## INDONESIA
PENGARUH KOMBINASI CEKAMAN NITROGEN DAN FOTOPERIODE TERHADAP BIOMASSA, KANDUNGAN KUALITATIF TRIASILGLISEROL DAN PROFIL ASAM LEMAK MIKROALGA Nannochloropsis sp.
Dini Ermavitalini 1 ; Sumarni Dwirejeki 2 ; Sri Nurhatika 1 ; Triono Bagus Saputro 1
1 Departemen Biologi, Fakultas Sains, Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya
2 Alumni Departemen Biologi, Fakultas Sains, Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya

## Abstract
Biodiesel is a promising alternative fuel obtained from plant oils and animal fats through esterification with alcohol.  Nannochloropsis  sp.  is  a  high  (90%)  marine  triacylglycerol  (TAG)  producing  microalgae  under stress  conditions.  Production  of  lipid  TAG  and  fatty  acid  composition  of  Nannochloropsis  sp.  can  be engineered with abiotic stress. This study aims to examine the effect of nitrogen stress and photoperiod on biomass,  chlorophyll  content,  fatty  acid  profile,  and  qualitative  content  of  TAG.  Nannochloropsis  sp. cultivated from starter cultures were then treated in variations of nitrogen stress (N100, N75, N50, N25 and N0)  with  bright  photoperiods:  dark  (12:12;  16:  8  and  24:  0)  as  a  two-factor  complete  randomized  study design. Data retrieval of all research parameters  is carried out at the final exponential stage. The results showed the interaction of the two factors did not affect the biomass of Nannochloropsis sp. but it affects the chlorophyll content of chlorophyll content P14 (N100, 16: 8) of 7.367 mg / L not significantly different from treatment P6 (N25, 24: 0) of 3.339 mg / L and treatment P15 (N100, 24: 0) of 5,665 mg / L. All treatment combinations  show  the  TAG  content  qualitatively  with  Nile  Red  staining.  The  observation  of  fatty  acid profiles with GCMS showed that treatment P14 (N100, 16: 8) contained more varied fatty acids compared to  P1  (N0,  12:12),  P2  (N0,  16:  8),  P8  (N50,  16:  8)  ,  P10  (N75,  12:12)  which  consists  of  lauric  acid, hexanoic acid, palmitic acid, linoleic acid, oleic acid, stearic acid, eicosanoic acid.
Keyword : Nannochloropsis sp., interaction of nitrogen stress and photoperiod, biomass, chlorophyll, fatty acid.

## Abstrak
Biodiesel  adalah  bahan  bakar  alternatif  menjanjikan  yang  diperoleh  dari  minyak  tumbuhan  dan  lemak binatang  melalui  esterifikasi  dengan  alkohol.  Nannochloropsis  sp.  merupakan  mikroalga  laut  penghasil lipid  triasilgliserol  (TAG)  tinggi  (90%)  pada  kondisi  cekaman.  Produksi  lipid  TAG  dan  komposisi  asam lemak  Nannochloropsis  sp.  dapat  direkayasa  dengan  cekaman  abiotik.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk menguji  pengaruh  stres  nitrogen  dan  fotoperiode  terhadap  biomassa,  kandungan  klorofil,  profil  asam lemak,  dan  kandungan  kualitatif  TAG.  Nannochloropsis  sp.  dikultivasi  dari  kultur  starter  kemudian diperlakukan dalam variasi cekaman nitrogen (N100, N75, N50, N25 dan N0) dengan fotoperiode terang :
gelap  (12:12;  16:8  dan  24:0)  sebagai  rancangan  penelitian  acak  lengkap  dua  faktor.  Pengambilan  data semua  parameter  penelitian  dilakukan  pada  tahap  eksponensial  akhir.  Hasil  penelitian  menunjukkan interaksi kedua faktor tidak mempengaruhi biomassa Nannochloropsis sp. tetapi mempengaruhi kandungan klorofil yaitu  kandungan  klorofil  P14  (N100,  16:  8)  sebesar  7.367  mg  /L  tidak berbeda  secara signifikan dengan perlakuan P6 (N25, 24: 0) sebesar 3,339 mg / L dan perlakuan P15 (N100, 24: 0) sebesar 5,665 mg/L. Semua kombinasi perlakuan menunjukkan kandungan TAG secara kualitatif dengan pewarnaan Nile Red.  Hasil  pengamatan  profil  asam  lemak  dengan  GCMS  menunjukkan  perlakuan  P14  (N100,  16:  8) mengandung asam lemak lebih bervariasi dibandingkan dengan P1 (N0, 12:12), P2 (N0, 16: 8), P8 (N50, 16  :  8),  P10  (N75,  12:12)  yang  terdiri  dari  asam  laurat,  asam  heksanoat,  asam  palmitat,  asam  linoleat, asam oleat, asam stearat, asam eikosanoat.
