PENELUSURAN POTENSI FRAKSI n -HEKSAN DAN ETIL ASETAT DARI EKSTRAK METANOL DAUN GUGUR KETAPANG ( Terminalia catappa L.) SEBAGAI ANTIDIARE
Maulita Cut Nuria 1 * ; Zumrotul Chabibah 1 ; Syahar Banu 1 ; Risha Fillah Fithria 1 1 Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang *Email : cut.nuria@yahoo.com

## ABSTRAK
Daun  ketapang  (Terminalia  catappa  L.).  secara  empiris  digunakan  sebagai  obat  diare. Bakteri  yang  dapat  menyebabkan  diare  adalah  E.  coli  dan  S.  aureus.  Beberapa  penelitian melaporkan bahwa ekstrak metanol daun ketapang memiliki aktivitas antibakteri, serta daun gugur  ketapang  memiliki  aktivitas  antibakteri  lebih  besar  daripada  daun  hijau.  Daun ketapang  mengandung  senyawa  golongan  flavonoid,  tanin    dan    terpenoid . Penelitian    ini bertujuan    untuk    menelusuri  potensi  fraksi  n-heksan  dan  etil  asetat  dari  ekstrak  metanol daun  gugur  ketapang  segar  dan  kering  sebagai  antidiare,  serta  mengidentifikasi  senyawa aktif dalam fraksi tersebut.
Bahan  yang  digunakan  adalah  daun  gugur  segar  dan  kering  ketapang  yang  disari  dengan pelarut  metanol  menggunakan  metode  maserasi  dan  difraksinasi  secara  bertingkat  dengan pelarut  n-heksan  dan  etil  asetat  (EA).  Kedua  fraksi  tersebut  kemudian  diuji  aktivitas antibakterinya terhadap E. coli dan S. aureus menggunakan metode difusi agar, dengan seri konsentrasi 1000; 500; 250; 125; dan 62,5 µg/disk. Identifikasi senyawa aktif menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Kedua fraksi  uji  mempunyai  aktivitas  antibakteri   terhadap  E. coli dan S. aureus mulai konsentrasi 62,5 µg/disk. Hasil KLT fraksi n-heksan menunjukkan adanya senyawa terpenoid sedangkan fraksi EA mengandung senyawa flavonoid.
kata kunci  : Fraksi  n-heksan  dan  etil  asetat  dari  ekstrak  metanol  daun  gugur  ketapang, E. coli, S. aureus, terpenoid, flavonoid.

## 1. PENDAHULUAN
Diare  merupakan  salah  satu  penyebab  utama  angka  kesakitan  dan  kematian  yang cukup  tinggi  di  negara-negara  berkembang.  Data  beberapa  rumah  sakit  di  Indonesia menunjukkan diare akut karena infeksi berada pada peringkat pertama  sampai keempat bagi pasien  dewasa  yang  datang  berobat.  Penyebab  utama  disentri  di  Indonesia  adalah Shigella, Salmonella dan Escherichia  coli .  Di  negara  maju  dengan  kondisi  kesehatan  dan  ekonomi masyarakat  yang  lebih  baik  namun  insiden  diare  infeksi  tetap  tinggi  dan  masih  menjadi masalah kesehatan. Di negara Inggris, 1 dari 5 orang menderita diare infeksi setiap tahunnya dan 1 dari 6 orang pasien yang berobat ke praktek umum menderita diare infeksi. Tingginya kejadian diare di negara Barat ini disebabkan bakteri Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus dan Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) (Zein dkk., 2004).
Meningkatnya penggunaan obat tradisional dan penelitian terhadap kandungan kimia tanaman,  membuat  obat  tradisional  semakin  diketahui  fungsinya  dalam  pengobatan. Obat tradisional  tersebut  tidak  hanya  digunakan  dalam  fase  pengobatan  saja,  melainkan  juga
digunakan  dalam  fase  preventif,  promotif  dan  rehabilitatif.  Obat  tradisional  banyak digunakan  karena  keberadaannya  yang  mudah  didapat,  ekonomis,  dan    memiliki  efek samping  relatif  rendah  serta  adanya  kandungan  senyawa  aktif  yang  memiliki  efek  saling mendukung  secara  sinergis.  Namun  selain  keuntungan  yang  dimilikinya,  bahan  alam  juga memiliki  beberapa  kelemahan  yaitu  efek  farmakologisnya  yang  lemah,  bahan  baku  belum terstandar,  belum  dilakukan  uji  klinik  dan  mudah  tercemar  berbagai  jenis  mikroorganisme (Katno dan Pramono, 2008).
