## ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN 16S rRNA ISOLAT MIKROBA ASOSIATIF
PADA ALGA MERAH Kappaphycus alvarezii DARI PERAIRAN DESA BELANG, KABUPATEN MINAHASA TENGGARA, SULAWESI UTARA
(Isolation and amplification of 16S rRNA gen of Associated Microbial isolates in Red Algae Kappaphycus alvarezii from Belang, Southeast Minahasa Regency, North Sulawesi )
Letha L. Wantania 1 , Stenly Wullur 2* , Elvi L. Ginting 2 , Desy M. H. Mantiri 2 , Suzanne L. Undap 2 , Deiske A. Sumilat 2 , Grevo S. Gerung 2
1 Program Studi Magister Ilmu Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Sam Ratulangi, Manado 95115 . louisletha@gmail.com
*Author Correspondent: e-mail: stenlywullur@unsrat.ac.id
2) Staff Pengajar Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Univrsitas Sam Ratulangi Manado

## ABSTRACT
This study aims to obtain isolates and amplify the associative bacterial 16SrRNA gene  in K.  alvarezii algae.  The K.  alvarezii algae  was  collected  from  seaweed cultivation  area  in  Belang,  Southeast  Minahasa,  North  Sulawesi.  Associative bacteria  were  sampled  from K.  alvarezii algae,  grown  in  Nutrient  Agar  and separated  based  on  their  morphological  characteristics.    Each  isolates  were extracted their DNA genome and.the16S rRNA gene of each isolate was amplified using PCR.  Eight associative bacterial from K. alvarezii algae were successfully isolated based on morphological characteristics which were dominated by round shape,  smooth  edges,  convex  elevation,  and  white  color  of  the  isolates.  The results of genomic DNA extraction from each of these isolates were successfully used as templates to amplify the 16s rRNA gene. Key word: Bacteria, Kappaphycus alvarezii, Taxsonomy, 16S rRNA

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  isolat  dan  mengamplifikasi gen 16SrRNA bakteri asosiatif pada alga K. alvarezii . Metode penelitian diawali dengan pengambilan sampel alga K. alvarezii di lokasi pembudidayaan rumput laut  di  desa  Belang,  Minahasa  Tenggara,  Sulawesi  Utara.  Selanjutnya,  bakteri asosiatif pada alga K. alvarezii tersebut ditumbuhkan dalam media Nutrient Agar , isolat yang tumbuh kemudian dipisahkan berdasarkan karakteristik morfologinya. dan  gen  16S  rRNA  masing-masing  isolat  diamplifikasi  menggunakn  PCR. Delapan  isolat  bakteri  asosiatif  pada  alga K.  alvarezii berhasil  diisolasi  dengan karakteristik  morfologi  berbeda  yang  didominasi  dengan  bentuk  round,  tepian smooth,  elevasi  convex,  dan  warna  putih.  Hasil  ekstraksi  DNA  genom  dari masing-masing  isolat  tersebut  berhasil  digunakan  sebagai  template  untuk mengamplifikasi gen 16s rRNA.
Kata Kunci: Bakteri , Kappaphycus alvarezii, Taksonomi, 16S rRNA

## PENDAHULUAN
Alga  laut  atau  yang  lebih  dikenal dengan sebutan rumput laut merupakan salah  satu  sumberdaya  hayati  yang melimpah di perairan Indonesia. Rumput  laut  ini  merupakan  tumbuhan
yang  tidak  memiliki  batang,  akar,  dan daun yang sebenarnya. Berbagai manfaat  mulai  dari  peranan  ekologis dalam produktivitas primer di laut hingga potensi  ekonomi  sebagai  bahan  baku dalam  industri  dan  kesehatan  menjadi
daya  tarik  dari  komoditas  ini  (Dawes, 1998; Dahuri, 2015). Dewasa ini, rumput laut digunakan dalam industri makanan, pupuk  tanaman,  bahan  pembuatan kertas,  cat,  bahan  kosmetik,  produksi hidrokoloid  seperti  agar  dan  alginate, serat, bahan obat-obatan seperti antibiotik,  antikoagulan,  antihipertensi, pengurangan  kolestrol,  dan  insektisida (Chen & Duan, 2000; Gerung, 2004).
