Embriogenesis somatik pada kultur in vitro daun kopi robusta (coffea canephora var. Robusta chev.)
Embriogenesis somatik pada kultur in vitro daun kopi robusta (coffea canephora var. Robusta chev.)
Pinta MURNI 1)
1) Program Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Jambi. Jl Jambi Muara Bulian Km 15 Mendalo Darat, Jambi
ABSTRACT .  This  research  aims  to  induce  tissue  cells  of  robusta  coffee  leaves  ( Coffea  canephora var.  Robusta  Chev.)  for  embryogenesis  through  the  addition  of  growth  regulators  kinetin  and  2,4-D. The growth medium used is a solid Murashige-Skoog medium (MS). The added growth regulators are A = 10-7 Kinetin without 2,4-D, E = 5 x 10-6 M Kinetin and 2.5 x 10-5M 2,4-D; H = 5x10 -6 M Kinetin and 5x10 -5 M 2,4-D, I = 7.5 x 10 -6 M Kinetin and 5x10 -5 2,4-D. Explants used were the second leaf from top branch ortotroph  of coffee plants with  a size of about 0.5 x 1.0 cm. Observations were made on the percentage of live explants, explant growth response including the formation of callus, organogenesis, and  embryogenesis.  The  results  showed  that  the  planted  explants  are  100%  alive,  the  growth response in the form of direct somatic embryogenesis occurred on the addition of Kinetin 10 -7 without 2,4-D.  Other  Treatment,  E  produced  a  response  in  the  form  of  greenish  compact  callus,  while  two other treatments, H and I, form whitish crumb/fragile structured callus.  Thus, it was concluded that in vitro  culture  of  leaf  tissue  of  Robusta  coffee  (Coffea  canephora  var.  Robusta  Chev.)  on  Murashige- Skoog (MS) medium with the addition of kinetin growth regulators and 2,4-D at different concentrations produce higher different growth rate.  Response of growth that occurs is in the form of direct somatic embryogenesis, compact and crumb/fragile structured callus.  .
Keyword : somatic embryogenesis, organogenesis, in-vitro culture, Robusta coffee
ABSTRAK .    Penelitian  ini  bertujuan  menginduksi  sel-sel  jaringan  daun  kopi  robusta (Coffea canephora var.  robusta  Chev.)  untuk  embryogenesis  melalui  perlakuan  penambahan  zat  pengatur tumbuh kinetin dan 2,4-D. Media pertumbuhan yang digunakan media padat Murashige-Skoog (MS). Zat  pengatur  tumbuh  yang  ditambahkan  adalah  A  =  10 -7 Kinetin  dan  tanpa  2,4-D  ;  E  =  5  x  10 -6 M Kinetin dan 2,5 x 10 -5 M 2,4-D ; H = 5x10 -6 M Kinetin dan 5x10 -5 M 2,4-D ;  I = 7,5 x 10 -6 M Kinetin dan 5x10 -5 2,4-D.  Eksplan  yang  digunakan  adalah  daun  kedua  dari  pucuk  cabang  ortotrof  tanaman  kopi dengan  ukuran  sekitar  0,5  x  1,0  cm.  Pengamatan  dilakukan  terhadap  persentase  hidup  eksplan, respon  pertumbuhan eksplan  yang meliputi pembentukan kalus, organogenesis, dan embriogenesis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa eksplan yang ditanam hidup 100%, respon pertumbuhan berupa embriogenesis somatik langsung terjadi pada pelakuan A yaitu pada penambahan 10 -7 Kinetin tanpa 2,4-D.  Perlakuan  lainnya  E  menghasilkan  respon  tumbuh  berupa  kalus  yang  berstruktur  kompak berwarna  kehijauan,  sedangkan  dua  perlakuan  lainnya  H  dan  I  berupa  kalus  yang  berstruktur remah/fragil  berwarna  keputihan.  Dengan  demikian,  disimpulkan  bahwa  kultur in  vitro jaringan  daun kopi  robusta  ( Coffea  canephora var.  robusta  Chev.)  pada  medium  Murashige-Skoog  (MS)  dengan penambahan  zat  pengatur  tumbuh kinetin  dan  2,4-D  pada  konsentrasi    yang  berbeda  menghasilkan respon pertumbuhan yang berbeda. Respon pertumbuhan yang terjadi berupa embriogenesis somatik secara langsung, kalus yang berstruktur kompak dan remah/fragil.
