Pengaruh Penyimpanan Pada Suhu 5ºC Terhadap Motilitas, Persentase Hidup (Viabilitas) Dan Abnormalitas Semen Sapi  Simmental
Bayu Islami Pasyah, Bayu Rosadi * , Darmawan Fakultas Peternakan Universitas JambiProgram Studi Peternakan Fakultas Peternakan Universitas Jambi Jln. Jambi-Ma Bulian KM 15 Mendalo Darat Jambi 36361
* Penulis Koresponden : bayurosadi@unja.ac.id

## Abstrak
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  bagaimana  pengaruh  terhadap  penyimpanan pada  suhu  5 o C  selama  3  hari  mampu  memberikan  pengaruh  yang  baik  terhadap  motilitas,  persentase hidup  (viabilitas)  dan  abnormalitas  semen  sapi    Simmental.  Rancangan  yang  digunakan  adalah rancangan  acak  lengkap  dengan  4  perlakuan  dan  6  ulangan.  Perlakuan  terdiri  dari  P 0 =  tanpa penyimpanan  (kontrol),  P 1 =  penyimpanan  selama  24  jam,  P 2 =  penyimpanan  selama  48  jam  dan  P 3 = penyimpanan selama 72 jam. Peubah yang diamati adalah viabilitas, motilitas dan abnormalitas. Analisis data menggunakan analisis sidik ragam, dengan uji lanjut Duncan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penyimpanan  pada  suhu  5C  memberikan  pengaruh  yang  sangat  nyata  terhadap  nilai  motilitas  dan viabilitas,  namun  tidak  berpengaruh  nyata  terhadap  abnormalitas  semen  sapi    Simmental.  Dapat disimpulkan  bahwa  lama  penyimpanan    yang  dapat  mempertahankan  motilitas  spermatozoa  dan persentase hidup semen (viabilitas) sapi  Simmental suhu 5ºC adalah  24jam.
Kata kunci : sapi  Simmental, penyimpanan, motilitas, viabilitas, abnormalitas

