## PERUBAHAN PERILAKU GROOMING DAN IMOBILITAS MENCIT BALB/C TERINDUKSI DEPRESI YANG DISUPLEMENTASI TEMPE SEBAGAI SUMBER PARAPROBIOTIK
Alteration of Grooming and Immobility Behaviour in Depression-Induced Balb/c Mice Supplemented with Tempeh as Paraprobiotic Source
- Vanessa Ardianty 1 ) * , Brian Saputra Manurung 1 )
1) Program Studi Biologi, Fakultas Ilmu Hayati, Universitas Surya Jalan MH. Thamrin Tangerang, 15143
* Korespondensi Penulis: vanessa.ardianty@gmail.com

## ABSTRACT
Depression,  a  mental  disorder  marked  by  sadness,  anhedonia  and  increased  fatigability,  is becoming  more  common  in  this  industry  4.0  era.  Nowadays,  depression  affects  approximately  322 million people around the world (more than 14 million in Indonesia) and gives major contribution to the rise of global burden of disease. Although antidepressant is considered the common treatment for depression,  recent  studies  show  a  possibility  to  treat  depression  by  altering  gut  microbiome  of  the patient,  by  giving  them  probiotic  food.  Tempeh  is  a  globally  well-known  Indonesian  paraprobiotic food which already proven to modulate gut microbiota. This research aimed to find out the effect of tempeh to depression symptom as expressed in Balb/c mice behaviors. The methods used was to feed tempeh  or  tempeh  starter  to  mice  which  were  depressed-induced  by  Unpredictable  Chronic  Mild Stress (UCMS) procedure.  Parameter  measured  were  depression  level  of  the  Balb/c  mice  based  on immobility times and grooming durations acquired from tail suspension test, forced swim test, sucrose splash  test and  coat state score.  The  result showed that  tempeh supplementation  did  not  affect coat states and grooming durations but tend to improve immobility times of the Balb/c mice. Meanwhile, tempeh starter supplementation  tends to improve the  immobility time  and kept coat state clean/tidy, but lowered  grooming  duration.  In  conclusion, supplementation  of  paraprobiotic  tempeh, especially in starter form, tend to improve depression symptoms.
Keywords : depression, mice, paraprobiotic, tempeh

