## Infeksi Betanodavirus pada Ikan Kakap di Kepulauan Riau

## Betanodavirus Infection in Barramundi in Riau Islands
Achmad Bahtiar Rifai 1* , Titis Wulandari 2 , Desi Surastini 3 ,
Pramudya Dwi Wahyu Irawanto 3
1 Pusat Karantina Ikan, Jalan Merdeka Timur Gambir, Jakarta Pusat, 2 STKIP Muhammadiyah Muara Bungo, Jalan Rangkayo Hitam, Muara Bungo, Jambi, 3 Stasiun Karantina Ikan Batam, Jalan M Nahar No.1 Batam Center, Batam.
* Corresponding author : abherifai@gmail.com

## Abstrak
Penyakit yang dapat menyebabkan kerugian ekonomi yang sangat tinggi adalah virus dan salah satunya adalah  Betanodavirus  atau  biasa  disebut Viral  Nervous  Necrosis (VNN).  Infeksi  VNN  merupakan  penyakit yang terdaftar di The Office International des Epizooties (OIE) dan menjadi masalah utama di dalam produksi perikanan laut di dunia. Virus ini mampu menginfeksi ikan dari ukuran benih sampai ukuran konsumsi dalam kurun waktu yang singkat mencapai kematian dengan  frekuensi 80% samapi 100%. Penyakit tersebut dapat menginfeksi  ikan  kakap  putih  dan  tersebar  hampir  diseluruh  provinsi  Kepulauan  Riau.  Penelitian  ini menggunakan  metode  pengambilan  sampel  ikan  hidup  yang  menunjukkan  gelaja  VNN  dan  ikan  baru  mati. Sampel penelitian diperoleh dari  beberapa kota dan kabupaten di Provinsi  Kepulauan Riau antara lain  Kota Batam, Kabupaten Bintan, dan Kabupaten Tanjung Balai Karimun, pemilihan sampel berdasarkan dari gejala klinis dan angka kematian ikan. Kemudian sampel dinekropsi untuk diambil organ mata dan otak, selanjutnya di amplifikasi menggunakan primer dengan target gen RNA 2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa VNN telah terdeteksi  di  Provinsi  Kepulauan  Riau  yaitu  Kota  Batam,  Kabupaten  Bintan,  dan  Kabupaten  Tanjung  Balai Karimun.
Kata kunci: Lates calcarife, kakap putih , Viral Nervous Necrosis

## Abstract
Diseases that can cause very high  economic losses are viruses and one of them is Betanodavirus or commonly called Viral Nervous Necrosis (VNN). VNN is a disease registered by The Office International des Epizooties (OIE) and is a major problem in marine fishery production in the world. This virus is able to infect fish from larva size to consumption size in a short period of time to reach death with a frequency of 80% to 100%. The disease can infect barramundi and is spread throughout the Riau Islands. This study used a live fish sampling method showing VNN signs and freshly dead fish. The research samples were obtained from several cities and districts in  the Riau Islands Province, including  Batam City, Bintan  Regency, and Tanjung Balai Karimun Regency, the sample selection was based on clinical symptoms and fish mortality. Then the samples were necropsied for eye and brain organs, then amplified using primers targeting the RNA 2 gene. The results showed that VNN had been detected in the Riau Islands Province, i.e. Batam City, Bintan Regency, and Tanjung Balai Karimun Regency.
Keywords: Lates calcarifer, Barramundi, Viral Nervous Necrosis
Received: 8 Desember 2021 Revised: 28 Januari 2022 Accepted: 1 Maret 2022

## PENDAHULUAN
Ikan  kakap  merupakan  salah  satu  komoditi unggulan perikanan budidaya dan memiliki nilai ekomomis  yang  tinggi  di  Provinsi  Kepulauan Riau,  sehingga  budidaya  ikan  tersebut  banyak diminati oleh para pembudidaya didaerah pesisir pulau.  Salah  satu enis  ikan  kakap  yang  banyak
diminati konsumen adalah ikan kakap putih ( lates calcalifer ).  Ikan  kakap  putih  ( Lates  calcarifer ) merupakan  salah  satu  komoditas  budidaya  laut unggulan indonesia, karena memiliki pertumbuhan yang relatif cepat (Windarto et al., 2019). Menurut Rayes et al. (2013), pertumbuhan kakap  putih  dapat  mencapai  laju  pertumbuhan harian  sebesar  0.51%/hari.  Menurut  Purba et  al.
