Optimasi dan Validasi Metode KCKT untuk Identifikasi dan Penetapan Kadar Metabolit Nitrofuran dalam Bakso Udang
The HPLC Methods for Identificaton and Determination of Nitrofuran Metabolite Levels in Shrimps Meatballs
Rachma Ayuningtyas 1 , Riesta Primaharinastiti 2 , Mochammad Yuwono 2*
1 Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan (BBPOM) di Surabaya, Surabaya, Indonesia
2 Departemen Ilmu Kefarmasian, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
*Corresponding author: yuwono05@yahoo.com
Submitted: 4 Agustus 2020 Accepted: 15 September 2020 Published: 29 Agustus 2021

## Abstract
Background: Furazolidone, furaltadone, and nitrofurantoin are nitrofuran antibiotics still illegally used as food additives in shrimp farming and other food-producing animals. Therefore, due to their carcinogenicity, it is needed to control the contamination of nitrofuran metabolites in food products containing shrimps as the main ingredient. Objective:  This  study  aimed  to  validate  the  HPLC  method  for  determining  levels  of  nitrofuran  metabolites  in shrimp  meatballs.  Methods:  Furazolidone,  furaltadone  and  nitrofurantoin  were  derivatized  with  2- nitrobenzaldehyde, extracted into ethyl acetate, washed with hexane, and applied to HPLC with UV-PDA detector. The separation was performed on C-18 column 46 x 250 mm, 5 μm using the mobile phase of 20 mM ammonium acetate  and  acetonitrile (70:30), with a 0.5 mL/min  flow rate column temperature of  40 o C, injection volume of 100 μL. Results: The method showed good separation of metabolites and other interferences with an analysis time of 40 minutes, resulting in good linear response in the concentration ranges of 51.90 – 103.79 ng/mL (AOZ); 56.63 - 101.39 ng/mL (AMOZ); dan 49.92 – 89.86 ng/mL (AHD). The accuracy was found to be 78.50 - 102.29% for AOZ; 77.02 - 99.87% for AMOZ; and 85.54 - 99.77% for AHD; whereas the precision (RSD) for the repeatability test was 6.10 - 19.90%; 3.68 - 17.75%; and 2.75 - 12.58% for AOZ, AMOZ and AHD. LOD and LOQ obtained were between 3.09 and 10.29 ng/mL (AOZ); 6.84 and 22.82 ng/mL (AMOZ); and 4.61 and 15.36 ng/mL (AHD). Conclusion:  The  proposed  method  can  detect  and  quantify  nitrofuran  metabolite  contamination  in  shrimp meatballs.

## Keywords: AHD, AMOZ, AOZ, high-performance liquid chromatography, nitrofuran

## Abstrak
Pendahuluan :  Dikarenakan  sifat  dari  Furazolidon,  furaltadon,  dan  nitrofurantoin  yang  karsinogenik,  perlu dilakukan  pengawasan  terhadap  cemaran  metabolit  nitrofuran  dalam  produk  berbahan  dasar  udang.  Nitrofuran dimetabolisme  secara  cepat  dalam  jaringan  tubuh  hewan. Tujuan :  Penelitian  ini  bertujuan  melakukan  validasi metode KCKT untuk penetapan kadar metabolit nitrofuran dalam bakso udang. Metode : Metabolit furazolidone, furaltadone  dan  nitrofurantoin  yaitu  3-amino-2-oxazolidinone  (AOZ),  3-amino-5-methylmorpholino-2- oxazolidinone  (AMOZ),  dan  1-aminohydantoin  (AHD)  diderivatisasi  menggunakan  2-nitrobenzaldehida, diekstraksi dalam etil asetat dan dicuci dengan n-heksana, kemudian disuntikkan ke dalam system KCKT dengan detektor  UV-PDA.  Pemisahan  dilakukan  dengan  kolom  C-18  46  x  250  mm,  5  m.  Sebagai  fase  gerak  adalah ammonium asetat 20 mM : asetonitril (70:30), dengan laju alir 0.5 mL/menit, suhu kolom 40 o C, dan volume injeksi 100 µL. Hasil : Metode yang digunakan dapat memisahkan semua metabolit dari senyawa pengotor dengan waktu analisis 40 menit, dan menghasilkan linieritas yang baik dalam rentang konsentrasi 51,90 – 103,79 ng/mL (AOZ); 56,63 - 101,39 ng/mL (AMOZ); dan 49,92 - 89,86 ng/mL (AHD). Akurasi metode dipresentasikan sebagai rekoveri dengan hasil sebesar 78,50 - 102,29% untuk AOZ; 77,02 - 99,87% untuk AMOZ; and 85,54 - 99,77% untuk AHD. Presisi metode dinyatakan dalam simpangan baku relatif ( relative standard deviation , RSD) dengan hasil masing-
masing adalah 6,10 - 19,90%; 3,68 - 17,75%; and 2,75 - 12,58% untuk AOZ, AMOZ, dan AHD. LOD dan LOQ sebesar 3,09 ng/mL dan 10,29 ng/mL (AOZ); 6,84 ng/mL dan 22,82 ng/mL (AMOZ); serta 4,61 ng/mL dan 15,36 ng/mL (AHD). Kesimpulan : Metode uji dapat digunakan untuk skrining awal untuk mendeteksi dan penetapan kadar cemaran metabolit nitrofuran pada bakso udang.
