EFEK PROPOLIS CAIR Trigona spp. TERHADAP RESPONS IMUN TIKUS Sprague Dawley YANG DIINFEKSI Sthapylococcus aureus
( Effects of liquid propolis of Trigona spp. on immune response of Sprague Dawley rats infected with Sthapylococcus aureus )
Nurbani Kalsum 1* , Ahmad Sulaeman 2 , Budi Setiawan 2 , I Wayan Teguh Wibawan 3 1 Jurusan Teknologi Pertanian, Politeknik Negeri Lampung, Lampung 35144 2 Departemen Gizi Masyarakat, Fakultas Ekologi Manusia, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680 3 Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680

## ABSTRACT
This study aimed to evaluate the effect of liquid propolis of Trigona spp. on the immunological parameters in mice infected with Sthapylococcus aureus. The effects of propolis were analyzed using the macrophage activity as determined by the phagocytic activity and by the production of nitric oxide (NO) in Sprague Dawley rat peritoneal macrophages and the production of antibodies. The results showed that the liquid propolis produces (a) an increase in the phagocytic index, (b) a significant increase in NO production, and (c) an increase over the production of IgG antibodies. This study indicates that the ethanolic extract of propolis of Trigona spp. is able to activate macrophages, promote the production of No and antibodies. The combination of these results suggests that this extract has an immunomodulatory effect and can boost the immune responsse.
Keywords: antibodies, immunomodulator, macrophages activity, propolis Trigona spp .

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi efek pemberian propolis cair Trigona spp. terhadap parameter imunologi pada tikus yang diinfeksi Sthapylococcus aureus . Efek propolis dianalisis melalui aktivitas makrofag yang ditentukan oleh aktivitas fagositosis dan produksi Nitrit Oksida (NO) pada makrofag peritoneum tikus Sprague Dawley serta produksi antibodi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa propolis cair menghasilkan (a) peningkatan indeks fagositik, (b) peningkatan yang signifikan produksi NO, dan (c) peningkatan produksi antibodi IgG.  Studi ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol propolis cair Trigona spp. mampu mengaktifkan makrofag, meningkatkan produksi NO dan antibodi. Kombinasi hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak ini memiliki efek imunomodulator dan mampu meningkatkan respons imun.
Kata kunci : aktivitas makrofag, antibodi, imunomodulator, propolis Trigona spp.
* Koresponsdensi: Telp: +62 81369335135 , Surel: nurbanikalsum@yahoo.co.id
J. Gizi Pangan, Volume 12, Nomor 1, Maret 2017 23
J. Gizi Pangan, Maret 2017, 12(1):23-30 ISSN 1978-1059  EISSN 2407-0920
Terakreditasi SK Menristek Dikti 12/M/Kp/II/2015                   Tersedia daring: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jgizipangan

## PENDAHULUAN
Sistem imun merupakan lini pertama per- tahanan tubuh manusia, melindunginya dari pe- nyakit dan mengobatinya apabila telah terjadi penyakit. Tubuh manusia secara terus menerus terpejan oleh berbagai faktor yang berdampak pada melemahnya fungsi sitem imun dan me- ningkatkan imunosupresi. Disfungsi sistem imun tubuh bertanggung jawab untuk patofisiologi dari banyak penyakit.
Modulasi respons imun, baik dengan stimulasi sistem kekebalan tubuh atau dengan menekan reaksi imun yang tidak diinginkan, un- tuk meringankan penyakit tersebut, telah menarik beberapa peneliti selama bertahun-tahun. Terapi imunomodulator bisa memberikan alternatif un- tuk kemoterapi konvensional untuk berbagai kondisi sakit, terutama ketika mekanisme per- tahanan inang harus diaktifkan pada kondisi re- spons imun terganggu. Penelitian terkait aplikasi imunostimulan sebagai aktivator sistem imun
Kalsum dkk.
hasilnya tidak meyakinkan dan perlu pencarian imunostimulan baru dari sumber baru (Naga & Rajeshwari  2014).
