## Anjarsari, I.R.D ∙ E. Suminar ∙ Murgayanti

## Studi pendahuluan regenerasi eksplan teh sebagai upaya percepatan penyediaan bibit unggul secara in vitro
Sari. Pembiakan generatif tanaman teh yang dilakukan dengan biji, sementara secara vegetatif dengan setek  tunas  yang    mempunyai  kelemahan,  antara  lain  jumlah  bibit  yang  dihasilkan  terbatas,  perlu waktu  lama  untuk  menyeleksi  pohon  induk,  dan  bibit  yang  dihasilkan  kurang  optimal  dalam penyerapan  air  dan  unsur  hara  karena  perakarannya  dangkal  sehingga  kurang  toleran  terhadap kekeringan.  Kultur  jaringan  menjadi  salah  satu  alternatif  dalam  perbanyakan  teh  memperoleh  klon teh  unggul,  seperti  klon  Seri  Gambung  1-11,  dalam  jumlah  banyak  dan  sifatnya  yang  seragam. Penelitian  pendahuluan  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium  Kultur  Jaringan  Departemen  Budidaya Pertanian Fakultas Pertanian UNPAD, mulai bulan Juni hingga Desember 2021. Penelitian terdiri dari dua  tahap,  yaitu  (i)  metode  deskriptif  untuk  menginduksi  eksplan  organ  teh  (pucuk  +  ruas  batang serta daun), dan (ii) metode eksperimen dengan menguji eksplan yang ditumbuhkan pada berbagai media.  Metode  percobaan  yang  digunakan  untuk  penelitian  ke-2  adalah  rancangan  acak  lengkap (RAL) dengan 6 kombinasi perlakuan Benzyl Amino  Purine (BAP) (0 dan 0,5 ppm) dan 2,4-D (0,05; 0,1;  dan  0,2  ppm).  Hasil  pengamatan  pendahuluan  menunjukkan  masih  banyak  eksplan  yang mengalami  kematian,  namun  beberapa  eksplan  potongan  daun  menunjukkan  respon  yang  baik dengan  mampu  membentuk  kalus  berwarna  hijau.  Kombinasi  0,5  ppm  BAP  +  0,05  ppm  2,4-D memberikan pengaruh lebih baik terhadap bobot kalus, sedangkan kombinasi 0,5 ppm BAP + 0,2 ppm 2,4D memberikan pengaruh baik terhadap diameter kalus.
Kata kunci : Eksplan teh ∙ In vitro ∙ Klon unggul

## Preliminary study of tea explant regeneration as an effort to accelerate the supply of superior seeds by in vitro
Abstract. Generative propagation of tea plants is done by seed, while the vegetative method is by shoot cuttings which have weaknesses, including the limited number of seedlings produced, it takes a long time to  select  the  mother  tree,  and  the  resulting  seedlings  are  not  optimal  in  absorbing  water  and  nutrients because their roots are  shallow making it less tolerant of drought. Tissue culture is an alternative in tea propagation to obtain superior tea clones, such as the Gambung Series 1-11 clones, in large quantities and with uniform characteristics. This preliminary research was carried out at the Tissue Culture Laboratory of the Department of Agronomy, Faculty of Agriculture, UNPAD, from June to December 2021. The research consisted  of  two  stages,  namely  (i)  a  descriptive  method  to  induce  tea  organ  explants  (shoots  +  stem segments and leaves), and (ii) an experimental method by testing explants grown on various media. The experimental  method  used  for  the  second  study  was  a  completely  randomized  design  (CRD)  with  6 treatment combinations of Benzyl Amino Purine (BAP) (0 and 0.5 ppm) and 2.4 D (0.05; 0.1; and 0 .2 ppm). Preliminary  observations  showed  that  there  were  still  many  death  explants  observed,  however,  some explants in form of cut leaves showed a good response by being able to form green callus. The combination of 0.5 ppm BAP + 0.05 ppm 2.4 D had a better effect on callus weight, while the combination 0.5 ppm BAP + 0.2 ppm 2.4D had a good effect on callus diameter.
Keywords : In vitro ∙ Tea explants ∙ Superior clones
Diterima :  15 November 2022, Disetujui : 21 Desember 2022, Dipublikasikan : 21 Desember 2022 DOI: http://dx.doi.org/10.24198/kultivasi.v21i3.36607
Anjarsari, I.R.D. ∙ E. Suminar ∙ Murgayanti Jurusan Budidaya Pertanian Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Padjadjaran Jl. Raya Bandung Sumedang Km. 21 Jatinangor, Sumedang 45363 Korespondensi: intan.ratna@unpad.ac.id
ISSN: 1412-4718, eISSN: 2581-138x

## Pendahuluan
Teh  ( Camellia  sinensis (L.)  Kuntze)  merupakan salah  satu  komoditas  yang  memiliki  nilai ekonomis  dan  strategis  dalam  pembangunan agribisnis  perkebunan  di  Indonesia,  karena merupakan  sumber  devisa  negara  dan pendapatan  rakyat  serta  penyedia  lapangan kerja  bagi  masyarakat.  Namun  selama  kurun waktu 10 tahun terakhir (2009-2018) telah terjadi laju  penurunan  produksi  daun  kering  per tahunnya  sebesar  1,15%,  yang  kemungkinan disebabkan diantaranya karena kondisi pertanaman  teh  di  Indonesia  (Zikria,  2017). Begitupun  dengan  produktivitas  perkebunan teh  rakyat  hanya  sebesar  1,4  ton/ha,  lebih  kecil jika  dibandingkan  dengan  perkebunan  milik negara  (1,8  ton/ha)  maupun  swasta  (1,52 ton/ha),  sehingga  produktivitas  teh  secara nasional  (1,59  ton/ha)  pun  masih  dibawah potensi  produksinya  (diatas  3  ton/ha).  Oleh karena itu, salah satu upaya Direktorat Jenderal Perkebunan  untuk  meningkatkan  produksi  dan produktivitas  tanaman  perkebunan  diawali dengan penggunaan benih unggul.
