AKTIVITAS ANTIOKSIDAN HIDROLISAT PROTEIN IKAN WADER ( Rasbora jacobsoni ) DARI HIDROLISIS OLEH ENZIM CALOTROPIN DAN PAPAIN Antioxidant Activity of Protein Hydrolysates Common Barb Fish (Rasbora jacobsoni) from Hydrolysis by Calotropin and Papain Enzymes
Yuli Witono 1) * , Maryanto Maryanto 1) , Iwan Taruna 2) , Ardiyan Dwi Masahid 1) , Kinanti Cahyaningati 1)
1) Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Jember
2) Jurusan Teknik Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Jember Jalan Kalimantan No. 37, Kampus Tegal Boto Jember 68121
* Korespondensi Penulis: yuliwitono.ftp@unej.ac.id

## ABSTRACT
The potency of common barb fish as fish protein hydrolyzate caused by its high protein content. Fish protein hydrolyzate is produced through the hydrolysis process by the calotropin enzyme and the papain  enzyme.  This  study  used  common  barb  fish  with  one  type  of  treatment,  i.e.  the  difference combination of the calotropin (C) and papain (P) enzyme. Making fish protein hydrolyzate is used to determine  the  antioxidant  activity  of  the  common  barb  fish  protein  hydrolyzate.  The  observation parameters  in  this  study  were  enzyme  activity,  antioxidant  activity,  degree  of  hydrolysis,  molecular weight,  amino  acids,  dissolved  protein  content,  and  water  holding  capacity.  Samples  with  a ratio  of 40C:  60P  enzyme  concentration  are  wader  fish  protein  hydrolyzate  with  the  proportion  of  40% calotropin  enzyme  and  60%  papain  enzyme is the  highest  sample  that  has  an  antioxidant  activity of 36.41%, reduced power value of 0.57, hydrolysis degree of 74.40% and total amino acids of 82.79%. Wader fish hydrolyzate in the 70C: 30P sample of 76.98% has a high water holding capacity because it can maintain the protein component in meat.
Keywords : antioxidant, calotropin, common barb fish, fish protein hydrolyzate, papain

## PENDAHULUAN
Ikan  merupakan  sumber  protein hewani  tinggi  dan  memiliki  umur  simpan yang  relatif  pendek  sehingga  mudah mengalami  kerusakan  setelah  dilakukan penangkapan.  Menurut  Witono et  al. (2016), Rasbora jacobsoni atau yang biasa dikenal  di  Indonesia  sebagai  ikan  wader adalah salah satu jenis ikan air tawar yang melimpah  dan  memiliki  harga  murah dibandingkan  dengan  ikan  air  tawar lainnya. Berdasarkan Badan Pusat Statistik Kabupaten  Jember  (2015)  produksi  ikan wader sebesar 33,30 ton pertahun. Pengolahan  ikan  wader  menjadi  hidrolisat protein  ikan  merupakan  salah  satu  cara meningkatkan  nilai  komersial  dari  wader. Menurut Zaelani (2012), kandungan protein dalam 100 gram daging ikan wader sebesar  14,8  gram  sehingga  berpotensi
untuk  diolah  menjadi  hidrolisat  protein ikan.
Hidrolisat  protein  ikan  merupakan produk  yang  dihasilkan  dari  penguraian protein  ikan  menjadi  peptida  sederhana dan  asam  amino  melalui  proses  hidrolisis oleh  enzim,  asam,  atau  basa.  Hidrolisis secara  enzimatis  dapat  dilakukan  dengan menggunakan  jenis  enzim  protease  seperti enzim  calotropin  dan  enzim  papain. Berdasarkan letak pemutusan ikatan peptida, protease dibedakan menjadi edopeptidase  dan  eksopeptidase.  Enzim papain tergolong endopeptidase (Poedjiadi, 2006), sedangkan enzim calotropin tergolong eksopeptidase (Witono,  2009).  Endopeptidase  adalah jenis  protease  yang  memutuskan  ikatan peptida  yang  berada  di  dalam  rantai protein  sehingga  dihasilkan  peptida  dan polipeptida, sedangkan eksopeptidase
adalah  jenis  protease  yang  menguraikan protein  ujung  rantai  sehingga  dihasilkan suatu asam amino dan sisa peptida (Rao et al. 1998).
Hidrolisat protein ikan juga memiliki aktivitas  antioksidan  yang  bermanfaat untuk mencegah ketengikan pada makanan (Venugopal,  2006).  Aktivitas  antioksidan sangat  erat  kaitannya  dengan  ikatan peptida  yang  terdapat  pada  protein  serta asam amino yang terkandung di dalamnya. Enzim  calotropin  dan  enzim  papain diketahui  berperan  dalam  menghidrolisis protein  ikan  wader  sehingga  diperoleh aktivitas  antioksidan  hidrolisat  protein ikan  yang  tinggi.  Oleh  karena  itu,  perlu dilakukan  penelitian  terhadap  perbedaan kombinasi  konsentrasi  enzim  calotropin dan  enzim  papain  untuk  menghasilkan hidrolisat protein ikan wader dan kemampuannya sebagai antioksidan.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Peralatan  yang  digunakan  pH  meter (Jen Way tipe 3320), spektrofotometer dan kuvetnya  (Shimadzu),  blender  stainless steel  (Philips),  sentrifuge  dan  tabungnya (Yenaco  model  YC-1180),  neraca  analitik Ohaus,  vortex  (Thermolyne  type  16700), peralatan  gelas  kaca  (Pyrex  dan  Duran), lemari  pendingin,  waterbath  (GFL  1083), heater  listrik  (Maspion),  HPLC  ( high performance  liquid  chromatography ),  dan SDS-PAGE  ( sodium  dodecyl  sulphate polyacrylamide gel ).
Bahan  yang  digunakan  adalah  ikan wader, daging ayam, enzim calotropin, dan enzim  papain.  Ikan  wader  didapatkan  dari pasar  tanjung  Jember,  enzim  biduri diperoleh  dari  ekstrak  getah  tanaman biduri  di  Pantai  Puger,  dan  enzim  papain diperoleh  dari  ekstrak  getah  tanaman pepaya.  Bahan  kimia  yang  digunakan antara lain akuades, DPPH 0,1 mM,  HCl, asam  askorbat,  TCA  (asam  trikloroasetat) 10%,  BHT  ( butylated  hydroxytoluene ), Na 2 HPO 4 .2H 2 O,  NaH 2 PO 4 .2H 2 O,  kasein,
Na 2 CO 3 ,  follin  ciocalteau,  tirosin,  etanol p.a,  potassium  ferrycianide  [K 3 FE(CN) 6 ] 1%,  FeCl 3 0,1%,  BSA  ( Bovine  Serum Albumin ),  NaOH  0,1  N,  CuSO 4 1%, Sodium  Potassium  Tartrat,  FeCl  0,1%, HCl  0,02  N,  NaOH  40%,  H 3 BO 3 4%, etanol  97%,  buffer  ekstraksi  (50  mM MOPS-NaOH  pH  7,5,  1  mM  EDTA,  10 mM  MgCl,  dan  1  mM Phenyl  Methyl Sulfonyl Flouride (PMSF), reagen Bradford,  Buffer  loading  (Tris-Cl  0,5  M pH  6,8;  SDS  10%  glycerol  10%; bromophenol  blue),  acrylamide  15% buffer  elektroda  (Glycine  192  mM, Trisbase  25  mM,  SDS  0,1%), Coomassie Brilliant  Blue (CBB),  Blue  Prestained Protein  Standart,  ortoftalaldehida  (OPA), larutan buffer kalium borat pH 10,4.

