## PEMBUATAN PEPTON DARI BUNGKIL KEDELAI DAN KHAMIR DENGAN ENZIM PAPAIN UNTUK MEDIA PERTUMBUHAN BAKTERI

## [Peptone Production From Soybean Press Cake and Yeast
By Papain Enzyme For The Bacterial Growth Media]
Fachraniah 1) , Dedi Fardiaz 2) , dan Tami Idiyanti 3)
1) Mahasiswa Program Studi Ilmu Pangan PPs-IPB
2) Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi-Fateta-IPB
3) Puslitbang Kimia Terapan-LIPI- Serpong

## ABSTRACT
Peptone can be produced from soybean press cake and yeast by enzymatic hydrolysis with papain. The activity of papain used in this experiment against casein is indicated by Vm (2000 unit) and Km (0.8%). The process condition for soybean press cake was : [S] = 3.72%, [E] = 0.4%, 60 0 C, pH 6.2-6.3, 5 hours, while for yeast was [S] = 4.76%, [E] = 0.2%, 60 0 C, pH 5.8-5.9, 5 hours. The yield of the hydrolysis process of soybean press cake peptone  was 12.1%, while that of yeast  was 18.9%. The peptone obtained was brownish yellow in color with moisture content of 3 and 5%, ash content 6 and 7 %, total protein 9 and 11%, solubility 98%, amino nitrogen 1.9 and 2.82, and AN/TN ratio = 26.47 and 27.62%, respectively. The chromatographic pattern of the peptone using gel filtration column of Superdex-75 appeared to be the same as that of the commercial soy pepton. Growth test with E. coli, S. aureus, and B. subtilis showed that soybean press cake and yeast peptone could be used as component in media for microbial growth.
Key  words : Enyzme papain, E. coli, S. aureus, B. substilis, and peptone

## PENDAHULUAN
Pepton  sebagai  sumber  nitrogen  utama  dalam media komersial untuk  pertumbuhan bakteri, saat ini masih diimpor  dengan  harga  tinggi.  Pepton  adalah  produk campuran  polipeptida,  dipeptida,  dan  asam  amino,  dapat dihasilkan  dari  bahan-bahan  yang  mengandung  protein melalui  reaksi  hidrolisis  asam  atau  enzimatis.  Bungkil kedelai  dan  khamir  merupakan  limbah  yang  mengandung protein  tinggi.  Bungkil  kedelai  adalah  sisa  dari  proses ekstraksi minyak kedelai dengan kadar protein sekitar 40% (Fardiaz & Yasni, 1998), sedangkan khamir adalah limbah dari industri bir dengan kadar protein sekitar 55% (Atmaka, 1997).  Kedua  bahan  berprotein  ini  dapat  dimanfaatkan sebagai sumber bahan baku pembuatan pepton yang nilai ekonominya jauh lebih tinggi.
Papain  adalah  protease  yang  dapat  diperoleh  dari getah pepaya. Saat ini papain sudah dapat diisolasi untuk dapat  digunakan  sebagai  katalis  dalam  hidrolisis  protein. Atas dasar pemanfaatan limbah  dan enzim yang tersedia, penelitian  ini  dilaksanakan  dengan  tujuan  untuk mendapatkan  teknologi  proses  pembuatan  pepton  dari bungkil  kedelai  dan  khamir  menggunakan  papain.  Pepton yang  dihasilkan  selanjutnya  digunakan  sebagai  campuran media pertumbuhan bakteri.

