Hasil Penelitian

## AKTIVITAS ANTIBAKTERI GETAH PEPAYA KERING TERHADAP Staphylococcus aureus PADA DANGKE
[Antibacterial Activity of Dried Papaya Latex toward Staphylococcus aureus in Dangke]
Rifah Hestyani Arum 1) , Budiatman Satiawihardja 1,2) dan Harsi D. Kusumaningrum 1,2,3) *
1) Program Studi Ilmu Pangan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
3) Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center, Bogor
Diterima 19 November 2013 / Disetujui 12 Mei 2014

## ABSTRACT
Dangke  is  a  traditional  milk  curd  product,  made  by  coagulation  of  milk  using  fresh  papaya  latex.  This  product  is  usually  kept  at  room temperature (27-30ºC) until consumption. Dried papaya latex was used in this study to produce dangke, and its effect to S. aureus was determined by  direct  contact  in  TSB  and  dangke.  Fresh  papaya  latex  was  dried  using  vacuum  oven  at  50-55ºC  for  22  hours.  Dried  papaya  latex  at  a concentration of 2.7x10 -3 g/100 mL could reduce S. aureus approximately 1 log CFU/mL in TSB after 24 hours. Dried papaya latex and papain could maintain the S. aureus number in dangke within 24 hours storage at room temperature. The antibacterial activity of non-proteolytic compound of  papaya  latex,  i.e  ethanolic  extract  of  papaya  latex  was  determined  by  macrodilution  method,  resulted  an  the  MIC 90 of  8  mg/mL.  The  cell membrane  leakage  after  exposure  was  detected  by  measuring  the  optical  density  of  bacterial  supernatant  at  260  nm.  The  result  showed  that exposure to increasing antibacterial concentration resulted in increasing of optical density of S. aureus supernatant, indicating that the antibacterial caused the S. aureus membrane leakage. Fluorescence microscopy imaging showed that S. aureus exposure to antibacterial caused membrane leakage thus gave Propidium Iodide (PI) chance to penetrate into the cell, as indicated by changing of fluorescence color from green to red.
Keywords : cell membrane leakage, dangke, dried papaya latex

## ABSTRAK
Dangke merupakan produk curd susu tradisional yang dibuat melalui proses koagulasi susu menggunakan getah pepaya. Produk ini biasanya disimpan pada suhu ruang (27-30ºC) hingga akan dikonsumsi dan mampu bertahan selama kurang lebih 24 jam. Getah pepaya pada penelitian ini digunakan untuk membuat dangke dan efeknya terhadap S. aureus ditentukan dengan menggunakan metode kontak pada media Trypticase Soy Broth (TSB) dan dangke. Getah pepaya segar dikeringkan dengan menggunakan oven vakum pada suhu 50-55ºC selama 22 jam. Getah pepaya kering dengan konsentrasi 2.7×10 -3 g/100 mL mampu menurunkan jumlah S. aureus sebanyak 1 log CFU/mL setelah 24 jam. Getah pepaya kering dan papain menunjukkan kemampuan mempertahankan jumlah S. aureus pada dangke selama penyimpanan 24 jam pada suhu ruang. Aktivitas antibakteri  komponen  non-proteolitik  dari  getah  papaya,  seperti  ekstrak  etanol  getah  pepaya  ditentukan  dengan  menggunakan  metode macrodilution, diperoleh nilai KHM 90 sebesar 8 mg/mL. Kebocoran membran sel setelah pemaparan dengan antibakteri dideteksi dengan mengukur absorbansi  supernatan S.  aureus pada  panjang  gelombang  260  nm.  Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan  peningkatan  konsentrasi  antibakteri mengakibatkan  peningkatan  absorbansi  supernatan  yang  mengindikasikan  antibakteri  mampu  mengakibatkan  kebocoran  pada  membran S. aureus .  Pengamatan  dengan  menggunakan  mikroskop  fluoresens  memperlihatkan  terjadi  perubahan  warna  fluoresensi  yang  dihasilkan  oleh S. aureus akibat masuknya propidium iodida (PI) ke dalam sel melalui membran yang bocor akibat aktivitas antibakteri.
Kata kunci : dangke, getah pepaya kering, kebocoran membran sel

## PENDAHULUAN
1
Dangke  merupakan  salah  satu  produk  pangan  tradisional yang  berasal  dari  daerah  Enrekang,  Sulawesi  Selatan  yang mirip  dengan  tahu  susu.  Dangke  dibuat  dengan  menggum- palkan susu menggunakan getah pepaya, yang mengakibatkan perubahan konformasi pada struktur tiga dimensi protein karena aktivitas  proteolitiknya  (Geantaresa et  al. 2010).  Dangke  yang disimpan  pada  suhu  ruang  (27-30ºC)  berpotensi  dapat  te- rkontaminasi  oleh S.  aureus, mengingat  susu  pasteurisasi
*Penulis Korespondensi: E-mail: h_kusumaningrum@ipb.ac.id;  Telp: 0251-8626725
sebagai  bahan  baku  dangke  dapat  terkontaminasi  oleh S. aureus dengan jumlah  rata-rata  3.5 10 3 CFU/mL sebagimana dilaporkan oleh De Olievera et al. (2011).
