## Jurnal Sains dan Teknologi
Volume 13 Number 1, Tahun 2024, pp. 110-117 P-ISSN: 2303-3142 E-ISSN: 2548-8570 Open Access: https://doi.org/10.23887/jstundiksha.v13i1.79556
Deteksi  Molekuler  Bakteri Liberobacter  Asiaticum Penyebab Penyakit Citrus  Vein  Phloem  Degeneration (CVPD)  Pada Tanaman Jeruk Siam ( Citrus Nobilis )
Ketut Srie Marhaeni Julyasih 1* , I Putu Parwata 2
1, Biologi, Universitas Pendidikan Ganesha, Singaraja, Indonesia
2 Kimia, Universitas Pendidikan Ganesha, Singaraja, Indonesia

## A B S T R A K
Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) merupakan penyakit yang sering menyerang tanaman jeruk. Penyebab penyakit CVPD yang disebut juga citrus greening atau huang longbing adalah  bakteri Liberobacter yang  termasuk  dalam  subdivisi  Protobacteria. Bakteri Liberobacter hidup pada floem tanaman jeruk dan menimbulkan gejala yang khas, namun bakteri tersebut tidak dapat dibiakkan pada media buatan. Tujuan dari penelitian  ini  adalah  untuk  mengidentifikasi  gejala  secara  morfologi  terhadap tanaman jeruk yang menunjukkan gejala terserang penyakit CVPD dan tanaman jeruk yang  tidak  menunjukkan  gejala.  Peneltian  ini  tergolong  ke  dalam  penelitian eksperimental  laboratorium.  Subjek  penelitian  adalah  tanaman  jeruk  siam  yang menunjukkan  gejala  serangan  CVPD  dan  yang  tidak  menunjukkan  gejala  serangan yang diambil di dua lokasi yang berbeda. Metode pengumpulan data yang digunakan dalam penelitian ini adalah pengambilan sampel daun jeruk dari dua lokasi berbeda, yaitu dari tanaman jeruk yang nampak sehat dan yang menunjukkan gejala penyakit CVPD. Instrumen yang digunakan meliputi berbagai alat laboratorium seperti mesin PCR, alat elektroforesis, centrifuge, UV transilluminator, dan lainnya yang digunakan untuk  analisis  DNA.  Setelah  data  dikumpulkan  kemudian  dianalisis  dengan  teknik isolasi  DNA  dan  amplifikasi  DNA  menggunakan  teknik  PCR.    Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa,  deteksi  menggunakan  PCR  menunjukkan  keberadaan  bakteri Liberobacter  asiaticum  pada  daun  jeruk  Siam  bergejala  dan  tidak  bergejala  CVPD, dengan pita DNA teramplifikasi pada 1160 bp. Sehingga, dapat disimpulkan bahwa, daun  jeruk  Siam  yang  bergejala  dan  tidak  bergejala  CVPD  sama-sama  mengandung bakteri  Liberobacter  asiaticum,  yang  terdeteksi  melalui  PCR dengan pita DNA pada 1160  bp.  Maka  dari  itu,  memungkinkan  tindakan  pencegahan  lebih  awal  dalam pengelolaan penyakit jeruk.

## A B S T R A C T
Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) is a disease that often affects citrus plants. The cause of CVPD, also known as citrus  greening  or  huanglongbing,  is  Liberobacter  bacteria  belonging  to  the  Proteobacteria  subdivision.  Liberobacter bacteria live in the phloem of citrus plants and cause characteristic symptoms, but these bacteria cannot be cultured on artificial media. This study aimed to identify the morphological symptoms of citrus plants that show symptoms of CVPD disease and those that do not. This research is classified into laboratory experimental research. The research subjects were Siamese citrus plants that showed symptoms of CVPD attack and those that did not show symptoms of attack taken in two different locations. The data collection method used in this study is sampling citrus leaves from two other places: citrus plants  that  appear  healthy  and  those  that  show  symptoms  of  CVPD  disease.  The  instruments  used  include  various laboratory equipment such as PCR machines, electrophoresis equipment, centrifuge, UV transilluminators, and others used for DNA analysis. After the data was collected, it was analyzed using DNA isolation techniques and DNA amplification using PCR  techniques.  The  results  showed  that  PCR  detection  showed  the  presence  of  Liberobacter  asiaticum  bacteria  in symptomatic and non-symptomatic CVPD Siamese citrus leaves, with a DNA band amplified at 1160 bp. Thus, it can be concluded  that  both  symptomatic  and  non-symptomatic  CVPD  Siamese  citrus  leaves  contain  Liberobacter  asiaticum bacteria, detected through PCR with a DNA band at 1160 bp. Therefore, it allows for early preventive measures in managing citrus diseases.

