Pengembangan Indirect Dipstick ELISA untuk Deteksi Aflatoksin B1 pada Pakan  dan Jagung

## Sri Rachmawati, Prima Mei W idiyanti, Hasim Munawar
Balai Besar Penelitian Veteriner Jl.. R E Martadinata  30,  Bogor Email: srizai@hotmail.com
Diterima Maret 2013 disetujui untuk diterbitkan Mei 2013

## Abstract
Enzyme  Linked  Immunosorbent  Assay ( ELISA )  is  an  immunological  method  can  be used  to  analyze  aflatoxin  B 1 (AFB 1 )  in  feed. ELISA technique  must  be  done  by  using  an instument ( ELISA reader) which is  not effective  when  used in the field.  Therefore, the simple ELISA technique is  needed such as indirect dipstick ELISA ( d-ELISA ).  The aim of research is to  develop  AFB 1 screening  method  using d-ELISA .  The  research  is  focusing  on development  and  validation  of indirect  d - ELISA ,  and  its  application  on  sa mple  of  feed  and corn.  The  results showed  that  the  best coating time  for antigen  AFB 1 -BSA  (0,4  ug/ml) is  24 hours,  reaction  time  for  antibody  anti  AFB 1 (1/800)  and  AFB 1 standard  is  15  minutes,  and reaction  time  for goat  anti  rabbit -HRPO  conjugate  1/2500  and  substrate  of  orthodiasianin (ODN) is 20 minutes. The results of indirect d-ELISA on 22 samples are found that 7 sa mples are contaminated by AFB 1 with concentration above 20 ng/g and 7 samples are contaminated by AFB 1 with concentration in the range of 0 – 20 ng/g. Finally, it is concluded that the indirect d-ELISA is applicable to be used in the fields.
Key  words : feed, aflatoxin B 1 (AFB 1 ), indirect d- ELISA

## Abstrak
Enzyme Linked Immunosorbent  Assay ( ELISA ) adalah  metode i mmunologi yang  dapat digunakan  untuk  menganalisis  aflatoxin  B 1 (AFB 1 )  pada  pakan.    Teknik ELISA harus dilakukan  dengan  menggunakan  instrumen  ( ELISA  reader) yang  tidak  efektif  pada  saat digunakan  di  lapangan.    Oleh  karena  itu,  suatu  teknik ELISA sederhana  diperlukan  seperti indirect dipstick ELISA ( d-ELISA ).    Penelitian  ini  terfokus  pada  penge mbangan  dan  validasi indirect  d - ELISA ,  dan  aplikasinya  pada  sampel  pakan  dan  jagung.    Hasil  penelitian  ini menunjukkan  bahwa  waktu coating terbaik  untuk  antigen  AFB 1 -BSA  (0,4  ug/ml)  adalah  24 jam,  waktu  reaksi  untuk  antibody  anti  AFB 1 (1/800)  dan  AFB 1 standar  adalah15  menit,  dan reaksi  waktu  untuk goat  anti  rabbit -HRPO  conjugate  1/2500  dan  substrat  orthodiasianin (ODN) adalah 20 menit.  Hasil analisis indirect d-ELISA pada 22 sampel menunjukkan bahwa 7  sampel  terkontaminsai  AFB 1 dengan  konsentrasi  di  atas  20  ng/g  dan  7  sa mpel  lainnya terkonta minsai  oleh  AFB 1 dengan  konsentrasi  antara  0  –  20  ng/g.    Akhirnya,  dapat disimpulkan bahwa indirect d-ELISA dapat diaplikasikan di lapangan.
Kata kunci : pakan, aflatoksin B 1 (AFB 1 ), indirect d- ELISA