Penggunaan bahan tanaman teh monoklonal  dalam  satu  kebun  memiliki  risiko besar  jika  terjadi  ledakan  hama  atau  penyakit dan perubahan lingkungan yang sulit diprediksikan.  Untuk  mengurangi  kerugian yang  akan  muncul,  diperlukan  klon-klon  teh sinensis  baru  yang  potensial  agar  dapat menambah keragaman genetik sehingga pertanaman  memiliki  penyangga  individu ( individual  buffering )  dan  penyangga  populasi ( population  buffering )  (Sriyadi,  2012).  Secara konvensional,  tanaman  teh  dapat  diperbanyak secara  generatif  maupun  vegetatif.  Pembiakan generatif  dilakukan  dengan  biji,  namun pembiakan dengan cara ini sering menghasilkan tanaman  yang  berbeda  dengan  induknya. Pembiakan  secara  vegetatif  dapat  dilakukan dengan  setek  tunas.  Namun,  cara  perbanyakan ini  juga  mempunyai  kelemahan,  antara  lain jumlah  bibit  yang  dihasilkan  terbatas,  perlu waktu lama untuk menyeleksi pohon induk, dan bibit  yang  dihasilkan  kurang  toleran  terhadap kekeringan  karena  perakarannya  dangkal sehingga penyerapan air dan unsur hara kurang optimal.  Metode  kultur  in  vitro,  khususnya teknik  biak  sel,  berpotensi  untuk  mengatasi masalah tersebut.
Budidaya  jaringan  teh  menjadi  salah  satu alternatif  dalam  perbanyakan  teh  yang  dapat
digunakan  sebagai  pijakan  untuk  memperoleh klon  teh  unggul  dalam  jumlah  banyak  dan sifatnya yang seragam.  Dengan berkembangnya bioteknologi  tanaman,  khususnya  teknologi kultur  in  vitro,  teknik  perbanyakan  tanaman makin  luas  dan  dapat  dilakukan  dalam  waktu lebih singkat. Teknik kultur in vitro merupakan dasar pengetahuan yang mendorong berkembangnya  teknik  kultur  sel,  jaringan  dan organ  tanaman  secara  in  vitro  dalam  kondisi aseptik  dan  steril  dalam  laboratorium.  Teknik ini  merupakan  terobosan  dalam  program penyediaan  bibit  tanaman  dapat  ditingkatkan baik  kuantitas  maupun  kualitasnya  (Sriyadi, 2015).
Pada perbanyakan tanaman secara in vitro, eksplan  kotiledon  membutuhkan  waktu  yang lama  hingga  tanaman  menghasilkan  biji  yang akan  digunakan  sebagai  eksplan  dalam perbanyakan  tanaman.  Induksi  kalus  juga membutuhkan  waktu  sekitar  enam  bulan  sejak penanaman  kotiledon  hingga  pembentukan kalus.  Penelitian  tentang  perbanyakan  tanaman teh  melalui  kultur  jaringan  menggunakan eksplan  bagian  tanaman  muda  pada  tanaman teh  yang  ditanam  di  lapangan  dapat  dilakukan untuk  mendapatkan  metode  perbanyakan tanaman  yang  lebih  cepat  (Widhianata  dan Taryono, 2019). Keberhasilan budidaya jaringan teh  dipengaruhi  oleh  faktor  endogen  dan eksogen.  Pemilihan  sumber  dan  jenis  eksplan serta media tanam dan ZPT yang tepat, dan juga penanganan  terhadap  kontaminan,  diharapkan dapat  meningkatkan keberhasilan  dalam memperbanyak  teh  melalui  budidaya  jaringan (Eskundari,  2020).
Dasar-dasar  pembentukan  kultur  in  vitro adalah  jenis,  asal,  dan  ketersediaan  eksplan sepanjang  tahun.  Umumnya,  ujung  pucuk  dan segmen nodal dengan tunas ketiak dorman baik yang  berasal  dari  remaja  atau  dewasa  dari pertumbuhan  tahun  ini  biasanya  digunakan sebagai eksplan untuk tanaman teh (Singh et al ., 2019).  Komposisi  medium  yang  paling  sesuai harus dioptimalkan untuk mendapatkan produk yang  lebih  tinggi  serta  laju  pertumbuhan  yang lebih tinggi. Mikropropagasi umumnya melibatkan empat tahap berbeda: inisiasi kultur, perbanyakan tunas, perakaran tunas tumbuh in vitro,  dan  aklimatisasi  (Widhianata  dan Taryono, 2019).
Klon unggul teh seri Gambung (GMB1 - 11) adalah  klon  unggul  teh  dari  varietas  Assamica yang  memiliki  karakter  diantaranya:  daun  atau
pucuk  besar  dan  lebar,  permukaan  daun bergelombang  sangat  jelas  dan  terdapat  lapisan lilin,  tulang  daun  antara  8-13  pasang, percabangan  tanaman  baik,  persentase  pucuk peko  tinggi,  bentuk  batang  silinder,  warna batang  coklat  keabu-abuan,  warna  daun  antara hijau  agak  tua,  hijau  terang,  hijau  kekuningan, hijau  agak  muda,   hijau  sedikit  gelap,  dan perakaran baik sekali.  Klon ini memiliki potensi potensi  produksi  tinggi  4.021  kg  –  5800  kg  teh kering/  ha/tahun,  kandungan  antioksidan (katekin)  sangat  tinggi  13,9%  -  17,1%  dari  berat kering,  tahan  OPT  utama  pada  tanaman  teh terutama penyakit cacar daun teh (blister blight) (Sriyadi,  2012).  Klon-klon  ini  berpotensi dikembangkan melalui kultur in vitro berdasarkan sifat-sifat unggulnya.

