Jurnal Pharmascience, Vol. 9, No. 2, Oktober 2022, hal: 258-270 ISSN-Print. 2355 – 5386 ISSN-Online. 2460-9560 https://ppjp.ulm.ac.id/journal/index.php/pharmascience Research Article
Sitotoksisitas dan Selektivitas In Vitro Daun Benalu Cengkeh (Dendrophthoe pentandra L. Miq) terhadap Sel Kanker Serviks HeLa
Susilowati*, Truly Dian Anggraini, Nurul Kotimah
Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Nasional, Sukoharjo, Jawa Tengah, Indonesia Email: susilowati@stikesnas.ac.id

## ABSTRAK
Kanker serviks merupakan salah satu jenis kanker dengan tingkat kejadian dan kematian yang tinggi. Bahan alam dapat dianggap sebagai pendekatan yang menjanjikan untuk pengendalian dan manajemen kanker. Benalu cengkeh adalah salah satu tanaman parasit  yang  telah  diketahui  mengandung  komponen  anti  kanker.  Kuersetin  dalam benalu  cengkeh  diyakini  sebagai  senyawa  yang  bertanggung  jawab  sebagai  agen  anti- kanker.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menguji  sitotoksisitas  dan  selektivitas  daun benalu  cengkeh  terhadap  sel  HeLa.  Ekstraksi  menggunakan  metode  maserasi  dengan etanol 70% dan uji sitotoksik dievaluasi dengan metode MTT (3 (4,5-Dimethillitiazol-2- il) -2,5 diphenyltetrazolium bromide) pada model sel kanker Serviks HeLa dan model sel normal sel Vero. Efek sitotoksisitas diperoleh dari nilai IC50 dan selektivitas dinilai dari indeks selektivitas. Ekstrak etanol daun benalu cengkeh menurunkan viabilitas sel HeLa dengan  potensi  sitotoksik  moderat  (IC 50 sebesar  43,90  μg  /  mL)  dan  selektivitas  yang tinggi (SI sebesar 13,34), menunjukkan ekstrak tersebut berpotensi untuk dikembangkan sebagai produk biofarmasi. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk memastikan potensi antikankernya secara in vivo dan untuk menjelaskan mekanisme kerjanya pada tingkat molekuler dan biokimiawi.
Kata Kunci: Sitotoksik, Selektivitas, Dendrophthoe pentandra, Sel HeLa, Sel Vero, MTT

## ABSTRACT
Cervical cancer is one of cancer type with a high incidence and mortality rate. Nat- ural ingredients  can  be  considered  a promising  approach  to cancer  control  and  manage- ment. Dendrophthoe pentandra is one of the parasite plants that has been known to contain anticancer component. Quercetin in Dendrophthoe pentandra is believed to be marker com- pound as an anticancer agent. The current study aims to detect cytotoxicity and selectivity of  Dendrophthoe  pentandra  leaves  against  HeLa  cell.  The  extraction  using  maceration method with 70% ethanol and cytotoxic test was evaluated by MTT (3 (4,5-Dimethillitiazol-
2-il) -2,5 diphenyltetrazolium bromide). The cytotoxicity effect was obtained from IC 50 values and selectivity was assessed from selectivity index (SI). The ethanol extract of Dendrophthoe pentandra leaves reduces the viability of HeLa cells with moderate cytotoxic (IC 50 of 43,90 µg  /  mL)  and  high  selectivity  (SI  by  13,34)  compared  to  normal  vero  cells,  indicating  its potential for biopharmaceutical use. Further studies are needed to ascertain its efficacy in vivo and to elucidate its mechanism of action at molecular and biochemical levels.
Keywords: Cytotoxicity, Selectivity, Dendrophthoe pentandra, HeLa Cells, Vero Cells, MTT

## I. PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyebab kematian  utama  kedua  di  dunia  setelah penyakit kardiovaskuler dan kanker serviks merupakan  salah  satu  jenis  kanker  yang paling umum pada wanita (WHO, 2018). Di Indonesia  Kanker  serviks  merupakan kanker  dengan  tingkat  kejadian  dan penyebab  kematian  kedua  setelah  kanker payudara  (WHO,  2019a).  Angka  kejadian kanker  serviks  tersebut  adalah  23,4  per 100.000 penduduk dengan rata-rata kematian  13,9  per  100.000  penduduk. Berdasarkan  data  Riskesdas  tahun  2018 menunjukkan  adanya  peningkatan  angka kejadian  kanker  di  Indonesia  dari  1.4  per 1000 penduduk di tahun 2013 menjadi 1,79 per 1000 penduduk (Depkes RI, 2018). Hal ini  menunjukkan,  upaya  pencegahan  dan pengendalian  kanker  di  Indonesia  perlu dioptimalkan.
Metode  pengobatan  untuk  kanker serviks diantaranya pembedahan, radioterapi  dan  terapi  sistemik.  Selain  itu, terdaftar di WHO obat esensial sebanyak 30 sitotoksik dan adjuvant yang terbukti secara klinis  efektif  baik  dari  sisi  khasiat,
keamanan  maupun  biaya  yang  masih terjangkau.  Berbagai  metode  pengobatan untuk  melawan  kanker  serviks  tersebut masih belum dapat menanggulangi tingkat kejadiannya.  Hal  ini  ditunjukkan  dengan masih  tingginya  tingkat  kematian  akibat kanker  serviks  sebesar  90%  (WHO, 2019b).  Berdasarkan  hal  tersebut,  perlu untuk  terus  dilakukan  penelitian  guna memperoleh  pengobatan  kanker  dengan efektifitas dan selektivitas yang tinggi.
