pISSN : 2355-9942, eISSN:2656-792X Terakreditasi Nasional, Dirjen Pendidikan Tinggi, Riset, dan Teknologi Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset dan Teknologi RI S.K. No. 105/E/KPT/2022 Received: 13 Agustus 2022, Accepted:10 Mei 2023 Published online: 29 Juni 2023 DOI: https://doi.org/10.35508/nukleus.v10i1.7952 https://ejurnal.undana.ac.id/index.php/nukleus/article/view/7952

## PENGARUH PENAMBAHAN LAKTOSA DI DALAM PENGENCER TRIS DAN SITRAT TERHADAP KUALITAS SEMEN CAIR SAPI ANGUS
(The effect of additional lactose in tris and citrate diluents on the quality of liquid semen of angus cattle)
Satria J. S. Rihi Leo 1 , Wilmientje M. Nalley 2 , Kirenius Uly 2* , Hendriana L.L. Belli 2 1 Mahasiswa Program Studi Peternakan, Fakultas Peternakan, Kelautan dan Perikanan, Universitas Nusa Cendana
2 Fakultas Peternakan, Kelautan dan Perikanan, Universitas Nusa Cendana, Jl. Adisucipto Penfui Kota Pos 104 Kupang 8500 Telp (038) 881580. Fax (0380) 881674 *Correspondent author, email: ulykirenius@gmail.com

## ABSTRAK
Laktosa  merupakan  satu-satunya  karbohidrat  yang  terdapat  pada  susu  dan  berfungsi  sebagai  sumber  energi tambahan  dan  pelindung  membran  plasma  spermatozoa  dari  kerusakan  akibat  pengaruh  cold  shock  selama penyimpanan  pada  suhu  rendah.  Tujuan  dari  melakukan  penelitian  ini  adalah  untuk  menguji  pengaruh penambahan  laktosa  di  dalam  pengencer  tris  dan  sitrat  terhadap  kualitas  semen  cair.  Satu  ekor  sapi  angus dengan umur 3 tahun dalam kondisi sehat. Semen diencerkan dengan pengencer P0: Tris-kuning telur (T-KT) 100%, P1: Sitrat-kuning telur (S-KT) 100%, P2: T-KT 50%+S-KT 50%, P3: T-KT 50%+S-KT 50%+Laktosa 1,5g,  P4:  T-KT  50%+S-KT  50%+Laktosa  3,0g,  P5:  T-KT  50%+S-KT  50%+Laktosa  4,5g.  Semen  setelah diencerkan disimpan  pada  suhu  3-5oC.  Semen  dievaluasi pasca  pengenceran  dan  setiap  24  jam  penyimpanan terhadap  motilitas,  viabilitas,  abnormalitas  dan  daya  tahan  hidup  spermatozoa.  Data  dianalisis  menggunakan analysis  of  variance  (ANOVA)  dan  uji  Duncan.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  pada  perlakuan P3(P>0,05) terbaik dibandingkan dengan perlakuan lainnya, yaitu dengan persentase nilai motilitas spermatozoa sebesar  43,50±2,23%,  viabilitas  spermatozoa  53,07±3,36%,  abnormalitas  spermatozoa  8,01±2,14%,  dan  daya tahan  hidup  spermatozoa  selama  6,60,00±0,54  hari.  Hasil  penelitian  ini  menunjukan  bahwa  dengan menggunakanpengencer  kombinasi  T-KT  dan  S-KT  dengan  penambahan  laktosa  1,5  g  merupakan  pengencer terbaik dalam mempertahankan kualitas semen cair sapi angus.
Kata-kata kunci: laktosa, semen sapi angus, sitrat, tris, kuning telur

## ABSTRACT
Lactose  is the  only carbohydrate  found in milk and serves as an additional  source of energy and protects the plasma  membrane  of  spermatozoa  from  damage  due  to  cold  shock  during  storage  at  low  temperatures.  The purpose of this study was to examine the effect of adding lactose in tris and citrate diluents on the quality of liquid semen. One 3 year old angus cow in healthy condition. Semen was diluted with diluent P0: Tris-egg yolk (T-EY)  100%,  P1:  Citrate-egg  yolk  (C-EY)  100%,  P2:  T-EY  50  %+C-EY  50%,  P3:  T-EY  50%+  C-EY 50%+Lactose 1.5g, P4: T-EY 50%+ C-EY 50%+Lactose 3.0g, P5: T- EY 50%+ C-EY 50%+Lactose 4.5g. After diluted cement is stored at a temperature of 3-5oC. Semen was evaluated post dilution and every 24 hours of storage for motility, viability, abnormalities and survival of spermatozoa. The data were analyzed using analysis of variance (ANOVA) and Duncan's test. The results of this study showed that the P3 (P>0.05) treatment was the best compared to other treatments, namely the percentage of spermatozoa motility values of 43.50±2.23%, spermatozoa  viability  was  53.07±3.36%,  spermatozoa  abnormalities  were  8.01±2.14%,  and  spermatozoa survival was 6.60.00±0.54 days. The results of this study indicate that using a combination of T-EY and C-EY diluents with the addition of 1.5g lactose is the best diluent in maintaining the quality of liquid semen of angus cattle.
Keywords: lactose, Angus cattle semen, citrate, tris, egg yolk

## PENDAHULUAN
Teknologi inseminasi buatan (IB)
merupakan  salah  satu  teknologi  dalam reproduksi  ternak  yang  sudah  dikenal  meluas dimasyarakat, memiliki manfaat dalam mempercepat  peningkatan  mutu  genetik  ternak (Suprianto  dan  Djuliansah,  2018).  Keberhasilan program  IB  dapat  berhasil  jika  semua  faktor pendukung  dapat  dipenuhi  secara  optimal  salah satu  diantaranya  adalah  kualitas  semen  yang digunakan, baik semen cair ataupun semen beku. Penggunaan  semen  cair  lebih  baik  pada  daerah yang  sulit  mendapatkan  nitrogen  cair.  Semen cair  membutuhkan  peralatan  sederhana  dan semen disimpan pada suhu 3-5oC, spermatozoa akan  mengalami  cold  shock  saat  penyimpanan sehingga  akan  menurunkan  daya  gerak,  daya hidup  dari  spermatozoa  atau  menurunkan kualitas semen (Susilawati, 2013).
Penurunan  kualitas  semen,  selain  akibat cold  shock  juga  dapat  disebabkan  adanya penumpukan radikal bebas sisa hasil metabolisme. Kualitas semen harus dipertahankan,  oleh  karena  itu  di  dalam pengencer harus ada zat yang dapat melindungi membran  spermatozoa  dari  cold  shock.  Bahan pengencer  semen  harus  mengandung  sumber energi,  buffer,  dan  pelindung  membran  seperti lipoprotein  dan  lecithin  yang  ada  pada  kuning telur ayam (Nugroho et al ., 2014).
Upaya  memperbaiki  kualitas  semen  cair dapat  dilakukan  dengan  cara  menambahkan beberapa jenis gula di dalam pengencer, seperti yang  telah  dilaporkan  oleh  beberapa  peneliti yakni  Khaeruddin  dan  Kurniawan  (2020)  pada
pembekuan semen ayam, Humairoh (2014) pada pembekuan  semen  domba  garut  dan  preservasi semen  kambing  boer  oleh  (Rizal et  al .,  2021). Laktosa  merupakan  satu-satunya  karbohidrat yang terdapat pada susu dan merupakan sumber energi. Laktosa berfungsi sebagai sumber energi tambahan  dan  pelindung  membran  plasma spermatozoa  dari  kerusakan  akibat  pengaruh cold  shock  selama  penyimpanan  pada  suhu rendah.  Telah  dilaporkan  bahwa  penambahan laktosa  dalam  pengencer  semen  sudah  banyak dilakukan pada semen beku domba garut (Singh et  al .  1995),  pada  preservasi  semen  domba priangan dalam pengencer tris dengan tambahan laktosa  (Souhoka et  al .,  2009),  menggunakan laktosa dalam pengencer Tris pada spermatozoa sapi  bali  (Labetubun  dan  Siwa  2011), penambahan  laktosa  pada  semen  beku  domba garut  (Rizal  2009)  dan  pada  semen  cair  domba garut (Rizal et al ., 2003)
Peningkatan produktivitas ternak sapi bali sebagai  penghasil  daging  dapat  melalui persilangan  antara  sapi  bali  dan  sapi  angus menggunakan  semen  cair  maupun  semen  beku, merupakan salah satu peluang pengembangannya. Sapi  angus merupakan jenis sapi potong, yang memiliki pertumbuhan sangat cepat, dagingnya tebal dengan pakan sederhana, tahan  penyakit  bila  berada  di  daerah  tropis. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui pengaruh penambahan laktosa terhadap kualitas spermatozoa  sapi  angus  di  dalam  pengencer Tris,  Sitrat  dan  kombinasi  antara  kedua pengencer tersebut.

