## IDENTIFIKASI MIKROBIOLOGI DAN ANALISIS GEN 16S rRNA BAKTERI RESISTEN MERKURI ISOLAT S3.2.2 YANG DIPEROLEH DARI LIMBAH TAMBANG RAKYAT

## Fatimawali 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan  spesies  atau  genus  dari  kultur  bakteri resisten  merkuri  yang  telah  diisolasi  dari  perairan  tercemar  merkuri.  Kultur  S3.2.2  yang resisten  dilakukan  identifikasi  secara  mikrobiologi  yaitu  uji  morfologi,  fisiologi  dan  uji biokimia,  kemudian  dilakukan  analisis  secara  molekuler  dengan    mengamplifikasi  gen  16S rRNA  dengan  metode  PCR  menggunakan  primer  universal  Bact-  F1  forward  /Uni-B1 Reverse,  hasil  amplifikasi  dielektroforesis  dengan  agarose  1,5%  dan  selanjutnya  dilakukan sekuensing terhadap gen 16SrRNA.
Hasil identifikasi dengan uji  morfologi, fisiologi dan biokimia  menunjukkan bahwa kultur S3.2.2 adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang, nonmotil, katalase (+), sitrat (+), H 2 S  (-),fermentase  (+),  indol  (+)  dan  Lisin  (+).  Hasil  blast  terhadap  urutan  nukleotida  gen 16S rRNA mempunyai kesamaan 99% dengan Klebsiella pneumoniae .
Key words : Bakteri  resisten merkuri, gen 16S rRNA, limbah

## ABSTRAK
The  objective  of  this  research  was  to  determine  the  species  or  genus  of  mercury resistant  bacteria  culture  from  mercury  polluted  waters.  Microbiology  identification  of culture  S3.2.2  was  done  with  morphology,  physiology  and  biochemistry  test.  Molecular analysis  was  done  by  amplifying  16S  rRNA  gene  using  PCR  method.  Universal  Bact-  F1 forward/Uni-B1  Reverse  was  using  as  primer.  Amplification  result  was  electrophorize  with agarose 1,5%, furthermore sequencing was done against 16SrRNA gene.
The  result  shows  that  culture  S3.2.2  were  negative  grams  bacteria,  rod  shaped, nonmotil,  catalase  (+),  citrat  (+),  H 2 S  (-),  fermentase  (+),  indol  (+)  and  lisin  (+).  Blast analysis  against  nucleotide  sequence  of  16S  rRNA  gene  possesses  99%  similarities  with Klebsiella pneumoniae .
Kata kunci : Bakteri  resisten merkuri, gen 16S rRNA, limbah

