## Kajian Filogenetik Kupu-Kupu Papilio Spp Berdasarkan Sekuen Gen ND5 secara Insiliko

## Phylogenetik Study of Papilio Spp Butterfly Based on ND5 Genetik Sequence in In Silico
Abdu Mas'ud, Abubakar Abdullah, Chumidach Roini Prodi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Khairun Ternate Email: masudabdu.unk05@gmail.com

## Abstrak
Genus Papilio spp  merupakan  salah satu  anggota  family  Papilionidae.  Karakter  khas  kupu-kupu ini  memiliki  ukuran  tubuh  yang  besar  (makro  lepidoptera)  dan  memiliki  warna  tubuh  yang  menarik. Penyebaran Papilionidae ditemukan di Indo-Australia. Kupu-kupu ini ditemukan di wilayah Maluku Utara dan kepulauan Sula. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis hubungan filogenetik kupu kupu Papilio spp  berdasarkan  penanda  molekuler  gen  ND5  yang  terdapat  pada  mitokondria  secara  insiliko.  Analisis Filogenetik tersebut dapat dilihat dari pohon filogeni yang dikonstruksi  berdasarkan sequence nukleotida pada gen ND5. Sequence gen ND5 diperoleh dari National Center for Biotechnology Information (NCBI) dan  alignment sequence untuk  konstruksi  pohon  filogenetik  menggunakan  program  Clustal  W  yang diakses  dari National  Center  for  Biotechnology  Information (NCBI)  secara online .  Pohon  filogenetik menunjukkan  bahwa Papilio  ulyses asal  pulau  Obi  dan  Morotai  dari  Maluku  Utara  memiliki  nenek moyang yang sama (monophiletik) dengan Papilio ulyses telegonus dari Timika.
Kata kunci: Papilio spp, filogenetik, ND5 gen

## Abstract
Papilio  spp  is  one  of  the  members  Papilionidae  family.  The  specific  character  is  macro lepidoptera butterflies and has beautiful colour.  The distribution of butterflies is found in Indo_Australia. Papilio spp can found on Northen Maluku and Sula archipelago region. The objectif of the research is to know genetik relationship of Papilio spp based on moleculer marker of the ND5 gene mitokondrial using insilico  analysis.  The  genetik  relationship  can  be  knowed  from  the  phylogenetik  tree  construction  by sequence  ND5  gene  mitocondial.  The  Sequence  ND5  gene  is  obstained  from  the  National  Center  for Biotechnology  Information  (NCBI)  and  alignment  sequence for  the  construction  phylogenetik  tree  using Clustal  W  program  acces  from  the  National  Center  for  Biotechnology  Information  (NCBI)  online.  The phylogenetik  tree  showed  that  Papilio  ulyses  from  Obi  island  and  Morotai  island  have  one  ancestor (monophyletic) with Papilio ulyses telegous from Timika.
Keywords: Papilio spp, phylogenetik, ND5 genes
Abdu Mas’ud dkk: Kajian Filogenetik Kupu-Kupu Papilio…..

