P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
Cite this Pebrianti, D., Ekowati, J. and Ainunrrizma, D.A. (2023) 'Molecular Docking Study of Ferulic Acid Analog Compounds as Lung Antifibrotic At TGF-β1 Receptors ' , Berkala Ilmiah Kimia Farmasi , 10(1), pp. 7 - 11. DOI: 10.20473/bikfar.v10i1.45430.
Copyright: ©2023 by the authors. Submitted for possible open-access publication under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International (CC BY-SA) license

## Molecular Docking Study of Ferulic Acid Analog Compounds as Lung Antifibrotic
At TGF-β1 Receptors
Studi Penambatan Molekul Senyawa Analog Asam Ferulat Sebagai Antifibrotik Paru pada Reseptor TGF-β1
Denayu Pebrianti 1) , Juni Ekowati 1) * , Dhea Ananda Ainunrrizma 1)
1 Faculty of Pharmacy, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
*Corresponding author E-mail: juni-e@ff.unair.ac.id
Article History:
Received: May 14, 2023; Revised: November 19, 2023; Accepted: November 24, 2023; Online: November 28, 2023

## ABSTRACT
Pulmonary  fibrosis  was  one  of  the  conditions  that  occurred  in  Post-COVID  Syndrome  patients. Development of specific treatment as an agent to treat pulmonary fibrosis was still ongoing. Ferulic acid was  a  compound  that had  a  potential  lung  antifibrotic  agent  through  the inhibition of  TGF-β1-mediated signaling. Molecular docking studies using the AutoDock Tools program version 1.5.7 were conducted on ferulic  acid  and  its  analogs  to  determine  the  activity  of  compounds  as  antifibrotic.  Furthermore,  the interaction of the compounds with the receptor was visualized using the Discovery Studio 2021 program. The results showed that ferulic acid and its analogs had lower free energy than Pirfenidone, which was a standard  lung  antifibrotic  drug.  4-Benzoyloxy-3-methoxycinnamic  acid  was  the  compound  that  had  the greatest activity. The group that contributed to the ligand-receptor interaction was the aromatic group with π interaction.
Keywords:  Molecular Docking, AutoDock, Antifibrotic, TGF-β1, Ferulic Acid

## ABSTRAK
Fibrosis  paru  merupakan  salah  satu  kondisi  yang  terjadi  pada  pasien Post-COVID  Syndrome . Pengembangan  pengobatan  yang  spesifik  sebagai  agen  untuk  mengatasi  fibrosis  paru  masih  terus dilakukan.  Asam  ferulat  termasuk  senyawa  yang  berpotensi  sebagai  agen  antifibrotik  paru  melalui penghambatan  pensinyalan  yang  dimediasi  TGF-β1.  Studi  penambatan  molekul  menggunakan  program AutoDock Tools versi 1.5.7 dilakukan terhadap asam ferulat dan analognya untuk mengetahui aktivitasnya sebagai  antifibrotik.  Selanjutnya,  interaksi  senyawa  dengan  reseptor  divisualisasikan  menggunakan program Discovery Studio 2021. Hasil penelitian menunjukkan bahwa asam ferulat dan analognya memiliki energi  bebas  lebih  rendah  dibandingkan  pirfenidon  yang  merupakan  obat  standar  antifibrotik  paru. Aktivitas  terbesar  ditunjukkan  oleh  senyawa  asam  4-benzoiloksi-3-metoksisinamat.  Gugus  yang berkontribusi dalam interaksi ligan-reseptor adalah inti aromatis dengan interaksi π.
Kata kunci: Penambatan Molekul, AutoDock, Antifibrotik, TGF-β1, Asam Ferulat

