Menara Perkebunan , 2008, 76(2), 83-92

## Kloning dan karakterisasi gen penyandi inhibitor proteinase dari  kulit buah kakao
Cloning and characterization of gene encoding proteinase inhibitor of cacao pod wall
Mayta Novaliza ISDA 1) , Musliar KASIM 2) , MANSYURDIN 3) , Tetty CHAIDAMSARI 4) *) & Djoko SANTOSO 4)
1) Sekolah Pascasarjana Universitas Andalas,  Padang 25163, Indonesia
2) Fakultas Pertanian Universitas Andalas,  Padang 25163, Indonesia
3) Fakultas MIPA,Universitas Andalas, Padang 25163, Indonesia
4) Balai Peneltian Bioteknologi Perkebunan, Bogor 16151, Indonesia

## Summary
Attempts  to  increase  cocoa  production  in Indonesia  have  been  hinderred  by  attack  of CPB (Conopomorpha  cramerella) .  There  has been no effective measures to control  this pest leading  to  development  of  cacao  planting materials which resistant to the pod borer. One of  genes  functioning  in  plant  defense  system against  insect  pests  such  as  catepilar  is Proteinase  Inhibitor  (PIN).  This  research aimed  to  isolate  and  characterize  TcPIN  gene of  cacao  pod  wall.  A  clone  of  TcPIN  was isolated  with  RT-PCR  technique  using  total RNA  of  cacao  pod  wall  and  DNA  primer designed  based  on  the  sequence  Trypsin Inhibitor  of  cocoa  bean  accessible  online. BlastX  analysis  of  the  sequence  of  the  cDNA clone  demonstrated  that  the  ±  600  bp  gene cloned  with  pGEM-T  was  PIN  gene  as indicated  by  highly  homologous  to  Trypsin Inhibitor  of  Theobroma  microcarpum  resulted in  248  Score  bits  and  E  value  1  e -64 .  Two sequence  alligment  with  the  putative  21  kDa PIN  of cacao seed indicated a moderately high homology.  Contrasting  these  two  sequences however found some non identical amino acids implying some variations.
[ Key  Words : Theobroma  cacao L, TcPIN gene,  cDNA  clone,  cocoa-pod borer].

## Ringkasan
Usaha  peningkatan  produksi  kakao  di
Indonesia  terkendala  antara  lain  oleh  adanya serangan hama PBK ( Conopomorpha cramerella ).  Untuk  menanggulangi  serangan PBK  tersebut  perlu  adanya  satu  cara pengendalian yang efektif dan efisien, sehingga dapat  mendorong  usaha  pengembangan  bahan tanam  yang  tahan  PBK.  Salah  satu  gen membawa  sifat  ketahanan  tanaman  terhadap hama  ulat  adalah  Proteinase  Inhibitor  ( PIN ). Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  dan mengkarakterisasi  gen TcPIN dari  kulit  buah kakao.  Klon  cDNA TcPIN diisolasi  dari  kulit buah  kakao  dengan  teknik  RT-PCR  meng- gunakan  RNA  total  kulit  buah  kakao  dan primer DNA yang dirancang atas dasar sekuen Inhibitor Tripsin biji kakao yang diakses lewat internet. Hasil analisis BlastX dari sekuen klon cDNA  menunjukkan    bahwa  gen  berukuran ±  600  pb  yang  telah  diklon  dengan  pGEM-T tersebut adalah PIN karena memiliki homologi yang  tinggi  terhadap  21  kDa  trypsin  inhibitor dari Theobroma  microcarpum yang  meng- hasilkan  Skor  248  bits  dengan  Nilai  E  1e -64 . Penjajaran  dua  sekuen  dengan  PIN  putatif 21 kDa yang berasal dari biji kakao menunjuk- kan  tingkat  homologi  yang  tinggi,  dengan perbedaan nyata sehingga dapat terlihat bahwa keduanya tidak identik.
*) Penulis korespondensi
Isda et al.

