Cite this Sari, T.S., Kusumawati, I. and Isnaeni, I. (2023) 'Color Stability and Antioxidant Activity of Red Roselle ( Hibiscus Sabdariffa L.) Calyx Infuse', Berkala Ilmiah Kimia Farmasi , 10(2), pp. 36-41. DOI: 10.20473/bikfar.v10i2.51706.
Copyright: ©2023 by the authors. Submitted for possible open-access publication under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International (CC BY-SA) license
Color Stability and Antioxidant Activity of Red Roselle ( Hibiscus Sabdariffa L.) Calyx Infuse
Stabilitas Warna dan Aktivitas Antioksidan Infusa Kelopak Bunga Rosela Merah ( Hibiscus sabdariffa L.)
Trisiyana Sholika Sari 1) , Idha Kusumawati 2) * , Isnaeni Isnaeni 3)
1 Study Program of Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
2 Department of Pharmaceutical Science, Faculty of Pharmacy, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
3 Study Program of Pharmacy, Faculty of Health Science, Universitas Muhammadiyah Surabaya, Surabaya, Indonesia
*Corresponding author E-mail: idha-k@ff.unair.ac.id
Article History:
Received: November 17, 2023; Revised: November 21, 2023; Accepted: November 30, 2023; Online: November 30, 2023

## ABSTRACT
The roselle flower ( Hibiscus sabdariffa L.), was known as a potential functional food source because of its antioxidant and antibacterial properties. Apart from that, it was also used as a natural dye because of its red color. Antioxidant compounds in roselle flowers included neo-chlorogenic acid, chlorogenic acid, crypto- chlorogenic acid, routine, and isoquercitrin. The high content of these antioxidant compounds often causes color instability. For this reason, this research would analyzed the effect of temperature and long storage on  color  changes  and  the  antioxidant  activity  of  a  red  roselle  flower  infusion.  Storage  conditions  were carried out with three temperature variations, namely cold temperature (2–8℃), cool temperature (8–15℃), and room temperature (15–30℃), with a long storage of 8 days. The stability parameters used were color changes  and  activity  as  an  antioxidant.  Color  changes  were  measured  using  a  chromameter,  while  the antioxidant activity was measured by the IC 50 value using the DPPH method. The principle of this method was based on a purple color change reaction, which faded, and then the inhibitory intensity against DPPH was  measured  using  UV-Vis  spectrophotometer.  It  was  found  that  the  color  values  had  significant differences visible from the first day storage at the room temperature (30℃), cool temperature (11℃), and cold temperature (6℃). Thus, there was an influence of temperature and long storage on the color change of boiled red roselle flower calyx. A significant decrease in activity  was seen on the first day storage at room temperature (30℃) and third day storage at cool temperature (11℃). Meanwhile, at cold temperatures (6℃), there was no significant effect on the reduction in activity from boiling red roselle flower calyx for up to 8 days of storage.
Keywords:  Red Rosela, Stability, Infuse, Color, Antioxidant

## ABSTRAK
Bunga rosela ( Hibiscus sabdariffa L). memiliki potensi sebagai sumber bahan pangan fungsional, karena berkhasiat sebagai antioksidan dan antibakteri. Selain itu, kelopak bunga rosela merah juga dimanfaatkan sebagai zat pewarna alami, karena warnanya  yang  merah. Senyawa antioksidan dari bunga rosela antara lain  asam  neo  klorogenat,  asam  klorogenat,  asam  kripto  klorogenat,  rutin,  dan  isoquercitrin.  Tingginya kandungan  senyawa  antioksidan  ini  seringkali  menyebabkan  ketidakstabilan  pada  warna.  Penelitian  ini akan  menganalisis  pengaruh  suhu  dan  lama  penyimpanan  terhadap  perubahan  warna  dan  aktivitas antioksidan infusa kelopak bunga rosela merah. Kondisi penyimpanan dilakukan dengan tiga variasi suhu yaitu  suhu  dingin  (2-8℃),  sejuk  (8-15℃),  dan  kamar  (15-30℃)  dengan  lama  penyimpanan  8  hari. Parameter  stabilitas  yang  digunakan  adalah  perubahan  warna  dan  aktivitasnya  sebagai  antioksidan. Perubahan warna diukur menggunakan chromameter sedangkan aktivitas antioksidan menggunakan nilai IC 50 dengan metode DPPH. Prinsip metode ini adalah terjadinya reaksi yang ditandai dengan perubahan warna ungu, kemudian diukur daya inhibisi terhadap DPPH yang  terukur menggunakan data absorbansi pada  spektrofotometer  UV-Vis.  Dari  penelitian  ini  diketahui  bahwa  nilai  warna  memiliki  perbedaan bermakna terlihat sejak hari pertama penyimpanan di suhu ruang (30℃), suhu sejuk (11℃), dan suhu dingin (6℃). Ditemukan ada pengaruh suhu dan lama penyimpanan terhadap perubahan warna infusa kelopak bunga  rosela  merah.  Penurunan  aktivitas  secara  bermakna  terlihat  pada  hari  ke-1  penyimpanan  di  suhu ruang (30℃), dan hari ke-3 penyimpanan di suhu sejuk (11℃). Pada suhu dingin (6℃), penyimpanan tidak menyebabkan  penurunan  aktivitas  antioksidan  infusa  kelopak  bunga  rosela  merah  yang  bermakna  dari infusa kelopak bunga rosela merah hingga 8 hari.
