PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL AKAR PASAK BUMI ( Eurycoma longifolia Jack) TERHADAP EKSPRESI PROTEIN p53 PADA KANKER PAYUDARA TIKUS BETINA SPRAGUE DAWLEY (SD) YANG DIINDUKSI 7,12- Dimetilbenz[α]anthrasen (DMBA)
EFFECT OF GIVEN OF ETHANOLIC EXTRACT OF PASAK BUMI ROOT ( EURYCOMA LONGIFOLIA , JACK) AGAINST P53 EXPRESSION IN BREAST CANCER OF FEMALE MICE SPRAGUE DAWLEY - GROOVE (SD) THAT INDUCTED WITH 7,12-Dimethylbenz [  ] Anthracen (DMBA)
Normakiyah dan Laela Hayu Nurani* Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta laelagrin@yahoo.com

## ABSTRAK
Akar  pasak  bumi  mengandung  senyawa  kuasinoid  diduga  mempunyai  efek  penghambatan karsinogenesis,  antiulcer,  dan  antimalaria.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh pemberian  eksktrak  etanol  akar  pasak  bumi  terhadap  ekspresi  p53  pada  kanker  payudara  tikus betina yang diinduksi DMBA.Tikus dibagi menjadi 6 kelompok. Kelompok I, II dan III diberi ekstrak etanol  akar  pasak  bumi  dosis  berturut-turut  100;  200  dan  400  mg/kg  BB.  Kelompok  IV  diberi larutan DMBA 20 mg/kg BB. Kelompok V diberi corn oil . Kelompok VI sebagai baseline . Tikus yang mengalami  kanker,  dihitung  jumlah  nodul  tumornya  dan  pada  minggu  ke-23  semua  tikus dikorbankan dan diambil jaringannya untuk pengamatan secara mikroskopik menggunakan metode H&E  dan  imunohistokimia.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  rerata  ekpresi  p53 mutant pada pemberian ekstrak berturut-turut 100, 200 dan 400 mg/kg BB adalah 6,375 ± 4,07; 11,25 ± 16,53; dan 0,875 ± 1,75; kelompok  IV (DMBA) sebesar 13,125 ± 14,4; kelompok V ( corn oil ) adalah 1,375 ±  1,55;  kelompok  VI  ( baseline )  adalah  0,375  ±  0,75.  Hasil  penelitian  disimpulkan  bahwa  ekstrak etanol  akar  pasak  bumi  ( Eurycoma  longifolia Jack)  dosis  400  mg/kg  BB  yang  diberikan  sebelum dan  selama  induksi  DMBA  mampu  menurunkan  ekspresi  protein  p53  mutant  (proapotosis)  dan mampu  menghambat  pertumbuhan  kanker  payudara  tikus  betina Sprague  Dawley yang  diinduksi 7,12- dimetilbenz(α)antrasen (DMBA).
Kata  kunci: akar  pasak  bumi  ( Eurycoma  longifolia Jack),  kemopreventif,  imunohistokimia, ekspresi p53

## ABSTRACT
Chemopreventive compound can be  used to prevent, delay the occurrence of cancer. Root of pasak bumi containing quassinoid compound suspected have retardation effects carsinogenesis (antitumor  an in-vitro ),  antiulcer,  and  antimalaria.  This  study  aims  to  determine  the  effect  ethanol chemopreventive  of  root  of  pasak  bumi  extract  on  expression  of  p53  of  breast  cancer  in  female mice that induced with DMBA. In this study is used SD groove female mice with 1 month age. Mice divided  into  6  groups.  Group  I,  II  and  III  were  given  ethanol  of    root  of  pasak  bumi  extract consecutive dose 100 mg/kg Body Weight (BW), 200 mg/kg BW, and 400 mg/kg BW. Group IV as a  control  group  given  DMBA  solution  DMBA  20  mg/kg  BW.  Group  V  as  a  solvent  control  DMBA were given corn oil. Group VI as a control group of healthy called baseline. Ethanol extract made from root pasak bumi with the pivot maceration method. Mice that experienced cancer, the amount calculated nodul of cancer and on the 23 th weeks to all mice sacrificed and taken to the observation network of the mikroskopik method using H&E and immunohistochemical. Results of study indicate that the average expression p53 mutant mice in the group I extract 100 mg/kg BW is 6.375 ± 4.07; extract  II  200  mg/kg  BW  is  11.25  ±  16.53;  extract  III  400  mg/kg  of  BW  is  0.875  ±  1.75;  group  IV (DMBA)  is  13.125  ±  14.4;  group  V  (corn  oil)  is  1.375  ±  1.55;  group  VI  (baseline)  is  0.375  ±  0.75. Based on the evaluation results of research and analysis concluded that ethanol extract of   root of pasak bumi ( Eurycoma longifolia Jack) dose of 400 mg/kg BW given before and during DMBA able to  decrease  the  induction  of  protein  expression  of  p53  (proapotosis),  in  this  research  so  that  the expression of p53 mutant is able to prevent growth breast cancer mouse female Sprague Dawley that inducted with 7.12-dimetilbenz(  )antrasen (DMBA).
