## PERBANDINGAN AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM TIROSINASE  OLEH  FRAKSI  ETIL  ASETAT  DAUN  PATIKALA
( Etlingera elatior ) DAN HIDROKUINON SECARA In Vitro
1| Selfyana Austin Tee, 2| Apriyanto, 3| Musdalipah, 4| Elfirah Email Korespondensi : musdalipahapt@gmail.com
ABSTRACT

## ARTICLE INFO

## Pendahuluan
Tanaman  genus  etlingera  merupakan  salah  satu  bahan  alam  yang  melimpah  di  Sultra  tetapi belum termanfaatkan, sehingga perlu dilakukan kajian dari berbagai aspek (1). Etlingera elatior dikenal  dengan  nama  kecombrang  (Ind.),  wualae    (suku  Tolaki),  pacikala  (suku  Bugis). Masyarakat  di  Sulawesi  menggunakan  buah E.  elatior sebagai  campuran  masakan  berbahan baku ikan seperti kapurung (Bugis) dan sinonggi (Tolaki). Daun dan rhizoma tanaman E. elatior memiliki  aktivitas  antioksidan,  antibakteri  dan  penghambat  enzim  tirosinase  (2).  Ekstrak  air bunga tanaman ini juga bersifat antioksidan (27) dan ekstrak bijinya bersifat sitotoksik terhadap sel  murine  leukemia  P-388  (3).  Potensi  yang  ditunjukkan  oleh E.  elatior tidak  terlepas  dari kandungan kimia yang dimilikinya. Daun E. elatior menghasilkan turunan asam sinamat seperti asam 3-O-kafeoilkuinat, asam 5-O- kafeoilkuinat (asam klorogenat, and asam 5-O- kafeoilkuinat- metil ester (4).
Enzim  adalah  protein  yang  memiliki  aktivitas  katalis,  yaitu  mempercepat  reaksi  kimia  pada sistem  biologis.  Salah  satu  enzim  yang  berada  dalam  tubuh  adalah  enzim  tirosinase.  Enzim tirosinase merupakan jalur utama dalam proses pigmentasi sehingga menimbulkan pigmen (5). Enzim  tirosinase  dapat  menjadi  penentu  laju  katalis  dalam  proses  melanogenesis,  yaitu hidroksilasi  L-tirosin  menjadi  L-DOPA  dan  katalisator  perubahan  L-DOPA  menjadi  L- dopaquinone 2 .  Permasalahan  yang  terjadi  pada  kulit  begitu  kompleks,  antara  lain  kelainan pigmentasi  seperti  hiperpigmentasi.  Hiperpigmentasi  adalah  suatu  keadaan  bertambahnya jumlah  melanin  pada  lapisan  kulit  yang  mengakibatkan  perubahan  warna  kulit  menjadi  lebih gelap (6).
Dewasa  ini,  diberbagai  negara  khususnya  di  Indonesia  biaya  pelayanan  kesehatan  semakin meningkat (7). Salah satunya ialah hiperpigmentasi. Di Indonesia hiperpigmentasi yang banyak terjadi  yaitu  melasma.  Melasma  adalah  salah  satu  kelainan  pigmentasi  akibat  peningkatan jumlah  melanin  didalam  epidermis  maupun  dermis  berupa  bercak  cokelat,  abu-abu  atau  biru ireguler  di  wajah  dan  leher.  Hiperpigmentasi  dapat  mengakibatkan  beban  psikologis  yang mendalam bagi pasien, terutama ketika terletak pada wajah, leher, atau tangan (8).
Etlingera is one of the genus Zingiberacea which consists of 150 - 200 species in the world, and there are 48 species that grow in Sulawesi and 14 species of which are scattered in Sulawesi. Patikala (Etlingera elatior) has a bioactive compound in the form of flavonoids. Withdrawal of flavonoid compounds in plants is carried out using ethyl acetate solvents. One of the enzymes in the body is the tyrosinase enzyme. The tyrosinase enzyme  is  the  main  pathway  in  the  pigmentation  process,  causing  melanin  pigment.  This  study  aims  to compare the inhibitory activity of the tyrosinase enzyme in the paticala fraction of ethyl acetate (Etlingera elatior)  and  hydroquinone  in  vitro.  The  research  method  used  was  a  quasi  experimental consisting  of  the treatment group and the control group with measurements made after the treatment was given (posttest only design with non equivalent group). Concentration of ethyl acetate fraction of patikala leaves used were 7.8125 µg / mL, 15,625 µg / mL, 31.25 µg / mL, 62.5 and 125 µg / mL with positive control of hydroquinone, respectively. Based on the results obtained, Inhibitory activity of the tyrosinase enzyme by the paticala leaf ethyl acetate fraction with a concentration of 125 μg. The inhibitory activity of the tyrosinase enzyme by both samples increased with increasing concentration.
Keywords: Patikala Leaf; Fraction; Ethyl Acetate;
Hydroquion.
DOI: 10.24252/kesehatan.v13i1.10309
1, 2, 3, 4 Politeknik Bina Husada Kendari, Indonesia
Selfyana Austin Tee, Apriyanto,, Musdalipah, Elfirah. Perbandingan Aktivitas Penghambatan Enzim Tirosinase Oleh Fraksi Etil Asetat Daun Patikala (Etlingera Elatior) Dan Hidrokuinon Secara In Vitro. Jurnal Kesehatan. Vol 13 (1) 2020
Pembentukan  melanin dapat dihambat dengan  cara  menghambat  enzim tirosinase. Salah  satu tumbuhan  yang  mampu  menghambat  enzim  tirosinase  adalah  Patikala  ( Etlingera  elatior ). Patikala  ( Etlingera  elatior )  memiliki  senyawa  bioaktif  berupa  flavonoid  (9).  Kandungan flavonoid  pada  tanaman  memiliki  efek  antioksidan  dan  ampuh  menghambat  secara  langsung aktivitas  tirosinase  pada  proses  melanogenesis.  Penarikan  senyawa  flavonoid  pada  tanaman dilakukan  dengan  menggunakan  fraksi  etil  asetat  yang  merupakan  pelarut  semi  polar  yang dapat  menarik  senyawa  flavonoid.  Berdasarkan  penelitian  Handayani  (10)  esktrak  metanol daun Patikala memiliki aktivitas antioksidan yang kuat dengan nillai IC 50 30,65 mg/mL.

## Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah Plat mikro-96 sumuran, inkubator, beaker, labu ukur, corong pisah, Rotary  Vacum  Evaporator , microplate  reader ,  pH  meter,  bejana  maserasi,  batang  pengaduk, pipet mikro, microtube 1,5 mL, timer, timbangan analitik, vortex , dan rotator mixer. Bahan yang digunakan yaitu Daun patikala ( Etlingera elatior ), ekstrak kental daun patikala, fraksi etil asetat daun  patikala,  etanol  96%,  etil  asetat, n -heksan,  KH2PO4,  NaOH,  L-DOPA,  enzim  tirosinase, aquades, DMSO, dan hidrokuinon.

## Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Dipetik  sampel  daun  patikala  satu  persatu  menggunakan  pisau  pada  jam  09.00-11.00  WITA. Disortasi  basah  dan  dicuci  sampel  dengan  air  mengalir,  kemudian  ditiriskan  dan  diangin- anginkan. Dirajang daun patikala dan dikeringkan sampel di bawah sinar matahari ditutupi kain hitam. Disortasi kering sampel kemudian ditimbang simplisia dan diserbukkan.

## Pembuatan ekstrak
Dimasukkan serbuk daun patikala ke dalam wadah maserasi. Ditambahkan pelarut etanol 96% hingga  serbuk  simplisia  terendam.  Dibiarkan  selama  3-5  hari  sambil  sesekali  diaduk.  Setelah proses  ekstraksi  pertama  selesai,  ampasnya  dimaserasi  kembali  dengan  cairan  penyari  yang baru.  Ekstrak  yang  diperoleh  lalu  dipekatkan  dengan  menggunakan  alat Rotary  Vacum Evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.