Kata kunci: Bunga Rosela Merah, Stabilitas, Infusa, Warna, Antioksidan

## PENDAHULUAN
Rosela  ( Hibiscus  sabdariffa L.)  adalah  tumbuhan yang  termasuk  dalam  famili Malvaceae, dibudidayakan secara luas di seluruh negara tropis dan sub tropis seperti Sudan, Cina, Thailand, Mesir, Meksiko, India, Indonesia, dan  Malaysia  (Dhar et  al .,  2015).  Tingginya  nilai kemanfaatan tanaman rosela disebabkan karena kandungan  senyawa  fitokimia  alami  yang  potensial  di seluruh  bagian  tanaman,  utamanya  pada  kelopak  bunga rosela.  Komponen  fitokimia  potensial  tersebut  meliputi fenol, alkaloid, tannin, flavonoid, saponin, asam organik, antosianin,  dan  polisakarida  (Da-Costa-Rocha et  al ., 2014). Kelopak bunga rosela mengandung antosianin dalam jumlah  tinggi,  terutama  delphinidin  3-O-sambubiosida dan  cyanidin  3-O-sambubiosida  (Juliani et  al., 2009). Studi  penelitian  telah  menunjukkan  adanya  aktivitas antosianin  kelopak  bunga  rosela  sebagai  antioksidan (Mozaffari-Khosravi et  al .,  2009;  Yang et  al .,  2010), antibakteri,  antiinflamasi,  dan  aktivitas  lain  yang  terkait (Christian et al., 2006; Kouakou et al., 2010; Dhar et al ., 2015;  Zhen et  al .,  2015).  Rosela  di  masyarakat  lebih sering  digunakan  sebagai  minuman  seperti  teh,  dan dipasarkan  dalam  bentuk  kering  kemudian  diseduh  atau dalam bentuk minuman siap konsumsi.
Penjaminan stabilitas sediaan penting untuk menjaga persyaratan  mutu,  keamanan  dan  efektivitas.  Stabilitas merupakan kunci efektivitas dan toksisitas suatu produk. Stabilitas  didefinisikan  sebagai  jaminan  obat  yang  telah dipasarkan, disimpan dan digunakan dengan cara tertentu, namun  memiliki  sifat  dan  karakteristik  yang  sama  saat sediaan tersebut dibuat (FDA, 2016).
Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi stabilitas antosianin, di antaranya faktor eksternal seperti pH, suhu, cahaya,  oksigen,  ion  logam  dan  faktor  internal  seperti reaksi  enzimatik  (Sharara,  2017).  Antosianin  yang terdegradasi  menjadi  tidak  stabil  secara  fisika,  secara organoleptik  perubahan  dapat  diamati  seperti  warna, secara  kimia  terjadi  penurunan  kadar  senyawa  yang berdampak  pada  penurunan  efektivitas  produk.  Menurut penelitian  diketahui  adanya  degradasi  termal  terhadap senyawa antosianin dari rosela pada suhu 100℃ (Djaeni, 2017).
Kondisi  penyimpanan  menjadi  salah  satu  faktor penting  untuk  mempertahankan  kualitas  kandungan senyawa aktif dalam ekstrak selama umur simpan. Umur simpan suatu produk dapat didefinisikan sebagai periode penyimpanan pada kondisi yang ditetapkan dalam kondisi stabil  terkait  dengan  stabilitas  kimia,  fisik,  dan mikrobiologi. Tanggal kedaluwarsa biasanya ditunjukkan pada  produk  untuk  menunjukkan  akhir  masa  simpan. Kondisi dan waktu penyimpanan yang direkomendasikan oleh produsen berdasarkan studi pengujian stabilitas dapat menjamin  bertahannya  kualitas,  kemanan,  dan  khasiat selama umur simpan sediaan.
Pengujian stabilitas melibatkan serangkaian pengujian  yang  didesain  untuk  menyediakan  bukti kualitas  obat  di  bawah  pengaruh  lingkungan  yang bervariasi  (ASEAN  Guidlines,  2017).  Tujuan  pengujian stabilitas  adalah  untuk  mendapatkan  dasar  penentuan kualitas  produk  herbal  berdasarkan  perbedaan  waktu terhadap  paparan  suhu,  cahaya,  oksigen,  kelembaban terhadap  produk  tersebut,  yang  dapat  memengaruhi perubahan ukuran partikel, kontaminasi mikroba, logam,
sehingga dapat diputuskan shelf-life dalam jangka waktu tertentu (Sachan & Kumar, 2015).
