Antioxidant Activity of Flavonoid from Rhizome Kaemferia galanga L.

## Extract

## Elok Kamilah Hayati, Rachmawati Ningsih, Latifah
Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang
Email: eloksunardji@yahoo.com

## Abstract
Kaemferia galanga L. rhizome is a traditional crop which is widely used for herbal medicine.  This research is started from the extraction of maceration using ethanol 80% and partition with chloroform:water. 80 % ethanol extract  and  chloroform  fraction  tested  antioxidant  activity  with  DPPH  ( 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) , phytochemicals  with  reagents,  separation  of  the  active  compound  by  TLC  ( thin  layer  chromatography) analytical  and  preparative  TLC,  the  identification  of  compounds  with  sliding  reagent  using  UV-Vis.  The  test results on the antioxidant activity of 80% ethanol extract of 64,93% (100 ppm) and chloroform fraction of 54,9 % (100 ppm) with indigo IC50 of 13,07 mg/mL and 81,9 mg mL. 80 % ethanol extract and chloroform fraction has  potential  as  a  source  of  natural  antioxidants.  Phytochemical  test  showed  80%  ethanol  extract  contains flavonoids, alkaloids and tannins. At the chloroform fraction extract containing flavonoids. The separation of the active compounds with analytical TLC using eluent PE: ethyl acetate (5: 1) resulted in 7 stain (Rf 0,06 to 0,96) and preparative TLC produce 8 spots (Rf  from 0,19 to 0,83). Results from UV-Vis spectrum can be presumed that  such  a  class  of  flavonoid  compounds  flavanones  or  dihidroflavonol.  It  can  be  seen  from  the  wavelength range  210-285  nm  in  the  bands  I  and  300-550  nm  in  band  II.  The  addition  of  the  reagent  slide  showed  the presence of hydroxyl groups in ring A, B and C and O-hydroxy on ring A.
Keywords : antioxidant activity, Kaemferia galanga rizhome, sliding reagent, Thin Layer Chromatography , 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl

## Abstrak
Kencur  merupakan  tanaman  tradisional  yang  banyak  dimanfaatkan  sebagai    obat  alami.  Penelitian  ini diawali dengan ekstraksi maserasi menggunakan pelarut etanol 80 % dan partisi dengan kloroform:air. Ekstrak etanol  80  %  dan  fraksi  kloroform  dilakukan  uji  aktivitas  antioksidan  dengan  DPPH,  fitokimia  dengan reagen, pemisahan senyawa aktif dengan KLT analitik dan KLT preparatif, identifikasi senyawa dengan pereaksi geser menggunakan UV-Vis. Hasil uji aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol 80 % sebesar 64,93 % (100 ppm) dan fraksi kloroform 54,9 % (100 ppm) dengan nila IC 50 sebesar 13,07 mg/mL dan 81,9 mg/mL. Ekstrak etanol 80 % dan fraksi kloroform mempunyai potensi sebagai sumber antioksidan alami. Uji fitokimia menunjukkan ekstrak etanol  80  %  mengandung  senyawa  flavonoid,  alkaloid  dan  tanin.  Pada  ekstrak  fraksi  kloroform  mengandung senyawa  flavonoid.  Pemisahan  senyawa  aktif  dengan  KLT  analitik  menggunakan  eluen  PE:etil  asetat  (5:1) menghasilkan  7  noda  (Rf  0,06-0,96)  dan  KLT  preparatif    menghasilkan  8  noda  (Rf  0,19-0,83).    Hasil  dari spektrum  UV-Vis  dapat  diduga  bahwa  senyawa  flavonoid  tersebut  merupakan  golongan  flavanon  atau dihidroflavonol. Hal ini dapat dilihat dari rentang panjang gelombang 210 - 285 nm pada pita I dan 300 - 550 nm pada  pita  II.  Penambahan  pereaksi  geser  menujukkan  adanya  gugus  hidroksi  pada  cincin  A,  B  dan  C  dan  O- hidroksi pada cincin A.
Kata kunci :  aktivitas antioksidan, Kaemferia galanga L . , pereaksi geser, kromatografi lapis tipis , 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl

## 1. Pendahuluan
Indonesia  dikenal  dengan  kekayaan sumber daya alamnya yang melimpah, salah satunya  yaitu  memiliki  aneka  ragam tumbuhan  yang  digunakan  sebagai  obat tradisional.  Salah  satu  tumbuhan  yang
memiliki  potensi  sebagai  obat  yaitu rimpang  kencur (Kaemferia  galanga L ) Wijayakusuma,  2008).  Rimpang  kencur sudah  dikenal  luas  di  masyarakat  baik sebagai  bumbu  makanan  atau  untuk pengobatan diantaranya adalah batuk, mual,
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 127-137
bengkak,  bisul  dan  antitoksin  seperti keracunan  tempe  bongkrek  dan  jamur. Selain  itu,  berkhasiat  untuk  menambah daya  tahan  tubuh,  menghilangkan  masuk angin, dan kelelahan (Gholib, 2009).
Rimpang kencur mengandung beberapa  senyawa  aktif.  Hasil  penelitian Hasanah  (2011)  menginformasikan  bahwa hasil  skrining  fitokimia  ekstrak  etanol rimpang  kencur  terdeteksi  mengandung senyawa flavonoid, polifenol, tanin, kuinon, dan seskuiterpen.
Flavonoid  merupakan  salah  satu kelompok  senyawa  metabolit  sekunder yang  paling  banyak  ditemukan  di  dalam jaringan  tanaman.  Flavonoid  berperan sebagai antioksidan
dengan
cara mendonasikan  atom  hidrogennya  atau melalui  kemampuannya  mengkelat  logam, berada dalam bentuk glukosida (mengandung  rantai  samping  glukosa)  atau dalam  bentuk  bebas  yang  disebut  aglikon (Cuppett, 1954).
Metode  yang  sering  digunakan  dalam pengujian  antioksidan  adalah  DPPH  yang merupakan  radikal    bebas  yang  stabil. Parameter yang digunakan untuk mengetahui  aktivitas  antioksidan  ialah  IC 50 (konsentrasi  substrat  untuk  menghasilkan 50%  reduksi  dari  DPPH)  (Molyneux, 2003).
Eluen-eluen  yang  digunakan  untuk memisahkan  senyawa  flavonoid  adalah metanol-kloroform (1:39) dan (1:9)
(Milyasari,  2011)  menghasilkan  bercak lembayung  gelap,  petroleum  eter-etil  asetat (5:1)  menghasilkan  bercak  coklat-merah dan kloroform-metanol-air (9,7:0,2:0,1) (Fitriani, 2011).
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan dugaan  senyawa  flavonoid  yang  terdapat pada  ekstrak  rimpang  kencur.  Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah dan sebagai studi pendahuluan  potensi  senyawa  flavonoid
yang  terkandung  dalam  kencur Kaemferia galanga L .

## 2. Metodologi Penelitian
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian ini terdiri dari  serbuk rimpang kencur  yang berasal  dari  Materia  Medika  Batu.  Bahan kimia  etanol  p.a,  HCl  2  %,  kloroform, NaOH,  asam  asetat  glasial,  petroleum  eter, n-butanol,  aquades,  H 2 SO 4, larutan  FeCl 3 , reagen Dragendrofff, reagen Meyer, pereaksi  Lieberman  Burchard,  DPPH, vitamin  C,  logam  Mg,    asam  asetat anhidrat, amonia dan plat KLT Gel 60 F 254 . Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini adalah spektronik 20+ dan UV-vis.

## 2.1 Preparasi sampel
Sampel  rimpang  kencur  dicuci  hingga bersih,  lalu  dikering  anginkan  kemudian sampel  dipotong  kecil-kecil.  Setelah  itu, sampel  kering  dihaluskan  dengan  blender hingga  halus dan diayak dengan ayakan 90 mesh.

## 2.2  Ekstraksi maserasi
Serbuk rimpang kencur ditimbang sebanyak 60  gram.  Kemudian  dilarutkan  dengan pelarut  etanol  80  %  sebanyak  180  mL. Maserasi dilakukan selama 24 jam, kemudian  di shaker selama  3  jam  dengan kecepatan 120 rpm, kemudian disaring dan ampas  yang  diperoleh  dimaserasi  kembali dengan  pelarut  yang  sama  dan  dilakukan sebanyak  3  kali  pengulangan  sampai filtratnya  berwarna  bening.  Selanjutnya disaring dan filtratnya dipekatkan menggunakan rotary evaporator vaccum . Ekstrak  pekat  sebanyak  2,5  gram  yang diperoleh  selanjutnya  dihidrolisis  dengan HCl  2  N  sebanyak  5  mL  kemudian dihomogenkan  selama  1  jam,  lalu  dipartisi dengan  pelarut  air  :  kloroform  (1:1) sehingga  terbentuk  2  lapisan,  lapisan  atas (fase  air)  dan  lapisan  bawah  (fase
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 127-137
kloroform)  dan  partisi  dilakukan  secara bertahap (3 × 12,5 mL). Senyawa flavonoid diasumsikan  berada  pada  lapisan  bawah (fase  organik),  Fase  organik  kemudian dipekatkan  dengan rotary  evaporator . Ekstrak flavonoid dapat dihitung randemennya menggunakan rumus berikut:
% Rendemen =     Berat ekstrak   x 100   (1)
Berat sampel 2.3  Penentuan Panjang Gelombang

## Maksimum
Larutan  DPPH  0,2  mM  sebanyak  1,5  mL dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi, ditambah  4,5  mL  etanol  p.a.  kemudian diinkubasi pada suhu 37  °C dan didiamkan selama  ±  30  menit,  dimasukkan  ke  dalam kuvet. Diamati  λ maks larutan untuk digunakan pada tahap selanjutnya.
2.4  Penentuan Waktu Kestabilan

