## PENGARUH PEMBERIAN TERAPI OKSIGEN HIPERBARIK 2,4 ATA TERHADAP KADAR C-REACTIVE PROTEIN (CRP) DARAH MENCIT MODEL RHEUMATOID ARTHRITIS
Thalia Tamara *) , Hendrata Erry *) , Totot  Mudjiono **)
*) Fakultas Kedokteran Universitas Hang Tuah Surabaya **) Rumkital Dr. Ramelan Surabaya
E-mail : thaliatamara49@gmail.com

## Abstract
Background: Rheumatoid  Arthritis  (RA)  is  an  autoimmune  disease  with  an  increasing prevalence from year to year. RA mortality continues to increase in the last 1 decade due to the  absence  of  effective  prevention  and  therapy.  Hyperbaric  oxygen  therapy  can  be  an adjuvant therapy for Rheumathoid Arthritis.
Objective: This study uses Hyperbaric Oxygen Therapy to reduce the inflammatory reaction in patients with Rheumatoid Arthritis.
Method: Samples used are 16 male balb/c mice, divided into 2 groups, 1) group of induced experimental  animals  as  models  of  Rheumatoid  Arthritis  2)  group  of  induced  experimental animals  as  models  of  Rheumatoid  Arthritis  and  given  3x30  minutes  of  2.4  ATA  hyperbaric oxygen therapy for 10 consecutive days. On 59th day, ELISA screening test is performed for C-ReactiveProtein measurement.
Result : The average results of C-Reactive Protein levels between 2 groups, are, the group of mice with rheumatoid arthritis model that was not treated with HBO therapy had an average CRP level of 0.204 Pg / ml, while the group of mice with rheumatoid arthritis model which is treated with HBO therapy has a mean CRP level of 0.113 Pg / ml.
Conclusion: There  is  an  effect  of  hyperbaric  oxygen  therapy  to  C-Reactive  Protein  level  in mice with rheumatoid arthritis model.
Key words: Rheumatoid Arthritis, Hyperbaric Oxygen Therapy, C-Reactive Protein

## Abstrak
Latar  Belakang: Artritis  Rheumatoid/  Rheumatoid  Arthritis  (RA)  adalah  suatu  penyakit autoimun dengan prevalensi  yang terus meningkat dari tahun ke tahun. Angka kematian RA terus meningkat  dalam 1 dekade terakhir akibat  belum ditemukannya pencegahan dan terapi yang  efektif.  Terapi  oksigen  hiperbarik  bisa  menjadi  terapi  adjuvant  untuk  penderita Rheumathoid Arhtritis.
Tujuan: Penelitian  ini  menggunakan  Terapi  Oksigen  Hiperbarik  untuk  mengurangi  reaksi inflamasi pada penderita Rheumatoid Arthritis.
Metode: Sampel yang digunakan adalah Mice BALB/C jantan sebanyak 16 ekor yang dibagi menjadi  2  kelompok,  yaitu  1)  kelompok  mencit  yang  diinduksi  menjadi  model  Rheumatoid Arthritis, 2)  kelompok hewan coba  yang diinduksi menjadi  model Rheumatoid  Arthritis dan diberikan  terapi  HBO  2,4  ATA  3x30  menit  selama  10  hari  berturut-turut.  Pada  hari  ke-59 dilakukan pemeriksaan C-Reactive Protein menggunakan metode ELISA.
Hasil: Hasil  rerata  kadar  C-Reactive  Protein  antara  2  kelompok  yaitu,  kelompok  mencit model  RA  yang  tidak  diterapi  HBO  memiliki  rerata  kadar  CRP  0.204  Pg/ml,  sedangkan kelompok mencit model RA yang diterapi HBO memiliki rerata kadar CRP 0.113 Pg/ml.
Kesimpulan: Terdapat pengaruh terapi oksigen hiperbarik terhadap kadar C-Reactive Protein darah mencit model rheumatoid arthritis.
Kata kunci: Rheumatoid Arthritis, Terapi Oksigen Hiperbarik, C-Reactive Protein