## Tahapan Penelitian
Produksi Hidrolisat Protein Ikan
Ikan wader dilakukan filleting sehingga  diperoleh  daging  ikan  wader. Daging  ikan  ditimbang  lalu  dihancurkan menggunakan food  processor dengan perbandingan  akuades  dan  daging  ikan adalah  2:1  dari  berat  ikan  sehingga dihasilkan suspensi. Selanjutnya ditambahkan  enzim  calotropin  dan  enzim papain  sesuai  persentase  perbandingan konsentrasi  yang  terdapat  pada Tabel  1 . Lalu  dilakukan  hidrolisis  pada  suhu  55°C selama  3  jam  dan  dilanjutkan  inaktivasi enzim  pada  suhu  85°C  selama  20  menit yang bertujuan untuk menghentikan proses hidrolisis.  Selanjutnya  hidrolisat  protein ikan  dilakukan  proses  sentrifugasi  pada kecepatan  3500  rpm  pada  suhu  10°C selama  30  menit  hingga  menghasilkan supernatan  dan  residu.  Supernatan  yang diperoleh  dilakukan  pengeringan  dengan menggunakan freeze dryer sehingga didapatkan  hidrolisat  protein  ikan  wader berbentuk kering.

## Rancangan Percobaan
Penelitian  ini  menggunakan  satu perlakuan  yaitu  perbedaan  konsentrasi kombinasi  enzim  calotropin  dan  papain.
Jenis  ikan  yang  digunakan  adalah  ikan wader.  Pengujian  menggunakan  sembilan perbandingan  konsentrasi  enzim  dengan tiga  kali  pengulangan  dan  dua  kali pengamatan. Perbandingan kombinasi konsentrasi  ditunjukkan pada Tabel 1 .
Tabel  1 .  Persentase  kombinasi  enzim  calotropin dan papain
Konsentrasi Enzim Calotropin:Papain 90% C : 10% P 80% C : 20% P 70% C : 30% P 60% C : 40% P 50% C : 50% P 40% C : 60% P 30% C : 70% P
20% C : 80% P
10% C : 90% P Keterangan:  %  (v/b)  dalam  total  3%  dari  berat daging ikan
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan software microsoft  excel dan dianalisis menggunakan metode deskriptif.  Setelah  mendapatkan  data,  data ditampilkan  dalam  bentuk  grafik  dan menggunakan error bar .

## Metode Analisis
Pengamatan yang dilakukan meliputi aktivitas  enzim  calotropin  dan  papain (Walter,  1984),  kadar  protein  terlarut (Metode lowry ; Purwanto, 2004), aktivitas antioksidan  dengan  metode  DPPH  (2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl) (Shimada et al.
1992),  daya  reduksi  antioksidan  metode reducing  power  (Oyaizu,  1986),  derajat hidrolisis  metode  SN-TCA  (Amiza et  al. 2012),  komposisi  asam  amino  (AOAC 2005), berat molekul (Laemlli, 1970), daya ikat  air  ( Water  Holding  Capacity/ WHC ) (Tounkara et al. 2013)
Aktivitas  Enzim  Calotropin  dan  Papain (Walter, 1984)
Terdapat tiga perlakuan dalam pengujian  aktivitas  enzim,  yaitu  blanko, standar  tirosin,  dan  sampel.  Perlakuan
blanko  dan  standar,  enzim  diganti  dengan akuades  dan  tirosin  0,1  mM.  Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37 o C selama 10 menit. Resi hidrolsis dihentikan dengan cara  penambahan  1  mL  TCA  0,1  M. Larutan enzim sebanyak 0,1 mL dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  yang berisi  0,5  mL  kasein  1%  b/v  dan  0,5  ml bufffer  phosphat  pH  7.  Pada  blanko  dan standar  ditambahkan  0,1  mL  akuades  lalu diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  10 menit. Supernatan yang dihasilkan kemudian  diambil  sebanyak  0,75  mL  dan ditambahkan ke dalam tabung reaksi  yang berisi 2,5 mL Na 2 CO 3 0,4 M, ditambahkan 0,5 mL pereaksi follin ciocalteau (1:2) dan diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  20 menit.  Hasil  inkubasi  diukur  dengan spektrometer  pada  λ  =  670  nm.  Rumus pengkuran aktivitas enzim protease sebagai berikut :
Keterangan:
UA = Unit aktivitas enzim (dinyatakan dalam Unit/mL) Asp   = Nilai absorbasi sampel Abl = Nilai absorbasi blanko Ast = Nilai absorbasi standar tirosin P = Faktor Pengenceran T = Waktu Inkubasi
Kadar  Protein  Terlarut Metode  Lowry
(Purwanto, 2014)
Sampel hidrolisat protein ikan sebanyak  0,1  gram  dilarutkan  dalam  10 mL aquades. Setelah itu, larutan disentrifugasi  selama  10  menit  pada kecepatan  4000  rpm.  Kemudian  bagian supernatan  dianalisis  proteinnya  dengan metode  lowry.  Penentuan  protein  metode lowry dimulai dengan pengambilan sampel dari supernatan yang dihasilkan sebelumnya sebanyak 250 µl dan ditambah reagen  lowry  sebanyak  2  mL  kemudian divortex  dan  diamkan  selama  10  menit. Setelah  itu  ditambahkan  250  µl  follin  dan
divortex. Selanjutnya didiamkan selama 20 menit lalu dilakukan pengukuran absorbansi dengan menggunakan
spektrofometer  pada  panjang  gelombang (λ) 550 nm.
