## EFEK KITOSAN TERHADAP VIABILITAS SEL PUNCA LIGAMENTUM PERIODONTAL

## (EFFECT OF CHITOSAN ON THE VIABILITY OF PERIODONTAL LIGAMENT STEM CELL)
Yuniarti Soeroso, Endang Bachtiar, Prayitno
Departemen Periodonsia Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Indonesia Jl. Salemba Raya Jakarta 10430 E-mail: yuniarti_22@yahoo.co.id

## Abstract
Periodontal therapy using bone graft has been attempted to achieve periodontal regeneration. In cellular level, stem cells have been  used  extensively  for  periodontal  regeneration  of  new  bone  formation  in  osteogenesis  process.  The  biological  and mechanical property of chitosan can be used as a scaffold for tissue regeneration. Chitosan has an effect as blood and tissue interphase  in  healing  process  and  non  toxic.  The  aim  of  study  was  to  observed  the  effects  of  chitosan  on  the  ability  of osteogenesis PDL stem  cells, which was evaluated through viabilitas level PDL stem cells. Periodontal ligament stem cells harvested from the  apical  region of healthy and periodontitis third  molar.  Human PDL stem cells  was isolated by magnetic bead selection and identified using an antibody anti Stro-1 (marker of mesenchymal stem cells). PDL stem cells viability was tested using the MTT technique. The samples were divided into  experimental group consisted of  6 PDL stem cells  groups were coated by chitosan 0.025, 0.5, 0.1, 0.15, 0.2, and 0.25% and a control group without chitosan. A total of approximately 10,000 PDL stem cells were cultured with  medium containing of 10% fetal bovine serum (FBS),   10% NCS, penstrep, and 250μg/ml  fungizone/amphoterisin  B.  The  results  showed  that  the  viability  of  PDL  stem  cells  isolated  from  healthy  tooth which  coated  by  chitosan  0,15%,  has  the  higest  proliferation  compared  to  other  groups.  In  conclusions,  the  exposu re  of chitosan 0.15% in PDL cultures showed the highest cell viability, it’s explained that chitosan 0,15% has the highest effect in stimulated cell proliferation.
Key words: stem cell, osteogenesis, chitosan, cell viability

## Abstrak
Pada kerusakan tulang alveolar, pembentukan tulang baru dapat dirangsang oleh bahan yang bersifat merangsang osteogenesis. Kitosandapat sebagai interfase darah dan jaringan serta memiliki efek regeneratif sebagai scaffold pada pertumbuhan tulang. Tujuannya mengamati efek kitosan terhadap sel punca PDL pada proses osteogenesis, diamati melalui viabilitas sel punca PDL. Sel punca dipanen dari apikal gigi molar 3 sehat dan gigi periodontitis, didentifikasi dengan  Antibodi Stro-1.  Kelompok  eksperimental terdiri atas sel punca PDL yang dipapar kitosan 0,025,  0,5,  0,1,  0,15,  0,2  dan  0,25%  dan  kelompok  kontrol  tanpa  dipapar  kitosan.Viabilitasnya  diamati  dengan tehnik MTT . Sejumlah 10.000 sel punca PDL ditebar dalam plat kultur jaringan yang berisi 10% FBS, 10% NCS, penstrep, and 250µg/ml fungizone/amphoterisin B. Hasil penelitian menunjukkan viabilitas sel tertinggi terdapat pada  kelompok  sel  punca  PDL sehat  yang  dipapar  kitosan  0,15% , artinya  pada  konsentrasi  tersebut  kitosan memiliki efek tertinggi dalam menstimuli proliferasi sel.  Kesimpulannya, kelompok sel  punca PDL sehat yang dipapar kitosan menunjukkan viabilitas sel yang tertinggal dalam menstimulasi proliferasi sel.
Kata kunci: sel punca, osteogenesis, kitosan, viabilitas sel

## Pendahuluan
Hasil  survei  distribusi  penyakit  periodontal  di Klinik  Periodontologi  Rumah  Sakit  Gigi  dan  Mulut, Fakultas  Kedokteran  Gigi  Universitas  Indonesia tahun 2002 menunjukkan bahwa periodontitis kro-nis menduduki urutan pertama, yaitu 89%. 1 Perio-
dontitis  kronis  merupakan  penyakit  periodontal yang  paling  sering  terjadi  dan  merupakan penyakit  infeksi,  disebabkan  plak  gigi  yang mengandung  mikroorganisme. 2,3 Gejala  klinis terjadi  perdarahan  saat  probing,  pembentukan poket  periodontal,  ke-rusakan  tulang  alveolar serta kehilangan perlekatan jaringan ikat gigi.
