ISSN 2085-2916  e-ISSN 2337-3652 Tersedia daring http://jai.ipb.ac.id J. Agron. Indonesia, April 2018, 46(1):95-102 DOI: https://dx.doi.org/10.24831/jai.v46i1.12897
Pembentukan Buah dan Perkecambahan Tanaman Jarak Pagar pada Transformasi Langsung Melalui Jalur Tabung Polen
Fruit Set and Germination of Physic Nut on Direct Transformation via Pollen-Tube Pathway
Agus Zainudin 1,2 , Bambang Sapta Purwoko 3 *, Tri Joko Santoso 4 , Sintho Wahyuning Ardie 3 , dan Trikoesoemaningtyas 3
1 Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor 2 Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian-Peternakan, Universitas Muhammadiyah Malang, Malang 65144, Indonesia
3 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (Bogor Agricultural University), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
4 Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB Biogen) Jl. Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16111, Indonesia
Diterima 22 September 2016/Disetujui 27 September 2017

## ABSTRACT
The genetic transformation via pollen-tube pathway in jatropha is the first alternative method that was applied in this plant. The objective of the research was to study fruit set and germination of three genotypes of jatropha following direct transformations via pollen-tube pathways. The research was conducted during April 2014 until January 2015 at jatropa’s experimental field, Pasuruan, and at green house of ICABIOGRAD, Bogor. Three genotypes of jatropha i.e., IP3A, IP3P and JcUMM18 were used. In the first experiment, split plot design was used where 3 levels of DNA plasmid concentration as a main plot and 5 levels of stigma-drip time of DNA plasmid as a subplot. In the second experiment randomized block design was used with single factor consisting of 15 combinations of concentration and stigma-drip time of DNA plasmid as treatments and control. The results demonstrated that interaction between concentration and application time of DNA plasmid did not significantly affect fruit and seeds formation of three Jatropha genotypes. Combination of DNA plasmid concentration with time of stigma-drip had significant effect on seed germination rate of IP3A genotype, but not significant on the other variables. The concentration of 0.05-0.5 µg µL -1 and application time of DNA plasmid at 1-10 hours after pollination could be applied on jatropha genetic transformation via pollen-tube pathways.
Keywords: DNA plasmid, Jatropha curcas, pCAMBIA1301, pollen-tube, stigma-drip

## ABSTRAK
Transformasi genetik melalui jalur tabung polen pada jarak pagar adalah metode alternatif pertama yang diterapkan pada tanaman tersebut. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari pembuahan dan perkecambahan tiga genotipe tanaman jarak pagar pada transformasi secara langsung melalui jalur tabung polen. Penelitian dilaksanakan pada bulan April 2014 hingga Januari 2015 di kebun percobaan jarak pagar, Pasuruan, dan di rumah kaca BB Biogen, Bogor. Tiga genotipe jarak pagar digunakan yaitu IP3A, IP3P dan JCUMM18. Percobaan pertama disusun dalam rancangan petak terbagi. Tiga taraf konsentrasi DNA plasmid sebagai petak utama dan lima taraf waktu penerapan plasmid DNA sebagai anak petak. Percobaan kedua disusun dalam rancangan kelompok lengkap teracak faktor tunggal dengan 15 kombinasi perlakuan  konsentrasi  dengan  waktu  tetes  DNA  plasmid  dan  1  tanaman  kontrol.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa interaksi konsentrasi dan waktu pemberian DNA plasmid tidak berpengaruh nyata terhadap pembentukan buah dan biji tiga genotipe jarak pagar. Kombinasi konsentrasi dan waktu tetes DNA plasmid berpengaruh nyata terhadap saat berkecambahan genotipe IP3A, tetapi tidak berpengaruh nyata terhadap peubah-peubah lain pada perkecambahan ketiga genotipe jarak pagar.  Konsentrasi  DNA  plasmid  0.05-0.5  µg  µL -1 dan  waktu  penetesan  plasmid  1-10  jam  setelah  penyerbukan  dapat diterapkan pada transformasi genetik jarak pagar melalui jalur tabung polen.
Kata kunci: DNA plasmid, Jatropha curcas, pCAMBIA1301, stigma-drip, tabung polen

## PENDAHULUAN
Jarak  pagar  merupakan  tanaman  potensial  penghasil bahan  bakar  nabati  dengan  kandungan  minyak  35-45% yang  mudah  dikonversi  menjadi  biodiesel,  serta  sebagai tanaman pengendali erosi (Cholid, 2014) disamping dapat dimanfaatkan untuk keperluan bidang farmasi, kosmetik dan lainnya.  Karena  itu,  upaya  peningkatan  produksi  melalui perbaikan  genetik,  teknik  budidaya  dan  sistem  usaha  tani lainnya  perlu  terus  dilakukan.  Pengembangan  jarak  pagar sebagai  salah  satu  sumber  bahan  bakar  nabati  masih menghadapi banyak kendala antara lain belum tersedianya varietas yang berproduksi tinggi atau belum menguntungkan bagi petani (Ghosh dan Singh, 2011; Hartati et al., 2012), karena itu, upaya perbaikan genetik perlu terus dilakukan.