Kata  kunci : Nannochloropsis sp.,  interaksi  cekaman  nitrogen  dan  fotoperiode, biomassa,  klorofil, TAG, asam lemak

## I. Pendahuluan
Krisis  energi  saat  ini  terjadi  karena
tingginya tingkat konsumsi energi
masyarakat meliputi bidang industri, transportasi  dan  rumah  tangga.  Pemenuhan kebutuhan  energi  masyarakat  Indonesia hampir  seluruhnya  berasal  dari  bahan  bakar fosil.  Di  sisi  lain  sumber  energi  fosil  di Indonesia  dan  dunia  pada  umumnya  sangat terbatas  ketersediaannya  saat  ini,  sehingga sumber  energi  alternatif  dibutuhkan  untuk menggantikannya yaitu salah satunya biodiesel  [1].  Biodiesel  dapat  diperoleh  dari minyak bekas, tumbuhan atau lemak binatang melalui  proses  esterifikasi  dengan  alkohol [2].  Bagaimanapun,  sumber  lipid  dari tumbuhan  seperti  minyak  jarak  ( Jatropha curcas ),  minyak  sawit  ( Elaeis  guineensis ) serta  beberapa  lipid  hewani  masih  memiliki kendala  untuk  dikembangkan  sebagai  bahan baku  biodiesel  akibat  adanya  kapasitas oksidasi yang rendah pada temperatur rendah [3] dan kecepatan pertumbuhan tanaman dan hewan  yang  relatif  lambat  [4].  Untuk
mengatasi  keterbatasan  tersebut,  mikroalga atau  fitoplankton  dapat  digunakan  sebagai alternatif  sumber  bahan  baku  biodiesel  [5]. Salah satu mikroalga laut yaitu Nannochloropsis sp.    memiliki  kandungan lipid  mencapai  12.0-53.0  %  per  gram  berat kering  biomassa  akan  tetapi  pada  kondisi cekaman,  kandungan  lipid Nannochloropsis sp.  akan  mampu  mencapai  90  %  per  gram berat  kering  [5];  [6]  ,  sangat  lebih  tinggi dibandingkan kandungan lipid tanaman Jarak sebesar  35  %  per  gram  berat  kering  [7]  dan tanaman sawit sebesar 75.6 % per gram berat kering  [8].  Mikroalga  memproduksi  banyak polyunsaturates  fatty  acid (PUFA),  dimana semakin  tinggi  kandungan  PUFA  akan mengurangi  kestabilan  oksidasi  dan  nilai cetane  biodiesel  yang  dihasilkan.  Di  lain pihak,  PUFA  memiliki  titik  cair  yang  lebih rendah  dibandingkan monounsaturated  fatty acid (MUFA)  dan  asam  lemak  jenuh sehingga biodiesel  dari  mikroalga akan lebih baik  pada  cuaca  dingin  dibandingkan  jenis bahan  baku  alami  yang  lain  [3].  Dengan
demikian diperlukan rekayasa untuk menghasilkan  komposisi  asam  lemak  jenuh dan  asam  lemak  monounsaturated  pada mikroalga  sekaligus  meningkatkan  jumlah triasilgliserol  untuk  menghasilkan  biodiesel yang unggul dalam pemrosesan dan aplikasinya.  Rekayasa  metabolisme  yang dapat menginduksi peningkatan triasilgliserol dan  perubahan  komposisi  asam  lemak  pada mikroalga  antara  lain  cekaman  pengurangan nutrien  berupa  nitrogen  dan  fosfor,  cekaman temperatur,  cekaman  osmotik,  cekaman salinitas  dan  ph,  cekaman  logam  berat, perubahan  intensitas  cahaya,  siklus  terang/ gelap dan paparan radiasi sinar UV dan sinar gamma [9]. Dengan adanya cekaman tersebut maka sel mikroalga akan mengubah kemampuan  pertumbuhan  biomassa  menjadi penyimpanan  lipid  netral  triasilgliserol  yang merupakan  prekursor  dalam  pembuatan biodiesel sebagai bentuk pertahanan terhadap kondisi lingkungan yang tidak ideal [10]. Hal ini  terjadi  sebagai  akibat  perubahan  jalur biosintesis  lipid  yang  mengarahkan  pada pembentukan  dan  akumulasi  lipid  netral dalam bentuk TAG sebagai bentuk pertahanan  pada  kondisi  cekaman  abiotik [11].  Ketika  pertumbuhan  sel  berjalan melambat  karena  keterbatasan  nutrien,  maka kumpulan  akseptor  elektron  utama  pada proses  fotosintesis  yaitu  NADP+  menjadi habis.  Fotosintesis  sendiri  sangat  dikontrol oleh  cahaya  dan  tidak  bisa  dihentikan seketika,  maka  kondisi  habisnya  NADP+
akan  mengakibatkan  situasi  yang  berbahaya bagi  sel  yang  dapat  merusak  komponen  sel. Sehingga  NADPH  akan  dikonsumsi  dari sintesis  asam  lemak  dan  mengakibatkan terjadi  peningkatan  asam  lemak  yang  akan disintesis menjadi TAG menggantikan NADP+  di  kondisi  yang  terbatas  [12]. Cekaman  fotoperiode  dapat  meningkatkan kandungan lipid mikroalga dan mempengaruhi  fotosintesis  dalam  produksi biomassa. Kondisi ketersediaan cahaya dibutuhkan  saat  pembentukan  ATP  dan NADPH, sedangkan kondisi gelap berpengaruh  pada  sintesis  biokimia  meliputi pembentukan  protein,  karbohidrat  dan  lemak [9]. Berdasarkan paparan di atas, maka tujuan dari  penelitian  ini  adalah  menguji  pengaruh kombinasi  perlakuan  cekaman  ketersediaan nitrogen  dan  fotoperiode  terhadap  biomassa, kandungan  klorofil,  kandungan  kualitatif TAG dan profil asam lemak Nannochloropsis sp.

## 1. Metode Penelitian

## 1.1 Tahap persiapan
Kultur Nannochloropsis sp. didapatkan  dari  Laboratorium  Pakan Alami  Balai  Budidaya  Perikanan  Air Payau  (BBPAP)  Situbondo  dengan kepadatan  10 7 sel/mL.  Media  yang digunakan  dalam  kultur  mikroalga Nannochloropsis sp.  adalah  air  laut buatan  [13]  yang  telah  difilter  dan disterilisasi  menggunakan  autoklaf  dan
diatur  kondisi  salinitas  pada  30-32  ppt [14]  ;  [15],  ph  7-8.  Semua  alat  gelas
termasuk selang plastik aerator disetrilisasi dengan menggunakan
autoklaf. Pupuk Conway dibuat
berdasarkan formula  yang dimodifikasi oleh  [16].  Disiapkan  5  jenis  pupuk Conway berdasarkan persentase cekaman  nutrient  nitrogen  (NaNO3) [17] yaitu N100 atau cekaman nitrogen 0%  (100  gram/L),  N75  atau  cekaman nitrogen  25  %  (75  gram/L),  N50  atau cekaman  nitrogen  50  %  (50  gram/L), N25  atau  cekaman  nitrogen  75  %  (25 gram/L) dan N0 atau cekaman nitrogen 100 % (0 gram/L).
1.2 Tahap  penentuan  waktu  starter kultur Nannochloropsis sp.
Waktu  starter  ditentukan  pada setengah  fase  eksponensial  kultur Nannochloropsis sp. yang ditumbuhkan pada  kondisi  medium  tanpa  cekaman yaitu NaNO3 100 % (100 gram/L) [18]. Kultivasi  penentuan  waktu  starter dilakukan  dengan  memasukkan  10% kultur Nannochloropsis sp.  ke  dalam
medium pertumbuhan optimal
Nannochloropsis sp. dengan kondisi ph 7,  salinitas  30  ppt,  fotoperiode  16 terang : 8 gelap dan suhu 28 ˚C. Setiap 24  jam  dilakukan  pengukuran  OD dengan  spektrofotometer  UV  Vis  pada panjang  gelombang  680  nm  yang
direpresentasikan  sebagai  jumlah  sel. Kultivasi dilakukan sampai dengan fase kematian yang ditandai dengan terjadinya  penurunan  nilai  OD  yang terukur.  Hasil  pengukuran  OD  diplot sebagai  sumbu  Y  dan  waktu  dalam satuan  hari  diplot  sebagai  sumbu  X. Dari  grafik  yang  dihasilkan  akan  dapat ditentukan  kapan  waktu  pengambilan starter dilakukan.
