Aktivitas Antifouling dan Karakteristik Fitokimia Ekstrak Rumput Laut Sargassum sp. dari Perairan Gunung Kidul,

## Yogyakarta
Muhamad Fikri Hudi Nur Hakim*, Ita Widowati, Agus Sabdono Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl.Prof.H.Soedarto S.H, Tembalang,Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia *Corresponding author, e-mail: fikridroid@gmail.com
ABSTRAK : Marine biofouling merupakan tumbuhnya organisme yang tidak diinginkan pada suatu permukaan  yang  terendam  air  laut.  Penempelan  ini  dapat  menyebabkan  gangguan  teknis  dan kerusakan. Penelitian ini bertujuan untuk mencari senyawa aktif antifouling yang ramah lingkungan sebagai  pengganti  TBT.  Materi  yang  digunakan  adalah  ekstrak  rumput  laut Sargassum echinocarpum dan S.  cinereum dengan  berbagai  macam  pelarut  (n-heksan,  etil  asetat,  dan metanol).  Sampel  diambil  dari  perairan  Gunungkidul,  Yogyakarta.  Bakteri  biofilm  diisolasi  dari substrat plat kayu mahoni yang direndam selama 2 minggu. Metode dalam penelitian ini adalah Uji aktivitas antifouling menggunakan metode disk-diffusion , Uji Fitokimia, Uji Biokimia, dan Uji Brine Shrimp  Lethality  Test .  Hasil  penelitian  menunjukan  aktivitas  antimikrofouling  terbaik  ditunjukkan oleh  ekstrak  kasar S.  cinereum dengan  pelarut  etil  asetat  dan S.  echinocarpum dengan  pelarut metanol.  Berdasarkan  analisa  One-Way  ANOVA  dengan  signifikansi  <0,05menunjukkan  ekstrak dengan pelarut metanol dan etil asetat tidak berbeda nyata, sedangkan ekstrak dengan pelarut n- heksan  tidak  membentuk  zona  hambat.  Uji  Biokimia  menunjukkan  jenis  bakteri  yang  dapat dihambat  adalah Bacillus sp.,  dan Nacordia sp.  Hasil  fitokimia  menunjukkan  ekstrak S.  cinereum dengan  pelarut  etil  asetat  mengandung  senyawa  alkaloid,  quinon,  steroid,  dan  flavonoid. Sedangkan  ekstrak S.  echinocarpum dengan  pelarut  metanol  mengandung  senyawa  quinon, triterpenoid,  dan  flavonoid.  Uji Brine  Shrimp  Lethality  Test menunjukkan  bahwa  ekstrak S. echinorcarpum dan S.  cinereum dengan  pelarut  metanol  dan  n-heksan  memiliki  nilai  LC 50 568,4347  bpj;  663,613  bpj;  639,711  bpj;  dan  855,3114  bpj  dengan  kategori  toksik.  Dapat disimpulkan dari penelitian ini bahwa ekstrak S. cinereum dan S. echinocarpum dapat digunakan sebagai sumber antifouling .
Kata kunci : Rumput Laut Sargassum sp., Antifouling, Bakteri Fouling.

## Antifouling Activity and Phytochemical Characteristics of Sargassum sp. hrom the waters of
Gunung Kidul, Yogyakarta
ABSTRACT  : Marine  biofouling  is  the  growth  of  unwanted  organism  on  the  structure  which  is submerged  in  seawater.  The  attachment  of  those  organism  could  lead  to  technical  because  it attaches  and  destroys  the  structures.The  aim  of  this  research  to  find  an  antifouling  active compound that is environmentally friendly as a replacement for TBT.This research used a sample of  S.  echinocarpum  and  S.  cinereum  which  is  extracted  in  various  solvents  (n-hexane,  ethyl acetate,  and  methanol).  The  seaweed  samples  are  taken  from  Gunungkidul,  Yogyakarta.  The biofilm bacteria is isolated from the mahogany plate substrate that has been submerged in the sea for  two  weeks.  Antifouling  activity  test  used  the  disk  diffusion  method,  Phytochemicals  test  used the  Harborne  test  methods,  Biochemical  test  used  the  Cowan  and  Steel  methods,  and  Brine Shrimp  Lethality  Test  used  the  Meyer  methods.The  results  showed  that  the  antimicrofouling activity is most well demonstrated by the extract of  S. cinereum with ethyl acetate solvent and S. echinocarpum with methanol solvent. Based on the analysis of One-Way ANOVA with significance <0.05  is  known  that  the  different  types  of  solvent  does  not  affects  the  results  of  inhibitory  zone where methanol and ethyl acetate  are not significantly different, which the extract with n-hexane solvent does not form an inhibition zone.Biochemistry test shows that the type of bacteria that can be inhibited is Bacillus sp., and Nacordia sp.. The results showed that the phytochemical extracts
of the S. cinereum crude extract with ethyl acetate solvent contains alkaloid, quinone, steroid and flavonoid compounds. While the crude extract of S. echinocarpum with methanol solvent contains quinone, triterpenoid and flavonoid compounds.Brine Shrimp Lethality Test showed that the crude extract  of  S.  echinorcarpum  and  S.  cinereum  with  methanol  and  n-hexane  occupy  the  toxic category  with  LC 50 values  568.4347  bpj;  663.613  bpj;  639.711  bpj;  and  855.3114  bpj.  It  was concluded  that  the  crude  extract  of  S.  cinereum  and  S.  echinocarpum  making  it  possible  to  be used as a source of antifouling.
Keywords : Seaweed Sargassum sp., Antifouling, Fouling Bacteria.

## PENDAHULUAN
Marine  biofouling  menurut  Yebra et  al. (2004)  dapat  diartikan  sebagai  tumbuhnya  suatu organisme yang tidak diinginkan pada suatu permukaan buatan manusia yang terendam oleh air laut.  Penempelan  organisme  tersebut  dapat  menyebabkan  gangguan  teknis  dan  gangguan ekonomi karena menempel pada struktur buatan manusia (Cho, 2012 b ).
Organisme fouling yang biasa menempel pada struktur tersebut diantaranya adalah mikroba, diatom,  teritip, tunicates,  bryozoans dan  spora  dari  ganggang  laut  (Bhadury  dan  Wright,  2004). Organisme  fouling  seperti  teritip  dan  kerang  pada  umumnya  diketahui  menjadi  organisme  yang mendominasi sebagai penyebab biofouling. Biofouling dapat menyebabkan kerugian serius secara global,  yaitu  dengan  menghancurkan  substrat  secara  struktural.  Contoh  kerusakan  yang  umum terjadi  adalah  seperti  rusaknya  lambung  kapal,  kandang  pada  sistem  budidaya,  dan  juga tersumbatnya  saluran  pendingin  dan  saluran  limbah  pada  stasiun  pembangkit  listrik  (Majik et  al., 2014).