Infusa  memiliki  kandungan  air  tinggi  yang merupakan pelarut utama, sehingga menjadi faktor utama untuk kecepatan degradasi di penyimpanan selama 8 hari. Reaksi kimia yang terjadi akibat adanya air adalah reaksi hidrolisis, yang merupakan salah satu reaksi utama dalam degradasi produk.
Dengan alasan tersebut, penting dilakukan pengujian pengaruh  suhu  dan  lama  penyimpanan  supaya  menjaga kualitas,  keamanan,  dan  efektivitas  ekstrak  rosela.  Pada penelitian  ini,  parameter  pengukuran  di  dasarkan  pada perubahan warna yang diukur menggunakan chromameter dan aktivitas antioksidan dengan nilai IC 50 berdasarkan  metode  penangkapan  radikal  bebas  2,2- Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Penelitian ini bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  penyimpanan ekstrak  kelopak  bunga  rosela  yang  dilakukan  selama  8 hari  penyimpanan  dengan  pengujian  penyimpanan  pada suhu dingin (2-8℃), suhu sejuk (8-15℃), dan suhu kamar (15-30℃)  terhadap  perubahan  warna  dan  aktivitas antioksidan.
Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan  untuk mengevaluasi  pengaruh  penyimpanan  infusa  kelopak bunga rosela merah ( Hibiscus sabdariffa L.) selama 8 hari pada suhu dingin (2-8℃), sejuk (8-15℃), dan kamar (15- 30℃)  terhadap  warna.  Kemudian  untuk  mengevaluasi pengaruh  penyimpanan  infusa  kelopak  bunga  rosela merah  ( Hibiscus  sabdariffa L.)  selama  8  hari pada  suhu dingin (2-8℃) dan sejuk (8-15℃).

## METODE PENELITIAN

## Alat
Alat-alat  yang  akan  digunakan  pada  penelitian  ini adalah panci infusa, Spektrofotometer UV-Vis Shimadzu , Chroma meter.

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  untuk  penelitian  ini  bunga rosela merah yang diperoleh dan telah diidentifikasi dari Materia Medika Batu Malang. Bahan lain seperti Metanol p.a , air suling, DPPH (Merck).

## Pembuatan Infusa 10%
Simplisia  kering  kelopak  bunga  rosela  ditimbang sebanyak 50 g. Kemudian dipotong menjadi bagian yang lebih  kecil  dimasukkan  ke  dalam  panci  infus  dan ditambahkan dengan air 500 ml. Panci infus dipanaskan hingga  suhu  mencapai  90℃.  Pemanasan  dilanjutkan selama  15  menit  sambil  sekali-sekali  diaduk.  Infus disaring  selagi  panas  dengan  kain  flanel.  Air  panas ditambahkan secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume infus yang dikehendaki yaitu 500 ml.

## Kondisi Penyimpanan
Infusa  Rosela  disimpan  dengan  interval  waktu penyimpanan (0 hari, 1 hari, 2 hari, 3 hari, 4 hari, 7 hari, 8  hari)  pada  suhu  dingin  (2-8℃),  sejuk  (8-15℃),  dan kamar (25-30℃).

## Uji Aktivitas Antiradikal Bebas DPPH
Dipipet  0,15  ml  larutan  infusa  dari  berbagai konsentrasi  yaitu  12,5  ppm,  25  ppm,  50  ppm,  100 ppm, dan  200  ppm  dan  masing-masing  ditambahkan  1,35  ml
larutan  DPPH  40  ppm  dan  dimasukkan  kedalam  tabung reaksi  yang  telah  terbungkus  aluminium  foil  kemudian campuran di vortex dan diukur serapannya pada panjang gelombang  maksimum  517  nm. Pengujian ini  dilakukan dengan  replikasi  tiga  kali.  Aktivitas  antioksidan  sampel ditentukan oleh besarnya hambatan serapan radikal DPPH melalui  perhitungan  persentase  (%)  inhibisi  serapan DPPH dengan menggunakan rumus.

## Pengukuran Warna
Uji  warna  dilakukan  dengan  sistem  ruang  warna. Chroma meter terlebih dahulu dikalibrasi dengan standar warna putih. Hasil analisis derajat warna yang dihasilkan berupa  nilai  total  perbedaan  warna Red  Green  Blue (RGB).

## Analisa Data
Untuk  mengetahui  adanya  perbedaan  bermakna antara  aktivitas  antioksidan,  perubahan  warna  dengan durasi  penyimpanan  serbuk  ekstrak  rosela,  dilakukan analisis statistik dengan metode Multivariate Analysis of Variance (MANOVA)  dan  uji Post  Hoc  Bonferroni dengan derajat kepercayaan 0,95 (α = 0,05).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Bunga Rosela merah yang digunakan pada penelitian ini  diperoleh  dan  telah  diidentifikasi  di  Materia  Medika Batu, Malang. Dari hasil pembuatan infusa 10% diketahui berat jenisnya sebesar 26,0 mg/mL.

