KINETIC PARAMETERS DETERMINATION OF GLUCOAMYLASE ON HYDROLYSIS REACTION OF SAGOO STARCH ( Metroxylon sp)
Penentuan Parameter Kinetika Glukoamilase pada Reaksi Hidrolisis Pati Sagu
( Metroxylon Sp.)
Adriani Bandjar 1, * , Matheis F.J.D.P. Tanasale 1 , Maher Syalal Luhukay 1
1 Chemistry Department, Faculty of Mathematics and Natural Sciences Pattimura University, Kampus Poka, Jl. Ir. M. Putuhena, Ambon 97134
*Corresponding author, e-mail: abandjar@fmipa.unpatti.ac.id
Received:  October 2014 Published: January 2015

## ABSTRACT
Sagoo plant (Metroxylon sp.) numerous in eastern Indonesia, such as Maluku and Papua. Sagoo starch containing amylose and amylopectin. Sagoo starch hydrolysis can be carried out by enzymes, such as glucoamylase  or  often  called  amiloglukosidase  or  α-1  ,4-glukanoglukohidrolase,  an  extracellular enzyme capable hydrolyzes α-1, 4 on amylose and α-1, 6 in amylopectin. The enzymatic hydrolysis of starch  can  be  reviewed  in  the  kinetics  of  the  Michaelis-Menten  equation  and  Lineweaver-Burk equation. The  aims of this study to determine the  kinetic parameters (V max and K m) of glucoamylase on hydrolysis of sagoo starch. Glucoamylase has an optimum temperature of 50 oC and pH optimum 6.5. At optimum conditions, based on Michaelis-Menten equation, the value of V max is 1.09 U / mL / min and K m value is 0.82. Based on Lineweaver-Burk equation, the value of V max was 1.03 U / mL / min and K m value was 0.84%.
Keywords : Glucoamylase, hydrolysis, sago starch.

## PENDAHULUAN
Bioetanol  dapat  diproduksi  dari  tumbuhan penghasil  pati,  seperti  ubi  kayu,    kentang,  sagu, dan  lain-lain.  Tanaman  sagu  ( Metroxylon sp.) jika dikelola dengan baik dapat menghasilkan 25 ton  pati  kering/ha/tahun.  Produktifitas  ini  setara dengan  tebu,  namun  lebih  tinggi  dibandingkan dengan ubi kayu dan kentang dengan prodiktifitas  pati  kering  10-15  ton/ha/tahun (Sumaryono, 2007).
Tanaman  sagu  ( Metroxylon sp.)  banyak terdapat  pada  Indonesia  bagian  timur,  seperti Maluku  dan  Papua.  Luas  areal  tanaman  sagu  di Maluku  mencapai  31.360  ha  yang  tersebar  di tujuh kabupaten. Berdasarkan peta zona agroekologi  Maluku  skala  1:250.00,  luas  areal sagu masih dapat dikembangkan hingga 649.983 ha (Bustaman, 2008).
Pengolahan  pati  sagu  menjadi  bioetanol dapat  dilakukan  melalui  dua  tahap,  yaitu  tahap hidrolisis  dan  tahap  fermentasi.  Pati  dapat dihidrolisis  menjadi  glukosa  dalam  suasana asam.  Asam  yang  biasa  digunakan  biasanya asam  klorida.  Proses  ini  kurang  menguntungkan karena  menghasilkan  produk  yang  tidak  ramah lingkungan dan membutuhkan biaya  yang besar. Enzim  adalah  pilihan  utama  yang  digunakan untuk  proses  hidrolisis  pati.  Penggunaan  enzim memberi  keuntungan  antara  lain  produk  lebih murni,  lebih  mudah  dan  tanpa  produk-produk sampingan  yang  berbahaya.  Salah  satu  enzim yang berperan dalam menghidrolisis pati menjadi glukosa  adalah  enzim  amilase,  terutama  α- amilase  dan  glukoamilase  (Melliawati  dkk, 2006)
Enzim  glukoamilase  atau  sering  disebut amiloglukosidase
atau α-1,4- glukanoglukohidrolase merupakan enzim
Adriani Bandjar, dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2015, 2, 176 - 181
1
ekstraseluler  yang  mampu  menghidrolisis  ikatan α-1,4  pada  rantai  amilosa,  amilopektin,  likogen, dan  pullulan.  Enzim  glukoamilase  juga  dapat menyerang ikatan α-1,6 pada titik  percabangan, walaupun dengan laju yang lebih rendah. Hal ini berarti  bahwa  pati  dapat  diuraikan  secara sempurna  menjadi  glukosa  (Melliawati  dkk, 2006).
Proses  hidrolisis  pati  secara  enzimatik dapat  ditinjau  secara  kinetika.  Dalam  reaksi enzim  dikenal  reaksi  hidrolisis,  penguraian,  atau reaksi  katalisis  lain  yang  disebut Velocity atau disingkat V. Harga V dari suatu reaksi enzimatik pada umumnya sangat tergantung pada konsentrasi  substrat.  Pada  konsentrasi  enzim tetap  (tertentu)  harga  V  hampir  linier  dengan konsentrasi  substrat  [S]  tetapi,  pada  konsentrasi substrat  yang  tinggi  (berlebihan),  kecepatan reaksi  V  akhirnya  mencapai  maksimum  (V maks ). Untuk  menerangkan  hal  ini,  Leonor  Michaelis dan Maud Menten mengajukan suatu model. Hal yang  diajukan  adalah  bahwa  dalam  suatu  reaksi enzim  selalau  terbentuk  senyawa  peralihan  ES (Enzim Substrat), jadi:
E + S
ES          E + P Dari persamaan reaksi di atas Michaelis dan Menten  mendefinisikan  suatu  tetapan,  yang sekarang dinyatakan sebagai K m, yang bermanfaat  dalam  menyatakan  hubungan  yang tepat diantara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik (Winarno, 1995).
Mandik  dkk  (2004),  telah  menghidrolisis pati  sagu  papua  ( Metroxylon  sagu Rottbol) dengan  menggunakan  Termamyl TM 120L  (α- amilasi dari Bacillus licheniformis ). Berdasarkan jumlah  glukosa  yang  dihasilkan,  Termamyl TM
120L  mempunyai K m sebesar  2,36  %  dan  V maks sebesar 50,8 % unit/mg.
Harga K m ternyata  sangat  bervariasi, tergantung pada jenis substrat dan juga keadaaan lingkungan  seperti  suhu  dan  pH  (Winarno, 1995).

