DOI: http://dx.doi.org/10.29244/jhi.9.1.54-62
Tersedia online di http://journal.ipb.ac.id/index.php/jhi

## Mutasi Induksi Dendrobium sylvanum var. flava Menggunakan Kolkisin secara In Vitro
In Vitro Induction Mutation of Dendrobium sylvanum var. flava Using Colchicine
Musalamah 1 *, Ni Made Armini Wiendi 2 , dan Sri Rianawati 3
Diterima 30 Agustus 2017/Disetujui 28 Februari 2018

## ABSTRACT
In  vitro  mutation  using  colchicine  on  2  month  of  self-pollinated  protocorm  like  bodies  of Dendrobium  sylvanum  var.  flava  was  conducted  to  determine  the  effects  of  concentration  and immersion duration in colchicine on proliferation of PLBs, and to identify of ploidy variants based on stomatal variable. Research was arranged using factorial completely randomized design with three factors  in  three  replications.  The  first  factor  was  concentration  of  colchicine,  consisted  of  five concentrations (0.02; 0.04, 0.06; 0.08; dan 0.1%). The second factor was duration of immersion in the colchicine, consisted of four durations (1; 24; 48; 72 hours). The third factor was proliferation medium  consisted  of  two  concentrations  of  BAP  (1;  0.5  mg  L -1 ).  Analysis  of  variance  showed  the significant effect of colchicine treatment on percentage of survived explants. LD 50 in media 1 mg L -1 BAP was obtained at a colchicine concentration of 0.069% with duration immersion of 58.19 hours. On Media 0.5 mg L -1 BAP, LD 50 was obtained at colchicine concentration of 0.054% with duration immersion of 47.63 hours. Percentage of solid polyploid mutant of Dendrobium sylvanum var. flava can not be determined on MV2 generation because the stomata leaf showed chimeras based on the chloroplast number in cell guard and stomata size.
Keywords: colchicines, Dendrobium sylvanum, mutation, number of chloroplast stomatal density.

## ABSTRAK
Mutasi dengan kolkisin pada PLBs hasil selfing Dendrobium sylvanum var. flava umur 2 bulan dilakukan  secara in  vitro dengan  tujuan  mempelajari  pengaruh  konsentrasi  kolkisin,  durasi perendaman  dalam  kolkisin,  media  proliferasi  terhadap  pertumbuhan  PLBs Dendrobium  sylvanum var. flava serta mengidentifikasi variasi ploidi berdasarkan variabel stomata. Penelitian disusun dalam Rancangan  Acak  Lengkap  Faktorial  3  Faktor  dengan  3  ulangan.  Faktor  pertama  ialah  konsentrasi kolkisin  yang  terdiri  atas  5  taraf  (0.02;  0.04,  0.06;  0.08;  dan  0.1%).  Faktor  kedua  ialah  durasi perendaman yang terdiri atas 4 taraf (1; 24; 48; 72 jam). Faktor ketiga ialah media proliferasi media V&W  yang  ditambah  BAP  terdiri  atas  2  taraf  (1;  0.5  mg  L -1 ).  Hasil  analisis  ragam  menunjukkan pengaruh kolkisin yang nyata  terhadap variabel persentase hidup. LD 50 pada media 1 mg L -1 BAP diperoleh  pada  konsentrasi  0.069%  dengan  durasi  perendaman  58.19  jam.  Pada  media  0.5  mg  L -1 BAP,  LD 50 diperoleh  pada  konsentrasi  0.054%  dengan  durasi  perendaman  47.63  jam.  Persentase mutan  poliploid  pada  MV2 Dendrobium  sylvanum var. flava ini  belum  dapat  ditentukan  karena stomata daunnya masih kimera berdasarkan karakter jumlah kloroplas sel penjaga dan ukuran stomata.
Kata kunci: Dendrobium sylvanum , jumlah kloroplas, kerapatan stomata, kolkisin, mutasi.

