PEMERIKSAAN Viral Nervous Necrosis (VNN) PADA IKAN DENGAN METODE Polymerase Chain Reaction (PCR)
Viral nervous necrosis (VNN) EXAMINATION AT FISH BY Polymerase Chain Reaction (PCR) METHOD

## Elly Fitriatin dan Abdul Manan
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp. 031-5911451

## Abstract
Fish production annually  has  increased. Trading activities  of Fishery in Indonesia both  exports and  imports  will  continue  to  increase  every  year.  Control  and  monitoring  of  fisheries  products  was transported  in  Indonesia  aims  to  reduce  the  risk  of  entry  and  spread  of  pests  and  diseases  of  fish  in Indonesia.  The  purpose  of    Study  is  to  know  examination  techniques  of  virus Viral  Nervous  Necrosis (VNN)  at fish by Polymerase Chain Reaction (PCR) method. This Study was held in the Quarantine Fish Quality Control and Safety of Fishery Products (BBKIPM-KHP) Soekarno Hatta Tangerang, Banten on January  12 th to  February  12 th ,  2015.  The  methods  of  data  fetching  consisted  of  primary  and  secondary data.  The  data  fetching  was  performed  with  active  participation,  observation,  interviews,  and  literature. Examination  methods Viral  Nervous  Necrosis (VNN)  by Polymerase  Chain  Reaction (PCR).  Stages  of virus  examination  by  PCR  method  includes  necropsy  samples,  RNA  extraction,  amplification, electrophoresis,  and  the  diagnosis  results  using  UV  transluminator.  Fish  samples  were  examined  VNN virus consisting of a live fish and frozen fish both commodity exports, imports, or domestic. The results showed that all fish samples are negative infected with the virus VNN.
Keywords : Viral nervous necrosis (VNN) , PCR Technique, Examination result
Pendahuluan Kegiatan
perdagangan produk
perikanan  di  Indonesia  baik  ekspor  maupun impor  setiap  tahunnya  akan  terus  meningkat dengan  potensi  sumber  daya  yang  besar,  maka lalulintas komoditas perikanan baik antar negara maupun  antar  area  di  dalam  wilayah  Indonesia akan  meningkat.  Hal  ini  memberikan  peluang besar  terhadap  resiko  masuk  dan  tersebarnya hama  dan  penyakit  ikan  yang  berasal  dari  luar negeri  maupun antar area di wilayah Indonesia. Terkait dengan usaha pencegahan dan penanggulangan  wabah  penyakit,  sehingga diselenggarakan  Karantina  Ikan  di  Indonesia. Jenis  virus  yang  berbahaya  dan  sering menyebabkan kerugian pada budidaya perikanan  adalah Viral  Nervous  Necrosis (VNN).  Virus  VNN  telah  banyak  dilaporkan menginfeksi  ikan  laut  yang  dibudidayakan  di Indonesia  dan  telah  ditetapkan  dalam  Kepmen nomor  26  tahun  2013  sebagai  Hama  Penyakit Ikan Karantina (HPIK) Golongan I.
Metode  diagnosis  pathogen  virus  dapat dilakukan  dengan  cara  melihat  gejala  klinis, histopatologi,  mikroskop  elektron,  isolasi  agen virus  dalam  kultur  sel  yang  kemudian  diikuti dengan  identifikasi  secara  molekuler  atau dengan  metode Polymerase  Chain  Reaction
(PCR). Metode PCR ini telah banyak digunakan oleh  laboratorium  uji  di  Indonesia,  karena dinilai  dengan  menggunakan  metode  ini  dapat diperoleh hasil secara cepat dan sangat efektif.
Tujuan Studi ini adalah untuk mengetahui  teknik  dan  hasil  pemeriksaan  VNN ( Viral  nervous  necrosis )  pada  ikan  dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR).

## Materi dan Metode
Studi  ini  dilaksanakan  di  Balai  Besar Karantina  Ikan  dan  Pengendalian  Mutu  Hasil Perikanan  (BBKIPM-KHP)  Soekarno  Hatta Tangerang,  Banten  pada  tanggal  12  Januari-12 Februari  2015.  Metode  kerja  yang  digunakan adalah metode deskriptif sedangkan pengumpulan  data  dilakukan  dengan  cara observasi,  wawancara,  partisipasi  aktif  dan telaah pustaka.

