Optimasi  Metode  dan  Uji  Stabilitas  pada  Penetapan  Kadar  Filantin  dalam  Ekstrak Phyllanthus  niruri Menggunakan KLT-Densitometri
Rachma Nurhayati, Riesta Primaharinastiti, Mochammad Yuwono* Departemen Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
*Coresponding author: yuwono05@yahoo.com
Submitted: 11 Februari 2020 Accepted: 10 April 2020 Published: 30 November 2020

## Abstract
Background: Phyllanthin is the major lignan compound in Phyllanthus niruri with hepatoprotective activity. For the standardization of P. niruri extracts, a simple and selective TLC-densitometric method has been developed, and phyllanthin was used as a phytochemical marker in this study. Objective: To obtain the optimal condition of the separation and to evaluate the stability of phyllanthin as a pre-validation stage by using TLC-densitometry. Methods: Optimal  conditions  were  studied  in  the  variation  of  the  mobile  phase  composition,  the  analytical wavelength, the saturation time  of TLC chamber, the elution  distance and the volume of  the spot. The stability test was done by analyzing the standard and extract solutions at 0, 4, 8, and 24 hours. Results: The composition of selected mobile phase  which  gave  good  separation and symmetrical peak  shape  was toluene: ethyl acetate: formic  acid  (15:  10.5:  1.5  v  /  v  /  v)  with  a  wavelength  of  279  nm,  time  of  saturation  was  60  minutes,  elution distance  was  8  cm  and  volume  of  spots  was  10  µL.  Stability  tests  showed  a  decrease  in  area  and  shift  of  Rf during  storage. Conclusion: In  this  study,  the  optimal  condition  for  analysis  of  phyllanthin  in  the  P.  niruri extracts has been  proposed and  successfully applied  for stability test  in  the pre-validation stage of  the method develepoment.  Phyllanthin  was  unstable  during  storage,  therefore  standard  solutions  and  extracts  should  be made fresh to maintain the stability.
Keywords: phyllanthin, optimization of analytical methods, stability, TLC-densitometry

## Abstrak
Pendahuluan: Filantin  merupakan senyawa  lignan utama  pada Phyllanthus  niruri yang  menunjukkan aktivitas hepatoprotektif. Untuk keperluan standardisasi ekstrak, metode kromatografi lapis tipis (KLT)-densitometri yang sederhana  dan  selektif  telah  dikembangkan  dalam  penelitian  ini  dengan  menggunakan  filantin  sebagai  marker fitokimia. Tujuan: Untuk  menetapkan  kondisi  analisis  KLT-densitometri  yang  optimal  dan  mengevaluasi stabilitas  filantin. Metode: Penentuan  kondisi  optimal  analisis  dilakukan  dengan  cara  menentukan  komposisi fase  gerak,  panjang  gelombang  analisis,  waktu  penjenuhan  bejana,  jarak  elusi  dan  volume  penotolan.  Uji stabilitas  filantin  dilakukan  dengan  menganalisis  larutan  standar  dan  ekstrak  pada  0,  4,  8  dan  24  jam. Hasil: Komposisi  fase gerak terpilih  yang  menghasilkan pemisahan  yang  baik dan  bentuk  puncak  yang  simetris  yaitu toluen : etil asetat : asam format (15 : 10,5 : 1,5 v/v/v) dengan panjang gelombang 279 nm, waktu penjenuhan bejana  60  menit,  jarak  elusi 8 cm dan  volume  penotolan 10 µL. Uji  stabilitas  larutan  uji  menunjukkan adanya penurunan  area  dan  pergeseran  Rf  pada  waktu  penyimpanan. Kesimpulan: Pada  penelitian  ini  telah  diperoleh kondisi optimal untuk analisis filantin. Kondisi optimal yang diperoleh pada penelitian ini dapat digunakan untuk uji  stabilitas  tahap  pre-validasi  metode.  Filantin  tidak  stabil  selama  penyimpanan,  sehingga  larutan  baku  dan ekstrak sebaiknya dibuat baru ketika akan dilakukan analisis untuk menjamin stabilitas.
Kata kunci: filantin, optimasi metode analisis, stabilitas, KLT-densitometri

