## Jurnal Pendidikan Biologi Undiksha
p-ISSN : 2599-1450 e-ISSN : 2599-1485 Volume 8 Nomor 3 Tahun 2021 Open Acces : https://ejournal.undiksha.ac.id/index.php/JJPB/index

## Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Ekstrak Sarang Lebah Madu (Apis dorsata Binghami)
Valensia Valeria Potu 1 , Dintje F. Pendong 2 , dan Mokosuli Yermia Semuel 2*
1 Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Manado
2 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Manado Kampus Unima di Tondano, Sulawesi Utara 95618, Indonesia *Korespondensi penulis, Mokosuli Yermia Semuel,  e-mail: yermiamokosuli@unima.ac.id

## Abstract
Apis dorsata Binghami is a honey bee endemic to the Walacea Zone. Apis dorsata Binghami that has not been bred has a higher  variety  of  feed  sources  than  other  honey  bees.  Apis  dorsata  Binghami's  nest  is  made  of  different  types  of  nectar, propolis and pollen than Apis mellifera. Research has been carried out to determine the toxicity of Apis dorsata Binghami honeycomb extract based on the BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) test. Fresh Apis dorsata nests were obtained from the Minahasa forest, North Sulawesi. After being air-dried, the honeycomb was extracted using the maceration method with a ratio of 1:2 (w/v) simplicia nest and solvent. Ethanol extracts were examined for their toxicities to shrimp larvae Artemia salina  Leach.  The  test  concentrations  used  were  10  mg/L,  100  mg/L,  500  mg/L  and  1000  mg/L.  Each  concentration  was carried  out  in  three  replications.  The  results  showed  that  the  LC50  of  the  honeycomb  ethanol  extract  was  LC50  54,457 mg/L.  Based  on  the  LC50,  the  honeycomb  of  Apis  dorsata  Binghami  can  be  consumed  directly  by  humans  and  contains bioactives that have medicinal potential.
Keywords: Apis dorsata Binghami, Toxicity,  Honeycomb extract, BSLT

## Abstrak
Apis  dorsata  Binghami  merupakan  lebah  madu  endemic  Zona  Walacea.    Apis  dorsata  Binghami  yang  belum  dapat ditangkarkan memiliki variasi sumber pakan lebih tinggi dibandingkan lebah madu lainnya. Sarang Apis dorsata Binghami dibentuk  dari  berbagai  jenis  nectar,  propolis  dan  polen  dibandingkan  Apis  mellifera.  Telah  dilaksanakan  penelitian  yang bertujuan  mengetahui  toksisitas  ekstrak  sarang  lebah  madu  Apis  dorsata    Binghami  berdasarkan  uji  BSLT  (Brine  Shrimp Lethality  Test).  Sarang  Apis  dorsata  segar  diperoleh  dari  hutan  Minahasa,  Sulawesi  Utara.  Sarang  lebah  setelah  dikering anginkan, diekstraksi  menggunakan  metode  maserasi  dengan  perbandingan  simplisia  sarang dan  pelarut  1:6  (b/v).  Ekstrak etanol  were  examined  their  toxicities  to  shrimp  larvae  Artemia  salina  Leach.  Konsentrasi  uji  yang  digunakan  adalah  10 mg/L,  100  mg/L,  500  mg/L  dan  1000  mg/L.  Masing-masing  konsentrasi  dilakukan  dalam  tiga  ulangan.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  LC50  ekstrak  etanol  sarang  lebah  adalah  LC50 54,457  mg/L.  Berdasarkan LC50,  maka  sarang  lebah madu  Apis  dorsata  Binghami  dapat  dikonsumsi  secara  langsung  oleh  manusia  dan  mengandung  bioaktif  yang  berpotensi obat.
Kata-kata kunci: Apis dorsata Binghami, Toxicity,  Honeycomb extract, BSLT