## Bahan dan Metode
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan  Departemen  Budidaya  Pertanian Fakultas Pertanian UNPAD, mulai bulan Januari hingga Juni 2022. Bahan yang digunakan adalah eksplan teh berasal dari pucuk teh klon GMB 7, bahan  sterilisasi  berupa  fungisida,  bakterisida, NaHOCl 2%, HgCl 0.01%. Alat yang digunakan antara  lain laminar  air  flow  cabinet , petridish , pinset, scalpel , blade .
Penelitian tahap ke-1 merupakan percobaan awal melalui metode deskriptif untuk menginduksi  eksplan  organ  teh  dengan menggunakan media MS + 1 mg L -1 BAP + 0.05 mg  L -1 yang  biasa  digunakan  untuk  induksi kalus  pada  eksplan  anggrek  (Suminar et  al. 2010).  Percobaan  yang  dilakukan  terdiri  dari  2 set,  yaitu:  set  I  menanam  eksplan  pucuk  dan ruas  batang,  sedangkan  percobaan  set  II menggunakan  eksplan  potongan  daun.  Kultur menggunakan  25  botol,  masing-masing  botol ditanam  2  eksplan  sehingga  eksplan  potongan daun  yang  digunakan  berjumlah  50  potongan. Proses  penanaman  eksplan  pucuk    dan  ruas batang melalui proses tahapan sterilisasi sebagai berikut:  merendam  dengan  larutan  deterjen selama  5  menit,  fungisida  dan  bakterisida selama  15  menit,  perendaman  NaHOCl  2% selama  20  menit,  perendaman  dengan  NaHOCl 1%  selama  10  menit,  selanjutnya  diberikan larutan  HgCl  0,01%  dengan  mencelupkan eksplan  ke  dalam  larutan  tersebut.  Eksplan
ditanam dalam media MS + 1 mg L -1 BAP + 0,05 mg L -1 2,4-D. Pengamatan  penelitian tahap ke-1 dilakukan  secara  visual  terhadap  pertumbuhan eksplan  pucuk  dan  ruas  batang  tanaman  teh, pertumbuhan  eksplan  potongan  daun,  dan pertumbuhan kalus.
Penelitian  tahap  ke-2  adalah  metode eksperimen  dengan  menguji  eksplan  yang ditumbuhkan  pada  berbagai  media  untuk mendapatkan media yang tepat guna menunjang  eksplan  daun  tumbuh  menjadi kalus.  Eksplan  daun  disiapkan  melalui  tahapan sterilisasi  sebagai  berikut:  merendam  dengan larutan  deterjen  selama  5  menit,  fungisida  dan bakterisida  selama  15  menit,  perendaman NaHOCl  2%  selama  20  menit,  perendaman dengan  NaHOCl  1%  selama  10  menit, selanjutnya  diberikan  larutan  HgCl  0,01% dengan  mencelupkan  eksplan  ke  dalam  larutan tersebut.  Eksplan  daun  tanaman  teh  ditanam dalam media MS ditambah ZPT BAP dan  2,4-D sesuai perlakuan.
Metode  percobaan  yang  digunakan  yaitu rancangan  acak  lengkap  (RAL)  dengan  6 kombinasi  perlakuan.  Setiap  perlakuan  diulang 4  kali  sehingga  terdapat  24  satuan  percobaan.
Adapun perlakuan disusun sebagai berikut:
A : 0 ppm BAP + 0,05 ppm 2,4-D B : 0 ppm BAP + 0,1 ppm 2,4-D C: 0 ppm BAP + 0,2 ppm 2,4-D D : 0,5 ppm BAP + 0,05 ppm 2,4-D E : 0,5 ppm BAP + 0,1 ppm 2,4-D F : 0,5 ppm BAP + 0,2  ppm 2,4-D Pengamatan penelitian tahap ke-2 dilakukan terhadap bobot kalus, diameter kalus, dan  warna  kalus.  Bobot  kalus  (g)  dihitung dengan  cara  destruksi  pada  akhir  percobaan, yaitu 12 minggu setelah tanam (MST). Destruksi dilakukan dengan hati-hati dan kalus dibersihkan  dari  sisa  media  yang  menempel untuk  selanjutnya  ditimbang  menggunakan timbangan  analitik.  Diameter  kalus  (mm) diamati  pada  akhir  pengamatan,  yaitu  pada  12 MST.  Diameter  kalus  dihitung  dengan mengukur diameter terpanjang kalus menggunakan  milimeter  blok.  Pengamatan warna  dan  tekstur  kalus  pada  percobaan  ini dilakukan  pada  4  MST.  Warna  kalus  diamati dengan  menggunakan color  chart dari The  Royal Horticultural Society .
ISSN: 1412-4718, eISSN: 2581-138x

## Hasil dan Pembahasan
Pengujian Eksplan Organ Teh Pertumbuhan  Eksplan  Pucuk  dan  Ruas Batang Tanaman Teh. Hasil pengamatan pada 4 minggu  setelah  tanam  menunjukkan  beberapa eksplan  mengalami  perubahan  warna  menjadi kecoklatan, hal ini diduga adanya senyawa fenol yang  menyebabkan  kematian  eksplan,  media kultur  berupa  MS,  Sitokinin  BAP  dan  2,4-D.