Keywords : Root of pasak bumi ( Eurycoma longifolia Jack), chemopreventive, imunohistochemical, p53 Expression

## PENDAHULUAN
Kanker  payudara  merupakan  kanker terbanyak kedua sesudah kanker leher rahim di Indonesia  (Tjindarbumi  and  Mangunkusumo, 2001). Diperkirakan di daerah yang mempunyai resiko  tinggi,  kemungkinan  seorang  wanita terkena  kanker  payudara  ialah  1  di  antara  10 – 12 orang (Underwood, 2000). Usaha pencegahan dan penundaan proses karsinoge- nesis  serta  pengurangan  kanker  untuk  terjadi kembali,  dapat  dilakukan  melalui  pemberian suatu  senyawa  kemopreventif.  Penemuan senyawa kemopreventif berawal dari pengama- tan  kebiasaan  pola  konsumsi  makanan  yang ternyata  dapat  mengurangi  resiko  terkena kanker.  Upaya  ini  merupakan  alternatif  yang mudah  dan  murah  terhindar  dari  kanker terutama  bagi  masyarakat dengan  resiko  tinggi (Susilowati,  2004).  Senyawa  penting  dalam tanaman  dapat  mendukung  pengobatan  yang ditujukan  untuk  dapat  bekerja  pada  sel  tumor yang  mengalami  kecacatan  pada  protein checkpoint (misalnya  mutasi  pada  protein  p53) (Sofyan,  2000).  Di  sisi  lain,  telah  banyak dilaporkan  bahwa  bahan-bahan  dari  tanaman memiliki  potensi  sebagai  regulator  negatif onkogen dan regulator positif tumor suppressor gene sehingga  berpotensi  sebagai  antikanker (Cardens et al ., 1998).
Khasiat  pasak  bumi  diantaranya  akar digunakan  untuk mengobati  demam,  luka  pada mulut, cacingan, dapat juga digunakan sebagai tonik  pada  anak,  sebagai  obat  disentri, beberapa  bagian  dari  tanaman  pasak  bumi dapat  mengurangi  sakit  kepala,  sakit  perut, sakit  yang  disebabkan  sipilis,  dan  kebanyakan penyakit  pada  umumnya  (Hadiah,  2007). Beberapa  aktivitas  lain  akar  ini  telah  banyak dilaporkan  berdasarkan  kandungan  kimianya antara  lain  kuasinoid  yang  memiliki  efek antiulcer (Tada et al ., 1991), sitotoksik terhadap sel  kanker  A-549,  MCF-7  dan  antimalaria  (Kuo et al ., 2004).
Kuasinoid 14,15 beta-dihydroxyklai- neanone menghambat aktivasi tumor promoter- induced  Epstein-Barr virus  pada  percobaan in vitro . Eurycomanone menunjukkan  aktivitas antikanker  tinggi  terhadap  sel  leukemia. Eurycomanone mempunyai efek sitotoksik pada colon kanker, kanker payudara, kanker payudara, kanker kulit (Tada et al ., 1991).
