## Journal of Islamic Medicine
Volume 2 (4) (2018), Pages 44-53
PROTEIN ADHESI SUB UNIT PILI Shigella flexneri 18 kDa MENINGKATKAN EKSPRESI  PROTEIN ANTIMIKROBA  DEFENSIN PADA MENCIT
( STRATEGI PENGEMBANGAN VAKSIN SHIGELLOSIS BERBASIS PROTEIN

## ADHESI)
ADHESION PROTEIN PILI SUB UNIT 18 kDa Shigella flexneri IMPROVES EXPRESSION MICE DEFENSIN ANTIMICROBIAL PROTEIN (SHIGELLOSIS VACCINES DEVELOPMENT STRATEGY BASED ON PROTEIN ADHESION)
Avin Ainur Fitrianingsih 1 , Lailia Nur Rachma 1 , Alvi Milliana 1
1 School of Medicine, Faculty of Medical and Health Sciences, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang Indonesia avinainur@kedokteran.uin-malang.ac.id

## ABSTRAK
Shigellosis merupakan penyakit endemis  yang terutama terjadi di  negara  berkembang dan  merupakan penyebab  tersering  penyakit  diare  yang  berdarah.  Pengembangan  vaksin  dari  molekul  adhesin  memiliki kelebihan  pada  reaksi  imun  tubuh  yang  terbentuk  akan  membentuk  sistem  pertahanan  tubuh  yang  lebih  kuat dalam mengeliminasi bakteri serta tidak menimbulkan panas seperti vaksin dari sel utuh bakteri atau dari LPS- nya. Berdasarkan penelitian sebelumnya diketahui bahwa  pili Shigella flexneri dengan Berat Molekul (BM) 18 kDa merupakan molekul adhesi serta mampu bereaksi silang dengan pili Shigella spesies lainnya. Penelitian ini dimulai  dengan  proses  isolasi  pili S.    flexneri ,  kemudian  dilanjutkan  dengan  profiling  pili  dengan  cara elektroforesis SDS-PAGE.  Kemudian dilakukan perbanyakan protein  sub unit  pili  dengan elektroelusi. Protein sub unit  yang sudah diperoleh kemudian  diimunisasikan ke  mencit Balb/c  secara peroral  menggunakan sonde, dengan pemberian  4 kali selang 1 minggu, dan pada akhir minggu ke 4 mencit dimatikan. Serum, mukosa usus dan  paru  mencit  yang  didapatkan  kemudian  diuji  kadar Antimicrobial  peptide β  defensin  dengan  metode ELISA.  Kesimpulan  penelitian  ini  adalah  pemberian  protein  adhesi  sub  unit  pili S.  flexneri 18  kDa  selama  4 minggu  mampu  meningkatkan  kadar Antimicrobial  peptide  β  defensin pada  serum,  mukosa  usus,  dan  paru mencit. Sehingga  protein  adhesi  sub  unit  pili S.  flexneri 18    kDa  berpotensi  menjadi  vaksin  berbasis  sub  unit protein adhesi untuk kasus Shigellosis.
Kata Kunci : Shigella flexneri , sub unit pili 18 kDa, Antimicrobial peptide  β defensin

## ABSTRACT
Shigellosis  is  an  endemic  disease  that  mainly  occurs  in  developing  countries  and  is  the  most common cause of bloody diarrhea. Vaccine development from adhesin molecules has advantages in the body's immune reactions that are formed which will form a stronger body's defense system in eliminating bacteria and not causing heat such as vaccines from intact bacterial cells or from its LPS. Based on previous research, it is known that Shigella  flexneri pili with Molecular Weight (BM) 18 kDa  is  an adhesion  molecule and  is able to cross-react  with  other  species  of  Shigella  pili.  This  study  began  with  the  isolation  process  of S.  flexneri pili, followed by profiling pili by SDS-PAGE electrophoresis. Then the protein multiplication of pili sub-units was carried out by electroelution. The sub unit protein that has been obtained is then immunized into Balb / c mice orally  using  sonde,  with  4  times  a  week,  and  at  the  end  of  the  fourth  week  the  mice  are sacrificed. Serum, intestinal  and  lung  mucosa  obtained  from  mice  were  then  tested  for  Antimicrobial  peptide  β  defensin  levels using ELISA method. The conclusion of this study is the administration of adhesion protein sub-unit pili 18 kDa S. flexneri for 4 weeks can  increase levels of antimicrobial peptide β defensin in serum, intestinal mucosa, and
lung of mice. So that the adhesion protein of the  sub unit pili 18 kDa S. flexneri has the potential to become a vaccine based sub-protein adhesion unit for the case of Shigellosis.