1.3 Tahap  penentuan  waktu  panen kultur Nannochloropsis sp.
Waktu panen kultur
Nannochloropsis sp.  ditentukan  pada fase  eskponensial  akhir,  dimana  pada saat  eksponensial  akhir  sel  secara  aktif mengakumulasi  makromolekul  seperti lipid,  karbohidrat  dan  protein  [19]; [20]. Kultivasi dilakukan dengan memasukkan  10  %  kultur  starter Nannochloropsis sp.  Kultivasi  pada penentuan waktu panen dilakukan pada setiap perlakuan dimana secara keseluruhan  terdapat  15  perlakuan  dari kombinasi  faktor  konsentrasi  NaNO3 (N0,  N25,  N50,  N75  dan  N100)  dan faktor  fotoperiode  terang:gelap  (12:12; 16:8  dan  24:0).  Perlakuan  tersebut adalah  perlakuan  P1  (N0,12:12),  P2 (N0,16:8),  P3  (N0,24:0),  P4(N25, 12:12),  P5(N25,  16:8),  P6(N25,  24:0),
P7(N50,12:12), P8(N50, 16:8), P9(N50, 24:0), P10(N75, 12:12),
P11(N75, 16:8), P12(N75, 24:0),
P13(N100, 12:12), P14(N100,16:8) dan P15(N100,24:0).  Setiap  ph  medium perlakuan diatur pada ph 7, salinitas 30 ppt  dan  suhu  ruang  28  ˚C.  Setiap  24 jam  dilakukan  pengukuran  OD  dengan spektrofotometer UV Vis pada panjang gelombang
680 nm yang direpresentasikan  sebagai  jumlah  sel.
Kultivasi dilakukan sampai dengan fase kematian yang ditandai dengan terjadinya  penurunan  nilai  OD  yang terukur.  Hasil  pengukuran  OD  diplot sebagai  sumbu  Y  dan  waktu  dalam satuan  hari  diplot  sebagai  sumbu  X. Dari  grafik  yang  dihasilkan  akan  dapat ditentukan kapan waktu panen dilakukan pada setiap perlakuan.
1.4 Tahap perlakuan
Setelah  diketahui  waktu  starter dan  panen,  tahap  selanjutnya  adalah
perlakuan yang sesungguhnya.
Terdapat  15  perlakuan  sama  seperti perlakuan  tahap  penentuan  waktu panen. Setiap perlakuan diulang
sebanyak  3  kali  sehingga  terdapat  45 unit  percobaan.  Kultivasi  dihentikan sampai waktu panen yaitu fase eksponensial  akhir  yang  didapatkan pada tahap 2.3 pada setiap perlakuan.
1.5 Pengambilan data
Parameter  yang  diamati  dalam penelitian  ini  antara  lain  :  biomassa, kandungan  klorofil,  kandungan  TAG secara  kualitatif  dan  profil  asam  lemak Nannochloropsis sp.  Semua  parameter diambil  pada  masa  panen  yaitu  pada fase  eksponensial  akhir  sebelum  kultur memasuki fase stationer.
a. Parameter biomassa
Analisa biomassa dilakukan dengan menyaring biomassa Nannochloropsis sp. dari 100 ml kultur usia  panen  [21]  ;  [20]  ,  menggunakan kertas  saring  Whatmann  41.  Sebelum digunakan  untuk  menyaring,  kerats saring ditimbang menggunakan timbangan  analitik  untuk  mengetahui berat  kertas  saring.  Kertas  saring bersama biomassa Nannochloropsis sp. selanjutnya  dikeringkan  di  dalam  oven sampai  mencapai  berat  kering  yang konstan.  Selisih  antara  berat  kering kertas saring bersama biomassa dengan berat  kering  kertas  saring  saja  adalah biomassa  [22].  Biomassa  dinyatakan dalam satuan gram/100 ml.
b. Parameter kandungan klorofil Sampel  sebanyak  4  ml  diambil dan  disentrifugasi  pada  4000  rpm selama  5  menit.  Supernatan  diambil dan  sel  dimasukkan  dalam  4  ml  air destilasi  untuk  menghilangkan  garam pada biomassa, kemudian
disentrifugasi.    Pencucian  dalam  air destilasi  dilakukan  2  kali  [23].  Sampel disuspensikan  dalam  4  ml  pelarut etanol,  kemudian  disentrifugasi  selama 10  menit  dengan  kecepatan  3000  rpm [23].  Supernatan  diambil  untuk  diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang
selombang (λ) 645 nm dan 665 nm dan
630 nm. Blanko yang digunakan berupa etanol 96% sebagai pembanding [24].
Perhitungan kadar klorofil menggunakan  rumus  Strickland  and
Parsons [25] :  Klorofil a = 11,6 E665 – 1,31 E645 –0,14 E630 µg/ml
c. Parameter kandungan TAG secara kualitatif
Analisis  kandungan  triasilgliserol secara kualitatif berupa pendaran warna dilakukan  dengan  metode  Nile  Red Fluorometry [26]. Stok Nile Red dibuat denga  cara  melarutkan  1  mg  serbuk Nile  Red  ke  dalam  10  ml  aseton  [27]. Biomassa mikroalga yang akan diwarnai, disiapkan dan diwarnai dalam 0.5 ml larutan Nile Red dan diinkubasi selama  10  menit  dalam  suhu  ruang, selanjutnya dilakukan sentrifugasi dalam  suhu  4˚C  selama  10  menit  pada kecepatan  3000  rpm  [28].  Selanjutnya dilakukan pencucian dengan
menggunakan air distilat dengan bantuan  sentrifuge.  Mikroalga  yang telah  diwarnai  selanjutnya  diamati  di
atas  gelas  obyek  dan  dilakukan pengamatan di bawah mikroskop fluoresense dengan panjang gelombang 450-496  nm  [29]  ;  [30].  Pendaran warna  kuning-  oranye  terang  yang terlihat menunjukkan adanya kandungan  TAG  dalam  sel  mikroalga secara kualitatif [31].
d. Parameter profil asam lemak
Profil  asam  lemak  dilakukan dengan  metode  Gas  Chromatography
Mass
Spectrometry (GC-MS). Biomassa  mikroalga  dikonsentrasikan dengan  sentrifugasi  selama  7  menit pada  5400  rpm.  Biomassa  dikeringkan kemudian  digerus  dengan  mortar  dan pestel.  Ekstraksi  dilakukan  dengan melarutkan 2 gram mikroalga dalam 75 ml  pelarut  n-hexane  [32].    Mikroalga dilarutkan dalam n-hexane dan dimasukkan  dalam  tabung  derivatisasi. Sampel  diuapkan  hingga  kering  dan ditambahkan 1 ml NaOH 2%, kemudian  ditutup  rapat,  divorteks kemudian  dipanaskan  pada  suhu  90 o C selama  5  menit,  kemudian  didinginkan pada  suhu  ruang.  Sampel  ditambahkan 1 ml BF3 dalam metanol, ditutup rapat, divorteks,  dipanaskan  pada  suhu  90 o C selama 30 menit kemudian didinginkan pada suhu ruang. Kemudian ditambahkan  1  ml  n-hexana,  divorteks selama  2  menit  dan  didiamkan  hingga
terbentuk  2  fase  yang  terpisah.  Fasa  n- hexane  (lapisan  atas)  diambil  hingga volume  1  µL  dan  dimasukkan  dalam vial  GC  untuk  dianalisa.  Identifikasi asam lemak dilakukan dengan membandingkan  hasil  puncak  yang muncul  di  kromatogram  GCMS,  asam lemak dihitung dengan membandingkan  luas  puncak  masing- masing komponen asam lemak terhadap  luas  total  dari  keseluruhan puncak  yang  muncul  di  kromatogram GC-MS, dan dinyatakan dalam presentase [33].

