## UNPAD

## Molecular Docking of Bioactive Compounds from Wungu Leaves
( Graptophyllum pictum (L) Griff) as Tyrosinase Inhibitors

## Abdul Aziz*, Dimas Andrianto, Mega Safithri
Department of Biochemistry, Faculty of Sciences and Mathematics, IPB University, West Java, Indonesia
Submitted 25 october 2021; Revised 25 november 2021; Accepted 26 november 2021; Published 30 june 2022 *Corresponding author: abdulargapura@gmail.com

## Abstract
Melasma is characterized as a skin disorder by hyperpigmentation of the skin in areas exposed to sunlight. Currently, melasma treatment and cosmetic applications as a whitening agent were carried out by regulating tyrosinase activity through the use of compounds such as kojic acid which poses a health risk. Therefore, it was necessary to have other alternatives that can regulate tyrosinase activity without harming health, one of them is wungu leaves which is become a novelty of this research. This study aimed to determine inhibitory effects of wungu leaves ( Graptophyllum pictum (L) Griff) bioactive component as an agent to inhibit tyrosinase activity through a molecular docking approach. A total of 28 wungu leaves bioactive components as a result of the analysis of Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) and Gas Chromatography-Flame Ionization Detector (GC-FID) were tested for their inhibitory effects on tyrosinase activity. Linolenic acid and phytol were ligands that have the best inhibition on tyrosinase enzyme activity with affinity energies of -5.8 kcal/mol and -5.4 kcal/mol, respectively, and inhibition constants of 55.718 M and 109.489 M. It shows that ligands from wungu leaves have inhibit activity against tyrosinase.
Keywords: Graphtophyllum pictum L. Grift; hyperpigmentation; melanogenesys; molecular docking; tyrosinase
Penambatan Molekuler Senyawa Bioaktif dari Daun Wungu ( Graptophyllum Pictum (L) Griff) sebagai Inhibitor Tirosinase

## Abstrak
Melasma merupakan kelainan kulit yang ditandai dengan hiperpigmentasi kulit pada daerah yang terpapar sinar matahari. Saat ini pengobatan melasma maupun pemutih dilakukan dengan meregulasi aktivitas tirosinase melalui penggunaan asam kojat yang menimbulkan risiko bagi kesehatan. Oleh sebab itu perlu ada alternatif lain yang dapat meregulasi aktivitas tirosinase tanpa memberikan dampak negatif terhadap kesehatan, salah satunya adalah daun wungu yang menjadi kebaruan dalam penelitian ini. Penelitian ini bertujuan memprediksi daya inhibisi komponen bioaktif daun wungu ( Graptophyllum pictum (L)  Griff)  sebagai  agen  penghambat  aktivitas  tirosinase  melalui  pendekatan  penambatan molekuler. Sejumlah 28 komponen bioaktif daun wungu hasil analisis Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)  dan Gas Chromatography-Flame Ionization Detector (GC-FID)  diuji  daya inhibisinya terhadap aktivitas tirosinase. Asam linolenat dan fitol merupakan ligan uji yang memiliki daya inhibisi terbaik dengan energi afinitas masing-masing sebesar -5,8 kkal/mol dan -5,4 kkal/mol serta konstanta inhibisi 55,718 μM dan 109,489 μM. Hal ini menunjukkan ligan-ligan uji dari daun wungu memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim tirosinase. Kata  Kunci: Graphtophyllum pictum L.  Grift;  hiperpigmentasi;  melanogenesis;  penambatan molekuler; tirosinase

## 1. Pendahuluan
Melasma merupakan kelainan kulit yang ditandai dengan hiperpigmentasi kulit pada daerah yang terpapar sinar matahari terutama wajah 1 . Melasma termasuk kategori kelainan kulit yang dominan di beberapa negara. Sebuah survey telah dilakukan terhadap  53.343  diagnosis  pada  beberapa klinik dermatologi di Brazil tahun 2006 oleh Brazilian Society of Dermatology (BSD). Hasil survey menunjukkan melasma merupakan kelompok terbesar ketiga penyakit dalam praktik dermatologi. Selain itu sebuah penelitian yang dilakukan di Nepal pada tahun 2008 terhadap 546 orang pasien dermatologi menunjukkan bahwa melasma merupakan kelainan dermatologi yang paling sering dilaporkan. Sementara itu, sebuah studi yang dilakukan di Saudi Arabia terhadap data dari 1076 pasien dermatologi menunjukkan melasma merupakan kelainan dermatologi keempat paling tinggi 2 . Melasma terjadi karena akumulasi melanin di dalam sel. Pembentukan pigmen melanin atau melanogenesis hakikatnya merupakan fotoprotektif yang paling penting dalam menanggapi radiasi sinar ultraviolet dari matahari dan karsinogenesis. Sehingga hilangnya melanin dan depigmentasi yang abnormal justru dapat menjadi masalah estetika dan dermatologis wajah yang serius pada manusia. Sebaliknya, peningkatan sintesis melanin dan akumulasi pigmen yang berlebih atau dikenal hiperpigmentasi juga dapat menyebabkan berbagai jenis gangguan kulit termasuk diantaranya melasma 3 . Biosintesis melanin di dalam sel melibatkan sebuah enzim sentral atau rate limiting enzim yaitu tirosinase. Biosintesis melanin dapat direduksi dengan menghambat aktivitas rate limiting enzim dalam lintasan metabolisme melanogenesis. Data Badan Pengawasan Obat  dan  Makanan  (BPOM)  2021 menunjukkan bahwa kosmetik mengalami peningkatan  cukup  signifikan  dalam  hal produk yang terdaftar selama periode enam tahun  terakhir  (2016-2021).  Kosmetik mengalami peningkatan yang cukup tinggi dari 0,01% pada tahun 2016 menjadi 57,4% pada tahun 2021. Sejak tahun 2018 sampai
