## ANALISIS  ENZIM ALANIN AMINO TRANSFERASE (ALAT), ASPARTAT AMINO TRANSFERASE (ASAT), UREA DARAH, DAN  HISTOPATOLOGIS HATI DAN GINJAL TIKUS PUTIH GALUR Sprague-Dawley SETELAH PEMBERIAN ANGKAK
[The Effects of Angkak Administration in Sprague-Dawley White Rats on Alanine Amino Transferase (ALAT) and Aspartic Amino Transferase (ASAT) Enzyme, Blood Urea, and Liver and Kidney Histopathology Test]

## HASIM DANURI
Departemen Biokimia, FMIPA, Institut Pertanian Bogor, Kompleks Fapet IPB, Kampus Darmaga, Bogor, Indonesia, 16680
hasim@ipb.ac.id
Diterima  2 Agustus 2008/ Disetujui  14 Juni 2009

## ABSTRACT
Acute  toxicity  of  angkak  had  been  tested  on  2  months  aged  male  Sprague-Dawley  white  rats.  Twenty  five  rats  were  divided  into  5 groups; control, 2.5 g/kg body weight (bw), 5 g/kg bw, 10 g/kg bw and 15 g/kg bw, and each group was administered by angkak in water orally. The toxic  effect  of  angkak  to  liver  and  kidney  were  tested  by  biochemical  analysis  for  the  activity  of  enzyme  alanin  amino  transferase  (ALAT/  EC 2.6.1.2),  enzyme  aspartate  amino  transferase  (ASAT/  EC  2.6.1.1)  and  the  level  of  urea  in  blood  at  one  day  before  (H-1)  and  after  (H+1)  the treatment, as well as 6 days after the treatment (H+6). The mortality rate and clinical symptoms were observed after 24 hours until 6 days after treatment. The rats were necropsied to observe the lesion of liver and kidney both macroscopically and microscopically.
The result shows that all rats still survived since 24 hours to 6 days after the test. During the treatment with ad libitum rat chow contained 18% protein, the body weight of the rats were unsignificantly increased (P>0.05). There were no changed of the appetite, eyes condition, fur, and behaviour of the rats. However, the feces of the rats which were treated with angkak are reddish. The activity of ALAT, ASAT enzyme as well as the  urea  level  in  blood  were  significantly  increased  as  shown  on  H+1  compared  to  H-1  within  all  treatment  groups,  after  that  there  were  no significant changes in those parameter on H+6 compared to  H+1. The histopathological result due to angkak on kidney shows less lesions and these lesions were reversible.
Key words : Angkak, Monascus sp., Acute Toxicity, Liver and Kidney

## PENDAHULUAN
Angkak  adalah  produk  fermentasi  beras  oleh kapang  galur Monascus  sp. ,  yaitu  kapang  dari  kelas Ascomycetes ,  yang  banyak  digunakan  sebagai  pewarna makanan. Angkak mengandung beberapa pigmen antara lain rubropunktatin  dan  monaskorubrin  yang  berwarna  merah, monaskin  dan  ankaflavin  yang  berwarna  kuning,  dan rubropunktamin  yang  berwarna  ungu  (Suwanto,1985; Maolinang et al., 2001). Di samping itu Carvalho et al ., (2005) melaporkan bahwa angkak juga mengandung sitrinin. Pigmen yang  dikandung  angkak  mempunyai  kestabilan  yang  lebih baik bila disimpan pada pH yang netral maupun alkali.  Oleh karena  itu,  pigmen  yang  terkandung  dalam  angkak  sangat cocok  sebagai  bahan  tambahan  pangan  (Fink-Gremmels et al., 1991; Fabre et al., 1993; Juzvola et al., 1996).
Di  samping  kandungan  pigmen  yang  banyak digunakan  untuk  pewarna  merah  makanan,  angkak  juga mengandung  metabolit  yang  digunakan  untuk  kepentingan medis yaitu monakolin K atau lovastatin (Juzvola et al., 1996). Monakolin  merupakan  metabolit  penting  yang  sudah diidentifikasi  dari Monascus  sp. (Endo  1979)  dan  telah  diuji
kemampuannya dalam menghambat sintesis kolesterol (Endo 1979;  Albert  1980;  Endo et  al., 1985;  1986) . Angkak  dapat memperbaiki  sirkulasi  darah  dan  dapat  menurunkan  kadar kolesterol sebesar 11-32% dan kadar trigliserida sebesar 12- 19%.  Penurunan  kadar  kolesterol  merupakan  pencegahan primer  terhadap  penyakit  jantung  dan  komplikasi  lain  dari aterosklerosis.  Disamping  kemampuan  dalam  perbaikan sirkulasi  darah,  angkak  dipercaya    mampu  meningkatkan jumlah  trombosit  darah  pada  penderita  penyakit  demam berdarah  dengue,  obat  asma,  diare,  desentri,  mabuk  laut, luka  memar,  dan  anti  ngompol  (Wong  &  Koehler,  1981). Selain  itu,  angkak  telah  teruji  mampu  mempertahankan kualitas  daging  dan  ikan  karena  adanya  aktivitas  antibakteri yaitu terhadap bakteri patogen dan perusak berspora seperti Bacillus  cereus dan Bacillus  stearothermophilus (Wong  & Koehler, 1981).
