## Evaluasi Sekuens Gen 16S rRNA untuk DNA Barcoding Ikan Tuna
(Evaluation of 16S rRNA Gene Sequence for DNA Barcoding of Tuna Fish)

## Beivy Jonathan Kolondam
Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Sam Ratulangi Jl. Kampus UNSRAT FMIPA, Manado 95115, Indonesia Corresponding author: beivy.kolondam@unsrat.ac.id

## Abstract
For  fish  product  authentication,  DNA  barcoding  has  been  a  reliable  tool.  This  is  due  to  its requirement  of  a  small  amount  of  tissue  sample  in  order  to  conduct  a  full  analysis  for  species identification.  This  research  aimed  to  conduct  an  assessment  for  the  use  of  16S  rRNA  gene sequence for tuna fish identification through DNA barcoding. Previous in silico studies using the COI gene and CYB gene were conducted using the same tuna fish specimens. A comparison of 16S rRNA gene sequence between Bluefin tuna (five species), Yellowfin tuna (three species), and another group of tuna (five species) showed the reliability of this gene in differentiating all species represented  by  the  respective  specimens.  The  multiple  sequence  alignment  of  1695  bp  in  this research  is  reliable  for  accurate  identification.  All  specimens  of  Thunnus  (Bluefin  group  and Yellowfin  group)  were  able  to  be  differentiated  with  other  genera  (Auxis,  Euthynnus,  and Katsuwonus) group in 27 sites. The other tuna fish genera group members are similar in 27 sites and the member Thunnus group has a polymorphism in the same location. The similarity among the Bluefin group is 99.3% to 99.8%. The similarity among Yellowfin group is 99.6% to 99.9%. The similarity among the other group is 97.5% to 99.5%. In conclusion, the 16S rRNA gene is a reliable marker for DNA barcoding of tuna fish.
Keywords: DNA barcoding ; 16S rRNA gene ; tuna fish

## Abstrak
Untuk  kepentingan  autentikasi  produk-produk  dari  ikan,  DNA  barcoding  merupakan perangkat yang dapat diandalkan. Ini disebabkan karena metode ini hanya membutuhkan sedikit sampel  jaringan  untuk  analisis  identifikasi  spesies.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  melakukan asesmen penggunaan sekuens gen 16S rRNA untuk identifikasi ikan tuna melalui DNA barcoding. Studi in silico sebelumnya untuk gen COI dan gen CYB dilaksanakan menggunakan spesimen ikan tuna yang sama. Perbandingan sekuens gen 16S rRNA antara kelompok ikan tuna Bluefin (lima spesies), kelompok ikan tuna Yellowfin (tiga spesies), dan kelompok ikan tuna jenis lain (lima spesies) menunjukkan kemampuan gen ini dalam membedakan semua spesies. Dari hasil yang diperoleh, penjajaran multisekuens dari 1695 bp dapat diandalkan untuk indentifikasi yang akurat. Semua spesimen genus Thunnus (kelompok Bluefin dan kelompok Yellowfin) dapat dibedakan dengan  spesimen  lainnya  pada  27  titik  nukleotida.  Kelompok  tuna  jenis  lain  juga  memiliki nukleotida yang seragam di 27 lokasi dibandingkan dengan yang dari genus Thunnus. Tingkat kesamaan antar spesimen kelompok tuna Bluefin yaitu 99,3% sampai 99,8%. Tingkat kesamaan antar  spesimen  kelompok  tuna  Yellowfin  yaitu  99,6%  sampai  99,9%.  Tingkat  kesamaan  antar kelompok tuna jenis lain yaitu 97,5% sampai 99,5%. Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa gen 16S rRNA merupakan gen yang dapat diandalkan untuk DNA barcoding ikan tuna.
Kata-kata kunci: DNA barcoding ; gen 16S rRNA ; ikan tuna

## PENDAHULUAN
Tuna  merupakan  spesies  ikan  yang popular  dijual  sebagai  produk  makanan kaleng.  Di  pasaran  juga  tersedia  produk dalam bentuk-bentuk lain misalnya daging mentah  dan  dalam  bentuk  filet  beku (Servusova dan Piskata, 2021). Meningkatnya  pengolahan  makanan  dan perdagangan  ikan  tuna  secara  otomatis meningkatkan  potensi  penipuan  beberapa
produk  makanan  olahan  (processed  food) ikan tuna. Salah satu dari bentuk penipuan ini  adalah  adanya  subtitusi  spesies,  di mana makanan diberikan label yang sesuai (mislabeling) dengan tujuan untuk meningkatkan keuntungan.
