ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (1) (2017) : 25 – 29
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi Bakteri Endofit pada Rimpang Jahe Merah ( Zingiber officinale Linn. Var Rubrum) Penghasil Senyawa Antioksidan
Okky Triana a , Purbowatiningrum Ria Sarjono a,* , Nies Suci Mulyani a
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: purbowatining@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords: endophytic bacteria, antioxidants, red ginger ( Zingiber officinale Linn. Var rubrum )
This research has been done about solation of Endophytic Bacteria on Rhizome Red Ginger ( Zingiber officinale Linn. Var rubrum ) as producer of antioxidan compounds. The purpose of this research is to obtain isolates of endophytic bacteria in symbiosis with red ginger rhizome, obtain data antioxidant activity by DPPH method and find out information about the chemical content of secondary metabolites of endophytic bacteria. The method used in  this  study  are  surface  sterilization  and  spreading  on  YMA  medium  followed  by antioxidant  activity  is  analyzed  by  using  DPPH  radical  scavenging  method  and phytochemical  screening.  This  study  resulted  in  three  isolates  of  endophytic  bacteria isolates namely J 1 , J 2 isolates and isolates J 3 which has a different cell morphology as well as  having  the  most  effective  antioxidant  activity  at  concentrations  of  31.25  ppm  with values % inhibition on isolates J 1 , J 2 and J 3 , respectively for 22,71%; 20.86% and 13.08% and all the secondary metabolites of endophytic bacterial isolates contain flavonoids and saponins.

## A b s t r a k
Kata kunci: Bakteri endofit, Antioksidan, jahe merah ( Zingiber officinale Linn. Var rubrum)
Telah dilakukan penelitian mengenai isolasi bakteri endhofit pada jahe merah ( zingiber officinale linn. var rubrum) penghasil senyawa antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh  isolat  bakteri  endofit  yang  bersimbiosis  dengan  rimpang  jahe  merah, memperoleh data aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dan mengetahui informasi mengenai kandungan kimia metabolit sekunder bakteri endofit. Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah surface sterilization dan spreading pada media YMA dilanjutkan dengan uji aktivitas antioksidan dengan metode peredaman radikal DPPH dan penapisan fitokimia.  Tahapan  penelitian  ini  meliputi  isolasi  bakteri  endofit  yang  bersimbiosis dengan  rimpang  jahe,  produksi  metabolit  sekunder  isolat  bakteri  endofit,  uji  aktivitas antioksidan  dan  penapisan  fitokimia.  Penelitian  ini  menghasilkan  tiga  isolat  bakteri endofit  yaitu  isolat  J 1 ,  isolat  J 2 dan  isolat  J 3 yang  memiliki  morfologi  sel  berbeda  serta memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  paling  efektif  pada  konsentrasi  31,25  ppm  dengan nilai % inhibisi pada isolat J 1 , J 2 dan J 3 berturut-turut sebesar 22,71% ; 20,86% dan 13,08% dan semua metabolit sekunder isolat bakteri endofit memiliki kandungan flavanoid dan saponin.

## 1. Pendahuluan
Penyakit  yang  timbul  akhir-akhir  ini  disebabkan karena  adanya  radikal  bebas.  Maka  dari  itu  tubuh memerlukan  suatu  substansi  untuk  menangkap  radikal bebas yang bisa disebut dengan antioksidan. Menurut Ito dkk. [1] antioksidan sintetik memiliki efek samping yaitu dapat  menimbulkan  karsinogenik  dalam  konsentrasi yang  berlebih,  maka  dari  itu  penggunaan  antioksidan alami sangat potensial untuk dikembangkan.
Antioksidan  dapat  dihasilkan  dari  bakteri  endofit yang  bersimbiosis  pada  tumbuhan  yang  juga  memiliki aktivitas  antioksidan  [2].  Hal  ini  dikarenaka  adanya pertukaran genetis dan hubungan evolusi yang panjang.
Rimpang  jahe  merah  ( Zingiber  officinale  Linn.  Var Rubrum) diketahui  mempunyai  beberapa  senyawa  yang berperan  pada  aktivitas  antioksidan.  Menurut  Aruoma dkk. [3]  senyawa  bioaktif  yang  berperan  sebagai antioksidan dalam jahe merah meliputi β -karoten, asam askorbat,  terpenoid,  alkaloid,  dan  polifenol  seperti flavonoid,  glikosida  flavonoid,  rutin,  dll.  Tanaman  jahe merah  dimungkinkan  memiliki  bakteri  endofit  yang berpotensi menghasilkan antioksidan.
Penelitian terdahulu melaporkan aktivitas antimikroba  metabolit  sekunder  mikroba  endofit  yang diisolasi  dari  akar  jahe  merah,  namun  sampai  saat  ini belum pernah dilaporkan mengenai aktivitas antioksidan metabolit  sekunder  bakteri  endofit  dari  rimpang  jahe merah.  Sehingga  pada  penelitian  ini  dilakukan  uji aktivitas  antioksidan  dari  metabolit  sekunder  isolat bakteri  endofit  dan  mengetahui  kandungan  kimia  yang terdapat dalam metabolit sekunder tersebut.

