AKTIVITAS ANTIKANKER PROTEIN KAPANG Xylaria psidii KT30
(Anticancer Activity of Protein Fungus Xylaria psidii KT30)
Aris Munandar 1) , A. Zaenal Mustopa 3) , Kustiariyah Tarman 2) , Tati Nurhayati 2)
1 Jurusan Perikanan, Fakultas Pertanian Universitas Sultan Ageng Tirtayasa, Jl. Raya Jakarta Km. 4 Pakupatan, Serang Banten
2 Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor
3 Laboratorium Protein Rekombinan, Vaksin, dan Sistem Pengantaran Terarah, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bioteknologi
Email: kustya@gmail.com

## ABSTRACT
Previous research shows that protein of an algicolous fungus Xylaria psidii KT30 inhibited HeLa cell with an average 264.7 μg/mL. To enhance the potent anticancer activity of  extracellular  protein  from  Xylaria  psidii  KT30,  the  present  research  demonstrated purification of its secreted protein. Anticancer against Chang cell line (liver cell) and HeLa cell line (cervical cancer) was done by MTT cytotoxic method. Protein concentration assay was done by bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit. Anticancer assay showed protein of  fungus  KT30  was  not  toxic  against  Chang  cell  line  and  HeLa  cell  line.  Based  on calculation, IC 50 value protein of fraction ammonium sulfat 90% and fractions 11-12 were 670.86 and 1451.68 µg/mL. The protein concentration of fraction ammonium sulfat 90% and fractions 11-12 were 9.013 and 0.604 mg/mL.
Keywords : anticancer, marine fungi, Xylaria psidii

## PENDAHULUAN
Penderita  kanker  di  dunia  pada  tahun  2008  mencapai  12,662  juta  dan 7,564 juta diantaranya meninggal dunia. Jenis kanker yang menyebabkan tingginya angka  kematian  pada  perempuan  adalah  kanker  leher  rahim  ( serviks ).  Kanker serviks di  dunia  mencapai  530  ribu  kasus  (4,2%)  dan  di  wilayah  Asia  Tenggara angka kematiannya mencapai 8,3% (Ferlay et al . 2010). Menurut WHO (2008), 136 laki-laki  dan  109  perempuan  pada  tiap  100  ribu  populasi  penduduk  di  Indonesia meninggal dunia akibat kanker. Prevalensi penyakit kanker di Indonesia mencapai 0,4% berdasarkan diagnosis oleh tenaga kesehatan. Pada tahun 2004, kasus kanker serviks di Indonesia mencapai 3.818 (13%), dan 193 diantaranya meninggal dunia (BPPK 2008).
Pencegahan  penyakit  kanker  dapat  dilakukan  menggunakan  bahan  alam. Makro  dan  mikroorganisme  menghasilkan  metabolit  sekunder  yang  memiliki aktivitas  biologis.  Menurut  Soemiati (2009), sumber bahan alam dapat  diperoleh dari biota laut misalnya kapang laut endofit. Kapang laut endofit memiliki aktivitas antikanker  sehingga  dapat  dijadikan  sumber  untuk  bahan  obat.  Hasil  penelitian
beberapa tahun terakhir juga menunjukkan adanya aktivitas antikanker dari kapang laut. Salah satu kapang laut endofit yang berpotensi adalah Xylaria psidii KT30. Kapang endofit Xylaria psidii KT30 diisolasi dari rumput laut Kappaphycus alvarezii yang  biasa  dimanfaatkan  sebagai  penghasil  karaginan.  Kapang  KT30 menghasilkan metabolit sekunder yang mempunyai aktivitas antikanker (Tarman et al . 2011). Menurut Tarman et al . (2012), protein ekstraseluler yang diekstrak dari media  kultur  kapang  KT30  juga  memiliki  aktivitas  tersebut.  Protein  tersebut mempunyai  aktivitas  antikanker  terhadap  sel  HeLa  (kanker serviks )  dengan  IC 50 264,7  μg/mL.  Aktivitas  antikanker  protein  yang  dihasilkan  kapang  KT30  masih belum  optimal  sehingga  perlu  dilakukan  upaya  untuk  meningkatkan  aktivitas protein tersebut.
Peningkatan  aktivitas  antikanker  protein  kapang  KT30  dilakukan  melalui proses  purifikasi  berdasarkan  sifat  dan  fungsi  yang  berhubungan  dengan  sisi aktifnya. Menurut Munandar et al. (2014), proses purifikasi protein kapang KT30 dilakukan  melalui  kromatografi  filtrasi  gel.  Penelitian  tersebut  menunjukkan adanya  peningkatan  aktivitas  dalam  menghambat  bakteri Escherchia  coli dan Bacillus  subtilis .  Oleh  karena  itu,  pada  penelitian  ini  protein  yang  digunakan merupakan  pelet  dan  fraksi  terbaik  hasil  dari  purifikasi  tersebut.  Tujuan  dari penelitian  ini  adalah  untuk  menguji  aktivitas  antikanker  dan  menentukan  kadar protein kapang Xylaria psidii KT30.

