## TOKSISITAS DAN KARAKTERISASI GUGUS FUNGSI DAUN SISIK NAGA ( Drymoglossum piloselloides (L) Presl.)
Frengky Anri Bali 1) , Fatimawali 1) , dan Frenly Wehantouw 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
The purpose of this study was to determine LC 50 sisik naga ( Drymoglossum piloselloides (L) Presl)  epiphytic  leaf  extract  using  Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT),  and  to  know  the characteristics  of  functional  groups  contained  in  the  extract  of  the  most  toxic  fraction.  The method used in this study was Maceration and fractionation. The implementation of toxicity test used BSLT method. The toxicity test was then performed the isolation of compounds by thin  layer  chromatography  (TLC),  and  then  determined  the  characteristics  of  functional groups with spectrophotometer Fourier Transform Infra Red (FTIR). The result showed that the most toxic fraction has LC 50 values of 15.71 ppm which has the potential as anti-cancer. The result of the isolation of the most toxic fraction obtains at least seven compounds, then identified  by  FTIR  spectrophotometer  suspected  this  fraction  contains  amine  functional groups and amide (N-H), phenol, alcohol monomers, alcohol hydrogen bonds (O-H), alkanes, alkenes (C-H), aldehyde, ketone, carboxylic acid, ester (C=O), alcohol, ether, carboxylic acid and ester (C-O).
Key words : Toxicity, Characterization, Fractionation, Sisik Naga epiphytic leaf

## ABSTRAK
Tujuan penelitian ini  yaitu menentukan LC 50 ekstrak epifit daun sisik naga ( Drymoglossum piloselloides (L)  Presl)  menggunakan  metode Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT)  dan mengetahui karakteristik gugus  fungsi  yang terdapat dalam ekstrak dan fraksi paling toksik. Metode  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu  maserasi  dan  fraksinasi.  Pelaksanaan  uji toksisitas  menggunakan  metode  BSLT.  Hasil  uji  toksisitas  fraksi  paling  toksik  selanjutnya dilakukan  isolasi  senyawa  dengan  kromatografi  lapis  tipis  (KLT),  kemudian  ditentukan karakteristik gugus fungsinya dengan spektrofotometer Fourier Transform Infra Red (FTIR). Hasil penelitian menunjukkan fraksi paling toksik mempunyai nilai LC 50 sebesar 15,71 ppm yang  berpotensi  sebagai  anti  kanker.  Hasil  isolasi  dari  fraksi  paling  toksik  didapat  paling sedikit  tujuh  senyawa,  hasil  identifikasi  dengan  spektrofotometer  FTIR  diduga  fraksi  ini mengandung gugus  fungsi  amina dan amida (N-H), fenol,  monomer alkohol,  alkohol ikatan hydrogen (O-H), alkana dan alkena (C-H), aldehida, keton, asam karboksilat dan ester (C=O), alkohol, eter, asam karboksilat dan ester (C-O).
Kata kunci : Toksisitas, Karakterisasi, Fraksinasi, Daun Epifit Sisik Naga

