## KARAKTERISASI DAN DETEKSI CEPAT BAKTERI PENYEBAB PENYAKIT DARAH PADA PISANG

## CHARACTERIZATION AND RAPID DETECTION OF BLOOD DISEASE BACTERIUM ON BANANA AND PLANTAIN
Nur Edy 1) , Siti Subandiyah * 2) , Christanti Sumardiyono 2) , dan Jaka Widada 2)
1) Program Studi Fitopatologi, Sekolah Pascasarjana Universitas Gadjah Mada
2) Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, Jln. Flora 1 Bulaksumur Yogyakarta 55281
* Penulis untuk korespondensi. E-mail: sitisubandiyah@ugm.ac.id

## ABSTRACT
Blood disease of banana is one of the most serious banana disease in Indonesia. Although the disease has became the subject of quarantine it eventually spread and found in most provinces in Indonesia. The aim of this research were to identify the blood disease bacterium (BDB) using morphological observation, biochemical assay, pathogenicity testing of hosts range using infectivity titration and rapid detection by Polymerase Chain Reaction (PCR). The results showed that the blood disease bacterium could be differentiated from Ralstonia solanacearum race 2, the causal agent of Moko disease and R. solanacearum tobacco isolates. BDB isolates were not able to hydrolyze gelatin, Tween 80, starch, and were not able to produce nitrite from nitrate. They were only able to produce acid from galactose and glycerol. The pathogenicity test indicated that the BDB was only able to infect the banana/plantain and was  not able to infect  tomato, eggplant, and chili. Rapid detection using PCR method showed that the 121F/R primers was able to amplify the BDB genome and was not able to amplify the genome of R. solanacearum tobacco isolates .
Key words: Blood Disease Bacterium, characterization, Polymerase Chain Reaction

## INTISARI
Penyakit darah pada pisang masih merupakan kendala utama dalam budidaya pisang di Indonesia. Walaupun pato- gen penyakit darah sudah  merupakan OPT karantina, namun saat ini penyakit sudah tersebar di seluruh provinsi di In- donesia.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  bakteri  penyebab  penyakit  darah  dengan  karakterisasi morfologi, biokimia, kisaran inang, dengan infectivity titration dan deteksi cepat menggunakan PCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri penyakit darah (BDB) dapat dibedakan dengan Ralstonia solanacearum ras 2, penyebab penyakit  Moko dan R. solanacearum isolat tembakau.  Isolat BDB tidak dapat menghidrolisis gelatin, Tween 80, pati dan tidak  dapat menghasilkan nitrit dari nitrat. Bakteri ini hanya menghasilkan asam dari galaktosa dan gliserol.  Hasil uji patogenisitas menunjukkan bahwa bakteri penyakit darah (BDB) hanya dapat menginfeksi  pisang dan plantain dan tidak dapat menginfeksi tomat, terung dan cabai. Deteksi cepat dengan PCR menunjukkan bahwa primer 121F/R dapat mengamplifikasi  genom  bakteri penyakit darah (BDB) dan tidak dapat mengamplifikasi R. solanacearum isolat tem- bakau.
