## Analisa  Vitamin  B1,  B6  dan  B12  Secara  Simultan  dengan  Metode Kromatografi Pasangan Ion

## Simultaneous Analysis of B1, B6 and B12 with Ion Pair Chromatography
Diana (a)*
( a) Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya
Article info: Received Date : 03/10/2022 Revised Date   : 07/10/2022 Accepted Date : 07/10/2022 Abstrak: Kromatografi pasangan  ion dapat digunakan untuk meretensi senyawa yang  memiliki  muatan,  bersifat  polar  dan  memisahkan  analit  yang bervariasi  kepolaran  dan  hidrofobisitasnya.  Hal  yang  tidak  dapat dilakukan  dengan  mudah  pada  metode  kromatografi  fase  balik  biasa. Pemisahan senyawa pada kolom menggunakan kromatografi pasangan ion dilakukan untuk menganalisa kadar Thiamine Mononitrate (Vitamin B1),  Pyridoxine  HCl  (Vitamin  B6)  dan  Cyanocobalamine  (Vitamin  B12) secara simultan.  Validasi juga dilakukan untuk membuktikan performa metode  analisa  yang  diusulkan.  Dari  penelitian  ini  dibuktikan  bahwa kromatografi  pasangan  ion  dapat menjadi  metode alternatif  yang lebih efisien  untuk  menganalisa  sediaan  tablet  oral  dengan  kandungan  B1, B6 dan B12.

## Abstract
Ion  pair  chromatography  has  ability  to  retain  charged  analyte,  polar  in nature  and  separate  compound  that  have  various  polarity  and hydrophobicity.  Something  that  can’t  be  easily  done  using  reversed phase  chromatography.  Separation  of  analyte  using  Ion  pair chromatography  was  evaluated  for  simultaneous  assay  of  Thiamine Mononitrate  (Vitamin  B1),  Pyridoxine  HCl  (Vitamin  B6)  and Cyanocobalamin  (Vitamin  B12).  Validation  was  also  conducted  to evaluate performance of analytical method proposed. This study proved that Ion Pair Chromatography can be an efficient alternative method to analyze oral tablet containing B1, B6 and B12.
Keywords: Validation Ion Pair HPLC B complex Corresponding Authors: Diana, Fakultas Farmasi Universitas Katolik
Widya Mandala Surabaya, Jl. Raya Kalisari Selatan No. 1 Surabaya, 60112, (031)99005299, ext 10604 Email: diana_tan@ukwms.ac.id

## PENDAHULUAN
Kombinasi Thiamine Mononitrate (Vitamin B1),  Pyridoxine  HCl  (Vitamin B6)  dan Cyanocobalamine  (Vitamin  B12)  umum  dijumpai dalam bentuk  kombinasi pada sediaan tablet oral yang  digunakan  untuk  mencegah  dan  mengatasi kondisi  defisiensi  Vitamin  B.  Vitamin  B1 merupakan  koenzim  esensial  yang  berperan dalam  metabolisme  karbohidrat.  Kekurangan vitamin B1 akan menyebabkan serangkaian gejala neuropati  perifer,  lemah  otot  dan  paralisis  yang dikenal  sebagai  penyakit  beri-beri.  Vitamin  B6 terlibat  dalam  metabolisme  asam  amino, karbohidrat  dan  lemak,  serta  berperan  dalam pembentukan haemoglobin. Defisiensi B6 menimbulkan  gejala  anemia,  dermatitis,  serta simptom  neurologis  lain.  Sementara  Vitamin  B12 merupakan koenzim yang berfungsi dalam sintesa asam  nukleat  dan  berperan  dalam  reaksi pembentukan energi dalam sel (Sweetman, 2008).
Farmakope  Indonesia  VI  mencantumkan metode  analisa  kadar  Vitamin  B1,  B6  dan  B12
dalam  monografinya  masing-masing.  Analisa dilakukan  dengan  menggunakan  Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) dengan kondisi yang  berbeda  antar  senyawa  (Kementerian Kesehatan  RI,  2020).  Penerapan  metode kompendial  ini  pada  sediaan  kombinasi  B1,  B6 dan  B12  akan  memakan  lebih  banyak  waktu  dan biaya serta menghasilkan limbah yang lebih besar dalam pengerjaannya.
Penelitian ini bertujuan untuk memberikan alternatif metode analisa yang dapat mengevaluasi  kadar  Vitamin  B1,  B6  dan  B12 secara  simultan  sehingga  lebih  sederhana  dan efisien  dalam  penggunaannya.  Validasi  metode analisa  juga  dilakukan  untuk  membuktikan performa  dari  metode  untuk  dapat  melakukan analisa  kadar  Vitamin  B1,  B6  dan  B12  dalam sediaan tablet oral mengikuti ketentuan Farmakope dan ICH (ICH, 2022).
Gambar 1. Struktur Kimia B1, B6 dan B12 (Kim dkk., 2023)

