## KERAGAMAN GENETIK
Metarhizium anisopliae DAN VIRULENSINYA PADA LARVA KUMBANG BADAK ( Oryctes rhinoceros )
GENETIC DIVERSITY of Metarhizium anisopliae AND VIRULENCE TOWARD LARVAE OF RHINOCEROS BEETLE ( Oryctes rhinoceros )
Aisyah Surya Bintang 1) * , Arif Wibowo 1) , & Tri Harjaka 1)
1) Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada Jln. Flora 1, Bulaksumur, Sleman, Yogyakarta 55281
*Penulis untuk korespondensi. E-mail: bintang.aisyahsurya@gmail.com

## ABSTRACT
Rhinoceros beetle ( Oryctes rhinoceros) is one of the important pests of coconut tree. One of eco-friendly control applied for this pest is by using entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae. There is not much information about the variability and virulence of M. anisopliae toward O. rhinoceros . M. anisopliae isolates obtained from Biological Control Laboratory, Faculty of Agriculture, Universitas Gadjah Mada were cultured on PDA medium. M. anisopliae isolates was isolated from O. rhinoceros larvae (MaOr), Lepidiota stigma larvae (MaLs), Brontispa longissima beetle (MaBl). O. rhinoceros beetles were obtained from Kulon Progo, DIY. This study used molecular test, and virulence test toward 3 rd stadium of O. rhinoceros larvae by using dipping method. Molecular test by sequence and phylogenetic analysis, showed that MaOr was located at different group (out group) with MaLs and MaBr. On the density 10 7 conidium/ml MaOr and MaLs were more virulent than MaBl towards 3 rd stadium of O. rhinoceros larvae. Keywords: genetic diversity , Metarhizium anisopliae, Oryctes rhinoceros, virulence

## INTISARI
Kumbang badak ( Oryctes rhinoceros ) merupakan salah satu hama penting pada tanaman kelapa. Salah satu upaya pengendalian  yang  ramah  lingkungan  adalah  dengan  menggunakan  jamur  entomopatogen,  yakni Metarhizium anisopliae . Belum banyak diketahui mengenai keragaman dan juga virulensi dari M. anisopliae terhadap O. rhinoceros . Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui keragaman genetik M. anisopliae dan virulensinya pada larva kumbang badak. Isolat yang digunakan berasal dari Laboratorium Pengendalian Hayati, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada dalam bentuk kultur murni pada medium PDA. Isolat yang gunakan diisolasi dari larva Oryctes rhinoceros (MaOr), larva Lepidiota stigma (MaLs), dan kumbang Brontispa longissima (MaBl). Serangga yang diuji berasal dari daerah Kulon Progo, DIY. Pengujian secara molekuler dengan analisis sekuensing dan filogenetik, menunjukkan bahwa isolat MaOr terletak pada grup yang berbeda dengan MaLs dan MaBl berdasarkan pada urutan basa DNA. Pada kerapatan 10 7 konidium/ml isolat MaOr dan MaLs lebih virulen terhadap larva O. rhinoceros instar 3 dibandingkan dengan MaBl.
Kata kunci: keragaman genetik, Metarhizium anisopliae , Oryctes rhinoceros, virulensi
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, Vol. 19, No. 1, 2015: 12–18

## PENGANTAR
Oryctes rhinoceros atau kumbang badak adalah salah satu hama penting pada pertanaman kelapa. Stadium O. rhinoceros yang menyebabkan kerusakan pada tanaman kelapa adalah imago, baik jantan maupun betina (Anonim, 1980). Serangan O. rhinoceros tersebut dapat mengurangi hasil panen, mematikan bibit muda pada persemaian dan tanaman tua, serta merusak areal tanaman baru ( replanting ) (Bedford, 1980). Pada tanaman kelapa dengan serangan ringan, O. rhinoceros menyebabkan gejala daun seperti tergunting dan  daya  hasil  menurun, bahkan  pada  saat  awal pertumbuhan  generatif  produksi dapat  tertunda. Kumbang  dewasa  masuk  ke  dalam  daerah  titik tumbuh  dan  memakan  bagian  yang  lunak.  Bila serangan sampai ke titik tumbuh, maka tanaman akan mati (Rahman, 2010).
