ISSN 2085-2916  e-ISSN 2337-3652 Tersedia daring http://jai.ipb.ac.id J. Agron. Indonesia, Desember 2018, 46(3):306-313 DOI: https://dx.doi.org/10.24831/jai.v46i3.16397
* Penulis untuk korespondensi. e-mail: dsukma70@gmail.com
Komposisi Media Pertumbuhan Protokorm Sebelum Perlakuan Kolkisin untuk Meningkatkan Poliploidi pada Phalaenopsis amabilis (L.) Blume
Protocorm Growth Medium Composition Before Colchicine Treatment to Increase Polyploidy on Phalaenopsis amabilis (L.) Blume
Astrid Aditya Putri 1 , Dewi Sukma 2* , Sandra Arifin Aziz 2 , dan Muhamad Syukur 2
1 Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor 2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (Bogor Agricultural University), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
Diterima 10 Mei 2017/Disetujui 23 Agustus 2018

## ABSTRACT
Polyploidy induction in Phalaenopsis amabilis is one of the methods to increase genetic diversity. A highly meristematic condition of protocorm induced by cytokinines may improve the success rate of polyploidy induction. This experiment was aimed to study the effect of Benzylaminopurine (BAP), Thidiazuron (TDZ) and coconut water (CW) in a half concentration of Murashige & Skoog (MS) medium before colchicine treatment on growth, multiplication and the success rate of polyploidy induction on Phalaenopsis amabilis protocorm. The experiment used completely randomized  design with one factor, medium treatment (15% of CW); 0.51 mg L -1 BAP; 0.50 mg L -1 TDZ; 15% CW + 0.51 mg L -1 BAP; 15% CW + 0.50 mg L -1 TDZ). Each treatment consisted of three replications with five culture bottles of protocorm for each replication and ten protocorms per bottle. The protocorms were incubated for eight weeks in the medium before treated with 50 mg L -1 of colchicine for ten days. The results showed that 15% CW, 15% CW + 0.51 mg L -1 BAP or 0.5 mg L -1 TDZ gave the highest percentage (100%) of alive protocorm. The highest percentages of protocorm multiplication were resulted from 15% CW+0.51 mg L -1 BAP (65.3%) and 15% CW + 0.5 mg L -1 TDZ (62.7%). The best treatment to promote formation of leaves and roots from protocorm was 15% CW. The percentage of polyploid plantlets of 3% was found in plantlet from 15% CW + 0.50 mg L-1 TDZ media treatment while from other treatments could not be detected.
Keywords: BAP, chromosome, coconut water, plantlet, TDZ

## ABSTRAK
Induksi poliploidi pada Phalaenopsis amabilis merupakan salah satu metode dalam peningkatan keragaman genetik tanaman. Kondisi meristematik pada protokorm yang dapat diinduksi sitokinin diduga dapat meningkatkan keberhasilan induksi poliploidi. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh BAP, TDZ dan air kelapa dalam setengah konsentrasi media  Murashige  &  Skoog  (1/2MS)  sebelum  perlakuan  kolkisin  terhadap  pertumbuhan,  multiplikasi,  dan  keberhasilan induksi poliploidi pada protokorm Phalaenopsis amabilis. Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap dengan satu faktor, yaitu perlakuan media media terdiri dari 5 perlakuan (15% air kelapa (AK); 0,51 mg L -1 BAP; 0,5 mg L -1 TDZ; 15 % AK + 0,51 mg L -1 BAP; 15% AK + 0,5 mg L -1 TDZ). Setiap perlakuan diulang sebanyak 3 kali, setiap ulangan terdiri dari 3 botol yang masing-masing berisi 10 protokorm . Protokorm diinkubasi dalam media perlakuan selama 8 minggu, lalu diberi perlakuan perendaman dalam kolkisin 50 mg L -1 selama 10 hari. Hasil penelitian menunjukkan persentase protokorm hidup tertinggi (100%) dihasilkan pada perlakuan 15% AK, 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP, dan  15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ. P ersentase protokorm bermultiplikasi tertinggi dihasilkan dari perlakuan 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP (65.3%) dan 15% AK + 0.51 mg L -1 TDZ (62.7%). Morfogenesis protokorm membentuk daun dan akar paling baik terdapat pada perlakuan 15% AK. Persentase planlet poliploid sebesar 3% ditemukan pada plantlet dari perlakuan media 15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ sedangkan pada planlet dari perlakuan lainnya tidak dapat dideteksi.