## Pendahuluan
Kakao ( Theobroma cacao L.)
merupakan  salah  satu  komoditas  per- kebunan  penting  bagi  Indonesia  yang merupakan  negara  produsen  terbesar ketiga  setelah  Pantai  Gading  dan  Ghana. Untuk  meningkatkan  produksi  kakao, pemerintah mencanangkan program revitalisasi perkebunan termasuk diantara- nya  perluasan  areal  dan  peremajaan tanaman kakao. Luas lahan tanaman kakao Indonesia lebih kurang 992.448 ha dengan produktivitas  rata-rata  900  Kg  per  ha (Indonesia,  Departemen  Perindustrian, 2007).  Saat  ini,  Indonesia  mengekspor 40% kakao ke Malaysia, 30% ke AS, 15% ke Singapura, dan 15% ke Eropa. Produksi kakao Indonesia tahun 2008 dibandingkan dengan  tahun  2007  menurun  4%  dari 500.000  ton  menjadi  480.000  ton.  Harga rata-rata kakao selama tahun 2008 sebesar US$  2.500  per  ton  dan  pada  tahun  2009 diperkirakan  meningkat  menjadi  US  $ 2.900  per  ton  (Husaini,  2009).  Sebagai salah satu komoditi ekspor nonmigas yang potensial, maka produksi kakao perlu terus ditingkatkan.
Namun  demikian  usaha  peningkatan produksi  kakao  di  Indonesia  masih  ter- kendala  oleh  adanya  serangan  penggerek buah  kakao  (PBK).    Kehilangan  produksi dapat  mencapai  hingga  80%,  dan  biji kakao  yang  berasal  dari  buah  yang terserang  mutunya  menurun  atau  bahkan tidak  laku  dijual  (Wardojo,  1992). Penggerek  buah  kakao  (PBK)  adalah masalah  utama  pada  tanaman  kakao  di Asia  Tenggara,  termasuk  Indonesia. Berdasarkan  sifat  larva  PBK,  hama  ini sangat  sulit  penanggulangannya  baik secara kimiawi maupun biologis. Berbagai  upaya  telah  dilakukan  untuk penanganan masalah serangan PBK
tersebut.    Cara-cara  penanggulangan  PBK yang  dapat  dipandu  dengan  pengalaman petani  diantaranya;  (1)  panen  lebih  awal, (2)  panen  semua  buah  menjelang  akhir masa  panen,  (3)  membersihkan  sarasah  di permukaan tanah, (4) mengurangi naungan,  (5)  mematikan  kutu  putih,  kutu hijau  dan Apis sp.  yang  menghasilkan embun  madu,  (6)  menghindari  peng- gunaan peptisida guna melestarikan musuh  alami  perlu  diusahakan,  (7)  meng- isolasi  kebun  kakao  dari  ladang-ladang kecil  (Depparaba,  2002).    Adanya  sistem sarungnisasi  (penyarungan  buah)  untuk penanggulangan  hama  PBK  juga  dilaku- kan  di  Sulawesi  Tengah  dan  Nusa Tenggara  Timur (Badan  Penelitian  dan Pengembangan  Pertanian ,  2006).  Namun sistem ini efektif pada musim buah sedikit karena  pada  saat  itu  hama  PBK  ter- akumulasi keberadaannya.
Hingga  saat  ini  belum  ada  cara pengendalian  yang  efektif  dan  efisien terhadap  hama  PBK  yang  penyebarannya sangat cepat.  Salah satu pemecahan yang menjadi  pusat  perhatian  saat  ini  adalah penyediaan  bahan  tanam  kakao  tahan terhadap  PBK.    Salah  satu  gen  ketahanan tanaman  terhadap  serangga  hama  adalah gen  penyandi  Proteinase  Inhibitor.  Enzim ini  beperan  untuk  menghambat  aktivitas protease  serangga.  Dengan  demikian pengembangan  tanaman  tahan  terhadap serangga  hama  terbuka  peluang  dengan memanfaatkan gen ketahanan PIN semacam  ini  (Lawrence  &  Koundal, 2002). PIN diharapkan  dapat  membantu upaya  pemuliaan  maupun  seleksi  klon kakao  tahan  PBK  dari  beberapa  sentra kakao di Indonesia.
Proteinase  inhibitor  tanaman  di- ketahui  bersifat  toksik  terhadap  predator dan  patogen.  Jika  protein  tersebut  ter-
Kloning dan karakterisasi gen penyandi inhibitor……
makan  oleh  hama, PIN akan  berinteraksi dengan  protease  yang  terdapat  di  dalam usus, selanjutnya terikat dan terkunci pada situs  aktif  ( active  site )  protease  (Terra et  al. ,  1996;  Walker et  al. ,  1998).  Oleh karena  asam amino tidak dapat  dihasilkan oleh  proteasenya,  hama  menjadi  ke- kurangan  nutrisi  sehingga  pertumbuhan dan perkembangannya menjadi terhambat. Pada biji kakao telah ditemukan proteinase inhibitor  sebagai  protein  penyimpanan (Tai et  al., 1991).  Santosa  (2001)  telah melakukan pengembangan prosedur
analisis  ekspresi  gen PIN pada  tingkat
DNA dari tanaman kakao UAH.
Sedangkan  usaha  untuk  mengkaitkan  gen PIN dengan ketahanan terhadap PBK telah dianalisis    di  tingkat  DNA  pada  tanaman yang  diduga  tahan  PBK  (Jaya et  al.,
2004).  Namun  klon-klon  dari  tanaman tersebut mempunyai produksi yang rendah. Berdasarkan upaya dalam mendapatkan tanaman kakao tahan terhadap  hama  PBK, maka  tujuan penelitian  ini  adalah  meng-  isolasi  dan karakterisasi  gen TcPIN dari  kulit  buah kakao  melalui  hama  larva  PBK  yang masuk  menyerang  buah  kakao  dan merusak  isinya.  Teknik  yang  digunakan adalah  RT-PCR  dengan  primer  spesifik dan RNA total dari kulit buah kakao.