## 1. PENDAHULUAN
Jeruk Siam adalah salah satu komoditas buah yang penting di Indonesia. Jeruk banyak dikonsumsi oleh masyarakat luas, karena memiliki harga yang terjangkau dan mengandung vitamin C yang baik untuk kesehatan, permintaannya cukup besar dari tahun ke tahun dan paling menguntungkan untuk diusahakan (Abadi, 2016; Riyanto & Iswarini, 2023) .  Salah  satu  provinsi  di  Indonesia  yang memiliki  potensi  untuk budidaya jeruk adalah provinsi Bali. Perkebunan jeruk di provinsi Bali adalah jenis perkebunan buah lokal yang hasilnya dimanfaatkan langsung oleh penduduk Bali.  Hasil  panen  buah  jeruk selain dikonsumsi oleh

## A R T I C L E   I N F O
Article history: Received January 08, 2024 Accepted April 13, 2024 Available online April 25, 2024
Kata Kunci: Citrus Vein Phloem Degeneration , Jeruk, Liberobacter , Polymerase Chain Reaction

## Keywords:
Citrus Vein Phloem Degeneration, Citrus, Liberobacter, Polymerase Chain Reaction
This is an open access article under the CC BY-SA license. Copyright © 2024 by Author. Published by Universitas Pendidikan Ganesha.
wisatawan, banyak  dimanfaatkan sebagai sarana dan prasarana dalam pelaksanaan upacara keagamaan yang mewajibkan  penggunaan  buah  lokal  dalam  setiap  upacara  keagamaan (I Ketut Suda Armawan et al., 2023; Rini et al., 2023) . Sesungguhnya potensi permintaan terhadap buah-buahan di Provinsi Bali relatif besar, karena Bali merupakan destinasi wisata nusantara dan mancanegara terkemuka yang membutuhkan produk pertanian termasuk buah-buahan lokal Bali (Nurul Asiah et al., 2022; Tamba, 2024)
Wilayah dengan potensi produktivitas jeruk yang sangat baik di Bali adalah Kecamatan  Kintamani yang  merupakan  salah  satu  kecamatan yang  terletak  di Kabupaten Bangli. Buah jeruk Siam Kintamani terkenal  secara luas memiliki ciri- ciri  berkulit  tipis  dengan  rasa  yang khas  yakni  manis  dengan  sedikit asam. Namun hasil produksi buah jeruk Siam belum memenuhi harapan.  Produksi jeruk di Provinsi Bali cenderung mengarah  pada penurunan selama beberapa tahun  terakhir. Pada tahun 2020 produksi buah jeruk mencapai 490 393 ton, lalu menurun menjadi 241. 617 ton pada tahun 2021 dan 135. 071 ton pada tahun 2022 (BPS, 2022). Beberapa faktor yang mengakibatkan   menurunnya   hasil   produksi   buah   jeruk adalah faktor  iklim, cara  pengolahan  tanaman  yang  meliputi  pemupukan  dan  pengairan,  pengendalian hama dan penyakit (Ayu & Yuniti, 2018; Elake et al., 2022) .
Serangan  penyakit  CVPD  terjadi  pertama  kali  pada  tahun  1932-1946  di  Vietnam,  khususnya  di Delta Mekong, 70-79% tanaman telah terinfeksi, dan di Thailand kerusakan tanaman jeruk lebih dari 95%. Sedangkan di Indonesia sekitar tiga juta tanaman rusak antara tahun 1960-1970. Pada tahun 1984 di Afrika Selatan diketahui bahwa penyebab penyakit CVPD adalah bakteri dan berusaha diisolasi dengan berbagai macam medium. Bakteri penyebab CVPD adalah Liberobacter asiaticus yang  masuk  ke  dalam  sel  tanaman melalui  tusukan  serangga  vektor Diaphorina citri kuw. Daun  tanaman  yang terinfeksi  penyakit  CVPD berwarna  kuning  pada  seluruh  permukaan  daun,  tulang  daun  warnanya  hijau  tua  atau  lebih  tua,  dan daunnya  menjadi  lebih  kaku  juga  lebih  tebal.  Selain  itu,  ukuran  buah  menjadi kecil, memiliki rasa masam, mengalami gagal panen, dan memperpendek masa hidup tanaman (Melani et al., 2018) . Meskipun deteksi  secara  visual  merupakan  cara  yang  mudah  dilakukan,  tetapi  pengamatan  secara  visual  tidak memberikan  hasil  yang  akurat  karena  gejala  penyakit  CVPD  mirip  dengan  gejala  seperti  tanaman kekurangan unsur Zn dan Mn (Patandjengi et al., 2023; Triwiratno et al., 2003; Wirawan & Julyasih, 2015) . Polymerase Chain Reaction (PCR) mampu mengamplifikasi  DNA secara in-vitro yang melibatkan beberapa  tahap  secara berulang.    Teknik  PCR  menggunakan  sepasang  primer  spesifik  dari  sekuen  DNA bakteri CVPD. Primer tersebut sangat baik digunakan untuk  mendeteksi  serangan  penyakit CVPD  pada jeruk,  dengan  menggunakan  primer  tersebut  maka  hanya  sekuen  16S  rDNA  dari  bakteri  CVPD,  yaitu Liberobacter asiaticus yang teramplifikasi.  Hasil deteksi penyakit CVPD  menggunakan PCR pada masing- masing sampel tulang daun tanaman jeruk yang memiliki variasi gejala klorosis dari ringan sampai berat pada elektroforesis 1% gel agarose hingga menghasilkan pita DNA pada 1160 bp. Terdeteksinya bakteri Liberobacter asiaticus pada sampel yang menunjukkan bahwa, pola gejala  klorosis  pada  daun  tanaman jeruk  Siam  yang terserang penyakit CVPD dengan jenis yang berbeda-beda (Alydrus et al., 2024; Nurhayati & Bagus, 2016; Susilo et al., 2024).
