## STUDI PERBANDINGAN RENDEMEN PRODUKSI XANTOFIL DAN KAROTEN KAPANG ONCOM MERAH PADA BERBAGAI WAKTU INKUBASI
[The Comparison of Yield and Production of Xanthophyll and Carotene From Red Oncom Mold at Different Incubation Time]
Asniawati 1* , Ahmad Ridhay 1 , Prismawiryanti 1
1) Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Tadulako, Palu Jl. Soekarno Hatta Km.9, Kampus Bumi Tadulako Tondo Palu, Telp. 0451- 422611
*)Coresponding author: asniawati57@gmail.com
Diterima  28 September 2018, Disetujui 24 November 2018

## ABSTRACT
The  research  about  the  comparison  of  yield  and  production  of  xanthophyll  and  carotene  from  red oncom  mold  at  different  incubation  time  has  been  done.  The  aim  was  to  find  out  the  amount  of xanthophyll  and  carotene  yield  of  group  fraction  from  various  incubation  time  of  red  oncom  on  corn cobs medium. The test was done by measuring the absorbance of xanthophyll and carotene extract in uv-vis spectrophotometer. The observed parameters were  incubation time of red oncom mold spores. Incubation  times  were  started  from  2, 3,  4,  5,  6,  until  7  days.  The  research  showed  incubation  time that  produced  effective  xanthophyll  yield  on  day  3 rd with an  average  yield  of  4.435%,  while  effective yield of beta-carotene were on day 5 th with average yield of 4.532 %.
Keywords : xanthophyll, carotene, red oncom mold, incubation time, yield

## ABSTRAK
Telah  dilakukan  penelitian  tentang  studi  perbandingan  rendemen  produksi  xantofil  dengan  karoten kapang  oncom  merah  pada  berbagai  waktu  inkubasi.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui jumlah  rendemen  fraksi  kelompok  xantofil  dan  karoten  dari  berbagai  waktu  inkubasi  kapang  oncom merah  pada  medium  tongkol  jagung.  Pengujian  dilakukan  dengan  mengukur  absorbansi  ekstrak xantofil  dan  karoten  pada  instrumen  spektrofotometer  uv  vis,  parameter  yang  diamati  adalah  waktu inkubasi spora kapang oncom merah. Waktu inkubasi yang digunakan adalah dimulai dari hari ke 2, 3,  4,  5,  6,  dan  ke  7.  Hasil  penelitian  menujukkan  bahwa  waktu  inkubasi  yang  menghasilkan  jumlah rendemen  xantofil  efektif  pada  hari  ke  3  dengan  rerata  rendemen  sebesar  4,435%.  Sedangkan jumlah rendemen karoten efektif pada hari  ke 5 dengan rerata rendemen 4,532%.
Kata kunci : xantofil, karoten, kapang oncom merah, waktu inkubasi, rendemen

