Kadar Hemoglobin Dan Jumlah Eritrosit Mencit ( Mus musculus ) Jantan setelah Perlakuan dengan Ekstrak Etanol Daun Nimba ( Azadirachta indica )
The Haemoglobin concentration and Erythrocyte level  of Male Mice ( Mus musculus ) after Treated with Ethanolic of Neem ( Azadirachta indica ) Leaf Extract
Agung Janika Sitasiwi*, Sri Isdadiyanto
Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro Jl. Prof. Soedarto, SH, Tembalang, Semarang
*Email: agssiwi@yahoo.co.id
Diterima 2 Juli 2017 / Disetujui 22 Agustus 2017

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis kadar hemoglobin (Hb) dan jumlah eritrosit mencit jantan setelah paparan  ekstrak  ethanol  daun  Nimba.  Hewan  uji  dalam  penelitian  ini  adalah  dua  puluh  empat  ekor  mencit jantan  dewasa  berusia  2.5  bulan  dengan  bobot  badan  25-30  gram,  diaklimasi  selama  2  minggu,  serta dipelihara  dalam  kondisi  kandang  dengan  kelembaban  dan  temperatur  yang  terkontrol.  Hewan  uji  dibagi menjadi  4  kelompok,  yaitu  P0  sebagai  kontrol  dengan  bahan  uji  berupa  akuades;  P1,  P2  dan  P3  masing- masing diberi ekstrak daun Nimba dengan dosis  8.4; 11.2; 14 mg/ekor/hari. Perlakuan diberikan secara oral dengan  volume  0.3  mL,  selama  21  hari.  Sampel  darah  diisolasi  langsung  dari  jantung  setelah  hewan  uji dikorbankan  dengan  cara  pembiusan  menggunakan  chloroform.  Plasma  darah  ditampung  untuk  pengukuran kadar  Hb  dan  jumlah  eristrosit.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  kadar  Hb  dan  eristrosit  kelompok perlakuan  lebih  rendah  dan  berbeda  bermakna  dari  kelompok  kontrol.  Penurunan  kadar  Hb  hewan  uji kelompok  perlakuan  menunjukkan  pola  yang  sejalan  dengan  penurunan  jumlah  eritrosit.  Dapat  disimpulkan bahwa penggunaan esktrak etanol daun Nimba secara oral selama 21 hari berpotensi mengganggu kesehatan serta menurunkan kebugaran hewan.

## Kata kunci: hemoglobin, nimba, mencit

## ABSTRACT
This  study  was  conducted  to  analyze  the  hemoglobin  concentration  and  the  amount  of  erythrocyte  of  male mice  after  exposure  with  ethanolic  Neem  leaf  extract.  The  laboratory  animals  were  twenty  four  male  mice aged 2.5 months with 25-30 gram in weight, acclimated for 2 weeks, and kept in a controlled condition cage. The mice were divided into 4 groups, namely P0 as control group, treated with distilled water; P1, P2 and P3 were  given  Neem  leaf  extract  at  dose  8.4;  11.2;  14  mg/animal/day  respectively.  The  treatment  was administered orally with 0.3 mL in volume, for 21 days. Blood samples were isolated directly from the heart after  the  mice  were  sacrificed  by  using  chloroform  anaesthesia.  Plasma  of  blood  were  prepared  for  Hb  and number  of  erythrocytes  measurement.  The  results  showed  that  the  hemoglobin  levels  and  erythrocytes  of treated groups were lower and show a significantly different with the control group. The decrease pattern of Hb concentration was in line with erythrocytes levels. It could be concluded that the use of  ethanolic Neem leaf extract for 21 days potentially affecting the health and decreasing of animal fitness.

