Optimalisasi Produksi Fikosianin pada Sianobakteria Laut BTM 11 dan Uji Aktivitas Antioksidannya
(Optimization  of  Phycocyanin  Production  of  Marine Cyanobacteria BTM 11 and Its Antioxidant Properties Test)
BASO DIDIK HIKMAWAN 1 , SWASTIKA PRAHARYAWAN 2 , KINTOKO 3*
1 Fakultas  Farmasi,  Universitas  Mulawarman,  Jl.  Muara  Muntai,  Gn.  Kelua,  Samarinda  Ulu, Samarinda, Kalimantan Timur, 75242, Indonesia
2 Pusat Riset Mikrobiologi Terapan, Badan Riset dan Inovasi Nasional (BRIN), Jl. Raya Jakarta- Bogor KM 46, Cibinong, Bogor, Jawa Barat, 16911, Indonesia
3 Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan, Jl. Prof. Dr. Soepomo, S.H., Janturan, Warungboto,
Umbulharjo, Yogyakarta, 55164, Indonesia
Diterima 17 Februari 2022, Disetujui 10 Maret 2022
Vol. 20, No. 2 JURNAL ILMU KEFARMASIAN  INDONESIA, Oktober 2022,  hlm. ISSN 1693-1831
*Penulis korespondensi e-mail: kintoko@pharm.uad.ac.id
Abstract: Phycocyanin  (PC)-producing  cyanobacteria  have  many  pharmaceutical  applications,  the main one being their antioxidant properties. The biosynthesis of PC-producing cyanobacteria is aﬀ ected by many factors, such as nitrogen availability and light intensity during cultivation. This study aimed to determine the optimum  concentration of nitrogen and light intensity during the cultivation of PC biosynthesis in marine cyanobacteria BTM 11 and to identify its antioxidant properties. This study used an experimental laboratory method, and the PC level was determined through the variation of sodium nitrate (NaNO 3 ) as  a source of nitrogen dissolved in media and using diﬀ erent light intensities. The optimum nitrogen and light intensity values of PC were determined by its antioxidant activity using the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical capture method. Data were analyzed using one-way ANOVA and post-hoc Duncan’s test to determine whether p<0.05. The results showed that there was a signiﬁ cant diﬀ erence in the PC level cultivated with variation in NaNO  concentrations. The highest PC level was observed in media containing 525 mg NaNO 3 and an optimum light intensity of 4500 lux. The result of the antioxidant activity assay showed that the BTM11’s PC’s antioxidant activity had its IC 50 at 91.89 μg/mL and the IC 50 of ascorbic acid was 2.39 μg/mL
Keywords: Antioxidant, DPPH, light intensity, marine cyanobacteria BTM 11, nitrogen concentration, phycocyanin
Abstrak: Pigmen  ﬁ kosianin  (PC)  dari  sianobakteria  telah  banyak  menunjukkan  efek  farmasetikal termasuk salah satunya efek antioksidan. Biosintesis PC oleh sianobakteria dipengaruh oleh beberapa faktor,  diantaranya  ketersediaan  nitrogen  dan  intensitas  cahaya  yang  dipaparkan  selama  kultivasi. Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui pengaruh kadar nitrogen dan intensitas cahaya optimum untuk biosintesis PC serta mengetahui aktivitas antioksidan dari PC yang diisolasi dari sianobakteria laut BTM 11. Metode penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratorik dengan mengamati respon  PC  dari  variasi  pemberian  natrium  nitrat  (NaNO 3 )  sebagai  sumber  nitrogen  dalam  media serta  intensitas  cahaya  yang  berbeda.  PC  dari  hasil  nitrogen  dan  intensitas  cahaya  yang  optimum diuji  aktivitas  antioksidannya  dengan  metode  penangkapan  radikal  bebas  1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Data hasil perlakuan variasi NaNO 3 dan intensitas cahaya dianalisis dengan one-way ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Duncan apabila p<0,05. Hasil penelitian ini menunjukkan adanya perbedaan signiﬁ kan respon kadar PC dari tiap variasi konsentrasi NaNO 3 Kadar PC tertinggi didapat dari media dengan  konsentrasi  NaNO 3 525,0  mg  dan  intensitas  cahaya  optimum  4.500 lux Hasil  uji  aktivitas antioksidan  menunjukkan  PC  memiliki  aktivitas  antioksidan  dengan  nilai  IC 50 sebesar  91,89  µg/mL sedangkan IC 50 dari asam askorbat sebesar 2,39 µg/mL.
Kata kunci: Antioksidan, DPPH, ﬁ kosianin, intensitas cahaya, konsentrasi nitrogen, sianobakteria laut BTM 11
217-224
HIKMAWAN ET AL. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
218
ﬁ kosianin  yaitu  US$  0,13  per  miligram  (mg)  dan untuk ﬁ kosianin analitis ( analytical grade ) berkisar US$ 15 per mg. Harga tersebut bisa sewaktu-waktu naik, karena tergantung pada tingkat kemurniannya. Maka, usaha untuk mendapatkan pigmen ﬁ kosianin dengan kemurnian yang tinggi perlu dilakukan (6, 7) . Produksi, akumulasi, dan kemurnian ﬁ kobilipro- tein, dalam hal ini ﬁ kosianin, diregulasi oleh beberapa faktor. Contoh faktor yang  mempengaruhi  meliputi strain  yang  digunakan,  intensitas  cahaya,  panjang gelombang  yang  dipaparkan,  suhu,  dan  komposi- si media (5) . Penelitian oleh Nur et al . (8) menyatakan bahwa produksi C-ﬁ kosianin dari sianobakteria jenis Arthrospira platensis dipengaruhi oleh faktor nutrisi dan lingkungan seperti salinitas, paparan radiasi, ket- ersediaan nitrogen, dan tata cara kultivasi.