Keywords: Shigella flexneri , pili 18 kDa sub unit, Antimicrobial peptide β defensin

## PENDAHULUAN
Shigellosis merupakan masalah kesehatan bagi seluruh penduduk dunia. Di Indonesia, diare  merupakan  salah  satu  penyebab  utama  kematian  bayi. 1 Berdasarkan  hasil  survei  pada balita di beberapa rumah sakit di Indonesia dan studi yang dilakukan di Jakarta Selatan pada 612 anak umur 0-12 tahun, Shigella flexneri terbukti sebagai etiologi utama diare. 2,3
Patogenesis  diare  oleh S.  flexneri merupakan  mekanisme  yang  komplek  yang menyebabkan  proses  inflamasi  usus  berat  dan    nekrosis  epitelium  kolon.  Kemampuan Shigella  melintasi  mukosa  kolon,  berkolonisasi  di  epitelium  usus,  dan  mendownregulasi antimicrobial peptide yang merupakan antibiotik alami tubuh adalah kunci penyebab sangat virulen-nya  bakteri  ini, 4,5 sehingga  konsumsi  10  -100  bakteri  dapat  menyebabkan  individu menderita diare berat. 6
Dikarenakan  berbagai  kemampuan  yang  dimiliki S.  flexneri untuk  menghindar  dari mekanisme  kerja  antibiotik,  saat  ini  telah  banyak  dilaporkan  resistensi  antibiotic multidrug oleh S.  flexneri sehingga  dapat  meningkatkan  risiko  epidemi  di  berbagai  negara  termasuk Indonesia.  Oleh  karena  itu World  Health  Organization memprioritaskan  pengembangan vaksin yang efektif dan aman untuk membantu pengendalian Shigellosis. 7
Tujuan dari penelitian ini membuktikan pengaruh protein adhesi sub unit pili S. flexneri 18 kDa sebagai kandidat vaksin terhadap level protein antimikroba β defensin.
Metode  yang  digunakan  adalah  dengan  memberikan  imunisasi  menggunakan  molekul adhesi S. flexneri 18 kDa secara peroral pada hewan coba mencit balb/c. Kemudian ditinjau daya  protektivitas  dan  respon  imun  berupa  level    protein  defensins yang  diisolasi  dari mucus  lumen  usus  mencit,  darah,  dan  paru.  defensins dianalisa  menggunakan  metode ELISA.  Hasil  penelitian  ini  diharapkan  dapat  menunjang  ditemukannya  vaksin  yang  handal untuk mengatasi shigellosis.

## BAHAN DAN METODE PENELITIAN

## Bahan penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : bakteri S. flexneri diperoleh dari Laboratorium  Kesehatan  DI  Yogyakarta;  Medium  pembiakan  bakteri:  medium  Mc.Conkey, medium Thiaproline  Carbonate  Glutamate (TCG)      agar, Bismuth  sulfite  agar (BSA)  dan Brain Heart Infusion (BHI) broth; Hewan coba: mencit galur Balb/C jantan usia 6-8 minggu dengan berat badan ±25 gram; Reagen Kimia: TCA (Trichloroacetic acid), ammonium sulfat, NaCitrat,  EDTA  (Ethylene  diamine  tetra-acetatic  acid),  EGTA  (Ethylene  glycol  tetra-acetic acid),  dithitreitol,  NaCL,  Na 2 HPO 4 ,  KH 2 PO 4 ,  ethanol,  acrylamid,  bis  acrylamid,  glisin,  tris- HCL,  tris  base,  SDS,  temed,  ammonium  persulfat,  commassie  blue,  methanol,  asam  asetat
glacial, gliserol, brompenol, brompenol blue, Tween 20; Protease inhibitor: protease inhibitor cocktail (Sigma Ultra); Adjuvant: CTB; Mouse beta defensin ELISA kit.

## Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :  Lempeng mikrotiter bentuk U dan bentuk  V,  membrane  dialysis,  membrane  elektroelusi,  tips,  tabung  sentrifus  1,5  ml (eppendorf), 15 ml, pipet mikro 5 – 20 µl, 50 – 200 µl, 200 – 1000 µl, jarum suntik; Alat-alat gelas; Omni-mixer modifikasi, magnetic stirrer, incubator, otoklaf, ELISA reader, pili cutter (Desain Sumarno), mikroskop.

## METODE PENELITIAN
Persiapan Bakteri S. flexneri .
Isolat S. flexneri dikultur pada medium SSA (Salmonella Shigella Agar) pada  suhu 37°C selama 24 jam untuk memastikan  kemurnian sampel bakteri. S. flexneri yang dipanen dari kultur SSA secara  terpisah kemudian dipindahkan ke cawan  petri yang berisi medium MacConkey pada  suhu 37 o C selama 24 jam untuk multiplikasi  bakteri.  Hasil kultur bakteri dari  medium  MacConkey    kemudian  dilarutkan  dalam  PBS  10  ml    dengan  pH  7,4. Selanjutnya dimasukkan ke  dalam botol berisi larutan BHI (Brain Heart  Infusion) 1000 ml. Botol tersebut kemudian  digoyang-goyang  pada  water bath  selama  30 menit pada suhu 37 o C.   Kemudian setelah digoyang, isi medium BHI  diambil sebanyak 10 mL dimasukkan ke dalam medium TCG  yang telah dibuat sebelumnya.  Inkubasi pada medium TCG dilakukan pada  suhu 37 0 C selama 2 x 24 jam.
Isolasi Protein Pili S.  flexneri .
Koleksi protein pili S.  flexneri mengacu pada metode yang dilakukan oleh Ehara 8 dengan    modifikasi    Sumarno.    Hasil  koleksi  bakteri  dikumpulkan    dalam  satu  botol  steril yang  kemudian    ditambahkan  Tricoleracetic  Acid  (TCA)  dengan      konsentrasinya  3%. Selanjutnya  dilakukan  sentrifugasi  dengan  kecepatan    sebesar  6.000  rpm  selama  30  menit pada suhu  4 o C. Endapan  yang  terbentuk merupakan whole-cell dari S. flexneri sedangkan supernatannya  adalah    produk  metabolit  dari  bakteri  tersebut.  Endapan  hasil  sentrifugasi kemudian    diencerkan  memakai  cairan  PBS  pH  7,4  dengan  perbandingan  endapan  : pengencer = 1 : 10  sehingga terbentuk suspensi baru.  Suspensi  bakteri kemudian dilakukan pemotongan  pili  dengan  kecepatan    5.000  rpm  selama  30  detik  pada  suhu  4 o C.  Setelah  itu hasil  pemotongan dimasukkan kedalam tabung  falcon dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000  rpm  selama  30  menit.  Hasil  supernatan  merupakan    pili,  sedang  endapannya diencerkan    dengan  PBS  PH  7,4  dengan  perbandingan    endapan  :  PBS  =  1  :  1.  Setelah diencerkan  maka  hasil pengenceran endapan dapat  disimpan atau dapat dilakukan langsung dilakukan  persiapan karakterisasi pili menggunakan  metode elektroforesis.
Sodium Dodecyl Sulfate  –  Polyacrilamide  Gel Electrophoresis  (SDS-PAGE).
