PHARMACON – PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,

## ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF POTENTIAL BACTERIA DEGRADING USED MACHINE OIL FROM SEVERAL WORKSHOP LOCATIONS IN MANADO CITY

## ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI POTENSIAL PENDEGRADASI OLI MESIN BEKAS DARI BEBERAPA LOKASI BENGKEL DI KOTA MANADO
Melitia L. Sendo 1)* , Fecky R. Mantiri 1) ,  Marhaenus J. Rumondor 1)
1) Program Studi Biologi FMIPA UNSRAT Manado, 95115 *melitiasendo@gmail.com

## ABSTRACT
Soil  pollution  due  to  indiscriminate  disposal  of  used  oil  in  workshops  is  currently  getting  more serious, this is due to the compound content in the oil which is difficult to decompose and can cause disease.  This  study  aims  to  isolate,  characterize  and  identify  potential  bacteria  that  degrade  used engine  oil  from  several  workshop  locations  in  Manado  City.  This  research  was  conducted  for  4 months,  December  2020  to  March  2021.  Selection  of  bacteria  using  selective  media  (Busnhell- Haas)  modified  with  the  addition  of  used  oil.  The  results  showed  that  there  were  3  isolates  that were  successfully  isolated,  namely  bacteria  23,  29  and  bacteria  33  with  different  characteristics and  had  been  identified  and  it  was  found  that  bacteria  23  was  a  species  of  bacteria  Citrobacter freundii  which  has  the  potential  as  bacteria  to  degrade  used  engine  oil  for  the  bioremediation process.
Keywords : Isolation, characterization, degrading bacteria, used oil, 16S rRNA sequences.

## ABSTRAK
Pencemaran tanah akibat dari pembuangan oli bekas secara sembarangan pada bengkel-bengkel saat ini  semakin  serius,  hal  ini  dikarenakan  kandungan  senyawa  yang  ada  dalam  oli  yang  sulit  untuk diurai  dan  dapat  menyebabkan  penyakit.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi, mengkarakterisasi  serta  mengidentifikasi  bakteri  potensial  pendegradasi  oli  mesin  bekas  dari beberapa  lokasi  bengkel  di  Kota  Manado.  Penelitian  ini  dilaksanakan  selama  4  bulan,  Desember 2020  sampai  Maret  2021.  Seleksi  bakteri  menggunakan  media  selektif  ( Busnhell-Haas )  yang dimodifikasi dengan penambahan oli bekas. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat 3 isolat yang berhasil diisolasi, yaitu bakteri 23, 29 dan bakteri 33 dengan karakteristik yang berbeda-beda serta  telah  teridentifikasi  dan  ditemukan  bahwa  bakteri  23  merupakan  spesies  bakteri Citrobacter freundii yang berpotensi sebagai bakteri pendegradasi oli mesin bekas untuk proses bioremediasi.
Kata kunci:  Isolasi, karakterisasi, bakteri pendegradasi, oli bekas, gen 16S rRNA
PHARMACON – PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,