## Fraksinasi
Ditimbang ekstrak kental daun patikala 10 gram. Dilarutkan dengan  aquadest sebanyak 5 mL. Dipartisi  dengan  15  mL  pelarut n -heksan dalam  corong  pisah sebanyak  3  kali, dan ekstrak n - heksan ditampung. Dipartisi residu dengan pelarut etil asetat sebanyak 15 mL sebanyak 3 kali. Diuapkan ekstrak etil asetat hingga diperoleh ekstrak kental etil asetat.

## Pembuatan Larutan Dapar Fosfat pH 6,8
Ditimbang  0,68045  gram  KH2PO4  kemudian  dilarutkan  dengan  aquades  sebanyak  50  mL (larutan stok A). Kemudian sebanyak 0,2 gram NaOH ditimbang dan dilarutkan dengan aquades sebanyak 50 mL (larutan stok B). Sebanyak 50 mL larutan stok A dimasukkan ke dalam beaker. Dipipet sebanyak 22,4 ml NaOH kemudian dimasukkan ke dalam beaker yang sama. Diukur pH, jika  pH  telah  menapai  6,8  maka  dicukupkan  dengan  aquades  hingga  100  mL.  Jika  pH  belum mencapai  6,8  maka  ditambahkan  NaOH  sedikit  demi  sedikit  hingga  mencapai  pH  yang diinginkan.

## Pembuatan Larutan L-DOPA 2 mM
Ditimbang 0,00394 gram L-DOPA. Ditambahkan 10 mL larutan dapar fosfat.
Selfyana Austin Tee, Apriyanto,, Musdalipah, Elfirah. Perbandingan Aktivitas Penghambatan Enzim Tirosinase Oleh Fraksi Etil Asetat Daun Patikala (Etlingera Elatior) Dan Hidrokuinon Secara In Vitro. Jurnal Kesehatan. Vol 13 (1) 2020

## Pembutan Larutan Tirosinase
Enzim  tirosinase  25  KU  dilarutkan  dengan  2  mL  dapar  fosfat.  Dipipet  400  µL  kemudian dimasukkan  ke  dalam  eppendorf  dan  ditambahkan  600  µL  dapar  fosfat.  Diperoleh  5000 Unit/mL. Dipipet 50 µL larutan enzim tirosinase 5000 Unit/ml kemudian ditambahkan 950 µL dapar  fosfat.  Diperoleh  250unit  enzim/mL  dalam  1 microtube. Enzim  tirosinase  yang  tidak digunakan, disimpan dalam freezer -20 0 C.

## Penyiapan Sampel dan Kontrol Positif
Fraksi etil asetat daun patikala ( Etlingera elatior ) ditimbang 0,5 mg. Dilarutkan dengan 50 µL DMSO  100%  kemudian  ditambahkan  950  µL  larutan  dapar  fosfat.  Diperoleh  larutan  stok ekstrak  500  µg/mL.  Dibuat  seri  konsentrasi  sampel  7,8125  µg/mL  hingga  125  µg/mL  dengan cara pengenceran bertingkat. Pembuatan kontrol positif dilakukan dengan cara ditimbang 8 mg hidrokuinon.  Dilarutkan  dengan  50  µL  DMSO  100%  kemudian  ditambahkan  950  µL  larutan dapar  fosfat.  Diperoleh  larutan  strok  hidroquinon  8000  µg/mL.  Dibuat  seri  konsentrasi hidrokuinon 31,25 µg/mL hingga 2000 µg/mL dengan cara pengenceran bertingkat.

