## Analisa Polimorfisme Gen BMP-15 (Bone Morphogeninetic Protein) Sapi PO  (Bos Indicus) Dan Hubungannya Dengan Keberhasilan Inseminasi Buatan
Erni Usnia Damayanti 1)* , Sri Rahayu 1)
1) Laboratorium Biologi Seluler dan Molekuler Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universits Brawijaya, Malang 65145, Jawa Timur, Indonesia. E-mail: chilicuitz@gmail.com
ABSTRAK
Gen  BMP-15  merupakan  salah  satu  anggota  TGF- β yang  terekspresi  khusus  pada  oosit  yang  sedang berkembang di ovarium. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui polimorfisme gen BMP-15 pada sapi PO  dengan  menggunakan  metode  PCR-RFLP  dan  hubungannya  terhadap  keberhasilan  inseminasi buatan  sapi  PO.  DNA  diisolasi  dari  10  sampel  darah  sapi  PO  betina,  yang  diperoleh  secara  acak  dari Pasuruan.  Isolasi  DNA  dilakukan  dengan  metode  salting  out.  Amplifikasi  DNA  dilakukan  dengan  PCR menggunakan  primer  forward  5’-GCTCTGGAATCACAAGGGG-3’  dan  primer  reverse  5’- AGAGATGGGGAGCGATGAT-3’.  Fragmen  DNA  yg  dihasilkan  dari  amplifikasi  sebesar  350  bp.  Hasil amplifikasi  gen  BMP-15  dipotong  dengan  enzim  restriksi  HaeIII    menghasilkan  dua  macam  haplotip, yaitu    9  sampel  merupakan  haplotip  satu    dengan  ukuran  fragmen  100  bp  dan  200  bp,  sedangkan  1 sampel  merupakan  haplotip  dua  dengan  ukuran  fragmen  100  bp,  125  bp,  200  bp,  300  bp,  dan  400  bp. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa terdapat polimorfisme gen BMP-15 pada sapi PO namun tidak terdapat hubungannya dengan keberhasilan inseminasi buatan.
Kata Kunci :  Gen BMP-15, polimorfisme,  Sapi PO.

## ABSTRACT
BMP-15 gene is a member of the TGF- β are expressed specifically in developing oocytes in the ovary. The aims  of  this  study  was  to  determine  the  BMP-15  gene  polymorphism  in  PO  cattle  using  PCR-RFLP method and its relationship to success of artificial insemination of PO cattle. Genomic DNA was isolated from  blood  of  10  PO  cattle  using  salting  out  method,  obtained  randomly  from  Pasuruan.  BMP-15  gene was amplified with 5'-GCTCTGGAATCACAAGGGG-3' as forward primer and 5'- AGAGATGGGGAGCGATGAT-3' as reverse primer. The results of amplification is fragments DNA with the length 350 bp. The amplicon of BMP-15 gene was cut by restriction enzyme HaeIII and polymorphism are indicated by the presence of two haplotypes. The first haplotyp with 2 fragments consist of 100 bp and 200 bp and the second haplotyp with 5  fragments consist of , 100 bp, 125 bp, 200 bp, 300 bp, and 400 bp. In  conclusion,  there  is  polymorphism  of  PO  cattle  (Bos  indicus)  BMP-15  gene,  however  there  is  no correlation between BMP-15 gene polymorphism with success of artificial insemination of PO cattle. .
Keywords : BMP-15 gene, polymorphism, PO cattle.

## PENDAHULUAN
Pengembangan sapi potong perlu mendapatkan  perhatian  khusus  karena  secara nasional  konsumsi  daging  sapi  cenderung meningkat  seiring  bertambahnya  jumlah  [7]. Salah  satu  cara  untuk  memenuhi  kebutuhan daging adalah dengan   meningkatkan populasi sapi  PO.  Dalam  upaya  meningkatkan  populasi sapi PO ini, reproduksi memiliki peranan yang penting. Kemampuan reproduksi setiap individu  berbeda-beda  yang  disebabkan  oleh adanya variasi genetic pada populasi tersebut.
