## KONSTRUKSI VEKTOR BINER GEN KAPPA(κ)-CARRAGEENASE DAN TRANSFORMASI KE Agrobacterium tumefaciens SEBAGAI MEDIA UNTUK  PEMBUATAN RUMPUT LAUT TRANSGENIK
BINARY VECTOR CONSTRUCTION OF KAPPA(κ)-CARRAGEENASE GENE AND TRANSFORMATION TO Agrobacterium tumefaciens AS MEDIATOR FOR SEAWEED TRANSGENIC GENERATION
Muh Alias L.Rajamuddin 1 , Alimuddin 2* , Utut Widyastuti 3 , Enang Harris 2 , dan Emma Suryati 4
1 Jurusan Budidaya Perikanan, Politeknik Pertanian Negeri Pangkep, Pangkep
1 Program Studi Ilmu Akuakultur, Sekolah Pascasarjana, IPB, Bogor
2 Departemen Budidaya Perairan, FPIK, Institut Pertanian Bogor, Bogor
3 Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor, Bogor
4 Balai Riset dan Pengembangan Budidaya Air Payau, Maros *E-mail: alimuddin_alsani@yahoo.com

## ABSTRACT
Increasing  of  kappa  (κ)-carrageenan  content  in  Kappaphycus  alvarezii  seaweed  is  potentially  be achieved by applying transgenesis technology. This study was performed to obtain a construction of κ-Carrageenase  gene  and  Agrobacterium  tumefaciens  to  carry  those  construction  genes.    The  κ- Carrageenase  (κ-Car)  gene  was  involved  in  κ-carrageenan  biosynthesis.  The  κ-Car  gene  sequence was ligated between the 35S CaMV promoter and tNos terminator sequences to generate pMSH/κ-Car expression vector. Transformation of pMSH/κ-Car plasmid to Escherichia coli was performed by heat- shock method, and to Agrobacterium tumefaciens by tri-parental mating method. The results showed that several colonies of  E. coli and A. tumefaciens grew in the selective culture mediums containing antibiotic. PCR analysis using primers 35S-Forward and tNos-Reverse with DNA template from those bacterial colonies resulted DNA fragment of about 2,000 bp, the same as the total length of 35S CaMV promoter,  κ-Car  gene  and  tNos  terminator  sequences.  Therefore,  the  construction  of  pMSH/κ-Car gene was succeeded and a colony of A. tumefaciens transformant carrying pMSH/κ-Car plasmid was successfully produced.
Keywords:  Agrobacterium tumefaciens, kappa(κ)-Carrageenase gene, transgenesis, vector

## ABSTRAK
Peningkatan  kandungan    kappa(κ)-karagenan  pada  rumput  laut Kappaphycus  alvarezii berpotensi dicapai melalui aplikasi teknologi transgenesis. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan konstruksi gen κ-Carrageenase, dan Agrobacterium  tumefaciens membawa  konstruksi  gen  tersebut. Gen  pe- nyandi enzim κ-Carrageenase ( κ-Car ) berperan dalam biosintesis κ-karagenan. Sekuen gen κ-Car dili- gasi  antara  sekuen  promoter    35S  CaMV  dan  terminator  Nos  untuk  menghasilkan  vektor  ekspresi pMSH/ κ-Car .  Ekspresi  gen κ-Car pada  plasmid  pMSH/ κ-Car diatur  oleh  promoter  35S  CaMV  dan terminator  Nos.  Transformasi  plasmid  pMSH/ κ-Car ke  bakteri Escherichia  coli dilakukan  meng- gunakan  metode heat-shock ,  sedangkan  ke Agrobacterium  tumefaciens menggunakan  metode tri- parental  mating .  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  beberapa  koloni  bakteri E.  coli dan A. tume- faciens tumbuh pada media selektif yang mengandung antibiotik. Analisis PCR dengan templat DNA dari koloni bakteri E. coli dan A. tumefaciens tersebut  menggunakan primer 35S- Forward dan tNos- Reverse menghasilkan  fragmen  DNA  berukuran  sekitar  2.000  bp,  sama  dengan  total  ukuran  sekuen promoter 35S CaMV, gen κ-Car , dan terminator tNos.   Hal tersebut menunjukkan bahwa konstruksi pMSH/ κ-Car telah berhasil dibuat, dan koloni A. tumefaciens transforman  positif membawa plasmid pMSH/ κ-Car telah dihasilkan.
Kata kunci:  Agrobacterium tumefaciens, gen kappa(κ)-Carrageenase , transgenesis, vektor

## I. PENDAHULUAN
Peningkatan  kandungan  karagenan pada rumput laut Kappaphycus alvarezii me- rupakan salah satu target rekayasa gen (trans- genesis)  yang  sangat  potensial  untuk  dilaku- kan.  Hal  tersebut  dapat  dicapai  dengan  me- nyisipkan  gen  penyandi  enzim κ-Carrageena- se yang terlibat dalam biosintesis karagenan.
