## PENGARUH CHLOROQUINE TERHADAP
INTERLEUKIN-1β , AKTIVASI CASPASE-1 DAN SURVIVAL RATE PADA TIKUS MODEL SEPSIS
EFFECT OF CHLOROQUINE ON INTERLEUKIN-1β, CASPASE-1 ACTIVATION AND

## SURVIVAL RATE ON MOUSE SEPSIS MODEL
Aryo Suseno. Tatar Sumandjar. H M Bambang Purwanto. Bagian Ilmu Penyakit Dalam RS Dr.Moewardi – FK Universitas Sebelas Maret Surakarta.
Korepondensi: Aryo Suseno: aryosuseno23@gmail.com
ABSTRAK
Sepsis masih merupakan salah satu penyebab kematian tertinggi di ruang rawat intensif. Mekanisme sepsis belum diketahui secara penuh. Perlunya metode-metode baru dalam penanganan sepsis. Penelitian-penelitian baru menemukan adanya peran dari Nod-like Receptor dan inflammasome. Chloroquine menunjukkan hasil yang cukup  menjanjikan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  qloroquin  terhadap  interleukin-1β, aktivasi caspase-1 dan survival rate pada tikus model sepsis. Penelitian adalah eksperimen hewan coba (Rattus norvegicus) yang disepsiskan dengan Cecal Ligation and Puncture (CLP). Sampel 52 tikus, dibagi menjadi 2 kelompok; Kelompok 1 untuk IL-1β dan kelompok 2 aktivasi Caspase-1. Tiap kelompok dibagi 3 sub kelompok; kontrol tanpa CLP + placebo (NaCl 0.9% 2ml), perlakuan dengan CLP + placebo, dan kelompok terapi dengan CLP  +Chloroquine  (CHQ)  50mg/Kg  BB  personde.  Terapi  dan  placebo  diberikan  24,  48  dan  72  Jam  setelah CLP. Tikus mati dan moribund dicatat sebagai mortalitas. Pada hari ke 6, tikus yang hidup diambil darahnya dan dikorbankan dengan dislokasi servikal. Kadar IL-1β dengan ELISA pada serum, Aktivasi Caspase-1 dengan Flowcytometry dengan pewarnaan FLICA 660 pada Peripheral Blood Mono-Nuclear Cells (PBMC) dan Whole Blood (WB).  Analisis  dengan SPSS 22. Beda rerata masing-masing subkelompok dianalisa dengan ANOVA bila distribusi normal dan atau uji Kruskal-Wallis dilanjutkan dengan Mann–Whitney.Hasil penelitian menunjukkan tidak adanya perbedaan survival rate yang bermakna antar sub-kelompok dan antar kelompok (mean 52 vs 62, CI: (-37.32) - 27.98, P=0.767). Didapatkan rerata kadar IL-1β yang lebih rendah pada kelompok terapi dibanding kelompok perlakuan (mean 0.08975 vs 0.09680 CI: (-0.024) – 0.0097, P=0,376), namun tidak bermakna secara statistik. Rerata tingkat aktivasi Caspase-1 pada PBMC (mean 9,46 vs 15.04 CI: (-6.72) – 24.82 , P=0.865) dan WB (mean 2,99 vs 10,99 CI: (-5.303) – 5.844, P=0.478) lebih rendah pada kelompok terapi dibanding perlakuan walaupun  tidak  bermakna  secara  statistik.  Penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  penghambatan  kadar  inflamasi tidak berhubungan langsung dengan survival rate. Mekanisme anti-inflamasi Chloroquine, salah satunya, tampak melewati jalur inflammasome.
Kata kunci: Sepsis, Chloroquine, Inflammasome, Caspase-1, IL-1β, Survival rate.

