## EFEK KONSUMSI MINUMAN BUBUK KAKAO LINDAK BEBAS LEMAK TERHADAP AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FLAVONOID PADA PLASMA MANUSIA
Welli Yuliatmoko (welli@mail.ut.ac.id) Universitas Terbuka
Fransiska Zakaria R (fzakaria@ipb.ac.id) Feri Kusnandar (fkusnandar@ipb.ac.id) Institut Pertanian Bogor

## ABSTRACT
Fat free cocoa powder is a rich source of flavonoid antioxidants including epicatechin, catechin, and procyanidins, which have attracted interest regarding cardiovascular health. The aim of this research was to evaluate the effect of Indonesian fat free cocoa powder drink consumption on antioxidants activity. Healthy woman subjects were divided into cocoa group (n=9) and control group (n=9).  Cocoa powder drink containing skim milk and sugar was given to the cocoa group.  The control group received only water containing skim milk and sugar.  The criteria of the respondents were according to health medical diagnosis and informed consent signature.  Their peripheral blood was withdrawn for the analysis of antioxidants capacity.  Antioxidants capacity consisted of antiradical by DPPH method, malonaldehyde (MDA) content, vitamin C, and diene conjugation.  The data of cocoa group showed that there were  significant increased in antiradical, vitamin C and decreased in MDA content (p<0.05). Cocoa consumption increased diene conjugation however was not significantly (p<0.05).  In conclusion, the Indonesian fat free cocoa powder has increased plasma antioxidant system, which manifest good health function.
Keywords: antioxidants activity, bioavailability, cocoa powder, flavonoid, MDA.
Sistem pertahanan tubuh terhadap senyawa kimia berbahaya seperti radikal bebas terjadi melalui sistem antioksidan (Zakaria, Abidin, Pramudya, & Sanjaya, 1996).  Antioksidan dapat mencegah laju kerusakan akibat radikal bebas karena mampu memperlambat atau mencegah proses oksidasi.  Perlindungan antioksidan terhadap plasma darah merupakan gambaran dari perlindungan total terhadap tubuh, karena semua metabolit sel tubuh akan bermuara pada plasma darah.   Selain itu, beberapa produk metabolit hasil oksidasi senyawa radikal seperti malonaldialdehid (MDA) dan diena terkonjugasi kerap kali dijadikan model oleh para peneliti untuk menggambarkan sistem pertahanan antioksidan tubuh terhadap senyawa radikal bebas (Zakaria, Nurrahman, Prangdimurti, & Tejasari, 2003)
Biji kakao mengandung senyawa flavonoid seperti katekin, prosianidin, dan antosianidin yang dapat berfungsi sebagai antioksidan (Hammerstone, Lazarus, & Schmitz, 2000).  Kapasitas antioksidannya lebih tinggi bila dibandingkan dengan anggur, teh hijau, dan teh hitam (Lee, Kim, Lee, & Lee, 2003).  Di samping itu, beberapa peneliti juga melaporkan beberapa manfaat senyawa flavonoid di bidang kesehatan, yaitu dapat memacu peredaran darah dengan baik, sebagai agen
perlindungan terhadap kardiovaskular, dan menghambat oksidasi (Heiss, Dejam, Kleinbongard, Schewe, Sies, & Kelm, 2003; Zhu, Schramm, & Grooss, 2005).
Seperti halnya biji kakao, bubuk kakao lindak bebas lemak yang merupakan produk samping hasil produksi lemak kakao dari perkebunan Indonesia  dilaporkan mengandung senyawa polifenol (flavonoid) yang cukup tinggi, yaitu sebesar 12 - 18% (Misnawi, Jamilah, & Nazamid, 2002). Sayangnya, pemanfaatan produk samping ini baru dirintis oleh Balai Pusat Penelitian Kopi dan Kakao, Jember dan masih dalam skala terbatas.  Hasil penelitian secara in vitro terhadap bubuk kakao menunjukkan bahwa bubuk kakao mempunyai kapasitas antioksidan dan melindungi sel limfosit dari berbagai oksidator.  Lebih lanjut, bubuk kakao tersebut tidak bersifat toksik terhadap sel limfosit (Zairisman,  2006).