## Hasil  Uji  Aktifitas  Antioksidan  dari  Infusa  Rosela Merah
Penyimpanan  menjadi  salah  satu  parameter  yang digunakan  untuk  melihat  kestabilan  produk.  Faktor lingkungan  seperti  suhu  mempengaruhi  reaksi  oksidasi zat  aktif  dan  proses  hidrolisis  secara  enzimatik menyebabkan  kerusakan  infusa  rosela  yang  berakibat sediaan tidak bertahan lama.
Parameter  kestabilan  untuk  melihat  pengaruh penyimpanan  adalah  dilihat  dari  potensi  aktivitas antioksidan dan warna dari infusa kelopak bunga rosela. Aktivitas  antioksidan  dari  infusa  kelopak  bunga  rosela dinyatakan  dalam  nilai  IC 50 .  Nilai  IC 50 didapatkan  dari persamaan  regresi  kurva  persentase  inhibisi  DPPH. Persentasse  inhibisi  merupakan  persentase  penangkalan radikal  bebas  yang  dihitung  menggunakan  rumus  antara absorban  DPPH  dengan  absorban  sampel  yang  diukur, sedangkan  nilai  IC 50 menyatakan  besarnya  konsentrasi efektif  ekstrak  yang  diuji  yang  dapat  menangkal  radikal bebas sebanyak 50%. Suatu senyawa dinyatakan sebagai antiradikal  bebas  sangat  kuat  apabila  nilai  IC 50 <  50 µg/mL dan bila nilai IC 50 berkisar antara 201-1000 µg/mL maka  zat  tersebut  kurang  aktif  namun  masih  memiliki potensi sebagai antioksidan (Molyneux, 2004).
Pada pengamatan profil spektra metode spektrofotometri  UV-Vis  yang  diamati  pada  panjang gelombang  400-800  nm  didapatkan  panjang  gelombang maksimum pada 516 nm yang kemudian didapatkan nilai absorbansi  untuk  masing-masing  sampel  penyimpanan. Dari  data  absorban  tersebut,  selanjutnya  dihitung persentase  peredaman  radikal  bebas  DPPH  (%  inhibisi). Hasil  %  inhibisi  kemudian  dibuat  kurva  persamaan regresi  sehingga  dapat  dihitung  nilai  IC 50 sampel.  Hasil IC 50 infusa kelopak bunga rosela pada kondisi awal hari
ke-0  sebesar  45,381  ppm  menunjukan  aktivitas antioksidan  yang  kuat.  Warna  yang  dihasilkan  pada kondisi awal hari ke-0 menunjukan warna merah cerah.
Gambar 1. IC 50 dari Masing-Masing Infusa Rosela yang disimpan dalam Berbagai Suhu
Hasil  uji  aktivitas  selama  penyimpanan  suhu  ruang ( Gambar 1 ) menunjukkan nilai penghambatan IC 50 DPPH yang  dihasilkan  pada  uji  aktivitas  hari  ke-0  sampai  hari ke-8  diketahui  adanya  penurunan  nilai  aktivitas antioksidan  dibuktikan  dengan  semakin  besarnya  nilai IC 50 yang signifikan pada penyimpanan suhu ruang. Pada hari  ke-0  nilai  IC 50 sebesar  45,381  ±  2,256  mengalami penurunan  aktivitas  hampir  50%  pada  hari  ke-1  dengan nilai IC 50 menjadi 66,738 ± 3,191. Penyimpanan hingga hari  ke-8  nilai  IC 50 menjadi  138,103  ±  6,769  dengan penurunan  aktivitas  antioksidan  sebesar  204,32% dibanding kondisi awal penyimpanan.
Penyimpanan  suhu  sejuk  ( refrigerator )  nilai penghambatan  IC 50 DPPH  yang  dihasilkan  pada  uji aktivitas  hari  ke–0  sampai  hari  ke–8  juga  menunjukan penurunan aktivitas antioksidan. Pada hari ke-0 nilai IC 50 sebesar  45,381  ±  2,256  mengalami  penurunan  aktivitas 14,25% pada hari ke-1 dengan nilai IC 50 menjadi 51,846 ± 2,702. Penyimpanan hingga hari ke-8 nilai IC 50 menjadi 90,995  ±  4,693  dengan  penurunan  aktivitas  antioksidan sebesar 90% dibanding kondisi awal penyimpanan.
Penyimpanan  suhu  dingin  ( freezer )  pada Tabel  1 menunjukan  nilai  penghambatan  (nilai  IC 50 )  DPPH  hari ke–0 sampai hari ke–8. Pada hari ke-0 nilai IC 50 sebesar 45,381  ±  2,256  mengalami  penurunan  aktivitas  14,25%. Penurunan  yang  tidak  signifikan  terlihat  pada  hari  ke-1 sebesar 2,97% dengan nilai 46,730 ± 2,129, artinya infusa rosela  ini  masih  dapat  dinyatakan  stabil  sebab  aktivitas yang  dihasilkan  masih  memiliki  potensi  >90%  sebagai antioksidan.  Penyimpanan  hingga  hari  ke-8  nilai  IC 50 menjadi 62,293 ± 2,661 yang secara teori masih memiliki aktivitas antioksidan yang sedang.