## PENDAHULUAN
1 Mahasiswa Pascasarjana, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor
2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor Jl. Meranti, Kampus IPB, Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
3 Balai Penelitian Tanaman Hias, Pusat Penelitian dan Pengembangan Hortikultura, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Kementrian Pertanian Jl. Raya Ciherang, Segunung, Pacet, Ciherang, Cianjur 43252, Jawa Barat, Indonesia Email: sasha_soma@yahoo.com (*Penulis korespondensi)
Dendrobium sylvanum var. flava
(2n=38) merupakan salah satu anggrek spesies potensial  sebagai  bunga  potong. Dendrobium sylvanum var. flava memiliki  jumlah  kuntum yang  banyak  yaitu  30-40  per  tangkai, bertangkai  panjang,  dengan  warna  sepal  petal yang  unik  yaitu  kuning  sementara  pada umumnya Dendrobium  sylvanum var. flava memiliki warna sepal petal coklat muda dengan garis coklat tua  serta  labellum  berwarna putih (Pfahl,  2017).  Namun  demikian, Dendrobium sylvanum var. flava memiliki bunga berukuran kecil  dan  corollanya  agak  tipis.  Salah  satu upaya  untuk  memperbaiki  ukuran  bunganya agar  lebih  besar  dengan  corolla  lebih  tebal sehingga lebih sesuai untuk bunga potong ialah melalui  pengandaan  kromosom  (poliploid). Menurut  Hartati et  al. (2014)  salah  satu kelebihan  tanaman  anggrek  poliploid  ialah memiliki  ukuran  bunga  lebih  besar  dan ketahanan  bunga  lebih  lama.  Saat  ini  telah banyak dilaporkan pemanfaatan teknik pemuliaan  tanaman  poliploid  menggunakan kolkisin  (Griesbach,  1985;  Silva et  al., 2000; Sulistianingsih et al., 2004; Bautista, 2005; Li et al., 2008; Sarathum et al ., 2010; Miguel dan Leonhardt,  2011;  Tharawood et  al .,  2012; Tiwari dan Mishra 2012; Yulianti et al., 2015; Tuwo  dan  Indrianto  2016;  He et  al., 2016; Atichart, 2013; Rahayu et al., 2015) Pada  galur  mutan  generasi  awal seringkali terjadi kimera pada sel-selnya. Untuk memisahkan  sel-sel  kimera  tersebut  maka masing-masing  sel  harus  diperbanyak  melalui sub  kultur  pada  media  proliferasi  yang  tepat. Untuk  menghindari  kimera,  Geier  (2012) menyarankan  sistem  regenerasi  sel  tunggal. Penggunaan  zat pengatur  sitokinin dan  auksin baik  secara  tunggal  atau  dikombinasikan dilaporkan mampu memproliferasi sel-sel yang telah  terpapar  mutagen  kolkisin  (Atichart, 2013).  Azmi  dan  Wiendi  (2013)  melaporkan penambahan 1 mg L -1 BAP mampu
menginduksi kalus dengan persentase tertinggi (48.61%) pada anggrek Paphiopedilum glaucophyllum J.J. Smith.
Dalam  banyak  penelitian  dilaporkan bahwa  ploidi  individu  tanaman  memiliki korelasi  dengan  karakter  stomatanya.  Adanya korelasi  ukuran  dan  jumlah  stomata  terhadap individu  poliploid  tersebut  menyebabkan analisis  stomata  ini  juga  sering  digunakan dalam  mengidentifikasi  individu  poliploid  pada populasi  diploidnya  (Miguel  dan  Leonhardt,
2011;  Tharawood et  al. ,  2012;  Tiwari  dan Mishra, 2012; Yulianti et al ., 2015; Rahayu et al ., 2015; Tuwo dan Indrianto, 2016; He et al ., 2016; Azmi et al ., 2016).
Konsentrasi  optimum  kolkisin  pada anggrek pada umumnya berkisar antara 0.01 – 0.1%, sementara durasi perendaman tergantung pada  eksplan  dan  metode  yang  digunakan (Suryo,  2007).  Penelitian  ini  bertujuan mempelajari  pengaruh  konsentrasi  dan  durasi perendaman kolkisin, media proliferasi, interaksinya  terhadap  pertumbuhan  PLBs
Dendrobium sylvanum var. flava serta mengidentifikasi  variasi  ploidi  berdasarkan peubah stomata.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium Kultur Jaringan Balai Penelitian Tanaman Hias Pasarminggu  dan  Laboratorium  Mikroteknik Institut Pertanian Bogor dari  bulan  November 2015  sampai  Maret  2017.  Penelitian  disusun menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap  3 faktor dengan 3 ulangan. Faktor pertama ialah konsentrasi kolkisin yaitu; 0.02% (K1); 0.04% (K2);  0.06  (K3);  0.08  (K4);  dan  0.1%  (K5). Faktor kedua ialah durasi perendaman kolkisin yaitu  1  jam  (T1);  24  jam  (T2);  48  jam  (T3); dan  72  jam  (T4).  Faktor  ketiga  ialah  media proliferasi  yaitu  media  dasar  Vacin  and  Went dengan  2  taraf BAP  yaitu 1  mg  L -1 (M1); 0.5 mg  L -1 (M2).  Media  yang  digunakan  berupa media dasar Vacin and Went (V&W) + 50 ml L -1 air kelapa + 20 g L -1 sukrosa + 7 g L -I agar +  0.1  mg  L -1 IAA,  dengan  kontrol  tanpa kolkisin. Eksplan yang digunakan adalah PLBs ( protocorm  like  bodies )  dari  semaian  biji anggrek Dendrobium sylvanum var. flava hasil selfing umur  2  bulan.  PLBs  direndam  dalam media V&W yang ditambahkan kolkisin sesuai perlakuan  dan  diletakkan  pada shaker dengan kecepatan 100 rpm dengan durasi sesuai durasi perendaman. Setelah perendaman  dalam kolkisin, PLBs ditanam pada media proliferasi, diletakkan  pada  ruang  inkubasi  suhu  25 0 C dengan intensitas penyinaran 1000 lux dan lama penyinaran 24 jam/hari.
