Peningkatan imunitas nonspesifik ikan mas, Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758) yang diinfeksi Aeromonas hydrophilla dengan pemberian asam humat tanah gambut
[Enhancement of nonspecific immunity in Aeromonas hydrophilla infected carp, Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758) by the administration of peat’s humic acid]
Diah Wulandari Rousdy 1  , Nastiti Wijayanti 2
1 Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Tanjungpura Jl. Prof. Dr. H. Hadari Nawawi Pontianak 78111
2 Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada , Bulaksumur, Yogyakarta
Diterima: 7 Maret 2016; Disetujui: 27 September 2016

## Abstrak
Tanah gambut diketahui mempunyai kandungan humus yang tinggi. Salah satu komponen humus dalam gambut adalah asam  humat.  Senyawa  asam  humat  mempunyai  struktur  yang  kompleks  dan  berbeda  untuk  tiap  jenis  tanah,  sehingga memungkinkan asam humat memiliki potensi biologis, salah satunya menstimulus sistem imunitas nonspesifik. Peneli- tian ini bertujuan menentukan pengaruh pemberian asam humat dalam pakan ikan terhadap aktivitas fagosit makrofag dan produksi radikal oksidatif sel neutrofil ikan  mas ( Cyprinus carpio L.) yang telah diinfeksi bakteri Aeromonas hy- drophilla .  Ikan  yang  digunakan  berukuran 10-15  cm. Perlakuan pada  penelitian  ini  yaitu  dosis  asam  humat  diberikan melalui pakan selama 21 hari. Perlakuan yang diberikan mencakup kelompok kontrol dan perlakuan asam humat (1; 3; 5% bobot pakan). Penambahan asam humat dalam pakan ikan mas cenderung meningkatkan aktivitas fagositik dan pro- duksi radical oxidative species (ROS) meski tidak berbeda dengan kontrol ( P >0,05). Peningkatan indeks fagositik ter- tinggi  ditunjukkan  oleh  perlakuan  asam  humat  3%  dan  peningkatan  ROS  diberikan  oleh  perlakuan  asam  humat  1%. Hasil uji tantang dengan bakteri A. hydrophilla secara intraperitoneal menunjukkan bahwa asam humat konsentrasi 1% mampu menghasilkan nilai sintasan terbaik.
Kata penting: asam humat, gambut, imunitas non-spesifik, ikan mas

## Abstract
Peat  soils  are  known  to  have  a  high  humus  content.  One  of  the  humus  compounds  is  humic  acid.  Humic  acid  has  a complex and a different chemical structure for each type of soil. Therefore humic acid has the biological potency, one of them is stimulating the nonspecific immune system. The aim of this study was to determine the effect of humic acid to  the  phagocytic  activity  of  macrophages  and  production  of  neutrophils  radical  oxidative  species  (ROS)  in  carp ( Cyprinus carpio L.) that have been infected by the bacteria Aeromonas hydrophilla . In this experiment, we used carp with  body  length  ranged  from10-15  cm.  Humic  acid  treatment  was  given  through  the  feed  for  21  days.  Treatments include control groups and the humic acid groups (i.e. 1, 3, 5% weight of the feed). The addition of humic acid in carp’s feed was able to increase phagocytic activity. The highest phagocytic index was shown at 3% humic acid treatment and radical  oxidative  species  (ROS)  was  increased  in  1%  humic  acid  treatment.  The  result  of  challenge  test  with A. hydrophilla injected  by  intraperitoneal  route  showed  the  highest  survival  rate  was  found  in  the  1%  humic  acid treatment.
Keywords: carp, humic acid, nonspecific immunity, peat

## Pendahuluan
Ikan  mas  ( Cyprinus  carpio Linn.)  adalah jenis ikan air tawar yang banyak dikonsumsi ma- syarakat.  Peningkatan  produksi  ikan  mas  kerap menghadapi  kendala,  salah  satunya  adalah  pe- nyakit  ikan  yang  disebabkan  bakteri Aeromonas hydrophilla .  (Jasmanindar  2011).  Upaya  untuk mengendalikan kasus penyakit ikan dapat dilaku- kan dengan menggunakan imunostimulan. Salah
satu  bahan  alam  yang  mempunyai  potensi  me- ningkatkan  sistem  imun  adalah  senyawa  asam humat yang terkandung dalam tanah gambut.
