## Optimasi Sumber Karbon Dan Nitrogen Isolat Bakteri Termofilik TUA-504 Penghasil Protease
Assyifa Syafrita (1), Anthoni Agustien(2*), Yetti Marlida(3),
(1)Departemen Nutrisi dan Makanan Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Andalas (2*)Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas
assyifasyafrita64@gmail.com (1), anthoniagustien@sci.unand.ac.id (2*), yettimarlida@ansci.unand.ac.id (3),

## ABSTRAK
Protease  merupakan enzim  yang paling  banyak dimanfaatkan diberbagai  industri seperti  industri kesehatan, farmasi, deterjen, makanan, dan tekstil. Protease termasuk golongan enzim hidrolase yang mampu memecah protein  menjadi  oligopeptida  pendek  atau  asam  amino.  Enzim  mudah  terdenaturasi  pada  suhu  tinggi. Sedangkan dalam industri, protease lebih banyak diaplikasikan pada suhu tinggi. Sehingga diperlukan enzim yang  tahan  terhadap  suhu  tinggi  (termostabil).  Enzim  termostabil  yang  dihasilkan  oleh  bakteri  termofilik sangat dibutuhkan dalam bidang industri karena kemampuannya yang tahan terhadap suhu tinggi. Tujuan dari penelitian  ini  untuk  mengetahui  sumber  karbon  dan  sumber  nitrogen  optimum  terhadap  isolat  bakteri termofilik  TUA-504  produksi  protease.  Metode  penelitian  dilakukan  secara  eksperimen  dengan menggunakan  variasi  sumber  karbon  dan  sumber  nitrogen  konsentrasi  1%  untuk  mendapatkan  kondisi optimum  dari  aktivitas  protease.  Hasil  dari  penelitian  ini  didapatkan  kondisi  optimum  isolat  bakteri termofilik  TUA-504  dalam  memproduksi  protease  yaitu  pada  sumber  karbon  glukosa  dan  sumber  nitrogen NaNO 3 .
Kata Kunci : Bakteri termofilik, karbon, nitrogen, optimasi, protease.

## ABSTRACT
Protease  is  an  enzyme  that  is  most  widely  used  in  various  industries  such  as  the  health,  pharmaceutical, detergent, food and textile industries. Proteases are a class of hydrolase enzymes that are able to break down proteins  into  short  oligopeptides  or  amino  acids.  Enzymes  are  easily  denatured  at  high  temperatures. Meanwhile,  in  industry,  proteases  are  mostly  applied  at  high  temperatures.  So  an  enzyme  is  needed that  is resistant to  high temperatures (thermostable). Thermostable enzymes produced by thermophilic bacteria are needed  in  the  industrial  sector  because  of  their  ability  to  withstand  high  temperatures.  The  aim  of  this research  was  to  determine  the  optimum  carbon  source  and  nitrogen  source  for  the  thermophilic  bacterial isolate TUA-504 producing protease. The research method was carried out experimentally using a variety of carbon sources and  nitrogen sources with a concentration of 1% to obtain optimum  conditions  for protease activity. The results of this research showed that the optimum conditions for the thermophilic bacterial isolate TUA-504 in producing protease were the carbon source glucose and the nitrogen source NaNO3.
Keywords : Thermophilic Bacteria, Carbon, Nitrogen, Optimization, Protease.

