## PENINGKATAN IMUNITAS BENIH IKAN KERAPU HIBRID CANTIK DENGAN LIPOPOLISAKARIDA (LPS)

## INCREASE OF IMMUNITY CANTIK HYBRID GROUPER JUVENILES BY LIPOPOLYSACCHARIDE (LPS)

## Des Roza
Balai Besar Riset Perikanan Budidaya Laut dan Penyuluhan Perikanan BD Gondol, Desa Penyabangan, Kec. Gerokgak, Kab. Buleleng, Bali E-mail : desrozaboer14@gmail.com

## ABSTRACT
Disease is one of obstacle in fish culture. Immunity of fish against disease can be increased by using immunostimulant.  The  purpose  of  this  experiment  to  increasing  immunity  of  cantik  hybrid  grouper (cross  breeding  of  tiger  grouper,  Epinephelus  fuscoguttatus  female  with  marbled  grouper,  E. polyphekadion male) to the diseases by using immunostimulant. Treatments were LPS cell walls of V. alginolyticus  and  commercial  LPS  was  also  used  in  this  study,  as  a-control  without  LPS  was  used saline water (0.85% NaCl). The LPS was delivered by injection intra-muscularly with concentration of 0.1 mL/fish. This experiment was design by completely randomized with 3 replicates. Results showed that LPS were effective to increase titer antibody values and survival rates of  cantik hybrid grouper. The titer antibody values of fish after 90 days rearing period were 128 LPS from V. alginolyticus, 64 (commercial  LPS),  and  only  4  in  the  control  fish.  The  survival  rates  at  the  end  of  experiment  were 88.67 ± 3.62% (LPS from V. alginolyticus), 85.22 ± 5.93% (commercial LPS), and only 50.13 ± 6.11% in the control fish. Relative percentage survival of fish following challenged with live V. alginolyticus were  77.46%  in  the  received  LPS  from  V.  alginolyticus  cell  wall  and  71.12%  in  the  fish  received commercial  LPS.  It  is  suggested  that  LPS  effective  to  increase  immunity  of  cantik  hybrid  grouper against bacterial infection.
Keywords :Cantik Hybrid Grouper, immunity, lipopolysaccharide, Vibrio alginolyticus

## ABSTRAK
Penyakit  merupakan  salah  satu  kendala  dalam  budidaya  perikanan.  Imunitas  ikan  terhadap  serangan penyakit dapat ditingkatkan antara lain dengan pemberian imunostimulan. Tujuan penelitian ini untuk meningkatkan  imunitas  benih  ikan  kerapu  hibrid  cantik  (perkawinan  silang  antara  kerapu  macan, Epinephelus  fuscoguttatus betina  dengan  kerapu  batik, E.  polyphekadion jantan) terhadap  penyakit melalui pemberian imunostimulan. LPS yang digunakan dalam penelitian ini adalah LPS dari dinding sel Vibrio alginolyticus dan LPS komersial, sedangkan kontrol hanya menggunakan larutan fisiologis 0,85%  NaCl  (tanpa  LPS).  LPS  diaplikasikan  melalui  penyuntikan  intra-muskuler  dengan  dosis  0,1 mL/ekor ikan. Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap dengan tiga ulangan. Hasil penelitian menunjukkan  bahwa  LPS  yang  diberikan  efektif  meningkatan  nilai  titer  antibodi  dan  sintasan  benih kerapu hibrid cantik. Nilai titer antibodi pada masing-masing perlakuan di akhir penelitian adalah 128 (LPS  dari V.  alginolyticus ),  64  (LPS  komersial)  dan  4  pada  kontrol.  Sintasan  ikan  sampai  akhir penelitian  adalah  88,67  ±  3,62%  (LPS  dari V.  alginolyticus ),  85,22  ±  5,93%  (LPS  komersial)  dan hanya  50,13  ±  6,11%  pada  kontrol.  Nilai  relative  percentage  survival  setelah  uji  tantang  adalah 77,46% pada ikan yang disuntik dengan LPS dari V. alginolyticus dan 71,12% pada ikan yang disuntik dengan LPS komersial. LPS efektif meningkatkan imunitas benih kerapu hibrid cantik terhadap infeksi bakteri.
Kata Kunci: Kerapu Hibrid Cantik, imunitas, lipopolisakarida, Vibrio alginolyticus

## I. PENDAHULUAN
Kerapu  Hibrid  Cantik  merupakan hasil perkawinan silang antara kerapu macan, Epinephelus  fuscoguttatus betina  dengan kerapu  batik, E.  polyphekadion jantan.  Pada proses  hibridisasi  ini  dilakukan  penyilangan antara  telur  kerapu  macan  dengan  sperma kerapu batik (James et al ., 1999). Hibridisasi bertujuan  untuk  mendapatkan  strain  kerapu baru  yang  lebih  unggul  dari  induknya, misalnya  harganya  tinggi,  tumbuh  cepat, tahan  terhadap  perubahan  lingkungan  dan resisten  terhadap  penyakit  (Kusumawati  dan Ismi, 2013; Yudha dan Sutarmat, 2014).
Gambar 1. Ikan Kerapu Hibrid Cantik.
Hasil  pengamatan  di  lapangan  me- nunjukkan  bahwa  sering  terjadi  kematian ikan budidaya yang disebabkan oleh berbagai jenis bakteri  patogen, namun  sampai saat  ini belum tersedia informasi  yang memadai  ten- tang jenis, patogenisitas dan potensi masing- masing  bakteri  tersebut  untuk  digunakan sebagai  imunostimulan.  Mengingat  perairan Indonesia sangat  kaya akan keanekaragaman mikroba  atau  bakteri  maka  potensi  bakteri- bakteri  tersebut  untuk  digunakan  sebagai kandidat  imunostimulan  perlu  dipelajari. Penggunaan  imunostimulan  dan  vaksinasi merupakan  salah  satu  faktor  pendukung  ke- berhasilan  budidaya  perikanan  melalui  pe- ningkatan daya kebal ikan.
Perkembangan  usaha  budidaya  ikan kerapu  selalu  diikuti  oleh  berjangkitnya  ber-
bagai  jenis  penyakit,  baik  yang  disebabkan oleh  infeksi  virus,  bakteri,  parasit  maupun penyakit  non-infeksi  seperti  malnutrisi  dan deformiti. Dari kelompok bakteri yang umum patogen terutama dari genus Vibrio, Flexibacter dan Streptococcus (Toranzo et al ., 2005; Zafran et al., 2008; Austin, 2010). Banyak  keluhan  pembudidaya  ikan  yang mengalami  ekor  buntung  akibat  serangan bakteri Flexibacter ,  demikian  pula  halnya dengan Vibrio dan Streptococcus. Pengem- bangan  vaksin  untuk  kelompok  patogen  ini juga  perlu  dilakukan.  Di  BBPPBL  Gondol baru  satu  jenis  vaksin Vibrio  polivalen yang telah  dikembangkan ( Zafran et  al .,  2010; Zafran et al ., 2011 ) dan saat ini dalam proses paten .