Kata kunci : AHD, AMOZ, AOZ, kromatografi cair kinerja tinggi, metabolit

## PENDAHULUAN
Nitrofuran  adalah  golongan  antibiotik  yang seringkali  digunakan  sebagai  bahan  tambahan  pakan pada  budidaya  udang.  Penggunaan  nitrofuran  untuk ternak telah dilarang di negara-negara seperti Australia, AS,  Filipina, Thailand  dan  Brasil  (Khong  dkk.,  2004). Namun  pada  tahun  2007 Rapid  Alert  System  for  Food and  Feed (RASFF)  Uni  Eropa  menemukan  adanya kandungan  metabolit  nitrofuran  yaitu  3-amino-2- oxazolidinone  (AOZ)  pada  udang  masak  yang dibekukan,  yang  diekspor  dari  Indonesia  ke  Belgia (European  Comission,  2007).  Hal  ini  menunjukkan bahwa  antibiotika  golongan  nitrofuran  masih  banyak digunakan,  walaupun  telah  dilarang.  Di  Indonesia, menurut  Peraturan  Menteri  Kelautan  dan  Perikanan Republik  Indonesia  nomor  39/PERMEN-KP/2015 tentang Pengendalian Residu Obat Ikan, Bahan Kimia, dan  Kontaminan  pada  Kegiatan  Pembudidayaan  Ikan Konsumsi, batas minimum kerja laboratorium (BMKL) metabolit  nitrofuran  dalam  ikan  dan  udang  adalah 1  g/Kg. Oleh karena itu diperlukan adanya pengawasan terhadap  cemaran  metabolit  nitrofuran  dalam  produk- produk dengan komposisi utama udang.
Beberapa  obat  golongan  nitrofuran  yang  umum digunakan adalah furazolidon, furaltadon, dan nitrofurantoin. Golongan ini dimetabolisme secara cepat dalam tubuh hewan dan umumnya tidak muncul sebagai residu, sehingga menyulitkan deteksinya dalam produk makanan  yang  berasal  dari  hewan.  Ketiga  senyawa nitrofuran  tersebut  ternyata  mampu  membentuk metabolit toksik, yaitu 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ) dari furazolidon, 3-amino-5-methylmorpholino-2- oxazolidinone  (AMOZ)  dari  furaltadon,  dan  1- aminohydantoin (AHD) dari nitrofurantoin (Vass dkk., 2008).  Rumus  struktur  furazolidon,  furaltadon, nitrofurantoin,  dan  masing-masing  metabolitnya  dapat dilihat  pada  Gambar  1.  Metabolit  ini  dapat  terikat  di jaringan  dan  stabil  untuk  waktu  yang  lama,  sehingga berfungsi sebagai penanda untuk penggunaan nitrofuran secara ilegal pada hewan penghasil makanan (Vass dkk., 2008).  Hidrolisis  dengan  asam  adalah  metode  yang umum  digunakan  untuk  memecah  ikatan  antara metabolit  dengan  protein  (Verdon  dkk.,  2007),  dan
derivatisasi  dengan  nitrobenzaldehida  dilakukan  untuk meningkatkan sensitivitasnya pada metode kromatografi cair (Kaufmann dkk., 2015).