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat  dan  bahan  yang  digunakan  pada penelitian  ini  adalah  instrument  KCKT  (Agilent  1200)  yang  dilengkapi  dengan  detektor  diode array  (DAD).  Kolom encapped oktadesil  silika (Phenomenex  ) dengan dimensi 150 x 4.6 mm, 5 µ m  digunakan  sebagai  fase  diam.  Reagen Na 2 HPO 4 (Merck  ),  sodium  heksan  sulfonat (TCI  ),  air  murni  (menggunakan  sistem pemurnian  air  Milli-Q  )  dan  metanol pro  HPLC (Merck  ) sebagai komponen fase gerak. Thiamine Mononitrate,  Pyridoxine  HCl,  Cyanocobalamine serta  bahan  lain  sebagai  analit  dan  pembuatan sediaan simulasi tablet. Alat dan bahan lain yang digunakan adalah kertas saring Whatmann  0,45 µm  untuk  menyaring  fase  gerak  dan  larutan  uji,
neraca  analitik,  mikropipet,  dan  alat  gelas  lain yang umum digunakan dalam proses analisa.

## Pembuatan Fase Gerak
Fase  gerak  dibuat  dengan  mencampurkan metanol  pro  HPLC  dan  air  murni  dengan perbandingan  23:  77  dengan  kandungan  2  g sodium heksan sulfonate tiap liter fase  gerak dan 40mM Na 2 HPO 4 yang diadjust ke pH 3.

## Kondisi analisa dan Larutan Uji
Kromatografi  dijalankan  pada  kondisi isokratik  dengan  laju  alir  1,0  mL/menit,  volume penginjekan  10  µL , suhu  oven  25°C,  dan  deteksi pada panjang gelombang 361 nm untuk B1 dan B6 serta  275  nm  untuk  B12.  Larutan  uji  dipreparasi dengan menimbang setara 1 tablet sediaan dengan kandungan B1 100 mg, B6 100 mg dan B12 5 mg
dan  melarutkan  dalam  fase  gerak.  Analit  diamati pada konsentrasi B1 dan B6 100 ppm serta B12  5 ppm  setelah  dilarutkan  dalam  fase  gerak.  Semua preparasi dilakukan dalam kondisi  gelap dan alat gelas  aktinik  digunakan  untuk  menjaga  stabilitas analit.

