PRODUKSI SERUM Rabbit Anti-Catfish TERHADAP PENYAKIT Motile Aeromonas Septicemia (MAS) PADA IKAN PATIN SIAM ( Pangasius hypophthalmus )
SERUM RABBIT PRODUCTIONANTI-CATFISHOF MotileAeromonas Septicemia (MAS) DISEASEINPATINSIAMESE( Pangasius hypophthalmus )
M. Bunyamin 1 ,  Mulyana 1 , Angela M. Lusiastuti 2
1 Jurusan Perikanan, Fakultas Pertanian, Universitas Djuanda Bogor, Jl. Tol Ciawi No. 1, Kotak Pos 35 Ciawi,  Bogor 16720.
2 Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar (BPPBAT) Bogor , Jl. Sempur No.1 Kota Bogor.

## ABSTRAK
Penelitian  mengenai  produksi  serum Rabbit  Anti-Catfish dengan  konsentrasi  terbaik  telah dilakukan untuk mendeteksi bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan patin siam ( Pangasius hypophthalmus )  menggunakan  metode  ELISA.    Serum  ikan  patin  diambil  melalui venacaudalis kemudian  diinjeksikan  secara  sub  kutan  pada  kelinci New  Zealand  White . MetodeELISA  yang  digunakan  adalah  metode indirect dan  dilakukan  untuk  memperoleh konsentrasi RAC yang tepat menggunakan 2 jenis Antigen (Ag) A. hydrophila yang berbeda yaitu  berupa  pelet  dan  supernatan.    Perbandingan  konsentrasi  RAC  yang  digunakan  yaitu 1:50,  1:100,  1:200,  1:500,  1:1000,  1:5000.  Parameter  yang  diamati  yaitu  konsentrasi  total protein serum dan serum yang sudah didialisis pada darah ikan patin dan darah kelinci. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbandingan antara RAC dengan PBS-T yang menghasilkan konsentrasi pengenceran terbaik yaitu 1:5000 untuk antigen pelet dan 1:200 untuk antigen supernatan.
Kata Kunci: ELISA, serum, rabbit anti-Catfish ,  ikan Patin, Pangasius hypophthalmus

## ABSTRACT
Research  on  the  production  of  serum  Rabbit  Anti-Catfish  with  the  best  concentration  was performed  to  detect  the  bacterium Aeromonas  hydrophila in  Siamese  catfish  ( Pangasius hypophthalmus )  using  ELISA  method.  Serum  catfish  taken  through  a  vein  caudalis  then injected  sub-cutaneous  in  New  Zealand  White  rabbits.  ELISA  method  used  is  the  indirect method and carried out to obtain the proper  concentration RAC uses two types of antigen (Ag) A.  hydrophila different  in  the  form of  pellet  and  supernatant.  RAC  concentration  ratio used  is  1:50,  1:100,  1:200,  1:500,  1:1000,  and  1:5000.  Parameters  observed  that  the concentration of serum total protein and serum blood that has been dialyzed in catfish and rabbit  blood.  The  results  showed  that  the  ratio  between  the  RAC  with  PBS-T  to  the concentration of the best dilution is 1:5000 for antigen pellets and 1:200 for the supernatant antigens.
Keywords: ELISA, serum, rabbit anti-Catfish, Patin, Pangasius hypophthalmus
Bunyamin M, Mulyana dan Lusiastuti AM.2015.  Produksi serum Rabbit Anti-Catfish terhadap penyakit Motile Aeromonas Septicemia (MAS) pada ikan Patin (Pangasius hypophthalmus. Jurnal Mina sains ... (...): ... - ....

## PENDAHULUAN
Ikan patin siam ( Pangasius hyphothalmus )  merupakan  salah  satu spesies  budidaya  perairan  tawar  utama yang  banyak  dibudidayakan  di  Indonesia disamping  ikan  mas,  lele  dan  ikan  nila dengan produksi pada tahun 2010 mencapai 104.574 ton (Dirjen Budidaya, 2011). Dalam dunia perikanan, ikan patin dikenal sebagai komoditi  yang  memiliki  prospek  cerah untuk dibudidayakan karena rasa dagingnya yang  lezat  dan  gurih.Selain  itu,  ikan  patin memiliki  beberapa  kelebihan  lain  seperti ukuran per individunya besar, mudah untuk dibudidayakan  dan  pertumbuhannya  yang pesat (Normalina, 2007).
Penyakit  merupakan  salah  satu  faktor yang dapat menghambat dalam peningkatan produksi  ikan  secara  intensif.  Salah  satu penyakit  utama  yang  menyerang  ikan menurut  Angka  (2004)  adalah  penyakit Motile  Aeromonas  Septicemia (MAS)  atau disebut dengan penyakit bercak merah ( red spot  disease )  yang  disebabkan  oleh  bakteri Aeromonas  hydrophila .  Penyakit  yang disebabkan  oleh  oleh  bakteri A.  hydrophila ini  sering  dihubungkan  dengan  perubahan kondisi lingkungan, tekanan-tekanan, termasuk  kepadatan  dalam  populasi, temperatur  tinggi,  rendahnya  oksigen terlarut,  status  nutrisi  yang  kurang  baik, infeksi  parasit  dan  kontribusi  perubahan fisiologis (Hayes, 2000).