## Keywords: hemoglobin, neem, mice

## PENDAHULUAN
Azadirachta  indica merupakan  tanaman yang  berasal  dari  India  dan  tersebar  sampai  ke Indonesia. Tanaman tersebut dikenal dengan nama lokal  Imba,  Nimba  atau  Mimba.    Sharma  (2013)
menyatakan  bahwa  Nimba  banyak  dimanfaatkan sebagai  tanaman  obat.  Nimba  telah  terbukti memiliki  efek  anti-bakteri,  anti-inflamasi,  serta anti-diabetes. Auta and Hassan (2016) menyatakan bahwa  ekstrak  Nimba  juga  terbukti  memiliki
kemampuan  menekan  pertumbuhan  sel  kanker. Ekstrak  beberapa  bagian  pohon  nimba,  juga  telah terbukti  memiliki  efek  anti-malaria,  spermisida, anti-tuberkolusis,  anti-piretik,  anti-virus,  anti- seboroik,  anti-alergi,  anti-enzimatik,  serta  anti jamur.
Suryawanshi  (2011)  serta  Auta  and  Hassan (2016)  menyatakan  bahwa  nimba  mengandung senyawa  yang  berpotensi  sebagai  anti-fertilitas, baik  pada  hewan  jantan  maupun  betina.  Tanaman nimba  telah  digunakan  sebagai  tanaman  yang mempengaruhi  kesuburan  manusia  dan  terbukti mampu  menginduksi  sterilitas  secara  temporer (Umadevi,  2013).    Efek  ekstrak  beberapa  bagian dari tanaman nimba juga diketahui mempengaruhi fungsi reproduksi pada hewan jantan (Assif, 2013). Sharma  (2013)  menyatakan  bahwa  ekstrak  etanol daun  nimba  memiliki  kemampuan  anti-fertilitas, tetapi  mekanisme  kerja  senyawa  tersebut  belum diketahui  dengan  pasti.  Sitasiwi et  al .  (2017) membuktikan  bahwa  paparan  ekstrak  etanol  daun nimba  selama  21  hari  menyebabkan  perubahan level hormon estradiol 17-β pada mencit betina.
Joshi et  al .  (2011)  menyatakan  bahwa metode  baku  pengujian  suatu  senyawa  anti- fertilitas  terhadap  hewan  harus  dilakukan  dengan tepat  karena  senyawa  yang  sama  juga  berpotensi mengganggu  atau  mempengaruhi  fungsi  beberapa organ  dalam  tubuh.  Penggunaan  ekstrak  nimba sebagai  kontrasepsi  herbal  diduga  menyebabkan gangguan  pada  organ  tubuh  yang  lain,  terutama jika  dikonsumsi  dalam  jangka  waktu  lama  dan dosis  yang  tinggi.  Efek  samping  Nimba  juga diduga dapat menyebabkan kerusakan struktur hati dan  ginjal  (Kupradinun et  al .  2012).  Umadevi (2013)  menyatakan  bahwa  pengujian  potensi antifertilitas dan toksisitas tanaman obat lokal akan memberikan  keyakinan  yang  besar  pada  pemakai sehingga dapat diterima secara luas oleh pengguna kontrasepsi  herbal.  Akin-Osanaiye et  al .  (2015) menyatakan  bahwa  penggunaan  ekstrak  nimba sebagai tanaman obat juga tidak diikuti bagaimana pemulihan  efek  atau  resiko  keamanan  dan toksisitasnya.
De-Oliviera dan Vitoria (2011) serta Bansal et  al .  (2014)  menyatakan  bahwa  senyawa  yang bertanggung jawab untuk efek kontrasepsi ini bisa
berupa alkaloid, steroid, triterpenoid, atau flavonoid.  Berbagai  senyawa  tersebut  telah diyakini memiliki efek sitotoksik (De-Oliviera dan Vitoria,  2011).  Paparan  senyawa  sitotoksik  dapat mempengaruhi pembelahan maupun perkembangan  sel  dalam  tubuh,  termasuk  sel darah.  Hasil  penelitian  Sitasiwi  and  Mardiati (2016)  menunjukkan  bahwa  paparan  senyawa antifertilitas dalam biji pepaya terbukti mempengaruhi status hematologis mencit betina.