dengan tahun 2021 kosmetik juga merupakan produk dengan prosesntase paling tinggi dibandingkan dengan produk lain seperti obat, obat tradisional, suplemen makanan dan makanan atau minuman 4 . Senyawa yang saat ini umum digunakan untuk meregulasi aktivitas tirosinase atau inhibitor tirosinase diantaranya adalah asam kojat, hidrokuinon, asam askorbat, arbutin dan merkuri. Asam kojat dalam hal ini merupakan senyawa dengan aktivitas inhibisi yang paling besar dibandingkan dengan senyawa tersebut diatas. Akan tetapi, asam kojat diketahui bersifat karsinogenik. Hasil penelitian menunjukkan aplikasi asam kojat  pada  konsentrasi  2%  secara  signifikan meningkatkan hepatokarsinogenisis pada tikus 5 . Penggunaan asam kojat dalam jangka panjang dengan konsentrasi tinggi justru dapat menyebabkan kerusakan pada kulit 6 . Hasil  penelitian  lain  menunjukkan  bahwa hidrokuinon menyebakan kerusakan pada bagian epidermis kulit serta menyebabkan inflamasi pada sel yang terletak pada lapisan kulit yang lebih dalam. Selain itu, hidrokuinon juga  menyebabkan  inflamasi  di  sekitar kelenjar sebaceous dan folikel rambut 7 . Penelitian untuk mengeksplorasi komponen bioaktif alami sebagai inhibitor tirosinase merupakan sebuah kebutuhan yang harus dilakukan guna memperoleh inhibitor tirosinase yang tidak memberikan dampak negatif terhadap kesehatan. Penelitian ini bertujuan menentukan daya inhibisi komponen bioaktif daun wungu sebagai agen penghambat aktivitas tirosinase melalui penambatan molekuler. Pendekatan ini dipilih karena mampu memprediksi konformasi yang cukup optimal antara ligan dengan situs pengikatan protein 8 .  Hal  ini  juga  menjadi dasar acuan untuk melakukan penelitian lebih lanjut melalui pendekatan in vitro . Daun wungu diharapkan dapat menghambat aktivitas tirosinase berkaitan dengan komponen bioaktif yang dimilikinya.

## 2.  Metode
2.1.  Alat Penelitian dilakukan menggunkan perangat personal computer dengan spesifikasi
Processor  Intel(R)  Core (TM) i3-2350m  CPU @  2.30GHz  (4CPUs)  ~2.3GHz,  memory 2048MB  RAM,  sistem  operasi  windows  7. Perangkat lunak yang digunakan MarvinView 6.0.0, BIOVIA Discovery Studio Visualizer v16.1.0.15350, AutoDockTools-1.5.68,
Marvin  Sketch,  Ligplot+  dan  PyMOL (TM) 1.7.4.5 Edu.
2.2.  Bahan Bahan yang digunakan adalah ligan berupa komponen bioaktif daun wungu ( Graptophyllum pictum (L) Griff) hasil analisis Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)  dan Gas Chromatography-Flame Ionization Detector (GC-FID) pada beberapa penelitian 9,10,11,12 . Ligan yang dimaksud terdiri atas  asam  linolenat,  isofitol,  asam  palmitat, fitol,  heksahidrofarnesil  aseton,  tetrakosan, heptakosan, triakontan, oktakosan, trikosan, nonakosan, pentakosan, heksakosan, n-hentriakontan,  stigmasterol,  kuersetin, rutin, stigmast-5-en-3-ol ,  β  sitosterol,  γ tokoferol, skualen, pyridine-3-carboxamide, propan-2-yl hexadecanoate, (e)-tricos-9-ene , mirisetin, 2,2,2-trifluoro-1-(p-tolil)  etanon dan benzilamino asetaldehid o-benzil. Asam kojat sebagai kontrol dan tropolon sebagai native ligan serta struktur 3D reseptor enzim tirosinase mutan dengan PDB ID 5m8t. Tirosinase PDB ID 5m8t merupakan struktur protein mutan resolui lebih baik daripada wildtype . Selain itu hasil analisa in vitro antara tyrosinase-related protein 1 dalam bentuk terkompleks  dengan  CU  (TYRP1-Cu)  baik wildtype maupun  mutan  (TYRP1-3M-Cu) keduanya menunjukkan aktivitas tirosinase 13 .
2.3. Preparasi  Struktur,  Analisis  Kelarutan dan Daya Serap Ligan
File struktur 2D ligan diunduh dari laman pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. dalam format *.sdf untuk kemudian dikonversi ke stuktur 3D dalam format *.pdb dengan mengunakan software Discovery Studio .  Kemudian  atom hidrogen ditambahkan dengan menggunakan aplikasi AutoDockTools-1.5.6. Hasil optimasi ini disimpan dalam format *.PDBQT. Analisis stabilitas ligan dilakukan dengan mengacu kepada kelarutan dan daya serap di
dalam tubuh melalui aturan Lipinski dengan mengakses  laman  http://www.scfbio-iitd.res. in/software/drugdesign/ lipinski.jsp.
2.4.  Analisis Toksisitas Ligan Analisis potensi toksisitas ligan dilakukan secara online dengan menggunakan bantuan  laman  http://lmmd.ecust.edu.cn/ admetsar1/predict/.  Sampel  ligan  yang dianalisis diunggah ke laman tersebut kemudian dipilih menu predict hingga keluar hasil analisis pada laman yang sama 14 .
