Pengaruh Gula Reduksi dan Total Nitrogen Terhadap Densitas dan Viabilitas Sel Saccharomyces cerevisiae dalam Fermentasi Etanol dari Molase
Ekwan Nofa Wiratno 1 , Tri Ardyati 1 *, Agustin Krisna Wardani 2
1 Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya, Malang
2 Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas THP, Universitas Brawijaya, Malang

## ABSTRAK
Fermentasi  etanol  dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor,  yaitu  kualitas  mikroba  (densitas  dan  viabilitas  sel khamir), kondisi lingkungan fermentasi (suhu, pH dan oksigen terlarut) dan kualitas media fermantasi. Penelitian ini bertujuan  mengetahui  pengaruh  variasi  total  nitrogen  dan  gula  reduksi  terhadap  densitas  dan  viabilitas  sel Saccharomyces cerevisiae (SAF Instan) selama proses fermentasi etanol dari molase.  Tahapan penelitian ini terdiri dari pengukuran kadar gula reduksi, total nitrogen, konsentrasi kalsium, penentuan densitas dan viabilitas sel khamir serta analisis data. Fermentasi dilakukan selama 72 jam dengan 3 ulangan. Perlakuan konsentrasi gula reduksi (GR) dan total nitrogen (N) yaitu GR 100 N 0, GR 100 N 6, GR 100 N 10, GR 125 N 0, GR 125 N 6 dan GR 125 N 10 g/l. Penghitungan viabilitas sel dilakukan setiap 24 jam. Viabilitas tertinggi adalah GR 125 N 0 (95,76 %) dan GR 100 N 6  (95,96  %).  Penurunan  viabilitas  sel  disebabkan  oleh  rendahnya  perkembangbiakan  sel  khamir  (tidak  terjadi peningkatan jumlah sel secara signifikan (p>0,05)). Hal ini terjadi karena tingginya konsentrasi kalsium (0,21 %).
Kata kunci: densitas, molase, Saccharomyces cerevisiae , kalsium, viabilitas

## ABSTRACT
Ethanol fermentation influenced by many factor,  there are microbe quality (density and viability of  yeast  cell),  environmental  condition  (temperature,  acidity  and  dissolved  oxygen)  and  quality  of fermentation medium. Aim of this research is to know effect of reducing sugar and total nitrogen variation to cell density and viability during ethanol fermentation with molasses by Saccharomyces cerevisiae (SAF Instant ).  Step of this research are determination of reducing sugar, total nitrogen and calcium, density and viability cell counting and data analysis. Treatment of reducing sugar (GR) and total nitrogen (N) there are GR 100 N 0, GR 100 N 6, GR 100 N 10, GR 125 N 0, GR 125 N 6 and GR 125 N 10 g/l. Fermentation was carried out for  72 hours  with triplicates.  Cell viability observed every 24 hours. High cell viability are  GR  125  N  0,33  (95,76  %)  and  GR  100  N  6  (95,96  %).  Decrease  of  cell  viability  caused  by  low  of yeast reproduction. Low of yeast reproduction caused by high cancium concentration (0,21 %).
Key word: calcium, density, molasses, Saccharomyces cerevisiae , viability
* Corresponding author:
E-mail: tri_ardyati@yahoo.com Laboratorium Mikrobiologi, FMIPA-UB

## PENDAHULUAN
Keterbatasan  minyak  bumi  menyebabkan perlunya dilakukan peningkatan produksi bioenergi sebagai  alternatif  pengganti  bahan  bakar  fosil. Penggunaan  bionergi  memiliki  keuntungan  utama antara  lain  terbaharukan  dan  dampak  negatif penggunaannya  terhadap  lingkungan  jauh  lebih rendah  dibandingkan  dengan  penggunaan  bahan bakar  fosil  [1].  Produksi  minyak  bumi  Indonesia semakin  menurun,  sedangkan  kebutuhan  terhadap produk  turunannya  semakin  meningkat,  seiring dengan meningkatnya jumlah penduduk. Perbandingan  kebutuhan  terhadap  etanol  dan produksinya pada tahun 2012 mencapai 15:1 [2].
