TOXICITY OF CHITOSAN OLIGOMER ENZYMATIC LOW DEGREE OF DEACETYLATION USING BRINE SRIMP LETHALITY TEST (BSLT) METHOD
Toksisitas Oligomer Kitosan Derajat Deasetilasi Rendah Enzimatis Menggunakan Metode Brine Srimp Lethality Test (BSLT)
Sarni 1
1 Midwifery Academic of National Healting Fondation, Jl. Palagimata, Baubau-Indonesia *Corresponding author, email: sarni_malik@yahoo.com
Received: Dec. 2016 Published: Jan. 2017

## ABSTRACT
Chitosan oligomers or  chitooligomer is a mixture of oligomers of D-glucosamine  which are formed through a process  of  depolymerization  of  chitosan  with  cuting  its  β-glycosidic  bonding.  Chitosan  oligomer  has  received much  attention  in  various  fields  because  of  the  specific  biological  activity  10  times  greater  than  chitosan. Chitosan oligomer having biological activity as antibacterial, antiviral, antioxidant, anti-tumor and anti-cancer. Before  it  is  applied  to  humans,  the  bioactive  compounds  to  be  used  as  pharmaceutical  products  must  pass  a preliminary test using test animals. BSLT method is often used to praskrining against bioactive compounds. This method  uses  shrimp  larvae  are  widely  used  in  searches  that  are  toxic  bioactive  compounds  from  natural materials. This study aims to determine the toxicity of chitosan oligomers enzymatic (crude) as a preliminary test before being used as a pharmaceutical product either as anti-cancer or anti microbial with BSLT method. The results showed chitosan oligomer (crude) hydrolysis of leather tiger shrimp chitosan (DD 60%) with chitosanase enzyme  for  each  time  of  incubation  has  strong  toxicity  properties  with  a  value  of  36.90  ppm  LC50  (1  hour incubation); 47.43 ppm (incubation 2 hours) and 104.86 ppm (incubation 3 hours).
Keywords : Chitosan Oligomers, Toxicity, BSLT