Parameter  hematologi  adalah  parameter yang  terkait  dengan  organ  pembentuk  darah  dan darah  (Akin-Osanaiye et  al .,  2015).  Jasper et  al . (2012)  menyatakan  bahwa  parameter  hematologi, seperti  hematokrit,  hemoglobin,  dan  jumlah eritrosit  dan  sel  darah  putih,  dapat  digunakan sebagai  indikator  toksisitas  dan  memiliki  aplikasi potensial  yang  luas  dalam  pemantauan  kondisi lingkungan. Pemeriksaan hematologis juga merupakan  salah  satu  metode  yang  dapat digunakan  untuk  mendeteksi  beberapa  perubahan status  kesehatan,  yang  mungkin  tidak  terlihat dalam  pemeriksaan  fisik  tetapi  mempengaruhi kebugaran  hewan  (Akin-Osanaiye et  al .,  2015). Etim et  al .  (2014)  menyatakan  bahwa  parameter hematologis  merupakan  indikator  status  fisiologis hewan  yang  baik  karena  darah  berperan  sebagai reflektor  patologis  terhadap  status  hewan  yang terpapar terhadap racun dan kondisi lainnya.
Berdasar  latar  belakang  di  atas,  tujuan penelitian ini adalah menganalisis kadar hemoglobin  dan  eritrosit  mencit  jantan  setelah paparan  ekstrak  ethanol  daun  Nimba.  Hasil penelitian  ini  diharapkan  memberikan  informasi tentang  tingkat  keamanan  penggunaan  ekstrak Nimba  sebagai  senyawa  anti-fertilitas  terhadap status hematologis mamalia.

## METODE PENELITIAN

## Hewan Uji
Penelitian  ini  menggunakan  24  ekor mencit  jantan  dewasa  yang  berumur  2.5  bulan, dengan  bobot  berkisar  25-30  g.  Sebelum  diberi perlakuan  dengan  bahan  uji,  mencit  diaklimasi pada  kondisi  laboratorium  selama  2  minggu. Pemeliharaan  dilakukan  dengan  menempatkan
Kadar Hemoglobin Dan Jumlah Eritrosit Mencit (Mus musculus) Jantan setelah Perlakuan dengan Ekstrak Etanol Daun Nimba (Azadirachta indica)
mencit  pada  kandang  pemeliharaan  dengan kepadatan  4-5  ekor  per  kandang.  Pakan  dan minum  hewan  uji  diberikan  secara ad  libitum . Pencahayaan, temperatur dan kelembaban kandang pemeliharaan dicatat setiap hari.
Cara  Pembuatan  ekstrak  ethanol  daun A.

## Indica
Daun  nimba  dikumpulkan  dari  satu  pohon nimba  yang  terdapat  di  sekitar  kampus  FSM UNDIP.  Daun  yang  diperoleh,  dicuci  bersih dengan  air  mengalir  selanjutnya    dikeringkan dengan  oven  pada  suhu  40 o C  selama  10  hari.
Daun  yang  telah  kering  diketahui  dengan  cara menimbang  selama  3  hari  berturut-turut,  apabila berat  telah  konstan  selama  3  hari  berturut-turut maka  daun  dianggap  telah  kering.  Daun  yang sudah kering dibuat tepung dengan cara menghancurkan  dengan  blender  kemudian  diayak. Tepung daun selanjutnya diesktraksi menggunakan ethanol  70%.  Hasil  akhir  ekstraksi  ethanol  daun nimba berupa serbuk. Ekstrak ethanol daun nimba dibuat  sediaan  bahan  perlakuan  sesuai  dengan konsentrasi  yang  telah  ditentukan,  yaitu  8.4,  11.2 dan 14 mg/ekor/hari (Sitasiwi et al. , 2017).

## Cara Perlakuan
Mencit jantan ditimbang sebelum perlakuan dilaksanakan.  Mencit  dengan  bobot  badan  yang seragam  dipilih  sebagai  hewan  uji,  ditempatkan pada  kandang  pemeliharaan  dengan  kepadatan  3 ekor mencit per kandang. Mencit dibagi menjadi 4 kelompok  perlakuan  yaitu:  P0,  kelompok  kontrol, hewan  uji  yang  diberi  perlakuan  akuades; kelompok  perlakuan  P1,  P2  dan  P3,  yang  diberi perlakuan  ekstrak  ethanol  daun  nimba  dengan dosis  masing-masing  8.4;  11.2;  14  mg/ekor/hari. Perlakuan  diberikan  secara  oral  menggunakan jarum  gavage,  dengan  volume  0.3  mL/hewan  uji, setiap  pagi  hari,  selama  21  hari  berturut-turut. Bobot  badan  hewan  uji  diukur  setiap  1  minggu sekali,  sedangkan  konsumsi  pakan  dan  minum diukur setiap hari.