## Pendahuluan
Kupu  kupu  family  Papilionidae  pada umumnya  memiliki  ukuran  tubuh  yang  besar (makrolepidoptera) dan berwarna menarik (Mastrigt  dan  Rosariyanto  2005).  Distribusi georafis  kupu-kupu Papilio spp  antara  lain  di wilayah  Maluku,  Kepulauan  Maluku  Utara,  dan Papua  Irian  Jaya.  Selanjutnya  Vane-Wright (2003)  melaporkan  bahwa  tiga  kelompok Papiliondae  (Swallotail)  dapat  ditemukan  di wilayah  Indo  Australia.  Noted  Entomologis melaporkan  bahwa  salah  satu  hotspot  kupu  kupu Papilio spp adalah kepulauan Maluku dan daratan Papua  (Hermawanto et  al ,  2015).  Lebih  lanjut dijelaskan  lokasi  penyebaran Papilio spp  di Maluku  Utara  adalah  pulau  Bacan,  pulau  Obi, pulau  Halmaera,  Morotai  dan  kepulauan  Sula (Wallace, 1865; Mallet, 2003).
Family Papilionidae tersebar secara kosmopolit  dengan  foodplant  yang  terdiri  dari family
Annonaceae, Aristolochiaceae, Lauracheae,  Magnoliceae,  Rutaceae.  Famili papilionidae  terdiri  dari  550  spesies  dalam  tiga sub  family,  hanya  satu  sub  family  yang  terdapat di  Maluku  (Hauser et  al ,  2001). Troides  hellena merupakan  salah  satu  spesies  dari  Papilionidae yang dilindungi (CITES Appendix II)  dan dalam list status konservasi terancam punah (vulnerable).  Family  Papilionidae  terdiri  dari  5 genus,  38  spesies  dan  84  subspesies  dengan sinonim  Swallowtail,  Swordtail    dan  Birdwing butterflies terdapat  di Maluku  dan  Maluku  Utara termasuk  kepulauan  Sula.  Jenis  kupu-kupu  yang endemik  dari  family  Papilionidae  ada  9  yang terdiri dari 2 Grapium, 2 Troides, 2 Ornithoptera dan 3 Papilio (Peggie et al , 2005).
Sumber daya genetik kupu-kupu merupakan  keanekaragaman  hayati  yang  harus dijaga  kelestariannya  dari  kepunahan  jenisnya. Salah  satu  upaya    yang  dapat  dilakukan  adalah konservasi  genetik  terhadap  kupu-kupu  endemik dan kajian sistematika kupu. Informasi kemiripan (similaritas)  dari  Papilio  Spp  dengan  kupu-kupu lain  dapat  diketahui  melalui  studi  taksonomi numerik  dengan  memanfaatkan  data  morfologi sebagai  karakter.  Sedangkan  kekerabatannya dapat  diketahui  melalui  konstruksi  pohon filogenetik dengan memanfaatkan data molekuler.
Data  molekuler  suatu  organisme  termasuk kupu  kupu  dari  semua  divisi  yang  berupa sequence DNA  dapat  diakses  dengan  relatif mudah dari bank data misalnya NCBI. Salah satu data  molekuler  yang  dapat  digunakan  adalah sequence DNA untuk gen mitokondria ND5. Gen tersebut  dapat  dipergunakan  sebagai  penanda molekuler dalam penyusunan klasifikasi filogenetik  karena  gen  tersebut  terdapat  pada mitokondria  semua  organisme  termasuk  kupu- kupu Papilio spp. Ekspresi dari gen ND5  adalah protein  fungsional  NADH  sub  unit  5  yang berfungsi mengkatalisis respirasi sel secara aerob (Tabita et al ., 2008).
Dalam  klasifikasi  filogenetik  ini  data sequence gen ND5 pada mitokondria kupu-kupu Papilio spp yang disimpan di National Center for
Biotechnology Information (NCBI) akan
digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik  yang  menggambarkan  kekerabatan evolusioner  kupu-kupu Papilio spp  dari  Maluku dan  Papua.  Pohon  filogenetik  adalah  ilustrasi evolusi  yang  terjadi  pada  sekelompok  organisme yang berasal dari nenek moyang yang sama, yang disusun  berdasarkan  kesamaan  dalam  beberapa hal, misalnya gen, protein dan organ (Ochieng et al , 2007).

## Metode Penelitian
Bahan
Sekuens gen ND5  yang diunduh dari bank data internasional National Center for Biotechnology Information (NCBI).

## Prosedur
Klasifikasi  filogenetik  kupu-kupu  Papilio spp ini  dibuat  dengan  memanfaatkan  data sequence DNA  yang  disimpan  di  bank  data internasional NCBI dan program untuk konstruksi pohon  filogenetik  secara online yang  disediakan oleh National Center for Biotechnology Information (NCBI).  Identifikasi  spesies  secara online  menggunakan  data  genbank  pada  NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.ncbi)  dengan berbagai    nomer  akses  dengan  metode  BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool ) Selanjutnaya dilakukan alligment dengan menggunakan  Clustal  W  vers.  1.4  (Thompson et al., 1994).  Hasil  alignment  digunakan  untuk
Abdu Mas’ud dkk: Kajian Filogenetik Kupu-Kupu Papilio…..
mengkonstruksi pohon filogenetik yang visualisasinya    dilakukan  menggunakan  program MEGA  6    (Tamura et  al .  2011).  Jarak  genetik dianalisis menggunakan metode Kimura parameter2 (Kimura, 1980) dan pohon filogenetik menggunakan  metode Maximum  Likelihood berdasarkan  model  Tamura-Nei  (Tamura  &  Nei 1993).