Getah  pepaya  yang  digunakan  pada  pembuatan  dangke, selain  memiliki  aktivitas  proteolitik  juga  dilaporkan  memiliki kemampuan  sebagai  bahan  antibakteri  dan  anti-inflamasi (Ashok et  al .  2011;  Aravind et  al .  2013).  Aktivitas  antibakteri getah  pepaya  dan  papain  dari  getah  pepaya  telah  dilaporkan oleh Seenivasan et al. (2010) yang menguji aktivitas antibakteri papain terhadap beberapa bakteri dan fungi pada media Mueller Hinton  Agar (MHA).  Selain  itu,  ekstrak  petroleum  eter  dan metanol  getah  pepaya  juga  menunjukkan  kemampuan  meng- hambat  pertumbuhan E.  coli,  S.  aureus ,  dan P.  aeruginosa
Hasil Penelitian
(Ashok et  al .  2011).  Pengujian  aktivitas  antibakteri  getah tanaman selama ini banyak dilakukan pada media MHA (Aref et al. 2010;  Arekemase et  al. 2011).  Pada  penelitian  ini  selain dilakukan pengujian sifat antimikroba getah pepaya pada media pertumbuhan  juga  dilakukan  pengujian  pada  produk  pangan, yaitu dangke.
Kemampuan  antibakteri  dalam  menghambat  pertumbuhan bakteri dapat berlangsung melalui beberapa mekanisme, salah satunya  adalah  mengakibatkan  gangguan  pada  membran  sel bakteri  (Cowan et  al .  1999).  Salah  satu  metode  yang  dapat digunakan adalah dengan mengamati efek kebocoran membran yang  mengakibatkan  terlepasnya  material  sitoplasma,  khusus- nya  senyawa-senyawa  dengan  berat  molekul  rendah  dan komponen penyusun asam nukleat (Oonmetta-aree et al . 2006). Pelepasan  material  sitoplasma  akibat  kebocoran  membran  ini dapat diperiksa dengan mengukur absorbansi supernatan pada panjang gelombang 260 nm (Liu et al . 2004). Selain itu, metode lain  yang  dapat  dilakukan  adalah  dengan  pengamatan  meng- gunakan  mikroskop  fluoresensi  dengan  memanfaatkan  DNA probe sebagai  penanda.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  me- ngetahui  aktivitas  antibakteri  getah  pepaya  pada  dangke selama  penyimpanan  pada  suhu  ruang  (27-30ºC  serta pengaruh  getah  pepaya  terhadap  membran Staphylococcus aureus .

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Getah pepaya yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari  buah  pepaya  varietas  Calina  IPB  ( University  Farm IPB) yang  dikumpulkan  dengan  cara  menoreh  buah  dengan kedalaman  kurang  lebih  2  sampai  3  mm.  Getah  selanjutnya dikeringkan  menggunakan  oven  vakum  pada  suhu  50–55ºC selama  22  jam,  kemudian  digerus  hingga  menjadi  bubuk  dan ditentukan  aktivitas  proteolitiknya  berdasarkan  metode Bergmeyer (1984).
Persiapan papain dari getah pepaya (Modifikasi Nitsawang et al . 2006)
Getah  pepaya  segar  dihomogenkan  menggunakan  buffer fosfat  pH  8.  Larutan  yang  diperoleh  kemudian  dibuat  menjadi pH 5 dengan menggunakan HCl (Merck, USA) 6 M lalu diaduk selama 15 menit pada suhu 4ºC. Filtrat dan bagian yang tidak larut  dipisahkan  dengan  penyaringan  menggunakan  kertas saring  Whatman  no.  1.  Protease  yang  larut  pada  filtrat  di- presipitasi menggunakan etanol 96% dengan perbandingan 1:6 (v/v).  Endapan  yang  diperoleh  dipisahkan  dengan  sentrifugasi (Hermle,  Jerman)  pada  kecepatan  4000  rpm  pada  suhu  4ºC. Presipitat  kemudian  dikeringkan  menggunakan  oven  vakum pada suhu 50ºC hingga diperoleh papain kasar kering. Papain kasar  yang  diperoleh,  dihitung  rendemennya  dan  diukur aktivitas proteolitiknya dengan metode Bergemeyer (1984).
Persiapan ekstrak etanol getah pepaya (Modifikasi Wang et al . 2008) Komponen  bioaktif  non-proteolitik  getah  pepaya  diperoleh melalui  proses  ekstraksi  menggunakan  pelarut  etanol.
Modifikasi  yang  dilakukan  dari  penelitian  Wang et  al. 2008 adalah  konsentrasi  etanol  yang  digunakan  sebesra  96%. Campuran  getah  pepaya  kering  dan  etanol  dengan  per- bandingan  1:20  (b/v)  diultrasonikasi  menggunakan  BRAN- SONIC Ultrasonic cleaner 8510E-MTH, USA selama 20 menit. Larutan  getah  yang  telah  melalui  proses  ultrasonikasi  disaring menggunakan  kertas  Whatman  no.1.  Filtrat  kemudian  dipekat- kan dengan evaporasi menggunakan rotary evaporator (BUCHI, Switzerland) pada suhu 40ºC. Filtrat pekat kemudian dihembus dengan  gas  nitrogen  hingga  diperoleh  berat  konstan  untuk mendapatkan ekstrak etanol kering.
