## Pendekatan Bioinformatika terhadap Transkriptomik Filagrin

## Bioinformatics Approach towards Transcriptomics of Filaggrin
Dito Anurogo 1 , Arli Aditya Parikesit 2 1 S2 Ilmu Biomedik, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada
2 Tim Informatika, STAI ALHIKMAH Jakarta, Cilandak Timur, Pasar Minggu, Jakarta Selatan, Indonesia e-mail korespondensi: dito.anurogo@mail.ugm.ac.id

## Abstrak
Filaggrin, atau filamen yang menggabungkan protein, adalah salah satu protein struktural penting yang berfungsi untuk  pengembangan,  pemeliharaan,  dan  pembentukkan  kulit  sebagai  penghalang  utuh.  Produk breakdown filaggrin mengatur hidrasi kulit; berkontribusi pada pH asam dari kulit, yang pada gilirannya sangat penting untuk aktivitas  berbagai  protease  stratum  korneum  dalam  deskuamasi  dan  sintesis  lipid.  Filaggrin  diproduksi  oleh keratinosit  granular  sebagai  prekursor  besar  yang  disebut  profilaggrin,  yang  disandikan  oleh  gen  FLG,  terletak  di kompleks  diferensiasi  epidermal  pada  kromosom  1  (lokus  1q21).  Lokus  tersebut  berisi  sekelompok  gen  yang terlibat  dalam  diferensiasi  epidermal.  Kekurangan  filaggrin  memiliki  beberapa  konsekuensi  pada  organisasi  dan fungsi  epidermal  dengan  implikasi  penting  seperti  risiko  yang  lebih  tinggi  untuk  penyakit  atopik  atau  infeksi mikroba.  Mutasi  FLG,  gen  yang  mengkodekan  filaggrin,  telah  terbukti  menyebabkan ichthyosis  vulgaris , meningkatkan risiko dermatitis atopik dan penyakit atopik lain. Kajian ini meneliti gen FLG berdasarkan pendekatan bioinformatika  untuk  mencari conserved  region dari  perwakilan  mamalia  yang  menyandikan coding (m)  dan non coding (nc)  RNA.  Diharapkan  ekspresi  mRNA  dapat  digunakan  sebagai  agen  diagnostik  dan  terapetik  terhadap defisiensi dan mutasi filaggrin.
Kata kunci: filaggrin, FLG, profilaggrin, defisiensi filaggrin, bioinformatika.

## Abstract
Filaggrin,  or  filaments  which  combines  protein,  is  one  of  the  important  structural  protein  that  works  for  the development,  maintenance,  and  the  formation  of  the  skin  as  an  intact  barrier.  Filaggrin  breakdown  products regulate the hydration of the skin; contribute to the acidic pH of the skin, which in turn is essential for the activity of various proteases in the stratum corneum desquamation and lipid synthesis. Filaggrin produced by keratinocytes granular as a major precursor called profilaggrin, encoded by the FLG gene, located in the epidermal differentiation complex on chromosome 1 (1q21 locus). The locus contains a group of genes involved in epidermal differentiation. Filaggrin  deficiency  has  some  consequences  on  the  organization  and  function  of  epidermal  with  important implications such as increased risk for atopic disease or a  microbial infection. FLG mutation, a gene that encodes filaggrin,  has  been  shown  to  cause  ichthyosis  vulgaris,  increasing  the  risk  of  atopic  dermatitis  and  other  atopic diseases.  This  research  examined  the  FLG  gene  based  bioinformatics  approach  to  search  for  conserved  region  of representative  mammals  that  encode  coding  (m)  and  non-coding  (nc)  RNAs.  Expected  mRNA  expression  can  be used as a diagnostic and therapeutic agent against deficiencies and filaggrin mutations.
Key words : filaggrin, FLG, profilaggrin, filaggrin deficiency, bioinformatics.

## Pendahuluan
Protein Filaggrin diproduksi oleh keratinosit granular sebagai prekursor besar yang dinamakan profilaggrin, yang  terdiri  dari  10 – 12  filaggrin  berulang,  diapit domain  terminal  tunggal  N-  dan  C-.  Profilaggrin adalah  komponen  utama  granul keratohyalin (McAleer  &  Irvine  2013).  Filaggrin  berproses bersama  berbagai  protease.  Proteolisis  memicu pembebasan  asam  amino  higroskopis  dan  turunan mereka,  yang  membentuk natural  moisturizing factor (NMF), yang bertanggung-jawab untuk retensi air  di  lapisan  stratum  korneum.  Pemecahan beberapa  asam-asam  amino  ini  memunculkan  dua asam-asam organik, yakni: trans-urocanic acid (UCA), suatu turunan histidin; dan pyrrolidone-5- carboxylicacid (PCA), suatu turunan glutamin. Asam- asam  ini  adalah  dua  dari  faktor-faktor  utama  yang bertanggung  jawab  untuk  memelihara  derajat  pH keasaman  stratum  korneum,  yang  berperan  penting pada  metabolisme  dan  organisasi  lipid  di  matriks ekstraseluler.  Fungsi  lain  sebagai  aksi  antimikroba dan  untuk  peran  regulator  pada  aktivitas  enzim  dan deskuamasi  fisiologis  (McAleer  dan  Irvine  2013; Angelova-Fischer et al ., 2014; Cole et al., 2014).
