## ANALISIS LEMAK ANJING DALAM  BAKPAO AYAM MENGGUNAKAN FTIR
( FOURIER TRANSFORM INFRARED ) DIKOMBINASI KEMOMETRIKA
DOG FAT ANALYSIS IN CHICKEN MEATBUN USING FTIR ( FOURIER TRANSFORM INFRARED ) WITH CHEMOMETRIC COMBINATION
Any Guntarti * , Muhamad Ali Zainal Abidin Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta
*Penulis Korespondensi, e-mail: any_guntarti@yahoo.co.id

## ABSTRAK
Bakpao  ayam  adalah  makanan  yang  dikenal  masyarakat  Indonesia.  Bahan  utama  umumnya daging ayam yang kemudian dikukus. Daging yang digunakan, kadang belum tentu terjamin keasliannya.  Penelitian  ini  bertujuan  mengetahui  dan  mendeteksi  adanya  kandungan  lemak anjing  dalam  produk  makanan  bakpao  ayam.  Analisis  dengan  spektrofometri  FTIR  yang dikombinasi  kemometrika  dapat  memberikan  informasi  adanya  kandungan  lemak  anjing dalam  bakpao  ayam.  Model  analisisnya  dengan  membuat  variasi  konsentrasi  campuran daging  anjing  dengan  daging  ayam.  Bakpao  produk  di  pasaran  diambil  empat  sampel  yang dijual  di  kota  Yogyakarta  dengan  teknik stratified  random  sampling .  Hasil  spektra  FTIR dianalisis  dengan  kemometrika.  Analisis  kuantitatif  menggunakan Partial  Least  Square (PLS), dan analisis kualitatif dengan Principles Component Analysis (PCA). Hasil optimasi bilangan gelombang diperoleh pada 1226-840 cm -1 . Analisis dengan PLS diperoleh persamaan y=0,9969x+0,1697 ; nilai R 2 0,9969; RMSEC 1,38% ; RMSEP 0,27% ; RMSECV 1,31%.    Analisis  dengan  PCA  menunjukkan  bahwa  keempat  sampel  bakpao  pasaran pedagang kaki lima di kota Yogyakarta tidak mengandung lemak anjing.
Kata kunci : Daging anjing, FTIR, PLS, PCA, Bakpao

## ABSTRACT
Chicken  Meatbuns  are  a  food  known  in  Indonesian  society.  The  main  ingredients  are generally  chicken  meat  which  is  then  steamed,  but  the  meat  used  is  not  necessarily guaranteed authenticity. This study aims to find out and detect the presence of dog fat content in chicken meatball food products.Combination of  chemometric FTIR analysis aims to detect dog  fat    contamination  in  chicken  dumplings  by  making  fat  extract  variations  in  the concentration of dog meat mixed with chicken meat and taking four market banana samples in  the  city  of  Yogyakarta  with  stratified  random  sampling  technique.  FTIR  spectra  results were analyzed by chemometrics to find out samples of chicken meatbuns contaminated with dog fat. The spectra of various concentration samples inputted into the PLS analysis obtained quantitative data calibration models and sample spectra of the meatbun market were inputted into  the  PCA  analysis  for  grouping  of  samples  containing  dog  fat.  FTIR  analysis  results  of PLS  chemometrics  combination  obtained  optimization  wave  number  1226-840  cm-1  and obtained  calibration  equation  PLS  y  =  0.99695x  +  0.1697;  value  of  R2  0.9969;  RMSEC 1.38%; RMSEP 0.27%; RMSECV 1.31%. Conclusion from the results of PCA analysis of the four samples of chicken meatbuns, street food in the city of Yogyakarta are free from dog fat.
Keywords: Dog meat, FTIR,PLS, PCA, Meatbun

## PENDAHULUAN
Pasar  produk  halal  telah  meningkat  secara  dramatis,  terutama  di  negara-negara dengan mayoritas penduduknya adalah muslim seperti di Indonesia, Malaysia, Pakistan, dan Timur  tengah  (Riaz  and  Chaudry,  2003).  Seorang  muslim  didorong  untuk  memperoleh makanan, obat, dan kosmetika yang halal dengan standar kualitas yang tinggi. Bagi seorang muslim,  sudah  menjadi  kewajibannya  untuk  mengkonsumsi  produk  apapun  yang  halal (Rohman  and  Che  Man,  2012).  Halal  merupakan  suatu  syarat  makanan  yang  harus dikonsumsi dan menjadi ketetapan wajib bagi umat beragama Islam (Mursyidi, 2013). Suatu makanan  dikatakan  halal  jika  tidak  ada  dalil  yang    melarangnya.  Makanan  halal  pun  bisa menjadi haram apabila makanan itu tidak baik untuk dikonsumsi (Regenstein et al., 2003).
