Menara Perkebunan 2014 82(2), 81-94

## Evaluasi 18 primer SSR untuk pengembangan sidikjari DNA tanaman karet  ( Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
Evaluation of 18 SSR primers to develop DNA fingerprint of rubber tree  ( Hevea brasiliensis Muell. Arg. )
Asmini BUDIANI 1)*) , Sekar WOELAN 2) , Hayati MINARSIH 1) ,  NUHAIMI-HARIS 1)
& Riza Arief PUTRANTO 1)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jln Taman Kencana No.1 Bogor 16182, Indonesia
2) Pusat Penelitian Karet, Jl. Salak No. 1, Bogor 16182, Indonesia
Diterima tanggal 8 September 2014/disetujui tanggal 25 Nopember 2014

## Abstract
Breeding  program  of  rubber  tree  to  produce elite  clones  is  hampered  by  the  length  of  selection cycles.  On  the  other  hand,  attempts  to  increase production by extensification of the plantation area is also  facing  a  problem  from  the  availability  of  the rootstock,  causing  the  occurence  of  fake  clones without any information of their origin. Therefore, the availability of molecular markers  to  be used as  DNA fingerprint  of  rubber  tree  clones  is  needed.  This  will help  the  breeder  to  shorten  the  length  of  selection program  and  to  identify  the  purity  of  the  clone.  This research  was aimed to evaluate 18 SSR primer pairs that had been published  to  identify 17  rubber clones. Pure  genomic  DNAs  were  isolated  from  17  clones, followed  by  experiment  to  optimize  annealing  tempe- rature for each primer to obtain the best amplification product.  Initially,  the  PCR  product  was  run  in  both the  agarose  and  polyacrylamide  gels.  However,  the analysis of all PCR products  were then conducted on SDS  polyacrylamide  gel,  since  this  gel  can  separate DNA fragments with only a few bases differences. The results  showed  that  14  clones  have  been  identified specifically  using  11  primers.  Four  out  of  18  primer pairs used could identify 12 rubber tree clones, which are PR 107, PR 261, SP 217, PB 330, PB 340, IRR 5, IRR  112,  IRR  118,  IRR  220,  GT  1,  BPM  101  and RRIM  712.  Each  clone  can  be  distinguished  from each  other  using  only  one  primer  pair.  Identification of the other  tree  clones (PB  5/51, PB  260, and RRIC 110)  has  to  be  conducted  by  combining  the  several PCR  products  using  different  primer  pairs.  Although these  results  showed  that  SSR  markers  had  high potential  to  be  used  as  DNA  fingerprint  on  rubber tree  clones,  the  set  of  the  primer  pairs  should  be tested  among  other  clones,  as  well  as  other  SSR primers  should  be  tested  to  identify  the  clones  which could  not  be  identified  using  the  18  primer  pairs  in this experiment.
[ Keywords:  Rubber  clone,  molecular  marker,  PCR- SSR,   polymorphism ]

## Abstrak
Pemuliaan  tanaman  karet  untuk  menghasilkan klon-klon  unggul  baru  menghadapi  masalah  lamanya siklus  seleksi.  Di  sisi  lain,  upaya  peningkatan produksi  melalui  pembukaan  lahan  baru,  juga terkendala  oleh  ketersediaan  bibit,  yang  memicu beredarnya bibit palsu, yang umumnya tidak jelas asal usulnya.  Oleh  karena  itu,  diperlukan  ketersediaan marka  yang  dapat  digunakan  sebagai  sidikjari  DNA bagi  klon-klon  tanaman  karet  yang  ada,  sehingga dapat  membantu  mempercepat  proses  seleksi  dan mengetahui  kemurnian  bibit.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengevaluasi  18  primer  SSR  yang  telah dipublikasikan  untuk  mengidentifikasi  17  klon  karet. DNA  yang  murni  diisolasi  dari  17  klon,  kemudian dilakukan optimasi suhu annealing untuk setiap  jenis primer  agar diperoleh  hasil amplifikasi terbaik.  Pada awal percobaan hasil PCR dicek pada gel agarosa dan gel poliakrilamida, namun analisis untuk seluruh hasil PCR  dilakukan  pada  gel  SDS  poliakrilamid,  karena gel ini secara nyata dapat memisahkan  fragmen DNA yang  hanya  berbeda  beberapa  basa.  Hasil  percobaan menunjukkan  bahwa  14  klon  dapat  diidentifikasi secara  spesifik  menggunakan  11  primer. Empat  dari 18  pasang  primer  yang  diuji  dapat  mengidentifikasi 12  klon  yang  dianalisis,  yaitu  PR  107,  PR  261,  SP 217, PB 330, PB 340,. IRR 5, IRR 112, IRR 118, IRR 220,  GT  1,  BPM  101  dan  RRIM  712.  Masing-maing klon tersebut dapat dibedakan dari klon lainnya hanya dengan  menggunakan  satu  jenis  primer.  Sedangkan identifikasi  tiga  klon  lainnya  (PB  5/51,  PB  260,  dan RRIC110)  harus  dilakukan  dengan  menggabungkan hasil  PCR  menggunakan  beberapa  primer.  Meskipun hasil  percobaan  ini  menunjukkan  bahwa  marka  SSR sangat  berpotensi  untuk  digunakan  sebagai  sidikjari DNA klon-klon karet, namun primer yang sama perlu diuji  untuk  klon-klon  lainnya.  Demikian  pula  primer lain perlu diuji untuk mengidentifikasi klon-klon yang belum  teridentifikasi  menggunakan  18  primer  dalam penelitian ini.
[Kata kunci:  Klon karet, marka  molekul, PCR-SSR, , polimorfisme]
*) Penulis korespondensi: asminib@yahoo.com
Evaluasi 18 primer SSR untuk pengembangan sidikjari DNA tanaman karet …….(Budiani et al .)

