## RESPON REGENERASI BEBERAPA GENOTIPE DAN STUDI TRANSFORMASI GENETIK
TOMAT ( L ycopersicon esculentum Mill.) MELALUI VEKTOR Agrobacterium tumefaciens
Response Regeneration of Some Genotypes and Genetic Transformation Study of Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) through Agrobacterium tumefaciens Vector.
Santoso T.J. 1 , A. Sisharmini 1 dan M. Herman 1
1 Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111 Email: bb_biogen@litbang.pertanian.go.id

## ABSTRACT
The  development  of  an  effective Agrobacterium transformation  for  tomato depends  on  several  factors including  plant  genotype,  explant  vigor, Agrobacterium strain,  selection  system  and  culture  conditions.  It  has been reported that tomato genotype contributed to success of transformation and regenerability in tissue culture. The  purpose  of  this  experiment  was  to  study  of  regeneration  response  of  four  tomato  genotypes  and  genetic transformation  of  tomato  through Agrobacterium  tumefaciens vector.  The  experiment  of  tomato  genotype regeneration study was conducted at Biotechnology  Laboratory,  Asian Vegetables Research and Development Center (AVRDC), Taiwan, meanwhile the experiment of tomato genetic transformation study was conducted at Molecular  Biology  Laboratory,  Indonesian  Center  for  Agricultural  Biotechnology  and  Genetic  Resources Research and Development (ICABIOGRAD), Bogor.  Three of well-adapted genotypes in Indonesia i.e. Intan, Gondol  Hijau  and  CL6046  were  used  as  regeneration  response  experimental  materials.  AVRDC’s  genotype, CLN1559A, was used as a control genotype in in-vitro culture. The result of experiment showed that there was variation  response  on  the  ability  of  explant  to  regenerate  and  form  the  shoot  among  the  four  genotypes.  The control  genotype,  CLN1559,  was  the  most  regenerable  genotype  that  indicated  by  the  highest  number  of regenerated  explants  and  shoots  per  explants  (90,56%  and  0,66),  followed  respectively  by  Intan  (66,22%  and 0,37), CLN6046 (45,94% and 0,26) and Gondol Hijau (17,08% and 0,09). Based on the results, among of the well-adapted genotypes in Indonesia, Intan was the most responsive genotype to be regenerated compared with two other genotypes. Considerably, Intan  could be used as an explant for study on genetic engineering tomato through  A . tumefaciens vector. The results  of  genetic  transformation  study  have  successfully  obtained  several explants  formed  the  callus  dan  shoot  on  medium  selection  containing  50  mg/l  kanamycin.  Nevertheless, transformaton  efficiency  in  the  experiment  still  low  which  of  55,7  explants  in  average  generated  1,7  shoots (about of 3%) that survive on selection medium (50 mg/l kanamycin).
Keywords: Lycopersicon esculentum Mill . , Regeneration, Genetic Transformation, Agrobacterium tumefaciens

