Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra
# Korespondensi:  Balai  Uji  Standar  Karantina  Ikan  Pengendalian Mutu  dan  Keamanan  Hasil  Perikanan.  Jalan  Raya  Setu  No.  1, Setu  Cipayung,  RT.3/RW.3,  Setu,  Jakarta  Timur  13880,  Indonesia Tel.  +  62  21  844  8506 E-mail:  emei.widiyastuti@gmail.com

## SKRINING  DAN  IDENTIFIKASI  BAKTERI  ANTI  QUORUM  SENSING ASAL  TAMBAK  UDANG  VANAME  PENGHAMBAT  VIRULENSI  Vibrio  parahaemolyticus
Emei  Widiyastuti *)# ,  Iman  Rusmana **) ,  dan  Munti  Yuhana **)
*) Balai Uji Standar Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Jalan Raya Setu No. 1, Setu Cipayung, RT.3/RW.3, Setu, Jakarta Timur 13880
**) Institut Pertanian Bogor Kampus IPB, Jl. Raya Dramaga, Babakan, Kec. Dramaga, Kota Bogor, Jawa Barat 16680
(Naskah  diterima:  6  Agustus  2020;  Revisi  final:  15  Desember  2020;  Disetujui  publikasi:  18  Desember  2020)

## ABSTRAK
Vibriosis  dapat  dicegah  dan  dikendalikan dengan  memanfaatkan  mekanisme  anti quorum  sensing  (AQS). Salah satu strategi anti quorum sensing dalam menghambat ekspresi faktor virulen dari Vibrio parahaemolyticus yaitu  dengan  mendegradasi  sinyal  komunikasi  sel  bakteri  menggunakan  AHL  laktonase. Penelitian  ini bertujuan untuk menyeleksi dan mengindentifikasi bakteri penghasil AHL laktonase yang berpotensi mampu menghambat virulensi bakteri patogen V. parahaemolyticus. Isolasi bakteri dilakukan dari sampel saluran pencernaan udang vaname, air, dan sedimen tambak. Sebanyak 18 dari 111 isolat yang diisolasi menunjukkan adanya aktivitas AQS terhadap bioindikator Chromobacterium violaceum. Hasil uji patogenitas secara in vitro pada agar darah didapatkan tiga isolat yang tidak menunjukkan aktivitas hemolisis yaitu B5, K4, dan S12. Hasil konfirmasi dan analisis gen aiiA menggunakan Blast-X menunjukkan bahwa isolat B5 dan S12 memiliki kesamaan dengan AHL laktonase pada Bacillus cereus, sedangkan K4 memiliki similaritas dengan AHL laktonase pada multispesies Bacillus sp. Hasil pensejajaran sekuen gen 16S rRNA ketiga isolat tersebut dengan data pada GenBank, teridentifikasi sebagai Bacillus siamensis (B5), Bacillus cereus (K4), dan Bacillus amyloliquefaciens (S12). Berdasarkan hasil uji antagonis dan uji kultur bersama disimpulkan bahwa isolat K4 bekerja dengan mekanisme AQS sedangkan isolat B5 dan S12 diduga berjalan dua mekanisme secara bersama yaitu antibiosis dan anti quorum sensing. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut memiliki potensi sebagai kandidat agen biokontrol pada akuakultur sehingga perlu dilakukan uji lanjutan.
KATA KUNCI: Vibrio parahaemolyticus; anti quorum sensing (AQS); AHL-laktonase
ABSTRACT: Screening and identification of anti-quorum sensing bacteria from vannamei shrimp ponds as virulence  inhibitors  of  Vibrio  parahaemolyticus.  By:  Emei  Widiyastuti,  Iman  Rusmana, and  Munti  Yuhana
Vibriosis  can  be  prevented  and  controlled  by  utilizing  the  anti-quorum  sensing  (AQS)  mechanism.  One  of the  anti-quorum  sensing  mechanisms  to  inhibit  the  expression  of  virulent  factors  of  Vibrio parahaemolyticus  is  by  degrading  the  quorum  sensing  communication  signals  using  AHL  lactonase.  The study  aimed  to  select  and  identify  AHL  lactonase-producing  bacteria  that  have  the  potentials  to  inhibit  the virulence  of  V.  parahaemolyticus.  Several  batches  of  bacteria  were  isolated  from  the  digestive  tract  of vannamei  shrimp,  water,  and  sediment  of  shrimp  ponds.  There  were  18  out  of  111  isolates  that  showed AQS  activity  against  Chromobacterium  violaceum  used  as  a  bioindicator.  In  vitro  pathogenicity  test  on blood agar showed that B5, K4, and S12 isolates showed gamma hemolysis activity. The results of confirmation and  analysis  of  aiiA  genes  using  Blast-X  showed  that  B5  and  S12  isolates  have  AHL  lactonase  similarities with  Bacillus  cereus,  whereas  K4  has  similarities  with  multispecies  Bacillus  sp.  Alignment  results  of  the  16S rRNA  gene  sequences  with  GenBank  data  showed  that  B5,  K4,  and  S12  isolates  were  identified  as  Bacillus siamensis,  Bacillus  cereus,  and  Bacillus  amyloliquefaciens,  respectively.  The  follow  up  antagonistic  and coculture  tests  revealed  that  K4  uses  the  AQS  mechanism,  while  B5  and  S12  likely  use  antibiotic  mechanism
and  anti  quorum  sensing  to  inhibit  the  virulent  expression  of  V.  parahaemolyticus.  This  study  concludes that  the  three  isolates  have  the  potential  to  be  used  as  biocontrol  agents  in  brackishwater  aquaculture. Further  research  is  needed  to  determine  the  pathogenicity  of  AQS  bacteria  to  vannamei  shrimp  and  the effective  concentration  of  AQS  bacteria  to  inhibit  the  virulence  of  V.  parahaemolyticus  to  vannamei  shrimp by  in  vivo  treatment.
KEYWORDS: Vibrio  parahaemolyticus;  anti-quorum  sensing  (AQS);  AHL-lactonase
bertujuan  untuk  menyeleksi  dan  mengindentifikasi bakteri  penghasil  AHL  laktonase  yang  berpotensi mampu menghambat virulensi V. parahaemolyticus.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan  Uji
V.  parahaemolyticus  koleksi  Balai  Uji  Standar Karantina  Ikan  Pengendalian  Mutu  (BUSKIPM) Kementerian Kelautan dan Perikanan. Chromobacterium violaceum  (Cv)  koleksi  Laboratorium  Mikrobiologi Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia.