Sejauh  ini  pengendalian  hama  tanaman  yang dilakukan oleh para petani masih mengandalkan insektisida kimia (Marwoto, 1992). Petani umumnya menggunakan insektisida dengan frekuensi dan dosis yang tinggi. Ini membawa dampak negatif penggunaan pestisida seperti, resistensi, resurjensi hama, terbunuh- nya musuh alami, peningkatan residu pada hasil, pencemaran lingkungan dan gangguan kesehatan bagi  pengguna.  Secara  hayati,  pengendalian O. rhinoceros dapat dilakukan dengan menggunakan jamur entomopatogen Metarhizium anisopliae (Untung, 2001). Pattemore et al . (2014) mengemukakan bahwa M. anisopliae dikelompokkan bersama tiga spesies lainnya, yaitu M. pingshaense , M. robertsii , dan M. brunneum . Menurut Freed et al . (2011), melalui metode SSR ( Sample Sequence Repeats ) ditemukan
bahwa M. anisopliae yang berasal dari China, Laos, Singapura,  Belanda,  dan  Korea  menunjukkan tingkat keragaman morfologi yang rendah meski- pun memiliki distribusi yang luas. Hasil tersebut diperkuat dengan penggunaan analisis sekuen ITS- rDNA yang juga menyatakan bahwa M. anisopliae yang diuji memiliki tingkat keragaman secara genetik yang rendah atau tidak bervariasi. Rendahnya tingkat keragaman ini bisa jadi karena adanya kesamaan topografi dari masing-masing lokasi pengambilan sampel. Kemungkinan lain juga disebabkan karena imigrasi M. anisopliae ke daerah-daerah sekitar, serta adanya kemungkinan bahwa jamur-jamur yang telah tersebar tersebut berasal dari tetua yang sama. Di daerah Barat Daya Cina, kesamaan genotip pada M. anisopliae banyak ditemukan meskipun sampel diambil  dari  ekosistem  geografis  yang  berbeda (pertanian, hutan, dan pemukiman). Untuk saat ini, belum banyak pengetahuan mengenai keragaman genetik dan virulensi dari M. anisopliae di Indonesia. Oleh  karena  itu  penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui keragaman genetik M. anisopliae dan virulensinya terhadap larva kumbang badak.

## BAHAN DAN METODE
Sumber Serangga Uji Pada penelitian ini digunakan larva O. rhinoceros instar 3. Larva tersebut didapat dari lokasi perkembang- biakan O. rhinoceros yaitu tumpukan kotoran ternak di daerah Kulon Progo, Daerah Istimewa Yogyakarta.
Sumber Isolat Jamur Isolat M. anisopliae diperoleh dari isolat yang berasal  dari  Laboratorium  Pengendalian  Hayati Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada yang terdiri dari (1) isolat M. anisopliae yang berasal dari kumbang Brontispa longissima (MaBl), (2) isolat M. anisopliae yang berasal dari larva O. rhinoceros (MaOr), (3) isolat M. anisopliae yang berasal dari larva Lepidiota stigma (MaLs). Isolasi dan pemurnian masing-masing jamur tersebut dilakukan dengan menggunakan medium PDA.
Uji Molekuler Ekstraksi  DNA . Sebanyak  0,5  gram  miselium jamur yang sebelumnya dibiakkan dengan medium potato dextrose broth (PDB) diekstraksi/diisolasi DNA-nya menggunakan CTAB 2% (CTAB, Tris HCl 1M, EDTA 0,5 M, NaCl 5M, B-mercapto-ethanol 1%, aquades steril).
Amplifikasi DNA menggunakan primer spesifik DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan meng- gunakan teknik PCR mengikuti prosedur dari Curran et al . (1994) cit Lei Liu et al . (2012) menggunakan
primer forward TW81  (5’-GTTTCCGTAGGTGAA CCTGC-3’) dan primer reverse AB21 (5’-ATATG CTTAAGTTCAGCGGGT-3’)  yang  akan  meng- amplifikasi  DNA  dengan  berat  molekul  500  bp. Total volume untuk reaksi PCR dengan komposisi bahan yaitu DNA template 1 µl, primer forward dan reverse masing-masing 1 µl, PCR kit sebanyak 12,5 µl dan Milli-Q water sebanyak 9,5 µl. Proses amplifikasi berikut ini: pada tahap denaturasi hingga ekstensi diulang  sebanyak  33  siklus  menggunakan  suhu sebagai berikut: Pra denaturasi pada 94 o C selama 4 menit; denaturasi 94 o C selama 30 detik; annealing pada 55 o C selama 30 detik; ekstensi 72 o C selama 1 menit; dan pos ekstensi pada 72 o C selama 4 menit. Amplifikasi DNA menggunakan primer universal . DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan meng- gunakan teknik PCR menggunakan primer forward ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTTGCGG-3’) dan primer reverse ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3’) yang akan mengamplifikasi DNA dengan berat molekul pada kisaran 500 bp (Tangthirasunun et al ., 2010). Total volume untuk reaksi PCR dengan komposisi bahan yaitu DNA template 1 µl, primer forward dan reverse masing-masing 1 µl, PCR kit sebanyak 12,5 µl dan Milli-Q water sebanyak 9,5 µl. Proses amplifikasi pada tahap denaturasi hingga ekstensi diulang sebanyak 32 siklus menggunakan suhu berikut ini (Pereira de Lyra et al ., 2012): Pra denaturasi pada 95 o C selama 3 menit; denaturasi 94 o C selama 1 menit; annealing pada 50 o C selama 1  menit;  ekstensi  72 o C  selama  1  menit;  dan post - ekstensi pada 72 o C selama 5 menit. Elektroforesis dan visualisasi hasil amplifikasi . Elektroforesis hasil amplifikasi menggunakan agarose 1% (dalam TBE 1X) yang direndam dalam ethidium bromide . Untuk pengukuran DNA digunakan marker 100 bp ladder . Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 90 V selama 45 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan transilluminator  ultra  violet dan hasilnya difoto dengan menggunakan Gel Documentation.