Persiapan kultur S. aureus (Oonmetta-aree et al . 2006) Kultur S. aureus yang berada dalam media Trypticase Soy Agar (TSA) miring diinokulasikan ke media Brain Heart Infution Broth (BHIB)  lalu  diinkubasi  selama  18  sampai  24  jam  pada suhu 37ºC. Suspensi bakteri yang diperoleh kemudian digores pada media TSA di cawan lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37ºC. Koloni identik dan tunggal diambil lalu diinkubasikan ke dalam 10 mL media TSB dan diinkubasi selama 18 sampai 24 jam pada suhu 37ºC. Penghitungan jumlah koloni dilakukan berdasarkan  metode  BAM  (2003).  Suspensi S.  aureus pada media  TSB  digunakan  sebagai  kultur  kerja  untuk  pengujian aktivitas  antibakteri  getah  pepaya  kering,  papain,  dan  ekstrak etanol getah pepaya.
Pengujian  aktivitas  antibakteri  getah  pepaya  pada  media pertumbuhan (Modifikasi Eshamah et al . 2013) Aktivitas antibakteri getah pepaya pada media pertumbuhan diuji  dengan  menggunakan  metode  kontak  pada  media  cair. Kontak  antara  bakteri  dengan  komponen  antibakteri  dilakukan pada tabung reaksi, berbeda dengan Eshamah et al. 2013 yang melakukan kontak pada cawan petri. Getah pepaya kering atau papain  dimasukkan  ke  dalam  2  mL  TSB (Oxoid,  UK)  hingga diperoleh  konsentrasi  yang  setara  dengan  konsentrasi  getah pepaya  segar  yang  digunakan  pada  pembuatan  dangke berdasarkan  aktivitas  proteolitiknya  (2.7×10 -3 g/100  mL  untuk getah  pepaya  kering  dan  0.1×10 -3 g/100  mL  untuk  papain). Sebanyak  20 L S.  aureus dengan  konsentrasi  10 6 CFU/mL ditambahkan  ke  dalam  1.98  mL  media  sehingga  diperoleh konsentrasi  sekitar  10 4 CFU/mL  kemudian  diinkubasi  dengan inkubator  bergoyang  selama  24  jam  pada  suhu  37ºC. Penurunan  jumlah S.  aureus akibat  aktivitas  antimikroba ditentukan  dengan  menumbuhkan  bakteri  yang  telah  dipapar- kan  dengan  antimikroba  selama  24  jam  pada  media  TSA (Oxoid,  UK)  dan  dihitung  dengan  menggunakan  metode  BAM (2003).
Pengujian  penghambatan S.  aureus pada  dangke  oleh getah pepaya dan papain
Dangke  dibuat  dengan  memanaskan  susu  sapi  segar hingga  dicapai  suhu  63ºC  selama  10  menit.  Setelah  suhu diturunkan hingga 50ºC, 2.7×10 -3 g/100 mL getah pepaya kering atau 0.1×10 -3 g/100 mL papain ditambahkan ke dalam 100 mL susu.  CaSO 4 1%  juga  digunakan  sebagai  koagulan  untuk membuat  dangke,  sebagai  kontrol  negatif.  Pemanasan  terus dilanjutkan  dengan  pengadukan  hingga  protein  susu  meng- gumpal  dan  terjadi  pemisahan  antara curd dan whey . Curd
Hasil Penelitian
disaring  dan  dipadatkan  hingga  air  yang  ada  pada curd tidak tersisa  lagi.  Dangke  disimpan  pada  jar  steril  selama  48  jam pada suhu ruang. Jumlah S. aureus yang tumbuh pada dangke dihitung pada 0, 6, 24, dan 48 jam selama penyimpanan dangke pada suhu ruang berdasarkan metode BAM (2003).
Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol getah pepaya Pengujian  awal  aktivitas  antibakteri  ekstrak  etanol  getah pepaya  dilakukan  dengan  menentukan  zona  hambat  meng- gunakan  metode  difusi  sumur  berdasarkan  Baskaran et  al. (2012).  Suspensi S.  aureus dengan  konsentrasi  10 8 CFU/mL disebarkan menggunakan cotton bud steril pada media Mueller Hinton  Agar (Oxoid,  UK)  lalu  dibuat  sumur  dengan cork  borer steril berdiameter 4 mm. Sebanyak 20 µL ekstrak etanol getah pepaya dengan konsentrasi masing-masing 100, 32, 16, 8, and 4  mg/mL  diteteskan  ke  sumur.  Cawan  kemudian  didiamkan selama kurang lebih satu jam pada suhu ruang (27-30ºC) untuk memberi  kesempatan  antibakteri  berdifusi  ke  agar  lalu  di- inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Zona penghambatan ekstrak etanol getah pepaya yang ditandai dengan terbentuknya zona bening diukur diameternya.