Dalam mendeteksi dan mencegah adanya subtitusi  spesies  di  pasar  komersil,  telah dikembangkan beberapa metode berdasarkan  profil  protein  dan  profil  asam
deoksiribonukleat  (DNA)  dari  beragam spesies  berbeda  (Hellberg  dan  Morrissey, 2011).  Pada  masa  sekarang,  adanya metode DNA barcoding menjadi perangkat biologi molekuler penting
untuk autentifikasi spesies-spesies ikan tuna dan banyak  produk  hasil  perikanan  lainnya (Hebert et  al .,  2003;  Rasmussen  dan Morrissey, 2008).
Meningkatnya praktek pelabelan yang  tidak  sesuai  dari  produk-produk berbahan ikan tuna menyebabkan meningkatnya kebutuhan akan pemanfaatan DNA barcoding  (Xiong et al ., 2019).  Proses  identifikasi  spesies  ikan menggunakan fitur-fitur morfologi membutuhkan sumber daya manusia yang kompeten.  Pada  saat  ini,  pendekatan morfologi  sulit  untuk  digunakan  dalam proses  identifikasi  untuk  autentifikasi produk pangan yang sudah berbentuk filet dan  ikan  kaleng  (Bottero et  al .,  2007).  Di lain sisi, pihak konsumen ikan tuna memiliki hak  untuk  diinformasikan  identitas  bahan dari  produk  yang  dibeli,  baik  ikan  mentah maupun  ikan  hasil  proses,  sehingga metode  identifikasi  akurat  penting  untuk tetap dilakukan (Aranishi et al ., 2004).
Adanya  teknologi  DNA  barcoding telah  membuka  peluang  untuk  identifikasi spesies  menggunakan  spesimen  jaringan yang  dalam  jumlah  yang  sedikit  (Dudu et al .,  2016).  Untuk  kasus  ikan  tuna, digunakan  berapa  sekuens  gen  yang berasal dari DNA mitokondria  karena bisa diandalkan  untuk  membedakan  banyak dari  spesies  ikan  ini  (Wulansari et  al ., 2015). Penelitian yang memanfaatkan DNA barcoding  untuk  identifikasi  spesies  ikan tuna di Indonesia telah dilakukan. Nurilmala et al . (2016) dan Wulansari et al .
(2015)  menggunakan  gen  sitokrom  B (CYB) untuk autentifikasi produk ikan tuna. Publikasi  Kolondam  (2020a)  melakukan asesmen terhadap  gen COI yang menjadi gen  standar  DNA  barcoding  hewan. Hasilnya  dianggap  kurang  memuaskan karena ada beberapa spesies yang identik atau sama persis urutan sekuens DNAnya. Tujuan  penelitian  ini  adalah  melakukan asesmen  penggunaan  gen  16S  rRNA untuk  identifikasi  ikan  tuna  lewat  DNA barcoding.  Genom  DNA  mitokondria  yang sama dengan penelitian Kolondam (2020a dan 2020b) digunakan untuk
membandingkan spesies-spesies ikan tuna secara in silico .

## METODE PENELITIAN

## Pemilihan DNA Spesimen Ikan Tuna
Dalam  penelitian  ini  digunakan  DNA mitokondia  dari  spesimen-spesimen  yang ada  dalam  repositori  DNA  dan  dianalisis semuanya  secara in  silico .  Komputer dengan sistem operasi Windows 10 (64 bit) digunakan untuk mengolah data. Pengumpulan  informasi  sekuens  DNA dilakukan tanggal 10 Desember 2021 dari laman GenBank NCBI (National Center for Biotechnology  Information)  di  Amerika Serikat (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) yang tersedia daring menggunakan aplikasi  Google  Chrome  v96.  Urutan sekuens gen 16S rRNA dari spesimen ikan tuna  dalam  penelitian  ini  diambil  dari genom mitokondria. Informasi detail semua sekuens  yang  digunakan  dalam  analisis telah  dicantumkan  dalam  Tabel  1,  sesuai dengan penelitian sebelumnya oleh
Kolondam (2020a dan 2020b).
