Evaluasi Aktivitas Sitotoksik Dan Indeks Selektivitas Daun Afrika ( Vernonia amygdalina) Terhadap Model Sel Kanker Kolon Secara In Vitro
Ichwan Alamsyah Lubis(1), Ramadhan Bestari(2)
Fakultas Kedokteran, Universitas Islam Sumatera Utara
ichwan.alamsyah@fk.uisu.ac.id (1), ramadhan.bestari@fk.uisu.ac.id(2)

## ABSTRAK
Kanker kolon  merupakan jenis kanker  yang  memiliki tingkat insidensi tertinggi  ketiga pada pria dan kedua pada  wanita.  Pengobatan  terhadap  kanker  ini    salah  satunya  adalah  kemoterapi.  Beberapa  jenis  obat kemoterapi  telah  mengalami  resistensi,  sehingga  penting  untuk  pengembangan  obat  baru  atau  pendamping obat  yang  telah  ada.  Daun  afrika  ( Vernonia  amygdalina )  memiliki  aktivitas  sebagai  antikanker,  namun selektivitas  ekstrak  ini  terhadap  sel  kanker  masih  perlu  diteliti  lebih  lanjut.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mencari nilai indeks selektivitas (IS) dari ekstrak etil asetat daun afrika (EEADA) melalui perbandingan nilai half maximal inhibitory concentration (IC50) dari hasil uji aktivitas sitotoksik dengan metode Microculture Tetrazolium  Technique (MTT).  Penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperimen in  vitro dengan menggunakan  metode posttest  only  control  group  design .  Metode  penelitian  dimulai  dari  pembuatan simplisia, pembuatan EEADA  menggunakan  metode  maserasi, uji sitotoksisitas EEADA pada sel Vero dan WiDr menggunakan uji MTT, serta penentuan IS dari EEADA. EEADA mempunyai nilai IC50 sebesar 9,07, menunjukkan  aktivitas sitotoksik yang sangat kuat terhadap sel WiDr, namun tidak selektif hanya terhadap sel kanker (IS<3).
Kata Kunci : Vernonia amgydalina , indeks selektivitas, antikanker, aktivitas sitotoksik

## ABSTRACT
Colon  cancer  is  a  type  of  cancer  with  the  third  highest  incidence  rate  in  men  and  the  second  highest  in women.  One  of  the  treatments  for  this  cancer  is  chemotherapy.  Some  chemotherapy  drugs  have  developed resistance,  making  developing  new  drugs  or  adjuvants  essential  to  existing  ones.  African  leaves  ( Vernonia amygdalina ) have anticancer activity, but the selectivity of this extract against cancer cells still needs further research.  This  study  aims  to  determine  the  selectivity  index  (SI)  of  ethyl  acetate  extract  of  African  leaves (EAAE)  by  comparing  the  half-maximal  inhibitory  concentration  (IC50)  values  obtained  from  cytotoxic activity  tests  using  the  Microculture  Tetrazolium  Technique  (MTT)  method.  This  research  is  an  in  vitro experimental  study  using  the  posttest-only  control  group  design  method.  The  research  method  began  with preparing  the  simplicia,  preparing  EAAE  using  the  maceration  method,  cytotoxicity  testing  of  EAAE  on Vero and WiDr cells using the MTT assay, and determining the SI of EAAE. EAAE had an IC50 value of 9,07, indicating extreme cytotoxic activity against WiDr cells, but it  was not selective only  for cancer cells (SI < 3).
Keywords : Vernonia amgydalina , selectivity index, anticancer, cytotoxic activity

