## KARAKTERISTIK  PROTEASE DARI BAKTERI PATOGEN Staphylococcus epidermidis
Ace Baehaki 1 , Tati Nurhayati 2 dan Maggy T. Suhartono 3

## Abstrak
Beberapa  bakteri  patogen    memproduksi  enzim  hidrolitik  seperti    protease  dan hialuronidase yang berfungsi untuk  mendegradasi  komponen matrik ekstraseluler sehingga dapat merusak  struktur  jaringan  inang.    Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  melakukan  karakterisasi protease  dari  bakteri Staphylococcus  epidermidis yang  diisolasi  dari  koleksi  Rumah  Sakit Pertamina Jakarta. Bakteri ditumbuhkan pada media Luria broth (LB)  yang mengandung tryptone 1  %,  NaCl  1  %  dan yeast  extract 0,5  %.  Hasil  karakterisasi  menunjukkan  bahwa  protease S. epidermidis ini memiliki pH dan suhu optimum 8 dan 50 o C. Ion logam Mn 2+ (5 mM) dan Ba 2+ (5  mM) merupakan  aktivator  kuat  protease S.  epidermidis yang  dapat  meningkatkan  aktivitas protease  masing-masing    3    dan  2  kali  lipat  dari  protease  kontrol,  sedangkan  Na + (1  mM), K + (1  mM), Fe 3+ (1  dan 5  mM),  Zn 2+ (5 mM), dan  Ca 2+ (1 mM)  merupakan   inhibitor ion logam yang  kuat.      Protease S.  epidermidis digolongkan  ke  dalam  serin  metaloprotease  karena  dapat dihambat  secara  sempurna  oleh  PMSF  dan  EDTA.  Protease  tersebut  mempunyai  berat  molekul sekitar 35 kD.
Kata Kunci: bakteri patogen, karakterisasi, protease , Staphylococcus epidermidis .

## PENDAHULUAN
Bakteri  patogen  menghasilkan  berbagai  enzim  yang  pada  dasarnya  tidak toksik  tetapi  berperan  penting  dalam  proses  infeksi.  Beberapa  bakteri  patogen memproduksi enzim  hidrolitik seperti  protease dan  hialuronidase  yang berfungsi untuk  mendegradasi    komponen  matrik  ekstraseluler  sehingga  dapat  merusak struktur  jaringan  inang.  Enzim  hidrolitik  ini  digunakan  oleh  bakteri  untuk memperoleh  sumber  karbon  dan  energi  dengan  menghancurkan  polimer  inang menjadi gula sederhana dan asam amino (Salyers dan Whitt 1994).
Bakteri Staphylococcus dapat menyebabkan  sakit  melalui  kemampuannya berkembang  biak  dan  menyebar  secara  luas  dalam  jaringan  dan  pembentukan berbagai  zat  ekstraseluler.    Beberapa  zat  ini  adalah  enzim,  sedangkan  yang  lain diduga berupa toksin  (Jawetz et al. 1996). Bakteri Staphylococcus menghasilkan
1 Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya
2 Departemen Teknologi Hasil Perairan, FPIK IPB
3 Departemen Teknologi Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor, Bogor
protease  ekstraseluler  jenis  metaloprotease  yang  bersifat  toksik  (Hase  dan Finklestein  1993).
Mengingat  pentingnya  protease  dalam  mekanisme  penyebab  penyakit, maka  saat  ini perhatian para peneliti terhadap protease sebagai target obat sangat besar.    Oleh  karena  itu  informasi  tentang  karakteristik  protease  tersebut  amat diperlukan  karena  akan  memudahkan  bagi  kita  untuk  mengupayakan  mencari penghambat  (inhibitor)  enzim  tersebut.    Sebagai  sumber  inhbitor  dapat  berasal dari organisme laut, seperti sponge atau dari simbionnya.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  melakukan  karakterisasi  protease  dari bakteri patogen yaitu bakteri Staphylococcus epidermidis.

