## DOI: 10.30644/rik.v8i2.359
Potensi Pseudomonas  fluorescens dalam  menghasilkan  asam  salisilat  dengan menggunakan limbah udang sebagai substrat
Ririn Puspadewi * , Putranti Adirestuti, Mira Andam Dewi, Aditya Ayuning Tyas Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Jenderal Achmad Yani Cimahi,
Jawa Barat, 40531 *Email korespondensi: ririn.puspadewi@lecture.unjani.ac.id
Accepted: 13 Februari 2020; revision: 10 Juni 2020; published: 30 Juni 2020

## Abstrak
Latar  Belakang :  Pemanfaatan  limbah  udang  saat  ini  kurang  mendapatkan  perhatian  dikarenakan kurangnya  pengetahuan  masyarakat  akan  manfaat  kandungan  dalam  limbah  udang.  Limbah  udang mengandung protein sebagai nutrisi terpenting bagi pertumbuhan bakteri dalam pembentukan sel dan pertumbuhan  sehingga  dapat  dimanfaatkan  sebagai  substrat  untuk  pertumbuhan  mikroba Pseudomonas  fluorescens .  Tujuan  penelitian  adalah  memanfaatkan  limbah  udang  sebagai  substrat untuk pertumbuhan Pseudomonas florescens dalam menghasilkan asam salisilat. Metode : Fermentasi dilakukan pada suhu 30 ℃ dengan pengadukan kontinyu dengan kecepatan 150 rpm. Substrat dibuat dalam dua formula yaitu formula 1 (limbah udang), formula 2 (limbah udang dan MgSO 4 0,02% w/w). Asam salisilat sebagai produk fermentasi dianalisis secara kimia kualitatif dan uji aktivitas anti mikroba terhadap Staphylococcus aureus dan Propionibacterium acnes . Hasil :  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  uji  kimia  kualitatif  dengan  uji  esterifikasi  terdapat  bau ester  khas  seperti  minyak  gandapura,  uji  dengan  FeCl 3 menunjukkan  warna  ungu,  sedangkan  uji dengan  HCl  menunjukkan  hasil  negatif. Uji  aktivitas  antimikroba  asam  salisilat dari  formula  1 setelah  fermentasi  28  jam terhadap Staphylococcus  aureus menghasilkan  zona  bening    sebesar 18,65 mm dan terhadap Propionibacterium acnes sebesar 19,65 mm. Kesimpulan :  Limbah  udang  dapat  digunakan  untuk  substrat  pada  pertumbuhan Pseudomonas flourescens dalam menghasilkan asam sitrat
Kata kunci: asam salisilat, fermentasi, limbah udang, Pseudomonas fluorescens

## Abstract
Background : Utilization of shrimp waste is currently receiving less attention due to the lack of public knowledge  about  the  benefits  of  the  content  in  shrimp  waste.  Shrimp  waste  contains  protein  as  the most important nutrient for bacterial growth in cell formation and its growth so that can be used as a substrate  for  microbial  growth.  The  research  objective  is  to use  shrimp  waste as  a  substrate  for  the growth of Pseudomonas florescens in producing salicylic acid.
Method :  Conditions  needed  for  fermentation  are  temperature  30 ℃ ,  with continuous  shaking  at 150 rpm.  The  substrate  is  made  in  two  formulas,  namely,  formula  1  (shrimp  waste),  formula  2  (shrimp waste and MgSO 4 0.02%). Salicylic acid as a fermentation product is analyzed chemically qualitatively and antimicrobial activity test against Staphylococcus aureus and Propionibacterium acnes.
Results :  The  results  showed  that  a  qualitative  chemical  test  with  an  esterification  test  contained  a distinctive  ester  odour  such  as  gandapura  oil,  a  test  with FeCl3  showed  a  purple  colour,  whereas  a test with HCl showed a negative result. Antimicrobial activity test on Staphylococcus aureus produces a clear zone of 18.55 mm from formula 1 after 22 fermentation and against Propionibacterium acnes produces a clear zone of 19.65 mm from the formula 1 substrate after 28 hours fermentation. Conclusion : Shrimp waste can be used as a substrate. on the growth of Pseudomonas flourescens.
Key words: fermentation, Pseudomonas fluorescens, salicylic acid, shrimp waste
ISSN 2548-6462 (online), ISSN 2088-8740 (print)