## Bahan dan Metode

## Isolasi RNA biji dan kulit buah kakao
RNA  kakao  dari  klon  Ary  dan  klon Bal diisolasi dengan menggunakan metode Chaidamsari et  al. (2005).  Untuk  meng- endapakan RNA digunakan bufer ekstraksi sebagai deterjen, fenol kloroform sebagai pelarut organik serta litium klorida (LiCl).  Uji  kualitatif  dilakukan  melalui teknik  elektroforesis  RNA  dalam  gel
agarosa  1%  yang  ditambah  dengan 1,5 mg/L etidium bromida, pada tegangan 25  voltase  selama  dua  jam  yang  berperan untuk  melihat  pita  hasil  elektroforesis, sedangkan  uji  kuantitatif  dengan  melihat perbandingan serapan pada panjang gelombang  260  nm  dengan  280  nm ( Sambrook et al., 1989).

## Design primer
Primer dirancang menggunakan program  primer3  yang  tersedia  pada  situs web  http://frodo.mit.edu/.  Hal  pertama yang dilakukan dalam perancangan primer adalah  memasukkan  data  urutan  basa DNA  target,  urutan  dapat  diketahui dengan  mencari  data  gen PIN pada tanaman  dikotil  lain  yang  telah  tersedia datanya  di  www.ncbi.nlm.nih.gov.  Peran- cangan  menghasilkan  beberapa  primer dengan  ukuran  perkiraan  fragmen  hasil PCR  yang  bervariasi.  Setiap  primer disusun  sedemikian  rupa  agar  memenuhi kriteria  (Rozen  &  Skaletsky,  1999).  Hasil perancangan tersebut berupa urutan oligonukelotida  dengan  beberapa  data yang  penting  untuk  diketahui  dalam pelaksanaan  proses  PCR,  seperti,  Tm ( melting temperature ), jumlah basa, kandungan GC dan yang lainnya.
Isolasi  dan  kloning  gen  TcPIN pada pGEM-T- Easy
Isolasi  gen TcPIN dilakukan  dengan RT-PCR menggunakan satu pasang primer spesifik yang komplemen ujung 5’ TcPIN F21 (5’ A T G A A G A CCGCAACAGCCG TA ’3 ) dan ujung 3’ gen TcPIN R11 ( 5’AT GCTTCGGTTAACAACTTG3’ ) sebagai- mana  diuraikan  untuk  gen TcAP1 pada Santoso (2006).  Setelah diisolasi dari gel, fragmen  DNA  hasil  PCR  dikloning
Isda et al.
menggunakan  vektor  pGEM-T  Easy. Volume  ligasi  yang  digunakan  adalah 10  µL,  terdiri  atas:  3,5  µL  DNA  insert hasil  purifikasi TcPIN (~1.000  ng  DNA insert), 0,5 µL vektor pGEM-T Easy, 5 µL bufer ligasi (Promega), dan 1 µL enzim T4 ligase.  Reaksi  ligasi  dilakukan  pada  suhu ruang selama satu jam, kemudian dilanjutkan  pada  suhu  4  °C  semalam. Kemudian  transformasi  ke  sel  kompeten E.  Coli ( XLI-Blue ).  Selanjutnya  dikultur- kan  100  µL  pada  medium  LA  yang mengandung ampisilin 200 µg/mL, 100  µL  100  mM  IPTG  dan  100  µL 50  mg/mL  X-Gal.    Setelah  diinkubasikan pada suhu 37°C semalam, maka dilakukan seleksi  terhadap  koloni  yang  tumbuh. Koloni yang dipilih adalah berwarna putih dan selanjutnya dilakukan PCR koloni dan membuat duplikat terhadap koloni  terpilih tersebut.  Program  PCR  terdiri  dari  initial denaturasi  pada  suhu  95°C  selama  empat menit,  denaturasi  pada  suhu  94°C  selama 30  detik,  penempelan  pada  suhu  55°C selama  satu  menit,  ekstensi  pada  suhu 72°C    selama  satu  menit  sebanyak  30 siklus, serta ekstensi final pada suhu 72 °C selama  lima  menit.  Hasil  PCR  koloni selanjutnya  diperiksa  dengan  gel  agarose 1%.