Kata kunci: karakterisasi, penyakit darah pisang, Polymerase Chain Reaction

## PENGANTAR
Penyakit darah masih menjadi kendala utama dalam budidaya pisang di Indonesia. Penyakit ini banyak dijumpai pada pisang Kepok akan tetapi va- rietas lainnya juga dapat terinfeksi. Gejala yang ditimbulkan sangat mirip dengan gejala penyakit Moko  di  Amerika  Latin  yang  disebabkan  oleh Ralstonia solanacearum ras 2 (Sequeira, 1997). Sampai saat ini patogen  penyakit darah pada pisang belum memiliki nama yang valid sekalipun kedudukan taksonominya telah ditentukan bahwa patogen ini tergolong ke dalam Ralstonia kompleks spesies dan memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan Ralstonia solanacearum ras 2, penye-
bab  penyakit  layu  pisang  di Amerika  Latin  dan Filipina serta Ralstonia syzygii penyebab penyakit mati pucuk pada cengkeh (Fegan & Prior, 2006). Bakteri  penyebab  penyakit  darah  hanya  dikenal dengan  nama  umum Blood  Disease  Bacterium (BDB). Roberts et  al .  (1990)  dan  Baharuddin et  al . (1994) telah membuktikan bahwa strain BDB dan
R. syzygii memiliki DNA yang homolog pada uji serologi dan menunjukkan sidik jari dengan tingkat similaritas  yang  tinggi  melalui  uji Polymerase Chain Reaction dengan amplifikasi menggunakan primer  tRNA  (Seal et  al .,  1992b). Analisis  filo- genetik  menggunakan  16S  rDNA,  poligalaktu-
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, Vol. 17, No.1, 2011: 26–30
ronase,  dan  endoglukanase  (Seal et  al .,  1994; Thagayi et al ., 1996; Fegan et al ., 1998) lebih mene- gaskan bahwa BDB dan R. syzygii dapat diklasi- fikasi kembali ke dalam genus Ralstonia. BDB dan R.  syzygii dapat  dengan  mudah  dibedakan  dari isolat R.  solanacearum berdasarkan  kisaran inangnya, perbedaan morfologi bakteri, sifat fisio- logi jika dikulturkan (Eden-Green, 1994), dan ke- spesifikan fragmen DNA R. solanacearum dengan metode Polymerase Chain Reaction (Seal et al ., 1992a). Analisis filogenetik berdasarkan 16S-23S ( Internal Transcribed Spacer , ITS), endoglukanase dan  urutan  DNA  gen  mutS,  menggolongkan BDB  dalam  filotipe  IV,  sedangkan Ralstonia solanacearum ras 2 digolongkan dalam filotipe II (Fegan & Prior, 2005).
Sebaran  geografi  BDB  yang  sangat  luas  di Indonesia dan kompleksnya keragaman bakteri layu vaskular pada pisang menjadi alasan dibutuhkannya metode deteksi BDB strain Indonesia untuk mem- bedakannya dengan strain-strain bakteri lain penye- bab  penyakit  layu  pada  pisang.  Penelitian  ini bertujuan untuk mengkarakterisasi bakteri penye- bab penyakit darah (BDB) dan deteksi cepat de- ngan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk kepentingan diagnosis.

## BAHAN DAN METODE
Isolasi dan karakterisasi bakteri . Isolat BDB yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 1. Isolat-isolat BDB diperoleh dari daerah-
daerah berbeda di Indonesia. Bakteri dikulturkan pada  medium Tetrazolim  Chloride  Agar (TZC) (Kelman, 1994) pada suhu ruang. Karakterisasi bak- teri dilakukan menurut metode yang dideskripsikan oleh Fahy dan Hayward (1983), Lelliot dan Stead (1987), Baharuddin (1994), Eden-Green (1994).
Uji  patogenisitas . Untuk  mengetahui  kisaran inang  BDB,  uji  patogenisitas  dilakukan  dengan metode infectivity  titration (Subandiyah,  1991) dengan kerapatan sel bakteri 10 8 CFU/ml. Tanaman uji adalah pisang, tomat, terung, dan cabai.
Ekstraksi dan pemurnian DNA . Total genom DNA  BDB  diekstraksi  dengan  metode  yang dideskripsikan oleh Ausubel et al . (1992).