Setelah  perlakuan  berakhir,  hewan  uji dipuasakan selama 12 jam. Bobot hewan uji diukur sebelum  hewan  uji  dikorbankan  dengan  cara
anestesi menggunakan chloroform. Darah diisolasi langsung  dari  bagian  jantung,  menggunakan syringe dengan  ukuran  1  mL  dengan needle No. 23G.  Darah  yang  berhasil  ditampung,  selanjutnya ditempatkan  pada  tabung  yang  mengandung EDTA,  selanjutnya  disentrifus  3000  rpm.  Plasma darah  dipisahkan  dan  ditempatkan  pada  tabung eppendorf  untuk  analisa  kadar  Hb  dan  eritrosit. Analisa kadar Hb dan jumlah eritrosit dilakukan di Laboratorium  Wahana,  Semarang.  Efek  paparan ekstrak  ethanol  daun  Nimba  terhadap  kadar  Hb dan  eritrosit  ditentukan  dengan  membandingkan kadar  Hb  dan  eritrosit  hewan  uji  pada  kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.

## Analisis Data
Data  berupa  kadar  Hb  dan  jumlah  eritrosit dianalisa  dengan  ANOVA.  Hasil  ANOVA menunjukkan perbedaan bermakna maka dilanjutkan  dengan  uji  DMRT  pada  taraf signifikasi 5%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  pengamatan  terhadap  hewan  uji selama perlakuan  berlangsung menunjukkan terjadi kematian 3 hewan uji. Kematian hewan uji dialami  oleh  1  ekor  mencit  pada  kelompok perlakuan  P2  dan  2  ekor  mencit  pada  kelompok perlakuan  P3.  Hal  tersebut  dapat  diartikan  bahwa dosis  dan  lama  paparan  bahan  uji  mempengaruhi ketahanan hidup hewan uji.
Hasil  pengukuran  kadar  hemoglobin  dan penghitungan jumlah eritrosit disajikan pada Tabel 1. Hasil ANOVA terhadap rerata kadar hemoglobin  menunjukkan  perbedaan  bermakna (p<0.05)  antara  hewan  uji  pada  kelompok  kontrol (14,26±0.671)  dan  hewan  uji  pada  kelompok perlakuan.    Hasil  uji  lanjut  DMRT  dengan  taraf signifikansi  0.5%  menunjukkan  bahwa  rerata kadar  hemoglobin  pada  kelompok  perlakuan  P1 (12,42±0.234)  tidak  berbeda  bermakna  (p>0.05) dengan  kelompok  perlakuan  P2  (12,25±0.862) maupun  P3  (11.95±0.457).  Hal  tersebut  juga menunjukkan  bahwa  dosis  perlakuan  P3  (14 mg/ekor/hari)  memberikan  penurunan  kadar  Hb yang paling besar.
Tabel  1.  juga  menunjukkan  bahwa  hasil ANOVA terhadap rerata jumlah eritrosit menunjukkan perbedaan bermakna (p<0.05) antara hewan  uji  pada  hewan  uji  kelompok  kontrol (8.83±0.662)  dan  kelompok  perlakuan.  Hasil  uji lanjut  DMRT  dengan  taraf  signifikansi  0.5%
menunjukkan  perbedaan  tidak  bermakna  (p>0.05) pada  jumlah  eritrosit  pada  hewan  uji  kelompok perlakuan  P1  (7.15±0.567)  dan  P2  (7.00±0.453), tetapi menunjukkan perbedaan bermakna (p<0.05) dengan  hewan  uji  kelompok  perlakuan  P3 (5.83±0.239).
Tabel 1. Rerata kadar hemoglobin dan jumlah eritrosit mencit jantan setelah perlakuan dengan ekstrak etanol daun Nimba
Hb (g/dL) X ± SD Eritrosit (x10 6 ) X ± SD P0 (n=6) 14.26 a ± 0.671 8.83 a ± 0.662 P1 (n=6) 12.42 b ± 0.234 7.15 b ± 0.567 P2 (n=5) 12.25 b ± 0.862 7.00 b ± 0.453 P3 (n=4) 11.95 b ± 0.457 5.83 c ± 0.239
Keterangan: Hasil penelitian disajikan dalam bentuk rerata (X) dan simpangan baku (SD) Angka yang diikuti superksrip yang sama pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan tidak bermakna pada taraf signifikansi 5%. Hb: Hemoglobin.