Oleh karena itu, untuk mengetahui pengaruhnya terhadap antioksidan tubuh manusia perlu dilakukan penelitian lebih lanjut secara in vivo dengan manusia sebagai responden.  Penelitian ini bertujuan menguji efek konsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak dalam meningkatkan aktivitas antioksidan flavonoid plasma darah manusia.  Hasil penelitian ini diharapkan dapat memperjelas khasiat bubuk kakao lindak bebas lemak varietas lokal terhadap kesehatan.  Penelitian ini  diharapkan juga dapat meningkatkan citra positif kakao varietas lokal Indonesia.

## METODOLOGI

## Pembuatan Minuman Bubuk Kakao
Minuman bubuk kakao bebas lemak dibuat dari 4 gram bubuk kakao bebas lemak dilarutkan dalam 100 ml air panas, kemudian ditambahkan 2 gram gula dan 2 gram susu bubuk skim. Selanjutnya minuman ini disajikan dalam keadaan hangat.

## Persiapan Responden
Responden penelitian ini adalah 18 orang mahasiswi IPB, berusia 22-27 tahun, dan bertempat tinggal indekos di perumahan dosen komplek IPB II Sindang Barang. Semua responden dinyatakan sehat berdasarkan hasil pemeriksaan kesehatan oleh dokter di Klinik Farfa Kampus IPB Darmaga.
Selanjutnya responden dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kelompok kakao (n = 9 orang) dan kelompok kontrol (n = 9 orang).  Kelompok  kakao diberi  minuman bubuk kakao lindak  bebas lemak. Sebaliknya, kelompok kontrol diberi minuman yang sama namun tanpa penambahan bubuk kakao lindak bebas lemak.

## Pelaksanaan Intervensi
Intervensi dilaksanakan setiap hari pada pukul 07.00–08.00 WIB selama 25 hari di IPB Bogor.  Sebelum minum minuman bubuk kakao lindak bebas lemak, responden diberi sarapan pagi yang seragam oleh peneliti.  Menu yang sama, juga diberikan pada waktu makan malam.  Sebelum pelaksanaan intervensi dilakukan penandatanganan kontrak persetujuan sebagai responden ( informed consent) dan wawancara terhadap responden.

## Pengukuran Status Gizi
Pengukuran status gizi responden dilakukan secara antropometri meliputi tinggi badan (TB) dan berat badan (BB).  Status gizi responden digolongkan berdasarkan body mass index (BMI) dengan satuan kg/m 2 .

## Pengambilan Darah
Pengambilan darah dilakukan sebelum dan sesudah intervensi di Klinik Farfa Kampus IPB Darmaga pada pukul 07.00-08.00 pagi oleh seorang asisten tranfusi darah.  Darah diambil secara aseptis sebanyak 35 ml dengan menggunakan jarum Precisionglide TM steril sekali pakai. Selanjutnya darah dimasukkan ke dalam tabung vacutainer steril yang mengandung antikoagulan.
Isolasi Plasma
Plasma darah  dipisahkan dari komponen seluler dengan sentrifugasi  pada 1500 rpm selama 5 menit menggunakan sentrifus rotor swing .  Plasma darah akan terpisah ke bagian atas. Sebaliknya, bagian darah yang lebih berat (sel darah merah) akan terpisah ke bagian bawah. Selanjutnya, plasma darah diambil dengan microfifet dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifus.
Analisis Kadar Vitamin C Plasma (Zakaria et al., 1996)
Sebanyak 500 µl plasma, blanko, dan standar dicampur dengan 100 µl larutan DNPH (2,4- dinitrofenilhidrazin) dengan cara divortek, kemudian campuran diinkubasi pada suhu 37  C selama 4 jam. Selanjutnya, campuran tersebut ditambah 750 µl H 2 SO 4 65% dan didiamkan selama 1 jam di dalam ruang gelap. Berikutnya, campuran tersebut disentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Akhirnya, supernatan yang diperoleh dibaca dengan spektrophotometer pada λ  520 nm.
Analisis Kadar MDA Plasma (Modifikasi Metode Winarsi, 2003; Hong, Yeh, Chang, & Hu, 2000) Sebanyak 75 µl plasma atau standar dimasukkan dalam tabung sentrifus, lalu ditambahkan 75 µl TCA 20% (dalam 0,6 mol/l HCl).  Setelah didinginkan dalam lemari pendingin bersuhu 5–10 °C selama 20 menit, campuran tersebut disentrifus pada 4000 rpm selama 20 menit.  Kemudian, 100 µl supernatannya ditambah 20 µl pereaksi TBA.  Selanjutnya campuran tersebut didihkan selama 30 menit.  Setelah dingin campuran dimasukkan  ke dalam lempeng mikro 96 sumur dan diukur absorbansinya menggunakan mikroplate reader pada λ 540 nm.  Kadar MDA plasma dihitung berdasarkan kurva standar dari larutan tetra etoksipropana.