FLG,  sebagai  gen  penyandi  FLG,  berlokasi  di epidermal-differentiation complex (EDC) pada kromosom  1q21.  EDC  mengandung  gen-gen  yang mengkode S100- fused type proteins (SFTP), misalnya profilaggrin,  hornerin,  filaggrin-2,  repetin, cornulin , trichohyalin ,  dan trichohyalin-like  1 (Thyssen  dan Kezic  2014) . Keluarga  gen  “ fused-type ”  S100  ini berbagi suatu struktur terkonservasi, terdiri dari tiga ekson  dan  dua  intron.  Kodon  inisiasi  berlokasi  di ekson  2,  sedangkan  bagian  terbesar  poliprotein profilaggrin  dikode  oleh  ekson  3.  Terdapat  kesulitan saat  melakukan sequencing exon  3,  bukan  hanya karena  ukurannya  (>12  kb)  melainkan  juga  karena terdiri  dari  10-12  unit  filaggrin  yang  tersusun berulang  dan  tandem.  Meskipun  ekson  3  secara keseluruhan dapat diamplifikasi menggunakan suatu long-range PCR,  tidak  mungkin  untuk  mensekuens fragmen  besar  ini  karena  secara  alami  repetitif. Setiap  unit  pengulangan  filaggrin  berukuran  serupa (~1 kb). Karena hanya sejumlah kecil basa-basa yang ada di setiap pengulangan yang unik, pilihan daerah primer  yang  tepat  untuk  amplifikasi  dan sequencing amat terbatas (Sandilands et al. , 2007).
Banyak  manifestasi  klinis  kulit  atopik  terkait  mutasi FLG, antara lain penurunan kadar asam amino bebas di  stratum  korneum,  peningkatan  kehilangan  air transepidermal dan pH stratum korneum, kekeringan,
kolonisasi bakteri abnormal (Thyssen dan Kezic 2014). Untuk  memahami  efek  defisiensi  filaggrin  dengan lebih  baik  pada  keratinosit  di fibroblast-  and immunological  cell-free  context ,  para  peneliti melakukan knocked  down ekspresinya  dengan teknologi small-hairpin RNA (shRNA) di reconstructed human  epidermis (HE)  pada  filter  polikarbonat (Gutowska-Owsiak et  al. ,  2012;  Pendaries et  al ., 2014) .
Secara  biomedis,  defisiensi  filaggrin  merupakan konsekuensi dari mutasi gen FLG. Defisiensi filaggrin memiliki  multikonsekuensi  pada  organofungsional epidermal  dengan  multiimplikasi,  seperti  risiko menderita penyakit atopik atau infeksi mikrobial. Hal ini  terkait  erat  dengan  perubahan  morfologi permukaan korneosit, defek paraseluler atau respons stres  yang  dimediasi  oleh  interferon  tipe  1,  yang merepresentasikan  mekanisme  fungsional  yang bertanggung  jawab  untuk  infeksi  virus  pada  pasien defisiensi  filaggrin  (Sandilands et  al. ,  2007). Defisiensi filaggrin berperan penting pada patogenesis  dermatitis  atopik.  Ekspresi  filaggrin dapat  didownregulasi  oleh  sitokin  Th 2 dan  inflamasi atopik,  sedangkan  FLG intragenic  copy  number variation memengaruhi  risiko  dermatitis  atopik, bahkan pada ketiadaan mutasi null FLG (Brown et al., 2012;  Eichenfield et  al. ,  2014;  Thyssen  dan  Kezic 2014).  Filaggrin  diekspresikan  mula-mula  sebagai long  insoluble  polyprotein ,  profilaggrin,  yang dipotong  untuk  menghasilkan  monomer  fungsional yang  mengagregasi  dan  meluruskan  filamen-filamen keratin.  Setelah  itu,  filaggrin  didegradasi  pada multistep proteolysis untuk  membebaskan  asam amino-asam amino higroskopis, berkontribusi terhadap  " natural  moisturizing  factor "  kulit. Mekanisme  dimana  protein-protein  profilaggrin/ filaggrin multifungsional memicu terjadinya dermatitis  atopik,  asma  atopik,  rinitis  alergi, sensitisasi  terhadap  makanan,  alergi  kacang,  telah menjadi  fokus  riset  selama  beberapa  tahun  terakhir ini (Eichenfield et al., 2014). Berdasarkan survey dari World Allergy Organization (WAO), atopik dermatitis merupakan penyakit alergi yang mempengaruhi 2-5% anak-anak,  dan  sekitar  10%  remaja  di  dunia  (Darsof et al., 2014). Sementara itu, menurut IDAI, dermatitis atopik  bisa  dicegah  dengan  menghindari  makanan dan agen alergi tertentu (Munasir dan Komala 2015).