## PENDAHULUAN
Tomat  ( Lycopersicon  esculentum Mill.) adalah  salah  satu  komoditas  sayuran  yang penting  secara  ekonomi  yang  dibudidayakan hampir  di  seluruh  dunia  termasuk  Indonesia. Buah  tomat  mempunyai  banyak  fungsi  di antaranya sebagai sayuran, buah meja, minuman,  bahkan  sebagai  bahan  kosmetik  dan obat-obatan (Duriat, 1996). Di bidang kesehatan,  selain  kaya  akan  vitamin  dan mineral,  tomat  juga  mengandung  senyawa antioksidan yang bermanfaat untuk pencegahan penyakit  kronis  seperti  jantung  koroner  dan kanker  (Weisburger,  1998).  Selain  itu,  tomat
merupakan lima besar tanaman sayuran penting di Indonesia selain kubis, bawang putih, kacang kapri dan cabai.
Di  dalam  budidaya  tanaman  tomat banyak  menghadapi  kendala,  baik  biotik maupun abiotik. Saat ini penyakit keriting daun yang  disebabkan  oleh  infeksi Tomato  Yellow Leaf  Curl  Virus (TYLCV)  dari  kelompok Gemini  virus  adalah  salah  satu  kendala  biotik yang serius pada produksi tomat dan ditemukan di  banyak  negara  di  dunia  (Green  &  Kalloo, 1994; Moriones & Navas Castillo, 2000; Jones 2003).  Penggunaan  varietas  tomat  yang  tahan merupakan cara yang terbaik untuk mengendalikan  serangan  penyakit  tersebut.
Namun demikian, program pemuliaan konvensional  untuk  merakit  varietas  tahan masih menghadapi banyak kendala, di antaranya  adalah  sumber  gen  ketahanan  yang belum  ditemukan  pada  plasma  nutfah  tomat dan  proses  pemuliaannya  banyak  memakan waktu  di  dalam  proses  persilangan  dan  seleksi progeni. Hal ini menjadikan cara tersebut tidak cukup reaktif untuk mengimbangi patogen baru yang  lebih  virulen.  Pemanfaatan  teknologi rekayasa genetik merupakan pendekatan alternatif yang dapat dilakukan untuk memperoleh tanaman tomat tahan virus.
Teknik rekayasa genetik melalui penyisipan  gen  atau  transformasi  gen  akan menghasilkan tanaman transgenik yang kemudian  dapat  dimanfaatkan  sebagai  sumber plasma  nutfah  atau  langsung  diseleksi  menjadi galur  harapan.  Teknik  transformasi  genetik tanaman  yang  paling  sering  digunakan  saat  ini adalah transformasi tidak langsung menggunakan  vektor  bakteri Agrobacterium tumefaciens . Sementara itu, teknik transformasi secara langsung seperti penggunaan penembakan  partikel  sudah  jarang  digunakan. Keuntungan  penggunaan  teknik  transformasi menggunakan A.  tumefaciens adalah  lebih efisien,  murah  dan  stabil  (Veluthambi et  al. , 2003).
Di  dalam  aplikasi  transformasi  genetik tanaman,  kultur  sel/jaringan  dan  sistem regenerasinya  memegang  peranan  yang  sangat penting.  Transformasi  genetik  secara in  vitro akan  berhasil  bila  sudah  diperoleh  sistem regenerasi  tanaman  yang  bersifat  efisien  dan stabil.  Oleh  karena  itu,  kompetensi  untuk beregenerasi  yaitu  kemampuan  membentuk tanaman  lengkap  (mempunyai  tunas  dan  akar) dan kompetensi untuk ditransformasi merupakan dua kunci penting penentu keberhasilan  program  transformasi  genetik. Beberapa usaha yang dilakukan untuk mencapai sistem regenerasi yang efisien adalah dengan  menentukan  parameter  penting  yang spesifik  pada  tanaman  (Shahriari et  al .,  2006).
Salah  satu  parameter  untuk  mendapatkan sistem regenerasi yang efisien adalah pemilihan genotipe  yang akan digunakan sebagai  eksplan karena  pada  umumnya  kemampuan  regenerasi atau  transformasi  sangat  tergantung  pada genotipe  yang digunakan ( highly dependent  on genotype ).
Tujuan  penelitian  untuk  mempelajari respons  regenerasi  beberapa  genotipe  tomat dan  melakukan  studi  transformasi  genetik melalui vektor Agrobacterium tumefaciens .

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium Bioteknologi, Asian  Vegetables  Research  and Development Center (AVRDC), Taiwan,
sedangkan  studi  transformasi  genetik  tomat dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan  Bioteknologi  dan  Sumberdaya Genetik  Pertanian  (BB  BIOGEN)  Bogor. Untuk  studi  regenerasi,  tiga  genotipe  tomat Indonesia  yaitu  Intan,  Gondol  Hijau  dan CL6046.  Sebagai  kontrol  digunakan  genotipe CLN1558A  yang  berasal  dari  AVRDC, Taiwan.  Genotipe  kontrol  tersebut  merupakan genotipe  yang sangat  responsif terhadap media kultur yang digunakan dalam penelitian ini.

## Respons Regenerasi Beberapa Genotipe
Tomat
Perkecambahan benih in vitro Benih  tomat  dimasukkan  ke  dalam botol  kultur  dan  ditambahkan  ethanol  70  % serta  dibiarkan  selama  1  menit.  Pada  laminar, benih  disterilisasi  dengan  5,25  %  NaClO  dan 0,1  %  Tween  20  selama  20-40  menit  dengan diputar dengan magnet pengaduk. Benih dicuci sebanyak  6-7  kali  dengan  air  steril  pada  gelas beaker.  Setelah  itu,  benih-benih  diletakkan pada petridish steril. Benih-benih steril ditanam ke  botol  kultur  yang  mengandung  medium perkecambahan  (1/2  MS  +  Sukrosa  20  g/L  + Agar 0,7 g/L) dan kemudian botol kultur berisi benih  ditempatkan  pada  ruang  kultur  dengan suhu  25 0 C,  fotoperiod  16  jam  dan  intensitas pencahayaan  3000-4000 lux.

## Induksi kalus dari eksplan potongan daun
Kecambah  yang  berumur  14  hari diambil  dari  botol  kultur  dan  diletakkan  pada petridish  steril  yang  berisi  air  steril.  Kotiledon diambil  dari  kecambah  dengan  gunting  atau pisau  steril  kemudian  ujung  dan  pangkal  dari daun  dipotong  sehingga  membentuk  persegi.
Dengan  menggunakan  ujung  pinset  atau  pisau silet,  tanam  potongan  kotiledon  tersebut  pada medium induksi kalus (MS + 2 mg/L BA + 0,5 mg/L  IAA  +  Sukrosa  30  g/L  dan  pH  5,8). Petridish ditutup dengan parafilm dan potongan daun dikulturkan selama dua minggu pada suhu 25 0 C  di  bawah  pencahayaan  4000  lux sehingga membentuk kalus.

