BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 2, Nomor 3 (2020): 463 - 477 E-ISSN: 2714-8564
Eksplorasi Bakteri Diazotrof dari Rizosfer Tanaman Bawah Merah ( Allium ascalonicum L.) di Brebes, Jawa Tengah
Dwi Ayu Lutfiani Amalia 1 , Oedjijono 1 , Purwanto 2
1 Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman
2 Jurusan Agroteknologi, Fakultas Pertaninan, Universitas Jenderal Soedirman Jalan dr. Suparno 63 Purwokerto 53122 email: oedjijono@unsoed.ac.id
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  : 08/11/2020
Disetujui  : 22/12/2020

## Abstract
This study aims to  explore the  diazotroph bacteria that are able to produce  nitrogen and produce the IAA hormone by selecting it from the rhizosphere of the shallots plant in Brebes, Central Java. The  research  design  used  was  a  survey  method.  This  research  consisted  of  taking  samples  of shallot  rooting  soil  in  Brebes,  Central  Java,  isolation  of  soil  bacteria  in  Yeast  Mannitol  Agar, Ashby,  and  Caceres  medium,  IAA  production  test  of  nitrogen-fixing  quantitative  test  using Kjeldahl  analysis,  and  bacterial  characterization.  A  total  of  nine  diazotroph  bacterial  isolats capable  of producing  IAA  were successfully isolated.  The nine  isolats  were able to produce  IAA with  concentrations between 305-3.51 ppm, with LAR3 isolats as the highest IAA producer. The results of total nitrogen  levels by the  Kjeldahl  method  of the 6 best isolats producing  IAA,  were able  to  produce  concentrations  ranging  from  3.15  to  88.55  ppm.  LAR5  isolats  was  the  highest nitrogen  producer.  Identification  results  showed  that  the  nine  bacterial  isolats  obtained  were included  in  3  different  bacterial  groups,  four  isolats  including  species  belonging  to  the  genus Rhizobium (isolats LAR3, LAR5, LBR1, and LCR3), three isolats including species belonging to the  genus  Azospirillum  (isolats  LAA4,  LAA5,  and  LCA1),  and  two  isolats  including  species belonging to the genus Azotobacter (isolats LBZ2 and LBZ2).
Key Words : Diazotrof bacteria, IAA, Nitrogen fixation, Shallots .

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengeksplorasi  bakteri  diazotrof  yang  mampu  menambat  nitrogen dan  menghasilkan  hormon  IAA dengan  cara  menyeleksinya dari rizosfer tanaman bawang  merah di Brebes, Jawa Tengah.  Penelitian  ini terdiri  dari pengambilan sampel tanah perakaran bawang merah  di  Brebes,  Jawa  Tengah,  isolasi  bakteri  tanah  pada  medium Yeast  Mannitol  Agar+ Congo red ,  Ashby,  dan  Caceres,  uji  produksi  IAA  metode  Salkowski,  uji  kemampuan  penambatan nitrogen metode Kjeldahl, dan identifikasi bakteri. Sebanyak sembilan isolat bakteri diazotrof yang mampu  menghasilkan  IAA  telah  berhasil  diisolasi.  Kesembilan  isolat  tersebut  mampu menghasilkan  IAA  dengan  konstentrasi  antara  3,05-3,51  ppm,  dengan  isolat  LAR3  sebagai penghasil IAA tertinggi. Hasil perhitungan kemampuan menambat nitrogen bebas dengan metode Kjeldahl menunjukkan bahwa 6 isolat penghasil IAA terbaik mampu menghasilkan  nitrogen total dengan  konsentrasi  berkisar  antara  3,15-88,55  ppm.  Isolat  LAR5  merupakan  penghasil  nitrogen tertinggi.  Hasil  identifikasi  menunjukkan  kesembilan  isolat  bakteri  yang  didapatkan  termasuk dalam  3  kelompok  bakteri  yang  berbeda,  yaitu  empat  isolat  termasuk  spesies  anggota  genus Rhizobium  (isolat  LAR3,LAR5,LBR1,dan  LCR3),  tiga  isolat  adalah  spesies  anggota  genus Azospirillum    (isolat  LAA4,LAA5,  dan  LCA1),  dan  dua  isolat  termasuk  spesies  anggota  genus Azotobacter  (isolat LBZ2 dan LBZ3).
Kata Kunci : Bakteri Diazotrof, IAA, Fiksasi Nitrogen, Bawang Merah.

## PENDAHULUAN
Bawang merah merupakan komoditas sayuran  penting  di  Indonesia,  tanaman  ini  biasa tumbuh  di  tanah  Entisol  (Alluvial).  Tanah  jenis Entisol  atau  Alluvial  merupakan  tanah  dengan
kadar  bahan  organik  dan  N-total  yang  tergolong sangat  rendah  (Firmansyah et  al .,  2015).  Nitrogen merupakan  salah  satu  unsur  hara  utama  yang dibutuhkan  oleh  tanaman  dalam  jumlah  besar  dan bermanfaat  bagi  tanaman  sebagai  penyusun protoplasma,  molekul  klorofil,  asam  nukleat,  dan asam  amino  (Nasikah,  2007).  Udara  mengandung
sekitar  78%  N,  tetapi  tanaman  tidak  dapat menggunakan  secara  langsung,  sehingga  pupuk  N
selalu    ditambahkan    sebagai    input    produksi tanaman  (Hindersah  &  Simarmata,  2004).  Petani menggunakan sumber  nitrogen tambahan ke dalam tanah  dalam  bentuk  pupuk  anorganik,  seperti  urea, ZA,  dan  NPK.  Hal  ini  mendorong    pemakaian pupuk  anorganik terus  meningkat (Nasikah, 2007).
Penggunaan pupuk bersubsidi untuk mencukupi  kebutuhan  nitrogen  setiap  tahunnya mengalami  peningkatan,  yaitu  setiap  tahun  naik sebesar  6,11%.  Kebutuhan  pupuk  urea  bersubsidi tahun  2010  sebesar  Rp.  6.791.811  triliun, meningkat  menjadi  Rp.  9.178.602  triliun  pada tahun  2015  (APPI,  2015).  Peningkatan  tersebut berdampak  meningkatnya  anggaran  subsidi  pupuk setiap  tahunnya,  namun  hasil  panen  yang  didapat tidak  sebanding  dengan  pemupukan  yang  telah diberikan.  Menurut  Saragih et  al .  (2013), pemberian pupuk urea dosis 285 kg urea/ha mampu meningkatkan  bobot  kering  berangkasan,  namun nitrogen  yang  diserap  hanya  7,74  kg  urea/ha. Menurut Danapriatna (2010), sebagian nitrogen dari pupuk  urea  yang  diaplikasikan  hilang  melalui beberapa  mekanisme  termasuk  volatilisasi  amonia, denitrifikasi,  dan  pencucian,  dan  mengakibatkan munculnya  masalah  polusi  terhadap  lingkungan. Upaya  dalam  pengurangan  penggunaan  pupuk anorganik  terus  ditingkatkan,  salah  satunya  adalah pemanfaatan  bakteri  diazotrof  dalam  penggunaan pupuk hayati (Panjaitan et al., 2015).
Bakteri  diazotrof  merupakan  bakteri  yang mampu  menambat  N  udara  (Widyawati et  al .,
2014).  Bakteri  tersebut  juga  mampu  memberikan efek  menguntungkan  bagi  pertumbuhan  tanaman atau  disebut  sebagai Plant  Growth  Promoting
Rhizobacteria (PGPR) melalui kemampuan penghasilan  hormon  tanaman  ( indoleacetic  acid , asam giberelat, sitokinin), pelarutan fosfat anorganik, pengurangan etilen, pengendalian patogen,  produksi  siderofor,  dan  produksi  β-1,3, glukanase  (Tilak et  al., 2010).  Beberapa  contoh
bakteri diazotrof adalah Azotobacter, Azospirillum, dan Rhizobium. Inokulasi Rhizobium pada tanaman padi  dapat  meningkatkan  panjang  akar  total  dan produksi biomassa (Islam et al., 2019; Purwanto et al., 2017).
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  (1) mengisolasi  bakteri diazotrof  dari rizosfer  bawang merah  ( Allium  ascalonicum L.);  (2)  mengetahui kemampuan  isolat  bakteri  diazotrof  dari  rizosfer bawang  merah    dalam  menghasilkan  hormon  IAA dan  menambat  nitrogen  secara  kuantitatif;  dan  (3) mengetahui  identitas  bakteri  diazotrof  dari  rizosfer bawang merah  yang mampu menghasilkan IAA.