## Abstract
The purpose of this study was to determine the effect of storage at 5C on motility, viability and abnormalitiy of simmental bovine semen. The design used was a completely randomized design with 4 treatments and 6 replications. The treatments consisted of P 0 = fresh semen (control), P 1 = storage for 24 hours,  P 2 =  storage  for  48  hours  and  P 3 =  storage  for  72  hours.  The  observed  variables  were  viability, motility and abnormality. Data analysis used analysis of variance, with Duncan's further test. The results showed that storage at  5C decreased motility and viability (P<0.05), but had no significantly affect on abnormality (P>0.05). In concluison, that the length of semen storage at  5ºC than can maintain motility and viability of simmental bovine spermatozoa is 24 hours.
Keywords: simmental cattle, storage, motility, viability, abnormality
Pendahuluan Sapi Simmental merupakan salah satu bangsa sapi potong yang mempunyai  pertumbuhan  cepat.  Sapi jenis ini merupakan sapi dwiguna, yaitu sapi  yang  menghasilkan  susu  dan daging.  Banyak  peternak  di  Indonesia yang memelihara Sapi Simmental untuk memenuhi  tingginya  kebutuhan  daging sapi  untuk  masyarakat.  Bibit  Sapi Simmental yang unggul dapat diperoleh dengan melakukan program pemuliabiakan ternak melalui
Inseminasi Buatan(IB).
Inseminasi  buatan  adalah  suatu cara  untuk  memasukan  semen  segar
atau semen beku  yang telah diencerkan dan  telah  diperoses  terlebih  dahulu yang  berasal  dari  ternak  jantan  ke saluran  alat  kelamin  betina  dengan menggunakan  metode  dan  alat  khusus yang disebut insemination gun (Hasibuan,  2009).  Kualitas  semen  sapi pejantan  mempunyai  peranan  yang sangat  penting  dalam  pelaksanaan perkawinan,  baik  secara  alami  maupun IB.
Banyak faktor yang dapat menurunkan  kualitas  semen  baik  itu dari  proses  pengolahan,  distribusi semen  itu  sendiri  hingga  tahap penyimpanan dalam kontainer. Masalah
yang  sering  menyebabkan  penurunan kualitas  semen  adalah  pada  proses pengolahan  terutama  pada  tahap penyimpanan  suhu  dingin.  Menurut
Vishwanath dan Shannon (2000)
keuntungan  yang  utamadariteknologi penyimpanan  semen  cair  adalah  jika kejadian  penurunan  fertilitas  pada penyimpanan  5˚C  atau  suhu  kamar dapat ditiadakan atau direduksi.
Prinsiputama penyimpanan (preservasi) semen terkait dengan upaya memperpanjang daya hidup spermatozoa adalah menurunkan derajat metabolisme melalui penyimpanan  pada  suhu  rendah. Kerusakan  semen  yang  terjadi  saat preservasi pada suhu rendah
merupakan kendala utama dalam upaya mempertahankan kualitas semen.
Motilitas  adalah  daya  gerak spermatozoa  yang  dapat  dijadikan sebagai  acuan  dalam  penilaian  kualitas spermatozoa.  Daya  gerak  progresif  ini mempunyai  peranan  yang  penting untuk  keberhasilan  fertilisasi.  Motilitas spermatozoa  pada  sapi  yang  fertil adalah  50-80%  dan  bergerak  progresif. Pada  penyimpanan  suhu  rendah spermatozoa  dalam  bentuk  beku menyebabkan  penurunan  motilitas. Penurunan  kualitas  spermatozoa  bisa terjadi karena adanyakerusakan strukturmembran  selama  endinginan sehingga proses metabolisme spermatozoa  terganggu  (Susilawati, 2005). Persentaseviabilitas  merupakan perhitungan persentase yang
membandingkan  spermatozoa  hidup dengan  spermatozoa  mati  sehingga dapat  menentukan  baik  atau  tidaknya kualitas  spermatozoa.  Viabilitas  adalah daya hidup spermatozoa. Viabilitas atau daya hidup spermatozoa dapat mengalami perubahan selama
penyimpanan,  selama  penyimpanan viabilitas spermatozoa dapat mengalami penurunan hal ini disebabkan meningkatnya jumlah spermatozoa yang rusak dan mati maka dari itu perlu dilakukan  penyimpanan  yang  baik seperti penyimpanan spermatozoa pada suhu dingin. Keuntungan utama penyimpanan  spermatozoa  pada  suhu dingin  adalah  mencegah  kerusakan terkait dengan pembekuan, memastikan viabilitas  semen  lebih  tinggi  (Crespilho et al, 2014).
Abnormalitas spermatozoa merupakan kelainan fisik dari spermatozoa  yang  terjadi  karena  pada saat  proses  pembentukan  spermatozoa dalam tubuli seminiferi maupun karena proses  perjalanan  spermatozoa  melalui saluran-saluran  organ  kelamin  jantan. Abnormalitas spermatozoa dibagi menjadi  dua  yaitu  abnormalitas  primer dan  sekunder.  Abnormalitas  primer terjadi  karena  adanya  kegagalan  dalam proses  spermatogenesis  di  tubuli seminiferus dikarenakan factor keturunan  dan  pengaruh  lingkungan yang  buruk.  Bentuk  dari  abnormalitas primer meliputi kepala besar (macrocephalus)  atau  kepala  kecil (microchepalus),  kepala  pendek,  lebar, dan  ekor  ganda.  Adapun  abnormalitas sekunder terjadi selama proses penyimpanan atau kriopreservasi spermatozoa. Bentuk abnormalitas sekunder  meliputi  bagian  ekor  yang melipat, adanya
butiran-butiran sitoplasmik  proksimal  atau  distal,  dan selubung  akrosom  yang  terlepas  dari kepala  tanpa  adanya  ekor,  dan  ekor yang terputus (Garner dan Hafez,2000).
Berdasarkan  hal  diatas  maka perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut mengenai pengaruh penyimpanan dengan  suhu  5 o C  terhadap  motilitas, viabilitas  dan  abnormalitas  semen  sapi

## Simmental.
Metode Penelitian
Tempat dan Waktu
Penelitian  ini  dilaksanakan  di Laboratorium
Fakultas Peternakan
Universitas  Jambi.  Penelitian  di  mulai dari  14  September  sampai  27  Oktober 2020.