## PENDAHULUAN
Indonesia memiliki sekitar 30.000 spesies, sekitar 940 di antaranya digunakan sebagai tanaman obat. Masyarakat Indonesia telah lama memanfaatkan tanaman  obat  sebagai  obat  tradisional. Obat  tradisional  ialah  bahan  atau  ramuan bahan yang berasal dari tumbuh- tumbuhan,  hewan,  dan  mineral,  sediaan sarian  (galenik)  atau  campuran  dari  bahan tersebut  yang  secara  turun-temurun  telah digunakan untuk pengobatan.
Salah satu tanaman obat yang ada di  Indonesia ialah epifit. Epifit merupakan tumbuhan  yang  hidup  menumpang  tanpa mengambil makanan dari inangnya. Beberapa  epifit  khas  menempati  stratum tertentu  pada  inangnya,  tetapi  kebanyakan menempati semua strata mulai dari bawah, tengah  sampai  tajuk  pohon.  Epifit  dapat menempel  pada  batang,  dahan,  daun, pohon, perdu, dan liana (Smith, 1979).
Tumbuhan paku epifit merupakan tumbuhan  yang  memiliki  nilai  manfaat bagi  kehidupan  sehari-hari  manusia.  Nilai manfaat tumbuhan paku epifit selain untuk keperluan  media  pembelajaran  yang  dapat diteliti  dan  dipelajari,  nilai  manfaat tumbuhan paku epifit juga dapat digunakan  sebagai  tanaman  hias,  obat- obatan,  kerajinan  maupun  makanan,  salah satu  epifit  yang  digunakan  sebagai  obat yaitu  paku  sisik  naga  (Drymoglossum piloselloides (L) Presl) merupakan tumbuhan yang memiliki aktifitas antioksidan  (Dalimunthe  dan  Anjelisa, 2011). Secara empiris masyarakat menggunakan  daun  paku  sisik  naga  ini untuk  mengobati  penyakit  gondok,  batuk darah, keputihan, kencing nanah, reumatik, sakit  kuning,  sariawan,  dan  anti  kanker (Malinda, 2013).
Metode Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT),  merupakan  salah  satu  uji  untuk mengetahui potensi anti kanker dari bahan alam,  metode  ini  sederhana,  cepat,  murah, dan  dapat  dipercaya.  Suatu  ekstrak dinyatakan bersifat toksik menurut metode BSLT  jika  memiliki  LC 50 <  1000  µg/mL. Jika  hasil  uji  BSLT  menunjukkan  bahwa
ekstrak  tumbuhan  bersifat  toksik  maka dapat  dikembangkan  ke  penelitian  lebih lanjut untuk mengisolasi senyawa sitotoksik tumbuhan sebagai usaha pengembangan  obat  alternatif  anti  kanker dan  Jika  hasil  uji  BSLT  menunjukkan bahwa  ekstrak  tumbuhan  tidak  bersifat toksik  maka  dapat  dikembangkan  ke penelitian  lebih  lanjut  untuk  meneliti khasiat-khasiat  lain  dari  ekstrak  tersebut (Meyer, dkk. 1982).

## METODOLOGI PENELITIAN Bahan dan Alat
Sampel yang digunakan ialah daun epifit sisik naga (Drymoglossum piloselloides  (L)  Presl)  yang  diambil  di daerah  sekitar  Universitas  Sam  Ratulangi Kota Manado. Selanjutnya sampel dibersihkan  dan  dikering  anginkan  hingga sampel kering. Bahan-bahan yang digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu ekstrak daun epifit sisik naga (Drymoglossum  piloselloides  (L)  Presl), etanol  96%,  plat  KLT  GF 254 ,  metanol ( Merck ),  etil  asetat  ( Merck ),  asam  asetat ( Merck ),  butanol  ( Merck ),  kloroform ( Merck ),  amoniak  ( Merck ),  asam  sulfat ( Merck ), air laut, larva Artemia salina L. Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  kain  hitam,  alat-alat gelas  (Pyrex),  corong  pisah,  timbangan digital  (AND),  pipet  ukur,  loop,  aerator, lampu,  oven  (Memmert), water  bath
(Eyela) ,  vacum  rotary  evaporator (Eyela N-1000), Spektrofotometer Shimadzu 1800 dan Spektrofotometer
FTIR Shimadzu Prestige 21.

## Persiapan Sampel
Daun sisik naga sebanyak 2500 g dibersihkan,  dicuci  dangan  air  mengalir, ditiriskan, dan dirajang, kemudian dikering anginkan selama dua minggu dan pengeringan dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 40ºC hingga kadar airnya berkurang. Selanjutnya sampel  kering  ditimbang,  berat  yang diperoleh  yaitu  sebanyak  250  g,  sampel sisik  naga  kering  dihaluskan  dengan
blender,  kemudian  diayak  dengan  ayakan mesh  200.  Hasil  ayakan  disimpan  dalam wadah plastik yang tertutup rapat.

