## Journal of Islamic Medicine
Volume 2 (4) (2018), Pages 26-32

## FRUCTOSE ALTERS THE EXPRESSION OF TYPE B LEPTIN RECEPTOR IN HYPHOTALAMUS AND INTESTINUM OF Rattus Novergicus
Ermin Rachmawati 1 , Risma Aprinda Kristanti 1 , Nurlaili Susanti 2
1 Physiology  Laboratory,  School  Of  Medicine  Faculty  Of  Medicine  And  Health  Science,  Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang Indonesia
2 Pharmacology  Laboratory,  School  Of  Medicine  Faculty  Of  Medicine  And  Health  Science,  Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang Indonesia
Background :  Several  epidemiological  data’s  reported  significant  correlation  between  fructose consumption  and  diabetes  mellitus  type  2  by  inducing  insulin  resistance.  Leptin  resistance  induced  by fructose  was  proposed  as  one  novel  mechanism  that  induce  insulin  resistance  but  the  exact  mechanism remains unclear.  We hypothesize that fructose diminish the type b leptin receptors in hypothalamus and intestine.
Aim :  This  study  was  aimed  to  elucidate  fructose  effect  on  the  expression  of  leptin  receptor  type  b  in hypothalamus and intestine of Rattus novergicus.
Method : twenty eight rats were used and divided into 4 groups: Group 1 was control, group 2 was given fructose 10%, group 3 was given fructose 30% and group 4 was given fructose 55% for 2 months. At the end of treatment, the animal were sacrificed and then the hypothalamus and intestine were collected. The expression  of  type  b  leptin  receptor  were  measured  by  immunohistochemistry  technique  with  primary antibody  from Bioss  antibodies  type Leptin  receptor  polyclonal  antibody  bs-0109R  using Staining  kit Skytec  Laboratories  and  DAB  chromogen. A  positive  expression  can  be  seen  as  a  brown  colour  in  cell cytoplasm and counted in 100 cell. The expression then analysed using SPSS 18 with anova one way tes (p<0,05) followed by post hoc test after the data showed normality and homogeneity using Saphiro wilk and Levene test (p>0,05).
Result : There was significant differences in type b leptin receptors found in hypothalamus between each group  (p<0.05).  The  significant  differences  also  could  be  seen  in  the  expression  between  control  and group fructose 30 and 50% in intestinal cell (p<0.05).
Conclusion :  the  consumption  of  Fructose  55%  for  2  months  attenuates  the  expression  of  type  b  leptin receptors in hypothalamus and intestine of Rat novergicus .
Contact person : Ermin Rachmawati
HP : +6281331478568

