## Toksisitas Fraksi Daun Boboan (Cleome rutidosperma D.C) terhadap Larva Udang Artemia salina

## Toxicity of Boboan (Cleome rutidosperma D.C) Fraction to Brine Shrimp Artemia salina
Dwi Wahyuni Leboe 1 , Muh.Fitrah 1 , Jumasni 2
1 Program Study Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Alauddin Makassar Jl. HM Yasin Limpo No. 36 Samata Kab. Gowa
2 Mahasiswa Jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Alauddin Makassar Jl. HM Yasin Limpo No. 36 Samata Kab. Gowa
Kontak sur-el: dwiwahyunileboe@gmail.com

## ABSTRAK
Boboan  ( Cleome  rutidospermae D.C)  adalah  tanaman  yang  umum  dibudidayakan  karena  keberadaannya  di alam  liar.  Beberapa  orang  menggunakannya  sebagai  obat  herbal  untuk  mengobati  bengkak,  rasa  sakit,  atau kemerahan di  mata. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan toksisitas terhadap larva udang Artemia  salina dan identifikasi golongan senyawa dari fraksi aktif daun boboan. Sampel diekstraksi secara bertingkat menggunakan n- heksana,  etil  asetat,  etanol  96%  dan  air  dengen metode  maserasi  dan  refluks  Ekstrak  kemudian  diuji  toksisitasnya dan etanol 96% memiliki toksisitas yang lebih tinggi. Nilai LC 50 ekstrak etanol 96% adalah 13.489 μg/ml. Ekstrak etanol  96%  kemudian  difraksinasi  dengan  kromatografi  kolom  dan  diperoleh  mendapatkan  7  fraksi.  Setiap  fraksi diuji toksisitas. Fraksi F I yang memiliki toksisitas paling besar dengan nilai LC 50 13,182 ug / ml. Hasil identifikasi fraksi FI menunjukkan adanya golongan senyawa steroid, flavonoid, fenolik dan senyawa organik.
Kata kunci: Uji Brine Shrimp Letality (BSLT), daun Boboan ( Cleome rutidospermae D.C).

## ABSTRACT
Boboan  (Cleome  rutidospermae  D.C)  is  an  officially  cultivated  plant  because  of  its  presence  in  the  wild. Some  people  use  it  as  an  herbal  medicine  to  treat  swelling,  pain,  or  redness  in  the  eyes.  This  researh  aims  to determine  toxicity  to  brine  shrimp  Artemia  salina  and  identification  of  the  class  of  compounds  from  the  active fraction of Boboan leaf. The sample was multilevel extraction using n-hexane, ethyl acetate, ethanol 96% and water using maceration and reflux methods. The extract then tested for toxicity and the ethanol 96% extract had a higher toxic  level.  The  LC 50 value  of  ethanol  96%  extract  is  13,489  μg/ml.  The  extract  then  fractionated  by  column chromatography  and  had  obtained  7  fractions.  Each  fraction  was  tested  for  toxicity.  Fraction  F I had  highest toxicity,  LC 50 value  is  13.182  ug/ml.  The  result  of  identification  of  F I fraction  showed  the  presence  of  steroid, flavonoids, and phenolic compounds class.
Keywords : Brine Shrimp Letality Test (BSLT), Boboan leaf (Cleome rutidospermae D.C).

