## Efektivitas Ozonated Virgin Coconut Oil
terhadap Penyembuhan Full Thickness Skin Defect pada Tikus Sprague Dawley 1 2 3 Herry Maha Putra Surbakti , Renn  Yuniati , Djoko Handojo i
Latar  belakang  : Luka  adalah  rusaknya  integritas/kontinuitas  jaringan  yang  dapat menimbulkan infeksi. Virgin coconut oil (VCO) merupakan produk olahan kelapa yang dibuat pengolahan daging buah kelapa segar pada suhu rendah dan memiliki kandungan nutrisi yang tinggi. Terapi ozon merupakan salah satu terapi alternatif yang memiliki sifat desinfektan dan dapat menginduksi stres oksidatif yang kuat.
Metode : Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental post test only control group design pada  60  tikus Sprague–Dawley jantan,  berat  250±50  gram,  aktif,  dan  tidak memiliki cacat fisik, yang dibagi dalam 10 kelompok. Dibuat luka full thickness 1  sentimeter  (cm)  pada  punggung  tikus  dan  diaplikasikan ozonated  VCO pada  luka dengan  dosis  3,305mg,  6,61mg,  13,2225  mg.  Penyusutan  ukuran  luka  diukur  dengan jangka sorong dan peningkatan kadar TGF-β pada biopsi jaringan luka tikus diukur dengan pemeriksaan  immunohistokimia  pada  hari  ke-7  dan  14.  Data  dianalisis  menggunakan SPSS v.22.0 dengan uji one way ANOVA, perbedaan signifikan bila p <0,05, dan dilanjutkan dengan uji post–hoc Bonferonni untuk mengetahui kelompok mana saja yang berbeda ( p = <0,05). Hasil : Didapatkan peningkatan kadar TGF-β dan penyusutan ukuran luka bermakna pada hari  ke-7  dan  ke-14  (masing-masing p =  <0,001; p =  <0,001).  Kadar  TGF-β  memiliki perbedaan yang signifikan pada kelompok O1vsO2, O1vsO3, O1vsO4, O1vsO5, O2vsO5, O3vsO5 ( p = 0,009; p = <0,001; p = <0,001; p = <0,001; p = <0,001; p =0,048, berurutan) pada hari ke-7. Pada hari ke-14 didapatkan perbedaan kadar TGF-β signifikan pada kelompok O6vsO8, O6 vsO9, O6vsO10, O7vsO9, O7vsO10, O8vsO10 (masing-masing p =0,011, p = <0,001, p = <0.001, p =0,001, p = <0,001, p =0,001, p =<0,001, p =0,004). Pada hari ke-7 didapatkan  perbedaan  signifikan  penyusutan  ukuran  luka  pada  kelompok  O1vsO2, O1vsO3, O1vsO4, O1vsO5, O2vsO5, O3vsO4, O3vsO5, O4vsO5 ( p = <0,001; p = <0,001; p = <0,001; p = <0,001; p = <0,001; p = 0,031; p = <0,001; p = 0,007, berurutan). Perbedaan signifikan  penyusutan  ukuran  luka  pada  14  hari  didapatkan  pada  kelompok  O6vsO7, O6vsO8, O6vsO9, O6vsO10, O7vsO10, O8vsO10, O9vsO10 (masing-masing p = 0,019; p = 0,001, p = <0,001; p = <0,001; p = <0,001; p = 0,001; p = 0,050). Simpulan : Pemberian ozonated virgin coconut oil efektif dalam meningkatkan ekspresi TGF-β pada full thickness defect tikus Sprague Dawley serta efektif dalam meningkatkan penyusutan ukuran luka pada full thickness defect tikus Sprague Dawley .
Kata  Kunci  : Ozonated  VCO ,  full  thickness  skin  defect,  TGF-β,  penyusutan  luka,  tikus Sprague Dawley
1 Magister Ilmu Biomedik – Konsentrasi Klinik Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro
2 Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro
3 Bedah Onkologi Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro / RSUP Dr. Kariadi, Semarang
Abstrak

## Original Article
Med Hosp 2021; vol 8 (2) : 220–228 p-ISSN: 2301-4369 e-ISSN: 2685-7898 https://doi.org/10.36408/mhjcm.v8i2.484
Diajukan: 21 Januari 2021 Diterima: 16 Juni 2021