Penelitian mekanisme antikanker ekstrak etanol  akar  pasak  bumi  penting  dilakukan.  Hal ini  dikarenakan  tingginya  insidensi  dan  terba- tasnya informasi mekanisme antikanker ekstrak etanol akar pasak bumi. Mekanisme antikanker, salah  satunya  melalui  peningkatan  ekspresi protein  p53.  Gen  p53  adalah  suatu  gen supressor  tumor  yang  dikenal  sebagai master guardian  of  the  genome dan  merupakan  unsur
utama  yang  memelihara  stabilitas  genetik (Sofyan, 2000). Oleh karena itu, pada penelitian ini  dilakukan  percobaan  terhadap  potensi antikarsinogenesis  ekstrak  etanol  akar  pasak bumi dengan melihat ekspresi protein p53 pada kanker payudara tikus yang diinduksi DMBA.

## METODE  PENELITIAN Bahan dan Alat
Bahan  uji  yang  digunakan  adalah  akar pasak  bumi Eurycoma  longifolia Jack  yang diperoleh  dari  daerah  Kalimantan  dan  bahan yang  digunakan  untuk  ekstraksi  simplisia adalah etanol 96%.
Bahan  uji  antikarsinogenesis  adalah ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi,  aquadest, 7,12- dimetilbenz(α)antrasen  (DMBA), corn  oil sebagai  pelarut  DMBA,  CMC  Na  0,5%, Hematoksilin  Eosin sebagai  pewarna  penge- catan histopatologi.
Bahan  imunohistokimia  adalah  hidrogen peroksidase,  metanol  absolut, Phospat  Buffer Saline (PBS) BA 0,5%, tablet Diaminobenzidine (DAB), antibodi monoklonal anti-p53, prediluted normal  horse  serum , prediluted  biotinylated secondary  antibodi , prediluted  streptavidin peroxidase conjugate , formalin, alkohol, benzen, parafin cair, air, xylol.
Hewan  uji  yang  digunakan  adalah  tikus betina Sprague  Dawley umur  1  bulan  dengan berat  yang  hampir  sama  dan  dalam  kondisi sehat yang diperoleh dari UGM.
Alat  yang  digunakan  untuk  membuat ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi  adalah  panci infusa, alat-alat gelas, corong Buchner, penangas air, timbangan analitik, termometer.
Alat yang digunakan untuk uji karsinogenesis  adalah  spuit  injeksi,  jarum  oral untuk  tikus,  seperangkat  alat  bedah  (pinset, scalpel , blade , gunting), neraca elektrik (Shimadzu,  type  LS-6DT),  kamera  digital (Panasonic  DMC-FX07,  Japan).  Alat  untuk  uji pemeriksaan imunohistokimia adalah mikrotom, oven,  kaca  preparat, hot  plate, nampan, inkubator, preparat , cover slip , mikroskop.

## Jalan Penelitian
Penelitian ini dibagi menjadi 2 tahap yaitu pembuatan  ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi  ( E. longifolia Jack) dan uji karsinogenesis.
1. Pembuatan ekstrak etanol dari akar pasak bumi ( E. longifolia Jack) a. Identifikasi tanaman
Identifikasi  tanaman  pasak  bumi  ( E. longifolia Jack) dilakukan  di  Laboratorium Biologi  Fakultas  Farmasi  Universitas  Gadjah Mada Yogyakarta.
b. Pembuatan serbuk simplisia
Bahan  yang  telah  dipetik,  dikumpulkan dan dipilih yang tidak rusak. Akar dicuci dengan
air  mengalir,  lalu  dikeringkan  di  bawah  sinar matahari  tidak  langsung  dengan  ditutup  kain hitam.  Akar  yang  telah  kering  disortasi  kering kemudian  dihaluskan  dengan  cara  diblender sampai didapat serbuk yang halus. c. Pembuatan ekstrak etanol akar pasak bumi Pembuatan  ekstrak  etanol  akar  pasak bumi  ini  dilakukan  di  Laboratorium  Obat Tradisional UAD. Metode  yang digunakan ialah metode  maserasi  dengan  etanol  96% . Serbuk kering E. longifolia 1 kg, kemudian ditambahkan etanol  96%  diaduk  selama  30  menit  didiamkan 24 jam kemudian saring dan perlakuan diulangi sebanyak 3 kali. Filtrat yang diperoleh diuapkan dengan  menggunakan vaccum  rotary dan evaporator  dengan  suhu  pemanasan  70 o C. Ekstrak kental yang diperoleh diuapkan kembali dengan pemanasan di atas water bath . Ekstrak disimpan dalam botol steril.

