p-ISSN 2354-6565 /e-ISSN 2502-3438 DOI: 10.26874/kjif.v6i2.153
Analisis fragmen DNA dari bakteri Pseudomonas fluorescens sebelum dan sesudah imobilisasi dalam κ-karagenan

## Syarif Hamdani, Isma Oktadiana, Dewi Astriany
Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia (STFI),  Jl. Soekarno-Hatta No.354 Bandung Corresponding author email: syarifhamdani@stfi.ac.id

## Abstrak
Imobilisasi  merupakan  pengurungan  fisik  atau  lokalisasi  bakteri  utuh  dalam  lingkungan tertentu  untuk  memaksimalkan  aktivitas  biokatalis  yang  diinginkan.  Imobilisasi  mampu menyediakan bakteri sebagai biokatalis dalam konsentrasi tinggi sehingga dapat  meningkatkan  efisiensi  serta produktivitas. Penelitian ini dilakukan untuk  mengamati efek  imobilisasi  terhadap  fragmen  DNA  bakteri  setelah  penyimpanan  dingin  selama  lima bulan, bakteri  yang digunakan adalah Pseudomonas fluorescens yang diimobilisasikan pada κ-karagenan lokal yang berasal dari perairan Karimun Jawa. Pengamatan dilakukan terhadap fragmen  DNA  setelah  direstriksi  oleh  enzim  EcoRI  dan  dianalisis  menggunakan elektroforesis gel. Bakteri diimobilisasi dalam karagenan pada konsentrasi 1% dan 2% (b/v). Hasil  menunjukkan  bahwa  DNA P.fluorescens memberikan  fragmen  identik  antara  bakteri terimobilisasi dan tanpa imobilisasi.
Kata Kunci :  Imobilisasi, Pseudomonas fluorescens, Karagenan, Elektroforesis Gel.
Analysis of Pseudomon as fluorescens’s  DNA fragments before and after immobilize in κ-carrageenan

## Abstract
Immobilization  is  physical  confinement  or  localization  of  bacteria  in  a  particular environment to maximize biocatalyst activity. Immobilization provide bacteria as biocatalysts in  high  concentrations  in  order  to  increase  efficiency  and  productivity.  This  study  was conducted  to  observe  the  effect  of  immobilization  to  bacterial  DNA  fragments  after  cool storage  for  five  months,  bacteria  used  was  Pseudomonas  fluorescens  that  immobilized  in local  κ-carrageenan  from  Karimun  Jawa.  Observations  conducted  to  DNA  fragments  after being restricted by EcoRI enzymes and analyzed using gel electrophoresis. The bacteria were immobilized  in  carrageenan  on  concentrations  of  1%  and  2%  (w  /  v),  respectively.  Result shown  that  P.fluorescens's  DNA  gave  similar  fragments  between  immobilized  and  without immobilized.
Keywords: Immobilization, Pseudomonas fluorescens, Carrageenan, Gel Electrophoresis.

## Pendahuluan
Imobilisasi  bakteri  merupakan  metode pengurungan  fisik  atau  lokalisasi  bakteri utuh  dalam  lingkungan  tertentu  untuk memaksimalkan  aktivitas  biokatalis  yang diinginkan  (Karel et  al., 1985).  Berbagai jenis  metoda  imobilisasi  telah  digunakan secara luas tidak hanya di bidang bioteknologi,  tetapi  juga  di  bidang  farmasi,
lingkungan,  makan  dan  industri  biosensor (Anal, 2007).
Imobilisasi harus dilakukan dengan menggunakan matriks untuk mempertahankan bakteri. Matriks imobilisasi yang  ideal  dapat  berfungsi  pada  suhu ambien,  tahan  terhadap  cekaman  air  limbah yang meliputi kontaminasi air dan turbidisasi,  dan  dapat  membiarkan  aliran
nutrien dan oksigen mengalir melalui matriks tersebut. Matriks juga dapat mencegah aliran sel  di  dalam  matriks  itu  sendiri  (Fleming, 2004).
