## PENGIKATAN GARAM EMPEDU OLEH SUSU KEDELAI TERFERMENTASI DAN STABILITASNYA TERHADAP PEPSIN DAN PANKREATIN

## [Binding of Bile Salts by Fermented Soymilk and Its Stability Against Pepsin and Pancreatin]
Yusmarini 1) *, Retno Indrati 2) , Tyas Utami 2) dan Yustinus Marsono 2)
1) Program Studi Teknologi Hasil Pertanian, Universitas Riau, Riau
2) Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Diterima 16 Februari 2012 / Disetujui 04 Desember 2012

## ABSTRACT
Processed  soybean  products  especially  the  fermented  ones  have  beneficial  health  effects  since  they  are  capable  of  reducing  the  level  of plasmacholesterol  (hypocholesterolemic  effect).  One  of  the  mechanisms  is  by  increasing  the    binding  of  bile  salt.  This  research  was  aimed  to assess the ability of soymilk, fermented soymilk products and fermented soymilk products combined with enzymatic hydrolysis to bind bile salts. The  stability  of  the  binding  against hydrolysis  by  digestive  enzymes  (pepsin  and  pancreatin)  was  also  evaluated.  Fermented  soybean  products inoculated with isolates of L. plantarum 1 R.11.1.2 was be able to bind 1.40 μmol/100 mg protein (62.26%) of natrium taurocholate. This binding ability is slightly higher than that of soymilk to natrium taurocholate, i.e.1.33 μmol/100 mg protein (59.04%). Addition of a protease enzyme specific to hydrophobic amino acid (thermolysin) on fermented soymilk products was able to enhance the ability of bind natrium taurocholate. Enzymatic hydrolysis  products  having  a  molecular  weight  of  <7  kDa  could  bind  1.51  μmol/100  mg  protein  natrium  taurocholate  (67.4%).  There  was  a significant increase in the binding, i.e. 7.9% by the fermented products or an increase of 13.5% from soymilk. Meanwhile peptides measuring ≥7 kDa showed no binding ability against natrium taurocholate .
Keywords : bile salt, fermented soymilk

## ABSTRAK
Produk  olahan  kedelai  terutama  produk  fermentasi  mempunyai  efek  menguntungkan  bagi  kesehatan  diantaranya  dapat  menurunkan  level kolesterol  plasma  (bersifat  hipokolesterolemik).  Salah  satu  mekanisme  hipokolesterolemik  adalah  melalui  pengikatan  garam  empedu.  Tujuan penelitian  adalah  untuk  mengkaji  kemampuan  susu  kedelai,  produk  fermentasi  susu  kedelai  dan  produk  fermentasi  susu  kedelai  yang dikombinasikan dengan hidrolisa enzimatis dalam mengikat garam empedu serta mengkaji stabilitas pengikatan garam empedu terhadap hidrolisa oleh  enzim  pencernaan  (pepsin  dan  pankreatin).  Garam  empedu  yang  terikat  diukur  dengan  menggunakan Total  Bile  Acid  Binding  Kit .  Produk fermentasi susu kedelai yang diinokulasi dengan isolat L. plantarum 1 R.11.1.2 mampu mengikat natrium taurokolat sebesar 1.40 µmol/100 mg protein (62.26%). Angka ini sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan kemampuan susu kedelai dalam mengikat natrium taurokolat 1.33 µmol/100 mg  protein  (59.04%).  Penambahan  enzim  protease  spesifik  asam  amino  hidrofobik  (thermolysin)  pada  produk  fermentasi  susu  kedelai  dapat meningkatkan kemampuan dalam mengikat natrium tauroklat. Produk hidrolisa enzimatis yang mempunyai berat molekul <7 kDa mampu mengikat natrium taurokolat sebesar 1.51  µmol/100 mg  protein (67.4%). Terjadi  peningkatan pengikatan yang signifikan yakni sebesar  7.9% dari produk fermentasi  atau  meningkat  13.5%  dari  susu  kedelai,  sedangkan  peptida  yang  berukuran  ≥7  kDa  tidak  menunjukkan  peningkatan  pengikatan terhadap natrium taurokolat.