## 2. Uji antikarsinogenesis
a. Persiapan hewan uji
Tikus  dipelihara  dalam  ruangan  berven- tilasi  cukup,  makanan  dalam  bentuk  pelet  dan minuman air secukupnya, hewan diadaptasikan dalam  kandang  selama  1  minggu  sebelum perlakuan.
b. Pembuatan larutan karsinogen (DMBA dalam corn oil ) 7,12- Dimetilbenz(α)antrasen (DMBA) sesuai  dengan  dosis  dilarutkan  dalam corn  oil sehingga  jika  larutan  diberikan  pada  hewan  uji seara  peroral  tidak  melebihi  volume  maksimal yang diperbolehkan. Larutan DMBA dalam corn oil selalu  dibuat  baru,  sebelum  pemberian terhadap hewan uji.
c.  Pembuatan  larutan  uji  (ekstrak  etanol  akar pasak bumi dalam CMC Na 0,5%)
Ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi  sesuai dengan  dosis  disuspensikan  dalam  larutan CMC  Na  0,5%  sehingga  jika  larutan  ini diberikan kepada hewan uji secara peroral tidak melebihi volume maksimal yang diperbolehkan. Larutan  ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi  dalam CMC  Na  0,5%  selalu  dibuat  baru  sebelum pemberian terhadap hewan uji.
d.  Induksi  karsinogenesis  dengan  DMBA  dan perlakuan ekstrak etanol akar pasak bumi
Tikus  betina Sprague  Dawley berumur  1 bulan  dibagi  menjadi  6  kelompok  secara random. Masing –masing kelompok terdiri dari 7 ekor  tikus.  Kelompok  I  merupakan  kelompok diberi ekstrak etanol akar pasak bumi dosis 100 mg/kgBB.  Kelompok  II  merupakan  kelompok diberi ekstrak etanol akar pasak bumi dosis 200 mg/kgBB.  Kelompok  III  merupakan  kelompok diberi ekstrak etanol akar pasak bumi dosis 400 mg/kgBB.
Kelompok IV merupakan kelompok kontrol  DMBA  yang  dibuat  model  kanker
dengan  pemberian  DMBA  dalam corn  oil dengan  dosis  20  mg/kgBB  secara  peroral sebanyak 10 kali, yaitu seminggu 2 kali selama 5  minggu.  Selama  14  hari  sebelumnya  tikus hanya mendapat pakan dan aquadest . Kelompok V merupakan kelompok kontrol corn oil yang merupakan pelarut DMBA. Corn  oil diberikan  sebanyak  10  kali,  yaitu seminggu  2  kali  selama  5  minggu.  Selama  14 hari  sebelumnya  tikus  hanya  mendapat  pakan kontrol.  Kelompok  VI  merupakan  kelompok baseline ,  kelompok  tanpa  perlakuan,  diberi pakan dan aquadest.
Setelah  pemberian  DMBA  yang  terakhir semua  tikus  hanya  diberi  pakan  dan  aquadest hingga  akhir  pengamatan  (minggu  ke-23 setelah  pemberian  DMBA  terakhir).  Tikus ditimbang  setiap  minggunya  untuk  mengetahui pertambahan  berat  badannya  dan  mulai minggu  ke-1  setelah  pemberian  DMBA  terakhir dilakukan palpasi setiap minggu untuk mengamati  perkembangan  tumor  hingga  akhir pengamatan. Skema perlakuan pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1.
3. Pemeriksaan histopatologi dengan metode pengecatan Hematoxyline Eosine Pada akhir pengamatan dilakukan nekropsi terhadap hewan  uji. Organ  yang akan diperiksa difiksasi dengan larutan formalin 10%. Analisis histopatologi dilakukan terhadap organ glandula  mammae untuk  mengetahui  keadaan sitologinya serta tingkat keparahan tumor/kanker yang terjadi. Pembuatan preparat jaringan  dilakukan  di  Laboratorium  Patologi Anatomi  FK  UGM.  Pemeriksaan  histopatologi dilakukan  di  bawah  mikroskop  di  Laboratorium Parasitologi FK UGM dengan perbesaran 40 X.

