## OPTIMALISASI  TNF –α DAN IL-3 MENGGUNAKAN BUAH TOMAT
( Lycopercicum esculentumMill var. grandifolium ) SEBAGAI UPAYA

## PENINGKATAN AKTIVITAS FAGOSITOSIS MAKROFAG  TERHADAP INFEKSI BAKTERI
Eny Hartadiyati Wasikin Haryanti 1) , Praptining Rahayu, Maria Ulfa
1 Jurusan Pendidikan Biologi, FPMIPA IKIP PGRI Semarang email: enyhartadiyati_wh@yahoo.com
OPTIMIZATION OF TNF – α AND IL-3 USES TOMATOES ( Lycopercicum esculentumMill var. grandifolium ) AS EFFORTS IN INCREASING MACROPHAGE PHAGOCYTOSIS TO BACTERIAL INFECTION

## ABSTRACT
TNF  –α  and  IL-3  are  sitokin  stimulates  macrophage phagocytosis  to  the  activity  in  eliminating  bacteria.  Karotenoid is  come  from  natural  resources,  one  of  them  is  tomatoes,  as known carotene and likopen  have potential in increasing TNF – α  and  IL-3.  Mencit  balb/c  in  normal  condition  are  24  tails randomly  uses  thermal  variations:  (50 0 C,  100 0 C  dan  150 0 C) role  to  sitokin  TNF  –α  and  IL-3  content.    The  result  shows tomatoes  preparasi  in  150 0 C  is  (p<0.05)  effects  sitokin  content of TNF –α and IL-3 highest.
Key words : TNF –α, IL-3, tomatoes

## ABSTRAK
TNF  –α  dan  IL-3  merupakan    sitokin  yang  berperan  untuk merangsang  fagositosis  makrofag  dalam  mengeliminasi  bakteri. Karotenoid yang berasal dari sumber alami , salah satunya dalam buah  tomat    .  Diketahui  karoten  dan  likopen  yang  berpotensi meningkatkan  TNF  –α  dan  IL-3.  Mencit  balb/c  keadaan  normal sebanyak  24  ekor  dipilih  secara  random  digunakan  untuk menyelidiki  pengaruh  preparasi  buah  tomat  ( Lycopercicum esculentumMill  var.  grandifolium )  yang  matang  dengan  variasi suhu  :  (50 0 C,  100 0 C  dan  150 0 C)  terhadap  kadar  sitokin  TNF  –α dan  IL-3 dari kultur sel  makrofag. Hasil penelitian menunjukkan preparasi  buah  tomat  dengan  suhu  150 0 C    secara  bermakna
(p<0.05)  menyebabkan  kadar  sitokin  TNF  –α  dan  IL-3  yang paling tinggi .
Key words: TNF –α, IL-3, buah tomat