Kata kunci : garam empedu, susu kedelai terfermentasi

## PENDAHULUAN
1
Hiperkolesterol merupakan salah satu faktor resiko penyakit kardiovaskuler.  Berbagai  upaya  dilakukan  untuk  mencegah penyakit  kardiovaskuler  antara  lain  dengan  mengonsumsi makanan yang bersifat hipokolesterolemik. Kedelai dan produk fermentasi  dari  kedelai  dikenal  dapat  menurunkan  kolesterol plasma  atau bersifat hipokolesterolemik (Kahlon dan Woodruff, 2002;  Nisa et  al. 2007).  Salah  satu  mekanisme  hipokoles- terolemik  adalah  melalui  pengikatan  garam  empedu  (Kahlon dan Shao, 2004; Yoshie-Stark et al. 2008; Nagaoka et al. 2010).
*Korespondensi Penulis : E-mail : yusmarini_69@yahoo.co.id; Telp: 08127699124
Pengikatan  garam  empedu  akan  berdampak  pada  meningkat- nya  jumlah  garam  empedu  yang  diekskresikan  melalui  feses dan menurunnya resirkulasi garam empedu ke hati. Penurunan resirkulasi garam empedu akan memacu hati untuk mensintesa garam  empedu  baru  dengan  menggunakan  kolesterol  sebagai prekursornya,  sehingga  secara  tidak  langsung  menyebabkan terjadinya  penurunan  konsentrasi  kolesterol  di  dalam  darah. Efek  hipokolesterolemik  dari  produk  kedelai  diberikan  antara lain  oleh  protein  atau  peptida  bioaktif  yang  merupakan  hasil hidrolisa protein kedelai secara enzimatis. Peptida bioaktif yang bersifat  hipokolesterolemik  umumnya  mempunyai  asam  amino hidrofobik  pada  terminal  nitrogennya  seperti  leusin  pada sequence Leu-Pro-Tyr-Pro-Arg  (Yoshikawa et  al. 2000);  Leu- Pro-Tyr-Pro  dan  Leu-Pro-Tyr-Pro-Arg  (Kwon et  al. 2002);
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.1.105 Komunikasi Singkat
triptofan  pada sequence Trp-Gly-Ala-Pro-Val-Thr,  Trp-Gly-Ala- Pro-Ser-Leu,dan  Trp-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile  (Zhong et  al. 2007 b ), valin  pada sequence Val-Ala-Trp-Trp-Met-Tyr  (Nagaoka et  al. 2010).
Susu kedelai terfermentasi yang dibuat dengan menambah- kan bakteri asam laktatproteolitik hasil isolasi dari susu kedelai yang  terfermentasi  secara  spontan,  diharapkan  mampu  meng- ikat  garam  empedu,  karena  diduga  mengandung  peptida bioaktif  yang  dihasilkan  oleh  aktivitas  proteolitik  bakteri  asam laktat. Kemampuan susu kedelai terfermentasi dalam mengikat garam empedu dapat ditingkatkan dengan hidrolisa protein lebih lanjut  sehingga  dihasilkan  peptida  bioaktif  lebih  banyak. Beberapa  peneliti  telah  melakukan  percobaan  penambahan protease pada produk fermentasi seperti tempe dan nato (Gibbs et al. 2004) maupun produk non fermentasi seperti pada isolat protein  kedelai  (Zhong et  al. 2007 a ).  Peptida  yang  dihasilkan mempunyai sifat anti hipertensi dan hipokolesterolemik.
Penambahan  protease  spesifik  asam  amino  hidrofobik (thermolysin) pada susu kedelai terfermentasi, merupakan cara yang  dapat  dilakukan  untuk  menghidrolisa  protein  lebih  lanjut menjadi  peptida  bioaktif  yang  bersifat  hipokolesterolemik. Tujuan  penelitian  adalah  untuk  mengkaji  kemampuan  susu kedelai,  susu  kedelai  terfermentasi  dan  produk  hidrolisa enzimatis  susu  kedelai  terfermentasi  dalam  mengikat  garam empedu  serta  mengkaji  stabilitas  pengikatan  garam  empedu terhadap  hidrolisa  oleh  enzim  pencernaan  (pepsin  dan pankreatin).

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah  kacang kedelai  varietas  Anjasmoro  yang  diperoleh  dari  Balai  Benih Tanaman  Palawija  –  Wonosari  Daerah  Istimewa  Yogyakarta. Isolat  bakteri  asam  laktat L.  plantarum  1 R.11.1.2  hasil  isolasi dari susu  kedelai  yang terfermentasi spontan (Yusmarini et al. 2009).  Enzim  protease  thermolysin  –  EC,3,4,24,27  (Nacalai- Jepang),  pankreatin  (Sigma-Aldrich)  dan  pepsin  EC,3,4,23,1 (Nacalai-Jepang), Total Bile Acid (TBA) Kit (Wako-Jepang) dan natrium taurokolat (Nacalai-Jepang).