Hasil  observasi  dan  wawancara  yang  sudah  dilakukan  dengan  beberapa  petani  jeruk  di  Desa Belantih, Kecamatan  Kintamani  menunjukkan bahwa,  penyakit CVPD  pernah  menyebabkan  gagal panen besar buah jeruk siam pada tahun 1980-1990 di Kintamani. Tanaman jeruk yang terserang penyakit CVPD memperlihatkan gejala  daun  menguning  atau  klorosis,  warna  tulang  daun  tetap  hijau, buahnya kerdil dan berasa masam, ukuran daun menjadi kecil, serta daun yang menjadi kaku. Sementara untuk saat ini penanganan penyakit CVPD yang bisa dilakukan oleh petani adalah hanya dengan menebang, membakar, melakukan peremajaan tanaman jeruk, dan pergiliran tanaman jeruk dengan tanaman lain. Dari hasil survei awal  di  lapangan,  hingga  saat  ini  masih  ditemukan  tanaman  jeruk  siam  di  Kintamani  yang  dicurigai bergejala  penyakit  CVPD.  Maka  dari  itu  penelitian  ini  hadir  dengan  kebaruan  untuk  melakukan pendekteksian lebih akurat mengenai keberadaan bakteri Liberobacter asiaticus yang menjadi  penyebab penyakit CVPD, hal ini dikarenakan patogen yang tidak dapat dikulturkan secara in-vitro, sehingga perlu dilakukan analisis secara molekuler dengan menggunakan teknik PCR. Deteksi dilakukan  pada tanaman jeruk Siam  yang bergejala  serangan penyakit CVPD  dan  yang belum  menunjukkan  gejala  (daun sehat) pada areal pertanaman jeruk di desa Belantih, dan Desa Daup, Kintamani, Bangli. Deteksi dilakukan agar penanganan terhadap penyakit CVPD bisa cepat dilakukan dan tidak menginfeksi lebih banyak tanaman jeruk di Kintamani. Berdasarkan uraian di atas, penelitian ini bertujuan untuk melakukan identifikasi gejala secara morfologi terhadap tanaman jeruk yang menunjukkan gejala terserang penyakit CVPD dan tanaman jeruk yang tidak menunjukkan gejala, serta melakukan analisis seca ra molekuler bakteri penyebab  penyakit  CVPD dengan menggunakan teknik PCR,

## 2. METODE
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium. Lokasi penelitian ini yaitu areal pertanaman jeruk milik petani pada dua lokasi, yaitu pengambilan sampel di areal pertanaman jeruk yang
tidak menunjukkan gejala (nampak sehat) secara visual yang terletak di desa Daup, Kecamatan Kintamani, Kabupaten Bangli. Pengambilan sampel daun jeruk yang menunjukkan gejala penyakit CVPD diambil dari lokasi pertanaman jeruk yang ada di desa Belantih, Kecamatan Kintamani, Kabupaten Bangli. Analisis lebih lanjut  isolasi  DNA  dilakukan  di  laboratorium  Sumberdaya  Genetika  Universitas  Udayana.  Bahan  yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun jeruk siam yang diambil dari tanaman jeruk yang menunjukkan gejala  serangan  CVPD  secara  visual  dan  yang  tidak  menunjukkan  gejala  (nampak  sehat).  Alat  yang digunakan  adalah  mesin  PCR,  seperangkat  alat  elektroforesis  (BioRad),  centrifuge  (Biofuge  13), termometer  UV  transilluminator,  tabung  Eppendorf,  shaker,  microwave,  alat  vorteks,  waterbath  dan Erlenmeyer. Adapun penjabaran singkat mengenai prosedur penelitian akan dijelaskan sebagai berikut.
Prosedur penelitian ini dimulai dari melakukan Isolasi DNA Total Tanaman Jeruk Bergejala dan Tidak bergejala (sehat). Sampel daun jeruk dihancurkan hingga halus dalam 280 µl Buffer PL Mix dan 20 µl proteinase kit. Suspensi tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro (1,5 ml) dan diinkubasi pada suhu 65°C selama 1 jam. Selanjutnya, suspensi disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit, dan supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke tabung mikro baru.  Kemudian, supernatan dicampurkan dengan 600 µl Buffer PB Mix dan diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit. Supernatan ditambahkan 200 µl etanol 95%. Sebanyak 900 µl supernatan tersebut dipindahkan ke dalam kolom dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya, ditambahkan 750 µl wash buffer pada kolom dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit. Kemudian, disuspensi kembali dalam 50 µl elution buffer untuk mendapatkan pelet DNA.
Hasil isolasi DNA diamplifikasikan dengan reaksi PCR menggunakan: 2 µl DNA sampel, 1 µl PCR primer OI1, 1 µl reverse primer OI2c, 10 µl PCR master mix solution, dan 6 µl buffer TE. Menggunakan primer  OI1  dan  OI2c,  ukuran  DNA  yang  teramplifikasi  adalah  1160  bp.  Amplifikasi  DNA  menggunakan program:  pre-treatment  pada  suhu  92°C  selama  30  detik  dengan  1  siklus  ulangan.  Bagian  kedua menggunakan 40 siklus ulangan: denaturasi pada suhu 92°C selama 60 detik, annealing pada suhu 60°C selama 30 detik, elongasi pada suhu 72°C selama 90 detik, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 90 detik dengan 1 siklus ulangan. Terakhir, Elektroforesis Gel Agarose dan Visualisasi Hasil PCR. Gel agarose terdiri dari 1% agarose yang dilarutkan dalam 100 ml TAE buffer (terdiri atas 40 mM tris asetat pH 7,9; 2 mM Sodium  EDTA).  Sampel  DNA  (8  µl  DNA  +  2  µl  loading  dye)  masing-masing  diisikan  pada  sumuran  gel. Elektroforesis  dilakukan  dengan  tegangan  100  volt  selama  ±20  menit.  Gel  kemudian  direndam  dalam larutan EtBr (Etidium Bromida) selama ±15 menit. Kemudian, hasil elektroforesis divisualisasikan dengan UV transiluminator untuk melihat posisi pita (band) DNA dari tiap sampel dan didokumentasikan (Astari et al., 2021; Rustiani et al., 2015) .

