## Peran Alpha-S2 kasein Susu Kambing PE Terhadap Perbaikan Morfologi dan Histologi Membran Synovial  Tikus Rheumatoid Arthritis
Rivqi Rifa Bia 1 , Aris Soewondo 1 , Fatchiyah Fatchiyah 1.2
1) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya Malang
2) Laboratorium Biosains Universitas Brawijaya

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menganalisa  efek  pemberian  alpha-S2  kasein    susu  kambing  PE terhadap  perubahan  morfologi  dan  histologi  membran  sinovial  tikus  Rheumatoid  Arthritis  (RA).  Tahapan penelitian  meliputi  pembuatan  RA  menggunakan  multidosis  CFA  (Complete  Freud  Adjuvant.  Kelompok perlakuan  dibagi  menjadi  (C:  Kontrol;  CM:  Kontrol  +  alpha-S2  kasein;  RA:  Rheumatois  Arthritis;  RAM: Rheumatois  Arthritis  +  alpha-S2  kasein).  Treatment  RA  dilakukan    selama  2  bulan  dengan  dosis  2mg/kg. Analisa morfologi dilakukan dengan skoring perubahan bentuk kaki dan histologi menggunakan metode HE yang  divisualisasi  menggunakan  mikroskop  BX53.  Hasil  penelitian  menunjukkan  adanya  perbaikan morfologi yang ditandai dengan penurunan hasil skor klinis (C = 0; RA = 4; CM = 0; RAM = 1.3). Perbaikan histologi terletak pada penurunan jumlah hiperplasia pada kelompok RA + alpha-S2 kasein menuju kondisi normal dimana penurunan level tersebut mengidikasikan alpha-S2 kasein dapat digunakan sebagai alternatif penyembuhan RA.
Kata kunci: alpha-S2 kasein, CFA, HE, Rheumatoid arthritis

## ABSTRACT
The aim of this study is to analyze the effect of alpha-S2 casein of goat Ethawah breed milk to  prove  morphological  and  histological  synovial  membrane  of  Rheumatoid  Arthritis  rat  models. Twelve of rats divided into four groups: 3 normal rats, 3 normal + treatment, 3 rats of RA-induced CFA  (multi  doses)  and  3  rats  RA  +  treatment  that  induced  by  2mg/kg  BW  alpha-S2  casein  every day  during  two  months.  Inflammation  leg  of  all  rats  was  scored  by  change  leg  morphology.  And histological slide stained by HE and measured using BX-53 microscope. The result shows the alpha- S2  casein  of  goat  Ethawah  breed  milk  can  prove  to  be  normally  of  the  inflammation  leg  and histological  synovial  membrane  leg.  That  indicate  that  goat  Ethawah  breed  milk  can  use  as rheumatoid arthritis healing.
Keywords: alpha-S2 kasein, CFA, HE, Rheumatoid arthritis
* corresponding author: Prof. Fatchiyah, PhD. e-mail: fatchiya@ub.ac.id; fatchiya@gmail.com Jurusan Biologi, FMIPA-UB, Jl Veteran, Malang 65145, Indonesia

## PENDAHULUAN
Rheumatoid  arthritis  (RA)  merupakan penyakit  autoimun  yang  ditandai  dengan  adanya peradangan, gejala nyeri, kekakuan, dan pembengkakan  (inflamasi)  sendi  yang  berakibat pada  kerusakan  kartilago,  erosi  tulang,  hingga berdampak  lanjut  pada  kelainan  bentuk  tulang [1].  Inflamasi  terjadi  karena  adanya  over produksi  sitokin  proinflamasi  seperti  interleukin (IL-1, IL-6, IL17), tumor necrosis factor (TNF α ) dan lainnya yang meningkat sehingga
menghambat  proliferasi  dan  diferensiasi  dari  sel T  serta  adanya  pengaruh  lingkungan  seperti radikal  bebas  yang  memicu  stress  oksidatif menjadikan  mediator  inflamasi  mendegradasi komponen  matriks  seluler  yang  berakibat  pada kondisi  RA  [2],  selain  itu  aktivasi  IL-17 membentuk  proinflamasi  dan  menyebabkan ketidak  seimbangan  osteoblas  dan  osteoklas sehingga  menjadikan  turn  over  yang  berlebihan dan  berakhir  pada  kerusakan  tulang  [3][4]. Ketidakseimbangan  tersebut  juga  dipengaruhi
oleh  TNF- α yang  menghambat  pematangan  dan fungsi  osteoblast[5],  meskipun  dalam  kondisi tertentu  ikatan antara Il-17 dengan Il-13, TGF- β , DAN  Igf-1  berperan  dalam  pembentukan kartilago tulang [6].