Mempelajari  gen  FLG Homo  sapiens akan  menjadi lebih jelas jika dibandingkan dengan spesies primata lain dalam pohon filogenetik, yang masih berkerabat dekat  (Mooers  dan  Heard  1997;  Rogers  dan  Gibbs 2014).  Hal  ini  karena  primata  yang  bukan  manusia
merupakan  organisme  model  yang  paling  relevan untuk  memahami  biologi  manusia  (Boffelli et  al. , 2003).
Tujuan  penelitian  ini  adalah  mempelajari  fenomena spesiasi pada gen penyandi filagrin FLG, menentukan struktur  2D  dari  mRNA  filagrin,  dan  mendalami fungsi  maupun  fitur  dari  struktur  3D  filaggrin  yang terpelihara pada semua spesies mamalia.

## Metode Penelitian
Sekuens  gen  FLG  pada  16  model  species  primata diunduh dari situs NCBI
di http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene ,  dan  disimpan dengan  aplikasi  editor text  notepad dalam  format FASTA  (Speir et  al. ,  2015).  Kemudian,  file  berbasis FASTA di- running multiple sequence alignment (MSA) dengan  CLUSTALX  versi  2  pada  semua  sekuens  gen FLG. Selanjutnya, luaran data MSA digunakan sebagai input  untuk  membangun  pohon  filogenetik  pada aplikasi  MEGA  versi  7  (Hall  2013).  Kemudian,  data MSA juga digunakan untuk input aplikasi Vienna RNA package versi  2  dalam  menentukan  struktur  2D (Gruber et  al .,  2015).  Dalam  rangka  mendalami fungsi  protein  filaggrin,  struktur  3D  diunduh  dari situs web RCSB di http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
dan dilakukan pengkajian modifikasi pos translasi dengan SCANPROSITE  di http://prosite.expasy.org (Rose et al., 2013;  Sigrist et  al .,  2010).      Prediksi  terhadap sistem host yang  terbaik  untuk  ekspresi  protein filaggrin  dilakukan  dengan tools suggestES  pada tautan http://expsys.weizmann.ac.il/expsysb/suggestES (Prilusky, 2004-2012.; Gräslund et al ., 2008). Analisis visual  secara  mendalam  terhadap  data  MSA  dan pohon  filogenetik  dilakukan  untuk  mengkaji  adanya potensi  mutasi.  Semua  operasi  komputasi  dilakukan dengan parameter default .

## Hasil Penelitian
Pencarian gen FLG pada 16 spesies primata dilakukan pada tautan http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene . Sekuens/  urutan  basa  yang  diunduh  dapat  dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Urutan basa gen Filaggrin 16 spesies primata
Nama Gen NCBI Reference Sequence Homo sapiens filaggrin, mRNA NM_002016.1 PREDICTED: Macaca mulatta filaggrin, mRNA XM_015152382.1 PREDICTED: Microcebus murinus filaggrin, mRNA XM_012767643.1 PREDICTED: Nomascus leucogenys filaggrin, transcript variant X1, mRNA XM_012511601.1 PREDICTED: Nomascus leucogenys filaggrin, transcript variant X2, mRNA XM_012511602.1 PREDICTED: Aotus nancymaae filaggrin, partial mRNA XM_012442882.1 PREDICTED:  Mandrillus  leucophaeus  filaggrin    , mRNA XM_011973494.1 PREDICTED: Macaca nemestrina filaggrin  , mRNA XM_011769402.1 PREDICTED:  Rhinopithecus  roxellana  filaggrin    , mRNA XM_010352972.1 PREDICTED: Callithrix jacchus filaggrin  , mRNA XM_008984401.1 PREDICTED:  Macaca  fascicularis  filaggrin    ,  partial mRNA XM_015452862.1 PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla filaggrin  , mRNA XM_004065245.1 PREDICTED: Pan paniscus filaggrin  , mRNA XM_014346893.1 PREDICTED: Pongo abelii filaggrin  , mRNA XM_003780333.2 PREDICTED: Tarsius syrichta filaggrin  , mRNA XM_008065208.1 PREDICTED: Otolemur garnettii filaggrin LOC100962525, mRNA XM_012811731.1
Pada  Tabel  1,  dapat  dilihat  bahwa  umumnya  urutan basa  gen  FLG  pada  primata  memiliki  status ‘PREDICTED’  atau  hasil  prediksi  komputasi.  Semua gen  FLG  pada  primata,  terkecuali  pada  manusia, diprediksi  dengan  menggunakan  pipeline Gnomon berbasis  aplikasi GENSCAN (Burge  dan  Karlin  1997; Souvorov et  al .,  2010).  Pipeline  berbasis GENSCAN pernah  kami  ujicoba  sebelumnya  untuk  anotasi domain  protein,  sehingga  prediksi  gen  tetap  valid digunakan dalam penelitian ini (Parikesit et al ., 2014).
Namun,  untuk  mengkaji  apakah  prediksi  gen  sudah representative ,  maka  langkah  selanjutnya  adalah melakukan Multiple  Sequence  Alignment (MSA) dengan aplikas Clustal Omega di
http://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web_clustalo .