Kata kunci : embriogenesis somastik, organogenesis, kultur in vitro , kopi robusta

## PENDAHULUAN
Teknik  kultur in  vitro dari  berbagai  jenis tumbuhan  akhir-akhir  ini  telah  banyak  dilakukan termasuk  untuk  jenis  kopi  (Coffea  sp).  Tenik  ini didasarkan  atas  sifat  totipotensi  sel  tumbuhan yang  berarti  setiap  sel  tumbuhan  mampu menurunkan  sifat  dan  mempunyai  potensi  yang sama  dengan  induknya  untuk  tumbuh  dan berkembang  bila  diberikan  lingkungan  yang sesuai.  Respon  pertumbuhan  secara  umum dalam  kultur in  vitro meliputi  diferensiasi langsung  maupun  tidak  langsung  yaitu  melalui pembentukan  kalus.  Kalus  merupakan  hasil antara
dalam morfogenesis, meliputi organogenesis dan embriogenesis dan akhir dari proses  ini  adalah  terbentuknya  planlet  (Thorpe, 1981).
Banyak  faktor  yang  mepengaruhi  keberhasilan kultur in  vitro ,  baik  faktor  dalam  seperti  kondisi sampel  yang  dijadikan  sebagai  eksplan  maupun faktor  luar  seperti  media  pertumbuhan  yang digunakan. Media perumbuhan merupakan campuran  berbagai  garam  mineral,  air,  asam amino,  vitamin,  gula,  zat  pengatur  tumbuh,  dan pemadat.  Media  pertumbuhan  Murashige  Skoog (MS)  merupakan  salah  satu  media  yang penggunaannya  lebih  luas  dalam  kultur in  vitro terutama  untuk  tumbuhan  berkayu  (Gunawan, 1995).
Jenis  dan  konsentrasi  zat  pengatur  tumbuh berperan  dalam  mengontrol  pertumbuhan  dan morfogenesis  (Wareing  dan  Phillips,  1973). Organogenesis  dan  embriogenesis  yang  berasal dari  kalus  telah  dihasilkan  dari  berbagai  jenis tanaman  yang  dikulturkan  dan  embrio  dapat dihasilkan  dari  sel-sel  somatik  ataupun  dari  sel gamet eksplan (Thorpe, 1981). Menurut Halperin dalam  Bhojwani  dan  Razdan  (1983)  secara anatomis dan histologis sel kalus yang dihasilkan dari kultur dapat dibedakan dalam dua tipe. Tipe yang  pertama  adalah  sel  yang  mempunyai vakuola  besar  dan  banyak,  biasanya  kurang ampu untuk membentuk embrioid dan tipe kedua adalah  sel  yang  mempunyai  sitoplasma  banyak, biasanya mampu membentuk embrioid.
Umumnya  induksi  yang  terjadi  akibat  pemberian zat  pengatur  tumbuh  dalam  kultur in  vitro dapat menyebabkan  terjadinya  pembelahan  sel  saja sehingga  menghasilkan  kalus  atau  induksi  yang menyebabkan terjadinya modifikasi gen sehingga sel  mengalami  morfogenesis  dan  diferensiasi termasuk  embriogenesis  somatik  (Street,  1973). Embrio  somatik  dicirikan  adanya  calon  akar  dan pucuk  pada  satu  sumbu  (Gunawan,  1995).
Selanjutnya  Rianawati,  dkk  (2009)  menyatakan bahwa  embriogenesis  somatik  pada  beberapa eksplan  tanaman  dapat  terjadi  secara  langsung maupun  tidak  langsung  atau  dapat  terjai keduanya pada eksplan yang sama

## BAHAN DAN METODE
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  media  pertumbuhan  Murashige-Skoog (MS) bentuk padat, eksplan jaringan daun kedua dari pucuk cabang ortotrof tanaman kopi robusta, zat  pengatur  tumbuh  Kinetin  dan  2,4-D,  sterilan klorox  atau  bayclin,  alkohol,  aluminium  foil, NaOH,  HCl,  detergen,  dan  spiritus.  Alat  yang digunakan  adalah  alat-alat  gelas,  botol  kultur, oven, autoklaf, hot plate dan magnetic stirrer, pH meter, timbangan analitis, laminar air flow, lampu spritus, pinset, pisau dan scalpel, mikroskop, dan kamera.
Alat-alat  gelas,  botol  kultur,  akuades,  dan  media pertumbuhan  semuanya    digunakan    dalam kondisi  aseptik  dan  disterilkan  dengan  autoklaf. Eksplan disterilkan dalam laminar air flow dengan menggunakan  bayclin/klorox,  alcohol  70%,  dan akuades untuk pembilas.