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil Gejala Penyakit CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration)
Pengamatan  morfologi  gejala  serangan  penyakit  CVPD  ( Citrus  Vein  Phloem  Degeneratioan ) dilakukan secara visual. Hasil pengamatan secara visual terhadap gejala serangan pada daun tanaman jeruk secara  umum,  gejala  khasnya  adalah  klorosis  pada  daun  seperti  gejala  kekurangan  unsur  Zn  dan  Mn disajikan pada Gambar 1 . Berdasarkan hasil pengamatan secara visual, gejala serangan penyakit CVPD pada daun  jeruk  siam  di  masing-masing  lokasi  tampak  gejala  klorosis  yang  bervariasi.  Tanaman  jeruk  yang terserang  CVPD  memperlihatkan  gejala  daun  menguning  atau  klorosis,  warna  tulang  daun  tetap  hijau, ukuran daun menjadi kecil dan daun menjadi kaku.
Gambar 1 . Gejala Serangan CVPD ( Citrus Vein Phloem Degeneration ) pada Daun  Tanaman Jeruk
Pengambilan sampel pada daun tanaman jeruk yang tidak menunjukkan gejala serangan dilakukan dengan  mengambil  daun  jeruk  yang  tidak  menunjukkan  gejala  (nampak  sehat)  pada  suatu  lokasi pertanaman jeruk. Pengamatan secara visual terhadap tanaman yang tidak menunjukkan gejala serangan penyakit CVPD ( Citrus Vein Phloem Degeneratioan ), daun nampak berwarna hijau segar secara keseluruhan, tidak terlihat klorosis pada daun disajikan pada Gambar 2 .
Gambar 2. Daun Tanaman Jeruk Siam Sehat (Tidak Menunjukkan Gejala Serangan Penyakit CVPD

## Deteksi Penyakit CVPD Pada Tanaman Jeruk dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)
Hasil amplifikasi PCR terhadap DNA yang diisolasi dari sampel daun tanaman jeruk yang bergejala penyakit CVPD dan tidak menunjukkan gejala (sehat) dari lokasi pengambilan sampel di lokasi kebun jeruk di Desa Belantih, Kintamani disajikan pada Gambar 3 .
Gambar 3. Deteksi Patogen Bakteri Liberobacter Asiaticum Penyebab Penyakit CVPD pada Daun Tanaman Jeruk Siam Bergejala dan tidak Bergejala (Sehat)
Keterangan:
M : Marker; B : Daun Jeruk Bergejala; S: Daun Jeruk tidak Bergejala

## 3000 bp
1500 bp 1000 bp 500 bp 100 bp M             B              S 1160 bp
Hasil analisis DNA menunjukkan bahwa keberadaan bakteri Liberobacter, seperti pada Gambar 3 , ditandai dengan adanya pita DNA yang terdeteksi pada 1160 bp pada sampel daun. Hal ini menunjukkan gejala serangan pada daun yang tidak menunjukkan gejala (daun sehat), meskipun pada daun sehat terlihat pita DNA yang tipis. Analisis PCR terhadap jeruk siam yang terserang CVPD menggunakan primer spesifik untuk CVPD menunjukkan bahwa tanaman yang terserang CVPD pada hasil elektroforesis gel agarosa 1% memiliki pita DNA pada 1160 bp. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman yang terserang CVPD mengandung bakteri Liberobacter asiaticum, karena keberadaan bakteri ini terdeteksi dengan primer 16S rDNA yang merupakan sekuen konservatif. Pada daun yang tidak menunjukkan gejala serangan penyakit CVPD secara visual, hasil gel elektroforesis  menunjukkan  pita/band  DNA pada 1160  bp. Ini  berarti, meskipun belum menunjukkan gejala serangan secara visual (daun tampak sehat), tidak menutup kemungkinan bahwa daun tersebut sudah terinfeksi bakteri Liberobacter asiaticum. Deteksi yang sensitif, cepat, dan akurat saat ini adalah dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan sepasang primer spesifik, forward primer  O11  dan  reverse  primer  O12c,  untuk  mengamplifikasi  16S  rDNA  Liberobacter  asiaticum  yang berukuran sekitar 1160 bp. Berdasarkan hasil amplifikasi PCR tersebut, sampel yang positif mengandung bakteri L. asiaticum ditemukan pada sampel daun jeruk siam di lokasi kebun jeruk. Sampel daun jeruk siam yang bergejala CVPD akan menunjukkan pita DNA dengan ukuran 1160 bp pada hasil PCR, yang berarti sampel tersebut positif mengandung bakteri Liberobacter patogen penyebab penyakit CVPD, yang berhasil diamplifikasi pada 1160 bp.