## Afiliasi Penulis:
Magister Ilmu Biomedik – Konsentrasi Klinik Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

## Korespondensi Penulis:
Herry Maha Putra Surbakti Jl. Prof. H. Soedarto, SH., Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275,
Indonesia
E-mail: herry.surbakti@gmail.com
Background : Wound is the damage of tissue integrity/continuity that can lead to infection. Virgin coconut oil is a processed coconut productthat is made by coconut meat processing at low temperatures and has a high nutrient content. Ozone therapy is an alternative therapy that has disinfectant properties and can induce strong oxidative stress.
Methods : Experimental study post test only control group design on 60 male Sprague-Dawley mice, 250 ± 50 grams, active, and have no physical abnormalities, which were divided into 10 groups. One centimeter of full thickness wound was made on the back of the mice and ozonated VCO was applied to the wound at a dose of 3.305 mg, 6.61 mg, 13.2225 mg. Wound size reduction were measured by caliper and increased levels of TGF-β in mice wound tissue biopsy were measured by immunohistochemical examination on day 7 and 14. Data were analyzed using SPSS v.22.00 with one way ANOVA test, significant difference if p <0.05, and continued with Bonferroni's post-hoc test to determine which groups were different ( p = <0.005). Results : There were a significant increase in the TGF-β level and a significant wound size reductionat days 7 and 14 ( p = <0.001; p = <0.001, respectively). There were a significant difference on TGF-β levels in O1vsO2, O1vsO3, O1vsO4, O1vsO5, O2vsO5, O3vsO5 groups ( p = 0.009;
th th p = <0.001; p = <0.001; p = <0.001; p = <0.001; p = 0.048, consecutively) on the 7  day. On the 14  day, there were significant difference in TGF-β levels in O6vsO8, O6vsO9, O6vsO10, O7vsO9, O7vsO10, O8vsO10 groups (each p = 0.011, p = <0.001, p = <0.001, p = 0.001, p = < 0.001, th p = 0.001, p = <0.001, p = 0.004). On the 7  day, there was a significant difference in wound size reduction in O1vsO2, O1vsO3, O1vsO4, O1vsO5, O2vsO5, O3vsO4, O3vsO5, O4vsO5 groups ( p = <0.001; p = <0.001; p = <0.001; p = <0.001; p = <0.001; p = 0.031; p = <0.001; p = 0.007, respectively). Significant differences in wound size reduction at 14 days were found in the O6vsO7, O6vsO8, O6vsO9, O6vsO10, O7vsO10, O8vsO10, O9vsO10 groups (each p = 0.019; p = 0.001, p = <0.001; p = <0.001; p = <0.001; p = 0.001; p = 0.050). Conclusion : Administration of ozonated VCO was effective in increasing TGF-β expression in full thickness defect wound of Sprague Dawley mice, and was also effective in increasing the rate of wound size reduction in full thickness defect of Sprague Dawley mice.
Keywords : Ozonated VCO, full thickness skin defect, TGF-β, wound size reduction, Sprague Dawley mouse

## Abstract

## The Effectiveness of Ozonated Virgin Coconut Oil on Full Thickness Skin Defect Healing in Sprague Dawley Mouse

## PENDAHULUAN
Luka  adalah  rusaknya  atau  hilangnya  kontuinitas jaringan  yang  dapat  diakibatkan  oleh  faktor  internal seperti  obat-obatan,  perubahan  sirkulasi,  perubahan proses metabolisme, infeksi, kegagalan transport oksigen dan juga oleh faktor eksternal seperti suhu yang ekstrim,
1 cedera, alergen, radiasi, zat-zat kimia.  Pembagian luka dapat  diklasifikasikan  berdasarkan  struktur  sifat a n a t o m i ,   p r o s e s   p e n y e m b u h a n   d a n   l a m a
2,3 penyembuhan.   Tubuh  memiliki  respon  fisiologis terhadap luka, yakni proses penyembuhan luka. Proses penyembuhan  luka  terdiri  dari  berbagai  proses  yang kompleks  untuk  mengembalikan  integritas  jaringan. Selama  proses  ini  terjadi  pembekuan  darah,  respon inflamasi  akut  dan  kronis,  neovaskularisasi,  apoptosis hingga proliferasi sel. Proses ini dimediasi oleh berbagai sel  (platelet,  neutrofil,  keratinosit,  monosit/makrofag neutrofil,  fibroblas),  sitokin,  matriks  ekstraselular,  dan faktor pertumbuhan seperti platelet–derived growth factor (PDGF)  dan transforming  growth  factor  beta (TGF–β), melalui  tiga  fase  proses  penyembuhan  luka,  yaitu  fase 2 inflamasi, proliferasi jaringan, dan remodeling.
Penyembuhan luka dimulai saat terjadinya cedera (injury) ,  di  mana  terjadi  pembentukan  jendalan  darah yang bertindak dalam hemostasis dan rekruitmen sel. Sel neutrofil  datang  pertama  kali  untuk  mencegah  infeksi bakteri dan aktivasi keratinosit, fibroblas dan sel imun.
Setelah  2–3  hari,  monosit  datang  dan  kemudian berdiferensiasi menjadi makrofag, yang memfagositosis jaringan  nekrotik  dan  bekerja  sama  dengan  neutrofil dalam mengontrol pertumbuhan bakteri. Fase proliferasi dimulai pada hari ke 2–10 setelah terjadinya cedera, di mana  makrofag  akan  mensekresi growth  factor seperti TGF–β dan merekrut fibroblas dari tepian lesi luka. Sel- sel  tersebut  membentuk  jaringan  granulasi  yang berfungsi sebagai substrat migrasi keratinosit, proliferasi 4,5 dan diferensiasi selama fase re-epitelisasi.
Virgin  Coconut  Oil merupakan  produk  olahan kelapa  yang  dibuat  pengolahan  daging  buah  kelapa segar pada suhu rendah atau tanpa melalui pemanasan dengan  tujuan  untuk  mempertahankan  kandungan
6 penting  dalam  minyak  kelapa.   Keunggulan  VCO dibandingkan  minyak  kelapa  biasa  adalah  bau  kelapa
7 segar, tidak tengik, rasa khas kelapa dan tidak berwarna. Virgin  coconut  oil terbentuk  apabila  ikatan  emulsi  yang 8 terdapat  pada  kelapa  dipecahkan.   Kandungan  utama VCO  adalah  asam  lemak  jenuh  sekitar  90%  dan  asam lemak tak jenuh sekitar 10%. VCO memiliki kandungan antioksidan seperti tokoferol dan betakaroten serta sifat moisturizer yang  menjaga  kelembapan  kulit  serta 9 meningkatkan  hidrasi  kulit. Virgin  coconut  oil terbukti meningkatkan jaringan granulasi, penurunan bermakna waktu re-epitelisasi, kadar GAG, total protein, heksosa, asam  sialic  dan  elastin  pada  luka  sehingga  dapat meningkatkan  laju  penutupan  luka  pada  luka  yang
mengalami delayed  wound  healing serta  meningkatkan berbagai  petanda  luka  pada  luka full-thickness  wound pada tikus. Jumlah total kolagen pada luka yang diterapi dengan  VCO  juga  mengalami  peningkatan  signifikan. D i d a p a t k a n   p u l a   p e n i n g k a t a n   k a d a r   D N A , glikohidrolase,  beta  glukoronidase  dan  N-asetil-beta- glukosaminidase  pada  luka  yang  diterapi  dengan 10,11 VCO. Terapi ozon merupakan salah satu terapi alternatif yang memiliki sifat desinfektan dan dapat menginduksi stres oksidatif yang kuat, sehingga dapat menstimulasi mekanisme  protektif  dari  sel  serta  organ,  sehingga dengan  terapi  ini  efikasi  dari  sifat scavenging radikal bebas  oksigen  endogen  oleh  sel  itu  sendiri  dapat 12 ditingkatkan.   Terapi  ozon  menginaktivasi  bakteri dengan merusak selubung sel melalui oksidasi fosfolipid dan  lipoporotein,  menghambat  pertumbuhan  jamur, merusak kapsid virus, dan menganggu siklus reproduksi 13 bakteri.  Terapi ozon dapat digunakan sebagai adjuvan ataupun alternatif dari terapi standar pada pasien-pasien 13 dengan berbaga macam jenis perlukaan.
TGF–β  adalah  salah  satu growth  factor yang ditemukan  pada  proses  penyembuhan  luka.  TGF–β1 memiliki  efek  respons fibrotic  scarring ,  dan  TGF–β3 bertanggung  jawab  terhadap  pembentukan scarless wound healing . Ketiga isoform dari TGF–β tersebut sama- sama berperan aktif dalam penyembuhan luka dan dapat
14 ditemukan  pada  lesi  luka.   Kolagen  adalah  salah  satu protein yang terlibat dalam penyembuhan luka. Kolagen dihasilkan  oleh  fibroblas  pada  fase  proliferasi  dan remodelling luka, di mana kolagen mempertautkan luka, memungkinkan kulit untuk memiliki sifat tensile strength , serta  menjadi framework serta scaffolding pergerakan fibroblas dan sel-sel lainnya dalam proses penyembuhan luka.  Kolagen  dapat  dilihat  menggunakan  pewarnaan hematoksilin  eosin  sebagai  zona  rangkaian  serat 15 berwarna merah muda cerah.
Penelitian  ini  dimaksudkan  untuk  mengetahui efek  pemberian  ozon  dalam  bentuk ozonated  virgin coconut  oil dalam  mempercepat  waktu  penyembuhan luka full–thickness defect pada tikus Sprague Dawley yang diberi  ozon,  yang  ditinjau  dari  kadar  TGF–β  dan penyusutan ukuran luka.