## 4. Pewarnaan Imunohistokimia
Preparat  yang  memperlihatkan  warna coklat  berarti  protein  p53,  sedangkan  preparat yang  menunjukkan  warna  biru  seperti  kontrol negatif  atau  kontrol  reagen  berarti  tidak mengandung protein p53.
Setiap  kali  pewarnaan  harus  disediakan kontrol  negatif,  kontrol  reagen  dan  kontrol positif.  Kontrol  positif  berupa  preparat  kanker payudara  tikus  betina  SD  yang  direaksikan dengan  antibodi  primer.  Kontrol  negatif  berupa preparat  infeksious/  non  infeksious  yang direaksikan  dengan  pengencer  antibodi  primer. Kontrol  reagen  berupa  preparat  yang  direaksi- kan dengan antibodi primer.
Proses-proses  yang  dilakukan  untuk membuat  preparat  imunohistokimia  p53,  baik proses  jaringan  maupun  pengecatan  imunohis- tokimia  p53  dilakukan  sesuai  prosedur  standar pengecatan yang dilakukan di bagian Parasitologi FKU UGM.
Tabel 1 –Waktu pemberian DMBA dan perlakuan dengan ekstrak etanol akar pasak bumi
Minggu ke Perlakuan Ekstrak Kontrol  DMBA Kontrol corn oil Baseline 1-2 Setiap hari diberi ekstrak etanol akar pasak bumi Pakan + Aquadest Pakan + Aquadest Pakan + Aquadest 3-7 Setiap hari diberi ekstrak etanol akar pasak bumi & 2 x Seminggu DMBA dalam corn oil peroral 2 x Seminggu DMBA dalam corn oil peroral 2 x Seminggu corn oil Peroral Pakan + Aquadest 8-23 Pakan+ Aquadest Pakan + Aquadest Pakan + Aquadest Pakan + Aquadest

## Analisis Data
Evaluasi  hasil  uji  meliputi  pengamatan keadaan  histologi  organ  payudara  dari  hasil pewarnaan  H&E  dan  pembahasan  hispatologik serta  ekspresi  protein  p53  dengan  imunohisto- kimia.  Preparat  H&E  diamati  secara  deskriptif kualitatif  untuk  mengetahui  informasi  tentang tingkat  keparahan  tumor  payudara.  Preparat imunohistokimia  p53  dianalisis  secara  semi kuantitatif.
Analisis hasil secara statistik nilai imunohistokimia  p53  dilakukan  dengan  statisti- ka nonparametrik menggunakan analisis Kruskal-Wallis  dilanjutkan  uji  Mann-Whitney dengan menggunakan taraf kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Pembuatan Ekstrak
Ekstrak diperoleh dari 1 kg serbuk kering akar  pasak  bumi  yang  diekstraksi  dengan pelarut  etanol  96  %  menggunakan  maserasi sehingga  dihasilkan  ekstrak  etanol  akar  pasak bumi  sebanyak  4,76  gram  dengan  rendemen sebesar 0,476 %.

## Karakteristik  kanker  payudara  pada  tikus yang diinduksi DMBA
Hasil  induksi  DMBA  dosis  20  mg/Kg  bb sebanyak 10 kali pemberian dengan  pengama- tan  selama  16  minggu  setelah  pemberian DMBA  terakhir  secara  makroskopis  tidak memunculkan  nodul  yang palpable pada payudara  tikus.  Secara  mikroskopis  berdasar- kan analisis histopatologi  salah satu tikus  yang hanya  diberi  DMBA  menunjukkan  adanya proliferasi  epitel  acinus  ke  arah  lumen  dan proliferasi  epitel  acinus  ke  arah  membran basalis.
