Evaluasi varietas, sumber eksplan dan strain Agrobacterium terhadap keberhasilan transformasi tebu dengan gen P5CS
Evaluation of v arieties, explant sources, and Agrobacterium strains for successful sugarcane transformation using P5CS gene
Hayati MINARSIH 1)*) , Dwi SUBIYARTI 2) , Imron RIYADI 1) , Soekarno Mismana PUTRA 1) & Laksmi AMBARSARI 2)
1) Pusat Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia, Jl. Taman Kencana No. 1, Bogor 16128 Indonesia
2) Sekolah Pascasarjana, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Jln. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
Diterima tanggal 2 Maret 2015/disetujui tanggal 4 Mei 2015

## Abstract
Genetic  transformation  can  be  used  as  an  alter- native to develop  sugarcane (Saccharum officinarum L. ) tolerant  to  drought  stress. P5CS gene  has  a  role in  biosynthesis  of  proline,  an  amino  acid  that accumulated  under  drought  stress  conditions. Transfer of a P5CS gene construct into plant cells in conjunction with regeneration of transgenic plantlets may  develop  sugarcane  tolerant  to  drought  stress. The  aim  of  this  research  was  to  obtain  an  optimal transformation  method  which  includes  a  suitable strain  of Agrobacterium  tumefaciens ,  and  the  best sugarcane  explant  and  variety.  The  results  showed that  transfer  of P5CS gene  has  been  successfully carried out on sugarcane explants from solid media- derived calli, embryogenic calli and somatic embryos derived  from  temporary  immersion  system  (TIS) culture.  Whilst Agrobacterium strain  LBA4404  was indicated as the most effective transformation vector. The  regeneration  of  Kidang  Kencana  variety transformants  from  calli  and  somatic  embryos  was better  than  those  of  PS  881  and  PS  891.  The  best performance of transformants based on the source of explants  obtained  from  somatic  embryos  from  TIS culture.  Moreover,  a  succesfull Agrobacterium mediated transformation on sugarcane was indicated by transient expression of Gus gene and the ability of the  transformants  grew  in  a  selection  medium containing 50 ppm of kanamycin.
[ Keywords:  Drought  stress,  embryogenic  calli, somatic embryos, proline ]

## Abstrak
Transformasi  genetik  dapat  digunakan  sebagai upaya untuk merakit tebu ( Saccharum officinarum L.) toleran  terhadap  cekaman  kekeringan.  Gen P5CS diketahui  berperan  dalam  biosintesis  prolin,  yaitu
asam  amino  yang  umumnya  terakumulasi  ketika tanaman  mengalami  cekaman  kekeringan.  Transfor- masi  gen P5CS dan  regenerasi  transgeniknya mungkin  dapat  menghasilkan  tanaman  tebu  trans- genik  yang  toleran  terhadap  cekaman  kekeringan. Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mendapatkan metode  transformasi  yang  optimum  yang  mencakup strain Agrobacterium  tumefaciens yang  sesuai, sumber  eksplan  dan  varietas  tebu  terbaik  sebagai target  transformasi.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  transformasi  gen P5CS telah  berhasil dilakukan  ke  eksplan  tebu  baik  yang  berupa  kalus asal  media  padat  maupun  kalus  embriogenik  dan embrio somatik asal kultur sistem perendaman sesaat (SPS). Sementara itu strain A. tumefaciens LBA4404 menunjukkan hasil yang paling efektif sebagai vektor transformasi.  Pertumbuhan  transforman  baik  pada kalus  maupun  embrio  somatik  pada  varietas  Kidang Kencana  terlihat  paling  baik  dibandingkan  dengan varietas  PS  881  dan  PS  891.  Sumber  eksplan  yang paling  efektif  adalah  embrio  somatik  yang  diperoleh dari  kultur SPS. Keberhasilan transformasi tebu me- lalui Agrobacterium ditunjukkan  oleh  ekspresi transien  dari  gen  GUS  dan  kemampuan  dari  trans- forman  untuk  tumbuh  di  media  yang  mengandung 50 ppm kanamisin.
[Kata  kunci:    Cekaman  kekeringan,  embrio  somatik, kalus embriogenik, prolin]