Aplikasi  transgenesis  pada  rumput laut  (alga)  memperlihatkan  potensi  besar  di masa  mendatang  (Walker et  al. ,  2005;  Hall- mann,  2007;  Potvin    Zhang,  2010).  Bebe- rapa  penelitian  transgenik  pada  alga  yang telah  berhasil  dilakukan,  antara  lain:  pengu- jian  ekspresi  gen  β- glucuronidase (GUS) pada Laminaria  japonica (Li et  al. ,  2009), gen LacZ pada Gracilaria (Huddy et  al ., 2012),  gen Sitrat  sintase pada K.  alvarezii (Daud et  al .,  2013),  gen green  fluorescent protein (GFP) pada K. alvarezii (Rajamuddin et  al .,  2014),  gen Lizosim pada K.  alvarezii (Handayani et  al .,  2014),  dan  gen Metallo- thionein tipe  II  pada K.  alvarezii (Fajriah et al ., 2014).
Dalam rangka pembuatan rumput laut transgenik,  dua  tahap  awal  diperlukan  yaitu pembuatan vektor ekspresi gen dan penyedia- an  bakteri  transforman  sebagai  kendaraan/ biotranspor (Muladno, 2002). Terkait dengan biosintesis  kappa-karagenan,  telah  tersedia informasi sekuen gen penyandi enzim kappa - Carrageenase ( κ-Car ).  Gen  penyandi  enzim κ-Car mengonversi  µ-karagenan  menjadi  κ- karagenan  dalam  tubuh K.  alvarezii (Campo et al ., 2009), namun demikian sampai saat ini belum  ada  informasi  sekuen  gennya  dalam database.  Pembuatan  sekuen  gen  secara  sin- tetik dan pembuatan vektor ekspresi telah da- pat  dilakukan  menggunakan  metode  mole- kuler. Selanjutnya, teknik penyediaan bakteri Agrobacterium tumefaciens transformasi menggunakan  metode tri-parental  mating / TPM  (Bevan,  1984;  Guo et  al .,  2011)  juga sudah  dikembangkan  untuk  kebutuhan  pem- buatan  rumput  laut  transgenik.  Tiga  jenis bakteri  diperlukan,  yaitu Escherichia  coli DH5α  sebagai  vektor  kloning  dan  donor,
E.coli DH1  (pRK2013)  sebagai helper ,  dan A.  tumefaciens LBA4404  sebagai  resipien dalam proses TPM.
Agrobacterium  tumefaciens sebagai agen  transformasi  telah  digunakan  pada  pro- ses  transfer  gen  pada  makroalga  laut Por- phyra  yezoensis (Rhodopiceae)  (Cheney et al .,  2001;  Bernasconi et  al .,  2004),  pada K. alvarezii (Daud et  al .,  2013;  Handayani et al .,  2014;  Fajriah et  al .,  2014),  mikroalga Haematococcus  pluvialis (Kathiresan et  al. , 2009), mikroalga laut Schizochytrium (Cheng et  al. ,  2012),  dan  fungi  perairan Blastocla- diella  emersonii (Vieira dan  Camilo,  2011). Hingga saat ini belum ada K. alvarezii trans- genik  yang mengekspresikan gen κ-Car . Da- lam  rangka  pembuatan K.  alvarezii trans- genik  tersebut  yang  mampu  menyintesis  ba- nyak  kappa-karagenan,  sebagai  tahap  awal diperlukan  vektor  ekspresi  dan  biotranspor yang  membawa  vektor  ekspresi  tersebut. Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  dilakukan  un- tuk  mendapatkan  konstruksi  gen κ-Car dan bakteri A. tumefaciens yang membawa kons- truksi gen tersebut.

## II. METODE PENELITIAN
2.1. Sekuen dan Sumber Gen κ-Carragee-
nase
Gen κ-  Carrageenase ( κ-Car )  yang digunakan  pada  penelitian  ini  dibuat  secara sintetis in  vitro menggunakan  jasa  Genetika Science  (1st  BASE  Pte  Ltd.  Singapore)  ber- dasarkan sekuen gen κ-Car yang berasal dari Pseudoalteromonas (Zhou et al ., 2008) yang ada  di  bank  gen.  Sekuen  gen κ-Car disisip- kan  sementara  pada  vektor  kloning  pJET1.2 (Gambar 1) sebelum digunakan lebih lanjut.