Aktivitas  antibakteri  ekstrak  etanol  getah  pepaya selanjutnya  diuji  dengan  menentukan  konsentrasi  hambat minimum  (KHM 90 )  menggunakan  metode  pengenceran  makro ( macrodilution )  berdasarkan  Cosentino et  al. (1999).  KHM 90 merupakan  konsentrasi  dimana  antimikroba  mampu  menurun- kan  jumlah  bakteri  sebanyak  90%  atau  1  logaritma.  Senyawa antibakteri dimasukkan ke dalam tabung berisi TSB sebanyak 2 mL  dan  dibuat  seri  pengenceran  dua  kali,  sehingga  diperoleh konsentrasi  antibakteri  masing-masing  16,  8,  4,  dan  2  mg/mL. Masing-masing  tabung  kemudian  ditambahkan S.  aureus dengan  konsentrasi  10 6 CFU/mL  sebanyak  200  µL  sehingga diperoleh  konsentrasi  bakteri  10 5 CFU/mL.  Inkubasi  dilakukan dengan  menggunakan  inkubator  bergoyang  pada  suhu  37ºC selama  24  jam.  KHM 90 ditentukan  dengan  menghitung  pe- nurunan jumlah S. aureus,
Pengujian pelepasan material sitoplasma akibat kerusakan membran (Modifikasi Oonmetta-aree et al . 2006) Getah pepaya kering atau papain ditambahkan ke dalam 1 mL  suspensi  bakteri  hingga  diperoleh  konsentrasi  yang  setara dengan  setengah,  satu,  dua,  dan  tiga  kali  konsentrasi  getah pepaya  segar  pada  pembuatan  dangke  berdasarkan  aktivitas proteolitik  (2.7×10 -3 g/100  mL  untuk  getah  pepaya  kering  dan 0.1×10 -3 g/100 mL untuk papain). Ekstrak etanol getah pepaya ditambahkan  ke  1  mL  suspensi  bakteri  hingga  diperoleh konsentrasi  yang  setara  dengan  setengah,  satu,  dan  dua  kali nilai KHM 90 ekstrak etanol getah pepaya. Pemaparan dilakukan selama 2 jam pada suhu 37ºC. Kebocoran material sitoplasma ditentukan  dengan  mengukur  material  sel  yang  ada  di  dalam supernatan  menggunakan  spektrofotometer  (Shimadzu  UV 1800, Jepang) pada panjang gelombang 260 nm.
Pengamatan  kerusakan  membran  sel  dengan  mikroskop fluoresens (Modifikasi Berney et al. 2007) Pengujian  pengaruh  antibakteri  terhadap S.  aureus dilakukan dengan cara sel bakteri yang telah dipisahkan dengan media dicuci  sebanyak dua kali  dengan NaCl 0.85%  steril lalu
diresuspensi  menggunakan  NaCl  0.85%  dan  dikonsentrasikan hingga konsentrasi kira-kira 10 8 CFU/mL. Getah pepaya kering atau  papain  ditambahkan  ke  1 mL  suspensi  bakteri  hingga  di- peroleh  konsentrasi  yang  setara  dengan  konsentrasi  getah pepaya  segar  pada  pembuatan  dangke  berdasarkan  aktivitas proteolitik  (2.7×10 -3 g/100  mL  untuk  getah  pepaya  kering  dan 0.1×10 -3 g/100 mL untuk papain). Ekstrak etanol getah pepaya ditambahkan  ke  1  mL  suspensi  bakteri  hingga  diperoleh konsentrasi  yang  setara  dengan  nilai  KHM.  Pemaparan dilakukan selama 2 jam pada suhu 37ºC. Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan 200 L SYBR Green (KAPA Biosystem, USA) dan 200 L propidium iodida 0.2 mg/mL (Invitrogen, UK) lalu  diinkubasi  selama  15  menit  pada  suhu  ruang  dan  kondisi gelap,  kemudian  diamati  menggunakan  mikroskop  fluoresens (Olympus  CH30,  Jepang).  Sel  dengan  membran  yang  utuh menghasilkan  fluoresensi  hijau,  sedangkan  sel  dengan membran  yang  rusak  menghasilkan  fluoresensi  merah. Fluoresensi merah terbentuk pada eksitasi maksimum 535 nm dan emisi maksimum 617 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik getah pepaya segar, getah pepaya kering dan papain
Karakteristik getah pepaya segar, getah pepaya kering, dan papain  disajikan  pada  Tabel  1.  Kadar  air  getah  pepaya  segar adalah sebesar 81 % (basis basah), hal ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh El Moussaoui et al. (2001) yaitu kadar air getah pepaya  segar  adalah  sekitar  85%.  Aktivitas  proteolitik  getah pepaya kering adalah 723±20  U/g per berat kering enzim dan aktivitas proteolitik papain adalah 678±5.4 U/g per berat kering enzim. Getah pepaya segar memiliki aktivitas proteolitik sebesar 371±2  U/g  per  berat  basah  enzim,  Nitsawang et  al. (2006) melaporkan  aktivitas  proteolitik  getah  pepaya  segar  varietas Thai  adalah  sebesar  529±162  U/g.  Perbedaan  aktivitas proteolitik  yang  diperoleh  ini  dipengaruhi  oleh  perbedaan  jenis pepaya  yang  digunakan  seperti  yang  dinyatakan  oleh  Chaiwut et al. (2007). Aktivitas proteolitik komponen getah pepaya pada penelitian ini diukur sebagai acuan untuk menyetarakan jumlah getah  pepaya  kering  dan  papain  yang  digunakan  sebagai pengganti  getah  pepaya  segar  pada  pembuatan  dangke berdasarkan jumlah yang diaplikasikan di masyarakat.
