SMART MEDICAL JOURNAL (2022) Vol. 5 No. 1. eISSN : 2621-0916

## Pengaruh Durasi DM Tipe 2 Terhadap Angka Leukosit dan Hitung Jenis Leukosit Pada Tikus Wistar Pasca Bilateral Common Carotid Artery Occlusion (BCCAO)
Farah Jasmine Dianita 1 , Rahma Yuantari 2 , Ety Sari Handayani 3*
1. Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia
2. Departemen Patologi Klinik, Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia
3.    Departemen Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia
*Korespondensi : 097110415@uii.ac.id

## ABSTRAK
Pendahuluan : Stroke iskemik merupakan masalah kesehatan yang sering ditemui di dunia terutama  Indonesia.  Salah  satu  faktor  risiko  stroke  iskemik  adalah  diabetes  mellitus  tipe  2 (DM tipe 2). Angka leukosit dan hitung jenis leukosit mengalami perubahan pada kejadian stroke iskemik maupun DM tipe 2. Pada hewan coba model iskemia otak terdapat perubahan angka  leukosit  dan  hitung  jumlah  jenis  leukosit.  Pada  hewan  coba  DM  tipe  2  dijumpai peningkatan  angka  leukosit  dan  semakin  lama  durasi  DM  maka  leukosit  semakin  tinggi. Belum ada data yang menunjang bagaimana jumlah angka leukosit dan hitung jenis leukosit pada  hewan  coba  iskemia  otak  yang  diinduksi  DM  tipe  2. Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui pengaruh durasi diabetes melitus tipe 2 terhadap angka leukosit dan hitung jenis leukosit pada tikus yang diinduksi iskemia otak.
Metode: Jenis penelitian berupa kuasi eksperimental. Subjek penelitian ini yaitu tikus jantan dewasa  ( Rattus  norvegicus )  galur  Wistar.  Tikus  dikelompokkan  menjadi  4  kelompok perlakuan, masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus. K1 merupakan kelompok sham operated , K2 merupakan kelompok iskemia (BCCAO durasi iskemia 20 menit dan reperfusi 7 hari), K3 merupakan  kelompok  perlakuan  DM  2  minggu  dengan  BCCAO,  dan  K4  merupakan kelompok DM 3 minggu dengan BCCAO. Angka leukosit dan jenis leukosit diukur dengan menggunakan automatic  hematology  analyzer .    Hitung  jenis  leukosit  menggunakan Fluorescence Flow Cytometry . Analisis data menggunakan uji ANOVA dan Kruskal Wallis. Hasil: Penuruan  nilai  netrofil  (23,53x  5,57;  p  =  0,014,  p  <0,05)  dan  peningkatan  limfosit (66,68 x 6,16; p = 0,028, p <0,05) pada kelompok DM 3 minggu yang diinduksi iskemia. Kesimpulan: Terdapat pengaruh durasi diabetes melitus tipe 2 terhadap hitung jenis leukosit yaitu neutrofil dan limfosit pada tikus pasca BCCAO.
Kata Kunci: Durasi DM; BCCAO; angka leukosit; hitung jenis leukosit

## ABSTRACT
Background:  Ischemic  stroke  is  a  health  problem  that  is  often  encountered  in  the  world, especially  in  Indonesia.  DM  type  2  is  a  risk  factor  for  ischemic  stroke.  Lekocytes  dan differential white blood cell (WBC) count changes in the incidence of ischemic stroke and type 2 DM. In the rat stroke model dan rat diabetic model there is a change in total and WBC. Total WBC increases in rat diabetic model.  Duration of diabetes affects differential WBC in rat diabetic model. This research aims this study to determine the effect of duration of type 2 diabetes mellitus on total and differential WBC count on rat stroke model.
Method: This type of research was quasi-experimental. The subjects of this study were adult male rats (Rattus norvegicus) Wistar strain. Rats are devided into 4 groups, each consisting of 6 mice. Group 1 is a sham-operated group, group 2 is a ischemic group (BCCAO is ligated for 20 minutes and 7 days reperfusion), group 3 is a DM-ischemic  group (DM for 2 weeks with BCCAO), and group 4 is a DM-ischemic group ( DM for 3 weeks with BCCAO). Data
analysis  used  ANOVA  and  Kruskal  Wallis  tests.  Total  and  differential  WBC  count  are measured using an automatic hematology analyzer. A differential WBC count are measured using Fluorescence Flow Cytometry.
Results: Decrease in netrophile values (23.53x 5.57; p = 0.014, p <0.05) and increase in lymphocytes (66.68 x 6.16; p = 0.028, p <0.05) in K4 group.
Conclusion: There is a difference in the duration of type 2 diabetes mellitus against leukocyte counts, namely neutrophils and lymphocytes in rats after BCCAO.
Keywords: DM duration; BCCAO; white blood cells; differential count