## Pengukuran Antioksidan
Dibuat  larutan  ekstrak  100  ppm  sebanyak 25  mL,  kemudian  diambil  sebanyak  4,5 mL.  Ditambahkan  0,2  mM  larutan  DPPH sebanyak 1,5 mL, lalu diinkubasi pada suhu 37 O C.  Larutan  yang  diperoleh  dipipet  ke dalam  kuvet,  kemudian  dicari  waktu kestabilan  pada  rentangan  waktu  5-120 menit  dengan  interval  5  menit.  Sampel diukur  menggunakan  spektronik  20+  pada λ maks yang  telah  diketahui  pada  tahap sebelumnya (Suroso, 2011).
2.5  Pengukuran Potensi Antioksidan pada Sampel
a. Absorbansi  kontrol:  1,5  mL  larutan
DPPH  dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi, ditambahkan etanol p.a sebanyak  4,5  mL,  kemudian  ditutup tabung  reaksi  dengan  aluminium  foil, lalu diinkubasi pada suhu 37 O C selama waktu kestabilan yang telah didapatkan
pada  tahap  sebelumnya,  setelah  itu larutan  dimasukkan  ke  dalam  kuvet hingga penuh dan diukur absorbansinya dengan λ maks yang didapatkan.
b. Sampel  dilarutkan  dalam  etanol  p.a dengan konsentrasi 10, 25, 50 dan 100 ppm.  Tabung  reaksi  disiapkan  untuk masing-masing  konsentrasi,  kemudian tiap-tiap tabung reaksi diisi dengan 4,5 mL  ekstrak  dan  ditambahkan  DPPH 1,5  mL  (1:3).  Perlakuan  tersebut diulangi  hingga  tiga  kali  pada  tiap konsentrasi.  Sampel  diinkubasi  pada suhu 37°C kemudian diukur absorbansinya  pada  λ maks. Data absorbansi  yang  diperoleh  dari  tiap konsentrasi masing-masing ekstrak dihitung  nilai  persen  (%)  aktivitas antioksidannya (Rizkia, 2014):
c. Pembanding vitamin C dilakukan seperti  sampel,  akan  tetapi  sampel diganti dengan larutan vitamin C.

## 2.6 Uji fitokimia flavonoid
Ekstrak pekat masing-masing sampel dimasukkan dalam tabung reaksi  kemudian dilarutkan dalam   1 – 2 mL metanol panas 50  %.  Setelah  itu  ditambah  logam  Mg  dan 0,5 mL HCl pekat. Larutan berwarna merah atau  jingga  yang  terbentuk,  menunjukkan adanya  flavonoid.  Hasil  uji  pereaksi  ini selanjutnya  digunakan    pada    tahap pemisahan  senyawa  aktif    dengan    KLT analitik  untuk  mengidentifikasi  golongan flavonoid.
100 x kontrol Abs sampel Abs - kontrol Abs = n Antioksida Aktivitas % (2)
Setelah  didapatkan  persen  (%)  aktivitas antioksidan,  selanjutnya  masing-masing ekstrak  dihitung  nilai  IC 50 dengan memperoleh persamaan regresi menggunakan program “ GraphPad prism5 software, Regression for analyzing dose-response data”.
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 127-137

## 2.7 Uji fitokimia Alkaloid
Ekstrak pekat masing-masing sampel dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambah
0,5  mL  HCl  2  %  dan  larutan  dibagi  dalam dua  tabung.  Tabung  I  ditambahkan  3  tetes pereaksi Dragendorff, tabung
II
ditambahkan   3 tetes  pereaksi Meyer. Jika tabung  I  terbentuk  endapan    jingga    dan pada    tabung  II  terbentuk  endapan kekuning-kuningan
atau putih, menunjukkan  adanya  alkaloid.
2.8 Uji Fitokima Tanin Ekstrak pekat masing-masing sampel dimasukkan    kedalam  tabung  reaksi, kemudian    ditambahkan    dengan    2-3  tetes larutan    FeCl 3 1    %.  Jika    larutan menghasilkan warna hijau kehitaman menunjukkan adanya senyawa tanin.

## 2.9 Uji Fitokima Saponin
Ekstrak pekat masing-masing sampel dalam tabung  reaksi  ditambah  air  (1:1)  sambil dikocok selama 1 menit, apabila menimbulkan  busa  ditambahkan  2  tetes HCl  1  N  dan  dibiarkan  selama  10  menit, bila  busa  yang  terbentuk  bisa  tetap  stabil maka ekstrak positif mengandung saponin.

## 2.10  Uji  Fitokima  Triterpenoid  dan Steroid
Ekstrak pekat masing-masing sampel dimasukkan dalam tabung reaksi,
dilarutkan    dalam  0,5    mL  kloroform  lalu ditambah  dengan  0,5  mL  asam  asetat anhidrat. Campuran ini selanjutnya ditambah  dengan  1  -  2  mL  H 2 SO 4 pekat melalui  dinding  tabung  tersebut.  Jika  hasil yang  diperoleh    berupa  cincin    kecoklatan atau    violet  pada    perbatasan    dua  pelarut menunjukkan    adanya    triterpenoid, sedangkan  jika  terbentuk  warna  hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid.

