## ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF PAPAIN FROM THE LATEX OF PAPAYA
( Carica papaya L)
Isolasi dan Karakterisasi Papain dari Buah Pepaya ( Carica Papaya L) Jenis Daun Kipas
Dominggus Malle 1,* , Ivonne Telussa 2 , Astrid A. Lasamahu 2
1 Faculty of Agriculture Pattimura University, Kampus Poka, Jl. Ir. M. Putuhena, Ambon 97134
2 Chemistry Department, Faculty of Mathematics and Natural Sciences Pattimura University, Kampus Poka, Jl. Ir. M. Putuhena, Ambon 97134
*Corresponding author, e-mail: d.malle@faperta.unpatti.ac.id
Received:  October 2014 Published: January 2015

## ABSTRACT
The papain enzyme was isolated from the latex of papaya and it was purified by ammonium sulfat fractionation and dialysis methods. Determination of papain enzyme activity showed that the highest activity was found in the 80% fraction with a specific activity of 10.5797 x 10 5 U/g. Papain concentration after Bradford  method was 53 mg/mL.  Molecular  mass of papain  was detected to be 21.6 kDa after SDS-PAGE analysis. Characterization of papain showed that the optimum activity of papain was found at pH 8.0 with a specific activity of 14.07031 x 10 U/g, and at temperature 60 °C with a specific activity of 14.39755 x 10 U/g.
Keywords : Isolation, characterization, papain, papaya

## PENDAHULUAN
Buah  pepaya  merupakan  buah  tropis  yang enak rasanya dan banyak mengandung zat nutrisi yang  dibutuhkan  oleh  tubuh.  Buah  pepaya umumnya  mengandung  air  dan  karbohidrat, rendah kalori dan kaya akan vitamin dan mineral khususnya  vitamin    A  dan  C  serta  mineral kalium (K) (da Silva dkk., 2007). Selain sebagai penghasil  buah,  tanaman  pepaya  juga  memiliki banyak  khasiat.  Hampir  semua  bagian  tanaman pepaya  dapat  dimanfaatkan,    mulai  dari  akar, batang, daun, kuntum bunga, kulit pohon, sampai getahnya.
Batang, daun, dan buah pepaya mengandung getah berwarna putih yang mengandung  enzim  pemecah  protein  atau proteolitik  yang  biasa  disebut papain (Kalie, 2002).  Papain  [EC.  3.4.22.2]  adalah  satu  dari enzim  proteolitik  asal  tanaman  yang  secara intensif digunakan dalam proses pembuatan roti, pengempukan daging, pelembutan kulit, “ defibrinating ” luka, pelepasan  gum pada sutera dan wool serta untuk pengobatan penyakit edema (Virdi, 2009).
Papain  banyak  digunakan  dalam  berbagai proses  industri,  sehingga  prospek  ekonomis
papain  tampaknya  semakin  cerah  (Kalie,  2002). Oleh  karena  itu  eksplorasi  penelitian  dan pemanfaatan  papain  terus  dilakukan.  Kahar (1995)  melakukan  penelitian  tentang  pengaruh jenis substrat terhadap aktivitas proteolitik enzim papain amobil.
Pemanfaatan  papain  untuk  penghilangan lapisan kapur pada teripang pasir telah dilakukan oleh  Sudrajat  (2002).  Penggunaan  enzim  papain sebanyak  4%  mampu  menghilangkan  lapisan kapur pada tubuh teripang dan tidak menyebabkan  lapisan    kulit  hitam  pada punggung teripang rusak.
Sebagai enzim proteolitik, papain diharapkan  memiliki  aktivitas  yang  tinggi  dan tahan  terhadap  lingkungan  yang  ekstrim  seperti suhu  yang  tinggi  dan  pH  yang  rendah.  Untuk mendapatkan  papain  dengan  aktivitas  yang tinggi,  berbagai  upaya    dilakukan  termasuk pendekatan  bioteknologi  rekayasa  genetika pepaya. Selain itu usaha-usaha untuk mendapatkan  sumber-sumber  baru  penghasil papain  terus  dilakukan.  Hingga  saat  ini  isolasi papain  lebih  banyak  berasal  dari  jenis  pepaya berdaun  jari,  padahal  ada  beberapa  jenis  pepaya seperti  pepaya  daun  kipas  yang  mungkin  dapat
Dominggus Malle , dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2015, 2, 182 - 189
1
digunakan sebagai sumber papain. Kajian ilmiah papian  dari  pepaya  daun  kipas  masih  sangat terbatas.  Oleh  karena  itu  suatu  kajian  ilmiah papain  dari  pepaya  jenis  daun  kipas  sangat diperlukan.