## PENDAHULUAN
Kegiatan pertambangan melahirkan keuntungan  ekonomi  yang  sangat  besar, namun dilain pihak juga mengancam akan kelestarian lingkungan. Proses penambangan  dipercayai  memiliki  potensi daya  ubah  Iingkungan  yang  tinggi  karena dianggap  sebagai  pengrusakan  alam  dan lingkungan.  Indonesia  merupakan  salah satu  negara  dengan  cadangan  bahan tambang  emas  yang  banyak  terdapat  pada batuan  di  gunung  ataupun  pasir  di  sungai. Kegiatan  eksplorasi  penambangan  emas semakin  banyak  dilakukan  baik  secara perseorangan maupun berkelompok. Keberadan bijih emas tersebut dimanfaatkan  oleh  masyarakat  sekitarnya sebagai  sumber  penghasilan  sehingga berkembanglah  kegiatan  pertambangan emas  rakyat  yang  dikenal  dengan  istilah Penambangan  Emas  Tanpa  Izin  (PETI) dan paling banyak PETI ini menggunakan merkuri  (Hg) sebagai  media  pengikat emas ( Inswiasri, 2008)
Pencemaran  logam  berat  merkuri pada  tanah  dan  air  sangat  membahayakan lingkungan dan kesehatan manusia.
Senyawa  merkuri  dalam  bentuk  Hg(II) dapat terikat pada residu sistem protein/enzim  manusia/binatang  sehingga protein/enzim  kehilangan  aktivitasnya. Selain  Hg(II),  senyawa  merkuri  paling berhahaya  bagi  kesehatan  manusia  adalah senyawa organomerkuri, khususnya metilmerkuri  dan  fenilmerkuri.  Senyawa ini  bersifat  sangat  reaktif  dan  mempunyai mobilitas  tinggi  dibanding  dengan  Hg(O) atau Hg(II). Hal ini disebabkan gastrointestine  manusia  dapat  menyerap sekitar  95%  senyawa  metilmerkuri,  dan senyawa  ini  iuga  dapat  menyerang  syaraf manusia  melalui  peredaran  darah.  Pada lingkungan  perairan  (aquatic)  atau  laut (marine), senyawa metilmerkuri mengalami biomagnifications melalui jaringan makanan, khususnya untuk jaringan makanan di air.
Pada  tahun  1960,  pertama  kali dilaporkan  resistensi  hakteri  terhadap
senyawa merkuri dalam suatu isolasi klinis Staphylococcus  aureus .  Pada  lingkungan tercemar merkuri pada umumnya dijumpai komunitas bakteri resisten merkuri sehingga  resisten  merkuri  berjalan  dengan cepat. Semua bakteri resisten merkuri yang diisolasi  dari  tanah  maupun  air  tercemar merkuri memiliki mekanisme dasar biokimia  detoksifikasi  senyawa  merkuri yang  sama  yaitu  semuanya  menghasilkan enzim merkuri reduktase. Mikrooragnisme yang  hidup  pada  daerah  tercemar  merkuri mempunyai  peran  yang  sangat  penting untuk  detoksifikasi  merkuri.  Dengan adanya  bakteri  yang  mampu  hidup  dalam daerah  tercemar  merkuri  dengan  jumlah yang  tinggi,  dapat  mengatasi  masalah pencemaran  merkuri.  Bakteri  ini  adalah Pseudomonas  fluorescens , Staphylococcus aureus dan Bacillus  Sp .  Peran  bakteri  ini kemudian dimanfaatkan para ahli biomolekular  untuk  memadukan  fungsi gen beberapa bakteri sehingga menghasilkan  strain  unggul  yang  mampu mengatasi  pencemaran  merkuri  secara tepat dan efektif.
Sulawesi  Utara  memiliki  beberapa lokasi  yang  dijadikan  sebagai  tambang emas  yang  menggunakan  merkuri  sebagai senyawa untuk mengekstraksi emas. Telah diperoleh  kultur  bakteri  resisten  tinggi yang  diisolasi  dari  limbah  tambang  rakyat kultur  S.3.2.2  oleh Fatimawali  dan  Billy Kepel (tidak  dipublikasikan)  .  Bakteri resisten  tinggi  ini,  diduga  mempunyai  gen merkuri  reduktase,  yang  dapat  dijadikan sebagai  sumber  enzim  merkuri  reduktase yang  dapat  digunakan  untuk  detoksifikasi merkuri  anorganik  di  perairan.  Dari  latar belakang di atas, maka dilakukan penelitian  lanjutan  untuk  mengetahui genus  atau  spesies  dari  kultur  bakteri resisten  merkuri  dengan  mendeterminasi jenis  bakteri    secara    konvensional menggunakan Bergey’s  Manual dan mengkarakterisasinya menggunakan metode modern secara biomolekuler dengan menganalisis
16SrRNA. Mengidentifikasi secara mikrobiologi
kultur  bakteri  resisten  merkuri  S.3.2.2 dengan menggunakan uji pewarnaan gram, uji fisiologi, dan uji biokimia.
Mengidentifikasi jenis bakteri melalui  analisis  gen  16SrRNA  dari  kultur bakteri resisten merkuri S.3.2.2.
.