## PENDAHULUAN
Stroke
merupakan penyakit serebrovaskular  yang  menyebabkan  aliran darah ke otak terganggu. Penyakit ini memiliki prevalensi  kematian  tertinggi  di  dunia  yaitu 9,4 juta kematian dan akan meningkat menjadi 23,3  juta  kematian  pada  tahun  2030.  Di Indonesia, jumlah penderita stroke pada tahun 2013  diperkirakan  sebanyak  1.236.825  orang dan tertinggi di Provinsi Jawa Barat sebanyak 238.001 orang 1 .
Stroke dapat disebabkan karena oklusi pembuluh  darah  intrakranial  sehingga  aliran darah ke otak berkurang (stroke iskemik) atau karena perdarahan (stroke hemoragik). Penyebab  stroke  iskemik  yang  sering  terjadi yaitu aterosklerosis
intrakranial.
Aterosklerosis  merupakan  kondisi  dimana terjadinya  inflamasi  vaskuler.  Indikator  yang berkontribusi  terhadap  aterosklerosis  dan terjadinya  inflamasi  yaitu  leukosit.  Leukosit merupakan komponen darah untuk mendeteksi adanya infeksi yang disebabkan oleh virus atau bakteri dan berperan dalam sistem pertahanan tubuh 2 . Profil subtipe leukosit pada fase akut stroke  iskemik  menjadi  tanda  prediktor prognosis pasien 3 . Jumlah sel darah putih dan neutrofil  total  yang  lebih  tinggi  dikaitkan dengan  peningkatan  risiko  terjadinya  stroke fatal 4 .
Penelitian  menggunakan  hewan  coba dengan model stroke iskemik untuk mengidentifikasi mekanisme yang menyebabkan kerusakan jaringan dan pengembangan  pengobatan  penyakit  stroke
sudah  berkembang  sejak  dahulu 5 .  Metode tersering  yang  dapat  menggambarkan  kondisi stroke  iskemia  pada  manusia  dan  angka mortalitas  hewan  coba  yang  rendah  yaitu model  transient bilateral  common  carotid artery occlusion (BCCAO) 6 . Teknik BCCAO menyebabkan cedera iskemia reperfusi. Ketika terjadi reperfusi jaringan setelah iskemia maka kerusakan  jaringan  akan  bertambah  berat  dan dapat  menyebabkan  nekrosis  jaringan 7 .  Pada patogenesis  cedera  iskemia  reperfusi  otak terdapat faktor penentu yang akan menginisasi proses  selanjutnya.  Faktor  tersebut  adalah infiltrasi  leukosit.  Selama  reperfusi,  leukosit aktif menempel pada sel endotel melalui sinyal kemotaksis,  diikuti  oleh  produksi  matriks metalloproteinase dan neutrofil, menyebabkan gangguan  sawar  darah  otak.  Leukosit  pada gilirannya  akan  mengalami  ekstravasasi  dari kapiler  dan  menyusup  ke  jaringan  otak, melepaskan sitokin yang memediasi peradangan,  yang  akhirnya  mengakibatkan kerusakan penumbra 8 .
Identifikasi  faktor  risiko  pada  pasien stroke  sangat  penting  dilakukan  untuk melakukan  pencegahan  lebih  dini.  Diabetes melitus  merupakan  faktor  risiko  independen yang  diakui  untuk  stroke  dengan  morbiditas dan mortalitas yang lebih tinggi 9 .
Diabetes  Melitus  (DM)  merupakan
penyakit metabolik dengan adanya
peningkatan  kadar  glukosa  darah  yang melebihi dari normal 10 . Sekitar 43% kematian terjadi  pada  usia  dibawah  70  tahun  karena tingginya  kadar  glukosa  darah  sehingga  DM menjadi  salah  satu  penyebab  kematian  di
dunia.  WHO  memprediksi  akan  terjadi kenaikan pasien DM di Indonesia dari 8,4 juta jiwa pada tahun 2000 menjadi sekitar 21,3 juta jiwa  pada  tahun  2030.  Dari  semua  klasifikasi DM, DM tipe 2 memiliki prevalensi terbanyak di dunia 10 .
Hiperglikemia  pada  DM  tipe  2  dapat menyebabkan  gangguan  fungsi  endotel  dan meningkatkan  agregasi  leukosit  dan  platelet sehingga  proses  tersebut  akan  menyebabkan proses  aterosklerosis.  Diabetes  melitus  dapat menginduksi  defisiensi  imun  karena  kadar glukosa yang tinggi dan tidak terkontrol dalam waktu  lama  dapat  menurunkan  fungsi  sel leukosit  dalam  fagositosis  sehingga  penderita rentan terkena infeksi dan dapat menyebabkan inflamasi. Menurut Yakhchalian et al. (2018), total  sel  darah  putih  meningkat  (leukositosis) dapat diamati pada tikus kelompok diabetes 11 . Berdasarkan  penelitian  sebelumnya,  terdapat hubungan  antara  usia  dan  durasi  diabetes dengan  jumlah  leukosit,  sehingga  dapat dikatakan  bahwa  jumlah  leukosit  yang  lebih tinggi  pada  usia  yang  lebih  tua  dan  memiliki diabetes lebih lama 12 .
Seiring dengan meningkatnya kejadian diabetes  melitus,  perkembangan  penelitian mengenai DM pun semakin banyak dilakukan seperti  menggunakan  hewan  coba  model diabetes.  Terdapat  beberapa  jenis  perlakuan yang  dapat  dilakukan  kepada  hewan  model untuk  DM  tipe  II.  Salah  satunya  dengan pemberian agen diabetogenik seperti streptozotosin  (STZ).  Pada  streptozotosin dapat menginduksi DM tipe 2. Model STZ-NA diabetes tipe II telah dilaporkan sebagai model yang baik untuk studi komplikasi diabetes dan telah  digunakan  dalam  studi  yang  berfokus pada komplikasi DM 13 .
Berdasarkan pernyataan diatas, stroke iskemik  dapat  menyebabkan  peningkatan leukosit  dan  terbentuknya  agregasi  leukosit. Hal ini didukung oleh hasil beberapa penelitian yang  menunjukkan  adanya  perubahan  angka leukosit dan hitung jumlah jenis leukosit pada hewan coba model stroke iskemik.  Diketahui
pula  bahwa  adanya  faktor  risiko  DM  Tipe  2 pada  hewan  coba  model  iskemik  dapat menyebabkan  cedera  jaringan  semakin  parah. Pada  hewan  coba  DM  tipe  2  dijumpai peningkatan angka leukosit dan semakin lama durasi  DM  maka  leukosit  semakin  tinggi. Sayangnya  selama  ini  belum  ada  data  yang menunjang  bagaimana  jumlah  angka  leukosit dan  hitung  jenis  leukosit  pada  hewan  coba iskemia  yang  diinduksi  DM.  Atas  dasar  itu maka  penulis  melakukan  penelitian  ini  untuk dapat  mengetahui pengaruh  durasi  DM tipe  2 terhadap  angka  leukosit  dan  hitung  jenis leukosit pada tikus wistar pasca stroke iskemik.