Perbaikan  genetik  tanaman  jarak  pagar  yang dikategorikan  sebagai  tanaman  menyerbuk  silang sudah  diupayakan  melalui  berbagai  metode  pemuliaan konvensional  maupun  non-konvensional.  Perbaikan genetik  jarak  pagar  juga  telah  berhasil  dilakukan  melalui pemanfaatan  bioteknologi  seperti  transformasi  genetik menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens antara lain transformasi genetik dengan gen JcFAD2-1 (Qu et al ., 2012), gen PaCS (Tistama, 2012) dan gen Cry 1Ab/1Ac (Gu et al ., 2014) maupun gen-gen lain. Transformasi genetik jarak  pagar  dengan  metode  yang  ada  masih  menghadapi kendala  yaitu  rendahnya  persentase  keberhasilan memperoleh tanaman transgenik dewasa akibat rendahnya keberhasilan pengakaran pada perbanyakan in vitro (Pan et al .,  2010; Tistama,  2012).  Diperlukan  kajian  transformasi genetik  menggunakan  metode  alternatif  untuk  mengatasi hambatan  tersebut  seperti  penerapan  metode  transformasi genetik  secara  langsung  pada  tingkat in  vivo dengan memanfaatkan jalur tabung polen.  Penerapan transformasi genetik  melalui  jalur  tabung  polen  juga  telah  dibuktikan keberhasilan dan efektifitasnya pada tanaman padi (Luo dan Wu, 1988), sorghum (Wang et al ., 2007), gandum (Zale et al ., 2009), jagung (Yang et al ., 2009; Wang et al ., 2012), kapas  (Zhang et  al .,  2009;  Chen et  al .,  2010;  Bibi et  al ., 2013), kedelai (Yang et al ., 2011), serta berhasil diterapkan untuk meningkatkan keberhasilan hibridisasi antara gandum dan sorgum (Zhang et al ., 2012), tetapi penerapan metode tersebut pada tanaman jarak pagar belum dilaporkan.
Tujuan penelitian ini adalah mempelajari pembentukan buah  dan  perkecambahan  tiga  genotipe  tanaman  jarak pagar  hasil  perlakuan  konsentrasi  dan  waktu  penetesan DNA plasmid pada penerapan metode transformasi secara langsung melalui jalur tabung polen.

## BAHAN DAN METODE
Pembentukan  Buah  dan  Biji  Tanaman  Jarak  Pagar pada  Transformasi  Langsung  Menggunakan  Plasmid pCAMBIA1301
Percobaan  tahap  pertama  ini  bertujuan  untuk memperoleh  informasi  keberhasilan  pembentukan  buah dan  biji  hasil  penerapan  transformasi  langsung  pada  tiga
genotipe  tanaman  jarak  pagar  melalui  jalur  tabung  polen dengan  perlakuan  konsentrasi  dan  waktu  penetesan  DNA plasmid pCAMBIA1301. Penelitian ini dilakukan di lahan percobaan jarak pagar Desa Kedungpengaron, Kecamatan Kejayan,  Kabupaten  Pasuruan  pada  bulan  April  hingga Oktober 2014. Tanaman yang digunakan dalam pengujian adalah  genotipe  IP3A,  IP3P  dan  JcUMM18  yang  sudah berumur  sekitar  3  tahun.  Plasmid  yang  digunakan  adalah pCAMBIA1301 berukuran 11,837 pb yang membawa gen β- glucuronidase ( gus ) pengendali terbentuknya warna kebiruan saat  bereaksi  dengan  senyawa  X-Gluc  dan  hygromycin- phosphotransferase  ( hptII )  pengendali  ketahanan  terhadap antibiotik  higromisin  dengan  promotor  CaMV  35S.  DNA plasmid  yang  sudah  diketahui  konsentrasinya  (0.8532  µg µL -1 )  menggunakan  perangkat  Nanodrop  dilarutkan  ke dalam aquades steril untuk mendapatkan konsentrasi sesuai perlakuan.
Rancangan  yang  digunakan  adalah  rancangan  petak terbagi dengan 3 ulangan. Petak utama berupa konsentrasi DNA plasmid yang  terdiri  atas 3  taraf,  yaitu  0.05; 0.25 dan 0.50 μg μL -1 (Daud et al ., 2009; Bibi et al ., 2013); dan anak petak  berupa  waktu  penetesan  DNA  plasmid  pada  kepala putik  ( stigma-drip )  terdiri  atas  5  taraf,  yaitu  W1=  1  jam, W2= 2 jam, W3= 4 jam, W4= 7 jam, dan W5= 10 jam setelah penyerbukan  (Wang  dan  Ding,  2012).  Berdasarkan  dua faktor perlakuan tersebut diperoleh sebanyak 15 kombinasi perlakuan dan 45 unit percobaan pada tiap genotipe dari tiga genotipe yang diujikan. Jumlah sampel tiap unit percobaan adalah 10 bunga.
Proses  pelaksanaan  transformasi  secara  langsung melalui  jalur  polen  diawali  dengan  penyerbukan  bunga betina  tanaman  jarak  pagar  dengan  serbuk  sari  dari genotipe yang sama. Penyerbukan secara manual dilakukan pada  pukul  06.30-07.00  WIB,  dilanjut  dengan  pelabelan sesuai  perlakuan  masing-masing.  Kepala  putik  yang sudah  diserbuki  ditandai  dengan  adanya  serbuk  sari  yang menempel merata pada permukaannya ditetesi 2 µL DNA plasmid  (Shan et  al .,  2012)  sesuai  perlakuan  konsentrasi dan waktu pemberiannya.