Salah  satu  upaya  pencegahan  infeksi penyakit  di  hatchery  juga  dapat  dilakukan dengan  meningkatkan  respon  imun  non- spesifik  ikan  melalui  pemberian  imuno- stimulan  (Rukyani et  al ., 1998;  Alifuddin, 2002; Roza et  al .,  2004).  Imunostimulan merupakan sekelompok senyawa biologi dan sintetis  yang  dapat  meningkatkan  sistem imunitas  spesifik  maupun  non-spesifik.  Me- kanisme  kerja  imunostimulan  yaitu  dengan cara meningkatkan aktivitas oksidatif netrofil (Nayak., 2010; Johnny et al ., 2005). Aplikasi imunostimulan  sudah  banyak  diterapkan pada beberapa jenis ikan baik melalui peren- daman,  suntikan  maupun  secara  oral  melalui pakan (Thompson et al ., 1999; Johnny et al ., 2010; Roza et al ., 2012).
Percobaan  skala  laboratorium  peng- gunaan  imunostimulan  pada  ikan  kerapu telah  dilakukan  di  BBPPBL  Gondol,  dian- taranya  penggunaan  imunostimulan  peptido- glican  dalam  pakan  pelet  (Johnny et  al ., 2001;  Johnny et  al .,  2009),  dengan  peren- daman  (Crosbie  and  Nowak,  2004:  Roza et al .,  2004;  Roza et  al .,  2006),  penyuntikan peptidoglycan secara  intraperitoneal  pada ikan  kerapu  macan, Epinephelus  fuscogut- tatus (Johnny  dan  Roza,  2002;  Roza et  al ., 2010).  Tetapi,  aplikasi  imunostimulan  skala massal  di  hatchery  belum  banyak  dilakukan. Imunostimulan dapat diperoleh dari berbagai
sumber  antara  lain  dari  dinding  sel  bakteri (Rukyani et  al .,  1998;  Kamiso et  al .,  2005), dinding sel ragi (Zhu et al ., 2006), cangkang udang dan krustasea (Kumar et al ., 2008) dan miselia jamur (Almendras, 2001).
Perusakan  dinding  sel  bakteri  ber- tujuan  untuk  memperoleh  LPS  yang  murni dan  bebas  dari  ikatan-ikatan  biokimia  sel bakteri,  sehingga  bahan  aktif  LPS  dari  sel bakteri  yang  diperoleh  tidak  diikuti  oleh bahan penghambat aktivasi LPS.  LPS adalah komponen  utama  lapisan  luar  dari  bakteri, penyambung  utama  dari  integritas  struktur dari  bakteri  dan  melindungi  membran  dari berbagai  jenis  kerusakan  oleh  bahan  kimia. Selain  itu,  LPS  merupakan  suatu  endotoksin yang  memicu  suatu  respon  yang  kuat  dari sistem  kebal  hewan  normal.  LPS  berperan sebagai  prototipikal  endotoksin  karena  LPS akan berikatan ke reseptor dari sel makrofag. LPS terdiri dari lipid A, polisakarida inti, dan rantai  polisakarida  spesifik-O.  Lipid  A adalah  glikolipid  yang  terdiri  dari  disakarida glukosamin  yang  tersubstitusi  ikatan  beta (1,6)-nya.  Lipid  A  bertanggungjawab  ter- hadap  efek  beracun  dengan  cara  mensti- mulasi pembentukan dan juga pada sekresi sitokina yang menimbulkan gejala ke- racunan. Stimulasi  tersebut  terjadi  karena Lipid  A  bersama  dengan  protein  pengikat LPS/ LPS  binding  protein (LBP)  berikatan ke reseptor  CD14 dari  sel makrofag.  IL- 10 dan faktor nekrosis tumor (TNF) akan me- nginduksi  pada  peningkatan  sintesis  pros- taglandin E2 di hipotalamus. Polisakarida inti adalah  polisakarida  kompleks  yang  biasanya terhubung  dengan  lipid  A  melalui  ikatan  3- deoksi-D-manno-octulosonat. Rantai  spesifik O  terdiri  dari  rantai  subunit  oligosakarida identik  (linear  atau  bercabang)  dengan panjang  yang  bervariasi.  Jumlah  subunit dapat  bervariasi  bahkan  pada sel  yang sama, yang  jumlah  subunitnya  antara  3,  4  atau 5. Rantai  spesifik  O  menentukan  spesifisitas antigen O dari serotipe tertentu.
LPS  dapat  meningkatkan negative charge  cell membrane dan  membantu  men- stabilkan  struktur  membran  secara  ke-
seluruhan. Sebagai itu LPS adalah exogenous pyrogen  atau  senyawa  yang  menyebabkan demam  eksternal.    Dengan  peran  LPS  yang begitu penting bagi bakteri, dapat mematikan sel  jika  dimutasi/dipindahkan  atau  dibuang, maka  LPS  selanjutnya  merupakan  target utama  untuk  senyawa  antimikrobial  dimasa depan  (Ezzel et  al .,  1990;  Vadstein,  1997: Roza et al., 2002).
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah untuk  menguji  efektivitas  LPS  dari  dinding sel  bakteri Vibrio  alginolyticus sebagai kandidat imunostimulan dalam meningkatkan imunitas benih kerapu hibrid cantik, sehingga dengan  demikian  dapat  meningkatkan  pro- duksinya terutama di hatchery.

## II. METODOLOGI

## 2.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Pelaksanaan  penelitian,  mulai  bulan Agustus  sampai  Desember  2015  selama  90 hari.  Penelitian  ini  dilakukan  di  Labora- torium  Patologi,  Balai  Besar  Penelitian  dan Pengembangan  Budidaya  Laut  (BBPPBL) Gondol,  Desa  Penyabangan,  Kecamatan Gerokgak, Kabupaten Buleleng, Bali.