## I. PENDAHULUAN

## 1. Latar Belakang
Kanker kolon adalah jenis kanker yang memiliki tingkat insidensi tertinggi ketiga pada pria dan  kedua  pada  wanita,  dengan  lebih  dari  1,9  juta  kasus  baru  dan  lebih  dari  930.000 kematian  di  seluruh  dunia  (Morgan  et  al.,  2023).  Angka  kejadian  kanker  kolon menyumbang  6%  dari  seluruh  kasus  kanker  yang  dilaporkan.  Indonesia  sendiri  memiliki angka  kematian  akibat  kanker  kolon  yang    tertinggi  di  Asia  Tenggara,  dengan  perkiraan 9444  kematian  pada  tahun  2020  (Natanael  et  al.,  2022).  Pengobatan  kanker  kolon melibatkan prosedur bedah, radioterapi, dan kemoterapi, yang bervariasi berdasarkan tahap perkembangan penyakit. Kemoterapi umumnya diterapkan pada pasien dengan stadium III dan  dalam  beberapa  kasus  kanker  kolon  stadium  II  setelah  operasi  dilakukan  untuk mengurangi  risiko  kekambuhan.  Bahkan,  seringkali  kemoterapi  menjadi  metode pengobatan utama pada kanker kolon  yang sudah mencapai stadium lanjut (Benson et al., 2021).  Meskipun  demikian,  beberapa  jenis  obat  kemoterapi  telah  mengalami  resistensi dalam pengobatan kanker kolon (Wang et al., 2022). Oleh karena itu, sangat penting untuk mengembangkan  obat-obatan  baru  yang  dapat  mengatasi  resistensi  terhadap  kemoterapi atau potensial sebagai obat kemoterapi baik sebagai pengobatan utama maupun tambahan dalam  pengobatan  kanker  kolon  (Rejhová  et  al.,  2018).    Banyak  senyawa  alam  yang ditemukan  dalam  tumbuhan  diketahui  memiliki  sifat  sitotoksik  terhadap  sel-sel  kanker, salah  satunya  adalah  tumbuhan  dalam  genus  Vernonia,  yaitu  daun  Afrika  ( Vernonia amygdalina )  yang  memiliki  potensi  sebagai  agen  kemoterapi  (Kaur  et  al.,  2019).  Ekstrak dari daun Afrika telah dilaporkan memiliki efek sitotoksik pada beberapa jenis sel kanker kolon  dan  jenis  kanker  lainnya  (Bestari,  2021).  Terutama,  ekstrak  daun  Afrika  yang diekstraksi dengan pelarut etil asetat tampaknya memiliki aktivitas sitotoksik  yang sangat kuat, dengan nilai IC50 kurang dari 10 μg/mL (Bestari et al., 2017).  Salah satu cara untuk mengukur  sejauh  mana  suatu  zat  uji  bersifat  selektif  terhadap  sel  kanker  adalah  dengan menghitung  Indeks  Selektivitas  (IS),  yang  merupakan  rasio  antara  nilai half  maximal inhibitory concentration (IC50) sel Vero dan IC50 model sel kanker yang diuji (McGaw et al.,  2014).  Jika  nilai  IS  lebih  besar  dari  3,  maka  menandakan  bahwa  obat  atau  ekstrak tersebut  memiliki  tingkat  selektivitas  yang  tinggi  (López-Lázaro,  2015).  Pengujian  IS sering  dilakukan  dengan  menggunakan  sel  Vero  untuk  memahami  respon  sel  normal terhadap  berbagai  senyawa  kimia.  Sel  Vero  adalah  jenis  sel  epitel  non-kanker  yang diperoleh  dari  organ  ginjal  monyet  hijau  asal  Afrika,  memiliki  karakteristik  sebagai  sel monolayer dengan bentuk yang poligonal dan pipih, bersifat immortal, tidak menyebabkan pembentukan tumor, dan memiliki karakteristik sel fibroblastik. (Ammerman et al., 2008).

## 2. Perumusan Masalah
Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :
Berdasarkan  penjelasan  latar  belakang  di  atas,  penulis  ingin  meneliti  bagaimana  aktivitas sitotoksik dari ekstrak etil asetat daun afrika ( Vernonia amygdalina ) (EEADA) dan profil selektivitas ekstrak ini terhadap model sel kanker kolon melalui penentuan nilai IS.