## PENDAHULUAN
Tomat  merupakan  buah  yang  banyak  dikonsumsi  masyarakat  baik  dimakan langsung,  campuran  dalam  sayur-mayur  sehari-hari,  maupun  dipergunakan sebagai produk-produk olahan seperti jus, saus, dan pasta tomat. Tomat diketahui mengandung banyak karotenoid likopen, dan karotenoid lainnya seperti  -karoten dan lutein.
Banyak  faktor  yang  mempengaruhi  absorpsi  dan    bioavailabilitas  diet karotenoid.    Karotenoid,  termasuk  likopen  ditemukan  berada  dalam  bentuk kristalin atau terikat protein kompleks dalam bahan makanan. Tahap pertama agar dapat  terabsorpsi  adalah  pelepasan  likopen  dari  bentuk  ikatan  tersebut  (Clinton ,S.K,1998  dan  Parker  ,R.S,  1997)  .  Terlepasnya  likopen  dari  matriks  makanan akibat suatu proses, keberadaan diet lipid dan isomerisasi yang disebabkan panas pada  konformasi  all- trans menjadi cis meningkatkan  bioavailabilitas  likopen (Williams  ,  AW,  et  al.,  1998)  .  Kadar  likopen  dalam  olahan  tomat  bentuk  pasta lebih tinggi dibanding olahan yang lain seperti saus dan tepung tomat ( Khachick et al., 2002).
Antioksidan  dalam  buah-buahan  dan  sayuran  telah  memperlihatkan kemampuannya memberikan efek memodulasi fungsi  imun ( Shuichi Kainogawa et  al.,  2004).  Beberapa  penelitian  menunjukkan  pemberian  jus  tomat  selama periode  tertentu  berhasil  menambah  kadar  serum  karotenoid  (dengan  likopen memiliki kenaikan yang paling besar) dan menstimulasi limfosit T, demikian juga meningkatkan TNF –α ( Tumor Necrosis Factor-α) (Bernhard Watzl et al. 2000). Secara  empiris  TNF-α  dan  IL-3  (  Interleukin-3)  dapat  meningkatkan  NO makrofag  yang  penting  dalam  mekanisme  eliminasi  bakteri.  Peran  buah  tomat sebagai  imunomodulator  terhadap  infeksi  bakteri  merupakan  permasalahan  yang menarik  untuk  dikaji.  Imunomodulator  pada  infeksi  bakteri  pada  akhirnya  akan
Bioma , Vol. 3, No. 1, April 2014
menstimulasi  respon  imun  dengan  cara  merangsang  produksi  antibody,  aktivasi dan proliferasi sel T dan makrofag.
Bakteri  dapat  melawan  penggabungan  fagolisosom  dan  bermultiplikasi dalam  makrofag  (Owens,  MD  et  al.  ,  1999).  Upaya  tubuh  menghadapi  bakteri intraselluler  maupun ekstraseluler adalah  melalui respon imun  spesifik maupun nonspesifik.    Efektor  imunitas  nonspesifik  utama  terhadap  bakteri  adalah  sel fagosit  dan  NK  sel.  Bakteri  dapat  mengaktivasi  NK  sel  atau    melalui  aktivasi makrofag  dan  sel  imunitas  yang  lain  seperti  limfosit,  monosit  dan  neutrofil. Namun  aksi  poten  untuk  membunuh  mikroba  dilakukan  oleh  serangkaian  aksi sebagai  berikut  senyawa    IL-3  dapat  meningkatkan  makrofag  yang  teaktivasi (Kauffman  et  al.,  2002)  dan  NO  makrofag  yang  distimulasi  oleh  TNF  –α. Makrofag  yang  teraktivasi  kemudian  dapat  membunuh  mikroba  menggunakan molekul  pembunuh  dalam  fagolisosom  diantaranya  NO  (  Nitric  Oxide).  NO memiliki sifat reaktif tinggi untuk melawan patogen (Abbas AK et al., 2005)
Karakter interaksi  kadar  karotenoid  serum darah  atau jaringan  yang artinya memperlihatkan  bioavaibilitas  yang  tinggi  dengan  kadar  senyawa  imunitas  yang tinggi memberikan pemahaman secara komprehensif tentang potensi imunomodulator dari buah tomat .
Berdasarkan penjelasan di atas menarik untuk menganalisis teknik preparasi buah  tomat    dengan  variasi  suhu  (50 0 C,  100 0 C  dan  150 0 C)    sebagai  upaya menghasilkan bioavailabilitas tinggi dalam tubuh terhadap kadar TNF –α  dan IL- 3 dari cairan makrofag dan mengetahui suhu berapakah yang menghasilkan kadar TNF –α  dan IL-3  paling tinggi.
Penelitian    karotenoid  dalam  buah  tomat  buah  tomat  tipe  kentang ( Lycopercicum esculentumMill var. grandifolium ) memberikan informasi tentang potensi  buah  tomat  yang  mudah  dan  murah  serta  dapat  bermanfaat  sebagai imunomodulator.
Haryanti, E.H.W, et.al. OPTIMALISASI  TNF –α
Buah tomat ( Lycopersicum grandifolium : Tomat tipe kentang) O lah an to m at ( 3 tekn ik prepara si ) Suplemen (dengan tingkat absorpsi tinggi) Menyediakan sitokin  : Kadar IL-3, dan TNF-α Teknik pengolahan Temperatur : 50, 100 dan 150 0 C Olive oil buah matang

## MATERIAL DAN METODE

## 1. Subjek Penlitian
Subjek penelitian ini adalah mencit jantan Balb/c yang memenuhi kriteria sebagai berikut:
Kriteria inklusi :  strain Balb/c, jenis kelamin jantan, umur 8-10 minggu, berat  badan  20-30  gram,  sehat  sebelum  infeksi.  Kriteria  eksklusi  :  terdapat kelaianan  anatomi,  mencit  mati.  Besar  sampel  yang  akan  digunakan  yaitu  enam ekor perkelompok . Mencit dibagi 4 kelompok, sehingga jumlah yang dibutuhkan sebanyak 24 ekor.