Peubah  yang  diamati  pada  6  bulan setelah  perlakuan  kolkisin  ialah  persentase hidup dan persentase proliferasi. Data persentase  hidup  planlet  diambil  pada  MV1. Perhitungan  persentase  hidup  ialah  jumlah
planlet yang bertahan hidup dibagi jumlah total planlet yang ditanam dikalikan seratus persen. Data  persentase  PLBs  berproliferasi  diambil pada  MV1.  Perhitungan  persentase  proliferasi ialah jumlah planlet yang berploriferasi dibagi jumlah  total  planlet  yang  ditanam  dikalikan seratus  persen.  Peubah  yang  diamati  pada  12 bulan  setelah  perlakuan  kolkisin  ialah  jumlah tunas  pada  generasi  MV2  dengan  cara menghitung jumlah tunas total dari planlet yang hidup  pada  saat  sub  kultur  kedua.  Data  yang diperoleh  kemudian  dianalisis  menggunakan analisis  ragam  Uji  F  menggunakan  SAS  9.3. Jika  terdapat  beda  nyata  maka  dilanjutkan dengan  uji  DMRT dan  T-Dunnet  pada  taraf  α 5%.  Data Lethal  Dose 50  (LD 50 )  dianalisis menggunakan software CurveExpert 1.3.
Analisis  stomata  dilakukan  secara destruktif  pada  daun  teratas  yang  sudah membuka  sempurna  dari  3  planlet  per perlakuan.  Bagian abaxial daun  dikerik menggunakan  silet,  ditetesi  air  kemudian preparat  diamati  menggunakan  mikroskop dengan  perbesaran  400  kali.  Sebanyak  5 stomata diamati untuk dihitung panjang, lebar dan  jumlah  kloroplas  pada  sel  penjaga. Kerapatan stomata diperoleh dengan menghitung  jumlah  stomata  per  bidang pandang  (0.196  mm 2 ).  Kerapatan  stomata diambil  dari  3  bidang  pandang  yang  berbeda pada  satu  preparat.  Data  kerapatan  stomata, panjang  stomata,  lebar  stomata  dan  jumlah kloroplas pada sel penjaga, dihitung rerata dan standar  deviasi  nya  menggunakan Microsoft Office Excel 2010. Data rerata yang diperoleh digunakan untuk analisis gerombol menggunakan software STAR .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Lethal Dose 50 (LD 50 )
Pengaruh perendaman kolkisin terhadap Dosis lethal ( Lethal Dose ) kolkisin pada PLBs Dendrobium  sylvanum var. flava diamati dengan menumbuhkan pada media M1: V&W + 1 mg L -1 BAP dan media M2: V&W + 0.5 mg L -1 BAP  disajikan  pada  Tabel  1.  Pada  media M1 (V&W + 1 mg L -1 BAP) diperoleh LD 50 = 0.069%  dengan  durasi perendaman 58.19  jam dengan pola respon kematian linier yang berarti menunjukkan  semakin  tinggi  konsentrasi kolkisin dan semakin lama durasi perendaman maka  persentase  PLBs  yang  hidup  semakin rendah.  Hasil  ini  sejalan  dengan  yang dilaporkan  oleh  Sarathum et  al. (2010)  pada PLBs Dendrobium scabrilingue L.
Pada media 2 (V&W + 0.5 mg L -1 BAP), diperoleh  LD 50 =  0.054%  dan  durasi perendaman 47.63 jam. Hasil ini sejalan dengan hasil  Kerdsuwan  dan  Te-chato  (2012)  dengan perlakuan kolkisin menghasilkan respon kematian kuadratik pada anggrek Rhynchostylis gigantean var. rubrum .  Berdasarkan  Tabel  1 nampak  ada  perbedaan  pengaruh  konsentrasi BAP  terhadap  LD 50 pada  media  proliferasi yang  berbeda,  dengan  penambahan  1  mg  L -1 BAP  konsentrasi  kolkisin  untuk  mencapai LD 50 menunjukkan  nilai  lebih  tinggi  daripada konsentrasi  pada  media  proliferasi  dengan penambahan  0.5  mg  L -1 BAP.  Demikian  pula dengan  durasi  perendaman  dalam  kolkisin, LD 50 pada penambahan  1  mg  L -1 BAP menghasilkan  durasi  yang  lebih  lama  (58.19 jam) dibandingkan dengan penambahan 0.5 mg L -1 BAP.
