## Jurnal Ilmu Farmasi dan Farmasi Klinik (JIFFK)
Vol. 15, No. 2, DESEMBER 2018, Hal. 83 – 90 ISSN: 1693 -7899
AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN KEDONDONG ( Spondias pinnata (L.F) Kurz.) TERHADAP ANTIBODI IgM DAN IgG PADA MENCIT BALB/C YANG DIINDUKSI VAKSIN HEPATITIS B
Maria Ulfah 1 , Penni Dwi Royani 1 , dan Rita Febrianti Lidya Putra 1
1 Fakultas Farmasi, Universitas Wahid Hasyim Jl. Menoreh Tengah X/22, Sampangan, Semarang 50236 Email : mariau_astra@yahoo.com

## INTISARI
Antibodi  berperan  dalam  mempertahankan  sistem  imun  tubuh  dari  berbagai  mikroorganisme.  Saat tubuh mengalami ketidakseimbangan, tubuh memerlukan suatu senyawa yang dapat meningkatkan antibodi. Senyawa  flavonoid,  polifenol  dan  alkaloid  dapat  meningkatkan  antibodi.  Ekstrak  etanol  daun  kedondong mengandung  senyawa  flavonoid,  alkaloid  dan  polifenol.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  mengetahui  aktivitas imunomodulator  ekstrak  etanol  dalam  antibodi  IgM  dan  IgG  pada  mencit  balb/c  yang  diinduksi  vaksin hepatitis B. Ekstrak etanol daun kedondong dimaserasi dengan pelarut etanol 96%. Dosis konsentrasi ekstrak etanol  daun  kedondong  yang  digunakan  5,  10  dan  20%  secara  p.o  selama  46  hari  dan  vaksinasi  dilakukan pada hari ke-7, 28 dan 43. Kontrol positif yang digunakan levamisol dengan dosis 0,45mg/20gBB secara p.o. Analisis Optical Density (OD) IgM dan IgG pada hari ke 14, 35 dan 46 menggunakan uji statistik Friedman dan Mann Whitney . Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun kedondong memiliki aktivitas meningkatkan antibodi IgM dan IgG pada konsentrasi 5, 10 dan 20% hari ke 14, 35 dan 46 serta mengandung flavonoid, alkaloid dan polifenol.
Kata kunci : Vaksin Hepatitis B, IgM, IgG, Optical Density ( OD )