## PENDAHULUAN
Oligomer kitosan atau kitooligomer merupakan campuran oligomer dari D- glukosamin  yang  terbentuk  melalui  proses depolimerisasi  kitosan  dengan  memutus  ikatan β-glikosidik.  Kitooligomer  merupakan  kitosan yang  telah  terdepolimerisasi  sehingga  memiliki ukuran  dan  bobot  molekul  yang  lebih  kecil. Berkurangnya  bobot  molekul  dari  kitosan  ini menjadikan  sifatnya  lebih  mudah  larut  di  dalam air dibanding sebelum terdepolimerisasi (Srijanto dkk., 2006; Julianti dkk., 2012).
Oligomer  kitosan  dapat  dihasilkan  dengan iradiasi  sonik,  hidrolisis  secara  kimiawi  dan hidrolisis  secara  enzimatis.  Hidrolisis  secara kimiawi  dan  iradiasi  sonik  bersifat  acak,  tidak terkontrol, efisiensi yang rendah dan menghasilkan oligomer dengan derajat polimerisasi  (DP)  yang  rendah  dengan  lebih banyak  monomer  D-glukosamin.  Sedangkan, hidrolisis  secara  enzimatis  bersifat  spesifik, terkontrol, menghasilkan oligomer kitosan dengan  DP  yang  lebih  tinggi  dan  sedikit
glukosamin yang dihasilkan serta ramah lingkungan  (Jeon  dkk.,  2000;  Meidina  dkk., 2005;  Wahyuni  dkk.,  2006;  Liu  dkk.,  2007; Chasanah,  2010),  sehingga  cara  enzimatis  ini lebih  baik  dan  umumnya  digunakan  dalam memproduksi  Oligomer  kitosan.  Salah  satu enzim yang dapat digunakan untuk menghidrolisis  kitosan  adalah  enzim  kitosanase (Choi dkk., 2004).
Oligomer  kitosan  memiliki  manfaat  yang lebih  besar  jika  dibandingkan  kitin  maupun kitosan.  Oligomer  kitosan  menjadi  lebih  penting karena  memiliki  potensi  yang  tinggi  dan  dapat diaplikasikan  di  bidang  makanan  fungsional, bantuan  medis,  obat-obatan  dan  agen  pertanian (Yoon  dkk.,  2001).  Pada  bidang  biomedik, oligomer  kitosan  lebih  unggul  karena  mendekati 100% dapat diserap oleh  tubuh manusia. Hal ini berarti  bahwa  dalam  bentuk  yang  sederhana, kitosan  akan  lebih  mudah  dimanfaatkan  dalam metabolisme  (Pratitis  ,2006).  Oligomer  kitosan ini  mendapat  banyak  perhatian  di  berbagai bidang dikarenakan aktivitas spesifik biologisnya  (Hotmatua,  2004).  Aktivitas  dan
fungsi  biologis  oligomer  kitosan  10  kali  lebih besar  dibandingkan  kitosan  (Pratitis,  2006). Oligomer  kitosan  mudah  diserap  melalui  usus, cepat masuk ke dalam aliran darah dan memiliki efek  biologis  yang  sistemik  dalam  organisme karena  berat  molekulnya  yang  rendah  jadi karakteristik utama aktivitas biologisnya (Mourya  dkk.,  2011).    Oligomer  kitosan mempunyai aktivitas biologis sebagai antibakteri,  antivirus,  antioksidan,  antitumor, menurunkan  tekanan  darah  tinggi  (Struszczyk dkk., 2009),
antimikroba, hemostatik, penstimulasi  sistem  imun,  osteokonduktivity, anti  koagulan,  penurun  kolesterol  dan  masih banyak  lagi  sehingga  penggunaannya  dalam industri makanan dan farmasi serta dalam bidang medis semakin luas (Mourya dkk., 2011; Natalia, 2013).
Beberapa  penelitian  melaporkan  potensi oligomer  kitosan  dari  bahan  berkitin,  misalnya Pae  (2001)  melaporkan  terjadinya  induksi granulositik  pada  sel promyelocytic  leukemia (HL-60)  oleh water-soluble  chitosan  oligomer (WSCO).  Caiqin  Qin  dkk  (2002)  melaporkan kitosan  larut  dalam  air  secara  enzimatik  dan aktivitasnya sebagai anti tumor. Sri Wahyuni dkk (2006) melaporkan aktivitas anti kanker senyawa-senyawa  kitooligomer.  Qingsong  Xu dkk  (2007)  melaporkan  Oligomer  kitosan  dapat menginduksi apoptosis cell kanker hepatocellular pada manusia. Sanaa T. El-Sayed dkk  (2012)  melaporkan  Oligomer  kitosan  yang dihasilkan  dengan  kitosanase  dari Capsicum annuum efektif dalam menghambat sel karsinoma hepatocellular (HEP-G2),  sel  kanker usus  dan  sel  kanker  payudara  (MCF7)  pada konsentrasi yang berbeda.
Uji  toksisitas  adalah  suatu  uji  pendahuluan untuk  mengetahui  aktivitas  farmakologi  suatu senyawa.  Prinsipnya  komponen  bioaktif  selalu bersifat toksik jika diberikan dengan dosis tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah (Meyer dkk., 1982).  Sebelum  diaplikasikan  kepada  manusia, senyawa  bioaktif  yang  akan  digunakan  sebagai produk  farmasi  harus  melewati  uji  pendahuluan menggunakan hewan uji (Marwati, 2012).
Metode  BSLT  sering  digunakan  untuk praskrining  terhadap  senyawa  bioaktif  yang terkandung dalam ekstrak tumbuhan. Metode  ini menggunakan larva udang yang banyak digunakan  dalam penelusuran  senyawa  bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini
dapat digunakan sebagai bioassay-guided fractionation dari  bahan  alam  karena mudah, cepat, dan murah (Meyer dkk., 1982).
Oleh karena itu pada penelitian ini bertujuan untuk  mengetahui  toksisitas  dari  oligomer kitosan  sebagai  uji  pendahuluan  sebelum digunakan  sebagai  produk  farmasi  baik  itu sebagai anti kanker ataupun sebagai anti mikroba dengan metode BSLT.

## METODOLOGI

## Bahan
Bahan yang digunakan diantaranya Oligomer  kitosan  enzimatis  dengan  waktu inkubasi  1,2  dan  3  jam  dari  Kitosan  DD  60  % (Sarni,  2016),  CH 3 COOH  33%,  NaOCl  0,5  % (Merk),  air  laut  steril,  aquades,  telur Artemia Salina Leach .