Salah  satu upaya pengobatan kanker dapat dilakukan diantaranya melalui eksplorasi  tanaman  obat  yang  diduga berkhasiat  sebagai  antikanker.  Salah  satu tanaman di Indonesia yang dapat dikembangkan  sebagai  agen  antikanker adalah benalu. Benalu memiliki kandungan senyawa  aglikon  flavonoid  kuersetin dengan potensinya sebagai antioksidan dan antikanker  (Ikawati et  al .,  2008).  Potensi antioksidan  dan  antikanker  flavonoid kuersetin  dalam  benalu  menunjukkan tanaman  benalu  merupakan  agen  yang cukup  menjanjikan  untuk  dikembangkan sebagai antikanker. Benalu teh dan benalu mangga  merupakan  jenis  benalu  yang
masuk  daftar  calon  fitofarmaka,  sehingga benalu  lain  yang  masih  dalam  satu  family dengan  benalu  tersebut  memiliki  peluang untuk dikembangkan.
Benalu  cengkeh  merupakan  salah satu jenis benalu yang diketahui mengandung flavonoid total sebesar 13,7021% Quersetin  Equivalen dalam ekstrak  methanol  (Lekal  &  Watuguly, 2017).    Aktivitas  antioksidan  dengan metode DPPH  free  radical  scavenging menunjukkan ekstrak air dan ekstrak etanol benalu cengkeh memiliki potensi antioksidan  yang  kuat  dengan  nilai IC 50 berturut-turut  sebesar  11,4  µg/mL  dan  6,8 µg/mL (Fitrilia, 2015). Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat Reactive  Oxygen  Species
(ROS) yang  menyebabkan  terjadinya kerusakan  sel  sebagai  salah  satu  pemicu terjadinya kanker manusia. Hasil penelitian Sammar, et  al .  (2019)  menunjukkan aktivitas antioksidan dari hasil skrining 57 tanaman berbanding lurus dengan aktivitas sitotoksitasnya.  Berdasarkan  hal  tersebut menunjukkan benalu cengkeh dapat dikembangkan selanjutnya melalui pembuktian  aktivitasnya  terhadap  sel kanker  terutama  sebagai  upaya  penemuan agen terapi kanker serviks.
Upaya  penemuan  agen  terapi terhadap  kanker  servik  dari  jenis  benalu lain sejauh ini sudah dilakukan, akan tetapi aktivitasnya  tergolong  lemah.  Aktivitas
sitotoksik  benalu  belimbing  dan  benalu alpukat  menunjukkan  nilai IC 50 secara berturut-turut  sebesar  217.72  µg/ml  dan 1000 ppm  (Mutiah et  al ., 2017)(Mutiah et al .,  2018).  Berdasarkan  uji  toksisitas ekstrak etanol daun benalu cengkeh dengan metode Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT)  menunjukkan  nilai LD 50 1673,72 µg/mL    (Elsyana et  al .,  2016)  dan  hingga sejauh  ini  potensi    sitotoksiknya  terhadap sel  HeLa  dan  selektifitasnya  terhadap  sel normal  belum  dilaporkan.  Pada  penelitian ini  akan  dilakukan  pemeriksaan  aktivitas sitotoksik  dari  ekstrak  etanol  daun  benalu cengkeh terhadap sel HeLa dan juga potensi keamananya pada sel normal Vero dengan metode MTT secara in vitro.

## II. METODE

## A. Preparasi Bahan
Benalu  cengkeh  yang  digunakan dalam penelitian dideterminasikan di Balai Besar  Penelitian dan  Pengembangan Tanaman  Obat  dan  Obat  Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu,
Karanganyar. Daun benalu cengkeh dipetik,  disortasi  basah,  dicuci,  kemudian dikeringkan  di  bawah  sinar  matahari dengan  ditutup  kain  hitam  selama  5  hari. Setelah kering, dilakukan sortasi kering dan daun  kering  dihaluskan  dengan  blender sampai  berbentuk  serbuk  dan  diayak dengan ayakan 65 mesh.
Sebanyak  50  gram  simplisia  daun benalu  cengkeh  dimaserasi  dengan  etanol 70% (LKPI)  sebanyak 500 mL atau 10 kali berat sampel  selama 3 hari sambil sesekali diaduk.  Kemudian  disaring  dengan  kain flanel untuk memisahkan filtrat dari ampas. Filtrat  dipekatkan  menggunakan rotary evaporator (IKA ® RV10) dan  dilanjutkan dengan diuapkan di atas waterbath (Mem- mert ® )  pada  suhu  60⁰C  sampai  diperoleh ekstrak kental.

## B. Uji Kromatografi Lapis Tipis
Uji kromatografi lapis tipis dilakukan  menggunakan  sistem  normal dengan  fase  diam  lengpeng  silika  gel  60 F 254 dan  Fase  gerak  butanol,  asam  asetat dan  air  (5:1:1).  Fase  gerak  tersebut diperoleh  berdasarkan  hasil  optimasi  rasio pelarut  hingga  diperoleh  pemisahan  yang terbaik.  Profil  KLT  dideteksi  di  bawah UV 254 , UV 366 dan Uap Amonia.

