## PERBANDINGAN DETEKSI PROLIFERASI SEL DENGAN IMUNOHISTOKIMIA PCNA DAN BrdU PADA PANKREAS TIKUS

## EVALUATION OF CELL PROLIFERATION IN RAT PANCREAS WITH PCNA AND BrdU IMMUNOHISTOCHEMISTRY
David Pakaya 1 , Wiwit Setyowati 2 , Rina Susilowati 2
1 Departemen Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Tadulako, Palu
2 Departemen Histologi Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat dan Keperawatan Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Korespondensi: dr. David Pakaya, M.Biomed. Email: david_pakaya@untad.ac.id

## ABSTRAK
Pankreas merupakan jaringan labil karena terdiri dari sel-sel asinar yang selalu berproliferasi sepanjang hidupnya  untuk  menggantikan  sel  yang  rusak.  Proliferasi  tersebut  dapat  diidentifikasi  dengan  pemeriksaan histologis,  yaitu  mikroteknik  dengan  pewarnaan  imunohistokmia  (IHC).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk membandingkan deteksi proliferasi sel dengan IHC anti-PCNA dan anti-BrdU pada pankreas. Tikus diinjeksi BrdU secara intraperitoneal sebanyak 4 kali dengan selang waktu 3 jam dengan dosis BrdU 0,125 ml, 0,375 ml, 0,250 ml, dan 0,250 ml dan dibiarkan selama 1 malam. Jaringan pankreas dipotong sepanjang ± 5 mm dan direndam dalam fiksatif  paraformaldehid  4%,  kemudian  dibuat  blok  paraffinnya.  Blok  parafin  diiris  dengan  ketebalan  6µm  untuk pengecatan hematoksilin eosin (HE) dan 4 µm untuk pengecatan IHC. Pengecatan IHC dengan antibodi anti PCNA (antibodi  monoklonal  PCNA  1;1000  dalam  PBS).  Pengecatan  IHC  dengan  antibodi  anti  BrdU  menggunakan antibodi  primer  (antibodi  anti  BrdU  1:1000).  Pengecatan  dianalisis  secara  kualitatif.  IHC  menggunakan  antibodi anti-PCNA  dan  anti-BrdU  menunjukkan  adanya  penyebaran  warna  coklat  gelap  yang  menandakan  proliferasi  sel aktif,  dimana  sel  yang  terekspresi  pada  BrdU  lebih  sedikit  dibandingkan  PCNA.    Penelitian  ini  menyimpulkan bahwa  proliferasi  sel  pankreas  dapat  terekspresi  melalui  perwarnaan  IHC  dengan  antibodi  anti  PCNA  dan  anti BrdU.
Kata kunci: Imunohistokimia, PCNA, Brdu, Proliferasi

## ABSTRACT
The pancreas is a labile tissue because it consists of acinar cells which proliferate throughout their lives to replace damaged cells. The proliferation can be identified by histological examination, that is microtechnics with immunohistochmia  (IHC)  staining.  This  study  aims  to  compare  the  detection  of  cell  proliferation  with  anti-PCNA and  anti-BrdU  IHC  in  the  pancreas.  The  rats  were  injected  BrdU  intraperitoneally  4  times  with  an  interval  of  3 hours with a dose of BrdU 0.125 ml, 0.375 ml, 0.250 ml, and 0.250 ml and left for 1 night. Pancreatic tissue were necropsy along ± 5 mm and soaked in 4% paraformaldehyde fixative, then made paraffin block. The paraffin block was  sliced  to  a  thickness  of  6  µm  for  hematoxylin  eosin  (HE)  and  4  μm  for  IHC  painting.  IHC  used  anti  PCNA antibodies (PCNA monoclonal antibody 1; 1000 in PBS) and anti BrdU antibodies (anti BrdU primary antibodies 1: 1000).  Staining  was  analyzed  qualitatively.  IHC  with  anti-PCNA  and  anti-BrdU  antibodies  showed  the  spread  of dark  brown  which  indicates  active  cell  proliferation,  whereas  cells  expressed  in  BrdU  are  less  than  PCNA.  This study concluded that pancreatic cell proliferation can be expressed through the coloring of IHC with anti-PCNA and anti-BrdU antibodies.
Keyword: Immunohistochemistry, PCNA, Brdu, Proliferation
How To Cite: Pakaya, D., Setyowati, W., & Susilowati, R. (2020). PERBANDINGAN DETEKSI PROLIFERASI SEL DENGAN IMUNOHISTOKIMIA PCNA DAN BrdU PADA PANKREAS TIKUS. Biomedika, 12(2), 98-106 doi:https://doi.org/10.23917/biomedika.v12i2.10641
DOI: https://doi.org/10.23917/ biomedika.v12i2.10641