## METODE PENELITIAN

## Desain, Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan  Maret–April  2019. Pembuatan ozonated virgin coconut oil dilakukan di Center Plasma  Research  Universitas  Diponegoro  (Gedung Rektorat).  Proses  pembuatan  model  luka full  thickness defect, perawatan,  dan  perlakuan  terhadap  tikus,  serta proses pengambilan jaringan dilakukan di Laboratorium Hewan  Coba  Fakultas  Kedokteran  Universitas Diponegoro,  Semarang.  Proses  pembuatan  preparat dilakukan  di  Laboratorium  Hewan  Coba,  Gedung  A
Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang, pengukuran  penyusutan  diameter  luka  dilakukan  di Laboratorium  Hewan  Coba  Gedung  A  Fakultas Kedokteran  Universitas  Diponegoro  Semarang, sedangkan  pengecatan  dan  pemeriksaan  kadar  TGF–β dilakukan  di  Laboratorium  Terpadu  FK  Universitas Gadjah  Mada  Jogjakarta.  Persetujuan  penelitian didapatkan  dari  Komisi  Etik  Penelitian  Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.

## Sampel Penelitian
Sampel penelitian ini adalah 60 tikus jantan jenis Sprague Dawley dewasa dengan berat 250±50 gram, kondisi sehat (bergerak  aktif),  dan  tidak  memiliki  abnormalitas  yang tampak.  Tikus  betina,  memiliki  kecacatan,  dan  tikus jantan Spraque  Dawley yang  menunjukkan  perubahan perilaku  (tampak  lemah  dan  malas)  dikeluarkan  dari penelitian.  Dilakukan  pembuatan  model full  thickness defect berdiameter 1 cm pada punggung belakang tikus. Prosedur pembuatan full thickness defect akan dijelaskan pada  bagian  berikutnya.  Tikus  dipelihara  dalam  suhu ruang 28,0±2,0°C dengan pencahayaan lampu selama 12 jam, dari pukul 09.00–21.00 dan diberikan makan ad  libitum (secukupnya).  Penelitian  ini  menggunakan jumlah  6  tikus  tiap  kelompoknya.  Tikus  kemudian dieliminasi pada hari ke-7 dan hari ke-14 untuk melihat kadar TGF–β dan penyusutan ukuran luka.