## Pendahuluan
Karet  ( Hevea  brasiliensis Muell.  Arg . )  merupa- kan  salah  satu  komoditas  perkebunan  penting penghasil  devisa  negara  dari  sektor  non-migas. Sejalan  dengan  semakin  berkembangnya  areal  per- kebunan dan hutan tanaman industi karet, permintaan akan bibit karet terus meningkat  Meskipun  sejumlah klon  karet  anjuran  yang  memiliki  karakter  unggul telah  dihasilkan  melalui  program  pemuliaan  yang dilakukan  oleh  Pusat  Penelitian  Karet,  PT  Riset Perkebunan  Nusantara  (RPN),  namun  terbatasnya pasokan  bibit,  menyebabkan  para  pekebun  seringkali harus membeli bibit dari berbagai sumber yang belum tentu  dapat  dijamin  kemurniannya.  Hal  tersebut mengakibatkan  produktivitas  kebun  tidak  dapat dicapai secara maksimal.
Sebagian  klon  karet  dapat  dibedakan  melalui karakter  morfologi  namun  sebagian  lainnya  sulit dibedakan.  Di  sisi  lain  keragaman  genetik  yang semakin  sempit  dan  lamanya  siklus  seleksi  meng- hambat  program  pemuliaan  dalam  menghasilkan klon-klon unggul karet. Berkembangnya teknik-teknik molekuler  yang  sangat  pesat  beberapa  dasawarsa terakhir  telah  melahirkan  berbagai  teknik  yang  dapat digunakan  sebagai  penanda  untuk  membedakan varietas,  klon  atau  bahkan  individu  tanaman  yang secara  genetik  mempunyai  kekerabatan  yang  sangat dekat  dan  sulit  dibedakan  secara  morfologi.  Selain membantu  para  pemulia  dalam  kegiatannya  untuk menghasilkan klon-klon baru dalam waktu yang lebih cepat  dan  mengevaluasi  latar  belakang  genetik  suatu individu tanaman yang baru ditemukan,  ketersediaan penanda molekuler atau DNA fingerprint juga berguna untuk  melindungi  hak  kekayaan  intelektual.  Para pemulia  dapat  melindungi  varietas  temuannya  tidak hanya melalui identifikasi secara morfologi tetapi juga secara  genetik.  Suatu  tanaman  yang  secara  fisik/ morfologi  sama  tetapi  secara  genetik  berbeda  tidak dapat diklaim sebagai  individu  yang sama,  begitupun sebaliknya.  Profil  atau  fingerprint  DNA  juga  diguna- kan dalam program pemuliaan untuk memeriksa suatu turunan dari spurious pollination (Corley, 2005).
Penanda  molekuler  berbasis  DNA  telah  banyak digunakan  karena  memiliki  kelebihan  dalam  hal sensitivitas  dan  kecepatan  mengidentifikasi  spesies yang  berbeda serta dapat membedakan  individu  yang mempunyai hubungan kekerabatan dekat (Ilbi, 2003). Penanda  molekuler  dapat  diklasifikasikan  ke  dalam dua  kelompok  besar,  yaitu  penanda  molekuler berbasis  hibridisasi  dan  penanda  molekuler  berbasis PCR  seperti  RAPD,  SSR  atau  microsatellites,  AP- PCR and AFLPs (Semagn, 2006). Penanda molekuler berbasis  PCR  lebih  banyak  digunakan  karena memerlukan  DNA  dengan  konsentrasi  yang  rendah, mampu  mengamplifikasi  sekuen  DNA  genom  dari jaringan  yang  telah  disimpan  (preserved  tissue), metodenya cukup sederhana, serta relatif murah.
Riset  terkait  sidikjari  DNA  telah  dikembangkan dan  diaplikasikan  pada  berbagai  tanaman.  Salah  satu penanda molekuler berbasis PCR yang sangat popular saat  ini  adalah Simple  sequence  repeat (SSR). Penanda  ini  telah  digunakan  untuk  mempelajari keragaman  genetik  pada  berbagai  tanaman,  seperti gandum  (Liu et  al .,  2007;  Hao et  al .,  2006), barley (Brantestam et  al .,  2007), cole (Hasan  et  al.,  2006), jowar (Marco et  al .,  2007), winter  triticale (Tams et al ., 2004), dan kopi (Aggarwal et al., 2007). Selain relatif  sederhana  dan  murah,  teknik  ini  juga  lebih reproduksibel,  bersifat  kodominan  dan  multi  alelik, melingkupi  daerah  genom  yang  luas,  serta  pada umumnya  bersifat  polimorfik  (Saha et  al .,  2005; Gouvêa et al ., 2010).
Aplikasi  teknik  SSR  pada  tanaman  karet  juga telah  dilaporkan  (Feng et  al. ,  2009;  Yu et  al. ,  2011; Pootakham et  al., 2012).  Dalam  upayanya  untuk mengembangkan  marker  mikrosatelit  pada  tanaman karet,  Pootakham et  al. (2012)  menggunakan teknologi pyrosequencing 454  untuk  mendapatkan genomic  shotgun  sequences dan  mengidentifikasi lebih  dari  24  000 putative  simple  sequence  repeats (SSRs).  Sebanyak  418  locus  SSR  potential  dipilih untuk  validasi  empiris,  224  pasangan  primer  meng- hasilkan  produk  amplifikasi,  dan    90  marker  SSR menunjukkan  polimorfisme  antar  18  aksesi  tanaman karet.  Dari  penelitiannya  tersebut, telah  diidentifikasi lima  marker  SSR  potensial  yang  dapat  membedakan ke-18  tanaman  karet  yang  dievaluasi.  Garcia et  al . (2011) melaporkan hasil penelitiannya dalam identifikasi  12  klon  karet  komersial  di  Kolombia secara in  silico menggunakan  marker SSR . Sebanyak 15  marker  SSR  dipilih  dari  561  marker  mikrosatelit hasil rancangan menggunakan sekuen yang terdeposit pada  GenBank.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa empat  marker  SSR  (SSRH103,  SSRH134,  SSRH510 dan  SSRH516)  dapat  membedakan  10  dari  12  klon yang  diuji.  Hasil  penelitian  lain  mengemukakan bahwa  lima  primer  SSR,  yaitu  (EHB85,  EHB109, EHB169,  EHB177  and  EHB178)  dinyatakan  sangat informatif  dan  dapat  digunakan  untuk  membedakan 20 klon karet (Triwiyatakorn et al. , 2011).
Atas  dasar  hasil-hasil  penelitian  yang  telah dipublikasi  tersebut,  maka  tujuan  dari  penelitian  ini adalah mengevaluasi 18 primer yang telah direkomen- dasikan  sebagai  primer  yang  informatif  oleh  peneliti sebelumnya,  untuk  mengidentifikasi  17  klon  penting koleksi Pusat Penelitian  Karet,  PT Riset Perkebunan Nusantara, Indonesia.

## Bahan dan Metoda

## Bahan tanam
Material genetik yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  17  klon  karet  yang  merupakan  koleksi Pusat  Penelitian  Karet    sebagaimana  disajikan  pada Tabel 1.
Menara Perkebunan 2014 82(2), 81-94
Tabel 1.  Daftar klon karet yang digunakan untuk analisis DNA fingerprinting menggunakan metode SSR yang digunakan dalam penelitian.
Table 1. List of rubber tree clones used for DNA fingerprinting analysis using SSR markers in this research.
No Klon Tetua Asal Keterangan 1 GT  1 Klon primer Indonesia Penghasil lateks 2 IRR 220 PB 260 x IAN 873 Indonesia Penghasil lateks 3 PR 261 TJIR 1 x PR 107 Indonesia Penghasil lateks 4 IRR 112 IAN 873 x RRIC 110 Indonesia Penghasil lateks 5 PB 5/51 PB 56 x PB 24 Malaysia Penghasil lateks 6 IRR 118 LCB 1320 x FX 2784 Indonesia Penghasil lateks 7 PR 107 Klon primer Indonesia Penghasil lateks kayu 8 IRR 104 BPM 101 x RRIC 110 Indonesia Penghasil lateks 9 PB 260 PB 5/51 x PB 49 Malaysia Penghasil lateks 10 IAN 873 PB 86 x F 1717 Brazil Penghasil lateks kayu 11 IRR 5 PBIG seedling Indonesia Penghasil lateks kayu 12 BPM 101 Klon primer Indonesia Penghasil lateks kayu 13 RRIC 110 LCB 1320 x RRIC 7 Sri Lanka Penghasil lateks kayu 14 PB 330 PB 5/51 x PB 32/36 Malaysia Penghasil lateks 15 SP 217 Tidak diketahui Indonesia Penghasil lateks 16 PB 340 PB 235 x PR 107 Malaysia Penghasil lateks 17 RRIM 712 RRIM 605 x RRIM 71 Malaysia Penghasil lateks