Aktivitas  Antioksidan  dengan  Metode DPPH  (2,2  diphenyl-1  picrylhydrazyl) (Shimada et al., 1992)
Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan  dengan  pengenceran  hidrolisat kering protein ikan sebanyak 20 kali dalam pelarut etanol p.a. larutan sampel hidrolisat protein  yang  telah  diencerkan  diambil masing-masing  1,5  mL  dan  direaksikan dengan  larutan  DPPH  0,1  mM  dalam tabung reaksi. Kemudian dilakukan homogenisasi menggunakan vortex selama 1  menit  dan  diinkubasi  selama  30  menit. Pengukuran  absorbansi  pada  panjang gelombang  517  nm  untuk  mengetahui persen  inhibisi  terhadap  radikal  bebas berupa  DPPH.    Aktivitas  antioksidan DPPH dapat dihitung dengan menggunakan persamaan berikut :
Daya Reduksi
Antioksidan
Metode
Reducing Power (Oyaizu, 1986) Sampel hidrolisat kering protein ikan sebesar 2000 ppm diambil 1 mL kemudian ditambah  2,5  mL  buffer  pottasium  fosfat 0,2  M  (pH  6,6)  dan  2,5  mL  K 3 Fe(CN) 6 1%.  Campuran  larutan  diinkubasi  selama 20  menit  pada  suhu  50 o C.  Kemudian dilakukan  penambahan  2,5  mL  TCA  10% dan  dihomogenisasi  menggunakan  vortex. Hasil  homogenisasi  diambil  2,5  mL  dan ditambahkan  2,5  mL  aquades  dan  0,5  mL FeCl 3 0,1%.  Campuran  larutan  didiamkan selama  30  menit  sebelum  diabsorbansi dengan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang 700 nm.  Blanko menggunakan aquades  sebagai  pengganti  sampel.  Asam askorbat  digunakan  sebagai  kurva  standar dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 ppm. Peningkatan nilai absorbansi menunjukkan
terjadi  penurunan  daya  ( reducing  power ) dari  radikal  bebas  berupa  K 3 Fe(CN) 6 ( potassium ferrcyanide ).
Derajat  Hidrolisis SN-TCA  (Amiza  et  al., 2012)
Sebanyak  20  mg  hidrolisat  protein ditambahkan  20  mL  TCA  10%  (b/v). Pendiaman  selama  30  menit.  Setelah  itu sentrifugasi  7800  rpm  selama  15  menit. Supernatan  yang  diperoleh  kemudian dianalisis kadar nitrogennya menggunakan metode  semi  mikro  Kjeldahl  (Sudarmadji et  al. ,  1997).  Sampel  ditimbang  sebanyak 0,1 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu  Kjeldahl,  lalu  ditambahkan  0,9  gram selenium  dan  5  mL  H 2 SO 4 pekat.  Sampel didestruksi  pada  suhu  410 o C  selama kurang  lebih  1  jam  sampai  larutan  jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu.  Kjeldahl  ditambahkan  50  mL akuades dan 20 mL NaOH 40%, kemudian dilakukan  proses  destilasi  dengan  suhu destilator 100 o C. Hasil destilasi ditampung dalam labu erlenmeyer 250 mL yang berisi campuran  15  mL  asam  borat  (H 3 BO 3 )  4% dan  2  tetes  indikator  MmMb  yang berwarna  biru.  Setelah  volume  destilat mencapai  40  mL  dan  berwarna  kehijauan, maka  proses  destilasi  dihentikan.  Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,02 N sampai terjadi  perubahan  warna  biru  keunguan. Volume  titran  dibaca  dan  dicatat.  Larutan blanko dianalisis seperti sampel.
Berat  Molekul SDS-PAGE  (Laemmli,
1970)
a. Ekstraksi sampel
Sampel  berupa  hidrolisat  protein ikan wader sebanyak 0,25 gram ditambahkan  750μl  buffer  ekstraksi mengandung 50 mM MOPS-NaOH (pH7,5), 1 mM EDTA, 10 mM MgCl, dan 1  mM  Phenyl  Methyl  Sulfonyl  Fluoride (PMSF) kemudian diberi perlakuan sonikator  selama  15  menit.  Homogenat yang terbentuk  disentrifugasi  dingin  (4°C) selama 10 menit dengan kecepatan 12.000 rpm.  Selain  itu,  untuk  analisis  selanjutnya
supernatan  yang  diperoleh  dipindah  ke microtube baru dan disimpan dalam suhu - 80°C.
b. Pengukuran kandungan protein Sebanyak  5  μl  supernatan  ekstrak
protein  ditambah  995  μl  reagen  Bradford kemudian  dilakukan  homogenisasi  dan dilanjut dengan inkubasi selama 15 menit. Proses tersebut akan menghasilkan perubahan  warna. Selanjutnya warna  yang telah terbentuk tersebut diukur menggunakan  spektrofotometer  (λ=  595 nm).  Perhitungan  kadar  protein  total  pada sampel dilakukan dengan cara mengkonversikan  nilai  absorbansi  sampel kedalam  persamaan  regresi  linier  dari standart  protein  BSA.  Konsentrasi  protein yang dihasilkan diperlukan untuk menentukan  volume  sampel  yang  akan dianalisis.
c. Analisis SDS-PAGE
Larutan  hasil  pengujian  ekstraksi ditambah buffer loading (Tris-Cl 0,5M pH 6,8; SDS 10%; glycerol 10 %; bromophenol blue) dan didenaturasi dengan  pemanasan  95°C  selama  3  menit. Sampel protein  kemudian sebanyak 40 μg dimasukkan  ke  dalam  sumuran  gel  lalu dipisahkan  dengan  menggunakan  (SDS- PAGE)  dengan  konsentrasi  akrilamide  15 %.  Pemisah  protein  dengan  SDS-PAGE dilakukan  dengan  arus  listrik  40-70  V selama  4  jam  dalam  buffer  elektorda (glycine  192  mM,  Tris  base  25  nM,  SDS 0,1  %).  Protein  yang  terpisah  diwarnai dengan  Coomassie  Brilliant  Blue  (CBB). Protein  marker  menggunakan  Gangnam Stain  Prestained  Protein  Ladder  sebanyak 3μl.
Asam  Amino Metode  High  Performance Liquid  Chromatography  (HPLC) (AOAC 2005 No. 982.30E)
a. Preparasi sampel Kadar  protein  sampel  ditentukan terlebih  dahulu  dengan  metode  Kjeldahl. Sampel  yang  mengandung  3  mg  protein dimasukkan ke dalam tabung ulir, ditambah 1 mL HCl 6 N dan dialiri gas N 2 ,
kemudian ditutup. Sampel tersebut dihidrolisis  dalam  oven  bersuhu  110 o C selama 24 jam  lalu disaring menggunakan 6 penyaring kaca masir. Sampel kemudian dipindahkan  ke  labu  rotary  evaporator untuk  dikeringkan,  ditambah  dengan  HCl 0,01  N  dan  ditera  sampa  5  mL,  dan disaring dengan kertas milipore No. 45
Larutan  bufer  kalium  borat  pH  10,4 ditambahkan  ke  dalam  sampel  dengan perbandingan  1:1  sehingga  diperoleh larutan  sampel  yang  siap  dianalisis. Larutan  sampel  sebanyak  10μL  dicampur dengan  25  μL  pereaksi  ortoftalaldehida (OPA).  Hal  yang  sama  dilakukan  pada larutan  standar  asam  amino.  Larutan  yang telah  tercampur  (baik  sampel  maupun standar)  didiamkan  selama  1  menit  agar derivatisasi berlangsung sempurna. Larutan  standar  diinjeksikan  ke  dalam kolom HPLC sebanyak 5 μL, lalu ditunggu sampai  pemisahan  semua  asam  amino selesai.