## Alat
Alat  yang  digunakan  adalah  Micro  pipet, Aerator,  Lampu  TL  15  watt  serta  beberapa peralatan gelas ( pyrex ).

## Prosedur Kerja
A. Penyiapan Larva Artemia Salina Leach Telur Artemia  salina Leach  direndam dengan  aquades  selama  10  menit,  kemudian ditambah  beberapa  tetes  NaOCl  5%  dan  dicuci dengan  aquades.  Selanjutnya  telur Artemia salina Leach  dimasukkan  ke  wadah  berisi  air laut,  diaerasi  di  bawah  sinar  lampu  selama  24 jam.  Telur  akan  menetas  setelah  24  jam  dan menjadi  larva.  Larva  yang  berumur  2  hari  siap digunakan sebagai hewan uji
B. Persiapan Larutan Sample
Senyawa oligomer kitosan enzimatis inkubasi  1,  2  dan  3  jam  dibuat  larutan  stok dengan  konsentrasi  5000  ppm.  Selanjutnya, dibuat  seri  konsentrasi  sampel  sebesar  10;  20; 40;  80  dan  160  ppm  dari  larutan  stok  tersebut dengan  pengenceran  menggunakan  air  laut. Sebagai kontrol, digunakan pelarut air laut.

## C. Pelaksanaan Pengujian Sampel
Sepuluh  ekor  larva Artemia  salina Leach dimasukkan ke dalam  tabung yang berisi sampel dan  kontrol.  Volume  tabung  dicukupkan  hingga 5  mL  dengan  air  laut.  Masing-masing  perlakuan dan  kontrol  dilakukan  tiga  kali  ulangan.
Selanjutnya,  semua  tabung  diinkubasikan  di bawah lampu TL 15 watt selama 24 jam. Setelah diinkubasi,  jumlah  larva Artemia  salina Leach yang  mati  pada  tiap  tabung  dilihat  dengan bantuan  kaca  pembesar  dan  dihitung  untuk menentukan  persentase  kematiannya.  Nilai
Lethal Concentration (LC 50 ) dihitung menggunakan analisis probit.
Efek  toksisitas  dianalisis  dari  pengamatan dengan  persen  kematian  larva  menggunakan rumus (Meyer et al ., 1982):
Dengan mengetahui kematian larva Artemia salina Leach,  kemudian  dicari  angka  probit melalui  tabel  dan  dibuat  persamaan  garis  :    Y  = Bx + A Dimana,  Y = log konsentrasi, dan X = Angka probit Dari  persamaan  tersebut  kemudian  dihitung LC 50 dengan  memasukkan  nilai  probit  (50% kematian).  Apabila  pada  kontrol  ada  larva  yang mati, maka % kematian ditentukan dengan rumus Abbot (Meyer dkk., 1982).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Suatu  senyawa  dikatakan  sangat  toksik  jika nilai  LC 50 < 30 ppm,  toksik  jika  nilai  LC 50 30 – 1000 ppm dan jika nilai LC 50 > 1000 ppm. Nilai LC 50 Oligomer  kitosan  yang  dihasilkan  secara enzimatis untuk tiap waktu inkubasi dapat dilihat pada Tabel 1.