## 2.2. Uji Patogenisitas
Berdasarkan  hasil  karakterisasi  ter- hadap  bakteri  patogen  pada  budidaya  ikan kerapu telah diketahui 3 spesies bakteri yaitu Vibrio  harveyi , V.  alginolyticus dan Photo- bacterium leiognathi . Terhadap ketiga spesies bakteri patogen tersebut dilakukan uji tingkat  patogenisitasnya  dan  spesies  bakteri yang diketahui paling patogen untuk diguna- kan  pada  uji  selanjutnya  sebagai  kandidat untuk  imunostimulan.  Masing-masing  isolat bakteri,  diinjeksikan  secara  intramuskuler dengan dosis 0,1 mL/ekor pada benih kerapu hibrid  ukuran  6-8  cm  (panjang  total).  Pe- nelitian mempergunakan benih kerapu hibrid cantik  sebanyak  25  ekor,  ikan  dipelihara dalam  bak  fiber  volume  250  L  berisikan  air laut sebanyak 200 L dan diaerasi. Pakan yang diberikan  adalah  pakan  pelet  Otohime (Jepang)  dengan  kadar  protein  48%  setiap
pagi  dan  sore  hari  (ad  libitum),  dan penyifonan  dilakukan  setiap  pagi  sebesar 50%.  Pengamatan  dilakukan  selama  lima belas  hari  dengan  melihat  gejala  kilinis  dan sintasan sampai akhir pengamatan.
2.3. Pemisahan  Lipopolisakarida Vibrio alginolyticus Bakteri  ditumbuhkan  pada  media penumbuh  TSA  ( Tryptic  Soy  Agar )  dan dipanen dalam saline steril dengan kepadatan 10 10 CFU/mL.  Suspensi  disentrifusa  dengan kecepatan  10.000  rpm  selama  15  menit dengan suhu 4 o C. Buang supernatan, tambah- kan  0,1  g/mL  dalam  0,1  M acetate  buffer (1,25  mM  MgOSO4,  pH  5,0)  dengan  per- bandingan  1:1.  Suspensi  diaduk  rata  dengan vortex,  tambahkan  1  µg  DNase  dan  RNase per  mL.  Dinginkan  suspensi  dalam freezer suhu  -10 o C  selama  10  menit,  perusakan dinding  sel  bakteri  dilakukan  dengan  meng- gunakan  larutan  phenol  chloroform  absolut dalam  kondisi  hangat  pada  suhu  56-60 o C dengan  konsentrasi  1-2  kali  suspensi  dan didiamkan  beberapa  menit.  Suspensi  yang mengandung  sel  bakteri  yang  telah  rusak disentrifusa  dengan  kecepatan  10.000  rpm selama  15  menit  dengan  suhu  4 o C,  buang supernatan.  Lakukan  pencucian  pelet  se- banyak  3x  dalam  larutan  dingin  HEPES  (10 mM  N-2-hydroethylpiperazine-N’-2-ethane- sulphonic  acid)  yang  mengandung  0,1  M NaCl.  Pemeriksaan  mikroskopis  dilakukan dengan  pewarnaan crystal  violet untuk memastikan  tidak  ada  lagi  sel  yang  utuh. Tambahkan 0,05 g/mL PBS (10 mM sodium phospate  dalam  0,85%  NaCl,  pH  7,3). Suspensi  diaduk  rata  dan  disterilkan  dengan autoclave selama 15 menit.  Lipopolisakarida telah  diperoleh,  dapat  dikoleksi    dan  siap digunakan.  Metode  yang  digunakan  dalam percobaan adalah modifikasi metode Kamiso et al. (2005).

## 2.4. Uji Aplikasi Lipopolisakarida
Penelitian  aplikasi  ini  digunakan  2 jenis  LPS  yaitu  :  LPS  dari  dinding  sel V. aginolyticus dan LPS komersial serta kontrol
(tanpa  LPS).  Terhadap  masing-masing  300 ekor  benih  kerapu  hibrid  cantik  dengan panjang  total  8-10  cm  disuntik  secara  IM (intramuskuler)    dengan  ke-2  jenis  LPS  uji dengan dosis 0,1 mL/ekor, sedangkan kontrol hanya  disuntik  dengan  NaCl  fisiologis dengan  dosis  0,1  mL/ekor.  Ikan  kemudian dipelihara  di  bak  beton  volume  1  m 3 yang dilengkapi  dengan  aerasi  dan  air  mengalir dengan kepadatan 100 ekor/bak.
Pakan  diberikan  2  kali  sehari  yaitu pelet Otohime (Jepang) dengan kadar protein 48%  pada  pagi  dan  sore  (ad  libitum), sedangkan  penyifonan  bak  sebanyak  50% dan  pembuangan  kotoran  dilakukan  setiap hari. Booster dilakukan 15 hari pasca injeksi awal  LPS.  Ikan  dipelihara  selama  90  hari, pengambilan darah, pengukuran panjang dan bobot  tubuh  dilakukan  pada  awal  serta  30 hari, 60 hari dan diakhir setelah 90 hari pasca injeksi LPS.

## 2.5. Uji Titer Antibodi
Uji  titer  antibodi  dilakukan  dalam wadah  microwell  dengan  96  sumur/lubang berpedoman  pada  Bricknell  and  Dalmo (2005)  dan  Kamiso et  al .  (2005).  Serum darah  ikan  uji  diencerkan  secara  bertingkat sebagai  berikut:  Ke  dalam  sumur  pertama dan  ke-2  dimasukkan  masing-masing  50  µL serum  darah  ikan.  Ke  dalam  sumur  ke-2 selanjutnya  ditambahkan  50  µL  PBS  dan diaduk  merata.  Dari  sumur  ke-2  diambil  50 µL dimasukkan ke dalam sumur ke-3 dan 50 µL  PBS  dan  diaduk  merata.  Proses  yang sama selanjutnya dilakukan pada sumur ke-4 dan  seterusnya.  Ke  dalam  masing-masing sumur selanjutnya dimasukkan 50 µL antigen bakteri.
Campuran  serum  darah  dan  antigen diaduk  kemudian  digoyang  dengan  rotator plate  selama  1-3  menit  dan  didiamkan  pada suhu  kamar  selama  4-6  jam.  Kemudian  di amati  aglutinasi  atau  penggumpalan  antigen oleh serum dibawah mikroskop, pada tingkat pengenceran  tertinggi  yang  masih  terjadi aglutinasi  dinyatakan  sebagai  nilai  titer antibodi dari ikan.

## 2.6. Uji Tantang
Uji  tantang  dilakukan  setelah  90  hari pasca  perlakuan  imunostimulan,  ke  dalam sembilan  bak  polikarbonat  volume  250  L dimasukkan masing-masing 20 ekor ikan dari masing-masing  perlakuan  LPS  yaitu  3  bak untuk LPS dari dinding sel V. alginolyticus , 3 bak  untuk  LPS  komersial  dan  3  bak  untuk kontrol.  Uji  tantang  dilakukan  dengan  cara menyuntikkan 0,1 mL inokulum V. Alginoly- ticus dengan  kepadatan  10 10 CFU/mL. Selanjutnya  ikan  dipelihara  selama  15  hari dan  diberi  pakan  pelet  Otohime  (Jepang) pada  pagi  dan  sore  hari.  Pembersihan  dan penyifonan  bak  dilakukan  setiap  pagi  dan selama  uji  tantang  berlangsung  hasil  pe- nyifonan  ditampung  dan  diklorin  selama  24 jam sebelum dibuang. Pengamatan dilakukan selama  15  hari  terhadap  gejala  klinis  dan sintasan.  Data  sintasan  disajikan  dalam bentuk Relative  Percentage  Survival/ RPS (Amend, 1981) :
...................... (1)
dimana:  Nt=  jumlah  ikan  yang  hidup  pada awal penelitian, No= jumlah ikan yang hidup pada akhir penelitian.