(2016),  kakap  putih  merupakan  salah  satu  jenis ikan air laut yang memiliki kandungan omega-3, kandungan protein sekitar 20%, dan mempunyai kadar  lemak  sebesar  5%.  Salah  satu  kendala dalam budidaya perikanan adalah kasus penyakit, penyakit  pada  ikan  merupakan  suatu  keadaan abnormal  yang  ditandai  dengan  penurunan kemampuan ikan secara gradual dalam mempertahankan fungsi fisiologis normal.
Penyakit yang menyerang ikan kakap antara lain  bakteri,  parasit,  jamur  dan  virus.  Salah  satu penyakit ikan yang dapat menyebabkan kematian masal  adalah  Betanodavirus  atau  biasa  disebut Viral  Nervous  Necrosis (VNN).  VNN  adalah penyakit  yang  terdaftar  oleh The  Office International  des  Epizooties (OIE)  dan  menjadi masalah utama di dalam produksi perikanan laut di  dunia  (Yuwanita,  2013).  VNN  dapat menyerang  sistem  saraf  pusat,  retina  mata,  serta organ  reproduksi.  Penyakit  ini  umumnya  dapat menginfeksi hampir pada seluruh fase pertumbuhan ikan (stadia  larva dan benih), serta mortalitasnya  dapat  mencapai  100%.  Penularan penyakit ini dapat terjadi secara vertikal maupun horizontal.  Gejala  umum  VNN  antara  lain  nafsu makan menurun, ikan sangat lemah, warna tubuh pucat, dan gejala spesifik berupa pergerakan yang tidak  terkoordinasi,  seperti  berenang  tidak terarah,  berputar-putar,  hiperaktif,  terbalik,  serta sering menghentakkan kepala ke atas permukaan air secara sporadik (Gomez et al ., 2006). Betanodavirus/VNN merupakan family Nodaviridae ,  penyakit  ini  dapat  menyebabkan kematian  yang  sangat  tinggi  pada  stadium  larva dan  dewasa  pada  berbagai  spesies  ikan  laut (Prihartini,  2016). Betanodavirus tidak  memiliki amplop,  berbentuk icosahedral, dan  memiliki ukuran  diameter  20-30  nm,  memiliki  dua strand positive –sense RNA yang dikenal dengan RNA1 dan  RNA  2.  RNA  1  mengkode  RNA dependent RNA  polymerase  (RdRp),  enzim  mitokondria, dan  bertanggungjawab  sebagai  replikasi  virus (Nopadon et  al., 2009),  sedangkan  RNA  2 mengkode protein kapsid (Low et al ., 2017).
International  Comitee  Of  Taxonomy  Virus (ICTV) tahun 2018 membagi genus Betanodavirus menjadi empat spesies antara lain Barfin  Flounder  Nervous  Necrosis  Virus
(BFNNV), Redspotted Grouper Nervous Necrosis Virus (RGNNV), Striped Jack Nervous Necrosis Virus (SJNNV),  dan Tiger  Puffer  Nervous Necrosis Virus (TPNNV). Sejak tahun 1990 virus tersebut ditemukan dan diberikan nama VNN atau Viral  Encephalopathy  dan  Retinopathy. Office International des Epizooties (2000), menyatakan bahwa virus tersebut telah berhasil ditemukan di
Amerika Utara, Ikan yang terinfeksi menunjukkan  berbagai  kelainan  saraf,  yang ditandai  dengan  vakuolisasi  dan  nekrosis  seluler dalam sistem saraf pusat dan retina (Curtis et al ., 2001).  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk menentukan  genomik  VNN  pada  ikan  Kakap putih  dengan  analisis  RT-PCR  sehingga  dapat menggambarkan distribusi virulensi VNN secara kualitatif.