Salah  satu  faktor  yang  berpengaruh  pada kemampuan  reproduksi  adalah  adanya  ovulasi yang diawali oleh folikulogenesis [1]. Pematangan  dan  perkembangan  folikel  ini dipengaruhi  oleh  keberadaan  Transforming growth factor- β (TGF- β ) yang dapat memodulasi  (memperkuat  atau  melemahkan)
kerja  dari  FSH  dan  LH  pada  ovarium.  Hal  ini merupakan  faktor  penting  yang  menentukan prolifikasi.  Gen  BMP-15  diketahui  memiliki peranan penting dalam meningkatkan kecepatan  ovulasi  dan  merupakan  salah  satu anggota  TGF- β yang  dianggap  sebagai  major gene sifat prolifik [5].
Gen  BMP-15  ditemukan  terekspresi khusus pada oosit yang sedang berkembang di ovarium  beberapa  spesies  mamalia.  Fungsi BMP-15  pada  setiap  spesies  bersifat  khas (specific species) terkait dengan perbedaan laju ovulasi  antar  species.  BMP-15  pada  mamalia berfungsi  sebagai  faktor  pertumbuhan  dan proliferasi  sel  granulosa.  BMP-15  juga berperan  dalam  menghambat  sensitivitas folikel  terhadap  Follicle  Stimulating  Hormone (FSH)  dengan  menekan  ekspresi  dari  reseptor FSH [10].
Gen BMP-15 merupakan gen yang terpaut kromosom X yang menyebabkan kenaikan laju ovulasi pada betina dalam keadaan heterozigot dan  menyebabkan  infertill  pada  betina  dalam keadaan  homozigot.  Mutasi  yang  terjadi  pada gen ini menyebabkan meningkatnya kecepatan ovulasi  dan  jumlah  anak  sekelahiran  (litter size) [4].
Penelitian lain menemukan bahwa mempengaruhi  laju  ovulasi  dan  sifat  prolific, antara  lain  FecX G (Galway)  yaitu  mutasi  titik gen  BMP-15  daerah  ekson  ke-2  pada  ke-718, FecX B (Belclare)  yaitu  mutasi  titik  gen  BMP- 15  daerah  ekson  ke-2  pada  basa  ke-1100 (Haranham et al, 2004), dan FecX I (Inverdale) yaitu  mutasi  titik  gen  BMP-15  daerah  ekson ke-2 pada basa ke-53 [3].
Pada  penelitian  Galloway  et  al.  [6] menyatakan  bahwa  mutasi  gen  BMP15  pada ruminansia  kecil  menyebabkan  sifat  prolifik pada  genotip  heterozigot  dan  sifat  steril  pada genotip  homozigot,  serta  penelitian  Davis  [4] menyatakan  bahwa  mutasi  heterozigot  pada gen  BMP-15  menyebabkan  kenaikan  laju ovulasi  pada  domba,  sedangkan  mutasi homozigot  akan  menyebabkan  kegagalan proses  folikulogenesis  karena  mengalami kerusakan pada ovarium.
Penelitian  mengenai  polimorfisme  gen BMP-15  telah  banyak  dilakukan  seperti  yang telah dilakukan oleh  Zhang et al. [13] dengan menggunakan teknik PCR-RFLP mengungkapkan  bahwa  pada  beberapa  jenis sapi ditemukan adanya mutasi delesi 4 pb yang menyebabkan  perubahan  reading  frame  dan menghasilkan  stop  kodon  prematur,  namun mutasi  ini  tidak  berkorelasi  dengan  sifat prolifik  pada  genotip  heterozigot.  Penelitian yang  dilakukan  oleh  Yan  et  al.  [12] menunjukkan bahwa tikus yang sudah diinaktivasi (knock  out)  gen  BMP15  nya  tidak menunjukkan sifat steril tetapi hanya mengalami penurunan laju ovulasi (sub fertil).
