Identifikasi  dan Analisis Filogenetik Portunus trituberculatus Dari Perairan Cirebon Menggunakan Barkode Gen COI Mitokondrial
Subagiyo 1 *, Ch. Retna Handayani 2 , Rahayu 2 dan Triandala Mada Sibero 1
1 Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan IlmuKelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. Soedarto, SH. Tembalang, Semarang 50275 Indonesia
2 Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau Jl. Cik Lanag Bulu Jepara 59418 Indonesia Email: subagiyo.kelautan13@gmail.com

## Abstract
Phylogenetic Identification and Analysis Portunus trituberculatus from Cirebon Coast Using the COI Barcode  Mitochondrial
Portunus  trituberculatus  spesimen  from  Cirebon  coast  were  successfully  identified  using mitochondrial DNA cytochrome c oxydase subunit I (COI) genes. Analysis of haplotype distribution of  P.  trituberculatus  along  with  the  same  species  from  China,  Korea,  India  and  the  Philippines obtained from NCBI gene banks resulted 17 haplotypes from 25 specimens. Haploid diversity was 0.943 + 0.031 and nucleotide diversity was 0.04821 + 0.0139. The Cirebon specimen is in separated haplotipe from the others. The results of phylogenetic analysis showed that the 25 specimens were clustered  into  3  clusters  in  2  different  lineages  with  percentages  genetic  distance  were  12.76%, 14.24% and 14.33% respectively. The genetic distance within each cluster ranges from 0 - 2.92%. The Cirebon crab specimen is in the same cluster as the Philippine specimen with 1% genetic distance.
Keywords : crab; Portunus trituberculatus; barcoding; gen COI

## Abstrak
Spesimen  rajungan Portunus  trituberculatus dari  perairan  Cirebon  berhasil  diidentifikasi menggunakan  gen    mitochondrial  DNA  cytochrome  c  oxidase  subunit  I  (COI).  Analisis  distribusi haplotipe  dengan  data P  trituberculatus yang  berasal  dari  China,  Korea,  India  dan  Filipina  yang diperoleh  dari  data  genebank  NCBI  didapatkan  17  haplotipe  dari  25  spesimen,  dengan keragaman  haploid  0,943  +0.031  dan  keragaman  nukleotida  0,04821+0.0139.  Spesimen  Cirebon merupakan  haplotipe  yang  terpisah  dari  yang  lainnya.  Hasil  kajian  filogenetik  menunjukkan  25 spesimen  mengelompok  ke  dalam  3  kluster  dari  2  garis  keturunan  yang  berbeda  dengan  jarak genetik berturut turut  12,76 %, 14,24 % dan 14,33 %. Jarak genetik di dalam masing-masing kluster berkisar antara 0 – 2,92 %.  Spesimen rajungan Cirebon berada pada garis keturunan dan kluster yang sama dengan spesimen Filipina dengan jarak genetik 1%.
Kata kunci : rajungan; Portunus trituberculatus; barcoding; gen COI

## PENDAHULUAN
Portunus. trituberculatus dikenal dengan  nama  lain gazami  crab,  Japanese blue crab atau horse crab . Spesies ini memiliki distribusi  geografis  di  Samudera  Hindia  dan Samudera  Pasifik  Barat:  Asia  Tenggara  dan Timur (dari Jepang, Korea, Cina dan Formosa dan Teluk Bengala), ke Barat, Utara dan Timur
Australia (FAO, 2018). Menurut Liu et al. (2013) P.  trityberculatus merupakan  hasil  perikanan tangkap  terbesar  di  dunia  (menempati sekitar  seperempat  tangkapan  komersial  di seluruh  dunia).    Sebagian  besar  dari  total tangkapan kepiting ini (95%) terjadi di Cina di tiga daerah penangkapan utama: Laut Cina Timur,  Laut  Kuning,  dan  Laut  Bohai.  Di Indonesia P.  trituberculatus merupakan
spesies  yang  jarang  ditemukan  (Irawan  dan Soegianto, 2006).