## Regenerasi tunas
Setelah  2  minggu  pada  media  induksi kalus,  eksplan  kotiledon  yang  telah  berkalus dipindahkan ke medium regenerasi (MS + 0,25 mg/L  BA  +  0,25  mg/l  GA3  +  Sukrosa  30  g/L dan pH 5,8) dengan permukaan atas menghadap  ke  atas.  Semua  kultur  dipindahkan ke  medium  regenerasi  yang  baru  setiap  dua minggu.  Setelah  dua  minggu  kultur  berada pada  media  regenerasi,  kalus  dengan  warna hijau,  kompak  dapat  dipindah  ke  medium regenerasi  yang  baru.  Kalus-kalus  dengan primordia tunas akan mulai tumbuh setelah dua minggu dan segera dipotong menjadi potongan kecil  dan  dipindahkan  ke  media  regenerasi yang baru pada botol untuk pemanjangan tunas.

## Perakaran tunas
Apabila    batang    dari    tunas  berukuran 2-4  cm,  tunas  dipisahkan  dari  kalus  dan dipindahkan  ke  media  perakaran  (MS  +  0,15 mg/L NAA + Sukrosa 3 g/L) pada botol kultur atau  kotak  magenta.  Potongan  kalus  dari  dasar batang tunas sebisa mungkin tidak diikutsertakan karena akan mengganggu pembentukan akar. Tunas-tunas akan membentuk  akar  dan  berkembang  selama  dua minggu setelah dipindah ke medium perakaran. Jika tidak berakar, potong kembali batang tunas dan  pindahkan  ke  media  perakaran  yang  baru, kemungkinan  tunas  tersebut  akan  berakar. Planlet  yang  berukuran  sekitar  5  cm  siap dipindahkan ke tanah.

## Pengamatan dan Analisis Data
Pengamatan dilakukan terhadap masing-masing  varietas  tanaman  tomat  dengan beberapa parameter, yaitu jumlah eksplan yang membentuk  kalus,  jumlah  eksplan  berkalus yang  membentuk  tunas,  jumlah  tunas  per eksplan  dan  jumlah  tunas  yang  membentuk akar.  Data-data  yang telah diperoleh kemudian
dianalisis menggunakan paket program analisis statistik SAS (SAS, 1990).

## Studi Transformasi Genetik Tomat
Eksplan yang digunakan untuk percobaan  studi  transformasi  genetik  tomat adalah  kotiledon  dari  genotipe  tomat  yang ditanam  secara in  vitro yang  menunjukkan respons  regenerasi  paling  baik  dari  percobaan sebelumnya.  Vektor  yang  digunakan  dalam percobaan  ini  adalah  bakteri A.  tumefaciens strain  LBA4404  yang  membawa  plasmid pBI121.  Plasmid  tersebut  mengandung  gen seleksi npt II untuk ketahanan terhadap antibiotik  kanamisin  dan  gen  pelapor gus (  - Glucuronidase ).

## Perkecambahan benih in vitro
Benih  tomat  dimasukkan  ke  dalam botol  kultur  dan  ditambahkan  ethanol  70  % serta  dibiarkan  selama  1  menit.  Pada  laminar, benih  disterilisasi  dengan  5,25  %  NaClO  dan 0,1  %  Tween  20  selama  20-40  menit  dengan diputar dengan magnet pengaduk. Benih dicuci sebanyak  6-7  kali  dengan  air  steril  pada  gelas beaker.  Setelah  itu,  benih-benih  diletakkan pada petridish steril. Benih-benih steril ditanam ke  botol  kultur  yang  mengandung  medium perkecambahan  (1/2  MS  +  Sukrosa  2g/L  + phytagel    3  g/L)  dan  kemudian  botol  kultur berisi  benih  ditempatkan  pada  ruang  kultur dengan  suhu  25 0 C,  fotoperiod  16  jam  dan intensitas  pencahayaan    3000-4000  lux. Kotiledon  yang  berumur  8-9  hari  adalah optimal untuk ko-kultivasi dengan Agrobacterium .

## Pre-kultur eksplan
Kecambah  yang  berumur  14  hari diambil  dari  botol  kultur  dan  diletakkan  pada petridish  steril  yang  berisi  air  steril.  Kotiledon diambil  dari  kecambah  dengan  gunting  atau pisau  steril  kemudian  ujung  dan  pangkal  dari daun  dipotong  sehingga  membentuk  persegi. Dengan  menggunakan  ujung  pinset  atau  pisau silet, buat luka-luka kecil pada kotiledon untuk meningkatkan peluang infeksi dari Agrobacterium dan  mempertinggi  efisiensi transformasi. Potongan kotiledon ditanam pada medium induksi kalus (MS + 2 mg/L BA + 0,5 mg/L  IAA  +  Sukrosa  30  g/L  +  phytagel  3  g/L dan pH 5,8). Petridish ditutup dengan parafilm
dan    diprekulturkan  selama  24  jam  pada  suhu 25 0 C  di  bawah  pencahayaan  yang  rendah (1000 lux).