## PENDAHULUAN
Jumlah  transportasai  baik  kendaraan motor maupun mobil yang semakin meningkat  dipicu  oleh  pertumbuhan  populasi penduduk sehingga mendorong jumlah kegiatan  usaha  bengkel  yang  ada  sebagai tempat yang menyediakan jasa perawatan dan perbaikan,  terlebih  khususnya  di  kota-kota besar  yang  ada  di  Indonesia.  Sejalan  dengan perkembangan  jumlah  kendaran  tersebut, maka volume oli bekas  akan terus  meningkat (Azharuddin et al., 2020).
Pencemaran  akibat  pembuangan  oli mesin  bekas  secara  sembarangan  telah menimbulkan masalah lingkungan yang serius dengan  mengingat  dampaknya  terhadap lingkungan maupun manusia, sehingga diperlukan  adanya  pengelolaan  yang  lebih baik  pada  lingkungan  tersebut  agar  tidak terjadi kerusakan
lingkungan yang berkelanjutan.  Salah  satu  cara  pengelolaan yang  ramah lingkungan  dan bersifat  ekonomi yaitu  dengan  menggunakan  mikroorganisme contohnya  bakteri  atau  yang  sering  disebut dengan  metode  bioremediasi  (Zam,  2011), metode  ini  lebih  efektif,  efisien,  dan  ramah lingkungan dibandingkan dengan metode lain untuk mengatasi pencemaran tanah (Pertiwi et al., 2011).  Bakteri  yang  sering  digunakan dalam  proses  bioremediasi  dari  minyak  bumi disebut  dengan  bakteri  hidrokarbonoklastik (Zam,  2011).  Bakteri  yang  akan  diisolasi untuk  proses  bioremediasi  akan  lebih  baik jika  bakteri  tersebut  berasal  dari  lokasi pencemaran yang merupakan habitat aslinya.
Gen 16S rRNA adalah bagian dari gen prokariot  yang  sering  dijumpai  pada  bakteri dan  archaea,  gen  ini  juga  merupakan  salah satu  jenis  gen  yang  sangat  stabil  karena walaupun  dalam  jangka  waktu  yang  sangat panjang  gen  tersebut  akan  susah  bermutasi sehingga  jika  digunakan  dalam  analisis filogenik  dapat  menguntungkan  (Ardiani, 2011).
Penelitian  ini  belum  pernah  dilakukan  di Kota Manado, Sulawesi Utara sebelumya dan juga  mengingat  dampak  yang  ditimbulkan bagi  manusia  dan  juga  lingkungan  sangat berbahaya.  Maka  dari  itu  berdasarkan  uraian
permasalahan  tersebut,  diperlukan  adanya penelitian  mengenai  isolasi  dan  karakterisasi bakteri  potensial  pendegradasi  oli  mesin bekas  dari  beberapa  lokasi  kengkel  di  kota manado untuk proses bioremediasi pada tanah tercemar oli bekas di Kota Manado. Tujuan dari penelitian ini adalah : 1. Mengidentifikasi jenis-jenis bakteri potensial  pendegradasi  oli  mesin  bekas yang  diisolasi  dari  tanah  tercemar  oli mesin  bekas  pada  beberapa  bengkel  di Kota Manado.
2. Mengidentifikasi karakteristik bakteri yang  berpotensi  sebagai  pendegradasi  oli mesin  bekas  yang  diisolasi  dari  tanah tercemar  oli  mesin  bekas  pada  beberapa bengkel di Kota Manado.

## METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Peneliatian
Penelitian  ini  dilaksanakan  selama  4  bulan dari  bulan  Desember  2020  –  Maret  2021  di Laboratorium  Mikrobiologi,  Program  Studi Farmasi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sam Ratulangi.  Sekuensing  dilakukan  di  tempat penyedia  jasa  sekuensing  PT. Genetika Science  Indonesia, Tangerang.  Analisis  data dilakukan di Jurusan Biologi, FMIPA Unsrat.

## Alat dan Bahan
Alat  dalam  penelitian  yaitu  cawan  petri, tabung  reaksi,  rak  tabung  reaksi,  pipet  tetes, gelas  ukur,  erlenmeyer,  timbangan  analitik, autoklaf,  inkubator,  laminar  air  flow,  spread glass,  jarum  ose,  kulkas,  lampu  spritus, mikropipet,  sudip, spidol hitam,  label,  plastik wrap, aluminium foil, spatula steril, mikroskop,  objek  glass,  tabung  ependorf, tabung  hach,  tabung  durham,  masker  dan sarung  tangan.  Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  Nutrien  Agar  (NA)  dan Nutrien  Broth  (NB)  untuk  pertumbuhan isolat,  KH 2 PO 4 ,  K 2 HPO 4 ,  NH 4 NO 3 ,  MgSO 4 , FeCl 3 ,  Media  selektif  ( Bushnell  Haas ), aquades,  Nacl  0.9%,  spritus,  alkohol  70%, alkohol  95%,  kristal  violet,  safranin,  lugols, Media  MTM  ( Motility  Test  Medium ),  Media
PHARMACON – PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,
SIM  ( Sulfida  Indol  Motiliy ),  Media  TSIA ( Triple  sugar  iron  agar ),  Media  Simmons Citrat,  Larutan  Hydorgen  Peroksida  (H 2 O 2 ) 6%,  alpha-naftol,  kalium  hidroksida,  Media MIO, Reagen Kovac’s, Gula laktosa, sukrosa dan  glukosa),  oli  mesin  bekas,  dan  sampel tanah  yang  terkontaminasi  oli  mesin  bekas diperoleh  dari  tanah  yang  terkontaminasi  oli bekas dari tiga bengkel di Kota Manado.