## C. Uji MTT terhadap sel HeLa dan sel Vero
Sitotoksisitas  ekstrak  daun  benalu terhadap sel HeLa dan sel Vero ditetapkan dengan  metode  MTT  (  3  (  4,  5  – Dimetillitiazol  –  2  –  il  )  -  2,5 difeniltetrazolium  bromida). Plate 96 diinkubasi dalam inkubator
CO2
( Memmert ® ) selama 24 jam (CCRC, 2013).
Masing-masing  seri  konsentrasi  sejumlah 100 µL dipindahkan ke dalam plate 96 yang
telah  berisi  sel  sebanyak  3  kali  replikasi. Konsentrasi larutan uji ekstrak etanol daun benalu  cengkeh  terhadap  sel  HeLa  yaitu 3,125µg/mL; 6,25µg/mL; 25µg/mL;
12,5µg/mL;  50µg/mL  dan  100µg/mL, sedangkan  pada  sel  Vero  konsentrasi 15,625μg/mL;  31,25μg/mL;  62,5  μg/mL;
125  μg/mL;  250  μg/mL;  500  μg/mL  dan 1000 μg/mL.
Data  hasil  pembacaan  sitotoksik yang  diperoleh  dalam  penelitian  ini selanjutnya  diuji  menggunakan  analisis probit  untuk  menentukan IC 50 yang disajikan dalam grafik log konsentrasi ver- sus perentase sel hidup. Potensi antikanker ekstrak berdasarkan National Cancer Insti- tute (NCI) guideline :  aktif  ( IC 50 <  20 µg/mL), moderat aktif (20 µg/mL ≤ IC 50 < 100 µg/mL), tidak aktif  ( IC 50 ≥ 100 µg/mL) (Bézivin et  al .,  2003).  Nilai IC 50 yang masih menunjukkan potensi antiproliferatif adalah  <100  µg/mL  (Kamuhabwa et  al ., 2000).
Selektifitas ekstrak etanol daun benalu cengkeh  dapat  diketahui  dari  nilai Selectivity Index (SI)  yang  diperoleh  dengan  mem- bandingkan IC 50 sel  vero  terhadap  sel  kanker serviks HeLa. Sampel yang memiliki nilai SI > 3  menunjukkan  selektifitas  yang  tinggi  dalam membunuh sel kanker dibandingkan sel normal vero (Bézivin et al ., 2003).
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak  etanol  yang  dihasilkan sebesar sebesar 8,46 gram dengan rendemen  sebesar  16,92%.  Organoleptis ekstrak  berwarna  hijau  kecoklatan,  kental dan  berbau  khas.  Hasil  ekstrak  yang diperoleh dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya metode yang digunakan, pelarut,  temperatur,  perbandingan  pelarut serta  lamanya  waktu  ekstraksi  (Azwanida, 2015).

## A. Hasil Uji Identifikasi Flavonoid
Identifikasi kandungan senyawa flavonoid pada ekstrak etanol daun benalu cengkeh dilakukan melalui uji kromatografi  lapis  tipis  dengan  fase  gerak butanol,  asam  asetat  dan  air  (5:1:1). Pemilihan fase gerak dilakukan berdasarkan  hasil  optimasi  mendapatkan eluen  yang  memberikan  hasil  pemisahan yang  paling  baik.  Eluen  yang  baik  ialah eluen  yang  bisa  memisahkan  senyawa dalam  jumlah  yang  banyak  yang  ditandai dengan  munculnya  noda.  Noda  yang terbentuk  tidak  berekor  dan  jarak  antara noda  satu  dengan  yang  lainnya  jelas (Harborne, 2006).
Berdasarkan  hasil  KLT  pada Gambar  1  dan  Tabel  1  menunjukkan ekstrak  etanol  daun  benalu  cengkeh
mengandung  senyawa  flavonoid  dimana salah satu diantaranya merupakan senyawa kuersetin. Pada hRf 91 menunjukkan warna spot  yang  sama  di  berbagai  detektor  dan hRf yang  hampir  sama  dengan  kuersetin (hRf 93). Hasil penelitian ini menunjukkan adanya  kesesuaian  dengan  penelitian sebelumnya  yang  menunjukkan  bahwa keursetin  merupakan senyawa  marker  dari benalu  (Ikawati et  al .,  2008).  Selain  itu, pada  hRf  83  dengan  warna  lembayung gelap  dan  kuning  kehijauan  setelah  diberi uap amonia pada UV 254 nm menunjukkan keberadaan  senyawa  flavonoid  lain.  Spot yang  berwarna  lembayung  gelap  dan setelah  pemberian  uap  amonia  berwarna kuning, hijau-kuning, atau hijau merupakan flavonoid  5-OH  flavon  atau  flavonol (tersulih  pada  3-OH  dan  mempunyai  4’- OH)  atau    5-OH  flavanon  dan  4’-OH khalkon  tanpa  OH  pada  cincin  B (Markham, 1988). Salah satu flavonoid lain yang telah diisolasi dari fraksi etanol daun benalu cengkeh adalah kuersitrin (Katrin et al .,  2005).  Hal  ini  menunjukkan  senyawa flavonoid merupakan senyawa yang bertanggung  jawab  terhadap  potensi  yang ditimbulkan dari daun benalu cengkeh.