Penelitian  ini  hanya  mengamati  kadar hemoglobin dan jumlah eritrosit hewan uji setelah paparan  ekstrak  etanol  daun  nimba.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  kadar  hemoglobin dan  jumlah  eritrosit  hewan  uji  dipengaruhi  oleh paparan ekstrak etanol daun Nimba selama 21 hari.
Hasil pengukuran kadar hemoglobin juga menunjukkan  pola  yang  sama  dengan  jumlah eritrosit  hewan  uji,  semakin  besar  dosis  maka semakin  rendah  kadar  hemoglobin  dan  jumlah eritrosit, disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. Komparasi kadar hemoglobin (g/dL) dan jumlah eritrosit (x10 6 ) mencit jantan setelah pemberian ekstrak etanol daun Nimba selama 21 hari
Etim et  al .  (2014)  menyatakan  bahwa hemoglobin  dan  eristrosit  merupakan  komponen hematologi.  Kedua  komponen  tersebut  dapat digunakan  sebagai  sarana  untuk  memantau toksisitas suatu bahan terutama yang
mempengaruhi darah serta status kesehatan hewan. Eritrosit  atau  sel  darah  merah  berfungsi  sebagai pembawa  hemoglobin.  Hemoglobin  inilah  yang bereaksi dengan oksigen yang dibawa dalam darah untuk membentuk oksihemoglobin selama
Kadar Hemoglobin Dan Jumlah Eritrosit Mencit (Mus musculus) Jantan setelah Perlakuan dengan Ekstrak Etanol Daun Nimba (Azadirachta indica)
respirasi  (Opara et  al .,  2010).  Hasil  penelitian Benkovic et  al .  (2012)  menunjukkan  bahwa konsentrasi  haemoglobin  dan  jumlah  sel  darah merah  pada  mencit  yang  normal  adalah  12,79 (g/dL)  untuk  kadar  hemolgobin  dan  8,77  (x10 6 ) untuk  jumlah  eritrosit.  Hasil  penelitian  Akin- Osanaiye et al . (2015) menunjukkan bahwa mencit kelompok  kontrol  memiliki  kadar  hemoglobin 15,90  (g/dL).  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan bahwa  kadar  hemoglobin  dan  jumlah  eritrosit hewan  uji  kelompok  kontrol  berada  pada  nilai normal. Berdasarkan hasil tersebut, dapat dipastikan bahwa perbedaan rerata antara kelompok  kontrol  dan  perlakuan  disebabkan  oleh bahan uji yang diberikan.
Ekstraksi  bahan  uji  dalam  penelitian  ini dilakukan  menggunakan  etanol.  Samsudin  (2011) menyatakan  bahwa  etanol  dapat  melarutkan  zat yang  memiliki  polaritas  rendah  sampai  tinggi. Etanol  juga  menghasilkan  bahan  aktif  yang optimal  dan  tidak  beracun.  Ekstraksi  etanol  juga memungkinkan alkaloid, saponin, serta tanin dapat larut  (Bansal et  al .,  2014).  Bahan  aktif  yang terlarut melalui ekstraksi etanol diduga menyebabkan  perbedaan  respon  hewan  uji,  baik antara  kelompok  kontrol  dengan  kelompok perlakuan  ataupun  hewan  uji  antar  kelompok perlakuan.    Francis et  al .  (2002)  menyatakan bahwa  saponin  merupakan  senyawa  antifertilitas yang  mempunyai  pengaruh  negatif  terhadap reproduksi  ternak,  seperti  aborsi  atau  kematian, menyebabkan  steril  dan  penghentian  proses kebuntingan. Bottger and Melzig (2013) menyatakan  bahwa  saponin  beraksi  dengan  cara mengganggu  stabilitas  membran  sel.  Gangguan membran  sel  yang  disebabkan  oleh  keberadaan saponin dalam bahan uji diduga menjadi penyebab penurunan  jumlah  eritrosit  dan  kadar  hemoglobin pada hewan uji kelompok perlakuan.