Metode jebakan merupakan metoda imobilisasi  yang  sangat  populer  dalam kalangan  peneliti  dan  perusahaan  bidang mikrobiologi. Proses imobilisasi telah banyak  ditemukan  jenis  matriks  yang  dapat digunakan  dalam  metode  penjebakan,  salah satunya yaitu pemanfaatan karagenan (Wijffels et al., 2007). Metode ini digunakan karena  bakteri  terimobilisasi  lebih  mudah dikendalikan,  matriks  stabil  dan  tidak  toksik (Karel et  al., 1985).  Pada  saat  ini  telah banyak  ditemukan  jenis  matriks  yang  dapat digunakan dalam metode jebakan, diantaranya agar, alginat, karagenan, selulosa dan turunannya (Ramakrishna, 2010).
Pada  penelitian  ini  di  gunakan  matrik pendukung  κ-karagenan  yang  berasal  dari alga merah yang banyak terdapat di perairan Indonesia  (Anggadiredja,  2010),  karagenan dari sumber ini belum diketahui kemampuannya  sebagai  matrik  penjerap dalam proses imobilisasi bakteri.
Karagenan  adalah  suatu  nama  umum untuk  kelompok  pembentuk  gel  polisakarida yang  sangat  kental  yang  didapat  secara komersil  dengan  ekstraksi  dari  suatu  spesies alga  merah  tertentu (rhodophyceae). Jenis karagenan  yang    umum  digunakan  sebagai matrik  penjerap  adalah  karagenan  dari  jenis kappa yang memiliki kekuatan pembentukan gel  yang  lebih  kuat  dibandingkan  dengan jenis iota dan gama (Rowe et al., 2009).
Imobilisasi  dengan  menggunakan  κ- karagenan dilakukan pada bakteri Pseudomonas fluorescens. P.fluorescens merupakan  bakteri  antagonis  yang  banyak dimanfaatkan  sebagai  agensia  hayati  untuk beberapa jamur dan bakteri patogen tanaman.  Bakteri P.fluorescens mempunyai sifat  sebagai Plant  Growth  Promoting Rizhobacteria (PGPR), menghasilkan antibiotika yang dapat menghambat pertumbuhan patogen terutama dari golongan tulartanah, dan mempunyai kemampuan  mengkoloni  akar  tanaman (Soesanto, 2011).
Bakteri pada kondisi terimobilisasi mendapatkan  sumber  nutrisi  yang  tidak optimal selama waktu penyimpanan sehingga  memungkinkan  terjadinya  pola adaptasi  yang  mendorong  terjadinya  mutasi secara  genetik.  Keadan  ini  yang  menjadi dasar dari penelitian ini yaitu melalui analisis fragmen  DNA  menggunakan  elektroforesisi gel
Metode Alat. Alat yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  inkubator  (Memmert), autoklaf, oven (Memmert), hotplate , microtube dan  tip  (Biologix), Laminar  Air Flow (Ersa  Scientific) ,  vortex , consentrator (Eppendorf),  sentrifugator  (Tomy  MX- 305®),  alat  elektroforesis  gel  (BioRad) , magnetic  stirrer, dan  alat  gelas  yang  umum digunakan di laboratorium.
Bahan. Bakteri  yang  digunakan  adalah Pseudomonas  fluorescens yang  merupakan koleksi dari  Laboratorium  Sekolah  Ilmu dan Teknologi  Hayati,  ITB  (Institut  Teknologi Bandung). Bahan yang digunakan antara lain Media Nutrient  Agar (Oxoid),  κ-karagenan standar  (Sigma  Aldrich),  κ-karagenan  dari perairan  Karimun  Jawa  (koleksi  STFI), akuades,  akuabides,  NaCl  0,9  %  (Widatra), isopropilalkohol,  KCl,  etanol  96  %, TAE Buffer, agarosa , DNA  Purification  Kit (Promega), Restriction  KIT (Promega) , EcoRI ( Promega); Elektrophoresis KIT: 1 kb DNA  leader (Thermo) ,  gel  red (Biotium) , loading dye, Nuclease Free Water (Biotium). Persiapan  Bakteri P.fluorescens untuk Imobilisasi. Bakteri P.fluorescens dibiakkan pada media agar nutrien dan diinkubasi pada suhu  30 o C  selama  24  jam,  kemudian  bakteri dibuat suspensi hingga diperoleh %T sebesar 25 %.