## METODOLOGI

## Bahan  Penelitian
Bahan  utama  berupa  isolat  bakteri  patogen Staphylococcus  epidermidis yang diperoleh dari koleksi Rumah Sakit Pertamina Jakarta.

## Produksi Protease
Galur bakteri patogen diinokulasi sebanyak 1-2 lup pada media luria broth (LB).  Proses  diawali  dengan  penentuan  umur  prekultur  (dalam  media  LB)  yang tepat untuk  keperluan produksi enzim.  Pengamatan dilakukan dengan mengukur optical  density (OD)  sampai  nilai  OD =  0,8 pada  λ  =  620  nm. Sebanyak  10  % media luria  broth (LB)  yang  sudah  mempunyai      OD  =  0,8    ditambahkan  pada media LB yang baru dan selanjutnya nilai OD dan aktivitas protease diukur setiap 8 jam selama 56 jam.

## Pengukuran Aktivitas Protease dan Kadar Protein
Aktivitas  protease  diukur  dengan  metode  Bergmeyer et  al. (1983) menggunakan  substrat  kasein  (Hammerstein  2  %)  (b/v).    Satu  unit  aktivitas protease didefinisikan  sebagai  jumlah enzim  yang dapat menghasilkan satu µmol produk    tirosin per menit   pada  kondisi   pengukuran. Kadar protein ditentukan dengan  metode  Bradford  (1976)  dengan  menggunakan  Bovine  Serum  Albumin Fraction V sebagai standar protein.

## Karakterisasi  Protease Ekstrak Kasar
Pengujian  karakterisasi  protease  yang  dilakukan    meliputi  pengaruh  pH (6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 dan 9), suhu (30 , 40, 50, 60, dan 70 0 C), ion logam (Na + , Ca 2+ ,
Mn 2+ , Zn 2+ , dan Ba 2+ ) dan  inhibitor spesifik (EDTA dan PMSF).

## SDS PAGE dan Zimogram
Penentuan  berat  molekul  dilakukan  menggunakan  SDS  PAGE  (Laemmli 1970), sedangkan  zimogram menggunakan modifikasi metode Choi et al . (2001). Analisis  zymogram  dilakukan  dengan  cara:  gel  akrilamid  8  %  dikopolimerisasi dengan  substrat  kasein  2  %.  Setelah    dilakukan  elektroforesis,  gel  direndam dengan  Triton  X-100  2,5  %  selama  1  jam  dan  dilakukan  inkubasi  dalam  buffer Tris-Cl 10 mM, pH 8 selama 24 jam. Setelah itu dilakukan pewarnaan coomassie blue.  Penentuan berat molekul dengan SDS PAGE dilakukan dengan pewarnaan silver  staining .    Pewarnaan  dengan silver  staining dilakukan  sebagai  berikut:  gel direndam  dalam  larutan  fiksasi  (25  %  metanol  dan  12  %  asam  asetat)  selama 1 jam kemudian direndam dalam 50 % etanol selama 20 menit, kemudian diganti dengan  30  %  etanol  selama  2  x  20  menit.  Larutan  diganti  dengan enhancer , kemudian dicuci dengan akuadestilata.  Larutan  silver  nitrat ditambahkan  selama 30  menit,  kemudian  dicuci  lagi  dengan  akuadestilata  2  x  20  detik  dan ditambahkan  larutan  campuran  Na 2 CO 3 ,    formaldehida  dan  terakhir  dengan larutan fiksasi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Produksi Protease
Produksi  protease  dilakukan  pada  media luria  broth (LB)  yang  dikultur dalam  medium  yang  sama  hingga  mencapai  OD=0,8.    Pengamatan  dilakukan setiap  8  jam  sekali  selama  56  jam,  pada  suhu  37 0 C  dan  kecepatan  120  rpm. Enzim  yang  telah  dihasilkan  oleh  bakteri  dipisahkan  dari  sel  bakteri menggunakan  sentrifugasi.    Dengan  teknik  ini,  sel  akan  mengendap  oleh  adanya gaya  gravitasi  sedangkan  enzim  tetap  terdapat  pada  supernatan.    Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah untuk mencegah terjadinya kerusakan struktur enzim, selanjutnya  dilakukan  pengujian  aktivitas  protease,  sedangkan  pertumbuhan
bakteri  diamati  melalui optical  density (OD)  pada  λ=  620  nm.    W aktu  produksi protease yang optimum dari bakteri patogen ini  dapat dilihat pada   Gambar  1.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 8 16 24 36 48 56 Jam ke O D 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 A k ti v it a s ( U /m l)
Gambar 1.  Produksi protease S. epidermidis (- ▲ - Pertumbuhan bakteri, - ■ - aktivitas protease).
Protease S. epidermidis memiliki aktivitas tertinggi (0,0288 U/ml)  setelah diinkubasi  selama  48  jam  dalam  media  LB,    protease  diproduksi  seiring  dengan pertumbuhan sel dan mencapai aktivitas tertinggi  pada fase stasioner (Gambar 1). Bakteri S.  epidermidis menghasilkan  protease  pada  saat  pertumbuhan  bakteri menjelang  stasioner.  Hal  ini  menunjukkan  bakteri  ini  memerlukan  protease sebagai  strategi  bakteri  dalam  mempertahankan  hidupnya.  Penelitian  tentang produksi  optimum  protease  yang  dilakukan  oleh  Fawzya  (2002)  menunjukkan bahwa isolat bakteri asal ikan hiu ( Carcharhinus limbatus ) menghasilkan protease optimal  pada  jam  ke-24,  pada  saat  pertumbuhan  bakteri  mulai  mencapai  fase stasioner. Selain  itu, dilaporkan pula bahwa protease  yang dihasilkan oleh Vibrio proteolyticus memiliki       produksi      yang    optimal    pada  fase  stasioner (Durham  1990).