## PENDAHULUAN
Lebah madu Apis dorsata berhabitat di hutan dan hanya berkembang di kawasan sub- tropis dan tropis Asia. Apis dorsata tersebar luas hampir di seluruh kepulauan di  Indonesia, kecuali Maluku dan Papua. (Sakagami et al. 1980; Raffiudin dan Crozier 2007; Hepburn dan Radloff,  2011).    Lebah  madu Apis  dorsata Binghami  adalah  lebah  endemik  Sulawesi  yang
hidup  secara  alami  di  hutan  yang  luas  dan  belum  dapat  dibudidayakan,  akan  tetapi menghasilkan  madu  yang  lebih  banyak  dibandingkan Apis  mellifera lebah  madu  yang umumnya di budidayakan (Mokosuli, et. al. 2019; Mokosuli, 2013).
Sulawesi  Utara,  lebih  khusus  wilayah  Minahasa,  mempunyai  macam-macam  spesies tumbuhan  yang  endemik  sebagai  sumber  nectar  dan  serbuk  sari  untuk  pertumbuhan  dan perkembangan lebah dan juga sebagai sumber makanan utama lebah Apis dorsata Binghami. Setiap  tanaman  mempunyai  karakteristik  metabolit  sekunder  yang  termasuk  di  dalamnya yaitu  proses  dan  komposisi  serbuk  sari  dan  nectar  yang  dibentuk  kemudian  menjadi  bahan pakan lebah madu (Mokosuli, 2013).
Lebah  madu  menghasilkan  beberapa  produk  yang  berguna  bagi  kehidupan  manusia. Produk-produk  yang  alami  dihasilkan  oleh  lebah  madu  antara  lain  yaitu  madu,  royal  jelly, malam atau lilin lebah, pollen, perekat (propolis), racun lebah. Produk-produk tersebut diolah dengan  sebaik  mungkin  sehingga  menjadi  obat  untuk  berbagai  macam  penyakit,  bahan industri  farmasi  dan  sebagainya  (Mokosuli,  et.  al.  2017).  Extrak  sarang  lebah  madu mengandung  alkaloid,  flavonoid,  saponin,  tannin,  steroid  dan  triterpoind  berdasarkan  hasil analisis fitokimia (Mokosuli et.al. 2019).
Penelitian sebelumnya, ekstrak sarang lebah madu hutan Apis dorsata Binghami dapat digunakan  sebagai  sumber  bioaktif  antihiperlipidemia  yang  sudah  dilakukan  uji in  vivo terhadap tikus sebagai hewan uji (Mokosuli et.  al. 2019). Walaupun demikian, uji toksisitas ekstrak sarang Apis dorsata Binghami dari Minahasa belum pernah dilaporkan. Uji toksisitas metode  BSLT  dapat  digunakan  secara  luas  sebagai  bioassay  awal  untuk  menguji  potensi bioaktif  suatu  ekstrak  bahan  alam.  Uji  BSLT  digunakan  sebagai  uji  awal  untuk  screening antikanker,  antioksidan  dan  antihiperlipidemia  (Tanvir  et.  al.  2018;  Yusop  et.  al.  2019; Carballo et al. 2002).

## METODE PENELITIAN

## Sampel
Pengambilan  sampel  Sarang  lebah  madu Apis  dorsata Binghami  ini  diperoleh  dari dataran perkebunan Desa Wulurmaatus, Kec. Modoinding, Kab. Minahasa Selatan, Sulawesi Utara.  Pengambilan  sarang  lebah  dilakukan  pada  sore  hari  pukul  05.00  Wita.  Sarang diletakkan pada kotak sampel, selanjutnya dibawah ke laboratorium.
Gambar 1. Sampel sarang Lebah madu Apis dorsata Binghami
Gambar 2. Lokasi pengambilan sampel sarang lebah A. dorsata Binghami di perkebunan Desa Wulurmaatus, Kec. Modoinding, Minahasa Selatan. (Sumber : Google Maps.)

## Metode Ekstraksi dan Maserasi
Ekstraksi  sarang  lebah  dilakukan  dengan  metode  maserasi  (Harborne,  1996, Mokosuli,  2008).  Sarang  lebah Apis  dorsata Binghami  ditimbang  sebanyak  100  gr dihaluskan menggunakan blender kemudian tuang kedalam dua toples yang berbeda masing- masing toples diberi 50 gr dan campurkan dengan ethanol 70% masing-masing toples diberi 300  ml.  Selanjutnya  diinkubasi  selama  2x24  jam  pada  suhu  kamar,  setiap  6  jam  digoyang mengunakan  orbital  Shaker  selama  30  menit.  Penyaringan  filtrat  dilakukan  dengan menggunakan  kertas  saring  Whatman.  Filtrat  hasil  ekstraksi  selanjutnya  diupakan  pelarut menggunakan  rotary  evaporator  Heidolp,  pada  suhu  54 0 C  dan  55  rpm.  Hasil  penguapan pelarutnya selanjutnya disebut ekstrak etanol sarang lebah Apis dorsata Binghami.

