ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 17 (1) (2014) : 6 – 11
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa

## Pengaruh Penambahan Biotin terhadap Produksi Kitinase dari Trichoderma Viride FNCC 6013
Dharma Pebruariawan Putra a , Wuryanti a* , Sriatun a
a Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang * Corresponding author: wuryanti@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords: chitinases, biotin, Trichoderma viride FNCC 6013 Research  on  the  effect  of  biotin  addition  on  chitinase  production  isolated  from Trichoderma viride FNCC 6013 was performed. Chitinase is an enzyme that hydrolyzes chitin into simple sugars like N-acetylglucosamine. The aim of this study was to obtain chitinase  isolated  from  Trichoderma  viride  FNCC  6013,  studying  the  effect  of  biotin addition on growth of Trichoderma viride FNCC 6013 and chitinase production, obtaining isolated chitinase character information. The media for the growth curve of Trichoderma viride FNCC 6013 and chitinase production were varied with variations in biotin addition of 0.1 mg/mL and 0.3 mg/mL and without addition of biotin. Furthermore, chitinase was purified by fractionation of ammonium sulfate and dialysis was then tested for its activity and character. Trichoderma viride FNCC 6013 growth and chitinase production increased with  biotin  but  not  significant.  The  pH  and  the  optimum  temperature  of  chitinase produced from the  medium without the addition of biotin, with addition of 0.1 mg/mL biotin and 0.3 mg/mL were pH = 3.6; 4.2 and 4.2 and temperature of 27.5°C, 29°C and 29°C.

## A b s t r a k
Kata Kunci: kitinase, biotin, Trichoderma viride FNCC 6013 Telah  dilakukan  penelitian  tentang  pengaruh  penambahan  biotin  terhadap  produksi kitinase  yang  diisolasi  dari  Trichoderma  viride  FNCC  6013.  Kitinase  merupakan  enzim yang menghidrolisis kitin menjadi gula sederhana seperti N-asetilglukosamin. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kitinase yang diisolasi dari Trichoderma viride FNCC
6013, mengkaji pengaruh penambahan biotin terhadap pertumbuhan Trichoderma viride FNCC 6013 dan produksi kitinase, mendapatkan informasi karakter kitinase hasil isolasi. Media  untuk  kurva  pertumbuhan  Trichoderma  viride FNCC  6013  dan  produksi  kitinase dibuat variasi dengan variasi penambahan biotin 0,1 mg/mL dan 0,3 mg/mL serta tanpa penambahan biotin. Selanjutnya kitinase dimurnikan dengan fraksinasi amonium sulfat dan dialisis kemudian diuji aktivitas dan karakternya. Pertumbuhan Trichoderma viride FNCC  6013  dan  produksi  kitinase  meningkat  dengan  adanya  biotin  namun  tidak signifikan. pH dan suhu optimum kitinase yang diproduksi dari media tanpa penambahan biotin, dengan penambahan biotin 0,1 mg/mL dan 0,3 mg/mL berturut-turut adalah pada pH = 3,6; 4,2 dan 4,2 serta suhu 27,5°C, 29°C dan 29°C.