## ABSTRACT
Antibodies  play  a  role  in  maintaining  the  body’s  immune  system  from  various  microorganism. When  the  body  experiences  an  imbalance,  the  body  needs  a  compound  that  can  increase  antibodies. Flavonoids,  polyphenols  and  alkaloids  can  increase  antibodies.  Flavonoids,  polyphenols  and  alkaloids  can increase  antibodies.  Ethanol  extract  of  kedondong  leaves  contains  compounds  of  flavonoid,  alkaloids,  and polyphenols. The purpose of this study was to determine the immunomodulatory activity of ethanol extract in IgM and IgG antibodies in balb /c mice induced by hepatitis B vaccine. Ethanol extract of kedondong leaves was macerated with 96% ethanol. The doses of the concentration of ethanol extract of kedondong leaves used were 5, 10 and 20% p.o for 46 days and vaccination was carried out on the 7th, 28th and 43rd days. Positive control was used with levamisole at a dose of 0.45mg / 20gBB by p.o. Analysis of Optical Density (OD) IgM and IgG on days 14, 35 and 46 using Friedman and Mann Whitney statistical tests. The results showed that the ethanol extract of kedondong leaves had activity of increasing IgM and IgG antibodies at concentrations of 5, 10 and 20% on days 14, 35 and 46 and contained flavonoids, alkaloids and polyphenols.
Keywords: Hepatitis B Vaccine, IgM, IgG, Optical Density (OD)
Corresponding author: Maria Ulfah Fakultas Farmasi, Universitas Wahid Hasyim Jl. Menoreh Tengah X/22, Sampangan, Semarang 50236 Email : mariau_astra@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Antibodi berperan dalam mempertahankan sistem imun tubuh dari berbagai mikroorganisme. Sistem  pertahanan  tubuh  terdiri  dari  sistem  imun  spesifik  dan  non  spesifik.  Sistem  imun  spesifik salah satunya adalah sel limfosit T dan sel limfosit B. Sel limfosit B yang tersensitasi oleh antigen dapat memproduksi antibodi (Kresno, 2010).
Antibodi  yang  diproduksi  pertama  kali  adalah  IgM  (Imunoglobulin  M).  Antibodi  IgM berperan  sebagai  respon  awal  terhadap  masuknya  antigen  ke  dalam  tubuh.  Kadar  antibodi  IgM akan  lebih  meningkat  pada  sensitasi  antigen  yang  kedua,  hal  ini  disebabkan  sel  B  yang memproduksi  antibodi  membentuk  sel  memori  sehingga  mengenal  langsung  antigen  tersebut. Antibodi IgG merupakan  antibodi terbanyak  yang  ada dalam  tubuh sekitar 70-75%. IgG berperan sebagai  pertahanan  tubuh  terhadap  bakteri,  virus,  parasit  dan  berbagai  jamur  (Abbas et  al .,  2012; Baratawidjaja, 2014).
Senyawa  –  senyawa  kimia  yang  terkandung  di  bahan  alam  seperti  polisakarida, andrographolide,  alkaloid,  flavonoid  dan  polifenol  dapat  meningkatkan  aktivitas  respon  imun. Suatu  senyawa  dikatakan  memiliki  aktivitas  imunomodulator  apabila  senyawa  tersebut  dapat meningkatkan respon imun yang sudah teraktifkan oleh antigen.
Senyawa flavonoid dan alkaloid adalah senyawa kimia yang berpotensi dapat meningkatkan IgM dan IgG (Carmelita, 2016; Effendi dan Widiastuti, 2014; Simorangkir dkk, 2014). Kandungan kimia  yang  terkandung  di  dalam  daun,  kulit  batang  dan  kulit  akar  kedondong  yaitu  flavonoid, alkaloid dan polienol (Hutapea, 1994 dan Muntari, 2012).
Vaksin merupakan salah  satu antigen berasal dari bakteri atau virus  yang telah dilemahkan. Vaksin hepatitis B mengandung protein selubung dari hepatitis B yang diproduksi melalui rekayasa genetika (Herawati, 2015).
Pemakaian vaksin hepatitis B berperan sebagai antigen yang dapat merangsang respon imun humoral  melalui  produksi  antibodi  yang  memberikan  imunitas  (Radji,  2009).  Vaksin  hepatitis  B dapat menginduksi antibodi menjadi lebih aktif dari sebelumnya (Rahayu, 2015).
Penelitian  tentang  uji  aktivitas  imunomodulator  ekstrak  etanol  daun  kedondong  ( Spondias pinnata (L.F.)  Kurz.)  terhadap  antibodi  IgM  dan  IgG  pada  mencit  balb/c  yang  diinduksi  vaksin hepatitis  B  belum  pernah  dilakukan,  sehingga  harapannya  penelitian  ini  dapat  menambah  bukti ilmiah mengenai manfaat daun kedondong terhadap sistem imun.

## METODE PENELITIAN

## Bahan
Daun  kedondong  dari  Gunung  Pati  Semarang,  mencit  balb/c  umur  ±  2bulan,  levamisol (Askamex),  etanol  96%,  vaksin  Hepatitis  B  (Engerix-B®),  PBS,  PBST 20 ,  serum  yang  telah diencerkan  (1:4  dalam  PBS),  isotype  spesifik  IgG  dan  IgM,  Antibodi  IgG  substrat  TMB,  2  N H 2 SO 4 ,  larutan  besi  (III)  klorida  10%,  HCl  2%,  reagen    Mayer,  reagen  Dragendorff,  methanol, logam  Mg  dan HCl pekat.