Gambar  1. Profil  KLT  ekstrak  etanol  daun  benalu  cengkeh  (A)  Profil  KLT  tanpa  deteksi bercak (B) Profil KLT pada UV 254 nm (C) Profil KLT pada UV 366 nm (D) Profil KLT pada UV 254 nm setelah diberi uap amonia (E) Profil KLT pada UV 366  nm  setelah  diberi  uap  amonia  1)  Ekstrak  etanol  daun  benalu  cengkeh  2) Standar kuersetin. Fase diam silika gel GF254; fase gerak Butanol:asam asetat: air (5:1:1)
Tabel I. Nilai hRf dan warna spot hasil KLT ekstrak etanol daun benalu cengkeh
Spot Warna spot hRf Sebelum diberi uap amonia Sesudah diberi uap amonia UV 254 nm UV 366 nm UV 254 nm UV 366 nm 1 Lembayung gelap  Kuning kehijauan Kuning kehi- jauan Kuning kehi- jauan 83 2 Kuning kehijauan  Kuning kehijauan Kuning kehi- jauan Kuning kehi- jauan 91 Standar kuersetin Kuning kehijauan  Kuning kehijaun Kuning kehi- jauan Kuning kehi- jauan 93 Flavonoid diketahui memiliki
aktivitas antioksidan yang mampu melindungi  tubuh dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh spesi oksigen reaktif atau  ROS  ( reactive  oxygen  species ).
Apabila ROS dalam tubuh meningkat dapat menyebabkan  stres  oksidatif  pada  sel sehingga mengakibatkan kerusakan komponen seluler seperti lipid, protein dan DNA.  Sel  dengan  stres  oksidatif  yang
persisten  merupakan  ciri-ciri  dari  sel kanker (Trachootham, et al ., 2009).
Senyawa antioksidan memiliki kemampuan  sebagai scavenger  ROS , penghambatan enzim dalam formasi ROS, dan  mencegah  peristiwa  oksidasi  seluler serta  ekstraseluler  (Zhang et  al .,  2015).
Adanya  penurunan  jumlah  ROS  dapat menurunkan terjadinya proliferasi sel (Day et al ., 2005) dan kematian sel kanker akibat
pengaruh  agen  sitotoksik  menunjukkan lebih  cepat  dibandingkan  sel  dikarenakan memiliki  respon  stotoksik  yang  lebih sensitif (Hanley et al ., 2005). Berdasarkan hal tersebut diharapkan ekstrak daun benalu cengkeh  dengan  kandungan  flavonoid mampu  melawan  pertumbuhan  sel  kanker dengan selektif.

## B. Sitotoksisitas dan selektifitas ekstrak daun benalu cengkeh
Sitotoksisitas  ekstrak  daun  benalu cengkeh  dalam  penelitian  ini  diuji  dengan metode MTT. Metode ini dapat digunakan untuk  mengukur  proliferasi  sel  secara kolorimetri.  Metode  ini  berdasarkan  pada perubahan  garam tetrazolium  3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide (MTT) menjadi kristal formazan  dalam  mitokondria  yang  aktif pada  sel  hidup.  Kristal  formazan  yang terbentuk  dapat  dilarutkan  dengan  pelarut tertentu  yang  kemudian  absorbansinya dapat  dibaca  dengan microplate  reader (Meerloo et al ., 2011).
Dalam  penelitian  ini,  konsentrasi larutan  uji  ekstrak  etanol  daun  benalu cengkeh  terhadap  sel  HeLa  yaitu  3,125  - 100µg/mL.    Penggunaan  konsentrasi  pada zat  uji  tersebut  berdasarkan  orientasi konsentrasi sebelumnya. Berdasarkan Gambar  2  hasil  uji  pada  konsentrasi terendah (3,125µg/mL) menunjukkan persentase  kehidupan  sel  HeLa  paling
tinggi, sedangkan persentase kehidupan sel HeLa paling rendah terdapat pada konsentrasi tertinggi 100µg/mL. Persentase ini  juga  ditunjukan  dengan  warna  larutan yang  semakin  memudar  dari    konsentrasi tertinggi  ke  rendah  yang  menandakan bahwa jumlah sel kanker banyak mengalami kematian dengan meningkatnya konsentrasi.  Nilai  korelasi  sebesar  0.9774 menunjukkan  hubungan  linieritas  antara pemberian  ekstrak  daun  benalu  cengkeh dengan  persentase  sel  HeLa  yang  hidup, dimana  koefisien  R  yang  bernilai  antara 0.800-1.000  menunjukkan  korelasi  yang sangat  kuat  (Sudjana,  2003).  Hasil  ini menunjukan  adanya  fenomena dose  de- pendent  respone, dimana  efek  sitotoksik meningkat  seiring  dengan  meningkatnya konsentrasi ekstrak yang diberikan.