Daging anjing diharamkan dikonsumsi oleh masyarakat muslim.  Masalah yang cukup mendapat  perhatian  saat  ini  banyaknya  pemalsuan  daging  anjing  pada  produk  makanan seperti bakpao, sosis, abon, dan bakso. Pemalsuan dengan menggunakan daging anjing cukup menguntungkan  sejak  perdagangan  daging  anjing  liar  di  beberapa  negara  dilakukan  dengan harga murah (Ali et al ., 2014).
Beberapa  pendekatan  digunakan  untuk  mendeteksi  dan  mengkuantifikasi  kandungan turunan  lemak  anjing  dan  turunan  babi.  Pendekatan  pertama  adalah  dengan  menentukan perbandingan (rasio) antara beberapa kandungan kimia dan mengasumsikan bahwa rasio ini adalah  tetap.  Pendekatan  kedua  adalah  dengan  mencari  penanda  ( marker )  tertentu  dalam produk  makanan,  baik  berupa  kandungan  kimia  ataupun  komponen  morfologi  yang  mampu membuktikan adanya turunan babi  dalam makanan. Sementara pendekatan ketiga dilakukan dengan  melakukan  analisis  fisika-kimia  (Cordella et  al .,  2002).  Beberapa  metode  analisis telah  dikembangkan  untuk  analisis  turunan  babi  baik  dalam  bahan  dasar  ( raw  materials ) maupun dalam produk makanan seperti spektrofotometri Fourier transform infrared (FTIR) (Guntarti et  al ,  2015), High  Performent  Liquit  Chromatography (HPLC)  (Rohman et  al ., 2012), Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (Rohman et al ., 2018), differential scanning calorimetry (DSC)  (Tan  and  Man,  2012),  metode-metode  yang  mendasarkan  pada  DNA seperti polymerase  chain  reaction (Guntarti et  al .,  2017),  dan  metode  analisis  berdasarkan identifikasi bau ( electronic nose ) (Marina et al ., 2010).
Penelitian ini bertujuan  untuk mengetahui adanya daging anjing dalam produk bakpao dengan model Partial Least Square (PLS) dan mengelompokkan lemak anjing dengan lemak ayam menggunakan Principles Component Analysis (PCA) (Rohman and Che Man, 2012).

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan Alat
Bahan dalam penelitian ini berupa sampel bakpao dengan variasi konsentrasi (daging ayam, daging anjing, bawang, rempah dan campuran bahan tambahan (tepung terigu, air es, garam,  baking  powder),  sampel  pasaran  didapat  dari  penjual  bakpao  ayam  yang  dijual  oleh pedagang kaki lima, n-hexane , Na 2 SO 4 anhidrat Alat  dalam  penelitian  ini  berupa:  blender,  S oxhlet , glasswere , effendorf , Spektrofotomerter FTIR ( Fourier Transform Infrared ) Shimadzu Pristage-21.
Jalannya Penelitian
Sampel  bakpao  terdiri  dari  sampel  validasi  dan  kalibrasi,  serta  sampel  pasaran diperoleh dari pedagang kaki lima di sejumlah tempat di kota Yogyakarta. Daging  anjing dan daging  ayam  dihaluskan  dan  ditambahkan  campuran  bahan  tambahan.  Tabel  I  menyajikan formulasi sampel dengan variasi konsentrasi untuk validasi dan kalibrasi.
Tabel I. Formula Bakpao dengan Variasi Konsentrasi. Konsentrasi (%) Ayam (g) Anjing (g) Bumbu (g) Ayam 100 25,00 - 10,00 Anjing 100 - 25,00 10,00 (An-Ay) 20 20,00 5,00 10,00 (An-Ay) 40 15,00 10,00 10,00 (An-Ay) 60 10,00 15,00 10,00 (An-Ay) 80 5,00 20,00 10,00 (An-Ay) 90 2,50 22,50 10,00
Note: An-Ay = Anjing-Ayam.