## METODOLOGI

## Bahan
Getah pepaya, Akuades/Akuabides, Natrium bisulfit 0,7% (E. Merck), Amonium sulfat kristal (E.  Merck),  BaCl 2 1%  (E.  Merck),  Buffer  Tris- HCl, Sistein, Tirosin, Asam trikloro asetat (TCA) 5%  (E.  Merck),  Bovine  Serum  Albumin  (BSA) (Wako,  Jepang),  Pereaksi  Bradford,  APS (Ammonium  persulfate)  10%  (Bio  Basic  Inc), TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylenediamine) (Bio  Basic  Inc),  Akrilamida  30%  (Bio  Basic Inc), bis-akrilamida 0,8% (Bio Basic  Inc), Bufer Tris-Glisin  10x  (Fermentas),  SDS  ( Sodium dodecyl  sulfate )  (Bio  Basic  Inc),  Gliserol  50% (E.  Merck),  Bromphenol  blue  0,1%  (Wako, Jepang),  Coomassie  Brilliant  Blue  R-250  (E. Merck),  Protein  Marker  (Fermentas),  Metanol (E.  Merck),  Asam  asetat  (E.  Merck),  Membran dialisis (MCO : 14000) (Wako, Jepang).

## Alat
Hot  plate (Cimarec  2),  Magnetic  strirrer (Cimarec  2),  Mikropipet  (Eppendorf  Research), Oven  (Shell  Lab),  pH  meter  (Metler  Toledo), Sentrifuge (Labofuge 200-HEREAUS), Seperangkat  alat  gelas  (Pyrex),  Seperangkat  alat gelas  (Pyrex),  Seperangkat  peralatan  SDS  – PAGE (Cole-Palmer), Spektrofotometer UV-VIS (APEL  PD-303  UV),  Timbangan  analitik (OHAUS Adventure TM Pro).

## Prosedur Kerja Persiapan Sampel
Penyadapan  getah  dilakukan  pada  buah pepaya  yang  berumur  2,5  -  3  bulan.  Kulit  buah ditoreh sedalam ± 1 – 2 mm dari atas ke bawah. Dari  torehan  akan  menetes  getah  buah.  Tetesan getah ditampung dalam wadah.

## Isolasi Papain
Getah  yang  diperoleh  dicampur  dengan larutan  natrium  bisulfit  0,7%  sebanyak  empat kali  jumlah  getah,  kemudian  diaduk  hingga
merata  sampai  terbentuk  emulsi  berwarna  putih susu  yang  agak  kental.  Kemudian  emulsi dituangkan merata dalam cawan petri, kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 50 – 60 °C.
Pemurnian Enzim Papain
Fraksinasi ammonium sulfat
Getah papaya yang telah diperoleh dihaluskan  dengan  menggunakan  mortar  dan ditimbang.  Kemudian  dilarutkan  dalam  50  mL akuades  dan  disentrifuge  selama  15  menit dengan  kecepatan  4000  rpm  lalu  diambil supernatan dengan cara dekantasi.
Supernatan yang diperoleh kemudian diendapkan  menggunakan  kristal  ammonium sulfat.
Protein dibagi menjadi 4 fraksi, yaitu fraksi 20%,  40%,  60%,  dan  80%.  Penentuan  jumlah kristal  ammonium  sulfat  yang  dibutuhkan  untuk setiap  fraksi  didasarkan  pada  tabel  fraksinasi ammonium sulfat.
Untuk menghasilkan fraksi 20%, digunakan 5,3  g  ammonium  sulfat  yang  telah  dihaluskan dan  dilarutkan  dalam  supernatan  di  dalam  ruang dingin lalu diaduk dengan magnetic stirer secara perlahan.  Selanjutnya  campuran  diendapkan dengan  cara  disentrifuge  pada  4000  rpm  selama 15  menit,  kemudian  supernatan  dipisahkan  dari endapannya.  Endapan  dilarutkan  dengan  Tris- HCl  50  mM  pH  7,0  dengan  volume  sesedikit mungkin. Larutan ini merupakan fraksi ammonium  sulfat  20%.  Supernatan  kemudian ditambah dengan 5,65 g ammonium sulfat untuk memperoleh  fraksi  40%.  Campuran    lalu diendapkan  dengan  cara  disentrifuge  pada kecepatan  4000  rpm  selama  15  menit  kemudian supernatan dipisahkan dari endapannya.
Endapan  dilarutkan  dengan  Tris-HCl  50 mM  pH  7,0  dengan  volume  sesedikit  mungkin. Larutan  ini  merupakan  fraksi  ammonium  sulfat 40%.    Supernatannya  kembali  ditambahkan  6  g ammonium sulfat untuk memperoleh fraksi 60%. Campuran lalu diendapkan dengan cara disentrifuge pada kecepatan 4000 rpm selama 15 menit  kemudian  dipisahkan  antara  supernatan dan endapannya. Endapan dilarutkan dalam Tris- HCl  50  mM  pH  7,0  dengan  volume  sesedikit mungkin. Larutan ini merupakan fraksi ammonium sulfat 60%.
Supernatannya  kembali  ditambah  6,45  g amonium  sulfat  untuk  memperoleh  fraksi    80%.
Dominggus Malle , dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2015, 2, 182 - 189
1
Campuran    lalu  diendapkan  dengan  cara disentrifuge pada kecepatan 4000 rpm selama 15 menit  kemudian  dipisahkan  antara  supernatan dan  endapannya.  Dilarutkan  dalam  Tris-HCl  50 mM  pH  7,0  dengan  volume  sesedikit  mungkin. Larutan  ini  merupakan  fraksi  ammonium  sulfat 80%.