## 2.2. Pembuatan Vektor Ekspresi pMSH/κ-
Car
Sekuen  gen κ-Car dari  plasmid pJET1.2 dikonstruksi (menggunakan jasa Ge- netika Science/1st BASE Pte Ltd. Singapore) ke  vektor  ekspresi  plasmid  biner  pMSH ( Nara  Institute  of  Science  and  Technology / NAIST, Japan), dan plasmid hasil ligasi dise-
pJET1.2-Emblcds- Carrageenase
4.168 bp Emblcds- Carrageenase (dari posisi 372)
Gambar 1.  Sekuen gen κ-Carrageenase (dalam kotak abu-abu pada gambar kanan) berukuran sekitar  1.200  bp  (pasang  basa)  diligasi  ke  vektor  kloning  pJET1.2  (gambar  kiri) menghasilkan  plasmid  pJET1.2-Emblcds- Carrageenase dengan  ukuran  total 4.168 bp.
but  pMSH/ κ-Car .  Plasmid  biner  pMSH  su- dah  umum  digunakan  sebagai  vektor  DNA plasmid  pada  transgenesis  yang  dimediasi oleh Agrobacterium tumefaciens . Sekuen  gen κ-Car disisipkan  pada daerah multiple  cloning  site (MCS)  pada plasmid  pMSH  (Gambar  2).  Selanjutnya plasmid  pMSH/ κ-Car ditransformasikan  ke sel  kompoten Escherichia  coli untuk  perba- nyakan plasmid.
Gambar 2.  Peta plasmid pMSH (NAIST, Ja- pan) (A) dan posisi insersi gen κ- Carrageenase ( κ-Car )  di  daerah multiple cloning site (MCS) plas- mid  pMSH,  RB: right  border , pNos: promoter Nos, NPT II: gen neomycin  phosphotransferase II penyandi resistensi antibiotik neomisin,  T:  terminator  Nos, HPT:  gen hygromycin  phospho- transferase penyandi  resistensi antibiotik  higromisin,  p35S:  pro- moter  35S  CaMV,  LB: left  bor- der .
2.3. Transformasi pMSH/κ-Car ke Esche- richia coli DH5α
Transformasi pMSH/ κ-Car ke bakteri E.  coli DH5α  menggunakan  metode heat- shock dan  identifikasi  koloni  transforman yang  membawa  plasmid  pMSH/ κ-Car dila- kukan  mengikuti  metode  Sambrook et  al . (1989)  dan  Suharsono et  al .  (2002)  dengan beberapa modifikasi.
2.3.1. Pembuatan Sel Kompeten Escheri-

## chia coli DH5α
Sebuah  koloni  bakteri E.  coli DH5α diambil dari  biakan  murni  dan  dikultur  dalam  2  mL media  cair  Luria  Bertani  (LB)  (1%  tripton; 0,5%  ekstrak  khamir;  dan  1%  NaCl)  dalam tabung  reaksi,  sebagai  subkultur  dan  diinku- basi  pada  suhu  37 o C  selama  16-18  jam  pada shaker inkubator  kecepatan  180  rpm.  Hasil kultur segar bakteri diletakkan di atas es sela- ma 30 menit. Sebanyak 1,5 mL disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 o C. Supernatan dibuang, pelet di- tambahkan transformation  buffer (TFB) CaCl 2 sebanyak  495  µL  (0,33  dari  volume 1,5 mL) dan diresuspensi,  kemudian diletak- kan  di  atas  es  selama  10  menit.  Selanjutnya disentrifugasi  dengan  kecepatan  10.000  rpm selama  5  menit  pada  suhu  4 o C.  Supernatan
dibuang  dan  pelet  ditambahkan  dengan  TFB sebanyak 125 µL (1/12 dari volume 1,5 mL) dan  antioksidan dimethylsulfooxide (DMSO) sebanyak 8,8 µL (7,8% dari volume 1,5 mL), kemudian  diletakkan  di  atas  es  selama  10 menit.  Bakteri  yang  telah  kompeten  siap  di- gunakan untuk transformasi.

## 2.3.2. Transformasi
Transformasi  dilakukan  dengan  cara mencampurkan  50  μL  sel  kompeten E.  coli DH5α dengan 5 μL plasmid pMSH/ κ-Car ke dalam tabung mikro, diinkubasi dalam es se - lama 20-30 menit, diberi kejutan panas ( heat- shock ) pada suhu 42 o C selama 45 detik untuk membuka pori sel bakteri, kemudian diletak - kan  dalam  es  selama  5  menit. Hasil  kejutan panas ditambahkan 100 μL media LB, selan- jutnya  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  pada shaker inkubator  dengan  kecepatan  200  rpm selama 30-60 menit.