## Preparasi Agrobacterium
Bakteri Agrobacterium yang
mengandung  konstruksi  gen  cp  ditumbuhkan pada    media    YEP    dengan    antibiotik    seleksi 2-3  hari  sebelum  digunakan.  Koloni  tunggal diambil  dari  plate  dan  bakteri  tersebut ditumbuhkan ke tabung reaksi yang mengandung  6  ml  media  YEP  dengan antibiotik    yang    sesuai.    Bakteri    diinkubasi pada  28 0 C  selama  satu  malam  dengan penggoyangan  200  rpm. Kultur  bakteri semalam  diencerkan  dengan  MSO  cair  hingga konsentrasinya yang sesuai dengan OD = 0,5.

## Ko-kultivasi
Kultur Agrobacterium yang  sudah diencerkan dituangkan ke dalam kotiledon yang ditempatkan  pada  medium  ko-kultivasi  (MS 2BA  0,5IAA  +  200  M    Asetosiringon  + sukrosa  30  g/L  +  phytagel  3  g/L  dan  pH  5,8) selama  30  menit  dengan  sekali-kali  diputar- putar.  Suspensi Agrobacterium disedot  dari plate  dan  diko-kultivasi  selama  48  jam  dan dibuat  dua  kontrol:  (1)  kontrol  positif,  eksplan kotiledon  yang  tidak  diko-kultivasi  (10-20) dengan Agrobacterium dan  dipindahkan  ke medium regenerasi (tanpa antibiotik).
Kotiledon  seharusnya  membentuk  kalus  dan meregenerasikan  planlet,  (2)  kontrol  negatif, eksplan  kotiledon  tidak  diko-kultivasi  (40-50) dengan Agrobacterium dan  dipindahkan  ke media regenerasi (dengan antibiotik). Kotiledon seharusnya mati.