## II. Hasil dan Pembahasan
Mikroalga Nannochloropsis sp.  pada penelitian  ini  memiliki  waktu  starter  pada hari  ke-6  berdasarkan  grafik  pertumbuhan (data  tidak  ditampilkan).  Waktu  starter adalah  waktu  dimana  sel  membelah  secara aktif  serta  dapat  melakukan  metabolisme secara  maksimal  sebelum  memasuki  fase stasioner  maupun  kematian  sel  [34]  ;  [18]. Starter  digunakan  sebagai  bibit  untuk pembuatan  kultur  baru  atau  untuk  produksi massal mikroalga [35].
Pada penentuan waktu panen didapatkan waktu panen kultur hari ke-6 pada perlakuan  P1  (N0,  12:12),  P2  (N0,  16:8). Waktu  panen  kultur  hari  ke-8  yaitu  pada perlakuan  P4  (N25,  12:12),  P5  (N25,  16:8). Waktu  panen  kultur  hari  ke-9  yaitu  pada
perlakuan  P7  (N50,  12:12),  P13  (N100, 12:12).  Waktu  panen  kultur  hari  ke-10  yaitu pada  perlakuan  P3  (N0,  24:0),  P6  (N25, 24:0), P8 (N50, 16:8), P10 (N75, 12:12), P11 (N75,  16:8),  P12  (N75,  24:0).  Waktu  panen kultur  hari  ke-11  yaitu  pada  perlakuan  P14 (N100, 16:8). Waktu panen kultur hari ke-12 yaitu  pada  perlakuan  P9  (N50,  24:0),  P15 (N100,  24:0).    Berdasarkan  jumlah  selnya, mikroalga pada perlakuan pemberian nitrogen 100% memiliki nilai OD (pertumbuhan) yang paling tinggi dibandingkan  dengan  kultur  dengan  nitrogen dalam  pupuk  75%,  50%,  25%  dan  0%.  Hal ini  berkaitan  dengan  ketersediaan  nutrisi untuk  tumbuh  serta  ketersediaan  cahaya untuk  fotosintesis  dan  metabolisme  sel lainnya.  Pada  nitrogen  yang  terpenuhi,  sel mikroalga  memiliki  laju  reproduksi  yang tinggi  sehingga  sel  yang  terbentuk  lebih banyak  [21]    yang  ditunjukkan  dengan  nilai OD pada spektrofotometer yang lebih tinggi.
Berdasarkan  hasil  pengamatan  tersebut, pemberian nitrogen mempengaruhi pertumbuhan Nannochloropsis sp.  dimana tanpa pemberian nitrogen dengan fotoperiode gelap yang lebih panjang, kultur Nannochloropsis sp.  memiliki  waktu  panen yang  singkat.  Hal  ini  sesuai  dengan  literatur yang mengatakan bahwa, kekurangan nitrogen pada alga dapat mempersingkat fase eksponensial  alga  tersebut  [36],  sedangkan pemberian nitrogen yang sesuai dan
fotoperiode  dengan  siklus  terang  yang panjang, kultur Nannochloropsis sp. memiliki  waktu  panen  yang  lebih  lama  serta jumlah  sel  yang  lebih  banyak  karena  nutrisi untuk  tumbuh  sel  terpenuhi,  sehingga  sel dapat  membelah  sehingga  ukuran  serta jumlahnya bertambah.
Hasil  pengamatan  terhadap  biomassa menunjukkan bahwa interaksi antara konsentrasi  nitrogen  dan  fotoperiode  tidak berpengaruh  terhadap  biomassa  dikarenakan
faktor  pertumbuhan  mikroalga  meliputi nutrisi,  aerasi,  salinitas,  pH,  suhu  untuk pertumbuhan  dari  mikroalga  tersebut  sesuai, sehingga  mikroalga  memiliki  kemampuan untuk mempertahankan hidup dan regenerasi, walaupun  jumlahnya  lebih  sedikit  [37]. Sedangkan uji statistik satu faktor menunjukkan  bahwa  faktor  pembatasan nitrogen  berpengaruh  terhadap  biomassa Nannochloropsis sp.  Berikut  adalah  diagram hasil penimbangan biomassa Nannochloropsis sp.pada berbagai perlakuan.
Gambar 1. Diagram pengaruh interaksi cekaman nitrogen dan fotoperiode terhadap biomassa Nannochloropsis sp.
Gambar 2. Kultur Nannochloropsis sp. pada saat panen. Keterangan : A. Kultur Nannochloropsis sp. pada perlakuan fotoperiode 12:12. B. Kultur Nannochloropsis sp. pada perlakuan fotoperiode 16:8. C. Kultur Nannochloropsis sp. pada perlakuan fotoperiode 24:0
A
B
C
Gambar 3. Diagram pengaruh interaksi cekaman nitrogen dan fotoperiode terhadap kandungan klorofil a Nannochloropsis sp. Keterangan : Huruf yang sama di atas diagram batang menunjukkan tidak terdapat perbedaan pengaruh perlakuan secara nyata.
Hasil  pengamatan  pengaruh  interaksi cekaman  nitrogen  dan  fotoperiode  terhadap kandungan  klorofil  a Nannochloropsis sp. ditunjukkan pada diagram di atas.