## Pendahuluan
Globalisasi,  urbanisasi,  kemajuan  dunia  teknologi    menyebabkan    peralihan  pola  konsumsi populasi  penduduk  manusia  menjadi  tinggi  kalori,  dimana  sumber  energi  tersebut  salah  satunya  didapat dari  gula  dan  pemanis  buatan.  Konsumsi  gula  menunjukkan  tren  meningkat  di  seluruh  dunia  termasuk negara berkembang utamanya Asia dan India. Amanda dalam penelitiannya melaporkan bahwa di Brazil terjadi peningkatan konsumsi gula dari sumber nasi, tepung, kopi, jus buah dan minuman ringan (Souza AM,  2013).  Hasil  serupa  dari  sebuah  data  survey  nasional  di  Amerika  Serikat  menunjukkan  adanya peningkatan  asupan  energi  dari  makanan  minuman  berkalori  tinggi  dengan  pemanis  sebesar  3,9  kalori pada  tahun  1977  menjadi  9,2%  di  tahun  2001  (Nielsen  SJ,  2004).  Hasil  studi  lain  menyebutkan  bahwa p revalensi konsumsi minuman ringan di antara pemuda usia 6 hingga 17 tahun meningkat 48%, dari 37% di 1977/1978 menjadi 56% di 1994/1998 (French SA, 2003) . Produk High Fructose Corn Syrup (HFCS) sebagai inovasi perkembangan teknologi industri makanan yang merupakan pemanis buatan utama pada makanan maupun minuman kemasan dikarenakan harga murah dan rasa yang manis (Walker RW, 2014). Berdasarkan  data  survei  nasional  di  Amerika  Serikat,  konsumsi  fruktosa  yang  didapat  dari  dua  sumber utama  yaitu  sukrosa  dan  HFCS  meningkat  sebesar  26%  dari  64  gram/hari  ditahun  1970  menjadi  81 gram/hari di tahun 1997 (Puttnam JJ, 1999).
Beberapa  penelitian  berhasil  membuktikan  hubungan  antara  konsumsi  fruktosa  dengan  peningkatan insidens  obesitas  melalui  stimulasi  lipogenesis  hepatik  dan  glukogenesis  yang  menjadi  dasar  terjadinya penyakit  metabolik  salah satunya  adalah  DM  tipe 2  (Malik,  2010;  Elliot  SS,  2002).  Publikasi  dari  hasil penelitian  yang  dilakukan  oleh  Fatma  Akar  menunjukkan  bahwa  diet  tinggi  fruktosa  menyebabkan terjadinya  stress  oksidatif  sebagai  pemicu  resistensi  insulin(Akar  F,  2012,  Martinez  MJ,  1994,  Bezzera RMN et al, 2001).
Selain  resistensi  insulin  yang  disebabkan  kondisi  hiperlipidemia  dan  hiperglikemia,  sebuah mekanisme novel resistensi leptin berkembang sebagai salah satu patofisiologi DM tipe 2. Masih terdapat perdebatan  mengenai  berapa  lama  paparan  fruktosa  yang  menyebabkan  resistensi  leptin.  Shapiro  dalam penelitiannya  menyebutkan  bahwa  tikus  menjadi  resisten  leptin  setelah  diberi  perlakuan  tinggi  fruktosa selama  6  bulan  (Shapiro  A  et  al,  2008).  Samantha  menyanggah  hasil  penelitian  Shapiro  karena  dalam penelitiannya  resistensi  leptin  dapat  diinduksi  oleh  fruktosa  pada  waktu  yang  lebih  pendek  4  minggu dengan konsentrasi yang sama (Haring SJ, 2011).
Penelitian ini ingin mengkonfirmasi berapa lama paparan fruktosa leptin dapat menginduksi resistensi  leptin.  Berdasarkan  kajian  literatur  sebelumnya,  masih  sedikit  publikasi  yang  menjelaskan patofisiologi resistensi leptin yang diinduksi fruktosa. Penelitian ini mencoba mengeksplorasi mekanisme resistensi  leptin  yang  diduga  disebabkan  oleh  penurunan  ekspresi  reseptor  leptin  tipe  b  utamanya  di intestinum dan di hipotalamus.

## Desain penelitian
Penelitian  ini  merupakan  penelitian true  experimental dengan post  test  only  control  group karena adanya intervensi perlakuan dengan menggunakan kontrol.

## Alat dan Bahan penelitian
Bahan  penelitian  yang  digunakan  adalah  HFCS  55%, staining  kit  Skytec  Laboratories Cat No  AMF080-IFU an  antibodi  primer Bioss  antibodies tipe Leptin  receptor  polyclonal  antibody bs- 0109R.Alat  penelitian  yang  digunakan  adalah  Mikroskop  Nikon  E-100  untuk  pengamatan  dan perhitungan jumlah ekspresi reseptor tipe b leptin.

## Adaptasi dan terminasi hewan coba
Sebanyak  30  tikus Rattus  Novergicus (200-250  gram)  diadaptasikan  dalam  kandang  yang suhu  ruangannya  dipertahankan  konstan  yakni  22±2ºC  dengan  kelembaban  relatif  50±15%  dan  siklus gelap terang 12 jam. Seluruh tikus jantan (28 ekor) yang telah diaklimatisasi selama satu minggu, dibagi menjadi  4  kelompok  secara  acak,  setiap  kelompok  terdiri  dari  7  ekor  tikus.  Masing-masing  tikusdiberi
label  pada  ekor  sesuai  kelompoknya  menggunakan  spidol  tahan  air.Kelompok  I  adalah  kontrol  dimana tikus    tidak  diberi  perlakuan  fruktosa  oral,  intake  minum  adlibitum  dan  pakan  sesuai  diet  standar. Kelompok  II,  III dan  IV secara beruturutan adalah tikus yang diberi fruktosa 10, 30 dan 55%. Fruktosa oral  diberikan  dengan  cara  disonde  kepada  hewan  coba  selama  8  minggu.  Selama  penelitian,  mencit diperlakukan  sebaik-baiknya,  diusahakan  agar  bebas stres,  leluasa  bergerak  dan  diberikan  makanan  dan minuman  setiap  hari  secara  ad  libitum.  Pengambilan  organ  mencit  dilakukan  setelah  8  minggu  untuk membandingkan apakah waktu yang lebih singkat dapat menyebabkan resistensi leptin secara bermakna. Berdarkan kajian literatur sebelumnya dari Harring SJ yang menyebutkan waktu induksi resistensi leptin seelah perlakuan dari diet tinggi fruktosa adalah 3 bulan atau 90 hari. Tikus dikorbankan dengan anaestesi urethane  pada  pagi  hari  setelah  dipuasakan  selama  8  jam.  Tikus  dibedah  dan  diambil  preparat  jaringan hipotalamus  dan  usus  halus.  Jaringan  tersebut  dicuci  dalam  dulbeccos  phosphate  buffered  saline  untuk mengeliminasi kontaminasi darah dan diawetkan menggunakan formalin 10%.