## METODE PENELITIAN

## Koleksi Sampel
Sampel  penelitian  diperoleh  dari  beberapa kabupaten di Provinsi Kepulauan Riau antara lain Kota  Batam,  Kabupaten  Bintan,  dan  Kabupaten Tanjung  Balai  Karimun.  Pemilihan  sampel berdasarkan dari gejala klinis dan angka kematian ikan.  Setiap  daerah  sampel  diambil  sebanyak  10 sampel.  Sampel  yang  dipilih  adalah  ikan  yang sakit dan menunjukan gejala klinis VVN. Sampel ikan  berasal  dari  beberapa  farm  yang  ada  di  3 kota/kabupaten  di  provinsi  kepulauan  Riau. Sampel yang dapat digunakan untuk pemeriksanaan VNN yaitu dari sampel ikan hidup dan ikan mati. Ikan mati yang belum mengalami autolisis  dalam  keadaan  beku  masih  bisa dilakukan  pemeriksaan  PCR.  Sampel  yang  akan diperiksa  dinekropsi  terlebih  dahulu  (dibedah), kemudian  pisahkan  organ  mata  dan  otak  untuk pemeriksaan VNN. jumlah organ yang digunakan yaitu 10-30 mg untuk keperluan ekstraksi RNA.

## Metode Ekstraksi RNA
Ekstraksi RNA dilakukan dengan menggunakan RNasy ® Blood and Tissue Kit dari Qiagen. Sampel organ mata dan otak sebanyak 30 mg dipotong kecil-kecil kemudian dimasukkan ke dalam  tabung  mikro  2  ml  ,  tahapan  selanjutnya dilakukan  sesuai  dengan  panduan  perusahaan.
Hasil  RNA  kemudian  disimpan  dalam freezer dengan suhu -20°C.

## Metode Amplifikasi
Amplifikasi  PCR  tahap  pertama  dilakukan dengan  total  volume  25  μl  larutan  reaksi  yang terdiri dari 13 µl RNase- free  water , 5 µl Qiagen one  Step RT-PCR  5×  (Qiagen),  1,5  µl primer forward (10 µM), 1,5 µl primer reverse (10 µM), 1 µl Qiagen onestep RT-PCR Enzyme Mix dan 2 μl  sampel  DNA.  Siklus  amplifikasi  diawali dengan Reverse  Transcription 50°C  selama  30 menit dan pre denaturasi 95°C selama 15 menit, dilanjutkan  dengan  35  siklus  yang  terdiri  dari denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing untuk semua  primer  57,3°C  selama  40  detik,  ekstensi pada suhu 72°C selama 40 detik dan dilanjutkan dengan  ekstensi  akhir  1  siklus  pada  suhu  72°C selama 10 menit.