Dalam  beberapa  tahun  terakhir, alga  dan  produk  turunannya  telah menarik perhatian dunia industri. Sebagai mikroba asosiatif, peran bakteri terhadap alga dapat juga bersifat positif, seperti  dapat  membantu  supply  nutrisi untuk  pertumbuhan  alga  serta  sebagai mikrooganisme  yang  bersifat  defensive terhadap  penyakit  dan  penempelan organisme  pengganggu  (Egan  et  al., 2012).  Selain  memiliki  dampak  positif, mikroorganisme  seperti  bakteri  juga dapat memberi dampak negatif. Interaksi alga dengan mikroba asosiatif sering dianggap sebagai sumber
penyakit  ataupun  kontaminan  dalam proses  produksi  hingga  komersialisasi alga  dan  turunannya  (Ramanan  et  al., 2015).
Kappaphycus alvarezii merupakan salah  satu  jenis  alga  yang  banyak dibudidaya dan mendominasi eksport di Indonesia. Alga ini dapat menghasilkan karagenan  yang  memiliki  beragam manfaat  di  bidang  industri  (Failu  et  al., 2016). Pada beberapa penelitian membuktikan  bahwa  bakteri  asosiasi alga merah  K.alvarezii  memiliki  potensi sebagai  bahan  antibakteri  (Naid  et  al., 2013)  dan  salah  satu  sumber  pigmen alami yang berasal dari laut (Sahara et al., 2013).
Penelitian  mengenai  bakteri  yang berasosiasi  dengan  rumput  laut K. alvarezii selalu dikaitkan dengan bakteri pathogen.  Penelitian  mengenai  jenis- jenis  bakteri  yang  berasosiasi  dengan alga K. alvarezii belum banyak dilakukan  terutama  di  berbagai  lokasi budidaya lokal Sulawesi Utara.

## METODE PENELITIAN

## Lokasi Penelitian
Pengambilan  sampel  dilakukan  di lokasi pembudidayaan rumput laut yang terletak  di  perairan  desa  Belang,
Kabupaten Minahasa Tenggara, Sulawesi  Utara  pada  bulan  November, 2018.  Lokasi  dan  analisis  sampel dilakukan  di    Laboratorium  Biologi Molekuler dan Farmasitika Laut, Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan, Universitas Sam Ratulangi, Manado.

## Isolasi dan Kultur Bakteri
Sampel  alga K.  alvarezii yang telah diperoleh dibilas dengan menggunakan air laut steril dan digerus di dalam ependorf. Setelah itu, dilakukan pengenceran hingga 10-4 dan di  inokulasi  ke  dalam  media  Nutrient Agar.  Sampel  yang  telah  diinokulasi kemudian  di  tumbuhkan  pada  suhu 37°C selama ±24-48 jam. Isolat  bakteri yang  telah  bertumbuh  dikarakterisasi morfologinya mulai dari ukuran, bentuk, warna, dan elevasi. Isolat yang diperoleh  kemudian  dipisahkan  dalam media nutrient agar baru untuk dijadikan stok dan untuk analisis selanjutnya.