Luaran  aplikasi  Clustal  Omega  adalah  pensejajaran urutan  berbasis  ClustalW  dan  dokumen  pohon filogenetik yang dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2.
Gambar  1. Multiple  Sequence  Alignment (MSA)  gen FLG  pada  16  spesies  primata.  Kotak  paling kiri:  nama  gen,  kotak  kanan:  urutan  basa yang  di align ,  kotak  bagian  bawah:  tingkat konservasi urutan basa.
Luaran Clustal Omega menunjukkan bahwa tidak ada sekuens yang terkonservasi, karena  tidak ditemukan sinyal  bintang  pada  semua  urutan  nukleotida (Gambar  1).  Seharusnya  gen  tersebut  sangat conserved karena  berasal  dari  famili  animal  yang sama.  Hal  ini  dapat  terjadi  karena  pembacaan  dan assembly gen FLG yang memang belum lengkap. Hal ini akan mempersulit kajian pengembangan obat dan diagnostik  kulit  atopik  yang  diakibatkan  oleh defisiensi  filaggrin  pada  model  primata,  sebab urutan gen filaggrin pada manusia dan ke-15 primata lainnya  sangatlah  berbeda.  Dengan  demikian,  jalur metabolisme obat kemungkinan akan tidak sepenuhnya  identik,  karena  metabolisme  selalu dipengaruhi  oleh  ekspresi  gen  (Kanehisa  dan  Goto 2000).
Gambar 2. Pohon Filogenetik Gen FLG pada 16 spesies Primata.  Ditayangkan  dengan software FigTree versi 1.4.2.
Pohon  filogenetik  gen  FLG  primata  pada  Gambar  2 menunjukkan  bahwa  secara  kekerabatan  gen tersebut  dekat,  memiliki  fungsi  sama.  Walaupun pada  luaran  MSA  di  gambar  1  menunjukkan  bahwa gen FLG pada manusia dan gorila tidak terkonservasi, namun  pada  gambar  2  dimungkinkan  keduanya adalah  gen  ortolog,  yang  memiliki  fungsi  sama berasal  dari  fenomena  spesiasi.  Fenomena  gen ortolog  juga  dapat  dilihat  pada Orolemur  garnetti dan Microcebus  murinus , Tarsius  syrichta dan Aotus nancymaae, Macaca mulatta dan Macaca
nemestrina . Namun,  pada Nomascus  leucogenys tidak dapat dikatakan fenomena gen ortolog, karena merupakan isoform dari transkrip yang sama.
Gambar 3. Prediksi Struktur 2D conserved pensejajaran dari mRNA gen FLG pada 16 spesies primata.
Software RNAfold  yang  merupakan  bagian  dari Vienna  RNA  package  untuk  mencari  struktur sekunder  (2D)  yang  terpelihara  dari  mRNA  gen  FLG 16  spesies  primate  (Gambar  3).  Prediksi  struktur terpelihara  pada  Gambar  3  menunjukkan  anomali, karena  membentuk hairpin-loop dengan  lingkaran yang  terlalu  lebar.  Secara  termodinamika,  hal  ini tidak terlalu disukai karena senyawa akan cenderung sangat  tidak  stabil.  Anomali  pada  Gambar  3  dapat terjadi karena tidak terpeliharanya urutan basa pada gen  FLG  16  spesies  primata.  Hal  ini  hanya  dapat diperbaiki  jika  kualitas  anotasi  gen  FLG  16  spesies tersebut memang sudah lebih baik. Namun sebelum perbaikan  itu  dilakukan,  kita  hanya  bisa  menerima anotasi versi Refseq/Genbank secara apa adanya.
Gambar  4.  Prediksi  struktur  2D  mRNA  gen  FLG  pada manusia.
Hanya struktur 2D mRNA gen FLG manusia yang kami prediksi  secara  individual,  karena  gen  primata  lain hanya  berbasis  metode  prediksi  gen  (Gambar  4). Struktur  2D  gen  FLG  manusia  tersebut  sangatlah rumit,  karena  terdiri  atas  banyak  cabang  dan sejumlah hairpin-loop .  Walaupun  kami  yakin  bahwa struktur  ini  eksis,  karena  berasal  dari  urutan  basa wet  experiment ,  namun  eksistensinya  di  sel  sangat dimungkinkan  waktu  hidupnya  pendek,  dalam  skala nano detik (Zhang et al ., 2006; And dan Pettitt, 1996).
Hal  ini  akan  mempersulit  studi  aktivitas  secara wet , karena akan tidak mungkin untuk diisolasi.
Struktur  3D  protein  filaggrin  ditemukan  pada  basis data  RSCB  dengan  kode  4PCW  ber tajuk  ‘ Crystal Structure  of  the  N-terminal  Domain  of  Human Profilaggrin at 2.2 A Resolution ’ (Gambar 5).
