## Optimization of Neuron cells Maturation and Differentiation
Choirunil Chotimah 1,4) *, Masruroh Rahayu 2) *, Gatot Ciptadi 3) , Fatchiyah Fatchiyah 1) †
1) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang
2) Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya, Malang
3) Fakultas Peternakan,  Universitas Brawijaya, Malang
4) Program Pascasarjana Biologi, Jurusan Biologi, Fakultas  Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Brawijaya, Malang
*Kontribusi kedua peneliti ini sama sebagai penulis pertama
† Corresponding author: Prof. Fatchiyah, PhD.
Jurusan Biologi, FMIPA-UB, Jl Veteran, Malang 65145, Indonesia
e-mail: fatchiya@ub.ac.id

## ABSTRACT
Neurodegenerative disease is the  brain and spinal  cord attacks to turn  off his  cell. One  of  the diseases that prevalence of HAD neurodegenerative is now increased by approximately 37%. The purpose of this  study  was to  determine the  optimal time of  growth of  cultured brain neurons in  rats  (Rattus norvegicus) and know the  stages  of morphological differentiation  of rat brain neurons. Isolate  of  neuron cells  was  provided  from fetal rat neurons,  aged 18-19 days,  and then  cells grown in  vitro on MEM+10%FBS+3%Penstrep culture  medium.  Cells  growth observed  once  each  day  during  14  days. The results obtained are optimal neuronal  cell growth are on the  eighth  day. Morphological differentiation  of neuronal cells began on  day 1 of the  form neuroblast cell morphology apolar (rounded), the  2nd  day  of neuronal cell morphology in the form of bipolar neuroblast (already formed axon and dendrites), on day 3 to day  14 cells already mature, with cell morphology namely bipolar neurons, pyramidal and multipolar. Mature neuron cells that have optimizations on the 10th day.
Key words : diferentiation, neuron culture, neuron morphology, proliferation.

## ABSTRAK
Penyakit neurodegenerasi adalah penyakit yang menyerang sel otak dan sumsum tulang belakang dengan mematikan selnya. Salah satu penyakit neurodegenerasi adalah HAD yang prevalensinya sekarang meningkat  sekitar  37  %.  Oleh  karena  itu, peneliti  mengembangkan  penelitian  untuk  mencari  obat  yang dapat mencegah atau mengobati penyakit ini, salah satunya dalam bidang kultur jaringan dan sel hewan. Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  menganalis waktu  optimal  pertumbuhan kultur  neuron  otak  tikus (Rattus  norvegicus) dan  tahapan  diferensiasi  morfologi  sel  neuron otak  tikus. Penelitian  ini  dilakukan dengan cara mengisolasi sel neuron fetus tikus yang berumur 18-19 hari dan ditumbuhkan secara in vitro (MEM+10%FBS+3%Penstrep).  Hasil  yang  didapatkan  adalah  pertumbuhan  sel  neuron  yang  optimal terdapat pada hari kedelapan. Diferensiasi morfologi sel neuron dimulai pada hari ke-1 dengan morfologi sel berupa neuroblast apolar (berbentuk bulat), hari ke-2 morfologi sel neuron berupa neuroblast bipolar (sudah  terbentuk  akson  dan  dendrit),  pada  hari  ke-3  sampai  hari  ke-14  sel  sudah matang, dengan morfologi  sel  yaitu  neuron  bipolar,  piramidal  dan  multipolar.  Sel neuron  yang matang mengalami optimalisasi pada hari ke-10.
Kata kunci : diferensiasi, kultur neuron, morfologi neuron, pertumbuhan sel neuron.

## PENDAHULUAN
Otak  dan  sumsum  tulang  belakang  terdiri dari kelompok-kelompok neuron yang bekerja dengan berbagai macam fungsi, seperti kontrol pergerakan,  memproses  informasi  sensorik,
dan pembuatan keputusan. Proses neurodegenerasi  terjadi  disfungsi  sistem  saraf yang  disebabkan  oleh  berkurangnya  sel-sel neuron pada struktur saraf, seperti halnya yang terdapat  pada  penyakit  neurodegeneratif  otak. Penderita  neurodegenerasi  akan  mengalami gangguan memori dan pergerakan [1].