Gambar 1 . Rumus struktur senyawa golongan nitrofuran dan metabolitnya: (a) furazolidon; (b) 3- amino-2-oxazolidinone (AOZ); (c) furaltadon; (d) 3- amino-5-methylmorpholino-2-oxazolidinone (AMOZ);
(e) nitrofurantoin; (f) 1-aminohydantoin (AHD)
(Vass dkk., 2008)
Metode yang telah digunakan untuk analisis kadar metabolit nitrofuran adalah Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). ELISA adalah metode analisis  kuantitatif  yang  menunjukkan  reaksi  antigen- antibodi  melalui  perubahan  warna  yang  diperoleh dengan  menggunakan  konjugat  dan  enzim  substrat enzim, yang berfungsi untuk mengidentifikasi keberadaan  dan  konsentrasi  molekul  dalam  sampel biologis  (Aydin,  2015).  Karena  sifatnya  yang menggunakan antibodi yang spesifik untuk analit target, metode  ini  tidak  dapat  digunakan  untuk  melakukan penetapan kadar beberapa analit secara simultan.
Metode  kromatografi  cair  kinerja  tinggi  dengan detektor  tandem  spektrometri  massa  (HPLC-MS/MS) semakin banyak digunakan dan telah  secara  signifikan meningkatkan  validitas  metode  kuantitatif  untuk penentuan  metabolit  nitrofuran  dalam  beberapa  tahun terakhir  (Verdon  dkk.,  2007).  Metode  LC-MS/MS memiliki selektivitas dan sensitivitas yang sangat tinggi, namun aplikasinya masih sangat mahal dan tidak semua
laboratorium  pengujian  memiliki  instrumen  ini. Untuk keperluan kontrol kualitas secara rutin terhadap sampel produk  pangan  yang  jumlahnya  cukup  banyak,  maka diperlukan suatu metode skrining sebagai metode awal sebelum  dilakukan  metode  LC-MS/MS.  Dengan demikian  LC-MS/MS  lebih  ditujukan  untuk  keperluan konfirmasi  terhadap  sampel  yang  dinyatakan  positif pada hasil metode skrining.
Metode lain yang digunakan untuk penentuan kadar metabolit  nitrofuran  adalah  kromatografi  cair  kinerja tinggi  (KCKT)  dengan  detektor  UV-PDA  atau  UV, antara  lain  yang  telah  dilakukan  oleh  Prihanani,  dkk . (2017) yaitu analisis AOZ pada hati dan otot dada ayam. Baru-baru  ini,  Fernando  dkk.  (2017)  menggunakan KCKT dengan detektor photodiode array (PDA) untuk analisis  metabolit  nitrofuran  dalam  udang,  dan memperoleh hasil rerata rekoveri  untuk  AOZ, AMOZ, semikarbazida (SEM), dan AHD masing-masing adalah 107%,  107%,  115%,  dan  114%.  Namun  sejauh  ini belum tersedia metode skrining yang sudah tervalidasi untuk penentuan kadar metabolit nitrofuran pada pangan olahan  yang  berbahan  dasar  udang,  misalnya  bakso udang.  Pada  penelitian-penelitian  terdahulu  untuk validasi metode analisis metabolit nitrofuran, digunakan bahan  baku  udang  segar.  Sedangkan  sejauh  ini  belum ada  penelitian  yang  menggunakan  sampel  pangan olahan  udang.      Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah melakukan optimasi dan validasi metode KCKT dengan detektor  UV-PDA  sebagai  metode  awal  untuk identifikasi  dan  penetapan  kadar  residu  metabolit nitrofuran dalam bakso udang.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Certified  Reference  Material AOZ  Vetranal™ (CAS # 80-65-9), AMOZ Vetranal™ (CAS # 43056-63- 9),  dan  1-aminohydantoin  hidroklorida  (AHD,  CAS  # 2827-56-7),  ketiganya  diperoleh  dari  Sigma-Aldrich; asetonitril  derajat  KCKT  (Merck),  metanol  derajat KCKT  (Merck),  2-nitrobenzaldehid  (2-NBA,  Sigma- Aldrich),  dimetil  sulfoksida pro  analysis (Merck),  etil asetat pro  analysis (Merck),  n-heksan pro  analysis (Merck),  ammonium  asetat pro  analysis (Merck), dikalium  hidrogen  fosfat pro  analysis (Merck),  asam hidroklorida pro analysis 37% (Merck).

## Alat
Sistem  KCKT  (Shimadzu  Prominence)  yang dilengkapi  detector  PDA  (SPD  20M),  pompa  (LC  20 AD), degasser (DGU  20  A),  oven  (CTO  20A),  dan autosampler (SIL 20 HT). Kolom C-18 250x46 mm, 5  m  (GL  Sciences); waterbath (Memmert  WNB  22),
sentrifuge (Thermo  Scientific  Megafuge  16),  neraca mikro  (Sartorius  MSA  6  GS),  neraca  analitik  (Mettler Toledo MS 204S).