Gambar  2. Grafik  hubungan  rerata persentase  kehidupan  sel HeLa terhadap log konsentrasi  ekstrak  etanol daun benalu cengkeh
Hasil  analisis  probit  ekstrak  etanol daun  benalu  cengkeh  terhadap  sel  HeLa menunjukkan  nilai IC 50 sebesar  43,90 μg/mL terhadap kanker yang menunjukkan
0. 22.5 45. 67.5 90. 0. 0.5 1. 1.5 2. 2.5 % s e l h e la h id u p Log konsentrasi  ekstrak daun benalu cengkeh
aktivitas  dalam  kategori  moderat  aktif terhadap  sel  kanker  HeLa.  Secara  umum, batas IC 50 yang  masih  memiliki  potensi antiproliferatif adalah <100 µg/mL (Kamuhabwa et  al .,  2000).  Hasil  tersebut menunjukkan ekstrak daun benalu cengkeh berpotensi  untuk  dapat  dikembangkan sebagai agen antikanker.
Pada  Gambar  3  pemberian  ekstrak etanol  daun  benalu  cengkeh  terhadap  sel Vero juga menunjukkan fenomena dose de- pendent  respone akan  tetapi  perlakuan dilakukan  pada  konsentrasi  yang  lebih tinggi (15,625 – 1000 μg/mL).  Hubungan antara log konsentrasi ekstrak daun benalu cengkeh dengan persentase hidup sel Vero menunjukkan  rumus  regresi  linier  y  =  - 46,038x  +  177,41  (R=  0,9941)  sehingga diperoleh nilai IC 50 sebesar 585,46 µg/mL.
Gambar  3. Grafik  hubungan  rerata persentase  kehidupan  sel Vero terhadap log konsentrasi  ekstrak  etanol daun benalu cengkeh
Selektivitas  ekstrak  etanol  daun benalu  cengkeh  terhadap  sel line normal Vero dapat  dilihat  dari  perolehan nilai Se- lectivity  Index .  Suatu  ekstrak  dikatakan mempunyai selektivitas yang tinggi apabila
memiliki  nilai Selectivity  Index ≥  3 (Bézivin et al ., 2003). Nilai Selectivity In- dex ekstrak daun benalu cengkeh terhadap sel HeLa sebesar 13,34. Hal ini menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  daun benalu  cengkeh  mempunyai  selektivitas yang  tinggi  sehingga  aman  terhadap  sel normal. Selectivity Index agen kemopreventif  artinya  hanya  sel  yang diidentifikasi sebagai sel kanker saja  yang dihambat,  sementara  sel line normal  Vero tidak dihambat.
Aktivitas  sitotoksik  ekstrak  etanol daun  benalu  cengkeh  terhadap  sel  HeLa dapat diamati dari perubahan morfologi sel setelah  24  jam  perlakuan.  Pada  Gambar  4 menunjukkan  sel  mengalami  perubahan bentuk  menjadi  lebih  bulat  dengan kepadatan  lebih  rendah  dibandingkan dengan  kontrol  sel.  Morfologi  sel  HeLa yang  hidup  berbentuk  memanjang  seperti daun,  melekat  pada  dasar  sumuran  dan dalam  jarak  yang  saling  berdekatan menggambarkan bahwa viabilitas sel yang baik,  Kondisi  sel  HeLa  yang  mati ditunjukkan  dengan  sel  tampak  bulat berukuran lebih kecil, tak berinti, berwarna bening  dan  cenderung  tersebar  ataupun soliter, karena perlakuan pemberian ekstrak daun  benalu  cengkeh  pada  konsentrasi tinggi  (100  μg/mL).  Sel  yang  mati  tidak dapat terwarnai oleh garam MTT sehingga tidak membentuk warna ungu seperti pada sel  hidup.  Mitokondria  sel  mati  pada  uji
0. 32.5 65. 97.5 130. 0. 0.75 1.5 2.25 3. 3.75 % se l Ve ro h id u p Log konsentrasi  ekstrak daun benalu cengkeh
sitotoksisitas  tidak  mampu  berespirasi sehingga tidak menghasilkan enzim suksinat  reduktase  tetrazolium  yang  dapat mereduksi  reagen  MTT  menjadi  produk formazan.  Pada  morfologi  sel  Vero menunjukkan  perubahan  morfologi  sel
terlihat jelas setelah pemberian konsentrasi ekstrak yang tinggi (1000 μg/mL). Hal ini berkaitan  dengan  selektifitas  ekstrak  daun benalu  cengkeh,  sehingga  membutuhkan konsentrasi  yang  lebih  tinggi  untuk  dapat mempengaruhi sel Vero.
Gambar  4. Morfologi  sel  diamati  dibawah  mikroskop  perbesaran  100x.  gambar  diambil dengan kamera canon lexus 100. (X)Morfologi sel Vero; (Y) Morfologi sel HeLa; (A) Morfologi sel pada kelompok control; (B) Morfologi sel setelah pemberian ekstrak (Sel HeLa pada ekstrak 100 µg/mL dan sel Vero pada 1000 µg/mL). (C); Sel setelah pemberian MTT. Keterangan à: sel hidup; - - > : sel mati.