## 1. Pendahuluan
Kitinase (EC 3.2.1.14) adalah enzim golongan glikosil hidrolase yang mengkonversi kitin menjadi monomernya  yakni  N-asetil  glukosamin  yang  dapat digunakan  sebagai  substrat  dalam  berbagai  aplikasi industri  [1,  2].  Kitinase  dikelompokkan  menjadi  dua,
yaitu  endokitinase  dan  eksokitinase.  Endokitinase menghidrolisis  kitin  secara  acak  dari  bagian  dalam menghasilkan  kitooligomer.  Eksokitinase  terdiri  dari kitobiohidrolase  yang  menghidrolisis  kitin  secara berurutan dari ujung nonreduksi menghasilkan kitobiosa sebagai  produk  akhir  dan β -N-asetilheksosaminidase yang  menghidrolisis  kitin  secara  berurutan  dari  ujung
nonreduksi  menghasilkan  senyawa  N-asetilglukosamin [3]. Saat ini, kitinase banyak diaplikasikan dalam bidang pertanian  dan  bioteknologi  sebagai  agen  biokontrol kapang  patogen  tanaman,  sebagai  inhibitor  untuk kapang  pembusuk  makanan  dan  insektisida.  Selain  itu, kitinase diaplikasikan untuk mendegradasi limbah kulit crustacea  seperti  kepiting,  udang  dan  lobster  karena memiliki dinding sel yang tersusun atas kitin [4].
Dilaporkan Sharaf dkk. [4] bahwa diantara 8 kapang kitinolitik  yang  diteliti  yakni  Trichoderma  viride, Fusarium  poae,  Fusarium  bulbigenum  var.  Lycopersici, Fusarium  moniliform,  Fusarium  chlamydosporum, Cephalosporium  curtipes,  Aspergillus  fumigatus  dan Chaetomium  globosum,  yang  mampu  menghasilkan enzim  kitinase  dengan  aktivitas  tertinggi  ialah Trichoderma  viride.  Ekstrak  kasar  kitinase  dari Trichoderma viride tersebut diuji aktivitas antijamurnya dan hasilnya ekstrak kasar kitinase mampu menghambat pertumbuhan  kapang  perusak  makanan  seperti Alternaria  solani,  Penicillium  italicum,  Penicillium oxalicum dan Botrytis cinerea.
Produksi  enzim  dapat  ditingkatkan  dengan  cara memperkaya  nutrisi  kedalam  media  produksi  enzim, misalnya  biotin  (vitamin  H).  Wuryanti  [5]  melakukan penelitian  pengaruh  penambahan  biotin  pada  media pertumbuhan  terhadap  produksi  sel  Aspergillus  niger dan diperoleh hasil penambahan biotin 0,1 mg/mL dapat meningkatkan  produksi  biomassa  Aspergillus  niger sampai 40,17%.
Dalam penelitian ini kitinase yang diuji aktivitas dan karakterisasinya  diisolasi  dari  kapang  Trichoderma viride FNCC 6013 dan dilakukan penambahan biotin pada media  pertumbuhan  agar  meningkatkan  pertumbuhan Trichoderma  viride  FNCC  6013.  Semakin  banyak biomassa  sel  Trichoderma  viride  FNCC  6013  maka semakin  banyak  kitinase  yang  diekskresikan  keluar  sel sehingga produksi kitinase dapat meningkat.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan kitinase  yang  diisolasi  dari  Trichoderma  viride  FNCC 6013,  memperoleh  data  pengaruh  penambahan  biotin terhadap  pertumbuhan  Trichoderma  viride  FNCC  6013 dan  produksi  kitinase  serta  mendapatkan  informasi karakteristik kitinase hasil isolasi yang meliputi pH dan suhu optimum.

## 2. Metode Penelitian

## Alat & Bahan
Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  peralatan  gelas  laboratorium  kimia,  autoklaf (Napco  Model  8000-DSE),  mikropipet  (Nichiryo  Model 5000F), sentrifus (Centrific-228), Spektrofotometer UV- Vis  (T60u  Spectrometer),  Shaker  incubator  (ES-20 Giant),  neraca  analitik  (Kern),  oven  (LG).  Bahan  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  biakan  murni kapang  Trichoderma  viride  FNCC  6013  koleksi Laboratorium  Pangan  dan  Gizi  Pasca  Sarjana  UGM, koloidal kitin, biotin, media PDA (Potato Dextrose Agar), CaCl 2 ,  MgSO 4 ,  KCl,  FeSO 4 ,  pepton,  yeast  extract, (NH 4 ) 2 SO 4 .
Peremajaan dan Pengadaptasian Trichoderma viride FNCC 6013:
Trichoderma viride FNCC 6013 yang berasal dari isolat murni  diambil  sebanyak  satu  kawat  ose  dan diinokulasikan  pada  media  agar  miring PDA ( Potato Dextrose  Agar ) secara berulang  sampai  tiga  kali. Setelah itu dilakukan pemindahan inokulum secara aseptik pada erlenmeyer  yang  berisi  media  fermentasi  cair. Selanjutnya  media  fermentasi  tersebut  diinkubasi  pada shaker incubator sampai tumbuh spora Trichoderma viride FNCC 6013. Berikut adalah komposisi  media fermentasi cair yang digunakan.