Analisis PCR . Isolat-isolat BDB diidentifikasi dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer spesifik (5’-CGT ATT GGA TGC CGT AAT GGA-3’) dan 121R (5’-AAG TTC ATT  GGT  GCC  GAA  TCA-3’).  Amplifikasi fragmen DN BDB dilakukan pada mesin pendaur panas (Biorad, Jerman), volume total reaksi 25 l dengan komposisi 200 M dNTP, 1,5 mM MgCl 2 , buffer 10 x, 1 unit DNA Taq polymerase (Core Kit, Roche, Jerman), 25 pmol masing-masing primer 121F  dan  121R,  50  ng  DNA template .  Kondisi mesin pendaur panas diatur sebagai berikut: 1 siklus 96°C selama 10 menit; 30 siklus berturut-turut ter- diri atas 94°C selama 15 detik, 59°C selama 30 detik, dan 72°C selama 30 detik. Satu siklus pe- manjangan akhir pada suhu 72°C selama 10 menit,
Tabel 1. Bakteri yang digunakan dalam penelitian No. Kode Daerah asal isolat Varietas inang 1. Slk-31 Solok, Sumatera Utara Kepok 2. Slk-33 Solok, Sumatera Utara Kepok 3. Lpg-29 Lampung Kepok 4. Sln-03 Sleman, D.I. Yogyakarta Kepok 5. Btl-11 Bantul, D.I. Yogyakarta Kepok 6. Skh-06 Sukoharjo, Jawa Tengah Kepok 7. Pwr-07 Purworejo, Jawa Tengah Kepok 8. Sal-48 Salaman, Jawa Tengah Kepok 9. Byl-35 Boyolali, Jawa Tengah Raja Bandung 10. Klt-34 Klaten, Jawa Tengah Kepok 11. Bal-50 Tabanan, Bali Kepok 12. Plu-32 Palu, Sulawesi Tengah Kepok 13. Mks-52 Makassar, Sulawesi Selatan Kepok 14 Mksr-51 Makassar, Sulawesi Selatan Kepok 15. Btp-22 Batu Putih, Sulawesi Selatan Ambon 16. Lmp-28 Lompo, Sulawesi Selatan Kepok 17. Mdo-53 Manado, Sulawesi Utara Kepok 18. Bpn-46 Tritip, Balikpapan, Kalimantan Timur Kepok 19. Bpn-47 Tritip, Balikpapan, Kalimantan Timur Kepok 20. Bpn-44 Karang Juang, Balikpapan, Kalimantan Timur Kepok 21. Smrd-45 Samarinda, Kalimantan Timur Kepok
Edy et al .: Karakterisasi dan Deteksi Cepat Bakteri Penyebab Penyakit Darah pada Pisang
PCR dihentikan pada suhu 11°C. Produk PCR (5 µl) dielektroforesis menggunakan agarosa 1% dalam larutan buffer 0.5 x ( Tris-acetate-EDTA buffer , 89 mM Tris-acetate, pH 8,0 dan 2 mM EDTA) dengan pengaturan pergerakan DNA pada gel agarosa 10 V/cm selama 25 menit. Pewarnaan DNA dilakukan dengan ethidium bromide (0,5 g/ml), lalu fragmen DNA  yang  terbentuk  diamati  di  atas  UV  trans- iluminator.  Untuk  membuktikan  kespesifikan primer. Uji yang sama dilakukan pada Ralstonia solanacearum isolat  tembakau  sebagai  kontrol. Isolat BDB dimurnikan dengan dikulturkan pada medium  TZC  sampai  ditemukan  koloni  tunggal dengan  ciri-ciri:  bentuk  koloni  bakteri  bulat, berdiameter 2–4 mm, berwarna putih susu dengan warna  merah  muda  pada  bagian  tengahnya, mengilap, dan tidak fluidal. Koloni tunggal kemu- dian dipindahkan ke medium CPG.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik bakteri . Ciri khusus yang terlihat secara teknis adalah koloni bersifat lengket pada medium jika diambil dengan jarum ose, pertum- buhan koloni pada medium CPG terbilang lambat, koloni baru jelas terlihat pada hari keempat sampai kelima setelah dikulturkan. Sebagai pembanding di- tampilkan hasil karakterisasi Baharuddin (1994). Hasil karakterisasi BDB oleh penulis dan Baha- ruddin disajikan pada Tabel 2.
