Menara Perkebunan , 2007, 75 (1), 20-31.
Kultur akar rambut in vitro serta pemanfaatan kultur ganda untuk pertumbuhan dan perkembangan  endomikoriza ( Gigaspora sp. dan Acaulospora sp.)
Hairy root culture in vitro and the application of dual culture  for growth and development of endomycorrhiza ( Gigaspora sp . and Acaulospora sp .)
Nurita TORUAN-MATHIUS 1) , SITI-CHALIMAH 2) , MUHADIONO 3) , Latifah AZNAM 3) &  Said HARAN 3)
1) SEAMEO BIOTROP, Bogor, Indonesia
2) Fakultas MIPA, Jurusan Biologi. Universitas PGRI, Tuban, Jawa Timur, Indonesia
3) Fakultas MIPA, Jurusan Biologi, Institut Pertanian Bogor, Bogor, Indonesia

## Summary
Arbuscular  mycorrhizal  (AM)  fungi  are ecologically important for most vascular plants for  their  growth  and  survival.  AM  fungi  are obligate  symbions,  and  conventionally  propa- gated by pot culture with a certain host plants. This  papers  describes  the  establishment  of monoxenic  cultures  of Gigaspora  sp. and Acaulospora sp  in  association  with  excised  Ri T-DNA  transformed  carrot  roots  and  tomato in  vitro plants.  Spores  of Gigaspora sp . and Acaulospora sp.  was  cultured  in  monoxenic tomato, carrot and hairy root of carrot in vitro cultures. The objectives of these studies were to obtained  dual  culture  (  axenic  and  hairy  root) for  germination,  sporulation,  and  infection  of Gigaspora sp.  and Acaulospora sp.  The research  consisted  of  (i)  host  plant  selection with  high  compatibility  for  hairy  root formation , (ii)  media  selection  for  potato  and carrot  hairy  root  culture, (iii)    hairy  root  of Granola potato and carrot in dual culture, and (iv)  germination,  sporulation,  and  infection  of Gigaspora sp.  and Acaulospora sp. in  vitro culture.  The  results  showed  that  hairy  roots induction  were  obtained  from  Granola, Atlantik  potato  and  carrot    in  MS,  B5  and White  media.  Granola,  Atlantik  potato  and carrot  hairy  root  grow  well  in  MS  and  White medium,  respectively.  In  dual  culture  media (MM media) hairy root of carrot grow well, but
hairy  root  of  Granola  potato  were  inhibited. Germination,  sporulation  of Gigaspora sp . and Acaulospora sp.  and  root    infection  by both CMA could be maintained in dual culture with  host  carrot,  tomato  plants    and  carrot hairy root culture in MM media.
[ Key  words :  Arbuscular-mycorrhizal  fungi, in-vitro culture, hairy root, Gigaspora sp., Acaulospora sp., dual culture].

## Ringkasan
Cendawan  Arbuskular  Mikoriza (CMA) s ecara  ekologi  berperan  penting  untuk  ke- langsungan  hidup  tanaman.  CMA  adalah simbion  obligat,  dan  secara  konvensional  di- perbanyak  dengan  kultur  pot  menggunakan tanaman  inang  tertentu.  Tulisan  ini  menjelas- kan    kultur  monoksenik Gigaspora sp. dan Acaulospora sp. berasosiasi dengan kultur akar rambut  tanaman  wortel  dan  tomat  yang diinokulasi  dengan  Ri  T-DNA.  Spora  dari Gigaspora sp. dan Acaulospora sp . dikultur- kan  secara  monoksenik in  vitro dengan tanaman  tomat,  wortel  dan  kultur  akar  rambut wortel. Tujuan   penelitian  ini   adalah    untuk mendapatkan kultur ganda (aksenik  dan  akar rambut)  untuk  perkecambahan,  sporulasi,  dan infeksi Gigaspora sp.  dan Acaulospora sp.

## Toruan-Mathius et al.
Penelitian terdiri atas  (i) seleksi tanaman inang dengan  tingkat  kompatibilitas  tinggi  untuk pembentukan akar rambut, (ii) seleksi medium untuk  kultur  akar  rambut  wortel,  (iii)    akar rambut  kentang  Granola  dan  kultur  ganda wortel,  dan  (iv)  perkecambahan,  sporulasi, serta  infeksi Gigaspora sp.  dan Acaulospora sp.  dalam kultur in vitro . Hasil yang diperoleh menunjukkan  bahwa  induksi  kultur  akar rambut  diperoleh  dari  kentang  Granola, Atlantik dan wortel dalam medium MS, B5 dan White. Akar rambut kentang Granola, Atlantik dan  wortel  tumbuh  baik  dalam  medium    MS dan White. Akar rambut kentang dapat tumbuh baik  dalam  medium  kultur  ganda,  yaitu medium  MM.  Sebaliknya  pertumbuhan  kultur akar rambut kentang dalam medium yang sama mengalami  hambatan.  Perkecambahan,  sporu- lasi Gigaspora sp.  maupun Acaulospora sp.. serta infeksi akar oleh kedua  jenis CMA dapat dilakukan dalam kultur ganda dengan tanaman inang  wortel,  tanaman  kentang  serta  dengan kultur akar rambut wortel dalam medium MM.

## Pendahuluan
Cendawan mikoriza arbuskular
(CMA)  adalah  mikroorganisme  yang bersifat  simbion  obligat,  karena  tanpa tanaman  inang  (asimbiotik)  pertumbuhan hifanya  sangat  sedikit  dan  hanya  mampu bertahan  hidup  20-30  hari.    CMA  juga bersifat  simbiosis  mutualistik  terhadap inangnya.  CMA  berperan  penting  dalam siklus  hara,  yang  berperan  dalam    mem- perbaiki  struktur  tanah  dan  menyalurkan unsur karbon dari akar ke organisme tanah lainnya.  Di  samping  itu    CMA  mampu mengeluarkan  enzim  fosfatase  dan  asam organik.  Pada  tanah  yang  kahat  fosfat  (P) CMA  dapat  melepas  P  yang  terikat sehingga  membantu  penyediaan  unsur  P (Smith et al., 2003).