## Pendahuluan
Kebutuhan  bibit  tebu  semakin  meningkat  seiring meningkatnya  produksi  gula  menuju  swasembada gula  di  Indonesia.  Jutaan  bibit  tebu  per  tahun diperlukan,  sebagai  contoh  pada  tahun  2011  sekitar 11  juta  bibit  tebu  disediakan  oleh  Kementrian Pertanian  dan  jumlah  ini  terus  meningkat  dari  tahun ke  tahun  (Mulyono,  2011).  Sementara  itu  lahan perkebunan  tebu  semakin  menurun  dan  bergeser  ke lahan-lahan   marjinal.  Pemanfaatan   lahan  marjinal
*) Penulis korespondensi: hmiskan@yahoo.com
Evaluasi varietas, sumber eksplan dan strain Agrobacterium ……….(Minarsih et al.)
menuntut  tanaman  tebu  yang  memiliki  produktivitas tinggi,  toleran  terhadap  cekaman  biotik  dan  abiotik, khususnya toleran kekeringan.
Rekayasa  genetik  merupakan  salah  satu  upaya yang  ditempuh  guna  merakit  tebu  yang  toleran kekeringan.  Prinsip  rekayasa  genetik  sama  dengan pemuliaan tanaman konvensional, yaitu memperbaiki sifat-sifat  tanaman  dengan  menambahkan  sifat-sifat ketahanan  terhadap  organisme  pengganggu  tanaman (OPT) maupun toleransi terhadap cekaman lingkung- an.  Namun  pemindahan  gen  dari  satu  organisme  ke organisme  lainnya  pada  pemuliaan  melalui  rekayasa genetika  terjadi  dengan  lebih  terarah  dan  spesifik. Keberhasilan  perakitan  tanaman  transgenik  unggul dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor  antara  lain  (1) adanya  sistem  transformasi  dan  regenerasi  yang mapan, (2) tersedianya konstruksi gen pembawa sifat unggul  yang  berfungsi  dan  sesuai,  serta  (3) tersedianya  klon-klon  tanaman  anjuran  baik  atas dasar  karakter agronomis  maupun  kemudahan  teknis (Berringer, 2000).
Perakitan tebu toleran kekeringan dapat diupaya- kan  dengan  mentransfer  gen P5CS yang  menyandi enzim ∆1-Pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) pada  tebu.  Gen P5CS berperan  dalam  biosintesis prolin.  Prolin merupakan  asam amino  yang  berperan sebagai senyawa osmoprotektan, yaitu senyawa  yang terakumulasi  saat  tanaman  mengalami  cekaman kekeringan  atau  cekaman  osmotik  (Szabados  & Savoure,  2009).  Transfer  gen P5CS ke Arabidopsis thaliana dan  tembakau  dilaporkan  meningkatkan kandungan  prolin  dan  ketahanan  tanaman  tersebut terhadap  cekaman  kekeringan  (Kishor et  al .,  2005; Verbruggen & Hermans, 2008).
Salah  satu  metode  transformasi  tanaman  yang banyak  digunakan  adalah  dengan  bantuan Agro- bacterium  tumefaciens yang  memiliki  kemampuan secara  biologis  dalam  mentransfer  bagian  DNA tertentu  (T-DNA)  dari  plasmid  Ti  ( tumor  inducing ) ke dalam sel tanaman yang kemudian berintegrasi ke genom tanaman target (Sheludko, 2008). Penggunaan A.  tumefaciens sebagai  vektor  untuk  melakukan transformasi  genetik  pada  berbagai  tanaman  dikotil dan  monokotil  telah  terbukti  efektif  dan  mempunyai tingkat  keberhasilan  dan  kestabilan  gen  yang  tinggi, spesifik,  mengurangi  terbentuknya  tanaman  kimera dan  lebih  ekonomis  dibandingkan  metode  trans- formasi genetik yang lain (Kumar et al ., 2014; Mano et al ., 2014; Sugiharto & Safitri, 2011).
Selain  untuk  perbanyakan,  kultur  jaringan  juga dapat  digunakan  untuk  meningkatkan  efisiensi transfer  gen,  seleksi  dan  regenerasi  tanaman  trans- genik (Shah et al ., 2009). Sistem regenerasi tanaman dengan teknik kultur jaringan dapat dilakukan melalui pembentukan   organ (organogenesis)  atau   embrio somatik  (somatic  embryogenesis).  Metode  embrio- genesis  somatik  merupakan  teknologi  yang  dapat
memperbanyak  tanaman  secara  seragam  dan  dalam jumlah  yang  sangat  banyak  karena  berasal  dari  satu sel.  Transformasi  genetik  ke  sel-sel  embrioid  atau embrio  somatik  dianggap  sebagai  metode  terbaik untuk  menghindari  terjadinya  kimera  (Deo et  al ., 2010) dan albino  yang dapat disebabkan oleh mutasi pembelahan  sel  di  titik  tumbuh  eksplan  (Susiyanti et  al .,  2007).  Transformasi  tanaman  tebu  telah berhasil dilakukan, tetapi masih banyak kendala yang dihadapi  antara  lain  terhambatnya  pertumbuhan tanaman  transgenik  dan  terbentuknya  planlet  albino (Miswar et  al .,  2007;  Susiyanti et  al .,  2007).  Oleh karena  itu,  penelitian  ini  penting  untuk  dilakukan dalam  upaya  mendapatkan  metode  transformasi melalui A.  tumefaciens yang  optimal  hingga  men- dapatkan  tebu  transgenik  yang  toleran  terhadap cekaman  kekeringan.  Tujuan  penelitian  ini  adalah untuk  mendapatkan  isolat Agrobacterium yang efektif, sumber eksplan yang sesuai dan varietas tebu yang responsif dalam proses introduksi gen P5CS dan regenerasi tanaman transgenik.

## Bahan dan Metode

## Penyiapan eksplan
Pucuk  tebu  dari  varietas  PS  881,  PS  891  dan Kidang Kencana (KK) ditanam pada media MS padat dan  diinkubasi  dalam  ruang  kultur  tanpa  cahaya selama  4-6  minggu  hingga  terbentuk  kalus.  Kalus embriogenik dan embrio somatik varietas PS 881, PS 891  dan  KK  disiapkan  melalui  metode Temporary Immersion  System (TIS)  atau  Sistem  Perendaman Sesaat (SPS) (Mordocco et al ., 2009; Minarsih et al ., 2013).  Kalus  yang  berasal  dari  pucuk  tebu  ketiga varietas tersebut setelah disubkultur sebanyak 2-4 kali kemudian  dimasukkan  dalam  bejana  SPS  RITA ® yang  dihubungkan  dengan  pompa  dan automatic timer ( Autonic )  dengan  lama  perendaman  diatur selama  tiga  menit  dengan  frekuensi  setiap  24  jam hingga  terbentuk  kalus  embriogenik  (enam  minggu) dan  embrio somatik  (delapan minggu).