Monitoring  berat  molekul  molekul  dikerjakan  dengan  SDS-PAGE  metode  Laemli, (1970).  Sample  protein  dipanaskan  100 0 C  selama  5  menit  dalam  larutan  penyangga  yang mengandung 5 mM Tris pH 6,8; 5% 2- mercapto ethanol ; 2,5% w/v sodium dodecyl sulfate , 10% v/v glycerol dengan menggunakan warna pelacak bromophenol blue . Dipilih 12,5 mini slab  gel  dengan tracking  gel 4%.  Voltase  aliran  listrik  yang  digunakan  adalah  120  mV. Sebagai  bahan  warna  yang  digunakan  adalah comassie  brilliant  blue dan  molekul  standar sigma  low  range  marker .  Setelah  dilakukan  perhitungan  berat  molekul  maka  dilakukan perbanyakan  protein  dengan  berat  molekul  18  kDa  dan  molekul  kemudian  dilakukan permurnian protein yaitu elektroelusi

## Pemberian Imunisasi
Imunisasi  diberikan  peroral  pada  mencit  dengan  menggunakan  sonde.  Imunisasi diberikan  4  kali  selang  1  minggu,  dan  pada  akhir  minggu  ke  4  mencit  dikorbankan,  dan diambil usus, paru dan serumnya.

## Preparasi Sampel homogenates usus dan omentum mencit
Dilakukan pengorbanan mencit dengan dislokasi leher, kemudian mencit di tempatkan pada  suatu  tatakan  gabus  yang  dilapisi  alumunium  foil,  difiksasi  pada  keempat  ekstremitas. Bagian  perut  mencit  dibuka  dengan  gunting  sampai  terlihat  organ  dalam  abdomen.  Darah diambil  dengan  spuit  1  cc  dari  jantung  mencit.  Kemudian  usus  paru    dihomogenisasikan dengan  1  ml  PBS  dan  kemudian  didisimpan  pada  suhu  -20 0 C overnight. Setelah  dua  kali siklus freeze-thaw untuk menghancurkan membran sel, homogentaes disentrifugasi 5000 x g selama  5  menit  pada  suhu  2  -  8 0 C.  Supernatan  diambil  dilakukan  pemurnian,  disuspensi dengan PBS dan dilakukan dialisis menggunakan PBS dan digunakan sebagai sampel untuk pemeriksaan kadar defensin dengan metode ELISA.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil Isolasi pili Shigella flexneri
Penggunaan  protein  adhesi  pili S.  flexneri dengan  berat  18  kDa  adalah  berdasarkan penelitian yang dilakukan pada tahun 2016 yang dapat membuktikan bahwa molekul tersebut merupakan  molekul  adhesin.  Hasil  dari  isolasi  protein  adhesi  pili S.  flexneri 18  kDa  dapat dilihat pada gambar berikut.
Gambar: Hasil elektroforesis SDS-PAGE 12,5% pili S. flexneri
Keterangan:
1. marker
2. potongan pili 1 S.  flexneri
3. potongan pili 2 S.  flexneri
4. Potongan pili 3 S.  flexneri

## Tabel Hasil Pengukuran Kadar β Defensin
Sampel
Kadar β Defensin
(pg/mL) Serum kelompok kontrol Serum kelompok imunisasi sub unit pili 18 kDa paru kelompok kontrol Paru kelompok imunisasi sub unit pili 18 kDa Usus kelompok kontrol usus kelompok imunisasi sub unit pili 18 kDa 1 25,989 36,813 17,039 23,681 58,862 279,102 2 23,681 36,813 17,039 23,269 59,194 303,347 3 24,888 37,933 18,126 23,515 58,862 258,321 4 24,188 37,933 17,890 24,622 64,575 339,996 5 23,765 38,263 17,094 22,089 59,529 324,359 6 23,681 36,813 17,039 23,598 64,575 357,158 7 24,888 39,801 18,125 23,187 58,862 249,006 8 24,188 37,933 17,890 23,107 64,575 253,582 9 23,681 38,263 18,185 22,241 64,191 310,053 Rata- rata 24,328 37,840 17,603 23,257 61,469 297,214
Kemudian  setelah  dilakukan  analisis  statistik  didapatkan  hasil  bahwa  terdapat  perbedaan yang  signifikan  kadar  defensin  mencit  baik  dari  sampel  serum,  mukosa  usus,  maupun  paru apabila  dibanding  dengan  kelompok  kontrol  (tanpa  perlakuan).  Sedangkan  kadar  defensin pada  usus  mencit  didapatkan  hasil  paling  tinggi  bila  dibanding  dengan  kadar  defensin  pada serum dan paru mencit.