## I. PENDAHULUAN

## 1. Latar Belakang
Kebutuhan protease di dunia menempati urutan pertama dalam penjualan enzim sekitar 60% dari  total  penjualan  enzim  di  dunia  dimana  52%  diantaranya  merupakan  protease  alkalin (Naveed  et  al.,  2021).  Protease  mampu  memecah  protein  menjadi  molekul  yang  lebih sederhana,  seperti  oligopeptida  pendek/  asam  amino  dengan  reaksi  hidrolisis  pada  ikatan peptida.  Protease  banyak  dimanfaatkan  di  berbagai  industri  seperti  industri  deterjen, terutama dalam formulasi deterjen cucian, pemrosesan kulit, dan sintesis peptida (Si et al., 2018;  Adelere  dan  Lateef,  2019).  Selain  itu,  dimanfaatkan  dalam  industri  lain  seperti makanan,  farmasi,  kosmetik  (Razzaq  et  al.,  2019),  fotografi,  sutra,  roti,  tekstil,  susu, bioremediasi  (Dutta  et  al.,  2016)  Protease  banyak  diaplikasikan  pada  suhu  tinggi (termostabil).  Bakteri  termofilik  mendapatkan  banyak  perhatian  sebagai  sumber  enzim protease termostabil yang penting. Pengaplikasian dalam berbagai bidang industri terutama dalam  bidang  kesehatan,  farmasi,  deterjen,  makanan,  penyamakan  kulit,  karena pertumbuhannya  yang  cepat,  hasilnya  mudah  ditingkatkan  melalui  pengaturan  kondisi pertumbuhan, serta mampu menghasilkan enzim pada kondisi yang ekstrim (Fachrial et al., 2021).  Kebutuhan  enzim  protease  di  Indonesia  dapat  mencapai  lebih  dari  2.500  ton/tahun dan  terus  meningkat.  Kebutuhan  enzim  protease  dipenuhi  melalui  impor  sehingga berdampak pada devisa negara  (Ramadhan et al., 2023). Strategi untuk mengurangi impor enzim  adalah  dengan  mengeksplorasi  sumber  enzim  protease  yang  bersifat  termostabil. Enzim termostabil dapat diperoleh dari bakteri yang hidup pada lingkungan yang memiliki suhu tinggi seperti sumber air panas. Isolasi bakteri termofilik dari sumber air panas Sungai Medang,  Kerinici  diperoleh  29  isolat  (Agustien  et  al.,  2024).  Penelitian  pendahuluan menunjukkan isolat bakteri termofilik TUA-504 menghasilkan protease paling tinggi. Agar enzim  dapat  digunakan  untuk  aplikasinya  maka  aktivitas  enzim  perlu  ditingkatkan.  Salah satu  teknik  untuk  meningkatkan  aktivitas  enzim  yaitu  melalui  optimasi  terhadap  bakteri tersebut.  Pada  penelitian  ini  optimasi  dilakukan  dengan  merekayasa  lingkungan ekstrinsiknya  seperti  sumber  karbon  dan  nitrogen.  Sumber  karbon  dan  sumber  nitrogen merupakan faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan dan produk mikroorganisme. Nitrogen  sangat  diperlukan  untuk  pertumbuhan  sel,  sedangkan  unsur  karbon  digunakan untuk  meningkatkan  energi  biosintesis. Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan  penelitian  untuk mengetahui jenis sumber karbon dan nitrogen optimum  isolat bakteri termofilik TUA-504 produksi protease.

## 2. Perumusan Masalah
Perumusan    masalah  dalam  pengabdian  ini,  yaitu  apakah jenis  sumber  karbon  dan  sumber nitrogen  optimum  terhadap  isolat  bakteri  termofilik  TUA-504  dalam  memproduksi protease?.

## 3. Tujuan Penelitian
Tujuan  penelitian  ini  adalah  mengetahui  jenis  sumber  karbon  dan  sumber  nitrgoen optimum terhadap bakteri termofilik TUA-504 dalam memproduksi protease.

## 4. Manfaat Penelitian
Serta manfaat penelitian ini yaitu   memberikan informasi ilmiah mengenai sumber karbon dan  sumber  nitrogen  yang  optimum  untuk  produksi  protease  oleh  isolat  termofilik  TUA- 504.

## II. METODE Tempat dan Waktu
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium  Bioteknologi,  UPT  Biota  Sumatera,  Universitas Andalas. Adapun penelitian ini dilakukan dari bulan maret-mei 2024.

## Rancangan Penelitian atau Model
Penelitian  ini  menggunakan  metode  eksperimen.  Tahapan  penelitian  dilakukan  dengan menentukan  kondisi  optimum  dari  variasi  sumber  karbon  dan  sumber  nitrogen menggunakan isolat bakteri termofilik TUA-504 dalam menghasilkan protease.

## Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah cawan Petri, tabung reaksi, Erlenmeyer, termometer, pH meter,  jarum  ose,  autoclave,  lampu  spritus,  timbangan  analitik,  inkubator, mikroskop,centrifuge, shaker, autoclaf, laminar air flow, dan spektrofotometer. Sedangkan bahan  yang  digunakan  adalah  isolat  TUA-504  koleksi  Laboratorium  Bioteknologi,  UPT Biota Sumatera, Universitas Andalas  yang berasal dari sumber air panas Sungai Medang, Kabupaten  Kerinci, Nutrient  Agar (NA),  medium  produski  protease,  Tris-HCl,  TCA, Na 2 CO3,  KNO 3 ,  NaNO 3 ,  NH 4 Cl,  (NH 4 ) 2 SO 4 ,  kasein,  glukosa,  maltosa,  sukrosa,  laktosa, folin ciocalteu, tirosin, akuades, dan alkohol.

## Tahapan Penelitian

## a. Sumber isolat bakteri
Isolat  yang digunakan pada penelitian ini  yaitu TUA-504 koleksi isolat bakteri termofilik Laboratorium  Bioteknologi,  UPT  Biota  Sumatera,  Universitas  Andalas.  Isolat  bakteri termofilik tersebut diisolasi dari sumber air Sungai Medang, Kabupaten Kerinci. Kemudian isolat bakteri TUA-504 diremajakan pada medium Nutrient Agar (NA) dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 50℃ selama 24 jam.

## b. Optimasi variasi sumber karbon
Disiapakan  inokulum  menggunakan  medium  produksi  protease.  Dipipetkan  5  mL inokulum  pada  medium  produksi  protease  yang  ditambahkan  dengan  variasi  sumber karbon  yaitu,  glukosa,  sukrosa,  laktosa  dan  maltosa  dengan  konsentrasi  masing-masing 1%.  Medium  produksi  diinkubasi  pada  kondisi  optimum  yang  telah  didapatkan  dan dicuplik  pada  waktu  idiofase.  Kemudian,  medium  produksi  disentrifugasi  pada  6000  rpm selama  20  menit  sehingga  diperoleh  larutan  enzim  dan  ditentukan  aktivitas  enzim (Agustien, 2010).

## c. Optimasi variasi sumber nitrogen
Setelah didapatkan kondisi optimum sumber karbon, kemudian dilanjutkan mengoptimasi sumber  nitrogen.  Disiapakan  inokulum  menggunakan  medium  produksi  protease. Dipipetkan  masing-masing  5  mL  inokulum  pada  medium  produksi  protease  yang ditambahkan  dengan  variasi  sumber  nitrogen  yaitu  KNO 3 ,  NaNO 3 ,  NH 4 Cl,  (NH 4 ) 2 SO 4 dengan  konsentrasi  masing-masing  1%.  Medium  produksi  diinkubasi  pada  kondisi optimum  yang  telah  didapatkan  dan  dicuplik  pada  waktu  idiofase.  Selanjutnya,  medium produksi disentrifugasi pada 6000 rpm selama 20 menit sehingga diperoleh larutan enzim dan ditentukan aktivitas enzim (Agustien, 2010).