Pembahasan Gejala  Penyakit  CVPD  ( Citrus  Vein  Phloem  Degeneration )  adalah  klorosis  pada  daun  yang menyerupai  gejala  defisiensi  mineral,  dan  deteksi  terhadap  penyakit  CVPD  tergolong  sulit  sehingga memerlukan  cara  deteksi  khusus.  Deteksi  secara  konvensional  kurang  memuaskan  karena  konsentrasi bakteri dalam tanaman rendah, distribusi tidak merata, masa inkubasi panjang dan banyak tanaman jeruk terinfeksi secara laten (Lamdo et al., 2023; Nurhadi, 2015) .  Kondisi seperti suhu rendah, varietas tanaman yang berbeda, defisiensi hara, atau kompleksitas dengan penyakit lain menyebabkan gejala tidak jelas yang menyulitkan pengamatan secara visual. Tanaman jeruk yang terserang CVPD memperlihatkan gejala daun menguning  atau  klorosis,  dengan  warna  tulang  daun  tetap  hijau.  Ukuran  daun  menjadi  kecil  dan  kaku. Klorosis terjadi karena pembentukan klorofil pada daun berkurang. Selanjutnya, peneliti lain menyebutkan bahwa gejala klorosis disebabkan oleh infeksi Liberobacter asiaticus yang menunjukkan adanya gangguan fisiologi  pada  tanaman.  Gangguan  fisiologi  terjadi  karena  massa  bakteri  menyebabkan  penghambatan transportasi  nutrisi  dari  dan  ke  jaringan  floem.  Hal  ini  sejalan  dengan  pendapat  peneliti  lain  yang menyebutkan bahwa pada tanaman dewasa, gejala yang sering tampak adalah cabang dengan daun-daun yang kuning, kontras dengan cabang lain yang daun-daunnya masih sehat. Gejala ini dikenal dengan sebutan greening  sektoral.  Daun  pada  cabang-cabang  yang  terinfeksi  menjorok  ke  atas  seperti  sikat.  Gejala  lain adalah daun berukuran lebih sempit, lancip, dengan warna kuning di antara tulang daun. (Meitayani et al., 2014; Ratu et al., 2020; Rustiani et al., 2015; Taufik, 2010) .
Berdasarkan  pengamatan  visual,  sampel  daun  jeruk  yang  menunjukkan  gejala  penyakit  CVPD memiliki ciri-ciri berwarna kuning (klorosis) dengan tulang daun berwarna hijau, daun menjadi kaku dan lebih tebal, serta ukurannya lebih kecil. Daun yang menunjukkan gejala klorosis berat memiliki seluruh permukaan daun yang berwarna kuning, urat daun berwarna hijau tua atau lebih gelap, dan daun menjadi lebih kaku dan tebal. Daun yang mengalami gejala klorosis sedang menunjukkan klorosis pada beberapa bagian permukaan daun, daun menjadi lebih tebal, dan urat daun tampak lebih tua. Daun dengan gejala klorosis  ringan  masih  terlihat  hijau,  urat  daun  sudah  tua,  dan  daun  menjadi  kaku.  Tanaman  yang menunjukkan gejala penyakit dengan tingkat serangan ringan mengalami klorosis secara parsial pada daun jeruk.  Lamina  daun  nampak  berwarna  kuning,  sedangkan  tulang  daun  masih  berwarna  hijau.  Gejala penyakit CVPD meliputi klorosis atau daun yang menguning, warna tulang daun menjadi hijau tua, daun lebih tebal, kaku, dan ukurannya menjadi lebih kecil. Klorosis ringan ditandai dengan lamina daun yang masih hijau dan tulang daun hijau, klorosis sedang ditandai dengan lamina daun sebagian menguning dan tulang daun tetap hijau, sedangkan pada klorosis berat, lamina daun berwarna kuning secara keseluruhan (Inoue et al., n.d.; Lestari et al., 2019; Pandey & Shrestha, 2023; Ratu et al., 2020) . Pada  daun  yang  tidak  menunjukkan  gejala  serangan  penyakit  CVPD  secara  visual,  hasil  gel elektroforesis menunjukkan pita DNA pada 1160 bp. Hal ini berarti, walaupun belum menunjukkan gejala serangan  secara  visual  (daun  nampak  sehat),  tidak  menutup  kemungkinan  bahwa  daun  tersebut  sudah terinfeksi bakteri Liberobacter asiaticum . Deteksi yang sensitif, cepat, dan akurat saat ini adalah dengan teknik PCR ( Polymerase Chain Reaction ) menggunakan sepasang primer spesifik, yaitu forward primer O11 dan reverse primer O12c, untuk mengamplifikasi 16S rDNA Liberobacter asiaticum yang berukuran sekitar 1160 bp. Berdasarkan hasil amplifikasi PCR tersebut, sampel yang positif mengandung bakteri L. asiaticum ditemukan pada sampel daun jeruk Siam di lokasi kebun jeruk. Sampel daun jeruk Siam yang bergejala
CVPD akan menunjukkan pita DNA dengan ukuran 1160 bp pada hasil PCR, yang berarti sampel tersebut positif  mengandung  bakteri Liberobacter ,  patogen penyebab penyakit CVPD, yang  berhasil diamplifikasi pada 1160 bp. Sesuai dengan pendapat peneliti lain, teknik yang tepat untuk mendeteksi DNA Liberobacter adalah  menggunakan  Polymerase  Chain  Reaction  dengan  primer  yang  spesifik  untuk  CVPD. (Asiah Salatalohy & Baguna, 2022; Pandey & Shrestha, 2023) .