P. trituberculatus secara umum memiliki penampilan  yang  mirip  dengan Portunus pelagicus . P.  trituberculatus dibedakan  dari P. pelagicus karena memiliki 3 gigi frontal (4 di P.  pelagicus )  dan  memiliki  4  duri  di  merus cheliped  (3  di P.  pelagicus )  (FAO  (2018), sehingga  dapat dengan mudah diidentifikasi secara fenotipik. Selanjutnya untuk mengetahui adanya variasi atau keragaman intraspesik  diperlukan  pendekatan  molelular diantaranya  adalah  menggunakan  urutan gen mtDNA (Habib, et al., 2011) yang dikenal dengan  nama DNA  barcoding (Raupach  & Radulovici. 2015). Data barcoding P trituberculatus di Indonesia masih belum ada. Oleh  karena  itu  spesimen P  trituberculatus yang  tertangkap  di  perairan  Cirebon  pada tahun  2016  ini  akan  dilakukan  analisis barcoding dan membandingkannya dengan data  spesies  yang  sama  yang  ada  di database  BOLD    ( The  Barcode  of  Life Data System ) dan gene bank NCBI ( The National  Center  for  Biotechnology Information ).
DNA  barcoding  merupakan tool yang kuat untuk mengidentifikasi dan mengkonfirmasikan spesies (Shen et al., 2013). Marka    gen  DNA  mitokondria  yang mengkodekan  gen  sitokrom  oksidase  (COI) umum  digunakan  untuk  barkoding.  Variasi intraspesifik  biasanya  kurang  dari  2,0%  dan dalam  banyak  kasus  kurang  dari  1,0%  (Shen et  al., 2013).  Penggunaan  gen  COI  sebagai marka  untuk barcoding dan  identifikasi  jenis- jenis kepiting telah memberikan banyak hasil seperti Portunus  sanguinolentus , Charybdis natator,  P.  pelagicus , P.trituberculatus dan Travancoriana napaea (Umamaheswari et al, 2016),  fiddler  crabs Uca  annulipes dan U. perplexa (Abbas et  al., 2016).  Selain  itu DNA barcoding juga  digunakan  untuk  studi keragaman  genetic Portunus  pelagicus (Klinbunga, et  al., 2010;  Sienes et  al., 2014; Ren et al., 2017), P. trituberculatus (Guo et al. , 2012), Portunus  sanguinolentus (Naz et  al. , 2016;  Ren et  al., 2017).  Pada  penelitian  ini DNA  barcode juga  digunakan  untuk mengevaluasi  perbedaan  intraspesifik    dari berbagai  lokasi  tangkap  di  dunia  yang datanya  diperoleh  dari  gene  bank  (NCBI)
yang selanjutnya digunakan untuk mengetahui  ada  tidaknya  perbedaan  jalur keturunannya. Penelitian mengenai
filogenetik  rajungan  menggunakan  gene penanda  COI  juga  telah  berhasil  dilakukan (Mantelatto et al. , 2007; Fujaya, et al., 2016).

## MATERI DAN METODE
Spesimen  rajungan  diperoleh  dari tangkapan nelayan
Cirebon yang
melakukan kegiatan penangkapan di perairan  Cirebon  ( one  day  fishing).  Satu spesimen yang diperoleh langsung diidentifikasi  secara  fenotipik  dan    diambil bagian capit kemudian diawetkan menggunakan  ethanol  96  %  sampai dilakukan analisis molekular.

## Ekstraksi DNA
DNA genom rajungan diekstraksi dengan  metode  menggunakan  Chelex  5% menurut  Aranishi  &  Okimoto  (2006)  yang dimodifikasi.  Sampel  capit  depan  rajungan diambil bagian ototnya menggunakan pinset steril dan dihancurkan dengan mortar dalam lumpang porselin. Homegenat yang diperoleh ditambahkan buffer TE (1 mM EDTA, 10  mM  Tris:  pH  8.0),  dihomogenkan  dan dibiarkan  selama  15  menit  pada  suhu ruangan. Suspensi homogenate ini disnetrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm untuk  mendapatkan  massa  sel.  Massa  sel yang  diperoleh  kemudian  ditambahkan Chelex  5  %  dan  proteinase  K  selanjutnya divortex. Suspensi sel ini  diinkubasi pada suhu 56  °C  selama  15-30  menit,  Selanjutnya dimasukkan  ke  dalam  penangas  air  yang mendidih  selama  8  menit.  DNA  genom diperoleh  dengan  cara  sentrifugasi  pada kecepatan 10.000 rpm selama 3 menit. Debris sel mengendap dan DNA ada di supernatant.