## Dialisis
Dialisis  dilakukan  dengan  memasukkan fraksi-fraksi  enzim  ke  dalam  kantong  selofan. Kemudian  enzim  dalam  plastik  selofan  ini direndam  dalam buffer Tris-HCl  50  mM.  Untuk mengetahui  masih  adanya  garam  ammonium sulfat  dalam  larutan  enzim,  dilakukan  uji kualitatif  ammonium  sulfat  yaitu  dengan menambahkan  larutan  BaCl 2 1%  (b/v)  ke  dalam cuplikan buffer Tris-HCl.

## Uji Aktivitas
Uji aktivitas dilakukan menggunakan kasein 1%  sebagai  substrat.  Dengan  menentukan  nilai At,  Ab,  As  dan  As 0 .  Dipipet  5  mL  kasein  (yang terdiri  dari  12  mM  sistein  dalam  0,05  M  buffer Tris-HCl  pH  7,0),  kemudian  diinkubasi  pada suhu  37  °C  selama  5  menit.  Selanjutnya ditambahkan  0,1  mL  enzim  murni  (tiap  fraksi), kemudian  diinkubasi  selama  1  menit,  kemudian ditambahkan  lagi  5  mL  TCA  5%,  dikocok  dan diinkubasi  selama  30  menit.  Selanjutnya campuran disentrifuge pada 4000 rpm selama 15 menit.  Absorbansi  supernatan  diukur  pada  280 nm  (A t ).  Untuk  memperoleh  nilai  Ab,  0,1  mL enzim dari tiap fraksi ditambahkan dengan 5 mL TCA  5%  dan  5  mL  kasein,  dikocok  dan diinkubasi  pada  suhu  37  °C  selama  30  menit. Kemudian disentrifuge pada 4000 rpm selama 15 menit.  Absorbansi  supernatan  diukur  pada  280 nm (Ab).
Untuk  As  digunakan  larutan  standar  tirosin 1  mM,  sedangkan  untuk  As 0 digunakan  larutan HCl  0,1  M,  diukur  absorbansinya  pada  280  nm untuk  memperoleh  nilai  As  dan  As 0 .  Satu  unit aktivitas  enzim  adalah  jumlah  enzim  yang dibutuhkan  untuk  menaikan  satu  absorban dengan  ekuivalen  dengan  1  µg  tirosin  per  menit sesuai dengan prosedur yang digunakan.