Penyakit neurodegeneratif dikelompokkan
menjadi dua macam yaitu penyakit neurodegeneratif primer dan sekunder. Neurodegeneratif  primer  misalnya penyakit Alzheimer dan penyakit Parkinson, sedangkan neurodegeneratif  sekunder  adalah Human Immunodeficiency  Virus-associated  dementia complex (HAD).
Pengetahuan  tentang  mekanisme  terjadinya
HAD,  obat  atau  terapi  yang  dapat  digunakan, perkembangan penyakit maupun hasil pengobatannya  memerlukan  penelitian  mulai dari  tingkat  sel,  jaringan,  organ  baik  secara  in vitro maupun in-vivo. Sehubungan dengan hal tersebut  diatas  peneliti  akan  melakukan penelitian  dengan  pendekatan  seluler  melalui metode  kultur  sel  hewan  yakni  kultur campuran neuron-glia. Kultur jaringan dan sel hewan  mulai  diperhatikan  oleh  para  peneliti sejak  awal  abad  20  yang  lalu,  terutama  untuk melakukan  penelitian  yang  bertujuan  untuk mengetahui perilaku sel hewan [2]. Lingkungan  kultur  yang berbeda  dengan kondisi in vivo akan menyebabkan berkurangnya  interaksi  antar  sel  dan  interaksi matriks  dengan  sel,  sehingga  berpengaruh terhadap proliferasi sel [3]. Selama perkembangan  kultur,  sel  juga  mengalami proses diferensiasi. Dalam suatu penelitian penting sekali diketahui  tentang  proliferasi  dan  diferensiasi sel  untuk  mengetahui  kapan  waktu  optimal dilakukan  perlakuan. Penghitungan  rata-rata proliferasi sel sering digunakan untuk menentukan  respon  sel  terhadap  stimulus  atau zat toksik. Kuantitas pertumbuhan sel di dalam kultur  juga  penting  untuk  dijaga  atau dipertahankan agar dapat diketahui konsistensi kultur,  saat  yang  baik  untuk  dilakukan subkultur,  dilusi  optimum,  perkiraan  densitas sel,  menguji  media,  serum,  dan  substrat  [3]. Oleh  karena  itu,  diperlukan  suatu  kajian
mengenai optimalisasi pertumbuhan dan diferensiasi sel  neuron, telah dilakukan observasi pertumbuhan  kultur  neuron  otak tikus  (Rattus  norvegicus)  dan analisis tahapan diferensiasi morfologi sel neuron otak tikus.

## METODE
Kultur  Neuron-Glia  Otak  Tikus [4]. Tikus bunting (18-19 hari) disemprot dengan alkohol 70  %, dilakukan  dislokasi leher  kemudian dibedah  dan  diambil  fetusnya.  Fetus  dicuci dengan  larutan  PBS  steril  (Phosphat  Buffer Saline),  kemudian  alkohol  70%  sebentar,  dan PBS  steril kembali.  Fetus  dibawa  ke  dalam LAF  (Laminar  Air  Flow)  (Esco,  USA). Plasenta  dibuka  dan  kepala  fetus  dipotong dengan  menggunakan  gunting  dan  pinset. Kepala  dimasukkan  ke  dalam  PBS  yang ditambah dengan antibiotik Penstrep
(Penicillin  Streptomycin)  (Sigma  Chemical Co.,  USA)  kemudian  dibedah  dan  diambil otaknya.  Otak  fetus  diletakkan  pada  cawan petri  yang  berisi  larutan  PBS  Penstrep, dibersihkan  dari  meninges  dan  darah.  Otak yang  sudah  bersih  kemudian  diletakkan  di dalam  botol  falcon  15  mL  (BD,  USA)  dan ditambah  dengan  Tripsin  EDTA  (Sigma Chemical  Co.,  USA)  (1:1)  sesuai  dengan volume  otak,  diinkubasi  selama  15  menit  di dalam  inkubator  CO 2 5%  suhu  37 0 C  (Binder, USA). Plate Well 12  (Corning,  USA) disiapkan  dan  diberi coverslip (Assistent,