Imobilisasi  Bakteri P.fluorescens. κ- karagenan  dilarutkan  terlebih  dahulu  dalam aquades  dan  disterilisasi  pada  suhu  121 o C. Bakteri  dimasukkan  ke  dalam  larutan  κ- karagenan dengan perbandingan 9 : 1 disertai dengan  pengadukan  pada  suhu  40 o C, kemudian  ditambahkan  larutan  KCl  dingin tetes demi tetes. Proses pengadukan dilanjutkan selama 20 menit sampai
terbentuk  fase  padat.    Konsentrasi  κ- karagenan  yang  digunakan  adalah  1%  dan 2%.(Suzana, 2004)
Pengujian Stabilitas Bakteri
Terimobilisasi. Media nutrien agar disiapkan  ke  dalam  cawan  petri,  kemudian dilakukan penggoresan bakteri terimobilisasi dan  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  24 jam  dengan  melakukan  pengujian  terhadap bakteri terimobilisasi berusia 1 dan 5 bulan.
Isolasi  DNA  Bakteri P.fluorescens. Hasil imobilisasi bakteri dalam jangka waktu lima  bulan,  selanjutnya  dilakukan  isolasi DNA P.fluorescens menggunakan Kit Purification  DNA, dengan  prosedur  sebagai berikut hasil imobilisasi diambil sebanyak   1 mL  dimasukkan  dalam  mikrotube,  lalu disentrifugasi  16.000  x  g  selama  2  menit. Hasil  sentrifugasi  terdapat  pellet  dan supernatan.  Buang  supernatan  dan  hasil pellet  ditambahkan  600  µL  lisis  nukleus kemudian  diresuspensi,  lalu  diinkubasi  pada suhu  8 o C  selama  5  menit,  kemudian dinginkan.  Tambahkan  3  µL RNAse lalu campurkan  dan  diinkubasi  selama  37 o C selama  15-60  menit,  dinginkan.  Tambahkan 200  µL  larutan  protein,  vortex  kuat,  lalu diinkubasi es selama 5 menit dan disentrifugasi  16.000  x  g  pada  suhu  4 o C selama  3  menit.  Hasil  supernatannya dipindahkan ke mikrotube  yang sudah berisi 600  µL  isopropanol  lalu campurkan. Kemudian  hasilnya  terdapat  pellet  dan ditambahkan  600  µL  etanol,  sentrifugasi 16.000  x  g  pada  suhu  4 o C  selama  2  menit. Hasil  pellet  dikeringkan  pada  konsentrator, lalu  ditambahkan DNA  dehidration dan diinkubasi  selama  18  jam  pada  suhu  4 o C. Prosedur  yang  sama  dilakukan  terhadap bakteri  terimobilisasi  yang  sudah  disimpan selama satu dan lima bulan.( Corkill, 2008) Restriksi  Enzim EcoRI dan  Analisis DNA  Secara  Kualitatif. Dalam  tabung mikrotube dimasukkan aquabides 16,3 μL, 2 μL Buffer, 0,2 μL  BSA,  sampel  DNA  isolat 1,0 μL, kemudian ditambahkan 0,5 μL enzim retriksi EcoRI, lalu  disentrifugasi  beberapa detik  dengan  kecepatan  16.000  x  g  dan diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  18  jam. Hasil isolat DNA bakteri P.fluorescens yang
telah  ditambahkan  enzim EcoRI ,  kemudian dilakukan  elektroforesis  menggunakan  gel agarosa 1 % (b/v) (Martin,1996). Tambahkan sampel DNA sebanyak 10 µL, loading dye 1 µL, loading  buffer 2  µL,  kemudian diinkubasi  selama  18  jam  pada  suhu  37 o C. Hasil  elektroforesis  diamati  menggunakan lampu UV.

## Hasil dan Pembahasan
Persiapan  Bakteri  Untuk  Imobilisasi. Pada  persiapan  untuk  imobilisasi,  bakteri yang  digunakan  yaitu P.fluorescens yang merupakan  bakteri  gram  negatif  bersifat aerob disuspensikan dengan  aquadest hingga diperoleh %T sebesar 25 %.