## Identifikasi  dan  analisis  klon  plasmid rekombinan
Miniprep/isolasi  DNA  plasmid  di- lakukan  terhadap  koloni  terpilih  dengan ukuran yang sesuai dan telah  dikulturkan semalam  pada  medium  LB  cair  dan diinkubasikan  pada  suhu  37°C  dengan pengocokan  200  rpm.  Prosedur  dalam melakukan  miniprep  DNA  plasmid  yang digunakan adalah prosedur Roche.
Kemudian diinkubasikan pada suhu 37 °C
selama  satu  jam  dan  diperiksa  hasilnya pada gel agarose 1%.
Selanjutnya untuk memeriksa kebera- daan  DNA  insert  dapat  dilakukan  dengan pemotongan  menggunakan  enzim  EcoRI sehingga  dapat  diketahui  ukuran  insert yang  digunakan.    Volume  reaksi  untuk digesti  adalah  10  µL  yang  terdiri  atas: 3  µL  DNA  plasmid  hasil  miniprep,  1  µL NEB  bufer,  1  µL  enzim  EcoRI,  dan 5µL  MQ.  Kemudian  diinkubasikan  pada suhu 37 °C selama satu jam dan diperiksa hasilnya pada gel agarose 1%.

## Penentuan dan analisis sekuen DNA
Fragmen  DNA  produk  RT-PCR  gen TcPIN disekuen  di  Lembaga  Biologi Molekuler Eijkman, Jakarta menggunakan primer  universal  M13F  dan  M13R.  Hasil sekuensing  yang  berupa  urutan  basa (nukleotida)  dari  fragmen  DNA  selanjut- nya  dapat  dianalisis  beberapa  program bioinformatika.    Untuk  membandingkan dengan  semua  database  yang  telah diketahui  pada  NCBI  (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/),  data  sekuen  dianalisis dengan program pencarian BLAST (Altschul et  al .,  1997).    Selanjutnya  ter- hadap  sekuen-sekuen  tersebut  dilakukan alignment  dengan  menggunakan  program alignment multi sekuen ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