## Prosedur Penelitian

## 1. Pengambilan Sampel
Sampel  diambil  secara purposive  sampling dari tanah yang tercemar oli mesin bekas pada tiga  bengkel  di  Kota  Manado.  Tanah  diambil dengan  kedalaman  2-10  cm  dari  permukaan dengan  spatula  steril  dengan  dua  titik  yang berbeda dari tiap lokasi kemudian dimasukkan  ke  dalam  tabung  ependorf  lalu dibungkus  dengan  kertas  aluminium  foil, kemudian  tanah  selanjutnya  dibawa  ke laboratorium untuk pembiakan bakteri.

## 2. Sterilisasi Alat
Untuk  sterilisasi  alat-alat  dilakukan  dengan menggunakan  autoklaf  yaitu  dengan  cara memilih  alat-alat  gelas  yang  akan  digunakan dalam penelitian kemudian dibungkus menggunakan  aluminium  foil  dengan  rapih lalu  dimasukkan  dalam  autoklaf,  pada  suhu 121 0 C  selama  15-30  menit  dan  untuk peralatan  yang  tidak  tahan  panas  disterilisasi dengan menggunakan  alkohol  90%  dan bunsen (Zam, 2011).
3. Isolasi  Bakteri  Pendegradasi  Oli  Mesin Bekas
Setelah  proses  sterilisasi  alat,  dilakukan pengenceran  beseri  kemudian  selanjutnya ditebar  ke  dalam  media  NA  ( Nutrient  agar ) untuk  memperoleh  koloni  bakteri  tunggal. Koloni  yang  diperoleh  kemudian  di  seleksi kembali dengan menumbuhkan koloni tersebut  didalam  media Bushnell-Haas yang dimodifikasi  dengan  penambahan  oli  bekas. Isolat yang berhasil tumbuh digores ke media NA pada cawan petri dengan metode kuadran. Kemudian selanjutnya, bakteri diinokulasikan kembali ke media miring sebagai stok simpan isolat murni.

## 4. Sekuensing
Salah  satu  isolat  terpilih  yang  sudah  dalam bentuk  stok  simpan  pada  media  miring, dikirim  untuk  identifikasi  bakteri  secara molekuler  dengan  metode  sekuensing  yang dilakukan di tempat penyedia jasa sekuensing PT.  Genetika  Science  Indonesia,  Tangerang. Hasil  yang  diperoleh  berupa  kromatogram, sekuens  bakteri,  dan  hasil  BLAST  yang menyandi  bakteri  hasil  isolasi,  dikirim melalui email.

## 5. Karakterisasi Bakteri
Karakterisasi  isolat  bakteri  pendegradasi  oli mesin  bekas  yang  telah  diperoleh,  dilakukan melalui  pengamatan  secara  makroskopis, mikroskopis dan uji biokimia.