## METODOLOGI Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  antara  lain: enzim  glukoamilase,  buffer  asetat,  buffer  fosfat, reagen  DNS,  maltose  monohydrate,  pati  sagu, dan aquades.

## Alat
Alat yang digunakan antara lain: seperangkat alat  gelas,  hot  plate,  pH-meter,  neraca  analitik, pipet mikro, oven, dan spektrofotometer UV-VIS APEL PD-303 UV.

## Prosedur Kerja Penyiapan Sampel
Sebanyak 500 g pati sagu dicuci dengan 2 L aquades  (lima  kali  pencucian  dengan  cara maserasi berpengadukan, masing-masing pencucian dilakukan selama 10 menit). Pati sagu basah dikeringkan dengan oven pada suhu 40 o C selama  24  jam.  Sebanyak  1g  pati  kering dilarutkan  dengan  50  mL  buffer  asetat  0,05  M pH  4,0  dalam  keadaan  mendidih,  setelah  itu volume  ditepatkan  menjadi  100  mL  dengan penambahan  buffer  asetat  mendidih,  sehingga diperoleh  larutan  pati  1  %  (b/v).  Hal  yang  sama juga  dilakukan  untuk  membuat  substrat  dengan pH: 4,5; 5,0; 5,5; sedangkan  untuk pH: 6,0; 6,5; dan 7,0 digunakan buffer fosfat.

## Penentuan pH Optimum
Ke  dalam  7  tabung  reaksi  dimasukkan masing-masing  1  mL  larutan  substrat  pati  sagu dengan berbagai variasi pH yang telah dibuat dan 1  mL  enzim,  kemudian  diinkubasi  selama  3,5 menit pada suhu  30 o C. Selanjutnya ditambahkan 2  mL  DNS  dan  20  mL  akuades,  kemudian serapan  diukur  dengan  spektrofotometer  pada panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansinya kemudian  diplotkan  pada  kurva  standar  maltosa untuk penentuan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan.