## PEMBAHASAN
Sub unit yang diujikan pada penelitian ini adalah sub unit protein pili S. flexneri 18 kDa yang  telah  dipotong  dari  permukaan  luar  bakteri.  Protein  yang  diberikan  tersebut merupakan  molekul  adhesi  yang  merupakan  sub  unit  bakteri  yang  memiliki  efek  samping reaksi  lokal  dan  reaksi  sistemik  yang  lebih  ringan  dibanding  pemberian whole  cell yang dilemahkan. 9 Beberapa  penelitian  menggunakan  murine  sebagai  hewan  coba  menunjukkan fakta  bahwa    vaksinasi  subunit  dapat  menginduksi  sel  Th1  secara  kuat  dengan long  term memory dan  daya  tahan  yang  sama  atau  melebihi  tingkat  perlindungan  yang  dicapai menggunakan wild type microorganism . 10,11,12
Pemilihan  Mice  beta  defensin-14  (MBD-14)  dikarenakan  MBD-14  telah diidentifikasi  sebagai  orthologue  beta-defensin  3  manusia  (hBD3  atau  DEFB103).  Selain memiliki  kesamaan  struktur  sekitar  70  %,  MBD-14  memiliki  karakteristik  fungsional  yang serupa  dengan  HBD-3.  Sama  dengan  HBD3,  MBD-14  memiliki  peran  yang  sangat  penting pada  respon  antimikroba  pada  sistem  imun innate . 13 MBD-14  juga  memiliki  kemampuan untuk  menginduksi  respon  inflamasi  lokal  bawaan  dan  respon  kekebalan  adaptif  sistemik dengan berinteraksi dengan CCR6 reseptor. MBD14 juga didapatkan pada berbagai jaringan termasuk  limpa,  usus,  dan  saluran  pernapasan  atas  dan  bawah.  Ekspresi  MBD14  juga  dapat diinduksi  oleh  ikatan  dengan  agonis  reseptor  Toll-like  seperti  lipopolisakarida  dan  oleh rangsangan sitokin pro-inflamasi seperti tumor necrosis faktor dan interferon-gamma. HBD3 dan  mBD14  juga  sama-sama  memiliki  kemampuan  kemotaktik  terhadap  sel-sel  kekebalan yang  homing  di  area  peritoneal.  Sehingga,  berdasarkan  kesamaan  struktural  dan  fungsional tersebut,  MBD-14  merupakan  orthologue  dari  hBD3  dan  dapat  digunakan  dalam  penelitian mewakili HBD-3 pada manusia. 13
Selain struktur dan fungsi, MBD-14 memiliki keterkaitan dengan sitokin IL-17 dan IL-22  yang  diujikan  pada  penelitian  ini.  Kehadiran  pathogen  pada  mukosa  usus  yang  telah ditangkap  oleh  APC  yang  kemudian  dipresentasikan  kepada  sel  Th  0  menyebabkan differensiasi  Th  0  menjadi  Th  17  yang  memproduksi  IL-17  dan  IL-22. 14 IL-17  dan  IL-22 kemudian  akan  memacu  sel  epitel  mukosa  usus  untuk  memproduksi  beta  defensin.  IL-17 ternyata tidak hanya dihasilkan oleh sel Th-17. Innate Lymphoid Cells T γδ, iNKT, LTi-like juga  memproduksi    IL-17  and  IL-2. 15,16 Banyak  penelitian  yang  menunjukkan  bahwa γ  δ  T cells yang memproduksi IL-17 merupakan komponen yang sangat penting pada respon cepat pada  awal  terjadinya  infeksi  dalam  upaya  pertahanan  tubuh  terhadap  pathogen  asing. 17,18 Sitokin  IL-17  dan  IL-22  memerankan  peran  proteksi  pada  pertahanan  tubuh  melawan berbagai  pathogen  asing  dan  melindungi  barier  mukosa  dengan  meningkatkan  ekspresi antimicrobial peptide yang termasuk diantaranya beta defensin. 19,20