Kandungan  klorofil  berbanding  lurus dengan  kandungan  biomassa  kultur.  Klorofil perlakuan  P14  (N100,  16:8)  tidak  berbeda secara  signifikan  dengan  perlakuan  P15 (N100,  24:0)  dan  P6  (N25,  24:0),  namun berbeda  secara  signifikan  dengan  perlakuan lain.  Pengaruh  pemberian  nitrogen  100% terhadap  klorofil  berbeda  signifikan  dengan pemberian nitrogen 75%, 50%, 25% dan 0%. Berdasarkan  hasil  uji  klorofil  dengan perhitungan  metode  Strickland  and  Parsons (2014),  kandungan  klorofil  tertinggi  yaitu perlakuan nitrogen 100% dengan fotoperiode 16:8  yaitu  7.367143  mg/L  dan  kandungan klorofil  terendah  yaitu  perlakuan  kombinasi nitrogen  0%  dan  fotoperiode  16:8  sebesar
0.480073  mg/L.  Interaksi  atara  nitrogen  dan fotoperiode  ini  berpengaruh  dalam  proses pembentukan klorofil dimana nitrogen berperan  dalam  sintesis  asam  glutamat sebagai prekursor pembentuk klorofil, sedangkan cahaya berpengaruh dalam aktivasi  enzim philida  reductase yang berfungsi dalam pengubahan protoklorofilida menjadi  klorofilida  sehingga  dihasilkan klorofil  [38].  Konsentrasi  nitrogen  yang rendah menghambat sintesis protein, sehingga  apabila  terjadi  kekurangan  unsur nitrogen  akan  menyebabkan  penurunan kandungan protein, terjadi degradasi komponen sel yang berkaitan dengan sintesis protein  termasuk  klorofil  serta  terjadi gangguan  in  vivo  pada  klorofil  serta kloroplas  [39].  Fotoperiode  mempengaruhi proses  pembentukan  klorofil  dimana  cahaya berperan  dalam  aktivasi  induksi  gen  HSP70
yang  berperan  dalam  penjagaan  aktivitas fotosistem  II  dari  kerusakan  fotoinhibitor, aktivasi  gen  ini  menstimulasi  Mg-Proto  dan MgProtoMe  menjadi  dapat  terakses  di  sisi sitoplasmik dari kloroplas. Cahaya memediasi  peningkatan  prekursor  klorofil  di sitoplasma [38].
Pengamatan pengaruh interaksi cekaman  nitrogen  dan  fotoperiode  terhadap kandungan  TAG  secara  kualitatif  dengan pewarnaan  Nile  Red,  menunjukkan  adanya pendaran warna merah hingga kuning-oranye pada berbagai perlakuan. Hal ini menunjukkan terdapat respon berupa kandungan kualitatif TAG yang berbeda beda pada  sel  mikroalga Nannocchloropsis sp. yang  diperlakukan  berbeda  beda.    Berikut adalah  hasil  pengamatan  pendaran  warna  sel Nannochloropsis sp.  dengan  pewarnaan  Nile Red.
Nile  Red  berfungsi  untuk  mendeteksi adanya  TAG  intraseluler  sel  mikroalga, warna  orange  menandakan  kandungan  TAG dalam  mikroalga  dalam  jumlah  sedikit sedangkan warna kuning menandakan kandungan  TAG  dalam  sel  mikroalga  dalam jumlah banyak. Apabila sel tidak mengandung lipid maka warna yang terpendar  adalah  warna  merah  karena  emisi dari  klorofil  [40].  Berdasarkan  pengamatan tersebut,  pada  perlakuan  interaksi  cekaman nitrogen dan fotoperiode kultur Nannochloropsis sp.  yang  terdiri  dari  P1 sampai  P15  mengandung  TAG.  Hal  ini
dikarenakan pada dasarnya mikroalga mensintesis  lipid  membran  dan  asam  lemak sebagai  ester  gliserol,  sementara  di  bawah kondisi  tercekam  sebagian  besar  mikroalga menyesuaikan metabolisme dengan pembentukan  dan  akumulasi  lipid  dalam bentuk  triasilgliserol.  Triasilgliserol  (TAG) disimpan  di  sitosol  sebagai  cadangan  energi dan sumber karbon.
Pada  saat  kekurangan  nitrogen  sebagai sebuah  cekaman,  siklus  glikoksilat  dan glukoneogenesis  terhambat  dan  ketersediaan asetil-KoA  untuk  sintesis  lemak  meningkat. Konsumsi  asetat  terjadi  karena  adanya peningkatan  aktivitas  dalam  asetil  KoA sintase  dan  pengalihan  produk  menjadi sintesis  TAG  karena  sintesis  pati  terhambat [41].  Selain  nutrisi  berupa  nitrogen,  faktor yang  mempengaruhi  produksi  TAG  yaitu faktor  fisika  berupa  cahaya/fotoperiode. Cahaya  digunakan  sebagai  sumber  energi untuk  fotosintesis  dengan  mengkonversi karbondioksida dan air menjadi gula, dimana gula dapat  terderivatisasi  menjadi  TAG [42]. Cekaman  fotoperiode  dapat  meningkatkan panen  lipid  mikroalga  serta  mempengaruhi fotosinteis  untuk  produksi  biomassa,  kondisi terang  dibutuhkan  dalam  fase  fotokimia pembentukan  ATP  dan  NADPH  sedangkan kondisi  gelap  mempenguhi  sintesis  biokimia molekul untuk pertumbuhan meliputi pembentukan  protein,  karbohidrat  dan  lemak [9].  Kondisi  cekaman  lingkungan  tersebut juga dapat menurunkan kecepatan
pembelahan  sel,  sel  akan  merangkai  asam lemak  menjadi  lipid  simpanan  berupa triasilgliserol  untuk  mengisi  ketersediaan NADP+  karena  saat  nutrisi  atau  lingkungan tercekam,  NADP+  mengalami  penurunan sehigga  NADPH  yang  dihasilkan  dari fotosintesis  dikonsumsi  untuk  pembentukan asam lemak [12].
Analisis  profil  asam  lemak  dilakukan pada  perlakuan  P14  (N100,  16:8),  P2  (N0, 16:8)  dan  P8  (N50,  16:8)  berdasarkan  hasil perhitungan dari biomassa tertinggi, terendah,  dan  biomassa  median  kultur Nannochloropsis sp.  Selain  itu  pengujian dilakukan pada perlakuan P1 (N0, 12:12) dan P10  (P75,  12:12)  berdasarkan  pendaran  dari pewarnaan  TAG  dengan  Nile  Red  yang menghasilkan warna kuning yang menunjukkan kandungan TAG pada sel yang tinggi. Berdasarkan hasil pengamatan,
Nannochloropsis sp.  mengandung  2  jenis asam  lemak  yaitu  asam  lemak  jenuh ( saturated  fatty  acid )  yang  terdiri  dari  asam laurat  (C12:0),  asam  stearate  (C18:0),  asam palmitat  (C16:0),    asam  eikosanoat  (C20:0)
dan  asam  lemak  tak  jenuh  ( unsaturated  fatty acid )  tunggal  yang  terdiri  dari  asam  oleat (C18:1)  serta  asam  lemak  tak  jenuh  ganda yaitu asam linoleat (C18:2), asam heksadecatrionat (C16:3) [43].