## Pendahuluan
Enzyme Linked Immunosorbent Assay ( ELISA )  adalah  metode  immunologi yang  melibatkan  suatu  enzim  untuk
mendeteksi  antibodi  atau  antigen  dalam suatu sampel. Pemanfaatan ELISA secara luas  dapat  digunakan  untuk  mendeteksi senyawa  toksik  dalam  makanan  (Asensio et  al., 2008).  Metode  ini  dapat  digunakan
74       Biosfera 30 (2) Mei 2013
juga untuk berbagai matrik sa mpel (jagung,  pakan,  kacang,  hati  dan  telur) dengan ELISA format indirect dan direct microplate-ELISA ( p-ELISA ) untuk mendeteksi Aflatoksin B1 (AFB 1 ) (Rachmawati,  2005;  Rachmawati,  2006). ELISA me mpunyai kelebihan dibandingkan dengan alat sebelumnya yaitu
kromatografi  cair  kinerja  tinggi  (KCKT) yaitu  lebih  spesifik,  murah,  mudah,  dan sensitif.    Aflatoksin  adalah  senyawa metabolit  sekunder  yang  dihasilkan  dari kapang  ,terutama  oleh Aspergillus  flavus, yang  diketahui  dapat  membahayakan kesehatan  hewan  dan  manusia.  Diantara jenis-jenis  aflatoksin  yang  paling  banyak mendominasi  di  alam  adalah  Aflatoksin  B 1 (AFB 1 )  dan  merupakan  jenis  aflatoksin yang  paling  berbahaya . AFB 1 diketahui sering  kali  mencemari  berbagai  komoditas pertanian  seperti  kelo mpok  serealia  dan bahan  pakan  ternak  terutama  di  daerah tropis  dan  sub-tropis  yang  mendukung pertumbuhan kapang dan produksi senyawa tersebut (Eraslan et al., 2005).
AFB 1 juga dapat menimbulkan
kerugian ekonomi karena terjadi
penurunan  kualitas  dan  kuantitas  produk peternakan.Kerugian ekonomi
yang disebabkan  oleh  ce maran mikotoksin teruta ma  aflatoksin  di  Asia  mencapai  400 juta  dolar  per  tahun  (Zanelli,  2000). Berbeda  dengan  di  Amerika,  kerugian akbibat  senyawa  ini  dapat  ditaksir  dari laporan  tahunan  kehilangan  sekitar  932 juta  dollar  dan    446  juta  dolar  untuk penanggulangan  dari  aflatoksin  (Cast,
2003). AFB 1 dilaporkan dapat
menyebabkan  efek  toksisitas  pada  hewan ternak (Mani et  al., 2001).  Efek  kronis  dari keracunan AFB 1 dapat meyebabkan penurunan  bobot  badan  ternak  ayam pedaging  secara nyata  terjadi  pada pe mberian  pakan yang  mengandung  AFB 1 200  ng/g  selama  8  minggu.  Selain  itu, AFB 1 menyebabkan  gangguan  kesehatan ternak seperti pertumbuhan terhambat  dan ke matian, sehingga produksi ternak
menurun (Muthiah et al., 1998).
Keberadaan  aflatoksin  dalam  telur  tetas juga  berpengaruh  terhadap  daya  tetas
maupun  status  kesehatan  ayam  yang ditetaskan.Percobaan mengenai efek berbagai  dosis  AFB 1 (15,6  -  250  ng) terhadap  embrio  (telur  bertunas)  ayam menunjukkan
adanya gangguan
perkembangan, ke matian dan daya tetasnya  terutama  pada  dosis  250  ng (Bahri et  al., 2005).  Sedangkan  residu AFB 1 dan  senyawa  turunannnya  seperti Aflatoksikol  dan  Aflatoksin  M 1 ,    juga dite mukan  pada  jaringan  tubuh  (daging) dan  hati  dari  aya m  yang  berhasil  menetas (Widiastuti et  al., 2003). Selain  pada hewan,  AFB1  sangat  berbahaya  juga  bagi manusia.
International Agency for Research on Cancer (IARC) mengklasifikasikan aflatoksin sebagai salah satu penyebab kanker pada manusia sehingga  AFB 1 diklasifikasikan  dalam  grup 1  (bahan  yang  bersifat  karsinogenik terhadap  manusia)  (IARC,  1993).  AFB 1 dapat  menyebabkan kanker hati yang  akut dan secara epide miologi melalui biomarker ,  pengaruh  AFB 1 dengan  kanker hati menunjukkan korelasi positif (Probst et al., 2007; Groopman et al., 2005).
Pencemaran  pakan  oleh  aflatoksin banyak  juga  dilaporkan  di  Indonesia. Status ce maran  AFB 1 di Propinsi Lampung dan  Jawa  Ti mur  menunjukkan  tingkat kejadian  100% untuk  pakan  komersial  dan jagung  asal Jawa Ti mur. Selain itu, tingkat kejadian 86,7% dan 70% untuk jagung dan pakan  komersial  asal  Lampung  (Bahri et al. 2005). Sedangkan, hasil pengujian mikotoksin  pada  jagung  lokal  (Jawa, Sumatera  Utara,  Lampung  dan  Sulawesi Selatan) maupun impor (USA dan Argentina)    asal  berbagai  pabrik  pakan  di Indonesia  yang  diuji  secara ELISA menunjukkan  bahwa  AFB 1 terdeteksi pada kisaran  konsentrasi  19,1  -  87,4ng/g (Tangendjaja et  al., 2008).  Sehingga, keadaan  diatas  bertentangan dengan SNI tentang  batas  kadar  aflatoksin  yang dipersyaratkan  yaitu        20  ng/g  untuk pangan  dan  50  ng/g  untuk  pakan  (Dewan Standardisasi Nasional, 2000).
Penelitian ini dilakukan untuk menge mbangkan  metode  skrining  AFB 1 menggunakan indirect dipstick  ELISA ( d-
ELISA )  yang  menggunakan  prinsip  relatif sama  dengan p - ELISA .  Namun, p - ELISA memerlukan  alat ELISA reader sebagai alat ukurnya sehingga membutuhkan tenaga teknis yang handal untuk pengoperasiannya  dan  juga  tidak  efektif digunakan  di  lapang  sedangkan d - ELISA sebaliknya  tidak  perlu  alat  ukut  dan  tidak perlu  teknisi  yang  handal.  Oleh  karena itu, d-ELISA me mpunyai  keuntungan  yaitu biaya  analisis relatif murah, mudah dilakukan  dan  dapat  diaplikasikan  di lapang (Zheng et al., 2006).