Diagnosa  penyakit  ini  pada  ikan  lebih sulit  untuk  dilakukan.  Gejalanya  sering terkacaukan  oleh  trauma  ikan  yang disebabkan  perkelahian  antar  ikan  serta gejala  klinis  yang  tidak  spesifik  tergantung dari spesies ikan dan lingkungan sekitarnya. Oleh  karena  itu  diperlukan  strategi pengendalian  penyakit  akuakultur  yang lebih  baik  lagi  antara  lain  dengan  diagnosa penyakit  yang  cepat,  tepat,  dan  akurat (Austin & Austin, 1999 dalam Bijanti, 2011). Pemeriksaan  dapat  dilakukan  secara serologis  dan  klinis.  Pemeriksaan  secara serologis dapat dilakukan dengan menggunakan  beberapa  metode,  seperti Aglutinasi (AG), Haemaglutination Inhibition (HI),  Agar  Gel  Precipitation  Test  (AGPT),
Serum  Netralisasi  (SN), Enzyme  Linked Immuno  Sorbent  Assay (ELISA)  dan Flourescent  Antibody  Test (FAT)  (Halimah, 2001).  Dari  beberapa  metode  di  atas, metode  ELISA  merupakan  metode  yang paling  banyak  digunakan  karena  memiliki spesifisitas dan sensitifitas yang tinggi.
ELISA  merupakan  suatu  uji  serologik yang  menggunakan  kombinasi  antara antibodi  spesifik  dengan  enzim  yang berfungsi  sebagai  pelacak  keberadaan antigen.Adanya  ikatan antibodi  dan  antigen dapat  dideteksi  melalui  penambahan substrat  yang  akan  terurai  oleh  enzim penanda  tersebut  dan  dapat  dilihat  secara langsung  melalui  perubahan  warna  atau dengan menggunakan spektrofotometer(Zainuddin, 2009).
Berdasarkan teknik produksinya antibodi terbagi  atas  dua  yaitu  antibodi  poliklonal dan  antibodi  monoklonal.  Harga  antibodi monoklonal terbilang cukup mahal, sehingga diperlukan adanya penelitian yang bertujuan untuk membuat antibodi poliklonal dari serum kelinci spesifik untuk mendiagnosa  penyakit  MAS  atau red  spot disease .  Diharapkan  dengan  tersedianya antibodi poliklonal tersebut dapat menggantikan  antibodi  poliklonal  sebagai perangkat  diagnostik.  Dengan  demikian, diagnosa yang tepat penyakit MAS pada ikan patin dapat dilakukan dengan baik.
Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan untuk  memproduksi  serum  R abbit  Anti- catfish (RAC)  dan  memperoleh  kensentrasi terbaik sebagai bahan perangkat diagnostik.

## MATERI DAN METODE
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan Oktober 2012 sampai Februari 2013 di Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar (BPPBAT) Bogor.
Secara umum protein diukur menggunakan metode Bradford (1976).Darah ikan diambil dengan menyuntikkan  spuit  3  mL  ke  bagian vena caudalis .Darah  yang  sudah  diendapkan selama  24  jam  dipisahkan  dengan mengambil  serum  berupa  cairan  bening yang  telah  memisah  menggunakan  spuit  1
mL.  Serum  yang  masih  berada  pada endapan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 0 C.Serum yang dihasilkan dipisahkan kembali, disimpan  pada  suhu  –20 0 C  untuk  diproses lebih lanjut.
Sebelum  serum  siap  digunakan  untuk proses  produksi  antibodi  poliklonal  pada kelinci, serum ikan diproses terlebih dahulu dalam beberapa proses tahapan pemurnian untuk  mendapatkan  protein  spesifik. Tahapan pertama adalah mengisolasi serum ikan ke dalam bentuk murni dengan metode presipitasi  amonium  sulfat.  Tahapan purifikasi serum dilakukan dengan penambahan  ammonium  sulfat  jenuh  ke dalam serum dengan konsentrasi kejenuhan 100% dan dihitung menggunakan kalkulator  ammonium  sulfat.  Dari  175  mL serum  ikan  patin,  dilakukan  beberapa  kali proses  penambahan  ammonium  sulfat.  15 mL serum ikan patin ditambahkan 10,75 gr ammonium sulfat pada suhu 4 0 C, presentasi kejenuhan  yang  diinginkan  adalah  100% dengan  presentasi  kejenuhan  awal  0%. Volume  akhir  setelah  penambahan  10,75 gram  ammonium  sulfat  ke  dalam  15  mL serum adalah 20,71 mL.
