Efek  pemberian Chlorophyllin terhadap  kadar nitric  oxide dan malondialdehida tikus hiperkolesterolemia
Galeh S. Pontang 1 , Andrew Johan 2 , Hertanto W. Subagio 1

## ABSTRACT
Background  : Endothelial  dysfunction  is  well-known  as  an  early  stage  of  atherosclerosis.  Increased  oxidative  stress  in hypercholesterolemia triggers endothelial dysfunction that is characterized by decreased biological availability of nitric oxide (NO). Experimental studies showed that chlorophyllin had an effective antioxidant activity.
Objectives :  To  determine  the  effect  of  chlorophyllin  on  nitric  oxide  (NO)  and  malondialdehyde  (MDA)  level  of hypercholesterolemic rats.
Methods : Post test only randomized control  group used twenty four male Sprague Dawley rats were randomly divided into four groups: without treatment (technical control/K1), hypercholesterolemic (negative control/K2), hypercholesterolemic with chlorophyllin  at  dose  of  1,8  mg/200  g/d  (P1)  and  hypercholesterolemic  with  chlorophyllin  at  dose  of  3,34  mg/200g/d  (P2). Chlorophyllin was dissolved in water and was given via nasogastric tube for 21 days after the rats got hypercholesterolemia. Total cholesterol level of blood was measured by CHOD-PAP method, level of NO plasma was measured by Griess reaction and  level of MDA plasma was measured by TBARS method. Hypothesis test was analyzed by One Way Anova continued by Post hoc LSD test and Kruskall Wallis by significant level of 0,05.
Results : NO plasma level was  the lowest in group P2 (0.203+0.015 μM) and the highest in the group K2 (0,224±0,001 μM), but  no  difference  of  NO  plasma  level  among  groups  (p  =  0.118).  There  were  differences  in  MDA  plasma  level  among  the groups (p = 0.001). P1 and P2 groups had lower MDA plasma level than K2 (2.40+0.11 nmol/ml), indicated by  (1.94 +0.07 nmol/ml,  p=0.0001)  and  (1,37  +0.13  nmol/ml,  p=0.0001)  respectively,  but  still  higher  than  K1  (0.94+0.05  nmol/ml, p=0.0001).
Conclusion  : The  treatment  of  chlrophyllin  does  not  have  an  effect  of  NO  plasma  level,  but  gives  an  effect  of  lower  MDA plasma level.
Keywords: chlorophyllin, nitric oxide,malondialdehyde, hypercholesterolemia

## ABSTRAK
Latar  Belakang: Disfungsi  endotel  dikenal  sebagai  tahap  awal  dari  aterosklerosis.  Peningkatan  stres  oksidatif  pada hiperkolesterolemia memicu disfungsi endotel yang ditandai dengan penurunan ketersediaan biologis oksida nitrat (NO). Studi eksperimental menunjukkan bahwa klorofilin memiliki aktivitas antioksidan yang efektif.
Tujuan: Mengetahui  pengaruh  klorofilin  pada  oksida  nitrat  (NO)  dan  malondialdehid  (MDA)  tingkat  tikus hiperkolesterolemia.
Metode: Penelitian  eksperimen  dengan  rancangan  post  test  only  dilakukan  terhadap  24  ekor  tikus  Sprague  Dawley  secara acak  dibagi  menjadi  empat  kelompok:  tanpa  pengobatan  (kontrol  teknis  /  K1),  hiperkolesterolemia  (kontrol  negatif  /  K2), hiperkolesterolemia dengan klorofilin pada dosis 1,8 mg / 200 g / d (P1) dan hiperkolesterolemia dengan klorofilin pada dosis 3,34  mg  /  200g  /  d  (P2).  Klorofilin  dilarutkan  dalam  air  dan  diberi  melalui  pipa  nasogastrik  selama  21  hari  setelah  tikus mendapat  hiperkolesterolemia.  Kadar  kolesterol  total  darah  diukur  dengan  metode  CHOD-PAP,  tingkat  NO  plasma  diukur dengan reaksi Griess dan tingkat MDA plasma diukur dengan metode TBARS. Uji hipotesis dianalisis dengan One Way Anova dilanjutkan dengan Post hoc LSD tes dan Kruskall Wallis pada tingkat signifikan 0,05.