## Prosedur Penelitian
Ozonated  ointment diperoleh  dari  laboratorium  Plasma Research Universitas Diponegoro, yang didapatkan dari pencampuran  ozon  hasil  generator  ozon  ke  dalam minyak. Dilakukan pencampuran ozon dengan minyak menggunakan pengaduk magnetik sehingga didapatkan ozonated  virgin  coconut  oil yang  siap  digunakan  sebagai bahan perlakuan. Sampel minyak berozon diambil untuk diuji  dengan  menggunakan  spektrometer  (merk,  kota asal)  atau  kit dissolved  ozone  meter (merk,  kota  asal). Pengukuran kadar ozon dalam minyak berozon diukur 16,17 dengan metode titrasi kalium iodida. Pembuatan  model full  thickness  defect pada  tikus dilakukan  dengan  cara  menganestesi  tikus  dengan campuran  Ketamine–Xylazine  (dosis  ketamine  80  mg/ kgBB;  dosis  Xylazine  10  mg/kgBB)  melalui  jalur  intra- peritoneal,  cubit  kaki  tikus  untuk  mengecek  apakah sedasi  sudah  bekerja.  Tikus  kemudian  diposisikan left lateral dekubitus . Tandai punggung tikus sebagai daerah pembuatan model luka dengan diameter 1 cm, kemudian bersihkan  dengan  povidone  iodine  dan  dilanjutkan dengan ethanol 70%. Kulit punggung dipotong sampai dasar dari panniculus carnosus. Lokasi insisi dibebaskan dari jaringan lemak dan jaringan pengikat secara lembut, bila  perlu  dapat  diirigasi  dengan  normal  saline.  Luka kemudian dibungkus dengan plester hansaplast dengan segmen  non  adhesif  tidak  menutupi  luka  kemudian difiksasi pada bagian dada tikus dengan plester elastomull
Efektivitas Ozonated Virgin Coconut Oil terhadap Penyembuhan Full Thickness Skin Defect pada Tikus Sprague Dawley
untuk mencegah segmen non adhesif hansaplast bergeser. Pemasangan plester elastomull harus diperhatikan agar tidak  membuat  tikus  sulit  bergerak,  sulit  bernapas (pengembangan  dada  tikus  harus  tetap  adekuat)  dan lengan tikus dapat bergerak dengan bebas.
18,19 Jurnal  pendahulu menggunakan  variasi ozonated  sesame  oil dengan  jumlah  8  mikroliter  dengan luka  bulat  berdiameter  3,5  mm.  Dosis  yang  digunakan adalah  50,6  mg/mL ozonated  virgin  coconut  oil ,  101,3 mg/mL ozonated  virgin  coconut  oil ,  dan  202,5  mg/mL ozonated virgin coconut oil . Dengan demikian, dosis ozon dalam  tiap  luka  berukuran  diameter  3,5mm  adalah 0,405 mg; 0,81 mg; dan 1,62 mg; secara berurutan. Rumus  kapasitas  minyak  berozon  (Cap)  ditentukan dengan rumus :
Cap = C × F × T Rate
Di mana C ditetapkan sebagai 45 mg/L, F ditetapkan rate 18
sebagai  1,5  liter/menit,  dan  T  30,  60  dan  120  menit.
18 Volume ozonated virgin coconut oil adalah 40 mL.  Dengan
demikian,  kapasitas  ozon  per  40  mL ozonated  virgin coconut oil secara berurutan adalah 2025 mg, 4050 mg dan 8100 mg. Dalam 1 mL ozonated virgin coconut oil , kapasitas ozon  yang  terbentuk  secara  berurutan  adalah  50,6  mg; 101,3 mg; dan 202,5 mg. Jika luas permukaan luka saat ini
2 2 2
adalah  314,15  mm   (dari  hasil  πr   =  (22/7)  ×  5 ),  maka dosis ozon  yang  dibutuhkan  adalah  (78,5714/9,6211)  × dosis  sebelumnya  =  8.166x  dosis  sebelumnya.  Dengan demikian,  dosis  ozon  yang  digunakan  dalam  setiap kelompok pada penelitian ini adalah 3,305 mg, 6,61 mg, dan 13,2225 mg ozon.
Ozonated virgin coconut oil diaplikasikan pada luka sehari  sekali,  tipis-tipis  menutupi  seluruh  permukaan luka setiap perlakuan. Pengaplikasian ozonated ointment dilakukan sampai hewan coba mendapatkan perlakuan eksisi  untuk  pemeriksaan  kadar  TGF–β.Untuk pengukuran penyusutan ukuran luka, setiap kali peneliti akan  melakukan  pengolesan ozonated  virgin  coconut  oil , peneliti terlebih dahulu mengukur diameter luka dengan mikrometer/jangka sorong dengan bantuan mikroskop untuk mengetahui penyusutan luka pada hari ke-7 dan
Medica Hospitalia | Vol. 8, No. 2, Juli 2021
1cm (A) (B) (C) (D)
Gambar 1. A. Lokasi pembuatan luka pada punggung tikus. B. Contoh luka pembuatan model full thickness defect (pada gambar berbentuk kotak, pada penelitian ini berbentuk bulat). C. Bagian non-adesif dari Hansaplast ditempelkan pada model luka yang telah dibuat. D. Plester Elastomull digunakan untuk menyelubungi bagian thorax dan dorsum tikus, dan diatur sedemikian  rupa  kekencangannya  agar  tikus  dapat  bernafas  dengan  baik  (pengembangan  dada  adekuat)  serta  dapat menggerakan ekstermitas sebelum dikembalikan ke kandang.
ke-14. Kemudian data penyusutan luka akan ditabulasi untuk diolah kemudian. Untuk melakukan pengukuran TGF–β  secara  imunohistokimia,  terlebih  dahulu  tikus harus dikorbankan. Eksisi dilakukan pada hari ke-7 dan hari ke-14 di setiap kelompok dengan mengorbankan 5 hewan coba setiap kali dilakukan eksisi. Pengambilan jaringan  luka  dilakukan  dengan  mengorbankan  hewan coba menggunakan eter. Setelah efek tercapai, dilakukan eksisi  pada  bagian  luka  yang  paling  luas  dengan mengikutsertakan  jaringan  kulit  normal.  Jaringan  hasil eksisi  segera  dibentangkan  di  kertas  untuk mempermudah  pemotongan  dengan microtome , kemudian difiksasi dalam formalin buffer 10% dan dibuat blok  parafin,  kemudian  dipotong  dengan  ketebalan 4-6  mikron  untuk  dilakukan  pemeriksaan  selanjutnya berupa pemeriksaan ekspresi TGF–ß pada jaringan hasil biopsi. Jaringan diambil dari luka berukuran 5mm x 5mm x  1  mm  pada  hari  ke  7  dan  14.  Setengah  dari  jaringan
diukur dan dihomogenikan pada 3 ml PHS (pH 7,4) lalu diikuti sentrifugasi yang kemudian disimpan pada freezer -80  C  lalu  diukur  kadar  TGF–β  dengan  menggunakan TGF–β ELISA kit dan dibaca pada spektrofotometer pada Panjang gelombang 450 nm. Peningkatan kadar TGF–β yang  dihitung  berdasarkan  intensitas  ekspresi  (0=tidak ada  ekspresi  pada  sel;  1=pewarnaan  lemah; 2=pewarnaan  sedang;  3=pewarnaan  kuat)  dan persentase sel yang terwarnai (0=tidak ada ekspresi pada sel; 1= <33% ekspresi pada sel; 2= 33–66% ekspresi pada sel; 3= >66% ekspresi pada sel; persentase dihitung pada 100  sel  pada  daerah hot  spot ).  Setiap  spesimen  akan diekspresikan  pada  pg/mg  dengan  rerata  ±  standar deviasi (SD).
Penelitian  ini  dilakukan  dengan  melakukan perhitungan penyusutan ukuran luka dan peningkatan kadar  TGF-β full  thickness  defect yang  diterapi  dengan ozonated  virgin  coconut  oil .  Total  tikus  yang  digunakan
Efektivitas Ozonated Virgin Coconut Oil terhadap Penyembuhan Full Thickness Skin Defect pada Tikus Sprague Dawley
Hewan Coba 7 hari
Adaptasi (K-) tanpa perlakuan (K+) Genta- misin (P1) Ozonated VCO 13,22 mg (P2) Ozonated VCO 26,44 mg (P3) Ozonated VCO 52,89 mg (K-) tanpa perlakuan (K+) Genta- misin (P1) Ozonated VCO 13,22 mg (P2) Ozonated VCO 26,44 mg (P3) Ozonated VCO 52,89 mg 7 hari 14 hari Penyusutan Pengukuran Luka Terminasi & Pengambilan Jaringan
Pengukuran TGF- secara imunohistokimia Penyusutan Pengukuran Luka Terminasi & Pengambilan Jaringan Pengukuran TGF- secara imunohistokimia Analisis Data
Gambar 2. Alur penelitian uji coba ozonated virgin coconut oil pada penyembuhan full thickness skin defect .
dalam  penelitian  ini  adalah  60  tikus,  yang  terbagi menjadi 2 kelompok waktu yaitu terminasi pada waktu 7 hari dan 14 hari paska pembuatan luka dan pemberian terapi ozonated VCO . Tidak ada tikus yang drop out pada penelitian  ini,  karena  hingga  akhir  penelitian  jumlah tikus dalam tiap kelompok tetap berjumlah 6 tikus.