## Pengujian Penghambatan Enzim Tirosinase
Dipipet  50  µL  fraksi  etil  asetat  daun patikala  dimulai  dari  konsentrasi  sampel  yang terendah. Dimasukkan  ke  dalam well sampel  dan well kontrol  warna  sampel  fraksi  etil  asetat  daun patikala.  Dipipet  50  µL  hidrokuinon  dimulai  dari  konsentrasi  hidrokuinon  yang  terendah. Dimasukkan  ke  dalam well hidrokuinon  dan well kontrol  warna  hidrokuinon.  Dipipet  90  µL larutan  dapar  ke  dalam well semua  well  yang  digunakan  ( well sampel, well kontrol  warna sampel, well hidrokuinon , well kontrol warna hidrokuinon , well L- DOPA). Dipipet 30 µL enzim tirosinase.  Dimasukkan  ke  dalam well sampel .  Well hidrokuinon , dan well  L- DOPA.  Diinkubasi selama 30 menit. Dipipet 30 µL L-DOPA. Dimasukkan ke dalam well sampel , well hidrokuinon , dan well  L- DOPA.  Dihomogenkan  di  atas  rotator  mixer  selama  5  menit.  Diukur  serapannya menggunakan panjang gelombang 490 nm. Untuk menentukan persen inhibisi dihitung dengan rumus berikut:
% Inhibisi Tirosinase = [ 𝐴−𝐵 𝐴 ] × 100%
Keterangan :
A = serapan larutan kontrol negatif
B = serapan larutan sampel yang telah dikurangi serapan kontrol warna sampel