## PENDAHULUAN
Bahan  alam  telah  banyak  dimanfaatkan  sebagai obat  karena  mengandung  senyawa  bioaktif  yang memberikan  efek  terapi  untuk  tubuh.  Sebanyak  30  - 40%  produk  obat  yang  beredar  saat  ini  berasal  dari bahan  alam  baik  melalui  proses  isolasi  maupun  semi sintesis.  Salah  satu  bahan  alam  yang  sedang  dan banyak  dikembangkan  untuk  produk  obat  saat  ini adalah Phyllanthus  niruri. Ekstrak  daun,  batang  dan akar  tanaman ini telah lama digunakan sebagai obat di berbagai  negara  untuk  terapi  penyakit  ginjal  dan kandung  kemih,  infeksi  saluran  cerna,  diabetes  dan virus hepatitis B (Khatoon dkk., 2006).
Penelitian  yang  banyak  dilakukan  pada P.  niruri adalah membuktikan efek hepatoprotektif (Bhattacharjee  &  Sil,  2007;  Krithika  dkk ., 2009; Chirdchupunseree & Pramyothin, 2010) . Efek hepatoprotektif pada P.  niruri disebabkan  oleh adanya senyawa filantin. Ravikumar dkk. (2011) membuktikan bahwa  filantin  secara  bermakna  menghambat  enzim NS3 protease dan NS5B RNA serta mencegah replikasi virus  hepatitis  C.  Krithika  dkk.  (2015)  juga membuktikan  bahwa  filantin  dapat  menyebabkan hambatan  pada  reseptor  kinase transforming  growth factor (TGF)  beta  tipe  1  dan  hambatan  pada  jalur pensinyalan  TGF  melalui  ALK5,  Smad  2  dan  3 sehingga mencegah fibrosis hati. Struktur filantin dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Struktur filantin (3,3’,4,4’,9,9’- Hex- methoylignan )
Di  Indonesia,  standar  simplisia  dan  ekstrak  yang digunakan  dalam  pengobatan  diatur  dalam  Farmakope Herbal  Indonesia  (FHI)  (Depkes  RI,  2009).  Pada monografi  FHI,  prosedur  analisis  herba  meniran ditentukan  menggunakan  metode  Kromatografi  Lapis Tipis (KLT) dengan larutan pembanding kuersetin dan belum  disebutkan  metode  baku  untuk  analisis  filantin. Beberapa  metode  analisis  untuk  penentuan  filantin telah  dikembangkan  dan  metode  Kromatografi  Lapis Tipis  Kinerja  Tinggi  (KLTKT)  menjadi  metode  yang paling  banyak digunakan  (Tatiya dkk.,   2011; Tripathi dkk.,  2006;  Arsul  dkk.,  2011;  Nayak  dkk.,  2010;
Murugaiyah & Chan, 2007; Khabiya dkk., 2014). Akan tetapi  metode  ini  tidak  banyak  diaplikasikan  oleh industri farmasi di Indonesia karena relatif lebih mahal dibandingkan metode KLT.
Penetapan  kadar  filantin  menggunakan  metode KLT  pada  ekstrak  etanol  herba  meniran  juga  telah dilaporkan  oleh  Alegantina  dkk  (2015)  menggunakan fase  gerak  kloroform  :  metanol  (9  :  1),  akan  tetapi resolusi puncak filantin dalam ekstrak rendah sehingga senyawa  filantin  belum  memisah  dengan  sempurna. Selain  itu  stabilitas  filantin  juga  belum  dilaporkan. Tujuan  dari  penelitian  ini  untuk  mendapatkan  kondisi optimal analisis menggunakan metode KLT- densitometri  yang  diharapkan  memberikan  hasil pemisahan  yang  baik  dan  mengevaluasi  stabilitas filantin  sebagai  tahap  awal  pengembangan  metode untuk analisis filantin.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Standar  filantin  (Sigma  Aldrich),  ekstrak  etanol Phyllanthus niruri (Natura Lab), toluen (Merck), asam format  (Merck),  etila  setat  (Merck),  metanol  (Merck), n-heksana  (Merck),  aseton  (Merck),  kloroform (Merck), asetonitril (Merck).

