ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (2) (2010): 61 – 65

## Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi
Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi Enzim L- Asparaginase dari Rimpang Temulawak ( Curcuma xanthorrhiza Roxb.) dan Uji Potensi terhadap Kultur Sel Leukemia Tipe K562
Oktarina Puspitasari a , Wuryanti a*
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: wuryanti@live.undip.ac.id
Art ic le   Info Ab s t rac t
Keywords:
L- Asparaginase , anticancer, temulawak, MTT,
ELISA Reader)
Enzyme  L- Asparaginase is  an  enzyme  that  hydrolyzes  L-asparagin  to  L-aspartic  acid  and ammonia.  L- Asparaginase can  be  used  to  treat  cancer,  which  works  by  inhibiting  protein synthesis  of  cancer  cells  without  damaging  normal  cells.  One  of  the  L- Asparaginase source plants is temulawak ( Curcuma xanthorrhiza Roxb.). The objectives of this study were to isolate L- Asparaginase from  temulawak  rhizome,  to  determine  the  initial  enzyme  activity  of  L- Asparaginase ,  and  to  find  potency  of  L- Asparaginase enzyme  anticancer  effect  against  K562 leukemia  cell.  Isolation  and  testing  of  L- Asparaginase enzyme  potential  from  temulawak rhizomes  were  conducted  in  several  stages.  The  first  stage  was  the  insulation  and  partial purification of L- Asparaginase enzyme from the temulawak  rhizome. The second stage was a activity  specific  test  of  L- Asparaginase enzyme  at  optimum  condition  (37°C,  pH  8,6,  and incubation time 30 min). In the enzyme with the highest specific activity, an anticancer test was performed on cell leukaemia type K562 with cell viability method with addition of MTT and measurement  using  ELISA  Reader.  L- Asparaginase enzyme  from  Temulawak  rhizome  had specific activity of 77.18 unit/mg protein at fraction 4 (fraction with 60-80% saturation level). However,  fraction  4  was  less  potential  for  leukaemia  cell  anticancer  activity  type  K562  as obtained LC 50 of 534.89 μg/mL, while the standard of a bioactive compound as anticancer has LC 50 of 20 μg/mL.

## Ab s t rak
Kata kunci: L- Asparaginase ,
antikanker, temulawak, MTT, ELISA Reader )
Enzim L- Asparaginase merupakan enzim yang menghidrolisis L-asparagin menjadi  asam L- aspartat dan amonia. L- Asparaginase dapat digunakan untuk mengobati penyakit kanker, yang bekerja dengan cara menghambat sintesis protein sel kanker tanpa merusak sel normal. Salah satu tumbuhan sumber L- Asparaginase adalah temulawak ( Curcuma xanthorrhiza Roxb.). Tujuan penelitian  ini  yaitu  mengisolasi  L- Asparaginase dari  rimpang  temulawak,  menentukan  nilai aktivitas spesifik enzim L- Asparaginase hasil isolasi, dan mengetahui potensi antikanker enzim L- Asparaginase hasil isolasi terhadap sel leukemia tipe K562. Isolasi dan uji potensi enzim L- Asparaginase dari rimpang temulawak dilakukan beberapa tahap. Tahap pertama yaitu isolasi dan pemurnian parsial enzim L- Asparaginase dari rimpang temulawak. Tahap kedua yaitu uji aktivitas spesifik enzim L- Asparaginase pada kondisi optimum (suhu 37°C, pH 8,6, dan waktu inkubasi  30  menit).  Pada  enzim  dengan  aktivitas  spesifik  tertinggi  dilakukan  uji  antikanker terhadap sel leukemia tipe K562 dengan  metode viabilitas sel dengan penambahan MTT dan pengukuran  menggunakan  ELISA Reader .  Enzim  L- Asparaginase dari  rimpang  temulawak mempunyai aktivitas spesifik sebesar 77,18 unit/mg protein pada fraksi 4 (fraksi dengan tingkat kejenuhan 60-80%). Namun fraksi 4 tersebut kurang potensial untuk aktivitas antikanker sel leukemia  tipe  K562  karena  diperoleh  LC 50 sebesar  534,89  µg/mL,  sedangkan  standart  suatu senyawa bioaktif sebagai antikanker adalah LC 50 ≤ 20 µg/mL.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (2) (2010): 61 – 65