## 2.3.3. Analisis Escherichia coli DH5α Transforman
Analisis keberhasilan transformasi  ke E.  coli dilakukan  dengan  pengujian  pada media  selektif  yang  mengandung  antibiotik, dan  analisis  PCR  koloni E.  coli hasil  trans- formasi.  Pengujian  pada  media  selektif  dila- kukan  dengan  cara  menumbuhkan  bakteri E. coli hasil transformasi pada media Luria Ber- tani  Agar  (LA)  (1%  tripton;  0,5%  ekstrak khamir; 1% NaCl, dan bacto agar 2,5%) yang mengandung antibiotik kanamisin dan higro- misin, masing-masing 50 mg/L. Bakteri yang tumbuh pada media tersebut merupakan kan- didat  transformasi  yang  membawa  plasmid pMSH/ κ-Car .
Analisis  PCR  dilakukan  untuk  meya- kinkan koloni bakteri transforman. PCR dila- kukan  menggunakan  primer  35S-F:  5’-ATG GCT  GGA  GTA  TTA  GCT  GGG-3’  dan tNos-R: 5’-CTC ATA AAT AAC GTC ATG CAT  TAC  A-3’  (didesain  oleh  Hannum, 2012). Templat DNA yang digunakan adalah koloni bakteri yang dilarutkan dengan ddH 2 O sebanyak 10 µL. Program PCR yang diguna- kan adalah pradenaturasi pada suhu 95 ° C se-
lama 5 menit, 30 siklus amplifikasi yang ter- diri  atas  denaturasi  pada  suhu  94°C  selama 30 detik, annealing pada suhu 56°C selama 1 menit, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 2 menit,  serta  ekstensi  akhir pada  suhu  72°C selama  5  menit  dan  pendinginan  pada  20°C selama  10  menit.  Sebanyak  10  μl  produk PCR  diseparasi  dengan  elektroforesis  100  V selama 30 menit pada gel agarosa 1% dengan menggunakan  bufer  TAE  1x  (stok  TAE  50x terdiri atas Tris base : 4,84 g, Acetic acid gla- cial :  1,14  mL,  EDTA  :  2  mL  pH  8  0,5  M, ddH2O  :  800  mL).  Hasil  elektroforesis  divi- sualisasi  dengan gel  documentation  system - UV  transilluminator .  Sampel  koloni  sebagai templat DNA juga digoreskan ke dalam mas- ter  plate ,  yang  merupakan  sumber  koloni bakteri  untuk  tahap  penelitian  berikutnya. Master  plate berisi  koloni  bakteri  transfor- man,  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  8 jam.

## 2.4  Transformasi pMSH/κ-Car ke Agro- bacterium tumefaciens
Transformasi  plasmid  pMSH/ κ-Car ke A.  tumefaciens dilakukan  menggunakan metode tri-parental  mating (TPM)  mengacu pada Bevan (1984), Liberty et al . (2008) dan Handayani et  al .  (2014)  dengan  beberapa modifikasi.  Proses  transformasi  mengguna- kan prinsip konjugasi melibatkan tiga macam bakteri,  yakni E.  coli DH5α  sebagai  donor pembawa  plasmid  pMSH/ κ-Car ,  bakteri E. coli DH1  (pRK2013)  sebagai helper ,  dan A. tumefaciens LBA4404 sebagai resipien. Bak- teri E.  coli DH5α  tahan  terhadap  antibiotik kanamisin R dan  higromisin R , E.coli DH1  ta- han  kanamisin R ,  dan A.  tumefaciens LBA44 04 tahan terhadap streptomisin R .
Ketiga  bakteri  ini  disegarkan  terlebih dahulu  dengan  mengkultur  pada  media  LB yang  ditambahkan  antibiotik  sesuai  resisten- sinya,  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37  C selama  24  jam  ( E.  coli DH5α  dan E.  coli DH1)  dan A.  tumefaciens pada  suhu  30  C selama 32 jam. Hasil kultur segar ditumbuh- kan masing-masing sebanyak 20 μl pada  me- dia  LA secara sendiri-sendiri (tunggal) seba-
gai kontrol positif dan secara mix (gabungan ketiganya)  untuk  proses  konjugasi.  Selanjut- nya  bakteri  diinkubasi  pada  suhu  30  C  sela- ma 32 jam.