## Karakterisasi Protease Ekstrak Kasar
Karakterisasi  protease  yang  dilakukan  meliputi  penentuan  suhu  dan  pH optimum, pengaruh kation dan inhibitor spesifik serta penentuan berat molekul.

## Keasaman (pH)  Optimum
Semua reaksi  enzimatis  dipengaruhi  pH,  sehingga  diperlukan  bufer untuk mengontrol  pH  reaksi.    Pada  umumnya  enzim  bersifat  amfolitik,  yang  berarti enzim  mempunyai  konstanta  disosiasi  pada  gugus  asam  maupun  gugus  basanya terutama  pada  gugus  residu  terminal  karboksil  dan  gugus  terminal  aminonya. Diperkirakan perubahan keaktifan enzim adalah sebagai akibat perubahan ionisasi pada  gugus  ionik  enzim,  baik  pada  sisi  aktifnya  atau  sisi  lain  yang  secara  tidak langsung  mempengaruhi  sisi  aktif.    Gugus  ionik  berperan  dalam  menjaga konformasi  sisi  aktif  dalam  mengikat  substrat  dan  dalam  mengubah  substrat menjadi  produk.    Perubahan  ionisasi  juga  dapat  dialami  oleh  substrat  atau kompleks  enzim-substrat,  yang  juga  berpengaruh  terhadap  aktivitas  enzim (Muchtadi et  al .  1996).    Pada  skala  deviasi  pH  yang  besar,  perubahan  pH  akan mengakibatkan    enzim    mengalami    denaturasi  sehubungan    dengan  adanya gangguan  terhadap  berbagai  interaksi  non  kovalen  yang  menjaga  kestabilan struktur 3D enzim (Hames dan Hooper 2000).
Gambar 2 memperlihatkan pengaruh pH terhadap  aktivitas protease kasar bakteri  patogen,    pH  optimum S.  epidermidis pada  pH  8,  sedangkan  menurut penelitian Drapeau et al . (1972)  pH optimum dari  protease ini adalah 7,6.
0 20 40 60 80 100 120 6.5 7 7.5 8 8.5 9 pH A k tiv it a s r e la ti f (% )
Gambar 2. Pengaruh pH terhadap aktivitas protease S. epidermidis
Pada Gambar 2, terlihat terjadi naik turun dengan berbedanya pH,  hal ini dipengaruhi  oleh  pK  dari  gugus  yang  terionisasi  pada  sisi  aktif  enzim  yang berperan mengikat substrat, pK gugus molekul substrat yang terikat enzim dan pK gugus  fungsional  enzim  yang  bertanggung  jawab  terhadap  aktivitas  katalitik (Thenawidjaja  1988).