Menurut  sejarah pada awalnya masalah fouling diatasi dengan mengganti material utama pada struktur yang terendam air untuk meminimalisir terjadinya fouling. Semakin  berkembangnya zaman,  digunakan  cat  antifouling  pada  tahun  1800-an  untuk  meminimalisir  terjadinya  fouling tersebut  (Rajan et  al., 2016).  Menurut International  Maritime  Organisation (IMO)  cat  antifouling merupakan cat yang digunakan sebagai pelapis permukaan kapal untuk mencegah menempelnya moluska  dan  alga  pada  lambung  kapal.  Pada  masa  sebelumnya,  cat  antifouling  menggunakan bahan  utama  berupa  TBT  (Trybuyultin)  sebagai  agen  pencegah  dan  penempelan  organisme fouling (Cho, 2012 a ). Tetapi penggunaan TBT sebagai bahan dasar antifouling telah dilarang oleh International  Maritime  Organization (IMO)  pada  bulan  September  2008  karena  akan  berdampak pada organisme non-target (IMO 2001).
Di Indonesia cat antifouling banyak digunakan sebagai pelapis pada kapal-kapal tradisional maupun  modern.  Cat  yang  dijual  secara  umum  merupakan  jenis  cat self-polishing yang menggunakan sistem binder/resin dimana terdapat TBT didalamnya ( European Chemical Agency , 2014).  Setelah  pelarangan  penggunaan  TBT  oleh  IMO,  PT.  International  Paint  Indonesia  (IPI) pada  tahun  2008  mulai  membuat  cat  kapal  bebas  racun,  tetapi  berdasarkan  penelitian Kusumastuti et al. pada tahun 2013 diketahui terjadi imposex sebesar 50,84% pada Keong Macan ( Babylonia  spirata  spirata )  di  Pelabuhan  Tanjung  Mas  Semarang  karena  adanya  cemaran Tributyltin diperairan, padahal berdasarkan hasil pengukuran parameter lingkungan masih berada dibawah batas SNI yang ditentukan.
Berdasarkan  dampak  negatif  tersebut  maka  TBT  menjadi  polutan  di  laut  yang  harus digantikan secepatnya  mengingat senyawa logam  berat  yang terkandung dalam TBT tidak dapat didegradasi  dan  akan  terus  terakumulasi  diperairan  seperti  pada  sedimen  maupun  organisme yang  hidup.Setelah  pelarangan  penggunaan  TBT  oleh International  Maritime  Organisation (IMO) pada tahun 2008, mulai banyak dilakukan penelitian mengenai pencarian antifouling yang ramah lingkungan sebagai pengganti biosida yang berbahaya. Salah satunya yaitu dengan menggunakan sampel  dari  organisme  laut,  organisme  laut  dipilih  karena  cara  hidup  organisme  tersebut  yang selalu  terendam  oleh  air  laut  tetapi  hanya  sedikit  atau  bahkan  tidak  ada  sama  sekali  organisme fouling  yang  menempel.  Terdasarkan  teori  tersebut  maka  dilakukan  penelitian  antifouling  dari banyak  organisme  laut  dengan  tujuan  untuk  mencari  senyawa  yang  dapat  menghambat tumbuhnya organisme fouling (Trepos et al., 2013).
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan terhadap sumber antifouling dari organisme laut diketahui bahwa bakteri simbion karang (Sabdono dan Radjasa, 2006), Rumput laut (Bazes et al., 2009),  Lamun  (Iyapparaj et  al., 2014),  Puffer  Fish  (Soliman et  al., 2014),  Mangrove  (Idora  et  al., 2015)  dan  mikroba  asosiasi  mangrove  (Sibero et  al .,  2017)  mempunyai  hasil  yang  cukup  baik sebagai  potensi  sumber  antibakteri.  Rumput  laut  diketahui  mempunyai  metabolit  bioaktif  yang menunjukkan  spektrum  luas  dari  segi  bioaktivitasnya.  Diketahui  rumput  laut  coklat  dapat menghambat  bakteri  dengan  baik  seperti  bakteri S.  aureus,  E.  coli, dan P.  vulgaris (Moorthi  dan Balasubramanian, 2015). Menurut Iyapparaj et al. pada tahun 2012, salah satu genus yang telah diketahui  memiliki  senyawa  bioaktif  antifouling  adalah  dari  genus  Sargassum  (Phaeophyceae). Berdasarkan  dengan  hal  tersebut  perlu  diadakannya  penelitian  lebih  lanjut  untuk  mengkaji Sargassum sp.  sebagai  potensi  sumber  antifouling  yang  ramah  lingkungan  untuk  menggantikan TBT sebagai bahan dasar cat antifouling yang sudah dilarang penggunaannya.

## MATERI DAN METODE
Materi  yang  digunakan  adalah  ekstrak  rumput  laut S.  echinocarpum dan S.  cinereum . Masing-masing spesies telah diekstraksi menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol. Sampel  rumput  laut  diambil  dari  perairan  Gunungkidul,  Yogyakarta.  Isolasi  bakteri  biofouling dilakukan dengan cara merendam plat kayu Mahoni dengan ukuran 12x8x1cm di perairan Pantai Marina Semarang selama 2 minggu lalu dilakukan isolasi untuk mendapatkan kultur bakteri murni. Brine Shrimp Lethality Test dilakukan dengan menggunakan hewan uji Artemia salina Leach yang telah  ditetaskan  selama  2x24  jam.  Metode  dalam  penelitian  adalah  metode  eksperimental laboratoris,  dimana  penelitian  ini  mengkaji  varian-varian  dari  semua  atau  hampir  semua  variabel bebas  yang  mungkin  berpengaruh,  sedangkan  variabel  yang  tidak  relevan  dengan  masalah- masalah  penelitian  dibuat  (Setyono,  2005).Metode  ini  merupakan  modifikasi  dan  pengembangan dari metode yang telah digunakan pada penelitian Santi et al. (2014). Salah satu pengembangan yang  dilakukan  adalah  dengan  uji  lanjutan  Uji Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT)  sebagai perwakilan terhadap makrofouling.