Pengamatan  dilakukan  terhadap  beberapa  peubah yang meliputi: umur panen tiap buah, jumlah buah berbiji normal,  ukuran  diameter  dan  panjang  tiap  buah,  jumlah biji normal yang terbentuk tiap buah, bobot biji kering tiap buah, dan bobot tiap biji.  Data yang diperoleh dianalisis dengan uji F taraf 5% dan 1%, jika menunjukkan pengaruh nyata dilanjutkan uji jarak berganda Duncan taraf 5%.
Perkecambahan  Benih  Jarak  Pagar  Generasi  T0  Hasil Transformasi Langsung melalui Jalur Tabung Polen
Percobaan tahap kedua ini bertujuan untuk memperoleh informasi  pengaruh  konsentrasi  dan  waktu  penetesan plasmid  pada  proses  transformasi  langsung  melalui  jalur tabung polen terhadap perkecambahan benih tiga genotipe jarak pagar generasi T0.
Bahan tanam yang digunakan berupa benih tanaman jarak pagar generasi T0 (benih yang dihasilkan dari bunga dengan  perlakuan  penetesan  DNA  plasmid)  dan  benih
kontrol (benih yang dihasilkan dari bunga tanpa perlakuan penetesan  DNA  plasmid)  dari  genotipe  IP3A,  IP3P,  dan JcUMM18  hasil  percobaan  tahap  pertama.  Penelitian dilakukan di dalam rumah kaca Fasilitas Uji Terbatas Balai Besar  Litbang  Bioteknologi  dan  Sumberdaya  Genetik Pertanian Bogor pada bulan November 2014 hingga Januari 2015.  Pelaksanaan  pengujian  menggunakan  rancangan kelompok  lengkap  teracak  (RKLT)  faktor  tunggal  dengan 16 taraf perlakuan, yaitu 1 kontrol (benih asal tanaman tanpa perlakuan transformasi) dan 15 kombinasi konsentrasi DNA plasmid  0.05,  0.25,  dan  0.50  µg  µL -1 dengan  waktu  tetes 1, 2, 4, 7, dan 10 jam setelah penyerbukan. Tiap perlakuan diulang 3 kali sehingga terdapat 48 unit percobaan. Jumlah benih yang disemai tiap perlakuan (Tabel 4) sesuai jumlah benih yang diperoleh masing-masing unit pada percobaan sebelumnya.
Peubah pengamatan meliputi: saat benih berkecambah dan  persentase  benih  tumbuh  (dihitung  berdasarkan jumlah  benih  yang  tumbuh  dibagi  jumlah  benih  yang disemai  dikalikan  100%).  Data  persentase  benih  tumbuh ditransformasi  dengan  log(x+1)  sebelum  dianalisis.  Data yang diperoleh dianalisis dengan uji F taraf 5% dan 1%, jika menunjukkan pengaruh nyata dilanjutkan uji jarak berganda Duncan taraf 5%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembentukan  Buah  dan  Biji  Tanaman  Jarak  Pagar pada  Transformasi  Langsung  Menggunakan  Plasmid pCAMBIA1301
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  interaksi perlakuan  konsentrasi  dan  waktu  penetesan  DNA plasmid pada kepala putik yang diberikan dengan metode transformasi  langsung  melalui  jalur  tabung  polen  tidak berpengaruh  nyata  terhadap  umur  panen,  jumlah  dan persentase buah yang dipanen, diameter dan panjang buah, jumlah biji per buah, bobot biji per buah serta bobot tiap
biji jarak pagar genotipe IP3A, IP3P, dan JcUMM18. Akan tetapi,  perlakuan  konsentrasi  DNA  plasmid  berpengaruh nyata terhadap persentase buah panen genotipe JcUMM18, sedangkan perlakuan waktu tetes DNA plasmid berpengaruh nyata  terhadap  persentase  buah  panen  dan  bobot  biji  per buah genotipe IP3A serta panjang buah genotipe JcUMM18 (Tabel 1, 2,  dan 3).
Keberhasilan  reproduksi  tanaman  jarak  pagar dipengaruhi beberapa faktor antara lain: keguguran bunga betina, pembentukan biji yang relatif rendah, fertilitas bunga betina rendah, sangat jarangnya penyerbukan sendiri karena sifat  berkelamin  tunggal,  keberadaan  faktor  penyerbuk, tertundanya  periode  reseptif  stigma,  dan  diferensiasi morfologi  stigma  reseptif  untuk  penerimaan  serbuk  sari yang  tepat  (Bhattacharya et  al .,  2005).  Perbedaan  tipe penyerbukan  juga  tidak  menyebabkan  perbedaan  pada keberhasilan pembentukan buah jarak pagar (Abdelgadir et al ., 2012). Umur  panen  buah  jarak  pagar  genotipe  IP3A,  IP3P dan  JcUMM18  pada  penelitian  transformasi  ini  berturut- turut  berkisar  antara  51.9-54.7,  48.2-53.4,  dan  52.5-59.0 hari  setelah  penyerbukan  (Tabel  1).  Umur  panen  tersebut relatif  sama  dengan  yang  dilaporkan  peneliti  jarak  pagar lain  yaitu  40-50  hari  setelah  pembuahan  (Hasnam,  2006) atau  rata-rata  48.2  hari  setelah  pembuahan  (Pranesh et al .,  2010).    Hal  tersebut  membuktikan  bahwa  perlakuan penetesan  DNA  plasmid  pada  kepala  putik  yang  sudah diserbuki  pada  penerapan  metode  transformasi  langsung melalui  jalur  tabung  polen  tidak  mengganggu  proses pembuahan sehingga buah jarak pagar dapat terbentuk dan dipanen pada kisaran umur panen yang relatif sama dengan umur panen buah jarak pagar tanpa perlakuan transformasi yang dilaporkan beberapa peneliti lain.