Pengobatan RA selama ini bersifat sintetik dan  mahal  serta  berdampak  pada  jangka  yang lama,  hal  ini  dapat  ditekan  dengan  pola  hidup sehat  dengan  asupan  nutrisi  yang  cukup.  Nutrisi merupakan bahan penting untuk tubuh, salah satu nutrisi  yang  penting  dalam  tubuh  adalah  susu kambing  PE,  selain  itu  olahan  susu  baik  susu segar    maupun  yogurt  mengandung  biopeptida aktif  alpha-S2  kasein  yang  berada  pada  36kDa [7]  dan  [8].  Berdasarkan  hal  tersebut,  penelitian ini  dilakukan  untuk  mengetahui  efek  pemberian protein  alpha-S2  kasein  terhadap  perubahan bentuk morfologi dan histologi.

## METODE
Penelitian  ini  mendapatkan  sertifikat  Kelaikan Etik  No.90-KEP-UB  tertanggal  29  Maret  2012, dari KEP UB.
Hewan  coba.  Hewan  coba  dalam  penelitian  ini menggunakan  tikus  jantan  strain  wistar  dengan umur  3  bulan  dengan  berat  badan  300  ±  30, hewan  coba  diperolehdari  Universitas  Gajah Mada  Jogjakarta  yang  diaklimatimatisasi  selama 1 minggu.
Model  dan  kelompok  perlakuan.  Model perlakuan  RA  menggunakan  CFA.  Injeksi  yang digunakan  secara  subkutan  dan  intraperitonial. Kelompok perlakuan terbagi menjadi 4 kelompok  yaitu  (C:  Kontrol;  CM:  Kontrol  + alpha-S2  kasein;  RA:  Rheumatois  Arthritis; RAM: Rheumatois Arthritis + alpha-S2 kasein).
Isolasi  casein.  Isolasi  casein  dilakukan  dengan pengambilan  sampel  susu  diambil  250  mL dipanaskan  hingga  suhu  40 0 C  dan  diteteskan asam  asetat  glasial  sampai  terjadi  gumpalan, setiap  5  tetes  dilakukan  pengadukan.  Setelah terjadi  gumpalan  ditambahkan  1  gram  kalsium karbonat  untuk  menetralisir  pH,  kemudian dilakukan  penyaringan  dengan  kain  nilon  dan endapan  dimasukkan  dalam  mikrotube  1,5  mL. Setelah  dimasukkan  dalam  tube  ditambahkan Tris  HCL  pH  6,8  dan  dilakukan  pengukuran kadar  protein  dengan  nanodrop  dan  disimpan dalam suhu -20 0 C jika tidak langsung digunakan [modifikasi 9].
Analisa  inflamasi.  Analisa  inflamasi  dilakukan dengan  cara  skoring  perubahan  morfologi  dan histologi jaringan synovial.
Dosis sonde. Sonde dilakukan untuk memberikan  protein  alpha-S2  kasein  dengan dosis 2 mg/kg BB [modifikasi 10].
Pengambilan  organ  sendi.  Pengambilan  organ sendi  dilakukan  pembedahan  dengan  dislokasi ekor  dan  disimpan  pada  suhu  4 0 C  dalam  PFA (PBS dengan pelarut PFA) .
Histologi  paraffin.  Pembuatan  sediaan  paraffin diambil  dari  organ  yang  telah  disimpan  dalam 4%  PFA  dan  dicuci  dengan  PBS  dua  kali sebelum  dilakukan  rangkaian  histologi  sampai pada pemotongan dengan mikrotom.