## METODE PENELITIAN

## Materi Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  semen  segar dari  satu  ekor  sapi  angus  yang  berumur  tiga tahun,  dalam  kondisi  tubuh  sehat  dan  sudah terlatih  untuk  penampungan  semen.  Sapi  angus ini  dipelihara  dalam  kandang  individu  yang dilengkapi  dengan  tempat  makan  dan  minum, setiap hari ternak diberi pakan hijauan sebanyak 10%  dari  berat  badan,  konsentrat  0,5Kg/  hari dan diberi minum secara ad libitum.

## Metode Penelitian
Metode  yang  digunakan  dalam  penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL), yang terdiri  dari  enam  perlakuan  dan  lima  ulangan sehingga  terbentuk  tiga  puluh  unit  percobaan.
Keenam  perlakuan  tersebut  adalah:  P0:  Tris- kuning  telur  (T-KT)  100%,  P1:  Sitrat-kuning telur (S-KT) 100%, P2: T-KT 50%+S-KT 50%, P3: T-KT 50%+S-KT 50%+Laktosa (L) 1,5w/v, P4: T-KT 50%+S-KT 50%+L 3,0 w/v, P5: T-KT 50%+S-KT 50%+L 4,5 w/v.

## Penyiapan Kuning Telur
Telur  ayam  dibersihkan  menggunakan kapas  yang  dibasahi  alkohol  70%.  Kemudian dipecahkan lalu pisahkan kuning telur dari putih telur.  Letakan  kuning  telur  pada  kertas  saring sambil  diputar  agar  semua  putih  telur  terserap habis, membran vitellin kuning telur ditoreh dan kuning telur dimasukkan dalam gelas ukur.
Penyiapan Pengencer Tris-Kuning Telur
Tris (hydrokxymetil) aminomethane (Merk,  Jerman)  ditimbang  sebanyak  3,634g, asam  sitrat-monohidrat  (Merk,  Jerman)  1,99g, fruktosa  0,50g,  lalu  dimasukkan  ke  dalam tabung  erlenmeyer,  selanjutnya  tambahkan aquadest sampai dengan 100mL lalu homogenkan. Pembuatan pengencer Tris-kuning telur,  ambil  80mL  pengencer  Tris  dan tambahkan  20mL  kuning  telur,  dihomogenkan menggunakan  stirrer  dan  spin  bar,  selanjutnya ditambahkan  penisilin-G  0,5mL  (PT.  Meiji Indonesia  Pharmaceutical  Industries,  Bangil) dan  streptomisin  sulfat  0,4mg/mL  (PT.  Meiji Indonesia Pharmaceutical Industries, Bangil) ke dalam setiap tabung perlakuan yang sudah terisi pengencer.

## Penyiapan Pengencer Sitrat-Kuning Telur
Timbang  natrium  sitrat  (Na3C6H5O7) (Merk,  Jerman)  sebanyak  2,9g  kemudian dimasukan ke dalam erlenmeyer dan tambahkan
aquades  sampai  dengan  100mL,  kemudian dilarutkan hingga homogen. Pembuatan pengencer Sitrat, ambil 80mL larutan Sitrat dan tambahkan  20mL  kuning  telur,  dihomogenkan menggunakan  stirrer  dan  spin  bar,  kemudian tambahkan  antibiotik  sama  seperti  pembuatan pengencer Tris kuning telur.

## Penyiapan Laktosa
Laktosa  yang  digunakan  dalam  bentuk bubuk  ditimbang  menggunakan  timbangan analitik  sesuai  dengan  dosis  yang  dibutuhkan dalam  penelitian  pada  P3,P4  dan  P5  secara berturut-turut  sebanyak  1,5g,  3,0g  dan 4,5g.selanjutnya  laktosa  dimasukan  kedalam tabung  pengencer  yang  sudah  terisi  pengencer kombinasi T-KT 50% dan S-KT 50% kemudian dihomogenkan. Komposisi pengencer penelitian sesuai  perlakuan  dengan  menggunakan  Tris, Sitrat,  kombinasi  Tris  dan  Sitrat  dan penambahan laktosa Tabel 1.
Tabel. 1. Komposisi pengencer perlakuan dengan berbagai konsentrasi laktosa.
Bahan Pengencer Perlakuan P0 P1 P2 P3 P4 P5 Tris-KT (mL) 100 0 50 50 50 50 Sitrat-KT (mL) 0 100 50 50 50 50 Laktosa (w/v) 0 0 0 1,5 3,0 4,5 Jumlah (mL) 100 100 100 100 100 100
Keterangan : (w/v) = weight/volume; mL= mililiter

