## POTENSI ANTIBAKTERI  DIATOM LAUT
Skeletonema costatum TERHADAP BAKTERI Vibrio sp.
Iriani Setyaningsih 1), Lily M. Panggabean 2), Bambang Riyanto 1), Novita Nugraheny 3)

## Abstrak
Budidaya udang di  Indonesia berkembang dengan cukup pesat karena  udang  merupakan salah  satu  sumber  devisa  bagi  negara.  Akan  tetapi  perkembangan  ini  menghadapi  permasalahan seperti adanya  penyakit bakterial.  Salah satu bakteri  patogen pada  budidaya udang adalah Vibrio sp.  Upaya  untuk  mengatasi  hal  ini  dapat  dilakukan  antara  lain  dengan  menggunakan  bahan antibakteria S. costatum .  Pada penelitian ini, kulitivasi diatum S. costatum dilakukan dalam botol schott yang  berisi  f  medium  yang  dilengkapi  dengan  aerator  dan  cahaya  dengan  intensitas  2000 luks.  Kulivitasi  dilakukan  pada  suhu  25 o C.  Kurva  pertumbuhan S.  costatum ditentukan  dengan menghitung jumlah sel setiap harinya.  Untuk ekstraksi antibakteri, kultur dipanen pada hari ke-6, selanjutnya  dilakukan  ekstraksi  terhadap  biomasanya  dengan  menggunakan  metanol  untuk mendapatkan  ekstrak  antibakteri.  Ekstrak  antibakteri  ini  diujikan  pada  bakteri Vibrio  sp dengan metode  difusi  agar.  Hasil  pengujian  terhadap  aktivitas  penghambatan  bakteri  tersebut menunjukkan  bahwa  ekstrak  kasar  ( crude )  intraseluler S.  costatum mampu  menghambat pertumbuhan  bakteri Vibrio  sp dengan  potensi  hambatan  ( inhibitor  potention )  75,47%  (pada konstertasi ekstrak 2000 ppm), 52,08% (pada 1000 ppm), 30,43% (pada 500 ppm), 23,81% (pada 250 ppm) dan 15,79% (pada 100 ppm) dibandingkan dengan kloramfenikol.
Key word: Skeletonema costatum , antibakteri, Vibrio

## PENDAHULUAN
Budidaya udang secara komersiel di Indonesia berkembang dengan cukup pesat.  Hal  ini  dikarenakan  udang  mempunyai  nilai  ekonomis  yang  penting dipasaran  internasional  dan  juga  berperan  untuk  memenuhi  keperluan  domestik terhadap  protein  hewani.  Pertumbuhan  usaha  budidaya  udang  dipengaruhi  oleh beberapa  faktor  diantaranya  serangan  bakteri  dan  pengendalian  parameter  kimia- fisika yang berupa pengontrolan pH, suhu serta BOD air.
Pada  budidaya  udang  windu,  penyakit  vibriosis  terjadi  pada  skala  larva dan  stadia  dewasa.  Larva  udang  windu  yang  terserang  penyakit  biasanya  pada stadia zoea, mysis dan awal post larva. Penyakit vibriosis pada stadia larva terdiri dari  penyakit  berpendar  dan  penyakit  udang  bengkok,  sedangkan  pada  stadia udang  dewasa  mengakibatkan  terjadinya  bercak  coklat  putih  pada  cangkangnya. Bakteri  penyebab  penyakit-penyakit  tersebut  berasal  dari  genus Vibrio (Sunaryanto et al. , 1987 dan Lovilla-Pitogho et al. , 1990).
1.  Staf Pengajar Departemen Teknologi Hasil Perairan FPIK- IPB
2.  Staf  Pusat Penelitian dan Pengembangan Oseanologi, LIPI
3.  Alumni Departemen Teknologi Hasil Perairan FPIK -IPB
Berbagai  upaya  telah  dilakukan  untuk  mencegah  timbulnya  penyakit udang  di  tambak,  antara  lain  melalui  pengelolaan  limbah  dengan  menggunakan tandon dan biofilter tetapi hasilnya belum memuaskan. Penggunaan antibiotik dan pestisida  sering  dilakukan  petani  untuk  menanggulangi  terjadinya  serangan penyakit  pada  budidaya  udang,  namun  tanpa  disadari  oleh  petani,  hal  ini  akan membawa dampak negatif terhadap lingkungan budidaya maupun terhadap udang yang dibudidayakan.
Tindakan  pemberian  antibiotik  sintetik  yang  terus  menerus  dapat menimbulkan  resistensi  bakteri,  meninggalkan  residu  pada  udang  yang selanjutnya  dapat  membahayakan  konsumen  (Taufik et  al. ,  1996).  Sedangkan penggunaan  pestisida  secara  berlebihan  dapat  menghambat  perkembangan organisme nontarget seperti plankton dan bakteri pengurai, sehingga mengganggu sistem keseimbangan dalam lingkungan tambak.
Berdasarkan  hal  tersebut  maka  perlu  dicari  alternatif  pemecahannya, antara  lain  penggunaan  bahan  alami  yang  mengandung  bioaktif,  mudah  terurai, dan  dapat  digunakan  sebagai  antibiotik. S.  costatum merupakan  salah  satu  jenis diatom yang dominan di laut dan tumbuh subur diperairan sekitar pantai terutama setelah musim hujan. Namun sejauh ini, S. costatum belum banyak dimanfaatkan sebagai  salah  satu  penghasil  antibakteri  alami.  Berdasarkan  hal  tersebut  maka dilakukan penelitian ini, yang dimaksudkan untuk mengetahui kemampuan diatom S.  costatum dalam  menghasilkan  bahan  antibakteri  serta  menentukan  konsentrasi minimum untuk menghambat bakteri Vibrio sp .