Salah satu tanaman yang banyak dimanfaatkan sebagai tanaman obat adalah ketapang ( Terminalia  catappa L.).  Ketapang  secara  empiris  digunakan  sebagai  obat  diare,  penyakit kulit,  sariawan,  dan  lain-lain  (Anonim,  1986 a ).  Babayi  dkk.,  (2004)  melaporkan  bahwa ekstrak  metanol  daun  ketapang mempunyai  aktivitas  antibakteri  terhadap Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis . Suksmawan dkk., (2004) melaporkan ekstrak etanol dan ekstrak air  dari  daun  gugur  dan  daun  hijau  ketapang memiliki  aktivitas  terhadap  bakteri,  namun aktivitasnya  lebih  baik  pada  daun  gugur  dibandingkan  daun  hijau.  Dewi  dkk.,  (2004)  juga telah  melakukan  penapisan  fitokimia  daun  ketapang yang  menunjukkan  adanya  senyawa golongan flavonoid, tanin, dan terpenoid.
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui potensi fraksi n-heksan dan etil asetat dari ekstrak metanol daun gugur ketapang segar maupun kering terhadap bakteri penyebab diare yakni S. aureus dan E. coli dan pengujian dilakukan secara in vitro. Tujuan  akhir penelitian ini adalah menentukan potensi kedua fraksi tersebut sebagai anti diare.
2. METODE PENELITIAN

## 2.a. Bahan yang digunakan
1. Bahan  penelitian  :  daun  gugur  ketapang  ( Terminalia  catappa L.)  segar  maupun  yang telah  dikeringkan,  diperoleh  dari  Taman  Wisata  Pendidikan  Biologi  Universitas  Negeri Semarang yang dipanen pada pagi dan sore.
2. Bahan penyari : metanol (kualitas teknis)
3. Bahan  untuk  fraksinasi  dengan  metode  partisi  cair-cair  : n- heksan,  etil  asetat,  akuades dan metanol.
4. Bahan untuk uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar :
a) Bakteri : Staphylococcus  aureus ATCC  25923 dan Escherichia  coli ATCC 25922 b) Media : Nutrient broth (NB) (Merck), Nutrient agar (NA) (Oxoid)
c) Kontrol positif :  kloramfenikol 30 µg/ disk (Oxoid) d) Kontrol negatif : Dimetilsulfoxide (DMSO) (Merck)
5. Bahan  untuk  uji  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT)  yakni  identifikasi  terpenoid  dan flavonoid adalah :
a) Fase  diam  :  silika  gel  GF 254 (Merck)  untuk  identifikasi  terpenoid  dan  selulosa (Merck) untuk identifikasi flavonoid.
b) Fase  gerak  :  toluen-etil  asetat  (9:1)  untuk  identifikasi  terpenoid  dan  kloroform- aseton-asam formiat (60:15:5) untuk identifikasi flavonoid (kualitas pro analisis)
c) Penampak  bercak  :  anisaldehid-asam  sulfat  untuk  identifikasi  terpenoid  dan  uap amonia untuk identifikasi flavonoid
d) Baku  pembanding  terpenoid  :  terpineol  (Merck)  untuk  identifikasi  terpenoid  dan kuersetin (Sigma) untuk identifikasi flavonoid.

## 2.b. Alat yang Digunakan
Alat  yang  digunakan  adalah  blender  (Maspion),  timbangan    kilogram  (Five  Goats), timbangan gram (ACII), moisture balance (Ohauss MB 23), rotary evaporator (Heidolph tipe :  Hei-VAP),  viskosimeter  (Iscotester),  inkubator  (Binder),  autoklaf  (All  American),  oven (Memmert), Laminar Air Flow (LAF) (LAF 105/1 18), timbangan analitik (OHAUS AR2140 dengan kepekaan 0,0001 gram), bejana kromatografi, lampu UV 254 nm , UV 366 nm .

## 2.c. Jalannya Penelitian
2.c.1. Identifikasi Daun Ketapang
Identifikasi  daun  ketapang  dilakukan  di  Laboratorium  Ekologi  dan  Biosistematik Jurusan  Biologi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam  Universitas  Diponegoro Semarang.  Identifikasi  menggunakan  daun  hijau  yang  masih  menempel  pada  pohon ketapang.  Hal  ini  dimaksudkan  agar  tidak  terjadi  kesalahan  dalam  pengambilan  bahan  yang akan diidentifikasi.
2.c.2. Pengumpulan dan Pengeringan Daun Gugur ketapang Daun  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  merupakan  daun  gugur  berwarna  merah.
Daun  kemudian  disortasi,  dicuci  dengan  air  bersih  mengalir  untuk  menghilangkan  pengotor yang  menempel.  Selanjutnya  daun  ditiriskan,  dan  diangin - anginkan  selama            30  menit. Pengeringan daun ketapang dilakukan dengan oven pada suhu 50°C selama      2 hari. Daun yang  sudah  kering  dibuat  serbuk  dengan  cara  diblender,  kemudian  diayak  dengan menggunakan ayakan berukuran 50 mesh serta diukur kadar airnya .