Tabel 1. Karakteristik getah pepaya segar, getah pepaya kering, dan papain 1) Komponen Kadar Air (%) Rendemen (%) Aktivitas Proteolitik (U/g) 2 Aktivitas Proteolitik (U/g) 3 Getah segar 81±0.3 - 1944.9±10 371±2 Getah kering 9.8±0.2 17.1±1.26 722.5±20 652±18 Papain 3.4±0.1 1.5±0.28 687.0±5 656±5
Keterangan: 1) Data disajikan dalam rata-rata ± SD; 2) Aktivitas per berat kering getah dan papain; 3) Aktivitas per berat basah getah dan papain
Aktivitas  antibakteri  getah  pepaya  dan  papain  pada media pertumbuhan dan dangke
Gambar  1  menunjukkan  getah  pepaya  kering  mampu  me- nurunkan  jumlah S.  aureus sebanyak  1  log  dari  jumlah  awal
Hasil Penelitian
3.4 8.5 3.5 1.9 3.4 3.6 0 2 4 6 8 10 0 24 Ju m la h S. a ur eu s (lo g C FU U /m L)
Waktu Inkubasi (Jam) control getah pepaya papain 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 6 24 48 Ju m la h S. a ur eu s (lo g C FU /m L) Waktu Inkubasi (jam) CaSO4 getah pepaya papain 5.5 10.5 7.5 5.2 4.2 1.7 0 2 4 6 8 10 12 awal kontrol 2 4 8 16 Ju m la h S. a ur eu s (lo g C FU /m L) Konsentrasi Ekstrak Etanol (mg/mL)
(dari  3.0×10 3 menjadi  2.5×10 2 CFU/mL).  Papain cenderung mampu  mempertahankan  jumlah S.  aureus (dari  2.7×10 3 menjadi  4.7×10 3 CFU/mL)  setelah  24  jam  pada  media  per- tumbuhan.  Hasil  ini  mengindikasikan  getah  pepaya  memiliki kemampuan penghambatan yang lebih tinggi dibanding papain. Kemampuan getah pepaya yang lebih tinggi ini dipengaruhi oleh kandungan  getah  pepaya  yang  lebih  kompleks  bila  di- bandingkan  papain  yang  telah  dipisahkan  dari  komponen  aktif lainnya (Chaiwut et al . 2007). Konsentrasi getah pepaya kering dan  papain  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  berturut-turut adalah  2.7×10 -3 dan  0.1×10 -3 g/100  mL.  Konsentrasi  ini  setara dengan  jumlah  getah  pepaya  segar  yang  digunakan  pada pembuatan  dangke  di  masyarakat  berdasarkan  aktivitas proteolitik.
Gambar 1.  Aktivitas  antibakteri  getah  pepaya  kering  dan  papain terhadap S. aureus pada media TSB selama 24 jam
Hasil  yang  ditunjukkan  pada  Gambar  2  memperlihatkan getah  pepaya  kering  dan  papain  mampu  menghambat  per- tumbuhan S.  aureus pada  penyimpanan  dangke  selama  6 hingga  24  jam  pada  suhu  ruang  (27-30ºC).  Jumlah S.  aureus mengalami peningkatan setelah disimpan selama 24 hingga 48 jam  dengan  kecepatan  yang  sama  seperti  pada  perlakuan kontrol  CaSO 4 .  Hasil  yang  diperoleh  ini  menunjukkan  getah pepaya  kering  dan  papain  yang  digunakan  sebagai  bahan penggumpal  pada  pembuatan  dangke  memiliki  kemampuan menghambat laju pertumbuhan S. aureus yang mengontaminasi produk  ini.  Dangke  merupakan  produk  berbasis  susu  yang cenderung berisiko terkontaminasi oleh S. aureus. De Olievera et al. (2011) menemukan kontaminasi S. aureus pada beberapa produk  susu  pasteurisasi. S.  aureus cenderung  mengonta- minasi  makanan  jadi  yang  diolah  dan  ditangani  secara  tidak higienis (Singh et al . 2010).
Aktivitas antibakteri getah pepaya kering pada dangke lebih rendah  bila  dibandingkan  aktivitasnya  pada  media  per- tumbuhan.  Getah  pepaya  kering  pada  dangke  tidak  dapat mereduksi  jumlah S.  aureus seperti  pada  media  pertumbuhan yang diperlihatkan pada Gambar 1 dan 2. Hal ini diduga karena bahan  pangan  merupakan  bahan  yang  kompleks  dan  me- ngandung beberapa macam komponen gizi yang diduga dapat mendukung pertumbuhan S. aureus dan menghambat aktivitas antibakteri.  Selain  itu,  juga  diduga  bahan  antibakteri  berikatan secara  tidak  dapat  balik  dengan  sel  bakteri,  partikulat,  dan komponen  bahan  pangan  sehingga  sisi  aktif  bahan  antibakteri
ini  kehilangan  aktivitasnya  terhadap  sel  lain  yang  belum berikatan (Rhoades et al . 2000).
Gambar 2.  Aktivitas antibakteri getah pepaya kering dan papain pada dangke  selama  penyimpanan  48  jam  pada  suhu  ruang (27-30ºC)

## Aktivitas antibakteri ekstrak etanol getah pepaya
Konsentrasi  terendah  yang  mampu  menghambat  per- tumbuhan yang berbeda nyata adalah 16 mg/mL yaitu sebesar 0.76  mm  (data  tidak  ditampilkan).  Konsentrasi  ini  selanjutnya digunakan pada penentuan KHM 90 . Akujobi et al. (2010) meng- gunakan ekstrak air pepaya muda 100% dan memperoleh zona hambat sebesar 26 mm pada suhu 30ºC. Pada pengujian etanol dan  DMSO  yang  digunakan  sebagai  kontrol  negatif  tidak menunjukkan  penghambatan  terhadap S.  aureus .  Hasil  yang diperoleh menunjukkan nilai KHM 90 ekstrak etanol getah pepaya sebesar 8 mg/mL (Gambar 3).