## Isolasi DNA total
Isolasi  DNA  dari  daun  karet  dilakukan  meng- gunakan  prosedur  yang  dikembangkan  berdasarkan metode  Orozco-Castilo et  al (1994).  Sebanyak  1  g daun  karet  ditambah  0,1g  PVPP  ( Polyphynilpoly- pirolidone ),  digerus  dalam  keadaan  dingin  hingga halus dengan penambahan N 2 cair. Serbuk halus yang dihasilkan dimasukkan ke dalam 5 mL bufer ekstraksi (CTAB  2  %,  EDTA  020  mM  pH  8,0,  Tris-HCl  100 mM pH 8,0, NaCl 1,26 M) yang telah dipanaskan dan ditambah β-merkaptoetanol 1%. Campuran divorteks, kemudian  dipanaskan  selama  30  menit  pada  suhu 65 o C.  Setelah  disentrifus  (10  menit,  11.000  rpm), supernatant  dipisahkan,  ditambah  1  x  volume kloroform  :  isoamilalkohol  (24  :  1),  divortex  dan disentrifus  (10  menit  ,  11.000  rpm).  Lapisan  atas  di- pindahkan  ke  tabung  baru  dan  diekstrak  kembali dengan  1xV  larutan  kloroform  :  isoamilalkohol (24:1).  Ke  dalam  supernatan  hasil  sentrifugasi  di- tambahkan  1  x  volume  isopropanol  dingin,  dikocok perlahan  hingga  homogen  kemudian  disimpan  pada suhu  4 o C  dalam  kulkas  selama  30  menit,  kemudian disentrifus  (10  menit  ,  11.000  rpm).  Supernatan dibuang dan pelet DNA dilarutkan dalam 1 mL bufer TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM), ditambah 1/10  x  volume  CH 3 COONa  3M  pH  5.2  dan  2,5  mL etanol  absolut,  dikocok  hingga  homogen  dan  simpan pada  suhu  -20 o C  selama  30  menit  atau  semalam. Setelah disentrifus  selama 10  menit 12.000 rpm pada suhu  4 o C,  supernatan  dibuang,  pelet  DNA  dicuci dengan  etanol  70%,  kemudian  dikeringkan  dalam DNA  speed  vacum .  Pelet  DNA  yang  sudah  kering dilarutkan   dalam  500  µL  bufer   TE  atau  ddH 2 O,
ditambah  RNase  25  µg/mL,  diinkubasi  pada  suhu 37 o C  selama  30  menit,  kemudian  disimpan  dalam freezer.  Kuantitas  dan  kualitas  DNA  diuji  dengan mengukur  absorbansinya  pada  panjang  gelombang 260  nm  (λ260)  ,  dan  280  nm  (λ280),  serta  dengan elektroforesis  pada  gel  agarosa.  Konsentrasi  DNA dihitung  berdasarkan  nilai  absorbansi  pada  λ260, sedangkan  kemurniannya  terhadap  protein  dihitung berdasarkan nisbah λ260/ λ280.

## Primer SSR dan amplifikasi PCR
Untuk amplifikasi fragmen DNA yang mempunyai motif  SSR , primer  spesifik  yang  digunakan  adalah primer  yang  telah  dipilih  dari  beberapa  publikasi mengenai  SSR  pada  tanaman  karet.  Nama  dan susunan  nukleotida  dari  primer  yang  digunakan  di- tunjukkan pada Tabel 2. PCR dilakukan dalam 25 uL campuran  reaksi  yang  mengandung  DNA  genomik 25  ng,  primer  0.4  μM  ,  MgCl 2 1.5  mM,  dNTP  200 mM dan Taq polymerase satu unit. Proses amplifikasi dilakukan  menggunakan  mesin  PCR  Applied  Bio- system Veriti, dengan program PCR sebagai berikut : pra  denaturasi  94  °C  selama  tiga  menit,    dilanjutkan 35 siklus  meliputi denaturasi   94  °C selama  45 detik, annealing 52-59 °C tergantung masing-masing primer (Tabel 1) selama 45 detik, extention 72 °C selama satu menit,  dan  terakhir post  extention 72  °C  selama  lima menit.  Pada  awal  percobaan,  hasil  PCR  dianalisis dengan  elektroforesis  pada  gel  agarosa  (3%)  dan SDS-poliakrilamida.  Tetapi  setelah  dipastikan  bahwa gel  agarosa  tidak  diskriminatif,  maka  selanjutnya analisis dilakukan pada gel SDS-poliakrilamida.
Evaluasi 18 primer SSR untuk pengembangan sidikjari DNA tanaman karet …….(Budiani et al .)
Tabel  2.  Daftar  primer  yang  digunakan  dalam  penelitian  beserta  susunan  nukleotida  dan  perkiraan  panjang amplikon yang dihasilkan.
Table 2. List of primers used in this research along with nucleotide sequences and amplicon length.
No Kode TM Primers (5´--- 3’) SSR motif/ Ukuran (pb) Referensi 1 SSRH103_F 64.7 TCCTCTCCTCGTCAACATCC (CT) 21 / 251 Garcia et al., 2011 SSRH103_R 62.4 TGTCATTCGAACTCCGTCAA 2 SSRH403_F 63.5 TGCCATCCTGCAGTTATCAG (F) (GA)16 / 242 Garcia et al., 2011 SSRH403_R 63.7 GCACATATG AGGAAGCCACA (R) 3 SSRH358_F 64.9 TCCGCTCTAGCTTCTTCCTG (F) (GA)20 / 226 Garcia et al., 2011 SSRH358_F 63.9 GCCGCATAAGAGTGAACGA (R) 4 SSRH548_F 64.8 TGAGCAACGGAGGAGAGAA (F) (GA)4CA(GA)7 /250 Garcia et al., 2011 SSRH548_R 63.1 CCAAACACCCAAACCCAATTC 5 gSSR165_F 60.8 CAAGCATGTCATGTGTTTGG (AAT)19 / 230–270 Pootakham et.  al., 2012 gSSR165_R 65.2 GGGAGGATGATTGGCTACCT 6 gSSR194_F 61.7 GGGCCTCATTGTTCGTTTTA (ATA)21 / 470–530 Pootakham et.  al., 2012 gSSR194_R 64.6 GTAGGGTGCCCATAAAGCAC 7 gSSR212_F 63.0 CCTTCCCCACTGATTCTTCA (ATT)6 / 250–260 Pootakham et.  al., 2012 gSSR212_R 66.3 CTCTGCCTGGTCCTACTTGC 8 gSSR213_F 62.9 CAACGGTGCATAGAGAAAGGA (ATT)6 / 480–520 Pootakham et.  al., 2012 gSSR213_R 60.0 TCATGTTGGGTCAGATTTTTACA 9 gSSR268_F 58.6 TGGCATGATCGTTTAAGAAAAA (TAA)13 / 230–280 Pootakham et.  al., 2012 gSSR268_R 64.0 CGGTTTCCTACCTCAGCTTG 10 EHB085_F 62.2 CGATTAGGTACGTGATCCCA (TCATGC)5 /110– 120 Triwiyatakorn et al., 2011 EHB085_R 61.7 AAGTTGTTGAGGAATGATCAGGA 11 EHB109_F 64.0 GAAaGCTAACGGTGGACTCG (ATC)10 / 252–254 Triwiyatakorn et al., 2011 EHB109_R 63.1 ACGAATCGGACTTTGGTGTT 12 EHB169_F 63.3 TCACTTTTCACAACCCACCA (TCT)11 / 200–225 Triwiyatakorn et al., 2011 EHB169_R 62.3 GGCAAACCAGGAAATCAACA 13 EHB177_F 60.7 CGCTTTCTCCATATAGAGTTTCA (GAA)7(TTC)8 Triwiyatakorn et al., 2011 EHB177_R 62.3 CAGCAAGAAATCCCTCAACC 14 EHB178_F 61.6 TCGTGACCCAACAGAATAAAGA (ATTA)8 / 209–212 Triwiyatakorn et al., 2011 EHB178_R 64.4 GGAAATTCTGCTGGCACTGT 15 HBE280_F 61.8 GGACACCTGGAGCAAAATAG (GAAA)4 / tdk terinformasi Feng et al ., 2012 HBE280_R 58.8 TATGCTTCGATGTATATTCACGT 16 HBE301_F 53.1 GGCATACAAGAAAAAAATTT (CAGCAA)5 / tidak terinformasi Feng et al ., 2012 HBE301_R 60.7 TAAGGATTGACGGCTACG 17 HBE316_F 61.8 CGACAACCAGGAACTTACC (TCTGT)4 / tidak terinformasi Feng et al ., 2012 HBE316_R 61.4 AAACAACTGCGGAGGATT 18 HBE329_F 58.1 CCAAAACAAGGGAAATCAC (AGA)9 /tidak terinformasi Feng et al ., 2012 HBE329_R 61.7