## PENDAHULUAN
Depresi didefinisikan
sebagai gangguan mental dengan gejala kemurungan,  anhedonia  atau  kehilangan minat  terhadap  kesenangan,  penurunan energi,  perasaan  rendah  diri,  gangguan makan dan tidur, serta penurunan kemampuan berkonsentrasi. Dengan jumlah  penderita  mencapai  ±350  juta orang  di  seluruh  dunia,  depresi  memiliki peran  besar  terhadap  beban  kesehatan global.  Depresi  tidak  hanya  menurunkan produktivitas  kerja  dan  kualitas  hidup penderitanya, tetapi juga, pada kasus  yang parah,  berpotensi  menyebabkan  kematian. Tercatat  lebih  dari  800  ribu  jiwa  hilang setiap  tahunnya  akibat  bunuh  diri,  dengan
depresi  sebagai  salah  satu  pemicunya ( World Health Organization , 2015).
Di Indonesia, jumlah persis penderita  depresi  belum  pernah  didata secara  terperinci.  Namun,  berdasarkan Riskesdas  2018  yang  dilakukan  oleh Balitbangkes dengan teknik Mini International  Neuropsychiatric  Interview (MINI),  diketahui  penduduk Indonesia yang  menderita  depresi diperkirakan mencapai  6,1%  dari  total  penduduk  usia ≥15  tahun  atau  sekitar  14  juta  orang. Sebanyak  91%  dari  penderita  depresi tersebut  belum  mendapatkan  bantuan medis maupun mengonsumsi anti-depresan (Badan  Penelitian  dan  Pengembangan Kesehatan, 2019).
Secara  patofisiologi,  depresi  tidak memiliki  konsep  yang  utuh,  mengingat gejala  yang  ditunjukkan  bervariasi  dari penderita satu  ke penderita lain, walaupun usaha  untuk  menjelaskan  mekanisme depresi  secara  neural  dan  molekular  telah dicoba. Gejala fisik/psikologis yang ditunjukkan  penderita  depresi  umumnya berhubungan  dengan  penurunan  jumlah neurotransmiter,  perubahan  pada  kinerja sumbu Hipothalamus-Pituitari-Adrenal (HPA),  gangguan  pada  siklus  sirkadian, perubahan  pada  sistem  GABAnergik  dan atau  serotonergik,  dan  peralihan  pada mekanisme neurotrophic signaling (Krishnan  and  Nestler,  2008;  Hasler, 2010).
Sesuai dengan konsep dari patofisologi  depresi  dan  mekanisme  yang mendasarinya,  penangganan  depresi  pada umumnya  melibatkan  penggunaan  obat- obatan,  seperti  antidepresan  berbasis monoamine dan psikoterapi, seperti cognitive behavioral therapies /CBT (DeRubeis , et  al .,  2008).  Akan  tetapi, meskipun metode penanganan yang efektif sudah  diketahui,  separuh  dari  penderita depresi masih belum menerima penanganan medis (World Health Organization , 2017).
Di  sisi  lain,  penelitian  terbaru menunjukkan  penyebab  terjadinya  depresi tidak hanya berkaitan dengan ketidakseimbangan neurotransmitter, tetapi juga  berhubungan  dengan  komposisi mikrobiota  usus.  Komposisi  mikrobiota usus yang sehat diketahui dapat mendorong  kesehatan  sistem  saraf  pusat dan sebaliknya gangguan pada sistem saraf pusat  dapat  mengganggu  keseimbangan mikrobiota usus dan kesehatan pencernaan.  Hubungan timbal balik antara otak  dan  usus  ini  dikenal  dengan  istilah Sumbu  Otak-Usus  ( Gut  Brain  Axis /GBA) (Clapp , et  al .,  2017).  Paradigma  baru  ini menimbulkan ketertarikkan dalam penanganan  depresi  menggunakan  asupan makanan sehat, terutama makanan
fermentasi/probiotik  (Selhub , et  al .,  2014; Dash , et al ., 2015).
Berbagai penelitian yang membuktikan  efektivitas  probiotik  dalam mengatasi  gejala  depresi  telah  dilakukan. Penelitian  oleh  Bravo et  al .  (2011) menunjukkan bahwa pemberian lactic acid bacteria (LAB)  mempengaruhi  ekspresi reseptor  GABA  ( Gamma  aminobutyric acid )  di  sistem  saraf  pusat,  produksi  dari kortikosteron,  dan  perilaku  khas  depresi/ kecemasan  via  saraf  vagus.  Penelitian lainnya  oleh  Desbonnet et  al. (2010) mengenai  pemberian  minuman  probiotik dengan kandungan Bifidobacterium infantis pada  mencit  yang  diinduksi depresi  menunjukkan  bahwa  pemberian probiotik memulihkan gejala depresi, yang meliputi peningkatan produksi IL-6, penurunan  noradrenaline,  dan  imobilitas atau  perilaku  pasif  pada  saat  tes  renang paksa. Selhub et  al. (2014) juga mengulas penggunaan  probiotik  sebagai  alternatif yang  menjanjikan  untuk  penanganan depresi  karena  kemampuannya  mengubah interaksi otak-usus.
Sementara  itu,  Indonesia  memiliki makanan  tradisional  yang  kaya  akan probiotik,  yakni  tempe  (Astuti , et  al.,
2000). Tempe merupakan makanan fermentasi  dari  kedelai  yang  direkatkan oleh  hifa Rhizopus  oligosporus ,  mikroba utama  yang  biasanya  digunakan  dalam fermentasi tempe. Akan tetapi, sebenarnya tempe  merupakan  hasil  fermentasi  dari campuran  berbagai  kapang,  khamir,  LAB, dan bakteri gram negatif, yang menjadikan tempe  sangat    kaya  akan  probiotik  (Babu , et al. , 2009).
Berbeda  dengan  makanan  probiotik lain  seperti  yoghurt  dan  tape,  tempe biasanya  tidak  dikonsumsi  dalam  kondisi mentah.  Kebiasaan  mengonsumsi  tempe yang  sudah  dimasak  membuat  tempe kurang dianggap sebagai sumber probiotik yang  efektif  (Nuraida,  2015).  Padahal, manfaat  tempe  tampak  tidak  berubah meskipun  tempe  telah  diproses,  baik dengan direbus maupun digoreng
(Kuligowski , et  al .,  2013;  Soka , et  al. , 2014;  Soka , et  al .,  2015).  Tempe  yang masih memiliki manfaat makanan probiotik  setelah  dimasak  ini  disebut paraprobiotik atau probiotik bayangan.
Tempe  dalam  bentuk  paraprobiotik masih  dapat  memodulasi  mikrobiota  usus dengan  mendorong  pertumbuhan  bakteri baik dan pembentukan komposisi mikroflora  usus  yang  seimbang/sehat (Soka , et al. , 2014). Konsumsi tempe yang telah  dimasak  juga  diketahui  dapat meningkatkan  jumlah Lactobacillus dan Bifidobacterium dalam  usus  (Kuligowski , et al ., 2013). Seperti disebutkan sebelumnya, kedua bakteri tersebut merupakan  probiotik  yang  telah  diuji sebagai  alternatif  penanganan  depresi (Selhub , et  al. ,  2014).  Akan  tetapi, penelitian  tentang  efek  tempe  terhadap gejala  depresi  belum  pernah  dilakukan.
Oleh karena itu, dengan mempertimbangkan tempe sebagai sumber paraprobiotik yang potensial dalam menangani  depresi,  penelitian  ini  akan menganalisis  efek  tempe  terhadap  gejala depresi mengunakan model mencit.
Pemodelan  depresi  dan  tes  depresi dengan  mencit  sendiri  sudah  sering dilakukan  (Bergner , et  al. ,  2010).  Salah satu  pemodelan  yang  cukup  sering dilakukan dan terpercaya adalah pemodelan Unpredictable  Chronic  Mild Stress (UCMS),  yaitu  induksi  depresi dengan pemberian berbagai stressor secara acak  dalam  jangka  waktu  tertentu  (Nollet , et  al .,  2013).  Setelah  induksi  depresi, tingkat  depresi  pada  mencit  dapat  diukur dengan  mengamati  perilaku  mencit  yang setara  dengan  gejala  depresi  manusia. Contoh  perilaku  tersebut  antara  lain  sikap berdiam  diri  (imobilitas)  ketika  diberikan stressor yang  setara  dengan  sikap  pasrah pada  manusia,  penurunan  higenitas  atau perilaku grooming yang  setara  dengan sikap  apatis,  dan  penurunan  konsumsi makanan  manis  yang  setara  dengan anhedonia (Willner, 2005). Dalam
penelitian ini, perubahan perilaku grooming dan sikap imobilitas akan diukur untuk  mengetahui  efek  tempe  terhadap gejala  depresi  yan  diindukasi  oleh  metode UCMS.
Adapun  tujuan  dari  penelitan  ini adalah  untuk  mengetahui  pengaruh  tempe sebagai  makanan  paraprobiotik  terhadap gejala  depresi,  khususnya  perubahan perilaku grooming dan  imobilitas  pada mencit  Balb/c.  Penelitian  ini  memiliki beberapa  batasan,  yakni  bahwa  gejala depresi  yang  dimaksud  merupakan  gejala yang  ditimbulkan  metode  UCMS  dan bahwa pengukuran tingkat depresi dilakukan  berdasarkan  observasi  langsung pada  kondisi  rambut  mencit  Balb/c,  uji cipratan sukrosa, uji suspensi ekor, dan uji renang paksa pada mencit Balb/c.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  induksi dan  tes  depresi  antara  lain  botol  semprot, gelas beaker, kain hitam untuk merekayasa kondisi  gelap-terang,  kandang  mencit, kandang  transit,  kanebo/kain  pengering, lampu, meja, pengganjal untuk memiringkan  kandang,  pensil, scoring sheet , stopwatch, tail suspension apparatus, telepon  genggam,  timer,  dan tripod.
Bahan yang digunakan adalah mencit, dan tempe. Mencit yang digunakan merupakan  mencit  Balb/c  yang  diperoleh dari  PT  Biofarma  Bandung,  berusia  3 bulan  dengan  berat  awal  27-30  gram  dan berjenis  kelamin  jantan.  Tempe  yang digunakan  dibuat  di  Laboratorium  Biologi Universitas  Surya  dengan  menggunakan laru  tempe  yang  berasal  dari  inokulasi kultur  murni Rhizopus  oligosporus milik Universitas  Surya.  Selain  itu,  bahan  yang diperlukan  adalah  air,  alkohol,  selotip kertas,  serbuk  gergaji  untuk  alas  kandang ( bedding ), sukrosa, dan tisu.
Tail  suspension  apparatus dibuat dengan dimensi Lebar 11,5 cm x Tinggi 60 cm  x  Panjang  60  cm  (dibagi  4  kamar dengan  panjang  masing-masing  15  cm). Gelas beaker (Tinggi 25 cm x Diameter 17 cm)  berisi  air  setinggi  15  cm  digunakan sebagai tabung renang paksa.

