakan  mikroba  selulo- litik  yang  terkait  dengan  kandungan  serat buah  sawit  yang  mencapai  21%  (Lubis, 1992).
Enam isolat fungi dari tempe seluruh- nya  menghasilkan  zona  fluoresens.  Dua koleksi kultur fungi yaitu Rhizopus oryzae dan Absidia  corymbifera juga  menghasil- kan  zona  fluoresens. Rhizopus  oryzae dan Absidia  corymbifera masih  dalam  ordo yang sama yaitu Zygomycetes. Lima isolat memiliki  zona  fluoresens  yang  cukup tinggi yaitu  P2,  P3  dan  P6  serta Rhizopus oryzae dan Absidia  corymbifera. Isolat
yang  diperoleh  dalam  penelitian  ini menghasilkan  zona  fluoresens  yang  lebih tinggi  (84  mm)  dibandingkan  dengan fungi  terbaik  yang  diseleksi  Olivia et  al. (1998)  yaitu R.  stolonifer dengan  zona fluoresens 77 mm. Isolat yang menghasil- kan  zona  fluoresens  tertinggi  (isolat  P6) diduga mampu menghasilkan lipase dengan  aktivitas  yang  tinggi  pula  dan memiliki spesifitas 1,3-gliserida dari CPO. Untuk  mengetahui  kemampuan  isolat tersebut,  aktivitas  lipase  akan  diuji  untuk hidrolisis  CPO  dengan  mengukur  kadar hasil pecahannya.
Jumlah  isolat  fungi  yang  diperoleh dari buah sawit lebih banyak dibandingkan dari  CPO  diduga  karena  ketersediaan nutrisi  dalam  komponen  penyusun  buah yang  lebih  lengkap  dan  ketersediaan oksigen  yang  mendukung  pertumbuhan mikroba.  Selain  itu,  proses  pengolahan CPO  menggunakan  uap  panas  bertekanan tinggi  untuk  sterilisasi  tandan  buah  segar (TBS)  dapat  mematikan  miselium  dan spora  fungi.  Hasil  seleksi  yang  dilakukan Ibrahim et al. (1991) menunjukkan bahwa fungi pada umumnya mempunyai kemampuan  lipolitik  pada  minyak  sawit yang  lebih  baik  dari  pada  bakteri  dan khamir.    Fungi  dalam  tempe  diisolasi untuk  mikroba  sumber  dan  seluruhnya menghasilkan  zona  fluoresens.  Olivia et  al .  (1998)  melaporkan  bahwa Rhizopus spp.  memiliki  kemampuan  lipolitik  yang cukup baik.
Hasil  gliserolisis  TAG  dalam  CPO ditunjukkan oleh terbentuknya spot komponen  lemak  dalam  pelat  gel  silika, yaitu  berturut-turut  dari  yang  paling bawah  DAG,  ALB,  TAG,  dan  karoten. Hasil  perhitungan  persentase  luasan  spot masing-masing  komponen  lemak  menjadi TAG,  DAG  dan  ALB  (Tabel  2)  oleh ketiga  isolat  fungi  (P2,  P3  dan  P6) berbeda-beda.  Nilai  perbandingan  DAG/
Tri-Panji et al.
Tabel 1.  Penapisan fungi penghasil lipase hasil isolasi dari CPO, buah kelapa sawit, dan tempe pada suhu ruang (26-30 o C) selama 48 jam kultur.
Table 1. Screening for lipase -producing fungi isolated from CPO, fruit of oil palm, and tempe at room temperature (26-30 o C) after 48 hours of culture.
Kode isolat Isolate code Diameter zona fluoresens Diameter of fluorescence zone (mm) Pertumbuhan miselium Mycelium growth Isolat asal CPO & buah sawit
Isolate from CPO & oil palm fruit
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7
P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20
Isolat asal tempe/ tempe isolate T1 (Psr Gn Batu, Bogor) T2 (Pasar Rawa Sari, Jakarta) T3 (Pasar Wr Jambu, Bogor) T4 (Pasar Kebumen, Jawa Tengah) T5 (Pasar Ciluar, Bogor) T6 (Pasar Ciseeng, Parung)
Isolat koleksi / collection isolate
Rhizopus oryzae Absidia corymbifera
48 50 55 46 27 84 24 31 35 - 21 32 - 35 - - 25 - - 33 37 28 42 27 29 52 50 52
+ ++ ++ + + +++
+ + + + ++ ++ + ++ + + ++ + - +
+++ ++ ++ + ++ + ++ ++
Keterangan/ Note : + sedikit ( slight ), ++ banyak ( robust ), +++ sangat banyak dan padat ( abundant and dense ).