Kapang  penghasil  pigmen  merah  gelap  adalah Monascus  sp. Beberapa  galur  yang  dapat  memproduksi pigmen  tersebut  adalah Monascus  purpureus,  Monascus angka,  Monascus  barkeri,  Monascus  major ,  serta Monascus rubroprunctus (Carels & Shepherd, 1977).
Hasil Penelitian                                                                         J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XX No. 1 Th. 2009
Steinkrauus (1983), melaporkan bahwa nilai Lethal Dose 50  (LD 50 )  angkak  melalui  injeksi  peritoneal  (IP)  pada tikus putih sebesar 7 g/kg bb, sedangkan pada uji toksisitas sub-akut  tidak  menimbulkan  kelainan  pada  organ.    Akan tetapi Su & Wong (1977) melaporkan bahwa mengkonsumsi angkak  dengan  dosis  18  g/kg  bb  secara  oral  tidak menyebabkan kematian.
Atas  dasar  kepentingan  medis,  maka  penelitian  ini dilakukan,  dan  bertujuan  untuk  menentukan  toksisitas  akut LD50  angkak  pada  tikus  putih  galur Sprague-Dawley yang dilanjutkan  dengan  analisis  biokimia  dan  analisa histopatologis  terhadap organ hati dan ginjal.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Dua  puluh  lima  ekor  tikus  putih  jantan  galur Sprague-Dawley berumur 60 hari, sehat, dan bebas patogen dipelihara pada kandang individual berukuran 30 cm x 20 cm x  20  cm  di  laboratorium  hewan  coba  Departemen  Biokimia, Kampus  IPB  Jalan  Gunung  Gede  Bogor.  Semua  tikus diadaptasikan  selama  40  hari  sebelum  perlakuan,  sehingga pada  awal  perlakuan  umur  tikus  100  hari.  Pada  masa adaptasi  tikus  diberi  makan  dan  minum ad  libitum ,  serta ditimbang  bobot  badannya  setiap  hari.  Pakan  standar  yang digunakan  adalah  pakan  tikus  yang  diperoleh  dari  PT Indofeed  Bogor  dengan  kandungan  18%  protein.  Satu  hari sebelum perlakuan (H-1), semua tikus diambil darahnya untuk analisis aktivitas enzim ALAT, ASAT, dan kadar urea darah.

## Metode penelitian
Angkak yang digunakan dibuat dari beras putih IR- 42 dengan fermentasi menggunakan M. purpureus strain 915 selama  15  hari  (Danuri,  2008).  Sediaan  angkak  disiapkan dengan  cara  digerus  dan  dilarutan  dalam  akuades  dengan volume  pencekokan  maksimal  5  ml  per  ekor.  Tikus dikelompokkan  menjadi  lima  kelompok.  Kelompok  satu digunakan  sebagai  kontrol  hanya  diberikan  akuades  tanpa pemberian  angkak,  kelompok  dua  diberikan  angkak  dengan dosis  tunggal  2.5  gram/kg  BB,  kelompok  tiga  diberikan angkak dengan dosis tunggal 5 gram/kg BB, kelompok empat diberikan angkak dengan dosis  tunggal  10 gram/kg  BB, dan kelompok  lima  diberikan  angkak  dengan  dosis  tunggal  15 gram/kg  BB.  Pemberian  angkak  dilakukan  secara  per  oral yaitu dengan cara cekok menggunakan sonde lambung pada hari ke-0 dan diamati setiap hari selama 10 hari perlakuan.
Semua  hewan  pada  tiap  kelompok  diamati  gejala klinisnya  dan  ditimbang  bobot  badannya  setiap  hari. Pengamatan  gejala  klinis  meliputi  nafsu  makan,  keadaan mata,  feses,  bulu  dan  tingkah  laku.  Hewan  coba  diambil darahnya  melalui  vena  ekor  mulai  hari  ke  satu  sebelum perlakuan  sebagai  acuan  (H-1),  serta  pada  hari  pertama (H+1) dan hari keenam perlakuan (H+6). Selanjutnya contoh darah  disimpan  selama  24  jam  di  kulkas  dan  disentrifugasi pada  3.000  g  selama  15  menit.  Serum  darah  dipisahkan
untuk  dianalisis  kadar  enzim  ALAT,  ASAT,  dan  urea  serum darah.  Analisis  dilakukan  dengan  menggunakan  metode spektroskopi  enzimatis  dengan  kit  analisis  Randox.  Setelah H+6,  hewan  dinekropsi  untuk  mendapatkan  gambaran makroskopik  dan  mikroskopik  organ-organ  hati  dan  ginjal. Analisis  histopatologis  dilakukan  di  Laboratorium  Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

## Analisis kelainan hati (Bergmeyer, 1986)
Serum  sebanyak  0.1  ml  dicampur  dengan  1  ml pereaksi ALAT.  Setelah inkubasi selama  1 menit pada  suhu 30 C,  campuran  dibaca  absorbansinya  pada  panjang gelombang  340  nm  dan  dilanjutkan  kembali  pembacaannya pada  menit  ke  1,  2,  3  dan  4.  Analisis  aktivitas  enzim  ASAT dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas, hanya saja pereaksi yang digunakan adalah pereaksi ASAT Pereaksi ALAT terdiri atas buffer tris HCl, L-alanin, α-oksoglutarat, laktat dehidrogenase, dan NADH. Sedangkan pereaksi  ASAT  terdiri  dari  buffer  tris  HCl,  L-aspartat,  α- oksoglutarat, malat dehidrogenase, laktat dehidrogenase, dan NADH.