## 2.7. Analisis Data
Penelitian  ini  menggunakan  Ran- cangan  Acak  Lengkap  dengan  3  perlakuan dan  3  ulangan.  Data  dianalisis  dengan Analisis Ragam (Anova)  yang menggunakan software SPSS.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Setelah  dilakukan  uji  patogenisitas ke-3 spesies bakteri patogen yaitu V. harveyi , V.  alginolyticus dan P.  leiognathi selama  15 hari  pengamatan,  terlihat V.  alginolyticus lebih  patogen  terhadap  benih  kerapu  hibrid cantik  dibandingkan V.  harveyi dan P. leiognathi. Mortalitas mulai terlihat setelah 4 hari  pascainfeksi  buatan.  Mortalitas  tertinggi
terjadi  pada  hari  ke  7-8  pascainfeksi.  Hasil lengkap disajikan pada Tabel 1.
Tabel  1.  Mortalitas  (%)  benih  kerapu  hibrid cantik yang diinfeksi dengan Vibrio harveyi , V. alginolyticus dan Photo- bacterium  leiognathi selama  15 hari.
Spesies bakteri (10 5 CFU/mL) Mortalitas (%) Vibrio harveyi 21,33±8,33 b Vibrio alginolyticus 50,67±8,33 a Photobacterium leiognathi 9,33±10,07 c Kontrol (tanpa bakteri) 2,67±4,62 c
Keterangan:  Nilai  dalam  kolom  yang  diikuti oleh  huruf  superskrip  yang sama tidak berbeda nyata (<0,05).
Tabel  1  terlihat  bahwa  benih  kerapu hibrid  cantik  memberikan  respon  yang  ber- beda  terhadap  masing-masing  agen  patogen, terlihat  ikan  uji  dalam  penelitian  ini  lebih rentan  terhadap V.  alginolyticus. Kepadatan 10 5 CFU/mL  sudah  menyebabkan  mortalitas sebesar  50,67%, V.  harveyi hanya  21,33%, sedangkan P.  leiognathi cenderung  tidak membahayakan  karena  angka  mortalitasnya sangat  rendah  (9,33%)  dan  hampir  sama dengan kontrol yang hanya 2,67% .
Mortalitas  yang  disebabkan  oleh Vibriosis  mencapai  80%  walaupun  tidak semua spesies Vibrio bersifat patogen primer karena  bakteri  ini  merupakan  mikroflora yang  normal  hidup  dilingkungan  akuatik. Banyak  dilaporkan  bahwa V.  alginolyticus bersifat patogen oportunis (Roza dan Johnny, 2008;  Subasinghe,  2009)  dimana  pada  kon- disi  tertentu  bisa  menjadi  patogen  (Johnny dan  Roza,  2012).  Penelitian  membuktikan bahwa  hanya  beberapa  spesies  Vibriosis yaitu V.  anguillarum,  V.  ordalii dan V. salmonicicida yang  bertindak  sebagai  pato- gen primer pada ikan laut, yaitu spesies yang virulensinya  tinggi  dapat  menyebabkan
Vibriosis meskipun tanpa adanya faktor stres eksternal (Toranzo et al. , 2005).
Setelah  diinfeksi  dengan V.  algino- lyticus,  V.  harveyi dan P.  leiognathi gejala klinis  yang  terlihat  hampir  sama  dengan gejala klinis yang diinfeksi dengan V. algino- lyticus .  Badan  ikan  terlihat  kemerahan, terjadi peradangan, nekrosis dan ulser, selain itu  prilaku  berenangnya  mulai  terganggu dengan  berputar-putar  atau  diam,  tidak  mau makan  dan  produksi  lendir  meningkat. Melihat  produksi  lendir  yang  berlebihan  ini mengindikasikan  ikan  dalam  kedaan  tibak baik  (Roza et  al. ,  2010).  Sementara  itu, Toranzo et  al. (2005)  menyatakan  Vibriosis menyebabkan  gejala  septisemia  dengan  luka menyebar  pada  kulit,  terjadi  nekrosis  pada hati,  ginjal  dan  jaringan  yang  lain. V. alginolyticus menyerang ikan dan organisme lainnya  dimulai  dari  bagian  lendir  (mukus) yang  diproduksi  oleh  tubuh  karena  lendir merupakan lapisan pertama pertahanan ikan.
Irianto  (2005)  mengatakan  tanda  kli- nis  infeksi Vibrio adalah  terjadi  septisemia, hemoragik  pada  kulit,  insang  dan  ekor  serta borok  pada  kulit,  hemoragik  pada  jaringan otot  juga  permukaan  serosal.  Limpa  ikan yang  terinfeksi  mengalami  pembengkakan dan  berwarna  merah  cerah,  secara  histologis hati,  ginjal,  limpa  dan  mukosa  usus  me- ngalami nekrosis. Kemampuan menimbulkan Vibriosis  dari  isolat  uji  berhubungan  dengan kecepatan  bakteri  mengakses  organ  atau jaringan  target  dan  menghasilkan  faktor virulensi (Kamiso et al. , 2005).
Pertumbuhan  bakteri  pada  fase  loga- ritmik  (eksponensial)  dipengaruhi  oleh  sifat genetik yang diwariskan, kandungan nutrien
dalam media, suhu inkubasi dan kondisi  pH. Jika pertumbuhan bakteri telah menghasilkan populasi yang maksimum, maka akan terjadi keseimbangan  antara  jumlah  sel  yang  hidup dan yang mati. Fase stasioner terjadi saat laju pertumbuhan  bakteri  sama  dengan  laju  ke- matiannya,  sehingga  jumlah  keseluruhan bakteri  akan  tetap,  keseimbangan  jumlah bakteri  terjadi  karena  pengurangan  pem- belahan  sel  akibat  berkurangnya  nutrien media dan akumulasi produk toksik.
