Universitas Muhammadiyah Metro
ANALISIS IN SILICO SENYAWA HIBISCETIN KOMBUCHA ROSELLA SEBAGAI IMUNOMODULATOR SEL IMUNOKOMPETEN PADA PENYAKIT MALARIA
Nurhaida Widiani 1
Ovi Prasetya Winandari 2 Marlina Kamelia 3 Puji Nurrohmah 4
1, 2, 3,4 Pendidikan Biologi, UIN Raden Intan Lampung E-mail: 1 nurhaidawidiani@radenintan.ac.id, 2 oviprasetyawinandari@radenintan.ac.id,
3 marlinakamelia@radenintan.ac.id, 4 Pujinurrohmah290398@gmail.com
Abstract :  Malaria  is  one  of  the  public  health  problems  in  Indonesia.  The  data  show  that  drug resistance is found in malaria control. For this reason, various efforts are needed to find solutions to  overcome  these  problems.  The  presence  of  the  flavonoid  compound  hibiscetin  in  Kombucha Rosella is thought to act as an immunomodulator that can increase the activity and proliferation of lymphocyte  cells  during  malaria  infection.  Kombucha  Rosella  is  considered  to  be  a  supportive therapy for malaria treatment. The purpose of this study was to obtain a scientific basis for the use of  Kombucha  Rosella  tea  as  immunotherapy  for  malaria.  The  method  used  is  by  using  An  silico docking  simulation.  The  ligand  compound  used  was  hibiscetin  and  the  target  protein  was  TCR  – MHC  II  complex.  Docking  simulation  using  AutodockTools  1.5.6,  Autodock  4.2,  and  Discovery Studio Visualizer applications. The results showed that the Hibisctin compound had the potential to increase  the  activity  of  immunocompetent  cells  in  silico  with  the  value  of  Free  Energy  Binding (∆Gbinding) -3.08, the value of the inhibition constant was 5.49 nM, and the RMSD value <5 was 3.32 .
Kata Kunci : Immunomodulator, In Silico, Kombucha Rosella, Sel Imunokompeten

## PENDAHULUAN
Malaria  merupakan  penyakit  tular vektor  yang  disebabkan  oleh  protozoa . Jumlah  kasus  malaria  berdasarkan  data WHO  diperkirakan  300  –  500  juta/tahun dengan  angka  kematian  lebih  dari  1  juta (Liwan,  2015).  Berdasarkan  data  WHO (2010), malaria dapat menyebabkan anemia dan menurunkan produktivitas kerja, bahkan dapat menyebabkan kematian pada kelompok  resiko  tinggi    (bayi,  balita,  dan ibu hamil). Selama 5 tahun terakhir malaria menjadi  penyebab  kematian  anak  di  dunia. Lebih  dari  200  ribu  kasus  kematian  pada anak  di  Afrika  disebabkan  oleh  malaria falciparum sedangkan malaria vivax menjadi  penyebab  anemia  dan  kematian
pada anak di Asia dan Oceania (Ashley dan Jeanne, 2020).
Di
Indonesia malaria masih dianggap  ancaman  kesehatan  masyarakat. Salah satu provinsi  yang merupakan daerah endemis  malaria  adalah  Lampung.  Selama tahun 2010 – 2017 persentase kasus malaria di  Lampung  yang  terkonfirmasi  dengan laboratorium  dan  diobati  dengan  ACT cenderung meningkat (Dinkes, 2017). Malaria disebabkan oleh 5 spesies Plasmodium yaitu P.  falciparum,  P.    vivax, P.  ovale,  P.  malariae, dan P.  knowlesi, tetapi  kasus  malaria  di  Indonesia  yang disebabkan P.  knowlesi belum  banyak dilaporkan  (Kemenkes,  2017).  Vektor penyakit  ini  adalah  nyamuk Anopheles
betina.Lebih dari 20 spesies Anopheles yang merupakan  vektor  dari  empat  spesies Plasmodium ditemukan di Indonesia (Elyazar et  al, 2011).  Bahkan  berdasarkan data  Dinas  Kesehatan  Provinsi  Lampung, sebanyak 10spesies Anopheles yang menjadi vektor  malariaditemukan  di  Lampung. Spesies  tersebut  yaitu An.  sundaicus,  An. vagus , An.  acconitus,  An.  barbirotris,  An. subpictus,  An.  indefinitus,  An.kochi,  An. minimus, An. tesselatus, dan An. maculatus (Dinkes, 2017).