Hasil  Imobilisasi  Bakteri P.fluorescens . Matriks pendukung imobilisasi yang digunakan  yaitu  matriks  κ-Karagenan  yang berasal  dari  perairan  Karimun  Jawa  dan  κ- Karagenan Sigma sebagai pembanding. Pada saat  suhu  diturunkan  menjadi  40 o C,  polimer κ-Karagenan  akan  membentuk  struktur pilinan  ganda  dan  semakin  bertambahnya bentuk  heliks  maka  akan  terbentuk  agregat yang bertanggung jawab terhadap terbentuknya  gel  yang  kuat  sehingga  bakteri dapat  terjerap  dalam    matriks  κ-karagenan (Fleming, 2004), penambahan bakteri dilakukan  pada  suhu  ini  untuk  memastikan bakteri  tetap  hidup  dan  terjadi  penjerapan dalam karagenan secara merata. Penambahan KCl bertujuan untuk meningkatkan  kekuatan  gel  karena  pada dasarnya  κ-karagenan  akan  membentuk  gel yang  kuat  dengan  adanya  kation-kation tertentu  seperti  K + ,  Rb + ,  dan  Cs + yang berperan  sebagai gelling  agent (Glicksman, 1982) . κ-karagenan  yang  berasal  dari  Karimun Jawa  menunjukkan  stabilitas  pembentukan gel yang serupa dengan κ-karagenan standar. κ-karagenan  Karimun  Jawa  menunjukkan sifat thermoreversible, yaitu  gel  dapat mencair pada saat pemanasan dan membentuk gel kembali pada saat pendinginan  Gliksman  (1983),  bertahan dalam  jangka  waktu  penyimpanan  selama  5 bulan.    Secara  visual  κ-karagenan  Karimun Jawa dengan konsentrasi 1 % dan 2 % ber-

## Gambar 1. Bakteri terimobilisasi κ-karagenan Karimun Jawa
warna  putih  terang,  strukturnya  halus,  dan tidak  berbau,  berbeda  dengan  κ-karagenan standar  yang  berwarna  lebih  coklat,  kondisi ini  tetap  bertahan  setelah  penyimpanan selama 5 bulan pada suhu 4 0 C (gambar 1).
Uji  Stabilitas  Bakteri  Terimobilisasi. Uji stabilitas bakteri terimobilisasi dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk dapat  tetap  hidup  dalam  matriks  penjerap setelah  disimpan  setelah  selang  waktu  pada suhu  4 0 C.    Setelah  penyimpan  selama  5 bulan  bakteri  masih  dapat  hidup  dan berkembangbiak  secara  optimal  baik  pada konsentrasi  κ-karagenan  1  %  dan  2  %, sebanding dengan bakteri yang terimobilisasi pada κ-karagenan standar.
Hasil Isolasi DNA Bakteri P.fluorescens. DNA hasil isolasi dari bakteri terimobilisasi pada pengujian dengan elektroforesis  gel  menunjukkan  pita  tanpa adanya  fragmentasi,    membuktikan  DNA bakteri berhasil diisolasi dan dapat digunakan  untuk  proses  tahapan  selanjutnya (gambar 2).
Hasil  Restriksi  Enzim EcoRI dan Analisis  DNA  Secara  Kualitatif. DNA bakteri  hasil  isolasi  dipotong  dengan penambahan  enzim  restriksi EcoRI dan diamati  dengan  elektroforesis  gel  agarosa. Hasil  visualisasi  gel  agarosa  dibawah  sinar UV memperlihatkan pita DNA yang terfragmentasi.    Pola  fragmen  dari  bakteri terimobilisasi  pada  κ-karagenan  Karimun Jawa  dengan  konsentrasi  1%  identik  dengan yang  terimobilisasi  pada  κ-karagenan standar,  kedua  fragmen  ini  pun  identik dengan fragmen dari bakteri tanpa imobiliasi, hal  ini  menunjukkan  tidak terjadi perbedaan pola pemecahan DNA dan hal ini pun  menunjukkan  tidak  terdapat  perbedaan
pola urutan basa. Pada bakteri  terimobilisasi yang disimpan selama 5 bulan menunjukkan pola  fragmen  yang  identik  antara  κ- karagenan  Karimun  Jawa  dan  standar walaupun  pola  fragmentasi  tidak  terlihat nyata pada setiap DNA (gambar 3).
