Journal of Natural Resources and Environmental Management 10 (1): 124-137. http://dx.doi.org/10.29244/jpsl.10.1.124-137 E-ISSN: 2460-5824
http://journal.ipb.ac.id/index.php/jpsl
Keragaman genetik  mimi  ( Carcinoscorpius  rotundicauda dan Tachypleus  gigas ) di  perairan  Demak,  Madura  dan  Balikpapan  berdasarkan  penanda Random Amplified Polymorphic DNA
Genetic diversity of horseshoe crabs ( Carcinoscorpius rotundicauda and Tachypleus gigas ) in Demak, Madura and Balikpapan waters based on Random Amplified Polymorphic DNA marker
Naila K. Aini a , Ali Mashar b , Hawis H. Madduppa c , Yusli Wardiatno bd
a Mahasiswa Pascasarjana Prodi Pengelolaan Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga Bogor, 16680, Indonesia [+62 82213739330]
b Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga Bogor, 16680, Indonesia
c Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga Bogor, 16680, Indonesia
d Pusat Penelitian Lingkungan Hidup, Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga Bogor, 16680, Indonesia
Article Info: Received: 12 - 03 - 2020 Accepted: 31 - 03 - 2020
Keywords: Adaptation capability, heterozygosity, Limulidae, Xiphosura
Corresponding Author: Yusli Wardiatno Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor; Tel. +628128608966 Email: yusli@apps.ipb.ac.id
Abstract. Horseshoe  crab  is  an  exotic  and  protected  marine  organism  in Indonesia  and is  considered  as  the  living fossil  animal  in  the  world.  IUCN conservation status of Carcinoscorpius rotundicauda and Tachypleus gigas is still  Data  Deficient,  and  in  Indonesia  research  on  genetic  population  is lacking, if any. This study aims to reveal genetic diversity of C. rotundicauda and T.  gigas populations  in  northern  Java  (Demak  and  Madura)  and Balikpapan waters. This research was conducted by using molecular analysis with  genetic  markers  Random  Amplified  Polymorphic  DNA  (RAPD).  The primers used in this study were OPB 06, OPG 10, and OPX 03. The results showed that the highest polymorphism of C. rotundicauda was found in Demak (74.6667%)  and  heterozygosity  was  0.2669.  Furthermore, T.  gigas had  the highest  polymorphism  in  Madura  (74.3590%)  and  heterozygosity  was 0.25551. Based on pairwise comparison tests, populations of C. rotundicauda and T. gigas in Demak, Madura, and Balikpapan were significantly different (p<0.05).  The  difference  is  believed  due  to  the  limitation  movement  of horseshoe crabs from and into the three locations, as well as the presence of natural geographic barrier. Thus,it can be concluded that horseshoe crabs in northern  Java  and  Balikpapan  waters  has  different  genetic  diversity. Genetically,  horseshoe  crab  in  northern  Java  or  Balikpapan  had  relatively moderate diversity and low adaptation capability.

## How to cite (CSE Style 8 th Edition):
Aini  NK,  Mashar  A,  Maduppa HH,  Wardiatno  Y. 2020.  Keragaman  genetik  mimi  ( Carcinoscorpius  rotundicauda dan Tachypleus gigas ) di perairan Demak, Madura dan Balikpapan berdasarkan penanda Random Amplified Polymorphic DNA . JPSL 10 (1): 124- 137. http://dx.doi.org/10.29244/jpsl.10.1.124-137.

## PENDAHULUAN
Mimi atau belangkas ( horseshoe crab ) merupakan salah satu hewan yang berasal dari famili Limulidae. Mimi  adalah  biota  perairan  yang  eksotik  dan  merupakan  salah  satu living  fossil  animal yang  ada  di  dunia (Eldredge  dan  Stanley,  1984).  Hewan  ini  ditemukan  sejak  zaman  Paleozolitikum  periode  Ordovician  dan diduga nenek moyangnya berasal dari zaman Mesozolotikum. Hingga saat ini, di dunia terdapat empat jenis mimi. Carcinoscorpius  rotundicauda (Latreille,  1802), Tachypleus  gigas (Müller,  1785),  dan Tachypleus tridentatus (Leach,  1819)  ditemukan  hidup  di  sekitar  kawasan  pantai  Asia  termasuk  Indonesia  dan  biasa disebut dengan Asian horseshoe crab . Selanjutnya, Limulus polyphemus atau biasa dikenal sebagai Atlantic horseshoe crab hanya ditemukan di pantai Atlantik Amerika Utara (Walls et al ., 2002).
Mimi adalah hewan yang dilindungi di Indonesia, namun penelitian terhadap hewan ini tidak sebanyak hewan yang dilindungi lainnya, misalnya seperti penyu (Ismane et al ., 2018) atau gajah Sumatera (Febryano dan Rusita, 2018). Status konservasi setiap jenis mimi berbeda satu sama lain. Jenis C. rotundicauda dan T. gigas berstatus konservasi data deficient (World Conservation Monitoring Centre 1996a). Makna dari status tersebut adalah informasi yang ada saat ini belum memadai untuk menentukan resiko kepunahan dari kedua jenis mimi ini. T. tridentatus mempunyai status perlindungan endangered (EN) atau terancam punah (Laurie et al ., 2019). Status konservasi T. tridentatus diperbarui pada bulan April 2019, status konservasi sebelumnya adalah data deficient (World Conservation Monitoring Centre, 1996b). Mimi  jenis L. polyphemus mempunyai status IUCN lower risk / near threatened atau rentan (Smith et al ., 2016).
Mimi mempunyai persebaran yang luas. Persebaran mimi terbagi menjadi dua wilayah yang besar yaitu di wilayah Atlantik Utara dan Asia. Persebaran mimi di Atlantik Utara terdapat di sepanjang pantai Atlantik dan Teluk Mexico dengan kelimpahan terbesar dapat ditemukan di antara Virginia dan New Jersey (Shuster, 1982). Persebaran mimi di wilayah perairan Asia mulai dari India hingga Jepang termasuk sekitar Indonesia dan Filipina (Walls et al ., 2002). Persebaran mimi di perairan berkaitan dengan kondisi arus dan fase larva (planktonik)  (Shanks,  2009).  Mimi  dewasa  cenderung  akan  melakukan  migrasi  ke  pantai  untuk  proses pemijahan dan meletakkan telur. Telur tersebut akan menetas setelah masa inkubasi selama kurang lebih dua hingga empat minggu (Sekiguchi et al ., 1982). Setelah menetas menjadi larva, mimi akan bergerak menuju ke perairan terbuka untuk tumbuh dan berkembang. Larva mimi akan berenang bebas kurang lebih selama enam hari sebelum  menetap ( settle ) di dasar perairan. Kondisi lingkungan perairan  menentukan pergerakan larva mimi sebelum akhirnya menetap di dasar wilayah lokasi tertentu. Keterkaitan antara populasi di lokasi satu dengan lainnya dapat diketahui melalui penanda genetik.