## Tabel 1: Komposisi media fermentasi cair
Bahan gram % Koloidal kitin 1,5 NaNO 3 0,2 KH 2 PO 4 0,1 MgSO 4 .7H 2 O 0,05 FeSO 4 .7H 2 O 0,05 KCl 0,05 Yeast extract 0,25 Pepton 0,25

## Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Media  fermentasi  cair  untuk  kurva  pertumbuhan dibuat  variasi  yakni  tanpa  penambahan  biotin,  dengan penambahan biotin 0,1 mg/mL dan 0,3 mg/mL. Masing- masing  variasi  dibuat  sebanyak  100  mL  lalu  disterilkan dengan  autoklaf.  Selanjutnya  sebanyak  10  botol  diisi media fermentasi cair dari setiap variasi sebanyak 10 mL. Masing-masing  botol  diinokulasikan  1  mL  inokulum kapang Trichoderma  viride FNCC  6013  (sebagai  sampel) secara  aseptik  dan  1  buah  botol  yang  lain  dijadikan sebagai  kontrol.  Kemudian  botol-botol  tersebut dimasukkan  dalam shaker  incubator pada  suhu  ruang, selanjutnya sebanyak satu botol sampel diambil tiap 24 jam  sekali  selama  kurun  waktu  240  jam  untuk  diukur berat  keringnya.  Penentuan  pertumbuhan  kapang Trichoderma  viride FNCC  6013  dilakukan  menggunakan metode pengukuran berat kering.

## Produksi Kitinase
Produksi  kitinase  diawali  dengan  membuat  media starter sebanyak  50  mL  dengan  langkah  sama  seperti tahap pengadaptasian Trichoderma viride FNCC 6013 pada media  cair.  Sebanyak  20  mL starter  Trichoderma  viride FNCC  6013  dipindahkan  secara  aseptik  kedalam  media produksi 500 mL (4% starter ). Komposisi media produksi sama  dengan  komposisi  media starter .  Media  produksi dibuat  tiga  variasi,  yakni  media  I  (tanpa  penambahan biotin), media II (media dengan penambahan biotin 0,1 mg/mL)  dan  media  III  (dengan  penambahan  biotin  0,3 mg/mL).  Media  produksi  diinkubasi  pada shaker incubator . Setelah mencapai waktu sesuai fase log, media produksi  disaring  menggunakan  kertas  saring  untuk memisahkan  sel  kapang Trichoderma  viride FNCC  6013 dari  media  produksi.  Media  produksi  selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 5°C
selama 30 menit untuk memisahkan filtrat (ekstrak kasar kitinase) dan endapan.

## Fraksinasi Kitinase dengan Amonium Sulfat :
Amonium  sulfat  ditambahkan  kedalam  ekstrak kasar  enzim  sambil  diaduk  dengan magnetic  stirrer dengan  kecepatan  lambat  sampai  padatan  amonium sulfat  larut  sempurna.  Tingkat  kejenuhan  amonium sulfat 0-20% dikelompokkan menjadi fraksi 1 (F1), 20- 40% fraksi2 (F2), 40-60% fraksi 3 (F3), 60-80% fraksi 4 (F4)  dan  80-100%  fraksi  5  (F5).  Campuran  tersebut didiamkan  selama  satu  malam  dalam  keadaan  dingin. Selanjutnya  campuran  disentrifugasi  dengan  kecepatan 5000  rpm  selama  20  menit  pada  suhu  5°C.  Hasil sentrifugasi  akan diperoleh  endapan  yang  terpisah dari filtratnya.  Endapan  diambil  dan  disuspensikan  dengan bufer asetat 0,2 M pH 5. Filtrat yang diperoleh kemudian dilanjutkan  dengan  perlakuan  yang  sama  untuk  fraksi berikutnya.

## Dialisis Kitinase :
Proses  dialisis  dilakukan  dengan  memasukkan masing-masing  fraksi  kedalam  membran  selofan  dan merendamnya dalam bufer asetat 0,0002 M dan diaduk dengan magnetic  stirrer pada  suhu  dingin.  Bufer  asetat diganti  tiap  dua  jam  sekali  hingga  semua  fraksi  bebas amonium  sulfat.  Hal  ini  diketahui  dengan  menguji keberadaan  amonium  sulfat  di  dalam  bufer  perendam dengan  cara  bufer  perendam  diambil  3  mL  lalu ditambahkan larutan BaCl 2 0,1 M.

## Penentuan Aktivitas Kitinase
Aktivitas enzim kitinase diuji menurut metode Veda dan Arai [6] dengan substrat koloidal kitin. Sebanyak 1,0 mL koloidal kitin 0,3 %, 2,0 mL bufer asetat 0,2 M pH 5 dan  1,0  mL  filtrat  enzim  dimasukkan  kedalam  tabung reaksi  dan  diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  waktu tertentu.  Kemudian  campuran  tersebut  dipanaskan dalam  air  mendidih  selama  20  menit  untuk menghentikan  reaksi  enzimatis  dalam  campuran tersebut  lalu  didinginkan.  Aktivitas  enzim  dalam campuran  tersebut  ditentukan  secara  spektrofotometri pada λ = 660 nm.
Unit aktivitas =
x
Keterangan:  x = serapan kontrol y = serapan sampel