Tabel 1. Nilai LD 50 kolkisin pada Dendrobium sylvanum var. flava secara in vitro Faktor Model Persamaan LD 50 R 2 Konsentrasi Kolkisin pada Media 1 Linear Fit y=86.69-530.47x 0.069 % 0.90 Durasi Perendaman pada Media 1 Quadratic Fit y=79.16-2.73x+0.04x 2 58.19 jam 0.81 Konsentrasi Kolkisin pada Media 2 Quadratic Fit y=80.28-642.60x+5168.18x 2 0.054 % 0.83 Durasi Perendaman pada Media 2 Quadratic Fit y=78.78-1.93x+0.03x 2 47.63 jam 0.95
Pertumbuhan  PLBs  Dendrobium  sylvanum var. flava MV2
Hasil  analisis  ragam  menunjukkan pengaruh  yang  nyata  dari  mutagen  kolkisin terhadap  semua  variabel  pertumbuhan  PLBs (data  tidak  disajikan).  Persentase  PLBs  hidup dari  hasil  perlakuan  kolkisin  berbeda  nyata dengan kontrol. Durasi perendaman dan media proliferasi sangat nyata mempengaruhi persentase hidup eksplan. Interaksi yang nyata antara  konsentrasi  dengan  durasi  perendaman kolkisin  diperoleh  pada  peubah  persentase hidup.  Interaksi  antara  konsentrasi  dengan durasi perendaman dan  interaksi antara  ketiga perlakuan  nyata  mempengaruhi  persentase eksplan  berproliferasi.  Jumlah  tunas  yang terbentuk  hanya  dipengaruhi  oleh  konsentrasi kolkisin. Hasil yang sama dilaporkan oleh He et al . (2016) yaitu persentase hidup ( survival rate ) Dendrathema  indicum var. aromaticum yang diberi  perlakuan  kolkisin  menunjukkan  nilai yang lebih rendah dibanding perlakuan kontrol. Persentase  hidup  dari  PLBs Dendrobium sylvanum var. flava yang  telah  mendapat perlakuan  kolkisin  nyata  dipengaruhi  oleh interaksi  antara  konsentrasi  dengan  durasi perendaman dan interaksi antara media dengan durasi perendaman (Tabel 2). Rerata persentase hidup  PLBs  tertinggi  perlakuan  durasi perendaman  72  jam  pada  semua  level
konsentrasi  kolkisin  namun  tidak  berbeda dengan kontrol. Perlakuan durasi perendaman 1 jam juga menunjukkan rerata persentase hidup yang  tidak  berbeda  dengan  kontrol,  kecuali pada  konsentrasi  0.1%.  Hal  tersebut  dapat dijelaskan  karena  ada  pengaruh  media  yang digunakan, dimana BAP yang digunakan baik pada konsentrasi 1 mg L -1 maupun 0.5 mg L -1 menunjukkan  hasil  persentase  hidup  yang tinggi. Hasil yang diperoleh pada penelitian ini sama  dengan  hasil  penelitian  Atichard  (2013) yang  memperlihatkan  persentase  hidup  PLBs yang  rendah  pada  konsentrasi  0.03%  dengan durasi perendaman 3 hari tetapi kemudian pada durasi  yang  lama  (4  dan  5  hari)  persentase hidupnya kembali tinggi.
Rerata  persentase  proliferasi  tertinggi diperoleh  pada  perlakuan  durasi  perendaman kolkisin 72 jam (Tabel 3). Media V&W dengan 1  mg  L -1 BAP  menginduksi  proliferasi  yang lebih tinggi pada PLBSs yang diinduksi mutasi dengan  konsentrasi  kolkisin  0.06%  -  0.1%, sedangkan  pada  kolkisin  0.02%  dan  0.04% proliferasi lebih tinggi pada media V&W yang ditambahkan 0.5 mg L -1 BAP.  Atichart (2013) melaporkan penambahan 1 mg L -1 NAA dan 0.5 mg  L -1 BA  pada  media  V&W  menghasilkan proliferasi tunas tertinggi pada PLBs Dendrobium chrysotoxum yang telah dimutasi kolkisin dengan konsentrasi 0.01% dan 0.02%.