2.5.  Preparasi Struktur Reseptor Reseptor yang digunakan dalam penelitian ini adalah struktur enzim tirosinase yang diunduh dari laman NCBI online database dengan kode aksesi 5m8t. Data reseptor diperoleh dalam format *.fasta untuk kemudian diubah ke struktur tiga dimensi dalam format *.pdb dengan menggunakan software Discovery Studio . Ligan dan molekul air yang masih terikat dengan reseptor diputus/dihapus  kemudian  atom  hidrogen ditambahkan ke protein atau reseptor dengan menggunakan software yang sama yaitu Discovery Studio dan hasilnya disimpan dalam format  *.fasta.  Hasil  preparasi  kemudian dikonversi ke dalam format *.pdbqt dengan menggunakan aplikasi AutoDockTools -1.5.6. Analisis diagram Ramachandran dilakukan secara  online  menggunakan  PROCHECK dengan  mengakses  laman  http://servicesn. mbi.ucla.edu/.  Struktur  3D  5m8t  yang diunduh dari protein data bank diunggah ke laman  PROCHECK  kemudian  diklik  “run procheck”.
2.6.  Validasi Metode Penambatan Molekuler Validasi metode penambatan molekuler dilakukan dengan menentukan nilai grid box 15 . Dimensi grid box yang digunakan yaitu x = 16, y = 16, z = 16 dengan jarak antar atom 1 Å. Validasi ini dilakukan hingga diperoleh nilai Root Mean Standard Deviation (RMSD) kurang dari 2 Å sejumlah minimal 3 nilai dari 20 kali validasi 16 .
2.7. Penambatan Molekuler Ligan Uji Struktur ligan dan reseptor yang
telah dipreparasi disimpan dalam format .pdbqt dan disalin ke folder Vina. Program AutoDockTools-1.5.6  dijalankan  melalui Command Prompt (CMD).  Perintah pemrograman yang dijalankan yaitu “vina  –config  conf.txt  –log  log.txt”.  Hasil penambatan molekul didapatkan dokumen out dengan format *.pdbqt dan log yang berisi energi  afinitas  dan  RMSD  dengan  format *.txt.

## 2.8. Analisis Hasil Penambatan Molekuler
Analisis dilakukan dengan mengacu kepada dokumen out yang memuat data perubahan  energi  bebas  Gibbs  (ΔG)  serta analisis posisi ligan dengan menggunakan bantuan aplikasi LigPlot+ dan PyMOL. Hasil dari  LigPlot+  tersebut  merepresentasikan diagram interaksi ligan dengan reseptor. Adapun energi yang diperoleh dari penambatan digunakan untuk keperluan analisa  afinitas  ligan  dengan  reseptor  serta Konstanta  Inhibisi  (KI)  dari  ligan  terhadap reseptor.  Konstanta  Inhibisi  ligan  diperoleh dari  persamaan  ΔG=RTlnKI  (ΔG  =  Energi bebas gibbs (kkal/mol), R = 1.986 kal/molK, T = 298.15 K) 17 .
3.  Hasil 3.1. Struktur,  Kelarutan  dan  Daya  Serap Ligan Ligan yang digunakan dalam penelitian ini merupakan komponen bioaktif tanaman daun wungu hasil analisis GC-MS dan GC- FID. Komponen utama bioaktif daun wungu terdiri atas fitol (75,7 %), n- nonakosan (6,5
%)  dan  heksahidrofarnesil  aseton  (2,6  %) 10 . Kelarutan  dan  daya  serap  ligan  dianalisis dengan  menggunakan  aturan  Lipinski  yang terdiri atas massa molekul relatif, donor ikatan hidrogen, akseptor ikatan hidrogen, log P dan refraktivitas molar. Tabel 1 menunjukkan data hasil analisis kelarutan dan daya serap ligan dari daun wungu yang digunakan dalam penelitian. Berdasarkan hasil analisis pada Tabel 1 didapatkan bahwa tidak semua ligan  memenuhi  aturan  Lipinski,  beberapa diantaranya memiliki nilai diluar parameter standar pada lebih dari dua parameter.

## 3.2. Toksisitas Ligan
Analisis toksisitas ligan dilakukan dengan harapan senyawa target yang menjadi kandidat obat dapat bekerja efektif tanpa memberikan dampak negatif bagi organisme pengguna. Analisis ini dilakukan dengan menggunakan  bantuan  laman  http://lmmd. ecust.edu.cn/admetsar1/predict/ untuk memprediksi toksistas setiap ligan yang digunakan dalam penelitian. Parameter kontrol analisis toksisitas yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas inhibisi human ether a go-go related gene (herG), karsinogenisitas, dan toksisitas oral akut (Tabel 2).
3.3.  Struktur Reseptor
Reseptor yang digunakan dalam penelitian merupakan struktur enzim tirosinase  Homo  sapiens  dengan  PDB  ID 5m8t yang diperoleh dari laman Protein Data Bank. Struktur enzim tirosinase 5m8t
Gambar 1 Diagram Ramachandran tirosinase (PDB ID : 5m8t) (sumber : https://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/)
I Most favoured regions III G e n e r o u s l y allowed regions II
Additional allowed regions
IV
Disallowed
regions
Phi (degrees)
Ligan Massa molekul relatif Donor ikatan hidrogen Akseptor ikatan hidrogen Log P Refraktivitas molar tropolon asam kojat stigmasterol kuersetin mirisetin 2,2,2-trifluoro-1-(p- tolil) etanon rutin β sitosterol γ tokoferol stigmast-5-en-3-ol benzilamino asetalde -
hid o-benzil asam linolenat skualen isofitol pyridine-3-carbox- amide asam palmitat fitol heksahidrofarnesil aseton propan-2-yl hexadec- anoate tetrakosan (e)-tricos-9-ene heptakosan triakontan oktakosan trikosan nonakosan pentakosan heksakosan n-hentriakontan 118,00 138,00 412,00 302,00 318,00 203,00 610,00 414,00 312,00 414,00 254,00 278,00 410,00 296,00 122,00 256,00 296,00 268,00 298,00 338,00 322,00 380,00 422,00 394,00 324,00 408,00 352,00 366,00 436,00 2 2 1 5 6 1 0 1 5 1 1 1 0 1 2 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 4 1 7 8 2 6 1 6 1 3 2 0 1 3 2 1 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -0,545 -1,446 7,801 2,011 1,717 2,634 -1,879 8,025 -0,053 8,025 2,979 5,661 10,605 6,363 0,181 5,552 6,364 6,015 6,419 9,608 8,994 10,779 11,949 11,169 9,218 11,559 9,999 10,389 12,339 27,139 28,680 128,123 74,050 75,715 45,707 137,495 128,217 77,146 128,217 77,872 86,900 140,060 95,540 32,755 77,948 95,562 85,400 91,540 112,922 108,211 126,773 140,624 131,390 108,305 136,007 117,539 122,156 145,241
Tabel 1. Hasil Analisis Kelarutan dan Daya Serap Ligan Berdasarkan Aturan Lipinski.