Dalam  proses  perkecambahan  spora yang  merupakan  titik  awal  terjadinya
simbiosis  mutualistik  antara  inang  dan CMA,  dimulai  dengan  adanya  eksudat akar  dan  CO 2 yang  dihasilkan  tanaman inang. CMA    segera berubah ke  perkem- bangan  yang  baru  (presimbiotik)    yang ditandai  dengan  percabangan  hifa  secara intensif  (Tamasloukht et  al., 2003). Menurut Juge et al. (2002)  peranan inang adalah  menyediakan  eksudat  akar  untuk mempercepat  pecahnya  tabung  perkecam- bahan  dan  sumber  karbon  untuk  kelang- sungan hidup CMA.
Perbanyakan CMA umumnya dilaku- kan  menggunakan  kultur  pot  mengingat sifatnya  yang    simbion  obligat.  Namun kelemahan  cara  ini  adalah  kurang  efektif karena  spora  yang  dihasilkan  tidak  steril, dan  besar  kemungkinan  terjadi  kontami- nasi  dengan  jamur  hiperparasitik,  atau bakteri  yang  berasosiasi  dengan  dinding spora  yang  sangat  sukar  disterilkan. Kesulitan  yang  dihadapi  dalam  mem- pelajari  simbion obligat dan tujuan praktis untuk  memproduksi  inokulum  CMA secara  masal,  telah  memberikan  motivasi yang  sangat  kuat  untuk  mengkulturkan CMA secara aksenik.
Kultur in  vitro CMA  untuk  pertama kali  berhasil  dilakukan  pada  tahun  1960- an  (Mosse,  1962).  Sejak  itu  keberhasilan kultur  aksenik  atau  monoksenik  CMA menggunakan  berbagai  sumber  inokulum dilaporkan.  Kemajuan  dalam  pemahaman biologi  dari  CMA  sangat  terbatas  pada beberapa  spesies  yang  dapat  diperbanyak dan dipelajari secara in vitro . Sistem untuk mengkulturkan  potongan  akar  dari  ber- bagai spesies tanaman inang dan berbagai formulasi  medium  sudah  dikembangkan untuk  mengkulturkan  CMA  secara  akse- nik. Namun kurang  dari 5% spesies CMA di antaranya Gigaspora margarita (Becard &  Fortin,  1988), Glomus  fasiculatum (Declerck et al., 1998), G. intraradices
Kultur akar rambut in vitro serta pemanfaatan kultur ganda...
(St-Arnaud et al., 1996), G.macrocarpum (Declerck et  al., 1998)  dan G.  versiforme yang  telah  berhasil  ditumbuhkan  dan bersporulasi  dalam  asosiasi  dengan  kultur hairy root (akar rambut) tomat dan wortel. Pembentukan  jaringan  hifa  dengan  akar, dan  appresoria  pada  permukaan  akar  juga dilaporkan  untuk  spora Glomus  eluni- catum yang  berkecambah  dekat  dengan akar  rambut  wortel  (Schreiner  &  Koide, 1993).  Pawlowska et  al. (1999)  telah berhasil  memperbanyak  secara in  vitro Glomus  etunicatum menggunakan  spora istirahat  yang  dikulturkan  dengan  koloni potongan akar dalam medium White yang dimodifikasi.
Gigaspora sp.  adalah  salah  satu CMA yang telah berhasil dikembangkan melalui kultur in  vitro ,  efisien  terhadap  pertum- buhan  tanaman  perkebunan,  diantaranya tanaman  kelapa  sawit  (Widiastuti,  2004), kakao,  jambu  mete  (Trisilawati,  2001). Sedang Acaulospora sp . sejauh  ini  me- rupakan    salah  satu  CMA  yang  belum berhasil  dikembangkan  secara in  vitro . Pada  kenyataannya Acaulospora sp. mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman kelapa sawit  (Widiastuti , 2004), tanaman    manggis  (Lucia,  2005).  Schulz et  al. (1999)  menyatakan  bahwa Acaulo- spora  sp adalah  CMA  yang  cocok  dan efektif  meningkatkan  daya  hidup  planlet kelapa  sawit  dari  40%  (tidak  diinokulasi) menjadi  91%  (diinokulasi).  Upaya  untuk pengembangan  kedua  CMA  tersebut masih  mengalami  kendala  khususnya untuk  perbanyakan  secara  masal  yang masih menggunakan teknik kultur pot.
Tujuan  penelitian  adalah  untuk  men- dapatkan  (i)    tanaman  inang yang  mampu membentuk  akar  rambut,  (ii)  medium terbaik  untuk  pertumbuhan  akar  rambut kentang  dan  wortel,  (iii)  medium  kultur ganda  terbaik  untuk  pertumbuhan  akar
rambut  kentang jenis Granola dan wortel, dan  (iv)  perkecambahan,  sporulasi    dan infeksi Gigaspora sp. dan Acaulospora sp. dalam kultur in vitro .

## Bahan dan Metode
Penelitian  ini  terdiri  dari  beberapa percobaan, yaitu (i) seleksi tanaman inang yang mampu membentuk akar rambut, (ii) seleksi medium pertumbuhan akar rambut kentang dan wortel, (iii) pertumbuhan akar rambut  dan  kentang  jenis  Granola  dan Wortel  pada  medium  kultur  ganda,  dan (iv) perkecambahan, sporulasi  dan infeksi Gigaspora sp. dan Acaulospora sp. dalam kultur in vitro .