## METODOLOGI PENELITIAN Bahan
Bahan  :  aquades,  alkohol, nutrient agar,  nutrient  broth ,  NaCl, yeast ekstrak, peptone,  safranin,  kristal  violet,  kaldu karbohidrat/ fenol  red (maltosa,  glukosa, laktosa), motility  test  medium , simon citrate agar , Triple Sugar Iron (TSI) agar , MT-3  agar.  Kit  isolasi  DNA  bakteri, Primer  set  (untuk  bakteri),  Ready  to  Go (RTG) PCR beads untuk amplifikasi DNA, Isopropanol  dan  Genomicprep  untuk isolasi  DNA,  miliQ  water  steril,  Gel agarosa,  1x  TAE  buffer,  loading  dye, etidium bromide, alcohol 70%.

## Alat
Alat : pH meter, termometer, autoklaf, inkubator,  cawan  petri,  tabung  reaksi, jarum  ose,  erlenmeyer,  gelas  ukur, beker glass ,  spatula,  timbangan  analitik,  pipet ukur, pipet tetes, kaca slide/objek, mikroskop,  lampu spritus, tabung durham, tabung hush, aluminium foil, plastik wrap, mikropipet,  mesin  PCR,  MUPID-like Electrophoresis Simple Unit, UV transiluminator,  BioDoc  Digital  Compact, Simplicity  Water  Purification  System, pellet  pestle,  tabung  ependorf,  sarung tangan dan hotplate.

## Prosedur Penelitian

## Identifikasi Bakteri
Pada  tahap  awal,  dilakukan  uji  morfologi dan  fisiologi  terhadap  koloni  bakteri.  Uji morfologi  dilakukan  dengan  pewarnaan gram,  sedangkan  uji  fisiologi  dilakukan untuk menentukan ada tidaknya pergerakan
(motilitas)
bakteri menggunakan media semi padat       ( Holt et.  al.,  1994)  .  Selanjutnya  dilakukan  tes
biokimia meliputi tes katalase, uji fermentasi  karbohidrat,  sitrat,  uji  H 2 S,  uji indol dan uji lisin.

## Isolasi DNA Genomik
Isolasi  DNA  Genomik  dari  kultur  bakteri: kultur  S.3.2.2    dilakukan  dengan  metode Illustra  bacteria  genomic  Prep  Mini  Spin Kit (GE Healthcare). Larutan DNA genom disimpan pada suhu -20°C untuk selanjutnya digunakan pada tahap amplifikasi gen 16SrRNA.

## Amplifikasi  16SrRNA  dengan  Teknik PCR
Templat  yang  digunakan  untuk amplifikasi  gen  16SrRNA  adalah  DNA genomik  dari  kelima  koloni  bakteri. Amplifikasi dengan teknik PCR dilakukan dengan  variasi  komposisi  reagen    dan kondisi reaksi PCR seperti dibawah ini.

## Elektroforesis dan Visualisasi
DNA  yang  telah  diamplifikasi,  diseparasi dengan    elektroforesis  gel  agarosa  1%, selanjutnya dilakukan visualisasi menggunakan  pewarna  etidium  bromida dan  dideteksi  dengan  sinar  UV  pada  UV- transiluminator.
Hasil deteksi
didokumentasikan.
Sekuensing Sekuensing
dilakukan untuk menentukan urutan nukleotida pada fragmen  DNA  yang  terdeteksi  dari  hasil visualisasi DNA yang teramplifikasi dalam proses PCR menggunakan mesin sekuensing DNA otomatis. Proses sekuensing kiririm ke Macrogen Korea..

## HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1.  Hasil  Uji  morfologi  dan  Fisiologi
Bakteri
Hasil  pewarnaan  gram  dari  kultur S3.2.2  yang  diperiksa  dengan  mikroskop, menunjukkan  sel  bakteri  bewarna  ungu menunjukkan bahwa gram negative, berbentuk batang dan tidak ada pergerakan, ditunjukkan pada   Tabel 1.