Tabel 2.  Interaksi  durasi  perendaman  dengan  konsentrasi  kolkisin  dan  BAP  terhadap  persentase hidup PLBs Dendrobium sylvanum var. flava pada MV1 Perlakuan Durasi Perendaman dalam Kolkisin (jam) 1 24 48 72 Konsentrasi Kolkisin (%) ..............................Persentase Hidup PLBs (%).............................. Kontrol 90.8 0.02 86.9 a 40.4 def* 51.1 bcdef 88.5 a 0.04 73.4 abcd 46.5 cdef* 57.3 abcdef 82.7 ab 0.06 65.4 abcde 55.5 abcdef 30.5 f* 76.3 abc 0.08 74.0 abcd 23.3 f* 36.7 f* 83.4 ab 0.1 30.9 f* 47.3 cdef* 65.1 abcde 81.4 abc KK (%) = 30.7 BAP (mg L -1 ) ..............................Persentase Hidup PLBs (%).............................. Kontrol 90.9 1.0 59.1 bc* 42.7 cd* 33.6 d* 83.1 a 0.5 77.4 ab 45.4 cd* 56.4 c* 81.8 a KK (%) = 30.4
Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT dengan α 5%, *= berbeda nyata terhadap kontrol berdasarkan hasil uji T-dunnet dengan α 5%.
Tabel 3. Interaksi konsentrasi, durasi perendaman kolkisin, dan media proliferasi terhadap persentase eksplan berproliferasi Dendrobium sylvanum var. flava pada MV1
Konsentrasi Kolkisin (%) BAP (mg L -1 ) Durasi Perendaman dalam Kolkisin (jam) 1 24 48 72 Kontrol 42 ............... Eksplan Berproliferasi (%)............... 0.02 0.5 26.7 d-i 20.0 e-i 60.0 a-i 72.3 a-d 0.04 0.5 63.3 a-g 14.8 g-i 16.7 f-i 93.3 ab 0.06 0.5 70.0 a-d 33.3 d-i 36.7 g-i 43.3 b-i 0.08 0.5 77.3 a-d 08.3 i 09.3 i 69.1 a-f 0.1 0.5 66.7 a-g 33.3 d-i 28.3 d-i 67.8 a-f 0.02 1 50.0 a-i 50.0 a-i 30.0 d-i 62.5 a-h 0.04 1 46.6 a-i 49.1 a-i 53.3 a-i 53.1 a-i 0.06 1 30.0 d-i 34.4 c-i 13.3 h-i 63.3 a-h 0.08 1 16.6 f-i 26.7 d-i 33.3 d-i 96.49 a 0.1 1 22.4 e-i 30.0 d-i 16.7 f-i 86.7 abc
KK (%) = 57.45
Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT dengan α 5%, *= berbeda nyata terhadap kontrol berdasarkan hasil uji T-dunnet dengan α= 5%.
Durasi  perendaman  berpengaruh  nyata terhadap  jumlah  tunas.  Rerata  jumlah  tunas tertinggi  diperoleh  pada  PLBs  yang  direndam kolkisin  selama  72  jam  sebanyak  4.1  tunas, sementara  jumlah  tunas  terendah  ditunjukkan oleh  durasi  perendaman  24  jam  sebanyak  2.4 tunas (data tidak disajikan).

## Karakter Stomata Daun
Hasil  analisis  stomata  daun  planlet Dendrobium  sylvanum var. flava pada  MV2 menunjukkan fenomena
kimera yang
ditunjukkan  oleh  adanya  stomata  berukuran lebih besar diantara stomata berukuran normal dan stomata dengan jumlah kloroplas pada sel penjaga lebih banyak dari normalnya (Gambar 1).  Kimera  yang  terjadi  pada  induksi  mutasi dapat  diakibatkan  oleh  penyerapan  mutagen yang  berbeda  pada  tingkat  individu,  jaringan, maupun organ. Kimera juga dapat diakibatkan oleh  jenis  mutagennya.  Fenomena  kimera lebih  banyak  dijumpai  pada  induksi  mutasi dengan  kolkisin  dibanding  dengan  oryzalin (He et al ., 2016).
Keterangan: K5T2M2.2 = Konsentrasi kolkisin 0.1%, durasi perendaman kolkisin 24 jam, media proliferasi 0.5 mg L -1 BAP,  galur  2.  Jumlah  kloroplas  pada  sel  penjaga  stomata  (k),  panjang  stomata  (p),  lebar  stomata  (l), tanda  panah  menunjukkan  stomata  nomer  4.  a)  satu  bidang  pandang  sediaan  permukaan  bawah  daun galur K5T2M2.2, b-e) stomata (µm) pada galur K5T2M2.2, dan f) stomata (µm) kontrol.