## Preparasi Ekstrak Rumput Laut
Sampel  yang  digunakan  berupa  rumput  laut  dari  daerah  Pantai  Kukup,  Gunungkidul, Yogyakarta.  Pengambilan  sampel  dilakukan  disekitar  pantai  pada  daerah  yang  telah  ditentukan pada  saat  surut.  Sampel  yang  diambil  adalah  berupa  seluruh  rumput  laut  yang  ditemukan  dari genus  Sargassum.  Sampel S.  echinorcarpum dan S.  cinereum yang  telah  diambil  lalu  dicuci menggunakan  air  laut  steril  dan  air  tawar  untuk  menghilangkan  epifit  yang  menempel  dan menurunkan kadar garam (Santi et al., 2014). Sebelumnya sampel yang didapatkan diidentifikasi terlebih  dahulu  berdasarkan  referensi.  Sampel  yang  telah  bersih  lalu  dikeringkan  menggunakan metode  Kering  Angin  selama  7  hari  di  dalam  suhu  ruangan  dan  terhindar  dari  cahaya  matahari langsung  (Cho et  al., 2001).Sampel  kering  dihancurkan    menggunakan  blender  untuk mendapatkan simplisia rumput laut. Simplisia (100 gram) diekstrak menggunakan teknik maserasi bertingkat menggunakan pelarut non-polar, semi-polar  dan polar  dengan perbandingan 1:4 (w/v). Maserasi  dimulai  dari  pelarut  non-polar  (n-heksan),  lalu  semi-polar  (etil-asetat)  dan  polar (metanol).  Setiap  maserasi  pelarut  dilakukan  selama  2x24  jam.  Hasil  maserasi  disaring menggunakan kertas Whatman No.41 dengan diameter 125 mm dan dilakukan penguapan pelarut pada maserat untuk mendapatkan ekstrak kasar (Septiana et al., 2012).

## Isolasi Bakteri Biofilm
Isolasi  dilakukan  dengan  meletakkan  kayu  Mahoni  berukuran  12x8x1  cm  yang  dikaitkan pada substrat dengan tali pada kedalaman 100 cm dibawah permukaan laut pada surut terendah selama  2  minggu  (Santi et  al., 2014).Lempeng  kayu  yang  telah  terendam  lalu  diambil  dan disemprot  menggunakan  air  laut  steril  dan  dilakukan  pengerokan  menggunakan  bantuan cutter steril secara aseptik. Dilakukan pengenceran 10 -1 dengan mengambil 1 ml sampel dan dilarutkan dengan air laut steril hingga volume 10 ml. Hasilpengenceran  10 -1 diambil 1 ml sampel dilarutkan dengan air laut steril sampai volume 10 ml menghasilkan pengenceran 10 -2 . Pengenceran dengan cara yang sama dilakukan pada 10 -3 , 10 -4 dan, 10 -5 (Sabdono et al., 2005).
Sampel  diambil  50  µl  dari  masing-masing  pengenceran  kemudian  diletakkan  pada  cawan petri  berisi  media  zobell  2216E  dan  diratakan  diatas  permukaan  media  menggunakan spreader lalu  diinkubasi  selama  48  jam  dalam  suhu  37°C.  Koloni  yang  ditemukan  tumbuh  pada  media diidentifikasi  secara  morfologi  berdasarkan  warna,  bentuk,  tekstur  dan  tepian.  Koloni  yang diperoleh  dipisahkan  menggunakan  teknik streak yaitu  dengan  cara  menggoreskan  koloni  yang dipilih kedalam cawan petri terpisah sehingga diperoleh isolat bakteri biofilm primer berupa kultur murni (Sabdono et al., 2005).

## Uji Aktivitas Antimikrofouling
Ekstrak  yang  didapat  diuji  menggunakan  bakteri  fouling  dengan  metode  disk  diffusion (Radjasa et al., 2007). Bakteri yang telah dimurnikan lalu dibiakkan pada media Zobell 2216E cair (10  ml)  selama  2x24  jam  diatas shaker lalu  dihitung  kekeruhannya  sesuai  dengan  standar McFarland  menggunakan  spektrofotometer.  Koloni  bakteri  yang  telah  sesuai  standar  McFarland lalu dibiakkan kedalam petri yang telah berisi media Zobell 2216E padat (15 ml) sebanyak 50 μl pada  setiap  petri  disk  dan  diinkubasi  selama  30  menit  sebelum  dilakukan  peletakan  paper  disk. Sebelumnya  kertas  saring  Whatman  No.41  dipotong  dengan  pembolong  kertas  dengan  ukuran diameter  6  mm  untuk  dijadikan  sebagai  paper  disk,  paper  disk  yang  ditelah  dipotong  lalu disterilisasi untuk dipakai pada uji disk diffusion (Rajan et al, 2016).
Sebanyak  0,05  gram  ekstrak  dilarutkan  kedalam  10  ml  pelarut  (sesuai  pelarut  pada  saat ekstraksi) untuk dijadikan sebagai larutan ekstrak. Larutan ekstrak diteteskan sebanyak 10 μl pada setiap paper  disk,  sehingga  terdapat  50  μg  ekstrak  pada  setiap  paper  disk  (Santi et  al., 2014). Paper  disk  diletakkan  pada  petri-disk  yang  telah  berisi  bakteri  uji,  lalu  ditutup  dan  diinkubasi terbali k  selama  2 24  jam  dalam  suhu  37 C.  Pengukuran  zona  hambat  dilakukan  pada  jam  ke-24 dan  ke-48  untuk  setiap  paper  disk.    Setiap  sampel  uji disk  diffusion dilakukan  dua  kali pengulangan.
Hasil uji antimikrofouling dianalisis menggunakan Uji Statistika One-Way ANOVA ( α= 0,05). Berdasarkan  hasilOne-Way  ANOVA,  2  jenis  sampel  ekstrak  dengan  zona  hambat  terbaik dilanjutkan pada Uji Fitokimia. Sedangkan untuk isolat bakteri, 2 buah isolat terbaik yang memiliki hasil zona hambat paling besar dilanjutkan pada Uji Biokimia.

## Uji Fitokimia dan Uji Biokimia
Uji laboratorium yang digunakan berupa Uji Fitokimia (Uji alkaloid, Uji saponin, Uji flavonoid, Uji Steroid, Uji Fenol, Uji Quinon, Uji Tanin) pada 2 jenis hasil ekstrak terbaik yang dilakukan untuk mengetahui  senyawa  yang  terkandung  pada  ekstrak  rumput  laut.  Selanjutnya  dilakukan  Uji Biokimia pada 2 isolat bakteri uji terbaik untuk mengetahui jenis bakteri biofouling yang diperoleh berdasarkan morfologi (Santi et al., 2014).
Uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dilakukan menggunakan  metode Meyer et al. (1982) yaitu  larva Artemia  salina Leach  yang  diperoleh  dari  inkubasi  kista  Artemia  salina  sebanyak  0,1 gram dalam media air laut steril sebanyak 1 liter dengan diberi penerangan lampu pijar 40-60 watt serta  diberi  aerasi  selama  48  jam. Artemia  salina yang  telah  menjadi  larva  lalu  dipisahkan  untuk diujikan  menggunakan  ekstrak  yang  telah  diencerkan  dengan  konsenterasi  1000  ppm,  500  ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, dan 12,5 ppm (Muaja et al., 2013). Kontrol negatif (0 ppm) dilakukan tanpa  penambahan  ekstrak.  Masing-masing  konsenterasi  diberi  10  ekor  larva Artemia  salina dengan  tiga  kali  pengulangan  untuk  setiap  konsentrasi.  Pengamatan  dilakukan  pada  jam  ke-24 dari  waktu  pemberian  ekstrak.  Pada  saat  pengamatan  dilakukan  penghitung  dan  pencatatan jumlah  larva  Artemia  yang  hidup  (Muaja et  al., 2013).  Data  hasil  uji  BSLT  lalu  dihitung  dengan metodestatistika regresi linier menggunakan Microsoft Exceluntuk menentukkan nilai dan kategori toksisitas (LC 50 ).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel  yang  diperoleh  terdiri  dari  2  spesies,  yaitu S.  echinocarpum dan S.  cinereum . Karakteristik sampel pertama sesuai dengan spesies S. echinocarpum menurut Agardh J.G. (1848)
yaitu berwarna coklat keemasan; holdfast berbentuk diskoid dan conical; diameter thallus 0,5-3,5 cm dan tinggi 0,5-2 cm; berduri banyak; dan tumbuh pada perairan berbatu didekat ujung rataan terumbu  yang  terkena  ombak.  Karakteristik  sampel  kedua  serupa  denganspesies S. cinereum menurut  identifikasi  Atmadja et  al., (1996)  yaitu  batang  thallus  silindris  dan  licin;  bentuk thallus  yang  menyerupai  daun  lonjong  dan  bergerigi  berukuran  kecil;  cryptostomata  jelas menyebar  pada  lembaran  thallus  yang  menyerupai  daun  dan  gelembung  udara  berbentuk  bulat dengan ujung melengkung.
Pencucian dengan air laut dan air tawar berguna untuk menghilangkan epifit yang menempel pada  sampel  dan  untuk  mengurangi  kadar  garam  pada  sampel.  Kadar  garam  pada  sampel dikurangi  untuk mendapatkan  ekstrak  yang  lebih  baikpada  saat  penguapan  pelarut.  Pengeringan bertujuan untuk mengurangi kadar air yang terkandung pada sampel sehingga akan mudah pada proses ekstraksi dan pada proses penguapan pelarut. Pengeringan dilakukan dengan kering angin pada suhu ruangan, hal ini dilakukan untuk mencegah rusaknya senyawa yang terkandung dalam sampel  (Cho et  al., 2001).  Hasil  pengeringan  diekstraksi  menggunakan  metode  maserasi bertingkat. Pelarut yang digunakan untuk maserasi adalah n-heksan (non-polar), etil asetat (semi- polar),  dan  metanol  (polar).  Maserasi  dilakukan  dari  pelarut  non-polar  ke  pelarut  polar,  hal  ini dilakukan karena untuk mengambil ekstrak sesuai kepolaran dan karena sampel yang digunakan adalah sampel kering sehingga dimulai dari pelarut non-polar.
Proses ekstraksi menghasilkan ekstrak S. echinocarpum dan S. cinereum dengan berbagai macam  karakteristik  dan  perbedaan  berat.  Berdasarkan  hasil  (Tabel  1)  diketahui  bahwa  pelarut yang paling banyak dihasilkan ekstrak adalah pelarut metanol dari sampel S. echinocarpum dan S. cinereum walau memiliki berat yang berbeda (5,03 gram dan 2,51 gram) dibandingkan pelarut etil asetat atau n-heksan. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang banyak terdapat pada sampel S. echinocarpum dan S.  cinereum adalah  senyawa  polar  karena  banyak  terserap  oleh  pelarut metanol.

## Isolasi Bakteri Biofilm dan Uji Aktivitas Antimikrofouling
Bakteri  biofilm  yang  berhasil  di  isolasi  dari  plat  kayu  yang  direndam  pada  Perairan  Pantai Marina  Semarang  diperoleh  sebanyak  5  isolat  bakteri.  Bakteri  yang  berhasil  diisolasi  selanjutnya digunakan pada uji aktivitas antimikrofouling. Uji dilakukan dengan menghitung zona hambat yang terbentuk dari ekstrak S. echinocarpum (N-heksana, etil asetat, dan metanol) dan S. cinereum (N- heksana,  etil  asetat,  dan    metanol)  melawan  5  bakteri  biofilm  yang  telahdiisolasi.  Aktivitas antimikrofouling dinyatakan positif apalagi terbentuk zona hambat di sekeliling paper-disk . Berdasarkan  hasil  pengukuran  diketahui  zona  hambat  terbaik  dimiliki  oleh  ekstrak S. echinocarpum metanol (SEM) dan ekstrak S. cinereum etil asetat (SFE) terhadap seluruh bakteri ujisetelah dibandingkan dan dikategorikan sesuai sifat zona hambatnya pada pengamatan jam ke- 24  dan  ke-48  (Tabel  2).  Sedangkan  ekstrak S.  echinocarpum dan  ekstrak S.  cinereum dengan pelarut n-heksan tidak menghasilkan zona hambatpada seluruh isolat (Gambar 1).
Ekstrak  yang  dapat menghambat  banyak  bakteri  selanjutnya  akan melalui  uji  lanjutan  yaitu uji  fitokimia  untuk  mengetahui  kandungan  senyawa  bioaktif  didalamnya.  Bakteri  biofilm  yang sensitif terhadap ekstrak S. echinocarpum dan S. cinereum selanjutnya akan diidentifikasi menurut morfologinya  dengan  menggunakan  uji  biokimia.Hasil  pengukuran  uji  aktivitas antimicrofouling di analisa menggunakan uji statistika One-way ANOVA (Tabel 3).Hasil pengambilan keputusan One- way ANOVA menunjukkan hasil Terima H 0 atau Tolak H 1 yang berarti setiap jenis ekstrak dengan perbedaan jenis pelarut tidak mempengaruhi secara nyata aktivitas zona hambat yang terbentuk.