## TUJUAN PENELITIAN
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mengekstrak bahan antibakteri dari diatom S. costatum
2. Menentukan  potensi  hambatan  ekstrak  intraseluler  terhadap  kloramfenikol yang diperoleh untuk menghambat bakteri Vibrio sp .

## BAHAN DAN METODE
Bahan  yang digunakan  adalah  kultur diatom S. costatum yang merupakan koleksi  Pusat  Penelitian  dan  Pengembangan  Oseanologi  –  LIPI,  Jakarta  Utara, medium  f  atau  Guillard,  pelarut  organik  metanol,  bakteri Vibrio  sp media Thiosulfate  Citrate  Bile  –  Salt  Sucrase  Agar  (TCBSA ),  media Trypticase  Soy Broth  (TSB) ,  air  laut,  aquades  steril, Dimetil  Sulfoksida  (DMSO), serta  antibiotik kloramfenikol.
Alat-alat yang digunakan adalah botol Schott berukuran 2 liter, tutup karet, pipet  kaca,  lampu  TL  20 watt, aerator,  luxmeter,  refractometer , alumunium  foil , selang  silikon, autoclave ,  ruang clean  banch ,  mikropipet, ultracentrifuse, sudip, freezer , freeze  dryer ,  erlenmeyer,  batang  pengaduk, ultrasonic ,  gelas  ukur,  pipet serologis,  inkubator,  spektrofotometer,  kertas  filter,  pinset,  cawan  peteri,  tabung reaksi, kapas, jarum ose, , bunsen,  dan paper disc 6 mm.

## Pengkulturan Diatom Skeletonema costatum
Pengkulturan diatom S. costatum dilakukan dalam 2 tahap. Tahap pertama bertujuan untuk menentukan kurva serta umur panen dari diatom S. costatum pada medium f steril. Tahap pengkulturan S. costatum disajikan pada Gambar 1.