## Alat
Ependrof tube, mikro plate 96, mikro pipet, blue tip, yellow tip, ELISA Reader, alat-alat gelas. Jalannya Penelitian 1. Pengumpulan dan Identiikasi Bahan
Daun  Kedondong  diperoleh  dari  Gunung  Pati,  Kabupaten  Semarang,  Jawa  Tengah.  Daun Kedondong  dikeringkan  dengan  oven  pada  suhu  50 0 C.  Simplisia  kering  dibuat  serbuk  kemudian diayak  dengan  ayakan  ukuran  25  mesh  serta  diukur  kadar  airnya  dengan  alat moisture  balance . Serbuk  daun  kedondong  disimpan  dalam  wadah  kaca  tertutup  rapat  dengan  silika  gel  didalamnya agar tahan lama.
2. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kedondong
Pembuatan ekstrak  etanol daun kedondong dilakukan dengan metode maserasi menggunakan cairan  penyari  etanol  96%.  Cairan  penyari  yang  digunakan  untuk  ekstrasi  dengan  perbandingan 1:10 artinya 1 bagian serbuk simplisia dilarutkan dalam 10 bagian pelarut. Maserat yang diperoleh dipekatkan  menggunakan rotary  evaporator pada  suhu  <50ºC  sampai  diperoleh  ekstrak  kental etanol.Setelah  didapatkan  ekstrak  etanol  simplisia,  rendemen  dihitung  dengan  rumus  sebagai berikut :
Randemen =

## 3. Uji Kandungan Kimia
Senyawa polifenol dengan  cara larutan  ekstrak uji sebanyak 1 ml direaksikan dengan  larutan besi  (III)  klorida  10%,  jika  terjadi  warna  biru  tua  atau  hitam  kehijauan  menunjukkan  adanya polifenol. Senyawa  alkaloid dengan cara ekstrak daun kedondong dimasukkan   ke dalam   tabung reaksi,    ditambah    0,5  mL  HCl  2    %    dan    larutan    dibagi    dalam    dua    tabung.  Tabung  I ditambahkan  2-3  tetes  reagen  Dragendorff,  tabung  II  ditambahkan      2-3  tetes  reagen  Mayer.  Jika tabung  I  terbentuk  endapan  jingga  dan  pada  tabung  II  terbentuk  endapan  kekuning-  kuningan, menunjukkan  adanya  alkaloid.  Senyawa  flavonoid  dengan  cara  ekstrak  daun  kedondong dimasukkan   ke dalam  tabung  reaksi  kemudian dilarutkan. Setelah itu, ditambah  logam  Mg  dan 4-5  tetes  HCl  pekat.  Larutan  berwarna  merah  atau  jingga  yang  terbentuk  menunjukkan  adanya flavonoid (Harborne, 1987).

## 4. Persiapan Hewan Uji dan Pengambilan Sampel Uji
Hewan uji sebanyak 24 mencit Balb/c  yang  berumur  sekitar 8 minggu dengan berat kira-kira 20 gram diadaptasi selama 7 hari. Hewan uji diberi perlakuan dengan menggunakan ekstrak etanol daun kedondong sesuai dengan kelompok masing-masing sampai 46 hari. Pada hari ke-7 hewan uji di  induksi  vaksin  hepatitis  B  dengan  dosis  0.052  mcg/20gBB  secara  intraperitoneal  kemudian induksi  kedua  dilakukan  pada  hari  ke-28  dengan  dosis  dan  cara  yang  sama,  induksi  booster dilakukan pada hari ke-43 dengan cara : 1/10 dosis total antigen diinjeksi secara i.p volume 0,3 ml dalam  PBS.  Tunggu  45  menit,  1/10  dosis  total,  dengan  cara  dan  volume  sama,  pada  titik  yang berbeda.  Tunggu  45  menit,  2/10  dosis  total  dengan  cara  dan  volume  yang  sama,  pada  titik  yang sama.  Tunggu  30  menit,  6/10  dosis  total  secara  i.v.  Pada  hari  ke-14  hewan  uji  diambil  darahnya dari vena plexus retoorbitalis. Pengambilan darah kedua dilakukan pada hari  ke-35 (7 hari setelah induksi kedua) dan pengambilan darah setelah induksi booster dilakukan pada hari ke-46.
5. Uji Aktivitas IgM dan IgG dengan metode ELISA tak langsung
Mikroplat 96 dilapisi dengan hepatitis B sebagai antigen kadar 2 μg/mL dalam 18 μl PBS per sumuran,  diinkubasi  semalam  pada  suhu  4°C.  Masing-masing  sumuran,  cuci  3x  dengan  450  μL 0,05 % PBST 20 . Blok dengan BSA 0,5% dalam PBS sebanyak 100 μl per sumuran, diinkubasikan selama  1  jam  pada  37 0 C.  Ditambahkan  100  μL  serum  yang  telah  diencerkan  (1:4  dalam  PBS). Diinkubasi 2 jam pada suhu kamar. Cuci 3x dengan 450 μL 0,05% PBST 20 . Ditambahkan 100 μL masing-masing isotype spesifik  IgM dan  IgG, lalu diinkubasi 30 menit pada suhu kamar. Cuci 3x dengan  450  μL  0,05%  PBST 20 dan  tambahkan  100  μL  Antibodi  IgM  dan  IgG  100  μL  masing- masing sumuran yang telah diencerkan (1 : 5000), diinkubasi 15 menit pada suhu  kamar.  Cuci 3x dengan  300  μL  0,05%  PBST 20 .  Dimasukkan  100  μL  substrat  TMB,  lalu  inkubasi  15  menit  pada suhu  kamar.  Reaksi  dihentikan  dengan  penambahan  100  μl  2  N  H 2 SO 4 .  Hasil  dibaca  dengan mikroplat reader pada panjang gelombang 450 nm.