Salah  satu  produk  alami  dari  laut  adalah  ﬁ ko- sianin. Fikosianin merupakan senyawa aktif biologis larut air yang diisolasi dan dipuriﬁ kasi dari beragam jenis rumput laut atau alga eukariotik, dan sianobak- teria. Fikosianin termasuk dalam famili ﬁ kobilipro- tein yang merupakan salah satu komponen dari ﬁ ko- bilisom dan memiliki absorbansi maksimum sekitar 610-620 nm atau 610-625 nm. Senyawa ini berper- an  dalam  menyerap  energi  cahaya  pada  spektrum tertentu  –  pada  umumnya  spektrum  cahaya  kuning sampai  merah –  dan menjalankan  proses  fotosinte- sis (4, 9,10) . Paparan sinar UV (313 nm) dan cahaya mo- nokromatik tampak (600 nm) selama satu jam akan menyebabkan ﬁ kosianin kehilangan pigmen warnan- ya sebesar 9% dan 15% (pH 5), 12% dan 2% (pH 7) (7) .
Faktor yang mempengaruhi  produksi  ﬁ kosianin adalah  sumber  nitrogen  dan  intensitas  cahaya.  Ni- trogen berperan sebagai makronutrien yang diperlu- kan untuk pertumbuhan sianobakteria, pembentukan kloroﬁ l,  dan  menginduksi  pembentukan  ﬁ kosianin. Namun  jumlahnya  terbilang  terbatas.  Melalui penambahan dissolved inorganic nitrogen (DIN) dan intensitas  cahaya  yang  tepat  terbukti  berpengaruh besar terhadap produksi metabolit dan biomasa, se- hingga  pertumbuhan  dan  konsentrasi  produk  yang dihasilkan dapat maksimal (10, 11) .
Sianobakteria  dapat  dikultivasi  dalam  media yang mengandung garam anorganik. Nitrogen mer- upakan  nutrient  yang  penting  dan  digunakan  oleh hampir seluruh algae yang berfungsi sebagai regu- lator produksi biomassa, akumulasi lipid dan karot- enoid. Khusus pada sianobakteria, nitrogen berperan penting  dalam  menjaga  viabilitas  sel  lalu  meregu- lasi sintesis ﬁ kobiliprotein, seperti ﬁ kosianin. Fiko- biliprotein  ini  kemudian  dijadikan  sebagai  tempat penyimpanan sumber nitrogen, yang disebut ﬁ kobi- lisom (5) . Pemberian suplai nitrogen juga dapat digu-

## PENDAHULUAN
RADIKAL  bebas  pada  konsentrasi  rendah  sampai sedang mempunyai dampak menguntungkan, karena molekul  ini  terlibat  dalam  berbagai  sistem  ﬁ siolo- gis. Radikal bebas terlibat dalam proses imunologi, sinyal  transduksi  seluler,  respon  mitogen,  dan  reg- ulasi  reduksi-oksidasi  (redoks).  Namun  pada  kon- sentrasi  tinggi,  radikal  bebas  dapat  menyebabkan adanya  stress  oksidatif  dan  nitrosatif  dan  berakibat pada kerusakan biomolekul seperti lipid, protein, dan asam deoksibonukleat (DNA) (1) .
Antioksidan adalah senyawa-senyawa yang ber- peran  di  dalam  sel  dalam  bentuk  pasangan  redoks ( redox couple ) untuk mengurangi konsentrasi reac- tive  oxidative  species (ROS)  dan  mempertahankan sel  pada  kondisi  redoks  yang  rendah.  Sel  mampu mengekspresikan  beberapa  faktor  endogen  yang dapat  bertindak  sebagai  antioksidan,  meliputi  glu- tathione  peroksidase  (GPx),  superoksida  dismutase (SOD), dan katalase (CAT). Pada suatu kondisi, lev- el  antioksidan  endogen  akan  berkurang  dan  guna menurunkan stres  oksidatif  secara sistematis  di da- lam  sel,  diperlukan tambahan  antioksidan  eksogen. Antioksidan  jenis  ini  dapat  diperoleh  melalui  diet, mencerna  ( ingestion ),  maupun  memasukkan  suatu senyawa antioksidan yang telah dimurnikan (2,3) .
Dewasa ini, produk alami dari laut telah banyak dikembangkan  dan  digunakan  sebagai  pengobat- an.  Produk  alami  dari  laut  juga  merupakan  salah satu  sumber  terpenting  karena  mengandung  senya- wa-senyawa  organik  yang  bermanfaat  dan  belum dapat  terindentiﬁ kasi  seluruhnya.  Namun  senyawa yang  belum  diketahui  ini  berpotensi  dapat  diman- faatkan sebagai pengobatan penyakit serius (4) . Salah satu sumber produk alami laut adalah sianobakteria BTM 11.
Sianobakteria  merupakan  kelompok  prokariot fotosintetik  yang  sudah  ada  sejak  3,5  milyar  tahun yang lalu. Mikroorganisme ini dapat hidup di beber- apa  kondisi  lingkungan  seperti  danau,  sungai,  dan lokasi panas. Sianobakteria diakui sebagai salah satu sumber bioteknologi yang digunakan sebagai bahan baku  farmasi,  makanan,  klinis,  dan  industri  pem- bangkit energi (5) .
