## STUDI EFIKASI DAN KEAMANAN EKSTRAK AKAR DAN DAUN

## Calotropis gigantea TERHADAP SEL KANKER KOLON DAN SEL KANKER PAYUDARA SECARA IN VITRO

## Roihatul Mutiah
1 Departement of Pharmacy, Faculty of Medical and Health Sciences, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang Indonesia
roiha@farmasi.uin-malang.ac.id

## ABSTRAK
Pengembangan  fitofarmakauntuk  penyakit  kanker  sampai  saat  ini  menjadi  langkah utama  dalam  mengatasi  kegagalan  terapi  kanker. Calotropis  gigantea adalah  salah  satu tanaman  yang  telah  terbukti  secara  ilmiah  baik in  vitro maupun in  vivo sebagai  agen kemopreventif.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menjelaskan  efikasi  dan  keamanan  ekstrak daun Calotropis  gigantea (EDCG)  dan  ekstrak  akar Calotropis  gigantea (EACG)  pada  sel normal  NIH3T3,  sel  kanker  kolon  WiDr  dan  sel  kanker  payudara  T47D.  Dari  hasil  analisis MTT  dan  analisis Selectivity  Index (SI)  didapatkan  hasil  bahwa  Ekstrak  etanol  daun Calotropis gigantea (EDCG) dapat menghambat pertumbuhan sel kanker kolon WiDr secara selektif    (SI>3)  namun  tidak  selektif  dalam  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker  payudara T47D  (SI<3).  Ekstrak  etanol  akar Calotropis  gigantea (EACG)  tidak  selektif  dalam menghambat  pertumbuhan  sel  kanker  kolon  WiDr  dan  sel  kanker  payudara  T47D  (SI<3). Oleh  karena  itu  EDCG  dapat  direkomendasikan  sebagai  kandidat  Fitofarmaka  dengan pembuktian lebih lajut melalui uji klinik.
Katakunci : Calotropis  gigantea ,  Sel  NIH3T3,  Sel  WiDr,  Sel  T47D,  efikasi,  keamanan, Selectivity Index (SI)

## ABSTRACT
Development of phytopharmaca for cancer until now has become a major step in overcoming the failure of cancer therapy. Calotrophis gigantea is one of the scientifically proven plants both in vitro  and  in  vivo  as  a  chemopreventive  agent.  This  study  aims  to  explain  the  efficacy  and  safety  of Calotropis  gigantea  leaf  extract  (EDCG)  and  Calotropis  gigantea  root  extract  (EACG)  on  NIH3T3 cell, colon cancer cell WiDr and T47D breast cancer cells. From the analysis of MTT and Selectivity Index  (SI)  analysis  showed  that  ethanol  extract  of  leaf  Calotropis  gigantea  (EDCG)  can  inhibit selective growth  of  selective  colon  cancer  cells  (SI> 3)  but  not  selective  in inhibiting the  growth  of breast cancer cells T47D (SI <3 ). Calotropic gigantea (EACG) root ethanol extract is not selective in inhibiting  the  growth  of  colon  cancer  cells  WiDr  and  breast  cancer  cells  T47D  (SI  <3).  Therefore EDCG can be recommended as a Phytopharmaca candidate with further proof through clinical trials.
Keywords : Calotrophis gigantea, NIH3T3 Cells, WiDr Cells, T47D Cells, efficacy, safety.