## Isolasi  Bakteri  AQS  Pendegradasi  AHL
Sebanyak  satu  gram  sampel  (organ  pencernaan, sedimen  dan  1  mL  air  tambak)  dihomogenasi  lalu dipanaskan  pada  suhu  80°C  selama  15  menit selanjutnya dilakukan pengenceran berseri hingga 10 10 . Sebanyak 0,1 mL suspensi disebar pada media isolasi bakteri  laut  yaitu  seawater  complate  agar  atau  SWC 50% (air laut 750 mL; akuades 250 mL; bakto pepton 2,5 g; bakto agar 20 g; yeast ekstrak 0,5 g; dan gliserol 1,5 mL) secara duplo kemudian diinkubasi 24 sampai 48 jam pada suhu 30°C dalam kondisi aerob (Umoro, 2016).  Koloni  bakteri  yang  memiliki  morfologi (ukuran,  warna,  dan  bentuk)  berbeda  kemudian dimurnikan  dengan  metode  gores  kuadran  hingga didapat koloni tunggal dan seragam.

## Seleksi  Bakteri  AQS  dengan  Bioesei  Terhadap

## C.  violaceum
Seleksi bakteri AQS menggunakan bioindikator C. violaceum dengan metode disc diffusion. Isolat bakteri ditumbuhkan pada SWC broth dengan di-shaker selama 24-72  jam.  Kultur  disentrifugasi  pada  11.000  rpm selama 10 menit. Sebanyak 100  L filtrat supernatan diteteskan  di  atas  paper  disk  steril  (6  mm)  pada permukaan media semi padat Luria-Bertani agar (LA) 1,2%  yang  mengandung  kultur  1%  C.  violaceum  10 9 CFU/mL (v/v), lalu diinkubasi pada suhu 28°C selama 24  jam.  C.  violaceum  1%  ditanam  pada  media  semi padat LA dengan metode agar tuang. Kontrol negatif menggunakan  SWC  broth  steril.  Aktivitas  degradasi AHL  ditunjukkan  dengan  terbentuknya  zona  tidak berwarna ungu di sekitar paper disk. Indeks degradasi (ID) AHL menggunakan rumus sebagai berikut:

## PENDAHULUAN
Vibriosis pada budidaya udang vaname merupakan salah satu kendala yang sering dihadapi para petambak, salah  satunya  disebabkan  oleh  bakteri  Vibrio parahaemolyticus  (Sarjito  et  al.,  2018).  Vibrio parahaemolyticus  strain  tertentu  dilaporkan  juga sebagai salah satu jenis bakteri pembawa toksin agen penyebab  Acute  hepatopancreatic  necrosis  disease (AHPND)  pada  udang  vaname  (Tran  et  al.,  2013). Petambak selama ini sering menggunakan antibiotik secara  berlebihan  dan  tidak  tepat  sasaran  untuk mengendalikan vibriosis, sehingga memicu terjadinya resistensi  antibiotik,  serta  efek  residu  pada  biota perairan.
Terdapat alternatif pencegahan dan pengendalian vibriosis yang ramah lingkungan, salah satunya adalah dengan menghambat ekspresi gen faktor virulen dari V. parahaemolyticus. Regulasi gen  virulen merupakan salah  satu  respons  positif  dari  mekanisme  quorum sensing (Defoirdt et al., 2004). Mekanisme ini berjalan jika  kelimpahan  sinyal  komunikasi  antar  sel  atau autoinduser di lingkungan mencapai quorum. Senyawa autoinduser yang dihasilkan oleh V. parahaemolyticus berupa acyl homoserin lactones (AHL) yaitu 3-oxo-C6- HSL (Vinoj et al., 2014). Apabila quorum sensing dari populasi V. parahaemolyticus di lingkungan terganggu, maka dapat menghambat virulensi bakteri. Gangguan tersebut salah satunya dapat berupa terdegradasinya senyawa autoinduser oleh enzim laktonase sehingga kondisi quorum AHL tidak tercapai. Selanjutnya tidak terjadi respons balik yang diterima oleh reseptor sel bakteri dan pada akhirnya regulasi faktor virulen pun tidak  terjadi.  Enzim  ini  juga  dapat  dihasilkan  oleh bakteri yang dikenal dengan bakteri anti quorum sens- ing (AQS).
Penelitian  mengenai pengaplikasian  bakteri  AQS untuk menangani  vibriosis pun telah  dilakukan dan menunjukkan  hasil  yang  memuaskan  di  antaranya adalah  B.  subtilis  berhasil  menghambat  virulensi  V. harveyi  pada  larva  Penaeus  monodon  (Yuniarti  et  al., 2015); selain itu, B. licheniformis mampu mengurangi kematian lar va vaname yang dinfeksi V. parahemolyticus (Vinoj et al., 2014). Melihat adanya potensi bakteri AQS asal tambak udang vaname untuk mencegah vibriosis, maka dilakukan penelitian ini yang
Pengukuran  Unit  Violacein  pada  C.  violaceum Sebanyak  300  L  supernatan  bakteri  AQS ditambahkan pada 30 mL medium Luria-Bertani Broth (LB) yang telah diinokulasi dengan 1% C. violaceum (v/ v). Kultur diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 28°C. Ekstrak pigmen violacein diambil dan diukur setelah inkubasi 48 dan 72  jam.  Kultur  C.  violaceum  disentrifugasi  pada kecepatan  11.000  rpm  selama  15  menit,  pelet ditambahkan  1,5  mL  DMSO,  di-vortex  kemudian disentrifugasi 11 000 rpm selama 15 menit. Violacein terlarut diukur absorbansinya pada panjang gelombang 585  nm,  pertumbuhan  bakteri  C.  violaceum  diukur pada  600  nm.  Unit  violacein  dihitung  dari  rasio absorbansi  585  nm  dengan  absorbansi  600  nm (Chaudhari  et  al.,  2014).  Kontrol  negatif  yang digunakan  hanya  kultur  C.  violaceum  tanpa penambahan bakteri uji AQS.

## Uji  Patogenitas  Bakteri  AQS  Secara  In  Vitro
Bakteri uji AQS ditumbuhkan pada media agar darah lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30°C. Isolat dipilih yang tidak menunjukkan aktivitas hemolisis.

## Deteksi Gen aiiA  Penyandi AHL  Laktonase
DNA  genom  bakteri  AQS  yang  terpilih  diisolasi menggunakan mericon DNA Bacteria Kit Plus (Qiagen). Amplifikasi  gen  aiiA  menggunakan  primer  aiiAF  (5'- ATGGGATCCATGACAGTAAAGAAGCTTTAT-3')  dan primer  aiiAR  (5'-GTCGA AT TCCTCA ACAAGA TACTCCTAATG-3')  dengan  target  produk  amplikasi 800  bp  (Dong  et  al.,  2002).  Komponen  reaksi amplifikasi PCR untuk volume 25 µL terdiri atas 12,5 µL GoTaq Green Master Mix 2X (Promega, Madison, WI, USA), 1 µL  primer (10 pmol µL -1 ), template  DNA dan nuclease free water (NFW). Profil suhu amplifikasi yaitu pradenaturasi (94°C, 10 menit); 30 siklus untuk denaturasi (94°C, 30 detik), annealing (52°C, 30 detik) dan  elongasi  (72°C,  satu  menit);  post  elongasi  (72°C, lima  menit).  Produk  PCR  dipurifikasi  menggunakan QIAquick  PCR  Purification  Kit  (Qiagen),  lalu disekuensing menggunakan DNA Sequencer ABI 3130. Sekuen  nukelotida  disejajarkan  dengan  database sekuen pada NCBI menggunakan program Basic Local Aligment  Search  Tool-Protein  (BL AST-X).  Analisis filogenetik  menggunakan program  MEGA X  dengan metode  Maximum  Likelihood  dengan  bootstrap 1.000x.

## Identifikasi  Bakteri  AQS  Berdasarkan  Gen Penyandi 16S rRNA
Amplifikasi gen penyandi 16S rRNA menggunakan primer forward 63F (5'-CAGGCCTAACACATGCAAGTC- 3') dan primer reverse 1387R (5'- GGGCGGWGTGTACAAGGC-3') (Marchesi et al., 1998). Profil  suhu  amplifikasi,  pradenaturasi  (95°C,  lima menit);  30  kali  siklus  untuk  denaturasi  (95°C,  satu menit),  annealing  (55°C,  satu  menit),  elongasi  (72°C, 1,5 menit); post elongasi (72°C, 10 menit). Visualisasi produk  PCR  dielektroforesis  pada  agarose  1% menghasilkan 1.300 bp.