Gambut merupakan jenis tanah yang bera- sal  dari  materi  organik  yang  terdegradasi  secara lambat.  Laju  pembentukan  gambut  di  Indonesia cukup  tinggi  karena  dipengaruhi  oleh  tingginya curah  hujan  dan  topografi  wilayah  berupa  ce- kungan.  Oleh  sebab  itu,  Indonesia  tercatat  se- bagai  negara  dengan  luas  lahan  gambut  terbesar nomor  empat  di  dunia.  Tanah  gambut  diketahui
_____________________________  Penulis korespondensi Alamat surel: diah.w.rousdy@gmail.com
mempunyai kandungan humus yang tinggi. Salah satu  komponen  humus  dalam  gambut  adalah asam humat.
Manfaat  humus  dan  asam  humat  yang  te- lah  diketahui  adalah  meningkatkan  kesuburan tanah.  Namun  beberapa  penelitian  mengungkap manfaat  lain  asam  humat  di  bidang  kesehatan. Kompleksitas  struktur  asam  humat  memungkin- kan senyawa ini memiliki berbagai aktivitas bio- logis  dalam  tubuh  organisme  (Stevenson  1994). Asam  humat  mempunyai  potensi  antioksidan atau  kemampuan  menangkap  radikal  bebas  dise- babkan  oleh  banyaknya  gugus  oksigen  reaktif seperti  karboksil,  hidroksil,  dan  keton  (Vetvicka et al. 2010). Nakagawa et al. (2009) melaporkan asam humat 10% dapat meningkatkan daya tahan hidup ikan ayu ( Plecoglossus altivelis ) yang diin- feksi Flavobacterium  psycrophilum .  Selain  itu,
penelitian  lain  yang  dilakukan  oleh  Joone et  al.
(2003)  dan  Junek et  al. (2009)  melaporkan  kon- sentrasi  asam  humat  10-100  µg  mL -1 dapat  me- ningkatkan  pelepasan  TNF-α  dan  produksi  sito- kin pada konsentrasi asam humat  80 µg mL -1 .
Berdasarkan hal tersebut maka besar po- tensi asam humat untuk dikembangkan menjadi salah satu imunostimulant alami. Tujuan peneli- tian ini adalah menentukan pengaruh pemberian asam humat dalam pakan ikan terhadap aktivitas fagosit makrofag dan produksi radikal oksidatif sel neutrofil ikan mas ( Cyprinus carpio L.) yang telah diinfeksi bakteri Aeromonas hydrophilla .

## Bahan dan metode
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan  Mei 2013.  Tahapan  penelitian  meliputi:  ekstraksi asam  humat  dari  tanah  gambut,  pemberian  asam humat melalui pakan kepada ikan mas selama 21 hari, dan uji tantang dengan bakteri A. hydrophil- la .  Bakteri  ini  diperoleh  dari  Laboratorium  Pe-
nyakit Ikan, Departemen Perikanan Fakultas Per- tanian Universitas Gadjah Mada.
Bahan  yang  digunakan  yaitu  metanol, Giemsa  3%,  larutan  HCl,  larutan  NaOH, NaEDTA,  media Tryptone  Soy  Broth (TSB),
Tryptone  Soy  Agar (TSA), Glutamate  Starch Phenol  Red  Agar (GSP),  larutan Phosphate Buffer  Saline (PBS),  nitro  blue  tetrazolium ( Sigma ), n-metil formamide (Merck), levamisole, dan isolat bakteri A. hydrophila .
Hewan  uji  adalah  ikan  mas  ( Cyprinus carpio Linn.) strain merah Cangkringan yang di- peroleh  dari  kolam  budi  daya  Balai  Pembenihan dan  Budidaya  Ikan  Air  Tawar,  Muntilan,  Mage- lang.  Ikan  mas  yang  digunakan  berumur  sekitar dua bulan dengan panjang 10-15 cm.