Penanda genetik merupakan urutan DNA yang dapat diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya. Urutan  basa  nukleotida  yang  beragam  antar  spesies  dapat  digunakan  sebagai  penanda  spesifik  yang memberikan  pengetahuan  mengenai  hubungan  filogenetik  untuk  mengatasi  keraguan  dalam  sistematika. Penanda  genetik Random  Amplified  Polymorphic  DNA (RAPD)  merupakan  amplifikasi  genom  DNA berdasarkan teknik PCR (Williams et al ., 1990). Analisis ini menggunakan primer tunggal dengan panjang urutan  basa  nukleotida  sebanyak  10  basa.  Analisis  RAPD  digunakan  untuk  melihat  keragaman  genetik berdasarkan tingkat polimorfisme. Ruas penempelan dengan perbedaan panjang fragmen DNA diasumsikan mengikuti  pola  pewarisan  Mendel  (Chauhan  dan  Rajiv,  2010).  RAPD  DNA fingerprint dapat  memberikan penjelasan secara global jumlah urutan DNA dalam suatu populasi, walaupun terbatas oleh sifat anomin dari poliorfisme genetik yang diperoleh. Penanda RAPD mempunyai kelebihan tidak memerlukan informasi urutan basa nukleotida untuk melakukan pembacaan (Iyengar et al. , 2000; Nebauer et al. , 2000). Teknik ini lebih murah  dan  cepat  untuk  dilakukan.  Kekurangan  dari  RAPD  yaitu  belum  mampu  membedakan  antara  lokus homozigot  dan  heterozigot  sehingga  memerlukan  analisis  urutan  basa  nukleotida  dengan  teknik  yang beresolusi tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk mengungkap keragaman genetik pada populasi mimi jenis C. rotundicauda dan T. gigas di perairan Demak, Madura, dan Balikpapan.
Pemilihan  lokasi  tersebut  berdasarkan  pada  dua  pertimbangan.  Pertama  pesisir  Balikpapan  mewakili lokasi habitat mimi dengan kondisi ekosistem mangrove yang masih baik. Selain itu, mimi yang ditemukan di Balikpapan mempunyai ukuran yang lebih besar (Hery Seputro dari Dinas Pangan Pertanian dan Perikanan Kota Balikpapan, komunikasi pribadi 2019). Mangrove di Balikpapan terdapat di Kelurahan Teritip dengan luasan ± 61.35 ha (Noor dan Helminuddin, 2009). Mimi yang ditemukan sekitar pesisir utara Jawa mempunyai ukuran yang lebih kecil jika dibandingkan dengan mimi yang berasal dari pesisir Balikpapan (Mashar et al ., 2017). Kedua, sebagai pembanding dipilih lokasi pesisir utara Jawa khususnya Demak dan Madura sebagai ekosistem  dengan  kondisi  sudah  banyak  terjadi  kerusakan  (Faturrohmah  dan  Majuki,  2017),  tetapi  masih terdapat  ekosistem  mangrove  walaupun  tidak  sebaik  di  Balikpapan.  Luasan  mangrove  di  Demak  (daerah Betahwalang)  mencapai  37.41  ha  (Faturrohmah,  2017)  sedangkan  di  Madura  (daerah Kalianget,  Sumenep) adalah 39.4 ha (Muhsoni et al ., 2011). Selain itu tekanan penangkapan terhadap sumberdaya mimi di kedua daerah tersebut cukup tinggi.

## METODE

## Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan  April  hingga  Desember  2019  di  Laboratorium  Biologi  Molekuler, Departemen  Manajemen  Sumberdaya  Perairan,  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,  Institut  Pertanian Bogor.  Pengambilan  sampel  dilakukan  di  tiga  lokasi  yaitu  Demak  (daerah  Betahwalang),  Madura  (daerah Kalianget, Sumenep), dan Balikpapan (Gambar 1).
Gambar 1 Peta lokasi penelitian yang memperlihatkan titik pengambilan contoh kedua jenis mimi (bulatan merah), yakni C. rotundicauda dan T. gigas .

## Metode Pengumpulan Data
Pengambilan  contoh  dilakukan  dengan  menggunakan  teknik  acak  sederhana.  Contoh  mimi  didapatkan dari jaring  yang  dijalankan  oleh  kapal  nelayan  atau diambil  menggunakan  tangan  secara langsung.  Contoh yang  diambil  adalah  mimi  jenis C.  rotundicauda dan T.  gigas .  Dilakukan  pengukuran  mimi  contoh  yang didapatkan dalam kondisi hidup diambil darahnya masing-masing sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan ke dalam tube berukuran 2 mL yang telah berisi alkohol absolute (100%) sebanyak 1 mL (Dillon et al ., 1996; Quicke et al ., 1999).

## Ekstraksi DNA
Sampel darah yang berasal dari Demak, Madura, dan Balikpapan akan diisolasi dan diekstraksi, tetapi sebelumnya  dilakukan  pencucian  terlebih  terlebih  dahulu  untuk  menghilangkan  kandungan  alkohol  yang digunakan  sebagai  pengawetnya. Tahap pencucian  dilakukan  dengan  menggunakan  akuades.  Sampel  darah sebanyak 400-500 µ L dipindahkan kedalam microtube 1.5 ml kemudian disentrifius selama 1.5 menit dengan kecepatan  14000  rpm.  Supernatan  dihilangkan  dan  setiap  tube  diisi  dengan  akuades  sebanyak  400 µ L  dan disentrifius.  Pencucian  dilakukan  sebanyak  tiga  kali.  Setelah  itu  dilakukan  isolasi  dan  diekstraksi  untuk memperoleh total genom sesuai dengan arahan protokol GeneAID Kit.