## GACCGAGACGCTTAGTTC
Elektroforesis  pada  gel  SDS-poliakrilamid  di- lakukan  dengan  metode  yang  diacu  dari  Diputra (2013).  Gel  akrilamid  6  %  dibuat  dengan  meng- homogenkan  terlebih  dahulu  urea, aquabidest steril, buffer  TBE  10x  dan acrylamide/bis 40  %  (19:1).  . Amonium  persulfat  (APS)  10  %  dan  TEMED  di- tambahkan  ke  dalam  larutan  yang  sudah  tercampur merata kemudian dimasukkan ke dalam chamber dan ditunggu  hingga  mengeras  selama  30  menit.  Produk
PCR  ditambah  20  µL loading  dye formamide, kemudian didenaturasi pada suhu 94 o C di mesin PCR selama tiga menit. Gel yang sudah mengeras dipanas- kan  terlebih  dahulu  dengan  melakukan pre-run pada 75  W  selama  satu    jam.  Selanjutnya  sebanyak  6  µL produk  PCR    yang  telah  didenaturasi  dimasukkan  ke dalam sumur gel, kemudian  elektroforesis dijalankan pada 65 W selama lebih kurang  satu jam atau sampai warna  hijau  dari xylene  cyanol berada  pada  2/3  dari
Menara Perkebunan 2014 82(2), 81-94
ujung  gel.  Setelah  selesai  elektroforesis,  dilakukan visualisasi  pita  DNA  pada  gel  dengan  pewarnaan menggunakan perak nitrat.
Gel  dimasukkan  ke  dalam tray pewarnaan  yang berisi larutan fiksasi (asam asetat 10 %) dan dibiarkan selama 20 menit di atas shaker , kemudian dicuci  dua kali  dengan aquadest masing-masing  selama  dua menit. Selanjutnya ditambahkan larutan pewarna (1 g AgNO 3 dan  1.5  mL  formaldehida  dilarutkan  dengan aquades  hingga  volume  1  L)  dan  ditempatkan kembali    dalam shaker selama  30  menit.  Larutan pewarna  kemudian  dibuang,  dan  gel  dicuci  kembali dengan  aquades. Setelah  itu    gel  direndam  dengan larutan developer (30  g  serbuk  Na 2 CO 3 ,  1.5  mL formaldehida  37  %,  dan  200  µL  larutan  Natrium- tiosulfat  10  mg  mL -1 dilarutkan  dengan  aquades hingga  volume  1  L)  sambil  di shaker hingga  pita-pita DNA  muncul.  Proses  pewarnaan  dihentikan  setelah semua  pita  DNA  muncul  dengan  menambahkan larutan  fiksasi,    kemudian  gel  dicuci  kembali  dengan aquades dan dikeringkan.

## Analisis data dan evaluasi marka SSR
Analisis  data  hasil  elektroforesis  pada  gel akrilamid  dilakukan  dengan  melakukan  skoring  atau penilaian  muncul  tidaknya  setiap  pita/fragmen  DNA. Ukuran pita DNA ditentukan dengan software Photo- CapMw .  Setiap  pita  DNA  pada  marka  SSR  yang teramplifikasi  merepresentasikan  posisi  alel  pada lokus.  Satu  marka  SSR  dianggap  sebagai  satu  lokus (Mulsanti,  2011).  Nilai  (+)  diberikan  untuk  amplifi- kasi  positif  yang  menggambarkan  alel  yang  teramati, sedangkan nilai (-) diberikan untuk amplifikasi negatif yang  menggambarkan  tidak  adanya  alel  terdeteksi. Data  ditampilkan  dalam  bentuk  kode  warna  dimana warna hitam merepresentasikan skor positif dan warna abu-abu  merepresentasikan  skor  negatif.  Data  tidak terdeteksi  ditampilkan  dalam  warna  putih.  Automa- tisasi  menggunakan Microsoft  Excel dilakukan  untuk membentuk kluster hierarki untuk tiap alel dari marka SSR terhadap klon-klon karet yang diuji.

## Analisis tingkat polimorfisme
Tingkat polimorfisme ( Polymorphic Information Content /PIC)  dihitung  untuk  masing-masing  marka mikrosatelit.  Nilai  PIC  diukur  dengan  menggunakan software  yang  dapat  diakses  secara online (www. genomics.liv.ac.uk/animal/Pic.html)  (Mulsanti  2011). Nilai PIC juga dapat diukur dengan rumus :
i= 1,2,3,....n , dimana P i dan P j frekuensi populasi alel ke- i dan ke- j (Nagy, 2012)