## Materi dan Peralatan
Materi  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  semen  sapi Simmental,  batu  es,  NaCl  fisiologis  dan eosin  negrosin.Alat  yang  digunakan untuk penelitian ini adalah gelas beaker, termos  es,  refrigerator  suhu  5ºC, mikroskop, objek glass, dan cover glass.

## Koleksi dan Pengenceran SemenSapi Simmental
Semen  ditampung  dari  sapi jantan  Simmental  berumur  4  tahun menggunakan  vagina  buatan.  Semen segar  selanjutnya  diencerkan  dengan dengan  larutan  tris  sitrat  kuning  telur. Komposisi  bahan  pengencer  tris  sitrat kuning  telur  yang  digunakan  terdiri dari kuning telur 20 ml, asam sitrat 1,86 g, fruktosa 1,37, antibiotik (penisilin 0,1 100.000  IU/100ml  dan  streptomisin  0,1
g), aquades100 ml. Pengenceran dilakukan sampai mencapai konsentrasi akhir 10 8 spermatozoa/ml.

## Penyimpanan Semen
Semen  yang  telah  diencerkan disimpan  dalam  tabung  plastik  ukuran 1,5  ml  diisi  0,5  ml  larutan  semen. Larutan ini disimpan dalam refrigerator bersuhu 5 o C dengan lama penyimpanan sesuai perlakuan.

## Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan Rancangan  Acak  Lengkap  dengan  4 perlakuan  dan  6  ulangan.  Perlakuan disusun berdasarkan lama penyimpanan sebagai berikut:
P0 : semen segar (kontrol) P1 : penyimpanan selama 24 jam, P2 : penyimpanan selama 48 jam, P3 : penyimpanan selama 72 jam.

## Peubah yang Diamati
Peubah  yang  diamati  dalam penelitian ini meliputi motilitas, persentase  hidup  (viabilitas)  dan abnormalitas.

## Motilitas
Motilitas  dihitung  menggunakan metode  estimasi  (Junaedi et  al 2016). Motilitas  spermatozoa  diamati  dengan cara  meletakkan  satu  tetes  semen ditambah  10  tetes  NaCl  fisiologis. Motilitas  spermatozoa  dihitung  dengan estimasi  dari  lima  lapang  pandang, dinyatakan dalam persentase.

## Viabilitas
Penghitunganv iabilitas menggunakan pewarnaan eosin
negrosin. Sebanyak 2 tetes larutan eosin negrosin  ditempatkan  pada  gelas  objek bersih,  satu  tetes  semen  dicampurkan kedalam larutan eosinnigrosin, selanjutnya  diulas  memakai  gelas  objek lainnya.  Perhitungan  persentase  hidup didasarkan  atas  perbandingan  jumlah spermatozoa  yang  hidup  (kepala  tidak berwarna)  dengan  total  spermatozoa yang dihitung. Jumlah
total spermatozoa  yang  diamati  minimal  200 setiap pengamatan.

## Abnormalitas Spermatozoa
Abnormalitas adalah
penyimpangan  dari  bentuk  morfologi normal  spermatozoa  yang    dapat menyebabkan
penurunan daya fertilitanya. Penghitungan abnormalitas spermatozoa  dilakukan  menggunakan pewarnaan yang sama dengan spermatozoa hidup. Jumlah
spermatozoa  yang  dihitung  minimal 200 setiap pengamatan.

## Analisis Data
Data yang didapatkan dari setiap peubah  yang  diamati  analisis  dengan sidik ragam, Bila perlakuan
berpengaruh  nyata  dan  berpengaruh sangat  nyata,  dilakukan  uji  lanjut Duncan (Steel dan Torrie, 1993).