Sapi  PO  merupakan  salah  satu  sapi  local Indonesia    yang  memiliki  potensi  untuk dikembangkan  populasinya.  Penelitian  tentang gen  BMP  15    pada  sapi  PO  untuk  saat  ini belum  banyak  dilakukan.  Oleh  karena  itu penelitian ini perlu dilakukan untuk mengetahui  polimorfisme  gen  BMP-15  pada populasi sapi PO dengan metode PCR-RFLP.

## METODE PENELITIAN

## Sampel Penelitian.
Penelitian  ini  menggunakan  10  sampel darah  sapi  PO  betina  yang  diperoleh  secara acak dari Pasuruan. Data keberhasilan inseminasi  buatan  (IB)  diperoleh  secara deskritif  berdasarkan  keberhasilan  Inseminasi Buatan atau nilai service per conception (S/C) yang  dimiliki  oleh  masing-masing  sapi  PO. Isolasi  DNA  dilakukan  dengan  metode  salting out. Kuantitas hasil isolasi DNA diukur dengan
spektrofotometri λ 260,  sedangkan  kualitas DNA  hasil  isolasi  dapat  diketahui  dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 1%.

## PCR-RFLP.
Amplifikasi gen BMP-15 dilakukan dengan  metode  PCR.  Sepasang  primer  yang digunakan  adalah  BMP-15  Forward  5’-GCTC TGG  AAT  CAC  AAG  GGG-3’  dan  BMP-15 Reverse  5’-AGA  GAT  GGG  GAG  CGA TGAT-3’.  Komposisi  PCR  terdiri  dari  5µl ddH 2 O,    primer  forward  dan  primer  reverse masing-masing  2µl  dengan  konsentrasi  30 pmol/µl, 10 µl PCR mix dan 2 µl DNA dengan konsentrasi 2  g/  l . Amplifikasi gen BMP-15 pada  sapi  PO  dilakukan  dengan  metode  PCR menggunakan alat Thermal cycler sebanyak 34 siklus.  Program    PCR  dilakukan  pada  suhu denaturasi  awal  95ºC  selama  5  menit,  suhu denaturasi  95ºC  selama  45  detik,  suhu annealing 61ºC selama 45 detik, suhu ekstensi 72ºC  selama  45  detik  dan  suhu  ekstensi  akhir 72ºC selama 10 menit. Konfirmasi keberhasilan  hasil  PCR  dilakukan  dengan elektroforesis gel agarosa 1,5%. Hasil amplifikasi  kemudian    dipotong  dengan menggunakan enzim restriksi HaeIII. Komposisi PCR-RFLP terdiri dari 5µl ddH 2 O, 1µl buffer, 1µl enzim restriksi HaeIII, dan 3µl DNA  hasil  PCR.  Dilakukan  inkubasi  pada suhu  37  ºC  selama  3  jam.  Hasil  PCR-RFLP dieletroforesis  menggunakan  gel  poliakrilamid 10%  dan  kemudian  dilakukan  pewarnaan dengan perak nitrat.

## Analisa Data.
Analisa  data  dilakukan  secara  deskriptif, dengan  melihat  pola  pita  yang  dihasilkan  dari hasil  PCR-RFLP  dan  dikorelasikan  terhadap keberhasilan Inseminasi Buatan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi  gen  BMP-15 pada  DNA  sapi PO  pada  penelitian  ini    masing-masing menghasilkan  satu  pita  dengan  ukuran  sekitar 350 bp (gambar 1).