## Regenerasi tunas
Setelah  ko-kultivasi  selama  48  jam, eksplan  kotiledon  dipindahkan  ke  medium regenerasi  (MS  2BA  0,5IAA  Km50  Cb500
Ct50  +  Sukrosa  30  g/L  +  phytagel  3  g/L  dan pH 5,8) dengan permukaan atas menghadap ke atas.  Semua  kultur  dipindahkan  ke  medium regenerasi yang baru setiap dua minggu. Kalus- kalus  dengan  primordia  tunas  akan  mulai tumbuh  setelah  dua  minggu  dan  segera dipotong menjadi potongan kecil dan dipindahkan  ke  media  pemanjangan  tunas untuk  disubkultur.  Kultur  ditransfer  ke  media yang  baru  setiap  dua  minggu  atau  lebih  sering apabila  dibutuhkan.  Setelah  dua  atau  tiga minggu  kultur  berada  pada  media  seleksi  dan regenerasi,  kalus  dengan  warna  hijau,  kompak dapat  dipindah  ke  medium  pemanjangan  tunas (MS  0,25BA  0,25GA3  Km50  Cb250  Ct50 dengan  penambahan  30  g/L  sukrosa,  3  g/L phytagel dan pH 5,8).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Respons  Regenerasi  Beberapa  Genotipe Tomat
Pada studi sebelumnya telah didemonstrasikan bahwa penggunaan kotiledon tomat  yang  berumur  sekitar  8-14  hari merupakan jenis eksplan  yang paling responsif untuk  menginduksi  kalus  dan  organogenesis tunas  dibandingkan  dengan  jenis  eksplan  yang lain seperti hipokotil, batang dan daun (Hamza and  Chupeau,  1993,  Van  Roekel et  al. , 1993, Ling et  al .,  1998).  Mengacu  pada  penelitian sebelumnya  tersebut,  pada  penelitian  ini  juga digunakan  eksplan  kotiledon  yang  berasal  dari kecambah  umur  14  hari  setelah  tanam  (HST) yang  ditumbuhkan  secara in  vitro (Gambar 1A) . Dari  kecambah  umur  14  hari  tersebut, kemudian  kotiledonnya  diambil  dan  dipotong bagian  ujung  dan  pangkal  sehingga  kotiledon berbentuk  persegi  dan  untuk  selanjutnya ditanam  pada  media  induksi  kalus  (Gambar 2B).
Gambar  1.  A.  Kecambah  tomat in  vitro yang  berumur  14  hari  pada  media  ½  MS  dan  B.  Potongan kotiledon ditanam pada media induksi kalus (B) ( A . 14 day old in vitro seedlings on ½ MS medium and B. The cotyledon pieces cultured on callus induction medium )
Gambar 2.  A. Kalus-kalus awal yang terbentuk pada dua minggu setelah kultur  pada media induksi kalus,  NRC=Kalus  yang  tidak  dapat  diregenerasikan  dan  OC=Kalus  organogenik,  B. Tunas-tunas kecil  yang terbentuk setelah eksplan yang berkalus dipindah/subkultur pada media  yang  baru  ( A.  Initial  calli  were  formed  2  weeks  after  culture  on  callus  induction medium, NRC=non-regenerable callus and OC=organogenic callus, B) Shoot primordia were formed after the callused explants transferred to fresh  medium)
Kalus-kalus akan terbentuk pada bagian bekas  potongan  pada  eksplan  setelah  berada pada  media  induksi  kalus  selama  dua  minggu (Gambar  2A).    Ada  dua  tipe  kalus  yang  dapat diamati  pada  penelitian  ini,  kalus  yang berwarna  coklat  yang  merupakan  kalus  tidak dapat diregenerasikan ( non-regenerable callus ) (NRC,  Gambar  2)  dan  kalus  yang  berwarna putih  yang  akan  berubah  menjadi  kehijauan dalam  beberapa  hari  dan  kalus  ini  merupakan kalus  organogenik  ( organogenic  calllus )  (OC, Gambar  2).  Kalus  organogenik  ini  akan menghasilkan  atau  membentuk  primordia-
primordia  tunas  setelah  sekitar  10-14  hari (Gambar 2B). Untuk
mempercepat pembentukan primordia tunas maka merupakan hal  yang  penting  untuk  melakukan  subkultur kalus-kalus  tersebut  pada  media  yang  baru sehingga akan tersedia nutrisi yang cukup bagi kalus-kalus untuk membentuk primordia tunas.
Eksplan yang berasal dari kotiledon dari semua  genotipe  yang  digunakan  mempunyai kemampuan  untuk  membentuk  kalus  100  % setelah  ditumbuhkan  pada  media  induksi  kalus (Tabel  1).  Bahkan  di  antara  eksplan-eksplan yang  berkalus  terdapat  eksplan    yang  telah
NRC OC A primordia tunas B A B
berinisiasi membentuk primordia tunas (Gambar 2B). Primordia tunas ditandai dengan munculnya jaringan seperti daun yang berukuran kecil dan akan berkembang menjadi tunas  kecil.  Untuk  menginduksi  tumbuhnya tunas-tunas dari eksplan yang berkalus
selanjutnya kalus-kalus dengan primordia tunas ini  dipindahkan  ke  media  regenerasi  sehingga kalus  akan  berkembang  dan  membentuk  tunas yang lebih besar.
Tabel  1.  Persentase  eksplan  yang  membentuk  kalus  dan  primordia  tunas  dari  empat  genotipe  yang digunakan  ( Percentage  of  explants  producing  callus  and  shoot  primordia  of  the  used  four genotypes )
Genotipe ( Genotype )
Eksplan membentuk kalus ( explants producing callus ) (%)
Eksplan membentuk primordia tunas ( explants producing shoot primordia ) (%) Intan 100 a 74,02 b Gondol Hijau 100 a 24,06 c CL6046 100 a 66,22 b CLN1558A 100 a 97,27 a
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda dalam satu kolom menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf  =5 % ( Number with different letter at the same column was significant at the  =5 % )
Meskipun eksplan dari keempat genotipe  menunjukkan  kemampuan  untuk membentuk  kalus  sebesar  100  %,  namun kemampuannya  membentuk  primordia  tunas bervariasi  (Tabel  1).  Kemampuan  membentuk primordia  tunas  tertinggi  ditunjukkan  oleh genotipe  CLN1558A  (97,27  %)  dibandingkan dengan genotipe-genotipe lain. Tomat CLN1558A  merupakan  genotipe  yang  berasal dari  AVRDC  sedangkan  lainya  (Intan,  Gondol Hijau  dan  CL6046)  adalah  genotipe-genotipe yang  telah  berdaptasi  baik  dan  ditanam  di Indonesia.  Tingginya  kemampuan  eksplan  dari genotipe  CLN1558A  diduga  karena  komposisi atau formula dari media-media yang digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  media  yang dikembangkan oleh AVRDC dan telah menunjukkan respons  yang baik  pada  genotipe tersebut.  Namun  demikian,  di  antara  ketiga genotipe  yang  ditanam  di  Indonesia,  terlihat bahwa  Intan  merupakan  genotipe  yang  paling responsif  untuk  membentuk  primordia  tunas (74,1  %),  diikuti  oleh  CL6046  (66,7  %)  dan Gondol Hijau (24,5 %).