## Penentuan Kadar Protein
Penentuan kadar protein diawali dengan penentuan panjang gelombang larutan standar BSA dan pembuatan kurva  standar BSA .  Penentuan  panjang  gelombang maksimum  larutan  standar BSA dilakukan  dengan mereaksikan  0,5  mL  larutan BSA 0,1  mg/mL  dengan reagensia  Lowry  kemudian  diukur  serapannya  dengan spektrofotometer UV-Vis pada  rentang  panjang gelombang  sebesar  200-900  nm.  Pembuatan  kurva standar BSA dilakukan serupa dengan penetuan panjang gelombang maksimum dimana pembuatan kurva standar dilakukan  dengan  membuat  variasi  konsentrasi  larutan
BSA antara  0,02-0,30  mg/mL  dengan  rentang  0,04 mg/mL dan diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum. Penentuan kadar protein dilakukan dengan mereaksikan  0,5  mL  kitinase  dengan  reagensia  Lowry dan  diukur  serapannya  pada  panjang  gelombang maksimum.

## Penentuan Aktivitas Spesifik Kitinase
Aktivitas  spesifik  kitinase  ditentukan  dengan menghitung unit aktivitas kitinase dibagi dengan kadar protein kitinase.

## Karakterisasi Kitinase
Penentuan  pH  optimum  dilakukan  dengan mereaksikan 1 mL kitinase hasil fraksinasi ditambah 1 mL substrat koloidal kitin 0,3% yang telah dilarutkan dalam variasi  bufer  asetat  0,2  M  pH  3,6;  3,8;  4,0;  4,2;  4,4 sebanyak  2  mL,  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  ruang selama  90  menit.  Hasil  inkubasi  kemudian  dipanaskan dalam  air  mendidih  selama  20  menit.  Aktivitas  enzim dalam campuran tersebut ditentukan secara spektrofotometri pada λ = 660 nm.
Setelah  diperoleh  hasil  pH  optimum,  dilakukan penentuan suhu optimum. Sebanyak 1 mL kitinase hasil fraksinasi  ditambah  1  mL  substrat  koloidal  kitin  0,3% yang telah dilarutkan dalam 2 mL bufer asetat 0,2 M pada kondisi pH optimum yang telah ditentukan sebelumnya, kemudian  diinkubasi  selama  90  menit  dengan  variasi suhu  inkubasi  27°C,  27,5°C,  28°C,  28,5°C,  29°C  dan 29,5°C.  Hasil  inkubasi  kemudian  dipanaskan  dalam  air mendidih  selama  20  menit.  Aktivitas  enzim  dalam campuran  tersebut  ditentukan  secara  spektrofotometri pada λ = 660 nm.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Peremajaan dan Pangadaptasian Trichoderma viride FNCC 6013
Peremajaan  Trichoderma  viride  FNCC  6013 dilakukan pada media PDA (Potato Dextrose Agar) secara aseptik  dan  berulang  dengan  tujuan  agar  isolat  yang diremajakan memiliki sifat yang sama dengan sifat isolat murninya  serta  menghindari  kontaminasi  atau  mutasi. Isolat Trichoderma viride FNCC 6013 tumbuh setelah hari kelima  peremajaan.  Selanjutnya  isolat  tersebut dipindahkan  ke  media  fermentasi  cair  agar  diperoleh isolat yang aktif dan siap untuk digunakan sebagai starter dalam  proses produksi  kitinase.  Pada media  fermentasi cair, ditambahkan substrat kitin koloidal sebagai sumber karbon  dan  induser  supaya  Trichoderma  viride  FNCC 6013 menghasilkan kitinase.