Amplifikasi PCR ( Polymerase Chain Reaction ) dengan metode RAPD
Screening 13 jenis primer dilakukan sebagai tahap awal dalam analisis RAPD. Primer yang dipilih untuk analisis  adalah  primer  yang  mampu  menghasilkan  pitapolimorfik.  Hasil  pengujian  tahap  awal  primer  yang menghasilkan  pita  tersebut  diantaranya  adalah  OPB  06,  OPG  10,  dan  OPX  03.  PCR  dilakukan  dengan menggunakan thermocyler gradient (AB) dengan tujuan pengaturan suhu annealing dapat dilakukan sesuai dengan temperature melting (TM) masing-masing primer. Komponen bahan yang diginakan dalah PCR terdiri atas  12.5 µ L Dream  Taq  Master  Mix 2x  (Thermo  Scientific,  USA),  1 µ L  primer  RAPD,  3 µ L  DNA,  dan ditambahkan free  water sampai  dengan  total  volume  25 µ L.  Tahapan  PCR  yang  dilakukan  diataranya denaturasi awal pada suhu 94ºC selama dua menit, denaturasi 94ºC selama satu menit, annealing dilakukan sesuai  dengan  TM  masing-masing  primer  (OPB  06  39.8ºC,  OPG  10  41.2ºC,  OPX  03  41.8ºC)  selama  satu menit,  dan  elongasi  72ºC  selama  dua  menit,  dan post elongasi  72ºC  selama  satu  menit  (modifikasi  dari Williams et al ., 1990).

## Elektroforesis dan Visualisasi
Produk  PCR  kemudian  dielekroforesis.  Produk  tersebut  dimasukkan  kedalam  sumur  pada gel  agarose 1.5% sebanyak  6 µ L  (sudah  termasuk dye ) (modifikasi  dari  Williams et  al .,  1990).  Media  yang  digunakan adalah larutan 1x TBE (Tris Borate EDTA) (Lee dan Cowman 1994). Elektroforesis dilakukan bersama dengan marker 100 bp pada tegangan listrik sebesar 100 volt selama 60 menit menggunakan PowerPac Basic (Bio- Rad). Visualisasi dilakukan dengan menggunakan bantuan sinar UV (Gel documentation –UV transiluminator Alphalmager).

## Metode Analisis Data
Scoring kemunculan fragmen DNA dilakukan pada hasil elektroforesis yang telah diperoleh. Kemunculan fragmen  tersebut  akan  bergantung  pada  berat  molekul  yang  dihasilkan.  Prediksi  berat  molekul  produk amplifikasi dilakukan dengan menggunakan bantuan software AlphaView SA. Scoring dilakukan dengan cara memberikan  nilai  1  untuk  fragmen  DNA  yang  mucul  dan  nilai  2  untuk  fragmen  DNA  yang  tidak  muncul (mengubah menjadi data biner). Hasil scoring yang berupa data biner dianalisis dengan menggunakan software TFPGA ( Tools for Population Genetic Analyses ). Software tersebut digunakan untuk menentukan nilai derajat polimorfisme,  heterozigositas,  serta  jarak  genetik.  Pembuatan  dendrogram  digunakan  untuk  melihat pengelompokan  hirarki  mimi  yang  berada  di  Demak,  Madura,  dan  Balikpapan  serta  koefisien  nilai 𝐹 𝑆𝑇 digunakan  untuk  melihat  kemampuan  migrasi  individu.  Kedua  analisis  tersebut  dilakukan  berdasarkan UPGMA ( Unweighted Pair Group Arthimatic Average ) (Miller, 1997).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil
Hasil amplifikasi menggunakan primer OPB 06, OPX 03, dan OPG 10 pada 70 contoh mimi yang terdiri atas 30 individu C. rotundicauda dari ketiga lokasi penelitian masing-masing 10 individu (Demak, Madura, dan Balikpapan), 30 individu T. gigas juga dari lokasi yang sama (Gambar 2).

## Carcinoscorpius rotundicauda
Berdasarkan hasil analisis diketahui bahwa setiap primer memiliki profil jumlah fragmen yang berbeda karena memiliki daerah penempelan yang berbeda-beda disetiap individu. Total jumlah lokus yang muncul dengan menggunakan tiga jenis primer (OPB 06, OPG 10, OPX 03) pada jenis C. rotundicauda di tiga lokasi adalah  75  lokus  (Tabel  1).  Jumlah  lokus  paling  banyak  berada  pada  primer  OPG10  sebanyak  29  lokus, sedangkan jumlah paling sedikit pada primer OPB 06 sebanyak 19 lokus. Jumlah kisaran fragmen yang paling banyak  ditemukan  pada  populasi C.  rotundicauda di  Balikpapan,  sedangkan  jumlah  kisaran  fragmen  yang paling sedikit ditemukan di populasi Madura.
Hasil  analisis ukuran fragmen  pada jenis C.  rotundicauda di  masing-masing  lokasi  berbeda satu  sama lain. Ukuran fragmen C. rotundicauda paling panjang diantara ketiga lokasi tersebut terdapat di Balikpapan dengan kisaran 200 hingga 2900 pb. Kisaran ukuran terpanjang C. rotundicauda di Balikpapan pada primer OPG 10 dan terpendek pada primer OPB 06. Kisaran ukuran fragmen C. rotundicauda di Madura paling rendah dibandingkan dengan lokasi lainnya yaitu pada kisaran ukuran 200 hingga 2400 pb. Pajang fragmen dengan ukuran terpanjang terdapat pada primer OPX 03 dan terpendek pada OPG 10. Ukuran fragmen C. rotundicauda di Demak berkisar antara 200 hingga 2500 pb, dengan ukuran terpanjang pada primer OPX 03 yaitu 400-2400 pb dan ukuran terpendek 200-1500 pb (Tabel 1).
Variasi  keragaman  genetik  berdasarkan  derajat  polimorfisme  dan  heterozigositas C.  rotundicauda di Demak, Madura, dan Balikpapan terdapat di Tabel 2. Berdasarkan hasil analisis, derajat polimorfisme tertinggi pada C.  rotundicauda terdapat  di  Demak  dengan  nilai  persentase  sebesar  74.6667%.  Keragaman  genetik terendah berdasarkan nilai derajat polimorfisme terdapat pada C. rotundicauda di Madura dengan nilai sebesar 58.6667%. Selain derajat polimorfisme terdapat nilai heterozigositas yang dapat menggambarkan keragaman genetik.  Nilai  heterozigositas  tertinggi  pada C.  rotundicauda terdapat  di  Demak  sedangkan  nilai heterozigositas  terendah  terdapat  di  Balikpapan  yaitu  0.2669  dan  0.1885.  Sementara  itu,  nilai  derajat polimorfisme antar populasi di ketiga lokasi tersebut adalah 76% dengan nilai heterozigositas 0.2678.
Hasil  uji  F ST berpasangan  ditampilkan  pada  Tabel  3.  Berdasarkan  hasil  analisis  menunjukkan  bahwa antara ketiga populasi C. rotundicauda di Demak, Madura, dan Balikpapan pada ketiga spesies mempunyai karakter genotype yang berbeda secara signifikan satu sama lain ( p <0.05). Perbedaan terjauh terdapat di antara Madura dan Balikpapan sedangkan perbedaan terdekat derdapat diantara Demak dan Madura.