## Penampungan dan Evaluasi Semen
Semen  ditampung  menggunakan  metode vagina buatan, dilakukan pada pagi hari berkisar jam  06:30  sampai  07:00,  semen  segar  yang diperoleh dievaluasi secara:
Makroskopis: Volume semen dapat dilihat secara  langsung  pada  tabung  penampung berskala  yang  dinyatakan  dalam  mL/ejakulasi. Warna  semen  dapat  dilihat  pada  tabung penampung.  Konsistensi/kekentalan  dari  semen dapat  dilihat  dengan  cara  memiringkan  tabung penampung  yang  berisi  semen  secara  perlahan- lahan  sambil  mengamati  gerakan  perpindahan semen  ke  posisi  semula.  Konsistensi  dapat teramati  dari  gerakan  yang  cepat  atau  lambat perpindahan  semen  ke  posisi  semula.  Derajat keasaman  (pH)  dari  semen  dapat  diketahui menggunakan  kertas  indikator  pH,  dengan  cara celupkan dengan cepat kertas indikator ke dalam tabung  berisi  semen  kemudian  langsung diangkat,  perhatikan  perubahan  warna  dan
cocokkan  pada  standar  warna  yang  ada  pada kertas indikator pH.
Mikroskopis: Gerakan massa
spermatozoa.  Evaluasi  gerakan  massa  untuk melihat pergerakanspermatozoa secara berkelompok,  penilaian  dibagi  kedalam  3 kelompok  :  a).  Gelombang  besar,  gelap,  tebal seperti awan, dan cepat berpindah tempat(+++), b).  Gelombang  kecil  tipis,  dan  bergerak lambat(++),  c).  Gelombang  massa  tipis,  tidak adanya  gumpalan  awan  dan  lambat  berpindah tempat(+).  Motilitas  spermatozoa  ditentukan dari  hasil  pengamatan  di  bawah  mikroskop dengan  perbesaran  lensa  objektif  dan  lensa okuler  40×10.  Motilitas  spermatozoa  dinilai berdasarkan  pergerakan  progresif  spermatozoa yang ditentukan secara subjektif pada 10 lapang pandang  yang  berbeda,  nilai  yang  diberikan berkisaran  antara  0  sampai  100%  dengan  skala 5%.
Konsentrasi  spermatozoa  menunjukkan jumlah sel spermatozoa/mL semen. Konsentrasi spermatozoa  dihitung  dengan  menggunakan Haemocytometer  neubauer,  semen  diencerkan dengan  larutan  eosin  2%,  homogenkan  dengan gerakan memutar selanjutnya teteskan beberapa tetes  di  tissu  kemudian  teteskan  pada haemocytometer  hingga  memenuhi  chamber, amati dibawah dengan perbesaran 40×10.
Viabilitas  spermatozoa  dilakukan  dengan cara  mewarnai  satu  tetes  semen  dengan  empat tetes  eosin-negrosin  kemudian  dibuat  preparat ulas  tipis  dan  dikeringkan  pada  heating  table. Spermatozoa hidup ditandai dengan spermatozoa  tidak  menyerap  warna  eosin- negrosin  sedangkan  spermatozoa  mati  akan terlihat  penyerapan  warna  merah  ungu. Pengamatan  viabilitas  dilakukan  menggunakan mikroskop  dengan  perbesaran  40 × 10, spermatozoa  dihitung  dengan  total ≥ 200 spermatozoa atau  pada 10 lapang pandang yang berbeda.
Penilaian terhadap abnormalitas spermatozoa menggunakan cara yang sama pada penyiapan  preparat  viabilitas.  Abnormalitas spermatozoa ditandai dengan morfologi spermatozoa  tidak  normal  baik  abnormalitas primer maupun sekunder.

## Pengenceran dan Penyimpanan Semen
Semen  yang  memiliki  motilitas  >70%, konsentrasi  >900×106  sel/mL  dan  abnormalitas <15%  digunakan  dalam  penelitian  ini.  Semen
dibagi  ke  dalam  6  tabung  perlakuan  yang  telah terisi pengencer dengan bebagai jenis konsentrasi:  P0:  T-KT  100%,  P1:  S-KT  100%, P2:  T-KT  50% +  S-KT  50%,  P3:  T-KT  50% + S-KT 50% + L 1,5g, P4:T-KT 50% + S-KT 50% + L 3,0g, P5: T-KT 50% + S-KT 50% + L 4,5g, setiap  perlakuan  diulang  sebanyak  lima  kali. Selanjutnya tabung reaksi dimasukkan ke dalam wadah berisi air bersih dan disimpan pada suhu 3-5  oC.  Evaluasi  kualitas  semen  meliputi motilitas,  viabilitas,  abnormalitas,  dan  daya tahan  hidup  (DTH)  spermatozoa  setiap  24  jam hingga  spermatozoa  motil  mencapai  minimum 40% (SNI 2017).

## Variabel Penelitian
Variabel  yang  diukur  dalam  penelitian adalah:  1).  Motilitas  spermatozoa(%),  2). Viabilitas  spermatozoa(%),  3).  Abnormalitas spermatozoa(%),  4).  Daya  tahan  hidup spermatozoa  (hari)  diukur  dengan  lama spermatozoa  dapat  bertahan  hidup  dalam penyimpanan,  dengan  persentase  motilitas minimal 40%.