Sistem pertahanan tubuh atau respons imun yang terjadi akibat adanya invasi bakteri se- bagai antigen ketika masuk ke dalam tubuh akan dieliminasi oleh neutrofil dan makrofag sebagai perannya pada sistem imun innate . Respons imun seluler lebih efektif dalam mengeliminasi pato- gen intraseluler. Makrofag merupakan efektor utama pada respons imun seluler. Sebagai fagosit profesional, makrofag bertanggung jawab dalam memusnahkan sel yang terinfeksi patogen intra- seluler, termasuk Sthapylococcus aureus (Abbas et al . 2012). Keadaan aktivasi makrofag dan limfosit T dan B memainkan peran utama dalam patoge- nesis gangguan yang diperantarai imun (Rieux- Laucat et al .  2003).  Makrofag adalah anggota penting dari sistem kekebalan tubuh bawaan dan bersama-sama dengan neutrofil, eosinofil dan sel- sel NK (pembunuh alami) merupakan garis perta- hanan pertama untuk mengidentifikasi, mengeli- minasi atau mengandung serangan mikroorganis- me dan makromolekul beracun. Makrofag kunci penting dalam pemeliharaan homeostasis jaring- an dan bertanggung jawab untuk mendeteksi, melanda, dan menghancurkan patogen (Nathan & Xie 1994; Billack 2006). Dalam merespons cidera, makrofag mengikat patogen dan me- ngantarkannya ke komponen lain dari kekebalan adaptif, yang dibentuk oleh antibodi dan respons yang diperantarai sel yang dilakukan oleh sel- sel limfosit yang berbeda, masing-masing, sel B dan sel T (Medzhitov 2001; Adereem 2001). Se- lama aktivasi makrofag, beberapa senyawa yang dilepaskan seperti sitokin, spesies oksigen reaktif, oksida nitrat, dan mediator inflamasi lipid, terli - bat dalam respons inflamasi (Abbas et al . 2012). Hasil penelitian Kang et al. (2011) menun- jukkan asam lipoteikoat (LTA) pada bakteri gram positif tidak dapat menginduksi produksi NO pada cell line makrofag RAW 264,7 kecua- li  jika  terdapat  interferon  gamma  (IFN-γ)  yang dapat meningkatkan aktivitas pengikatan DNA dari faktor transkripsi NF-κB yang diketahui ter - libat pada ekspresi gen iNOS. Diferensiasi dan proliferasi limfosit B secara bersama-sama di- dorong oleh senyawa IL-6 yang dihasilkan oleh makrofag dan IL-2 yang dihasilkan oleh sel T helper . Diferensiasi limfosit B sangat penting un- tuk tahap perkembangan dalam mengatur jumlah immunoglobulin (Ig) yang dihasilkan (Papanico- laou 2000). Aktivasi sel B tidak hanya disebab- kan oleh IL-6, tetapi juga dibantu oleh IL-4 yang
berfungsi mengaktivasi sel B yang sedang istira- hat dan IL-5 yang berfungsi memacu pertumbu- han sel B yang sudah aktif. Sitokin-sitokin inilah yang memacu sel B untuk menghasilkan antibodi (Noss et al. 2001). Pemaparan berulang dalam jangka waktu tertentu dari imunomodulator diperlukan untuk mendapatkan limfosit T spesifik yang mensekre - sikan sitokin yang mampu mengaktivasi mak- rofag (Naga & Rajeshwari 2014). Berdasarkan hal tersebut maka diperlukan imunomodulator yang tingkat ketersediaannya tinggi sehingga bisa diberikan berulang dalam jangka waktu pan- jang seperti imunomodulator yang berasal dari alam, yang salah satunya adalah propolis. Propolis adalah produk resin yang diguna- kan oleh lebah pekerja untuk menutup celah- celah, mendempul retakan-retakan, memperkecil dan menutup lubang, dan komposisi kimianya ter- gantung pada spesies lebah dan vegetasi sumber resin (Bankova 2009). Lebih dari 300 senyawa kimia telah diidentifikasi dari propolis, termasuk polifenol (misalnya, flavonoid), kumarin, terpe - noid, asam amino, mineral, dan sebagainya (Mar- cucci et al . 2001; Falcão et al . 2013; Shi et al . 2012; Bonvehí & Bermejo 2013). Propolis juga mengandung banyak senyawa fenol khususnya flavonoid  sehingga  propolis  merupakan  sumber senyawa flavonoid yang baik (Mihai et al .  2011). Krol et al . (1994) menyatakan bahwa flavonoid merupakan kelompok senyawa kimia yang di- ketahui memiliki aktivitas antioksidan terutama kemampuannya dalam mengikat radikal bebas ( free radical scavenging ) dan sifat mengkelat lo- gam ( metal chelating ). Senyawa fenol yang terdapat pada tumbu- han, umumnya memiliki beragam kemampuan bioaktivitas termasuk aktivitas anti-oksidan. Produk ini telah menarik minat peneliti dalam beberapa dekade terakhir karena sifat-sifat biolo- gis dan farmakologisnya, antara lain seperti anti- mikroba (Sforcin et al . 2000; Bufalo et al . 2009; Silva et al. 2012), imunomodulator (Silva et al . 2012), antiinflamasi (Silva et al. 2012), dan  an- tioksidan (Kumazawa et al . 2004). Salah satu spesies lebah yang potensial memproduksi propolis yang dimiliki Indonesia yaitu spesies lebah lokal Trigona spp.  Berdasar- kan uraian di atas, maka penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek ekstrak etanol propolis Trigona spp. terhadap aktivitas fagositosis dan produksi nitrit oksida makrofag peritenium tikus Sprague Dawley yang diinfeksi Staphylococcus aureus .