## Bahan dan Alat
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium Mikrobiologi dan Lab. Analisis Pusat Penelitian Kimia (P2K) LIPI, PUSPIPTEK, Serpong.
Bahan  utama  yang  digunakan  adalah  bungkil kedelai yang diperoleh dari LIPI Bandung, endapan khamir dari  pabrik  Bir  PT  Multi  Bintang  Indonesia  Jakarta, sedangkan  enzim  papain  kasar  dihasilkan  di  P2K,  LIPI, Serpong. Baktri uji  yaitu E. coli, S. aureus, dan B. subtilis diperoleh  dari  Lab.  Mikrobiologi  P2K  LIPI  Serpong. Peralatan  yang  digunakan  antara  lain  Certomat  WR  (B Braun Biotech Int.), Sentrifus (Beckman), Spektrofotometer UV/Vis  (Hitachi  U-2000),  Freeze-drier  (Dura-Dry  MP),  dan Khromatografi  filtrasi  gel  AKTA  explorer  (Pharmacia Biotech).
Metode Pengujian  aktivitas  enzim  papain  dilakukan terhadap  kasein  1%  pada  suhu  40 0 C  selama  5  menit. roduksi  pepton  dilakukan  pada  kondisi  protein  terlarut optimum.  Untuk  menghilangkan  aktivitas  enzim  dilakukan pemanasan pada 90 0 C selama 5 menit, dilanjutkan dengan sentrifugasi  dan  pemisahan  enzim  dengan  ultrafiltrasi (membran 10.000da),selanjutnya permeat dikeringbekukan. Pengukuran protein terlarut dilakukan dengan

## METODOLOGI
spektrofotometri  (Lowry,  1951).  Produk  bubuk  yang dihasilkan  dikarakterisasi  meliputi  kelarutan,  nilai  N  total dan    nilai  N  amino  (Silvestre,  1996).  Pola  kromatografi pepton diamati pada kolom filtrasi gel Superdex-75 dengan eluen  bufer  asetat  pH  5.6.  Efektivitas  produk  terhadap pertumbuhan  bakteri  uji  dilakukan  dengan  mengamati  % transmitans medium pertumbuhan ( 1 ml biakan simpanan pada 50 ml pepton 0.5 %) selama 24 jam (Susetyo, 2000). Hasil  pertumbuhan  tersebut  dilanjutkan  dengan  angka lempeng  total  (ALT)  pada  medium  agar  nutrien  (NA) dengan masa inkubasi 24 jam.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Aktivitas enzim papain
Aktivitas proteolitik papain pada subtrat kasein 1%, suhu 40 0 C dan inkubasi selama 5 menit  memberikan nilai 1164  unit.  Unit  dalam  hal  ini  didefinisikan  sebagai  jumlah g  produk  (tirosin)  yang  terbentuk  per  mg  per  menit  dari substrat  kasein  pada  kondisi  di  atas.  Dari  hasil  analisis menggunakan kurva Lineweaver-Burk diperoleh karakteristik  dari  papain  yang  bersangkutan  adalah  Vm sebesar 2000 unit dan Km =  0.8 %.