Amplifikasi  PCR  dilakukan  dengan  total volume 25 μl larutan reaksi yang terdiri dari 7 µl RNase-free  water,  12.5  µl  HotStarTaq  Master Mix 2× (Qiagen), 0,5 µl primer forward (10 µM), 0,5 µl primer reverse (10 µM), 2,5 µl coral load dan  2  μl  sampel  DNA  (Tabel  1).  Siklus amplifikasi  diawali  dengan  pre  denaturasi  94°C selama  3  menit,  dilanjutkan  dengan  35  siklus yang terdiri dari denaturasi 94°C selama 40 detik, annealing  untuk  semua  primer  50°C  selama  40 detik,  ekstensi  pada  suhu  72°C  selama  40  detik dan  dilanjutkan  dengan  ekstensi  akhir  1  siklus pada  suhu  72°C    selama  10  menit.  Hasil  PCR selanjutnya  divisualisasi  dengan  elektroforesis menggunakan  1.5%  agarose  gel  dan  pewarnaan menggunakan  SYBR  Green  0.5  µg/ml.  Marker yang  digunakan  adalah  DNA  marker  100bp. Analisis  hasil  data  dilakukan  secara  deskriptif dengan membandingkan hasil pengamatan gejala klinis, hasil dikonfirmasi dengan uji RT-PCR.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Masalah utama dalam budidaya ikan hingga saat  ini  salah  satunya  adalah  penyakit.  Penyakit ini  dapat  menyebabkan  kerugian  ekonomi  serta dapat menyebabkan pertumbuhan terhambat  dan proses  pemeliharaan  lebih  lama.  Kematian  ikan yang disebabkan karena penyakit mengakibatkan
menurunnya  atau  hilangnya  produksi  sehingga menyebabkan  kerugian  ekonomis  (Abdullah et al., 2017).  Berdasarkan  hasil  sampel  penelitan pada ikan kakap putih menunjukkan perilaku ikan antara  lain  nafsu  makan  berkurang,  gerakan lemah,  berenang  tidak  normal  (memutar-mutar), pembesaran  gelembung  renang  pada  beberapa sampel.  Menurut  Sembiring  (2018),  ikan  yang terinfeksi  oleh  VVN  menunjukkan  gejala  yaitu, gerakan  renang  yang  lemah,  nafsu  makan menurun, mengalami anemia, bercak merah pada insang  dan  terdapat  pembengkakan  pada  organ (Tabel 2).
Hasil deteksi VNN pada sampel ikan Kakap putih  terlihat  pada  Gambar  1. Sampai  saat  ini, penyakit  ini  telah  dilaporkan  dilebih  dari  120 spesies pada 30 famili dari 11 orde yang berbeda terutama  ikan  laut  yang  rentan  terhadap  infeksi (Tan et  al .,  2001;  Costa et  al .,  2016).  Selain  itu VNN  dapat  menginfeksi  ikan  air  tawar  seperti Lele  cina  ( Pasotus ),  Lele  Australia  ( Tandanus tandanus ),  Baramundi  ( L  calcarifer ),  Medaka ( Oryzias latipes ), Guppy ( Poicelia reticulate ) dan Zebrafis  ( Danio  rerio ).  Ikan  yang  terinfeksi menunjukan  tanda-tanda  klinis  yang  berbeda tergantung  spesies,  umur  dan  suhu  linkungan (Ghiasi et  al .,  2016).  Tanda-tanda  umum  yang spesifik  dan  umum  teramati  pada  spesies  yang berbeda  adalah  kebiasaan  berenang  abnormal, luka  dan  hiperflasia  gelembung  renang  yang membuat bagian perut membesar.
Deteksi terhadap keberadaan VNN dilakukan  pada  semua  sampel  dari  beberapa kabupaten di Provinsi Kepulauan Riau yaitu Kota Batam,  Kabupaten  Bintan,  dan  Kabupaten Tanjung Balai Karimun. Sampel dari Kota Batam menunjukan  3  positif  terhadap  VNN  dan  7 negatif,  dari  Kabupaten  Bintan  menunjukan  2 sampel positif dan 8 sampel negatif, sedangkann dari Kabupaten Tanjung Balai Karimun menunjukanj  2  sampel  positif  dan  8  sampel negatif. Hasil amplifikasi PCR ditampilkan pada Gambar  1.  Beberapa  peneliti  sudah  merancang primer  untuk  mendeteksi  VNN,  namun  pada penelitian  ini  primer  yang  digunakan  dirancang oleh Thiéry et al ., 1999 dengan target gen adalah RNA  2  yang  merupakan  target  yang  kuat  dan sensitif untuk identifikasi infeksi Betanodavirus