Kata kunci: air kelapa, BAP, kromosom, planlet, TDZ

## PENDAHULUAN
Phalaenopsis amabilis Blume sangat potensial untuk dikembangkan sebagai tetua persilangan dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi sebagai spesies yang membawa warna putih  bersih.  Menurut  Chen et  al .  (2011),  pengembangan varietas  baru  anggrek Phalaenopsis dengan  karakter unggul  secara  terus  menerus  diperlukan  karena  menjadi penentu  keberlanjutan  industri  anggrek.  Spesies-spesies Phalaenopsis memiliki jumlah kromosom dasar 2n = 2x=38 (diploid) sedangkan varietas-varietas hibrida komersial yang populer biasanya poliploid. Beberapa contoh Phalaenopsis poliploid  adalah Phal. Sunrise  Goldmour  ‘KHM637’ (tetraploid) dan Phal. Taipei Gold ‘STM’ (triplod) (Chuang et al., 2008; Chuang et al., 2013).
Poliploidi  merupakan  peristiwa  yang  umum  dalam tanaman yang melibatkan akuisisi lebih dari dua set lengkap kromosom (Del Pozo dan Ramirez-Parra, 2015). Tanaman poliploid  biasanya  menunjukkan  vigor  yang  lebih  baik dibanding  diploidnya,  mengatasi  efek  kerusakan  karena mutasi, meningkatkan heterozigositas, dan heterosis (Sattler et al., 2016). Usaha dalam memperoleh anggrek poliploid telah  banyak  dilakukan,  diantaranya  oleh  Khosravi et al. (2009)  pada  anggrek Dendrobium ‘Serdang  Beauty’  , Kerdsuwan dan Te-chato (2012) pada anggrek Rhynchostilis gigantea var. Rubrum Sagarik, Sarathum et al. (2010) pada anggrek Dendrobium  scabrilingue ,  Atichart  (2013)  pada Dendrobium chrysotoxum , Rahayu et al. (2015) pada Phal. amabilis dan Phal.  amboinensis ,  dan  Azmi et  al. (2016) pada Phal. amabilis . Penelitian  induksi  poliploid  sering  mengalami kesulitan  terkait  metode  yang  efektif  untuk  menghasilkan individu  poliploid  dengan  persentase  tinggi.  Jenis  bahan tanaman  akan  menentukan  sel  apa  yang  menjadi  target duplikasi kromosom, salah satunya adalah protokorm (Azmi et al., 2016).  Protokorm  merupakan  istilah untuk  struktur globular  sebagai  bentuk  lanjut  dari  hasil  perkecambahan embrio  anggrek.  Protokorm  primer  dari  perkecambahan embrio dapat membentuk protokorm sekunder atau sering disebut  sebagai protocorm-like  bodies (PLBs).  Pada anggrek,  induksi  poliploid  menggunakan  kolkisin  pada eksplan protokorm dilakukan untuk menargetkan duplikasi kromosom  pada  sel  somatik  yang  bersifat  meristematik (Arditti, 2008). Protokorm pada fase pembelahan sel aktif sangat  potensial  untuk  bahan  induksi  poliploidi,  namun karena  protokorm  sudah  berada  pada  fase  multiseluler, maka ploidisasi kemungkinan hanya terjadi pada satu atau beberapa  inti  sel  saja.  Selanjutnya  kemungkinan  terjadi diplontic selection , yaitu perubahan pada protokorm yang mengarah  pada recovery menjadi  kondisi  diploid  kembali ataupun  campuran  sel-sel  diploid  dan  poliploid  atau yang  sering  disebut  mixoploid.  PLBs  mixoploid  ketika membentuk planlet akan menjadi tanaman kimera dimana hanya  beberapa  sel  atau  organ  tertentu  saja  yang  bersifat poliploid.
Perbaikan  metode  induksi  poliploid  pada  protokorm Phal. amabilis masih perlu dilakukan untuk meningkatkan persentase tanaman poliploid. Salah satu metode alternatif
adalah  menggunakan  media  pra-perlakuan  dengan penambahan  hormon  sitokinin  sintetis  ataupun  bahan organik mengandung hormon yang diduga dapat mendorong kondisi meristematik tinggi pada sel-sel PLBs. Pada kultur jaringan hormon sitokinin memiliki dua peran penting, yaitu dapat  merangsang  morfogenesis  eksplan  dan  merangsang pembentukan  tunas  muda  (Hopkins,  1999).  Penggunaan hormon  sitokinin  untuk  meningkatkan  regenerasi  dan multiplikasi  pada  protokorm  tanaman  anggrek  telah dilakukan oleh Chen dan Chang (2004), Chugh et al. (2009), Nuraini et al. (2010), Nikjenad et al. (2011), serta Raynalta (2013). Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh BAP, TDZ dan air kelapa dalam setengah konsentrasi media Murashige  &  Skoog  (1/2MS)  sebelum  perlakuan  kolkisin terhadap  pertumbuhan,  multiplikasi  dan  keberhasilan induksi poliploidi pada protokorm Phal. amabilis .

## BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Oktober 2015 sampai dengan Oktober 2016. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman 1 dan Laboratorium Mikroteknik,  Departemen  Agronomi  dan  Hortikultura, Institut Pertanian Bogor.

## Uji Pertumbuhan Protokorm
Rancangan percobaan yang digunakan pada percobaan ini  adalah  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan perlakuan  komposisi  media  PLBs  sebelum  perlakuan kolkisin. PLBs dihasilkan dari hasil multiplikasi protokorm dari perkecambahan benih Phalaenopsis amabilis, berumur sekitar  6  bulan  setelah  perkecambahan.  Media  dasar yang  digunakan  adalah  setengah  konsentrasi  media  dasar Murashige  Skoog (1/2MS).  Perlakuan  terdiri  atas  media 1/2MS dengan penambahan: a) 15% air kelapa (AK);  b) 0.51 mg L -1 BAP; c) 0.50 mg L -1 TDZ; d) 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP; dan e) 15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ. Setiap perlakuan  diulang  sebanyak  3  kali,  dan  setiap  ulangan terdiri atas 3 botol, setiap botol ditanami 10 PLBs, sehingga total  PLBs  yang  digunakan  dalam  percobaan  adalah  450 PLBs. Pengkulturan di media perlakuan dilakukan hingga 8 minggu setelah subkultur (MSS) lalu diamati persentase PLBs  hidup,  bermultiplikasi,  berdaun,  dan  berakar. Pengolahan data menggunakan dianalisis sidik ragam, jika perlakuan berpengaruh nyata, diuji lanjut dengan uji Tukey pada α sebesar 5%.

## Induksi Poliploidi dengan Kolkisin
PLBs  yang  diuji  pertumbuhan  pada  berbagai komposisi media perlakuan seperti dijelaskan pada bagian Uji  Pertumbuhan  Protokorm  di  atas;  setelah  8  minggu pengkulturan diberi perlakuan kolkisin dengan cara direndam dalam larutan kolkisin 50 mg L -1 (konsentrasi optimum yang diperoleh Azmi et al ., 2015). Rendaman PLBs dalam kolkisin ditempatkan pada shaker dengan kecepatan rotasi 120 rpm selama 10 hari. Setelah perendaman, PLBs dikeluarkan dari
larutan  kolkisin,  dibilas  3  kali  dengan  aquades  steril  lalu dikulturkan  dalam  media  pemulihan  yaitu  media  1/2MS yang ditambahkan air kelapa 7.5% (v/v), diinkubasi dalam ruang kultur bersuhu 23-25 o C dengan cahaya  lampu TL 40 watt dan diamati selama 8 minggu. Selanjutnya, PLBs disubkultur  ke  media  pembesaran  berupa  media  1/2MS yang ditambah ekstrak kentang dan pisang  masing-masing 100  g  L -1 dan  arang  aktif  2  g  L -1 .  Pengkulturan  di  media pembesaran dilakukan selama 10 minggu kemudian diamati jumlah planlet mati, jumlah daun dan akar planlet,  stomata dan jumlah kromosom dari planlet putatif poliploid.
Seleksi  planlet  putatif  poliploid  dilakukan  secara visual  dengan  membandingkan  planlet  hasil  perlakuan kolkisin dengan planlet kontrol (tanpa perlakuan kolkisin) berdasarkan  morfologinya.  Karakter  yang  dibandingkan diantaranya adalah ukuran planlet, daun, dan basal organ of the protocorm (BOP). Menurut Azmi et al . (2016) planlet putatif poliploid memiliki daun yang lebih tebal dan BOP yang membesar. Pengamatan juga dilakukan pada karakter jumlah  kloroplas  sel  penjaga,  kerapatan  stomata  dan ukuran  stomata.  Pengamatan  kloroplas  dilakukan  pada  5 sampel planlet putatif poliploid. Analisis jumlah kromosom dilakukan  dengan  menggunakan  metode squash pada kromosom yang diisolasi dari akar planlet putatif poliploid mengikuti metode Azmi et al . (2016).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pertumbuhan dan Regenerasi PLBs pada Media Perlakuan
Persentase hidup PLBs sebesar 100% pada 8 minggu setelah  sub-kultur  (MSS)  ditemukan  pada  tiga  media perlakuan yaitu 15% air kelapa (AK), 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP, dan 15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ. Persentase hidup PLBs  terendah  dihasilkan  pada  media  0.51  mg  L -1 BAP sebesar  68.67%  (Gambar  1).  Hasil  tersebut  menunjukkan bahwa adanya air kelapa dan BAP atau TDZ dalam media menghasilkan persentase hidup PLBs tertinggi dibandingkan media  yang  hanya  ditambahkan  BAP  atau  TDZ  .  Air kelapa  atau  kombinasinya  dengan  BAP  atau  TDZ  lebih sesuai  untuk  menunjang  pertumbuhan  PLBs.  Air  kelapa merupakan  senyawa  organik  komplek  yang  mengandung asam  amino,  vitamin,  mineral  dan  zat  pengatur  tumbuh seperti auksin dan sitokinin (Yong et al., 2009). Berbagai senyawa  organik  tersebut  kemungkinan  bersinergi  dalam mendorong pertumbuhan PLBs.