2.c.3. Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Gugur Ketapang
Rajangan daun gugur segar 2800 g dimaserasi menggunakan pelarut metanol sebanyak 28  L,  sedangkan  serbuk  daun  gugur  kering  sebanyak  1070  g  dimaserasi  dengan  pelarut metanol  sebanyak  10,7  L.  Proses  maserasi  terdiri  dari  dua  tahap.  Maserasi  tahap  pertama menggunakan  60 bagian  pelarut  metanol  untuk  rajangan  daun  gugur  segar  yaitu  16,8  L  dan untuk serbuk daun gugur kering yaitu 6,42 L. Pada tahap kedua digunakan   40 bagian pelarut metanol untuk rajangan daun gugur segar yaitu  11,2 L dan untuk serbuk daun gugur kering 4,28  L.  Maserat  yang  diperoleh  kemudian  dienaptuangkan  dan  endapannya  dibuang, sedangkan  filtratnya  dipekatkan  dengan rotary  evaporator dengan  suhu  60°C  sampai diperoleh ekstrak kental, kemudian diukur viskositas dan rendemennya.
2.c.4. Pembuatan Fraksi Uji dari Ekstrak Metanol Daun Gugur Ketapang
Ekstrak  kental daun  gugur ketapang  segar sebanyak 225 g dilarutkan dalam        1100 mL air dan 127 g ekstrak kental daun gugur kering ketapang dilarutkan dalam     600 mL air sampai  seluruh  ekstrak  larut.  Ekstrak  kental  dari  daun  gugur  segar  dapat  sepenuhnya  larut dalam  air,  sedangkan  ekstrak  kental  dari  daun  gugur  kering  tidak  sepenuhnya  dapat  larut, maka  ditambahkan  150  mL  campuran  air  :  metanol  (9  :  1).  Fase  air-metanol  selanjutnya difraksinasi  secara  bertingkat  dengan  metode  partisi  cair-cair.  Proses  ini  dilakukan menggunakan  corong  pisah  dengan  pelarut n -heksan  terlebih  dahulu,  kemudian  dilanjutkan dengan  memfraksinasi  fase  air  dengan  pelarut  etil  asetat.  Proses  ini  dilakukan  hingga  fase yang  diinginkan  (baik n -heksan  maupun  etil  asetat)  menjadi  jernih      (4-5  kali  penambahan pelarut), sehingga komponen senyawa aktif yang dikehendaki dapat tersari seluruhnya.
Jumlah  pelarut  yang  digunakan  untuk  fraksinasi  sebanding  dengan  volume  air  yang ditambahkan ke dalam ekstrak metanol (perbandingan 1 : 1). Ketiga fraksi tersebut kemudian ditampung  dan  diuapkan  pelarutnya  dengan  menggunakan rotary  evaporator sampai diperoleh  fraksi  kental.  Fraksi-fraksi  tersebut  kemudian  ditimbang    dan  diuji  aktivitas
antibakterinya.
2.c.5. Pembuatan Fraksi Uji
Fraksi uji dibuat larutan  stok dengan konsentrasi 100 mg/mL dengan  cara melarutkan fraksi menggunakan pelarut DMSO hingga homogen. Pengenceran dibuat bertingkat dengan empat  seri  konsentrasi  (50  ;  25  ;  12,5  ;  dan  6,25  mg/mL).  Konsentrasi  fraksi  uji  kemudian dikonversi dalam satuan µg/disk disesuaikan dengan kontrol positifnya. 2.c.6. Pengujian Aktivitas Antibakteri
Uji  ini  dilakukan  dengan  metode  difusi  menggunakan  teknik  pour  plate.  Suspensi masing-masing  bakteri  uji  sebanyak  200  µL  dicampur  ke  dalam  20  mL  media  NA  (dalam keadaan  hangat),  kemudian  dituang  ke  dalam  cawan  petri  lalu  ditunggu  hingga  media memadat. Masing-masing seri  konsentrasi fraksi  uji diambil sebanyak 10 µL lalu diteteskan di atas paperdisk. Paperdisk yang mengandung fraksi uji diletakkan di atas permukaan media agar,  dan  diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  18-24  jam  (Anonim,  1993).  Kontrol  positif (kloramfenikol 30 µg/disk) dan kontrol negatif  (paperdisk yang telah ditetesi pelarut DMSO) juga  diaplikasikan  pada  media  agar,  inkubasi  pada  suhu  37°C  selama  18-24  jam.  Parameter adanya  aktvitas  antibakteri  ditunjukkan  dengan  terbentuknya  zona  jernih  di  sekeliling paperdisk    yang  kemudian  diamati,  diukur,  dan  dihitung  rata-ratanya.  Zona  jernih  tersebut dinyatakan sebagai DDH (diameter daerah hambat).