Gambar  1.  Kimera  stomata  daun  planlet Dendrobium  sylvanum var. flava MV2  pada  perlakuan K5T2M2.2  (konsentrasi  kolkisin  0.1%,  durasi  perendaman  kolkisin  24  jam,  media proliferasi 0.5 mg L -1 BAP, galur 2). Stomata 1    Stomata 2    Stomata 3     Stomata 4     Stomata Kontrol k = 40 k = 44 k = 54 k = 65 k = 25 p = 36 p = 40 p = 39 p = 44 p = 35 l  = 31 l  = 29 l  = 34 l  = 39 l  = 24 a b c d e f
Keterangan:  Genotipe  K (0-5) T (0-4) M (1-2) .n  :  genotipe  yang  digunakan  sebagai  sampel  pada  perlakuan  konsentrasi kolkisin (K0-K5), durasi perendaman kolkisin (T0-T4), dan media proliferasi (M1 dan M2), genotipe ke-n.
Gambar 2. Dendogram analisis gerombol genotipe planlet Dendrobium sylvanum var. flava MV2 berdasarkan karakteristik panjang, lebar, dan kerapatan stomata serta jumlah kloroplas pada sel penjaga.
G en o ti p e K (0 -5) T (0 -4) M (1 -2) .n I V III II I
Pada Gambar 1 tersebut, terlihat bahwa dari  4  sampel  stomata  dari  satu  daun menunjukkan  stomata  “e”  memiliki  ukuran stomata lebih besar dan jumlah kloroplas lebih banyak.  Munculnya  kimera  ini  menunjukkan bahwa  pada  generasi  MV2  ini  mutasi  yang terjadi belum bersifat solid. Hal tersebut berarti bahwa  untuk  mengetahui  apakah  mutasi  yang dihasilkan sudah benar-benar solid atau  justru hilang  karena  peristiwa diplotic  selection , maka perlu dilakukan beberapa kali subkultur, sehingga  mutan  solid  baru dapat dikonfirmasi pada generasi lanjut (MV3 dan seterusnya).

## Analisis  Gerombol  Galur  Dendrobium
sylvanum var. flava MV2

## Hasil  analisis  gerombol  berdasarkan
Agglomerative  Cluster  Analysis dengan  jarak Eucledean  dan  metode  penggerombolan  ward pada  mutan  MV2 Dendrobium  sylvanum var. flava membentuk empat gerombol (Gambar 2). Dari  hasil  penggerombolan  tersebut, gerombol  4  memperlihatkan  karakteristik panjang dan lebar stomata yang bernilai tinggi, kerapatan  rendah,  dan  jumlah  kloroplas  pada sel penjaga stomatanya lebih banyak dibanding kontrol  (Tabel  4).  Pada  umumnya,  individu poliploid memiliki ukuran stomata lebih besar, kerapatan  stomata  rendah,  serta  jumlah kloroplas  pada  sel  penjaga  nya  lebih  banyak, dibandingkan  dengan  diploidnya  (Miguel  dan Leonhardt,  2011;  Tharawood et  al .,  2012; Tiwari dan Mishra, 2012; Yulianti et al ., 2015; Tuwo  dan  Indrianto,  2016;  He et  al .,  2016). Berdasarkan  karakter  stomata  dan  kloroplas pada  sel  penjaga  stomata  pada  gerombol  4 tersebut  diduga  gerombol  4  berisi  individu poliploid. Genotipe generasi MV2 yang masuk
dalam  gerombol  4  ini  ada  13  individu  MV2, yaitu  K1T2M2.3,  K1T4M1.1,  K1T4M2.2, K1T4M2.3, K2T2M2.2, K2T3M2.1, K2T3M2.2, K3T3M1.1 K3T3M1.2, K4T3M2.2, K5T2M2.1, K5T3M2.1,  dan  K5T4M1.2.  Sarathum et  al . (2010) melaporkan konsentrasi yang tinggi dan durasi  yang  lama  menghasilkan  persentase poliploid tertinggi pada Dendrobium scabrilingue L.
Pada  penelitian  ini,  salah  satu  mutan putatif diduga poliploid diperoleh juga dengan perlakuan  konsentrasi  kolkisin  tinggi  dalam durasi perendaman lama yaitu galur K5T4M2.2 (konsentrasi kolkisin 0.1%, durasi perendaman kolkisin selama 72 jam, pada media proliferasi 0.5 mg L -1 BAP). Dari 13 genotipe yang masuk pada gerombol 4, semua perlakuan konsentrasi dan  durasi  perendaman  serta  media  kultur, ditemukan  genotipe  diduga  mutan  poliploid. Namun, keberadaan kimera menunjukkan pada MV2  belum  dapat  dipastikan  galur-galur poliploid  yang  solid  sehingga  masih  perlu dilakukan subkultur kembali untuk mendapatkan mutan solid. Chang et al . (2014)
melaporkan  peningkatan  persentase  sel  mutan poliploid sebesar 75.8%-96.6% dengan subkultur mutan kimera sebanyak 4-6 generasi pada grapevine.