Dari  hasil  dapat  dilihat  bahwa  ekstrak S.  echinocarpum dan S.  cinereum dengan  pelarut metanol  dan  n-heksan  mempunyai  spektrum  yang  luas  sebagai  antimikrofouling  karena  dapat menghambat  pertumbuhan  berbagai  bakteri  biofilm  meskipun  mempunyai  daya  sensitifitas  yang berbeda  (Santi et  al., 2014).  Dari  hasil  ini  diketahui  bahwa  ekstrak S.  echinocarpum dan S. cinereum dengan  pelarut  metanol  dan  n-heksan  mempunyai  potensi  untuk  digunakan  sebagai antifouling  yang  ramah  lingkungan karena  berasal  dari  metabolit sekunder  rumput  laut.  Metabolit sekunder ini yang diduga mengganggu pertumbuhan bakteri biofilm (Santi et al., 2014).
Journal of Marine Research Vol.7, No. 3 Agustus 2018, pp. 201-211
Tabel 1. Berat dan Karakteristik Hasil Ekstraksi S. echinocarpum dan S. Cinereum
Tabel 2. Hasil Pengukuran Uji Aktivitas Antimicrofouling Berdasarkan Sifat Zona Hambat
Spesies Pelarut Maserasi (W/V) Ekstrak (%) Residu (%) Bentuk Warna S. Echinocarpum n-heksan 100 gr/ 400 ml 0,62 99,38 Pasta cair Hijau gelap Etil asetat 100 gr/ 400 ml 0,21 99,79 Pasta cair Hijau gelap Metanol 100 gr/ 400 ml 5,03 94,97 Pasta Hijau S. Cinereum n-heksan 100 gr/ 400 ml 1,41 98,59 Pasta cair Hijau gelap Etil asetat 100 gr/ 400 ml 1,73 98,27 Pasta cair Hijau gelap Metanol 100 gr/ 400 ml 2,51 97,49 Pasta Hijau B1 B2 B3 B5 B8 sidal statik SEM sidal statik sidal sidal statik 3 2 terbaik SEN - - - - - 0 0 SEE statik statik sidal statik statik 1 4 SFM sidal statik statik sidal statik 2 3 SFN - - - - - 0 0 SFE sidal statik sidal sidal sidal 4 1 terbaik Jenis Sampel Kode Isolat
total Keterangan
Journal of Marine Research Vol.7, No. 3 Agustus 2018, pp. 201-211
Tabel 3. Hasil Uji Statistika One-way ANOVA

## Uji Biokimia dan Uji Fitokimia
Hasil uji laboratorium biokimia menunjukkan bahwa secara morfologi isolat dengan kode B1 adalah bakteri yang berasal dari genus Bacillus, sedangkan isolat dengan kode B5 adalah bakteri yang berasal dari genus Nocardia. Menurut Bhadury dan Wright (2004) dan Vlamakis et al. (2013) diketahui  bahwa  bakteri  dari  genus  Bacillus  merupakan  bakteri  yang  umum  dijumpai  pada  awal terbentuknya  lapisan  biofilm.  Selain  itu  diketahui  bahwa  bakteri  dari  genus  Bacillus  biasa digunakan  sebagai  bakteri  untuk  uji  antifouling  (Pandithuria et  al., 2015).  Bakteri  dari  genus Nocardia  diketahui  sebagai  bakteri  fouling  yang  menempati  membran  bioreaktor  pada  penelitian Lim et  al. (2004)  dengan  jenis  bakteri  lain.  Pada  umumnya,  genus  Nocardia  diketahui  sebagai bakteri  pathogen  pada  manusia  maupun  hewan.  Pada  manusia  bakteri  dari  genus  Nocardia diketahui  dapat  mengurangi  sistem  kekebalan  tubuh  (Agterof et  al., 2007),  selain  pada  manusia bakteri  dari  genus  Nocardia  diketahui  menjadi  penyebab  penyakit  pada  ikan  mulai  dari  tingkat juvenile menurut penelitian Merck Animal Health.
Analisa  fitokimia  menunjukkan  ekstrak S.  echinocarpum dan S.  cinereum dengan  pelarut metanol  dan  n-heksan  mengandung  beberapa  macam  senyawa  bioaktif  (Tabel  4).  Hasil menunjukkan adanya perbedaan kandungan senyawa walaupun berasal dari sampel yang sama. Perbedaan  ini  terjadi  karena  penggunaan  pelarut  yang  berbeda  tingkat  kepolaran  sehingga senyawa  yang  ditarik  akan  sesuai  tingkat  kepolaran  pelarut  tersebut,  yaitu  pelarut  polar  akan menarik  senyawa  polar  dan  pelarut  semi  polar  akan menarik  senyawa  semi  polar.  Hal  ini  sesuai dengan  pendapat  Nur  dan  Adijuana  (1989)  yang  menyebutkan  bahwa  suatu  senyawa menunjukkan kelarutan yang berbeda satu sama lain dalam berbagai macam pelarut dan senyawa kimia akan mudah larut pada pelarut yang relatif sama tingkat kepolarannya.
Alkaloid  positif  ditemukan  pada  ekstrak S.  cinereum etil  asetat,  sedangkan  negatif  pada ekstrak S. echinocarpum metanol. Hal serupa dengan hasil penelitian Widowati et al. (2014) yang mendapat hasil bahwa kandungan senyawa alkaloid ditemukan pada ekstrak S. duplicatum dan S. echinocarpum dengan  pelarut  etil  asetat.  Hampir  semua  alkaloida  ditemukan  di  alam  dengan keaktifan  biologis  tertentu,  ada  yang  bersifat  toksik  misalnya  kuinin,  morfin  dan  stiknin  (Lenny, 2006).
Senyawa quinon positif ditemukan pada ekstrak S. echinocarpum metanol dan S. cinereum etil asetat. Quinon merupakan senyawa yang bersifat fenol yang biasa ditemukan pada tumbuhan dan  bermanfaat karena dapat  bersifat  antikanker  (Purwianingsih  dan  Hamdiyati,  2011).  Volk  dan Wheeler  (1984),  Pelczar  dan  Reid  (1988)  menyatakan  bahwa  senyawa  fenol  mampu  melakukan migrasi  dari  fase  cair  ke  fase  lemak  yang  terdapat  pada  membran  sel  bakteri  menyebabkan turunnya  tegangan  permukaan membran  sel  (Rahayu,  2000).  Selanjutnya  mendenaturasi  protein dan  mengganggu  fungsi  membran  sel  sebagai  lapisan  yang  selektif,  sehingga  sel  menjadi  lisis (Jawetz et al., 2008).