2.c.7. Identifikasi Senyawa Aktif dalam Fraksi Uji dengan Metode KLT Bejana  kromatografi  sebelumnya  dijenuhi  dahulu  dengan  fase  geraknya.  Fraksi  uji kemudian  dilarutkan  dalam  metanol  dan  ditotolkan  pada  lempeng  silika  gel  GF 254 ,  setelah totolan mengering, lempeng KLT  kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh dengan fase gerak, sehingga terjadi proses elusi. Lempeng KLT yang telah dielusi dikeringkan  dengan  cara  diangin-anginkan.  Hasilnya  diamati  di  bawah  lampu  UV 254  nm dan UV 366 nm , lalu dideteksi warna bercak yang dihasilkan. Kromatogram yang dihasilkan diamati berdasarkan  warna  yang  terbentuk  pada  bercak  dan  kesesuaian  bercak  senyawa  uji  dengan bercak senyawa pembanding. Bercak yang teridentifikasi dihitung nilai Rf-nya.
2.d. Analisis Data
Analisis  data  untuk  hasil  uji  aktivitas  antibakteri  adalah  bila  fraksi  uji  menghasilkan nilai  DDH  yang  lebih  dari  6  mm,  maka  fraksi  uji  dikatakan  memiliki  aktivitas  antibakteri. Analisis  data  untuk  identifikasi  senyawa  aktif  terpenoid  dilakukan  dengan  melihat  bercak warna  ungu  setelah  disemprot  anisaldehid-asam  sulfat  dan  warna  kuning  setelah  diuapi amoniak  untuk  senyawa  flavonoid.  Bercak  senyawa  uji  yang  terbentuk  kemudian dibandingkan  dengan  bercak  senyawa  standar,  lalu  dilakukan  perhitungan  nilai  Rf  pada masing-masing bercak (Sastrohamidjojo, 1985).

## 3. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

## 3.a. Identifikasi Daun
Tujuan  identifikasi  adalah  untuk  mengetahui  identitas  dan  memastikan  daun ketapang (Terminalia  catappa L.).  Hasil  identifikasi  menunjukkan  bahwa  daun  yang digunakan benar-benar daun ketapang.
3.b. Pengumpulan dan Pengeringan Daun Gugur Ketapang
Hasil perhitungan kadar air terhadap daun gugur kering ketapang adalah sebesar 2%. Hal ini sesuai dengan persyaratan simplisia yang baik bahwa kadar air tidak lebih dari 10%.

## 3.c. Ekstraksi Daun Gugur Ketapang
Ekstrak  kental  yang  diperoleh  dari  daun  gugur  segar  adalah  301,24  g  dengan rendemen sebesar 10,76 % b / b , sedangkan yang berasal dari daun gugur  kering menghasilkan ekstrak  kental  sebanyak  167,36  g  dengan  rendemen    15,64  % b / b. Viskositas  ekstrak  daun gugur  segar  dan  kering  ketapang  masing-masing  sebesar  40  dpa’s  dan                70  dpa’s  yang berarti  daun  gugur  kering  lebih  kental  dari  pada  daun  gugur  segar.  Perbedaan  viskositas tersebut disebabkan pada daun gugur kering memiliki ukuran partikel yang lebih kecil akibat proses  pengubahan  bentuk  menjadi  serbuk.  Oleh  karena  itu  cairan  penyari  mungkin  lebih banyak menarik senyawa aktif.

## 3.d. Fraksinasi Ekstrak Metanol Daun Gugur Ketapang
Ekstrak  difraksinasi  dengan  teknik  partisi  cair-cair.  Tujuan  fraksinasi  adalah  untuk memisahkan  komponen - komponen  senyawa  aktif  dari  ekstrak  yang  telah  dihasilkan. Pemisahan secara partisi cair-cair harus memiliki perbedaan kelarutan antara pelarut dan zat terlarut serta kedua pelarut yang digunakan tidak saling bercampur.
Hasil proses fraksinasi bertingkat dari kedua fraksi uji disajikan pada tabel I berikut ini :
Tabel I. Hasil Fraksinasi dari Ekstrak Metanol Daun Gugur Ketapang Fraksi uji Jenis daun gugur Organoleptis Volume yang dihasilkan (mL) Bobot fraksi kental (gram) n- heksan Segar Warna hijau 2500 3,12 Kering Warna hijau 1700 0,50 Etil asetat Segar Warna coklat 4000 21,79 Kering Warna coklat 1900 3,48

## 3.d. Uji Aktivitas Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri pada kontrol positif maupun negatif memberikan hasil bahwa  kontrol  negatif  tidak  memiliki  aktivitas  antibakteri.  Hal  ini  ditandai  dengan  tidak adanya zona hambatan disekitar paperdisk , sedangkan kontrol positif (kloramfenikol) mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri  uji.    Antibiotik  kloramfenikol  30  µg/ disk menghasilkan DDH  sebesar  20,00-23,60  mm.  Hasil  pengamatan  terhadap  kedua  fraksi  uji  menunjukkan bahwa fraksi uji memiliki aktivitas antibakteri terhadap  bakteri uji. Hal tersebut ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambatan di sekeliling paperdisk.