## 1. Pendahuluan
Kanker  merupakan  salah  satu  penyakit  yang ditandai  dengan  pembelahan  sel  yang  tidak  terkendali dan  kemampuan  sel-sel  tersebut  untuk  menyerang jaringan  biologis  lainnya,  baik  dengan  pertumbuhan langsung  di  jaringan  yang  bersebelahan  ( invasi )  atau dengan  migrasi  sel  ke  tempat  yang  jauh  ( metastasis ). Kanker merupakan penyakit yang menempati peringkat kedua  di  dunia  sebagai  penyebab  kematian. Berbagai usaha dilakukan untuk menyembuhkan penyakit kanker. Salah satu usaha yang sedang intensif dilakukan adalah melalui pencarian senyawa antikanker dari bahan alam. Umumnya  pengobatan  kanker  dilakukan  dengan  obat- obat sintesis dan radiasi terapi yang digunakan tersebut banyak  menimbulkan  efek  samping  yang  merugikan penderita  [1].  Hal  ini  menyebabkan  penelitian  untuk menemukan  obat-obat  baru  terus  berkembang,  salah satu cara yang dilakukan adalah dengan mengembangkan pengobatan dari bahan alam [2].
Enzim  adalah  molekul  protein  yang  sangat  besar yang  dapat  digunakan  sebagai  katalis  organik  yang mempercepat  reaksi  biologis  berjuta-juta  kali  [3]. Sekarang ini penggunaan enzim telah semakin luas yaitu di bidang pangan dan kesehatan. Salah satu enzim yang sangat  berperan  di  dalam  bidang  kesehatan  yaitu  L- Asparaginase .
L- Asparaginase adalah  enzim  yang  mengkatalisis reaksi  hidrolisis  L-asparagin  menjadi  L-aspartat  dan amonia  [4].  L-asparagin  merupakan  asam  amino  non- esensial  [5]  yang  dibutuhkan  oleh  sel  untuk  sintesis protein  dan  pertumbuhan.  Pada  sel  penderita  leukemia limfoblastik  akut,  jumlah  asparagin  sintetase  terbatas, sehingga ketersediaan asparagin bergantung dari luar sel [6], sedangkan pada sel normal asparagin sintetase dapat bekerja  secara  normal  menghasilkan  asparagin  [5]. Adanya
L- Asparaginase dalam tubuh akan mengakibatkan penurunan konsentrasi asparagin dalam darah  sehingga  asupan  asparagin  bagi  sel  kanker tersebut  menjadi  sangat  terbatas  dan  sintesis  protein pada  sel  tersebut  akan  terganggu  yang  pada  akhirnya akan  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker,  dan mengakibatkan kematian sel kanker tersebut. Selain itu aktivitas  L- Asparaginase tidak  mengganggu  sel  normal, karena  sel  normal  mampu  menghasilkan  enzim asparagin  sintetase  dalam  jumlah  yang  semestinya, sehingga kebutuhan asparagin akan dapat dipenuhi oleh sel normal itu sendiri [5].
Indonesia  merupakan  negara  tropis  yang  memiliki keanekaragaman  hayati,  sehingga  berpotensi  besar dalam  memperoleh  L- Asparaginase dari  tumbuhan. Berdasarkan  penelitian  sebelumnya,  salah  satu tumbuhan  yang  dapat  digunakan  sebagai  sumber  L- Asparaginase adalah  temulawak.  Enzim  L- Asparaginase pada  fraksi  ke-4  dari  rimpang  temulawak  mempunyai aktifitas  spesifik  yang  besar  dibanding  dengan  fraksi- fraksi  yang  lain  dalam  rimpang  temulawak,  sehingga diharapkan memiliki potensi sebagai antikanker [7]. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih  lanjut untuk mengetahui potensi enzim L- Asparaginase dari rimpang temulawak terhadap sel kanker.