## 2.11 Pemisahan Flavonoid
Pemisahan dengan KLT Analitik menggunakan  plat  G 60 F 254 1x10  cm  yang telah  diaktifkan  dengan  pemanasanpada suhu  100 o C  selama  30  menit.  Ekstrak flavonoid  ditotolkan  pada  jarak  1  cm  dari tepi  bawah  plat  dandikeringkan  kemudian dielusi  dengan  jarak  8  cm.  Eluen  yang digunakan adalah metanol-kloroform (1:39) dan  (1:9),  PE-etil  asetat  (5:1)  dan kloroform-metanol-air (9,7:0,2:0,1). Setelah gerakan  larutan  pengembang  sampai  pada garis batas, elusi dihentikan . Plat hasil elusi dikeringkan,  noda  yang  terbentuk  diamati dengan lampu  UV  pada  gelombang maksimum  254  nm  dan  366  nm  dan dihitung  nilai  Rf.  Eluen  yang  terbaik digunakan untuk pemisahan KLT preparatif.
penotolan dari eluen rambat Jarak senyawa rambat Jarak = Rf (3)
Pemisahan  dengan  KLT  preparatif  sama dengan  KLT  Analitik,  akan  tetapi  ukuran Platnya  lebih  besar  yaitu  10  cm  x  20  cm dan  dielusi  menggunakan  eluen    yang memberikan  pemisahan  terbaik  pada  KLT analitik.  Isolat  yang  menunjukkan  positif senyawa flavonoid dikerok. Isolat dilarutkan dalam etanol p.a dan disentrifuge untuk  mengendapkan  silikanya,  kemudian disaring dan diambil filtratnya.
2.12  Identifikasi Flavonoid menggunakan Spektrofotometer UV-Vis dan Pereaksi Geser
Filtrat  yang  diperoleh  dari  hasil  KLT preparatif dianalisis menggunakan spektrofotometer  UV-Vis,  masing-masing filtrat  sebanyak  3  mL  dimasukkan  dalam kuvet  dan  diamati  spektrumnya  pada panjang  gelombang  200  –  800  nm.
Identifikasi dilanjutkan dengan
penambahan  pereaksi  geser  NaOH  2  M,
AlCl 3 5  %,  AlCl 3 5  %/HCl,  NaOAc,
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 127-137
NaOAc/H 3 BO 3 , kemudian diamati pergeseran  puncak  serapannya,  tahapan kerja penggunaan pereaksi geser meliputi:
1. Isolat diamati pada panjang gelombang 200  –  800  nm,  dicatat  spektrum  yang dihasilkan.
2. Isolat  dari  tahap  1  ditambah  dengan  3 tetes  NaOH  2  M,  dikocok  hingga homogen  dan  diamati  spektrum  yang dihasilkan. Sampel didiamkan selama 5 menit  dan  diamati  spektrum  yang dihasilkan.
3. Isolat  dari  tahap  1ditambah  6  tetes pereaksi  AlCl 3 5  %  dalam  metanol, kemudian  dicampur  hingga  homogen dan  diamati  spektrumnya.  Sampel ditambah  3  tetes  HCl  kemudian dicampur hingga homogen dan diamati spektrumnya.
4. Isolat  dari  tahap  1  ditambah  serbuk natrium  asetat  ±  250  mg.  Campuran dikocok hingga homogen menggunakan  vorteks  dan  diamati spektrumnya, selanjutnya larutan tersebut  ditambah  asam  borat  ±  150 mg,  dikocok  hingga  homogen  dan diamati spektrumnya.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1  Preparasi Sampel.
Pengeringan dilakukan dengan cara diangin-anginkan  pada  suhu  ruang,  hal  ini berfungsi  mengurangi  kadar  air  untuk menghindari tumbuhnya  mikroba, sehingga sampel  tidak  mudah  rusak.  Pengeringan sampel  pada  suhu  ruang  berfungsi  untuk menghindari  rusaknya  senyawa  aktif  yang terkandung dalam sampel. Menurt Hernawan,  2003  pengeringan  sebaiknya dilakukan pada suhu kamar atau kurang dari 40  °C,  pada  suhu  lebih  dari  40  °C  dapat terjadi  penurunan  kadar  dan  ekstrabilitas flavonoid  secara  drastis.  Tahap  selanjutnya yakni  penyerbukan  sampel  yang  berfungsi untuk  menyeragamkan  ukuran  sampel dengan  ukuran  90  mesh  dan  memperluas
permukaan,  sehingga  diharapkan  proses ekstraksi  lebih  maksimal  karena  kontak antara sampel dengan pelarut lebih maksimal.
Proses  ekstraksi  serbuk  rimpang kencur  menggunakan  metode  maserasi. Prinsipnya  adalah  mengekstrak  senyawa aktif  yang  dapat  larut  dalam  pelarut berdasarkan  tingkat  kepolaran  masing- masing  pelarutnya like  dissolves  like (Khopkar,  2008).  Metode  ini  didasarkan pada  perendaman  sampel  didalam  pelarut sehingga  pelarut  akan  menembus  dinding sel  dan  masuk  ke  dalam  rongga  sel  yang mengandung  senyawa  aktif.  Senyawa  aktif akan larut dalam pelarut yang sesuai karena adanya  perbedaan  konsentrasi  antara  zat aktif  di  dalam  sel  dan  di  luar  sel,  sehingga larutan  yang  berdekatan  terdesak  keluar. Peristiwa  tersebut  akan  berlangsung  terus- menerus  sampai  terjadi  keseimbangan konsentrasi  antara  larutan  yang  di  luar dengan  yang  ada  di  dalam  sel  (Voight, 1995).
Pemilihan  pelarut  etanol  80  % karena  memiliki  nilai  kepolaran  yang  lebih tinggi  daripada  etanol  p.a  sehingga  dapat mengekstrak sampel dengan lebih
maksimak. Selain itu, karena sifat ketoksikan  yang  rendah  daripada  pelarut alkohol lainnya (Guenther, 2006).
Filtrat  hasil  maserasi  di rotary vacuum evaporator yaitu proses pemisahan ekstrak  dari  pelarut  dengan  pemanasan yang  diatur  dengan  mempercepat putaran dari labu alas bulat .  Pelarut dapat menguap pada suhu  5 ̶ 10  ºC  dibawah  titik  didihnya karena  adanya  penurunan  tekanan  (Sudjaji, 1988).  Ekstrak  pekat  yang  dihasilkan sebanyak 5 gram dengan warna hijau pekat. Selanjutnya, dihidrolisis menggunakan HCl 2N  untuk  mempercepat  pemutusan  ikatan glikosida  antara  senyawa  glikon  (gula)  dan aglikon (bukan gula).
Hasil  partisi  menghasilkan  2  lapisan  yaitu lapisan  air  dan  lapisan  organik.  Komponen
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 127-137
glikon terdistribusi pada fase air sedangkan senyawa  metabolit  sekunder  (aglikon) terdistribusi  pada  fase  organik.  Flavonoid terkandung  dalam  fasa  organik  karena memiliki  kepolaran  yang  sesuai.  senyawa- senyawa  yang  memiliki  kepolaran  berbeda dapat  terekstrak  kedalam  pelarut  yang sesuai  (Voight,  1994).  Fasa  organik dipekatkan  menggunakan vacuum  rotary evaporator untuk menghilangkan pelarutnya  sehingga  diperoleh  ekstrak flavonoid.
3.2  Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Panjang  gelombang  maksimal  DPPH  0,2 mM adalah 515,1 nm.