Keterangan: Gambar batang yang pertama menunjukkan jumlah awal S.aureus yang digunakan untuk pengujian
Gambar 3. Penghambatan  ekstrak  etanol  getah  pepaya  terhadap S. aureus pada media TSB setelah inkubasi 24 jam
Baskaran et al. (2012) melaporkan komponen fitokimia yang diekstraksi  daun  pepaya  menunjukkan  efek  penghambatan terhadap  beberapa  bakteri.  Hasil  lain  yang  dilaporkan  oleh Ashok et  al. (2011)  menunjukkan  kemampuan  ekstrak petroleum  eter  dan  metanol  getah  pepaya  menghambat  per- tumbuhan E. coli, P. aeruginosa, dan S. aureus . Sifat antibakteri ektrak  bagian  tanaman  getah  pepaya  ini  dipengaruhi  oleh kandungan  senyawa  aktif  yang  dikandung  oleh  ekstrak  getah pepaya yaitu flavonoid, alkaloid, tanin, triterpenoid, seroid, dan saponin (Krishna et al . 2008). Adejuwon et al. (2011) melapor-
Hasil Penelitian
Membran sel utuh
Membran sel rusak 5.5 10.5 7.5 5.2 4.2 1.7 0 2 4 6 8 10 12 awal kontrol 2 4 8
16
Ju m la h S. a ur eu s (lo g C FU /m L) Konsentrasi Ekstrak Etanol (mg/mL)
kan  nilai  KHM 90 ekstrak  metanol  dan  air  akar  pepaya  yang mengandung  flavonoid,  alkaloid,  tannin,  dan  glikosida  masing- masing adalah 2.0 mg/mL dan 8.0 mg/mL.
Pengaruh antibakteri terhadap membran sel S. aureus Hasil  pengukuran  absorbansi  untuk  masing-masing perlakuan  yang  diperlihatkan  pada  Gambar  4  menunjukkan perubahan  nilai  absorbansi  seiring  perubahan  konsentrasi antibakteri  yang  digunakan,  Perubahan  nilai  absorbansi supernatan  menandakan  terjadi  perubahan  jumlah  komponen yang  mampu  menyerap  cahaya pada  panjang  gelombang  260 nm yang dilepaskan dari dalam  sel  akibat aktivitas antibakteri. Penurunan  nilai  absorbansi  mengindikasikan  senyawa antibakteri  tidak  mengakibatkan  efek  kebocoran  membran  sel lagi  kemungkinan  disebabkan  oleh  efek  subletal  yang memberikan  kemampuan  bagi  bakteri  untuk  melakukan osmoregulasi  terhadap  senyawa  toksik  (Carson et  al. 2002). Hasil  ini  mengindikasikan  getah  pepaya  kering,  papain,  dan ekstrak etanol mampu mengakibatkan kebocoran membran sel pada konsentrasi tertentu.

## Keterangan:  Konsentrasi  adalah  kelipatan  jumlah  getah  pepaya  kering  dan papain  yang  digunakan  pada  pembuatan  dangke  dan  nilai  KHM  ekstrak etanol getah pepaya
Gambar 4.  Absorbansi  260  nm  supernatan S.  aureus setelah pemaparan dengan bahan antibakteri selama 2 jam
Metode  deteksi  lain  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah  dengan  pengamatan  menggunakan  mikroskop fluoresens.  Gambar  5a  menunjukkan  sel  utuh  yang  diwarnai dengan  SYBR Green dan  PI  menghasilkan  fluoresensi  hijau. SYBR Green merupakan pewarna DNA yang mampu berdifusi ke dalam sel sehingga mampu mewarnai sel baik yang memiliki membran  yang  utuh  maupun  yang  rusak.  Broadaway et  al. (2003)  menggunakan  SYBR Green untuk  mendeteksi keberadaan  bakteri  dalam  jumlah  yang  sedikit  dengan  cepat menggunakan laser-cytometry .  Sel  dengan  membran  yang rusak  diperlihatkan  pada  Gambar  5b,  warna  merah  dihasilkan dari  ikatan  antara  pewarna  PI  dengan  DNA.  PI  tidak  mampu berdifusi ke dalam sel dengan membran utuh karena ukurannya yang  besar  (BM  668.4)  sehingga  hanya  mampu  masuk  ke dalam sel bila terdapat bagian yang rusak pada membran (Giao et al . 2009), yang pada penelitian ini diakibatkan oleh aktivitas getah pepaya kering, papain, ekstrak etanol.
Sifat  PI  yang  tidak  mampu  berdifusi  melalui  sel  yang  utuh dan  hanya  mampu  masuk  melalui  membran  yang  mengalami
kerusakan  inilah  yang  dimanfaatkan  pada  pengujian  untuk membedakan  sel  yang  utuh  dengan  sel  yang  mengalami kebocoran.  PI  yang  masuk  ke  dalam  sel  berikatan  dengan komponen  asam  nukleat  dan  menghasilkan  fluoresensi  merah (Santo et  al .  2011).  Penggunaan  PI  sebagai  pewarna  untuk mendeteksi kerusakan sel telah dilakukan oleh Otto et al . (2010) yang menguji efek campuran mineral CB07 dan BY07 terhadap integritas  membran S.  aureus dan E.  coli. PI  yang  masuk  ke dalam  sel  akan  menggantikan  posisi  pewarna  lain  dan menghilangkan  efek  fluoresensi  yang  dihasilkan  oleh  pewarna sebelumnya, yang dalam hal ini adalah SYBR Green , sehingga yang tampak di bawah mikroskop fluoresens adalah fluoresensi merah (Berney et al . 2007).