## d. Pengujian aktivitas protease
Pengujian aktivitas protease dilakukan dengan metode Takami et al. (1989) dimulai dengan membuat  substrat  kasein  1%,  larutan  substrat  kemudian  dipipetkan  sebanyak  0,5  mL,
selanjutnya  ditambahkan  larutan  enzim  sebanyak  0,5  mL,  ditambahkan  0,25  Tris-HCL buffer  50mM  pH  8,0  diinkubasi  (60°C,  15  menit).  Ditambahkan  0,5  mL  TCA  diinkubasi pada  suhu  ruang  selama  20  menit.  Disentrifugasi  pada  (6000  rpm,  20  menit),  lalu supernatan  (0,375  mL)  dan  dipindahkan  kedalam  tabung  reaksi,  ditambahkan  1,25  mL Na2CO3  dan  0,25  mL  1N  Folin  Ciocelteu.  Pembacaan  OD  dilakukan  pada  λ  578  nm. Penentuan  nilai  blanko  dilakukan  dengan  0,5  mL  akuades.  Penentuan  nilai  standar dilakukan dengan 0,5 mL sampel protease diganti dengan 0,5 mL tirosin 5 mM.
Keterangan:
UA = Unit Aktivitas Protease (U/mL) Asp   = Absorbansi sampel Abl = Absorbansi blanko Ast = Absorbansi standar
T
= Waktu inkubasi (menit)
P = Pengenceran

## III. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
a. Aktivitas enzim protease terhadap variasi sumber karbon
Gambar  1 .  Aktivitas  protease  dari  isolat  bakteri  termofilik  TUA-504  dengan  variasi sumber karbon konsentrasi 1%
Gambar  1.  menunjukkan  aktivitas  protease  dari  optimasi  menggunakan  beberapa  sumber karbon yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, dan maltosa masing-masing dengan konsentrasi 1% dihasilkan nilai aktivitas spesifik protease yang berbeda-beda oleh isolat bakteri termofilik TUA-504.  Diantara  keempat  jenis  sumber  karbon  yang  diberikan,  glukosa  memiliki  nilai aktivitas  spesifik  protease  yang  tertinggi  dengan  nilai  aktivitas  2,675  U/mg.  Glukosa menjadi  sumber  karbon  terbaik  disebabkan  karena  glukosa  dapat  menghasilkan  energi yang  cukup  dan  memicu  ekspresi  gen-gen  yang  terlibat  pada  proses  biosintesis  serta sekresi  enzim  dalam  meningkatkan  aktivitas  protease  (Jingying  dan  Yan,  2023). Kemampuan suatu organisme untuk memecah karbohidrat yang berbeda dapat disebabkan oleh preferensi mikroorganisme terhadap lingkungan yang rendah kandungan organiknya.
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 Glukosa Sukrosa Laktosa Maltosa A kt iv it as P ro te as e (U/m L )
Sumber Karbon (1 %)