Perawatan periodontitis kronis dapat berupa tinda- kan nonbedah dan bedah periodontal. Pada perio- dontitis berat disertai poket dalam dan kerusakan tulang, perlu dilakukan perawatan bedah periodontal dan kombinasi perawatan regenerasi berupa cang- kok tulang guna menggantikan tulang yang rusak. 4-6
Kondisi ideal yang ingin dicapai pada suatu pe- rawatan  periodontal  adalah  terjadinya  perlekatan baru dan regenerasi periodontal, yang secara klinis terjadi  pendangkalan  poket  dan  rekonstruksi  ja- ringan periodonsium. 4 Pada kenyataannya, suatu pe- rawatan periodontal baik bedah maupun non bedah, sering  terjadi  penyembuhan  yang  disertai pem- bentukan long junctional epithelium, ankilosis tu- lang dan gigi, resorbsi akar, rekurensi poket perio- dontal, resesi karena hilangnya pendukung jaringan periodonsium, sehingga fungsi terganggu dan estetis buruk, atau kombinasi dari keadaan yang ada. 4,5
Pada  regenerasi  periodontal  diharapkan terjadi pembentukan  ligamentum  periodontal,  sementum dan  tulang al
perlu  dimodifikasi  untuk  mengatasi  sifat-sifat dasar-nya. Pemprosesan pembuatan kitosan memenuhi  spesifikasi  dan  standard  BATAN  dan telah berhasil menurunkan sifat viskositasnya yang tinggi  dengan  dilarutkan  dalam  asam  asetat  0,5%. Kitosan  ini  dapat  memenuhi  beberapa  persyaratan sebagai  ba-han  regeneratif  yang  dapat  dijadikan alternatif dalam perawatan periodontal. 7,13,16
Kitosan  pada penelitian  ini  didapat dari  25  gram kulit  udang  campuran  udang  putih  (Penaeus  mer- guiensis),  udang  krosok  (Metepenaeus  sp.)  dan udang  belang  (Parapneosis  sp.)  yang  diproses secara  diasetilasi.  Kemudian  dilakukan chipping dan se-lanjutnya dilakukan radiasi untuk sterilisasi. Pem-prosesan pembuatan kitosan memenuhi spesifikasi  dan  standard  Badan  Tenaga  Atom Nasional (BA-TAN)
dan telah berhasil menurunkan  sifat  visko-sitasnya  yang  tinggi dengan  dilarutkan  dalam  asam  asetat  0,5%.  Tahap 1,  kitosan  dibuat  pada  6  kon-sentrasi  (0,1,  0,5,  1, 1,5, 2, 2,5 dan 3%). 17 Di-lakukan uji viabilitas sel dengan  metode MTT, hasilnya  hanya  kitosan konsentrasi  di  bawah  0,5  yang  memiliki  viabilitas sel  baik.  Tahap  2  pem-buatan  kitosan  konsentrasi 0,025, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, dan 0,25%.
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperimental laboratorik  in  vitro;  dibagi  atas  kelompok  eksperi- mental  yang  terdiri  atas  6  kelompok  sel  punca PDL yang  diisolasi  dari  gigi  sehat  dan  6  kelompok  sel punca PDL yang  diisolasi  dari  gigi  periodontitis  dan dipapar  kitosan  dengan  6  konsentrasi  yaitu  0,025, 0,05,  0,1,  0,15,  0,2  dan  0,25%.  Kelompok  kontrol adalah kelompok sel punca PDL sehat dan sel punca PDL gigi periodontitis tanpa dipapar kitosan.
Penelitian  ini  dilakukan  3  tahap  yaitu:  1)  Di- lakukan  persiapan  pembuatan  kitosan  dengan  ber- bagai  konsentrasi  di  BATAN,  2)  Panen  sel  punca PDL dari gigi sehat dan sel punca PDL gigi dengan diagnosis periodontitis kronis dengan teknik kultur jaringan,  3)  Pemaparan  kitosan  pada  sel  punca PDL yang  diisolasi  dari  gigi  sehat  dan  sel  punca PDL gigi periodontitis kronis. Pengambilan sampel penelitian  dilakukan  di  paviliun  khusus  Rumah Sakit  Gigi  dan  Mulut  FKG  UI.  Kultur  sel  punca ligamentum perio-dontal
dilakukan di Laboratorium Biologi Oral FKG UI.