## Analisis Data
Analisis  Data  menggunakan  SPSS  v.22.0.  Normalitas distribusi data diuji dengan uji Shapiro Wilk dikarenakan jumlah sampel masing-masing kelompok <50, distribusi data  dikatakan  normal  bila p >0.05.  Apabila  distribusi data  normal  dilanjutkan  dengan  membandingkan distribusi  dari  kelompok  kontrol  dan  perlakuan menggunakan  uji one  way ANOVA,  hasil  dikatakan signifikan  bila p <0,05.  Bila  didapatkan  distribusi  data tidak  normal  maka  dilakukan  transformasi,  apabila setelah  transformasi,  didapatkan  hasil  yang  tidak homogen; maka data akan diuji beda dengan pengujian non-parametrik metode Kruskall–Wallis . Jika didapatkan adanya perbedaan antar kelompok dengan uji beda, uji dilanjutkan  pada  pengujian post-hoc untuk  mengetahui kelompok  mana  saja  yang  mengalami  perbedaan  pada pengujian ini. Untuk menentukan pilihan pengujian post- hoc ,  harus  dilakukan  uji  homogenitas  data  melalui Levene  Test  terlebih  dahulu.  Jika  didapatkan  variansi data  yang  sama  (data  homogen),  maka  uji  akan dilanjutkan dengan post-hoc Bonferonni; sedangkan jika didapatkan adanya variansi data (data tidak homogen), maka dilakukan dengan uji post-hoc Games-Howell.