## Uji Toksisitas Metode BSLT
BSLT  digunakan  sebagai  bioassay  pendahuluan  dalam  menilai  toksisitas  ekstrak tumbuhan,  fungi,  logam,  substansi  toksin  dari  pestisida  dan  sianobakteria  (Carballo  et  al. 2002,  Mokosuli,  2008).    Penelitian  ini  akan  digunakan  4  taraf  perlakuan  dan  diulang sebanyak 3 kali, sehingga total unit perlakuan adalah 12. Setiap unit percobaan diberi ekstrak sarang lebah madu hutan Apis dorsata Binghami. Penelitian terdiri atas tahap ekstraksi sarang lebah, uji BSLT dan analisis data penelitian.
Ekstrak  etanol  sarang Apis  dorsata digunakan  untuk  uji  toksisitas.  Uji  BSLT dilakukan menurut metode McLaughlin et. al. 1998 yang dimodifikasi. Ekstrak sarang lebah dibuat  dalam  sebaran  konsentrasi  uji  10  ppm,  100  ppm,  500  ppm  dan  1000  ppm.  Setiap konsentrasi  dilakukan  3  kali  pengulangan.  Perlakuan  dibiarkan  selama  24  jam,  kemudian dihitung  jumlah  larva  yang  mati  dan  masih  hidup  pada  tiap  vial  uji  (Meyer  et  al.,  1982; Juniarti dkk, 2009; McLaughlin et. al., 1998).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Ekstrak Sarang Lebah Madu Apis dorsata Binghami
Sarang  lebah  setelah  dihaluskan  berwarna  kuning  kecoklatan,  beraroma  cengkih. Sarang  lebah  yang  dihaluskan  dengan  menggunakan  blender,  telah  dibersihkan  dari  larva.
Aroma  cengkih  disebabkan  karena  lokasi  sarang  tersebut  berdekatan  dengan  perkebunan cengkih,  sekitar  700  –  1000  m.  Filtrat  hasil  maserasi    sarang  lebah  dengan  etanol  70  % selama  2  x  24  jam,  berwarna  kuning  kecoklatan.  Setelah  pelarut  diuapkan  dengan  Rotary Evaporator Buchi, diperoleh ekstrak kasar sarang lebah Apis dorsata Binghami dari Minahasa selatan  hitam  kecoklatan  dengan  bobot  50  gr.    Ekstrak  kasar  beraroma  khas  sarang  lebah, beraroma madu dan cengkih.
Gambar 3. Ekstrak kasar sarang lebah hasil rotary evaporator