## Ekstraksi dan Fraksinasi
Ekstraksi daun sisik naga dilakukakn  dengan  menggunakan  pelarut metanol:air  (4:1).  Metode  ekstraksi  yang digunakan  yaitu  maserasi.  Sebanyak  50  g simplisia  kering  dimasukkan  kedalam wadah  maserasi,  ditambahkan  pelarut metanol  200  ml:air  50  ml.  Ekstraksi dilakukan  selama  3x24  jam.  Sampel disaring  dengan  menggunakan  kertas saring  untuk  memisahkan  filtrat  dan residunya, sehingga diperoleh filtrat metanol.  Ekstraksi  dilakukan  pada  residu yang  telah  diangin-anginkan  sehingga terbebas  dari  metanol.  Residu  kemudian dimasukkan kedalam wadah dan diekstraksi  dengan  menambahkan  etil asetat  200  ml.  Ekstraksi  dilakukan  selama 3x24  jam.  Sampel  disaring  dengan menggunakan kertas saring untuk memisahkan  filtrat  dan  residunya,  filtrat etil asetat dipekatkan dengan vacum rotary evaporator , sehingga diperoleh ekstrak etil asetat.
Fraksinasi  dilakukan  pada  filtrat metanol. Filtrat metanol diasamkan dengan penambahan  beberapa  tetes  asam  sulfat hingga pH larutan 4, kemudian dimasukkan pada corong pisah. Selanjutnya dipartisi dengan menambahkan  kloroform,  setelah  itu dikocok  berulangkali  sampai  homogen. Didiamkan  selama  24  jam  sehingga terbentuk  lapisan  kloroform  dan  lapisan metanol-asam, masing-masing lapisan ditampung  dalam  wadah  yang  berbeda. Lapisan  kloroform  selanjutnya  dipekatkan dengan vacum rotary evaporator , sehingga diperoleh  fraksi  kloroform.  Fraksinasi berikut  dilakukan  pada  lapisan  metanol- asam,  lapisan  metanol-asam  ditambahkan beberapa tetes  amoniak  hingga pH larutan 10.  Kemudian  dimasukkan  pada  corong pisah, selanjutnya dipartisi dengan menambahkan  kloroform-metanol  dengan perbandingan  1:1,  setelah  itu  dikocok
berulang kali sampai homogen. Didiamkan selama  24  jam  sehingga  terbentuk  lapisan kloroform-metanol  dan  lapisan  air-basa, masing-masing  lapisan  ditampung  dalam wadah  yang  berbeda.  Lapisan  kloroform- metanol  selanjutnya  dipekatkan  dengan vacum rotary evaporator , sehingga diperoleh fraksi kloroform-metanol.
Fraksinasi  berikut dilakukan pada lapisan air-basa, lapisan air-basa kemudian dimasukkan  pada  labu  pisah,  selanjutnya dipartisi dengan metanol sebanyak 200 ml, setelah  itu  dikocok  berulangkali  sampai homogen.  Didiamkan  selama  24  jam. Sehingga didapat filtrat metanol kemudian dipekatkan dengan vacum rotary evaporator ,  sehingga  diperoleh  fraksi metanol.
Penyiapan Larva Artemia salina Penyiapan  larva Artemia  salina dilakukan dengan  menetaskan  telur Artemia  salina 48  jam  sebelum  dilakukan  uji.  Penetasan dilakukan  dengan  cara  merendam  telur tersebut  dalam  air  laut  di  dalam  wadah yang diberi suplai oksigen dari aerator dan diberi penerangan dengan lampu 15 watt .

## Pelaksanaan Uji Toksisitas
Pelaksanaan uji toksisitas dilakukan  dengan  konsentrasi  0  ppm (kontrol), 50 ppm, 100 ppm, 250 ppm, dan 500  ppm.  Setiap  konsentrasi  ekstrak sampel  memerlukan  5 vial .  Selanjutnya pada  tiap  konsentrasi  dimasukkan  larva Artemia salina yang telah berumur 48 jam, setiap  tabung  uji  berisi  10  ekor  larva Artemia  salina .  Volume  akhir  setiap tabung  uji  sebesar  10  mL.  Tabung  uji kemudian diletakkan di bawah penerangan selama 24 jam, kemudian dihitung jumLah larva Artemia  salina yang  mati.  Kriteria standar  untuk  menilai  kematian  larva udang  ialah  bila  larva  udang  tidak menunjukkan  pergerakan  selama  beberapa detik observasi.
Isolasi  Fraksi  Paling  Toksik  Dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Isolasi  dengan  kromatografi  lapis tipis  (KLT),  eluen  yang  digunakan  berupa campuran butanol-etil asesat-Aquades dengan  perbandingan  4:1:5  (BEA)  dan campuran  butanol-asam  asetat-aquades dengan perbandingan 4:1:5 (BAA), dijenuhkan  dalam  chamber.  Lempeng silika  yang  digunakan  diaktifkan  di  dalam oven  pada  suhu  100ºC  selama  60  menit. Ekstrak  dilarutkan  dengan  1  ml  etanol 96%,  ekstrak  ditotolkan  pada  lempeng kromatografi.  Pergerakan  eluen  diamati hingga  mencapai  batas  atas,  dikeringkan dengan  hair  dryer  atau  diangin-anginkan. Bercak  yang  terjadi  diamati  dengan menggunakan  sinar  UV  pada  panjang gelombang  254  nm  dan  365  nm  (Mohrig, 1979).