## Tabel 1. Hasil Uji toksisitas oligomer kitosan dengan metode BSLT
Sampel Jumlah larva sampel mati pada tiap konsentrasi LC 50
Kontrol 10 ppm 20 ppm 40 ppm 80 ppm 160 ppm - 2 2 3 3 4 3 3 3 3 3 3 2 4 2 3 Total kematian 8 7 10 8 10
% kematian 26,67 23,33 33,33 %  26,67 %  33,33 %
OK.
1 jam 7 9 8 7 10 36,90
ppm
7 8 8 8 9 (Toksik) 4 7 8 10 8 Total kematian 18 24 24 25 27 % kematian 60 % 80 % 80% 83,33% 90 %
OK. 2 jam 3 9 9 10 10 47,43 ppm (Toksik) 7 8 8 8 6 7 4 8 9 10 Total kematian 17 21 25 27 26 %
kematian 56,67 % 70% 83,33 %  90 % 86,67%
OK. 3 jam 4 5 6 7 10 104,86 ppm (Toksik) 4 4 7 7 10 5 4 4 6 10
Total kematian 13 13 17 20 30 % kematian 43,33%  43,33%  56,67 %  66,67 % 100 %
Oligomer kitosan untuk tiap waktu inkubasi memiliki  sifat  toksik  dengan  nilai  LC 50 yang semakin meningkat dari inkubasi 1 jam hingga 3 jam.  Nilai  LC 50 untuk  1,2  dan  3  jam  inkubasi berturut-turut 36,90 ppm; 47,43 ppm dan 104,86 ppm  (Tabel  1).  Semakin  kecil  nilai  LC 50 maka semakin  toksik  senyawa  tersebut.  Dengan demikian  tingkat  toksisitas  Oligomer  kitosan yang  dihasilkan  semakin  lama  waktu  inkubasi akan  semakin  berkurang.  Hal  ini  terjadi  karena semakin  lama  waktu  inkubasi  maka  akan semakin banyak monomer atau Oligomer kitosan dengan derajat polimerisasi rendah yang dihasilkan, yang mana bersifat tidak toksik.
Oligomer  kitosan  yang  dihasilkan  dari hidrolisis kitosan dari kulit udang windu (DD 60 %)  dengan  enzim  kitosanase  dari Klebsiella  sp untuk  tiap  waktu  inkubasi  bersifat  toksik berdasarkan  nilai  LC 50 ,  sehingga  memiliki potensi  untuk  dikembangkan  sebagai  obat  anti kanker. Dalam  hal  ini  Oligomer  kitosan  yang dihasilkan diuji lebih lanjut ke sitotoksisitasnya.
% kematian = 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑙𝑎𝑟𝑣𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑚𝑎𝑡𝑖 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑙𝑎𝑟𝑣𝑎 𝑢𝑗𝑖 𝑥 100 %

## KESIMPULAN
Hasil  penelitian  menunjukan  oligomer kitosan  ( crude )  hasil  hidrolisis  kitosan  dari  kulit udang  windu  (DD  60  %)  dengan  enzim kitosanase  untuk  tiap  waktu  inkubasi  memiliki sifat toksisitas kuat dengan nilai LC 50 36,90 ppm (inkubasi  1  jam);  47,43  ppm  (inkubasi  2  jam) dan 104,86 ppm (inkubasi 3 jam)