Tabel 1. Sekuen primer untuk amplifikasi
Primer Target Sekuen primer a Panjang amplicon Referensi F2 R3 RNA2 (F) CGTGTCAGTCAT GTGTCGCT (R) CGAGTCAACACGGGTGAAGA 420 bp Thiéry et al ., 1999 F’2 R’3 RNA2 (F) GTTCCCTGTACAACGATTCC (R) GGA-TTTGACGGGGCTGCTCA 294 bp Thiéry et al ., 1999
Tabel 2. Hasil uji RT-PCR ikan kakap putih menunjukkan infeksi VVN stadium berat/sedang
No Provinsi Kota/Kabupaten  Jenis Sampel Jumlah Sampel Gejala Klinis 1 Kepulauan Riau Batam Kakap 10 Nafsu makan menurun, berenang memutar, kematian diatas 50% 2 Kepulauan Riau Bintan Kakap 10 Ikan terlihat lemah, berenang tidak beraturan (memutar), exoptalmia, insang pucat. 3 Kepulauan Riau Tanjung Balai Karimun Kakap 10 Nafsu makan berkurang, berenang tidak beraturan (memutar),
Gambar 1. Deteksi  keberadaan Betanodavirus pada  sampel  asal  Kabupaten  Bintan,  Kabupaten Tanjung Balai Karimun, dan Kota Batam. 2 sampel positif dari Bintan, 2 sampel positif dari Tanjung Balai Karimun dan 3 positif dari Kota Batam. M 100 bp; Kontrol positif, NTC: non template control .
(Nishizawa et  al .,  1999;  Grotmol et  al .,  2000; Azad et al ., 2005). Saat ini, uji RT-PCR dengan atau  tanpa  nested  PCR  telah  dikembangkan sebagai  alat diagnostic yang  kuat  tersendiri  atau kombinasi  dengan  kultur  sel  (Furusawa et  al ., 2007).
Viral  Nerveous  Necrosis (VNN),  atau Viral Ecephalopathy and Retinopathy (VER) merupakan  penyakit  yang  disebabkan  oleh betanodavirus dan telah mengakibatkan kematian massal  ikan  budidaya  laut,  terutama  stadia  larva dan juvenil (Bovo et al ., 1999). Kejadian penyakit VNN di Indonesia dilaporkan terjadi pertama kali
pada  tahun  1997,  di  daerah  Banyuwangi,  Jawa Timur  pada  budidaya  Kakap  Putih  ( Lates calcaliver )  kemudian  menyebar  ke  Bali  pada tahun  1998,  dan  merambah  ke  pembenihan Kerapu  di  Bali  yang  menyebabkan  kematian massal 100% (Zafran et al ., 1998).
Berdasarkan  hasil  penelitian  Senggagau (2011),  menunjukkan  bahwa  Kerapu  Macan rentan  terhadap  virus  VNN.  Hasil  yang  hampir sama juga ditunjukkan pada penelitian mengenai pemetaan  pathognomik  pada  larva  kerapu  tikus ( Cromileptes  altivelis )  (Yuwanita et  al., 2013). Benih  nila  pada  penelitian  Senggagau  (2011),
terinfeksi VNN dari nodavirus yang diisolasi dari kerapu  tikus  yang  terinfeksi  VNN  yang meyebabkan  kematian  massal.  Penelitian  ini menunjukkan  bahwa  benih  nila  dapat  menjadi media pembawa virus (VNN).
Berdasarkan  analisis  genom  virus  VNN, Karakteristik  dari  4  genotipe  virus  tersebut memiliki  homologi  yang  tinggi.  Genotope  virus yang  memiliki  homologi  yang  tinggi  antara  lain bar fin flounder nervous necrosis virus (BFNNV), tiger  puffer NNV(TPNNV), striped  jack NNV (SJNNV),  dan red  spotted  grouper NNV (RGNNV) (Nishizawa et al ., 1999; Shetty et al., 2012;  Janina dan  Kim,  2016).  Bigarre et  al . (2009)  menjelaskan  bahwa  RNA  1  memberikan informasi  adanya  hubungan  genetik  antara Oreochromis  sp , sea  bass, dan Redspottle Grouper  Nervous  Necrosis  Virus (RGBBV).