β  defensin  (BD)  adalah antimicrobial  peptides dengan  ukuran  kecil  yang diekspresikan terutama oleh sel epitel mukosa. β defensin diekspresikan terutama saat terjadi inflamasi,  infeksi,  dan  proses  perbaikan  jaringan  yang  merupakan  respon  terhadap  adanya antigen  asing,  dan  sekresi  sitokin  ataupun  metabolit  pathogen. 21,22 β-Defensin  memiliki kemampuan membunuh bakteri pathogen yang berusaha untuk menginvasi barrier inang. 22,23 Selain  itu  β  defensin  memiliki  peran  dalam  menginduksi  respon  imun  adaptif  dengan rekruitmen  monosit,  sel  dendritik,  dan  sel  T  menuju  area  inflamasi. 24 β-Defensin  juga menginduksi ekspresi berbagai molekul kostimulator pada monosit dan sel dendritik melaluli
interaksi  dengan  TLR  4. 23 sehingga  meingkatkan  klirens  patiogen  asing.  Kelebihan  yang dimiliki  oleh  β-Defensin  yang  lain  adalah  kemampuannya  dalam  menginduksi  sekaligus menginhibisi  aktifasi  sel  imun,  sehingga  menjadikannya  sebagai  protein  yang  mampu memodulasi sistem imun inang. 23, 24
Pemberian molekul adhesi berupa sub unit pili 18 kDa S. flexneri pada penelitian ini  melalui  oral.  Hal  ini  berdasarkan  pada  pathogenesis S.  flexneri yang  menginfeksi  inang melalui  jalur  rute  feko-oral.  Selain  efektif,  pemberian  protein  sub  unit  pili  melalui  oral memiliki keuntungan yang yaitu mudah pemberiannya, tidak melukai mencit, dan tidak  perlu metode  asepsis. 25 Tujuan  utama  dari  prosedur  vaksinasi  jenis  apapun  adalah  untuk membentuk  respon  protektif  dengan  memori  yang  panjang  dan  kualitas  respon  imun  yang memadai terhadap infeksi berikutnya.
Selain  itu,    kurangnya  waktu  pemberian  perlakuan juga  berpengaruh  pada  respon  imun yang  terjadi.  Respon  imun  yang  terbentuk  hingga  dapat  menghasilkan  sitokin  fase  respon imun adaptif melalui proses yang cukup panjang dan membutuhkan waktu yang lebih lama. Proses tersebut dimulai dengan antigen pada usus yang dipresentasikan pada sel T oleh APC (makrofag, sel dendritik, dan sel limfosit B). Pada folikel, antigen dipresentasikan pada sel B oleh sel dendritik folikular. Selama Patch of Peyer terpapar dengan antigen, sel limfosit yang naïve (sel T dan B) teraktivasi menjadi sel efektor.  Setelah meninggalkan Patch of Peyer , sel limfosit aktif mengikuti aliran limfe menuju kelenjar getah bening menseterial dan berakhir pada ductus  thoracicus kemudian  masuk  kedalam  darah  dan  bersirkulasi  keseluruh  tubuh. Selanjutnya sel limfosit masuk kembali ke jaringan mukosa usus ( homing ) melalui pembuluh darah kecil yang terdapat pada dinding usus dan menyebabkan respon imun mukosa usus  . 26 Selain  itu,  pemberian  imunisasi  protein  sub  unit  Omp S.  flexneri 28  KDa  harus  diberikan dengan secara kontinyu, karena pemeliharaan aktivitas protektif sel T helper bergantung pada adanya stimulasi antigen secara kontinyu. Keberadaan stimulasi kemokin  dibutuhkan secara kontinyu untuk perekrutan dan retensi sel T di jaringan. 14
Untuk data kadar β defensin, dari hasil independent T sample , kadar β defensin antara kedua  kelompok  perlakuan  ,  menunjukkan  adanya  perbedaan  antara  kelompok  kontrol  dan dan kelompok perlakuan yang  dilakukan imunisasi sub unit pili 18 kDa S. flexneri . Hal ini membuktikan  bahwa  kelompok  yang  diberi  perlakuan  imunisasi  sub  unit  pili  18  kDa S. flexneri dapat  meningkatkan  kadar  β  defensin,  sedangkan  kelompok  kontrol  tidak  dapat meningkatkan  kadar  β  defensin.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pemberian  imunisasi  protein adhesi sub unit pili S. flexneri 18 kDa saja mampu meningkatan kadar β defensin.