Serum  dari  ikan  patin  dimasukkan  ke dalam beaker  glass sebanyak  15  ml.Serum tersebut ditambahkan ammonium sulfat dan di stirrer 24  jampada  suhu  4 0 C  (di  dalam refrigerator ).  Setelah  itu  disentrifus  3.000 rpm,  selama  30  menit  pada  suhu  4 0 C. Presipitat  (endapan)  yang  dihasilkan dilarutkan  ke  dalam  5  ml  buffer  karbonat- bikarbonat  (pH  9,6),  kemudian  disentrifus 3.000  rpm selama 30  menit pada suhu 4 0 C. Endapan  yang  dihasilkan  dikumpulkan  dan volumenya  dibuat  menjadi  2  mL  dengan penambahan  buffer  karbonat-bikarbonat. Selanjutnya 2 mL larutan tersebut disimpan pada suhu –20 0 C untuk proses pemurnian. Proses  pemurnian  dilakukan  dengan memasukkan  larutan  hasil  stirer  24  jam  ke dalam  membran  dialisis.Membran  dialisis tersebut terlebih dahulu direndam menggunakanPBS  (pH  7,2)  selama  24  jam. Selanjutnya membran dialisis diikat menggunakan  benang  dan  direndam  ke dalam  PBS  pH  (7,2)  selama  72  jam  pada
suhu  4 0 C.  Setelah  inkubasi  72  jam  larutan PBS  diambil  ±2  mL  untuk  direaksikan dengan  BaCl 2 10%  sebanyak  5  tetes,  jika masih terdapat endapan putih berarti masih terdapat  ammonium  sulfat,  dan  proses dialisis  dilanjutkan  selama  24  jam.Uji BaCl 2 kembali  dilakukan  sampai  tidak terbentuk  endapan,  hasil  pemurnian disimpan pada suhu –20 0 C untuk diinjeksikan ke kelinci.
Imunisasi  pada  kelinci dilakukan  dengan injeksi  secara subcutan menggunakan campuran  IgG  dan  adjuvant  seperti  pada Tabel  1.Pengambilan  darah  dilakukan setelah  14  hari  penyuntikan  akhir  selesai dilakukan.Darah  yang  dihasilkan  disimpan dalam refrigerator pada suhu 4 0 C selama 24 jam,  kemudian  serum  dipisahkan  dengan mengambil  cairan  bening  yang  telah memisah.Serum  yang  dihasilkan  diestimasi total  proteinnya  menggunakan  metode Bradford  dan  dipurifikasi  menggunakan metode  purifikasi  imunoglobulin  seperti pada ikan patin.
Tabel 1. Jadwal imunisasi pada kelinci
Penentuan  titer  antibodi  yang  berasal dari  serum  kelinci  yang  diimunisasi dilakukan  mengggunakan  metode indirect ELISA.Antigen  untuk  proses  ELISA  dibuat dari  bakteri Aeromonas  hydrophila dengan kode  AH 26 .  Bakteri  tersebut  dibarukan kembali  dan  diperbanyak  pada  media  TSA dan  diinkubasi  pada  suhu  28 0 C  selama  24 jam.  Setelah  inkubasi  dipindah-biakkan pada  media  salin  0,845%  satu  petri  ke dalam  10  mL  media  salin,  kemudian disonikasi pada 45 Hz selama 5 menit dalam keadaan dingin ( onice ). Bakteri dalam media salin  yang  sudah  disonikasi  disentrifus selama  60  menit  dengan  kecepatan  3000 rpm  dalam  suhu  4 o C.Endapan  (pellet)  dan supernatan  dipisahkan,  endapan  dilarutkan kembali dalam media salin 0,845%.
Tahapan  yang  dilakukan  dalam  uji  ini diantaranya  memasukkan  100  µl  antigen ditambah buffer karbonat-bikarbonat dengan  pH  9,6  ke  dalam  mikroplate, kemudian  dilakukan  inkubasi  24  jam  pada suhu  4°C.  Antigen  yang  dimasukkan  ke dalam  mikroplate  terdiri  dari  dua  kategori yaitu  untuk  antigen  pellet  dan  antigen supernatan.Setelah diinkubasi larutan tersebut  kemudian  dibuang  dan  mikrotiter plate  dicuci  menggunakan  PBS-TpH  7,4, kemudian  ditambahkan  3%  BSA  sebanyak 200 µl dan diinkubasi selama satu jam pada suhu  25°C.  Larutan  dibuang  kembali  dan mikroplate  dicuci  kembali  menggunakan PBS-T pH 7,4. Selanjutnya ditambahkan 100
µl PBS-T pH 7,2 dan antibodi sampel (1:50, dengan  PBS-T  pH  7,2)  sebanyak  100  µl, kemudian  dilakukan serial  dilution dan diinkubasi selama satu jam pada suhu 25°C. Larutan dibuang dan mikrotiter plate dicuci dengan PBS-T pH 7,4.