## Uji Antagonis  dan Kultur  Bersama AQS  dan
V.  parahaemolyticus
Bakteri AQS diinokulasi pada SWC agar yang telah disebar 100 µL biakan bakteri V. parahaemolyticus 10 6 CFU mL -1 , diinkubasi pada suhu 30°C selama  24-48 jam, lalu amati ada tidaknya zona hambat. Uji kultur bersama antara bakteri AQS dan V.  parahaemolyticus berdasarkan metode Gram et al. (1999), masing-masing sebanyak 10 6 CFU mL -1 diinokulasikan ke dalam SWC broth,  diinkubasi  pada  30°C  selama  24  jam.  Kultur disebar pada media TCBS, diinkubasi pada suhu 30°C selama 48 jam, lalu diamati dan dihitung total vibrio count  (TVC).

## Analisis  Data
Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif.

## HASIL DAN BAHASAN
Isolasi  dan  Seleksi  Bakteri  AQS  Pendegradasi AHL
Sebanyak 117 isolat bakteri berhasil diisolasi dari 25 sampel (saluran pencernaan udang, air, dan sedimen tambak).  Hasil  penapisan  menggunakan  bakteri bioindikator C. violaceum, 18 isolat di antaranya yang berasal dari sampel sedimen dan saluran pencernaan udang  berpotensi  memiliki  aktivitas  degradasi  AHL yang  ditunjukkan  dengan  terbentuknya  zona  tidak ungu  di  sekitar  paper  disk  yang  ditetesi  supernatan bakteri uji (Tabel 1 dan Gambar 1). Tidak ditemukan isolat  potensial AQS  pada sampel  air tambak.  Zona tidak  ungu  terbentuk  karena  adanya  hambatan terhadap QS C. violaceum sehingga pigmen violacein tidak diproduksi oleh sel-sel bakteri di sekitar paper disk  (McClean  et  al.,  1997).  Terganggunya  produksi violacein  tersebut  dapat  disebabkan  oleh  adanya aktivitas enzim laktonase pendegradasi senyawa sinyal acyl  homoserine  lactone,  yang  disekresikan  dalam supernatan bakteri uji (Novita et al., 2015).
Nilai indeks degradasi AHL yang dihasilkan dari 18 isolat AQS tersebut sangat bervariasi dari 0,33 hingga
100% x disk paper d disk paper d ungu tidak zona d AHL ID   di mana: d= diameter
2,  tertinggi  dihasilkan  oleh  isolat  S12  dan  UB6 sedangkan terendah oleh isolat U21 (Gambar 1 dan 2). Indeks degradasi yang didapat dari supernatan hasil inkubasi  72  jam  lebih  optimal  dibandingkan  hasil inkubasi  24  jam.  Hal  ini  diduga  lambatnya  sekresi enzim ekstraselular pendegradasi AHL pada beberapa isolat bakteri tersebut, seperti yang telah dilaporkan oleh (Tan, 2017). Tren meningkatnya indeks degradasi AHL  dari  supernatan  hasil  inkubasi  72  jam, menggambarkan  semakin  banyaknya  enzim pendegradasi AHL yang disekresikan bakteri AQS.
Aktivitas  AQS  dapat  juga  ditentukan  melalui penambahan supernatan kultur bakteri AQS ke dalam kultur  C.  violaceum  (Suryanti,  2019).  Aktivitas  AQS ditunjukkan jika supernatan yang diduga mengandung enzim  pendegradasi  AHL  dapat  menyebabkan berkurangnya  kadar  pigmen  violacein  tanpa memengaruhi  pertumbuhan  populasi  sel  bakteri  C. violaceum.  Mekanisme  AQS  diduga  terjadi  pada  11 perlakuan di  antaranya K4, M4,  M5, M9,  M10, S12, B5, U34, UJ2, UJ5 dan UJ6 karena terjadi penurunan kadar violacein secara signifikan pada hari ketiga yang
Tabel 1. Sumber dan jumlah isolat hasil isolasi dari saluran pencernaan udang dan lingkungan tambak
Table 1. Source  and  number  of  bacterial  isolates  isolated  from  shrimp  digestive  tract  and  pond environment Asal Origin Sumber Source Jumlah Number Saluran pencernaan udang Digestive tract of shrimp 4 20 3 (U2, U21) Air (Water of shrimp pond ) 1 3 - Sedimen (Sediment of shrimp pond ) 1 6 1 (S12) Saluran pencernaan udang Digestive tract of shrimp 2 26 3 (UJ2, UJ5, UJ6) Air (Water of shrimp pond ) 1 2 - Sedimen (Sediment of shrimp pond ) 1 8 - Saluran pencernaan udang Digestive tract of shrimp 4 8 - Air (Water of shrimp pond ) 2 2 - Sedimen (Sediment of shrimp pond ) 3 20 3 (K1, K2, K4) Saluran pencernaan udang Digestive tract of shrimp 2 8 1 (UB6) Air (Water of shrimp pond ) 1 2 - Sedimen (Sediment of shrimp pond ) 1 10 5 (M4, M5, M6, M9, M10) Lampung Sedimen (Sediment of shrimp pond ) 1 2 2 (B5, B8) 25 117 18 Bengkalis Total Jumlah isolat hasil isolasi