## METODE
Penelitian ini telah mendapatkan Ethical clearance dari komite etik Fakultas
Kedokteran  Universitas  Islam  Indonesia dengan nomor 6/Ka/Kom.Et/70/KE/IV/2019.
Penelitian  ini  merupakan  penelitian Kuasi  eksperimental  dengan  desain post  test control group design . Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. Subyek penelitian ini yaitu tikus jantan dewasa ( Rattus norvegicus )  galur  Wistar.  Berdasarkan  rumus Charan  (2013),  jumlah  tikus  yang  digunakan pada penelitian ini tiap kelompok terdiri dari 6 ekor  tikus,  sehingga  total  jumlah  tikus  yang digunakan yaitu 24 ekor tikus 14 .
Terdapat  empat  kelompok percobaan. Kelompok 1 (K1) merupakan kelompok sham operated . Kelompok 2 (K2) merupakan stroke iskemik  (tanpa  perlakuan  durasi  DM  tetapi dilakukan ligasi arteri karotis komunis bilateral selama  20  menit  dan  reperfusi  7  hari. Kelompok  3  (K3)  merupakan  kelompok perlakuan durasi DM tipe 2 selama 2 minggu yang  diinduksi  BCCAO.  Kelompok  4  (K4) merupakan  kelompok  perlakuan  durasi  DM tipe  2  selama  3  minggu  yang  diinduksi BCCAO.

## Induksi Diabetes Melitus Tipe 2
Induksi DM tipe 2 menggunakan STZ dan NAD. Tikus ditimbang untuk menentukan dosis  pemberian,  kemudian  menyuntikkan NAD  dosis  110  mg/kgBB.  Volume  injeksi intra  peritoneal  maksimal  1  ml/100grBB (untuk  2  macam  obat  sehingga  volume  NIC maksimal  0,5  ml). Setelah  itu,  menyuntikkan STZ  dosis  65  mg/kgBB.  Volume  injeksi intraperitoneal maksimal  1  ml/100grBB (untuk  dua  macam  obat  sehingga  volume maksimal  STZ  0,5ml).  Kemudian  diberikan larutan  glukosa  5%  dan  pakan  secara ad libitum selama  24  jam  dan  diukur  kadar  gula darah puasa dan berat badan tikus dalam waktu 72  jam  post-induksi.  Tikus  dengan  kadar glukosa  darah  puasa  ≥  126  mgdL  tergolong tikus yang mengalami diabetes mellitus.

## Teknik  Bilateral  Common  Carotid  Artery Occlusion (BCCAO)
Teknik  BCCAO  mengikuti  prosedur yang pernah dilakukan sebelumnya 15 . Teknik ini dilakukan melalui beberapa tahap. Pertama, tahap anestesi. Sebelum dilakukan ligasi, tikus dianestesi  menggunakan  ketamin  dosis  80  – 100 mg/kgBB diberikan secara intra muscular pada  paha lateral tikus.  Tikus  kemudian diletakkan pada platform steril dan suhu rectal tikus dijaga pada suhu 37 ± 1°C. Kedua, tahap disinfeksi untuk mencegah infeksi pada tikus. Disinfeksi  menggunakan  alkohol  dan  larutan povidone iodine yang dioleskan pada permukaan leher anterior tikus. Ketiga, tahap insisi.  Insisi  dilakukan  secara  vertikal  pada bagian anterior  medial leher  tikus.  Keempat, tahap  eksplorasi arteri  carotis  communis . Eksplorasi dilakukan tanpa memotong glandula submandibularis dan nervus phrenicus .  Kemudian  tahap  ligasi.  Ligasi dilakukan pada arteri carotis communis dextra dan sinistra menggunakan clamp  vascular selama  20  menit  (durasi  iskemia). Tahap terakhir  adalah  penjahitan.  Setelah  ligasi selesai, clamp vascular dilepaskan. Selanjutnya  dilakukan  penjahitan  bekas  insisi
menggunakan  benang silk .  Daerah  sekitar insisi  didisinfeksi  menggunakan povidone iodine . Kemudian tikus dibiarkan hidup selama 7 hari (durasi reperfusi).