Sianobakteria BTM-11 ( Jaaginema sp .) merupa- kan  ﬁ lamentus  sianobakteria  dengan  sel  berbentuk silindris.  Sianobakteria  BTM-11  memiliki  potensi sebagai penghasil pigmen biru yaitu ﬁ kosianin, kare- na kandungannya di dalam sel cukup tinggi (40% per berat kering biomassa). Secara ekonomi, nilai komer- sial  pigmen  C-ﬁ kosianin  yang  termasuk  ke  dalam golongan  ﬁ kobiliprotein  memiliki  nilai  yang  tinggi mengingat harganya yang mahal, untuk food grade
Vol 20, 2022
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia ` 219 nakan untuk mempertahankan siklus hidupnya mel- alui proses asimilasi amonium (12) . Namun demikian, paparan  intensitas  cahaya  harus  optimum.  Apabila intensitas cahaya terlalu rendah, sianobakteria akan mencari  metode  alternatif  untuk  mendapatkan  ca- haya dan energi yang diperlukan untuk pertumbuhan. Intensitas cahaya yang terlalu tinggi akan menyebab- kan terjadinya fotoinhibisi, seperti yang terjadi pada Spirulina platensis yang tidak dapat tumbuh pada in- tensitas cahaya lebih dari 4000 lux (13) . Apabila aliran energi melebihi kapasitas suatu organisme, aktivitas seluler dan produksi ROS meningkat sehingga kon- disi dalam sel menjadi lebih toksik dan menyebabkan kematian sel. Namun ada beberapa jenis sianobakte- ria yang kurang sensitive terhadap kondisi eksogen yang ekstrim ini (10, 11,14) .
Penelitian  ini  perlu  dilakukan  untuk  mengeta- hui  pengaruh  konsentrasi  nitrogen  optimum  dalam media kultur sebagai salah satu nutrisi yang sangat berperan  dalam  pertumbuhan  sianobakteria  dalam menghasilkan ﬁ kosianin. Selain itu, untuk mengeta- hui pengaruh  intensitas cahaya yang optimal untuk pertumbuhan  sianobakteria  BTM  11.  Perlu  dilaku- kan  uji  aktivitas  antioksidan  dari  ﬁ kosianin  yang diperoleh  dari  sianobakteria  BTM  11  hasil  optima- si  konsentrasi  nitrogen  serta  intensitas  cahaya  un- tuk mengetahui aktivitas antioksidan dari ﬁ kosianin yang dihasilkan.

## BAHAN DAN METODE
BAHAN. Sianobakteria  BTM  11  (koleksi  kultur Laboratorium  Bioenergi  dan  Bioproses,  Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia),  NaNO 3 p.a  (Merck),  DPPH  (Sigma- Aldrich), asam askorbat p.a (Sigma-Aldrich) sebagai standar, metanol p.a (Merck).
Alat .  Spektrofotometer  UV-VIS  (Pharmaspec UV-1700  Shimadzu), centrifuge (Hitachi  Himac CT 6EL), micro ultracentrifuge (Hitachi Himac CS 150NX), neraca analitik (Ohaus BT 2245), pH meter (Eutech  Instrumen  pH  700),  autoklaf  (Tomy  ES- 215),  mikroskop  ﬂ uoresen  (Olympus  BX  53)  yang dilengkapi dengan kamera (optik).
METODE.  Kondisi  Kultur  dan  Kultivasi. Sianobakteria  BTM  11  dikultivasi  dalam  500  mL menggunakan  media  SWBT  (Tabel  1)  dengan  pH inisial  7,0.  Suhu  ruang  kultivasi  30±2  °C  dengan aerasi  terus  menerus  selama  kultivasi.  Intensitas cahaya untuk pengamatan pengaruh NaNO 3 terhadap biosintesis  pigmen  fikosianin  adalah  1500 lux , sedangkan konsentrasi NaNO 3 dalam media SWBT untuk  pengamatan  pengaruh  perbedaan  intensitas cahaya terhadap biosintesis ﬁ kosianin menggunakan
konsentrasi NaNO 3 optimum dari hasil studi pengaruh konsentrasi  NaNO 3 terhadap  biosintesis  ﬁ kosianin oleh sianobakteria. Produksi ﬁ kosianin menggunakan hasil  yang  optimal  dari  kedua  perlakuan  baik pengamatan  pengaruh  konsentrasi  NaNO 3 dalam media SWBT maupun pengaruh perbedaan intensitas cahaya. Pemanenan dilakukan setelah kultur berumur 7 hari. Optical density (OD) dari bibit sianobakteria BTM 11 yang akan ditanam diukur terlebih dahulu dengan  metode  turbidimetri  dengan  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang 680 nm. Sebanyak 50 mL bibit sianobakteria dengan OD 1 ditanam pada tiap media perlakuan.
Pengaruh  Konsentrasi  Nano 3 terhadap
Bahan dan Sampel Jumlah NaNO 3 Sesuai perlakuan Na 2 HPO 4 1 mg KH 2 PO 4 2,5 mg Fe Ammonium Sitrat 0,75 mg Na EDTA 0,75 mg Asam Sitrat 27,0 mg CaCl 2 . 2H 2 O 2,50 mg Air Laut ad 450 mL Kultur 50 mL
Tabel 1 Komposisi media SWBT dalam 500 mL.
Produksi Fikosianin. Variasi konsentrasi NaNO 3 yang digunakan  dalam  media  SWBT  untuk  mempelajari pengaruh  perbedaan  konsetrasi  NaNO 3 terhadap respon  ﬁ kosianin  oleh  sianobakteria  laut  BTM  11 adalah 131,25 mg; 262,5 mg; 393,75 mg; 525 mg; dan 656,25 mg, dibuat tiga kali replikasi.