## Pendahuluan
Arthritis  rheumatoid/  rheumatoid  arthritis  (RA)  adalah  suatu  penyakit  autoimun berupa inflamasi kronik yang utamanya terjadi pada tulang rawan sekitar sendi (Kumar et al., 2015). Penderita artritis rheumatoid biasanya mengeluhkan nyeri sendi saat bangun pagi. Hal ini  disebabkan  adanya  penebalan  di  bagian  synovial  sendi,  sarung  tendon,  dan  bursa  yang diikuti dengan erosi tulang dan destruksi tulang disekitar sendi (Syamsuhidajat, 2010). Artritis rheumatoid  merupakan  penyakit  progresif  yang  dapat  menimbulkan  cacat  permanen (Ledingham, Snowden and Ide, 2017).
Menurut  Arthritis  Foundation,  sekitar  3%  atau  1,5  juta  orang  dewasa  di  Amerika Serikat  berusia  18  tahun  atau  lebih  mengalami  RA  (Barr,  2015).  Di  negara  maju  prevalensi rheumathoid  arthritis  mencapai  0,5%-1%  (Choy,  2012).  Prevalensi  RA  di  Indonesia  sendiri lebih  sedikit  dibandingkan  di  Amerika  dan  Negara  maju  lainnya,  yaitu  hanya  0,1%  (1  di antara 1000-5000 orang) (Nainggolan, 2009).
Sebenarnya penyebab pasti dari artritis rheumatoid masih belum diketahui secara pasti hingga  saat  ini.  Tetapi,  peneliti  meyakini  faktor  genetik  dan  lingkungan  menjadi  penyebab utama dari penyakit ini.  Faktor  genetik  yang dapat  menurunkan penyakit artritis  rheumatoid adalah ditemukannya perbedaan allel  antigen leukosit manusia (HLA)-DRB1 pada penderita artritis rheumatoid dengan ACPA positif (Gibofsky, 2014). Berbagai faktor lingkungan telah dikaitkan sebagai  potensi  pemicu RA, salah satunya  adalah adanya hormon  yang diproduksi
oleh  wanita,  dimana  prevalensi  RA  pada  wanita  lebih  tinggi  daripada  pada  pria.  Selain  itu, rokok juga diduga sebagai pemicu RA (Gibofsky, 2014).
Meskipun kini, angka kematian pasein  RA sudah menurun, namun  tingkat  mortalitas keseluruhan masih setinggi pada dekade terakhir. Menurut penelitian dalam 15 tahun terakhir, pasien  dengan  rheumatoid  arthritis  (RA)  memiliki  risiko  kematian  54%  lebih  tinggi dibandingkan  penyakit  beresiko  lainnya,  seperti:  penyakit  jantung,  pernafasan,  dan  sistem pencernaan  (van  den  Hoek et  al. ,  2017).  Kematian  ini  sering  kali  terjadi  akibat  peningkatan risiko infeksi yang dikarenakan menurunya fungsi kekebalan tubuh pada pasien RA atau efek terapi imunosupresif.
Tujuan  utama  pengobatan  artritis  rheumatoid  adalah  untuk  mengurangi  gejala  dan menghentikan  proses  inflamasi  pada  sendi  yang  progresif.  Terapi  untuk  mengurangi  gejala seperti bengkak dan nyeri sering digunakan obat  anti inflamasi non steroid  (OAINS) seperti naproxen sodium, tetapi obat ini memiliki efek samping gangguan hati dan lambung.  Terapi untuk mencegah inflamasi yang progresif digunakan obat DMARDs (Disease Modifying Anti Rheumatoid  Drugs)  yang  dikombinasikan  dengan  kortikosteroid.  Salah  satu  DMARDs  yang paling  sering  digunakan  adalah  methotrexate.  Methotrexate  dapat  menggangu  produksi  sel darah  oleh  sumsum  tulang  (Rajnics et  al. ,  2017;  Andisari,  2018).  Methotrexate  yang dikombinasikan  dengan  kortikosteroid  dapat  menyebabkan  imunosupresif,  sehingga mengakibatkan  berbagai  infeksi  sekunder.  Lebih  dari  50%  kematian  pada  pasien  RA dikarenakan infeksi pada sistem respirasi (Widdifield et al. , 2018).
Terapi  oksigen  hiperbarik  merupakan  terapi  dengan  memberikan  oksigen  murni kepada  pasien  di  dalam  sebuah  tabung  (chamber)  yang  diberi  tekanan  lebih  besar  daripada permukaan laut (1 ATA). Mekanisme terapi ini melalui dua hal, yaitu hiperoksigenasi secara langsung  ke  dalam  sel  melalui  dfusi  dan  peningkatan  tekanan  hidrostatik.  Hingga  saat  ini, terapi oksigen hiperbarik telah berhasil mengobati luka kronis seperti ulkus diabetikum (Van
Neck et  al. ,  2017),  nekrosis  jaringan  lunak  akibat  radiasi,  beberapa  kondisi  kekurangan oksigen,  dan  penyakit  dekompresi.  Selain  indikasi  tersebut,  banyak  data  empiris  dan eksperimental  menunjukkan  bahwa  terapi  hiperbarik  dapat  memberi  manfaat  pada  penyakit autoimun  dengan  menekan  imunitas,  namun  mekanisme  dasarnya  belum  dipahami  dengan baik. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, saya ingin menyelidiki apakah terapi HBO dapat mencegah pengembangan inflamasi pada artritis rheumatoid.

## Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Kandang  hewan  coba  ukuran  860  cm2  dengan  tinggi  12  cm,  Tempat  makan  dan minum  hewan  coba , Timbangan , Gelas  ukur , Kain  flannel , Kapas , Spuit , Sample  container , Animal chamber , Gunting , Stop watch untuk menghitung lama HBO, Mencit jantan (balb/c), mBSA, PBS, CFA, PTx, CII, IFA, Bahan pangan dry food 4-8 gr/hewan/hari dan minum 5-8 ml/hewan/hari.

## Pembuatan Model Rheumatoid Arthritis
Sebanyak  16  mencit  putih  BALB/c  terlebih  ditimbang  berat  badannya,  kemudian dilakukan  injeksi  1  (100 mBSA  dalam  50 PBS  yang  diemulsikan  dengan  50 CFA subkutan  +  200ng  PTx  intraperitoneal  ),  hari  ke-7  dlakukan  injeksi  ke-2  (50 mBSA,
100 CII  yang  diemulsikan  dengan  50 IFA  subkutan  +  200ng  PTx  intraperitoneal),  hari ke-14  dilakukan  injeksi  ke-3  (50 mBSA,  100 CII  dalam  50 PBS  yang  diemulsikan dengan 50 IFA subkutan + 200ng PTx intraperitoneal) , hari ke-28 dilakukan injeksi ke-4 (50 mBSA  dilarutkan  dalam  20
PBS  dalam  rongga  sendi  lutut  kiri  intraartikular)  dan rongga sendi lutut kanan dilakukan injeksi (20 PBS intraartikular), dan hari ke 49 terbentuk ACIA kronis dan gejala inflamasi sendi lutut kiri.

## Prosedur Penelitian
Setelah  diaklimatisasi,  tikus  yang  ditetapkan  sebagai  sampel  dibagi  secara  acak menjadi  2  kelompok,  yaitu  kelompok  kontrol  dan  kelompok  perlakuan.  Kelompok  kontrol yaitu  perlakuan  model  rheumatoid  arthritis  tanpa  terapi  oksigen  hiperbarik.  Kelompok Perlakuan model rheumatoid arthritis dengan terapi oksigen hiperbarik 2,4 ATA selama 3x30 menit  selama  10  hari  berturut-turut.  Selanjutnya  dilakukan  pengambilan  sampel  darah  tikus dilakukan setelah pembiusan. Darah pada mencit diambil langsung dari jantung menggunakan teknik  cardiac  puncture  dengan  spuit  5  ml  dengan  menggunakan  jarum  sebesar  22  G.  CRP pada darah mencit diperiksa dengan metode ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) .

