## Sensitivitas Metode Pemeriksaan Mikroskopis Fluorokrom dan Ziehl-Neelsen untuk Deteksi

## Mycobacterium tuberculosis pada Sputum
Betty Suryawati 1 , Leli Saptawati 1 , Astari Febyane Putri 2 , Jatu Aphridasari 3
1. Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas maret 2. Program Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret 3. Bagian Ilmu Penyakit Paru, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret
E-mail : betty.suryawati@staff.uns.ac.id

## ABSTRAK
Pendahuluan: Teknik  pewarnaan  fluorokrom  ( Auroamine-rhodamine )  merupakan  salah satu  metode  untuk  deteksi  Bakteri  Tahan  Asam  (BTA)  pada  sampel  sputum.  Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa fluorokrom mempunyai sensitivitas yang lebih baik dari pada  metode Ziehl-Neelsen (ZN).  Walaupun  demikian  tetapi  metode  ini  belum  banyak digunakan  secara  rutin,  termasuk  di  Indonesia.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  untuk mengevaluasi sensitivitas, spesifisitas, dan biaya metode fluorokrom dan membandingkan dengan pewarnaan ZN untuk deteksi BTA pada sputum pasien dengan tuberculosis (TB) dan yang terduga TB.
Metode Penelitian: Subyek penelitian adalah 60 sampel sputum pasien TB dan tersangka TB  yang  dikirim  ke  Laboratorium  Mikrobiologi  Rumah  Sakit  Dr.  Moewardi.  Sampel diambil  secara consecutive .  Tiap  sampel  diperiksa  dengan  teknik  pewarnaan  ZN  dan fluorokrom, dan ditanam pada media Lowenstein-Jensen (LJ) sebagai gold standar . Data dianalisis dengan uji sensitivitas dan spesifisitas.
Hasil  Penelitian: Pemeriksaan  ZN  mendeteksi  BTA  pada  10  sampel  sedangkan fluorokrom  mendeteksi  BTA  pada  17  sampel.  Sensitivitas  dan  spesifisitas  metode  ZN adalah 70% dan 90%, sedangkan pada teknik flourokrom adalah 90% dan 84%.
Simpulan: Teknik  fluorokrom memiliki  sensitivitas lebih tinggi  dibanding  ZN. Teknik ini dapat direkomendasikan untuk deteksi dini kasus tuberkulosis di Indonesia.
Kata Kunci: Tuberkulosis, Basil Tahan Asam, Fluorokrom, Ziehl-Neelsen

## ABSTRACT
Background: Detection of fast acid bacteria (FAB) using smear microscopy is used as a primary  screening  for  tuberculosis  diagnosis.  Previous  studies  have  shown  that fluorochrome ( Auroamine-rhodamine ) staining  showed  better  sensitivity  compared  to Ziehl-Neelsen (ZN) method in the detection of FAB in sputum. However this method has not  been  recommended  for  routine  use  including  in  Indonesia.  This  study  aimed  to evaluate the sensitivity and specificity of fluorochrome compared to ZN to detect FAB in patient’s sputum.
Methods:  This  study  analyzed  60  sputum  samples  from  patients  with  tuberculosis  and suspected  pulmonary  tuberculosis.  Samples  were  obtained  consecutively  from microbiology  laboratory  Moewardi  Hospital,  Indonesia.  Each  sample  was  examined using  ZN  and  fluorochrome  staining  and  cultured  in  Lowenstein-Jensen  (LJ)  medium. Data were analyzed using sensitivity and spesificity tests.
Results:  ZN  staining  detected  FAB  in  12  samples  (10%),  while  fluorochrome  detected FAB  in  17  samples  (28%).  The  sensitivity  and  specificity  of  ZN  staining  were  70%  and 90% while these for fluorochrome were 90% and 84%.
Conclusions: The sensitivity of fluorochrome staining is better compared to ZN staining. This method can be recommended for early detection of tuberculosis.
Keywords: Tuberculosis, Acid Fast Bacilli; Fluorochrome; Ziehl-Neelsen staining

## PENDAHULUAN
Tuberkulosis  (TB)  merupakan  infeksi yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis 1 .  Penyakit  ini  merupakan  10 besar  penyakit  terbanyak  yang  menyebabkan kematian diseluruh dunia 2 . Indonesia merupakan salah satu negara dengan prevalensi infeksi TB yang tinggi.
