Medika Kartika : Jurnal Kedokteran dan Kesehatan

## EFEK DIKLOFENAK DAN VIRGIN COCONUT OIL TERHADAP EKSPRESI RESEPTOR EP3 PADA TIKUS STRAIN WISTAR ADIKSI NIKOTIN KONDISI
DEPENDENCE
(EFFECT OF DICLOFENAC AND VIRGIN COCONUT OIL IN THE EXPRESSION OF EP3 RECEPTORS ON NICOTINE-DEPENDENCE RATS)
Dian Anggraeny 1,2 , Anggraini Barlian 2 , Kusnandar Anggadiredja 3
1 Bagian Histologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Jenderal Achmad Yani, Cimahi 2 Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung, Bandung 3 Sekolah Farmasi,  Institut Teknologi Bandung, Bandung
Email korespondensi: diananggra.t@gmail.com

## ABSTRAK
Perilaku  ketergantungan  rokok  timbul  akibat  adanya  nikotin  sebagai  komponen  psikoaktif utama. Salah satu mekanisme yang diduga berperan adalah proses fisiologis yang melibatkan metabolisme  asam  arakhidonat  yang  dapat  diamati  melalui  perubahan  ekspresi  gen  reseptor epiprostanoid (EP3) di otak. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari ekspresi reseptor EP3 pada  model  tikus  adiksi  nikotin  kondisi dependence ,  dan  yang  diberi pre - treatment dengan diklofenak  dan  VCO.  Tikus-tikus  secara  random  dibagi  menjadi:  kelompok  1  (N)  diberi nikotin saja (0,5mg/kg i.p.), kelompok 2 (Nd) diberi pre - treatment diklofenak (3,2mg/kg i.p.) dan kelompok 3 (NVCO) diberi pre - treatment VCO (5ml/kg p.o.) sebelum pemberian nikotin. Pengukuran  ekspresi  dilakukan  saat  tikus  telah  mengalami  ketergantungan  ( dependence ) menggunakan metode Conditioned Place Preference (CPP). Tikus-tikus diambil bagian otak hipokampus dan bulbus olfaktoriusnya, kemudian dilakukan isolasi protein, elektroforesis dan ditransfer ke membran PVDF menggunakan metode Western Blotting . Selanjutnya dilakukan teknik Enhanced Chemiluminescence (ECL) menggunakan antibodi primer rabbit polyclonal anti reseptor EP3 (Abcam) dan antibodi rabbit polyclonal anti-actin (Abcam) sebagai kontrol internal.  Pita  yang  terbentuk  didedahkan  pada  film  dan  dihitung  dengan scion image secara semi  kuantitatif.  Ekspresi  reseptor  EP3  paling  tinggi  ditemukan  pada  kelompok  tikus  yang

## ARTIKEL PENELITIAN
hanya  diberi  nikotin,  dan  menurun  pada  kelompok  tikus  yang  diberi  diklofenak  dan  VCO. Pada  sampel  dari  tikus  yang  diberi  VCO,  teramati  penurunan  ekspresi  reseptor  EP3  yang sebanding  dengan  yang  diberi  diklofenak.  Paparan  nikotin  secara  berulang  akan meningkatkan  ekspresi  reseptor  EP3  yang  dapat  ditekan  dengan  pemberian  diklofenak. Penurunan  ekspresi  reseptor EP3  dengan  pemberian  VCO  memiliki  pola  yang  mirip  dengan pemberian diklofenak.
Kata kunci : nikotin, adiksi, asam arakhidonat, reseptor EP3, virgin coconut oil

## ABSTRACT
Smoking  dependence  arises  as  a  result  of  nicotine  as  the  major  psychoactive  component  in cigarettes. One of the mechanisms that play role in dependence behavior is a mechanism that involved in arachidonic acid metabolism, accompanied by changes in gene expression of EP3 receptors  in  brain  at  the  molecular  level.  This  study  aims  to  examine  the  changes  in  the expression  of  EP3  receptors  from  nicotine-dependence  rats,  and  from  rats  given  diclofenac and  VCO  pre-treatment.  The  rats  were  divided  randomly into  3  groups,  first  group  (N)  was given 0.5 mg/kg i.p nicotine, the second group  (Nd) was given 3.2 mg/kg i.p diclofenac and the  third  group  (NVCO)  was  given  5ml/kg  p.o  VCO  30  min  before  nicotine  administration. The  hippocampus  and  olfactory  bulb  from  all  rats  that  has  been  tested  by  preference  test using the Conditioned Place Preference (CPP) methods were isolated. The protein from the isolated  brain  then  were  isolated,  electroforised  and  transfer  to  PVDF  membrane  using Western  blotting  method.  The  Enhanced  Chemiluminsencene  (ECL)  was  done  using  rabbit polyclonal to prostaglandin E reseptor EP3 primer antibody (Abcam) and rabbit polyclonal Actin antibody (Abcam) as an internal control. The bands then were exposed to the film and were analyzed using semi quantitative scion image. The results showed that the expression of EP3 receptors was high in group of rats given nicotine alone, and decreased in groups given diclofenac  and  VCO.  The  decreased  pattern  of  the  expression  of  EP3  receptors  from  VCO group  was  similar  to  diclofenac  group.  The  results  of  present  study  indicated  the increased EP3  receptor  expression  in  nicotine  dependence  can  be  attenuated  by  diclofenac.  The decreased  of  the  EP3  receptor  expression  pattern  by  VCO  administration  was  similar  to diclofenac.
Key words : nicotine, addiction, arachidonic acid, EP3 receptor, virgin coconut oil