## ABSTRACT
Sepsis is still one of the main mortality cause in intensive care. The sepsis mechanism is still not fully undertood. The need to develop new method and strategies is imperative. Recent studies has higlighted the role of Nod-like Receptor and inflammmasome. Chloroquine has show promising results in animal studies. This aimed of this study is determine the effect of qloroquin toward  interleukin-1β, activation of caspase-1 and survival rate in mice model of sepsis.This is an animal base experimental study (Rattus norvegicus) which induce sepsis by Cecal Ligation and Puncture (CLP) method. Total of 52 mouse use as sample, divided into 2 groups; IL-1β group and Caspase-1 activation group. Each group are further divided to 3 sub-group; Control without CLP + placebo (NaCl 0.9% 2ml), intervention group with CLP + placebo, and treatment group with CLP + Chloroquine (CHQ) 50mg/ Kg BB orally administer. The treatment or placebo are given on 24, 48 and 72 hours after CLP. Dead mouse or in moribund condition are noted as mortality. On the 6 th day, all surviving animals are bled and euthenised by cervical dislocation. IL-1β serum levels are measured by ELISA, Caspase-1 activation are analyzed by Flowcytometry with FLICA 660 staining on Peripheral Blood Mono-Nuclear Cells (PBMC) and Whole Blood (WB). Statistical analysis are done by SPSS 22. Difference of mean between sub-group is analyzed by ANOVA in case of normally distributed data or with Kruskal-Wallis continue by the Mann–Whitney test. This study do not show any difference
in survival rate between groups and sub-groups. (mean 52 vs 62, CI: (-37.32) - 27.98, P=0.767). The mean of IL- 1β level are lower in the treatment group compares to the intervention group, although not statistically significant (mean 0.08975 vs 0.09680 CI: (-0.024) – 0.0097, P=0,376). The average of Caspase-1 activation are also lower in the treament PBMC sub-group (mean 9,46 vs 15.04 CI: (-6.72) – 24.82, P=0.865) as well as in the WB (mean 2,99 vs 10,99 CI: (-5.303) – 5.844, P=0.478) but no statistical significance is detected. This study shows that the inhibition of inflammation is not directly coresponds to survival rate. One of the anti-inflammatory mechanism of Chloroquine presumably through inflammasome pathway.
Keywords: Sepsis, Chloroquine, Inflammasome, Caspase-1, IL-1β, Survival rate.
PENDAHULUAN Sepsis adalah adanya suatu infeksi (kemungkinan  atau  terbukti)  bersama  dengan manifestasi sistemik dari infeksi (Dellinger et al, 2012).  Patofisiologi  sepsis  yang  dianut  sampai saat  ini  adalah  adanya  kondisi  hiper-inflamasi yang terpicu oleh adanya infeksi yang mana akan merusak tubuh penderita (Hermawan, 2008; Hermawan,  2011).  Walaupun  dengan  kemajuan ilmu kedokteran yang pesat para ahli telah dapat banyak mengungkap misteri dari sepsis, namun sepsis masih merupakan masalah dunia medis yang pelik. Pada tahun 2000 di Amerika Serikat, sepsis meningkat 9% setiap tahunnya, mengenai 240 orang tiap 100.000 penduduk. Sepsis menjadi penyebab kedua terbanyak penyebab admisi perawatan intensif non kegawatan kardiovaskular, 10-14% penyebab admisi ICU dari total dan merupakan penyebab kematian tertinggi kesepuluh di negara-negara maju, membunuh 200.000 orang di amerika dan 37.000 orang di Inggris tiap tahunnya dengan tingkat mortalitas mencapai 28- 50% (Van der Poll & Opal, 2008).
Penelitian-penelitan baru mengungkapkan beberapa target terapi baru pada sepsis. Salah satunya  melewati  jalur  aktivasi  Inflammasome NOD- like receptor (NLR).  NLR  adalah  salah satu jenis dari Pattern  Recognition  Receptor (PRR).  PRR  adalah  komponen  utama  dari sistem imun bawaan ( Innate )  yang  mengenali sinyal-sinyal bahaya, seperti infeksi bakteri, dan kemudian memicu respon kekebalan tubuh. PRR mengenali pola-pola khusus dari mikroorgnisme yang terdapat pada patogen yang disebut sebagai Pathogen-associted  molecular  pattern (PAMP) seperti  Lipopolisakarida  (LPS),  Peptidoglikan, Lipopeptida  (komponen  dari  banyak  patogen), Asam Lipoteikoik (dinding sel bakteri gram positif),  Flagelin  (faktor  mobilitas  bakteri),  dan DNA bakteri (Bianchi, 2007; Kawai & Akira, 2010). PRR juga dapat mengenali sinyal bahaya
endogen, yang disebut alarmins atau Danger– associated  molecular  pattern (DAMP),  yang dilepaskan pada saat tubuh inang mengalami stres  inflamasi  (misalnya,  luka  bakar,  trauma, dan  nekrosis  jaringan),  yang  kemudian memperingatkan sistem kekebalan tubuh terhadap bahaya yang akan datang (Kawai & Akira, 2011).