Konsentrasi DNA plasmid 0.50 µg µL -1 menyebabkan persentase  buah  panen  paling  banyak  yaitu  82.0%  pada genotipe  JcUMM.  Waktu  petetesan  DNA  plasmid  pada  7 dan 10 jam dari saat penyerbukan menyebabkan persentase buah panen genotipe IP3A yang lebih banyak, yaitu 87.8 dan
Konsentrasi plasmid (µg µL -1 ) Umur panen (HSP) Persentase buah (%) IP3A IP3P JcUMM18 IP3A IP3P JcUMM18 0.05 53.8 50.4 55.1 73.3 71.3 68.7b 0.25 52.8 49.6 55.4 70.0 68.0 75.3ab 0.50 52.7 51.9 52.7 72.7 68.0 82.0a Waktu (JSP) 1 52.0 51.1 53.3 73.3ab 72.2 78.9 2 54.7 51.6 54.5 53.3b 65.6 71.1 4 51.9 48.9 52.5 70.0ab 68.9 72.2 7 53.4 53.4 59.0 87.8a 77.8 78.9 10 53.6 48.2 52.9 75.6a 61.1 75.6
Tabel  1. Umur panen dan persentase buah tanaman jarak pagar genotipe IP3A, IP3P dan JcUMM18 pada transformasi langsung melalui jalur tabung polen dengan perlakuan konsentrasi dan waktu tetes plasmid pCAMBIA1301
Keterangan: Angka-angka dengan notasi sama pada masing-masing peubah, genotipe dan perlakuan menunjukkan tidak nyata perbedaannya berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05; JSP = jam setelah penyerbukan; HSP = hari setelah penyerbukan
75.6% dibandingkan pada waktu penetesan lainnya (Tabel 1).  Meskipun  demikian,  kisaran  persentase  buah  panen antara  53.3-87.8%  pada  penelitian  transformasi  melalui jalur tabung polen ini dibandingkan beberapa penelitian lain yang  bukan  transformasi  menunjukkan  bahwa  perlakuan transformasi melalui jalur tabung polen tidak berpengaruh negatif  terhadap  pembuahan  jarak  pagar  IP3A,  IP3P,  dan JcUMM18.  Divakara et  al .  (2009)  pada  penelitian  bukan transformasi  menjelaskan  bahwa  persentase  pembentukan buah jarak pagar akibat penyerbukan sendiri secara buatan, penyerbukan  silang  buatan  dan  penyerbukan  silang  alami secara berurutan adalah 87.9%, 86.7%, dan 76.4%.
Perlakuan  konsentrasi  dan  waktu  penetesan  DNA plasmid  pada  penerapan  metode  transformasi  langsung melalui jalur tabung polen ini tidak menyebabkan perbedaan nyata terhadap ukuran buah yang dipanen, kecuali panjang buah  jarak  pagar  genotipe  JcUMM18  pada  perlakuan waktu tetes DNA plasmid (Tabel 2). Buah terpanjang (2.88 cm)  diperoleh  pada  perlakuan  waktu  tetes  1  jam  setelah penyerbukan pada JcUMM18. Kisaran diameter (2.38-2.70 cm)  dan  panjang  buah  (2.50-2.88  cm)  jarak  pagar  pada penelitian ini relatif sama dengan ukuran buah jarak yang dilaporkan  beberapa  peneliti  lain  yang  tidak  menerapkan transformasi  genetik.  Ukuran  buah  30  aksesi  jarak  pagar dari  Indonesia  dan  beberapa  negara  lain  yang  dilaporkan Surahman et al . (2009) yakni berkisar antara 2.5-3.0 cm atau rata-rata 2.76 cm.  Ye et al . (2009) juga melaporkan bahwa buah jarak pagar yang diamati di Cina mencapai lebar 2.5- 3.0 cm dan panjang 3-4 cm. Perbedaan ukuran buah tersebut lebih banyak dipengaruhi oleh perbedaan genotipe.
Perlakuan konsentrasi dan waktu tetes plasmid pada transformasi langsung melalui jalur tabung polen juga tidak berpengaruh nyata terhadap jumlah biji per buah, bobot biji per  buah  serta  bobot  tiap  biji  jarak  pagar  genotipe  IP3A, IP3P, dan JcUMM18, kecuali perlakuan waktu tetes plasmid terhadap  bobot  biji  per  buah  genotipe  IP3A.  Waktu  tetes plasmid 2 dan 10 jam dari saat penyerbukan menyebabkan bobot biji per buah IP3A yang lebih berat, yaitu 1.45 dan
1.47 g (Tabel 3). Kisaran jumlah biji, bobot biji per buah dan bobot tiap biji dari genotipe IP3A, IP3P, dan JcUMM18 pada penelitian ini relatif sama dengan kisaran ukuran dan bobot  biji  beberapa  genotipe  lain  pada  penelitian  bukan transformasi  (Achten et  al .,  2010;  Negussie et  al .,  2013; Nietsche et al .,  2014; Novita et al .,  2014; Parwata et al ., 2014;  Surahman et  al .,  2009).  Perbedaan  jumlah,  ukuran dan bobot biji tersebut dipengaruhi oleh perbedaan genotipe, sedangkan  perlakuan  transformasi  melalui  jalur  tabung polen tidak berpengaruh nyata.