## 2. Metodologi Penelitian

## Alat dan bahan
Alat-alat  yang  digunakan  adalah  sentrifugator ( Centrific-228 ),  inkubator  ( Memmert ),  blender  ( Philip ), neraca  analitik  ( Kern  870 ),  pHmeter  ( Ezodo ), magnetic stirer ( Thermolyne  Cimarec ),  alat-alat  kultur  sel, spektrofotometer  UV-Vis  ( Shimadzu ), laminar  air  flow , 96- well  plate (Nunc),  mikroskop  fluoresen  dan  ELISA reader . Bahan-bahan yang digunakan adalah BSA ( Bovine Serum  Albumin ),  TCA  ( Trichloracetic  acid ),  Bufer  Tris- hidroksimetil-aminometan, Folin-ciocalteau ,  Kalium- natrium  tartrat,  L-asparagin  ( Merck ),  Amonium  sulfat, Raksa  (II)  klorida,  Asam  klorida,  Natrium  karbonat, Kalium iodida, Barium (II) klorida, Natrium hidroksida, Tembaga  (II)  sulfat,  temulawak  ( Curcuma  xanthorrhiza Roxb ) ,  akuades,  Sel  Kanker  leukemia  tipe  K562  yang dibiakkan oleh LPPT UGM, Larutan Bufer natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl, IMDM 1640 (Iscove’s  Modified  Dulbecco’s  Media) (Sigma),  FBS  ( Fetal Bovine Serum ) 10% (v/v) (Gibco), RPMI (sigma), larutan MTT ( [3-(4,5 – Dimethylthiazol – 2 yl) – 2,5 – diphenyltetrazolium  bromida]  )  dan  kertas  saring  yang semuanya  berkualitas  p.a,  kecuali  temulawak,  akuades dan kertas saring.

## Isolasi Enzim
Serbuk  temulawak  ( Curcuma  xanthorrhiza Roxb) sebanyak  1000  g  ditambahkan  500  mL  bufer  Tris- hidroksimetil-aminometan 0,2 M pH = 8,6 dan diblender selama 20 menit. Campuran kemudian dibiarkan selama 1,5  jam  pada  suhu  5°C  lalu  disaring.  Filtrat  kemudian disentrifugasi  pada  3400  rpm  selama  10  menit.  Filtrat yang diperoleh dari sentrifugasi pada 3400 rpm disebut ekstrak kasar (EK).

## Fraksinasi Enzim
Fraksinasi  enzim  dilakukan  dengan  menggunakan amonium  sulfat  secara  bertingkat  dengan  tingkat kejenuhan 0 - 20% (F 1 ), 20 – 40% (F 2 ), 40 – 60% (F 3 ), 60 – 80%  (F 4 ),  80  -  100%  (F 5 ).  Amonium  sulfat  ditimbang sesuai  fraksi  yang  dikehendaki  agar  diperoleh konsentrasi yang diinginkan, lalu dimasukkan ke dalam filtrat hasil akhir tahap isolasi enzim sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan magnetic stirer dalam penangas es. Campuran  kemudian  didiamkan selama  1  malam  dalam keadaan  dingin  (5˚C),  kemudian  disentrifugasi  dengan kecepatan  3500  rpm  selama  50  menit.  Endapan  yang diperoleh  dipisahkan  dari  filtratnya  dan  disuspensi dengan 3 mL bufer Tris-hidroksimetil-aminometan 0,2 M  pH  =  8,6.  Endapan  yang  disuspensi  tersebut merupakan EK, F 1 , F 2 , F 3 , F 4 , F 5 .

## Dialisis Enzim
Dialisis  dilakukan  dengan  menggunakan  membran selofan  yang  telah  direbus  selama  30  menit  dan  dicuci dengan akuades. Selofan yang berisi suspensi hasil akhir fraksinasi  enzim  direndam  dalam  bufer  Tris- hidroksimetil-aminometan  0,002  M  pH  =  8,6  dalam keadaan  dingin  dan  tiap  2  jam  bufer  diganti  serta  diuji kandungan amonium sulfat pada larutan di luar selofan
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (2) (2010): 61 – 65
dengan  BaCl 2 0,01  M  hingga  tidak  terbentuk  endapan putih.

## Penentuan Unit Aktivitas Enzim
Disiapkan  sebanyak  6  tabung  dan  masing-masing diisi dengan 1 mL larutan substrat L-asparagin 0,1665 M, 0,1 mL endapan yang disuspensi (EK, F 1 , F 2 , F 3 , F 4 , F 5 ), dan 0,4 mL bufer Tris-hidroksimetil-aminometan 0,2 M pH =  8,6  dan  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  30  menit, kemudian  ditambah  1  mL  larutan  TCA  1,5  M  dan disentrifugasi pada kecepatan 3400 rpm selama 15 menit untuk  memisahkan  endapannya.  Sebanyak  0,25  mL filtrat  diambil  lalu  ditambah  dengan  4,25  mL  akuades dan  0,5  mL  pereaksi  Nessler,  kemudian  absorbansi larutan tersebut diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 420 nm. Sebagai kontrol adalah 0,1 mL endapan yang disuspensi, yang telah dihilangkan aktifitasnya  (dengan  dipanaskan),  ditambah  0,4  mL bufer  Tris-hidroksimetil-aminometan  0,2  M  pH  =  8,6 dan  0,5  mL  larutan  L-asparagin  0,1665  M.  Aktivitas enzim  ditentukan  secara  regresi  linier  terhadap  kurva standar amonium sulfat.