Pewarnaa HE (hematoksilin eosin). Pembuatan sediaan  HE  dimulai  dengan  deparafinasi  dengan cara perendaman organ dalam xylol dengan lama perendaman  10  menit,  dan  dilanjutkan  dengan perendaman kedua selama 5 menit. Ketika organ selesai direndam dalam xylol dilanjutkan dengan perendaman pada etanol absolut, 90%, 80%, 70% dengan  lama  perendaman  5  menit.  Pencucian dengan PBS dilakukan tiga kali masing-masing 5 menit dan dilanjutkan dengan dikering anginkan. Setelah  organ  kering  dimasukkan  kedalam hematoksilin  selama  2  menit  untuk  memberi warna  ungu  pada  organ,  dilanjutkandengan pencucian  menggunakan  air  mengalir  selama  5 menit  atau  secukupnya  dan  dikering  anginkan. Organ  yang  telah  dikering  anginkan  dilanjutkan dengan  pemberian  eosin  selama  5  sampai  10 menit  atau secukupnya, lalu dilakukan dehidrasi dengan  etanol  bertingkat  dari  70  %  dilanjutkan dengan  etanol  absolut  2  kali  masing-masing  2 menit  dan  dilanjutkan  dengan  pemberian enthelan  jika  langsung  diamati  atau  dengan penyimpanan pada kotak preparat [11].

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Injeksi dengan CFA secara subkutan dan  intraperitonial  menyebabkan  adanya  respon imun yang ditandai dengan inflamasi (pembengkakan), inflamasi terjadi karena ketidak seimbangan  sitokin  proinflamasi  dan  anti inflamasi  serta  adanya  pengaruh  lingkungan, terapi  RA  kasein  susu  kambing  segar  PE memberikan  efek  penurunan  inflamasi  yang ditandai  dengan  penurunan  skor  klinis  (C  =  0;
RA = 4; CM = 0; RAM = 1.3) dimana 0: Normal; 1:  Inflamasi  dengan  ruam  merah  pada  kaki, sendi,  dan  sedikit  pembengkakan  kaki;  2: Pembegkakan bagian punggung kaki; 3: Pembengkakan  bagian  punggung  kaki  dan beberapa jari; 4: Pembengkakan bagian punggung  kaki  dan  semua  jari  berdasarkan kriteria  Hongxiang  [12].  Perubahan  tersebut menandakan  perbaikan  morfologi  bentuk  kaki (Gambar1).
Gambar1.  Perubahan  morfologi  kaki  (a).kontrol  (b).  RA; (C):Kontrol +  alpha-S2 kasein;  (d).RA +  alpha- S2 kasein). Perubahan ditunjukkan dengan anak panah.  Panah  kuning  menunjukkan  kondisi normal,  panah  merah  menunjukkan  adanya inflamasi pada kelompok RA.
Rheumatoid Arthritis (RA) tidak lepas dari faktor  imunitas  tubuh  selain  lingkungan  yang mendukung  dan  kesempatan  seperti  merokok yang  dapat  meningkatkan  resiko  rheumatoid arthritis  dengan adanya trigger  terjadinya  mutasi atau  modifikaasi  genetic,  melalui  peptil  arginil deimiinase  tipe  IV  (PADI4)  yang  menghasilkan perubahan  hilangnya  toleransi  pada    protein mukosa  maupun  kontaminasi  dengan  mikroba [13] sehingga permodelan RA mengunakan CFA yang  mengandung  bakteri  0,5  mg/ml  sehingga memberikan  efek  peradangan  yang  dapat mengakibatkan  inflamasi  kronis  serta  terjadinya autoimun  terutama  rheumatoid  arthritis  dengan dosis tertentu [14][15].