## Alat
Lempeng KLT silica gel 60 F 254 aluminium sheets 20  x  20  cm  (Merck),  bejana  pengembang  10  x  10  cm (Camag),  KLT scanner 3  dengan  UV  detektor (Camag), winCATS software versi 1.4.8.2012
(Camag).

## Metode

## Pembuatan larutan baku induk standar filantin
Ditimbang  1,0  mg  standar  filantin,  dilarutkan dalam  10  mL  metanol.  Baku  induk  ini  selanjutnya dapat  digunakan  untuk  membuat  baku  kerja  20  - 100 ppm melalui tahap pengenceran.

## Pembuatan larutan ekstrak
Ditimbang  1,0  gram  ekstrak  etanol P.  niruri dan dilarutkan  dalam  10  mL  metanol.  Larutan  dipanaskan pada  suhu  60 o C  diatas hotplate dan  diaduk menggunakan magnetic  stirrer selama  60  menit. Larutan  disentrifugasi  selama  2  menit  dengan kecepatan 4000 rpm untuk memisahkan supernatan dan endapannya.

## Pembuatan fase gerak
Untuk  tahap  optimasi  kondisi  maka  fase  gerak dibuat  dalam  beberapa  macam  komposisi  fase  gerak seperti tertera pada Tabel 1.
Tabel 1. Variasi komposisi fase gerak yang diuji untuk mendapatkan kondisi optimal No Komposisi fase gerak Perbandingan volume 1 n-heksana : aseton : etil asetat 37 : 6 : 6 v/v/v 2. Kloroform : etil asetat 1 : 1 v/v 3. Kloroform : asetonitril : metanol : asam format 60 : 30 : 10 : 0,5 v/v/v/v 4. Toluen : etil asetat : asam format 15 : 10,5 : 1,5 v/v/v

## Optimasi kondisi analisis
Optimasi  kondisi  analisis  dilakukan  dengan  cara mengubah  komposisi  fase  gerak,  menentukan  panjang gelombang  maksimum  untuk  pengamatan  noda, optimasi  waktu  penjenuhan  bejana  selama  15  -    90 menit,  optimasi  jarak elusi  pada panjang 7  - 9 cm  dan optimasi  volume  penotolan  sebanyak  6  -  20  µL  pada plat  KLT.  Parameter  yang  diamati  dalam  pemilihan kondisi  optimal  adalah  faktor  retardasi  (Rf),  bentuk puncak  dan  resolusi  (Rs)  terbaik.  Rs  dihitung menggunakan rumus matematika sebagai berikut:

## )                       )
Keterangan: Rs = resolusi Rf1 = faktor retardasi senyawa 1 Rf2
= faktor retardasi senyawa 2

## Uji stabilitas larutan uji
Uji  stabilitas  dilakukan  dengan  membagi  larutan standar  dan  ekstrak  dalam  4  tabung  berbeda.  Masing- masing tabung diberi label 0 jam, 4 jam, 8 jam, dan 24 jam.  Larutan  uji  dianalisis  sesuai  waktu  yang  telah ditentukan  dalam  label.  Semua  tabung  disimpan  pada suhu 4 o C.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Optimasi kondisi analisis
Berdasarkan  percobaan  yang  telah  dilakukan terhadap  variasi  komposisi  fase  gerak,  diperoleh  data pada  Tabel  2.  Komposisi  fase  gerak  1  menunjukkan resolusi  yang  baik  antara  puncak  filantin  dan pengotornya  yaitu  >  1,5  akan  tetapi  puncak  filantin fronting .  Hal  ini  dapat  mempengaruhi  hasil  analisis sehingga  fase  gerak  1  tidak  dipilih.  Komposisi  fase gerak  2  menunjukkan  resolusi  <  1,5  sehinga  puncak filantin  tidak  terpisah  sempurna  dengan  puncak pengotornya.  Selain  itu  puncak  filantin  juga fronting sehingga  fase  gerak  2  tidak  dipilih.  Komposisi  fase gerak  3  tidak  menunjukkan  adanya  puncak  filantin yang terelusi, sehingga fase gerak 3 tidak dipilih.Komposisi  fase  gerak  4  menunjukkan  resolusi yang  paling  optimal  dan  puncak  yang  simetris, sehingga  fase  gerak  ini  dipilih  dan  digunakan  untuk proses analisis selanjutnya.
Tabel 2. Data hasil percobaan variasi komposisi fase
gerak Fase gerak Rf Rs1 Rs2 Puncak 1 0,37 1,7 2,1 Fronting 2 0,78 1,1 - Fronting 3 NA NA NA NA 4 0,66 7,3 1,8 Simetris *NA: puncak tidak terdeteksi.
Panjang  gelombang  maksimal  yang  terdeteksi yaitu  200  nm.  Akan  tetapi  apabila  dilakukan  analisis pada panjang gelombang tersebut maka banyak puncak pengganggu  yang  muncul  dan  dapat  mempengaruhi hasil  analisis senyawa filantin.  Pada  panjang gelombang  279  nm,  area  yang  dihasilkan  puncak filantin tinggi dan puncak pengganggu yang dihasilkan sangat  sedikit  sehingga  panjang  gelombang  terpilih yang digunakan yaitu 279 nm (Gambar 2).
Gambar 2. Spektra dan panjang gelombang senyawa filantin
Penjenuhan  bejana  dengan  sempurna  diperlukan agar proses elusi dan pemisahan dapat berjalan dengan baik.  Hasil  optimasi  waktu  penjenuhan  bejana  tertera pada  Tabel  3.  Dari  hasil  optimasi  diperoleh  waktu penjenuhan  bejana  dapat  mempengaruhi  Rf.  Hal  ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Dezeeuw (1968)  yang  menunjukkan  ketidakstabilan  Rf  suatu senyawa  setelah  dielusi  pada  bejana  yang  tidak dilakukan  penjenuhan.Waktu  penjenuhan  bejana  yang optimal  pada  penelitian  ini  yaitu  minimal  60  menit karena Rf stabil setelah 60 menit.
100 ppm ppm nm λ A U 60 ppm ppm nm 279 nm ppm nm
Tabel 3. Data hasil optimasi waktu penjenuhan bejana Waktu penjenuhan (menit) Area Rf 15 921,4 0,59 30 956,6 0,61 60 1098,8 0,66 90 1095,0 0,66 120 1084,8 0,66
Hasil  optimasi  volume  penotolan  tertera  pada Tabel  4.  Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh,  volume penotolan  yang  memberikan  bentuk  puncak  simetris yaitu  6  µL  dan  10  µL.  Pada  volume  penotolan  16  µL dan  20  µL,  puncak  mengalami fronting .  Hal  ini  dapat disebabkan volume penotolan terlalu besar. Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh Tripathi  dkk.  (2006),  Khabiya  dkk.  (2014)  dan Alegantina  dkk.  (2015),  diperoleh  kadar  filantin  yang relatif  kecil  sehingga  volume  penotolan  10  µL  lebih dipilih pada penelitian ini dibandingkan 6 µL.
Tabel 4. Data hasil optimasi volume penotolan
Konsentrasi (ng/µL) Volume totolan (µL) Area Puncak 20,14 6 531,4 Simetris 20,14 10 1069,8 Simetris 20,14 16 1688,1 Fronting 20,14 20 2125,0 Fronting
Jarak  elusi  juga  telah  dioptimasi  pada  penelitian ini.  Hasil  optimasi  tertera  pada  Tabel  5.  Hasil  yang diperoleh  menunjukkan  bahwa  jarak  elusi  dapat mempengaruhi Rf dan Rs. Pemisahan yang paling baik didapatkan  pada  jarak  elusi  9  cm.  Akan  tetapi  jarak elusi 8 cm  juga  memenuhi persyaratan Rs  yaitu > 1,5.
Untuk menghemat waktu elusi maka dipilih jarak elusi 8 cm.
Tabel 5. Data hasil optimasi jarak elusi Jarak elusi (cm) Rf Rs1 Rs2 7 0,54 6,1 1,2 8 0,66 7,3 1,8 9 0,72 7,5 2