## 3. Tujuan Penelitian
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  :  menentukan  nilai  IS  dari  EEADA    menggunakan  uji sitotoksik dengan metode Microculture Tetrazolium Technique (MTT).

## 4. Manfaat Penelitian
Manfaat  dari  penelitian  ini  yaitu  untuk  mengetahui  aktivitas  antikanker  dan  profil selektivitas dari  EEADA terhadap model sel  kanker  kolon  yang dapat  dijadikan referensi
dan  peluang  penelitian  selanjutnya  untuk  pengembangan  obat  baru  yang  lebih  aman  dan efektif dalam pengobatan kanker.

## II. METODE

## Tempat dan Waktu
Pengumpulan  sampel  daun  afrika  ( Vernonia  amygdalina )  dari  Kebun  Tanaman  Obat Fakultas  Farmasi  Universitas  Sumatera  Utara.  Pembuatan  EEADA  serta  larutan  stok dilakukan di  Laboratorium  Farmakognosi,  Fakultas Farmasi,  Universitas  Sumatera Utara. Kultur  sel,  pengujian  aktivitas  sitotoksik,  serta  analisis  hasil  dilakukan  di  Laboratorium Parasitologi,  Fakultas  Kedokteran,  Kesehatan  Masyarakat,  dan  Keperawatan  Universitas Gadjah Mada.

## Rancangan Penelitian atau Model.
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  kuasi  eksperimental in  vitro dengan  desain posttest- only control group Bahan dan Peralatan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun Afrika segar, etilasetat hasil destilasi,  hepes,  iodium, isopropanol ,  kalium  iodida,  kloroform, metanol ,  natrium hidroksida, natrium sulfat  anhidrat,  petroleum  eter, raksa (II) klorida, serbuk magnesium, serbuk  zinkum,  sodium  hidrogen  sulfat,  timbal  (II)  asetat,  toluena,  air  suling, dimethyl sulfoxide (DMSO),  sel  kanker  kolon  WiDr  dan  sel  Vero  yang  merupakan  koleksi Laboratorium  Parasitologi  Fakultas  Kedokteran  UGM,  media Roswell  Park  Memorial Institute (RPMI), media M199, fetal bovine serum (FBS) 10% (v/v), penisillin-streptomisin 2%  (v/v),  dan  fungizone  ( amphoterisin  B )  0,5%,  larutan  0,25% trypsin-EDTA ,  MTT  (3-
(4,5- dimetiltiazol -2-il)-2,5 difeniltetrazolium  bromida )    konsentrasi  5  mg/mL, phospate buffer saline (PBS), sodium dodecyl sulfate (SDS) dalam hidrogen chloride (HCl) 0,01 N. Alat-alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  alat-alat  gelas, autoclave ,  blender, conical  tube ,  eksikator, microplate  reader ,  inkubator  CO2  5%, inverted  microscope , mikroskop  cahaya  yang  dilengkapi  dengan  kamera,  krus  porselin, laminar  air  flow , mikropipet, flask ,  hemositometer,  alat  penghitung,  neraca  kasar,  neraca  listrik,  oven, pengangas air, rotary evaporator , sentrifugator, seperangkat alat destilasi, cawan porselen alas rata, krus porselen bertutup, vortex , 24- well plate , 6- well plate , dan 96- well plate. Tahapan Penelitian Penyiapan Bahan Uji Sampel  bahan  uji  yang  telah  dikumpulkan  kemudian  diidentifikasi  oleh Herbarium Medanense (MEDA), Universitas Sumatera Utara, Medan. Proses pengeringan daun afrika dilakukan  dengan  menggunakan  lemari  pengering  pada  suhu  sekitar  60  °C  hingga  benar- benar  kering  menjadi  simplisia,  kemudian  diblender  hingga  berubah  menjadi  bentuk bubuk, lalu ditimbang dan disimpan dalam wadah plastik pada suhu kamar.

