## POTENTIAL  OF  NASAL  AND  ORAL  SPRAYS  OF  ALLYL  DISULFIDE  GARLIC  EXTRACT    AS PROTECTION AGAINST SARS-COV-2
Silvia Vera Indrawati*, Salwa Febria Monica*, Iftitah Nabiilah Ramadhani**, Siska Nurlivia**, Azka Putri Anisa**, Islamy Rahma Hutami***

## ABSTRACT
Background:  Severe  Acute  Respiratory  Syndrome  Corona  Virus  2 (SARS-CoV-2),  a  virus  that  causes  COVID-19  disease,  occurred  in 2019.  The  prevalence  of  COVID-19  was  increasing  and  spreading rapidly  in  several  countries  including  Indonesia.  Some  efforts  have been  proposed  to  reduce  the  coronavirus  outbreak,  which  is  the exploration  potentials  inhibitor  of  SARS-CoV-2,  vaccination,  and improving  health  protocols  by  implementing  5M.  This  study characterized several formulations of nasal spray and evaluated their biological function as antivirus.
Method: The garlic was used in this study, crude extract performed by garlic  extraction  using  maseration  and  evaporated  using  rotary evaporator.  The  garlic  crude extract was prepared to make nasal and oral  sprayer  agent  and  evaluated  using  thin  layer chromatography. Nasal and oral spray composition was modelled and docked with spike glycoprotein  of  SARS-CoV-2  and  angiotensin  converting  enzyme-2 (ACE-2).  Garlic  extract showed  containing  allyl  sulfide  as  bioactive compound in garlic, which was detected at Rf 0.5. biological functions revealed  that  the  component  of  nasal  and  oral  spray  have  antiviral agents and block the spike glycoprotein – ACE2 interaction.
Result: The allyl disulfide complex detected several active amino acid residues,  both  with  the  spike  glycoprotein  protein  and  the  ACE2 receptor.
Conclusion: This study suggested that the nasal and oral spray garlic has  the  potential  as  an  antiviral,  especially  inhibiting  the  interaction between  ACE2  and  spike  glycoprotein.  Further  in  vitro  and  in  vivo studies are required for advance investigation.

## PENDAHULUAN
Virus Severe Acute
Respiratory Syndrome  Corona  Virus  2 (SARS-CoV-2) merupakan  jenis  virus  yng  menyebabkan penyakit Corona Virus Disease-19 (COVID-19).
Penyakit  COVID-19  awal  terjadi  pada  tahun 2019  di  Wuhan,  China.  Prevalensi  kasus COVID-19 meningkat hingga awal tahun 2021 di
berbagai  negara,  dan  menyebabkan  angka kematian  yang  tinggi.  Berdasarkan  data  dari satgas COVID-19 (2021) tertanggal 3  Agustus 2021  kasus  COVID-19  di  Indonesia  mencapai 3.462.800  jiwa  terkonfirmasi  positif.  Berbagai upaya dilakukan oleh pemerintah Indonesia untuk mengurangi penyebaran virus COVID-19 ini  seperti  PPKM  (Pemberlakuan  Pembatasan
* Dentistry Study Program, Faculty of Dentistry Sultan Agung Islamic University ** Pharmacy Study Program, Faculty of Medical Sultan Agung Islamic University *** Orthodontics Departement, Faculty of Dentistry Sultan Agung Islamic University
Correspondence: silverve@std.unissula.ac.id
Keywords:
Anti-Virus; Allyl Disulfide; COVID-19; Garlic
Kegiatan  Masyarakat)  dan  juga  memperketat protokol  kesehatan  yang  dikenal  dengan  5M (Memakai  masker,  Mencuci  tangan  pakai sabun,  Menjaga  jarak,  Menjauhi  kerumunan, dan Membatasi Mobilitas serta interaksi). Selain itu,  di  Indonesia  juga  sedang  meningkatkan vaksinasi kepada masyarakat untuk menurunkan laju penyebaran COVID-19 1 . Akan tetapi,  upaya  dari  pemerintah  dinilai  masih belum  dapat  menurunkan  angka  penularan COVID-19  secara  signifikan  sehingga  upaya pencegahan  dari  segi  individu  sebagai  host sangat dianjurkan.
Indonesia merupakan salah satu negara dengan  biodiversitas  yang  tinggi  dengan keanekaragaman flora yang beragam. Bawang putih  merupakan  salah  satu  rempah  yang memiliki  aktivitas  antioksidan,  antibakteri, antivirus dan lainnya. Septiana (2020) melaporkan  bahwa  bawang  putih  ( Allium sativum  L. )  mengandung  senyawa  alkaloid seperti alil disulfida. Kandungan alkaloid bawang putih  diprediksi  berperan  sebagai  antivirus. Bawang  putih  memiliki  kandungan  aktif  alisin yang  merupakan  prekursor  pembentukan  alil sulfida,  misalnya  dialil  disulfida  (DADS),  dialil trisulfida  (DATS),  dialil  (DAS)  dan  yang lainnya 2 .  Senyawa  aktif  alil  disulfida  dari bawang putih berinteraksi dengan asam amino protein ACE2 3 .
Protein ACE2 merupakan reseptor untuk SARS  dan SARS-CoV-2. Ikatan antara protein S  dari  SARS-CoV-2  dengan  reseptor  ACE2 pada permukaan sel inang mukosa hidung dan mulut  merupakan  pintu  masuk utama  SARS- CoV-2.  Bawang  putih  memiliki  kandungan senyawa  aktif  berupa  alil disulfida  dan  alil trisulfida yang
mampu
menghalangi perlekatan protein  S  dari SARS-CoV-2 dengan reseptor  ACE2  dengan  cara  berikatan  kuat
dengan reseptor ACE2 pada penelitian in silico 4 .  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Thuy  et  al.
(2020)  menunjukkan  bahwa  penghambatan ligan  dalam  bawang  putih  tidak  hanya  untuk protein  ACE2  tetapi  juga  untuk  protein PDB6LU7 sebagai protease utama dari SARS- CoV-2.  Penelitian  sediaan  bawang  putih sebagai  antivirus  belum  banyak  dilaporkan. Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan  untuk mengevaluasi  formulasi  sediaan  spray  yang mengandung  alil  disulfida  dan  efektivitasnya sebagai antivirus.