## Uji Toksisitas Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Larva Artemia  salina Leach  yang  digunakan  ditetaskan  selama    2  x  24  jam menggunakan air yang diberikan garam laut. Penetasan Artemia salina Leach menggunakan aerator  untuk  mensuplai  oksigen  pada  larva  yang  akan  menetas.  Setelah  2x24  jam  telah dihasilkan larva yang menetas. Larva berenang dalam air menuju cahaya dan ke permukaan wadah  penetasan.  Larva  Artemia  bewarna  orange  dan  bergerak  aktif  ke  sumber  cahaya. Selanjutnya  larva  sehat  ditandai  dengan  pergerakan  yang  maksimal  (motil)  digunakan sebagai subjek uji toksisitas.
Rata  rata  mortalitas  tertinggi  ditunjukkan  pada  perlakuan  ekstrak  konsentrasi  1000 ppm. Sedangkan rata rata mortalitas terendah ditunjukkan pada perlakuan konsentrasi ekstrak 10  ppm.  Walaupun  demikian  rata  rata  mortalitas  konsentrasi  10  ppm  dan  100  ppm  tidak berbeda secara signifikan (Lampiran 1).
Penyebab  kematian  larva Artemia  Salina Leach  karena  adanya  perubahan  gradient konsentrasi  yang  drastis  antara  di  dalam  dan  diluar  sel  sehingga  menyebabkan  senyawa menjadi  toksik  dan  dapat  menyebar  dengan  baik  ke  tubuh  larva  udang.  Efek  kerusakan metabolisme  yang  ditimbulkan  terjadi  secara  cepat  dan  dapat  dideteksi  dalam  waktu  yang singkat selama 24 jam, hingga menyebabkan 50% kematian larva udang (Dwijayanti, 2015).
Larva  udang  diketahui  memiliki  kulit  yang  tipis  sehingga  peka  terhadap lingkungannya. Zat atau senyawa asing yang ada dilingkungan akan berdifusi ke dalam tubuh sehingga  mempengaruhi  sel-selnya.  Apabila  senyawa  yang  masuk  ke  dalam  sel  bersifat toksik  maka  akan  mematikan  larva  udang  tersebut.  Menurut  Carballo  et.  al.  2002,  suatu ekstrak bahan alam berpotensi sebagai obat apabila memiliki LC50 menurut uji BSLT kurang dari 1000 mg/L.
Menurut Meyer et. al. 1982 terdapat sebaran toksisitas berdasarkan nilai LC50 untuk 10 ppm< bersifat sangat kuat, 10 ppm – 100 ppm bersifat kuat, 100 ppm – 500 ppm bersifat sedang dan 500 ppm – 1000 ppm bersifat lemah.
Hasil  uji  BSLT  ekstrak  sarang  lebah  dengan  nilai  LC 50 54,457  mg/L  relative  masih dapat  dikonsumsi  langsung  manusia.  Perbandingan  LC 50 BSLT  dengan  dosis  pada  manusia adalah 1 / 1000. Sehingga LC 50 ekstrak sarang lebah yang diperoleh termasuk kategori tidak toksik pada manusia dan dapat dikonsumsi secara langsung (Lampiran 2).
Semakin  besar  nilai  LC 50 maka  tingkat  ketoksisitasnya  semakin  kecil  begitu  juga sebaliknya  semakin  kecil  nilai  LC 50 maka  semakin  besar  toksisitasnya  (Meyer  et  al,  1982). Suatu  ekstrak  dinyatakan  aktif  dan  bersifat  toksik  jika  menyebabkan  kematian  hingga  50% hewan  uji  pada  konsentrasi  kurang  dari  1000  ppm.  Kematian  larva Artemia  saliana L. disebabkan  karena  senyawa  metabolit  sekunder  yang  bersifat  toksik,  senyawa  toksit  dapat masuk melalui bagian mulut larva udang dan diabsorbsi masuk ke dalam saluran pencernaan dan terjadi proses kerusakan reaksi metabolisme pada larva udang. (Raineri, 1981)

## KESIMPULAN
Hasil  analisis  uji  toksisitas  ekstrak  sarang  lebah Apis  dorsata Binghami  memiliki LC 50 54,457. Berdasarkan nilai LC 50 ,  maka sarang lebah madu hutan Apis dorsata Binghami dapat dikonsumsi langsung oleh manusia dan mengandung bioaktif berpotensi obat.