## Uji Protein
Penetapan  serapan  maksimum  larutan  bovin serum albumin
Ditimbang  dengan  teliti  10  mg  bovine serum  albumin  dan  dilarutkan  dengan  akuades dalam  labu  takar  10  mL  hingga  tanda  batas.  Ke dalam tabung reaksi pipet sebanyak 1 mL larutan bovin  serum  albumin  1000  µg/mL.  Kemudian ditambahkan 0,5 mL pereaksi Bradford, dikocok dengan  segera  dan  dibiarkan  pada  suhu  kamar selama 30 menit. Selanjutnya dibaca serapannya pada  panjang  gelombang  400  sampai  600  nm hingga diperoleh serapan maksimum.

## Penentuan kurva baku larutan bovin serum albumin
Dipipet  larutan  bovin  serum  albumin  1000 µg/mL  ke  dalam  masing-masing  labu  takar  10 mL, dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,  80,  90  dan  100  ppm.  Kemudian  diencerkan dengan akuades hingga tanda batas. Dari masing- masing labu dipipet sebanyak 0,1 mL. Kemudian ditambahkan pereaksi Bradford masing-masing 5 mL,  dikocok  dengan  segera  dan  dibiarkan  pada suhu kamar selama 30 menit. Selanjutnya dibaca serapannya  pada  panjang  gelombang  maksimum dari tahap sebelumnya.

## Penentuan kadar protein enzim papain
Sebanyak 0,1 mL ekstrak enzim ditambahkan  dengan  5  mL  pereaksi  Bradford dan  dibiarkan  pada  suhu  ruang  selama  10  -  60 menit.  Absorbansi  larutan  sampel protein dibaca pada  panjang  gelombang  maksimum.  Dengan persamaan matematik dari kurva standar protein, akan  didapatkan  kadar  protein  terlarut  yang terkandung dalam enzim.

## Karakterisasi Papain

## Penentuan pH optimum
Uji  aktivitas  untuk  penentuan  pH  optimum dilakukan  menggunakan  kasein  1%  sebagai substrat.  Dengan  menentukan  nilai  At  dan  Ab. Dipipet 5 mL kasein dengan variasi pH 5,0; 5,5; 6,0;  6,5;  7,0;  7,5;  8,0;  8,5  dan  9,0,  kemudian diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  5  menit. Selanjutnya  ditambahkan  0,1  mL  enzim  murni (fraksi  dengan  aktivitas  tertinggi),  kemudian diinkubasi selama 1 menit, kemudian ditambahkan  lagi  5  mL  TCA  5%,  dikocok  dan diinkubasi  selama  30  menit.  Selanjutnya campuran disentrifuge pada 4000 rpm selama 15 menit.  Absorbansi  supernatan  diukur  pada  280 nm (At).
Dominggus Malle , dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2015, 2, 182 - 189
1
Untuk  memperoleh  nilai  Ab,  0,1  mL  enzim ditambahkan  dengan  5  mL  TCA  5%  dan  5  mL kasein (variasi pH), dikocok dan diinkubasi pada suhu  37°C  selama  30  menit.  Kemudian disentrifuge  pada  4000  rpm  selama  15  menit. Absorbansi supernatan diukur pada 280 nm (Ab).

## Penentuan suhu optimum
Uji aktivitas unutk penentuan suhu optimum dilakukan  menggunakan  kasein  1%  dengan  pH optimum  enzim  (hasil  penentuan  pH  optimum). Dengan  menentukan  nilai  At  dan  Ab,  dengan memvariasikan  suhu  inkubasi  yaitu,  40;  45;  50; 55; 60; 65; 70; 75; 80 dan 85°C.