## Karakterisasi  Gugus  Fungsi  Fraksi Paling Toksik Menggunakan FTIR
Fraksi  paling  toksik  yang  telah diisolasi  menggunakan  KLT,  kemudian dilanjutkan dengan identifikasi menggunakan  FTIR  untuk  mengetahui gugus fungsinya.

## Analisa Data
Data hasil penelitian akan diolah dan disajikan  dalam  bentuk  tabel  dan  grafik. Data  dari  uji  toksisitas  tersebut  dianalisis dengan regresi linear menggunakan Microsoft  Excel  2010 untuk  menentukan nilai LC 50.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil rendemen ekstrak dan fraksi daun  epifit  sisik  naga  (Drymoglossum piloselloides  (L)  Presl)  dapat  dilihat  pada Tabel 1.
Tabel 1. Rendemen Ekstrak dan Fraksi Daun Epifit Sisik Naga (Drymoglossum piloselloides (L) Presl) No Sampel Berat Ekstrak dan Fraksi (g) Rendemen % Warna Ekstrak dan Fraksi 1 EEA 1,8 3,60% Hijau pekat 2 FK 2 4,00% Hijau kecoklatan 3 FKM 0,41 0,82% Hijau bening 4 FM 4,69 9,30% Cokelat kehijauan
Keterangan :
EEA  :  Ekstrak  etil  asetat,  FK  :  Fraksi  kloroform,  FKM  :  Fraksi  kloroform-metanol,  FM  : Fraksi metanol

## Pelaksanaan Uji Toksisitas
Pengujian  pendahuluan  diperoleh bahwa  ekstrak  etil  asetat  dan  fraksi kloroform  bersifat  sangat  toksik,  sehingga konsentrasi  ekstrak  etil  asetat  dan  fraksi kloroform  dibuat  lebih  rendah  (kecil). Konsentrasi  yang  digunakan  yaitu  0  ppm
(kontrol),  1  ppm,  5  ppm,  10  ppm,  dan  50 ppm, hal ini dimaksudkan agar mendapatkan  hasil  terbaik  dibandingkan dengan  konsentrasi awal. Hasil  uji toksisitas ekstrak etil asetat, fraksi kloroform, kloroform-metanol dan metanol dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Nilai LC 50 Ekstrak dan Fraksi Daun Epifit Sisik Naga (Drymoglossum piloselloides (L) Presl) No Sampel Regresi Linear R 2 LC 50 (ppm) 1 Etil asetat y = 1.325x + 16.50 R² = 0.875 25,28 ppm 2 Kloroform y = 1.592x + 24.98 R² = 0.805 15,71 ppm 3 Kloroform – Metanol y = 0.104x + 7.116 R² = 0.934 412,34 ppm 4 Metanol y = 0.144x + 4.049 R² = 0.941 319,10 ppm
Meyer,  dkk , (1982)  menyatakan bahwa  senyawa  uji  dikatakan  toksik  jika harga  LC 50 lebih  kecil  dari  1000  μg/mL. Penentuan  potensi  bioaktif  dilakukan dengan membandingkan nilai LC 50 masing-masing
ekstrak menurut McLaughin  (1991).  Menurut  McLaughin (1991),  nilai  LC 50 <  30  ppm  ekstrak berpotensi sebagai anti kanker (sitotoksik), LC 50 30-200  ppm  ekstrak  berpotensi sebagai  anti  mikroba  dan  LC 50 200-1000 ppm ekstrak berpotensi sebagai pestisida.
Berdasarkan data pada Tabel  2 di atas,  Ekstrak  etil  asetat  dan  fraksi kloroform  berpotensi  sebagai  anti  kanker, sedangkan untuk fraksi kloroform-metanol dan  fraksi  metanol  berpotensi  sebagai pestisida.  Fraksi  kloroform  memiliki  nilai LC 50 yang  lebih  kecil  jika  dibandingkan dengan Ekstrak etil asetat, yang mengindikasikan  bahwa  senyawa  paling toksik    pada  fraksi  daun  sisik  naga  ialah fraksi kloroform.
Menurut  Harbone  (1982)  fraksi paling toksik daun sisik naga mengandung terpenoid  dan  fenolik,  diduga  senyawa inilah  yang  terlarut  pada  pelarut.  Menurut Haumahu,  (2011)  mekanisme  kematian larva  berhubungan  dengan  senyawa  yang terlarut pada pelarut yang dapat menghambat daya makan larva. Cara kerja senyawa  tersebut  ialah  dengan  bertindak sebagai stomach  poisoning atau  racun perut.  Oleh  karena  itu,  bila  senyawa- senyawa  ini  masuk  ke  dalam  larva,  alat pencernaannya  akan  terganggu.  Selain  itu, senyawa  ini  menghambat  reseptor  perasa pada  daerah  mulut  larva.  Hal  ini
mengakibatkan  larva  gagal  mendapatkan stimulus  rasa  sehingga  tidak  mampu mengenali  makanannya  sehingga  larva mati kelaparan.