## Amplifikasi Gen 16S rRNA
Proses amplifikasi Gen 16S rRNA diawali  dengan  proses  isolasi  DNA bakteri. Pada proses isolasi DNA, isolat bakteri  yang  telah  diperoleh  dikultur  ke dalam  media  Nutrient  Broth.  Nutrient broth  yang  telah  ditumbuhi  bakteri kemudian  disentrifus  pada  suhu  4°C selama  5  menit  dengan  kecepatan 14.000 rpm sebanyak 6 ml. Supernatan hasil  sentrifugasi  dibuang  hingga  yang tertinggal hanya pellet (Sari et al., 2013). Pellet  hasil  sentrifus  pada  tahap  ini merupakan isolat bakteri yang kemudian digunakan untuk Ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan  Kit  DNeasy  Blood  and Tissue (bukan bakteri). Tahapan proses isolasi DNA berpedoman pada prosedur pabrikan www.qiagen.com . Isolat bakteri  yang  telah  berada  dalam  tube ditambahkan  dengan  buffer  ATL  dan
proteinase K lalu divortex dan diinkubasi pada suhu 55°C selama 1 jam (Sampel divortex  setiap  15  menit  selama  waktu inkubasi).  Setelah  1  jam,  tambahkan buffer AL dan vortex kemudian inkubasi kembali  pada  suhu  70°C  selama  10 menit.  Lebih  lanjut  tambahkan  etanol pada sampel isolat bakteri dan divortex kemudian  larutan  dipindahkan  pada DNeasy Mini Spin Column yang berada di atas 2 ml collection tube. Sentrifugasi tube yang berisi larutan pada kecepatan 8000  rpm  selama  1  menit  dan  buang cairan  di  bagian  bawah  tube.  Tahap selanjutnya dilakukan dengan menambahkan  buffer  AW  1  dan disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama  1  menit  lalu  cairan  dibuang. Tambahkan buffer AW 2 dan sentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit dan buang cairan yang berada di bagian bawah tube. Pindahkan DNeasy Mini Spin Column ke atas elution tube. Setelah itu tambahkan buffer  AE  pada  bagian  tengah  DNeasy Mini  Spin  Column  dan  inkubasi  pada suhu  ruangan  selama  1  menit  lalu.
kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
Proses selanjutnya adalah proses amplifikasi  gen  16S  rRNA.  Proses amplifilasi gen dilakukan menggunakan metode  Polymerase  Chain  Reaction (PCR). Hal pertama yang perlu dilakukan  pada  proses  amplifikasi adalah membuat campuran reaksi yang diisi  dalam  tube  khusus  untuk  mesin PCR. Campuran tersebut antara lain 8,5
µl Rnase-free water (ddH2O), 12,5 µl 2x Top Taq Master Mix, 2,5 µl 10x coralload concentrate,  1  µl  primer  forward,  1  µl primer reverse, dan 2 µl DNA template. Primer  yang  akan  digunakan  pada bakteri  asosiasi  alga  adalah  primer universal 8F (5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') untuk  Primer  forward  dan  1492  R  (5'-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3')  untuk primer  reverse.  Proses  ini  diawali dengan  predenaturasi  95°C  selama  6 menit  selanjutnya  denaturasi  95°C selama  30  detik,  penempelan  52°C selama  30  detik,  dan  elongasi  72°C selama 30 detik.  Pada tahap denaturasi hingga elongasi dilakukan sebanyak 35 siklus  dan  1  siklus  perpanjangan  akhir pada  suhu  72°C  selama  10  menit. Keberhasilan  dari  proses  isolasi  DNA hingga  amplifikasi  gen  dapat  dilihat menggunakan  teknik  elektroforesis  gel. Gel  agarose  hasil  proses  elektroforesis kemudian  diletakkan  pada  alat  UV- transiluminator  untuk  melihat  ada  atau tidaknya pita DNA target.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada saat pengambilan sampel di lokasi pembudidayaan rumput laut desa Belang,  diperoleh  2  sampel  alga K. alvarezii dengan warna berbeda. Kedua warna  dari  alga  tersebut  adalah  hijau yang  lebih  dikenal  dengan  nama  sabai oleh  masyarakat  pembudidaya  dan warna coklat yang lebih dikenal dengan nama cottonii (Gambar 1).