## DAFTAR PUSTAKA
Almatsier, S. 2006. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta (ID): PT Gramedia Pustaka

## Utama.
Bankova VS, de Castrob SL, & Marcuccic MC. 2000. Propolis: recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie, 31, 3-15.
Carballo  et  al.  2002.  A  comparison  between  two  brine  shrimp  assays  to  detect  in  vitro cytotoxicity in marine natural products. BMC Biotechnology (2):1472-6750
Dwijayanti  E.,  Andi  H.A.,  Muhammad  A.W.  2015.  Skrinning  Fitokimia  Dan  Uji  Aktifitas Sitotosik Pada Kulit Batang Tampoi (Baccauren macrocarpa) Terhadap Artemia salina Leach Dengan Metode BSLT. Jurnal Kimia Khatulistiwa. 2015: 4(1): 6-10.
Dyer FC. 1985. Nocturnal orientation by the asian honey bee, Apis dorsata . Animal Behavior . 33:769–774
Fransk NR, Pratt SC, Mallon EB, Britton NF, Sumpter DJT. 2002. Information flow, opinion polling  and  collective  intelligence  in  house-hunting  social  insects. PTRSL. 357:  1567- 1583.
Hadisoesilo  S,  Kuntadi.  2007.  Kearifan  Tradisional  dalam  Budidaya  Lebah  Hutan  ( Apis dorsata). Departemen  Kehutanan.  Badan  Penelitian  dan  Pengembangan  Kehutanan. Pusat Penelitian dan Pengembangan Hutan dan Konservasi Alam. Bogor. ISBN : 978- 979-3145-38-9.
http://www.fordamof.org/files/Kearifan_Lokal_dalam_Budidaya_Lebah_Hutan- file_compres.pdf
Hussain  A,  Zia  M,  Mirza  B.  2006.  Cytotoxic  and  antitumor  potential  of  Fagonia  cretica  L. Turk J Biol 31:19-24.
Hegazi AG. 1998. Propolis an overview. J Bee Informed, 5, 22-28.
Kahono  S,  Nakamura  K,  Amir  M.  1999.  Seasonal  msigration  and  colony  behavior  of  the tropical honeybee Apis dorsata F. (Hymenoptera: Apidae). Treubia . 31(3)283-297.
Kaunang,  E.  N.  S.,  &  Mokosuli,  Y.  S.  (2017).  Botanical  and  phytochemical  constituents  of several medicinal plants from mount Klabat north Minahasa.
Kumazawa S, Hamasaka T, & Nakayama T. 2004. Antioxidant activity of propolis of various geographic origin. Food Chemistry, 84, 329-339.
Manach C, Scalbert A, Morand C, Remesy L, & Jimenez L. 2004. Polyfenols food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr, 79, 727-47.
Mc  Laughlin  JL  et  al,  1998.  The  use  of  biological  assays  to  evaluate  botanicals.  Drug information journal, vol 32, pp 513-524.
Mead  D.  2013.  A  guide  to  some  bees  and  wasps  of  Indonesia.  Sulang  Language  Data  and Working  Papers:  Topics  in  Lexicography,  no.  11.  Sulawesi  Language  Alliance. http://sulang.org/ .
Meyer,  B.N.,  Ferrigni,  N.R.,  Putnam,  J.E.,  Jacobsen,  L.B.,  Nichols,  D.E.,  McLaughlin,  J.L.,  1982.  Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay For Active Plant Constituents. Planta Medica. 45: 31-34.
Mokosuli YS, Pelealu J, Tulung M, Mandey LC. Pharmacological Bioactivity       Honey Bee Venom  Apis  nigrocincta  Smith  and  A.  dorsata  Binghami  Endemic  to  North  Sulawesi. International Journal of Science and Engineering Investigations. 2013; 2(18):25-33
Mokosuli,  YS.  2008.  Aktivitas  Antioksidan  dan  Antikanker  Ekstrak  Kulit  Buah  Batang Langsat  ( Lansium  Domesticum L.).  [Tesis].  Sekolah  Pasca  Sarjana  Institut  Pertanian Bogor. Qa\
Mokosuli  Y.S,  Mege,  R.  A.,  Versya,  G.,  &  Rompas,  C.  (2019).  The  antihyperlipidemic activity  of  Apis  dorsata  Binghami  nesting  extract  in  atherogenic  diet-induced hyperlipidemic rats. International Journal of Botany Studies , 4 (4), 174-178.
Mokosuli  Y.S,  Kaunang,  E.  S.  N.,  &  Manopo,  J.  S.  (2019).  The  bioactive  contents  and antioxidant activity of honey bee nest extract of Apis dorsata Binghami from the North Sulawesi. Molekul , 14 (2), 92-102.