Persentase  PLBs  yang  mengalami  multiplikasi tertinggi pada 8 MSS berasal dari perlakuan 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP (65.33%) namun tidak berbeda nyata dengan perlakuan 15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ (62.67%) (Tabel 1). Perlakuan  15%  AK  menunjukkan  persentase  PLBs  yang bermultiplikasi  sebesar  44.67%,  sedangkan  multiplikasi terendah  dihasilkan  oleh  perlakuan  0.50  mg  L -1 TDZ sebesar 22.49%, tidak berbeda nyata dengan perlakuan 0.51 mg L -1 BAP sebesar 24.68%. Hasil tersebut menunjukkan bahwa  kombinasi  15%  AK  dengan  BAP  maupun  TDZ efektif  meningkatkan  persentase  PLBs  bermultiplikasi. Air kelapa memiliki kandungan auksin dan sitokinin (Wu dan  Hu,  2009). Air  kelapa  bekerja  sama  dengan  hormon
sitokinin sintetis yang diberikan (BAP atau TDZ), sehingga lebih efektif dalam mendorong multiplikasi PLBs (Karjadi dan  Buchory,  2008;  Nuraini et  al. , 2010;  Nikjenad et  al., 2011).  Pengaruh  positif  air  kelapa  terhadap  peningkatan multiplikasi PLBs Phal. amabilis juga dilaporkan Raynalta et al . (2013). Regenerasi PLBs menjadi planlet terlihat mulai pada minggu  kedua  setelah  subkultur  pada  media  perlakuan, ditunjukkan  dengan  tumbuhnya  daun  dan  akar  sebagai tahap awal pertumbuhan PLBs menjadi planlet. Persentase PLBs yang membentuk daun tertinggi (96%) terdapat pada media  15% AK,  tidak  berbeda  nyata  dengan  media  15% AK  +  0.51  mg  L -1 TDZ  sebesar  94%.  Persentase  planlet berdaun terendah terdapat pada media perlakuan 0.50 mg L -1 TDZ  sebesar  82.64%  dan  tidak  berbeda  nyata  dengan media  perlakuan  15% AK  +  0.51  mg  L -1 BAP  (86.67%) dan  0.51  mg  L -1 BAP  (84.29%)  (Tabel  2).  Hasil  tersebut memperlihatkan  bahwa  komposisi  media  mempengaruhi kemampuan morfogenesis PLBs menjadi planlet. Komposisi media  dengan  penambahanan  hormon  sitokinin  sintetis (BAP  atau  TDZ)  cenderung  menghambat  pertumbuhan daun. Hal ini sesuai dengan pernyataan Parveen dan Shahzad (2010)  bahwa  sitokinin  merangsang  proliferasi  namun menghambat  pertumbuhan  lebih  lanjut.  Menurut  Chug et al. (2009),  tekanan  morfogenesis  karena  sitokinin  dapat dikurangi  dengan  penambahan  auksin.  Dalam  penelitian ini, morfogenesis dapat didorong dengan adanya air kelapa yang mengandung auksin, sitokinin, dan berbagai senyawa organik.
Hasil  pengamatan  menunjukkan  bahwa  persentase PLBs berakar tertinggi terdapat pada media perlakuan 15%
Gambar 1. Persentase protokorm hidup Phal. amabilis pada media perlakuan 15% AK, 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP, dan 15% AK + 0.5 mg L -1 TDZ menghasilkan persentase hidup  protokorm  yang  sama  yaitu  sebesar  100% (sehingga terlihat sebagai satu garis), media perlakuan 0.51 mg L -1 BAP sebesar 68.67%, serta media perlakuan 0.5 mg L -1 TDZ sebesar 82%. Pengamatan dilakukan pada 2-8 MSS. Huruf berbeda pada ujung garis grafik menunjukkan perbedaan nyata berdasarkan uji DMRT taraf α 5%
0 20 40 60 80 100 120 0 2 4 6 8 Pe rse nt ase p ro to ko rm hi du p (%) Minggu setelah subkultur (MSS) P0 P1 P2 P3 P4 a b c
AK sebesar 96%, selanjutnya pada media 15% AK + 0.51 mg  L -1 BAP  (66%)  dan  tidak  berbeda  nyata  dengan  15% AK + 0.5 mg L -1 TDZ (62%), sedangkan persentase PLBs membentuk  akar  terendah  terdapat  pada  media  perlakuan 0.50 mg L -1 TDZ, sebesar 14.43% (Tabel 3). Hasil tersebut menunjukkan bahwa TDZ menurunkan kemampuan PLBs menghasilkan  akar  dan  kondisi  tersebut  dapat  diperbaiki dengan penambahan air kelapa dalam media. Hal ini sesuai dengan  pernyataan  Lu  (1993),  bahwa  hormon  sitokinin dapat  menghambat  pertumbuhan  dan  TDZ  termasuk  ke dalam  kelompok  sitokinin  kuat  yang  dapat  menghambat pembentukan akar.