Deteksi keberadaan bakteri pada sampel daun jeruk yang bergejala dalam penelitian ini dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mengamplifikasi 16S rDNA Candidatus L. asiaticus . PCR merupakan teknik deteksi yang sensitif, cepat, dan akurat, menggunakan pasangan primer spesifik forward 011 dan reverse primer 012c untuk memperkuat rDNA 16S Candidatus L. asiaticus dengan panjang sekitar  1160  bp.  Hasil  deteksi  PCR  menunjukkan  fragmen  DNA  sampel  daun  jeruk  sepanjang  1160‐bp, menandakan bahwa sampel tersebut positif terinfeksi Candidatus L. asiaticus . Elektroforesis adalah teknik pemisahan  molekul  berdasarkan  perbedaan  tingkat  migrasi  dalam  medan  listrik,  dimana  molekul berukuran lebih besar akan bergerak lebih lambat. PCR merupakan teknologi yang mampu menggandakan fragmen DNA dari berbagai jenis organisme termasuk hewan, tumbuhan, bakteri, jamur, dan virus (Artati & Lubis, 2017; Jamaluddin et al., 2024) . Deteksi menggunakan metode PCR dengan primer target gen 16S rDNA  telah  digunakan  untuk  mengidentifikasi  Liberobacter  asiaticus  yang  tersebar  di  kawasan  Asia, termasuk Indonesia (Marlina et al., 2022; Tuwo et al., 2024).
Penelitian  ini  memiliki  beberapa  keterbatasan.  Salah  satunya  adalah  biaya  yang  tinggi  serta kebutuhan akan peralatan laboratorium yang canggih dan tenaga ahli terlatih untuk menjalankan teknik PCR  atau  Real-Time  PCR.  Hal  ini  bisa  menjadi  hambatan  bagi  penerapan  luas  metode  ini,  terutama  di kalangan petani kecil atau di daerah dengan sumber daya terbatas. Selain itu, sampel dari tanaman mungkin memerlukan  penanganan  khusus  untuk  mencegah  kontaminasi,  yang  bisa  mempengaruhi  akurasi  hasil deteksi.  Sensitivitas  metode  ini  juga  dapat  dipengaruhi  oleh  variasi  genetik  bakteri,  yang  mungkin menyebabkan false negatives jika bakteri yang ada memiliki mutasi pada gen target yang digunakan untuk deteksi. Sebagai solusi, diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengembangkan teknik deteksi yang lebih terjangkau  dan  mudah  digunakan  di  lapangan,  seperti  metode  isothermal  amplification  yang  tidak memerlukan peralatan PCR yang mahal. Pelatihan dan penyuluhan bagi petani tentang cara pengambilan dan penanganan sampel yang benar juga sangat penting untuk meningkatkan keakuratan diagnosis. Selain itu, pengembangan kit diagnostik komersial yang dapat digunakan langsung di lapangan tanpa memerlukan keahlian khusus bisa membantu mengatasi keterbatasan metode molekuler ini. Kolaborasi antara peneliti, pemerintah, dan sektor swasta sangat diperlukan untuk menyediakan dukungan finansial dan teknis dalam mengimplementasikan teknologi deteksi ini secara luas.
Implikasi  dari  penelitian  ini  sangat  penting  dalam  konteks  perlindungan  tanaman  jeruk  dari serangan Candidatus Liberobacter asiaticus. Dengan memperbaiki dan memvalidasi metode deteksi yang lebih  efektif,  petani  dan  peneliti  dapat  dengan  cepat  mengidentifikasi  keberadaan  bakteri  ini,  yang merupakan  penyebab  penyakit  HLB  (Huanglongbing),  sebelum  menyebabkan  kerusakan  besar  pada tanaman jeruk. Hal ini dapat mengarah pada upaya pengendalian yang lebih efektif dan tepat waktu, seperti pengaturan karantina, pengawasan intensif, dan penerapan strategi manajemen penyakit yang lebih efisien. Secara keseluruhan, penelitian ini  berpotensi memberikan kontribusi signifikan terhadap keberlanjutan industri  perkebunan  jeruk  di  Indonesia  dan  wilayah  Asia  lainnya,  serta  memberikan  landasan  bagi pengembangan teknologi deteksi dan pengendalian penyakit tanaman yang lebih maju di masa depan.

## 4. SIMPULAN
Hasil  penelitian  yang  sudah  dilaksanakan  menunjukkan  bahwa  daun  tanaman  jeruk  Siam  yang bergejala  CVPD  secara  visual  menunjukkan  hasil  positif  keberadaan  bakteri  Liberobacter  asiaticus, penyebab penyakit CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration), yang teramplifikasi pada 1160 bp dengan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Begitu pula dengan daun tanaman jeruk Siam yang tidak  menunjukkan  gejala  CVPD  (nampak  sehat),  hasilnya  juga  positif  untuk  keberadaan  bakteri Liberobacter yang teramplifikasi pada 1160 bp. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa daun jeruk Siam,  baik  yang  bergejala  maupun  tidak,  mengandung  bakteri  Liberobacter  asiaticus  yang  terdeteksi melalui PCR dengan pita DNA sepanjang 1160 bp. Temuan ini menyoroti pentingnya deteksi dini dalam pengelolaan penyakit jeruk, memungkinkan untuk dilakukannya tindakan pencegahan lebih awal dalam upaya mengendalikan penyebaran penyakit ini di kebun jeruk.