## Tabel 1. Hasil Isolasi, Uji Morfologi dan Fisiologi Bakteri
Kode isolat Uji morfologi Uji fisiologi Pewarnaan gram Bentuk sel Motilitas S3.2.2 Negatif Batang Nonmotil

## Hasil  Uji  Biokimia  dan  Identifikasi Jenis Bakteri
Hasil  uji  biokimia  menunjukkan bahwa pada uji fermentasi KH uji glukosa, laktosa dan maltosa semua isolat
menghasilkan  gas-asam,  positif  pada  uji pembentukan indole, uji sitrat negative, uji pembentukan H 2 S negative, katalase positif,  dan  uji lysine positif , ditunjukkan pada Tabel 2.

## Tabel 2. Hasil Uji Biokimia dan Identifikasi bakteri
Keterangan :   A = positif asam
AG = positif asam dan gas
Identifikasi  spesies  dari  kultur bakteri dilakukan dengan cara mencocokan hasil  uji  morfologi,  uji  fisiologi  dan  uji biokimia  dengan  tabel  uji  morfologi,  uji fisiologi  dan  uji  biokimia  spesies  yang terdapat pada Bergey’s  Manual  of
Determinative
Bacteriology . Hasil
menunjukkan bahwa kultur bakteri S.3.2.2 adalah jenis Klebsiella pneumoniae .

## Amplifikasi Gen 16S rRNA
DNA  genomik  yang  telah  diisolasi dan diekstraksi dari isolat S3.2.2kemudian dianalisis  dengan  metode  PCR  untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA
menggunakan  primer universal untuk  gen 16S rRNA Bact-F1: 5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’ /Uni-B1 5’GGTTACSTTGTTACGACTT3’ (Eurogentic AIT) yang dapat
mengamplifikasi gen 16S rRNA sepanjang 1500  bp.    Hasil  amplifikasi  dilakukan elektroforesis  dengan  agarose  1%  dan divisualisasi dengan sinar UV.
Untuk  melihat  spesies  bakteri, maka  hasil  amplifikasi  dilakukan  proses sekuensing. Urutan nukleotida hasil sekuensing  ditunjukkan  pada  Gambar  1.