## Transformasi  tebu  dengan  pBI-P5CS  melalui Agrobacterium
Konstruk  plasmid  pBI  yang  telah  membawa  gen P5CS Vigna aconitifolia diperoleh dari Dr. Desh Pal S. Verma, Ohio State University, USA. Transformasi tebu dengan  konstruk  tersebut dilakukan  mengguna- kan sel kompeten dari A. tumefaciens strain GV3101, LBA4404  dan  AGL1.  Pembuatan  sel  kompeten menggunakan  metode  pembekuan  (Wang,  2006). Pengujian  keberhasilan  transformasi  dilihat  dari pertumbuhan    koloni A.  tumefaciens di    media seleksi mengandung antibiotik kanamisin 50 ppm dan dari  analisis  menggunakan  PCR  dengan  primer spesifik, dan uji GUS pada kalus transforman.
2

## Menara Perkebunan 2015 82(1), 1-9
Gen P5CS yang  sudah  berada  di A.  tumefaciens selanjutnya ditransfer  ke  dalam  eksplan  tebu,  yaitu pada  kalus  asal  media  padat,  kalus  embriogenik  dan embrio somatik asal kultur SPS. Metode transformasi yang  digunakan  adalah  metode  Sain et  al .  (1994) yang  menggunakan  asetosiringon  100  ppm  dengan ko-kultivasi  dalam  kultur  gelap  selama  dua  hari. Setelah ko-kultivasi, kalus dipindahkan ke media MS untuk  pertumbuhan  tunas  yang  mengandung  anti- biotik kanamisin. Pertumbuhan kalus di media seleksi diamati  di  ruang  kultur  dengan  kondisi  terang  mulai hari  ke-1  hingga  hari  ke-28  yang  selanjutnya  disub- kultur setiap empat minggu hingga terbentuk planlet.
Setelah ko-kultivasi, jika Agrobacterium terlihat tumbuh  signifikan,  maka  eksplan  kemudian  dicuci dengan  media  MS  cair  yang  mengandung  antibiotik cefotaxime  untuk  menghilangkan  sisa-sisa Agro- bacterium lalu  disubkultur  di  media  MS  padat dengan  penambahan  sefotaksim  500  ppm  selama tujuh  hari  di  kultur  gelap.  Jika  pertumbuhan Agro- bacterium tidak  terlihat,  eksplan  dapat  langsung  di- pindahkan  ke  media  seleksi,  yaitu  MS  padat  yang mengandung  sefotaksim  500  ppm  dan  kanamisin 50  ppm.    Kontrol  positif,  yaitu  kalus,  kalus  embrio- genik dan embrio somatik yang tidak ditransformasi, ditanam  di  media  MS  padat  sedangkan  kontrol negatif,  yaitu  kalus,  kalus  embriogenik  dan  embrio somatik yang tidak ditransformasi, ditanam di media MS  padat  dengan  penambahan  sefotaksim  500  ppm dan  kanamisin  50  ppm.  Pengamatan  dilakukan  ter- hadap  pertumbuhan  kalus transforman,  pembentukan tunas  dan  regenerasinya.  Persentase  pertumbuhan kalus dihitung berdasarkan jumlah kalus yang tumbuh di  media  seleksi  dibandingkan  jumlah  kalus  yang ditransformasi.

## Uji GUS
Pengujian  GUS  dilakukan  pada  eksplan  yang telah  ditransformasi  berdasarkan  metode  Jefferson (1987). Larutan X-Gluc ( 5-Bromo-4-chloro-3- indolyl-β-D-glucuronic  acid )  dipersiapkan  dengan cara  mencampurkan  1  mM  X-Gluc;  0.1  mM K 3 Fe(CN) 6 ; 0.1 mM K 4 Fe(CN) 6 ; 50 mM fosfat bufer (NaH 2 PO 4 /NaHPO 4 )  dengan  pH  7.0.  Tebu  trans- forman  diinkubasi  selama  24  jam  dalam  larutan  X- Gluc  tersebut  pada  suhu  37 o C  tanpa  cahaya,  setelah itu  eksplan  dicuci  dengan  metanol,  dilanjutkan dengan  pengamatan  terhadap  eksplan  yang  meng- ekspresikan gen gusA dengan adanya warna biru pada eksplan.
Uji  keberadaan  konstruk P5CS pada  tebu  hasil transformasi
Pengujian  keberadaan  gen P5CS pada tunas tebu dilakukan menggunakan PCR dengan primer spesifik terhadap  daerah  terkonservasi  dari  Open Reading
Frame (ORF) gen P5CS dan primer spesifik terhadap gen  ketahanan  antibiotik  kanamisin  ( NPTII ).  Sampel dari  tanaman  transgenik  di  dalam  tabung  berumur sekitar dua bulan setelah transformasi diisolasi DNA genomiknya  dengan  metode  Orozco-Castillo et  al. (1994) skala kecil yang kemudian digunakan sebagai template untuk  analisis  PCR.  Beberapa  kontrol diikutsertakan untuk mengkonfirmasi hasilnya.

## Analisis statistik
Data  yang  diperoleh  dari  hasil  pengamatan  pada semua parameter diuji statistik dengan menggunakan statistika non parametrik. Perbedaan antara nilai rata- rata  antar  perlakuan  ditentukan  menurut  uji  jarak Duncan  Multiple  Range  Test (DMRT)  pada  taraf nyata 5%.