## LATAR BELAKANG
Senyawa golongan karotenoid, seperti  karoten  memiliki  manfaat  yang sangat  besar  dalam  industri  pengolahan pangan. Penambahan karoten pada makanan  mempunyai  dua  tujuan  yaitu sebagai  pigmen  atau  pemberi  warna  dan memiliki  nilai  nutrisi,  karena  senyawa  ini berfungsi  sebagai  prekursor  vitamin  A. Penyakit  akibat  kekurangan  vitamin  A, seperti xerofthalmia dan gangguan pertumbuhan dapat dicegah dengan banyak  mengkonsumsi  makanan  yang kaya akan karotenoid (Mappiratu, 1990).
Karotenoid  terdiri  atas  dua  jenis, yaitu  karoten  dan  xantofil  (Zeb  dan Mehmood, 2004). Karoten adalah kelompok karotenoid dengan rantai hidrokarbon panjang, seperti β-karoten dan likopen,  sedangkan  kelompok  xantofil adalah turunan karotenoid yang teroksidasi. Semua jenis senyawa kelompok  xantofil  dan  karoten  memiliki aktivitas  antioksidan  yang  berbeda  satu sama lain.
Produksi  karotenoid  kapang  oncom merah  ( Neurospora  sp )  telah  dilaporkan oleh berbagai peneliti diantaranya (Mapiratu,  1990; Purnamasari et al., 2013;
Gusdinar et  al., 2011).  Pahlevi et  al.,
(2008)  memperoleh  rendemen  karoten sebesar  18,81%  pada  media  ampas  tahu yang  di  inkubasi  selama  5  hari.  Indarto (2010)  memperoleh  berat  massa  sel sebesar 12,52 gram dengan waktu produksi  karoten  yang  optimal  terdapat pada  hari  ke  6  inkubasi.  Akan  tetapi
peneliti  tersebut  belum  melakukan  kajian tentang  profil  karotenoid  yang  diproduksi kapang  oncom  merah  relative  terhadap waktu  inkubasi.  Demikian  pula  fraksi kelompok karotenoid (karoten dan xantofil) yang  diproduksi  relatif  terhadap  waktu inkubasi.  Kapang  oncom  merah  yang ditumbuhkan pada medium tongkol jagung memproduksi  xantofil  (karotenoid  yang mengandung unsur oksigen), namun belum  terungkap  jumlah  xantofil  yang  di produksi relatif terhadap karoten (karotenoid yang tidak mengandung oksigen atau karotenoid hidrokarbon) pada berbagai waktu inkubasi.
Waktu  inkubasi  merupakan  waktu yang  diperlukan  oleh  mikrooorganisme untuk melangsungkan proses pertumbuhan  dengan  baik  dan  sempurna. Kapang  memiliki  waktu  inkubasi  yang berbeda  dengan  jamur.  Umumnya  kapang memiliki  rentang  inkibasi  antara  2  hinga  7 hari (Ifnawati, 2013).
Berdasarkan  latar  belakang  yang telah  disebutkan  diatas,  maka  dilakukan penelitian perbandingan rendemen produksi  xantofil  dan  karoten  kapang oncom  merah  pada  berbagai  waktu inkubasi.

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan Peralatan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian  adalah  tongkol  jagung  yang diperoleh  dari  pasar  tradisional  Inpres Palu,  Sulaweisi  Tengah  dan  inokulum kapang  oncom  merah.  Bahan  kimia  yang
digunakan, yaitu larutan campuran aseton/heksana  (2:1),  etanol  96%,  dan aluminium foil.
Peralatan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  kukusan,  kuas, timbangan, spektrofotometri UV-Vis (Perkinelmer), spektrofotometer FTIR, serta alat-alat gelas yang umum digunakan dalam Laboratorium Kimia.

## Prosedur Penelitian
Tahap  Produksi  Spora  Kapang  Oncom Merah Pada Limbah Tongkol Jagung
Tongkol  jagung  muda  disterilkan dengan  cara  direbus  selama  kurang  lebih 1 jam. Kemudian disimpan pada rak diatas wadah  tampi  dan  diinokulasi  dengan inokulum  kapang  oncom  merah.  Tongkol jagung  siap  diinkubasi.  Pada  hari  kedua, ketiga,  keempat,  kelima,  keenam,  dan ketujuh dilakukan pemanenan spora menggunakan kuas.

## Ekstraksi Xantofil
Ekstraksi xantofil dilakukan menggunakan  pelarut  etanol,  sedangkan ekstraksi  karoten  dilakukan  menggunakan pelarut  campuran  aseton/heksan  2:1  atas dasar  volume  pervolume  (v/v).  Ekstraksi xantofil  dilakukan  sebagai  berikut:  spora oncom  merah  diekstraksi  dengan  etanol menggunakan  metode  maserasi  yaitu dalam  2  gram  spora  oncom  merah dilarutkan  dengan  50  ml  etanol  kemudian dikocok  selama  30  menit  lalu  disaring, perlakuan  diulang  sebanyak  2  kali.  Hasil ekstraksi  ditepatkan  volumenya  hingga 100  ml.  Residu  yang  diperoleh  dikering
anginkan  dan  disimpan  untuk  ekstraksi karoten,  sedangkan  ekstrak  xantofil  diukur serapannya  pada  panjang  gelombang 464nm.

## Ekstraksi Karoten
Residu  kering  yang  diperoleh  dari ekstraksi xantofil diekstraksi dengan pelarut  campuran  aseton  heksan  2:1  (v/v) menggunakan  metode  maserasi  dengan  2 kali  penambahan  50  ml  pelarut  dan pengocokan  30  menit.  Ekstrak  yang diperoleh disatukan dan ditepatkan volumenya hingga 100 ml kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang 493.