## Hasil dan Pembahasan
Daun patikala diekstraksi menggunakan metode maserasi yang merupakan salah satu metode ekstraksi  dingin  menggunakan  pelarut  etanol  96%.  Keuntungan  dari  metode  maserasi  yaitu pengerjaanya yang sederhana serta alat yang digunakan mudah diperoleh. Ekstrak etanol daun patikala yang diperoleh kemudian difraksinasi menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat dengan  metode  partisi  cair-cair.  Pemilihan  etil  asetat  sebagai  pelarut  dikarenakan  senyawa kimia flavonoid pada tanaman  dapat ditarik menggunkan pelarut etil asetat yang merupakan pelarut  semi  polar  yang  dapat  menarik  senyawa  flavonoid.  Fraksinasi  bertujuan  untuk memisahkan  komponen  penyusun  daun  patikala  berdasarkan  tingkat  kepolarannya  menjadi lebih sederhana. Proses fraksinasi dengan pelarut organik yang berbeda tingkat kepolarannya akan mempengaruhi jenis dan kadar senyawa yang terekstrak .
Uji  penghambatan  enzim  tirosinase  dilakukan  pada  panjang  gelombang  maksimum  490  nm dengan penambahan L-DOPA pada tiap well pengujian sebanyak 250 U/mL pada suhu 37°C dan diinkubasi  selama  30  menit.  Tujuan  dilakukan  inkubasi  adalah  menjaga  suhu  tetap  optimum
untuk kecepatan  reaksi  enzim .  Kontrol  positif  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah hidrokuinon. Pemilihan hidroquinon dikarenakan hidrokuinon merupakan bahan pemutih yang sangat  sering  digunakan  pada  krim  pemutih,  terutama  untuk  melasma  dan  kelainan hiperpigmentasi  dengan  mekanisme  kerja  menghambat  kerja  enzim  tirosinase,  merusak  sel melanosit  secara  langsung,  mempercepat  degradasi  melanosom,dan  menghambat  sintesis enzim melanogenesis (11). Kadar hidrokuinon yang diperbolehkan beredar di pasaran yaitu 2%, lebih dari itu dipergunakan sebagai obat dan harus dengan resep dan pengawasan dokter (12) .
Konsentrasi sampel yang digunakan berturut-turut yaitu 7.8125 µg/mL, 15.625 µg/mL, 31.25 µg/mL, 62.5 µg/mL dan 125 µg/mL. Dari konsentrasi sampel di atas terdapat penurunan aktivitas enzim tirosinase yang diperoleh dengan persen hambatan berturut-turut yaitu 28.84%, 42.34%, 55.88%, 65.72%, dan 71.07%. Gambar 1 menunjukkan aktivitas penghambatan enzim tirosinase dari fraksi etil asetat daun patika yang meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi sampel.
Konsentrasi  hidrokuinon  yang  digunakan  yaitu  berturut-turut  31,25  µg/mL,  125  µg/mL,  500 µg/mL,  1.000  µg/mL,  2.000  µg/mL.  Dari  konsentrasi  hidroquinon  di  atas  diperoleh  persen hambatan  berturut-turut  yaitu  11.09%,  39.87%,  54.64,  62.00%,  dan  70.66%.  Gambar  2 menunjukkan  aktivitas  penghambatan  enzim  tirosinase  dari  hidrokuinon  yang  meningkat seiring  dengan  meningkatnya  konsentrasi  hidrokuinon  yang  digunakan.  Kontrol  hidrokuinon dimulai  dari  konsentrasi  31,25  µg/mL  dikarenakan  pada  konsentrasi  di  bawah  31,25  µg/mL hidrokuinon masih belum memberikan perubahan warna yang menandakan hidrokuinon belum memberikan  efek  penghambatan  terhadap  enzim  tirosinase.  Sampel  yang  memiliki  aktivitas
28,84 ± 16,06 42,34 ± 6,83 55,88 ± 5,27 65,72 ± 2,57 71,07 ± 9,23 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 A B C D E Ak tivi tas P en gh am b tan ( % ) Fraksi etil asetat daun patikala Gambar 1 Aktivitas penghambatan enzim tirosinase oleh fraksi etil asetat daun patikala dengan seri konsentrasi  A=7.8125 µg/ml, B=15.625  µg/mL, C=31.25 µg/mL, D=62.5 µg/mL dan E= 125 µg/mL.
11,09 ± 10,16 39,87 ± 6,4 54,64 ± 2,74 62 ± 4,9 70.66 ± 6,22 0 20 40 60 80 100 A B C D E Ak tivi tas
P en gh am b at an ( % ) Hidrokuinon
Gambar 2 Aktivitas penghambatan enzim tirosinase oleh hidrokuinon dengan seri konsentrasi hidrokuinon yang digunakan; A= 31,25  µg/ml, B=125 µg/ml, C= 500 µg/ml, D= 1.000  µg/ml dan E=2.000 µg/ml.
Selfyana Austin Tee, Apriyanto,, Musdalipah, Elfirah. Perbandingan Aktivitas Penghambatan Enzim Tirosinase Oleh Fraksi Etil Asetat Daun Patikala (Etlingera Elatior) Dan Hidrokuinon Secara In Vitro. Jurnal Kesehatan. Vol 13 (1) 2020
inhibitor  tirosinase  akan  menurunkan  intensitas  warna  coklat  keunguan.  Warna  coklat keunguan  merupakan  warna  dari  dopakrom  yang  terbentuk  sehingga  dapat  diukur penghambatannya .

## Kesimpulan
Perbandingan  aktivitas  penghambatan  enzim  tirosinase  oleh  Fraksi  etil  asetat  daun  patikala dengan konsentrasi 125 µg/mL sebesar 71,07% dan kontrol positif sebesar  39.87%. Aktivitas penghambatan  enzim  tirosinase  oleh  kedua  sampel  meningkat  seiring  dengan  meningkatnya konsentrasi.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih ditujukan pada Kementerian Riset Teknologi dan Pendidikan Tinggi yang telah membiayai penelitian ini hingga selesai pada skim Penelitian Dosen Pemula.