## PENDAHULUAN
Proliferasi sel merupakan siklus pembelahan  sel,  sel  tumbuh,  mereplikasi  DNA- nya, dan kemudian membagi menjadi dua sel anak (Albert et al., 2010). Siklus sel ini terbagi menjadi 4 fase yaitu G1 (presintesis), S (sintesis DNA), G2 (premitosis),  M  (mitosis)  (Albert et  al., 2010; Kumar et al ., 2014). Proliferasi sel dikontrol oleh sinyal  dari  lingkungan  mikro,  baik  yang menstimuli  maupun  menghambat  proliferasi tersebut.  Jaringan  tubuh  dibagi  menjadi  tiga kelompok  berdasarkan  aktifitas  proliferasinya, yaitu:  1)  jaringan  labil  yang  terus-menerus membelah.  2)  jaringan  stabil  yang  berada  dalam keadaan normal, 3) jaringan permanen yang tidak membelah yaitu sel-sel yang  meninggalkan siklus sel dan tidak mengalami pembelahan mitosis pada postnatal kehidupan (Kumar et al ., 2014).
Pankreas merupakan jaringan labil, sel-sel asinar  selalu  berproliferasi  sepanjang  hidupnya untuk  menggantikan  sel-sel  yang  rusak.  Untuk mengidentifikasi  proliferasi  tersebut  diperlukan pemeriksaan histologis dengan mikroteknik menggunakan  pewarnaan  imunohistokmia  (IHC) (Yin et al. , 2014). Aktifitas tersebut dapat diamati dengan  adanya  ikatan  antigen  dan  antibodi  yang
sangat spesifik. Melalui IHC dapat memvisualisasikan  letak  protein  spesifik  dan bukan  hanya  protein  dengan  aktivitas  enzimatik (Mescher, 2013).
Proliferating cell nuclear antigen (PCNA ) merupakan  suatu  siklin  yang  berkarakter sebagai sliding  clamp , berfungsi  sebagai  suatu faktor  progressivitas. 5-Bromo-2’-Deoxyuridine (BrdU)  merupakan  analog  sintetik  dari  timidin yang  dimasukkan  ke  dalam  DNA  selama  fase  S dari  siklus  sel.  Keduanya  digunakan  sebagai penanda adanya proliferasi sel. Hal ini dipengaruhi  karena  PCNA  berperan  sebagai sliding  clamp akan  membentuk  gulungan  yang mampu  berinteraksi  dengan  protein-protein  lain yang  terlibat  dalam  replikasi  DNA ,  dan BrdU cepat berasimilasi dengan sel-sel yang berproliferasi  (Maga and Hübscher,  2003; Muskhelishvili et  al ,  2003). Penelitian  ini bertujuan  untuk  melihat  struktur  histologis pankreas  dan  membandingkan  deteksi  proliferasi sel  dengan  IHC  menggunakan  antibody  anti PCNA dan antibody anti BrdU.

## METODE Perlakuan Hewan coba
Hewan  coba  yang  digunakan  adalah  1 ekor  tikus  betina  galur  Wistar,  usia  3  minggu, berat  badan  250  gram,  dari  Laboratorium  Hewan Coba  Fakultas  Farmasi  UGM. Tikus  ditimbang, dan  disuntikan  BrdU  secara  intraperitoneal sebanyak  4  kali  pada  area  yang  berbeda  dengan selang  waktu  3 jam.  Pertama,  dengan  dosis  BrdU 0,125  ml,  ke-2,  0,375  ml,  ke-3  0,250  ml,  terakhir 0,250  ml  dan  dibiarkan  selama  1  malam.  Metode ini  merupakan  hasil  pengoptimuman  pewarnaan BrdU  secara  in  vivo  yang  digunakan  di laboratorium Histologi FKKMK UGM.

## Perfusi dan Nekropsi
Tikus  dianestesi  terlebih  dahulu  sebelum nekropsi,  dengan Chloral  hydrate sebanyak  1  ml secara  intraperitoneal.  Tikus  diletakkan  pada  bak paraffin,  dimulai  proses  perfusi transcardial
dengan  PBS  dialirkan  selama  5  menit  dan paraformaldehid  4%  selama  15  menit.  Setelah tikus  terfiksasi  sempurna  kemudian  di  ambil jaringan pankreas dipotong sepanjang ± 5 mm dan dicuci  dengan  NaCl  0,9%,  selanjutnya  jaringan direndam dalam wadah yang berisi larutan fiksatif paraformaldehid 4%.