## Penentuan Rendemen
Penentuan rendemen xantofil/ karoten  dilakukan  dari  nilai  absorban  UV Vis yang dirumuskan dalam :
x =
…….. ……………… (1)
Rendemen = p 1     …. (2)
Keterangan:
x : Berat xantofil / karoten dalam gram A : Nilai serapan xantofil / karoten Y : Jumlah volume xantofil / karoten
: Koefesien ekstingsi molar karoten / xantofil (2500 ml/g)
b : Tebal kuvet ( 1 cm )

## Analisis Spektrum IR
Identifikasi  spektrofotometer  FTIR dilakukan  terhadap  hasil  ekstraksi  yang telah  dipekatkan.  Kemudian  dilakukan pengukuran  spektrum  FTIR  pada  rentang bilangan gelombang 4500 – 500 cm -1.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Rendemen Xantofil pada Berbagai Waktu  Inkubasi  Spora  Kapang  Oncom Merah
Untuk  mengetahui  pengaruh  waktu inkubasi  spora  kapang  oncom  merah terhadap rendemen xantofil yang diperoleh maka  diterapkan  4  pengulangan  pada  6 waktu  inkubasi  spora  kapang  oncom merah yaitu hari ke 2, ke 3, ke 4, ke 5, ke 6,  dan  ke  7.  Adapun  Rendemen  pada masing-masing waktu inkubasi spora kapang  oncom  merah  pada  penelitian  ini adalah sebagai berikut:
Gambar 1  Rendemen  xantofil  dari  berbagai waktu inkubasi spora kapang oncom merah
Hasil  yang  diperoleh  (Gambar  1) terlihat adanya kenaikan rendemen xantofil  dari  hari  ke  2  sampai  hari  ke    4. Namun,  pada  hari  ke  5,  ke  6,  dan  ke  7 mengalami penurunan, penurunan rendemen  ini  terjadi  diduga  oleh  nutrisi yang  diperlukan  oleh  kapang  mulai berkurang sehingga sebagian sel mengalami kematian. Berdasarkan sumber Johnson (1991), komposisi
utama  tongkol  jagung  adalah  selulosa
dan hemiselulosa. Keberadaan
kandungan  selulosa  dan  hemiselulosa yang tinggi pada jagung dapat digunakan sebagai sumber karbon bagi pertumbuhan  kapang.  Kapang  oncom merah  memiliki  kemampuan  aktivitas selulolitik  dan  hemiselulolitik  yang  tinggi pada  proses  fermentasi.  Aktivitas  ini dipengaruhi  oleh  kondisi  lingkungan seperti  suhu  dan  kelembaban  bagi pertumbuhan kapang. Kalsum dan sjofjan (2008)  mengungkapkan  suhu  ruangan untuk pertumbuhan kapang yaitu 25- 3 ˚C dengan  kelembaban  70-90%.  Dalam penelitian  ini  tidak  dilakukan  pengukuran suhu  dan  kelembaban  selama  waktu inkubasi.  Sehingga  diduga  sebagian  sel yang    mengalami  kematian  akibat  suhu ruangan yang tidak terkontrol menyebabkan sumber karbon mengalami percepatan degradasi.
Berdasarkan uji statistik untuk analisis pengaruh waktu terhadap r nd   n    ntofi   p d   α  =   , 5 menunjukkan  nilai  signifikan  0,00  atau waktu inkubasi berpengaruh nyata terhadap rendemen xantofil yang dihasilkan.  Oleh  karena  itu,  dilakukan analisis  lanjut  Duncan  untuk  menentukan waktu  inkubasi  terpilih.  Rendemen  xantofil pada  waktu  inkubasi  4  hari  berbeda  nyata dengan waktu inkubasi 2, 5, 6, dan 7 hari, tetapi  berbeda  tidak  nyata  dengan  waktu inkubasi  3  hari.  Berdasarkan  hasil  analisis statistik  tersebut,  maka  waktu  inkubasi  3 hari  merupakan  waktu  inkubasi  yang efektif untuk mengasilkan xantofil.
0 1 2 3 4 5 0 2 4 6 8 Rend emen (% ) Waktu Inkubasi (hari)
Rendemen Karoten pada Berbagai Waktu  Inkubasi  Spora  Kapang  Oncom Merah