## PENDAHULUAN
Fibrosis  paru  merupakan  pemadatan  matriks ekstraseluler  pada  jaringan  paru  sehingga  terjadi pengerasan  dan  penurunan  elastisitas  (Thannickal et  al ., 2014).  Di  negara-negara  Asia-Pasifik,  insidensi  fibrosis paru  idiopati  mencapai  0,35  –  1,30  per  10.000  populasi dengan  prevalensi  0,57  –  4,51  (Maher et  al .,  2021). Meskipun  tergolong  jarang,  penyakit  ini  menjadi  salah satu  penyakit  kronis  yang  mematikan.  Jika  tidak  segera ditangani,  kelangsungan  hidup  rata-rata  diperkirakan antara 2 sampai 3 tahun setelah diagnosis (Sharif, 2017). Kejadian  fibrosis  paru  ini  mulai  banyak  dijumpai  pada pasien  yang  pernah  menderita  COVID-19  dan  menjadi salah satu kondisi gejala Post- COVID Syndrome . Dalam sebuah penelitian terhadap 55 pasien terkonfirmasi
COVID-19  setelah  3  bulan,  35  (64%)  memiliki  gejala persisten dan 39 (71%) mengalami disfungsi paru seperti penebalan  interstisial  dan  fibrosis  (Zhao et  al .,  2020). Studi  lain  juga  mengungkapkan  perkembangan  fibrosis paru  dialami  oleh  44,9%  orang  yang  sebelumnya terinfeksi SARS-CoV-2 (Amin et al., 2022).
Gambar 1. Struktur Senyawa Pirfenidon
Saat  ini,  terapi  yang  digunakan  untuk  mencegah fibrosis paru yaitu penggunaan kortikosteroid. Kemampuan  kortikosteroid  sebagai  antiinflamasi  dapat mengurangi  kejadian Acute  Respiratory  Distress Syndrome (ARDS)  yang  menjadi  pemicu  fibrosis  paru (Chaudhuri et al ., 2021). Terapi khusus untuk mencegah fibrosis  paru  sendiri  masih  terbatas  dan  terus dikembangkan  (Nalbandian et  al .,  2021).  Obat  yang spesifik sebagai antifibrotik paru diantaranya Pirfenidone ( Gambar 1 ) yang hingga tahun 2020 masih menjalani uji klinis  fase  3  (Hoffmann-La  Roche,  2020).  Meskipun demikian,  obat  ini  menunjukkan  banyak  efek  samping yang  membatasi  kegunaannya,  antara  lain  ruam  kulit, mual,  hingga  fotosensitivitas  sehingga  perlu  adanya pilihan terapi lain yang lebih baru dan lebih aman (Vietri et al ., 2020).
Salah  satu  mekanisme  antifibrotik  dari  obat Pirfenidone  adalah  dengan  menghambat  ekspresi Transforming  growth  factor  beta (TGF-β)  yang merupakan stimulator sintesis protein matriks ekstraseluler  di  sebagian besar  fibroblas,  yang  disintesis dan  disekresikan  oleh  sel-sel  inflamasi  (Burnham et  al ., 2014).  Pada  paru-paru  mamalia,  TGF-β  terdiri  atas  tiga isoform  yaitu  TGF-β1,  TGF-β2,  dan  TGF-β3.  Namun, isoform  TGF-β1  memainkan  peran  sebagai  agen profibrotik  yang  lebih  progresif  untuk  mendorong diferensiasi  fibroblas  menjadi  miofibroblas  (Wei et  al ., 2019).