## Analisis Data
Data  dianalisis  menggunakan  analysis  of variance (ANOVA) dari rancangan acak lengkap yang  dilanjutkan  dengan  uji  jarak  berganda Duncan  dan  dianalisis  menggunakan  software IBM  SPSS  statistics  25  for  windows  dan  MS office Excel 2007.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik semen segar sapi angus
Karateristik  semen  segar  yang  diperoleh dari 5 kali penampungan memiliki rerata volume 3,20±0,45mL  dengan  konsistensi  sedang  dan motilitas  77,50±2,50%  ditampilkan  pada  Tabel 2.
Volume semen yang diperoleh 3,20±0,45mL  dengan  kisaran  2-6mL,  hasil  ini berbeda  dengan  laporan  Oktaviani  (2020) dimana volume semen sapi angus mencapai 5,0- 7,9mL,  6,7-7,2mL  berdasarkan  laporan  dari Rahmawati (2016) dan 6,6-7,0mL (Rahmadiansyah  dan  Susilawati  2021).  Namun hasil  penelitian  ini  masih  berada  pada  kisaran normal  volume  semen  sapi  yaitu  1-15mL (Garner dan Hafez, 2000).
Susilawati  (2013)  bahwa  kualitas  semen baik  dari  seekor  pejantan  unggul  dapat dipengaruhi  dari  beberapa  faktor,  diantaranya: umur  pejantan,  sifat  genetika,  ukuran  testis, ukuran badan, frekuensi ejakulasi, musim, suhu, dan makanan.
Warna  semen  segar  yang  dihasilkan selama  penelitian  ini  adalah  krem,  hasil  ini sesuai  dengan  pendapatnya  Isnaini  dan  Fazrien (2020)  bahwa  semen  sapi  normal  berwarna seperti  putih  susu  atau  krem,  keputih-putihan dan keruh. Sapi diperkirakan 10% menghasilkan semen  yang  normal  dengan  warna  kekuning- kuningan oleh karena adanya zat riboflavin yang dibawa oleh suatu kromosom somatis resesif dan tidak berpengaruh terhadap fertilisasi (Susilawati,  2013).  Semen  sapi  yang  rendah
dengan  konsentrasi  spermatozoa  yang  tinggi dapat menyebabkan warna semen menjadi krem atau  putih  susu.  Hasil  penelitian  ini  sesuai
dengan  pendapat  dari  Nabilla et  al .  (2018) dimana  warna  dari  semen  sapi  berwarna  putih susu dan krem.
Tabel 2. Karateristik semen segar sapi angus selama penelitian
Karakteristik semen Rerata±SD Volume (mL) 3,20±0,45 Warna Krem Konsistensi Sedang pH 6,46±0,13 Gerakan Massa (+) 2-3 Konsentrasi spermatozoa (×10 6 sel/mL) 1020,00±87,75 Motilitas spermatozoa (%) 77,50±2,50 Viabilitas spermatozoa (%) 86,04±2,33 Abnormalitas spermatozoa (%) 5,67±0,80
Derajat keasaman (pH) semen sapi angus hasil  penelitian  yaitu  6,46±0,13,  hasil  ini  tidak beda jauh dengan laporan Nyuwita et al . (2015) bahwa  pH  semen  segar  berkisar  antara  6,43- 6,50. Derajat keasaman berperan penting karena dapat  mempengaruhi  viabilitas  spermatozoa. Konsistensi  semen  sapi  angus  yang  diperoleh selama  penelitian  termasuk  dalam  kategori sedang,  karena  sesuai  dengan  laporan  dari Suyadi dan Rachmawati (2012) yang menyatakan  bahwa  warna,  konsistensi  dan konsentrasi  spermatozoa  mempunyai  sangkut paut  satu  sama  lain.  Semen  yang  tidak  kental maka  konsentrasi  spermatozoa  menjadi  rendah dan  warnanya  akan  semakin  pucat,  sementara semen dengan konsistensi sedang sampai kental akan  memiliki  konsentrasi  spermatozoa  yang tinggi dengan warna semen putih susu atau krem (Ismaya 2014)
Gerakan  massa  semen  segar  sapi  angus dari  hasil  penelitian  memperoleh  nilai  ++ sampai  +++.  Hasil  ini  sama  dengan  hasil penelitian Kurnia et al . (2018) yang menyatakan bahwa  gerakan  massa  pada  sapi  lokal  lainnya seperti  sapi  bali  diperoleh  rerata  sebesar  2,7 setara dengan (++/+++) yang disebabkan karena kondisi  ternak  maupun  lingkungan.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  semen  segar  sapi  angus memiliki  gerakan  yang  aktif,  dan  (Garner  dan Hafez,  2000)  mengemukakan  bahwa  perbedaan pada nilai gerakan massa dapat disebabkan oleh perbedaan bangsa dan umur ternak.
Motilitas adalah daya gerak spermatozoa  yang  dijadikan  sebagai  faktor pendukung dalam penilaian kualitas spermatozoa  untuk  IB.  Hasil  penelitian  ini menunjukan nilai motilitas spermatozoa
77,50±2,50%  dengan  kisaran  75-80%.  Hasil ini lebih  tinggi  dari  laporan  Anwar et  al .,  (2014) dengan  nilai  motilitas  spermatozoa  sebesar 62,50±5,00%.  Garner  dan  Hafez  (2000) melaporkan  motilitas  spermatozoa  sapi  berkisar antara  40-75%,  merupakan  syarat  semen  yang dapat  di  proses  selanjutnya  dibuat  semen  cair maupun semen beku minimal 70%.
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa nilai  konsentrasi  spermatozoa  sapi  angus memiliki  rata-rata  1020,00±87,75×106  sel/mL. Hasil  yang  diperoleh  selama  penelitian  ini nilainya lebih tinggi dibandingkan dengan yang dilaporkan  oleh  Agossou  dan  Koluman  (2018) pada sapi limousin sebesar 1004 ± 218,71 ×106 sel/mL dan produksi semen beku sapi Limousin, Simmental  dan  Angus  secara  berturut-turut  : 1143,58  ±  124,16  ×106  sel/mL;  1283,13  ± 119,43 ×106 sel/mL dan 1068,83 ± 116,24 ×106 sel/mL.
Viabilitas  spermatozoa  semen  sapi  angus yang  diperoleh  adalah    86,04±2,33%.  Hasil  ini tidak  berbeda  jauh  dengan  laporan  dari  Rizal (2009) yang menyatakan viabilitas spermatozoa dari  sapi  bali  sebesar  86,75%,  sapi  madura adalah  85%  dan  sapi  peranakan  ongole  sebesar 97% (Ratnawati et al ., 2017). Garner dan Hafez (2000) melaporkan bahwa viabilitas spermatozoa  yang  dapat  digunakan  untuk pembuatan  semen  cair  maupun  semen  beku kisaran 60-75% spermatozoa hidup.
Nilai  abnormalitas  spermatozoa  dari penelitian  sebesar  5,67±0,80%.  Semen  yang dihasilkan  masih  dalam  kisaran  normal  sesuai dengan  Hafez  (2000)  yaitu  abnormalitas spermatozoa tidak boleh lebih dari 20%.