## KESIMPULAN
1. Pemberian  protein  adhesi  sub  unit  pili  18  kDa S.  flexneri selama  4  minggu meningkatkan  secara  bermakna  kadar  Antimicrobial  peptide  Beta  defensins  pada serum, mukosa usus, dan paru  mencit.
2. Kadar  Antimicrobial  peptide  Beta  defensins  paling  tinggi  didapatkan  pada  mukosa usus mencit.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Peneliti  mengucapkan  terimakasih  kepada  Diktis  Kemenag  yang  telah  memberikan  bantuan dana BOPTN 2018 pada penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
1. UNICEF.  2013.  Semakin  banyak  anak  bertahan  hidup  melewati  usia  lima  tahun. http://www.unicef.org/indonesia/id/media_23111.html
2. Direktorat  Jenderal  Pemberantasan  Penyakit  Menular  dan  Penyehatan    Lingkungan Pemukiman  (Ditjen  PPM  &  PLP).  2009.  Tatalaksana  Kasus  Diare  Bermasalah. Departemen Kesehatan RI; Badan Koordinasi Gastrointerologi Anak Indonesia
3. Herwana. 2010. Shigella-associated Diarrhea in Children in South Jakarta Indonesia. Southeast  Asian  J  Trop  Med  Public  Health. -  USA :  Southeast  Asia  J  Trop  Med Public Health.  2 : Vol. 41.p.418-25.
4. Sansonetti, P. J. 2004. War and peace at mucosal surfaces. Nat. Rev. Immunol. 4:953– 964.
5. Sperandio  B.  2008.  Virulent Shigella  flexneri subverts  the  host  innate  immune response  through  manipulation  of  antimicrobial  peptide  gene  expression.    Exp. Med.  5 : Vol. 205.p.1121-1132.
6. Tortora  G.J,  Berdell  R,  Christine  L.  2010.  Microbiology  an  Introduction.  Tenth edition. Benjamin Cummings
7. Chakrabarti M. 2010. A Simple Approach Towards The Development Of A Shigella Vaccine. Al Ameen J Med Sci. 4 : Vol. 3. p. 263-264.
8. Ehara,  M.  Ishibashi,  Y.  Ichinose,  M.  Iwanaga,  S.  Shimotori  and  Naito,  T.  1987. Purification  and  Partial  Characterization of  Fimbriae  of  Fimbriae  of Vibrio  cholerae 01 . Vaccine. 5(4): 283-8
9. Center  For  Disease  Control  and  Prevention.  2006.  General  Recommendation  on Immunization.  Recommendation  of  the  advisory  Committee  on Immunization Practice . MMWR. 55: 1 – 48
10. Aagaard  C,  Hoang  T,  Dietrich  J,  cardona  P,  Izzo  A,  Dolganov  G,  et  al.  2011.  A multistage  tuberculosis  vaccine  that  confers  efficient  protection  before  and  after exposure. Natural Med . 17:189 –194.
11. Agger  E,  Rosennkrands  I,  Hansen  J,  Brahimi  K,  vandahl  B,  Aagaard  C,  et al.  2008. Cationic  liposomes  formulated  with  synthetic  mycobacterial  cordfactor  (CAF01):  a versatile adjuvant for vaccines with different immunological requirements. PLoS One 3:e3116. doi:10.1371/journal.pone.0003116.
12. Lindenstram T, Woodworth J, Dietrich J, Aagaard C, Andersen P, Agger EM. 2012. .Vaccine-Induced  Th17  Cells  Are  Maintained  Long-Term  Postvaccination  as  a
Distinct  and  Phenotypically  Stable  Memory  Subset. Journal  ASM .Volume  80(10)  : 3533–3544
13. Rohrl J, Yang D, Oppenheim JJ, Hehlgans T. 2010. Human {beta}-Defensin 2 and 3 and  Their  Mouse  Orthologs  Induce  Chemotaxis  through  Interaction  with  CCR2. J Immunol . 2010;184:6688–6694.