Hasil: Kadar NO plasma yang terendah pada kelompok P2 (0,203 + 0,015 M) dan tertinggi pada kelompok K2 (0.224 ± 0.001 M), tetapi tidak ada perbedaan tingkat NO plasma antar kelompok (p = 0,118). Ada perbedaan plasma MDA antar kelompok (p = 0,001). P1 dan P2 kelompok plasma MDA lebih rendah dibanding dengan K2 (2,40 + 0,11 nmol / ml), ditandai dengan (1,94 0,07 nmol / ml, p = 0,0001) dan (1,37 0,13 nmol / ml, p = 0,0001). Kadar MDA kelompok K1 lebih tinggi (0,94 + 0,05 nmol / ml, p = 0,0001).
Simpulan: pengobatan chlrophyllin tidak memiliki efek pada tingkat NO  plasma, tetapi memberikan efek  penurunan plasma MDA.
Kata kunci: klorofilin, oksida nitrat, malondialdehid, hiperkolesterolemia
PENDAHULUAN
Hiperkolesterolemia  merupakan  salah  satu  faktor risiko  terjadinya  aterosklerosis  yang  prosesnya diawali dengan adanya disfungsi endotel. 1,2
Aterosklerosis  telah  diketahui  sebagai  indikator penyakit  kardiovaskuler  yang  merupakan  penyebab utama kesakitan dan kematian di seluruh dunia.
1 Program Studi Gizi, Sekolah Tinggi Kesehatan Ngudi Waluyo, Indonesia
2 Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro,
Indonesia
Disfungsi  endotel  ditandai  adanya  hilangnya keseimbangan  fungsi  atau  penurunan  ketersediaan biologis nitric  oxide (NO).  NO  dikenal  sebagai endothelium-derived  relaxing  factors (EDRF)  yang memiliki  peran  penting  dalam  menjaga  homeostasis vaskuler. 3 NO  memegang  peranan  penting  dalam regulasi homeostasis vaskuler yaitu menjaga keseimbangan mekanisme vasokonstriksi dan vasodilatasi,  mencegah  dan  menstimulasi  proliferasi dan  migrasi  sel  otot  polos,  serta  trombogenesis  dan fibrinolisis. 4
Penurunan  kadar  NO  plasma  ditemukan  pada pasien  dengan  hiperkolesterolemia  yang  disebabkan adanya  peningkatan  stres  oksidatif  yang  kemudian memicu gangguan jalur dari endothelium Nitric Oxide Synthase (eNOS). 5 Gangguan yang diakibatkan antara lain  yaitu  penurunan  aktivitas  dan  ekspresi  eNOS, penurunan sensitivitas NO dan peningkatan degradasi NO yang berikatan dengan superoksida (O 2 - ) menjadi senyawa  reaktif  peroksinitrit  (ONOO - )  (Kawasima, 2004). 6 Peroksinitrit  juga  merupakan  oksidan  yang potensial dalam meningkatkan oksidasi lipid, khususnya Low Density Lypoprotein (LDL).
Peningkatan
stres oksidatif pada hiperkolesterolemia  memicu  terjadinya  peroksidasi lipid.  Peroksidasi  lipid  yang  tidak  terkendali  berefek langsung pada kerusakan membran sel dan mengawali berbagai  penyakit    seperti  jantung  koroner,  stroke, diabetes  mellitus,  penuaan  dan  lain-lain  (Utami, 2010). 7 Salah  satu  indikator  yang  sering  digunakan untuk  mengetahui  adanya  peroksidasi  lipid  dalam tubuh adalah kadar malondialdehyde (MDA) plasma. 8 Antioksidan diketahui bermanfaat untuk mengatasi adanya stres oksidatif. Pengaruh antioksidan terhadap fungsi  endotel  antara  lain quercetin yang  memacu peningkatan  ketersediaan  biologis  eNOS  pada diabetes mellitus dan puerarin yang dapat memperbaiki  ekspresi  eNOS  dan  menurunkan  indeks aterogenik pada tikus hiperkolesterolemia. 9
Klorofilin  merupakan  turunan  dari  klorofil  yang larut air dan mengandung ikatan garam Na-Cu bersifat lebih stabil dari klorofil. Salah satu manfaat klorofilin sebagai  antioksidan  yang  efektif,  khususnya  dalam mengikat  oksidan  seperti  OH - dan  O 2 - . 10 Hasil penelitian  Nurdin  (2008), 11 menunjukkan  bahwa klorofilin dosis 3,34 mg/200 g tikus dari ekstrak daun cincau berpengaruh pada profil lipid tikus hiperkolesterolemia.  Penelitian  oleh  Fathin  (2010), 12 menunjukkan  bahwa  dosis  1,8  mg/200  g  pada  tikus dapat  menurunkan  kadar  total  kolesterol  darah. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh klorofilin  terhadap  kadar  NO  dan  kadar  MDA  pada tikus hiperkolesterolemia.