## PENDAHULUAN
Kanker    payudaradan  kolon  termasuk  dalam  kelompok  lima  kanker  penyebab kematian  terbanyak  di  dunia  selain  kanker  paru-paru,  lambung  dan  hati.  Kanker  payudara menyebabkan  519.000  kematian  pertahun  sedangkan  kanker  kolon  menyebabkan  608.000 kematian per tahun [1]. Penelitian di Amerika menyatakan satu dari delapan wanita Amerika terserang  kanker  payudara  dan  30%  dari  penderita  mengalami  kematian  [2].  Di  Indonesia, prevalensi  kanker  payudara  menduduki  peringkat  ke-2  setelah  kanker  leher  rahim  dan merupakan  penyebab  kematian  utama  bagi  kaum  wanita.  Dari  semua  kasus  pada  wanita Indonesia, pada tahun 1991 kasus kanker payudara mencapai 17.77% [3].
Pengembangan pengobatan untuk penyakit kanker sampai saat ini sangat perlu untuk dikembangkan.  Hal  ini  disebabkan  karena  seringnya  terjadi  kegagalan  terapi  kanker  baik melalui  kemoterapi,  pembedahan  dan  radioterapi.  Kegagalan  terapi  tersebut  disebabkan karena terjadinya resitensi sel kanker terhadap obat kemoterapi dan timbulnya  efek samping yang  sangat  serius  pada  pasien.  Efek  samping  timbul  karena  obat  kemoterapi  tidak  spesifik hanya  membunuh  sel  kanker  namun  sel  normal  juga  ikut  terbunuh.  Pengembangan  terapi kanker  melalui  pengembangan  bahan  alam  baik  sebagai  agen  kemopreventif  maupun  untuk agen fitofarmaka sangat penting untuk dikembangkan. Karena kelebihan produk bahan alam adalah efek samping yang ditimbulkan lebih kecil dari obat sintesis.
Calotropis gigantea (L.) W.T Aiton( C.gigantea ) merupakan tanaman obat tradisional yang  tumbuh    tersebar  di  Indonesia.  Tanaman  ini  secara  turun  temurun  telah  dimanfaatkan oleh  masyarakat  Indonsia  sebagai  obat  gatal-gatal,  kudis,bisul,  batuk,  trakhoma,  konstipasi (daunnya), asma, mual,  nyeri lambung (bunganya), rajasinga, digigit ular berbisa (akarnya), sakit  gigi,  bengkak-bengkak,  radang  telinga,  cacingan  dan  disentri  [4].  Pada  penelitian sebelumnya  telah  dilaporkan  bahwa  senyawa  calotropon  dari  bagian  akar  mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap Leukemia K562 dan gastric cancer 7901 [5]; ekstrak etanol daun C.gigantea mampu  menghambat  pertumbuhan  fibrosarcoma  secara in  vivo pada  dosis  100 dan  150  mg/kgbb  dengan  mekanisme  peningkatan  ekspresi  caspase-3  [6] . Ekstrak  akar C.gigantea mempunyai  aktivitas  antikanker  yang  lebih  tinggi  dibanding  bagian  daun  dan bagian  bunga  [7].  Fraksi  etil  asetat  dari  bagian  daun  (IC 50 41.79  μg/ml)  dan  fraksi diklorometan  (IC 50 40.57μg/ml)  mempunyai  aktivitas  sitotoksik  yang  lebih  tinggi  dibanding fraksi butanol (IC 50 737.74 μg/ml) dan air (IC 50 8493 μg/ml) [8].
Oleh karena itu pada penelitian ini dilaporkan tentang hasil uji aktivitas dan keamanan secara  in  vitro    dari  Ekstrak  Etanol  Daun Calotropis  gigantea (EDCG)  dan  Ekstrak  Etanol Akar Calotropis  gigantea (EACG).  Parameter  aktivitas  antikanker  EDCG  dan
EACGdilakukan terhadap sel kanker kolon WiDr dan Sel T47D sedangkan untuk parameter keamanan dilakukan terhadap sel normal fibroblast NIH3T3 untuk menentukansitotoksisitasnya.  Selanjutnya  ditentukan  Selektifitas  Indeks  dari  aktivitas antikanker ekstrak uji.

## BAHAN DAN METODE PENELITIAN

## Bahan Uji
Bahan  uji  yang  digunakan  adalah  bagian  akar  dan  bagian  daun Calotropis  gigantea yang didapatkan  dari  Malang  Jawa  Timur.  Determinasi  tanaman  dilakukan  di  Lembaga  Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Purwodadi Jawa Timur.