(i) Seleksi tanaman inang yang mampu membentuk akar rambut
Bahan  tanaman  yang  digunakan adalah  jagung,  sorgum,  kentang  Granola dan    Atlantik  serta  wortel.  Benih  jagung, sorghum  dan  wortel  disterilkan  dengan alkohol  70%  dan  bayclean  30%,  masing- masing  selama  15  menit  kemudian  dicuci dengan akuades steril. Benih dikecambah- kan  di  dalam  cawan  Petri    berisi  kertas saring yang dilembabkan, sampai berumur dua  minggu.    Selanjutnya  sebanyak  lima kecambah  dari  masing-masing  tanaman dikulturkan  dalam  botol  berisi  medium Murashige  &  Skoog  (1962)  tanpa  zat pengatur tumbuh (MS o ) . Kultur diinkubasi dalam  ruang  bercahaya  12  jam/hari dengan Rh 80-90%. Bahan tanam kentang Granola  dan  Atlantik  yang  digunakan berupa  planlet  berumur  1-2  bulan  berasal dari  Lab.  Kultur  Jaringan  Jurusan. Agronomi  IPB.  Secara  rutin  kultur diremajakan  melalui  penggandaan  tunas aksiler dalam medium MS dengan penam- bahan 0,1 mg/L kinetin.
Toruan-Mathius et al.
Inokulasi  dilakukan  menurut  metode Toruan-Mathius et  al .  (2004).  Sebelum diinokulasikan pada potongan tanaman uji, Agrobacterium  rhizogenes galur  LBA 9457  dikulturkan  dalam  medium  suspensi YMB  dan  dikocok  dengan  mesin  pengo- cok pada kecepatan 100 rpm (12 jam/hari). Kultur  ditempatkan  dalam  ruang  kultur bercahaya 12 jam/hari dengan Rh 80-90%. Kultur  berumur  48  jam  siap  digunakan untuk  inokulasi.  Inokulasi A.  rhizogenes terhadap  tanaman  uji  dilakukan  dengan cara  melukai  potongan  batang  tanaman dan  eksplan  dengan  pisau  bedah  steril, kemudian dipotong-potong sepanjang 2  cm  dan  dikokultivasi  selama  satu  jam dalam  suspensi  bakteri.  Setelah  dikering- kan  di  atas  kertas  saring  steril,  sebanyak lima potong dari masing-masing  tanaman dikulturkan  dalam  medium  MS,  B5 Gamborg, dan White, dengan penambahan 100  mg/L  ampisilin.  Respons  tanaman terhadap A.  rhizogenes ditentukan  ber- dasarkan terbentuk tidaknya akar rambut.
(ii) Seleksi medium pertumbuhan akar rambut kentang dan wortel
Untuk  pertumbuhan  akar  rambut yang  lebih  baik  dari  percobaan  (i), sepanjang  2  cm  potongan  ujung  akar rambut kentang Granola, kentang Atlantik dan  wortel  dikulturkan  dalam  medium MS.  Pengaruh  medium dan  jenis  tanaman terhadap pertumbuhan akar rambut diama- ti  berdasarkan  berat  kering  akar  rambut pada  0,  3,  dan  6  minggu  setelah  dikultur- kan, serta penampakan akar rambut.
(iii) Pertumbuhan akar rambut kentang Granola  dan  wortel  pada  medium kultur ganda
Bahan  tanam  yang  digunakan  adalah akar rambut yang pertumbuhannya terbaik
dari  percobaan  (ii). Potongan  ujung  akar rambut sepanjang 2  cm dikulturkan dalam medium  White  (Minimal  medium,  MM) (Becard  &  Fortin,  1988)  dan  medium Strullu  dan  Romand  (MSR  medium) (Strullu  &  Romand  1986).  Akar  rambut yang  dihasilkan  selanjutnya  digunakan untuk  mengkulturkan Gigaspora sp.  dan Acaulospora sp. Pertumbuhan akar rambut dari  kedua  tanaman  uji  ditentukan  ber- dasarkan  berat  kering  akar  rambut  pada umur 0, 3, dan 6 minggu setelah dikultur- kan.

## (iv) Perkecambahan, sporulasi dan infeksi
Gigaspora sp.  dan Acaulospora sp. dalam kultur in vitro
Untuk perkecambahan, sporulasi serta  infeksi Gigaspora sp.  dan Acaulo- spora sp.  dalam  kultur in  vitro digunakan tanaman  inang  berupa  kecambah  tanaman wortel,  tomat  dan  akar  rambut  yang pertumbuhannya  terbaik  dalam  kultur ganda. Kecambah wortel dan tomat ditum- buhkan  dalam  medium  MS,  dan  setelah berumur  empat  minggu  dipindahkan  ke dalam  medium  kultur  ganda,  yaitu  MM dan    MSR.  Satu  potong  akar  rambut wortel  sepanjang  7  cm  dikulturkan  dalam cawan  Petri  yang  berisi  medium    yang sama untuk kecambah wortel dan tomat.
Spora  dari Gigaspora sp.  dan Acaulospora sp.  yang  sudah  disterilkan menurut    Buce et  al. (2000),    diinoku- lasikan  dengan  cara  memipet  masing- masing sebanyak 10 µL yang berisi 10-15 butir spora, dan menyemprotkannya secara perlahan-lahan dekat ujung akar baik pada kecambah  wortel  dan  tomat  (umur  empat minggu)    serta  akar  rambut  wortel  (umur satu  minggu).  Kultur  tanaman  wortel  dan tomat  diinkubasi  dalam  ruang  kultur bercahaya  12  jam/hari  dan  Rh  80-90%,
Kultur akar rambut in vitro serta pemanfaatan kultur ganda...
sedangkan  kultur  akar  rambut  wortel diinkubasikan  dalam  ruang  gelap.  Peubah yang diamati adalah persentase spora yang berkecambah, jumlah spora yang dibentuk (sporulasi)  dan  infeksi  akar,  yang  diamati tiga  bulan  setelah  diinokulasi.  Perkem- bangan  infeksi  akar  dipelajari  dengan membuat   histologi akar.