## Pembuatan slide Imunohistokimia
Tahapan  pembuatan  preparat  adalah:  (1)  fiksasi,  (2)  penanaman (embedding) ;  (3) pembelahan (sectioning) .  Setelah  preparat  jadi,  maka  dilakukan  proses  (1)  deparafinisasi  dan  rehidrasi; (2) antigen retrieval . Pewarnaan preparat menggunakan prosedur sesuai yang tertera di metode staining kit  yang  didapat  dari  Scytek  Laboratories    Cat  No  AMF080-IFU.  Tahapan  awal  dimulai  dengan  . meneteskan  Super  Block,  dilakukan  dengan  proses  pembilasan.  Setelah  itu  preparat  ditetesi menggunakan  antibody  primer  dan  inkubasi  sesuai  protokol  manufaktur.  Setelah  beberapa serial pencucian, preparat diberi Ultra tek HRP dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar Langkah  selanjutnya  adalah  menambahkan  kromogen  DAB  ke  preparat,  sebagai  counterstaining  adalah HE.  Ekspresi  protein  reseptor  leptin  tipe  B  terdapat  pada  sitoplasma  sel  yang  ditandai  dengan  warna coklat dan dihitung menggunakan mikroskop serta software masing-masing 10 lapang pandang setelah itu diukur nilai rerata ekspresinya.

## Analisa data
Uji  statistik  untuk  mengetahui  perbedaan  ekspresi reseptor  leptin  tipe  b  antar  masing-masing  kelompok menggunakan uji one Way Annowa. Nilai α ditetapkan 0,05 dengan derajat kepercayaan 95%.

## Hasil

## Fruktosa tidak mempengaruhi berat badan tikus
Tidak  terdapat    perbedaan  yang  signifikan  antara  berat  badan  sebelum  dan  sesudah  perlakuan pada kelompok P1 dan P3, namun tidak pada P2 yang menunjukan p=0,02<0,05. Namun dari keseluruhan grafik  kami  menyimpulkan  bahwa  pemberian  fruktosa  2  bulan  tidak  mempengaruhi  berat  badan  tikus pada 4 kelompok
Gambar  1. Nilai  rerata  berat  badan  sebelum  dan  sesudah  12  minggu  pada  masing-masing  kelompok.  K=kontrol; P1= perlakuan dengan fruktosa 10%; P2=perlakuan fruktosa 30%; dan P3 = perlakuan fruktosa 55%
Fruktosa menurunkan ekspresi reseptor leptin tipe b di hipotalamus dan intestinum Berdasar  hasil  uji  imunohistokimia,  tampak  gambaran  coklat  di  sitoplasma  yang  menandakan  ekspresi reseptor leptin tipe b positif baik di hipotalamus dan intestinum.
K P1 P2 P3
Gambar 2. Gambaran imunohistokimia ekspresi reseptor leptin tipe b di hipotalamus. Ekspresi + ditandai dengan warna coklat pada sitoplasma sel. Tanda panah adalah menunjukkan ekspresi positif reseptor leptin tipe b. K=kelompok kontrol; P1, P2 dan P3 berturut-turut=perlakuan fruktosa 10;30 dan 55%
Gambar  3. Rerata  jumlah  ekspresi  reseptor  leptin  tipe  b  di  intestinum  yang  ditunjukkan  dengan  tanda  panah K=kelompok kontrol; P1, P2 dan P3 berturut-turut=perlakuan fruktosa 10;30 dan 55%.
Gambar 4. Grafik yang menunjukkan nilai rerata ekspresi reseptor leptin tipe b di hipotalamus dan intestinum. K= kontrol; P1=fruktosa 10%; P2=fruktosa 30% dan P3=fruktosa 55%.
Berdasar uji one way Anova didapatkan adanya perbedaan signifikan jumlah ekspresi reseptor leptin tipe b  di  hipotalamus  antara  masing-masing  kelompok  baik  K,  P1,  P2,  P3    (p<0,05),  dimana  angkanya cenderung  meningkat  secara  bertahap  dari  kelompok  kontrol  ke  P1  diikuti  dengan  P2  namun  trennya menurun  pada  kelompok  P3.  Sementara  di  intestinum,  hasil  uji one  way  Anova menunjukka  adanya perbedaan  signifikan  antara  kelompok  P1  dengan  P2  dan  P2  dengan  P3  (p<0,05)  dengan  nilai  ekspresi yang menunjukkan tren menurun.