## MATERI DAN METODE

## Pengambilan Sampel Rizosfer
Sampel  tanah  rizosfer  berasal  dari  lahan pertanian  bawang  merah  di  Brebes.  Sampel  tanah diambil dari 3  lokasi  berbeda  yaitu desa  Larangan, Dukuhturi,  dan  Karangbale  Kecamatan  Larangan, Kabupaten  Brebes,  Jawa  Tengah.  Tanah  diambil dengan mencabut tanaman bawang merah, kemudian  sampel  tanah  yang  akan  digunakan adalah  tanah  pada  sisa  akar  dan  dimasukan  ke dalam  plastik.  Nilai  pH  dan  kelembaban  tanah diukur  menggunakan soil  tester ,  pengukuran  suhu tanah meggunakan termometer, pengukuran dilakukan secara in situ.
Isolasi  Bakteri  (modifikasi  dari  Oedjijono et  al., 2014)
Sebanyak  10  g  sampel  tanah  dicampurkan dengan  90  mL  akuades  steril,  kemudian  dilakukan pengenceran  bertingkat  dengan  cara  mengambil sebanyak 1 mL  dicampurkan dengan akuades steril 9 mL dan didapatkan pengenceran 10 -2 , selanjutnya dilakukan  pengenceran  bertingkat  sampai  dengan 10 -6 .  Sebanyak  0,1  mL  dari  dua  pengenceran terakhir  diinokulasikan  pada medium  Caceres,
medium  YMA+ congo  red, dan  medium  Asbhy secara spread  plate dan  masing-masing  media
diinkubasi  selama  2-4  x  24  jam  suhu  ruang.  Isolat yang  tumbuh  dan  berbeda  dilakukan  pemurnian, kemudian disimpan dalam medium agar miring.

## Pembuatan Kurva Standar IAA
Larutan  standar  IAA  konsentrasi  0,  2,  4,  6, 8,  dan  10    mg/L  dibuat  dengan  cara  dilarutkan dengan metanol. Sebanyak 0,5 mL larutan IAA dari masing-masing  konsentrasi  tersebut  dicampurkan reagen Salkowski  1,5 mL (150 mL H 2 SO 4 , 250 mL akuades dan 7,5 mL FeCl 3 6 H 2 O) dan diinkubasi di ruang  gelap  selama  30  menit.  Larutan  selanjutnya diukur absorbansinya pada spektrofotometer dengan  panjang  gelombang  530  nm.  Nilai absorbansi  dari  setiap  konsentrasi  dibuat  kurva regresi  untuk  mendapatkan  kurva  standar  dan persamaan IAA.
Uji Kemampuan  Isolat Bakteri  Diazotrof dalam Menghasilkan  IAA  (modifikasi  dari  Reetha et al., 2014)
Uji Produksi IAA dilakukan dengan menumbuhkan  isolat  bakteri  pada  10  mL  medium NB+ L-Triptofan 2%,  diinkubasi  1  x  24  jam.
Larutan  kemudian  disentrifugasi  pada  sentrifuse dengan kecepatan 4.500 rpm (RCFxg 2422) selama 10 menit. Sebanyak 0,5 mL supernatan diambil dan ditambahkan  ke  dalamnya  1,5  mL  reagen Salkowski,  kemudian  diinkubasi  pada  ruang  gelap selama  30  menit.  Larutan  selanjutnya  diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan  panjang  gelombang  530  nm.  Nilai absorbansi  ditiap  sampel  kemudian  dimasukan  ke dalam persamaan IAA, sehingga diperoleh konsentrasi IAA isolat.
Uji  Kemampuan  Bakteri  Diazotrof    dalam Menambat N 2 (Oedjijono et al., 2014)
Kadar N 2 yang mampu ditambat oleh bakteri diazotrof  diukur  dengan  menggunakan  metode Kjeldahl.  Sebanyak  2  isolat  dari  masing-masing genus  ditumbuhkan  dalam  medium  selektif  NfB semipadat  untuk  isolat  LAA4  dan  LAA5,  medium
YMA untuk isolat LAR3 dan LARH5, dan medium Asbhy  untuk  isolat  LAZ2  dan  LAZ3.  Masing- masing  kultur  diinkubasi  selama  10-20  hari  pada suhu ruang. Kultur bakteri yang tumbuh dimasukan ke dalam labu Kjeldahl yang berisi campuran garam (perbandingan  yang  digunakan  40:  2,5:  1,5  dari K 2 SO 4 ,  CuSO 4 dan  logam  selenium),  kemudian  3 mL  asam  sulfat  pekat  ditambahkan  ke  dalam  labu Kjeldahl.  Labu  kemudian  dipanaskan  di  lemari asam  pada Digester pada  suhu  420 o C  selama  20 menit.  Setelah  melalui  proses  tersebut,  labu kemudian didinginkan dengan ditambahkan akuades  mencapai  volume  akhir  50  mL.  Sebanyak 20  mL  sampel  digesti  dituangkan  ke  dalam  tabung destilasi  kemudian  dimasukkan  pada  alat  destilasi.
Labu Erlenmeyer 250  mL  yang  berisi 20  mL asam borat  4%  dan  6  tetes Conway  reagen (1000mg methyl red , 150 mg bromcresol green , 200ml etanol 96%)  ditempatkan  di  bawah  kondensor  peralatan distilasi  dan  ujung  outlet  kondensor  berada  di bawah larutan. Distilasi dilakukan dengan menggunakan unit distilasi Semiotomatis, kemudian  sebanyak  30  mL    NaOH  40%  dan  100 mL  akuades  secara  otomatis  dituangkan  melalui peralatan pada destilator. Larutan yang mengandung  NH 3 ,  asam  borat  dan  indikator campuran pada Erlenmeyer 250mL dititrasi dengan 0,05  N  HCl  menggunakan  Autotitrator.  Jumlah konsentrasi N 2 pada sampel  dapat dihitung  melalui persamaan:
N total (ppm) = a – bx Nx 14 x 1000000 c (g) x 1000
Keterangan: a : Sampel Titer b : Titer Blanko c : Berat Sampel N : Normalitas HCl

## Pengamatan Makromorfologi Koloni Bakteri
Karakter  makromorfologi  yang  diamati antara  lain  bentuk  koloni,  ukuran  koloni,  tepi
koloni, warna koloni, elevasi dan permukaan koloni pada medium selektif.
Pengamatan Mikromorfologi
Bakteri
(modifikasi Ramadhaniah, 2013) Pengamatan mikromorfologi dilakukan dengan pewarnaan Gram. Sebanyak satu ose kultur diulas  di object  glass .  Inokulum    difiksasi  dengan melewatkan  sampel  yang  berada  di object  glass di atas api. Pewarna karbol Crystal violet diteteskan di atas glass dan  didiamkan  selama  ±  1  menit kemudian  dicuci  dengan  akuades  mengalir  dan dikeringkan. Lugol's iodine kemudian diteteskan  di atas object glass dan didiamkan selama 40-60 detik, cuci  dengan  akuades  dan  keringkan.  Larutan alkohol 96% diteteskan pada object  glass selama  1 menit,  kemudian  dicuci  dengan  akuades  megalir dan  dikeringanginkan.  Larutan  safranin  diteteskan di  atas object  glass dan  didiamkan  selama  ±  45 detik  kemudian  dicuci  dengan  akuades  mengalir dan  dikeringanginkan.  Hasil  pewarnaan  Gram diamati  pada  mikroskop.  Sel  bakteri  Gram  positif akan  terwarnai  menjadi  ungu,  sedangkan  Gram negatif  terwarnai  menjadi  merah.  Pengamatan karakter  Gram  dan  bentuk  sel  bakteri  diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 10x100.