## Hasil dan Pembahasan

## Elektroforegram hasil PCR- SSR
Gambar  1  menunjukkan  perbedaan  pemisahan DNA  hasil  PCR  yang  sangat  signifikan  antara  gel SDS-poliakrilamid  dibandingkan  dengan  pada  gel agarosa.    Elektroforesis  pada  gel  agarosa  hasil  PCR menggunakan  primer  SSRH403  hanya  memberikan satu  pita  DNA  untuk  masing-masing  klon  yang dianalisis  sehingga  pola  antar  klon  tidak  dapat dibedakan. Sebaliknya, dengan elektroforesis pada gel SDS-poliakrilamid  dihasilkan  5  pita  DNA,  dimana  4 pita di antaranya bersifat polimorfik. Oleh karena itu, analisis  untuk  17  primer  lainnya  dilakukan  pada  gel SDS-poliakrilamid. Hasil elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid 6% mampu memisahkan DNA lebih sempurna  dibandingkan  dengan  gel  agarosa  3%.  Hal ini  disebabkan  gel  poliakrilamid  memiliki  pori-pori yang  lebih  kecil  daripada  gel  agarosa  sehingga molekul  DNA  untai  pendek  dapat terpisah  lebih  baik (Diputra, 2013).
Hasil  elektroforesis  pada gel  SDS-Poliakrilamida dari produk PCR-SSR ke 17 klon karet yang dianalisis disajikan  pada  Gambar  2.  sampai  dengan  Gambar  5. Gambar  2.  menunjukkan  hasil  elektroforesis  produk PCR  menggunakan  primer    seri  SSRH  (SSRH  103, SSRH  358,  SSRH403  dan  SSRH  548).  Dapat  dilihat bahwa  SSRH103  menghasilkan  total  lima  pita  DNA, SSRH403  menghasilkan  lima  pita  DNA,  dan  SSRH 548  menghasilkan  dua  pita  DNA.  Sedangkan SSRH358 menghasilkan elektroforegram yang kurang jelas  pemisahannya  sehingga  tidak  diikutsertakan untuk analisis klon.
Pada  Gambar  3.  dapat  dilihat  bahwa  dari  lima primer  seri  gSS,  yaitu  gSS165,  gSS194,  gSS212, gSS213, dan gSS268, satu primer tidak menghasilkan pola DNA yang jelas, sehingga tidak digunakan dalam analisis  lebih  lanjut.  Primer  gSS165  menghasilkan tiga  pita  DNA  dengan  dua  pita  polimorfik,  primer gSS194  menghasilkan    enam  pita  DNA,  lima  pita  di antaranya  bersifat  polimorfit,  gSS213  menghasilkan tiga  pita  DNA  polimorfik,    gSS268  menghasilkan lima  pita  yang  semuanya  juga  bersifat  polimorfik. Sedangkan  primer  lainnya,  yaitu  gSS212  tidak menghasilkan  pola  DNA  yang  diskrit  untuk  setiap klon  sehingga  tidak  digunakan  dalam  analisis  klon. Pola  elektroforegram  hasil  PCR  menggunakan  lima primer EHB menghasilkan 17 pita DNA total, 14 pita DNA  di  antaranya  bersifat  polimorfik,  sedangkan empat  primer  HBE  yang  digunakan  menghasilkan total  11  pita  DNA,  dengan  tujuh  pita  DNA  yang polimorfik  (Gambar  4  dan  5).  Secara  rinci,  jumlah pita  DNA  yang  dihasilkan  oleh  setiap  primer  yang digunakan  disajikan  pada  Tabel  3.  Polimorfisme  pita per  primer  bervariasi  mulai  dari  1-5  dengan  jumlah pita   polimorfis   sebanyak 46.  Primer  gSSR268  dan
Evaluasi 18 primer SSR untuk pengembangan sidikjari DNA tanaman karet …….(Budiani et al .)
Tabel 3. Jumlah pita DNA yang dihasilkan oleh setiap primer dan nilai PIC yang dihasilkan.
Table 3. Number of DNA band produced by each primer and its PIC value.
Primer Jumlah pita DNA PIC Total Polimorfis SSRH103 5 4 0.5802 SSRH358 - - - SSRH403 5 4 0.7069 SSRH548 2 2 0.3719 gSSR165 3 2 0.5818 gSSR194 6 5 0.7183 gSSR212 - - - gSSR213 3 3 0.5916 gSSR268 5 5 0.5066 EHB085 3 2 0.5229 EHB109 3 2 0.5307 EHB169 5 5 0.6559 EHB177 3 2 0.4563 EHB178 3 3 0.5112 HBE301 2 0 - HBE316 3 2 0.5666 HBE329 5 4 0.6361 HBE280 1 1 0.0000 Total 57 46 -
Gambar 1.  Pola  elektroforegram  hasil  amplifikasi  DNA  daun  karet  menggunakan  primer  SSRH403  pada  (A)  gel agarosa dan (B)  gel SDS-poliakrilamida. (M= Marker  1 kb DNA  ladder, (-)=kontrol negatif, 1= GT 1, 2= IRR 220, 3= PR 261, 4= IRR 112, 5= PB 5/51, 6= IRR 118, 7= PR 107, 8= IRR 104, 9= PB 260, 10= IAN 873, 11= IRR 5, 12= BPM 101, 13= RRIC 110, 14= PB 330, 15= PB 217, 16= PB 340, dan 17= RRIM 712).
Figure 1.  Electrophoretic profile of amplification product of rubber leaf DNA using primer SSRH403 on (A) agarose gel and (B) SDS-polyacrylamide gel (M=  1 kb DNA ladder marker, (-)=negative control, 1= GT 1, 2= IRR 220, 3= PR 261, 4= IRR 112, 5= PB 5/51, 6= IRR 118, 7= PR 107, 8= IRR 104, 9= PB 260, 10= IAN 873, 11= IRR 5, 12= BPM 101, 13= RRIC 110, 14= PB 330, 15= PB 217, 16= PB 340, and 17= RRIM 712).
M    (-)   1    2    3    4    5   6   7    8    9    10   11   12   13   14   15  16  17 A
M    (-)   1    2    3    4    5   6   7    8    9    10   11   12   13   14   15  16  17
B 200  pb 150 pb 100 pb
Menara Perkebunan 2014 82(2), 81-94
Gambar  2.    Profil  elektroforesis  hasil  amplifikasi  DNA  karet  menggunakan  primer  SSRH103  (A),  SSRH358  (B), SSRH403 (C) dan SSRH 548 (D)  (M= Marker 1 kb DNA ladder, (-)=kontrol negatif, 1= GT 1, 2= IRR 220, 3= PR 261, 4= IRR 112, 5= PB 5/51, 6= IRR 118, 7= PR 107, 8= IRR 104, 9= PB 260, 10= IAN 873, 11= IRR 5, 12= BPM 101, 13= RRIC 110, 14= PB 330, 15= PB 217, 16= PB 340, dan 17= RRIM 712)
Figure 2     Electrophoretic  profile  of  amplification  product  of  Rubber  DNA  using  primer SSRH103  (A),  SSRH358 (B), SSRH403 (C) and SSRH 548 (D)  (M= 1 kb DNA ladder marker, (-)=negative controlf, 1= GT 1, 2= IRR 220, 3= PR 261, 4= IRR 112, 5= PB 5/51, 6= IRR 118, 7= PR 107, 8= IRR 104, 9= PB 260, 10= IAN 873, 11= IRR 5, 12= BPM 101, 13= RRIC 110, 14= PB 330, 15= PB 217, 16= PB 340,  and 17= RRIM 712)
EHB169  merupakan  primer  yang  menghasilkan  pita polimorfis terbanyak  yaitu  lima pita. Primer HBE280 merupakan  primer  dengan  jumlah  pita  polimorfis terendah  yaitu  satu  pita  (Tabel  3).  Primer  yang  baik untuk  membedakan  klon  adalah  primer  yang menghasilkan  pita  polimorfis.  Optimasi  konsentrasi gel  dan  besarnya  tegangan  diperlukan  untuk menghasilkan  pita  yang  jelas  dan  terpisah  dengan sempurna.
Polymorphic Information Content (PIC)
Hasil perhitungan nilai PIC menunjukkan bahwa dari  16  primer  yang  digunakan  dalam  analisis  pola DNAnya, satu primer yaitu HBE280 mempunyai nilai PIC=0  karena  hanya  menghasilkan  satu  pita  DNA, sedangkan  15  primer  lainnya  mempunyai  nilai  PIC
antara  0.3719  sampai  dengan  0.7183  (Tabel  3). Primer gSSR194  merupakan primer dengan  nilai  PIC paling tinggi yaitu 0.7183, sedangkan primer HBE280 merupakan primer dengan nilai PIC terendah  yaitu 0. Nilai PIC dari primer SSRH358  dan primer gSSR212 tidak  dapat  dihitung  karena  hasil  amplifikasi  yang tidak terlihat dengan jelas.
Nilai  PIC  mencerminkan  kemampuan  marka dalam menghasilkan alel polimorfis (Hidayatun et al., 2011),  sehingga  nilai  tersebut  diperlukan  untuk  me- milih marka yang dapat membedakan antar klon yang digunakan  (Mulsanti,  2011).  De  Vicente  &  Fulton (2003)  mengemukakan  bahwa  nilai  polimorfisme ditentukan oleh frekuensi kemunculan pita DNA atau alelnya.  Oleh  karena  itu  marka  yang  menghasilkan alel  lebih  sedikit  memiliki  kemampuan  yang  lebih
150 bp 200 bp M   (-)    1    2    3    4     5    6    7    8     9    10  11   12   13  14  15  16   17 M  (-)   1    2     3    4     5     6    7    8    9  10   11   12  13  14   15   16   17 100 bp 150 bp 200 bp M     (-)     1     2     3     4     5     6    7     8     9 10    11   12  13  14  15  16   17 A B C D
Evaluasi 18 primer SSR untuk pengembangan sidikjari DNA tanaman karet …….(Budiani et al .)
Gambar 3.  Profil elektroforesis hasil amplifikasi DNA karet menggunakan primer gSS165 (A), gSS194 (B), gSS212  (C), gSS213 (D)  dan gSS268 (E).  M= Marker 1 kb DNA  ladder, (-) = kontrol negatif, 1= GT 1, 2= IRR 220, 3= PR 261, 4= IRR 112, 5= PB 5/51, 6= IRR 118, 7= PR 107, 8= IRR 104, 9= PB 260, 10= IAN 873, 11= IRR 5, 12= BPM 101, 13= RRIC 110, 14= PB 330, 15= PB 217, 16= PB 340, dan 17= RRIM 712)
Figure 3. Electrophoretic  profile  of  amplification  product  of  rubber  DNA  using  primer  gSS165  (A), gSS194 (B), gSS212 (C) , gSS213(D) dan gSS268 (E). M= 1 kb DNA ladder marker,   (-) = negative control, 1= GT 1, 2= IRR 220, 3= PR 261, 4= IRR 112, 5= PB 5/51, 6= IRR 118, 7= PR 107, 8= IRR 104, 9= PB 260, 10= IAN 873, 11= IRR 5, 12= BPM 101, 13= RRIC 110, 14= PB 330, 15= PB 217, 16= PB 340, dan 17= RRIM 712)
kecil untuk membedakan sampel yang diuji. Nilai PIC yang tinggi ditunjukkan pada  marka  yang  menghasil- kan  banyak  alel.  Sejalan  dengan  itu,  Emrani et  al. (2011)  menyatakan  bahwa  nilai  PIC  merupakan standar yang baik untuk mengevaluasi marka genetik.