## HASIL PENELITIAN
Kadar  TGF–β  dalam  penelitian  ini  didapatkan  melalui pemeriksaan ELISA pada protein penyusun jaringan full thickness skin defect . Kadar TGF–β pada hari ke-7 semakin meningkat pada peningkatan dosis ozonated VCO . Kadar paling tinggi didapatkan pada ozonated VCO 13,2225 mg (15,30±  2,22)  dan  terendah  pada  kontrol  negatif  (4,00  ± 2,00).  Hasil  serupa  juga  didapatkan  pada  kelompok periode 14 hari, kadar TGF-β paling tinggi pada ozonated VCO 13,2225 mg (17,80 ± 1,92), dan terendah pada kontrol negatif (7,20 ± 1,92).
Data penyusutan ukuran luka dalam penelitian ini didapatkan melalui pengukuran yang dilakukan dengan menggunakan jangka sorong, yang dilakukan pada hari ke-7 dan hari ke-14. Didapatkan hasil ukuran luka yang semakin  menyusut  dengan  peningkatan  dosis ozonated VCO yang  diaplikasikan.  Pada  hari  ke-7  didapatkan ukuran luka paling kecil pada kelompok ozonated VCO 13,225  mg  (4,52  ±  0,54  cm)  dan  paling  besar  pada kelompok kontrol negatif (9,17 ± 0,39 cm).
Apabila dibandingkan dengan kelompok kontrol positif yang mendapatkan pemberian terapi gentamisin selama  tujuh  hari,  ketiga  kelompok  pemberian  ozon tersebut  juga  memiliki  kadar  TGF–β  yang  lebih  tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol positif, dengan peningkatan bermakna didapatkan pada kelompok yang mendapatkan  terapi ozonated  VCO dengan  dosis 13,2225  mg  (Tabel  7).  Sedangkan,  pada  periode
Medica Hospitalia | Vol. 8, No. 2, Juli 2021
P R O1 O2 O3 O4 O5 X1 O1 X2 O2 X3 O3 X4 O4 X5 O5 O1 O2 O3 O4 O5 X1 O1 X2 O2 X3 O3 X4
O4 X5 O5 Keterangan : O1 : Kelompok Kontrol Negatif – 7 Hari
O2 : Kelompok Kontrol Positif Gentamisin – 7 Hari O3 : Kelompok Ozonated VCO Dosis 3,305 mg – 7 Hari O4 : Kelompok Ozonated VCO Dosis 6,61 mg – 7 Hari O5 : Kelompok Ozonated VCO Dosis 13,2225 mg – 7 Hari
O6 : Kelompok Kontrol Negatif – 14 Hari O7 : Kelompok Kontrol Positif Gentamisin – 14 Hari O8 : Kelompok Ozonated VCO Dosis 3,305 mg – 14 Hari O9 : Kelompok Ozonated VCO Dosis 6,61 mg – 14 Hari O10 : Kelompok Ozonated VCO Dosis 13,2225 mg – 14 Hari
Gambar 3. Skema post-test only control group design .
perlakuan  selama  14  hari,  peningkatan  bermakna  telah dapat ditemukan pada terapi ozonated VCO dengan dosis 6,61  mg  (Tabel  8).  Hasil  pengukuran  pengukuran penyusutan ukuran luka memberikan hasil yang serupa dengan TGF-β, di mana pada periode perlakuan 7 hari dan 14 hari hanya pemberian terapi ozonated VCO dengan dosis  13,2225  mg  memberikan  penyusutan  luka  yang lebih  baik  secara  bermakna  dibandingkan  dengan
kontrol positif (Tabel 9 dan 10). Dengan demikian, dapat disimpulkan  bahwa  dosis  bertingkat  yang  dibutuhkan dalam  pemberian ozonated  VCO untuk  mendapatkan penyembuhan  luka  lebih  baik  dibandingkan  dengan terapi  standar  menggunakan  gentamisin  adalah 13,2225  mg,  yang  dapat  memberikan  hasil  lebih  baik dalam hal peningkatan TGF – β dan penyusutan ukuran luka dibandingkan dengan terapi standar.
Efektivitas Ozonated Virgin Coconut Oil terhadap Penyembuhan Full Thickness Skin Defect pada Tikus Sprague Dawley
Kelompok

## TABEL 1
Rerata ± standar deviasi TGF-ß pada periode 7 hari
TGF-ß 7 hari
Mean ± SD

## Kontrol Negatif – 7 Hari
Ozonated VCO 3,305 mg – 7 Hari
Ozonated VCO 13,2225 mg – 7 Hari Kontrol Positif  Gentamisin – 7 Hari Ozonated VCO 6,61 mg – 7 Hari 4,00 ± 2,00 8,90 ± 2,51
15,30 ± 2,22
11,30 ± 1,75
12,20 ± 1,25 Kelompok

## TABEL 2
Rerata ± standar deviasi TGF-ß pada periode 14 hari
TGF-ß 14 hari Mean ± SD
Kontrol Negatif – 14 Hari
Ozonated VCO 3,305 mg – 14 Hari
Ozonated VCO 13,2225 mg – 14 Hari Kontrol Positif  Gentamisin – 14 Hari Ozonated VCO 6,61 mg – 14 Hari 7,20 ± 1,92 8,20 ± 1,92 17,80 ± 1,92 12,20 ± 2,68 14,80 ± 1,78
Kelompok

## TABEL 3
Rerata ± standar deviasi penyusutan ukuran luka pada periode 7 hari Penyusutan Ukuran Luka 7 hari Mean ± SD Kontrol Negatif – 7 Hari
Ozonated VCO 3,305 mg – 7 Hari
Ozonated VCO 13,2225 mg – 7 Hari Kontrol Positif  Gentamisin – 7 Hari Ozonated VCO 6,61 mg – 7 Hari 9,17 ± 0,39 6,73 ± 0,54 4,52 ± 0,54 7,04 ±0,63 5,89 ±0,56
Kelompok

## TABEL 4
Rerata ± standar deviasi penyusutan ukuran luka pada periode 14 hari
Penyusutan Ukuran Luka 14 hari
Mean ± SD
Kontrol Negatif – 14 Hari
Ozonated VCO 3,305 mg – 14 Hari
Ozonated VCO 13,2225 mg – 14 Hari Kontrol Positif  Gentamisin – 14 Hari Ozonated VCO 6,61 mg – 14 Hari 6,49 ± 0,76 5,36 ± 0,51 3,37 ± 0,31 4,96 ± 0,49 4,37 ± 0,28 Kelompok TABEL 5 Analisis post-hoc Bonferonni pada TGF-ß 7 hari
a O1 a O1 c O3 e O5 b O2 d O4 – 0,009* <0,001* <0,001* <0,001* b O2 c O3 d O4 e
O5 <0,001* <0,001* – 0,166 0,001* 1,000 0,048* – 0,233 0,009* 0,717 0,166 0,001* <0,001* 0,717 – 1,000 0,048* 0,233 – a b c d
Keterangan : Kontrol Negatif – 7 Hari,  Kontrol Positif Gentamisin – 7 Hari, Ozonated VCO 3,305 mg – 7 Hari, Ozonated VCO 6,61 mg – 7 Hari, e Ozonated VCO 13,2225 mg  –7 Hari, * p = nilai signifikansi post-hoc Bonferonni, signifikan bila <0,05