Metode Pembuatan larutan baku induk (50  g/mL)
Ditimbang saksama 2,5 mg masing-masing baku 3- amino-2-oxazolidinone
(AOZ); 3-amino-5- methylmorpholino-2-oxazolidinone (AMOZ); 1-
aminohydantoin (AHD), dimasukkan masing-masing ke dalam  labu  tentukur  coklat  50,0  mL,  masing-masing dilarutkan dan diencerkan dengan metanol hingga tanda. Pembuatan larutan baku antara tunggal (1  g/mL) Dipipet 1,0 mL masing-masing larutan baku induk, dimasukkan  ke  dalam  labu  tentukur  coklat  50,0  mL secara  terpisah  dan  diencerkan  hingga  tanda  dengan metanol.
Pembuatan larutan baku antara campuran (1  g/mL)
Dipipet 5,0 mL masing-masing larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu tentukur coklat 50,0 mL dan diencerkan  hingga  tanda  dengan  metanol  sehingga diperoleh  larutan  baku  antara  campuran  10  g/mL. Larutan  ini  kemudian  dipipet  1,0  mL,  dimasukkan  ke dalam  labu  tentukur  coklat  10,0  mL  dan  diencerkan dengan metanol hingga tanda.

## Pembuatan larutan 2-NBA 50 mM
Ditimbang  75  mg  2-NBA,  dimasukkan  ke  dalam labu  tentukur  10,0  mL,  dilarutkan  dan  diencerkan dengan dimetilsulfoksida hingga tanda.

## Pembuatan matriks sampel
Udang untuk pembuatan matriks sampel merupakan  udang  ukuran  sedang  yang  diperoleh  dari pasar  tradisional.  Pada  analisis  yang  telah  dilakukan sebelumnya,  tidak  ditemukan  adanya  cemaran  AOZ, AMOZ  dan  AHD  dalam  udang  yang  digunakan. Ditimbang sejumlah udang segar yang telah dikupas dan dibersihkan,  kemudian  dihaluskan  menggunakan food processor .  Kemudian  dicampur  dengan  bumbu  halus dan  tepung  tapioka,  diaduk  hingga  merata  dan  dapat dibentuk. Campuran tersebut lalu dibentuk bulat dengan bantuan  dua  buah  sendok,  kemudian  direbus  pada  air panas bersuhu 70  C selama  10 menit, dan perebusan dilanjutkan  hingga  air  mendidih  (100  C)  dan  bakso udang mengapung. Bakso udang yang telah mengapung diangkat dan ditiriskan.

## Preparasi larutan matriks sampel
Larutan  matriks  sampel  dibuat  dengan  cara menimbang sampel bakso udang yang sudah dihaluskan sejumlah 2,0 g, dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga 50  mL.  Kemudian  ditambahkan  5,0  mL  larutan  HCl 0,1M  dan  200  L  2-NBA  50mM,  dikocok  hingga
homogen dengan alat vortex selama 2 menit, diinkubasi selama  tidak  kurang  dari  16  jam  pada  suhu  37  C.
Setelah  derivatisasi,  larutan  didinginkan  pada  suhu ruang  dan  dinetralkan  dengan  penambahan  1  mL dikalium  hidrogen  fosfat  1M,  dikocok  dengan mixer selama 1 menit, cek pH 7  0,3. Kemudian ditambahkan 5  mL  etil  asetat  dan  3  mL  n-heksana,  dikocok  hingga homogen  dengan  vortex  selama  2  menit,  kemudian disentrifugasi  selama  15  menit  pada  laju  4000  G. Diambil 6 mL fase organik dan dimasukkan ke tabung sentrifus lain yang bersih, dikeringkan dengan aliran gas nitrogen  dalam  waterbath  pada  suhu  42  C,  kemudian direkonstitusi dengan 2 mL n-heksana, dikocok hingga homogen  dengan  alat  vortex  selama  2  menit. Ditambahkan  4,0  mL  metanol:air  (5  :  95),  dikocok hingga  homogen  dengan  vortex  selama  2  menit  dan disentrifugasi selama 5 menit pada laju 4000 G. Diambil lapisan  bawah  menggunakan  pipet  tetes,  disaring dengan syringe filter 0,2  m  dan dimasukkan ke dalam vial autosampler .  Larutan  uji  disuntikkan  pada  sistem KCKT (Alkan dkk., 2016).