Efek  permberian propolis cair terhadap imun tikus

## METODE
Desain, tempat, dan waktu Penelitian ini menggunakan desain ran- cangan acak lengkap dengan tiga perlakuan pem- berian dosis propolis dan dua perlakuan kontrol. Pembuatan ekstraksi dan sediaan propolis cair dilakukan di laboratorium Analisis Pangan, Po- liteknik Negeri Lampung, pemeliharaan hewan dilakukan di Rumah Sakit Hewan Pendidikan FKH IPB. Analisis fagositosis makrofag dilaku- kan di laboratorium Bakteriologi dan Imunologi Fakultas Kedokteran Hewan, IPB dan analisis nitrit oksida (NO) dan antibodi (IgG) dilakukan di Laboratorium Imunologi Pusat Studi Satwa Primata, LPPM IPB, Bogor.  Penelitian ini dilak- sanakan mulai bulan Januari hingga Desember 2016.
Jumlah dan cara pengambilan sampel Penelitian ini menggunakan 25 ekor tikus, jumlah sampel dihitung berdasarkan rumus Fre- derer (1967), (t-1)(r-1)>15, dimana t=banyaknya kelompok perlakuan dan r=jumlah replikasi, menggunakan tiga perlakuan pemberian dosis propolis dan dua perlakuan kontrol sehingga masing-masing perlakuan terdiri atas lima ekor tikus. Tikus dipilih secara acak dibagi menjadi 5 kelompok, kelompok I pemberian 0,5% (v/b) senyawa CAPE 20 mg/kg sebagai kontrol posi- tif, yang memiliki efek sebagai imunomodulator (Park 2004). Kelompok II pemberian akuades ( ad libitum ) sebagai kelompok kontrol negatif, kelompok III, IV, dan V pemberian dosis propolis cair 0,16%, 0,48%, 1,44% dari bobot badan/hari.
Pertimbangan etik dalam pelaksanaan penelitian ini diperoleh dari Komisi Pengawasan Kesejahteraan dan Penggunaan Hewan Peneli- tian, Rumah Sakit Hewan Pendidikan, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor dengan Nomor: 2-2016 RSHP FKH-IPB tanggal 4 Januari 2016
Alat dan bahan Peralatan yang digunakan antara lain kan- dang berukuran 50 x 30 x 20 cm, botol air, maser- ator , magnetic stirer , evaporator merek Buchi Tipe-190. Alat untuk uji fagositosis makrofag dan uji NO yakni spuit injeksi 1 ml, 3 ml, dan 10 ml, sonde, pipa kapiler, tabung eppendorf , neraca elektronik (KERN ABT 220 SDM), alat sentri- fus (SORVALL-LEGEND RT), inkubator CO 2 5% 37°C, lempeng mikro ( microplate ) 24 sumur (Nunc), lempeng mikro 96 sumur (Nunc), cover- slip plastik bulat (Thermanox) diameter 13 mm, alat sentrifugasi, haemositometer, microplate
reader (Bencmark  BIO-RAD)  λ  550  nm.  Alat untuk uji respons antibodi yakni pipet volume 2 µl - 1 ml, pipet reagen 1-25 ml, silinder graduate 100 ml dan 1 liter, kertas absorben, tabung reaksi standar  dan  sampel,  kertas  grafik  log  dan soft- ware data ELISA, dan microplate reader (Benc- mark BIO-RAD) λ 450 nm. Bahan penelitian berupa propolis men- tah asal daerah Sulawesi Selatan yang diperoleh dari CV Nutrima Sehatalami, Bogor. Bahan un- tuk ekstraksi berupa etanol grade teknis dan ba- han pengisi berupa propilen gilkol. Bahan untuk pemeliharaan tikus adalah pakan tikus, propolis cair 20%, senyawa Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE) C8221-Sigma-Aldrich , minyak jagung ( Corn Oil-SIGMA C8267 ), dan air destilasi. Uji aktivitas fagositosis makrofag menggunakan bahan yakni kloroform, Free Hank’s Balanced Salt solution , Medium Roswell Park Memo- riam Institute (RPMI), etanol 70%, akuabides, Phosphate Buffer Saline (PBS), akuades steril, glutamin, penisilin, streptomisin, Fetal Bovine Serum (FBS), metanol absolut, coverslips bulat, Gyemsa modified solution 20%. Penetapan kadar NO menggunakan senyawa standar nitrit, reagen merah netral, serta larutan Griess A dan Griess B. Penetapan kadar IgG, menggunakan Mouse IgG EL1SA (ELM-IgG-RayBio® Mouse IgG). Hewan uji yang digunakan berupa tikus putih Sprague Dawley berumur kurang lebih empat bulan (Andreollo et al. 2012) yang dipe- roleh dari Laboratorium Hewan Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM), serta isolat bakteri Staphylococus aureus non protein A yang digu- nakan diperoleh dari laboratorium Bakteriologi dan Imunologi FKH, IPB.