Sebelum  ditanam  eksplan  yang  sudah  steril dipotong  dengan  ukuran  sekitar  0,5  x  1,0  cm. Selanjutnya  ditanam  pada  media  partumbuhan sesuai  dengan  perlakuan  penambahan  zat pengatur tumbuh yaitu: 10 -7 M kinetin tanpa 2,4-D (A), 5 x 10 -6 M kinetin dan  2,5 x 10 -5 M 2,4-D (E), 5 x 10 -6 M kinetin dan 5 x 10 -5 M 2,4-D (H) dan 7,5 x 10 -6 M kinetin dan 5 x 10 -5 M 2,4-D (I)
Setelah  penanaman,  sampel  disimpan  dalam gelap  selama  2  x  24  jam,  selanjutnya  dipelihara di  rak  kultur.  Pengamatan  dilakukan  terhadap persentase  hidup  eksplan,    respon  pertumbuhan yang dapat dilihat secara visual, dan pengamatan  secara  mikroskopis  dari  hasil pertumbuhan.  Data  yang  diperoleh  dianalisis secara deskriptif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Persentase Pertumbuhan Eksplan. Hasil pengamatan  terhadap  eksplan  sampai  tiga minggu  masa  tanam,  menunjukkan  bahwa semua  eksplan  yang  ditanam  tetap  hidup. Ekspan  yang  masih  hidup  dicirikan  dengan adanya  bagian  daun  (eksplan)  yang  masih  hijau dan  adanya  respon  pertumbuhan  berupa  kalus dan butiran kecil warna keputihan pada sebagian eksplan.  Dengan  demikian,  persentase  hidup
ekplan  yang  ditanam  adalah  100%,  data selengkapnya disajikan pada Tabel berikut. Data ini  menunjukkan  bahwa  sel-sel  penyusun jaringan  daun  yang  dijadikan  eksplan  dapat menyerap  unsur  hara  dan  zat  pengatur  tumbuh yang  diberikan  dalam  media  pertumbuhan, sehingga terjadi metabolisme dan sel tetap hidup dan  selanjutnya  terjadi  pertumbuhan  yang  dapat diamati dari respon pertumbuhannya.
Respon  Pertumbuhan  Eksplan. Pengamatan setelah  tiga  minggu  masa  tanam,  menunjukkan bahwa terjadi respon pertumbuhan yang berbeda dari perlakuan yang diberikan. Respon pertumbuhan  yang  diamati  secara  visual  adalah pembentukan  embrio  somatik  langsung  dan kalus. Selengkapnya disajikan pada Tabel 1.
Tabel  1.  Persentase  Hidup  dan  Respon  Pertumbuhan  Eksplan  Daun  Kopi  ( Coffea  canephora var. robusta Chev.) pada Umur Tiga Minggu Setelah Tanam
Perlakuan Persentase hidup (%) Respon pertumbuhan Keterangan A 100 Embriogenesis langsung - E 100 Kalus SK, WKH H 100 Kalus SR, WKP, LB I 100 Kalus SR, WKP
Keterangan :
SK      = Struktur kalus kompak, SR      = Struktur kalus remah/fragi, WKH = Warna kalus putih kehijauan WKP  = Warna kalus putih, LB    = Ukuran kalus lebih besar dari perlakuan lainnya
Berdasarkan  hasil  pengamatan,  menunjukkan bahwa  konsentrasi  dan  jenis  zat  pengatur tumbuh  yang  berbeda,  memberikan  respon pertumbuhan  yang  berbeda.  Pemberian  10 -7 M kinetin tanpa auksin pada perlakuan A menginduksi sel-sel jaringan daun untuk membentuk  embrio  somatik  langsung  (Gambar 1.a).  Selanjutnya  pada  perlakuan  E  (5  x  10 -6 M kinetin  dan  2,5  x  10 -5 M  2,4-D)  menghasilkan kalus  yang  berstruktur  kompak  (Gambar  1.b.), perlakuan H ( 5 x 10 -6 M kinetin dan 5 x 10 -5 M 2,4-
D),  dan  perlakuan  I  (7,5  x  10 -6 M  kinetin  dan  5  x 10-5M 2,4-D) menghasilkan kalus yang berstruktur  remah  atau  fragil  (Gambar  1.c  dan d.).  Perbedaan respon tumbuh ini terjadi karena perubahan  keseimbangan  zat  pengatur  tumbuh dalam  sel  jaringan  eksplan  akibat  penambahan zat pengutur tumbuh secara eksogen. Perubahan keseimbangan  antara  zat  pengatur  tumbuh auksin  dan  sitokinin  mengakibatkan  terjadinya perubahan  fisiologis  sel  termasuk  perubahan metabolismenya, sehingga menghasilkan respon tumbuh yang berbeda. Hasil penelitian Rianawati,  dkk  (2009)  menunjukkan  bahwa embrio  somatik  dapat  diinduksi  melalui  tahapan inisiasi  kalus,  media  yang  paling  baik  untuk inisiasi  kalus  adalah  MI-3  yang  mengandung thidiazuron  0,1  mg/l  dan  10  mg/l  2,4-D.  Menurut
Wattimena  (1992)  morfogenesis  dari  eksplan bergantung  dari  interksi  antara  auksin  dan sitokinin,  selanjutnya  dinyatakan  Salisbury  dan Ross  (2000)  bahwa  kinetin  adalah  zat  pengatur tumbuh yang sangat aktif dari kelompok sitokinin, dan  dinyatakan  oleh  (Smith,  1992)  pengaruh sitokinin  dalam  kultur in  vitro antara  lain pembelahan  sel,  proliferasi  dan  morfogenesis pucuk.