## Pembuatan susu kedelai
Susu  kedelai  dibuat  dengan  menggunakan  metode  yang mengacu  pada  Yusmarini et  al .  (2010) . Biji  kedelai  kering disortir dan direndam dalam air selama 8 jam, kemudian dicuci dan  ditiriskan  lalu  direbus  hingga  matang  dan  dicuci.  Kedelai matang  dihancurkan  dengan blender sambil  ditambahkan  air panas  dengan  perbandingan  1:6,  lalu  disaring  dengan  meng- gunakan kain bersih yang telah dicuci dengan air panas. Susu kedelai  yang  dihasilkan  kemudian  dimasukkan  ke  dalam erlenmeyer  dan  ditutup  dengan  aluminium  foil  dan  plastik. Setelah  itu  susu  kedelai  disterilisasi  dengan  menggunakan autoklaf (Eastern Medical EA-632) pada suhu 115ºC selama 10 menit. Dilakukan uji kemampuan mengikat garam empedu.

## Fermentasi susu kedelai oleh isolat BAL
Proses fermentasi susu kedelai mengacu pada Yusmarini et al .  (2010).  Susu  kedelai  yang  telah  disterilisasi  pada  suhu
115ºC  selama  10  menit  didinginkan  dengan  cepat  hingga mencapai  suhu  45ºC  selama  15-30  menit.  Setelah  itu  di- inokulasi  dengan  isolat  BAL  ( Lactobacillus  plantarum  1 R.11.1.2) sebanyak 1% (v/v) dengan jumlah mikroba 4.5 x 10 -6 dan  diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  20  jam  di  dalam incubator  (Sanyo  MIR-262).  Pada  akhir  fermentasi  dilakukan pengukuran pengikatan garam empedu.

## Hidrolisa enzimatis susu kedelai terfermentasi oleh Thermolysin
Susu  kedelai  terfermentasi  dihidrolisa  dengan  meng- gunakan protease spesifik asam amino hidrofobik (thermolysin). Prosedur  hidrolisa  enzimatis  mengacu  pada  Yoshie-Stark  dan Wäsche  (2004).  Susu  kedelai  terfermentasi  dipanaskan  pada suhu  80ºC  selama  20  menit.  Setelah  itu  dilakukan  pengaturan nilai  pH  susu  kedelai  terfermentasi  tersebut  hingga  mencapai pH  8  dengan  menggunakan  NaOH  dan  kemudian  ditambah thermolysin, diinkubasi selama 2 jam pada suhu 65ºC di dalam water  bath  shaker (Sibata  WS-240).  Setelah  itu  dilakukan pemanasan  selama  20  menit  pada  suhu  90ºC  untuk  meng- inaktifkan enzim thermolysin.

## Pemisahan protein dengan teknik dialisa
Produk  hidrolisa  enzimatis  dari  susu  kedelai  terfermentasi dialisa  menggunakan  kantung  dialysis  ( cut  off 7  kDa).  Pe- misahan  protein  dengan  teknik  dialisa  mengacu  pada  Pohl. (1990). Sampel sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam kantung dialisa dalam larutan buffer fosfat 20 mM pH 7. Dialisa dilakukan selama  12  jam  di  dalam  ruang  pendingin  ( cool  room )  dan selama  proses  dialisa  dilakukan  pengadukan  dengan  meng- gunakan magnetic  stirrer (Cimarec  2).  Sampel  yang  terdapat pada kantung (berat molekul ≥7 kDa) dan sampel yang terdapat pada buffer (berat molekul <7 kDa) dibekukan dan selanjutnya dikeringkan  dengan  menggunakan freeze  dryer. Peptida  hasil dialisa  baik  yang  berukuran  ≥7  kDa  maupun  peptida  yang berukuran  <7  kDa  dianalisa  kemampuannya  dalam  mengikat garam empedu.