Number of isolates isolated Jumlah dan kode isolat bakteri AQS
Number and code of AQS bacterial isolates Sampel (Sample ) Karawang Tanggerang Pamanukan Gambar 1. Aktivitas  degradasi  AHL  isolat  bakteri  uji  terhadap  C.  violaceum  sebagai bioindikator AQS.
Figure 1. AHL degradation activity of selected bacterial isolates against C. violaceum as AQS bioindicator.
tidak  diikuti  dengan  penurunan  pertumbuhan  sel bakteri  C.  violaceum  (Gambar  3).  Penurunan  kadar violacein tersebut terjadi karena terganggunya ekpresi gen penyandi violacein yang diduga disebabkan adanya degradasi  AHL  pada  kultur  C.  violaceum  oleh  enzim
pendegradasi  AHL  (Suryanti,  2019).  Perubahan pigmentasi  violacein  C.  violaceum  yang  dihasilkan pada media mudah diamati dan dapat dikuantifikasi secara fotometrik (Chaudhari et al., 2014).
Gambar 3. Hubungan  kepadatan sel  dan  produksi violacein  C.  violaceum  akibat  perlakuan  penambahan supernatan bakteri uji. Perlakuan penambahan supernatan bakteri AQS pada kultur C. violaceum yang diinkubasi selama 48 jam (2d) dan perlakuan selama 72 jam (3d).
Figure  3. Patterns  of  cell  density  and  violacein  production  of  C.  Violaceum  after  subjected  to  screened- bacteria  supernatants.  C.  Violaceum  were  incubated  for  48  hours  (2d)  and  treatment  for  72 hours  (3d)  post  the  addition  of  AQS  bacterial  supernatant.
In d ek s d eg ra d as i A H L (A H L de gr ad at io n in de x) Supernatan isolat uji (Supernatant of the test isolate) The  supernatant  was  incubated  for  24  hours Supernatan hasil inkubasi 24 jam The  supernatant  was  incubated  for  72  hours Supernatan hasil inkubasi 72 jam
Gambar 2. Hasil seleksi bakteri AQS menggunakan C. violaceum berdasarkan nilai indeks degradasi AHL.
Figure 2 The screening results of anti-QS bacteria using C. violaceum based on AHL degradation index values.
0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 0 1 2 3 4 5 K I- 2 d
K I- 3 d K 2 -2 d K 2 -3 d K 4 -2 d K 4 -3 d M 4 -2 d M 4 -3 d M 5 -2 d M 5 -3 d M 6 -2 d M 6 -3 d M 9 -2 d M 9 -3 d M 1 0 -2 d M 1 0 -3 d S1 2 -2 d S1 2 -3 d B 5 -2 d B 5 -3 d B 8 -2 d B 8 -3 d U 3 4 -2 d U 3 4 -3 d U B 6 -2 d
U B 6 -3 d
U 1 2 -2 d
U 1 2 -3 d
U 2 1 -2 d
U 2 1 -3 d
U J2 -2 d
U J2 -3 d
U J5 -2 d
U J5 -3 d
U J6 -2 d
U J6 -3 d
K (- )- 2 d K (- )- 3 d
U n it v io la ce in (V io la ce in u ni t) O D 6 0 0 ( p er tu m b u h an b ak te ri C V ) OD 6 0 0 (b ac te ri al g ro w th C V ) Perlakuan (Treatments) OD600 (Pertumbuhan bakteri) Unit violacein Unit violacein (Violacein  unit)
OD600 (Pertumbuhan bakteri/Bacterial growth)
Berdasarkan  uji  patogenitas  secara  in  vitro  pada agar  darah  didapatkan  tiga  isolat  yang  tidak menunjukkan  aktivitas  hemolisis  yaitu  B5,  K4,  dan S12.  Konfirmasi  keberadaan  gen  aiiA  penyandi  AHL laktonase  menggunakan PCR  terhadap ketiga  isolat tersebut menghasilkan panjang basa 800 bp (Gambar 4).  Selanjutnya  dilakukan  sekuensing  dan  analisis pohon filogenetik untuk mengidentifikasi jenis asam amino dan kekerabatannya dengan AHL laktonase yang dimiliki oleh bakteri lain pada GenBank (Gambar 5).