## METODE PENELITIAN

## Pembuatan Ekstrak Bawang Putih
Pembuatan  ekstrak  bawang  putih  segar dengan diblender kemudian dimaserasi menggunakan  etanol  70%  selama  3  hari. Maserat selanjutnya disaring dengan perbandingan  pelarut  yang  sama.  Maserat yang didapatkan kemudian dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator kemudian dilanjutkan dengan waterbath hingga diperoleh ekstrak kental 5 .
Pengujian Senyawa Aktif dengan Kromatografi Lempeng Tipis Pengujian
kualitatif senyawa aktif menggunakan  metode  kromatografi  lempeng tipis  untuk  mengetahui  adanya  kandungan  alil disulfida  dalam  ekstrak  etanol  70%  bawang putih dengan menggunakan parameter perbandingan nilai Rf standar alil disulfida dan ekstrak etanol 70% dari sampel 5 .

## Pembuatan  Sediaan  Spray  Nasal  dan  Oral Senyawa Alil Disulfida
Pada penelitian ini, sediaan spray dibuat dalam 3  formula,  yaitu  dengan  konsentrasi  10% (formula 1), 20% (formula 2), dan 30% (formula 3).  Pembuatan  sediaan  spray  nasal  dan  oral senyawa  alil  disulfida  sebagai  bahan  aktif adalah  dengan  cara  mencampurkan  semua bahan pada masing-masing formula. Kemudian diaduk  hingga  tercampur  rata,  masukkan sediaan ke botol spray 6 .
Tabel 1. Formulasi Sediaan Nama Bahan F1 (% b/v) F2 (%b/v) F3 (%b/v) Ekstrak Bawang Putih l x X x Tween 80* 10 10 10 PEG 400* 2.5 2.5 2.5 Metil Paraben 0.03 0.03 0.03 Propil Paraben 0.01 0.01 0.01 Aquadest Ad 100 Ad 100 Ad 100 Castor Oil 2 2 2
*) Perbandingan antara Tween 80 dan PEG 400 adalah 4:1 (Monica et all, 2019)
Prediksi  aktivitas  sediaan  spray  Allyl disulfida secara In Silico
Allyl  disulfide (CID  16590), carboxymethyl cellulose (CID  24748), sucrose (CID  5988),
methyl  paraben (CID  7456)  diunduh  dari database  PubChem  dan  dipreparasi  dengan software  PyRX  0.8.  senyawa  diminimalisir energinya  dan  dikonversi  dalam format  pdb. Protein  ACE-2  dan  SARS-CoV-2  diambil  dari database Protein Data Bank (PDB) dengan ID 7DMU.  Senyawa Allyl  disulfide (CID  16590), carboxymethyl  cellulose (CID  24748), sucrose (CID  5988), methyl  paraben (CID  7456)
dibentuk  kompleks  dengan  diinteraksikan dengan program HEX Cuda 8.0.0 dan disimpan dalam bentuk pdb. Tahap selanjutnya kompleks ligan  diinteraksikan dengan  protein  ACE2  dan SARS-CoV-2  dengan  menggunakan  software Molegro  Virtual  Docker  yang  dilanjutkan dengan  visualisasi  dengan  software  Discovery Studio Ver 21.1.1.