## Perlakuan Kelompok Sham Operated
Kelompok sham mendapatkan perlakuan anestesi, disinfeksi, insisi,
eksplorasi,  dan  penjahitan  tanpa  dilakukan BCCAO.

## Euthanasia dan Pengambilan Darah
Euthanasia dilakukan  setelah  7  hari reperfusi.  Tikus  dianestesi  menggunakan ketamin dosis 80 – 100 mg/kgBB secara intra muscular pada paha lateral tikus. Selanjutnya dilakukan  insisi linea  mediana pada  dinding abdomen , dilanjutkan dengan insisi sepanjang linea  mediana  axillaris sampai  dinding  dada terbuka  dan  jantung  terlihat.  Dilakukan pengambilan  darah  menggunakan  spuit  3  cc pada  apeks  jantung.  Setelah  dilakukan pengambilan darah selanjutnya darah dimasukkan  ke  dalam  tabung  EDTA  dan dilakukan homogenisasi dengan cara menggoyang-goyangkan tabung EDTA secara perlahan.

## Pemeriksaan  Darah  Leukosit  dan  Hitung Jenis Leukosit
Darah  yang  telah  tersimpan  pada tabung EDTA selanjutnya dilakukan pemeriksaan  darah  di  salah  satu  pelayanan laboratorium  kesehatan  di  Yogyakarta  untuk dilakukan  pemeriksaan  angka  leukosit  dan hitung jenis leukosit. Angka leukosit dan jenis hitung  leukosit  diukur  dengan  menggunakan automatic  hematology  analyzer .    Jenis  jenis leukosit  menggunakan Fluorescence  Flow Cytometry .

## Analisis Data
Analisis  dilakukan  dengan  perangkat lunak statistik. Dilakukan uji Saphiro Wilk Test untuk  mengetahui  normalitas  data.  Jika  data terdistribusi  normal  maka  selanjutnya  akan
dilakukan  uji One  Way  Analysis  of  Variance (ANOVA) Test dengan  interpretasi  H0 diterima  apabila p  value >  0,05  dilanjutkan dengan Post  Hoc  Tamhane’s .  Analisis  juga dilakukan  secara  deskriptif  untuk  mengetahui nilai  rerata,  dan  nilai  standar  deviasi  masing- masing variabel penelitian.

## HASIL
Uji normalitas data pada penelitian ini dilakukan  dengan Shapiro-Wilk  Test dan didapatkan data data terdistribusi normal pada angka leukosit, neutrofil, limfosit dan monosit dengan  p  >  0,05  sehingga  dilakukan  analisis menggunakan  uji  ANOVA.    Dan  data terdistribusi tidak normal pada nilai basofil dan eosinofil  dengan  nilai  p  <  0,05  sehingga analisis menggunakan uji Kruskal Wallis.
Hasil  uji ANOVA  test didapatkan angka  leukosit  (p  =  0,263),  neutrofil  (p= 0,014),  limfosit  (p  =  0,028)  dan  monosit  (p= 0,159) dan hasil uji Kruskal Wallis didapatkan basofil (p  =  0,119)  dan  eosinofil  (p  =  0,495). Data  hasil  analisis  ANOVA  dan  Kruskal Wallis,  nilai  rerata  dan  standar  deviasi disajikan  pada  tabel  1.  Dari  hasil  di  atas menunjukan  bahwa  neutrofil  dan  limfosit memiliki  nilai  p  <  0,05  yang  berarti  hasil tersebut  signifikan  atau  terdapat  pengaruh durasi  DM  tipe  2  pada  tikus  pasca  ligasi BCCAO.
Terdapat  perbedaan  variabel  neutrofil antara  kelompok sham  operated (K1)  dengan kelompok stroke iskemik (K2) dengan nilai p = 0,026 (p < 0,05) dan kelompok sham operated (K1)  dengan  kelompok  DM  3  minggu  yang diinduksi iskemia (K4) dengan nilai p = 0,028 (p < 0,05). Nilai rerata neutrofil pada K1 lebih tinggi  daripada  K2.  Perbedaan  selanjutnya terdapat pada variabel limfosit antara kelompok  tikus sham  operated (K1)  dengan kelompok DM 3 minggu (K4) dengan nilai p = 0,046 (p < 0,05). Nilai rerata limfosit pada K4 lebih tinggi daripada K1.
Tabel 1. Nilai Rerata, Std Deviasi, dan Nilai P Variabel Grup Rerata ± Std deviasi Nilai P Leukosit (ribu/mm 3 ) K1 K2 K3 K4 8852.00 ± 1133.01 8386.66 ± 5171.50 9006.66 ± 4353.41 13470.00 ± 6461.18 0,263 Neutrofil (%) K1 K2 K3 K4 46.78 ± 8.35 23.33 ± 15.59 26.85± 14.61 23.53± 5.57 0,014* Limfosit (%) K1 K2 K3 K4 43.16 ± 7.29 64.65 ± 17.83 64.75 ± 16.09 66.88 ± 6.16 0,028* Monosit (%) K1 K2 K3 K4 6.08 ± 1.05 10.85± 4.48 8.16 ± 2.11 8.96 ± 4.07 0,159 Basofil (%) K1 K2 K3 K4 0.00 ± 0.00 0.30 ± 0.73 0.00 ± 0.00 0.21 ± 0.39 0,119 Eosinofil (%) K1 K2 K3 K4 0.56 ± 0.53 0.86 ± 0.82 0.23 ± 0.22 0.40 ± 0.40 0,495
* : Nilai p < 0,05 menunjukan hasil yang bermakna

## PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan bahwa  terdapat  pengaruh  yang  signifikan durasi  DM  tipe  2  terhadap  nilai  neutrofil  dan limfosit  pada  tikus  pasca  ligasi  BCCAO ( Billateral Common Carotid Artery Occlution ). Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang  signifikan  pengaruh  durasi  DM  tipe  2 terhadap angka leukosit, nilai limfosit, basofil, eosinofil,  dan  monosit  pada  tikus  pasca BCCAO  ( Billateral  Common  Carotid  Artery Occlution ).

## Angka leukosit
Hasil penelitian ini menunjukkan tidak terdapat  pengaruh  yang  signifikan  antara durasi DM tipe 2 terhadap angka leukosit pada tikus  setelah  stroke  iskemik.  Pada  kelompok sham operated , K2 dan K3 terjadi peningkatan
jumlah  leukosit  tetapi  masih  didalam  kisaran nilai normal angka leukosit (8000 sd 9000/ mm kubik),  sedangkan  angka  leukosit  pada kelompok  K4  diatas  nilai  normal  (>11.000/ mm  kubik).  Peningkatan  angka  leukosit  yang masih  dalam  kisaran  nilai  normal  sesuai dengan  penelitian  lainnya.  Pada  penelitian Sienel et  al (2022)  melaporkan  bahwa  tikus yang  diinduksi  oklusi  arteri  medial  cerebral (MCAO) 2 jam dengan durasi reperfusi 1 jam menunjukkan  bahwa  leukosit  dalam  kapiler dan adhesi arteriol cenderung meningkat tetapi peningkatannya tidak signifikan 16 . Nilai angka lokosit  yang  tinggi  pada  tikus  kelompok  K4 menunjukkan  bahwa  durasi  DM  yang  lebih lama  akan meningkatkan  angka  leukosit  pada tikus  iskemia.  Hasil  penelitian  ini  juga  sesuai dengan kejadian yang terjadi di pasien diabetes tipe  2.  Naredi et  al .  (2017)  menyebutkan bahwa 56% pasien dengan DM tipe 2 memiliki angka leukosit yang tinggi tetapi masih dalam kisaran nilai normal   7000-11000/ mm kubik 17 . Penelitian Moradi et al . (2012)
menunjukkan  bahwa  peningkatan  angka leukosit dalam kisaran nilai normal pada pasien diabetes berhubungan dengan kejadian komplikasi 12 . Induksi DM menggunakan STZ dosis  60  mg/kgBB  meningkatkan  angka leukosit pada tikus 18 .
Kemungkinan  yang  menyebabkan ketidakbermaknaan  angka  leukosit  dalam darah dapat disebabkan karena adanya migrasi leukosit  ke  venula  serebral  dan  jaringan serebral.  Pada  penelitian  Sienel et  al (2022) melaporkan bahwa tikus yang diinduksi oklusi arteri medial  cerebral  (MCAO)  2  jam dengan durasi  reperfusi  1  jam  menunjukkan  ada peningkatan  leukosit  dan  agregasi  platelet- leukosit  di  venula  serebral  yang  signifikan sedangkan  leukosit  dalam  kapiler  dan  adhesi arteriol cenderung meningkat tetapi peningkatannya  tidak  signifikan 16 .  Faktor lainnya adalah tikus mengalami stress  selama perlakuan. Stres dapat menurunkan mekanisme pertahanan tubuh 19 . Perlu juga dipertimbangkan  menggunakan  hewan  coba
berjenis  kelamin  betina.  Salah  satu  penelitian melaporkan  bahwa  angka  leukosit  pada penderita  DM  tipe  2  dipengaruhi  oleh  jenis kelamin. Angka leukosit pada pasien perempuan meningkat signifikan. Pada pasien laki  laki  tidak  dijumpai  peningkatan  angka leukosit 20 .