## Uji Motilitas (modifikasi Sirois 2014, 2008)
Disiapkan  tusuk  steril  dan  medium  SIM  A, kemudian  ambil  sebanyak  satu  ose  koloni  tunggal dengan tusuk steril secara aseptis dan diinokulasikan  ke  dalam  medium  SIM  A  secara tegak  lurus,  kemudian  diinkubasi  selama  24  jam pada suhu ruang.
Uji  Pengaruh  Suhu  (modifikasi  Adiguzel et  al. , 2011)
Pengujian  pengaruh  suhu  dilakukan  dengan cara koloni  pada  media  miring diambil  sebanyak  1 ose,  kemudian  diinokulasikan  pada  medium  NB. Kultur  bakteri  diinkubasi  pada  suhu  ruang,    37 o C, dan  50 o C.  Inkubasi  dilakukan  selama  1  x  24  jam.
Hasil  diinterpretasikan  positif  apabila  medium
menjadi  keruh  dan  negatif  apabila  tidak  ada perubahan pada medium (tetap bening).
Uji  Pengaruh  pH  (modifikasi  Adiguzel et  al. , 2011)
Pengujian  pH  dilakukan  dengan  cara mengambil sebanyak 1 ose isolat pada medium NA miring,  kemudian  dinokulasikan  ke  dalam  medium NB dengan pH 4, 7 dan 9. Kultur bakteri kemudian diinkubasi selama 1 x 24 jam. Hasil diinterpretasikan  positif  apabila  medium  menjadi keruh dan negatif apabila tidak ada perubahan pada medium (tetap bening).
Uji Salinitas (modifikasi Adiguzel et al. , 2011)
Pengujian  salinitas  dilakukan  dengan  cara mengambil sebanyak 1 ose isolat pada medium NA miring,  kemudian  dinokulasikan  ke  dalam  medium NB  dengan  penambahan  NaCl  3%,  5%  dan  7%. Kultur  bakteri diinkubasi selama 1  x 24  jam. Hasil diinterpretasikan  positif  apabila  medium  menjadi keruh dan negatif apabila tidak ada perubahan pada medium (tetap bening).

## Uji Oksidase (modifikasi Ramadhaniah, 2013)
Koloni pada  medium  miring diulaskan pada kertas  saring  diatas object  glass .  Isolat  bakteri ditetesi  reaegen tetramethyl-p–phenylenediamine- dihydricloride . Hasil diinterpretasikan positif apabila  di  bawah  koloni  berwarna  biru  kehitaman dan  interpretasi  negatif  apabila  tidak  berubah warna.

## Uji Katalase (Brown, 2007)
Koloni  pada  media  miring  diulaskan  pada object glass , kemudian isolat bakteri ditetesi reagen H 2 O 2 . Interpretasi positif apabila terbentuk gelembung gas dan interpretasi negatif apabila tidak terbentuk gelembung gas.
Uji  Produksi  Asam  Dari  Karbohidrat  (Lay, 1994)
Koloni pada media miring diambil sebanyak 1  ose.  Selanjutnya,isolat  bakteri  diinokulasikan pada  medium  basal  dengan  ditambahkan  gula dengan  konsentrasi  5%  yang  diberi  reagen phenol
red dengan sumber  gula dari glukosa, laktosa, dan sukrosa.  Kultur  bakteri  masing-masing  diinkubasi selama  1  x  24  jam  pada  suhu  ruang.  Hasil diinterpretasikan  positif  apabila  medium  menjadi kuning  dan  negatif  apabila  tidak  ada  perubahan pada medium.

## Uji Oksidatif Fermentatif (OF) (Lay 1994)
Isolat  diambil  dengan  tusuk  steril  dari medium agar miring, kemudian isolat diinokulasikan  secara  aseptis  pada  medium  OF dengan stab inoculation . Sebagian dari medium OF yang  sudah  inokulasikan  isolat  bakteri  ditetesi dengan  paraffin.  Semua  kultur    bakteri  diinkubasi selama  2  x  24  jam  pada  suhu  ruang.  Setelah diinkubasi isolat diamati apabila bakteri fermentatif maka  medium  yang  sudah  diberi  parafin  akan berubah  menjadi  warna  kuning.  Apabila  bakteri termasuk dalam sifat oksidatif, maka medium yang tidak  ditutup  parafin  akan  menjadi  warna  kuning. Apabila bakteri bersifat oksidatif fermentatif baik di medium  yang  ditutup  oleh  parafin  dan  yang  tidak akan berubah menjadi warna kuning.
Uji  Penggunaan  Karbohidrat  Sebagai  Satu- satunya  Sumber  Karbon  untuk  Pertumbuha Bakteri Diazotrof (Lay, 1994)
Koloni pada media miring diambil sebanyak 1  ose,  kemudian  isolat  bakteri  diinokulasikan  pada medium  basal  dengan  ditambahkan  gula  dengan konsentrasi  5%  dengan  sumber  gula  dari  glukosa, laktosa,  maltosa  dan  sukrosa.  Kultur  bakteri diinkubasi  selama  1  x  24  jam  pada  suhu  ruang. Hasil  positif  apabila  media  menjadi  keruh  dan negatif apabila tidak ada perubahan pada media.

## Analisis Data
Data  dianalisis secara  deskriptif.  Uji kemampuan  bakteri  diazotrof  dalam  menghasilkan
IAA dengan metode Salkowski dan uji kemampuan bakteri diazotrof dalam menambat N 2 menggunakan metode  Kjeldahl  disajikan  dalam  bentuk  tabel. Penentuan  identitas  bakteri  dilakukan  dengan mengidentifikasi  hasil  pengamatan  morfologi, fisiologi,  dan  biokimiawi  berdasarkan Bergeys Manual  of  Determinative  Bacteriology  Second Edition .

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Bakteri Diazotrof
Hasil  pengukuran  nilai  pH  tanah  pada rizosfer tanaman bawang merah ( Allium ascalonicum L) di kecamatan Larangan, Kabupaten Brebes pada 3 lokasi pengambilan sampel, berkisar antar  6-6,1(Tabel  1.).  Menurut  Firmansyah et  al.
(2015),  tanah  pertanian  bawang  merah  di  Brebes memiliki pH mulai dari asam sampai dengan alkalis (pH 5,6-8,5). Suhu tanah pada ketiga lokasi sampel 32,5-34,2 o C, dengan kelembaban tanah pada ketiga lokasi  sampel  dalam  rentang  54%-64%  (Tabel  1.). Jenis  tanah  lahan  pertanian  bawang  merah  Brebes merupakan  tanah  jenis  Alluvial  (Entilisol)  dan berstekstur liat (Sumarni et al., 2012). Reaksi tanah (pH), kelembaban, suhu, aerasi, drainase yang baik, kandungan  bahan  organik,  serta  kondisi  perakaran tumbuhan menentukan sebaran bakteri penambat N 2
(Agustian et al., 2012). Bakteri penambat nitrogen dapat  tumbuh  dalam  rentang  pH  4,5-8,5,  dan kelembaban  tanah  antara  50%-65%  (Holt et  al. , 1994).  Menurut  Simanungkalit et  al .  (2006),  suhu tanah  yang  baik  untuk  pertumbuhan  bakteri diazotrof dalam rentang 25-35 o C. Kondisi lingkungan  tempat  pengambilan  sampel  tanah cenderung baik untuk pertumbuhan bakteri diazotrof.
Tabel 1. Hasil Pengukuran Suhu, pH dan Kelembaban Tanah Rizosfer Bawang Merah
Lokasi Suhu ( o C) pH Kelembaban(%) Dukuhturi 32,8 6,0 64 Larangan 32,5 6,0 63 Karanggale 34,2 6,1 54
Isolasi  bakteri  diazotrof  dilakukan  dengan menumbuhkan  sampel  tanah  rizosfer  tanaman bawang  merah  ( Allium  ascalonicum L.)  pada medium  bebas  nitrogen,  yaitu  YMA+ congo  red untuk  menumbuhkan  bakteri  Rhizobium  (Rao, 1994),  medium  Caceres  untuk  menumbuhkan bakteri  Azospirillum  (Caceres,  1982),  dan  medium Asbhy  untuk  menumbuhkan  bakteri  Azotobacter (Rao,  1994).  Ketiga  genera  tersebut  merupakan kelompok jenis bakteri diazotrof . Hasil isolasi dari ketiga  lokasi  sampling  didapatkan  sebanyak    28 isolat  (Tabel  2.),  yang  diberi  kode  sesuai  lokasi sampling  dan  media  perumbuhan.  Sebanyak  14 isolat  yang  diperoleh  dari  medium  YMA  diberi kode  isolat  LAR1,  LAR2,  LAR3,  LAR4,  LAR5, LAR6  LBR1,  LBR2,  LBR3,  LBR4,  LCR1,  LCR2, LCR3,  dan  LCR4.  Isolat  yang  tumbuh  pada medium  YMA+ congo  red memiliki  karakteristik warna  koloni  putih  susu  atau  merah  muda,  tidak
transparan,  bentuk  koloni  sirkuler,  konveks,  semi translusen,  koloni  bakteri  lembek  atau  berlendir pada  agar  diduga  merupakan  bakteri  dari  genus Rhizobium (Surtiningsih et  al ., 2009). Hasil  isolasi dari  medium  Caceres  didapatkan  sebanyak  9  isolat dengan  kode  isolat  LAA1,  LAA2,  LAA3,  LAA4, LAA5,  LBA1,  LBA2,  LBA3,  dan  LCA1.  Isolat yang  didapatkan  pada  medium  Caceres  dengan karakteristik  koloni  berwarna  merah,  berbentuk bulat,  tepi  halus,  dan  elevasi  rata  mencirikan spesies  anggota  genus  Azospirillum  (Caceres, 1982).  Sebanyak  5  isolat  didapatkan  pada  medium Asbhy dan kode isolat LAZ1, LAZ2, LAZ3, LBZ1, dan  LCZ1.    Isolat  yang  diperoleh  pada  medium Asbhy  memiliki  karakter  koloni  berwarna  bening atau putih, dengan bentuk circular, irregular; elevasi convex,  effuse;  bentuk  tepi    undulate,  crenate mencirikan  spesies  anggota  genus  Azotobcter (Yulitaasary et al ., 2017) (Tabel 2.).