Over produksi sitokin seperti  Tumor Necrosis  Factor  alpha (TNF α )  dan  proinflamasi lain  seperti  IL-1,  IL-6,  dan  IL-17  yang menginduksi peradangan pada sendi dan
meningkatan  proliferasi  synoviocyte  inflamasi serta  kehancuran  sel.  Rheumatoid  arthritis berlanjut  pada    peradangan  sendi,  degradasi tulang    dan  adanya  inflamasi    yang  bisa menjadikan kondisi yang sama dengan osteoporosis, dan berubahnya sisitem metabolism dan  imunitas  tubuh  [1],  kondisi  ini  diawali dengan  adanya  diferensiasi  osteoklas  menjadi mature  melewati  proses  migrasi,  invasi,  dan homing  precursor  osteoklas  menuju  tulang  dari sirkulasi  perifer,  sel  ini  terbentuk  karena  adanya diferensiasi  dan  fusi  dari  monosit  makrofag mononuclear  melalui  stimulasi  RANKL  dan Macrophage Colony Stimulating Factor (M-CSF) [16].
Induksi  alpha-S2  kasein  susu  kambing segar  PE  dalam  terapi  RA  menunjukkan  adanya penurunan sel yang mengalami hyperplasia pada histologi  dengan  pewarnaan  HE,    dimana  sel yang  mengalami  hipertropi  dan  berlanjut hyperplasia  tersebut  dalam  keadaan  hipoksia mengalami pertumbuhan abnormal yang menjadikan  lapisan  sinovium  menebal  dan membengkak yang ditunjukkan dengan banyaknya  inti  sel  pada  kelompok  RA  dan mengalami  penurunan  pada  kelompok  RA+ alpha-S2  kasein  seperti  pada  kelompok  kontrol dan  kontrol  +  alpha-S2  kasein  (Gambar2) sehingga  dalam  keadaan  normal  susu  segar kambing PE aman untuk dikonsumsi dikonsusmsi.
Gambar2.  Histologi  membrane  synovial  (C:  Kontrol;  CM: Kontrol  +  alpha-S2  kasein;  RA:  Rheumatois Arthritis;  RAM:  Rheumatois  Arthritis  +  alpha- S2  kasein).  Panah  kuning  menunjukkan  kondisi normal,  panah  merah  menunjukkan  sel  yang memngalami hyperplasia.
Jaringan  synovial  normal    mengandung mesenchymal, fibroblast-like synoviocytes (FLSs)  dan  makrofag  dalam  jumlah  yang seimbang,  namun  dalam  kondisi  RA  sinovium mengalami hyperplasia dimana komponen tersebut  meningkat  menjadikan  over  produksi baik  pada  sitokin,  kemokin,  molekul  adhesi, matriks  metalloproteinase  (MMPs),  dan jaringan inhibitor  dari  metalloproteinase  (TIMPs)  dan FLSs. Hyperplasia sel terjadi karena peningkatan FLSs,  mutasi  gen  p53,  stress  protein  (misalnya, heat-shock protein 70), modulasi Fungsi retikulum  endoplasmatic  oleh  synoviolin  yang merupakan  ligase  ubiquitin  E3  yang  mengatur keseimbangan  proliferasi  sel  dan  apoptosis, sintesis  Matrix metalloproteinase (MMPs). MMPs  disekresikan  oleh  sel  sebagai  inaktif zymogen  dan  diaktifkan  oleh  proMMP-3, pengaktifan  tersebut  menyebabkan  komponen matrix ekstraselluler terdegradasi dan menyebabkan  kerusakan  tulang  [1].  Selain komponen  matrix  karena  adanya  over  produksi sitokin  seperti  Tumor  Necrosis  Factor  alpha (TNF α ) dan proinflamasi lain seperti IL-1, IL-6, dan  IL-17.  Fungsi  dari  sel  Th17  adalah menghilangkan  patogen  sedangkan    IL-17 merupakan  inducer  poten  peradangan  [17]. Peningkatan  IL-17  dalam  cairan  sinovial merangsang  osteoklastogenesis  yang  bergantung pada  osteoblast  [18]  hal  ini  didukung  dengan peran pro - osteoklastogenik dari IL-17 secara in vitro  dan  in  vivo  [19].  IL-17  menstimulasi osteoklastogenesis dalam co-kultur osteoklas dan makrofag  sumsum  tulang  (prekursor  osteoklas), namun  tidak  berpengaruh  terhadap  diferensiasi makrofag,  hal  ini  menunjukkan  bahwa  IL-17 menginduksi ekspresi RANKL  (osteoklas faktor diferensiasi) pada osteoklas  serta adanya induksi osteoblas [20]. Membran sinovial pada rheumatoid  terkait  dengan  peningkatan  ekspresi miR-155  dan  Src  homologi  2  yang  mengandung inositol fosfatase-1 (SHIP-1) menjadikan tingginya produksi sitokin proinflamasi [21].