Patogenisitas bakteri . BDB hanya menginfeksi pisang dengan gejala layu, sedangkan tomat, terung, dan  cabai  tidak  menunjukkan  gejala  layu  (tetap sehat) sampai 4 minggu setelah inokulasi. Ini me- nunjukkan bahwa BDB hanya menginfeksi pisang dan tidak menginfeksi tanaman lain. Bakteri layu pisang mampu memproduksi berba- gai  enzim  ekstraseluler  dengan  fungsi  yang berbeda-beda,  antara  lain  adalah  yang  berfungsi untuk mendegradasi komponen dinding sel tanaman hubungannya  dengan  patogenisitas,  tetapi  tidak satupun di antaranya yang dibutuhkan secara mutlak untuk  menimbulkan  penyakit.  Mutan  yang kehilangan kemampuan membentuk proten-protein ekstraseluler seperti endopoligalakturonase ( PglA ), eksopoligalakturonase  B  ( PglB ),  pektin  metil esterase ( Pme ), atau endogalakturonase ( Egl ) masih mampu menyebabkan penyakit meskipun kemu- nculan gejala layu dan kematian tanaman membu- tuhkan waktu yang lebih lama. Faktor virulen lain yakni ekstrapolisakarida yang bersifat asam dengan berat molekul tinggi menyebabkan penyumbatan pada xilem sehingga menimbulkan kelayuan tetapi tidak  mempunyai  efek  dalam  proses  invasi  dan multiplikasi  sel  bakteri  tersebut.  Mutan  spontan yang tertentu akan menunjukkan koloni yang tidak fluidal karena EPS tidak terbentuk (Kelman, 1953). Selanjutnya diketahui bahwa mutan tersebut meng- alami inaktivasi pada lokus phcA yang membawa gen untuk mempertahankan fenotipe liar ( wild type )
Tabel 2. Karakteristik isolat-isolat BDB dibandingkan dengan Ralstonia solanacearum ras 2
*) Uji dilakukan oleh Baharuddin (1994) Karakter Bakteri Blood Disease Bacterium R. solanacearum ras 2 *) Gram (KOH 3%) - - Katalase + + Kovacs’ Oksidasi + + Oksidasi Fermentasi O+/F- O+/F- Pencairan Gelatin - + Hidrolisis Tween 80 - + Hidrolisis Pati - - Reduksi Nitrat - + Produksi Levan - + Pigmen Fluoresen - - Reaksi Hipersensitif + + Produksi asam dari: - Maltosa - - - Laktosa - - - Sukrosa - - - Galaktosa + + - Mannitol - + - Sorbitol - - - Selobiosa - - - Gliserol + +
Beberapa primer telah dikembangkan untuk de- teksi  strain-strain  bakteri  layu  seperti R. solanacearum dan bakteri layu lain yang sekerabat dengannya melalui metode Polymerase Chain Re- action . Di antara primer-primer deteksi yang telah dikembangkan tersebut, Opina et al . (1997) mene- mukan  primer  759  dan  760  yang  telah  terbukti mampu mengamplifikasi fragmen DNA dari semua strain-strain R.  solanacearum dan  bakteri  yang memiliki  kekerabatan  dekat  dengannya,  yakni Pseudomonas syzygii dan Blood Disease Bacterium pada panjang fragmen 282 pb secara konsisten. Kemajuan teknik molekuler membantu dalam identifikasi cepat suatu jasad pengganggu tanaman untuk  diagnosis.  Sifat  efisien  dari  teknik-teknik molekuler  akan  memudahkan  deteksi  patogen karena tidak perlu mengkulturkannya pada medium buatan, atau dapat langsung dari bagian tanaman yang  dicurigai  membawa  patogen.  Analisis molekuler untuk mendeteksi keberadaan mikroba pengganggu di dalam tanaman sangat membantu efisiensi waktu dan akurasi untuk kepentingan diag- nosis.

## KESIMPULAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa patogen penyakit darah pada pisang di Indonesia adalah Blood Disease Bacterium , bukan Ralstonia solanacearum .
dengan kemampuannya menyebabkan gejala ke- layuan secara cepat pada tanaman (Hayward, 2000).