Mikroba  yang  aktif  dalam  perubahan  glukosa menjadi  etanol  adalah  khamir  dari  spesies Saccharomyces  cerevisiae .                  Pertumbuhan khamir  merupakan  salah  satu  faktor  yang berpengaruh terhadap produksi etanol. Pertumbuhan  khamir  dipengaruhi  oleh  faktor nutrisi  dan  faktor  lingkungan.  Nutrisi  utama  yang penting dalam kehidupan sel khamir adalah sumber karbon, nitrogen, oksigen dan hirdogen. Bahan lain yang  diperlukan  dalam  jumlah  sedikit  untuk komponen  sel  yaitu  unsur  fosfor,  sulfur,  kalium dan  magnesium.  Diperlukan  pula trace  minerals dan growth  faktor berupa  asam  amino,  purin, pirimidin  dan  vitamin. Growth  faktor yang  paling penting  untuk  khamir  meliputi  biotin,  asam pantotenat,  inositol,  thiamin,  asam  nikotinat  dan asam folat. Faktor lingkungan terdiri dari suhu, pH, oksigen dan tekanan udara [3].
Bahan  baku  utama  untuk  produksi  etanol  di Indonesia  adalah  tetes  tebu  (molase).  Bahan  ini digunakan  karena  merupakan  limbah  pabrik  gula dan  tidak  banyak  dimanfaatkan  sebagai  bahan pangan pokok, seperti halnya dengan bahan berpati [1].
Molase lebih umum digunakan sebagai bahan baku  industri  etanol  karena  tidak  memerlukan proses  awal  terlebih  dahulu  seperti  bahan  berpati atau berselulosa [4]. Namun, penggunaan konsentrasi  gula  reduksi  dalam  molase  sebagai sumber  karbon  dan  nutrisi  tambahan  berupa  urea sebagai  sumber  nitrogen  sangat  bervariasi  pada tiap industri yang memanfaatkannya. Penelitian ini penting  dilakukan  untuk  mengetahui  variasi penggunaan  gula  reduksi  dan  total  nitrogen terhadap  viabilitas  sel  khamir  sehingga  dapat meningkatkan produksi etanol.

## METODE PENELITIAN
Pengukuran  Total  Nitrogen. Pengukuran total nitrogen molase dengan metode Kjeldahl [5].
Pengukuran  Konsentrasi  Gula  Reduksi. Pengukuran  konsentrasi  molase  murni  dan  molase selama  tiap  24  jam  pada  proses  fermentasi dilakukan  dengan  metode 3,5-dinitrosalicylic (DNS) [6].
Pengukuran  Konsentrasi  Kalsium  (Ca). Pengukuran  konsentrasi  kalsium  molase  dengan metode standart nasional [5].
Fermentasi Etanol. Molase  diencerkan dengan  akuades  hingga  memiliki  konsentrasi  gula reduksi  125  g/l  dan  ditambahkan  urea  sebanyak 0,37 g/l (pH 5,5). Molase tersebut dipanaskan pada suhu  100  °C  selama  10  menit.  Proses  fermentasi terdiri dari pembiakan ( enrichment ), prefermentasi dan fermentasi.
Sebanyak  20  ml  molase  steril  ditambahkan  2 g baker  yeast SAF  Instan  Gold  Label  dan dihomogenkan  dengan  kecepatan  120  rpm  selama 3 jam pada suhu 30 °C (Pembiakan). Hasil tersebut dimasukkan  ke  dalam  molase  steril  hingga volumenya  200  ml  dan  dihomogenkan  dengan kecepatan 120 rpm selama 12 jam pada suhu 30 °C (Prefermentasi). Setelah itu dipindahkan ke molase steril dengan konsentrasi gula reduksi dan nitrogen sebagai  perlakuan  (Tabel  1)  hingga  volumenya 1000 ml dan dihomogenkan dengan kecepatan 300 rpm selama 72 jam.
Tabel  1. Perlakuan  konsentrasi  gula  reduksi  dan  total nitrogen
Densitas  dan  Viabilitas  Sel  Khamir. Densitas  dan  viabilitas  sel  khamir  ditentukan dengan  metode  Petroff-Hauser  menggunakan hemositometer (Persamaan 1) [7].