## Analisis kelainan ginjal (Kaplan & Pesce, 1989)
Sampel  berupa  serum  darah  diambil  sebanyak  10  µl dan  dicampur  dengan  1.000  µl  pereaksi  urea.  Setelah  30 detik pada suhu 37 C larutan dibaca absorbansinya pada 340 nm  dan  dilanjutkan  kembali  pembacaannya  setelah  1;  2;  3; dan 4 menit. Standar diukur pada keadaan yang sama, hanya mengganti  serum  dengan  larutan  standar  urea.  Perhitungan konsentrasi urea diperoleh menggunakan persamaan berikut:
[urea](mg/dL) = ΔAstandar ΔAsampel x [standar]
Persiapan histopatologis (Humason, 1972; Kiernan, 1990) Organ  hati  dan  ginjal  dibuat  preparat  histopatologis. Pengamatan  dilakukan  dengan  mikroskop  cahaya  dengan perbesaran 400 X.

## Pengamatan mikroskopis
Pengamatan  mikroskopis  hati  dan  ginjal  dilakukan menggunakan mikroskop cahaya. Metode skoring digunakan untuk  menilai  tingkat  keparahan  pada  setiap  luasan  wilayah pengamatan.  Kongesti,  degenerasi  lemak,  degenerasi protein,  dan  nekrosis  diberi  skor  dari    0  sampai  3.  Skor dengan nilai nol berarti normal, 1 berarti terjadi perubahan 0- 25%,  skor  2  berarti  terjadi  perubahan  antara  25-50%,  dan skor 3 untuk perubahan lebih dari 50%.

## Analisis data (Matjik & Sumertajaya, 2000)
Rancangan  yang  digunakan  pada  penelitian  adalah rancangan acak lengkap dengan lima perlakuan dan lima kali ulangan .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Bobot  badan dan keadan klinis hewan coba Jumlah ulangan per kelompok ditentukan berdasarkan persamaan  Federer,  yaitu  (t-1)  (n-1)  >  15  (Sastrosupadi, 1977).  Sehingga  jumlah  ulangan  per  kelompok  ditetapkan sebanyak 5 ulangan.
Bobot badan hewan percobaan tidak berbeda nyata antar  semua  kelompok  selama  adaptasi  maupun  setelah perlakuan  (Gambar  1).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  semua hewan  percobaan  seragam.  Bobot  badan  selama  perlakuan bagi  semua  kelompok  tidak  berbeda  nyata  (P>0.05).  Jadi pemberian  berbagai  dosis  angkak  tidak  berpengaruh  nyata terhadap pertumbuhan hewan coba.
Dosis  komersial  angkak  pada  manusia  adalah  17 mg/kg bb per hari (Lin et al ., 2005), sehingga dosis terendah yang dicobakan pada penelitian ini adalah 145 kali dosis pada manusia. Hasil pengamatan gejala klinis semua hewan coba tidak  menunjukkan  perbedaan  nyata,  baik  selama  masa adaptasi  maupun  perlakuan.  Feses  berwarna  merah ditemukan pada semua kelompok dengan perlakuan angkak. Pengamatan  di  bawah  mikroskop  terhadap  warna  merah pada  feses  menunjukkan  bahwa  dosis  angkak  yang  cukup tinggi  telah    menyebabkan  pigmen  angkak  mewarnai  feses. Kematian  hewan  tidak  ditemukan  pada  semua  kelompok sampai pada akhir masa perlakuan, termasuk pada kelompok kontrol.

## Pengaruh  angkak  terhadap  aktivitas  enzim  ALAT  dan ASAT darah
ALAT  dan  ASAT  merupakan  dua  enzim  yang  sering dipakai  untuk  analisis  kerusakan  organ  hati.  Aktivitas  enzim ALAT sebelum perlakuan rata-rata sebesar 30,87±10,68 U/l, sedangkan aktivitas enzim ASAT rata-rata sebelum perlakuan adalah  sebesar  63,00±20,99  U/l.  Hal  ini  sesuai  dengan Altman  &  Dittmer  (1971)  yang  menyatakan  bahwa  kisaran normal  aktivitas  ALAT  pada  tikus  sebesar  17,0-30,2  U/l, sedangkan aktivitas enzim ASAT sebesar 45,7-80,8 U/l. Jadi aktivitas  enzim  ALAT  dan  ASAT  tikus  sebelum  perlakuan masih dalam kisaran normal.