NLR berdasarkan letaknya yang berada di sitoplasma sel, bertugas untuk mengenali materi- materi PAMP atau DAMP yang masuk ke dalam sel. Ini termasuk DNA dan RNA virus, LPS yang berhasil masuk ke dalam sel, produksi sitokin pro- inflamasi  endogen  sel,  komponen  bakteri  gram negatif yang masuk dalam sel via jalur sekretori bakteri tipe 3 dan tipe 4, dan sebagainya. PRR sitosilik ini dibagi menjadi dua golongan besar berdasarkan susunan N-terminalnya. NLRP yang mengandung domain  Pyrin dan NLRC yang mengandung domain CARD. Dari kedua golongan besar tersebut, telah diidentifikasi beberapa NLR, akan tetapi yang sampai saat ini yang paling banyak  dipelajari  adalah  NLRP-3  (Bournefiend &  Hornung,  2013).  NLR  pada  dasarnya  akan mengaktifkan protein pro Caspase-1 yang bertugas merubah bentuk inaktif pro IL-1β dan pro IL-18 menjadi bentuk aktif IL-1β dan IL-18 yang dapat disekresikan  keluar  sel  untuk  mengamplifikasi reaksi  inflamasi.  NLR  juga  dapat  menginduksi Pyroptosis di mana akan menyebabkan kematian sel  dan  terlepasnya  berbagai  mediator  inflamasi. Dari beberapa NLR tersebut di atas, yang paling banyak dipelajari adalah NLRP3 dikarenakan keunikannya karena dapat distimulasi oleh berbagai macam DAMP dan PAMP atau bahkan disregulasi dari lingkungan intrasel seperti influks calsium dan efluks kalium (Bournefield & Hornung, 2013; Wen et al , 2013). Chloroquin atau Hydroxy-Chloroquine merupakan obat anti-malaria yang mempunyai efek  anti-inflamasi  dan  telah  digunakan  sebagai agen DMARD. Chloroquine telah diketahui
mampu menghambat produksi HMGB-1 pada mencit yang diinduksi oleh LPS.  Beberapa penelitian menunjukkan bahwa Chloroquine dapat mengahambat produksi TNF-α , IL-6, dan IL-1 . Pada satu penelitian, produksi HMGB-1 dihambat produksinya terlepas dari aktivasi TLR4 yang merupakan PRR utama yang mengenali LPS di membran sel dan telah dikaitkan dengan penghambatan  pembentukan  inflammasome (Lamkanfi et al ,  2010).  Dikarenakan HMGB1 merupakan mediator fase lambat yang mana biasanya dikeluarkan setelah nekrosis sel, hal ini menimbulkan pertanyaan apakah efek anti- inflamasi Chloroquine berada pada penghambatan sistem inflammasome atau dikarenakan penghambatan kematian sel.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh Chloroquine pada kadar IL-1β, aktivasi Caspase-1 dan survival rate pada sepsis.
METODE PENELITIAN Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental berbasis hewan, dengan memberi perlakuan terhadap tikus Rattus  norvegicus sebagai hewan coba di laboratorium. Dipilihnya jenis penelitian ini karena dapat menghasilkan data dengan validitas yang tinggi dikarenakan perlakuan dan kondisi percobaan dapat diatur oleh peneliti sehingga dapat mengurangi bias-bias yang mungkin  menggangu  analisa  (Zainuddin,  1999). Penelitian dilakukan di Laboratorium Biomedik, Laboratorium Histologi dan Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT), Kementerian Kesehatan, Tawangmangu.