Hasil pengamatan pada semua perlakuan, Nannochloropsis sp.  mengandung asam  palmitat,  sedangkan  asam  laurat,  asam stearat  dan  asam  eikosanoat  hanya  terdapat pada  perlakuan  P2  (N0,  16:8).  Berdasarkan total  presentase  normalisasi,  asam  palmitat tertinggi  terdapat  pada  perlakuan  P2  (N0, 16:8),  presentase  terendah  pada  P10  (N75, 12:12).  Berdasarkan  hasil  tersebut,  pada berbagai  perlakuan  dapat  digunakan  sebagai bahan  biodiesel  karena  mengandung  asam lemak  dengan  rantai  C16-C18  seperti palmitat  yang  memiliki  karakter  dapat meningkatkan  stabilitas  oksidatif,  melumasi mesin  dan  mempengaruhi  viskositas  dalam pembakaran [44].
Hasil  retensi  waktu  serta  presentase komposisi  berbagai  jenis  asam  lemak  pada kromatogram hasil GC-MS, ditunjukkan pada tabel 1.
Gambar 4. Pendaran warna sel Nannochloropsis sp. dengan pewarnaan Nile Red pada perbesaran 100x. A. Sel Nannochloropsis sp. pada perlakuan P1(N0,12:12). B. Sel Nannochloropsis sp. pada perlakuan P3 (N0, 24:0). C. Sel Nannochloropsis sp. pada perlakuan P6 (N25, 24:0). D. Sel Nannochloropsis sp. pada perlakuan P10 (N75,12:12).
A B C D
A

## B
Gambar 5. Kromatogram profil asam lemak kultur Nannochloropsis sp.
A. Kultur Nannochloropsis sp. perlakuan
P1 (N0,12:12) B. Kultur Nannochloropsis sp. perlakuan
P2 (N0,16:8) C. Kultur Nannochloropsis sp. perlakuan
P8 (N50,16:8) D. Kultur Nannochloropsis sp. perlakuan
P10 (N75,12:12) E. Kultur Nannochloropsis sp. perlakuan P14 (N100,16:8) Keterangan : A. Methyl ester dodecanoic acid
(C12:0),B. Methyl ester 7,10,13- Hexadecatrienoic acid (C16:0),C. Asam Palmitat (C16:1), D. Asam Linoleat (C18:2),E. Asam Oleat (C18:1), F. Asam Stearat (C18:0),G Methyl ester Eicosanoic acid (C20:0)
C D

## E

## Tabel 1. Presentase Normalisasi Asam Lemak
Retensi Waktu Komponen % Normalisasi P1 N0,12:12 P2 N0, 16:8 P8 N50, 16:8 P10 N75, 12:12 P14 N100, 16:8 1.82 Asam Laurat - 1.18% - - - 3.69 Asam Heksadekatrionat - 8.99% 13.38% - 13.05% 4.02 Asam Palmitat 28.55% 30.53% 26.87% 15.77 % 17.30% 6.13 Asam Linoleat 8.34% 30.53% 10.47% - 10.19% 6.26 Asam Oleat 31.29% 29.75% 27.31% - 20.74% 6.7 Asam Stearat - 6.90% - - - 12.08 Asam Eikosanoat - 1.26% - - - Asam  lemak  yang  terbentuk  pada perlakuan P2 (N0, 16:8) bervariasi dikarenakan  nitrogen  sebagai  unsur  makro pertumbuhan sel jumlahnya terbatas sehingga sel  mikroalga  mengubah  jalur  biosintesis karbohidrat  menjadi  pembentukan  asam lemak [12]. Hal ini berkorelasi positif dengan hasil perhitungan biomassa dimana biomassa terendah  terdapat  pada  perlakuan  P2  (N0, 16:8)  sebesar  0.0658  gram/100  ml  dan menghasilkan  jenis  asam  lemak  yang  lebih bervariasi,  hal  ini  sesuai  dengan  penelitian yang menyebutkan bahwa perlakuan cekaman nitrogen dapat meningkatkan produksi  lipid  yang  lebih  tinggi  [45];  [16] karena  protein  dari  mikroalga  terpecah menjadi  Asetil-KoA  yang  berperan  dalam pembentukan  lipid  [44].  Asam  lemak  yang diproduksi  dalam  sel  merupakan  bentuk pertahanan  sel  terhadap  cekaman  yang diterima oleh sel mikroalga tersebut.
Mikroalga Nannochloropsis sp. mengandung  banyak  jenis  asam  lemak
omega-3.  Asam  lemak  alami  yang  termasuk asam  lemak  omega-3  adalah  asam  linoleat (C18),  asam  eikosapentaenoat  atau  EPA (C20)  dan  asam  dekosaheksanoat  atau  DHA (C22:6)  serta  asam  arachidoneat  atau  AA (C20)  [44].    Namun  pada  perlakuan  P10 (N75,  12:12)  tidak  mengandung  asam linoleat, pada P1 (N0, 12:12), P2 (N0, 16:8), P8  (N50,  16:8)  dan  P14  (N100,  16:8)  tidak mengandung  asam  eikosanoat,  hal  ini berkaitan dengan respon gen pengkode  asam lemak  serta  enzim  pembentuk  asam  lemak tersebut pada sel mikroalga terhadap kombinasi  nitrogen  dan  fotoperiode  yang diberikan.  Pemberian  cekaman  nitrogen  dan fotoperiode  menyebabkan  sintesis  asam lemak  dalam  sel  bertambah,  namun  jenis asam  lemak  yang  terbentuk  ditentukan  oleh enzim-enzim  yang  terlibat  dalam  mekanisme biosintesis tersebut.

## III. Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa interaksi
antara  nitrogen  dan  fotoperiode  tidak berpengaruh
terhadap biomassa
Nannochloropsis sp.  namun  berpengaruh terhadap kandungan klorofil dimana kandungan  klorofil  perlakuan  P14  (N100, 16:8)  sebesar  7,367  mg/L  tidak  berbeda signifikan  dengan  perlakuan  P6  (N25,  24:0) sebesar  3,339  mg/L  dan  perlakuan  P15
(N100, 24:0) sebesar 5,665 mg/L
Berdasarkan  uji  kualitatif  Nile  Red,  semua perlakuan mengandung triasilgliserol (TAG). Pada  uji  GC-MS,  perlakuan  P2  (N0,  16:8) mengandung  7  jenis  asam  lemak  baik  asam lemak jenuh maupun tak jenuh.

## Daftar Pustaka
[1]  Setiaji,  S.,  Nila,  T.B.,  Tety,  S.,  Eko,  P., Bebeh, W.N. 2017. Alternatif Pembuatan
Biodisel Melalui Transesterifikasi Minyak  Castor  (Ricinus  communis) Menggunakan Katalis Campuran
Cangkang  Telur  Ayam  dan  Kaolin. Jurnal  Penelitian  dan  Pengembangan Ilmu Kimia, Vol. 3 (1): 1-10.