## Materi dan Metode

## Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah antibodi  anti  AFB 1 (Produksi  Balai  Besar Penelitian Veteriner (Bbalitvet)) (Rachmawati et  al., 2004),  Antigen  AFB 1 -
BSA SIGMA, dan konjugat goat anti rabbit - HRPO SIGMA, TMB dan ODN. Pengambilan  sampel  dilakukan  dengan metode purposive sa mpling dengan jumlah yang disesuikan dengan jumlah
maksimum adalah  22 sa mpel  yang disesuaikan  menurut  Isaac  dan  Micahel (Isaac and Michael, 1995).
Sensitifitas  antibodi  anti  AFB 1 tes,  indirect p- ELISA
Metode  analisis  dengan p-ELISA dilakukan  dengan coating 100  µl  (10 µg/ml)    antigen          AFB 1 -BSA  dalam microplate ,  diinkubasi  semalam,  dicuci dengan  akuades,  di bloking dengan  200  µl skim  milk (2,5%)  selama  2  jam,  dicuci dengan  akuades,  ditambahkan  100  µl antibodi anti AFB 1 yang  di tes, selanjutnya diinkubasi  selama  1  jam, plate di  cuci ke mbali    dan  ditambahkan  konjugat goat anti  rabbit- HRPO  (1/2500)  selama  1  jam,
dicuci dengan akuades, direaksikan dengan  100  µl    substrat tetrametilbenzidin (TMB)  selama  30  menit,  dita mbah  50  µl H 2 SO 4 2,5  M,  diukur optical  density (OD) dengan ELISA reader.
Optimasi waktu uji indirect d-ELISA
Stick dicelupkan  pada  400  µl  larutan AFB 1 -BSA  0,4 µg/ml  dan diinkubasi semalam.
Kemudian, stick dicuci menggunakan  air  keran,  di bloking dengan susu skim 2,5% dalam PBS,  dan diinkubasi selama 2 jam. Selanjutnya, stick dicuci,  dicelupkan pada campuran antibodi anti  AFB 1 (1/800)  dan standar  AFB 1 (0,  20 dan 50  ng/g) atau spike ekstrak sampel  (0, kontrol  negatif  dan  20  ng/g  serta  50  ng/g, positif AFB 1 ) atau ekstrak sampel, selanjutnya diinkubasi 10-60 menit.
Setelah itu, stick dicuci, ditambah  konjugat g oat  anti  rabbit- HRPO  (1/2500)  dan diinkubasi  10-30  menit.  Kemudian, stik dicuci,  dicelupkan  kembali kedalam  larutan substrat  ODN  selama  10-30  menit,  dan dia mati  warna yang  menempel  pada stick .
Makin  tinggi  analit  AFB 1 yang  terkandung pada  sampel,  warna  yang  terbentuk semakin pudar atau warna hilang, sedangkan  warna  kuning  kecoklatan  pada stick kontrol  negatif  paling  jelas  terlihat. Lamanya  waktu  pencelupan  pada  setiap tahap  dipelajari  dan  yang  memberikan respon  cepat  dan  sensitif  dipilih.  Evaluasi warna  yang  terbentuk/terlihat  menempel pada stick ,  dilakukan  dengan  memberikan tanda (si mbol) sbb:
* = terlihat warna  kuning  kecoklatan sedikit menempel pada stick .
**=  terlihat  warna  kuning  kecoklatan  lebih banyak menempel pada stick
Tidak  ada  bintang  (-)  =  tidak  terbentuk warna