Lipase spesifik 1,3-gliserida dari fungi lokal untuk biokonversi CPO...
Tabel 2. Hasil kromatografi lapis tipis komponen hasil biokonversi CPO dengan   lipase isolat P2, P3 dan P6 dan waktu gliserolisis tiga hari, suhu 30 ºC.
Table 2. Result of thin layer chromatography of  components  from CPO bioconversion with lipase from isolate P2, P3 and P6 and glycerolysis for three days, at temperature 30 ºC.
Fraksi minyak (%)
Oil fraction (%) Kode  isolat
Isolate code
TAG DAG ALB ( FFA ) P2 P3 P6 87 81 83 5 8 10 8 11 7 Nilai perbandingan Ratio DAG/TAG ALB/TAG (FFA/TAG ) Keterangan Remark P2 P3 P6 0,06 0,01 0,12 0,09 0,14 0,08 lipase tak spesifik ( unspecific lipase )
lipase tak spesifik ( unspecific lipase ) lipase spesifik 1,3-gliserida ( specific
lipase 1,3-gliseride )
TAG  atau  ALB/TAG  dapat  meng- indikasikan  spesifitas  lipase.  Jika  nilai perbandingan  DAG/TAG  lebih  besar  dari ALB/TAG,  maka  diindikasikan  bahwa lipase  yang  bekerja  merupakan  lipase spesifik  1,3-gliserida.    Isolat  P6  memiliki nilai perbandingan  DAG/TAG  lebih  besar dari  ALB/TAG,  yaitu  0,12  >  0,08. Berbeda  dengan  dua  isolat  lainnya,  nilai perbandingan  DAG/TAG  pada  isolat  P6 lebih  kecil  dari  ALB/TAG.    Oleh  karena itu  isolat  P6  diindikasikan  memiliki kemampuan  menghasilkan  lipase  spesifik 1,3-gliserida.  Hasil  identifikasi  dari  pe- nampakan  karakteristik  morfologi  koloni dan  pengamatan  mikroskopik  menunjuk- kan  bahwa  isolat  P6  adalah N.  sitophila Shear & Dodge.  Fungi yang adaptif pada substrat berlemak ini juga dikenal sebagai jamur roti merah  atau jamur oncom.

## Optimasi Biokonversi
N. sitophila P6 selanjutnya digunakan untuk  optimasi  biokonversi  CPO  menjadi DAG melalui proses gliserolisis. Lipase N. sitophila mampu mengkatalisis gliserolisis triasilgliserol  (TAG)  dalam  CPO  meng- hasilkan  DAG.  Secara  umum,  aktivitas gliserolisis  yang  dikatalisis  lipase  masih terus berlangsung sampai inkubasi hari ke- 10, dilihat dari penurunan kadar TAG dan kenaikan  kadar  DAG  maupun  ALB (Gambar  1-6).  Namun,  pada  kondisi tertentu seperti pada  suhu 30 o C dan pH 8, 50 o C  dan  pH  6,  atau  50 o C  dan  pH  7, aktivitas  sudah  mencapai  optimal  pada inkubasi selama tujuh hari. Hasil optimasi gliserolisis  untuk  produksi  DAG  pada variasi pH 6, 7, dan 8  dengan waktu inku- basi 0 sampai 10 hari pada suhu 30 –50 o C
Tri-Panji et al.
menunjukkan bahwa kadar DAG  tertinggi diperoleh  pada  pH  6  suhu  40 o C,  dengan kadar DAG mencapai 29% waktu inkubasi 10  hari  (Gambar  1).  Hasil  yang  sedikit lebih  rendah,  yaitu  kadar  DAG  sebesar 27%    diperoleh    dalam    gliserolisis  pada pH  7  dan  suhu  40 o C  (Gambar  2).  Kadar
DAG makin menurun pada pH gliserolisis
8,0 (Gambar 3)
Pada kondisi  optimal  tersebut, isolat
P6    juga      menghasilkan    ALB        paling rendah,  yaitu  sebesar  6%  (Gambar  4). Kondisi  lain  yang  cukup  baik,  yaitu  pada suhu  40 o C  pada  pH  7  yang  menghasilkan DAG sebesar 27%, sisa TAG paling kecil yaitu  48%.  Tetapi  pada  kondisi  ini,  ALB yang  dihasilkan  sangat  tinggi,  yaitu mencapai  25%  (Gambar  5).  Pada  umum- nya  standar  kandungan  ALB  untuk  bahan baku minyak konsumsi maksimum 3%.