Tabel 1 menginformasikan 13 spesimen  spesies  ikan  tuna  berbeda beserta nomor aksesinya dalam GenBank. Nomor  aksesi  setiap  spesimen  DNA dicantumkan  untuk  penelusuran  kembali semua  spesimen  ini.  Spesimen-spesimen ini mewakili spesies ikan tuna yang dibagi menjadi  tiga  kelompok,  yaitu  tuna  Bluefin, tuna  Yellowfin,  dan  tuna  jenis  lain.  Untuk Euthynnus  lineatus dan Allothunnus  fallai tidak  dicantumkan  untuk  dianalisis  karena belum  ada  informasi  gen  16S  rRNA  utuh dalam  genom  DNA  mitokondria  yang terdata dalam GenBank. Untuk mempermudah perbandingan dengan hasil penelitian  Kolondam  (2020a  dan  2020b), penelitian ini menggunakan genom mitokondria yang sama (tetapi dengan gen berbeda  yaitu  gen  16S  rRNA)  untuk mendapat  perbandingan analisis  dari  satu sumber data individu.

## Pemisahan Sekuens Gen 16S rRNA dari Genom DNA Mitokondria
Panjang  DNA  mitokondria  yang diperoleh  dari  GenBank  masing-masing spesimen memiliki panjang 16,5 kbp. Dari tiap  spesimen  dipisahkan  gen  16S  rRNA dari gen-gen lain dan dari bagian yang tidak mengkode  protein  (non-coding  region).
Lokus gen-gen ini ditentukan dari keterangan nama gen, region gen (berupa nomor)  dalam  genomnya,  dan  CDS (Coding  Sequence)  sekuens  asam  amino
yang  dikode  gen  tersebut.  Panjang  gen 16S rRNA utuh yaitu 1.691-2.692 bp sesuai informasi pemetaan genetik spesimen.
Tabel 1. Nomor aksesi DNA Mitokondria Spesies Ikan Tuna dari GenBank No. Nama Spesies Nomor aksesi Referensi 1 Thunnus alalunga 1 AB101291.1 Manchado et al . (2016) 2 T. maccoyii 1 KF925362.1 Li et al . (2016) 3 T. obesus 1 GU256525.1 Martinez-Ibarra et al . (2016a) 4 T. orientalis 1 KF906721.1 Chen et al . (2014) 5 T. thynnus 1 AP006034.1 Satoh et al . (2016) 6 T. atlanticus 2 NC_025519.1 Marques et al . (2016) 7 T. tonggol 2 NC_020673.1 Martinez-Ibarra et al . (2013) 8 T. albacares 2 NC_014061.1 Martinez-Ibarra et al . (2010) 9 Auxis rochei 3 KM651784.1 Li et al . (2014a) 10 A. thazard 3 AB105447.1 Catanese et al . (2008) 11 Euthynnus affinis 3 NC_025934.1 Li et al . (2014b) 12 E. alletteratus 3 NC_004530.1 Infante et al . (2006) 13 Katsuwonus pelamis 3 JN086155.1 Martinez-Ibarra et al . (2016b)
1) Kelompok Tuna Bluefin; 2) Kelompok Tuna Yellowfin; 3) Kelompok Tuna Jenis Lain

## Penjajaran Sekuens Gen CYB
Penjajaran sekuens (sequence
alignment) penelitian ini digunakan algoritma  MUSCLE  berdasarkan  Edgar (2004)  yang  sudah  terintegrasi  dalam piranti lunak Geneious v5.6. (Kearse et al ., 2012).  Penjajaran  sekuens  digunakan untuk  menunjukkan  perbedaan  tiap  titik nukleotida di urutan penomoran yang sama untuk  spesimen  dalam  penelitian  ini. Tingkat  persentase  kesamaan  disajikan dengan dihitung berdasarkan hasil penjajaran  sekuens  yang  sebelumnya. Sekuens  konsensus  ditampilkan  masing- masing  dengan  menggunakan  notasi- notasi  nukleotida  baku  dari  variasi  pada titik-titik yang terdapat perbedaan nukleotida.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Gen  16S  rRNA  telah  menunjukkan polimorfisme  yang  baik  untuk  digunakan sebagai pembeda spesies. Pada Gambar 1 ditampilkan  1.695  bp  hasil  penjajaran semua  spesimen  yang  mewakili  spesies dari kelompok-kelompok ikan tuna. Penjajaran sekuens mendeskripsikan adanya  99  posisi  nukleotida  yang  dapat dibandingkan dan sangat berpotensi untuk membedakan spesies ikan tuna.