## S. costatum
Inokulasi 1 ml ke dalam 50 ml larutan medium steril ( aerasi, 7 hari)
Scale up dengan menginokulasikan inokulum ke dalam 1000 ml medium (aerasi,  6 hari)
Pemanenan
Gambar 1.  Proses pengkulturan S. costatum

## Ekstraksi Bahan Antibakteri
Ekstraksi  bahan  antibakteri  dari  biomassa S.  costatum dilakukan  dengan modifikasi  metode  Naviner et  al .  (1999).  Proses  tersebut  dapat  dilihat  pada Gambar 2.
Pemanenan S.  costatum
Pemisahan
(Ultracentrifuse)
Biomassa Pengeringan Biomassa kering Penambahan pelarut metanol Pemecahan sel Penyaringan dengan kertas saring Whatman dan penguapan dengan desikator
Ekstrak kasar bahan antibakteri
Gambar 2.  Proses ekstraksi bahan antibakteri

## Pengujian Aktivitas Bahan Antibakteri
Ekstrak  intraselular  dan  kloramfenikol  yang  akan  diuji  dilarutkan  dalam DMSO dengan  konsentrasi  2000, 1000, 500, 250,  100 ppm.  Kertas  cakram  steril yang  telah  ditetesi  dengan  25  µl  ekstrak  yang  akan  diuji  tersebut  (ekstrak
intraselular  maupun  kontrol  antibiotik  kloramfenikol)  diletakkan  diatas  agar. Cawan  petri  yang  sudah  berisi  kultur  bakteri  dan  ekstrak  senyawa  antibakteri disimpan dalam  inkubator dengan posisi terbalik  selama 18 jam  pada suhu 30 o C. Diameter  daerah  penghambatan  yang  terbentuk  pada  cawan  petri  diukur  dengan cara  mengukur  diameter  hambatan  yang  terbentuk  disekeliling paper  disc dikurangi  dengan  diameter paper  disc .  Besarnya  diameter  hambatan  yang dibentuk  oleh  ekstrak  intraselular  kasar  dapat  dibandingkan  dengan  diameter kloramfenikol  sebagai  senyawa  kontrol,  sehingga  dapat  diketahui  besarnya potensi  hambatan  ekstrak  intraselluler.    Rumus  perhitungan  potensi  antimikroba adalah sebagai berikut :
100% x sama i konsentras dengan kontrol senyawa Diameter diperiksa yang senyawa hambatan Diameter Potensi 

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kurva Pertumbuhan S. costatum
Pola  pertumbuhan S.  costatum mengikuti  model  pertumbuhan  logaritmik, yaitu  dimulai  dari  fase  log  atau  eksponensial,  fase  penurunan  laju  pertumbuhan, fase  stationer,  dan  fase  kematian.  Pada  kultur S. costatum ,  waktu  terjadinya  fase lag  diduga  karena  kultur  telah  mengalami  adaptasi  sebelumnya,  yaitu  dengan penyegaran  yang  telah  dilakukan  berkali-kali  di  Puslitbang  Oseanologi  –  LIPI sehingga dihasilkan inokulum yang bermutu tinggi untuk skala kultur selanjutnya.
Fase  log  atau  eksponensial S.  costatum berlangsung  dari  awal  kultivasi sampai  hari  ke-  4  dengan  log  kepadatan  1,0  –  2,9  sel/ml.  Pada  fase  ini  kultur mengalami peningkatan jumlah sel yang sangat besar karena sel mulai mengalami pembelahan  dengan  cepat  dimana  kecepatan  pembelahan  sel S.  costatum yang berasal  dari  daerah  tropis  berlangsung  sekitar  4  jam,  tergantung  kondisi lingkungan (Arinardi et al ., 1997).
Pada hari ke-5 kultur mengalami peningkatan jumlah sel yang lambat pada log  kepadatan  3,08  sel/m.  Fase  ini  disebut  sebagai  fase  penurunan  laju pertumbuhan  dengan  warna  kultur  sama  seperti  akhir  fase  log.  Turunnya  laju pertumbuhan mikroalga disebabkan oleh 3 hal,  yaitu berkurangnya mikro-nutrien
sebagai  faktur  pembatas  karena  telah  banyak  dimanfaatkan  selama  fase eksponensial,  adanya  toksik  yang  dihasilkan  oleh  alga  itu  sendiri  sebagai  hasil dari  metabolisme  dan  berkurangnya  proses  fotosintesis  akibat  bertambahnya jumlah  sel  sehingga  hanya  bagian  permukaan  kultur  saja  yang  memperoleh cahaya (Riley dan Chester, 1971)
Kurva Pertumbuhan S. costatum 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hari Ke- L o g K e p a d a ta n s e l
Gambar 3.  Kurva pertumbuhan S. costatum
Fase  stasioner  dimulai  pada  hari  ke-  6  sampai  hari  ke-  12  dengan  log kepadatan  sel  berkisar  antara  3,17  sampai  3,43  sel/ml.  Pada  fase  ini  sel  tidak mengalami peningkatan maupun penurunan laju pertumbuhan sehingga jumlah sel pada fase ini tetap.
Fase  kematian  kultur S.  costatum dimulai  sejak  hari  ke–  13  dengan  log kepadatan sel 2,67 sel/ml yang ditandai dengan warna kultur yang menjadi kuning keputihan. Sel yang mati terlihat tidak membentuk koloni, bagian dalam cangkang terlihat kosong serta terjadi penumpukan cangkang  yang tidak beraturan. Kondisi tersebut  disebabkan  oleh  adanya  produk  toksik  yang  dihasikan  mikroalga  dan habisnya nutrient didalam medium sehingga sel tidak dapat bertahan hidup.