## Tabel 2. Lokasi Sampel dan Bakteri Dizotrof Hasil Isolasi
Lokasi Pengambilan Sampel Medium Kode Isolat
Genus Dukuhturi
Yeast Manitol Agar
LAR1 LAR2 LAR3 LAR4
LAR5
LAR6
Rhizobium Larangan LBR1 LBR2 LBR3 LBR4 Karanggale LCR1 LCR2 LCR3 LCR4 Dukuhturi Caceres LAA1 LAA2 LAA3 LAA4 LAA5 Azospirillum
Larangan LBA1 LBA2 LBA3 Karanggale LCA1 Dukuhturi Asbhy LAZ1 LAZ2 LAZ3 Azotobacter Larangan LBZ1 Karanggale LCZ1 Tabel 3. Kemampuan IAA Isolat Bakteri Diazotrof dalam Menghasilkan IAA No. Kode Isolat Konsentrasi IAA (ppm) 1. LCR3 3,22 2. LAR5 3,34 3. LBR1 3,21 4. LAZ2 3,05 5. LAZ3 3,05 6. LCA1 3,16 7. LAR3 3,51 8. LAA5 3,21 9. LAA4 3,35

## Pengujian Kemampuan Bakteri Diazotrof dalam menghasilkan IAA
Sebanyak  28  isolat  bakteri  diazotrof    hasil isolasi  diuji  kemampuannya  dalam  menghasilkan IAA. Hasil pengukuran produksi IAA menunjukkan sebanyak  9  isolat  mampu  menghasilkan  hormon IAA berkisar antara 3,05-3,51 ppm (Tabel 3.).
Hasil  penelitian  menunjukkan  konsentrasi IAA  tertinggi  dihasilkan  oleh  isolat  LAR3  sebesar 3,51  ppm.  Isolat  LAR3  dapat  menghasilkan  IAA dengan konsentrasi  yang  lebih tinggi dibandingkan dengan  isolat  bakteri  diazotrof  yang  diisolasi  dari rizosfer  tanaman  kelapa  sawit  yaitu  0,097  ppm (Walida et  al .,  2019).  Isolat  bakteri  Rhizobium yang diisolasi dari tanah perkebunan karet, mampu menghasilkan IAA dengan konsentrasi sebesar 2,86 ppm,  isolat  Azospirillum  sebesar  0,0429  ppm,  dan isolat  Azotobacter  sebesar  0,0517  ppm  (Widawati, 2015).  Konsentrasi  IAA  yang  dihasilkan  oleh kesembilan  isolat  bakteri  diazotrof  dari  rizosfer tanaman  bawang  merah  lebih  tinggi  dibandingkan dengan yang dilaporkan oleh Widawati (2015).
Kemampuan Bakteri Diazotrof dalam Menambat N 2 Pengukuran  kemampuan  fiksasi  N 2 isolat bakteri  diazotrof  didasarkan  pada  N-  total  menurut
metode  Kjeldahl.  Dua  isolat  terbaik  dari  masing- masing  anggota  genus  bakteri  diazotrof  dipilih untuk  pengujian  kemampuan  penambatan  N 2 . Menurut  Wiyantoko et  al. (2017),  penentuan kemampuan  penambatan  N 2 menggunakan  metode Kjeldahl  dihitung  berdasarkan  N  total  yang  terdiri atas  nitrat  (NO 3- )  amonium  (NH 4+ )  dan  NH 3 . Prinsip metode ini adalah sampel padat  dihidrolisis dengan  asam  sulfat  membentuk  senyawa  amonium sulfat.  Senyawa  nitrat  dengan  asam  salisilat membentuk  nitrosalisilat,  kemudian  akan  direduksi dengan  natrium  tiosulfat  dan  akan  terbentuk senyawa  amonium.  Produk  hasil  destruksi  berupa senyawa amonium yang kemudian didestilasi dalam suasana  alkali  dan  ditampung  dengan  asam  borat. Hasil  destilasi  yang  dihasilkan  berwarna  hijau  dan selanjutnya  hasil  destilasi  dititrasi  sampai  berubah warna  merah  muda.  Banyaknya  N  yang  diperoleh berdasarkan nilai titrasi dengan HCl sebagai titer.
Hasil  pengukuran  N  total  bakteri  isolat diazotrof dari rizosfer tanah bawang merah (LAA4, LAA5, LAZ2, LAZ3, LAR3, LAR5) berkisar antar 3,50-88,55  ppm.  Kemampuan  penambatan  N 2
Rhizobium  lebih  tinggi  daripada  Azotobacter  dan
Azospirillum (Tabel 4.). Isolat LARH5
menghasilkan  nitrogen  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  hasil  penelitian  Ummah et  al. (2019) terhadap bakteri yang diisolasi dari tanah pertanian tanaman  bawang  merah  yaitu  sebesar  4,55  ppm dengan  waktu  inkubasi  selama  2  hari.  Menurut Raffi  &  Charyulu  (2012),  berdasarkan  hasil penelitiannya pada Azospirillum spp. yang diisolasi dari  rizosfer  dan  non  rizosfer  tanah  serealia, menghasilkan nitrogen dengan rentang 2,95 sampai 12,4  ppm  dengan  waktu  inkubasi  selama  45  hari.
Menurut  Allito et  al .  (2020)  isolat  bakteri Rhizobium  yang  diisolasi  dari  tanaman  legum mampu  menambat  N 2 sebesar  85,5-87,5  ppm. Menurut  penelitian  yang  dilakukan  Ricard et  al . (2018),  isolat  bakteri  kelompok  genus  Azotobacter yang  berasal  dari  rizosfer  tanaman  jagung  mampu menambat N 2 sebesar 3 ppm.  Kemampuan keenam isolat  dalam  memfiksasi  N 2 lebih  tinggi  dari  yang dilaporkan  Raffi  &  Charyulu  (2012),  Ricard et  al.
(2018); Allito et al. (2020).
Tabel 4.  Kemampuan Bakteri Diazotrof dalam Menambat N 2 No. Kode Isolat Konsentrasi N total (ppm) 1. LAA4 3,50 2. LAA5 6,65 3. LAZ2 14,00 4. LAZ3 7,00 5. LAR3 87,15 6. LAR5 88,55 Kelompok bakteri diazotrof mampu
menstimulasi  pertumbuhan  tanaman  karena  bakteri yang  dikonsorsiumkan mempunyai hubungan sinergis  yang  baik  dalam  penambatan  N  dan pelarutan  P,  sehingga  mampu  meningkatkan ketersediaan  hara  atau  memproduksi  fitohormon pemacu  tumbuh  tanaman  yang  meningkatkan pertumbuhan serta produktivitas tanaman (Halmedan et  al .,  2017).  Fiksasi  nitrogen  oleh bakteri  yang  mampu  menambat  N 2 ,  yaitu  bakteri yang  hidup  bebas  atau  bersimbiosis  pada  tanaman legum.  Fiksasi  Nitrogen  melibatkan  ATP  dan proses    reduksi    ekivalen  yang  berasal  dari metabolisme  primer.  Semua  reaksi  yang  terjadi dikatalisis oleh nitrogenase. Nitrogenase merupakan  enzim  kompleks  yang    terlibat    dalam proses    fiksasi    nitrogen.  Nitrogenase    berperan dalam  pengubahan bentuk nitrogen bebas di udara menjadi  amonia  (NH 3 )  (Susilowati  &  Setyowati, 2016). Purwanto et al . (2017)  menyebutkan bahwa inokulasi bakteri diazotrof pada tanaman padi dapat meningkatkan  panjang  akar  total  dan  produksi biomassa.  Bakteri  diazotrof  yang  berasal  dari rizosfer  tanaman  padi  yang  dilaporkan  memiliki aktivitas nitrogenase dalam rentang 0,04-0,07 µM.