Perkecambahan  Benih  Jarak  Pagar  Hasil  Perlakuan Penetesan DNA Plasmid di Kepala Putik pada Penerapan Metode Transformasi Langsung
Kemampuan berkecambah benih tanaman jarak pagar bervariasi diantara morfotipe, dengan kata lain faktor genetik banyak  mempengaruhi  perkecambahan  tersebut  meskipun faktor  lingkungan  juga  berperan  (Padonou et  al .,  2014). Penetesan DNA plasmid pada kepala putik yang diterapkan di metode transformasi langsung melalui jalur tabung polen tidak  berpengaruh  nyata  terhadap  hampir  semua  peubah perkecambahan tanaman jarak pagar genotipe IP3A, IP3P, dan  JcUMM18  kecuali  saat  berkecambah  pada  genotipe IP3A  (Tabel  3).  Saat  berkecambah  benih  genotipe  IP3A paling lama yaitu 11.6 hari setelah semai ditemukan pada benih yang diperoleh dari perlakuan penetesan DNA plasmid pCAMBIA1301 konsentrasi 0.5 µg µL -1 dengan waktu tetes 7 jam setelah penyerbukan. Hal tersebut bisa terjadi karena viabilitas benihnya rendah akibat perubahan metabolisme di dalam benih tersebut (Moncaleano-Escandon et al ., 2013). Perubahan  metabolisme  mungkin  terjadi  akibat  terjadinya penyisipan gen asing pada area fungsional genom tanaman. Berkenaan  dengan  tujuan  pemuliaan,  idealnya  tanaman transgenik  berisi  satu  salinan  utuh  dari  transgen  yang diinginkan yang tersisipkan ke dalam area non fungsional dari  genom  tanaman,  tanpa  perubahan  lebih  lanjut  dari DNA tanaman target. Namun, dengan menggunakan teknik
Konsentrasi plasmid (µg µL -1 ) Diameter buah (cm) Panjang buah (cm) IP3A IP3P JcUMM18 IP3A IP3P JcUMM18 0.05 2.51 2.42 2.68 2.66 2.56 2.79 0.25 2.54 2.45 2.70 2.71 2.74 2.80 0.50 2.51 2.43 2.65 2.72 2.57 2.77 Waktu (JSP) 1 2.58 2.48 2.75 2.77 2.65 2.88a 2 2.56 2.44 2.66 2.69 2.83 2.78abc 4 2.51 2.38 2.64 2.68 2.50 2.69c 7 2.39 2.45 2.67 2.59 2.57 2.85ab 10 2.57 2.39 2.66 2.75 2.56 2.74bc
Tabel 2. Diameter buah dan panjang buah tanaman jarak pagar genotipe IP3A,  IP3P dan JcUMM18 pada transformasi langsung melalui jalur tabung polen dengan perlakuan konsentrasi dan waktu tetes plasmid pCAMBIA1301
Keterangan: Angka-angka dengan notasi sama pada masing-masing peubah, genotipe dan perlakuan menunjukkan tidak nyata perbedaannya berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05; JSP = jam setelah penyerbukan
transformasi tanaman saat ini, situs penyisipan transgen tidak terjadi secara acak. Penyisipan T-DNA pada area fungsional dari  genom  tanaman  dapat  mengganggu  atau  mengubah fungsi atau ekspresi gen yang terlibat dalam semua aspek
biologi tanaman target (Wilson et al ., 2006). Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa saat berkecambah benih jarak pagar hasil perlakuan transformasi langsung ini tidak selalu konsisten  dipengaruhi  oleh  kombinasi  konsentrasi  dengan
Konsentrasi (µg µL -1 ) Jumlah biji per buah Bobot biji per buah (g) Bobot tiap biji (g) IP3A IP3P JcUMM18 IP3A IP3P JcUMM18 IP3A IP3P JcUMM18 0.05 2.3 2.3 2.4 1.31 1.31 1.51 0.56 0.57 0.64 0.25 2.4 2.4 2.5 1.38 1.31 1.56 0.58 0.55 0.64 0.50 2.4 2.4 2.5 1.41 1.35 1.46 0.62 0.58 0.61 Waktu (JSP) 1 2.3 2.3 2.6 1.35ab 1.32 1.61 0.56 0.58 0.63 2 2.5 2.3 2.4 1.45a 1.24 1.52 0.6 0.56 0.63 4 2.3 2.5 2.5 1.38ab 1.37 1.39 0.59 0.53 0.58 7 2.3 2.3 2.4 1.18b 1.33 1.65 0.57 0.56 0.72 10 2.4 2.4 2.4 1.47a 1.37 1.37 0.62 0.58 0.59
Tabel  3. Jumlah biji per buah, bobot biji per buah dan bobot tiap biji tanaman jarak pagar genotipe IP3A, IP3P dan JcUMM18 pada  transformasi  langsung  melalui  jalur  tabung  polen  dengan  perlakuan  konsentrasi  dan  waktu  tetes  plasmid pCAMBIA1301
Keterangan:  Angka-angka  dengan  notasi  sama  pada  masing-masing  peubah  dan  perlakuan  menunjukkan  tidak  nyata  perbedaannya berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05;  JSP = jam setelah penyerbukan