Analisis Anti Radikal Bebas Plasma (Modifikasi Turkmen, Ferda, & Velioglu, 2004) Sebanyak 1 ml plasma ditambahkan metanol pro-analisis 1 ml dan 1 ml DPPH 0,2 mM lalu dikocok.  Kemudian, campuran disimpan dalam ruang gelap selama 60 menit dan disentrifus selama 10 menit. Selanjutnya, absorbansinya dibaca dengan spektrofotometer pada λ 517 nm.  Kontrol yang digunakan adalah campuran larutan DPPH ( 2,2-Diphenil-1-pictihidrazil) dan metanol.  Aktivitas antioksidan dihitung dengan rumus:
% 100 % x
Kontrol Absorbansi Sampel Absorbansi Kontrol Absorbansi Bebas Radikal Anti  
Analisis Diena Terkonjugasi  Plasma (Zakaria, Septiana, & Sulistiyani, 2001) Sampel plasma diencerkan dengan larutan NaCl 0,9%-NaHCO 3 1 mM sampai konsentrasi protein 50 µg/ml, kemudian dioksidasi dengan penambahan 5µM CuSO 4 (konsentrasi akhir) pada suhu 37 °C.  Selanjutnya, absorbansi  dibaca dengan spektrofotometer pada λ 234 nm.
Analisis Statistik
Data yang diperoleh diolah menggunakan analisis statistik uji t (t-test) perbandingan dua sampel untuk melihat adanya pengaruh nyata konsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak sebelum dan sesudah intervensi antara kelompok kakao dan kelompok kontrol terhadap parameter yang diukur.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Keadaan Umum Responden
Semua  responden penelitian dinyatakan sehat oleh dokter, baik sebelum maupun sesudah intervensi. Hasil pengukuran antropometri terhadap responden menunjukkan adanya kenaikan berat badan pada kedua kelompok.  Namun secara statistik, kenaikan tersebut tidak nyata.  Dengan demikian, minuman bubuk kakao lindak bebas lemak bukanlah penyebab kenaikan berat badan responden.  Hal ini sejalan dengan hasil penelitian Murphy et al. (2003) yang menyatakan bahwa konsumsi flavanol kakao selama 28 hari tidak menyebabkan perubahan berat badan secara nyata. Sependapat dengannya, Van Heerden (2006) juga menyatakan bahwa coklat bukan penyebab obesitas.

## Kadar Vitamin C
Pengukuran vitamin C (asam askorbat) plasma bertujuan menguji kapasitas antioksidan minuman bubuk kakao lindak bebas lemak dalam melindungi antioksidan gizi plasma yaitu vitamin C. Prinsip analisis dalam pengukuran ini adalah mereaksikan asam askorbat dengan 2,4 DNPH dalam suasana asam hingga terbentuk warna kuning merah, lalu intensitas warnanya dibaca dengan spektrofotometer.
Asam askorbat merupakan antioksidan larut air dan menjadi bagian dari pertahanan terhadap ROS ( Reactive oxygen spesies ) di dalam plasma dan sel.  Asam askorbat dapat memutus reaksi radikal yang dihasilkan melalui peroksidasi lipid.  Bahkan pada konsentrasi rendah asam askorbat dapat bereaksi langsung dengan radikal peroksil (LOO * ) (Zakaria et al. , 2003).  Di samping itu, vitamin C juga berfungsi sebagai antioksidan yang bekerja secara sinergis dengan vitamin E. Vitamin C dapat memulihkan kembali vitamin E yang teroksidasi oleh radikal bebas dengan cara memberikan ion hidrogennya (Zakaria et al. , 2003).
Hasil pengukuran menunjukkan kadar rata-rata vitamin C plasma kelompok kakao dan kelompok kontrol sesudah  intervensi mengalami peningkatan.  Kadar rata-rata vitamin C plasma kelompok kakao meningkat secara nyata (p < 0,05) dari 4,13 mg/l menjadi 5,99 mg/l dengan selisih peningkatan rata-rata sebesar 1,86 mg/l.  Sebaliknya kelompok kontrol  juga mengalami peningkatan dari  4,97 mg/l menjadi 5,11 mg/l dengan selisih peningkatan sebesar 0,13 mg/l namun tidak berbeda nyata (p > 0,05) (Gambar 1).