## Pemilihan kondisi reaksi hidrolisis
Kondisi  hidrolisis  umumnya  dipengaruhi  oleh konsentrasi  substrat,  konsentrasi  enzim,  suhu,  pH,  dan waktu (Muchtadi et al., 1992).
Kebutuhan banyaknya substrat bungkil kedelai dan khamir  bagi  enzim  papain    ditentukan  dengan menggunakan  jumlah  substrat  yang  bervariasi  antara  1  – 10% (b/v). Hidrolisis dilakukan pada konsentrasi enzim 1% dengan  waktu  1  jam  dan  suhu  60 0 C.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  konsentrasi  substrat  bungkil  kedelai 3,72%  atau  setara  dengan  1,32  %  protein  bungkil  kedelai
sudah cukup untuk dijadikan dasar dalam produksi pepton selanjutnya,  sedangkan  untuk  substrat  khamir  dibutuhkan konsentrasi  4,76%  atau  setara  dengan  2,6%  protein khamir.
Untuk masing-masing jumlah substrat maksimum di atas  dilakukan  hidrolisis  dengan  menggunakan  papain pada  konsentrasi  di  bawah  1%.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  laju  reaksi  optimum  pada  proses hidrolisis bungkil kedelai cukup dibutuhkan papain dengan konsentrasi  0,4%  dan  menghasilkan  protein  terlarut sebesar  11  mg/ml,  sedangkan  untuk  khamir  cukup dibutuhkan  papain  dengan  konsentrasi  0,2%  dan menghasilkan protein terlarut sebesar 13,64 mg/ml. Hal ini diduga  karena  protein  khamir  lebih  sederhana.  Hubungan antara  konsentrasi  substrat  dan  enzim  pada  proses hidrolisis kedua substrat di atas dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2. Rasio konsentrasi enzim papain terhadap substrat bungkil  kedelai  masih  dapat  dilakukan  pada  1  :  20 sedangkan untuk khamir masih dapat dilakukan pada rasio 1  :  30.  Netto  &  Galeazzi  (1998)  melaporkan  rasio enzim/substrat untuk hidrolisis isolat protein kedelai dengan pankreatin  adalah  1/35  sementara  Henn  &  Netto  (1998) mengamati  hidrolisis  isolat  protein  kedelai  dengan pankreatin pada rasio enzim/substrat 1/15.
Perlakuan pada beberapa kondisi suhu (40 – 80 0 C) menunjukkan laju hidrolisis optimum untuk bungkil kedelai dapat  dicapai  pada  suhu  70 0 C  sedangkan  laju  optimum untuk  khamir  adalah  60-70 0 C.  Dapat  disimpulkan  bahwa suhu 60 0 C adalah optimum untuk kedua substrat tersebut. Papain  termasuk  protease  yang  tahan  terhadap  suhu tinggi.  Tsumura  et  al.,  (2000)  melakukan  hidrolisis  protein kedelai  pada  suhu  60  -  80 0 C  dengan  berbagai  protease khususnya  papain  sementara  Liener  (1981)  menyebutkan suhu optimal untuk papain adalah 50 – 60 0 C.
5 7 9 11 13 15 0 20 40 60 80 100 [S ]/[E] P ro t te rl a ru t (m g /m l) Gb. 1. Pengaruh rasio [S]/[E] pada  hidrolisis bungkil oleh papain 5 10 15 20 25 30 35 0 20 40 60 80 100 [S]/[E] P ro t. T e rl a ru t (m g /m l)
Gb. 2. Pengaruh rasio [S]/[E] pada  hidrolisis  khamir kedelai oleh papain
Dari hasil percobaan pada berbagai kondisi pH awal (5,0;  5,5;  6,0;  6,5;  7,0;  7,5  dan  8,0)  ternyata  pH  optimal untuk bungkil kedelai adalah pada pH 6-8 sedangkan untuk khamir  adalah  5-7.  Hal  ini  diduga  karena  struktur  protein kedua substrat berbeda. Papain relatif stabil di daerah pH netral, dan diamati hidrolisis protein kedelai optimum pada pH  5-8  (Cowan,  1983;  Tsumura  et  al.,  2000)  sedangkan Liener  (1981)  menyebutkan  aktivitas  papain  berada  pada selang pH 3 sampai 11.
Hidrolisis protein bungkil kedelai dan khamir dengan papain  pada  kondisi  optimal  yang  didapatkan  di  atas diamati  masing-masing  selama  20  dan  8  jam.  Kurva hidrolisis  ditunjukkan  pada  Gambar  3  dan  4.  Kurva hidrolisis  yang  dihasilkan  menunjukkan  kenaikan  jumlah protein terlarut yang tajam pada awal reaksi sampai 5 jam, selanjutnya  mulai  melambat.  Netto  &  Galeazzi  (1998) mengamati  kecepatan  hidrolisis  isolat  protein  kedelai dengan pankreatin, tinggi pada 4 jam pertama, selanjutnya kecepatan mulai menurun. Hal ini diduga disebabkan oleh beberapa hal, yaitu penurunan ikatan peptida yang spesifik bagi  enzim  (sesuai  untuk  aksi  enzim  tersebut),  inhibisi produk dan inaktifasi enzim,  kompetisi antara substrat asli atau  protein  yang  tidak  terhidrolisis  dengan  peptida  yang terbentuk selama hidrolisis.
pernyataan  ini  dengan  menyebutkan  bahwa  peptida dihasilkan  dengan  proteolisis  parsial  memiliki  ukuran molekul  yang  lebih  kecil  dan  struktur  sekunder  yang  lebih sedikit dari protein aslinya.