Diperkirakan  terdapat 1   juta  kasus  baru  TB pada  tahun  2015 1 .  Kecepatan  dan  ketepatan diagnosis  TB  merupakan  dasar  keberhasilan pengobatan TB 3 . Pemeriksaan mikroskopis dengan metode  pewarnaan Ziehl-Neelsen (ZN)  masih menjadi  pilihan  pertama  untuk  deteksi  awal TB.  Teknik  ZN  merupakan  teknik  yang mudah,  murah,  dan  mempunyai  spesifisitas yang  tinggi  untuk  mendeteksi  bakteri  tahan asam  (BTA)  pada  sputum.  Akan  tetapi penelitian  melaporkan  bahwa  sensitivitasnya cukup rendah (20-60%) 4,  5 . Selain teknik ZN, pemeriksaan  mikroskopis  dengan  mikroskop fluoresen  dengan  pawarnaan  fluorokrom ( Auroamine-rhodamine ) sudah digunakan dibeberapa  negara.  Penelitian  sebelumnya memperlihatkan bahwa pewarnaan
fluorokrom mempunyai sensitivitas dan spesifisitas  yang  lebih  baik  dari  pada  ZN 6 .
Akan  tetapi  di  Indonesia,  teknik  ini  belum direkomendasikan  untuk  digunakan  secara rutin di laboratorium. Hal ini karena teknik ini memerlukan  peralatan  yang  relatif  mahal. Akan  tetapi  pada  saat  ini  tersedia  mikroskop fluoresen deangan harga yang relatif terjangkau  misalnya  dengan  adanya  teknologi LED microscopy 7, 8 . Selain itu, adanya stigma bahwa  pemeriksaan  fluorokrom  merupakan teknik  yang  sulit  dikerjakan  dan  mahal membuat  teknik  ini  belim  direkomendasikan untuk pemeriksaan rutin diagnosis awal TB di Indonesia. Oleh karena itu diperlukan evaluasi
penggunaan  teknik  ini  di  rumah  sakit  daerah untuk  melihat  efektivitasnya  dibandingkan dengan teknik rutin pewarnaan ZN.
Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi  sensitivitas  dan  spesifisitas teknik  pewarnaan  fluorokrom  dibandingkan dengan  pewarnaan  ZN  untuk  deteksi  BTA pasien  TB  dan  pasien  tersangka  TB  di  rumah sakit pendidikan di Indonesia.

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental  laboratorik  dengan  desain untuk  uji  diagnostik.  Penelitian  dilaksanakan di  Laboratorium  Mikrobiologi  Universitas Sebelas Maret dan Laboratorium Mikrobiologi  Klinik  RSUD  Dr.  Moewardi. Sampel  sputum  diambil  dari  pasien  dengan diagnosis  TB  atau  pasien  tersangka  TB  yang melakukan  pemeriksaan  di  Balai  Besar Kesehatan Para Masyarakat (BBKPM) Surakarta  pada  bulan  Februari-Oktober  2017. Sampel  sputum  sebanyak  60  yang  diambil secara consecutive sampling, pasien tersangka TB  paru  maupun  yang  telah  terdiagnosis  TB paru.  Setiap  sampel  dilakukan  pemeriksaan dengan teknik pewarnaan ZN, fluorokrom dan ditanam pada media Lowenstein Jensen (LJ). Teknik pewarnaan ZN dilakukan dengan membuat sediaan apusan sputum pada object  glass .  Kemudian  dituangkan  larutan carbol  fuchsin 0,3%  pada  seluruh  permukaan sediaan (apusan sputum). Setelah itu dipanaskan  diatas  nyala  api  sampai  keluar asap  (tetapi  tidak  sampai  mendidih  atau kering)  selama  5  menit.  Sediaan  dibiarkan kering  di  udara  selama  5-7  menit.  Kelebihan cat  dibuang  dan  dicuci  dengan  air  yang mengalir.  Setelah  itu  sediaan  di  beri  larutan asam  alkohol  3%  ( hydrochloric  acid-ethanol ) dan  dibiarkan  2-4  menit  kemudian  dicuci
dengan air mengalir selama 1-3 menit. Setelah itu  dituang  larutan methylene  blue 0,1% sampai  menutup  seluruh  permukaan  dan ditunggu  selama  1  menit  kemudian  larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir 6 . Metode  fluorokrom  dilakukan  dengan merendam  sediaan  (apusan  sputum  pada object  glass )  dalam  larutan Auramine- rhodamine) selama  15  menit.  Sediaan  dicuci dengan  H2O  destilata  dan  dikeringkan, kemudian  direndam  dalam  asam  alkohol selama  2  menit.  Setelah  itu  dicuci  dengan H2O  destilata  dan  dikeringkan.  Setelah  itu sediaan  direndam  lagi  dalam  potasium permanganat  0,5%  selama  2  menit.  Yang terakhir,  sediaan  dicuci  dengan  H2O  destilata dan dikeringkan di udara 6 .