Pada  penelitian  ini  hanya  1  tikus  yang hanya  diberi  DMBA terdiagnosis kanker payudara  padahal  7,12-dim etilbenz(α)antrasen spesifik untuk pembuatan model tumor payudara.  Hal  itu  kemungkinan  disebabkan oleh  kepekaan  yang  dimiliki  tiap  tikus  berbeda terutama pada tikus  yang  diberi larutan  DMBA. Tikus  dalam  kelompok  ini  memiliki  kepekaan yang  tinggi  sehingga  terjadi  kematian  sebelum waktu pengamatan berakhir. Sebelum kematian terjadi, tikus kelompok DMBA mengalami penu- runan  nafsu  makan  yang  diikuti  penurunan berat badan, tikus tidak mampu untuk bergerak dan kemudian mati.
Pengaruh  ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi terhadap kanker  payudara  tikus  yang diinduksi DMBA
Munculnya  nodul  yang  teramati  secara makroskopis  pertama  kali  terjadi  pada  tikus perlakuan pada minggu ke-12 setelah pemberian  DMBA  yang  terakhir.  Jumlah  nodul pada  tikus  ini  hanya  satu  nodul.  Nodul  ini berada  di  dekat  leher  dengan  ukuran  diameter 21  mm.  Letak  nodul  tidak  tepat pada  payudara tikus  tetapi  secara  mikroskopis  nodul  teramati sebagai adenokarsinoma mammae.
Berdasarkan  hasil  pemeriksaan  jaringan pada  nodul  tersebut  terlihat  adanya  proliferasi epitel  acini  ke  arah  lumen,  ukuran  sel  epitel besar dan bervariasi, nukleus terlihat besar dan hiperkromatik,  ditemukan  gambaran  mitosis abnormal, terlihat juga pertumbuhan sel ke arah membran  basalis.  Kemungkinan  proses  terjadi- nya  tumor  dengan  arah  pertumbuhan  ke  luar ( growth  out )  dari  letak  payudara  namun  masih berada  pada milkline dan  sel  kanker  belum mengalami  metastasis  ke  organ  lain. Kanker payudara  tipe  ini  memperlihatkan  gambaran acini terisi penuh sel (tipe solid) sehingga nodul teraba sebagai benjolan keras.
Jaringan  payudara  tikus  lain  pada kelompok  perlakuan  mempunyai  satu  lapis  sel epitel  acinus  dan  tidak  ditemukan  adanya proliferasi  duktus  (masih  dalam  batas  normal). Kondisi jaringan payudara normal pada kelompok perlakuan bukan hasil penghambatan oleh  ekstrak  namun  pada  penelitian  ini karsinogen  yang  digunakan  tidak  mampu membentuk  kanker  payudara  karena  jumlah karsinogen yang masuk dalam tubuh tikus tidak cukup untuk menginisiasi kanker payudara.
Penentuan  Tingkat  Ekspresi  p53  pada  Sel Payudara  Hewan  Uji  dengan  Teknik  Pewar- naan Imunohistokimia
Antibodi  yang  digunakan  untuk  mende- teksi  protein  p53  dalam  penelitian  ini  adalah IgG1  (Lab  Vision)  yang  hanya  dapat  bereaksi dengan  p53 mutant ,  sehingga  penentuan tingkat  ekspresi  dilakukan  dengan  menggu- nakan tingkat ekspresi p53 mutant . Perhitungan  tingkat ekspresi p53 mutant dilakukan  dengan  menghitung  jumlah  sel  yang positif  mengekspresikan  p53 mutant dengan  5 bidang  pandang  berbeda  pada  masing-masing
sampel  dari  setiap  kelompok.  Sel  positif  yang mengekspresikan  p53 mutant terlihat  berwarna coklat, pada bagian inti sel (nukleus). Pengamatan  dilakukan  oleh  2  orang  pengamat untuk mengurangi tingkat kesubyektifan hasil.
Pengamatan  preparat  imunohistokimia p53,  secara  semi  kualitatif  terlihat  bahwa gambaran  skor  p53  menunjukkan  kecende- rungan  bahwa  dosis  200  mg/kgBB  mempunyai tingkat ekspresi p53 mutant tertinggi dibanding- kan dua dosis lainnya (Gambar 1).