## Tachypleus gigas
Berdasarkan  hasil  analisis  RAPD  diperoleh  bahwa  setiap  jenis  primer  yang  digunakan  menampilkan jumlah dan ukuran fragmen yang disetiap individu. Jumlah lokus yang diperoleh dengan menggunakan primer OPB 06, OPG 10, OPX 03 pada jenis T. gigas di tiga lokasi adalah 78 lokus (Tabel 5). Jumlah lokus paling banyak berada pada primer OPG10 sebanyak 32 lokus, sedangkan jumlah paling sedikit pada primer OPB 06 sebanyak  19  lokus.  Jumlah  kisaran  fragmen T.  gigas di  masing-masing  lokasi  hampir  sama  yaitu  Demak sebanyak 2 hingga15, Madura 2 hingga16, dan Balikpapan 3 hingga14.
Jarak genetik yang diperoleh digambarkan dengan menggunakan dendogram (Gambar 3). Hasil tersebut menunjukkan bahwa jarak genetik C. rotundicauda di Demak dan Madura lebih dekat dibandingkan dengan Balikpapan yaitu (Tabel 4). Jarak genetik terjauh C. rotundicauda terdapat di antara Madura dan Balikpapan yaitu 0.3604.
Gambar 2 Sebagian dari hasil amplifikasi dengan menggunakan primer OPB 06, OPX 03, dan OPG 10 pada C. rotundicauda dan T. gigas.
Tabel 1 Kisaran jumlah fragmen pada populasi C. rotundicauda yang diambil dari perairan utara Jawa
(Demak dan Madura) dan Balikpapan. Kisaran Jumlah Fragmen Kisaran Ukuran Fragmen (pb) Jumlah lokus per primer Demak Madura Balikpapan Demak Madura Balikpapan OPB 06 0-12 5-12 7-12 300-1500 300-1800 300-1700 19 OPG 10 0-16 3-11 6-11 200-2500 200-1500 200-2900 29 OPX 03 0-14 1-12 5-12 450-2400 400-2400 450-2800 27 Total 0-16 3-12 5-12 200-2500 200-2400 200-2900 75
Tabel 2 Heterozigositas dan polimorfisme pada populasi C. rotundicauda yang diambil dari perairan utara
Jawa (Demak dan Madura) dan Balikpapan. Heterozigositas Polimorfisme (%) Demak 0.2669 74.6667 Madura 0.1921 58.6667 Balikpapan 0.1885 64 Antar populasi 0.2678 76 Tabel 3 Nilai F ST populasi C. rotundicauda yang diambil dari perairan utara Jawa (Demak dan Madura) dan Balikpapan Demak Madura Balikpapan Demak - Madura 0.0004 - Balikpapan 0.0001 0.0000 - Tabel 4 Jarak genetik pada populasi C. rotundicauda yang diambil dari perairan utara Jawa (Demak dan Madura) dan Balikpapan Demak Madura Balikpapan Demak - Madura 0.2874 - Balikpapan 0.2963 0.3604 -
Gambar 3 Visualisasi jarak genetik pada populasi C. rotundicauda yang diambil dari perairan utara Jawa (Demak dan Madura) dan Balikpapan
Hasil  analisis  ukuran  fragmen  pada  jenis T.  gigas di  setiap  lokasi  penelitian  berbeda  satu  sama  lain. Ukuran  fragmen T.  gigas di  Balikpapan  lebih  panjang  dibanding  dengan  lokasi  lainnya  yaitu  kisaran  400 hingga 3000 pb. Kisaran ukuran terpanjang T. gigas di Balikpapan terdapat pada primer OPG 10 dan terpendek pada primer OPB 06. Berbeda halnya dengan T. gigas Demak yang mempunyai kisaran ukuran fragmen lebih rendah  dibandingkan  dengan  lokasi  lainnya  yaitu  200  hingga  2500  pb.  Populasi T.  gigas di  Demak  ini mempunyai  kirasan  ukuran  fragmen  terpanjang  terdapat  pada  primer  OPX  03  dan  terpendek  pada  OPG  10 (Tabel 5).
Hasil  analisis  RAPD  pada T.  gigas di  Demak,  Madura,  dan  Balikpapan  menunjukkan  derajat polimorfisme dan nilai heterozigositas yang berbeda-beda (Tabel 6). Derajat polimorfisme tertinggi pada jenis T.  gigas terdapat  di  Madura  dengan  nilai  persentase  sebesar  74.3590%.  Keragaman  genetik  terendahnya terdapat  di  Demak  dengan  nilai  persentase  sebesar  51.2821%.  Selain  derajat  polimorfisme  terdapat  nilai heterozigositas.  Nilai  heterozigositas  tertinggi  pada T.  gigas terdapat  di  Madura  sedangkan  nilai heterozigositas  terendah  terdapat  di  Balikpapan  yaitu  0.2551  dan  0.1864.  Sementara  itu,  nilai  derajat polimorfisme antar populasi di ketiga lokasi tersebut adalah 89.7436% dengan nilai heterozigositas 0.2938.
Uji F ST berpasangan dilakukan untuk mengetahui kemampuan migrasi suatu individu. Berdasarkan hasil yang diperoleh pada Tabel 7 menunjukkan bahwa ketiga populasi T. gigas di Demak, Madura, dan Balikpapan berbeda secara signifikan ( p <0.05). hal tersebut mengartikan bahwa pola perpindahan T. gigas dari satu lokasi ke lokasi lainnya cenderung rendah.  Selain itu, hasil analisis tersebut juga menunjukkan bahwa populasi T. gigas di ketiga lokasi mempunyai karakter genotype yang berbeda satu sama lain.
Berdasarkan hasil analisis, diperoleh nilai jarak genetik yang menunjukkan bahwa jarak genetik T. gigas di Demak dan Madura lebih dekat dibandingkan dengan T. gigas Balikpapan yaitu 0.3232 (Gambar 4). Jarak genetik terjauh T. gigas terdapat di antara Demak dan Balikpapan yaitu 0.4631 (Tabel 8).