## Tahapan Penelitian
Penelitian  yang  dilakukan  berupa eksperimen  laboratorium  yang  meliputi suplementasi makanan tikus dengan paraprobiotik tempe, proses induksi depresi,  dan  pengukuran  tingkat  depresi mencit.  Eksperimen  dilaksanakan  pada November-Februari 2018, di Laboratorium Biologi Universitas Surya, Tangerang.
Paraprobiotik  dalam  penelitain  ini diberikan melalui suplementasi pada pakan standar  mencit  dengan  tempe  atau  laru tempe.  Pakan  bersuplementasi  tersebut kemudian  diberikan  pada  mencit  seperti pakan  standar  (5  gr/hari/ekor).  Tempe yang  digunakan  merupakan  tempe  yang telah  direbus  (10  menit)  sehingga  berupa paraprobiotik.  Tempe  lalu  dikeringkan dalam  oven  40 o C  semalaman  kemudian dihaluskan  dengan  blender.  Bubuk  tempe kemudian  dicampurkan  dengan  bubuk pakan  mencit  komersil,  diadon  menjadi
satu,  lalu  dikeringkan  kembali  dengan oven.  Sementara  itu,  laru  tempe,  yang sudah  dalam  bentuk  bubuk,  langsung dicampurkan  dengan  bubuk  pakan  standar dan  diolah  dengan  cara  yang  sama  seperti di atas. Metode pengolahan ini berdasarkan pada gabungan metode pengawetan  tempe  oleh  Koswara  (2009) dan Soka et  al .  (2014) dengan modifikasi.
Dosis tempe yang diberikan sesuai dengan metode  yang  dilakukan  oleh  Soka et  al . (2014), yakni 5: 100 terhadap jumlah total pakan  standar,  sedangkan  rasio  dosis  laru tempe  adalah  5:1000,  disesuaikan  dengan jumlah laru yang digunakan saat pembuatan tempe.
Induksi depresi pada mencit dilakukan  sesuai  Metode Unpredictable Chronic  Mild  Stress (UCMS)  yang digunakan oleh Berger , et al. (2010), Peng , et  al .  (2012),  Nollet et  al .  (2013)  dan Frisbee , et  al .  (2015)  dengan  modifikasi. Mencit  diberikan  serangkaian stressor ringan  dengan  urutan  acak  selama  5 minggu.  Varian stressor yang  digunakan dijelaskan pada Tabel 1 .
Tingkat  depresi  diukur  berdasarkan pengamatan  perilaku  mencit  yang  setara dengan  indikator  depresi  pada  manusia, yakni  sikap  berdiam  diri  (imobilitas)
Tabel 1 . Jenis stressor yang digunakan untuk menginduksi depresi Stressor Waktu Keterangan Gangguan siklus sirkadian 2 x 12 jam Gelap atau terang konstan Gangguan siklus sirkadian Per  30  menit  selama  8  jam atau per 2 jam selama 6 jam selang-seling gelap terang Bedding basah 1-6 jam Penambahan 125 ml air pada bedding Kandang basah 15-30 menit Penempatan  dalam  kandang  tanpa  bedding  yang diisi dengan air setinggi 1cm (suhu air disarankan sekitar 30 o C) Kandang kosong 1-6 jam Penempatan dalam kandang tanpa bedding Kandang miring 1-4 jam Penempatan  dalam  kandang  (tanpa bedding ) dengan posisi miring Suara predator 10  menit,  30  menit,  atau  3 jam Penyiaran suara elang atau kucing Air panas/es 5 menit Perendaman dalam air dingin atau air panas Pengekangan 3 jam Dalam tabung berdiameter 4 cm sepanjang 12 cm
ketika  diberikan stressor yang  setara dengan  sikap  putus  asa  (Bergner , et  al ., 2010)  dan  penurunan grooming yang setara  dengan  penurunan  kepedulian  diri/ self-care (Nollet , et al ., 2013). Pengukuran perilaku grooming dilakukan  dengan pengamatan  visual  kondisi  rambut  dan  uji cipratan  sukrosa,  sedangkan  perilaku imobilitas diukur melalui uji renang paksa dan uji suspensi ekor pada mencit Balb/c.

## Pengamatan Kondisi Rambut
Pengamatan  kondisi  rambut  mencit dilakukan  seminggu  sekali  sesuai  metode Bergner et  al. (2010)  dan  Nollet et  al.
(2013).  Perbandingan  visual  diamati  pada pada  8  bagian,  yaitu  kepala,  leher, punggung,  perut,  ekor,  kaki  depan,  kaki belakang,  dan  area  genital.  Area  yang tampak  normal  (rambut  mulus  dan  rapi) diberi  skor  0,  sedangkan  yang  tampak berantakan  (rambut  berdiri/  bernoda/ botak)  diberi  skor  1.  Jika  terdapat  bagian rambut  yang  agak  mengembang  (kondisi agak berantakan), dapat diberikan skor 0,5. Total  skor  dari  kedelapan  area  dirata-rata untuk dibandingkan antar kelompok perlakuan selama 3 minggu.
Uji Cipratan Sukrosa Prosedur uji cipratan sukrosa ( Sucrose  Splash  Test/ SST)  dilakukan mengikuti  metode  Frisbee , et  al .  (2015). Dalam  uji  ini,  mencit  ditempatkan  dalam kandang  berlapis  kain  kemudian  diciprati dengan  larutan  sukrosa  kental  (10%) menggunakan botol semprot. Durasi mencit  membersihkan  diri  ( grooming ), baik  dengan  menjilat  atau  menggaruk, dicatat selama 5 menit periode tes.