Efek samping yang biasa muncul dari penggunaan  obat  kemoterapi  salah  satunya disebabkan  karena  kurang  selektifnya  agen tersebut  dalam  menghambat  pertumbuhan sel.  Agen  tersebut  dapat  menyerang  sel kanker  dan  juga  sel  normal,  sehingga  sel normal ikut rusak dan mati. Hal ini berbeda dengan  cara  agen  kemopreventif  dalam membedakan  sel  kanker  dan  sel  normal dengan berdasarkan dari kebutuhan sel akan ATP  ( Adenosine  Trifosfate )  (Alali et  al .,
1999).  Sel  kanker  bergerak,  tumbuh  dan
berduplikasi lebih cepat dan aktif dibandingkan  sel  normal,  sehingga  sel kanker  membutuhkan  energi  ATP  dalam jumlah  yang  lebih  banyak.  Hal  ini  dapat dideteksi  oleh agen kemopreventif,  dimana agen  tersebut  dapat  masuk  ke  dalam  sel kanker  dan  menempel  pada  dinding  dalam mitokondria  untuk  memblok  produksi energi ATP. Akibatnya suplai energi untuk sel  kanker  terputus,  sel  kanker  menjadi lemah dan akhirnya mati.
X Y
Aktivitas  sitotoksik  ekstrak  etanol daun  benalu  cengkeh    terhadap  sel  HeLa diduga dapat melalui jalur siklus sel maupun apoptosis yang disebabkan oleh kandungan metabolit  sekunder  dari  daun  benalu cengkeh yaitu flavonoid kuersetin.
Diketahui  kuersetin  dapat  bereaksi  sebagai antikanker pada regulasi siklus sel, berinteraksi  dengan  reseptor  estrogen  (ER) tipe II dan menghambat enzim tirosin kinase (Lamson & Brignall, 2000). Kuersetin juga berperan  dalam  menekan  ekspresi  mutan protein p53. Pada kondisi wild type , protein ini  merupakan  protein  yang  penting  dalam kontrol siklus sel, yaitu dengan memacu sel untuk  berhenti  atau  apoptosis.  Namun apabila  terjadi  mutasi  maka  protein  ini menjadi sebuah penanda abnormalitas yaitu siklus memacu  sel ke fase G2-M (penggandaan  sel)  dan  apabila  sel  terus menerus  pada  fase  ini  maka  akan  terjadi proliferasi (pembelahan tak terkendali). Sel HeLa  memiliki  gen  p53  dan  p105Rb  yang berbentuk wild type serta memiliki onkogen yaitu  protein  E6  dan  E7.  Aktivitas proliferasi  yang  berlebihan  pada  sel  HeLa diakibatkan  oleh  ikatan  antara  protein  E6 yang  berikatan  dengan  gen  p53  sehingga mempercepat  degradasi  p53  dan  stimulasi aktivitas  enzim  telomerase.  Protein  E7 berperan  dalam  meningkatkan  aktivitas poliferasi sel melalui hiperfosforilasi p105Rb (DeFilippis et al ., 2003).
Proses  penghambatan  proliferasi terhadap  sel  kanker  oleh  ekstrak  daun benalu  cengkeh  memang  belum  diketahui, akan  tetapi  mekanisme  penghambatan  dari ekstrak  daun  benalu  manga  dengan  profil kandungan  senyawa  yang  sama  telah dilakukan.  Penghambatan  proliferasi  sel kanker  pada  ekstrak  daun  benalu  manga terjadi melalui dua mekanisme. Mekanisme pertama terjadi akibat penghambatan sintesis  DNA  yang  terjadi  akibat  aktivasi Chk2 kinase oleh ekstrak daun benalu yang menyebabkan  akumulasi  P21.  Akumulasi ini  berujung  pada  hipopolarisasi  Rb  yang mencegah  sekresi  E2F1.  Pencegahan  ini mampu menghambat sintesis DNA. Mekanisme  lain  yang  terlibat  dalam antiproliferasi disebabkan oleh depolimerisasi  mikrotubul  yang  berujung pada  perubahan  struktur  sekunder  tubulin. Perubahan  ini  menyebabkan  kromosom mengalami kegagalan penataan dan pemisahan (Endharti et al ., 2018). Selain 2 mekanisme  tersebut,  ekstrak  daun  benalu manga  juga  mampu  menginduksi  ekspresi p53  yang  berguna  untuk  mengatasi  infla- masi  sel  berlebih.  Ekspresi  protein  p53  ini juga mencegah proliferasi sel kanker dengan menghambatnya  pada  fase  S.  Selain  itu, daun benalu juga mampu mengurangi IL-22. Pengurangan  IL-22  ini  mampu  meregresi keberadaan  sel  kanker  payudara.  Kebera- daan kanker payudara mampu ditingkatkan
oleh  bertambahnya  jumlah  IL-22.  Penuru- nan  jumlah  IL-22  akan  menyebabkan  pe- nurunan  COX-2  dan  sitokin  proinflamasi. COX-2 berperan sebagai agen yang mening- katkan  resistensi  apoptosis,  proliferasi,  an- giogenesis, inflamasi, invasi, dan metasis sel kanker (Endharti et al ., 2016).
Daun  benalu  cengkeh  merupakan tanaman yang berpotensi untuk dikembangkan menjadi agen kemopreventif dan  kuratif.  Hal  ini  didukung  dengan sitotoksiksisitas  daun  benalu  cengkeh  yang tidak  hanya  perpotensi  terhadap  sel  HeLa, namun  juga  menunjukkan  efek  sitotoksik kuat dan antiploriferasi terhadap sel kanker K562  (Sel  kanker  leukimia)  dan  MCM-B2
(sel kanker payudara) (Elsyana et al ., 2016).
Selain itu, daun benalu cengkeh juga mampu berperan sebagai immunomodulator.