Odaviruses  merupakan  pembawa  RNA  2  terkait dengan RGNNV dan RNA 1 berhubungan dengan Striped Jack Nervous Virus (SJNNV).
Penyakit  VNN  sangat  sulit  dikendalikan apabila  sudah  menginfeksi  ikan  budidaya,  untuk itu  perlunya  kontrol  dan  pencegahan  agar  virus tersebut  tidak  masuk  kedalam  area  budidaya. Salah  satu  yang  dapat  mencegah  virus  tersebut adalah vaksinasi. Vaksinasi sangat penting untuk mencegah penyakit terutama selama tahap primer dan beberapa peneliti melaporkan prosedur yang efektif dalam mengendalikan penyakit (Furusawa et al ., 2007; Xie et al ., 2016; Vimal et al ., 2014).
Kebersihan  yang  ketat  dapat  membantu mengendalikan VNN di hatceri (Tan et al ., 2001; Bigarre et  al .,  2009;  Shetty et  al .,  2012).  Tidak ada  daur  ulang  air  dan  sterilisasi  kimia  air  laut selama  siklus  penetasan  berhasil  mengurangi penyakit  VNN  di  tempat  penetasan  ikan barramundi (Azad et al ., 2005). Langkah-langkah biosekuriti dan praktek kebersihan umum, seperti treatmen  UV,  penerapan  sanitasi,  pemantauan berkala dan desinfeksi tangki dan filter biologis, desinfeksi  peralatan  dan  penurunan  faktor  stress serta  kepadatan  larva  dan juvenile sangat disarankan (Uwanita, 2018).

## KESIMPULAN
Betanodavirus atau VNN telah terdeteksi di Provinsi Kepulauan Riau antara lain Kota Batam, Kabupaten Bintan, dan Kabupaten Tanjung Balai Karimun  yang  menginfeksi  ikan  kakap  putih. VNN  juga  dapat  menginfeksi  ikan  lain  seperti kerapu, lele Cina, lele Australia dan Guppy.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada Pusat  Karantina  Ikan  dan  Stasiun  KIPM  Batam yang  telah  mengizinkan  kami  untuk  melakukan penelitian tersebut.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdullah,  A.,  Ramli,  R.,  Ridzuan,  M.  S.  M., Murni,  M.,  Hashim,  S.,  Sudirwan,  F., Abdullah,  S.  Z.,  Mansor,  M.  N.,  Amira,  S., Saad, M. Z., & Amal, M. N. A. (2017). The presence of vibrionaceae, betanodavirus and iridovirus in marine cage cultured fish Role of fish size, water physicochemical parameters  and  relationships  among  the pathogens. Aquaculture Reports , 7, 57-65.
Azad, I. S., Shekhar, M. S., Thirunavukkarasu, A. R., Poornima, M., Kailasam, M., & Rajan, J. J. S. (2005). Nodavirus infection causes mass mortalities  in  hatchery  produced  larvae  of Asian  seabass Lates  calcarifer Bloch  first report  from  India. Diseases  of  Aquatic Organisms , 63, 113-118.
Bigarre,  L.,  Cabon,  J.,  Baud,  M.,  Heimann,  M., Body,  A.,  Lieffrig,  F.,  &  Castric,  J.  (2009). Outbreak  of  betanodavirus  infection  in tilapia Oreochromis  niloticus  (L.) in  fresh water. Journal  of  Fish  Diseases ,  32,  667- 673.
Bovo, G., Nishizawa, T., Maltese, C., Borghesan, F.,  Mutinelli,  F.,  Montesi,  F.,  &  Mas,  D.
(1999). Viral encephalopathy and retinopathy of farmed marine fish species in Italy. Virus Research , 63, 143-146.