Gambar 1.  Produksi diasilgliserol (DAG) dari biokonversi CPO dengan lipase N. sitophila pada berbagai suhu dan waktu inkubasi pada pH 6.
Figure 1.   Diacylglycerol (DAG) production from bioconversion of CPO with lipase from N. sitophila at several different temperatures and incubation times at pH 6.0
Gambar 2. Produksi diasilgliserol (DAG) dari biokonversi CPO dengan lipase N. sitophila pada berbagai suhu dan waktu inkubasi pada pH 7.
Figure 2.  Diacylglycerol (DAG) production from bioconversion of CPO with lipase from N. sitophila at several different temperatures and incubation times at pH 7.0
30 o C, pH 6
40 o C, pH 6 50 o C, pH 6 10 0 10 20 30 40 0 5 K a d a r D A G D A G l ev el (% )
Waktu inkubasi (hari) ( Incubation time (days))
Waktu inkubasi (hari) ( Incubation time (days)) 0 10 20 30 40 0 5 10 K a d a r D A G D A G l ev el ( % ) 30 o C, pH 7 40 o C, pH 7 50 o C, pH 7
Lipase spesifik 1,3-gliserida dari fungi lokal untuk biokonversi CPO...
Gambar 3. Produksi diasilgliserol (DAG) dari biokonversi CPO dengan lipase N. sitophila pada berbagai suhu dan waktu inkubasi pada pH 8.
Figure 3.  Diacylglycerol (DAG) production from bioconversion of CPO with lipase from N. sitophila at several different temperatures and incubation times at pH 8.0
Gambar 4. Perubahan kadar asam lemak bebas (ALB) dari biokonversi CPO dengan lipase N. sitophila pada berbagai suhu dan waktu inkubasi pada pH 6.
Figure 4.  Change  of   free  fatty  acid (FFA)  content  from  bioconversion  of  CPO  with  lipase  from N. sitophila at several different temperatures and incubation times at pH 6.0.
0 10 20 30 40 0 5 10
Waktu inkubasi (hari) ( Incubation time ( days ))
K a d a r D A G D A G l ev el (% ) 30 o C, pH 8 40 o C, pH 8 50 o C, pH 8 40 0 10 20 30 0 5 10
Waktu inkubasi (hari) ( Incubation time ( days ))
30 o C, pH 6 40 o C, pH 6
50 o C, pH 6 K a d a r A L B F F A l ev el (% )
Tri-Panji et al.
Pada  seluruh  kondisi  yang  diteliti, kadar DAG tertinggi mencapai 29%, yaitu pada  pH  6,  suhu  40 o C,  dan  waktu inkubasi  10  hari.  Kadar  DAG  ini  masih terlalu rendah dibandingkan dengan tuntutan  kadar  DAG  yang  dikehendaki oleh  kalangan  industri  untuk  minyak nutrasetikal,  yaitu  kadar  DAG  minimum 80%. Untuk mencapai kadar DAG sebesar ini  mungkin  dapat  dicapai  dengan  cara pemisahan  komponen  TAG  melalui  frak- sinasi  bertingkat.  Pada  proses  pen- dinginan,  secara  bertahap  TAG  yang memiliki bobot molekul paling tinggi akan membeku  terlebih  dahulu,  baru  kemudian disusul  oleh  DAG  dan  kemudian  MAG (Muderwa et  al .,  1985).  Dengan pemisahan  TAG  melalui  pendinginan bertahap,  kandungan  DAG  akan  mening- kat.  TAG  yang  dipisahkan  dapat  diguna- kan  kembali  dalam  proses  gliserolisis untuk memproduksi DAG.
Asam  lemak  utama  penyusun  DAG adalah  asam  oleat  (56,2%),  palmitat (40,0%),  dan  miristat  (2,7%).  Komposisi ini berbeda dengan komposisi asam lemak CPO yang didominasi oleh palmitat 64,5%
dan  oleat  41,6%.  Analisis  sebelumnya menunjukkan  bahwa  komposisi  asam lemak  CPO  tersusun  atas  asam  palmitat 39,5%,  oleat  25,5%,  stearat  15,8%, linoleat  13,7%,  linolenat  2,5%,  dan miristat 2,4% (Tri-Panji, 1997).