## METODE DAN BAHAN
Penelitian  ini  termasuk  eksperimental  murni  dengan rancangan post  test  only  randomized  control  group design . 16 Dua  puluh  empat  tikus Sprague  Dawley jantan  berumur  8  minggu  dibagi  secara  acak  menjadi 4  kelompok,  yaitu  kelompok  kontrol  teknik  (K1) diberi  pakan  standar  dan  tanpa  perlakuan.  Kelompok kontrol  negatif  (K2)  diinduksi  hiperkolesterolemia tanpa perlakuan; kelompok perlakuan 1 (P1) diinduksi hiperkolesterolemia dengan perlakuan klorofilin dosis 1,8  mg/200  g  BB/hari;  kelompok  perlakuan  2  (P2) diinduksi  hiperkolesterolemia  dengan  perlakuan klorofilin dosis 3,34 mg/200 g BB/hari.
Induksi  hiperkolesterolemia  dengan  pemberian lemak  babi  2  ml/hari  (10%  dari  pakan  sehari  20  g) melalui  sonde  selama  14  hari  yang  kemudian dilanjutkan  hingga  akhir  penelitian.  Klorofilin dilarutkan dalam air sebanyak 1 ml diberikan melalui sonde selama 21 hari. Induksi hiperkolesterolemia dan pemberian klorofilin diberikan di pagi hari.
Pengambilan  sampel  darah  melalui  pembuluh darah  mata  ( plexus  reorbitalis ).  Darah  dipisahkan menjadi  serum  menggunakan  alat  sentrifus.  Variabel yang  diukur  adalah  kadar  NO  plasma  dengan  reaksi Griess ,  kadar  MDA  plasma  dengan  metode  TBARS, sedangkan kadar kolesterol total dengan CHOD-PAP.
Pemeliharaan  hewan  coba  dan  pemeriksaan  kadar kolesterol  total  dan  MDA  plasma  dilakukan  di  Pusat Studi Pangan dan Gizi UGM, sedangkan pemeriksaan kadar  NO  plasma  di  Laboratorium  Penelitian  dan Pengujian  Terpadu  (LPPT)  UGM,  Yogyakarta. Penelitian  dilakukan  setelah  memperoleh  dengan Ethical  Clearance dari  Komisi  Etik  Penelitian Kesehatan (KEPK) FK UNDIP/RSUP dr. Kariadi  No. 018/EC/FK/RSDK/2014 tertanggal 20 Januari 2014.
Data  kadar  MDA  plasma  dianalisis  menggunakan uji One Way Anova yang dilanjutkan dengan Post hoc LSD , sedangkan data kadar NO plasma menggunakan uji Kruskall  Wallis. 14 Adanya  perbedaan  ditemukan jika  nilai  p<0,05,  analisa  dilakukan  dengan  nilai derajat kemaknaan 0,05.

## HASIL

## Berat Badan Tikus Selama Per cobaan
Berat  badan  tikus  di  semua  kelompok  mengalami peningkatan  selama  penelitian.  Pada  awal  adaptasi, tidak terdapat perbedaan berat badan antara kelompok dengan  nilai  p=0,978  (p>0,05)  yang  berarti  bahwa tikus yang digunakan memiliki kondisi dan karakteristik  berat  badan  yang  homogen  pada  awal penelitian (gambar 1).