## 2. Metode Penelitian

## Alat
Alat yang digunakan antara lain erlenmeyer 250 mL; gelas ukur 100 mL, 50 mL, dan 25 mL; gelas beker 1000 mL,  500  mL,  dan  50  mL;  labu  ukur  1000  mL;  tabung reaksi,  cawan  petri,  neraca  analitik,  spirtus,  pengaduk, kaca  arloji,  kawat  ose,  micro  pipet,  shaker,  inkas, spreader ,  autoklaf  (Clinical  Autoclave  Pretige  Medical Series 2100), freeze dryer, m ikroskop, sentrifuge (Hettich Zentrifugen Micro 200R) dan spektrofotometer UV-VIS.

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah rimpang jahe merah (Zingiber officinale Linn Var. rubrum),  Yeast  extract,  Dextrosa,  Malt  Extract  Agar, Nystatin,  soluble  strach,  pepton,  etanol  70%,  kalsium dipoklorit,  aquades  steril,  DPPH,  aquades,  safranin, alkohol aseton, lugol iodin, pewarna kristal ungu violet, metanol,  asam  klorida  p.a.10%,  amoniak  p.a  25%, kloroform  p.a.,  kertas  saring,  pereaksi  Dragendorff, pereaksi  mayer,  serbuk  magnesium,  amil  alkohol  p.a., asam  klorida  p.a.  2  N,  ferri  klorida  p.a  1%,  natrium hidroksida p.a. 1 N, anhidrida asam asetat p.a.,dietil eter p.a dan asam sulfat p.a.

## Preparasi dan Sterilisasi Bahan Baku
Bahan baku jahe merah didapatkan dari perkebunan jahe  di  daerah  Ungaran,  Semarang.  Metode  sterilisasi yang  digunakan  adalah  metode surface  sterilization . Sampel disterilisasi permukaan dengan cara merendamnya  dalam  etanol  70%  selama  60  detik. Langkah berikutnya perendaman dengan Ca(ClO) 2 5,25% selama 3 menit, kemudian direndam lagi dengan etanol 70%  selama  60  detik.  Langkah  terakhir  adalah pembilasan dengan menggunakan aquades steril secara bertahap  dengan  pengulangan  sebanyak  tiga  kali  [4]. Bagian  yang  sudah  disterilisasi  selanjutnya  digerus menggunakan mortar secara aseptik untuk mendapatkan ekstrak dari rimpang jahe merah tersebut.

## Isolasi Bakteri Endofit
Ekstrak  sampel  yang  telah  diperoleh  kemudian diambil  sebanyak  100  µL,  kemudian  diinokulasikan secara  aseptik  pada  media yeast  malt  agar  (YMA) dan kemudian  diinkubasi  pada  suhu  ruang  hingga  koloni bakteri  endofit  tumbuh  [5].  Berdasarkan  perbedaan kenampakan morfologinya, koloni bakteri endofit dapat dipisahkan sehingga mendapatkan isolat tunggal.

## Produksi Metabolit Sekunder Isolat Bakteri Endofit
Sebanyak 2  mL kultur hasil  peremajaan diinokulasikan  pada  200  mL  media  cair  dan  diinkubasi dalam shaker incubator pada suhu 25 o C. Kultur di panen pada saat fasa stasioner mendekati fasa kematian sesuai dengan  hasil  kurva  pertumbuhan  yang  didapatkan. Tahap  selanjutnya  kultur disentrifugasi  5000  rpm pada suhu  4°C  selama  10  menit.  Supernatan  dari  kultur  ini selanjutnya  dipekatkan  dengan  menggunakan freeze dryer.