## Hasil dan Diskusi
Tabel  1  Hasil  CRP  darah  hewan  coba  yang  dibuat  model  RA  pada  kelompok  kontrol positif dan kelompok perlakuan
Keterangan: K(+): Kelompok mencit model RA yang tidak diterapi HBO K(P): Kelompok mencit model RA yang diterapi HBO Variabel No Kelompok K(+)
K(P) Kadar  CRP  Darah  Mencit (Pg/mL) 1 0.246 0.112 2 0.133 0.136 3 0.202 0.134 4 0.095 0.109 5 0.286 0.089 6 0.202 0.119 7 0.265 0.095
Tabel 2 Gambaran nilai rerata dan standar deviasi kadar CRP darah hewan coba yang dibuat model RA pada kelompok kontrol positif dan kelompok perlakuan.
Kelompok Rerata (Pg/ml) Standar Deviasi Kontrol Positif 0.204 0.07 Perlakuan 0.113 0.018
Berdasarkan  Tabel  2,  maka  dapat  diketahui  kelompok  mencit  model  RA  yang  tidak diterapi  HBO  memiliki  rerata  kadar  CRP  0.204  Pg/ml  dan  standar  deviasi  0.070  Pg/ml. Sedangkan kelompok mencit model RA yang diterapi HBO memiliki rerata kadar CRP 0.113 Pg/ml dan standar deviasi 0.018 Pg/ml.
Tabel 3 Hasil uji normalitas data dengan Uji Saphiro-Wilk

## Uji Normalitas
Kelompok Shapiro-Wilk Statistic df  Sig. Kontrol Positif 0.937 7 0.610 Perlakuan 0.941 7 0.644 Keterangan hasil uji Saphiro-Wilk :
a. Jika signifikansi p>0,05 maka distribusi data normal
b. Jika signifikansi p<0,05 maka distribusi data tidak normal.
Berdasarkan  Tabel  3,  dapat  diperoleh  nilai  signifikansi  dari  kelompok  mencit  model RA  yang  tidak  diterapi  HBO  sebesar  p  =  0,610  (p>0.05)  dan  nilai  signifikansi  kelompok mencit    model RA yang diterapi HBO sebesar p = 0,644 (p>0.05).
Hal ini menunjukkan bahwa kelompok mencit model RA yang tidak diterapi HBO dan kelompok mencit model RA yang diterapi HBO memiliki data berdistribusi normal. Sehingga dapat  diambil  kesimpulan  bahwa  semua  kelompok  memiliki  distribusi  data  normal,  maka
selanjutnya  dapat  dilakukan  perhitungan  menggunakan  statistik  parametrik  apabila  hasil  uji homogenitas data memiliki variasi homogen.

## Tabel 4  Hasil uji homogenitas data dengan Uji Lavene Statistic
Uji Homogenitas Levene Statistic df1 df2 Sig. 6.181 1 12 0.029 Keterangan hasil uji Lavene Statistic:
a. Jika signifikansi p>0,05 maka variasi data homogen
b. Jika signifikansi p<0,05 maka variasi data tidak homogen.
Berdasarkan Tabel 5.4 dapat diperoleh nilai signifikansi variasi data sebesar p = 0,029 (p<0,05).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  variasi  data  tidak  homogen  karena  syarat  suatu  data agar berdistribusi normal yaitu jika nilai signifikansinya p>0,05. Oleh karena itu, dilanjutkan dengan uji non-parametrik dengan uji Mann Whitney U Test untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan rerata diantara 2 kelompok.