## 6. Analisis Data dan Penyajian Data
Data  Penelitian  yang  dilakukan  ini  bersifat observatif dan deskriptif. Data yang diperoleh ditabulasi dan dideskripsikan dengan menampilkan tabel dan foto hasil pengamatan secara  makroskopis  dan  mikroskopis  serta hasil sekuensing.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Bakteri Potensial Pendegradasi Oli Mesin Bekas
Sampel yang digunakan sebagai sumber isolat bakteri  pendegradasi  berasal  dari  tanah tercemar  oli  mesin  bekas  dari  tiga  lokasi bengkel  yang  berbeda-beda.  Sampel  tanah yang  diambil  berada  disekitar  lokasi  dengan kriteria,  diantaranya  berminyak,  hitam  dan berbau  oli  yang  menyengat  (Hezi et  al., 2015). Dari tiga lokasi bengkel yang berbeda- beda  diperoleh  masing-masing  satu  isolat yang mewakili masing-masing lokasi pengambilan sampel, dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 . Deskripsi Lokasi Isolat Kode Isolat Lokasi Bakteri 23 (3B, 10 -4 ) Bengkel 3 (Malalayang) Bakteri 29 (2A, 10 -4 ) Bengkel 2 (Malalayang) Bakteri 33 (1B, 10 -3 ) Bengkel 1 (Kleak)
PHARMACON – PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,
3  isolat  tersebut  memiliki  kemampuan pendegradasi hidrokarbon dan berhasil tumbuh pada media selektif yang digunakan.
Indikasi  yang  menandakan  bahwa terdapat  bakteri  potensial  pendegradasi  oli bekas  yang  mampu  tumbuh  pada  media selektif Bushnell-Haas cair  dapat  dilihat  dari
perubahan  media  yang  menjadi  keruh  setelah 7  hari  inkubasi  (Gambar  1)  karena  bakteri menggunakan  oli  bekas  dalam  media  sebagai sumber karbonnya maka dapat memungkinkan bakteri tersebut untuk melakukan pertumbuhan/pembelahan sel
(Ahmad et al., 2012).
Gambar 1. Isolat bakteri dalam medium Bushnell-Hass cair setelah inkubasi.

## Karakterisasi Makroskopis
Hasil  pengamatan  makroskopis  (Tabel  2) menunjukkan  bahwa  ketiga  isolat  yang diperoleh  memiliki  morfologi  warna  yang sama  yaitu  putih.  Bentuk  dari  isolat-isolat bervariasi  mulai  dari  bentuk  bulat  ( circular ), tak  beraturan  ( irregular )  dan  poros  ( spindle ). Isolat-isolat  tersebut  juga  memiliki  variasi terhadap  tepinya  yaitu  ada  yang  rata  (entire) dan  ada  yang  bergelombang  ( undulate ).
Permukaan atau elevasi dari isolat-isolat yang
didapatkan juga berbeda-beda yakni cembung dibagian  tengah  lebih  menonjol  ( umbonate ) dan  timbul  ( raised ).  Penampakan  morfologi koloni yang berbeda-beda ini mengindikasikan bahwa koloni bakteri tersebut  berasal  dari  spesies  yang  berbeda. Hasil  isolasi  pada  penelitian  ini  didominasi oleh  isolat  23  dengan  bentuk  bulat,  dengan tepi rata, elevasi timbul tengah serta memiliki warna putih.
Bakteri 23 Bakteri 29
Bakteri 33 100 վ l 250 վ l
PHARMACON – PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,
Tabel 2. Deskripsi makroskopis dan mikroskopis isolat bakteri pendegradasi
Kode Isolat Makroskopis Mikroskopis Bentuk Tepi Permukaan Warna Bentuk sel Kelompok gram Bakteri 23 Circular Entire Umbonate Putih Basil Bakteri 29 Irregular Undulate Raised Putih Basil Bakteri 33 Spindle Entire
Raised Putih Basil

## Karakterisasi Mikroskopis
Hasil  pengamatan  yang  dilakukan  secara mikroskopis menunjukkan hasil bahwa semua isolat merupakan bakteri Gram negatif dengan bentuk  sel  bakteri  yaitu  batang  ( basil )  (Tabel 2).  bakteri  Gram  negatif  berwarna  merah sebab  kompleks  tersebut  larut  pada  saat
pemberian larutan alkohol sehingga mengambil  warna  merah  safranin.  Hal  yang menyebabkan  perbedaan  warna  Gram  antara bakteri  Gram  negatif  dan  juga  bakteri  positif yaitu karena berbedanya struktur dinding dari kedua jenis bakteri tersebut.