Untuk  mengetahui  pengaruh  waktu inkubasi  spora  kapang  oncom  merah terhadap rendemen karoten yang diperoleh maka diterapkan pula 4 pengulangan pada 6 waktu inkubasi spora kapang oncom merah yaitu hari ke 2, ke 3, ke 4, ke 5, ke 6, dan ke 7. Rendemen yang diperoleh  pada  masing-masing  waktu inkubasi  spora  kapang  oncom  merah ditunjukan pada Gambar 2.
Gambar 2  Rendemen  karoten  dari  berbagai waktu inkubasi spora kapang oncom merah
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh yang  ditunjukan  pada  (Gambar  2),  terlihat adanya  kenaikan  rendemen  karoten  yang cukup  signifikan  setiap  harinya.  Namun mengalami penurunan mulai pada hari  ke 6  hingga  hari  ke  7.  Sama  halnya  dengan xantofil  penurunan  rendemen  ini  terjadi diduga  oleh  nutrien  yang  diperlukan  oleh kapang mulai berkurang sehingga sebagian sel mengalami kematian.
Berdasarkan  uji  statistik  untuk analisis pengaruh waktu terhadap r nd   n  k rot n    p d   α  =   , 5
menunjukkan  nilai  signifikan  0,00  atau waktu inkubasi berpengaruh nyata terhadap rendemen karoten yang dihasilkan.  Oleh  karena  itu,  dilakukan analisis  lanjut  Duncan  untuk  menentukan waktu  inkubasi  terpilih.Waktu  inkubasi  5 hari  berbeda  nyata  dengan  perlakuan lainnya. Berdasarkan hasil analisis tersebut  maka  waktu  inkubasi  5  hari merupakan  waktu  inkubasi  yang  efekif menghasilkan  karoten.  Perbedaan  waktu inkubasi efektif yang terjadi pada perolehan  xantofil  dan  karoten  di  duga bahwa  xantofil  telah  mengalami  oksidasi lebih  dahulu  di  banding  karoten.  Dimana keberadaan  ikatan  rangkap  xantofil  dan karoten  yang  jumlahnya  berbeda  memberi pengaruh  kerentanan.  Ikatan  rangkap konjugasi  xantofil  dianggap  lebih  mudah rentan  karena  jumlahnya  lebih  sedikit  di banding karoten.
Panjang  Gelombang  Ekstrak  Xantofil dan  Karoten  dengan  menggunakan Spektrofotometer UV Vis
Senyawa karotenoid memiliki serapan  sinar  tampak  maksimum  pada panjang  gelombang  400-500  nm  (Britton, 1995 dalam Susilowati, 2008).
Berdasarkan  penelitian,  nilai  panjang gelombang xantofil adalah 464 nm sedangkan  karoten  493  nm.  Sesuai dengan  aturan  Woodward-Fiescher,  nilai panjang gelombang suatu senyawa sangat bergantung  pada struktur  dari  senyawa  itu sendiri  (terutama  sekali  jumlah  dan konformasi  ikatan  rangkap  terkonjugasi). S ny     β-karoten    memiliki  rumus
0 1 2 3 4 5 0 2 4 6 8 Ren de m e n (% ) Waktu inkubasi (hari)
molekul  C 40 H 56 dengan  11  ikatan  rangkap dan sebagian besar terkonjugasi, sedangkan  pada  xantofil  jenis  kapxantin memiliki  10  ikatan  rangkap  dengan  2 gugus  hidroksil  (Hock-Eng et  al., 2011).
Nilai panjang gelombang maksimum suatu senyawa  akan  semakin  tinggi  jika  ikatan rangkap terkonjugasi semakin banyak.
Hujaya  (2008)  melaporkan  bahwa nilai panjang gelombang maksimum xantofil  (444  nm)  dan  karoten  (450  nm) yang  terlihat  tidak  berbeda  jauh  namun tetap  dapat  dipastikan  bahwa  kedua senyawa  tersebut  berbeda.  Hal  ini  dapat dilihat  dari  perbedaan  bentuk  kurva, dimana  kurva  serapan  xantofil  cenderung memiliki  puncak  yang  tajam,  sementara
karoten  memiliki  serapan  yang  tidak setajam xantofil, sehingga dapat dikatakan bahwa  spektrum  UV-Vis  dalam  penelitian ini bersesuaian dengan literatur.