Rancangan  percobaan yang digunakan untuk  percobaan  (i),  (ii)  dan  (iii)  adalah Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL).  Untuk percobaan  (i) RAL faktorial 3x3, sebagai faktor  pertama  adalah  jenis  tanaman (kentang  Granola,  kentang  Atlantik  dan wortel). Sebagai faktor kedua adalah jenis medium  (MS,  B5  dan  White).  Untuk percobaan (ii) RAL satu faktor yaitu jenis tanaman  asal  akar  rambut    (kentang Granola,  kentang  Atlantik  dan  wortel), serta  satu  jenis  medium  (MM).  Untuk percobaan  (ii)    RAL  faktorial  2x2x3. faktor pertama adalah jenis medium ( MM dan  MSR),  faktor  kedua  adalah  jenis inokulum,  yaitu Gigaspora sp.  dan Acaulospora sp.,  dan  jenis  inang  (kecam- bah wortel, tomat dan akar rambut wortel).
Data  hasil  penelitian  dari  masing- masing  percobaan  yang  diperoleh  di- analisis  dengan  analisis    varians,  sedang kesimpulan  diambil  berdasarkan  uji  F ( Fisher test ). Apabila hasil uji  F   tersebut menunjukkan beda nyata  atau beda sangat nyata  antar  perlakuan,  maka  pengujian dilanjutkan  dengan  uji  jarak  berganda Duncan (DMRT) dengan tingkat kepercayaan   95% ( P< 0,05).

## Hasil dan Pembahasan
(i) Seleksi  tanaman  inang  yang  mampu membentuk akar rambut
Kelima  jenis  eksplan    menunjukkan respons  yang  berbeda  terhadap  inokulasi
A.  rhizogenes. Tidak  terjadi  induksi pembentukan akar rambut pada kecambah jagung  dan  sorghum  pada  ketiga  jenis medium  yang  diuji.  Sebaliknya  pada eksplan kentang Granola, kentang Atlantik dan  wortel  terjadi  induksi  pembentukan akar  rambut  terjadi  pada  ketiga  medium yang  diuji.  (Tabel  1).  Induksi  pemben- tukan  akar  rambut  tumbuh  terjadi  pada bagian  yang  dilukai  tanpa  didahului  pem- bentukan kalus.
Pada  eksplan  jagung  dan  sorgum tidak  terjadi  induksi  pembentukan  akar rambut.  Hal  ini  kemungkinan  disebabkan kedua  tanaman  tersebut  tergolong  dalam Monokotiledon,  yang  apabila  jaringannya dilukai  tidak  mengeluarkan  senyawa  poli- fenol.  Sebaliknya  pada  kentang  Granola, kentang  Atlantik  dan  wortel  yang  ter- golong  dalam  dikotiledon  memiliki  ke- mampuan  untuk  memproduksi  senyawa fenolik  pada  saat  terjadi  pelukaan. Menurut  Douglas et  al. (1985)  apabila jaringan  tanaman  dilukai  secara  alami akan  mengeluarkan  senyawa  di  antaranya asam  amino,  gula,  dan  senyawa  fenolik. Christey  &  Braun  (2004)  menjelaskan bahwa  pelepasan  senyawa  kimia  tersebut dari jaringan tanaman yang terluka terjadi secara kemotaksis yang akan memberikan sinyal  terhadap  gen  virulen A.  rhizogenes dan  terjadilah  langkah  awal  dari  infeksi. Menurut  Christey  &  Braun  (2004)  dan Sheng  &  Citovsky  (1996) A.  rhizogenes memiliki gen virulen yang tersusun dalam lokus  utama,  yaitu vir  A,  vir  B,  vir  C,  vir D,  vir  E,  vir  G dan vir  H.  Agrobacterium merupakan  bakteri  tanah  gram-negatif yang  termasuk  dalam  kelompok Rhizo- biaceae ,  dan  mempunyai  kemampuan untuk  mentransfer  sebagian  bahan  gene- tiknya  (DNA)  pada  sel  tanaman  melalui pelukaan.  DNA  yang  ditransfer  disebut dengan  T-DNA,  merupakan  potongan
Toruan-Mathius et al.
Tabel  1. Respons    eksplan   sorgum,   jagung, kentang  Granola,  kentang  Atlantik dan  wortel      terhadap A.  rhizogenes galur  LBA  9457,  yang  dikulturkan dalam medium MS, B5 dan  White
Table 1. Respons  of   sorghum,  Granola  and Atlantik potato and carrot explants on
A. rhizogenes var.   LBA     9457,
cultured  in MS, B5 and White media .
Keterangan *):  -  Tidak  terjadi  pembentukan akar  rambut  ( No    formation  of hairy root)
Explanation : +  Terjadi   pembentukan    akar rambut ( The formation of hairy root happened )
beberapa ratus kilo basa dari plasmid yang dikenal dengan Ri plasmid  ( root inducing plasmid )  (Nillson  &  Olsson  1997).  T- DNA  akan  terintegrasi  pada  kromosom tanaman  dan  akan  meng-ekspresikan  gen- gen  untuk  mensintesis  senyawa  opin,  di samping  itu  T-DNA  juga  mengandung onkogen  yaitu  gen-gen  yang  berperan untuk  menyandi  hormon  pertumbuhan auksin  dan  sitokinin.  Apabila  onkogen terekspresi  maka  akan  terjadi  pertum- buhan  cepat  dari  sel.  Ekspresi  onkogen pada plasmid Ri mencirikan pembentukan akar  adventif  secara  besar-besaran  pada tempat yang  diinfeksi  dan  dikenal  dengan ‘ hairy root’ atau akar rambut.