## DISKUSI
Pada penelitian ini, seluruh kelompok perlakuan dengan ozon  baik  selama  7  maupun  14  hari,  dengan  dosis 3,305 mg, 6,61 mg maupun 13,2225 mg memiliki kadar TGF-Beta  yang  lebih  tinggi  secara  bermakna dibandingkan dengan kontrol negatif dan kontrol positif. Pada  variabel  penyusutan  ukuran  luka,  seluruh
kelompok perlakuan dengan ozon selama 7 dan 14 hari, dengan  dosis  3,305  mg,  6,61  mg  maupun  13,2225  mg memiliki ukuran luka yang lebih baik secara bermakna dibandingkan dengan kelompok kontrol positif. Kedua temuan ini serupa dengan temuan yang didapatkan oleh Kim et al . yang menemukan bahwa terdapat peningkatan (up-regulation) TGF – β  dan  peningkatan  penyusutan ukuran  luka full-thickness  skin  wound pada  guinea  pig setelah pemberian ozonated olive oil dibandingkan dengan
Medica Hospitalia | Vol. 8, No. 2, Juli 2021
Kelompok TABEL 6 Analisis post-hoc Bonferonni pada TGF-ß 14 hari
a O6 a O6 c O8 e O10 b O7 d O9 – 1,000 0,011*
<0,001*
<0,001*
b O7 c O8 d O9 e
O10 <0,001* <0,001* – 0,001* <0,001* 0,613 0,004* – 0,332 1,000 0,063 0,001* <0,001* – 0,011* 0,063 0,613 0,004* 0,332 – a b c d
Keterangan :  Kontrol Negatif – 14 Hari,  Kontrol Positif Gentamisin – 14 Hari, Ozonated VCO 3,305 mg – 14 Hari, Ozonated VCO 6,61 mg – 14 Hari, e Ozonated VCO 13,2225 mg  – 14 Hari, * p = nilai signifikansi post-hoc Bonferonni, signifikan bila <0,05
Kelompok

## TABEL 7
Analisis post-hoc Bonferonni pada penyusutan ukuran luka 7 hari
a O1 a O1 c O3 e O5 b O2 d O4 – <0,001* <0,001*
<0,001* <0,001*
b O2 c O3 d O4 e O5
<0,001* – <0,001*
<0,001* – 0,007* <0,001* 1,000 0,246
<0,001*
– <0,001* 1,000 0,031* <0,001* <0,001* 0,246 0,031* 0,007* – a b c d
Keterangan :  Kontrol Negatif – 7 Hari,  Kontrol Positif Gentamisin – 7 Hari, Ozonated VCO 3,305 mg – 7 Hari, Ozonated VCO 6,61 mg – 7 Hari,
e Ozonated VCO 13,2225 mg  – 7 Hari, * p = nilai signifikansi post-hoc Bonferonni, signifikan bila <0,05
Kelompok TABEL 8 Analisis post-hoc Bonferonni pada penyusutan ukuran luka 14 hari
a O6 a O6 c O8 e O10 b O7 d O9 – 0,019* 0,001* <0,001* <0,001* b O7 c O8 d O9 e
O10 <0,001* – <0,001* 0,001* – 0,050* 0,019* 1,000 0,054
<0,001*
– 0,001* 1,000 0,752 0,001* <0,001* 0,054 0,752 0,050* – a b c d
Keterangan :  Kontrol Negatif – 14 Hari,  Kontrol Positif Gentamisin – 14 Hari, Ozonated VCO 3,305 mg – 14 Hari, Ozonated VCO 6,61 mg – 14 Hari, e Ozonated VCO 13,2225 mg  – 14 Hari, * p = nilai signifikansi post-hoc Bonferonni, signifikan bila <0,05
20 kelompok  kontrol.   Hal  ini  menunjukkan  bahwa pemberian terapi ozonated virgin coconut oil meningkatkan ekspresi  TGF – β  dan  dibandingkan  dengan  kelompok kontrol  negatif  sehingga  memiliki  potensial  untuk 20,21 meningkatkan proses penyembuhan luka.
Penelitian  ini  menemukan  bahwa  pemberian ozonated virgin coconut oil dapat meningkatkan keluaran penyembuhan  luka  kulit  akut.  Pemberian  ozon  secara topikal  dapat  mempengaruhi  pembentukan  jaringan granulasi  dari  proses  penyembuhan  luka,  yang ditunjukkan melalui penyusutan ukuran luka yang lebih 20 baik.  Peningkatan kadar TGF–β yang ditemukan pada penelitian  ini  juga  menunjukkan  bahwa  ozon  dalam ozonated  virgin  coconut  oil dapat  menginduksi  ekspresi TGF–β  dari  keratinosit  epidermis  dan  dari  fibroblas 20 dermal pada lokasi luka.
Kekurangan  dari  penelitian  ini  adalah  bahwa kami  tidak  melakukan  uji  regresi  linier  untuk  melihat korelasi antara TGF–β dan penyusutan ukuran luka. Ke depannya,  kami  menilai  ada  perlunya  dilakukan penelitian  dengan  periode  yang  lebih  panjang  untuk menilai penyembuhan luka kronis pada pemberian ozon.