## Hasil Dan Pembahasan
Berdasarkan  hasil  analisis  sidik ragam,  diperoleh  rataan  nilai  motilitas, viabilitas  dan  abnormalitas  semen  sapi Simmental dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Rataan Nilai Motilitas, Viabilitas dan Abnormalitas
Peubah Perlakuan Ket P0 P1 P2 P3 Motilitas 56,83±6,46 a 37,83±4,83 b 31,50±5,89 b 19,00± 3,58 c P< 0,05
Viabilitas
68,67±5,16 a 56,17±5,30 b 39,33±6,62 c
25,83±6,34 d P< 0,05 Abnormalitas 8,00±1,00 7,67±0,81 7,50±1,04 7,50±1,04 P> 0,05
Ket: - Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata (P<0,05)

## Motilitas
Hasil  analisis  ragam  menunjukkan bahwa  perlakuan  lama  penyimpanan semen  sapi    Simmental  pada  suhu  5ºC memberi  pengaruh  yang  nyata  (P<0,05) terhadap  nilai  motilitas  semen  sapi Simmental.  Angka  motilitas  P0  berbeda sangat  nyata  terhadap  P1,  P2  dan  P3. Nilai  Motilitas  tertinggi  diperoleh  pada P0 yakni 56,83% dan diikuti P1: 37,83%, P2: 37,83% dan P3:31,50%. Hal Ini terjadi karena  P0  merupakan  semen  segar. Penurunan  motilitas  secara  signifikan terjadi  setelah  penyimpanan  48  jam, pada penyimpanan 24 jam belum terjadi penurunan.  Hal  ini  sesuai  dengan  studi pada domba  yang menunjukkan bahwa refrigerasi  mempertahankan  viabilitas spermatozoa  domba  selama  48  jam tetapi  motilitas  menurun  setelah  24  jam (Bergstein-Galan  et  al.,  2018),  dapat digunakan  untuk  IB  sampai  3  hari penyimpanan  walaupun  fertilitasnya juga  menurun  setelah  penyimpanan selama 24 jam (O’Hara et al., 2010). Pada P1, P2 dan P3 memiliki nilai  yang lebih
rendah  dibandingkan  dengan  P0  dan rataan  nilai  motilitas  (36,29%)  yang dihasilkan  tidak  sesuai  dengan  syarat minimal motilitas semen yakni 40%. Hal ini  di  dukung  dengan  pendapat Toelihere  (1993)  yang  menyatakan bahwa  besaran  persentase  motilitas individu  sapi  yang  normal  (fertile) mempunyai  motilitas  individu  40-  75% dan  motilitas  spermatozoa  di  bawah 40%  menunjukkan  nilai  semen  yang kurang  baik  dan  berhubungan  dengan infertilitas. Pada perlakuan yang hampir sama,  Samsudewa  dan  Suryawijaya (2008) mendapatkan persentase motilitas spermatozoa  tertinggi  yaitu  45%  sapi Simmental.
Penurunan  motilitas  semen  pada penelitian  ini  dapat  di  sebabkan  oleh waktu  penyimpanan    yang  terlalu  lama yang  akan  menyebabkan  aktivitas metabolisme
meningkat sehingga banyak energi yang habis dengan cepat, dengan habisnya
energi akan menyebabkan  penurunan  pH  akibat peningkatan  asam  laktat  yang  bersifat racun  bagi  semen  yang  akhirnya
menyebabkan  kematian.    Situmorang
(2002) menambahkan bahwa penurunan motilitas spermatozoa setelah pendinginan  di  duga  karena  turunnya kandungan phospholipid yang
merupakan  komponen  membran  sel spermatozoa,  sehingga  antar  perlakuan memiliki penurunan nilai yang signifikan akibat dari lama
penyimpanan yang dilakukan. Menurut Sugiarti et al (2004) proses pendinginan pada  suhu  5°C  akan  menyebabkan penurunan motilitas spermatozoa akibat adanya asam laktat sisa metabolisme sel yang  menyebabkan  kondisi  medium menjadi semakin asam karena penurunan pH.