## Penentuan Kadar Protein Enzim
Sebanyak 0,1 mL larutan protein hasil fraksinasi (EK, F 1 , F 2 , F 3 , F 4 , F 5 ) ditambah dengan 2 mL larutan Lowry C, diinkubasi  pada  suhu  optimum  (37°C)  selama  30  menit sambil  sesekali  dikocok.  Selanjutnya  ditambah  dengan 0,2  mL  Lowry  D  dan  diinkubasi  selama  10  menit  pada suhu  kamar  dengan  sesekali  dikocok,  kemudian  diukur absorbansinya.  Absorbansi  larutan  diukur  pada  panjang gelombang  ( λ )  optimum  BSA  yaitu  720  nm  dengan spektrofotometer  UV-Vis.  Kadar  protein  ditentukan secara regresi linier terhadap kurva standar BSA.

## Kultur Sel Kanker Darah (Leukemia)
Sel leukemia yang telah siap dikultur dalam FBS dan IMDM, ketiganya diperoleh dari LPPT  UGM Yogyakarta. Proses  selanjutnya  dikerjakan  dengan  teknik  aseptik  di bawah laminair air flow cabinet (LAFC).
Proses Thawing Sel Leukemia
Sel  leukemia  disentrifugasi  dengan  kecepatan  1500 rpm  selama  lima  menit  pada  suhu  4°C.  Endapan  sel ditanam  pada  botol  kultur  yang  berisi  media  yang mengandung  10%  FBS.  Selanjutnya  kultur  disimpan dalam inkubator yang mengandung 95% CO 2 dan 5% O 2 pada suhu 37°C selama 24 jam.

## Inisiasi Kultur Sel Leukemia
Disiapkan cawan petri steril bertutup. Homogenkan sel  leukemia  hasil thawing dan  tuangkan  ke  masing- masing  petri  sebanyak  2  mL.  Inkubasi  dalam  inkubator yang  mengandung  95%  CO 2 dan  5%  O 2 pada  suhu  37°C selama  24  jam.  Hitung  jumlah  sel/mL  >  104  sel/mL (Hidayat, 2002).

## Uji Sitotoksik Terhadap Sel Leukemia
Larutan  uji  dibuat  dengan  seri  dosis  1000  μg/mL, 500  μg/mL,  250  μg/mL,  125  μg/mL,  62,5  μg/mL,  31,25 μg/mL,  15,625  μg/mL,  7,81  μg/mL,  3,90  μg/mL,  1,95
μg/mL,  0,97  μg/mL,  0,488  μg/mL,  0,244  μg/mL,  0,122 μg/mL, 0,061 μg/mL.
Kultur  hasil  inisiasi  dihomogenkan.  Kontrol  terdiri dari sel, medium IMDM, dan larutan dapar natrium fosfat 5  mM  pH  =  7,2.  Blanko  terdiri  dari  medium  IMDM, larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH = 7,2 dan variasi konsentrasi  sampel  enzim  L- Asparaginase .  Perlakuan untuk  uji  sitotoksisitas  terdiri  dari  sel,  medium  IMDM, larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH = 7,2 dan variasi konsentrasi sampel enzim L- Asparaginase . Sampel yang diuji  adalah  variasi  konsentrasi  sampel  enzim  L- Asparaginase dengan aktivitas spesifik tertinggi.

## Penghitungan Persen Kematian Sel Menggunakan Metode MTT
Larutan MTT dimasukkan dalam sumuran. Sel yang hidup akan membentuk kristal formazan berwarna ungu yang  intensitasnya  dapat  diukur  dengan  ELISA Reader . Absorbansi  yang  terbaca  sebanding  dengan  jumlah  sel hidup.