Adanya  senyawa  fenol  yang  keluar  dari potongan jaringan menyebabkan pencoklatan dan eksplan  gagal  beregenerasi  dan  pada  umumnya muncul lalu terakumulasi saat ada pelukaan pada eksplan  yang  diinisiasi  oleh  aktivitas  enzim polyphenol  oksidase.  Menurut  Ru et  al .  (2013), browning dipicu oleh ketidakseimbangan metabolisme  dari Reactive  Oxygen  Species ,  yang menyebabkan  enzim  peroksidase  bekerja  pada membran  lipid  sehingga  integritas  dari  membran sel  hilang  lalu  mendorong  akumulasi  yang berlebihan  dari  senyawa  fenolik.  Adanya perubahan  permeabilitas  dari  membran  sel menyebabkan pelepasan enzim dan substrat pada sitosol sehingga menginisiasi terjadinya pigmentasi atau pencoklatan (Mellidou et al ., 2014) Solusi untuk meminimalisasi browning pada kalus adalah  dengan  menambahkan  senyawa  antifenol berupa  polivinyl  pirolidon  ke  dalam  media perlakuan  untuk  penanaman  eksplan  organ berupa pucuk dan ruas batang serta harus segera dilakukan subkultur agar tidak terjadi pencoklatan yang dapat menyebabkan kematian.
Pertumbuhan  Eksplan  Potongan  Daun. Hasil  pengamatan  menunjukkan  masih banyak  potongan  daun  yang  mengalami kematian.  Hal  ini  dapat  dilihat  dengan terjadinya  perubahan  warna  eksplan  menjadi coklat  dan  menyebabkan  kematian  eksplan. Namun  beberapa  eksplan  potongan  daun menunjukkan  respon  yang  baik  mampu membentuk  kalus  berwarna  hijau  pada  3  MST, diduga bersifat embrionik memiliki kemampuan untuk tumbuh (Gambar 1).
Menurut Nurwahyuni et al . (2020), eksplan daun  yang  lebih  produktif  dalam  induksi  kalus dan  multiplikasi  tunas  terbentuk  karena  daun memiliki  tulang  daun.  Pada  kondisi  demikian, eksplan  yang  berasal  dari  potongan  daun memiliki luka potongan pada berkas
pengangkut  (xylem  dan  floem)  cukup  banyak. Dengan  demikian  kalus  akan  terus  terbentuk sehingga  luka yang ada tertutup.
Gambar 1. Pertumbuhan eksplan potongan daun dalam media  MS + 0.5 mg L -1 BAP + 0.05 mg L -1 2,4-D
Salah satu media tanam yang paling banyak digunakan untuk budidaya jaringan adalah media MS.  Media  ini  juga  dilaporkan  cocok  untuk budidaya  jaringan  teh.  Media  MS  cocok  untuk budidaya jaringan melalui embriogenesis somatik teh  klon  Yabukita  dan  secara  spesifik menggunakan  pengenceran  ½  terhadap  media tanam tersebut untuk semua tahap perkembangan eksplan (Tahardi et al ., 2016)
Beberapa  ZPT  yang  digunakan  untuk budidaya  jaringan  meliputi  auksin,  sitokinin, dan asam giberelin (GA3). Ardiyani et al . (2020) melaporkan keberhasilan dalam induksi embriogenesis  somatik  menggunakan  sitokinin berupa Benzyl Amino Purine (BAP). Konsentrasi BAP sebesar 2 mg.L -1 memberikan hasil tertinggi dalam  induksi  embriogenesis  somatik  yaitu sekitar 57 %, disusul dengan konsentrasi sebesar 1  mg.L -1 dan  tanpa  penambahan  BAP,  masing- masing memberikan hasil sebesar sekitar 40 dan 30  %.  Eskundari  (2020)  melaporkan  bahwa penggunaan  BAP  dengan  konsentrasi  sebesar  2 mg.L -1 berhasil  menginduksi  organogenesis eksplan embryonic axis teh klon TRI2025 dengan persentase 100%, baik menggunakan media MS, ½  MS,  1/3  MS,  ¼  MS,  ataupun  1/8  MS.  Zat Pengatur  Tumbuh  yang  dapat  menggantikan hormone  auksin  salah  satunya  adalah  senyawa 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), merupakan herbisida daun lebar sistemik pasca kemunculan  yang  digunakan  untuk  kontrol selektif  tanaman  berdaun  lebar  dan  sebagai pengatur  pertumbuhan  tanaman  (auxin)  yang kuat pada konsentrasi rendah (Truta et al ., 2011). Keseimbangan  ZPT  endogen  dan  eksogen, kondisi  fisiologis  eksplan,  dan  kemampuan
eksplan  menyerap  hara  dan  komposisi  media tanam  mempengaruhi  pertumbuhan  eksplan. Dalam  perkembangan  eksplan  ini,  sitokinin mendorong  pembelahan  sel  dalam  biakan jaringan  dengan  cara  meningkatkan  peralihan dalam  daur  sel,  yatu  dari  G 2 (masa  sesudah replikasi DNA, sel bersiap untuk membelah) ke fase  mitosis  (pembelahan  sel),  hal  itu  dapat terjadi  karena  sitokinin  meningkatkan  laju sintesis protein (Takahashi and Umeda, 2014). Pertumbuhan  Kalus. Hasil  pengamatan pertumbuhan  kalus  pada  minggu  ke-1  hingga minggu  ke-3  menunjukkan  bahwa  pertumbuhan kalus  cukup  baik  ditandai  dengan  warna  kalus berwarna  hijau  umumnya    namun  ada  beberapa yang terkontaminasi (Gambar 2). Kalus merupakan  sekumpulan  masa  sel  yang  belum terorganisasi (amorphous) yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Kalus  dapat  terbentuk  pada  bekas-bekas  luka irisan karena sebagian  sel pada permukaan  irisan tersebut  akan  mengalami  proliferasi  (Bano et  al ., 2022)  yang  terbentuk    secara  in  vitro.  Terdapat beberapa  tipe-tipe  kalus  menurut  (Budisantoso et al .,  2017),  yaitu:  kalus  embriogenik,  kalus proliferatif, dan kalus senesen.