## Tabel 5 Hasil uji non-parametrik dengan uji Mann Whitney U Test
Uji Non-Parametrik Nilai Mann-Whitney U 7.500 Asymp. Sig. (2-tailed) 0.029 Keterangan hasil uji Mann Whitney U Test:
a. Jika signifikansi p>0,05 maka H1 ditolak dan H0 diterima
b. Jika signifikansi p<0,05 maka  H0 ditolak dan H1 diterima
Hipotesis statistika data uji Mann Whitney U Test:
a. H0: Tidak terdapat perbedaan bermakna rerata kadar CRP darah antara kelompok mencit model RA yang tidak diterapi HBO dan kelompok mencit model RA yang diterapi HBO.
b. H1:  Terdapat  perbedaan  bermakna  rerata  kadar  CRP  darah  antara  kelompok mencit model RA yang tidak diterapi HBO dan kelompok mencit model RA yang diterapi HBO.
Berdasarkan hasil uji Mann Whitney U Test pada Tabel 5, diperoleh nilai signifikansi p = 0,026 (p<0,05). Maka, H0 ditolak dan H1 diterima. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan  rerata  kadar  CRP  darah  antara  kelompok  mencit  model  RA  yang  tidak  diterapi HBO dan kelompok mencit model RA yang diterapi HBO.
Jadi,  terapi  HBO  dapat  menurunkan  CRP  dengan  menurunkan  infiltrasi  sel-sel inflamasi,  salah  satunya  adalah  monosit,  melalui  persinyalan  HIF-1  α.  Terapi  HBO  juga berpengaruh  langsung  pada  sel  monosit.  Terapi  HBO  akan  menurunkan  pelepasan  sitokin inflamasi  oleh  sel  monosit,  seperti  IL-6  yang  diperantarai  oleh  heme  oxygenase-1  dan  heat shock proteins. Maka, produksi CRP oleh sel hepatosit yang distimulasi oleh sitokin IL-6 juga akan menurun yang juga menandakan bahwa inflamasi telah berkurang. (Novak et al. , 2016 ; Thom, 2009 ).
Hal ini sesuai dengan dengan penelitian oleh Nuri Karadurmus et all pada tahun 2010 dengan  menggunakan  28  pasien  (11  wanita  dan  17  pria)  yang  telah  mengalami  diabetes melitus tipe 2 selama 5 tahun dan telah mengalami ulkus kaki diabetikum kronis tingkat 2-4 menurut  skala  Wagner.  Pasien  diberikan  terapi  HBO  sebanyak  30  sesi,  dimana  dalam  1 minggu  dilakukan  5  sesi.  Dalam  1  sesi,  terapi  HBO  diberikan  selama  105  menit  dan menggunakan tekanan 2,4 ATA. Hasil dari penelitian tersebut  menunjukan rata-rata hs-CRP pasien sebelum diberikan terapi HBO adalah 4.4 ± 1.3 mg/dL. Kadar hs-CRP menurun secara signifikan  setelah  diberikan  terapi  HBO  selama  30  sesi  dengan  rata-rata  1.6  ±  0.7  mg/dL. (Karadurmus, 2010).
Penelitian  selanjutnya  dilakukan  oleh  Na  Li  et  all  pada  tahun  2017  dengan menggunakan 39 pasien (28 wanita dan 11 pria) yang telah diabetes tipe 2 berdasarkan China Guideline  for  Prevention  and  Treatment  of  Type  2  Diabetes  dan  mengalami  ulkus  kaki diabetikum  tingkat  2  dan  3  berdasarkan  skala  Wagner.  Terapi  HBO  diberikan  selama  5 minggu dengan tekanan 243 kPA selama 70 menit. Hasil penelitian menunjukkan penurunan
kadar CRP dari 4.31 ± 1.65 mg/dL menjadi 1.31 ± 0.42 mg/dL setelah diberikan terapi HBO dan kadar IL-6 menurun dari 67.58 ± 12.24pg/L menjadi 53.68 ± 8.28 pg/L. (Li et al. , 2017).
Terapi  HBO  meningkatkan  saturasi  oksigen  dan  jaringan  yang  juga  akan meningkatkan produksi  reactive oxygen species (ROS) dan reactive nitrogen species (RNS). Keadaan  hipoksia  saat  terjadi  inflamasi  disertai  dengan  peningkatan  ROS/RNS  dapat menginduksi hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1 α). Pensinyalan HIF-1α yang aktif juga akan mengarah  ke  ekspresi  mRNA  Catalase  (CAT)  dan  Glutathione  peroxidase  1  (GPx1)  yang lebih tinggi sehingga mengurangi stres oksidatif. HIF-1α mengurangi injuri jaringan oksidatif melalui penurunan adhesi neutrofil, monosit, dan limfosit serta infiltrasi ke jaringan inflamasi. (Novak et al. , 2016).
Efek terapi  HBO pada  monosit /  makrofag sebagai  dasar berkurangnya  kadar sitokin yang  bersirkulasi  setelah  stres  oksidatif,  seperti  yang  disebutkan  di  atas.  Mekanisme biomolekular dalam monosit ini belum diketahui secara pasti, tetapi diduga diperantarai oleh protein heme oxygenase-1 dan heat shock proteins (HSP; seperti, HSP70). (Thom, 2009).