## Analisis Hasil
Sitotoksisitas  variasi  konsentrasi  sampel  enzim  L- Asparaginase dianalisa  dengan  menghitung  persentase kematian  sel  yang  diperoleh  dari  perhitungan menggunakan rumus Abbot [8]:
Persen kematian = 𝐴−𝐵 𝐴 × 100%
Keterangan:
A = Nilai rata-rata absorbansi dari beberapa kontrol
B = Nilai rata-rata absorbansi dari beberapa perlakuan
Efek  toksisitas  dianalisis  dari  pengamatan  dengan persen  kematian.  Dengan  mengetahui  kematian  sel kanker,  kemudian  dicari  angka  probit  melalui  tabel  dan dibuat persamaan garis:
Y = Bx + A
di mana: Y = Angka probit dan X = log konsentrasi
Dari  persamaan  tersebut  kemudian  dihitung  LC 50 dengan memasukkan nilai probit (50% kematian) [8].

## 3. Hasil dan Pembahasan
Isolasi dan Pemurnian Enzim L- Asparaginase dari Rimpang Temulawak ( Curcuma xanthorrhiza Robx .)
Enzim L- Asparaginase dapat diperoleh dari rimpang temulawak  ( Curcuma  xanthorrhiza Robx.)  dengan mengeluarkan  enzim  tersebut  dari  jaringan  secara mekanik, yaitu dengan diblender dan penambahan bufer Tris-hidroksimetil-aminometan.  Proses  pemblenderan menghasilkan  campuran  coklat  yang  terdiri  dari komponen sel, protein dan non-protein dari temulawak. Pemisahan  protein  dari  komponen  non-protein  dan  sel dilakukan  dengan  penyaringan  dan  sentrifugasi  pada filtrat.  Sentrifugasi  pada  kecepatan  yang  sama,  yaitu pada 3400 rpm selama 10 menit diperoleh endapan yang berwarna coklat yang merupakan komponen-komponen sel dari temulawak dan filtrat sebanyak 900 mL berwarna merah  kekuningan  yang  merupakan  enzim  kasar  ( crude
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (2) (2010): 61 – 65 64
enzyme ). Kemudian pengendapan protein menggunakan fraksinasi diikuti dengan sentrifugasi untuk memisahkan  endapan  dan  supernatan.  Endapan  yang diperoleh  merupakan  protein  enzim  yang  berwarna coklat  dan  masih  mengandung  amonium  sulfat,  maka dilakukan  pemurnian  lebih  lanjut  untuk  memisahkan amonium  sulfat  dengan  cara  dialisis  menggunakan membran  selofan  [9].  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa,  penggantian  bufer  di  luar  membran  dilakukan sebanyak enam kali, dengan volume setiap penggantian adalah 2000 mL. Apabila tidak terbentuk endapan putih diperoleh  enzim  yang  telah  terbebas  dari  amonium sulfat, kemudian selanjutnya dilakukan uji unit aktivitas enzim  dengan  metode  Nessler  dan  pengukuran  kadar protein dengan metode lowry.
Penentuan Unit Aktivitas dan Aktivitas Spesifik Enzim L- Asparaginase
Penentuan aktivitas enzim L- Asparaginase dilakukan  dengan  mereaksikan  enzim  tersebut menggunakan  substrat  yang  sesuai.  Substrat  yang digunakan pada reaksi enzimatis ini adalah L-asparagin. Penentuan  aktivitas  enzim  L- Asparaginase dalam rimpang  temulawak  dilakukan  melalui  identifikasi amonia yang terbentuk dari proses penguraian  tersebut dapat dianalisis dengan pereaksi Nessler.
Nilai  aktivitas  spesifik  ini  dapat  digunakan  sebagai ukuran  besarnya  kemurnian  enzim  hasil  isolasi  [5]. Kadar  protein  dapat  ditentukan  dengan  metode  Lowry. Penentuan  aktivitas  dan  aktivitas  spesifik  terhadap enzim  L- Asparaginase dari  rimpang  temulawak dilakukan pada EK, F1, F2, F3, F4, dan F5 yang diperoleh. Hasil penentuan aktivitas enzim spesifik disajikan pada tabel 1:
Tabel 1. Tabel penentuan aktivitas enzim spesifik L- Asparaginase
Fraksi Aktivitas Enzim (Unit/mL) Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik (Unit/mg protein) Tingkat Kemurnian EK 393,345 13,653 28,809 1,000 F 1 360,071 10,020 35,935 1,247 F 2 407,605 8,886 45,867 1,592 F 3 433,749 7,720 56,185 1,950 F 4 480,095 6,220 77,185 2,679 F 5 327,985 5,486 59,778 2,074