Gambar 2 menunjukkan bahwa aktivitas enzim ALAT pada semua kelompok perlakuan meningkat secara signifikan sejak  mulai  H+1  hingga  H+6  dibandingkan  dengan  H-1 (P>0.05).  Namun  bila  dibandingkan  dengan  keadaan  pada H+1, aktivitas enzim ALAT pada semua kelompok perlakuan pada  H+6  menurun  namun  tidak  signifikan.  Gambar  2 menunjukkan  bahwa  pada  H+1  ada  perbedaan  yang signifikan pada semua dosis (P>0.05). Sedangkan pada H+6, kelompok  2.5  g/kg  bb,  10  g/kg  bb,  dan  15  g/kg  bb menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan dosis 5 g/kg bb  (P>0.05).  Hati  merupakan  organ  yang  memiliki  fungsi detoksifikasi  bagi  tubuh,  konsentrasi  enzim  ALAT  yang berbeda  nyata  pada  H+1  dan  H+6  perlakuan  dibandingkan dengan  H-1  pada  semua  kelompok  menunjukkan  bahwa dosis berpengaruh pada kerusakan sel-sel hati.
Gambar 1 Bobot badan tikus Sprague-Dawley selama adaptasi dan perlakuan
0 50 100 150 200 250 300 350 -50 -40 -30 -20
-10
0 10 20 hari ke- b o b o t b ad an (g ra m) (g ra m) kontrol 2.5 g/kg BB 5   g/kg BB
10  g/kg BB 15  g/kg BB
0 20 40 60 80 100 120 -2 0 2 4 6 8 A kt ivi ta s e nz im A L T (U /L ) 2.5 g/kg BB 5 g/kg BB 10 g/kg BB
15 g/kg BB
Gambar 2  Perbandingan aktivitas ALAT perlakuan  pemberian angkak pada H-1, H+1, dan H+6.
Gambar  3  menunjukkan  bahwa  aktivitas  enzim ASAT pada semua kelompok perlakuan dibandingkan dengan sebelum perlakuan mengalami peningkatan secara signifikan mulai pada H+1 dan H+6 (P>0.05). Sama seperti halnya pada ALAT, aktivitas enzim ASAT pada semua kelompok perlakuan pada H+6 mengalami kenaikan dibanding keadaan pada H+1, namun tidak signifikan.
Peningkatan aktivitas enzim ALAT dan ASAT pada semua kelompok perlakuan angkak menunjukkan kemungkinan  terjadinya  hepatolisis.  Hal  ini  sesuai  dengan hasil analisa histopatologis sel hati yang menunjukan adanya degenerasi lemak dan nekrosis. Peningkatan aktivitas enzim ALAT  dan  ASAT  di  dalam  darah  disebabkan  adanya perubahan  fisiologis  hati,  sehingga  konsentrasi  enzim tersebut  terlepas  dalam  aliran  darah.  Kenaikan  aktivitas enzim  hati  dalam  darah  dapat  diakibatkan  oleh  kerusakan parenkim hati atau gangguan permeabilitas membran sel hati sehingga enzim bebas ke luar sel.

## Pengaruh  angkak  terhadap kadar urea darah
Kerusakan  ginjal  dapat  dideteksi  melalui pengukuran  kadar  urea  darah.  Kadar  urea  darah  diukur berdasarkan  jumlah  nitrogen  yang  dilepaskan  sebagai konsentrasi  urea  dalam  darah  yang  disebut Blood  Urea Nitrogen (BUN). Pengukuran BUN menunjukkan jumlah urea yang  terhidrolisis  oleh  enzim  urease  membentuk  amonia, yang  dapat  diukur  dengan  analisis  spektrofotometri.  Rataan kadar  urea  darah  tikus  sebelum  perlakuan  adalah 19,639±2,143  mg/dL.  Hal  ini  sesuai  dengan  Malole  & Pramono  (1989)  yang  melaporkan  bahwa  kadar  urea  darah tikus  normal  berkisar  antara  15,0-21,0  mg/dL.  Gambar  4 menunjukkan  bahwa  terhadap  H-1,  kadar  urea  darah  pada
semua  kelompok  perlakuan  meningkat  secara  signifikan (P>0.05). Namun terhadap H+1, kadar urea darah pada H+6 semua  kelompok  perlakuan  tidak  berbeda  signifikan. Perbandingan kadar urea dalam darah pada H+1 dosis 5 g/kg BB  dan  15  g/kg  BB  berbeda  secara  signifikan  dengan  2.5 g/kg BB dan 10 g/kg BB. Pada H+6 antara dosis 2.5 g/kg BB dan  5  g/kg  BB  menunjukkan  nilai  yang  berbeda  secara signifikan dengan dosis 10 g/kg BB dan 15 g/kg BB (P>0.05). Hal ini menunjukkan bahwa dosis angkak berpengaruh pada kerusakan sel-sel ginjal.