## Uji Biokimia
Karakterisasi  dilakukan  pula  melalui  uji biokimia  dengan  melihat  proses  metabolisme dari  bakteri  tersebut  baik  secara  ekstraseluler maupun intraseluler (Cappuccino dan Sherman,  2005).  Pengamatan  untuk  melihat proses  biokimia  dari  bakteri  potensial pendegradasi  oli  mesin  bekas  dilakukan dengan  beberapa  uji  yakni  motilitas,  TSIA,
sitrat,  katalase,  VP,  lysin,  indol  dan fermentasi karbohidrat Tabel 3. Dan dari hasil uji biokimia menunjukkan bahwa ketiga isolat memberikan  reaksi  yang  positif  terhadap  uji motilitas, TSIA, sitrat, katalase dan fermentasi  karbohidrat,  sedangkan  untuk  uji VP,  lysin,  indol  menunjukkan  hasil  yang negatif.
PHARMACON – PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,
Tabel 3. Karakterisasi berdasarkan uji biokimia isolat bakteri pendegradasi
Uji Biokimia Kode isolat Bakteri 23 Bakteri 29 Bakteri 33 Motilitas + + + TSIA + + + Sitrat + + + Katalase + + + VP - - - Lysin - - - Indol - - - Fermentasi karbohidrat + + +
Keterangan: tanda (-) menunjukan hasil negatif dan tanda (+) menunjukan hasil positif.

## Identifikasi Bakteri Pendegradasi menggunakan Gen 16S rRNA
Hasil  ekstraksi  DNA  total  dielektroforesis untuk  menunjukkan  DNA  kromosomal  yang telah  dimurnikan.  Hasil  elektroforesis  DNA dapat dilihat pada Gambar 2. Hasil elektroforesis  menunjukkan  bahwa  isolat memiliki  pita  tebal  dan  terang.  Tebalnya  pita menandakan  isolat  tersebut  memiliki  DNA
yang  cukup  untuk  analisis  sekuens  DNA. Besarnya  ukuran  pita  yang  dihasilkan  adalah sekitar  1500  bp,  besarnya  ukuran  ini  sesuai dengan  yang  diharapkan  dari  gen-gen  16S rRNA.
Gambar 2. Hasil elektroforesis gel agarosa 0,8% dari produk PCR gen 16S rRNA bakteri
PHARMACON – PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,
Bagian  dari  sekuens  yang  telah  diediting untuk kualitas pembacaan yang baik kemudian  dipilih  untuk  dilakukan  BLAST yang akan diakses diwebsite NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Penggunaan BLAST dalam sekeunsing memiliki  tujuan  untuk  mengetahui  identitas dari  sekuens  yang  diperoleh  (Ramadhani, 2017).
Tabel 4. Hasil BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool ) Gen 16S rRNA Sampel Bakteri
N o Nama Spesimen Bakteri Lokasi Pengambilan Query Coverage Per. Identity E. Val ue Nama Pembanding (nomor aksesi) Referensi 1. Bakteri 23 Bengkel 3 (Malalayang) 100% 100% 0 Citrobacter freundii (CP048382.1) Nuesch et al. (2020) 2. 100% 100% 0 Citrobacter freundii (LS992183.1) Gonzaga (2018) 3. 100% 100% 0 Citrobacter freundii (MG209573.1) Singh et al. (2017) 4. 100% 100% 0 Citrobacter freundii (CP016952.1) Leski et al. (2016) 5. 100% 100% 0 Citrobacter freundii (MT793132.1) Dong (2020)
Tabel  4  menunjukkan  bahwa  salah  satu bakteri  yang  berhasil  diisolasi  dari  tanah tercemar  oli  mesin  bekas  yaitu  bakteri  23 berdasarkan  hasil  BLAST  merupakan  bakteri Citrobacter freundii dengan presentase kemiripan yang melebihi 95%. Suatu sekuens dapat  dikatakan  homolog  apabila  tingkat similaritasnya  melebihi  70%  (Claverie  dan
Notredame, 2007). Untuk sampel
mikroorganisme  jika  menggunakan  marka 16S rRNA maka dikatakan identikal ( similar ) pada  level  spesies  jika  nilai  “ percentage identity ”  nya  diatas  97.5%,  dan  pada  level genus  jika  nilai  “ percentage  identity ”  nya diatas 95% (Stackebrandt dan Goebel, 1994).