## Bahan untuk ekstraksi
Pelarut yang akan digunakan untuk tahap ekstraksi maserasi adalah etanol 70% (Merck).

## Bahan untuk kultur sel
Sel  kanker  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  sel line kanker  kolon  WiDr  dan  sel kanker  payudara  T47D.    Sel  tersebut  diperoleh  dari Cancer  Chemoprevention  Research Centre (CCRC), Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada dan dari Prof. Masasi Kawaichi, laboratorium  of  Gene  Function  in  Animal,  Graduate  School  of  Biological  Science,  Nara Institute of Science and Technology .
Sel WiDr dan sel T47D dalam medium Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)  ditambah dengan 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)(PAA Labortories), 1% v/v penicillin- streptomicin  (Nacalay    Tesque),  dan  1,0mM  L-glutamin  (Nacalay    Tesque).  Kemudian  sel dikultur dalam inkubator, pada 5% CO 2 , 95% O 2 suhu 37 o C.

## Bahan uji sitotoksik
Dimetil sulfoksida (DMSO) digunakan untuk melarutkan Ekstrak Daun Calotropis gigantea (EDCG).  Konsentrasi  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  maksimal  1%  dalam  medium kultur.  0,025%    tripsin  dalam  medium  kultur  digunakan  untuk  memanen  sel.  Phosphate buffer saline (PBS) digunakan sebagai larutan penyangga pencuci . 3-(4,5-dimetiltiazole-2-il)- 2,5-difeniltetrazolium (MTT) digunakan sebagai reagen yang bereaksi dengan enzim suksinat dehidrogenase  pada  sel.  5  Fluorouracil,  Doxorubisin  sebagai  agen  kemoterapi dikombinasikan dengan EDCG.

## Alat
Alat  utama  yang  diperlukan  dalam  penelitian  ini  adalah  maserator,  evaporator,  sentrifuse ,tangki  nitrogen  cair,  CO 2 - Jacketed  Incubator ,  mikroskop  fase  kontras, Laminar  Air  Flow cabinet (Nuaire), Elisa reader .

## Metode Penelitian

## Ekstraksi
Dimasukkan  10  bagian  simplisia  (akar/daun)  dengan  derajat  halus  kedalam  sebuah  bejana, dituangi  dengan  75  bagian  cairan  penyari,  ditutup,  biarkan  selama  5  hari  terlindung  dari cahaya  sambil  sering  diaduk,  diserkai,  diperas,  ampas  dicuci  dengan  cairan  penyari secukupnya  hingga  diperoleh  100  bagian.  Dipindahkan  kedalam  bejana  tertutup,  dibiarkan ditempat  sejuk,  terlindung  dari  cahaya  selama  2  hari.  Di  enaptuangkan  dan  disaring.  Filtrat yang  diperoleh  dikumpulkan    lalu  diuapkan  dalam rotary  evaporator pada  suhu  50 o C. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian dikeringkan dan  didesikator vakum dan selanjutnya dialiri  gas  N2  untuk  menghilangkan  semua  sisa  pelarut  pada  ekstrak.  Ekstrak  etanol  dari bagian  daun Calotropis  gigantea disebut  EDCG,  Ekstrak  etanol  dari  bagian  akar Calotropis gigantea disebut EACG.

## Uji aktivitas sitotoksik metode MTT
Suspensi sel (kanker kolon WiDr, sel T47D, Sel NIH3T3) masing-masing sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 10 4 sel/100 µL media didistribusikan ke dalam sumuran- sumuran pada 96- well  plate dan  diinkubasikan  selama  24  jam.  Setelah  diinkubasi,  ke  dalam  sumuran dimasukkan  100  µL  larutan  uji  pada  berbagai  seri  konsentrasi.  Sebagai  kontrol  positif ditambahkan  100  µL  medium  kultur,  kemudian  100  µL  cisplatin  pada  berbagai  seri konsentrasi  ke  dalam  sumuran  yang  telah  berisi  100  µL  suspensi  sel.  Sebagai  kontrol  sel ditambahkan 100 µL medium kultur ke dalam sumuran yang berisi 100 µL suspensi sel dan sebagai  kontrol  pelarut  ditambahkan  100  µL  DMSO  ke  dalam  sumuran  yang  berisi  100  µL medium kultur dan 100 µL suspensi sel dengan delusi yang sesuai dengan delusi konsentrasi larutan uji, kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator dengan aliran 5% CO 2 dan 95% O 2 . Pada akhir inkubasi, media kultur dibuang lalu ditambahkan 10 µL larutan MTT (5 mg/mL PBS), dan medium diganti dengan 190 µL medium RPMI 1640 komplit. Kemudian sel  diinkubasi  selama  3-4  jam.  Reaksi  MTT  dihentikan  dengan  penambahan  reagen stopper SDS  (100  µL). Microplate kemudian  dibungkus  dengan tissue dan  diinkubasi  selama  1 malam  pada  suhu  kamar  dan  ruangan  gelap.  Sel  yang  hidup  bereaksi  dengan  MTT membentuk  warna  ungu.  Hasil  pengujian  dibaca  dengan  ELISA reader pada  panjang gelombang 595 nm [9].