Hasil analisis sekuen gen aiiA menggunakan BLAST- X pada GenBank menunjukkan bahwa isolat B5 dan S12  memiliki kesamaan  dengan N-acyl homoserinelactonase  yang  dimiliki  Bacillus  cereus masing-masing 99,56% (WP098582883.1) dan 99,17% (WP098582883.1), sedangkan K4 memiliki kemiripan 99,55% dengan multispesies Bacillus (WP071727701.1) (Gambar 5). Hasil konstruksi filogenetik dari sekuen penyusun asam amino  AHL laktonase menunjukkan ketiganya berada pada kluster yang sama dengan AHL laktonase yang dimiliki kelompok Bacillus lainnya, dan berbeda  kluster  dengan  AHL  laktonase  dari  Vibrio alginolyticus  sebagai  out  group  (Gambar  5).  Gen  aiiA pada  ketiga  isolat  tersebut  tergolong  ke  dalam superfamili  metallo -hydrolase-like  metallo-ã- lactamase. Metallo hydrolase adalah enzim hidrolitik yang melakukan berbagai fungsi biologis salah satunya
AHL laktonasese sebagai katalis hidrolisis pembukaan cincin lakton AHL (Chen et al., 2013).
Hasil  pensejajaran  sekuen  gen  16S  rRNA menggunakan  BL AST-N  menunjukkan  isolat  B5 memiliki kemiripan 99,93% dengan Bacillus siamensis (MN176482.1), isolat K4 memiliki homologi 99,25% dengan  Bacillus  cereus  (KU377337.1)  dan  isolat  S12 memiliki  similaritas  99,93%  dengan  Bacillus amyloliquefaciens  (NR117946.1).  Analisis  konstruksi filogenetik menunjukkan isolat B5 dan S12 termasuk dalam satu klaster dan  tergolong kompleks spesies Bacillus  subtilis  (Fan  et  al.,  2017),  sedangkan  K4 terbentuk dalam satu klaster B. cereus (Gambar 6).
Spesies  Bacillus  termasuk  bakteri  pertama  yang dilaporkan  mampu  mendegradasi  AHL  dengan menghidrolisis cincin lakton oleh enzim laktonase yang dihasilkannya  (Dong  et  al.,  2002).  Beberapa  bakteri terutama Bacillus spp., memanfaatkan AHL-laktonase dalam quorum quenching untuk meningkatkan kekuatan kompetitif  di  tanah  (Rasmussen  &  Givskov,  2006). Penelitian  dan  pengaplikasian  Bacillus  sebagai pendegradasi  AHL  pada  akuakutur  mulai  banyak dilakukan.  Pemanfaatan  Bacillus  subtilis  1  x  10 6 CFU mL -1 dapat  meningkatkan  SR  larva  Penaeus  monodon sebesar 65,56% yang diinfeksi Vibrio harveyi (Yuniarti et  al.,  2015).  Penambahan  B.  amyloliquefaciens  10 3 CFU mL -1 mampu meningkatkan imunitas Litopenaeus
Gambar 4. Visualisasi DNA gen aiiA isolat uji. Lajur M: marker DNA 100  bp  plus  (Qiagen),  lajur  1  kontrol  negatif,  lajur  2-4 sampel DNA isolat uji bertururt-turut K4, B5, dan S12.
Figure 4. Visualization of DNA aiiA gene test isolates. Lane M: DNA marker 100 bp plus (Qiagen); lane 1 negative control; lane 2-4 DNA samples from isolates K4, B5, and S12.
1500 bp 1000 bp 500 bp 800 bp
vannamei  pada  tambak  sistem  bioflok  (Llario  et  al., 2020).  Sebelumnya Novita  et  al.  (2015)  melaporkan pengaplikasian B. amyloliquefaciens melalui pakan ikan lele yang diinfeksi A. hydrophila mampu menghasilkan sintasan sebesar 81%.  Selanjutnya Wee et al.  (2018) melaporkan Bacillus cereus berperan dalam menghambat patogentitas  dari  A.  hydrophila  pada  juvenil Macrobrachium rosenbergii. Sementara penambahan B. siamensis 10 7 CFU g -1 pakan sebagai probiotik efektif meningkatkan  kinerja  pertumbuhan  pada  catfish (Meidong et al., 2016).
Gambar 5. Pohon  filogenetik  gen  aiiA  menggunakan  metode  Maximum  Likelihood  dengan  bootstrap
1.000X.
Figure  5. The  phylogenetic  tree  of  aiiA  gene  analyzed  usingthe  Maximum  Likelihood  method  with bootstrap  1,000X.
N-acyl homoserine lactonase Bacillus cereus WP_098582883
N-acyl homoserine lactonase hydrolase Bacillus cereus Multispecies AGW45370