Hal  tersebut  dikarenakan  angkak  mengandung berbagai  senyawa  aktif  seperti  lovastatin,  monakolin, mevinolin,  dan  sitrinin  yang  kesemuanya  merupakan xenobiotik  (Danuri,  2008).  Sitrinin  bersifat  nefrotoksik (Carvalho et al ., 2005). Hati sampai dengan kapasitas tertentu mampu mendetoksifikasi xenobiotik dan mengekskresikannya melalui  empedu.  Konsentrasi  xenobiotik  yang  tinggi menyebabkan  hati  tidak  mampu  mendetoksifikasinya  dan xenobiotik  akan  mengalami  eksresi  melalui  urin  via  ginjal, sehingga dapat pula menyebabkan kerusakan pada ginjal.
Dalam  diagnosa  klinis,  peningkatan  kadar  urea darah  adalah  diagnosa  patognomonis  terhadap  kerusakan sel-sel  ginjal.  Hal  itu  didukung  pada  analisa  histopatologis bahwa di dalam lumen tubulus terdapat akumulasi protein dan nekrosis sel tubuli. Namun disamping hal tersebut, kenaikan kadar urea darah menunjukkan jumlah protein di dalam tubuh tinggi  serta  tidak  adanya  faktor  penghambat  pembentukan urea  dalam  darah.  Kenaikan  nilai  BUN  disebabkan  karena tidak  adanya  penghambatan  kerja  enzim  ornitin  karbamoil transferase,  yang  mengkatalisis  reaksi  kondensasi  ornitin dengan  karbamoil  fosfat  menghasilkan  sitrulin  dan  fosfat anorganik yang selanjutnya menghasilkan ureum.
Gambar 3 Perbandingan aktivitas ASAT perlakuan pemberian angkak pada H-1, H+1, dan H+6.
0 10 20 30 40 50 60 -2 0 2 4 6 8 Hari ke- K ad ar U re a d ar ah ( m g /d L ) 2.5 g/kg BB 5 g/kg BB 10 g/kg BB
15 g/kg BB
Gambar 4 Perbandingan kadar urea darah perlakuan pemberian angkak pada H-1, H+1, dan H+6.

## Gambaran makro dan mikroskopis organ  hati
Pada pengamatan makroskopis terhadap organ hati hewan  coba  akibat  pemberian  angkak  per  oral  tidak ditemukan  kelainan  yang  spesifik  pada  semua  kelompok (Gambar  5).  Namun  pemeriksaan  secara  mikroskopis terhadap  preparat  histopatologis  hati  ditemukan  perubahan pada  sel  hepatosit  pada  semua  kelompok  perlakuan,  yaitu kongesti.  Sedangkan  pada  sel  hepatosit  banyak  ditemukan degenerasi lemak dan nekrosis.
Gambar  5a  juga  menunjukkan  adanya  kongesti pada kelompok kontrol. Kongesti hati terjadi di vena sentralis dan  sinusoid-sinusoid  di  sekelilingnya.  Hal  ini  menyebabkan sinusoid mengalami dilatasi. Perubahan tersebut diperkirakan merupakan  respon  pembuluh  darah  terhadap  anestesi  eter sebelum  nekropsi  (Ganiswara,  1995).  Oleh  karena  itu, kongesti  tidak  digunakan  sebagai  kategori  kerusakan  hati pada hewan coba yang diperlakukan dengan anestesi eter.
Gambar  5b  dan  5c  yang  diambil  dari  kelompok dengan  asupan  angkak  15  g/kg  bb  menunjukkan  adanya degenerasi  lemak  dan  nekrosis.  Degenerasi  lemak merupakan  gangguan  metabolisme  pada  sel,  sehingga kehilangan struktur dan fungsi normalnya. Degenerasi lemak terjadi pada sel yang hidup dan bersifat reversibel. Sel yang
mengalami  degenerasi  lemak  ditandai  dengan  adanya pengumpulan  produk  metabolisme  seperti  molekul  lemak, protein,  dan  glikogen  dalam  jumlah  yang  abnormal. Degenerasi lemak menunjukkan adanya gangguan biokimiawi sel  yang  disebabkan  karena  metabolisme  abnormal  dan  zat kimia  yang  toksik.  Degenerasi  lemak  secara  mikroskopis terlihat  butiran  lemak  pada  lobulus  hati  terutama  daerah perilobuler  (Benirschke et  al .,  1978;  Lawrence  &  Bennet, 1992).  Faktor-faktor  penyebab  degenerasi  lemak  adalah bahan  toksik,  kekurangan  oksigen,  atau  kelebihan  konsumsi lemak. Jadi degenerasi lemak akibat angkak mungkin terjadi karena angkak mengandung  sitrinin yang dilaporkan bersifat nefrotoksik (Carvalho et al ., 2005).