Fase  stasioner  ini  dilanjutkan  dengan fase  kematian  yang  ditandai  dengan  pening- katan  laju  kematian  yang  melampaui  laju partumbuhan,  sehingga  secara  keseluruhan menyebabkan  terjadinya  penurunan  populasi bakteri.  Dari  pengamatan  terhadap  gejala klinis yang ditimbulkan masing-masing isolat bakteri  ternyata  tidak  terlihat  adanya  per- bedaan  yang  jelas,  begitu  juga  pada  pola pertumbuhannya.  Berdasarkan hasil uji  pato- genisitas  ini,  maka  untuk  uji  selanjutnya digunakan V. alginolyticus karena lebih pato- gen dibanding 2 spesies bakteri lainnya.
Setelah  90  hari  perlakuan  terlihat tidak  ada  perbedaan  sintasan  antara  per- lakuan  LPS  dari  dinding  sel V.  aginolyticus dan  LPS  komersial,  sedangkan  dengan kontrol  (tanpa  LPS)  sangat  berbeda  nyata (P<0,05).  Secara  kasat  mata,  hal  ini  mulai terlihat setelah sebulan pasca perlakuan. Ikan pada  bak  kontrol  mulai  terlihat  lemah,  nafsu makan  mulai  menurun  dan  tidak  banyak bergerak, permukaan tubuh terlihat memerah, adanya  luka  dan  borok,  tetapi  ikan  yang diberi perlakuan LPS masih terlihat bergerak aktif  dengan  nafsu  makan  yang  tinggi.  Data lengkap disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Sintasan (%) benih kerapu hibrid cantik yang diberi perlakuan LPS V. alginolyticus dan LPS komersial selama 90 hari.
Perlakuan D-0 D-30 D-60 D-90 LPS V.alginolyticus 100 ± 0 a 97,67±2,80 a 95,33±1,53 a 89,33±3,62 a LPS komersial 100 ± 0 a 96,33±4,04 a 94,00±1,73 a 86,13±5,93 a Kontrol 100 ± 0 a 93,67±2,52 a 80,33±4,04 b 50,11±6,11 b Keterangan:  Nilai dalam kolom  yang diikuti oleh huruf  superskrip  yang sama tidak berbeda nyata (<0,05).
Tabel 2 terlihat bahwa setelah 90 hari perlakuan  LPS  dari  dinding  sel V.  algino- lyticus maupun  LPS  komersial  memberikan sintasan yang jauh lebih tinggi yakni masing- masing sebesar 89,33% dan 86,13% daripada kontrol  (tanpa  LPS)  yang  hanya  50,11%. Walaupun diantara perlakuan ke-2 jenis  LPS tersebut  tidak  memperlihatkan  perbedaan yang  nyata.  Memang  terlihat  ada  penurunan persentase  sintasan  sejalan  dengan  ber- tambahnya  umur  ikan,  tetapi  disini  terlihat bahwa secara langsung pemberian LPS dapat berperan  sangat  baik  sebagai  imunostimulan dan  efektif  untuk  meningkatkan  imunitas ikan. Hal  ini juga ditemukan pada penelitian Zafran et al. (2008) dimana ikan kerapu yang diberi  vaksin  bakteri  polivalen  sintasannya jauh  lebih  tinggi  dibanding  ikan  yang  tidak divaksin.
Uji  tantang  dilakukan  setelah  90  hari pasca  perlakuan  imunostimulan,  dengan penyuntikan  0,1  mL  inokulum V.  Algino- lyticus pada kepadatan 10 10 CFU/mL. Setelah 15  hari  pengamatan,  hasilnya  memperlihat- kan  bahwa  ikan  kerapu  hybrid  cantik  yang diberi  perlakuan  imunostimulan,  baik  pada perlakuan  LPS  dari  dinding  sel V.  Algino- lyticus maupun  pada  LPS  komersial  mampu bertahan hidup walaupun diinfeksi dengan V. alginolyticus (Tabel  3).  Tetapi  pada  kontrol setelah  tiga  hari  paska  infeksi  terlihat  ikan mulai  mengalami  gangguan  nafsu  makan, gerakan  mulai  lamban  dan  sering  muncul kepermukaan.  Sedangkan  gejala  klinis  lain- nya  pada  permukaan  tubuh  dan  ekor  me- merah,  akhirnya  timbul  luka  yang  berujung
pada  kematian.  Gejala  ini  tidak  terlihat  pada ikan  yang diberi perlakuan  LPS dari dinding sel V.  alginolyticus maupun  LPS  komersial, bahkan  pada  ikan  yang  mati  sekalipun  tidak terlihat  adanya  bercak  merah  dan  luka  pada tubuhnya.  Nilai  RPS  perlakuan  LPS  dari dinding  sel V.  alginolyticus adalah  77,46% dan  LPS  komersial  71,12%.  Dari  nilai  RPS tersebut  dapat  dipastikan  bahwa  pemberian LPS  dari  dinding  sel V.  alginolyticus dan LPS  komersial  efektif  sehingga  meningkat- kan  imunitas  benih  kerapu  hybrid  cantik  di hatchery. Hal ini juga dibuktikan oleh Lin et al. (2006),  vaksinasi  ikan  cobia  dengan vaksin  polivalen  juga  dapat  meningkatkan imunitasnya  baik  di  hatchery  maupun  di keramba jaring apung.
Berdasarkan  data  dari  Tabel  4,  di- ketahui  bahwa  nilai  titer  antibodi  benih kerapu  setelah  90  hari  tertinggi  pada perlakuan  LPS  dari  dinding  sel V.  algino- lyticus sebesar  128  kali  pengenceran,  diikuti LPS  komersial  yaitu  sebesar  64  kali pengenceran  dan  terendah  pada  kontrol (tanpa  LPS)  hanya  4  kali  pengenceran. Lipopolisakarida  ( lipopolysaccharide,  lipo- glycan,  LPS )  adalah  sebuah  molekul  besar berupa  kompleks  antara  senyawa  lipid  dan polisakarida dengan ikatan kovalen. Senyawa LPS  banyak  ditemukan  pada  lapisan  mem- bran sel sebelah luar bakteri gram negatif dan bersifat  endotoksin,  yang  memicu  aktivasi. LPS  memainkan  peran  penting  dalam  fungsi bakteri.  Molekul-molekul  besar  yang  dapat terbentuk  dari  polisakarida  dan  lipid  disebut LPS.
Tabel 3. Sintasan (%) benih kerapu hibrid cantik yang diberi perlakuan LPS V. alginolyticus dan LPS komersial setelah uji tantang dengan V. alginolyticus selama 15 hari.
Perlakuan Sintasan (%) Relative Percentage Survival (%) LPS Vibrio alginolyticus 89,33±3,62 a 77,46 LPS komersial 86,13±5,93 a 71,12 Kontrol 50,11±6,11 b -
Keterangan:  Nilai dalam kolom  yang diikuti oleh huruf superskrip  yang sama tidak berbeda nyata (<0,05).