Penelitian ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi 62,5-1000 µg/ disk , fraksi  uji n - heksan mampu memberikan nilai DDH pada S. aureus dan E. coli berkisar antara 6,88-20,65 mm. Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi uji n -heksan yang berasal dari daun gugur segar dan kering ternyata memberikan nilai DDH yang hampir sama terhadap bakteri  uji,  yakni fraksi uji n -heksan  daun  gugur  segar  memberikan  nilai  DDH  yang  lebih  besar  dari  daun  gugur kering terhadap bakteri uji. Perbedaan ini kemungkinan diakibatkan oleh proses pengeringan yang menggunakan oven. Daun gugur kering bisa mengalami pengurangan jumlah komponen dan  konsentrasi  senyawa  yang  mudah  menguap  yang  kemungkinan  besar  dapat  ditarik  oleh pelarut n -heksan. Bila dilihat dari nilai DDH maka aktivitas antibakteri fraksi uji tidak lebih baik dibandingkan kontrol positifnya. Namun karena DDH  yang dihasilkan fraksi uji cukup besar  maka  hasil  ini  bisa  dikembangkan  lebih  lanjut  khususnya  sebagai  antidiare.  Besarnya nilai DDH yang dihasilkan fraksi uji n -heksan dapat dilihat pada Tabel II.
Pada  konsentrasi  125  µg/ disk ,  fraksi  uji  etil  asetat  (EA)  daun  gugur  segar  aktif terhadap semua bakteri uji, namun pada daun gugur kering hanya aktif pada S. aureus tetapi tidak  aktif terhadap E. coli . Pada konsentrasi 62,5 µg/ disk fraksi EA  yang berasal dari daun gugur  segar  maupun  kering  hanya  dapat  menghambat S.  aureus namun  tidak  bisa menghambat E.  coli. Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  bakteri E.  coli lebih  tahan  terhadap pengaruh fraksi EA dibandingkan dengan bakteri S. aureus .
Tabel II. Diameter Daerah Hambat (DDH) yang dihasilkan fraksi n -heksan terhadap bakteri uji, diameter paperdisk 6 mm.
Perbedaan  kepekaan  diantara  kedua  bakteri  uji  dipengaruhi  oleh  perbedaan  struktur membran  sel  bakteri,  seperti  jumlah  peptidoglikan  dan  jumlah  lipid,  serta  adanya  enzim pendegradasi  yang  mampu  memecah  senyawa  aktif  yang  ada  dalam  fraksi  uji. E.  coli mempunyai  membran  sel  dengan  kandungan  lipid  yang  tinggi  (11-22  %)  dan  struktur membran  sel  yang  berlapis  tiga  (multilayer)  yaitu  lipoprotein,  membran  luar  fosfolipid (lapisan  dalam),  dan  lipopolisakarida  (lapisan  luar)  tersusun  atas  lipid  A  yang  bersifat  non polar.  Senyawa  aktif  yang  terkandung  dalam  fraksi  uji  memiliki  sifat  semipolar  sehingga lebih mudah menembus lapisan peptidoglikan yang bersifat semipolar daripada lapisan lipid yang  non  polar.  Hal  ini  yang  menyebabkan  senyawa  tersebut  lebih  sulit  untuk  masuk  ke dalam membran sel bakteri E. coli , sehingga bakteri ini lebih tahan terhadap pengaruh fraksi uji.  Selain  itu  bakteri E.  coli memiliki  membran  luar  fosfolipid  yang  berfungsi  sebagai pertahanan  selektif  senyawa-senyawa  yang  keluar  atau  masuk  sel  dan  menyebabkan  efek toksik,  sehingga  dapat  mengurangi  masuknya  zat  antibakteri  ke  dalam  sel  (Jawetz et  al ., 2005).  Mekanisme  lainnya  kemungkinan  adalah E.  coli mengaktifkan  pompa  efluks  untuk
Bakeri uji Perlakuan S. aureus E. coli Rata-rata DDH ± SEM (daun gugur segar) Rata-rata DDH ± SEM (daun gugur kering) Rata-rata DDH ± SEM (daun gugur segar) Rata-rata DDH ± SEM (daun gugur kering) Kloramfenikol 30 µg/ disk 23,06 ± 0,19 20,00 ± 0,85 Fraksi uji konsentrasi 1000 µg/ disk 20,65 ± 0,44 20,60 ± 0,90 19,12 ± 0,63 18,93 ± 0,35 Fraksi uji  konsentrasi 500 µg/ disk 17,98 ± 0,04 17,30 ± 0,20 15,58 ± 0,39 14,84 ± 0,02 Fraksi uji  konsentrasi 250 µg/ disk 13,89 ± 0,35 13,67 ± 0,33 13,35 ± 0,28 13,25 ± 0,06 Fraksi uji  konsentrasi 125 µg/ disk 12,68 ± 0,21 12,22 ± 0,43 11,91 ± 0,55 11,91 ± 0,38 Fraksi uji  konsentrasi 62,5 µg/ disk 12,24 ± 0,35 10,67 ± 0,15 9,68 ± 0,51 6,88 ± 0,39 DMSO - - - -
membuang keluar zat antibakteri yang ada di dalam sel (Alvarez et al ., 2008). Besarnya nilai DDH yang dihasilkan fraksi uji EA dapat dilihat pada Tabel III.