## Pengaruh Perlakuan terhadap Motilitas Spermatozoa
Motilitas merupakan salah satu parameter yang sangat penting dan dapat dijadikan sebagai dasar  fertilitas  spermatozoa.  Rerata  nilai
motilitas spermatozoa sapi angus hasil penelitian ini dapat dilihat pada Tabel.3
Tabel 3. Rerata motilitas spermatozoa sapi angus selama penyimpanan (%)
abcd Superskrip dengan huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Hasil  analisis  statistik  terhadap  motilitas spermatozoa  sapi  angus  pasca  pengenceran hingga  hari  ke-3  penyimpanan    menunjukkan perbedaan  yang  tidak  nyata  (P>0,05)  antar perlakuan.  Namun  pada  hari  ke-4  hingga  hari ke-7 penyimpanan terjadi perbedaan yang nyata (P<0,05)  antar  perlakuan.  Pada  hari  ke-5 penyimpanan motilitas spermatozoanya pada P5 sudah  dibawah  40%,  sementara  P0,  P1  dan  P4 teramati  pada  hari  ke-6,  sedangkan  P2  dan  P3 pada hari ke-7.
Perbedaan  ini  dapat  terjadi  mungkin karena  adanya  perlakuan  pengencer  yang  di  uji hal  ini  terlihat  bahwa  nilai  motilitas  pada  hari ke-5, perlakuan P0: 42,50±5,59% dan P1:42,40±6,85%    memiliki  nilai  yang  hampir sama, hal ini disebabkan karena ke-2 perlakuan ini  sama-sama  sebagai  pengencer  yang mengandung  buffer  dan  berfungsi  dalam mempertahankan pH semen selama penyimpanan.  Susilawati  (2013)  T-KT  dan  S- KT  dapat  bersifat  penyangga  selama  preservasi untuk  menjaga  daya  hidup  dan  fertilitas spermatozoa.
Perlakuan  P2  hingga  P5  menggunakan pengencer  kombinasi  dengan  penambahan laktosa  hingga  4,5g,  nilai  motilitas  P2: 42,50±2,50% dan P3: 43,50±2,23% mempunyai nilai  yang  hampir  sama  pada  hari  ke-6,  P4: 45,00±4,67%  nilai motilitas diatas 40% teramati pada  hari  ke-5  dan  P5  pada  hari  ke-4  dengan nilai:  43,50±4,54%.  Pada  P2  dan  P3 menunjukkan hasil  yang  sama,  hal ini mungkin didukung  dengan  adanya  kombinasi  pengencer T-KT  dan  S-KT  dan  juga    pada  P3  terdapat penambahan  laktosa  sebanyak  1,5g  yang  dapat memberi  sumber  energi  tambahan  lebih  baik guna  mendukung  daya  gerak  spermatozoa.
Sedangkan  pada  P4  dan  P5  menunjukkan  hasil yang  berbeda  yaitu  P4:  45,00±4,6%  dan P5:43,50±4,54%,  perbedaan  ini  disebabkan meningkatnya  level  laktosa  yang  ditambahkan pada  P4  dan  P5  memberikan  dampak  yang negatif    atau  sudah  bersifat  toksin  bagi spermatozoa. (Rizal, 2009).
Pengaruh  toksin  yang  muncul  mungkin dikarenakan  adanya  ketidakstabilan  tekanan osmotik  didalam  pengencer  seiring  dengan bertambahnya dosis laktosa, sehingga mengakibatkan  terjadinya  peningkatan  tekanan osmotik  didalam  sel  yang  menimbulkan kerusakan  pada  membran  plasma  sel.  Selama penyimpanan  tekanan  osmotik  harus  tetap dipertahankan  karena  jika  tidak  dipertahankan dapat  mengakibatkan  tekanan  osmotik  didalam dan  diluar  sel  menjadi  berbeda  sehingga mengalir  ke  daerah  yang  bertekanan  osmotik tinggi.  Toksin  ini  dapat  membuat  kerusakan pada  organel  sel,  ketidaklancaran  metabolisme dan  kematian  sel  spermatozoa.  Efek  toksin  ini dapat  dicurigai  menyebabkan  respirasi  didalam mitokondria  sel  menjadi  tidak  lancar.  Apabila hal  ini  terjadi  organel  sel  tersebut  akan mengalami kerusakan dan menyebabkan pergerakan  sel  spermatozoa  terganggu  karena terganggunya  metabolisme  energi  (Siswanto, 2006).
Disisi  lain  laktosa  berguna  sebagai sumber  nutrisi  dan  juga  dapat  memiliki  fungsi yang  hampir  sama  dengan  senyawa  antioksidan dan  mampu  mengurangi  senyawa-senyawa pengoksidasi, serta dapat berperan meminimalkan  terjadinya  reaksi  oksidasi. Reaksi oksidasi yang ditimbulkan dapat bersifat kurang  baik  karena  produk  yang  dihasilkan dapat  merusak  mutu  membran  plasma  sel  dan
Hari Ke Perlakuan Nilai P P0 P1 P2 P3 P4 P5 0 78,00±4,27 a 78,00±4,27 a 77,50±3,53 a 77,00±2,73 a 77,50±3,53 a 77,00±2,73 a 0,995 1 71,00±2,23 a 71,00±3,79 a 71,50±4,87 a 72,00±2,73 a 72,00±2,73 a 69,00±3,79 a 0,763 2 65,00±3,35 a 63,50±6,51 a 66,00±5,47 a 66,00±2,23 a 66,00±2,23 a 61,00±2,23 a 0,333 3 57,50±5,00 a 56,50±8,58 a 59,50±5,12 a 59,50±2,73 a 58,50±4,87 a 55,00±3,06 a 0,718 4 51,00±4,18 b 49,00±8,58 ab 54,00±4,18 b 54,50±3,70 b 54,00±2,23 b 43,50±4,54 a 0,013 5 42,50±5,59 ab 42,40±6,85 ab 49,00±4,18 b 49,50±2,73 b 45,00±4,67 b 36,00±6,51 a 0,005 6 34,00±4,18 ab 35,40±6,53 ab 42,50±2,50 cd 43,50±2,23 cd 36,10±4,72 bc 28,50±7,82 a 0,001 7 24,00±5,47 ab 27,50±7,28 b 35,70±3,42 c 37,50±3,53 c 28,00±4,47 b 18,50±8,58 a 0,000
laktosa  juga  memiliki  fungsi  ganda  dalam mempertahankan  kehidupan  spermatozoa.  Hal ini  ditunjukkan  pada  P3  dengan  penambahan laktosa  sebanyak  1,5g  memberi  nilai  yang terbaik,  hasil  ini  sesuai  dengan  laporan  dari Rizal  (2009)  yaitu  dosis  optimum  penggunaan laktosa  sebanyak  1g  karena  jika  penambahan laktosa  lebih  dari  2g  dapat  mengakibatkan kualitas  spermatozoa  menjadi  lebih  rendah dibandingkan  dengan  1g,  tingginya  konsentrasi laktosa  yang  ditambahkan  dapat  menimbulkan ketidakstabilan  tekanan  osmotik  dalam  larutan pengencer  yang  menyebabkan  daya  adaptasi spermatozoa  menjadi  rendah  sehingga  akan mengganggu  proses  biokemik  didalam  sel  yang pada  akhirnya  akan  menurunkan  daya  hidup spermatozoa itu sendiri selama masa penyimpanan (Rizal, 2009).
Laktosa  adalah  jenis  karbohidrat  dari kelompok  disakarida,  laktosa  sendiri  tersusun atas  satu  unit  glukosa  dan  satu  unit  galaktosa yang keduanya dapat digunakan oleh spermatozoa  untuk  proses  glikolisis  dan  siklus krebs agar menghasilkan energi berupa adenosin trifosfat  (ATP).  Laktosa  juga  dapat  digunakan oleh spermatozoa sebagai krioprotektan
ekstraseluler  seperti  karbohidrat  yang  berfungsi untuk  melindungi membran  plasma  dari larutan dingin selama penyimpanan disuhu 3-5oC (Rizal et al ., 2003)
Vishwanath  dan  Shannon  (2000)  laktosa dapat menjadi krioprotektan karena berasal dari golongan karbohidrat dan mempunyai kemampuan  untuk  menggantikan  molekul  air secara  normal  dalam  kelompok  polar  hydrated. Laktosa  termasuk  dalam  golongan  karbohidrat disakarida  mampu  yang  dapat  menggantikan posisi air pada permukaan membran plasma sel yang  langsung  berhubungan  dengan  pengencer, selanjutnya  dinyatakan    bahwa  laktosa  dapat berinteraksi  langsung  dengan  gugus  pusat fosfolipid  polar  selama  pembekuan,  dan menurunkan  interaksi  ikatan  van  der  Walls  di antara rantai karbon.