## Produksi pepton
Pepton  diproduksi  pada  kondisi  hidrolisis  yang diperoleh  sebelumnya.  Untuk  bungkil  kedelai  digunakan substrat 3,72%, enzim 0,4%, suhu 60 0 C, waktu 5 jam dan pada  pH  sesuai  dengan  kondisi  campuran  awal  (6,2-6,3). Untuk khamir digunakan substrat 4,76%, enzim 0,2%, suhu 60 0 C, waktu 5 jam dan pH sesuai dengan kondisi campuran awal  (5,8-5,9).  Rendemen  produk  untuk  bungkil  kedelai sebesar  12,1%  (b/b)  sedangkan  untuk  khamir  sebesar 18,8% (b/b).
Rendemen  pepton  khamir  lebih  besar  bila dibandingkan  dengan  pepton  dari  bungkil  kedelai,  hal  ini diduga  karena  bentuk  atau  struktur  protein  dari  kedua bahan  tersebut  berbeda.  Netto  &  Galeazzi  (1998) menyebutkan  seringkali  sulit  bagi  protein  dalam  bentuk alami  ( native )  seperti  protein  kedelai  untuk  mengalami dekomposisi  dengan  enzim  hidrolitik  seperti  protease. Disebutkan  pula  bahwa  denaturasi  protein  dengan  panas, alkohol,  dll  umumnya  dilakukan  lebih  dahulu  sebelum
Waktu hidrolisis rata-rata dari berbagai isolat protein kedelai  dengan  pankreatin  dilaporkan  berkisar  dari  0,8 sampai  4,2  jam  (Henn  &  Netto,  1998).  Dilaporkan  pula bahwa isolat protein kedelai dengan indeks dispersi protein lebih  tinggi  dan  mengandung  semua  sub  unit  fraksi polipeptida  yang  larut  air,  memiliki  protein native .  Protein dengan  komposisi  demikian  memerlukan  waktu  hidrolisis yang  lebih  panjang.  Enzim  mula-mula  memecah  protein besar ke dalam bentuk yang lebih kecil, sebagian fragmen larut,  seterusnya  terhidrolisis  menjadi  peptida  yang  lebih kecil.  Pada  tahap  akhir  hidrolisis  protein  menjadi  lebih banyak terlarut. Wu et al., (1998) juga mendukung
diperlakukan  dengan  hidrolisis  proteolitik.  Dilaporkan protein kedelai terdiri atas 2 komponen utama, glisinin dan -konglisinin  yang  memiliki  bobot  molekul  antara  20 sampai  90  kDa  (Lei  et  al.,  1983;  Romagnolo  et  al.,  1990; Fukushima,  1991).  Dilaporkan  pula  ikatan  disulfida intermolekular  yang  terdapat  pada  glisinin  akan  terbuka atau putus selama hidrolisis (Lei et al., 1983). Pembukaan ikatan  residu  asam  amino  terjadi  selama  hidrolisis  protein kedelai  oleh  enzim  karena  pemutusan  ikatan  peptida (Fukushima, 1991).
10 12 14 16 18 20 22 0 5 10 15 20 Waktu (jam) P ro t te rl ar u t (m g /m l) Gb. 3. Pengaruh lama waktu hidrolisis bungkil kedelai terhadap protein 15 16 17 18 19 20 21 22 23 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Waktu (jam) P ro t. te rl a ru t (m g /m l)
Gb. 4. Pengaruh lama waktu hidrolisis khamir terhadap protein terlarut
Khamir pada umumnya memiliki berbagai protease endogenous  dengan  pH  dan  temperatur  optimum  yang berbeda-beda  (Kelly,  1983),  sehingga  papain  diduga berperan  membantu  meningkatkan  hasil  akhir  (rendemen) dan laju kelarutan.