## 2. Metode dan Desain Penelitian
Penelitian  diawali  dengan  preparasi  buah  tomat  tipe  kentang  ( Lycopercicum esculentumMill  var.  grandifolium )  untuk  menghasilkan  karotenoid  dengan bioavailabilitas  yang  tinggi  dan  potensinya  menstimulasi  sekresi  senyawa imunitas  seperti  TNF  –α    dan  IL-3  .  Upaya  tersebut  dilakukan  melalui  prosedur penelitian ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1.   Skema preparasi buah tomat  terhadap kadar TNF –α  dan IL-3
Bioma , Vol. 3, No. 1, April 2014
Hasil preparasi buah tomat dicobakan pada 24 ekor mencit jantan Balb/ c dengan rancangan post test control group design .
Dua puluh empat ekor mencit jantan Balb/ c diadaptasikan dalam kandang dan  diberi  ransum  pakan  standard  serta  minum    selama  satu  minggu  secara  ad libitum  selanjunta  mencit  dibagi  dalam  empat  kelompok.  Masing-masing kelompok  terdiri  dari  enam  ekor  mencit  yang  dipilih  secara  acak  dan dikandangkan  secara  berkelompok,  dan  diberi  perlakuan  selama  15  hari. Kelompok mencit tersebut adalah :
Kelompok P0 (Kontrol) :  kelompok  kontrol,  tanpa  pemberian  buah tomat Kelompok P1 : kelompok pemberian preparasi -1 (pemanasan 50 0 C) dosis 0,36 g/ekor/hari + 1ml olive oil Kelompok P2 : kelompok pemberian preparasi -2 (pemanasan 100 0 C) dosis 0,36 g/ekor/hari + 1ml olive oil Kelompok P3 : kelompok pemberian preparasi -3 (pemanasan 150 0 C) dosis 0,36 g/ekor/hari + 1ml olive oil

## 3. Teknik Pengumpulan Data
Data berupa TNF –α  dan IL-3  dari supernatan kultur sel makrofag.

## Isolasi makrofag
Pada  hari  ke-16  ,  mencit  diterminasi  dengan  cara  dislokasi  tulang  leher, selanjutnya mengisolasi  makrofag  dari cairan rongga peritoneum mencit dengan metode Ding dan Lewis :
Prosedur dibawah ini dilakukan untuk mendapatkan 5 x 10 5 sel/ml.
1. Mencit didekapitasi dengan dislokasi tulang leher.
2. Mencit  diletakkan  dalam  posisi  terlentang,  kulit  perut  terbuka  dan selubung peritoneumnya dibersihkan dengan alcohol 70%
3. Injeksikan 10cc larutan RPMI dingin ke dalam rongga peritoneum
4. Peritoneum dipijat pelan untuk mendapatkan cairan yang cukup banyak
5. Cairan disedot kembali sampai habis dan dimasukan dalam tabung falcon 15cc
Haryanti, E.H.W, et.al . OPTIMALISASI  TNF –α
6. Cairan  dalam    tabung  disentrifus  dengan  kecepatan  1200 rpm pada  suhu 4 o C selama 10 menit
7. Bila cairan terkontaminasi darah, sel dicuci dengan PBS sampai bersih
8. Buang  supernatant,  tambahkan  3  ml  medium  RPMI  komplit  yang  terdiri dari RPMI 1640,FBS 10%, dan penicillin pada pellet yang didapat
9. Sel-sel dihitung dengan hemositometer setelah dilarutkan dalam 3% asam asetat untuk melisiskan sel darah merah
10. Lakukan resuspensi dengan medium komplit di dalam microplate 96 well yang di bawahnya datar dan dasarnya diberi kaca benda (coverslip), setiap sumuran 200 µl (kepadatan 5 x 10 5 sel/ml)
11. Inkubasi dalam incubator CO 2 pada suhu 37 o C selama 30 menit 12. Tambahkan medium RPMI komplit 1 ml tiap sumuran
13. Inkubasi lagi selama 2 jam
14. Sel dicuci dengan RPMI 2 kali dan ditambahkan medium komplit 1 ml tiap sumuran

## 15. Inkubasi dilanjutkan sampai 24 jam

## Analisis Kadar TNF –α  dan IL-3
Analisis  kadar  TNF  –α    dan  IL-3 dilakukan  menggunakan s upernatan  dari kultur  sel  makrofag.  Pengukuran  kadar  TNF  –α    menggunakan  teknik  ELISA ( Enzyme  –linked  Immunosorbent  Assay)  for  quantitative  detection ,  dari eBioscience,  USA.  Pengukuran  kadar  IL-3  menggunakan the  quqntitqtive sandwich enzyme immunoassay technique , dari Quantikine, R&D Systems USA.