## PENDAHULUAN
Penyakit kanker merupakan suatu penyakit yang  disebabkan  oleh  pertumbuhan  sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal, berkembang  cepat  dan  terus  membelah  diri, hingga  menjadi  penyakit  berat  (Maharani, 2009,  p.  12).  Kanker  merupakan  penyakit
yang  ditandai  dengan  pembelahan  sel  tidak terkendali  dan  kemanpuan  sel-sel  tersebut menyerang jaringan biologis lainnya (Sunaryanti,  2011,  p.  12).  Salah  satu  sumber obat kanker adalah dari obat tradisional.
Obat  tradisional  atau  obat-obatan  alami telah dikenal oleh masyarakat Indonesia sejak
zaman  dahulu.  Selain  khasiatnya  yang  telah turun  temurun  digunakan  oleh  masyarakat, obat  ini  lebih  murah  dan  mudah  didapat. Namun  diperlukan  penelitian  yang  lebih lanjut karena banyaknya tanaman yang belum diketahui  kadar  toksisitasnya  (Hyeronimus, 2008,  p.  15).  Salah  satunya  adalah  daun Boboan.
Tanaman  untuk  dapat  dijadikan  sebagai obat tradisional harus memenuhi standar mutu dari WHO, meliputi standar kualitas, keamanan dan khasiat. Uji toksisitas merupakan  salah  satu  persyaratan  suatu tanaman  dapat  dikembangkan  sebagai  obat, termasuk  sebagai  antikanker.  Salah  satu metode  yang  digunakan  untuk  mengetahui toksisitas  dari  suatu  ekstrak  atau  senyawa bahan  alam  adalah Brine  Shrimp  Lethality Test .  Beberapa  kelebihan  metode  ini  adalah mudah,  relatif  murah,  tidak  membutuhkan kompetensi  tertentu  dalam  pelaksanaannya dan memiliki hasil dengan tingkat kepercayaan  tinggi.  Dengan  alasan-alasan tersebut,  maka  uji  ini  sangat  tepat  digunakan dalam  penelitian  bahan  alam  Toksisitas diketahui dari jumlah kematian larva Artemia salina karena  pengaruh ekstrak  atau  senyawa bahan  alam  pada  konsentrasi  yang  diberikan. Ekstrak  atau  senyawa  bahan  alam  yang diketahui  memiliki  aktivitas  toksik  melalui metode  BSLT  (nilai  LC 50 <  1000  ppm)  dapat dikembangkan  lebih  lanjut  sebagai  obat antikanker (Meyer, 1982., p. 112).
Uji Toksisitas merupakan metode uji yang digunakan  untuk  mengetahui  tingkat  toksik
dari  suatu  senyawa  yang  ditentukan  dalam waktu  singkat  setelah  pemberian  suatu sediaan.  Uji  toksisitas  dengan  metode  BSLT ini  memiliki  spektrum  aktifitas  farmakologi yang luas (Krishnarajua, et al., 2005).
Secara empiris, tanaman  Boboan memiliki beberapa manfaat yang digunakan masyarakat dan berpotensi dalam menyembuhkan beberapa  penyakit.  Daun  Boboan  yang dikenal  telah  dapat  mengatasi  penyakit Antidiare, obat mata, dan anti inflamasi.
Metode brine shrimp lethality test merupakan  salah  satu  metode  bioassay  yang dipertimbangkan  sebagai  uji  pendahuluan toksisitas  atau  untuk  uji  praskrining  terhadap senyawa-senyawa  yang  diduga  berkhasiat sebagai  antitumor.  Uji  ini  mempunyai korelasi  positif  dengan  potensinya  sebagai anti kanker (Sukardiman & Pratiwi, 2004).

## METODE PENELITIAN

## Sampel
Tanaman dideterminasi oleh  Divisi Botani di  Laboratorium  Biologi  Fakultas  MIPA Universitas Negeri Makassar. Bagian tanaman  yang  digunakan  adalah  daun. Sampel  dikeringkan  dalam  lemari  pengering, kemudian  diserbukkan  hingga  diperoleh simplisia.

## Ekstraksi
Simplisia  diekstraksi  sebanyak  600  g dengan  pelarut  n-heksan,  etil  asetat,  etanol 96%  dan  air.  Metode  ekstraksi  yang digunakan  untuk  n-heksan,  etil  asetat,  etanol
96%  adalah  maserasi  bertingkat  yang menggunakan  3  pelarut  dilakukan  pada  suhu ruang selama 24 jam dengan sesekali diaduk. Sampel kemudian diekstraksi lagi menggunakan air dengan metode refluks

## Uji Toksisitas dengan Metode BSLT

## Penyiapan larva Udang
Langkah  awal  dalam  penyiapan  larva udang  yaitu  dengan  menetaskan  kista.  Kista Artemia  salina direndam  dalam  aquades  (±1 jam), lalu ditiriskan. Kemudian kista ditetaskan  dalam  wadah  kerucut  dilengkapi dengan aerator dan lampu penerangan selama 24  jam.  Setelah  larva  menetas  kemudian dipindahkan ke  wadah 2 bilik (gelap-terang) dengan sekat berlubang-lubang yang berisi air laut.  Bilik  penetasan  diberi  kondisi  gelap sedangkan  bilik  satunya  dilengkapi  dengan lampu  sebagai  sumber  cahaya  dan  diberi aerator  yang  berfungsi  sebagai  oksigen  dan menjaga  agar  kista  tidak  mengendap.  Larva yang  baik  akan  berenang  menuju  ruang yang terang karena bersifat fototropik. Larva udang akan  siap  untuk  digunakan  dalam  pengujian setelah berumur 48 jam.