Subjek penelitian adalah tikus putih jantan ( Rattus  norvegicus )  dewasa  dengan  berat  badan 150-200 gram dan berumur 3-4 bulan. Bahan makanan tikus putih yang digunakan adalah BR I. Pada penelitian ini diadakan dua kelompok yang mana pada kelompok pertama untuk mengukur kadar IL-1 Beta plasma dan kelompok kedua untuk mengukur aktivasi Caspase-1 . Kedua kelompok kemudian dibagi lagi menjadi 3 sub-kelompok; 1) Kelompok perlakuan yang dilakukan prosedur CLP yang diberi plasebo NaCl 0,9% , Kelompok terapi yang dilakukan prosedur CLP yang diberi perlakuan dengan Chloroquine oral, dan kelompok Kontrol adalah kelompok tikus tanpa prosedur CLP dan diberi NaCl 0,9% peroral, disebut “K”. Untuk mengurangi bias sampling, maka teknik
pengelompokan sampel pada penelitian ini adalah dengan menggunakan random sampling . Untuk pengambilan besar sampel dihitung berdasarkan rumus besar sampel: n =  (Steel and Torrie, 1980) σ 2 diambil dari studi yang sama sebelumnya atau  maka  diasumsikan  σ 2 ≈  δ 2 ,  sehingga hasilnya : n =   (Z½ α  +  Zβ) 2 n =  (1,645    +    0,842) 2 = 6,185 dibulatkan menjadi 6
Minimal sampel tiap kelompok adalah 6 ekor tikus putih. Dalam penelitian ini kami menggunakan minimal 6 sampel untuk setiap kelompoknya, namun dikarenakan karena tingkat mortalitas sepsis cukup tinggi, pada kelompok yang dilakukan prosedur CLP yang bersifat invasif dan diketahui akan menimbulkan tingkat sepsis yang lebih berat (Menezes et al .  2008), Pada penelitian ini digunakan 10 sampel. CLP dilakukan setelah aklimatisasi 1 minggu. Pemberian Choloroquine atau NaCl 0,9% dilakukan pada jam  ke 24, 48, dan 72 sejak dilakukannya CLP. Sejak hari ke-1 sampai hari ke-5. Semua kelompok diberi diet standar. Setiap jumlah makanan yang dihabiskan, dan diperiksa akan tanda-tanda sepsis seperti hudling , inaktivitas, diare, dan piloereksi. Pemeriksaan survival rate dilakukan setiap 24 jam sejak dilakukannya CLP. Tikus yang menunjukkan tanda-tanda mendekati kematian ( Moribund state ), dikorbankan dan dicatat sebagai mortalitas. Pada hari ke 6 dilakukan pengambilan sampel darah  (@2ml)  dan  kemudian  semua  tikus  yang masih hidup dikorbankan. Perlakuan pada tikus mengikuti standar Humane  end-point (ENV/JM/ MONO,2000) Kadar IL-1β diperiksa dari plasma darah tikus. Sampel darah diambil melalui pembuluh darah sinus orbita dengan menggunakan pipet kaca dan diletakkan dalam tabung steril, lalu dibiarkan selama 2 jam pada suhu kamar kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Plasma yang terpisah kemudian diambil dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur pemeriksaan ELISA dengan menggunakan reagen IL-1β tikus ( Thermo Fisher Scientific , USA). Pengukuran aktivasi Caspase- 1 dilakukan dengan cara Flowcytomery pada isolate Peripheral Blood  Mono-Nuclear  Cells (PBMC)  dan  Whole
blood tikus percobaan. Reagen yang digunakan adalah FLICA  660  Caspase-1  Assay  far-red fluorescence ( Immunochemistry  Technologies, USA )  Aktivasi Caspase-1 kemudian diukur dengan bantuan alat Flowcytometry Fluorochrome detector 4 .
Data disajikan dalam bentuk mean  ±  SD kemudian dianalisis menggunakan SPSS  22  for windows. Pemilihan analisis statistik dilakukan setelah dilakukan uji normalitas data dengan Shapiro-Wilk . Analisis statistik dilakukan dengan uji One  Way ANOVA dan dilanjutkan dengan
Post Hoc Test Least Significant Difference/ Fisher (LSD) menggunakan program SPSS for Windows release version 22. Post  Hoc  Test adalah uji hipotesis untuk membandingkan dua kelompok, yang dilakukan bila p <0,05. Uji One Way ANOVA adalah uji parametrik untuk membandingkan perbedaan mean pada lebih dari dua kelompok. Syarat uji One Way ANOVA adalah skala numerik, distribusi normal dan homogen. Apabila data tidak memenuhi syarat distribusi normal, maka digunakan uji alternatifnya yaitu uji Kruskal- Wallis dilanjutkan dengan Mann –Whitney.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Gambar 1. Alur perjalanan penelitian dan mortalitas dari kelompok Il-1β dan kelompok aktivasi Caspase-1 .
1.    Survival Rate
Dari penelitian ini, kami dapatkan bahwa total tingkat mortalitas pada populasi eksperimen kami mencapai hingga 70% dari semua kelompok yang disepsiskan. Tingkat mortalitas ini sebetulnya sesuai dengan yang dilaporkan oleh Menezes et al dan Toscano et al pada eksperimen yang menggunakan tikus C57BL/6 dan  Balb/c (Menezes et al , 2008; Toscano et al ,  2011).