## Uji Suspensi Ekor
Prosedur  uji  suspensi  ekor  ( Tail Suspension  Test /  TST),  sesuai  yang dijelaskan  Bergner et al . (2010) dan (Can , et al. (2012), dilakukan dengan menggantung mencit setinggi ± 35 cm dari permukaan  alas  dengan  memasang tape pada  ekor  mencit  ke  kait/  rak  selama
durasi  6  menit.  Waktu  ketika  mencit berhenti  bergerak  dan  durasi  imobilitas kemudian diukur dengan stopwatch sebagai variabel terukur. Kondisi imobilitas  didefinisikan  sebagai  kondisi menggantung tidak bergerak, hanya menggerakan  sedikit  kaki  depan,  atau hanya  berayun  akibat  momentum  dari gerakan sebelumnya.

## Uji Renang Paksa
Uji  renang  paksa  ( Forced  Swim Test /FST)  dilakukan  sesuai  metode  yang dijelaskan oleh  Castagné et  al. (2009)  dan Yankelevitch-Yahav et  al. (2015)  dengan modifikasi. Uji dilakukan dengan menempatkan  mencit  di  dalam  tabung berisi  air  dengan  kedalaman  tertentu sehingga  kaki  belakang  mencit  tidak menyentuh  dasar  tabung  dan  kaki  depan tidak dapat  berpegangan pada tepi tabung. Suhu  air  disesuaikan  pada  suhu  ruang karena  suhu  air  terlalu  dingin  dapat memicu  perilaku  renang  lebih  aktif. Durasi  renang  paksa  adalah  6  menit  dan waktu  ketika  mencit  menunjukan  tanda- tanda imobilitas dicatat.

## Rancangan Percobaan
Evaluasi efek
suplementasi paraprobiotik tempe terhadap gejala depresi  menggunakan  hewan  coba  mencit Balb/c  yang  dibagi  dalam  4  kelompok, yakni  kelompok  netral  (K-),  kontrol depresi  (K+),  depresi+tempe  (T),  dan depresi+laru  tempe  (LT).  Berdasarkan metode resource  equation (Charan  &
Kantharia, 2013), masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor mencit.

## Metode Analisis
Skor  kondisi  rambut  pada  8  bagian tubuh  dirata-rata  sebagai  acuan  perilaku grooming kasar.  Total  durasi grooming selama  SST  setiap  mencit  digunakan sebagai acuan perilaku grooming terinduksi (Smolinsky , et al ., 2009).
Pengukuran  waktu  imobilitas  pada FST  dan  TST  dilakukan  sesuai  metode
yang  dijelaskan  oleh  Slattery  and  Cryan (2012).  Perhitungan  frekuensi  masing- masing  fase  dilakukan  dengan  membagi jangka waktu 5 menit  (300 detik) menjadi 60 bagian, masing-masing bagian selama 5 detik,  lalu  mengategorikan  setiap  bagian tersebut  sebagai  fase  imobilitas  atau  fase bergerak  tergantung  pada  gerakan  yang mayoritas dilakukan mencit pada jangka 5 detik  tersebut.  Jika  mencit  hanya  diam pada  detik  ke-3  hingga  ke-5,  maka  bagian pertama  dihitung  1  (satu)  poin  untuk  fase mengambang.  Sebaliknya,  jika  mencit berusaha kabur pada detik ke-4 hingga ke- 10,  maka  bagian  kedua  dihitung  satu  poin untuk  fase  berontak.  Begitu  seterusnya sepanjang  300  detik  hingga  didapat  total 60 poin jika semua fase dijumlahkan.
Data  skor  kondisi  rambut,  durasi grooming (SST),  dan  waktu  imobilitas (TST  dan  FST)  dihitung  nilai  median, kuartil  atas,  dan  kuartil  bawah  per kelompok. Data tersebut lalu diilustrasikan dalam bentuk box plot . Oleh karena variansi (standar
deviasi)  yang  besar  dalam  satu  kelompok uji  dan  jumlah  sampel  yang  terhitung kecil, data diuji dengan metode nonparametrik,  yakni  uji  Mann-Whitney untuk membandingkan data antar kelompok  dalam  minggu  yang  sama  dan uji  Friedman  untuk  membandingkan  data antar  minggu.  Jika  diperlukan,  digunakan uji Wilcoxson sign-rank untuk membandingkan  data  antara  2  minggu. Nilai  p-value  yang  lebih  kecil  dari  0,05 menunjukkan  nilai  signifikan.  Analisis dilakukan mengunakan piranti lunak SPSS ver.23.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Efek Terhadap Perilaku Grooming Perilaku grooming sebagai salah satu indikator  gejala  depresi  pada  mencit diukur  dengan  dua  metode.  Pengukuran perilaku grooming secara umum didasarkan  pada  penurunan  kebersihan kondisi  rambut  setiap  minggu,  sedangkan
secara  khusus  didasarkan  pada  penurunan durasi grooming saat  diinduksi  dengan SST.