## Pembuatan Kurva Pertumbuhan Trichoderma viride FNCC 6013
Kurva  pertumbuhan  merupakan  kurva  yang menggambarkan  fase  pertumbuhan  mikroorganisme. Tujuan dari pembuatan kurva pertumbuhan adalah untuk mengetahui waktu isolasi enzim dari media pertumbuhan. Pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan berdasarkan  berat  kering  sel  yaitu  dengan  menghitung pertambahan  massa  sel  dari  Trichoderma  viride  FNCC 6013  selama  240  jam.  Hal  ini  dilakukan  karena  kapang
Trichoderma  viride  FNCC  6013  tidak  homogen  dalam media  kurva  pertumbuhan  sehingga  pengukuran pertumbuhan  dengan  spektroskopi  UV-Vis  tidak menggambarkan  pertumbuhan  yang  sesungguhnya. Trichoderma viride FNCC 6013 dalam media cair diambil setiap  24  jam  kemudian  disaring,  dikeringkan  dengan oven  dan  disimpan  dalam  desikator  secara  berulang sampai  massa  sel  konstan,  kemudian  ditimbang massanya.  Berikut  adalah  kurva  pertumbuhan  yang diperoleh.
Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Trichoderma viride FNCC6013
Dari  kurva  pertumbuhan  tersebut,  diperoleh  titik untuk  produksi  enzim  adalah  jam  ke-96  untuk  media tanpa  penambahan  biotin  dan  jam  ke-120  pada  media kurva pertumbuhan yang ditambahkan biotin 0,1 mg/mL dan 0,3 mg/mL. Penambahan biotin dapat meningkatkan pertumbuhan  Trichoderma  viride  FNCC  6013  namun peningkatannya  tidak  signifikan.  Hasil  yang  sama  juga didapatkan  oleh  Kalsum dkk. [7]  yang  melakukan penelitian  tentang  pengaruh  pemberian  air  leri  (air cucian  beras)  sebagai  nutrisi  tambahan  pada pertumbuhan  jamur  tiram  putih  (Pleurotus  ostreatus). Pada  penelitian  tersebut  diperoleh  hasil  pemberian  air leri  tidak  berpengaruh  secara  signifikan  terhadap variabel  berat  total  jamur  tiram  putih  (Pleurotus ostreatus)  yakni  berat  total  dari  media  tanpa penambahan air leri, dengan penambahan air leri 20 mL, 40 mL dan 60 mL berturut-turut sebesar 189,96 gram, 185,90 gram, 234,63 gram dan 190,83 gram.

## Produksi Kitinase
Produksi kitinase diawali dengan pembuatan starter yang  digunakan  sebagai  sumber  mikroba  yang  akan mengawali  fermentasi  dalam  proses  produksi  kitinase. Sebanyak  20  mL  starter  Trichoderma  viride  FNCC  6013 dipindahkan secara aseptik kedalam media produksi 500 mL  (4%  starter).  Media  produksi  kitinase  dibuat  tiga variasi yakni media I (tanpa penambahan biotin), media II  (penambahan  biotin  0,1  mg/mL)  dan  media  III (penambahan  biotin  0,3  mg/mL).  Media  produksi diinkubasi  pada  shaker  incubator  sesuai  dengan  kurva pertumbuhan. Pada hari ketiga, terdapat spora berwarna putih  kehijauan,  berbentuk  bulat  dan  terapung  di  atas media. Setelah mencapai jam ke-96 (untuk media I) dan jam  ke-120  (untuk  media  II  dan  III),  media  produksi disaring menggunakan kertas saring dan diperoleh filtrat media  produksi.  Filtrat  media  produksi  kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 5°C
selama  20  menit  untuk  memisahkan reagen  yang  tidak larut  dalam  media  produksi.  Filtrat  yang  diperoleh merupakan  ekstrak  kasar  kitinase  ekstraseluler  yang selanjutnya disebut EK.

## Fraksinasi dengan Amonium Sulfat
Ekstrak  kasar  kitinase  diendapkan  dengan menambahkan  garam  amonium  sulfat  pada  berbagai tingkat  kejenuhan.  Amonium  sulfat  banyak  digunakan untuk mengendapkan protein (termasuk enzim) karena kelarutannya  tinggi,  harga murah,  dan  umumnya  tidak mempengaruhi  struktur  protein  [8].  Kelarutan  protein dipengaruhi  oleh  konsentrasi  garam  amonium  sulfat yang  ditambahkan  dan  kekuatan  ion  yang  ditimbulkan dari penambahan garam amonium sulfat. Semakin besar konsentrasi  garam  yang  ditambahkan,  maka  terjadi peningkatan muatan listrik di sekitar protein yang akan menarik  molekul  air  dari  protein.  Interaksi  hidrofobik antara sesama molekul protein pada suasana ionik tinggi akan  menurunkan  kelarutan  protein.  Peristiwa  ini disebut  “salting  out”  dan  dapat  digunakan  untuk memisahkan protein dari komponen terlarut lainnya [9]. Setelah itu dilakukan sentrifugasi pada suhu 5°C dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit untuk memisahkan protein  yang  terendapkan  pada  tingkat  kejenuhan sebelumnya.