## DAFTAR PUSTAKA
Chasanah  E.,  2010.  Pengembangan  Produk Oligomer  kitosan  dari  Limbah  Industri Perikanan Udang Secara Enzimatis Prospek dan  Kendala.  Balai  Besar  Riset  Pengolahan Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan  dan Perikanan. J. Squalen Vol 5 (2).
Choi  J.Y.,  Kim  E.J.,  Piao  Z.,  Yun  Y.C.,  Shin Y.C., 2004. Purification and Characterization of  Chitosanase  from  Bacillus  sp.  Strain KCTC  0377BP  and  Its  Application  for  the Production  of  Chitosan  Oligosaccharides. American Society for Microbiology,
Applied  and  Environmental  Microbiology . Vol. 70 (8) : 4522-4531
El-Sayet,  S.,  El-Sayat,  M.,  Shousha,  W.G., Shehata, A.N., Omar, N.I., 2012. Production of  Novel  Antitumor  Chitooligosaccharides by  Using  Purified  Chitosanases  from Capsium annuum Leaves. Australian
Journal  of  Basic  and  Applied  Sciences , 6(4):1-15
Hotmatua,  A.,  2004. Potensi  Antimikroba Oligomer  Kitosan  yang  Dihasilkan  Dengan Menggunakan Enzim Termostabil Kitosanase LH 28.38 , Skripsi tidak
Diterbitkan. Institut Pertanian Bogor, Bogor
Jeon  Y.J.  &  Kim  S.K.,  2000.  Production  of Chitooligosaccharides  Using  Ultrafiltration Membran  Reactor  and  Their  Antibacterial Activity. Carb. Polymer 41: 133-141.
Julianti  S.,  Agusnar  H.,  Alfian  z.,  2012. Pembuatan  Kitosan  Oligomer  Melalui
Metode Degradasi Oksidatif dan Pengaruhnya Terhadap Viskositas dan Berat Molekul.  Universitas Sumatera  Utara,
Medan , J. Saintia Kimia Vol.1(1)
Liu  B.  ,  Wan-Shun  Liu,  Bao-Qin  Han,  Yu-Ying Sun,    2007.    Anti    diabetic  effects    of chitooligosaccharides    on  pancreatic    islet cells    in  streptozotocin-induced  diabetic
rats. World  J.  Gastroenterol 13  (5):    725– 731.
Marwati  D.,  2012. Sintesis  Senyawa  Potensial Anti  Kanker  Turunan  Sinamat .  Tesis  tidak dipublikasikan.  Program  Studi  Ilmu  Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia, Depok.
Meidina,  2005. Aktivitas  Antibakteri  Oligomer Kotosan  yang  Diproduksi  menggunakan Kitosanase dari Isolat B. Licheniformis MB- 2 ,  Tesis  tidak  Diterbitkan.  Pasca  Sarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Meyer, F., Putnam, Jacobsen N., & Mc L., 1982,
Brine  Shrimp:  A  Convenient  General Bioassay for Active Lant Constituents , Plant Medika 45.
Mourya,  V.K.,  Inamdar,  N.N.,  Choudari,  Y.M.,
2011.  Chitooligosacharides  :  Synthesis, Caracterization and Applications.
Goverment  Pharmacy  Collage,  Osmanpura, Aurangabad,  India. Polimer  Science.  Ser.  A 53 (7): 583 – 612.
Natalia,  D.,  2013, Kloning  dan  Ekspresi  Gen
Pengkode Kitosanase dalam Rangka Produksi Kitooligosakarida Untuk Keperluan Medis , Program Riset
Desentralisasi  DIKTI,  Institut  Teknologi Bandung, Bandung.
Pae,  Ho,  2001.  Introducton  ofGranulocytic Differentiation  in  Acute  Promyelocytic Leukemia  Cell  (HL-60)  by  Water-Soluble chitosan oligomer. Leukemia Res . 25: 339 – 346.
Prastitis,  2006. Isolasi  dan  Karakterisasi  Enzim kitosanase dari Bakteri Laut Yang
Berasosiasi  Dengan  Spons ,  Skripsi  tidak Diterbitkan., Institut  Pertanian  Bogor,
Bogor. Qin Caiqin, Du Yumin, Xiao Ling, Li Zhan, Gao Xiao  hai,  2002.  Enzymic  Preparation  Of Water-Soluble Chitosan and Their
Antitumor  Activity.  Wuhan  University, China. Int.  J.  Biological  Macromolecules 31(2002):111-117.
Sarni,  Natsir,  H.,  Dali,  S.,  2016.  Production  and Characterization  Chitosanase  Of  Sponge Symbiont  Bacteria Klepsiella  sp To Hydrolyze Chitosan Be Chitooligosaccarides Int.  Journal  Marina Chimica  Acta
Vol.  17  No.  1  (April
2016)ISSN 1441-2132.
Andi Rusnaenah , dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2017, 4(2), 373-377
Srijanto B., Paryanto I., Masduki, Purwatiningsih,  2006.  Pengaruh  Derajat Deasetilasi Bahan Baku Pada Depolimersasi
Kitosan.  Pusat  Pengkajian  dan  Penerapan Teknologi  Farmasi  dan  Medika-BPPT, Bogor, Akta Kimia Indonesia Vol.1 (2) : 67- 72. Wahyuni  S.,  Zakaria  F.,  Witarto  A.B.,  Syah  D.,
Suhartono  M.T.,  2006.  Aktivitas  Anti Kanker  Senyawa-Senyawa  Kitooligomer . J.
Teknologi  dan  Industri  Pangan Vol  XVII (1).
Xu,  Q.,  Dou, J.,  Wei, P.,  Tan,  C.,  Yun,  X., Wu, Y.,  Bai,  X.,  Ma,  X.,  Du,  Y.,  2007. Chitooligosaccharides  Induce  Apoptosis  of Human  Hepatocellular  Carcinoma  Cell  via Up-regulation of Bax. Elsevier Since Direct. Carbohydrat Polimers 71