Pertumbuhan  PLBs  Setelah  Induksi  Poliploidi  dengan Kolkisin
Tabel  4  menyajikan  pertumbuhan  planlet Phal. amabilis asal berbagai media perlakuan terhadap pertumbuhan PLBs setelah  induksi  poliploidi  dengan  kolkisin.  Pada  Tabel  4 terlihat bahwa komposisi media sebelum perlakuan kolkisin tidak  berpengaruh  nyata  terhadap  jumlah  daun  dan  akar planlet,  namun  mempengaruhi  jumlah  planlet  yang  mati. Planlet mati terbanyak adalah yang berasal dari perlakuan 0.5 mg L -1 TDZ (1.83 planlet) dan 0.51 mg L -1 BAP (1.75 planlet).  Planlet  mati  terendah  adalah  yang  berasal  dari media perlakuan 15% AK + 0.5 mg L -1 TDZ (0.11 planlet) dan tidak berbeda nyata dengan  perlakuan 15% AK + 0.51
mg  L -1 BAP  dan  15% AK  sebesar  0.25  dan  0.42  planlet. Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa  perlakuan  air  kelapa dapat  menekan  jumlah  planlet  mati  karena  pengaruh negatif BAP dan TDZ. Hormon alami maupun nutrisi yang terdapat dalam air kelapa dapat memperbaiki pertumbuhan planlet. Hal ini sesuai dengan pernyataan Yong et al. (2009) bahwa  air  kelapa  mengandung  banyak  zat  penting  untuk pertumbuhan,  seperti gula, vitamin, mineral, asam amino, serta fitohormon yang berperan penting dalam pertumbuhan tanaman.
Skrining terhadap planlet putatif poliploid dilakukan dengan  membandingkan  planlet  kontrol  dengan  planlet hasil perlakuan kolkisin secara visual, hasil skrining dipisah antara tipe planlet normal dan tipe planlet putatif poliploid. Tipe planlet normal memiliki karakteristik morfologi yang mirip  dengan  planlet  kontrol  (tanpa  perlakuan  kolkisin), sedangkan  tipe  planlet  putatif  poliploid  memiliki  daun yang lebih tebal serta memiliki basal organ pada protokorm (BOP) yang membesar (Azmi et al., 2016). Menurut Chen et al . (2009) tidak ada perbedaan lebar daun antara tanaman diploid  dan  tetraploid  pada Phal.  hieroglyphica, namun panjang daun nyata lebih pendek dan indeks luas daun lebih rendah.
Hasil  skrining  terhadap  planlet  dari  perlakuan  15% AK, 0.51 mg L -1 BAP, 0.50 mg L -1 TDZ, 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP, dan  15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ, menghasilkan tipe  planlet  putatif  poliploid  masing-masing  sebesar  42,
Perlakuan Persentase protokorm bermultiplikasi (%) 2 MSS 4 MSS 6 MSS 8 MSS 15% AK 10.00c 34.67b 34.67b 44.67b 0.51 mg L -1 BAP 0.00d 4.71c 3.18c 24.68c 0.50 mg L -1 TDZ 0.00d 6.43c 11.18c 22.49c 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP 27.33a 48.00a 49.33a 65.33a 15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ 16.67b 29.33b 48.00a 62.67a KK (%) 28.29 27.67 24.94 20.25
Tabel 1. Persentase protokorm Phal. amabilis bermultiplikasi pada beberapa komposisi media perlakuan
Keterangan:  Angka diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan beda nyata pada uji DMRT taraf α 5%. AK = air kelapa, MSS = minggu setelah subkultur, KK = koefisien keragaman.