## Kode
Uji Biokimia Identifikasi Jenis Isolat Fermentasi KH Pemb. Indol Uji sitra t H 2 S Uji Ferm entas i Uji Katalas e Uji Lysin e
Glu  Lak  Mal S.3.2.2  AG  AG  AG
+ + - + + + Klebsiella pneumoniae
CCATGCAGTCGAGCGGTAgCaCaGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGC GGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTA CTGGAAACGGTAGCTAATACCGCAtAATGTCGCaaGACCAAAGTGGGGGAC CTTCGGGCCTCaTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTaGGTG GGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGAC CAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTG TGTGAAGAACGCCTTCGGGTTGTAAAGCAcTTTCAGCGGGGAGGAAGGCG TTAAGGTTAATAACCTtGgCGATTGACGTTACCCGCAGAAgAAGCACCGGC TAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCG GAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCAGATGTGA AATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAAGGCTAGAG TCtTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGA TCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACG CTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC CACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTT CCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTT AAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGA ACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGC ATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG AGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGG AGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATC ATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAG AGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCC GGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCG TAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC CGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCG GGAGGGCGT
Gambar 1.  Hasil Sekuensing  rangkaian gen 16S rRNA isolat S3.2.2
Hasil  sekuensing  ini  menghasilkan urutan nukleotida gen 16S rRNA. Terhadap urutan nukleotida gen 16S rRNA diBlast secara online melalui : http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
. Hasil  blast  menunjukkan  kesamaan  urutan nukleotida  gen  16S  rRNA  isolat  yang diperoleh  dengan  urutan    nukleotida  gen
16S  rRNA  bakteri  yang  ada  pada GenBank.  Hasil  blast  ditunjukkan  pada tabel    3.  Selanjutnya  untuk  melihat hubungan  kekerabatan  tiap-tiap    isolat dengan  beberapa  bakteri  yang  mempunyai kesamaan  gen  16S  rRNA  99%,  maka dilakukan  pensejajaran    secara  on  line melalui http://expasy.org/tools/
Tabel 3. Hasil Blast Gen 16S rRNA Isolat Bakteri.
No. Isolat bakteri Deskripsi spesies Max. identity % Coverage 1. S3.2.2 Klebsiella pneumoniae galur JDM-8 99% 99
Hasil analisis gen 16S rRNA  isolat S3.2.2 pada gambar 2 mempunyai kesamaan 99% dengan
Klebsiella pneumoniae .    Pohon  filogenik  yng menggambarkan  hubungan  kekerabatan
S3.2.2  dengan  Klebsiella  lain  yang  ada pada  GenBank,  ditunjukkan  pada  Gambar 2.  Terlihat  Bahwa    isolat    S3.2.2 berkerabat dekat dengan Klebsiella pneumoniae galur JDM 8.
Gambar 2. Pohon Filogenik  Hasil Penjajaran 16S rRNA  kultur S3.2.2
Dari  hasil  analisis  gen  16S  rRNA menunjukkan  hasil  yang  sama  dengan hasil  analisis  secara  mikrobiologi  yaitu Klebsiella  pneumoniae .      Hasil  ini menunjukkan  kesamaan  kedua  metode, baik  secara  mikrobiologi,  maupun  dengan analisis  gen  16S  rRNA.  Dengan  demikian bakteri  resisten  merkuri  anorganik  HgCl 2 yang diperoleh dari limbah tambang rakyat
di  Sulawesi  Utara  adalah  jenis  bakteri gram  negative,  Klebsiella  pneumoniae. Bakteri ini kemungkinan mengandung gen mer A  yang  mengkode  protein  MerA  yang dapat  digunakan  untuk  remediasi  merkuri anorganik  pada  limbah  atau  perairan tercemar merkuri anorganik.

## PENUTUP Kesimpulan
Bakteri  resisten  merkuri  anorganik  yang diisolasi  dari  limbah  tambang  rakyat  di Sulawesi  Utara  Kultur  S3.2.2.,  merupakan bakteri jenis Klebsiella pneumoniae .