## PENDAHULUAN
Ketergantungan  merokok  menjadi satu  permasalahan  serius  yang  dihadapi  di banyak  negara  maju  maupun  negara berkembang. National  Institute  on  Drug Abuse (2011)  melaporkan  bahwa  lebih kurang  440.000  jiwa  meninggal  setiap tahunnya  di  Amerika  Serikat,  karena berbagai  penyakit  yang  ditimbulkan  dari kebiasaan merokok. 1 Merokok tidak hanya meningkatkan  resiko  penyakit  respirasi, kardiovaskuler  dan  kanker  pada  perokok aktif,  tetapi  juga  pada  perokok  pasif. Permasalahan  lain  yang  muncul  adalah sulitnya  seorang  perokok  untuk  lepas  dari ketergantungan  merokok;  lebih  kurang 70%  perokok  berniat  untuk  berhenti merokok,  tapi  hanya  sekitar  3%  perokok berhasil  keluar  dari  ketergantungan  rokok setiap  tahunnya. 2 Bila  individu  secara kompulsif telah merasakan ketergantungan untuk  selalu  merokok,  walaupun  tahu kesehatannya akan terancam akibat kebiasaannya  tersebut,  maka  individu tersebut  dikategorikan  telah  mengalami adiksi. 1
Berbagai  penelitian  telah  dilakukan untuk meneliti bermacam-macam komponen  toksik  yang  ditemukan  dalam rokok. Nikotin merupakan komponen yang paling  berperan  dalam  ketergantungan rokok. 3 Nikotin akan mempengaruhi aktivitas  neuron  yang  terlibat  dalam brain
reward system (suatu sistem yang berkaitan  dengan  ketergantungan)  pada saat  berikatan  dengan  reseptor nicotinic acetylcholine  (nACh) dalam  sistem  saraf pusat,  yang  selanjutnya  mempengaruhi motivasi  dan  perilaku. 4,5 Keterlibatan metabolisme asam arakhidonat dan reseptor  EP3  dalam brain  reward  system kini  menjadi  perspektif  baru  dalam memahami  proses  adiksi  nikotin.  Peranan metabolisme  asam  arakhidonat  dalam adiksi  ditandai  dengan  adanya  kenaikan kadar  prostaglandin  E2  (PGE2)  dalam otak. 6 PGE2  merupakan  salah  satu  produk akhir  dari  metabolisme  asam  arakhidonat pada  jalur cyclooxigenase (COX),  yang akan  mempengaruhi  neurofisiologi  otak melalui  reseptor  EP3. 6,7 Penelitian  di tingkat  perilaku  telah  menyimpulkan bahwa  diklofenak  sebagai  obat  golongan Non  Steroidal  Anti  Inflammatory Drugs (NSAID) yang menghambat enzim cyclooxigenase dalam  metabolisme  asam arakhidonat,  dapat  mengurangi  gejala ketergantungan  dan  kekambuhan  pada hewan  percobaan  yang  diberi  nikotin. 8,9
Penelitian  lain  mengenai  reseptor  EP3  di tingkat  mRNA  menyimpulkan  bahwa ekspresi  reseptor  EP3  di  tingkat  mRNA meningkat  pada  tikus  yang  mengalami ketergantungan nikotin, dan menurun pada tikus  yang  diberi pre - treatment diklofenak sebagai  obat COX inhibitor .  Penelitian  ini
juga  menyimpulkan  bahwa  pemberian diklofenak dapat menurunkan ekspresi gen reseptor  EP3  secara dose - specific dengan dosis optimum 3,2 mg/kgbb. 10
Penelitian-penelitian lain juga dilakukan  untuk  mencari  produk  alami yang  dapat  digunakan  sebagai  alternatif dalam  mengatasi  ketergantungan  obat. Virgin Coconut Oil (VCO)  adalah  minyak murni  dari  buah  kelapa  yang  tidak mengalami proses hidrogenisasi dan pemanasan  seperti  minyak  sayur/minyak goreng, dan sering digunakan sebagai obat. Berbagai  macam  khasiat  telah  diteliti  dari VCO,  seperti  anti  mikroba,  anti  virus  dan anti Candida . 11,12
Penelitian yang dilakukan oleh Intahphuak dkk (2010) juga mempelajari  khasiat  VCO  sebagai  anti inflamasi pada tikus yang diinduksi demam dan  edema. 13 Pengaruh  VCO  dalam ketergantungan  nikotin  dilakukan  oleh Anggadiredja dkk (2011) yang membuktikan bahwa VCO dapat terlibat di jalur asam arakhidonat, karena metabolisme  asam  arakhidonat  merupakan bagian  dari  proses  inflamasi. 14 Hasil penelitian  tersebut  menyimpulkan  bahwa pemberian  VCO  dapat  mengubah  perilaku ketergantungan  tikus,  namun  bagaimana mekanisme  senyawa  aktif  VCO  dapat mengubah  perilaku  adiksi,  khususnya  di jalur metabolisme asam arakhidonat masih
belum  jelas  sehingga  perlu  untuk  diteliti lebih lanjut.
Berdasarkan  hasil  tersebut  di  atas, penelitian ini dilakukan untuk mempelajari ekspresi  reseptor  EP3  pada  bagian  otak hipokampus dan bulbus olfaktorius, sebagai bagian  yang berperan dalam brain reward  system pada  hewan  adiksi  nikotin kondisi dependence .  Pengaruh  pemberian VCO  sebagai  senyawa  anti  inflamasi  di jalur  metabolisme  asam  arakhidonat  akan dipelajari,  dengan  diklofenak  sebagai pembanding.  Hasil  dari  penelitian  ini diharapkan  dapat  menjadi  dasar  untuk lebih  memahami  keterlibatan  metabolisme asam  arakhidonat  dalam  adiksi  nikotin, juga sebagai dasar pengembangan senyawa VCO dalam penanganan adiksi nikotin.