Perlakuan Persentase protokorm berdaun (%) 2 MSS 4 MSS 6 MSS 8 MSS 15% AK 56.00a 86.00a 91.33a 96.00a 0.51 mg L -1 BAP 28.82b 72.26b 77.24b 84.29b 0.50 mg L -1 TDZ 21.14b 73.12b 78.95b 82.64b 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP 48.67a 80.67ab 85.33ab 86.67b 15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ 48.67a 89.33a 92.67a 94.00a KK (%) 16.54 7.67 6.23 4.35
Tabel 2. Persentase protokorm Phal. amabilis berdaun pada beberapa komposisi media perlakuan
Keterangan: Angka diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan beda nyata pada uji DMRT taraf α 5%. AK = air kelapa, MSS = minggu setelah subkultur, KK = koefisien keragaman.
42,  37,  58,  dan  61%  (Gambar  2).  Hasil  ini  menunjukkan bahwa kombinasi air kelapa dan zat pengatur tumbuh BAP atau  TDZ  kemungkinan  dapat  mendorong  pembelahan sel  sehingga  memperbesar  peluang  terjadinya  poliploidi. Perlakuan kolkisin pada sel yang sedang aktif membelah, makin besar kemungkinan terjadinya poliploidi.
Hasil  pengamatan  kloroplas  pada  5  sampel  planlet putatif poliploid menunjukkan 100% planlet yang diamati poliploid (Gambar 2). Menurut Syukur et al . (2013), jumlah kloroplas dalam sel penjaga pada tanaman tetraploid lebih banyak dibandingkan dengan tanaman diploidnya. Gambar 3 menyajikan keragaan ukuran dan densitas stomata planlet
Perlakuan Persentase protokorm berakar (%) 2 MSS 4 MSS 6 MSS 8 MSS 15% AK 37.33a 82.00a 88.67a 96.00a 0.51 mg L -1 BAP 3.50c 23.21c 27.39c 42.23c 0.50 mg L -1 TDZ 0.00c 10.79d 11.16d 14.43d 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP 9.33b 20.67cd 36.00bc 62.00b 15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ 10.67b 36.00b 44.67b 66.00b KK (%) 21.29 17.04 17.02 9.29
Tabel 3. Persentase protokorm Phal. amabilis berakar pada beberapa komposisi media perlakuan
Keterangan: Angka diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan beda nyata pada uji DMRT taraf α 5%. AK = air kelapa, MSS = minggu setelah subkultur, KK = koefisien keragaman.
Media asal planlet Jumlah daun Jumlah akar Jumlah planlet mati 15% AK 3.21 2.58ab 0.25b 0.51 mg L -1 BAP 2.88 2.04c 1.75a 0.50 mg L -1 TDZ 3.16 2.90ab 1.83a 15% AK + 0.51 mg L -1 BAP 2.84 2.31bc 0.42b 15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ 3.47 2.95a 0.11b KK (%) 19.81 19.23 65.49 Tabel 4. Pertumbuhan planlet Phal. amabilis asal beberapa komposisi media sebelum perlakuan kolkisin pada 10 minggu setelah induksi poliploid menggunakan kolkisin
Keterangan: Angka diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan beda nyata pada uji DMRT taraf α 5%. AK = air kelapa, KK = koefisien keragaman.
Gambar  2.  Persentase  planlet  putatif  poliploid  asal  berbagai  media  sebelum  perlakuan  kolkisin  berdasarkan  karakter  morfologi Phal. amabilis pada media pembesaran dan konfirmasi poliploidi berdasarkan analisis sitologi. Huruf berbeda pada persentase planlet diduga poliploid dari masing-masing perlakuan menunjukkan perbedaan nyata berdasarkan uji DMRT taraf α 5%
1
50/120 (ab) (42%) 25/60 (ab)
42% 11/30 (b) 37% 105/180 (a)
58% 110/180 (a) 61% 5/5 (100%) 3/15 (20%) 0 20 40 60 80 100 120 15% AK 0.51 mg L-1 BAP 0.5 mg L-1 TDZ 0.51 mg L-1 BAP + 15% AK
0.5 mg L-1 TDZ + 15% AK Σ kloroplas Σ kromosom
Pe rsen ta se d id ug a po lip lo id (%) Konfirmasi poliploidi berdasarkan jumlah kloroplas dan kromosom Planlet putatif poliploid berdasarkan morfologi
1 A D G H F E C B

## I
Gambar 3. Perbandingan densitas stomata dari planlet normal dari kontrol (A), planlet tipe normal dari hasil perlakuan kolkisin (B) dan tipe diduga poliploid (putatif poliploid) dari hasil perlakuan kolkisin(C); kloroplas di dalam stomata dari planlet normal dari kontrol (D), planlet tipe normal dari hasil perlakuan kolkisin (E) dan tipe diduga piloploid (putatif poliploid) dari perlakuan kolkisin (F); serta kromosom pada fase metafase dari planlet kontrol (G), planlet tipe normal dari hasil perlakuan kolkisin (H), dan tipe diduga piloploid (putatif poliploid) dari hasil perlakuan kolkisin (I). Pengamatan dengan mikroskop OPTIKA M-699 dengan perbesaran 400X
putatif poliploid dan planlet normal. Ukuran stomata planlet putatif poliploid berbeda nyata dengan planlet normal (rata- rata 0.4 kali lebih besar dari planlet normal) pada uji t dengan taraf α = 1%. Densitas stomata pada planlet putatif poliploid nyata  lebih  rendah  (setengah  dari  densitas  stomata  dari planlet normal), pada uji t dengan α = 1%. Hasil yang sama dilaporkan oleh Miguel dan Leonhardt (2011), Kerdsuwan dan Te-chato (2012), Rahayu et al . (2015) dan Azmi (2016), bahwa planlet poliploid (tetraploid) memiliki ukuran yang lebih  besar,  namun  dengan  densitas  stomata  lebih  kecil daripada planlet diploid.