mengandung logam zinc pada bagian sisi aktifnya yang sekaligus menjadikan enzim ini termasuk dalam kategori metaloenzim 13 . Reseptor dianalisis dengan menggunakan  Ramachandran  plot  (Gambar 1). Ramachandran plot terdiri atas 4 kuadran berbeda yaitu most favoured regions (kudran I), additional allowed regions (kuadran II), generously allowed regions (kuadran III),  dan disallowed regions (kuadran  IV).
Ramachandran plot merupakan scatter plot antara phi ϕ dan psi ψ, mencerminkan daerah yang diizinkan dari ruang konformasi yang tersedia untuk rantai protein 18 . Tirosinase 5m8t mengalami mutasi pada beberapa residu asam amino. Visualisasi
hasil superimpose antara wildtype dan mutan  dilakukan  untuk  mengkonfirmasi  ada tidaknya perubahan khususnya pada residu katalitik  tirosine.  Gambar  2  menunjukkan visualisasi hasil superimpose antara tirosenase mutan  (merah)  dan wild type (hijau).  Hasil menunjukkan mutasi tidak menyebabkan perubahan signifikan khususnya pada residu katalitik tirosinase 5m8t. Mutasi terjadi pada residu asam amino urutan ke 338, 350 dan 367 sedangkan situs katalitik tirosinase dengan PDB ID 5m8t terdiri atas residu asam amino  His377,  His381,  His404,  His224, His192,  dan  His215.  Kondisi  ini  didukung oleh hasil analisis in vitro antara tyrosinase- related protein 1 dalam bentuk terkompleks
Ligan Inhibisi Human Ether-a- go-go-Related Gene Karsinogenisitas Toksisitas Oral Akut Kategori P Kategori P Kategori P tropolon asam kojat stigmasterol kuersetin mirisetin 2,2,2-trifluoro-1-(p- tolil) etanon rutin β sitosterol γ tokoferol stigmast-5-en-3-ol benzilamino asetal -
dehid o-benzil asam linolenat skualen isofitol pyridine-3-carbox- amide asam palmitat fitol heksahidrofarnesil aseton propan-2-yl hexa- decanoate tetrakosan (e)-tricos-9-ene heptakosan triakontan oktakosan trikosan nonakosan pentakosan heksakosan n-hentriakontan lemah lemah lemah lemah lemah lemah lemah lemah lemah lemah kuat Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah Lemah 0,977 0,944 0,803 0,978 0,978 0,962 0,981 0,803 0,719 0,803 0,557 0,882 0,769 0,906 0,995 0,932 0,784 0,821 0,909 0,862 0,827 0,862 0,862 0,862 0,862 0,862 0,862 0,862 0,862 nk nk nk nk nk k nk nk nk nk k Nk k nk nk nk nk k k k k k k k k k k k k 0,827 0,543 0,918 0,945 0,945 0,607 0,961 0,918 0,881 0,918 0,654 0,650 0,563 0,543 0,910 0,645 0,506 0,615 0,671 0,642 0,635 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642 III III I II II III III I III I III IV III III III IV III III III III III III III III III III III III III 0,642 0,619 0,429 0,735 0,735 0,722 0,597 0,429 0,716 0,429 0,756 0,639 0,897 0,905 0,786 0,638 0,855 0,769 0,862 0,614 0,824 0,614 0,614 0,614 0,614 0,614 0,614 0,614 0,614
Tabel 2. Toksisitas Ligan Kontrol, Ligan Alami dan Ligan Uji Senyawa Bioaktif Daun Wungu.
dengan  CU  (TYRP1-Cu)  baik  wild  type maupun  mutan  (TYRP1-3M-Cu)  keduanya menunjukkan aktivitas tirosinase 13 .
3.4. Validasi Metode Penambatan Molekuler Validasi metode penambatan molekuler dilakukan dengan menambatkan ulang antara reseptor 5m8t dengan ligan alami tropolon.  Hal  ini  penting  dilakukan  untuk memperoleh daerah penambatan yang tepat berupa gridbox yang mencakup sisi aktif enzim sebagai target penambatan molekuler. Validasi dilakukan sejumlah 20 kali ulangan. Adapun dimensi gridbox yang digunakan yaitu  center_x=121.444,  center_y=278.358,
center_z=216.460,  size_x=16,  size_y=16, size_z=16 dengan jarak antar atom 1 Å.