[2] Gerpen, J.V. and Knothe, G.. 2005.   The Biodiesel  Handbook.  Champaign  :  Aocs Press.
[3]  Prakoso,  T.,  Udomsap,  P.,  Tanaka,  A., Hirostu, T., Goto,
S. 2012. Characteristics  of  Oxidative  Storage Stability  of  Canola  Fatty  Acid  Methyl
Ester Stabilised with Antioxidant. Journal ITB. Eng. Sci, Vol. 4: 303-318.
[4] Maharsyah, T., Musthofa, L., Wahyunato, A.N.  2013.  Efektivitas  Penambahan Plant  Promoting  Bacteria  (Azospirillum sp)  dalam  Meningkatkan  Pertumbuhan Mikroalga  (Chlorella  sp)  Pada  Media Limbah  Cair  Tahu  Setelah  Proses Anaerob.  Jurnal  Keteknikan  Pertanian Tropis  dan  Biosistem,  Vol.  1  (3):  258- 264.
[5]  Kwangdinata,  R.,  Indah,  R.,  Zakir,  M. 2013.  Produksi  Biodiesel  dari  Lipid Fitoplankton Nannochloropsis sp. Melalui Metode Ultrasonik. Jurnal Marina  Chimica  Acta,  Vol.  14  (2):  29- 36.
[6] Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S., 2010.Microalgae for Biodiesel Production  and  Other  Applications:  A Review,  Renew.  Sustainable  Energy Rev, Vol. 14: 217-232.
[7]  Alamsyah,  R.,  Enny,  H.L.,  Siregar,  N.C. 2011.  Esterifikasi-Transesterifikasi  Dan Karakterisasi  Mutu  Biodiesel  Dari  Biji Jarak  Pagar  (Jatropha  curcas  Linn).  J. Kimia Kemasan, Vol. 33 (1): 124-130.
[8]  Arita,  S.,  Attaso,  K.,  Rangga,  S.  2013. Pembuatan Biodiesel Dari Minyak Kelapa  Sawit  dengan  katalis  CaO Disinari  Dengan  Gelombang  Mikro. Jurnal Teknik Kimia, Vol. 19 (4): 45-52.
[9]  Gammanpila,  A.M.,  Rupasinghe,  C.P., Subasinghe.  2015.  Light  Intensity  and Photoperiode  Effect  On  Growth  And Lipid  Accumulation  Of  Microalgae
Chlorella Vulgaris And Nannochloropsis sp. For Biodiesel
Production.
Proceedings of 12th ISERD International Conference: 51-55.
[10] Sharma, A. K., Schuhmann, H., Schenk, P.M.  2012.  High  Lipid  Induction  in Microalgae  for  Biodiesel  Production. Energies.5. 1532-1553
[11]  Schuhmann,  H.,  Lim,  D.  K.Y.,  Schenk, P.  M.,  2011.  Perspective  on  Metabolic engineering  for  increased  lipid  contents in microalgae. Biofuels. 3. 71-86
[12]  Hu,  Q.,  Milton,  S.,  Eric,  J.,  Maria,  G., Matthew,  P.,  Michael  S.,  Darzins,  Al. 2008.  Microalgal  Tryacylglycerols  as Feedstock for Biofuel Production: Perpectives and and Advances. The Plant Journal, Vol. 54: 621-639.
[13]  Nisak,  K.,  Rahardja,  B.S.,  Masithah, E.D. 2013. Studi Perbandingan
Kemampuan  Nannochloropsis  sp.  Dan Chlorella sp. Sebagai Agen Bioremidiasi Terhadap  Logam  Berat  Timbal  (Pb). Jurnal  Ilmiah  Perikanan  dan  Kelautan,
Vol. 5 (2): 175-180.
[14]  Fogg,  G.E.  1987.  Algal  Cultured  and Phytoplankton Ecology. 2nd ed. Wisconsin: The University of Wisconsin Press.
[15] Endrawati, H., Riniatsih, I. 2013. Kadar
Total  Lipid  Mikroalga  Nannochloropsis oculate yang Dikultur Dengan Suhu yang Berbeda.  Buletin  Oseanografi  Marina Januari, Vol. 1: 25-33.
[16] Widianingsih., Retno, H., H. Endrawati.,
Valentina,  R.  Iriani.  2012.  Kandungan Lipid  Total  Nannochloropsis  oculate pada Kultur dengan Berbagai
Fotoperiode.  Jurnal  Ilmu  Kelautan,  Vol. 17 (3): 119-124.
[17]  Yanti,  N.,  Muhaemin,  M.,  Hudaidah,  S. 2014.  Pengaruh  Salinitas  Dan  Nitrogen Terhadap  Kandungan  Protein  Total Nannochloropsis  sp.  Jurnal  Rekayasa Dan  Teknologi  Budidaya  Perairan,  Vol. 2 (2): 273-278.
[18] Widayat, H. 2015. Pemanfaatan Limbah Cair  Industri  Tahu  Untuk  Produksi Biomassa Mikroalga Nannochloropsis sp Sebagai  Bahan  Baku  Biodiesel.  Jurnal Reaktor, Vol. 15 (4): 253-260.
[19]  Duong,  V.T.,  Li,  Y.,  Nowak,  E.,  and Schenk,  M.  2012.  Microalgae  Isolation and  Selection  for  Prospective  Biodiesel Production. Energies 5: 1835-1849.
[20]  Safitri,  M.E.,  Diantari,  R.,  Suparmono., Muhaemin, M. 2013. Kandungan Lemak Total Nannochloropsis sp Pada Fotoperiode Yang Berbeda. Jurnal Rekayasa  dan  Teknologi  Budidaya Perairan, Vol. 1 (2): 127-134.
[21]  Panggabean,  L.,  Sutomo.,  Radini,  N., Afdal.  2011.  Mikroalga  Laut  Sebagai Produsen Biodiesel.Pusat Penelitian
Oseanografi Lembaga  Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI)
[22]  Mahdi,  M.Z.,  Titisari,  Y.N.,  Hadiyanto. 2012.  Evaluasi  Pertumbuhan  Mikroalga
Dalam  Medium  Pome:  Variasi  Jenis
Mikroalga, Medium Dan Waktu
Penambahan  Nutrisit.  Jurnal  Teknologi Kimia dan Industri, Vol. 1 (1): 284-291.
[23]  Henriques,  M.,  Silva,  A.,  Rocha,  J. 2007.  Extraction  and  Quantification  of Pigments  from  a  Marine  Microalga:  A Simple and Reproducible Method. FORMATEX: 586-593.
[24]  Pratama,  A.J.,  Laily,  A.N.  2015. Analisis  Kandungan  Klorofil  Gandasuli
(Hedychium  garderianum  Shephard  ex
Ker-Gawl) pada Tiga Daerah Perkembangan  Daun  yang  Berbeda. Seminar Nasional Konservasi dan Pemanfaatan  Sumber  Daya  Alam:  216- 219.