Kondisi  alat  HPLC  pada  saat dilakukan analisis: Kolom : Ultra techspere Fase mobil :  Larutan  A  (Na-EDTA, metanol, THF) dan larutan B (metanol 95%, akuades) Detektor : Flouresensi
Konsentrasi  asam  amino  (μmol)  dalam sampel dihitung menggunakan rumus : Konsentrasi AA (µmol)
= 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑥 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
Persen  asam  amino  dalam  sampel  dapat dihitung dengan rumus :
%AA= µmol x Mr AA x 100% µg sampel
Daya Ikat Air (Water Holding
Capacity/WHC) (Tounkara, 2013)
Penentuan uji daya ikat air menggunakan  media  daging  ayam  untuk mengetahui  seberapa  besar  kemampuan daging yang ditambahkan dengan hidrolisat  protein  ikan  wader  dalam mengikat air bebas. Daging ayam
digunakan  sebagai  media  karena  memiliki harga  yang  terjangkau  dibanding  daging sapi,  selain  itu  jika  menggunakan  daging ikan  maka  akan  bias.  Pencampuran hidrolisat  protein  ikan  wader  dengan kombinasi  enzim  calotropin  dan  papain pada  daging  ayam,  diharapkan  mampu meningkatkan  kualitas  daging  ayam. Hidrolisat protein berpotensi sebagai smart flavour yang  baik  untuk  diaplikasikan dalam  bahan  pangan.  Daging  ayam  yang diolah  menjadi  suatu  produk  agar  dapat dikonsumsi  oleh  manusia  sebelumnya melewati perlakuan, salah satu diantaranya yaitu  dengan  cara  perebusan.  Tujuan  dari perebusan  pada  daging  adalah  untuk mendapatkan  kualitas  fisik  daging  yang baik  dan  memberikan  keempukkan  pada daging  (Dwiloka  dan  Atmomarsono, 2007).
Daging ayam terlebih dahulu dilakukan  penghancuran  menggunakan food  processor ,  kemudian  timbang  ayam sebanyak 5 gram. Setelah itu ditambahkan aquades  1,5  mL  dan  sampel  hidrolisat protein  ikan  wader  0,05  gram.  Lalu dilakukan  pendiaman  di  dalam freezer selama 30 menit. Setelah 30 menit, sampel dimasukkan ke dalam waterbath pada suhu 95 o C  selama  10  menit.  Kemudian  sampel dialiri  menggunakan  air  dingin  dan ditimbang berat akhirnya.
WHC (%) = 100 - air yang hilang

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Aktivitas Enzim Calotropin dan Papain
Pengujian  aktivitas  enzim  dilakukan untuk mengukur kemampuan dalam menghidrolisis  protein  menjadi  peptida dan asam-asam amino sederhana. Aktivitas enzim  calotropin  dalam  proses  hidrolisis protein  sebesar  15,04  U/mL  dan  enzim papain  sebesar  86,32  U/mL.  Kedua  enzim
ini  dinyatakan  aktif  karena  memiliki aktivitas  yang  dapat  digunakan  untuk menghidrolisis  protein.  Hasil  aktivitas enzim  calotropin  dan  papain  dapat  dilihat pada Gambar 1 .
Gambar 1 . Aktivitas enzim calotropin dan papain
Gambar  1 menunjukkan  bahwa enzim  papain  memiliki  aktivitas  5,73  kali lebih tinggi dibandingkan enzim calotropin.  Pengukuran  aktivitas  enzim digunakan untuk mengukur jumlah konsentrasi yang ditambahkan pada sampel. Enzim calotropin dan papain yang digunakan  untuk  menghidrolisis  protein ikan wader merupakan ekstrak yang belum dimurnikan. Menurut Witono et al. (2007) enzim dalam bentuk ekstrak kasar memiliki aktivitas enzim yang lebih tinggi dari pada enzim dalam bentuk murni, akan tetapi aktivitas spesifiknya lebih rendah.

## Kadar  Protein  Terlarut  Hidrolisat Protein Ikan Wader
Kelarutan  protein  mengacu  pada jumlah protein total pada suatu bahan yang masuk  ke  dalam  larutan  dalam  kondisi tertentu (Zayas, 1997) dan tergantung pada struktur  protein,  pH,  konsentrasi  garam, suhu,  lama  ekstraksi  dan  banyak  faktor instrinsik lainnya. Semakin banyak protein yang  larut  dibagian  supernatan,  maka menunjukkan peningkatan kelarutan protein.  Kadar  protein  terlarut  pada hidrolisat  protein  ikan  wader  ditunjukkan pada Gambar 2 .
15,04 86,32 0 20 40 60 80 100 Calotropin Papain A k tiv itas e n zim (Un it/m L ) Jenis enzim
Gambar  2 .  Kadar  protein  terlarut  pada  hidrolisat protein ikan wader
Kadar  protein  terlarut  tertinggi terdapat  pada  sampel  hidrolisat  protein ikan wader dengan perbandingan konsentrasi  10C:90P  sebesar  1.994,41 µg/mL  dengan  kombinasi  10%  enzim calotropin dan 90% enzim papain ( Gambar  2 ).  Kadar  protein  terlarut mengalami  kenaikan  dengan  penambahan konsentrasi  enzim  papain  mulai  dari  60% hingga  90%.  Murray et  al. (2003) mengemukakan  bahwa  konsentrasi  enzim berpengaruh terhadap reaksi inisiasi antara enzim dengan substrat yang akan menentukan kecepatan awal reaksi hidrolisis.  Semakin  besar  protein  terlarut maka  semakin  besar  pula  nilai  gizi  suatu bahan  pangan.  Semakin  terurai  struktur protein  suatu  bahan  semakin  mudah dicerna  dan  semakin  banyak  persentase protein terlarutnya. Semakin tinggi protein terlarut dalam air semakin tinggi nilai  gizi produk  yang  akan  dicerna  oleh  tubuh (Gelichpour  dan  Shabanpour,  2011). Kadar protein terlarut yang turun menunjukkan  bahwa  kualitas  protein  pada ikan juga mengalami penurunan.
Aktivitas Antioksidan
Hidrolisat
Protein Ikan Wader Pengujian aktivitas antioksidan hidrolisat protein ikan wader menggunakan metode DPPH ( 2,2 diphenyl-1 picrylhydrazyl ) bertujuan untuk
mengetahui  aktivitas  antioksidan  tertinggi terhadap  perlakuan  perbedaan  kombinasi enzim  calotropin  dan  papain.  Aktivitas antioksidan dalam mereduksi radikal bebas dari  hidrolisat  protein  ikan  ditentukan dengan  kemampuannya  dalam  mereduksi DPPH. Nilai persen penghambatan hidrolisat  protein  ikan  wader  papain ditunjukkan pada Gambar 3 .
