## RESEARCH ARTICLE

## Purification of Xylooligosaccharide From Casavva Pulp by Ultrafiltration Method
(Pemurnian Xilooligosakarida Dari Ampas Singkong Dengan Metode Ultrafiltrasi)
Anak Agung Istri Ratna Dewi *) , Kamelia Rizqi Fauziyah, Dwi Indarti Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember Jalan Kalimantan 37, Jember 68121

## ABSTRACT
Xylan is the main component of hemicellulose. Xylan can be extracted from agricultural waste, such as cassava pulp. Xylan is used as an endo-β-1,4-D-xylanase substrate to produce impure xylooligosaccharides (XOS)This study aims to purify XOS from cassava pulp using the ultrafiltration method. The components of XOS obtained from the enzymatic hydrolysis were analyzed using thin layer chromatography (TLC) and densitometry methods. In addition, the XOS was purified by the ultrafiltration method using a cellulose membrane with a Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 12 kDa. The permeate obtained from the purification results was also analyzed using TLC and densitometry. The results of this study indicated that the components in XOS cassava pulp before and  after  purification  by  the  TLC  method  were  X5  and  X6,  while  the  XOS  components  before  and  after  purification  by  the densitometric method were X3, X4 and X5.
Keywords: Xylan, Xylooligosaccharides, Cassava, Ultrafiltration.

## PENDAHULUAN
Xilan adalah komponen utama dari hemiselulosa. Xilan  dapat  diekstraksi  dari  limbah  pertanian yang dapat  dimanfaatkan  untuk  menghasilkan XOS mengunakan  metode hidrolisis  secara  enzimatis [1]. Xilan dari  sumber  ampas  singkong dihidrolisis  oleh enzim endo -1,4-D-xilanase yang berasal dari Bacillus sp dalam  abdomenal  rayap  isolat  terpilih,  dengan aktivitas  endo -1,4-D-xilanase  sebesar  0,29 U/mg. Proses hidrolisis xilan ampas singkong pada suhu 40 o C selama  16  jam dan menghasilkan produk xilooligosakarida (XOS). Xilooligosakarida merupakan oligomer gula yang terdiri dari ikatan β-(1- 4)-xilosida dari unit xilosa. Xilooligosakarida memiliki beberapa  komponen  yaitu  xilobiosa  (X2),  xilotriosa (X3),  xilotetraosa  (X4),  xilopentaosa  (X5), xiloheksaosa (X6) [1].
Xilooligosakarida dari  hidrolisis  ampas  singkong yang diperoleh dalam penelitian tersebut masih belum murni. Hal ini dikarenakan masih ada komponen lain yang  tidak  diinginkan  seperti  xilan  dan  sisa  enzim.
Maka perlu dilakukan pemurnian untuk menghilangkan  komponen  yang  tidak  diinginkan tersebut. Pemurnian  merupakan  suatu  proses pemisahan  fisik  bahan  kimia  yang  diinginkan  dari bahan  pengotornya. Dalam  proses  pemurnian  dapat digunakan berbagai metode agar didapatkan suatu zat yang  murni.  Salah  satu  metode  pemurnian  adalah mengunakan membran ultrafitrasi. Ultrafiltrasi adalah proses  pemisahan  dengan  membran  berdasarkan perbedaan  ukuran  pori  membran  dengan  ukuran partikel yang akan dipisahkan dan hasil dari pemisahan sehingga  diharapkan  larutan  hasil  pemisahan (permeat)  mengandung  komponen  yang  sesuai [2]. Metode ultrafiltrasi digunakan karena metode ini bisa menyaring molekul dengan berat molekul yang besar. Fei  Wong [3] telah  melakukan penelitian  mengenai pemurnian XOS menggunakan  metode  ultrafiltrasi untuk  pemurnian XOS yang  diperoleh  melalui hidrolisis jerami padi. Membran yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah membran  selulosa komersil (Millipore  USA)  dengan Molecular  Weight  Cut  Off (MWCO) sebesar 5 kDa. Komponen yang diperoleh
*)Corresponding author: Anak Agung Istri Ratna Dewi E-mail: istri_dewi.fmipa@unej.ac.id
Dewi et al, Purification of Xilooligosaccharide From …
pada  permeat  dalam  penelitian  tersebut  adalah  X1 sampai  X6. Geetha  dan  Gunasekaren  [4] juga melakukan  penelitian  mengenai  pemurnian XOS menggunakan  metode  ultrafiltrasi  untuk  pemurnian. Membran  yang  digunakan  dalam  penelitian  tersebut adalah membran komersil dengan MWCO sebesar 10 kDa.  Membran  tersebut  mampu  memurnikan XOS yang  akan  digunakan  untuk  pembuatan  sirup XOS prebiotik.  Debora [5] juga  melakukan  penelitian mengenai  pemurnian XOS dari  cangkang  almond. Membran  yang  digunakan  dalam  penelitian  tersebut adalah membran komersil dengan MWCO sebesar 8 kDa. Kinerja  membran  tersebut kurang  maksimal dalam memurnikan XOS cangkang almond sehingga diperlukan  metode  tambahan  untuk  meningkatkan kemurniannya.  Berdasarkan  data  tersebut,  peneliti menggunakan membran  selulosa komersil  (Merk Serva, Servapor dialysis membrane) dengan MWCO sebesar 12 kDa.