[25]  Sartika.,  Mukarlina.,  Tri,  R.S.  2014.
Kandungan Klorofil dan Lipid Nannochlorosis  oculate  yang  Dikultur dalam  Media  Limbah  Cair  Karet.  Jurnal Probiont, Vol. 3 (3): 25-30.
[26] Liu, X. 2014. Quantitative
Determination  of  Lipid  Analysis  Using Nile Red Fluorometry. Thesis of Applied Science Master. Faculty of Graduate and Postdoctoral  Studies  Chemical  and
Biological Engineering. Kanada: University of Otawa.
[27]  Storms,  Z.J.,  Cameron,  E.,  Siegler,  H., McCaffrey,  W.  2014.  A  Simple  and Rapid  Protocol  for  Measuring  Neutral Lipids in Algal Cells Using
Fluorescence.  Journal  of  Visualized
Experiment, Vol. 87: 1-7. [28] Pratiwi, S., Nurhidayati, T.,
Ermavitalini.  D.,  and  Muhibbudin,  A. 2015.  The  Influences  of  Physiological Stress  from  Silicon  (Si)  Nutrien  toward Total  Lipid  Content  at  Skeletonema. Journal  of  Applied  Environmental      and Biological Sciences. Vol 5(11): 68-71.
[29]  Matsunaga,  T.,  Matsumoto,  M.,  Maeda, Y.,  Sugiyama,  H.,  Sato,  R.,  Tanaka,  T. 2009. Characterization of Marine Microalgae,  Scenedesmus  sp.  strain JPCCGA0024 toward Biofuel
Production,”  Biotechnol.  Let,  Vol.  31: 1367-1372.
[30]  Elumalai,  S.,  Prakasam,  V.,  Selvajaran, R.  2011.  Optimization  of  Abiotic Condition Suitable for The Production of Biodiesel from Chlorella vulgaris. Indian Journal of Sci. and Tech, Vol. 4: 91-97.
[31] Cooksey, K.E., Guckert, J.B., Williams, S.A.,  Collis,  P.R.  1987.  Fluorometric Determination  of  The  Neutral  Lipid Content  of  Microalgal  Cells  Using  Nile Red. Journal of Microbiol Methods, Vol. 6: 333-345.
[32] Hurtado, D.X., Castro, C.L.G., Romero, J.C.,  Camacho,  E.T.  2018.  Comparison of  Lipid  Extraction  Methods  for  The Microalgae  Acutodesmus  obliquus.  Int. J.  Agric  &  Biol  Eng,  Vol.  11  (5):  211- 217.
[33]  Astuti,  J.T.,  Sriwuryandari,  L.  2011. Biodiesel  Dari  Mikroalga:  Perbanyakan Biomassa  Melalui  Penambahan  Nutrisi Secara Bertahap. Bionatura, Jurnal Ilmu- Ilmu Hayati dan Fisik, Vol. 12 (3): 160- 168.
[34]  Agustin,  N.W.S.,  Afriastini,  M.,  Yoana, M.  2012.  Potential  of  Fatty  Acid  from Microalgae Nannochloropsis sp as Antioxidant  and  Antibacterial  (Thesis).
Jakarta: Institut Sains Teknologi Nasional.
[35]  Perumal,  P.,  Prasath,  B.B.,  Santhanam, P.,  Ananth,  S.,  Devi,  A.S.,  Kumar,  S.D. 2012. Isolation and Culture of Microalgae  :  Workshop  on  Advances  in Aquaculture  Technology.  Tamil  Nadu: Bharathidasan University.
[36] Muhaemin, M., Practica, F., Dona, R.S., Agustina, T. 2014. Starvasi Nitrogen dan Pengaruhnya  Terhadap  Biomassa  dan
Protein Total Nannochloropsis sp. Maspari Journal, Vol. 6 (2). 98-103.
[37]  Darsi,  R.,  Supriadi,  A.,  Sasanti,  A.D. 2012. Karakteristik Kimiawi dan Potensi Pemanfaatan Dunaliela salina dan Nannochloropsis  sp.  Jurnal  Fishtech, Vol. 1 (1): 14-25.
[38] Kropat, J., Oster, U., Rudiger, W., Beck, C.F.  1997.  Chlorophyll  Precursors  are Signals  of  Chloroplast  Origin  Involved in  Light  Induction  of    Nuclear  Heat- Shock  Genes.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci. USA, Vol. 94: 14168-14172.
[39]    Chrismadha,  T.,Panggabean,  L.M.,
Mardiati, Y. 2006. Pengaruh Konsentrasi Nitrogen Dan Fosfor Terhadap Pertumbuhan, Kandungan Protein,
Karbohidrat  Dan Fikosianin Pada Kultur Spirulina fusiformis. Berita Biologi, Vol. 8 (3):163-169.
[40] Halim, R., Webley, P.A. 2015. Nile Red Staining  for  Oil  Determination  in Microalgal Cells: A New Insight through Statistical Modelling. International Journal  of  Chemical  Engineering,  Vol. 2015: 1-14.
[41]  Goncalves,  E.C.,  Wilkie,  A.C.,  Kirst, M., Rathinasabapathi, B. 2016.
Metabolic  Regulation  of  Triacylglycerol Accumulation  in  The  Green  Algae: Identification  of  Potential  Targets  for Engineering  to  Improve  Oil  Yield.  Plant Biotechnology  Journal,  Vol.  14:  1649- 1660.
[42]  Cagliari,  A.,  Margis,  R.,  Maraschin, F.S.,  Loss,  G.,  Pinheiro,  M.M.  2011. Biosynthesis of Triacylglycerols (TAGs) in Plant and Algae. International Journal of Plant Biology, Vol. 2 (10): 40-52.
[43] Widianingsih., Retno, H., Hadi, E., Jane, M.  2013.  Fatty  Acid  Composition  of Marine Microalgae in  Indonesia. Journal Of  Tropical  Biology  and  Conservation, Vol. 10: 75-82.
[44] Ma, X. N., Chen, T.P.,  Liu, B.Y., Feng, C. 2016. Lipid Production from
Nannochloropsis.  Journal  Mar.  Drugs, Vol. 14 (61): 1-18.
[45]  Nur,  M.M.A.  2014.  Potensi  Mikroalga sebagai  Sumber  Pangan  Fungsional  di Indonesia. Jurnal Eksergi, Vol. XI (2): 1- 6.
[45] Widianingsih., Retno, H., H. Endrawati.,
Valentina,  R.  Iriani.  2012.  Kandungan Lipid  Total  Nannochloropsis  oculate pada Kultur dengan Berbagai
Fotoperiode.  Jurnal  Ilmu  Kelautan,  Vol.
17 (3): 119-124.