Gambar  5d  menunjukkan  pada  kelompok  kontrol masih  terlihat  hepatosit  yang  masih  baik  yaitu  masih berbentuk lobus yang jelas dengan vena sentralis di tengah. Sitoplasma  berwarna  merah  muda  karena  mengikat  zat warna  Eosin  dan  inti  sel  berwarna  ungu  kebiruan  karena mengikat  zat  warna  Hematoksilin.  Lesio  yang  terjadi  pada organ hati kemudian dianalisis melalui skoring sehingga diberi nilai sesuai tingkat keparahan. Nilai skoring histopatologis hati (Tabel  1)  menunjukkan  hasil  pengamatan  adanya  kongesti, nekrosis, dan degenerasi lemak pada organ hati.
(a) (b) (c) (d)
Gambar 5  Gambaran mikroskopis hati tikus dengan pewarnaan HE yang mengalami kongesti pada (a) kelompok kontrol (1 bar = 30 µm), (b) dosis angkak 15 g/kg bb (1 bar = 30  m), (c) 15g/kg bb (1 bar = 50  m), dan (d) sel hati tikus normal pada kelompok kontrol (1 bar = 50  m). 1 bar 1  bar 1  bar 1  bar
Setelah didapatkan nilai skoring histopatologis hati, kemudian nilai  tersebut  diuji  dengan  analisis  Kruskal-Wallis  (Tabel  2). Pada  Tabel  2,  lesio  pada  organ  hati  yaitu  kongesti  dan degenerasi  lemak  antara  kontrol  dan  semua  perlakuan  tidak berbeda secara signifikan (P>0,05), sedangkan nekrosis yang terjadi  pada  perlakuan  2,5  dan  5  g/kg  bb  angkak  berbeda nyata dengan perlakuan 10 g/kg bb angkak (p<0,05).
Tabel 1 Nilai skoring histopatologis hati Perlakuan (g/ kg BB) Pengamatan Kongesti Degenerasi Lemak Nekrosa Kontrol 0.333 0.400 0.333 2.5 0.267 1.267 0.533 5 0.433 1.267 0.533 10 0.233 1.233 1.000 15 0.333 1.033 0.900 Tabel 2  Hasil Uji Kruskal-Wallis  histopatologis hati Perlakuan (g/ kg BB) Pengamatan Kongesti Degenerasi Lemak Nekrosa Kontrol 5.25 a 1.50 a 2.50 a 2.5 4.50 a 6.50 a 5.50 bc 5 8.25 a 7.25 a 4.50 ab 10 4.00 a 7.25 a 8.25 c 15 5.00 a 5.00 a 6.75 bc
Keterangan:  nilai yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan nilai yang berbeda nyata.

## Gambaran makro dan mikroskopis organ ginjal
Pengamatan  makroskopis  terhadap  organ  ginjal, tidak ditemukan kelainan nyata pada semua kelompok hewan coba. Pengamatan mikroskopis preparat histopatologis organ ginjal hewan kontrol ditemukan perubahan, yaitu pada kapiler antar  tubulus  terjadi  kongesti,  sel  tubulus  mengalami nekrosis.  Selain  itu,  lumen  tubulus  mengalami  akumulasi protein. Pada kelompok yang diberi angkak dengan dosis 2,5; 5;  10;  dan  15  g/kg  bb  ditemukan  degenerasi  protein  dan nekrosis  yang  tingkat  keparahannya  sebanding  atau  linear terhadap  dosis  (Tabel  4).  Dosis  pada  manusia  adalah  16,7 mg/kg bb (Lin et al. 2005).
Gambar  6a  (dosis  asupan  angkak  15  g/kg  bb) menunjukkan  adanya  sel-sel  nekrosis  organ  ginjal.  Sel-sel tubulus  mengalami  nekrosis  intinya  terlihat  suram  dan mengalami  karioreksis.  Nekrosis  pada  sel-sel  epitel  tubulus terjadi pada semua perlakuan. Nekrosis dapat terjadi karena adanya senyawa hepatotoksik yang dikandung pada angkak, mungkin sitrinin (Saleh 1996; Carvalho et al ., 2005).
Gambar  6b  (dosis  asupan  angkak  15  g/kg  bb) menunjukkan  adanya  akumulasi  protein  di  lumen  tubulus. Keberadaan  protein  di  dalam  lumen  tubulus  dipengaruhi berbagai faktor diantaranya peningkatan permeabilitas kapiler glomerulus  sehingga  protein  yang  berukuran  besar  dapat lolos  ke  urin.  Bila  epitel  tubulus  mengalami  degenerasi  dan nekrosis maka protein yang lolos tidak mampu untuk diserap
kembali  secara  maksimal  yang  akhirnya  tertimbun  di  dalam lumen  (Carlton  &  Mc  Gavin,  1995).  Akumulasi  protein  pada tubuli  ginjal  kemungkinan  besar  karena  dosis  angkak  yang sangat tinggi sehingga merusak sel-sel ginjal.