## Uji  stabilitas  terhadap  enzim  pencernaan  (pepsin  dan pankreatin)
Stabilitas  pengikatan  garam  empedu  oleh  produk  hidrolisa enzimatis  dari  susu  kedelai  terfermentasi  terhadap  hidrolisa oleh  pepsin  dan  pankreatin  dilakukan  secara in  vitro .  Uji stabilitas  mengacu  pada  Yoshie-Stark  dan  Wäsche  (2004). Susu kedelai terfermentasi yang telah dihidrolisa oleh protease spesifik dan didialisa diatur pH hingga mencapai pH 2 dengan menggunakan  HCl.  Setelah  itu  ditambah  enzim  pepsin  dan diinkubasi  selama  2  jam  pada  suhu  37ºC  di  dalam  inkubator (Sanyo  MIR-262).  Sebagian  sampel  dianalisa  kemampuan pengikatan  garam  empedunya  dan  sebagian  digunakan  untuk tahap  berikutnya  yakni  stabilitas  terhadap  pankreatin.  Nilai  pH dari  susu  kedelai  fermentasi  yang  telah  dihidrolisa  dengan pepsin ditingkatkan menjadi 7 dengan menggunakan NaOH dan ditambahkan  enzim  pankreatin.  Inkubasi  dilakukan  pada  suhu 37ºC selama 3 jam. Kemudian dilakukan pemanasan selama 20 menit pada suhu 80ºC, selanjutnya dilakukan analisa pengikat- an garam empedu.
1.33 a 1.4 b 1.51 c 1.29 a 1.15 1.2 1.25 1.3 1.35 1.4 1.45 1.5 1.55 SK SKF SKF +
hidrolisa enzimatis BM <7000 Da SKF + hidrolisa enzimatis BM ≥7000 Da N at riu m T au ro ko la t y an g Te rik at (µ m ol/ 10 0 m g pr ot ein )

## Pengikatan garam empedu
Preparasi sampel mengacu pada Yoshie-Stark dan Wäsche (2004). Satu milliliter sampel (susu kedelai non fermentasi dan susu kedelai terfermentasi) ditambah 2.5 ml larutan 0.1 M buffer fosfat  pH  7  dan  diaduk  dengan  menggunakan vortex (Nesco XH-C),  hingga  tercampur  secara  sempurna.  Seratus  mikroliter suspensi  sampel  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan ditambah  larutan  garam  empedu  0.25  mM  sebanyak  900  µl. Garam  empedu  yang  digunakan  adalah  natrium  taurokolat. Suspensi  diinkubasi  selama  2  jam  pada  suhu  37ºC  dan kemudian  disentrifugasi  pada  kecepatan  9900  x  g  selama  10 menit  dengan  menggunakan  sentrifuse  (eppendorf  5417-R). Supernatan  dipisahkan  dan  endapan  yang  terbentuk  ditambah dengan  0.5  ml  larutan  0.1  M  buffer  natrium  fosfat  pH  7. Dilakukan  pencampuran  dan  kemudian  disentrifugasi  kembali pada  kecepatan  dan  waktu  yang  sama.  Supernatan  yang dihasilkan digabungkan dengan supernatan yang didapat pada sentrifugasi  pertama.  Garam  empedu  yang  terdapat  pada supernatan dianalisa dengan Total Bile Acid kit (Wako-Jepang) yang dilanjutkan dengan pengukuran absorbansi dengan meng- gunakan  spektofotometer  (Genesys  20)  dan  hasil  yang diperoleh  merupakan  garam  empedu  yang  tidak  terikat.  Per- hitungan jumlah garam empedu yang terikat adalah pengurang- an dari jumlah garam empedu yang ditambahkan dengan garam empedu  yang  terdapat  pada  supernatan  (garam  empedu  tidak terikat).
Data  yang  diperoleh  ditabulasi  dan  kemudian  dianalisa dengan menggunakan software SPSS versi 17 dan untuk mem- bedakan antar perlakuan digunakan uji Duncan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengikatan garam empedu oleh produk susu kedelai Hasil  penelitian  yang  dilakukan  oleh  beberapa  peneliti menyebutkan  bahwa  protein  kedelai  dapat  mengikat  garam empedu (Sugano et al. 1990; Kahlon dan Shao 2004; Yoshie- Stark et  al. 2008).  Penelitian  ini  mengkaji  pengaruh  proses fermentasi  dan  fermentasi  yang  dikombinasikan  dengan hidrolisa  enzimatis  terhadap  kemampuan  produk  dalam  me- ngikat natrium taurokolat. Kemampuan produk mengikat natrium taurokolat disajikan pada Gambar 1.
Data  pada  Gambar  1  menunjukkan  bahwa  susu  kedelai dapat  mengikat  natrium  taurokolat  sebesar  1.33  µmol/100  mg protein  atau  sebesar  59.04%.  Kemampuan  mengikat  natrium taurokolat  diduga  ada  kaitannya  dengan  kandungan  asam amino hidrofobik  yang dikandung oleh  susu kedelai. Dari hasil analisa  dengan  menggunakan  HPLC  diketahui  bahwa  kedelai mengandung sejumlah asam amino hidrofobik maupun hidrofilik ( unpublished result ).