Pengaruh  Cahaya  terhadap  Produksi Fikosianin. Variasi intensitas cahaya yang digunakan dibuat dengan variasi intensitas cahaya, yaitu 1500 , 2500,  3500 , 4500,  dan  5500 lux ;  serta  cahaya  luar ruangan. Respon yang diamati adalah kadar ﬁ kosianin yang  dihasilkan  oleh  sianobakteria  laut  BTM  11 setelah  kultivasi  selama  7  hari.  Dibuat  tiga  kali replikasi.
Ekstraksi  Fikosianin. Pemanenan  biomassa dilakukan dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. Endapan yang diperoleh merupakan wet biomass . Fikosianin diekstrak dengan metode freezing and thawing . Biomassa hasil panen dari tiap perlakuan dimasukkan dalam buﬀ er fosfat 0,1 M pH 7,0. Kemudian dibekukan pada suhu -20 o C, setelah itu  dicairkan pada  suhu  4 o C  selama  24 jam secara  berulang  hingga  diperoleh  warna  biru  pada buﬀ er fosfat.  Larutan yang  diperoleh disentrifugasi pada 6000 rpm selama 10 menit, untuk menghilangkan cell debris . Supernatan yang didapatkan dipisahkan dari endapan. Supernatan tersebut merupakan ekstrak pigmen ﬁ kosianin ( crude extract) (15, 16) . Prosedur ini dilakukan untuk setiap media perlakuan.
HIKMAWAN ET AL. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 220
Perhitungan  Kadar  Fikosianin  dalam Crude Extract . Perhitungan  kadar  pigmen  fikosianin dilakukan dengan mengukur serapan supernatannya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 620 dan 650 nm. Penetapan kadar dihitung dengan menggunakan rumus (17) :
adalah larutan DPPH  0,15 mM dalam metanol p.a. Pembuatan  larutan  blangko  ( blank  solution )  dibuat dengan  memipet  1,0  mL  dari  masing-masing  seri larutan  (baik  pada  sampel  maupun  kontrol  positif) kemudian  dimasukkan  kedalam  tabung  reaksi  dan ditambahkan  1,0  mL  metanol  p.a.  Kontrol  negatif dibuat dengan mencampur 1,0 mL larutan DPPH 0,15 mM dengan 1,0 mL metanol p.a. Pembuatan larutan uji pigmen ﬁ kosianin kering yang telah dimurnikan dengan kitosan-karbon aktif serta presipitasi amonium sulfat dilarutkan dalam metanol p.a dengan konsentrasi konsentrasi sampel 5, 10, 25, 50, 100, 125, dan 150 μg/mL.  Larutan  vitamin  C  sebagai  kontrol  positif: Konsentrasi larutan vitamin C dalam metanol yang digunakan berturut-turut 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; dan 4 μg/mL.
Penentuan operating  time dilakukan  dengan membuat  larutan  uji  dan  kontrol  positif  dengan konsentrasi berturut-turut 50 μg/mL dan 2,5 μg/mL dipipet  sebanyak  1,0  mL  dihomogenkan  dengan 1,0  mL  larutan  DPPH  0,15  mM,  kemudian  diukur absorbansinya  pada  panjang  gelombang  517  nm. Untuk  penentuan  panjang  gelombang  maksimal (λ maks ):Larutan  uji  diamati  absorbansinya  pada panjang  gelombang  400-800  nm. Absorbansi  dari larutan  kontrol  negatif  juga  diamati  absorbansinya pada  panjang  gelombang  400-600 nm.  Pengukuran absorbansi  larutan  dilakukan  pada masing-masing 1,0 mL seri konsentrasi larutan uji dan 1,0 mL seri konsentrasi  kontrol  positif  digojok  dengan  1,0  mL larutan DPPH 0,15 mM, campuran larutan kemudian didiamkan di tempat gelap selama operating time yang telah  diperoleh.  Serapan  larutan  uji  diukur  dengan spektrofotometri  UV-Vis  pada  panjang  gelombang maksimal  (λ maks )  yang  diperoleh  dari  pengukuran panjang gelombang maksimal untuk kontrol negatif. Blangko yang digunakan adalah metanol p.a.