Ekstraksi  lemak  dari  bakpao  dengan  variasi  konsentrasi  dan  bakpao  pasaran  : Ditimbang  sejumlah berat  isi bakpao, dibungkus  dan dilakukan proses maserasi  dengan  alat Soxhlet ,  pelarut n-hexane .  Ekstraksi  selama  4-7  jam,  suhu  70˚C.  Setelah  ekstraksi ditambahkan  Na2SO4 anhidrat .  Hasil  ekstrak  lemak  kental  dipindahkan  ke effendorf selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer FTIR.
Analisis lemak dengan spektroskopi FTIR : Ekstrak sampel dengan variasi konsentrasi dan  sampel  pasaran  dianalisis  rentang  bilangan  gelombang  pada  4000-400  cmˉ 1 .  Berbagai data  spektrum  FTIR  yang  didapat  dari  pembacaan  ekstrak  lemak  diolah  kedalam  progam Software  Horizon  MB™ kemometrika  yang  merupakan  perangkat  lunak  komputer.  dengan teknik penanganan sampel ATR (attenuted total  reflectance ). Hasil analisis instrumen FTIR dianalisis  kalibrasi  multivariat  PLS  dan  PCA.  Akurasi  dan  presisi  ditunjukkan  melalui  nilai RMSEC  ( root  mean  square  error  of  calibration )  dan  nilai  R 2 yaitu  koefesien  determinasi, kedua  parameter  ini  didapat  dari software Horizon  MB™ .  Sedangkan  nilai  RMSECV  ( root mean square error  of  cross  validation ) dan RMSEP ( root mean square error  of  prediction ) didapat dari software fungsi Microsoft Excel 2010.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Ekstraksi Lemak dari Bakpao
Ekstraksi  lemak  dengan  S oxhlet .  Lemak  memiliki  tingkat  kepolaran  yang  berbeda berdasarkan teori like disolves like . Lemak bersifat lebih polar seperti (glikolipid) larut dalam pelarut  yang  lebih  polar  (alkohol)  sedangkan  lemak  yang  bersifat  non  polar  seperti (trigliserid)  lebih  larut  dalam  pelarut  non  polar  seperti n-hexan .  Pemilihan  pelarut n-hexan karena  kelarutannya  sesuai  dengan  lemak  (trigliserid)  yaitu  non  polar.  Pemilihan  pelarut n- hexan karena  memiliki  rantai  struktur  karbon  yang  panjang  C 6 H 14 bersifat  non  polar,  tidak bersifat  toksik,  derajat  polaritas  kecil,  dan  memiliki  titik  didih  yang  rendah.  Ekstrak  lemak dengan pelarut n-hexan yang telah dihasilkan ditambahkan serbuk Na 2 SO 4 anhidrat bersifat higroskopik yang dapat mengikat air untuk menghilangkan sisa air dalam ekstrak (Sheskey et al., 2009).
Interpretasi Spektra FTIR  Lemak Anjing dalam Bakpao Ayam
Spektra  FTIR  dapat  dibedakan  dengan  senyawa  atau  sampel  lainnya  dengan  melihat posisi  bilangan  gelombang,  intensitas,  dan  jumlah  puncak  (Rohman  and  Che  Man,  2011 a ). Tiap  sampel  memiliki  spektra  IR  yang  berbeda-beda  karena  memiliki  sifat fingerprint yang artinya tidak semua sampel yang sama memiliki spektra IR yang sama. Daerah tengah dari IR yang sering digunakan untuk analisis sampel yaitu pada bilangan gelombang 4000-400 cm -1 . Sumbu  (x)  sebagai  bilangan  gelombang  penunjuk  gugus  fungsi  dan  sumbu  (y)  sebagai intensitas serapan.
Bilangan  gelombang  direspon  oleh  spektrometer  FTIR  dan  menjelaskan  jenis  gugus fungsi  yang  terdapat  pada  sampel  analit.  Hasil  spektra  IR  dari  sampel  bakpao  anjing  dan sampel bakpao ayam disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. (A Merah) Spektra Lemak Bakpao Anjing 100% dan (B Biru) Spektra Lemak Bakpao Ayam 100 %.