## ANALISIS DATA

## Uji Aktivitas IgM dan IgG dengan metode ELISA Reader
Data  yang  didapat  berupa Optical  Dencity (OD)  yang  akan  dianalisis  dengan  program  SPSS 16 for  windows menggunakan  perhitungan  statistik Friedman dilanjutkan  dengan  uji Mann- Whitney dengan taraf kepercayaan 95%.

## Uji Kandungan Kimia
Identifikasi  dilakukan  dengan  menambahkan  reagen  kedalam  larutan  uji.  Hasil  reaksi dibandingkan dengan kontrol untuk melihat terjadinya perubahan warna atau terjadinya endapan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hewan  uji  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  mencit  jantan  galur  Balb/c  usia  8 minggu. Mencit yang digunakan adalah mencit galur Balb/c karena galur ini lebih sensitif terhadap rangsangan  antigen  serta  responsif  terhadap  rangsangan  eksogen.  Mencit  yang  dipilih  berusia  8 minggu karena sistem organ telah terbentuk dengan baik (Olivera dkk., 2010).
Uji  aktivitas  imunomodulator  terhadap  antibodi  IgM  dan  IgG  dalam  serum  mencit  balb/c menggunakan  metode  ELISA  tak  langsung.  Prinsip  dari  metode  ELISA  tak  langsung  adalah penggunaan enzim  untuk mendeteksi ikatan  antara  antigen dengan antibodi. Enzim akan  merubah
substrat  yang  tidak  berwarna  menjadi  biru  dan  setelah  ditambahkan  H 2 SO 4 menimbulkan  warna kuning, perubahan warna menunjukkan adanya ikatan antara antigen dan antibodi. Intensitas warna yang terjadi diukur dan hasilnya dinyatakan dalam optical density yang menunjukkan nilai antibodi IgG.  Semakin  tinggi  intensitas  warna  maka  antibodi  yang  dihasilkan  semakin  banyak  (Crowther, 1995).
Pengambilan  serum  dilakukan  pada  hari  ke  14,  35  dan  46  melalui  plexus  retroorbitalis sebanyak ±0,5 ml. Pengambilan serum pertama kali dapat menimbulkan respon imun primer yang ditandai dengan munculnya IgM sehingga produksi IgM lebih besar dari IgG. Pengambilan serum kedua akan menimbulkan respon imun sekunder yang ditandai dengan meningkatnya produksi IgG sehingga  IgG  lebih  banyak  dari  IgM.  Pengambilan  serum  ketiga  merangsang  respon  imun  untuk membentuk  antibodi  lebih  cepat  dan  banyak  dibanding  respon  imun  sekunder  (Sasmito,  2006; Sheehan, 1997).
Keterangan: KN         : Kontrol normal K+ : Kontrol positif KV : Kontrol dengan vaksin
EEDK    : Ekstrak etanol daun kedondong *Hasil uji Mann-Whitney berbeda bermakna dengan kontrol vaksin p<0,05
Gambar 1. Grafik Mean ± SD Nilai OD Berbagai Konsentrasi EEDK pada Pengambilan Serum Hari Ke-14
Hasil uji Mann Withney terhadap nilai OD antar kelompok perlakuan pada pengambilan serum hari  ke-14  dapat  dilihat  pada  gambar  1.  Berdasarkan  gambar  1  terlihat  bahwa  perlakuan  EEDK konsentrasi  5%,  10%  dan  20%  menunjukkan  peningkatan  jika  dibandingkan  dengan  kelompok kontrol  normal  dan  kontrol  vaksin.  Peningkatan  respon  imun  pada  kelompok  sampel  uji ditunjukkan  mulai  dari  konsentrasi  5%  jika  dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol  normal. Aktivitas tertinggi peningkatan respon imun diperoleh pada konsentrasi 20%.