Tahapan penelitian Penelitian dimulai dengan pembuatan se- diaan propolis cair, tahap pemeliharaan tikus dan intervensi perlakuan, dan tahap pengumpu- lan sampel terminal. Sediaan propolis cair dipe- roleh melalui ekstraksi propolis dari sarang lebah Trigona spp. , dilakukan menggunakan metode Hasan et al . (2011). Sebanyak 150 g sarang lebah Trigona spp., dimaserasi dengan 650 ml etanol 70% (direndam sambil digoyang menggunakan shaker ) selama tujuh hari di dalam wadah er- lenmeyer  1.000  ml.  Setelah  tujuh  hari,  filtrat didekantasi kemudian residu dimaserasi lagi de- ngan 50 ml etanol 70% yang baru. Proses ini di- lakukan secara berulang setiap hari selama tujuh hari, hingga pelarut etanol pada residu tampak bening. Dengan demikian, total pelarut (etanol) yang digunakan adalah sebanyak 1.000 ml, dan total waktu maserasi selama 14 hari. Filtrat yang
diperoleh diuapkan selanjutnya disatukan di dalam wadah gelap. Ekstrak propolis dilarutkan dengan propilen glikol dalam perbandingan 1:5 (b/b). Kedua puluh lima ekor tikus hewan per- cobaan dikandangkan secara terpisah di dalam bak plastik berukuran 50 x 30 x 20 cm dengan tutup kawat yang mudah dibuka tutup, tiap kan- dang berisi dua ekor tikus.  Alas kandang dialasi dengan sekam yang harus diganti tiap hari agar kondisi kandang tetap bersih. Selama penelitian semua kelompok tikus diberi pakan pelet AD-II sebanyak 10% dari berat badan. Pemberian mi- num dilakukan secara adlibitum. Pencucian bak kandang dilakukan tiga hari sekali. Kandang di-letakkan dalam ruangan yang memiliki venti- lasi cukup dengan temperatur berkisar antara 25- 28 o C dan kelembaban berkisar antara 70-75%. Penerimaan cahaya diatur 12 jam terang serta 12 jam gelap. Semua tikus hewan percobaan diakli- matisasi selama tujuh hari. Pemberian senyawa CAPE dan propolis cair dilakukan secara oral selama 14 hari sebelum tikus dinfeksi dengan S. aureus non protein A. Infeksi S. aures dilakukan pada hari ke-14 dengan menyuntikkan inokulum bakteri S. aureus dosis 1x10 9 cfu/ml secara intra- peritoneal.
Pada hari ke-15 semua tikus pada masing- masing kelompok dilakukan euthanasia dengan eter dan diambil cairan peritoneum untuk peng- ujian aktivitas fagositosis makrofag (Wijayanti 2009) dan produksi NO menggunakan metode Griess (Dietert et al . 1995) serta pengambilan da- rah untuk pengujian produksi antibodi menggu- nakan ELISA (ELM-IgG-RayBio® Mouse IgG).
Pengolahan dan analisis data Data yang diperoleh pada disajikan dalam rata-rata ± standar deviasi.  Semua analisa statis- tik dilakukan menggunakan Microsoft Excel dan SAS 9.1. Perbedaan yang signifikan antara per - lakuan dianalisis menggunakan ANOVA, jika terdapat perbedaan nyata antar perlakuan dilaku- kan uji lanjut Duncan. Perbedaan secara signifi - kan dinyatakan dalam p<0,05.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tikus jantan jenis Sprague Dawley yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kisaran rata-rata berat badan awal (sebelum pemelihara- an) adalah 180-200 g/ekor. Berat badan ditim- bang setiap satu minggu, pada akhir perlakuan dilakukan penimbangan berat badan sehingga di- peroleh berat badan akhir dan dapat dihitung pe-
Kalsum dkk.
rubahan berat badan tikus selama pemeliharaan. Secara umum semua kelompok perlakuan meng- alami pertumbuhan yang baik, ditunjukkan oleh peningkatan berat badan (data tidak ditampilkan) dan tidak berbeda nyata antar grup perlakuan.
Pengaruh propolis Trigona spp. terhadap ak- tivitas fagositosis makrofag Pengaruh propolis Trigona spp. terhadap kemampuan fagositosis makrofag dirangsang oleh perlakuan yang berbeda seperti yang di- tunjukkan pada Gambar 1. Aktivitas fagositosis meningkat  secara  signifikan  melalui  pemberian dosis propolis yang berbeda (0,16%, 0,48% dan 1,44%) sama dengan yang diamati pada CAPE (kontrol positif).