## Diskusi
Masih  terdapat  perdebatan  mengenai  kapan  waktu  terjadinya  resistensi  leptin  pada  paparan fruktosa  konsentrasi  tinggi.  Penelitian  Shapiro  membuktikan  bahwa  pemberian  fruktosa  dosis  tinggi selama  6  bulan  menginduksi  terjadinya  resistensi  leptin.  Pemeriksaan  Resistensi  leptin  oleh  Shapiro diperlihatkan  dengan  melakukan  pengamatan  setelah  injeksi  leptin  eksogenous,  dimana  pada  kelompok fruktosa  dosis  tinggi  tikus  tidak  menunjukkan  pola  perilaku  penurunan  nafsu  makan.  Penelitian  oleh Bursac berhasil membuktikan bahwa penurunan sensitivitas leptin terjadi pada pemberian fruktosa dosis tinggi  selama  8  minggu  (2  bulan).  Penurunan  sensitivitas  leptin  diukur  dengan  ekspresi  reseptor  leptin menggunakan  metode qPCR( Bursac, 2014). Penelitian kami  melengkapi hasil penelitian Bursac bahwa pemberian  fruktosa  dosis  tinggi  selama  8  minggu  menyebabkan  penurunan  sensitivitas  insulin  yang dilihat dari penurunan jumlah ekspresi reseptor leptin tipe b dari gambaran imunohistokimia.
Hasil  penelitian  ini  mendukung  penelitian  sebelumnya  bahwa  fruktosa  menginduksi  resistensi leptin. Terdapat beberapa mekanisme yang  mampu menjelaskan fenomena tersebut diantaranya adalah : defek  pada  produksi  leptin,  defek  transduksi  sinyal  yang  dimediasi  leptin  akibat  stress  reticulum endoplasma, stimulasi inflamasi kronis yang menyebabkan aktivasi jalur transduksi sinyal NFκB (Morris DL etal, 2009).

## Pengaruh fruktosa terhadap ekspresi reseptor leptin b di hipotalamus
Mekanisme  molekuler  yang  dapat  menjelaskan  terjadinya  resistensi  insulin  sentral  hipotalamus adalah  menurunnya  ekspresi  gen  pSTAT3  pada  pemberian  fruktosa  dosis  tinggi.  Pada  kondisi  normal leptin menyebabkan ekspresi reseptor tipe b melalui aktivasi jalur Jak-STAT3 fosforilasi. Ketika terjadi penurunan ekspresi pSTAT3 di hipotalamus, maka tentunya hal tersebut menyebabkan kegagalan ekspresi protein  reseptor  leptin  tipe  b.  Shapiro  menduga  bahwa  penurunan  ekspresi  STAT3  disebabkan  karena kegagalan  leptin  menembus  Blood  Brain  Barrier  akibat  tingginya  kadar  trigliserida  sehingga  tidak mencapai titik lokasi hipotalamus. Penelitian oleh Bursac senada dengan Shapiro bahwa resistensi leptin disebabkan  oleh  dislipidemia  yang  ditandai  dengan  peningkatan  trigliserida.  Penjelasan  yang  sedikit berbeda  diterangkan  oleh  Bursac  bahwa  peningkatan  trigiliserida  menyebabkan  adipogenesis  dan menurunnya  asam  lemak  bebas  di  hipotalamus.  Masih  belum  terdapat  data  mengenai  mekanisme trigliserida  dalam  menonaktifkan  ekspresi  reseptor  leptin  tipe  b  di  hipotalamus,  apakah  sesuai  yang dihipotesiskan  Shapiro  atau  bukan.  Bursac  melengkapi  efek  lanjutan  dari  penurunan  ekspresi  reseptor leptin  di  hipotalamus  yaitu  meningkatnya  ekspresi  reseptor  NPY  (neuropeptida  oreksigenik)  yang menyebabkan tidak adanya rasa kenyang sehingga menimbulkan perilaku makan berkepanjangan.

## Pengaruh Fruktosa terhadap ekspresi reseptor leptin tipe b di intestinum
Kami memiliki dugaan kemungkinan lain mengenai penurunan sensititas leptin yaitu penurunan kemampuan absorbsi leptin di saluran cerna. Adapun dasar hipotesis ini adalah masih adanya perbedaan hasil  mengenai  kadar  leptin  plasma  pada  pemaparan  fruktosa  dosis  tinggi.  Pada  beberapa  penelitian mengemukaan  bahwa  fruktosa  konsentrasi  tinggi  menyebabkan  tingginya  leptin  plasma,  sementara publikasi-publikasi lainnya menyatakan bahwa kadar leptin plasma tetap pada nilai normal.