## BAHAN DAN METODE Subyek Penelitian
Hewan yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  tikus  jantan  galur Wistar  berumur  delapan  minggu  dengan berat  badan  berkisar antara  150-200  gram. Jumlah  tikus  percobaan  yang  digunakan adalah  sebanyak  27  ekor,  yang  dibagi menjadi tiga kelompok pengulangan dengan  jumlah  sembilan  ekor  yang ditempatkan  dalam  satu  kandang.  Suhu ruangan tetap (23 ± 2  C) dengan siklus 12 jam  terang  dan  12  jam  gelap.  Persediaan makan dan minum diberikan ad libitum.
Gambar 1 Pengelompokan tikus percobaan berdasarkan kondisi dan perlakuan

## Tempat dan Waktu Penelitian
Pemeliharaan dan pengamatan perilaku hewan dilakukan di  Laboratorium Perhewanan dan Laboratorium Farmakologi  Sekolah  Farmasi  ITB  mulai bulan  Agustus  2010  sampai  bulan  April
2011. Isolasi otak dilakukan di Laboratorium  Fisiologi  Hewan  SITH  ITB, sedangkan fraksinasi protein sampai proses deteksi protein (Western blot dan enhanced chemiluminescence) dilakukan  di  Ruang Preparasi dan Laboratorium Analisis Struktur  dan  Perkembangan  Hewan  SITH ITB  mulai  bulan  April  sampai  bulan Agustus 2011.

## Bahan Pemeriksaan
Bahan  yang  diperiksa  adalah  bagian bulbus  olfaktorius  dan  hipokampus  dari model  tikus  yang  telah  mendapatkan perlakuan,  dan  perilakunya  telah  diukur menggunakan metode CPP. Tikus dibunuh dengan  cara  dekapitasi  dan  diambil otaknya  dalam  waktu  30-40  detik.  Bagian bulbus olfaktorius dan hipokampus dipisahkan  dari  otak  di  atas  cawan  petri berisi  larutan phosphate  buffer  saline
(PBS)  dingin,  kemudian  ditimbang  dan masing-masing  dimasukkan  ke  dalam cryotube .  Otak  yang  diisolasi  selanjutnya disimpan  dalam  tangki  nitrogen  cair sampai seluruh otak tikus perlakuan selesai diisolasi.

## Prosedur Penelitian
Tikus-tikus  percobaan  pada  setiap kelompok  pengulangan  dibagi  secara  acak ke  dalam  tiga  kelompok  perlakuan,  yaitu kelompok  N  yang  terdiri  atas  tikus-tikus yang  diinduksi  nikotin  (Sigma),  kelompok Nd yang terdiri atas tikus-tikus yang diberi perlakuan sodium diklofenak (Dexa Medica) dan nikotin, dan kelompok NVCO yang  terdiri  atas  tikus-tikus  yang  diberi perlakuan  VCO  (C-Oil  Minyak  Kelapa Murni, Aphrodita) dan nikotin. Nikotin dan sodium  diklofenak  diberikan  secara  intra peritoneal  dengan  dosis  0,5  mg/kg  untuk nikotin  dan  3,2  mg/kg  untuk  sodium diklofenak,  sedangkan  VCO  diberikan secara  per  oral  dengan  dosis  5  ml/kg.  15 Alur  proses  perlakuan  dan  uji  CPP  dapat dilihat  pada  Gambar  2.  Setelah  itu  tikus dibunuh  untuk  diambil  bagian  bulbus
olfaktorius  dan  hipokampusnya  sebagai
bahan pemeriksaan.
Gambar 2 Diagram alur perlakuan hewan percobaan. Uji CPP dilakukan sebelum dan sesudah perlakuan ( pre-conditioning test dan conditioning test )
Uji  CPP  adalah  uji  perilaku  tikus diamati  dan  diukur  menggunakan  metode Conditioned Place Preference (CPP), yaitu suatu metode untuk mengukur ketergantungan obat secara kuantitatif pada hewan  percobaan,  menggunakan  alat  CPP. Uji  perilaku  dilakukan  dengan  cara mengamati  dan  merekam  perilaku  hewan
percobaan dalam alat CPP, yang selanjutnya dianalisis menggunakan Software  Smart  Junior TM .  Parameter  yang digunakan  adalah  preference  score,  yaitu lama waktu tinggal hewan di ruangan yang dikondisikan dengan nikotin dibagi dengan total waktu uji perilaku (detik). 15

## Metode Pemeriksaan
Bahan pemeriksaan selanjutnya akan melalui  beberapa  tahapan  pemeriksaan, dimulai  dari  isolasi  protein,  penentuan konsentrasi protein, elektroforesis, Western blotting , dan Enhanced Chemiluminescence (ECL) .