Gambar 1. Pengaruh propolis Trigona spp. terha- dap kemampuan fagositosis makrofag
Makrofag merupakan komponen penting dalam imunitas bawaan. Makrofag berfungsi ter- utama sebagai sel fagosit dan mampu fagositosis organisme patogen. Selain itu, makrofag adalah produsen sitokin ampuh dan memainkan peran penting dalam berbagai proses, termasuk pre- sentasi antigen dan penyembuhan luka. Terkait dengan peran makrofag sebagai penyaji antigen (APC), makrofag akan mengekspresikan MHC II pada permukaannya. Makrofag bersama-sama dengan MHC II menyajikan antigen kepada sel T, ekspresi MHC II meningkat bila makrofag ter- aktivasi (Abbas et al . 2012).
Pemberian propolis sebagai imunomodu- lator memberikan pengaruh pada indeks fagosi- tosis makrofag yang terlihat dari peningkatan ke- mampuan fagositosis makrofag pada pemberian propolis 0,16% dan menunjukkan sedikit pening- katan kemampuan fagositosis makrofag pada pemberian 0,48% bila dibandingkan dengan kon- trol positif. Hal ini menunjukkan bahwa propolis sebagai imunomodulator berpotensi meningkat- kan kemampuan fagositosis makrofag peritoneal tikus bila diberikan dalam jangka waktu tertentu, dan sedikit  meningkatkan kemampuan fagosi- tosis makrofag peritoneal bila diberikan dalam
Efek  permberian propolis cair terhadap imun tikus jumlah yang lebih tinggi. Hal ini dikarenakan sifat propolis sebagai imunomodulator dimana ketika diberikan dengan dosis kecil, dapat berpo- tensi meningkatkan kemampuan fagositosis mak- rofag (Takagi et al . 2005).
Pengaruh propolis Trigona spp. terhadap produksi nitrit oksida (NO)
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, propolis mampu meningkatkan produksi NO dalam makrofag oleh perlakuan pemberian dosis propolis yang berbeda. Produksi NO meningkat secara  signifikan  melalui  pemberian  dosis  pro- polis yang berbeda (0,16%, 0,48% dan 1,44%). Pada pemberian dosis 0,48% dan 1,44% berbe- da secara bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif serta kelompok dosis 0,16%. Dalam penelitian ini, ditemukan bahwa pada pemberian propolis dosis 0,16% makrofag telah mampu menginduksi produksi NO.
Hasil ini sesuai dengan penelitian lain yang menunjukkan bahwa NO memiliki peran regulasi penting  dalam  berbagai  jenis  proses  inflamasi. Limonene dilaporkan dapat menekan produksi TNF-α,  sehingga  menjadi  agen  antiinflamasi yang kuat terutama pada kondisi peradangan ku- lit (Yoon et al . 2010). Studi in vitro menunjukkan bahwa D-limonene meningkatkan produksi NO makrofag peritoneal pada tikus yang menderita tumor (Del Toro-Arreola et al . 2005). Terpenoid pada ekstrak propolis menye- babkan aktivasi makrofag yang diikuti dengan diferensiasi dan proliferasi. Proses diferensiasi dan proliferasi ini menyebabkan peningkatan jumlah makrofag yang beredar di dalam tubuh (Abbas et al. 2012). Namun penelitian Kang et al. (2011) menunjukkan asam lipoteikoat (LTA) pada bakteri gram positif tidak dapat menginduksi produksi NO pada cell line makrofag RAW 264.7 kecuali  jika  terdapat  interferon  gamma  (IFN-γ) yang dapat meningkatkan aktivitas pengikatan
Gambar 2. Pengaruh propolis Trigona spp. terha- dap produksi NO
DNA dari faktor transkripsi NF-κB yang diketa - hui terlibat pada ekspresi gen iNOS. Menurut Fa- rooqui dan Farooqui (2010), komponen propolis seperti quercetin, CAPE maupun terpenoid, di- duga dapat menghambat terbentuknya peroksini- trit (NO 2 - ) penyebab kerusakan sel. Propolis ti- dak hanya menekan pembentukan prostaglandin dan leukotrien dengan menghambat ekspresi dan aktivitas cyclooxygenase dan lipoxygenase, teta- pi juga memperlambat ekspresi gen nitrat oksida sintase, aktivasi NF-κB yang dimediasi TNF-α. Penghambatan aktivasi NF-κB ini dapat menjadi dasar molekuler sifat anti inflamasi dari propolis. Hal ini sangat berbeda dengan hasil pene- litian Buffalo et al . (2013),  yang menunjukkan bahwa pemberian ekstrak propolis dan asam caf- feic (5, 10, 25, 50 and 100 µg/ml) mampu meng- hambat produksi NO dalam cell line makrofag ( raw 264.7 cells) , selanjutnya mampu menekan jalur sinyal yang disebabkan LPS, yaitu p38 MAPK, JNK1/2 dan NF-kB. Demikian juga menurut  Márquez et al . (2004), pemberian se- nyawa CAPE (1, 5 dan 10 µM) memiliki efek penghambatan terhadap faktor transkripsi NF- κB dan NFAT dan akibatnya, CAPE dapat meng - hambat transkripsi gen IL-2, ekspresi IL-2R
(CD25), dan proliferasi sel T pada manusia.