Tabel 4. Nilai titer antibodi benih kerapu hibrid cantik yang diberi perlakuan LPS dari dinding sel V. alginolyticus dan LPS komersial setelah 90 hari.
Perlakuan Uji titer Hari ke-30 Hari ke-60 Hari ke-90 LPS V. alginolyticus V. alginolyticus 1/16 1/32 1/128 LPS komersial V. alginolyticus 1/16 1/32 1/64 Kontrol/ Control V. alginolyticus 1/2 1/4 1/4
Endotoksin  bakteri  adalah  molekul LPS, yang merupakan komponen dinding sel bakteri  Gram-negatif,  yang  dapat  menimbul- kan  respon  pirogenik  (demam).  Endotoksin adalah  toksin  pada  bakteri  Gram-negatif berupa  LPS pada membran luar dari dinding sel yang pada keadaan tertentu bersifat toksik pada inang tertentu. LPS ini disebut endotok- sin karena terikat pada bakteri dan dilepaskan saat  mikroorganisme  mengalami  lisis  atau pecahnya  sel  (Han,  2000;  Johnny et  al. , 2010).  Beberapa  juga  dilepaskan  saat  repli- kasi  bakteri.  Komponen  toksik  pada  LPS adalah bagian lipid  atau lemak,  yang disebut lipid  A.  Komponen  lipid  A  ini  bukanlah struktur  makromolekuler  tunggal  melainkan terdiri  dari  susunan  kompleks  dari  residu- residu lipid.
Endotoksin  hanya  ada  pada  bakteri Gram-negatif  berbentuk  basil/batang  dan kokus  dan  tidak  secara  aktif  dilepaskan  dari sel  serta  dapat  menimbulkan  demam,  syok, dan  gejala  lainnya.  Deteksi  dan  eliminasi endotoksin  telah  menjadi  masalah  bertahun- tahun bagi industri farmasi. Contohnya pem- berian  obat  yang  terkontaminasi  dengan endotoksin  dapat  berakibat  pada  komplikasi bahkan  kematian  kepada  pasien.  Prosedur tersebut  harus  sangat  sensitif  sehingga  dapat mendeteksi  endotoksin  sampai  dengan  0,25 endotoksin  unit  (EU)  atau  setara  dengan 0,025 ng/mL.
Deteksi  endotoksin  dapat  dilakukan dengan  menggunakan LAL  (Limulus  Amoe- bocyte  Lysate) test.  Prosedur  ini  akurat  dan lebih  praktis  dibanding  metode  kuno  se- belumnya  yaitu  menggunakan  kelinci.  LAL test  didasarkan  pada  observasi  pembentukan gel  beku  sewaktu  endotoksin  bersentuhan dengan  protein  pembeku  dari  amoebocytes
limulus  yang  bersikulasi.  Perangkat  uji  ini terdiri  dari  kalsium,  enzim  propembekuan (proclotting) dan senyawa propenggumpalan/ prokoagulan (procoagulan).
Enzim  proclotting  akan  teraktivasi oleh  endotoksin  dan  kalsium  unuk  mem- bentuk  enzim  pembeku  ( clotting  enzyme ) yang  akan  memotong  prokoagulan  menjadi subunit  polipeptida  (koagulogen).  Sub  unit- sub unit tersebut akan bergabung membentuk ikatan  disulfida  membentuk  gel  beku. Jika diperlukan,  bisa  dilakukan  metode  spektro- fotometri  untuk  mengukur  jumlah  protein yang  tergumpalkan  pada  lisat  tersebut  yang mana bisa terdeteksi hingga 10 pg/mL LPS.
Mekanisme kerja imunostimulan dalam  merangsang  tanggap  kebal  menurut Crosbie  and  Nowak  (2014),  imunostimulan merangsang  makrofag  untuk  memproduksi interleukin  dan  membuat  makrofag  menjadi aktif  (makrofag  teraktivasi).  Interleukin kemudian  merangsang  pematangan  sel  lim- fosit  sehingga  berdiferensiasi  menjadi  sel  B dan  sel  T.  Selanjutnya  sel  T  akan  mempro- duksi  limfokinin  yang  akan  menjaga  makro- fag  tetap  aktif  sehingga  memfagositosis benda  asing  lebih  banyak,  sedangkan  sel  B akan berdiferensiasi menjadi sel memori dan sel  plasma  yang  akhirnya  memproduksi antibodi  (kekebalan  spesifik).  Aktivitas  ma- krofag  yang  berkesinambungan  inilah  yang menyebabkan  peningkatan  tanggap  kebal non-spesifik.
Menggertak  kembali  proses  tanggap kebal  dilakukan  booster  atau  pengulangan pemberian bahan imunostimulan ketika kadar imunitas  ikan  menurun.  Hal  ini  bertujuan untuk  meningkatkan  kembali  produksi  anti- bodi.  Menurut  Bagni et  al .  (2000)  dengan booster  ulang  dapat  meningkatkan  kembali
fungsi leukosit, pertahanan melawan penyakit  infeksius  dan  tidak  menyebabkan ikan stres.
Pengendalian  penyakit  harus  dilaku- kan sedini mungkin, agar tidak terjadi wabah penyakit  yang  menyebabkan  kerugian  pada ekonomi.  Upaya  pengendalian  yang  dapat dilakukan  dengan  pemakaian  bahan  kimia, namun  pemakaiannya  untuk  jangka  panjang dapat menimbulkan dampak negatif. Dampak ini  bukan  saja  terhadap  lingkungan  perairan dan  patogen  yang  menjadi  resisten,  bahkan terhadap  kesehatan  konsumen  karena  residu antibiotik yang bersifat karsinogenik. Imuno- stimulan  merupakan  alternatif  aman,  efektif dan  ekonomis  dalam  mencegah  terjadinya wabah  penyakit  sehingga  produksi  dapat ditingkatkan.
Kegiatan budidaya ikan, metode yang sering  digunakan  untuk  menangani  infeksi patogen  adalah  penggunaan  antibiotik  dan kemoterapeutik  secara  terbatas.  Namun, selain memiliki efektivitas rendah dan mahal, penggunaan  bahan-bahan  kimia  dapat  me- nyebabkan  akumulasi  di  lingkungan maupun dalam tubuh ikan yang secara potensial dapat mengancam kesehatan konsumen serta lingkungan  (Evelyn,  2002).  Aplikasi  imuno- stimulan  LPS  berkorelasi  positif  terhadap perbaikan lingkungan disatu sisi dan pening- katan  keuntungan  pembudidaya  disisi  lain sebagai efek turunnya kejadian penyakit.