Germany) di dalamnya, dilapisi dengan gelatin (Sigma Chemical, USA) dengan menggunakan filter  0,20  µm  (Corning, Germany)  dan  jarum spuit (Terumo, Jepang), diinkubasi dalam LAF selama  30  menit.  Setelah  15  menit,  otak ditambahkan  dengan  3200  µL  10%  FBS (Gibco,  USA) dalam  PBS  dan  dihomogenasi dengan  sentrifugasi  kecepatan  1200  rpm selama  2  menit  menggunakan  sentrifus  (MSE Ministral  1000, United  Kingdom).  Supernatan diambil  dengan  mikropipet  dan  dibuang, kemudian  ditambahkan  3200  µL  10%  FBS dalam PBS dan dihomogenasi dengan sentrifugasi  kecepatan  1200  rpm  selama  2 menit.  Supernatan  diambil  dengan  mikropipet dan  dibuang,  kemudian  pelet  ditambahkan dengan  media  non  serum  (Minimum  essential medium  Eagle’s /MEM)  (MP  Biomedicals, Germany),  kemudian  dihomogenasi  dengan sentrifugasi  kecepatan 1200  rpm  selama  2 menit.  Supernatan  diambil  dengan  mikropipet dan  dibuang,  pelet  ditambahkan  dengan
complete  media (  3%  Penstrep  +  10%  FBS  + MEM)  sampai  12  mL,  dihomogenasi  dengan mikropipet.  Kemudian  otak  ditanam  di plate well-12, setiap well 1000 µL. Plate disemprot dengan  alkohol  70  %  dan  dimasukkan  ke dalam  inkubator  CO 2 5  %  suhu  37 0 C.  Kultur diinkubasi selama 9 hari dengan pencucian sel selama 2 hari sekali
Pencucian  Sel  Neuron-Glia. Pencucian  sel dilakukan  dengan  membuat  15  mL complete media (3%  Penstrep  +  10%  FBS  +  MEM) kemudian  di  inkubasi  dalam  inkubator  CO 2 5%  suhu  37 0 C  selama  15  menit.  Media  di dalam plate  well diambil  dan  diganti  dengan media  non  serum  dilakukan  sebanyak  2  kali. Setelah  pencucian  dengan  media  non  serum selesai, media diganti dengan complete media.
Menghitung  Sel. Penghitungan  sel  neuron dilakukan setelah sel selapis, jumlah sel hidup dihitung berdasarkan pengamatan mikroskopis dengan mikroskop inverted (Olympus,
Germany)  perbesaran  200  x  yaitu  sel  yang masih melekat pada dasar plate dan mempunyai  sitoplasma  yang  bisa  teramati, penghitungan  dilakukan  mulai  hari  ke-1 sampai  dengan  hari  ke-14.  Pengamatan dilakukan pada 5 titik per lapang pandang dari coverslip  yang  diambil  per  sumur  kemudian dihitung nilai reratanya [5].
Imunohistokimia. Plate-well  12  difiksasi dengan  paraformaldehid  (PFA)  selama  15 menit, kemudian dicuci dengan PBS steril 1x 5 menit.  Ditetesi  dengan  H 2 O 2 3%  selama  15 menit  (±  1  cc).  Dicuci  PBS  3x5  menit, kemudian  ditetesi blocking  buffer selama  60 menit (±  1  cc). Diinkubasi  dengan  antibodi primer untuk neuron  anti MAP-2(Microtubue Associated Protein-2) (Santa Cruz, California)
(1:1000) masing-masing sumur 500 µL selama semalam.  Dicuci  PBS  3x5  menit  (±  1  cc). Ditetesi dengan antibodi sekunder (anti mouse biotin)  (Santa  Cruz,  California)  (1:200) masing-masing  sumur  500  µL,  diinkubasi selama  1  jam  kemudin  dicuci  PBS  3x5  menit (± 1 cc). Selanjutnya ditetesi dengan SA-HRP (1:1000)  (Daco,  Inc.,  USA)  selama  40-50 menit  kemudian  dicuci  PBS  3x5  menit  (±  1 cc).  Selanjutnya  diberikan  chromogen  untuk HRP  yaitu  DAB  (Diamino  Benzidine)  (Daco, Inc.,  USA)1  mL  selama  20-30  menit,  dicuci PBS  3x5  menit  (±  1  cc).  Kemudian  dicuci akuades  selama  3x  5  menit.  Selanjutnya
dilakukan counterstaining dengan  mayer hematoxilin (Lab Vision, California) ditambah air  sebagai  pengencer  sampai  terendam, selama  6  menit.  Dicuci  dengan  air  kran  3x5 menit.  Coverslip  diambil,  diletakkan  di  tisue. Objek  glass  dilapisi  enthelan,  coverslip diletakkan  di  atas  objek  glass  yang  dilapisi enthelan  (Merck, Germany). Setelah  enthelan kering,  ditambah  dengan  enthelan  di  atasnya dan ditutup dengan coverslip.