## B5 S12
AHL-lactonase Bacillus cereus AAL98724
N-acyl homoserine lactonase hydrolase Bacillus cereus group Multispecies WP_000216575 N-acyl homoserine lactonase hydrolase Bacillus cereus AGW45370
AHL-lactonase Bacillus thuringensis ABD93922
AHL-lactonase Bacillus thuringensis ABD93922 serovar aizawai AEY70474 N-acyl homoserine lactonase hydrolase Bacillus Multispecies WP_059303559 N-acyl homoserine lactonase hydrolase Bacillus cereus WP_088054546 N-acyl homoserine lactonase hydrolase Bacillus WP_065211778
16 26 17 26 29 46 58 AHL-lactonase Bacillus thuringensis ABD93926 N-acyl homoserine lactonase hydrolase Bacillus thuringensis AGW45369 27 61 100 81 31 61 K4
N-acyl homoserine lactonase hydrolase Bacillus cereus WP_000216607

## N-acyl homoserine lactonase Bacillus sp. WP_136445127
N-acyl homoserine lactonase Bacillus Multispecies WP_071727701

## N-acyl homoserine lactonase Agrobacterium tumefaciens WP_113180086
N-acyl homoserine lactonase Vibrio alginolyticus ARP48622
Hasil uji aktivitas antagonis bakteri AQS terhadap V. parahaemolyticus, isolat S12  dan B5 menunjukkan adanya zona hambat, sedangkan sekitar isolat K4  tidak terbentuk  zona  hambat  (Gambar  7A).  Hal  ini mengindikasikan bahwa penghambatan patogenitas V. parahaemoliticus  oleh  isolat  K4  menggunakan mekanisme AQS, sedangkan isolat B5 dan S12 diduga berjalan dua proses secara bersama yaitu antibiosis dan  anti  quorum  sensing  yang  didukung  data  kultur bersama bakteri V. parahaemolyticus dan bakteri AQS (Gambar 7B-D).
S12 Bacillus amyloliquefaciens strain BCRC 11601 NR_116022 Bacillus amyloliquefaciens strain MPA 1034 NR_117946 64 65 68 69 100 76 100 Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC 15535 NR_112685 Bacillus siamensis strain KCTC 13613 MN176482
Bacillus siamensis strain KCTC 13613 KY643639 Bacillus velezensis strain NRRL B-41580 KY694464
B5 K4
Bacillus velezensis strain BCRC 17467 EF433407
Bacillus cereus strain CCM 2010 KY628813
Bacillus cereus strain ATCC 14579 NR_114582
Bacillus cereus strain CCM 2010 KU377337 Pseudomonas aeruginosa strain KSG LN874213
Gambar 6. Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA menggunakan metode  Maximum  Likelihood  dengan  Bootstrap  1.000X.
Figure  6. Phylogenetic  tree  based  on  16S  rRNA  gene  sequences  analyzed  us- ing  the  Maximum  Likelihood  method  with  Bootstrap  1,000X.
Hasil  uji  kultur  bersama  selama  48  jam  antara bakteri V.  parahaemolyticus  dan bakteri  AQS.  Jumlah total vibrio pada perlakuan bakteri B5, K4, dan S12 berturut-turut adalah 1,45 x 10 7 CFU mL -1 ; 3,74 x 10 7 CFU mL -1 ; dan 1,29 x 10 7 CFU mL -1 , sedangkan pada kontrol positif 4 x 10 7 CFU mL -1 (Gambar 7B-D).

## KESIMPULAN
Isolat  bakteri  AQS  yang  berhasil  diisolasi  dari tambak udang vaname teridentifikasi sebagai Bacillus siamensis  (B5),  Bacillus  cereus  (K4)  dan  Bacillus amyloliquefaciens  (S12)  yang  terkonfirmasi  memiliki AHL  laktonase  dan  memiliki  potensi  sebagai  agen biokontrol. Ketiga isolat tersebut perlu dilakukan uji lanjutan  secara  in  vivo  untuk  memastikan efektivitasnya  dalam  penghambatan  patogenitas  V. parahemolyticus pada udang.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada kepala Balai Uji Standar Karantina  Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan yang telah memfasilitasi laboratorium  sebagai  tempat  penelitian  ini dilaksanakan.