Pada  akhir  penelitian,  kenaikan  berat  badan  pada kelompok  K2  lebih  tinggi  daripada  kedua  kelompok perlakuan  secara  signifikan  masing-masing  yaitu p=0,041(P1)  dan  p=0,23(P2),  (p<0,05),sedangkan berat  badan  antara  kelompok  perlakuan  (P1  dan  P2) tidak berbeda dengan nilai p=0,780 (p>0,05) (gambar 1).
Gambar  1.   Diagram perubahan berat badan tikus selama percobaan.
Ket : = K1,   =K2,  = P1 dan   = P2
Kadar  Kolesterol  Total  Darah  Tikus  Selama Percobaan
Gambar  2. Diagram perubahan kadar kolesterol total darah tikus selama percobaan Ket : = K1,   =K2,  = P1 dan    = P2
Kadar  kolesterol  total  darah  di  awal  penelitian  antara kelompok  menunjukkan  tidak  adanya  perbedaan dengan  nilai  p=0,726  (p>0,05)  yang  berarti  antara kelompok memiliki karakteristik kadar kolesterol total darah  yang  homogen  (gambar  2).  Kenaikan  kadar kolesterol  total  darah  terjadi  pada  ketiga  kelompok setelah diinduksi  hiperkolestrolemia.  Di  akhir
penelitian, kadar kolesterol total darah pada kelompok K2  terus  meningkat,  sedangkan  kelompok  perlakuan mengalami  penurunan.  Kelompok  P2  memiliki  kadar kolesterol  total  darah  lebih  rendah  dibanding  P2 (p=0,0001).
Pengaruh  Klorofilin  Kadar Nitric  Oxide (NO)
plasma
Hasil  penelitian  menunjukkan  rerata  kadar  NO
plasma tertinggi pada kelompok K2 yaitu 0,224±0,001μM , sedangkan terendah pada kelompok P2  yaitu  0,203±0,015μM.  Uji  beda  yang  dilakukan menunjukkan  bahwa  tidak  ada  perbedaan  kadar  NO plasma  di  antara  kelompok  penelitian  (p=0,018).  Hal tersebut dapat disimpulkan bahwa tidak ada pengaruh pemberian klorofilin terhadap  kadar NO plasma pada tikus hiperkolesterolemia (tabel 1).
Gambar 3. Diagram  kadar  NO  plasma  tikus  di  akhir percobaan Pengaruh Klorofilin Kadar Malondialdehyde
(MDA) plasma
Gambar 4. Diagram kadar MDA plasma tikus di akhir percobaan
Hari
Pada akhir penelitian kelompok P2 memiliki kadar MDA  terendah  di  antara  kelompok  perlakuan  yaitu 1,37+0,13  nmol/ml  atau  57%  lebih  rendah  daripada kelompok  K2,  namun  masih  lebih  tinggi  dibanding kelompok K1 yaitu 0,94+0,05 nmol/ml. Uji beda yang
dilakukan  menunjukkan  bahwa  terdapat  perbedaan kadar  MDA  plasma  di  antara  kelompok  penelitian. Hal  ini  berarti  ada  pengaruh    pemberian  klorofilin terhadap kadar MDA plasma pada tikus hiperkolesterolemia (tabel 1).