## PENDAHULUAN
Udang  yang  merupakan  bagian  dari biota  laut,  pada  saat  ini  banyak  dibudidaya dengan  menggunakan  tambak  air  tawar. Hasilnya  mempunyai  nilai  ekonomis  tinggi dan udang merupakan komoditi ekspor yang dapat  diandalkan.  Secara  umum  udang dikonsumsi bagian dagingnya saja sedangkan  bagian  kepala  dan  kulit  udang tidak  dimanfaatkan  sehingga  hal  tersebut akan menjadi  limbah  rumah  tangga  maupun limbah industri rumahan yang menggunakan udang sebagai bahan utamanya (1).
Pengolahan  udang  memberikan  hasil sisa  berupa  bagian  kepala,  ekor,  dan  kulit udang serta udang yang rusak. Hasil sisa ini menjadi  limbah  yang  sangat  potensial  untuk dijadikan  sumber  protein  hewani  karena ketersediaannya cukup banyak dan mengandung zat-zat gizi yang tinggi, terutama protein dan mineralnya. Kandungan  nutrien  dari  limbah  udang  yaitu 42,65%  protein  kasar,  8,07%  lemak  kasar, dan 18,18% serat kasar (2).
Pemanfaatan  limbah  di  era  globalisasi saat  ini  kurang  mendapatkan  perhatian dikarenakan kurangnya pengetahuan masyarakat akan manfaat kandungan dalam limbah.  Berdasarkan  alasan  tersebut  protein sebagai  sumber  nitrogen  dan  mineral  dari limbah udang diharapkan dapat dimanfaatkan sebagai substrat untuk pertumbuhan mikroba Pseudomonas fluorescens dalam mensintesis asam salisilat. Protein merupakan nutrisi terpenting bagi  pertumbuhan  bakteri  untuk  mensintesis makanan  dalam  pembentukan  sel  dan pertumbuhan  (3).  Tujuan  penelitian  adalah memanfaatkan limbah udang sebagai subtrats  untuk  pertumbuhan Pseudomonas florescens dalam menghasilkan asam salisilat. Penelitian diharapkan mampu menguragi limbah
udang dengan memanfaatkannya
sebagai substrat
pertumbuhan Pseudomonas florescens dalam menghasilkan asam salisilat.

## METODE

## Alat
Ose,  bunsen,  tabung  reaksi,  labu erlenmeyer,  gelas  ukur,  gelas  piala,  labu
ukur,  batang  pengaduk,  pipet,  spatel  logam, alumunium foil, timbangan analitik, inkubator, inkubator shaker, alat sentrifugasi, lemari es, autoklaf, kertas pH, termometer, cawan petri, kapas,  kasa,  kertas  sampul,  mikropipet, perforator.

## Bahan
Limbah  udang  yang  diperoleh  dari Pasar Antri Cimahi, Jawa Barat, NA ( Nutrient Agar ), NB ( Nutrient Broth ), air pepton, media MR- VP,  Cimmon’s  Citrate  Agar,  aquadest, natrium klorida 0,9%, natrium hidroksida 1M, besi  (III)  klorida,  asam  klorida  encer,  asam sulfat pekat, kalium dihidrogen fosfat magnesium  sulfat,  metanol,  etanol  70%, asam salisilat, metil merah, pereaksi kovacks, larutan α-naftol. Kultur Bakteri Pseudomonas fluorescens diperoleh  dari  laboratorium Mikrobiologi  Sekolah  Ilmu  dan  Teknologi Hayati  ITB dan Staphylococcus  aureus  dan Propionibacterium  acnes dari  laboratorium Teknik Kimia ITB.
Pembuatan kurva pertumbuhan Pseudomonas fluorescens. Kultur
Pseudomonas fluorescens diinokulasikan  secara  aseptis  ke  dalam  labu Erlenmeyer  berisi  media  NB,  kemudian diinkubasi pada suhu 30°C dengan kecepatan  150  rpm.  Pengamatan  dilakukan setiap jam dengan mengukur nilai transmitan menggunakan  spektrofotometer  Uv-visibel pada  panjang  gelombang  600  nm  selama. Nilai  serapan  dan  waktu  pengambilan sampel  menghasilkan  kurva  pertumbuhan bakteri.  Nilai  serapan  yang  diukur  adalah gambaran  jumlah  populasi  sel  bakteri  pada setiap fase pertumbuhan (4).