Penelitian Menezes menyelidiki tingkat kematian dari tikus percobaan sepsis dengan menggunakan prosedur Cecal  Ligation  and  Puncture (CLP). Didapatkan tingkat kematian yang cukup besar tergantung dari tinggi rendahnya derajat sepsis yang diinduksi. Berat ringannya derajat sepsis dapat ditentukan berdasar besar jarum yang digunakan untuk perforasi, dan letak ligasi sekum.
Gambar 2. Survival rate dari A) Kelompok IL-1β, B) Kelompok Caspase-1, C) Kelompok IL-1β dan Caspase-1. Tidak didapatkan perbedaan bermakna antara sub-kelompok perlakuan dan terapi di kedua kelompok.
Pada penelitian ini, kami dengan sengaja mengiduksi sepsis berat dengan menggunakan metode perforasi sekum through  and  through dan letak ligasi >1 cm di atas ujung distal sekum.
Survival  Rate kelompok IL-1β dan Kelompok Caspase-1 tidak terjadi perbedaan yang bermakna antara sub-kelompok maupun antar kelompok.
Tabel 1. Survival rate antara kelompok dengan hasil analisa statistik Kelompok Survival rate hari 6 95% CI P-Value Perlakuan Terapi IL-1β 40% 40% (-27.4850) - 21.7707 0.810 Caspase-1 30% 30% (-8.3062) – 0,4929 0.073 Total 35% 35% Pada penelitian ini pemberian Chloroquine tidak  berpengaruh  secara  signifikan  dalam perbaikan survival rate pada tikus model sepsis. Bahkan pada kelompok IL-1β terdapat peningkatan angka  mortalitas  yang  signifikan  pada  24  jam pertama pemberian Chloroquine dengan dosis 50 mg/KgBB, namun setelah itu tidak terdapat mortalitas tambahan sampai akhir penelitian. Pada
kelompok aktivasi Caspase-1 tetap tidak berbeda jauh dengan kelompok perlakuan, namun pada jam ke 72 dari pemberian CHQ dosis pertama terdapat mortalitas tambahan yang tidak terdapat pada kelompok perlakuan.
Efek pemberian CHQ pada hewan coba model sepsis pada penelitian-penelitian terdahulu menunjukkan adanya perbaikan survival rate
yang bermakna dibandingkan kelompok kontrol (Yasuda et al , 2008; Yang et al, 2013,).  Pada penelitian oleh Yang et al yang disepsiskan dengan CLP pada mencit Balb/C dan kemudian diberikan injeksi intraperitoneal dosis tunggal CHQ 50mg/KgBB. Mencit lalu diinjeksi dengan LPS untuk menginduksi sepsis berat. Pada penelitan tersebut didapat tingkat survival yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok mencit yang diberikan NaCl 0,9% dan kelompok yang diberikan dosis CHQ 5mg/KgBB (Yang et al , 2013).  Hasil  eksperimen  di  atas  menunjukkan bahwa pemberian CHQ pada sepsis dapat mencegah terjadinya sepsis berat. Pada penelitian yang sama, Yang et al, 2013 juga melihat apakah pemberian CHQ setelah tejadinya sepsis berat dengan memberikan injeksi Chloroquine dengan dosis yang sama setelah injeksi LPS. CHQ diberikan sebanyak 4 kali pada jam ke 4, 12, 24 dan 36 setelah induksi LPS pada kelompok CHQ 50 mg/KgBB. Pada eksperimen tersebut juga didapatkan hasil survival yang lebih baik. Hasil yang sama juga didapatkan pada eksperimen lain pada rangkaian penelitian yang sama di mana pemberian CHQ pada jam ke 24, 36, 48, 60 setelah terjadinya sepsis dapat melindungi mencit dari kematian pada percobaan dengan induksi sepsis dengan CLP tanpa tambahan injeksi LPS.  