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan  di  laboratorium Center  for Development of  Advanced Science and Technology (CDAST) Universitas  Jember  dan  Laboratorium  Kimia  Fisik Fakultas MIPA Universitas Jember.
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah spektrofotometer, kuvet, autoclave , sentrifuge , laminar air flow , shaker  incubator , hotplate , lemari  asam, water  bath , magnetic stirrer , vortex ,  kulkas, oven ,  pH-meter, kompresor, dan satu set alat ultrafiltrasi.
Bahan yang digunakan adalah enzim endo-1,4-D- xilanase yang berasal dari abdomen rayap. Bahan lain yang digunakan adalah membran ultrafiltrasi komersial dengan MWCO sebesar 12 kDa, media Luria Bertani (LB),  triptofan, yeast  extract , oat spelt  xylan, xilosa, standar xilooligosakarida NaCl, KNaTartrat, asam 3,5- dinitrosalisilat,  NaOH,  fenol, Na 2 SO 3 ,  etanol  95%, Na 2 HPO 4 , asam sitrat, 1-butanol, CH 3 COOH, HCl ∝ -naftol, dan plat TLC F254.
Proses  Hidrolisis  Xilan Ampas  Singkong oleh endo- β -1,4-D-xilanase Hidrolisis xilan dilakukan dengan mencampurkan 50 mL enzim endo- -1,4-D-xilanase dengan substrat xilan sebanyak 50 ml konsentrasi 1,1% (b/v) [6] dalam buffer  fosfat-sitrat  pH  5.  Campuran  substrat  dan enzim diinkubasi dalam waterbath pada suhu 40 o C [7]
selama  16  jam [8].  Kontrol  yang  digunakan  untuk membandingkan hasil yang diperoleh adalah endo- - 1,4-D-xilanase yang diinaktifkan. Inaktif enzim endo- -1,4-D-xilanase  dilakukan  dengan  125 µ enzim dipanaskan pada suhu 100 o C selama 60 menit. Hasil hidrolisis  xilan  dengan  enzim endo- β -1,4-D-xilanase berupa XOS ampas  singkong dianalisis  dengan metode KLT dan densitometri.
Pemurnian XOS  Ampas  Singkong dengan Membran Ultrafiltrasi Larutan XOS ampas singkong dimurnikan dengan ultrafiltrasi  menggunakan  membran dengan  MWCO 12 kDa. Larutan XOS yang akan diultrafiltrasi disebut umpan.  Umpan  sebanyak  50  mL  dialirkan  menuju membran  menggunakan  alat  ultrafiltrasi  untuk dilakukan proses pemurnian. Tekanan diatur sebesar 2.5 bar. Hasil pemurnian larutan kemudian dialirkan menuju gelas ukur untuk dianalisis komponennya dan retentatnya dibuang.