Pengambilan  Data. Data  berupa  foto  sel neuron  diambil  dari  pengamatan  dengan  cara sel  kultur  di  dalam plate  well diamati  dengan menggunakan  mikroskop  inverted  (Olympus, Germany) dengan perbesaran 200 x.
Pengamatan dilakukan setiap hari, dimulai dari hari  ke-1 sampai  hari  ke-14.  Data  berupa morfologi neuron per hari.
Analisis  Data. Analisis  data  dilakukan  secara deskriptif  berdasarkan  perubahan  morfologi neuron  dan rerata  jumlah  sel  mulai  dari  hari ke-1 sampai hari ke-14.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pertumbuhan  Kultur  Neuron  Otak  Tikus (Rattus  norvegicus). Kultur  sel  neuron  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  berasal  dari otak fetus tikus (Rattus norvegicus) pada umur kebuntingan  18-19  hari yang ditumbuhkan dalam  media  MEM.  Metode  ini  diambil  dari penelitian sebelumnya dan  telah  mengalami modifikasi [4]. Penggunaan otak janin sebagai sumber kultur sel karena sel neuron pada otak janin mempunyai kemampuan proliferasi lebih tinggi  dibandingkan  dengan  sel  neuron  yang berasal  dari  jaringan  otak  dewasa [6]. Hasil dari  kultur  sel  neuron  otak  tikus  didapatkan bahwa  jumlah  sel  pada  hari  pertama  sampai hari kedelapan mengalami peningkatan karena proliferasi  sel  terus  meningkat.  Proliferasi  sel mengalami  saat  yang  optimal  pada  hari kedelapan (rerata  jumlah  sel  tertinggi  sebesar 10,33).  Kemudian  pada  hari  kesembilan sampai  hari keempat  belas proliferasi  sel menurun,  beberapa  sel  sudah  ada  yang mengalami apoptosis menyebabkan jumlah sel menurun. Hal ini dapat dilihat pada gambar 1.
Pada gambar 1 tampak bahwa pertumbuhan sel  meningkat  sesuai  dengan  fase  log  dan sangat  produktif  sampai  pada  hari  kedelapan. Akan tetapi mulai hari kesembilan sampai hari keempat  belas sel  mengalami  penurunan
jumlah  sel. Hal  ini  sejalan  dengan  proses diferensiasi sel neuroblast menjadi sel multipolar  neuron.  Proses  proliferasi  kultur neuron pada tahap pertumbuhan yang tercepat adalah  pada  hari pertama sampai  hari  kelima. Setelah  tahap  pertumbuhan  yang  cepat tersebut, rata-rata pertumbuhan mulai menurun [7]. Hal ini dikarenakan sel sudah berdiferensiasi sehingga pembelahan sel berkurang dan bahkan tidak ada [3]. Pada hari kedua sampai  ketiga sel  neuron  mulai berinteraksi dengan sel neuron lainnya [8].
Gambar 1  Pertumbuhan  sel  neuron  dari  hari ke-1 sampai hari ke-14. Rerata jumlah sel yang paling tinggi terdapat pada hari ke-8.
Pada hari ke-6 kultur, sel neuron berinteraksi  untuk  membentuk  jaringan  antara sel  satu  dengan  sel  lainnya.  Selama  proses pertumbuhan, sel neuron tidak hanya berinteraksi dengan sel tetangganya tetapi juga dengan  neurit  dari  tubuh  sel  neuron  sendiri.
Jaringan  akan  berubah  secara  signifikan tergantung dari umur dan tahap perkembangan sel.  Setelah  tahap  awal  pembentukan  neurit tubuh sel neuron mulai membentuk kumpulan. Proses  pembentukan  kumpulan  sel  disertai dengan  penggabungan  cabang  dan  seluruh neurit.  Somata  akan  berpindah  seiring  dengan pembentukan  sel  neuron,  kultur  sel  neuron tunggal  akan  berkembang  menjadi  kumpulan sel  neuron  yang  dihubungkan  dengan  urat saraf  yang  tebal [7].  Pada  hari  ke-7  tubuh  sel neuron  mengalami  peningkatan  ukuran  dan peningkatan proses perluasan jaringan [8].