Dalam  rangka  pengendalian  penyakit malaria  di  Indonesia,  monitoring  dan evaluasi  perlu  terus  dilakukan,  serta  perlu adanya  formulasi  kebijakan  dan  strategi yang tepat. Pemerintah menargetkan Indonesia  bebas  malaria  tahun  2030.  Untuk tahun  2020  sebanyak  23  kabupaten/kota masuk kriteria endemis tinggi, 21 kabupaten/kota  masuk  kriteria  endemis sedang,  dan  152  kabupaten/kota  masuk kriteria  endemis  rendah.  Provinsi  yang mencapai  100%  eliminasi  malaria,  adalah DKI  Jakarta,  Jawa  Timur,  dan  Bali. Sedangkan  provinsi  yang  belum  mencapai eliminasi adalah Maluku, Papua, dan Papua Barat  (Biro  Komunikasi  dan  Pelayanan Masyarakat  Kementerian  Kesehatan  RI, 2021).
Penurunan efikasi beberapa obat antimalari menjadi tantangan terbesar dalam pengendalian  malaria.  Di  Indonesia  sudah sejak  lama  resistensi  terhadap  Klorokuin dan Sulfadoksin terjadi pada P. falciparum, P.  vivax, dan P.  malariae (Elyazar et  al, 2011).  Saat  ini  pengobatan  malaria  yang dianjurkan di Indonesia dengan menggunakan ACT ( Artemisin-based Combination  Theraphy ).  Mutasi  genetik yang  terjadi  pada Plasmodium dapat menyebabkan munculnya
strain
Plasmodium yang  tahan  terhadap  obat
antimalaria  (Yusuf,  2014).  Berdasarkan kemampuan Plasmodium tersebut kemungkinan  munculnya  strain  baru  yang resisten terhadap artemisin bisa saja terjadi.
Menghadapai hal tersebut perlu dipikirkan  alternatif  terapi  pendamping diantaranya  melalui  usaha  peningkatan imun  tubuh  dengan  konsumsi  bahan-bahan alami.  Kelopak  bunga  Rosella  dapat  diolah menjadi  minuman  herbal  yaitu  Kombucha Rosella.  Berdasarkan  penelitian  diketahui aktivitas imunomodulatorterhadap proliferasi sel limfosit mencit secara in vitro tertinggi  yaitu  dengan  pemberian  teh Kombucha Rosella yang difermentasi selama  10  hari.  Hal  ini  diduga  karena adanya  kandungan  asam  organik  (Ulfah et al, 2016).Selain  itu  Rosella  juga  diketahui kaya akan antioksidan diantaranya flavonoid seperti hibiscetin,gossypetin dan quercetin . Berdasarkan penelitian diketahui  senyawa-senyawa  tersebut  dapat digunakan sebagai kandidat obat antimalaria karena  dapat  menghambat  perkembangan plasmepsin  I  dan  plasmepsin  II  (Nerdy, 2017) . Selain itu pemanfaatan herbal seperti Kombucha Rosella diprediksi dapat digunakan untuk meningkatkan sistem imun tubuh.
Salah  satu  upaya  dalam  penemuan obat adalah dengan memanfaatkan teknologi  komputerisasi  dengan  metode  in silico.  In  silico  dengan molecular  docking mampu  memprediksi  ikatan  terkuat  antara senyawa  bioaktif  dan  protein  target. Penggunaan metode in silico , dapat digunakan  untukmemprediksi  penelitian lanjutansecara in  vitro atau in  vivo. Penelitian Malau  dan  Fatimah  (2019)  secara  in  silico diketahui  bahwa  senyawa  ligan  Cyanidin 3,5- di-(6-malonylglucoside) memiliki kestabilan  yang  kuat  terhadap  enzim Enoyl Acyl  Carrier  Protein  Reductase ( PfENR)
dari P. falcivarum.