## Isolasi  Fraksi  Paling  Toksik  Dengan KLT
Sistem  eluen  BEA  menunjukkan pemisahan  yang  paling  baik,  sehingga digunakan sebagai eluen pada KLT. Eluen BEA memiliki pola pemisahan yang paling baik daripada eluen lain karena memberikan  noda  terbanyak  dan  terpisah baik serta jarak antar noda cukup terpisah. Ini  juga  dapat  ditinjau  pada  metode Harbone  (1987),  yang  menuliskan  bahwa eluen  yang  baik  ialah  eluen  yang  bisa memisahkan  senyawa  dalam  jumlah  yang banyak  yang  ditandai  dengan  munculnya noda.  Noda  yang  terbentuk  tidak  berekor dan  jarak  antara  noda  satu  dengan  yang lainnya jelas.
Isolasi Fraksi paling toksik menggunakan  metode  KLT.  KLT  dibuat dengan  menggunakan  silika  gel  GF 254 sehingga  dapat  berfluoresensi  di  bawah lampu  UV.  Pada  plat  KLT,  Fraksi  paling toksik  yang  akan  dipisahkan  ditotolkan berupa  garis  pada  salah  satu  sisi  plat lapisan  dan  dikembangkan  secara  tegak lurus  pada  garis  cuplikan  sehingga campuran  akan  terpisah  menjadi  beberapa pita (Gritter dkk, 1991). KLT fraksi paling toksik  setelah  proses  elusi  selesai  terlihat dibawah lampu UV paling sedikit terdapat tujuh  noda,  nilai  Rf  hasil  isolasi  fraksi paling toksik dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Nilai Rf Hasil Isolasi Fraksi Paling Toksik Dengan KLT Noda Nilai Rf Warna noda setelah disinari dengan lampu UV 365 nm A 0,64 Jingga B 0,59 Merah muda C 0,55 Kuning muda D 0,52 Ungu E 0,50 Hijau muda F 0,47 Jingga muda G 0,16 Hijau muda
Identifikasi Senyawa Fraksi Paling Toksik Dengan FTIR
Spektro Inframerah untuk senyawa fraksi paling toksik
memperlihatkan  adanya  serapan-serapan yang  khas  untuk  beberapa  gugus  fungsi, dapat  dilihat  pada  gambar  4  dan  Tabel  4.
Gambar 4. Spektrum IR Fraksi Paling Toksik Daun Epifit Sisik Naga (Drymoglossum piloselloides (L) Presl)
Tabel 4. Identifikasi Gugus Fungsi Senyawa dalam Fraksi Paling Toksik Daun Epifit Sisik Naga (Drymoglossum piloselloides (L) Presl)
Berdasarkan  Tabel  4  diatas,  data spektro  inframerah  senyawa  fraksi  paling toksik  diduga  mengandung  gugus  N-H dengan  intensitas  sedang  dan  O-H  dengan intesitas  kuat  pada  serapan  yang  melebar dengan  bilangan  gelombang  3363  cm -1 , terdapat  gugus  C-H  dengan  intesitas  kuat
pada  serapan  bilangan  gelombang  2922 cm -1 dan  didukung  dengan  pita  serapan 2852  cm -1 ,  terdapat  gugus  C=O  dengan intensitas  kuat  pada  serapan  bilangan gelombang  1716  cm -1 ,  adanya  gugus  C-O dengan  intesitas  kuat  pada  serapan bilangan  gelombang  1166  cm -1 dan
Bilangan Gelombang (cm -1 )
Literatur frekuensi (cm -1 ) Gugus Jenis Senyawa 3363  cm -1 3300-3500  cm -1 N-H Amina, amida 3200-3600 cm -1 O-H Fenol, monomer alkohol, alkohol ikatan hydrogen 2922  cm -1 2850-2970 cm -1 C-H Alkana 1716  cm -1 1690-1760  cm -1 C=O Aldehida, keton, asam karboksilat, Ester 1166  cm -1 1050-1300  cm -1 C-O Alkohol, eter, asam karboksilat, ester 752  cm -1 675-995  cm -1
C-H
Alkena
didukung  dengan  pita  serapan  1050  cm -1 , adanya  gugus  C-H  dengan  intensitas  kuat pada serapan bilangan gelombang 752 cm - 1 ,  diduga  fraksi  ini  memiliki  gugus  fungsi utama  amina  dan  amida  (N-H),  fenol, monomer alkohol, alkohol ikatan hydrogen (O-H),  alkana dan alkena (C-H),  aldehida, keton,  asam  karboksilat  dan  ester  (C=O), alkohol,  eter,  asam  karboksilat  dan  ester (C-O).  hal  ini  sesuai  dengan  data  tabel identifikasi  menurut  Settle,  (1997)  dan Skoog, dkk (1998).

