## Rahmatan

## PERBANDINGAN METODE EKSTRAKSI DNA PHENOL-CHLOROFORM DAN KIT EXTRACTION PADA SAPI ACEH DAN SAPI MADURA

## Kamaliah
Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi  UIN Ar-Raniry Banda Aceh, Email: dyahelmy@gmail.com

## ABSTRAK
Ekstraksi  DNA  merupakan  tahap  pertama  penelitian  molekular  yang  sangat  berpengaruh  terhadap kualitas  isolasi  DNA. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  perbandingan  ekstraksi  DNA menggunakan  metode Phenol-Chloroform dan KIT  Extraction.  Visualisasi  hasil  isolasi  DNA menggunakan teknik elektroforesis setelah gen leptin sapi Aceh dan sapi Madura diamplifikasi secara in vitro (Polymerase Chain Reaction). Tidak ada teknik ekstraksi DNA yang memberikan keunggulan secara  keseluruhan.  Metode  ekstraksi Phenol-Chloroform memberikan  keunggulan  terhadap  harga yang  lebih  murah,  lebih  sensitif  dalam  isolasi  DNA,  dan  menghasilkan pita  DNA  yang  jelas. Keunggulan KIT Extraction lebih mudah, cepat, dan DNA yang dihasilkan lebih tebal.

## Kata Kunci: Metode Ekstraksi DNA, Metode Phenol-Chloroform, PCR

## ABSTRACT
DNA  extract  is  the  first  phase  of  molecular  research  which  really  influences  the  quality  of  DNA isolate.  The  aim  of  this  study  was  to  find  out  the  comparison  of  DNA  extract  by  using Phenol- Chloroform and  KIT  extraction.  The  visualization  of  DNA  isolate  resulted  from  electrophoresis technique  after  leptin  gen  of  Aceh’s  cow  and  Madura’s  cow  were  amplificated  through  in  vitro (Polymerase Chain Reaction). There were not any techniques of DNA extraction which can provide excellence results as a whole. Phenol-Chloroform extraction method gives advantage for lower price, more sensitive in isolating DNA, and clear DNA ribbon. Meanwhile, KIT extraction method is easier, fast, and thick DNA produced.
Keywords: DNA extraction method, Phenol-Chloroform method, KIT extraction

## PENDAHULUAN
CR (Polymerase Chain  Reaction) merupakan  teknik  paling  akurat  untuk identifikasi spesies, identifiksi hubungan  kekerabatan  spesies  secara evolusi  genetis,  identifikasi  DNA  forensik, deteksi  fungi,  virus  atau  bakteri  dalam  medis, pengujian kualitas air, dan sebagainya [1,2,3,4,5].  Tingkat  keberhasilan  teknik  PCR ditentukan  oleh  metode  ekstraksi  DNA  yang digunakan [6].  Pelet  DNA  yang  mengandung polisakarida dari hasil ekstraksi dapat menghambat aktivitas kerja enzim Taq Polimerase [7].  Selain  itu,  kontaminan  lainnya seperti  polifenol  teroksidasi  dapat  mengikat DNA dalam bentuk ikatan kovalen [8]. Tahapan  ekstraksi  DNA  terdiri  dari  tiga proses  utama,  yaitu  proses  lisis  sel,  purifikasi,
dan  presipitasi.  Proses  lisis  sel  merupakan proses  pertama  ekstraksi  DNA  diawali  dengan menghancurkan  membran  sel  dengan  cara memberikan enzim Proteinase K untuk merusak protein dan Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) untuk mengikat lipid sehingga  membran sel rusak dan semua isi sel keluar. Proses lisis sel menyebabkan DNA bercampur dengan makromolekul  sel  lainnya.    Pemurnian  DNA dari  makromolekul  sel  dilakukan  pada  tahap purifikasi  dengan  cara  memberikan Phenol dan CIAA  (Chloroform Isoamil  Alkohol)  untuk mengikat makromolekul  selain  DNA  seperti protein,  lipid,  dan  karbohidrat.  Pada  tahap  ini DNA dan air terpisah dari bahan organik lainnya setelah  disentrifugasi.  Untuk  menarik  air  dari DNA  dibutuhkan  alkohol.  Proses  ini  disebut