## Analisis Sekuens Gen 16S rRNA Bakteri

## Citrobacter freundii
Menurut  buku  identifikasi  bakteri  Bergey’s (Holt et  al., 1994)  dan  NCBI  (2014)  bakeri Citrobacter freundii , termasuk kedalam Filum Proteobacteria, Kelas Gammaprobacteria. Ordo Enterobacteriales, Famili Enterobacteriaceae  dan  Genus Citrobacter .
Bakteri C. freundii terbukti dapat mendegradasi hidrokarbon berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Singh dan Lin (2008),  yang  berhasil  mengisolasi  bakteri C. freundii (MRC3)  dari  sampel  tanah  yang terkontaminasi diesel pada perusahaan
transportasi di Kwazulu-Natal, Afrika Selatan dan  terbukti  mampu  menurunkan  86,94% minyak diesel dalam dua minggu. Erdogan et al., (2011),  dalam  penelitiannya  berhasil mengisolasi  empat  jenis  bakteri  yang  mampu mendegradasi hidrokarbon dari tanah tercemar minyak bumi di Adana, Batman, dan Adiyaman,  Turki  diantaranya Pseudomonas aeruginosa ,
Klesibella
pneumonia , Citrobacter koseri
dan Citrobacter amalonaticus .
PHARMACON – PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang telah  dilakukan,  diperoleh  tiga  isolat  yang diisolasi  dari  tanah  tercemar  oli  mesin  bekas yang  berasal  dari  tiga  bengkel  memiliki potensi  sebagai  bakteri  pendegradasi  oli mesin  bekas  dengan  karakteristik  yang berbeda-beda,  salah  satu  isolat  yaitu  bakteri 23  teridentifikasi  sebagai  spesies Citrobacter freundii .

## SARAN
Jenis-jenis  bakteri  yang  didapat  memiliki potensi  sebagai  pendegradasi  oli mesin  bekas yang perlu dikaji lebih lagi melalui studi lebih lanjut,  disarankan  adanya  penelitian  lanjutan, baik  menyangkut  kemampuan  berbagai  isolat bakteri dalam mendegradasi berbagai komponen hidrokarbon, maupun pengembangan potensi bakteri tersebut dalam upaya bioremediasi lingkungan di lapangan.