(ii)  Seleksi  medium  pertumbuhan  akar rambut kentang dan wortel
Berdasarkan bobot kering akar rambut diperoleh  adanya  interaksi  antara jenis  medium  dan  jenis  eksplan  terhadap berat  kering  akar  rambut.  Berat  kering akar  rambut  tertinggi  diperoleh  dari tanaman  wortel  yang  dikulturkan  dalam medium  White.  Sedang  untuk  kentang pertumbuhan  akar  rambut    terbaik  diper- oleh  dari  kentang  Granola  yang  ditum- buhkan  dalam  medium  MS    (Tabel  2). Tampak  bahwa  akar  rambut  kentang tumbuh  baik  pada  medium  MS  yang memiliki komposisi nutrisi hara yang lebih lengkap dibandingkan dengan medium B5 dan  medium  White.  Sebaliknya,  akar rambut  wortel  tumbuh  lebih  baik  dalam medium  White  dengan  komposisi  nutrisi hara    yang  lebih  sederhana  khususnya untuk hara makro.
Christey & Braun (2004) melaporkan bahwa  wortel  adalah  salah  satu  spesies yang  rentan  untuk  memproduksi  akar rambut. Ridgway et al.( 2004) menemukan bahwa  potongan  akar  rambut  wortel  yang diinokulasi  dengan A.  rhizogenes A4T dapat tumbuh baik dalam medium Lauria- Bertoni  (+/-  asetosiringon)  atau  dalam medium Yeast Mannitol.
Untuk  pengujian  lebih  lanjut  antara akar rambut dari kedua jenis kentang yang diuji,  akar  rambut  dari  kentang  Granola dan kentang Atlantik disubkultur ke dalam medium  MS.  Hasil  yang  diperoleh menunjukkan  bahwa  pertumbuhan  akar rambut  kentang  Granola  lebih  baik dibandingkan  dengan  pertumbuhan  akar rambut  kentang  Atlantik  (Gambar  1). Berdasarkan  hasil  tersebut  maka  untuk percobaan  kultur  ganda  digunakan  akar rambut kentang Granola dan wortel.
Bahan tanam Plant materilas Medium Media MS B5 White Sorgum (Sorghum) - *) - - Jagung ( Corn ) - - - Kentang Granola Granola potato + + + Kentang Atlantik Atlantik potato + + + Wortel ( Carrot ) + + +
Kultur akar rambut in vitro serta pemanfaatan kultur ganda...
Tabel 2. Berat  kering  akar rambut   kentang   Granola, kentang Atlantik, dan wortel yang  dikulturkan dalam medium  B5, MS, dan White  umur enam minggu setelah dikulturkan.
Table 2. Dry weight hairy roots  of Granola and Atlantik potato, and carrot cultured in B5, MS,  and White media six-week-old  after cultured.
Keterangan*) : Huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P< 0,05).
Explanation *): The same letters in the same coloumn are not significantly different  base on DMRT (P<0.05).
(iii) Pertumbuhan  akar  rambut  kentang Granola dan wortel pada medium kultur ganda
Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan bahwa  dalam  medium  kultur  ganda  MM pertumbuhan  akar  rambut  kentang  Gra- nola  mengalami  hambatan,  sedang  per- tumbuhan  akar  rambut  wortel  tidak  me- ngalami  hambatan  (Gambar  1).  Medium kultur  ganda  MM  memiliki  komposisi dengan konsentrasi hara P sangat   rendah, yaitu  4,4  mg/L  sedang  medium  MS 4170mg/L . Tampaknya komposisi medium asal  dari  akar  rambut  mempengaruhi keberhasilan  akar  rambut  untuk  beradap- tasi  di  dalam  medium  kultur  ganda. Pawlowska et  al .  (1999)  melaporkan bahwa  akar  rambut  wortel  tumbuh  baik dalam  medium  White  yang  ditambah bufer 10 mM MES (pH 6,0) atau MOPSO (pH 6,5).
(iv) Perkecambahan, sporulasi dan infeksi Gigaspora sp.  dan Acaulo- spora sp. dalam kultur in vitro.
Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan adanya  interaksi  yang  nyata  antar  inang, jenis  medium  dan  jenis  CMA  terhadap
jumlah  spora  yang  berkecambah,  sporu- lasi,  dan  infeksi  akar  oleh  kedua  CMA tersebut  (Tabel  3, 4  &  5).  Tampak  bahwa medium  MM  adalah  yang  terbaik  untuk kultur  ganda  ketiga  inang  yang  diuji  baik untuk  perkecambahan,  sporulasi  dan  daya infeksi Gigaspora sp.  maupun Acaulo- spora sp.  dibandingkan  dengan  kultur ganda dalam medium MSR.
Kultur  ganda  antara Gigaspora sp.. dengan inang tanaman wortel,  tomat, dan akar rambut tomat memberikan perkecam- bahan spora dan sporulasi yang sama baik- nya.  Sedang  untuk  infeksi  akar  terbanyak diperoleh  dalam  kultur  ganda  dengan inang  tanaman  wortel  dan  tomat.  Ketiga inang  yang  diuji    memberikan  perkecam- bahan  spora Acaulospora sp..  yang  sama baiknya.  Namun  untuk  sporulasi  dan banyaknya infeksi akar yang terjadi  diper- oleh  dalam   kultur    ganda menggunakan inang tanaman wortel.
Perkecambahan Gigaspora sp.  mulai terlihat  15  -  20  hari  setelah  inokulasi, sedang untuk Acaulospora sp. terjadi lebih lambat  yaitu    30  -  50  hari  setelah  inoku- lasi.  Perkecambahan selalu terjadi melalui pembentukan hifa-hifa seperti benang ang tumbuh  ke  segala  arah (Gambar 2a & b),
Medium Media Kentang Atlantik Atlantik potato Kentang Granola Granola potato Wortel Carrot ------------------------   mg  ------------------------------------- B5 5,80 e*) 8,44 d 5,26 f MS 8,86 c 13,94 b 3,40 h White 4,66 g 4,50 g 36,02 a
Gambar  1.  Pertumbuhan  akar  rambut  dalam  medium  MS  (A)  dan  MM  (B)  umur  0,  3  dan  6  minggu setelah tanam.
Figure 1.    The growth of hairy root in MS (A) and MM (B)  media 0,  3,  and 6  weeks after  cultured.