## Hasil Ekstraksi Bahan Antibakteri S. costatum
Kultur  diatom S.  costatum dipanen  pada  awal  fase  stationer,  yaitu  pada hari  ke–  6.  Metabolit  sekunder  yang  berupa  karbon  organik  lebih  banyak dihasilkan  pada  fase  lag  dan  fase  stationer  daripada  fase  log.  Akan  tetapi  tidak
pada  setiap  kondisi  suatu  metabolit  dapat  dihasilkan,  tergantung  pada  pH, salinitas,  kondisi  aerob/anaerob,  cahaya  dan  nutrisi  (Hellebust 1879  yang  dikutip Stewart, 1974).
Sebanyak  7  liter  kultur S.  costatum dipisahkan  dengan ultrasentrifuge dengan kecepatan 18.000 rpm yang bertujuan untuk memisahkan antara filtrat dan biomassa.  Banyaknya    biomassa  yang  didapat  adalah  4,473  gr  (berat  basah)  dan setelah dikeringkan dengan freeze dryer diperoleh serbuk biomassa sebesar 1,810 gr.  Serbuk  biomassa  dilarutkan  dengan  pelarut  metanol  dengan  perbandingan  1  : 25  (b/v)  kemudian  dipecah  selnya  menggunakan ultrasonic ,  selanjutnya  disaring dengan kertas Whatman no. 42 untuk memisahkan antara precipitat (padatan) dan supernatan  (cairan).  Supernatan  yang  telah  dipisahkan  ditempatkan  dalam desikator dengan tujuan menguapkan pelarut metanol  sehingga didapatkan bahan antibakteri berupa serbuk berwarna hijau dengan berat 0,208 gr.