## DAFTAR  ACUAN
Chen,  F.,  Gao,  Y.,  Chen,  X.,  Yu,  Z.,  &  Li,  Z.  (2013).
Quorum quenching enzymes and their application in  degrading  signal  molecules  to  block  quorum sensing-dependent infection. International Journal of Molecular Sciences, 14(9), 17477-17500.
Chaudhari, V., Gosai, H., Raval, S., & Kothari, V. (2018). Effect  of  certain  natural  products  and  organic solvents on quorum sensing in Chromobacterium violaceum.  Asian  Pacific  Journal  of  Tropical  Medi- cine,  7(1),  S204-S211.
Defoirdt,  T.,  Boon,  N.,  Bossier,  P.,  &  Verstraete,  W.
(2004).  Disruption  of  bacterial  quorum  sensing: an  unexplored  strategy  to  fight  infections  in aquaculture. Aquaculture, 240, 69-88.
Dong, Y.H., Gusti, A.R., Zhang, Q., Xu, J.L., & Zhang, L.H. (2002).  Identification of  quorum-quenching N-acyl  homoserine  lactonases  from  Bacillus  spe- cies.  Applied  and  Environmental  Microbiology,  68, 1754-1759.
Fan,  B.,  Blom,  J.,  Klenk,  H-P.,  &  Borriss,  R.  (2017). Bacillus  amyloliquefaciens,  Bacillus  velezensis,  and Bacillus siamensis form an  “Operational Group B. amyloliquefaciens” within the B. subtilis species com- plex. Frointier in Microbiology, 8(22), 1-15.
Gram, L., Melchiorsen, J., Spanggaard, B., Huber, I., & Nielsen,  T.F.  (1999).  Inhibition  of  Vibrio anguillarumby Pseudomonas  fluorescens AH2,  a possible probiotic treatment of fish. Applied and Environmental Microbiology, 65, 969-973.
Llario,  F.,  Romano,  L.A.,  Rodilla,  M.1.,  Sebastiá- Frasquet,  M.T.1.,  Poersch,  L.H.  (2020).  Applica- tion  of  Bacillus  amyloliquefaciens  as  probiotic  for Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) cultivated in a bioflocsystem. Iranian Journal of Fisheries Sciences, 19(2), 904-920.
McClean,  K.H.,  Winson,  M.K.,  Fish,  L.,  Taylor,  A., Chhabra, S.R., Camara, M., Daykin, M., Lambr, J.H., & Swift, S. (1997). Quorum sensing and Chromo- bacterium violaceum: Exploitation of violacein pro- duction  and  inhibition  for  the  detection  of Nacylhomoserine  lactones.  Microbiology,  143, 3703- 3711.
Meidong,  R.,  Doolgindachbaporn,  S.,  Jamjan,  W., Sakai,  K.,  Tashiro,  Y.,  Okugawa,  Y.,  &  Tongpim. (2017). A novel probiotic Bacillus siamensis B44
Gambar 7. Uji aktivitas antagonis bakteri AQS dan V. Parahaemolyticus pada media SWC(A)  dan  koloni  bakteri  hasil  kultur  bersama  antara  bakteri  AQS (B5,  K4,  dan  S12)  dengan  V.  parahaemolyticus  (B-D).  Koloni  V. parahaemolyticus (tanda panah), koloni bakteri AQS (kepala panah).
Figure 7. Antagonistic activity test of AQS bacteria to V. parahaemolyticus on SWC media (A) and (B-D) growth of colonies of AQS bacteria (B5, K4, and S12) (short arrow) and V. parahaemolyticus (long arrow) during coculture test. A B C D
isolated from Thai pickled vegetables (Phak-dong) for potential use as a feed supplement in aquacul- ture. The Journal of General and Applied Micro- biology.
Novita, H., Rusmana, I., Yuhana, M., & Pasaribu, F.H.
(2015). Potential of Bacillus sp., as a producer of AHL lactonase and its application as a probiotic for  the  prevention  of  MAS  in  catfish  (Clarias gariepinus). Journal of Fisheries and Aquatic Science, 10(6), 464-476.
Rasmussen,  T.B.  &  Givskov,  M.  (2006).  Quorum sensing inhibitors: A bargain of effects. Microbio- logy, 152, 895-904.
Sarjito,  Haditomo,  A.H.C.,  Desrina,  Djunaedi,  & Prayitno,  S.B.  (2018).  The  diversity  of  vibrios associated with vibriosis in Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei) from extensive shrimp pond in Kendal District, Indonesia. In 3rd International Conference  on  Tropical  and  Coastal  Region  Eco Development. (p. 012011.1-012011.7). Yogyakarta, Indonesia.
Suryanti,  E.  (2019).  Potensi  bakteri  penghasil  Ahl laktonase  sebagai  pengendali  busuk  lunak  pada kentang  oleh  Dickeya  Dadantii.  Tesis.  Bogor  (ID): Institut Pertanian  Bogor.
Tan, A.F. (2017). Isolation and characterisation of coral mucusbacilli  with  quorum  quenching  potential  as abiocontrol agent for shrimp gut protection against
Early Mortality Syndrome (EMS). .Tesis. Swinburne University of Technology. Malaysia.
Tran,  L.,  Nunan,  L.,  Redman,  R.M.,  Mohney,  L.L., Pantoja,  C.R.,  Fitzsimmons,  K.,  &  Lightner,  D.V. (2013). Determination of the infectious nature of the  agent  of  acute  hepatopancreatic  necrosis syndrome  affecting  penaeid  shrimp.  Diseaseof Aquatic Organisms, 105(1), 45-55.
Umoro,  A.  (2016).  Isolasi  Bacillus  sp.  penghasil bacteriosin  dan  peningkatan  aktivitasnya  sebagai penghambat  Vibrio  harveyi.  Tesis.  Bogor  (ID): Institut Pertanian  Bogor.
Vinoj, G., Vaseeharan, B., Thomas, S., Spiers, A.J., & Shanthi, S. (2014). Quorum-quenching activity of the AHL-lactonase from Bacillus licheniformis DAHB1 inhibits  Vibrio  biofilm  formation  in  vitro  and reduces shrimp intestinal colonisation and mor- tality. Marine Biotechnology, 16(6), 707-715.
Wee,  W.C., Mok,  C.H.,  Romano,  N., Ebrahimi,  M.,  & Natrah, I. (2018). Dietary supplementation use of Bacillus cereus as quorum sensing degrader and their effects on growth performance and response of Malaysian  giant  river  prawn  Macrobrachium rosenbergii juvenile towards Aeromonas hydrophila. Aquaculture Nutrition, 24(6), 1804-1812.
Yuniarti, A., Maftuch, Soemarno, & Aulanni’am. (2015).
In  vitro  and  in  vivo  study  of  acyl  homoserine lactone  degrading  Bacillus  against  Vibrio  harveyi. International Journal of Biosciences, 6(2), 338-348.