Perlakuan Jumlah benih disemai Saat berkecambah (HSS) Persentase tumbuh (%) tr IP3A IP3P JcUMM18 IP3A IP3P JcUMM18 IP3A IP3P JcUMM18 Kontrol 20.7 21.7 21.0 7.5b 10.0 8.6 56.7 41.2 67.1 K1W1 18.7 19.0 20.0 8.8b 9.0 9.9 49.8 62.6 70.5 K1W2 19.3 17.0 15.0 8.5b 8.5 9.3 34.6 70.9 61.3 K1W3 19.0 17.0 14.0 8.1b 8.1 9.7 78.9 56.8 60.2 K1W4 16.0 22.3 15.3 9.2b 7.6 8.9 68.0 66.0 74.2 K1W5 20.0 18.3 15.7 8.0b 8.3 11.1 76.0 60.8 53.3 K2W1 15.0 15.7 15.3 8.1b 8.3 8.3 81.1 61.3 66.3 K2W2 19.7 18.3 19.3 7.5b 7.6 8.9 57.6 58.7 80.7 K2W3 15.7 16.0 15.3 8.8b 8.5 8.7 64.1 46.0 78.8 K2W4 18.3 19.7 19.0 7.8b 7.8 7.9 85.2 68.9 71.7 K2W5 20.0 22.0 17.0 7.6b 8.6 9.4 65.8 52.2 53.9 K3W1 19.7 16.0 19.3 8.2b 7.3 9.4 65.3 80.2 57.9 K3W2 19.7 19.0 16.0 7.5b 8.7 11.0 62.5 90.5 63.4 K3W3 19.7 19.3 18.3 8.5b 8.4 8.5 56.0 63.7 53.4 K3W4 21.7 19.0 16.0 11.6a 7.9 7.9 26.7 89.6 89.8 K3W5 14.3 18.0 22.0 8.0b 9.1 8.4 76.7 63.3 55.5
Tabel 4. Jumlah benih disemai, saat berkecambah dan persentase tumbuh tanaman jarak pagar IP3A, IP3P dan JcUMM18 pada transformasi langsung melalui jalur tabung polen
Keterangan: Angka-angka dengan notasi yang sama pada masing-masing peubah menunjukkan tidak nyata perbedaanya berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05;  HSS = hari setelah disemai; tr = analisis terhadap data yang ditransformasi dengan log(x+1); Kontrol  =  benih  asal  tanaman  tanpa  perlakuan,  K1  =  pCAMBIA1301  konsentrasi  0.05  µg  µL -1 ,  K2  =  pCAMBIA1301 konsentrasi 0.25 µg µL -1 , K3 = pCAMBIA1301 konsentrasi 0.50 µg µL -1 , W1 = penetesan 1 jam setelah penyerbukan, W2 = penetesan 2 jam setelah penyerbukan, W3 = penetesan 4 jam setelah penyerbukan, W4 = penetesan 7 jam setelah penyerbukan, W5 = penetesan 10 jam setelah penyerbukan
waktu penetesan DNA plasmid. Konsentrasi DNA plasmid yang lebih pekat dengan waktu penetesan yang lebih lama dari saat penyerbukan tidak selalu menyebabkan benih yang diperoleh  berkecambah  lebih  cepat  maupun  lebih  lambat (Tabel 4).
Jumlah  benih  yang  disemai,  saat  berkecambah, jumlah benih tumbuh dan persentase benih tumbuh tanaman jarak pagar hasil perlakuan penetesan DNA plasmid pada penerapan  metode  transformasi  langsung  (benih  generasi T0) dalam penelitian ini relatif sama dengan benih kontrol
(benih yang dihasilkan dari bunga tanpa perlakuan penetesan DNA  plasmid)  pada  masing-masing  genotipe  IPA3,  IP3P, dan  JcUMM18.  Keragaan  morfologi  kecambah  benih generasi T0 genotipe IP3A, IP3P, dan JcUMM18 juga relatif sama  dibanding  dengan  kontrol  masing-masing  (Gambar 1). Hasil tersebut relatif sama dengan laporan peneliti lain bahwa persentase dan saat berkecambah benih jarak pagar non  transgenik  berturut-turut  65.3%  dan  5.5  hari  setelah semai (Moncaleano-Escandon et al. , 2013). Perkecambahan pada  kondisi  lingkungan  yang  terkontrol  dari  beberapa
1 A B C D I F G E H J K L
Gambar 1. Bibit jarak pagar generasi T0 hasil perlakuan konsentrasi dan waktu tetes DNA plasmid pada penerapan transformasi langsung melalui jalur tabung polen. A = jarak pagar tanpa perlakuan (kontrol); B-F = bibit jarak pagar T0 hasil perlakuan penetesan DNA plasmid pada waktu 1, 2, 4, 7, 10 jam setelah penyerbukan; G-I = bibit jarak pagar T0 hasil perlakuan penetesan DNA plasmid konsentrasi 0.05,  0.25, 0.5 µg µL -1 ; J-L = bibit jarak pagar IP3A, IP3P, JCUMM18 generasi T0 hasil perlakuan penetesan DNA plasmid pada konsentrasi dan waktu yang sama
morfotipe  jarak  pagar  berkisar  50-89%.  Hal  tersebut membuktikan bahwa perbedaan perkecambahan benih jarak pagar dipengaruhi oleh vigor benih masing-masing genotipe (Padonou et al ., 2014).