Hal  ini  dukung  oleh  Suberu  et  al.  (2019),  bahwa  secara  umum  perbedaan  sumber karbon akan memiliki pengaruh  yang berbeda dalam memproduksi enzim ekstraseluler. Produksi enzim  ini  diatur  oleh  mekanisme  fisiologis  dan  katabolit  glukosa  (represi  glukosa)  dalam cairan  medium  kultur.  Aktivitas  protease  mengalami  penurunan  pada  glukosa  disakarida. Hal  ini  disebabkan  karena  terjadinya  represi  katabolit  serta  memicu  jalur  regulasi  yang dapat menekan ekspresi gen-gen yang terlibat dalam metabolisme produksi enzim. Represi katabolit karbon (CCR) adalah mekanisme  pengaturan  yang mencegah ekspresi  gen  yang diperlukan  untuk  pemanfaatan  sumber  karbon  sekunder  seperti  maltosa,  sukrosa  dan laktosa dengan adanya substrat yang disukai (Stulke dan wolfgang, 1999).
b. Aktivitas enzim protease terhadap variasi sumber nitrogen
Gambar  2 . Aktivitas protease dari isolat bakteri termofilik TUA-504 dengan variasi sumber nitrogen konsentrasi 1%
Gambar 2. menunjukkan bahwa aktivitas enzim isolat bakteri mengalami peningkatan yang signifikan  pada  penambahan  sumber  nitrogen  berupa  kalium  nitrat  (KNO 3 )  sebesar  0,907 U/mL.  Beberapa  penelitian  telah  membuktikan  bahwa  Kalium  nitrat  dapat  berpengaruh positif terhadap  produksi  enzim  oleh  bakteri  tertentu.  Sebagai  contoh,  sebuah  penelitian yang  dilakukan  oleh  Agwa  &  Abu,  (2016)  menunjukkan  bahwa  penambahan  KNO 3 ke dalam  medium  kultur Bacillus sp.  S5  dapat  meningkatkan  aktivitas  enzim  selulase. Penelitian  lain  oleh  Abdollahi  et  al.,  (2021)  menunjukkan  bahwa  penambahan  KNO 3 ke dalam  medium  kultur Bacillus  amyloliquefaciens dapat  meningkatkan  produksi  enzim protease  dan  amilase.  Penambahan  KNO 3 dapat  meningkatkan  aktivitas  protease  karena dapat  menyediakan  nitrat  (NO 3 )  sebagai  sumber  nitrogen.  Nitrat  adalah  bentuk  oksidasi nitrogen  yang  dapat  digunakan  oleh  bakteri  sebagai  sumber  nitrogen  untuk  pertumbuhan dan  sintesis  protein.  Beberapa  bakteri  memiliki  jalur  metabolisme  nitrat  yang memungkinkan  mereka  mengambil  nitrat  dari  lingkungan  dan  menggunakannya  sebagai sumber  nitrogen.  Dalam  jalur metabolisme  ini,  nitrat  diubah  menjadi  amonium  (NH 4 +) melalui  reduksi  nitrat  yang  melibatkan  enzim  seperti  nitrat  reduktase.  Amonium selanjutnya dapat digunakan untuk sintesis protein, termasuk sintesis enzim protease. KNO 3 mengandung nitrat yang mudah diakses oleh bakteri. Ketika KNO 3 ditambahkan ke media pertumbuhan, bakteri yang memiliki jalur metabolisme nitrat akan menggunakan NO 3 dari
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 KNO3 NaNO3 NH4Cl (NH4)2SO4 A kt iv it as P ro te as e (U/m L )
Sumber Nitrogen (1 %)
KNO 3 untuk sintesis protein. Keberadaan nitrat yang melimpah dalam media memberikan sumber nitrogen yang cukup untuk pembentukan enzim  protease.