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Viabilitas Spermatozoa
Viabilitas  spermatozoa  adalah  salah  satu indikator  yang  dapat  digunakan  untuk  menilai kualitas  semen,  semakin  tinggi  persentase viabilitas  semen  maka  semakin  baik  kualitas semen tersebut (Adrianto, 2017).
Tabel 4. Rerata viabilitas spermatozoa sapi angus selama penyimpanan (%)
abc Superskrip dengan huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Hasil  analisis  statistik  terhadap  viabilitas spermatozoa  sapi  angus  pasca  pengenceran hingga  hari  ke-3  penyimpanan  menunjukkan perbedaan  yang  tidak  nyata  (P>0,05)  antar perlakuan.  Namun  pada  hari  ke-4  hingga  hari ke-7 penyimpanan terjadi perbedaan yang nyata (P<0,05) antar perlakuan.
Viabilitas  spermatozoa  sapi  angus  dalam perlakuan  P2  dan  P3  lebih  tinggi  (P<0,05)  dari keempat  perlakuan  lainnya,  hal  ini  dapat dibuktikan bahwa kombinasi antara T-KT dan S- KT    dan  dengan  penambahan  laktosa  dapat mempertahankan viabilitas spermatozoa.
Nilai  viabilitas  berkaitan  erat  dengan kemampuan fertilisasi spermatozoa, apabila nilai viabilitas tinggi maka kemampuan fertilitas juga akan  tinggi.  Viabilitas  spermatozoa  sapi  angus dapat  menurun  selama  preservasi  hal  ini disebabkan  karena  cengkaman  dingin,  lain  dari itu  yang  mempengaruhi  turunnya  viabilitas adalah  penumpukan  radikal  bebas  sisa  hasil metabolisme  (Butta et  al .,  2021).  Persentase viabilitas  spermatozoa  sapi  angus  hasil penelitian  ini  pada  hari  ke-7  berkisar  antara 45,28±4,68%-47,64±4,52%,  hasil  ini  hampir sama  dengan  laporan  Blegur et  al .  (2020)  pada sapi  bali  dengan  perlakuan  T-KT-VCO  yang
Hari Ke Perlakuan Nilai P P0 P1 P2 P3 P4 P5 0 85,92±3,32 a 85,54±4,05 a 85,24±5,30 a 83,29±3,10 a 85,65±2,24 a 84,90±2,24 a 0,872 1 78,66±1,75 a 81,04±5,14 a 79,06±5,09 a 79,46±1,71 a 78,47±2,05 a 77,89±2,95 a 0,772 2 72,70±4,19 a 72,64±5,88 a 73,61±4,84 a 74,47±2,41 a 71,18±3,29 a 72,52±3,84 a 0,880 3 68,31±4,51 a 67,37±9,32 a 70,50±2,77 a 69,11±2,13 a 65,45±5,41 a 63,77±6,35 a 0,460 4 61,37±5,93 ab 60,89±10,82 ab 65,21±3,26 b 62,78±3,93 ab 61,70±5,19 ab 54,64±9,14 a 0,303 5 53,76±4,60 ab 52,96±7,22 ab 58,67±4,38 b 58,32±4,36 b 53,93±4,27 ab 48,97±10,79 a 0,198 6 44,54±3,97 ab 45,38±8,73 ab 58,40±12,08 c 53,07±4,35 bc 46,75±4,70 ab 37,25±10,84 a 0,008 7 32,83±3,57 a 37,14±7,67 a 47,64±4,52 b 45,28±4,68 b 34,96±4,43 a 28,80±9,16 a 0,000
dapat  mempertahankan  viabilitas  sebesar 48.68±2.25%, hingga 6 hari preservasi.
Viabilitas
spermatozoa selama penyimpanan  mengalami  penurunan,  hal  ini terjadi karena adanya penurunan  suhu penyimpanan yang dapat menyebabkan perubahan  struktur  dari  fosfolipid  membran plasma  spermatozoa  dan  mengganggu  fungsi dan  permeabilitas  membran  sel.  Rataan persentase  viabilitas  spermatozoa  mengalami penurunan seiring dengan lamanya penyimpanan dengan tingkat penurunan viabilitas spermatozoa berbeda-beda  nilainya  antar  perlakuan.  Nilai penurunan  viabilitas  tertinggi  pada  P0:  11,7% hari  ke-6,  P1:  8,4%  hari  ke-1,  P2:  10,76%  hari ke-6, P3: 10,79% hari ke-4, P4: 11,79% hari ke- 6 dan  P5: 11,72% hari ke-5.
Menurut  Sukmawati et  al .  (2014) spermatozoa yang mengalami kerusakan membran akan mengganggu proses metabolisme
sehingga  sintesis  ATP  menjadi  terhambat  dan terjadinya  penurunan  viabilitas  spermatozoa, dilaporkan  dari  Susilawati  (2013)  bahwa spermatozoa  yang  mati  permeabilitas  membran selnya  meningkat,  terutama  pada  bagian  post nuclear  caps  sehingga  sel  spermatozoa  yang mati  akan  menyerap  warna  eosin-negrosin,  dan sel  spermatozoa  yang  masih  hidup  mempunyai kondisi membran yang baik sehingga zat warna tidak  dapat  menembus  membran,  yang menyebabkan  sel  spermatozoa  tetap  berwarna putih/bening  (tidak  menyerap  warna  eosin- negrosin).

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Abnormalitas Spermatozoa
Hasil  analisis  abnormalitas  menunjukkan perbedaan  yang  tidak  nyata  (P>0,05)  pada semua perlakuan Tabel 5.
Tabel 5. Rerata abnormalitas spermatozoa sapi angus selama penyimpanan
Hari Ke Perlakuan Nilai P P0 P1 P2 P3 P4 P5 0 6,06±2,71 a 6,35±2,51 a 5,94±2,83 a 6,04±2,52 a 6,38±2,30 a 6,74±2,15 a 0,996 1 6,49±2,71 a 6,84±2,78 a 6,12±2,92 a 6,14±2,47 a 6,55±2,26 a 6,93±2,15 a 0,993 2 6,17±2,65 a 6,88±2,57 a 6,46±2,38 a 6,93±2,24 a 6,99±2,27 a 7,12±2,07 a 0,987 3 7,06±2,69 a 7,05±2,59 a 6,89±2,51 a 6,54±2,42 a 7,15±2,29 a 7,32±2,03 a 0,997 4 6,89±2,24 a 7,38±2,43 a 7,81±2,96 a 6,90±2,15 a 7,22±2,27 a 7,46±2,06 a 0,988 5 7,42±2,22 a 7,36±2,36 a 6,73±2,53 a 7,15±2,25 a 7,72±2,31 a 7,76±2,14 a 0,982 6 7,29±2,30 a 7,58±2,36 a 7,35±2,47 a 8,01±2,14 a 8,00±2,39 a 7,89±2,18 a 0,992 7 7,74±2,37 a 7,71±2,15 a 7,61±2,50 a 8,17±2,17 a 8,24±2,53 a 8,07±2,20 a 0,997
a Superskrip dengan huruf yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Tidak  adanya  perbedaan  antar  perlakuan menunjukkan  bahwa  pengencer  Tris  dan  Sitrat, maupun  kombinasi  Tris  dan  Sitrat  dengan penambahan laktosa tidak memengaruhi abnormalitas spermatozoa. Hasil ini menunjukan bahwa  pengencer  memiliki  kondisi  fisiologis yang  sama  dengan  spermatozoa  sehingga  dapat mendukung daya simpan spermatozoa secara in vitro.
Nilai  abnormalitas  hasil  penelitian  ini antara  5,94-8,07  sedikit  lebih  tinggi  dibanding hasil  laporan  Djita et  al .  (2021);  Blegur et  al . (2020) dan Meo et al . (2022) yaitu  dengan nilai abnormalitas  mencapai  4,13%;  5,92%;  7,06%. Abnormalitas spermatozoa yang diamati selama penelitian  adalah  spermatozoa  yang  tidak memiliki  ekor,  ekor  melingkar,  kepala  tanpa ekor,  hal  ini  sesuai  Susilawati  (2013)  yang menyatakan  bahwa  abnormalitas  tersebut  diatas termasuk abnormalitas sekunder.
Perbedaan nilai abnormalitas yang didapat mungkin  disebabkan  saat  pembuatan  preparat ulasan  terlalu  ditekan  atau  heating  table  yang suhunya  terlalu  panas  (Safitri et  al .,  2018). Garner  dan  Hafez.  (2000)  juga  melaporkan bahwa  kemungkinan  terjadinya  perbedaan  ini disebabkan  oleh  umur  dan  faktor  kesuburan pejantan. Abnormalitas juga dapat terjadi karena spermatozoa  mengalami  cold  shock  dan ketidakseimbangan  tekanan  osmotik  akibat  dari proses metabolik yang terus berlangsung selama masa penyimpanan.

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Daya  Tahan Hidup Spermatozoa
Hasil  analisis  daya  tahan  hidup  (DTH) menunjukkan  perbedaan  yang  nyata  (P<0,05) pada semua perlakuan Tabel 6.