Setelah  diinkubasi  pada  media  induksi kalus selama dua minggu dan disubkultur pada
media  yang  sama  maka  eksplan  yang  berkalus dan telah membentuk primordia tunas kemudian  dipindahkan  ke  media  regenerasi sehingga  primordia  tunas  dapat  berkembang menjadi tunas. Setelah beberapa hari diletakkan pada  media  regenerasi  maka  primordia  tunas akan  terlihat  membesar  dan  berkembang membentuk  tunas  dengan  bagian  daun  dan batang  yang  lengkap  (Gambar  3).  Seperti diketahui  bahwa  respons  dari  genotipe  tomat untuk beregenerasi ditandai dengan kemampuan  eksplan  dari  genotipe  tersebut untuk  membentuk  tunas  dengan  bagian  daun dan batang. Terdapat dua tipe tunas yang dapat diamati  pada  tahap  regenerasi  ini  yaitu  tunas yang  dapat  dipindahkan  ke  media  perakaran karena  mempunyai  bagian  daun  dan  batang yang  normal  dan  tipe  tunas  yang  abnormal dimana  tunas  tersebut  bagian  batangnya  tidak berkembang dengan baik atau daun berkembang  tidak  normal.  Tipe  tunas  yang pertama  (normal)  akan  membentuk  akar dengan  baik  ketika  dipindahkan  ke  media perkaran  sedangkan  tipe  tunas  yang  kedua (abnormal)  apabila  dipindahkan  ke  media perakaran akan sulit membentuk akar.
Tabel  2.  Persentase  jumlah  eksplan  beregenerasi  dan  jumlah  tunas  per  eksplan  pada  empat  genotipe tomat ( Percentage of number of regenerated explants and shoot per explant of four tomato genotypes )
Genotipe
( Genotype )
Eksplan beregenerasi ( regenerated explants ) (%) Jumlah tunas per eksplan ( No. of shoot per explant ) Intan 66,22 b 0,37 b Gondol Hijau 17,08 d 0,09 c CLN6046 45,94 c 0,26 b CLN 1558A 90,56 a 0,66 a
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda dalam satu kolom menunjukkan perbedaan yang  nyata  pada  taraf  =5  %  ( Number  with  different  letter  at  the  same  column  was significant at the  =5 % )
Kemampuan eksplan yang telah membentuk  kalus  untuk  beregenerasi  dan jumlah  tunas  yang  terbentuk  per  eksplan menunjukkan adanya variasi di antara keempat genotipe yang digunakan (Tabel 2).
CLN1558A merupakan genotipe yang
menunjukkan respon beregenerasi paling tinggi
yang diindikasikan dengan tingginya persentase eksplan yang beregenerasi dan jumlah tunas per eksplan  (92,7  %  dan  0,68  %).  Kemampuan regenerasi untuk genotipe-genotipe lain setelah CLN1558A berturut-turut adalah Intan,
CL6046 dan Gondol Hijau.
Gambar 3. Tunas-tunas yang dihasilkan (ditandai dengan anak panah) dari eksplan pada media regenerasi tunas (S hoots produced by explants on regeneration medium )
Gambar 4. A. Induksi akar dari tunas-tunas pada media perakaran ( Root induction of the s hoots on rooting medium ) B.Aklimatisasi planlet tomat pada polibag di rumah kaca ( Acclimatization of tomato planlets on polybag in greenhouse )
A B
Untuk  menginduksi  terbentuknya  akar  maka tunas-tunas yang  terbentuk  pada  media regenerasi kemudian dipisahkan dari kalus/eksplan  dan  kemudian  dipindahkan  ke media  perakaran  (Gambar  4A).  Selanjutnya, tunas  yang  telah  membentuk  akar  dipindahkan ke  media  tanah  dalam  polibag  di  rumah  kaca (Gambar 4B).
Kultur in  vitro pada  tomat  dapat digunakan  untuk  aplikasi  bioteknologi  yang berbeda  seperti  misalnya  propagasi  klonal, produksi  tanaman  bebas  virus  (Moghaieb, 1999)  dan  transformasi  genetik  tanaman  (Ling et  al. ,  1998).  Dalam  bidang  rekayasa  genetik, kultur in  vitro atau  sistem  regenerasi  tomat yang  efektif  dan  efisien  sangat  bermanfaat untuk  mendapatkan  transforman  sebanyak mungkin, sehingga akan memberi peluang yang besar untuk merakit tanaman transgenik dengan karakter yang diinginkan.
Seperti  telah  dilaporkan  sebelumnya, bahwa paling tidak ada tiga faktor penting yang sangat  berpengaruh  di  dalam  sistem  regenerasi tanaman  secara in  vitro .  Faktor-faktor  tersebut adalah  genotipe,  tipe  eksplan  dan  komposisi media  (Moghaieb,  1999;  Gubis et  al .,  2003).
Faktor  komposisi  media  dan  tipe  eksplan  pada penelitian ini mengadopsi  teknologi  yang telah dikembangkan  oleh  AVRDC.    Pada  penelitian ini, dapat diamati adanya perbedaan yang nyata di  dalam  kemampuan  regenerasi  di  antara empat  genotipe  yang  digunakan,  yang  ditandai dengan  adanya  perbedaan  di  dalam  jumlah eksplan  yang  membentuk  primordia  tunas, eksplan  yang  beregenerasi  membentuk  tunas dan  jumlah  tunas  per  eksplan.  Genotipe CLN1558A  yang  digunakan  sebagai  kontrol pada  penelitian  ini  menunjukkan  respons  yang paling  tinggi.  Ini  dapat  dimengerti  karena teknologi  yang  dikembangkan  oleh  AVRDC tentunya  akan  sangat  tinggi  responsnya  bila digunakan  untuk  meregenerasikan  genotipe
yang  berasal  dari  AVRDC  juga.  Sedangkan dari  genotipe-genotipe  tomat  yang  beradaptasi baik dan ditanam di Indonesia, Intan merupakan  genotipe  yang  mempunyai  respons yang  terbaik  untuk  regenerasi  tanaman  secara in  vitro .  Dengan  demikian,  untuk  tujuan rekayasa  genetika  atau  transformasi  genetika tomat  dimana  salah  satunya  untuk  merakit tanaman  tomat  transgenik  tahan  virus,  maka Intan dapat digunakan untuk tujuan tersebut.