Induksi  kalus  diawali  dengan  penebalan eksplan  pada  bagian  potongan  dan  di  daerah yang  mengalami  pelukaan.  Penebalan  tersebut
merupakan  interaksi  antara  eksplan  dengan media  tumbuh,  zat  pengatur  tumbuh,  dan lingkungan tumbuh sehingga eksplan bertambah  besar  (Yelnititis,  2012).  Pada perlakuan  2,4-D  dengan  konsentrasi  yang  lebih rendah, eksplan hanya memperlihatkan penebalan dan tidak berkembang menjadi kalus walaupun  dikulturkan  dalam  jangka  waktu yang lama. Menurut Ogunyale (2014) konsentrasi  zat  pengatur  tumbuh  yang  berbeda memberikan  respon  yang  berbeda  terhadap induksi  kalus.  Senyawa  2,4-D    yang  diberikan pada  media  merupakan  jenis  auksin  yang berperan  dalam  merangsang  perbesaran  dan pembelahan  sel  untuk  membentuk  kalus. Selanjutnya, Dwipayana et al . (2016) menyatakan bahwa munculnya pembengkakan pada eksplan diakibatkan  adanya  pengaruh  pemberian  2,4-D yang  menginisiasi  pembelahan  dan  perbanya- kan  sel  akibat  penyerapan  air,  nutrisi  dan  zat pengatur  tumbuh  dari  media.  Perbesaran  sel disebabkan  oleh  meningkatnya  daya  plastisitas dinding  sel  dan  terbentuknya  enzim  selulase yang  dapat  melarutkan  selulosa  pada  dinding sel,  sehingga  menyebabkan  membran  dinding sel  lebih  mudah  dilalui  oleh  oksigen,  air,  dan garam  mineral  untuk  proses  pertumbuhan  dan perbesaran sel (Fauziyyah et al ., 2012).
M
ISSN: 1412-4718, eISSN: 2581-138x

## Pengujian Media Tumbuh Eksplan
Bobot  Kalus. Hasil  analisis  statistik menunjukkan bahwa pemberian BAP dan  2,4-D dapat  meningkatkan  bobot  kalus  (Tabel  1). Pemberian 0,5 ppm BAP dengan 0,05 ppm 2,4-D memberikan  pengaruh  nyata  terhadap  bobot kalus  namun  tidak  berbeda  nyata  dengan  0,5 ppm  BAP  dengan  0,1  ppm  2,4-D  serta  0,5  ppm BAP  dengan  0,2  ppm  2,4-D.  Keberhasilan induksi  kalus  pada  beberapa  perlakuan  di  atas mengindikasikan  bahwa  kombinasi  BAP  dan 2,4-D  pada  konsentrasi  tersebut  mampu mendorong terjadinya pembelahan dan pembentangan  sel  sehingga  mampu  meng- induksi kalus. Sesuai dengan Ikeuchi et al . (2013) yang  menyatakan  bahwa  dalam  pembentukan kalus, auksin berperan dalam pembentangan sel, sementara sitokinin berperan dalam pembelahan sel. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian BAP dan  2,4-D  berpengaruh  positif  terhadap  bobot kalus.
Tabel 1. Pengaruh pemberian BAP dan 2,4-D terhadap bobot kalus
Perlakuan Bobot Kalus (g) A  0 ppm BAP + 0,05 ppm 2,4-D 0,25 a B  0 ppm BAP + 0,1 ppm 2,4-D 0,53 bc C  0 ppm BAP + 0,2 ppm 2,4-D 0,33 ab D  0,5 ppm BAP + 0,05 ppm 2,4-D 0,61 c E  0,5 ppm BAP + 0,1 ppm 2,4-D 0,69 c F  0,5 ppm BAP + 0,2 ppm 2,4-D 0,79 c
Media  yang  sesuai  untuk  pertumbuhan kalus  yang  umum  digunakan  untuk  tanaman budidaya  adalah  media  MS  (Murashige  & Skoog)  dengan  tambahan  zat  pengatur tumbuh.  Zat  pengatur  tumbuh  sintetik  perlu ditambahkan karena zat pengatur umbuh yang terbentuk  secara  alami  seringkali  tidak mencukupi  pertumbuhan  jaringan  eksplan (Handayani et  al .,  2022).  Zat  pengatur  tumbuh yang  umum  digunakan  untuk  induksi  kalus adalah auksin dan sitokinin.
Pemberian  auksin  sangat  efektif  untuk menginduksi  pembentukan  kalus.  Kadar auksin yang lebih tinggi dari sitokinin memacu pembentukan  akar,  sementara  kadar  auksin
yang lebih rendah dibanding sitokinin memacu pembentukan  tunas,  dan  bila  kadar  keduanya yang  seimbang  akan  mengarahkan  eksplan pada pembentukan kalus. Kecepatan pembentukan kalus ditentukan oleh daya kerja dari  zat  pengatur  tumbuh  yang  diberikan  dan fitohormon yang terdapat pada eksplan. Indah dan  Ermavitalini  (2013)  menyatakan  bahwa penambahan  zat  pengatur  tumbuh  eksogen akan mengubah gradien fitohormon dalam sel- sel eksplan.  Menurut Purwitasari et al . (2012), penambahan  2,4-D  dalam  media  akan mendorong  pembelahan  dan  pembesaran  sel pada  eksplan  yang  kemudian  akan  memicu pembentukan  dan  pertumbuhan  kalus.  Zat pengatur  tumbuh  2,4-D  merupakan  jenis auksin  sintetik  yang  efektif  mendorong pembelahan  sel-sel  yang  telah  mengalami diferensiasi untuk kembali menjadi terdiiferensiasi.