## Hasil Pengujian Aktivitas Ekstrak Intraselular terhadap Vibrio sp
Ekstrak  intraselular  yang  akan  diuji,  terlebih  dahulu  dilarutkan  dengan DMSO  dengan  konsentrasi  2000,  1000,  250,  dan  100  ppm.  Penggunaan  DMSO dimaksudkan  untuk  melarutkan  dan  menstabilkan  ekstrak  intraselular  yang  akan diujikan dan penggunaannya bertujuan untuk mencegah kerusakan bahan  farmasi selama dilakukan penyimpanan (Singleton dan Sainsbury, 1980 dan Bains, 1995). Kertas  cakram  yang  berukuran  6  mm  ditetesi  dengan  bahan  yuang  akan  diuji kemudian  diletakkan  pada  cawan  petri  yang  berisi  media  TCBSA  yang  telah diinokulasikan dengan 25 µl Vibrio sp. Setelah diinkubasi dalam inkubator selama 18  jam  pada  suhu  30 o C,  maka  sensitivitas  terkecil  dari  zat  tersebut  dapat ditentukan  dengan  adanya  zona  bening  terkecil  yang  masih  dapat  dibentuk  oleh konsentrasi  terkecil  ekstrak  intraselular.  Zona  bening  diukur  dalam  milimeter dengan cara mengukur seluruh garis tengah zona bening dikurangi diameter kertas cakram.  Hasil  pengujian  aktivitas  ekstrak  kasar  intraselular S.costatum terhadap bakteri Vibrio sp dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Diameter penghambat ekstrak kasar intraseluler Skeletonema
costatum terhadap Bakteri Vibrio sp.
Konsentrasi (ppm) Jenis Bahan Bakteri Diameter Hambatan (mm) Potensi Hambatan (%) 2000 Ekstrak intraselular (A) Kloramfenikol (B) 20 26,5 75,47 1000 Ekstrak intraselular (A) Kloramfenikol 12,5 24 52,8 500 Ekstrak intraselular (A) Kloramfenikol 7 23 30,43 250 Ekstrak intraselular (A) Kloramfenikol 5 21 23,81 100 Ekstrak intraselular (A) Kloramfenikol 3 19 15,79
Apabila  diameter  daerah  penghambatan inhibitor  zone  diameter yang terbentuk lebih besar atau sama dengan 6 mm maka bakteri tersebut dikategorikan “sensitif”  terhadap  bahan  antibakteri  yang  diujikan  tetapi  jika  diameter  yang terbentuk kurang dari 6 mm maka bakteri tersebut dikategorikan resisten terhadap senyawa antibakteri yang diujikan (Bell, 1984).
Berdasarkan  hasil  pengujian  aktivitas  ekstrak  intraseluler S.  costatum dapat ditentukan  bahwa  konsentrasi  hambatan  minimum  adalah  500 ppm dengan kandungan  ekstrak  intraselular  sebesar  12,5  µg  dalam  25  µl  pelarut.  Pada konsentrasi  tersebut  ekstrak  intraselular  dan  kloramfenikol  mempunyai  diameter hambatan  sebesar  7  mm  dan  23  mm  serta  potensi  hambatannya  30,42  %  artinya kemampuan ekstrak intraselular dari S. costatum dalam menghambat pertumbuhan Vibrio  sp. sebesar  35,43  %  dibandingkan  dengan  kloramfenikol.  Ekstrak intraselular S.  costatum dan  kloramfenikol  merupakan  antibakteri  yang  bersifat bakteriostatik, yaitu hanya mampu menghambat pertumbuhan Vibrio sp. tapi tidak membunuh.  Hal  tersebut  terbkti  dengan  munculnya  sejumlah  koloni Vibrio  sp. pada  zona  bening  ekstrak  intraselular  pada  jam  ke  –  24  dan  pada  zona  bening kloramfenikol pada jam ke – 36. Akan tetapi sifat bakteriostatik ini dapat berubah memberikan  efek  bakterisidal  apabila  konsentrasi  ekstrak  yang  digunakan semakin besar. Mekanisme  yang bersifat bakterisidal akan mempengaruhi bakteri dengan  merusak  dinding  selnya  sehingga  akan  pecah  dan  bakteri  tidak  dapat
bertahan terhadap pengaruh luar, atau mengganggu keutuhan membran sel bakteri sehingga  pertukaran  zat  aktif  atau  metabolit  ke  dalam  dan  keluar  sel  akan terganggu (Pelczar dan Chan, 1988).

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Kultur S.  costatum sebanyak  7  liter  menghasilkan  biomassa  sel  sebesar 1,810  gr  dan  ekstrak  intraseluler  diatom S.  costatum yang  terbentuk  serbuk berwarna hijau sebesar 0,208 gr.
Ekstrak  kasar S.  costatum mengandung  bahan  antibakteri  yang  mampu menghambat  bakteri  patogen Vibrio  sp. Besarnya  potensi  hambatan  ekstrak intraseluler Skeletonema  costatum dibandingkan  dengan  kloramfenikol  pada konstrasi  2000  ppm  adalah  75,47%.  Pada  konsentrasi  1000  ppm  adalah  52,08%, pada  konsentrasi  500  ppm  adalah  30,43%,  pada  konsentrasi  250  ppm  adalah 23,81%,  dan  pada  konsentrasi  100  ppm  adalah  15,79%.  Konsentrasi  hambatan minimum  ekstrak  intraselular  kasar  dan  kloramfenikol  sebagai  kontrol  adalah  7 mm dan 23 mm.