Tahap  selanjutnya  adalah  penambahan RACberbagai  konsentrasi  dengan  PBS-T  pH 7,2  sebanyak  100  µl  dan  diinkubasi  selama satu  jam  pada  suhu  25°C.  Perbandingan konsentrasi  RAC  dengan  PBS-T  yang digunakan adalah sebagai berikut:
A. Perbandingan  konsentrasi  RAC  :  PBS-T dalam uji ELISA = 1 : 50
B. Perbandingan  konsentrasi  RAC  :  PBS-T dalam uji ELISA = 1 : 100
C. Perbandingan  konsentrasi  RAC  :  PBS-T dalam uji ELISA = 1 : 200
D. Perbandingan  konsentrasi  RAC  :  PBS-T dalam uji ELISA = 1 : 500
E. Perbandingan  konsentrasi  RAC  :  PBS-T dalam uji ELISA = 1 : 1000
F. Perbandingan  konsentrasi  RAC  :  PBS-T dalam uji ELISA = 1 : 5000.
Selanjutnya larutan dibuang kembali dan mikrotiter plate dicuci menggunakan PBS-T pH  7,4,  kemudian  ditambahkan  enzim peroksidase  conjugate  anti-rabbit IgG dengan  perbandingan  1:5000  antara  enzim peroksidase dengan  PBS-T  pH  7,2  sebanyak 100 µl dan diinkubasi selama satu jam, pada suhu 25°C. Selanjutnya larutan dibuang dan mikrotiter plate kembali dicuci menggunakan  PBS-T  pH  7,4  kemudian ditambahkanTMB-ELISA 100 µl dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 25°C. Untuk  blanko  ditambahkan  terlebih  dahulu 100  µl,  1M  H 2 SO 4 diinkubasi  selama  20 menit  kemudian  ditambahkan  TMB.Sumur yang  dijadikan  blanko  pada  mikroplate adalah  lubang  pertama.Selanjutnya  reaksi dihentikan  dengan  menambahkan  100  µl, 1M H 2
SO 4 . Tahap terakhir adalah pembacaan OD menggunakan ELISA reader .
Hari
Ke- Volume IgG + Adjuvant Keterangan Perbandingan 0 0,2 mL + 0,2 mL Ig G + Freund’s Complete Adjuvant 1:1 3 0,4 mL + 0,4 mL Ig G + Freund’s Complete Adjuvant 1:1 7 0,6 mL + 0,6 mL Ig G + Freund’s Complete Adjuvant 1:1 9 0,8 mL + 0,4 mL Ig G + Freund’s Complete Adjuvant 2:1 13 1,0 mL + 0,5 mL Ig G + Freund’s Complete Adjuvant 2:1 15 2,0 mL + 2,0 mL Ig G + Freund’s Incomplete Adjuvant 1:1
Analisis Data Data  pengambilan  darah  dan  pemisahan serum,  data  estimasi  total  protein  serum, total  protein  setelah  purifikasi  ikan  patin dan  kelinci  dianalisa  secara  deskriptif. Untuk mendapatkan konsentrasi ELISA yang tepat  pada  uji  ELISA  data  yang  diperoleh diolah  dengan  membandingkan  antara berbagai perbandingan konsentrasi RAC.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari ikan patin 32 kg yang memiliki berat rata-rata  450  –  500  gram,  darah  diambil rata-rata  5  –  6  mL  per  ekor  ikan menghasilkan  darah  330,7  mL.  Setelah dilakukan  pemisahan  antara  darah  dan serum  diperoleh  serum  murni  sebanyak 192,6 mL.
Purifikasi serum dilakukan untuk memperoleh  spesifisitas  dan  kemurnian Immunoglobulin  (Ig).Kemurnian  maupun spesifitas imunoglobulin dapat ditingkatkan dengan  menghilangkan  protein  serum yang tidak diinginkan. Penelitian ini menggunakan  ammonium  sulfat  100% berdasarkan  kadar  jenuhnya.  Konsentrasi 100%  dianggap  lebih  dari  cukup  untuk dapat  memisahkan  protein  sekaligus  tetap mempertahankan  aktivitas  protein  yang dimiliki  oleh  serum.  Apabila  kemurnian suatu protein bertambah maka konsentrasinya  akan  berkurang.  Ketika suatu  larutan  garam  dengan  konsentrasi tinggi  dan  mengandung  banyak  ion  seperti ion  amonium  (NH 4+ )dan  ion  sulfat  (SO 42- ) ditambahkan  ke  dalam  larutan  yang mengandung protein, maka larutan tersebut akan  bersaing  dengan  protein  untuk mengikat  molekul  air  (Heymant,  1995).  Air akan  berpindah  dan  berikatan  dengan garam,  sehingga  kelarutan  protein  akan berkurang,  menyebabkan  pengendapan protein. Protein yang mengendap mempunyai  afinitas  yang  lebih  baik terhadap  molekul  protein  lain  daripada dengan molekul air (Harlow dan Lane 1988 dalam Ramlah, 2008). Kebanyakan antibodi akan  mengendap  pada  kondisi  50%  jenuh. Kelemahan  dari  pengendapan  dengan menggunakan  amonium  sulfat  ini  adalah protein  yang  diinginkan,  misalnya  antibodi,
tidak didapatkan dalam keadaan murni dan masih  terkontaminasi  oleh  protein-protein dengan  berat  molekul  tinggi  lainnya.  Oleh karena  itu,  pengendapan  dengan    sulfat tidak  dapat  digunakan  sebagai  metode tunggal,  tetapi  harus  dikombinasikan dengan metode lain agar diperoleh antibodi yang murni (Adyawati, 2003).