Berdasarkan aktivitas imunomodulator yang dimiliki
teh
Kombucha  Rosella,  maka  ingin  diketahui apakah  teh  Kombucha  Rosella  juga  dapat meningkatkan  aktivitas  sel  imunokompeten yang berperanandalamimunitasterhadapinfeksi penyakit  malaria  melalui  simulasi  in  silico docking.  Senyawa  flavonoid  hibiscetin digunakan sebagai ligan. Sedangkan Protein TCR  αβ  –  MHC  II  complex  digunakan sebagai  protein  target.  Hal  ini  perlu dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan  landasan  ilmiah  penggunaan teh  Kombucha  Rosella  sebagai  imunoterapi untuk penyakitmalaria.

## METODE
Uji  aktivitas  sel  imunokompeten dilakukan  dengan    metode In  Silico ,  secara komputasi. Untuk melakukan proses docking  molekuler  digunakan  perangkat keras  leptop HP  14-bs0xx dengen  spesifikasi RAM 4096 MB . Simulasi docking dilakukan dengan mengunakan aplikasi Autodock tools 1.5.6 , Autodock  4 dan Discovery  Studio Visualizer  2020 .Ligand  berupa  hibiscetin diunduh
dari laman PubChem
( http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov) denganko dePubChem: 15559735 . Protein target struktur kristal  enzim  TCR  αβ  -  MHC  II  Complex di unduh dari Protein  Data  Bank  (PDB) ( http://www.pdb.org/pdb/home/home.do ) dengan kode PDB: 4GRL.
Proses docking menggunakan perangkat  lunak Autodock  Tools  1.5.6 dilakukan  untuk  memperoleh  data  berupa nilai Binding Energy, nilai konstanta inhibisi dan  nilai  RMSD.  Selain  itu  juga  dilakukan proses  docking  menggunakan  perangkat lunak Discovery  Studio  Visualizer untuk mendapatkan  data  berupa  gambar  yang
dapat  memvisualisasikan  ikatan  hidrogen serta interaksi ligan dan protein target.

## HASIL
Minuman  herbal  yang  berasal  dari fermentasi  kelopak  rosella,  jamur  dan bakteri yeast sering dikenal sebagai kombucha  rosella  (Achmad  dkk,  2016). Hasil  fermentasi  tersebut  mengandung banyak senyawa kimia, salah satunya adalah hibiscetin.  Penelitian  ini  menggunakan senyawa  hibiscetin  sebagai  ligan  yang digunakan sebagai immunomodulator
penyakit malaria.
Efektivitas minuman kombucha rosella sebagaipendamping obat antimalaria dapat  dilihat  dengan  metode  docking  in sillico. Tahap penyiapan strukturmakromolekuldiunduhdariPDB dengan alamat berikut http://www.rscb.org.pdb . Struktur  makromolekul  yang  telah didapat masih dalam bentuk terikatdenganligandanmolekulair.Pemisahan residunonstandarmenggunakanprogramDisc overyStudio 3.5Visualizer.
Gambar 1 . Struktur T Cell reseptor. Tosca : rantai  A;Coklat  :  rantai  B;  Ungu  :  rantai C;Pink : rantai D;Biru: ligan;Bintik:molekulair.
Hibiscetin( kodePubChemCID:15559 735)diunduhmelalui(http://pubChem.ncbi.nl m.nih.gov).
Hibiscetin dibuatdua dimensi(2D)kemudiantigadimensi(3D).Ikata nantaraligandanmakromolekuldiprediksi melaluibindingenergidarihasildocking.
Bindingenergimerupakan  kekuataninteraksi antar  molekul.  Nilai  binding  energi  yang
semakin  tinggi,  mempengaruhi  afinitas reseptor dan ligan menjadi semakinrendah.Interaksiligandanproteinterja dijikastrukturyangdihasilkanmemilikinilaise makinkecil,sehingga ikatannya
semakinstabil.  Liganuji  yang  digunakan yaitu hibiscetin. Berikut tabel hasil uji antara reseptor4GRLdengan hibiscetin. Tabel 1. Rantai Penyusun T Reseptor Molecule Chains Sequence lenght Organism Details MHC class IIHLA-DQ- alphachain A 183 Homosapiens Mutation(s): 0 MHCclassII antigen B 200 Homosapiens Mutation(s):0 TCRHy.1B11 alphachain C 209 Homosapiens Mutation(s):0 TCRHy.1B11 betachain D 268 Homosapiens Mutation(s):0
Hasil  analisis  docking  dapat  dilihat dari  nilai  RMSD  yang  berguna  untuk mengetahuiadakah  kedekatan  antara  ligan alami dengan ligan uji. Ikatan ligan semakin banyak  dengan  reseptor  maka  jarak  antar ikatan  semakin  dekat  dan  semakin  kuat.