## Validasi metode
Validasi  metoda  dilakukan  dengan me mbuat spiked sample dengan menambahkan  standar  AFB 1 konsentrasi 50  ng/g  pada  matrik  sampel  jagung  dan pakan  dan  menggunakan  prosedur seperti pada bagian pengembangan  metode.

## Analisis sampel dengan indirect d-ELISA
Sampel  ditimbang  5  g  jagung  atau pakan, dimasukkan dalam tabung sentrifugasi,  dita mbahkan  25  ml  metanol 60%,  dikocok,  disentrifus,  diambil  lapisan atas  untuk  dianalisis  dengan d-ELISA
76       Biosfera 30 (2) Mei 2013
(sesuai  prosedur  pada  bagian  optimasi d - ELISA ).

## Analisis sampel dengan direct p-ELISA
Metode  analisis  dengan p-ELISA dilakukan  dengan coating 100  µl  antibody- anti  AFB 1 dalam microplate ,  diinkubasi semalam, dicuci dengan akuades, di bloking dengan 200  µl skim  milk selama 2 jam, dicuci  dengan akuades,  direaksikan 75  µl  campuran  sa mpel  dan  konjugat goat
anti  rabbit- HRPO  (1:2)  selama  1  jam, dicuci dengan akuades, direaksikan dengan  100  µl    substrat  TMB  selama  30 menit,  dita mbah 50  µl  H 2 SO 4 2,5  M,  diukur nilai  OD  dengan ELISA  reader ,  dan dihitung persen inhibisinya dengan rumus . Kadar
AFB 1 dihitung
dengan me mbandingkan  %  inhibisi  sampel  dan  % inhibisi  seri  standar  AFB 1 pada  linier kalibrasi (Rachmawati et al., 2012).
% Inhibisi Standar =  1- A standar - A blanko standar A kontrol - A blanko standar x 100
% Inhibisi Sampel =  1- A sampel - A blanko standar A kontrol - A blanko standar x 100

## Hasil dan pembahasan
Sensitifitas antibodi anti AFB 1 tes,  indirect p- ELISA
Penelitian  pengembangan d-ELISA
diawali dengan pengujian sensitifitas antibodi  yang  dilakukan  secara indirect p -
ELISA .  Hasil  pengujian  ditunjukan  pada
Ga mbar  1,  bahwa  antibodi-anti  AFB 1 (terutama  kode  2  dan  3)  masih  dapat digunakan  untuk  pengembangan d- ELISA .  Nilai  OD  antibodi  masih  cukup tinggi  yaitu  berkisar  0,9  -  1,2  untuk penggunaan  pada  pengenceran  800-1600 kali.
Gambar 1.  Respon aktifitas antibodi-anti AFB 1 (nilai OD) pada berbagai pengenceran Figure 1. Antibody anti AFB 1 activity response (OD value) on variety of dilution factor