## Amplifikasi dan Sekuensing
Gen  COI    diamplifikasi  menggunakan kit PCR  dan primer universal  gen COI : LCOI 1490-5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG- 3’
dan HCOI 2198-5’-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ (Gebhardt  &  Knebelsberger,  2015).  Siklus thermal  yang  digunakan  adalah  hasil
optimasi  yang  dilakukan  di  laboratorium manajemen kesehatan hewan akuatik (MKHA) Balai Besar Perikanan
Budidaya  Air  Payau  Jepara . Amplifikasi dilakukan  pada Hotstart 94 o C  (5  menit), denaturasi  94 o C  (5 menit) diikuti  35 siklus 94 o C  (1  menit),  annealing  56 o C  1  menit, ekstensi 72 o C (1.5 menit) dan ekstensi akhir 72 o C  (5  menit)  serta  Hold  12 o C.  Kegiatan amplifikasi  ini  dilakukan  di  laboratorium  Hasil amplifikasi  gen  COI  di  sekuensing  melalui Genetika Science Indonesia.

## Analisis data
Sekuens gen COI dianalisis
menggunakan  perangkat  lunak  MEGA  5.20 meliputi edit/aligment menggunakan ClustalW. Sekuens diidentifikasi menggunakan BOLD system
(http://www.boldsystems.org/index.ph p/IDS_OpenIdEngine)  dan  BLAST  (www.ncbi. nlm.nih.gov/ ) .  Analisis  filogenetika  dilakukan dengan perangkat lunak MEGA 5.2 menggunakan  metode  statistiK Neighbor- joining (NJ)  dan Maximum  Likelihood (ML). Test  phylogeny dengan bootstrap  methods dan  model  Kimura  2-parameter.  Jarak genetiK, dihitung menggunakan fasilitas yang ada  di  MEGA  5.2.  Data  yang  digunakan dalam rekonstruksi filogenetik meliputi spesimen  rajungan P.  trituberculatus yang diperoleh  dari  perairan  Cirebon  dan  data FASTA  gen  COI  spesimen  rajungan P. trituberculatus yang diperoleh dari database NCBI  (Tabel  1).  Analisis  haplotipe  dan polimorfisme
dilakukan menggunakan perangkat lunak DnaSP v.5.
Tabel 1. Data fasta sekuens gen COI spesimen rajungan P. pelagicus yang diambil dari database NCBI untuk rekonstruksi filogenetik (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)
Spesimen Asal spesimen Acc. number P. trituberculatus voucher CrP10 Philippines: Pangasinan, Region 1 KF604898.1 P. trituberculatus voucher CrP12 Philippines: Pangasinan, Region 1 KF604899.1 P. trituberculatus voucher ihb201306720 China: Hubei, Wuhan, Huanan supermarket KP976344.1 P. trituberculatus voucher ihb201306725 China: Hubei, Wuhan, Huanan supermarket KP976352.1 P. trituberculatus voucher ihb201306722 China: Hubei, Wuhan, Huanan supermarket KP976349.1 P. trituberculatus voucher ihb201306727 China: Hubei, Wuhan, Huanan supermarket KP976354.1 P. trituberculatus voucher ihb201306728 China: Hubei, Wuhan, Huanan supermarket KP976355.1 P. trituberculatus voucher ihb201306729 China: Hubei, Wuhan, Huanan supermarket KP976356.1 P. trituberculatus voucher ihb201306733 China: Hubei, Wuhan, Huanan supermarket KP976343.1 P. trituberculatus isolate De172910-1-1 Korea JX502944.1 P. trituberculatus voucher CASMBGM-1PR   Tamil Nadu, India MG753565.1 P. trituberculatus voucher CASMBGM-PR3  Tamil Nadu, India MG753567.1 P. trituberculatus isolate Potr2 China GQ180780.1 P. trituberculatus isolate Potr3 China GQ180781.1 P. trituberculatus isolate Potr4 China GQ180782.1 P. trituberculatus isolate Potr5 China GQ180783.1 P. trituberculatus haplotype 1 China GU321229.1 P. trituberculatus haplotype 15 China GU321240.1 P. trituberculatus haplotype 16 China GU321241.1 P. trituberculatus haplotype 18 China GU321243.1

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil identifikasi spesimen rajungan CR 2 yang  ditangkap  di  perairan  Cirebon menggunakan barcoding  bold system
menunjukkan
sebagai
spesies P.