## Rancangan percobaan
Penelitian  menggunakan  rancangan  acak lengkap dengan lima perlakuan dan tiga ulangan. Setiap ulangan terdiri atas 20 ekor ikan. Perlaku- an  yang  diberikan  yaitu:  kontrol  normal  (ikan tidak  diberi  asam  humat  dan  tanpa  uji  tantang), kontrol negatif (ikan tidak diberi asam humat tapi dilakukan uji tantang), kontrol positif (ikan diberi imunostimulant levamisole), dan perlakuan asam humat (konsentrasi 1; 3; 5% bobot pakan).
Sebelum  perlakuan,  ikan  diaklimasi  sela- ma dua  minggu dalam  wadah berkapasitas 25 L. Wadah  dibersihkan  dengan  cara  direndam  de- ngan KMnO 4 20 ppm selama 24 jam dan dibilas dengan  air  bersih.  Selama  aklimasi,  ikan  diberi pakan  pellet  2%  dari  bobot  badan  per  hari.  Air diganti 25% setiap hari.
Parameter fisik dan kimiawi air diukur dan dipantau  setiap  minggu.  Kadar  oksigen  terlarut diukur dengan metode titrasi Winkler, pengukur- an pH dengan pH meter, suhu menggunakan ter- mometer,  dan  kadar  amonia  menggunakan  kit Sera test.

## Ekstraksi asam humat
Ekstraksi  asam  humat  mengacu  pada metode  IHSS ( International  Humic  Substance Society )  dengan  modifikasi  (IHSS  2012).  Tanah gambut diambil pada kedalaman 30 cm dari per- mukaan tanah, kemudian dibersihkan dari kerikil dan  sisa  akar  tumbuhan.  Tanah  50  g  diekstrak dengan 0,1 M NaOH 500 mL selama  empat jam sambil diaduk. Campuran didiamkan satu malam. Filtrat  disaring  beberapa  kali  dengan  kapas  dan kertas saring. Fraksi humin yang tidak larut dihi- langkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Kemudian asam humat di- endapkan  dengan  asam  kuat  6  M  HCl  sebanyak 1/3  volume.  Campuran  didiamkan  selama  +15 jam. Endapan asam humat yang terbentuk disen- trifugasi kembali hingga pemisahan sempurna.
Ekstrak asam humat dibuat dalam konsen- trasi  yang  telah  ditentukan.  Larutan  dinetralkan dengan  NaOH,  dicampur  dengan  pellet  (protein 38%)  dan  dikeringkan  dalam  inkubator  50 o C.
Jumlah  pellet  yang  diberikan  setiap  hari  adalah
2% dari bobot badan ikan.
Biakan bakteri Aeromonas hydrophila Patogenitas A.  hydrophila diaktifkan  de- ngan cara direinfeksi  kembali pada ikan. Bakteri diisolasi dari organ ginjal dan hepar dan ditanam pada  media  selektif  GSP.  Setelah  24  jam  koloni yang  bewarna  kuning  ditanam  ke  media  TSA hingga  diperoleh  koloni  yang  seragam.  Biakan murni A.  hydrophilla dilakukan  subkultur  pada media TSB. Biakan disentrifugasi selama 10 me- nit kecepatan 10.000 rpm. Bakteri yang mengen- dap  dicuci  dan  diresuspensi  dengan  PBS.  Kepa- datan  bakteri  yang  digunakan  untuk  uji  tantang adalah 1x10 7 sel mL -1 yang diukur menggunakan spektrofotometer (El-Boshy et al. 2010).

## Pengukuran indeks fagositik
Pengukuran indeks fagositik dilakukan pa- da hari ke-7, 14, 21, dan setelah uji tantang. Sam- pel darah 20 µL dicampur dengan 20 µL suspensi A. hydrophila (sebagai antigen dengan kepadatan 10 7 sel  mL -1 ).  Campuran  diinkubasi  selama  20 menit  kemudian  dibuat  preparat  apus.  Apusan campuran  di  atas  gelas  objek  difiksasi  dengan metanol  dan  dikeringkan.  Apusan  diwarnai  de- ngan Giemsa 5 menit dan dicuci dengan akuades. Indeks  fagositik  dihitung  berdasarkan  persentase sel  fagosit  yang  menunjukkan  proses  fagositosis dari jumlah total sel fagosit yang terhitung (Ispir & Dorucu 2005).