## Uji selektivitas
Larutan  untuk  uji  selektivitas  dibuat  dengan  cara cara  menimbang  sampel  bakso  udang  yang  sudah dihaluskan sejumlah 2,0 g, dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga  50  mL  dan  ditambahkan  0,32  mL  larutan baku  antara  campuran  (1  g/mL).  Proses  selanjutnya sama dengan pembuatan larutan matriks sampel.

## Linieritas, akurasi, dan presisi
Larutan  untuk  uji  linieritas,  akurasi  dan  presisi dibuat  dengan  cara  menimbang  sampel  bakso  udang sejumlah 2,0 g, dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga 50  mL,  lalu  ditambahkan  masing-masing  0,2;  0,24; 0,28;  0,32;  0,36;  dan  0,4  mL  larutan  baku  antara campuran  (1  g/mL).  Proses  selanjutnya  sama  dengan pembuatan  larutan  matriks  sampel.  Untuk  uji  akurasi, ditambahkan 0,24; 0,32; dan 0,4 mL larutan baku antara campuran  1  g/mL  dan  dilakukan  replikasi  tiga  kali, kemudian  dihitung  persen  rekoveri  beserta  standar deviasinya.  Sedangkan  untuk  uji  presisi,  digunakan
larutan  yang  sama  seperti  pada  uji  akurasi,  kemudian dihitung RSD.

## LOD-LOQ
Untuk  menentukan  LOD,  dibuat  larutan  baku tunggal AOZ, AMOZ dan AHD dalam matriks sampel. Ditimbang sejumlah 2,0 g matriks sampel, dimasukkan ke  dalam  tabung  sentrifuga  50  mL,  kemudian ditambahkan  0,16  mL  larutan  baku  antara  tunggal  (1  g/mL).  Proses  selanjutnya  sama  dengan  pembuatan larutan matriks sampel. Dari kromatogram yang didapat, diukur  tinggi  puncak  analit  dan  gangguan  ( noise ), kemudian dihitung dengan rumus:
LOD = Cs 3 S N ⁄ LOQ = Cs 10 S N ⁄
Dimana: Cs : konsentrasi baku yang disuntikkan S : tinggi puncak analit N : tinggi noise

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi  kondisi  KCKT  dilakukan  dengan mengacu  pada  penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh Aldeek  dkk.  (2018)  dan  Alkan  dkk.  (2016).  Kedua metode  tersebut  menggunakan  LC-MS/MS  sehingga dalam  optimasi  metode  untuk  penelitian  ini  dilakukan beberapa adaptasi, seperti laju alir. Hasil dari optimasi metode dapat dilihat pada Tabel 1.
Dari  optimasi  yang  telah  dilakukan,  didapatkan hasil kondisi KCKT yang optimum untuk memisahkan ketiga  senyawa  yaitu  penyesuaian  dari  metode  yang digunakan  oleh  Alkan  dkk.  (2016),  dengan  fase  gerak ammonium asetat 20 mM : asetonitril (70 : 30), dengan laju  alir  0,5  mL/menit  dan  suhu  kolom  40  ºC,  volume injeksi  100  m  dan  waktu  analisis  40  menit.  Detektor PDA digunakan untuk mengetahui panjang gelombang analit, kemudian untuk kuantifikasi digunakan detektor UV. Panjang gelombang analisis yang digunakan adalah 260 nm.