## IV. KESIMPULAN
Kesimpulan  dari  penelitian  tersebut  yaitu  didaptakan  kondisi  optimum  isolat  bakteri termofilik TUA-504 dalam memproduksi enzim protease yaitu pada sumber karbon glukosa dan  sumber  nitrogen  NaNO 3 dan  peningkatan  aktivitas  protease  sebelum  dan  sesudah optimasi mencapai 78%.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdollahi,  P.,  Ghane,  M.,  &  Babaeekhou,  L.  (2021).  Isolation  and  characterization  of Thermophilic bacteria from Gavmesh Goli hot spring in Sabalan geothermal field, Iran: Thermomonas  hydrothermalis  and  Bacillus  altitudinis  isolates  as  a  potential  source  of Thermostable Protease. Geomicrobiology Journal, 38(1), 87-95.
Adelere,  I.  A.,  &  Lateef,  A.  (2019).  Degradation  of  keratin  biomass  by  different microorganisms. Keratin as a Protein Biopolymer: Extraction from Waste Biomass and Applications, 123-162.
Agustien, A. 2010. Protease Bakteri Termofilik. UNPAD Press. Bandung.
Agustien,  A.,  Melhanza,  Z.  N.,  Annisa,  A.,  Husnah,  Q.,  Nasir,  N.,  &  Rilda,  Y.  (2018). Isolation  and  Screening  Protease  Acid,  Neutral  and  Alkaline  Producing  Bacteria  from Dadih  (Traditional  Indonesian  Food). Available  Online  Www.Jocpr.Com  Journal  of Chemical and Pharmaceutical Research , 10 (1), 50–54. www.jocpr.com Agustien,  A.,  Muqarramah,  M.,  &  Alamsjah,  F.  (2024).  Optimization  and  Molecular Identification  of Protease-Producing  Thermophilic  Bacterial  Isolate  TUA-26. OnLine Journal of Biological Sciences , 24 (3), 321–329.
Agustien, A., W. Cahyati, and Y. Rilda, “Exploration and Characterization of Thermophilic Bacteria from the Kerinci-Jambi Geothermal Source for Alcohol Production,” Online J Biol Sci, vol. 24, no. 3, pp. 313–320, 2024, doi: 10.3844/ojbsci.2024.313.320.
Agwa,  O.  K.,  &  Abu,  G.  O.  (2016).  Influence  of  various  nitrogen  sources  on  biomass  and lipid production by Chlorella vulgaris. British Biotechnology Journal, 15(2), 1-13.
Dutta,  S.,  Y.S.  Park  &  K.  Park.  2016.  Proteolytic  Activity  of  Thermophilic  Bacillus licheniformis  strain  SF5-1  for  the  Efficient  Bioconversion  of  Pork  Waste  to  Amino Acid Fertiliser. Int. Biodeterior. Biodegrad. 111: 31-36.
Fachrial,  E.,  V.  Krisdianilo,  Harmileni,  I.N.E.  Lister,  T.T.  Nugroho  &  Saryono.  2021. Isolation, Characterization, Activity Test and Molecular Identification of Thermophilic Bacteria  Producing  Proteases  from  Dolok  Tinggi  Raja  Natural  Hot  Springs,  North Sumatra, Indonesia. Biodiversitas 22: 1725-1732.
Jingying,  C.  &  G.  Yan.  2023.  Optimization  of  Fermentation  Conditions  for  Protease Production from Bacillus subtilis. BIO Web of Conferences 59.
Kurniawan,  H.M.,  R.  Fikrinnisa  &  A.  Adriadi.  2022.  Optimasi  Ekstrinsik  Produksi  Protease dari  Bacillus  sp.  TG-50  Isolat  Tanah  Tempat  Pembuangan  Akhir  Sampah  (TPAS) Talang Gulo Jambi. Jurnal Penelitian Biologi (Journal of Biological Research) 9(1): 1- 14.
Naveed,  M.,  F.  Nadeem,  T.  Mehmood,  M.  Bilal,  A.  Zahid,  A.  Fazeha.  2021.  Protease-A Versatile  and  Ecofriendly  Biocatalyst  with  Multi-Industrial  Applications:  An  Updated Review. Catalysis Letter 151: 307-323.
Ramadhan, D., F. Firdayani, N. Karimah, E. E. Permadi, S. El Muttaqien, and A. Supriyono, “Identification  of  potential  bioactive  compounds  from  Azadirachta  indica  (Neem)  as inhibitors of SARS-CoV-2 main protease: Molecular docking and molecular dynamics
simulation  studies,”  J  Appl  Pharm  Sci,  vol.  13,  no.  11,  2023,  doi: 10.7324/JAPS.2023.139799.
Razzaq,  A.,  Shamsi,  S.,  Ali,  A.,  Ali,  Q.,  Sajjad,  M.,  Malik,  A.,  &  Ashraf,  M.  (2019). Microbial proteases applications. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 7, 110. Si, J.B., E.J. Jang, D. Charalampopoulos & Y.J. Wee. 2018. Purification and Characterization of  Microbial  Protease  Produced  Extracellularly  from  Bacillus  subtilis  FBL-1. Biotechnology and Bioprocess Engineering 23:176-182.
Stülke, J., & Hillen, W. (1999). Carbon  catabolite repression in bacteria. Current opinion in microbiology, 2(2), 195-201.
Suberu, Y.,  I.  Akande, T. Samuel. A.  Lawal & A. Olaniran. 2019. Optimization of Protease Production  in  Indigenous  Bacillus  sp.  Isolated  from  Soil  Samples  in  Lagos,  Nigeria using Response Surface Methodology. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 18: 1-13.
Takami,  H.,  T.  Akiba  &  K.  Horikosh.  1989.  Production  of  Extremely  Thermostable Alkaline Protease from Bacillus sp. AH-101. Applied Microbiol Biotechnol 30: 120- 124.
Accepted Date Revised Date Decided Date Accepted to Publish 10 Juni 2024 17 Juni 2024 27 Juni 2024 Ya