DNA sequencing dan identifikasi molekuler . Sampel dikirim ke FirstBase Malaysia. Hasil sekuensing yang  telah  didapatkan  selanjutnya  dianalisis  ber- dasarkan data GeneBank pada National Center for Biotechnology International (NCBI) dengan program BLAST  ( Basic  Local  Alignment  Tools ).  Setelah diperoleh hasil BLAST, ditentukan sejumlah spesies acuan yang memiliki persentase tingkat similaritas mendekati 100% untuk konstruksi pohon filogenetik dengan menggunakan software MEGA 5.0.
Uji Virulensi Isolat Uji infeksi jamur terhadap O. rhinoceros dilakukan dengan metode dipping , yaitu larva O. rhinoceros
Gambar 1. Hasil elektroforesis PCR dengan primer spesifik Metarhizium anisopliae (TW81 dan AB21) Keterangan: M : Marker 100 bp ladder 1 : Isolat jamur Metarhizium anisopliae dari larva Oryctes rhinoceros 2 : Isolat jamur Metarhizium anisopliae dari larva Lepidiota stigma 3 : Isolat jamur Metarhizium anisopliae dari kumbang Brontispa longissima
instar  3  dimasukkan  ke  dalam  suspensi  jamur dengan kerapatan 10 7 konidium/ml dalam cawan petri  kurang  lebih  selama  15  detik  atau  sampai konidium  menempel  pada  kutikula  larva.  Larva yang  telah  diperlakukan  dipindahkan  ke  dalam stoples  isolat  yang  berisi  serbuk  gergaji  steril. Sebagai  kontrol,  larva  dicelupkan  ke  dalam  air steril. Larva dipelihara selama 14 hari. Pengamatan mortalitas larva O. rhinoceros dilakukan setiap hari selama  14  hari.  Parameter  yang  diamati  adalah persentase  larva  bergejala  atau  mati.  Data  yang diperoleh dianalisis dengan analisis varian apabila terdapat beda nyata dilanjutkan dengan uji DMRT pada taraf 5%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Molekuler Identifikasi spesies secara molekuler . Dengan menggunakan primer AB21 dan TW81 yang merupakan primer spesifik untuk spesies M. anisopliae , pita tunggal fragmen DNA dari ketiga isolat tersebut teramplifikasi pada nilai optimasi sekitar 500 bp (Gambar 1) yang menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut merupakan spesies M. anisopliae . Variabilitas genetik. Hasil polymerase chain reaction terhadap tiga isolat jamur M. anisopliae (MaOr, MaLs, dan MaBl) memperlihatkan hasil yang sangat baik yaitu dengan teramplifikasinya pita DNA yang sesuai target.
Pita tunggal fragmen DNA isolat MaOr, MaLs, dan MaBl teramplifikasi pada nilai optimasi sekitar
500 bp dengan menggunakan primer universal yakni ITS1 dan ITS4 (Gambar 2). Tangthirasunun et al. (2010) menyatakan bahwa isolat-isolat Metarhizium spp. yang berasal dari Thailand memiliki pita tunggal fragmen DNA yang teramplifikasi pada kisaran 550 bp dengan menggunakan primer ITS1 dan ITS4. Destéfano et al. (2004) menganalisis dengan primer yang sama, fragmen DNA teramplifikasi pada kisaran 540 bp untuk isolat M. anisopliae var. anisopliae strain E9, B/Vi, dan isolat C yang berasal dari Brazil. Isolat M. anisopliae strain 14 yang berasal dari Australia berada pada kisaran 600 bp.