## Viabilitas
Penentuan  spermatozoa  hidup atau  mati  didasarkan  pada  pengamatan bagian  kepala  spermatozoa,  pada spermatozoa  yang  hidup  (membran utuh)  kepala  tidak  menyerap  warna, spermatozoa  yang  mati  (membran  tak utuh)  menyerap  warna . Perlakuan  lama penyimpanan  semen  sapi    Simmental pada suhu 5ºC memberi pengaruh yang nyata (P<0,05) terhadap viabilitas semen sapi    Simmental.  Viabilitas  P0  berbeda terhadap  P1,  P2  dan  P3.  Nilai  viabilitas tertinggi  diperoleh  pada  P0  yakni 68,67%,  selanjutnya  diikuti  P1(56,17%), P2(39,33%)  dan  P3(25,83%).  Pada penelitian ini terjadi penurunan motilitas  secara  signifikan  setelah penyimpanan selama 48 jam, sedangkan persentase hidup tidak berbeda.
Artinya,  terdapat  sebagian  spermatozoa yang  hidup  tetapi  tidak  motil  yang jumlahnya cenderung meningkat seiring lama    penyimpanan.  Penelitian  lain menyimpulkan  bahwa  penyimpanan spermatozoa pada suhu 5 o Cmeningkatkan  daya  tahan  dan mempertahankan  fertilitas spermatozoa (Kaneko et al., 2009) tetapi lama
penyimpanan mempengaruhi motilitas  dan  viabilitas  spermatozoa (Sariozkan  et  al.,  2014).  Dari  hasil  yang di  dapatkan  pada  perlakuan  P2  dan  P3 lebih  rendah  di  bandingkan  dengan  P0 dan  P1,  semen  pada  P0  dan  P1  masih dapat  digunakan  karena  masih  dalam syarat minimal persentase hidup semen yakni 50%. Semen P2 dan P3 tidak dapat digunakan  dalam  IB  karena  tergolong rendah  yakni  dibawah  50%.  Hal  ini sesuai  dengan  pendapat  Menurut Toelihere  (1993)  yang  menyatakan bahwa semen yang baik
memilikiviabilitas  diatas  50%.  Proses penyimpanan  yang  lebih  panjang menunjukkan nilai
persentase spermatozoa  hidup  yang  lebih  rendah dibandingkan  dengan  penyimpanan yang  lebih  pendek,  hal  ini  disebabkan karena  spermatozoa  banyak  mengalami kematian  akibat  adanya  tekanan  pada suhu  yang  cepat  tanpa  adanya  waktu tepat untuk penyesuaian diri.
Pendinginan  dengan  suhu  5ºC selama
72 jam tidak mampu mempertahankan  angka  persentase spermatozoa  hidup.  Kristal-kristal  es yang  terbentuk  saat  prosespendinginan semen juga dapat merusak spermatozoa. Konsentrasi  elektrolit  yang  berlebihan akan  melarutkan  selubung  lipoprotein pada  dinding  sel  spermatozoa  sehingga permeabilitas  membrane  sel  akan berubah  dan  menyebabkan  kematian sel. Menurut Yudhaningsih (2004), suhu yang  rendah  akan  mengakibatkan bocornya substansi vital dalam spermatozoa sehingga enzim
intraseluler,  lipoprotein,  ATP,  kalium intraseluler dan lemak berfosfor berkurang  dan  menyebabkan kerusakan  membrane  plasma.  Menurut Toelihere  (1993)  spermatozoa  yang hidup memiliki membrane utuh meskipun lingkungan disekitarnya
berwarna,  kepala  tetap  tidak  akan berwarna (transparan) dikarenakan permeabilitas  membrane  masih  normal, sedangkan    spermatozoa  yang  mati karena  membran  tidak  mampu  untuk mencegah  masuknya  pewarna  yang telah  rusak.  Sebagai  akibatnya,  kepala spermatozoa  akan  berwarna  sesuai dengan warna eosin yaitu merah muda. Susilawati  (2013)  menyatakan  bahwa kondisi  spermatozoa  yang  mudah mengalami kerusakan pada saat perlakuan  maupun  penyimpanan  dapat berakibat  spermatozoa  tidak  mampu mempertahankankualitasnya.