## Suhu Optimum
Pada  umumnya  setiap  enzim  memiliki  aktivitas  maksimum  pada  suhu tertentu,  aktivitas  enzim  akan  semakin  meningkat  dengan  bertambahnya  suhu hingga  suhu  optimum  tercapai,    kenaikan  suhu  lebih  lanjut  akan  menyebabkan aktivitas  enzim  menurun.  Berdasarkan  hasil  pengukuran  aktivitas  enzim  pada berbagai  suhu  (Gambar  3),  terlihat  bahwa  aktivitas  tertinggi  protease S. Epidermidis diperoleh pada suhu inkubasi 50 0 C.
0 20 40 60 80 100 120 30 40 50 60 70 Suhu (oC) A k ti v it a s r e la ti f (% )
Gambar 3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas S. epidermidis
Suhu  mempengaruhi  laju  reaksi  katalisis  enzim  dengan  dua  cara. Pertama,  kenaikan  suhu  akan  meningkatkan  energi  molekul  substrat  dan  pada akhirnya  meningkatkan  laju  reaksi  enzim.    Peningkatan  suhu  juga  berpengaruh terhadap  perubahan  konformasi  substrat  sehingga  sisi  aktif  substrat  mengalami hambatan  untuk  memasuki  sisi  aktif  enzim  dan  menyebabkan  turunnya  aktivitas enzim.    Kedua,  peningkatan  energi  termal  molekul  yang  membentuk  struktur protein  enzim  itu  sendiri  akan  menyebabkan  rusaknya  interaksi-interaksi  non kovalen  (ikatan  hidrogen,  ikatan  van  der  walls,  ikatan  hidrofobik  dan  interaksi elektrostatik)    yang  menjaga  struktur  3D  enzim  secara  bersama-sama  sehingga
enzim  mengalami  denaturasi.    Denaturasi  menyebabkan  struktur  lipatan  enzim membuka  pada  bagian  permukaannya  sehingga  sisi  aktif  enzim  berubah  dan terjadi  penurunan  aktivitas  enzim  (Hames  dan  Hooper    2000).    Pada  suhu  yang lebih  rendah  dari  suhu  optimum,  aktivitas  enzim  juga  rendah,  hal  ini  disebabkan karena rendahnya energi aktivasi yang tersedia.  Energi tersebut dibutuhkan untuk menciptakan  kondisi  tingkat  kompleks  aktif,  baik  dari  molekul  enzim  atau molekul substrat.