Pada Gambar 1, kelompok ekstrak etanol pasak  bumi  dosis  200  mg/kg  BB  menunjukkan tingkat  ekspresi  p53 mutant paling  tinggi dibandingkan dengan kelompok ekstrak lainnya.  Hal  ini  menyatakan  bahwa  ekstrak etanol  pasak  bumi  dosis  200  mg/kg  BB  tidak dapat  mengurangi  ekspresi  p53 mutant yang terjadi  dibandingkan  kelompok  ekstrak  lainnya. Ekspresi  p53 mutant yang  tinggi  menunjukkan proliferasi  sel  kanker  yang  tinggi  terjadi  dan karsinogenesis (Lowe et al ., 1993)
Gambar  1,  terlihat  bahwa  kelompok DMBA  memiliki  tingkat  ekspresi  p53 mutant paling  tinggi  dibandingkan  kelompok  lainnya. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol dapat menurunkan ekspresi p53 mutant. Pada  kelompok corn  oil yang  tidak diinduksi  DMBA  menunjukkan  ekspresi  p53 mutant yang  rendah.  Pengaruh corn  oil tidak
memberikan  pengaruh  ekspresi  p53 mutant yang signifikan karena pada kelompok baseline yang  tidak  diberi  perlakuan  ekstrak  dan  DMBA juga ditemui ekspresi p53 mutant yang rendah. Hal  ini  menunjukkan  mutasi  sel  dapat  juga ditemukan pada sekelompok sel normal, mutasi sel  tidak  selalu  menjadi  nodul  atau  tumor.  Gen p53 menunjukkan  mutasi  yang  spesifik  untuk sejumlah  karsinogen.  Makan  makanan  yang mengandung  sejumlah  besar  aflatoksin  B1 berhubungan  dengan  transversi  G:C→T:A; pajanan  radiasi  UV  berhubungan  dengan mutasi  transisi  pada  dipirimidin;  merokok secara  positif  berhubungan  dengan  transversi G:C→T:A  pada  kanker  paru (Vakahangas, et al. , 1992) Pada kelompok perlakuan ekstrak, terlihat  bahwa  kelompok  ekstrak  III  (400  mg/kg BB) memiliki tingkat ekspresi p53 mutant paling kecil dibandingkan kelompok perlakuan ekstrak lain.  Tingkat  ekspresi  p53 mutant pada kelompok  ekstrak  III  (400  mg/kg  BB)  menga- lami  penurunan  sebesar  93,33%  dibandingkan kelompok  DMBA,  diikuti  kelompok  ekstrak  I (100 mg/kg BB) sebesar 51,43% dan kelompok ekstrak  II  (200  mg/kg  BB)  sebesar    14,29  %. Pada kelompok corn oil dan baseline mengalami penurunan tingkat ekspresi berturut- turut sebesar 89,52% dan 97,14 % dibandingkan kelompok DMBA.
Gambar 1 – Tingkat Ekspresi p53 mutant pada Kelompok Ekstrak I (100 mg/kg BB), Ekstrak II (400 mg/kg BB), Ekstrak III (400 mg/kg BB), DMBA, Corn Oil, dan Baseline
Tabel  2 –Hasil Uji Mann-Whitney Tingkat Ekspresi p53 Mutant pada  Kelompok  Ekstrak  I  (100  mg/kg  BB),  Ekstrak  II  (200 mg/kg BB), Ekstrak III (400 mg/kg BB), DMBA, Corn Oil, dan Baseline dengan taraf kepercayaan 95%
Pasangan kelompok perlakuan Signifikansi Hasil uji antar pasangan Keterangan EI-EII 0,686 Berbeda tidak bermakna E1 = E2 EI -EIII 0,057 Berbeda bermakna E1 > E3 EII-EIII 0,486 Berbeda tidak bermakna E2 = E3 EI-DMBA 0,486 Berbeda tidak bermakna E2 = DMBA EI-CO 0,114 Berbeda tidak bermakna E2 = C0 EI-BS 0,057 Berbeda bermakna E1 > BS EII-DMBA 0,686 Berbeda tidak bermakna EII = DMBA EII-CO 0,886 Berbeda tidak bermakna EII = CO EII-BS 0,486 Berbeda tidak bermakna EII = BS EIII-DMBA 0,057 Berbeda bermakna EIII < DMBA EIII-CO 0,486 Berbeda tidak bermakna EIII = CO EIII-BS 0,886 Berbeda tidak bermakna EIII = BS
EKSTRAK I  (100 mg/kg BB)+
DMBA + CORN OIL EKSTRAK II (200 mg/kg BB)+ DMBA + CORN OIL EKSTRAK III (400 mg/kg BB)+ DMBA + CORN OIL DMBA + CORN OIL CORN OIL BASELINE p53 + 6,375 11,25
0,875 13,125 1,375 0,375 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Ti ng ka t Ekspr e si p53 m ut ant p53 +

## KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Ekstrak etanol akar pasak bumi ( Eurycoma longifolia Jack) dosis 400 mg/Kg BB yang  diberikan  sebelum  dan  selama  induksi DMBA,  mampu  menurunkan  ekspresi  p53 mutant .