Viabilitas sel =                                X 100 %       (1)
No Perlakuan Gula Reduksi (g/l) Total Nitrogen (g/l) 1 100 2,7 2 100 6 3 100 10 4 125 3,3 5 125 6 6 125 10
Jumlah sel hidup Jumlah total sel

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Terjadi  penurunan  viabilitas  sel  khamir seiring  dengan  peningkatan  waktu  inkubasi (Gambar  1).  Penurunan  viabilitas  sel  khamir tercepat terjadi  pada  perlakuan  GR  100  N  10.  Hal ini  disebabkan  oleh  rendahnya  konsentrasi  gula reduksi  (100  g/l)  dan  tingginya  konsentrasi nitrogen  (10  g/l)  dalam  media.  Meskipun  dengan konsentrasi  total  nitrogen  sama,  tetapi  perlakuan GR  125  N  10  memiliki  viabilitas  sel  yang  lebih tinggi.  Hal  ini  dapat  disebabkan  karena  gula reduksi  dalam  media  tersebut  lebih  tinggi. Viabilitas  tertinggi  adalah  GR  125  N  0  (95,76  %) dan GR 100 N 6 (95,96 %).
Gambar 1 . Viabilitas sel khamir berbagai perlakuan selama waktu fermentasi GR 100 N 2,7 (♦), GR 125 N 3,3 (◊), GR 100 N 6 (■), GR 125 N 6 (□), GR 100 N 10 (▲), GR
125 N 10 (Δ)
Gambar 2 . Densitas sel khamir berbagai perlakuan selama waktu fermentasi GR 100 N 2,7 (♦), GR 125 N 3,3 (◊), GR 100 N
6 (■), GR 125 N 6 (□), GR 100 N 10 (▲), GR 125 N 10 (Δ)
Penurunan  viabilitas  sel  menunjukkan  bahwa perkembangbiakan sel khamir mengalami penghambatan  karena  tidak  terjadi  peningkatan jumlah  sel  secara  signifikan  (p>0,05)  selama proses  fermentasi  (Gambar  2).  Secara  umum, ketika  awal  proses  fermentasi  (24-48  jam)  terjadi kenaikan  jumlah  sel  khamir  sehingga  etanol  yang dihasilkan juga mengalami kenaikan yang signifikan [8; 9]. Hal ini disebabkan oleh tingginya konsentrasi kalsium (0,21 %) dalam media molase [10].
Sel Saccharomyces cerevisiae yang berbentuk pseudohifa  pada  fase  perkembangan  vegetatif (Gambar  3)  terjadi  apabila  terjadi  kekurangan nitrogen  [11].    Hal  ini  disebabkan  oleh  proses meiosis  yang  terjadi  cepat  sedangkan  pemisahan sel anak dan sel induk belum terjadi. Pembentukan pseudohifa  memberikan  keuntungan  bagi  khamir dalam  pencarian  nutrisi.  Selain  faktor  kekurangan nitrogen, pembentukan pseudohifa dapat disebabkan  karena  ketidakmampuan  khamir  untuk mengonsumsi  gula,  terlalu  terbatasnya  oksigen [12],  tingginya  fosfat  [13]  dan  rendahnya  sumber karbon  [14].  Tetapi,  pseudohifa  ternyata  terjadi pula  pada  kondisi  hipernitrogen  (>  6  g/l)  dan tingginya  konsentrasi  gula  reduksi  (>  100  g/l) (Gambar  3).  Munculnya  pseudohifa  pada  media yang  kaya  nitrogen  dimungkinkan  terjadi  akibat pengaruh isoamyl alcohol (IAA) [15; 16].
Gambar  3 . Saccharomyces cerevisiae yang mengalami pseudohifa  pada  perlakuan  total  nitrogen 10 g/l,
a.  Gula  reduksi  100  g/l,  b.  Gula  reduksi  125 mg/l dan c. Sel normal
KESIMPULAN a b c
Berdasarkan  hasil  penelitian  diketahui  bahwa secara umum terjadi penurunan viabilitas sel. Viabilitas sel  khamir  tertinggi  pada  perlakuan  GR  125  N  0,33 (95,76  %)  dan  GR  100  N  6  (95,96  %).  Penurunan viabilitas  sel  disebabkan  oleh  perkembangbiakan  sel khamir mengalami penghambatan (tidak terjadi peningkatan jumlah sel secara signifikan (p>0,05)). Hal ini  terjadi  karena  tingginya  konsentrasi  kalsium  (0,21 %).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  terima  kasih  kepada Dr.  Suharjono,  M.  Si.,  Dr.  Elok  Zubaidah  dan Yoga  Dwi  Jadmiko,  M.App.Sc.  atas  segala dorongan,  dukungan  dan  saran  yang  sangat mendukung terselesaikannya jurnal ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Kurniawan,  Y.,  A.  Susmiadi  dan  A.  Toharisman. 2005. Potensi Pengembangan Industri Gula Sebagai Penghasil  Energi    Di  Indonesia ,  Pusat  Penelitian Perkebunan Gula Indonesia (P3GI), Pasuruan.