Dibandingkan  dengan  penelitian  yang dilakukan  sebelumnya,  baik  gen  COI
(Kolondam,  2020a)  maupun  gen  CYB (Kolondam, 2020b) memiliki titik pembeda yang dua kali lebih banyak tetapi spesimen dalam  penelitian  ini  yang  dibandingkan menggunakan gen 16S rRNA ini semunaya memiliki  keunikan.  Tidak  ada  dua  sekuen atau  spesimen  yang  identik,  berbeda seperti  kedua  gen  yang  dibandingkan sebelumnya tersebut.
Dari  penjajaran  diamati  adanya variasi  yang  lebih  kecil  di  antara  anggota genus  Thunnus,  yaitu  kelompok  tuna Bluefin  dan  Yellowfin.  Variasi  yang  lebih besar  terjadi  antara  genus  Thunnus dibandingkan dengan kelompok tuna jenis lain  yaitu  genus  Auxis,  Euthynnus,  dan Katsuwonus.
Anggota-anggota spesimen dari genus  Thunnus  dapat  dibedakan  dengan spesimen lainnya pada 27 titik nukleotida. Posisi-posisi nukleotida dari perbedaan ini yaitu  nomor  4,  64,  90,  96,  240,  269,  427, 434,  439,  442,  443,  462,  464,  474,  528, 596,  598,  629,  640,  668,  803,  913,  915, 1.142, 1.144, 1196, dan 1.674. Perbedaan ini  dapat  dilihat  pada  Gambar  1  yang mendeskripsikan  polimorfisme  sekuens DNA  sepanjang  1.695  nukleotida.  Pada posisi  63  terdapat  bagian  yang  bisa dianggap  sebagai  delesi  pada  seluruh anggota genus Thunnus ketika dibandingkan dengan kelompok tuna jenis
yang  lain  yang  sama-sama  memiliki nukleotida A (adenin) pada posisi tersebut.
Gambar 1. Penjajaran (alignment) sekuens gen 16S rRNA spesies ikan tuna
Perbedaan-perbedaan  sekuens  ini berpotensi dalam pengembangkan metode PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism)  untuk  identifikasi  spesies atau  kelompok  makhluk  hidup  tertentu secara cepat (Dooley et al ., 2005). Dalam metode  ini  bisa digunakan  gen  16S  rRNA sebagai gen target yang kemudian potong menggunakan enzim restriksi tertentu yang dirancang  khusus  merestriksi  pada  lokasi dengan sekuens
DNA spesifik.
Pemotongan  yang  berhasil  terjadi  bisa dideteksi
menggunakan proses elektroforesis  gel  agarosa,  pewarnaan (staining)  menggunakan  etidium  bromida, dan  kemudian  divisualisasi  pita  DNA tersebut di bawah sinar ultraviolet menggunakan  alat  UV-transilluminator. Dari  dokumentasi  gel  dapat  diamati  dan diambil  kesimpulan  sesuai  dengan  tujuan aplikasinya.
Dari  Gambar  1  bisa  dilihat  bahwa tidak  ada  nukleotida  unik  yang  bisa mencirikan  kelompok  ikan  tuna,  misalnya nukleotida  yang bisa membedakan  antara anggota kelompok Bluefin dengan anggota kelompok Yellowfin maupun dengan kelompok ikan tuna jenis lain. Dari gambar yang  sama  bisa  dilihat  juga  bahwa kelompok  tuna  jenis  lain  juga  memiliki
nukleotida yang seragam di 27 lokasi, yaitu posisi  nomor  4,  63,  64,  90,  96,  230,  240, 269,  427,  434,  439,  442,  443,  462,  474, 528,  596,  598,  629,  640,  728,  803,  913, 915, 957, 1.598, dan 1.676.