## Skor Kondisi Rambut
Kondisi  rambut  mencit  dari  ketiga kelompok yang diinduksi depresi memburuk (semakin kotor dan berantakan) seiring  waktu.  Terlihat  pada Gambar  1 , skor kondisi rambut kelompok K+  (X 2 (3) = 8.846, p-value = 0,013), T (X 2 (3) = 8.793, p- value =0,003),  dan  LT  (X 2 (5) =  10.510, p- value =  0,028)  mengalami  peningkatan signifikan  antara  sebelum  induksi  depresi (H 0 )  dan  minggu  ke-3    induksi  depresi. Sementara  itu,  kondisi  rambut  kelompok yang  tidak  diinduksi  depresi  (K-)  tidak mengalami perubahan signifikan.
Gambar  1 .  Skor  kondisi  rambut  mencit  kelompok kontrol   netral ( ),  kontrol   depresi ( ),  perlakuan  tempe  ( )  dan  laru tempe  ( )  dan  *:  vs  H 0, p-value  < 0,05; + : vs LT, p-value < 0,05; # : vs
K-, p-value < 0,05
Jika kondisi rambut mencit dibandingkan  antar  kelompok,  perbedaan signifikan  antara  kelompok  kontrol  yang diinduksi  depresi  (K+)  dan  kelompok kontrol  yang  tidak  diinduksi  depresi  (K-) telah  teramati  sejak  minggu  ke-2  ( p- value =0,029), dengan median [IQR] untuk kelompok  K-  dan  K+  pada  minggu  ke-2 masing-masing  adalah  3,5  [2,875;  4,125] dan 0,75 [0;1,5]. Sementara itu, perbedaan antara K- dengan kelompok yang diinduksi
depresi disertai suplementasi paraprobiotik baru tampak pada minggu ke-3 (kelompok T: p-value = 0,029; kelompok LT: p-value = 0,029),  dengan  median  [IQR]  untuk kelompok T, LT dan K- pada minggu ke-3 masing-masing  adalah  3,75  [3,375;4,25], 5,75 [5,25; 6], dan 0,5 [0,375; 0,625].
Pada  kelompok  yang  mendapat suplementasi paraprobiotik sendiri, kelompok yang diberi laru tempe menunjukkan kondisi rambut yang cenderung  lebih  baik.  Pada  minggu  ke-1 induksi, skor kondisi rambut kelompok LT masih  0  [IQR  0,0],  jauh  di  bawah kelompok T yang telah meningkat menjadi 3,5 [IQR 2; 5,25] ( p-value = 0,029).

## Durasi Grooming Terinduksi
Durasi grooming kelompok  yang tidak  diinduksi  depresi  (K-)  menunjukkan peningkatan  dari  sebelum  induksi  hingga minggu terakhir induksi depresi (X 2 (4) = 9; p-value =  0,043)  ( Gambar  2 ).  Durasi grooming kelompok K- bertambah dari 86 [IQR  71;  92]  pada  hari  sebelum  induksi menjadi 133 [IQR 121; 137] di minggu ke- 3  induksi.  Hal  ini  sesuai  dengan  asumsi awal  bahwa  mencit  yang  tidak  diinduksi depresi cenderung memperhatikan kebersihan  dirinya  dengan  lebih  baik. Pengamatan  ini  juga  sejalan  dengan  data kondisi  rambut  kelompok  K-  yang menunjukkan kondisi lebih bersih/ rapi.
Kelompok  K+  dan  T  yang  diinduksi depresi  juga  menunjukkan  peningkatan dari  awal  induksi  hingga  akhir  induksi, namun peningkatan tersebut tidak signifikan  (K+:  X 2 (4) =  7,525, p-value = 0,085;  T:  X 2 (3) =  0,200, p-value =  1). Isingrini et  al .  (2010)  dalam penelitiannya menemukan  bahwa  penerapan  prosedur UCMS  pada  awalnya  tidak  menurunkan durasi grooming .  Setelah  prosedur  UCMS diperpanjang,  barulah terlihat  bahwa durasi grooming tidak  lagi  mengalami peningkatan  signifikan.  Oleh  karena  itu, kemungkinan  dalam  penelitian  ini  pun perbedaan  durasi grooming baru  akan tampak jika prosedur UCMS diperpanjang.
Gambar  2 .  Kurva  durasi grooming SST  pada waktu  H0  ( ),  minggu  1  ( ), minggu  2  ( ),  minggu  3  ( )  dan *: vs H 0, p-value < 0,05, #: vs K-, p-value
< 0,05
Hasil yang mencolok dari perubahan durasi grooming pada  uji  SST  ini ditunjukkan  oleh  kelompok  LT,  yang justru  menunjukkan trend penurunan durasi grooming setelah  induksi  depresi (Error!  Reference  source  not  found.). Bahkan,  pada  minggu  ke-3,  durasi grooming kelompok  LT  lebih  rendah secara signifikan dengan kelompok K- ( p- value =  0,050).  Hasil  ini  berlawanan dengan  pengamatan  kondisi  rambut,  yang menunjukkan kelompok LT justru memiliki  rambut  yang  lebih  rapi/bersih daripada kelompok K+ dan T. Hal tersebut kemungkinan  berhubungan  dengan  efek tes  berulang  ( repeated  measure  test )  yang menyebabkan  mencit  lama  kelamaan beradaptasi  terhadap  lingkungan  tes.  Efek ini  teramati  pada Open  Fiels  Test yang menguji  tingkat  kecemasan  pada  hewan pengerat  dalam  penelitian  Sturman et  al.
(2018).  Dalam  penelitian  tersebut,  gejala kecemasan  yang  ditunjukkan  berkurang pada  tes-tes  berikutnya  diduga  karena lingkungan  tes  tidak  lagi  terlalu  aversif bagi mencit setelah berkali-kali mengekplorasi  lingkungan  tersebut.  Efek ini pula  yang diperkirakan terjadi pada tes SST kali ini, sebab kondisi lingkungan tes SST  cukup  mirip  dengan  tes  OFT,  yakni
kotak  bening  kosong  tempat  mencit  dapat bebas bereksplorasi sendirian.
Parameter yang diamati pada eksperimen  OFT  adalah  perilaku rearing (berdiri  di  atas  2  kaki  belakang)  baik dengan  sandaran  maupun  tidak.  Frekuensi rearing yang tinggi menunjukkan tingginya  sifat  ekploratif  dan  rendahnya tingkat  kecemasan  mencit.  Sementara  itu, dalam SST, parameter yang diamati adalah jumlah  aktivitas grooming yang  dilakukan mencit sebagai indikasi kepedulian terhadap kebersihan diri ( self-care ). Kedua perilaku  tersebut  tidak  dapat  muncul bersamaan dan cenderung berlawanan satu sama  lain  karena  mencit  yang  sibuk mengekplorasi  lingkungan  tidak  akan memperhatikan  kondisi  kebersihan  diri. Dapat  dikatakan  jika  mencit  lebih  jarang melakukan rearing maka  potensi  mencit lebih  sering  melakukan grooming akan lebih  besar.  Dengan  demikian,  penurunan skor grooming mencit kelompok LT dalam SST  sesuai  dengan  peningkatan    skor rearing mencit  dalam  eksperiman  OFT yang dilakukan Sturman et al. (2018).