Perkembangan  selanjutnya  terbentuk  hifa eksternal  dan  melakukan  infeksi  akar (Gambar  2c  dan  d).  Setelah  tiga  bulan kemudian tampak bahwa hifa   mengalami proliferasi  sangat  cepat  dan  pada  lapisan epidermis  tanaman  inang  membentuk apresoria,  hifa  internal  (Gambar  2g), arbuskula    (Gambar  2h),  hifa  koil  dan vesikula (Gambar 2i).
Pada medium MM dengan akar rambut wortel,  waktu  perkecambahan  terjadi hampir sama  dengan kultur akar aksenik. Lebih dari 70% spora berkecambah (Tabel 3). Gigaspora sp.  dan Acaulospora sp. membentuk  koloni  di  dekat  ujung  akar rambut. Setiap koloni fungi tersebut selalu diawali dengan beberapa percabangan dari satu  hifa  yang  akan  berproliferasi  dekat dengan  akar.  Penetrasi  hifa  ke  dalam
jaringan epidermal dan sel kortikal segera terjadi melalui titik infeksi yang berbentuk spiral.  Arbuskular  dibentuk  dalam  lapisan yang  lebih  dalam  dari  kortikal  sel  dan akhirnya  terjadi  percabangan  (Gambar 2d).
Kolonisasi  akar  selanjutnya  diikuti dengan  pembentukan  spora  baru  atau sporulasi.  Sporulasi  sangat  jelas  terlihat berdasarkan  penampakan  pada  beberapa bagian    akar  tanaman  inang  wortel  dan tomat  maupun  akar  rambut  yang  pecah atau  terbelah,  dan  tampak  beberapa  spora ekstraradikal  (Gambar  2e  &  f).  Jumlah sporulasi yang diperoleh dalam waktu tiga bulan  setelah  inokulasi  relatif  rendah. Tampaknya sporulasi dalam kultur in vitro khususnya  menggunakan  akar  rambut memerlukan  waktu  inkubasi  yang relatif
0 3 6 Umur ( minggu )
Age (week)
Kentang Atlantik Atlantik potato Kentang Granola
Granola potato 160 140 120 100 80 60 40 20 10 0 B o b o t k er in g a k ar r a m b u t (m g ) D ry w ei g h t h a ir y ro o ts ( m g ) 0 3 6 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 B o b o t k er in g a k ar r a m b u t (m g ) D ry w ei g h t h a ir y ro o ts ( m g ) Kentang Atlantik Atlantik potato Kentang Granola Granola potato Umur ( minggu ) Age (week) A B A
Kultur akar rambut in vitro serta pemanfaatan kultur ganda...
Tabel 3. Pengaruh inang tanaman wortel, tomat, dan akar rambut wortel yang dikulturkan dalam medium  MM dan MSR terhadap jumlah  spora Gigaspora sp.  dan Acaulospora sp.  yang  berkecambah,  tiga bulan setelah diinokulasi.
Table 3. Effect of  carrot, tomato, and carrot hairy root as a host cultured in MM and MSR media  on the  number of spores  germinated  of Gigaspora sp . and Acaulospora sp.,  three  month   after inoculation.
Gigaspora sp .
Acaulospora sp . Medium kultur ganda Dual culture media Wortel Carrot Tomat Tomato Akar rambut Hairy root Wortel Carrot Tomat Tomato Akar rambut Hairy root MM 78,7 a 54,4b 70,7a 76,5a 67,6a 73,7 a MSR 24,0de 12,0f 30,8cd 19,3ef 10,3f 41,3c
Keterangan : Huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P< 0,05)
Explanation: The same letters in the same coloumn are not significantly different base on DMRT  (P<0.05)
Tabel 4. Pengaruh inang tanaman wortel, tomat, dan akar rambut wortel yang dikulturkan  dalam   medium MM dan MSR terhadap sporulasi Gigaspora sp. dan Aacaulospora sp., tiga bulan setelah diinokulasi.
Table 4. Effect of carrot, tomato and carrot hairy root as a host, cultured in MM and MSR media on the number of sporulation of Gigaspora sp. and Acaulospora sp., three months after inoculation.
Medium kultur ganda Dual culture media Gigaspora sp. Acaulospora sp. Wortel Carrot Tomat Tomato Akar rambut Hairy root Wortel Carrot Tomat Tomato Akar rambut Hairy root MM 3,6c 3,6c 3,6c 12,00a 9,0b 10,2b MSR 1,4 d 1,4d 2,0cd 2,0cd 1,8cd 1,4d
Keterangan: Huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P< 0,05)
Explanation: The same letters in the same  coloumn are not significantly  different  base  on DMRT (P<0.05)
Tabel  5.  Pengaruh  inang  tanaman  wortel,  tomat,  dan  akar  rambut  wortel  yang  dikulturkan  dalam  medium  MM  dan MSR  terhadap   infeksi   akar  oleh Gigaspora sp. dan Aacaulospora sp., tiga bulan setelah diinokulasi.
Table 5. Effect of carrot, tomato  and carrot hairy root as a host cultured in MM and MSR media  on roots infection of Gigaspora sp . and Acaulospora sp ., three months after inoculation.
Gigaspora sp.