## Hasil dan Pembahasan
Data karakter molekular yang diunduh dari NCBI  adalah sequence gen  ND5  mitokondria pada  10  spesies  kupu-kupu Papilio spp  dengan berbagai  kode  akses  seperti  pada  Tabel  1.  Data sequence gen  ND5    yang  tersimpan  di  NCBI memiliki panjang nukleotida kurang lebih 900bp. Jarak  genetik  dianalisis  menggunakan  metode Kimura  parameter2  (Kimura,  1980)  seperti  pada Tabel  2
Tabel 1. Data Acession Number 10 Spesies Papilio spp. No Kode Accesion Number Nama spesies 1 JQ982360.1 GI:  443419622 P. ulysses morotaicus -Pulau Morotai 2 JQ982359.1 GI: 443419620 P. ulysses dohertius -Pulau Obi 3 JQ982352.1 GI: 443419606 P. ulysses Ulysses -Pulau Seram Maluku 4 JQ982362. GI: 443419626 P. ulysses reikoae -Pulau Manipa Maluku 5 JQ982361.1 GI: 443419624 P. ulysses oxyartes -Pulau Aru Maluku 6 JQ982358.1 GI: 443419618 P. ulysses ampelius -Pulau Buru Maluku 7 JQ982351.1 GI:443419604 P ulysses telegonus -Timika Irian Jaya 8 JQ982350.1 GI:443419602 P. ulysses autolycus -Indonesia 9 AB 04055554  G.I 11990922 O. croesus -Pulau Bacan 10 AB 04055551  G.I 11990924 O. aesacus -Pulau Obi
Tabel 2. Data Jarak Genetik Papilio spp. Berdasarkan gen ND5 mitokondria dianalisis  dengan metode Kimura 2 parameter P. ulysses morotaicus -Pulau Morotai
P._ulysses_dohertius -Pulau
Obi 0,005 P. ulysses ulysses -Pulau Seram Maluku 0,040 0,035 P. ulysses reikoae -Pulau Manipa Maluku 0,040 0,035 0,000 P. ulysses oxyartes -Pulau Aru Maluku 0,049 0,043 0,008 0,008 P. ulysses ampelius -Pulau Buru Maluku 0,040 0,035 0,000 0,000 0,008 P. ulysses telegonus -Timika Irian Jaya 0,003 0,003 0,037 0,037 0,046 0,037 P. ulysses autolycus -Timika Irian Jaya 0,046 0,040 0,005 0,005 0,003 0,005 0,003 P. ulysses autolycus -Indonesia 0,046 0,040 0,005 0,005 0,003 0,005 0,043 0,000 O. croesus -Pulau Bacan 0,127 0,134 0,152 0,152 0,159 0,152 0,131 0,159 0,159 O. aesacus -Pulau Obi 0,144 0,144 0,149 0,149 0,156 0,149 0,148 0,156 0,156 0,037
Abdu Mas’ud dkk: Kajian Filogenetik Kupu-Kupu Papilio…..
Gambar 1. Pohon Filogenetik Papilio spp Berdasarkan gen Mitokondria ND5
Nilai jarak genetik pada kupu-kupu Papilio spp  diketahui  bahwa Pulyses  telegonus _Timika memiliki  nilai  jarak  genetik  terkecil,  selanjutnya P  ulyses  autolycus_ Indonesia  dan P  ulyses ampelius _Pulau  Aru    sedangkan P.  oxyartes dari Pulau  Aru  memiliki  nilai  jarak  genetik  terbesar. Selanjutnya  data  hasil alignment menggunakan program Clustal W ver 1.43 yang dilakukan pada sequence  ND5  Papilio  spp dapat  digunakan untuk  mengkonstruksi  pohon  filogenetik  yang menggambarkan    hubungan  evolusioner,  Pohon filogenetik  yang  dikonstruksi  berdasarkan  gen mitokondria  ND5 Ornithoptera spp seperti Gambar 1.