## Kamaliah
dengan  presipitasi.  Metode  ekstraksi  DNA tersebut  merupakan  metode  Fenol-Chloroform yang  umum  digunakan  didalam  prosedur laboratorium [9]. Sejalan dengan berkembangnya  teknologi  metode  ekstraksi DNA  diciptakan  seefisien  mungkin  untuk memudahkan  kegiatan  ekstraksi  DNA.  Salah satu  produk  ekstraksi    yang  digunakan  adalah KIT  Extraction. Tahapan KIT  Extraction mengikuti prosedur dari perusahaan.
Sapi  Aceh  dan  sapi  madura  merupakan hewan  ternak  penghasil  daging  yang  sedang diupayakan  oleh  pemerintah.  Penelitian  marka genetik  sapi  Aceh  dan  sapi  Madura  semakin berkembang.  Oleh  karena  itu  perlu  dilakukan penelitian  yang  bertujuan  untuk  mengetahui perbandingan  ekstraksi  DNA  menggunakan metode  ekstraksi  DNA Phenol-Chloroform dan KIT Extraction pada sapi Aceh dan sapi Madura.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan Januari  2011 di  bagian  Fungsi  Hayati  dan Prilaku  Hewan,  Departemen  Biologi  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam,
Institut Pertanian Bogor.

## Sampel
Sampel  yang  digunakan  pada  penelitian ini  adalah  sampel  darah  sapi  Madura  berasal dari koleksi Laboratorium Bagian Fungsi Hayati dan  Perilaku  Hewan  Departemen  Biologi FMIPA  IPB  sebanyak  6  sampel.  Sampel  darah sapi Aceh  berasal dari Balai Pembibitan Ternak Unggul (BPTU) Indrapuri Aceh besar sebanyak 3 sampel.

## Metode Ekstraksi Phenol-Chloroform
Sampel  darah  di  dalam  alkohol  absolut dicuci  dengan  air  destilata  steril  sebelum dilakukan  ekstraksi.  Kemudian  sampel  darah diendapkan  dengan  sentrifugasi  pada  kecepatan 5000  rpm  selama  5  menit.  Sampel  darah  yang diambil  untuk  ekstraksi  DNA  adalah  sebanyak 100 μl.
Pada  proses  lisis  endapan  sampel  darah 100  μl  dilarutkan  dalam  larutan  STE  (Salt  Tris EDTA)  hingga  1  ml.  Proteinase  K  digunakan sebanyak  10  µl  dan  diinkubasi  pada  suhu  55 0 C selama  1  jam.  Selanjutnya  ditambahkan  SDS (Sodium  Dodecyl  Sulfat).  Purifikasi  DNA digunakan Phenol 1 ml dan CIAA (Chloroform Isoamil  Alkohol)  1  ml.  Perbandingan  volume Phenol  :  Chloroform  :  Isomilalkohol  adalah 25:24:1. Kemudian ditambahkan larutan NaCl 5
M  sebanyak  100  µl  dan  disentrifugasi  dengan kecepatan  13000  rpm  selama  5  menit.  Proses presipitasi  menggunakan  alkohol  absolut  2  x volum  awal  dan  NaCl  5  M  1/10  volume  awal. Pada  tahapan  presipitasi  DNA  diendapkan dengan sentrifugasi 13000 rpm selama 10 menit.
Tahap  pencucian  etanol  dan  sisa  garam menggunakan etanol 70% sebanyak 1 ml.  DNA diendapkan  dengan  sentrifugasi  13000  rpm selama  10  menit. Etanol  diuapkan  dalam  ruang vakum sehingga  diperoleh endapan pelet DNA murni. Pengenceran DNA menggunakan aquadest sebanyak 100 µl.