RMSD merupakanparameteryangdigunakanuntukm engevaluasiparameter keberhasilan prosesdocking dan perubahan konformasinya.
Tabel 2. Ligan Alami T Cell Reseptor
ID Chains Name/Formula/InChike y 2Ddiagram NAG B N-ACETYL-D-
GLUCOSAMIN EC 8 H 15 N O 6 OVRNDRQM DRJTHS- FMDGEEDCSA-
N
Tabel 3 . Data Hibiscetin dan strukturnya
PubChemCID 15559735 Molecular Formula C 15 H 10 O 9 Synonyms Hibiscetin 577-24-2 SCHEMBL12640014CTK8J42 76LMPK12113272 3,5,7,8,3‟,4‟,5‟-heptahydroxyflavone Molecular Weight 334.23g/mol Struktur 2D 3D Hasil  docking  dikatakanvalid  apabila nilai  RMSD  kurang  atau  sama  dengan 2artinya ligan mampu melakukan penyesuaian struktur demi mencapai konformasiyangstabilsaatberikatandengansi siaktifreseptor. Berdasarkananalisishasildocking (Tabel 4), terlihatbahwahibiscetinberpotensiuntukberik atan  denganreseptor  TCR  αβ  –  MHC  II complex  secara in  silico .  Hal  ini  dapat diasumsikan
bahwahibiscetin ini berpotensidalammeningkatkanaktivitasselim unokompetensecara insilico, dengancarameningkatkanaktivasidanprolifer asisel limfosit (Hidayanti dkk, 2014). Tabel 4. Skor Docking Ligan Uji Hibiscetin Ligan Interaksir esidu Binding energy (kcal/mol) Konstantai nhibisi (mM) Cluster RMSD Reference RMSD

## Hibiscetin  ARG
B:149ASP A:110LEUB :147 THRA:90 -3.08 5.49 0.00 3.32 PEMBAHASAN Free Energy Binding
(∆G binding )pada  ligan  uji  bernilai-3.08 sedangkan  konstanta  inhibisinya  sebesar 5.49  nM.  Nilai  RMSD  yang  dihasilkan pada  uji  ini  kurang  dari  5  yaitu  3.32  Å. Hibiscetin  memiliki  nilai  RMSD  lebih besar  dibandingkan  ligan  alami.    Hal  ini disebabkan oleh proses pencarian konformasi dari ligan untukdapat berikatan dengan tepat ke reseptor TCR αβ – MHC II complex.
Antara liganuji dan protein terbentuk  7  ikatan  rantai  hidrogenpada rantai B dan AyaituLEU A:108, ASPA:110,THRA:90,PROB:146,ARGB:14 9,PHEA:146,  dan  LEUB:147  (Gambar  2).
ApabilaJumlahikatanhidrogenyang terbentuk  semakin  banyakmaka  interaksi antara  ligan  uji  dengan  reseptornyaakan semakin kuat.Liganhibiscetindalampenelitianini menunjukkan kemampuannya untuk digunakansebagaiinhibitorproteinreseptor karena  jumlah  ikatanhidrogennya  dapat menstabilkan
ikatanyangdihasilkan tersebut.
Ikatan  Van  Der  Waals,  π-Donor Hydrogen  Bond,  ConventionalHydrogen Bond,dan πAlkyl adalah ikatan selain ikatan hidrogen terbentuksetelah divisualisasi.
Ikatan  tersebut  terjadi  akibat  interaksi  ligan dan
proteinreseptor sehingga meningkatkanafinitasnya.
Gambar 2. Ikatan-ikatan yang terbentuk diantara Hibiscetin
Interaksi  yang  terjadi  antara  ligan  dengan protein reseptor dipengaruhi oleh hasildockingbindingenergi serta kostatainhibisinya.Apabila binding energinyasemakin  kecil  makaenergi  yang dibutuhkan semakin
sedikitdankemampuansenyawauji
dalam
menghambatreseptor akansemakinbesar. Analisisdocking
yang terjadi antarahibiscetindenganproteinreseptor menunjukkan hasil sebesar -3.08 kcal/mol.