## Hasil dan Pembahasan

## Profil elektroforesis RNA total dari kulit buah kakao
Isolasi  RNA  dari  biji  dan  kulit  buah kakao  dengan  ukuran  panjang  buah  9  cm dan  12  cm.  Pemilihan  ukuran  buah tersebut sesuai dengan    Wardoyo dalam
Kloning dan karakterisasi gen penyandi inhibitor……
Depparaba  (2002 )  yang  menyatakan bahwa  buah  kakao  dengan  usia  sangat muda  dan    panjang  5-7  cm  tidak  pernah terserang  PBK.  Buah  kakao  mulai terserang  PBK  pada  panjang    9  cm  dan PBK  lebih  menyukai  buah  kakao  yang panjangnya  lebih  dari  9  cm  (Sulistyowati et  al .,  2003).  Selain  itu  digunakan  biji kakao  sebagai  kontrol  karena  telah dipastikan  bahwa  gen PIN secara  natural terekspresi  pada  biji  kakao.  Pengukuran absorban  RNA  kulit  buah  kakao  (klon tahan  PBK  dan  tidak  tahan  PBK)  dan biji (  Tabel  1).  Berdasarkan  data  serapan masing-masing  sampel,  RNA  total  yang berhasil  diisolasi  memiliki  kemurnian yang  relatif  tinggi,  dilihat  dari  nisbah A260/280  yang  mempunyai  nilai  1,647- 2,095  (Sambrook et  al. ,  1989).  Adapun perolehan  RNA  total  tertinggi  adalah jaringan biji kakao.
Selain  kemurnian,  keutuhan  (inte- gritas)  RNA  juga  merupakan parameter lainnya  yang  sering  digunakan  dalam pengujian  kualitas  RNA.  Profil  elektro- foresis  (Gambar  1)  menunjukkan  bahwa RNA  total  dari  masing-masing  sampel mempunyai  intensitas  pita  yang  sama baiknya.  Hal  ini  ditunjukkan  adanya  dua pita  dengan  intensitas  yang  relatif  tajam dan  kuat.  Kedua  pita  ini  masing-masing adalah  RNA  ribosomal  28S  dan  18S. Kedua  jenis  RNA  ribosomal  ini  sangat distingtif  karena  kelimpahannya  di  dalam RNA  total  adalah  terbesar.  Dengan demikian  apabila  kuantitas  kedua  jenis RNA  tersebut  baik,  maka  RNA  jenis lainnya  di  dalam  RNA  total  tersebut  juga relatif baik.  Kualitas RNA total yang baik sangat  menentukan  keberhasilan  kerja dalam  percobaan-percobaan  selanjutnya seperti, pemurnian mRNA, sintesis cDNA, RT-PCR, dan microarray.
Kloning   fragmen   gen   TcPIN   dengan pGEM-T-Easy
Fragmen  DNA  hasil  RT-PCR  yang memiliki ukuran sekitar 600 pb (data tidak ditunjukkan),  setelah  dimurnikan  dari  gel agarosa kemudian direkombinasikan dengan  vektor  kloning pGEM-T  Easy .
Setelah  seleksi  pada  media  yang  sesuai, dan dilanjutkan penapisan untuk mendapatkan  rekombinan yang  membawa gen TcPIN ( true  rekombinant ),  kemudian dilakukan  PCR  koloni  terhadap  beberapa koloni  bakteri  yang  tumbuh  pada  media seleksi  yang  mengandung  antibiotika ampisilin.  Seleksi  transforman  melalui warna  koloni  yang  terbentuk  tidak  selalu sesuai  dengan  teori  yang  disebutkan sebelumnya.  Artinya  bahwa,  tidak  semua koloni  berwarna  putih  pasti  membawa fragmen gen sisipan dan sebaliknya belum tentu semua koloni  berwarna biru merupakan koloni negatif (tidak
membawa  fragmen).  Hal  tersebut  dapat disebabkan oleh karakteristik dari fragmen gen  hasil  PCR  yang  diklon  ke  dalam pGEM-T Easy .  Sebagai  contoh,  koloni biru  dapat  dihasilkan  dari  produk  PCR yang diklon pada frame yang sama dengan
Tabel  1.  Data  spektrofotometri  RNA  total kakao.
Table  1.  Spectrophotometric  data  of  cacao total RNA.
Sampel Sample A 260/280 RNA ng/µL Buah 9cm Fruit 9 cm 1,647 168 Buah 12cm Fruit 12 cm 2,095 264 Biji ( seed ) 2,050 2940
Isda et al.
gen LacZ .  Produk  PCR  tersebut  biasanya memiliki  tiga  basa  sama  yang  berulang pada  beberapa  bagian  fragmen,  termasuk memiliki  basa  adenin  yang  berulang  pada bagian ujungnya (Promega, 1999). Produk PCR yang demikian tidak memiliki kodon stop  pada  bagian  fragmennya,  sehingga akan  ditranslasi  bersamaan  dengan  gen LacZ dan  menghasilkan  koloni  berwarna biru.
Pada  PCR  koloni  terlihat  bahwa koloni  Kb1,  Kb2,  Kb3,  Kb4,  Bj1  dan Bj2 merupakan  koloni  positif  (Gambar  2). Koloni-koloni setiap klon kulit buah kakao yang  paling  terang  pitanya  selanjutnya dikulturkan  dalam  medium  NB  cair  yang mengandung  ampisilin  100  ppm.  Setelah dikulturkan    semalam  pada  suhu  37ºC, dilakukan isolasi plasmid dari setiap kultur yang  diperoleh  menggunakan high  pure plasmid isolation kit (Roche). Hasil isolasi plasmid  dicek  pada  gel  agarosa  1%. Koloni positif atau koloni yang membawa fragmen  gen TcPIN ditunjukkan  dengan terbentuknya  pita    berukuran  800  bp. Apabila  dicermati  lebih  lanjut,  ukuran fragmen  gen TcPIN yang  sebenarnya adalah 600 bp dan   terjadi   pertambahan
ukuran sekitar 200 bp, hal ini karena PCR koloni  dilakukan  dengan  menggunakan primer universal yang komplemen dengan daerah  pada  vektor  pGEM-T  yang mengapit situs kloning majemuk (MCS).
Plasmid  dari  koloni  setiap  klon  kulit buah kakao dan biji selanjutnya ditentukan urutan  basanya  menggunakan  primer universal  M13F  dan  M13R  berturut-turut (GTAAACGACGACGGCCAGT dan GGAAACAGCTATGACCATG).  Setelah dilakukan  sekuensing,  untuk  memastikan bahwa  gen  yang  diisolasi  adalah  gen PIN maka  dilakukan  analisis  BLASTX.  Di dalam  program  bioinformatika  online, input  sekuen  DNA  ditranslasikan  oleh program  tersebut  kemudian  hasil  translasi dibandingkan dengan sekuen protein yang ada di Bank Gen ( Genebank Data Base ).