## 3.3  Penentuan
Waktu

## Kestabilan Pengukuran Antioksidan
Penentuan  waktu  kestabilan  berfungsi mengetahui waktu  yang dibutuhkan  sampel untuk  mereduksi  radikal  DPPH  dengan sempurna  dan  memiliki  absorbansi  yang stabil.
Tabel 1. Waktu kestabilan sampel Sampel Waktu kestabilan (menit) Ekstrak etanol 80% 60 – 70 Fraksi kloroform 75 – 85 Vitamin C 50 – 60 Masing-masing  sampel  diinkubasi pada suhu 37 °C selama pengukuran waktu kestabilan. Pada suhu ini reaksi berlangsung  lebih  cepat  dan  optimal. Suroso (2007) membandingkan pengukuran waktu  kestabilan  DPPH  dari  sampel  yang diinkubasi  dengan  suhu  ruang  dan  pada suhu  37    °C  didapatkan  hasil  bahwa  pada suhu  37    °C  reaksi  DPPH  dengan  sampel lebih  stabil  yang  ditandai  dengan  nilai absorbansi  yang  tidak  jauh  berbeda  pada menit ke 30-55.

## 3.4 Uji Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan pada sampel  dilakukan  pada  panjang  gelombang 515.1 nm selama waktu kestabilan sebagaimana DPPH berperan sebagai radikal bebas  akan bereaksi  dengan antioksidan  membentuk  DPPH-H  ( 1,1- difenil-2-pikrilhidrazin ).  Antioksidan  akan mendonorkan  atom  hidrogennya  kepada radikal  DPPH  untuk  menetralkan  radikal DPPH  dan  membentuk  radikal  antioksidan yang lebih stabil.
DPPH* + AH          DPPH-H + A* Larutan kontrol berfungsi untuk
mengetahui absorbansi radikal  DPPH
sebelum  direduksi  oleh  sampel.  Selisih absorbansi  sampel  yang  telah  direduksi DPPH dengan
absorbansi kontrol merupakan sisa radikal DPPH  yang terbaca pada  spektrofotometer  UV-Vis.  Semakin besar  selisihnya  semakin  besar  aktivitas antioksidan sampel.
Tabel 2. Persentase aktivitas antioksidan
Konsentrasi sampel (ppm) % Aktivitas antioksidan Ekstrak etanol 80% Fraksi klorofor m Vitamin C 10 49 33 95 25 53,53 39,2 96 50 57,78 42,5 97 75 60,19 47,8 97 100 64,93 54,9 97
Persen (%) aktivitas antioksidan merupakan salah  satu  parameter  yang  menunjukkan kemampuan suatu antioksidan dalam menghambat  radikal  bebas.  Semakin  tinggi persen (%) aktivitas
antioksidan menunjukkan  banyaknya  atom  hidrogen yang  diberikan  oleh  senyawa  aktif    kepada radikal  DPPH  sehingga  DPPH  tereduksi menjadi  DPPH-H  (Rahayu  dkk,  2010).
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 127-137
Persentase  aktivitas  antioksidan  tertinggi terdapat  pada  vitamin  C  diikuti  ekstrak etanol  80%,  dan  ekstrak  fraksi  kloroform. Pada ekstrak etanol 80% selain mengandung senyawa flavonoid juga terdapat  senyawa  alkaloid  dan  tannin  yang bersifat sinergis sehingga, persen aktivitasnya lebih besar dibandingkan fraksi kloroform.
Parameter  lain  yang  digunakan  untuk mengetahui kekuatan antioksidan ialah IC 50 (Inhibition  Concentration  50  Value).  IC 50 merupakan  konsentrasi  substrat  yang  dapat menyebabkan  berkurangnya  50  %  aktivitas DPPH (Molyneux, 2003).
Tabe 3. Nilai IC 50 sampel
Sampel Nilai IC 50 ( μ g/mL) Ekstrak etanol 80% 13,07 Fraksi kloroform 81,09 Vitamin C 0,04 Semakin kecil nilai IC 50 menandakan semakin besar aktivitas antioksidan  sehingga  konsentrasi  yang dibutuhkan  untuk  meredam  radikal  DPPH sebesar  50  %  semakin  kecil.  Vitamin  C memiliki  aktivitas  antioksidan  tertinggi, kemudian  diikuti  ekstrak  etanol  80%  dan ekstrak fraksi kloroform. Hal ini disebabkan oleh kestabilan struktur vitamin C  yang  dapat  mendonorkan  dua  atom hidrogennya. Vitamin  C dan ekstrak etanol 80%  memiliki  nilai  IC 50 <  50  ppm  dan termasuk  dalam  kategori  sangat  kuat aktivitasnya,  sedangkan  nilai  IC 50 ekstrak fraksi  kloroform  berada  dalam  rentang  50- 100  ppm,  hal  ini  menunjukkan  bahwa ekstrak  fraksi  kloroform  memiliki  aktivitas antioksidan yang kuat.
Kuatnya    aktivitas  antioksidan ekstrak  etanol  80%  bisa  dipengaruhi  oleh kestabilan  struktur  dan  posisi  gugus hidroksil  pada  ketiga  senyawa  yang terdapat  pada  ekstrak  etanol  80%.  Menurut Winarno,  2008  posisi  orto  gugus  OH  pada suatu  senyawa  merupakan  posisi  yang paling  bagus  untuk  antioksidan.  Flavonoid mendonorkan  atom  H  sebagai  peredam radikal  DPPH,  sehingga  terjadi  penstabilan radikal flavonoid dengan adanya resonansi.