## Abnormalitas (%)
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa  perlakuan  lama  penyimpanan semen  sapi    Simmental  pada  suhu  5ºC memberi  pengaruh  yang  tidak  nyata (P>0,05)  terhadap  abnormalitas  semen sapi    Simmental.  Berdasarkan  hasil yang  di  dapat  menunjukkan  bahwa abnormalitas semen sapi  Simmental P0 tidak  berbeda  nyata  (P>0,05)  terhadap P1,  P2  dan  P3.    Penyimpanan  semen pada suhu 5 o Ctidak berpengaruh nyata terhadap  abnormalitas  spermatozoa sapi    Simmental.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  penyimpanan  pada  suhu  5ºC selama  72  jam  tidak  berdampak terhadap kerusakan morfologi spermatozoa. Kerusakan
struktur spermatozoa  yang  diduga  terjadi selama  proses  penyimpanan  tidak mengubah  morfologi  spermatozoa, sehingga persentase abnormalitas tidak terpengaruh.  Tingkat  abnormalitas morfologi  8–10%  tidak  mempunyai pengaruh  yang  berarti  bagi  fertilitas, tetapi  abnormalitas  lebih  dari  25%  dari satu  ejakulat  menyebabkan  penurunan fertilitas  (Bearden  &  Fuquay,  1997). Lama penyimpanan menunjukkan bahwa  angka  rata-rata  abnormalitas semen  masih  dibawah  10%  yakni
(5,37%). Menurut pendapat Ihsan (2009) yang  menjelaskan  bahwa  semen  yang dapat dipakai IB memiliki abnormalitas spermatozoa tidak boleh lebih dari 20% dan  jika  abnormalitas  spermatozoa lebih  dari  20%  maka  akan  terjadi penurunan  fertilitasnya.  Kemudian Suyadi  et  al  (2012)  juga  menambahkan bahwa peningkatan angka abnormalitas disebabkan  pada  saat  pembuatan preparat sebelum dilakukan pengamatan  dan  juga  disebabkan peroksidasi  lipid.  Karena  dalam  proses pembuatan  preparat  ulas  dan  proses penyimpanan dapat menyebabkan kelainan atau abnormalitas dari spermatozoa tersebut, pembuatan preparat ulas
menyebabkan spermatozoa berbentuk ekor bergulung, leher  patah,  kepala  dan  leher  putus. Menurut  Yani    et  al  (2001),  semakin lama  waktu  penyimpanan  maka semakin tinggi persentase abnormalitas yang  disebabkan  oleh  stres  dingin  dan ketidakseimbangan  tekanan  osmotik akibat dari proses metabolik yang terus berlangsung  selamapenyimpanan.

## Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan
pembahasan  di  atas  dapat  disimpulkan bahwa :
1.  penyimpanan  dengan  suhu  5ºC menurunkan  motilitas    dan  viabilitas tetapi tidak mempengaruhi abnormalitas spermatozoa sapi Simmental. 2.  Lama  penyimpanan  terbaik  yang dapat mempertahankan
motilitas spermatozoa  dan  persentase  hidup semen  Sapi  Simmental  pada  suhu  5ºC adalah selama 24 jam.