## Efek Terhadap Waktu Imobilitas
Waktu  imobilitas  mengacu  pada durasi/frekuensi  mencit  berhenti  berusaha meloloskan diri dari stressor yang diberikan. Semakin lama waktu imobilitas, semakin parah tingkat depresi mencit.

## Waktu Imobilitas Pada TST
Hasil  yang  didapat  dari  uji  ini  agak berbeda  dengan  hasil  uji  lainnya.  Tidak seperti uji lainnya, trend yang ditunjukkan kelompok  K-  justru  peningkatan  waktu imobilitas.  Hal  ini  mengimplikasikan bahwa  kelompok  kontrol  tersebut  justru memiliki  tingkat  depresi  lebih  tinggi. Peningkatan  durasi  diam  ini  diduga disebabkan  oleh  penambahan running wheel (roda putar untuk bermain hamster). Penambahan tersebut nampaknya memperbaiki  kondisi  stress  jika  ditinjau dari  segi  kebersihan  rambut  dan  berat badan, namun tampaknya dapat
menganggu  uji  perilaku  motorik.  Richter , et  al. (2014)  mengulas  efek  negatif pemberian roda putar pada hewan pengerat,  salah  satunya  kemungkinan terjadinya  deformasi  pada  ekor  mencit tertentu  yang  dapat  mempengaruhi  fungsi lokomotif  mencit  sehingga  dapat  memberi hasil berbeda pada uji perilaku kecemasan.
Di  sisi  lain  ( Gambar  3 ),  kelompok K+  yang  diinduksi  depresi  menunjukkan peningkatan durasi imobilitas dari sebelum induksi  depresi  (median  [IQR)=  23 [19;23])  ke  minggu  ke-2  induksi  depresi (median [IQR]= 30 [28; 33,25]; X 2 (4) = 7,6; p-value =  0,042).  Sementara  itu,  kelompok yang mendapat suplementasi paraprobiotik (T  dan  LT)  terlihat  memiliki  frekuensi imobilitas yang lebih rendah dibandingkan kelompok K+ yang diinduksi depresi tanpa suplementasi  pararobiotik  ( Gambar  3 ). Pada  minggu  ke-2,  ketika  efek  induksi depresi  mulai  tampak  pada  bertambahnya frekuensi imobilitas kelompok K+ (30[IQR  28;  33,25]),  frekuensi  imobilitas kelompok  yang  diberi  paraprobiotik  tetap rendah  (T=  15,5[IQR  11,75;  20], p- value =0,029;  LT  =  20,5  [IQR  17,75; 22,25], p-value = 0,029).
Gambar 3 . Kurva waktu imobilitas TST kelompok kontrol   netral  ( ),  kontrol   depresi ( ),  perlakuan  tempe  ( )  dan  laru tempe  ( )  dan  *  :  vs  H 0, p-value  < 0,05;  #  :  vs  K-,  p-value  <  0,05;  o  :  vs K+, p-value < 0,05
Di  antara  kedua  kelompok  yang mendapat suplementasi paraprobiotik, kelompok LT menunjukkan performa yang lebih  baik  pada  saat  uji  suspensi  ekor. Terlihat  pada Gambar  3 ,  kelompok  LT telah  menunjukkan  perbedaan  signifikan dengan  kelompok  kontrol  depresi  (K+) sejak minggu ke-1 induksi depresi (LT = 6 [IQR 3,75; 9,75]; K+ = 22[IQR 21; 35]; p- value = 0,016), lebih awal dari kelompok T yang  baru  menunjukkan  beda  signifikan pada  minggu  ke-2.  Ditambah  lagi  pada minggu  ke-3,  ketika  terjadi  anomali  pada kelompok K+ dan K-, frekuensi imobilitas kelompok  LT  tetap  paling  rendah  (12,5 [IQR  8,5;  17,75])  dan  berbeda  signifikan dengan  kelompok  K-  ( p-value =  0,032). Hal  ini  sejalan  dengan  hasil  pengamatan kondisi  rambut  kelompok  LT  yang menunjukkan  kondisi  lebih  baik  dari kelompok  kontrol  yang  tidak  diinduksi depresi (K-).

## Waktu Imobilitas Pada FST
Pada  FST,  frekuensi  imobilitas kelompok K-  yang tidak diinduksi depresi tidak  menunjukkan  hasil  anomali  seperti pada  hasil  TST.  Terlihat  pada Gambar  4 , kelompok  K-  menunjukkan  penurunan frekuensi  imobilitas  dari  sebelum  induksi depresi (X 2 (4) = 11,077; p-value = 0,009).
Berkebalikan  dengan  hasil  TST, kelompok  kontrol  depresi  (K+)  tidak menunjukkan peningkatan frekuensi imobilitas  yang  signifikan.  Frekuensi imobilitas kelompok K+ mengalami kenaikan  dari  42  [IQR  21;  61]  sebelum induksi  menjadi  70,5  [IQR  69,75;  71,25] pada  setelah  empat  minggu  induksi depresi,  namun  perbedaan  tersebut  tidak mencapai  nilai  signifikan  secara  statistik ( p-value = 0,367).
Hasil yang berlawanan pada uji FST
dan  TST  memang  dapat  terjadi  karena perbedaan  mekanisme  patofisiologis  yang mendasari  kedua  tes  (Cryan , et  al .,  2005). Voiculescu , et  al. (2015)  menemukan bahawa deprivasi melantonin menyebabkan perilaku depresif pada TST,
sementara  reaksi  pada  FST  tetap  normal. Mengingat  dalam  penelitian  kali  ini kelompok yang diinduksi depresi diberikan  penerangan  pada  malam  hari sebagai  salah  satu  stressor,  terdapat kemungkinan  salah  satu  penginduksi perilaku  depresif  kelompok  K+  yang diamati  pada  TST  adalah  penurunan jumlah melantonin, yang tidak berpengaruh  pada  perilaku  imobilitas  di FST.
Gambar  4 .  Kurva  waktu  imobilisasi  FST kelompok  kontrol      netral  ( ), kontrol      depresi  ( ),  perlakuan tempe  ( )  dan  laru  tempe  ( ) dan *: vs H 0, p-value < 0,05; #: vs K-, p- value < 0,05
Walaupun bila dibandingkan dengan frekuensi di awal induksi depresi, peningkatan frekuensi imobilitas kelompok  K+  tidak  berbeda  signifikan, terdapat perbedaan signifikan antara frekuensi  imobilitas  kelompok  K+  (56 [IQR 49,75; 63,75]) dan kelompok K-  (47 [IQR  28;47])  di  minggu  ke-3  ( p-value = 0,008).  Kelompok  yang  tidak  diinduksi (K-)  semakin  aktif  bergerak  setelah berkali-kali  diceburkan  dan  menunjukkan adaptasi terhadap kondisi tes renang paksa, sedangkan kelompok mencit yang diinduksi  depresi  (K+)  tetap  lebih  banyak berdiam diri. Perbedaan frekuensi imobilitas  ini  menunjukkan  efek stressor- stressor lain  di  luar  gangguan  siklus
sirkadian  mulai  menginduksi  timbulnya gejala depresi pada mencit K+.
Sementara  itu,  hasil  FST  untuk kelompok  yang  diinduksi  depresi  disertai pemberian tempe (T) menunjukkan frekuensi  imobilitas  yang  naik  turun  dan tidak  jauh  berbeda  dari  kelompok  K+, walupun cenderung lebih rendah ( Gambar 4 ).  Hasil  ini  berbeda  dengan  hasil  TST yang  menunjukkan  penurunan  signifikan frekuensi imobilitas kelompok T dibanding  K+  ( Gambar  4 ).  Perbedaan  ini dapat disebabkan oleh kandungan triptofan yang  merupakan  prekursor  serotonin  pada tempe.  Menurut  Chatterjee , et  al. (2012), peningkatan aktivitas serotonin meningkatkan  imobilitas  pada  FST,  tetapi menimbulkan  hiperaktivitas  pada  TST. Oleh sebab itu, tidak terlihatnya penurunan imobilitas FST pada kelompok T kemungkinan berhubungan dengan peningkatan  kadar  serotonin  pada  mencit Balb/c. Penelitian lanjutan yang mengukur kadar  serotonin  mencit  dapat  dilakukan untuk mengkonfirmasi hal tersebut.