Senyawa triterpenoid ditemukan pada ekstrak S. echinocarpum metanol dan tidak ditemukan pada  ekstrak S.  cinereum etil  asetat,  sedangkan  senyawa  steroid  ditemukan  pada  ekstrak S. cinereum etil  asetat  dan  tidak  pada  ekstrak S.  echinocarpum metanol.  Hal  ini  sedikit  berbeda dengan  pendapat  Harborne  (1987)  yang  menyebutkan  bahwa  senyawa  triterpenoid  diketahui merupakan golongan senyawa steroid yang digunakan sebagai bahan dasar pembuatan obat.
Hasil  analisis  pada  senyawa  flavonoid  menghasilkan  hasil  positif  dari  kedua  ekstrak S. echinocarpum metanol  dan S.  cinereum etil  asetat.  Flavonoid  memilik  gugus  hidroksi  yang  tidak tersubstitusi  sehingga  bersifat  polar  (Putri et  al., 2013)  karena  kepolaran  inilah  maka  senyawa flavonoid  masih  bisa  tertarik  oleh  senyawa  semi-polar.  Senyawa  flavonoid  merupakan  kelompok senyawa  fenol  yang  terbesar  yang  dapat  ditemukan  di  alam.  Senyawa  flavonoid  dihasilkan  oleh
Sumber Variansi Derajat Kebebasan Nilai F Nilai P F crit Pengambilan Keputusan Jenis Ekstrak dan Pelarut 3 0,205518 0,891069 3,238872 Terima H 0 , Tolak H 1
tanaman  sebagai  salah  satu  bentuk  metabolisme  sekunder  untuk  menghambat  pertumbuhan tumbuhan  lain  yang  ada  di  sekitarnya  sebagai  salah  satu  adaptasi  lingkungan  untuk  bertahan hidup  (Lenny,  2006).  Selain  itu  senyawa  flavonoid  diketahui  berperan  sebagai  senyawa antioksidan  untuk  melawan  radikal  bebas  (Septiana  dan  Asnani,  2012).  Flavonoid  bersifat  polar sehingga  lebih  mudah  menembus  lapisan  peptidoglikan  yang  juga  bersifat  polar  pada  bakteri Gram-positif  daripada  lapisan  lipid  yang  non-polar.  Di  samping  itu  pada  dinding  sel  Gram-positif mengandung polisakarida (asam terikat) merupakan polimer yang larut dalam air, yang berfungsi sebagai transfor ion positif untuk keluar masuk. Sifat larut inilah yang menunjukkan bahwa dinding sel  Gram-positif  bersifat  lebih  polar.  Aktivitas  penghambatan  ekstrak  pada  bakteri  Gram-positif menyebabkan terganggunya fungsi dinding sel sebagai pemberi bentuk sel dan melindungi sel dari lisis osmotik. Dengan terganggunya dinding sel akan menyebabkan lisis pada sel (Dewi, 2010).
Senyawa  bioaktif  yang  berasal  dari  metabolit  sekunder  yang  terdeteksi  pada  fitokimia diketahui bertanggung jawab atas aktivitas antibakteri dan antifouling yang dihasilkan (Iyapparaj et al., 2012, 2014; Santi et al., 2014; Widowati et al., 2014). Perbedaan hasil zona hambat aktivitas antimikrofouling dapat terjadi diduga karena spesifikasi senyawa bioaktif yang dihasilkan berbeda pada  setiap  ekstrak (Trepos et  al., 2013).  Untuk menghasilkan  senyawa  antimikrofouling  dengan spektrum yang lebih besar, harus dilakukan mixing senyawa bioaktif agar mendapatkan hasil yang lebih  baik  dibandingkan  menggunakan  senyawa  dari  salah  satu  ekstrak  saja  sehingga  dapat menghambat lebih banyak pertumbuhan bakteri biofilm (Cho et al., 2001; Trepos et al., 2013).

## Uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Menurut  hasil  uji Brine  Shrimp  Lethality  Test diketahui  bahwa  nilai  toksisitas  ekstrak S. echinorcarpum dan S.  cinereum termasuk  kedalam  kategori  toksisitas  rendah  (Tabel  5).  Hal  ini dapat dilihat melalui kategori hasil pembagian kategori menurut Meyer et al. (1982).
Tabel 4. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak S. echinocarpum dan S. Cinereum
Tabel 5. Hasil uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) menggunakan metode Meyer et al. (1984)
S. ec hinoc arpum metanol S. Cinereum etil asetat Alkaloid - + Quinon + + Fenolik - - Triterpenoid + - Saponin - - Steroid - + Flavonoid + + Parameter Ekstrak Kasar Pelarut
Linier a b R ² R LC 50 (bpj) Kriteria Metanol y = 0,065x + 12,541 12,541 0,065 0,8866 0,942 576,292 Toksik Etil asetat y = 0,0245x + 14,268 14,268 0,0245 0,8772 0,937 1458,45 Tidak Toksik n-heksan y = 0,061x + 9,5196 9,5196 0,061 0,9225 0,96 663,613 Toksik Metanol y = 0,0589x + 12,321 12,321 0,0589 0,9283 0,963 639,711 Toksik Etil asetat y = 0,0341x + 6,5894 6,5894 0,0341 0,8745 0,935 1273,04 Tidak Toksik n-heksan y = 0,0279x + 25,334 25,334 0,0279 0,7267 0,852 884,086 Toksik
S. echinocarpum
S. cinereum
Dari  hasil  diketahui  bahwa  nilai  toksisitas  ekstrak S.  echinorcarpum dan S.  cinereum dengan pelarut  metanol  dan  n-heksan  cukup  baik,  hal  ini  dikarenakan  ekstrak  dapat  membunuh  50% hewan uji dengan hasil kategori toksik. Sedangkan ekstrak S. echinorcarpum dan S. cinereum etil asetat  termasuk  kedalam  kategori  non-toksik  sehingga  tidak  efektif  untuk  dijadikan  sebagai sumber  bioaktif  karena  tidak  dapat  membunuh  50%  hewan  uji  dengan  konsentrasi  uji  yang diberikan.  Artinyauntuk  ekstrak S.  echinorcarpum dan S.  cinereum dengan  pelarut  etil  asetat dibutuhkan lebih banyak konsentrasi ekstrak untuk membunuh 50% dari hewan uji. Menurut Meyer et  al. (1982)  mengatakan  bahwa  semakin  kecil  nilai  LC 50 ,  maka  semakin  besar  potensi  sumber senyawa tersebut dijadikan sebagai obat antikanker. Dengan kata lain sedikit ekstrak yang dipakai pada  uji Brine  Shrimp  Lethality  Test dan  menghasilkan  nilai  LC 50 yang  kecil,  maka  akan mempunyai potensi yang lebih besar untuk digunakan sebagai sumber senyawa antifouling.