## SIMPULAN
Kami  menyimpulkan  bahwa  pemberian ozonated  VCO efektif  dalam meningkatkan  ekspresi TGF–β  pada luka full  thickness  defect tikus Sprague  Dawley serta  efektif dalam meningkatkan penyusutan ukuran luka pada luka full  thickness  defect tikus Sprague  Dawley .  Penelitian berikutnya sebaiknya membandingkan efek penggunaan minyak  selain  VCO  sebagai  media  dari  ozon  serta melakukan penelitian dengan waktu yang lebih panjang untuk  menilai  perubahan  yang  terjadi  pada penyembuhan luka kronis dengan pemberian ozon.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Dhivya S, Padma VV, Santhini E. Wound dressings - a review. BioMedicine. 2015 Dec;5(4):22.
2. Geoffrey C, Victor W. Wound Healing: Normal and Abnormal. th In: Thorne CH, editor. Grabb and Smith's Plastic Surgery. 7 ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2014.
3. Pastar  I,  Stojadinovic  O,  Yin  NC,  Ramirez  H,  Nusbaum  AG, Sawaya  A, et  al .  Epithelialization  in  Wound  Healing:  A Comprehensive Review. Adv Wound Care. 2014;3(7).
4. Gurtner  GC,  Werner  S,  Barrandon  Y,  Longaker  MT.  Wound repair and regeneration. Nature. 2008 May 15;453(7193):314–21.
5. Borges GÁ, Elias ST, da Silva SMM, Magalhães PO, Macedo SB, Ribeiro APD, et al . In vitro evaluation of wound healing and antimicrobial potential of ozone therapy. J Cranio-Maxillofacial Surg. 2017;45(3):364–70.
6. Tanasale ML. Aplikasi Starter Ragi Tape terhadap Rendemen dan Mutu Virgin Coconut Oil (VCO). Ekosains. 2012;2(1):47–52.
7. Fitri R. Formulasi Krim Anti-Aging yang Mengandung Minyak Kelapa  Murni  (Virgin  Coconut  Oil).  Universitas  Sumatera Utara; 2017.
8. Cristianti  L,  Prakosa  AH.  Pembuatan  Minyak  Kelapa  Murni (Virgin  Coconut  Oil)  menggunakan  Fermentasi  Ragi  Tempe. Universitas Sebelas Maret; 2009.
9. Harlinanda  SN.  Optimasi  Formulasi  Krim  Antioksidan Vitamin  E  (DL-Alfa  Tokoferol  Asetat)  dengan  VCO  (Virgin Coconut Oil) (Variasi Kadar VCO 15%, 30%, dan 45% dalam Basis Cold Cream). Universitas Muhammadiyah Malang; 2017.
10.  Nevin KG, Rajamohan T. Effect of Topical Application of Virgin Coconut  Oil  on  Skin  Components  and  Antioxidant  Status during Dermal Wound Healing in Young Rats. Skin Pharmacol Physiol. 2010;23(6):290–7.
11.  Soliman AM, Lin TS, Ghafar NA, Das S. Virgin coconut oil and diabetic  wound  healing:  histopathological  and  biochemical analysis. Eur J Anat . 2018;22(2):135–44.
12.  De Monte A, Gori C. Major ozonated autohaemotherapy in the treatment  of  limb  ulcers  not  responding  to  conventional therapy. Vol. 10, International Journal of Ozone Therapy. 2011. 85–98 p.
13.  Degli  Agosti  I,  Ginelli  E,  Mazzacane  B,  Peroni  G,  Bianco  S, Guerriero F, et al . Effectiveness of a Short-Term Treatment of Oxygen-Ozone  Therapy  into  Healing  in  a  Posttraumatic Wound. Case Rep Med. 2016;2016:1–5.
14.  Penn JW, Grobbelaar AO, Rolfe KJ. The role of the TGF-β family in  wound  healing,  burns  and  scarring:  a  review.  Int  J  Burn Trauma. 2012;2(1):18–28.
15.  Tanggo  VTIP.  Pengaruh  Pemberian  Topikal  Ekstrak  Kulit Delima Pada Penyembuhan Luka Split Thickness Kulit Tikus. Universitas Airlangga; 2013.
16.  Rijal  S,  Nur  M.  Analisa  Pengaruh  Ozonisasi  Hasil  Lucutan Plasma  Berpenghalang  Dielektrik  pada  Beras  terhadap Perubahan  Amilografi,  Kekerasan,  dan  Warna.  Vol.  4, Youngster Physics Journal. 2015.
17.  Teke S, Nur M. Produksi Ozon dalam Reaktor Dielectric Barrier Discharge  Plasma  (DBDP)  Terkait  Panjang  Reaktor  dan  Laju Alir Udara. Berk Fis. 2014;17(1):25–32.
18.  Sega A, Zanardi I, Chiasserini L, Gabbrielli A, Bocci V, Travagli V.  Properties  of  sesame  oil  by  detailed  1H  and  13C  NMR assignments  before  and  after  ozonation  and  their  correlation with iodine value, peroxide value, and viscosity measurements. Chem Phys Lipids. 2010 Feb;163(2):148–56.
19.  Valacchi G, Lim Y, Belmonte G, Miracco C, Zanardi I, Bocci V, et al . Ozonated sesame oil enhances cutaneous wound healing in SKH1 mice. Wound Repair Regen. 2011 Jan 1;19(1):107–15.
20.  Kim HS, Noh SU, Han YW, Kim KM, Kang H, Kim HO, et al . Therapeutic  effects  of  topical  application  of  ozone  on  acute cutaneous  wound  healing.  J  Korean  Med  Sci.  2009 Jun;24(3):368–74.
21.  Zhang  J,  Guan  M,  Xie  C,  Luo  X,  Zhang  Q,  Xue  Y.  Increased growth  factors  play  a  role  in  wound  healing  promoted  by noninvasive  oxygen-ozone  therapy  in  diabetic  patients  with foot ulcers. Oxid Med Cell Longev. 2014;2014.
Efektivitas Ozonated Virgin Coconut Oil terhadap Penyembuhan Full Thickness Skin Defect pada Tikus Sprague Dawley