## Hasil dan Pembahasan

## Transfer konstruk gen P5CS ke A. tumefaciens
Transfer  konstruk  gen P5CS ke  dalam A. tumefaciens strain  GV3101,  LBA4404  dan  AGL1 telah  berhasil  dilakukan.  Hal  ini  ditunjukkan  dengan adanya  pertumbuhan  koloni  pada  media  seleksi dengan  penambahan  antibiotik  kanamisin  50  ppm (Gambar 1a). Hasil elektroforesis dari isolasi plasmid dan  PCR  menunjukkan  ukuran  basa  yang  sama dengan kontrol positif pada 2.4 kb (Gambar 1b).  Hal tersebut  menunjukkan  keberhasilan  transformasi ketiga  strain A.  Tumefaciens dengan konstruk  gen P5CS  yang  selanjutnya  akan  ditransfer  ke  eksplan tebu .
Gambar 1.  a. Pertumbuhan koloni hasil transformasi pBI-P5CS  ke A.  tumefaciens .  b.  Profil elektroforesis  hasil  transformasi  pBI- P5CS  ke A.  tumefaciens. 1=  kontrol positif, 2–3= koloni 1 dan 3 strain AGL1; 4  –  5=  koloni  1  dan  2  strain  LBA4404 dan 6= koloni 1 strain GV3101
Figure 1.   a. Colony growth after transformation of pBI-P5CS  to A.  tumefaciens b.  Elektro- phoresis  profile  after  transformation  of pBI-P5CS to A. tumefaciens 1= Positive control;  2-3=  colony  1  and  3  strain AGL1;  4-5=  colony  1  and  2  strain BA4404 and 6= colony 1 strain GV3101.
2.4 kb 1    2    3    4    5    6 a b
Transformasi  tebu  dengan  konstruk  gen  P5CS  dan transient expression dengan uji GUS
Pertumbuhan  eksplan  tebu  asal  kalus  dari  media padat,  kalus  embyogenik  dan  kultur  SPS  menunjuk- kan  bahwa  kalus  yang  tidak  ditransformasi  yang ditanam  di  media  MS  sebagai  kontrol  positif  terlihat baik,  berwarna  putih  dan  sudah  mulai  muncul  tunas pada minggu ke-3. Eksplan yang tidak ditransformasi ditanam di media MS dengan penambahan antibiotik sefotaksim  500  ppm  dan  kanamisin  50  ppm  sebagai kontrol  negatif  menunjukkan  pertumbuhan  kalus yang  sangat  lambat,  berwarna  kuning  dan  coklat kehitaman,  tidak  berkembang  dan  akhirnya  mati. Eksplan yang sudah ditransformasi dapat tumbuh dan berproliferasi  walaupun  lebih  lambat  pertumbuhan- nya dibandingkan dengan kontrol positif. Selanjutnya terlihat  eksplan  kalus  yang  berwarna  putih  mulai membentuk calon tunas kehijauan (Gambar 2).
Pertumbuhan  eksplan  di  media  seleksi  yang mengandung  antibiotik  kanamisisn  mengindikasikan keberhasilan  proses  transformasi  karena  pada konstruk  plasmid  pBI-P5CS  terdapat  gen NPTII , yaitu gen ketahanan terhadap kanamisin (Kishor et al . 1995).  Kanamisin  merupakan  antibiotik  yang berperan  menghambat  proses  translasi  pada  bakteri. Oleh  karena  itu,  kanamisin  membantu  sefotaksim menghambat  pertumbuhan A.  tumefaciens pada jaringan  yang  telah  ditransformasi (Mentewab  dan Stewart, 2005).
Pengujian  tanaman  hasil  transformasi  dapat dilakukan  dengan  dua  cara,  yaitu  skrining  untuk ekspresi gen reporter (misalnya gen GUS) dan seleksi tanaman  transforman  yang  tahan  terhadap  agen penyeleksi  (antibiotik)  (Jouanin et al., 1993). Ekspresi  gen  GUS  yang  mengkode  enzim  β- glukuronidase  (GUS)  pada  kalus  ditandai  dengan terbentuknya  warna  biru (Gambar 3) pada eksplan
transforman, sehingga mengindikasikan bahwa transformasi  konstruk  gen  P5CS  telah  berhasil dilakukan ke tebu.
Aktivitas  enzim  tersebut  dapat  divisualisasikan dengan  kehadiran  substrat  X-Gluc  ( 5-bromo-4- chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic  acid )  yang  diurai- kan,  sehingga  membentuk  senyawa  antara  melalui reaksi  dimerisasi  oksidatif  yang  menghasilkan senyawa  dikloro-dibromoindigo  (ClBr-indigo)  yang berwarna  biru.  Gen  GUS  hanya  akan  diekpresikan pada  sel  tanaman  dan  tidak  pada Agrobacterium karena  adanya  intron  pada  daerah  N-terminal  dari sekuens  gen gusA (Jouanin et  al., 1993).  Uji  GUS merupakan  metode  yang  efektif  untuk  melihat ekspresi gen GUS pada tanaman transgenik (Hossain et al., 2006; Khamrit et al., 2012).
1. Pertumbuhan eksplan transforman di media seleksi
Keberadaan  konstruk  gen P5CS yang  membawa gen  reporter  NPTII  pada  eksplan  transforman  dapat diverifikasi  dari  pertumbuhan  eksplan  pada  media seleksi MS dengan penambahan antibiotik kanamisin 50  ppm  dan  sefotaksim  500  ppm.  Tabel  1 menunjukkan pertumbuhan dan perkembangan eksplan  transforman  berumur  16  minggu.  Persentase pertumbuhan  eksplan  transforman    yang  optimum adalah eksplan yang ditransformasi gen P5CS meng- gunakan A.  tumefaciens strain  LBA4404  dengan sumber eksplan embrio somatik.
Strain  LBA4404  adalah  salah  satu  strain A.  tumefaciens yang  telah  banyak  digunakan  untuk transformasi gen ke tebu seperti yang telah dilakukan Ahmed et  al .  (2007)  dan  Setyati et  al .  (2007),  serta direkomendasilan oleh Eldessoky et al . (2011). Selain itu,  strain  LBA4404  memiliki  nilai  efisiensi  trans- formasi  cukup  tinggi  yaitu  70%  (Tripathi et  al., 2005).
Gambar 2. Pertumbuhan eksplan tebu asal kalus setelah transformasi. a. Kontrol positif, b. Kontrol negatif dan c. Tunas tebu transforman.
Figure 2.  Growth of sugarcane explants from calli after transformation. a. Positive control,
b. Negative control, c. Transformant sugarcane shoots.
Gambar 3. Ekpresi transien gen reporter GUS pada kalus transforman. Figure 3.   Transient expression of GUS reporter gene on transformant calli.
Tabel 1.  Persentase pertumbuhan eksplan tebu transforman setelah 16 minggu menggunakan tiga strain A. tumefaciens.
Table 1. Growth percentages of  transformantof sugercane explants after 16 weeks using three A. tumefaciens strains.
Varietas Variety Sumber eksplan ( Explant source) Rata-rata tumbuh per strain Growth average per strain (%) Rata-rata tumbuh per varietas Growth average per variety (%) Kalus Callus (%) Kalus embriogenik Embryogenic calli (%) Embrio somatik Somatic embryo (%) Strain GV3101 KK 94.0 83.9 83.3 80.6 a 87.1 c PS 881 88.1 85.7 77.8 83.9 d PS 891 57.1 75.0 80.0 70.7 e Strain LBA4404 KK 88.0 97.5 80.7 85.3 a 88.7 c PS 881 87.6 85.0 82.4 85.0 d PS 891 83.7 72.7 90.0 82.1 e Strain AGL1 KK 92.9 88.9 81.5 80.8 a 87.8 c PS 881 77.8 81.8 76.2 78.6 d PS 891 66.7 70.1 91.7 76.2 e
Keterangan:  Angka yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji DMRT pada P=0,05
Note : Means on column followed by the same letters are not significantly different according to Duncan’s multiple range test at P= 0.05 ).
Sedangkan  sumber  eksplan  dalam  bentuk  embrio somatik memiliki persen rata-rata pertumbuhan yang tertinggi, yaitu 82.6%, meskipun secara statistik tidak berbeda  nyata  dengan  eksplan  lainnya.  Penggunaan embrio  somatik  sebagai  eksplan  telah  banyak digunakan  dalam  kultur  jaringan  tebu    (Khan  & Khatri, 2006; Ali et al., 2007; Malabadi et al., 2011; Ikram-ul-Haq  &  Memon,  2012)  karena  selain  per- tumbuhannya  yang  cepat  juga memiliki  bentuk  yang seragam.  Selain  itu,  penggunaan  embrio  somatik sebagai target transformasi gen menurunkan frekuensi terbentuknya kimera pada regenerasi trans- genik (Deo et al. 2010).
Pertumbuhan  tunas  transforman  pada  media seleksi  berumur  32  minggu  dapat  dilihat  pada  Tabel
2.  Persentase  rata-rata  pertumbuhan  tunas  trans- forman  tertinggi  diperlihatkan  oleh  eksplan  yang berasal dari kalus embriogenik dengan A. tumefaciens strain  LBA4404.  Akan  tetapi  hasil  analisis  statistik menunjukkan  bahwa  perlakuan  jenis  eksplan  dan strain Agrobacterium yang  digunakan  tidak  mem- berikan hasil yang berbeda nyata. Kalus embriogenik merupakan  sumber  eksplan  yang  efektif  sebagai target  transformasi  gen  pada  tebu  seperti  yang dilakukan oleh Carmona et al. (2005), Susiyanti et al.
(2007),  Gilbert et  al. (2009)  dan  Raza et  al .  (2010). Hasil  penelitian  menunjukkan  pula  bahwa  varietas tebu  yang  memiliki  pertumbuhan  eksplan  dan  tunas tertinggi  adalah  KK  (Tabel  1  dan  Tabel  2). Perhitungan persen rata-rata pertumbuhan pada media
Tabel 2.  Persentase pertumbuhan tunas transforman (32 minggu).
Table 2. Growth percentages of  transformant explants after 32 weeks.
Varietas Variety Sumber eksplan ( Explant source ) Rata-rata tumbuh per strain Growth average per strain (%) Rata-rata tumbuh per varietas Growth average per variety (%) Kalus Callus (%) Kalus embriogenik Embryogenic calli (%) Embrio somatic Somatic embryo (%) Strain GV3101 KK 28.9 5.0 15.7 19.3a 16.5c PS 881 16.7 23.1 34.0 24.6d PS 891 22.5 18.9 8.75 16.7e Strain LBA4404 KK 26.5 40.0 8.3 22.2a 24.9c PS 881 33.3 8.3 14.2 18.6d PS 891 25.9 22.9 20.0 22.9e Strain AGL1 KK 7.1 38.0 2.9 12.3a 16.0c PS 881 11.1 15.4 9.2 11.9d PS 891 11.1 15.4 0.7 9.1e
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji DMRT  pada P=0,05.
Note : Means on column followed by the same letters are not significantly different according to Duncan’s multiple range test at P= 0.05.