4.13 4.97 5.99 5.11 0 1 2 3 4 5 6 7 Kakao Kontrol Responden V it a m in C ( m g /L ) Sebelum Sesudah
Gambar 1.  Rata-rata kadar vitamin C sebelum dan sesudah intervensi.
Peningkatan  kadar vitamin C plasma kelompok kakao diduga karena efek konsumsi bubuk kakao lindak bebas lemak  selama 25 hari.  Hal ini disebabkan bubuk kakao lindak bebas lemak yang dipakai dalam  penelitian ini mengandung senyawa polifenol yang tinggi (Zairisman, 2006).  Senyawa polifenol memiliki kapasitas sebagai antioksidan (Sanbongi, Osakabe, Natsume, Takizawa, Gomi, & Osawa, 1998).  Senyawa polifenol kakao dari golongan flavonoid ini dapat berfungsi sebagai antioksidan primer karena mampu menghentikan reaksi berantai radikal bebas yang terjadi di dalam sel (Kochhar & Rossell, 1990).  Polifenol dalam bubuk kakao lindak bebas lemak diduga dapat bereaksi langsung dengan senyawa peroksida radikal yang terdapat pada membran atau di dalam sel, sehingga dapat melindungi vitamin C  plasma sebagai antioksidan gizi.  Mekanisme antioksidan flavonoid dalam melindungi vitamin C dapat dilukiskan sebagai berikut: (1) beberapa senyawa flavonoid bertindak sebagai antioksidan bagi vitamin C, (2) memperlambat konversi asam askorbat menjadi asam dehidroaskorbat, dan (3) mengkelat tembaga dan metal lainnya sehingga dapat mengurangi oksidasi terhadap asam askorbat (Middleton, Kandaswami, & Theoharis, 2000).
Menurut Fraga et al. (2005) konsumsi coklat yang kaya dengan kandungan senyawa flavanol dapat meningkatkan kadar vitamin E responden pemain sepak bola yunior  sebesar 12%. Sementara itu, vitamin C diketahui memiliki efek sinergis dengan vitamin E yaitu dapat memulihkan vitamin E yang terserang oleh radikal bebas.  Adanya peningkatan vitamin E diduga juga dapat meningkatkan vitamin C. Hasil pengukuran vitamin C dalam penelitian ini menunjukkan adanya peningkatan  kadar vitamin C plasma kelompok kakao secara nyata (p < 0,05) setelah intervensi.
Peningkatan kadar vitamin C kelompok kakao dan kelompok kontrol setelah menjalani intervensi diduga juga karena pola makan dan pengetahuan gizi responden yang membaik.  Selama intervensi berlangsung setiap makan pagi dan makan malam responden selalu mengkonsumsi sayur dan buah yang disediakan.  Sebaliknya sebelum intervensi, konsumsi sayur responden kurang teratur.  Zakaria et al. (1996) mengemukakan bahwa sayuran dan buah-buahan yang kaya vitamin E dan C dapat berfungsi sebagai antioksidan tubuh.  Di samping itu, selama intervensi berlangsung responden mengurangi konsumsi makanan jajanan karena sebagian kebutuhan makannya telah disediakan oleh peneliti.  Menurut Fardiaz dan Fardiaz (1993) makanan jajanan mengandung bahan-
bahan pencemar seperti mikroorganisme, pestisida, logam berat, zat pewarna, dan zat pengawet. Makanan jajanan yang tercemar bahan kimia berpotensi meningkatkan pembentukan senyawa radikal dalam tubuh (Zakaria, et al ,1996).
Kadar MDA
MDA merupakan produk peroksidasi lipid.  Oleh sebab itu, analisis kadar MDA sering digunakan sebagai salah satu parameter untuk mengevaluasi sejauh mana terjadi kerusakan sel karena reaksi radikal bebas.  Kadar MDA yang rendah menunjukkan adanya penghambatan  oleh suatu antioksidan.
Prinsip analisis pada pengukuran ini adalah MDA dapat melakukan reaksi penambahan nukleofilik dengan asam tiobarbiturat (TBA) membentuk senyawa MDA-TBA.  Senyawa ini berwarna merah jambu yang dapat diukur intensitas warnanya dengan menggunakan spektrofotometer. Senyawa 1,1,3,3-tetratoksipropan merupakan prekursor MDA sehingga dapat digunakan sebagai larutan standar.