## Perkiraan Massa Molekul Papain (Metode SDS-PAGE)
Elektroforesis  protein  dengan  SDS-PAGE dilakukan  dengan  menggunakan  gel  pemisah 15%  poliakrilamida  dan  gel  penahan  5% poliakrilamida.  Cetakkan  gel  berupa dua lempeng  kaca  dihimpitkan  dan  diantaranya diletakkan  pemisah  ( spacer )  pada  bagian  tepi, lalu  dijepit  dengan  klip  dan  diberdirikan  di  atas lempeng  kaca.  Larutan  gel  pemisah  ( separating gel ) dimasukkan ke dalam lempeng kaca. Setelah gel tersebut mengeras kemudian dimasukkan gel penahan ( stacking gel ) ke atasnya. Sisir pencetak sumur segera dimasukkan ke bagian gel penahan sebelum gel mengeras.
Lempeng  kaca  yang  berisi  gel  yang  sudah mengeras dimasukkan ke dalam alat elektroforesis  dan  diikuti  dengan  larutan  buffer elektroforesis.  Protein  (20  µL)  disuspensikan dengan  buffer  sampel  (5  µL)  dipanaskan  dalam air  mendidih  selama  10  menit.  Setelah  dingin larutan  protein  dimasukan  ke  dalam  gel poliakrilamid  sebanyak  15  µL.  Sebagai  standar protein digunakan standar protein dari Fermentas yang dimasukan ke dalam sumur sebanyak 5 µL. Kemudian  sampel  dan  standar  protein  dilarikan dalam  gel  elektroforesis  selama  70  menit  pada tegangan  150  V,  400  A.  Setelah  elektroforesis gel  diwarnai  dengan  larutan  CBB  R-250  1% selama 2 – 3 jam. Gel hasil pewarnaan kemudian direndam  di  dalam  larutan  penghilang  warna (metanol  dan  asam  asetat)  untuk  menghilangkan kelebihan  warna.  Pita  protein  yang  terpisah kemudian diukur jarak migrasinya dan dibandingkan dengan jarak protein standar.
Tabel 1. Komposisi gel elektroforesis
Keterangan :
Larutan A : akrilamida 30% (b/v) (29,2 g dalam 100 mL akuades) bis-akrilamida  0,8% (b/v) (0,8 g dalam 100 mL akuades).
Larutan B : 75 mL buffer Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) 21 mL akuabides.
Larutan C :  50 mL  buffer Tris-HCl 0,5 M (pH 6,81) 46 mL akuabides.
Tabel 2.  Komposisi  buffer  elektroforesis  dan buffer sumpel

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Papain
Getah  pepaya  disadap  dari  buah  pepaya jenis  daun  kipas  yang  berumur  2,5  –  3  bulan dengan  kedalaman  torehan  ±  1  –  2  mm. Penyadapan  dilakukan  sebanyak  empat  kali dengan  selang  waktu  selama  empat  hari  dan diperoleh getah basah sebanyak 126,4 g.
Getah  yang  diperoleh  dicampurkan  dengan natrium  bisulfit  0,7%,  dimana  penggunaan senyawa  sulfit  dimaksudkan  sebagai  pelarut bahan  kimia  dan  untuk  menekan  terjadinya kerusakan  akibat  proses  isolasi,  sedangkan penggunaan air sebagai pelarut sulfit dimaksudkan untuk mengencerkan getah. Campuran  hasil  pengadukan  membentuk  emulsi berwarna  putih  susu  yang  agak  kental  yang kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 60 °C  sampai  getah  mengering.  Sampel  yang  telah kering,  dihaluskan  menggunakan  mortar  dan diperoleh papain kering dengan ciri-ciri berwarna  putih  kekuningan  dan  baunya  seperti bau larutan sulfit (Gambar 1).
Dominggus Malle , dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2015, 2, 182 - 189
1