Setyowati  dkk.  (2015)  menyatakan  bahwa senyawa  lain  yang  dapat  larut  dengan  pelarut etanol  adalah  tanin.  Tanin  merupakan  metabolit sekunder  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan tumor.  Tanin  mempunyai  efek  anti  mitotik  dan bersifat  sitotoksik  pada  sel  yang  mengalami pembelahan  cepat.  Sifat  sitotoksik  yang  dimiliki oleh tanin diduga menyebabkan penurunan jumlah
eristrosit  pada  hewan  uji  kelompok  perlakuan, seperti yang terjadi dalam penelitian ini.
Subashree et  al .  (2014)  menyatakan  bahwa sel  darah  merah  berperan  dalam  pengangkutan oksigen  dan  karbon  dioksida  di  dalam  tubuh. Gangguan  fungsi  sel  darah  merah  sebagai  akibat paparan  bahan  uji  dalam  ekstrak  etanol  daun Nimba,  diduga  menjadi  penyebab  gangguan distribusi oksigen dan karbondioksida pada hewan uji  sehingga  menyebabkan  kematian  hewan  uji pada  kelompok  perlakuan  P2  dan  P3.  Kematian yang  terjadi  pada  hewan  uji  pada  kelompok perlakuan  P2  dan  P3  juga  diduga  terjadi  karena semakin  tinggi  dosis  yang  diberikan  akan menyebabkan  semakin  tingginya  senyawa  aktif yang bersifat toksik terhadap hewan uji.

## KESIMPULAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  kadar hemoglobin  dan  jumlah  eritrosit  mengalami penurunan yang berbeda bermakna sehingga dapat disimpulkan  bahwa  penggunaan  esktrak  etanol daun Nimba secara oral selama 21 hari berpotensi mengganggu kesehatan serta menurunkan kebugaran hewan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih  kepada Dekan  Fakultas  Sain  dan  Matematika  atas dukungan  dana  yang  diberikan  melalui  proyek PNBP  Fakultas  Sains  dan  Matematika  dengan Nomor Kontrak: 1643B/UN7.5.8/PP/2017 Tanggal 3 April 2017.

## DAFTAR PUSTAKA
Akin-Osanaiye,  B.  C.,  A.J.Nok,  E.  Amlabu,  E. Haruna,  2015.  Assessment  of   Changed in Serum  Haematological  Parameters  in  the Plasmodium berghei Infected Albino Mice Treated  with  Neem  ( Azadirachta  indica ) Extracts. International Journal of Chemical  and  Biomolecular  Science . 1(3): 148-152.
Asif  M.,  2013.  A  Review  on  Spermicidal Activities  of  Azadirachta  indica. Journal  of
Pharmacognosy  and  Phytochemistry. 1(5): 61-79.
Auta,  T.  and  A.T.  Hassan,  2016.  Reproductive toxicity  of  aqueous  wood-ash  extract  of
Azadirachta  indica (Neem)  on  male  albino mice. Asian Pacific Journal of Reproduction . X(x): 1-5.
Bansal  P,  R.  Bansal  R,  V.  Gupta,  2010. Antifertility  effects  of Azadirachta  indica
(Neem)  -  A  Review. Annals  of  Biological Research . 1(2): 108-113.
Benkovic, V., D. Dikic, T. Grgorinic, M. Mladinic, D.Z. Eljezic, 2012. Haematology and Blood
Chemistry  Changes  in  Mice  Treated  with Terbuthylazine and its Formulation Radazin TZ-50.  Bull  Environ  Contam  Toxicol.  89:
955–959.
Bottger,  S.  and M.F.  Melzig,  2013.  The  influence of saponins on cell membrane cholesterol. J.
Med. Chem. 21: 7118–7124.
DeOliveira,  J.G.,  A.P.  Vitoria,  2011.  Papaya: Nutritional
and
pharmacological
characterization,  and  quality  loss  due  to physiological disorders. An overview. Food Research International 44: 1306-1313.