Pada tabel 1 dapat diketahui bahwa aktivitas spesifik terendah  diperoleh  pada  F 1 dan  aktivitas  spesifik tertinggi  diperoleh  pada  F 4 (60-80%)  yaitu  77,109 Unit/mg  protein  dengan  tingkat  kemurnian  yang tertinggi  pula  dibanding  ekstrak  kasar  dan  di  antara fraksi-fraksi lainnya. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa  enzim  L- Asparaginase sebagian  besar  terdapat pada  F 4 .  Pada  penelitian  sebelumnya  [7]  diperoleh aktivitas  enzim  spesifik  pada  kondisi  optimum  sebesar 75,091 Unit/mg protein. Perbedaan nilai aktivitas enzim spesifik  yang  diperoleh  disebabkan  perbedaan  sumber temulawak  dan  kondisi  temulawak  yang  digunakan dalam penelitian.
Pengujian Enzim L- Asparaginase Aktivitas Tertinggi (Fraksi Empat) Pada Sel Kanker Leukemia(K562) Menggunakan Metode MTT
Enzim  dengan  nilai  aktivitas  spesifik  tertinggi  (F4: 77,18 unit/mg) selanjutnya diujikan terhadap sel kanker leukemia  tipe  K562.  Enzim  yang  diujikan  terhadap  sel leukemia  tipe  K562  dikeringkan  dengan  menggunakan freeze  dryer . Freeze  dryer adalah  alat  untuk  proses liofilisasi,  sehingga  diperoleh  enzim  berupa  serbuk kristal berwarna cokelat.
Enzim yang telah dikeringkan tersebut diuji pada sel kanker  leukemia  dengan  menggunakan  metode  MTT, yang mana pembacaan dilakukan dengan ELISA Reader. Prinsip  kerja  dari  instrumen  ini  hampir  sama  dengan spektrofotometer  pada  umumnya,  yaitu  interaksi (berupa absorbsi atau penyerapan) antara materi dengan energi yang berupa cahaya. Metode MTT adalah suatu tes laboratorium  dan  suatu  metode  standar  kolorimetri (suatu metode yang mengukur perubahan warna) untuk mengukur pertumbuhan sel.
Pada  proses  uji  sitotoksik  larutan  uji  berupa  enzim L- Asparaginase dibuat  dalam  15  variasi  konsentrasi. Sampel  yang  diuji  adalah  variasi  konsentrasi  sampel enzim L- Asparaginase dengan aktivitas spesifik tertinggi. Sel  yang  masih  hidup  masih  aktif  melakukan  aktivitas metabolisme sehingga adanya MTT pada lingkungannya akan  segera  dipecah  oleh  enzim  reduktase  suksinat tetrazolium  yang  terdapat  di  dalam  mitokondria  sel tersebut  membentuk  kristal  formazan  berwarna  ungu [10].
a. b.
Gambar 2. (A) gambar sel leukemia sebelum ditambah dengan ekstrak enzim L- Asparaginase (B) gambar sel leukemia setelah ditambah dengan ekstrak enzim L- Asparaginase dan penambahan MTT
Pada  gambar  tersebut,  sel-sel  yang  masih  hidup berbentuk  bulat  utuh  tidak  mengalami  perubahan bentuk,  ukuran  dan  membentuk  kristal  formazan  di sekitarnya,  Sedangkan  sel-sel  yang  mati  ukurannya cenderung lebih kecil karena sebagian isi sel (sitoplasma)
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (2) (2010): 61 – 65
65
keluar,  hal  ini  disebabkan  susunan  atau  integritas membran sel tersebut telah rusak.
Hasil pembacaan absorbansi dengan Elisa Reader di plotkan  dalam  bentuk  grafik  .  Data  dan  grafik  hasil  uji sitotoksisitas  enzim  L- Asparaginase fraksi  ke-4  dari temulawak  terhadap  sel  leukemia  tipe  K562  yang dinyatakan  dalam  persen  kematian  dapat  dilihat  pada gambar 3 di bawah ini
Gambar 3. Mortalitas sel leukemia hasil uji MTT
Pada  gambar  3  diperoleh  persamaan  y  =  24,629x – 17,175. Persamaan tersebut selanjutnya digunakan untuk menghitung  nilai  LC 50 dengan  memasukkan  nilai  50 sebagai  y  sehingga  didapatkan  nilai  x.  Nilai  x menunjukan nilai log dari konsentrasi fraksi ke-4 enzim L- Asparaginase .  Konsentrasi  fraksi  ke-4  enzim  L- Asparaginase adalah  antilog  2,728  yaitu  534,89  µg/mL. Hal ini berarti bahwa kematian dari sel kanker leukemia K562 mencapai 50% dengan adanya penambahan enzim L- Asparaginase dengan konsentrasi 534,89 µg/mL.
Enzim  L- Asparaginase mampu  menghambat  serta mematikan  sel  kanker  dapat  di  lihat  dari  berkurangnya sel  kanker  setelah  penambahan  enzim  L- Asparaginase , namun menurut NCI ( National Cancer Institut e) jika suatu uji sitotoksik suatu senyawa menghasilkan harga LC 50 ≤ 20 µg/mL  maka  senyawa  tersebut  dinyatakan  memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker  [11].  Karena  nilai  LC 50 enzim  L- Asparaginase fraksi  ke-4  dari  temulawak  yang  diuji  lebih  dari  20 µg/mL, maka senyawa bioaktif tersebut kurang potensial untuk  digunakan  sebagai  antikanker.  khususnya terhadap sel leukemia K562.