## Daftar Pustaka
1.   Sahidin  SS,  Wahyuni  W,  Adryan  F,  Imran  I.  Potensi  Antibakteri  Ekstrak  Metanol  dan Senyawa Aromatik dari Buah Wualae (Etlingera elatior). J Kim Val [Internet]. 2019;5(1):1 – 7. Available from: http://journal.uinjkt.ac.id/index.php/valensi/article/view/8658
2.   CE F, ML S, Susiarti S LD, Irawati C AJ. Inhibition of human pathogenic fungi by members of Zingiberaceae  used  by  the  Kenyah  (Indonesian  Borneo).  Natl  Cent  Biotechnol  Inf  Search database. 2003;85(2 – 3):289 – 93.
3.   A  R,  D  S,  T  R,  Adawiah.  Profil  fraksi  sitotoksik  terhadap  sel  murine  leukemia  P-388  dari ekstrak biji honje (Etlingera elatior). J Kim Val [Internet]. 2017;3(1):79 – 87. Available from: http://journal.uinjkt.ac.id/index.php/valensi
4.   Chan EWC, Lim YY, Ling SK, Tan SP, Lim KK, Khoo MGH. Caffeoylquinic acids from leaves of Etlingera species (Zingiberaceae). LWT - Food Sci Technol. 2009 Jun 1;42(5):1026 – 30.
5.   Ramsdena  CA,  Rileyb  PA.  Mechanistic  studies  of  tyrosinase  suicide  inactivation.  Arkivoc [Internet].  2010  Jul  30  [cited  2020  Sep  24];2010(1):260.  Available  from: http://hdl.handle.net/2027/spo.5550190.0011.107
6.   Wahyuni  R.  Pengaruh  Intervensi  Iontophoresis  Ser-C  Dengan  Terhadap  Hiperpigmentasi Kulit  Wajah  [Internet].  Universitas  Muhammadiyah  Surakarta;  2012.  Available  from: http://eprints.ums.ac.id/20567/
7.   Musdalipah  M,  Setiawan  MA,  Santi  E.  ANALISIS  EFEKTIVITAS  BIAYA  ANTIBIOTIK SEFOTAXIME  DAN  GENTAMISIN  PENDERITA  PNEUMONIA  PADA  BALITA  DI  RSUD KABUPATEN BOMBANA PROVINSI SULAWESI TENGGARA. J Ilm Ibnu Sina [Internet]. 2018 Mar  31  [cited  2020  Sep  24];3(1):1 – 11.  Available  from:  http://jiis.akfar- isfibjm.ac.id/index.php?journal=JIIS&page=article&op=view&path[]=104
8.   Moioli  EK,  Bakus  AD,  Yaghmai  D,  Hernandez  C.  Treatment  strategies  for  pigmentation disorders in skin of color. Cosmet Dermatology [Internet]. 2011;24(11):524 – 31. Available from: https://www.mdedge.com/dermatology/article/70024/pigmentation-
disorders/treatment-strategies-pigmentation-disorders-skin
9.   Chan EWC, Lim YY, Wong LF, Lianto FS, Wong SK, Lim KK, et al. Antioxidant and tyrosinase inhibition properties of leaves and rhizomes of ginger species. Food Chem [Internet]. 2008
Aug 1 [cited 2020 Sep 24];109(3):477 – 83. Available from:
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814608001775
10.   Handayani  V,  Ahmad  AR,  Sudir  M.  Uji  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Metanol  Bunga  dan Daun Patikala (Etlingera elatior (Jack) R.M.Sm) Menggunakan Metode DPPH. Pharm Sci Res [Internet].  2014  Aug  21  [cited  2020  Sep  24];1(2):86 – 93.  Available  from: http://psr.ui.ac.id/index.php/journal/article/view/3321
11.   Sofiana  R,  Wiraguna  AAGP,  Pangkahila  W.  Krim  ekstrak  etanol  biji  mengkudu  (Morinda citrifolia) sama efektifnya dengan krim hidrokuinon dalam mencegah peningkatan jumlah melanin  kulit  marmut  (Cavia  porcellus)  yang  dipapar  sinar  ultraviolet  B.  J  e-Biomedik [Internet]. 2017 Jan 18 [cited 2020 Sep 24];5(1). Available from:
https://ejournal.unsrat.ac.id/index.php/ebiomedik/article/view/15017 12.   Badan  POM  RI.  Kenalilah  Kosmetika  Anda,  Sebelum  Menggunakannya.  Info  POM. 2007;VII(4).