## Gambar 1. Papain Kasar

## Pemurnian Papain
Papain  kering  ( crude  extract )  yang  telah diperoleh  dilarutkan  dengan  larutan  buffer  Tris- HCl 50 mM pH 7,0 dengan tujuan mempertahankan kestabilan enzim papain. Enzim  yang  telah  dilarutkan  diendapkan  dengan ammonium  sulfat  untuk  fraksi  20%,  40%,  60% dan 80%.
Garam  netral  dapat  berpengaruh  terhadap kelarutan  protein.  Pada  konsentrasi  rendah, garam  dapat  menaikkan  kelarutan  protein  dalam air, suatu peristiwa yang dikenal sebagai salting- in .  Pengaruh  garam  netral  terhadap  kelarutan protein merupakan fungsi dari kekuatan ioniknya,  yaitu  suatu  ukuran  konsentrasi  dan jumlah  muatan  listrik  sumbangan  kation  dan anion  dari  garam.  Efek salting-in disebabkan oleh  kecenderungan  perubahan  gugus  rantai samping  protein  yang  tidak  terdisosiasi  untuk mengion.  Tetapi  bila  kekuatan  ion  meningkat, kelarutan  protein  akan  menurun.  Pada  kekuatan ionik yang tinggi, protein akan mengendap, yang dikenal dengan efek salting-out . Efek salting-out disebabkan  pada  konsentrasi  yang  tinggi,  garam dapat  menghidrasi  air  dari  permukaan  molekul protein  sehingga  protein  terendapkan.  Efek salting-in dan salting-out merupakan  cara  yang penting untuk memisahkan protein dari campurannya.  Hal  ini  disebabkan  protein  yang berbeda  menunjukkan  respon  yang  berbeda terhadap  konsentrasi  garam  netral.  Protein  yang diendapkan melalui proses presipitasi salting-out akan  tetap  berada  dalam  konformasi  alaminya (Sindumarta, 1999).
Proses fraksinasi bertujuan untuk memekatkan atau menjenuhkan larutan sehingga diperoleh  larutan  pekat  yang  mengandung endapan  protein.  Penambahan  amonium  sulfat
dalam  proses  fraksinasi  dilakukan  sedikit  demi sedikit  sambil  diaduk  di  atas magnetic  stirrer dengan  kecepatan  konstan.  Hal  ini  bertujuan untuk  mencegah  terbentuknya  busa  pada permukaan supernatan. Terbentuknya busa dapat mendenaturasi protein sebab busa dapat menurunkan  tegangan  permukaan  sehingga merusak struktur alami protein. Dalam  membebaskan  protein  dalam  larutan dari partikel-partikel penggangu lainnya
dilakukan  proses  dialisis.  Dalam  proses  ini digunakan  membran  dialisis  semipermeabel untuk menahan molekul-molekul protein, sedangkan  molekul  yang  lebih  kecil  seperti garam  dan  air  dapat  melewati  membran  tersebut (Sindumarta,  1999).  Pada  penelitian,  membran semipermeabel  yang  digunakan  adalah  selofan. Buffer  perlu  diganti  pada  saat  mencapai kesetimbangan  konsentrasi  antara  bagian  dalam dan  bagian  luar.  Dengan  pergantian  buffer, proses  difusi  akan  terus  berlanjut.  Untuk mengetahui  larutan  protein  bebas  dari  garam, maka  larutan  buffer  diluar  membran  dianalisis dengan  ditetesi  larutan  BaCl 2 1%.  Apabila larutan  protein  masih  mengandung  amonium sulfat,  maka  di  dalam  larutan  buffer  akan terbentuk  endapan  barium  sulfat  yang  berwarna putih.
Dari  proses  pemurnian  diperoleh  4  fraksi enzim,  yakni  fraksi  20%,  40%,  60%,  dan  fraksi 80%. Fraksi-fraksi ini kemudian diuji aktivitasnya menggunakan kasein sebagai substrat  untuk  mengetahui  aktivitas  tiap  fraksi. Hasil  uji  aktivitas  tiap  fraksi  ditunjukkan  pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil uji aktivitas fraksional
Berdasarkan data hasil uji aktivitas fraksional  pada  Tabel  3,  diketahui  bahwa  fraksi dengan  aktivitas  spesifik  tertinggi  adalah  fraksi 80%.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pada  fraksi 80%  terdapat  enzim  papain  dengan  jumlah
Dominggus Malle , dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2015, 2, 182 - 189
1
terbanyak  diantara  fraksi-fraksi  lainnya,  maka untuk  uji  protein  dan  karakterisasi  digunakan fraksi 80%.

## Uji Protein
Uji protein pada penelitian ini menggunakan metode  Bradford,  uji  ini  didasarkan  pada pengamatan  bahwa  absorbansi  maksimum  untuk larutan  pewarna  asam  Coomassie  Brilliant  Blue G-250  bergeser  dari  465  nm  ke  595  nm,  ketika mengikat  protein  maka  terjadi  perubahan  warna (Bradford,  1976).  Panjang  gelombang  yang digunakan  yaitu  595  nm,  yang  merupakan panjang gelombang maksimum. Hal ini dikarenakan  pada  panjang  gelombang  595  nm absorbansi  sebanding  dengan  pewarna  yang terikat  pada  protein.  Oleh  karena  itu,  kadar protein pun menjadi sebanding dengan absorbansi  jika  diukur  menggunakan  kurva standar.  Dari  persamaan  garis  yang  diperoleh dari  kurva  standar,  dilakukan  penentuan  kadar protein  papain  dari  fraksi  80%  dan  hasil  yang diperoleh  yaitu  kadar  protein  papain  sebesar  53 mg/mL.