## KESIMPULAN
Pemberian tempe tidak memperbaiki kondisi  rambut  akhir  ( p-value= 0,500) maupun  mempengaruhi  durasi grooming ( p-value= 1)  mencit  Balb/c.  Sementara pemberian  laru  tempe  membuat  kondisi rambut  lebih  baik  daripada  mencit  Balb/c, yang  tidak  diinduksi  depresi  ( p-value= 0,029),  namun  justru  menurunkan  durasi grooming hingga lebih  rendah dari mencit yang  tidak  diinduksi  depresi  ( p-value=
0,05).
Pemberian  paraprobiotik  tempe  dan laru  tempe  pada  mencit  Balb/c  yang diinduksi  depresi  menurunkan  waktu imobilitas pada TST dibandingkan dengan mencit  Balb/c,  kontrol  depresi  secara signifikan  (T: p-value= 0,029;  LT: p- value = 0,029). Pada FST, hanya kelompok laru  tempe  yang  menunjukkan  penurunan gejala  depresi  namun  dengan  beda  yang tidak signifikan ( p-value= 0,239). Berdasarkan  hasil  pengamatan  kondisi
rambut  dan  TST,  pemberian  paraprobiotik dalam  bentuk laru tempe memberi pengaruh yang lebih baik dalam menurunkan  gejala  depresi  mencit  Balb/c daripada  paraprobiotik  dalam  bentuk tempe.