## 3.5. Hasil Penambatan Molekuler
Penambatan molekuler dilakukan untuk melihat  nilai  energi  afinitas  setiap  ligan  uji yang digunakan dalam penelitian. Semakin kecil  nilai  energi  afinitas  maka  aktivitas penghambatan pada enzim semakin besar. Hasil  penambatan  molekuler  dianalisa  lebih lanjut dalam bentuk visualisasi 2D dan 3D untuk melihat interaksi antara ligan dengan reseptor. Data yang diperolah dari hasil visualisasi 2D dan 3D berupa jenis ikatan, panjang ikatan yang dibentuk, molekul
atom pada ligan yang terlibat dalam ikatan antara ligan dengan reseptor dan residu asam amino reseptor yang berinteraksi langsung dengan  ligan.  Hasil  penambatan  molekuler ditunjukkan pada Tabel 3.
Analisis lebih lanjut pada hasil penambatan molekuler dilakukan melalui visualisasi dua dimensi dengan bantuan program  aplikasi  Ligplot+.  Hasil  ini merepresentasikan residu asam amino dari reseptor yang terlibat dalam interaksi dengan ligan. Identifikasi ikatan hidrogen dan panjang ikatan yang terbentuk serta atom pada asam amino yang terlibat dalam pembentukan ikatan dapat dilihat pada hasil visualisasi dua dimensi. Sementara itu visualisasi tiga dimensi dilakuan dengan bantuan program aplikasi PyMOL  untuk  melihat  lokasi  terbentuknya ikatan antara ligan dengan reseptor.
Asam linolenat membentuk tiga ikatan hidrogen dengan residu asam amino tirosinase 5m8t yang juga berperan sebagai situs katalitik. Interkasi ini dapat dilihat pada hasil visualisasi dua dimensi. Interaksi ini juga sekaligus menjadikan asam linolenat sebagai ligan yang memiliki ikatan hidrogen paling banyak dibandingkan dengan ligan uji lain. Selain itu, asam linoleat juga diketahui membentuk dua interaksi hidrofobik dengan residu asam amino tirosinase 5m8t. Gambar 3 menunjukkan visualiasasi interkasi antara asam linolenat dengan reseptor dalam bentuk dua dimensi dan tiga dimensi.

## 4. Pembahasan
4.1.  Struktur,  Kelarutan,  dan  Daya  Serap

## Ligan
Upaya eksplorasi obat baru dalam aplikasinya diharapkan senyawa target memiliki aktivitas farmakologis maupun biologis tertentu yang efektif digunakan sebagai  obat.  Evaluasi  terhadap  sifat farmakokinetik obat termasuk didalamnya absorpsi, distribusi, metabolisme, dan ekskresi dilakukan dengan menggunakan aturan Lipinski. Aturan ini terdiri atas massa molekul relatif kurang dari 500 Da, donor ikatan hidrogen kurang dari 5, akseptor ikatan hidrogen kurang dari 10, log P kurang dari 5, dan nilai refraktivitas molar berkisar antara 40-130 19 . Semua ligan termasuk ligan kontrol, ligan uji dan ligan pembanding telah dievaluasi  dengan  aturan  Lipinski.  Semua ligan memiliki massa molekul relatif kurang dari 500 Da kecuali rutin. Selain itu donor ikatan hidrogen semua ligan kurang dari 5 kecuali mirisetin, kuersetin, dan γ tokoferol. Akseptor ikatan hidrogen semua ligan kurang dari 5. Sementara itu Log P untuk semua ligan kurang dari 5 kecuali skualen, stigmasterol, (e)-tricos-9-ene ,  β  sitosterol,  heptakosan, heksakosan, heksahidrofarnesil aseton, isofitol , asam linolenat, n-hentriakontan, nonakosan, oktakosan,  asam  palmitat,  pentakosan,  fitol, propan-2-yl hexadecanoate, stigmast-5-en-3- ol , tetrakosan, triakontan dan trikosan. Adapun
Gambar 2 Visualisasi hasil superimpose tirosinase mutan PDB ID 5m8t (merah) dan tirosinase wild type PDB ID 5m8n (hijau)
Ligan Status ligan ΔG Energi Afinitas (kkal/mol) Konstanta inhibisi (µM) tropolon asam kojat stigmasterol kuersetin mirisetin 2,2,2-trifluoro-1-(p-tolil) etanon rutin β sitosterol γ tokoferol stigmast-5-en-3-ol benzilamino asetaldehid o-benzil asam linolenat skualen isofitol pyridine-3-carboxamide asam palmitat fitol heksahidrofarnesil aseton propan-2-yl hexadecanoate tetrakosan (e)-tricos-9-ene heptakosan triakontan oktakosan trikosan nonakosan pentakosan heksakosan n-hentriakontan ligan alami ligan pembanding ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji ligan uji - 5,3 -5,5 -7,8 -7,7 -7,5 -6,8 -6,8 -6,6 -6,6 -6,6 -6,5 -5,8 -5,7 -5,6 -5,5 -5,4 -5,4 -5,2 -5,1 -4,9 -4,7 -4,6 -4,6 -4,5 -4,5 -4,4 -4,4 -4,3 -4,3
129,633 92,476 1,901 2,251 3,156 10,293 10,293 14,429 14,429 14,429 17,084 55,718 65,969 78,106 92,476 109,489 109,489 151,957 181,722 254,74 357,098 422,797 422,797 500,584 500,584 592,682 592,682 701,725 701,725
Tabel 3. Energi Afinitas dan Konstanta Inhibisi Ligan Hasil Penambatan Molekuler.
nilai refraktivitas molar semuanya ada dalam rentang 40-130 kecuali asam kojat, tropolon, skualen, n-hentriakontan, nonakosan, oktakosan, pyridine-3-carboxamide , rutin dan  triakontan.  Lipinski et al .  (2012) menyatakan bahwa suatu senyawa termasuk kategori memiliki permeabilitas yang buruk jika senyawa tersebut memiliki dua parameter di  luar  jangkauan.  Hasil  analisis  Lipinski menunjukkan terdapat enam senyawa dengan dua parameter di luar jangkauan yaitu rutin, skualen, triakontan, oktakosan, nonakosan dan n-hentriakontan.