## Pembuatan Ekstrak
Ekstraksi  dilakukan  dengan  menggunakan  metode maserasi menggunakan  pelarut etilasetat  yang  telah  didestilasi.  Awalnya,  1  kilogram  simplisia  dimasukkan  ke  dalam sebuah wadah yang gelap, kemudian dimaserasi dengan 7,5 liter pelarut etilasetat. Setelah itu, wadah tersebut ditutup rapat dan dibiarkan selama 5 hari tanpa terkena cahaya, sambil sesekali  diaduk.  Setelah  periode  5  hari  berlalu,  larutan  disaring  dan  ampasnya  dicuci dengan  pelarut  etilasetat  tambahan  hingga  mencapai  volume  total  10  liter.  Selanjutnya, larutan  tersebut  dialirkan  ke  dalam  botol  yang  tertutup  rapat  dan  berwarna  gelap,  lalu disimpan  di  tempat  yang  dingin  dan  terlindung  dari  cahaya  selama  2  hari.  Setelah  itu, larutan  tersebut  disaring  kembali  dan  diuapkan  dengan  menggunakan rotary  evaporator (Biobase, Cina) hingga menghasilkan ekstrak kental.

## III. HASIL PENELITIAN
Pengujian  sitotoksik  adalah  tahap  awal  yang  digunakan  untuk  mengevaluasi  potensi ketoksikan  suatu  senyawa,  dan  nilai  IC50  merupakan  faktor  utama  dalam  parameter  ini. Hasil pengukuran  absorbansi  dari uji sitotoksik  yang dilakukan dengan EEADA terhadap sel Vero dapat ditemukan dalam Tabel 1, sementara hasil yang sama pada uji terhadap sel WiDr tercantum dalam Tabel 2.

## Tabel 1. Nilai Absorbansi Uji Sitotoksik  EEADA terhadap Sel Vero
Perlakuan Absorbansi 1  Absorbansi 2  Absorbansi 3 Kontrol Sel 0.777 0.688 0.705 Kontrol Media 0.076 0.073 0.077 Konsentrasi 50 µg/mL 0.200 0.191 0.190 Konsentrasi 25 µg/mL 0.329 0.337 0.337 Konsentrasi 12.5 µg/mL 0.370 0.362 0.397 Konsentrasi 6.25 µg/mL 0.408 0.419 0.421 Konsentrasi 3.125 µg/mL 0.757 0.685 0.704