Dugaan kuat senyawa terpenoid yang di- kandung propolis Trigona spp. pada penelitian ini seperti limonene, mampu bekerja mengaktif- kan makrofag. Berbeda dengan hasil penelitian Halim et al . (2012) yang memperoleh senyawa bioaktif utama propolis Indonesia yaitu c yclo- lanost , fenol derivat, α-amyrin, senyawa eudes - mane, senyawa etil acridin, senyawa lupeol, senyawa friedooleanan, dan senyawa pirimidin, yang berperan sebagai antioksidan dan antihiper- glikemik. Beberapa penelitian lain telah menun- jukkan bahwa beberapa bahan dalam propolis, seperti caffeic acid phenethyl ester , asam sina- mat, dan artepillin C, juga mampu mengaktifkan makrofag secara in vitro dan in vivo (Gao et al.
2014). Data literatur menunjukkan bahwa mi- nyak esensial dari Eucalyptus globulus , yang mengandung p-cymene yang merupakan anggota monoterpene, juga mampu merangsang respons fagositosis makrofag serta p-cymene juga dapat merangsang fagositosis melalui pengikatan de- ngan reseptor TLR4 (Kummer et al .  2015).
Salah satu indikasi makrofag teraktivasi adalah terbentuknya nitrit oksida (NO) dari L- arginin oleh nitric oxide synthase (NOS). Nitrit oksida merupakan radikal bebas yang berupa gas anorganik dan bersifat dapat menembus lapisan membran. NO berperan penting pada berbagai
198,031
200
Kalsum dkk.
fungsi  fisiologis  salah  satunya  adalah  sebagai mediator kunci pada imunitas non spesifik. NO bersifat toksik terhadap bakteri patogen karena NO dapat menghambat enzim ribonukleotida reduktase dan mengganggu sintesis DNA. NO juga dapat menginaktivasi enzim yang berikatan dengan zat besi dan sulfur seperti Nicotinamide
Adenine Dinucleotide (NADH) dan ubikuinon oksidoreduktase . Meskipun NO sendiri bersifat cukup toksik dan secara alami sifatnya reaktif, tapi NO dapat dengan mudah berikatan dengan molekul lain seperti oksigen dan menghasilkan nitrat dan nitrit yang bersifat stabil dan tidak tok- sik (Billack 2006).
Pengaruh propolis Trigona spp. terhadap produksi antibodi
Pengaruh pemberian perlakuan propolis Trigona spp. yang berbeda mampu merangsang produksi antibodi oleh seperti ditunjukkan pada Gambar 3. Pemberian ekstrak propolis ini me- ningkatkan potensi respons imun humoral bila dibandingkan dengan hewan yang menerima an- tigen tanpa propolis (kontrol negatif). Produksi antibodi  IgG  meningkat  secara  signifikan  de- ngan konsentrasi propolis yang berbeda (0,16%, 0,48% dan 1,44%). Perlakuan pemberian propo- lis 0,48% tidak berbeda nyata bila dibandingkan dengan pemberian CAPE (kontrol positif). Kan- dungan IgG serum meningkat secara dramatis pada tikus yang menerima 0,48% propolis Tri- gona spp. dibandingkan dengan pemberian per- lakuan lain (0,16% dan 1,44%).
berbeda nyata. Terjadi penurunan pada kelom- pok perlakuan pemberian propolis 0,16% dan 1,44% maupun pada kelompok kontrol negatif (akuades). Pemberian dosis yang melebihi dosis efektif dapat bersifat toksik, sehingga pemberian ekstrak propolis Trigona spp. yang melebihi do- sis maksimal ini menyebabkan terjadinya pengu- rangan ekspresi respons imun karena mekanisme imunosupresan dari sistem imun tersebut. Adanya infeksi S. aureus pada hewan yang makrofagnya telah teraktivasi menyebab- kan makrofag bergerak ke arah sumber infeksi. Makrofag yang sudah sampai di tempat infeksi akan melakukan fagositosis terhadap S.  aureus. Selanjutnya kuman diproses di dalam fagoliso- som menjadi fragmen-fragmen peptida. Fragmen peptida yang terbentuk diikat oleh major histo- campactibility complex (MHC) dan dibawa ke permukaan sel untuk disajikan ke sel T. Selama fagositosis dan pemrosesan antigen, makrofag mengeluarkan beberapa sekresi, salah satunya adalah IL-2. Infeksi S. aureus pada saat makrofag sedang teraktivasi, menyebabkan fagositosis ber- jalan sempurna, sehingga fragmen antigen dari S. aureus disajikan keluar sel bersama protein MHC II dalam bentuk kompleks peptida MHC. Kom- pleks peptida MHC ini akan berinteraksi dengan sel-T helper melalui reseptornya. Selanjutnya sel T helper menjadi aktif dan mensekresikan IL-2. Sekresi IL-2 oleh sel-T helper akan beraki- bat pada aktivasi sel B. Aktivasi sel B ditandai oleh proliferasi dan diferensiasi sel B menjadi sel plasma secara berulang-ulang, sehingga terjadi peningkatan sel plasma di dalam tubuh. Selan- jutnya sel plasma ini akan menghasilkan antibodi terhadap bahan asing tersebut (Baratawidjaja 2014).