## METODOLOGI
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  Bulan  Mei  -  September  2013  di Laboratorium  Protein  Rekombinan,  Vaksin,  dan  Sistem  Pengantaran  Terarah, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bioteknologi, Cibinong, Kabupaten Bogor dan Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa Primata (PSSP), Institut Pertanian Bogor. Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah pelet  (fraksi  amonium  sulfat  90%)  dan  fraksi  11-12  dari  hasil  purifikasi  protein kapang Xylaria psidii KT30.

## MTT sitotoksik (CCRC 2009)
Sel normal dan kanker yang digunakan dalam penelitian ini adalah sel Chang (sel hati) dan HeLa (kanker serviks ). Sel Chang dan  HeLa dikultur pada inkubator (37 o C,  CO 2 5%)  dengan  media Dulbecco’s  Modified  Eagle’s  Medium (DMEM) yang mengandung 10% Fetal Bovine Serum (FBS), penicillin (100 unit/mL), dan streptomycin sulfat (10 μg/mL) selama 24 jam. Komposisi DMEM adalah garam anorganik, asam amino, vitamin, D-glukosa, asam piruvat, phenol red , L-glutamin.
Sel Chang dan HeLa yang telah confluent , kemudian dicuci dan dipanen.
Sel  Chang  dan  HeLa  dikultur  dalam 96-well  plate dengan  kepadatan  10 4 sel/100  μL  pada  setiap  sumur,  lalu  diinkubasi  selama  24  jam  (37 o C,  CO 2 5%). Setiap sumur dicuci dengan 100 μL PBS. Sel tersebut kemudian diberi perlakuan dengan berbagai konsentrasi dari sampel (triplo) dan kontrol sel yang berisi media
kultur dan sel. Setelah 24 jam, sel dicuci dengan 100 μL PBS, dan ditambahkan dengan 0,01 mL MTT per sumur. Plate diinkubasi pada suhu 37 o C dalam kondisi CO 2 5%  selama  4  jam,  lalu  ditambahkan  10%  SDS  dalam  0,01%  HCl  sebagai stopper . Setelah diinkubasi, absorbansi diukur pada 595 nm menggunakan ELISA reader dan  dibandingkan  dengan  kontrol.  Jumlah  sel  yang  hidup  dihitung  untuk mengetahui konsentrasi IC 50 dengan menggunakan persamaan berikut:
% 𝑆𝑒𝑙 ℎ𝑖𝑑𝑢𝑝 = (𝐴𝑏𝑠 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑠𝑒𝑙 − 𝐴𝑏𝑠 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙) 𝐴𝑏𝑠 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑠𝑒𝑙 𝑥 100%

## Kadar protein kapang KT30 (PIERCE 2003)
Kadar protein kapang KT30 dilakukan dengan menggunakan bicinchoninic acid ( BCA ) protein assay kit . Larutan standar bovine serum albumin (BSA) dengan konsentrasi  20-2000  µg/mL  dibuat  sebagai  tahap  persiapan.  Pembuatan  larutan standar  BSA  dengan  konsentrasi  20-2000  µg/mL  dapat  dilihat  pada  Tabel  1.
Working  reagent dibuat  dengan  mencampurkan  reagent  A  dan  B  (50:1).  Protein kapang KT30 sebanyak 0,1 mL ditambahkan 2 mL working reagent yang dibuat sebelumnya, dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Absorbansi sampel protein kapang KT30 di ukur pada panjang gelombang 562 nm.
Tabel 1 Pembuatan larutan standar BSA dengan konsentrasi 20-2000 µg/mL
Tabung Volume Dilusi (μL) Volume dan Sumber BSA (μL) Konsentrasi BSA (μg/mL) A 0 300 dari stok 2.000 B 125 375 dari stok 1.500 C 325 325 dari stok 1.000 D 175 175 dari dilusi tabung B 750 E 325 325 dari dilusi tabung C 500 F 325 325 dari dilusi tabung E 250 G 325 325 dari dilusi tabung F 125 H 400 100 dari dilusi tabung G 25 I 400 0 0