## Validasi Metode Analisa
Validasi  metode  analisa  dilakukan  atas parameter  spesifisitas,  linieritas,  akurasi,  presisi, range mengikuti  kategori  1  untuk  analisis kuantitatif  komponen  utama  dalam  sediaan. Linieritas dilakukan pada rentang konsentrasi 40- 120 ppm untuk B1 dan B6, dan B12 pada 2-6 ppm. Akurasi  dilakukan  pada  rentang  kadar  80%  – 120%  dan  keterulangan  hasil  analisa  kadar  dari sampel  homogen  dilakukan  untuk  mendapatkan data presisi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Metode  fase  balik  ( Reversed  Phase )  pada kromatografi cair kinerja tinggi  merupakan mode analisa  yang  paling  populer  dan  rutin  digunakan dalam  industri  farmasi  (Dolan,  2008).  Mode kromatografi  ini  sesuai  untuk  analisa  senyawa farmasi  yang  umumnya  berupa  senyawa  organik yang  bersifat  asam  atau  basa  lemah.  Pada  fase balik, fase diam bersifat non-polar dan fase gerak yang  digunakan  bersifat  polar.  Beberapa  fase gerak  yang  digunakan  pada  pemisahan  fase  balik antara  lain  air,  metanol,  acetonitrile  atau tetrahydrofuran.  Penggunaan  fase  gerak  polar  ini mengeliminir  penggunaan  fase  gerak  non-polar yang  banyak  digunakan  pada  mode  fase  normal seperti heksan dan kloroform yang bersifat mudah menguap dan toksik (Christian, 2013).
Fase  diam  yang  umum  digunakan  pada mode  fase  balik  adalah  kolom  silika  yang direaksikan  sehingga  memiliki  ikatan  dengan atom  Karbon  dengan  rantai  8  atau  18  (Christian, 2013).  Karena  merupakan  standar  emas  pada analisa  senyawa  farmasi,  instrumentasi  KCKT untuk  penggunaan  fase  balik  dengan  kolom  C8 maupun  C18  seringkali  dijumpai  sebagai perangkat  dasar  pada  industri  farmasi  (Dolan, 2008).
Meski  dapat  digunakan  pada  pemisahan pada  cukup  banyak  senyawa,  mode  fase  balik memiliki  kelemahan  pada  pemisahan  senyawa yang  bersifat  polar  ataupun  memiliki  muatan (Dolan, 2008). Thiamine mononitrate merupakan senyawa  organik  yang  bersifat  basa  dengan muatan  positif  dari  atom  Nitrogen  pada  cincin Thiazole  (Kim  dkk.,  2023).  Pada  pemisahan menggunakan  mode  fase  balik  biasa,  Thiamine mononitrate  tidak  teretensi  dan  terelusi  pada waktu yang sama dengan pelarut.
Retensi  pyridoxine  hydrochloride  pada mode  fase  balik  tidak  lebih  baik.  Dengan  4 hidrogen  donor  dan  4  hidrogen  akseptor, topological  surface  area  73,3  Å  dan  log  P  -0,95 (Kim dkk., 2023; Wishart dkk., 2006), nilai faktor kapasitas  yang  diperoleh  kurang  dari  2.
Sementara  cyanocobalamine  teretensi  dengan cukup  baik  pada  sistem  yang  sama.  Dengan melihat  variabilitas  sifat  fisika  kimia  analit, penggunaan  mode  kromatografi  pasangan  ion menjadi  alternatif  yang  lebih  baik  untuk diterapkan pada jenis sampel ini (Knox, 1976).
Pemisahan  campuran  analit  menggunakan metode  pasangan  ion  dapat  dilihat  pada  Gambar 2. Retensi analit secara berturut-turut menghasilkan  nilai  k’  =  1,8;  2,9  dan  4,3. Pemisahan antar analit baik ditandai dengan nilai Rs>2.  Asimetri  puncak  menghasilkan  nilai  1,12 untuk  B1,  1,3  pada  B6  dan  1,17.  Uji  linieritas menunjukkan hasil seperti yang ditampilkan pada Gambar  3  dengan  nilai  r  hitung  mendekati  1.  Uji akurasi pada tiga tingkatan kadar 80%, 100% dan 120%  memberikan  rata-rata  penerimaan  kembali sebesar  99,50%  dengan  rsd  0,41  untuk  Thiamine mononitrate, 99,84% ± 1,12 untuk Pyridoxine HCl dan  101,30%  ±  0,41  untuk  Cyanocobalamine. Tidak satupun akurasi jatuh dalam rentang di luar 98,0%-102,0%.  Uji  presisi  dilakukan  pada parameter  keterulangan/ repeatabilitas dengan hasil  rsd  dari  6x  pengulangan  preparasi  analisa sampel sebesar 0,83%; 0,56% dan 1,73% berturut- turut  untuk  Pyridoxine,  Cyanocobalamine  dan Thiamine  mononitrate.  Ketiganya  memenuhi persyaratan  ICH  dengan  nilai  <  2%.  Dari  hasil validasi  metode  analisa  rentang  dibuktikan  pada kadar  80–120  ppm  untuk  B1  dan  B6  serta  4-6 ppm untuk B12.
Pada  mode  kromatografi  pasangan  ion, analisa dilakukan dengan menggunakan instrumentasi  yang  sama  dengan  fase  balik dengan  menambahkan  reagen  pasangan  ion  ( ion pair )  yang  memiliki  muatan  berbeda  dengan analit  yang  akan  dianalisa.  Pada  metode  ini reagen  pasangan  ion  yang  digunakan  adalah sodium  heksan  sulfonat  yang  bermuatan  negatif. Mekanisme retensi yang diajukan terkait mode ini antara  lain  adalah  pemodelan  partisi,  pemodelan adsorbsi,  dan  pemodelan  elektrostatik  (Weiss, 2016).
Pemodelan partisi mengasumsikan senyawa analit  berinteraksi  dengan  reagen  pasangan  ion yang  memiliki  muatan  berbeda  dan  membentuk senyawa  non  polar  yang  dapat  berinteraksi dengan  fase  diam.  Pada  pemodelan  adsorbsi, rantai alkil dari reagen pasangan ion yang bersifat hidrofobik  diasumsikan  berinteraksi  dan  terikat pada fase diam non polar menyebabkan fase diam memiliki  muatan.  Muatan  tersebut  bertindak seakan-akan  sebagai  “penukar  ion”  pada  analit dengan muatan berbeda (Weiss, 2016).
Pada pemodelan elektrostatik, diasumsikan reagen pasangan ion dan pasangan ion bebasnya, menciptakan lapisan elektrostatik dengan muatan yang  berbeda.  Analit  akan  mengalami  atraksi elektrostatik  pada  reagen  pasangan  ion  yang menyebabkan  keduanya  seakan-akan  teradsobsi pada  fase  diam  dan  meningkatkan  retensi senyawa dalam kolom (Weiss, 2016).
Gambar 2. Kromatogram dengan puncak B6 pada tR 4,247; B12 pada tR 5,933; B1 pada tR 7,993
Gambar 3. Kurva linieritas
Gambar 4. Sodium heksan sulfonat (Kim dkk., 2023)
Metode  ini  menggunakan  reagen  pasangan ion  sodium  heksan  sulfonat  (Gambar  4)  yang bermuatan negatif. Muatan tersebut berkebalikan dengan  muatan positif yang terdapat  pada analit. Hal  lain  yang  perlu  diperhatikan  adalah memastikan  analit  berada  dalam  kondisi terionisasi.  Pemilihan  pH  3  pada  fase  gerak dilakukan untuk memaksimalkan interaksi antara reagen  pasangan  ion  dan  analit.  Kromatografi pasangan  ion  juga  sensitif  terhadap  konsentrasi ion  yang  dapat  berkompetisi  untuk  berpasangan dengan  reagen  pasangan  ion  dan  menciptakan muatan elektrostatik selama pemisahan berlangsung.
Meski sangat bermanfaat dalam
menganalisa  analit  bermuatan  dan  memiliki kepolaran  yang  tinggi,  metode  pasangan  ion  juga memiliki  kekurangan  yang  perlu  diperhatikan untuk mendapatkan metode dengan keterulangan yang  baik.  Metode  pasangan  ion  membutuhkan waktu  ekuilibrasi  yang  lebih  lama  dibandingkan dengan  metode  fase  balik  biasa  untuk  mencapai sistem yang stabil. Selain itu eluasi secara gradien tidak  begitu  direkomendasikan  dengan  alasan yang  sama,  meski  bukan  berarti  tidak  dapat dilakukan (Dolan, 2008).