## Karakterisasi Papain
Penentuan pH optimum
pH  optimum  enzim  adalah  pH  pada  saat aktivitas  enzim  mencapai  nilai  tertinggi.  Hasil penelitian  aktivitas  papain  pada  berbagai  variasi pH disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil uji penentuan pH optimum papain
Pada  kurva  penentuan  pH  optimum  ini terlihat  bahwa  aktivitas  enzim  mengalami kenaikan  pada  pH  5,0  hingga  8,0,  kemudian turun  pada  pH  8,5  hingga  9,0.  Grafik  tersebut menunjukkan  bahwa  nilai  aktivitas  tertinggi
dicapai pada pH 8,0 yaitu sebesar 14,07031 x 10 5 U/g,  sehingga  pH  8,0  merupakan  pH  optimum untuk  papain  murni  yang  diisolasi  dari  getah buah pepaya jenis daun kipas.
Gambar 2.  Kurva pH optimum enzim papain dari getah pepaya jenis daun kipas
Nilai  pH  sangat  berpengaruh  terhadap aktivitas  enzim.  Enzim  merupakan  protein  yang tersusun atas residu-residu asam amino. Perubahan  pH  menyebabkan  perubahan  muatan pada  residu-residu  asam  amino,  terutama  yang menyusun  pusat  aktif  enzim.  Hal  ini  sangat berpengaruh  terhadap  konformasi  enzim,  daya katalitik  dan  efisiensi  pengikatan  enzim-substrat (Wirahadikusumah, 1981).
Aktivitas papain mencapai nilai tertinggi pada  pH  8,0.  Pada  pH  optimum  tersebut,  enzim berada  pada  tingkat  ionisasi  yang  paling  sesuai untuk  berikatan  dengan  substrat.  Konformasi enzim dalam bentuk yang sangat stabil, sehingga efektifitas  pengikatan  enzim-substrat  tinggi (Stryer,  1988).  Perubahan  pH  di  sekitar  pH optimum  menyebabkan  berubahnya  muatan residu-residu  asam  amino,  terutama  yang menyusun  pusat  aktif  enzim,  dan  juga  muatan residu-residu  asam  amino  penyusun  substrat (kasein). Hal ini menyebabkan turunnya efektifitas  pengikatan  enzim-substrat,  sehingga perubahan  pH  disekitar  pH  8,0  menyebabkan turunnya  aktivitas  enzim.  Perubahan  pH  yang terlalu  jauh  dari  pH  optimum  menyebabkan enzim  mengalami  denaturasi,  sehingga  aktivitas yang  dihasilkan  sangat  kecil.  Hal  ini  terjadi ketika papain dikarakterisasi pada pH 5,0 dan pH 9,0,  aktivitas  enzim  tersebut  sangat  kecil  karena terjadi  perubahan  pada  konformasi  struktur tersier  akibat  dari  adanya  protonasi  pada  asam amino tertentu.
Dominggus Malle , dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2015, 2, 182 - 189
1

## Penentuan suhu optimum
Suhu  optimum  adalah  suhu  pada  saat aktivitas  enzim  mencapai  nilai  tertinggi.  Untuk menentukan  suhu  optimum  papain,  pH  substrat dikondisikan  ke  pH  8,0  yang  merupakan  pH optimum  dengan  menambahkan  buffer  Tris-HCl pH  8,0.  Hasil  uji  aktivitas  papain  pada  berbagai variasi suhu disajikan pada Gambar 3.
Gambar 3.  Kurva suhu optimum enzim papain dari getah pepaya jenis daun kipas
Pada  Gambar  3,  terlihat  bahwa  aktivitas papain  mengalami  kenaikan  seiring  dengan peningkatan  suhu  dari  40  °C  sampai  60  °C. Aktivitas  maksimum  dicapai  pada  suhu  60  °C yaitu  sebesar  14,39755  x  10 5 U/g.  Dengan demikian, suhu 60 °C merupakan suhu optimum bagi enzim papain.
Pemanasan di atas suhu 60 °C menyebabkan terjadinya  perubahan  konformasi  enzim  yang mengarah pada perubahan destruktif (denaturasi).  Ikatan-ikatan  non-kovalen  yang mempertahankan  struktur  sekunder  dan  tersier enzim  terputus,  sehingga  terjadi  kerusakan  pada molekul enzim (Sadikin, 2002). Kerusakan inilah yangmengakibatkan  turunnya  aktivitas  enzim, seperti  terlihat  pada  Gambar  3,  dimana  pada suhu  65  –  85  °C  papain  mengalami  penurunan aktivitas.