Hasil pengukuran menunjukkan kadar rata-rata MDA plasma kelompok kakao dan kelompok kontrol sesudah  intervensi mengalami penurunan.  Kadar rata-rata MDA plasma kelompok kakao menurun secara nyata (p < 0,05) dari 0,93 µmol/l menjadi 0,59 µmol/l dengan selisih penurunan rata-rata sebesar 0,33 µmol/l (Gambar 2).  Kelompok kontrol juga mengalami penurunan dari  0,71 µmol/l menjadi 0,58 µmol/l dengan selisih penurunan sebesar 0,12 µmol/l  tetapi tidak berbeda nyata (p > 0,05).
0.93 0.71 0.59 0.58 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Kakao Kontrol Responden N il a i M D A m ik ro m o l/ li te r) Sebelum Sesudah
Gambar 2.  Rata-rata kadar MDA plasma sebelum dan sesudah intervensi.
Penurunan kadar MDA plasma kelompok kakao diduga karena efek dari konsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak selama 25 hari.  Hal ini dimungkinkan karena bubuk kakao lindak bebas lemak yang dikonsumsi oleh kelompok kakao mengandung senyawa polifenol yang tinggi (Zairisman, 2006).  Dalam penelitian lain disebutkan bahwa kandungan polifenol total dalam bubuk kakao lebih tinggi bila dibandingkan dengan anggur, teh hitam, dan teh hijau (Lee et al., 2003). Sependapat dengannya, Sanbongi et al. (1998) juga menyatakan bahwa senyawa polifenol memiliki
kapasitas antioksidan.  Dalam hal ini senyawa polifenol kakao yaitu dari golongan senyawa flavonoid dapat berfungsi sebagai antioksidan primer.  Menurut Kochhar dan Rossell (1990), senyawa polifenol dapat bertindak sebagai antioksidan primer karena mampu menghentikan reaksi berantai radikal bebas yang terjadi di dalam sel.  Polifenol dalam bubuk kakao lindak bebas lemak akan bereaksi langsung dengan senyawa peroksida radikal yang terdapat pada membran atau di dalam sel. Dengan demikian dapat menurunkan kadar MDA yang merupakan produk oksidasi asam lemak karena radikal bebas.
Hasil penelitian ini mendukung hasil penelitian Erniati (2007) yang menyebutkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak setelah 25 hari secara nyata dapat menurunkan kadar MDA sel limfosit.  Di samping itu, hasil pengukuran ini memperkuat hasil temuan Fraga, et al. (2005) yang menyatakan bahwa konsumsi coklat yang mengandung senyawa flavanol dapat menurunkan kadar MDA responden pemain sepak bola yunior  sebesar 12%.
Sementara itu, penurunan kadar MDA pada kelompok kontrol (yang tidak mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak) secara statistik dengan uji t tidak berbeda nyata.  Hal ini diduga karena pola makan responden menjadi lebih teratur dan pengetahuan gizi responden menjadi lebih baik, seperti yang telah dibahas pada bab vitamin C di atas.

## Aktivitas Anti Radikal Bebas Plasma
Antioksidan merupakan  senyawa yang dapat melindungi sistem biologis tubuh dari reaksi yang dapat menyebabkan oksidasi berlebihan (Papas, 1991).
Pengujian ini bertujuan  menguji pengaruh konsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak terhadap aktivitas antiradikal bebas plasma menggunakan radikal bebas stabil DPPH. Prinsip pengujian ini adalah mereaksikan radikal bebas DPPH dengan antioksidan plasma dimana hasil reaksinya dapat diukur dari perubahan warna ungu DPPH menjadi warna kuning (Mello, Alves, Macedo, & Kubota, 2005).  Oleh karena itu, semakin tinggi kapasitas antioksidan plasma semakin pudar pula warna ungu yang dihasilkan.
Hasil pengukuran menunjukkan kadar rata-rata  aktivitas anti radikal bebas plasma kelompok kakao dan kelompok kontrol sesudah intervensi mengalami peningkatan.  Kadar rata-rata aktivitas anti radikal bebas plasma kelompok kakao meningkat secara nyata (p < 0,05) dari 26,43%  menjadi 42,28% dengan selisih peningkatan sebesar 15,85% (Gambar 3).  Kelompok kontrol juga mengalami peningkatan dari 33,55% menjadi 37,39% dengan selisih peningkatan sebesar 3,84% tetapi tidak berbeda nyata (p > 0,05).