## Optimasi waktu uji indirect d-ELISA
Waktu  kondisi  opti mum  dari  metode d-ELISA diketahui  yaitu  waktu coating antigen  AFB 1 -BSA  (0,4  µg/ml)  adalah  24 jam, waktu  pencelupan dala m antibodi anti AFB 1 (1/800)  (AB)  dan  standar  AFB 1 20 dan  50  ng/g    adalah  15  menit,  waktu
pencelupan  dalam  konjugat goat  anti rabbit -HRPO  1/2500  dan  substrat  masing- masing  10  menit,  sehingga  total  total waktu  uji yang  diperlukan adalah 35  menit. Data  selengkapnya  dapat  dilihat  pada Tabel 1. 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 800x 1600x 3200x 6400x opti cal de n sity pengenceran antibodi 1 2 3
Tabel  1.    Waktu  optimum  reaksi antibodi,,  standar  AFB 1 dan   konjugat  pada  pengembangan uji d-ELISA
Table  1.Optimation  time  of  reaction  between  antibody,  AFB 1 standard  and  conjugate  on development of d-ELISA
Waktu inkubasi (menit) AB + std AFB 1 Waktu inkubasi (menit) Konjugat (1/2500) Pengamatan warna + substrat (terbentuk warna pada menit ke- Negatif AFB 1
Positif AFB 1
20 ng/g 50 ng/g 60 30 ** * (-) 5 30 15 ** * (-) 5 15 10 ** * (-) 10
Keterangan: AB=  Antibodi  anti  AFB 1, **=  stick  berwarna  kuning  kecoklatan;  *=  warna me mudar;                        (-)  = tidak berwarna
Selain waktu opti mum, hasil penga matan visual menunjukkan terbentuknya  warna  kuning  kecoklatan  pada stick sebagai kontrol negatif yang menunjukkan tidak adanya  AFB 1 ,  dan  warna
semakin  me mudar  pada stick sebagai  kontrol positif yang menunjukkan naiknya konsentrasi  AFB 1 .  Visualisasi  pembentukan warna pada  stick  dapat  dilihat  pada  Gambar 1.
Gambar  2. d-ELISA kondisi  optimum  (a)  Kontrol  negatif  (tidak  ada  AFB 1 ),  stik  berwarna kecoklatan (**), (b) AB + 20 ng/g AFB 1, stik berwarna sedikit coklat (*), dan  (c) AB  + 50 ng/g AFB 1, stik tidak berwarna (-) Figure 2.  Opti mum condition of d-ELISA . a)  Negative control, stick  was colored (**), (b) AB + 20  ng/g  AFB 1, stick was  less colored (*),  dan   (c) AB   + 50  ng/g  AFB 1, stick  was  not colored (-)