Analisis hasil sekuensing dan filogenetik . Di dalam pendekatan filogenetik, sebuah kelompok organisme yang anggota-anggotanya memiliki banyak kesamaan karakter atau ciri dianggap memiliki hubungan yang sangat dekat dan diperkirakan diturunkan dari satu nenek moyang. Nenek moyang dan semua turunannya akan  membentuk  sebuah  kelompok  monofiletik. Dalam analisis filogenetika kelompok out group sangat dibutuhkan dan menyebabkan polarisasi karakter atau ciri, yaitu karakter apomorfik dan plesiomorfik. Karakter apomorfik adalah karakter yang berubah dan diturunkan dan terdapat pada in group , sedangkan karakter plesiomorfik merupakan karakter primitive yang terdapat dalam out group . Karakter sinaporfik adalah karakter yang diturunkan dan terdapat pada kelompok monofiletik (Hidayat & Pancoro, 2006).
Primer universal ITS1 dan ITS4 yang digunakan dalam penelitian ini menunjukkan bahwa isolat B. longissima (MaBl), isolat L. stigma (MaLs) yang berasal dari inang yang berbeda ternyata memiliki hubungan
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia                                                                Vol. 19 No. 1 14
Gambar 2. Hasil elektroforesis PCR dengan primer universal ITS1 dan ITS4 Keterangan: M : Marker 100 bp ladder 1 : Isolat jamur Metarhizium anisopliae dari larva Oryctes rhinoceros 2 : Isolat jamur Metarhizium anisopliae dari larva Lepidiota stigma 3 : Isolat jamur Metarhizium anisopliae dari kumbang Brontispa longissima
kekerabatan yang dekat dan terdapat pada grup yang sama ( in group ), sedangkan untuk isolat O. rhinoceros (MaOr) sudah terdapat pada grup yang berbeda ( out group ) (Gambar 3). Namun, ketiganya masih termasuk dalam kelompok yang sama, yakni monofiletik, yang berarti bahwa karakternya dapat diturunkan.
Muraji dan Nakahara (2001) melaporkan bahwa hasil analisis morfologi dan untai basa DNA tidak saling mendukung. Hal ini terjadi pada ketiga isolat M. anisopliae yang digunakan dalam penelitian ini. Ketiganya memiliki karakter morfologi yang masing- masing berbeda terutama pada warna miselium jamur yang ditumbuhkan pada medium PDA. Isolat MaOr dan  MaLs  yang  memiliki  warna  miselium  yang cenderung sama, yakni hijau zaitun, justru secara urutan basa DNA terletak pada grup yang berlainan. Sementara  itu  pada  isolat  MaBl  yang  memiliki karakter warna miselium yang cenderung berbeda dengan kedua isolat yang lain, secara urutan basa DNA terletak pada grup yang sama dengan isolat MaLs. Tangthirasunun et al. (2010) mengemukakan bahwa meskipun isolat diperoleh dari lokasi yang sama, isolat tersebut tidak saling berhubungan satu dengan yang lainnya dalam urutan basa.
Uji Virulensi Hasil pengamatan mortalitas larva O. rhinoceros akibat infeksi jamur selama 2 minggu menunjukkan bahwa ketiga isolat jamur M. anisopliae dengan kerapatan spora 10 7 konidium/ml belum mampu menyebabkan mortalitas larva instar 3 O. rhinoceros . Tiga isolat jamur M. anisopliae (MaOr, MaLs, dan
MaBr) dengan kerapatan spora 10 7 konidium/mldapat menyebabkan gejala sakit pada inang. Larva instar 3 O. rhinoceros sebagai serangga uji menunjukkan gejala terinfeksi jamur M. anisopliae pada minggu pertama setelah inokulasi. Pada minggu pertama larva menunjukkan gejala terinfeksi jamur yakni munculnya bercak berwarna cokelat kehitaman pada kutikula serangga (Gambar 4).
Persentase larva O. rhinoceros bergejala oleh jamur M. anisopliae menunjukkan bahwa isolat MaOr memiliki nilai yang paling tinggi yakni 100% kemudian berturut- turut MaLs 66,67% dan MaBl mencapai 6,67% seperti terlihat pada Tabel 1.