Pada penelitian tersebut tidak menyertakan keterangan mengenai berapa lama sepsis terjadi setelah tindakan CLP dan jumlah kematian tikus setelah dilakukan CLP sebelum dilakukan injeksi LPS atau pemberian terapi. CLP merupakan model sepsis polimikrobial yang dianggap paling mendekati dengan sepsis pada manusia, walupun pada beberapa percobaaan induksi sepsis dengan CLP tingkat kematian cukup tinggi tergantung dari teknik yang dilakukan (Menezes et al, 2008). Tingkat kematian dapat mencapi 50-100% dalam 48 jam pertama, yang mana sesuai dengan yang kami dapatkan pada penelitian ini. Survival rate pada penelitian Yang berkisar pada angka 60-70% pada 60 jam pasca terapi. Akan tetapi, memang tidak kami dapatkan adanya perbedan survival rate yang bermakna antara kelompok tikus yang diinduksi sepsis, pada kelompok terapi dan non terapi. Hasil penelitian oleh Yang et al tersebut mirip dengan penelitian oleh Yasuda et al yang menggunakan CHQ phosphate 50mg/Kg BB oral
yang diberikan 6 jam pasca tindakan CLP. Survival rate pada penelitian ini juga menunjukkan hasil yang lebih baik pada kelompok yang diberikan CHQ secara oral. Akan tetapi, perlu diperhatikan bahwa pada mencit penelitian Yasuda et al , tingkat survival dalam 72 jam berada di angka 50%, yang mana kurang lebih sama dengan hasil penelitian ini. Kekuatan penelitian Yang et al dan Yasuda et al adalah pengunaan jumlah mencit yang relative besar, yaitu Yang menggunakan 25 ekor mencit untuk tiap kelompok dan Yasuda menggunakan 13 ekor mencit untuk tiap kelompoknya. Hasil penelitian Yang dan Yasuda berbeda dengan hasil penelitian oleh Takahashi et al, yang menggunakan CHQ 60 mg/KgBB pada C57BL/6N mice dan GFP-LC3  transgenic  mic e. Takahashi meneliti bagaimana peran autofagi pada sepsis dan menggunakan CHQ sebagai inhibitor dari autofagi. Pada penelitian ini, hewan coba yang diberikan CHQ/inhibitor autofagi menunjukkan survival rate yang lebih buruk dibandingkan dengan tikus yang diberi normal saline (Takahashi et al , 2013). Waktu pemberian dari CHQ dari masing- masing penelitian juga berbeda. Pada Yang, CHQ diberikan sebelum dan /atau 4 jam setelah sepsis berat, Yasuda memberikannya pada 6 jam setelah CLP, sedangkan Takahashi memberikannya 1 jam setelah CLP sedangkan pada penelitian ini CHQ diberikan 24 jam pasca CLP. Pada Hal ini menunjukkan bahwa peran CHQ pada sepsis masih memerlukan studi lebih mendalam, terutama yang perlu dipelajari terlebih dahulu adalah efek CHQ dari masing-masing spesies hewan coba dengan dosis optimum yang digunakan.

## 2.   Kadar IL-1β
Pemeriksaan kadar IL-1 plasma tikus merupakan rerata dari dua kali pengukuran untuk tiap sampelnya. Pada penelitian ini semua sampel diambil dari tikus yang bertahan hidup pada hari ke-6. Seperti yang diharapkan, didapatkan kadar yang lebih tinggi pada kelompok perlakuan CLP dengan placebo NaCl 0,9% dibandingkan dengan kelompok CLP yang diberikan Chloroquine atau kelompok kontrol. Akan tetapi, setelah dianalisa dengan one-way ANOVA test, tidak didapatkan adanya perbedaan bermakna antar kelompok secara statistik.
Tabel 2. Kadar IL-1β antara kelompok dengan hasil analisa statistik. Rerata kadar IL-1β 95% CI P Value Kontrol VS Perlakuan 0.08700 vs 0.09680 (-0.02905) – 0.00945 0.547 Kontrol VS Terapi 0.08700 vs 0.08975 (-0.02327) – 0.01777 1.000 Perlakuan VS Terapi 0.09680 vs 0.08975 (-0.01427) – 0.02837 1.000
Gambar 3. Diagram batang yang menunjukkan rata-rata kadar IL-1β dari masing-masing sub-kelompok. Peningkatan tertinggi terdapat pada kelompok perlakuan, namun tidak bermakna secara statistik.
Pada penelitian ini, kami dapatkan terdapat penurunan kadar sitokin IL-1β pada kelompok sepsis yang diberi CHQ dibandingkan dengan kelompok yang diberi placebo. Perbedaann antar kelompok kecil tetapi sesuai dengan yang diarapkan. Kelompok kontrol tampak mempunyai rata-rata paling rendah dibandingkan dengan kelompok lain, di mana kelompok sepsis dengan placebo tampak mempunyai kadar paling tinggi.