Tabel  III.  Diameter  Daerah  Hambat  (DDH)  yang  dihasilkan  fraksi  etil  asetat,  kontrol positif,  dan  kontrol  negatif  terhadap  bakteri  uji,  dengan  diameter paperdisk
6 mm Bakteri uji Perlakuan S. aureus E. coli Rata-rata DDH ± SEM (daun gugur segar) Rata-rata DDH ± SEM (daun gugur kering) Rata-rata DDH ± SEM (daun gugur segar) Rata-rata DDH ± SEM (daun gugur kering) Kloramfenikol 30 µg/ disk 23,06 ± 0,07 20,00 ± 1,25 Fraksi uji konsentrasi 1000 µg/ disk 19,20 ± 0,04  19,12 ± 0,03 18,65± 0,05 18,26 ± 0,02 Fraksi uji konsentrasi 500 µg/ disk 17,32 ± 0,19  17,20 ± 0,03 17,11 ± 0,33 17,07 ± 0,02 Fraksi uji konsentrasi 250 µg/ disk 16,70 ± 0,09  16,46 ± 0,29 13,92 ± 0,07 13,28 ± 0,02 Fraksi uji konsentrasi 125 µg/ disk 14,05 ± 0,01  12,68 ± 0,13 11,98 ± 0,13 - Fraksi uji konsentrasi 62,5 µg/ disk 8,64 ± 0,11 8,47 ± 0,19 - - DMSO - - - -
Fraksi n- heksan  dapat  menyari  senyawa  terpenoid  yang  diduga  terkandung  dalam daun  gugur  ketapang  baik  segar  maupun  kering.  Pengamatan  bercak  di  bawah  sinar  visibel menghasilkan  tiga  bercak  berwarna  ungu  pada  fraksi  uji  daun  gugur  segar  (GS)  dan  daun gugur  kering  (GK),  dimana  warna  bercak  tersebut  menyerupai  warna  bercak  pembanding terpineol. Dapat disimpulkan bahwa dalam fraksi uji mengandung beberapa macam senyawa golongan  terpenoid  mudah  menguap  yang  terdiri  atas  C5-C20.  Oleh  karena  itu  tahapan selanjutnya  dapat  dilakukan  isolasi  dan  identifikasi  secara  spesifik  untuk  mengetahui  jenis senyawa terpenoid. Kromatogram hasil KLT dapat dilihat pada Gambar 1.
Fraksi uji tersebut tidak mengandung terpineol sebab nilai Rf pada fraksi uji baik GS maupun GK berbeda dengan Rf terpineol. Nilai Rf terpineol  adalah 0,32, sedangkan bercak fraksi uji GS adalah A, B, dan C dengan nilai Rf berturut-turut 0,24; 0,39; dan 0,50. Fraksi uji  GK  menghasilkan  bercak  D,  E,  dan  F  dengan Rf masing-masing  sebesar  0,24;0,40  dan 0,58. Dapat disimpulkan ada 3 jenis terpenoid dalam tiap-tiap fraksi uji karena ada 3 nilai Rf .