## Isolasi Protein
Isolasi  protein  dilakukan  dua  tahap. Pada  tahap  pertama,  sebanyak  0,3  gr bagian  otak  (hipokampus  atau  bulbus olfaktorius) yang berasal dari tiga kelompok  perlakuan  dalam  satu  kondisi dipindahkan  ke  dalam  tiga  tabung Falcon 15  ml  yang  masing-masing  telah  diisi dengan  4,5  ml Ice  Cold  Sucrose  Buffer /ICSB. Selanjutnya bagian otak dihomogenisasi dengan menggunakan pestle dalam keadaan dingin. Suspensi otak yang  didapat  disentrifugasi  menggunakan alat Superspeed  Centrifuge ( Sorval  RC-5B plus )  dengan  kecepatan  3000g  selama  10 menit  pada  suhu  4°C.  Supernatan  yang didapat  dipisahkan  untuk  menentukan jumlah protein total (metode Bradford) dan deteksi  protein actin (metode Western blot ),  sementara  pelet  yang  terbentuk disentrifugasi  sebanyak  dua  kali  dengan 4,5  ml  Tris-HCl  pH  8,0  pada  kecepatan 3000g  selama  10  menit  pada  suhu  4°C. Pelet  yang  terbentuk  dilarutkan  dengan
2,25  ml  Tris-Hcl  pH  8,0  dan  dipindahkan ke  dalam beaker  glass 40  ml  berisi magnetic  stirrer . Beaker  glass selanjutnya ditutup dengan alumunium foil dan diaduk dengan  stirrer  selama  +  16  jam  (semalam) pada suhu 4°C.
Pada  tahap  kedua,  suspensi  dalam beaker  glass yang  telah  diaduk  selama semalam  diberi  LiBr  50  mM  /  10  ml sebanyak  30  µl,  kemudian  diaduk  kembali di  atas plate  stirrer selama  2,5  jam  pada suhu 4°C. Suspensi selanjutnya dipindahkan  ke  tabung Eppendorf dan disentrifugasi  dengan  kecepatan  10.000g selama 10 menit pada suhu 4°C. Pelet hasil sentrifugasi dihomogenisasi dan diresuspensi  dengan  2,25  ml  Tris-HCl  pH 8,0. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan  6000g  selama  10  menit  pada suhu 4°C. Pelet yang terbentuk dihomogenisasi  dan  diresuspensi  dengan 2,25  ml  KBr  25%  B/V,  lalu  kembali disentrifugasi  dengan  kecepatan  10.000g selama 30 menit pada suhu 4°C. Pelet yang didapat  diberi  ICSB  sebanyak  1,5  ml  dan disentrifugasi  dengan  kecepatan  17.000g selama 20 menit pada suhu 4°C. Pelet yang didapat kemudian disuspensi dengan 15 µl ICSB  dan  disonikasi  selama  siklus  2x50 detik, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000g  selama  10  menit  pada  suhu  4°C. Pelet selanjutnya dipisahkan untuk
pemeriksaan  metode  Bradford  dan  deteksi protein EP3 dengan metode Western blot . Penentuan  Konsentrasi  Protein  Total Dengan Metode Bradford
Konsentrasi protein total dari supernatan  dan  pelet  hasil  isolasi  protein dihitung untuk menentukan volume sampel yang  berasal  dari  supernatan  dan  pelet yang  akan  dimasukkan  dalam  sumur  pada proses elektroforesis. Kuantifikasi dilakukan  dengan  menggunakan  metode Bradford.  Metode  ini  dilakukan  dengan mencampurkan  sampel  protein,  larutan NaCl  0,15  M  dan  CBBG-250  10%. Sebagai  protein  standar  digunakan  BSA ( bovine  serum  albumin ,  Sigma  A  9418) untuk  membuat  kurva  standar  konsentrasi protein,  sehingga  konsentrasi  sampel protein  dapat  dihitung.  Absorbansi  protein diukur menggunakan spektrofotometer ( Pharmasia Biotech ) pada panjang gelombang  595  nm,  lalu  konsentrasi protein  total  pada  sampel  protein  dapat dihitung  menggunakan  persamaan  kurva standar konsentrasi protein BSA.

## Elektroforesis dan Western Blotting
Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan  protein-protein  berdasarkan perbedaan  berat  molekul.  Sampel  protein sebanyak  20  µg  dimasukkan  ke  dalam Eppendorf dan  dicampur  dengan sample buffer dengan  perbandingan  volume  1:1.
Sampel  selanjutnya  didenaturasi  dalam waterbath pada suhu 95°C selama 5 menit, kemudian  dimasukkan  dalam  sumur  gel elektroforesis  poliakrilamid  10%  yang telah terpasang pada aparatus elektroforesis ( Advantec ) dan diisi running buffer . Elektroforesis dimulai pada tegangan  100  volt  sampai  sampel  protein mencapai  batas  antara stacking gel dan separating gel .  Tegangan  selanjutnya ditingkatkan  menjadi  120  volt  sampai sampel  protein  mencapai  batas  bawah  gel. Hasil  elektroforesis  selanjutnya  ditransfer ke  membran polyvinilidene diflouride ( PVDF Western Blotting Membrane ,
Roche )  menggunakan  alat tank  transfer system (BioRAD  Mini  PROTEAN ® Tetra System)  dalam  larutan transfer  buffer pH 8,3 dengan arus sebesar 10A selama 2 jam pada suhu 4°C.
Protein  actin  dan  EP3  selanjutnya dideteksi menggunakan metoda pemeriksaan Western  blot. Membran PVDF  dengan  protein  hasil  transfer elektroforesis  dibilas  dengan  methanol absolut  dan  deion.  Membran  PVDF  yang berisi protein EP3 direndam dalam larutan skim  milk 15%,  sedangkan  membran PVDF  yang  berisi  protein actin direndam dalam  larutan skim  milk 5%.  Proses perendaman  dilakukan  selama  15  jam. Membran  selanjutnya  diinkubasi  dengan antibodi  primer rabbit  polyclonal anti
reseptor  EP3  ab21227  (Abcam)  dan antibodi rabbit polyclonal anti- actin ab1801  (Abcam)  yang  dilarutkan  dalam larutan skim  milk 5%  dengan  pengenceran
1:500  untuk  EP3  dan  1:1000  untuk actin pada  suhu  4°C  selama  3  jam.  Membran kemudian  dibilas  dengan  larutan  TBST ( Tris-Buffered  Saline-Tween )  selama  5 menit  sebanyak  delapan  kali.  Membran selanjutnya  diinkubasi  dalam  antibodi sekunder Anti-mouse IgG- POD/anti- rabbit-IgG-POD ( BM  Chemiluminescence Western  Blotting  Kit ,  Roche) yang dilarutkan  dalam  larutan skim  milk 5% dengan  pengenceran  1:5000  selama  45 menit  pada  suhu  4°C.  Pada  tahap  akhir membran  kembali  dibilas  menggunakan larutan TBST selama 5 menit sebanyak 10 kali.
ECL ( Enhanced Chemiluminescence ) Proses pendeteksian selanjutnya dilakukan  dengan  menggunakan  sistem ECL ( Enhanced Chemiluminescence ). Membran  ditetesi  larutan luminescence substrate  solution  A dan  larutan starting solution B ( BM Chemiluminescence
Western Blotting Kit, Roche ), lalu didedahkan pada film ( Fuji Medical X-ray Film ) dalam kaset Kodak X-OMAT selama 45  menit.  Selanjutnya  film  dicuci  dengan larutan developer selama 10 menit, larutan fotofix selama 2 menit dan akuades selama
1 menit. Pita/larik yang terbentuk kemudian dikuantifikasi menggunakan program Scion Image .