## Saran
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  diperoleh  maka  perlu  dilakukan penelitian  lanjutan  yaitu pemurnian  ekstrak intraseluler kasar untuk mendapatkan ekstrak  intraseluler  dari Skeletonema  costatum yang  lebih  murni  serta pengujiannya  dan  penentuan  konsetrasi  hambatan  minimum  ekstak  intraseluler kasar ataupun murni terhadap bakteri patogen lainnya.

## DAFTAR PUSTAKA
Arinadi OH, Sutomo AB, Yusuf SA, Trimaningsih, Asnaryanti E dan Riyono SH 1997.  Pengantar  Tentang  Plankton  Serta  Kisaran  Kelimpahan  dan Plankton  Predominan  di  Sekitar  Pulau  Jawa  dan  Bali.  Puslitbang Oseanologi LIPI. Jakarta.
Bains W. 1995. Biotechnology from A to Z . Oxford
Bell,  S.M.  1984.  Antibiotic  sensitivity  testing  by  the  CDS  Methods . Dalam Clinical Microbiology Up date Program. Editor: Hartwig, N. The Prince of Wales Hospital/ New South Wales.
Lavilla-Pitogo  CR,  Baticados  LL,  Cruz  Lacierda  ER  dan  de  la  Pena  LD.  1990.
Occurrence  of  luminous  bacterial  disease  of  Penaeus  monodon  larvae  in the Philippines. Journal Aquaculture. Vol. 91. Elsevier Published.
Naviner  M,  Berge  JP,  Durand,  Le  Bris  H.  1999.  Antibacterial  activity  of  the marine  diatom Skeletonema  costatum against  aquacultural  patogens. J.  of Aquaculture Vol. 174. Elsevier Published.
Riley,  Chester.  1971. Introduction  to  Marine  Chemistry .  Academic  Press  Inc. London.
Singbetor  P.  1997. Bacteria  in  Biology.  Biotechnology  and  Medicine .  Fourth Edition. John Wiley and Sons. UK.
Singleton,  Sainsbury.  1980. Dictionary  of  Microbiology .  John  Wiley  and  Sons. Ltd. Great Britain.
Stewart,  D.P.  1974. Algal  Physiology  and  Biochemistry .  Blackwell  Scientific Published. London.
Sunaryanto  A,  Mariam  A,  Pudjianto.  1987. Penyakit  udang .  INFIS  Manual  Seri No. 43. Dirjen Peikanan Jakarta.
Taufik I, Koesharyani I, , Roza D. 1996. Pemanfaatan fitoplanton untuk menekan perkembangan  bakteri  bercahaya  ( Vibrio  harveyi ). Jurnal  Penelitian Perikanan Indonesia. Vol. 11. No. 2.

## Lampiran 1. Kepadatan (sel/ml) dan Log kepadatan diatom

## Skeletonema costatum
Hari Ke- Kepadatan Sel Log Kepadatan Sel 0 1,00 x 10 4 1 1 7,00 x 10 4 1,84 2 1,21 x 10 5 2,08 3 4,21 x 10 5 2,61 4 8,00 x 10 6 2,9 5 1,21 x 10 6 3,08 6 1,56 x 10 6 3,19 7 1,91 x 10 6 3,28 8 1,57 x 10 6 3,19 9 2,68 x 10 6 3,42 10 2,48 x 10 6 3,39 11 1,83 x 10 6 3,26 12 1,57 x 10 6 3,19 13 4,70 x 10 5 2,67 14 2,50 x 10 5 2,39 15 1,25 x 10 4 1,09