## 3.5 Uji Fitokimia dengan Reagen
Uji    kualitatif  untuk  mengetahui  senyawa aktif  yang  terkandung  dalam  tanaman. Adanya  reaksi  pengujian  warna  dengan suatu  reaksi  warna  (Kristanti,  2008).  Uji fitokimia  reagen  dilakukan  pada  ekstrak etanol  80  %  rimpang  kencur  dan  ekstrak pekat  hasil  partisi  yaitu  fraksi  kloroform. Berikut ini hasil pengujian fitokimia reagen dapat dilihat pada Tabel 4:
Tabel 4. H asil uji fitokimia rimpang kencur
Golongan senyawa aktif Ekstrak Keterangan Hasil Positif Etanol 80% Fraksi kloroform Flavonoid + + Berwarna jingga Alkaloid Mayer + - Endapan jingga Dragendroff + - Endapan kuning Tanin + - Berwarna hijau kehitaman Saponin - - Tidak ada busa atau gelembung Triterpenoid - - Tidak terbentuk cincin coklat
Keterangan:               +  = Positif mengandung senyawa -  = Tidak terkandung senyawa
Hasil  uji  fitokimia  dengan  reagen menunjukkan  bahwa  pada  ekstrak  etanol
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 127-137
80% dan fraksi kloroform positif mengandung  senyawa  flavonoid  yang ditandai dengan adanya warna jingga.
Selain  itu,  pada  ekstrak  etanol  80% positif  mengandung senyawa alkaloid  yang ditandai  dengan  terjadi  perubahan  warna ekstrak  dari  kuning  kehijauan  menjadi oranye  dengan  endapan  jingga  setelah diberi pereaksi Dragendorf, sedangkan pada uji  Mayer didapatkan endapan kekuningan- kuningan.  Positif  mengandung  tannin  yang ditandai  dengan  terbentuknya  warna  hijau kehitaman pada ekstrak setelah ditambahkan  dengan  FeCl 3 disebabkan karena  tanin  akan  membentuk  senyawa kompleks dengan ion Fe 3+ (Effendy, 2007).
3.6  Pemisahan senyawa flavonoid
dengan KLT analitik
KLT  analitik  ini  digunakan  untuk  mencari eluen terbaik dari beberapa eluen yang baik dalam pemisahan senyawa flavonoid. Eluen yang  baik  adalah  eluen  yang  menghasilkan senyawa  dalam  jumlah  yang  banyak ditandai  dengan  munculnya  noda.  Noda yang  terbentuk  tidak  berekor  dan  jarak antara  noda  satu  dengan  yang  lainnya  jelas (Harborne, 1987).
KLT  yang  digunakan  terbuat  dari silika  dengan  ukuran  1  ×  10  cm  G 60 F 254 (Merck). Pemisahan KLT akan optimal jika ukuran  bercak  penotolan  dibuat  sekecil mungkin.  Penotolan  sampel  yang  tidak tepat  akan  menyebabkan  noda  yang menyebar  dan  puncak  ganda  (Gandjar, 2007).
Tabel 5. Pemisahan flavonoid dengan KLTA
No.
Eluen Jumlah noda 1. PE:etil asetat (5:1) 7 2. PE:etil asetat (19:1) 5 3. PE:kloroform (1:9) 5 4. Metanol:kloroform (1:19) 1
Tabel 5 menunjukkan variasi pelarut PE: etil aseta (5:1) merupakan eluen terbaik yang mampu memberikan pemisahan terbaik dibandingkan dengan eluen lainnya. Eluen  ini  mampu  memisah  7  noda  dan menunjukkan  adanya  flavonoid  setelah diamati  bawah  lampu UV 254 dan 366  nm dengan  pereaksi  FeCl 3 2  %.  Nilai  Rf masing-masing  noda  pada  eluen  terbaik  ini adalah  0,06,  0,19,  0,6,  0,7,  0,85,  0,91  dan 0,96.  Rf  yang  lebih  besar  menunjukkan senyawa  cenderung  lebih  terdistribusi  pada fase  geraknya  (PE:etil  asetat)  yang  bersifat kurang.  Sehingga,  proses  migrasi  solut berlangsung lebih cepat.