## Studi Transformasi Genetik Tomat
Pada  umumnya  kemampuan  regenerasi atau  transformasi  sangat  tergantung  pada genotipe  yang digunakan ( highly dependent  on genotype ).  Beberapa  usaha  yang  dilakukan untuk  mencapai  sistem  regenerasi  yang  efisien adalah  menentukan  parameter  penting  seperti pemilihan  genotipe  yang  akan  digunakan sebagai  eksplan.  Berdasarkan  percobaan  studi regenerasi tiga genotipe tomat Indonesia (Intan, CL6046  dan  Gondol  Hijau),  Intan  merupakan genotipe yang paling respons untuk diregenerasikan. Oleh karena itu, pada percobaan studi transformasi genetik tomat ini, genotipe  yang  digunakan  sebagai  eksplan adalah Intan.
Dari  sebanyak  tiga  kali  transformasi genetik  yang  dilakukan  pada  genotipe  Intan, telah diperoleh beberapa  eksplan  yang  berhasil membentuk kalus dan tunas pada media seleksi yang mengandung 50 mg/L antibiotik kanamisin  (Tabel  3  dan  Gambar  5).  Hal  ini mengindikasikan  bahwa  diduga  gen  ketahanan terhadap  antibiotik  kanamisin  ( npt II)  yang dibawa oleh A. tumefaciens telah terintegrasi ke dalam  genom  tanaman  tomat.  Berdasarkan jumlah tunas yang terbentuk, efisiensi transformasi  genetik  pada  percobaan  ini  masih relatif  rendah  (sekitar  3  %)  dimana  dari  rerata 55,7  eksplan  hanya  diperoleh  1,7  tunas  yang lolos seleksi (Tabel 3).
Tabel 3. Jumlah  eksplan berkalus, eksplan bertunas dan tunas pada media seleksi  yang mengandung 50  mg/l  kanamisin  setelah  transformasi  genetik  melalui  vektor A.  tumefaciens ( Number  of callused  explant,  shooted  explant  and  shoots  on  selection  medium  containing  50  mg/l kanamycin following genetic transformation mediated A. tumefciens vector )
Transformasi ke- ( transformation ) Jumlah eksplan ( No. of explant ) Jumlah eksplan berkalus ( No. of callused explant )
Jumlah eksplan bertunas ( No. of shooted explant )
Jumlah tunas ( No. of shoot ) 1 60 10 (16,7) 1 (1,7) 1 2 50 27 (54,0) 4 (8,0) 3 3 57 20 (35,1) 3 (5,3) 1 Rerata 55,7 19 (34,1) 2,7 (5,0) 1,7 Kontrol positif 20 19 (95,0) 19 (95,0) 23 Kontrol  negatif 25 4 0 0
Keterangan:  -  Angka  dalam  kurung  menunjukkan  nilai  persentase  ( Number  with  parenthesis  was percentage value )
- Kontrol  positif  adalah  eksplan  kotiledon  yang  tidak  ditransformasi  dan  ditumbuhkan pada media tanpa 50 mg/L kanamisin ( Positive control was untransformed cotyledon explants and culture to medium without 50 mg/L kanamycin ).
- Kontrol  negatif  adalah  eksplan kotiledon  yang tidak ditransformasi dan  ditumbuhkan pada  media  seleksi  50  mg/L  kanamisin  ( Negative  control  was untransformed cotyledon explants and culture to medium with 50 mg/L kanamycin)
Teknik  transformasi  yang  digunakan pada  penelitian  ini  juga  mengadopsi  sistem transformasi  yang  sudah  rutin  digunakan  di AVRDC.  Oleh  karena  itu,  studi  sistem transformasi  hanya  pada  parameter  genotipe yang  digunakan.  Namun  demikian,  karena efisiensi  transformasi  yang  dilakukan  pada genotipe  Intan  masih  sangat  rendah  padahal Intan merupakan genotipe yang paling responsif  untuk  diregenerasikan  maka  perlu
dilakukan optimasi parameter-parameter transformasi  yang  lain.  Di  antara  parameter- parameter  tersebut  adalah  lamanya  waktu  ko- kultivasi dan konsentrasi asetosiringon. Optimasi parameter transformasi genetik menggunakan  vektor A.  tumefaciens telah dilakukan  oleh  beberapa  peneliti  di  antaranya pada  tanaman  kedelai  (Paz et  al .,  2004), ubijalar  (Sisharmini et  al .,  2005)  dan  tomat (Shahriari et al ., 2006)
Gambar 5. Eksplan berkalus (a), eksplan bertunas (b) dan tunas yang terbentuk (c) pada media seleksi yang  mengandung  50  mg/L  kanamisin  setelah  transformasi  genetik  melalui  vektor A. tumefaciens (callused explant (a), shooted explant (b) and shoots (c) on selection medium containing  50  mg/L  kanamycin  following  genetic  transformation  mediated  A.  tumefciens vector)
b c a