## KESIMPULAN
Hasil  isolasi  bakteri  biofilm  menunjukkan  bahwa  bakteri  dari  genus  Bacillus  dan  Nocardia dapat  dihambat  pertumbuhannya  oleh  ekstrak S.  echinocarpum dan S.  cinereum .Aktivitas antifouling pada ekstrak S. echinocarpum dan S. cinereum dengan pelarut metanol dan etil asetat memberikan  hasil  positif  yaitu  dengan  munculnya  zona  yang  dapat  menghambat  tumbuhnya bakteri biofilm primer (0,9-9,3mm) dan  memberikan nilai uji toksisitas Brine Shrimp Lethality Test kategori  toksik  (576,292  bpj).  Kandungan  ekstrak S.  echinocarpum dan S.  cinereum adalah senyawa dari golongan alkaloid, quinon, steroid, triterpenoid, dan flavonoid.

## DAFTAR PUSTAKA
Agardh,  J.G.  1848.  Anadema,  ett  nytt  slägte  bland  Algerne.  Öfversigt  af  Kongl.  Vetenskaps- Akademiens Förhandlingar, Stockholm 1846: 1-16, pl. XVII.
Agterof,  M.J.,  T.  van  der  Bruggen,  M.  Tersmette,  E.J.  ter  Borg,  J.M.M.  van  den  Bosch  dan  D.H. Biesma1. Nocardiosis: a case series and a mini review of clinical and microbiological features. Netherland The Journal of Medicine. June vol. 65, no. 6: 199-202.
Atmadja, W.S. dan Soelistijo. 1988. Beberapa Aspek Vegetasi dan Habitat Tumbuhan Laut Bentik di Pulau-Pulau Seribu. Jakarta : Pusat Penelitian dan Pengembangan Oseanologi-LIPI. 68-73.
Bazes,  A.,  A.  Silkina,  P.  Douzenel,  F.  Faÿ,  N.  Kervarec,  D.  Morin,  J.P.  Berge,  dan  N. Bourgougnon.  2009.  Investigation  of  the  antifouling  constituents  from  the  brown  alga Sargassum muticum (Yendo) Fensholt. J Appl Phycol 21:395 –403.
Bhadury, P. dan P.C. Wright. 2004. Exploitation of marine algae: biogenic compounds for potential antifouling applications. Planta, 219: 561 –578.
Cho, J.Y., E.H. Kwon, J.S. Choi, S.Y. Hong, H.W. Shin, dan Y.K. Hong. 2001. Antifouling Activity of Seaweed  Extracts  on  the  Green  Alga  Enteromorpha  prolifera  and  the  Mussel  Mytilus  edulis. Journal of Applied Phycology 13: 117-125.
Cho,  J.Y..  2012a.  Antifouling  chromanols  isolated  from  brown  alga  Sargassum  horneri.  J  Appl Phycol 25:299 –309.
Cho,  J.Y..  2012b.  Antifouling  steroids  isolated  from  red  alga  epiphyte  filamentous  bacterium Leucothrix mucor. Fish Sci 78:683 –689.
Dewi, F.K. 2010. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda Citrifolia, Linnaeus)
Terhadap Bakteri Daging Segar. Skripsi. Universitas Sebelas Maret. Surakarta.
European  Chemicals  Agency .  2014.  Transitional  Guidance  on  Efficacy  Assessment  for  Product Type 21 Antifouling Products. European Chemicals Agency Helsinki. Finland.
Harborne,  J.B.  1987.  Metode  Fitokimia.  Penuntun  Cara  Modern  Menganalisis  Tumbuhan.
Terjemahan K. Padmawinata dan I. Soediro. ITB. Bandung: 354 hlm.
Idora,  M.S.  Noor,  M.  Ferry,  W.B.W.  Wik,  dan  S.  Jasnizat.  2015.  Evaluation  of  tannin  from Rhizophora  apiculata  as  natural  antifoulingagents  in  epoxy  paint  for  marine  application. JasnizatSchool  of  Ocean  Engineering;  Universiti  Malaysia.  Progress  in  Organic  Coatings  81 125 –131.
IMO  ( The  International  Maritime  Organization ).  2001.  Internationalconvention  on  the  control  of harmful anti-fouling systems on ships. www.imo.org. Diakses tanggal 16 April 2016. Iyapparaj,  P.,  P.  Revathi,  R.  Ramasubburayan,  S.  Prakash,  A.  Palavesam,  G.  Immanuel,  P.
Anantharaman,  A.  Sautreau,  dan  C.  Hellio.  2014.  Antifouling  and  toxic  properties  of  the bioactive metabolites from the seagrasses Syringodium isoetifolium and Cymodocea serrulata. Ecotoxicology and Environmental Safety 103, 54 –60.
Iyapparaj,  P.,  R.  Ramasubburayan,  T.  Raman,  N.  Das,  P.  Kumar,  A.  Palavesam,  dan  G.
Immanuel.  2012.  Evidence  for  the  antifouling  potentials  of  marine  macroalgae  Sargassum wightii. Advances in Natural and Applied Sciences, 6(2): 153-162.
Jawetz,  E.,  J.L.  Melnick,  dan  E.A.  Adelberg.  2008.  Mikrobiologi  Kedokteran.  Jakarta:  Penerbit Buku Kedokteran EGC
Kusumastuti,  R.,  Widianingsih  dan  Nuraini,R.A.T.  2013.  Analisis  Imposeks  pada  Keong  Macan (Babylonia  spirata  spirata)  Sebagai  Bioindikator  Cemaran  Tributyltin  di  Pelabuhan  Tanjung Mas Semarang.  Journal Of Marine Research: Universitas Diponegoro Semarang.  Vol. 2, No. 3, Hal. 114-122.
Lenny,  S.  2006.  Senyawa  Flavonoida,  Fenilpropanoida  dan  Alkaloida.  Karya  Ilmiah.  Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sumatera Utara.
Lim, B.R., K.H. Ahn, P. Songprasert, J.W. Cho dan S.H. Lee. 2004. Microbial community structure of membrane fouling film in an intermittently and continuously aerated submerged membrane bioreactor treating domestic wastewater. Water Sci Technol 49 (2): 255-61.
Majik, M.S., C. Rodrigues, S. Mascarenhas, dan L. D'Souza. 2014. Design and synthesis of marine natural  product-based  1H-indole-2,3-dione  scaffold  as  a  new  antifouling/antibacterial  agent against fouling bacteria. Bioorganic Chemistry 54C: 89-95.
Meyer, B.N., N. R. Ferrigni, J.E. Putnam, L.B. Jacobsen, D.E. Nichols, dan J.L. McLaughlin. 1982. Brine  Shrimp:  A  Convenients  General  Bioassay  for  Active  Plant  Constituents.  Journal  of Medicinal Plant Research. Vol. 45: 31-34.