## KESIMPULAN
Penelitian ini menunjukkan bahwa pem- berian ekstrak etanol propolis cair Trigona spp. pada hewan coba tikus mampu mengindikasikan makrofag hewan tikus telah teraktivasi melalui peningkatan kemampuan fagositosis makrofag dan peningkatan produksi nitrit oksida dan me- ningkatkan produksi antibodi. Produksi antibodi tertinggi diperoleh pada perlakuan pemberian propolis 0,48%. Kombinasi hasil ini menunjuk- kan bahwa ekstrak ini memiliki efek imunomo- dulator dan mampu meningkatkan respons imun. Pemanfaatan propolis cair Trigona spp. sebagai herbal untuk memperbaiki sistem imun perlu digalakkan dan masih diperlukan penelitian lebih lanjut tentang uji klinis propolis cair Tri- gona spp.
Gambar 3. Pengaruh propolis Trigona spp. terha- dap produksi antibodi sebelum dan sesudah intervensi
Gambar 3 juga menunjukkan bahwa rerata produksi antibodi (IgG) akibat pengaruh pembe- rian ketiga dosis propolis terdapat peningkatan secara bermakna dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif (akuades). Terlihat juga terjadi peningkatan produksi IgG sebelum dan sesudah intervensi pada kelompok perlakuan pembe- rian propolis 0,48% dan kontrol positif (CAPE), meskipun peningkatan ini secara statistik tidak
Efek  permberian propolis cair terhadap imun tikus

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih ditujukan kepada Ke- menristek DIKTI yang telah membantu dalam pendanaan penelitian ini dan Bpk Mahani yang telah membantu dalam pengadaan sampel propo- lis.

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S.  2012.  Cel- lular and molecular immunology. 7 th ed. Philadelphia: Saunders Elsevier.
Bankova VS. 2009. Chemical diversity of propo- lis makes it a valuable source of new bio- logically active compounds. J Api Prod Api Med Sci 1(2):23-28.
Baratawidjadja KG. 2014. Imunologi dasar.  edisi 11. Jakarta: FKUI.
Billack B. 2006. Macrophage activation: role of toll-like 24 receptors, nitric oxide, and nu- clear factor kappa B. Am J Pharmaceutical Edu. 70(5):1-10.
Buffalo MC, Ferreira I, Costa G, Fansisco V, Lib- eral J, Cruz TM, Lopes MC, Batista MT, Sforcin JM.  2013.  Propolis and its constit- uent caffeic acid suppress LPS-stimulated pro-inflammatory  responsse  by  blocking NF-κB  and  MAPK  activation  in  macro - phages. J Ethnopharmacol149(1):84-92. Del Toro-Arreola S,  Flores-Torales E,  Torres- Lozano C,  Del Toro-Arreola A,  Tostado- Pelayo K,  Guadalupe Ramirez-Dueñas M, Daneri-Navarro A.  2005. Effect of D- limonene on immune responsse in BALB/c mice with lymphoma.  Int Immunopharma- col 5(5):829-838.
Dietert RR, Hotchkiss JH, Austic RE, Sung Y. 1995. Production of reactive nitrogenc in- termediates by macrophages. In: Burleson GR, Dean JH, Munson AE. A John, editor. Methodes in Immnunotoxicology. Volume 2. New York: Wilye Liss & sons Inc Publ. Farooqui T dan Farooqui AA.  2010.  Molecular mechanism underlying the therapeutic ac- tivities of propolis: A critical review.  Curr Nutr Food Sci 6(3):186-199.
Frederer WT. 1967. Experimental design: theory and application.  Calcutta: Oxford & IBH Publ Co.
Gao W, Wu J, Wei J, Pu L, Guo C, Yang J, Yang M, Luo H. 2014.  Brazilian green propolis improves immune function in aged mice. J Clin Biochem Nutr 55(1):7-10.