## Skoring dan identifikasi marka spesifik
Identifikasi keragaman genetik klon-klon tanaman karet secara sederhana dapat dilakukan menggunakan analisis  molekuler  dengan  skoring  terhadap  hasil
amplifikasi DNA marka SSR . Analisis tersebut disaji- kan  pada  Gambar  6  yang  menunjukkan  profil  klon- klon  tanaman  karet  yang  dibedakan  oleh  17  marka SSR yang diuji. Dibandingkan tampilan menggunakan tabel  (+)  dan  (-),  profil  hierarki  dengan  kode  warna memberikan  gambaran  umum  terhadap  tingkat  poli- morfisme  yang  lebih  jelas  antar  klon  tanaman  karet yang  diuji.  Dari  hasil  skoring,  total  diperoleh  61  alel dari 17 marka SSR yang digunakan. Empat puluh dua
M    (-)   1
2    3    4     5    6   7    8   9   10   11   12  13  14   15  16  17
250 bp M  (-)   1    2    3   4   5   6   7    8   9  10  11 12 13 14 15 16  17 M   (-)   1   2  3   4   5     6   7   8   9  10   11  12  13  14  15  16  17 200 bp 100 bp M  (-)  1   2   3   4     5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17 150 bp M     (-)     1        2       3    4      5       6     7      8     9    10     11    12    13    14    15    16     17 150 bp 100 bp A B C D E
Menara Perkebunan 2014 82(2), 81-94
alel dari marka-marka SSR tersebut seperti gSSR165.1, HBE316.3, EHB109.3, HBE301.1, HBE301.2,  SSRH548.1,  gSSR268.4,  SSRH403.4, SSRH103.4,  gSSR165.2,  HBE280.1,  HBE329.4, EHB178.2, HBE316.2, HBE316.1, EHB177.2, EHB109.1,  gSSR165.3,  EHB169.1,  gSSR213.3, EHB169.3,  SSRH403.2,  gSSR213.2,  gSSR194.2, SSRH103.2,  EHB085.2,  HBE329.2,  gSSR194.5, gSSR268.2, EHB085.1, EHB085.3, SSRH548.2,
EHB177.1,  gSSR212.2,  SSRH403.3,  HBE329.3, EHB169.2,  SSRH403.1,  gSSR213.1,  EHB109.2, gSSR194.6,  EHB178.3 memperlihatkan  amplifikasi positif  pada  5  hingga  17  klon  tanaman  karet.  Marka SSR tipe demikian dapat dikategorikan sebagai marka konstitutif.  Hasil  tersebut  masih  terhitung  sedikit dibandingkan  501  alel  pada  total  genom  yang dibutuhkan  untuk  membedakan  34  varietas  gandum (Zhang et al, 2002). Meskipun demikian, efektivitas
Gambar 4.  Profil elektroforesis hasil amplifikasi DNA karet menggunakan primer EHB085 (A),  EHB109 (B), EHB169 (C) , EHB177 dan EHB178 (E). M= Marker 1 kb DNA ladder,   (-)=kontrol negatif, 1= GT 1, 2= IRR 220, 3= PR 261, 4= IRR 112, 5= PB 5/51, 6= IRR 118, 7= PR 107, 8= IRR 104, 9= PB 260, 10= IAN 873, 11= IRR 5, 12= BPM 101, 13= RRIC 110, 14= PB 330, 15= PB 217, 16= PB 340, dan 17= RRIM 712).
Figure  4 . Electrophoretic profile of amplification product of rubber DNA using primer EHB085 (A), EHB109 (B), EHB169 (C) , EHB177 dan EHB178 (E). (M= 1 kb DNA ladder marker,   (-)=negative control, 1= GT 1, 2= IRR 220, 3= PR 261, 4= IRR 112, 5= PB 5/51, 6= IRR 118, 7= PR 107, 8= IRR 104, 9= PB 260, 10= IAN 873, 11= IRR 5, 12= BPM 101, 13= RRIC 110, 14= PB 330, 15= PB 217, 16= PB 340, dan 17= RRIM 712.
C D 150 bp M  (-)  1   2   3    4   5    6   7   8   9  10  11  12 13 14 15  16  17 B A 100 bp M  (-)   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17 200 bp 1500 bp
M   (-)   1    2   3    4   5   6    7   8   9  10  11  12  13 14 15 16 17 150 bp M  (-)   1    2    3   4   5   6   7   8    9   10  11 12  13  14  15  16  17
200 bp 150 bp
M  (-)   1   2    3   4    5    6   7     8    9   10  11  12 13 14 15  16  17
E
Evaluasi 18 primer SSR untuk pengembangan sidikjari DNA tanaman karet …….(Budiani et al .)
Gambar 5.  Profil  elektroforesis  hasil  amplifikasi  DNA  karet  menggunakan  primer  HBE280  (A),  HBE301  (B), HBE316 (C), dan EHB329 (D). M= Marker 1 kb DNA ladder, (-) =kontrol negatif, 1= GT 1, 2= IRR 220, 3= PR 261, 4= IRR 112, 5= PB 5/51, 6= IRR 118, 7= PR 107, 8= IRR 104, 9= PB 260, 10= IAN 873,  11=  IRR  5,  12=  BPM  101,  13=  RRIC  110,  14=  PB  330,  15=  PB  217,  16=  PB  340,  dan  17= RRIM 712).
Figure  5 Electrophoretic profile of amplification product  of rubber DNA using  primer HBE280 (A), HBE301 (B), HBE316 (C), and EHB329 (D). (M= 1 kb DNA ladder Marker,   (-)=negative control, 1= GT 1, 2= IRR 220, 3= PR 261, 4= IRR 112, 5= PB 5/51, 6= IRR 118, 7= PR 107, 8= IRR 104, 9= PB 260, 10= IAN 873, 11= IRR 5, 12= BPM 101, 13= RRIC 110, 14= PB 330, 15= PB 217, 16= PB 340, dan 17= RRIM 712.
dan efisiensi marka SSR yang digunakan dalam pene- litian  ini  telah  teruji.  Di  sisi  lain,  11  marka  SSR (SSRH 103, SSRH403, gSSR165, gSSR194, gSSR268,  EHB  085,  EHB109,  EHB169,  EHB  178, HBE 316, HBE 329) hanya muncul pada 1 klon karet saja.  Marka  tipe  ini  dapat  dikategorikan  sebagai marka  spesifik  dan  dapat  digunakan  sebagai  penanda dari klon bersangkutan.
Data skoring Gambar 6 tersebut kemudian dijabar- kan  dan  diseleksi  marka  yang  spesifik  untuk  klon tertentu  (Tabel  4).  Dari  Tabel  tersebut,  dapat  dilihat bahwa  marka  SSRH  103.3  spesifik  untuk  klon  PR 107,  SSRH 103.4 spesifik untuk klon IRR 220, SSRH 103.1  dengan  SSRH  103.4  spesifik  untuk  klon  IAN 875  dan  seterusnya.  Dari  Tabel  4  juga  dapat  diiden- tifikasi  marka  SSR  spesifik  untuk  masing-masing