Hasil  endapan  yang  dihasilkan  dari proses  penambahan  ammonium  sulfat ditambahkan  buffer  karbonat-bikarbonat sebanyak  5  mL.  Selanjutnya  dilakukan sentrifugasi  untuk  mengendapkan  kembali dan  hasilnya  ditambahkan  kembali  buffer karbonat-bikarbonat  sebanyak  2  mL  untuk proses  dialisis.  Serum  sebanyak  188,9  mL dipurifikasi  13  kali  sehingga  diperoleh sebanyak  26  mL  atau  13,76  %  yang mengendap dan didialisis untuk mendapatkan protein serum murni.
Di  dalam  suspensi  yang  dihasilkan  pada proses  di  atas  masih  terdapat  kandungan garam ammonium sulfat, untuk menghilangkan  kandungan  tersebut,  maka dilakukan proses dialisis menggunakan PBS pH 7,2 selama 72 jam pada suhu 4 0 C. Dalam sampel yang terkumpul diperkirakan masih banyak mengandung garam dengan konsentrasi  yang  cukup  tinggi,  oleh  karena itu dilakukan dialisis untuk menukar buffer yang  dimiliki  oleh  sampel  dengan  buffer yang tidak mengandung garam sama sekali. Hal  ini  dilakukan  agar  sampel  dapat disimpan  dalam  waktu  lama  tanpa  adanya kemungkinan terjadinya penurunan aktivitas protein (Rizkiani, 2006). IgM yang telah diperoleh ditempatkan dalam membran (kantung dialisis) selektif permeabel yang direndam dalam PBS maka molekul-molekul garam akan keluar melalui pori-pori  kantung  secara  bertahap  hingga konsentrasi  garam  di  dalam  dan  diluar menjadi  sama.  Partikel  yang  berat  molekul besar  akan  tetap  dalam  kantung  dialisis sebaliknya  partikel  yang  berat  molekulnya kecil  akan  berdifusi  keluar  dari  kantung dialisis  (Harlow  and  Lane,  1988 dalam Ramlah, 2008). Proses dialisis ini dilakukan pada  suhu  4 o C  selama  48  jam.  Hasil purifikasi  serum  26  mL  di  dianalisis sebanyak  2  kali  menghasilkan  serum
protein murni 15 mL atau sebanyak 57,7 % yang bisa diimunisasi pada kelinci.
Estimasi  Total  Protein  Serum  dan  Total Protein Hasil Purifikasi
Untuk mengetahui kuantitas protein pada serum  ikan  dan  hasil  dialisis  dilakukan pemeriksaan  kandungan  protein  IgM dengan menggunakan metode Bradford dan dibaca  dengan  spektrofotometer  pada panjang gelombang 595 nm.Menurut Tort et al .  (2003)  immunoglobulin  yang  terdapat ikan  teleostei  terdiri  dari  IgM  dan  IgD.  IgM merupakan  immunoglobulin  utama  yang pertama  dihasilkan  dalam  respons  imun primer (Jawetz et al. , 1998). IgM merupakan kira-kira  10%  Ig  serum  dengan  berat molekul 970.000. Sampel yang diuji berupa serum  yang  diambil  dari  ikan  dan  serum yang  sudah  dilakukan  proses  purifikasi. Berdasarkan  hasil  uji  Bradford,  kuantitas protein dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Kandungan protein dalam sampel serum ikan patin
IgM yang ada pada serum ikan patin dan serum  yang  sudah  dipurifikasi  memiliki perbedaan kuantitasnya.Pada penelitian ini, kuantitas  protein  yang  ditemukan  pada serum  ikan  patin  adalah  sebanyak  0,733 gram/mL  dan  serum  yang  sudah  didialisis 0,004  gram/mL  atau  sekitar  0,55%.Hasil tersebut  menunjukkan  bahwa  protein  di dalam  serum  memiliki  kuantitas  protein lebih besar jika dibandingkan dengan serum yang  sudah  dilakukan  proses  pemurnian sampai  tahap  dialisis.  Kuantitas  protein sampel serum hasil dialisis sebanyak 70,5 % dari  sampel  serum  ikan  patin  dalam  ppm. Kuantitas  protein  dalam  sampel  tersebut diperoleh dari penghitungan rataan ulangan sampel  yang  dikurangi  dengan  rataan ulangan  blanko,  kemudian  dimasukkan  ke dalam persamaan yang diperoleh dari kurva standar protein.

## Imunisasi Pada Kelinci
Setelah  dilakukan  proses  purifikasi serum  dan  pengujian  total  protein  pada hasil  purifikasi.  Hasil  purifikasi  tersebut diimunisasikan  pada  kelinciselama  4 minggu.Dua  minggu  setelah  imunisasi terakhir, darah diambil dari kelinci.