CHQ, seperti yang telah banyak diteliti, mempunyai  efek  anti-inflamasi  yang  salah satunya dengan menurunkan kadar IL-1β . Berbagai penelitian, baik berbasis hewan maupun manusia telah mengungkap mekanisme CHQ dapat menurunkan kadar IL- 1β. Pada prinsipnya, ada paling tidak 3 mekanisme dasar. Yang pertama adalah efek CHQ pada jalur NFkB yaitu Contohnya pada penelitian oleh Jang et al , menunjukkan bahwa pemberian CHQ tidak menurunkan tingkat dari transkripsi dari IL-1β , namun menurunkan kadar dari mRNA IL-1β , yang mana mengisyaratkan adanya gangguan pada stabilitas dalam sel (diduga sebuah proses gangguan PH intrasel)  sehingga  menghambat  ekspresi  dan
sekresi bentuk aktif dari IL-1 β.  Mekanisme  ke dua dari CHQ dalam menghambat produksi IL- 1β adalah melalui penghambatan proses autofagi. Proses autofagi adalah proses kematian sel akibat degradasi dari komponen seluler yang terjadi pada vakuola autofagi (Fink et al 2005).  Walaupun proses autofagi sendiri dianggap buka sebagai sebuah  proses  pro-inflamatori,  namun  beberapa penelitian lain telah menyatakan hubungan antara proses  autofagi  dengan  produksi  dari  IL-1β (Yasuda et al , 2013).
Aktivasi Caspase-1 Aktivasi Caspase-1 diukur dengan cara Flowcytometry pada isolat Peripheral Mononuclear  Cells (PBMC)  dan Whole  Blood (WB)  dari  tikus.  Sampel  darah  diambil  dari semua tikus yang bertahan hidup pada hari ke- 6. Sebelum pemeriksaan, dilakukan optimasi dengan menggunakan sampel darah tikus sehat untuk mennetukan Gating dan kompensasi serta menentukan kontrol positif dan negatif. Kontrol negatif menggunakan PBS dan kontrol positif menggunakan LPS 100ng/ml.
Gambar 4. Gambar Scatter plot dan histogram Flowcytometry dari aktivasi Caspase-1 di PBMC. Cut off diambil dari kontrol negatif.
Pada penelitian ini, didapatkan peningkatan aktivasi dari pro-Caspase-1 menjadi Caspase-1 aktif secara rata-rata pada kelompok perlakuan baik pada PBMC maupun pada WB. Hal ini
Gambar 5. Gambar Scatter plot dan histogram Flowcytometry dari aktivasi Caspase-1 di Whole Blood. Cut off diambil dari kontrol negatif.
sesuai yang diharapkan dan mempunyai korelasi dengan peningkatan kadar IL-1β , walaupun korelasi tersebut tidak dapat dianalisa secara statistik dikarenakan kedua variabel diambil dari dua kelompok yang berbeda.
Tabel 3. Tingkat aktivasi Caspase-1 antara kelompok dengan hasil analisa statistik Perlakuan Terapi Kontrol 95% CI P-Value PBMC 15.0367% 9.463% 14.44% (-6.72) – 24.82 0.856 WB 10.9933% 2.993% 6.0283% (-5.303) – 5.844 0.478 Pada penelitian kami, hasil pengukuran aktivasi dari Caspase-1 menunjukkan hasil yang bervariasi antar sampel yang diperiksa. Kelompok perlakuan baik pada sampel isolat PBMC maupun WB  menunjukkan peningkatan aktivasi dari Caspase-1 . Peningkatan lebih tinggi dibandingkan dengan  kelompok terapi, atau kelompok yang diberikan terapi CHQ. Hal ini seperti yang diharapkan dan sesuai dengan hipotesa kami. Efek CHQ pada aktivasi Caspase-1 masih belum banyak diteliti. Hanya beberapa referensi yang didapatkkan. Kebanyakan penelitian yang telah  dilakukan  tidak  secara  spesifik  melihat efek chloroquine pada aktivasi caspase-1 namun melihat efek CHQ pada inflammasome dan yang lebih banyak meneliti produk akhir dari aktivasi
Caspase-1 , yaitu IL-1β (Shin et 2012, Shin et al 2013).

## SIMPULAN
Pemberian CHQ menyebabkan penurunan kadar IL-1 β dan  aktivasi Caspase -1 secara rata- rata namun tidak secara signifikan dalam analisa statistik. Sedangkan untuk survival rate tidak terbukti pemberian CHQ akan memberikan perlidungan dari kematian akibat sepsis. Hal tersebut meninjukkan bahwa mortalitas pada tikus model sepsis tidak semata-mata berhubungan dengan  tingkat  inflamasi.  Penelitian  lebih  lanjut dengan metode yang lebih baik diperlukan untuk mengungkap misteri dari sepsis.