## Dialisis Kitinase
Proses  dialisis  dilakukan  untuk  membebaskan kitinase  dari  garam  amonium  sulfat  karena  dengan adanya  amonium  sulfat  dalam  protein  enzim  akan menghambat  kerja  katalisis  enzim.  Prinsip  dialisis adalah  difusi,  yakni  terjadinya  aliran  zat  terlarut  dari konsentrasi tinggi (bufer pensuspensi enzim, yakni bufer asetat  0,2  M)  ke  konsentrasi  rendah  (bufer  perendam, yakni  bufer  asetat  0,0002  M)  melalui  membran  semi permeabel  (membran  selofan).  Membran  selofan memiliki ukuran tertentu yang hanya akan melewatkan ion-ion berukuran kecil seperti ion amonium dan sulfat tetapi protein yang memiliki ukuran besar akan tertahan didalam  membran.  Proses  difusi  ini  akan  mencapai kesetimbangan  saat  laju  aliran  amonium  sulfat  keluar membran sama dengan laju kembalinya amonium sulfat kedalam membran. Saat mencapai kestimbangan, bufer yang digunakan sebagai pelarut harus diganti agar proses dialisis  tetap  berjalan  sampai  semua  amonium  sulfat yang  ada  dalam  suspensi  protein  dapat  keluar. Identifikasi bebasnya amonium sulfat dilakukan dengan menambahkan  larutan  BaCl 2 ke  dalam  bufer  yang digunakan. Proses ini dihentikan sampai tidak terbentuk endapan putih pada saat penambahan BaCl 2 .

## Uji Aktivitas Kitinase
Aktivitas  kitinase  yang  diuji  pada  penelitian  ini adalah  aktivitas  kitinase  total  atau  non-spesifik,  yakni meliputi  aktivitas  endokitinase  maupun  eksokitinase [10].  Produk  yang  dihasilkan  adalah  kitooligosakarida dan N-asetilglukosamin. Aktivitas kitinase diuji dengan metode  Veda  dan  Arai  [6]  berdasarkan  pengurangan substrat koloidal kitin. Unit aktivitas dalam penelitian ini didefinisikan sebagai sejumlah enzim yang
menyebabkan  pengurangan  serapan  sebesar  0,001 campuran reaksi per menit.
Gambar 2.Diagram Aktivitas Kitinase
Aktivitas  kitinase  tidak  berubah  secara  signifikan dengan  adanya  penambahan  biotin  0,1  mg/mL  dan  0,3 mg/mL.  Aktivitas  kitinase  yang  tinggi  dapat  diperoleh dengan penambahan biotin 0,3 mg/mL jika dibandingkan dengan pemberian biotin sebesar 0,1 mg/mL karena pada ekstrak  kasar  dan  semua  fraksi  menunjukkan  aktivitas kitinase dari media produksi dengan penambahan biotin 0,3  mg/mL  lebih  tinggi  daripada  dengan  penambahan biotin  sebesar  0,1  mg/mL.  Hal  ini  dipengaruhi  oleh jumlah sel Trichoderma viride FNCC 6013 yang tumbuh pada  media  produksi.  Penambahan  biotin  0,3  mg/mL menyebabkan  pertumbuhan  sel  lebih  banyak  dibanding penambahan biotin 0,1 mg/mL meskipun tidak berbeda jauh, sehingga kitinase yang dieksresikan lebih banyak. Hasil yang mencolok ditunjukkan F3 dari media produksi dengan  penambahan  biotin  0,3  mg/mL.  Kemungkinan pengukuran  aktivitas  pada  fraksi  tersebut  kurang  tepat karena terdapat kelemahan dari metode yang digunakan yakni  metode  Ueda-Arai.  Pengukuran  aktivitas  kitinase dengan metode Ueda-Arai menjadi kurang tepat karena kemungkinan besar substrat kitin koloid yang tidak larut dalam bufer asetat menghalangi serapan cahaya UV-Vis dari  spektrofotometer  sehingga  data  serapan  yang diperoleh tidak tepat.
Kadar  protein  diuji  dengan  metode  Lowry dkk. [11] yakni  menambahkan  reagen  Lowry  ke  dalam  fraksi kitinase kemudian warna biru yang terbentuk ditentukan nilai  serapannya  menggunakan  spektrofotometer  UV- Vis pada panjang gelombang optimum larutan BSA yang sebelumnya telah diukur, yakni pada panjang gelombang 733 nm.
Nilai  unit  aktivitas  dan  kadar  protein  yang  telah diketahui  digunakan  untuk  menentukan  nilai  aktivtas spesifik  kitinase.  Fraksi  dengan  nilai  aktivitas  spesifik tertinggi merupakan fraksi dengan jumlah enzim paling banyak  dibandingkan  dengan  fraksi  lainnya  sehingga kemungkinan  menemukan  enzim  lebih  besar  dimana aktivitas  spesifik  merupakan  rasio antara  unit  aktivitas enzim  dengan  protein  dalam  miligram.  Fraksi  dengan aktivitas spesifik tertinggi selanjutnya dikarakterisasi pH dan suhu optimumnya.
Gambar 3. Diagram aktivitas spesifik kitinase