Tabel 1. Optimasi kondisi KCKT untuk analisis metabolit nitrofuran Penelitian Pengekstraksi Pelarut rekonstitusi Fase gerak Eluasi kolom Laju alir Hasil Aldeek dkk. (2017) Etil asetat, dengan penambahan NaCl Amonium asetat: metanol (20:80) A= 0,1% asam format dalam air B= 0,1% asam format dalam asetonitril Gradien 0,5 mL/min Puncak kromatogram AOZ dan AHD tampak pecah ( split peaks ) Alkan dkk. (2016) 5 mL etil asetat + 3 mL n- heksan Air : metanol (95:5) Amonium format: metanol Isokratik, 70:30 1 mL/min Puncak AMOZ tampak pecah ( split peak ) Alkan dkk. (2016), dengan penyesuaian 5 mL etil asetat + 3 mL n- heksan Air : metanol (95:5) Amonium asetat: metanol Isokratik, 70:30 0,5 mL/min Semua analit dapat terpisah dan memiliki profil puncak yang cukup baik
Sebelum  melakukan  validasi  metode,  terlebih dahulu dilakukan uji kesesuaian sistem terhadap sistem kromatografi.  Hal  ini  dilakukan  dengan  menyuntikkan satu  konsentrasi  larutan  baku  ke  dalam  sistem  KCKT dengan  kondisi  analisis  terpilih,  dengan  pengulangan sebanyak  enam  kali  (Shabir,  2003).  Parameter  yang
diuji antara lain faktor retensi (k’), keterulangan waktu retensi  dan  area  puncak  (dinyatakan  dengan  %RSD), resolusi  (Rs),  tailing  factor  (T),  dan  angka  lempeng teoritis (N). Hasil uji kesesuaian sistem pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil uji kesesuaian sistem KCKT pada kondisi terpilih*) Analit %RSD Rt %RSD Area Rerata k’ Rerata Resolusi Rerata T Rerata N AOZ 0,08 1,71 4,79 2,52 1,13 15357,32 AMOZ 0,11 0,32 5,38 3,22 1,10 20167,10 AHD 0,08 0,28 2,78 4,08 1,66 11852,76 Syarat Keberterimaan (Shabir, 2003)  1  1 > 2 > 2  2 > 2000
*)Fase gerak ammonium asetat : asetonitril (70:30), laju alir 0,5 mL/menit, volume injeksi 100  L, panjang gelombang 260 nm.
Analisis metabolit nitrofuran dilakukan dengan cara derivatisasi  dalam  suasana  asam.  Proses  derivatisasi menggunakan  2-nitrobenzaldehida  dilakukan  melalui inkubasi  selama  16  jam  pada  suhu  37  C.  Kemudian dilakukan  ekstraksi  menggunakan  campuran  etil asetat dan  n-heksana,  setelah  itu  hasil  ekstraksi  dikeringkan. Ekstrak  kering  dilarutkan  kembali  dengan  n-heksana, kemudian  ditambahkan  larutan  methanol  :  air  (5  :  95) dan  dikocok  menggunakan mixer .  Fase  air  inilah yang diambil dan disuntikkan ke system KCKT.
Uji selektivitas dilakukan untuk mengetahui apakah suatu  metode  dapat  memisahkan  analit  dari  senyawa pengotor, matriks atau degradan. Puncak kromatogram analit  tidak  boleh  diganggu  oleh  puncak-puncak
komponen lain, dan memberikan pemisahan yang baik antara analit dengan komponen lain (matriks, pengotor, degradan). Persyaratan agar suatu metode dapat disebut selektif adalah resolusi lebih besar dari 1,5 (Yuwono & Indrayanto,  2005).  Hasil  dari  uji  selektivitas  dapat dilihat  pada  Gambar  2  dan  Gambar  3.  Uji  resolusi  ini menunjukkan keterpisahan AOZ, AMOZ, dan AHD dari satu  sama  lain  dan  juga  keterpisahan  ketiga  analit tersebut  dari  puncak  lain  dalam  matriks  sampel.  Pada Gambar  4,  dapat  dilihat  bahwa  resolusi  AOZ,  AMOZ dan AHD masing-masing adalah 12,62; 3,31; dan 4,28. Sehingga dapat disimpulkan bahwa tiap analit memiliki keterpisahan  yang  baik  dan  memenuhi  syarat keberterimaan.
Gambar 2 . Kromatogram matriks sampel
Gambar 3 . Kromatogram analit pada uji selektivitas: 1) AHD; 2) AOZ; 3) AMOZ (konsentrasi: AOZ 83,03 ng/mL; AMOZ 90,13 ng/mL; AHD 79,87 ng/mL).