## Metode Analisis
Data  diperoleh  berdasarkan  rasio reseptor  EP3  terhadap  kontrol  internal actin , dan merupakan data yang reproducible .  Hasil  rasio  disajikan  dalam bentuk grafik histogram.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekspresi reseptor EP3 tampak paling tinggi  pada  kelompok  tikus  yang  diberi nikotin saja, baik pada wilayah hipokampus  maupun  bulbus  olfaktorius, sehingga  total  ekspresi  reseptor  EP3  di kedua  wilayah  otak  tersebut  menunjukkan ekspresi  reseptor  EP3  yang  tinggi  pada kelompok N dibandingkan dengan kelompok  lainnya  (Gambar  4b,  kelompok N). Ekspresi reseptor EP3 yang tinggi pada kelompok N diduga terjadi karena pemberian  nikotin  mempengaruhi  ekspresi reseptor  EP3  secara  tidak  langsung. Diduga  nikotin  yang  diinjeksi  secara intraperitoneal  akan  diabsorpsi  masuk  ke dalam sirkulasi darah melalui vena porta. 16
Darah  akan  membawa  nikotin  sampai  ke dalam  otak,  melewati blood  brain  barrier lalu berikatan dengan nicotinic acetylcholine receptors ( nAChRs ). 17
Albuquerque dkk (2009)
memaparkan,  reseptor nACh adalah  suatu reseptor  transmembran  yang  merupakan subtipe dari acetylcholine receptors ( AChRs ) dan sangat sensitif untuk teraktivasi  oleh  nikotin. 18 Reseptor nACh memiliki struktur pentamerik, yang tersusun  atas  lima  sub  unit  dan central pore yang  menjadi  jalan  masuknya  ion  ke dalam  sel  pada  saat  reseptor  teraktivasi. Sub  unit  penyusun  reseptor  merupakan kombinasi  sub  unit  α  dan  β  yang  tersusun secara  homomerik  atau  heteromerik  dan berperan di dalam memperantarai berbagai fungsi  yang  khas.  Reseptor nAChRs terutama  ditemukan  pada  sistem  saraf, selain  dapat  pula  ditemukan  di luar  sistem saraf  ( non  neuronal  nAChRs ).  Ikatan antara nikotin dan reseptor nACh kemudian akan  menyebabkan  pelepasan  berbagai macam  neurotransmiter. 3 Neurotransmiter glutamat  diduga  memperantarai  proses memori  yang  melibatkan  jalur  asam arakhidonat. 3,19 Reseptor nACh yang diduga terlibat dalam pengeluaran neurotransmiter  glutamat  adalah  reseptor subtipe  α7. 4,20 Lubin  dkk  melaporkan keberadaan  reseptor  ini  pada  presinaps terminal saraf hipokampus. 4
Reseptor nACh merupakan ligand gated  ion  channel ,  sehingga  pada  saat nikotin  berikatan  dengan  reseptor nACh , terjadi perubahan konformasi pada struktur
reseptor  yang  menyebabkan  kation-kation seperti  Na+  ,  K+  ,  dan  Ca2+  ekstraseluler masuk  melewati channel ,  menginduksi depolarisasi,  meningkatkan  eksitabilitas dan  perubahan  pada  Ca2+  intraseluler. 4
Peningkatan  jumlah  Ca2+  intraseluler menyebabkan terjadinya pelepasan neurotransmiter  glutamat.  Ikatan  antara glutamat  dan  reseptornya  pada  post  sinaps akan meningkatkan jumlah Ca2+ intraseluler  dan mengaktivasi  cPLA2  yang ada  di  sitoplasma. 19 Cytosolic PLA2 merupakan  stimulus  langsung  aktivasi proses  metabolisme  asam  arakhidonat melalui  hidrolisis  pada  posisi sn -2  dari membran
phospolipid. 21 Proses metabolisme asam arakhidonat yang terjadi dengan  bantuan  enzim cyclooxigenase akan menghasilkan berbagai macam produk  akhir,  salah  satunya  PGE2  yang akan berfungsi melalui reseptor EP3.
Ekspresi  yang  ditampilkan  pada kelompok  N  di  wilayah  bulbus  olfaktorius tampak  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan kelompok  N  di  wilayah  hipokampus (Gambar 4b, kelompok N wilayah hipokampus  dan  bulbus  olfaktorius).  Hal ini  diduga  berkaitan  dengan  peranan bulbus  olfaktorius  dan  hipokampus  dalam pembentukan  memori. 22 Pada  sebagian mamalia, terutama hewan pengerat, bulbus olfaktorius  merupakan  wilayah  otak  yang sangat  penting  dalam  mengembangkan
kemampuan  untuk  cepat  mempelajari, mengingat dan membedakan bau. 23
Distribusi  reseptor  EP3  sendiri  telah diketahui banyak ditemukan di bagian otak yang  mempunyai  peran  dalam  fungsi kognitif. 7 Berdasarkan hal tersebut di atas, diduga reseptor EP3 lebih banyak terdistribusi  di  wilayah  bulbus  olfaktorius pada  hewan  pengerat,  sehingga  ekspresi reseptor  EP3  di  bulbus  olfaktorius  lebih tinggi dibandingkan dengan wilayah hipokampus.  Hasil  yang  didapat  di kelompok nikotin sesuai dengan penelitian Faridah  (2010)  yang  meneliti  ekspresi reseptor  EP3  di  tingkat  mRNA. 10 Dengan demikian,  ekspresi  reseptor  EP3  yang ditampilkan  di  tingkat  protein  sejalan dengan  ekspresi  reseptor  EP3  di  tingkat mRNA.