## Produksi radikal oksidatif neutrofil
Pengukuran  produksi  radikal  oksidatif (ROS) neutrofil dilakukan pada hari ke-7, 14, 21, dan  setelah  uji  tantang.  Produksi  ROS  oleh  sel neutrofil  selama respiratory  burst dilakukan  de- ngan  reduksi  NBT  ( Nitro  Blue  Tetrazolium ) membentuk  formazan.  Satu  tetes  NBT  0,2%  di- berikan di atas kaca objek dan kaca penutup dile- takkan di atasnya,  diinkubasi  kembali selama 30 menit.  Sel  neutrofil  yang  aktif  mengandung  gra- nula  kebiruan.  Sel  neutrofil  aktif  dihitung  pada perbesaran  400x  dan  ditampilkan  dalam  jumlah sel per lapangan pandang (Ispir & Dorucu 2005).

## Uji tantang (challenge test)
Setelah  21  hari  imunostimulasi  semua kelompok,  kecuali  kontrol  normal,  dilakukan  uji tantang  ( challenge  test )  masing-masing  dengan 10 ekor ikan. Ikan diinjeksi secara intraperitoneal dengan  bakteri A.  hydrophila (1x10 7 sel  mL -1 ) dosis 0,1 mL per ikan. Setelah uji tantang dilaku- kan  pengamatan  mortalitas  ikan  selama  10  hari dan dihitung persentase sintasan (Mulia 2003).

## Analisis data
Data  dianalisis  secara  statistik  dengan ANOVA  satu  jalur  dan  uji  lanjut  Duncan’s Multiple  Range  Test  (DMRT)  menggunakan perangkat lunak SPSS versi 15.

## Hasil
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa pemberian pakan yang mengandung asam humat selama  21  hari  mampu  meningkatkan  aktivitas fagositik sel  monosit  menjadi 23-28% (Tabel 1). Setelah  diinfeksi  bakteri A.  hydrophilla ,  indeks fagositik  semua  kelompok  perlakuan  meningkat, kecuali kontrol negatif yang mengalami penurun- an.  Peningkatan  aktivitas  fagositik  tertinggi  pas- cainfeksi  diberikan  oleh  perlakuan  asam  humat 3%.
Penelitian  menunjukkan  pemberian  asam humat 3% meningkatkan produksi ROS pada hari
ke-21  tertinggi  sebesar  0,26  lebih  baik  diban- dingkan  kelompok  perlakuan  lainnya,  meski  ti- dak berbeda nyata secara statistik ( P >0,05). Sete- lah  ikan  mas  diinfeksi A.  hydrophilla terjadi  ke- naikan  produksi  ROS  pada  kelompok  kontrol normal, kontrol negatif, levamisol, dan asam hu- mat 1%; sedangkan penurunan ROS terjadi pada perlakuan asam humat 3% dan 5% (Tabel 2). Se- telah dilakukan uji tantang diperoleh nilai sintas- an  terbaik  hingga  pengamatan  terakhir  yakni pada  perlakuan  asam  humat  1%  sebesar  83% (Gambar 1).
Data kualitas air selama penelitian diperli- hatkan  pada  Tabel  3.  Kualitas  air  dalam  wadah pengujian  diperoleh  kisaran  suhu  air  (26-29 o C), pH  (6,8-7,0),  oksigen  terlarut  (5,0-6,9  mg  L -1 ) dan amonia (0,5-1,0 mg L -1 ).
Tabel 1. Indeks fagositik ikan mas selama pemberian asam humat dan setelah uji tantang
Perlakuan Indeks Fagositik (%) Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21 Hari ke-25 (4 hari setelah infeksi) Kontrol normal 17,33 ± 2,30 a 18,67 ± 4,62 a 18,67 ± 2,31 a 20,00 ± 0,00 a Kontrol negatif 19,33 ± 4,16 ab 17,17 ± 1,04 ab 21,33 ± 2,31 a 19,67 ± 3,75 a Levamisol 22,00 ± 4,00 ab 26,33 ± 4,04 c 29,33 ± 14,04 a 31,33 ± 13,01 a Asam humat 1% 23,33 ± 5,03 ab 24,00 ± 4,00 ab 23,67 ± 8,50 a 27,67 ±2,52 a Asam humat 3% 24,67 ± 1,15 b 25,33 ± 4,62 ab 24,00 ± 4,00 a 32,00 ± 17,44 a Asam humat 5% 22,67 ± 4,16 ab 25,33 ± 2,31 ab 28,00 ± 4,00 a 31,67 ± 4,73 a
Data ditampilkan dalam nilai rata-rata ± simpangan baku. Huruf yang berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata ( P<0,05 ).