UV 254 nm UV 365 nm Visibel Keterangan : Sampel : Fraksi n- heksan ekstrak metanol daun gugur ketapang Analisa : Terpenoid Fase Diam : Silika gel F 254 (Al - Sheet) Fase Gerak : Toluen : Etil Asetat (93:7) Pereaksi : Anisaldehid Asam Sulfat Jarak Pengembangan     : 8,5 cm P     : Pembanding Terpineol
GK  : Fraksi n- heksan dari ekstrak metanol daun gugur kering GS   : Fraksi n- heksan dari ekstrak metanol daun gugur segar Warna spot terpenoid di visibel   : violet
Rf : A=0,24;  B=0,39 ;C=0,50; D=0,24; E=0,40; F=0,58; G=0,32
Gambar 1. Kromatogram identifikasi senyawa golongan terpenoid dari fraksi n- heksan ekstrak  metanol  daun  gugur  ketapang  segar  (GS)  dan  kering  (GK) dibandingkan dengan baku pembanding terpineol (P)
Hasil pengamatan terhadap bercak fraksi uji menunjukkan bahwa senyawa terpenoid pada  bercak  A  dan  D  lebih  polar  dibandingkan  dengan  bercak  lainnya  sedangkan  senyawa terpenoid  pada  bercak  F  merupakan  jenis  terpenoid  yang  bersifat  paling  non  polar.  Hal  ini terlihat  dari  sifat  fase  diam  silika  gel  yang  bersifat  polar  dan  fase  gerak  yang  bersifat  non polar,  sehingga  masing-masing  bercak  akan  bergerak  sesuai  dengan  kepolarannya  masing- masing. Semakin besar nilai Rf maka semakin non polar senyawa terpenoid yang dihasilkan. Mekanisme terpenoid sebagai antibakteri adalah dengan cara bereaksi terhadap porin (protein transmembran) yang terletak pada membran luar dinding sel bakteri, lalu membentuk ikatan  polimer  yang  kuat  dan  menyebabkan  rusaknya  porin.  Kerusakan  ini  akan mengakibatkan  berkurangnya  permeabilitas  membran  sel  bakteri  sehingga  sel  bakteri  akan kekurangan nutrisi, yang  akhirnya pertumbuhan bakteri  akan terhambat atau mati   (Cowan, 1999).
Kromatogram yang dihasilkan oleh fraksi etil asetat daun gugur  ketapang segar dan kering  adalah  bercak  berwarna    kuning  setelah  diuapi  amonia  di  daerah  sinar  tampak.
P  GK  GS P  GK  GS P  GK  GS A B C D E F G
Kromatogram  hasil  KLT  dapat  dilihat  pada  Gambar  2.  Nilai Rf pada  bercak  sampel  daun gugur  kering  dan  segar  berturut-turut  adalah  0,66  dan  0,80.  Perbedaan  nilai Rf tersebut dikarenakan  perbedaan  polaritas  dari  senyawa  aktif  yang  terkandung  dalam  fraksi  uji. Senyawa  yang  lebih  polar  akan  berinteraksi  lebih  kuat  dengan  fase  gerak  yang  digunakan, sedangkan senyawa yang  lebih tidak polar akan tertahan lebih kuat pada fase diam selulosa. Bercak dari daun gugur segar ketapang dengan nilai Rf 0,80 mempunyai interaksi lebih kuat dengan fase  gerak  sedangkan  interaksinya dengan fase diam lebih lemah, sehingga senyawa flavonoid  yang  ada  dalam  daun  gugur  segar  bersifat  relatif  lebih  polar  dibandingkan  daun gugur kering dengan nilai Rf 0,66. Perbedaan nilai Rf dikarenakan adanya proses pemanasan pada  daun  gugur  kering  yang  menyebabkan  struktur  kimia  flavonoid  menjadi  berubah. Perubahan  struktur  kimia akan mempengaruhi polaritas dari  senyawa tersebut dan  juga efek antibakterinya. Hal ini bisa dilihat pada profil KLT, dimana nilai Rf dari daun gugur ketapang segar dan kering berbeda.
Berdasarkan  hasil  KLT  terbukti  bahwa  fraksi  uji  yang  berasal  dari  ekstrak  metanol daun gugur ketapang mengandung senyawa flavonoid. Senyawa flavonoid memiliki aktivitas antibakteri  yang  baik  karena  adanya  gugus  fenol.  Mekanisme  flavonoid  sebagai  antibakteri berhubungan dengan pembentukan ikatan kompleks dengan protein pada membran (protein- fenol) sehingga menyebabkan permeabilitasnya turun. Ikatan kompleks yang telah terbentuk kemudian  terurai  dan  berpenetrasi  ke  dalam  sel  sehingga  terjadi  koagulasi  protein  dan menyebabkan  enzim  bakteri  tidak  aktif.  Akibatnya  membran  sel  bakteri  tidak  terbentuk dengan baik sehingga terjadi kebocoran sel dan bakteri mati (Pelczar et al ., 2008).
Katekin  merupakan  senyawa  golongan  flavonoid  dari  buah  belimbing  manis ( Averrhoa  carambola Linn.  L)  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri E.  coli dan S. aureus .    Isolat  senyawa  flavonoid  dari  kulit  akar  awar-awar  ( Ficus  septica Burm  F)  juga memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap Vibrio  cholera dan E.  coli (Sukadana,  2009; Sukadana, 2010).