Diameter  kalus. Kalus  yang  tumbuh dengan  baik  ditandai  adanya  pertambahan diameter,  setiap  milimeter  pertambahan  kalus menjadikan  jumlah  sel-sel  meningkat  sebagai materi  genetik  yang  terus  tumbuh  dan berkembang,    yang  selanjutnya  memiliki potensi  untuk  beregenerasi  menjadi  tunas (Latief et  al .,  2018).    Berdasarkan  Tabel  2, terlihat bahwa perlakuan E (0,5 ppm BAP + 0,2 ppm 2,4 D) menunjukkan diameter kalus lebih tinggi  dibandingkan  perlakuan  lainnya, walaupun  tidak  berbeda  nyata  dengan perlakuan  D  (0,5  ppm  BAP  +  0,05  ppm  2,4  D) dan  perlakuan  E  (0,5  ppm  BAP  +  0,1  ppm  2,4 D).    Secara  umum,  perlakuan  0,5  ppm  BAP dan 0,05 – 0,2 ppm 2,4 D berpengaruh terhadap pertumbuhan  diameter  kalus.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  pemberian  ZPT  secara eksogen  dapat  menunjukkan  efek  positif  pada pertumbuhan  vegetatif  kalus.  Zat  pengatur tumbuh 2,4 D memiliki efek fisiologis terhadap pertumbuhan  kalus  yang  secara  positif mempengaruhi sel, pembesaran, pembentukan tunas  dan  inisiasi  akar.  Pemberian    BAP  dan 2,4 D  dalam konsentrasi yang rendah mampu meningkatkan  diameter  kalus.  Pemberian  ZPT eksogen ini menginisiasi produksi hormon lain, dan  dalam  hubungannya  dengan  sitokinin (BAP)  mengontrol  pertumbuhan  batang,  serta diameter  dan  pertumbuhan  akar  (Ogunyale et al ., 2014).
Tabel 2. Pengaruh pemberian BAP dan 2,4-D terhadap diameter kalus
Perlakuan Rata-rata A 0 ppm BAP + 0,05 ppm 2,4-D 1,50  a B 0 ppm BAP + 0,1 ppm 2,4-D 1,78  ab C 0 ppm BAP + 0,2 ppm 2,4-D 1,63  a D 0,5 ppm BAP + 0,05 ppm 2,4-D 2,30  bc E 0,5 ppm BAP + 0,1 ppm 2,4-D 1,90  abc F 0,5 ppm BAP + 0,2 ppm 2,4-D 2,25  c
Warna  Kalus. Warna  dan  tekstur  kalus merupakan  salah  satu  indikator  dalam menentukan kalus tersebut masuk kategori kalus embrionik  atau non-embrionik. Indikator pertumbuhan  eksplan  pada  budidaya  in  vitro berupa warna kalus menggambarkan penampilan  visual  kalus  sehingga  dapat diketahui apakah suatu kalus masih memiliki sel- sel yang aktif membelah atau telah mati. Jaringan kalus  yang  dihasilkan  dari  suatu  eksplan biasanya  memunculkan  warna  yang  berbeda- beda.  Kualitas  kalus  yang  baik  memiliki  warna yang hijau. Menurut Rasud and Bustaman (2020), warna  kalus  mengindikasikan  keberadaan klorofil  dalam  jaringan.  Semakin  hijau  warna kalus  maka  semakin  banyak  pula  kandungan klorofilnya. Warna  terang  atau  putih  dapat mengindikasikan  bahwa  kondisi  kalus  masih cukup baik.
Tabel 3. Pengaruh pemberian BAP dan 2,4-D terhadap warna kalus
Perlakuan Ulangan I II III IV 0 ppm BAP + 0,05 ppm 2,4-D GG 143 C GG 143 D GG 143 D GG 143 C 0 ppm BAP + 0,1 ppm 2,4-D GG 143 C GG 143 D GG 143 D GG 143 D 0 ppm BAP + 0,2 ppm 2,4-D GG 143 A GG 143 D GG 141 B GG 143 D 0,5 ppm BAP + 0,05 ppm 2,4-D GG 141 D GG 143 B GG 141 A GG 143 C 0,5 ppm BAP + 0,1 ppm 2,4-D YGC 144 B YGC 144 A YGC 144 A YGC 144 A 0,5 ppm BAP + 0,2 ppm 2,4-D GG 143 A GG 143 C GG 143 D GG 143 D Keterangan : G.G. = green group ; Y.G.G. = yellow green group ; Y.G.C. = yellow  green ;
Warna  kalus  pada  4  MST  masih  pada kelas yellow green group (YGG) (Tabel 3), hal ini dikarenakan  kalus  pada  4  MST  masih diinkubasi  pada  ruangan  tanpa  cahaya, sehingga  menyebabkan  belum  terbentuknya klorofil pada kalus. Pada minggu ke-5 dan ke-6
kalus  kemudian  diinkubasi  dalam  ruangan dengan  cahaya  sehingga  kalus  yang  awalnya berwarna yellow  green  group menjadi  lebih hijau.  Penambahan 2,4-D pada media mempengaruhi
peningkatan
konsentrasi auksin endogen pada eksplan yang berhubungan  dengan  potensial  air  dalam  sel (Ariati,  2012).  Pengaruh  penambahan  auksin dari  luar  dan  kandungan  hormon  auksin endogen pada eksplan yang diproduksi secara internal juga sangat besar  pengaruhnya dalam pembentukan  kalus  tersebut    (Lizawati,  2012). Untuk  kalus  yang  teksturnya  kompak,  diduga disebabkan  penurunan  aktivitas  (Fadhilah et al .,  2015)  atau  meningkatnya  penyerapan  air oleh  medium  dari  dalam  sel  akibat  adanya perbedaan  konsentrasi  larutan  antara  ZPT dengan  hormon  endogen  eksplan  (Robbiani et al .,  2010),  Hubungan  antara  media  dasar  MS, jenis  eksplan,  dan  zat  pengatur  tumbuh  2,4-D, jenis  gula  dan  konsentrasi gula  juga mempengaruhi  tekstur  dan  warna  kalus.  Zat pengatur tumbuh 2,4-D berkontribusi terhadap pembentukan  warna  hijau.  Keberhasilan pembentukan  warna  hijau  merupakan  awal dari  regenerasi  tanaman,  dimana  regenerasi diinisiasi  oleh  pembentukan  akar  yang  diikuti oleh  pembentukan  spot  hijau.  Keberhasilan regenerasi  dipengaruhi  oleh  kombinasi  jenis auksin  dalam  media  regenerasi.  Interaksi  zat pengatur  tumbuh  auksin  dan  sitokinin  dalam tanaman  akan  mempengaruhi  diferensiasi  sel dan morfogenesis sel tanaman (Artadana et al ., 2017).