## Hasil dan Pembahasan
Kegiatan  pemeriksaan  virus  yang dilakukan  meliputi  beberapa  tahapan  yaitu penerimaan  sampel,  persiapan  sampel,  dan pemeriksaan secara PCR.
Penerimaan Sampel
Penerimaan sampel berupa ikan diterima oleh balai dari pemilik yang mengirimkan  sampel.  Sampel  yang  masuk kemudian didata oleh petugas bagian penerimaan  sampel.  Sampel  diberi  kode  sesuai jenis  sampel  yaitu  DK  untuk  sampel  yang dilalulintaskan secara domestik, E untuk sampel yang  akan  diekspor,  IM  untuk  sampel  yang diimpor (ikan hidup), dan IB untuk sampel yang diimpor dalam kondisi mati (ikan beku). Sampel yang  sudah  didata,  kemudian  dikirim  ke Laboratorium BBKIPM Soekarno-Hatta beserta surat  tanda  terima  penerimaan  sampel  yang berisi  data  awal  tentang  sampel,  tanggal penerimaan, jenis sampel, permohonan pemeriksaan,  dan  kode  sampel.  Surat  tersebut dibuat  rangkap  dua,  satu  untuk  pengguna  jasa, dan satu lagi digunakan sebagai arsip.
Persiapan Alat dan Bahan Alat
yang
digunakan untuk
pemeriksaan  virus  adalah  1) Dissecting  set ,  2) Alat  penumbuk  atau  mortar,  3) Microtube (1.5 ml dan 0.2 ml), 4) Micropipet (100-1000 µl, 10- 200  µl,  10-100  µl,  0.5-10  µl,  0.1-3  µl  ),  5) Microtip (1000  µl,  200  µl,  dan  10  µl),  6) Laminary  flow ,  7) Thermoblock (inkubator),  8) Vortex ,  9) Centrifuge ,  10) Mini  Centrifuge ,  11) Refrigerator ,  12) Freezer ,  13) Thermocycler- Biometra ,  14) Stopwatch ,  15) Powerpac  – Biorad , 16) Uvidoc (UV transilluminator ) yang terhubung  dengan  monitor  dan  printer,  17) Cetakan Gel, 18) Spatula.
Bahan  yang  digunakan  adalah,  1) Ethanol  70  %,  2)  RNA Extraction  solution ,  3) Chloroform , 4) Isopropanol, 5) Ethanol 75 %, 6) DEPC  ddH 2 O,  7) Reagent ( First PCR: Nucleus free  water ,  RT-AMV acces  quick  enzyme , master  mix  acces  quick , primer VNN  (F 2 dan R 3 ),  8) Template RNA,  9) Nested PCR premix : GoTaq Green Master mix , Primer (F’ 2 dan R’ 3 ), 10)  Kontrol  positif  VNN,  11) Yeast (kontrol negatif),  12)  DNA Marker 100bp,  13) Agarose gel ,  14)  TE buffer ,  15)  Larutan  EtBr  ( Etidium Bromide ), 16) Air.
Sterilisasi Alat Sterilisasi  adalah  proses  pemusnahan semua
bentuk
kehidupan
terutama mikroorganisme.  Laboratorium  Balai  Besar Karantina  Ikan  dan  Pengendalian  Mutu  Hasil Perikanan Soekarno-Hatta  melakukan  sterilisasi peralatan  menggunakan  sinar ultaviolet dan autoclave .  Sinar ultaviolet berfungsi  untuk mensterilkan ruangan dan peralatan yang ada di dalamnya.  Sesuai  dengan  penelitian  yang dilakukan  oleh  Srigede  dan  Zaetun  (2014) bahwa  terjadi  penurunan  jumlah  bakteri
sebelum  dan  sesudah  paparan  sinar ultraviolet . Autoclave digunakan  untuk  sterilisasi  alat  yaitu microtube dan microtip .  Prinsip  sterilisasi dengan autoclave adalah  menggunakan  suhu dan  tekanan  tinggi.  Menurut  Pelczar  (1988) metode paling efektif untuk membunuh mikroorganisme  adalah  dengan  menggunakan suhu tinggi dan kelembaban tinggi.