Hasil  analisa  menunjukkan  bahwa  asam  amino  yang terdapat pada kedelai yang terdeteksi dengan HPLC terdiri atas 15  jenis  asam-asam  amino  dan  29.51%  dari  asam  amino tersebut  adalah  asam  amino  hidrofobik  yang  meliputi  alanin, metionin,  valin,  fenilalanin,  isoleusin,  leusin  dan  lisin ( unpublished  result ).  Asam-asam  amino  hidrofobik  tersebut  di- duga memegang peranan dalam pengikatan natrium taurokolat. Hal  ini  didukung  oleh  pernyataan  Sugano et  al .  (1990)  dan
Kwon et al . (2002) yang menyatakan bahwa asam-asam amino hidrofobik yang terdapat pada terminal-N dari suatu protein atau peptida  mempunyai  peranan  penting  dalam  mengikat  asam atau garam empedu.
Keterangan: SK (susu kedelai); SKF (susu kedelai terfermentasi); SKF+hidrolisa enzimatis  (susu  kedelai  terfermentasi  +  thermolysin,  BM  <7  kDa); SKF+hidrolisa  enzimatis  (susu  kedelai  terfermentasi  +  thermolysin,  BM  ≥7 kDa)
Gambar 1.  Pengikatan  natrium  taurokolat  oleh  susu  kedelai,  susu kedelai  terfermentasi  dan  produk  hidrolisa  enzimatis  dari susu  kedelai  terfermentasi.  (Notasi  dengan  huruf  yang berbeda  menunjukkan  perbedaan  yang  nyata  pada  taraf kepercayaan 95% (p < 0.05)
Kemampuan  susu  kedelai  terfermentasi  yang  diinokulasi dengan isolat L. plantarum 1 R.11.1.2 dalam mengikat natrium taurokolat sebesar 1.40 µmol/100 mg protein (62.26%). Angka ini  sedikit  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  kemampuan  susu kedelai  dalam  mengikat  natrium  taurokolat  1.33  µmol/100  mg protein  (59.04%).  Peningkatan  yang  terjadi  hanya  sebesar 5.3%.  Selama  proses  fermentasi  terjadi  hidrolisa  protein  men- jadi peptida oleh protease yang dihasilkan oleh isolat tersebut. Sebagian  dari  peptida  yang  dihasilkan  diduga  mempunyai kemampuan mengikat natrium taurokolat. Hasil penelitian yang dilaporkan oleh Sugano et al . (1990) menyatakan bahwa terjadi peningkatan  pengikatan  natrium  taurokolat  setelah  protein kedelai  dihidrolisa  oleh  protease  yang  berasal  dari Aspergillus oryzae dan Bacillus  subtilis yakni  sebesar  0.35%-24.91%. Beragamnya  kemampuan  produk  untuk  mengikat  natrium taurokolat diduga berkaitan dengan struktur kimia dansifat ionik dari  peptida  yang  dihasilkan  oleh  proses  hidrolisa  enzimatik. Protease  mempunyai  spesifisitas  yang  berbeda  sehingga peptida yang dihasilkan juga akan berbeda. Zhong et al . (2007 b ) menyatakan  bahwa  pola  pemecahan  dan  derajat  hidrolisa berpengaruh  terhadap  produksi  peptida  bioaktif.  Peptida  yang bersifat  hipokolesterolemik  umumnya  mempunyai  susunan asam  amino  yang  spesifik  yakni  mengandung  asam  amino hidrofobik pada terminal-N.
Kecilnya  peningkatan  garam  empedu  oleh  susu  kedelai setelah  difermentasi  oleh  isolat L.  plantarum  1 R.11.1.2 kemungkinan  disebabkan  oleh  beberapa  faktor  antara  lain spesifisitas  dari  protease  yang  dihasilkan  oleh  isolat  bakteri
asam  laktat  kemungkinan  tidak  sepenuhnya  dapat  meng- hidrolisa protein menjadi peptida bioaktif atau aktivitas protease dari isolat bakteri asam laktat yang tidak optimal. Oleh karena itu  perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk  meng- karakterisasi protease yang dihasilkan oleh isolat bakteri asam laktat proteolitik sehingga diketahui karakter dan spesifisitasnya dalam menghidrolisa protein.