Analisis  XOS Ampas  Singkong Sebelum  dan Setelah Pemurnian dengan KLT XOS ampas  singkong sebelum  dan  setelah pemurnian diuji  menggunakan KLT. Kromatoplat terlebih dahulu diaktifkan dengan dicelupkan ke dalam wadah  berisi  eluen. Sebanyak  20 μL produk  XOS ampas  singkong sebelum  dan  setelah  pemurnian ditotolkan  pada  kromatoplat  yang  telah  diaktifkan.. Selain  sampel  XOS  ampas  singkong, standar XOS, xilan yang  dihidrolisis  dengan enzim  inaktif juga ditotol  dalam  kromatoplat Kromatoplat  yang mengandung  sampel  dan  standar  dicelupkan  dalam wadah yang telah berisi eluen. Eluen tersebut berupa campuran  dari  n-butanol,  asam  asetat,  dan  akuades dengan perbandingan 2:1:1 [9]. Kromatoplat diambil setelah eluen mencapai batas garis atas. Kromatoplat dikeringkan dan disemprot dengan larutan penampak noda yang terdiri dari campuran ∝ -naftol, asam sulfat, dan  etanol  dengan  perbandingan  1:10:200 [10]. Kromatoplat kemudian diletakkan dalam oven dengan suhu 100 ° C selama 5 menit hingga noda tampak. Noda yang terbentuk selanjutnya diukur jaraknya dari batas bawah dan digunakan  untuk  menentukan  faktor retensi  yang  diperoleh  dengan  menggunakan persamaan:
Rf = (1)
Dewi et al, Purification of Xilooligosaccharide From …

## Analisis  XOS Ampas  Singkong Sebelum  dan Setelah Pemurnian dengan Densitometri
XOS ampas  singkong sebelum  dan  setelah pemurnian diuji  menggunakan densitometri. Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang  berdasarkan  interaksi  radiasi  elektromagnetik dengan analit berupa bercak pada KLT. Kromatoplat diaktifkan  dengan  cara  dicelupkan  ke dalam  wadah berisi  eluen.  Sebanyak  20 μL produk  XOS ampas singkong sebelum  dan  setelah  pemurnian ditotolkan pada kromatoplat yang telah diaktifkan. Kromatoplat yang  mengandung  sampel  dan  standar  dicelupkan dalam  wadahberisi  eluen.  Eluen  tersebut  berupa campuran  dari  n-butanol,  asam  asetat,  dan  akuades dengan  perbandingan  2:1:1 [9].  Kromatoplat kemudian diambil setelah eluen mencapai batas garis atas  lalu  dikeringkan  dengan  cara  dianginkan. Kemudian  dilanjutkan  pembacaan  komponenmya dengan  fotodensitometer  pada  panjang  gelombang 303. nm Scanning instrumen  densitometer  dilengkapi dengan digital konverter dan data akan diproses secara digitalisasi oleh komputer sehingga dapat ditentukan luas area dan data nilai Rf.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Hidrolisis  Xilan Ampas Singkong  oleh endo-β-1,4-D-xilanase
Proses  hidrolisis  xilan  ampas  singkong  dengan endo -1,4-D-xilanase menghasilkan  XOS. Hasil hidrolisis dari xilan ampas singkong oleh endo-β-1,4- D-xilanase kemudian  dipanaskan  pada  suhu  100 o C. Hal  ini  dilakukan  untuk  menghentikan reaksi enzimatis  yang  terjadi.  Larutan  tersebut  kemudian disentrifugasi  dengan  kecepatan  10.000  rpm  suhu 40 o C. Sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan antara produk  hidrolisis  dan  pengotor  lain  seperti enzim ataupun sisa rantai xilan  yang  tidak  dihidrolisis  oleh enzim endo-β-1,4-D-xilanase. Xilooligosakarida yang diperoleh dari produksi tersebut masih belum murni. Xiloologosakarida  produk  hidrolisis  xilan  ampas singkong dapat dilihat pada Gambar 1.