## 4. Analisis dan Interpretasi Data
Data hasil penelitian  yaitu :  kadar  TNF –α  dan  IL-3   yang  terkumpul dilakukan cleaning, coding , dan tabulasi selanjutnya di entry ke dalam komputer, selanjutnya dilakukan analisis statistik dengan urutan sebagai berikut :
Analisis yang dilakukan secara univariat dengan menghitung nilai mean terhadap kadar TNF –α  dan IL-3   tiap kelompok, selanjutnya data disajikan dalam bentuk grafik  batang.  Sebelum  dilakukan  analisis  lebih  lanjut,  dilakukan  uji  normalitas.
Bioma , Vol. 3, No. 1, April 2014
Kadar    TNF  –α    dan  IL-3    yang  terukur  setelah  perlakuan  dianalisis  dengan  uji parametrik ANOVA ,  dengan  tingkat  kepercayaan  5  %  dilanjutkan  dengan  UJGD (Uji Jarak Ganda Duncan). Seluruh analisis data dilakukan dengan memanfaatkan fasilitas  pengolah  dan  penyaji  data  program Statistical  Product and Service Solution (SPSS) for Window Release 20.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## KADAR TNF-α
Preparasi buah tomat dengan variasi suhu 50 0 C , 100 0 C dan 150 0 C menyebabkan kadar TNF-α dan IL-3 dari kultur sel makrofag seperti yang terlihat pada Gambar 2. di bawah ini :
Gambar 2. Kadar TNF-α Makrofag
Keterangan : P0  : Kontrol , tanpa pemberian buah tomat P1  : Preparasi buah tomat matang pada suhu 50 o C + olive oil 1 ml P2 : Preparasi buah tomat matang pada suhu 100 o C  + olive oil 1 ml P3 : Preparasi buah tomat matang pada suhu 150 o C + olive oil 1 ml
Haryanti, E.H.W, et.al . OPTIMALISASI  TNF –α
Adapun kadar IL-3 terlihat pada Gambar 3. berikut ini:

## Gambar 3. Kadar IL-3 Cairan Makrofag
Data hasil penelitian menunjukkan rerata kadar TNF-α  pada P1, P2 dan P3 (semua perlakuan) lebih tinggi dibanding P0 (kontrol) dan P3 menunjukkan kadar paling  tinggi.  Hasil  analisis  data  menggunakan  ANOVA  menunjukkan  kadar TNF-α  berbeda  secara bermakna, (F=342,640 ; sig= 0,00) , dan berdasarkan uji lanjut  menggunakan  UJGD  diketahui  semua  perlakuan  berbeda  secara  bermakna (p<0,05)  dengan  P0  (kontrol)  namun  antar  perlakuan  tidak  berbeda  secara bermakna ( p>0,05).
Demikian  pula  kadar  IL-3  ,  P1,  P2  dan  P3  (semua  perlakuan)  lebih  tinggi dibanding  P0  (kontrol)  dan  P3  menunjukkan  kadar  paling  tinggi.  Hasil  analisis data  menggunakan  ANOVA  menunjukkan  IL-3    berbeda    secara  bermakna,  ( F=41,860;  sig  =0,00),  dan  berdasarkan  uji  lanjut  menggunakan  UJGD  diketahui P0  tidak  berbeda  bermakna  dengan  P1,  P2  (  p>0,05),  namun  P0,  P1  dan  P2 menunjukkan perbedaan yang bermakna dengan P3 (p<0,05).
Hasil  penelitian  yang  demikian  ini  dapat  dijelaskan  sebagai  berikut  : Pemanasan  dapat  menyebabkan  terlepasnya  bentuk  kristalin  likopen  dan betakaroten  dari  struktur  membran  selain  itu  dapat  menyebabkan  perubahan
Bioma , Vol. 3, No. 1, April 2014
konformasi trans menjadi cis. Konformasi cis menyebabkan    likopen  dan betakaroten  dapat  diserap  secara  maksimal  oleh  intestinum,  dengan  demikian bioavailabilitas likopen dan betakaroten di dalam tubuh dapat maksimal. Semakin tinggi suhu pemanasan (150 0 C) akan lebih memunculkan  lebih banyak likopen. Likopen  diketahui  sebagai  fitokimia  yang  berfungsi  sebagai  antioksidan  dan berpotensi  sebagai  imunimodulator  (Hartadiyati  Eny,  2009  dan  Hartadiyati  Eny, 2012).
Spesies oksigen reaktif  yang tidak seimbang dengan keberaaan antioksidan tubuh menyebabkan stress oksidatif. Stress Oksidatif ditimbulkan secara endogen dari proses metabolik seluler normal seperti respirasi mitokondria reaksi sitokrom P450,  dapat  pula  disebabkan  tingginya  laju  respirasi  sel  fagosit  seperti  neutrofil dan makrofag  (Stohs.  SJ,  1995 dan Marks  DB et al.,  2000) dan lebih meningkat pada keadaan terinfeksi bakteri  karena aktivitas fagositosis .
Diet  likopen  dan  betakaroten  mengalami  sirkulasi  terikut  transport lipoprotein  plasma  darah  beredar  ke  jaringan  hepatik  dan  ekstra  hepatik (Argarawal  and  Rao,  1998),  selanjutnya  karotenoid  terutama    likopen  dapat terakumulasi  dalam  plasma  dan  jaringan  sehingga  meningkatkan  antioksidan tubuh  (Hartadiyati  Eny,  2009).  Aktivitas  antioksidan  likopen  dan  betakaroten dapat  memproteksi  kerusakan  seluler  termasuk  sel  punca hematopoietic pluripotent yang dapat memproduksi leukosit, dan memproteksi sel-sel darah saat di  sirkulasi  darah  serta  saat  meninggalkan  aliran  darah  dan  masuk  ke  dalam jaringan ,termasuk makrofag.
Makrofag  diketahui sebagai sel efektor dalam sistem imun nonspesifik untuk pertahanan  tubuh  melawan  agen  infeksius  terutama    mengeliminasi  bakteri. Aktifitas  fagositosis  makrofag  distimulasi  oleh  TNF-α  yang  disekresi  oleh makrofag  dan IL-3 yang disekresi oleh sel T helper. IL-3 dapat bertindak sebagai Macrophage  activating  factor (MAF)  sehingga  meningkatkan  makrofag  yang teraktivasi (Kauffman SHE, 2002).
Makrofag yang teraktivasi dapat meningkatkan granula lisosom, lebih banyak mitokondria dan kapasitas yang lebih besar untuk memfagosit partikel yang tersaji
. Penggabungan vakuola fagositik ( fagosoma) dengan lisosom
Haryanti, E.H.W, et.al. OPTIMALISASI  TNF –α
menghasilkan  fagolisosom,  tempat  dimana  mekanisme  elimiminasi  bakteri dikonsentrasikan.  Makrofag  yang  teraktivasi  membunuh  bakteri  yang  difagosit dengan  memproduksi  molekul  pembunuh  agen  infeksius  mikroba  atau  zat  asing lain  dalam  fagolisosom  molekul  tersebut  diantaranya  ROI  ( reactive  oxygen intermediate )  yang  merupakan  agen  oksidasi  tinggi  penghancur  mikroba.  Selain ROI,  makrofag  juga  memproduksi Nitric  oxide (NO)  melalui  aktivasi  enzim inducible  nitric  oxide  synthase (iNOS)  (Abbas  AK  et  al.,  2005).  Ekspresi  iNOS dipicu  oleh  sitokin  inflamasi  seperti  TNFα.  NO  adalah  radikal  peroksi  nitrit reaktif tinggi yang dapat membunuh mikroba yang telah ditelan.
Tanpa pemberian perlakuan  buah tomat maka terjadi rendahnya sekresi IL-3 oleh sel T helper, hal ini berakibat rendahnya  makrofag yang teraktivasi sehingga sekresi    TNF-α  juga  rendah  secara  bermakna  pada  kelompok  P0  (kontrol). Semakin  tinggi  suhu  pada  preparasi  buah  tomat  semakin  menunjukkan  kadar TNF-α  dan  IL-3  semakin  tinggi.  TNF-α  yang  disekresi  makrofag  meningkat diakibatkan  oleh  interaksi  langsung  dengan  agen  penginvasi  seperti mikroorganisme  bakteri,  dapat  juga  diaktifkan  oleh  produk  limfosit  (limfokin) seperti  IL-3  yang  dirangsang  oleh  senyawa  aktif  likopen.    Hasil  penelitian  yang sama  menunjukkan  likopen  meningkatkan  TNF  –α  demikian  juga  menstimulasi limfosit  T.  (Bernhard  Watzl  et  al.  2000).  Kadar  TNF-α  dan  IL-3  paling  tinggi secara  bermakna  pada  perlakuan  P3  (p<0,05),  walaupun  tidak  bermakna  pada TNF-α (p>0,05).