Hasil  analisis  EEDK  pada  konsentrasi  5%  menunjukkan  perbedaan  bermakna  bila dibandingkan  dengan  konsentrasi  10%  dan  20%.  Demikian  pula  untuk  EEDK  konsentrasi  10% menunjukkan  perbedaan  bermakna  bila  dibandingkan  dengan  konsentrasi  20%,  sehingga  dapat dikatakan  bahwa  EEDK  konsentrasi  5%,  10%  dan  20%  pada  hari  ke-14  memiliki  aktivitas imunomodulator yang setara dalam meningkatkan antibodi IgM.
Keterangan:
KN        : Kontrol normal K+         : Kontrol positif
KV         : kontrol dengan vaksin EEDK    : Ekstrak etanol daun kedondong *Hasil uji Mann-Whitney berbeda bermakna dengan kontrol vaksin p<0,05
Gambar 2. Grafik Mean ± SD Nilai OD Berbagai Konsentrasi EEDK pada Pengambilan Serum Hari Ke-35
Berdasarkan  gambar  2,  analisis  secara  statistik  terhadap  nilai  OD  didapatkan  hasil  bahwa konsentrasi  5%,  10%  dan  20%  menunjukkan  perbedaan  bermakna  ( p <0,05 ) terhadap  kelompok dengan  vaksin,  sehingga  pada  semua  kelompok  konsentrasi  dikatakan  memiliki  aktivitas imunomodulator.
Hasil  analisis  EEDK  konsentrasi  5%  menunjukkan  ada  perbedaan  bermakna  apabila dibandingkan  dengan  konsentrasi  10%  dan  20%.  Hasil  analisis  EEDK  konsentrasi  10% menunjukkan  tidak  ada  perbedaan  bermakna  dibandingkan  dengan  konsentrasi  20%.  Sehingga dapat  dikatakan  bahwa  konsentrasi  5%  memiliki  aktivitas  imunomodulator  yang  berbeda  dengan konsentrasi 10%, 20% dan konsentrasi 10% memiliki aktivitas imunomodulator yang setara dengan konsentrasi 20%.
0,59 0,141 1,877 0,285 0,893 0,103 1,286 0,184* 1,474 0,259* 1,889 0,332* 0,185 0,025 0,242 0,019 0,516 0,093 0,419 0,090* 0,602 0,083* 0,575 0,061* 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 KN K+ KV EEDK
5% EEDK 10% EEDK 20% N ila i O D kelompok Perlakuan IgM IgG Keterangan:
KN       : Kontrol normal K+ : Kontrol positif KV : kontrol dengan vaksin
EEDK   : Ekstrak etanol daun kedondong *Hasil uji Mann-Whitney berbeda bermakna dengan kontrol vaksin p<0,05
Gambar 3. Grafik Mean ± SD Nilai OD Berbagai Konsentrasi EEDK pada Pengambilan Serum Hari Ke-46
Berdasarkan  gambar  3  analisis  secara  statistik  terhadap  nilai  OD  didapatkan  hasil  bahwa konsentrasi  5%,  10%  dan  20%  menunjukkan  perbedaan  bermakna  ( p <0,05 ) terhadap  kelompok dengan  vaksin,  sehingga  pada  semua  kelompok  konsentrasi  dikatakan  memiliki  aktivitas imunomodulator.
Peningkatan IgM dan IgG melalui senyawa flavonoid yang berasal dari EEDK diduga karena adanya aktivitas  IL-2 dan proliferasi limfosit. Sel limfosit pada imunitas humoral akan beriteraksi dengan  sel  B  yang  akan  berdiferensiasi  menjadi  sel  plasma  yang  memproduksi  antibodi  dan membentuk sel memori. Antibodi yang dapat dihasilkan oleh sel B antara lain IgM, IgG, IgA, IgE dan IgD (Baratawidjaja dan Rengganis, 2014).