## Tabel 2. Nilai Absorbansi Uji Sitotoksik  EEADA terhadap Sel WiDr
Setelah  memperoleh  nilai  absorbansi,  langkah  selanjutnya  adalah  mengubahnya  menjadi persentase  sel  yang  masih  hidup.  Hal  ini  dilakukan  untuk  menghitung  parameter  IC50, yang  digunakan  untuk  menilai  tingkat  toksisitas  suatu  senyawa.  Pengaruh  dari  setiap ekstrak terhadap viabilitas sel Vero dan WiDr dapat dilihat pada Gambar 1 dan Gambar 2.
Gambar 1. Grafik Hasil Uji Sitotoksik EEADA terhadap Sel Vero
Perlakuan Absorbansi 1  Absorbansi 2  Absorbansi 3 Kontrol Sel 0.604 0.585 0.587 Kontrol Media 0.078 0.071 0.064 Konsentrasi 50 µg/mL 0.115 0.113 0.125 Konsentrasi 25 µg/mL 0.170 0.177 0.183 Konsentrasi 12.5 µg/mL 0.250 0.238 0.241 Konsentrasi 6.25 µg/mL 0.313 0.319 0.315 Konsentrasi 3.125 µg/mL 0.602 0.585 0.583
Gambar 2. Grafik Hasil Uji Sitotoksik EEADA terhadap Sel WiDr.
Aktivitas  sitotoksik  pada  sel  Vero  dan  WiDr  dihitung  dengan  memanfaatkan  analisis probit, sehingga diperoleh nilai IC50 untuk masing-masing ekstrak. Selanjutnya, dilakukan perhitungan  IS  yang  merujuk  pada  parameter  selektivitas  ekstrak  yang  menunjukkan kemampuan  ekstrak  dalam  mengaktifkan  efek  antikanker  terhadap  sel-sel  normal,  seperti yang tercatat pada Tabel 3.
Tabel 3. Parameter Nilai IC50 dan IS dari EEADA
Uji Sitotoksik EEADA IC 50 (µg/mL) IS Sel Vero 13,27 1.46 Sel WiDr 9,07
Untuk  mengevaluasi  potensi  efek  sitotoksik  dari  suatu  ekstrak,  dapat  dilakukan perhitungan nilai IC50 melalui analisis probit (Akçay, 2013). Nilai IC50 EEADA terhadap sel WiDr adalah 9,07, yang dapat diklasifikasikan memiliki aktivitas sitotoksik sangat kuat karena  memiliki  nilai  IC50  kurang  dari  10  µg/mL.  Daun  afrika  memiliki  aktivitas sitotoksik  terhadap sel  kanker kolon  maupun jenis  sel  kanker lainnya oleh karena  adanya sejumlah  senyawa  bioaktif  utama  melalui  berbagai  jalur  mekanisme  penghambatan  sel kanker  yang  telah  dipelajari  (Joseph  et  al.,  2020).  Senyawa  bioaktif  utama  yang  telah diisolasi dari tanaman ini dapat berasal dari bagian daun, batang, maupun akarnya (Ugbogu et  al.,  2021).  Kemampuan  selektivitas  dari  suatu  ekstrak  yang  menunjukkan  aktivitas sitotoksik  diukur  dengan  menghitung  nilai  IS  dengan  menghitung  pembagian  nilai  IC50 ekstrak terhadap sel normal dengan nilai IC50 ekstrak terhadap sel kanker (McGaw et al., 2014). Suatu ekstrak diklasifikasikan memiliki selektivitas tinggi terhadap suatu sel kanker apabila  nilai  IS  melebihi  3  (López-Lázaro,  2015).  