## Metode Ekstraksi Genomic DNA Mini Kit for Blood (Geneaid)
Ekstraksi Genomic  DNA  Mini  Kit for Blood (Geneaid)  yang  digunakan  dimodifikasi pada tahap pencucian sampel darah dari alkohol dan  tahap  resuspensi  yang  menggunakan  air destilata steril. Endapan sel darah sebanyak 200 μl  dilisis  menggunakan  larutan GB  buffer sebanyak  200  μl,  kemudian  diinkubasi  pa da suhu  35 0 C  selama  10  menit.  Selanjutnya  DNA diikat  pada  matriks  di  dalam  tabung.  Tahap pengikatan  DNA  pada  matriks  bertujuan  untuk memisahkan  DNA  dari  makromolekul  sel lainnya.  DNA  terikat  pada  matriks,  sedangkan makromolekul  sel  lainnya  mengendap  pada bagian  dasar  tabung.  DNA  pada  matriks  dicuci menggunakan larutan 400 μl W1 buffer dan 600 μl Wash  buffer.  Selanjutnya  DNA  diencerkan menggunakan  larutan Elution  buffer sebanyak 100 μl.

## Amplifikasi
Pengujian  hasil  ekstraksi  DNA  dilakukan dengan menggunakan  teknik  PCR  (Polymerase Chain Reaction).  Amplifikasi  menggunakan mesin  PCR  ESCO Swift  Maxi  Thermal  Cycler. Gen yang diamplifikasi adalah gen leptin daerah ekson  2.  Panjang  daerah  ekson  2    yang  diapit oleh sepasang primer sebesar 234 pb. Pasangan primer  yang  digunakan  primer forward dengan urutan nukleotida L5 (5’ - CCATGGCAGACAGCAAATCTCGT- 3’)  dan reverse dengan  urutan  nukleotida L 6  (5’ -
TGGTGTCATCCTGGACCTTCC- 3’) [10].
Volume  total  reaksi  amplifikasi  sebanyak  25  μl terdiri  atas  12,5  μl  1  unit  KAPA2G  R obust Hotstart  ReadyMix  (MgCl 2 2mM  dan  masing- masing  dNTP  0,2  mM),  masing-masing  primer
0,5 μM 1,25 μl, dan genom DNA 10 ng. Kondisi PCR  yang  digunakan  untuk  amplifikasi  daerah ekson  2  terdiri  atas  tahap  pradenaturasi  pada suhu  95 0 C  selama  3  menit.  Tahap  selanjutnya 30  siklus  dengan  kondisi  denaturasi  pada  suhu 95 0 C  selama  15  detik,  penempelan  primer  pada suhu  55 0 C  selama  15  detik,  dan  elongasi  pada
suhu 72 0 C selama 15 detik. Elongasi akhir pada suhu 72 0 C selama 10 menit.

## Visualisasi Produk Amplifikasi
Produk  amplifikasi  gen  leptin  daerah ekson  2  dimigrasikan  menggunakan  teknik Elektroforesis  Gel  Poliakrilamid  (PAGE  6%) dengan  konsentrasi  bufer  1Χ  TBE  (Tris -HCl 0,5;  Asam  Borat  0,65;  EDTA  0,02  M). Visualisasi  DNA  menggunakan  pewarnaan perak berdasarkan Byun et al. (2009) [11].