## Perkiraan Massa Molekul Papain (Metode SDS-PAGE)
Pemurnian  enzim  papain  yang  dilakukan menunjukkan hasil yang baik. Hasil ini didukung oleh  data  hasil  analisis  SDS-PAGE  seperti  pada Gambar 4.
Gambar 4. Hasil SDS-PAGE ; M= Marker ; 1= Fraksi 20% ; 2= Fraksi 40% ;
3= Fraksi 60% ; 4= Fraksi 80%
Hasil SDS-PAGE menunjukkan adanya pita pada tiap-tiap fraksi. Fraksi 20% terdapat 4 pita, sedangkan  fraksi  40%,  60%  dan  80%    terdapat masing-masing  3  pita.  Hasil  perhitungan  berat molekul tiap-tiap fraksi disajikan pada Tabel 6.
Tabel 6. Hasil perhitungan berat molekul sampel
Seperti  yang  dikemukakan  oleh  Hasanah (2005) bahwa papain mempunyai massa molekul 21.000 Dalton. Hasil analisa dengan SDS-PAGE untuk  fraksi  20%,  40%,  60%  dan  80%, menunjukkan  adanya  enzim  papain  pada  fraksi 80%,  pada  pita  ke-3  dengan  jarak  migrasi  5,3 cm, dengan hasil perhitungan menunjukkan berat molekul sebesar 21,6 kDa.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa :
1. Enzim  papain  dapat  diisolasi  dari  pepaya jenis  daun  kipas,  dengan  hasil  pemurnian menunjukan aktivitas enzim papain tertinggi yaitu  fraksi  80%  dengan  aktivitas  spesifik sebesar 10,5797 x 10 5 U/g.
2. Aktivitas  enzim  papain  dari  pepaya  jenis daun  kipas  memiliki  pH  optimum  8,0  dan
Dominggus Malle , dkk / Ind. J. Chem. Res. , 2015, 2, 182 - 189
1
suhu  optimum  60°C,  dengan  kadar  protein yang  diperoleh  dari  fraksi  80%  adalah  53 mg/mL  dengan    massa  molekul  dari  hasil analisa SDS – PAGE adalah 21,6 kDa.

## DAFTAR PUSTAKA
Bradford,  M.  M.,  1976, A  Rapid  and  Sensitive
Method for Quantitation of ProteinUtilization , The Principle of Protein- dye Binding , Anal. Biochem , 72:248-254.
Da  Silva,  J.  A.  T.,  Z.  Rashid,  D.  T.  Nhut,  D.
Sivakumar, A. Gera, M. T. Souza Jr., dan P. F.  Tennant.  2007, Papaya (Carica  papaya L.)  Biology  andBiotechnology, Tree  and Forest Science and Biotechnology 1 (1): 47- 73.
Kahar,  Z.,  1995, Pengaruh  Jenis  Substrat terhadap  Aktivitas  Proteolitik  Enzim  Papain Amobil ,  Laboratorium  Kimia  Universitas Andalas.
Kalie,  M.  Baga,  2002, Bertanam  Pepaya , Penebar Swadaya, Jakarta.
Sadikin, M., 2002, Biokimia Enzim , terbitan ke 1, Widya Medika, Jakarta.
Sindumarta,  H.,  dan  Natalia,  D.,  1999, Catatan Kuliah  Biokimia  1  :  Struktur  danKatalir , Jurusan  Kimia  MIPA,  ITB,  Bandung,  Hal 101.
Sudrajat, Y., 2002, Teknik Penghilangan Lapisan Kapur  pada  Teripang  Pasir  Menggunakan Enzim  Papain , Buletin  Teknik  Pertanian Vol. 7 Nomor 2. Virdi, M. S. 2009. Papain from Papaya . Science Tech Entrepreneur.
Wirahadikusumah,  M.,  1981, Biokimia  Protein, Enzim dan Asam Nukleat , terbitan ke 2, ITB,
Bandung.
Stryer,  L.,  1988, Biochemistry ,  3rd  ed.,  W.  H. Freeman and Company, New York.