Suatu  senyawa  dikatakan  sebagai  antioksidan  yang sangat kuat apabila nilai IC 50 < 10 ppm, kuat apabila nilai IC 50 antara  10-50  ppm,  sedang  apabila  nilai  IC 50 antara 50-100 ppm, lemah apabila nilai IC 50 berkisar antara 100- 250  ppm  dan  dinyatakan  tidak  aktif  apabila  nilai  IC 50 diatas  250  ppm.  Sehingga,  selama  8  hari  penyimpanan infusa  kelopak  bunga  rosela  ini  memiliki  penurunan aktivitas  menjadi  lemah  sebagai  antioksidan  saat disimpan  di  suhu  ruang  dan  menjadi  sedang  saat penyimpanan di suhu sejuk dan dingin. Berdasarkan hasil tersebut,  diketahui  bahwa  infusa  kelopak  bunga  rosela merah  10%  selama  penyimpanan  mempunyai  nilai aktivitas  IC 50 paling  besar  pada  penyimpanan  selama  8 hari di suhu kamar.
0 50 100 150 Hari ke-0 Hari ke-1 Hari ke-2 Hari ke-3 Hari ke-4 Hari ke-7 Hari ke-8 IC5 0 Suhu ruang Suhu sejuk Suhu dingin
Hasil  Pengamatan  Warna  Infusa  Rosela  selama Penyimpanan
Warna  merupakan  parameter  penting  dari  sebuah produk  pangan  karena  secara  visual  faktor  ini  terlihat perubahannya jika terjadi penurunan stablitas. Pengukuran warna secara objektif sering dilakukan untuk mengukur  warna  pada  produk.  Analisis  warna  infusa kelopak  bunga  rosela  dilihat  berdasarkan  tingkat  warna merah (R), hijau (G) dan biru (B) dapat dilihat pada Tabel
1 .
Hasil  pengujian  menunjukan  bahwa  penyimpanan dan  hari  ke-0  sampai  hari  ke-8  intensitas  warna  infusa rosela memberikan nilai R (merah) semakin menurun. Hal tersebut  menunjukan  terjadi  penurunan  intensitas  warna merah  infusa  seiring  lama  waktu  penyimpanan.  Nilai  G (hijau)  dan  B  (biru)  kurang  dominan  apabila dibandingkan  dengan  nilai  R  (merah)  yang  dihasilkan rosela  merah.  Hal  tersebut  menunjukan  bahwa  warna merah  pada  infusa  kelopak  bunga  rosela  lebih  dominan dibandingan warna hijau dan biru. Namun, intensitas nilai G  dan  B  selama  waktu  penyimpanan  infusa  rosela  juga menunjukan penurunan yang nyata.
Tabel  1. Nilai  Warna Chromameter Infusa  Kelopak  Bunga
Rosela Merah selama Penyimpanan Penyimpanan R G B Intensitas Warna Kondisi Lama Suhu Ruang Hari ke-0 255 24 33 Cheey red Hari ke-1 231 4 0 Red Hari ke-2 222 0 0 Red Hari ke-3 206 0 0 Red Hari ke-4 198 0 0 Red Hari ke-7 189 0 0 Dark red Hari ke-8 181 0 0 Dark red Suhu sejuk Hari ke-0 255 24 33 Cheey red Hari ke-1 239 4 0 Red Hari ke-2 239 0 0 Red Hari ke-3 222 0 0 Red Hari ke-4 214 0 0 Red Hari ke-7 206 0 0 Red Hari ke-8 198 0 0 Red
Suhu dingin Hari ke-0 255 24 33 Cheey red Hari ke-1 255 4 0 Red Hari ke-2 247 0 0 Red Hari ke-3 239 8 0 Red Hari ke-4 239 4 0 Red Hari ke-7 231 4 0 Red Hari ke-8 222 0 0 Red
Setelah  dilakukan  penyimpanan,  hasil  penurunan aktivitas  yang  paling  besar  terjadi  pada  penyimpanan suhu  ruang  (30℃)  hari  ke-7  telah  menunjukan  aktivitas antioksidan  yang  lemah  dan  perubahan  warna  infusa menjadi  merah  gelap.  Hasil  aktivitas  maupun  warna  di suhu  ruang  berbeda  makna  secara  signifikan  selama  0-8 hari penyimpanan. Sehingga infusa kelopak bunga rosela merah tidak stabil sampai 1 hari jika disimpan pada suhu ruang 30℃. Pada suhu sejuk (11℃), aktivitas antioksidan yang berbeda makna terlihat pada hari ke-3 penyimpanan dengan perubahan warna menjadi merah. Sehingga dilihat dari parameter aktivitas dan warna, infusa kelopak bunga rosela tidak stabil selama 3 hari penyimpanan suhu sejuk. Meskipun  sebenarnya  pada  penyimpanan  suhu  sejuk hingga  di  akhir  hari  ke-8  masih  menunjukan  aktivitas antioksidan  yang  sedang,  akan  tetapi  penurunan  sebesar 43,03% dari kondisi awal penyimpanan terlihat di hari ke- 3 masa simpan. Sehingga hampir setengah dari aktivitas
telah  hilang  di  hari  ke-3  penyimpanan  suhu  sejuk meskipun  secara  potensi  masih  menunjukan  aktivitas antioksidan yang sedang.