Gambar  5: Struktur 3D Protein Fillagrin, dengan ID RCSB: 4PCW
Struktur 3D yang diunduh adalah struktur aseli hasil eksperiment wet kristalografi  protein,  bukan merupakan  hasil  prediksi.  Dengan  ditemukannya struktur  aseli,  maka  prediksi homology  modeling tidak  diperlukan.  Selanjutnya,  keberadaan  struktur 3D  mempermudah  penentuan  fungsi  katalitik  dan domain  dari    protein  filaggrin  itu  sendiri.  Setelah dilakukan  pencaharian  pada  basis  data  PROSITE, maka fungsi domain filaggrin dapat dikaji pada Tabel 2.
Tabel  2. Pola (pattern) yang ditemukan PROSITE pada protein Filaggrin Nama Rantai (Chain) Posisi Urutan (Sekuens) Kode  ID PROSITE Fungsi Domain 4PCW-A 56-77 PS00303 S-100/ICaBP type calcium binding protein signature 61-73 PS00018 EF-hand calcium-binding domain 4PCW-B 56-77 PS00303 S-100/ICaBP type calcium binding protein signature 61-73 PS00018 EF-hand calcium-binding domain 4PCW-C 56-77 PS00303 S-100/ICaBP type calcium binding protein signature 61-73 PS00018 EF-hand calcium-binding domain 4PCW-D 56-77 PS00303 S-100/ICaBP type calcium binding protein signature 61-73 PS00018 EF-hand calcium-binding domain
Dapat  kita  lihat  pada  Tabel  2,  ternyata  protein filaggrin terdiri atas 4 rantai (chain), yaitu rantai A, B, C, dan D. Keempat rantai tersebut diketahui memiliki fungsi  yang  sama,  karena  jika  kita  kaji  pada  tabel, ternyata kesemua rantai tersebut memiliki dua fungsi yang  sama,  pada  urutan  asam  amino  yang  sama, yaitu  domain  pengikat  kalsium  tipe  S-100  dan  EF- hand .  Menurut  informasi  basis  data  PROSITE,  S-100 adalah  dimerik  kalsium  asam  dan  sisi  aktif  protein pengikat  seng  ( zinc )  yang  banyak  terdapat  di  otak. Sementara  itu,  EF- hand adalah  sisi  aktif  yang memastikan  bahwa  S-100  tetap  memiliki  fitur pengikat  kalsium  ( error  detecting ),  dan  menjaga integritas  fitur  tersebut.  Berdasarkan  informasi  ini, kita  dapat  memastikan  bahwa  pengikatan  dengan kofaktor/  ligan  kalsium  memastikan  bahwa  protein filaggrin  tetap  memiliki  struktur  dan  fungsi  yang normal.  Gagalnya  pengikatan  dengan  kalsium  akan
mengganggu  fungsi/kerja  filaggrin  (Markova et  al ., 1993).
Salah satu solusi mengatasi defisiensi filaggrin adalah memberikan  asupan  filaggrin  kepada  pasien.  Hanya saja,  untuk  memproduksi  filaggrin  dibutuhkan teknologi rekayasa genetika, yang mensyaratkan host ekspresi yang cocok untuk produksi protein tersebut. Berdasarkan  komputasi tool suggestES,  ditemukan bahwa    berdasarkan  hasil  eksperimen wet ,  E.coli dengan  Taxo  ID  562  adalah  yang  paling  cocok. Sementara,  berdasarkan  hasil  kesamaan  komposisi asam  amino,  ditemukan  bahwa Toxoplasma  gondii ME49  dengan  Taxo  ID  508771  adalah  yang  paling cocok.  Dengan  demikian,  peneliti wet sudah mendapatkan informasi untuk melakukan percobaan rekayasa genetika untuk produksi filaggrin.

## Pembahasan
Protein  penting  epidermal  adalah  filaggrin,  yang penting untuk pembentukan corneocyte , membangkitkan metabolit intraseluler, yang berkontribusi untuk hidrasi stratum korneum dan pH, sementara  juga  menghalangi  foton  dari irradiation UV-B  (Thyssen  &  Maibach  2014).  Ekspresi  filaggrin epidermal  di downregulated oleh  sitokin  Th 2 pada pasien  dermatitis  atopik,  proteolisis  filaggrin diakselerasi  setelah  terpapar  baik  pada  kelembaban ambient (lingkungan)  rendah  atau  pengiritasi  kulit. Sehingga  kadar  filaggrin  dan  produk-produk degradasinya  dipengaruhi bukan hanya  oleh genotip filaggrin  melainkan  juga  oleh  inflamasi  dan  stresor eksogen  (Thyssen  dan  Kezic  2014).  Observasi  ini mendukung  baik  hipotesis  patogenetik  dermatitis atopik  " outside-to-inside ",  yang  mempostulasikan bahwa  dermatitis  atopik  berkembang  karena abnormalitas  sawar  kulit  primer  dengan  perubahan imunologis,  mewakili  fenomena downstream ,  dan patogenesis  dermatitis  atopik  " outside-to-inside dan back-to-outside " dimana aktivasi imunologis sekunder  akan  menghasilkan  stres  lanjutan  pada sawar ( barrier ) (Elias et  al ., 2008; Thyssen  dan Kezic 2014).