Tabel 1. Pengaruh klorofilin terhadap kadar nitric oxide plasma dan kadar malondialdehyde plasma Parameter K1 Kelompok perlakuan p K2 P1 P2 Kadar NO (μM) 0,218±0,016 0,224±0,001 0,220±0,003 0,203±0,015 0,118 b Kadar MDA (nmol/ml) 0,94±0,05 2,40±0,11 1,94±0,07 1,37±0,13 0,001 a
a Uji One Way Anova b Uji Kruskal Wallis

## PEMBAHASAN
Pada  penelitian  ini  induksi  hiperkolesterolemia  dapat memicu  kenaikan  berat  badan.  Pemberian  lemak secara terus menerus memicu terjadinya keseimbangan  energi  positif  disebabkan  lemak memiliki  nilai  konversi  yang  lebih  tinggi  daripada karbohidrat  dan  protein  (4  kkal/g),  yaitu  9  kkal/g. Kelebihan asupan energi secara akumulatif menyebabkan menumpuknya jaringan lemak sehingga memacu kenaikan berat badan pada tikus. 15 Kenaikan berat  badan  kelompok  diinduksi  hiperkolesterolemia yang  lebih  tinggi  daripada  kelompok  kontrol  juga ditemukan oleh Yan et al. 9
Sintesa  kolesterol  di  tubuh  prosesnya  melalui  dua jalur  yaitu  endogen  dan  eksogen.  Dua  pertiganya dipenuhi  melalui  jalur  endogen,  sisanya  dari  eksogen yaitu  dari  asupan  makanan. 16 Kandungan  kolesterol yang  tinggi  pada  lemak  babi  (85,17  mg/100g) meningkatkan  sintesis  kolesterol  melalui  jalur eksogen. 17 Sintesis  kolesterol  juga  dipicu  dengan adanya asam lemak jenuh, terutama dengan rantai C > 14. 15 Asam  lemak  jenuh  memicu  sintesa  kolesterol, khususnya  LDL-kolesterol  dalam  hati.  Asam  lemak jenuh juga  menurunkan  ekspresi reseptor  LDL dalam hati  sehingga  terjadi  akumulasi  LDL  di  plasma  dan peningkatan  pembentukan  LDL  dari  VLDL. 16 Lemak babi  mengandung  tinggi  asam  lemak  jenuh,  terutama jenis  palmitat dan stearat (rantai C>14). 18 Pada  penelitian  ini  tidak  ditemukan  perbedaan kadar NO plasma antara kelompok penelitian. Induksi hiperkolesterolemia  maupun  pemberian  perlakuan klorofilin  tidak  memberikan  efek  kadar  NO  plasma dibanding kelompok kontrol teknik. Keadaan tersebut menunjukkan bahwa induksi hiperkolesterolemia yang diberikan tidak memiliki efek terhadap fungsi endotel. Hasil  penelitian  ini  mendukung  Lorkowska  et  al, 19 tikus  hiperkolesterolemia  (hipertensi/non-hipertensi) tidak mempengaruhi fungsi endotel dengan mengukur kemampuan  dilatasi  pembuluh  darah.  Disfungsi endotel  ditemukan  hanya  pada  tikus  yang  diinduksi
diet  tinggi  fruktosa  yang  memicu  resistensi  insulin dan  hipertrigliseridemia, 20 walaupun  pada  penelitian Garjani  et  al, 21 keadaan  hiperkolesterolemia  dapat memicu  adanya  disfungsi  endotel  dengan  mengukur kemampuan relaksasi pada pembuluh aorta thoracic.
Superoksida  dismustase  (SOD)  merupakan  enzim utama  yang  berperan  menetralkan  superoksida  (O 2 -) menjadi  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )yang  kemudian dikonversi  menjadi  air  oleh  katalase  (CAT)  dan glutation  peroksidase  (GSH-Px). 22 Menurut  White  et al, 23 aktivitas  SOD  tidak  cukup  efektif  mengikat  O 2 - yang  meningkat  pada  keadaan  hiperkolesterolemia. Hal  tersebut  didukung  oleh  Wu  JH  et  al, 24 bahwa aktivitas  SOD  tidak  membaik  meski  diberikan senyawa  antioksidan.    Penurunan  kadar  NO  plasma berkaitan  dengan  O 2 - yang  kadarnya  tergantung aktivitas  SOD,  namun  baik  kadar  O 2 - atau  aktivitas SOD  pada  penelitian  ini  tidak  dapat  dijelaskan  dan menjadi keterbatasan penelitian ini.