Dari Gambar 1 merupakan dua buah spektra FTIR dari ekstrak lemak anjing 100% dan lemak  ayam  100%  yang  dilakukan scanning pada  bilangan  gelombang  4000-400  cm -1 . Berdasarkan  pengamatan  antara  lemak  anjing  dan  lemak  ayam  tidak  berbeda  secara  visual. Kedua  spektra  ini  menunjukan  puncak-puncak  yang  cenderung  identik  karena  kedua komponen  penyusun  senyawa  ini  merupakan  trigliserida,  namun  intensitas  serapan  relatif berbeda pada tiap puncak dari masing-masing bilangan gelombang (Rohman and Che Man., 2011 b ). Penjelasan gugus fungsi pada bilangan gelombang akan disajikan pada Tabel II.
Tabel II. Gugus Fungsi dan Model Vibrasi pada Lemak Anjing dan Lemak Ayam pada Bakpao Variasi Konsentrasi.
Penafsiran secara mendalam dilakukan pada model spektrum Gambar 3, dimana daerah d, f, h, i, dan j adalah daerah sidik jari atau pembeda keduanya.
Gambar 2. Perbesaran Spektrum Lemak Anjing dan Lemak Ayam Daerah Fingerprint
Pada  Gambar  2,  menunjukkan  perbedaan  intensitas  absorbansi  pada  pola  puncak bilangan  gelombang  di  daerah fingerprint .  Pada  puncak  (h,i,j)  bilangan  gelombang  1400- 1000  cm -1 terdapat  perbedaan  intensitas  puncak,  lemak  anjing  (merah)  memiliki  intensitas absorbansi  yang  lebih  besar  dari  lemak  ayam  (biru).  Penentuan  bilangan  gelombang  lemak anjing dan lemak ayam dipilih pada bilangan gelombang yang telah dioptimasi 1250-800 cm - 1 karena pada kisaran ini terdapat perbedaan yang mencolok dari kedua spektra lemak anjing dan  lemak  ayam.  Kemudian  dilakukan  analisis  kuantitatif  PLS  daerah  bilangan  gelombang 1250-800 cm -1 dengan software Horizon MB™ .

## Analisis Kuantitatif Kemometrika PLS
Analisis kuantitatif dalam penelitian ini dilakukan menggunakan aplikasi kemometrika Horizon MB TM dengan 2 metode, yaitu Partial Least Square (PLS). Analisis kuantitatif PLS dilakukan  pada  daerah fingerprint karena  daerah  ini  menunjukkan  perbedaan  khas  pada intensitas serapan yang signifikan dan menjadi target pemilihan bilangan gelombang optimasi (Sa’adah,  2012)  dan  dipilih  pada  bilangan  gelombang  1250-800  cm -1 .  Ratnasari  (2016) daerah  yang  menunjukkan  kekhasan  lemak  anjing  pada  bilangan  gelombang  1218,08  cm -1 dan 1123,15 cm -1 .
Hasil  analisis  kuantitatif  dengan  PLS  diperoleh  y=0,9969x+0,1697,  nilai  Koefesien determinasi  (R 2 )  sebesar  0,9969.  Nilai  RMSEC  sebesar  1,38%.  Gambar  4  menyajikan hubungan  keakuratan  antara  nilai  prediksi  dan  nilai  sebenarnya  yaitu  99,69%  dan  RMSEC 1,38%.  Nilai  kesalahan  acak  menunjukkan  kecil  kesalahan  dalam  prediksi  sampel  dari persamaan  model  kalibrasi  dengan  nilai  RMSEP  sebesar  0,27%  dan  RMSECV  sebesar 1,31%.  Nilai  R2  mendekati  1,  nilai  RMSEC,  RMSEP,  dan  RMSECV  semakin  kecil, menunjukkan hasil yang baik.
Gambar  3 .  Hasil  olah  data  Model  Kalibrasi  PLS  Variasi  Konsentrasi  Lemak  Anjing  dan  Lemak Ayam (0-100%).