## HASIL PENELITIAN

## Profil biokimia sediaan bawang putih
Persentase  hasil  ekstraksi  bawang  putih didapatkan  13,2%  (330  ml  dari  2500  ml). ekstrak  total  bawang  putih  menunjukkan adanya  alil  disulfida  dengan  nilai  Rf  0,5.  Spot alil disulfida didapatkan dari profil kromatografi lapis tipis dengan eluen heksana : isopropanol dengan perbandingan 3:1. Spray  nasal dan oral menunjukkan spray  yang  stabil  pada  suhu  4 o C dan 40 o C dalam waktu sehari dan dengan pH 5 (Gambar 1).
Gambar  1.  Profil  biokimia  dan  stabilitas sediaan spray nasal dan oral ekstrak bawang putih. a. profil kromatografi lapis tipis sediaan
ekstrak  bawang putih,  b.  uji  stabilitas  suhu dingin, c. uji stabilitas suhu panas, d. pH spray nasal dan oral.
Uji aktivitas sediaan sediaan spray bawang putih sebagai antivirus secara In Silico
Sediaan ekstrak bawang berikatan dengan  protein  ACE2  pada  residu  asam    amino ALA386,  GLN388,  ASN33,  GLU37,  ALA387, ASN33,  GLU37,  HIS34,  PHE390,  ARG393, GLU37, HIS34 (Gambar 2). Residu asam amino tersebut didominasi dengan ikatan hydrogen baik sebagai donor maupun acceptor.    Nilai hidrofobisitas  interaksi  sediaan  ekstrak  bawang putih  dengan  protein  ACE-2 menunjukkan  nilai yang  rendah  mengindikasikan  tidak  terdapat adanya interaksi hidrofob.
Gambar  2.  Interaksi  antara  sediaan  ekstrak bawang  dengan  protein  ACE2  dan SARSCOV2, A.  tampilan  struktur  3D interaksi  kompleks  sediaan  dengan ACE-2 –  SARSCOV2,  B.  Daerah ikatan  interaksi  sediaan  dengan protein , C. Tampilan ikatan hidrogen ,  D.  Tampilan  interaksi  hidrofobik, hijau menunjukkan protein ACE2, biru adalah  protein  SARSCOV2,  dan merah adalah kompleks sediaan.
Sisi aktif sediaan ekstrak bawang terhadap protein  Spike  SARS-CoV-2  yaitu  B:ARG403,
B:TYR453,
B:TYR505, B:TYR505, B:ASP405,B:GLY496,  B:TYR453,  B:GLY496, B:TYR453,  B:ASP405,  B:ASP405,  B:TYR453, B:ARG403,  B:GLY496,  B:ARG403,  B:TYR505, dan B:ARG403  (Gambar  3). Residu asam amino tersebut teridentifikasi merupakan sisi aktif ikatan antara ACE-  2  dan  spike  protein  SARS-CoV-2. Pengikatan  disisi  aktif  yang  sama  dengan pengikatan ACE2 mengindikasikan bahwa sediaan berpotensi untuk menghambat interaksi ACE2 dan SARS-CoV-2.
Gambar  3.  Skor  ikatan antara  sediaan dengan  protein  ACE2,  spike protein SARS-CoV-2dan kompleks protein ACE-2 – SARS-CoV-2.
Gambar  3  membuktikan  bahwa  sediaan ekstrak  bawang  putih  mengikat  residu  asam amino  ACE2  dan  SARS-CoV-2.  Residu  asam amino  tersebut  yaitu  B:ARG403,  B:TYR453, B:TYR505,  B:TYR505,  B:ASP405,  A:ALA386, A:GLN388,  A:ASN33,  A:GLU37,  A:ALA387, A:GLU37,  A:ALA387,  B:GLY496,  B:TYR453, B:GLY496,  B:TYR453,  A:ASN33,  A:GLU37, A:HIS34,  A:PHE390,  A:ARG393,  A:ALA386, B:ASP405,  B:ASP405,  A:GLU37,  A:GLU37, A:GLU37,  A:GLU37,  A:GLU37,  B:TYR453,
A:HIS34, A:HIS34, B:ARG403, B:GLY496, B:ARG403, B:TYR505, B:ARG403 Gambar 4. Mekanisme Alil Disulfida menghambat perlekatan reseptor S dari  SARS-CoV-2  ke  ACE2  di rongga mulut dan hidung
Menariknya,  setelah  sediaan  diinteraksikan dengan ACE2 dan SARS-CoV-2, tidak terdeteksi  adanya  ikatan  antara  ACE2  dan SARS-CoV-2 (Gambar 4). Hal ini mengindikasikan  bahwa  sediaan  berpotensi sebagai  antivirus  terhadap  SARS-CoV-2  dan dapat  digunakan  untuk  pencegahan  infeksi COVID-19.  Berdasarkan  skor  sediaan  ekstrak dengan protein ACE2 memiliki MolDock Score dan  Rerank  score  yang  lebih  rendah  dari kompleks  sediaan  dengan  SARS-CoV-2  dan sediaan ekstrak bawang - ACE2 – SARS-CoV- 2. Semakin rendah skor docking maka semakin kuat interaksi antara ligand dan protein.