## Identifikasi dengan BlastX
Hasil  analisis  menggunakan  program BLASTX  (www.  ncbi.  nlm.  nih.  gov.) (Tabel  2),  memperlihatkan  penjajaran dasar dengan sekuen protein dari gen yang ada  di  Bank  Gen,  serta    menunjukkan
Gambar 1. Profil  elektroforesis   RNA   total kakao.  Lajur 1-3 berturut-turut dari buah 9 cm, 12 cm dan biji.
Figure1.  Electrophoresis profile of cacao total RNA. Lane 1-3 are  from fruits  of  9,
12 cm and seed, respectively . Kb1 Kb2  Kb3  Kb4  Bj1  Bj2   M
800 bp
Gambar  2.  Hasil  PCR  koloni TcPIN asal  kulit buah  (Kb)  dan  biji  (Bj)  kakao.  M marker DNA 1kb plus  ladder.
Figure 2. Results of colony PCR of cocoa pod wall (Kb)  and   seed (Bj) TcPIN . M is
1 kb ladder DNA  marker . 1             2              3 28S 18S
Kloning dan karakterisasi gen penyandi inhibitor……
bahwa gen yang telah diisolasi dan diklon dari  kulit  buah  kakao  menyandi  protein yang  memiliki  tingkat  kesamaan  struktur primer  (sekuen)  dengan  protein Putative
21  kDa  trypsin  inhibitor Theobroma bicolor . Hasil analisis terhadap protein ini memberikan Skor 256 bits dengan Nilai E sama  dengan 6  e -67 .  Sedangkan  analisis dengan  protein Putative  21  kDa  trypsin inhibitor Theobroma  microcarpum dan Putative 21 kDa trypsin inhibitor
Theobroma  cacao dengan  skor  dan  nilai yang  sedikit  lebih  rendah.  Hasil  ini membuktikan  bahwa,  fragmen  DNA  yang telah  diisolasi  dari  kulit  buah  kakao  dan diklon dengan vektor pGEM-T menyandi- kan  Inhibitor  Proteiase  dari  kakao ( Theobroma cacao ) sehingga dapat dituliskan dengan TcPIN .    Secara teoritis kisaran  skor  >  150  bits  dengan E-value > e -04 pada  analisis  Blast  menunjukkan tingkat  kemiripan  yang  tinggi  (Claveri et al., 2003).

## Homologi inhibitor tripsin biji kakao
Proteinase  Inhibitor  (PIN)  berukuran 21  kDa  kakao  pertama  kali  dilaporkan oleh  Tai et  al .  (1991),  berfungsi  sebagai protein  penyimpanan  pada  biji  kakao. Untuk  mengetahui karakteristik dalam hal tingkat  homologinya  dengan  PIN  biji
kakao  tersebut,  maka  dilakukan  analisis penjajaran  dua  sekuen  (www.ncbi.nlm. nih. gov)  (Gambar 3). Data ini menunjuk- kan  bahwa  PIN  dari  kulit  buah  kakao memiliki tingkat homologi ( identity = ID) cukup tinggi   > 56% dengan PIN dari biji kakao.  Namun  demikian,  perbedaannya juga  signifikan  yaitu,  sekitar  43,56% sehingga  sangat  logis  untuk  memprediksi bahwa  kedua  protein  yang  berasal  dari jaringan yang berbeda dari tanaman kakao memiliki  fungsi  yang  tidak  sepenuhnya sama. Hal tersebut karena secara fisiologis,  metabolisme  biji  berfungsi sebagai jaringan penyimpanan ( sink tissue ),  maka  sangatlah  logis  bahwa metabolit  yang  dikandung  dalam  biji sebagai  cadangan  makanan, food  reserve atau  metabolit  tersimpan.  Menurut  Tai et  al. (1991)  bahwa  PIN  yang  ditemukan dalam  jumlah  yang  besar  di  biji merupakan protein tersimpan.
Secara  fisiologis  kulit  buah  kakao berfungsi sebagai tempat perlindungan biji kakao  dari  kerusakan  fisik  dan  biologis. Selain struktur fisik, menurut Chaidamsari et  al. ,  2007,  diduga  sistem  perlindungan buah  kakao  dari  gangguan  luar  terutama oleh  hama  seperti  PBK  dan  penyakit. Bahwa  ada  perbedaan  antara  struktur primer  antara  PIN dari  kulit  buah  kakao dengan   PIN  biji  kakao   diduga   karena
Tabel 2.  Hasil analisis BLASTX dari gen yang diisolasi dari kulit buah kakao.
Table 2. Result of BlastX analysis of the gene isolated from cacao pod wall.
Protein yang bersesuaian Score (Bits) E Value Putative 21 kDa trypsin inhibitor [ Theobroma bicolor ] 256 6e -67 Putative 21 kDa trypsin inhibitor [ Theobroma microcarpum ] 246 5e -64 Albumin 246 5e -64 Trypsin inhibitor [ Theobroma sylvestre ] 231 1e -59
Isda et al.
terkait  dengan  adanya  sedikit perbedaan pada fungsinya, yaitu PIN biji kakao lebih berfungsi sebagai protein tersimpan sedangkan  PIN  dari  kulit  buah  kakao berfungsi juga di dalam sistem pertahanan dari  buah  kakao.  Untuk  membuktikan dugaan ini perlu dilakukan penelitian lebih lanjut secara terpisah.