Gambar  3 .  Aktivitas  antioksidan  DPPH  hidrolisat protein ikan wader
Aktivitas  antioksidan  paling  optimal pada  hidrolisat  protein  ikan  wader  dengan perbandingan  konsentrasi  40C:60P  yaitu 40%  enzim  calotropin  dan  60%  enzim papain  sebesar  36,41%  ( Gambar  3 ), namun  secara  keseluruhan  hasil  uji aktivitas  antioksidan  mengalami  keadaan yang tidak stabil, semakin tinggi konsentrasi  enzim  belum  tentu  aktivitas antioksidannya  tinggi.  Keadaan  seperti  ini dikaitkan  dengan  berat  molekul  dan  asam amino  yang  dihasilkan  pada  proses hidrolisis. Komposisi asam amino tertinggi terdapat  pada  sampel  hidrolisat  protein ikan wader dengan perbandingan konsentrasi  40C:60P  yaitu  40%  enzim calotropin  dan  60%  enzim  papain  sebesar 82,79%.  Menurut  Wu et  al. (2003)  berat molekul  dan  komposisi  asam  amino  pada peptida  yang  terbentuk  selama  hidrolisis sangat mempengaruhi aktivitas antioksidan pada  hidrolisat  protein.  Semua  protein yang dihidrolisis akan menghasilkan asam-
1 8 7 1 ,8 1 1 7 5 4 ,9 6 1 7 9 5 ,5 2 1 8 7 2 ,7 4 1 6 4 8 ,1 1 1 5 2 7 ,5 6 1 7 5 4 ,2 2 1 8 7 2 ,3 7 1 9 9 4 ,4 1 0 500 1000 1500 2000 2500 Kad ar p ro tein ter lar u t (% ) Kombinasi enzim calotropin:enzim papain 25,26 24,84 27,76 24,94 31,34 36,41 33,67 29,56 20,55 0 5 10 15 20 25 30 35 40 A k tiv itas a n tio k sid an ( %R SA ) Konsentrasi enzim calotropin:enzim papain
asam  amino,  tetapi  ada  beberapa  protein yang disamping menghasilkan asam amino juga menghasilkan molekul-molekul protein  yang  masih  berikatan  (Kurniawan et al. 2012).
Daya  Reduksi  Antioksidan  Hidrolisat Protein Ikan Wader
Penentuan aktivitas antioksidan metode reducing  power digunakan  untuk menganalisis  senyawa  antioksidan  yang memiliki  kemampuan  mereduksi  suatu bahan sebagai antioksidan sekunder. Reducing  power (daya  reduksi)  hidrolisat protein ikan wader menggunakan kombinasi  enzim  calotropin  dan  papain ditunjukkan pada Gambar 4 .
Gambar  4 .  Daya  reduksi  hidrolisat  protein  ikan wader
Hidrolisat protein ikan wader memiliki  kemampuan  untuk  mereduksi sumber  radikal  bebas  yang  direaksikan sehingga menjadikannya lebih stabil. Hasil paling  optimal  ditunjukkan  pada  sampel hidrolisat protein ikan dengan perbandingan konsentrasi 40C:60P sebesar 0,57  ( Gambar  4 ).  Penentuan  aktivitas antioksidan reducing power dalam hidrolisat  protein  dapat  diketahui  melalui komposisi dan urutan asam amino penyusun  peptida.  Menurut  Xie et  al. (2008)  aktivitas reducing  power peptida dalam hidrolisat protein disebabkan karena adanya residu asam amino tirosin,
methionin,  sistein,  histidin,  lisin,  dan triptofan  yang menyusun peptida sehingga peptida  tersebut  mampu  menjadi  donor elektron bagi radikal bebas.
Derajat  Hidrolisis  Hidrolisat  Protein Ikan Wader
Derajat hidrolisis merupakan parameter  kunci  dalam  memantau  reaksi hidrolisis, semakin tinggi derajat hidrolisis menunjukkan  semakin  efektif  proses hidrolisis  dalam  memecah  ikatan  peptida (Charoenphun et  al. 2013). Nilai  derajat hidrolisis yang semakin tinggi menunjukkan bahwa pada proses hidrolisis protein  yang  berlangsung  juga  semakin baik.  Derajat  hidrolisis  hidrolisat  protein ikan wader ditunjukkan pada Gambar 5 .
Gambar  5 .  Derajat  hidrolisis  hidrolisat  protein ikan wader
Derajat  hidrolisis  tertinggi  pada sampel  hidrolisat  protein  ikan  wader perbandingan konsentrasi 40C:60P dengan proporsi  40%  enzim  calotropin  dan  60% enzim  papain  sebesar  74,40%  ( Gambar 5 ).  Nilai  derajat  hidrolisis  yang  dihasilkan mengalami  keadaan  yang  tidak  stabil, keadaan  ini  disebabkan  penggunaan  dua enzim  protease  yang  berbeda  yaitu  enzim calotropin dan enzim papain. Hal ini sesuai dengan  pendapat  Ovissipur et  al. (2010) menyebutkan  bahwa  perbedaan  jenis enzim yang digunakan dapat menyebabkan perbedaan  nilai  derajat  hidrolisis  pada
0,423 0,4710,482 0,37 0,507 0,57 0,465 0,420,417 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 A k tiv itas a n tio k sid an ( R ed u cin g P o w er ) (λ =7 0 0 n m ) Konsentrasi enzim calotropin:enzim papain 44,19 30,48 37,52 42,65 64,23 74,40 44,65 40,35 55,88 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Der aj at h id ro lis is ( %)
Konsentrasi enzim calotropin: enzim papain
proses  hidrolisis  protein  kepala  ikan  tuna sirip kuning (Thunnus albacares) . Konsentrasi  enzim  dan  substrat  yang berbeda  serta  waktu  hidrolisis  yang berbeda  menyebabkan  perbedaan  derajat hidrolisis (Hasnaliza et al. 2010).
Menurut  Kurniawan  (2012)  nilai derajat  hidrolisis  dipengaruhi  oleh  jumlah senyawa  peptida  dan  asam  amino  sebagai hasil  pemecahan  protein  oleh  enzim. Karena  derajat  hidrolisis  diukur  dari perbandingan  α-amino  nitrogen  dengan total  nitrogen  (AN/TN)  maka  dengan semakin  tinggi  tingkat  pemecahan  protein menjadi senyawa berantai pendek termasuk  senyawa  α-amino  nitrogen, derajat  hidrolisisnya  menjadi  semakin tinggi.  Peningkatan  derajat  hidrolisis disebabkan  oleh  peningkatan  peptida  dan asam  amino  yang  terlarut  dalam  TCA (Trichloroacetic Acid) akibat dari pemutusan ikatan peptida selama hidrolisis protein (Hasnaliza et al. 2010).