Tabel  2.  Produksi  ROS  dengan  metode  NBT  selama  pemberian  asam  humat  dan  setelah  uji  tantang  pada ikan mas
Perlakuan Produksi ROS O.D 540 nm (A) Hari ke-7 Hari ke-14 Hari ke-21 Hari ke-25 (4 hari setelah infeksi) Kontrol normal 0,37 ± 0,12 a 0,35 ± 0,19 b 0,15 ± 0,02 a 0,17 ± 0,04 a Kontrol negatif 0,32 ± 0,11 a 0,24 ± 0,10 ab 0,13 ± 0,03 a 0,19 ± 0,06 a Levamisol 0,30 ± 0,12 a 0,11 ± 0,17 a 0,15 ± 0,05 a 0,22 ± 0,16 a Asam humat 1% 0,32 ± 0,11 a 0,12 ± 0,10 a 0,14 ± 0,07 a 0,29 ± 0,20 a Asam humat 3% 0,14 ± 0,79 a 0,18 ± 0,10 ab 0,26 ± 0,19 a 0,16 ± 0,05 a Asam humat 5% 0,21 ± 0,20 a 0,17 ± 0,08 ab 0,19 ± 0,05 a 0,17 ± 0,04 a
ROS= radical oxidative  species ,  NBT= Nitro  Blue  Tetrazolium .  Data  ditampilkan  dalam  nilai  rata-rata  ±  simpangan baku. Huruf yang berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata ( P<0,05 ).
Gambar  1.  Persentase  sintasan  kumulatif  setelah  uji  tantang  dengan  bakteri A.  hydrophila melalui  injeksi intraperitoneal
Tabel 3. Kisaran parameter kualitas air selama pemberian asam humat
Perlakuan Suhu ( o C) pH Oksigen terlarut (mg L -1 ) Amonia (mg L -1 ) Kontrol normal 26-27 6,8-7,0 5,5-6,2 0,6-1,0 Kontrol negatif 26-27 6,8-7,0 5,7-7,0 0,6-1,0 Levamisol Asam humat 1% Asam humat 3% Asam humat 5% 27-28 26-28 28-29 27-28 6,8-7,0 6,8-7,0 6,8-7,0 6,8-7,0 5,4-7,2 6,0-7,8 5,0-6,6 6,6-6,9 0,7-1,0 0,5-1,0 0,5-1,0 0,5-1,0

## Pembahasan
Pemberian  asam  humat  konsentrasi  1-5% selama  21  hari  memberikan  hasil  peningkatan indeks fagositik sel monosit. Aktivitas fagositosis tertinggi  diberikan  oleh  kelompok  asam  humat 5%  sebesar  28,0%,  tidak  berbeda  jauh  dengan kontrol  positif  levamisol  sebesar  29,3%  (Tabel 1).  Peningkatan  aktivitas  fagositik  tertinggi  pas- cainfeksi  diberikan  oleh  perlakuan  asam  humat 3%.
Peningkatan  aktivitas  fagositosis  oleh pemberian  asam  humat  3%  diduga  disebabkan asam  humat  mampu  menstimulasi  produksi  sito- kin selama proses kemotaksis sel fagosit menuju partikel  asing.  Partikel  asing  kemudian  menem- pel pada reseptor di sel fagosit. Proses ini kemu- dian diikuti dengan ingesti partikel dan pemben- tukan fagosom. Partikel dalam fagosom kemudi- an dihancurkan dengan pembentukan radikal ok-
sidatif  (ROS),  radikal  nitrogen  (RNS)  atau  de- ngan  bantuan  lisozim  (Iwama  &  Nakanishi 1996).