Tabel 5 Kisaran jumlah fragmen pada populasi T. gigas yang diambil dari perairan utara Jawa (Demak dan
Madura) dan Balikpapan Kisaran Jumlah Fragmen Kisaran Ukuran Fragmen (pb) Jumlah lokus per primer Demak Madura Balikpapan Demak Madura Balikpapan OPB 06 2-9 2-11 11-14 400-1900 400-1900 400-1600 19 OPG 10 12-15 6-16 8-14 200-2100 300-2900 400-2900 32 OPX 03 4-13 7-13 3-9 300-2500 300-2500 650-3000 27 Total 2-15 2-16 3-14 200-2500 300-2900 400-3000 78
Tabel 6 Heterozigositas dan polimorfisme pada populasi T. gigas yang diambil dari perairan utara Jawa (Demak dan Madura) dan Balikpapan Heterozigositas Polimorfisme (%) Demak 0.1950 51.2821 Madura 0.2551 74.3590 Balikpapan 0.1864 52.5641 Antar populasi 0.2938 89.7436
Tabel 7 Nilai F ST pada populasi T. gigas yang diambil dari perairan utara Jawa (Demak dan Madura) dan
Balikpapan Demak Madura Balikpapan Demak - Madura 0.0000 - Balikpapan 0.0000 0.0000 - Tabel 8 Jarak genetik pada populasi T. gigas yang diambil dari perairan utara Jawa (Demak dan Madura) dan Balikpapan Demak Madura Balikpapan Demak - Madura 0.3232 - Balikpapan 0.4631 0.3847 -
Gambar 4 Visualisasi jarak genetik pada populasi T. gigas yang diambil dari perairan utara Jawa (Demak dan Madura) dan Balikpapan

## Pembahasan
Ukuran  mimi  yang  ditemukan  di  Balikpapan  cenderung  lebih  besar  (Hery  Seputro  dari  Dinas  Pangan Pertanian dan Perikanan Kota Balikpapan, komunikasi pribadi 2019) diantaranya karena tekanan tangkapan mimi di Balikpapan lebih rendah. Hal tersebut dikarenakan mimi di Ballikpapan cenderung tidak dikonsumsi oleh masyarakat setempat. Kondisi mangrove di Balikpapan lebih luas dibandingkan dengan Demak (daerah Betahwalang) dan Madura (daerah Kalianget). Berbeda halnya dengan di Demak dan Madura, mimi di kedua daerah tersebut masih dikonsumsi oleh masyarakat khususnya betina yang bertelur (komunikasi pribadi 2019 dengan  nelayan  Betahwalang,  Kabupaten  Demak  dan  Kalianget,  Kabupaten  Sumenep,  Madura).  Ancaman keberadaan mimi menjadi serius dengan adanya budaya festival dugderan di Kendal, Jawa Tengah. Telur mimi di festival tersebut menjadi menu makanan yang sangat diminati, sehingga permintaan mimi betina bertelur menjadi meningkat. Tidak hanya di Indonesia, mimi betina bertelur juga menjadi salah satu menu makanan eksklusif di beberapa restoran mahal di Thailand dan Malaysia (Christianus  dan Saad, 2007). Hal lain yang menjadi ancaman mimi adalah perlakuan nelayan terhadap mimi. Sebagian besar nelayan menyatakan bahwa mimi adalah hama yang bersifat merusak jaring nelayan apabila tertangkap, sehingga cenderung melakukan pelepasan paksa dari jaring. Selain itu, mimi juga dimanfaatkan secara komersil sebagai umpan penangkapan ikan  sidat  ( Anguilla  rostrata )  (Kreamer  dan  Michels  2009),  di  Jambi  (Kuala  Tungkal)  digunakan  sebagai umpan ikan sembilang ( Euristhmus microceps ) (Rubiyanto 2012) dan beberapa juga di impor ke Amerika utara untuk digunakan sebagai umpan penangkapan (Smith et al . 2016).
Analisis kisaran  ukuran dan jumlah fragmen yang  menempel pada setiap induvidu berdasarkan primer masing-masing cenderung berbeda. Pemilihan primer dalam analisis RAPD berpengaruh karena setiap primer mempunyai situs penempelannya masing-masing. Hal tersebut mengakibatkan adanya perbedaan kemunculan pita polimorfik yang dihasilkan. Keberhasilan suatu primer dalam mengamplifikasi DNA template ditentukan oleh  ada  tidaknya  kesamaan  (homologi)  antara  sekuen  nukleotida  primer  dan  sekuen  nukleotida  DNA template. Hal lain yang juga dapat mempengaruhi perbedaan tersebut diantaranya suhu annealing, enzim Taq DNA polimerase, dan kualitas serta kuantitas DNA (Panner et al ., 1999). Kontaminasi adanya senyawa lain saat ekstraksi juga dapat menurunkan kualitas pita dan konsentrasi DNA sehingga mempengaruhi kemunculan pita  menjadi  tidak  jelas  (Wedden et  al .,  1992).  Sebelum  melakukan  analisis  RAPD  sebaiknya  melakukan proses screening primer terlebih dahulu. Hal tersebut dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh primer yang sesuai untuk dapat menghasilkan pita polimorfik.
Keragaman  genetik  penelitian  ini  didasarkan  derajat  polimorfisme  dan  heterozigositas.  Polimorfisme merupakan  ukuran  keragaman  genetik  berdasarkan  proporsi  lokus  polimorf  terhadap  total  lokus  yang teridentifikasi,  sedangkan  heterozigositas  adalah  ukuran  keragaman  genetik  berdasarkan  proporsi  jumlah individu  heterozigot  dalam  populasi  (Soewardi,  2007).    Keragaman  genetik C.  rotundicauda berdasarkan derajat polimorfisme di Demak, Madura, dan Balikpapan masih tegolong sedang, namun dari ketiga lokasi tersebut C. rotundicauda di Demak mempunyai keragaman tertinggi. Hal tersebut juga didukung dengan nilai heterozigositas yang lebih tinggi dibandingkan dengan dua lokasi lainnya. Berbeda halnya dengan T. gigas keragaman tertinggi terdapat di Madura dengan nilai derajat polimorfisme dan heterozigositas masing-masing adalah  74.3590%  dan  0.2551.  Nilai  tersebut  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  polimorfisme T.  gigas di Cherating, Malaysia yaitu 83.33%, akan tetapi nilai tersebut juga lebih tinggi dibandingkan dengan T. gigas yang berasal dari Tanjung Dawai, Malaysia yaitu sebesar 44.44% (Ismail et al ., 2011).