Deteksi  BDB  dengan Polymerase  Chain Reaction . Hasil polimerasi dengan primer 121F dan 121R,  primer  spesifik  untuk  deteksi  BDB  pada pisang  di  Indonesia  menunjukkan  bahwa  semua isolat (21) positif sebagai BDB yang ditunjukkan dengan terbentuknya fragmen DNA dengan ukuran 317 pb (Gambar 1). Primer tersebut dikembang- kan  dari  hasil  klon  DNA  genom  BDB  yang dibandingkan  dengan  DNA  genom Ralstonia solanacearum lalu  diidentifikasi  dengan  metode substractive hybridization . Meskipun sekuen yang diperoleh tidak sesuai dengan data base Bank Gen, akan tetapi hasil uji pada banyak strain BDB me- nunjukkan  hasil  positif  sedangkan  pada R. solanacearum menunjukkan hasil negatif. Spesifikasi  urutan basa DNA primer 121F dan 121R mampu mengenali BDB pada total genom DNA-nya. Hasil polimerasi menunjukkan bahwa primer spesifik tersebut hanya mampu mengam- plifikasi fragmen DNA BDB dan tidak mengampli- fikasi fragmen DNA R. solanacearum isolat tem- bakau.  Sekalipun  kedua  jenis  bakteri  tersebut tergolong dalan satu genus Ralstonia, akan tetapi pencirian khusus yang dimiliki oleh BDB pada frag- men DNA-nya akan menjadi faktor identitas utama sekaligus menjadi karakter pembeda dengan bakteri yang lain.
Gambar 1. Amplifikasi DNA genom BDB dengan PCR menggunakan primer 121F dan 121R menunjukkan seluruh isolat positif sebagai bakteri penyebab penyakit darah
1500 pb 1000 pb
500 pb 300 pb 100 pb Keterangan: 1. Slk-31 6. Skh-06 11. Bal-50 16. Lmp-28 21. Smrd-45 2. Slk-33 7. Pwr-07 12. Plu-32 17. Mdo-53 K.  Kontrol ( R. solanacearum 3. Lpg-29 8. Sal-48 13. Mks-52 18. Bpn-46 isolat tembakau) 4. Sln-03 9. Byl-35 14. Mkasr-51 19. Bpn-47 5. Btl-11 10. Klt-34 15. Btp-22 20. Bpn-44
Edy et al .: Karakterisasi dan Deteksi Cepat Bakteri Penyebab Penyakit Darah pada Pisang
Hayward,  A.C.  2000. Ralstonia  solanacearum . Encyclopedia of Microbiology 4: 32–42. Kelman, A. 1953. The Bacterial Wilt Caused by Pseudomonas solanacearum . A Literary Review and Bibliography . Technical Bulletin of North Carolina Agricultural Experiment Station No. 99. Raleigh, North Carolina. 194 p.
Lelliot, R.A. & D.E. Stead. 1987. Methods in Plant Pathology . Vol. 2. Methods for the Diagnosis of Bacterial  Diseases  of  Plants.  British  Society  for Plant Pathology by Blackwell Scientific Publica- tion, Oxford. 216 p.
Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J. Wang, T. Li, R. Maghirang, M. Fegan, A. Hayward, V. Krish- napillai, W. Hong, B. Holloway, & J. Timmis. 1997. A Novel Method for Development of Species and Strain-Specific DNA Probes and PCR Primers for Identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum ). Asia-Pacific Journal of  Molecular Biology and Biotechnology 5: 19–30. Roberts, S.J. Eden-Green, P. Jones, & D.J. Ambler. 1990. Pseudomonas syzygii sp. Nov., the Cause of Sumatera  Disease  of  Cloves. Systematic  and Applied Microbiology 13: 34–43.
Seal, S.E., L. Jackson, & M.J. Daniels. 1992a. Iso- lation of a Pseudomonas solanacearum , specific DNA probe by subtraction hybridization and Con- struction  of  Species-species  Oligonucleotida Primers  for  Sensitive  Detection  by  Polymerase Chain Reaction. Applied and Environmental Micro- biology 59: 3751–3758.