## KESIMPULAN
Kesimpulan  dari  penelitian  ini  adalah pemberian  protein  kasein  pada  terapi  RA  dapat menurunkan inflamasi berdasarkan skor RA yang ditandai  dengan  perubahan  morfologi  bentuk kaki  menuju  pada  konsdisi  normal  dan penurunan  sel  yang  mengalami  hiperthropi  dan
hyperplasia,  sehingga  terapi  dengan  kasein  susu kambing PE dapat dijadikan alternative penyembuhan Rheumatoid Artritis.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan Terima Kasih disampaikan kepada Laboratorium  Biosains  UB,  dan  Pak  Bambang Setiawan  atas  bimbingannya.  Penelitian  ini didanai  oleh  sebagian dana  riset  Program  Ristek Unggulan Perguruan Tinggi 2012-2014, Program Desentralisasi UB, DIKTI Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan,.

## DAFTR PUSTAKA
[1].  Scheett,  G  and  Ian  B.M.  2011.  The Pathgenesis of Rheumathoid   Arthritis. The New England. Journal of Medicine. 365:2205-19.
[2].  Breenan,    F.  M.  and  I.  B.  Mc  Innes.  2008. Evidence  that  Cytokines  Play  a  Role  in Rheumathoid  Arthritis.  Journal  of  Clinical Investigation. 118, 11.
[3].  Walsh  NC,  Reinwald  S,  Manning  CA, Condon KW, Iwata K, Burr DB, Gravallese EM. 2009. Osteoblast function is compromised  at  sites  of  focal  bone  erosion in  inflammatory  arthritis.  J  Bone  Miner Res.24:1572–1585
[4].  Hein  G.  E.  2006.  Glication  end  product  in Osteoporosis  is  there  a  pathophisyologic importance?.  Clinica  Cimic  Acta.    371:  32- 36.
[5].  Diarra  D,  Stolina  M,  Polzer  K,  Zwerina  J, Ominsky MS, Dwyer D, Korb A, Smolen J, Hoffmann  M,  Scheinecker  C,  Heide  D  van der,  Landewe  R,  Lacey  D,  RichardsWG, Schett  G.  2007.  Dickkopf-1  is  a  master regulator  of  joint  remodeling.  Nat  Med. 13:156–163.
[6].  Koshy,P.J.,  N.  Henderson,  C.  Logan,  P.  F. Life,  T.  E.  Cawston,  A.  D.  Rowan.  2002. Interleukin  17  Induces  Cartilage  Collagen Breakdown:  Novel  Synergistic  Effects  in Combination with Proinflammatory Cytokines.  Ann  Rheum  Dis  61:  704-713. doi: 10.1136/ard.61.8.704.
[7].  Khoiriyah,  L.  K.,  dan  Fatchiyah.  2013. Karakter Biokimia dan Profil Protein Yogurt Kambing  PE  DifermentasiBakteri  Asam Laktat  (BAL). The  Journal  of  Experimental Life Science (JELS). Vol. 3 No. 1.
[8].   Budiarti, I. K., Masdiana P. D., Fatchiyah.
2013. Nutritional Composition and Protein Profile  of  Goat  Yogurt  PE  with  Double Culture between Streptococcus thermophiles  and  Lactobacillus  species. Cukorova  Medical  Journal.  38(4):  681- 686.