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis hasil aktivitas antikanker EDCG dan EACG terhadap sel kanker kolon WiDr dan sel kanker payudara T47D
Tujuan  uji  aktivitas  antikanker  EDCG  dan  EACG  terhadap  sel  kanker  kolon  WiDr dan  sel  kanker  payudara  T47D  adalah  untuk  mengetahui  perbandingan  efektifitas  kedua ekstrak terhadap kedua sel yang berbeda. Dikarenakan efektifitas suatu bahan uji mempunyai efikasi yang berbeda terhadap jenis sel yang berbeda. Aktivitas antikanker EDCG dan EACG terhadap sel kanker kolon WIDr dan sel T47D disajikan pada gambar 1 dan gambar 2.
Gambar 1. Perbandingan efek penghambatan pertumbuhan sel akibat : A) perlakuan Ekstrak etanol  Daun Calotropis  gigantea (EDCG)  terhadap  sel  kanker  kolon  WiDr;    B)  perlakuan EDCG  terhadap  sel  kanker  payudara  T47D  dengan  metode  reduksi  MTT.  Sel  sebanyak  10 4 sel/sumuran  ditanam  dalam  96 well  plate, diinkubasi  selama  24  jam  dalam  media  RPMI komplit.  Data  merupakan  representasi  dari  3  (tiga)  eksperimen  yang  berbeda  dengan  hasil yang konsisten dan masing-masing eksperimen dilakukan dengan 3(tiga)x replikasi.
Pada  gambar  1  dapat  diketahui  bahwa  perlakuan  EDCG  terhadap  sel  kanker  kolon WiDr  menyebabkan  viabilitas  sel  kanker  semakin  menurun  dengan  peningkatan  dosis. Sedangkan  perlakuan  EDCG  terhadap  sel  kanker  payudara  T47D  menunjukkan  bahwa peningkatan dosis tidak berpengaruh terhadap viabilitas sel kanker.
Gambar 2. Perbandingan efek penghambatan pertumbuhan sel akibat : A) perlakuan Ekstrak etanol  Akar Calotropis  gigantea (EACG)  terhadap  sel  kanker  kolon  WiDr;    B)  perlakuan EACG  terhadap  sel  kanker  payudara  T47D  dengan  metode  reduksi  MTT.  Sel  sebanyak  10 4 sel/sumuran  ditanam  dalam  96 well  plate, diinkubasi  selama  24  jam  dalam  media  RPMI komplit.  Data  merupakan  representasi  dari  3  (tiga)  eksperimen  yang  berbeda  dengan  hasil yang konsisten dan masing-masing eksperimen dilakukan dengan 3(tiga)x replikasi.
Gambar  2  di  atas  menjelaskan  tentang  perbandingan  pengaruh  perlakuan  ekstrak  akar Calotropis gigantean (EACG) terhadap viabilitas sel kanker kolon WiDr dan sel T47D. pada gambar  A  dapat  diketahui  bahwa  pemberian  perlakuan  EDCG  terhadap  sel  kanker  kolon WiDr  dapat menurunkan viabilitas sel seiring dengan peningkatan dosis EDCG. Sedangkan pada  gambar  B  dapat  dijelaskan  bahwa  perlakuan  EACG  tidak  berpengaruh  terhadap viabilitas  sel  kanker  payudara  T47D  yang  dibuktikan  dengan  masih  tingginya  viabilitas  sel sampai dosis 100 µ g/ml.