Analisis Principle Component Analysis (PCA)
PCA  ( Principal  Component  Analysis )  metode  ini  digunakan  sebagai  pengelompokkan sampel  pasaran  dengan  sampel  murni  bakpao  daging  anjing  dan  bakpao  daging  ayam  yang disajikan dalam 4 kuadran. PCA dapat  memisahkan sesuai  dengan komponen terbesar  yang dimiliki  suatu  sampel  dan  dapat  mengelompokkan  sesuai  kemiripan  (Widyaninggar et  al., 2012). Gambar 5 menunjukkan kedua score plot terpisah dan mengelompok sesuai kesamaan jenis.
Gambar 5. Hasil replikasi olah PCA Lemak Anjing 100% dan Lemak Ayam 100% . Ket: Hijau (A) (lemak anjing), Merah (B) (lemak ayam).
Lemak  anjing  100%  (A)  dan  lemak  ayam  100%  (B)  mempunyai  jarak  yang  cukup jauh.  Sehingga  lemak  anjing  dan  lemak  ayam  dapat  dikelompokkan  secara  terpisah berdasarkan sifat fisika kimia dengan kemometrika PCA.
Analisis  Sampel  Produk  Bakpao  Ayam  Pasaran  yang  Beredar  di  Kota  Yogyakarta  dengan Permodelan PCA.
Sampel  bakpao  diambil  di  4  wilayah    kota  Yogyakarta,  ekstraksi  lemak  sama  seperti ekstraksi  pada  sampel  sebelumnya.  Hasil  spektra  dianalisis  dengan  PCA  pada  bilangan gelombang  yang  telah  dioptimasi  1226-840  cm -1 .  Gambar  6  disajikan  hasil  PCA  dengan sampel di pasaran.
Gambar 6 . Hasil Score Plot PCA dengan sampel di Pasaran. Keterangan : Lemak anjing (A), Lemak ayam (B)
Gambar 6 menunjukkan bahwa score plot sampel (S1,S2,S3,S4) yang merupakan sampel  bakpao  pasaran,  berada  pada  kuadran lemak  ayam  100%,  sehingga  semua bakpao  ayam  yang  dijual  di  pasaran  tidak  mengandung  lemak  anjing.  Pada  penelitian Guntarti et al (2015), dengan menggunakan sampel bakso sapi yang dipalsukan dengan bakso  celeng  memberikan  informasi  ada  2  sampel  yang  berada  pada  daerah  lemak celeng,  sedangkan  8  sampel  lainnya  ada  berada  di  daerah  sampel  bakso  sapi.  Guntarti and Shesilia (2017), dengan menggunakan sampel bakso sapi dipalsukan dengan daging tikus, memberikan kesimpulan ada 3 sampel yang berada di kuadran tikus

## KESIMPULAN
Analisis  kuantitatif  lemak  anjing  dengan  kemometrika  PLS  diperoleh    optimasi bilangan gelombang pada 1226-840 cm -1 , dengan persamaan kalibrasi, y=0,9969x+0,1697,  nilai  R 2 0,9969;  nilai  RMSEC  1,38%;  nilai  RMSEP  0,27%  ;  dan nilai RMSECV 1,31%. Sampel bakpao di pasaran tidak mengandung lemak anjing.

## DAFTAR PUSTAKA
Ali, M.E., Rahman, M.M,. Hamid, S.B., Mustofa, S,. Hashim, U., Hanapi, U.K., 2014, “ Polymerase Chain Reaction Assay Targeting Cytocrome b Gene for Detection of Dog  Meat  Adulteration  in  Meatball  Formulation”, Meat  science,  Malaysia, Universiti Malaya Kuala Lumpur.
Cordella, C., Moussa, I., Martel, A.-C., Sbirrazzuoli, N., and Lizzani-Cuvelier, L., 2002, Recent  Developments  in  Food  Characterization  and  Adulteration  Detection: Technique-Oriented  Perspectives. Journal  of  Agricultural  and  Food  Chemistry , 50 :1751-1764.
Guntarti,  A.,  Martono  S.,  Yuswant,  A.,  Rohman  A.,  2015,  FTIR  Spectroscopy  in Combination  with  Chemometrics  for  analysis  of  Wild  Boar  Meat  in Meatball Formulation, Asian Journal of Biocemisty , 10(4) : 165-172
Guntarti, A., Martono, S., Yuswanto, A., Rohman, A., 2017, Analysis of beef meatball adulteration  With  wild  boar  meat  using  real-time  polymerase  chain  reaction, International Food Research Journal 24(6): 2451-2455.