[2] ESDM. 2012. Produksi, konsumsi, ekspor dan impor minyak Indonesia 2009. http://www.migas.esdm.go.id/wap/?op=Berita&id=2
787. Diakses 26 Juni 2012.
[3]  Loureiro,  V.  dan  M.  Malfeito-Ferreira.  2003. Spoilage yeasts in the wine industry, Int. J. of Food. Microb, 86 , 23-50.
[4] da Silva, G.P., E.F. de Araújo, D.O. Silva dan W.V. Guimarães.  2005.    Ethanolic  Fermentation  of Sucrose,  Sugarcane  Juice  and  Molasses  by Escherichia  Coli  Strain  Ko11  and  Klebsiella
Oxytoca Strain P2. Braz. J. of Microb.. 36 , 395-404.
[5]  Sudarmadji,  S.,  Haryono  dan  B.  Suhardi.  1996. Analisa  Bahan  Makanan  dan  Pertanian . Penerbit
Liberty, Yogyakarta.
[6]  Miller,  G.L.  1959.  Use  of  Dinitrosalicylic  Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem.. 3 , 426-248.
[7]  Doyle,  A.  dan  J.B.  Grififths.  2000. Cell  and  tissue culture  for  medical  research. John  Wiley  &  Son,
New York.
[8] Supriyanto, T. dan Wahyudi. 2010. Proses Produksi Etanol  oleh Saccharomyces  cerivisiae dengan Operasi  Kontinyu  pada  Kondisi  Vakum,  Jurusan
Teknik Kimia Universitas Diponegoro, Semarang.
[9] Ingledew, M.W.. 1993. Yeasts for production of fuel ethanol. The Yeasts 5 , 245-286.
[10] Balakumar, S. dan V. Arasaratnam. 2009.   Comparison  of  industrial  scale  ethanol production  from  palmyrah-based  carbon  source  by
commercial  yeast  and  a  mixed  culture  from palmyrah toddy, J. of Instr. Brew. 115 , 105-109.
[11] Chotineeranat, S., R. Wansuksri, K.
Piyachomkwan,  P.  Chatakanonda,  P.  Weerathaworn dan  K.  Sriroth  .  2010.  Effect  of  calcium  ions  on ethanol production from molasses by Saccharomyces cerevisiae . Sug. Tech. 12 , 120-124.
[11]  Ceccata-Antonini,  S.R.  dan  P.E.  Sudbery.  2004. Filamentous  Growth  in Saccharomyces  cerevisiae . Braz. J. of Microb. 35 , 73-181.
[12]  Gimeno,  C.J.,  P.O.  Ljungdahl,  C.A.  Styles  dan G.R. Fink. 1992. Unipolar cell divisions in the yeast Saccaromyces  cerevisiae lead  to  filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68 , 1077-1090.
[13]  Sudbery,  P.,  N.  Gow  dan  J.  Berman.  2012.  The distinct  morphlogenic  states  of Candida  albicans , Trends in Microb. 23 , 1-8.
[14]  Lorenz,  M.C.,  S.  Cutler  dan  J.  Heitman.  2000. Characterization  of  Alcohol-induced  Filamentous Growth  in Saccharomyces  cerevisiae . Mol.  Biol.  of the Cell . 11 , 183–199.
[15]  Ceccata-Antonini,  S.R.  dan    P.C.  da  Silva.  2002. Hyphal-Like Extension and Pseudohyphal
Formation in Industrial Strains of Yeasts Induced by Isoamyl Alcohol. Braz. J. of Microb.. 33 , 209-212.
[16] Hauser, M., P. Horn, H. Tournu, N.C.  Hauser, J.D. Hoheisel,  A.J.P.  Brow  dan  J.R.  Dickinson.  2007.  A transcriptome  analysis  of  isoamyl  alcohol-induced filamentation in yeast reveals a novel role for Gre2p as  isovaleraldehyde  reductase. FEMS  Yeast  Res 7 , 84–92.