## Uji Aktivitas antioksidan dari metabolit sekunder
Uji  aktivitas  antioksidan  dari  metabolit  sekunder menggunakan  metode  DPPH.  Setiap  sampel  dibuat larutan  induk  1000  ppm.  Setiap  sampel  diencerkan menjadi 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, 62,5 ppm dan 31,25 ppm. Setiap konsentrasi sampel dipipet sebanyak 0,2 mL kedalam microplate ditambahkan 3,8  mL  larutan  DPPH. Kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Larutan standar (vitamin C) dibuat dengan konsenterasi 10 ppm, 5 ppm, 2,5 ppm, 1,25 ppm dan 0,3125 ppm.
Persen inhibisi dapat dihitung dari persamaan:
% Inhibisi = (𝑐−𝑠) 𝑐 × 100%
Keterangan:
S = Absorbansi sampel

## C= Absorbansi tidak mengandung sampel

## Penapisan Fitokimia
Pengujian  senyawa  metabolit  sekunder  dilakukan terhadap  ekstrak  isolat  bakteri  endofit  rimpang  jahe merah  dengan  tujuan  untuk  mengetahui  kandungan golongan senyawa  kimia meliputi  uji  alkaloid, saponin, flavanoid,  tanin,  triterpenoid  dan  steroid  dengan menggunakan metode Farnsworth [6].

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Preparasi dan Sterilisasi Bahan
Sampel  tanaman  jahe  merah  ( Z.  Officinale  Linn.  Var Rubrum )  diperoleh  dari  perkebunan  jahe  di  daerah Ungaran,  Semarang.  Jahe  yang  telah  diperoleh, selanjutnya  disterilisasi  permukaan  dengan  merujuk pada metode [7]. Menurut Purwanto [8], etanol berfungsi untuk  mendenaturasi  protein  bakteri  kontaminan sehingga  tidak  mengganggu  proses  isolasi.  Proses selanjutnya,  jahe  merah  direndam  dengan  Ca(ClO) 2 3,125%  selama  3  menit.  Dalam  larutan, calsium dypochlorite akan  melepaskan  radikal  klor  (Cl)  yang mampu  merusak  membran  dan  protein  bakteri  [8]. Perendaman  dengan  Ca(ClO) 2 tidak  boleh  terlalu  lama untuk  mencegah  masuknya  Ca(ClO) 2 melalui  pori-pori sampel  yang  akan  mematikan  bakteri  endofit  di  dalam sampel. Tahap selanjutnya direndam di dalam Ca(ClO) 2 , kemudian  direndam  lagi  dengan  etanol  70% selama  60 detik.  Langkah  terakhir  adalah  pembilasan  dengan menggunakan  aquades  steril  secara  bertahap  dengan pengulangan  sebanyak  tiga  kali  [4].  Hal  ini  bertujuan untuk  mencuci  sisa  etanol  dan  Ca(ClO) 2 pada  tahap sebelumnya.
Sterilisasi permukaan
bertujuan untuk menghilangkan bakteri kontaminan yang terdapat pada sampel  rimpang  jahe  merah  yang  telah  diperoleh sehingga bakteri yang diisolasi hanya merupakan bakteri endofit  dari  rimpang  jahe  merah  tersebut.  Bagian  yang sudah  disterilisasi  selanjutnya  digerus  menggunakan mortar secara aseptik agar bakteri endofit yang terdapat di  dalam  jaringan  jahe  merah  dapat  keluar  dan  bisa diisolasi.  Dengan  mendapatkan  ekstrak  kasar  rimpang jahe  merah,  diharapkan  bakteri  endofit  terdapat  di dalamnya dan bisa diisolasi dengan media Yeast Malt Agar (YMA).

## Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit
Isolasi  dilakukan  selama  72  jam  penginkubasian pada suhu  ruang. Hasil  yang didapat  pada  tahap  isolasi adalah  diperoleh  3  isolat  bakteri  dengan  karakteristik koloni  berbeda  yang  diberi  nama  isolat  J 1 ,  isolat  J 2 dan isolat  J 3. Gambar  1  menunjukkan  hasil  isolasi  bakteri endofit  dari  rimpang  jahe  merah  ( Z.officinale  Linn.  Var rubrum)
Gambar 1. Hasil Isolasi Bakteri Endofit pada Ja
Hasil isolasi bakteri endofit dari rimpang jahe merah pada jam ke-72 didapatkan 3 isolat bakteri yang memiliki karakter koloni dan morfologi sel yang berbeda, terlihat pada tabel 1.
Tabel 1. Karakteristik morfologi isolat bakteri endofit dari rimpang jahe merah Isolat Koloni Morfologi Warna Bentuk Tepi Gram (+/-) Bentuk sel J1 Putih Tidak beraturan Tepian bergelombang negatif diplobasil J2 Putih susu Bulat Bulat, bertepi negatif streptobasil J3 Putih bening Tidak beraturan Tepian berlekuk negatif monobasil
Hasil  karakterisasi  gram  bakteri  menunjukkan bahwa  ketiga  isolat  bakteri  merupakan  bakteri  gram negatif.  Pengelompokan  bakteri  ini  berdasarkan  pada komponen dinding selnya. Bakteri gram negatif memiliki dinding  sel  yang  lebih  kompleks  daripada bakteri  gram positif.  Dari  data  di  atas  juga  memperlihatkan  bahwa ketiga isolat menunjukkan bahwa karakter dan morfologi sel  berbeda.  Sehingga  diharapkan  memiliki  aktivitas antioksidan dari metabolit sekundernya berbeda pula.

## Produksi Metabolit Sekunder Isolat Bakteri Endofit
Tahap Produksi Metabolit Sekunder bertujuan untuk mendapatkan  metabolit  sekunder  yang  diharapkan memiliki  aktivitas  antioksidan.  Produksi  metabolit sekunder isolat bakteri dilakukan selama 45 jam.
Tahap  setelah  mencapai  jam  ke-45,  media fermentasi tersebut disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm pada suhu 4°C selama 15 menit untuk memisahkan sel  bakteri  dan  supernatan.  Sentrifugasi  pada  suhu rendah  dimaksudkan  agar  metabolit  sekunder  yang terdapat  didalam  sel  tidak  rusak.  Supernatan  yang diperoleh  dari  hasil  sentrifugasi  merupakan  ekstrak kasar metabolit sekunder. Ekstrak kasar ini selanjutnya dilakukan  pemekatan  dengan  menggunakan  metode freeze  drying. Massa  sampel  hasil freeze  dry isolat  J 1 sebesar  0,427  g,  isolat  J 2 sebesar  0,418  g  dan  isolat  J 3 sebesar 1,169 g. Perbedaan massa sampel yang dihasilkan oleh  isolat  bakteri  menunjukkan  setiap  bakteri menghasilkan  senyawa  metabolit  sekunder  yang berbeda.  Oleh  karena  itu  kemungkinan  aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh ketiganya juga berbeda.