Analisis  Data. Data  dianalisis  menggunakan uji one-way analysis of variance (ANOVA) dengan aplikasi  R  Studio.  Uji  dilanjutkan  dengan post-hoc Duncan apabila  perlakuan  berpengaruh  terhadap respon  (p<0,05).  Histogram  dibuat  dengan  aplikasi Microsoft Excel 2019.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh  Konsentrasi  Nitrogen  (NaNO 3 ) terhadap Produksi Fikosianin oleh Sianobakteria Laut  BTM  11. Hasil  perhitungan  kadar  pigmen ﬁ kosianin yang diperoleh selama pengamatan dapat dilihat pada Gambar 1 yang  menunjukkan keadaan optimum  untuk  sianobakteria  BTM  11  dalam menghasilkan  ﬁ kosianin. Kadar  ﬁ kosianin  tertinggi diperoleh  dari  media  SWBT  dengan  penambahan
(A620 nm ‒  0,7 x A650 nm)
7,38
Konsentrasi pigmen ﬁ kosianin (mg/mL) (PC)=
Persamaan ini ditetapkan menggunakan persamaan simultan  oleh  Bennett  dan  Bogobad  (1973) (18) dan konstanta persamaan oleh Bryant et al. , (1979) (19) . Pemurnian  Fikosianin. Ekstrak  kasar  ( crude extract )  ﬁ kosianin  (ﬁ kobiliprotein)  hasil  ekstraksi dari sianobakteria BTM 11 yang dikultivasi di media dengan konsentrasi NaNO 3 dan cahaya yang optimum dimurnikan  dengan  teknik  presipitasi  ammonium sulfat yang dikombinasikan dengan pemberian karbon aktif  1%  dan  kitosan  dengan  konsentrasi  0,01  g/L. Crude extract diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer selama  15  menit.  Setelah  15  menit,  larutan disentrifuge dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit (20) . Supernantan diambil dan dipresipitasi dengan amonium sulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ). Supernatan dipresipitasi dengan 20% w/v dan 50% w/v (NH 4 ) 2 SO 4 pada suhu 4 o C dengan pengadukan secara terus menerus. Hasil presipitasi  diendapkan  dengan  sentrifugasi  dengan kecepatan 27.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 o C (15) . Presipitasi dilakukan dengan cara memasukkan serbuk (NH 4 ) 2 SO 4 secara perlahan ke dalam larutan ekstrak ﬁ kobiliprotein yang sebelumnya telah diberi perlakuan  kitosan-karbon  aktif  hingga  mencapai konsentrasi 20% w/v saturasi sambil diaduk dengan magnetic  stirrer selama  1  jam  pada  suhu  4 o C. Larutan kemudian didiamkan pada suhu 4 o C selama sehari semalam. Endapan dari hasil presipitasi pada saturasi 20% w/v dibuang (16) . Supernatan ditambahkan serbuk (NH 4 ) 2 SO 4 hingga mencapai konsentrasi 50% w/v saturasi sambil diaduk dengan magnetic stirrer selama 1 jam pada suhu 4 o C. Endapan dikeringkan (pigmen  ﬁ kosianin)  sedangkan supernatan  (bening) dibuang. Pigmen ﬁ kosianin kering dilarutkan kembali dalam bufer fosfat 0,1 M pH 7,0, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.  Kemurnian  ﬁ kosianin  diukur  berdasarkan rasio  antara  absorbansi  fikosianin  pada  panjang gelombang 620 nm dan 280 nm (22) .
Uji Aktivitas  Antioksidan. Uji  Kualitatif: Uji  kualitatif  antioksidan  dilakukan  dengan  cara melarutkan sejumlah ﬁ kosianin kemudian ditambah larutan DPPH 0,15 mM dengan perbandingan volume yang  sama  (1:1).  Larutan  DPPH  yang  digunakan
Vol 20, 2022 Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia ` 221
Konsentrasi ﬁ kosianin tertinggi (2,258 mg/mL) yang dihasilkan  oleh Spirulina  plantesis terdapat  pada NaNO 3 konsentrasi  3,5  g/L.  Penelitian  sebelumnya menyatakan bahwa total protein dan nitrogen tertinggi dalam Spirulina plantesis diperoleh pada perlakuan 100  g  NaNO 3 masing-masing  sebesar  44,30%  dan 7,09 (25) . Konsentrasi dan rendemen ﬁ kosianin terbaik diperoleh pada perlakuan 80 g NaNO 3 sebesar 1,32 mg/mL dan 32,93%.
Pengaruh  Intensitas  Cahaya  Terhadap Produksi  Fikosianin  oleh  Sianobakteria  Laut BTM  11. Pengaruh  intensitas  cahaya  terhadap produksi  fikosianin  oleh  sianobakteria  diamati dengan mengukur kadar ﬁ kosianin yang diisolasi dari sianobakteria  BTM  11  pada  kondisi  kultur  dengan variasi pemaparan intensitas cahaya. Hasil perhitangan kadar pigmen ﬁ kosianin yang teramati dari kondisi kultur  dengan  pemaparan  variasi  intensitas  cahaya yang  berbeda-beda  dapat  dilihat  pada  Gambar  2. Hasil uji statistik menunjukkan bahwa ada perbedaan signiﬁ kan  untuk  masing-masing  perlakuan,  kecuali kadar ﬁ kosianin dari perlakuan 3500 lux dan cahaya di luar ruangan tidak menunjukkan adanya perbedaan signifikan  serta  kadar  fikosianin  dari  perlakuan 5500 lux dan cahaya di luar ruangan tidak terdapat perbedaan  signiﬁ kan.  Intensitas  cahaya  3500  dan 5500 lux juga tidak menunjukkan perbedaan signiﬁ kan terhadap kadar ﬁ kosianin.
Gambar  2  menunjukkan  bahwa  dari  intensitas cahaya  1500,  2500,  3500,  dan  4500 lux kadar fikosianin  yang  disintesis  oleh  sianobakteria  laut BTM 11 semakin besar dan berbanding lurus dengan
NaNO 3 sebanyak  525,0  mg.  Pada  media  dengan penambahan NaNO 3 sebanyak 626,25 mg diperoleh kadar ﬁ kosianin yang lebih rendah jika dibandingkan dengan kadar ﬁ kosianin yang dihasilkan dari media dengan  NaNO 3 525,0.  Hal  ini  menggambarkan konsentrasi optimum kadar NaNO 3 yang ditambahkan ke media pertumbuhan untuk sianobakteria BTM 11 adalah  525,0  mg.  Hasil  uji  statistik  menunjukkan adanya  perbedaan    signiﬁ kan  pada  masing-masing kadar ﬁ kosianin hasil isolasi dari setiap konsentrasi media yang ditambahkan ke dalam media kultivasi.