Sekresi  sitokin  yang  berperan  dalam  ke- motaksis  dapat  distimulus  oleh  pemberian  asam humat.  Junek et  al. (2009)  menyatakan  bahwa senyawa  polianionik  dari  asam  humat  bersifat menstimulus  sekresi  sitokin  selama  proses  infla- masi  dan  fagositosis.  Selain  itu  peningkatan  fa- gositosis  juga  disebabkan  oleh  sifat  polianionik asam humat yang secara baik dikenali oleh resep- tor  SR  pada  membran  sel  fagosit  atau  makrofag Reseptor  ini  termasuk  ke  dalam pattern  recog- nition receptors (PRRs) yang merespon berbagai variasi  ligand  terutama  untuk  makromolekul polianionik (Platt & Gardon 1998).
Hasil penelitian  ini sejalan dengan peneli- tian  Schepetkin et  al. (2003)  yang  menyatakan bahwa  pemberian  fraksi  fulvat  dari  substansi
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sint as an (% ) Hari setelah uji tantang Kontrol normal Kontrol negatif
Levamisol
Asam humat 1% Asam humat 3% Asam humat 5%
asam  humat  pegunungan  Tajikistan  meningkat- kan  fagositosis  secara in  vitro disebabkan  oleh polisakarida  yang  terikat  pada  substansi  asam humat.  Keberadaan  polisakarida  terikat  telah dibuktikan  oleh  penelitian  Lasmi  (2013)  yang menunjukkan  hasil  spektrum  inframerah  asam humat  dari  tanah  gambut  Kalimantan  memiliki polisakarida  terikat.  Polisakarida  yang  terikat oleh  asam  humat  diduga  bekerja  pada  reseptor SR  leukosit  dan  mengaktivasi  NF-  B  ( necrosis factor-kappa B )
Hasil  pengukuran  ROS  yang  diproduksi neutrofil  menunjukkan  penurunan  setelah  pem- berian  asam  humat  21  hari  (Tabel  2).  Asam  hu- mat 1% menunjukkan kadar ROS terendah sebe- sar 0,14 demikian pula untuk kontrol positif leva- misol  dengan  kadar  ROS  0,15.  Penurunan  nilai ROS  pada  beberapa  kelompok  perlakuan  ke- mungkinan  disebabkan  suplai  oksigen  dalam  tu- buh  ikan  tidak  mengimbangi  konsumsi  oksigen oleh  sel  neutrofil.  Sel  neutrofil  menggunakan oksigen untuk memproduksi ROS.
Perbedaan  terjadi  setelah  ikan  diinfeksi bakteri A. hydrophilla , perlakuan asam humat 1% memberikan  kenaikan  ROS  tertinggi  hingga 107%  dan  diikuti  dengan  kontrol  positif  levami- sol sebesar 46%. Dengan demikian dapat dikata- kan bahwa peningkatan aktivitas fagositosis pada kelompok  asam  humat  1%  dan  levamisol  terjadi karena  peningkatan  produksi  ROS.  Produksi  se- nyawa  ROS  oleh  neutrofil  dengan  pemberian asam  humat  1%  merupakan  salah  satu  mekanis- me dalam sistem imunitas nonspesifik.  Saat neu- trofil  memakan  partikel  asing  akan  terjadi  pe- ningkatan  konsumsi  oksigen.  Oksigen  direduksi menjadi  O 2  - (anion  superoksida) oleh  NADPH oksidase, suatu kompleks enzim yang ditemukan pada  membran  plasma  sel  fagosit  (Iwama  & Nakanishi 1996).
Beberapa  penelitian  imunostimulan  me- nunjukkan peningkatan aktivitas fagositosis tidak selalu  diiringi  dengan  peningkatan  produksi ROS. Inhibisi produksi ROS oleh sel fagosit ter- jadi pada pemberian imunostimulan radix Scutel- laria pada  ikan  nila  dengan  konsentrasi  0,5-1% selama  empat  minggu  (Yin et  al. 2006).  Namun pemberian  imunostimulan  tersebut  memberikan peningkatan sekresi lisozim dalam darah. Hal ini menunjukkan  bahwa  mekanisme  penghancuran partikel  asing  (bakteri)  tidak  hanya  dilakukan dengan  mekanisme  produksi  ROS  namun  dapat juga  dengan  bantuan  enzim  antibakteri,  lisozim yang dihasilkan oleh sel fagosit.