## Pembuatan Konsentrasi Sampel dan Kontrol
Ekstrak  dari  daun  boboan  (ekstrak  n- heksan,  etil  asetat,  etanol  90%  dan  ekstrak air)  ditimbang  masing-masing  sebanyak  30 mg.  Kemudian  ekstrak  tersebut  dilarutkan dalam  pelarut  sesuai  dengan  jenis  ekstrak sebanyak 3 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10000  μg/ml  sebagai  larutan  stok.    Untuk membuat  konsentrasi  10  μg/ml,  100  μg/ml
dan  1000  μg/ml,  maka  dari  larutan  stok tersebut dipipet ke dalam vial masing-masing 5  μl,  50  μl,  dan  500  μl  menggunakan mikropipet,  kemudian  diuapkan  dengan  cara diangin-anginkan hingga pelarutnya menguap. Pembuatan kontrol pelarut dilakukan  dengan  memasukkan  pelarut  n- heksan,  etil  asetat,  etanol  96%  dan  air  ke dalam  vial  berbeda  dengan  volume  masing- masing 5 ml, kemudian diuapkan.

## Pelaksanaan uji
Larva  udang  disiapkan  ke  dalam  vial-vial masing-masing sebanyak sepuluh ekor Artemia  salina umur  48  jam  yang  sehat (bergerak aktif) dipilih secara acak, kemudian ditambahkan  air  laut  sampai  5  ml.  Satu  tetes suspensi  ragi Saccharomyces  cerevicease (3 mg/10 ml air laut) ditambahkan ke dalamnya sebagai  makanan Artemia  salina .  Vial diletakkan  di  bawah  lampu  penerangan selama  24  jam.  Setelah  24  jam  jumlah  larva yang  hidup  dihitung  dengan  bantuan  kaca pembesar.  Persen  kematian  larva  dihitung dengan menggunakan rumus:
% kematian larva = 𝐿𝑀 − 𝐿𝐾 𝐿𝑇 x 100%
dimana  LM=  jumlah  larva  yang  mati,  LK  = jumlah larva kontrol, LT = jumlah total larva uji

## Analisis dan Pengolahan Data
Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis  dengan  menggunakan  analisis probit.  Toksisitas  dihitung  sebagai  LC 50 dalam  unit  μg/ml  yang  diperoleh  dari  kurva persen  kematian  larva  (sumbu  y)  terhadap konsentrasi (sumbu x).

## Kromatografi Lapis Tipis
Ekstrak  teraktif  dari  sampel  ditotolkan pada  lempeng  bagian  batas  bawahnya. Lempeng  dielusi  dengan  eluen  dalam chamber,  sampai  cairan  pengelusi  mengelusi lempeng  sampai  batas atas. Lempeng dikeluarkan dikeringkan. Lempeng yang telah dielusi  diamati  penampakan  noda  yang terbentuk  dibawah  sinar  lampu  UV  254  nm dan 366 nm.

## Fraksinasi
Ekstrak etanol 96% ditimbang sebanyak 11 gram, kemudian difraksinasi dengan menggunakan  kromatografi  kolom.  Proses fraksinasi dilakukan dengan metode Kromatografi Kolom (KK) dengan fase gerak gradien  kepolaran  yang  semakin  meningkat yaitu berturut-turut Heksan : Etil [(9:1), (7:1), (6:1),  (5:1),  (3:1),  (2:1),  (1:1)].  Hasil fraksinasi kemudian diujikan ke larva udang.