## KESIMPULAN
Interaksi  antara  perlakuan  konsentrasi  dan  waktu tetes  DNA  plasmid  pCAMBIA1301  pada  transformasi langsung  melalui  jalur  tabung  polen  tidak  berpengaruh nyata  terhadap  pembentukan  buah  dan  biji  tanaman  jarak pagar genotipe IP3A, IP3P, dan JcUMM18. Pengaruh nyata hanya ditemukan pada perlakuan konsentrasi DNA plasmid terhadap  persentase  buah  panen  JcUMM18,  perlakuan waktu  tetes  DNA  plasmid  terhadap  persentase  buah panen  dan  bobot  biji  per  buah  IP3A,  serta  panjang  buah JcUMM18. Perlakuan kombinasi konsentrasi dengan waktu penetesan DNA plasmid tidak berpengaruh nyata terhadap hampir semua peubah perkecambahan yang diamati, kecuali terhadap saat berkecambah IP3A. Konsentrasi DNA plasmid 0.05-0.5  µg  µL -1 dan  waktu  penetesan  1-10  jam  setelah penyerbukan  dapat  diterapkan  pada  transformasi  genetik tanaman jarak pagar melalui jalur tabung polen.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada DIKTI yang telah memberikan Beasiswa BPPS (BPP-DN) Tahun 2012- 2014  serta  BB  Biogen  atas  penyediaan  bahan,  peralatan, laboratorium molekuler dan fasilitas LUT.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdelgadir,  H.A.,  S.D.  Johnson,  J.  Van  Staden.  2012. Pollen viability, pollen germination and pollen tube growth  in  the  biofuel  seed  crop Jatropha  curcas (Euphorbiaceae). South African J. Bot. 79:132-139.
Achten,  W.M.J.,  L.R.  Nielsen,  R.  Aerts,  A.G.  Lengkeek, E.D. Kjær, A. Trabucco, J.K. Hansen, W.H. Maes, L. Graudal,  F.K. Akinnifesi,  B.  Muys.  2010.  Towards domestication  of Jatropha  curcas .  Biofuels  1:91- 107.
Bhattacharya, A., K. Datta, S.K. Datta. 2005. Floral biology, floral resource constraints and pollination limitation in Jatropha curcas L. Pak. J. Bio. Sci. 8:456-60.
Bibi, N., K. Fan, S. Yuan, M. Ni, I.M. Ahmed, W. Malik, X. Wang. 2013. An efficient and highly reproducible approach for the selection of upland transgenic cotton produced by pollen tube pathway method. Austr. J. Crop Sci. 7:1714-1722.
Chen, T., S. Wu, J. Zhao, W. Guo, T. Zhang. 2010. Pistil drip  following  pollination:  A  simple  in  planta Agrobacterium-mediated  transformation  in  cotton. Biotech. Lett. 32:547-555.
Cholid, M. 2014. Potensi jarak pagar ( Jatropha curcas L.) sebagai  tanaman  pengendali  erosi.  Info-Tekbun.
6:25-28.
Daud, M.K., M.T. Variath, S. Ali, M. Jamil, M.T. Khan, M. Shafi, S. Zhu. 2009. Genetic transformation of Bar gene and its inheritance and segregation behavior in the resultant transgenic cotton germplasm (BR001). Pak. J. Bot. 41:2167-2178.
Divakara, B.N., H.D. Upadhyaya, S.P. Wani, C.L.L Gowda. 2009. Biology and genetic improvement of Jatropha curcas L.: A review. Appl. Energy 87:732-742.
Ghosh, L., L. Singh, 2011. Variation in seed and seedling characters of Jatropha curcas L with varying zones and provenances. Trop. Ecol. 52:113-122.
Gu,  K.,  H.  Mao,  Z.  Yin.  2014.  Production  of  marker- free  transgenic Jatropha  curcas expressing  hybrid Bacillus  thuringiensis δ-endotoxin  Cry1Ab/1Ac for  resistance  to  larvae  of  tortrix  moth  ( Archips micaceanus ). Biotech. for Biofuels 7:1-9.
Hartati, R.R.S, A. Setiawan, B. Heliyanto, Sudarsono. 2012.
Keragaman genetik, heritabilitas, dan korelasi antar karakter  10  genotipe  terpilih  jarak  pagar  ( Jatropha curcas L.). J. Littri 18:74-80.
Hasnam.  2006.  Variasi Jatropha  curcas L.  Infotek  Jarak Pagar 1:5-8.
Luo,  Z.X.,  R.  Wu.  1988.  A  simple  method  for  the transformation of rice via the pollen tube pathway. Plant Mol. Bio. Rep. 6: 165-174.
Moncaleano-Escandon, J., B.C.F. Silva, S.R.S. Silva, J.A.A Granjab,  M.C.J.L.  Alvesc,  M.F.  Pompellib.  2013. Germination responses of Jatropha curcas L. seeds to  storage  and  aging.  Industrial  Crops  and  Prod . 44:684-690.
Negussie, A., W.M.J. Achten, H.A.F. Verboven, M. Hermy,
B. Muys. 2013. Floral display and effects of natural and  artificial  pollination  on  fruiting  and  seed  yield of the tropical biofuel crop Jatropha curcas L. GCB. Bioenergy 1:1-9.