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Aktivitas antikanker protein kapang KT30
Hasil uji antikanker terhadap sel Chang menunjukkan bahwa protein KT30 bersifat tidak toksik.  Inhibisi fraksi amonium sulfat 90% dengan konsentrasi 500 dan 1.000 ppm  mencapai  3,30% dan 19,78%, sedangkan pada fraksi  11-12 tidak ada  inhibisi  terhadap  sel  Chang.  Hasil  tersebut  berarti  protein  KT30  aman digunakan  sebagai  bahan  obat.  Sel  Chang  pada  uji  antikanker  dapat  dilihat  pada Gambar 1. Haglund (2011) menyatakan bahwa toksisitas agen antikanker biasanya mempengaruhi sel misalnya sel pembentuk darah, sel epithelium, hati, dan ginjal. Dalam pengembangan obat, antikanker baru harus memiliki efek klinis yang baik dan toksisitasnya rendah terhadap sel normal.
Sampel Konsentrasi (ppm) 125 250 500 1000
Pelet protein (Sel Chang)
Fraksi 11-12
(Sel Chang)
Pelet protein (Sel HeLa) Fraksi 11-12 (Sel HeLa) (Kontrol Sel Chang) (Kontrol Sel HeLa)
Gambar 1 Sel Chang dan HeLa pada uji antikanker
Berdasarkan  hasil  uji  antikanker  protein  kapang  KT30  terhadap  sel  HeLa, fraksi amonium sulfat 90% dan fraksi 11-12 bersifat tidak toksik. Menurut National Cancer Institute (NCI), suatu senyawa memiliki potensi sebagai antikanker apabila memiliki  nilai  IC 50 ≤  20  µg/mL.  Berdasarkan  perhitungan,  nilai  IC 50 fraksi amonium sulfat 90% dan fraksi 11-12 adalah 670,86 dan 1451,68 µg/mL. Sel HeLa pada uji antikanker dapat dilihat pada Gambar 1. Hasil uji antikanker protein KT30 pada media NaCl 0% selama 15 hari tersebut masih rendah dibandingkan dengan penelitian  terdahulu.  Tarman et  al .  (2012)  melaporkan  bahwa  pelet  dan  fraksi  1 protein  kapang  KT30  pada  media  NaCl  3%  selama  7-9  hari  memiliki  aktivitas antikanker terhadap sel HeLa dengan nilai IC 50 450,8 dan 264,7 µg/mL.
Berdasarkan hasil tersebut, maka protein yang dibutuhkan untuk membunuh 50% sel  HeLa jumlahnya banyak, tetapi  tidak bermasalah karena protein  kapang KT30 tidak bersifat toksik terhadap sel normal. Pengunaan protein sebagai bahan obat  memiliki  keunggulan  yaitu  dapat  diterima  dengan  baik  oleh  tubuh  dan  efek sampingnya sedikit (Arifudin et al . 2001). Aktivitas protein antikanker dari kapang Cordyceps militaris (CMP) juga dilaporkan oleh Park et al. (2009). CMP memiliki nilai IC 50 9,3 µM untuk kanker payudara dan 8,1 µM untuk kanker kandung kemih. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kapang merupakan sumber protein baru yang dapat diaplikasikan dalam bidang biologi dan pengobatan.