## Nilai Neutrofil
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan adanya  pengaruh  signifikan  durasi  DM tipe  2 terhadap  nilai  neutrofil  pada  tikus  pasca induksi  iskemia.  Terjadi  penurunan  neutrofil pada  kelompok  iskemia  (K2)  dan  kelompok DM  3  minggu  dengan  iskemia  (K4) dibandingkan dengan sham-operated (K1). Pada kejadian stroke akibat
penyumbatan  pembuluh  darah  arteria  cerebri media  (MCA),  terjadi  penyumbatan  60-67% kapiler  yang  terletak  distal  dari  MCA. Penyumbatan  tersebut  disebabkan  karena akumulasi neutrofil di lumen kapiler, sehingga menambah  hambatan  aliran  darah  daerah cortex  cerebri 21 .  Saat  terjadi  stroke,  dalam beberapa  menit  kemudian  neutrofil  akan bermigrasi  ke  otak.  Migrasi  tersebut  melalui pembuluh  darah  menuju  area  otak  yang mengalami iskemia. Neutrofil akan melepaskan  berbagai  jenis  molekul  adesi endotel  dalam  15  menit  pertama  kejadian stroke.  Pada  penelitian  menggunakan  hewan coba  disebutkan  bahwa  infiltrasi  neutrofil terjadi di hari pertama stroke, mencapai puncak pada hari ketiga, lalu menurun di hari  ke 4, 5 dan  6.  Netrofil  tetap  terdeteksi  pada  hari ketujuh  dan  ke-15  pasca  stroke 22 .  Jumlah leukosit  dan  neutrofil  perifer  yang  tinggi berkaitan erat dengan tingkat volume jaringan iskemik yang lebih besar 23 . Aktivitas neutrofil akan  melemah  pada  hari  ke  2  hingga  ke  4 setelah iskemik terjadi dan semakin menurun 8 . Jumlah neutrofil yang terdeteksi dalam plasma  darah  bervariasi  menurut  waktu reperfusinya.  Pada  tikus  diabetes  yang diinduksi  iskemia  dengan  teknik  MCAO terjadi  peningkatan  neutrofil  di  awal  masa
reperfusi yaitu 1 sampai 24 jam 24 . Pada tikus diabetes  1  minggu  didapatkan  peningkatan jumlah  neutrofil 11 .  Netrofil  akan  menurun pada minggu kedua hiperglikemia pada hewan coba  model    diabetes  yang  diinduksi  dengan aloxan 25 .  Penelitian  ini  menunjukkan  bahwa jumlah netrofil dalam darah pada kelompok K4 mengalami  penurunan  signifikan  pada  hari ketujuh reperfusi.
Penurunan  signifikan  neutrofil  dalam darah pada hewan coba diabetes yang diinduksi iskemia mungkin berhubungan dengan derajat keparahan  iskemia  otak.  Pada  awal  kejadian iskemia  terjadi  peningkatan  kadar  neutrofil darah  (1  jam  sampai  24  jam).  Neutrofil  akan bermigrasi  ke  jaringan  parenkim  otak.  Dalam 24  jam  pertama  iskemia  dijumpai  sedikit neutrofil    pada  parenkim cortex dan striatum otak  tikus.  Jumlah  neutrofil  tertinggi  pada  96 jam  (4  hari)  pasca  iskemia 26 .  Saat  jumlah neutrofil dalam darah menurun maka dijumpai peningkatan jumlah neutrofil di jaringan otak. Kelemahan  penelitian  ini  adalah  tidak dilakukan  pengukuran  neutrofil  pada  jaringan otak  sehingga  tidak  dapat  dilihat  hubungan antara jumlah neutrofil darah dengan jaringan otak.

## Nilai limfosit
Pada  penelitian  ini  menunjukkan terdapat  pengaruh  yang  signifikan durasi  DM tipe 2 terhadap nilai limfosit pada tikus pasca diinduksi  iskemik  serebral.  Rerata  limfosit diperifer  kelompok  DM  3  minggu  (K4)  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  kelompok  stroke iskemik (K2). Hiperglikemia pada pasien DM tipe  2  dapat  menyebabkan  gangguan  fungsi endotel  dan  meningkatkan  agregasi  leukosit sehingga  proses  tersebut  akan  menyebabkan proses aterosklerosis sehingga terjadi komplikasi  stroke.  Limfosit  T  lebih  banyak berperan dalam meningkatkan kerusakan pada jaringan yang iskemik daripada limfosit B, dan diketahui  bahwa  tikus  dengan  defisiensi limfosit  T  memiliki  ukuran  infark  yang  lebih kecil  dibandingkan  kelompok  kontrol 27 .
Limfosit  berperan  aktif  pada  mekanisme iskemia  otak.  Limfosit  mampu  menghasilkan pro  inflamasi  sitokin  dan  senyawa  sitotoksik lainnya. Beberapa penelitian pada hewan coba menunjukkan  peningkatan  limfosit  sesaat setelah  neutrofil  meningkat.  Peningkatan limfosit  terjadi  pada  hari  ke-3  sampai  ke-6 pasca induksi iskemia 28 . Hal ini sesuai dengan hasil  penelitian  ini  dimana  masih  terjadi peningkatan  limfosit  disaat  kadar  neutrofil sudah menurun pada kelompok K4.