Gambar 1. Alga Kappaphycus alvarezii dari Lokasi Pembudidayaan di Desa Belang
Berdasarkan pengamatan dengan  membandingkan  morfologi  dari alga  dengan  buku  identifikasi  (Trono, 1988; Tanji, 2013), ciri-ciri mofologi yang
diperoleh  dari  alga K.  alvarezii adalah talus yang berbentuk silinder dan kokoh, berwarna  hijau  dan  coklat,  memiliki percabangan  terbuka,  agak  jarang- jarang  dan  tidak  beraturan.  Panjang cabang  berkurang  pada  setiap  tingkat percabangan.
Cabang terminal
berbentuk  runcing  membulat  dengan tekstur  permukaan  yang  halus  dan cartilaginous.  Meskipun  memiliki  warna yang berbeda, namun K.alvarezii dengan warna coklat dan hijau mengandung  pigmen  yang  sama  yaitu zeaxantin dan klorofil (Fretes, 2012).
Bakteri  yang  berasosiasi  dari kedua  sampel  alga K.  alvarezii ini
ditumbuhkan  pada  media  NA.  Sampel yang  telah  digerus  di  dalam  ependorf dan telah diencerkan dengan pengenceran  bertingkat  ditumbuhkan pada media NA dengan cara di sapukan di permukaan media agar yang ditandai dengan tumbuhnya  koloni  bakteri  pada  media. Pengenceran sampel ini bertujuan untuk memperoleh isolat murni bakteri. Setiap koloni  bakteri  yang  tumbuh  dipisahkan berdasarkan warna, ukuran dan bentuk koloni kemudian diisolasi dengan menumbuhkannya  pada  media  yang sama.
Tabel 1.  Karakteristik isolat bakteri asosiasi alga K. alvarezii berwarna Hijau (Sabai) Kode Isolat Karakteristik Isolat Bentuk Tepian Elevasi Warna Ukuran S1 Serabut Irregular Datar Putih 8 mm S2 Bundar Entire Cembung Putih 3 mm S3 Bundar Entire Raised Putih 8 mm
Tabel 2. Karakteristik isolat bakteri asosiasi alga K. alvarezii berwarna Coklat (cottonii) Kode Isolat Karakteristik Isolat Bentuk Tepian Elevasi Warna Ukuran C1 Bundar Entire Cembung Kuning 1 mm C2 Bundar Entire Cembung Putih Susu 8 mm C3 Bundar Entire Datar Kuning Susu 11 mm C4 Bundar Entire Cembung Putih 2 mm C5 Bundar Lobate Raised Abu-abu 21 mm
Karakteristik  dari  bakteri  asosiatif  pada  alga K.  alvarezii dari  lokasi  budidaya rumput laut di Perairan Desa Belang telah diamati secara makroskopis dengan mengacu pada Leboffe (2012). Morfologi isolat  bakteri asosiasi alga K. alvarezii yang berwarna hijau  (Sabai)  dapat  dilihat  pada  Tabel  1  dan  morfologi  isolat  bakteri  asosiasi  alga K. alvarezii yang berwarna coklat pada Tabel 2.
Berdasarkan  hasil  pengamatan  morfologi  diperoleh  8  isolat  bakteri,  masing- masing 3 isolat dari K. alvarezii berwarna hijau dan 5 isolat dari K. alvarezii berwarna coklat. Tabel 1 menunjukkan isolat bakteri S1, S2, dan S3 memiliki warna dominan putih dengan  elevasi  yang  beragam,  dan  didominasi  bentuk  bundar  dengan  tepian  entire (sangat rata) yang memiliki ukuran 3 dan 8 mm. Pada Tabel 2, isolat C1,C2,C3,C4, dan C5 memiliki bentuk yang serupa yaitu bundar dengan dominasi tepian entire dan satu isolat memiliki tepian lobate.