## Validasi Metode
Validasi uji d-ELISA dilakukan dalam matrik  sampel  jagung  dan  pakan  yang tidak  mengandung  aflatoksin.  Sampel- sampel  tersebut  diekstrak  dalam  metanol 60%,  kemudian  ditambahkan  ( spiked ) standar  AFB 1 50  ng/g,  selanjutnya  sa mpel
spiked tersebut  dianalisis  secara d-ELISA pada  kondisi  optimum.  Hasil  validasi menunjukkan  bahwa  dari  sampel spiked matriks  jagung,  hanya  satu  dari  tiga ulangan  yang  memberikan  sedikit  warna kecoklatan.    Sedangkan  pada  sampel spiked matrik  pakan,  semua  perlakuan
(a) (b)
(c)
menunjukkan tidak  berwarna. Berdasarkan hasil  tersebut, d-ELISA dapat  mengukur konsentrasi  AFB 1 50  ng/g  dalam  jagung dan  pakan  sehingga  hal  ini  sangat  sesuai dengan  yang  diharapkan.  Jika  uji  ini dianggap  seperti  uji recovery (perolehan
ke mbali)  pada  analisa  kuantitatif,  maka metode d-  ELISA mempunyai  validasi yang  cukup  baik, recovery sebesar 83,3%,    karena  5  dari    6  perlakuan menunjukkan kesesuaian. Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil uji validasi d-ELISA pada matrik sampel jagung dan pakan
Table 2. Method validation  of d-ELISA on corn and feed samples Uraian sampel Hasil penga matan warna pada dipstick (ulangan) ke- 1 2 3 Kontrol negatif ** ** ** Spike (Jagung + 50ng/g AFB 1 ) * (-) (-) Spike (Pakan + 50 ng/g AFB 1 ) (-) (-) (-)
Keterangan:** = berwarna kuning kecoklatan, * = warna memudar (sedikit terlihat warna), (-)  = tidak terlihat warna
Tes d-ELISA sudah  dikembangkan untuk  pengujian  penyakit  toksoplasma pada  hewan  ternak,  dimana  sampel  yang dianalisis  adalah  serum  (Subekti,  2007). Rapid test tidak  hanya  menggunakan stick polystyrene ,  tetapi  juga  menggunakan membrane  nitrocellulose sebagai  media, seperti  pada    deteksi  cepat  analisis  AFB 1 pakan  babi  dengan  melihat  perbedaan intensitas  warna.  Kontrol  negatif  akan memberikan warna merah
muda sedangkan kontrol positif akan
memberikan warna yang memudar berdasarkan  tingkat  konsentrasi  AFB 1 (Demulle et  al., 2005).  Secara  prinsip, pendekatan  pe mbentukan  warna  pada penelitiannya cenderung memiliki kesa maan dengan penelitian yang dilaporkan pada makalah ini.
Hasil  analisis  sampel  jagung  dan  pakan secara d-ELISAdan p-ELISA
Selanjutnya,  metoda d-ELISA diuji cobakan  untuk  menganalisis  22  sa mpel dengan  rincian  10  sampel  jagung  dari mulai  kode sampel J1- J10  dan 12 sa mpel pakan dari  mulai  kode sampel  P1-P12  dan
hasilnya  akan  dibandingkan  dengan  hasil pengukuran dengan p-ELISA .
Pada  sampel  jagung  dan  pakan, hasil  uji d-ELISA diperoleh  7  sa mpel yaitu J2,  J6,  J7,  J10,  P1,  P5,  dan  P8, me mpunyai  kandungan  AFB 1 diatas  20 ng/g  yang  ditandai  dengan  tidak  terbentuk warna  pada  stick  (-).  Sampel  jagung  J4, J8,  dan J9  dan sa mpel  pakan P6, P7,  P11 dan  P12    terbentuk  sedikit  warna  pada stick (*)  yang menunjukkan  sampel tersebut  me mpunyai  kandungan  AFB 1 berada  disekitar 0-20  ng/g.  Sampel  jagung dan pakan lainnya menunjukkan kandungan  AFB 1 sangat  rendah  yang ditunjukan  dengan  pembentukan  warna pekat  pada  stick  (**).    Hasil  uji d-ELISA pada sampel jagung dan pakan, menunjukkan  bahwa  semua  sampel  yang dianalsis  mempunyai  hasil  yang  sa ma  jika diukur  dengan p-ELISA .  Kesesuaian  ini ditunjukkan  dengan  adanya  kesamaan dengan  ketentuan  pengukuran  dari d- ELISA yaitu jika  konsentrasi  diatas 20 ng/g maka tidak akan memberikan warna, tetapi jika dibawah 20 ng/g maka akan me mberikan  warna  pada stick dengan intensitas  warna  yang  berbeda  tergantung
Sri Rachmawati dkk., Pengembangan Indirect Dipstick ELISA. : 73-81       79
dari  konsentrasi  AFB 1 .  Data selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Kandungan AFB 1 (ng/g) sampel  jagung dan pakan dengan metode d-ELISA dan p- ELISA
Table 4. AFB 1 concentration of corn and feed samples (ng/g) analyzed by d-ELISA and p- ELISA Kode sampel d-ELISA p-ELISA Kode sampel d-ELISA p-ELISA J1 ** Tt P2 ** Tt J2 (-) 34,1 P3 ** Tt J3 ** Tt P4 ** Tt J4 * 10,9 P5 (-) 26,5 J5 ** Tt P6 * 11,5 J6 (-) 26 P7 * 0,7 J7 (-) 47,2 P8 (-) 37,1 J8 * 10 P9 ** Tt J9 * 1,9 P10 ** Tt J10 (-) 46,8 P11 * 6,3 P1 (-) 45 P12 * 10,8
Keterangan: J = sampel jagung, P = sampel pakan, tt=  tidak terdeteksi (kadar lebih kecil dari 0,,3ng/g) pada pengujian dengan p-ELISA , ** = stick berwarna kuning kecoklatan (kadar AFB 1 tidak terdeteksi),                      *= stick sedikit berwarna (tt > kadar AFB 1 <20 ng/g), (-)= stick tidak berwarna (kadar AFB 1 > 20ng/g)
Hasil  analisis  AFB 1 dengan  uji d- ELISA diatas  menunjukkan  bahwa  metode ini  dapat  diaplikasikan  untuk  analisis sampel lapangan, sehingga mempermudah pengguna seperti
peternak,  petani,  dan  petugas  karantina untuk  monitoring  kualitas  produknya  dari residu AFB 1 secara langsung.