Pembacaan  hasil  teknik  ZN  dilakukan dengan  mikroskop  pembesaran  1000x  dengan meneteskan  minyak  emersi  pada  sediaan. Pembacaan  pada  metode  fluorokrom  dengan mikroskop fluoresen pembesaran 400X. Pembacaan  hasil  jumlah  BTA  berdasarkan skala  IUATLD  (International  Union  Againts Tuberculosis  and  Lung  Diseases,  lihat  Tabel 1).
Tabel 1 . Skala IUATLD (International Union Againts Tuberculosis and Lung Diseases Pembacaan dibawah mikroskop Pelaporan Hasil Tidak ditemukan BTA pada 100 lap pandang Neg. 1-9 BTA dalam 100 lapangan pandang Tulis jumlah BTA yang ditemukan 10-99 BTA dalam 100 lapangan pandang +1 1-10 BTA dalam 1 lapangan pandang +2 >10 BTA dalam 1 lapangan pandang +3
Analisis  statistik  dilakukan  dengan  uji sensitivitas  dan  spesifisitas,  nilai  prediktif positif  dan  nilai  prediktif  negatif  dari  kedua teknik pemeriksaan dibandingkan dengan gold standar (baku-emas)  yaitu  pertumbuhan/ kultur pada medium LJ.

## HASIL PENELITIAN
Visualisasi mikroskopis BTA dengan pewarnaan fluorochrome dan ZN
Pemeriksaan mikroskopis dengan fluorokrom  memberikan  gambaran  kuman BTA  seperti  terlihat  pada  Gambar  1  (A)  dan BTA pada pewarnaan ZN pada Gambar 1 (B).
Gambar 1.
Hasil visualisasi mikroskopis pewarnaan BTA dengan metode pewarnaan f luorochrome (A) dan pewarnaan ZN (B)
Perbandingan hasil deteksi BTA pada sputum dan hasil pertumbuhan pada medium Lowenstein Jensen
Dari  60  sampel  sputum  yang diperiksa, 10  (17%)  sampel  menunjukkan pertumbuhan pada medium LJ. Perbandingan  hasil  identifikasi  BTA pada sampel sputum dengan metode fluorokrom  dan  hasil  kultur  ditunjukkan pada Tabel 2. Perbandingan hasil pewarnaan ZN terhadap kultur ditunjukkan pada Tabel 3. Hasil Pewarnaan  fluorokrom  dan  ZN,  berturut- turut  menunjukkan  hasil  positif  pada  10 sampel  (28%)  dan  10  sampel  (20%)  dari 60 sampel sputum yang diperiksa.
Nilai sensitivitas dan spesifisitas pewarnaan  ZN  adalah  70%  dan  90%.  Nilai positive  predictive  value (PPV)  dan  nilai negative  predictive  value (NPV)  pewarnaan ZN  adalah  58%  dan  94%  (Lihat  Tabel  4). Nilai  sensitivitas  dan  spesifisitas  teknik pewarnaan  fluorokrom  adalah  90%  dan  84%,
A B
PPV  dan  NPV  untuk  teknik  fluorokrom adalah 53% dan 98% (lihat Tabel 5).
Tabel 2. Hasil pewarnaan fluorokrom
terhadap kultur pada medium LJ. Interpretasi Hasil Pewarnaan Fluorokrom Kultur pada medium LJ Kultur pos.  Kultur neg. 3+ 3 0 2+ 3 3 1+ 1 1 Scanty/rare 2 4 Neg. 1 42 Total 10 50 Ket: Pos=positif, Neg= Negatif Tabel 3. Hasil pewarnaan ZN terhadap kultur pada medium LJ. Interpretasi Hasil Perwarnaan ZN Kultur pada medium LJ Kultur pos. Kultur neg. 3+ 3 0 2+ 0 2 1+ 4 3 1-9 BTA/100LP 0 0 Neg. 3 45 Total 10 50 Ket: Pos=positif, Neg= Negatif
Sebanyak  14  sampel  pada  masing- masing  pewarnaan  memberikan  hasil  yang berbeda  dengan  hasil  pertumbuhan  pada medium  LJ.  Sepuluh  sampel  memberikan hasil  BTA  positif  pada  salah  satu  atau  kedua macam  pewarnaan  tetapi  tidak  menunjukkan adanya pertumbuhan Mycobacterium sp . pada medium  LJ,  meskipun  masa  inkubasi  telah dilakukan hingga 8 minggu.