Berbeda  dengan  suhu  ruang  dan  sejuk,  pada penyimpanan  suhu  dingin  (6℃)  terlihat  kestabilan  yang baik selama penyimpanan 0-8 hari. Di akhir masa simpan, hari  ke-8,  aktvitas  menunjukan  potensi  sedang  sebagai antioksidan  sedangan  potensi  aktivitas  yang  kuat  masih terlihat  di  hari  ke-2  penyimpanan.  Hasil  ini  menurut analisis  statistik  tidak  berbeda  makna  secara  signifikan antara  kondisi  awal  penyimpanan  hari  ke-0  dengan  hari ke-1, hari ke-2, hari ke-3, hari ke-4, hari ke-7, dan hari ke- 8. Penyimpanan suhu dingin pada penelitian ini dilakukan pada lemari freezer yang secara teori memiliki suhu <0℃. Sampel  sediaan  dari  infusa  rosela  yang  beku  perlu dilakukan proses thawing dengan cara merendam sampel di dalam air dingin hingga mencair. Suhu dingin peneliti menggunakan  6℃  merupakan  hasil  pengukuran  sampel rosela yang telah mencair. Proses thawing ini dibutuhkan sekitar  60  menit,  sehingga  perlu  diperhatikan  supaya thawing ini tidak memengaruhi kestabilan sampel infusa kelopak bunga rosela.
Infusa  yang  memiliki  kandungan  air  tinggi  sebagai pelarut utama menjadi faktor utama cepatnya mengalami degradasi  di  penyimpanan  selama  8  hari.  Reaksi  kimia yang  terjadi  akibat  adanya  air  adalah  reaksi  hidrolisis, yang merupakan salah satu reaksi utama dalam degradasi produk.  Terjadinya  hidrolisis  pada  ikatan  gula  antara gugus  aglikon  dengan  gugus  glikon  menyebabkan degradasi  antosianin  membentuk  senyawa carbinol dan chalcone yang tidak bewarna (Sharara, 2017). Perubahan struktur  senyawa  antosianin  akibat  adanya  degradasi menyebabkan penurunan kandungan total antosianin pada infusa  rosela  sehingga  terjadi  penurunan  aktivitas antioksidan selama penyimpanan.
Bentuk senyawa hasil degradasi dari reaksi hidrolisis membentuk  gugus carbinol dan chalcone yang menyebabkan  terjadinya  terjadi  perubahan  warna (Mehran et  al .,  2020).  Ketidakstabilan  antosianin cenderung  meningkat  selama  proses  penyimpanan  yang diiringi  dengan  kenaikan  suhu.  Suhu  berpengaruh terhadap  kestabilan  warna  ekstrak  rosela.  Semakin meningkatnya  suhu  dapat  menyebabkan  hilangnya glikosil  pada  antosianin  dengan  reaksi  hidrolisis  pada ikatan glikosidik (van Boekel et al ., 2010). Aglikon yang dihasilkan  kurang  stabil  dan  menyebabkan  hilangnya warna  pada  antosianin  (Hayati et  al .,  2012).  Suhu  yang relatif  tinggi  dapat  menyebabkan  sebagian  antosianin mengalami  degradasi  akibat  terjadinya  hidrolisis  pada ikatan  glikosidik  antosianin,  sehingga  menghasilkan aglikon  yang  bersifat  tidak  stabil  dan  membuka  cincin aglikon,  kemudian  membentuk  gugus carbinol dan chalcone yang tidak berwarna (Inggrid et al ., 2018). Reaksi  hidrolisis  karena  adanya  air  menyebabkan sensitivitas  senyawa  terhadap  suatu  suhu  meningkat sehingga menyebabkan degradasi produk semakin cepat. Kadar  air  yang  tinggi  secara  signifikan  memperpendek umur  simpan  karena  air  bebas  memfasilitasi  reaksi degradasi  antosianin.  Oksigen  juga  memainkan  peran penting  dalam  proses  degradasi  antosianin.  Kehadiran oksigen dapat mempercepat degradasi dengan mekanisme oksidatif  secara  langsung  dan/atau  melalui  kerja  suatu enzim  pengoksidasi  oksidasi  seperti  enzim  polifenol oksidase  (PPO)  membentuk  produk  kondensasi  coklat (Patras et  al .,  2010).  Enzim  PPO  tersebut  memiliki
kondisi  optimum  sebagai  katalis  reaksi  hidrolisis  saat berada  pada  suhu  40℃.  Oleh  karena  itu,  penurunan aktivitas  antioksidan  terbesar  ditunjukan  pada  produk yang disimpan pada suhu ruang (30℃) karena suhu yang relatif  mendekati  40℃  mengalami  degradasi  antosianin yang semakin meningkat.