Limfositumumnyaakanberproliferasi ketika  terjadi  pengikatanantigen  ke  reseptor di permukaanselTbersamaan dengan interlukin-1(IL-1) yang berasal dari AntigenPresentingCell (APC) sehingga proteinG  dapat  teraktifasi.    ProteinG kemudian akanmengaktifasienzimfosfolipaseC yang akan mengubah substrat fosfatidilinositolbifosfat(PIP 2 )menjadi produk berupa diasilgliserol(DAG)dan trifosfat inositol (IP 3 ). Proses ini berlangsung di membran plasma (Dewa dkk, 2014). IP 3 selanjutnya akan berdifusi kesitosol
lalu berikatandenganproteinreseptor calcium- sequestering
compartment di permukaansitoplasmik.
Proses  pengikatan  tersebut  akan mengakibatkan peningkatankonsentrasiionCa 2+ sitosol.
KonsentrasiionCa 2+ dan DAG akan menyebabkan proteinkinaseC menjadi aktif.ProteinkinaseC yang teraktifasiselanjutnya akanmemfosforilasifosfatkeresiduserinataup un treonin yang spesifik pada proteinmembransehingga memicu pertukaranNa + ,  selain  itu  ion  H + akan menurun  sehingga  terjadi  peningkatanpH. Derajat  keasaman  (pH)  yang  neningkat akanmenjadisinyal bagi seluntuk berproliferasi. ProteinkinaseC yang teraktifasi  akanmemicu  produksiinterleukin- 2(IL-2)  sehingga  selB  maupun  selT  akan aktif berproliferasi (Ulfah dkk, 2016).
Sel  limfosit  yang  teraktivasi  dan berproliferasi akibat dipicu
senyawahibiscetinkombucharosella, mekanismenyasamadenganmekanismeproli ferasipadaumumnya. Antigen yangnantinya dikenali  reseptorsel  T  maupun  sel  B  akan diperankan  oleh  hibiscetin  kombucha rosella  akan  memicuresponimun.  Hasil penelitianini
menunjukkan antigendenganselTnaif pengenalannya melalui adanya reseptornya TCR αβ.TCRαβterletak pada permukaanselLimfositTnaif dalam
mengenaliantigen  membutuhkan  bantuan dari  APC.  Antigen  akandipresentasikan MHC  II  yang  merupakan  molekul  pada permukaan  sel  APC  (Sel  dendritik) sehinggaterjadi  aktivasi  danproliferasi  sel Limfosit T (Baratawidjaja&Rengganis, 1991).
Pada penelitian yang telah dilakukan pengikatan molekul ke proteintarget TCRαβ–
MHCIIcomplex.Limfosit  T  naif  yang  telah matang akan meninggalkan timus sehingga teraktivasi    dan  mengalami    proliferasi apabila
terpaparantigenyangdipresentasikanolehM HCII.    Pada  penelitian  ini  yang  bertindak sebagai antigen adalah senyawahibiscetinkombucharosella. SelTnaifkemudian berdiferensiasimenjadiselTh0  (Ulfah  dkk, 2016). Adanya pembawa pesan kedua(diasilgliserol) serta peningkatankonsentrasiCa 2+ dalamsitosol yang terjadi ketika aktivasi danproliferasisellimfosit akan menyebabkan sel Th0 terpacu untukmemproduksi serta  mensekresikan sitokin IL-2.IL-2 yang dihasilkan menyebabkan  selT,selB  danselNK  akan berproliferasi
dandiferensiasi
(Baratawidjaja, 1991).
Apabila sel darah merah terinfeksi Plasmodium maka selTh0dari seltersebutakanberdiferensiasimenjadiTh1 danTh2. Kondisi tersebut akan mengaktifkan mikrofag yang dipicu sitokinjenisIFN-γ  hasil  sekresi  selTh1,  ini terjadi padafaseefektor (Baratawidjaja&Rengganis, 1991).
Bentukresponimun seluler yang terjadi yaitumakrofag
teraktivasi akanmemfagosit Plasmodium padastadiumer itrositer.