Diferensiasi Morfologi Sel-Sel Neuron Otak Tikus (Rattus norvegicus). Pengamatan morfologi neuron dilakukan dengan mikroskop inverted  (Olympus)  dengan  perbesaran  200x. Untuk  mengetahui  apakah  morfologi  yang diamati  adalah  sel  neuron,  maka  dilakukan pengecatan sel dengan teknik imunohistokimia
dengan antibodi microtubule associated protein-2 (MAP-2). Microtubule  associated protein-2 merupakan  marker  khusus  untuk  sel neuron [4]. Berdasarkan pengamatan morfologi  kultur  sel  neuron,  didapatkan  data perubahan  morfologi  sel  neuron  selama  14 hari.  Pada  hari pertama morfologi  neuron masih berbentuk sel bulat, pada hari kedua sel sudah  mulai  membentuk  akson,  jumlah  sel yang  membentuk  akson  yang  paling  banyak terjadi  pada  hari  ketiga.  Pada  hari  ketiga sampai  hari keempat  belas sel  neuron  sudah mature dengan  morfologi  sel  yang  berupa badan  sel  dengan inti  sel  bulat  memanjang,
terbentuk akson yang memanjang dan membentuk  hubungan  dengan  sel  neuron lainnya.  Sel  neuron  yang mature mengalami optimalisasi  pada  hari  kesepuluh dan  akan terus  berdiferensiasi  sampai  hari keempat belas,  oleh  karena  itu  morfologi  sel  neuron yang sudah terbentuk akson dan morfologi sel neuron  yang  aksonnya  memanjang  akan  tetap ada  sampai  hari keempat  belas.  Hal  ini  dapat di lihat pada gambar 2.
Morfologi neuron yang  berbentuk sel bulat
akan berproliferasi dan berdiferensiasi membentuk akson pada hari kedua. Sel neuron mulai  membentuk  dendrit  dan pemanjangan akson  pada  hari  ketiga sampai  hari keempat belas.  Diferensiasi  ini  akan  berlangsung sampai  sel  neuron mature dimulai  dari  hari ketiga sampai hari keempat belas.
Gambar 2  Perbandingan  skor  morfologi neuron per hari
Kultur  sel neuron yang ditumbuhkan pada media  MEM  sudah  menempel  pada  coverslip saat  hari pertama.  Sel  yang  tidak  menempel pada  coverslip  akan  terbuang  saat  pencucian sel  dengan  media serum free.  Berdasarkan gambar 3 dapat dilihat bahwa kultur otak tikus pada hari pertama sampai dengan hari keempat belas menunjukkan adanya perbedaan morfologi. Perbedaan morfologi ini
menunjukkan bahwa sel mengalami pertumbuhan.  Pada  hari pertama sel  masih berbentuk  bulat  disebut  dengan apolar neuroblast.  Pada  hari  kedua sel  neuron  sudah mulai  membentuk  akson  yang  kemudian  akan terus  memanjang  dan  membentuk  suatu hubungan  dengan  akson  lainnya,  sel  neuron berdiferensiasi membentuk bipolar neuroblast. Pada  hari  ketiga sampai  hari  keempat  belas akson  sudah  memanjang  dan  membentuk jaringan  dengan  akson  lainnya,  dendrit  sudah terbentuk  (neuron mature)  dengan  morfologi berupa bipolar neuron, pyramidal neuron, dan multipolar neuron.
Proses perkembangan neuron adalah awalnya neuroblast melakukan proses
pemanjangan ke lumen, tetapi ketika neuroblast  berpindah  ke mantle  layer proses ini  tidak  terlihat  dan  neuroblast  untuk sementara membulat menjadi apolar. Kemudian  terjadi  proses  pertumbuhan  dua sitoplasmik baru pada sisi yang berlawanan di tubuh  sel,  membentuk bipolar  neuroblast [9]. Hari kedua  setelah plating neurit  atau  akson berkembang  dari  soma,  bercabang  dan berhubungan dengan neurit lain [7]. Pertumbuhan  sel  neuron  pada  hari  keenam menunjukkan  sel-sel  yang  saling  berlekatan antara  yang  satu  dengan  yang  lain  dan  bentuk morfologi sel-sel yang tumbuh bervariasi [10]. Perkembangan  sel  neuron  dari hari pertama sampai  dengan  hari  keempat  belas dapat dilihat pada gambar 4.