trituberculatus dengan nilai kesamaan sebesar 99.67% demikian juga menggunakan analisis  BLAST  ( The  Basic  Local  Alignment Search  Tool )  NCBI  menunjukkan  kemiripan dengan P. trituberculatus sebesar  99%  (Tabel 2).  Berdasarkan  tingkat  kesamaan  dan identity  yang  sangat  tinggi  (  ≥  99%  ) menunjukkan bahwa DNA barcoding berdasarkan  gen  cytochrome  c  oxidase  I (COI)    mitokondrial    dapat  digunakan  untuk identifikasi  spesimen  rajungan  CR2.  Hal  ini sesuai  dengan  Hebert et  al. (2003)  bahwa DNA  barcoding menggunakan  fragmen pendek  mitokondria  efektif  untuk  diagnosis spesies.  Informasi  mengenai P  trituberculatus di  Indonesia  sangat  sedikit  sekali.  Menurut FAO  (2018)  perairan  Indonesia  merupakan daerah  distribusi  jenis  rajungan  tersebut (Gambar 1).
Analisis  filogenetik  menggunakan  data gen  COI P.  trituberculatus yang  ada  di database NCBI (21 dari China, 1 dari Korea, 2 dari India )dan 1 spesimen yang berasal dari tangkapan
di perairan
Cirebon menggunakan Neighbor-joining (NJ) methods (Saitou  &  Nei  1987)  dan Maximum  Likelihood method ( ML) menggunakan model Kimura 2- parameter Kimura M.
(1980)dengan bootstrap 1000  kali    ( Felsenstein  1985) dengan    menunjukkan  secara  konsistensi pola  garis  keturunan  yang  sama  (Gambar  2 dan  Gambar  3).  Penggunaan  2  spesies out group yaitu Octopus  vulgaris ( accession FN24381.1) dan
Uroteuthis duvauceli ( accession KC951889.1) pada pohon filogenetik  menggambarkan  semua  garis percabangan P.  trituberculatus berasal  dari ancestor yang  sama.  Hal  ini  menunjukkan garis  keturunan  monofiletik  (Baum et  al., 2008).  Berdasarkan  hasil  analisis  filogenetik dengan  2  metode  ini    semua  data  set mengelompok  kedalam  2  garis  keturunan ( lineage )  yang  berbeda  yang  berasal  dari  1 ancestor yang  sama.  Pengelompokan  ini
Gambar 1. Distribusi geografi P trituberculatus
Keterangan : pasti; : tidak pasti ; : area tangkapan FAO
Sumber : FAO (2018)

## Tabel 2 . Hasil identifikasi menggunakan BOLD system dan analisis blast NCBI
Spesimen  Similaritas Spesies Max score Query cover Identity Spesies Accession CR2 99.67% Portunus trituberculatus 1094 100 % 99 % Portunus trituberculatus KF604898
Tabel 3. Jarak  genetik  tiga  klaster P.  trituberculatus .  Diagonal  kekanan  merupakan  nilai  jarak genetic intra garis keturunan, nilai dibawah diagonal merupakan jarak genetic inter garis keturunan.  Nilai  diatas  diagonal  adalah  standard  deviasi  jarak  genetik  inter  garis keturunan
Lineage C Lineage A Lineage B Klaster 3 Klaster 1 klaster 2 Lineage C, klaster 3 0,0292 0,0155 0,0149 Lineage A, klaster 1 0,1424 0,0046 0,0158 Lineage B, klaster 2 0,1276 0,1433 0
Tabel 4. Distribusi  haplotipe25    spesimen P.  trituberculatus. Jumlah  urutan  yang  digunakan:  25, Wilayah  terpilih:  1-615  Jumlah  situs:  615,  Jumlah  total  situs  (tidak  termasuk  situs  dengan kesenjangan  /  data  yang  hilang):  610,  Situs  dengan  kesenjangan  penjajaran:  tidak dipertimbangkan.