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Amplifikasi Gen Leptin dari Hasil Ekstraksi
Perbandingan  metode  ekstraksi  DNA menggunakan metode ekstraksi Phenol- Chloroform dan  metode  ekstraksi  KIT  setelah diamplifikasi  menunjukkan  pita  DNA  yang jelas.  Amplifikasi  menggunakan  gen  leptin menunjukkan ukuran pita DNA sebesar 234 bp. Visualisasi DNA pada metode Phenol- Chloroform menunjukkan  pita  DNA  tunggal, tidak  terlihat  kontaminan,  dan  ukuran  DNA lebih  tipis  (Gambar  1).  Hasil  ini  menunjukkan metode Phenol-Chloroform lebih cocok digunakan  untuk  pemetaan  genetik,  teknologi marker, dan DNA sequencing [12]. Metode KIT
Extraction memperlihatkan  sedikit  kontaminan dan  semua  sampel  pada KIT  Extraction menunjukkan  ukuran  pita  DNA  yang  tebal (Gambar 2).
Gambar  1.    Produk  Amplifikasi  Gen  Leptin  Menggunakan  Metode  Ekstraksi Phenol-Chloroform. M:Penanda,  1:Sapi  Aceh  (Kml_BosA11),  2:Sapi  Aceh  (Kml_BosA12),  3:Sapi Aceh(Kml_BosA13),  4:Sapi  Madura  (AF14),  5:Sapi  Madura  (AF26),  6:Sapi  Madura (AF38), 7:Sapi Madura (AF32), 8:Sapi Madura (AF41), 9:Sapi Madura (AF29).
Gambar  2.  Produk  Amplifikasi  Gen  Leptin  Menggunakan  Metode KIT  Extraction. M:Penanda, 1:Sapi Aceh (Kml_BosA11), 2:Sapi Aceh (Kml_BosA12), 3:Sapi Aceh(Kml_BosA13),
4:Sapi Madura (AF14), 5:Sapi Madura (AF26), 6:Sapi Madura (AF38), 7:Sapi Madura (AF32), 8:Sapi Madura (AF41), 9: Sapi Madura (AF29).

## Perbedaan Reagent dan Prosedur
Reagent yang  digunakan  pada  setiap tahapan  metode  ekstraksi Phenol-Chloroform
dan KIT  Extraction menunjukkan  perbedaan.
Metode  ekstraksi Phenol-Chloroform secara umum  terdiri  atas  tiga  tahap,  yaitu  proses  lisis