## Nilai monosit, basofil dan eosinofil
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan tidak terdapat pengaruh yang signifikan antara durasi  DM  tipe  2  terhadap  nilai  monosit, basofil dan eosinofil pada tikus pasca BCCAO. Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  yang dilakukan  Kraft et  al (2015)  mengatakan bahwa  pasien  yang  telah  terdiagnosis  stroke iskemik akut tidak mengalami perubahan nilai monosit  yang  signifikan 29 .  Monosit  dapat diamati  paling  cepat  pada  2  jam  setelah iskemik,  sedangkan  aktivitas  di  otak  dapat dilihat setelah 10 jam dan sampai 48 jam pasca kerusakan,  aktivitas  makrofag  dan  mikroglia akan  terlihat  pada  seluruh  lesi  serta  dapat bertahan  dalam  1  minggu  atau  lebih  lama 28 . . Penelitian  lain  menunjukkan  bahwa  monosit berespon pada hari ke 3 hingga 7 setelah onset 23 .
Eosinofil  dapat  menjadi  prediktor keparahan  iskemia  otak.  Jumlah  eosinophil yang rendah (eosinopenia) berkorelasi dengan besarnya  area  iskemia  otak  dan  berkorelasi dengan keparahan gejala 30 . Pada penelitian ini terjadi penurunan jumlah eosinophil walaupun tidak  signifikan  pada  kelompok  DM  2  dan  3 minggu  yang  diinduksi  BCCAO.  Penelitian Zhao et al . (2020) menyebutkan bahwa puncak penurunan jumlah eosinophil terjadi pada hari kedua reperfusi 30 . Hal ini sesuai dengan hasil penelitian  ini  dimana  pada  hari  ketujuh reperfusi penurunan menjadi tidak signifikan.
Pada  penelitian  ini  tidak  terjadi perubahan pada angka basofil dalam darah. Hal
ini  sesuai  dengan  penelitian  lainnya  dimana angka  basophil  pada  kelompok    DM  tipe  2 tidak  berbeda  dengan  kelompok  kontrol 20 . Pada hewan coba model diabetes lainnya tidak dijumpai  peningkatan  jumlah  basophil  dalam darah 31 .

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  analisis  data  dapat disimpulkan  bahwa  terdapat  pengaruh  durasi diabetes  melitus  tipe  2  terhadap  hitung  jenis leukosit yaitu neutrofil dan limfosit pada tikus pasca ligasi BCCAO.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terimakasih  ditujukan  kepada Unit  Penelitian  dan  Pengabdian  Masyarakat (UPPM)  Fakultas  Kedokteran  Universitas Islam Indonesia.