## Karakterisasi Kitinase
pH  Optimum  :  Penentuan  pH  optimum  dalam penelitian  ini  dilakukan  terhadap  fraksi  enzim  hasil pemurnian awal dengan aktivitas spesifik tertinggi pada setiap variasi penambahan biotin dalam media produksi. Variasi  pH  dilakukan  pada  suhu  optimum  berdasarkan penelitian Sharaf dkk. [4] dimana suhu optimum kitinase dari  Trichoderma  viride  adalah  28°C.  Berikut  adalah grafik aktivitas pada variasi pH optimum kitinase.

## Gambar 4. Grafik pH optimum
Dari  hasil  karakterisasi  pH  optimum  kitinase, diperoleh  pH  optimum  kitinase  pada  media  produksi tanpa  penambahan  biotin  adalah  pH  3,6  dengan  unit aktivitas 48,222 Unit/mL. Kitinase pada media produksi dengan  penambahan  biotin  0,1  mg/mL  memiliki karakteristik  pH  optimum  pada  pH  4,2  dengan  unit aktivitas 50,667 Unit/mL. Hasil karakterisasi yang sama juga  ditunjukkan  kitinase  pada  media  produksi  dengan penambahan biotin 0,3 mg/mL yakni pH optimum pada pH  4,2  dengan  unit  aktivitas  67,333  Unit/mL. Penambahan  biotin  pada  media  produksi  kitinase menyebabkan perubahan pH optimum aktivitas kitinase karena  dimungkinkan  bahwa  biotin  dalam  sel  kapang Trichoderma viride FNCC 6013 memicu ekskresi berlebih salah satu kelompok kitinase yang memiliki pH optimum yang lebih tinggi. Hal ini seperti penelitian Harman dkk. [12] yang melaporkan bahwa dari dua kelompok kitinase yang diisolasi dari Trichoderma harzianum, kitobiosidase (termasuk kelompok eksokitinase) memiliki  pH  yang  lebih  tinggi  (dikisaran  pH  6) dibandingkan  endokitinase  yang  memiliki  pH  optimum dikisaran pH 4. kitinase dari Trichoderma viride adalah 28°C.  Berikut  adalah  grafik  aktivitas  pada  variasi  pH optimum kitinase
Suhu Optimum: Suhu berperan dalam meningkatkan interaksi  antara  enzim  dan  substrat  dalam  reaksi enzimatis.  Perubahan  suhu  mempengaruhi  ikatan hidrogen atau interaksi hidrofobik yang berperan dalam menjaga  konformasi  molekul  enzim  [13].  Perubahan konformasi akan mempengaruhi ikatan sisi aktif enzim, kondisi  panas  tertentu  menyebabkan  mudahnya pemutusan  ikatan  hidrogen  selanjutnya  dalam  rantai polipeptida tersebut sehingga protein enzim mengalami denaturasi  [14].  Berikut  adalah  grafik  unit  aktivitas enzim terhadap perubahan suhu.

## Gambar 5. Grafik suhu optimum
Hasil  karakterisasi  menunjukkan  bahwa  suhu optimum  kitinase  pada  media  produksi  tanpa penambahan  biotin  adalah  27,5°C.  Hasil  ini  mendekati suhu optimum kitinase yang diisolasi dari Trichoderma viride  oleh  Sharaf dkk. [4]  yakni  pada  suhu  28°C.  Pada media produksi dengan penambahan biotin sebanyak 0,1 mg/mL  dan  0,3  mg/mL  menunjukkan  hasil  yang  sama yakni  suhu  optimum  aktivitas  kitinase  pada  29°C. Penambahan  biotin  menyebabkan  perubahan  suhu optimum aktivitas kitinase. Sama seperti pada penentuan pH  optimum,  biotin  yang  ditambahkan  pada  media produksi kitinase dimungkinkan menyebabkan ekskresi berlebih  salah  satu  kelompok  kitinase  yang  memiliki suhu optimum yang lebih tinggi.