Mokosuli,  Y.  S.  (2019).  The  bioactive  contents  and  antioxidant  activity  of  honey  bee  nest extract of Apis dorsata Binghami from the North Sulawesi. Jurnal MOlekul.
Nazzi,  F. (2016). The hexagonal shape of the honeycomb cells depends on the construction behavior of bees. Sci Rep. 2016; 6: 28341.
Neupane  KR,  Woyke  J,  Poudel  SM.  2013.  Nesting  site-preference  and  behavior  of  giant honey bee Apis dorsata. Paper presented on Apimondia, 29 September-4 October 2013 , Kyiv, Ukraine and published on abstract and working procedure Apimondia, 2013.
Ningdyah  AW,  Alimuddin  AH,  Jayuska  A.  2015.  Uji  toksisitas  dengan  metode  bslt  (brine shrimp  lethality  test)  terhadap  hasil  fraksinasi  ekstrak  kulit  buah  tampoi    ( baccaurea macrocarpa ). Universitas Tanjungpura
Nur,  dkk.  2014.  Estimasi  bobot  larva  melalui  Panjang  dan  lebar  larva  lebah  hutan Apis dorsata.
Oldroyd BP, Nanork P. 2009. Conservation of asian honeybees. Apidologie . 40: 296-312. Putri, Z. S., Wati, R. R., Widyanto, R. M., Rahmi, Y., & Proborini, W. D. (2020). Pengaruh Tepung Kulit Pisang Kepok (Musa Paradisiaca L.) terhadap Aktivitas Antioksidan dan Sitotoksisitas  pada  Sel  Kanker  Payudara  T-47D.  JURNAL  AlAZHAR  INDONESIA SERI SAINS DAN TEKNOLOGI, 5(3), 166. https://doi.org/10.36722/sst.v5i3.380 Purbowati, I. S. M., Syamsu, K., Warsiki, E., &  Rukmini, H. S. (2015). Evaluasi toksisitas, aktivitas  antibakteri  dan  antioksidan  komponen  bioaktif  rosela  dengan  variasi  jenis pelarut. Journal of Agroindustrial Technology , 25 (2).
Rachman, Sitti Rahimah; MARYAM, Fadillah; Limbong, Bertha Ayu. The Toxicity Test of Ethanol  Extrak  of  Leaves  Averhoa  bilimbi  L.  Using  Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT) Methode on shrimp larvae (Artemia salina Leach). Journal of Pharmaceutical and Medicinal Sciences , [S.l.], v. 4, n. 1, mar. 2020. ISSN 2580-328X. Raineri,  M.  1981.  Histochemichal  Localization  of  Chitin  In  Larva  of  Artemia  salina  L. Journal of Zoology 48 (2): 139-141.
Rasyid,  M.  I.,  Yuliani,  H.,  &  Angraeni,  L.  (2020).  Toxicity  Test  LC50  of  Pineung  Nyen Teusalee  Seeds  (Areca  catechu)  Extract  by  Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT) Methode. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 515, 12052.
Ruttner  F.  1988. Biogeography  and  Taxonomy  of  Honeybees .  New  York  (US).  Springer- Verlag Berlin Heidelberg.
Sakagami FS, Matsumara T, Ito K. 1980. Apis laboriosa in Himalaya, the little known world largest honeybee (Hymenoptera:Apidae). Insect Matsum . 19:47-77. Seeley  TD.  1985. Honeybee  Ecology  A  Study  of  Adaptation  in  Social  Life .  Princeton University Press. Princeton, New Jersey, United Kingdom
Starr CK, Schmidt PJ, Schmidt JO. 1987. Nest site-preferences of the giant honey bee, Apis dorsata (Hymenoptera: Apidae), in Borneo. Pan Pasific Entomol. 63(1):37-42.
Tanvir, E. M., Sakib Hossen, M., Mahfuza Shapla, U., Mondal, M., Afroz, R., Mandal, M., ... &  Hua Gan, S. (2018).  Antioxidant,  brine shrimp lethality  and analgesic properties of propolis from Bangladesh. Journal of Food Biochemistry , 42 (5), e12596.
Yusop,  S.  A.  T.  W.,  Sukairi,  A.  H.,  Sabri,  W.  M.  A.  W.,  &  Asaruddin,  M.  R.  (2019). Antioxidant, antimicrobial and cytotoxicity activities of propolis from Beladin, Sarawak stingless bees Trigona itama extract. Materials Today: Proceedings , 19 , 1752-1760.
Vitalia,  N.,  Najib,  A.,  &  Ahmad,  A.  R.  (2016).  uji  toksisitas  ekstrak  daun  pletekan  (ruellia tuberosa  l.)  dengan  menggunakan  metode  brine  shrimp  lethality  test  (bslt).  Jurnal Fitofarmaka Indonesia, 3(1), 124–129.