Etim,  N.N.,  M.E.  Williams,  U.  Akpabio,  E.E.A. Offiong,  2014.  Haematological  Parameters and  Factors  Affecting  Their  Values.
Agricultural Science. 2(1): 37-47.
Francis, G., Z. Kerem, H.P.S. Makkar, K. Becker. 2002.  The  Biological  action  of  saponins  in animal  system:  review. British  Journal  Of Nutrition. 88: 587-605.
Jasper,  R.,  G.  O.  Locatelli,  C.  Pilati,  C.  Locatelli, 2012. Evaluation of biochemical,
hematological  and  oxidative  parameters  in mice  exposed  to  the  herbicide  glyphosate- Roundup.  Interdiscip  Toxicol.  5(3):  133–
140. Joshi,  M.,  K.  Gaonkar,  S.  Mangoankar,  S. Satarkar, 2011. Pharmacological
investigation  of  Areca  catechu  extracts  for evaluation of learning, memory and behavior  in  rats. International  Current Pharmaceutical Journal . 1(6): 128-132.
Kupradinun,  P.,  A.  Tepsuwan,  N.  Tanthasri,  N. Meesiripan,  S.  Tunsakul,  W.  Tompat,  Y. Jarratwisautpom,  W.R.  Kusamran,  2012. Toxicity  Testing  of  Flowers  of  Neem  Tree ( Azadirachta  indica A.  Juss). Thai  J.  Vet.
Med . 40(1): 47-55.
Opara,  M.N.,  N.  Udevi,  and  I.C.  Okoli,  2010. Haematological  Parameters  And  Blood Chemistry  Of  Apparently  Healthy  West African  Dwarf  (Wad)  Goats  In  Owerri, South  Eastern  Nigeria.  New  York  Science Journal. 3(8): 68.
Samsudin,  2011, Biosintesa  Dan  Cara  Kerja Azadirachtin Sebagai Bahan Aktif Insektisida Nabati , Balai Penelitian Tanaman  Rempah  dan  Aneka  Tanaman Industri, Sukabumi.
Setyowati,  E.A.W.,  D.R.S.  Ariani,  Ashadi,  B. Mulyani,  A.  Hidayat.  2015.  Aktivitas Antifertilitas  Kontrasepsi  dari  Kulit  Durian ( Durio  zibethinus Murr.)  Varietas  Petruk. program  Studi  Pendidikan  Kimia  Jurusan FMIPA FKIP UNS, Surakarta.
Sharma,  R.K.,  A.K.  Goyal,  R.A.  Bhat,  2013.
Antifertility  of  Plants  Extracts  on  Female Reproduction:  A  Review. IJBS .  3(3):  493- 514.
Sitasiwi,  A.J.  dan  S.M.  Mardiati,  2016.  Effect  of Carica  papaya Seeds  Water  Extract  on
Haematological Parameters of mice.
Proceeding 6 th ISNPINSA.
Sitasiwi, A.J., S. Isdadiyanto, S.M. Mardiati, 2017. The  estradiol  17-β  concentration  in  mice after  treated  with  ethanolic  leaf  extract  of
Azadirachta  indica (neem).  Proceeding  of International Conference on Global Resource and Conservation. AIP Conference Proceeding. doi: 10.1063/1.4983425.
Subashree,  A,R.,  P.J.  Phrameswari,  B.  Shanti,  C. Revathy,  B.O.  Parijatham,  2014.  The reference  intervals  for  the  healthy  adult population  of  Chennai,  Southern  India. Journal of Clinical and Diagnostic research. 6(10): 1675-1680.
Kadar Hemoglobin Dan Jumlah Eritrosit Mencit (Mus musculus) Jantan setelah Perlakuan dengan Ekstrak Etanol Daun Nimba (Azadirachta indica)
Suryawanshi,  J.A.S.  2011.  Neem  -  natural contraceptive  for  male  and  female-an overview. International Journal of Biomolecules and Biomedicine . 1(2): 1-6.
Umadevi, K., P.K. Sampath Khumar, D. Bhownik,
S.  Duraivel,  2013.  Medicinal  Plants  with Potential  Antifertility  Activities. Journal  of Medicinal Plants Studies . 1(1): 26-33.