4.2.  Toksisitas Ligan Hasil  uji  inhibisi  herG  menunjukkan bahwa benzylamino-acetaldehyde O-benzyl termasuk dalam kategori inhibitor kuat terhadap  herG,  sedangkan  ligan  uji  lainnya merupakan  inhibitor  lemah.  Klasifikasi
karsinogenisitas berdasarkan International Agency for Research on Cancer (IARC) terdiri atas 4 golongan, yaitu golongan I ( carsinogen ), golongan  IIA  ( probably carcinogenic ), golongan  IIB  ( possibly carcinogenic ), golongan  III  (tidak  terklasifikasi),  dan golongan IV ( non carsinogenic ) 20 . Sejumlah lima ligan uji termasuk dalam kategori I dan  II  dalam  hal  toksisitas  oral  akut.  Ligan yang dimaksud yaitu stigmasterol, kuersetin, mirisetin, β sitosterol dan stigmast-5-en-3-ol dengan  probabilitas  masing  masing-masing sebesar 0,429; 0,735; 0,735; 0,429; dan 0,429.
4.3. Struktur Reseptor
Analisis  protein dilakukan menggunakan diagram Ramachandran yang didasarkan pada struktur sekunder protein. Suatu struktur protein dinyatakan baik jika jumlah plot residu asam amino non glisin
Gambar 3. Interaksi asam linolenat dengan reseptor (a) visualisasi 2D, (b) visualisasi 3D model pengisi ruang, (c) visualisasi 3D model pita
yang terdapat pada daerah yang disukai lebih dari 90% dan residu asam amino pada kuadran IV kurang dari 20% 21 .  Kualitas struktur sebuah protein dinyatakan baik jika residu asam amino yang berada pada daerah yang disukai semakin besar dan presentase residu asam amino pada daerah yang tidak diizinkan semakin rendah. Diagram Ramchandran mengelompokkan residu asam amino pembentuk struktur sekunder protein berdasarkan sudut phi dan psi. Rantai utama ikatan  N-Cα  dan  Cα-C  pada  polipeptida relatif berputar bebas dan rotasi ini masing- masing disebut dengan sudut torsi phi dan psi. Diagram Ramachandran merepresentasikan polipeptida yang secara sistematis memvariasikan sudut phi dan psi dengan tujuan mendapatkan konformasi yang stabil. Konformasi struktur dianalisis melalui kontak plot antar atom 22 . Phi menyatakan sumbu x dan psi menyatakan sumbu y dari residu asam amino suatu struktur protein. Hasil  analisis  berdasarkan  Ramachandran plot menunjukkan bahwa residu asam amino reseptor yang berada pada kuadran I sebesar 84,7%,  kuadran  II  sebesar  14,5%,  kuadran III sebesar 0,5% dan kuadran IV sebesar 0,3%.  Hasil  ini  menujukkan  bahwa  struktur tirosinase dengan PDB ID 5m8t memiliki kualitas yang baik untuk dapat digunakan sebagai reseptor dalam penambatan molekuler karena residu asam amino pada kuadran IV kurang dari 20% 21 . Warna  yang  berbeda  pada  masing- masing kuadran merepresentasikan sebaran asam amino sesuai struktur sekunder protein. Daerah steril pada kuadran IV ditunjukkan oleh area putih, yaitu area yang tidak diizinkan untuk semua asam amino kecuali glisin karena tidak memiliki rantai samping. Daerah merah yaitu daerah yang diperbolehkan untuk
konformasi  alfa-heliks,  beta turn dan beta sheet , sesuai dengan konformasi tidak adanya benturan sterik. Daerah kuning berkorelasi dengan konformasi atom dalam protein lebih  dekat  dibandingkan  jumlah  jari-jari Van der waals . Daerah yang tidak diizinkan pada umumnya melibatkan hambatan sterik antara  rantai  samping  gugus  C-beta  metilen dan rantai utama atom. Glisin tidak memiliki rantai samping, oleh sebab itu dapat berada pada sudut phi dan psi kuadran IV diagram Ramachandran 22 . Residu asam amino tirosinase PDB ID 5m8t dominan berada pada kuadran I dan kuadran II (Gambar 1). Struktur tirosinase dengan PDB ID 5m8t merupakan struktur mutan dengan mutasi pada residu asam amino urutan ke 338, 350 dan 367. Mutasi ini menghasilkan albinisme okulokutaneus (OCA),  satu kelompok gangguan resesif autosomal yang ditandai dengan berukurangnya produksi melanin di kulit, rambut dan mata 13 . Tirosinase 5m8t mutan digunakan dalam penelitian ini karena memiliki resolusi yang lebih baik daripada tirosinase wild type yaitu 2,35  Å  dan  Ramachandran  outliers  0,1% dengan ligan alami berupa tropolon. Beberapa syarat reseptor yang baik diantaranya adalah memiliki ligan alami, struktur kristal dan resolusi  ≤2,5  Å 23 .  Gambar  2  menunjukkan hasil superimpose antara tirosinase mutan dengan PDB ID 5m8t (merah) dan tirosinase wild type PDB ID 5m8n (hijau).
Data merujuk kepada kondisi bahwa mutasi diharapkan tidak berdampak signifikan terhadap perubahan pada bagian sisi katalitik enzim tirosinase dengan PDB ID 5m8t. Tampak dalam visualisasi tiga dimensi residu asam amino antara tirosinase 5m8t dengan residu asam amino 5m8n saling behimpitan satu sama lain. Perbedaan tampak pada ligan
alami dari masing-masing enzim. Tirosinase 5m8t memiliki ligan alami tropolon sementara tirosinase 5m8n memiliki ligan alami asam kojat. Hasil analisis in vitro antara tyrosinase- related protein 1 dalam bentuk terkompleks dengan  CU  (TYRP1-Cu)  baik wild type maupun  mutan  (TYRP1-3M-Cu)  keduanya menunjukkan aktivitas tirosinase 13 .