Menurut  Muderhwa et  al .  (1985) struktur  gliserida  minyak  sawit  tersusun atas  palmitat  yang  90%  berada  di  posisi luar  dari  gliserida  sehingga  berakibat minyak sawit (CPO) berbentuk padat pada suhu  ruang.  Berkurangnya  asam  palmitat pada  DAG  dibanding  pada  TAG  menun- jukkan  bahwa  lipase N.  sitophila bekerja secara  relatif  spesifik  pada  posisi  luar, yaitu  pada  C1  atau  C3,  dari  gliserida. Hasil ini berbeda dengan hasil uji aktivitas lipase dari Pseudomonas fluorescens yang menunjukkan aktivitas yang tidak spesifik (Tri-Panji & Siswanto, 1998). Kerja lipase yang  spesifik  ini  penting  dalam  produksi DAG  agar  reaksi  dapat  dikendalikan sehingga  tidak  menghasilkan  pemecahan total  gliserida  menjadi  ALB  seperti  yang biasa  terjadi  pada  pemecahan  secara  non enzimatis.
Gambar 5. Perubahan kadar asam lemak bebas (ALB) dari biokonversi CPO dengan lipase N. sitophila pada berbagai suhu dan waktu inkubasi pada pH 7.
Figure 5.  Change of free fatty acid (FFA) content produced from bioconversion of CPO with lipase from N. sitophila at several different temperatures and incubation times at pH 7.0.
0 10 20 30 40 0 5 10
Waktu inkubasi (hari) ( Incubation time ( days ))
30 o C, pH 7 40 o C, pH 7
50 o C, pH 7 K a d a r A L B F F A l ev el (% )
Lipase spesifik 1,3-gliserida dari fungi lokal untuk biokonversi CPO...
Gambar 6.  Perubahan kadar asam lemak bebas (ALB) dari biokonversi CPO dengan lipase N. sitophila pada berbagai suhu dan waktu inkubasi pada pH 8.
Figure 6.   Change  of  free  fatty  acid (FFA)  produced  from  bioconversion  of   CPO  with lipase from N. sitophila at several different temperatures and incubation times at pH 8.0.

## Kesimpulan
1. Sebanyak  26  isolat  telah  diisolasi  dari buah  sawit  dan  CPO  dan  dari  hasil penapisan  dengan  medium  penapis lipase  diperoleh  20  isolat  penghasil lipase.  Isolat  yang  menghasilkan  zona fluoresens tertinggi pada medium penapis  lipase  adalah  isolat  P6.  Lipase dari  isolat  yang  didentifikasi  sebagai N.  sitophila tersebut  spesifik  1,3- gliserida  karena  menghasilkan  nilai perbandingan  DAG/TAG  lebih  besar dari nilai perbandingan ALB/TAG (0,12 > 0,08).
2. Lipase N.  sitophila mampu  mengkata- lisis  gliserolisis  triasilgliserol  (TAG) dalam  CPO  menghasilkan  DAG.  Kon- disi  optimum  biokonversi  enzimatis  ini diperoleh  pada  suhu  40 o C,  pH  6,  dan waktu  inkubasi  selama  10  hari.  Asam lemak  utama  penyusun  DAG  adalah asam  oleat  (56,2%),  palmitat  (40,0%), dan miristat (2,7%). Berkurangnya asam palmitat  pada  DAG  dibanding  pada
TAG menunjukkan bahwa lipase N.  sitophila bekerja  secara  relatif spesifik pada C1 atau C3 dari gliserida.

## Daftar Pustaka
AOAC (1995). Official Methods of Analysis of the  Association  of  Official  Analytical Chemistry. Washington DC, AOAC Press.
Domsch,  K.H.,  Gams  W.  &  Anderson  T.H.
(1980). Compendium of Soil Fungi. Vol 1. London, Academic Press.
Elisabeth,  J  (2003). Roadmap dan  agenda Rusnas  kelompok  kerja  farmasi  dan nutrasetikal. Dalam Panduan  Lokakarya
Nasional : Identifikasi Agenda Riset Strategis  Dalam  Rangka  Pengembangan Industri  Hilir  Kelapa  Sawit.  Jakarta, Masyarakat Perkelapa-Sawitan Indonesia.
Elisabeth,  J.,  A.  Jatmika  &  E.  Nainggolan (1998).  Preparasi  mono-  dan  digliserida dari minyak sawit dengan proses gliserolisis enzimatik. J. Penelitian
Kelapa Sawit , 6 (1), 79-87. 0 10 20 30 40 0 5 10 Waktu inkubasi (hari) ( Incubation time (days )) K a d a r A L B F F A l ev el (% ) 30 o C, pH 8 40 o C, pH 8
50 o C, pH 8

## Tri- Panji et al.
Elisabeth,  J.,  A.  Jatmika  &  O.P.  Sitanggang (1999). Optimasi proses gliserolisis enzimatik  pada  minyak sawit  untuk meningkatkan  hasil  monogliserida. J. Penelitian Kelapa Sawit , 7 (3), 173-185.