klon.  Sebagai  contoh,  klon  PR  107  dapat  diidenti- fikasi  dengan  menggunakan  marka  SSRH  103.3, gSSR 165.1, gSSR194.2 + 5 + 6, gSSR268.3 + 4, dan EHB169.2 + 6.  Klon GT1 dapat diidentifikasi  meng- gunakan  marka  SSRH403.2  +  4  dan  gSSR268.4  +  5. Demikian  seterusnya  dengan  cara  yang  sama  dapat diidentifikasi  marka  SSR  lain  untuk  identifikasi  klon klon  lainnya.  Dari  Tabel  tersebut  juga  dapat  dilihat bahwa  dari  17  klon  yang  dianalisis,  4  dari  18  primer (SSRH  103,  SSRH403,  gSSR194,  EHB169)  yang diuji  dapat  mengidentifikasi  12  klon  yang  dianalisis, yaitu PR 107, PR 261, SP 217, PB 330, PB 340,. IRR 5, IRR 112, IRR 118, IRR 220, GT 1, BPM 101 dan RRIM  712.  Masing-maing  klon  tersebut  dapat dibedakan dari klon lainnya hanya dengan mengguna- kan satu jenis primer.
A M  (-)  1    2   3    4    5   6   7    8    9   10  11  12  13  14  15  16  17 250 bp M     1   2    3    4   5   6   7    8   9   10   11  12   13   14   15  16  17 100 bp B M    (-)  1   2   3   4    5    6   7    8   9   10  11 12  13 14 15 16  17 350 bp 300 bp C M   (-)    1   2   3    4    5   6    7    8    9  10   11   12 13  14  15  16   17
100 bp
D
Klon tanaman karet
G T 1 IR R 220 P R 261 IR R 112 P B 5/ 51 IR R 118 P R 107 IR R 104 P B 260 IA N 873 IR R 5 B P M 101 R R IC 110 P B 330 S P 217 P B 340 R R IM 712 gSSR165.1 HBE316.3 EHB109.3
HBE301.1 HBE301.2 SSRH548.1 gSSR268.4 SSRH403.4 SSRH103.4 gSSR165.2 HBE280.1 HBE329.4 EHB178.2 HBE316.2 HBE316.1 gSSR212.1 EHB177.2 EHB109.1 gSSR194.1 gSSR165.3 EHB169.1 gSSR213.3
EHB169.3
SSRH403.2 gSSR213.2 gSSR194.2 SSRH103.2 EHB085.2
HBE329.2 gSSR268.5
gSSR194.5 gSSR268.2 EHB085.1 EHB085.3 SSRH548.2 EHB177.1 gSSR212.2 SSRH403.3 HBE329.3 EHB169.2 SSRH403.1 gSSR213.1 EHB109.2 SSRH103.3 HBE329.1 gSSR194.3 EHB169.4 EHB177.3 gSSR194.6 EHB178.3 HBE329.5 SSRH403.5 gSSR268.3 EHB169.5 EHB178.1 SSRH103.1 gSSR194.4 gSSR212.3 SSRH103.5
gSSR268.1 SSRH358 Gambar 6. Profil skoring marka SSR pada 17 klon tanaman karet. Warna hitam menunjukkan hasil amplifikasi positif; warna abu-abu menunjukkan hasil negatif. Data tidak teridentifikasi ditampilkan dalam warna putih. Angka setelah titik pada marka SSR, menunjukkan nomor pita.
Figure 6.   Scoring profile of SSR markers in 17 rubber tree clones. Black colour showed positive amplification as opposed to gray  colour for negative amplification.  Non determined data  were  shown in  white.Band  number  was  shown after point in SSR marker name.
Evaluasi 18 primer SSR untuk pengembangan sidikjari DNA tanaman karet …….(Budiani et al .)
Tabel 4. Marka SSR hasil amplifikasi yang memberikan pola spesifik klon-klon tanaman karet. Table 4. SSR markers resulted from PCR amplification which give specific pattern of rubber tree clones.
Dari  Tabel  4  juga  menunjukkan  bahwa  dengan menggunakan  11  primer  (SSRH  101,  SSRH  403, gSSR165,  gSSR194,  gSSR268,    EHB  085,  EHB109, EHB169,  EHB  178,  HBE  316,  dan  HBE  329, sebanyak  14  klon  dapat  diidentifikasi.  Atau  dengan kata lain, sidik jari DNA dari 14 klon yang diuji telah diperoleh.  Sedangkan  identifikasi  tiga  klon  lainnya,
yaitu  PB  5/51,  PB  260,  dan  RRIC  110  harus  dilaku- kan dengan menggabungkan hasil PCR menggunakan beberapa primer. Sebagai contoh identifikasi PB 5/51, harus  dilakukan  dengan  menggunakan  gabungan paling  tidak  dua  primer  SSR  (SSRH403  dan HBE329), dan marka identitasnya adalah  SSRH403.1 + 4 bersama dengan HBE329.4 + 5.
Primer No. alel Klon SSRH 103 3 PR 107 4 IRR 220 1 4 IAN 873 4 5 SP 217 2 4 5 PB 330 SSRH403 1 2 4 PR 261 2 4 GT 1 2 3 IAN 873 3 4 IRR 220 1 2 3 4 5 IRR 118 gSSR165 1 PR 107 gSSR194 1 5 IRR 220 2 5 PR 261 1 3 5 IRR 112 3 5 6 IRR 118 2 5 6 PR 107 4 5 6 BPM 101 2 3 PB 340 2 6 RRIM 712 gSSR268 1 2 SP 217 3 4 PR 107 4 5 GT 1 EHB 085 1 2 IRR 112 EHB109 2 PB 340 EHB169 1 BPM 101 3 PR 261 2 3 PB 340 3 4 IRR 112 2 4 IRR 104 2 5 PR 107 EHB 178 1 3 IRR 5 HBE 316 2 RRIM 712 HBE 329 1 4 PR 261 4 BPM 101
Menara Perkebunan 2014 82(2), 81-94
Szewe-McFadden  e t  al. (1996)  menyatakan bahwa  penggunaan  primer  SSR  sebanyak  10-20 memungkinkan  untuk  membedakan  sejumlah  genotip yang  berkerabat  dekat  karena  kemampuan  meng- hasilkan  polimorfisme  yang  tinggi.  Namun  Zhang et al . (2002) mendemonstrasikan tidak adanya jumlah pasti  dari  marka SSR  yang digunakan.  Untuk spesies tanaman karet yang memiliki panjang genom ~ 2 GB, semakin banyak marka SSR akan semakin baik untuk membedakan  keragaman  genetis  dari  klon-klon tanaman  karet  (Li et  al., 2012).  Oleh  kareana  itu, meskipun  hasil  percobaan  ini  menunjukkan  bahwa marka SSR yang digunakan sangat berpotensi sebagai sidikjari  DNA klon-klon  karet,  namun  primer  yang sama perlu diuji untuk klon-klon  lainnya  yang  belum diuji  pada  penelitian  ini.  Demikian  pula  primer  lain perlu  dicoba  untuk  mengidentifikasi  klon-klon  yang belum  teridentifikasi  menggunakan  18  primer  dalam penelitian ini.