## Gambar 2. Struktur Asam Ferulat
Asam  ferulat  ( Gambar  2 )  menjadi  salah  satu  agen yang berpotensi digunakan sebagai antifibrotik. Pengujian in vivo pada tikus menunjukkan bahwa asam ferulat (100 mg/kg,  300  mg/kg)  mengurangi  perkembangan  fibrosis paru dengan hasil uji histopatologi yaitu penurunan kadar TGF-β  yang  signifikan  dibandingkan  dengan  kelompok kontrol  (Ali et  al .,  2021).  Dengan  demikian,  temuan tersebut  menunjukkan  kemungkinan  peran  asam  ferulat dalam  memperbaiki  fibrosis  paru  yaitu  dengan menghambat pensinyalan yang dimediasi TGF-β. Namun, masalah utama yang membatasi penggunaan klinis asam ferulat  adalah  bioavailabilitasnya  yang  rendah.  Asam ferulat  bentuk  bebas  hanya  ditemukan  sebanyak  20% pada  plasma  darah  manusia  setelah  penggunaan peroral (Mancuso & Santangelo, 2014).
Strategi yang dapat digunakan untuk meningkatkan bioavailabilitas  adalah  dengan  modifikasi  struktur  agar lebih lipofilik. Semakin besar lipofilisitas suatu senyawa maka  semakin  mudah  menembus  membran  sel  secara difusi  sehingga  persentase  obat  yang  diabsorbsi  lebih besar (Siswandono, 2016). Selain itu, modifikasi struktur suatu  senyawa  juga  dapat  meningkatkan  interaksinya dengan  reseptor  target.  Berdasarkan  penelitian  yang dilakukan  oleh  Ekowati et  al (2018),  modifikasi  asam ferulat  dilakukan  pada  gugus  OH-fenolik  dengan
penambahan gugus-gugus tertentu, di antaranya karbonil ester hingga inti aromatis.
Prediksi  aktivitas  biologis  suatu  senyawa  dapat dilakukan  secara in  silico melalui  penambatan  molekul senyawa  obat  (ligan)  dengan  protein  target  (Dar  &  Mir, 2017).  Hasil  yang  akan  diperoleh  yaitu  energi  bebas ikatan  yang  berbanding  terbalik  dengan  aktivitas  suatu senyawa. Semakin rendah nilai energi bebas ikatan antara senyawa uji dan protein target maka diprediksi senyawa ini memiliki aktivitas biologis yang lebih besar (Ekowati et  al .,  2018).  Pada  penelitian  ini,  akan  dilakukan  uji penambatan molekul terhadap empat analog asam ferulat pada reseptor TGF-β1 (PDB ID: 5QIM) ( Gambar 3 ).
Gambar 3. Struktur Senyawa (a) Turunan 1 (b) Turunan 2 (c) Turunan 3 (d) Turunan 4

## METODOLOGI PENELITIAN

## Reseptor
Reseptor  yang  digunakan  adalah  TGF-β1  dengan PDB ID : 3TZM ( Gambar 4 ) dan native ligand 4-[5-(1,3- benzodioxol-5-yl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl] benzamide  kode  085.  Struktur  molekul  reseptor  dapat diunduh melalui website Protein Data Bank ( https://www.rcsb.org/ ).
Gambar 4. Reseptor TGF-β1 (PDB ID: 3TZM)

## Ligan
Ligan  yang  digunakan  adalah  pirfenidon,  asam ferulat,  dan  4  analog  asam  ferulat  (Gambar  3).  Struktur ligan  digambar  dengan  program ChemDraw versi  19.1 kemudian  disalin  pada  Chem3D  versi  19.1  untuk membuat  struktur  3D  dan  mengukur  energi  minimum
menggunakan  MMF94.  Selanjutnya,  struktur  ligan disimpan dengan format mol2 {SYBYL2 (*.Mol2)}.

## Validasi Penambatan Molekul
Validasi  studi  penambatan  molekul  dilakukan dengan redocking reseptor  dengan native  ligand dan direplikasi  sebanyak  3  kali.  Prosedur  penambatan molekul dinyatakan valid apabila nilai root mean square deviation (RMSD) < 2.0 Å.