Gambar 1. Hasil amplifikasi gen BMP-15. M : DNA leader 100 bp. 1-10 : fragmen DNA gen BMP-15 hasil amplifikasi
Berdasarkan  informasi  sequen  gen  BMP- 15 pada  Bos Taurus yang diperoleh dari NCBI dengan  kode  akses  AC_000187.1,  posisi primer  forward  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  didesain  pada  urutan  basa  7015- 7033 sedangkan posisi primer reverse didesain pada  urutan  basa  7367-7385.  Amplikon  yang diperoleh  berdasarkan  informasi  tersebut memiliki  panjang  sebesar  371  bp.  Adanya perbedaan  hasil  amplifikasi  dalam  penelitian ini  dengan  yang  telah  diperoleh  dari  NCBI kemungkinan  disebabkan  karena  bangsa  sapi yang  digunakan  berbeda,  dalam  penelitian  ini menggunakan Sapi PO (Bos indicus) sedangkan  pada  informasi  NCBI  adalah  Sapi Eropa (Bos Taurus) sehingga terjadi perbedaan wilayah amplifikasi.
PCR-RFLP dilakukan untuk mengetahui  perbedaan  runutan  nukleotida DNA  dengan  menggunakan  enzim  restriksi, yang  pada  penelitian  ini  yaitu  HaeIII.    Enzim HaeIII  merupakan  enzim  yang  mengenali  sisi pemotongan pada sekuen GG*CC [2].
Pemotongan  hasil  amplifikasi  dengan teknik  PCR-RFLP  ini    menghasilkan  2  variasi pemotongan  yang  ditunjukkan  pada  gambar  2 dan gambar 3.
Gambar  2.  Elektroforesis  gel  poliakrilamid 10%  hasil  PCR-RFLP  gen  BMP- 15. M : DNA leader 100 bp. 1-10 :  DNA  hasil  PCR-RFLP.  11  : uncut (PCR)
Gambar  3.  Zimrogram  hasil  PCR-RFLP fragmen  gen  BMP-15  dengan enzim Hae III
Berdasarkan  hasil  PCR-RFLP  gen  BMP- 15  pada  penelitian  ini  terdapat  dua  tipe haplotip,  yaitu  haplotip  satu  dan  haplotip  dua. Tipe  haplotip  tersebut  ditentukan  berdasarkan jumlah  situs  restriksi  dan  ukuran  fragmen DNA. Sampel nomer 1-10 dapat dilihat  bahwa semua  DNA  hasil  amplifikasi  terpotong  oleh enzim  HaeIII.  Haplotip  satu  terpotong  dengan dua ukuran fragmen  yaitu 200 bp dan 100 bp, sedangkan haplotip dua yaitu terpotong dengan lima  ukuran  fragmen  sebesar  400  bp,  300  bp, 200  bp,  125  bp,  dan  100  bp  (tabel  1).  Variasi haplotip ini menunjukkan adanya polimorfisme  gen  BMP-15  pada  sapi  PO. Terjadinya  polimorfisme  gen  BMP-15  pada sapi  PO  ini,  dikarenakan  adanya  perbedaan susunan  gen  BMP-15  pada  sapi  PO,  yang ditunjukkan  dengan  ukuran  fragmen  DNA pada haplotip dua.

## M    1    2     3    4    5    6     7    8    9    10
M   1   2    3    4    5    6    7    8    9   10 11
350 bp 400 bp
100 bp
600 bp 400 bp 200 bp 100 bp

## Table 1. Haplotip Gen BMP-15 Sapi PO
Haplotip Jumlah situs retriksi Ukuran fragmen (bp) Sampel no 1 2 100, 200 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9 2 5 100, 125, 200, 300, 400 10

## Penelitian mengenai polimorfisme gen
BMP-15  juga  dilakukan  pada  beberapa  hewan lain,  seperti  domba  dan  tikus.  Menurut penelitian  yang  dilakukan  oleh  Davis  [4] menyatakan  bahwa  mutasi  heterozigot  pada gen  BMP-15  menyebabkan  kenaikan  laju ovulasi  pada  domba,  sedangkan  mutasi homozigot  akan  menyebabkan  kegagalan proses  folikulogenesis  karena  mengalami kerusakan pada ovarium. Pada penelitian yang dilakukan  oleh  Yan  et  al.  [12]  menunjukkan bahwa  tikus  yang  sudah  diinaktivasi  (knock out)  gen  BMP15  nya  tidak  menunjukkan  sifat steril  tetapi  hanya  mengalami  penurunan  laju ovulasi (sub fertil).