Pembuktian  keberhasilan  transforma- si  pMSH/ κ-Car ke A.  tumefaciens hasil konjugasi  TPM,  dilakukan  menggunakan  uji pada  media  selektif  mengandung  antibiotik, dan  analisis  PCR  terhadap  koloni  transfor- man. Pada uji media selektif, koloni dari kul- tur  tunggal  (kontrol  positif)  maupun  kultur mix (hasil konjugasi), diambil satu gores dan dilarutkan dengan 1 ml LB, kemudian ditum- buhkan  pada  media  LA  yang  ditambahkan antibiotik higromisin. Biakan diinkubasi pada suhu  30  C  selama  32  jam.  Pada  analisis PCR, dilakukan sama seperti pada uji koloni E. coli transforman.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1.  Vektor Ekspresi pMSH/κ-Car
Gen κ-Carrageenase (berukuran seki- tar 1.200 bp) tersisip pada situs Not I dan Spe
I di daerah multiple cloning site (MCS) pada vektor pMSH yang dikendalikan oleh promo- ter 35S CaMV (berukuran sekitar 300 bp) di bagian depan, dan terminator Nos (tNos; ber- ukuran sekitar 500 bp) di bagian left border , sehingga  total  ukuran  sekuen  dari  promoter 35S,  gen κ-Car ,  sampai  dengan  tNos  adalah sekitar 2.000 bp (Gambar 3).

## 3.2.  Identifikasi  Escherichia  coli  DH5α Transforman
Bakteri E.  coli DH5α  hasil  transfor- masi  yang  ditumbuhkan  pada  media  selektif ditunjukkan  pada  Gambar  4A, E.  coli DH5α yang  bukan  hasil  transformasi  pada  Gambar 4B,  sedangkan E.  coli DH5α  yang  ditum- buhkan pada media tanpa antibiotik ditunjuk- kan pada Gambar 4C.
Kemampuan  koloni  bakteri E.  coli DH5α hasil transformasi untuk tumbuh pada media  selektif  menunjukkan  bahwa  bakteri tersebut mengandung pMSH/ κ-Car atau dise- but  sebagai  bakteri E. coli DH5α   transfor- man.  Bakteri  transforman  dapat hidup pada
Gambar 3.  Peta plasmid biner pMSH/ κ-Car : Gen κ-Carrageenase ( κ-Car ) tersisip pada situs Not I dan Spe I di daerah multiple cloning site (MCS) pada vektor pMSH. Panjang total sekuen dari p35S hingga terminator Nos (T) pada plasmid pMSH/ κ-Car ada- lah 2.000 bp.
Gambar 4.  Koloni  bakteri Escherichia  coli DH5α  pada  uji  media  selektif.  A:  Koloni-koloni bakteri  transforman (ditunjukkan dengan  tanda panah)  dapat  tumbuh  pada media selektif mengandung antibiotik, B: koloni E. coli DH5α tanpa transformasi, tidak dapat tumbuh, sebagai kontrol negatif, C: dan koloni E. coli pada media LA tanpa antibiotik sebagai kontrol positif.
Κ-Car Κ-Car
E1 E2 E3 E4 E5
media  selektif  karena  plasmid  pMSH/ κ-Car mengandung  gen neomycin  phosphotransfe- rase II (NPT II) penyandi resistensi terhadap kanamisin,  dan hygromycin  phosphotransfe- rase (HPT)  penyandi  resistensi  higromisin. Sebaliknya, E.  coli yang  bukan  transforman, tidak  dapat  tumbuh  pada  media  selektif (Gambar  4B).  Hal  tersebut  sejalan  dengan Muladno  (2002);  Tsen et  al .  (2002),  dan  Tu et al . (2005), bahwa apabila sel bakteri mem- bawa  DNA  rekombinan  (DNA  plasmid  dan gen insersi) ditumbuhkan pada media dengan antibiotik  marka  seleksi,  maka  sel E.  coli akan  mampu  berkembang  biak  membentuk koloni. Sebaliknya jika sel E. coli tidak mem- bawa  plasmid  gen  insersi,  akan  mati  pada media dengan antibiotik
Hasil verifikasi transforman lebih lan- jut  dengan  analisis  PCR  menggunakan  pasa- ngan primer 35S- Forward dan Tnos- Reverse disajikan pada Gambar 5. Lima sampel kolo- ni E.  coli DH5α  transforman  (Gambar  5A) menghasilkan  amplikon  dengan  posisi  frag- men sekitar 2.000 bp (Gambar 5B). Fragmen tersebut  sesuai  dengan  total  ukuran  sekuen promoter 35S CaMVsampai dengan termina- tor Nos (Gambar 3).  Hal  tersebut  juga   me- nunjukkan bahwa proses ligasi gen κ-Car ke
plasmid  pMSH,  dan  proses  transformasi pMSH/ κ-Car ke bakteri E. coli DH5α berha- sil dilakukan.