## Tabel 6. Pengaruh perlakuan terhadap daya tahan hidup spermatozoa
Perlakuan Daya Tahan Hidup (hari) P0 5,00±0,77 ab P1 5,00±1,00 ab P2 6,00±0,00 bc P3 6,60±0,54 c P4 5,00±0,70 ab P5 4,40±1,14 a Nilai P 0,002
abc Superskrip dengan huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Hasil  penelitian  ini  DTH  yang  diamati adalah kemampuan spermatozoa untuk bertahan hidup  selama  persentase  motilitas  spermatozoa >40%  sesuai  dengan  syarat  kelayakan  IB, berpengaruh  nyata  (P<0,05)  terhadap  semua variabel yang diuji.
Pada perlakuan P2 dan P3 memiliki daya tahan  hidup  yang  sama  dapat  disimpan  hingga hari  ke-6  daripada  perlakuan  lain,  karena  pada P2  dan  P3  pengencer  yang  digunakan merupakan  kombinasi  T-KT  dan  S-KT  yang diduga  kedua  pengencer  memberikan  pengaruh positif selama penyimpanan sedangkan pada P3 kombinasi  pengencer  T-KT  dan  S-KT  juga mendapat  suplementasi  laktosa  1,5g  memberi respon  yang  sama  yaitu  motilitas  40%  teramati pada hari ke-6.
Hasil  penelitian  ini  makin  memperkuat fakta  bahwa  pengencer  berperan  penting  dalam memperpanjang daya hidup spermatozoa invitro. Jika  spermatozoa  tidak  mendapat  suplementasi nutrisi  dan  bahan  pelindung  terhadap  cold shock,  maka  spermatozoa  akan  mengalami
kematian  karena  kehabisan  substrat  energi  dan energi  yang  digunakan  hanya  mengandalkan dari bahan-bahan yang ada dalam pengencer dan plasma semen (Hine et al ., 2014).
Kehabisan  suplai  energi  yang  terjadi selama  masa  penyimpanan  dapat  menyebabkan proses  glikolisis  untuk  menghasilkan  energi tidak dapat berlangsung. Cold shock menyebabkan kerusakan membran, jika membran  bagian  midpiece  yang  rusak,  enzim aspartate  amino  transferase  hilang  dan mitokondria tidak bisa merombak ATP menjadi ADP  dan  seterusnya,  sehingga  spermatozoa berhenti bergerak (Hine et al ., 2014).
Dalam  keadaan  anaerob,  persediaan nutrisi  bagi  spermatozoa  terutama  diberikan lewat  jalur  glikolisis  (Migliaccio et  al .,  2018). Salah  satu  hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa glikolisis  dapat  menyeimbangi  terbatasnya produksi ATP bagi mitokondria dalam menjaga kemampuan  daya  gerak  dari  sperma  mencit (Chang dan Suarez, 2012).

## SIMPULAN
Dapat  disimpulkan  bahwa  kombinasi pengencer T-KT dan S-KT dengan penambahan laktosa  1,5g  yaitu  dengan  persentase  nilai motilitas  spermatozoa  sebesar  43,50±2,23%, viabilitas spermatozoa 53,07±3,36%,
abnormalitas  spermatozoa  8,01±2,14%,  dan daya  tahan hidup spermatozoa selama 6,60,00±0,54 hari merupakan pengencer terbaik dalam mempertahankan kualitas semen cair sapi angus.

## SARAN
Dari  hasil  penelitian  ini,  perlu  dilakukan penelitian  lebih  lanjut  dalam  pelaksanaan inseminasi buatan dengan menggunakan
kombinasi  pengencer  T-KT  dan  S-KT  dengan penambahan laktosa 1,5g.