Ekspresi reseptor EP3 pada kelompok  tikus  yang  diberi  diklofenak cenderung  lebih  rendah  bila  dibandingkan dengan kelompok tikus yang diberi nikotin saja  (Gambar  4b,  kelompok  N  dan kelompok Nd pada wilayah otak hipokampus,  bulbus  olfaktorius  dan  total wilayah hipokampus dan bulbus olfaktorius).  Hasil  ini  sesuai  dengan ekspresi reseptor EP3 di tingkat mRNAdan sesuai  pula  dengan  perubahan  perilaku adiksi tikus yang ditandai dengan penurunan  nilai  preference  score  yang berarti  menurunnya  keinginan  tikus  untuk
berada di tempat yang dikondisikan dengan nikotin. 10,15 Diklofenak  adalah  obat  yang termasuk  dalam  golongan non  steroid  anti inflammation drugs (NSAID) yang berkerja  sebagai  COX  ( cyclooxigenase ) inhibitor  non  spesifik.  Ekspresi  EP3  yang rendah terjadi disebabkan karena diklofenak menghambat enzim cyclooxygenase secara competitive inhibitor. 24 Pada  penelitian  ini,  diduga pemberian  diklofenak  30  menit  sebelum induksi  nikotin  menyebabkan site enzim cyclooxigenase telah diikat oleh diklofenak sebelum proses metabolisme asam arakhidonat  terjadi.  Hal  ini  menyebabkan enzim menjadi tidak aktif, sehingga proses metabolisme asam arakhidonat yang terjadi setelah  induksi  nikotin  terhambat,  yang mengakibatkan  produk  akhir  dari  proses metabolisme asam arakhidonat yaitu PGE2 di jalur cyclooxygenase menurun.
Penurunan  rasio  EP3  juga  terjadi pada  kelompok  tikus  adiksi  nikotin  yang diberi VCO, dan tampak sebanding dengan penurunan  rasio  EP3  pada  kelompok  yang diberi  diklofenak  (Gambar  4b,  kelompok Nd dan NVCO, wilayah otak hipokampus), bahkan lebih rendah (Gambar 4b, kelompok  Nd  dan  NVCO,  wilayah  otak bulbus  olfaktorius  dan  total  wilayah hipokampus  dan  bulbus  olfaktorius).  VCO telah  diketahui  mempunyai  efek  anti inflamasi.  13,25  Penelitian  lain  mengenai
VCO  dalam  adiksi  nikotin  dilakukan  oleh
Anggadiredja dkk (2011) yang menyimpulkan bahwa VCO dapat mencegah kondisi dependence dan relapse tikus  model  adiksi  nikotin  di  tingkat perilaku,  yang  ditandai  dengan  rendahnya nilai preference score .  VCO  mengandung
berbagai  macam  senyawa  aktif. 14 Salah satu  senyawa  aktif  yang  paling  banyak terkandung  dalam  VCO  adalah  asam laurat,  yang  tergolong  ke  dalam  golongan asam  lemak  jenuh  rantai  sedang  atau Mid Chain Fatty Acids (MCFA).
Gambar 4 (A) Hasil Western Blot untuk reseptor EP3 dan actin (sebagai kontrol internal) (B) Rasio relatif  EP3  terhadap actin pada  wilayah  otak  hipokampus,  bulbus  olfaktorius  dan  total  hipokampus- bulbus  olfaktorius  kondisi dependence .  N:  hanya  diberi  nikotin  0,5  mg/kg.  Nd:  diklofenak  diberikan 3,2mg/kg 30 menit sebelum nikotin. NVCO: VCO diberikan 5ml/kg 30 menit sebelum nikotin.
Asam  laurat  di  dalam  pencernaan akan  diurai  menjadi  monolaurin  dan gliserol,  kemudian  diabsorpsi  usus  halus langsung  masuk  ke  dalam  sirkulasi  darah yang  dapat  digunakan  langsung  sebagai energi. 26 Hal  ini  berbeda  dengan  asam lemak  jenuh  rantai  panjang  seperti  asam palmitat, asam oleat pada VCO yang tidak dapat  masuk  ke  dalam  sirkulasi  darah secara  langsung  namun  harus  diikat terlebih  dahulu  dalam  bentuk  kilomikron
dan  dideposit  sebagai  lemak.  Monolaurin telah  diketahui  memiliki  berbagai  macam khasiat,  seperti  anti  mikroba,  anti  jamur dan  anti  virus. 11,12 Diduga  monolaurin mempengaruhi  jalur  lain  selain  jalur  asam arakhidonat,  yang  terkait  dengan down regulation ekspresi  gen  reseptor  EP3. 27
Masih  diperlukan  penelitian  lebih  lanjut mengenai mekanisme seluler dari senyawa-senyawa  aktif  di  dalam  VCO yang  terlibat  dalam  jalur  metabolisme
asam arakhidonat. Penemuan yang didapat akan  mengarahkan  pemahaman  yang  lebih mendalam  mengenai  peran  VCO  pada metabolisme  asam  arakhidonat,  khususnya di  dalam  menanggulangi  masalah  adiksi nikotin.
Mekanisme  Nikotin,  Peran  Diklofenak dan  VCO  di  Jalur  Asam  Arakhidonat dalam Ketergantungan
Dari  hasil  penelitian  di  atas,  dapat dibuat  suatu  mekanisme  seluler  proses ketergantungan  nikotin  yang  melibatkan metabolisme  asam  arakhidonat.  Gambar  5 memperlihatkan  model  mekanisme  adiksi nikotin, peran diklofenak dan dugaan peran VCO  dalam  menghambat  proses  adiksi nikotin pada penelitian ini.