## Hasil uji sitoksisitas EDCG dan EACG pada sel normal fibroblast NIH3T3
Hasil  uji  aktivitas  antikanker  EDCG  dan  EACG  pada  sel  kanker  kolon  WiDr menunjukkan  potensi  yang  cukup  tinggi  namun  terhadap  sel  kanker  payudara  T47D  tidak menunjukkan  adanya  aktivitas  antikanker.  Sebelum  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut mengenai  potensinya  sebagai  antikanker  perlu  dipastikan  terlebih  dahulu  efek  sitotoksiknya terhadap  sel  normal.  Efek  toksik  pada  sel  normal  menjadi  permasalahan  besar  pada  terapi kanker,  berupa  efek  samping  yang  dapat  menurunkan  kualitas  hidup  pasien.  Efek  toksisitas EDCG dan EACG di sajikan pada tabel di bawah ini:
Tabel  1.  Rata-rata  persen  viabilitas  sel  dan  nilai  IC 50 EDCG  dan  EACGterhadap  sel  normal fibroblast NIH3T3
N o Ekstrak Rata-rata % viabilitas sel NIH3T3 pada konsentrasi uji (µg/mL) IC 50 (µg/mL) 10 100 500 1000 2000 1 Ekstrak Etanol daun 86.0 57.2 47.3 34.1 7.6 203 2 Ekstrak Etanol Akar 75.4 44.3 27.1 6.6 1.6 60.8
Untuk  keperluan  uji  sitotoksisitas  pada  sel  normal  di  gunakan  sel  NIH3T3,  yang merupakan sel  fibroblast normal  dari embrio tikus. Pemberian perlakuan  EDCG dan EACG terhadap  sel  NIH3T3  menunjukkan  adanya  efek  penekanan  pertumbuhan  sel    mulai  dosis 100µg/ml.  Profil  pengaruh  perlakuan  EDCG  dan  EACG  terhadap  viabilitas  sel  normal NIH3T3 di sajikan pada gambar di bawah ini:
Gambar 3. Pengaruh perlakuan EDCG dan EACG terhadap pertumbuhan sel NiH3T3. Sel  sebanyak  10 4 sel/sumuran  ditanam  dalam  96 well  plate, diinkubasi  selama  24  jam.  Sel diberi  perlakuan  EDCG  dan  EACG  (10-2000  µg/mL)  dengan  waktu  inkubasi  24  jam. Viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT. Analisis t test dengan taraf kepercayaan 95% menunjukkan  konsentrasi  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  (10-1000  µg/mL)  tidak menyebabkan  penghambatan  pertumbuhan  sel  yang  signifikan.Data  merupakan  representasi dari  3  (tiga)  eksperimen  yang  berbeda  dengan  hasil  yang  konsisten  dan  masing-masing eksperimen dilakukan dengan 3(tiga)x replikasi.
Analisis  hasil Selectivity  Index (SI)  perlakuan  EDCG  dan  EACG  terhadap  sel  kanker kolon WiDr, Sel kanker T47D dan sel normal fibroblast NIH3T3
Tujuan  analisis  ini  adalah  untuk  mengetahui  apakah  pemberian  EDCG  dan  EACG bersifat selektif dalam membunuh sel target yaitu sel kanker kolon WiDr dan atau sel kanker payudara  T47D.  Suatu  bahan  uji  dikatakan  bersifat  selektif  hanya  membunuh  sel  target apabila  nilai Selectivity  Index (SI)  >3  [9].  Nilai Selectivity  Index (SI)  di  peroleh  dari
perbandingan  konsentrasi  yang  dapat  membunuh  50%  sel  normal  (CC 50 )  dibandingkan dengan konsentrasi yang dapat membunuh 50% sel kanker (IC 50 ). Tabel hasil perhitungan SI disajikan pada tabel 2 dibawah ini.
Tabel 2. Nilai Selectivity Index (SI) dari EDCG dan EACG terhadap sel kanker kolon WiDr dan sel T47D
Sampel IC 50 ±SD* Selectivity Index (SI) [CC 50 /IC 50 ]** Sel WiDr Sel T47D Sel NIH3T3 Sel WiDr Sel T47D EDCG 48.47±2.45 459.51±24.2 203.00±9.89 4.19 0.44 EACG 44.20±2.30 89.75±5.67 60.80±3.67 1.38 0.68 * Rata-rata IC50± standart deviasi, eksperimen dilakukan 3 kali replikasi ** Nilai indeks selektifitas (SI)=CC 50 /IC 50 , bahan uji bersifat selektif terhadap sel target jika SI > 3
Berdasarkan  data  penghitungan  indeks  selektifitas  pada  tabel  2  dapat  diketahui  bahwa yang memiliki nilai SI>3 adalah EDCG terhadap sel kanker kolon WiDr dengan nilai SI yaitu  4.19.  Sedangkan  EDCG  terhadap  sel  kanker  payudara  T47D,  EACG  terhadap  sel kanker  WiDr  dan  T47D  memiliki  nilai  SI<3.  Hal  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak etanol  daun Calotropis  gigantea (EDCG)  bersifat  selektif  dalam  menghambat pertumbuhan  sel  kanker  kolon  WiDr  namun  tidak  selektif  dalam  menghambat pertumbuhan  sel  kanker  payudara  T47D.  Sedangkan  EACG  tidak  selektif  dalam menghambat pertumbuhan sel kanker kolon WiDr dan sel kanker payudara T47D.