## Pembuatan blok parafin dan Pengecatan
Sampel  pankreas  dibuat  blok  paraffin. Pengirisan  dilakukan  dengan  mikrotom  putar, untuk  setiap  pengecatan  dibuat  3  irisan.  Blok parafin  diiris  dengan  ketebalan  4  µm  untuk pengecatan IHC. Pengecatan IHC dengan antibodi anti  PCNA  menggunakan  antibodi  primer (antibodi  monoklonal  PCNA  1;1000  dalam  PBS) yang diinkubasi selama 10 menit. Pengecatan IHC dengan antibodi anti BrdU menggunakan antibodi primer  (antibodi  anti  BrdU  1;1000)  yang diinkubasi overnight ,  pada  suu  ruang.  Seluruh kontrol  negatif  adalah  jaringan  pankreas  yang hanya  diberikan  larutan  PBS  (Kumar  and  Lars, 2009).

## Pengamatan
Pengamatan  dilakukan  dengan  mikroskop cahaya  Olympus  CX21  yang  terhubung  dengan kamera  digital.  Foto  dibuat  dengan Software “Optilab”.  Jaringan akan dianalisis secara kualitatif.  Pada  Pankreas  akan  diamati  sel-sel asinus,  sel  yang  berproliferasi  akan  menunjukkan warna coklat.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Gambaran proliferasi sel dengan PCNA
Pengecatan IHC merupakan suatu metode pewarnaan  jaringan  yang  digunakan  untuk mendeteksi  adanya  suatu  antigen  atau  antibodi pada  sel  atau  jaringan,  melaui  reaksi  imunologik dan  kimiawi.  Reaksi  imunologik  IHC  ditandai dengan adanya reaksi antara antigen dan antibodi. Sedangkan reaksi kimiawi ditandai dengan adanya reaksi enzimatik antara enzim dan substrat.
Pengamatan dilakukan dengan menggunakan  3  sediaan  jaringan  histologis  yaitu (1)  kontrol  negatif  berupa  jaringan  pankreas
dengan  PBS  tanpa  anti-PCNA,  (2)  kontrol  positif berupa  jaringan  kolon  dengan  antibodi  anti- PCNA,  dan  (3)  sampel  berupa  jaringan  pankreas dengan  anti-PCNA.  Pengecatan  dengan  metode indirect IHC  menggunakan  antibodi  primer  (anti- PCNA)  dan  sekunder  ( trekki  universal  link )  yang dilabel  dengan  biotin.  Pewarnaan  label  dengan betazoid  DAB  memberikan  citra  coklat  gelap untuk mempermudah pengamatan dengan mikroskopis.  Berdasarkan  gambaran  struktur histologis sel yang aktif berproliferasi memberikan  warna  coklat  gelap  seperti  yang tampak pada gambar 2.
Gambar 1. Gambaran IHC dengan anti-PCNA (skala 10µm). (A, B & C) Kontrol negatif menggunakan jaringan Pankreas, tidak tampak adanya proliferasi sel. (D, E & F) kontrol positif menggunakan jaringan kolon. Tampak sel- sel positif mengalami proliferasi yang ditandai dengan sel-sel berwarna coklat pada sebagian besar jaringan. (G, H & I) sampel jaringan pankreas yang diberikan antibodi PCNA, tampak sel-sel positif mengalami proliferasi hampir pada semua sel.