Produksi  antibodi  pada  kelinci  dapat dirangsang  jika  antigen  terlebih  dahulu diemulsikan dengan suatu adjuvan. Adjuvan yang  paling  umum  digunakan  adalah Freund’scompleteadjuvant dan Freund’s incomplete  adjuvant .  Adjuvan  merupakan substansi yang apabila disuntikkan bersama-sama dengan antigen akan menambah  produksi  antibodi  dan  juga berfungsi memperlambat pengeluaran antigen  ke  dalam  tubuh.  Berbagai  macam substansi  dengan  komposisi  kimiawi  yang berbeda-beda telah dijumpai memilliki efek adjuvan.  Substansi  semacam  itu  meliputi alumunium  dan  garam-garam  alumunium lainnya,  natrium  alginate,  endotoksin bakteri,  dan  suspense  air  dalam  minyak dengan  atau  tanpa  mikrobakteri  yang  telah dimatikan.Adjuvan Freund’s terdiri  dari minyak  mineral,  zat  pengemulsi,  dan Mycobacterium  tuberculosis yang  telah dimatikan. Freund’s  complete  adjuvant dan Freund’s incomplete adjuvant hanya berbeda dalam  hal  ada  tidaknya  bakteri  tersebut yang dapat menambah aktivitasnya. Adanya minyak  mendorong  terjadinya  reaksi inflamasi  lokal  dan  pembentukan  jaringan granuloma di sekitar tempat suntikan.Antigen  yang  berada  di  dalam granuloma  ini  perlahan-lahan  keluar  ke dalam  tubuh  dan  menyediakan  rangsangan antigenik  yang  lama  (Rizkiani  2006). Menurut Baratawidjaya (2006), bila antigen tertentu dimasukkan ke dalam sistem imun hewan  percobaan,  semua  sel  B  yang mengenal banyak epitop pada antigen akan dirangsang  dan  memproduksi  antibodi. Darah  yang  diambil  dari  hewan  tersebut mengandung  antibodi  yang  multipel  yang akan  bereaksi  dengan  epitop.  Serum tersebut  disebut  poliklonal  oleh  karena mengandung  produk  yang  berasal  dari banyak  klon  sel  B.  Antibodi  selalu  bersifat
Nama Sampel Kuantitas Protein Ppm g/mL Serum ikan patin 260 0,733 Serum hasil dialisis 183,5 0,004
b
spesifik terhadap antigen tertentu, demikian juga  dengan  penelitian  ini,  penyuntikan menggunakan  protein  dari  serum  patin akan  menghasilkan  antibodi  poliklonal terhadap antigen ikan patin.

## Koleksi dan Purifikasi Serum Kelinci
Kelinci  yang  sudah  diimunisasi  dan dipelihara  selama  dua  minggu.  Setelah imunisasi  terakhir  dilakukan  pengambilan darah. Dari hasil pengambilan darah kelinci diperoleh  sebanyak  50  mL  dari  dua  kali pengambilan.Setelah  dilakukan  pemisahan antara darah dan serum diperoleh sebanyak 23,5 mL serum. Produksi serum pada kelinci menghasilkan  47%  dari  total  darah,  hal  ini berbeda  dengan  ikan  yang  mampu menghasilkan serum sebanyak 58,24% dari total darah.
Serum yang dihasilkan tersebut dilakukan  proses  purifikasi  dan  dialisis seperti  yang  dilakukan  pada  metode purifikasi  serum  ikan  patin.  Sebanyak  23,5 mL  serum  yang  dipurifikasi  dan  didialisis menghasilkan  sebanyak  5  mL  atau  21,27% dari total serum yang akan digunakan untuk deteksi menggunakan metode ELISA.

## Estimasi Total Protein Serum Kelinci dan Total Protein Hasil Purifikasi
Proses  pengukuran  total  protein  serum kelinci  dan  total  protein  hasil  purifikasi sama  halnya  dengan  pengukuran  yang dilakukan  pada  serum  dan  hasil  purifikasi serum  ikan  patin,  yaitu  menggunakan metode  Bradford.  Hasil  pengujian  total protein  serum  dan  proses  purifikasi  dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3.Total protein serum kelinci
Setelah dilakukan pengukuran konsentrasi  protein  di  dalam  serum  kelinci
dan serum yang telah dipurifikasi menggunakan  metode  Bradford  didapatkan konsentrasi  protein  pada  serum  sebanyak 1,241  g/mL,  sementara  setelah  dianalisis diperoleh  konsentrasi  protein  sebanyak 0,141  g/mL  atau  11,36%  dari  konsentrasi serum  kelinci.  Hal  ini  dikarenakan  pada serum  kelinci  masih  terdapat  banyak protein  di  dalamnya,  sementara  setelah proses  purifikasi,  protein  yang  diperoleh adalah protein spesifik yaitu IgG. IgG adalah antibodi utama dalam respon sekunder dan merupakan  pertahanan  inang  yang  penting terhadap  bakteri  yang  terbungkus  oleh virus-virus  (Jawetz et  al .,  1998).  Menurut Tizard  (1988),  IgG  adalah  imunoglobulin yang  terdapat  dalam  konsentrasi  tertinggi dalam serum dan strukturnya dapat dipakai sebagai model bagi imunoglobulin yang lain. IgG  mempunyai  berat  molekul  180.000 Dalton.