Tabel 4. Pemeriksaan mikroskopis sputum dengan metode ZN dibandingkan dengan
kultur pada medium LJ.
Kultur LJ Pos. Neg. Jumlah ZN Pos. 7 5 12 Neg. 3 45 48 Jumlah 10 50 60 Ket: Pos=positif, Neg= Negatif
Tabel 5. Pemeriksaan mikroskopis sputum dengan metode fluorokrom dibandingkan dengan kultur pada medium LJ.
Ket: Pos=positif, Neg= Negatif

## PEMBAHASAN
Pemeriksaan mikroskopis sputum merupakan pemeriksaan awal yang sederhana, cepat,  murah,  dan  cukup  sensitif  untuk menegakkan  diagnosis  TB  paru.  Sensitivitas pemeriksaan  mikroskopis sputum  dipengaruhi oleh  beberapa  faktor  seperti  prevalensi tuberkulosis,  kualitas  dan  jumlah  spesimen, metode  pewarnaan,  dan skill dari  analisis 9 . Penelitian ini membandingkan metode pewarnaan  ZN  yang  dibaca  menggunakan mikroskop  cahaya  biasa  dengan  emersi pembesaran 100X dan teknik fluorokrom yang dibaca  menggunakan  mikroskop  fluorosens dengan pembesaran 400X.
Hasil  penelitian  didapatkan  bahwa sensitivitas  metode  pewarnaan  ZN  dan fluorokrom  masing-masing  sebesar  70%  dan 90%.  Sesuai  dengan  penelitian-penelitian sebelumnya,  BTA  pada  sputum  dengan pewarnaan ZN akan menunjukkan hasil positif bila  sputum  mengandung  paling  sedikit  10 5 BTA/ml,  sedangkan  metode  pewarnaan  yang lebih  sensitif  seperti  fluorokrom  dapat mendeteksi  BTA  dengan  jumlah  minimal  10 4
BTA/ml 10 .  Metode  pewarnaan  fluorokrom juga  memiliki  keuntungan  berupa  pembacaan hasil  yang  lebih  mudah  dan  cepat,  karena pembesaran  yang  lebih  kecil  sehingga  lapang pandang per unit lebih besar. Pembacaan hasil metode pewarnaan ZN diperlukan pembesaran 100x  lensa  objektif  dan  10x  lensa  okuler, sedangkan pada metode pewarnaan
fluorokrom hanya diperlukan pembesaran 40x lensa  objektif  dan  10x  lensa  okuler.  Metode
Kultur LJ Pos. Neg. Jumlah Fluoro- krom Pos. 9 8 17 Neg. 1 42 43 Jumlah 10 50 60
pewarnaan  fluorokrom  menggunakan  zat warna auramine-rhodamine/KMnO4 ,  BTA akan  tampak  berwarna  kuning  oranye  dengan latar  bewarna  gelap  seperti  pada  Gambar  1 9 . Diperlukan  waktu  sekitar  2  menit  dengan mikroskop  fluorosens  untuk  pembacaan  hasil per  area  sementara  dengan  mikroskop  cahaya biasa dibutuhkan waktu 10 menit 11 .
Spesifisitas  dan  nilai  NPP  pewarnaan fluorokrom  pada  penelitian  ini  sedikit  lebih rendah  dibandingkan  dengan  pewarnaan  ZN, yaitu 84% dibanding 90%. Beberapa penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa spesivitas  dan  sensitivitas  metode  fluorokrom cukup  tinggi  bahkan  mencapai  100% 12 . Angka  spesifisitas  yang  lebih  rendah  dapat terjadi  karena  pemeriksaan  dengan  teknik fluorokrom  juga  dapat  mendeteksi  jaringan non spesifik, debris sel, atau bakteri lain yang sudah  mati 13 .  Hal  ini  dapat  diatasi  dengan membuat  kualitas  sediaan  sputum  yang  baik pada proses pewarnaan.