Pada  pohon  filogenetik    tersebut  diketahui bahwa  terbentuk    dari  2  klaster  utama  dengan outgroup Ornithopter a  spp.  Pohon  filogenetik selain  menunjukkan  kekerabatan  antar  spesies yang  diperbandingkan,  juga  menggambarkan perubahan  yang  terjadi  pada  gen  penanda  untuk masing-masing  spesies.  Semakin  panjang  suatu cabang  artinya  semakin  banyak  perubahan  yang terjadi  pada  gen  penanda  selama  proses  evolusi, akibatnya  spesies  yang  berada  pada  cabang tersebut dapat dikatakan lebih maju. Berdasarkan hasil  analisis  menggunakan  pohon  filogenetik  di atas diketahui bahwa Papilio ulyses dohertius _dari  Obi, Papilio  ulyses  morotaicus dari  Morotai  dan Papilio  ulyses  telegoneus dari Timika    merupakan    kerabat  dekat  dalam  satu kluster.    Selanjutnya  Kupu-kupu Papilio  ulyses
oxyartes dari  Aru, Papilio  ulyses  autolysus dari Timika  dan Papilio  ulyses  autolycuc dari Indonesia  merupakan  kerabat  dekat  dalam  satu subkluster.  Untuk Papilio  ulyses  ulyses dari Seram, Papilio  ulyses  reikoae dari  Manipa  dan Papilio  ulyses  ampillus dari  Buru  merupakan kupu-kupu Papilio spp  kluster  termuda  dan paling  modern.  Menurut  Ochieng et  al .  (2007) pohon  filogenetik  tersusun  atas  nodus-nodus  dan percabangan.
Masing-masing nodus
menggambarkan proses spesiasi selama terjadinya  evolusi.  Nodus-nodus  ujung  mewakili data  yang  dibandingkan  ( operational  taxonomic units ),  sedangkan  nodus  internal  melambangkan unit nenek moyang ( hypothetical taxonomic unit ). Panjang  masing-masing  cabang  mewakili  jumlah perubahan  yang  terjadi  pada  karakter  yang digunakan sebelum terjadinya separasi berikutnya.  Karakter  yang  sangat  mirip  akan berdekatan  di  dalam  percabangan.  Salah  satu tahap  penting  dalam  mengkonstruksi  pohon filogenetik adalah alignment , yaitu
membandingkan sisi yang homolog-homolog dan variable-variabel antar sequence sehingga diperoleh nilai similaritas.
Analisis  filogenetik  secara  insiliko  dalam tulisan  ini  dapat  digunakan  sebagai  informasi awal  dalam  kajian  biosistematika  dan  taksonomi molekuler  kupu-kupu  yang  berasal  dari  Maluku Utara.  Hasil  penelitian  ini  merupakan  analisis awal  dalam  riset  kajian  diversitas  genetik  kupu
P. ulysses ulysses -Pulau_Seram Maluku
P. ulysses reikoae -Pulau_Manipa Maluku
P. ulysses ampelius -Pulau_Buru_Maluku
P. ulysses oxyartes -Pulau Aru Maluku
P. ulysses autolycus -Timika Irian
P. ulysses autolycus -Indonesia
P. ulysses dohertius -Pulua Obi
P. ulysses morotaicus -Pulau Morotai
P. ulysses telegonus -Timika Irian
O. croesus -Pulau Bacan
O. aesacus -Pulau Obi 0.02
Abdu Mas’ud dkk: Kajian Filogenetik Kupu-Kupu Papilio…..
Papilio spp  di  Maluku  Utara.  Selanjutnya  hasil hasil  penelitian  berikutnya  merupakan  databse yang dapat digunakan untuk  menentukan strategi konservasi  satwa  endemik  khususnya  kupu-kupu di Maluku Utara.