Pada  penelitian  ini,  kadar  NO  terendah  justru terdapat  di  kelompok  P2  dan  tertinggi  kelompok  K2, walaupun tidak berbeda signifikan.  Kadar NO plasma yang  lebih  rendah  daripada  kelompok  K1  merupakan tanda  menurunnya  ketersediaan  biologis  NO.  Pada keadaan hiperkolesterolemia disertai hiperhomosisteinemia
disebabkan
homosistein merupakan  fraksi  dari  lipoprotein. 25 Menurut  Emsley et al, 26 pemberian Cu 2+ pada keadaan hiperhomosisteinemia memicu
penghambatan relaksasi dimediasi NO. Konsentrasi Cu 2+ yang tinggi menurunkan kemampuan enzim  CAT dan SOD serta mengkatalisis  produksi  O 2- dan  H 2 O 2 sehingga menyebabkan  penurunan  produksi  NO  endotel. 27 Konsentrasi Cu 2+ yang tinggi juga mengoksidasi LDL yang  kemudian  memicu  peroksidasi  lipid  sehingga mengganggu  fungsi  normal  sel  endotel  melalui penurunan  kadar  NO. 28,29 Berdasarkan  mekanisme tersebut  diduga  kandungan  Cu 2+ pada  klorofilin mempengaruhi kadar NO plasma.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa klorofilin berpengaruh  terhadap  kadar  MDA  plasma.  Hasil  ini
mendukung  penelitian  Nurdin  dkk  (2008), 11 bahwa pemberian  klorofilin  dari  daun  cincau  dapat menurunkan kadar MDA pada tikus hiperkolesterolemia.  Hasil  penelitian  serupa  juga didapatkan  oleh  Jiangwei  M et  al (2011), 30 yang menunjukkan  bahwa  pemberian  antioksidan  (ekstrak Astragalus  mongholicus )  dapat  menurunkan  kadar MDA  pada  tikus  dengan  diet  tinggi  kolesterol. Keadaan hiperkolesterolemia dapat memicu terjadinya peningkatan stres oksidatif akibat produksi berlebihan dari radikal bebas, diantaranya yaitu O 2 - , NO - , radikal hidroksi (OH - ) dan radikal lipid (LOH - ). 29 Peningkatan radikal  bebas  berpotensi  memicu  terbentuknya senyawa  reaktif  oksigen  seperti  H 2 O 2 dan  senyawa reaktif  nitrogen  seperti  peroksinitrit  (ONOO - )  atau senyawa  reaktif  lain  seperti  asam  hipoklorus (HOCl). 31 Senyawa reaktif tersebut kemudian bereaksi dan    mengoksidasi  lipid  yang  tidak  jenuh  (PUFA) pada membran sel atau disebut peroksidasi lipid yang kemudian  memicu  kerusakan  membran  sel  serta komponen di dalam sel. 32
Antioksidan  berperan  dalam  mempengaruhi  reaksi rantai tersebut dengan memindahkan produk intermediet radikal bebas, menghambat agen oksidasi lain. 33 Pemberian senyawa antioksidan juga berpengaruh  meningkatkan  aktivitas  CAT  dan  GSH- Px  yang  berfungsi  dalam  konversi  H 2 O 2 menjadi  air, H 2 O 2 diketahui  juga  senyawa  reaktif  yang  dapat memicu peroksidasi lipid. 24
Salah  satu  peran  klorofilin  yang  sangat  penting adalah sebagai anti oksidan. Secara in vitro, klorofilin melindungi sel dari stres oksidatif dengan menangkap Reactive  Oxygen  Species (ROS)  yang  terbentuk, 33 khususnya senyawa yang mengandung singlet oxygen seperti OH - , O 2 - dan 1 O 2 . 10 yang kemudian membentuk senyawa  kloroperoksi  radikal  yang  mencegah  adanya peroksidasi lipid.  Klorofilin juga  berpengaruh efektif mencegah  peroksidasi  lipid  dalam  keadaan  enzim SOD tidak aktif dan penurunan GSH-Px. 22

## SIMPULAN
Pemberian  klorofilin  tidak  memberikan    pengaruh pada kadar NO plasma pada tikus hiperkolesterolemia.  Pemberian  klorofilin  dosis  3,34 mg/200 g BB/hari memberikan pengaruh kadar MDA plasma  yang  lebih  rendah  dibanding  kelompok  lain yang hiperkolesterolemia.