## Pengaruh Ion Logam
Beberapa  enzim  membutuhkan  ion  logam  sebagai  kofaktor  untuk mendukung  efisiensi  katalitik  enzim.  Logam  tersebut  membantu  reaksi  katalitik dengan  cara  mengikat  substrat  pada  sisi  pemotongan.    Selain  berperan  dalam pengikatan  antara  enzim  dengan  substrat,  beberapa  logam  juga  dapat  mengikat enzim secara langsung untuk menstabilkan konformasi aktifnya atau menginduksi formasi situs pengikatan atau situs aktif suatu enzim.
Berdasarkan  hasil  pengukuran  aktivitas  dengan  penambahan  ion  logam pada  substrat  kasein  (Gambar  4),  ion  logam  Mn 2+ (5  mM)  dan  Ba 2+ (5  mM) merupakan  aktivator  kuat  protease S.  epidermidis ,  yang  dapat  meningkatkan aktivitas  protease  masing-masing    3    dan  2  kali  lipat  dari  protease  kontrol, sedangkan inhibitor ion logam yang  kuat adalah Na + (1 mM), K + (1 mM), Fe 3+ (1 dan 5 mM), Zn 2+ (5 mM), dan Ca 2+ (1 mM). 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 Kontrol NaCl KCl CaCl2 MnCl2 CoCl2 ZnCl2 BaCl2 FeCl2 A k ti v it a s p ro te a s e ( U /m l)
Gambar 4. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas protease S. epidermidis
Adanya  peningkatan  keaktifan  karena  penambahan  logam  tertentu menunjukkkan  bahwa  ion  logam  diperlukan  sebagai  komponen  dalam  sisi  aktif enzim.    Mekanisme  ion  logam  dalam  memperbesar  aktivitas  enzim  melaui  yaitu (a)  menjadi  bagian  integral  dari  sisi  aktif,  (b)  merubah  konstanta  kesetimbangan dari  reaksi  enzimatis,  (c)  merubah  muatan  listrik,  (d)  mengusir  ion  inhibitor,  (e) menukar  ion  yang  kurang  efektif  pada  sisi  aktif  enzim  atau  substrat. Penghambatan  ion  logam  terhadap  aktivitas  protease  pada  konsentrasi  tertentu berkaitan  dengan  kekuatan  ion,  dimana  kekuatan  ion    itu  sendiri  mempengaruhi konformasi  atau  struktur  tiga  dimensi  dari  protein  enzim  atau  protein  substrat. Pada  konsentrasi  tertentu  ion  logam  tertentu  dapat  bertindak  sebagai  inhibitor, tetapi  dapat  juga  bertindak  sebagai  aktivator  pada  konsentrasi  berbeda (Richardson dan Hyslop  1985).

## Pengaruh Inhibitor Spesifik
Protease  memiliki  kemampuan  menghidrolisis  substrat.  Oleh  karena  itu enzim  protease  digolongkan  ke  dalam  enzim  hidrolase.  Berdasarkan  mekanisme reaksi  yang  dikatalisis,  protease  dapat  dikelompokkan  menjadi  empat,  yaitu protease serin, protease aspartat, protease sistein dan protease logam.
Berdasarkan hasil analisis diketahui bahwa aktivitas protease S. epidermidis dihambat sempurna oleh  inhibitor  protease  serin  yaitu PMSF, dan juga  dihambat  oleh  EDTA,  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  protease  tersebut digolongkan  ke  dalam  serin  metaloprotease.  Teufel  dan  Gotz  (1993) menggolongkan protease S. epidermidis sebagai metaloprotease.
Perkiraan  Berat Molekul dengan SDS-PAGE dan Zimogram
Penentuan  berat  molekul  dilakukan  dengan  teknik  SDS-PAGE  (Sodium dodecyl  sulfat-poliakrilamida  gel  elektroforesis),  yang  merupakan  metode  yang sudah digunakan secara luas.
Berdasarkan  hasil  analisis  SDS-PAGE  pada  ekstrak    kasar  protease S.  epidermidis didapatkan  2  pita  yaitu  35  kD  dan  26,7  kD  sedangkan  hasil zimogram  menunjukkan  pita  yang  berukuran  35  kD  (Gambar  2).  Protease S. aureus menurut penelitian Drapeau (1978) memiliki berat molekulnya  27 kD.
Vol VIII  Nomor 2 Tahun 2005

## M           1                      M               1
A B
Gambar  5.    Hasil  SDS silver  staining dan  Zimogram  aktivitas  protease ekstrak kasar (A dan B)  (M=Marker, 1= S. aureus ).