## KESIMPULAN
Kromatografi  pasangan  ion  dapat  menjadi alternatif metode analisa yang mudah, terjangkau serta  dapat  diaplikasikan  pada  analit  yang bermuatan  dan  bersifat  polar,  khususnya kombinasi Vitamin B1, B6 dan B12.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih penulis haturkan pada semua  pihak  yang  memungkinkan  penelitian  ini untuk dapat ditulis dan diterbitkan.

## DAFTAR PUSTAKA
Agilent  Technologies,  2016,  The  LC  Handbook:  Guide  to  LC Columns and Method Development, USA.
Christian,  G.D.,  Gasgupta,  P.K.,  &  Schug,  K.A.,  2013, Analytical Chemistry, 7th ed. John Wiley & Sons, Inc.
Dolan,  J.W.,  2008,  Ion  Pairing-Blessing  or  Curse, LCGC
Europe , 21(5):258-263.
ICH,  2022,  Validation  of  Analytical  Procedures:  Text  and Methodology, International  Conference  on  Harmonization (ICH) , Q2(R2), Geneva.
Kementerian Kesehatan RI, 2020, Farmakope Indonesia Edisi VI, Jakarta: Kementerian Kesehatan RI.
Kim, S., Chen, J., Cheng, T., Gindulyte, A., He, J., He, S., Li, Q., Shoemaker, B. A., Thiessen, P. A., Yu, B., Zaslavsky, L., Zhang, J. & Bolton, E.E., 2023, PubChem 2023 update, Nucleic Acids Research , 51 (D1):  D1373–D1380, https://doi.org/10.1093/ NAR/GKAC956 .
Knox,  J.H.,  Laird,  G.R.,  1976,  Soap  chromatography—a  new high-performance  liquid  chromatographic  technique  for separation  of  ionizable  materials:  Dyestuff  intermediates,
Journal of Chromatography A , 122 (C):17–34, https://doi.org/10.1016/S0021-9673(00)82234-7.
Sweetman,  S.  (Ed.),  2008, Martindale:  The  Complete  Drug Reference 36 , London: Pharmaceutical Press.
Weiss,  J.,  2016, Handbook  of  Ion  Chromatography ,  Wiley- VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Germany.
Wishart,  D.S., Knox, C., Guo,  A.C.,  Shrivastava,  S., Hassanali, M., Stothard, P., Chang, Z., & Woolsey, J., 2006, DrugBank: a comprehensive  resource  for  in  silico  drug  discovery  and exploration, Nucleic Acids Research , 34 (Database issue):D668-D672, https://doi.org/10.1093/NAR/GKJ067.