## Karakterisasi produk
Produk  dikarakterisasi  kelarutannya  dalam  air  dan derajat  hidrolisisnya  melalui  perbandingan  nilai  nitrogen amino  dan  nitrogen  total  (AN/TN).  Sebagai  standar digunakan Soy  peptone dari  Scharlau  dan Bacto  peptone dari Difco. Hasil  ditabulasikan pada Tabel 1.
papain  dalam  hal  ini  cukup  efektif  memutuskan  ikatan peptida  dalam  protein  bungkil  kedelai  dan  khamir  menjadi produk pepton.

## Pola kromatografi pepton pada kolom filtrasi gel
Pepton  bungkil  kedelai  dan  pepton  khamir  yang dihasilkan  difraksinasi  dengan  kolom  Superdex-75  (tinggi paking    30  cm,  diameter  1,5  cm)  dengan  eluen  bufer asetat pH 5.6. Fraksi-fraksi diamati absorbansinya pada 280  nm  pada  spektrofotometer.  Pola  kromatogram terlihat pada Gambar 5 dan 6. Berdasarkan data elusi tersebut
Tabel 1.  Nilai  kelarutan, Ntotal dan Namino pepton Nama pepton Kelarutan (%) Ntotal (TN) Namino (AN) AN/TN(%) Pepton bungkil kedelai 97,6 7,33 1,94 26,47 Pepton khamir 98,5 10,21 2,82 27,62 Soy pepton Scharlau 99,9 8,62 1,73 20,07 Bacto pepton Difco 99,9 13,93 1,52 10,91
Kelarutan  pepton  yang  dihasilkan  sedikit  lebih rendah  dibandingkan  dengan  pepton  standar  sedangkan rasio AN/TN menunjukkan hasil  yang lebih besar dari  soy pepton  dan  bacto  pepton.  Hal  ini  diduga  dari  tahap  akhir pembentukan  produk  yang  digunakan  berbeda.  Penelitian ini  menggunakan  membran  ultrafiltrasi  dengan  MWCO 10.000 dalton. Untuk menghasilkan filtrat yang lebih jernih lagi dapat digunakan membran yang lebih kecil dari 10.000 dalton.  Dilaporkan  ultrafilter  5.000-10.000  dalton  efektif untuk  memisahkan  semua  fraksi  peptida  yang  lebih  besar (Lahl & Braun, 1994).
Nilai  AN/TN  pepton  bungkil  kedelai  dan  pepton khamir  yang  dihasilkan  sedikit  lebih  besar  bila dibandingkan dengan pepton standard. Rasio AN/TN dapat menunjukkan  derajat  hidrolisis  (Lahl  &  Braun,  1994). Pepton dari kasein dan konsentrat protein whey dilaporkan memiliki  AN/TN  sebesar  24%  sedangkan  peptidanya masing-masing 48% dan 43% (Lahl & Braun, 1994). Quest International  memproduksi HY-Soy dan HY-Yest .  HY-Soy didefinisikan  sebagai  sumber  peptida  kualitas  tinggi  yang dihasilkan  melalui  hidrolisis  enzimatis  protein  kedelai.  HY- Soy  memiliki  nilai  AN  sebesar  1.9,  TN  9.5,  dan  AN/TN sebesar  20.0%.  HY-Yest  didefinisikan  sebagai  ekstrak alami  dari  pertumbuhan  primer  khamir  yang  diperoleh dengan pengeringan beku. HY-Yest memiliki nilai TN 10.8 – 11.5%. Cowan (1983) melaporkan beberapa jenis pepton untuk  mikrobiologis,  diantaranya  hidrolisis  protein  daging dan protein kedelai dengan papain. Nilai AN dan TN pepton daging  sebesar  1.7  dan  14.5,  sedangkan  untuk  pepton kedelai  adalah  1.0  dan  10.1.  Bila  dibandingkan  dengan beberapa hasil yang sudah dilaporkan, dapat dikatakan
disimpulkan bahwa ada 3 puncak yang muncul pada hasil hidrolisis  selama  5  jam.  Pola  ini  menguatkan  dugaan bahwa  pepton  bungkil  kedelai  dan  pepton  khamir  yang. dihasilkan  dari  hidrolisis  5  jam  memiliki  campuran  peptida berbobot molekul kecil lebih banyak dibandingkan dengan proses hidrolisis 1 jam. Dengan demikian dapat disebutkan secara teoritis hidrolisis selama 5 jam dapat menghasilkan pepton  yang  dapat  dimanfaatkan  sebagai  media pertumbuhan bakteri.