## Simpulan
Waktu  kondisi  optimal  uji indirectd- ELISA diperoleh,  yaitu coating antigen
AFB 1 -BSA (0,4 µg/ml semalam, pencelupan dalam antibodi anti AFB 1 (1/800)  yang  ditambahkan  standar AFB 1 selama  15  menit,  pencelupan  dalam konjugat goat  anti  rabbit -HRPO  (1/2500) 10 menit dan substrat 10 menit.
Indirect  d-ELISA dapat  digunakan untuk  menganalisis  22  sampel  (pakan  dan jagung).  Namun,  aplikasi  metode  ini  perlu terus dike mbangkan dan direvisi mengingat  jumlah  sampel  yang  dianalisis
belum  me mpresentasikan  kehandalan  dari metode ini.

## Ucapan terima kasih
Ucapan
terima kasih perlu disa mpaikan  kepada  Kemenristek  yang telah  mendanai  penelitian  ini    serta  Dr. Andria  Agusta  yang  telah  memberikan saran  dan  kritik  dalam  perbaikan  karya ilmiah ini.

## Daftar Pustaka
Asensio, L., Isabel G., Teresa G., Rosario M.2008. Determination of food authenticity by enzyme- linkedi mmunosorbent assay ( ELISA ). Food Control 19: 1–8.
Bahri,  S.,  R.  Marya m  dan  R.  Widiastuti. 2005.  Ce maran  aflatoksin  pada pakan  dan  bahan  pakan  dari Propinsi Lampung  dan Jawa  Timur. J  Ilmu Ternak  dan Veteriner . 10(3): 236-241.
80       Biosfera 30 (2) Mei 2013
Bahri, S., R. Widiastuti dan Y. Mustikaningsih. 2005. Efek aflatoksin  B1  (AFB1)  pada  embrio ayam. J Ilmu Ternak dan
Veteriner .10(2): 160-168 Cast.2003.  Council  of  Agricultural  Science and  Technology.Mycotoxins:  Risk in plant,  ani mal and human systems. CAST,Ames,IA.p.139 Demulle,  B.S.,  S.  M.D.G.  De  Saeger.,  L. Sibanda., I. B. Vetro., and C.H. Van
Peteghem.  2005.  Development  of an  immunoasssay-based lateral flow dipstick for  the  rapid  detectin of  aflatoxin  B1 in  pig  feed.  Faculty of  Pharmacetical  Sciences,  Ghent University, Belgium. p. 1-4.
Dewan  Standardisasi  Nasional.  2000. Standar  Nasional  Indonesia  (SNI), persyaratan  kadar  aflatoksin  pada pangan dan pakan.
Eraslan,G.khan,  D.  Epsuz,  M.  Akdouan, F.Pahundokuyucu, andL.Altintap.2005.  The  Effects  of Aflatoxin  and  Sodium  Bentonite Combined  andAlone  on  Some Blood  Electrolyte  Levels  in  Broiler Chickens.  Turk  J  Vet  Anim  Sci. 29:601-605
Groopman,  J.D.,  and  T.W.  Kensler.  2005.
Role  of  metabolism  and  viruses  in aflatoxin-induced liver cance. Toxicol.and  Applied  Pharmacol .  206: 131-137.
IARC.  1993.  IARC  Monographs  on  the evaluation  of  carcinogenic  risks  to human.  Vol.  56.  Some  naturally occurring  substances:  food  items and constituents, heterocyclic aromatic  amines  and  mycotoxins. International  Agency  for  Research on Cancer, Lione. hal 245-395.