Nilai  IC50  EEADA  terhadap  sel  Vero adalah  sekitar  13,27  μg/mL,  sementara  nilai  IC50  EEADA  terhadap  sel  WiDr  adalah sekitar  9,07  μg/mL,  sehingga  menghasilkan  nilai  IS  sebesar  1,46.  Oleh  karena  itu,  dapat dinyatakan  bahwa  EEADA  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  kurang  selektif  terhadap sel kanker WiDr. Tujuan utama dari terapi antikanker saat ini adalah untuk mengeliminasi sel-sel  tumor  tanpa  mengganggu  kesehatan  secara  keseluruhan  pada  pasien.  Namun, dampak  negatif  yang  sering  terjadi  dari  obat  kemoterapi  adalah  pembatasan  dosis  yang dapat diberikan dengan aman, karena efek samping yang mungkin timbul. Akibatnya, sel- sel  kanker  masih  dapat  bertahan,  yang  pada  gilirannya  dapat  menghasilkan  hasil  yang kurang  memuaskan  dalam  pengobatan  rutin  dan  perkembangan  tumor  yang  menjadi resisten  terhadap  obat  (Mathijssen  et  al.,  2014).  Oleh  karena  itu,  pentingnya  selektivitas obat terhadap sel kanker menjadi kunci dalam memastikan keamanan dan efektivitas terapi (Mathijssen et al., 2014). Kita dapat berharap untuk melihat lebih banyak obat kemoterapi
yang  efektif  yang  dirancang  untuk  menargetkan  komponen  tertentu,  namun,  ada  risiko bahwa  obat-obatan  semacam  itu  dapat  memungkinkan  sel  kanker  untuk  menghindari penghambatan  jalur  tertentu  karena  sifat  yang  terlalu  spesifik  dari  senyawa  tersebut  (A Baudino,  2015).  Obat-obatan  tersebut  cenderung  memiliki  indeks  terapi  yang  sempit  dan juga  selektivitas  yang  rendah.  Sebagian  besar  obat  antikanker  yang  ada  saat  ini,  selain menghambat  pertumbuhan  sel  kanker,  juga  memiliki  efek  negatif  pada  sel-sel  normal. Terlebih lagi, resistensi terhadap obat antikanker seringkali tidak dapat dihindari, sehingga pengembangan  obat  antikanker  dari  sumber  alam  menjadi  sangat  penting  (Greenwell  & Rahman,  2015).    Arah  penelitian  yang  banyak  dilakukan  saat  ini  bertujuan  untuk menemukan  senyawa  antikanker  baru  dengan  harapan  dapat  memberikan  profil  senyawa yang lebih baik dalam hal selektivitas hanya terhadap sel kanker tertentu. Selektivitas suatu obat digunakan sebagai ukuran untuk menilai kebaikan dan keburukan obat tersebut, serta sejauh mana obat tersebut aman (Seca & Pinto, 2018). Semakin sempit indeks selektivitas dari  obat  antikanker  yang  saat  ini  ada,  semakin  banyak  efek  samping  yang  mungkin muncul,  yang  pada  akhirnya  dapat  membuat  pasien  kanker  menghentikan  terapi kemoterapi karena tidak dapat menoleransi efek samping  yang ditimbulkan oleh prosedur kemoterapi yang diberikan (Thurston & Pysz, 2021)