14. Sotirakis  P.K.,  Simonazzi  E.,  Navarro  P.J.,  and  Rozières  A.  2012.  Differential capacity of human skin dendritic cells to polarize CD4+ T cells into IL-17, IL-21 and IL-22 producing cells. PLoS ONE 7:e45680. doi: 10.1371/journal.pone.0045680
15. Blaschitz C & Raffatelu M. 2010. Th 17 cytokines and the gut mucosal barrier. J Clin Immunol. 30. 196-203
16. Steinbach,  Sabine;  Vordermeier,  H  Martin;  Jones,  Gareth  J.  2016.  CD4+  and [gamma][delta] T Cells are the main Producers of IL-22 and IL-17A in Lymphocytes from  Mycobacterium  bovis-infected  Cattle. Nature  Publishing  Group.  Scientific Reports 6 .Doi:10.1038./srep29990.
17. Hamada  S,  Umemura  M,  Shiono  T,  Tanaka  K,  Yahagi  A,  Begum  MD,   et  al.  2008. IL-17A  produced  by  gammadelta  T  cells  plays  a  critical  role  in  innate  immunity against Listeria monocytogenes infection in the liver. J Immunol . 181: 3456–3463.
18. Raifer, H., Mahiny, A. J., Bollig, N., Petermann, F., Hellhund, A., Kellner, K., et al. 2012. Unlike alphabeta T cells, gammadelta T cells, LTi cells and NKT cells do not require  IRF4  for  the  production  of  IL-17A  and  IL-22 . Eur.  J.  Immunol. 42,  3189– 3201. doi: 10.1002/eji.20114215
19. Hasegawa  M.,  Yada,  S.,  Liu,  M.  Z.,  Kamada,  N.,  Munoz-Planillo,  R.,  Do,  N.,  et  al. 2014.  Interleukin-22  regulates  the  complement  system  to  promote  resistance  against pathobionts  after  pathogen-induced  intestinal  damage . Immunity 41,  620–632.  doi: 10.1016/j.immuni.2014.09.010
20. Muñoz,  M.,  Eidenschenk,  C.,  Ota,  N.,  Wong,  K.,  Lohmann,  U.,  Kühl,  A.  A.,  et  al. 2015.  Interleukin-22  induces  interleukin-18  expression  from  epithelial  cells  during intestinal infection. Immunity 42, 321–331. doi: 10.1016/j.immuni.2015.01.011
21. Corrales  G.L, Ortiz E, Delgado cJ, Santiago B, Corzo G. 2013. Bacterial expression and antibiotic activities of recombinant variants of human ß-defensins on pathogenic bacteria and M. tuberculosis. Protein
Expr Purif. 2013;89:33– 43.doi:10.1016/j.pep.2013.02.007.
22. Archer  N.K,  Adappa  N.D, Palmer  J.N,  Cohen  N.A, Harro  J.M,  Lee  SK., Miller  L.S, Shirtliff  M.E.  2016.    IL-17A  and  IL-17F  are  critical  for  antimicrobial  peptide production  and clearance  of Staphylococcus  aureus  nasal colonization.  Infection  and immunity. Journal of American Society for microbiology . 16 . doi:10.1128/IAI.00596- 16
23. Zhu C, Tan H, Cheng T, Shen H, Shao J, Guo Y, Shi S and Zhang X. 2013.  Human β-defensin  3  inhibits  antibiotic-resistant  Staphylococcus  biofilm  formation. J  Surg Res. 183:204–213.
24. Jarczak  J,  Kościuczuk  EM,  Lisowski  P,  Strzałkowska  N,  Jóźwik  A,  Horbańczuk  J, Krzyżewski J, Zwierzchowski L and Bagnicka E. 2013. Defensins: natural component of human innate immunity. Hum Immunol . 74:1069–1079.
25. Katz D.E, Coster T.S, Wolf M.K, Trespalacios FC, Cohen D, Robins G, Hartman AB, Venkatesan  MM,  Taylor  DN,  Hale  TL.  2004. Two  studies  evaluating  the  safety  and immunogenicity  of  a  live,  attenuated  Shigella  flexneri  2a  vaccine  (SC602)  and excretion of vaccine organisms in North American volunteers. Infect Immun 72:923– 930. doi:.10.1128/IAI.72.2.923-930.2004
26. Bodera, P. & Chcialowski, A. 2009. Immunomodulatory Effect of Probiotic Bacteria. Recent Patents. Inflammation & Allergy Drug Discovery. 3, 58-64