## DAFTAR PUSTAKA
Azharuddin.,  A.A.  Sani  &  M.A.  Ariasya. 2020.  Proses  Pengolahan Limbah B3 (Oli Bekas) Menjadi  Bahan  Bakar Cair Dengan Perlakuan Panas Yang
Konstan. Journal Austenit. 12 : 48-53.
Ardiani,  U.  2011.  Analisis  Keragaman
Genetik Gen  16S-rRNA  Dan Karakterisasi  Fisiologis  Bakteri  Asal Usus Udang Vaname Litopenaeus Vannamei Dari Berbagai Umur.
[skripsi].  FPIK  Institut  Pertanian Bogor, Bogor.
Ahmad,  N.  2012.  Isolation  and  Identification of  Secondary  Metabolites  Producing Organisms  from  Marine  Sponge. Discovery . 1 : 14-17.
Cappuccino,  J.G.,  &  N.  Sherman.  2005 .
Microbiology  A  Laboratory  Manual sevent  edition .  Rockland  Community College, New York: State University.
Claverie,  J.M.  &  C.  Notredame.  2007.
Bioinformatics  for  Dummies.  2nd  ed. Wiley  Publishing, Inc, New York.
Dong,  N.  2020.  Citrobacter  freundii  strain CF1 16S  ribosomal  RNA  gene,
partialsequence.https://www.ncbi.nlm. nih.g/nucleotide/  MT793132.1  [11
Juni 2021].
Erdoğan,  E.E.,  F.  Sahin  &  A.  Karaca.  2011. Determination of petroleum
degrading bacteria isolated from crude oil-contaminated  soil  in Turkey.
Journal of Biotechnology . 11 : 4853-4859.
Gonzaga,  M.A.  2018.  Citrobacter  freundii isolate Citrobacter freundii  str. U2785 genome  assembly,  chromosome:  1. de/LS992183.1 [10 Juni 2021].
Hezi,  Y,P.,  Periadnadi  &  Nurmiati.  2015.
Isolasi Bakteri Pendegradasi Hidrokarbon  di  Tanah  Tercemar Lokasi Perbengkelan Otomotif.
Journal  Biologi  Universitas  Andalas .
4 : 153-157.
Holt,  J.G.,  N..R  Krieg.,  P.H.A.  Sneath.  J.T Staley & S.T Wiliams. 1994. Bergey’s Manual  of  Determinate  Bacteriology. Wiliam  and  Wilkins  Co  Baltimore,
Unites States Maryland.
Leski,  T.A.,  C.R  Taitt.  U.  Bangura.  R. Ansumana.  D.A.  Stenger.  Z.  Wang  & G.J.  Vora.  2016.  Citrobacter  freundii strain  SL151  chromosome,  complete genome.https://www.ncbi.nlm.nih.go /nucleotide/CP016952.1 [11 Juni
2021].
Nuesch-Inderbinen,  M.,  M.J.A.  Stevens  and R. Stephan. 2020. Citrobacter freundii strain  62  chromosome,  complete genome.https://www.ncbi.nlm.nih.gon ucleotide/CP048382.1 [10 Juni 2021].
PHARMACON – PROGRAM STUDI FARMASI, FMIPA, UNIVERSITAS SAM RATULANGI,
Pertiwi,  S.,  W.  Hary.  Y.  Bambang  dan  W.
Hary.  2011.  Pemanfaatan  Rumput Fimbrisylis sp.
dalam Proses Bioremediasi  Tanah  pada  Berbagai
Konsentrasi  Limbah  Minyak  Bumi.
Jurnal Penelitian Sains. 14 : 57-61.
Singh,  A.,  H.K  Tiwari.  S.  Singh.  R.  Kaur. And S.  Das.  2017.  Citrobacter
freundii  strain  B06  16S  ribosomal RNA gene, partial sequence.https://www.ncbi.nlm.nih.go v/nucleotide/MG209573.1  [10  Juni
2021].
Singh,  C.  &  J.  Lin.  2008.  Isolation andcharacterization  of  diesel  oil- degradingindigenous  microorganisms in Kwazulu-Natal, South Africa.African. Journal of Biotechnology . 7 : 1927- 1932.
Stackebrandt,  E.,  &  B.  M.  Goebel.  1994.
Taxonomic  Note:  A  Place  for  DNA DNA  Reassociation  and  16s  rRNA Sequence  Analysis  in  the  Present Species Definition in PertiBacteriology. International journal of systematic
bacteriology . 44 : 846-849.
Zam,  S.I.  2011.  Bioremediasi  Tanah  yang
Tercemar Limbah Pengilangan Minyak  Bumi  Secara  In  Vitro  pada Konsentrasi  pH  Berbeda. Jurnal
Agroteknologi . 1 : 1-8.