Isaac,  S.  and  Michael,  W.B.  1995.
Handbook in Research and
Evaluation 3 rd Edition.  SanDiego CA: EdITS
Mani, K., K. Sundaresan and K.
Viswanathan. 2001. Effect of immunomodulators on the performance of petelurs in aflatoxicosis. Indian.  Vet.  J. 78  (12): 1126-1129.
Muthiah,  J.,  P. Reddy  and N.D.J.
Chandran.  1998.  Effect  of  graded levels of aflatoksin B1 and the effect
of  direct  fed  microbials  (DFM)  on egg production in egg type breeders. Indian.Vet.  J. 75 (3):  231- 233.
Probst,  C.,  H.  Njapau    and  P.J.  Cotty. 2007. Outbreak of an acute aflatoxicosis  in  Kenya  in  2004: Identification  of  the  causal  agent. App. Environ.  Mcrobiol. 73(8): 2762- 2764.
Rachmawati,  S.  2005.    Aflatoksin  dalam
pakan ternak di Indonesia: Persyaratan kadar dan
penege mbangan  teknik  deteksinya. Wartazoa 15: 26-37.
Rachmawati,  S.  2006.  Penge mbangan metode  analisis aflatoksin  B1  dalam hati  ayam  secara  Enzyime  Linked Immunosorbent Assay ( ELISA ). Pros.  Seminar  Nasional  Peternakan dan  Vetriner  2006.  Pusat  Penelitian dan  Pengembangan  Peternakan.
Badan penelitian dan Pengembangan Pertanian.
Departe men  Pertanian.  Bogor  5-6
September 2006. p. 783-789. Rachmawati,  S.,   A. Lee,  T.B. Murdiati  dan I.  Kennedy.2004.  Pengembangan Enzyme Linked Immunosorbent Assay ( ELISA )  Teknik  untuk  Analisis Aflatoksin B1pada Pakan Ternak. Prosiding Seminar Parasitologi dan Toksikologi Veteriner, 2004.134-148
Rachmawati,S.  dan  H.  Munawar.  2012. Validation  of  Analysis  of  Aflatoxin
B1 in Corn using Enzyme Linked Immunosorbent Assay.
Proceeding  of     National     Seminar
Sri Rachmawati dkk., Pengembangan Indirect Dipstick ELISA. : 73-81       81
for  Standardization .  2012  p  97  - 108
Subekti,, D.T. 2007. Laporan akhir penelitian. Balai Besar Penelitian Veteriner. p. 8-13.
Ta nge nd ja ja ,B;  s .  Rachmawati and E. WINA. 2008. Mycotoxin contamination on corn used by feed mills in Indonesia. Indon. J. Agric.
Sci. 9(2): p.68-76
Widiastuti,  R.,  Darminto,S.  Bahri  dan  R.
Firmansyah. 2003. Inokulasi aflatoksin  B1  pada  telur  berembrio dan  residunya  pada  ayam  yang menetas. Prosiding Seminar
Nasional.  Teknologi Peternakan  dan Veteriner.  Bogor  29-30  September 2002, hal. 462-465.
Zanelli. 2000. Mould, bacteria and solution. Feed Industry Service (FIS). Italy:2.
Zheng,  M.Z.,  J.L.  Richard  dan  J.  Binder. 2006.  A  review of  rapid  methods  for the  analysis  of  mycotoxins. J. Mycophatologia 161: 261-273
.