## Kesimpulan
1. Dengan  teknik  RT-PCR  meng-gunakan primer  spesifik  telah  berhasil  diklon TcPIN dengan  ORF  lengkap  dari  kulit buah kakao.
2. TcPIN kulit  buah  kakao  menyandi protein  ini  memiliki  tingkat  homologi cukup  tinggi  dengan  yang  berasal  dari biji kakao.
3. PIN  diduga  memiliki  fungsi  pertahanan
buah  kakao  terhadap  serangan  PBK namun hal ini perlu dilakukan penelitian lebih lanjut secara terpisah.

## Ucapan Terimakasih
Penelitian ini dibiayai oleh
Departemen  Pertanian  melalui  program KKP3T (Kerja Sama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi) tahun 2007-2008.

## Daftar  Pustaka
Altschul,  S.F.,  L.M.  Thomas,  A.S.  Alejandro, Z.  Jinghui,  Z.  Zheng,  M.  Webb  &
J.L.    David  (1997).  Gapped  BLAST  and
PSI-BLAST:  a  new  generation  of  protein database  search  programs. Nuc.    Acids Res .,  25, 3389-3402.
Skor = 5230 Panjang penjajaran = 202 Sekuen TcPIN Biji :  1 - 221 (Panjang sekuen = 221) Sekuen TcPIN Kulit :  1 - 196 (Panjang sekuen = 196)
Biji MKTATAVVLLLFAFTSKSYFFGVANAANSPVLDTDGDELQTGVQYYVLSSISGAGGGGLALGRATG ||.||||||||||||||||||||| | .|||||   . |  . .    . .  .    ..... Kulit MKSATAVVLLLFAFTSKSYFFGVARADESPVLDKAVQKL--SFKEDPTTMVFPSFQ--MPMAKMVL Biji QSCPEIVVQRRSDLDNGTPVIFSNADSKDDVVRVSTDVNIEFVPIRDRLCSTSTVWRLDNYDNSAG .   .     |..|.   .  | .         .||||||||||||||| |||||.||.|| |.| Kulit SAYLLMTSSFPSGIDSVHRLCGSLTIMTPRQAN-GTDVNIEFVPIRDRLCLTSTVWKLDDYDPSTG Biji KWWVTTDGVKGEPGPNTLCSWFKIEKAGVLGYKFRFCPSVCDSCTTLCSDIGRHSDDDGQIRLALS |||||||||||.|| ||| |||||| || |||||||||||||||  ||.|.|||. .|||.||||| Kulit KWWVTTDGVKGDPGHNTLTSWFKIEDAGALGYKFRFCPSVCDSCIHLCNDFGRHG-HDGQVRLALS
Biji DNEW .| | Kulit ENGW Percentage ID = 56.44
Gambar 3.  Analisis penjajaran dua sekuen dari protein PIN asal kulit buah dan biji kakao. Figure 3. Pairwise output of two sequence alligment of PIN  from cacao seed and pod wall .
Kloning dan karakterisasi gen penyandi inhibitor……

## Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian
(2006).  Sarungisasi  kakao  di  Kabupaten Donggala  berhasil  tingkatkan  produkt- ivitas kakao.  Jakarta, Litbang Pertanian.
Chaidamsari,    T.  (2005).  Biotechnology  for cocoa  pod  borer  resistance  in  cocoa. Disertasi. Netherland, Wageningen University
Chaidamsari, T., A. Soesilo, Juliarni, R.A.  de  Maagd  &  D.  Santoso  (2007). Cellular  characterization  of  cocoa  fruit development  in  relation  to  pod  bore resistance. In: International  Conference on  Molecular  Biology  of  Life  Sciences , Malang, 19-21 November 2007.
Claveri,  J.M.  &  C.  Notredame  (2003). Bioinformatics  for  Dummies .  Ed  ke-2. New York,  John Wiley Publ.
Indonesia,  Departemen  Perindustrian  (2007).
Gambaran Sekilas Industri Kakao . http://www.depperin.go.id/gambaran_seki las_   industri_kakao.pdf  [02/02/2009].
Depparaba,  F.  (2002). Penggerek buah kakao ( Conopomorpha  cramerella Snellen)  dan penanggulangannya. J. Litbang Pertanian, 21 (2), 69-74.
Husaini,  A.  (2009).  Pengusaha  Kakao  Minta PPN  Tetap  0%. Harian  Kontan  tanggal 10 Januari 2009 http://www.kontan.co.id/ Pengusaha
Jaya,  A.M.S.,  H.  Aswidinnoor  &  D.  Santoso.
(2004).    Deteksi  dan  analisis  sekuen  gen inhibitor  proteinase  pada  beberapa  klon kakao  harapan  tahan  penggerek  buah kakao  dari  Sulawesi  Selatan. Menara Perkebunan , 72 (1),  1-10.
Lawrence, P.K. & K.R. Koundal (2002).  Plant protease  inhibitors  in  control  of  phyto- phagous insects. J. Biotech ., 5, 93-109.
Promega (1999). pGEM ® -Tand pGEM ® -T Easy
Vector Systems (Technical Manual
No.042). Wisconsin, Promega Corporation. Reece,  R.J.  (2004). Analyses  of  Genes    and Genomes. England,  John  Willey  &  Sons
Ltd.
Rozen, S. &n  H. Skaletsky (1999). Primer3 on the  www  for  general  users  and  for biologist  programmers. Method  In  Mol
Biol., 132, 365-385.
Sambrook,  J.,  E.  F.  Fristsch  &  T.  Maniatis.
(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual . New York, Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Santoso,  D.  (2001).  Pengembangan  pelacak DNA spesifik gen melalui bioinformatika:
Indentifikasi  gen  penyandi  protein  biji
21 kDa pada kakao UAH Indonesia Menara
Perkebunan , 69 (1), 10-17.
Santoso,  D.  (2006).  Molecular  And  Genetic
Engineering Studies Toward Improvement Of  Cacao  Bean  Production.  Bogor, Indonesian Biotechnology Research Institute for Estate Crops. 133p Sulistyowati, E .,  Y.D.  Junianto,  S.  Sukamto,
S. Wiryadiputra, L. Winato &
N.  Primawati  (2003).  Analisis  status penelitian  dan  pengembangan  PHT  pada pertanaman  kakao. Dalam Simposium Nasional    Penelitian  PHT  Perkebunan Rakyat. Bogor, 17-18 September 2003.
Terra,  W.  R.,  C.  Ferreira,  B.  P.  Jordao  &
R.  J.  Dillon  (1996).  Digestive  enzymes.
In :  M.  J.  Lehane  &  P.  F.  Billingsley Biology  of  the  Insect  Midgut .  London,
Chapman & Hall London. 153-186.
Tai, H., L. McHenry, P. J. Fritz & D.B. Furtek. (1991). Nucleid acid sequence of a 21 kDa cocoa  seed  protein  with  homology  to  the soybean trypsin inhibitor (Kumitz) family of  protease  inhibitors. Plant  Mol.  Biol .,
16 , 913-915 .
Isda et al.
Walker,  A.  J.,  L.  Ford,  M.E.N.  Majerus, I.E. Geoghegan, A.N.E. Birch, J.A.  Gatehous  &  A.M.R.  Gatehouse. (1998).    Characterisation  of  the  midgut digestive  proteinase  activity  of  the  two- spot  ladybird  ( Adalia  bipunctata L.)  and its  sensitivity  to  proteinase  inhibitors.
Insect  Biochem.  &  Mol.  Biol ., 28 ,  173- 180.
Wardojo,  S.    (1992)  Major  pests  and  diseases of  cocoa  in  Indonesia. In :  P.J.  Keane    & C.  A.  J.  Putter  (eds). Cocoa  Pest  and Disease  Management  in  Southeast  Asia and Australia FAO Plant Production and Protection,  paper  No  112.  Rome,  FAO.  p 63-67.