Hasil penelitian yang diperoleh kemudian dihubungkan  dengan  performa  reproduksi yang  diperoleh  berdasarkan  data  Inseminasi Buatan, yaitu nilai S/C (service per conception)  pada  masing-masing  sampel  Sapi PO (tabel 2).
Table  2.  Hubungan  keberhasilan  Inseminasi Buatan dengan haplotip Gen BMP-15
Sampel Haplotip Keberhasilan Inseminasi Buatan 1 1 Bunting 2 1 Bunting 3 1 Tidak Bunting 4 1 Tidak Bunting 5 1 Bunting 6 1 Bunting 7 1 Bunting 8 1 Bunting 9 1 Bunting 10 2 Bunting
Berdasarkan  tabel  2  diatas  dapat  dilihat bahwa  pada  haplotip  satu  terdapat  variasi keberhasilan  Inseminasi  Buatan,  yaitu  dua induvidu  yang  tidak  mengalami  kebuntingan dan tujuh individu yang mengalami kebuntingan.  Sedangkan  haplotip  dua  terdapat
satu  individu  yang  mengalami  kebuntingan. Sehingga  berdasarkan  tabel  2  tersebut  dapat disimpulkan  bahwa  tidak  terdapat  hubungan antara  polimorfisme  gen    BMP-15    dengan keberhasilan Inseminasi Buatan pada Sapi PO.
BMP-15  terekspresi  berlimpah  pada folikel  primer,  yang  menunjukkan  bahwa transkripsi  BMP-15  telah  ditranslasikan  pada tahap  folikulogenesis.  Pada  manusia  BMP-15 terekspresi dalam konsentrasi yang rendah [5]. Mutasi  alami  pada  gen  BMP-15  menjadi factor yang berpengaruh terhadap ovarium dan dapat  mengakibatkan  peningkatan  kecepatan ovulasi  maupun  fenotip  infertile  [5].  Mutasi pada  BMP-15  menyebabkan  fungsi  terhadap pengaturan  sirkulasi  ekspresi  FSH  pada  sel granulosa  menurun.  Kerusakan  sistem  BMP selama perkembangan folikel dapat meningkatnya rata-rata ovulasi, yang diakibatkan oleh kehilangan fungsi pada sistem BMP yang diakibatkan oleh mutasi [11].
BMP-15 meregulasi proliferasi dan differensiasi  sel  granulose  dengan  cara mempromotori  mitosis  sel,  menekan  ekspresi reseptor FSH dan menstimulasi ekspresi ligand kit,  dimana  semua  fungsi  tersebut  berperan pada kesuburan mamalia betina [5]
Menurut  Davis  [4]  hilangnya  fungsi  pada sistem  BMP-15  mengakibatkan  aktivitas  gen BMP-15  semakin  direduksi.  Berkurangnya aktifitas gen BMP-15 menyebabkan berkurangnya pengaturan sirkulasi FSH sehingga  ekspresi  hormone  ini  semakin  tinggi dan  memicu  proses  follikulogenesis  pada  sel- sel  ovarium.  Mutasi  pada  gen  BMP-15 menyebabkan kehilangan fungsi pada BMP-15 yang menghambat ekspresi reseptor FSH pada granulosa  cells  menurun  sehingga  membuka peluang  sensitifitas  FSH  menjadi  lebih  tinggi dan meningkatkan ekspresi dari gen BMP-15.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang telah  dilakukan,  hasil  pemotongan  enzim restriksi    HaeIII  berdasarkan  analisis  dengan metode  PCR-RFLP  menghasilkan  2  haplotip, yang  menunjukkan  adanya  polimorfisme  gen BMP-15 pada Sapi PO.  Namun, polimorfisme tersebut  tidak  ada  hubungannya  dengan keberhasilan Inseminasi Buatan Sapi PO.