Perbedaan  nilai  derajat  polimorfisme  terjadi  karena  perbedaan  variasi  genetik  intrapopulasi  dan  pola diferensiasi populasi dalam penanda genetik seperti allozymes , DNA mitokondria, dan mikrosatelit (Selander et al ., 1970; Saunders et al ., 1986; King et al ., 2005). Penelitian  Primer RAPD pada dasarnya didesain untuk mendeteksi  polimorfisme  yang  disebabkan  oleh  adanya  mutasi  poin  (Smith,  2005).  Kemunculan  pita polimorfisme pada penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat bentuk mutasi insersi dan delesi yang terjadi saat  amplifikasi  (Clark  dan  Lanigan,  1993).  Hasil  analisis  menunjukkan  bahwa  nilai  derajat  polimorfime intrapopulasi  dan  interpopulasi  pada  spesies C.  rotundicauda dan T.  gigas masih  tergolong  sedang. Berdasarkan hasil yang diperoleh, nilai heterozigositas C . rotundicauda dan T . gigas intrapopulasi tergolong rendah dan cenderung homogen. Penurunan heterozigositas suatu populasi dapat menghilangkan keberadaan alel  potensial,  misal  yang  berkaitan  dengan  ketahanan  terhadap  penyakit,  timbulnya  abnormalitas,  serta gangguan pertumbuhan (Slamat, 2009). Nilai heterozigositas dalam keragaman genetik menunjukkan tingkat potensi adaptasi terhadap lingkungan. Semakin rendah nilai heterozigositas maka semakin sedikit gen yang terlibat dalam  menyumbangkan tingkat kebugaran suatu populasi yang artinya spesies tersebut mempunyai kemampuan  adaptasi  yang  lemah  (Tave,  1993).  Secara  umum,  rendahnya  keragaman  genetik  intrapopulasi akan memberikan efek terhadap rendahnya daya adaptasi suatu spesies dalam populasi untuk mempertahankan kelangsungan hidup jangka panjang (Schemske et al ., 1994). Uji  perbandingan  berpasangan  (F ST )  digunakan  untuk  melihat  keterkaitan  antara  populasi.  Hasil pengukuran keragaman antar populasi berdasarkan pada uji F ST menunjukkan bahwa populasi C. rotundicauda dan T.  gigas di  Demak,  Madura,  dan  Balikpapan  berbeda  secara  signifikan  ( p <0.05).  Hal  tersebut mengindikasikan bahwa ketiga populasi C. rotundicauda dan T. gigas berasal dari stok dengan keragaman alel terfiksasi yang berbeda antar populasinya. Selain itu, hal tersebut juga mengindikasikan bahwa aliran gen ( gene flow ) yang terjadi antara ketiga populasi tersebut cenderung rendah. Perbedaan populasi tersebut diduga karena kemampuan  mimi  dalam  melakukan  perpindahan  ( movement )  dari  lokasi  satu  ke  lokasi  lainnya  cenderung terbatas. King et al . (2005) menjelaskan bahwa secara genetik bahwa pergerakan mimi terbatas di beberapa bagian dari wilayah jelajahnya. Hal ini juga sesuai dengan hasil penelitian Moore  dan Perrin (2007) terkait dengan penggunaan ruang dan pola pergerakan mimi ( L . polyphemus ) berdasarkan musim. Penelitian lain yang mendukung  keterbatasan  wilayah  jelajah  mimi  pernah  dilakukan  di  Taiwan  untuk  jenis T.  tridentatus . Penelitian tersebut menjelaskan bahwa antar populasi terjadi aliran gen pada jarak 15 km dimana jarak tersebut dianggap sebagai jarak pendek antara dua populasi, aliran gen tidak ditemukan di antara dua populasi ketika jarak geografisnya melebihi 150 km (Yang et al ., 2007). Jarak maksimum yang tercatat pada penelitian terkait pola pergerakan dan perpindahan L . polyphemus di teluk Great, New Hampshire (AS) adalah 9,2 km (Schaller et  al .,  2010).  Studi  populasi  yang  dilakukan  di  perairan  Atlantik  Utara  mulai  dari  New  York  hingga  teluk Delaware dan Chesapeake mencatat sebanyak 14 individu mimi yang melakukan pergerakan atau perpindahan pada kisaran jarak 104 - 265 km (Swan, 2005). Grogan (2004) berhasil mengungkap bahwa mimi mempunyai jarak perpindahan maksimum yang berbeda antara jantan dan betina. Mimi betina mampu menempuh jarak hingga  493.74  km  sedangkan  mimi  jantan  hanya  mampu  menempuh  jarak  maksimum  363.7  km.  Dengan demikian dapat dikatakan bahwa mimi betina mempunyai wilayah jelajah yang lebih luas dibandingkan dengan
mimi jantan. Hal tersebut menjelaskan bahwa tidak cukup hanya jarak geografis yang menjadi pembatas antar populasi,  akan  tetapi  terdapat  faktor  lain  yang  juga  berperan  penting  salah  satunya  adalah  adanya natural barriers (Pierce et al ., 2000; Grogan, 2004).
Jarak genetik populasi mimi jenis C. rotundicauda dan T. gigas di ketiga lokasi penelitian terlihat bahwa hubungan kekerabatan mimi di Demak dan Madura lebih dekat dibandingkan dengan mimi yang berada di Balikpapan. Hal tersebut dapat terjadi karena mimi di Demak dan Madura masih berada dalam wilayah yang sama  yaitu  pantai  utara Jawa.  Berdasarkan  siklus  hidupnya,  mimi  dewasa  cenderung  berdiam  di  dasar  dan melakukan perpindahan ke daerah pantai untuk melakukan proses reproduksi (Sekiguchi, 1988). Larva mimi jenis L. polyphemus cenderung akan bersifat planktonik selama periode waktu yang singkat sebelum akhirnya menerap didasar perairan (Shuster, 1982). Berbeda halnya dengan T. tridentatus , larva jenis ini setelah menetas akan mendiami daerah yang dekat dengan tempat menetasnya ( natal beach ) (Sekiguchi, 1988; Chen et al ., 2004). Pada dasarnya mimi mempunyai wilayah jelajah yang terbatas (Pierce et al ., 2000) terlebih untuk jenis C.  rotundicauda yang  habitatnya  di  mangrove,  akan  tetapi  di  daerah  utara  Jawa  mimi  menjadi  salah  satu komoditas  makanan  yang  populer,  sehingga  terdapat  kemungkinan  adanya  intervensi  serta  peran  manusia (Chiu dan Morton, 1999).