## SARAN
Perlu  penelitian  lebih  lanjut  dengan  mengukur  kadar O 2 - atau  aktivitas  SOD  dan  pemeriksaan  fungsi endotel lain seperti kemampuan relaksasi endotel.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Amin KA, Abd El-Twab TM. Oxidative markers, nitric  oxide  and  homocysteine  ateration  in hypercholesterolemic  rats:  role  of  atorvastatine and cinnamon .  Int  J  Clin  Exp  Med.  2009;  2:254- 65.
2. Feron  O,  Dessy  C,  Moniotte  S,  Desager  JP, Balligand  JL.    Hypercholesterolemia  decreases nitric  oxide  production  by  promoting  the interaction of caveolin and endothelial nitric oxide synthase. Journal of  Clinical Investigation. 1999; 103:897-905
3. Carr  AC,  McCall MR,  Frei  B.  Oxidation  of  LDL myeloperoxidase  and  reactive  nitrogen  species  : reaction  pathways  and  antioxidant  protection. Arterioscler  Thromb  Vasc  Biol.  2000;  20:1716- 23.
4. Davignon  J,  Ganz  P.  Role  of  endothelial dysfunction in atherosclerosis. J. American Heart Association . 2004; 109(Suppl III):27-32.
5. Sardo  MA  et  al.  Effect  of  atorvastatin  treatment on  Sicam-1  and  plasma  nitric  oxide  levels  in hypercholesterolemic  subject.  Clin  Appl  Thromb Hemost. 2002; 8(3):257-63.
6. Kawashima  S  and  Yokohama  M.  Dysfunction  of endothelial nitric oxide synthase and atherosclerosis.  Journal  of  The  American  Heart Association. 2004; 24: 998-1005.
7. Utami  DFR.  Peroksidasi  lipid  pada  tikus hiperkolesterolemia  selama  pemberian  ekstrak kulit  batang  mahoni  ( Swietenia  macrophylla ) [Sarjana  Skripsi].  Bogor:  Institut  Pertanian Bogor:2010.
8. Nielsen  F,  Mikkelsen  BB,  Nielsen  JB,  Andersen HR,  Grandjean  P.  Plasma  malondialdehyde  as biomarker  for  oxidative  stress:  reference  interval and  effects  of  life-style  factors.  Clinical Chemistry, 1997;43(7): 1209-14.
9. Yan Li-Ping, et al. Puerarin decreases serum total cholesterol and enhances thoracic aorta endothelial nitric oxide synthase expression in diet induced  hypercholesterolemic rats. Life Sciences, 2006; 79:324-30.
10. Kamat  PJ,  Boloor  KK,  Devasagayam  TPA. Chloropyllin  as  an  effective  antioxidant  against membran  damage  in  vitro  and  ex  vivo. Biochimica  et  Biophysica  Acta.  2000;  1487:113- 27.
11. Nurdin,  Khomsan  A,  Marliyanti  SA,  Anwar  F, Kusharto  CM,  Agungpriyono  DR.  Pengaruh pemberian bubuk ekstrak cu-turunan klorofil daun cincau ( premna oblongifolia merr ) terhadap profil
lipid  darah  kelinci.  Media  Gizi  dan  Keluarga, 2008; Juli 32(1): 104-14.
12. Fathin  K.  Pengaruh  pemberian  klorofil  dari tanaman alfalfa ( Medicago Sativa) terhadap kadar kolesterol total tikus putih ( Rattus norvegicus )[Sarjana Skripsi] Surakarta: Universitas Sebelas Maret; 2010.
13. Campbell  DT,  Stanley  JC.  Experimental  and quasi-experimental  designs  for  research.  Boston: Houghton Mifflin Company; 1966.
14. Dahlan,  MS.  Statistik  untuk  kedokteran  dan kesehatan. Jakarta: Salemba Medika; 2011.
15. Gropper,  SS,  Smith  JL,  Groff  JL.  Advanced nutrition  and  human  metabolism.  Wadsworth: Wadsworth Cengange Learning; 2009.
16. Murray  RK,  Granner  DK,  Mayes  PA,  Rodwell VW  (Ed.).  Biokimia  Harper:  Alih  bahasa  Andri Hartono. Jakarta:EGC; 2001.