## Kesimpulan
Eksplan  organ  tanaman  teh  berupa  pucuk  dan ruas  batang  masih  mengalami  pencoklatan  dan gagal  beregenerasi,  sedangkan  eksplan  daun berhasil  membentuk  kalus  pada  media  yang diduga  bersifat  embrionik.  Kombinasi  0,5  ppm BAP  +  0,05  ppm  2,4-D  memberikan  pengaruh lebih  baik  terhadap  bobot  kalus,  sedangkan kombinasi  0,5  ppm  BAP  +  0,2  ppm  2,4D memberikan  pengaruh  baik  terhadap  diameter dan warna kalus.

## Daftar Pustaka
Ardiyani, F., E.S.W. Utami, H. Purnobasuki, and S.A.  Paramita.  2020.  Development  and
ISSN: 1412-4718, eISSN: 2581-138x
regeneration  of  somatic  embryos  from leaves-derived  Calli  of  Coffea  Liberica.
Biodiversitas, 21(12): 5829–5834. https://doi.org/10.13057/biodiv/d211246 Ariati. 2012. Pengaruh
Perimbangan
Konsentrasi  NAA  dan  Kinetin  Terhadap Pertumbuhan Tiga Varietas Anggrek  Pada Media  Greener  Melalui  Teknik  Kultur Jaringan. [Skripsi]. Universitas Jember.
Artadana,  I.B.M.,  G.B.F.  Suhono,  P.H.  Hardjo, M.  Purwanto,  Y.B.  Wang,  and  K. Supaibulwatana.  2017.  Plant  regeneration induced  from  mature  embryo-derived callus of Balinese red rice (Oryza sativa Cv. Barak  Cenana).  Bali  Medical  Journal,  6(3): 12. https://doi.org/10.15562/bmj.v6i3.710 Bano, A.S., A.M. Khattak, A. Basit, M. Alam, S.T. Shah, N. Ahmad, S.A.Q. Gilani, I. Ullah, S. Anwar,  and  H.I.  Mohamed.  2022.  Callus induction,  proliferation,  enhanced  secon- dary  metabolites  production  and  anti- oxidants activity of Salvia moorcroftiana L. as  influenced  by  combinations  of  auxin, cytokinin and melatonin. Brazilian Archives of Biology and Technology, 65: 1– 16. https://doi.org/10.1590/1678-4324- 2022210200
Budisantoso,  I.,  N.  Amalia,  and  K.  Kamsinah.
2017.  In  vitro  callus  induction  from  leaf explants  of  Vanda  sp  stimulated  by  2,4-D. Biosaintifika: Journal  of Biology & Biology Education,  9(3):  492.  https://doi.org/ 10.15294/biosaintifika.v9i3.11018
Dwipayana,  G.,  H.  Yuswanti,  dan  I.  Mayun. 2016. Induksi kalus stroberi (Fragaria Spp.) melalui  aplikasi  asam  2,4-Diklorofenok- siasetat  secara  in  vitro.  E-Jurnal  Agro- ekoteknologi  Tropika  (Journal  of  Tropical Agroecotechnology), 5(3): 310–321. Eskundari,  R.D.  2020.  Budidaya  jaringan tanaman  teh  di  Indonesia.  BIOMA:  Jurnal Biologi Makasar, 5(1): 121–130.
Fadhilah, N., Z.A. Noli, dan S. Suwirmen. 2015. Induksi kalus Artemisia vulgaris L. dengan pemberian  beberapa  konsentrasi  2,4- Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D). Jurnal
Biologi Unand, 4(4): 216.
https://doi.org/10.25077/jbioua.4.4.216- 222.2015
Fauziyyah,  D.,  T.  Hardiyati,  dan  Kamsinah. 2012.  Upaya  memacu  pembentukan  kalus eksplan  embrio  kedelai  (Glycine  max  (L.) Merril) dengan pemberian kombinasi 2.4-D dan  sukrosa  secara  kultur  in  vitro.  Jurnal
Pembangunan Pedesaan, 12(1): 30–37. Handayani,  E., M.B.  Irsyadi,  R.L.M.N. Alawiyah,  and  I.  Aris.  2022.  Effect  of explants  sterilization  and  plant  growth regulators  on  embryo  culture  of  kepel (Stelechocarpus  burahol).  IOP  Conference Series:  Earth  and  Environmental  Science, 985(1):  0–7.  https://doi.org/10.1088/1755- 1315/985/1/012016
Ikeuchi,  M.,  K..  Sugimoto,  and  A.  Iwase.  Plant callus:  mechanisms  of  induction  and repression. Plant Cell, 25(9): 3159-3173. doi: 10.1105/tpc.113.116053.
Indah,  P.N.  dan  D.  Ermavitalini.  2013.  Induksi kalus  daun  nyamplung  (Calophyllum inophyllum Linn.) pada beberapa kombinasi  konsentrasi  6-Benzylamino- purine  (BAP)  dan  2,4-Dichlorophen- pxyacetic  Acid  (2,4-D).  Jurnal  Sains  Dan Seni Pomits, 2(1): 1–6.