## DAFTAR PUSTAKA
Adrianto  H.  2017.  Buku  Ajar  Biologi  Sel  dan Molekuler. Deepublish. CV. Budi Utama Agossou D dan Koluman N. 2018. An objective analysis  of  factors  affecting  buck  semen quality attributes during cryopreservation: a mini review. annual research dan review
in biology, 27(3), 1 – 7. https://doi.org/10.9734/arrb/2018/4208
7
Anwar  P,  Ondho  Y,  Samsudewa  D.  2014.
Pengaruh  Pengencer  ekstrak  air  tebu dengan penambahan kuning telur terhadap kualitas  spermatozoa  Sapi  Bali. Jurnal Peternakan , 11(2), 48 – 58.
Butta CA, Gaina CD,  Foeh ND. 2021. Motilitas dan  viabilitas  spermatozoa  babi  dalam pengencer  air  kelapa-kuning  telur  ayam kampung. Jurnal
Veteriner
Nusantara , 4(1), 3-3.
Blegur J, Nalley WM, Hine TM. 2020. Pengaruh penambahan  virgin  coconut  oil  dalam pengencer  tris  kuning  telur  terhadap kualitas  spermatozoa  sapi  bali  selama preservasi. Jurnal  Nukleus  Peternakan , 7(2), 130 – 138.
Chang H, Suarez SS. 2012. Unexpected flagellar movement patterns and epithelial binding behavior  of  mouse  sperm  in  the  oviduct. Biology of Reproduction, 86(5), 140 – 141. https://doi.org/https://doi.org/10.1095/ biolreprod.111.096578
Djita  FK,  Nalley  WM,  Hine  TM,  Marawali  A. 2021.  Pengaruh  penambahan  ekstrak bawang  merah  (  allium  cepa  )  dalam pengencer  tris  -  kuning  telur  terhadap kualitas  spermatozoa  sapi  bali  pada penyimpanan  in  vitro. Jurnal  Nukleus Peternakan 8(2), 92 – 100.
Garner DL, Hafez EZE. 2000. Spermatozoa and seminal  plasma.  Reproduction  in  Farm Animals, 96 – 109.
Hafez  EZE.  2000.  Anatomy  of  male reproduction.  Reproduction  in  farm animals.  7 th ed.  Lea  and  Febiger, Philadelpia Hine  TM,  Marawali  A.  2014.  Efektivitas  air buah  lontar  dalam  mempertahankan motilitas, viabilitas  dan  daya  tahan hidup spermatozoa  sapi  bali.  Jurnal  Veteriner, 15(2), 263-273 – 273.
Humairoh  L.  2014.  Kualitas  post-thawed spermatozoa  domba  yang  disentrifugasi
sebelum  dibekukan  dengan  pengencer laktosa. Veterinaria Indonesiana, 2(1), 31- 35.
Ismaya.  2014.  Bioteknologi  Inseminasi  Buatan Pada  Sapi  dan  Kerbau.  UGM  Press, Yogyakarta.
Isnaini  N,  Fazrien  WA.  2020.  Fisiologi
Reproduksi  dan  Inseminasi  Buatan  pada Kerbau.  Universitas  Brawijaya  Press,
Malang. Khaeruddin, Kurniawan ME. 2020.
Keberhasilan  pembekuan  semen  ayam yang  diencerkan  dan  diperkaya  dengan glukosa,  trehalosa,  sukrosa  dan  laktosa.
Jurnal Veteriner, 21(3), 476 – 484.
https://doi.org/10.19087/jveteriner.2020
.21.3.476
Kurnia  A,  Soeparna  ZIA,  Hidayat  R.  2018. Fertilitas  semen  beku  dalam  tris  kuning telur dan skim yang diberi omega-3 pada sapi simmental dengan ransum berimbuhan  seng  dan  selenium  minimal. Jurnal Veteriner, 19(2), 251 – 262. Labetubun  J,  Siwa  IP.  2011.  Kualitas spermatozoa  kauda  epididimis  sapi  Bali dengan  penambahan laktosa  atau  maltosa yang dipreservasi pada suhu 3-5 o C. Jurnal Veteriner, 12(3), 200 – 207.
Meo  MY, Telnoni SP, Dilak HI. 2022. Kualitas spermatozoa  sapi  angus  (bos  taurus) dalam pengencer tris kuning telur dengan substitusi ekstrak sari buah tomat. Flobijo. 1(1), 10 – 16.
Migliaccio M, Ricci G, Suglia A, Manfrevola F, Mackie  K,  Fasano  S,  Pierantoni,  R, Chioccarelli  T  dan  Cobellis  G.  2018. Analysis of endocannabinoid system in rat testis  during  the  first  spermatogenetic wave. In Frontiers in Endocrinology. 9(5), 268-269 https://doi.org/10.3389/fendo.2018.002 69
Nabilla  A,  Arifiantini  RI,  Purwantara  B.  2018. Kualitas  semen  segar  sapi  bali  umur produktif dan non-produktif serta penentuan konsentrasi krioprotektan dalam pengencer tris kuning telur. Jurnal Veteriner , 19(2), 242 – 250.
Nugroho  Y,  Susilawati  T,  Wahyuningsih  S. 2014.  Kualitas  semen  Sapi  Limousin selama pendinginan menggunakan
pengencer  CEP-2  dengan  penambahan berbagai konsentrasi kuning telur dan sari buah  jambu  biji  (Psidium  guajava). Ternak  Tropika  Journal  of  Tropical Animal Production, 15(1), 31 – 42.
Nyuwita  A,  Susilawati  T,  Isnaini  N.  2015. Kualitas semen segar dan produksi semen beku  sapi  simmental  pada  umur  yang berbeda.  Ternak  Tropika  Journal  of Tropical Animal Production, 16(1), 61-68.
Oktaviani,  D.  2020.  Pengaruh  perbedaan  umur terhadap  kualitas  semen segar  sapi  angus di  Balai  Inseminasi  Buatan  Lembang. Dissertation,  UIN  Sunan  Gunung  Djati Bandung 2(2), 33. Rahmadiansyah  AMF,  Susilawati  IT.  2021. Kualitas semen dan produksi semen beku pada bangsa sapi dan bulan penampungan yang  berbeda  di  Balai  Inseminasi  Buatan Lembang. Jurnal
Ilmu-Ilmu
Peternakan, 25(3), 25-36.
Rahmawati  M.  2016.  Kualitas  semen  dan produksi  semen  beku  pada  bangsa  sapi dan  bulan  penampungan  yang  berbeda  di balai  inseminasi  buatan  lembang.  Jurnal Ilmu-Ilmu Peternakan, 25(3), 25-36. Ratnawati  D,  Isnaini  N,  Susilawati  T.  2017. Pemanfaatan  casa  dalam  observasi motilitas  spermatozoa  semen  cair  Sapi Madura  dalam  pengencer  berbeda.  Jurnal Ilmu-Ilmu Peternakan. 27(1), 80 – 95. Rizal  Muhammad,  Nisa  C,  Norliani  R.  2021. Daya hidup spermatozoa kambing peranakan boer yang  dipreservasi dengan pengencer laktosa dan ekstrak daun kelor. Prosiding  Seminar  Nasional  Lingkungan Lahan Basah, 6(3), 45 – 52.
Rizal  M,  Toelihere  MR,  Yusuf  TL,  Purwantara B,  Situmorang  P.  2003.  Kriopreservasi semen domba garut dalam pengencer Tris dengan konsentrasi laktosa yang berbeda. Media Kedokteran Hewan, 19(2), 79 – 83.
Rizal  M.  2009.  Daya  hidup  spermatozoa epididimis  sapi  Bali  yang  dipreservasi pada  suhu  3-5 o C  dalam  pengencer  tris dengan konsentrasi laktosa yang berbeda. Jurnal  Ilmu  Ternak  dan  Veteriner,  14(2), 142 – 149.
Safitri AM, Sardjito T, Wibawati PA, Mustofa I, Saputro  AL,  Prastiya  RA.  2018.  Kualitas semen  segar  sapi  rambon  banyuwangi dalam  pengencer  tris  kuning  telur  dan susu  skim  kuning  telur.  Jurnal  Medik
Veteriner, 1(3), 62 – 67. https://doi.org/https://doi.org/10.20473/ jmv.vol1.iss3.2018.62-67
Singh MP, Sinha AK, Singh BK. 1995. Effect of cryoprotectants  on  certain  seminal attributes  and  on  the  fertility  of  buck spermatozoa.  Theriogenology,  43(6), 1047 – 1053.
Siswanto.  2006.  Kualitas  semen  di  dalam pengencer  tris  dan  natrium  sitrat  dengan berbagai  karbohidrat  dan  level  gliserol pada  proses  kriopreservasi  semen  rusa timor (Cervus timorensis). Tesis. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor Souhoka DF, Matatula MJ, Mesang-Nalley WM,
Rizal  M.  2009.  Laktosa mempertahankan daya hidup spermatozoa kambing peranakan  etawah  yang  dipreservasi dengan  plasma  semen  domba  priangan. Jurnal Veteriner, 10(3), 135 – 142.
Standardisasi  Nasional  Indonesia.  2017.  Badan Standardisasi  Nasional.  4869.1:2017. Standar  Nasional  Indonesia  (SNI)  Semen Beku-Bagian 1:Sapi.
Sukmawati  E,  Arifiantini  RI,  Purwantara  B. 2014.  Daya  tahan  spermatozoa  terhadap proses  pembekuan  pada  berbagai  jenis sapi  pejantan  unggul. Jurnal  Ilmu  Ternak dan Veteriner, 19(3), 168-175.
Suprianto  S  dan  Djuliansah  D.  2018.  Kajian Aplikasi  Teknologi  Inseminasi  Buatan dalam  Upaya  Peningkatan  Produktivitas dan  Pendapatan  Usaha  Ternak  Sapi Potong di Kabupaten Tasikmalaya. Jurnal Pemikiran Masyarakat
Ilmiah Berwawasan  Agribisnis,  1(3),  210-211. https://doi.org/10.25157/ma.v1i3.41
Susilawati T. 2013. Pedoman Inseminasi Buatan pada Ternak. Universitas Brawijaya Press, Malang.
Suyadi  A,  Rachmawati IN.  2012.  Pengaruh  α - tocopherol yang berbeda dalam pengencer dasar  tris  aminomethane  kuning  telur terhadap  kualitas  semen  kambing  boer yang  disimpan  pada  suhu  5 o C.  Jurnal Ilmiah Ilmu-Ilmu Peternakan, 22(3), 1 – 8. Vishwanath  R,  Shannon  P.  2000.  Storage  of bovine  semen  in  liquid  and  frozen  state. Animal  Reproduction  Science,  62(1 – 3),
23 – 53. https://doi.org/10.1016/S0378- 4320(00)00153-6