Selain itu, jarak antar sel yang relatif dekat dan  jumlah  sel  yang  semakin  banyak menandakan bahwa sel-sel mengalami pertumbuhan dengan baik dan mulai menunjukkan kondisi yang konfluen. Morfologi akson terlihat berbentuk lurus yang menunjukkan  hubungan  antara  akson  satu dengan  akson  lainnya [7]. Pada  akhir  proses pemanjangan,  sel  neuroblast  bipolar  dengan cepat  membentuk  akson  primitif  dan  dendrit primitif.  Sel  ini  berkembang  menjadi  sel neuron multipolar atau sel neuron dewasa [9].
Berdasarkan  pengamatan  morfologi  sel neuron mature yang ditemukan pada kultur ini adalah  sel  neuron  bipolar,  neuron  piramidal dan  yang  terbanyak  adalah  neuron  multipolar.
Sel  neuron bipolar  mempunyai  satu  dendrit dan  satu  akson,  neuron  piramidal  mempunyai soma  yang  berbentuk  piramid,  dan  neuron multipolar mempunyai satu akson dan sisanya merupakan  dendrit [11]. Sel  neuron  bipolar mempunyai  dendrit  yang  panjang  dengan
beberapa cabang. Sel neuron bipolar mempunyai  satu  dendrit  dan  satu  akson [12]. Sel  neuron  piramidal  mempunyai  dendrit dengan  cabang  yang  banyak,  soma  berbentuk segitiga,  dan  dendrit  apikalnya  mencolok.  Sel neuron  multipolar  mempunyai  dendrit  dengan cabang yang banyak. Perbedaan tipe morfologi sel  neuron    terlihat  pada  tahap  awal diferensiasi [11].
Diferensiasi  sel  neuron  dorsal  pada  embrio fetus  usia  12-13  hari  yaitu  berawal  dari progenitor  neuroepithelial  yang  menyebabkan pemanjangan  sel radial  glial (RG)  yang memiliki  ukuran  sepanjang    zona  ventrikuler sampai permukaan pial. Sel RG mengekspresikan  faktor  transkripsi  Pax6 (paired  box  6),  RC2,  dan  Nestin.  Sedangkan beberapa sub populasi mengekspresikan berbagai  macam  marker  lainnya  termasuk brain  lipid  binding  protein (BLBP)  dan glutamate-aspartate  transporter (GLAST). Selain  itu,  sel  RG  juga  menunjukkan perbedaan fungsi pada signal transduksi Notch dan  potensial  diferensiasi.  Ciri-ciri  khusus  sel RG adalah sinkronisasinya dengan perkembangan  siklus  sel.  Inti  sel  RG berpindah  dari apical (ventrikuler)  ke  basal (pada  fase  G1)  dan  kembali  (pada  fase  G2), proses ini menunjukkan perpindahan interkinetic  nuclear.  Perilaku  ini  dipercaya untuk  meregulasi  pembongkaran  inti  sel  RG neurogenik  melawan  sinyal  proliferasi  seperti notch  signaling.  Sel  RG  dibagi  secara asimetris  pada  permukaan  ventrikuler  dengan bidang pembelahan
vertikal untuk menghasilkan  sel  RG  dan sel  neuron  lainnya (neurogenesis  langsung)  atau intermediate progenitor  cell (IPC)  (neurogenesis  tidak langsung). Intermediate progenitor cell adalah sel  multipolar  yang  mengekspresikan  T-box faktor  transkripsi  Tbr2  dan  berpindah  dari permukaan ventrikuler kemudian mengekspresikan basic Helix-Loop-Helix
(bHLH)  faktor  transkripsi  NeuroD  untuk menghasilkan  zona  germinal  sekunder  atau subventricular  zone (SVZ)  yang  membelah secara  horisontal  untuk  menghasilkan  dua  sel neuron yang mengekspresikan Tbr1 [13].