Dari segi biaya pemeriksaan mikroskopis,  metode  pewarnaan  fluorokrom lebih murah dibandingkan dengan metode ZN, biaya  masing-masing  adalah  Rp.  4000  per sampel untuk Fluorokrom  dan Rp. 15.000 per sampel untuk ZN. Masih jarangnya penggunaan metode pewarnaan fluorokrom di Indonesia  kemungkinan  disebabkan  oleh harga mikroskop fluorosens  yang  lebih  mahal dibandingkan dengan mikroskop cahaya biasa, tetapi  mikroskop  fluorosens  hemat  daya seperti  mikroskop  fluorosens Light-Emitting Diode (LED) dapat dijadikan alternatif supaya biaya  menjadi  lebih  efektif.  Penelitian  di Negara dengan kondisi ekonomi yang terbatas menunjukkan  bahwa  metode  pemeriksaan fluorokrom  sangat  ideal  untuk  diterapkan sebagai  pemeriksaan  rutin  untuk  deteksi  dini TB 14 .
Mikroskop fluorosens biasa yang menggunakan  sumber  cahaya  dari  merkuri atau  halogen,  hanya  dapat  digunakan  selama 150  jam.  Sedangkan  mikroskop  fluorosens LED  dapat  digunakan  selama  15.000  jam
(CLSI,  2008).  Hal  ini  tentunya  dapat mengurangi  biaya  secara  signifikan  sehingga metode  pewarnaan  BTA  fluorokrom  dapat mulai dikembangkan di negara-negara berkembang  termasuk  Indonesia  dengan angka kejadian TB yang tinggi.

## SIMPULAN
Pemeriksaan  mikroskopis  BTA  dengan metode  pewarnaan  fluorokrom  memiliki sensitivitas  dan  NPP  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  metode  pewarnaan  ZN . Metode  ini  dapat  direkomendasikan  sebagai pengganti metode ZN, apalagi didukung biaya yang lebih murah.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Collins D, Hafidz F, Mustikawati D 2017 Int J Tuberc Lung Dis 21 1041-8
2. Dodd P J, Yuen C M, Sismanidis C, Seddon J A,  Jenkins  H  E  2017  Lancet  Glob  Health  5 e898-e906
3. Lawn  S  D,  Mwaba  P,  Bates  M,  Piatek  A, Alexander H, Marais B J , et al. 2013 Lancet Infect Dis 13 349-61
4. Agrawal M, Bajaj A, Bhatia V, Dutt S 2016 J Clin Diagn Res 10 DC09-12
5. Shakeel  K,  Iram  S,  Akhtar  M,  Hussain  S, Maryam H, Anwar A 2018 J Pak Med Assoc 68 33-7
6. Karuniawati  A,  Risdiyani  E,  Nilawati  S, Prawoto,  Rosana  Y,  Alisyahbana  B ,  et  al. 2005 MAKARA 9 29-33
7. Whitelaw  A,  Peter  J,  Sohn  H,  Viljoen  D, Theron G, Badri M , et al. 2011 Eur Respir J 38 1393-7
8. Khatun  Z,  Kamal  M,  Roy  C  K,  Sultana  T, Rahman  M  Q,  Azad  M ,  et  al. 2011
Bangladesh Med Res Counc Bull 37 7-10
9. O  A,  Nurbanu  S,  Aygün  Ö,  Nur  Y,
Sürücüoğlu S, Yüce A 2011 Turk J  Med  Sci 41 411-7
10. NS  M,  G  A  2016 International  Journal  of Contemporary Medical Research 3 968-71
11. J  B,  Shahapur  P,  P  C,  SS  H  2013 J.  Pharm. Sci. & Res 5 89-92
12. Shea Y R, Davis J L, Huang L, Kovacs J A, Masur  H,  Mulindwa  F ,  et  al. 2009 J  Clin Microbiol 47 1553-5
13. J  A,  Caulfield,  Nancy  L,  Wengenack  2016 Journal  of  Clinical  Tuberculosis  and  Other Mycobacterial Diseases 4 33-43
14. Alfred  N,  Lovette  L,  Aliyu  G,  Olusegun  O, Meshak P, Jilang T , et al. 2014 BMJ Open 4 e004093