Haplotipe Spesimen Asal spesimen Hap_1: 1 KF604898.1 Filipina Hap_2: 1 KF604899.1 Filipina Hap_3: 4 KP976344.1 KP976349.1 KP976355.1 KP976343.1 China Hap_4: 5 KP976356.1 KP976354.1 KP976352.1 GU321243.1 GQ180779.1 China Hap_5: 1 JX502944.1 Korea Hap_6: 2 MG753567.1 MG753565.1 India Hap_7: 1 GQ180780.1 China Hap_8: 1 GQ180781.1 China Hap_9: 1 GQ180783.1 China Hap_10: 1 GU321241.1 China Hap_11: 1 GU321240.1 China Hap_12: 1 GU321229.1 China Hap_13: 1 CR2_Cirebon Indonesia Hap_14: 1 GU321230.1 China Hap_15: 1 GU321244.1 China Hap_16: 1 GU321242.1 China Hap_17: 1 GU321231.1 China
didukung dengan nilai bootstrap sebesar  81 –  100  %.  Spesimen  yang  berasal  dari  China dan  Korea  berada  dalam  1  garis  keturunan yang  sama  ( lineage A),  spesimen  India, Filipina  dan  Cirebon  berada  dalam  1  garis keturunan yang sama ( lineage B). Selanjutnya  garis  keturunan  B  terbagi menjadi 2 klaster yaitu klaster yang terdiri dari specimen  India  dan  klaster  yang  terdiri  dari specimen  Filipina  dan  specimen  Cirebon. Pengelompokan  ke  dalam  3  kluster  ini  juga
diperkuat  oleh  analisis  jarak  genetik  antar kelompok  (Tabel  3).    Jarak  genetik  antara lineage  A  dan  B  sebesar  12,76  %,  antara  A dan B klaster 2 sebesar 14,24 % dan antara B klaster  2    dan  B  klaster  3  sebesar  14,33  %. Sedangkan  jarak  genetik intralineage antara 0 – 2,92 %.  Spesimen Cirebon karena berada di  dalam  klaster  yang  sama  dengan spesimen  Filipina  menunjukkan  adanya hubungan  kekeraban  yang  dekat  terutama dengan spesimen KF604898.1. Hal ini diukung
Gambar  2. Analisis  hubungan  filogenetika  diantara P.  trituberculatus berdasarkan  gen  COI sepanjang  602bp    dengan  metode Neighbor-Joining (model  Kimura-2  parameter). Bootstrap (1000 replikan). Analisis menggunakan MEGA 5.2.
GQ180779.1 China
GU321231.1 China
KP976352.1 China
GU321242.1 China
KP976354.1 China
GU321229.1 China
KP976356.1 China
GU321243.1 China
GU321240.1 China
GU321244.1 China
GU321241.1 China
GQ180781.1 China
GU321230.1 China
GQ180783.1 China
JX502944.1 Korea
KP976344.1 China
KP976349.1 China
KP976355.1 China
KP976343.1 China
GQ180780.1 China
MG753567.1 Tamil Nadu India
MG753565.1 Tamil Nadu India
KF604899.1 Filipina
KF604898.1 Filipina
CR2 Cirebon Indonesia FN424381.1 Octopus vulgaris KC951889.1 Uroteuthis duvauceli 100 100 99 82 100 88 100 48 39 13 16 58 34 10 0.05 Lineage B , klaster 2 P.trituberculatus Lineage A, klaster 1 P.trituberculatus Lineage B , klaster 3 P.trituberculatus
Gambar 3. Analisis hubungan filogenetika  berdasarlan gen COI pada 25 sekuens P. trituberculatus dengan  metode Maximum  Likelihood dengan  model  Kimura  2-parameter.  Bootstrap (1000 replikan). Analisis dilakukan di MEGA 5.2.