Berat  Molekul  Hidrolisat  Protein  Ikan Wader
Pengukuran berat molekul ini bertujuan untuk mengetahui berat molekul protein  pada  hidrolisat  protein  setelah
mengalami  proses  hidrolisis.  Satuan  yang digunakan adalah kilodalton (kDa). Ketiga hidrolisat  protein  ikan  wader  masing- masing  memiliki  6  pita  (band)  protein. Sampel  A  yaitu  hidrolisat  protein  ikan wader  dengan  perbandingan  konsentrasi 10C:90P  yaitu  10%  enzim  calotropin  dan 90%  enzim  papain  memiliki  nilai  berat molekul  yaitu  12,76  kDa;  15,63  kDa; 28,72  kDa;  35,18  kDa;  87,59  kDa;  dan 114,77  kDa.  Pita  protein  pada  sampel  B dengan perbandingan konsentrasi 40C:60P yaitu  40%  enzim  calotropin  dan  60% enzim papain memiliki berat molekul yaitu 12,34  kDa;  15,63  kDa;  28,72  kDa;  35,18 kDa;  76,52  kDa;  dan  107,27  kDa, sedangkan  pita  protein  pada  sampel  C dengan perbandingan konsentrasi 90C:10P yaitu  90%  enzim  calotropin  dan  10% enzim papain memiliki nilai berat molekul yaitu  11,93  kDa;  15,63  kDa;  28,72  kDa; 35,18  kDa;  60,40  kDa;  dan  93,71  kDa ( Gambar 6 ).
Jika  berat  molekul  ketiga  sampel dikaitkan dengan  aktivitas antioksidannya, maka hidrolisat protein ikan wader sampel 90C:10P  memiliki  aktivitas  antioksidan lebih  tinggi.  Menurut  Wu et  al. (2003), berat  molekul  dan  komposisi  asam  amino
Gambar  6 .  Berat  molekul  hidrolisat  protein  ikan  wader  dengan  variasi  10%  enzim  calotropin  dan  90% enzim papain ( A ), 40% enzim calotropin dan 60% enzim papain ( B ), 90% enzim calotropin dan 10% enzim papain ( C ) berdasarkan pengujian SDS-PAGE dengan marker 245 kDa ( M )
pada  peptida  yang  terbentuk  selama hidrolisis  sangat  mempengaruhi  aktivitas antioksidan pada hidrolisat protein. Namun, pada analisis aktivitas antioksidan nilai  tertinggi  terdapat  pada  sampel hidrolisat protein ikan dengan perbandingan konsentrasi 40C:60P.
Pernyataan  ini  dibuktikan  pada  penelitian ( Gambar  6 ),  ketika  sampel  10C:90P memiliki  nilai  berat  molekul  12,76  kDa; 15,63  kDa;  28,72  kDa;  35,18  kDa;  87,59 kDa;  dan  114,77  kDa  dengan  nilai aktivitas  antioksidan  sebesar  20,55%, sampel  40C:60P  memiliki  berat  molekul 12,34  kDa;  15,63  kDa;  28,72  kDa;  35,18 kDa;  76,52  kDa;  dan  107,27  kDa  dengan nilai  aktivitas  antioksidan  sebesar  36,41% dan  sampel  90C:10P  memiliki  nilai  berat molekul  11,93  kDa;  15,63  kDa;  28,72 kDa;  35,18  kDa;  60,40  kDa;  dan  93,71 kDa  dengan  nilai  aktivitas  antioksidan sebesar  25,26%,    Hal  ini  tidak  sesuai dengan  pernyataan  Ranahtunga et  al.
(2006)  yang  menyatakan  bahwa  potensi antioksidan  lebih  tinggi  didapatkan  dari peptida  dengan  bobot  molekul  yang  lebih rendah  yang  didapatkan  dari  fraksinasi membran  karena  dapat  lebih  mudah mengikat radikal bebas.
Jika  berat  molekul  ketiga  sampel dikaitkan  dengan  perbedaan  konsentrasi
enzim  calotropin  dan  enzim  papain,  maka sampel dengan penambahan enzim calotropin  sebesar  90%  memiliki  berat molekul  yang  kecil.  Sampel  hidrolisat protein  ikan  wader  dengan  konsentrasi 90C:10P  memiliki  berat  molekul  nilai berat molekul antara 93,71-11,93 kDa. Hal ini  mengindikasikan  bahwa  penambahan enzim  calotropin  yang  termasuk  enzim eksoprotease efektif dalam proses hidrolisis  yang  berfungsi  untuk  memecah protein  menjadi  peptida  dan  asam  amino yang  sederhana  atau  lebih  kecil.  Menurut Ranathunga et  al. (2006),  molekul  yang memiliki berat lebih kecil dapat menghambat  proses  oksidatif  dengan peningkatan reaktivitas.

## Komposisi  Asam  Amino  Hidrolisat Protein Ikan Wader
Hidrolisat  protein  ikan  dari  reaksi pemecahan  enzimatis  dapat  mengkonversi protein  ikan  menjadi  peptida  yang  lebih kecil  yang  biasanya  mengandung  2-20 asam  amino  (Chalamaiah et  al. 2012). Variasi  komposisi  asam  amino  yang berbeda  dalam  hidrolisat  protein  ikan, dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor  yaitu bahan  baku,  enzim,  dan  kondisi  hidrolisis (Klompong et  al, 2009a).  Komposis  asam amino ditunjukkan pada Gambar 7 .
Gambar  7 .  Komposisi  asam  amino  hidrolisat  protein  ikan  wader  dengan  perlakuan  enzim  calotropin  dan  papain:
10C:90P ( ), 40C:60P( ), 90C:10P( ) 8 ,7 4 3 ,6 1 3 ,3 3 1 5 ,3 4 6 ,7 4 6 ,1 9 4 ,1 0 2 ,3 6 3 ,7 7 7 ,0 4 1 ,9 6 3 ,2 2 2 ,4 0 7 ,3 9 4 ,6 6 9 ,2 9 3 ,6 1 3 ,4 0 1 6 ,1 9 7 ,9 5 6 ,9 1 4 ,1 1 2 ,2 7 3 ,8 2 7 ,1 7 2 ,3 2 3 ,7 7 2 ,3 0 4 ,2 2 5 ,4 6 8 ,2 2 3 ,3 5 3 ,0 9 1 4 ,7 5 7 ,0 8 6 ,2 5 3 ,7 8 2 ,0 5 3 ,6 4 6 ,6 6 2 ,0 2 3 ,5 6 2 ,2 2 3 ,7 9 5 ,1 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Asp Thr Ser Glu Gly Ala Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys Arg Ju m lah asam am in o ( % w /w ) Jenis asam amino
Asam  glutamat  merupakan  asam amino  dengan  nilai  tertinggi  sebesar 16,19%,  diikuti  dengan  asam  aspartat sebesar  9,29%  ( Gambar  7 ).  Wu et  al. (2003)  melaporkan  bahwa  asam  amino bebas telah memiliki aktivitas antioksidan. Diantara semua asam amino, asam aspartat dan  asam  glutamat  ditemukan  lebih  tinggi disebagian  besar  hidrolisat  protein  ikan yang dilaporkan (Ghassem et al., 2011).