## Aktivitas Antioksidan
Tahap  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  data aktivitas  antioksidan  metabolit  sekunder  dari  isolat bakteri  endofit  yang  didapatkan.  Metode  pengujian dilakukan  secara in  vitro dengan  DPPH  yakni  melalui mekanisme  penangkapan  radikal  bebas  oleh  senyawa antioksidan. Mekanisme reaksi dari Reaksi antara DPPH dengan  suatu  molekul  antioksidan  ditunjukkan  pada Gambar 2.
Gambar 2. Reaksi antara DPPH dengan suatu molekul antioksidan [9]
Adapun  hasil  pengujian  aktivitas  antioksidan terhadap  metabolit  bakteri  endofit  jahe  merah  dapat dilihat pada gambar 3.
Gambar 3. Grafik hasil pengukuran antioksidan metabolit sekunder
Pada gambar 3 dapat dilihat bahwa terdapat korelasi antara meningkatnya konsentrasi dengan % inhibisi. Hal ini dikarenakan karena dengan meningkatnya konsentrasi  sampel  maka  memiliki  metabolit  sekunder yang  lebih  banyak  sehingga  dapat  meningkatkan  % inhibisinya. Namun peningkatan konsentrasi terhadap % inhibisi  tidak  terlalu  signifikan.  Pada  isolat  J 1 di konsentrasi 31,25 ppm; 62,5 ppm; 125 ppm; 250 ppm; 500 ppm;  dan  1000  ppm  mempunyai  nilai  %  inhibisi berturut-turut  sebesar  22,72%;  23,09%;  23,34%; 23,58%; 23,95% dan 27,53%. Pada isolat J 2 di konsentrasi 31,25 ppm; 62,5 ppm; 125 ppm; 250 ppm; 500 ppm; dan 1000  ppm  mempunyai  nilai  %  inhibisi  berturut-turut sebesar 20,86%; 22,46%; 22,71%; 23,95%; 27,65% dan 30,61%. Pada isolat J 3 31,25 ppm; 62,5 ppm; 125 ppm; 250 ppm;  500  ppm;  dan  1000  ppm  mempunyai  nilai  % inhibisi berturut-turut sebesar 13,08%; 19,5%; 20,37%, 20,5%; 21,35% dan 24,07%.
Dengan  peningkatan  konsentrasi,  nilai  %  inhibisi ketiga  isolat  bakteri  endofit  hanya  meningkat  sebesar 1,01-1,14  kali  lebih  tinggi.  Apabila  konsentrasi  tertinggi (1000 ppm) dibandingkan dengan konsentrasi terendah (31,25  ppm)  nilai  persen  inhibisi  ketiga  isolat  bakteri endofit  yaitu  J 1 ; J 2 dan J 3 hanya meningkat sebesar  1,21; 1,46;  dan  1,84  kali.  Dari  pemaparan  data  diatas,  dapat disimpulkan bahwa ketiga isolat mempunyai konsentrasi optimal untuk meredam radikal bebas pada konsentrasi terendah yaitu pada konsentrasi 31,25 ppm.
Senyawa yang digunakan sebagai pembanding pada pengujian  ini adalah asam askorbat.  pada  pengujian  ini asam  askorbat  memiliki  kemampuan  meredam  radikal
bebas  sebesar  57,03%  pada  konsentrasi  10  ppm. Perbedaan kemampuan inhibisi dari metabolit sekunder isolat bakteri dengan asam askorbat disebabkan karena asam askorbat merupakan senyawa yang telah diketahui memiliki ikatan rangkap terkonjugasi untuk mendonorkan  proton,  sedangkan  sampel  merupakan padatan metabolit sekunder yang belum murni sehinga kemampuan  untuk  meredam  radikal  bebas  kurang optimal.

## Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui  senyawa  kimia  yang  berperan  dalam meredam  radikal  bebas.  Sampel  yang  digunakan  pada tahap penapisan fitokimia ini adalah rimpang jahe merah yang  digunakan  sebagai  simplisia  tanaman  inang  dan endapan  metabolit  sekunder  dari  hasil freeze  dry . Rimpang  jahe  merah  digunakan  sebagai  pembanding untuk  mengetahui  senyawa  kimia  sebelum  dilakukan isolasi.  Golongan  kimia  yang  diidentifikasi  pada penelitian  ini  antara  lain  alkaloid,  flavonoid,  saponin, tanin,  triterpenoid  dan  steroid  Hasil  dari  penapisan fitokimia tertera pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil penapisan fitokimia Golongan Senyawa Hasil J 1 J 2 J 3 Simplisia Alkaloid - - - - Flavonoid + + + + Tanin + + - + Saponin + + + + Steroid - - - - Triterpenoid + + - +
Pada  hasil  penapisan  fitokimia  penelitian  ini terdapat  beberapa  senyawa  dari  tumbuhan  inang  yang tidak mampu dihasilkan oleh isolat bakteri endofit kulit rimpang jahe merah ( Zingiber officinale Linn. Var Rubrum) . Menurut Nofiani dkk. [10] terdapat dugaan bahwa isolat tersebut memiliki gen pengkode pembentukan senyawa metabolit sekunder, namun tidak terekspresi pada media produksi yang digunakan. Gen tersebut baru terekspresi ketika  diinduksi  terlebih  dahulu.  Pada  media  produksi yang  digunakan  kemungkinan  tidak  ada  induser  untuk mengekspresikan  gen  pembentukan  senyawa  metabolit sekunder.
Adanya  aktivitas  antioksidan  dikarenakan  pada isolat  J 1 ,  J 2 ,  dan  J 3 mempunyai  senyawa  metabolit sekunder  yang  potensial  untuk  meredam  radikal  bebas yaitu  flavonoid.  Flavonoid  merupakan  salah  satu komponen  yang  mengandung  gugus  fenol.  Perbedaan aktivitas antioksidan dari ketiga isolat disebabkan karena perbedaan kandungan senyawa yang akan menyumbangkan  hidrogennya.  Hasil  tersebut  sesuai dengan penelitian [3] yang menunjukkan bahwa senyawa golongan  flavonoid  memiliki  kemampuan  sebagai antioksidan.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (1) (2017) : 25 – 29