Penambahan  enzim  protease  spesifik  asam  amino hidrofobik  (thermolysin)  pada  susu  kedelai  terfermentasi  dapat meningkatkan  kemampuan  dalam  mengikat  natrium  tauroklat. Thermolysin  mempunyai  aktifitas  spesifik  yakni  dapat  meng- hidrolisa  ikatan  peptida  dan  menghasilkan  peptida  dengan asam  amino  hidrofobik  pada  terminal-N.  Bark et  al .  (2001) menyatakan  bahwa  thermolysin  menghidrolisa  ikatan  peptida pada  asam-asam  amino  hidrofobik  terutama  fenilalanin,  valin, leusin dan soleusin.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  produk  hidrolisa  dari susu  kedelai  terfermentasi  yang  mempunyai  berat  molekul  <7 kDa  mampu  mengikat  natrium  taurokolat  sebesar  1.51 µmol/100  mg  protein  (67.4%).  Terjadi  peningkatan  pengikatan yang signifikan yakni sebesar 7.9% dari produk fermentasi atau meningkat  13.5%  dari  susu  kedelai,  sedangkan  peptida  yang berukuran  ≥7  kDa  tidak  menunjukkan  peningkatan  pengikatan terhadap  natrium  taurokolat  (Gambar  1).  Berdasarkan  data tersebut diketahui produk yang mengandung peptida berukuran kecil  (<7  kDa)  mempunyai  kemampuan  lebih  besar  dalam mengikat  natrium  taurokolat  dibanding  produk  yang  me- ngandung peptida dengan berat molekul lebih besar (≥7 kDa). Hasil ini sejalan dengan pernyataan Erdmann et al . (2008) yang menyatakan  bahwa  peptida  bioaktif  yang  bersifat  hipo- kolesterolemik  umumnya  disusun  oleh  2-20  asam  amino  atau lebih  dengan  kata  lain  peptida  bioaktif  umumnya  mempunyai berat molekul kecil. Dari hasil penelitian dapat dikatakan bahwa kemampuan mengikat garam empedu selain dipengaruhi  oleh sifat  dan  susunan  asam  amino  penyusun  peptida  atau  protein serta  struktur  kimia  dari  garam  empedu  juga  dipengaruhi  oleh besar kecilnya ukuran peptida.
Kemampuan  produk  hidrolisa  enzimatis  dari  susu  kedelai terfermentasi  dalam  mengikat  garam  empedu  kemungkinan dapat lebih besar jika selama proses hidrolisa oleh thermolysin dilakukan  pengendalian  pH  susu  kedelai.  Thermolysin  yang digunakan  dalam  penelitian  berasal  dari Bacillus  stearo thermophilus yang  diproduksi  oleh  Nacalai-Jepang,  aktif  pada pH 5.0–8.5 namun pH optimumnya adalah 8.0. Proses hidrolisa akan  menyebabkan  terjadinya  perubahan  nilai  pH  sehingga secara  tidak  langsung  akan  mempengaruhi  aktivitas  thermo- lysin.
Jika dibandingkan dengan kolestiramin (obat yang biasanya digunakan  untuk  penderita  hiperkolesterolemia  dengan  cara mengikat  garam  empedu)  kemampuan  produk  fermentasi  dan hidrolisa  enzimatis  dari  susu  kedelai  dalam  mengikat  garam empedu masih jauh di bawah. Kolestiramin dapat mengikat 11.1 µmol garam empedu/100 mg protein (Kahlon dan Shao, 2004), sedangkan  susu  kedelai  terfermentasi  dan  produk  hidrolisa enzimatis  dari  susu  kedelai  terfermentasi  (BM  <7  kDa)  yang dihasilkan  dalam  penelitian  ini  hanya  mampu  mengikat  garam empedu  1.40  µmol/100  mg  protein  dan  1.51  µmol/100  mg protein.  Kemampuan  kedua  produk  tersebut  hanya  sebesar
12.61 dan 13.60% dari kemampuan kolestiramin. Kemampuan susu  kedelai  terfermentasi  dan  produk  hidrolisa  enzimatis  dari susu  kedelai  terfermentasi  dalam  mengikat  garam  empedu setara  dengan  kemampuan  serat  pangan  yang  berasal  dari asparagus  yakni  13.4%,  namun  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  serat  pangan  yang  berasal  dari  wortel  yang  ke- mampuannya  hanya  3.1%  dari  kemampuan  kolestiramin (Kahlon et al. 2007).