Aktivitas  antioksidan  hidrolisat  ikan bergantung  pada  beberapa  asam  amino dengan  gugus  samping  aromatik  dan ikatan pepetida yang berkontribusi terhadap penangkapan radikal kuat. Hidrolisat protein  yang mengandung asam amino hidrofobik, seperti leucine, alanine, tryptophan, dan phenylalanine diyakini memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  tinggi (Mendis et  al. 2005).  Jika  ketiga  sampel dikaitkan  dengan  aktivitas  antioksidan, maka sampel hidrolisat protein ikan wader dengan perbandingan konsentrasi 40C:60P yaitu  40%  enzim  calotropin  dan  60% enzim papain memiliki aktivitas antioksidan  tertinggi  dengan  nilai  total asam amino sebesar 82,79 % w/w. Hal ini sesuai  dengan  hasil  analisis  aktivitas antioksidan  dan  hasil  analisis  asam  amino yang menunjukkan bahwa hidrolisat protein  ikan  wader  memiliki  kadar  asam glutamat  dan  asam  aspartat  yang  paling tinggi.  Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan Chalamaiah et  al. (2012)  yaitu  di  antara semua  asam  amino,  asam  aspartat  dan asam  glutamat  yang  ditemukan  lebih banyak  disebagian  besar  HPI  yang  sudah dilaporkan.
Daya  Ikat  Air  Hidrolisat  Protein  Ikan Wader
Daya ikat air ( water holding capacity )  merupakan  pengujian  untuk mengetahui  seberapa  besar  kemampuan daging dalam mengikat air bebas (Soeparno,  2009).  Pengujian  daya  ikat hidrolisat protein ikan wader menggunakan media daging ayam.
Pengujian kualitas fisik dapat dilakukan  dengan  cara  memperhatikan daya ikat air. Daging ayam  yang memiliki daya  ikat  air  rendah  akan  kehilangan banyak cairan, sehingga berat daging ayam akan  hilang.  Jika  nilai  daya  ikat  air semakin  kecil,  maka  susut  masak  daging ayam  semakin  besar,  sehingga  kualitas daging  ayam  akan  semakin  rendah  karena banyak komponen-komponen terdegradasi.
Gambar  8 .  Daya  ikat  air  hidrolisat  protein  ikan wader
Gambar  8 menunjukkan  bahwa daya  ikat  air  tertinggi  terdapat  pada hidrolisat  protein  ikan  wader  dengan perbandingan konsentrasi 70C:30P dengan proporsi  70%  enzim  calotropin  dan  30% enzim  papain  sebesar  76,98%,  sedangkan hasil  paling  rendah  terdapat  pada  blanko sebesar 65,73%. Penambahan enzim calotropin  dan  papain  pada  daging  ayam cenderung  memiliki  nilai  daya  ikat  air yang  lebih  tinggi  dibandingkan  blanko karena  adanya  pengikatan  air  yang disebabkan  oleh  kerja  enzim  pada  saat pemasakan. Sampel dengan hasil daya ikat tinggi dianggap lebih mampu mempertahankan  komponen  di  dalam daging  sehingga  susut  masaknya  kecil. Pada  blanko  menghasilkan  nilai  paling kecil  karena  tidak  ditambahkan  hidrolisat protein ikan.
Daging  dengan  daya  ikat  air  rendah akan  kehilangan  banyak  cairan,  sehingga terjadi  kehilangan  berat.  Semakin  kecil
65,73 75,26 74,06 76,98 71,77 73,25 75,9073,67 69,03
72,71
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Day a ik at air (%) Konsentrasi enzim calotropin:enzim papain
nilai  daya  ikat  air,  maka  susut  masak daging  semakin  besar,  sehingga  kualitas daging  semakin  rendah  karena  banyak komponen-komponen  terdegradasi.  Hasil pengujian membuktikan bahwa, penambahan  hidrolisat  protein  ikan  wader mampu  meningkatkan  daya  ikat  daging ayam  sehingga  mampu  mempertahankan komponen  protein  di  dalam  daging  ayam. Hal tersebut sejalan dengan hasil penelitian  Tounkara et  al .  (2013)  yang menunjukkan bahwa penambahan hidrolisat  protein  biji  Rosela  mampu meningkatkan  daya  ikat  daging  sapi.  Hal tersebut  dipengaruhi  oleh  konsentrasi  dan jenis  protein  yang  digunakan  selama proses  pemanasan  daging.  Kemampuan daya  ikat  air  juga  dipengaruhi  oleh  berat molekul.  Peptida  dengan  berat  meolekul rendah  lebih  efektif  meningkatkan  daya ikat air karena bersifat lebih hidrofilik.

## KESIMPULAN
Kombinasi konsentrasi 40C:60P dengan proporsi 40% enzim calotropin dan 60%  enzim  papain  merupakan  perlakuan terbaik.  Aktivitas  antioksidan  hidrolisat protein  ikan wader dengan metode DPPH, reducing  power ,  derajat  hidrolisis  dan asam amino tertinggi dimiliki oleh sampel 40C:60P  yaitu  hidrolisat  protein  ikan wader  dengan  proporsi  40%  enzim calotropin  dan  60%  enzim  papain  dengan nilai  berturut-turut  36,41%,  0,57,  74,40%, dan  82,79  %  w/w.  Hidrolisat  protein  ikan wader  memiliki  kemampuan  daya  ikat  air yang tinggi karena mampu mempertahankan  komponen  protein  di dalam daging.

## DAFTAR PUSTAKA
AOAC.  2005.  Official  methode  analysis. association of official analytical chemists .  Benjamin  Franklin  Station, Washington.
Amiza,  M.A.,  Kong,  Y.L.,  and  Faazaz,  A.L. 2012. Effect of hydrolysis on physicochemical  properties  of  cobia ( Rachycentron canadum ) frame
hydrolysate. Journal International Food Research , 19 (1): 199-206.
Badan  Pusat  Statistik  Kabupaten  Jember. 2013.  Produksi  dan  nilai  produksi budidaya  perikanan  air  tawar  menurut jenis  produksi  dan  jenis  perairan. (http://jemberkab.bps.go.id) [Diakses pada 29 Juli 2019].