Nilai  skoring  histopatologis  ginjal  (Tabel  3), menunjukkan  adanya kelainan pada ginjal yaitu nekrosis dan degenerasi  protein.  Setelah  mendapatkan  nilai  lesio histopatologis  organ  ginjal  kemudian  nilai  tersebut  diuji dengan  uji  Kruskal-Wallis  (Tabel  4)  menunjukkan  bahwa degenerasi protein dan nekrosis yang terjadi, berbeda nyata antara  tiap  kelompok  perlakuan  termasuk  kontrol  (P>0,05). Nekrosis  yang  terjadi  signifikan  dengan  naiknya  dosis. Semakin tinggi dosis yang diberikan mengakibatkan nekrosis yang terjadi juga semakin besar.
Epitel  ginjal  merupakan  bagian  yang  sensitif terhadap  bahan-bahan  yang  bersifat  toksik.  Dalam  hal  ini angkak  mengandung  sitrinin  yang  bersifat  nefrotoksik (Calvarho et  al .,  2005).  Senyawa  toksik  yang  mungkin dikandung  oleh  angkak  terutama  sitrinin  masuk  ke  ginjal melalui  aliran  darah  dapat  menimbulkan  perubahan  pada ginjal berupa degenerasi lemak dan nekrosis (Smith & Jones, 1974).  Menurut  Lu  (1995),  tubulus  proksimal  merupakan bagian  yang  paling  mudah  mengalami  kerusakan  akibat  zat toksik.  Hal  itu  dapat  disebabkan  karena  pada  tubulus proksimal  terjadi  proses  absorbsi  dan  sekresi  berbagai  zat. Bila  terjadi  absorbsi  bahan  toksik  pada  epitel  tubuli  akan mengganggu  metabolisme  dan  absorbsi.  Selain  itu,  kadar sitokrom  P-450  pada  tubulus  proksimal  lebih  tinggi  untuk mendetoksifikasi  atau  mengaktifkan  zat  toksik.  Jika degenerasi  dan  nekrosis  belum begitu  parah,  regenerasi  sel epitel  mungkin  terjadi  setelah  penyebabnya  dihilangkan (Smith & Jones, 1974).
Tabel 3 Nilai skoring histopatologis ginjal Perlakuan (g/ kg BB) Pengamatan Akumulasi Protein Nekrosa Kontrol 5.50 2.40 2.5 6.55 5.60 5 7.00 8.80 10 9.15 7.75 15 11.20 11.50 Tabel 4 Hasil uji Kruskal-Wallis histopatologis ginjal Perlakuan (g/ kg BB) Pengamatan Akumulasi Protein Nekrosa Kontrol 1.5a 1.5a 2.5 3.5b 3.5b 5 7.5d 5.5c 10 5.5c 7.5d 15 9.5e 9.5e Keterangan:  nilai  yang  diikuti  oleh  huruf  yang  berbeda  pada kolom  yang  sama  menunjukkan  nilai  yang berbeda nyata
(a) (b)
(c)
Gambar 6 Gambaran mikroskopis ginjal tikus dengan pewarnaan HE yang  mengalami (a) nekrosa pada sel tubulusnya dengan dosis 15 g/kg bb (1 bar =  50 µm),  (b) akumulasi protein pada sel tubulusnya dengan  dosis 15 g/kg  bb (1 bar = 30 µm), dan (c) ginjal yang normal pada kelompok kontrol (1 bar = 50 µm).

## KESIMPULAN DAN SARAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  tidak  ditemukan adanya kematian hewan coba pada semua kelompok selama perlakuan,  sehingga  angkak  dikategorikan  sebagai  senyawa non  toksik.  Selama  perlakuan,  bobot  badan  tikus  tidak mengalami  kenaikan.  Peningkatan  aktivitas  enzim  ALAT, ASAT, dan kadar urea darah berbanding lurus dengan dosis. Perbedaan  antar  dosis  tersebut  menunjukkan  bahwa  dosis berpengaruh terhadap kerusakan organ hati dan ginjal.
Gambaran  histopatologis  akibat  pemberian  angkak pada  organ  hati  dan  ginjal  menunjukkan  terdapatnya  lesio ringan  yang  tingkat  keparahannya  sebanding  dengan  dosis dan  bersifat  reversibel.  Organ  hati  mengalami  kongesti, degenerasi  lemak  dan  nekrosis,  sedangkan  organ  ginjal mengalami  degenerasi  protein  dan  nekrosis  pada  sel tubulusnya. Lesio tersebut tampak jelas mulai pada dosis 10 g/kg  bb,  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  angkak  aman digunakan sampai pada dosis 5 g/kg bb (300 kali dosis pada manusia).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  penulis  sampaikan  kepada  Ahmad Endang  Zainal  Hasan,  Hernomoadi  Huminto,  dan  Dimas Andrianto  atas  bantuan  dan  saran-sarannya  serta  terima kasih kepada Khirani Afrisha Pratiwi atas semua bantuannya.

## DAFTAR PUSTAKA
Albert  AW.  1980.  Mevinolin:  a  Highly  Potent  Competitive Inhibitor  of  Hydroxymethylglutaryl  Coenzyme  A Reductase and a Cholesterol-lowering Agent. Proceedings  National  Academy  of  Sciences .  77:  3957- 3961.