Pada  penelitian  ini,  kadar  ﬁ kosianin  optimum didapatkan dari media dengan NaNO 3 sebanyak 525,0 mg. Hasil ini menunjukkan bahwa pada kadar tersebut kapasitas sianobakteria BTM 11 dalam mencadangkan nitrogen dalam bentuk ﬁ kosianin mencapai kondisi optimum,  sehingga  pada  saat  kosentrasi  NaNO 3 dinaikkan menjadi 626,25 mg dalam media SWBT, kadar ﬁ kosianin yang diproduksi oleh sianobakteria BTM 11 menjadi lebih rendah. Hal ini terjadi karena pada kadar yang terlalu tinggi, kapasitas enzim nitrate reductase dan nitrite reductase tidak memadai untuk mengubah  nitrat  dan  nitrit  menjadi  amonia  yang terlibat  dalam  sintesis  protein  dalam  sel,  sehingga dengan  tingginya  kadar  nitrat  dalam  lingkungan sianobakteria dapat berefek toksik dan mempengaruhi produktivitas sianobakteria (23) .
Nitrat menjadi bentuk nitrogen yang tersedia bagi alam  dan  sering  dimanfaatkan  oleh  sianobakteria. Asimilasi nitrat yang terjadi di dalam sianobakteria meliputi tiga proses: 1) Nitrat dialirkan ke sitoplasma
Gambar  1.  Histogram  hubungan  kadar  ﬁ kosianin  versus konsentrasi  NaNO   dalam  media.  Perlakuan  yang  memi- liki  anotasi  huruf  yang  berbeda  menunjukkan  perbedaan signiﬁ kan.
melalui  suatu  transporter  spesifik,  2)  Ion  nitrat direduksi  ke  bentuk  ion  amonium  (NH 4 + )  dengan memanfaatkan dua enzim yaitu nitrate reductase (NR) dan nitrite reductase (NiR), 3) Ion amonium bergabung ke senyawa karbon yang membentuk seperti α-amino group L-glutamat pada enzim glutamin sintetase (23) . Penelitian Kaewdam et al. (24) menyatakan bahwa nitrogen merupakan salah satu faktor penting untuk pertumbuhan  sel  dan  produktivitas  pigmentasi.
Gambar 2. Hubungan kadar ﬁ kosianin versus intensitas cahaya dalam media. Perlakuan yang memiliki anotasi huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan signiﬁ kan. pertambahan  intensitas  cahaya  yang  dipaparkan. Kadar ﬁ kosianin tertinggi dan memberikan perbedaan signifikan  diperoleh  dari  kultur  yang  dipaparkan cahaya  dengan  intensitas  cahaya  4500 lux .  Pada intensitas cahaya yang lebih tinggi lagi, yaitu 5500 lux , kadar ﬁ kosianin yang diperoleh lebih rendah jika dibandingkan dengan kadar ﬁ kosianin dari intensitas cahaya 4500 lux . Pada kultur yang ditempatkan di luar
HIKMAWAN ET AL.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
222
DPPH  memiliki  nilai  besaran  korelasi  (r  hitung) lebih  besar  daripada  r  tabel  (dengan  probabilitas 0,95) sehingga korelasi kedua besaran tersebut adalah signiﬁ kan dan persamaan regresi linear tersebut dapat digunakan.
Data persen penangkapan  radikal bebas DPPH pada berbagai konsentrasi sampel dapat dihitung nilai IC 50 .  Potensi  aktivitas  antioksidan  ﬁ kosianin  yang diisolasi dari sianobakteria laut BTM 11 dapat dilihat dari nilai IC 50 . Semakin kecil nilai IC 50 maka semakin besar  kemampuan  senyawa  sebagai  antioksidan.
ruangan dan mengikuti intensitas cahaya luar. Kadar ﬁ kosianin dari kultur yang dikultivasi di luar ruangan (cahaya matahari), tidak lebih bagus jika dibandingkan dengan kadar ﬁ kosianin yang diperoleh dari intensitas cahaya 4500 lux . Hal ini menunjukkan jika kultivasi dilakukan  tanpa  adanya  periode  gelap  dan  terang (penyinaran  terus  menerus  selama  kultivasi), sianobakteria  laut  BTM  11  mensintesis  ﬁ kosianin secara optimum pada intensitas cahaya 4500 lux . Hasil ini lebih efektif jika dibandingkan dengan kultivasi yang dilakukan dengan kondisi adanya periode gelap dan terang (siang dan malam) di luar ruangan. Pada intensitas  cahaya  5500 lux ,  kadar  ﬁ kosianin  yang terukur menurun jika dibandingkan dengan 4500 lux .
Hal ini dapat disebabkan karena adanya foto inhibisi yang  menyebabkan  pigmen  sianobakteria  BTM  11 menurun.
warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang didonorkan (Gambar 3) (27) .
Uji  kuantitatif  aktivitas  antioksidan  ﬁ kosianin didapatkan penangkapan radikal bebas (% inhibisi) dan  nilai  IC 50 dari  ﬁ kosianin  dan  vitamin  C  dapat dilihat berturut-turut pada Tabel 2.
Tabel 2 dan 3 menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi maka semakin besar persen penangkapan radikal bebas DPPH. Hasil analisis diketahui bahwa persamaan  garis  regresi  linear  antara  konsentrasi senyawa dengan persen penangkapan radikal bebas
Gambar 3 Uji kualitatif antioksidan: (a) DPPH dalam metanol p.a, (b) Fikosianin dalam metanol sebelum ditambahkan DPPH (c) Fikosianin setelah ditambahkan DPPH.