## Daftar Pustaka
Bearden  HJ,  Fuguay  J.W.  1997.  Applied Animal  Reproduction.  Reston Publishing Company Inc. Printice
Hall Company, RestonVirginia.
Bergstein-Galan TG, Weiss RR., Barbosa TSR, Kozicki LE, Bicudo SD. 2018. Ovine  epididymal  spermatozoa preservation  in  liquid  state  with or  without  seminal  plasma.
Ciência Rural 48.
Crespilho  AM,Safilho  MF,  Dell’Aqua  Jr JA,  Nichi  M,  Monteiro  GA, Avanzi BR, Martins A,  Papa FO.
2014.  Comparison of  in  vitro  and in  vivo  fertilizing  potential  of bovine  semen  frozen  in  egg  yolk or  new  lecithin  based  extenders.
Livestock 149 (1-2): 1-6. Garner DL, Hafez ESE. 2000.
Spermatozoa and seminal plasma.
Reproduction in Farm Animals. Hasibuan,  Z.F.  2009.  Penggunaan  Air Kelapa  Sebagai  Penyeimbang Fruktosa dalam Pengencer Terhadap  Kualitas  Spermatozoa Sapi  Simmental.  Skripsi.  Fakultas Pertanian.Universitas  Sumatera Utara.Medan. Ihsan NM. 2009. Bioteknologi Reproduksi  Ternak.  Universitas
Brawijaya. Malang.
Junaedi,  Arifiantini  I,   Sumantri  C,
Gunawan  A.  2016. Penggunaan Dimethyl Sulfoxide Sebagai Krioprotektan  dalam  Pembekuan Semen Ayam Kampung. JurnalVeteriner 17 (2) : 300-308.
Kaneko  T,  Fukumoto  K,  Haruguchi  Y, Kondo  T,  Machida  H,  Koga  M, Nakagawa Y, Tsuchiyama S, Saiki K,  Noshiba  S,  Nakagata  N.  2009. Fertilization  of  C57BL/6  mouse sperm  collected  from  cauda epididymies  after  preservation  or transportation  at  4°  Cusing  laser microdissected
oocytes. Cryobiology 59,59–62.
Keren  K.  2011.O’Hara  L,  Hanrahan  J.P, Richardson L, Donovan A, Fair S, Evans  ACO,  Lonergan  P.  2010. Effect of storage duration, storage temperature,  and  diluent  on  the viability and fertility of fresh ram sperm.  Theriogenology  73,  541– 549.
Samsudewa  D,    Suryawijaya  A.  2008. Pengaruh Berbagai Metode Thawing Terhadap Kualitas
Semen  Beku  Sapi.  Seminar Nasional  Teknologi  Peternakan dan Veteriner. 1: 88 – 92
Sariozkan  S,  Ozdamar  S,  Turk  G, Canturk  F,  Yay  A.  2014.  In  vitro effects of lcarnitine and glutamine on motility, acrosomal abnormality, and plasma
membrane  integrity  of  rabbit sperm  during  liquid-  storage. Cryobiology 68 : 349–353. Situmorang, P. 2002. Pengaruh penambahan eksogenous phospholipid ke dalam pengencer tris  dengan  tingkat  kuning  telur yang  berbeda  pada  daya  hidup spermatozoa sapi.JITV 7(3): 181  – 187.
Sugiarti  T,  Triwulanningsih  E,  P Situmorang, Sianturi RG, Kusumaningrum DA. 2004. Penggunaan Katalase dalam Produksi  Semen  Dingin  Sapi. Puslitbang Peternakan. Bogor.
Susilawati.  2005.  Motilitas  dan  Proses
Pembentukan Semen Segar menjadi  Semen  Beku.  Fakultas Peternakan Universitas
Brawijaya.Malang.
Suyadi  A,  Rachmawati  N,    Iswanto. 2012.  Pengaruh  α-Tocopherol yang  Berbeda  dalam  Pengencer Dasar Tris Aminomethane kuning
Telur  Terhadap  Kualitas  Semen Kambing  Boer  yang  Disimpan pada  Suhu  50C.  Jurnal  Ilmiah Ilmu-ilmu Peternakan. 22 (3):1-8.
Toelihere  MR.  1993.  Inseminasi  Buatan pada Ternak. Angkasa. Bandung.
Viswanath  R,  Shannon  P.  2000.  Storage of  Bovine  Semen  In  Liquid  and Frozen  State.  Anim.  Repord.  Sci. 62: 23-53.
Yani  A,  Nuryadi,  Pratiwi  T.  2001. Pengaruh  Tingkat    Substitusi
Santan  Kelapan  pada  Pengencer Santan Kelapa terhadap Kualitas Semen Kambing Peranakan  Etawa  (PE).  Skripsi.
Fakultas  Peternakan.  Universitas Brawijaya.
Yudhaningsih,  H.  2004.  Kualitas  dan
Integritas  Membran  Spermatozoa Sapi Madura Menggunakan Motilitas  dan  Pengencer  yang Berbeda Selama Proses Pembekuan Semen. Skripsi.
Fakultas  Peternakan.Universitas Brawijaya. Malang.