Moorthi,  P.  V.,  dan  Balasubramanian  C.  2015.  Antimicrobial  properties  of  marine  seaweed,
Sargassum  muticum  against  human  pathogens.  Journal  of  Coastal  Life  Medicine  3  (2):  122- 125.
Muaja,  A.D.,  H.S.J.  Koleangan,  Runtuwene  dan  R.J.  Max.  2013.  Uji  Toksisitas  dengan  Metode BSLT  dan  Analisis  kangdungan  Fitokimia  Ekstrak  Daun  Soyogik  (Saurauia  bracteosa  DC) dengan Metode Soxhletasi. Jurnal MIPA UNSRAT Online (2) 115-118.
Nur,  M.A.  dan  H.  Adijuwana.  1989.  Teknik  Spektroskopi  dalam  Analisis  Biologi.  Bogor:  Institut Pertanian Bogor: 143 hlm.
Pandithurai, M., S. Murugesan, dan V. Sivamurugan. 2015. Antibacterial Activity of Various Solvent Extracts of Marine Brown Alga Sargassum asperum. International Journal of Pharmacological Research. ISSN: 2277-3312. India: 133-137.
Pelczar, M.J. dan R.D. Reid. 1988. Microbiology. McGraw Hill Book Co., New York.
Purwianingsih, W. dan Y. Hamdiyati.  2011. Elicitation Method using Sacharomyces cerevisiae H. to  Improve  Quinone  Bioactive  content  of  Morinda  citrifolia  L.  (Mengkudu)  Callus.  Universitas Pendidikan Indonesia: Bandung: 1-14.
Putri,  W.  S.,  N.K.  Warditiani,  dan  L.P.F.  Larasanty.  2013.  Skrining  Fitokimia  Ekstrak  Etil  Asetat Kulit  Buah  Manggis  (Garcinia  mangostana  L.).  Jurusan  Farmasi  Fakultas  Matematika  Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Bali: 56-60.
Radjasa,  O.K.,  S.I.O.  Salasia,  A.  Sabdono,  dan  J.  Weise.  2007.  Antobacterial  Activity  of  Marine Bacterium  Pseudomonas  sp.  Associated  with  Soft  Coral  Sinularia  polydactyla  against Streptococcus equi Subsp. Zooepidemicus. Int. J. Pharmacol. 3 (2): 170-174.
Rahayu,  P.W.  2000.  Aktivitas  Antimikroba  Bumbu  Masakan  Tradisional  Hasil  Olahan  Industri Terhadap Bakteri Patogen dan Perusak. Buletin Teknologi dan Industri Pangan: Vol 11(2)
Rajan,  R.,  M.  Selvarajb,  S.  Palrajb,  dan  G.  Subramanianc.  2016.  Studies  on  the  anticorrosive  & antifouling  properties  of  the  Gracilariaedulis  extract  incorporated  epoxy  paint  in  the  Gulf  of Mannar Coast, Mandapam, India. Progress in Organic Coatings 90: 448 –454.
Sabdono,  A.  dan  O.K.  Radjasa.  2006.  Antifouling  Activity  of  Bacteria  Associated  with  Soft  Coral Sarcophyton  sp.  Against  Marine  Biofilm-  Forming  Bacteria.  Jurnal  of  Coastal  Development Vol. 10: 55-62.
Sabdono,  A.,  O.K.  Radjasa,  dan  T.  Bachtiar.  2005.  Eksprolasi  Bioaktif  Antifoulant  Bakteri  yang berasosiasi  dengan  Avertebrata  Laut  sebagai  Alternatife  Penanganan  Biofouling  Laut. Laporan Akhir Tahun Hibah Bersaing Perguruan Tinggi. Pusat Studi Pesisir dan Laut Tropis, Universitas Diponegoro, Semarang. 26 hlm.
Santi,  I.W.,  O.K.  Radjasa,  dan  I.  Widowati.  2014.  Potensi  Rumput  Laut  Sargassum  duplicatum Sebagai Sumber Senyawa Antifouling. Journal of Marine Research Vol. 3, No. 3: 274-284. Septiana,  A.T.  dan  A.  Asnani.  2012.  Kajian  Sifat  Fitokimia  Ekstrak  Rumput  Laut  Cokelat Sargassum  duplicatum  Menggunakan  berbagai  Pelarut  dan  Metode  Ekstraksi.  Agrointek Vol.6, No.1: 22-28.
Setyono, B. 2005. Penilaian Otentik dalam Kurikulum Berbasis Kompetensi. Lembaga Pendidikan (LP3). Jurnal pengembangan pendidikan. Universitas Jember.
Sibero,  M.  T.,  Sahara,  R.,  Syafiqoh,  N.,  Tarman,  K.  2017.  Antibacterial  activity  of  red  pigment isolated  from  coastal  endophytic  fungi  against  multidrug  resistant  bacteria.  Biotropia  24(2): 161-172.
Soliman,  Y.A.,    A.  S.  Mohamed,  dan  M.N.  Gomaa.  2014.  Antifouling  activity  of  crude  extracts isolated from two Red Sea puffer fishes. Egyptian Journal of Aquatic Research 40: 1 –7.
Trepos,  R.,  E.  Pinori,  P.R.  Jonsson,  M.  Berglin,  J.  Svenson,  R.  Coutinho,  J.  Lausmaa  dan  C. Hellio.  2013.  Innovative  Approaches  For  The  Development  of  New  Copper-free  Marine Antifouling  Paints.  European  Union  Seventh  Frameworks  Programme.  LEAF.  The  Journal  of Ocean Technology. Vol 9. No 4: 7-18.
Vlamakis, H., Y. Chai, P. Beauregard, R. Losick, dan R. Kolter. 2013. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3):157-68.
Volk  dan  Wheeler.  1984.  Mikrobiologi  Dasar.  Penerjemah:  Markhman.  Edisi  Kelima.  Penerbit:
Erlangga. Jakarta.
Widowati, I., A.B. Susanto, M. Puspita; V.S. Pouvreau, dan N. Bourgougnon. 2014. Potentiality of Using Spreading Sargassum Species from Indonesia as an Interesting Source of Antibacterial and  Radical  Scavenging.  IJMARCC.  International  Journal  of  Marine  and  Aquatic  Resource Conservation and Co-existence 1 (1): 63-67.
Yebra  D.M.,  S.  Kiil,  dan  K.D.  Johansen.  2004.  Antifouling  technology  past,  present  and  future steps  towards  efficient  and  environmen  tally  friendly  antifouling  coatings.  Prog  Org  Coat 50:75 –104.