## KESIMPULAN
Mimi ( C. rotundicauda dan T. gigas ) di perairan Demak, Madura, dan Balikpapan berasal dari satu nenek moyang yang sama. Persentase nilai keragaman genetik cenderung sedang dan beresiko mengarah ke rendah. Kedua  jenis  spesies  tersebut  di  masing-masing  lokasi  berpeluang  membentuk  spesies  yang  berbeda berdasarkan  rendahnya  tingkat  adaptasi.  Prediksi  populasi  mimi  di  Demak,  Madura,  dan  Balikpapan kedepannya akan cenderung homogen secara genetik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didanai oleh Pusat Penelitian Oseanografi, Lembaga  Ilmu Pengetahuan Indonesia (PPO- LIPI) melalui Demand-Driven Research Fund (DDRF) No. B-5063/IPK.2/KS.02/III/2019 untuk YW dan IPB melalui  skema  PMDSU  No.  6623/IT3.L1/PN/2019  ke  YW  (mengikuti  kontrak  antara  Universitas  IPB  dan Kementerian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi No. 261/SP2H/LT/DRPM/ 2019). Para penulis ingin mengucapkan  terima  kasih  kepada  mereka  yang  membantu  dalam  pengumpulan  sampel  dan  pekerjaan laboratorium: Heri Seputro, Rani Nuraisah, Agus Alim Hakim, dan Ananingtyas Septia Darmarini.

## DAFTAR PUSTAKA
Chauhan T, Rajiv K. 2010. Molecular markers and their applications in fisheries and aquaculture. Advances in Bioscience and Biotechnology . 1: 281-291.
Chen  C-P,  Yeh  H-Y,  Lin  P-F.  2004.  Conservation  of  horseshoe  crabs  in  Kinmen,  Taiwan:  strategies  and practices . Biodiversity and Conservation. 13: 1889–1904.
Chiu HMC, Morton B. 1999. The distribution of horseshoe crabs Tachypleus tridentatus and Carcinoscorpius rotundicauda in Hong Kong. Asian Marine Biology . 16:185-196.
Christianus A, Saad CR. 2007. Horseshoe crabs in Malaysia and the world. Fishery Mail . 16: 8-9. Clark AG, Lanigan CMS. 1993. Prospects for estimating nucleotide divergence with RAPDs. Molecular and Biological Evolution . 10: 1096-1111.
Dillion N, Austin AD, Bartowsky E. 1996. Comparison of preservation techniques for DNA extraction from hymenopterous insects. Insect Molecular Biology . 5(1): 21-24.
Eldredge N, Stanley SM. 1984. Living Fossils . Berlin (BE): Springer.
Faturrohmah  S,  Marjuki  B.  2017.  Identifikasi  dinamika  spasial  sumberdaya  mangrove  di  wilayah  pesisir Kabupaten Demak Jawa Tengah. Majalah Geografi Indonesia . 31(1): 56-64.
Febryano IG, Rusita. 2018. Persepsi wisatawan dalam pengembangan wisata pendidikan berbasis konservasi gajah  Sumatera  ( Elephas  maximus  sumatranus ). Jurnal  Pengelolaan  Sumberdaya  Alam  dan Lingkungan . 8(3): 376-382. Grogan WN. 2004. A mid-Atlantic study of the movement patterns and population distribution of the American horseshoe  crab, L.  Polyphemus . [master  thesis].  Virginia  (USA):  Virginia  Polytechnic  Institute  dan State University.
Ismail N, Taib M, Shamsuddin AA, Shazani S. 2011. Genetic variability of wild horseshoe crab, Tachypleus gigas (MÜller)  in  Tanjung  Dawai,  Kedah  and  Cherating,  Pahang,  Peninsular  Malaysia. European Journal of Scientific Research . 60 (4): 592-601.
Ismane  MA,  Kusmana  C,  Gunawan  A,  Affandi  R,  Suwardi  S.  2018.  Keberlanjutan  pengelolaan  kawasan konservasi  penyu  di  pantai  Pangumbahan,  Sukabumi,  Jawa  Barat. Jurnal  Pengelolaan  Sumberdaya Alam dan Lingkungan . 8(1): 36-43.
Iyengar  A,  Piyapattanakorn  S,  Stone  DM,  Heipel  DA,  Howell  BR,  Baynes  SM,  Maclean  N.  2000. Identification of microsatellite repeats in turbot ( Scophthalmus maximus ) and dover sole ( Solea solea ) using  RAPDbased  technique:  characterization  of  microsatellite  markers  in  dover  sole. Marine Biotechnology. 2: 49-56.
King  TL,  Eackles  MS,  Spidle  AP,  Brockmann  HJ.  2005.  Regional  differentiation  and  sex-biased  dispersal among populations of the horseshoe crab Limulus polyphemus . Transactions of the American Fisheries Society . 134: 441-465.
Kreamer  G,  Michels  S.  2009.  History  of  horseshoe crab  harvest  on  Delaware  Bay.  Di dalam : Biology  and conservation  of  horseshoe  crabs .  Tanacredi  JT,  Botton  ML,  Smith  DR,  editor.  New  York  (NY): Springer. hlm 299–313.
Laurie K, Chen CP, Cheung SG, Do V, Hsieh H, John A., Mohamad F, Seino S, Nishida S, Shin P, Yang M.
Tachypleus  tridentatus (errata  version  published  in  2019). The  IUCN  Red  List  of  Threatened Species 2019 [Internet]. 2019 [cited 2020 Jan 18]. Available from : https://www.iucnredlist.org/species/21309/149768986.
Leary RF, Allendrof FW, Knudsen KL. 1985. Development instability and high meristic counts in interspecific hybrid of salmonid fishes. Evolution . 39: 318-326.
Mashar A, Butet NA, Juliandi B, Qonita Y, AA Hakim, Wardiatno Y. 2017. Biodiversity and distribution of horseshoe crabs in northern coast of Java and southern coast of Madura. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 54: 012076.
Meilana  L,  Wardiatno  Y,  Butet  NA,  Krisanti  M.  2016.  Karakter  morfologi  dan identifikasi molekuler dengan  marka  gen  CO1  pada  mimi  ( Tachypleus  gigas )  di  Perairan  Utara Jawa. Ilmu  dan  Teknologi Kelautan Tropis. 8: 145-158. Miller MP. 1997. Tools for population genetic analysis (TFPGA) 1.3 : A windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data . Software didistribusikan oleh penulis. Tersedia di: http://www.marksgeneticsoftware.net/.
Moore  S,    Perrin  S.  2007.  Seasonal  Movement  and  Resource-Use  Patterns  of  Resident  Horseshoe  Crab ( Limulus polyphemus ) Populations in a Maine, USA Estuary. Estuaries and Coasts . 30 (6): 1016–1026. Muhsoni FF, Syarief M, Effendi M. 2011. Inventarisasi data potensi sumberdaya wilayah pesisir Kabupaten Sumenep. Jurnal Kelautan. 4(1): 96 - 201.