## PENUTUP Kesimpulan
1. Ekstrak  etil  asetat  dan  fraksi  kloroform berpotensi sebagai anti kanker,
sedangkan  fraksi  kloroform-metanol dan  fraksi  metanol  berpotensi  sebagai pestisida.
2. Karakteristik gugus fungsi yang terlihat pada  fraksi  paling  toksik  diduga memiliki gugus fungsi utama amina dan amida  (N-H),  fenol,  monomer  alkohol, alkohol  ikatan  hidrogen  (O-H),  alkana dan alkena (C-H), aldehida, keton, asam karboksilat  dan  ester  (C=O),  alkohol, eter, asam karboksilat dan ester (C-O).
Saran
Pada  penelitian  ini  fraksi  kloroform terbukti fraksi paling toksik yang berpotensi sebagai anti kanker.
Berdasarkan  hasil  ini  perlu  adanya penelitian  yang  lebih  lanjut  tentang  fraksi kloroform daun epifit sisik naga ( Drymoglossum  piloselloides (L)  Presl) terhadap sel kanker.

## DAFTAR PUSTAKA
Gritter ., Roy J. 1991 . Pengantar Kromatografi .  Bandung:  Penerbit
ITB.
Harbone,  J.  B.  1987. Metode  fitokimia.
Edisi ke-dua . ITB, Bandung.
Malinda,  A.  F.,  Fatimawali,  Adithya,  Y. 2013. Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol  Daun  Paku  Sisik  Naga (Drymoglossum  piloselloides  (L) Presl)  Terhadap  Peroksidasi  Lipid Hati  Pada  Tikus  Jantan  Galur Wistar  Yang  Diinduksi  CCl4. Pharmacon, Vol. 2 : 72-75 McLaughlin  JL.  1991.  Crown  Gall
Tumours  on  Potato  Disks  a  Brine Shrimp  Lethality,  Two  Simple Bioassays for Higher Plant Screening  and  Fractination . In: K.Hostettman  (ed),  Methods  in Plant Biochemistry.  Vol.  6,  Assay for  Bioactivity, Academic  Press ,
1991: 1-32.
Meyer,  B.  N.  Ferrigni,  Putnam,  J.  E.
Jacobsen, L. B. Nichols.,
McLaughlin.  1982.  Brine  Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active  Plant  Constituents. Planta
Medica 45: 31-34. Mohrig., Neckers. 1979. Laboratory
Experiments in Organic Chemistry .
Third Edition.  D.  Van  Nostrand Company New York. Settle,  F.  1997. Instrumental  Techniques for  Analytical  Chemistry .  Prentice- Hall,  Inc.  Upper  Sadle  River.  New Jersey
Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. 1998. Principles  Of  Instrumental Analysis,  5th  Edition .  Saunders College Publishing. Philadelphia Smith,  G.  M.  1979. Cryptogamic  Botany Vol. II Bryophyte and Pteridophyte. Mc.Graw-Hill  Book  Company  Inc . New York. P 214-222