## Identifikasi Bakteri Diazotrof
Hasil  pengamatan  isolat  bakteri  diazotrof asal  rizosfer  tanah  bawang  merah  (LAA4, LAA5,LCA1)  yang  ditumbuhkan  pada  medium Caceres  yaitu  sebagian  besar  koloni  berwarna merah.  Medium  Caceres  merupakan  medium selektif  bagi  Azospirillum  yang  ditandai  dengan koloni  berwarna  merah.  Koloni  bakteri  yang tumbuh  pada  medium  Caceres  juga  memiliki bentuk bulat ( circuler ) dan tidak teratur ( irregular ), elevasi    rata  ( flat )  dan  timbul  ( raised ),  serta memiliki  tepi  ( margin ) entire (Tabel  5.).  Koloni bakteri  Azospirillum berbentuk  bulat,  tepi  halus, dan  memiliki  elevasi  rata  (Caceres,  1982). Beberapa  strain  memiliki  elevasi  datar  dan  timbul (Pangestika et al ., 2017).
Hasil pengamatan
mikromorfologi berbentuk  batang,  sifat  Gram  negatif,  motil  dan non motil  (Tabel  5.).  Menurut  Hot et  al. (1994);
Cowan et  al .  (1993),  bakteri  dari  anggota  genus Azospirillum sel berbentuk vibroid atau batang, sel bersifat Gram negatif. Spesies anggota
Azospirillum  memiliki flagella sehingga    motil,
namun  dalam  kondisi  yang  tidak  memungkinkan dapat  bersifat  non  motil.  Oedjijono et  al .  (2014),
juga  menyebutkan  bahwa  Azospirillum  merupakan bakteri  yang  hidup  bebas  di  perakaran  dan  mampu memfiksasi  nitrogen.  Sel-selnya  berbentuk  batang dan  vibroid,  Gram  negatif,  motil,  membentuk pelikel pada semisolid NfB.
Uji  fisiologi  yang  dilakukan  pada  bakteri diazotrof  yang  diperoleh  dari  medium  Caceres meliputi    uji  pengaruh  suhu,  uji  pengaruh  pH,  dan uji  ketahanan  terhadap  salinitas.  Hasil  pengamatan pada  pengaruh  suhu  terhadap  pertumbuhan  bakteri menunjukkan    bahwa  bakteri  mampu  tumbuh  pada suhu  ruang  dan  37 0 C,  sedangkan  pada  suhu  50 o C tidak  mampu  tumbuh.  Ketiga  isolat  tersebut  hanya mampu  tumbuh  pada  pH  4  dan  7.  Pengujian perlakuan  pada  medium  yang  diberi  salinitas berbeda,  menunjukkan  bahwa  semua  isoat  bakteri mampu tumbuh pada konsentrasi NaCl 3%, namun isolat  LAA4  dan  LAA5  mampu  tumbuh  pada medium  dengan  konsentrasi  NaCl  5%(Tabel  5.). Menurut  Rasool et  al .  (2015),  Azospirillum memiliki  pertumbuhan  optimum  pada  suhu  30 o C dengan  kisaran  pH  6-7.  Santoso et  al .  (2019),
menyebutkan
bahwa suhu pertumbuhan Azospirillum  yaitu  27-29 o C,  dengan  pH  6,9-7,  dan konsentrasi NaCl sebesar 3%.
Pengujian  biokimia  terhadap  isolat  yang didapatkan  dari  medium  Caceres  meliputi  uji oksidase,  uji  katalase,  uji  produksi  asam  dari karbohidrat, uji oksidatif-fermentatif. Hasil pengamatan  menunjukkan  ketiga  isolat  positif oksidase.  Isolat  LAA4  dan  LCA1  bersifat fermentatif,  dan  hanya  isolat  LAA5  yang  bersifat oksidatif-fermentatif. Ketiga isolat mampu mengubah  asam  pada  medium  yang  mengandung glukosa. Isolat LAA4 dan LCA1 mampu
menghasilkan asam pada medium yang mengandung sukrosa, dan hanya isolat LAA4 yang mampu  menghasilkan  asam  dari  medium  dengan penambahan  laktosa.  Pengamatan  uji  katalase menunjukkan ketiga isolat negatif untuk uji katalase (Tabel  5.).  Kelompok  bakteri  Azospiriillum
memiliki kemampuan menghasilkan enzim katalase ditandai  dengan  positif  pada  uji  katalase,  namun beberapa isolat negatif pada uji katalase, sedangkan beberapa  isolat  mampu  menghasilkan  enzim oksidase  dan  beberapa  negatif  pada  saat  uji oksidase (Pangestika, et al .,  2017.  Menurut Hot et al. (1994)  Azospirillum  mampu  mengubah  asam pada  medium  yang  mengandung  maltosa,  laktosa, D-mannosa, Sitrat, laktat, D-sorbitol, D-ribose.
Berdasarkan  pengamatan  uji  gula  sebagai sumber  karbon  satu-satunya  menunjukkan  ketiga isolat  (LAA4,  LAA5,  dan  LCA1)  mampu  tumbuh pada  medium  yang  mengandung  glukosa  sebagai sumber  karbon.  Isolat  LAA4  dan  LCA1  mampu tumbuh pada  medium  basal dengan sumber karbon sukrosa dan maltosa. Isolat LAA5 dan LCA1 dapat tumbuh pada  medium  basal dengan sumber karbon dari  laktosa  (Tabel  5.).  Azospirillum agricola sp. nov.  dapat  menggunakan  sumber  karbon  yang berasal  dari  gula  seperti  arabinosa,  fruktosa, galaktosa, asam piruvat, asam suksinat, asam asetat, asam sitrat, dan glukosa 6-fosfat (Lin et al ., 2016).
Beberapa  isolat  mampu  menggunakan  glukosa, laktosa,  dan  sukrosa  sebagai  sumber  karbon, sebagian  ada  yang  hanya  dapat  menggunakan glukosa  sebagai  sumber  karbon.  Menurut  Trivendi et.  al .  (2010),  penggunaan  jenis  gula  sebagai sumber  karbon  dipengaruhi  oleh    aktivitas enzimatis    di    dalam    sel.    Mikroorganisme  tidak semua  dapat  menggunakan  semua  jenis  gula sebagai  sumber  karbon,  karena  keterbatasan aktivitas  enzim.  Keterbatasan  dalam  menggunakan jenis  gula  tertentu  sebagai  sumber  karbon  dapat digunakan  sebagai  kunci  melakukan  identifikasi terhadap  jenis  tertentu
Hasil  pengamatan  bakteri  diazotrof  asal rizosfer  tanah  pertanian  bawang  merah  (LAZ2  dan LAZ3) asal rizosfer tanah pertanian  bawang  merah yang didapatkan dari  medium  Asbhy  menunjukkan koloni  berwarna  putih  bening.  Koloni  bakteri Azotobacter  sebagian  koloni  berwarna  bening,
berbentuk bulat ( circuler ), memiliki elevasi convex dan  datar  ( flat ),  tepi  ( margin )  rata  ( entire )  dan berukuran kecil serta punctiform . Kelompok bakteri Azotobacter  memiliki  koloni  yang  berwarna  putih atau  bening  saat  ditumbuhkan  di  media  Asbhy (Islam et  al .,  2019).  Hal  yang  sama  dijelaskan bahwa  koloni    Azotobacter  dapat  berwarna  putih, bening,  keruh,  dan  coklat  (Wedastri, et  al. 2002).
Menurut  hasil  penelitian  Santoso et  al .  (2019),
menunjukkan karakter morfologis koloni Azotobacter  berbentuk  bulat,  tepian  tidak  rata, elevasi konveks.
Hasil  pengamatan  morfologi  sel  memiliki bentuk  bulat  ( coccus )  dan  Gram  negatif,  dan bersifat motil (Tabel 5.). Menurut Holt et al . (1994) dan  Cowan et  al .  (1993),  anggota  genus Azotobacter  memiliki  sel  berbentuk  ovoid,  batang maupun  kokus,  bakteri  bersifat  Gram  negatif. Kelompok  bakteri    Azotobacter  bersifat  motil karena  memiliki  flagella,  namun  pada  beberapa jenis  lain  tidak  memiliki  flagella  sehingga nonmotil.  Hal  yang  sama  juga  dilaporkan  oleh Rahmi  (2014),  Azotobacter    merupakan  bakteri yang  bersifat  motil  yang  bergerak  menggunakan flagel,  dengan    kecepatan    pergerakan    yang berbeda-beda.
Hasil  pengamatan  pada  uji  fisiologi  pada bakteri  diazotrof  yang  diperoleh  dari  medium Asbhy  (LAZ2  dan  LAZ3).  Kedua  isolat  bakteri dapat  tumbuh  pada  suhu  ruang  dan  suhu  37 o C, positif  pada  pH  medium  4  dan  7,  dan  mampu tumbuh pada medium dengan konsentrasi NaCl 3% (Tabel  5.).  Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan Packialakshmi  &  Aliya  (2014),  bakteri  genus Azotobacter  mampu  tumbuh  pada  suhu  28 o C  dan 30 o C,  dan  dapat  tumbuh  dengan  baik  pada  pH  7,5 dan  7,45.  Menurut  penelitian  yang  dilakukan Agustian et  al .  (2012),  genus  Azotobacter  tumbuh optimum pada pH 7, namun pada pH 4 masih dapat tumbuh.  Kelompok  anggota  Azotobacter  mampu tumbuh  pada  NaCL  3%,  sehingga  bakteri  ini
mampu  hidup  dikondisi  salin.  Holt et  al. (1994) dalam  Bergey’s  Manual  of    Determinative Bacteriology menyebutkan  bahwa , anggota Azotobacter dapat tumbuh pada rentang pH 4,8-8,5, dan  memiliki  pH  optimum  untuk  fiksasi  nitrogen antara 7,0-7,5.
Hasil pengamatan biokimia pada isolat yang didapat dari medium Asbhy, Kedua positif pada uji katalase,  isolat  mampu  memproduksi  asam  dari sumber  glukosa,  dan  bersifat  fermentatif.  Uji nutrisional  yang  dilakukan  menunjukkan  bakteri mampu  menggunakan  glukosa  sebagai  sumber karbon  satu-satunya  (Tabel  5.).  Menurut  Agisti et al. (2014),  karakter  kunci  dari  genus  Azotobacter adalah  sel  berbentuk  cocoid,  oksidase  negatif, katalase  positif  dan  membentuk  kista  yang merupakan  mekanisme  melindungi  dari  keadaan lingkungan  yang  ekstrim.  Holt et  al .  (1994) dalam Bergey’s  Manual  of    Determinative  Bacteriology menyebutkan , Azotobacter  mampu  menggunakan glukosa  sebagai  sumber  karbon  satu-satunya,  serta mampu  memfermentasikan  glukosa,  sukrosa  dan latosa.
Hasil  pengamatan  morfologi  isolat  bakteri diazotrof  asal  rizosfer  tanah  pertanian  Bawang merah di Brebes (LAR3, LAR5, LBR1, dan LCR3) yang  diperoleh  dari  medium  YMA  + congo  red menunjukkan  isolat  bakteri  memiliki  koloni berwarna  merah  muda  dan  putih,  memiliki  bentuk Circuler dan irregular ,  berbentuk  kecil  dan  ada yang  besar,  elevasi raised,  convex,  flat dan umbonate ,  serta  memiliki  tepi entire dan raised
(Tabel  5.).  Menurut  Sari et  al .  (2018),  isolat Rhizobium yang  ditumbuhkan  di  medium  YMA+ congo  red memiliki  warna  pink,  atau  putih  karena bakteri  Rhizobium  tidak  dapat  menyerap  warna merah.  Surtiningsih et    al .    (2009),    menjelaskan karakteristik
bakteri Rhizobium secara
makroskopis    adalah    warna  koloni    putih    susu, tidak  transparan,  bentuk  koloni  sirkuler,  konveks, semitranslusen, diameter 2  -  4  mm  dalam  waktu
3  -  5  hari  pada  agar  YMA+ congo red .  Hal ini sesuai  dengan  penjelasan  Holt et  al .  (1994) dalam Bergey’s  Manual  of    Determinative  Bacteriology , kelompok  Rhizobium  koloni  berbentuk circular, convex , putih, semi translucent atau opaque , raised .
Hasil  pengamatan  mikromorfologi  bakteri diazotrof  yang  didapat  pada  medium  YMA+ congo red bersifat  Gram  negatif,  berbentuk  batang,  dan motil  (Tabel  5.).  Karakter  mikroskopis  sel  bakteri Rhizobium    berbentuk  batang,  aerobik,  Gram negatif  dengan  ukuran  0,5    -    0,9  x  1,2    -    3  µm, bersifat  motil    pada    media    cair,    umumnya memiliki    satu    flagella    polar    atau  subpolar (Surtiningsih et  al .,  2009).  Menurut  Holt et  al .
(1994) dalam  Bergey’s  Manual  of    Determinative Bacteriology ,  aggota  genus  Rhizobium berbentuk batang,  motil  dengan  flagella.  Menurut  Dutta  & Podile  (2010),  sifat  motil  penting  bagi  bakteri PGPR dikarenakan motilitas bakteri berperan dalam kolonisasi akar.
Hasil  pengamatan  uji  fisiologi  pada  isolat bateri  yang  diperoleh  dari  medium  YMA+ congo red dapat  tumbuh  suhu  ruang  dan  37 o C,  medium dengan  pH  4  dna  7,  dan  mampu  tumbuh  pada medium  dengan  NaCl  3%  dan  5%  (Tabel  5.). Menurut  Holt et  al. (1994),  Kelompok  bakteri Rhizobium  memiliki  suhu  optimum  dalam  rentang 4 o C-40 o C,  namun  optimum  pada  kisaran  30 o C.
Genus Rhizobium mampu tumbuh pada rentang pH 4-10.  Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan  Nasikah (2007),  bahwa    suhu  optimal    untuk    Rhizobium berkisar    18°C    -    26°C,    minimal    3°C    dan maksimal  45°C.  Sedangkan  kisaran  pH  optimal untuk  Rhizobium adalah  sedikit  di  bawah  netral hingga  agak  alkali,  kendati  demikian pada pH 5,0 beberapa  strain    Rhizobium  masih  dapat  bertahan hidup.
Hasil  pengamatan  uji  biokimia  pada  isolat yang  didapat  di  medium  YMA+c ongo  red menunjukkan  positif  pada  katalase,  keempat  isolat mampu  memproduksi  asam  dari  sumber  karbon
glukosa.  Isolat  bakteri  diazotrof  LAR3,  LAR5, LCR3  mampu  mereduksi  asam  dari  sumber  gula jenis sukrosa. LAR3 dan LAR5 mampu memproduksi  asam  dari  laktosa.  Hasil  uji fermentatif  dan  oksidatif,  menunjukkan  isolat LAR5,  LBR1,  dan  LCR3  bersifat  oksidatif- fermentatif.  Isolat  LAR3  bersifat  fermentatif. Pengamatan  uji  oksidase  menunjukkan  keempat isolat  negatif  (Tabel  5.).  Enzim  katalase  berfungsi untuk  menguraikan  hidrogen  peroksida  yang bersifat  racun  bagi  sel  dan  menghasilkan  gas oksigen  dana  air  sesuai  reaksi  (Pelczar  &  Chan 2008).
Hasil  uji  nutrisional  yg  diamati  yaitu  uji karbohidrat  sebagai  sumber  satu-satunya    karbon. Isolat  bakteri  diazotrof  LAR3  dan  LCR3  mampu menjadikan  glukosa,  laktosa,  sukrosa,  dan  maltosa sebagai  sumber  karbon  satu-satunya.  Isolat  bakteri diazotrof  LBR1  mampu  menjadikan  laktosa, sukrosa,  dan  maltosa  sebagai  sumber  karbon  satu- satunya,  LAR3  hanya  mampu  menjadikan  glukosa sebagai  sumber  karbon  satu-satunya.    (Tabel  5.). Menurut  de  Lajudie et  al. (1994) dalam  Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology ,
Rhizobium menggunakan glukosa, laktosa, sukrosa, maltosa, malonat, argunin, glukonat sebagai sumber karbon.  Sari  &  Retno  (2015),  menjelaskan Rhizobium    bersifat    kemoorganotropik,    yaitu dapat  menggunakan    berbagai    karbohidrat    dan garam-garam    asam    organik  sebagai    sumber karbonnya.
Berdasarkan  hasil  pengamatan  terhadap karakter  morfologi, fisiologi, biokimia,  dan nutrisional serta mengacu kepada Bergey’s Manual of  Determinative Bacteriology bahwa isolat LAA4,
LA5,  LCA1  termasuk  spesies  anggota  genus Azospirillum,  kemudian  isolat  LAZ2  dan  LAZ3 termasuk  spesies  anggota  genus  Azotobacter,  dan isolat  LAR3,  LAR5,  LBR1,  LCR3  merupakan spesies anggota genus Rhizobium.