Kerja nikotin mempengaruhi aktivitas saraf dan perilaku tidak lepas dari peran  reseptor nACh Rs.  Nikotin  yang diberikan  secara  intra  peritoneal  diduga sampai  ke  sistem  saraf  pusat  dengan  cara masuk  ke  sistem  sirkulasi  darah  melalui vena  porta  melewati blood brain barrier dan  selanjutnya  berikatan  dengan  reseptor nACh yang  berada  pada  neuron  pre sinaps. 16 Ikatan  nikotin  dengan  reseptor nACh menyebabkan perubahan konformasi reseptor,  sekaligus  membuka  gerbang ion channel . 19 Akibatnya  Ca 2+ ekstraseluler masuk ke dalam sel neuron pre sinaps dan mengakibatkan  jumlah  Ca 2+ intraseluler
meningkat.  Peningkatan  Ca 2+ intraseluler ini akan menyebabkan pengeluaran neurotransmiter.  Dari  berbagai  macam neurotransmiter, glutamat diduga memperantarai proses-proses yang
melibatkan jalur asam arakhidonat (Gambar 6a). 19
Glutamat  yang  berada  pada  celah sinaps  selanjutnya  akan  berikatan  dengan reseptor  glutamat  yang  terdapat  pada neuron  post  sinaps.  Ikatan  antara  glutamat dan  reseptornya  akan  menyebabkan  Ca 2+ ekstraseluler di daerah celah sinaps masuk ke  dalam  sel  sehingga  Ca 2+ intraseluler  di post  sinaps  meningkat,  yang  selanjutnya akan  mengaktivasi  cPLA2  yang  terdapat pada sitosol. Aktivasi cPLA 2 akan menghidrolisis  asam  arakhidonat  dari fosfolipid  pada  membran  plasma,  dan proses  metabolisme  asam  arakhidonat dimulai. 19 Proses metabolisme asam arakhidonat di jalur cyclooxigenase dengan bantuan  enzim  COX1  dan  COX2  akan menghasilkan  produk-produk  akhir,  salah satunya  adalah  PGE 2 .  PGE 2 selanjutnya akan  berdifusi  keluar  dari  sel  untuk berikatan  dengan  reseptor  epiprostanoid (EP3).  Ligand  PGE2  dengan  reseptor  EP3 akan  menimbulkan  sinyal  transduksi  yang selanjutnya  diteruskan  ke  nucleus,  dan menginduksi  transkripsi  gen  EP3. 10 Pada penelitian  ini  ekspresi  reseptor  EP3  yang
diisolasi  dari  membran  sel  saraf  di  daerah hipokampus dan bulbus dipelajari.
Diklofenak  yang  telah  diketahui berperan  sebagai  COX  inhibitor  non spesifik, bekerja menghambat enzim cyclooxigenase pada  proses  metabolisme asam arakhidonat.
Karena enzim
cyclooxigenase  dihambat  oleh  diklofenak
maka proses metabolisme asam arakhidonat  di  jalur  cyclooxigenase  akan terhambat  dan  PGE 2 akan  menurun. Penurunan  PGE 2 sebagai  ligan  reseptor EP3  diduga  akan  menurunkan  sinyal transduksi yang berdampak pada penurunan jumlah reseptor EP3.
Gambar  5 (A)  Pada  celah  sinaps  di  wilayah  hipokampus  dan  bulbus  olfaktorius,  nikotin  berikatan dengan reseptor nACh, yang menyebabkan ion channel terbuka dan Ca 2+ ekstraseluler masuk ke dalam sel neuron pre sinaps. Peningkatan Ca 2+ intraseluler akan menyebabkan pengeluaran berbagai macam neurotransmiter, salah satunya glutamat. (B) Pada post sinaps, glutamat yang berada pada celah sinaps berikatan  dengan  reseptor  glutamat,yang  menyebabkan  Ca 2+ ekstraseluler  di  daerah  celah  sinaps masuk ke dalam sel sehingga Ca 2+ intraseluler di post sinaps meningkat.  Akumulasi Ca 2+ intraseluler akan  mengaktivasi  cPLA 2 yang  terdapat  pada  sitosol  yang  selanjutnya  akan  menghidrolisis  asam arakhidonat  dari  fosfolipid  pada  membran  plasma  (Turco  dkk,  2002).  Proses  metabolisme  asam arakhidonat  terjadi,  salah  satunya  di  jalur  cyclooxigenase  dengan  bantuan  enzim  COX  1  dan  COX2 akan menghasilkan produk-produk akhir, salah satunya adalah PGE 2 . PGE 2 selanjutnya akan berdifusi keluar  dari  sel  untuk  berikatan  dengan  reseptor  EP3.  Ligand  PGE 2 dengan  reseptor  EP3  akan menimbulkan  sinyal  transduksi  yang  selanjutnya  diteruskan  ke  nucleus,  dan  menginduksi  transkripsi gen  EP3.  Diklofenak  menghambat  kerja  enzim  COX,  sedangkan  monolaurin,  monokaprat  dan monokaprilat  merupakan  senyawa  bioaktif  VCO  yang  diduga  mempengaruhi  transduksi  sinyal reseptor EP3 sehingga menghambat induksi transkripsi gen EP3.
VCO diduga mempengaruhi ekspresi reseptor  EP3  melalui  senyawa-senyawa bioaktif  yang  terkandung  dalam  VCO. Monolaurin, monokaprat dan monokaprilat merupakan senyawa bioaktif yang termasuk  dalam  golongan  asam  lemak
rantai  sedang  yang  akan  diabsorpsi  dalam usus  halus  langsung  masuk  ke  dalam sirkulasi  darah. 26 Senyawa-senyawa  ini diduga  mempengaruhi  transduksi  sinyal reseptor  EP3  dan  menghambat  induksi transkripsi  gen  EP3  sehingga  jumlah
reseptor  EP3  menurun. 27 Namun  hingga saat ini belum diketahui senyawa aktif apa yang  ada  pada  VCO  dan  bagaimana  dapat berperan  dalam  mengatur  ekspresi  gen reseptor  EP3,  apakah  melalui  jalur  asam arakhidonat atau jalur lain.