Acaulospora sp . Medium Media Wortel Carrot Tomat Tomato Akar rambut Hairy root Wortel Carrot Tomat Tomato Akar rambut Hairy root Kultur ganda Dual culture 60,2b 60,8b 56,2b 72,0a 58,0b 57,8b SR 30,0c 15,8d 13,00d 31,00c 30,2c 34,6c
Keterangan: Huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT (P< 0,05)
Explanation : The same letters in the same coloumn are not significantly different base on DMRT  (P<0.05)
Toruan-Mathius et al.
lebih  lama.  Menurut  Diop et  al. (1992) simbiosis Gigaspora  margarita yang diinokulasikan  pada  akar  rambut  tanaman wortel,  sporulasi  terjadi  empat  bulan setelah diinokulasi dan berlangsung relatif lambat.  Sporulasi lebih aktif dimulai 6-12 bulan  setelah  inokulasi.  Perkembangan spora Gigaspora sp.  dimulai  dengan penebalan  dinding  spora,  yang    diikuti dengan  peningkatan  pigmentasi  dinding spora  sebelah  dalam.  Spora  yang  masih muda  ditandai  dengan  warna  putih  susu sampai  bening,  sedang  sitoplasma  penuh dengan struktur granular.  Isi spora akan
berubah  menjadi  lebih  pekat  diikuti dengan  pigmentasi  dinding  sel  sebelah dalam  yang  berlangsung  sangat  cepat,  hal ini  menyebabkan  spora  yang  sudah  tua sangat  mudah  dilihat.  Spora Acaulospora sp.  yang  masih  muda  berwarna  cokelat muda,  dan  dengan  perkembangan    lebih lanjut  terjadi pigmentasi yang sangat aktif di dalam spora, menyebabkan warna spora berubah  menjadi  cokelat  tua  (Gambar  2a s/d i).
Medium  MM  lebih  sesuai  untuk  per- kecambahan,  sporulasi,  dan  infeksi  akar tanaman inang oleh  CMA  yang diuji, hal
c a d f e i h g b
Gambar  2.  Perkembangan  dan  perubahan  struktur Gigaspora sp.  dan Acaulospora sp.  dalam  akar  inang umur tiga bulan setelah tanam; (a). Gigaspora sp. yang berkecambah; (b). Acaulospora sp. yang berkecambah; (c). hifa eksternal Gigaspora sp.; (d). hifa eksternal Acaulospora sp.; (e). sporulasi dari Gigaspora sp.; (f). sporulasi Acaulospora sp.; (g). hifa internal dan sekunder; (h). hifa koil vesikula  dan (i). hifa koil arbuskula.
Figure 2.  The  development and  the  changes of Gigaspora sp. and Acaulospora sp. structures in hosts plant,  three  month  old  after  cultured;  (a).  germination  of Gigaspora sp.;  (b).  germination  of Acaulospora sp.;  (c).  external  hypha  of Gigaspora sp.;  (d).  external  hypha  of Acaulospora sp.; (e).  sporulation  of Gigaspora sp.;  (f).  sporulation  of Acaulospora sp.;  (g).  external  and secondary hypha; (h). hypha coil vesicular hypha, and (i). hypha coil arbuscular.
Kultur akar rambut in vitro serta pemanfaatan kultur ganda...
hal  ini  disebabkan  kandungan  fosfatnya lebih  rendah  (4,4  mg/L)  dibandingkan dengan  medium  MSR  yang  kandungan fosfatnya  sebanyak  68  mg/L.  Labor et  al. (2003)  menyatakan  bahwa  konsentrasi fosfat  yang  tinggi  dalam  medium  dapat menghambat  proses  sporulasi  dan  koloni- sasi  akar  oleh  CMA.  Konsentrasi  P  yang rendah, merangsang pembentukan eksudat akar lebih banyak.
Menurut  Tamasloukht et  al .  (2003) simbiosis  antara  CMA  dengan  akar tanaman  inang  dimulai  setelah  spora berkecambah  yang  ditandai  dengan  per- cabangan hifa yang aktif dan pembentukan hifa  eksternal.  Setelah  melakukan  kontak dengan  akar,  akan  membentuk  appre- sorium, dan membentuk hifa internal, hifa interseluler,  arbuskula  dan  vesikula  untuk Acaulospora sp.,  sedang Gigaspora sp. tidak  membentuk  vesikula.  Akar  yang terinfeksi  selanjutnya  dapat  membentuk spora  baru  (sporulasi).  Jadi  akar  yang terinfeksi  dengan  pewarnaan  triplan  biru akan  terlihat  hifa  eksternal,  apresorium, hifa  internal,  arbuskula,  vesikula  dan kadang-kadang  adanya  spora  baru.  Hal tersebut  juga  dinyatakan  oleh  Jane et  al . (1998)  bahwa  spora  yang  berkecambah akan  melakukan  kontak  dengan  akar membentuk  apresorium  dan  berkembang membentuk  hifa  internal,  hifa  intrasel, arbuskula, vesikula dan hifa koil.

## Kesimpulan
Dari  hasil  penelitian  yang  diperoleh dapat disimpulkan bahwa:
1. Eksplan  tanaman  wortel,  kentang Granola dan kentang  Atlantik mampu membentuk akar rambut setelah diinokulasi dengan A. rhizogenes galur LBA  9475,  yang  dikulturkan      dalam medium MS, B5 dan White.
2. Medium MS adalah yang terbaik untuk pertumbuhan  akar  rambut  kentang Granola  dan  kentang  Atlantik,  sedang medium  White  baik  untuk  pertum- buhan  akar rambut wortel.
3. Dalam  medium  MM  yang  digunakan untuk kultur ganda, akar rambut wortel dapat berkembang dengan baik, sedang  pertumbuhan    akar  rambut kentang  Granola  mengalami  ham- batan.
4. Kultur    ganda  antara  akar  rambut  dan CMA  menggunakan  medium  MM dapat  dimanfaatkan  untuk  perkecam- bahan,  sporulasi  dan  infeksi Giga- spora sp.  maupun Acaulospora sp.. secara in vitro

## Daftar Pustaka
Buce,  M.,  M.  Rossignol,  A.  Jauneau, R.  Ranjeva  &  G.  Becard  (2000).  The presymbiotic growth of arbuscula mycorrhizal  fungi  is  induced  by  a branching  factor  partially  purified  plant root exudates. Mol. Plant., 13 , 693 -698.
Bécard, G., & J.A. Fortin (1988). Early events of
vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots. New Phytol., 108 ,211-218.
Christey,  M.C.  &  R.H.  Braun  (2004). Production  of  hairy  root  and  transgenic plants  by Agrobacterium  rhizogenes - mediated  transformation. In Pena,  L  (ed) Methods  in  Molecular  Biology. Vol.  268, Transgenic Plants. p.47-60.