## Saran
1.  Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut dengan  berbagai  dosis  untuk  mendapatkan dosis  efektif  ekstrak  etanol  akar Eurycoma
longifolia Jack  yang  berkhasiat  sebagai chemoprevention  agent terhadap  kanker payudara  dan  aman  (tidak  toksik  pada  sel normal).
2.  Perlu  dilakukan  penelitian  tentang  mekanis- me  penurunan  ekspresi  p53 mutant oleh ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi,  dengan melakukan  penelitian  lanjutan  dan  penga- matan  peningkatan  ekspresi  p53 wild-type dengan  menggunakan  antibodi  yang  sesuai dan  pengamatan  ekspresi  gen  Bax  (pro- apoptosis) dengan metode analisis lain.

## DAFTAR ACUAN
Cardens,  M.E.,  Sanfidson  A.,  Cutler  N.S.,  and  Heitmen  J.,  1998, Signal-Tranduction  Cascade  as Targets for Theraupeutic Intervetion by Natural Poduct , TIBTECH, vol 16, October: 427 –433
Hadiah, J.T, 2007, Eurycoma longifolia Jack. (Pasak
Bumi) , Terdapat di: http://www.bogor.indo.net.id/kri/eurycoma.htm, Diakses pada tanggal 5 September 2008
Kuo,  P.C.,  Damu, A.G.,  Leeb,  K.H.,  and Wua, T.S.,  2004,  Cytotoxic  and  Antimalarial  Constituens from The Roots of Eurycoma longifolia , Bioorganic and Medicinal Chemistry: 12, 537 –544
Lowe,  SW.,  Schmit,  E.M,Smith,  S.W.,  Osborne,  B.A.,  and  Jacks  T.,  1993,  p53  requaired  for radiation-induced apoptosis in mouse thermocytes, Nature : 362, 847 –849
Sofyan, R., 2000, Terapi Kanker pada Tingkat Molekuler, Cermin Dunia Kedokteran : 127, 5 –10.
Suibu, T. 2005. Kanker. Healty First , diambil dari www.detik.com , diakses April 2008
Susilowati,  S.,  2004,  Efek  Kemopreventif  Ekstrak  Etanolik  Daun Gynura  procumbens (Lour)  Merr terhadap  Kanker  Payudara  Tikus  yang  Diinduksi  7,12- Dimetilbenz(α)antrasen  (DMBA), Thesis , Fakultas Pasca Sarjana Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Tada H, Yasuda F, Otani K, Doteuchi M, Ishihara Y, Shiro M, 1991, New antiulcer quassinoids from Eurycoma longifolia . Eurycoma Journal Medical Chemistry : 26 , 345 –349
Tjindarbumi,  D.,  and  Mangunkusumo,  R.,  2001, Cancer  In  Indonesia  Present  and  Future , Departements of Surgery and Pathologi, Fakultas Kedokteran Universitas  Indonesia, Jakarta , Hal 17 –21
Underwood, J.C.E, 2000, Patologi Umum dan Sistematik , edisi 2, vol 2, diterjemahkan oleh Sarjadi, Penerbit Kedokteran EGC, Jakarta, hal 557 –562
Vakahangas, K.H., Samet, J.M., Metcalf,  R.A., Welsh, J.A., Bennet, W.P., Lane, D.P. And Harris, C.C. 1992, Mutations of p53 and  ras genes in radon-associated lung cancer from uranium miners, The Lancet , 339, 576-580