## Kesimpulan
Sidikjari  DNA  berbasis  marka  SSR  untuk  14 klon  karet  ,  yaitu  PR  107,  PR  261,  SP  217,  PB  330, PB  340,  IRR  5,  IRR  112,  IRR  118,  IRR  220,  GT  1, BPM  101,  RRIM  712,  IRR  104  dan   IAN  873  telah diperoleh.   Empat  primer  SSR,  yaitu  SSRH  103, SSRH403,  gSSR194,  EHB169,  cukup  untuk  meng- identifikasi  12  klon  karet  yang  dianalisis,  yaitu  PR 107,  PR  261,  SP  217,  PB  330,  PB  340,  IRR  5,  IRR 112,  IRR  118, IRR  220,  GT  1,  BPM  101  dan  RRIM 712.

## Daftar Pustaka
Aggarwal  RK,  PS  Hendre,  RK  Varshney,  PR  Bhat, V  Krishnakumar  &  L  Singh  (2007).  Identification, characterization  and  utilization  of  EST-derived  genic microsatellite  markers  for  genome  analyses  of  coffee and related species. Theor Appl Genet 114, 359-72.
Anonim (2010). Statistik Perkebunan Indonesia 2009-2011: Karet. Jakarta,  Sekretariat  Direktorat  Jenderal Perkebunan.  46p.
Brantestam  AK,  RV  Bothmer,  C  Dayteg,  I  Rashal, S  Tuvesson  &  J  Weibull  (2007).  Genetic  diversity changes  and  relationships  in  spring  barley  ( Hordeum vulgare L.)  germplasm  of  Nordic  and  Baltic  areas  as shown by SSR markers. Genetic Resources and Crop Evolution 54, 749-58.
Corley  RHV  (2005).  Illegitimacy  in  oil  plam  breeding  -  a review. J  Oil Palm Res 17, 64-9.
Diputra  IM  (2013).  Keragaman  genetik Pinus  merkusii
Jungh.  et  Ed  Vriese  strain  Tapanuli  berdasarkan penanda mikrosatelit Skripsi. Bogor, Institut Pertanian Bogor.
Elshire RJ, JC Glaubitz & Q Sun Q (2011). A robust, simple genotyping-by-sequencing  (gbs)  approach  for  high diversity species. PLoS ONE 6, e19379.
Feng  SP,  WG  Li,  HS  Huang,  JY    Wang  &  YT  Wu  (2009) Development,  application  and  cross-species/genera transferability  of  EST-SSR  makers  for  rubber  tree ( Hevea brasiliensis ). Mol Breed 23 (1), 85-97.
García  IR,  SSM  González,  DC  Montoya  &  F  Aristizabal (2011).  Identification  in  silico  of  SSR  markers  for genotyping Hevea sp. clone gardens in Colombia. Agr Colombiana 29, 359-366.
Gouvêa  LRL,  LB  Rubiano,  AF  Chioratto,  A  Fernando, MI  Zucchi  &  Paulo  DSG  (2010). Genetic  divergence of  rubber  tree  estimated  by  multivariate  techniques and  microsatellite  markers. Genet  and  Mol  Biol 33, 308-18.
Gupta  PK  &  RK  Varshney    (2000).  The  development  and use  of  microsatellite  markers for genetic analysis and plant  breeding  with  emphasis  on  bread  wheat. Euphytica 113, 163-85.
Hao CY, XY Zhang, LF Wang, YS Dong, XW Shang & JZ Jia  (2006).  Genetic  diversity  and  core  collection evaluations  in  common  wheat  germplasm  from  the Northwestern  spring  wheat  region  in  China. Mol Breed 17, 69-77.
Hasan  M,  F  Seyis,  AG  Badani,  J  Pons-Kuhnemann,
W Friedt, W Luhs & RJ Snowdon (2006) Analysis of genetic  diversity  in  the Brassica  napus  L .  gene  pool using  SSR  markers. Genet  Res  and  Crop  Evolution , 53 (4), 793- 802.
Ilbi H (2003). RAPD markers assisted varietal identification  and  genetic  purity  test  in  pepper, Capsicum annuum. Sci Hort 97, 211-21.
Li  D,  Z  Deng,  B  Qin,  X  Liu  &  Z  Men  (2012)  De  novo assembly  and  characterization  of  bark  transcriptome using  Illumina  sequencing  and  development  of  EST- SSR markers in rubber tree ( Hevea brasiliensis Muell. Arg.). BMC Genom , 13, 192.
Liu JC, L Liu, N  Hou,  A Zhang & CG Liu (2007) Genetic diversity  of  wheat  gene  pool  of  recurrent  selection assessed by microsatellite markers and morphological traits. Euphytica 155 (1-2),  249-258.
Marco  M,  PI  Luca,  LSB  Nadia  &  V  Vincenzo  (2007) Genetic  diversity  assessment  in  Somali  sorghum ( Sorghum  bicolor  (L. )  Moench)  accessions  using microsatellite  markers. Biodivers  Conser 16  (6), 1715–1730.
Mulsanti  IW  (2011).  Identifikasi  dan  evaluasi  kemurnian genetik  benih  padi  hibrida  menggunakan  marka mikrosatelit. Tesis . Bogor, Institut Pertanian Bogor.
Nagy  S,  P  Poczai,  I  Cernak,  AM  Gorji,  G  Hegedus  & J  Taller  (2012).  PICcalc:  an  online  program  to calculate  polymorphic  information  content  for molecular  genetic  studies. Biochem  Genet 50,  670– 672.
Orozco-Castillo  C,  KJ  Chalmers,  R  Waugh  &  W  Powell (1994).  Detection  of  genetic  diversity  and  selective gene  introgression  in  coffe  using  RAPD  markers.
Theor Appl Genet 87, 934-40.
Evaluasi 18 primer SSR untuk pengembangan sidikjari DNA tanaman karet …….(Budiani et al .)
Pootakham  W,  J    Chanprasert,  N  Jomchai,    D  Sangsrakru,
T  Yoocha,  S  Tragoonrung  &  S  Tangphatsornruang.
(2012).   Development   of   genomic-derived   simple sequence  repeat  markers in  Hevea  brasiliensis from 454  genome  shotgun  sequences. Plant  Breed 131, 555—562.
Prince JP, VK Lackney, C Angeles, JR Blauth & MM Kyle.
(1995).  A  survey  of  DNA  polymorphism  within  the genus Capsicum and  the  fingerprinting  of  pepper cultivars. Genome 38, 224-231.
Saha  T,  CB  Roy    &  MA  Nazeer    (2005)  Microsatellite variability  and  its  use  in  the  characterization  of cultivated  clones  of Hevea  brasiliensis . Plant  Breed 124 (1), 86-92.
Semagn  K,  A  Bjornstad  &  MN  Ndjiondjop  (2006).  An overview  of  molecular  marker  methods  for  plants. African J Biotechnol 5(25), 2540-2568.
Struss  D  &  J  Plieske  (1998)  The  use  of  microsatellite markers  for  detection  of  genetic  diversity  in  barley populations. Theor  Appl Genet 97, 308-315.
Szewc-McFadden AK, S Kresovich, SM Bliek, SE Mitchell & JR McFerson (1996) Identification of polymorphic, conserved  simple  sequence  repeats  (SSRs)  in
cultivated Brassica species. Theor  Appl  Genet 93, 534-538.
Tams  SH,  E  Bauer,  G  Oettler  &  AE  Melchinger  (2004) Genetic  diversity  in  European  winter  triticale determined  with  SSR  markers  and  coancestry coefficient. Theor Appl Genet ,  108( 7), 1385–1391.
Triwitayakorn K,P Chatkulkawin & S Kanjanawattanawong (2011). Transcriptome sequencing of Hevea brasiliensis for development of microsatellite markers and  construction  of  a  genetic  linkage  map. DNA  Res 18, 471-82.
Yu  F,  BH  Wang,  SP  Feng,  JY  Wang,  WG  Li  &  YT  Wu (2011)  Development,  characterization,  and  cross- species/genera  transferability  of  SSR  markers  for rubber  tree  ( Hevea  brasiliensis ). Plant  Cell  Rep . 30(3), 335– 344.
Zhang X, C Li, L Wang, H Wang, G You & Y Dong (2002) An estimation of the minimum number of SSR alleles needed  to  reveal  genetic  relationships  in  wheat varieties.  I.  Information  from  large-scale  planted varieties and  cornerstone breeding parents in Chinese wheat  improvement  and  production. Theor  Appl Genet 106, 112-117.