Tabel 5 . Hasil analisis keragaman P. trituberculatus intra garis keturunan
Lineage A Kluster 1 Lineage B Kluster 2 Lineage B Kluster 3 Jumlah sekuens 20 2 3 Jumlah segregating sites, S 20 0 26 Jumlah haplotipes, h 13 1 3 Keragaman Haplotipe , Hd 0,9158 0 1 Keragaman Nukleotida, Pi 0.0046 0 0.02842 Tabel 6 .Keragaman P. trituberculatus Jumlah sekuen Jumlah haplotipes Jumlah tempat polimorfik ( segregating) Jumlah total mutasi Keragaman Haplotipe Keragaman Nukleotida 25 17 128 144 0,943 +0.031 0,04821+0.0139
GU321243.1 China
GQ180779.1 China
KP976352.1 China
KP976354.1 China
KP976356.1 China
GU321242.1 China
JX502944.1 Korea
GU321229.1 China
GQ180783.1 China
GU321244.1 China GU321241.1 China
GU321240.1 China
GU321230.1 China
GQ180781.1 China
GU321231.1 China
KP976344.1 China
KP976349.1 China
KP976355.1 China KP976343.1 China
GQ180780.1 China
MG753567.1 Tamil Nadu India MG753565.1 Tamil Nadu India
KF604899.1 Filipina
KF604898.1 Filipina
CR2 Cirebon Indonesia FN424381.1 Octopus vulgaris KC951889.1 Uroteuthis duvauceli 100 100 99 81 100 87 100 36 53 0.05 Lineage A P.trituberculatus Lineage  B, klaster 2 P.trituberculatus
Lineage B , klaster 3 P.trituberculatus
dengan  nilai  bootstrap  sebesar  100  %. Kedekatan  ini  juga  ditunjukkan  oleh  jarak genetik  antara  spesimen  Filipina    KF604898.1 dengan spesimen Cirebon sebesar 1%.
Hasil  analisis  haplotipe  menggunakan DnaSP  v  5  menunjukkan  bahwa    lienage  A terdapat  20  sekuens  yang  terdistribusi  dalam 13  haplotipe,  pada  lineage  B  kluster  2 terdapat 2 sekuens yang  terdistribusi dalam 2 haplotipe  dan    pada  lineage  B  kluster  3 terdapat  3  sekuens  yang    terdistribusi  ke dalam  3  haplotipe  (Tabel  4  ).  Keragaman haplotipe  tertinggi  terdapat  di  lineage  B kluster  3  yaitu  sebesar  1  dan  terendah  di lineage  B  kluster  2  sebesar  0.  Keragaman nucleotide tertinggi terjadi di lineage B kluster 3  yaitu  sebesar  2,842  %  dan  terendah  di lineage B kluster 2 sebesar 0 (Tabel 5). Analisis keragaman terhadap 25 sekuens menunjukkan  semua  data  tersebar  kedalam 17 haplotipe dan spesimen rajungan Cirebon merupakan  satu  haplotipe  tersendiri  yang terpisah  dengan  data  rajungan  lainnya (Tabel  4).    Hasil  analisis  keragaman  seluruh data P. trituberculatus yang ada teridentifikasi  sebanyak  128  situs  polimorfik dan jumlah mutasi sebanyak 144, keragaman haploid sebesar 0,943 +0.031 dan keragaman nukleotida  sebesar  0,04821+0.0139  (Tabel  6). Kelompok  garis  keturunan  A  beranggotakan spesimen  dari  China  dan  Korea.  Hasil penelitian  Guo et  al. (2009)  terhadap P.trituberculatus di  sepanjang  pantai  China didapatkan  53  mtDNA  haplotipes  dari  72 individu dan 102 situs mutasi terdeteksi di 617 bp. Keragaman haplotipik dan keanekaragaman  nukleotida  berkisar  antara 0,733-1,00 dan 0,00759-0,02614. Hasil yang lain didapatkan oleh Xu et al., (2009) melalui studi menggunakan  metode Amplified  Fragment Length  Polymorphisms (AFLPs)  terhadap  213 samples P.trituberculatus yang  diperoleh  di  3 area  tangkap  East  China  Sea,  Yellow  Sea, dan    Bohai  Sea  terdistribusi  ke  dalam  25 haplotipe dengan 22 variable sites.