Costa,  J.  Z.,  &  Thompson,  K.  D.  (2016). Understanding  the  interaction  between betanodavirus and its host for the development  of  prophylactic  measures  for viral  encephalopathy  and  retinopathy. Fish and Shellfish Immunology , 53, 35-49.
Curtis,  P.  A.,  Drawbridge,  M.,  Iwamoto,  T., Nakai, T., Hedrick, R. P., & Gendron, A. P.
(2001).  Nodavirus  infection  of  juvenile white sea-bass ( Atracto scionnobilis ) cultured  in  southern  California:  first  record of  viral  nervous  necrosis  (VNN)  in  North America. Journal of Fish Diseases , 24, 263– 271.
Furusawa,  R.,  Okinaka,  Y.,  Uematsu,  K.,  &
Nakai,  T.  (2007).  Screening  of  freshwater fish  species  for  their  susceptibility  to  a betanodavirus. Diseases of Aquatic
Organisms , 77, 119-125.
Ghiasi, M., Binaii, M., Ghasemi, M., Fazli, H., &
Zorriehzahra, M. J. (2016).
Haematobiochemical  disorders  associated with  nodavirus  like-agent  in  adult  leaping mullet Liza saliens Risso 1810 in the Caspian Sea. Virus Disease , 27, 12-18.
Gomez,  D.  K.,  Lim,  D. J.,  Baeck,  G.  W., Youn, H.  J.,  Shin,  N.  S.,  &  Youn,  H.  Y.  (2006). Detection  of  betanodaviruses  in  apparently healthy  aquarium  fishes  and  invertebrates. Veterinary Science , 7(4), 369–374.
Grotmol, S., Nerlan, A. H., Biering, E., Totland,
G. K., & Nishizawa, T. (2000). Characterisation  of  the  capsid  protein  gene from  nodavirus  strain  affecting  the  Atlantic halibut  Hippoglossus  hippoglossus  and design  of  an  optimal  reversetranscriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) detection  assay. Diseases  in  Aquatic Organism , 39, 79-88.
Janina,  Z.  C.,  &  Kim,  D.  T.  (2016). Understanding  the  interaction  between
Betanodavirus  and  its  host  for  the development  of  prophylactic  measures  for viral  encephalopathy  and  retinopathy. Fish and Shellfish Immunology , 53, 35-49.
Low,  C.  F.  C.,  Nataqain,  S.  B  ,  Chee,  H.  Y.,
Rozaini,  M.  Z.  H.,  &  Najiah,  M.  (2017). Betanodavirus  Dissection  of  the  viral  life cycle. Journal of Fish Diseases , 40, 1–8.
Nishizawa,  T.,  Furuhashi,  M.,  Nagai,  T.,  Nakai, T.,  &  Muroga,  K.  (1999).  Genomic classification of fish nodaviruses bymolecular  phylogenetic  analysis  of  the coat protein gene.
Applied and
Environmental  Microbiology ,  63,  1633– 1636.
Nopadon, P., Aranya, P., Tipaporn, T., Toshihiro,
N., Takayuki, K., Masashi, M., & Makoto, E. (2009). Nodavirus associated with pathological  changes  in  adult  spotted coralgroupers  (Plectropomus  maculatus)  in Thailand  with  viral  nervous  necrosis. Research in Veterinary Science , 87, 97–101.
Purba,  E.  P.,  Ilza,  M.,  &  Leksono,  T.  (2016). Study Penerimaan Konsumen terhadap Steak ( Fillet )  Ikan  Kakap  Putih  Flavor  Asap.
Jurnal Online Mahasiswa , 3(2), 1-11.
Prihartini, N. C. (2016). Distribusi Pathognomik Virulensi  VNN  ( Viral  Nervous  Necrotic ) Pada  Benih  Nila  ( Oreochromis  sp ). Jurnal Ilmu Perikanan , 7(2), 51-56.