## KESIMPULAN
Ekspresi  reseptor  EP3  meningkat pada  kelompok  tikus  yang  diberi  nikotin saja  dan  menurun  pada  kelompok  tikus yang  diberi pre-treatment diklofenak  dan VCO.  Pola  penurunan  ekspresi  reseptor EP3 pada kelompok tikus yang diberi pre- treatment VCO sebanding dengan kelompok  tikus  yang  diberi pre-treatment diklofenak.  Perlu  dilakukan  penelitian lebih lanjut mengenai efek nikotin terhadap bahan lainnya.

## DAFTAR PUSTAKA
1. National  Institute  on  Drug  Abuse.
Tobacco Addiction  – December 2011. Topics  in  Brief:  National  Institute  on Drug Abuse, 2011
2. Benowitz, N. L. Nicotine Addiction. N Engl J Med, 2010; 362(24): 2295–303.
3. Benowitz,  N.L.  Neurobiology  of
Nicotine  Addiction:  Implication  for
Smoking  Cessation  Treatment.  Am  J Med, 2008; 121(4 Suppl 1): S3-10
4. Mao  D, McGehee  DS.  Nicotine  and Behavioral Sensitization. J Mol Neurosci, 2010; 40 (1-2): 154-63
5. Laviolette  SR, van  der  Kooy  D.  The Neurobiology  of  Nicotine  Addiction: Bridging  the  Gap  from  Molecules  to Behaviour.  Nat  Rev  Neurosci, 2004; 5(1): 55-65.
6. Yamamoto,  T.,  Anggadiredja,  K.,  dan Hiranita,  T.  New  Perspective  in  The Studies  on  Endocannabinoid  and Cannabis: a Role for The Endoccannabinoid-Arachidonic  Acid Pathway  in  Drug  Reward  and  Long Lasting  Relapse  to  Drug  Taking.  J Pharmacol Sci, 2004; 96(4): 382-88.
7. Narumiya,  S.,  Sugimoto,  Y.,  dan Ushikubi,  F.  Prostanoid  Receptors: Structures,  Properties,  and  Functions. Physiol Rev, 1999; 79(4): 1193-226.
8. Sjah, S. dan Anggadiredja, K. (2007) : Study  on  The  role  of  Arachidonic Acid  Cascade  in  The  Rewarding Effects of Nicotine Using Conditioned Place  Preference  Method.  Skripsi Sarjana  Program  Studi  Sains  dan Teknologi  Farmasi  Sekolah  Farmasi ITB.
9. Lucius, A. Peran Jalur Asam
Arakhidonat  dalam  Kekambuhan  dan Ketergantungan Nikotin. Skripsi
Sarjana  Program  Studi  Sains  dan
Teknologi Farmasi. 2010.
10. Sekolah  Farmasi  ITB.  Faridah,  L.
Pengaruh  Diklofenak  pada  Perubahan Tingkat  Ekspresi  Gen  Reseptor  EP3 pada  Model  Tikus  Ketergantungan Nikotin,  Tesis  Program  Magister, Institut Teknologi Bandung. 2010.
11. Nevin,  K.  G.  dan  Rajamohan,  T.
Effect  of  Topical  of  Virgin  Coconut Oil  and  Skin  Components  and
Antioxidant  Status  during  Dermal Wound  Healing  in  Young  Rats.  Skin Pharmacol Physiol, 2010; 23(6): 290-7 12. Oghbolu  DO,  Oni  AA,  Daini  OA  ,
Oloko  AP.  In  Vitro  antimicrobial
Properties  of  Coconut  Oil  on  Candida species  in  Ibadan,  Nigeria.  J  Med Food, 2007; 10(2): 384-7.
13. Intahphuak  S,  Khonsung  P,  Panthong A.  Anti-inflammatory,  Analgesic  and Antipyretic Activities of Virgin Coconut Oil. Pharm Biol, 2010; 48(2)
: 151-7.
14. Anggadiredja  K,  Barlian  A,  Pinang YDM,  Anggraeny  D.  Virgin  Coconut Oil Prevents Nicotine Dependence and Relapse.  International  Journal  of Pharmacology, 2011; 7(5):  664-9.
15. Pinanga,  Y.  Efek  Virgin  Coconut  Oil (VCO)  dalam  Ketergantungan  dan Kekambuhan Ketergantungan Nikotin.
Skripsi  Sarjana  Program  Studi  Sains
dan Teknologi Farmasi Sekolah Farmasi ITB. 2011 16. Riviere, Jim. E. Comparative
Pharmacokinetics:
Principles, Techniques  and  Applications.  2 nd . Wiley-Blackwell, 2011: 39-72.
17. Le  Houezec  J.  Role  of  Nicotine
Pharmacokinetics in Nicotine
Addiction  and  Nicotine  Replacement Therapy: A Review. Int J Tuberc Lung
Dis, 2003; 7(9): 811-9.
18. Albuquerque EX, Pereira EF. Alkondon M, Rogers SW. Mammalian Nicotinic  Acetylcholine  Receptors: from  Structure  to  Function.  Physiol Rev, 2009; 89(1): 73-120
19. Rodriguez  De  Turco  EB, Jackson FR, DeCoster  MA, Kolko  M, Bazan
NG. Glutamate Signalling and Secretory Phospholipase A2 Modulate The Release of Arachidonic Acid from Neuronal.  J  Neurosci  Res, 2002; 68(5): 558-67.
20. Ge S, Dani JA. Nicotinic Acetylcholine  Receptors  at  Glutamate Synapses Facilitate Long-Term Depression or Potentiation. J Neurosci, 2005; 25(26): 6084-91.
21. Gijon  MA,  Leslie  CC.  Regulation  of Arachidonic Acid Release and Cytosolic Phospholipase A2
Activation.  J  Leukoc  Biol, 1999; 65(3): 330-6.
22. Gourévitch  B, Kay  LM, Martin  C. Directional Coupling from the
Olfactory  Bulb  to  the  Hippocampus during a Go/No-Go Odor Discimination Task. J Neurophysiol, 2010; 103(5): 2633-41.
23. Max L. Fletcher, Wei R. Chen. Neural Correlates  of  Olfactory  Learning:
Critical Role of Centrifugal
Neuromodulation.  Learn  Mem,  2010; 17(11): 561–70.
24. Lucas  R,  Warner  TD,  Vojnovic  I,
Mitchell  JA.  Cellular  Mechanism  of Acetaminophen: Role of Cyclooxygenase. FASEB J, 2005;
19(6): 635-7.
25. Zakaria  ZA,  Somchit  MN,  Mat  Jais AM,  Teh  LK,  Salleh  MZ.  In  vivo Antinociceptive and Anti- inflammatory  Activities  of  Dried  and Fermented  Processed  Virgin  Coconut Oil.  Med  Princ  Pract, 2011;  20(3): 231-6.
26. German JB, Dillard CJ. Saturated Fats: What Dietary Intake?. Am J Clin Nutr, 2004; 80(3): 550-9.
27. Ruzin  A,  Novick  RP.  Equivalence  of Lauric Acid and Glycerol Monolaurate as Inhibitors of Signal Transduction in Staphylococcus aureus. J Bacteriol, 2000; 182(9): 2668-71.