## KESIMPULAN
DNA  barcoding menggunakan  gen Cytochrom  oxidase  sub  unit  I  mitokondrial dapat  digunakan  untuk  identifikasi  spesies
rajungan.  Pada  penelitian  ini  spesimen rajungan P.  trituberculatus ,  dari  perairan Cirebon  dapat  diidentifikasi  secara  akurat dengan  tingkat  similaritas  sebesar  99,67  %. Hasil  analisis  filogenetik  dengan  24  spesies yang  sama  yang  berasal  dari  China,  Korea, India dan Filipina (data diambil dari gen bank NCBI) menunjukkan bahwa spesimen Cirebon secara  genetis  masuk  ke  dalam  kelompok garis  keturunan  yang  sama  dengan  spesies Filipina.  Sedangkan  berdasarkan  analisis distribusi  haplotipe  menunjukkan  spesimen Cirebon merupakan haplotipe tersendiri.

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas  E.M.,  Abdelsalam  K.M.,  Mohammed- Geba  K,  Ahmed  H.O,  and  Kato  M., 2016,  Genetic  and  morphological identification  of  some  crabs  from  the Gulf  of  Suez,  Northern  Red  Sea,  Egypt, The  Egyptian  Journal  of  Aquatic Research, 42,  3:319-329
Apreshgi,  K.  P.,    K.  V.  Dhaneesh, Radhakrishnan  T.  and  Kumar  A.B,  2016, DNA  barcoding  of  fiddler  crabs Uca annulipes and U. perplexa ( Arthropoda, Ocypodidae)  from  the  Ssouthwest coast of India, J. Mar. Biol. Ass. India, 58 (1), doi: 10.6024/jmbai.2016.58.1.1865-13 Aranishi,  F.,  T.  Okimoto,  2006,  A  simple  and reliable method for DNA extraction from bivalve mantle J Appl Genet 47(3):251– 254
Baum, D. (2008) Reading a phylogenetic tree:
The  meaning  of  monophyletic  groups. Nature Education 1(1):190 Fisheries  and  Aquaculture  Department,  2018, Eshragh,  R.  &  B.  S.  Leander,  2014, Molecular  contributions  to  species boundaries  in  dicyemid  parasites  from eastern  Pacific  cephalopods,  Marine Biology  Research.,  doi  :  10.1080/ 17451000.2014.943241
FAO,  2018,  Species  Fact  Sheets Portunus trituberculatus (Miers, 1876), http://www.fao.org/fishery/species/263
0/en
Fujaya,  Y.,  Asphama,  A.  I.,  Hidayani,  A.  A., Parenrengi, A. & Tenriulo, A. (2016). High genetic vari ation of Portunus pelagicus from Makassar Straits revealed by RAPD
markers  and  mitochondrial  16S  rRNA sequences. African Journal
of Biotechnology , 15(7), 180-190 Gebhardt,  K.  &  T.  Knebelsberger,  2015, Identification  of  cephalopod  species from  the  North  and  Baltic  Seas  using morphology,  COI  and  18S  rDNA sequences, Helgol Mar Res, 69:259–271, DOI 10.1007/s10152-015-0434-7 Guo E, Liu Y, Cui Z, Li X, Cheng Y, Wu X., 2012, Genetic  variation  and  population structure  of  swimming  crab  ( Portunus trituberculatus ) inferred from
mitochondrial  control  region.  Mol  Biol Rep.  39(2):1453-63.  doi:  10.1007/s11033- 011-0882-3. .
Habib, M.,  W. S. Lakra, V. Mohindra , P. Khare,
A.  S.  Barman,    A.  Singh,    K.  K.  Lal,    P. Punia,   A.  A. Khan,  2011,  Evaluation of cytochrome  b  mtDNA  sequences  in genetic  diversity  studies  of  Channa marulius  (Channidae:  Perciformes),  Mol Biol Rep, 38:841–846 DOI 10.1007/s11033- 010-0175-2.