17. Tobing  SWL.  Perbandingan  kualitas  karkas  dan daging  antara  babi  peliharaan  dengan  babi  hutan. [Master  Tesis].  Padang:  Universitas  Andalas; 2012.
18. Buettner  R  et  al.  2006.  Defining  High-Fat  Diet Models:  Metabolic  and  Molecular  Effect  of Different  Fat  Types.  Journal  of  Moleculer Endocrinology, 36:485-501.
19. Lorkwoska  B  et  al . Hypercholesterolemia  does not  alter  endothelial  function  in  spontaneously hipertensive  rats.  The  Journal  of  Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2006; 317: 1019- 26.
20. Bartus  M  et  al.  2005.  Hypertriglyceridemia  but not  Hypercholesterolemia  Induces  Endothelial Dysfunction in The Rat. Pharmacological Report, 57(Suppl): 127-37.
21. Garjani  A,  Azarmy  Y,  Zakheri  A,  Akbari  NA, Andalib S, Maleki-Dijazi N. Vascular dysfunction in  short-term  hypercholesterolemia  despite  the absence  of  atherosclerotic  lesion.  Journal  of Cardiovasculer  and  Thoracic  Research.  2011; 3:73-7.
22. Devasagayam  TPA,  Tilak  JC,  Boloor  KK,  Sane KS,  Ghaskadbi  SS,  Lele  RD.  Free  radical  and antioxidants  in  human  health:  Current  status  and future  prospects.  Journal  of  Association  of Physicians of India. 2004; 52:794-804.
23. White  CR  et  al.  Superoxide  and  peroxinitrite  in atherosclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994; 91:1044-8.
24. Wu  JH,  et  al.  Suppresion  of  diet-induced hypercholesterolemia  by  turtle  jelly,  a  traditional chinese  functional  food,  in  rats.  Evidence-Based Complementary  and  Altervative  Medicine,  2012: 15p.
25. Olszewski  AJ  and    McCully  KS.  Homocysteine content  of  lipoprotein  in  hypercholesterolemia. Science Direct, 1991; 91:257-4.
26. Emsley  AM,  Jeremy  JY,  Gomes  GN,  Angelini GD,  Plane  F.  Investigation  of  the  inhibitory effects of homocystein and copper on nitric oxide- mediated  relaxation  of  rat  isolated    aorta.  British Journal of Pharmacology. 1999; 126:1034-40.
27. Huck D, Thuraisingham RC, Raftery MJ, Yaqoob MM.  Homocystein  induced  impairment  of  nitric oxide-dependent  vasorelaxation  is  reversible  by the  superoxida  dismustase  mimetic  tempol. Nephrol Dial Transplant. 2004 ; 19:1999-2005.
28. Filipe  P et  al .    Anti-  and  Pro-oxidant  Effects  of Quercetin  in Cpper-Induced Low Density Lipoprotein  Oxidation.  European  Journal  of Biochemistry. 2004; 271:1991-99.
29. Stapleton  PA,  Goodwill  AG,  James  EM,  Brock RW,  Frisbee  JC.  Hypercholesterolemia  and
Microvasculer Dysfunction: Interventional
Strategies. Journal of Inflammation, 2010; 7:54.
30. Jiangwei M, Zengyong Q,  Xia X. Aqueos extract of  astragalus  mongholicus  ameliorates  high cholesterol  diet  induced  oxidative  injury  in experimental  rats  model.  Journal  of  Medicinal Plants Research. 2011; 5:855-58.
31. Aher  VD,  Wahi  A,  Pawdey  AM,  Sonawane  A. Antioxidants  as  immunomodulator:  an  expanding reseach  avenue.  International  Journal  of  Current Pharmaceutical Research. 2011; 3(1):8-10.
32. Cai H, Harrison DG. Endothelium dysfunction in cardiovascular diseases: the role of oxidant stress. Journal of The American Heart Association. 2000; 87:840-44.
33. Kumar  SS,  Shankar  B,  Sainis  KB.  Effect  of chlorohyllin  againts  oxidative  stress  in  splenic lymphocytes  in  vitro    and  in  vivo.  Biochimia  et Biophysica Acta. 2004; 1672: 100-11.