Gambar 1. A, B dan C, jaringan pankreas sebagai kontrol negatif hanya diberikan PBS tanpa antibodi  anti-PCNA,  tidak  menunjukkan  adannya proliferasi sel (imunonegatif), yang ditandai tidak ada  warna  atau  citra  coklat  gelap.  Hal  ini  berarti bahwa  tidak  adanya  reaksi  antigen-antibodi sehingga  pada  saat  pewarnaan.  Gambar  1.  D,  E dan  F,  jaringan  kontrol  positif  berupa  jaringan kolon yang diberi antibodi anti-PCNA.
Menunjukkan  aktivitas  proliferasi  sel  ditandai dengan  sel-sel  yang  berwarna  coklat  gelap (proliferasi  sel  aktif)  yang  luas  pada  jaringan tersebut.  Gambar  1.  G,  H  dan  I  yaitu  jaringan sampel  menunjukkan  penyebaran  warna  coklat gelap  atau  proliferasi  sel  aktif.  Jaringan  sampel yang  diperiksa  berupa  irisan  jaringan  pankreas yang  diberikan  antibodi  anti-PCNA.  Sel  pankreas sampel  yang  aktif  berproliferasi  menghasilkan antigen PCNA dan berikatan dengan antibodi anti- PCNA.  Ikatan  ini  membentuk  reaksi  imunologi sehingga  dapat  diberi  label  pada  antibodi sekunder.  Betazoid  DAB  akan  menempel  pada antibodi  sekunder  yang  berikatan  pada  antibodi primer  sehingga  sel  yang  aktif  berproliferasi berwarna coklat gelap.
Molekul PCNA merupakan  stimulator sintesis  DNA  yang  dikatalisis  oleh  enzim  DNA polimerase.  Enzim  ini  bertindak  sebagai sliding clamp yang  berfungsi  sebagai  suatu  faktor progresivitas.  Factor  progresivitas  ini  akan membentuk  gulungan  yang  mampu  berinteraksi dengan  protein-protein  lain  yang  terlibat  dalam replikasi DNA. Satu atau beberapa DNA helikase dan  protein  pengikat untai  tunggal  atau single- stranded  binding  protein (Ssb)  yang  disebut dengan  protein  replikasi  A  atau replication protein  A (RP-A) diperlukan  untuk  memisahkan kedua  untai  DNA  (Wang,  2014).  Pada  tahap selanjutnya,  tiga  DNA  polimerase  yang  berbeda terlibat  dalam  elongasi.  Untai  pengarah  dan masing-masing  fragmen  untai  tertinggal  diinisiasi oleh  RNA  primer  dengan  bantuan  aktivitas primase  yang  merupakan  bagian  integral  enzim DNA  polimerase.  Enzim  ini  akan  meneruskan elongasi replikasi tetapi kemudian segera digantikan  oleh  DNA  polimerase  pada untai  pengarah  dan  DNA  polimerase  pada  untai tertinggal.  Enzim  DNA  polimerase  mempunyai fungsi penyuntingan. Kemampuan DNA polimerase  untuk  mensintesis  DNA  yang  panjang
disebabkan oleh adanya antigen PCNA ( Maga and Hübscher, 2003; Muskhelishvili et al. , 2003).