Chalamaiah, M., Dinesh Kumar, B.,
Hemalatha,  R.,  and  Jyothirmaryl,  T. 2012. Fish protein hydrolysates: proximate  composition,  amino  acid composition,  antioxidant  activities  and applications: A Review.
Food Chemistry , 135: 3020-3038. Charoenphun,  N.,  Benjamas,  C.,  Nualpun,  S., and Wirote. 2013. Calcium- bindingpeptides  derived  from  tilapia ( Oreochromis niloticus ) protein hydrolysate. European  Food  Research and Technology , 236(1): 57-63.
Dwiloka,  B.,  dan  Atmomarsono,  U.  2007. Kandungan  Logam  Berat  pada  Daging Dada  dan  Paha  Ayam  Broiler  yang Dipelihara  dengan  Sistem  Kandang Panggung Setelah Direbus dan Dikukus .
Staf Dosen pada Laboratorium Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan, UNDIP. 235-242.
Gelichpour,  M.,  and  Shabanpour.  2011.  The investigation  of  proximate  composition and  protein  solubility  in  processed mullet fillet. International Food
Research Journal , 18 (4): 1343-1347.
Ghassem,  M.,  Fern,  S.S.,  Said,  M.,  Ali,  Z.M., Ibrahim,  S.,  and  Babji,  A.S.    2011.
Kinetic  characterization  of  channa striatus muscle sarcoplasmic and myofibrillar protein hydrolysates. Journal of Food Science and Technology .  [Doi:  10.1007/  s13197- 011-0526-6].
Haslaniza,  H.  2010.  The  effects  of  enzyme concentration, temperature, and incubation time on nitrogen content and degree of hydrolysis of protein precipitate from cockle ( Anadara granosa ) meat wash
water.
International  Food  Research  Journal , 17: 147-152.
Klompong,  V.,  Benjakul,  S.,  Yachai,  M., Visessanguan,  W.,  Shahidi,  F.,  and
Hayes, K.D. 2009. Amino acid
composition  and  antioxidative  peptides from  protein  hydrolysates  of  yellow stripe  trevally  ( Selaroides  leptolepis ).
Journal  of  Food  Science, 74:  C126- C133.
Kurniawan,  S.,  Lestari.,  dan  Hanggita,  S.R.J. 2012. Hidrolisis protein tinta cumi-cumi ( Loligo sp.)  dengan  enzim  papain. Fishtech, 1 (1): 41-54 .
Laemmli,  U.K.  1970.  Cleavage  of  structural proteins during the assembly of the head of  cateriophage  T4. Journal  Nature, 227: 680-685.
Mendis,  E.,  Rajapakse,  N.,  Byun,  H.G.,    and Kim, S.K. 2005. Investigation of jumbo squid  ( Dosidicus  gigas )  skin  gelatin peptide  for  their  in  vitro  antioxidant effects. Journal  of  Life  Science, 77: 2166-2178.
Murray,  R.  K.,  Granner,  D.  K.,  Mayes,  P.  A and  Rodwell,  V.W.  2003. Biokimia Harper .  Penerbit  Buku  Kedokteran EGC, Ed 25, Jakarta.
Ovissipour,  M.,  Benjakul,  S.,  Safari,  R.,  and Motamedzadegan, A. 2010. Fish protein hydrolysates  production  from  yellowfin tuna  thunnus  albacares  head  using alcalase  and  protamex. International Aquatic Research, 2: 87-95.
Oyaizu,  M.  1988.  Antioxidative  activity  of browning  products  of  glucosamine fractionated by organic solvent and thin layer  cromatography. Journal  Nippon Shokuhin  Kogyo  Gakkaisshi ,    Volume 35: 771-775
Poedjiadi A. 2006. Dasar-dasar Biokimia . UI- Press, Jakarta.
Purwanto.  2014. Evaluasi  Hasil  Belajar . Pustaka Pelajar, Yogyakarta.
Ranathunga,  S.,  Rajapakse,  N.,  and.,  Kim,
S.K. 2006. Purification
and characterization of antioxidative peptide derived  from  muscle  of  conger  eel ( Conger  myriaster ). Euro  Food  Res Technol , 222: 310–315.
Rao,  M.B.,  Tanksale,  A.M.,  Ghatge,  M.S., and.,  Deshpande, V.V.  1998.  Molecular and biotechnological aspect of microbial proteases . Microbiol  Mol  Biol  Review , 62:597-635.
Shimada,  K.,  Fujikawa,  K.,  Yahars,  K.,  and Nakamura,  T.  1992.  Antioksidative properties of xantan on the antioxidation of soy bean oil in eyelodextrin emultion. Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry, 40: 945-948 .
Soeparno.  2009. Ilmu  dan  Teknologi  Daging . Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.  6;  152-156;  289-290;  297–
299.
Tounkara,  F.,  Bernard,  S.,  Tidjani,  A.,  Guo- Wei,  L.,  and  Yong-Hui  Shi.  2013. Antioxidant  effectand  water-holding capacity  of  roselle  ( Hibiscus  sabdariffa L.)  Seed  protein  hydrolysates. Advance Journal of Food Science and Technology, 5 (6): 752-757.
Venugopal,  V.  2006. Seafood  Processing: Adding  Value  Through  Quick  Freezing,
Retortable Packaging, and Cook- Chilling . CRC Pr, Boca Raton. Walter, H.E., 1984. Method
With Haemoglobin,  Casein,  and  Azocoll  as Substrate  in.  Bergmeyer.  Hu  (ed). Methods  of  Enzymatic  Analysis .  Verlag Chemie, Deerfield Beach Florida Basel.
Witono,  Y.,  Aulanni’am,  Subagio,  A.,  dan Widjanarko,  S.B.  2007.  Preliminary Study  for  Enzymatic  Processung  of Milkfish Hydrolysate by Using “Biduri” Protease. Prosiding  Seminar  Nasional Perhimpunan  Ahli  Teknologi  Pangan Indonsesia (PATPI), Bandung  17-18 Juli 2007.
Witono,  Y.  2009.  Spesifitas  dan  Stabilitas Protese  Biduri  (Calotropis  gigantea). Tidak  Diterbitkan. Prosiding  Seminar Nasional  Perhimpunan  Ahli  Teknologi Pangan (PATPI) , Denpasar.
Witono,  Y.,  Taruna  I.,  Windrati.  W.S.,
Azkiyah, L., and Sari, T.N. 2016. Wader ( Rasboa
jacobsoni ) protein
hydrolysates:  Production,  biochemical, and  funcional  properties. Agriculture and  Agricultural  Science  Procedia, 9: 482-492.
Wu  Hui-chun.,  Chen,  H.M.,  and  Shiau,  C.Y. 2003.  Free  amino  acids  and  peptides  as related  to  antioxidant  properties  in protein hydrolysates of mackerel ( Scomber austriasicus ). Food Research , 36: 949-957.
Zayas,  J.F.  1997. Funcionally  of  Protein  in Food . Springer, Germany.