## Tabel 3.  Tingkat warna kehijauan tunas tebu transforman.
Table 3. Green colour level of transformant of sugercane shoots.
Varietas Variety Kalus ( Callus) Kalus embriogenik Embryogenic calli Embrio somatic Somatic embryo Strain GV3101 KK + + + PS 881 +++ +++ +++ PS 891 + + + Strain LBA440 KK + + + PS 881 + +++ + PS 891 ++ + ++ Strain AGL1 KK ++ ++ + PS 881 + + + PS 891 +++ +++ ++
Keterangan ( Note ) : +++  =  baik (hijau tua seperti kontrol),  ++  =  cukup (hijau muda),  +  =  kurang (hijau keputih-putihan) ( +++  = Good (dark green similar to  control), ++ = moderate (light green), + = poor (white greenish) )
seleksi  telah  diuji  secara  statistik  menggunakan  uji beda  Duncan/ Duncan  Multiple  Range  Test dengan selang  kepercayaan  5%.  Hasil  analisis  menunjukkan bahwa  persentase rata-rata  pertumbuhan  berdasarkan strain A.  tumefaciens ,  sumber  eksplan  dan  varietas tebu yang digunakan tidak berbeda nyata. Sedangkan dalam  perkembangannya,  yang  menunjukkan tingkat
warna  hijau  tunas  yang  baik  adalah  varietas  PS  881 (Tabel  3).  Perbedaan respons  dan  efektivitas  metode transformasi  gen P5CS pada  ketiga  varietas disebabkan  karena  variasi  genotipe  tebu  yang  unik dari  masing-masing  varietas  tebu  yang  digunakan (Gilbert et al. , 2005).
6