Guntarti, A and Seshilia, R.P., 2017, Application method of fourier transform infrared (FTIR) combined With Chemimetrics for Analysis of rat meat ( Rattus diardi ) in meatball beef, Pharmaciana , Vol.7 (:2) : 133-140. Marina, A.M., Che Man, Y.B. and Ismail, A., 2010, Use of the SAW sensor electronic nose  for  detecting  the  adulteration  of  virgin  coconut  oil  with  RBD  palm  kernel olein. Journal of the American Oil Chemists’ Society , 87 :263-270.
Mursyidi, A., 2013, The Role of Chemical Analysis in the Halal Authentication of Food and  Pharmaceutical  Products. Journal  of  Food  and  Pharmaceutical  Sciences , 1 :76-86.
Pavia, D.L., 2008, Introduction to spectroscopy Statitic , 4 th Edition, USA : Brooks Cole. Ratnasari, I.A., 2016, Analisis Kandungan Lemak Anjing dalam Bakso yang Beredar di Pasar  Wage  Purwokerto  Menggunakan  FTIR  yang  dikominasikan  dengan Kemometrika  Sebagai  Autentikasi  Halal. Skripsi ,  Fakultas  Farmasi,  Universitas Muhammadiyah Purwokerto
Regenstein,  J.,  Chaudry,  M.,  and  Regenstein,  C.E.,  2003,  The  Kosher  and  Halal  Food
Laws. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety , 2 : 111-127.
Riaz,  M.N.  and  Chaudry,  M.M.,  2003, Halal  Food  Production ,  1  edition.  ed.  CRC Press, Boca Raton, FL.
Rohman,  A.,  and  Che  Man,  Y.B.,  2011 a ,  Application  of  Fourier  Transform  Infrared (FT-IR)  Spectrocopy  Combined  with  Chemometrics  for  Autentication  of  Cod- Liver Oil. Vibrational Spectroscopy, 55 :141-145. Rohman, A., and Che Man., 2011 b “The Optimization of FTIR Spectroscopy Combined with  Partial  Least  Square for  Analysis of  Animal Fats  in  Quaternary Mixtures” Spectroscopy : Biomedical Applications 3-3: 169-176.
Rohman, A., Triyana, K., Sismindari, and Erwanto, Y., 2012, Differentiation of lard and other animal fats based on triacylglycerols composition and principal component analysis. International Food Research Journa l, 19 (2):475-479 .
Rohman,  A.  and  Che  Man,  2012,  Analysis  of  pig  derivatives  for  halal  authentication studies. Food Review International , 28 :97-112
Rohman,  A.,  Rahayu,  W.S.,  Sudjadi.,  Martono,  S.,  2018,  Identification  of  Dog  for Halal Autentification with Gas Chromatography Mass Spectroscopy (GCMS)  and  Chemometrics, Advanced  Science  Letter ,  Vol  24-1,  American Scientific Publishers
Saadah,  M.,  2012,  “Kombinasi  Metode  Spektroskopi  Inframerah  dan  Kemometrika untuk  Analisis  Lemak  Babi  ( Lard )  dalam  Sediaan Lotion ”. Skripsi ,  Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, Indonesia.
Sheskey, P.J., Rowe, R.C., Quinn M.E., 2009, Handbook of Pharmaceutical Excipients , 418, 685, Lexi-Comp, American Pharmaceutical Association, Inc.
Tan,  C.P.  and  Man,  Y.B.C.,  2012, Analysis  of  adible  oils  differential  scanning calorimetry , dalam : Adolf, R.O. (Ed.), Advance in Lipid Methodology, Oily Press Lipid Library Series. Woodhead Publishing, pp 1-42.
Widyaninggar,  A.T.,  Triyana  K.,  dan  Rohman  A.,  2012,  Dofferentiation  Between Porchine and Bovine Gelatin In Comercial Capsule Shells Based on Amino Acid Profil and Principal Component analysis, Indonesian J. Pharm, 23 (2): 96-101 .