Hasil  komputasi  penelitian  disimpan  pada  data suplemen,  yang  dapat  digunakan  pada  penelitian berikutnya (Parikesit, 2016). Walaupun gen FLG pada 15  primata  yang  diujicoba  adalah  hasil  prediksi, bukan  berarti  tidak  valid  untuk  digunakan  karena prediksi  gen  sudah  sangat  umum  digunakan  pada metode kerja anotasi genom(Curwen et a l., 2004) .
Namun,  kita  harus  waspada  jika  membandingkan
primata  dengan  mamalia  yang  lain,  seperti  dengan lumba-lumba  atau alpaca. Penggunaan  transkrip Genbank  terbukti  dapat  memberikan  resolusi  yang kurang  baik  dalam  membangun  pohon  filogenetik, karena tidak konsistennya jumlah transkrip gen pada mamalia (Parikesit et al ., 2010; Parikesit et al ., 2010). Oleh  karena  itu,  solusi  jangka  panjang  adalah membangun pipeline atau  metode  kerja  yang  lebih baik  untuk  memprediksi  protein coding  genes (Indrischek  et  al.  2016).  Metode  kerja  prediksi struktur  yang  lebih  optimal  akan  membangun struktur 2D mRNA yang lebih solid. Sebelum metode kerja  tersebut  ditemukan,  ada  baiknya  berhati-hati dengan  model  primata  dalam  pengembangan  obat, karena jalur metabolisme dimungkinkan tidak identik.
Tidak terkonservasinya urutan basa gen FLG primate menunjukkan bahwa proyek anotasi genom primata memang  belum  dilakukan  secara  ekstensif  diluar genom  manusia,  seperti  yang  pernah  dibuktikan sebelumnya  pada  mamalia  (Parikesit et  al., 2014). Perbandingan genomik ( comparative genomics ) yang lebih  ekstensif  harus  dilakukan  antara  genom manusia dan primate non-manusia supaya mendapatkan informasi lebih valid untuk mengurangi noise latar belakang genetic (Haus et al ., 2014) . Pada  akhirnya, penggunaan metode prediksi gen  yang  lebih  akurat  dan  efisien  dibanding  yang disediakan  oleh  Refseq/  GenBank  memang  harus diutamakan  untuk  anotasi  gen  yang  lebih  baik  (Hoff dan Stanke 2013; Souvorov et al. , 2010)

## Keimpulan
Penelitian ini berhasil menemukan urutan basa yang terpelihara,  pohon  filogenetik,  dan  prediksi  struktur 2D  mRNA  dari  gen  FLG  16  spesies  primata. Berdasarkan  informasi  dari  urutan  basa  yang terpelihara, kehati-hatian harus dijaga jika melakukan uji klinis obat maupun diagnostik dengan model  primata.  Pembangunan  pohon  filogenetik harus  diproses  dengan  hati-hati  jika  memasukkan famili mamalia yang lain. Prediksi struktur 2D mRNA gen  FLG  dapat  dilakukan  dengan  baik,  namun  akan sangat  sulit  memvalidasi  hasilnya  pada wet experiment karena  waktu  hidup  senyawa  tersebut. Kemudian,  berdasarkan  kajian  terhadap  struktur  3D filaggrin,  ditemukan  bahwa  fungsi  pengikatan terhadap  kalsium  merupakan  hal  kunci  yang memastikan protein filaggrin berfungsi dengan baik. Kemudian,  berdasarkan  kajian  prediksi host, mikroorganisme E.  coli dan T.  gondii merupakan sistem  ekspresi  yang  paling  cocok  untuk  protein
filaggrin.  Pertimbangan  ini  dapat  menjadi  dasar untuk desain obat kedepannya.
Kedepannya  akan  dilakukan  prediksi  gen  FLG terhadap  genom  primate  yang  diuji  pada  penelitian ini  dengan  menggunakan  metode comparative genomics dan  prediksi  gen.  Kajian  penambatan  dan dinamika  molekul  terhadap  kandidat  obat  yang melibatkan  protein  filaggrin  juga  akan  kami pertimbangkan.

## Ucapan Terima Kasih
Terima  kasih  kami  ucapkan  kepada  Hibah  DIKTIS- POSFI/4/2016  Kemenag  RI,  dan  Lembaga  Penelitian dan Pengabdian Masyarakat  (LPPM) STAI ALHIKMAH Jakarta  atas  bantuan  dan  dukungannya.  Kami mengucapkan  terima  kasih  atas  kontribusi  fasilitas High  Performance  Computing (HPC)  LIPI  untuk  hasil riset  ini,  URL http://grid.lipi.go.id .  Terima  kasih kepada I Wayan Aditya Swardiana dari HPC LIPI yang memberikan  asistensi  teknis  pemakaian Cluster . Terima  kasih  kami  ucapkan  kepada  Prof.  Jamie Prilusky dari Bioinformatics Unit, Weizmann Institute of Science, Israel, atas informasinya terkait suggestES. Dalam penulisan manuskrip, Dito Anurogo mengusulkan tema, mempersiapkan materi onkologi termutakhir  dan  suplemen  data.  Sementara  Arli Aditya  Parikesit  mempersiapkan  metodologi  dan melakukan  pekerjaan  teknis  penelitian.  Kedua  autor menulis manuskrip ini secara bersama-sama.