Hasan AEZ, Artika IM, Fatoni A. 2011.  Antibac- terial activity of propolis Trigona spp. from
Bukittinggi, West Sumatera against Salmo- nella sp.  Chem Progress 4(2):55-59. Halim E, Sutandyo N, Sulaeman A, Artika M,
Harahap Y. 2012. Kajian bioaktif dan zat gizi propolis Indonesia dan Brasil.  J  Gizi Pangan 7(1):1-6.
Kang SS, Ryu YH, Baik JE, Yun CH, Lee K, Chung DK, Han SH. 2011. Lipoteichoic acid from Lactobacillus plantarum induces nitric oxide production in the presence of interferon-γ in murine macrophages. Mol. Immunol 48(15-16):2170-2177. Krol W, Czuba Z, Scheller S, Gabrys J, Grabiec S, Shani J. 1994. Anti-oxidant properties of ethanolic extract of propolis (EEP) as evaluated by inhibiting the chemilumines- cence oxidation of luminal. Biochem Int 21(4):593-597.
Kumazawa S, Hamasaka T, Nakayama T. 2004. Antioxidant activity of propolis of various geographic origins. Food Chem 84(3):329- 339.
Kummer R, Estevão-Silva CF, Bastos RL, Gres- pan R, de Souza Silva-Comar FM, Spiro- nello RA , Rocha BA, Bersani-Amado CA, Cuman RKN. 2015. Effect of p-cymene on chemotaxis, phagocytosis and leukocyte behaviors.  Int J Appl Res Nat Prod 8(2): 20-27.
Marcucci MC, Ferreres F, Garcia-Viguera C, Bankova VS, De Castro SL, Dantas AP, Valente PHM, Paulino N. 2001. Phenolic compounds from Brazilian propolis with pharmacological activities. J Ethnophar- macol 74(2):105-112.
Márquez N, Sancho R, Macho A, Calzado MA, Fiebich BL, Mu˜noz E. 2004. Caffeic acid phenethyl ester inhibits T-cell activation by targeting both nuclear factor of activated T-cells and NF-κB transcription factors. J Pharmacol Exp Ther 308(3):993-1001. Mihai CM, Marghitas LA, Dezmirean D, Bar- nutiu L. 2011.  Correlation between poly- phenolic profile and antioxidant activity of propolis from Transylvania. Anim Sci Bio- tech 44(2):100-103.
Naga PN, Rajeshwari P.  2014. An overview on immunomodulators.  Int J of Curr Pharma- ceutical & Clinical Research 4(2): 108-114. Nathan C, Xie QW.  1994.  Nitric oxide synthases: roles, tolls, and controls.  Cell 78(6):915- 918.
Noss EH, Pai  RK, Sellati  TJ, Radolf  JD, Belisle J, Golenbock DT, Boom WH, Harding CV. 2001. Toll-like receptor 2-dependent in-
Kalsum dkk.
effect on Brazilian propolis antibacterial activity. J Ethnopharmacol 73(1):243-249. Silva JC, Rodrigues S, Féas X, Estevinho LM. 2012. Antimicrobial activity, phenolic pro- file and role in the inflammation of propo - lis. Food Chem Toxicol 50(5):1790-1795. Takagi Y, Choi I, Yamashita T, Nakamura T, Suzuki I, Hasegawa T, Oshima M, Gu Y. 2005.  Immune activation and radioprotec- tion by propolis.  Institute for Advance Re- search in Asian Science and Medicine. Am J Chin Med. 33(3):231-240. Yoon WJ, Lee NH, Hyun CG. 2010. Limonene suppresses lipopolysaccharide-induced production of nitric oxide, prostaglandin E and  pro-inflammatory  cytokines  in  RAW 264.7 macrophages. J Oleo Sci 59(8):415- 421.
Wijayanti M. 2009. Isolasi Makrofag dan Uji Daya Fagositosis. Yogyakarta: UGM Press.
hibition of macrophage class II MHC ex- pression and antigen processing by 19-kDa lipoprotein of M. tuberculosis . J Immunol
167(2):910-918. Papanicolaou DA. 2000. Interleukin-6: Endo- crine cytokine. J Clin Endocrinol Metab 85(3):1331-1333.
Park JH, Lee JK, Kim HS, Chung ST, Eom JH, Kim KA, Chung SJ, Paik SY, Oh HY. 2004.
Immunomodulatory effect of caffeic acid phenethyl ester in Balb/c mice. Int Immu- nopharmacol 4(3):429-436.
Rieux-Laucat F, Fischer A, Le Deist F. 2003.
Cell-death signaling and human disease. Curr Opin Immunol 15(3):325-331.
Sforcin JM. 2007. Propolis and the immune sys- tem: a review. J Ethnopharmacol 113(1):1- 14. Sforcin JM, Fernandes Júnior A, Lopes CAM, Bankova V, Funari SRC. 2000. Seasonal