## Menara Perkebunan 2015 82(1), 1-9
Pengujian  keberadaan  konstruk  gen P5CS pada transforman dengan metode PCR
Pengujian  keberadaan  gen P5CS dilakukan dengan analisis PCR dari DNA eksplan transforman. Amplifikasi  menggunakan  primer  spesifik P5CS CR Forward dan P5CS CR Reverse menghasilkan  pita DNA  dengan  ukuran  sekitar  1.2  kb  seperti  terlihat pada  Gambar  5.  Primer  spesifik  ini  berasal  dari daerah  terkonservasi  dari  sekuen  gen  P5CS  tanaman V.  aconitifolia (Minarsih et  al. ,  2001).  Gambar  6 menunjukkan  bahwa  gen P5CS telah  tertransformasi ke  dalam  eksplan  dengan  adanya  pita  yang  mem- punyai  ukuran  yang  sama  dengan  kontrol  positif. Kontrol  positif  menggunakan  DNA  plasmid  pBI- P5CS,  sedangkan  kontrol  negatif  menggunakan  air sebagai templat pada proses PCR.
Pengujian  menggunakan  primer  spesifik NPTII juga  membuktikan  kebenaran  adanya  konstruk gen
P5CS dalam eksplan transforman yang dapat tumbuh dengan  baik  di  media  seleksi  dengan  penambahan kanamisin  50  ppm.  Oleh  karena  itu,  eksplan  yang tumbuh  dan  tahan    terhadap  kanamisin  karena  telah tertransformasi  oleh  konstruk  gen P5CS . Hasil amplifikasi PCR dapat dilihat pada Gambar 6.
Gen NPTII ( Neomycin  Phosphotransferase II) telah  digunakan  secara  luas  dalam  seleksi  tanaman transforman.  Gen  ini  membawa  sifat  resistensi terhadap  antibiotik  yang  berbeda-beda  (kanamisin, neomisin, paronomisin dan genetisin) (Jouanin et al., 1993).  Analisis  PCR  menunjukkan  adanya  pita  pada ukuran  kurang  lebih  700  bp  yang  mengindikasikan bahwa  konstruk  gen P5CS yang  juga  membawa  gen ketahanan  terhadap  kanamisin  telah  tertransformasi dan  masuk  ke  dalam  genom  tebu.  Sedangkan  pada kontrol negatif dan eksplan yang tidak ditransformasi tidak terdapat pita karena tidak mengandung konstruk gen P5CS .

## M 1   2  3   4  5  6  7   8  9 10 11 12  M 1   2  3  4   5  6  7  8  9 10 11 12  M  1 2  3  4   5  6  7  8  9 10 11 12
Gambar  5.    Profil  elektroforesis  amplifikasi  eksplan transforman  menggunakan  primer  spesifik  P5CS  CR  F-R. A=  kalus,  B=  kalus  embriogenik  dan  C=  embrio  somatic,  M=  Marka  DNA,  1.  Kontrol  positif,  2. Kontrol negatif , 3 – 12. Eksplan transforman
Figure 5.     Electrophoretic profile of the amplification of transformant explants using specific primer P5CS CR F-R.  A=  callus,  B=  embryogenic  calli,  and  C=  somatic  embryo,  M=  DNA  marker.  1=  Postive control, 2= Negative control, 3-12= transformant explants .

## M 1   2  3  4 5  6  7  8  9 10 11 1213   1  2  3  4  5  6  7  8  9 10 11 12 13    M 1 2  3  4 5  6  7  8  9 10 11 12 13
Gambar 6.   Elektroforegram amplifikasi PCR menggunakan primer spesifik NPTII pada  eksplan kalus embriogenik. M= Marka DNA, 1= Kontrol positif, 2=  Kontrol negatif, 3 – 12= Eksplan transforman dan 13= Eksplan yang tidak ditransformasi.
Figure 6.    Electrophoregram of PCR amplification using specific primer NPTII on embryogenic calli explants. M= DNA marker, 1= positive control, 2= negative control, 3-12= transformant explants and 13= non-transformant explants . a c b b a c 1.2 kb 700 kb 7
Evaluasi varietas, sumber eksplan dan strain Agrobacterium ……….(Minarsih et al .)