## 3.3. Identifikasi Agrobacterium tumefaci- ens Transforman
Uji  keberhasilan  konjugasi  dengan metode  TPM  untuk  transformasi  pMSH/ κ- Car ke Agrobacterium tumefaciens ditunjuk- kan  pada  Gambar  6.  Pada  kultur  tunggal, bakteri A.  tumefaciens yang  dikonjugasi  dan diinkubasi  pada  media  selektif  berhasil  tum- buh  (Gambar  6A),  sedangkan  ketiga  bakteri tidak tumbuh (Gambar 6B).
A.  tumefaciens transforman  mampu tumbuh  di  media  selektif  yang  ditambahkan antibiotik  (kanamisin,  higromisin  dan  strep- tomisin),  karena  selain  memiliki  gen  pe- nyandi  resistensi  streptomisin,  juga  telah membawa gen penyandi resistensi kanamisin dan higromisin yang terdapat pada konstruksi pMSH/ κ-Car .  Sementara  kultur  tunggal  (do- nor, helper dan resipien) tidak dapat tumbuh, karena donor E. coli DH5α maupun helper E. coli DH1  (pRK2013)  hanya  membawa  gen penyandi resistensi kanamisin dan higromisin saja,  tetapi  tidak  membawa  gen  penyandi resistensi streptomisin. Demikian juga resipi-
Gambar 5. Master  plate (replika)  koloni Escherichia  coli DH5α  transforman  (A),  elektro- foregram  hasil  amplifikasi  PCR  menggunakan  primer  35S-F  dan  tNos-R  meng- hasilkan  fragmen  sekitar  2.000  bp  (kepala  panah)  (B),  M:  marka gene  ruler 1kb DNA ladder , K+: produk PCR dengan templat plasmid pMSH/ κ-Car sebagai kon- trol  positif,  K-:  produk  PCR  dengan  templat  koloni  tanpa  transformasi  sebagai kontrol negatif, E1-E5: koloni bakteri E. coli DH5α hasil transformasi.
Gambar 6.  Koloni Agrobacterium  tumefaciens transforman  hasil  konjugasi  dapat  tumbuh pada  media  selektif  (tanda  panah)  yang  mengindikasikan  proses tri-parental mating /TPM  berhasil  dilakukan  (A),  sedangkan  kultur  tunggal  masing-masing: Escherichia  coli DH5α/donor  (1), E.  coli DH1  (pRK2013)/ helper (2), Agrobac- terium tumefaciens/ resipien (3) tidak tumbuh pada media selektif, sebagai kontrol negatif (B).
en A. tumefaciens (sebelum konjugasi)  yang hanya  resisten  streptomisin  tetapi  tidak  re- sisten  kanamisin  dan  higromisin.  Bakteri yang mampu tumbuh pada media selektif, ha- nya A. tumefaciens hasil konjugasi yang telah mengandung  gen  insersi  (Wise et  al .,  2006; Sanniyasi et al ., 2012 ) , dalam hal ini plasmid pMSH/ κ-Car .  Hasil  tersebut  menunjukkan bahwa  proses  transformasi  pMSH/ κ-Car ke A. tumefaciens telah berhasil dilakukan.
Hasil  analisis  PCR  disajikan  pada Gambar 7B, dengan templat DNA dari koloni A.  tumefaciens yang  tumbuh  pada  media  se- lektif  (Gambar  7A).  Ukuran  produk  PCR menggunakan  pasangan  primer  35S-F  dan tNos-R sama dengan hasil PCR dengan tem- plat DNA dari Escherichia coli DH5α trans- forman, yakni sekitar 2.000 bp (Gambar 7B). Produk PCR dengan primer 35S-F dan tNos- R (2.000 bp; Gambar 7B) sama dengan yang ukuran  total  ukuran  sekuen  promoter  35S, gen κ-Car ,  dan  tNos  (Gambar  3).  Selanjut- nya,  hasil  ini  mendukung  hasil  identifikasi transforman  melalui  uji  pada  media  selektif. Dengan  demikian  dapat  disimpulkan  bahwa proses  transformasi  konstruksi  gen  pMSH/ κ- Car berhasil  dilakukan  ke A.  tumefaciens . Bakteri A.  tumefaciens transforman  yang
membawa konstruksi pMSH/ κ-Car telah siap digunakan  untuk  perlakuan  ke  rumput  laut Kappaphycus alvarezii atau rumput laut jenis lainnya untuk pembuatan transgenik.
Proses  transfer  gen  untuk  pembuatan K.  alvarezii transgenik  dapat  dilakukan menggunakan  metode  elektroporasi  (Raja- muddin et  al .,  2014),  dan  metode  perantara A. tumefaciens (Daud et al ., 2013; Fajriah et al ., 2014; Handayani et al ., 2014).