## Penambatan Molekul
Penambatan molekul menggunakan perangkat laptop Lenovo 21CS04900, sistem operasi Windows 11, 64 bit, 11th  Intel(R)  Core  (TM)  i3-1115G4,  CPU  @3.00GHz, dan RAM 8.00 GB. Program yang digunakan untuk studi penambatan  molekul  adalah AutodockTools 1.5.7.  Hasil yang  akan  diperoleh  yaitu  energi  bebas  ( estimated  free energy  binding )  yang  berbanding  terbalik  dengan aktivitas  suatu  senyawa.  Selanjutnya,  interaksi  reseptor dan  ligan  hasil  penambatan  divisualisasi  menggunakan program Discovery Studio 2021.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Validasi Penambatan Molekul
Validasi  dilakukan  untuk  membuktikan  bahwa metode  yang  digunakan  memberikan  hasil  yang  tepat sesuai nilai yang sebenarnya. Hasil penambatan molekul dilihat  dari  nilai root  mean  square  deviation (RMSD) yang merupakan penyimpangan antara koordinat prediksi penambatan kembali native ligand dibandingkan dengan konformasi awal (Prieto-Martínez et al ., 2018). Pada studi penambatan molekul antara native ligand dengan reseptor TGF-β1 (PDB ID: 3TZM) diperoleh nilai RMSD sebagai berikut ( Tabel 1 ).
Dari proses validasi penambatan molekul, diperoleh nilai  RMSD  kurang  dari  2.0  (Å).  Hal  ini  menunjukkan bahwa metode penambatan molekul yang digunakan telah valid  sehingga  dapat  digunakan  untuk  penambatan molekul antara reseptor dengan ligan yang lain.

## Hasil Penambatan Molekul
Penilaian hasil penambatan molekul dapat dilakukan salah  satunya  berdasarkan  besar  kecilnya  energi  bebas ikatan. Semakin kecil energi bebas ikatan maka semakin rendah  energi  yang  dibutuhkan  dalam  pembentukan kompleks  ligan  dengan  protein  target.  Hal  ini
menunjukkan  bahwa  ikatan  ligan-protein  target  semakin stabil  sehingga  diprediksi  memiliki  aktivitas  biologis yang lebih besar (Ekowati et al ., 2018). Pada AutoDock  Tools ,  energi  ikatan  dinyatakan sebagai  energi  ikatan  bebas  (∆G ikatan )  yang  merupakan akumulasi  energi  bebas  dari  energi  antarmolekul (∆G antarmolekul ) dan energi bebas dari torsi (∆G torsi ) (Huey et al ., 2007). Energi antarmolekul meliputi interaksi van der Waals, ikatan hidrogen, energi desolvasi, dan energi elektrostatik.  Energi  torsi  merupakan  perkalian  antara berat  (W torsi )  dan  jumlah  torsi  (N torsi )  pada  ligan (Sriramulu et al ., 2020).