Rayes,  R.  D.,  Sutresna,  I.  W.,  Diniarti,  N.,  & Supii,  A.  I.  (2013).  Pengaruh  Perubahan Salinitas Terhadap Pertumbuhan dan Sintasan Ikan Kakap Putih ( Lates calcarifer
Bloch ). Jurnal Kelautan , 6(1), 47-56.
Sembiring, S. B. M., Wibawa, G. S., Mahardika, K.,  Widiastuti,  Z.,  &  Haryanti.  (2018). Prevalensi  Infeksi Viral  Nervous  Necrosis (VNN)  dan Iridovirus Pada  Hatcheri  Dan Budidaya  Ikan  Laut. Media  Akuakultur ,  13 (2), 83-90.
Senggagau,  B.  (2011).  Uji  Resistensi  Terhadap Virus  Vnn  Pada  Beberapa  Spesies  Ikan Ekonomis. Jurnal Perikanan dan Kelautan , 1(1), 43-48.
Shetty, M., Maiti, B., Santhosh, K. S., Venugopal,
M. N., & Karunasagar, I. (2012). Betanodavirus of marine and freshwater fish distribution genomic organization diagnosis and  control  measures. Indian  Journal  of Virology , 23, 123.
Thiery, R., Cozien, J., de Boisseson, C., Boscher, K.  S.,  &  Nevarez,  L.  (1999).  Genomic classification  of  new  betanodavirus  Isolates by phylogenetic analysis of the coat protein gene  suggests  a  low  host-fish  species specificity. Journal of General Virology , 85, 3079–3087.
Tan,  C.,  Huang,  B.,  Chang,  S.  F.,  Ngoh,  G.  H.,
Munday,  B.,  &  Chen,  S.  C.  (2001). Determination  of  the  complete  nucleotide sequences of RNA1 and RNA2 from greasy grouper  ( Epinephelus  tauvina )  nervous necrosis  virus,  Singapore  strain. Journal  of General Virology , 82, 647-653.
Uwanita,  R.,  Buwono,  N.  R.,  &  Putra,  H.  F.  E.
(2018). Pengaruh Dunaliella Salina Terhadap  Polimorfonuklear  Leukosit  Ikan Kerapu Cantang ( Epinephelus fuscoguttatus x Epinephelus  lanceolatus )  Yang  Diinfeksi Viral  Nervous  Necrosis  (VNN). Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan , 10(2).
Vimal,  S.,  Farook,  M.,  Madan,  N.,  Abdul,  M., Nambi, S., Taju, K., Venu, G., Subburaj, S., Thirunavukkarasu,  A.,  &  Hameed.  A.  S. (2014).  Development,  distribution  and expression  of  a  DNA  vaccine  against nodavirus in Asian Seabass, Lates calcarifier (Bloch, 1790). Aquaculture Research , 47(4), 1209-1220.
Windarto, S., Hastuti, S., Subandiyono, Nugroho, R.  A.,  &  Sarjito.  (2019).  Performa pertumbuhan  ikan  kakap  putih  (lates calcarifer  bloch,  1790)  yang  dibudidayakan dalam  sistem  keramba  jaring  apung  (KJA). Jurnal Sains Akuakultur Tropis , 3(1), 56-60.
Xie, J., Huang, R., & Lai, Y. (2016). Prokaryotic production  of  virus-like  particle  vaccine  of betanodavirus  Vaccine  design  Methods  and protocols. Vaccines for Veterinary Diseases , 11(2), 211-223.
Yuwanita,  R.,  Yanuhar,  U.,  &  Hardoko.  (2013). Pathognomonic  of Viral  Nerveous  Necrotic (VNN)  virulence  on  larvae  of  humpback grouper  ( Cromileptes  altivelis ). Advance Environmental Biology , 7(6), 1074-1081.
Zafran, I., Koesharyani, Roza, D., Jhonny, F., & Yuasa.  (1998).  Peningkatan  sintasan  ikan kerapu  tikus  dengan  penambahan  vitamin dan  immunostimulan  kedalam  pakan  segar. Seminar  Teknologi  Perikanan  Pantai ,  164- 168.