## Preparasi Sampel
Preparasi  sampel  untuk  pemeriksaan VNN,  jika  sampel  berukuran  lebih  dari  3  cm maka  organ  yang  diambil  yaitu  mata  dan  otak dan  jika  berukuran  kurang  dari  3  cm  seperti benih  maka  diambil  seluruh  bagian  tubuh  atau hanya  bagian  kepala  saja.  Pengambilan  organ mata dan otak disebabkan karena organ tersebut memiliki  reseptor  yang  spesifik  dengan  virus VNN.  Pada  penelitian  yang  dilakukan  oleh Munday et al. (2002) bahwa virus ini ditemukan berada  dalam  sitoplasma  sel  otak  pada  ikan kakap  dan  kerapu.  Organ  yang  sudah  diambil dimasukkan  dalam  botol  sampel  yang  sudah diisi  dengan Ethanol 70%,  kemudian  diberi label  kode  sampel  serta  target  virus  yang diperiksa.  Penggunaan  Ethanol  70%  berfungsi untuk  menyimpan  sampel  organ  dan  menjaga kualitas materi genetik target uji.
Ekstraksi RNA Prinsip dari
ekstraksi adalah
memisahkan  asam  nukleat  dengan  komponen sel  lainnya.  Menurut  Langga  (2012)  ada  tiga tahap  utama  dalam  ekstraksi  materi  genetik yaitu  perusakan  membran  sel  (lisis),  pemisahan materi  genetik  dari  bahan  padat  seperti  protein dan  selulosa,  serta  pemurnian  materi  genetik. Langkah  pertama  pada  proses  ekstraksi  RNA adalah  proses  fisik  dimana  sampel  organ diambil sebanyak ± 20 mg, dipotong halus atau digerus. Penggerusan dilakukan untuk memperluas  permukaan  bidang  sentuh  sampel dengan reagent untuk  meningkatkan  efektivitas ekstraksi. Proses kimia yaitu dengan
menambahkan  larutan  guanidine  tiosianat  dan kloroform  untuk  pemisahan  materi  genetic  dari protein dan selulosa, serta penambahan isopropanol  dan  ethanol  untuk  pemurnian materi genetik.
Amplifikasi Amplifikasi  merupakan  proses  utama dalam  PCR.  Amplifikasi  bertujuan  untuk memperbanyak  DNA  target  untuk  dapat dianalisis menggunakan  elektroforesis  gel agarose.  Satu  siklus  dalam  proses  amplifikasi meliputi tiga tahapan yaitu denaturasi, annealing  primer ,  dan  ekstensi.  Pada  proses
amplifikasi  dapat  terjadi  30-40  siklus  yang dapat  menghasilkan  berjuta-juta  DNA.  Proses amplifikasi  virus  RNA  dari  VNN  di  BBKIPM Soekarno-Hatta menggunakan
metode amplifikasi two  step yaitu  RT-PCR  ( Reverse Transcriptase  –  Polymerase  Chain  Reaction ) dan Nested RT-PCR.  Proses  amplifikasi dijalankan dalam mesin PCR atau Thermocycler . Amplifikasi  tahap  pertama  adalah Reverse  Transcriptase  –  Polymerase  Chain Reaction (RT-PCR). Proses RT-PCR digunakan untuk  sintesis  RNA  menjadi complimentary DNA  (cDNA)  untai  tunggal  agar  dapat diamplifikasi menggunakan mesin PCR. Komponen  utama  dalam  proses  PCR  adalah DNA  cetakan, primer ,  dNTPs, Taq DNA polimerase,  dan  larutan buffer (Verkuil et  al ., 2008).  Proses  amplifikasi  tahap  kedua  yaitu Nested RT-PCR.  Menurut  Yusuf  (2010) Nested RT-PCR  memungkinkan  untuk  mengurangi kontaminasi  pada  produk  selama  amplifikasi dari  penyatuan  primer  yang  tidak  diperlukan. Nested primer  akan  menyatu  dengan  produk PCR  yang  pertama  dan  menghasilkan  produk yang  lebih  pendek  daripada  produk  yang pertama.

## Elektroforesis
DNA  hasil  amplifikasi  dianalisa  lebih lanjut  menggunakan  elektroforesis  untuk  dapat melihat  apakah  sampel  yang  diperiksa  positif atau  negatif  terinfeksi  virus  VNN.  Pada prinsipnya adalah DNA yang bermuatan negatif akan  berpindah  menuju  ke  arah  muatan  positif dalam  medan  listrik.  Menurut  Seow  and Bahaman
(2012)
perpindahan tersebut tergantung  pada  kondisi buffer ,  suhu,  durasi waktu,  konsentrasi  gel  dan  ukuran  molekul. Tahapan  dalam  proses  elektroforesis  adalah pembuatan  Gel  Agarose,  elektroforesis,  dan pewarnaan.