## Kamaliah
sel,  purifikasi,  dan  presipitasi.  Proses  lisis  sel menggunakan  SDS  (Sodium  Dodecyl  Sulfat) untuk  mengikat  protein  dan  lemak  pada membran sel sehingga membran sel terbuka dan semua  isi  sel  keluar [13].  Selain  itu  proses  lisis sel  menggunakan  enzim  Proteinase  K  berperan untuk  menghancurkan protein [14]. Pada proses lisis  endapan  sampel  dilarutkan  dalam  larutan STE  (Salt  Tris  EDTA).  STE  berfungsi  sebagai buffer  untuk  mencegah  kerusakan  DNA  dengan mempertahankan  pH  dalam  keadaan  normal, yaitu  pH=8 [15].  Tahap  purifikasi  bertujuan untuk memurnikan DNA dari makromolekul sel lainnya  setelah  sel  dihancurkan.  Metode ekstraksi Phenol-Chloroform menggunakan larutan  Fenol  dan  CIAA  (Chloroform  Isoamil Alkohol)  untuk  mengikat  protein,  lipid,  dan karbohidrat [9].  Selain  itu  pada  tahap  purifikasi digunakan larutan NaCl jenuh untuk memekatkan  DNA [12].  Pemisahan  DNA  dan makromolekul  sel  lainnya  terpisah  setelah disentrifugasi. Makromolekul protein dan polisakarida  yang diikat  oleh Phenol dan  dan CIAA (Chloroform Isoamil Alkohol) mengendap  di  dasar  tabung,  sedangkan  DNA dan  air  berada  di  lapisan  atas [16].  DNA  yang diperoleh  masih  terlarut  di  dalam  air  sehingga dalam  metode  ekstraksi  ini  digunakan  alkohol absolut pada proses presipitasi. Tahap Pencucian etanol  dan  sisa  garam  dari  endapan  DNA dilakukan dengan sentrifugasi dan vakum untuk memurnikan  DNA.  Etanol  diuapkan  dalam ruang vakum sehingga  diperoleh endapan pelet DNA murni.  Pelet DNA berupa endapan kering sehingga  pada metode  ini menggunakan
aquadest untuk  pengenceran  DNA.  Pada KIT
Extraction bahan yang digunakan telah dirancang untuk memudahkan dalam melakukan isolasi  DNA.  Selain  itu,  fasilitas  pengikatan DNA  dirancang  dalam  suatu  tabung  yang memiliki  matriks  sebagai  tempat  pengikatan DNA.  Matriks  terlindungi  di  dalam  tabung sehingga tidak mudah rusak.
Ekstraksi  DNA  menggunakan  metode KIT Extraction lebih  singkat  jika  dibandingkan dengan metode Phenol-Chloroform. Total waktu yang  dibutuhkan  pada  metode KIT  Extraction sekitar  35  menit,  sedangkan  metode  ekstraksi DNA Phenol-Chloroform membutuhkan  waktu sekitar  2  jam  47  menit  (Tabel  1).  Metode Phenol-Chloroform merupakan  metode  yang lebih  sensitif  jika  dibandingkan  dengan KIT Extraction sehingga  membutuhkan  ketelitian dalam  melakukan  ekstraksi  DNA  atau  dalam mempersiapkan  larutan  yang  dibutuhkan [17].
Larutan Phenol dan Chloroform-Isoamil Alkohol  perlu  dipersiapkan  sebelum  ekstraksi DNA  dilakukan. Phenol,  Chloroform,  dan Isoamil  alkohol  merupakan  larutan  yang  mudah mengalami oksidasi. Selain itu, Phenol merupakan  senyawa  yang  bersifat  toksik.
Perbandingan  biaya  yang  dikeluarkan  pada  saat melakukan  ekstraksi  DNA  metode Phenol- Chloroform memerlukan  biaya  yang  lebih murah jika dibandingkan dengan KIT Extraction
[17].
Tabel 1. Reagent dan Total Waktu pada Metode Ekstraksi Phenol-Chloroform dan KIT Extraction
Metode Isolasi Reagent Total Waktu Yang Dibutuhkan Fenol- Chloroform SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) 2 jam 47 menit Fenol, CIAA, NaCl Etanol, NaCl KIT Extraction GB Buffer 35 menit Etanol, Matriks GD Coloum
W1 Buffer, Wash buffer,
Elution Buffer