## Proses  fermentasi  untuk  menghasilkan asam salisilat.
Kultur  bakteri  hasil  peremajaan  kultur diinokulasikan masing-masing 10% v/v pada substrat  limbah  udang  formula  1  hanya terdiri  dari  limbah  udang  dan  air,  formula  2 terdiri  dari  limbah  udang,  air,  dan  MgSO 4 0,02%  w/w.  Substrat  diinkubasi  pada  suhu 30 ℃ secara aerob. Substrat hasil fermentasi yang  mengandung  asam  salisilat  kemudian
Ririn Puspadewi, Putranti Adirestuti, Mira Andam  Dewi,
Ayuning Tyas
disentrifugasi  pada  kecepatan  3000  rpm selama  20  menit.  Biomassa  dan  filtrat dipisahkan  untuk  selanjutnya  dilakukan pengujian  kualitatif  terhadap  asam  salisilat dan  uji  mikrobiologi  untuk  mengetahui kemampuan hambatannya.

## Analisis  kualitatif  kimia  metabolit  bakteri

## Pseudomonas fluorescens
Asam  salisilat  sebagai  metabolit  dari hasil  fermentasi  yang  diperoleh  dapat diketahui keberadaannya dengan melakukan pengujian identifikasi secara kualitatif dengan cara: 1.  Sampel  direaksikan  dengan  besi  (III) klorida,  sampel  akan  menghasilkan  warna biru violet-merah lembayung tua. 2. Sampel direaksikan dengan 1,5 mL asam sulfat  pekat  dan  3  mL  metanol  dan keseluruhannya  dipanaskan  perlahan-lahan, maka  akan  diperoleh  bau  yang  khas  dari esternya (seperti bau minyak gandapura). 3.  Sampel  direaksikan  dengan  asam  klorida encer,  sampel  akan  menghasilkan  endapan kristalin asam salisilat.
4.  Sampel  dibandingkan  nilai  serapannya dengan  spektrum  standar  asam  salisilat menggunakan  spektrofotometer  UV  pada panjang  gelombang  302  nm  dalam  pelarut metanol.

## Pengujian  mikrobiologi  metabolit  bakteri

## Pseudomonas fluorescens
Cawan  petri  steril  diisi  dengan  1  mL mikroba uji yaitu Staphylococcus aureus dan Propionibacterium acnes yang mengandung populasi 108 koloni/mL, ditambahkan 20 mL media  NA  dihomogenkan  dan  di  diamkan pada  suhu  kamar  hingga  dingin  dan  beku. Cawan  dibuat  lubang  sumuran  dan  diisikan dengan  hasil  fermentasi  dari  kultur  bakteri dari  U0  dan  U1  yang  diduga  megandung asam  salisilat  masing-masing  sebanyak  50 µL  diukur  dengan  mikropipet  standar,  asam salisilat  sebagai  kontrol  positif  dan  air  steril sebagai  kontrol  negatif.    Cawan  di  pra- inkubasi pada suhu kamar selama 15 menit, kemudian  di  inkubasi  pada  suhu  35-37 ℃ selama  24  jam.  Lubang  pada  cawan  yang berisi  sampel  uji  diamati  adanya  hambatan terhadap  pertumbuhan  mikroba  uji,  yang
ditunjukkan  dengan  zona  bening.  Diameter zona  bening  atau  zona  hambat  di  ukur dengan jangka sorong (5).

## HASIL
Kurva
pertumbuhan
Pseudomonas fluorescens.
Gambar  1.  Kurva  pertumbuhan Pseudomonas fluorescens dalam media NB
Untuk melihat pola pertumbuhan bakteri,  maka  dibuat  kurva  pertumbuhan dengan  tujuan  untuk  menentukan  fase pertumbuhan  bakteri  yang  optimal  saat produksi metabolit sekunder. Pola pertumbuhan  dilihat  dari  tingkat  kekeruhan media  yang  diukur  setiap  jam  selama  34 jam.
Proses  fermentasi  untuk  menghasilkan asam salisilat
Gambar 2. Substrat untuk proses fermentasi
Setelah mengetahui fase-fase pertumbuhan bakteri  yang  tepat  untuk memantau metabolit yang dihasilkan dilanjutkan dengan proses fermentasi.
Ririn Puspadewi, Putranti Adirestuti, Mira Andam  Dewi,
Ayuning Tyas