Nietsche, S., W.A. Vendrame, J.H. Crane, M.C.T. Pereira. 2014. Assessment of reproductive characteristics of Jatropha curcas L. in south Florida. GCB. Bioenergy 6:351-359.
Novita,  L.,  N.  Haska,  M.  Surahman,  Y.  Wahyu.  2014. Pendugaan  parameter  genetik  karakter  morfo- agronomi  dan  seleksi  genotipe  untuk  perbaikan genetik jarak pagar. J. Agron. Indonesia 42:236-243.
Padonou, E.A., B. Kassa, A.E. Assogbadjo, B. Fandohan,
S. Chakeredza, R.G. Kakaï, B. Sinsin. 2014. Natural variation in fruit characteristics and seed germination of Jatropha curcas in Benin,West Africa. J. Hort. Sci. Biotech . 89:69-73.
Pan, J., Q. Fu, ZF. Xu. 2010. Agrobacterium tumefaciens - mediated  transformation  of  biofuel  plant Jatropha curcas using kanamycin selection. African J. Biotech.
9:6477-6481.
Parwata,  I.G.M.A.,  D.  Indradewa,  P.  Yudono,  B.D.
Kertonegoro,  R.  Kusmarwiyah.  2014.  Respon pertumbuhan dan hasil tanaman jarak pagar ( Jatropha curcas L.)  terhadap  cekaman  kekeringan  di  lahan pasir  pantai  pada  tahun  pertama  siklus  produksi.  J. Agron. Indonesia 42:59-65.
Pranesh,  K.J.,  M.R.G.  Rao,  H.C.  Sowmya,  B.  Gowda, D.L.  Savithramma,  N.L.  Naveen.  2010.  Studies  on floral display and mode of reproduction in jatropha ( Jatropha  curcas L.).  Electronic  J.  Plant  Breed . 1:832-838.
Qu, J., H.Z. Mao, W. Chen, S.Q. Gao, Y.N. Bai, Y.W. Sun, Y.F. Geng, J. Ye. 2012. Development of marker-free transgenic  Jatropha  plants  with  increased  levels  of seed oleic acid. Biotech. Biofuels 5:1-11.
Shan, W., C. Zhao, J. Fan, H. Cong, S. Liang, X. Yu. 2012. Antisense  suppression  of  alcohol  acetyltransferase gene  in  ripening  melon  fruit  alters  volatile composition. Sci. Hort. 139:96-101.
Surahman, M., E. Santosa, F.N. Nisya. 2009. Karakterisasi dan  analisis  gerombol  plasma  nutfah  jarak  pagar Indonesia  dan  beberapa  negara  lain  menggunakan marka morfologi dan molekuler. J. Agron. Indonesia 37:256-264.
Tistama, R. 2012. Isolasi dan introduksi gen sitrat sintase dari Pseudomonas  aeruginosa ke  dalam  tanaman untuk  meningkatkan  toleransi  terhadap  cekaman aluminium. Disertasi. Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Wang, W.,  J. Wang,  C. Yang, Y.  Li,  L.  Liu,  J.  Xu.  2007. Pollen-mediated transformation of Sorghum bicolor plants. Biotechnol. Appl. Biochem. 48:79-83.
Wang, X., B. Liu, C. Huang, X. Zhang, C. Luo, X. Cheng, R.  Yu,  Z.  Wu.  2012.  Over  expression  of Zmda1-1 gene increases seed mass of corn. African J. Biotech. 11:13387-13395.
Wang,  X.R.,  G.J.  Ding.  2012.  Reproductive  biology characteristic  of Jatropha  curcas (Euphorbiaceae). Rev. Biol. Trop. 60:1525-1533.
Wilson,  A.K.,  J.R.  Latham,  R.A.  Steinbrecher.  2006. Tansformation-induced  mutations  in  transgenic plants: Analysis and biosafety implications. Biotech. Genet. Engineering Rev. 23:209-234.
Yang, A., Q. Su, L. An. 2009. Ovary-drip transformation: A simple method for directly generating vector- and marker-free transgenic maize ( Zea mays L.) with a linear GFP cassette transformation. Planta 229:793- 801.
Yang. S., G. Li, M. Li, J. Wang. 2011. Transgenic soybean with low phytate content constructed by agrobacterium transformation  and  pollen-tube  pathway.  Euphytica 177:375-382.
Ye,  M.,  C.  Li,  G.  Francis,  H.P.S.  Makkar.  2009.  Current situation  and  prospects  of Jatropha  curcas as  a multipurpose tree in China. Agroforest. Syst. 76:487- 497.
Zale, J.M., S. Agarwal, S. Loar, C.M. Steber. 2009. Evidence for  stable  transformation  of  wheat  by  floral  dip  in Agrobacterium tumefaciens . Plant Cell Rep. 28:903- 913.
Zhang, H., F. Zhao, Y. Zhao, C. Guo, C. Li, K. Xiao. 2009. Establishment  of  transgenic  cotton  lines  with  high efficiency  via  pollen-tube  pathway.  Front.  Agric. China 3:359-365.
Zhang,  W.,  L.  Jin,  X.  Li,  X.  Jiang,  Y.  Wang,  X.  Wang. 2012. Grain quality evaluations of hybrids between Triticum  aestivum and Sorghum  bicolor produced by pollen tube pathway method. Aust. J. Crop. Sci. 6:1712-1717.