## Stabilitas larutan uji
Uji  stabilitas  pada  larutan  standar  dan  ekstrak merupakan  salah  satu  uji  yang  dilakukan  pada  tahap pre-validasi.  Uji  stabilitas  ini  dilakukan  untuk mengevaluasi  stabilitas  larutan  uji  pada  waktu penyimpanan  tertentu.  Analit  pada  larutan  uji dikatakan  stabil  apabila  selisih  area  maupun  faktor retardasi  sebesar  2%  terhadap  analit  pada  larutan  uji yang  baru  dibuat  dan  langsung  dianalisis  (Indrayanto, 2012).  Hasil  uji  stabilitas  larutan  uji  pada  beberapa waktu  pengukuran  dapat  dilihat  pada  Tabel  6  dan Tabel 7.
Berdasarkan  data  yang  diperoleh  diketahui  bahwa larutan  uji  tidak  stabil  setelah  penyimpanan  4  jam. Kemudian  dilakukan  analisis  menggunakan  SPSS untuk menentukan apakah terdapat perbedaan bermakna  antara  area  dan  faktor  retardasi  pada  setiap waktu pengamatan.  Data yang diperoleh  menunjukkan distribusi  normal  dan  homogen  sehingga  dilakukan pengujian  dengan one-way ANOVA.  Hasil  analisis menunjukkan  terdapat  perbedaan  bermakna  rata-rata area  dan  Rf  pada  setiap  waktu  pengamatan.  Hal tersebut  menunjukkan  bahwa  semakin  lama  larutan standar  disimpan  maka  akan  semakin  menurun kadarnya (Gambar 3).
Tabel 6. Hasil uji stabilitas larutan standar dalam waktu tertentu Waktu pengamatan (jam) Rata-rata Area Selisih area (%) Rf Selisih Rf (%) 0 7421,0 ± 0,5 - 0,66 - 4 6829,7 ± 0,4 7,9 0,67 1,5 8 6715,3 ± 0,5 9,5 0,71 7,5 24 6579,4 ± 0,5 11,3 0,71 7,5 Tabel 7. Hasil uji stabilitas larutan ekstrak dalam waktu tertentu Waktu pengamatan (jam) Rata-rata Area Selisih area (%) Rf Selisih Rf (%) 0 2889,7 ± 0,3 - 0,62 - 4 2883,9 ± 0,5 0,2 0,58 6,4 8 2671,9 ± 0,3 7,5 0,58 6,4 24 2452,2 ± 0,3 15,1 0,56 9,7
Gambar 3. Kromatogram standar filantin (a) dan ekstrak filantin (b) menggunakan fase gerak toluen : etil asetat : asam format (15 : 10,5 : 1,5 v/v/v)

## KESIMPULAN
Kondisi optimal yang diperoleh pada penelitian ini untuk  analisis  filantin  adalah  komposisi  fase  gerak toluen : etil asetat : asam format (15 : 10,5 : 1,5 v/v/v) dengan lama penjenuhan 60 menit, panjang gelombang analisis  279  nm,  jumlah  penotolan  10  µL  dan  jarak elusi  8  cm.  Stabilitas  larutan  diuji  pada  penelitian  ini sebagai  tahap  prevalidasi.  Stabilitas  larutan  uji menurun  dengan  penyimpanan  pada  waktu  tertentu ditandai  dengan  penurunan  area  dan  pergeseran  faktor retardasi pada kromatogram  filantin. Disarankan untuk larutan  uji  dibuat  baru  ketika  akan  dilakukan  analisis. Pada  penelitian  selanjutnya  dapat  dilakukan  validasi metode untuk kondisi optimal yang telah diperoleh.