Tiga  dari  isolat  bakteri  asosiasi K.  alvarezii yang  berwarna  hijau  ini  memiliki elevasi  cembung  dan  dua  diantaranya  memiliki  elevasi  datar  serta  raised  (sedikit menonjol). Kelima isolat bakteri ini memiliki warna yang beragam dengan ukuran yang beragam pula mulai dari 1 mm hingga 21 mm. Hal ini disebabkan karena kepadatan dan kerapatan sel bakteri serta ketersediaan nutrisi dalam media pertumbuhan (Wiley et al., 2008).  Elevasi  koloni  dari  isolat  bakteri  asosiasi K.  alvarezii disajikan  pada Gambar  2 dan 3.
Gambar 2 . Isolat Bakteri pada alga K. alvarezii yang berwarna hijau (Sabai)
Gambar 3 . Isolat Bakteri pada alga K. alvarezii yang berwarna Coklat  (Cottonii)
Gambar 4. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari bakteri asosiatif pada alga K. alvarezii
Hasil  ekstraksi  DNA  genom  pada isolat  bakteri  asosiasi K.  alvarezii yang digunakan sebagai DNA template dalam proses  amplifikasi  gen  16S  rRNA menggunakan  primer  8  F  dan  1492  R.
Hasil  amplifikasi  gen  yang  divisualisasi dengan menggunakan UV- Transiluminator disajikan pada Gambar 4. Berdasarkan gambar diatas, tampak bahwa terdapat 7 pita DNA pada lintasan  sampel  S1,  S2,  S3,  C1,  C3, C4,dan C5 yang telah berhasil diamplifikasi  dengan  posisi  panjang
amplicon  sekitar  1500  bp  sedangkan pada  lintasan  sampel  C2  tidak  tampak pita  DNA.  Posisi  panjang  amplikon tersebut  sesuai  dengan  posisi  panjang basa  gen  16S  rRNA  yang  digunakan sebagai primer universal dalam identifikasi  mikroorganisme  (Clarridge, 2004).  Sampel  S1  merupakan  sampel yang memiliki tampakan pita paling tebal dan  jelas  diantar  enam  pita  lainnya. Pada  sampel  C1,  C3,  C4,  dan  C5 tampak  pita  yang  terlihat  jelas  namun kurang  tebal  jika  dibandingkan  dengan pita  S1.  Pada  sampel  S2  dan  S3, tampakan  pita  yang  terlihat  sedikit samar. Salah satu faktor yang mempengaruhi tampakan pada visualisasi  elektroforesis  berasal  dari kondisi sampel DNA tersebut. Selain itu faktor lain yang mempengaruhi tampakan  pita  diduga  diakibatkan  oleh jumlah/kuantitas  sampel  koloni  bakteri yang digunakan kurang cukup memadai pada  saat  isolasi  DNA  ataupun  kurang tepatnya primer yang digunakan (Yilmaz et al., 2012; Dwiyitno, 2010).

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah  diperoleh  dalam  penelitian  ini, maka dapat disimpulkan:
1.  Hasil analisis morfologi bakteri yang hidup  berasosiasi  dengan  alga  K. alvarezii  di  lokasi  pembudidayaan rumput laut di Perairan Desa Belang diperoleh  8  isolat  bakteri  dengan karakteristik morfologi berbeda yang didominasi  dengan  bentuk  round, tepian  smooth,  elevesi  convex,  dan warna putih.
2.  Gen  16s  RNA  sebagai  gen  target untuk  analisis  DNA  taknsonomi bakteri berhasil
diamplifikasi sebanyak  7  dari  8  isolat  bakteri asosiatif pada alga K. alvarezii.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  terima kasih kepada Kementrian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi,
Republik Indonesia, dan Pusat Penelitian  Oceanografi  LIPI  yang  telah membiayai  penelitian  ini  dalam  skema Penelitian  Pengembangan  Unggulan Perguruan Tinggi (PPUPT) tahun anggaran 2018, dan Penelitian Unggulan  Strategis  Nasional  tahun anggaran  2018,  serta    program  LIPI khususnya  Coremap-CTI  dalam  Drive Research  Grant  2018  dan  Demand Driven  Research  Fund  2019  dengan ketua tim peneliti Dr. Joshian Schaduw yang  telah  banyak  mengambil  bagian dalam terselenggaranya kegiatan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Chen,  K.  Z.  &  Duan,  Y.,  2000.