Resolusi analit: AOZ 12,62; AMOZ 3,31; AHD 4,28
Gambar 4 . Kurva baku AOZ pada rentang konsentrasi 51,90 - 103,79 ng/mL
Uji  linieritas  dilakukan  dengan  membuat  kurva baku.  Larutan  baku  campuran  dalam  matriks  sampel dibuat  dengan  rentang  konsentrasi  AOZ,  AMOZ,  dan AHD  masing-masing  adalah  51,90  -  103,79  ng/mL; 56,63 -  101,39 ng/mL;  dan 49,92  -  89,86 ng/mL. Dari kromatogram  yang  didapat,  dibuat  kurva  baku  antara area  puncak  dengan  konsentrasi  baku,  kemudian dihitung harga koefisien korelasi (r) dan persamaan y = a + bx. Persamaan regresi dianggap linier jika r  0,999
dan  nilai  V xo tidak  boleh  lebih  dari  5%  (Yuwono  and Indrayanto,  2005).  Kurva  baku  masing-masing  analit dapat dilihat pada Gambar 4, Gambar 5 dan Gambar 6, sedangkan parameter keberterimaan (koefisien korelasi dan nilai V x0 ) tercantum pada Tabel 3. Dari Gambar 4, Gambar 5 dan Gambar 6 serta Tabel 3, terlihat koefisien korelasi  AOZ  dan  AHD  serta  nilai  V x0 AHD  tidak memenuhi syarat keberterimaan.
1 2 3
Tabel 3. Validitas metode analisis Parameter Analit AOZ AMOZ AHD Koefisien korelasi (r) 0,99037 0,99977 0,97963 V x0 (%) 4,52 0,66 5,35 Rekoveri (%) 78,50 - 102,29 77,02 - 99,87 85,54 - 99,77 RSD (%) 6,10 - 19,90 3,68 - 17,75 2,75 - 12,58 LOD (ng/mL) 3,09 6,84 4,61 LOQ (ng/mL) 10,29 22,82 15,36
Gambar 5. Kurva baku AMOZ pada rentang konsentrasi 56,63 - 101,39 ng/mL
Gambar 6. Kurva baku AHD pada rentang konsentrasi 49,92 - 89,86 ng/mL
Akurasi  dinyatakan  sebagai  persen  rekoveri  dari hasil analisis uji terhadap kadar analit sebenarnya yang ditambahkan dalam masing-masing sampel. Pembuatan larutan  uji  akurasi  dilakukan  dengan  cara  menyiapkan sampel bakso udang yang ditambah dengan larutan baku antara campuran 1  g/mL sebanyak 0,24; 0,32; dan 0,4 mL  dengan  replikasi  sebanyak  tiga  kali  untuk  setiap konsentrasi,  kemudian  dihitung  persen  rekoveri  dan standar deviasinya. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 3. Menurut AOAC  (2016), syarat keberterimaan rekoveri untuk  analit  dengan kadar 10  -  100 ng/mL adalah 60  - 115%.  Dari  hasil  yang  diperoleh,  dapat  dilihat  bahwa rekoveri ketiga analit memenuhi kriteria.
Uji  presisi  yang  dilakukan  pada  penelitian  ini adalah repeatability , yaitu analisis dengan replikasi tiga
kali  secara  independen  dari  tiga  konsentrasi  sampel seperti  pada  uji  akurasi.  Kriteria  penerimaan  presisi adalah  dengan  menghitung  nilai relative  standard deviation (RSD). Untuk AOZ, AMOZ, dan AHD pada penelitian  ini,  syarat  keberterimaan  RSD  pada  kadar analit  10-100  ng/mL  adalah  21%  (AOAC,  2016). Sebagaimana dapat dilihat pada Tabel 3, bahwa semua analit memenuhi kriteria.
Penentuan  LOD  dan  LOQ  dilakukan  dengan  cara menghitung  rasio signal - to-noise .  Disuntikkan  larutan baku dengan konsentrasi  lebih rendah daripada larutan baku  terkecil  pada  uji  linieritas.  Hasil  LOD  dan  LOQ penelitian  ini  dapat  dilihat  pada  Tabel  3,  dan  dapat disimpulkan  bahwa  metode  yang  digunakan  dapat
mendeteksi  analit  dalam  konsentrasi  lebih  rendah daripada rentang linieritas.
Hasil  dari  serangkaian  uji  yang  telah  dilakukan menunjukkan  bahwa  metode  ini  masih  memerlukan penyempurnaan, terutama untuk linieritas AHD. Untuk keperluan  skrining  analit,  parameter  utama  adalah selektivitas dan LOD serta LOQ. Dengan melihat hasil uji selektivitas, LOD dan LOQ pada penelitian ini yang semuanya  memenuhi  kriteria  keberterimaan,  maka metode  ini  dapat  digunakan  untuk  skrining  cemaran AOZ, AMOZ dan AHD dalam produk olahan udang.