Untuk penelitian ini, tingkat kesamaan  antar  spesimen  kelompok  tuna Bluefin yaitu antara 99,3% sampai dengan 99,8%. Tingkat kesamaan antar spesimen kelompok  tuna  Yellowfin  yaitu  antara 99,6%  sampai  dengan  99,9%.  Tingkat kesamaan  antar  kelompok  tuna  jenis  lain yaitu antara 97,5% sampai dengan 99,5%. Tidak  ada  yang  sama  antar  spesimen  di dalam maupun di luar kelompok tuna yang dibandingkan.
Dari segi kesamaan, spesimen dengan  tingkat  kesamaan  tertinggi  adalah 99,9%  yaitu  antara Thunnus  tonggol dengan T. maccoyii juga antara T. tonggol dengan  T.  atlanticus .  Tingkat  kesamaan kedua  tertinggi  adalah  99,8%  antara T. maccoyii dengan T.  obesus , T.  atlanticus ,
T.  albacares .  Tingkat  kesamaan  99,8% juga  terjadi  antara T.  obesus dengan T. tonggol dan T. albacares . Untuk T. tonggol dan T.  albacares juga  memiliki  tingkat kesamaan 99,8%. Untuk tingkat kesamaan terendah  yaitu  96,1%  terjadi  antara T. thynnus dengan Euthynnus affinis .
Tabel 2. Kesamaan Sekuens 16S rRNA dari Ikan Tuna yang terdata di GenBank
No. Nama Spesies* Tingkat Kesamaan (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 Thunnus alalunga 100 2 T. maccoyii 99,4 100 3 T. obesus 99,3 99,8 100 4 T. orientalis 99,6 99,5 99,5 100 5 T. thynnus 99,6 99,4 99,3 99,7 100 6 T. atlanticus 99,3 99,8 99,7 99,5 99,4 100 7 T. tonggol 99,4 99,9 99,8 99,6 99,5 99,9 100 8 T. albacares 99,3 99,8 99,8 99,4 99,2 99,6 99,8 100 9 Auxis rochei 96,6 96,8 96,8 96,7 96,5 96,7 96,8 96,7 100 10 A. thazard 96,3 96,6 96,6 96,4 96,2 96,5 96,6 96,5 99,5 100 11 Euthynnus affinis 96,3 96,3 96,2 96,2 96,1 96,2 96,3 96,3 97,9 97,5 100 12 E. alletteratus 96,4 96,6 96,6 96,3 96,2 96,5 96,6 96,5 97,8 97,7 98,6 100 13 Katsuwonus pelamis 97,3 97,5 97,4 97,3 97,2 97,5 97,6 97,5 98,3 98,2 97,9 98,2 100
*) Sesuai spesimen dan nomor aksesi pada Tabel 1.
Dalam  identifikasi  spesies,  secara khusus pemanfaatannya untuk autentifikasi spesies,  gen  16S  rRNA  sebagai  barcode DNA  diharapkan  mampu  membedakan semua  spesies  ikan  tuna.  Berdasarkan Tabel  2  dapat  dengan  mudah  ditentukan bahwa harapan ini sudah tercapai. Semua spesimen  ikan  yang  dibandingkan  dalam penelitian  ini  tidak  ada  yang  identik.  Hasil
ini  berbeda  dengan  penelitian  Kolondam (2020a) sebelumnya yang memiliki sekuens-sekuens yang identik dari perbandingannya  menggunakan  gen  COI. Meskipun  gen  COI  merupakan  gen penanda  standar,  gen  ini  tidak  bisa membedakan  beberapa  spesies  tuna.  Di lain  sisi,  gen  16S  rRNA  yang  bukan merupakan  penanda  standar  untuk  DNA
barcoding  hewan  telah  menunjukkan kemampuan yang lebih baik membedakan semua  spesimen  yang  terdiri  atas  13 spesies  tersebut.  Ini  tentunya  menjadikan gen  ini sebagai  gen  yang bisa diandalkan sebagai pembanding, sekaligus berpotensi untuk  dimanfaatkan  untuk  kepentingan lain,  misalnya  perancangan  metode  PCR- RFLP  untuk  autentifikasi  cepat  yang dibahas sebelumnya

## KESIMPULAN
Sekuens gen 16S rRNA telah mampu membedakan  semua  spesimen  yang mewakili  13  spesies  ikan  tuna  dari kelompok  tuna  Bluefin,  kelompok  tuna Yellowdin,  dan  kelompok  tuna  jenis  lain dari  27  titik  perbedaan  nuklotida.  Ini membuat gen 16S rRNA lebih baik dari gen COI  (yang  menjadi  standar)  dan  gen  ini bisa  diandalkan  sebagai  gen  penanda untuk DNA barcoding ikan tuna. Pengembangan metode autentifikasi menggunakan gen ini juga memungkinkan untuk dilakukan di masa depan.