## Penentuan Suhu Optimum
Ke  dalam  7  tabung  reaksi  masing-masing dimasukan  1  mL  larutan  substrat  pada  kondisi pH  optimum  dan  1  mL  enzim,  kemudian diinkubasi  selama  3.5  menit  pada  suhu  30 o C, 35 o C,  40 o C,  45 o C,  50 o C,  55 o C,  dan  60 o C. Selanjutnya ditambahkan 2 mL DNS dan 20 mL aquades,  kemudian  serapan  diukur  dengan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  540 nm.  Nilai  absorbansinya  kemudian  diplotkan pada  kurva  standar  maltosa  untuk  penentuan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan.
1

## Hidrolisis Pati
Hidrolisis  pati  dilakukan  pada  pH dan  suhu optimum  dengan  variasi  konsentrasi  0,1  %;  0,2 %;  0,4  %;  0,6  %,  0,9  %,  1,2  %,  1,5  %;    1,8  %; dan    2,2  %  (b/v).  Kemudian  ditambahkan  1  mL enzim  dan  diinkubasi  selama  3,5  menit  pada suhu  optimum.  Selanjutnya  ditambahkan  2  mL larutan  DNS,  kemudian  diencerkan  dengan penambahan  20  mL  aquades.  Serapan  diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang  540  nm.  Nilai  absorbansinya kemudian  diplotkan  pada  kurva  standar  maltosa untuk penentuan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan.
Unit  aktivitas  enzim  glukoamilase  dihitung berdasarkan  gula  pereduksi  sebagai  µmol maltosa  yang  dihasilkan  per  menit  pada  kondisi percobaan dengan persamaan:
Keterangan: AE    = Unit Aktivitas enzim (U/mL = µmol/mL/menit) ppm  = Maltosa yang dihasilkan (ppm) BMg = Berat molekul maltosa (g/mol) MI    = Masa inkubasi (menit)
Penentuan  nilai  parameter  kinetika  berupa V maks dan K m berdasarkan  persamaan  Michaelis- Menten dan Lineweaver-Burk.

## Pembuatan Kurva Standar Maltosa
Pembuatan kurva standar dilakukuan dengan cara melarutkan 0,2 g maltosa dalam 100 mL aquades sehingga diperoleh konsentrasi 2000 ppm.  Larutan  kemudian  diencerkan  dengan aquades  sehingga  diperoleh  konsentrasi  0 (kontrol); 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, dan  1600  ppm.  Selanjutnya  masing-masing larutan  ditambahkan  2  mL  DNS,  kemudian diencerkan  sampai  10  mL.  Serapan  diukur  pada panjang  gelombang  540  nm.  Kemudian  dibuat hubungan absorbansi dengan mg maltosa.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kurva Standar Maltosa Pembuatan kurva standar maltosa memberikan hasil seperti terlihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Kurva standar maltosa
Kurva  standar  maltosa  memberikan  hasil yang  baik  dengan  R 2 =  99,7%  dan  persamaan garir  linear  y  =  0.000556x  -  0.000643  untuk penentuan  konsentrasi  maltosa  sebagai  gula pereduksi pada tiap absorbansi yang diukur.

## Penentuan pH Optimum
Penentuan  pH  optimum  menggunakan metode  DNS  menunjukan  kondisi  optimum enzim  glukoamilase  dalam  menghidrolisis  pati sagu yaitu pada pH 6,5 dengan absorbansi 0,338 atau 0,48 µmol/mL/menit dan minimum pada pH 5 dengan absorbansi 0,192 atau 0,28 µmol/mL/menit.  Selengkapnya  dapat  dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Kurva  penentuan  pH  optimum enzim
glukoamilase dalam menghidrolisis pati sagu
Enzim  glukoamilase  dapat  menghidrolisis pati  sagu  komersial  secara  optimal  menjadi  gula pereduksi  pada  substrat  dengan  pH  6,5  dengan unit  aktivitas  V  sebesar  0,48  µmol/mL/menit. Pada  pH  4,0  –  5,0  terjadi  penurunan  aktifitas enzim  sehingga  gula  pereduksi  yang  dihasilkan juga rendah dengan unit aktivitas V sebesar 0,33 – 0,28 µmol/mL/menit. Pada pH 5,5 – 5,6 terjadi
y = 0.000556x - 0.000643 R² = 0.997015 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 500 1000 1500 2000 ab so rb an si [maltosa] (ppm) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 5 10 u n it a kt iv it as V (µ m ol /m L/ m e n it )
pH
Adriani Bandjar, dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2015, 2, 176 - 181
1
peningkatan  aktifitas  dan  mencapai  maksimum pada  pH  6,5  namun  pada  pH  yang  lebih  tinggi aktifitasnya menjadi berkurang.