## TERIMA KASIH
Terima kasih kepada pihak penyandang dana dan seluruh staff Laboratorium  Biologi  Seluler  dan  Molekuler,
Jurusan  Biologi,  Fakultas  Matematika  dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Brawijaya  atas  fasilitas  yang  diberikan bantuannya  selama  proses  penelitian  ini berlangsung.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]   Austin CR, Short RV. 1987. Reproduction In  Mammals.  Ed  Ke-3  New  York  : Cambridge University Press.
[2]    Becker,  W.M,  L.J.  Kleinsttonh.2000.  The World  Of  The  Cell  Fourth  Edition.  The Benjamins Cumming
Publishing
Company, New York.
[3]  Bodin L, et al. 2007. A novel mutation in the  bone  morphogenetic  protein  15  gene causing  defective  protein  secretion  is associated  with  both  increased  ovulation rate  and  sterility  in  Lacaune  sheep Endocrinology 148 (1) : 393-400.
[4]  Davis  GH.  2005.  Major  Genes  Effecting Ovulation  Rate  In  Sheep.  Genet  Sel  Evol 37:S11-S23.
[5]  Dube  JL  et  al.  1998.  The  Bone morphogenetic  protein  15  gene  is  X linked  and  expressed  in  oocytes.  Mol Endocrinol 12 : 1809–1817.
[6]  Galloway,  S.M.,  S.M.  Gregan,  T.  Wilson, K.P. Mcnatty, J.L. Juengel, O. Ritvos And G.H.  Davis.  2002.  BMP15  mutations  and ovarian  function.  Mol.  Cell.  Endrocinol. 191: 15-18. ha_ternak.pdf
[7]  Hadi  P.  U.  Dan  N.  Ilham.  2000.  Peluang Pengembangan  Usaha  Pembibitan Ternak Sapi  Potong  Di  Indonesia  Dalam  Rangka Swasembada Daging 2005. PSE, Bogor.
[8]  Hanrahan,  J.P.,  S.M.  Gregan,  P.  Mulsant, M.  Mullen,  G.H.  Davis,  R.  Powell  And S.M.  Galloway.  2004.  Mutations  in  the genes  for  oocyte-derived  growth  factors GDF9  and  BMP15  are  associated  with both increased ovulation rate and sterility in  Cambridge  and  Belclare  sheep  (Ovis aries). Biol. Reprod. 70: 900-909. .
[9] Lewis, R . 2003. Human Genetics: Concept and  Aplication  5 th edition.  Mc  Graw HillCo. New York. Halaman:183-184.
[10]  Otsuka,  F.  And  S.  Shimasaki.  2002.  A Negative  Feedback  System  Between Oocyte  Bone  Morphogenetic  Protein  15 And  Granulosa  Cell  Kit  Ligand:  Its  Role In  Regulating  Granulosa  Cell  Mitosis.
Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  99:8060- 8065.
[11]  Wilson  T  et  al.  2001.  Highly  prolific Booroola  sheep  have  a  mutation  in  the intracellular  kinase  domain  of  bone morphogenetic  protein  IB  receptor (ALK-6)  that  is  expressed  in  both oocytes and granulosa cells. Biol Reprod 64: 1225–1235.
[12] Yan C, Wang P, DeMayo J, DeMayo FJ, Elvin  JA,  Carino  C,  et  al.  2001. Synergistic roles of bone morphogenetic protein  15  and  growth  differentiation factor  9  in  ovarian  function.  Mol Endocrino 115: 854–866.
[13]  Zhang,  L.P,  Q.F.  Gan,  X.H.Zhang, H.D.Li, G.Y.Hou, J.Y.Li, X.Gao,
H.Y.Ren,  J.B.Chen,  S.Z.Xu.  2009. Detecting  a  Deletion  in  the  coding region of the Bovine Bone
Morphogenetic  Protein  15  Gene  (BMP- 15). J Appl Genet 50 (2): 145-148.