## Daftar Pustaka
And, L.Y. dan Pettitt, B.M., 1996. B to A Transition of DNA on the Nanosecond Time Scale.
Angelova-Fischer, I. et al. , 2014. Skin barrier integrity and  natural  moisturising  factor  levels  after cumulative dermal exposure to alkaline agents in atopic dermatitis. Acta Dermato- Venereologica , 94(6), pp.640 – 644.
Boffelli,  D. et  al .,  2003.  Phylogenetic  shadowing  of primate sequences to find functional regions of the  human  genome. Science ,  299(5611),
pp.1391 – 1394. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/126103 04.
Brown,  S.J. et  a l.,  2012.  Intragenic  copy  number variation within filaggrin contributes to the risk of  atopic  dermatitis  with  a  dose-dependent effect. The Journal of investigative
dermatology ,  132(1),  pp.98 – 104.  Available  at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articleren der.fcgi?artid=3236450&tool=pmcentrez&rend ertype=abstract.
Burge, C. dan Karlin, S., 1997. Prediction of complete gene  structures  in  human  genomic  DNA. Journal of molecular biology , 268(1), pp.78 – 94. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/914914 3 [Accessed October 26, 2012]. Cole, C. et al. , 2014. Filaggrin-stratified transcriptomic  analysis  of  pediatric  skin identifies  mechanistic  pathways  in  patients with  atopic  dermatitis. Journal  of  Allergy  and Clinical Immunology , 134(1), pp.82 – 91.
Curwen, V. et al ., 2004. The Ensembl automatic gene annotation  system. Genome  Research ,  14(5),
pp.942 – 950. Available at: http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.18
58004 [Accessed July 10, 2016].
Darsof, U., Eyerich, K. dan Ring, J., 2014. Eczema (E),
Atopic Eczema (AE) and Atopic Dermatitis (AD). World  Allergy  Organization ,  p.0.  Available  at: http://www.worldallergy.org/professional/aller gic_diseases_center/atopiceczema/.
Eichenfield,  L.F. et  al. ,  2014.  Guidelines  of  care  for the  management  of  atopic  dermatitis:  section 1.  Diagnosis  and  assessment  of  atopic dermatitis. Journal  of  the  American  Academy of Dermatology , 70(2), pp.338 – 51. Available at: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articleren der.fcgi?artid=4410183&tool=pmcentrez&rend ertype=abstract.
Elias, P.M., Hatano, Y. dan Williams, M.L., 2008. Basis for the barrier abnormality in atopic dermatitis: Outside-inside-outside pathogenic mechanisms. Journal  of  Allergy  and  Clinical  Immunology , 121(6), pp.1337 – 1343.
Gräslund,  S. et  al .,  2008.  Protein  production  and purification. Nature methods , 5(2), pp.135 – 46. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/182354 34 [Accessed July 27, 2016].
Gruber, A.R., Bernhart, S.H. dan Lorenz, R., 2015. The viennaRNA web services. In RNA
Bioinformatics . pp. 307 – 326.
Gutowska-Owsiak,
D. et al. , 2012. IL-17 downregulates filaggrin and affects
keratinocyte  expression  of  genes  associated with cellular adhesion. Experimental Dermatology , 21(2), pp.104 – 110.
Hall,  B.G.,  2013.  Building  phylogenetic  trees  from molecular  data  with  MEGA. Molecular  Biology and  Evolution ,  30(5),  pp.1229 – 1235.  Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/234866 14 [Accessed July 3, 2016].
Haus,  T. et  al .,  2014.  Genome  typing  of  nonhuman primate  models:  implications  for  biomedical research. Trends  in  genetics :  TIG ,  30(11),
pp.482 – 7. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/249541
83.
Hoff,  K.J.  dan  Stanke,  M.,  2013.  WebAUGUSTUS--a web  service  for  training  AUGUSTUS  and predicting  genes  in  eukaryotes. Nucleic  acids research ,  41(Web  Server  issue),  pp.W123-8. Available at: http://nar.oxfordjournals.org/content/early/20 13/05/21/nar.gkt418.short  [Accessed August 30,
2013].
Indrischek,  H. et  al .,  2016.  The  paralog-to-contig assignment problem: high quality gene models from  fragmented  assemblies. Algorithms  for molecular  biology :  AMB ,  11(1),  p.1.  Available at: http://www.almob.org/content/11/1/1 [Accessed July 10, 2016].
Kanehisa, M. dan Goto, S., 2000. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic Acids Research ,
28, pp.27 – 30. Available at: http://www.genome.jp/kegg/.
Markova,  N.G. et  al .,  1993.  Profilaggrin  is  a  major epidermal  calcium-binding  protein. Molecular and  cellular  biology ,  13(1),  pp.613 – 25. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/841735 6 [Accessed July 27, 2016].