## Stabilitas  pengikatan  garam  empedu  terhadap  pepsin  dan pankreatin
Uji  stabilitas  bertujuan  untuk  mengetahui  apakah  terjadi penurunan kemampuan produk dalam mengikat garam empedu setelah  dihidrolisa  oleh  enzim  pepsin  dan  pankreatin  yang merupakan  enzim  proteolitik  pada  saluran  pencernaan.  Hasil pengujian disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1.  Stabilitas pengikatan natrium taurokolat oleh produk hidrolisa enzimatis BM ≥7 kDa dan BM <7 kDa
Perlakuan Natrium Taurokolat yang Terikat (µmol/100 mg Protein) BM ≥7 kDa BM <7kDa Susu kedelai terfermentasi+ thermolysin 1.29 1.52 Susu kedelai terfermentasi+ thermolysin + pepsin 1.36 1.54 Susu kedelai terfermentasi+ thermolysin+ pepsin+ pankreatin 1.41 1.58
Data  pada  Tabel  1  menunjukkan  bahwa  hidrolisa  oleh pepsin  dan  pankreatin  tidak  menurunkan  kemampuan  produk hidrolisat dalam mengikat natrium taurokolat, baik pada produk yang  mempunyai  berat  molekul  ≥7  kDa  maupun  yang berukuran  <7  kDa  dengan  kata  lain  produk  stabil  terhadap hidrolisa  pepsin  dan  pankreatin.  Hasil  ini  sejalan  dengan penelitian yang dilakukan oleh Yoshie-Stark dan Wäsche (2004) yang  menyatakan  bahwa  hidrolisa  isolat  protein  Lupin  oleh pepsin  dan  pankreatin  tidak  menurunkan  kemampuan  isolat protein dalam mengikat garam empedu.
Kemampuan  protease  untuk  menghidrolisa  protein  dan menghasilkan  peptida  bioaktif  yang  bersifat  hipokolesterolemik akan  mempengaruhi  kemampuan  produk  untuk  mengikat natrium  taurokolat.  Hasil  penelitian  Sugano et  al. (1990)  dan Zhong et  al .  (2007 b )  menyatakan  bahwa  peptida  yang  bersifat hipokolesterolemik  mempunyai  asam  amino  hidrofobik  pada terminal-N.  Pepsin  dan  pankreatin  tidak  spesifik  menghidrolisa asam  amino  hidrofobik  pada  terminal-N,  sehingga  aktivitas peptida  tersebut  tidak  terpengaruh.  Oleh  karena  itu,  meskipun terjadi  hidrolisa  dan  peningkatan  jumlah  peptida  karena hidrolisa  oleh  pepsin  dan  pankreatin,  namun  ternyata  tidak berpengaruh  secara  signifikan  terhadap  kemampuan  produk untuk mengikat natrium taurokolat.

## KESIMPULAN
Produk  hidrolisa  enzimatis  dari  susu  kedelai  terfermentasi yang  mempunyai  berat  molekul  <7  kDa  mempunyai kemampuan  lebih  besar  dalam  mengikat  natrium  taurokolat
dibanding susu kedelai dan susu kedelai terfermentasi. Natrium taurokolat yang terikat pada  susu kedelai adalah sebesar 1.33 µmol/100  mg  protein,  sedangkan  susu  kedelai  terfermentasi dapat  mengikat  natrium  taurokolat  sebesar  1.40  µmol/100  mg protein.  Kemampuan  produk  hidrolisa  enzimatis  dari  susu kedelai  terfermentasi  yang  mempunyai  BM  <7  kDa  untuk mengikat natrium taurokolat lebih tinggi yakni 1.51 µmol/100mg protein. Kemampuan pengikatan natrium taurokolat oleh produk hidrolisat  stabil  terhadap  hidrolisa  oleh  enzim  pencernaan (pepsin dan pankreatin).

## DAFTAR PUSTAKA
Bark  SJ,    Muster  N,  Yates  JR,  Siuzdak  G.  2001.  High- temperature  protein  mass  mapping  using  a  thermophilic protease.  J  Am  Chem  Soc  123:  1774-1775. DOI: 10.1021/ja002909n.
Erdmann  K,  Cheung  BWY,  Schröder  H.  2008.  The  possible roles of food-derived bioactive peptides in reducing the risk of  cardiovascular  diseases.  J  Nutr  Biochem  19:  643-645. DOI: 10.1016/j.jnutbio.2007.11.010.