Nebauer SG, del Castillo-Agudo L, Segura J. 2000. An assesment of genetic relationships within the genus Digitalis based on PCR-generated RAPD markers. Theoretical and Applied Genetics. 100:1209-1216. Noor  P,  Helminuddin.  2009.  Valuasi  ekonomi  pemanfaatan  hutan  mangrove  di  kelurahan  Teritip  kota Balikpapan. Jurnal Kehutanan Tropika Humida . 2 (1): 69-80.
Penner GA, Bush A, Wise R, Kim W, Domier L, Kasha K, Laroche A, Scoles G, Molnar SJ, fedak G. 1993. Reproducibility  of  random  amplified  polymorphic  DNA  (RAPD)  analysis  among  laboratories. PCR Methods Applications . 2(4): 341–345. doi:10.1101/gr.2.4.341.
Pierce JC, Tan G, Gaffney PM. 2000. Delaware bay and Chesapeake bay populations of the horseshoe crab Limulus polyphemus are genetically distinct. Estuaries. 23: 690-698.
Quicke DLJ, Belshaw R, Lopez-Vaamonde C. 1999. Preservation of hymenopteran specimens for subsequent molecular and morphological study. Zoologica Scripta . 28(1-2): 261-267. Rubiyanto E. 2012. Studi Populasi Mimi (Xiphosura) di Perairan Kuala Tungkal, Kabupaten Tanjung Jabung Barat, Jambi [tesis]. Depok (ID): Universitas Indonesia.
Saunders NC, Kessler LG, Avise JC. 1986. Genetic variation and geographic differentiation in mitochondrial DNA of the horseshoe crab, Limulus polyphemus . Genetics . 112(3): 613-627.Schaller YS, Chabot CC, Watson III WH. 2010. Seasonal movements of American horseshoe crabs L. polyphemus in the Great Bay Estuary, New Hampshire USA. Current Zoology . 56(5): 587-598.
Schaller  YS,  Chabot  CC,  Watson  III  WH.  2010.  Seasonal  movements  of  American  horseshoe  crabs L. polyphemus in the Great Bay Estuary, New Hampshire USA. Current Zoology . 56(5): 587-598.
Schemske  DW,  Husband  BC,  Ruckelshaus  MH,  Goodwillie  C,  Parker  IM,  Bishop  JG.  1994.  Evaluating approaches to the conservation of rare and endangered plants. Ecology . 75: 584–606
Sekiguchi K,  Yamamichi Y,  Costlow JD.  1982.  Horseshoe  crab  development  studies  I.  Normal  embryonic development of Limulus polyphemus compared with Tachypleus tridentatus . Di dalam: Boneventura J, Bonaventura C, Tesh S, editor. Physiology and Biology of Horseshoe Crabs: Studies on Normal and Environmentally Stressed Animals . New York (NY): Alan R. Liss, Inc. hlm 53-73. Sekiguchi K. 1988. Biology of Horseshoe Crabs . Tokyo (JPN): Science House.
Selander RK, Yang SY, Lewontin RC, Johnson WE. 1970. Genetic variation in the horseshoe crab ( Limulus polyphemus ), a phylogenetic "relic". Evolution . 24: 402-414. Shanks AL. 2009. Pelagic larval duration and dispersal distance revisited. Biological Bulletin . 16: 373-385. Shuster CN Jr. 1982. A pictorial review of the natural history and ecology of the horseshoe crab, Limulus polyphemus,  with  reference  to  other  limulidae .  pp.  1–52. In :  Physiology  and  Biology  of  Horseshoe Crabs: Studies on Normal and Environmentally Stressed Animals. (Bonaventura JC. Bonaventura, dan S. Tesh, Eds. New York (NY): Alan R Liss, Inc.
Slamat. 2009. Keanekaragaman genetik ikan betok (Anabas testudineus Bloch) pada ekosistem perairan rawa di Provinsi Kalimantan Selatan [master tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Smith DR, Beekey MA, Brockmann HJ, King TL, Millard MJ, Zaldívar-Rae JA. 2016. Limulus polyphemus . The IUCN Red List of Threatened Species 2016. e.T11987A80159830. Available online at: http://www. iucnredlist.org/details/11987/0.
Smith JP. 2005. Random amplified polymorphic DNA (RAPD). Stock Identification Methods . 5(18): 371-388. Soewardi  K.  2007. Pengelolaan  Keragaman  Genetik  Sumberdaya  Perikanan  dan  Kelautan .  Bogor  (ID): Institut Pertanian Bogor.
Swan BL. 2005. Migrations of adult horseshoe crabs, Limulus polyphemus , in the Middle Atlantic Bight: a 17- year tagging study. Estuaries . 29(1): 28-40.
Tave D. 1993. Genetic for fish hatchery managers . Netherland (EU): Kluwer Academic Publishers.
Walls  EA,  Berkson  J,  Smith  SA.  2002.  The  horseshoe  crab, Limulus  polyphemus :  200  million    years    of existence,  100  years  of  study. Reviews  in  Fisheries  Science . 10(1): 39-73.
Weeden NF, Timmerman GM, Hemmat M, Kneen BE, Lodhi M.A. 1992. Inheritance and reliability of RAPD markers.  In: Applications  of  RAPD  Technology  to  Plant  Breeding .  Joint  Plant  Breeding  Symposia Series, November 1, 1992, Minneapolis, MN. Crop Science Society of America, Madison, WI.
Williams  JG,  Kubelik  AR,  Lival  KJ,  Rafalski  JA,  Tingey  SV.  1990.  DNA  polymorphisms  amplified  by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research. 18: 6531-5.
World Conservation Monitoring Centre.  1996b. Tachypleus Tridentatus, The IUCN Red List of Threatened Species [Internet]:  [diunduh  28  Maret  2020] e.  T21309A9267047 .  Tersedia  pada:  https://doi.org/ 10.2305/ IUCN.UK.1996.RLTS.T21309A9267047.en World Conservation Monitoring Centre. 1996a . Tachypleus gigas. The IUCN Red List of Threatened Species [Internet].  [diunduh  18  Januari  2020].  Tersedia  pada:  https://www.iucnredlist.org/species/21308/ 9266907.
Yang  MC,  Chen  CA,  Hsieh  HL,  Chen  CP.  2007.  Population  Subdivision  of  the  tri-spine  horseshoe  crab, Tachypleus tridentatus in Taiwan Strait. Zoological Science . 24: 219-224.Yang MC, Chen CA, Hsieh HL, Chen CP. 2007. Population Subdivision of the tri-spine horseshoe crab, Tachypleus tridentatus in Taiwan Strait. Zoological Science . 24: 219-224.