## SIMPULAN
Dari tiga genotipe tomat yang beradaptasi  baik  dan  ditanam  di  Indonesia, Intan  mempunyai  respons  terbaik  di  dalam regenerasi  tanaman  tomat  secara in  vitro bila dibandingkan  dengan  dua  genotipe  lainnya. Studi transformasi genetik tomat Intan
menunjukkan bahwa telah diperoleh transforman  yang  lolos  pada  media  seleksi yang       mengandung       antibiotik     kanamisin 50 mg/L.

## DAFTAR PUSTAKA
Duriat,  A.S.  1996.  Management  of  pepper viruses  in  Indonesia:  problem  and progress. IARD J. 18(3): 45-50.
Green,  S.K.,  and  G.  Kalloo.  1994.  Leaf  curl and  yellowing  viruses  of  pepper  and tomato: An overview . Technical Bulletin Asian Vegetables Research and Development Center . Tainan, ROC. No.
21.
Gubis,  J.,  Z.  Laichova,  J.  Farago  and  S. Jurekova. 2003. Effect of genotype and explant  type  on  shoot  regeneration  in tomato ( Lycopersicon esculentum Mill.) in vitro. Czech J. Genet Plant Breed 39 (1) : 9-14.
Hamza,  S.,  and  Y.  Chupeau.  1993.  Re- evaluation  of  conditions  for  plant regeneration and Agrobacterum- mediated  transformation  from  tomato ( Lycopersicon  esculentum ). J.  Exp  Bot 44: 1837-184.
Jones,  D.R.  2003.  Plant  viruses  transmitted  by whiteflies. Eur J. Plant Pathol .
109:195-219.
Ling, H-Q., D. Kriseleit, and M.G.Ganal. 1998. Effect of ticarcillin/potassium
clavulanate  on  callus  growth  and  shoot regeneration in
Agrobacterium - mediated  transformation  of  tomato ( Lycopersicon  esculentum Mill).  Plant Cell Rep 17: 843-847.
Moghaieb,  R.E.A.,  H.  Saneoka,  and  K.  Fujita. 1999. Plant regeneration from hypocotyl  and  cotyledon  explant  of tomato ( Lycopersicon esculentum Mill).
J. Soil Sci Plant Nutr 45:639-646.
Moriones,  E.,  and  J.  Navas  Catillo.  2000. Tomato  yellow  leaf  curl  virus,  an emerging virus complex causing epidemics  worldwide. Virus  Res 71:
123-134.
Paz,  M.M.,  H.  Shou,  Z.  Guo,  Z.  Zhang,  A.K.
Banerjee, and K. Wang. 2004. Assesment  of  conditions  affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation  using  the  cotyledonary node explant. Euphytica 136: 167-179.
SAS    Institute  Inc.,  1990.  SAS/STAT  User’s
Guide Version 6. SAS Institute Inc. Shahriari,  F.,  H.  Hashemi,  and  B.  Hosseini. 2006.  Factors  influencing  regeneration and genetic transformation of three elite cultivars  of  tomato  ( Lycopersicon esculentum L.).  Pakistan J.  Biol  Sci 9(15):2729-2733.
Sisharmini,  A.,  A.D.  Ambarwati,  T.J.  Santoso,
M. Herman, dan G.A. Wattimena. 2005.
Optimasi  transformasi  genetik  Ubijalar melalui vektor Agrobacterium tumefaciens . Penelitian Pertanian 24(2):104-109.
Van  Roekel,  J.S.C.,  B.  Damm,  L.S.  Melchers,
and  A.  Hoekema.  1993.  Factors influencing transfromation frequency of tomato ( Lycopersicon esculentum ).
Plant Cell Rep 12: 644-647.
Veluthambi, K., A.K. Gupta, A. Sharma. 2003.
The current status of plant transformation  technologies. Cuurent Science 84(3): 368-380. Weisburger, J.H. 1998. International symposium  on  lycopene  and  tomato products  in  disease  prevention. Proc Soc Exp Biol Med 218: 93-143.