4.4. Validasi Metode Penambatan Molekuler Validasi terhadap metode penambatan molekuler dilakukan dengan melihat data Root Mean Square Deviation (RMSD)  dari 20 kali pengulangan proses docking. Metode penambatan molekuler dapat dikatakan valid jika nilai RMSD kurang dari sama dengan 2 Å16. Nilai RMSD merepresentasikan perbandingan antara konformasi aktual dengan konformasi hasil penambatan molekuler, dengan demikian RMSD juga mencerminkan tingkat akurasi sebuah metode penambatan molekuler 24 .  Hasil  validasi metode penambatan molekuler dengan melibatkan reseptor 5m8t dan ligan alaminya diperoleh rataan nilai RMSD sebesar 1,61 Å dan  energi  afinitas  sejumlah  -5,3  kkal/mol. Hasil tersebut sekaligus menunjukkan bahwa metode penambatan molekuler tersebut termasuk dalam kategori valid. Nilai RMSD yang semakin kecil merepresentasikan posisi atom pada ligan semakin baik karena mendekati konformasi asal.

## 4.5.  Hasil Penambatan Molekuler
Energi  afinitas  antara  ligan  dengan reseptor merupakan salah satu parameter untuk menentukan kualitas ligan yang digunakan dalam penambatan molekuler. Energi afinitas yang rendah merepresentasikan interaksi antara ligan dengan reseptor dapat terjadi dengan lebih mudah. Menurut kaidah termodinamika jika energi bebas Gibbs  bernilai  negatif  atau  kurang  dari  nol maka reaksi kimia dapat terjadi spontan. Ligan  yang  memiliki  nilai  energi  afinitas lebih rendah dapat lebih mudah berinteraksi dengan reseptor daripada ligan yang memiliki energi  afinitas  lebih  tinggi.  Energi  afinitas yang semakin rendah memiliki korelasi positif dengan nilai konstanta inhibisi.
Semakin  rendah  nilai  energi  afinitas  maka nilai konstanta inhibisi juga semakin rendah. Tabel 3 menunjukkan ligan dari komponen bioaktif  daun  wungu  beserta  energi  afinitas dan konstanta inhibisinya.
Analisis hasil penambatan molekuler dilakukan dengan menggunakan bantuan program  aplikasi  Ligplot+  dan  PyMOL (TM) 1.7.4.5 Edu. Asam kojat sebagai pembanding membentuk tiga ikatan hidrogen dengan reseptor  melalui  residu  asam  amino  Ser394 (O 3 ),  Ser394  (O2)  dan Asn378  dengan  jarak ikatan  masing-masing  2,86  Å,  3,15  Å,  dan 3,00 Å. Asam kojat juga membentuk interaksi hidrofobik dengan residu asam amino His377, His215,  Gly388,  Gln390,  Val391,  Gly389, dan His381. Sementara itu tropolon sebagai ligan alami membentuk ikatan hidrogen dengan reseptor melalui residu asam amino Ser394  dengan  jarak  2,71  Å.  Adapun  pada interaksi hidrofobik tropolon dengan reseptor melibatkan  residu  asam  amino  His192, His377,  His215,  Asn378,  Gln390,  Val391, His38, dan Gly389. Proses penambatan molekuler dilakukan pada daerah situs katalitik enzim tirosinase.  Lai et al .  (2017)  menyatakan bahwa situs katalitik tirosinase dengan PDB ID 5m8t terdiri atas residu asam amino His377,  His381,  His404,  His224,  His192, dan  His215.  Hal  ini  menjadi  acuan  untuk menentukan kualitas ligan uji yang digunakan dalam penambatan molekuler. Ligan uji asam linolenat  dan  fitol  menunjukkan  interkasi melalui ikatan hidrogen yang lebih dominan dibandingkan dengan ligan uji lainnya. Asam linonelat membentuk tiga ikatan hidrogen dengan reseptor melalui residu asam amino His192,  Ser394  dan  His215  dengan  jarak ikatan  masing-masing  yaitu  3,15  Å,  2.85 Å,  dan  3.14  Å.  Dua  diantara  residu  asam amino tersebut merupakan bagian dari situs katalitik tirosinase yaitu His192 dan His215. Sementara  itu  fitol  membentuk  dua  ikatan hidrogen dengan reseptor melalui residu asam  amino  His  192  dan  His  215  dengan jarak  ikatan  masing-masing  yaitu  3,21 Å,  dan  3,12  Å.  Kedua  residu  asam  amino tersebut merupakan bagian dari situs katalitik tirosinase.
Disisi lain asam linolenat juga membentuk interaksi hidrofobik dengan residu asam amino His381, Gly389, Val391, Asn378,  His377,  Glu216,  Phe362,  Leu382, dan  Phe400.  Demikian  pula  halnya  dengan fitol  yang  membentuk  interaksi  hidrofobik dengan  residu  asam  amino  Ser394,  His381, Gly389,  Val391,  Asn378,  Phe362,  Leu382, dan  Phe400.  Asam  linolenat  dan  fitol merupakan ligan uji terbaik dalam kasus komponen bioaktif daun wungu berkaitan dengan interaksinya dalam menghambat aktivitas enzim tirosinase.
5.  Kesimpulan Ligan-ligan uji dari daun wungu yang digunakan dalam penambatan molkular pada penelitian ini, yaitu senyawa asam linolenat dan fitol terbukti memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim tirosinase dengan energi afinitas masing-masing sebesar -5.8 kkal/mol dan -5.4 kkal/mol serta konstanta inhibisi  55,718  μM  dan  109,489  μM.  Hasil penelitian ini dapat menjadi dasar untuk melakukan penelitian selanjutnya tentang aktivitas inhibisi daun wungu terhadap enzim tirosinase melalui pendekatan in vitro .