McAleer,  M.A.  dan  Irvine,  A.D.,  2013.  The multifunctional  role  of  filaggrin  in  allergic  skin disease. Journal  of  Allergy  and  Clinical Immunology , 131(2), pp.280 – 291.
Mooers,  A.O.  dan  Heard,  S.B.,  1997.  Inferring Evolutionary  Process  from  Phylogenetic  Tree Shape. The Quarterly Review of Biology , 72(1), p.31.
Munasir,  Z.  dan  omala,  K.,  2015.  Pentingnya
Perawatan  Kulit  pada  Anak  dengan  Dermatitis Atopik. Ikatan  Dokter  Anak  Indonesia ,  p.0. Available at: http://www.idai.or.id/artikel/seputar- kesehatan-anak/pentingnya-perawatan-kulit- pada-anak-dengan-dermatitis-atopik.
Parikesit,  A.A. et  al .,  2014.  Pitfalls  of  Ascertainment Biases  in  Genome  Annotations — Computing Comparable  Protein  Domain  Distributions  in Eukarya. Malaysian  Journal  of  Fundamental and  Applied  Sciences ,  10(2),  pp.65 – 75. Available at: http://www.mjfas.utm.my/index.php/mjfas/art icle/view/57/249.
Parikesit, A.A., 2016. “Research Data:  Bioinformatics
Approach towards Transcriptomics of Filaggrin”  Mendeley  Data,  v1.  Available  at: http://dx.doi.org/10.17632/t5x4dnz44v.1.
Parikesit,  A.A.,  Stadler,  P.F.  dan  Prohaska,  S.J.,  2010.
Detection  of  Protein  Domains  in  Eukaryotic Genome Sequences. In C. E. Fereira, S. Miyano,
& P. F. Stadler, eds. Advances in Bioinformatics and  Computational  Biology  Lecture  Notes  in Computer  Science .  Springer,  p.  pp  71-74. Available at:
http://link.springer.com/chapter/10.1007/978- 3-642-15060-9_9.
Parikesit,  A.A.,  Stadler,  P.F.  dan  Prohaska,  S.J.,  2010. Quantitative  comparison  of  genomic-wide protein  domain  distributions.  In Ger.  Conf. Bioinform.,  P-173 .  Bonn:  Gesellschaft  für Informatik, pp. 93 – 102. Available at: http://www.bioinf.uni-
leipzig.de/Publications/PUBLISHED/Parikesit:10 a.pdf.
Pendaries, V. et a l., 2014. Knockdown of Filaggrin in a Three-Dimensional Reconstructed Human Epidermis Impairs Keratinocyte Differentiation. Journal  of  Investigative  Dermatology ,  134(10), pp.2938 – 2946.
Prilusky, J., SuggestES: Suggest an Expression System.
(2004-2012) . Available at:
http://expsys.weizmann.ac.il.
Rogers, J. dan Gibbs, R. a, 2014. Comparative primate genomics:  emerging  patterns  of  genome content  and  dynamics. Nature  reviews.
Genetics ,  15(5),  pp.347 – 59.  Available  at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/247097 53.
Rose, P.W. et al ., 2013. The RCSB Protein Data Bank:
New  resources  for  research  and  education.
Nucleic Acids Research , 41.
Sandilands, A. et al. , 2007. Filaggrin’s fuller figure: a glimpse into the genetic architecture of atopic dermatitis. The  Journal  of  investigative dermatology , 127(6), pp.1282 – 1284.
Sigrist, C.J.A. et al ., 2010. PROSITE, a protein domain database  for  functional  characterization  and annotation. Nucleic acids research , 38(Database  issue),  pp.D161-6.  Available  at: http://nar.oxfordjournals.org/content/38/suppl _1/D161.short [Accessed February 3, 2016].
Souvorov,  A. et  al .,  2010.  Gnomon – NCBI  eukaryotic gene  prediction  tool. National  Center  for Biotechnology Information , pp.1 – 24.
Speir,  M.L. et  al. ,  2015.  The  UCSC  Genome  Browser database: 2016 update. Nucleic acids research ,
44(D1), pp.D717 – D725. Available
at:
http://nar.oxfordjournals.org/lookup/doi/10.10 93/nar/gkv1275 [Accessed July 10, 2016].
Thyssen, J.P. dan Kezic, S., 2014. Causes of epidermal filaggrin  reduction  and  their  role  in  the pathogenesis  of  atopic  dermatitis. Journal  of Allergy  and  Clinical  Immunology ,  134(4), pp.792 – 799.
Thyssen, J.P. dan Maibach, H.I. eds., 2014. Filaggrin: Basic  Science,  Epidemiology,  Clinical  Aspects and Management , Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg. Available at: http://link.springer.com/10.1007/978-3-642-
54379-1 [Accessed July 3, 2016].
Zhang, Q. et al., 2006. Resolving the motional modes that  code  for  RNA  adaptation. Science ,
311(5761), pp.653 – 656. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/164560 78 [Accessed July 10, 2016].