26.43 33.55 42.28 37.39 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Kakao Kontrol Responden A k ti v it a s A n ti ra d ik a l B e b a s ( % ) Sebelum Sesudah
Gambar 3.  Rata-rata aktivitas antiradikal bebas  plasma sebelum dan sesudah intervensi.
Peningkatan aktivitas antiradikal bebas plasma kelompok kakao sesudah mengkonsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak selama 25 hari diduga karena adanya aktivitas antioksidan dari bubuk kakao yang digunakan.  Bubuk kakao lindak bebas lemak dari Balai Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Jember mengandung senyawa polifenol yang tinggi (Zairisman, 2006). Senyawa polifenol ini akan bertindak sebagai antioksidan primer yang mampu menahan serangan radikal bebas DPPH.  Hal ini ditunjukkan oleh adanya peningkatan anti radikal bebas kelompok kakao dibandingkan kelompok kontrol. Adanya peningkatan aktivitas antiradikal bebas plasma pada kelompok kakao dimungkinkan karena senyawa polifenol yang terkandung dalam minuman bubuk kakao lindak bebas lemak dapat masuk ke dalam sirkulasi darah dan selanjutnya masuk ke dalam plasma.  Pada tubuh kita flavonoid (bagian dari senyawa polifenol) akan bersikulasi dalam plasma (Grassi, 2006).
Hasil penelitian ini sejalan dengan temuan Erniati (2007) yang menyebutkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak setelah 25 hari dapat meningkatkan aktivitas antiradikal bebas sel limfosit.
Hasil penelitian ini juga memperkuat temuan Osman, Nasarudin, dan Lee (2003) yang menyebutkan bahwa ekstrak kakao yang telah berkecambah mempunyai aktivitas antioksidan yang sama dengan teh hijau. Selain itu, hasil penelitian ini juga memperkuat simpulan Wollgast dan Anklam (2000) yang mengemukakan bahwa polifenol biji kakao memiliki aktivitas antioksidan yang sangat baik dalam  menangkal radikal bebas.

## Diena Terkonjugasi Plasma
Diena terkonjugasi adalah produk antara dari lipid yang teroksidasi.  Adanya diena terkonjugasi dalam plasma mengindikasikan adanya kerusakan lipid.  Tujuan analisis diena terkonjugasi adalah menguji kapasitas antioksidan minuman bubuk kakao lindak bebas lemak dalam menahan oksidasi LDL ( low density lipoprotein ) plasma. Diena terkonjugasi menyerap sinar pada panjang gelombang UV 234 nm, sehingga dapat dibuat kurva oksidasi antara lamanya waktu
oksidasi dengan kadar diena terkonjugasi yang terbentuk.  Sampel yang mengandung antioksidan biasanya memiliki fase lag sebelum terjadinya lonjakan diena terkonjugasi.  Sehingga semakin lama fase lag mengindikasikan semakin tingginya kapasitas antioksidan sampel tersebut. Dalam analisis ini, plasma dioksidasi menggunakan CuSO 4. Perhitungan fase lag dimulai sejak penambahan CuSO 4 sampai titik perpotongan fase propagasi terhadap sumbu absis/waktu (Gambar 4).
0 50 100 150 200 250 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Waktu (menit) n m o l d ie n a te r k o n ju g a s i/ m g p r o te in p la s m a P2-0 hr (kelompok kakao) P2-25 hr K1-0 hr (kelompok kontrol) K1-25hr
Gambar 4.  Kurva oksidasi plasma seorang subjek dari kelompok kakao (P2) dan kelompok kontrol (K1) sebelum dan sesudah intervensi.
Sesudah  intervensi rata-rata fase lag  plasma  kelompok kakao (Gambar 4) mengalami peningkatan dari 46,67 menit menjadi 50,56 menit dengan selisih peningkatan sebesar 3,89 menit, begitu pula kelompok kontrol juga mengalami peningkatan dari  45 menit menjadi 48,75 menit dengan selisih peningkatan sebesar 3,75 menit.  Tetapi kelompok kakao memperlihatkan selisih yang lebih besar dibandingkan kelompok kontrol.