Hasil pengamatan jumlah kromosom dari 15 planlet putatif  poliploid  dari  berbagai  perlakuan  menunjukkan kesulitan  dalam  mengamati  jumlah  kromosom.  Jumlah kromosom mengganda hanya ditemukan pada planlet dari perlakuan 15% AK + 0.50 mg L -1 TDZ sebesar 3% sedangkan pada  planlet  dari  perlakuan  lainnya  tidak  dapat  dideteksi. Keragaan  kromosom  pada  planlet  seperti  terlihat  pada Gambar 3. Kesulitan dalam mengamati jumlah kromosom dapat  disebabkan  ketidaksesuaian  waktu  pengambilan sampel dengan fase metafase sel.

## KESIMPULAN
Kombinasi air kelapa (15%) dengan BAP (0.51 mg L -1 ) atau TDZ (0.50 mg L -1 ) menghasilkan persentase PLBs hidup tertinggi  (100%)  dan  multiplikasi  protokorm.  Persentase
PLBs  bermultiplikasi  tertinggi  dihasilkan  dari  perlakuan 15% air kelapa + 0.5 mg L -1 BAP (65.3%) atau 0.51 mg L -1 TDZ  (62.7%).  Morfogenesis  protokorm  membentuk  daun dan akar paling baik pada media dengan penambahan 15% air kelapa tanpa BAP atau TDZ. Hasil analisis kromosom
menunjukkan  persentase  planlet  poliploid  sebesar  3% ditemukan  pada  planlet  dari  perlakuan  media  15% AK  + 0.50  mg  L -1 TDZ  sedangkan  pada  planlet  dari  perlakuan lainnya tidak dapat dideteksi .

## DAFTAR PUSTAKA
Arditti,  J.  2008.  Micropropagation  of  Orchids. Volume  1. Blackwell Pub, Malden, US.
Atichart,  P.  2013.  Polyploid  induction  by  colchicine treatments  and  plant  regeneration  of Dendrobium chrysotoxum . Thai. J. Agric. Sci. 46:59-63.
Azmi,  T.K.K.,  D.  Sukma,  S.A.  Aziz,  M.  Syukur.  2016.
Morfologi  dan  pertumbuhan  planlet  hasil  induksi poliploidi  melalui  perlakuan  kolkisin  pada  kuncup bunga  anggrek  bulan  ( Phalaenopsis  amabilis (L.) Blume). J. Agron. Indonesia 44:68-75.
Chen,  J.T.,  W.C.  Chang.  2004.  Induction  of  repetitive embryogenesis  from  seed-derived  protocorms  of Phalaenopsis  amabilis var.  formosa shimadzu. in vitro cell. Dev. Biol. Plant. 40:290-293.
Chen,  W.H.,  C.Y.  Tang,  C.Y.,  Y.L.  Kao.  2009.  Ploidy doubling by in vitro excised protocorm or protocorm- like bodies in Phalaenopsis species. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 98:229-238.
Chen,  W.H.,  Y.L.  Kao,  C.Y.  Tang,  G.T.  Jean.  2011. Endopolyploidy  in Phalaenopsis orchids  and  its application in polyploid breeding. In W.H.Chen, H.H. Chen. Orchid Biotechnology II. World Scientific.
Chuang, H.T., S.T. Hsu, T.M. Shen. 2008. Breeding barriers in yellow Phalaenopsis orchids. J. Taiwan. Soc. Hort. Sci. 54:59-66.
Chuang,  H.T.,  K.L.  Huang,  R.S.  Shen,  I.  Miyajima,  S.T.
Hsu. 2014. Using Cut-Column Pollination Method to Overcome Crossing Barriers in Phalaenopsis Sunrise Goldmour  ‘KHM637’.  J.  Fac.  Agr.,  Kyushu  Univ. 59:265-271.