## Gambaran proliferasi sel dengan BrdU
Penelitian  ini  diawali  penyuntikan  4  kali secara  teratur  dan  dilakukan  inkubasi overnight tujuannya  untuk  lebih  mengakumulasikan  antigen tersebut  sehingga  dapat  terekspresi  dengan  baik. Pengamatan  dilakukan  dengan  menggunakan  3 sediaan  jaringan  histologis  yaitu  (1)  kontrol
negatif  berupa  jaringan  pankreas  dengan  PBS tanpa  anti-BrdU,  (2)  kontrol  positif  berupa jaringan  kolon  dengan  antibodi  anti-  BrdU,  dan (3) sampel  berupa jaringan  pankreas  dengan  anti- BrdU.  Pewarnaan  dengan  metode indirect IHC menggunakan  antibodi  primer  (anti-  BrdU)  dan sekunder  ( trekki  universal  link )  yang  dilabel dengan  biotin.  Pewarnaan  label  dengan  betazoid DAB  memberikan  citra  coklat  gelap  seperti  yang tampak pada gambar 2.
Gambar 2. Gambaran IHC dengan anti-BrdU (skala 10µm). (A, B & C) Kontrol negatif menggunakan jaringan Pankreas, tidak tampak adanya proliferasi sel. (D, E & F) kontrol positif menggunakan jaringan kolon. Tampak sel- sel positif mengalami proliferasi yang ditandai dengan sel-sel berwarna coklat. (G, H & I) sampel jaringan pankreas yang diberikan antibodi BrdU, pada perbesaran 400x tampak sel-sel positif mengalami proliferasi.
Gambar 2. A, B dan C, jaringan pankreas sebagai kontrol negatif hanya diberikan PBS tanpa antibodi  anti-BrdU,  tidak  menunjukkan  adannya sel  yang  berproliferasi  (imunonegatif),  dengan ditandai  tidak  ada  warna  atau  citra  coklat  gelap. Gambar  2.  D,  E  dan  F,  jaringan  kontrol  positif berupa  jaringan  kolon  yang  diberi  antibodi  anti- BrdU.  Menunjukkan  aktivitas  proliferasi  sel ditandai  dengan  sel-sel  yang  berwarna  coklat gelap  pada  jaringan  tersebut.  Antigen  BrdU diekspresikan  oleh  sel  yang  aktif  berproliferasi
sehingga  hasil  pengamatan  mikroskopis  jaringan kontrol  positif  memberikan  warna  coklat  gelap. Gambar  2.  G,  H  dan  I  jaringan  sampel  yang diperiksa  berupa  irisan  jaringan  pankreas  yang diberikan antibodi anti-BrdU. Sel pankreas sampel yang  aktif  berproliferasi  menghasilkan  antigen BrdU  dan  berikatan  dengan  antibodi  anti-  BrdU pada  saat  pewarnaan  IHC.  Antigen  BrdU diekspresikan  oleh  sel  yang  aktif  berproliferasi sehingga  hasil  pengamatan  mikroskopis  jaringan kontrol positif memberikan warna coklat gelap.
Gambar  3.  Gambaran  histologis  pankreas  (skala  10µm),  dengan  IHC  menggunakan  anti-PCNA  dan  anti BrdU. (A, B, & C) IHC menggunakan anti-BrdU, dengan perbesaran 400x tampak sedikit sel-sel terwarnai coklat. (D, E & F) IHC dengan anti-PCNA tampak sel-sel terwarnai coklat yang lebih banyak dibanding dengan BrdU.
Siklus  sel  dapat  dibagi  menjadi  empat tahap  presintesis  (G1),  saat  sel-sel  tumbuh  akan
bersiap  untuk  memasuki  fase  sintesis  (S).  Pada fase  S  terjadi  duplikasi  genom  (replikasi  DNA).
Pada  G2  sel-sel  melakukan  pemeriksaan  apakah replikasi DNA sudah sempurna dan mempersiapkan  diri  untuk  masuk  pada  fase mitosis (M) dan terjadi proliferasi sel. Setiap fase berada  di  bawah  kendali  umum  kompleks cyclin- dependent  protein  kinases (CDKs).  Kompleks CDK-cyclin  spesifik:  kompleks  CDK  4,6-cyclin- D  mengatur  perkembangan  melalui  G1,  Cdk2- cyclin-E  terlibat  dalam  mengatur  transisi  dari  G1 ke  fase  S,  Cdk2-cyclin-A  dan  Cdk1-cyclin-A bekerja  pada  seluruh  fase  S,  sedangkan  Cdk1- cyclin-B  mengatur  proses  mitosis.  Selain  itu,  ada mekanisme  pemeriksaan  khusus  yang  diaktifkan untuk  menghentikan  perkembangan  siklus  sel (Maga and Hübscher, 2003; Cappella et al., 2015, Ahn et al., 2019).
Molekul PCNA dapat membentuk kompleks  dengan  semua  kompleks  CDK-cyclin ini sehingga saat dilakukan pengecatan IHC maka akan  terekspresi  pada  setiap  fase  proliferasi  sel (Maga and Hübscher, 2003; Muskhelishvili et al. ,
2003; Zińczuk et  al. ,  2018).  Berbeda  dengan
BrdU, BrdU diinkorporasi ke dalam DNA sel pada timidin  karena  merupakan  analog  timidin.  Sel yang  telah  terinkorporasi  dengan  BrdU  dapat dideteksi  menggunakan  antibodi  monoklonal
BrdU. Analisis hasil dari reaksi inkorporasi BrdU bersifat  spesifik  untuk  menunjukkan  keberadaan sel  pada  fase  sintesis  (S).  Semakin  banyak  sel mengalami  inkorporasi,  sel  tersebut  dominan berada pada fase sintesis DNA (Muskhelishvili et al. ,  2003;  Ota et  al .,  2016;  Wakayama et  al ., 2014).  Itu  sebabnya  sel-sel  positif  dengan  anti- BrdU  pada  IHC  yang  dilakukan  tampak  sedikit yang  terekspresi  pada  inti  sel.  Berbeda  dengan PCNA  yang  terekspresi  pada  banyak  sel (Wakayama et al ., 2014).