## Penentuan Suhu Optimum
Penentuan  suhu  optimum  menggunakan metode  DNS  menunjukan  kondisi  optimum enzim  glukoammilase  dalam  menghidrolisis  pati sagu  yaitu  pada  suhu  50 o C  dengan  absorbansi 0,244  atau  0,64  µmol/mL/menit  dan  minimum pada  suhu  30 o C  dengan  absorbansi  0,118  atau 0,34 µmol/mL/menit. Selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3.
Kurva  penentuan  suhu  optimum enzim glukoamilase dalam menghidrolisis pati sagu Enzim glukoamilase yang digunakan memiliki  suhu  optimum  50 o C  dengan  aktivitas enzim  sebesar  0,64  µmol/mL/menit.  Pada kondisi  suhu  di  bawah  50 o C  aktivitas  enzim pada  umumnya  stabil  dan  tidak  terlalu  terjadi peningkatan kemampuan katalitik enzim. Namun pada  suhu  di  atas  50 o C,  daya  katalitik  enzim menjadi berkurang, hal ini ditujukan dengan nilai absorbansi yang menurun.
Hidrolisis  pati  yang  dilakukan  pada  kondisi pH dan suhu optimum dengan variasi konsentrasi memberikan hasil seperti pada Tabel 1.
Persamaan Michaelis-Menten Penentuan parameter kinetika dengan persamaan  Michaelis-Menten  dilakukan  dengan memvariasikan konsentrasi substrat dalam hal ini pati  sagu  terhadap  enzim.  Pada  persamaan
Michaelis-Menten:
m maks K S S V V   ] [
] [ 0 jika  kecepatan
reaksi  awal  tepat  sema  dengan  setengah kecepatan  maksimum  maka  diperoleh K m =  [S]. Berdasarkan Persamaan diatas, jika kita memplotkan  V 0 pada  sumbu  y  dan  [S]  pada sumbu  x,  dan  dengan  menggunakan  program kaleidagraph  3.6  didapat  V max sebesar  1,0901 µmol/mL/menit  dan  k m sebesar  0,82%,  dengan R 2 = 0,98. Hal ini dapat dilihat pada Gambar  4.
Tabel 1. Hidrolisis pati oleh enzim glukoamilase pada berbagai konsentrasi Konsentrasi %(b/v) Absorbansi Gula pereduksi (ppm) Unit aktivitas (µmol/mL/menit) (V) 0,1 0,082 148,715 0,12 0,2 0,095 172,108 0,14 0,4 0,272 490,617 0,39 0,6 0,320 576,992 0,46 0,9 0,423 762,339 0,60 1,2 0,454 818,123 0,65 1,5 0,502 904,498 0,71 1,8 0,518 933,290 0,74 2,2 0,584 987,275 0,78
Gambar 4. Kurva  V 0 vs  [S]  berdasarkan persamaan Michaelis-Menten
Pada konsentrasi substrat yang amat rendah, kecepatan reaksipun amat rendah, tetapi kecepatan ini akan meningkat dengan meningkatnya  konsentrasi  substrat,  namun  pada konsentrasi  substrat  yang  lebih  besar,  kecepatan reaksi  hanya  akan  meningkat  sedemikian  kecil. Kecepatan  reaksi  hanya  akan  mendekati,  tetapi tidak  akan  pernah  mencapai  garis  maksimum, sehingga  sulit  untuk  menentukan V max dengan tepat. V max hanya  diduga  dan  tidak  pernah  dapat diketahui nilai sebenarnya (Lehninger, 2000).
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 20 40 60 80 u n it a kt iv it as V (µ m ol /m L/ m e n it ) suhu ( o C)
Adriani Bandjar, dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2015, 2, 176 - 181
1
Tetapan Michaelis-Menten K m didefinisikan sebagai  ( k 2 + k –  1 )/ k 1 .  Jika k 2 + k –  1 >> k 1 maka nilai K m lebih  besar  dari  satu.  Hal  ini  berarti kecepatan penguraian  [ES]  lebih besar dari pada kecepatan pembentukan  [ES]  (Lehninger, 1982), sehingga  enzim  mempunyai  afinitas  rendah terhadap substrat. Kesetimbangan menguntungkan  [E]  +  [S],  bukannya  kompleks [ES] (Page, 1997).
Jika k 2 + k – 1 << k 1 maka nilai K m lebih kecil dari satu, ini menunjukkan kecepatan pembentukan  [ES]  lebih  besar  dari  kecepatan penguraian  [ES],  sehingga  enzim  mempunyai afinitas yang tinggi terhadap substrat.
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh,  enzim glukoamilase  memiliki  afinitas  yang  cukup tinggi  terhadap  substrat  karena  nilai K m lebih kecil dari satu yaitu 0,82 %.