## Efektivitas pepton terhadap pertumbuhan bakteri
Gambar  7,  8,  dan  9  masing-masing  menunjukkan kurva pertumbuhan bakteri Escherichia coli , Staphylococcus aureus , dan Bacillus subtilis. Dari  kurva  tersebut  terlihat  bahwa  pola pertumbuhan  bakteri  pada  media  pepton  bungkil  kedelai mirip  dengan  media  pepton  kedelai  komersial  (Scharlau) sedangkan  pola  pertumbuhan  pada  media  pepton  khamir lebih  mirip  dengan  bacto  pepton  dari  Difco.  Dengan demikian  dapat  disimpulkan  bahwa  pertumbuhan  semua bakteri  uji  pada  media  pepton  yang  dihasilkan  dari penelitian mirip dengan media pepton komersial.
Untuk melihat kualitas pertumbuhan bakteri tersebut dilakukan penanaman (0.1 ml setiap pengenceran tertentu dari suspensi bakteri yang tumbuh 24 jam pada pepton uji) pada  medium  NA,  kemudian  diinkubasi  selama  24  jam. Hasil uji pertumbuhan koloni terlihat pada Gambar 10. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pertumbuhan semua bakteri identik satu sama lain.
Gambar  5. Pola kromatografi pepton bungkil kedelai
Gambar 6. Pola kromatografi pepton khamir
Gambar 7. Kurva pertumbuhan E.coli
Gambar 8. Kurva pertumbuhan S.aureus
pada beberapa media pepton                                                                 pada beberapa media pepton
0 20 40 60 80 100 0 4 8 12 16 20 24 Waktu (jam) % T ra n sm ita n s Bacto Soy Khamir B.Kedelai 0 20 40 60 80 100 0 4 8 12 16 20 24 Waktu (jam) % T ra n s m it a n s Bacto Soy Khamir B.Kedelai
Gambar. 9. Kurva pertumbuhan B.subtilis pada beberapa media pepton

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Produksi  pepton  dari  bungkil  kedelai  dan  khamir dengan  menggunakan  papain  kasar  dapat  dilakukan. Kondisi  yang    digunakan  dalam  produksi  pepton  dari bungkil kedelai adalah [S] = 3,72%, [E] = 0,4%, suhu 60 0 C, pH  sesuai  campuran  awal  (6,2-6,3)  dan  waktu  5  jam, sedangkan  untuk  khamir  adalah  [S]  =  4,76%,  [E]  =  0,2%, suhu 60 0 C, pH sesuai campuran awal (5,8-5,9) dan waktu 5 jam. Pepton yang dihasilkan memiliki kualitas yang mirip dengan  pepton  komersial  baik  dalam  sifat  fisik  dan  kimia yang  diujikan  maupun  dalam  mendukung  pertumbuhan bakteri.

## Saran
Disarankan  ada  rancangan  lebih  lanjut  untuk menentukan  optimasi  proses  yang  dikaitkan  dengan keuntungan komersial.