## SIMPULAN
Proliferasi sel-sel pankreas dapat terekspresi  melalui  perwarnaan  imunohistokimia dengan  menggunakan  antibodi  anti  PCNA  dan anti  BrdU.  Sel  yang  terekspresi  pada  BrdU  lebih sedikit  dibandingkan  PCNA.  Keduanya  dapat digunakan untuk identifikasi sel-sel yang mengalami  proliferasi.  PCNA  akan  terekpresi pada  semua  fase  siklus  sel  sedangkan  BrdU spesifik terekspresi pada fase S.

## PERSANTUNAN
Terima  kasih  kami  ucapkan  untuk  pak Yohanes  Suhardi  untuk  bantuan  teknis  di laboratorium, dan Departemen Histologi FKKMK UGM atas izin penggunaan laboratorium.

## DAFTAR PUSTAKA
Albert,  B.,  Bray,  D.,  Hopkin,  K.,  Johnson,  A., Lewis, J.,  Raff, M.,  Roberts, K., and Walter, P.  2010.  Essential  Cell  Biology  3th  edition.
Newyork and London. Garland Science.
Ahn, S-H., Granger, A., Rankin, M.M., Lam, C.J., Cox,  A.R.,  Kushner,  J.A.  2019.  Tamoxifen suppresses  pancreatic  β-cell  proliferation  in mice. PLoS ONE 14(9): e0214829.
Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., and Moll, J. 2015. CellProliferation Method: Click Chemistry Based on BrdU Coupling forMultiplex Antibody Staining. Curr. Protoc. Cytom. 72:7.34.1-7.34.17.
Kumar, G.L. and Lars, R. 2009. Education Guide; Imunnohistochemical  Staining  Methods  5 th edition. California, USA. Dako .
Kumar,  F.,  Abbas,  A.K.,  Fausto,  N., and Aster,
J.C.  2014.  Tissue  renewal,  regeneration  and repair. Robbins  and  Cotran  pathologic  basis of  disease  9 th edition .  Philadelphia.  Saunders Elsevier.
Maga,  G. and Hübscher,  U.  2003.  Proliferating cell  nuclear  antigen  (PCNA):  a  dancer  with many  partners. J  Cell  Sci .  116.  Pp:  3051- 3060.
Mescher, A.L. 2013. Junqueira’s Basic Histology Text  &  Atlas  13 th edition. Singapore. McGraw-Hill Companies, Inc.
Muskhelishvili,  L.,  Latendresse,  J.R.,  Kodell, R.L., and Henderson,  E.B.  2003.  Evaluation of  Cell  Proliferation  in  Rat  Tissues  with BrdU, PCNA, Ki-67(MIB-5)
Immunohistochemistry and In Situ Hybridization for Histone mRNA. J Histochem  Cytochem. 51(12).  Pp:  1681– 1688.
Ota, S., Nishimura, M., Murakami, Y., Birukawa, N.K.,  Yoneda,  A.,  Nishita,  H.,  Fujita,  R., Sato,  Y.,  Minomi,  K.,  Kajiwara,  K., Miyazaki,  M.,  Uchiumi,  M.,  Mikuni,  S., Tamura,  Y.,  Mizuguchi,  T.,  Imamura,  M.,
Meguro,  M.,  Kimura,  Y.,    Hirata,  K.,  and Niits,  Y.  2016.  Involvementof  Pancreatic StellateCells inRegenerationof Remnant Pancreasafter Partial Pancreatectomy. PLoSONE . 11(12):e0165747. Wakayama,  T.,  Nakata,  H.,  Kumchantuek,  T., Gewaily, M.S., and Iseki, S. 2014. Identification  of  5-Bromo-2’-Deoxyuridine- Labeled Cells during Mouse Spermatogenesis by  Heat-Induced  Antigen  Retrieval in  Lectin Staining and Immunohistochemistry. J Histochem Cytochem. 63(3). Pp: 190–205.
Wang, S.C. 2014. PCNA: a silent housekeeper or a  potential  therapeu-tic  target?. Trends Pharmacol Sci . 35. Pp: 178-86.
Yin,  D.D,  You,  L.H,  Yuan,  Q.X.,  Liang,  X.D., Wang,  N.,  Wang,  L.T.,  Yuan,  L.,  Wang, K.M., and De,  W.  2014.  Mesothelin promotes cell proliferation in the remodeling of neonatal rat pancreas. World J Gastroenterol. 20(22). Pp: 6884-96.
Zińczuk,  J.,  Zaręba,  K.,  Guzińska-Ustymowicz, K.,  Kędra,  B.,  Kemona,  A., and Pryczynicz A. 2018. Expression of chosen cell cycle and proliferation markers in pancreatic intraepithelial  neoplasia. Prz  Gastroenterol. 13(2). Pp: 118–126.