Fase lag
46.67 45 50.56 48.75 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 Kakao Kontrol Responden P h a s e l a g ( m e n it ) Sebelum Sesudah
Gambar 5. Rata-rata nilai fase lag oksidasi diena terkonjugasi plasma sebelum dan sesudah intervensi.
Peningkatan fase lag pada kelompok kakao yang lebih tinggi dibandingkan  kelompok kontrol diduga karena aktivitas antioksidan  plasma yang berasal dari flavonoid bubuk kakao bebas lemak. Hal ini dimungkinkan mengingat bubuk kakao lindak bebas lemak yang digunakan pada percobaan ini mengandung senyawa polifenol yang tinggi (Zairisman, 2006).  Senyawa polifenol ini akan bertindak sebagai antioksidan dalam melindungi LDL plasma dari kerusakan oksidasi.  Hasil temuan ini memperkuat simpulan Mathur, Devaraj, Grundy, dan Jialal (2002) yang mengungkapkan bahwa produk kakao dapat menurunkan LDL dari berbagai oksidator dengan memperpanjang waktu lagnya. Dalam penelitian lain  Fraga et al. (2005) menyebutkan bahwa konsumsi flavanol yang terkandung dalam coklat susu telah terbukti mampu mengurangi kolesterol plasma, LDL, MDA serta meningkatkan vitamin E dan plasma darah responden yang berprofesi sebagai pemain sepak bola.
Peningkatan fase lag oksidasi diena terkonjugasi plasma oleh flavonoid kakao diduga karena senyawa flavonoid yang terkandung dalam minuman bubuk kakao lindak bebas lemak dapat masuk dalam sirkulasi darah dan selanjutnya berada dalam plasma.  Dengan demikian, selama berada dalam plasma flavonoid diduga melindungi LDL dari berbagai kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas.
KESIMPULAN Konsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak setiap hari selama 25 hari berpengaruh nyata dalam meningkatkan aktivitas antioksidan plasma manusia yang meliputi meningkatnya kadar vitamin C plasma (1,86 mg/l), meningkatnya antiradikal bebas plasma (15,85%), menurunnya nilai MDA plasma (0,33 µmol/l), dan cenderung memperpanjang fase lag diena terkonjugasi (3,89 menit). Dengan meningkatnya sistem antioksidan plasma, maka dapat disimpulkan bahwa minuman bubuk kakao lindak bebas lemak varietas lokal berkhasiat bagi kesehatan karena sistem antioksidan plasma dapat menggambarkan sistem pertahanan tubuh secara keseluruhan.

## REFERENSI
Erniati. (2007). Efek konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap sifat antioksidatif dan proliferativ limfosit manusia [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Fardiaz, D & Fardiaz, S. (1993). Keamanan makanan jajanan . Penyuluhan Keamanan Makanan Jajanan pada Konsumen .  Proyek Makanan Jajanan IPB. Bogor. 16-17 Februari. Fraga, C.G., Goretta L.A., Ottaviani, J., Carrasquedo, F., Lotito, S., Lazarus, S., et al (2005).  Regular consumption of flavanol rich chocolate can improve oxidant stress in young soccer players. Journal of Clinic & Dev. Immun, 12 (1) ; 11-17.
Grassi, D. (2006).  Cocoa and cardiovaskuler health. The sweet heart protection. Agronomy Food Industrize Hi Technology, 17 (1). Hammerstone, J.F., Lazarus, S.A.,  & Schmitz, H.H. (2000).  Procyanidin conten and variation in some commonly consumed foods. Journal Nutrition, 130; 2086S-2092S. Heiss, C., Dejam, A., Kleinbongard, T., Schewe, T., Sies, H. & Kelm, M. (2003).  Vascular effects of cocoa rich in flavan-3-ols. Journal of American Medical Association, 290: 1030-1031. Hong, Y.L., Yeh, S.l., Chang, C.Y., & Hu, M.L. (2000).  Total plasma malonaldehyde level in 16 Taiwanese College Studens determined by various thiobarbituric acid test and improved high performance liquid chromatography based method. Clinical Biochemestry 33: 619-625. Kochhar, S.P., & Rossell, J.B.  (1990).  Detection, estimation, and evaluation of antioxidants in food system. Di dalam: Hudson, B.J.F. Food Antioxidants .  London: Elsevier Applied Science. Lee Kw, Kim, Y.J., Lee, H.J., Lee, C.Y., (2003).  Cocoa has more phenolic phytochemical and a hinger antioxidant capacity than teas and red wine. Journal  Agricultural Food Chemistry, 51; 7292-7295.