Pustaka
1.  Arrowitz C, Schoelermann AM, Mann T, Jiang  LI,  Weber  T.  Effective  tyrosinase inhibition by thiamidol results in significant  improvement  of  mild  to moderate melasma. J Invest Dermatol. 2019;139(8):1691–98.
2. Handel  AC,  Miot    LDB,  Mio    HA. Melasma : a clinical and epidemiological review. An Bras Dermatol. 2014;89(5):771–82.
3. Zolghadri  S,  Bahrami  A,  Hassan  Khan MT,  Munoz-Munoz  J,  Garcia-Molina F,  Garcia-Canovas  F,  Saboury  AA.  A comprehensive review on tyrosinase inhibitors.  J  Enzyme  Inhib  Med  Chem. 2019;34(1):279–309.
4. [BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. Statistik Produk yang Mendapat Persetujuan Izin Edar. Jakarta (ID): BPOM; 2021.
5. Ashooriha  M,  Khoshneviszadeh  M,
Khoshneviszadeh M, Rafiei A, Kardan M, Yazdian-Robati R, Emami S. Kojic acid- natural product conjugates as mushroom tyrosinase  inhibitors.  Eur  J  Med  Chem. 2020;201:112480
6. Saeedi  M,  Eslamifar  M,  Khezri  K. Kojic  acid  applications  in  cosmetic  and pharmaceutical preparations. Biomed Pharmacother. 2019;110:582-593
7. Owolabi  JO,  Fabiyi  OS,  Adelakin  LA, Ekwerike MC. Effects of skin lightening cream  agents  –  hydroquinone  and kojic acid , on the skin of adult female experimental rats. Clin Cosmet Investig Dermatol. 2020;13283–289.
8.  Trott O, Olson AJ. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading. J Comput Chem. 2010;31(2):455–61.
9. Rustini  NL,  Ariati  NK.  Identification of active antioxidant Compounds from ungu leaf ethanol extract (Graptophyllum pictum  L.  Griff).  J  Heal  Sci  Med. 2018;2(1):9–12.
10. 1Jiangseubchatveera  N,  Liawruangrath B,  Liawruangrath  S.  The  chemical constituents and the cytotoxicity , antioxidant and antibacterial activities of the essential oil of Graptophyllum pictum (  L  .)  Griff  .  J  Essent  Oil  Bear  Plants. 2015;18(1):11–7.
11. Budiaji A, Ismail, Nani H. Identification compound contained in extract methanol leaf  wungu  (Graptophyllum  pictum (L.)  Griff).  Int  J  Heal  Med  Curr  Res. 2018;3(3):961–64.
12. Aulia Z, Khamid M, Aninjaya M. Analisis kandungan flavonoid ekstrak etanol 70% simplisia  daun  ungu  (Graptophyllum pictum  (L.)  Griff)  dengan  metode kromatografi  lapis  tipis  densitometri.  J Ilmu Kesehat Stikes Duta Gama Klaten. 2019;10(2):81–8.
13. Lai  X,  Wichers  HJ,  Soler-Lopez  M, Dijkstra  BW.  Enzyme  structure  and function very important paper structure of human tyrosinase related protein 1 reveals a binuclear zinc active site important for melanogenesis. Angew Chem Int.
2017;569812–9815.
14. Ochieng PJ, Sumaryada T, Okun D. Molecular docking and pharmacokinetic prediction of herbal derivatives as maltase-glucoamylase  inhibitor.  Asian  J Pharm Clin Res. 2017;10(9):392–98.
15. Anitha  K,  Gopi  G,  Girish,  Kumar  PS. Molecular docking study on dipeptidyl peptidase-4  inhibitors.  Int  J  Res  Dev Pharm Life Sci. 2013;2(5):602–10.
16. Purnomo  H.  Kimia  Komputasi  Uji  In Silico Senyawa Anti Kanker. Yogyakarta:
Pustaka Pelajar; 2013.
17. Ortiz  CLD,  Completo  GC,  Nacario RC, Nellas RB. Potential Inhibitors of galactofuranosyltransferase  2  (GlfT2): molecular  docking  ,  3D-QSAR  ,  and  in silico ADMETox studies. Sci Reports Nat Res. 2019;9(17096):1–28.
18. Najibi MS, Maadooliat M, Zhou L, Huang JZ, Gao X. Protein structure classification and loop modeling using multiple Ramachandran distributions. Comput
Struct Biotechnol J. 2017;15:243–254.
19. Lipinski  CA,  Lombardo  F,  Dominy BW,  Feeney  PJ.  Experimental  and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev. 2012;64:4–17.
20. Tarone RE. On the International Agency for  Research  on  Cancer  classification of glyphosate as a probable human carcinogen.  Eur  J  Cancer  Prev.
2018;27(1):82-87.
21. Carugo  O,  Djinović-Carugo  K.  Half  a century  of  Ramachandran  plots  Half  a century of Ramachandran plots. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr.
2013;68:1333–41.
22. DasGupta  D,  Kaushik  R,  Jayaram  B. From Ramachandran Maps to Tertiary Structures of Proteins. J Phys Chem B.
2015;119(34):11136–45.
23. Aarthy M, Singh SK. Discovery of Potent Inhibitors for the Inhibition of Dengue
Envelope Protein: An In Silico Approach. Curr Top Med Chem. 2018;18(18):1585- 1602.
24. Dhanik  A,  Mcmurray  JS,  Kavraki  LE.
DINC : A new AutoDock-based protocol for docking large ligands. Bio Med Cent Struct Biol. 2013;13(1):1–14.