Pemanfaatan  metode  deteksi  ploidi dengan menghitung jumlah kloroplas pada sel penjaga terbukti bermanfaat pada seleksi putatif poliploid  pada  fase  pertumbuhan  awal  pada pertanaman  dalam  jumlah  banyak.  Disamping itu, teknik deteksinya lebih mudah dibandingkan dengan menghitung jumlah kromosom. Namun demikian,  uji  sitologi  perlu  dilakukan  untuk memastikan  ploidi  dari  setiap  putatif  yang dihasilkan.
Tabel 4. Rerata karakter panjang stomata, lebar stomata,  kerapatan stomata, serta jumlah kloroplas pada sel penjaga stomata pada MV2 Gerombol Jumlah Galur Panjang (µm) Lebar (µm) Jumlah Kloroplas Kerapatan Kontrol 6 31.74 ± 2.07 29.72 ± 3.58 24.72 ± 5.14 64.25 ±   5.45 1 51 30.93 ± 2.04 28.00 ± 2.44 26.13 ± 3.57 71.32 ± 10.48 2 37 30.54 ± 2.57 29.45 ± 2.14 24.99 ± 5.46 51.63 ±   8.89 3 18 33.81 ± 1.58 29.02 ± 1.64 34.67 ± 6.76 77.17 ±   7.29 4 13 37.64 ± 1.91 34.39 ± 1.97 44.52 ± 6.40 46.80 ±   8.09
Keterangan: Nilai rerata karakternya merupakan nilai rerata karakter dari sejumlah galur yang diperoleh pada analisis gerombol Dendrobium  sylvanum var. flava berdasarkan Agglomerative  Cluster  Analysis dengan  jarak eucledean dan metode penggerombolan ward.

## KESIMPULAN
LD 50 Dendrobium  sylvanum var. flava yang  dimutasi  dengan  kolkisin  pada  media proliferasi  1  mg  L -1 BAP  diperoleh  pada konsentrasi  kolkisin  0.069%  dan  durasi perendaman 58.19 jam. Pada media proliferasi 0.5  mg  L -1 BAP,  LD 50 diperoleh  pada konsentrasi  0.054%  dan  durasi  perendaman 47.63  jam.  Perlakuan  konsentrasi  dan  durasi perendaman  kolkisin,  serta  media  proliferasi berpengaruh nyata terhadap keragaman persentase hidup. Persentase proliferasi pada 6 bulan  setelah  subkultur  dan  jumlah  tunas setelah 12 bulan subkultur tidak berbeda nyata dengan kontrol. Media proliferasi 1 mg L -1 BAP menunjukkan  rerata  persentase  proliferasi tertinggi  (96.5%)  pada  perlakuan  konsentrasi kolkisin  0.08%  dengan  durasi  perendaman  72 jam.  Media  proliferasi  0.5  mg  L -1 BAP, persentase  proliferasi  tertinggi  (93.3%)  pada konsentrasi  kolkisin  0.04%  dengan  durasi perendaman  72  jam.  Persentase  mutan poliploid  pada  MV2 Dendrobium  sylvanum var. flava ini  belum  dapat  ditentukan  karena stomata  daunnya  masih  berupa  kimera berdasarkan  karakter  jumlah  kloroplas  sel penjaga stomata daun dan ukuran stomata daun.

## DAFTAR PUSTAKA
Atichart,  P.  2013.  Polyploid  induction  by colchicine treatments and plant regeneration of Dendrobium chrysotoxum .  Thai.  J.  Agric.Sci.  46(1): 59-63. Azmi, T.K.K., N.M.A. Wiendi. 2013. Perbanyakan anggrek spesies Paphiopedilum glaucophyllum J.J. Smith melalui proliferasi tunas adventif secara in vitro . J. Hort. Indonesia. 4(3): 131-139.
Azmi,  T.K.K.,  D.  Sukma,  S.A.  Aziz,  M.
Syukur. 2016. Morfologi dan
pertumbuhan  planlet  hasil  induksi poliploidi  melalui  perlakuan  kolkisin pada  kuncup  bunga  anggrek  Bulan ( Phalaenopsis  amabilis (L) Blume ).  J.
Agron. Indonesia. 44(1): 68-75.
Bautista,  N.R.  2005.  Polyploidy  Breeding  in Orchids.  Philippine  Orchid  Review. http://www.philorchidsociety.org/index. php?option=com_content&task=view&i d=43&Itemid=38. [28 Agustus 2017].