## KESIMPULAN
Pertumbuhan  sel  neuron  yang  optimal terdapat  pada  hari  kedelapan. Diferensiasi morfologi sel  neuron  dimulai  pada  hari pertama dengan morfologi sel berupa
neuroblast apolar (berbentuk bulat), hari kedua morfologi sel neuron berupa neuroblast bipolar (sudah terbentuk akson dan dendrit), pada hari ketiga  sampai  hari  keempat  belas sel  sudah mature, dengan  morfologi  sel  yaitu  neuron bipolar,  piramidal  dan  multipolar,  sel  neuron sudah  membentuk  hubungan  dengan  sel neuron  lainnya.  Sel  neuron  yang mature mengalami optimalisasi pada hari kesepuluh.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terimakasih  atas  kerjasama  untuk  tim  dan fasilitas  laboratorium  Biomedik  FK  UB  dan laboratorium  Biomol  jurusan  Biologi  FMIPA UB untuk fasilitas hewan coba.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Bertram,  L. dan  E.  T.  Rudolph.  2005.  The
Genetic Epidemiology of Neurodegenerative Disease. The Journal of Clinical Investigation. 115:6. 2. Djati,  M.  S.  2006.  Teknologi  Manipulasi dan Kultur Sel-Jaringan Hewan. Teknologi Dasar  untuk  Pengembangan  Bioteknologi
Hewan  melalui  Kultur  Sel-Sel  Spesifik. Program Pasca Sarjana Universitas Brawijaya. Malang.
3. Freshney,  R.  I.  2000.  Culture  of  Animal Cells.  A  Manual  of  Basic  Technique.  John Willey and Sons, Inc. New York.
4. Jana,  M.,  A.  Jana, U.  Pal, dan  K.  Pahan. 2007.  A  Simplified  Method  for  Isolating
Highly Purified Neurons, Oligodendrocytes, Astrocytes, and Microglia  from  the  Same  Human  Fetal
Brain  Tissue. Journal  of Neurochem  Res.
32(12): 2015 – 2022.
5. Nurmawati, T. 2008. Perubahan Jumlah Sel Neuron dan Mikroglia pada Kultur Neuron
yang  Dipapar  dengan  Lipopolysaccharide (LPS) dan Alfa Pinen. Tesis Program Studi Biomedik Kekhususan Farmakologi. Program Pasca Sarjana. Universitas
Brawijaya. Malang.
6. Murtyastami, K. 2008. Kajian Efek α -Pinen terhadap  iNOS  (Inducible  Nitric  Oxide
Synthase) pada  Kultur  Sel  Neuron-Glia yang  Dipapar  Lipopolisakarida  (LPS). Skripsi Jurusan Biologi. Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam. Universitas Brawijaya. Malang. 7. Shefi, O., I. Golding, R. Segev, E. B. Jacob, A. Ayali. 2002. Characterization of in vitro Neuronal Networks Morphological. Physical Review. 66 : 021905. 8. Ray, J., D. A. Peterson, M. Schinstine,  dan
F. H. Gage. 1993. Proliferation, Differentiation,  and  Long-Term  Culture  of
Primary  Hippocampal  Neurons. Journal  of
Neurobiology. 90 : 3602-3606.
9. Sadler,  T.  W.  2004.  Langman’s  Medical Embryology,  Ninth  Edition.  Lippincott Williams and Wilkins. USA.
10. Listiani, R. F. D. 2008. Kajian Pengaruh α - Pinen  terhadap  Konsentrasi  NO  (Nitric Oxide)  pada  Kultur  Sel  Neuron-Glia  yang Dipapar  LPS  (Lipopolisakarida). Skripsi Jurusan  Biologi.  Fakultas  Matematika  dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Brawijaya. Malang.
11.Kriegsten,  A.  R.  dan  M.  A.  Dichter. 1983. Morphological Classification of Rat Cortical  Neurons  in  Cell  Culture. Journal of Neuroscience. Volume 3. 1634-1647.
12.Junqueira, L. C.,  J. Carneiro, R. O. Kelley (Alih  bahasa  Jan  Tambayong).  1995. Histologi Dasar. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.
13.Sodersten, E. 2009. On Molecular Mechanism  of  Neural  Differentiation  and Forebrain Development. Karolinska Institutet. Swedia.
Gambar 3. Morfologi  sel  neuron mature. A.  Neuron  bipolar.  B.  Neuron  piramidal.  C.  Neuron multipolar
Gambar 4. Perkembangan morfologi sel neuron dari kultur hari pertama sampai dengan hari keempat belas (A-N),  Imunohistokimia  sel  neuron  dengan  pewarnaan  menggunakan  DAB  tampak  bahwa sitoplasma sel neuron berwarna coklat (O). Perbesaran 200x.