Pengamatan Mikroskopis. Pengamatan mikrskopis hasil pertumbuhan eksplan
menunjukkan bahwa pada perlakuan A ditemukan  embrio  somatik  yang  berada  fada fase-fase  embriogenesis  yang  berbeda-beda. Fase  yang  ditemukan  adalah  fase  bulat (globular), fase hati (heart), da fase torpedo yang mulai  memperlihatkan  adanya  calon  pucuk  dan akar. (Gambar 2.). Perlakuan lainnya E, H, dan I menunjukkan adanya kumpulan sel-sel parenkim yang terdiri dari beberapa bentuk dan ukuran sel (Gambar 3.a).
Pengamatan  selanjutnya  terhadap  pertumbuhan dan perkembangan embrio somatik, menunjukkan bahwa pada umur delapan minggu setelah tanam embrio tersebut sudah
membentuk  tumbuhan  secara  utuh  (planlet) seperti disajikan pada Gambar 3.b.
Gambar 1.   Respon  pertumbuhan  eksplan  daun  kopi  :  a.  embriogenesis  somatik  langsung,  b.  kalus dengan  struktur  kompak,  c.  kalus  dengan  struktur  remah,  dan  d.  kalus  dengan  struktur lebih remah
Gambar 2. Fase embriogenesis somatik langsung: (a). fase globular, (b). fase heart, dan ©. fase torpedo
( a )
( b ) ( c )
( d ) ( a ) ( b ) ( c )
(a) (b)
Gambar 3. Sel-sel  dari  kalus  yang  remah  (a)  dan  planlet  dari  embriogenesis  somatik langsung (b)

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan,  disimpulkan  bahwa  kultur in  vitro jaringan  daun  kopi  robusta  ( Coffea  canephora var.  robusta  Chev.)  pada  medium  Murashige- Skoog  (MS)  dengan  penambahan  zat  pengatur tumbuh kinetin dan 2,4-D pada konsentrasi  yang berbeda  menghasilkan  respon  pertumbuhan yang berbeda. Respon pertumbuhan yang terjadi berupa  embriogenesis  somatik  secara  langsung, kalus yang berstruktur kompak dan remah/fragil.

## DAFTAR PUSTAKA
Bhojwani.S.S  dan  M.  K.  Razdan .  1983.  Plant Tissue  Culture  Theory  and  Practice. Elvisier. Amsterdam.
Gunawan,  L.W .  1995.  Teknik  Kultur  In  Vitro dalam  Hortikultura.  Penebar  Swadya. Bogor.
Rianawati,  S.,  Agus,  P.,  Budi,  M.,  Ridho,  K., dan  Suryanah 2009.  Embriogenesis somatik  dari  eksplan  daun  anggrek
Phalaenopsis  sp L.  Jurnal  Agronomi Indonesia (Indonesian Journal of Agronomy). Perhimpunan Agronomi Indonesia  dan  Departemen  Agronomi  dan
Hortikultura  Fakultas  Pertanian.    Institut Pertanian Bogor. Vol. XXXVII No. 3
Salisbury,  F.B  dan  C.W.  Ross .  2000.  Fisiologi Tumbuhan.  Jilid  Tiga.  Terjemahan  oleh Ratna Dewi Lukman. ITB. Bandung.
Smith. H.R. 1992. Plant Tissue Culture Techniques  and  Experiments.  Second Edition. Academic Press. New York.
Street, H.E. 1973. Plant Tissue and Cell Culture. Blackwell  Scientific  Publications.  Oxford. Melbourne.
Thorpe,  T.A. 1981.  Plant  Tissue  Culture Methods  and  Applications  in  Agriculture. Academic Press. New York.
Wareing,  P.F dan I.D.J.  Phillips .  1973.  The Control  of  Growth  and  Differentiation  in Plants.First  Edition.  Pergamon  Press. Oxford.
Wattimena.  G.A. 1992.  Bioteknologi  Tanaman. Dirjen  Dikti.  Pusat  Antar  Universitas. Bioteknologi.  Institut  Pertanian  Bogor. Bogor.