## IV. KESIMPULAN
Imunostimulan  LPS  dari  dinding  sel Vibrio  alginolyticus dan  LPS  komersial dengan metode penyuntikan secara intramus- kuler  efektif  untuk  meningkatkan  imunitas benih  kerapu  hibrid  cantik  terhadap  infeksi bakteri. Nilai titer antibodi dan RPS tertinggi terlihat  pada  perlakuan  LPS  dari  dinding  sel V. alginolyticus sebesar 128 kali pengenceran dan  RPS  77,46%.  Pada  perlakuan  LPS komersial nilai titer antibodi 64 kali dan RPS 71,12%.  Sedangkan  kontrol  hanya  4  kali. Hasil  penelitian  ini  dapat  diaplikasikan  pada pemeliharaan  kerapu  di hatchery ,  sehingga
dapat  meningkatkan  produksi  benih  yang berkualitas baik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dibiayai dari DIPA T.A. 2015  Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengem- bangan Budidaya Laut, Gondol, Bali. Terima kasih  kepada  Fris  Johnny  (Alm)  sebagai penanggung  jawab  penelitian  ini  serta Zafran,  Slamet  Haryanto,  Mohamad  Ansari, Sri  Suratmi  dan  Kristiana  Subyakto  yang telah membantu terlaksananya penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Alifudin, M. 2002. Imunostimulan pada hewan akuatik. Akuakultur  Indonesia, 41(2):
87-92.
Almendras,  J.M.E.  2001.  Immunity  and biological  methods  of  disease  preven- tion and control. In Lio-Po, G.D., C.R. Lavilla, and E.R. Cruz-Lacierda (eds.). Health  Management  in  Aquaculture. Tigbauan,  Iloilo,  Phillippines.  SEA- FDEC  Aquaculture  Department.  137- 158pp.
Amend,  D.F.  1981.  Potency  testing  of  fish vaccines. Dev.  Biol.  Stand. ,  49:447- 454.
Austin,  B.  2010.  Vibrios  as  causal  agents  of zoonoses. Vet.  Microbiol .,  140:310- 317.
Bagni,  M.,  L.  Archetti,  M.  Amadori,  and  G. Marino.  2000.  Effect  of  long-term oral  administration  of  an  immune- stimulant  diet  on  innate  immunity  in seabass  ( Dicentrarchus  labrax ). J. Vet. Med ., 47:745-751.
Bricknell, I. and R.A. Dalmo. 2005. The use of  immunostimulants  in  fish  larval aquaculture. Fish and Shellfish Immunology, 19(5):457-472.
Crosbie,  P.B.  and  B.F.  Nowak.  2004. Immune  responses  of  barramundi, Lates calcarifer (Bloch), after administration  of  an  experimental Vibrio  harveyi bacterin  by  intra-
peritoneal  injection,  anal  intubation and  immersion. J.  Fish  Diseases, 27:623-632.
Evelyn,  T.P.T.  2002.  Finfish  immunology and  its  use  in  preventing  infectious diseases  in  cultured  finfish. In Di- seases in Asian Aquaculture IV. C.R. Lavilla-Pitogo  and  E.R.  Cruz-La- cierda  ( eds. ).  Fish  Health  Section,
Asian Fisheries Society, Manila. 303- 324pp.
Ezzel,  J.W.,  T.G.  Abshire,  S.F.  Little,  B.C. Lidgerding,  and  C.  Brown.  1990. Identification of Bacillus anthracis by using  monoclonal  antibody  to  cell wall  Galactose-N-Acetylglucosamine -Polysaccharide. J.  Clinical  Micro- biology, 28(2):223-231.
Han. 2000. The role of immunostimulants in monogastric  animal  and  fish-review. J. Anim. Sci ., 13(8):1178-1187.
Irianto,  A.  2005.  Patologi  ikan  teleostei. Gadjah  Mada  University  Press.  Yog- yakarta. 256hlm.
James,  C.M.,  S.A.  Al-Thobaiti,  B.M.  Rasem, and  M.H.  Carlos.  1999.  Potential  of grouper  Hybrid  ( Epinephelus  fusco- guttatus x Epinephelus  polyphe- kadion )  for  aquaculture. Aquacult. Eur. Mag ., 24:35-37.
Johnny, F., I. Koesharyani, D. Roza, Tridjoko, N.A.  Giri,  dan  K.  Suwirya.  2001.
Respon  ikan  kerapu  bebek, Cromi- leptes altivelis terhadap imunostimulan peptidoglycan  melalui  pakan  pelet. J. Penelitian  Perikanan  Indonesia, 7(4): 52-56.
Johnny,  F.  dan  D.  Roza.  2002.  Pengaruh penyuntikan  imunostimulan  peptide- glikan  terhadap  peningkatan  tanggap kebal non-spesifik ikan kerapu macan, Epinephelus  fuscoguttatus .  Laporan Penelitian Balai Besar Riset Perikanan Budidaya Laut, Gondol. 12hlm.
Johnny,  F.,  D.  Roza,  Zafran  dan  A.  Prijono.
2005.  Penggunaan  imunostimulan untuk  meningkatkan  kekebalan  non- spesifik  benih  ikan  kerapu  lumpur,
Epinephelus  coioides terhadap  virus irido. J.  Penelitian  Perikanan  Indo- nesia , 11(5):75-83.
Johnny,  F.,  Zafran  dan  D.  Roza.    2009. Aplikasi vaksin anti bakteri polivalen pada  budidaya  ikan  kerapu  pasir, Epinephelus  corallicola di  keramba jaring apung. Prosiding Forum
Inovasi  Teknologi  Akuakultur  2009. Hlm.:967-971.
Johnny,  F.,  D.  Roza  dan  I.  Mastuti.    2010. Aplikasi  imunostimulan  untuk  me- ningkatkan imunitas non-spesifik ikan kerapu  macan, Epinephelus  fusco- guttatus terhadap  penyakit  infeksi  di hatchery.  Prosiding  Forum  Inovasi Teknologi  Akuakultur  2010.  Hlm.: 945-949.
Johnny,  F.  dan  D.  Roza.    2012.    Penyakit Infeksi  Vibriosis  pada  Calon  Induk Ikan  Kerapu  Sunu, Plectropomus leopardus di Hatchery. Dalam :
Samingan et  al. ( eds. ).  Prosiding Seminar  Nasional  XXI  Perhimpunan Biologi Indonesia. Univ. Syiah Kuala Banda Aceh.  Hlm.:185-187.
Kamiso,  H.N.,  A.  Isnansetyo,  Triyanto,  M.