## Uji ELISA
Metode  atau  konfigurasi  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  metode  ELISA tidak  langsung  ( indirect ELISA).Komponen yang dibutuhkan pada Indirect ELISA adalah antibodi,  RAC,  antibodi  sampel, Peroksidase Conjugate  anti-rabbit IgG,  TMB-ELISA,  PBS- T dan H 2 SO 4 . Percobaan ELISA yang dilakukan meliputi  perbandingan  antara  RACyang telah  diproduksi  pada  kelinci  dengan larutan  pencuci  (PBS-Tween  pH  7,2). Perbandingan  ini  diuji  untuk  mengetahui hasil pembacaan terbaik pada ELISA reader yang  dapat  dijadikan  acuan  untuk perbandingan  antara    RAC  dengan  PBS-T pada  saat  deteksi  menggunakan  metode ELISA. Perbandingan
berbagai perbandingan yang digunakan dapat dilihat Gambar 1. Nama Sampel Kuantitas Protein Ppm g/mL Serum Kelinci 440 1,241 Serum hasil dialisis 50 0,141
(A) (B) (C) (D) (E) (F) (G) (H) (I) (J) (K) (L)
Gambar 1. Konsentrasi RAC; menggunakan antigen pelet (A) 1:50, (C) 1:100,  (E)  1:200,  (G)  1:500,  (I)  1:1000,  (K)  1:5000;  menggunakan antigen  supernatan;  (B)  1:50,  (D)  1:100,  (F)  1:200,  (H)  1:500,  (J) 1:1000, (L) 1:5000
Hasil  pengukuran  menggunakan ELISA reader terhadap  perbandingan RAC  dengan  PBS-T  menggunakan  dua jenis  antigen  yaitu  antigen  pellet  dan antigen supernatan dari bakteri Aeromonas  hydrophila menunjukkan nilai  kerapatan  optik  ( optical  density ) terbaik pada perbandingan 1:200 untuk antigen  supernatan  dan  1:5000  untuk antigen  pellet.  Hal  ini  ditunjukkan dengan  nilai  kerapatan  optik  pada kedua perbandingan ini yang cenderung tidak  mengalami  peningkatan  dan penurunan grafik yang cukup tinggi bila dibandingkan dengan perbandingan lain baik dari antigen pellet maupun antigen supernatan.
Nilai  kerapatan  optik  pelet  1:200 memiliki kisaran pembacaan yang tidak terlalu  besar  jika  dibandingkan  dengan perbandingan 1:50, 1:100, 1:500, 1:100, dan 1:5000. Jika semua hasil pembacaan ELISA reader dibandingkan,  maka perbandingan  RAC  +  PBS-T  1:200  lebih bagus hasilnya daripada yang lain. Nilai kerapatan  optik  yang  terbaca  pada ELISA reader cenderung  tidak  ada peningkatan  angka  yang  tinggi  bila dibandingkan dengan pengenceran lain.
Pada  metode indirect ELISA,  plat dilapisi  dengan  antigen  yaitu  protein konjugat.Antibodi  dan  sampel/standar diinkubasi secara bersamaan, kemudian dimasukkan  ke  dalam  lubang  plat  yang berisi  antigen.  Seperti  halnya  ELISA kompetitif  langsung,  kompetisi  akan terjadi antara standar dan sampel untuk berikatan  dengan  antibodi.  Setelah pencucian ditambahkan antibodi sekunder  yang  dilabel  dengan  enzim. Adanya  reaksi  komplek  antara  antigen dengan  antibodi  akan  memberikan warna  setelah  penambahan  substrat, yang dapat diukur dengan menggunakan ELISA reader
(Spektrofotometer) (Maryam, 2007). Pelapisan  antigen  ataupun  antibodi terjadi  secara  adsorpsi  pasif  ke permukaan  mikroplat  karena  adanya
interaksi  hidrofobik  antara  protein nonpolar dengan matrik plastik. Interaksi  ini  dipengaruhi  oleh  muatan protein  dimana  tiap-tiap  protein memiliki  konstanta  pengikatan  yang berbeda-beda.  Reaksi  antara  antigen dan  antibodi  dipengaruhi  oleh  faktor intrinsik diantaranya temperatur,
distribusi  waktu  inkubasi  dan  pH (kondisi  buffer).  Umumnya  temperatur yang digunakan adalah 37 0 C, temperatur ruang dan 4 0 C. Memperpanjang waktu inkubasi antigen dapat  menurunkan  reaktivitas,  karena ada  pengaruh  pelapisan  berlebihan. Waktu  inkubasi  yang  diperlukan  agar terjadi 90% adsorbsi adalah minimal 2- 6  jam  inkubasi.  Untuk  mudahnya bekerja  maka  mikroplat  dibiarkan dilapisi  selama  semalam pada  suhu  4 0 C atau  suhu  kamar  atau  pada  suhu  37 0 C selama 1-3 jam (Crowther,  1995).