Declerck,  S.D.,  G.  Strullu  &  C.  Plenchette (1998). Monoxenic culture of the intraradical  forms  of Glomus  sp .  Isolated from  a  tropical  ecosystem:  a  proposed methodology  for  germplasm  colection. Mycologia, 90 , 579-585.
Diop,T.A., G.Becard & Y. Piche (1992). Long term in  vitro culture  of  an  endomycor- rhizal fungus, Gigaspora margarita , on Ri- TDNA transformed root of carrot. University  Laval . Balapan  ,  Philadelphia , p 249 – 259.
Douglas, C.J., R.J.Stanloni R.J., R.A. Rubin & E.W.  Nester  (1985).  Identification  and genetic  analysis  of  an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence
region. J. Bacteriol ., 161 ,850-860.
Kultur akar rambut in vitro serta pemanfaatan kultur ganda...
Jane,  B.S.  &    T.D.G.  Delp  (1998).  Regulation of  root  and  fungal  morphogenesis  in Mycorrhizal Symbioses, 116 ,1201-1207.
Juge,  C.,  J.  Samson,  C.  Bestien,  H.Vierheilig, A. Coughlan & Y. Piche (2002). Breaking dormancy  in  spores  of  the  arbuscular mycorrhizal  fungus Glomus  intraradies :  a critical  cold-storage  period. Mycorrhiza , 12 , 37-42.
Labour,  K.,  Mario  Jolicae,    S.T.  Marc  & Armaud  (2003).  Arbuscular  mycorrizae responsivenes of in vitro tomato root lines is  not  related  to  growth  and  nutrient uptake. Plant Physiol ., 124 ,943-953.
Lucia, Y. (2005). Cendawan mikoriza arbuskula  di  bawah  tegakan  tanaman manggis  dan  peranannya  dalam  per- tumbuhan bibit manggis ( Garcinia
mangostana ), Tesis. Bogor , Sekolah Pascasarjana IPB.
Mosse,  B.  (1962).  The  establishment  of vesicular-arbuscular mycorrhiza under aseptic  conditions. J.  Gen . Microbiol ., 27, 500-520.
Nillson, O. & O.O1sson (1997). Geeting to the root  :  The  role  of  the Agrobacterium rhizogenes  rol genes  in  the  formation  of hairy roots. Physiol Plant., 100, 463-473.
Pawloska, T. E., D. D. Douds Jr &   I. Charvat (1999). In  vitro propagation  and  life  cycle of  the  arbuscular  mycorrhizal  fungus Glomus etunicatum . Mycol. Res ., 103 (12), 1549-1556.
Ridgway,  H.J.,  J.  Kandula    &  A.  Stewart (2004).  Optimising  production  of  carrot hairy  roots. In 57 th Conf.  Proc.  The  New Zeland Plant Protection Soc. Inc . p.77-80.
Strullu,  D.G.  &  C.  Romand  (1986).  Methode axenique de vesicules a partir d’endomycorrhizae  et  re-association  in vitro  a’desracines  de  Tomate.C.R. Acad Sci. Paris, 303, 245-250.
Schreiner,  R.  P.  &  R.T.  Koide  (1993). Stimulation  of  vesicular-arbuscular  fungi by mycotrophic and non mycotrophic plant root  system. Appl.  Environ . Microbiol., 59 ,2750-2752.
Schultz,C.,  Subronto,  Sjafrul  Latif,  A.M. Moawad  &  P.L.G.Vlek  (1999).  Peranan mikoriza vesikuler-arbuskuler (MVA) dalam  meningkatkan  penyesuaian  diri plantlet  kelapa  sawit  terhadap  kondisi lingkungan tumbuh alami. Jurnal
Penelitian Kelapa Sawit , 7 (3),145-156.
Sheng,  J.  &  V.  Citovsky  (1996). Agrobac- terium plant  cell DNA  transport  :  have virulence  proteins,  will  travel. Plant  Cell,
8 ,  1699-1710.
Smith, S.E.,  F.A.  Smith    &  I.  Jacobsen
(2003).   Mycorrhizal  fungi  can dominate phosphate  supply  to  pints  irrespective  of growth responses. Plant Physiol ., 133 ,6-20.
St-Arnaud, M., C.Hamel, B. Vimard, M. Caron &  J.A.  Fortin  (1996).  Enhanced  hyphal growth  and  spore  production  of  the arbuscular  mycorrhizal  fungus Glomus intraradices in  an in  vitro system  in absence  of  host  roots. Mycol Res., 100,
328-332.
Tamasloukht, M., A.N.Sejalon-Delmas, A.  Kluever,  J.C.  Roux,  G.  Becard  &
P.  Franken  (2003).  Root  factors  induce mitochondrial-related  gene  express  fungal respiration  during  the  developmental switch  for  asymbiosis  to  presymbiosis  in the    arbuscular    mycorrhiza Gigaspora rosea . Plant Physiol ., 131 (3),1468-1478.
Toruan-Mathius,  N.,    Reflini,  Nurhaimi-Haris, Joko-Santoso    &  A.  Priangani-Roswiem (2004).  Kultur  akar  rambut Cinchona ledgeriana dan C.  Succirubra dalam kultur in vitro. Menara Perkebunan ,  2004,
72(2), 69-84.
Trisilawati,  O.,  T.  Supriatun  &  I.  Indrawati (2001).  Pengaruh  mikoriza  arbuskula  dan pupuk  fosfat  terhadap  pertumbuhan  jambu mete pada tanah podsolik merah kuning. J. Biol . 3 (2), 91-98.
Widiastuti,  H.  (2004).  Biologi  interaksi cendawan  mikoriza  arbuskula  kelapa sawit  pada  tanah  masam  sebagai  dasar pengembangan  teknologi  aplikasi  dini. Desertasi Sekolah  Pascasarjana,    IPB, Bogor.