## Gambar 1. Xilooligosakarida Produk Hidrolisis Xilan Ampas Singkong
Hasil  Analisis  XOS Ampas  Singkong Sebelum dan Setelah Pemurnian dengan KLT Analisis  dengan  KLT  bertujuan  untuk  melihat kemampuan enzim dalam menghidrolisis xilan dalam campuran  sampel  dan  produk  hidrolisis  yang dihasilkan. Analisis juga didasarkan pada warna spot noda  yang  terbentuk  pada  titik  penotolan  dan munculnya spot baru  pada  kromatogram seiring dengan bertambahnya  waktu  hidrolisis..  Hasil pemisahan  setelah  proses  elusi  ditunjukkan  dengan adanya spot noda yang terpisah pada plat silika. Spot noda yang terlihat merupakan komponen-komponen dari XOS ampas singkong . Gambar 2 menunjukkan kromatogram  hasil  uji  KLT  dari  XOS.  ampas singkong.
Gambar  2 Kromatogram  XOS  Produk  Hidrolisis Xilan  Ampas  Singkong: (a)  xilan ampas singkong;  (b)  standar  xos;  (c)  standar xilosa; (d) xilan + enzim inaktif; (e) XOS ampas singkong sebelum pemurnian; (f)
XOS ampas singkong setelah pemurnian
a b c d e f
Dewi et al, Purification of Xilooligosaccharide From …
Gambar 2 merupakan kromatogram hasil uji KLT dari XOS ampas singkong menunjukkan produk dari XOS  yang  ditandai  dengan  terlihatnya spot noda  di plat  yang  digunakan. Pada Gambar 2  untuk lajur  a merupakan  sampel  xilan ampas  singkong  yang  tidak terhidrolisis.  Kromatogram  menunjukkan tidak adanya spot noda  yang  terelusi, dengan noda hanya berada pada titik awal penotolan. Pada lajur b standar XOS terlihat adanya spot noda yang terpisah. memiliki kandungan  X1  sampai  X6.  Lajur  c  standar  xilosa dengan adanya satu spot noda. Pada lajur d (xilan + enzim inaktif) tidak memperlihatkan adanya spot noda yang terpisah namun terdapat spot noda di titik awal penotolan.  Hal  tersebut  disebabkan  endo- -1,4-D- xilanase  yang  digunakan  merupakan  enzim  inaktif, sehingga  xilan  tidak  terhidrolisis  menjadi XOS. Kromatogram  KLT  pada XOS sebelum  pemurnian (lajur  e)  menunjukkan  beberapa spot noda  terpisah dan masih terdapatnya spot noda  di  titik  awal penotolan. Spot noda-yang terpisah adalah komponen XOS ampas singkong hasil hidrolisis endo- -1,4-D- xilanase.  Ini  menunjukkan  bahwa endo- -1,4-D- xilanase  mampu  menghidrolisis  xilan  dari  ampas singkong. Noda yang terdapat di titik awal penotolan tersebut diduga karena terdapat sisa xilan yang belum terhidrolisis  oleh  enzim. Xilan yang  belum terhidrolisis tidak bisa dielusi oleh eluen. Hal ini karena xilan merupakan polimer dengan berat molekul besar. Semakin  besar  ukuran  partikel,  maka  kemampuan bergerak  semakin  kecil  sehingga  menyebabkan kemampuan  difusi  juga  rendah [11].  Spot    noda- terpisah merupakan  komponen sampel XOS yang belum melalui pemurnian (lajur e) memiliki posisi yang hampir  sejajar  dengan  noda  pemisahan  dari  standar XOS (lajur b). Berdasarkan hasil perhitungan, noda- noda  produk  hidrolisis  sebelum  pemurnian  (lajur  e) yang mampu terbaca memiliki nilai Rf sebesar 0,3 dan 0,25. Nilai tersebut sama seperti nilai Rf standar XOS. Nilai Rf menunjukkan 0,3 dan 0,25 secara berturut- turut  sama  seperti  nilai  X5  dan  X6.  Data  nilai  Rf selengkapnya dapat  dilihat  pada  Tabel  1.  Hasil  ini menunjukkan  bahwa  hidrolisis  xilan  dari  ampas singkong  hanya  menghasilkan  produk  X5  dan  X6 . Data  yang  diperoleh  memiliki  kemiripan  dengan dengan  hasil  yang  dilaporkan  oleh  Rahma  yang menghasilkan produk X2 hingga X6 [12].