Asam humat diketahui mempunyai potensi antioksidan atau  kemampuan  menangkap radikal bebas  yang  disebabkan  oleh  banyaknya  gugus oksigen  reaktif  seperti  karboksil,  hidroksil,  dan keton.  Hasil  penelitian  Vašková et  al. (2011) membuktikan  bahwa  asam  humat  mampu  me- nangkap radikal hidroksil dan tidak mencetuskan produksi  radikal  oksidatif  lain  pada  konsentrasi 0,1% secara in vitro . Potensi imunostimulan yang dimiliki  oleh  senyawa  antioksidan  dilaporkan oleh  Kumari  &  Sahoo  (2006),  suplementasi  vi- tamin  C  500  mg  kg -1 dalam  pakan  ikan  lele ( Clarias  batrachus )  selama  satu  bulan  tidak memberikan  peningkatan  produksi  ROS  (aktivi- tas respiratory  burst )  namun  secara  signifikan meningkatkan aktivitas fagositosis hingga 70%.
Pemberian  asam  humat  konsentrasi  1% memberikan  nilai  sintasan  lebih  tinggi  diban- dingkan  konsentrasi  asam  humat  yang  lebih  be- sar. Asam humat 1% dinilai mampu menstimulus sistem  imunitas  nonspesifik  melalui  mekanisme peningkatan aktivitas fagositosis. Hasil penelitian ini lebih baik dibanding penelitian Kodama et al.
(2007) yang menggunakan ekstrak humat 5% da- ri  gambut  subtropis  untuk  meningkatkan  nilai
sintasan  ikan  mas  ( Cyprinus  carpio )  yang  terin- feksi bakteri Aeromonas salmonicida .
Kualitas  air  selama  pengujian  diperoleh suhu air (26-29 o C), pH (6,8-7,0), oksigen terlarut (5,0-6,9 mg L -1 ) dan amonia (0,5-1,0 mg L -1 ). Pe- ningkatan  kadar  amoniak  terjadi  pada  penelitian ini  yakni  sekitar  1  mg  L -1 .  Kisaran  kualitas  air selama perlakuan asam humat masih berada pada kisaran normal, kecuali nilai amonia yang sedikit lebih  tinggi.  Menurut  Yin et  al .  (1995),  kisaran kadar oksigen terlarut untuk ikan mas sebesar 6- 7,9  mg  L -1 ;  pH  6,8-7,4  ;  kadar  amonia  0,5-1,1
mg  L -1 dan  suhu  23-29 o C.  Kadar  amoniak  yang lebih tinggi selama pengujian kemungkinan dise- babkan  oleh  terlarutnya  butiran  pelet  yang mengandung asam humat ke dalam air. Oleh ka- rena  itu  diperlukan  metode  suplementasi  asam humat dalam pakan secara lebih baik.

## Simpulan
Penambahan asam humat 1-5% dalam pa- kan mampu memodulasi sistem imunitas nonspe- sifik  pada  ikan  mas  dengan  meningkatkan  akti- vitas fagositik dan produksi ROS oleh sel neutro- fil.  Asam  humat  konsentrasi  1%  menghasilkan nilai  sintasan  terbaik  pasca  infeksi A.  hydro- philla .