Altman PL, Dittmer DS. 1971. Blood and Others Body Fluids . Bethesda:  Federation  of  American  Societies  for Experimental Biology.
Benirschke  KF,  M  Gardner,  TC  Johnes.  1978. Pathology  of
Laboratory Animals .
New York: Academic Press.
1bar bbbb bbbb bar 1  bar 1  bar
Hasil Penelitian                                                                         J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XX No. 1 Th. 2009
Bergmeyer  HU,  Gutmann  I.  1986. Methods  of  Enzymatic Analysis . Vol 2. New York: Springer Verlag.
Carels  M,  Shepherd.  1997.  The  effect  of  different  nitrogen sources  on  pigment  production  and  sporulation  of Monascus purpureus with regard to quality and quantity. J Food Sci 45: 567-9.
Carvalho  JC,  Oishi  BO,  Pandey  A,  Soccol  CR.  2005. Biopigments  from Monascus :  strains  selection,  citrinin production,  and  color  stability. Brazilian  Archieves  of Biology and Technology . 48: 885-94.
Danuri H. 2008. Optimizing Angkak Pigments and Lovastatin Production  by Monascus  purpureus . Hayati  J  Biosci 15: 61-66.
Endo A. 1979. Monacolin K, a New Hypocholesterolemic Agent  Produced  by  a Monascus Species. Journal  of Antibiotics. 32: 852-854.
Endo A, Hasumi K, Negishi S. 1985.Monacolin J and L, New Inhibitors  of  Cholesterol  Biosynthesis  Produced  by Monascus ruber. Journal of Antibiotics . 38:420-422.
Endo A, Komagata D, Shimada H. 1986.Monacolin M: A New Inhibitor  of  Cholesterol  Biosynthesis. Journal  of antibiotics. 39:1670-1673.
Fabre CE, Santreer AL, Loret MO, Baberian R, Pareilleux A, Goma  G,  Blanc  PJ.1993.  Production  and  Food Applications  of  The  Red  Pigments  of Monascus  ruber . J Food Sci 58(5): 1099-1102.
Fink  Gremmels  J,  Dresel  J,  Leistner  L.  1991.Use  of Monascus  Extracts  as  an  Alternative  to  Nitrite  in  Meat Products . Fleischwirtsch . 71: 1184-1186.
Heber et al .1999. Cholesterol Lowering Effects of Proprietary Chinese  Red-Yeast  Rice  Dietary  Suplement. American Journal of Clinical Nutrition 69(2): 231-236.
Humason GL. 1972. Animal Tissue Techniques. Ed ke-3. San Francisco: WH Freeman.
Juzlova  P,  Martinkova  L,  Kren  V.  1996.  Secondary Metabolites  of  the  Fungus  Monascus:  a  Review. J  Ind Microbiol 16(3): 163-170.
Kaplan LA, Pesce AJ. 2002. Clinical Chemistry . USA: Mosby.
Kiernan JA. 1990. Histological and Histochemical Methods  :  Theory  and  Practice.2 nd Ed.  Departement  of Anatomy The University of Western Ontario: Pengamon.
Lawrence  DR,  PN  Bennet.  1992. Clinical  Pharmacology. 7 th Ed. London: Churchil Livingstone.
Lin CC, Li TC, Lai MM. 2005. Efficacy and safety of Monascus purpureus Went rice with hyperlipidemia. Eur J Endocrinol 153: 679-86.
Lu  FC.1995. Toksikologi  Dasar ;  Asas,Organ,  Sasaran,  dan Penilaian Resiko. Edisi 2. Jakarta:UI.
Malole MBM, CSR Pramono. 1989. Penggunaan  Hewan- Hewan  Percobaan  di  Laboratorium .  Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Bogor: PAU-IPB.
Maolinang.Z,  Zhenwen  D,  Shenmeng  X.  2001.  Study  on Effective  Composition  of  Xuezhikang. Chinese  New Drugs.  Journal. http://www.wpu.en/english/C-3.  htm.(28 Sept 2001).
Matjik  AA,  Sumertajaya  M.  2000. Rancangan  Percobaan .
Bogor: IPB.
Ressang AA. 1984. Patologi Khusus   Veteriner .  Edisi  2. Denpasar: Bali Press
Saleh.  1996.  Patologi.  Himawan:  Bagian  Patologi  Fakultas Kedokteran  Universitas  Indonesia. Kelainan  Retrogresif dan Progresif . (1): 5-7.
Sastrosupadi  A.  1977. Experimental  Design .  Malang:  Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian.
Smith  HA,  TC  Jones.  1974. Veterinary  Pathology .  2 nd Ed.
Philadelpia:Lea and Febiger.
Steinkrauus  KH.  1983. Handbook  of  Indigenous  Fermented Food . New York: Marcel Dekker.
Suwanto  A.  1985.  Produksi  Angkak  sebagai  Zat  Pewarna Makanan. Media Teknol dan Pangan 1(2):8-14.
Wong HC, PE Koehler. 1981. Mutant for Monascus Pigment Production . J Food and Science 46:956-957.