Dari  penelitian  ini  diketahui  bahwa  suhu  dan  lama penyimpanan berpengaruh terhadap perubahan warna dan aktivitas antioksidan infusa kelopak bunga rosela merah. Data  warna  juga  memberikan  hasil  yang  berbeda  secara signifikan dari hari pertama penyimpanan. Dari parameter aktivitas  antioksidan,  infusa  rosela  stabil  di  suhu  dingin (6℃) hingga 8 hari penyimpanan, tidak lebih dari 3 hari penyimpanan bila disimpan pada suhu sejuk (11℃), dan tidak  stabil  sejak  hari  pertama  penyimpanan  pada  suhu ruang  (30℃).  Namun,  untuk  menentukan  tanggal kadaluarsa  yang  tepat  atau shelf  life dari  sediaan  infusa kelopak  bunga  rosela  ini  perlu  adanya  parameter  lain selain  dilihat  dari  perubahan  warna  dan  aktivitas. Penetapan  kadar  antosianin  dan  kestabilan  terhadap mikroorganisme  juga  menjadi  parameter  kestabilan produk.  Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan  analisis kandungan  senyawa  antosinain  dan  cemaran  mikroba sebagai  parameter  lain  untuk  menentukan  tanggal kadaluarsa  dari  produk  infusa  kelopak  bunga  rosela merah.

## Hasil Pengolahan Data
Dari hasil uji MANOVA dengan derajat kepercayaan 0,95 (α = 0,05) didapatkan hasil sig < 0,05 di kelompok faktor suhu penyimpanan dan faktor lama penyimpanan, maka  ada  perbedaan  yang  bermakna  antara  aktivitas antioksidan  dengan  suhu  dan  lama  penyimpanan.  Hal yang  sama  terlihat  pada  variabel  warna  infusa  rosela dengan suhu dan lama penyimpanan didapatkan hasil sig < 0,05, maka ada perbedaan bermakna antara nilai warna infusa rosela dengan suhu dan lama penyimpanan.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  dilakukan  dapat diambil  kesimpulan  bahwa  terdapat  pengaruh  suhu  dan lama  penyimpanan  terhadap  perubahan  warna  infusa kelopak  bunga  rosela  merah.  Hasil  warna  memiliki perbedaan  bermakna  terlihat  sejak  hari  pertama penyimpanan  di  suhu  ruang  (30℃),  sejuk  (11℃),  dan dingin (6℃). Kemudian terdapat pengaruh suhu dan lama penyimpanan  terhadap  aktivitas  antioksidan  infusa kelopak  bunga  rosela  merah.  Penurunan  aktivitas  secara bermakna  terlihat  pada  hari  ke-1  penyimpanan  di  suhu ruang (30℃), dan hari  ke-3 penyimpanan di  suhu sejuk (11℃).  Tidak  ada  pengaruh  penurunan  aktivitas antioksidan  yang  bermakna  dari  infusa  rosela  merah  di suhu dingin (6℃) hingga 8 hari penyimpanan.

## DAFTAR PUSTAKA
ASEAN  Guidelines  (2017)  'Annex  V  Asean  Guidelines on  Stability  Study  and  Shelf-Life  of  Traditional medicine', pp. 0–21.
Christian,  K.R.,  Nair,  M.G.  and  Jackson,  J.C.  (2006) 'Antioxidant  and  cyclooxygenase  inhibitory activity  of  sorrel  ( Hibiscus  sabdariffa )', Journal of  Food  Composition  and  Analysis ,  19(8),  pp.
778-783. doi: 10.1016/j.jfca.2006.04.004.
Da-Costa-Rocha, I., Bonnlaender, B., Sievers, H., Pischel, I. and Heinrich, M. (2014) 'Hibiscus sabdariffa L. - A phytochemical and pharmacological review', Journal of Food Chemistry , 165, pp. 424-443. doi: 10.1016/j.foodchem.2014.05.002.
Dhar, P., Kar, C.S., Ojha, D., Pandey, S.K. and Mitra, J.
(2015) 'Chemistry, phytotechnology, pharmacology  and  nutraceutical  functions  of kenaf  ( Hibiscus  cannabinus L.)  and  roselle ( Hibiscus  sabdariffa L.)  seed  oil:  An  overview', Industrial Crops and Products , 77, pp. 323-332.
Djaeni,  M.  (2017)  'Ekstraksi  Antosianin  dari  Kelopak Bunga Rosella ( Hibiscus Sabdariffa L.) Berbantu Ultrasonik:  Tinjauan  Aktivitas  Antioksidan', Jurnal  Aplikasi  Teknologi  Pangan ,  6(3), pp.  50- 62. doi: 10.17728/jatp.236.