Chang,  Y.Y,  X.  Ji,  J.L.  Zhu,  Y.  Hao.  2014. Polyploidy  induction  of  mutation  by using  colchicine  on  tube  seedlings  of Victoria  Grape.  Acta  Hort.  1046:  265- 270.
Geier,  T.  2012.  Chimeras:  properties  and dissociation  in  vegetatively  propagated plants. Di dalam QY Shu, BP Forster, H Nakagawa,  editor.  Plant  Mutation
Breeding  and  Biotechnology.  London (GB). Guternberg Press Ltd. 191-201.
Griesbach R.J. 1985. Polyploidi in Phalaenopsis  orchids  improvement.  J. of  Heredity.  76:  74-75.  http://images2. wikia.nocookie.net/orchids/en/images/2
/28/Polyploidy_in_Phalaenopsis_Orchi d_Improvement.pdf. [10 Agustus 2017].
Hartati,  S.,  L.  Darsana,  O.  Cahyono.  2014.
Studi  karakterisasi  anggrek  secara sitologi dalam rangka pelestarian plasma  nutfah.  Caraka  Tani.  J.  Ilmu-
Ilmu Pertanian. 29(1): 25-30.
He, M., W. Gao, Y. Gao, Z. Liu, X. Yang, H. Jiao,  Y.  Zhou.  2016.  Polyploidy induced  by  colchicine  in Dendrathema indicum var. aromaticum ,  a  scented Chrysanthemum .  Eur.  J.  Hortic.  Sci.
81(4): 219-226. Kerdsuwan,  N.,  S.  Te-chato.  2012.  Effects  of colchicine on survival rate, morphological, physiological and cytological  characters  of  Chang  Daeng orchid  ( Rhynchostylis  gigantean var. rubrum Sagarik)  in  vitro.  J.  of  Agric. Tech. 8(4): 1451-1460.
Li, H., S. Zheng, I. Chunlin. 2005. Induction of polyploidy  in Dendrobium  devonianum .
Yunnan Zhiwu Yanjiu. 27:552-556.
Miguel,  T.P.,  K.W.  Leonhardt.  2011.  In  vitro polyploidy  induction  of  orchids  using oryzalin. Sci. Hort. 130: 314-319.
Pfahl,  J.  2017. Dendrobium  sylvanum . http://www.orchidspecies.com/densylva num.htm. [13 Juli 2017].
Rahayu,  E.M.D.,  D.  Sukma,  M.  Syukur,
Irawati. 2015. Induksi poliploidi Phalaenopsis  amabilis (L.)  Blume  dan
Phalaenopsis  amboinensis J.J.  Smith dengan colchicine dalam kultur in vitro . J. Agron. Indonesia. 43(3): 219-226.
Sarathum,  S.,  M.  Hegele,  S.  Tantiviwat,  M. Nanakorn. 2010. Effect on concentration and duration of colchicine treatment on polyploidy  induction  in Dendrobium scabrilingue L.  Europ.  J.  Hort.  Sci . 75(3): 123-127.
Silva,  P.A.K.X.M.,  C.J.  Sidia,  H.B.Z.  Maria.
2000.  Induction  and  identification  of polyploids  in Cattlea  intermedia Lindl
(Orchidaceae)  by  in  vitro  techniques. Ciencia Rural. 30(1): 105-111.
Sulistianingsih, R., Z.A. Suyanto, E.N. Anggia. 2004.  Peningkatan  kualitas  anggrek Dendrobium hibrida  dengan  pemberian kolkisin. Ilmu Pertanian. 11(1): 13-21.
Suryo,  A..  2007.  Sitogenetika.  Gadjah  Mada University Press. Yogyakarta. 217-220.
Tharawood,  T.,  W.  Samyam,  S.  Vessabutr. 2012. Colchicine induced polyploidy of in  vitro Impatients patula Craibs. Thai. J. of Bot. 4: 75-80.
Tiwari,  A.K.,  S.K.  Mishra.  2012.  Effect  of colchicine  on  mitotic  polyploidization and  morphological  characteristics  of Phlox drummondi . African. J. Biotechnology. 11(39): 9336-9342.
Tuwo, M., A. Indrianto. 2016. Improvement of orchid  Vanda  hybrid  ( Vanda  limbata Blume  x Vanda  tricolor Lindl.  var. suavis ) by colchicines treatment in vitro. Modern.  Applied.  Science.  10(11):  83- 89.
Yulianti, F., A. Purwito, A. Husni, D. Dinarti. 2015.  Induksi  tetraploid  tunas  pucuk jeruk Siam Simadu ( Citrus nobiris Lour) menggunakan colchicine secara in vitro . J. Agron. Indonesia. 43(1): 66-71.