Asam  ferulat  dan  analognya  memiliki  nilai  energi bebas yang lebih rendah dibandingkan obat standar yaitu Pirfenidon ( Tabel 2 ). Hal ini menunjukkan bahwa ikatan asam ferulat dan analognya lebih stabil sehingga memiliki aktivitas antifibrotik yang lebih besar. Selain itu, 4 analog asam  ferulat  sendiri  memiliki  energi  bebas  yang  lebih rendah dari  senyawa  asam  ferulat.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  terdapat  pengaruh  penambahan  gugus  terhadap stabilitas  ikatan  reseptor  dan  ligan.  Penambahan  gugus karbonil  dan  inti  aromatis  dapat  menurunkan  energi ikatan  yang  ditunjukkan  oleh  hasil  energi  bebas  dari senyawa  asam  4-benzoiloksi-3-metoksisinamat  (-9,69 kkal/mol)  yang  lebih  rendah  dibanding  analog  asam ferulat  lainnya.  Perbandingan  nilai  energi  bebas  dapat diamati pada Tabel 2 . Hasil  visualisasi  ( Gambar  5 )  menunjukkan  bahwa terdapat  beragam  jenis  interaksi  antara  ligan  dengan reseptor. Interaksi tersebut diantaranya interaksi van der Waals , ikatan hidrogen, π-  π, π-σ, dan π-alkil. Terdapat pula interaksi khas pada native ligand yaitu unfavorable donor-donor yang menunjukkan terjadinya tolakan antara dua  atom  pada  ligan  dan  reseptor.  Selain  itu,  pada pirfenidone  dan  asam  4-benzoiloksi-3-metoksisinamat juga  memiliki  interaksi  π-anion.  Inti  aromatis  menjadi gugus  yang  paling  berkontribusi  dalam  interaksi  antara ligan dengan reseptor karena di setiap senyawa yang diuji selalu memiliki interaksi yang melibatkan gugus tersebut.
Peningkatan jumlah gugus yang berinteraksi dengan reseptor  dapat  menurunkan  energi  ikatan  sehingga aktivitasnya  meningkat  (Ekowati et  al .,  2018).  Oleh karena  itu,  secara  teori  senyawa  asam  4-(4-metoksi) benzoiloksi  -3-metoksisinamat  memiliki  energi  ikatan yang  lebih  rendah  dibandingkan  senyawa  asam  4- benzoiloksi-3-metoksisinamat karena penambahan gugus metoksi  pada  posisi para yang  dapat  membentuk  ikatan hidrogen dan interaksi lipofilik dengan reseptor. Hal yang terjadi justru sebaliknya. Senyawa asam 4-benzoiloksi-3- metoksisinamat  memiliki  interaksi  π-anion  yang berkontribusi  besar  meningkatkan  stabilitas  ikatan reseptor-ligan  sehingga  energi  ikatannya  lebih  rendah dibanding senyawa 4-(4-metoksi)benzoiloksi-3-
metoksisinamat. Tabel 1. Hasil Validasi Replikasi RMSD (Å) Rerata (Å) I 0,842 0,834 ± 0,0014 II 0,839 III 0,821 Tabel 2 . Nilai Energi Ikatan Bebas
Nama Senyawa Energi Ikatan (kkal/mol) 4-[5-(1,3-benzodioxol-5-yl)-4-(pyridin-2-yl)-1H- imidazol-2-yl] benzamide -10.91 Pirfenidone -5.82 Asam ferulat -6.51 Asam 3,4-dimetoksisinamat -6.72 Asam 4-asetoksi-3-metoksisinamat -7.23 Asam 4-benzoiloksi-3-metoksisinamat -9.69 Asam 4-(4-metoksi)benzoiloksi-3-metoksisinamat -9.04
(a)
(c) (e) (b) (d)
(f)
Gambar 5. Visualisasi Interaksi Ligan-Reseptor (a) Native ligand (b) Pirfenidon (c) Asam Ferulat (d) Turunan 1 (e) Turunan 2 (f) Turunan 3 (g) Turunan 4
P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048