Seal, S.E. & J.G. Elphinstone. 1994. Advances in Identification  and  Detection  of Pseudomonas solanacearum , p. 35–57. In A.C. Haywards & G.L. Hartman (eds.), Bacterial Wilt: the Disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum. CAB International. Wallingford, UK.
Sequeira, L. 1997. Bacterial Wilt: The Missing El- ement in International Banana Improvement Pro- grams,  p.  6–14. In P.  Prior,  C.  Allen,  &  J. Elphinstone (eds.) Bacterial Wilt Disease: Molecu- lar and Ecological Aspect , Reports of the Second International Bacterial Wilt Symposium. France.
Subandiyah,  S.  1991. Bacterial  Wilt  of  Peanut Caused by Pseudomonas solanacearum F.F. Smith . Thesis master. The University of Queensland, St. Lucia, Queensland, Australia.
Thagavi, M., A.C. Hayward, L.I. Sly, & M. Fegan. 1996.  Analysis  of  Phylogenetic  Relationship  of Strains Bulkhoderia solanacearum , Pseudomonas syzygii ,  Blood  Disease  Bacterium  based  on  16S rRNA Gene Sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46: 10–15.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada: Australian  Centre  for  International Agricultural Research (ACIAR) dalam proyek Diagnosis and Management of Banana Wilt in Indonesia (ACIAR CP 2004/034) sebagai penyandang dana penelitian ini.  Dr.  Mark  Fegan  ( Queensland  University , Australia)  yang  telah  mendesain  spesifik  primer untuk deteksi BDB.

## DAFTAR PUSTAKA
Ausubel,  F.M.,  R.  Brent.,  R.E.  Kingston,  D.D. Moore,  J.G.  Seidman,  J.A.  Smith,  &  K.  Struhl (eds.).  1992. Current  Protocols  in  Molecular Biology .  Greene  Publishing Association;  Wiley- Interscience, New York. Baharuddin. 1994. Pathological, Biochemical, and Serological Characterization of the Blood Disease Bacterium Affecting Banana and Plantain . Cuvillier Verlag, Gottingen, Doctoral Dissertation.
Eden-Green, S.J. 1994. Diversity of Pseudomonas solanacearum and Related Bacteria in South Asia: New Direction of Moko Disease, p. 25–34. In A.C. Hayward & G.L. Hartman (eds.). Bacterial Disease and  its  Causative  Agent Pseudomonas solanacearum. CAB International, Wellington.
Fahy,  P.C.  &  A.C.  Hayward.  1983.  Media  and Methods for Isolation and Diagnostic Tests, p. 337– 378. In P.C.  Fahy  &  G.J.  Persley  (eds.), Plant Bacterial Diseases: a Diagnostic Guide . Academic Press, Sidney.
Fegan, M., M. Taghavi, Sly Li, & A.C. Hayward. 1998. Phylogeny, Diversity, and Molecular Diag- nostic of Ralstonia solanacearum, p. 19–33. In P.C. Prior, C. Allen, J. Elphinstone. (eds.), Bacterial Wilt, Molecular, and Ecological Aspects . Berlin Heidel- berg, Germany and Paris, Frances. Springer-Verlag and INRA Edition.
Fegan, M. & P. Prior. 2005. How Complex is the
" Ralstonia  solanacearum species  complex"?, p.
449–461. In C. Allen, P. Prior, & A.C. Hayward
(eds.), Bacterial  Wilt  Disease  and  the Ralstonia solanacearum Species  Complex .  American Phyto- pathological Society Press, St. Paul, Minnesota.
Fegan, M. & P. Pror. 2006. Diverse Members of the Ralstonia  solanacearum Species  Complex Cause Bacterial Wilt of Banana. Australian Plant Pathology 35: 93–101.
French,  E.R.  &  L.  Sequiera. 1970.  Strains  of Pseudomonas  solanacearum from  Central  and South America: Comparative Study. Phytopathology 60: 506–512.