## 5. UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terima  kasih  kami  sampaikan  kepada  Universitas  Pendidikan  Ganesha  yang  telah memberikan dana penelitian Fundamental Institusi 2023 melalui Dana DIPA BLU Universitas Pendidikan Ganesha sesuai dengan Kontrak Penelitian Nomor: 689/UN48.16/LT/2023.

## 6. DAFTAR PUSTAKA
Abadi, K. (2016). Identifikasi Karakter Morfologi Dan Anatomi Tanaman Jeruk Lokal ( Citrus Sp ) Di Desa Karya Agung Dan Karya Abadi . 4 (6), 642 – 649.
Alydrus, N. L., Saputri, J., & Alyidrus, R. (2024). Deteksi Helicobacter pylori Pada Feses Mahasiswa Gastritis Tingkat  Akhir  Angkatan  2018  Di  Universitas  Megarezky  Makassar  Menggunakan  Metode Polymerase Chain Reaction ( PCR ). Inhealth: Indonesian … , 13 – 24. https://doi.org/10.56314/inhealth.v3i1.198.
Artati, D., & Lubis, S. (2017). Optimasi performa . 15 (2), 47 – 50.
Asiah Salatalohy, & Baguna,  dan F. L. (2022). Potensi dan Pemanfaatan Limbah Hasil Tebangan Kayu Manis sebagai Biopestisida. Jurnal Agribisnis Perikanan , 15 (2), 413 – 418. https://doi.org/10.52046/agrikan.v15i2.1248.
Astari, D. D., Dewi, S. G., Setyaningrum, S., & Lidya, B. (2021). Perancangan Primer untuk Deteksi Kandungan Gen Cytochrome b Babi dengan Metode Polymerase Chain Reaction dan Aplikasinya pada Berbagai Produk Industri. Fullerene Journ. Of Chem , 6 (2), 110 – 117. https://doi.org/10.37033/fjc.v6i2.329.
Ayu, I. G., & Yuniti, D. (2018). Perbanyakan Tanaman Jeruk Siam ( Citru s nobilis L .) dengan Teknik Kultur in vitro  Menggunakan  Biji  Tanaman  Terinfeksi  Penyakit  Citrus  Vein  Phloem  Degeneration  (  CVPD  ) Citrus ( Citru s nobilis L .) Propagation Through Culture In Vitro Using Seed . 8 (2), 179 – 188.
Elake, W., Riry, J., & Riry, R. B. (2022). Pengelolaan Tanaman Kakao (Theobroma cacao) Oleh Petani Di Desa Makububui Kecamatan Taniwel Timur Kabupaten Seram Bagian Barat. Jurnal Jendela Pengetahan , 17 (2), 187 – 197. https://doi.org/10.30598/jp17iss2pp187-197. I Ketut Suda Armawan, Ni Komang Alit Astiari, & Ni putu Anom Sulistiawati. (2023). Pengaruh Pemberian Dosis Pupuk Kalium Nitrat dan Magnesium Sulfate Terhadap Hasil Tanaman Jeruk Siam (Citrus nobilis var. Microcarpa L.). Gema Agro , 28 (1), 14 – 21. https://doi.org/10.22225/ga.28.1.5632.14- 21.
Inoue, H., Yamashita-muraki, S., Fujiwara, K., & Honda, K. (n.d.). Fe 2 + Ions Alleviate the Symptom of Citrus Greening Disease . Jamaluddin, S. N., Fitriana, F., & Amirah, S. (2024). Molecular Identification of Endophytic Fungi Isolated from  Bidara  Root  (Ziziphus  mauritiana  Lam.)  Using  Polymerase  Chain  Reaction  (Pcr). Journal Microbiology Science , 4 (1), 11 – 21. https://doi.org/10.56711/jms.v4i1.994.
Lamdo, H., Sari, Y., Faridzi, R. Al, Pebriyanti, P., Winanta, R. A., & Latif, F. (2023). Teknologi Dan Budidaya Tanaman Hortikultura, Buah Subtropika, Pangan, Pemanis Dan Serat, Serta Perkebunan Teh. Jurnal Pendidikan : SEROJA , 2 (4), 84 – 92. https://doi.org/10.572349/seroja.v2i4.1017. Lestari, F. R., Purwanti, I.,  Purnama, N., Sajiah,  A. M., Aksara, B., Informatika, J. T.,  Teknik, F., Halu,  U.,  & Machine,  M.  V.  (2019). Identifikasi  Penyakit  Tanaman  Jeruk  Siam  Menggunakan  Metode  M-SVM . 441 – 448. Marlina, M., Hayati, I., & Mapegau,  M. (2022). Deteksi PenularanPenyakit CVPD pada Jeruk Rough  Lemon Menggunakan  Inokulum  dari  Berbagai  Jaringan  Tanaman  Sakit  dengan  Tingkat  Gejala  yang Berbeda . 6 , 11 – 22.
Meitayani, N. P. S., Adiartayasa, W., & Wijaya, I. N. (2014). Deteksi Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (Cvpd)  dengan  Teknik  Polymerase  Chain  Reaction  (Pcr)  pada  Tanaman  Jeruk  di  Bali. E-Jurnal Agroekoteknologi Tropika , 3 (2), 70 – 79.
Melani, R., Adiartayasa, W., & Wijaya, I. N. (2018). Deteksi Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) Dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) pada Daun Tanaman Jeruk Yang Memiliki Pola Gejala Klorosis Berbeda. E-Jurnal Agroekoteknologi Tropika , 7 (2), 164 – 173.