## Spektrum  IR    Ekstrak  Xantofil  dan Karoten
Puncak  O-H  pada  spektrum  infra merah  karoten  adalah  puncak  yang  tidak diharapkan  karena  karoten  seharusnya merupakan  senyawa  pigmen  yang  hanya dibentuk  oleh  atom  karbon  dan  oksigen. Karoten yang teroksidasi tidak lagi disebut karoten  melainkan  xantofil.  Puncak  O-H diduga  oleh  keberadaan  air  dari  pelarut dan sampelyang mana dalam penelitian ini tidak  dilakukan  proses  penghilangan  air tersebut.
Gambar 3. Spektrum FTIR senyawa xantofil
500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2500 3000 3500 4000 4500 1/cm 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %T 3 3 5 2 .2 8 2 9 3 1 .8 0 1 7 3 9 .7 9 1 6 3 3 .7 1 1 4 6 0 .1 1 1 3 8 2 .9 6 1 2 2 6 .7 3 1 1 4 5 .7 2 1 0 8 5 .9 2 1 0 4 5 .4 2 1 0 2 8 .0 6 9 9 3 .3 4 9 3 3 .5 5 8 3 9 .0 3 8 0 2 .3 9 7 1 7 .5 2 6 1 9 .1 5 5 8 0 .5 7 5 2 8 .5 0 xa
Gambar 4. Spektrum FTIR senyawa karoten
Tabel 1 Puncak serapan senyawa xantofil Puncak Serapan (cm -1 ) Vibrasi Gugus Fungsi Penelitian Pembanding 3352.28 O-H 3427.51 cm -1 (Hujaya ,2008) 2931.80 CH 2918.30 – 2850.79 cm -1 (Hujaya ,2008) 1739.79 C=O 1718.58 cm -1 (Hujaya ,2008) 1633.71 C=C 1649.02 cm -1 (Susilowati, 2008) 1460.11 CH 2 1451.33 cm -1 (Susilowati, 2008) 1382.92 CHalifatik 1375.25 dan 1460.11 cm -1 (Tanduk et al , 2015 ) 1226.73 1145.72 1085.92 1045.42 1028.06 C-O 1261.45 dan 1128.36 cm -1 (Tanduk et al , 2015 ) 993.34 933.55 839.03 802.39 717.52 C-H Alkena keluar bidang Tabel 2 Puncak serapan senyawa karoten Puncak Serapan (cm -1 ) Vibrasi Gugus Fungsi Penelitian Pembanding 3414.00 O-H 3427.51 cm -1 (Hujaya 2008) 2924.09 2854.65 C-H 2953.02 ; 2926.01 ;  2854.65 cm - 1 (Hujaya 2008) 1722.43 C=O 1718.58 cm- 1(Hujaya 2008) 1654.92 1543.05 C=C 1664.57 – 1631.79 cm -1 (Hujaya 2008) 1460.11 CH 2 1451.33 cm - 1 (Susilowati 2008), 1379.10 C-Halifatik 1375.25 dan 1460.11 cm -1 (Tanduk et al , 2015) 1379.10 1234.44 1080.14 1041.56 C-O 1261.45 dan 1128.36 cm-1 (Tanduk et al. , 2015)

## KESIMPULAN
Waktu inkubasi spora kapang oncom merahterbaik  terhadap  rendemen  xantofil yaitu  pada  hari  ke  3  dengan  rerata
500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2500 3000 3500 4000 4500 1/cm 40 50 60 70 80 90 100 %T 3 4 1 4 .0 0 2 9 2 4 .0 9 2 8 5 4 .6 5 1 7 2 2 .4 3 1 6 5 4 .9 2 1 5 4 3 .0 5 1 4 6 0 .1 1 1 3 7 9 .1 0 1 2 3 4 .4 4 1 0 8 0 .1 4 1 0 4 1 .5 6 5 7 8 .6 4 k
rendemen sebesar 4,435%. Waktu
inkubasi spora kapang oncom merahterbaik  terhadap  rendemen  karoten yaitu  pada  hari  ke  5  dengan  rerata rendemen  sebesar 4,532%.