## DAFTAR PUSTAKA
1.   Kemenkes. Riset Kesehatan Dasar RISKESDAS  2013.  Kementrian  Kesehatan Republik Indonesia. 2013.
2.   Wu TH, Chien KL, Lin HJ, Hsu HC, Su TC, Chen MF, et al. Total white blood cell count or  neutrophil  count  predict  ischemic  stroke events among adult Taiwanese: Report from a community-based cohort study. BMC Neurol [Internet].  2013;13(1):1.  Available  from: BMC Neurology 3.   Semerano A, Strambo D, Martino G, Comi G,
Filippi M, Roveri L, et al. Leukocyte Counts and Ratios Are Predictive of Stroke Outcome and Hemorrhagic Complications Independently  of  Infections.  Front  Neurol. 2020;11(April):1–7.
4.   Hu Z bing, Lu Z xiong, Zhu F, Jiang C qiang, Zhang W sen, Pan J, et al. Higher total white blood cell and neutrophil counts are associated with  an  increased  risk  of  fatal  stroke occurrence:  the  Guangzhou  biobank  cohort study.  BMC  Neurol  [Internet].  2021;21(1).
Available from: https://doi.org/10.1186/s12883-021-02495-z
5.   Handayani ES, Susilowati R, Setyopranoto I,
Partadiredja  G.  Transient  Bilateral  Common Carotid  Artery  Occlusion  (tBCCAO)  of  Rats as  a  Model  of  Global  Cerebral  Ischemia. Bangladesh J Med Sci. 2019;18(03):491–500.
6.   Sanderson TH, Wider JM. 2-Vessel Occlusion
/ Hypotension : A Rat Model of Global Brain Ischemia. J Vis Exp [Internet]. 2013;76(50173):1–8. Available from: http://www.jove.com/video/50173 7.   Kalogeris  T,  Baines  CP,  Krenz  M,  Korthuis RJ.  Cell  Biology  of  Ischemia/Reperfusion
Injury. Vol. 298, International Review of Cell and Molecular Biology. 2012. 229–317 p.
8.   Lin, Wang, Yu. Ischemia-reperfusion Injury in the Brain: Mechanisms and Potential
Therapeutic  Strategies.  Biochem  Pharmacol (Los Angel). 2016;5(4).
9.   Chen R, Ovbiagele B, Feng W. Diabetes and Stroke: Epidemiology, Pathophysiology, Pharmaceuticals  and  Outcomes.  Am  J  Med
Sci. 2016;351(4):380–6. 10.   WHO.  Global  Report  on  Diabetes  [Internet]. Vol.  978,  WHO.  2016.  Available  from:
https://sci- hub.si/https://apps.who.int/iris/handle/10665/ 204874%0Ahttps://apps.who.int/iris/bitstrea m/handle/10665/204874/WHO_NMH_NVI_
16.3_eng.pdf?sequence=1%0Ahttp://www.w ho.int/about/licensing/copyright_form/index. html%0Ahttp://www.who.int/about/licens 11.   Yakhchalian  N,  Hatami  K,  Nosrati  H,
Yousofvand  N.  Hematological  and  Serum Biochemical  Analysis  of  Streptozotocin- Induced Insulin Dependent Diabetes Mellitus in  Male  Adult  Wistar  Rats  Nima  [Internet]. Iran; 2018. Available from:
https://doi.org/10.1101/359844
12.   Moradi  S,  Kerman  SRJ,  Rohani  F,  Salari  F.
Association  between  diabetes  complications and  leukocyte  counts  in  Iranian  patients.  J Inflamm  Res  [Internet].  2012;5(1):7–11. Available from: http://dx.doi.org/10.2147/JIR.S26917
13.   Ghasemi A, Khalifi S, Jedi S. Streptozotocin- nicotinamide-induced  rat  model  of  type  2 diabetes. Acta Physiol Hung. 2014;101(April 2015):408–20.
14.   Charan  J,  Kantharia  ND.  How  to  calculate sample  size  in  animal  studies?  J  Pharmacol Pharmacother. 2013 Oct;4(4):303–6.
15.   Handayani  ES,  Nurmasitoh  T,  Akhmad  SA, Fauziah AN, Rizani R, Rahmawati RY, et al. Effect  of  BCCAO  Duration  and  Animal Models Sex on Brain Ischemic Volume After 24 Hours Reperfusion. Bangladesh J Med Sci [Internet].  2018;17(01):129–37.  Available from: http://dx.doi.org/10.3329/bjms.v17i1.35293 16.   Sienel  RI,  Kataoka  H,  Kim  SW,  Seker  FB,
Plesnila  N.  Adhesion  of  Leukocytes  to Cerebral  Venules  Precedes  Neuronal  Cell Death  and  Is  Sufficient  to  Trigger  Tissue Damage  After  Cerebral  Ischemia.  Front
Neurol. 2022;12(January):1–16. 17.   Naredi  M,  Jhavae  D,  Krishan  D.  Study  of relationship between WBC count and Diabetic complications. Int J Adv Med. 2017;4(4):1128. 18.   Yakhchalian N, Mohammadian N, Hatami K, Nosrati H, Yousofvand N. Hematological and Serum Biochemical Analysis of Streptozotocin-Induced  Insulin  Dependent Diabetes Mellitus in Male Adult Wistar Rats. bioRxiv [Internet]. 2018;(Iddm):359844. Available from: https://doi.org/10.1101/359844 19.   Konsue A, Picheansoonthon C, Talubmook C. Fasting blood glucose levels and
hematological values in normal and streptozotocin-induced diabetic rats of mimosa  pudica  L.  extracts.  Pharmacogn  J. 2017;9(3):315–22.
20.   Zaidan HK, Ibrahim IH, Al Saadi AH, Ewadh MJ, Ali QM, Ameri A. Total and differential leukocytes  count  in  type  2  diabetes  mellitus patients  in  Iraq.  Res  Biotechnol  [Internet].
2012;3(2):32–40. Available from: www.researchinbiotechnology.com 21.   El  Amki  M,  Glück  C,  Binder  N,  Middleham
W,  Wyss  MT,  Weiss  T,  et  al.  Neutrophils
Obstructing  Brain  Capillaries  Are  a  Major Cause of No-Reflow in Ischemic Stroke. Cell Rep. 2020;33(2).
22.   Dolgushin II, Zaripova ZZ, Karpova MI. The role  of  neutrophils  in  the  pathogenesis  of ischemic
stroke. Bull Sib Med.
2021;20(3):152–60.
23.   Li  P,  Gan  Y,  Mao  L,  Leak  R.  The  Critical Roles  of  Immune  Cells  in  Acute  Brain
Injuries.  In:  Immunological Mechanisms  and Therapies in Brain Injuries and Stroke. 2014.
p. 9–25.
24.   Desilles JP, Syvannarath V, Ollivier V, Journé C, Delbosc S, Ducroux C, et al. Exacerbation of  Thromboinflammation  by  Hyperglycemia Precipitates  Cerebral  Infarct  Growth  and
Hemorrhagic Transformation.
Stroke.
2017;48(7):1932–40.
25.   Slijepčević V, Manojlović M, Dekić R, Lolić S,  Đeri  A,  Radović  I.  Differential  leucocyte count of alloxan-treated Wistar rats Animals. SKUP. 2019;10(1):37–44.
26.   Otxoa-De-Amezaga A, Gallizioli M, Pedragosa  J,  Justicia  C,  Miró-Mur  F,  Salas- Perdomo A, et al. Location of Neutrophils in Different  Compartments  of  the  Damaged Mouse Brain after Severe Ischemia/Reperfusion. Stroke. 2019;50(6):1548–57.
27.   Kim JY, Park J, Chang JY, Kim S-H, Lee JE. Inflammation after Ischemic Stroke: The Role
of Leukocytes and Glial Cells. Exp Neurobiol [Internet].  2016;25(5):241.  Available  from: https://synapse.koreamed.org/DOIx.php?id=1 0.5607/en.2016.25.5.241
28.   Kawabori  M,  Yenari  MA.  Inflammatory Responses  in  Brain  Ischemia.  Curr  Med Chem. 2015;22(10):1258–77.
29.   Kraft  P,  Drechsler  C,  Schuhmann  MK, Gunreben I, Kleinschnitz C. Characterization of peripheral immune cell subsets in patients with  acute  and  chronic  cerebrovascular disease:  A  case-control  study.  Int  J  Mol  Sci [Internet].  2015;16(10):25433–49.  Available from: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
30.   Zhao H, Xu Q, Feng H, Hou X, Wen Z, Cheng Q. Dynamic Change of Eosinophil and Acute Ischemic  Stroke  [Internet].  2020.  Available from: https://orcid.org/0000-0003-2211-4749
31.   Gopinath  H,  Shivashankar  M.  A  study  on toxicity  and  anti-hyperglycemic  effects  of Abhrak  Bhasma  in  rats.  J  Ayurveda  Integr Med [Internet]. 2021;12(3):443–51. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jaim.2021.03.004