## Persamaan Lineweaver-Burk
Persamaan Lineweaver-Burk mentransformasikan persamaan Michaelis-
Menten  yang  diturunkan  secara  sederhana
menjadi  Persamaan  8:
maks maks m V S V K V 1 ] [ 1 1 0   ,
dan dengan memplotkan 1/V o pada sumbu y dan 1/[s]  pada  sumbu  x  didapat  karva  pada  Gambar 5.
Gambar 5. Kurva  1/S  vs  1/V  berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk Perpanjangan garis linier
y= 0,819967x+0,975097, akan memotong sumbu y  dan  sumbu  x.  Perpotongan  terhadap  sumbu  y akan  memberikan  nilai  1/V max =  0,975097 kemudian  perpotongan  terhadap  sumbu  x  akan memberikan  nilai  -1/K m =  -1,19  ;  sehingga
diperoleh  V max =  1,03  µmol/mL/menit  dan  nilai K m = 0,84 % dengan R 2 = 0,90.
Berdasarkan  nilai  R 2 yang  diperoleh, penentuan K m menggunakan persamaan Michaelis-Menten  secara  non  linier  memberikan tingkat  keeratan  hubungan  antara  dua  variabel atau  lebih  menunjukan  hasil  yang  lebih  baik, yaitu  0,98  atau  98  %  dibandingkan  dengan persamaan  Lineweavar-Burk  yaitu  0,90  atau  90 %.  Namun  demikain  nilai K m dan V max yang ditentukan berdasarkan kedua persamaan tersebut  tidak  memberikan  perbedaan  yang signifikan. Hal ini berarti penentuan nilai K m dan V max dapat dilakukan baik menggunakan persamaan Michaelis-Menten ataupun persamaan Lineweaver-Burk.
Jika  dibandingkan  dengan  penelitian  yang dilakukan  oleh  Mandik  dkk  (2004),  dalam menghidrolisis  pati  sagu,  enzim  glukoamilase memberikan  nilai K m yang  lebih  baik  dari  pada enzim  α-amilase.  Enzim  α-amilase  memberikan nilai K m sebesar  2,36  %  sedangkan  enzim glukoamilase  memberikan K m sebesar  0,8  %. Sedangkan  nilai  V max enzim  α-amilase  dalam menghidrolisis  pati  sagu  yang  didapai  oleh Mandik  dkk  (2004)  sebesar  50,8  unit/mg  tidak dapat  dibandingkan  dengan  nilai  V max enzim glukoamilase  sebesar  1,0  U/mL/menit  karena untuk  penentuan  nilai  V max dengan  satuan unit/mg harus dilakukan pengujian kadar protein, sedangkan  dalam  penelitian  ini  tidak  dilakukan penguji kadar protein.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh,  maka dapat disimpulkan bahwa:
1. pH  optimum  enzim  glukoamilase  dalam menghidrolisis  pati  sagu  komersial  adalah 6,5.
2. Suhu  optimum  enzim  glukoamilase  dalam menghidrolisis  pati  sagu  komersial  adalah 50 o C.
3. Nilai  K m dan  V max berdasarkan  persamaan Michaelis-Menten  dan  Lineweaver-Burk berturut-turut  adalah  0,82%  dan  1,09 U/mL/menit, 0,84% dan 1,03 U/mL/menit.

## DAFTAR PUSTAKA
Bustaman,  S.,  2008.  Potensi  Ulat  Sagu  dan
Prospek Pemanfaatannya , Litbang Pertanian : 27 (50-54). y = 0.819967x + 0.975097
R² = 0.909328 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 1 /V 1/[S]
1
Lehninger,  L.  A.,  2000. Dasar-dasar  Biokimia, Jilid  1,  Penerjemah  M.  Thenawidjaja Suhartono, Penerbit Erlangga, Jakarta. Mandik,  Y.  I.,  Sindumarta,  M.,  dan  Natalia,  D., 2004.  Penentuan  Parameter  Kinetika Hidrolisis  Pati  Sagu  Papua  ( Metroxylon sagu Rottbol)  oleh  α-Amilase, Prosiding Seminar MIPA IV : 368-371.
Meliawati,  R.,  Suherman,  R.  S.,  dan  Subardjo,
B., 2006,  Pengkajian  Kapang  Endofit dari Taman Nasional Gunung Halimun Sebagai Penghasil  Glukoamilase, Berk.  Penel.
Hayati : 12 (19-25).
Page,  D.  S.,  1997. Prinsip-Prinsip  Biokimia , edisi  ke  dua,  Penerjemah  Drs.  R. Soendoro, Penerbit Erlangga, Jakarta.
Sumaryono,  2007.  Tanaman  Sagu  sebagai
Sumber Energi Alternatif, Warta
Penelitian  dan  Pengembangan  Pertanian Vol. 29, No. 4 .
Winarno,  F.  G.,  1995. Enzim  Pangan .  Penerbit PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.