## DAFTAR PUSTAKA
Gusdinar,  Marlia  Singgih,  Sri  Priatni,
Sukmawati  AE,  Tri  Suciati.  2011.
Enkapsulasi  Dan  Stabilitas  Pigmen Karotenoid Dari Neurospora intermedia  N-1 . J.  MANUSIA  DAN LINGKUNGAN, 18(3): 206 - 211 .
Hujaya, S. D. 2008, Isolasi Pigmen Klorofil,
Karoten,  dan  Xantofil  dari  Limbah Alga  di  Area  Budi  Daya  Ikan Bojongsoang.  [ Skripsi ].  Bandung:
Institut Teknologi Bandung.
Ifnawati, K. 2013. Pengaruh Enzim Kitinase Kasar dari Bakteri Pseudomonas pseudomallei dan Klebsiella ozaenae Terhadap Pertumbuhan,  Morfologi,  dan  Kadar N-Aseitlglukosamin Fusarium oxysporum . [Skripsi]. Malang:
Jurusan  Biologi,  Fakultas  Sains  dan
Teknologi, UIN Maulana Malik Ibrahim.
Indarto,  A.  D.  2010,    Pengaruh  Waktu Inkubasi Terhadap Kandungan
Karoten Dari Kapang Oncom Merah.
[ Skripsi ] . Palu: Universitas Tadulako ,
Johnson,  L.A.  1991.  Corn  :  Production,
Processing,  and  Utilization.  In  :  K.J. Lorentz  and  K.  Pulp  (ed).  Handbook of  Cereal  Science  and  Tecnology.
New York : Marcell Dekker, Inc
Kalsum,  U.,  dan  O.  Sjofjan.  2008.
Pengaruh  waktu  inkubasi  campuran ampas  tahu  dan  onggok  yang difermentasi dengan Neurosporasitophila terhadap kandungan  zat  makanan. Pros. Seminar Nasional Teknologi
Peternakan dan Veteriner Bogor , 11 – 12 Nopember 2008. Puslitbang Peternakan, Bogor.hlm. 226 –232. Mappiratu.  1990.  Produksi  beta  karoten pada  limbah  cair  tapioka  dengan kapang Oncom merah. [ Tesis ].
Bogor: FPS-Institut Pertanian Bogor.
Pahlevi  YW,  Estiasi  T  dan  Saparianti  E.
2008. Mikroenkapsulasi Ekstrak
Karoten  Dari  Kapang  Oncom  Merah ( Neorospora  sp. )  Dengan  Bahan Penyalut Berbasis Protein Menggunakan  Metode  Pengeringan
Semprot . Jurnal Teknologi Pertanian,
9( 1): 31-39.
Purnamasari  et  al.  2013.  Pengaruh  Jenis Pelarut  Dan  Variasi  Suhu  Pengering
Spray Dryer Terhadap Kadar Karotenoid Kapangoncom Merah (Neurospora sp.) Surakarta: Universitas Sebelas Maret.
Susilowati.  2008.  Isolasi  dan  Identifikasi
Senyawa  Karotenoid  Dari  Cabai
Merah (Capsicum anuum L. ), [Skripsi]. Malang:  Universitas  Islam Negeri (UIN).
Tanduk,  R.K.,  Ahmad,  A.,  Dali,  S.  2015.
Isolasi dan Identifikasi Pigmen
Karotenoid  Alga  Merah  Eucheuma cottonii  Serta  Potensinya  Sebagai Antioksidan Dan Antikanker.
http://repository.unhas.ac.id/bitstrea m/handle/123456789/17744/JURNA
L%20RESKY%20K.TANDUK.pdf;seq uence=1, diakses  pada  tanggal  20
Agustus 2017.
Zeb,  Alam,  dan  Mehmood,  Sultan,  2004.
Carotenoid  Contents  from  Various Sources  and  Their  Potential  Helth Applications. Pakistan  Journal  of Nutrition, 3 (3): 199-204.