## 3.7  Pemisahan  Senyawa  Tanin  dengan KLT Preparatif
Eluen  yang  digunakan  merupakan  eluen terbaik pada pemisahan KLTA yaitu PE:etil asetat (5:1).
Pemisahan  flavonoid  menggunakan  KLTP menghasilkan  8  spot.  Perbedaan  jumlah noda  pada  pemisahan  KLTA  dan  KLTP dimungkinkan  karena  pemisahan  senyawa pada  KLTA  kurang  maksimal  dilihat  dari ukuran  plat  pada  KLTA  yaitu  1x10 sedangkan  pada  KLTP  10x20  dan  prosen penjenuhan dari keduanya sehingga, proses elusinya lebih maksimal pada KLTP.
3.8  Identifikasi senyawa flavonoid
dengan  spektrofotometer  UV-Vis dan pereaksi  geser Spektrofotometer UV-Vis merupakan metode  yang  berguna  untuk  menganalisis dugaan awal struktur flavonoid. Metode ini membantu  mengidentifikasi  jenis  senyawa polifenol dan pola oksigenasinya.
Kedudukan  gugus  hidroksi  fenol  pada  inti flavonoid dapat ditentukan dengan menambahkan  pereaksi  geser  (Markham, 1988).  Serapan  khas  senyawa  flavonoid pada UV-Vis mempunyai dua pita. Panjang gelombang pada pita I antara 300 - 550 nm,
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 127-137
Sedangkan pada pita II mempunyai panjang gelombang antara 210 - 285 nm. Isolat hasil KLTP  yang  diidentifikasi  pada  penelitian ini  adalah  isolat  6,  7  dan  8  dan  dilarutkan dalam etanol.
Tabel 6. Hasil pemisahan dengan KLTP Spot Nilai Rf Warna noda dibawah sinar UV 366 nm Dugaan senyawa 1 0,19 Kuning - 2 0,24 Hijau Flavonoid 3 0,39 Merah muda - 4 0,53 Kuning - 5 0,58 Merah muda - 6 0,69 Oranye Flavonoid 7 0,72 Hijau Flavonoid Tabel 7. Data spektrum isolat 6, 7 dan 8
Isolat Panjang gelombang maksimum (nm) dengan penambahan pereaksi geser EtOH EtOH + NaOH EtOH + NaOH 5 menit EtOH + AlCl 3 EtOH + AlCl 3 /HCl EtOH + NaOAc
EtOH +
NaOAc/H 3 BO 3 6 291,1 285,0 289,0 292,9 292,0 291,1 284,9 7 308,0 217,7 307,0 216,0 308,0 219,0 308,0 - 309,1 - 307,0 217,0 302,0 220,0 8 280,0 280,1 281,8 281,8 282,6 280,0 282,9
Dari  data  spektrum  di    atas diasumsikan    senyawa  flavonoid    yang mungkin    dari  hasil    KLT  preparatif dibawah  sinar  UV  366  nm  adalah  isolat 7.  Hal    ini  dikarenakan    isolat  7    tersebut setelah ditambahkan pereaksi geser memiliki    2    panjang    gelombang maksimum    pada  daerah    210  -  285    nm (pita  II)  dan  300 - 550  nm  (pita  I).
Isolat    yang    lain  diduga  bukan merupakan    senyawa    flavonoid    karena setelah    ditambahkan    pereaksi    geser    ada yang  memiliki    satu    panjang    gelombang maksimum    dan    panjang    gelombang maksimum  pada  pita  I  dan  pita  II  tidak sesuai  dengan  data  literatur.  Sehingga diperkirakan
isolat-isolat tersebut dimungkinkan merupakan senyawa polifenol yang lain. Penambahan  pereaksi  geser  NaOH
menyebabkan terjadinya pergeseran batokromik  sebesar  1,5  pada  pita  II,  yang menunjukkan  adanya  gugus  hidroksi  pada cincin  A  yaitu  pada  atom  C-7.  Dugaan  ini
diperkuat  dengan  pergeseran  batokromik pada  pita  II,  setelah  penambahan  pereaksi geser NaOAc pada isolat.
Penambahan  pereaksi  geser  NaOH setelah  5  menit  menunjukkan  adanya pergeseran hipsokromik pada pita II, hal ini menunjukkan  bahwa  ada  gugus  orto dihidroksi pada cincin  A. Hal  ini diperkuat dengan  adanya  pergeseran  hipsokromik pada  pita  II  setelah  penambahan  pereaksi geser  H 3 BO 3 ,  yang  menunjukkan  adanya gugus  orto  dihidroksi  pada  atom  C-6,C-7 atau C-7,C-8.
Penambahan AlCl 3 tidak meyebabkan pergeseran panjang
gelombang,  hal  ini  menunjukkan  bahwa  5- OH  dengan  gugus  prenil  pada  cincin  6. Sedangkan,
penambahan
AlCl 3 /HCl menghasilkan  pergeseran  batokromik  pada pita  I  sebesar  1,1  nm  yang  memungkinkan adanya  gugus  o-diOH  pada  cincin  B  dari auron dan khalkon.
Pergeseran  batokromik  yang  terjadi pada  penambahan  pereaksi  geser  NaAc
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 127-137
menujukkan  adanya  gugus  7-OH  atau  ada gugus yang peka terhadap basa seperti pada C-6,C-7  atau  C-7,C-8  atau  C-3,C-4’- dihidroksi.  Pergeseran  hipsokromik  yang terjadi  pada  pita  I  dan  pita  II,  setelah penambahan  pereaksi  geser  NaAc  dan H 3 BO 3 menunjukkan  adanya  gugus  orto dihidroksi  pada  cincin  A  dan  B  pada  atom C-6,C-7  atau  C-7,C-8.  Berdasarkan  data interpretasi  perubahan  panjang  gelombang maksimum  isolat  7  dari  spektrofotometer UV-Vis  maka  senyawa  flavonoid  yang mungkin  dari  isolat  7  termasuk  golongan flavanon  atau  dihidroflavonol,  karena spektrum  yang  terbentuk  merupakan  ciri khas  dari  flavanon  atau  dihidroflavonol dengan kemungkinan terdapat gugus hidroksi  pada C-3,C-6, C-7, dan C-4’.