Murdjani,  dan  Murwantoko.  2005. Produksi  vaksin Vibrio untuk  me- ngatasi penyakit ikan kerapu. Seminar Riset  Unggulan  Strategis  Nasional (RUSNAS) Kerapu. Jakarta. 16hlm. Kumar,  S.R.,  V.P.I.  Ahmed,  V.  Parames- waran,  R.  Sudhakaran,  V.S.  Babu, S.A.S.  Hameed.  2008.  Potential  use of  chitosan  nanoparticles  for  oral delivery of DNA vaccine in Asian sea bass ( Lates calcarifer ) to protect from Vibrio ( Listonella ) anguillarum.  Fish and Shellfish Immuno ., 25:47-56. Kusumawati, D. dan S. Ismi. 2013. Karakter fenotip  dan  genotip  kerapu  hybrid cantik  ( Epinephelus  fuscoguttatus x Epinephelus  polyphekadion )  dengan populasi asal. Prosiding Forum Inovasi  Teknologi  Akuakultur  2014. Hlm.:729-740.
Lin,  J.H.T.,  T.Y.  Chen,  M.S.  Chen,  H.E. Chen,  R.L.  Chou,  T.I.  Chen,  M.S. Shu, and H.E. Yang. 2006.
Vaccination  with  three  in  activated pathogens  of  cobia  ( Rachicentron canadum ) stimulates protective immunity. Aquaculture, 255:125-132. Nayak, S.K. 2010. Probiotic and immunity: a fish  perspective. Fish  and  Shellfish Immunol., 29:2-14.
Roza,  D.,  F.  Johnny,  dan  Tridjoko.  2004. Peningkatan  imunitas  yuwana  ikan kerapu  bebek, Cromileptes  altivelis terhadap  infeksi  viral  nervous  necro- sis  (VNN). J.  Penelitian  Perikanan Indonesia, 10(1):61-70.
Roza,  D.,  F.  Johnny,  dan  Tridjoko.  2006.
Peningkatan respon imun non-spesifik benih  kerapu  bebek, Cromileptes altivelis dengan  imunostimulan  dan bakterin  terhadap  infeksi  Viral  Ner- vous  Necrosis  (VNN). J.  Penelitian Perikanan Indonesia, 8(1):25-35.
Roza,  D.  dan  F.  Johnny.  2008.  Aplikasi bakterin sebagai imunostimulan untuk pencegahan infeksi viral  nervous ne- crosis (VNN) pada benih ikan kerapu bebek, Cromileptes  altivelis . J.  Per- ikanan UGM , 5(2);139-148.
Roza,  D.,  F.  Johnny,  dan    Zafran.    2010.
Pengembangan  vaksin  bakteri  untuk meningkatkan  imunitas  ikan  kerapu macan, Epinephelus fuscoguttatus ter- hadap  penyakit  infeksi.  Prosiding Forum  Inovasi  Teknologi  Akuakultur 2010.  Hlm.:939-944.
Roza,  D.,  F.  Johnny,  dan  Zafran.    2012. Upaya  meningkatkan  titer  antibodi benih  ikan  kerapu  macan,  Epinep- helus fuscoguttatus di hatchery
dengan  menggunakan  vaksin  strepto- coccus.    Laporan  Teknis  Balai  Besar Penelitian  dan  Pengembangan  Budi- daya Laut. Tahun 2012.  10hlm.
Rukyani,  A.,  F.H.  Pasaribu,  dan  A.  Sunarto.
1998.  Penggunaan  imunostimulan asal  dinding  sel  bakteri  untuk  me- ningkatkan  kekebalan  udang  windu.
Dewan Riset Nasional. Laporan Riset Unggulan Terpadu.  64hlm.
Subasinghe,  R.  2009.  Diseases  control  in aquaculture  and  responsible  use  of veterinary  drugs  and  vaccine:  the issues,  prospects  and  challenges. In : Rogers,  C.  ( eds. ).  The  use  of  veteri- nary  drugs  and  vaccines  in  Mediter- ranean  aquaculture.  Zaragoza  Ci- heaam. 5-11pp.
Taib,  A.N.M.,  M.N.  Shamsudin,  and  R. Rozita. 2002. Vibriosis vaccine development : Vibrio alginolyticus. In :  Diseases  in  Asian  Aquaculture  IV.
Lavilla-Pitogo,  C.R.  and  E.R.  Cruz- Lacierda  ( eds. ).  Fish  Health  Section,
Asian Fisheries Society. Manila. 325- 335pp.
Thompson,  K.D.,  J.H.  Lilley,  S.C.  Chen,  A. Adams, and R.H. Richards. 1999. The immune  response  of  rainbow  trout ( Onchorhynchus mykiss ) against Aphanomyces  invadans . Fish  and Shelfish Immunology , 9:195-210.
Toranzo,  A.E.,  B.  Magarinos,  and  J.L.
Romalde. 2005. A review of the main bacterial  fish  diseases  in  mariculture systems. Aquaculture, 246:37-61.
Vadstein,  O.  1997.  The  use  of  immune- stimulation  in  marine  larviculture: possibilities and challenges. Aquacul- ture , 155:401-417.
Yudha,  H.T.  dan  T.  Sutarmat.  2014.
Keragaan pertumbuhan kerapu macan ( Epinephelus  fuscoguttatus ),  kerapu batik  ( Epinephelus  microdon )  dan kerapu  hibrida  cantik  sebagai  hasil persilangan kerapu macan dan kerapu batik.  Prosiding  FITA  2013.  Hlm.: 617-623.
Zafran,  F.  Johnny  dan  D.  Roza.  2008. Peningkatan  imunitas  benih  ikan kerapu  pasir, Epinephelus  corallicola melalui  penggunaan  vaksin  bakteri polivalen.  Prosiding  Seminar  Nasio- nal  Biodiversitas  II.  Universitas  Air- langga Surabaya, 19 Juli 2008.  Hlm.: 203-206.
Zafran,  D.  Roza  dan  F.  Johnny.  2010. Respon  juvenil  ikan  kerapu  bebek, Cromileptes  altivelis terhadap  vaksin Vibrio yang  diberikan  melalui  peren- daman.  Prosiding  Seminar  Nasional Perikanan Indonesia 2010.  Hlm.:305- 308.
Zafran,  D.  Roza,  dan  F.  Johnny.    2011.  Uji aplikasi  vaksin  bakteri  vibrio  poli- valen  pada  larva  ikan  kerapu  bebek, Cromileptes  altivelis di  hatchery. Dalam Isnansetyo et  al .  ( eds. ). Prosiding  Seminar  Nasional  Tahunan
VIII  Hasil  Penelitian  Perikanan  dan Kelautan Tahun 2011. Hlm.: 1-5. Zhu, K., Z. Chi, J. Li, F. Zhang, M. Li, H.N. Yasoda,  and  L.  Wu.  2006.  The surface  display  of  haemolysin  from Vibrio harveyi on yeast cells and their potential  applications  as  live  vaccine in  marine  fish. Vaccine, 24:6046-
6052. Diterima : 3 Oktober 2016 Direview : 3 November 2016 Disetujui : 20 Mei 2017