## DAFTAR PUSTAKA
Aranishi,  F.,  T.  Okimoto,  dan  S.  Izumi.
(2005) Identification of Gadoid Species  (Pisces,  Gadidae)  by  PCR- RFLP  Analysis. Journal  of  Applied Genetics 46(1): 69 –73.
Bottero, M. T., A. Dalmasso, M. Cappelletti, C.  Secchi,  dan  T.  Civera  (2007) Differentiation  of  Five  Tuna  Species by  a  Multiplex  Primer-extension Assay. Journal  of  Biotechnology , 129(3), 575 –580.
Catanese, G., C. Infante, dan M. Manchado (2008)  Complete  Mitochondrial  DNA Sequences of the Frigate Tuna Auxis thazard and  the  Bullet  Tuna Auxis rochei . DNA  Sequence ,19(3),  159- 166.
Chen, C., Y. Li, H. Yu, S. Peng, S. Sun, L. Wang,  X.  Meng,  Y.  Huang  dan  X. Kong  (2014) Thunnus  orientalis Mitochondrion,  Complete  Genome https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore /KF906721.1  [diakses  30  November
2021]
Dooley, J.J., H.D. Sage, M.L. Clarke, H.M.
Brown,  dan  S.D.  Garrett  (2005) Fish Species Identification using
PCR−RFLP  Analysis  and  Lab-on-a-
Chip Capillary
Electrophoresis:
Application  to  Detect  White  Fish Species  in  Food  Products  and  an Interlaboratory  Study. Journal  of Agricultural  and  Food  Chemistry ,
53(9), 3348-3357.
Dudu,  A., T.  Barbălată,  G.  Popa,  S.
Georgescu, dan M. Costache (2016) Advantages  and  Limitations  of  DNA Barcoding in Identifying Commercially-Exploited Fish Species. Scientific  Papers  Animal
Science  and  Biotechnologies ,  49(1),
45-49.
Edgar,  R.C.  (2004)  MUSCLE:  Multiple Sequence Alignment with High Accuracy  and  High  Throughput.
Nucleic Acids Research , 32(5), 1792- 1797.
Hebert,  P.D.,  A.  Cywinska,  S.L.  Ball  dan J.R.  de  Waard  (2003)  Biological
Identifications through DNA Barcodes. Proceedings o f  Royal Society B Biological Sciences ,
270(1512), 313 –321.
Hellberg,  R.S.R.,  dan  M.T.  Morrissey (2011)  Advances  in  DNA-Based Techniques  for  the  Detection  of Seafood Species  Substitution  on  the Commercial Market. JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation , 16(4), 308-321. Infante, C., G. Catanese dan M. Manchado (2006) Euthynnus alletteratus
Mitochondrion,  Complete  Genome. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore /NC_004530.1 [diakses 30 November
2021]
Kearse, M., R. Moir, A. Wilson, S. Stones- Havas,  M.  Cheung,  S.  Sturrock,  S. Buxton,  A. Cooper, S. Markowitz, C. Duran,  T.  Thierer,  B.  Ashton,  P. Meintjes,  and  A.  Drummond  (2012) Geneious  Basic:  An  Integrated  and
Extendable Desktop Software Platform  for  the  Organization  and Analysis of Sequence Data.
Bioinformatics , 28(12), 1647-1649. Kolondam,  B.J.  (2020a)  Variasi  Sekuens Gen  COI  untuk  DNA  Barcoding  Ikan Tuna. Media Teknologi Hasil Perikanan , 8(2), 70-75.