## 4. Kesimpulan
Temulawak mengandung enzim L- Asparaginase dan memiliki aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi ke 4 (60 -  80%)  dengan  aktivitas  spesifik  77,18  unit/mg protein pada kondisi optimum. Enzim L- Asparaginase fraksi ke- 4  rimpang  temulawak  telah  diujikan  pada  sel  kanker leukimia  tipe  K562.  Fraksi  tersebut  kurang  potensial sebagai senyawa antikanker.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Sulistia G. Ganiswara, Farmakologi dan Terapi, 4 ed., Bagian Farmakologi Fakultas
Kedokteran
Universitas Indonesia, Jakarta, 1995.
[2]  Maksum  Radji,  Atiek  Sumiati,  Nuning  Indani,  Uji Mutagenisitas  dan  Anti  Kanker  Ekstrak  Aseton  dan n-Heksana  dari  Kulit  Batang  Sesoot  ( Garcinia picrorrhiza Miq.), Majalah  Ilmu  Kefarmasian ,  1,  2,
(2004) 69-78
[3]  Wesley  A.  Volk,  Margaret  F.  Wheeler,  Mikrobiologi Dasar, Markham, Erlangga, Jakarta, 1993.
[4]  Abraham  White,  Philip  Handler,  Emil  L.  Smith, Principles of Biochemistry, 6 ed., Mcgraw-Hill, 1978.
[5]  Albert  L  Lehninger,  Dasar-Dasar  Biokimia,  M. Thenawidjaja, Erlangga, Jakarta, 1990.
[6] P. Konečná, B. Klejdus, H. Hrstková, Monitoring The Asparaginase  Activity  and  Asparagine  Levels  in Children  with  Acute  Lymphoblastic  Leukaemia Treated  with  Different  Asparaginase  Preparations, Scripta Medica (BRNO) , 77, 2, (2004) 55-62
[7]  Didik  Adika  Haninda,  Isolasi  dan  Karakterisasi Enzim  L-Asparaginase  dari  Rimpang  Temulawak (Curcuma  xanthorrhiza  Roxb.)  Dalam  Sediaan  Utuh dan  Serbuk,  Skripsi,  ^Jurusan  Kimia,  Universitas Diponegoro, Semarang
[8]  B.  N.  Meyer,  N.  R.  Ferrigni,  J.  E.  Putnam,  L.  B. Jacobsen,  D.  E.  Nichols,  J.  L.  McLaughlin,  Brine Shrimp:  A  Convenient  General  Bioassay  for  Active Plant Constituents, Planta Med , 45, 05, (1982) 31-34 http://dx.doi.org/10.1055/s-2007-971236
[9]  Felix  Franks, Characterization of  Proteins, Humana Press, 1988.
[10] R. Ian  Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Aplication, Lissing, New York, 1986.
[11]  M.  Suffness, J.  M.  Pezzuto, Assay  Related  to Cancer Drug Discovery,  in:  K.  Hostettman  (Ed.) Methods  in Plant  Biochemistry:  Assay  for  Bioactivity ,  Academic Press, London, 2009, pp. 71-133.
y = 24.629x - 17.175 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 -2 -1 0 1 2 3 4 log  konsentra si % k e m a ti a n