## Uji Kandungan Kimia
Uji  kandungan  kimia  dalam  ekstrak  etanol  daun  kedondong  digunakan  untuk  mengetahui adanya golongan senyawa polifenol, alkaloid dan flavonoid. Pengujian polifenol dilakukan dengan penambahan  pereaksi  FeCl 3 .  Hasil  uji  polifenol  dengan  menggunakan  uji  warna  menghasilkan larutan warna hitam kehijauan, yang menandakan hasil positif. Hal ini menandakan bahwa ekstrak daun kedondong mengandung polifenol (Gambar 5).
Keterangan :   A = larutan ekstak sebelum ditambahkan pereaksi B = larutan ekstrak setelah ditambahkan FeCl 3

## Gambar 5. Hasil Uji Polifenol
Hasil  uji  alkaloid  bertujuan  untuk  mengetahui  adanya  senyawa  golongan  alkaloid  dengan menggunakan  pereaksi  warna  Dragendorff  dan  Mayer.  Hasil  uji  alkaloid  dengan  pereaksi Dragendroff menghasilkan larutan dengan warna orange yang apabila dibiarkan beberapa saat akan menghasilkan  endapan  berwarna  orange/jingga  pada  dasar  tabung  dan  hasil  tersebut  menandakan bahwa uji alkaloid dengan pereaksi dragendroff menunjukkan hasil positif.
Keterangan :   A = larutan ekstak sebelum ditambahkan pereaksi

## B = larutan ekstrak setelah ditambahkan pereaksi Dragendroff & Mayer

## Gambar 6. Hasil Uji Alkaloid dengan Pereaksi Dragendroff dan Pereaksi Mayer
Hasil uji alkaloid dengan pereaksi dragendroff dapat dilihat pada gambar 6. Hasil uji alkaloid dengan pereaksi mayer menghasilkan larutan dengan hijau ke orange-orangean. Pengujian alkaloid bersifat basa sehingga diekstrak dengan pelarut yang mengandung asam (Harborne, 1996). Hal ini menunjukkan hasil yang negatif pada uji alkaloid dengan pereaksi mayer (Gambar 6).
A B Endapan Jingga Hijau Kekuningan A    B Hijau Kehitaman Hitam Kehijauan A     B Hijau Kehitaman Hijau Kehitaman A    B
Uji flavonoid dilakukan dengan menggunakan serbuk Mg dan HCl pekat. Hasil uji flavonoid (Gambar 7) dengan menggunakan uji warna menghasilkan larutan warna jingga, yang menandakan hasil  positif.  Perubahan  warna  dapat  terjadi  karena  logam  Mg  dan  HCl  pada  pengujian  berfungsi mereduksikan  inti  benzopiron  yang  ada  pada  flavonoid,  sehingga  terbentuk  warna  jingga  (Illing dkk, 2017).
Keterangan :  A = larutan ekstak sebelum ditambahkan pereaksi