## Kesimpulan dan Saran
Transformasi gen P5CS telah berhasil dilakukan pada  tebu  menggunakan A.  tumefaciens strain GV3101, LBA4404 dan AGL1 dengan eksplan kalus dari  media  padat,  embryo  somatik  dan  kalus  asal kultur  SPS.  Pertumbuhan  eksplan  dan  tunas transforman  dari  eksplan  embrio  somatik  dan  kalus embriogenik asal kultur SPS lebih baik dibandingkan eksplan kalus.  Sedangkan eksplan transforman yang berasal  dari  varietas  Kidang  Kencana  menunjukkan pertumbuhan  tunas  yang  paling  baik  dibandingkan dua varietas lainnya. Hasil uji GUS dan analisis PCR menunjukkan  bahwa  konstruk  gen P5CS telah berhasil ditransformasi ke tanaman tebu.
Untuk  selanjutnya  perlu  dilakukan  pengamatan pertumbuhan pada regenerasi tanaman transgenik dan analisis ekspresi gen P5CS pada eksplan transforman yang diberikan perlakuan cekaman kekeringan.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  kontrak kerja  sama  antara  Balai  Penelitian  Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), PT Riset Perkebunan Nasional  (RPN)  dengan  Pusat  Penelitian  dan Pengembangan  Perkebunan  (PUSLITBANGBUN) dengan dana DIPA APBN Tahun 2012. Terima kasih kami  ucapkan  kepada  Tim  Peneliti  BPBPI  dan Dr.  Sony  Suhandono,  Sekolah  Ilmu  dan  Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung.