## DAFTAR PUSTAKA
Abdul  Rehman,  Ashfaq  Ali,  Bushra Muneer  and  Abdul  Rauf  Shakoori, 2007,  Resistance  and  Biosorption  of Mercury  by  Bacteria  Isolated  from Industrial  effluents,  Department  of Microbiology and Molecular genetics  and  school  of  Biological
Sciences,  University  of  The  Punjab,
New  campus,  Lahore,  Pakistan, Pakistan Journal Zoology.
Alexandre  J.  Poulain,  Sinead  M.  Ni Chadhain,  Parisa  A  Ariya,  marc Amyot,  Edenise  Garcia,  Peter  G.  C. Campbell,  Gerben  J.  Zylstra,  and tamar  Barkay,  2007,  Potential  for Mercury  Reduction  by  Microbes  in the  High  Arctic,  Applied  and environmental Microbiology,
American Society for Microbiology. Fatimawali dan Billy Kepel , 2009. Isolasi dan  identifikasi  bakteri  resisten merkuri pada sediment tanah buangan  limbah  pertambangan  emas rakyat di Tanoyan, Bolaang Mongondow.  FK-Unsrat  :  Hasil penelitian, belum dipublikasikan.
Inswiasri.  (2008),  “Paradigma  Kejadian Penyakit  Pajanan  Merkuri  (Hg),”
Jurnal Ekologi   Kesehatan , 7(2):
775-778.
Osborn, A. M., Bruce, K. D., Strike, P. and
Ritchie,  D.  A.(1997).  Distribution, Diversity  and  Evolution  of    the Bacterial Mercury Resistance (mer)operon. FEMS Microbiol. Rev. 19: 239-262. Perisa  Keramati,  Mehran  Hoodaji  and
Arezoo Tahmourespour,
2011,
Multi-metal  Resistance  Study  of bacteria  Highly  resistant  to  Mercury Isolated from Dental Clinic Effluent, African  Journal  of  Microbiology Research Vol. 5(7) pp.831-837.
Rasmussen  L.  D.,  Zawadsky  C.,  Binnerup S.  J.,  Oregaard  G.,  Serensen  S.  J., and  Kroer  N.,  2008,  Cultivation  of hard-To-Culture Subsurface Mercury-Resistant Bacteria and
Discovery  of  New mer A  Gene sequences, Department of Environmental Chemistry and Microbiology, national Environmental  research  Institute, University  of  Aarhus,  Denmark, Applied and Environmental
Microbiology.
Simon  Silver  and  Le  T.  Phung,  1996,
Bacterial  Heavy  Metal  Resistance  : New  Surprises,  Annual  Review  of Microbiology.
Sinead  M.  Ni  Chadhain,  Jeffra  K.
Schaefer,  Sharron  Crane,  Gerben  J. Zylstra  and  tamar  Barkay,  2006,
Analysis  of  mercuric  reductase ( mer A) gene diversity in an anaerobic mercury-contaminated sediment  enrichment,  Department  of
Biochemistry and Microbiology,
Biotechnology
Centre for Agriculture  and  the  Environment, Rutgers University, New Brunswick,
NJ  08901,  USA,  Environmental Microbiology.
Stackebrandt, E. & Goebel, B. M. 1994 .
Taxonomic note: a place for DNA- DNA reassociation  and 16s rRNA sequence analysis in the present
species definition in bacteriology. Int J Syst Bacteriol 44, 846-849.
Tamar  Barkay  and  Irene  Wagner-Dobler,
2005,  Microbial  Transformation  of Mercury: Potentials, Challenges, and Achievements in Controlling Mercury Toxicity in the Environment, department of Biochemistry and Microbiology Cook  College,  Rutgers  University New Brunswick, New Jersey 08901. Advances in Applied Microbiology. Tamar  Barkay,  Susan  M.  Miller,  Anne  O.
Summers,  2003,  Bacterial  mercury resistance from atoms to ecosystems, Department  of  Biochemistry  and Microbiology, Cook
College, Rutgers University, New Brusnwick, USA, FEMS Microbiology Reviews, Elsevier. Tomonobu Kusano, Guangyong Ji, Chihiro  Inoue,  and  Simon  Silver, 1990,  Constitutive  Synthesis  of  a Transport  Function  Encoded  by  the
Thiobacillus ferrooxidans merC gene Cloned in Esherichia coli. World Health Organization (1976); Environmental  Health  Criteria  1,
Mercury. Xianzhen  Li,  Daohai  Zhang,  Feng  Chen, Jie  Ma,  Yihu  Dong  and  Lianhui Zhang, 2004, Klebsiella
singaporensis  sp.  nov.,  a  novel isomaltulose-producing bacterium,
International  Journal  of  Systemic and Evolutionary Microbiology, American Society for Microbiology.
Zeroual Y., Moutaouakkil A., Dzairi F. Z.,
Talbi  M.,  Chung  P.U.,  Lee  K.,
Blaghen  M.,  2003,  Purification  and Characterizatition of Cytosolic mercuric  reductase  from  Klebsiella pneumoniae, laboratory of
Microbiology,  Biotechnology,  and Environment,  Faculty  of  Sciences
University  Hassan  II  Marocco.
Annals of
Microbiology.