## KESIMPULAN
Ekstrak etanol daun Calotropis  gigantea (EDCG) dapat  mengahambat pertumbuhan sel kanker  kolon  WiDr  secara  selektif    (SI>3)  namun  tidak  selektif  dalam  menghambat pertumbuhan sel kanker payudara T47D (SI<3). Ekstrak etanol akar Calotropis gigantea (EACG) tidak selektif dalam menghambat pertumbuhan sel  kanker kolon  WiDr dan sel kanker payudara T47D (SI<3).

## UCAPAN TERIMAKASIH
Peneliti  mengucapkan  terimakasih  kepada  RistekDikti  atas  dana  hibah  PEKERTI  pada penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] American Cancer Society. Global Cancer Facts & Figures 3rd Edition . Am Cancer Soc. 2015;(800):1–64.
[2] Tjindrabumi D & Mangunkusumo R. 2002. Cancer In Indonesia, Present and Future . J pn.J.Clin.Oncol .32
[3] King  R.J.B.,2000. Cancer  Biology .  2 nd edition.  School  of  Biological  Science. University  of  Surrey.  Pearson  Education.  Harlow-England-London-New  York. hal.228-231,263-264
[4] Mardisiswojo  danRadjakmanugunsudarso  .  1968.  Cabe  Puyang  Warisan  Nenek Moyang.. p. 4–4.
[5] Wang  Z-N,  Wang  M-Y,  Mei  W-L,  Han  Z,  Dai  H-F.  2008.  A  new  cytotoxic pregnanone from Calotropis gigantea . Molecules. 13(12):3033–9.
[6] Mutiah,  R.,  Griana,  T.P.,  et  al.,  2016a.  The  Effect  of  Calotropis  gigantea  Leaves Extract  on  Fibrosarcoma  Growth  and  Caspase  3  Expression  .Interational  Journal Phamaceutical and Clinial Research, 8(3), pp.167–171.
[7] Mutiah,  R.,  Sukardiman.,  Widyawaruyanti,  A.,  Zulaikah,  S.,  2016b.  Comparison  of Ethanol Extract from Roots Leaves and Flowers of  Calotropis gigantea as Anticancer on T47D Breast Cancer Cell Lines. Alchemy; 5(1):1–4.
[8] Mutiah R., Widyawaruyanti A., Sukardiman S. 2017. Cytotoxic effect of crude extract and fraction from Calotropis gigantea leaves on human colon cancer widr cell lines.International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences (IJPPS), 9 (1). pp. 83-86.
[9] Mutiah  R.  (2014).  Pengembangan  Fitofarmaka  Antikanker  “  Panduan  Teknik Pengembangan  Obat  Herbal  Indonesia Menjadi  Fitofarmaka.Uin Maliki  Press.ISBN: 978-602-1190-26-5.pp 50-70