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah  dilaksanakan,  maka  dapat  disimpulkan  sebagai berikut  :  EEADA  menunjukkan  aktivitas  sitotoksik  yang  sangat  kuat  terhadap  sel  WiDr dengan  nilai  IC50  9,07  μg/mL  µg/mL,  dan  indeks  selektivitas  sekitar  1,46.  Data  ini mengindikasikan  bahwa  meskipun  EEADA  memiliki  efek  sitotoksik  yang  kuat,  namun tidak  menunjukkan  selektivitas  terhadap  sel  WiDr.  Penelitian  lanjutan  sangat  diperlukan untuk  mengevaluasi  potensi  dari  EEADA  sehingga  dapat  memberikan  profil  selektivitas senyawa yang lebih baik dan efektif hanya terhadap sel kanker tertentu.

## DAFTAR PUSTAKA
A  Baudino,  T.  2015.  Targeted  cancer  therapy:  the  next  generation  of  cancer  treatment.
Current Drug Discovery Technologies, 12(1), 3–20.
Akçay, A. 2013. The Calculation of LD50 Using Probit Analysis. The FASEB Journal, 27:
1217.28-1217.28.
Ammerman, N. C., Beier‐Sexton, M., dan Azad, A. F. 2008. Growth and maintenance of Vero cell lines. Current Protocols in Microbiology, 11(1), A-4E.
Benson, A. B., Venook, A. P., Al-Hawary, M. M., Arain, M. A., Chen, Y.-J., Ciombor, K. K.,  Cohen,  S.,  Cooper,  H.  S.,  Deming,  D.,  dan  Farkas,  L.  2021.  Colon  cancer, version  2.2021,  NCCN  clinical  practice  guidelines  in  oncology.  Journal  of  the National Comprehensive Cancer Network, 19(3), 329–359.
Bestari, R. 2021.  Senyawa Fitokimia  dan Aktivitas Farmakologis  Daun  Afrika  (Vernonia amygdalina Del.) sebagai Kandidat Obat Herbal. Jurnal Kedokteran STM (Sains Dan Teknologi Medik), 4(1), 63–74.
Bestari, R., Ichwan, M., Mustofa, M., dan Satria, D. 2017. Anticancer Activity of Vernonia amygdalina  Del.  Extract  on  WiDr  Colon  Cancer  Cell  Line.  2nd  Public  Health International Conference (PHICo 2017), 172–176.
Greenwell, M., dan Rahman, P. 2015. Medicinal plants: their use in anticancer treatment. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 6(10), 4103.
Joseph, J., Lim, V., Rahman, H. S., Othman, H. H.,  dan Samad, N. A. 2020. Anti-cancer effects  of  Vernonia  amygdalina:  A  systematic  review.  Tropical  Journal  of Pharmaceutical Research, 19(8), 1775–1784.
Kaur, D., Kaur, N., dan Chopra, A. 2019. A comprehensive review on phytochemistry and pharmacological  activities  of  Vernonia  amygdalina.  Journal  of  Pharmacognosy  and Phytochemistry, 8(3), 2629–2636.
López-Lázaro, M. 2015. A simple and reliable approach for assessing anticancer activity in vitro. Current Medicinal Chemistry, 22(11), 1324–1334.
Mathijssen, R. H. J., Sparreboom, A., dan Verweij, J. 2014. Determining the optimal dose in  the development  of anticancer  agents.  Nature  Reviews Clinical  Oncology, 11(5), 272–281.
McGaw,  L.  J.,  Elgorashi,  E.  E.,  dan  Eloff,  J.  N.  2014.  Cytotoxicity  of  African  medicinal plants  against  normal  animal  and  human  cells.  dalam  Toxicological  survey  of African medicinal plants (181–233). Elsevier.
Morgan, E., Arnold, M., Gini, A., Lorenzoni, V., Cabasag, C. J., Laversanne, M., Vignat, J., Ferlay, J., Murphy, N.,  dan Bray, F. 2023. Global burden of colorectal cancer in 2020  and  2040:  Incidence  and  mortality  estimates  from  GLOBOCAN.  Gut,  72(2), 338–344.
Natanael,  G.,  Hardini,  N.,  Lardo,  S.,  dan  Suzanna,  E.  2022.  Associations  between Nonalcoholic  Fatty  Liver  Disease  and  Histopathological  Features  of  Patients  with Adenocarcinoma  of  Colon  in  Dharmais  National  Cancer  Hospital,  National  Cancer Center, Indonesia. Asian Pacific Journal of Cancer Biology, 7(1), 37–41.
Rejhová,  A.,  Opattová,  A.,  Čumová,  A.,  Slíva,  D.,  dan  Vodička,  P.  2018.  Natural compounds  and  combination  therapy  in  colorectal  cancer  treatment.  European Journal of Medicinal Chemistry, 144, 582–594.
Seca,  A.  M.  L.,  dan  Pinto,  D.  C.  G.  A.  2018.  Plant  secondary  metabolites  as  anticancer agents:  successes  in  clinical  trials  and  therapeutic  application.  International  Journal of Molecular Sciences, 19(1), 263.
Thurston, D. E., dan Pysz, I. 2021. Chemistry and pharmacology of anticancer drugs. CRC press.
Ugbogu, E. A., Emmanuel, O., Dike, E. D., Agi, G. O., Ugbogu, O. C., Ibe, C., & Iweala, E. J. (2021). The phytochemistry, ethnobotanical, and pharmacological potentials of the  medicinal  plant-Vernonia  amygdalina  L.(bitter  Leaf).  Clinical  Complementary Medicine and Pharmacology, 1(1), 100006.
Wang, Q., Shen, X., Chen, G., & Du, J. (2022). Drug resistance in colorectal cancer: from mechanism to clinic. Cancers, 14(12), 2928A Baudino, Troy. 2015. Targeted Cancer Therapy:  The  next  Generation  of  Cancer  Treatment.  Current  Drug  Discovery Technologies 12(1):3–20.
Accepted Date Revised Date Decided Date Accepted to Publish 24 Agustus 2023 15 September 2023 28 Seotember 2023 Ya