## DAFTAR PUSTAKA
Alegantina, S., Setyorini, H. A. & Triwahyuni. (2015).
Pengujian  Mutu  dan  Penetapan  Kadar  Filantin Pada Ekstrak Etanol Herna Meniran  ( Phyllanthus niruri Linn). Buletin  Penelitian  Kesehatan;  43;
11-16.
Arsul,  V.  A.,  Ganjiwale,  R.  &  Yeole,  D.  (2011). Development  and  Validation  of  Phyllanthin  by HPTLC  in  Hepatoprotective  Polyherbal  Tablet Dosage  Form. Asian  Journal  of  Research  in
Chemistry ; 4; 815-817.
Bhattacharjee,  R.  &  Sil,  P.  (2007).  Protein  Isolates from the Herb, Phyllanthus niruri L. (Euphorbiaceae),  Plays  Hepatoprotective  Role
Against  Carbon  Tetrachloride  Induced  Liver Damage Via Its Antioxidant Properties. Food and Chemical Toxicology; 45; 817-826.
Chirdchupunseree,  H.  &  Pramyothin,  P.  (2010).
Protective  Activity  of  Phyllanthin  in  Ethanol- Treated  Primary  Culture  of  Rat  Hepatocytes.
Journal Ethnopharmacol; 128; 172-176. Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia  (Depkes RI).  (2009).  Farmakope  Herbal  Indonesia. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia Dezeeuw,  R.  A.  (1968).  Reproducibility  of  Rf  Values in Unsaturated Chambers and Related Development Techniques. Journal of chromatography; 33; 222-226.
Indrayanto,  G.  (2012).  Validation  of  Analytical Methods. Profiles of Drug Subtances, Excipients,
And Related Methodology; 37; 439-463. Khabiya,  R.,  Upadhyay,  D.,  Srivastava,  A.  & Anandjiwala, S. (2014). Simultaneous Quantification  of  Three  Bioactive  Lignans,  Viz., Phyllanthin, Hypophyllanthin and Niranthin from Phyllanthus  amarus Using  High-Performance Thin-Layer  Chromatography. Journal  of  planar chromatography; 27; 281-286.
Khatoon, S., Rai, V., Rawat, A. & Mehrotra, S. (2006).
Comparative  Pharmacognostic  Studies  of  Three
Phyllanthus Species. Journal of Ethnopharmacology; 104; 79-86.
Krithika,  R.,  Jyothilakshmi,  V.,  Prashantha,  K.  &
Verma,  R.  J.  (2015).  Mechanism  of  Protective Effect of Phyllanthin Against Carbon Tetrachloride-Induced Hepatotoxicity and Experimental  Liver  Fibrosis  in  Mice.  London: Taylor & Francis.
Krithika,  R.,  Mohankumar,  R.,  Ramtej,  J.  Y.  &
Shrivastav, P. S. (2009). Isolation, Characterization  and  Antioxidative  Effect  of Phyllanthin  Against  CCL-induced  Toxicity  in HepG2 Cell Line. Chemico-Biological
Interactions; 181; 351-358.
Murugaiyah, V. & Chan, K.. L. (2007). Determination of  Four  Lignans  in Phyllanthus  niruri L.  by  a Simple High-Performance Liquid Chromatography  Method  with  Fluorescence Detection. Journal of Chromatograpphy A; 1154; 198-204.
Nayak, P. S., Upadhyay, A., Dwivedi, S. K. & Rao, S. (2010). Quantitative Determination of Phyllanthin in Phyllanthus amarus by High Performance Thin Layer Chromatography. Boletin  Latinoamericano
(a) (b) filantin
y  del  Caribe  de  Plantas  Medicinales  y Aromaticas; 9; 353-358.
Ravikumara,  Y.,  Raya,  U.  &  Nandhithaa,  M.  (2011).
Inhibition  of  Hepatitic  C  Virus  Replication  by Herbal  Extract: Phyllanthus  amarus as  Potent Natural Source. Virus Research; 158; 89-97.
Tatiya,  A.,  Patil,  R.,  Sutar,  M.,  Shirkhedkar,  A.  &
Surana,  S.  (2011).  Determination  of  Phyllanthin and  Galic  Acid  in  Herbal  Hepatoprotective
Formulation  by  TLC-Densitometry  Analysis. Pharmacognosy Journal; 3; 39-43.
Tripathi, A. K., Verma, R. K., Gupta, A. K., Gupta, M.
M.  &  Khanuja,  S.  P.  (2006).  Quantitative
Determination of Phyllantine and Hypophyllantine  in Phyllantus Species  by  High- Performance Thin Layer Chromatography. Phytochemical Analysis ; 17; 394-397.