Gambar 5. Penampakan S. aureus setelah pemaparan dengan getah pepaya  kering,  papain,  dan  ekstrak  etanol  getah  pepaya dengan konsentrasi 1 kali KHM 90 selama 2 jam di bawah mikroskop fluoresens. (a) fluoresensi hijau dihasilkan oleh sel dengan membran yang utuh dan (b) fluoresensi merah dihasilkan oleh sel yang mengalami kebocoran membran
Getah  pepaya  kering  mampu  mengakibatkan  kebocoran pada  membran  sel  bakteri  akibat  aktivitas  senyawa-senyawa aktif yang dikandungnya, antara lain adalah enzim papain, yang merupakan  salah  satu  enzim  proteolitik  (El  Moussaoui et  al . 2001). Membran sel bakteri Gram positif dilapisi oleh dinding sel yang tersusun atas peptidoglikan dan mengandung GlcNAc, N- acetyl murmeric acid dan asam amino D- dan L- yang mampu berikatan  dengan  ion  positif  dari  senyawa  antibakteri.  Protein yang menyusun membran sel bakteri inilah yang menjadi target kerja papain yang terdapat pada getah pepaya. Terganggunya struktur  protein  pada  membran  sel  mengakibatkan  gangguan permeabilitas  membran  sel  seperti  yang  dilaporkan  oleh Seenivasan et al. (2010). Hal ini dibuktikan dengan perubahan nilai absorbansi supernatan yang diperoleh setelah pemaparan S.  aureus dengan  bahan  antibakteri  seperti  yang  ditunjukkan pada  Gambar  4  dan  terbentuknya  fluoresensi  merah  setelah pewarnaan dengan PI (Gambar 5b).

## KESIMPULAN
Penggunaan getah pepaya kering pada pembuatan dangke selain  berfungsi  sebagai  bahan  penggumpal  juga  berperan sebagai  komponen  yang  mampu  menahan  pertumbuhan S. aureus bila  dibandingkan  dengan  kontrol  sehingga  tidak menjadi lebih banyak  selama penyimpanan  24 jam  pada  suhu ruang  (27-30ºC).  Papain  dan  komponen  non-proteolitik  getah pepaya  yang  diekstraksi  dengan  etanol  juga  menunjukkan
Membran sel utuh
a b
Hasil Penelitian
kemampuan menghambat pertumbuhan S. aureus hingga 90% pada  media  TSB.  Mekanisme  penghambatan S.  aureus oleh getah pepaya kering, papain, dan ekstrak etanol getah pepaya adalah  dengan  menyebabkan  kerusakan  pada  membran  sel bakteri  yang  ditunjukkan  dengan  peningkatan  nilai  absorbansi 260  nm  dan  pengikatan  PI  oleh  DNA S.  aureus yang  diamati dengan mikroskop fluoresens.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dapat terlaksana atas bantuan dana penelitian dari  Hibah  Penelitian  Unggulan  Perguruan  Tinggi  tahun  2013 dengan  nomor  kontrak  62/IT3.41.2/LI/SPK/2013,  Direktorat Jenderal  Pendidikan  Tinggi  Kementerian  Pendidikan  dan Kebudayaan.

## DAFTAR PUSTAKA
Adejuwon  AO,  Agbaje  EO,  Idika  N.  2011.  Antifungal  and antibacterial  activities  of  aqueous  and  methanolic  root extracts  of Carica  papaya linn.  (Caricaceae).  Int  Res  J Microbiol 2: 270-277.
Akujobi CN, Ofodeme CN, Enweani CA. 2010. Determination of antibacterial  activity  of Carica  papaya (paw-paw)  extracts. Niger J Clin Pract Nigerian 13: 55-57.
Aravind G, Bhowmik D, Duraivel S, Harish G. 2013. Traditional and Medicinal Uses of Carica papaya . J Med Plant Stu 1: 7- 15.
Aref HL, Salah KBH, Chaumont JP, Fekih A, Aouni M, Said K. 2010. In vitro antimicrobial activity of four Ficus carica latex fractions  against  resistant  human  pathogens  (Antimicrobial activity of Ficus carica latex). Pak J Pharm Sci 23: 53-58.
Arekemase MO, Kayode RMO, Ajiboye AE. 2011. Antimicrobial activity and phytochemical analysis of Jatropha curcas plant against some selected microorganisms. Int J Bio 3: 52-59.
Ashok  CD,  Prachu  BM,  Umesh  JU,  Manohar  PV.  2011. Antibacterial and antioxidant activity of plant latex. J Pharm Res 4: 406-407.
[BAM]  Bacterial  Analytical  Manual  .  2003.  Chapter  3  Aerobic plate  count.  [FDA]  Food  and  Drug  Administration. www.fda.gov. [30 Januari 2013].
Baskaran  C,  Ratha  bai  V,  Velu  S,  Kumaran  K.  2012.  The efficacy of Carica papaya leaf extract on some bacterial and a fungal strain by  well diffusion  method. Asian Pac J Trop Dis 2: S658-662. DOI: 10.1016/S2222-1808(12)60239-4.
Bergmeyer HU (ed). 1984. Methods of Enzymatic Analysis, Vol V. 3 rd edition. 121. Verlag Chemie, Weinheim.
Berney  M,  Hammes  F,  Bosshard  F,  Weilenmann  H,  Egli  T. 2007.  Assessment  and  interpretation  of  bacterial  kit  in combination  with  flow  cytometry  viability  by  using  the LIVE/DEAD  BacLight.  Appl  Environ  Microb  73:  3283-3290. DOI: 10.1128/AEM.02750-06.