## Kesimpulan
Salah  satu  mekanisme  resistensi  leptin  akibat  paparan  fruktosa  konsentrasi  tinggi  secara  kronis adalah adanya penurunan ekspresi reseptor leptin tipe b di hipotalamus dan di intestinum. Penelitian ini hanya  menggunakan  satu  serial  waktu.  Untuk  pengembangan  ke  depannya  perlu  dilakukan  penelitian lanjutan dengan banyak variasi waktu pengukuran dan mengeksplorasi  mekanisme transduksi sinyal yang memperantarai terjadinya penurunan ekspresi reseptor leptin tipe b di hipotalamus dan di intestinum.

## Ucapan terimakasih
Ucapan terimakasih disampaikan kepada Kementerian Agama yang sudah membiayai penelitian ini menggunakan alokasi dana BOPTN 2017.

## Referensi
Akar F, Uludag O, Aydin A, Aytekin YA, Elbeg S, Tuzcu M, Sahin K. 2012. High fructose corn syrup  causes  vascular  dysfunction  associated  with  metabolic  disturbances  in  rats  : Protective effect of resveratrol." Food and chemical Toxicology 50: 2135-2141.
Bezzera RMN,  Ueno M, Silva MS, Tavares DQ, Carvalho  CRO etal.2001.A high fructose diet induces insulin resistance but nod blood pressure changes in normotensive rats. Braz J Med Biol Res 34(9):1155-60
Bursac  BN,  Vasiljević  AD,  Nestorović  NM,  Veličković  NA,  Vojnović  Milutinović  DD etal.2014.High fructose diets leads to visceral adiposity and hypothalamic leptin resistance in male rats. J Nutr Biochem 25(4):446-55
Elliot  SS,  Keim  NL,  Stern  JS,  Teff  K  dan  Havel  PJ.2002.Fructose,  weight  gan  and  the  insulin resistance. Am J Clin Nutr 76:911-22
French SA,  Lin  B, Guthrie JF. 2003.National  trends in  soft drink  consumption  among children and  adolescents  age  6  to  17  years  :  Prevalence,  amounts  and  sources  1977/1978  to 1994/1998.J Am Diet Assoc 103:1326-1331.
Harring  SJ  dan  Harris  RBS.2011.The  relation  between  dietary  fructose,  dietary  fat  and  leptin responsiveness in rats. Physiol Behav 104(5):914-22
Malik, Popkin BM, Bray, GA, Despres J-P, Hu FB. 2010. Sugar Sweetened Beverages, Obesity, Type 2 Diabetes and. Circulation 12 (11): 1356-1364.
Martinez  FJ,  Rizza  RA,  Romero  JC.  1994.  High  fructose  feeding  elicit  insulin  resistance, hyperinsulinemia, and hypertension in normal mongrel dogs. Hypertension 23: 456-463.
Morris DL, Cho KW, Zhou Y, Rui L. SH2B1 enhances insulin sensitivity by both stimulating the insulin  receptor  and  inhibiting  tyrosine  dephosphorylation  of  insulin  receptor  substrate proteins.Diabetes. 2009; 58(9):2039–2047. [PubMed: 19542202]
Nielsen SJ and Popkin BM.2004.Changes in Beverage intake between 1977 and 2001.Am J Prev Med 27(3)205-210
Putnam  JJ,  Allshouse  JE.  1999.  Food  consumption,  prices,  and  expenditures,  1970–97. Washington, DC: Economic Research Service, US Department of Agriculture, Roglans N, Vila  L,  Farre  M,  Alegret  M,  Sanchez  RM,  Vazquez-Carrera  M,  Laguna  C.2007. Impairment  of  hepatic  Stat-3  activation  and  redux=ction  of  PPAR  activity  in  male  rats. Hepatology 45:778-788
Shapiro A, Mu E, Roncal C, Cheng KY, Johnson RJ, Scarpace PJ.2008.Fructose-induced leptin resistance exacerbates weight gain in response to subsequent high fat feeding Souza  AM,  Pereira  RA,  Yokoo  EM,  Levy  RB,  Sichieri  R.2013.Most  consumed  foods  in Brazil:National Dietary Survey 2008-2009.Rev Saude Publica 47.
Walker RW, Dumke KA, Goran MI. 2014. Fructose content in popular beverages made with and without high fructose corn syrup.Nutrition 30: 928-935.