## Daftar pustaka
El-Boshy M, El-Ashramb  AM, Abdelhamid FM, Gadalla  HA.  2010.  Immunomodulatory effect  of  dietary Saccharomyces  cerevi- siae ,  b-glucan  and  laminaran  in  mercuric chloride  treated  nile  tilapia  ( Oreochromis niloticus )  and  experimentally  infected with Aeromonas  hydrophila . Fish  & Shellfish Immunology, 28(4): 802-808
IHHS  (International  Humic  Substances  Society). 2012. Isolation  of  IHSS  soil  fulvic  and humic acids . ( www.humicsubstances.org )
Ispir U, Dorucu M. 2005. A study on the effects of  levamisole  on  the  immune  system  of rainbow  trout  ( Oncorhynchus  mykiss , Walbaum), Turkish  Journal  of  Veterinary Animal Sciences, 29(5): 1169-1176
Iwama  G,  Nakanishi  T.  1996. The  Fish  Immune System, Organism, Pathogen and Environ- ment . Academic Press. California. 380 p Jasmanindar  Y.  2011.  Prevalensi  parasit  dan  pe- nyakit  ikan  air  tawar  yang  dibudidayakan di  Kota/Kabupaten  Kupang. Bionatura ,
13(1): 25-30
Joone  KT,  Dekker  J,  van  Rensburg  CEJ.  2003. Investigation  of  immunostimulatory  pro- perties  of  oxihumate. Naturforsch, 58(3): 263-267
Junek  R,  Morrow  R,  Schoenherr  J,  Schubert  R,
Kallmeyer  R,  Phul  S,  Klocking  R.  2009. Bimodal effect of humic acids on the LPS- induced TNF-α release from differentiated U937  cells. Phytomedicine, 16(5):  470– 476
Kodama  K,  Denso,  Nakagawa,  J.  2007.  Protect- ion  against  atypical Aeromonas salmoni- cida infection  in  carp  ( Cyprinus  carpio ) by  oral  administration  of  humus  extract. Journal  of  Veterinary  Medical  Science ,
69(4): 405-408
Kumari  J,  Sahoo  PK.  2006.  Non-specific  im- mune  response  of  healthy  and  immuno- compromised asian catfish ( Clarias batrachus )  to  several  immunostimulants. Aquaculture, 255(4): 133-141
Lasmi  L.  2013.  Studi  adsorpsi  kompetitif  logam Ag(I),  Cu(II)  dan  Cr  (III)  pada  asam  hu- mat. Tesis . Jurusan  Kimia Fakultas MIPA
Universitas Gadjah Mada. 64 hlm
Mulia DS. 2003. Pengaruh cara booster terhadap efikasi  vaksinasi  oral  dengan  deebris  sel Aeromonas  hydrophilla pada  lele  dumbo ( Clarias sp.). Jurnal  Perikanan ,  8(1):  34- 43
Nakagawa  J,  Iwasaki  T,  Kodama  H.  2009.  Pro- tection  against Flavobacterium psychro- pilium infection  (cold  water  disease)  in ayu  fish  ( Plecoglossus  altivelis )  by  oral administration  of  humus  extract. Journal of  Veterinary  Medical  Science, 71(11):
1487-1491
Platt N, Gordon S. 1998. Scavenger receptor: Di- verse  activities  and  promiscuous  binding of  polyanionic  ligands. Chemistry  &  Bio- logy, 5(8): 193-203
Schepetkin IA, Khlenbikov AI, Ah SH, Woo SB,
Jeong C, Klubachuk ON, Kwon BS. 2003. Characterization  and  biological  activities of  humic  substances  from  mumie Journal of  Agricultural  and  Food  Chemistry, 51(18): 5245-5254
Stevenson  FJ.  1994. Humus Chemistry,  Genesis,
Composition,  Reaction .  John  Willey  & Sons Inc. New York. 512 p.
Vašková J, Veliká B, Pilátová M, Kron I, Vaško L. 2011. Effects of humic acids in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, 47(5-6): 376–382
Vetvicka V, Baigorri R, Zamarreiio AM, Garcia- Mina JM, Yvin J. 2010. Glucan and humic acid:  synergistic  effects  on  the  immune system. Journal  of  Medicine  Food, 13(4): 863-869
Yin  G,  Jeney  G,  Racz  T,  Xu  P, Jun  X,  Jeney  Z. 2006.  Effect  of  two  chinese  herbs  ( Astra- galus radix and Scutellaria radix ) on non- specific immune response of tilapia, Oreo- chromis  niloticus.  Aquaculture ,  253(4): 39-47
Yin  Z,  Lam  TJ,  Sin  YM.  1995.  The  effects  of crowding  stress  on  the  non-specific immune response in fancy carp (Cyprinus carpio L.). Fish  &  Shellfish  Immunology, 5(7): 519-529