## (g)
Gambar 5. Visualisasi Interaksi Ligan-Reseptor (a) Native ligand (b) Pirfenidon (c) Asam Ferulat (d) Turunan 1 (e) Turunan 2 (f) Turunan 3 (g) Turunan 4

## KESIMPULAN
Asam  ferulat  dan  analognya  berpotensi  untuk digunakan  sebagai  agen  antifibrotik  paru  dengan mekanisme  penghambatan  persinyalan  yang  dimediasi oleh reseptor TGF-β1. Aktivitas paling besar ditunjukkan oleh  senyawa  asam  4-benzoiloksi-3-metoksisinamat dibandingkan analog asam ferulat lainnya. Namun, perlu pengujian lanjutan sebelum dapat digunakan secara klinis sebagai agen antifibrotik paru.

## DAFTAR PUSTAKA
Ali,  S.A.,  Saifi,  M.A.,  Pulivendala,  G.,  Godugu,  C.  and Talla,  V.  (2021)  'Ferulic  acid  ameliorates  the progression  of  pulmonary  fibrosis  via  inhibition of  TGF-β/smad  signalling', Food  and  Chemical Toxicology , 149, p. 111980.
Burnham, E.L., Janssen, W.J., Riches, D.W.H., Moss, M. and Downey,  G.P. (2014) 'The fibroproliferative response  in  acute  respiratory  distress  syndrome: mechanisms and clinical significance' , European Respiratory Journal , 43(1), pp. 276–285.
Chaudhuri, D. et al . (2021) 'Corticosteroids in COVID-19 and non-COVID-19  ARDS:  a  systematic  review and  meta-analysis', Intensive  Care  Medicine , 47(5), pp. 521–537.
Dar,  A.M.  and  Mir,  S.  (2017)  'Molecular  Docking: Approaches,  Types,  Applications  and  Basic
Challenges', Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques , 08(02).
Ekowati,  J. et  al .  (2018)  'Molecular  Docking  of  Ferulic Acid  Derivatives  on  P2Y12  Receptor  and  their ADMET  Prediction', Journal  of  Mathematical and Fundamental Sciences , 50(2), pp. 203–219.
Hoffmann-La  Roche  (2020)  'Multicenter,  International, Double-blind,  Two-Arm,  Randomized,  Placebo- controlled Phase II Trial of Pirfenidone in Patients With  Unclassifiable  Progressive  Fibrosing  ILD',
Clinical trial registration NCT03099187 . clinicaltrials.gov. (Accessed: 27 December 2022).
Hama  Amin,  B.J. et  al. (2022)  'Post  COVID-19 pulmonary  fibrosis;  a  meta-analysis  study', Annals of Medicine and Surgery , 77, p. 103590.
Huey, R. et al. (2007) 'A semiempirical free energy force field  with  charge-based  desolvation', Journal  of
Computational Chemistry , 28(6), pp. 1145–1152.
Maher,  T.M. et  al. (2021)  'Global  incidence  and prevalence  of  idiopathic  pulmonary  fibrosis', Respiratory Research , 22, p. 197.
Mancuso,  C.  and  Santangelo,  R.  (2014)  'Ferulic  acid: Pharmacological and toxicological aspects', Food and Chemical Toxicology , 65, pp. 185–195.
Nalbandian,  A. et  al. (2021)  'Post-acute  COVID-19 syndrome', Nature Medicine , 27(4), pp. 601–615.
Prieto-Martínez, F.D., Arciniega, M. and Medina-Franco, J.L. (2018) 'Molecular docking: current advances and  challenges', TIP  Revista  Especializada  en Ciencias Químico-Biológicas , 21. doi: 10.22201/fesz.23958723e.2018.0.143.
Sharif,  R.  (2017)  'Overview  of  idiopathic  pulmonary fibrosis  (IPF)  and  evidence-based  guidelines', American  Journal  of  Managed  Care ,  23(11 Suppl), pp. S176–S182.
Siswandono,  E.  (2016) Kimia  Medisinal  1  Edisi  2 .
Airlangga University Press.
Sriramulu, D.K., Wu, S. and Sun-Gu, L. (2020) 'Effect of ligand torsion number on the AutoDock mediated prediction  of  protein-ligand  binding  affinity', Journal of Industrial and Engineering Chemistry , 83, pp. 359–365.
Thannickal,  V.J. et  al. (2014)  'Matrix  Biology  of Idiopathic  Pulmonary  Fibrosis:  A  Workshop Report  of  the  National  Heart,  Lung,  and  Blood Institute', The  American  Journal  of  Pathology , 184(6), pp. 1643–1651.
Vietri,  L. et  al. (2020)  'Pirfenidone  in  idiopathic pulmonary  fibrosis:  real-life  experience  in  the referral centre of Siena', Therapeutic Advances in Respiratory Disease , 14.
Wei, P. et al. (2019) 'Transforming growth factor (TGF)- β1-induced  miR-133a  inhibits  myofibroblast differentiation  and  pulmonary  fibrosis', Cell Death & Disease , 10(9), pp. 1–17.
Zhao, Y. et al. (2020) 'Follow-up study of the pulmonary function and related physiological characteristics of  COVID-19  survivors  three  months  after recovery', EClinicalMedicine , 25, p. 100463.