## DAFTAR PUSTAKA
Astuti,  M.,  Meliala,  A.,  Dalais,  F.S.,  and Wahlqvist,  M.L.  2000.  Tempe,  a nutritious  and  healthy  food  from Indonesia. Asia  Pacific  Journal  of Clinical Nutrition, 9 (4): 322-325.
Babu, P.D.,
Bhakyaraj, R., and Vidhyalakshmi,  R.  2009.  A  low  cost nutritious  food  “Tempeh”-  A  Review. World  Journal  of  Dairy  &  Food Sciences, 4 (1): 22-27.
Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. 2019. Hasil Riskesdas 2018. [Online]. Available at: http://www.depkes.go.id/resources/dow nload/info-terkini/hasil-riskesdas-
2018.pdf.  [Diakses  tanggal  10  Maret 2019].
Bergner,  C.L.,  Smolinsky,  A.N.,  Hart,  P.C., Dufour,  B.D.,  Egan,  R.J.,  LaPorte,  J.L., and Kalueff, A.V. 2010. Mouse Models for Studying Depression-Like States and Antidepressant Drugs. In: G. Proetzel & M.  V.  Wiles,  eds. Mouse  Models  for Drug Discovery. s.l.: Humana Press, pp. 267-282.
Bravo,  J.A.  Forsythe,  P.,  Chew,  M.V., Escaravage,  E.,  and  Savignac,  H.M. 2011.  Ingestion  of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA  receptor  expression  in  a  mouse via  the  vagus  nerve. PNAS, 08  (38):
16050-16055.
Can,  A.,  Dao,  D.T.,  Terrillion,  C.E., Piantadosi,  S.C.,  Bhat,  S.,  and  Gould, T.D.  2012.  The  tail  suspension  test. JoVe: Journal of Visualized Experiment, 59:  e3769.
Castagné,  V.,  Moser,  P.,  and  Porsolt,  R.D. 2009. Behavioral Assessment of
Antidepressant  Activity  in  Rodents.  In:
B. JJ, ed. Methods of Behavior Analysis in  Neuroscience. 2nd  ed.  Boca  Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francis.
Charan, J., and Kantharia, N.D. 2013. How to calculate sample size in animal studies?.
Journal of
Pharmacology &
Pharmacotherapeutics, 4 (4): 303-306.
Chatterjee, M., Jaiswal, M., and Palit, G. 2012.
Comparative  evaluation  of  forced  swim test and tail suspension test as models of negative  symptom  of  schizophrenia  in rodents. ISRN  Psychiatry, Volume 2012: 595141.
Clapp, M. Aurora, N., Herrera, L., Bhatia, M., Wilen,  E.,  and Wakefield,  S.  2017.  Gut microbiota’s  effect  on  mental  health:
The gut-brain axis. Clinics and Practice, 7 (987): 131-136.
Cryan,  J.F.,  Mombereau,  C.,  and  Vassout,  A. 2005.  The  tail  suspension  test  as  a model  for  assessing  antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic  studies  in  mice. Neuroscience and  Biobehavioral  Reviews, 29:  571- 625.
Dash, S., Clarke, G., Berk, M., and Jacka, F.N. 2015.  The  gut  microbiome  and  diet  in psychiatry: Focus on depression.
Current Opinion Psychiatry, 28 (1): 1-6.
DeRubeis, R.J., Siegle, G.J., and Hollon, S.D.
2008. Cognitive therapy vs. medications for depression: Treatment outcomes and neural  mechanisms. Nature  Review Neuroscience, 9 (10): 788-796.
Desbonnet,  L.,  Garrett,  L.,  Clarke,  G.,  Kiely,
B.,  Cryan,  J.F.,  and  Dinan,  T.G.  2010. Effects of the probiotic Bifidobacterium infantis  in  the  maternal  separation model  of  depression. Neuroscience,
170: 1179-1188.
Frisbee, J.C.,  Brooks,  S.D.,  Stanley,  S.C., and d'Audiffret,
A.C. 2015.
An unpredictable chronic mild stress protocol  for  instigating  depressive symptoms,  behavioral  changes  and negative  health  outcomes  in  rodents.
JoVe: Journal
of Visualized Experiments, 106: e53109. Hasler, G. 2010. Pathophysiology of depression:  Do  we  have  any  solid evidence  of  interest  to  clinicians?. World Psychiatry, 9 (3), 155-161.
Isingrini,  E.,  Camus,  V.,  Guisquet,  A.-M.L., Pingaud,  M.,  Devers,  S.,  and  Belzung, C.  2010.  Association  between  repeated unpredictable chronic mild stress (UCMS) procedures with a high fat diet: A  model  of  fluoxetine  resistance  in mice. PLoS One, 5 (4): e10404.
Krishnan,  V.,  and  Nestler,  E.J.  2008.  The molecular  neurobiology  of  depression.
Nature Insight Review, 455: 894-902.
Kuligowski, M., Jasinska-Kuligowska, I.,  and Nowak, J. 2013. Evaluation of bean and soy  tempeh  influence  on  intestinal bacteria  and  estimation  of  antibacterial properties  of  bean  tempeh. Polish Journal  of  Microbiology, 62  (2):  189- 194.
Nollet,  M.,  Guisquet,  A.-M.L.,  and  Belzung,
C. 2013. Models of depression: unpredictable  chronic  mild  stress  in mice.
Current Protocols
in
Pharmacology, 5 (65): 1-17.
Nuraida, L. 2015. A review: Health promoting lactic  acid  bacteria  in  traditional Indonesian  fermented  foods. Food Science and Human Wellness, 4 (2): 47- 55.
Peng,  Y.-L. Liu,  Y.-N.,  Liu,  L.,  Wang,  X., Jiang,  C.-L.,  &  Wang,  Y.-X.  2012. Inducible  nitric  oxide  synthase  is involved in the modulation of depressive behaviors induced by unpredictable  chronic  mild  stress.. Journal  of  Neuroinflammation, 9  (75):
1-12.
Richter,  S.H.,  Gass,  P.,  and  Fuss,  J.  2014.
Resting  is  rusting:  A  critical  view  on rodent
wheel-running behavior.
Neuroscientist, 20 (4): 313-325.
Selhub,  E.M.,  Logan,  A.C.,  and  Bested,  A.C. 2014. Fermented foods, microbiota, and mental  health:  ancient  practice  meets nutritional psychiatry. Journal of Physiology Anthropology, 33 (1): 2.
Slattery, D.A., and Cryan, J.F. 2012. Using the rat forced swim test to assess antidepressant-like  activity  in  rodents.
Nature Protocol, 7 (6): 1009-1014.
Smolinsky,  A.N.,  Bergner,  C.L.,  LaPorte, J.L. and  Kalueff,  A.V.  2009.  Analysis  of Grooming  Behavior  and  Its  Utility  in Studying  Animal  Stress,  Anxiety,  and
Depression.  In:  T.  D.  Gould,  ed. Mood and  Anxiety  Related  Phenotypes  in Mice: Characterization Using
Behavioral  Tests. Humana  Press,  pp. 21-36, New York.
Soka,  S.,  Suwanto,  A.,  Sajuthi,  D.,  and Rusmana,  I.  2014.  Impact  of  tempeh supplementation  on  gut  microbiota composition  in  sprague-dawley  rats.
Research  Journal  of  Microbiology, 9 (4): 189-198.
Soka,  S.,  Suwanto,  A.,  Sajuthi,  D.,  and
Rusmana,  I.  2015.  Impact  of  tempeh supplementation on mucosal
immunoglobulin  A  in  Sprague-Dawley rats. Food  Science  and  Biotechnology, 24 (4), 1481-1486.
Sturman,  O.,  Germain,  P.,  and  Bohacek,  J. 2018.  Exploratory  rearing:  a  context- and stress-sensitive behavior recorded in the  open-field  test. Stress, 21  (5):  443- 452.
Voiculescu,  S., Rosca,  A.,  Zeca,  V.,  Zagrean, L.,  and  Zagrean,  A.  2015.  Impact  of maternal  melatonin  suppression  on forced  swim  and  tail  suspension behavioral despair tests in adult offspring. Journal of Medicine and Life, 8 (2): 202-206.
Willner,  P.  2005.  Chronic  mild  stress  (CMS) revisited:  Consistency  and  behavioural- neurobiological  concordance  in  the effects  of  CMS. Neuropsychobiology, 52 (2): 90-110.
World  Health  Organization,  2015. Depression
Factsheet. [Online] Available at: http://www.who.int/mediacentre/factshe ets/fs369/en/ [Diakses tanggal 11September 2015].
World  Health  Organization.  2017. Depression and  other  common  mental  disorders: global health estimates.. [Online]
Available at: https://apps.who.int/iris/handle/10665/2 54610.  [Diakses  tanggal  10  Maret 2019].
Yankelevitch-Yahav, R., Franko, M., Huly, A. and  Doron,  R.  2015.  The  forced  swim test  as  a  model  of  depressive-like behavior. JoVe:  Journal  of  Visualized Experiments, 97: e52587.