Tabel 1  Hasil  Perhitungan  Nilai  Rf  XOS  Sebelum Pemurnian Keterangan Sebelum Pemurnian Jarak Rf Standar Sampel Standar Sampel X1 6 - 0,6 - X2 5 - 0,5 - X3 4,5 - 0,45 - X4 3,5 - 0,35 - X5 3 3 0,3 0,3 X6 2,5 2,5 0,25 0,25
Deteksi kromatografi lapis tipis selanjutnya adalah XOS ampas singkong setelah proses pemurnian. pada (lajur f) Pada Gambar 2 menunjukkan beberapa spot noda  terpisah  dan  masih  terdapat spot noda  dititik awal  penotolan.  Noda-noda yang  terpisah yang dihasilkan pada kromatogram tersebut menunjukkan adanya  komponen XOS  ampas  singkong yang  telah dimurnikan  yaitu  X5  dan  X6  (Tabel 2),  sedangkan noda  yang  terdapat  di  titik awal penotolan  tersebut diduga karena terdapat sisa xilan yang tidak tersaring oleh membran.. Tahap pemurnian dengan ultrafiltrasi masih  belum  bisa  untuk  menghilangkan  sisa  xilan, hanya  bisa  memisahkan  komponen  saja.  Hasil  ini dapat dilihat dari adanya noda yang pekat di titik awal penotolan pada plat KLT. Bercak tersebut merupakan bercak  dari  sisa  xilan  yang  tidak  terhidrolisis  oleh endo- β-1,4-D-xilanase.  Hal  ini disebabkan  ukuran xilan  dari  ampas  singkong  tersebut  belum  diketahui secara  pasti  sehingga  ukuran  pori  membran  yang digunakan peneliti tidak mampu menghilangkan xilan. Tabel  2 Hasil  Perhitungan  Nilai  Rf  XOS Ampas Singkong Setelah Pemurnian
Keterangan Setelah Pemurnian Jarak Rf Standar Sampel Standar Sampel X1 6 - 0,6 - X2 5 - 0,5 - X3 4,5 - 0,45 - X4 3,5 - 0,35 - X5 3 3 0,3 0,3 X6 2,5 2,5 0,25 0,25
Dewi et al, Purification of Xilooligosaccharide From …
Hasil  Analisis  XOS  Sebelum  dan  Setelah Pemurnian dengan Densitometri Data hasil analisis yang diperoleh dari KLT tersebut diperkuat  dengan  data  metode  analisis  kedua  yaitu analisis densitometri. Hasil densitometri pertama dan kedua menunjukkan bahwa sampel XOS sebelum dan setelah  pemurnian  terdeteksi  memiliki  komponen yang sama yakni X3, X4, dan X5 (Tabel 3). Prediksi nilai komponen berdasarkan jarak dan Rf dari analisis KLT.  Hasil  yang  diperoleh  tersebut  memiliki  sedikit perbedaan  dengan  hasil  pada  analisis  KLT.  Hal  ini disebabkan densitometri memiliki tingkat akurasi yang lebih tinggi sehingga bisa membaca pita/bercak noda yang  sangat  tipis  seperti  X3,  sedangkan  data komponen  X6  (pada  KLT)  tidak  terbaca  pada densitometri.  Hal  ini  disebabkan  noda  pada  plat tersebut  terlalu  melebar  yang  akan  menghasilkan puncak absorbsi yang lebar dan tumpul[13]. Terjadinya pelebaran  pita  atau  noda  disebabkan  oleh ketidakmerataan diameter dari partikel fase diam yang menyebabkan  perbedaan  dorongan  kapiler,  yang secara  otomatis  akan  menghasilkan  kecepatan  aliran yang  tidak  merata  dari  fase  gerak  saat  melalui  pipa kapiler.
Tabel 3  Hasil Analisis XOS Ampas Singkong dengan
Densitometri No Sampel Rf Prediksi 1. Sampel 1 (Xos sebelum pemurnian) 0,28 X5 0,33 X4 0,44 X3 2. Sampel 2 (Xos sesudah pemurnian/ permeat ) 0,29 X5 0,34 X4 0,44 X3 Keterangan:  (X1)  Xilosa,  (X2)  Xilobiosa,  (X3)  Xilotriosa,  (X4) Xilotetrosa, (X5) Xilopentosa .