(a) (b) (c)
Uji Aktivitas  Antioksidan  Menggunakan Metode Penangkapan Radikal DPPH. Fikosianin memiliki  struktur  rantai  tetrapirol  terbuka  yang dikenal  sebagai  ﬁ kosianobilin  yang  melekat  secara kovalen  pada  apoprotein  dan  memiliki  struktur kimia yang mirip dengan bilirubin. Bilirubin mampu mengikat radikal peroksi dan mendonorkan elektron dari atom hidrogen yang terikat pada atom C nomor 10  dari  molekul  tetrapirol (26) .  Hasil  uji  kualitatif antioksidan oleh pereaksi DPPH dapat dilihat  pada Gambar 3.
Mekanisme penangkapan radikal bebas ini yaitu senyawa DPPH direduksi oleh senyawa antioksidan yang terdapat di dalam ﬁ kosianin. Hal ini dikarenakan ﬁ kosianin mendonorkan elektron dari atom hidrogen kepada  radikal  DPPH  sehingga  elektron  menjadi berpasangan  yang  ditunjukkan  dengan  perubahan
Tabel 2 Persen inhibisi dan nilai IC 50 ﬁ kosianin. No % Inhibisi pada Konsentrasi Fikosianin (µg/ml) Persamaan Regresi Linier IC 50 (µg/ml) 5 10 25 50 100 125 150 1 3,67 8,94 22,42 35,41 50,73 63,60 77,45 y = 6,1418 + 0,4715 x 93,02 2 6,49 10,29 22,79 34,55 52,32 62,62 79,41 y = 7,3279 + 0,4671 x 91,36 3 5,39 7,96 20,46 36,51 51,34 64,70 80,51 y = 5,6583 + 0,4888 x 90,72 4 6,98 10,78 20,83 33,94 53,92 62,13 77,57 y = 7,3044 + 0,4625 x 92,31 5 2,81 8,21 23,16 36,02 52,08 63,48 78,30 y = 5,8745 + 0,4795 x 92,02 Rata-rata ± SD 91,89±0,89 CV (%) 0,97
Vol 20, 2022
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia ` 223
5.  Zuorro  A,  Leal-Jerez,  AG,  Morales-Rivas  LK, Mogollón-Londoño SO, Sanchez-Galvis EM, García- Martínez  JB,  Barajas-Solano AF.  Enhancement  of phycobiliprotein  accumulation  in  thermotolerant Oscillatoria  sp .  through  media  optimization. ACS Omega. 2021; 6 (16): 10527–10536
6.  Praharyawan S, Setyaningsih T, Susilaningsih D, Dian Y,  Siregar  I,  Peningkatan  kemurnian  dan  toksisitas ekstrak  pigmen  c-ﬁ kosianin  dari  sianobakteria  laut Jaaginema sp. BTM-11 dengan menggunakan kitosan dan arang aktif enhancement . Jurnal Pascapanen dan Bioteknologi Kelautanan dan Perikanan. 2019; 14(1): 21–28
7.  Buchweitz  M.  Natural  solutions  for  blue  colors  in food. Elsevier Ltd, 2016.
8.  Nur  MMA,  Garcia  GM,  Boelen  P,  Buma  AGJ. Enhancement  of  C-phycocyanin  productivity  by Arthrospira platensis when growing on palm oil mill eﬄ uent  in  a  two-stage  semi-continuous  cultivation mode.  Journal  of Applied  Phycology.  2019;  31(5): 2855–2867.
9.  Schipper K, Fortunati F, Oostlander PC, Murakhi MA, Jabri HMSJH, Wijﬀ els RH, Barbosa MJ. Production of  phycocyanin  by Leptolyngbya  sp .  in  desert environments. Algal  Research.  2020; 47(September 2019): 101875.
10.   Hoi SK, Winayu BNR, Hsueh HT, Chu H. Light factors and  nitrogen  availability  to  enhance  biomass  and C-phycocyanin productivity of Thermosynechococcus sp .  CL-1.  Biochemical  Engineering  Journal.  2021; 167(1): 107899
11.  Rivera C, Niño L, Gelves G, Modeling of phycocyanin production  from Spirulina  platensis using  diﬀ erent light-emitting  diodes.  South African  Journal.  of Chemical Engineering. 2021; 37(March): 167–178.
12.   Zhang H, Yang C. Arginine and nitrogen mobilization in Cyanobacteria .  Molecular.  Microbiology.  2019. 111(4): 863–867.
13.  Chen F, Zhang Y, Guo S. Growth and phycocyanin formation of Spirulina platensis in photoheterotrophic culture. Biotechnology Letter. 1996; 18(5): 603–608.
14.  Pagels  F,  Guedes  AC,  Amaro  HM,  Kijjoa  A, Vasconcelos V. Phycobiliproteins from cyanobacteria: chemistry  and  biotechnological  applications. Biotechnology Advance.  2019; 37( 2019): 422–443. 15.   Kumar  D,  Dhar  DW,  Pabbi  S,  Kumar  N,  Walia  S.
Nilai  IC 50 rata-rata  untuk  ﬁ kosianin  dan  vitamin  C berturut-turut dapat dilihat pada Tabel 2 dan 3. Nilai IC 50 fikosianin  lebih  dari  vitamin  C  yang  berarti kemampuan  aktivitas  antioksidan  vitamin  C  lebih besar dibandingkan dengan ﬁ kosianin yang diisolasi dari sianobakteria laut BTM 11.