## KESIMPULAN
Dari  penelitian  yang  telah  dilakukan,  dapat disimpulkan bahwa metode analisis metabolit nitrofuran secara  KCKT  dengan  fase  gerak  ammonium  asetat 20 mM : asetonitril (70:30), laju alir 0,5 mL/menit dan panjang gelombang 260 nm ini  dapat digunakan sebagai metode  skrining  cemaran  metabolit  nitrofuran  (AOZ, AMOZ, AHD) dalam produk olahan udang.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terimakasih  kepada  Badan Pengawas  Obat  dan  Makanan  dan  khususnya  Balai Besar  Pengawas  Obat  dan  Makanan  di  Surabaya  atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan.

## DAFTAR PUSTAKA
Aldeek, F., Hsieh, K. C., Ugochukwu, O. N., Gerard, G.
&  Hammack,  W.  (2018).  Accurate  Quantitation and Analysis of Nitrofuran Metabolites,
Chloramphenicol,  and  Florfenicol  in  Seafood  by Ultrahigh-Performance  Liquid  Chromatography- Tandem  Mass  Spectrometry:  Method  Validation and  Regulatory  Samples  [Research-article]. Journal of Agricultural and Food Chemistry ; 66 ;
5018–5030.
Alkan,  F.,  Kotan,  A.  &  Ozdemir,  N.  (2016).
Development  and  Validation  of  Confirmatory Method for Analysis of Nitrofuran Metabolites in Milk,  Honey,  Poultry  Meat  and  Fish  by  Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry. Macedonian Veterinary Review ; 39 ; 15–22.
AOAC.  (2016).  Appendix  F:  Guidelines  for  Standard Method  Performance  Requirements.  Rockville: AOAC International.
Aydin, S. (2015). A Short History, Principles, and Types of  ELISA,  and  Our  Laboratory  Experience  with Peptide/Protein Analyses Using ELISA. Peptides ;
European  Comission. (2007).  The  Rapid  Alert  System for Food and Feed (RASFF) Annual Report 2007. Luxembourg:  Office  for  Official  Publications  of the European Communities.
Fernando, R., Munasinghe, D. M. S., Gunasena, A. R. C.  &  Abeynayake,  P.  (2017).  Determination  of Nitrofuran  Metabolites  in  Shrimp  Muscle  by Liquid  Chromatography-Photo  Diode  Array Detection. Food Control ; 72 ; 300–305.
Kaufmann,  A.,  Butcher,  P.,  Maden,  K.,  Walker,  S.  &
Widmer, M. (2015). Determination of Nitrofuran and Chloramphenicol Residues by High
Resolution  Mass  Spectrometry  Versus  Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. Analytica Chimica Acta ; 862 ; 41–52.
Khong,  S.  P.,  Gremaud,  E.,  Richoz,  J.,  Delatour,  T., Guy,  P.  A.,  Stadler,  R.  H. &  Mottier, P. (2004). Analysis of Matrix-Bound Nitrofuran Residues in Worldwide-Originated Honeys by Isotope Dilution High-Performance Liquid Chromatography-Tandem  Mass  Spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry ; 52 ; 5309–5315.
Prihanani,  N.  I.,  Nugroho,  W.  S.  &  Wijayanti,  A.  D. (2017). Analisis Residu 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ)  pada  Hati  dan  Otot  Dada  Ayam  Setelah
Proses Pemanasan menggunakan Metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Tesis;
Fakultas  Kedokteran  Hewan  Universitas  Gadjah Mada, Yogyakarta.
Shabir,  G.  A.  (2003).  Validation  of  High-Performance
Liquid Chromatography Methods for Pharmaceutical Analysis. Journal of Chromatography A ; 987 ; 57–66.
Vass, M., Hruska, K. & Franek, M. (2008). Nitrofuran Antibiotics:  A  Review  on  the  Application, Prohibition  and  Residual  Analysis. Veterinarni Medicina ; 53 ; 469–500.
Verdon,  E.,  Couedor,  P.  &  Sanders,  P.  (2007).  Multi- Residue  Monitoring  for  the  Simultaneous Determination of Five Nitrofurans (Furazolidone, Furaltadone, Nitrofurazone, Nitrofurantoine, Nifursol)  in  Poultry  Muscle  Tissue  Through  the Detection of Their Five Major Metabolites (AOZ, AMOZ,  SEM,  AHD,  DNSA. Analytica  Chimica Acta ; 586 ; 336–347.
Yuwono,  M.,  &  Indrayanto,  G.  (2005).  Validation  of Chromatographic  Methods  of  Analysis. Profiles of  Drug  Substances,  Excipients  and  Related Methodology ; 32 ; 241–260.