## Kesimpulan
Berdasarkan hasil analisis  data, terdapat  perbedaan  yang bermakna rerata  kadar CRP darah anatara kelompok mencit model RA yang tidak diterapi HBO dengan kelompok mencit model RA  yang diterapi HBO. Sehingga dapat  disimpulkan bahwa  ada pengaruh pemberian terapi  HBO  tekanan  2,4  ATA  selama  3x30  menit  10  hari  berturut-turut.terhadap  kadar C- Reactive Protein (CRP) darah mencit BALB/c model Rheumatoid Arthritis.

## Referensi
Andisari, H.E., 2018. Recent  Therapeutics Policies of Arthritis Rheumatoid  (part  I). Oceana Biomedicina Journal , 1 (1), pp.12-24.
Gibofsky, A. (2014) ‘Epidemiology, pathophysiology, and diagnosis of rheumatoid arthritis: A Synopsis’, Am. J. Manag. Care , 20(7 Suppl), pp. S128----35.
van  den  Hoek,  J. et  al. (2017)  ‘Mortality  in  patients  with  rheumatoid  arthritis:  a  15-year
prospective  cohort  study’, Rheumatology  International .  Springer  Berlin  Heidelberg, 37(4), pp. 487–493. doi: 10.1007/s00296-016-3638-5.
Karadurmus,  N.  (2010)  ‘Potential  benefits  of  hyperbaric  oxygen  therapy  on  atherosclerosis and glycaemic control in patients with diabetic foot Korzystny wpływ leczenia tlenem w  komorze  hiperbarycznej  na  czynniki  ryzyka  miażdżycy  i  kontrolę  glikemii  u chorych z zespołem stopy cu’, 61(3), pp. 275–279.
Ledingham,  J.,  Snowden,  N.  and  Ide,  Z.  (2017)  ‘Diagnosis  and  early  management  of inflammatory arthritis’, Bmj , p. j3248. doi: 10.1136/bmj.j3248.
Li,  N. et  al. (2017)  ‘Wound  healing  process  and  related  laboratory  indexes  in  patients  with type  2  diabetes  mellitus  after  hyperbaric  oxygen  intervention  .’,  28(20),  pp.  9005– 9010.
Nainggolan,  E.  (Puslitbang  B.  dan  F.  B.  P.  dan  P.  K.  and  Kesehatan,  D.  K.  R.  (2009) Prevalensi  dan  Determinan  Penyakit  Rematik  di  Indonesia , Majalah  Kedokteran Indonesia .
Van Neck, J. W. et al. (2017) ‘Hyperbaric oxygen therapy for wound healing in diabetic rats: Varying  efficacy  after  a  clinically-based  protocol’, PLoS  ONE ,  12(5),  pp.  1–16.  doi: 10.1371/journal.pone.0177766.
Novak, S. et al. (2016) ‘Anti-Inflammatory Effects of Hyperbaric Oxygenation during DSS- Induced Colitis in BALB / c Mice Include Changes in Gene Expression of HIF-1 , Proinflammatory Cytokines , and Antioxidative Enzymes’, 2016.  doi: 10.1155/2016/7141430.
Rajnics,  P. et  al. (2017)  ‘iMedPub  Journals  The  Hematologic  Toxicity  of  Methotrexate  in Patients  with  Autoimmune  Disorders  Keywords :  Case  Reports  Patient  ’  s characteristics’, pp. 1–6.
Thom, S. R. (2009) ‘Oxidative stress is fundamental to hyperbaric oxygen therapy’, pp. 988– 995. doi: 10.1152/japplphysiol.91004.2008.
Widdifield, J. et al. (2018) ‘Causes of death in rheumatoid arthritis: How do they compare to the general population?’, Arthritis Care & Research , pp. 0–2. doi: 10.1002/acr.23548.