## 4. Kesimpulan
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kitinase dapat diisolasi  dari  kapang  Trichoderma  viride  FNCC  6013 dengan  kitin  koloid  sebagai  induser.  Pertumbuhan biomassa sel Trichoderma viride FNCC 6013 dan produksi kitinase  mengalami  peningkatan  dengan  adanya penambahan  biotin  meskipun  tidak  signifikan.  Kondisi pH optimum  pada reaksi  enzimatik  kitinase dari media produksi tanpa penambahan biotin, dengan penambahan biotin sebesar 0,1 mg/mL dan 0,3 mg/mL berturut-turut pada  pH  3,6;  4,2;  dan  4,2.  Kondisi  suhu  optimum  pada reaksi  enzimatik  kitinase  dari  media  produksi  tanpa penambahan  biotin,  dengan  penambahan  biotin  0,1 mg/mL dan 0,3 mg/mL berturut-turut pada suhu 27,5°C, 29°C dan 29°C.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Gemma Reguera, Susan B Leschine, Biochemical and genetic characterization of ChiA, the major enzyme component  for  the  solubilization  of  chitin  by Cellulomonas  uda, Archives  of  microbiology ,  180,  6,
(2003)  434-443 http://dx.doi.org/10.1007/s00203- 003-0611-y
[2]  Magdalena  A  Gutowska,  Jeffrey  C  Drazen,  Bruce  H Robison,  Digestive  chitinolytic  activity  in  marine fishes  of  Monterey  Bay,  California, Comparative Biochemistry  and  Physiology  Part  A:  Molecular  & Integrative  Physiology ,  139,  3,  (2004)  351-358 http://dx.doi.org/10.1016/j.cbpb.2004.09.020
[3]  Phakapob  Setthakaset,  Rath  Pichyangkura,  Anawat Ajavakom,  Mongkol  Sukwattanasinitt,  Preparation of  N-acetyl-D-glucosamine  using  enzyme  from Aspergillus  sp, J  Metals,  Materials  and  Minerals ,  18,
(2008) 53-57
[4]  Eman Fathi Sharaf, Abd El-Aziz Qablan El-Sarrany, Mai  El-Deeb,  Biorecycling  of  shrimp  shell  by Trichoderma  viride  for  production  of  antifungal chitinase, African Journal of Microbiology Research , 6, 21, (2012) 4538-4545 http://dx.doi.org/10.5897/AJMR12.148 [5]  Wuryanti, Pengaruh Penambahan Biotin Pada Media Pertumbuhan  Terhadap  Produksi  Sel  Aspergillus niger,, BIOMA , Vol.10 No. 2, (2008) 6-50
[6]  Mitsuhiro  Veda,  Motoo  Arai, Purification  and  some properties of chitinases from Aeromonas sp. No. 10S- 24, Bioscience, biotechnology, and biochemistry , 56, 3,
(1992) 460-464
[7]  Ummu  Kalsum,  Siti  Fatimah,  Catur  Wasonowati, Efektivitas Pemberian Air Leri Terhadap Pertumbuhan  dan  Hasil  Jamur  Tiram  Putih (Pleurotus ostreatus), Agrovigor , 4, 2, (2011) 86-92
[8]  Maggy  T  Suhartono,  Enzim  dan  bioteknologi, PAU Bioteknologi IPB, Bogor , (1989)
[9]  Aula nni’am,  Protein  dan  Analisinya,  Citra  Mentari Group, Malang, 2005.
[10] H Bielka, HBF Dixon, P Karlson, C Liebecq, N Sharon, EJ Van Lenten, SF Velick, JFG Vliegenthart, EC Webb, A  Cornish-Brown,  Enzyme  nomenclature,  in, Academic Press, New York, 1984.
[11]  Oliver  H  Lowry,  Nira  J  Rosebrough,  A  Lewis  Farr, Rose J Randall, Protein measurement with the Folin phenol  reagent, The  Journal  of  biological  chemistry , 193, 1, (1951) 265-275
[12] GE Harman, CK Hayes, M Lorito, RM Broadway, A Di Pietro,  C  Peterbauer,  A  Tronsmo,  Chitinolytic enzymes of Trichoderma harzianum: purification of chitobiosidase  and  endochitinase, Phytopathology , 83, 3, (1993) 313-318
[13] Rudy  Wijaya,  Karakteristik  Enzim  serupa  Tripsin dari Cacing Tanah, Teknologi Pertanian, IPB, Bogor
[14] Anna  Poedjiadi,  FM  Titin  Supriyanti,  Dasar-dasar biokimia, Jakarta: Universitas Indonesia , (1994)