European  Medicines  Agency  (2003)  'ICH  Topic  Q1A (R2):  Stability  Testing  of  New  Drug  Substances and  Products'.  London:  European  Medicines Agency.
FDA (2016) 'USP 39 Published General Chapter <1132> Residual  Host  Cell  Protein  Measurement  in Biopharmaceuticals', Usp 39 , pp. 173–182.
Hayati,  E.,  Budi,  U.  and  Hermawan,  R.  (2012) 'Konsentrasi  Total  Senyawa  Antosianin  Ekstrak Kelopak Bunga Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.): Pengaruh  Temperatur  dan  pH', Jurnal  Kimia , 6(2), pp. 138-147.
Inggrid,  M.,  Hartanto,  Y.  and  Widjaja,  J.F.  (2018) 'Karakteristik  Antioksidan  pada  Kelopak  Bunga Rosella  (Hibiscus  sabdariffa  Linn.)', Jurnal Rekayasa Hijau , 2(3), pp. 62-72. doi: 10.26760/jrh.v2i3.2517.
Juliani,  H.R.,  Welch,  C.R.,  Wu, Q.,  Diouf,  B.,  Malainy, D. and Simon, J.E. (2009) 'Chemistry and quality of  hibiscus  ( Hibiscus  sabdariffa )  for  developing the natural-product industry in Senegal', Journal of  Food  Science ,  74(2),  pp.  524-543.  doi: 10.1111/j.1750-3841.2009.01076.
Kouakou, H.T., Kouakou, L.K., Decendit, A., Badoc, A., Da-Costa,  G.,  Merillon,  J.-M.  and  Teguo,  P.W. (2010) 'Preparative Purification of Delphinidin 3- O-sambubioside from Roselle ( Hibiscus sabdariffa L.)  Petals  by  fast  Centrifugation Partition  Chromatography', Journal  of  Advances in Chemistry , 6(2), pp. 999-1004. doi: 10.24297/jac.v6i2.2628.
Mehran,  M.,  Masoum,  S.  and  Memarzadeh,  M.  (2020) 'Improvement of thermal stability and antioxidant activity  of  anthocyanins  of  Echium  amoenum petal using maltodextrin/modified starch combination  as  wall  material', International Journal  of  Biological  Macromolecules ,  148,  pp.
768-776. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.01.197. Mozaffari-Khosravi, H., Jalali-Khanabadi, B.A., Afkhami-Ardekani,  M.  and  Fatehi,  F.  (2009)
'Effects of sour tea ( Hibiscus sabdariffa ) on lipid profile  and  lipoproteins  in  patients  with  type  II diabetes', Journal of Alternative and Complementary  Medicine ,  15(8),  pp.  899–903. doi: 10.1089/acm.2008.0540.
Molyneux,  P.  (2004)  'The  use  of  the  stable  free  radical diphenylpicryl-hydrazyl  (DPPH)  for  estimating antioxidant  activity’, Songklanakarin  Journal  of Science and Technology , 50(June 2003), pp. 211– 219.
Patras, A., Brunton, N.P., O’Donnell, C. and Tiwari, B.K.
(2010)  'Effect  of  thermal  processing  on anthocyanin  stability  in  foods;  mechanisms  and kinetics  of  degradation', Journal  of  Trends  in Food Science and Technology , 21, pp. 3-11. doi: 10.1016/j.tifs.2009.07.004.
Sachan, A.K. and Kumar, A. (2015) 'Stability Testing of Herbal  Products', Journal  of  Chemical  and Pharmaceutical Research , 7(12), pp. 511–514.
Sharara,  M.S.  (2017)  'Copigmentation  Effect  of  Some Phenolic  Acids  on  Stabilization  of  Roselle
( Hibiscus  sabdariffa )  Anthocyanin  Extract', American  Journal  of  Food  Science  and Technology , 5(2), pp. 45-52.
Van-Boekel, M., Vincenzo, F. and Nicoletta, P. (2010) 'A review  on  the  beneficial  aspects  of  food processing', Molecular  Nutrition  &  Food Research , 54(9), pp. 1215-1247. doi: 10.1002/mnfr.200900608.
Yang, M.Y., Peng, C.H., Chan, K.C., Yang, Y.I., Huang, C.N.  and  Wang,  C.J.  (2010)  'The  hypolipidemic effect  of Hibiscus  sabdariffa polyphenols  via inhibiting lipogenesis and promoting hepatic lipid clearance', Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry , 58(2), pp. 850-859.
Zhen,  J.,  Villani,  T.S.,  Guo,  Y.,  Qi,  Y.,  Chin,  K.,  Pan, M.H.  and  Wu,  Q.  (2015)  'Phytochemistry, antioxidant  capacity,  total  phenolic  content  and anti-inflammatory activity of Hibiscus sabdariffa leaves', Journal of Food Chemistry , 190, pp. 673- 680. doi: 10.1016/j.foodchem.2015.06.006.