Rumput  laut  yang  mengekspresikan gen κ-Carrageenase diharapkan  akan  memi- liki  kandungan  kappa-karagenan  lebih  ba- nyak daripada non-transgenik. Sebagai kelan- jutan  dari  riset  ini,  pembuatan Kappaphycus alvarezii transgenik  gen κ-Carrageenase menggunakan metode mediasi A. tumefaciens sedang dilakukan di laboratorium kami.

## IV. KESIMPULAN
Produk  PCR  dengan  templat  DNA dari Agrobacterium  tumefaciens berukuran sekitar  2.000  bp  menunjukkan  bahwa  kons- truksi gen pMSH/ κ-Car telah berhasil dibuat, dan Agrobacterium  tumefaciens yang  mem- bawa  konstruksi  gen  tersebut  telah  berhasil diperoleh.
Gambar 7. Master plate (replika) koloni A. tumefaciens transforman (A), dan elektroforegram amplikon  PCR  menggunakan  primer  35S-F  dan  tNos-R  dengan  fragmen berukuran sekitar 2.000 bp (B). Tanda kepala panah di sebelah kanan Gambar 5B menunjukkan  ukuran  produk  amplikon  PCR,  M:  marka gene  ruler 1kb  DNA ladder ,  K+:  produk  PCR  dengan  templat  plasmid  pMSH/ κ-Car sebagai  kontrol positif, K-: produk PCR dengan templat koloni tanpa transformasi sebagai kontrol negatif.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  kepada  Pusat Penelitian  Sumberdaya  Hayati  dan  Biotek- nologi  (PPSHB)  Institut  Pertanian  Bogor, dan Balai  Penelitian  dan Pengembangan  Bu- didaya  Air  Payau,  Maros  atas  bantuan  pera- latan,  fasilitas,  dan  dana.    Terima  kasih  juga kami  ucapakan  kepada anonymous  reviewer yang telah banyak memberikan komentar dan masukan untuk memperbaiki tulisan ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Bernasconi,  P., T. Cruz-Uribe, G. Rorrer, N. Bruce, and D.P. Cheney. 2004. Deve- lopment  of  a  TNT  detoxifying  strain of  the  seaweed Porphyra  yezoensis through  genetic  engineering. J.  Phy- col. , 40 (suppl 1):31.
Bevan, M. 1984. Binary Agrobacterium vec- tors  for  plant  transformation. Nucleic Acids Research , 12:8711-8721.
Campo,  V.L.,  D.F.  Kawano,  J.D.B.  Silva, and  C.I.  Ivone.  2009.  Carrageenans: biological  properties,  chemical  modi- fycations and structural analysis. Car- bohydrate Polymers , 77:167-180.
Cheney,  D.P.,  B.  Metz,  and  J.  Stiller.  2001.
Agrobacterium -mediated genetic transformation in the macroscopic red alga Porphyra  yezoensis . J.  Phycol. , 37:11-12.
Cheng,  R.,  R.  Ma,  K.  Li,  H.  Rong,  X.  Ling, Z. Wang, S. Yang, and  Y. Ma. 2012. Agrobacterium  tumefaciens mediated transformation  of  marine  microalgae Schizochytrium . Microbiological  Re- search , 167(3):179-186, doi: 10.1016/ j.micres.2011.05.003.
Daud, F.R., U. Widyastuti, Suharsono, E. Su- ryati,  dan  A.  Parenrengi.  2013.  Intro- duksi  gen Sitrat  sintase ke  dalam rumput  laut Kappaphycus  alvarezii menggunakan Agrobacterium tume- faciens. J.  Ris.  Akuakultur , 8(2):201- 208.
Fajriah, U., E. Suryati, A. Parenrengi, Suhar- sono, dan U. Widyastuti. 2014. Intro- duksi  gen Metallothionein tipe  II  ke dalam  rumput  laut Kappaphycus  al- varezii menggunakan Agrobacterium tumefaciens . J.    Ris.    Akuakultur, 9
(3):377-385.
Guo, M., X. Bian, X. Wu, and M. Wu. 2011. Agrobacterium -mediated genetic transformation:  history  and  progress.
A1 A2 A3 A4 A5
In: Alvarrez,  M.A.  ( ed .)  Genetic Transformation.  Rijeka.  InTech.  5- 28pp.
Hallmann,  A.  2007.  Algal  transgenics  and biotechnology. Trans  Plant  J., 1(1): 81-89.
Handayani, T., Alimuddin, U. Widyastuti, E. Suryati  E,  and  A.  Parenrengi.  2014. Binary  vector  construction  and  me- diated Agrobacterium  tumefaciens
transformation  of lysozyme gene  in seaweed Kappaphycus alvarezii. Biot- ropia, 21(2):80-90, doi:10.11598/ Btb.2014.21.2.2
Hannum,  S.  2012.  Isolasi,  pengklonan,  dan analisis  ekspresi  gen  penyandi Cop- per/Zinc Superoxide Dismutase ( Cuzn-SOD )  dari Melastoma  mala- bathricum L.  Disertasi.  Sekolah  Pas- casarjana  Institut  Pertanian  Bogor. Bogor. 107hlm.