Gambar 2.   Hasil Restriksi Bakteri Terimobilisasi Tanpa EcoRI Keterangan:
1`: κ-karagenan standar 1 % (5 bulan)
2 :  κ-karagenan standar 2 % (5 bulan)
3 :  κ-karagenan 1 % (5 bulan)
4  :  κ-karagenan 2 % (5 bulan) M : Marker 5  :  κ-karagenan standar 1 % (1 bulan) 6  :  κ-karagenan standar 2 % (1 bulan) 7  :  κ-karagenan 1 % (1 bulan) 8  :  κ-karagenan 1 % (1 bulan) 9  :  Non Imobilisasi 1 % 2 %
Gambar 3. Hasil Restriksi DNA dengan EcoRI
Keterangan: 1`: κ-karagenan standar 1 % (5 bulan) 2 :  κ-karagenan standar 2 % (5 bulan) 3 :  κ-karagenan 1 % (5 bulan) 4  :  κ-karagenan 2 % (5 bulan) M : Marker 5  :  κ-karagenan standar 1 % (1 bulan)
6  :  κ-karagenan standar 2 % (1 bulan)
7  :  κ-karagenan 1 % (1 bulan) 8  :  κ-karagenan 1 % (1 bulan)
9  :  Non Imobilisasi

## Kesimpulan
Dari  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa  bakteri Pseudomonas  fluorescens yang  diimobilisasi  dengan  menggunakan karagenan  lokal  yaitu  κ-karagenan  Karimun Jawa dengan konsentrasi 1 % dan 2 % dapat digunakan    untuk imobilisasi bakteri sebanding  dengan  κ-Karagenan  standar. Hasil  fragmen  DNA  menunjukkan  pola fragmen  yang  identik  yang  menunjukkan urutan  basa  bakteri  tidak  berubah  pada imobisasi  selama 5 bulan.

## Daftar Pustaka
Anal,  Kumar  Anil  dan  Harjander  Singh.
(2007) : Recent Advances in Microencapsulation  of  Probiotics  for
Industrial  Applications  and  Targeted Delivery. India:  Trends  Food  Science and Technology.
Anggadiredja,  T.,  Zatnika,  A.,  Purwoto,  H., dan  Istini,  S.  (2010): Rumput  Laut. Jakarta: Penebar Swadaya. Corkill, G., Rapley, R. (2008): The Manipulation  of  Nucleic  Acids:  Basic Tools  and  Techiques  in  Molecular
Biomethods, 2 th Edition . USA:  Humana Press. Fleming,  Dara  L.  (2004): Evaluating Bacterial  Cell  Immobilization  Matrices For  Use  In  A  Biosensor .  Virginia  USA: Virginia  Polytechnic  Institute  and  State University.
Glicksman,M. (1982): Red Seaweed Extracts (Agar,  Carrageenan,  Furcellaran)  in Food Hydrocolloids , Vol 2. Boca Raton: CRC Press.
Karel,  S.F.,  Libicki,  S.B.,  Robertson,  C.R. (1985): Immobilization  of  Whole  Cells: Engineering  Principles.  USA:  Chemical Engineering Science 40.
Martin,  R.  (1996): Gel  Elektrophoresis: Nucleic  Acids. Oxford:  Bros  Scientific Publisher Ltd.
Ramakrisna.  S.V.  and  Prakasham,  R.  S,.
(2010): Microbial  Fermentations  with Immobilized Cell .
Rowe, R.C., Sheskey, P.J. and Quinn M., E.
(2009): Handbook  of  Pharmaceutical Excipients. Lexi-Comp: American Pharmaceutical Association, Inc.
Soesanto L. (2008): Pengantar Pengendalian Hayati  Penyakit  Tanaman. Jakarta:  PT Raja Grafindo Persada.
Suzana,  C.  udia  S.  M.,  Claudia,  M.,  a,  M., Larissa Guedes Fiuacute za, M. C. o, & ra,  T.  dde  S.  (2013).  Immobilization  of microbial  cells:  A  promising  tool  for treatment of toxic pollutants in industrial  wastewater. African  Journal of Biotechnology , 12 (28), 4412–4418. Wijffels,  R.H.  (2007): Potential  of  Sponges and Microalgae for Marine Biotechnology . Netherlands: Wageningen University.