## 4. Kesimpulan
Diperoleh  tiga  isolat  bakteri  endofit  dari  rimpang jahe merah (isolat J 1 , isolat J 2 , dan isolat J 3 ). Isolat bakteri yang  diperoleh  memiliki  bentuk  beragam  yakni diplobasil  (isolat  J 1 ),  streptobasil  (isolat  J 2 )  dan monobasil  (isolat  J 3 ). Semua metabolit  sekunder  isolate mampu menginhibisi radikal bebas pada konsntrasi yang paling efektif yaitu pada konsentrasi 31,25 ppm dengan nilai  %  inhibisi  pada  isolat  J 1 ,  J 2 dan  J 3 berturut-turut sebesar 22,71%; 20,86% dan 13,08%. Kandungan kimia yang terdapat pada semua isolat meliputi flavonoid dan saponin.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  N. Ito, M. Hirose, S. Fukushima, H. Tsuda, T. Shirai, M.  Tatematsu,  Studies  on  antioxidants:  Their carcinogenic  and  modifying  effects  on  chemical carcinogenesis,  Food  and  Chemical  Toxicology,  24, 10,
(1986) 1071-1082 http://dx.doi.org/10.1016/0278-6915(86)90291-7
[2]  Gary  Strobel,  Eugene  Ford,  Jeerepun  Worapong,
James K. Harper, Atta M. Arif, David M. Grant, Peter C. W. Fung, Raymond Ming Wah Chau, Isopestacin, an isobenzofuranone
from Pestalotiopsis microspora,  possessing  antifungal  and  antioxidant activities,  Phytochemistry,  60,  2,  (2002)  179-183 https://doi.org/10.1016/S0031-9422(02)00062-6
[3]  Okezie  I.  Aruoma,  Jeremy  P.  E.  Spencer,  Donna Warren,  Peter  Jenner,  John  Butler,  Barry  Halliwell, Characterization  of  food  antioxidants,  illustrated using  commercial  garlic  and  ginger  preparations, Food Chemistry, 60, 2, (1997) 149-156 http://dx.doi.org/10.1016/S0308-8146(95)00254-5
[4]  Justin T Coombs, Christopher MM Franco, Isolation and  identification  of  actinobacteria  from  surface- sterilized  wheat  roots,  Applied  and  environmental microbiology, 69, 9, (2003) 5603-5608
http://dx.doi.org/10.1128/AEM.69.9.5603- 5608.2003
[5]  Sri Pujiyanto, Rejeki Siti Ferniah, Aktifitas inhibitor alpha-glukosidase  bakteri  endofit  PR-3  yang diisolasi dari tanaman pare (Momordica charantia), Bioma, 12, 1, (2010) 1-5
[6]  Norman R. Farnsworth, Biological and phytochemical  screening  of  plants,  Journal  of Pharmaceutical  Sciences,  55,  3,  (1966)  225-276 http://dx.doi.org/10.1002/jps.2600550302
[7]  Abdul  Kafur,  Anisa  Basheer  Khan,  Isolation  of endophytic actinomycetes from Catharanthes roseus (L.)  G.  Don  leaves  and  their  antimicrobial  activity, Iranian  Journal  of  Biotechnology,  9,  4,  (2011)  302- 306
[8]  Purwanto,  Isolasi  dan  Identifikasi  Senyawa Penghambat  Polimerisasi  HEM  dari  Fungsi  Endofit Tanaman Artemisia annua L., in:  S2 Ilmu Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
[9]  Hiroe Kikuzaki, Nobuji Nakatani, Antioxidant Effects of  Some  Ginger  Constituents,  Journal  of  Food
Science, 58, 6, (1993) 1407-1410 http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-2621.1993.tb06194.x
[10] Risa  Nofiani,  Siti  Nurbetty,  Ajuk  Sapar,  Aktivitas antimikroba  ekstrak  metanol  bakteri  berasosiasi spons dari pulau Lemukutan, Kalimantan Barat,  e-
Jurnal  Ilmu  dan  Teknologi  Kelautan  Tropis,  1,  2, (2009) 33-41