Tumbuhan ini dapat meningkatkan
proliferasi  splenosit  dan  timosit.  Splenosit merupakan  kelompok  sel  yang  terdiri  atas sel  B  sekitar  60%  dan  sel  T  sekitar  40%. sedangkan timosit tersusun atas hampir 99% sel  T mature .  Jumlah  splenosit  dan  timosit yang  meningkat  ini  mampu  memperbesar potensi untuk perawatan sel kanker (Ang et
al ., 2014). Guna mendapatkan dasar ilmiah dalam pengembangan daun benalu cengkeh sebagai agen kemopreventif perlu dilakukan penelitian  lebih  lanjut  terhadap  mekanisme aksi  dan  senyawa  aktif  yang  bertanggung jawab terhadap mekanisme tersebut.

## IV. KESIMPULAN
Ekstrak  etanol  daun  benalu  cengkeh dengan  kandungan  flavonoid  mempunyai aktivitas  sitotoksik  moderat  aktif  terhadap sel  kanker  serviks  HeLa  serta  selektif terhadap  sel  normal  vero.  Penelitian  lebih lanjut diperlukan untuk mengetahui mekanisme aksi ekstrak etanol daun benalu cengkeh  dalam  menghambat  pertumbuhan sel  kanker  servik  HeLa.  Selain  itu,  hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar untuk  pengembangan  ekstrak  etanol  daun benalu  cengkeh  sebagai  sediaan  berbasis bahan  alam  yang  dapat  digunakan  sebagai agen kemopreventif antikanker.

## KONFLIK KEPENTINGAN
Semua penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan pada artikel ini.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Peneliti  mengucapkan  terimakasih kepada Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada  Masyarakat  STIKES  Nasional melalui  Hibah  Internal  tahun  2021  yang diberikan untuk penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Alali, F. Q., Liu, X.-X., & McLaughlin, J. L.
(1999). Annonaceous  Acetogenins: Recent  Progress . 62 (3),  504–540. https://doi.org/https://doi.org/10.1021 /np980406d
Ang,  H.  Y.,  Subramani,  T.,  Yeap,  S.  K., Omar, A. R., Ho, W. Y., Abdullah, M.
P., & Alitheen, N. B. (2014). Immuno- modulatory effects of Potentilla indica and Dendrophthoe pentandra on mice splenocytes  and  thymocytes. Experi- mental  and  Therapeutic  Medicine ,
7 (6), 1733–1737.
https://doi.org/10.3892/etm.2014.165 7
Azwanida, N. (2015). A Review on the Ex- traction  Methods  Use  in  Medicinal Plants, Principle, Strength and Limita- tion. Medicinal  &  Aromatic  Plants , 04 (03), 3–8.
https://doi.org/10.4172/2167- 0412.1000196
Bézivin,  C.,  Tomasi,  S.,  Lohezic-Le Devehat, F., & Boustie, J. (2003). Cy- totoxic activity of some lichen extracts on  murine  and  human  cancer  cell lines.  In Phytomedicine (Vol.  10,  Is- sues 6–7, pp. 499–503). https://doi.org/10.1078/09447110332
2331458
Day,  R.  M.  and  Suzuki,  Y.  J.,  (2005)  Cell Proliferation,  reactive  oxygen  and Cellular  glutathione,  Vol  3;  425-442. https://doi.org/10.2203/dose-re- sponse.003.03.010 DeFilippis, R. A., Goodwin, E. C., Wu, L.,
&  DiMaio,  D.  (2003).  Endogenous Human  Papillomavirus  E6  and  E7 Proteins  Differentially  Regulate  Pro- liferation, Senescence, and Apoptosis in  HeLa  Cervical  Carcinoma  Cells.
Journal  of  Virology , 77 (2),  1551– 1563. https://doi.org/10.1128/jvi.77.2.1551- 1563.2003
Depkes RI. (2018). Kementerian Kesehatan Republik  Indonesia.  In Kementerian Kesehatan RI (p. 1).
Elsyana, V., Bintang, M., & Priosoeryanto, B. P. (2016). Cytotoxicity and antipro- liferative  activity  assay  of  clove mis- tletoe  (Dendrophthoe  pentandra  (L.) Miq.)  leaves  extracts. Advances  in Pharmacological Sciences , 2016 . https://doi.org/10.1155/2016/3242698
Endharti, A. T., Wahyuningtyas, T. E., Har- dini, Handono,  K.,  Widjajanto,  E., &
Permana,  S.  (2018).  Dendrophthoe pentandra  leaves  extract  promotes apoptotic effects of doxorubicin in hu- man breast cancer cell via modulation of  intracellular  calcium  and  survivin. Journal  of  Applied  Pharmaceutical Science , 8 (8), 039–043. https://doi.org/10.7324/JAPS.2018.88 06
Endharti, A. T., Wulandari, A., Listyana, A.,
Norahmawati,  E.,  &  Permana,  S. (2016).  Dendrophthoe  pentandra  (L.)
Miq  extract  effectively  inhibits  in- flammation, proliferation and induces p53  expression  on  colitis-associated colon  cancer. BMC  Complementary and Alternative Medicine , 16 (1), 1–8. https://doi.org/10.1186/s12906-016- 1345-0
Fitrilia,  T.  (2015).  Ekstrak  Daun  Benalu Cengkeh  (  Dendrophthoe  pentandra (L.)  Miq)  Sebagai  Agen  Antioksidan dan  Antidiabetes  Secara  In  Vitro.  In Sekolah Pascasarjana IPB .