Hebert,  P.  D.  N.,  Cywinska,  A.,  Ball,  S.  L.,  & deWaard,  J.  R.,  2003,  Biological identifications  through  DNA  barcodes. Proceedings  of  the  Royal  Society  B: Biological Sciences, 270(1512) : 313–321. http://doi.org/10.1098/rspb.2002.2218
Irawan, B dan  Soegianto, A., 2006, Kekayaan Jenis  Portunidae  Di  Sisi  Shipping  Line Selat  Madura,  Berk.  Penel.  Hayati, 11:93–96.
Klinbunga, S., Thamniemdeec, N., Yuvanatemiya, V., Khetpu,K.,
Khamnamtong  ,  B.,    Menasveta,  P., 2010,  Species  identification  of  the  blue swimming  crab  Portunus  pelagicus  in Thai  waters  using  mtDNA  and  RAPD- derived  SCAR  markers,  Aquaculture 308:S39–S46
Liu,  S.,    Sun,    J.,  Hurtado,  L.A.,  2013,  Genetic differentiation of
Portunus
trituberculatus,  the  world’s  largestcrab fishery,  among  its  three  main  fishing areas,  Fisheries  Research  148:  38–  46. http://dx.doi.org/10.1016/j.fishres.2013.0 8.003
Mantelatto,  F.L.,  Robles,  R.  and    Felder,  D.L., 2007,Molecular  phylogeny  of  the western  Atlantic  species  of  the  genus
Portunus (Crustacea, Brachyura,
Portunidae),  Zoological  Journal  of  the Linnean Society, 150: 211–220 Naz,  F.,  Saher,  N.U.,  And    Kama,  M.,  2016, Genetic  Diversity  Of  The  Portunus Sanguinolentus (Herbst, 1783) (Decapoda,  Brachyura,  Portunidae)  In Indo  West  Pacific  Region  Based  On Mitochondrial  Dna  16s  Gene,    Pakistan Journal  of  Marine  Sciences,  25  (1&2), 59-68,
Raupach, M.J., Radulovici A.E., 2015, Looking back  on  a  decade  of  barcoding crustaceans.  ZooKeys  539:  53–81.  doi: 10.3897/zookeys.539.6530
Ren  G.,  Ma  H., Ma C., Wang W.,  Chen  W.,
&    Ma  L,    2017,  Genetic  diversity  and population structure of Portunus sanguinolentus (Herbst,  1783)  revealed by  mtDNA  COI  sequences,  Journal Mitochondrial  DNA  Part  A    DNA Mapping, Sequencing, and Analysis , 28 (5) : 740-746
Ren G, Ma H, Ma C, Wang W, Chen W, Ma L.,
2017,  Genetic  diversity  and  population structure  of  Portunus  sanguinolentus (Herbst,  1783)  revealed  by  mtDNA  COI sequences.  Mitochondrial  DNA  A  DNA Mapp  Seq  Anal.  28(5):740-746.  doi: 10.1080/24701394.2016.1177040.
Shen  Y-Y,  Chen  X,  Murphy  R.W.  ,  2013, Assessing  Dna  Barcoding  As  A  Tool  For Species Identification And Data Quality
Control. Plos One 8(2): E57125. Doi:10.1371/Journal.Pone.0057125
Sienes  ,  P.M.Q,  Willette,  D.A.,    Romena  ,  L.R.,
Alvior  ,  C.  G.  and  Estacion  J.S.  2014, Genetic diversity and the discovery of a putative cryptic species within a valued crab fishery, Portunus pelagicus (Linnaeus  1758),  in  the  Philippines, Philippine Science Letters, 7 (2):317-323. Umamaheswari,  S.,  P.  S.  Bhavan,  R. Udayasuriyan,  C.  Vadivalagan  and  R. Kalpana,  2016,  Discrimination  of  four marine  crabs  and  one  freshwater  crab through  mt-COI  gene,  Journal  of Entomology  and  Zoology  Studies,  4(5): 766-782
Xu  ,  Q.,  Liu,  R.,    Liu  Y.,  2009,  Genetic population  structure  of  the  swimming crab, Portunus trituberculatus in the East
China  Sea  based  on  mtDNA  16S  rRNA sequences,  Journal  of  Experimental
Marine  Biology  and  Ecology  371:121– 129. doi:10.1016/j.jembe.2009.01.014