## KESIMPULAN
Koleksi  serum  ikan  patin  sebanyak 63 ekor dengan berat rata-rata 450-500 gram  diperoleh  sebanyak  330,7  mL darah  dan  menjadi  192,6  mL  serum. Setelah   proses  purifikasi  dihasilkan  26 mL dari presipitasi amonium sulfat dan 15 mL setelah dialisis.
Imunisasi  pada  kelinci  dilakukan secara  sub  kutan,  antibodi  yang diperoleh dari hasil purifikasi disuntikkan  dengan  terlebih  dahulu dicampur dengan adjuvant .
Uji  ELISA  yang  dilakukan  untuk mengetahui  konsentrasi  yang  tepat untuk  pengenceran  antara  RAC  dengan PBS-T menghasilkan konsentrasi pengenceran yang terbaik yaitu antigen pelet  adalah  1:5000,  sedangkan  untuk antigen supernatan adalah 1:200.

## DAFTAR PUSTAKA
Adyawati  M.  2003.  Produksi  Antibodi Poliklonal  Kambing Terhadap Canine Parvovirus Tipe  2  (CPV-2)  Untuk
Pengembangan  Bahan  Perangkat
Diagnostik.Skripsi.
Fakultas
Kedokteran Hewan IPB. Bogor.
Angka  SL,  Priosoeryanto  BP,  Lay  BW, Harris  E.  2004.  Penyakit Motile Aeromonad  Septicaemia Pada  Ikan Lele  Dumbo  ( Clarias sp.):  Upaya
Pencegahan dan Pengobatannya Dengan Fitofarmaka. Forum Pascasarjana. IPB. Bogor. Baratawidjaja  KG.  2006.  Imunologi Dasar  Edisi    ke  tujuh.  Balai  Penerbit Fakultas  Kedokteran  Universitas Indonesia. Jakarta.
Bijanti  R,  Gandul  M,  Wiwik  T,  2011. Antigenesity  Protein  of Aeromonas hydrophila caused  ulce  desease  on Goldfish ( Cyprinus carpio Linn.) Using
Indirect  ELISA  technique.  Faculty  of Veterinary Medicine,
Airlangga University. Surabaya. Crowther  JR.  1995.  ELISA  Theory  and Practice. Totowa,  New Jersey: Institute  for  Animal  Health,  Woking, UK. 42: 38-39.
Dirjen Budidaya. 2011. Statistik Perikanan Budidaya Indonesia. Kementrian  Kelautan  dan  Perikanan. Ditjen. Perikanan Budidaya. Heymant JM. 1995. Purifikasi Imunoglobulin.  Dalam:  Teknologi ELISA dalam Diagnosis dan Penelitian
(Penterjemah:  Artama  WT,  Editor Burgess GW). Yogyakarta: UGM Press. Hal: 33-49.
Hayes  J.  2000.  springtearmproject. oregonstateuniversity.net/aeromona shydrophila.net /html.
Jawetz E, Melnick JL, Adelberg EA. 1998. Mikrobiologi  Kedokteran.  Edisi  20. Alih  Bahasa:  Edin  Nugroho  dan  RF Maulany.  Jakarta:  Penerbit  Buku Kedokteran EGC.
Maryam  R.  2007.  Metode  Deteksi Mikotoksin. Balai Penelitian
Veteriner. vol 7: 20-21.
Normalina I. 2007. Pemanfaatan Ekstrak Bawang Putih ( Allium sativum) Untuk Pencegahan  dan  Pengobatan  Pada Ikan Patin ( Pangasiodon hypophthalmus) yang diinfeksi
Aeromonas  hydrophila .  Skripsi.  IPB
Bogor.
Ramlah.
2008. Purifikasi dan Karakterisasi  Immunoglobulin  Y (IgY) Spesifik KHV Dari Serum Ayam Single  Comb  Brown  Leghorn .  Skripsi. FKH IPB Bogor.
Rizkiani  F.  2006.  Produksi  Antibodi Poliklonal  Oleh  Toksin  Insektisida Photorhabdus  spp .  Dan  Deteksinya Dengan Teknik Nitrocellulose Membrane  –  Enzyme-Linked  Immuno Sorbent  Assay (NCM-ELISA).  Skripsi. Fakultas MIPA, IPB. Bogor.
Tizard  IR.  1988.  Pengantar  Imunologi Veteriner.  Penerjemah  Soehardjo Hardjosworo.  Airlangga  University Press.
Tort  L,  Balasch  JC,  Mackenzie  S.  2003. Fish  Immune  System.  A  Crossroads Between Innate and Adaptive Responses.  Immunologia  22  (3)  : 277-286.
Zainuddin  N.  2009.  Kajian  Penggunaan ELISA  Sebagai  Uji  Cepat  Dalam Mendeteksi Salmonella spp Pada Hati Sapi Impor. Tesis. IPB. Bogor.