Hanley C, Layne J, Punnoose A, Reddy KM,
Coombs  I,  et  al  (2008)  Preferential Killing  of  cancer  cells  and  activated human  T  cell  using  ZnO  nanoparti- cles, Nanotechnology 19:295103 Harborne,  J.  B.  (2006). Metode  Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan (cetakan 4). Bandung ITB
Bandung.
Ikawati, M., Wibowo, A. E., Sri, N., Octa,
U., & Adelina, R. (2008). Pemanfaatan  Benalu  Sebagai  Agen Antikanker. F akultas Farmasi
Universitas Gadjah Mada , May 2008 , 1–9.
Kamuhabwa,  A.,  Nshimo,  C.,  &  De  Witte, P.  (2000).  Cytotoxicity  of  some  me- dicinal  plant  extracts  used  in  Tanza- nian  traditional  medicine.  In Journal of Ethnopharmacology (Vol. 70, Issue
2, pp. 143–149).
https://doi.org/10.1016/S0378- 8741(99)00161-0
Katrin, Soemardji, A. A., Soeganda, A. G.,
&  Soediro,  I.  (2005).  Toksisitas  akut isolat fraksi n -hexana dan etanol daun
Dendrophthoe  pentandra  (  L  .)  Miq  .
yang mempunyai aktivitas imunostimulan  The  acute  toxicity  of isolates  from  n-hexane  and. Majalah Farmasi Indonesia , 16 (4), 227–231. Lamson,  D.  W.,  &  Brignall,  M.  S.  (2000). Antioxidants and cancer, part 3: quer- cetin. Alternative Medicine Review : A
Journal of Clinical Therapeutic , 5 (3), 196–208.
Lekal,  J.  A.,  &  Watuguly,  T.  (2017).
ANALISIS

## KANDUNGAN
FLAVONOID PADA TEH BENALU
( Dendropohtoe pentandra  ( L  .) Miq
.). Biopendix , 3 (2), 154–158. Markham,  K.  R.  (1988). markham (ITB (ed.)). ITB.
Meerloo, J. van, Kaspers, G. J. L., & Cloos, J. (2011). Cell Sensitivity Assays: The
MTT Assay. In Methods in Molecular Biology (Vol. 731). https://doi.org/10.1007/978-1-61779- 80-5_14 Mutiah, R., Listyana, A., & Suryadinata, A.
(2017). Aktivitas Antikanker Kombinasi Ekstrak Benalu Belimbing (Macrosolen cochinensis) dan Bawang Sabrang (Eleutherine palmifolia (L) Merr.) pada Sel Kanker Serviks  (SEL  HeLa). Traditional Medicine Journal , 22 (223), 146–152. Mutiah, R., Suryadinata, A., & Nurani, P. S. (2018).  UJI  SITOTOKSIK  KOM- BINASI CISPLATIN DENGAN
EKSTRAK ETANOL BENALU AL-
PUKAT ( Dendrophthoe pentandra ( L )  Miq  .)  PADA  SEL  HELA  dalam Roihatul Mutiah * , Arief Suryadinata ,  Prasasti  Swara  Nurani,    CYTO-
TOXIC EVALUATION OF CISPLA- TIN IN COMBINATION WITH ET.
Majalah  Kesehatan , 5 (September),
133–143.
National  Cancer  Institute.  Understanding
Cancer series. Diakses dari http://www.cancer.gov  18  Januari 2018
Sammar, M., Abu-Farich, B., Rayan, I., Fa- lah, M.,and Rayan, A., (2019) Corre- lation  between  cytotoxicity  in  cancer cells  and  free  radical-scavenging  ac- tivity: In vitro evaluation of 57 medic- inal  and  edible  plant  extracts. Oncol- ogy  Letters (Vol  18,  Issue  6  page  :
6563-
6571)https://doi.org/10.3892/ol.2019. 11054
Sudjana. (2003). Teknik regresi dan korelasi bagi para peneliti . Tarsito.
Trachootham  D,  Alexandre  J,  Huang  P (2009) Targeting cancer cells by ROS mediated mechanisms: a radical thera- peutic  approach, Nat  Rev  Drug  Dis- coverry , 8:579-591 WHO.  (2018). Ncd  Who  2018 .  Available from:https://www.who.int/health-top- ics/cancer#tab=tab_1
WHO.  (2019a).  Indonesia  Source  GLO- BOCAN  2018. International  Agency for Research on Cancer , 256 , 1–2. WHO.  (2019b). WHO  |  Cervical  cancer . Available from: https://www.who.int/cancer/preven- tion/diagnosis-screening/cervical- cancer/en/
Zhang, Y., De Stefano, R., Robine, M., Bu- telli, E., Bulling, K., Hill, L., Rejzek, M.,  Martin,  C.,  &  Schoonbeek,  H.  J.
(2015). Different reactive oxygen spe- cies  scavenging  properties  of  flavo- noids  determine  their  abilities  to  ex- tend  the  shelf  life  of  tomato. Plant Physiology , 169 (3), 1568–1583.
https://doi.org/10.1104/pp.15.00346