## KESIMPULAN
Protease S. epidermidis memiliki aktivitas tertinggi (0,0288 U/ml) setelah diinkubasi selama 16 jam dalam media LB.    Protease diproduksi seiring dengan pertumbuhan sel dan mencapai  aktivitas tertinggi  pada fase menjelang stasioner. Karakterisasi  protease S.epidermidis ini  adalah  memiliki  pH  optimum  8,  suhu optimum pada suhu 50 0 C.  Ion logam Mn 2+ (5 mM) dan Ba 2+ (5 mM) merupakan aktivator kuat protease S. epidermidis , yang dapat meningkatkan protease masing- masing   3  dan 2 kali  lipat dari protease kontrol.  Sedangkan  inhibitor ion  logam yang kuat adalah Na + (1 mM), K + (1 mM), Fe 3+ (1 dan 5 mM), Zn 2+ (5 mM), dan Ca 2+ (1  mM).   Protease S.  epidermidis digolongkan  sebagai  serin  metaloprotease karena  dapat  dihambat  secara  sempurna  oleh  PMSF  dan  EDTA.  Berat  molekul ditentukan  dengan  menggunakan  SDS-PAGE  dan  zimogram  didapatkan  berat molekul sekitar 35 kD.

## DAFTAR PUSTAKA
Bergmeyer H.U., Bergmeyer J ., . Graβl M. 1983. Methods of Enzymatic Analysis Vol 2.  Weinheim : Verlag Chemie. hal 1007-1009.
Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities  of  protein  utilizing    the  principle  of  protein  dye-binding. Anal Biochem, 72:234-254.
14,4 kD 97,0 kD 45,0 kD 30,0 kD
Choi  N.S.,  Yoon  KS,  Lee  JY,  Han  KY,  Kim  SH.  2001.    Comparison  of  three substrates  (casein,  fibrin,  and  gelatin)  in  zimographic  gel. J  Biochim  Mol Biol 34:531-536.
Drapeau  G.  1978.  The  Primary  Structure  of Staphylococcal Protease. Can  J Biochem, 56: 534.
Drapeau  G,  Boily  Y,  Houmard  J.  1972.  Purification  and  Properties  of  an Extracellular  Protease  of Staphylococcus  aureus . J  Biol  Chem  247(20): 6720-6726.
Durham  DR.  1990.  The  unique  stability  of Vibrio  proteolyticus neutral  protease under  alkaline  conditions  affords  a  selective  step  for purification  and  use in  amino  acid-coupling  reaction. Appl.  Environ.  Microbiol.  56:2277- 2281.
Fawzya  YN.  2002. Karakterisasi  protease  ekstraseluler  dari  isolat  bakteri  asal ikan  hiu  atas  (Carcharhinus  limbatus)”. [Tesis].    Bogor:  Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Hames  BD,  Hooper  NM.  2000.    Biochemistry:  The  Instant  Notes  2 nd ed. Hongkong: Springer-Verlag.  p83-84.
Hase  CC,  Finkelstein  R.  1993.  Bacterial  extracelluler  zinc-containing metalloprotease. Microbiol Reviews 57(4):823-837 .
Jawetz  E,      Melnick  J,    Adelberg  E.  1996. Medical  Microbiology .    Alih  bahasa Edi Nugroho, R.F. Maulany. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran.
Laemmli  UK.  1970.    Cleavage  of  structural  protein  during  the  assembly  of  the heat of bacteriophag T4. Nature 227:680-685 .
Mayer  AMS  dan    Lehmann  VKB.  2000. Marine  pharmacology .    The Pharmacological.  42(2):62-69.
Muchtadi  D,    Palupi  NS,    Astawan  M.  1996. Enzim  dalam  Industri  Pangan . Bogor: PAU Pangan dan Gizi  Institut Pertanian Bogor.
Richardson  T,    Hyslop  DB.  1985.    Enzyme. Di  dalam Fenema  OR  (Ed),    Food Chemistry.  New York: Mac Kerel Bekker, Inc.
Salyers  AA,  Whitt  DD.  1994. Bacterial  Pathogenesis,  A  Molecular  Approach . Department of Microbiology  University of Illinois.  Washington DC: ASM Press.
Teufel P, Gotz F. 1993. Characterization  of an extracellular metalloprotease with elastase activity from Staphylococcus epidermidis . J. Bacteriol. 175(13):4218-4224.
Thenawidjaya M. 1988.  Dasar-dasar Biokimia Jilid I. Jakarta: Penerbit Erlangga
Vol VIII  Nomor 2 Tahun 2005