## Analisis  kualitatif  kimia  metabolit  bakteri Pseudomonas fluorescens
Hasil  pengujian  secara  kualitatif tehadap  metabolit  setelah  fermentasi  6  jam pada  formula  1  (limbah  udang  +air)  dan formula  2  (limbah  udang  +  air  +  MgSO 4 0,02 %)  tidak  tercium  bau  minyak  gandapura. Hasil  pengujian  setelah  fermentasi  22  jam pada  formula  1  tercium  bau  minyak gandapura tapi pada formula 2 tidak tercium. Hasil  pengujian  setelah  fermentasi  28  jam pada  kedua  formula  tercium  bau  minyak gandapura.
Pengujian yang dilakukan berdasarkan reaksi
FeCl 3 warna menunjukkan  hasil  yang  positif  terhadap asam salisilat yaitu warna ungu pada seluruh sampel.
Uji  dengan  HCl  tidak  menunjukkan adanya  endapan  kristalin  namun  hanya  ada perubahan  warna  sampel  dari  kuning kehijauan menjadi jernih hingga putih keruh, endapan kristalin tidak terbentuk dikarenakan kandungan asam salisilat dalam sampel masih belum murni.

## Pengujian  mikrobiologi  metabolit  bakteri Pseudomonas flourescens
Pengujian  kemampuan  daya  hambat terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Propionibacterium acnes menunjukkan adanya  hambatan  terbesar  pada  formula  1 pada  jam  ke-28  fase  tengah  stasioner  yaitu sebesar 18,65 mm dan 19,65 mm.

## PEMBAHASAN
Kurva pertumbuhan Pseudomonas fluorescens.
Hasil  menunjukkan  awal  fase  log pada  jam  ke-6,  awal  stasioner  pada  jam  ke 22,  dan  tengah  fase  stasioner  pada  jam  ke 28.  Dimana  fase  log  yaitu  sel  berada  dalam keadaan  pertumbuhan  yang  seimbang,  sel membelah  dengan  kecepatan  konstan  yang ditentukan  oleh  sifat  intrinsik  bakteri  dan kondisi  lingkungan.  Fase  stasioner  terjadi kekurangan  nutrisi,  perubahan  pH  serta faktor lain yang dapat mendesak pertumbuhannya dan mengakibatkan penurunan kecepatan pertumbuhan sehingga  substrat  yang digunakan  oleh
mikroba tidak lagi digunakan untuk pertumbuhan,  tetapi  lebih  banyak  untuk memproduksi metabolit sekunder (6). Namun setelah  28  jam  tidak  menunjukkan  fase kematian karena pembuatan kurva pertumbuhan ini menggunakan metode tidak langsung, metode ini tidak dapat membedakan  sel  mati  dan  sel  yang  masih hidup  sehingga  seolah-olah  tidak  ada  fase kematian (7).

## Fermentasi  untuk  menghasilkan  asam salisilat
Fermentasi  dilakukan  pada  suhu  30 ℃ dan  pengocokan  secara  terus  menerus dalam incubator  shaker dengan  kecepatan 150 rpm selama proses fermentasi berlangsung. Mekanisme yang terjadi melalui  jalur  khorismat  dimana  terdapat  air sehingga terjadi reaksi hidrofilik pada C 2 dari khorismat  sehingga  terjadi  perpindahan gugus  hidroksil  C 4 dan  terbentuklah  enzim Isochorismate  Synthase (ICS)  dan  dari enzim ICS menghasilkan asam salisilat (8).

## Analisis  kualitatif  kimia  metabolit  bakteri Pseudomonas fluorescens
Untuk  mengetahui  keberadaan  asam salisilat  pada  substrat  fermentasi  dilakukan uji  kualitatif  berdasarkan  reaksi  yang  akan memberikan  bau  seperti  minyak  gandapura yang khas dari esternya dengan mereaksikan sampel, asam sulfat pekat yang bertindak  sebagai  zat  pendehidrasi  dan methanol.
Pengujian  berdasarkan  reaksi  yang akan  memberikan  warna  merah  lembayung tua  hingga  ungu  dengan  mereaksikan sampel  dengan  FeCl 3 .  Hal  ini  membuktikan adanya  gugus  karboksilat  pada  senyawa asam  salisilat.  Pengujian  yang  dilakukan berdasarkan reaksi FeCl 3 warna menunjukkan  hasil  yang  positif  terhadap asam salisilat yaitu warna ungu pada seluruh sampel,  sedangkan  pada  uji  dengan  HCl tidak menunjukkan adanya endapan kristalin namun hanya ada perubahan warna sampel dari  kuning  kehijauan  menjadi  jernih  hingga putih keruh, endapan kristalin tidak terbentuk dikarenakan kandungan asam salisilat dalam sampel masih belum murni (9).
Ririn Puspadewi, Putranti Adirestuti, Mira Andam  Dewi,
Ayuning Tyas