## Daftar Pustaka
Ahmed  MB,  MS  Akhter,  M  Hossain,  R  Islam, TA  Choudhury,  MM  Hannan,  MA  Razvy  &  I Ahmad  (2007).  An  efficient Agrobacterium - mediated genetic transformation method of lettuce ( Lactuca sativa L.) with an aphidicidal gene, Pta ( Pinellia Agglutinin ). Middle-East J Sci Res 2 (2), 155-160.
Ali  A,  S  Naz  &  J  Iqbal  (2007).  Effect  of  different explants  and  media:  Compositions  for  efficient somatic  embryogenesis  in  sugarcane  ( Saccharum officinarum ). Pak J Bot 39(6), 1961-1977.
Beringer  JE  (2000).  Releasing  genetically  modified organism:  will  any  harm  out  weigh  any advantage? J Appl Ecol 37, 207-214.
Carmona  ER,  AD  Arencibia,  J  Lopez,  J  Simpsin, D  Vargas  &  F  Sala  (2005).  Analysis  of  genomic variability in transgenic sugarcane plants produced by Agrobacterium tumefaciens infection. Plant Breed 124, 33-38.
Deo PC, AP Tyagi, M Taylor, R Harding & D Becker ( 2010).  Factors  affecting  somatic  embryogenesis and  transformation  in  modern  plant  breeding. SPJNAS 28, 27-40.
Eldessoky  DS,  RM  Ismail,  AA  Abdel-Hadi  &
N Abdallah (2011). Establishment of regeneration and  transformation  system  of  sugarcane  cultivar GT54-9 (C9). GM Crops 2 (2), 126-134.
Gilbert  RA,  M  Gallo-Meagher,  JC  Comstock, JD  Miller,  M  Jain  &  A  Abouzid  (2005). Agronomic evaluation of sugarcane lines transformed  for  resistance  to  sugarcane  mosaic virus strain E. Crop Sci . 45, 2060-2067.
Gilbert  RA,  NC  Glyun,  JC  Comstock  &  MJ  Davis (2009).  Agronomic  performance  and  genetic characterization  of  sugarcane  transformed  for resisteance  to  sugarcane  yellow  leaf  virus. Field Crops Res . 11, 39-46.
Hossain  MA,  MM  Shaik,  N  Islam,  HM  Faruquee  & MAS  Miah  (2007).  Transformation  of  foreign gene  in  sugarcane  variety  Isd  28  using Agrobacterium -mediated  method. Bangladesh  J Sugarcane 29, 1-6.
Ikram-ul-Haq  &  S.  Memon  (2012).  Efficient  plant regeneration  through  somatic  embryogenesis  in sugarcane  ( Saccharum  officinarum L.)  cultivar CPF-237 . Afr J Biotechnol 11(15), 3704-3708.
Jefferson  R  (1987).  Assaying  chimeric  genes  in plants:  The  GUS  gene  fusion  system. Plant  Mol Biol Reporter 5, 387-405.
Jouanin  L,  ACM  Brasileiro,  JC  Leple,  G  Pilate  &
D  Cornu  (1993).  Genetic  transformation:  a  short review  of  methods  and  their  application,  results and  perspectives  for  forest  trees. Ann  Forest  Sci 50, 325-336.
Khamrit  R,  P  Jaisil  &  S  Bunnag  (2012).  Callus induction,  regeneration  and  transformation  of sugarcane  ( Saccharum  officinarum L.)  with chitinase  gene  using  particle  bombardment.
African J Biotechnol 11(24), 6612-6618.
Khan  IA  &  A  Khatri  (2006).  Plant  regeneration  via organogenesis  or  somatic  embryogenesis  in sugarcane:  Histological  studies. Pak  J  Bot 38(3), 631-636.
Kishor PBK, Z  Hong, C Miao, C Hu & DPS Verma (1995). Overexpression of  ∆ 1 -pyrroline-5- carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol 108, 1387-1394.
Kavi Kishor PB, S Sangam, RN Amrutha, PS Laxmi, KR  Naidu,  KRSS  Rao,  S  Rao,  KJ  Reddy, P  Theriappan  &  N  Sreenivasulu  (2005). Regulation  of  proline  biosynthesis,  degradation, uptake  and  transport  in  higher  plants:  Its implication  in  plant  growth  and  abiotic  stress tolerance. Curr  Sci 88, 424-438.
Kumar  T,  MR  Khan,  SA  Jan,  N  Ahmad,  N  Ali, MA  Zia,  S  Roomi,  A  Iqbal  &  GM  Ali  (2014). Efficient  regeneration  and  genetic  transformation of  sugarcane  with  AVP1  gene.  American- Eurasian J Agric & Environ Sci 14 (2), 165-171.
Malabadi RB, GS Mulgund, K Nataraja & SV Kumar (2011).  Induction  of  somatic  embryogenesis  in different  varieties  of  sugarcane  ( Saccharum officinarum L.). RPB 1(4), 39-48.
Mano  H,  T  Fujii,  N  Sumikawa,  Y  Hiwatashi  & M Hasebe. (2014). Development of an Agrobacterium-mediated  stable  transformation method  for  the  sensitive  plant Mimosa  pudica . Plos One 9(2), 1-11.
Mentewab  A  &  CNJr.  Stewart  (2005).  Over- expression  of  an Arabidopsis  thaliana ABC transporter  confers  kanamycin  resistance  to transgenic plants. Nat Biotechnol 23, 1177-1180.
Minarsih  H,  D  Santoso  &  N  Fitranti  (2001). Identification of p5cs gene on sugarcane by PCR using heterologous  primer. Menara  Perkebunan , 69(1),1-9.
Minarsih  H,  I  Riyadi,  Sumaryono  &  A  Budiani (2013).  Perbanyakan  massal  planlet  tebu  melalui kultur  in  vitro  menggunakan  sistem  perendaman sesaat (SPS). Menara Perkebunan 81(1), 1-8.
Miswar, B Sugiharto, J Soedarsono & S Moeljopawiro (2007). Transformasi gen sucrose phosphate  synthase  (SoSPS1)  menggunakan Agrobacterium  tumefaciens untuk  meningkatkan sintesis  sukrosa  pada  tanaman  tebu  ( Saccharum officinarum L.). Berk Penel Hayati 12, 137-143.
Mordocco  AM,  JA  Brumbley  &  P  Lakshmanan (2009).  Development  of  a  temporary  immersion system (RITA ® ) for mass production of sugarcane ( Saccharum  spp .  interspecific  hybrids). In  Vitro Cell Dev-P 45 (4), 450-457.
Orozco-Castillo,  CKJ  Chalmers,  R  Waugh  & W  Powell  (1994).  Detection  of  genetic  diversity
and  selective  gen  introgression  in  coffee  using RAPD markers. Theor Appl Genet 8, 934-940.
Raza  G,  K  Ali,  Z  Mukhtar,  S  Mansoo,  M  Arshad  &
S  Asad  (2010).  The  response  of  sugarcane ( Saccharum  officinarum L)  genotypes  to  callus induction, regeneration and different
concentrations  of  the  selective  agen  (getecitin- 418). J Biotechnol 9 (51), 8739-8747.
Sain  SL,  KK  Oduro  &  DB  Furtex  (1994).  Genetic transformation  of  cocoa  leaf  cells  using Agrobacterium tumefaciens . PCTOC 37, 243-251.
Setyati  S,  P  Oktaviandari,  M  Hazmi  &  B  Sugiharto (2007).  Studi  perbandingan  metode  transformasi DNA menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens pada  tanaman  tebu  ( Sacharum hybrid ). Berk Penel Hayati 13, 39-44.
Shah AH, N Rashid, MS Haider, F Saleem, M Tahir
&  J  Iqbal  (2009).  An  efficient,  short  and  cost- effective  regeneration  system  for  transformation studies of sugarcane ( Saccharum officinarum L.).
Pak J Bot 41 (2), 609-614.
Sheludko  YV  (2008). Agrobacterium -mediated transient Expression as an approach to production of  recombinant  proteins  in  plants. Recent  Pat. Biotechnol . 2, 198-208.
Sugiharto,  B  &  H  Safitri.  (2011).  A  Comparison Study for Agrobacterium-mediated transformation Method in Sugarcane ( Saccharum spp L.). J Ilmu Dasar 12(2), 140 – 147.
Susiyanti,  GA  Wattimena,  M  Surahman,  M  Purwito &  DA  Santosa    (2007).  Transformasi  tanaman tebu  ( cv .  PSJT  94-41)  dengan  gen  fitase menggunakan Agrobacterium  tumefaciens GV 2260 ( p BinPI-IIEC). Bul Agr 35 (3), 205-211.
Szabados  L  &  A  Savoure  (2009).  Proline:  a multifunctional  amino  acid. Trends  Plant  Sci 15 (2), 1360-1385.
Tripathi  L,  JN  Tripathi  &  Jd’A  Hughes  (2005). Agrobacterium- mediated transformation of plantain  ( Musa spp.)  cultivar  Agbagba. African J Biotechnol 4 (12), 1378-1383.
Verbruggen  N  &  C  Hermans  (2008),  Proline accumulation  in  plants  :  A  review. Amino  Acids 35, 753-759.
Wang  K  (2006). Agrobacterium  Protocols  Second Edition . Totowa,  Humana Press.