## Identifikasi Golongan Senyawa

## Alkaloid
Pereaksi yang digunakan yaitu Dragendorf, jika  sampel  positif  mengandung  alkaloid, maka  timbul  warna  jingga  dengan  latar belakang kuning.

## Steroid
Pereaksi  yang  digunakan  Liebermann- Burchard atau pereaksi Salkowski. Kromatogram  terlebih  dahulu  dipanaskan, kemudian  diamati  di  lampu  UV  366  nm, munculnya  noda  berflouresensi  coklat  atau biru menunjukkan adanya triterpen,
sedangkan  munculnya  warna  hijau  kebiruan menunjukkan adanya steroid.

## Flavanoid
Pereaksi yang digunakan yaitu Aluminium Klorida  diamati  di  lampu  UV  366  nm,  jika sampel mengandung senyawa flavanoid maka noda akan berfluoresensi kuning.

## Fenolik
Pereaksi  yang  digunakan  Besi  (III) Klorida,  jika  sampel  positif  mengandung fenol akan dihasilkan warna hijau atau biru.

## Kumarin
Pereaksi  yang  digunakan  KOH  etanolik, jika  sampel  positif  mengandung  senyawa khumarin  akan  dihasilkan  warna  merah terang.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Rendemen paling diperoleh jika diekstraksi  dengan  air.  Tabel  1  menunjukkan rendemen  hasil  ekstraksi  daun  boboan  yang diperoleh  masing-masing  yaitu  ekstrak  n- heksan sebanyak 7,05 gram, ekstrak etil asetat sebanyak  7,9  gram,  ekstrak  etano  96% sebanyak 38,4 gram, dan ekstrak air sebanyak 39,7 gram.
Masing-masing  ekstrak  yang  telah diperoleh  diuji  efek  toksiknya  terhadap Artemia salina . Daya toksisitas suatu senyawa  dapat  diketahui  dengan  menghitung jumlah kematian larva udang dengan parameter Lethal  Concentration  50  percent (LC 50 ).  Suatu  sampel  dianggap  memiliki potensi  toksisitas  terhadap  larva  udang apabila  mempunyai  LC 50 <1000  μg/ml
(Kalauw,  Ilang,  Kartika,  Rachman,  & Simanjuntak, 2016).
Ekstrak  etanol  96%  dan  ekstrak  air memiliki  aktivitas  yang  toksik  terhadap larva udang Artemia  salina karena  memiliki  nilai LC 50 <1000  μg/ml,  sedangkan  ekstrak  n- heksan  dan  ekstrak  etil  asetat  tidak  memiliki aktivitas  toksik  terhadap  larva  udang,  karena hasil  kedua  ekstrak  ini  memiliki  nilai LC 50 >1000  μg/ml.  Ekstrak  yang  memiliki toksisitas  yang  paling  tinggi  yaitu  ekstrak etanol  96%  karena  semakin  kecil  nilai  LC 50 berarti  semakin  toksik  terhadap  larva  udang Artemia salina . Data toksisitas ekstrak tersaji dalam tabel 2.
Hasil identifikasi KLT (lihat tabel 3.)ekstrak  etanol  96%  pada  daun  boboan, dengan  eluen  heksan  :  etil  (9:1)  pada penampakan noda UV 254 nm diperoleh 3 noda dengan  nilai  Rf-nya  yaitu  0,09;  0,18;  dan 0,27;  sedangkan  pada  UV 366 nm  di  peroleh  4 noda  dengan  nilai  Rf-nya  yaitu  0,09;  0,18; 0,27; dan 0,45. Noda pada UV 254 adalah noda yang  sama  dengan  noda  pada  UV 366 karena
kesamaan nilai Rf, kecuali penambahan noda ke-4.
Ekstrak etanol 96% daun Boboan kemudian  difraksinasi  dengan  menggunakan metode  kromatografi  kolom  (KK).  Ekstrak etanol  96%  difraksinasi  sebanyak  11  gram. Pronsip kerja kromatografi kolom berdasarkan  perbedaan  daya  serap  dan kelarutan  dari  masing-masing  komponen campuran yang akan diuji terhadap fase gerak dan fase diam. Ekstrak Etanol 96% dilarutkan dengan  sedikit  pelarut  lalu  dimasukkan  ke kolom  dan  dibiarkan  mengalir  bersama  fase gerak.  Senyawa  yang  lebih  polar  akan terserap  lebih  kuat  oleh  fase  diam  sehingga turun  lebih  lambat  dari  senyawa  non  polar yang  terserap  lebih  lemah  dan  turun  lebih cepat  (Sastrohamidjojo,  2004).  Metode  ini dipakai karena hasil fraksinasi yang diperoleh sangat  baik,  sebab  elusi  terjadi  secara  wajar tanpa  ada  tekanan  dari  alat  lain  serta  waktu kontak  yang  lama.  Metode  ini  dilakukan menggunakan  fase  diam  silica  gel  60  PF 254 dan  fase  gerak  dengan  gradient  kepolaran