Gibbs FB, Zougman A, Masse R, Mulligan C. 2004. Production and  characterization  of  bioactive  peptide  from  soy hydrolysate and soy-fermented food. Food Res Int 37: 123- 131. DOI: 10.1016/j.foodres.2003.09.010.
Kahlon TS, Woodruff CL. 2002. In vitro binding of bile acids by soy  protein,  pinto  beans,  black  beans  and  wheat  gluten. Food  Chem  79:  425-429. DOI:  10.1016/S0308-8146(02) 00192-9.
Kahlon TS, Shao Q. 2004. In vitro binding of bile acids by soy (Glycine  max) ,  black  eye  bean (Vigna  unguiculata), garbanzo (Cicer  arietinum) and  lima  bean (Phaseolus lunatus). Food  Chem  86:  435-440. DOI:  10.1016/j.food chem.2003.09.018.
Kahlon TS,  Chapman MH,  Smith GE. 2007. In vitro binding of bile  acids  by  okra,  beets,  asparagus,  eggplant,  turnips, green  beans,  carrots  and  cauli  flower.  Food  Chem  103: 676–680. DOI: 10.1016/j.foodchem.2006.07.056.
Kwon DY, Oh SW, Lee JS, Yang HJ, Lee SH, Lee JH, Lee YB, Sohn  HS.  2002.  Amino  acid  substitution  of  hypo- cholesterolemic peptide originated from glycinin hydrolyzate. Food Sci Biotechnol 11: 55–61.
Nagaoka  S,  Nakamura  A,  Shibata  H,  Kanamaru  Y.  2010. Soystatin  (VAWWMY),  a  novel  bile  acid-binding  peptide, decreased  micellar  solubility  and  inhibited  cholesterol absorption in rats. Biosci Biotech Bioch 74: 1738-1741. DOI: 10.1271/bbb.100338.
Nisa  FZ,  Marsono  Y,  Harmayani  E.  2007.  Efek  hipokolesterol- emik susu kedelai fermentasi steril secara in vitro . J Berita Kedokteran Masyarakat 23: 47-51.
Pohl T. 1990. Concentration of Protein and Removal of Solute. In:  Guideto  Protein  Purification.  Ed.  Deutscher,  M.P. Academic Press Inc. California.
Sugano  M,  Goto  S,  Yamada  Y,  Yoshida  K,  Hashimoto  Y, Matsuo T, Kimoto M. 1990.  Cholesterol-lowering activity of various undigested fraction of soybean protein in rats. J Nutr 120: 977-985.
Yoshikawa M, Fujita  H, Matoba  N, Takenaka  Y,  Yamamoto T, Yamauchi  R,  Tsuruki  H,  Takahata  K.  2000.  Bioactive peptides  derived  from  food  proteins  preventing  lifestyle- related diseases. in: A new frontier in soy bioactive peptides that may prevent age-related chronic diseases. Compr Rev Food Sci F 4: 63-78.
Yoshie-Stark  Y,  Wäsche  A. 2004. In vitro binding of bile acids by lupin protein isolates and their hydrolysates. Food Chem 88: 179–184. DOI: 10.1016/j.foodchem.2004.01.033.
Yoshie-Stark  Y,  Wada  Y,  Wäsche  A.  2008.  Chemical composition,  functional  propertiesand  bioactivities  of rapeseed  protein  isolat.  Food  Chem  107:  32-39. DOI: 10.1016/j.foodchem.2007.07.061.
Yusmarini,  Indrati  R,  Utami  T,  Marsono  Y.  2009.  Isolasi  dan identifikasi  bakteri  asam  laktat  proteolitik  dari  susu  kedelai yang terfermentasi spontan. J Natur Indonesia 12: 28–33.
Yusmarini,  Indrati  R,  Utami  T,  Marsono  Y.  2010.  Kemampuan susu kedelai yang difermentasi oleh Lactobacillus plantarum 1 dalam  mengikat  garam  empedu.  Majalah  Farmasi Indonesia 21: 202–208.
Zhong  F,  Liu  J,  Ma  J,  Shoemaker  CF.  2007 a .  Preparation  of hypocholesterol  peptides  from  soy  protein  and  their hypocholesterolemic effect in mice. Food Res Int 40: 661– 667. DOI: 10.1016/j.foodres.2006.11.011.
Zhong F, Zhang X, Ma J, Shoemaker CF. 2007 b . Fractionation and  identification  of  a  novel  hypocholesterolemic  peptide derived  from  soy  protein  Alcalase  hydrolysates.  Food  Res Int 40: 756-762. DOI: 10.1016/j.foodres.2007.01.005.