‘Competitiveness  of  Canadian agri-food exports againts competitors  in  asia:  1980- 97’,
Journal  of  International  Food  & Agribusiness Marketing , 11(4), 19.
Dahuri,  R.,  Rais,  J.  &  Ginting,  S.  P., 2001. Pengelolaan  Sumber  Daya Wilayah Pesisir dan Lautan Secara Terpadu . Jakarta: Pradnya Paramita.
Dawes,  C.  J.,  1998. Marine  Botani
Second  Edition .  New  York:  John Wiley and Sons Inc. Dwiyitno, D., 2010.’ Pathogenic bacteria,  fish,  DNA  molecular, PCR’, Bulletin  of  Marine  and Fisheries Postharvest and Biotechnology , 5(2). Egan,  S.,  Harder,  T.,  Burke,  C.,
Steinberg,  P.,  Kjelleberg,  S.  & Thomas,  T.,  2013.’The  seaweed holobiont: understanding seaweed –bacteria  interactions’,
FEMS  Microbiology  Review ,  462-
476. Failu,  I.,  Supriyono,  E.  &  Suseno,  H., 2016. ‘Peningkatan Kualitas Kagenan Rumput Laut Kappaphycus  alvarezii Dengan Metode Budidaya Keranjang Jaring ’, Jurnal akuakultur Indonesia . 15(2), 123-124.
Fretes,  H.  D.,  2012.  Studi  komposisi, kandungan  pigmen,fotostabilitas
dan  termostabilitas  serta  analisis produk  degradasi  ekstrak  kasar pigmen alga merah Kappaphycus alvarezii doty varian merah, cokelat dan hijau. THESIS. Universitas Kristen Satya Wacana. Gerung,  S.G.,  2004.  Biodiversity  of Indonesian seaweed. Dalam Marine  Science  into  the  New Millenium:  New  Perspectives  and Challenges,  edited  by  Phang, S.M.,  Ho,  S.C.,  Chong,  V.C., Mokhtar,  N.  &  Ooi,  J.L.S. Kuala Lumpur:  University  of  Malaya Maritime Research Centre, 41-54.
Leboffe, M. J. & Pierce, B. E .,2012. Brief Microbiology.    Laboratory  Theory & Application 2 nd Edition . Englewood:  Morton Publishing . Naid,  T.,  Kasim,  S.,  Marzuki,  A.  & Sumarheni., 2013. ‘Produksi antibiotika  secara  fermentasi  dari biakan  mikroorganisme  simbion rumput  laut  Eucheuma  cottoni ’, Majalah Farmasi dan Farmakologi , 7(3), 61-68. Ramanan, R., Kim B. H., Cho, D. H., Oh, H. M. & Kim, H. S., 2015. ‘Algae– bacteria  interactions:  Evolution, ecology and emerging applications ’, Biotechnology Advance, Elsevier , 16.
Sahara,  F.  N.  I.,  Radjasa,  O.  K.  & Supriyantini, E., 2013. ‘Identifikasi Pigmen  Karotenoid  Pada  Bakteri Simbion Rumput Laut Kappahycus  alvarezii , Jpurnal  of Marine Research , 2(3), 58-67. Willey,  J.  M.,  Sherwood,  L.  M.  & Woolverton., 2008. Prescott, Harley,  and  Klein’s  Microbiology Seventh Edition . Newyork: McGraw-Hill. Yilmaz, M., Ozic, C. & Gok, I., 2012. Gel Electrophoresis Principal & Basics . Croatia: Intech.