## Chloroform dan KIT Extraction pada Sapi Aceh…

## KESIMPULAN
Ekstraksi  DNA  merupakan  tahap  pertama penelitian  molekular  yang  sangat  berpengaruh terhadap  kualitas  isolasi  DNA  yang  diperoleh.
Tidak ada teknik ekstraksi  DNA yang memberikan  keunggulan  secara  keseluruhan. Pada  penelitian  ini  kedua  teknik  ekstraksi  DNA yang digunakan memberikan perbedaan fasilitas keunggulan. Metode ekstraksi Phenol- Chloroform memberikan  keunggulan  terhadap harga  yang  lebih  murah,  lebih  sensitif  dalam isolasi DNA, dan  menghasilkan pita DNA  yang jelas.  Keunggulan KIT  Extraction lebih  mudah, cepat,  dan  DNA  yang  dihasilkan  lebih  tebal.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Pereira,  F,  J.  Carneiro,  dan  A.  Amorim. 2008. Identification  of  Species  with DNA-Based Technology: Current Progress and Challenges. Recent Patents on DNA & Gene Sequences, 2, 187-200. [2]  Sari,  EM,  H.  Jianlin,  R.R.  Noor,  C. Sumantri,  dan  E.T.  Margawati.  2016. Phylogenetic  analysis  of  aceh  cattle breed of Indonesia through mitochondrial  D-loop  region. Journal  of genetic  engineering  and  biotechnology 14:227-231. [3]  Swaran,  Y.C.  2014.  Direct  PCR  in  Forensic Science- An overview. Malaysian Journal of Forensic Sciences, 5(2):6-12. [4] Teranishi, H, dan K. Ouchi. 2014. Detection of bacteria, fungi, and viruses by a real- time  PCR  assay  using  universal  primers and  probes  from  blood  in  patients  with febrile  neutropenia. Kawasaki  Medical Journal 40(1):1-11. [5] Rompre, A, P. Servais, J. Baudart, M.R. de- Roubin, dan P. Laurent. 2002. Detection and enumeration of coliforms in drinking  water:  current  methods  and emerging approaches. Journal of Microbiological Methods, 49 : 31 – 54. [6]  Rawat,  S,  G.  Joshi,  D.  Annapurna,    A.  N. Arunkumar,  dan  N.N.  Karaba.  2016. Standardization  of  DNA  Extraction Method  from  Mature  Dried  Leaves  and ISSR-PCR  Conditions  for Melia  dubia Cav. A Fast Growing Multipurpose Tree Species.  American  Journal  of  Plant Sciences, 7, 437-445. [7] Fang, G, S. Hammar, dan  R. Grumet. 1992. A  Quick  and  Inexpensive  Method  for Removing  Polysaccharides  from  Plant Genome  DNA. BioTechniques, 13,  52- 56. [8]  Fatchiyah,  E.L.  Arumingtyas,  S.  Widyarti, dan S. Rahayu. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga. [9]  Sambrook,  J,  E.F.  Fritsch,  dan  T.  Miniatis. 1989. Molecular Clooning : A Laboratory Manual.  New  York:  Cold Spring Harbor Laboratory Press. [10] Buchanan R. W, Julie Kreyenbuhl, Julie M. Zito,  and  Anthony  Lehman. 2002. The Schizophrenia  PORT  Pharmacological Treatment Recommendations: Conformance and Implications for Symptoms  and Functional  Outcome. Schizophrenia  Bulletin,  Vol.  28,  No.  1, 200. [11]  Byun,  S.O,  Q.  Fang,  H.  Zhou,  dan  J.G.H. Hickford. 2009. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrilamid  gels. Anal  Biochem, 385,
174-175.
[12]  Wulandhari,  A.  2009.  Optimalisasi  Hasil
Ekstraksi  DNA  dari  Darah  Segar  Sapi Menggunakan High Salt Method dengan Perbandingan  Darah  dan Lysis  Buffer pada  Kecepatan  Sentrifugasi  Berbeda. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
[13] Budi,  P.A,  R.S.  Purbowotiningrum,  dan A.L.N.  Aminin.  2011.  Purifikasi  DNA kromosom Geobacillus  sp. dYtae14
menggunakan  kolom  silika  dengan denaturan  urea.  Jurnal  Sains  dan Matematika, 19(4), 101-106.
[14] Ebeling,  W.  1974.  Proteinase  K  From
Trilirachium  album Limber.  Eur  J Biochem, 47, 91-97.
[15]  Montgomery,  G.  W.  dan  J.  A.  Sise.  1990. Extraction DNA from sheep white blood cells. New Zealand Journal of
Agricultural  Research.  Vol.  33  :  437- 441.
[16] Kado,  C.I  dan  S.T.  Liu.  1981.  Rapid Procedure for Detection and Isolation of Large  and  Small  Plasmids. Journal  of Bacteriology. 145 (3), 1365-1373.
[17] Renshaw et al. 2015. The room temperature preservation  of  filtered  environmental DNA  Samples  and  Assimilation  Into  a Phenol – Chloroform – Isoamyl Alcohol DNA  Extraction. Journal  Molecular Ecology  Resources. Volume  15,  Issue  1 January 2015 Pages 168 – 176.