Sel  punca  dipanen  dari  kerokan  sepertiga  apikal gigi molar 3 sehat dan gigi dengan diagnosis perio- dontitis kronis yang terindikasi ekstraksi. Selanjut- nya dilakukan isolasi sel punca menggunakan mag- netic  bead dan  antibodi anti  STRO-1 ( Magna- Bind TM Protein  A  and  Protein  G  Beads,  Pierce, Rockford,  IL) ,  yang  merupakan  penanda  sel  punca mesenkimal.  Hasil  isolasi  stem  sel  selanjutnya  di- identifikasi menggunakan metoda imunositokimia
dengan  antibodi  anti  Stro-1.  Pada  proses  kultur sel  magnetic beads akan terlepas dari  sel  punca. Untuk  mengkonfirmasi  bahwa  hasil  isolasi  sel punca adalah benar positif STRO-1 maka setelah panen  sel  punca  dilakukan  identifikasi  sel punca secara  imu-nositokimia  menggunakan  anti  bodi anti STRO- 1 yang berlabel FITC.
Pemaparan  kitosan  pada  sel  punca PDL sehat  dan sel  punca PDL gigi  periodontitis , dan  diamati  via- bilitas  sel  nya  dengan  Uji  MTT. 23 Uji  viabilitas menggunakan  Uji MTT  (3-(4,5-Di-methylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium  bromide,  a  yellow  tetra- zole) dianggap sebagai  metode  yang  tepat  untuk mengetahui  viabilitas  sel.  Penelitian  ini  untuk  me- nentukan bahwa kitosan tidak toksik terhadap asi-
diinduksi kitosan 0,15% ( p<0,001).
Gambar  2.  Viabilitas  Sel  Setelah  Dipapar  Kitosan 0,025,  0,05,  0,1,  0,15,  0,2  dan  0,25% dengan Me-tode MTT **p<0,01

## PEMBAHASAN
Kemampuan  antibodi  anti Stro-1 dalam  men- deteksi keberadaan sel punca tidak ditentukan oleh kondisi klinis dari keadaan sampel PDL baik yang diisolasi dari jaringan PDL gigi sehat maupun gigi yang  periodontitis.  Keadaan  ini  dapat  dikaitkan dengan  kondisi  klinis  bahwa  walaupun  jumlah  sel punca  pada  keadaan  periodontitis  hampir  sama dengan keadaan kondisi sehat, tetapi kemungkinan kemampuan  berproliferasinya  berbeda  dengan  ke- adaan  sehat.  Kapasitas  terbesar  dari  tulang  untuk beregenerasi  secara  sempurna  dilihat  dari  ke- beradaan sel punca, dan keberadaannya antara lain dapat dikonfirmasi dengan antibodi anti Stro-1.
Dari  gambar  1  hasil  uji MTT mununjukkan viabilitas  sel  punca  yang  dipapar  kitosan  konsentrasi 0,5%  hingga  2,5%  sangat  rendah  dan  jauh  di  bawah kontrol.  Dari  penelitian  ini  ternyata  konsentrasi kitosan yang dibutuhkan sel punca PDL sehat dan sel punca PDL yang diisolasi dari gigi periodontitis pada proses  osteogenesis  adalah  berbeda.  Agaknya kemungkinan  bahwa  keparahan  kerusakan  tulang alveolar  atau  keparahan  penyakit  periodontal  sangat mempengaruhi  kemampuan  sel  punca  untuk  ber- proliferasi  dalam  menerima  induksi  suatu  bahan regeneratif setelah dipapar kitosan.
Gambar  2  hasil  uji MTT pada  pengamatan  panjang gelombang  490  nm  terlihat  viabilitas  sel  punca tertinggi  pada  kelompok  sel  punca PDL sehat  yang diinduksi  kitosan  0,15%  (  p<0,001)  artinya  pada konsentrasi  tersebut  kitosan  merangsang  pro-liferasi sel  punca PDL sehat.Viabilitas  sel  punca  yang dipapar kitosan pada konsentrasi 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25  terlihat  di  bawah  kontrol.  Pada  kelompok  sel punca PDL yang diisolasi dari penderita periodontitis terlihat di bawah kontrol. Dari hasil
penelitian  ini  juga  menunjukkan  perlunya pertimbangan  klinis  yang  teliti  dalam  memper- tahankan  gigi  dengan  kelainan  periodontal  pada kerusakan  lebih  dari  sepertiga  akar,  karena  ke- mampuan  regenerasi  sel  punca pada keadaan  ini telah menurun.