## KESIMPULAN
Teknik  preparasi  buah  tomat    dengan  variasi  suhu  (50 0 C,  100 0 C  dan  150 0 C) berpengaruh signifikan (p< 0,05) terhadap kadar TNF –α  dan IL-3 makrofag dan memperlihatkan  pemanasan  buah  tomat  matang  pada  suhu  150 0 C    menghasilkan kadar TNF –α  dan IL-3  paling tinggi.

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas  AK,  Lichtman.  2005. Celluler  And  Molecul  Immunology  5  ed .
Phyladelphia Elseveral Inc.
Bioma , Vol. 3, No. 1, April 2014
Argawal S, and Rao AV. 1998. Tomato and low density lipoprotein oxidation : a human dietary intervention study. Lipids 33 : 981-984.
Bernyhard  Watzl,  Achim  Bub,  Mark  Blockhaus,  Birgit  Maria  Herbert,  Petra Maria Luhrmann, Monika Neuha¨ user-Berthold  and Gerhard Rechkemmer. 2000.  Prolonged  Tomato  Juice  Consumption  Has  No  Effect  on  Cell- Mediated  Immunity  of  Well-Nourished  Elderly  Men  and  Women, J.  Nutr . 130: 1719–1723.
Clinton  ,SK.  Lycopene:  chemistry,  biology,  and  implications  for  human  health and disease. Nutr. Rev . 1998 ; 56 : 35-51.
Hartadiati  Eny  .WH.  2009.  Kajian  Potensi  Antioksidan  Dan  Sifat Hiperkolesterolemi  Fraksi  Lipid  Likopen  dari  Isolasi  Tomat  Lokal.  Hibah Bersaing DIKTI Th. Ke-3.
Hartadiati  Eny  .WH.  2012.  Pengaruh  Pemberian  Buah  Tomat  Sebagai  Pakan Tambahan  Terhadap  Jumlah  Leukosit  Ikan  Lele  Dumbo.  Hasil  Penelitian IKIP PGRI Semarang.
Khachik F, Beecher GR, Smith JC Jr. 1995. Lutein, lycopene, and their oxidative metabolite in chemoprevention of cancer. J. Cell Biochem. Suppl. 22 : 234- 44.
Marks  DB,  AD  Marks  and  C.M.  Smith.  2000.  Metabolisme  Oksigen  dan Toksisitas  Oksigen. Biokimia  kedokteran  dasar  sebuah  pendekatan  klini s. EGC, Jakarta. Hal. 518-530.
Owens  MD,  Warren  DA. Salmonella  infection [homepage  on  Internet].c1999  [ update 2008 Jul 17; cited 2009 Jan 22]. Availabel from: http://emedicine.medscape.com/article/785774-overwiew.
Parker ,RS. Biovailability of carotenoids. Eur. J. Clin. Nutr . (Suppl.1) 1997 ; 51 : S84-S90.
Shuichi Kainogawa and Masanobu Nanno2. Modulation of Immune Functions by Foods  Complementary  and  Alternative  Medicine,  Vol.  1 ,  eCAM 2004;1(3)241–250
Stohs  SJ.  1995.  The  role  of  free  radicals  in  toxicity  and  disease. J.  Basic.  Clin. Physiol. Pharmacol 4(3-4) : 205-28.
Williams AW, Bioleau TWM, and Erdman JW Jr. Factors influencing the uptake and absorption of carotenoid. Proc. Soc. Exp. Biol. Med . 1998 ; 218 : 104- 108.
Haryanti, E.H.W, et.al. OPTIMALISASI  TNF –α