## DAFTAR PUSTAKA
Bianchi ME. 2007, DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. J. Leukoc. Biol. 81:1–5.
Bouernfeind  F,  Hornung  V.2013,  Of  inflammasomes  and  pathogens-sensin  of  microbes  by  the inflammasome, EMBO Mol Med ., 5(6):814–826
Dellinger RP, Levy MM, Rhodes A, Annane D, Gerlach H, Opal SM, et al .2013, Surviving Sepsis Campaign Guidelines Committee including the Pediatric Subgroup. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2012. Crit Care Med ., 41:580- 637.
ENV/JM/MONO,2000, joint meeting of the chemicals committee and the working party on chemicals, pesticides and biotechnology. guidance document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. https:// ntp.niehs.nih.gov/iccvam/suppdocs/feddocs/oecd/oecd_gd19.pdf.
Fink SL & Cookson BT. 2005, Apoptosis, Pyroptosis, and Necrosis: Mechanistic Description of  Dead and Dying Eukaryotic Cells. Infection and immunity . 73 (4):1907–1916.
Hermawan AG. 2008, SIRS, Sepsis dan syok septik. 1 st edition. Surakarta: UNS press. Surakarta. Hermawan AG. 2011 Steroid dosis rendah pada penatalaksanaan sepsis. 1 st edition. Surakarta: UNS press. Surakarta.
Kawai T & Akira S. 2010, The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll- like receptors. Nat Immunol . 11:373-84.
Kawai T, Akira S. 2011, Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity . 34: 637-650.
Lamkanfi  M,  Sarkar A,  Walle  LV,  Vitari AC, Amer AO,  Wewers  MD, et  al. 2010,  Inflammasome- Dependent Release of the Alarmin HMGB1 in Endotoxemia. The J of Immun , 185: 4385–4392. Menezes GB, Amaral SS, Alvarenga DM, Cara DC. 2008, Surgical procedures to an experimental polymicrobial sepsis: Cecal Ligation and Puncture. Braz J Vet Pathol , 1(2): 77 – 80
Opal SM, Garber GE, LaRosa SP, et al. 2003, Systemic host responses in severe sepsis analyzed by causative microorganism and treatment effects of drotrecogin alfa (activated). Clin Infect Dis . 37 : 50–58.
Shin MS, Kang Y, Lee N, Wahl ER, Kim SH,Kang KS, Lazova R, Kang I.2013,  Self dsDNA induces IL-1β production from human monocytes by activating NLRP3 inflammasome in the presence of anti-dsDNA antibodies. J Immunol. 15; 190(4): 1407–141.
Shin MS, Kang Y, Lee N, Kim SH, Kang KS, Lazova R, Kang I. 2012, U1-snRNP activates the NLRP3 inflammasome in human Monocytes. J Immunol . 15; 188(10): 4769–4775.
Takahashi W, Watanabe E, Fujimura L, Watanabe-Takano H, Yoshidome H4,            Swanson PE, et al . 2013. Kinetics and protective role of autophagy in a mouse cecal ligation and puncture- induced sepsis. Critical Care , 17:R160.
Toscano MG, Ganea D, Gamero AM. 2011, Cecal Ligation Puncture Procedure. J Vis Exp . 7(51): 2860. Van der Poll T & Opal SM. 2008, Host-pathogen interactions in sepsis. Lancet Infect Dis. 8:32-43. Wen  H,  Miao  EA,  Ting  JPY.  2013,  Mechanisms  of  NOD-like  Receptor-Associated  Inflammasome Activation. Immunit, 39: 432-441.
Yang M, Cao L, Xie M, Yu Y, Kang R, Yang L, et al . 2013, Chloroquine Inhibits HMGB1 Inflammatory Signaling and Protects Mice from Lethal Sepsis. Biochem Pharmacol. 86(3): 410–418. Yasuda H, Leelahavanichkul A, Tsunoda S,  Dear JW,  Takahashi Y,  Ito S,  Hu X , Zhou H, Doi K, Childs R, Klinman DM, Yuen PST, Star RA. 2008, Chloroquine and inhibition of Toll- like receptor 9 protect from sepsis-induced acute kidney injury. Am J Physiol Renal Physiol. 294(5): F1050–F1058.
Zainuddin M. 1999, Metodologi Penelitian. Lembaga Penelitian Universitas Airlangga, Surabaya.
.