## Kadar protein kapang KT30
Kadar  protein  kapang  KT30  dihitung  pada  setiap  tahap  pemurnian  yang meliputi ekstrak kasar (supernatan), fraksi amonium sulfat 90%, dan fraksi fraksi 11-12  karena  memiliki  aktivitas  antibakteri  paling  tinggi  dibandingkan  fraksi lainnya. Tabel 2 menunjukkan kadar protein kapang X. psidii KT30. Berdasarkan perhitungan, kadar protein pada fraksi amonium sulfat 90% adalah 9,013 mg/mL. Penambahan amonium sulfat pada saturasi tinggi diduga menyebabkan interaksi air pada protein menurun dan protein akan saling berinteraksi, agregat, dan mengendap ( salting  out ).  Pada  umumnya,  protein  yang  mengendap  pada  saturasi  amonium sulfat tinggi adalah protein dengan bobot molekul rendah (Widyarti 2006).
Tabel 1 Kadar protein kapang X. psidii KT30 Sampel Volume (ml) Kadar protein (mg/ml) Total Protein (mg) Ekstrak Kasar (Supernatan) 150 5,715 857,297 Fraksi Amonium Sulfat 90% 3 9,013 27,038 Fraksi 11-12 (Sephadex G-50) 1 0,604 0,604
Fraksi  11-12  memiliki  kadar  protein  sebesar  0,604  mg/mL,  nilai  tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan protein dari kapang Cordyceps militaris (CMP). Park et  al. (2009)  melaporkan  bahwa  CMP  memiliki  kadar  protein  sebesar  0,2 mg/mL. CMP diperoleh dari hasil pemurnian dengan metode kromatografi penukar ion dan filtrasi gel. Haghbeen et al. (2004) juga melaporkan mengenai kadar protein dari  jamur  komersial.  Fraksi  protein  dari  hasil  kromatografi  filtrasi  gel  memiliki kadar protein sebesar 0,394 mg/mL dengan total protein sebesar 10,4 mg.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Protein kapang KT30 tidak toksik terhadap sel Chang dan memiliki aktivitas terhadap sel HeLa dengan nilai IC 50 670,86 µg/mL pada fraksi amonium sulfat 90% dan 1451,8 µg/mL pada fraksi 11-12. Fraksi amonium sulfat 90% dan fraksi 11-12 memiliki kadar protein sebesar 9,189 mg/mL dan 0,604 mg/mL.

## Saran
Berdasarkan hasil penelitian, perlu dilakukan purifikasi dengan metode yang berbeda dan lebih lanjut untuk mendapatkan protein yang murni dengan aktivitas yang tinggi.

## DAFTAR PUSTAKA
Arifudin,  Patong  R  dan  Ahmad  A.  2001.  Penelusuran  protein  bioaktif  dalam makroalga  sebagai  bahan  antibakteri  dan  antijamur. Mar.  Chim  Acta. 2(2): 11-18.
[BPPK] Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. 2008. Riset Kesehatan Dasar (RISKESDAS) 2007 . Jakarta (ID): Depatemen Kesehatan.
[CCRC] Cancer Chemoprevention Research Center. 2009. Uji Sitotoksik Metode MTT . Yogyakarta (ID): Universitas Gajah Mada. Ferlay  J,  Shin  HR,  Bray  F,  Forman  D,  Mathers  C  dan  Parkin  DM.  2010. GLOBOCAN  2008,  Cancer  Incidence  and  Mortality  Worldwide:  IARC CancerBase No. 10 . Lyon (FR): International Agency for Research on Cancer [Internet]. [diunduh Jun 11 2012]. Tersedia pada: http://www.globocan.iarc.fr.
Haghbeen  K,  Jazi  FR,  Karkhane  AA  dan  Borojerdi  SS.  2004.  Purification  of tyrosinase from edible mushroom. Iran J Biotechnol . 3(2): 189-194.
Haglund C. 2011. Integrating efficacy and toxicity in preclinical anticancer drug development [disertasi]. Uppsala (SE): Uppsala University.
Munandar A, Mustopa AZ, Tarman K, dan Nurhayati T. 2014. Aktivitas Antibakteri Protein Kapang Xylaria psidii KT30 terhadap Escherichia coli dan Bacillus subtilis . JTIP . 25 (2): 146-151.
Park BT, Na KH, Jung EC, Park JW dan Kim HH. 2009. Antifungal and anticancer of  a  protein  from  the  mushroom Cordyceps  militaris . Korean  J  Physiol Pharmacol. 13: 49-54. Pierce.  2003. Instruction  BCA TM Protein  Assay  Kit .  Rockford  (US):  Pierce Biotechnology Inc.
Soemiati  A.  2009. Mikroba  Endofit  :  Solusi  Bahan  Baku  Obat  yang  Murah  dan Ramah Lingkungan . Jakarta(ID): Universitas Indonesia.
Tarman K, Lindequist U, Wende K, Porzel A, Arnold N dan Wessjohan LA. 2011. Isolation of a new natural product and cytotoxic and antimicrobial activities of extracts from fungi of Indonesian marine habits. Mar. Drugs . 9: 294-306. doi: 10.3390/md9030294.