Carson  CF,  Mee  BJ,  Riley  TV.  2002.  Mechanism  of  action  of Malaleuca  alternifolia (tea  tree)  oil  on Staphylococcus aureus determined  by  time-kill,  lysis,  leakage,  and  salt
tolerance  assays  and  electron  microscopy.  Antimicrob Agents  Ch  46:  1914-1920.  DOI:  10.1128/AAC.46.6.1  914- 1920.2002.
Chaiwut  P,  Nitsawang  S,  Shank  L,  Kanasawud  P.  2007.  A comparative study on properties and proteolytic components of  papaya  peel  and  latex  proteases.  Chiang  Mai  J  Sci  34: 109-118.
Cosentino  S,  Tuberoso  CIG,  Pisano  B,  Satta  M,  Mascia  V, Arzedi E, Palmas F. 1999. In-vitro antimicrobial activity and chemical  composition  of  sardinian Thymus essential  oils.
Lett Appl Microb 29: 130-135.
Cowan  MM.  1999.  Plant  products  as  antimicrobial  agents.
Clinical Microbiology Reviews 12: 564-582.
De  Olievera  LP,  Barros  LSS,  Silva  VC,  Cirqueria  MG.  2011. Study of Staphylococcus aureus in raw and pasteurized milk consumed  in  the  Reconcavo  area  of  the  State  of  Bahia, Brazil. J Food Process Technol 2: 1-5. DOI: 10.4172/2157- 7110.1000128.
El  Moussaoui  A,  Nijs  M,  Paul  C,  Wintjens  R,  Vincentelli  J, Azarkan M, Looze Y. 2001. Review : Revisiting the Enzyme Storage  in  the  Laticifers  of Catica  papaya in  the  Contxt  of their possible participation in the plant defence mechanism. Cell Mol Life Sci  58: 556-570. DOI: 10.1007/PL000 00881. Eshamah  H,  Han  I,  Naas  H,  Rieck  J,  Dawson  P.  2013.
Bactericidal  effects  of  natural  tenderizing  enzymes  on Escherichia coli and Listeria monocytogenes . J Food Res2: 8-18. DOI: 10.5539/jfr.v2n1p8.
Geantaresa  E,  Supriyanti  FMT.  2010.  Pemanfaatan  ekstrak kasar  papain  sebagai  koagulan  pada  pembuatan  keju Cottage menggunakan bakteri. J Sains dan Teknologi Kimia 1: 38-43.
Giao MS, Wilks SA, Azevedo NF, Vieira MJ. 2009. Validation of SYTO 9/propidium iodide uptake for rapid detection of viable but  noncultivable  legionella  pneumophila. Microb  Ecol 58:
56-62. DOI: 10.1007/s00248-008-9472-x.
Krishna KL, Paridhavi M, Patel JA. 2004. Review on nutritional, medicinal and pharmacological properties of Papaya ( Carica papaya Linn.). Nat Prod Rad 4: 364-373.
Liu  H,  Du  Y,  Wang  X,  Sun  L.  2004.  Chitosan  kills  bacteria through  cell  membrane  damage.    Int  J  Food  Microbiol  95: 147-155. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2004.01.022
Nitsawang S, Hatti-Kaul R, Kanasawud P. 2006. Purification of papain  from Carica  papaya Latex:  aqueous  two-phase extraction versus two-step salt precipitation. Enzyme Microb Tech  39:  1103-1107.  DOI:  10.1016/j.enzmictec.2006. 02.013.
Oonmetta-aree  J,  Suzuki  T,  Gasaluck  P,  Eumkeb  G.  2006. Antimicrobial  properties  and  action  of  galangal  ( Alpina galangal Linn.) on Staphylococcus aureus . LWT - Food Sci Technol 39: 1214-1220. DOI: 10.1016/j.lwt.2005.06.015.
Otto  CC,  Cunningham  TM,  Hansen  MR,  Haydel  SE.  2010 Effects  of  antibacterial  mineral  leachates  on  the  cellular ultrastructure,  morphology,  and  membrane  integrity  of Escherichia  coli and  methicillin-resistant Staphylococcus aureus . Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 9: 1-13. DOI: 10.1186/1476-0711-9-26.
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Rhoades  J,  Roller  S.  2000.  Antimicrobial  actions  of  degraded and  native  chitosan  against  spoilage  organisms  in laboratory media and foods. Appl Environ Microb 66: 80-86. DOI: 10.1128/AEM.66.1.80-86.2000.
Santo  CE,  Lam  EW,  Elowsky  CG,  Quaranta  D,  Domaille  DW, Chang  CJ,  Grass  G.  2011.  Bacterial  killing  by  dry  metallic copper  surfaces.  Appl  Environ  Microb  77:  794-802.  DOI: 10.1128/AEM.01599-10.
Seenivasan  R,  Roopa  L,  Gheeta  S.  2010.  Investigation  on purification,  charachterization  and  antimicrobial  activity  of
enzyme  papain  from Carica  papaya Linn.  J  Pharm  Res  3: 1092-1095.
Singh  P,  Prakash  A.  2010.  Prevalence  of  coagulase  positive pathogenic Staphylococcus aureus in milk and milk products collected from unorganized sector of Agra. Acta Argiculturae Slovencia 96: 37-41.
Wang  J,  Sun  B,  Cao  Y,  Tian  Y,  Li  X.  2008.  Optimisation  of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheat bran. Food Chem 106: 804-810. DOI: 10.1016/j.food chem.2007.06.062.