[9].   Pavia, Lampman, Kriz & Engel,
Saunders.  2000.  Isolation  of  Casein, Lactose, and Albumin from Milk. Adapted by  R.  Minard  (Penn  State  Univ.)  from Introduction to Organic Laboratory Techniques: A Microscale Approach.
[10].   Nyborg, N C B, Anders Fuglsang, Dan N. Applied  and  Enviromental  Microbiology. 2002.  p.  3566–3569  Vol.  68,  No.  7  0099- 2240/02/$04.00 0 DOI: 10.1128/AEM.68.7.3566–3569.
[11].   John  D,  Bancroft,  Marilyn  Gamble.  2008. Theory  and  Practice  of  Histological Techniques”.6th edition. Churchill Livingstone, Elsevier, b. p 171.
[12].  Hongxiang,  B.  Zheng  S,  Wang  K,  Fan  L, Shi Zhibin, Chen J. 2013. The pain-related behavior  changes  correlate  with  the  bone damage  in  a  rat  model  of  rheumatoid arthritis.  Journal  of  Medical  Colleges  of PLA 28. 160-173.
[13].  Wegner  N,  Wait  R,  Sroka  A.  2010.  . Peptidylarginine deiminase from Porphyromonas  gingivalis  citrullinates human fibrinogen and α -enolase:
implications for autoimmunity in rheumatoid  arthritis.  Arthritis  Rheum. 62:2662-72.
[14]. Biliau, A. and  P. Matthys. 2001. Modes of action of Freud’s Adjuvant in Experimental  Models  of  Autoimmune Diseases.  Journal  of  Lymphosite  Biology. 70(6) 849-860.
[15]. Shakya A. K, and Nandakumar K. S. 2012. Applications  of  polymeric  adjuvants  in studying autoimmune responses and vaccination against infectious diseases. J R
Soc Interface. 10: 20120536.
[16]. Saltel F, Chabadel a, Zhao Y, Lafage Proust M,  Clezardin  P,  Jurdic  P,  Bonnelye  E. 2006.  Transmigration  a  New  Property  of Mature Multinucleated Osteoclast. Journal of  Bone  and  Mineral  Reseach.  21  (12):
1913-1923.
[17].  Kotake,  S.,  Udagawa,  N.,  Takahashi,  N., Matsuzaki,  K.,  Itoh,  K.,  Ishiyama,  S., Saito,  S.,  Inoue,  K.,  Kamatani,  N., Gillespie, M. T., Martin, T. J. and Suda, T. 1999.  IL-17  in  synovial  fluids  from patients  with  rheumatoid  arthritis  is  a potent  stimulator  of  osteoclastogenesis.  J. Clin. Invest. 103, 1345-1352.
[18].  Van  Bezooijen,  R.  L.,  Farih-Sips,  H.  C., Papapoulos, S. E. and Lowik, C. W. 1999. Interleukin-17:  A  new  bone  acting cytokine  in  vitro.  J.  Bone  Miner.  Res.  14, 1513-1521.
[19].  Sato,  K.,  Suematsu,  A.,  Okamoto,  K., Yamaguchi,  A.,  Morishita,  Y.,  Kadono, Y.,  Tanaka,  S.,  Kodama,  T.,  Akira,  S., Iwakura,  Y.,  Cua,  D.  J.  and  Takayanagi, H. 2006. Th17 functions as an osteoclastogenic  helper  T  cell  subset  that links T cell activation and bone destruction. J. Exp. Med. 203, 2673-2682.
[20].  Bush,  K.,  Farmer,  K.,  Walker,  J.  and Kirkham,  B.  2002.  Reduction  of  joint inflammation  and  bone  erosion  in  rat adjuvant  arthritis  by  treatment  with interleukin-17  receptor  IgG1  Fc  fusion protein. Arthritis Rheum 46: 802–805.
[21].  Kurowska-Stolarska  M,  Alivernini  S, Ballantine  LE,  Asquith  Dl,  Millar  Nl, Gilchrist  DS.  2011.  MicroRNA-155  as proinflamatory  regulator  in  clinical  and experimental  arthritis.  Proc  Natl  Aca  Sci USA; 108:11193-8.