PadajalurTh2 akan
diproduksisitokinIL-4  danIL-5  yang  akan disekresikan untuk membantu sel Bberdiferensiasi    menjadi  selplasma.  Sel plasma
akanmenimbulkan respon
yangspesifik    berupasekresi  antibodi  untuk menghancurkan Plasmodium pada  stadium eksoeritrositer  serta  stadium  eritrositer. Pada tahap respon imun humoral inijuga sel memori  akan  dihasilkan  agar  dapat mengenali Plasmodium lebihcepat apabila infeksi kembali menyerang tubuh(Baratawidjaja&Rengganis,1991).

## KESIMPULAN
Berdasarkan
hasil penelitian menunjukkanbahwasenyawahibiscetinko mbucha rosella berpotensi untuk berikatan dengan  dengan  TCR  Alpha-beta.  Dengan demikian Hibiscetin berpotensiuntuk meningkatkan aktivitas sel imunokompeten secara in silico.

## DAFTAR RUJUKAN
Hafid,A. F., N. Puliansari, N. S. Lestari, L. Tumewu,
A.Rahman,danA.Widyawaruyanti. 2016.
SkriningAktivitasAntimalariaBeber apaTanamanIndonesiaHasilEksplor asiDariHutanRayaCangar,Batu-
Malang, Jawa Timur. Jurnal Farmasi Dan Ilmu KefarmasianIndonesia 3,1: 6–10.
Ashley,  E.  A.  &J..R.  Poespoprodjo.  2020.
Treatment and prevention of malaria  in  children. Lancet  Child Adolesc Health 4: 775 - 789
Baratawidjaja,  K.  G&Rengganis,  I.  1991.
Imunologi Dasar . Universitas Indonesia: Jakarta.
Anandagiri,D. A.  W. M., I.B. P. Manuaba,
&  N.  G.A.M.  D.Suastuti.2014. Pemanfaatan Teh Kombucha SebagaiObatHiperurisemiaMelaluiP enghambatanAltivitasXantin Oksidase
pada RattusNorvegicus . JurnalKimia 8,no.2:220–225
Dinkes.  2017.  Profil  Kesehatan  Provinsi Lampung  Tahun  2017.  Dinkes PemProv Lampung.
Kemenkes.  2017.  Buku  Saku  Tatalaksana Kasus Malaria. Kemenkes RI.
Elyazar,  I.R.F,    S.  I.  Hay,J.K.Baird.  2011. Malaria  Distribution,  Prevalence,  Drug Resistance  and  Control  in  Indonesia. Advance in Parasitology 74: 42. Hidayanti,M.D.,S.Astuti,danM. E.Kustyawati. 2014. PengaruhPemberianKombuchaTeh RosellaTerhadapProfilDarahMencit (MusMusculusL). Jurnal Agritech 34, no.4: 382–89. Liwan. 2015. Diagnosis dan Penatalaksanaan Malaria Tanpa
Komplikasi  pada  Anak. Cermin
Dunia Kedokteran 42, 6: 425 – 429.
Malau  dan  Fatimah.  2019.  Analisa  Docking
Cyanidin 3,5-di-(6-
malonylglucoside) terhadap Reseptor Plasmodium  falciparum  Enoyl  Acyl Carrier  Protein  Reductase  (PfENR) sebagai Anti Malaria. J. EduMatSains 4, 1: 99-110.
Nerdy.  2017.  In  Silico  Docking  Roselle (Hibiscus  sabdariffa  l.)  Calyces Flavonoids  as  Antimalarial  against Plasmepsin  1  and  Plasmepsin  2. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 10(10):183
Ulfah,M., Octaviani, D.P., dan Sasmito, E.
2016. Uji aktivitas Imunomodulator Fermentasi  Teh  Rosela  Jamur
Kombucha Terhadap Proliferasi Sel
Limfosit  Mencit  Galur  Balb/c
Secara Invitro. Jurnal Ilmiah Fakultas Farmasi. Unwahas: Semarang.
World  Health  Organization.  2010. World Malaria Report 2010 . hal.32-33.
Yusuf. 2015. Anti-Malarial Drug Resistance. Majalah Kedokteran Andalas 37, 1: 64 – 69.