Kolondam,  B.J.  (2020b)  Comparison  of CYB  Gene  Sequence  for  Species Identification  of  Tuna  Fish. Jurnal Ilmiah Platax , 8(2), 257-263.
Li, M., L. Guo, H. Zhang, S. Yang, X. Chen, Z.  Meng,  dan  H.  Lin  (2014a). Auxis rochei Mitochondrion, Complete Genome.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore /KM651784.1  [diakses  30  November 2021]
Li, M., L. Guo, H. Zhang, S. Yang, X. Chen,
Z.  Meng  dan  H.  Lin  (2014b)
Euthynnus affinis Mitochondrion,
Complete Genome. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore /NC_025934.1 [diakses 30 November 2021]. Li, Y., C. Chen,  H. Yu, S. Peng, S. Sun, L. Wang,  X.  Meng,  Y.  Huang  dan  X. Kong (2016) The Complete Mitochondrial Genome of the Southern  Bluefin  tuna Thunnus maccoyii . Mitochondrial  DNA ,  27(6), 3921-3922.
Manchado,  M.,  G.  Catanese,  A.  Crespo dan  C.  Infante  (2016) Thunnus alalunga Mitochondrial DNA, Complete Genome. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore /AB101291.1  [diakses  30  November 2021].
Márquez,  E.J.,  J.P.  Isaza  and  J.F.  Alzate (2016)  Mitochondrial  Genome  of  the Blackfin  Tuna Thunnus  atlanticus Lesson, 1831 (Perciformes,
Scrombidae), Mitochondrial  DNA , 27(3), 1771-1772.
Martinez-Ibarra,  C.,  S.  Ishizaki  dan  Y. Nagashima (2016a) Thunnus obesus Mitochondrion,  Complete  Genome. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore /GU256525.1  [diakses  30  November 2021].
Martinez-Ibarra,  C.,  S.  Ishizaki  dan  Y.
Nagashima (2016b) Katsuwonus pelamis Voucher KP02-2318 Mitochondrion,  Complete  Genome.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore /JN086155.1  [diakses  30  November 2021].
Martinez-Ibarra,  C.,  S.  Ishizaki  dan  Y. Nagashima  (2013) Thunnus  tonggol
Mitochondrion,  Complete  Genome. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore /NC_020673.1 [diakses 30 November 2021].
Martinez-Ibarra,  C.,  S.  Ishizaki,  S.  dan  Y.
Nagashima (2010) Thunnus albacares Mitochondrion,  Complete
Genome. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore /NC_014061.1 [diakses 30 November 2021].
Nurilmala,  M.,  U.  Widyastuti,        W.A. Kusuma,  Nurjanah,  N.  Wulansari,  Y. Widyatuti.  2016.  DNA  Barcoding  for Identification of Processed Tuna Fish in Indonesian Market. Jurnal
Teknologi , 78(4), 115 –118
Rasmussen,  R.S.,  dan  Morrissey,  M.T. 2008.  DNA-based  Methods  for  the Identification of Commercial Fish and Seafood  Species. Comprehensive Review  of  Food  Science  and  Food Safety , 7(3), 280-295. Satoh,  T.P.,  M.  Miya,  K.  Mabuchi,  M. Nishida (2016) Structure and Variation of the Mitochondrial
Genome  of  Fishes. BMC  Genomics , 17(1), 719.
Servusova, E., Piskata, Z. (2021)
Identification of Selected Tuna Species  in  Commercial  Products. Molecules , 26(4), 1137.
Wulansari,  N.,  M.  Nurilmala  dan  Nurjanah (2015) Deteksi Ikan Tuna dan Produk Olahannya Berbasis Protein dan DNA Barcoding. Jurnal  Pengolahan  Hasil Perikanan Indonesia , 18(2), 119-127.
Xiong,  X.,  F.  Yuan,  M.  Huang,  L.  Lu,  X. Xiong, J. Wen (2019) DNA Barcoding Revealed  Mislabeling  and  Potential Health  Concerns  with  Roasted  Fish Products Sold across China. Journal of  Food  Protection ,  82  (7),  1200- 1209.