Huddy,  S.M.,  A.E.  Meyers  and  V.E.  Coyne.
2012.  Transformation  of lac Z  using different  promoters  in  the  comerci- ally  important  red  alga Gracilaria gracilis.  African  J.    Biotech., 11(8): 1879-1885.
Kathiresan, S., A. Chandrashekar, G.A. Ravi- shankar,  and  R.  Sarada.  2009. Agro- bacterium -mediated transformation in the  green  alga Haematococcus  pluvi- alis (Chlorophyceae,  Volvocales). J. Phycol. , 45(3):642-649.
Liberty,  M.  Herman,  dan  G.A.  Wattimena. 2008.  Konstruksi  plasmid  biner  pem- bawa  gen Cry 1Ab  dan  transformasi plasmid  biner  dengan  metode tri  pa- rental mating . Zuriat, 19(2):130-139. Li,  F.,  S.  Qin,  P.  Jiang,  Y.  Wu,  and  W. Zhang.  2009.  The  integrative  expres- sion of GUS gene driven by FCP pro- moter in the seaweed Laminaria japo- nica (Phaeophyta). J.  Appl.  Phycol., 21:287-293.
Muladno.  2002.  Seputar  teknologi  rekayasa genetika.  Pustaka  Wirausaha.  Bogor. 123hlm.
Potvin, G., and Z. Zhang. 2010. Strategies for high-level  recombinant  protein  ex- pression  in  transgenic  microalgae:  a review. Biotechnology  Advances, 28: 910-918.
Rajamuddin, M.A.L., Alimuddin, U. Widyas- tuti, and I. Faizal. 2014. Evaluation of different  promoters  driving  the  GFP reporter  gene  in  seaweed Kappa- phycus  alvarezii . Indonesian  J.  Bio- technology , 19(2):129-135.
Sambrook,  J.,  E.D.  Fritsch,  and  T.  Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.  Second  Edition.  Cold  Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). 1.74-1.110pp.
Sanniyasi,  E.,  R.  Selvarajan,  P.  Velu,  and  P. Mylsamy. 2012. Construction of plant expression  vector  of  synthetic bt- cry1ac gene  for  genetic  transforma- tion. Elixir  Bio  Tech. , 53:11736- 11740.
Suharsono, U., Y. Fujisawa, T. Kawasaki, Y. Iwasaki,  H.  Satoh,  and  K.  Shimamo- to. 2002. The heterotrimeric G protein a  subunit  acts  upstream  of  the  small GTPase  Rac  in  disease  resintance  of rice. Proc. Natl. Acad. Sci. , 99:13307- 13312, doi:10.1073/pnas.192244099.
Tsen, S.D., S.S. Fang, M.J. Chen, J.Y. Chien,
C.C.  Lie,  and  D.H.L.  Tsen . 2002. Natural plasmid transformation in Es- cherichia  coli.  J.  Biomed  Sci., 9(3): 246-252.
Tu, Z., G. He, K.X. Li, M.J. Chen, J. Chang, L.  Chen,  Q.  Yao,  D.P.  Liu,  H.  Ye,  J. Shi,  and  X.  Wu.  2005.  An  improved system for competent cell preparation and  high  efficency  plasmid  transfor- mation  using  different Escherichia coli strains. Electronic  J.  Biotechno- logy , 8(1):113-120.
Vieira,  A.L.G.,  and  C.M.  Camilo.  2011. Ag- robacterium tumefasciens -mediated transformation  of  the  aquatic  fungus Blastocladiella  emersonii . Fungal Genetics and Biology, 48:806-811.
Walker, T.L., C. Collet, and S. Purton. 2005. Algal  transgenic  in  the  genomic  era. J.  Phycol., 41:1077-1093.
Wise,  A.A.,  Z.  Liu,  and  A.W.  Binns.  2006.
Three methods for introduction of fo- reign  DNA  into Agrobacterium . Meth. Mol. Biol., 343(1):43-54
Zhou, M., J. Ma, J. Li, H. Ye, K. Huang, and X.  Zhao.  2008.  A  κ-carrageenase from  a   newly   isolated   Pseudoalte- romonas-like  bacterium,  WZUC10. Biotechnology  and  Bioprocess  Engi- neering, 13:545-551.
Diterima : 14 Maret 2016 Direview         : 21 Juni 2016 Disetujui : 27 Juni 2016