Chugh,  S.,  S.  Guha,  I.U.  Rao.  2009.  Micropropagation of  orchids:  A  review  on  the  potential  of  different explants. Sci. Hort . 122:507-520.
Del  Pozo,  J.C.,  E.  Ramirez-Parra.  2015.  Whole  genome duplications in plants: An overview from Arabidopsis. J. Exp. Bot.  66:6991-7003.
Hopkins, W.G. 1999. Introduction to Plant Physiology 2 nd ed. John Willey & Sons Inc, USA, US.
Karjadi,  A.K.,  A.  Buchory.  2008.  Pengaruh  auksin  dan sitokinin  terhadap  pertumbuhan  dan  perkembangan jaringan meristem kentang kultivar Granola. J. Hort. 18:380-384.
Kerdsuwan,  N.,  S.  Te-chato.  2012.  Effects  of  colchicine on  survival  rate,  morphological,  physiological and  cytological  characters  of  chang  daeng  orchid ( Rhynchostylis  gigantea var.  rubrum  Sagarik)  in vitro. J. Agric. Tech. 8:1451-1460.
Khosravi, A.R., M.A. Kadir, S.B. Kadzemin, F.Q. Zaman, A.E.  De  Silva.  2009.  RAPD  analysis  of  colchicine induced variation of the Dendrobium Serdang Beauty. Afr. J. Biotech. 8:1455-1465.
Lu,  C.  1993.  The  use  of  thidiazuron  in  tissue  culture.  In Vitro Cell Dev. Biol. 29:92-96.
Miguel,  T.P.,  K.W.  Leonhardt.  2011. In  vitro polyploidy induction  of  orchids  using  oryzalin . Sci.  Hort. 130:314-319.
Niknejad, A., M.A. Kadir, S.B. Kadzimin. 2011 . In vitro plant regeneration from protocorms like bodies (PLBs) and callus  of Phalaenopsis  gigantean ( Epidendroideae:
Orchidaceae ). Afr. J.  Biotech. 10:11808-11816.
Nuraini, A.,  W.R.  Herliya,  E.  Marliana.  2010.  Responses of protocorm like bodies hybrid Dendrobium orchid on various types and concentration of cytokinin and auxin on Murashige and skoog (MS) medium. hal. 130-135.  International  Seminar  on  Horticulture  to Support Food Security. Bandar Lampung 22-23 June 2010.
Parveen,  S.,  A.  Shahzad.  2010.  TDZ–induced  high frequency  shoot  regeneration  in Cassia  sophera Linn. via cotyledonary node explants. Physiol. Mol. Biol. Plants . 16:201-206.
Rahayu, Y.S., I.K. Prasetyo, A.U. Riyada. 2014. Pengaruh penggunaan kolkisin terhadap pertumbuhan vegetatif tanaman  sedap  malam  ( Polianthes  tuberose L.)  di dataran medium. J. Agromix 5:44-56.
Rahayu,  E.M.D.,  D.  Sukma,  M.  Syukur,  Irawati.  2015.
Induksi  poliploidi Phalaenopsis  amabilis (L.) Blume  dan Phalaenopsis  amboinensis J.J  Smith menggunakan kolkisin secara in vitro dan in vivo. J. Agron. Indonesia 43:219-226.
Raynalta,  E.  2013.  Pengaruh  komposisi  media  dalam pertumbuhan protocorm  like  bodies ,  planlet,  dan aklimatisasi Phalaenopsis amabilis. J. Hort. Indonesia 4:131-139.
Sarathum, S., M. Hegele, S. Tantiviwat, M. Nanakorn. 2010. Effect  of  concentration  and  duration  of  colchicine treatment  on  polyploidy  induction  in Dendrobium scabrilingue L. Europ J. Hort. Sci. 75:123-127.
Sattler,  M.C.,  C.R.  Carvalho,  W.R.  Clarindo.  2016.  The Polyploidy and its keyrole in plant breeding. Planta 243:281-296.
Syukur,  M.,  S.  Sastrosumarjo,  Y.  Wahyu,  S.I. Aisyah,  S. Sujiprihati, R. Yunianti. 2013. Sitogenetika Tanaman.
Edisi Kedua. IPB Press, Bogor, ID.
Wu, Y., B. Hu. 2009. Simultaneous determination of several phytohormones  in  natural  coconut  juice  by  hollow fiber-based liquid-liquid-liquid microextraction-high performance liquid chromatography. J. Chromatogr .
1216:7657-7663.
Yong, J.W.H., L. Ge, Y.F. Ng, S.N. Tan. 2009. The Chemical composition  and  biological  properties  of  coconut ( Cocos nucifera L.) water. Molecules 14:5144-5164.