Mathur, S., Devaraj, S., Grundy, S.M., & Jialal. (2002).  Cocoa product decrease low density lipoprotein oxidative susceptibility but do not effect biomarkers of inflammation in human. Journal Nurtrition, 132; 3663-3667.
Misnawi, J.S., Jamilah, B., & Nazamid, S. (2002).  Oxidation of polyphenols in unfermented and partly fermented cocoa beans by cocoa polyphenol oxidase tyrosinase. Journal of the Science of Food and Agriculture 82, 559-566. Middleton, J.r., Chithan, K.E., & Theoharis, C. (2000).  The effects of plant flavonoids on mamalian cells:  Implications for inflamation, heart disease, and cancer. Pharmacology.  Rev. 52; 673- 751.
Mello, L.D., Alves, A.A., Macedo, D.V., & Kubota, L.T. (2005).  Peroxides-based biosensor as a tool for fast evaluation of antioxidant capacity of tea. Food Chemistry, 92; 515-519. Murphy, K.J., Kronopoulus, A.K., Singh, I., Francis, M.A., Moriarty, H., Pike, M.J., et al . (2003). Dietary flavanols and procyanidin oligomers from cocoa ( Theobroma cacao ) inhibit platelet function. American Journal  Clinic Nutrition, 77; 1466-73. Osman, H.R., Nasarudin R., & Lee,S.S. (2003).  Extracts of cocoa (Theobroma L cacao) leaves and their antioxidant potentials. Journal Food Chemestry, 86; 41-46.
Papas, A.M., (1991).  Determinant of antioxidant in humans. Di dalam : Papas, A.M., Editor.
Antioxidant Status, Diet, Nutrition and Health. USA: CRC Press. P.21-23. Peterson., J, & Johanna, D. (2000). An Informatics approach to flavonoid database development. Journal Food Composition Analysis, 13; 441-454.
Sanbongi, C., Osakabe, N., Natsume, M., Takizawa, T., Gomi, S., & Osawa, T.(1998). Antioxidative polyphenols isolated from Theobroma cacao Journal Agricultural  Food Chemestry, 46; 452- 457.
Turkmen, N., Ferda, S., & Velioglu, Y.S. (2004). The Effect of cooking methods on total phenolics and antioxidant activity of selected green vegetables. Food Chemistry, 93 (2005) 713 – 718. Van Heerden IV. (2006). Chocolate update for easter . Diambil 29 Juli 2007 dari http:www.health24.com/dietnfood/weiht_Centre/15-51-736,21867.
Winarsi, H.  (2003).  Respon imunitas dan hormonal wanita premenopause terhadap minuman susu fungsional yang disuplementasi dengan isoflavon kedelai dan difortifikasi dengan seng [desertasi].  Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
Wollgast, J.,  & Anklam, E. (2000).  Polyphenols in chocolate: Is there a contribution to human health? Journal  Food Res International, 33; 449-459. Zhu, Q.Y., Schramm, D.D., & Grooss, H.B. (2005). Influence of cocoa flavanols and procyanidins on free radical in human erythrocyte hemolysis. Clinical & Devellopment Imunology, 12 (1); 27- 34.
Zairisman, S.Z.,  (2006). Potensi imunomodulator bubuk kakao bebas lemak sebagai produk sub standar secara in vitro pada sel limfosit manusia. [Skripsi]. Bogor.: Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB.
Zakaria, F.R.,  Abidin, Z., Pramudya, S.M., & Sanjaya. (1996).  Kadar malonaldehida dan zat gizi antioksidan plasma pada populasi remaja rentan pencemaran makanan. Buletin Teknologi dan Industri Pangan, 7 (3); 56-64.
Zakaria, R.F, Septiana, A.T., & Sulistiyani. (2001).  Ginger ( Zingiber officinale Roescoe) extracts increase human LDL resistance to oxidation and prevent cholesterol accumulation in macrophage. Abstract presented at the Second Intl Symp on Natural Antioxidant : Molecular Mechanism and Health Affects, Beijing, China.
Zakaria, F.R., Nurrahman, Prangdimurti, E., & Tejasari. (2003).  Antioxidant and immunoenhancement activities of ginger ( Zingeber offcinale Roscoe) extracts and compounds in vitro and in vivo mouse and human system. Nutraceuticals and Food, 8 (1);
96-104.