Nurhadi. (2015). Penyakit huanglongbing tanaman jeruk (Candidatus Liberibacter Asiaticus): ancaman dan strategi pengendalian. Pengembangan Inovasi Pertanian , 8 (1), 21 – 32. Nurhayati,  I.  K.  A.,  &  Bagus,  I.  G.  N.  (2016). Deteksi  Keberadaan  Penyebab  Penyakit  Citrus  Vein  Phloem Degeneration  (  CVPD  )  secara  Molekuler  pada  Tanaman  Jeruk  Siam  (  Citrus  nobilis  Lour  var  . microcarpa Hassk ) berdasarkan Variasi Gejala Klorosis . 5 (4), 344 – 353.
Nurul Asiah, S. T. M. T., A, C. E., Ikom, A. K. M., Ramadhan, K., Hidayat, S. G., & Apriyantono, I. A. (2022). Profil Kopi  Arabika  Kintamani  Bali (N.  Asiah  &  A.  Apriyantono  (eds.).  AE  Publishing. https://books.google.co.id/books?id=in5dEAAAQBAJ.
Pandey, S., & Shrestha, A. K. (2023). Citrus Greening: a Major Threat To Citrus Growers in Nepal. Tropical Agrobiodiversity , 4 (1), 22 – 26. https://doi.org/10.26480/trab.01.2023.22.26. Patandjengi, B., Farham, M., Kuswinanti, T., Melina, Asman,  & Tuwo, M. (2023). Detection of citrus  vein phloem  degeneration  disease  (Candidatus  Liberibacter  asiaticum)  in  orange  cv.  Selayar,  Citrus reticulata  L. IOP  Conference  Series:  Earth  and  Environmental  Science , 1192 (1),  012026. https://doi.org/10.1088/1755-1315/1192/1/012026.
Ratu, S., Taufik, M., & Khaeruni, A. (2020). Insidensi Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) dan
Kepadatan  Populasi  Serangga  Vektor  Diaphorina  citri  pada  Tanaman  Jeruk  di  Pulau  Siompu Kabupaten Buton Selatan. Berkala Penelitian Agronomi , 8 (1), 33. https://doi.org/10.33772/bpa.v8i1.13854. Rini, K. A. T. P., Budiasa, I. M., & Kardi, C. (2023). Analisis Permintaan dan Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Permintaan Buah Jeruk Lumajang di Kabupaten Gianyar. Jurnal AGRIFARM , 2 (3), 21 – 30.
Riyanto, R., & Iswarini, H. (2023). Studi Manajemen Usahatani Dan Dampak Diperolehnya Sertifikat Produk Prima  Tiga  Terhadap  Usahatani  Jeruk  Siam  Di  Desa  Budi  Mulya  Kecamatan  Air  Kumbang Kabupaten Banyuasin. Societa , 12 (1), 26 – 34. https://doi.org/10.32502/jsct.v12i1.6308.
Rustiani,  U.  S.,  Endah,  A.  S.,  Nurjanah,  N.,  Prasetiawan,  A.,  &  Nurmaida,  N.  (2015).  Detection  of  Bacteria Causing CVPD on Citrus Using DNA Extracted from Leaf Midrib. Jurnal Fitopatologi Indonesia , 11 (3), 79 – 84. https://doi.org/10.14692/jfi.11.3.79. Susilo, T. B., Soesanto, O., Susanti, D. S., Fahrudin, A. E., Suhartono, E., Hidayat, Y., Wahjono, S. C., Soendjoto, M. A., & Krisdianto, K. (2024). Penyuluhan Asal Mula Teknologi Polymerase Chain Reaction Bagi Komunitas Minggu Raya (Bagian 2). Jurnal Pengabdian ILUNG (Inovasi Lahan Basah Unggul) , 3 (3), 504. https://doi.org/10.20527/ilung.v3i3.11887.
Tamba, I. M. (2024). Kajian Buah-Buahan Lokal Unggulan Provinsi Bali dan Potensi Dinamisnya. JIA (Jurnal Ilmiah  Agribisnis) :  Jurnal  Agribisnis  Dan  Ilmu  Sosial  Ekonomi  Pertanian , 9 (2),  126 – 132. https://doi.org/10.37149/jia.v9i2.1117.
Taufik, M. (2010). Citrus vein phloem degeneration. Agriplus , 20 (3), 240 – 245.
Triwiratno, A., Supriyanto, A., Garnier, M., & Bove, J. M. (2003). Deteksi Penyebaran Geografis Penyakit CVPD di Bali Utara dengan Metode Polymerase Chain Reaction. Deteksi Penyebaran Geografis Penyakit CVPD Di Bali Utara Dengan Metode Polymerase Chain Reaction , 13 (2), 138 – 145.
Tuwo,  M.,  Kuswinanti,  T.,  Nasruddin,  A.,  &  Tambaru,  E.  (2024).  Journal  of  Genetic  Engineering  and Biotechnology  Uncovering  the  presence  of  CVPD  disease  in  citrus  varieties  of  South  Sulawesi  , Indonesia : A molecular approach. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology , 22 (1), 100332. https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2023.100332.
Wirawan,  I.,  &  Julyasih,  K.  (2015).  Detection  of  Citrus  Vein  Phloem  Degeneration  (  Cvpd  )  Disease  By Polimerase Vhain Reaction  (PCR) and  Protein Analysis  Using  SDS Page. International Journal of Biosciences and Biotechnology , 1 – 7.