## Pengujian  mikrobiologi  metabolit  bakteri Pseudomonas flourescens
Gambar  3.  Hasil  analisis  mikrobiologi  difusi perforasi terhadap Staphylococcus aureus setelah fermentasi 28 jam.
Gambar  4.  Hasil  analisis  mikrobiologi  difusi perforasi  terhadap Propionibacterium  acnes setelah fermentasi 28 jam.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa fermentasi dengan formula 1 (tanpa penambahan  mineral)  pada  fase  tengah stasioner  dapat  menghasilkan  metabolit sekunder asam salisilat lebih besar
dibandingkan  dengan  formula  lain  yang dikombinasikan  dengan  mineral.  Berarti bahwa  dengan  penambahan  mineral  dalam substrat  dapat  menghambat  pembentukan metabolit  sekunder.  Bakteri  membutuhkan mineral  untuk  pertumbuhan  normal  hanya sedikit  bahkan  diukur  dalam  (3).  Mika  dkk, (2013)  menunjukkan    bahwa  dalam  udang terkandung asam  amino esensial, komposisi lemak, makro mineral (Ca, Mg, P, K dan Na), dan mikro mineral (Cu, Fe, Mn, Se, Zn) (10).
Sehingga kebutuhan mineral yang bersumber  hanya  dari  limbah  udang  dapat mencukupi kebutuhan dalam proses biosintesis dari bakteri starter Pseudomonas fluorescens .

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan  dapat  disimpulkan  bahwa  limbah udang  dapat  digunakan  sebagai  substrat Pseudomonas fluorescens dalam melakukan biosintesis asam salisilat . Pengujian kemampuan  daya  hambat  terhadap  bakteri Staphylococcus aureus dan Propionibacterium acnes
menunjukkan adanya  hambatan  terbesar  pada  formula  1 pada  jam  ke-28  fase  tengah  stasioner  yaitu sebesar 18,65 mm dan 19,65 mm.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Tim peneliti mengucapkan terima kasih kepada  LPPM  Universitas  Jenderal  Achmad Yani  (UNJANI)  atas  dana  yang  diberikan untuk penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
1.   Saleha S, Murniana. Aktivitas Antioksidan  Astaxanthin  Dari  Limbah Kulit Udang. 2009;1 –26.
2.   Gernat  AG. The  effect  of  using  different levels of shrimp meal in laying hen diets. Poult Sci. 2001;
3.   Rosidah  U.  Diajukan  oleh:  Umi  Rosidah NIM. G1C215008. 2016;
4.   Sugiarti  S,  Sakti  SP,  Juswono  UP. Pemanfaatan  Pseudomonas  putida  dan Pseudomonas fluorescens Sebagai
Biosensor  untuk  Mengukur  Kadar  BOD 5 Dalam Air. 2013;2(2):134 –9.
5.   Balouiri  M,  Sadiki  M,  Ibnsouda  SK.
Ririn Puspadewi, Putranti Adirestuti, Mira Andam  Dewi,
Ayuning Tyas
Methods for in vitro evaluating antimicrobial  activity:  A  review.  J  Pharm
Anal [Internet]. 2016;6(2):71 –9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jpha.2015.11. 005 6.   Listyawati AF. Pola Pertumbuhan Pseudomonas sp. dengan Menggunakan  Variasi  Konsentrasi  D- glukosa  dalam  Media  Pertumbuhan terhadap  Waktu  Inkubasi.  J  Ilm  Kedokt Wijaya Kusuma. 2018;5(2):29.
7.   Studi  P,  Lingkungan  T.  Pada  Lumpur
Hasil Pengolahan Limbah Cat Identification  of  Bacterial  Diversity  in
Waste Recycling Paint Sludge. Program.
2009;15(April):1 –12.
8.   Dempsey  DA,  Vlot  AC,  Wildermuth  MC, Klessig  DF.  Salicylic  Acid  Biosynthesis and Metabolism. Arab B. 2011;
9.   Fatmawati F, Herlina L. Validasi Metode dan  Penentuan  Kadar  Asam  Salisilat Bedak  Tabur  dari  Pasar  Majalaya.
EduChemia (Jurnal Kim dan Pendidikan). 2017;2(2):141 –50. 10.  Ngginak J, Semangun H, Mangimbulude JC, Rondonuwu FS. Komponen Senyawa  Aktif  pada  Udang  Serta Aplikasinya dalam Pangan. 2013;5(2):128 –45.