Hou, C.T. & T.M. Johnston (1992).  Screening of  lipase  activities  with  culture  from agricultural  research  services  culture collection. JAOCS, 69, 1088-1097.
Ibrahim,  C.O.,  N.J.  Noor  &  I.  Darah  (1991). Isolation and identification of an exogenous  lipase  producing  fungi  using palm oil medium. J. Bioscience, 2, 59-69.
Kosugi,  Y.,  C.  Qing-long,  K.  Kanazawa  & H. Nakanishi (1997). Changes in hydrolysis  specificities  of  lipase  from rhizomucor  miehei  to  polyunsaturated fatty  acyl  ethyl  esters  in  different aggregation  states. JAOCS, 74 (11), 1395-1399.
Lubis,  A.U  (1992). Kelapa  Sawit (Elaeis guineensis  Jacq.) di  Indonesia .  Medan, Pusat  Penelitian  Perkebunan  Marihat. 383 p.
Mappiratu  (1999).  Penggunaan  biokatalis dedak  padi  dalam  biosistesis  antimikroba monoasilgliserol  dari  minyak  kelapa. Disertasi .  Bogor , Program  Pascasarjana, IPB.
Maliszewska,  I  &  P.  Mastalerz  (1992). Production  and  some  properties  of  lipase from Penicillium citrinum. Enzyme Microb. Technol. , 14, 190-193.
Muderhwa,  J.M.,  R.  Ratomahenina,  M.  Pina, J.  Graille  &  P.  Galzy  (1985).  Purification and properties of the lipases from Candida deformans (Zach)  Langeron  and  Guerra, JAOCS , 62 (6), 1031-1036.
Olivia,  A.,  A.W.  Gunawan  &  A.  Suwanto (1998).  Isolasi dan deteksi aktivitas lipase Rhizopus spp. Hayati , 5 (4), 113-115.
Onion,  A.H.S.,  D.  Allsoop  &  H.O.W.  Eggins (1981). Smith’s Introduction to Industrial Mycology. 7  th  (eds).  British,  Edward Arnold. p. 140-142.
Sigma  (2005). Biochemicals  &  Reagents  for Life Science Research . Singapore, Sigma- Aldrich Pte. Ltd., 2935 p.
Suzuki,  T.,  Y.  Mushiga,  T.  Yamane  & S.  Shimizu  (1988).  Mass  production  of lipase by fed-batch culture of Pseudomonas fluorescens. Appl.
Microbiol. Biotechnol. , 27 , 417-422.
Steele,  D.B.  &  M.D.    Stowers  (1991). Techniques  for  selection  of  industrially important  microorganisms. Ann.  Rev Microbiol., 45 , 89-106.
Tomita, F (1985).  Screening of useful of lipid strains  international. In  Post  Univercity
Course in Microbiology . Japanese National  Commission  for  UNESCO,
320 p.
Tri-Panji  (1997).    Growth  and  the  content  of polyunsaturated  fatty  acids  of Absidia corymbifera biomass on media containing crude  palm  oil. Menara  Perkebunan , 65,
(3), 104-110.
Tri-Panji & Siswanto (1998). Lipase production  of Pseudomonas  fluorescens
growing  on  media  containing  crude  palm oil (CPO) and its potential application for triglyceride  biotransformation. In Annual Reports of ICBiotech, International
Center  for  Biotechnology. Japan  Osaka
University. Wingender,  J.,  S.  Volz,  &  U.K.  Winkler (1987). Interaction of extracellular
Pseudomonas lipase  with  alginate  and  its potential  use  in  biotechnology, Appl. Microbiol. Biotechnol. , 27 , 139-145.
Yamane, T (1987).  Enzyme technology for the lipid  industry:  An  engineering  overview. In Applewhite, T.H. (ed). Proceeding Of World  Conference  on  Biotechnology  for Fats  and  Oils  Industry. AOAC Champaign, 17-22.
Yasunaga,  K.,  Y.  Katsuragi  &  T.  Yasukawa (2001).    Nutritional  characteristics  of diacylglycerol. In 2001  PIPOC  Interna- tional Palm Oil Congress , 149-155.