Tabel 1. Hasil ekstraksi daun boboan.
Sampel Berat sampel (gram) Pelarut Berat ekstrak (gram) Rendamen % Daun Boboan 600 Heksan Etil Asetat Etanol 96% Air 7,1 7,9 38,4 39,7 1,18 1,31 6,40 6,61
Table 2. Hasil uji toksisitas ekstrak daun boboan dengan menggunakan metode Brine shrimp lethality test (BSLT) Ekstrak LC 50 (μg/ml) Persamaan Regresi R 2 Heksan 19.952 y = 0,38x + 3.363 0,989 Etil Asetat 53.703 y = 0,205x + 4.03 0,957 Etanol 96% 13,49 y = 0,305x + 4.653 0,947 Air 218,77 y = 0,735x +   3.277 0,992
yang  semakin  meningkat  yaitu  berturut-turut heksan  :  etil  asetat  (9:1),  (7:1),  (6:1),  (5:1), (3:1), (2:1), (1:1). Etil asetat dan Etanol. Hasil fraksinasi  tersebut  selanjutnya  dianalisis menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT).  Hal  ini  dilakukan  dengan  tujuan pengelompokan  lebih  lanjut  terhadap  fraksi- fraksi  yang  diperoleh  berdasarkan  kesamaan profil kandungan kimia dari bercak KLT yang terbaik.
Hasil  fraksi  dari  ekstrak  daun  boboan diperoleh sebanyak 345 fraksi yang kemudian di KLT dengan fase gerak heksan : etil (2 :1), sehingga  pada  Kromatogram  fraksi  yang memiliki bercak warna yang sama digabungkan  sehingga  diperoleh  7  gabungan fraksi. Skrining toksisitas dari masing-masing gabungan  fraksi  kemudian  dilakukan  untuk mendapatkan fraksi teraktif.
Seluruh  fraksi  memiliki  toksisitas  dengan nilai LC 50 dibawah 200 (lihat tabel 4). Fraksi F1  memilki  efek  toksik  yang  paling  besar  di
antara  6  fraksi  lainnya  karena  memiliki  nilai LC 50 paling  kecil.  Semakin  kecil  nilai  LC 50 maka  semakin  toksik  terhadap  larva  udang Artemia salina .
Fraksi  F1  dilakukan  identifikasi  senyawa kimia  dengan  cara  ditotolkan  pada  lempeng KLT kemudian dielusi dengan eluen Heksan : etil asetat (2 : 1). Kromatogramnya disemprot dengan  menggunakan  pereaksi  penampak noda dragendorf untuk golongan alkaloid atau komponen  kimia  yang  mengandung  senyawa nitrogen,  FeCl 3 5%  untuk  senyawa  golongan fenolik,  pereaksi  Lieberman-Bouchard  untuk golongan  senyawa  terpenoid  seperti  triterpen dan sterol, pereaksi AlCl 3 5% untuk senyawa golongan  flavonoid  dan  KOH  etanolik  untuk senyawa kumarin.
Fraksi  F1  mengandung  senyawa  golongan flavonoid,  steroid  dan  fenolik  (lihat  tabel  5). Pada  uji  menggunakan  pereaksi  Dragendorf hasilnya  negatif  karena  tidak  terdapat  noda berwarna  jingga  dengan  latar  kuning,
Tabel 3. Hasil identifikasi KLT ekstrak etanol  daun Boboan
Ekstrak UV 254 nm UV 366 nm Eluen Noda Rf (cm) Noda Rf (cm) Etanol 96% 1 0,09 1 0,09 Heksan : Etil (9 : 1) 2 0,18 2 0,18 3 0,27 3 0,27 4 0,45
Tabel 4.  Hasil  uji  toksisitas  fraksi  daun  boboan  dengan  menggunakan  metode Brine  shrimp lethality test Fraksi LC 50 (μg/ml) Persamaan Regresi R 2 F 1 13,18 y = 0,125x + 4,86 0,959 F2 74,13 y = 0,765x + 3,13 0,869 F3 173,78 y = 0,25x + 4,44 0,853 F4 102,32 y = 0,895x + 3,2 0,993 F5 154,88 y = 0,74x + 3,37 0,895 F6 104,71 y = 0,385x + 4,22 0,961 F7 117,49 y = 0,635x + 3,68 0,859
sedangkan  pereaksi  Liebermann-Burchard memberikan hasil positif dengan adanya noda berwarna hijau kebiruan menunjukkan adanya komponen  kimia  golongan  steroid.  Pada  uji menggunakan  pereaksi  FeCl 3 5%  hasilnya positif  dengan  adanya  noda  berwarna  hitam dan  memberikan  hasil  positif  terhadap pereaksi AlCl 3 dengan adanya noda berwarna kuning  yang  menunjukkan  adanya  senyawa golongan  flavonoid.  Pada  uji  menggunakan pereaksi  KOH  hasilnya  negatif  karena  noda tidak berwarna merah.