## DAFTAR PUSTAKA
Atmaka, W. 1997 . Sifat-sifat fungsional konsentrat protein dari  Yeast  Press  industri  bir.  Tesis.  Jogyakarta: UGM.
[AOAC].  1984. Official  Methods  of  Analysis  of  The Association  of  Official  Analytical  Chemists. Washington DC.
Cowan, D. 1983. Protein. Di dalam Godfrey T, Reichelt J, editor.  Industrial  Enzymology.  USA:  Macmillan. hlm 352-374.
Fardiaz, D. dan Yasni, S. 1998. Produk Mutakhir Turunan
Kedelai. Di dalam Prosiding Seminar Pengembangan  Pengolahan  dan  Penggunaan Kedelai  Selain  Tempe.  CFNS,  IPB,  ASA.  hlm  119-
127.
0 20 40 60 80 100 0 4 8 12 16 20 24 Waktu (jam) % T ra n s m it a n s Bacto Soy Khamir B.Kedelai 0 2 4 6 8 10 12 Bacto Soy Khamir B. ked Jenis pepton L o g c fu /m l E. coli B. subt.
S. aureus
Gambar.  10.  Pertumbuhan  koloni  bakteri  dari medium pepton pada Nutrien Agar
Fukushima, D. 1991. Recent progress of soybean protein foods:  chemistry,  technology,  and  nutrition.  Food Reviews International. 7(3):323-351.
Henn,  R.L.  and  Netto,  F.M.  1998 .  Biochemical characterization  and  enzymatic  hydrolysis  of different commercial soybean protein isolat. J. Agric. Food Chem.46:3009-3015.
Kelly,  M.  1983. Yeast  Extract.  Di  dalam:  Godfrey  T, Reichelt  J,  editor.  Industrial  Enzymology.  USA: Macmillan. hlm 457-465.
Lahl,  W.  and  Braun,  S.D.  1994. Enzymatic  production  of protein hydrolysates for food use. Food Tech.:68- 71.
Lei, M.G., Tyrell, D. , Bassette, R. and Reeck, G.R. 1983 . Two  dimensional  electrophoretic  of  soybean proteins. J. Agric. Food Chem.(31): 963-968
Liener,  I.E.  1981. The  Sulfhidril  Protese.  Di  dalam: Schimmer  S.editor.  Source  Book  of  Enzymology. USA. AVI and Handbook Series.
Lowry,  O.H.,  Rosebrough,  N.J.,  Farr,  A.L.  and Randall, R.J. 1951 . Protein measurement with the Folin fenol reagent. J. Biol. Chem. 193:65-270.
Muchtadi, D., Palupi ,N.S. dan Astawan, M. 1992 . Enzim Dalam Industri Pangan. PAU IPB.
Netto,  F.M.  and  Galeazzi,  M.A.M.  1998. Production  and characterization of enzymatic hydrolysates from soy protein isolat. Iwt. 3:624–631.
Romagnolo,  D.,  Polan,  C.E.,  and  Barbeau,  W.E.  1990. Degradasi  of  soybean  meal  protein  fractions  as determined by sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide  gel  electrophoresis.  J.  Dairy  Sci 7(9):2379-2385.
Silvestre, M.P.C. 1997 . Review of methods for the analysis of protein hydrolysates. Food Chem. 60(2):263-271.
Susetyo,  A.R.  2000. Isolasi  Pepton  Secara  Ekstraksi Enzimatis Menggunakan Limbah Perikanan. Skripsi. Fateta. Bogor.
Tsumura,  penemu:  3  Oktober  2000 .  US  Patent 6,126,973.
Wu  WU,  Hettiarachchy,  N.S.  and  Qi  M.  1998 .
Hydrophobicity, solubility, and emulsifying properties  of  soy  protein  peptides  prepared  by papain  modification  and  ultrafiltration.  JAOCS 75(7):845-850.