## Tabel 5. Hasil Karakterisasi Isolat Bakteri Diazotrof
Karakter Isolat LAA4 LAA5 LCA1 LAZ2 LAZ3 LAR5 LAR3 LBR1 LCR3 Morfologi   Koloni Ukuran koloni Small Moderate Moderate Small Punctiform Small Small Small Large Bentuk koloni Circuler Circuler Irregular Circuler Circuler Circuler Circular Irregularr Irregular Elevasi koloni Flat Raised Flat Convex Flat Raised Convex Flat Umbonate Margin koloni Entire Entire Entire Entire Entire Entire Entire Entire Raised Warna koloni Merah Merah Merah Putih Putih Pink Pink Pink Pink Permukaan koloni Mengkilap  Mengkilap  Mengkilap  Mengkilap  Mengkilap Mengkilap  Mengkilap Mengkilap Mengkilap Morfologi Sel Bentuk bakteri Vibrio Vibrio Vibrio Coccus Coccus Basil Basil Basil Basil Gram - - - - - - - - - Motilitas + + - + + +
+ + +
Uji Fisiologi Suhu ( ο C)
SR + + + + + +
+
+ +
37 oC + + +
+ + + + + +
50 o C - - - - - - - - - pH 4 + + + + + +
+
+ +
7 + +
+ + + +
+ + + 9 - - - - - - - - - Salinitas (%) 3 + +
+ + + +
+ + + 5 + + - - - + + - + 7 - - - - - - - - - Uji Biokimia Oksidase + + + - - - - - - Katalase - - - + + + + + + Glukosa + + + +
+
+ + + + Sukrosa - + + - - + + - + Laktosa - + - - - + + - - Oksidatif - + - - - - + + + Fermentatif + + + + + + + + + Uji Nutrisional Glukosa + + + + - + + - + Laktosa - + + - - - + + + Sukrosa + - + - - - + + + Maltosa + - + - - - + + +