## 4. Kesimpulan
Ektrak etanol rimpang kencur 80% dan fraksi kloroform memiliki potensi antioksidan  yang  kuat  dengan  nilai  persen aktivitas  tertinggi  64,93  %  dan  54,9  % dengan  nilai  IC 50 13,07  μg/mL  dan  81,9 μg/mL.  Hasil  dari  KLTA  eluen  terbaik adalah PE:etil asetat yang mampu menghasilkan  spot  sebanyak  7.  Dan  hasil KLTP menghasilkan 8 spot. Hasil identifikasi  menggunakan  spektrofotometer UV-Vis dan diperkuat dengan penambahan pereaksi geser menunjukkan bahwa  isolat 7 merupakan golongan flavanon atau dihidroflavonol.

## 5. Ucapan Terima Kasih
1. DIPA  UIN  Malang  atas  bantuan pendanaan penelitian
2. Rachmawati  Ningsih,  M.Si  selaku dosen konsultan.
3. Semua  staf  laboratorium  jurusan kimia yang  telah  membatu  dalam  melayani fasilitas alat  dalam proses penelitian.

## 6. Daftar Pustaka
Cuppett,  S.M.,  dan  Schrepf,  C.  Hall  III. 1954. Natural  Antioxidant  Are  They
Reality .  Dalam  Foreidoon  Shahidi:
Natural Antioxidants, Chemistry,
Health  Effect  and Applications, AOCS Press, Champaign, Illinois: 12-
24.
Effendy.  2007. Perspektif  Baru  Kimia Koordinasi  Jilid  I .  Malang:  Banyu Media Publishing.
Fitriyani, A., Winarti, L., Muslichah, S. dan Nuri. 2011. Uji Antiinflamasi Ekstrak Metanol  Daun  Sirih  Merah  (Piper crocatum ruiz  &Pav )  pada  Tikus Putih .  Majalah  Obat  Tradisional : 16 (1), 34-42.
Gandjar,  I.G  dan  Rohman,  A.  2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Gholib,  D.  2009.  Daya  hambat  ekstrak kencur  terhadap  pertumbuhan  jamur Tripchophyton  mentagrobhytes dan cryptococcus neoformans jamur penyebab  penyakit  kurap  pada  kulit dan penyakit paru, Bul. Littro , vol.20, no.1, hal 59-67.
Guenther, E. 2006. Minyak Atsiri . Jakarta : UI Press.
Harborne,  J.  1987.    Metode  Fitokimia:
Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Cetakan Kedua . Penerjemah:  Padmawinata,  K.  dan  I. Soediro. Bandung: ITB.
Hasanah,  A.  N.,  Nazaruddin,  F.,  Febrina,
E., dan Zuhrotun, A. (2011). Analisis Kandungan  Minyak  Atsiri  dan  Uji Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Rimpang Kencur (Kaempferia galanga  L.)  . Jurnal  Matematika  & Sains. 147-153.
Khopkar.  2008. Konsep  Dasar  Kimia Analisis. Jakarta: Universitas Indonesia. Markham, K.R. 1998. Cara Mengidentifikasi Flavonoid,
ALCHEMY: Journal of Chemistry , Vol. 4 No. 2 Oktober 2015, hal 127-137
Terjemahan  Kosasih  Padmawinata .
Bandung: Penerbit ITB. Marliana,  E.  2005.  Aktivitas  Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Andong (Cordyline fruticosa L.). Jurnal
Mulawarman  Scientifie ,  Volume  11,
Nomor  1,  April  2012  ISSN  1412- 498X.
Milyasari,  C.  2011.  Isolasi  Senyawa Antibakteri Staphylococcus  aureus dan E.coli dari Ekstrak Buah
Blimbing  Wuluh (Averrhoa  blimbi. L) . Skripsi Tidak Diterbitkan. Malang: Fakultas Sains dan Teknologi  Universitas  Islam  Negeri
Malang.
Molyneux, P. 2003. The Use of The Stable Free  Radical  Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH),  for  Estimating  Antioxidant Activity. Journal  of  Science  and
Technology . Institute of Food Research  Colney,  Norwich,  United
Kingdom. Vol 26(2) : 211-219.
Rahayu,  D  dan  Hastuti,  S.D.  2009.
Stabilitas  Saponin  sebagai  Antibiotik Alami  Hasil  Isolasi  Gel  Daun  Aloe barbandis  miller  pada  Variasi  Suhu dan  Lama  Simpan.    Jurnal .  Malang: Jurusan Peternakan Fakultas Peternakan-Perikanan Universitas Muhammadiyah Malang.
Suroso,  H.C.  2007.  Uji  Antioksidan  dan Identifikasi  Senyawa  Aktif  pada Tanaman  Anting-anting (Achalypha Indica  L.) . Skripsi Tidak  Diterbitkan. Malang:  Jurusan  Kimia  Fakultas Sains  dan  Teknologi  Universitas
Islam Negeri Maaulana Malik Ibrahim Malang.
Voight,  R.1995. Buku  Pelajaran  Teknologi Farmasi. Diterjemahkan oleh Soedani Noerono Soewandi, Apt. Yogyakarta: Universitas Gajah Mada press Wijayakusuma,  H.  2008. Pengobatan Herbal  dengan  Ramuan  Tionghoa .
Jakarta: Niaga Swadaya.