## DISKUSI
Bawang  putih  mengandung  setidaknya  33 komponen  sulfur,  17  asam  amino,  banyak mineral,  vitamin,  dan  lipid.  Kandungan  sulfur dalam  bawang  putih  cukup  tinggi. Komponen inilah  yang  bertanggung  jawab  atas  berbagai macam  manfaat  terapeutik  dan  memberikan bau  khas  bawang  putih 7 .Alisin  merupakan prekursor  pembentukan  alil  sulfida, misalnya
dialil  disulfida  (DADS),  dialil  trisulfida  (DATS), dialil  sulfida  (DAS),  metalil  sulfida,  dipropil sulfida, dipropil disulfida, alil merkaptan, dan alil metil  sulfida.  Alisin  merupakan  senyawa organosulfur yang keberadaannya sebesar 70 – 80  persen  dari  total  tiosulfinat.  Senyawa  alisin sebagai  inhibitor  kovalen SARS-CoV-2 telah dievaluasi  dengan  metode in  silico. Alisin menyebabkan  Sthioallylation  ganda  Cys-145 dan  residu  Cys-85  /  Cys-156  yang  terpapar pelarut dari SARS-CoV-2 Mpro akan bertindak sebagai  penghambat  kuat SARS-CoV-2  Mpro. Dengan demikian, alisin memiliki peran sebagai penghambat ikatan  kovalen  protease  utama SARS-CoV-2 8 .  Pada  penelitian  yang  telah dilakukan  oleh  Pritacindy  (2017),  dalam sediaan spray dengan konsentrasi tertinggi 8% membutuhkan  waktu  bunuh  0.0630  jam. Dimana 8% ekstrak bawang putih lebih efektiv sebagai  insektisida  kutu  rambut  (P ediculus capitis )  karena  membutuhkan  waktu  bunuh yang lebih cepat daripada konsentrasi 4% dan 6%. Sehingga semakin tinggi tingkat konsentrasi  yang  digunakan  maka  akan semakin  cepat  waktu  bunuh  yang  dibutuhkan untuk  kutu  rambut  (P ediculus  capitis ) 9 .Virus SARS-CoV-2  menginfeksi  tubuh  manusia melalui  cairan  mulut,  hidung,  dan  mata. Mekanisme  masuknya  yaitu  melalui  sistem endositosis,  yaitu  virus  akan  ditangkap  oleh reseptor  yang  terdapat  di  permukaan  sel, kemudian  akan  ditarik  masuk  kedalam  sel. Protein S nantinya akan bertugas memfasilitasi masuknya  virus  ke  dalam  sel target,  terutama sel  paru.  Sel  paru  disini dilapisi  oleh  epitel pelindung  yang  memiliki  reseptor Angiotensin- Converting  Enzyme2 (ACE2).  Selain  itu, reseptor  ACE2  ditemukan  hampir  di  seluruh lapisan mukosa di manusia terutama pada jalan masuk  SARS-CoV-2  itu  sendiri  yaitu,  mukosa
oral,  dan  nasal 10 .  ACE2  merupakan  satu kesatuan  membran glikoprotein  yang  dikenal paling  tinggi  ekspresi  di  sebagian  besar jaringan  seperti  ginjal,  endotelium,  paru-paru, dan jantung. Protein ACE2 memiliki fungsi yang sama reseptor sel inang  bersama oleh SARS- CoV-2  dan  SARS  tipe  lain.  Oleh  karena  itu, selain menghambat SARS-CoV-2, penghambatan protein ACE2 mutlak  diperlukan mengurangi  pengoperasian  reseptor  inang SARS-CoV-2. Perlekatan protein ACE2 dengan alil  disulfida  mampu  melindungi  inang  dari perlekatan SARS-CoV-2 11 . Alil disulfida dan alil trisulfida sebagai senyawa yang dihasilkan oleh bawang  putih  diketahui  mampu  berikatan  kuat dengan reseptor ACE2, sehingga menghalangi penempelan virus SARS-CoV-2 pada sel inang.