UV 254 nm
UV 366 nm Visibel Keterangan: Sampel : Fraksi etil asetat ekstrak metanol daun gugur ketapang Analisa : Flavonoid Fase diam : Selulosa Fase gerak :  kloroform-aseton-asam formiat (60 : 15 : 5) Pereaksi : uap amonia Jarak pengembangan   : 8 cm P     : Pembanding kuersetin dengan Rf: 0,63
GK   : Fraksi etil asetat daun gugur kering ketapang GS   : Fraksi etil asetat daun gugur segar ketapang
Warna spot flavonoid di visible  : kuning
Gambar 2. Kromatogram identifikasi senyawa golongan flavonoid dari fraksi etil asetat ekstrak  metanol  daun  gugur  ketapang  segar  (GS)  dan  kering  (GK) dibandingkan dengan baku pembanding kuersetin (P)
Katekin  merupakan  senyawa  golongan  flavonoid  dari  buah  belimbing  manis ( Averrhoa  carambola Linn.  L)  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri E.  coli dan S. aureus .    Isolat  senyawa  flavonoid  dari  kulit  akar  awar-awar  ( Ficus  septica Burm  F)  juga memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap Vibrio  cholera dan E.  coli (Sukadana,  2009; Sukadana, 2010).

## 4. KESIMPULAN
1. Fraksi n-heksan dan etil asetat dari ekstrak metanol daun gugur ketapang segar dan kering memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. aureus dan E. coli.
2. Fraksi  n-heksan  mengandung  senyawa  golongan  terpenoid  sedangkan  fraksi  etil  asetat mengandung flavonoid.

## 5. DAFTAR PUSTAKA
Alvarez, M.A., Debattista, N.B., and Pappano, N.B., 2008, Antimicrobial Activity and Synergism of Some Substituted Flavonoids, Folia Microbiol , 53, 1, 23-28.
Anonim, 1986 a , Medical Herb Index In Indonesia , hal. 85, PT. Eisai, Indonesia.
Babayi,  H.,  Kolo,  I.,  Okogun,  J.I.,  dan  Ijah,  U.J.J.,  2004,  The  Antimicrobial  Activities  of Metanolic  Extract  of Eucalyptus  camaldulensis dan Terminalia  catappa Against Some  Pathogenic  Microorganisms, An  International  Journal  Nigerian  Society  for Experimental Biology , Vol. 16 No 2 , 106-111. Cowan,  M.,  1999,  Plant  Product  as  Antimicrobial  Agent, Clinical  Microbiology  Reviews , Volume 12 , No. 4 , hal. 564-582.
Dewi,  R.,  Gana,  A.,  dan  Ruslan,  K.,  2004,  Pemeriksaan  Kandungan  Flavonoid  dan  Asam Fenolat  Daun  Gugur  Ketapang (Terminalia  catappa L .) , Skripsi ,  Departemen Farmasi Institut Teknologi Bandung, Bandung.
Jawetz, E., Melnick, J.L., dan Adelberg, E., 2005, Mikrobiologi Kedokteran , penerjemah dan editor  oleh  Bagian  Mikrobiologi  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Airlangga,  Edisi Pertama, hal. 265, 285-286, 318, 357, Salemba Medika, Jakarta.
Katno dan Pramono, S., 2008, Tingkat Manfaat dan Keamanan Tanaman Obat Tradisional, hal. 45, Jogjakarta, Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada.
Pelczar,  M.,  Chan,  E.C.S.,  and  Pelczar,  M.F.,  2008, Dasar-dasar  Mikrobiologi , diterjemahkan oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, 514-515, Universitas Indonesia Press, Jakarta.
Sastrohamidjodjo,  H.,  1985, Kromatografi ,  Cetakan  pertama,  hal.  34,  Universitas  Gajah Mada, Yogyakarta.
Sukadana, I.M., 2009, Senyawa Antibakteri Golongan Flavonoid dari Buah Belimbing Manis ( Averrhoa carambola Linn.L), Jurnal Kimia , 3, 2, 109-116.
Sukadana,  I.M., 2010, Aktivitas  Antibakteri  Senyawa Flavonoid dari Kulit Akar  Awar-awar
( Ficus septica Burm F), Jurnal Kimia , 4, 1, 63-70.
Suksmawan,  R.,  Gana,  A.,  dan  Elin,  Y.,  2004,  Uji  Potensi  Antimikroba  Ekstrak  Daun Ketapang (Terminalia  catappa L .) , Skripsi ,  Departemen  Farmasi  Institut  Teknologi Bandung, Bandung.
Zein,  U.,  Sagala,  K.H.,  dan  Ginting,  J.,  2004, Diare  Akut  Disebabkan  Bakteri , www.library.usu.ac.id ., diakses tanggal 29 Agustus 2014.