## PENUTUP
Ekstrak  daun  boboan  memiliki  nilai  LC 50 lebih tinggi yaitu 13.489 μg/ml, dibandingkan dengan  nilai  LC 50 hasil  fraksinasi  yaitu 13.182  μg/ml.  Adapun  senyawa  kimia  yang terkandung  dalam  daun  boboan  yaitu  steroid, flavanoid, dan fenolik.

## REFERENSI
Hyeronimus,  S.  (2008). Ragam  dan  Khasiat Tanaman  Obat (1  ed.).  Jakarta:  Agro Media.
Kalauw,  S.  L.,  Ilang,  Y.,  Kartika,  R.,
Rachman,  F.,  &  Simanjuntak,  P.  (2016). Uji  BSLT  dan  Antioksidan  Ekstrak  N- Butanol  dan  Air  pada  Ranting  Tanaman Sirih  Hutan  (Piper  aduncum  L.). Seminar Nasional Kimia 2014.
Krishnarajua, A. V., Rao, T. V., Sundararajua,  D.,  Vanisree,  M.,  Tsay,  H.- S., & Subbaraju, G. V. (2005). Assessment of  Bioactivity  of  Indian  Medicinal  Plants Using  Brine  Shrimp  (Artemia  salina) Lethality  Assay. International  Journal  of Applied  Science  and  Engineering,  3 (2), 125-134.
Maharani,  S.  (2009). Kanker:  mengenal  13 jenis kanker dan pengobatannya.
Yogyakarta: Katahati.
Meyer,  H.  (1982.). Brine  Shrimp  Lethality
Test. Plant Research. (Vol. 45). Amsterdam: Hipokrates Verlag. Sastrohamidjojo, H. (2004). Teknik Pemisahan  Kromatografi. Yogyakarta: UGM Press.
Sukardiman,  A.  R.,  &  Pratiwi,  N.  F.  (2004).
Uji  Praskrining  Aktivitas  Antikanker
Ekstrak Eter dan Ekstrak Metanol Marchantia  cf.  planiloba  Steph.  Dengan Metode  Uji  Kematian  Larva  Udang  dan Profil Densitometri Ekstrak Aktif. Majalah Farmasi Airlangga, 4 (3), 97-100. Sunaryanti, S. (2011). Penyakit paling sering menyerang  dan  mematikan  (anti  kanker). Yogyakarta. : Flasbook.
Tabel   5.  Hasil identifikasi golongan senyawa kimia daun boboan Pereaksi Fraksi F7 117,49 y = 0,635x + 3,68 0,859 Golongan senyawa Hasil Dragendorf Alkaloid - AlCl3 Flavonoid + LB Steroid + KOH Khumarin - FeCl3 Fenolik +