## KESIMPULAN
Komponen  xilooligosakarida  hasil  hidrolisis  xilan ampas singkong yang terdeteksi sebelum dan setelah pemurnian oleh membran ultrafiltrasi dengan metode kualitatif KLT adalah X5 dan X6. Sedangkan untuk metode  densitometri  yang  terdeteksi  adalah  X3,  X4 dan  X5.  Hasil  pemurnian  tersebut  belum  maksimal karena sisa xilan pada proses hidrolisis belum mampu terpisahkan.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Ratnadewi, A. A. I., A. B. Santoso, E. Sulistyaningsih, & W. Handayani. 2016. “Application of  Cassava Peel and Waste  as  Raw  Materials  for  Xylooligosaccharide Productin Using Endoxylanase from Bacillus Subtilis of Soil Termite Abdomen”. Procedia Chemistry . 18 (31-38). [2] Piluharto. 2003. Kajian Sifat Fisik Film Tipis Nata de Coco Sebagai Membran Ultrafiltrasi. Jurnal Ilmu Dasar . 4: 55.
[3] Wang Fei. 2011, Improvement in The Productivity of Xylooligosaccharides from  Rice  Straw by  Feed Xylanase with Ultrafiltration. Arch. Biol. Sci., Belgrade , 63(1): 161-166.
[4] Geetha  K.,  Gunasekaran,  P.  2017, .  Purification  of Endoxylanase  from  Bacillus  pumilus  B20  for Production  of  Prebiotic  Xylooligosaccharide  Syrup; An In vitro Study. Iran J Biotechnol . 15(4): 232–240.
[5] Debora  N.,  T.  Charlez,  G.  Ricard,  M.  Daniel.  2006. Purification  of   Xylo-oligosaccharides  from  Almond Shells  by  Ultrafiltration. Separation  and  Purification Technology . 53: 235-243.
[6] Rahmawati,  Melia  Dwi.  2016.  Studi  Kinetika  Reaksi Enzimatis Endo-β-1,4-D-Xilanase Terhadap Substrat Xilan  Ampas  Singkong.  Skripsi.  Jember:  Universitas Jember.
[7] Firdausa,  F.  K.  2016.  Ekstraksi  Xilan  dari  Limbah Ampas Singkong dan Pemanfaatnya Sebagai Substrat Endo-β-1,4-D-xilanase.  Skripsi.  Jember: Universitas Jember.
[8] Kurniawan,  Andika  Ade.  2015. “Optimasi  kondisi hidrolisis xilan oat dengan endo-β-1,4-D-xilanase asal mikroorganisme dalam sistem abdomenal rayap untuk produksi  xilooligosakarida”. Tidak  Diterbitkan. Skripsi: Universitas Jember.
[9] Kubata,  Suzuki,  Horitsu,  Kawai,  dan  Takamizawa. 1994.  “Purification  and  Characterization  of Aeromonas caviae ME-1 Xylanase V, Which Produces Exclusively  Xylobiose  from  Xylan”. Appl.  Environ. Microbiol . 60(2): 531.
[10] Wang  X,  Zhao  G,  Li  J. 2011 Kinetic  and Thermodynamic  Study  of  1-naphthol  Adsorption from  Aqueous  Solution  to  Sulfonated  Graphene Nanosheets. Chem Eng J. 173:185–90.
[11] Stoddard, J.M, Nguyen,L.,Chavez H.M.,and Nguyen,
K.,2007.  TLC  plates  as  a  convenient  platform  for solvent-free reactions Journal Chemical Communication, Issue 12 [12] Rahma, Marena Talita. 2016. “Karakterisasi Fermentasi Xilooligosakarida  Ampas  Singkong  Hasil Hidrolisis endo-β-1,4-D-xilanase oleh Lactobacillus acidhopilus ”. Skripsi: Universitas Jember.
Dewi et al, Purification of Xilooligosaccharide From …
[13] Jammes  J &  Dubery L.  2011. Identification  and Quantification of  Triterpenoid Centelloids in Centella asiatica  (L.)  Urban  by  Densitometric  TLC  Jacinda Journal of  Planar Chromatography. 2011. 24(1): 82-87.