## SIMPULAN
Berdasarkan    hasil  dan  pembahasan  di  atas, dapat  disimpulkan  bahwa  sebanyak  28  isolat bakteri  diazotrof  dari  rizosfer  bawang  merah ( Allium  ascalonicum L.)  Brebes,  Jawa  Tengah berhasil  diisolasi.  Sembilan  dari  28  isolat  bakteri diazotrof (LAA4, LAA5, LCA1, LAR3,LAR5,LBR1,LCR3, LAZ2,dan LAZ3)
mampu  menghasilkan hormon IAA  berkisar antara
3,05-3,51  ppm,  dengan  isolat  LAR3  sebagai penghasil  IAA  tertinggi.  Sebanyak  enam  isolat bakteri diazotrof penghasil IAA terbaik (LAA4,LAA5,LAR3,LAR5,  LAZ2,  dan  LAZ3) mampu  menambat  nitrogen  berkisar  antara  3,50- 88,55  ppm,  dengan  isolat  LAR5  sebagai  penghasil nitrogen  tertinggi.  Isolat  bakteri  diazotrof  LAA4, LAA5,  dan  LCA1  diidentifikasi  sebagai  spesies anggota genus Azospirillum, isolat bakteri
diazotrof  LAZ2  dan  LAZ3  merupakan  spesies anggota genus Azotobacter, isolat bakteri diazotrof LAR3,  LAR5,  LBR1,  dan  LCR3  merupakan spesies anggota genus Rhizobium.