## SIMPULAN
Hasil penelitian ini menunjukkan kadar PC tertinggi didapat dari media dengan NaNO 3 sebesar 525,0 mg, dengan intensitas cahaya optimum adalah pada 4500 lux . Kedua parameter memberikan perbedaan signi- ﬁ kan.  Hasil  uji  aktivitas  antioksidan  menunjukkan PC  dari  sianobakteria  BTM  11  memiliki  aktivitas antioksidan dengan nilai IC 50 sebesar 91,89±0,89 µg/ mL sedangkan IC 50 dari asam askorbat (vitamin C) sebesar 2,39±0,02 µg/mL.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  berterimakasih  kepada  Prof.  Dr.  Dwi Susilaningsih,  M.Pharm.  atas  penyediaan  isolat BTM-11  sebagai  objek  penelitian.  Penulis  juga berterimakasih kepada Fakultas Farmasi Universitas Ahmad  Dahlan Yogyakarta  serta  Badan  Riset  dan Inovasi  Nasional  (BRIN)  yang  telah  memfasilitasi penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Phaniendra  A,  Jestadi  DB,  Periyasamy  L.  Free radicals:  properties,  sources,  targets,  and  their implication  in  various  diseases.  Indian  Journal  of Clinical Biochemistry. 2015; 30(1): 11–26.
2.  Henriksen  EJ,  Role  of  oxidative  stress  in  the pathogenesis of insulin resistance and type 2 diabetes, 2nd ed. Elsevier Inc., 2019.
3.  Zulaikhah ST. The role of antioxidant to prevent free radicals in the body. Sains Medika: Jurnal Kedokteran dan Kesehatan. 2017. 8(1): 39
4.  Jiang  L,  Wang Y, Yin  Q,  Liu  G,  Liu  H,  Huang Y. Phycocyanin: a potential drug for cancer treatment,” Journal of Cancer. 2017; (8)17: 3416–3429.

## Tabel 3 Persen inhibisi dan nilai IC
50 vitamin C. No % Inhibisi pada Konsentrasi Vitamin C (µg/mL) Persamaan Regresi Linier IC 50 (µg/mL) 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 1 24,60 31,54 42,93 50,91 63,35 70,15 82,19 y = 3,9547 + 19,3156 x 2,38 2 23,29 32,19 41,36 53,14 63,61 71,72 82,85 y = 3,6037 + 19,3156 x 2,37 3 22,90 31,02 39,65 49,86 65,05 71,33 83,79 y = 0,4067 + 20,6152 x 2,40 4 22,51 32,46 40,18 50,78 62,82 69,37 80,89 y =2,7908 + 19,3998 x 2,43 5 21,20 31,80 41,23 51,70 65,57 71,98 81,8 y =1,0237 + 20,4656 x 2,39 Rerata ± SD 2,39±0,02 CV (%) 0,84 Keterangan: r hitung > r tabel
HIKMAWAN ET AL. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
224
with applications in biology, biotechnology, foods and medicine. Applied. Microbiology and Biotechnology. 2008; 80(1): 1–14.
23.  Esen  M,  Öztürk  Ürek  R.  Nitrate  and  iron  nutrition eﬀ ects  on  some  nitrate  assimilation  enzymes  and metabolites in Spirulina platensis . Turkish Journal of Biology. 2014; 38(5): 690–700
24.  Kaewdam S, Jaturonglumlert S, Varith J, Nitatwichit C, Narkprasom K. Kinetic  models for phycocyanin production by fed-batch cultivation of the Spirulina platensis .  International  Journal  of  Geomate.  2019; 17(61): 187–194.
25.  Notonegoro, H, Setyaningsih I, Tarman K. Kandungan senyawa aktif Spirulina platensis yang ditumbuhkan pada media walne dengan konsentrasi NaNO 3 berbeda. Jurnal Pascapanen dan Bioteknologi Kelautanan dan Perikanan. 2018; 13(2): 111.
26.   Romay C, González R, Ledón N, Remirez D, Rimbau V.  C-Phycocyanin:A  Biliprotein  with  antioxidant, anti-inﬂ ammatory,  neuroprotactive  eﬀ ects).  Current Protein and Peptide Science. 2003; 4: 207–216.
27.   Kedare  SB  Singh  RP.  Genesis  and  development  of DPPH method of antioxidant assay. Journal of Food Science and Technology. 2011; 48(4): 412–422.
Extraction  and  puriﬁ cation  of  C-phycocyanin  from Spirulina platensis (CCC540). Indian Journal of Plant Physiology. 2014. 19(2): 184–188. 16.  Prabakaran  P,  Ravindran AD.  Eﬃ cacy  of  diﬀ erent extraction  methods  of  phycocyanin  from Spirulina platensis . International Journal of Life Science and Pharma Research. 2013; 1(1): 15–20.
17.  Becker  EW.  Microalgae  biotechnology  and microbiology. Cambridge University Press. 1994.
18.  Bennett A,  Bogobad  L,  Complementary  chromatic adaptation in a ﬁ lamentous blue-green alga.  Journal of Cell Biology. 1973; 58(2): 419–435.
19.  Bryant DA, Guglielmi G, de Marsac NT, Castets AM, Cohen-Bazire  G.  The  structure  of  cyanobacterial phycobilisomes: a model. Archives of Microbiology. 1979; 123(2): 113–127.
20.  Gantar M, Simović D, Djilas S, Gonzalez W, Miksovska
J. Isolation, characterization and antioxidative activity of C-phycocyanin from Limnothrix sp . strain 37-2-1.
Journal of Biotechnology. 2012; 159(1–2): 21–26.
21.  Silva LA, Kuhn KR, Moraes CC, Burkert CAV, Kalil SJ.  Experimental  design  as  a  tool  for  optimization of c-phycocyanin  puriﬁ cation by precipitation from Spirulina  platensis .  Journal  of  Brazilian  Chemical Society. 2009; 20(1): 5–12.
22.  Eriksen NT. Production of phycocyanin - A pigment