## Diagnosa Hasil
Gel  hasil  elektroforesis  yang  telah direndam  dengan  larutan  EtBr,  kemudian dimasukkan  dalam  alat  UV  doc  atau  UV Transluminator .  Setelah  UV Transluminator dinyalakan,  pita  DNA  akan  berpendar.  Hasil dari  sampel  dapat  dilihat  dilayar  monitor  yang terhubung  dengan  UV Transluminator .  Band atau  pita  DNA  yang  muncul  pada  sampel dibandingkan  dengan  band  yang  muncul  pada kontrol  positif.  Sampel  yang  dinyatakan  positif VNN apabila band sampel ada pada ukuran 294 bp atau sejajar dengan band pada kontol positif.
Gambar 1. Hasil elektroforesis VNN (Sumber  : Dokumentasi  BBKIPM  Soekarno- Hatta, 2015)
Keterangan :
1. Marker DNA 100 bp
2. Kontrol positif VNN
3. Kontrol negatif
4. Sampel (negatif)
Dari  hasil  pemeriksaan  diperoleh sampel  negatif  VNN.  Sampel  ikan  yang diperiksa dalam keadaan tampak sehat dan tidak menunjukkan gejala klinis. Pemeriksaan dilakukan  pada  ikan  yang  dilalulintaskan melalui  Bandara  Soekarno-Hatta  Tangerang, Banten  bertujuan  untuk  mencegah  masuk  dan tersebarnya  wabah  penyakit  VNN  di  Indonesia. Mengingat  pada  tahun  1998  terjadi  kasus kematian yang disebabkan oleh VNN ditemukan  pada  budidaya  ikan  kerapu  bebek ( Cromileptes  altivelis )  dengan  tingkat  kematian mencapai  100  %  (Sugianti,    2005).  Penyakit virus  tidak  bisa  disembuhkan  100  %,  karena ikan  yang  masih  hidup  setelah  terinfeksi  virus akan berperan sebagai inang perantara ( carrier ).

## Kesimpulan
Teknik  pemeriksaan Viral  Nervous Necrosis (VNN) pada ikan terdiri dari beberapa tahapan  yaitu  ekstraksi  RNA,  amplifikasi, elektroforesis  dan  diagnosa  hasil.  Pada  62 sampel  ikan  hasil  pemeriksaan  menunjukkan sampel  ikan  tersebut  negatif  terinfeksi  oleh virus VNN.

## Daftar Pustaka
Keputusan  Menteri  Kelautan  Dan  Perikanan Republik  Indonesia  Nomor  26  Tahun 2013 Tentang tentang Penetapan Jenis- Jenis Hama Dan Penyakit Ikan Karantina, Golongan, Media Pembawa, Dan Sebarannya. Jakarta.
Langga,  I.  F.,  M.  Restu,  dan  T.  Kuswinanti.
2012.  Optimalisasi  Suhu  dan  Lama Inkubasi dalam Ekstraksi DNA
Tanaman  Bitti  ( Vitex  cofassus  Reinw )
serta  Analisis  Keragaman  Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. J. Sains & Teknologi. Vol.12 (3) : 265 – 276. Munday  B.L.,  Kwang  J.  dan  Moody  N.  2002. Betanodavirus  infections  of  teleost fish:  a  review.  Jurnal  of  Fish  Diseases Vol. 25: 127–142.
Pelczar,  M.J.  dan  E.C.S  Chan.  1988.  Dasar  – Dasar Mikrobiologi 2. UI-Press.
Jakarta. Hal 461-467
Seow  V.  L  and  A.R.  Bahaman.  2012. Discriminatory  Power  of  Agarose  Gel Electrophoresis  in  DNA  Fragments Analysis.  In:  Magdeldin  S.  Gel
Electrophoresis –  Principles  And Basics. In Tech. Croatia. Hal 41-56 Sugianti, B. 2005. Pemanfaatan Tumbuhan Obat Tradisional Dalam Pengendalian Penyakit Ikan. Makalah Falsafah Sains. Institut Pertanian Bogor. Bogor. 37 hal. Srigede  L.  dan  S.  Zaetun.  2014.  Paparan  Sinar Ultra  Violet  (UV)  dengan  Pengamatan Waktu Sterilisasi terhadap Pertumbuhan  Bakteri Bacillus sp. Media Bina Ilmiah Vol. 8 (6) : 75-79. Verkuil  E.V.,  A.  van  Belkum,  dan  J.  P.  Hays. 2008. Principles and Technical Aspects of  PCR  Amplification.  Netherlands  : Springer  Science  +  Business  Media  B. V.
Yusuf, Z. K. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek Vol.5 (6) : 1-6.