## DAFTAR PUSTAKA
Adiguzel, A., Bektas, K. I., Sahin, F. & B. Özlem., 2011. Molecular  Diversity Of Thermophilic Bacteria Isolatd Adiguzel From Pasinler Hot Spring  (Erzurum,  Turkey). Turkish  Journal of Biology , 35 (3) : 267–274.
Agisti, A., Nur, H. A., & Tutik, N. Hidayati, 2014. Isolasi  dan  Dentifiasi  Bakteri  Penambat Nitrogen  Non  Simbiotik  pada  Lahan
Restorasi  dengan  Metode  Legume  Cover Crop  (LCC)  di  Daerah  Pasirian  Lumajang Jawa Timur. Jurnal Sains Dan Seni Pomits , 3 (2) : 36-39.
Agustian, R. Syafei, & L. Maria., 2012. Keragaman Bakteri  Penambat  N  Pada  Rhizosfir  Titonia ( Tithonia  diversifolia) Yang  Tumbuh  Pada Tanah Masam Ultisol. Jurnal Solum, 9 (2) : 98-105.
Allito,  Bunkura  B.,  Nana  Ensuwi-Mensah,  & Vimcent  L.,  2020.  Legume-Rhizobium Strain  Specifity  Enchanes  Nutrition  and Nitrogen  Fixation  in  Faba  Bean  ( Vica  faba L.). Journal Agronomy , 10 (82) : 1-21.
APPI.,  2015.  Kebutuhan  pupuk  urea  2006–2015. http://www.appi.or.id/ images/ statistic/ KEBUTUHAN_PUPUK_UREA_2006_- _2015.xls. Diunduh tanggal 15 Mei 2019.Atlas,  R.,  Brown,  A.,  Dobra,  K.  & Miller, L., 1984. Experimental Microbiology . New York: Macmillan Publishing Company.
Bergey,  D.  H.,  &  Boone,  D.,  2009. Bergey’s Manual  of    Determinative  Bacteriology. 2 nd
Edition.  New  York:  Sringer  Sciences- Business Media.
Brown, A. E., 2007. Microbiological Applications .
New York : Higher Education.
Cowan,  ST,  Steel,  KJ,  Barrow,  GI,  &  Feltham,
RKA.,1993. Cowan and Steel’s Manual  for The  Identification  of  Medical  Bacteria .  3rd Edition.  Australia:  Cambridge  University Press.
Danapriatna,  N.,  2010.  Biokimia  Penambatan Nitrogen    oleh    Bakteri    Non  Simbiotik.
Jurnal  Agribisnis    &  Pengembangan Wilayah, 1  (2): 1  –10.
de Lajudie, P., A. Willems, B. Pot, D. Dewettinck, G. Maestrojuan, M.Neyra, M.D. Collins, B.
Dreyfus,  K.  Kersters  and  M.  Gillis.,  1994. Polyphasic taxonomy of rhizobia: emendation of the genus Sinorhizobium and description of Sinorhizobium meliloti comb. nov., Sinorhizobium  saheli sp.  nov.,  and
Sinorhizobium teranga sp. nov.
International Jurnal.  Systematic  Bacterioly , 44 : 733.
Firmansyah,  I., Liferdi, Khaririyatun, N., & Yufdy,
MP., 2015. Pertumbuhan dan Hasil Bawang Merah  dengan  Aplikasi  Pupuk  Organik  dan Pupuk  Hayati  pada  Tanah  Alluvial    ( The Growth  and  Yield  of  Shallots  with  Organic Fertilizers  and  Biofertilizers  Application  in Alluvial  Soil ). Jurnal  Hortikultura ,  25  (2): 133-144.
Halmedan,  J.,  Yogi  S.,  Sudiarso.,  2017.  Respon
Tanaman Jagung Manis ( Zea mays saccharata ) Terhadap Aplikasi P lant Growth  Promoting  Rhizobacteria (PGPR) Dan Pupuk Kandang Ayam. Jurnal
Produksi Tanaman, 5(12). Hindersah,  R.  &  Simarmata T.,  2004.  Kontribusi rizobakteri Azotobacter Dalam Meningkatkan  Kesehatan    Tanah    Melalui Fiksasi    N 2 Dan  Produksi  Fitohormon  Di Rizosfer. Jurnal Nature Indo , 6 : 127–133 Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T.,
&  William,  S.T., 1994. Bergey’s Manual  of Determinative  Bacteriology .  2 nd Edition.
New York: Lippicolt William and Wilkins.
Islam, H., Nelvia, N., & Zul, D., 2019. Isolasi Dan Uji Potensi Bakteri Diazotrof Non Simbiotik Asal  Tanah  Kebun  Kelapa  Sawit  Dengan Aplikasi  Tandan  Kosong  Dan  Limbah  Cair Pabrik  Kelapa  Sawit. Jurnal  Agroteknologi , 9(2) : 35-40.
Lay, B. W., 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium .  Jakarta:  PT  Raja  Grafindo Persada.
Nasikah.,  2007. Pengaruh  Inokulasi  Rhizobium Dan  Waktu  Pemberian  Pupuk  N  (Urea) Terhadap  Pertumbuhan  Dan  Hasil  Kedelai Di  Lahan  Sawah  Setelah  Kedelai ( Glycine max L.  Merri ).  Skripsi.  Malang:  Fakultas Sains  dan  Teknologi.  Universitas  Islam Negeri Malang, Malang.
Oedjijono, E. S., Soetarto, S., & Moeljopawiro, S., 2014.  Promising  plant  growth  promoting rhizobacteria  of  Azospirillum  spp.  isolatd from  iron  sand  soils,  Purworejo  coast, central  Java,  Indonesia. Advances  in Applied. Science Research. , 5 : 302-308.
Packialakshmi,  N.  &  Aliya,  R.  T.,  2014.
Comparative    Study    of    Vermicast    and
Charcoal Used  as  a  Carrier  Inoculums  to the Biofertilizer Preparation. BMR journals , 1 (1) : 1-6.
Pangestika,  R.,  Oedjijono,  Lestanto,  U.  W.,  2017. Populasi Azospirillum spp.  Pada  Rhizosfer Ilalang  ( Imperata  cylindrica (L.)  Beauv.) yang  Tumbuh  Di  Lingkungan  Berbeda. Journals Science Pharmacy , 3 (2) : 21-28.
Panjaitan, A., Anas, I., Widyastuti, R., & Widayati, W. E., 2015. Kemampuan Bakteri Diazotrof Endofit  Untuk  Meningkatkan  Pertumbuhan Vegetatif  Bibit  Kelapa  Sawit  ( Elaeis guineensis jacq). Jurnal  Ilmu  Tanah  dan Lingkungan , 17(1) : 1-7.
Purwanto,  Yuyun,  Y.,  Sumadi  &  Tualar,  S.,  2017. Nitrogenase Activity and IAA Production of Indigenous  Diazotroph  and  Its  Effect  on Rice  Seedling  Growth .  AGRIVITA  Journal of Agricultural Science , 39(1) : 31-37
Raffi,  MMD.,  Charyulu,  PBBN.,  2012.  Nitrogen Fixation  by  the  Native Azotospirillum spp. Isolat from Rhizosphere and NonRhizosphere  of  Foxtail  Millet. Asian
Journal  Biological and Life Science , 1 (3) : 213-218.
Rahmi., 2014. Kajian Efektifitas Mikroba Azotobacter sp. Sebagai Pemacu Pertumbuhan  Tanaman  Kakao  ( Theobroma cacao L.). Jurnal  Galung  Tropika ,  3  (2)  : 44-53.
Ramadhaniah,  F.  A.,  2013. Keragaman  Bakteri Endofit  pada  Kultivar  Nanas  (Ananas comosus (L.)  Merr )  Leor  dan  Duri  di Kabupaten  Subang .  Skripsi.  Bandung  : Universitas Pendidikan Indonesia.
Rasool, L., A. asghari, A. Jamil and S.U. Rehman., 2015.    Identification    of Azospirillum Spesies  from    Wheat    Rhizosphere. The Journal  of  Animal & Plant Sciences , 25(4) : 1081-1086.
Reetha, S., Bhuvaneswari, G., Thamizhiniyan, P. & Mycin,  T.  R.,  2014.  Isolation  of  indole acetic acid (IAA) producing rhizobacteria of Pseudomonas  fluorescens and Bacillus subtilis and  enhance  growth  of  onion ( Allium  cepa L.). International  Journal  of Current  Microbiology  and  Applied  Science , 3(2) : 568-574.
Ricard, Patrick O., Abimbola O. A., Adenlyl A. O., 2018. Screening of bacteria isolatd from the rhizosfer of maize plant ( Zea mays L.) form ammonia  production  and  nitrogen  fixation.
African Journal of Microbiology Research, 12 (34) :. 829-834.
Santoso, K., Rahmawati, Rafdinal., 2019.
Eksplorasi  Bakteri  Penambat  Nitrogen  dari Tanah  Hutan  Mangrove  Sungai  Peniti, Kabupaten  Mempawah. Jurnal  Protobiont , 8 (1) : 52-58.
Saragih, D., Herawati H., & Niar Nurmauli., 2013. Pengaruh Dosis Dan Waktu Aplikasi Pupuk Urea  Dalam  Meningkatkan  Pertumbuhan Dan Hasil Jagung  (Zea Mays,  L.)  Pioneer 27. Jurnal Agrotek Tropika , 1 (1): 50-54.
Sari, E., Anggi, Nico F., Zulvia, Intan S., & Eman
S., 2018. Isolasi Dan Karakterisasi
Rhizobium    Dari Glycine  max L.  Dan Mimosa  pudica Linn. Jurnal  Penelitian Biologi , 3 (2) : 55-62.
Sari,  Ramdana,  &  Retno  P.,  2015.  Rhizobium: Pemanfaatannya  Sebagai  Bakteri  Penambat Nitrogen. Info  Teknis  Ebotani ,  12  (1)  :  51- 64.
Simanungkalit, R., D., M., Rasti S., Ratin Dewi H.,
&  Edi  H.,  2006. Bakteri  Penambat Nitrogen.,  Dalam  buku  Pupuk  Organik  dan Pupuk  Hayati .  Balai  Litbang  Sumberdaya Lahan Pertanian. Badan Litbang Pertanian.
Surtiningsih,  T.,  Farida,  &  T.  Nurhariyati.,  2009.
Biofertilisasi Bakteri Rhizobium pada Tanaman  Kedelai  ( Glycine  max (L)  Merr.). Berk. Penel. Hayati , 15 : 31–35.
Susilowati,  Dwi  N.,  &  Setyowati,  M.,  2016, Analisis  Aktivitas  Nitrogenase  Dan  Gen nifh Isolat  Bakteri Rhizosfer Tanaman Padi dari  Lahan  Sawah  Pesisir  Jawa  Barat.
Journal of Biology, 9 (2) : 126-137.
Tilak K.V.B.R., K.K. Pal, R. Dey., 2010. Microbes for sustainable agriculture , I.K. New Delhi, India:  International  Publishing  House  Pvt. Ltd.
Trivendi, P.C., Pandey, S., & Bhadauri., 2010 . Text Book  of  Microbiology .  Jaipur  India  :
Aavishkar Publisher Distributors.
Ummah,  R.,  Mahanani,  T.  S.,  Pramita,  Y.,  2019.
Potensi Isolat Bakteri Endofit Akar Tanaman Bawang Merah ( Allium ascalonicum )  sebagai  Penambat  Nitrogen.
Jurnal LenteraBio , 8 (2) : 143-149.
Walida, H., Fitra, S. H., Miranda, H., Febri, F. Y., 2019.  Isolasi  Dan  Identifikasi  Bakteri Penghasil  Iaa  Dan  Pelarut  Fosfat  Dari Rhizosfer  Tanaman  Kelapa  Sawit .  Jurnal Biologi Lingkungan , Industri, dan Kesehatan, 6 (2) : 1-7.
Wedastri, S. 2002., Isolasi dan Seleksi Azotobacter
spp. Penghasil Faktor Tumbuh dan
Penambat  Nitrogen  dari  Tanah  Masam. J. Ilmu Tanah dan lingkungan, 3 : 45-51
Widiawati,  S.,  2015.  Isolasi  dan  Aktivitas  Plant Growth Promoting Rhizobacteria dari Tanah Perkebunan  Karet,  Lampung. Jurnal  Berita Biologi , 14 (1) : 77-88.
Wiyantoko, B., P. Kurniawati, T. E., Purbaningtyas.,  2017.  Pengujian  Nitrogen
Total, Kandungan Air Dan Cemaran Logam Timbal  Pada  Pupuk  Anorganik  Nitrogen Phospor Kalium (NPK) Padat . Jurnal Sains dan Teknologi , 6 (1) :  51-60.
Yulitaasary,  A.  T.,  Asyiah,  I.  N.,  &  Iqbal,  M., 2017.  Isolasi  Dan  Identifikasi  Azotobacter Dari  Rhizosfer  Tanaman  Kopi  ( Coffea Canephora )  Yang  Terserang  Nematoda Parasit Pratylenchus  Coffeae . Saintifika , 19(2) : 13-23