## B = larutan ekstrak setelah ditambahkan logam Mg dan HCl

## Gambar 7. Hasil Uji Flavonoid

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun kedondong mampu meningkatkan titer antibodi IgM dan IgG mencit galur Balb/c pada konsentrasi 5%, 10% dan 20%. Selain  itu  ekstrak  etanol  daun  kedondong  mengandung  senyawa  kimia  antara  lain  flavonoid, alkaloid dan polifenol.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada Allah SWT., atas limpahan rahmat serta karunianya, terimakasih kepada seluruh pihak yang telah membantu dalam penelitian serta penyusunan junal ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas,  A.  K.,  Lichtman,  A.  H.  and  Pillai,  S.,  2012. Cellular  and  Molecular  Immunology, 7 th ed.,
Elsevier Saunders.
Baratawidjaja,  K.G.,  dan  Rengganis,  I.,  2014, Imunologi  Dasar, Edisi  ke-11,  Balai  Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.
Carmelita,  A.  B.,  2016,  Pengaruh  Pemberian  Ekatrak  Etanol  Umbi  Bawang  Dayak  ( Eleutherine palmifolia( L.) Merr.) Secara  Oral  pada  Mencit  Balb/c  terhadap  Pencegahan  Penurunan Diameter  Germinla  Center  pada  Kelenjar  Getah  Bening  serta  Kadar  IgG  serum,  Jurnal Biosains Pascasarjana.
Crowther JR. 2001. The ELISA Guidebook . New Jersey : Humana Press.
Effendi,  N.,  dan  Widiastuti,  H.,  2014,  Identifikasi  Aktivitas  Imunoglobulin  M  (IgM)  Ekstrak Etanolik Daun Ciplukan ( Physalis minima Linn.) Pada Mencit, Jurnal Kesehatan Vol. VII (2).
Harborne,  J.  B.,  1996, Metode  Fitokimia  Penuntun  Cara  Modern  Menganalisis  Tumbuhan,
Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Imam Sudiro, edisi II, ITB, Bandung.
Herawati, N., 2015, Pichia Pastoris : Yeast Penghasil Protein Terapeutik dan Vaksin Manusia, Bio Trends 1(1). Hutapea, J.R., 1994 , Inventaris Tanaman Obat Indonesia III , Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Illing  I.,  Wulan  S.,  dan  Erfiana.  2017.  Uji  Fitokimia  Ekstrak  Buah  Dengen.  Jurnal  Dinamika.
Fakultas Sains. Universtias Cokroaminoto Palopo.
Kresno,  S.B.,  2010, Imunologi:  Diagnosis  dan  Prosedur  Laboratorium ,  Fakultas  Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, 4, 450.
A    B Hijau Kehitaman Jingga
Muntari  Zuli.  2012.  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Etanol  Kulit  Batang  Kedondong  ( Spondias pinnata )  Terhadap Streptococcus  mutans Dan Shigella  sonnei .  Fakultas  Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Oliveira,  S.C.,  Macedo,  G.C.,  de  Almeida,  L.A.,  de  Oliveira,  F.S.,  and  Onate,  A.,  2010,  Recent Advances  in  Understanding  Immunity  Agent  Brucellous:  Application  of  Vaccine Development, The Open Veterinary Science Journal , Vol 4, 102-108.
Radji,  M.,  2009,  Vaksin  DNA:  Vaksin  Generasi  Keempat, Majalah  Ilmu Kefarmasian , 6 (1),  28- 37.Rahayu,  M.P.,  2015,  Aktivitas  Imunomodulator  Fraksi  n-Heksan  dari  HerbaSambiloto ( Andrographis  paniculata ,  (Burm.F)  Nees) t erhadap  Mencit  yang  Diinduksi  Vaksin Hepatitis B dengan Parameter IgG , Jurnal Pharmascience, 2 .
Rahayu,  M.P.,  2015,  Aktivitas  Imunomodulator  Fraksi  n-Heksan  dari  HerbaSambiloto ( Andrographis  paniculata ,  (Burm.F)  Nees) t erhadap  Mencit  yang  Diinduksi  Vaksin Hepatitis B dengan Parameter IgG , Jurnal Pharmascience, 2 .
Sasmito, E., Nunung, Y., dan Soegihardjo, C.J., 2006, Mekanisme Imunomodulator Ekstrak Buah Mengkudu (Morinda citrifolia, L.) Pada Mencit Balb/c Yang Diinduksi Vaksin Hepatitis B, Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogjakarta.
Sheehan,  C.,  1997, Clinical  Immunology  Principles  and  laboratory  Diagnosis ,  2 nd ,  Lippicontt Company, Philadelphia, 3-5.
Simorangkir,  H.,  Sinaga,  E.,  Riwayati.,  dan  Panggabean,  F.M.T.,  2014,  Potensi  Bioaktif Imunostimulan Alami dari Isolate Metabolit Sekunder Ekstrak Daun Ranti Hitam ( Solanum blumei Ness  ex  Blume),  dalam Prosiding  Seminar  Nasional  Biologi  Dan Pembelajarannya , Jurusan Biologi MIPA Universitas Negeri Medan, Medan.