## KESIMPULAN
Ektrak  total  bawang  putih  secara  kualitatif teridentifikasi mengandung alil disulfida.
Sediaan senyawa mampu menghambat interaksi  ACE2  dengan  SARS-CoV-2  dengan berikatan  di  daerah  ikatan  antara  ACE2  dan SARS-CoV-2.
Sediaan
dapat direkomendasikan sebagai antivirus dan diperlukan uji lanjut baik secara in vitro maupun in vivo.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didanai  dan  dibantu  oleh pendanaan PKM DIKTI Tahun 2021.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Susilo  A,  Rumende  CM,  Pitoyo  CW, Santoso WD, Yulianti M, Herikurniawan H,  et  al.  Coronavirus  Disease  2019: Tinjauan  Literatur  Terkini.  J  Penyakit Dalam Indones. 2020;7(1):45.
2. Moulia  MN,  Syarief  R,  Iriani  ES, Kusumaningrum  HD,  Suyatma  NE. Antimikroba  Ekstrak  Bawang  Putih.  J
Pangan. 2018;27(1):55 –66.
3. Thuy BTP, My TTA, Hai NTT, Hieu LT, Hoa  TT,  Thi  Phuong  Loan  H,  et  al. Investigation into SARS-CoV-2 Resistance  of  Compounds  in  Garlic Essential Oil. ACS Omega. 2020;5(14):8312 –20. 4. Septiana  E.  Prospek  Senyawa  Bahan Alam Sebagai Antivirus Dalam Menghambat SARS-CoV-2. Bio Trends. 2020;11(1):30 –8.
5. Prastiwi  R,  Siska  S,  Marlita  N. Parameter  Fisikokimia  dan  Analisis Kadar  Allyl  Disulfide  dalam  Ekstrak Etanol  70%  Bawang  Putih  (Allium sativum  L.)  dengan  Perbandingan Daerah  Tempat  Tumbuh.  Pharm  Sci Res. 2017;4(1):32 –47.
6. Sasmita  M,  Akademi.  Mutu  Fisik Sediaan  Suspensi  Oral  Spray  Ekstrak Rimpang Kencur ( Kaempferia Galanga L .) The Quality Of Physical Preparation Suspension  An  Oral  Spray  Extract Rhizomes Kencur ( kaempferia galanga L  .  )  Sasmita  ,  Mardhiyah  Akademi
Farmasi Putra Indonesia Mal. 2012;1 –9. 7. Martins  N,  Petropoulos  S,  Ferreira ICFR. Chemical composition and bioactive  compounds  of  garlic  (Allium sativum L.) as affected by pre- and post- harvest  conditions:  A  review.  Food Chem. 2016;211:41 –50.
8. Shekh  S,  Reddy  KKA,  Gowd  KH.  In silico  allicin  induced  S-thioallylation  of SARS-CoV-2  main  protease.  J  Sulfur
Chem  [Internet].  2021;42(1):109 –20. Available from: https://doi.org/17415993.2020.1817457
9. Pritacindy  AP,  Supriyadi  S,  Kurniawan A.  Uji  Efektifitas  Ekstrak  Bawang  Putih (Allium  Sativum)  Sebagai  Insektisida Terhadap  Kutu  Rambut  (Pediculus Capitis).  Prev    Indones  J  Public  Heal.
2017;2(1):1. 10. Sumarmi  S.  Kerja  Harmoni  Zat  Gizi dalam  Meningkatkan  Imunitas  Tubuh Terhadap Covid-19: Mini Review. Amerta Nutr. 2020;4(3):250.
11. Paraskevis  D,  Kostaki  EG,  Magiorkinis G,  Panayiotakopoulos  G,  Sourvinos  G, Tsiodras  S.  Full-genome  evolutionary analysis of the novel corona virus (2019- nCoV) rejects the hypothesis of emergence  as  a  result  of  a  recent recombination  event.  Infect  Genet Evol [Internet]. 2020;79(January):104212. Available from: https://doi.org/10.1016/j.meegid.2020.1 042