## Simpulan
Analisis  filogenetik  secara  insiliko  pada pada  kupu-kupu Papilio spp  menggunakan  data molekuler sekuen dari gen mitokondria ND5 pada genbank  NCBI  menunjukkan  bahwa  terdapat hubungan  kekerabatan  antara  kupu-kupu Papilio spp asal Timika Papua, dan asal Obi dan Morotai Maluku  Utara.  Kupu-kupu Papilio  ulyses asal Obi  dan  Morotai  memiliki  nenek  moyang  yang sama  dengan Papilio  ulyses  telegonus asal Timika berdasarkan analisis pohon filogenetik .

## Ucapan Terima Kasih
Penulis mengucapkan terimaksih tak terhingga kepada Dr Abdul Hamid A Toha, M.Si dan  Dr  Sundari  M.Pd  serta  Didik  Wahyudi  M.Si atas tutorial dan asistensinya dalam Bioinformatika  dan  analisis  data  molekuler sehingga penulisan artikel ini bisa terlaksana .

## Daftar Pustaka
Berg,  J.M.,  Tymoczko,  J.L.,  &  Stryer,  L.,  2012. The Calvin cycle and the pentose phosphate pathway. Biochemistry , 6 , 565-591.
Hermawanto, R., Panjaitan, R., & Fatem, S. 2015.
Kupu-Kupu (Papilionoidea) di Pantai Utara Manokwari, Papua Barat: Jenis,
keanekaragaman dan pola distribusi.
Prosiding  Seminar  Naional  Masyarakat Biodiversitas Indonesia . Volume 1, Nomor
6,  September  2015;  ISSN:  2407-8050 Halaman: 1341-1347 Hauzer,  C.L.De  Jong,R  Lauris.G,Robbin,R.K Smith.C.R Van Wright,R.I (2001). Pappilionidae_Revised Globis/GART Speciest Chechlist.www.insect- online.de/frame/papilio.htm Mastrigt,  V.H.,  &  Rosariyanto,  E.,  2005.  Buku panduan lapangan: Kupu-kupu untuk wilayah  Mamberamo  sampai  pegunungan Cyclops. Conservation International Indonesia. Jakarta .
Mallet,  J.,  2003.  Perspectives  Poulton,  Wallace and  Jordan:  how  discoveries  in  Papilio
butterflies led to a new species concept 100 years ago. Systematics and
Biodiversity , 1 (4), 441-452.
Ochieng,  J.W.,  Muigai,  A.W.,  &  Ude,  G.N.,
2007. Phylogenetiks in plant biotechnology:  principles,  obstacles  and opportunities for the resource poor. African Journal of Biotechnology , 6 (6). 639-649.
Peggie.  D.J,  Rawlins  &  R.I  Van  Wright.  2005.
An  illustrated  checklist  of  the  papilionidae butterflies  (Lepidoptera:  Papilionidae)  of Northen  and  Central  Maluku  Indonesia. Nachricten  Des  Entomologischen  Vereins Appolo N.F, 26 (1/2) 41-60 (20015)
Tabita,  F.R.,  Hanson, T.E.,  Satagopan,  S.,  Witte, B.H.,  &  Kreel,  N.E.,  2008.  Phylogenetik and  evolutionary  relationships  of  RubisCO and  the  RubisCO-like  proteins  and  the functional  lessons  provided  by  diverse molecular forms. Philosophical Transactions  of  the  Royal  Society  B: Biological Sciences , 363 (1504), 2629-2640. Tamura,  K.,  Nei,  M  and  Kumar,  S.,  2004. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings  of  the  National Academy  of  Sciences  (USA) 101:11030- 11035
Tamura,  K.,  Stecher,  G.,  Peterson,  D.,  Filipski,
A  and  Kumar  S.,  2013.  MEGA6: Molecular Evolutionary Genetiks Analysis Version  6.0. Molecular  Biology  and Evolution . 30: 2725-2729.
Van  Wrght.R.I  2002.  Endemic  and  Diversity  in Butterfly  Sistematic  pp  477-513  in  Bogg, C.L  Watt.  W.B  &  Ehlrich,  P.R  (eds) Butterflies  Ecology  and  Evolution  Taking Thight,XYII  +739  +  [16}  pp  Chicago University of Chicago
Wallace,  A.R.,  1865.  On  the  phenomena  of variation  and  geographical  distribution  as illustrated  by  the  Papilionidae  of  the Malayan  region. Transactions  of  the Linnean Society of London 25:1-71.