Dapat  disimpulkan  bahwa  paparan  kitosan  pada sel  punca  ligamentum  periodontal  gigi  yang  sehat beregenerasi  lebih  baik  daripada  paparan  kitosan pada sel punca yang berasal dari gigi periodontitis. Paparan  kitosan  0,15%  pada  sel  punca  PDL  me- nunjukkan  viabilitas  sel  tertinggi  artinya  pada konsentrasi tersebut kitosan memiliki efek tertinggi dalam  menstimuli  proliferasi  sel.  Kitosan  terbukti tidak  toksik  terhadap  sel  punca  ligamentum  perio- dontal  manusia,  dan  mempunyai  efek  dalam  me- ningkatkan  proses  osteogenesis  sel  punca  liga- mentum periodontal

## Daftar Pustaka
1. Syafril  Y.  The  Diagnosis  of  periodontal  diseases in periodontal  clinic,  Dental Hospital, University of  Indonesia.  In:  Bartold  PM.Current  trends  in perio-dontal  diagnosis.  Diseases  recognition  and manage-ment. Brisbane. Asian Pasific Society of Perio-dontology. 2003: 34-38.
2. Beck  JD,  Arbes  SJ.  Epidemiology  of  gingival  and periodontal  diseases.  In  Newman  MG,  Takei  HH, Klokkkevold PR, Carranza FA. Carranza’s Clinical Periodontology. St Louis: Saunders, 2006; 110-31.
3. Albandar J M, Tinoco E M. Global epidemiology of  periodontal  diseases  in  children  and  young persons. Periodontol 2000 2002; 29: 153-76.
4. Carranza  FA,  Henry  HT,  and  David  L,  Cochran. Reconstructive periodontal surgery.Clinical Perio-dontology  10  ed.  Philadelphia:  Saunders, 2006: 968-90.
5. Kinane D F, J. L, Trombelli L. Chronic periodontitis In Lindhe J, Lang NP, Karring T.Clinical perio-dontology and  implant  dentistry. 5 th  Ed,  Oxford  UK  Blackwell Munksgaard, 2008: 420-27.
6. Bhongade  M,  L,,  Tiwari  I,  R.,.  A  Comparative eva-luation  of  the  effectiveness  of  an  anorganic bone matrix/cell binding p
5.(0)40phodontitTJ  E and7.3 24 TJ  ET  05.9 3tro
10. Seo  BM,  Miura  M,  Gronthos  S,  Barthold  PM, Batouli S, Brahim J, et al. Investigation of multi- potent  postnatal  stem  cells  from  human periodontal ligament. Lancet 2004; 364: 149-55.
11. Fwu-Long  Mi,  Chin-Tsung  Huang,  Hsiang-Fa Liang,  Mei-Chin  Chen,  Ya-Ling  Chiu,  Chun- Hung Chen, et al. Phsicochemical, antimicrobial, and  cytotoxic  characteristics  of  a  chitosan  film cross-linked  by  naturally  occurring  cross-linking agent, aglycone geniopocidic acid. J. Agric Food Chem 2006; 54: 3290-96.
12. Syafril  Y,  Endang  Winiati  B,  BM.  B.  Prospek pemnberian  Poly-N-  Acetyl  glycosaminoglycan  (chi- tosan) dari limbah kulit udang pada osteogenesis stem sel ligamen periodontal.( Unpublished ). 2009.
13. Yamada S, Ganno T, Ohara N, Hayashi Y. Chitosan monomer accelerates alkaline phosphatase activity
on human osteoblastic cells under hypofunctional conditions.  J  Biomed  Mater  Res  A  2007;  83(2): 290-5.
14. Matsunaga T, Yanagiguchi K, Yamada S, Ohara N, Ikeda  T,  Hayashi  Y.  Chitosan  monomer  promotes tissue  regeneration  on  dental  pulp  wounds.  J Biomed Mater Res A 2006 15; 76(4): 711-20.
15. Polimeni G, Albandar JM, Wikesjo UME. Prognos- tic factors for alveolar regeneration: effect of space provision. J Clin Periodontol 2005; 32: 951-54.
16. 17.  Satsangi  ASN,  Glover  R,  Satsangi  RK,  Ong JL. Osteoblast response to phospholipid modified titanium  surface.  Biomaterials  Nov;  2003; 24(25): 4585-9.
17. Katalinich  M.  Characterization  of  chitosan  films for cell culture applications. University of Maine, 2001: 2-24.