Latief,  M.F.,  P.  Karti,  dan  I.  Prihantoro.  2018. Daya  tumbuh  kalus  lamtoro  varietas Tarramba  hasil  iradiasi  sinar  Gamma  40 Gray yang toleran asam pada media 2.4-D. Buletin  Makanan  Ternak,  16(1):  36–46. https://doi.org/https://journal.ipb.ac.id/ index.php/bulmater/issue/viewIssue/198 5/85
Lizawati.  2012.  Induksi  kalus  embriogenik  dari eksplan  tunas  apikal  tanaman  jarak  pagar (Jatropha  curcas  L.)  dengan  penggunaan 2,4  D  dan  TDZ.  Bioplantae,  1(2):  75–87. https://online-
journal.unja.ac.id/bioplante/article/view/ 1808
Mellidou, I.,  K. Buts,  D. Hatoum,  Q.T. Ho, J.W. Johnston,  C.B.  Watkins,  R.J.  Schaffer,  N.E. Gapper,  J.J.  Giovannoni,  D.R.  Rudell, M.L.A.T.M. Hertog, and B.M. Nicolai. 2014. Transcriptomic  events  associated  with internal  browning  of  apple  during postharvest  storage.  BMC  Plant  Biology, 14(1): 1–17. https://doi.org/10.1186/ s12870-014-0328-x
Nurwahyuni,  I.,  M.  Situmorang,  and  R.  Sinaga. 2020.  Plant  regeneration  through  callus cultures  from  leaf  explant  of  Sumatra Benzoin  (Styrax  benzoin).  International Journal  of  Forestry  Research,  2020. https://doi.org/10.1155/2020/8860178 Ogunyale, O.G., O.O. Fawibe, A.A. Ajiboye, and D.A.  Agboola.  2014.  A  review  of  plant growth substances: Their forms, structures, synthesis  and  functions.  Journal  of
Advanced Laboratory Research in Biology, 5(4): 152–168.
Purwitasari,  A.T.,  M.  Amin,  B.  Setya,  dan  U. Airlangga.  2012.  Pengaruh  konsentrasi  zat pengatur tumbuh (asam-2,4- diklorofenok- siasetat) terhadap pertumbuhan. Journal of Marine and Coastal Science, 1(2): 61–70. Rasud, Y. and B. Bustaman. 2020. In Vitro Callus Induction from Clove (Syzigium aromaticum  L.)  Leaves  on  Medium Containing Various Auxin Concentrations. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia, 25(1), 67– 72. https://doi.org/10.18343/jipi.25.1.67 Robbiani,  D.,  N.  Tutik,  dan  N.  Jadid.  2010. Pengaruh  Kombinasi  Naphthalene  Acetic Acid  (NAA)  dan  Kinetin  pada  Kultur  In Vitro  Eksplan  Daun  Tembakau  (Nicotiana tabacum L. var. Prancak 95). 1-13.
Ru, Z., Y. Lai, C. Xu, and L. Li. 2013. Polyphenol Oxidase  (PPO)  in  early  stage  of  browning of  phalaenopsis  leaf  explants.  Journal  of Agricultural Science, 5(9): 57–64. https://doi.org/10.5539/jas.v5n9p57
Singh,  A.K.,  G.K.  Rai,  S.  Bagati,  and  S.  Kumar. 2019.  Tissue  cultures.  Monographs  on Atherosclerosis,
1(July):
1–143.
https://doi.org/10.1201/b21441-193
Sriyadi,  B.  2012.  Seleksi  klon  teh  assamica unggul berpotensi  hasil dan kadar katekin tinggi.  Jurnal  Penelitian  Teh  Dan  Kina, 15(1): 1–10.
Sriyadi,  B.  2015.  Penilaian  hubungan  genetik klon  teh  berdasarkan  komponen  senyawa
kimia  Utama  Dan  Potensi  Hasil.  Jurnal Penelitian Teh Dan Kina, 18(1): 1–10. Tahardi,  J.S.,  T.  Raisawati,  I.  Riyadi,  dan  W.A. Dodd.  2016.  Embriogenesis  somatik langsung  dan  regenerasi  tanaman  teh melalui  perendaman  sesaat.  E-Journal Menara  Perkebunan,  68(1).  https://doi. org/10.22302/ppbbi.jur.mp.v68i1.133
Takahashi, N. and M. Umeda. 2014. Cytokinins promote  onset  of  endoreplication  by controlling  cell  cycle  machinery.  Plant Signaling  and  Behavior,  9(8):  11–13. https://doi.org/10.4161/psb.29396
Truta,  E.,  M.  Zamfirache,  M.,  C.  Rosu,  Z.
Olteanu,  C.  Mihai,  and  D.  Ghergel.  2011. Cytogenetic  effects  induced  by  2,4-D  and kinetin  in  radish  and  common  bean  root meristems. Rom Agric Res., 28: 207–215.
Widhianata, H. and Taryono. 2019.
Organogenesis  responses  of  tea  (Camellia sinensis  (L.)  O.  Kuntze)  var.  assamica  and sinensis.  AIP  Conference  Proceedings, 2099(April). https://doi.org/10.1063/1.5098431
Yelnititis.  2012.  Pembentukan  kalus  remah  dari eksplan daun ramin (Gonystylus bancanus (Miq)  Kurz.).  Jurnal  Pemuliaan  Tanaman, 6(3): 181–194.
Zikria,  R.  2017.  Outlook  Teh  2017 :  Komoditas Pertanian  Subsektor  Perkebunan.  Pusat Data  Dan  Sistem  Informasi  Pertanian Sekretariat  Jenderal  Kementerian  Perta- nian. Jakarta.