Dua isolat jamur M. anisopliae MaOr dan MaLs tidak berbeda nyata dalam menyebabkan gejala pada serangga uji O. rhinoceros , sedangkan isolat MaBr berbeda nyata. Hal ini diduga karena isolat MaOr dan MaLs berasal dari ordo yang sama yakni ordo Coleoptera dan berasal dari fase yang sama yakni larva, sehingga virulensi dari kedua isolat tersebut tidak berbeda nyata. Isolat yang berasal dari larva O. rhinoceros (MaOr) dan isolat yang berasal dari larva L. stigma (MaLs) merupakan isolat yang virulen terhadap kumbang badak ( O. rhinoceros ), sedangkan isolat yang berasal dari kumbang B. longissima tidak virulen terhadap kumbang badak ( O. rhinoceros ). Diketahui bahwa jamur M. anisopliae spesifik inang terhadap hama dari Coleoptera terutama O. rhinoceros . Prayoga (2005) menyatakan bahwa jenis hama yang menyerang  tanaman  akan  menentukan keefektifan jamur  entomopatogen  karena  setiap  jenis  jamur entomopatogen  mempunyai  inang  yang  spesifik,
Gambar 4. Larva Oryctes rhinoceros sehat (A); larva O. rhinoceros yang terinfeksi oleh jamur Metarhizium anisopliae pada hari ketujuh (B); dan pada hari keempat belas setelah inokulasi (C)
Gambar 3. Pohon filogenetik berdasarkan pada sekuen ITS yang berasal dari isolat Metarhizium anisopliae menggunakan analisis Neighbour-Joining dan Uji Filogeni Bootstrap 1000 replicates
Tabel 1. Persentase larva Oryctes rhinoceros instar 3 bergejala oleh jamur Metarhizium anisopliae pada hari ke-14 Isolat Kerapatan spora (konidia/ml) Persentase larva bergejala (%) MaOr 5,95 × 10 7 100,00 a MaBr 5,13 × 10 7 6,67 b MaLs 5,76 × 10 7 66,67 a Kontrol 0,00 b
Keterangan: Angka yang yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda (DMRT) dengan derajat kesalahan 5%. MaOr : Isolat jamur Metarhizium anisopliae dari larva Oryctes rhinoceros
MaLs : Isolat jamur Metarhizium anisopliae dari larva Lepidiota stigma MaBl : Isolat jamur Metarhizium anisopliae dari kumbang Brontispa longissima
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia                                                                Vol. 19 No. 1 16
walaupun ada pula yang mempunyai kisaran inang yang cukup luas (Marheni et al ., 2013). Isolat yang berasal dari kumbang B. longissima (MaBl) memiliki perbedaan nyata dengan menunjukkan persentase larva bergejala lebih rendah bila dibandingkan dengan kedua isolat yang lain. Hal ini diduga karena isolat MaBr lebih spesifik dalam membunuh kumbang B. longissima . Hasil analisis menunjukkan bahwa perbedaan yang nyata terdapat antara perlakuan dengan kontrol. Seluruh serangga uji pada perlakuan kontrol tidak menunjukkan gejala terinfeksi/sehat, tidak terdapat gejala  mikosis  yang  ditunjukkan  dengan  bercak coklat kehitaman pada kutikula larva dan larva yang bergerak secara aktif. Hal ini disebabkan oleh ketahanan larva O. rhinoceros terhadap M. anisopliae yang tidak sama. Meskipun virulensi M. anisopliae meningkat namun karena ketahanan larva O. rhinoceros juga meningkat, maka tidak diperoleh mortalitas larva instar 3 dalam jangka waktu 14 hari. Larva yang digunakan tidak berasal dari perbanyakan laboratorium, melainkan hanya melalui pemilihan larva dengan ukuran tubuh dan kaput yang hampir sama di lapangan. Meskipun  dosis  yang  digunakan  sudah  mampu menyebabkan mortalitas pada larva O. rhinoceros , ternyata  apabila  umur  larva  pada  masing-masing perlakuan  semakin  tua,  kepekaan  larva  terhadap jamur M. anisopliae juga semakin rendah. Prayogo et al . (2005) menyatakan bahwa keefektifan jamur M. anisopliae , di samping dipengaruhi oleh media tumbuh, tingkat virulensi, dan frekuensi aplikasi, juga sangat  ditentukan  oleh  instar  serangga  tersebut. Media pada saat aplikasi M. anisopliae sangatlah menentukan keberhasilan jamur tersebut untuk meng- infeksi. Larva yang mati akibat infeksi M. anisopliae yang dibawa imago terjadi pada hari pengamatan ke-12 sebanyak 12,5% dan meningkat hingga 100% pada hari ke-56. Sementara itu, kematian larva akibat konidum M. anisopliae yang di dalam serbuk gergaji mulai  terlihat  pada  hari  pengamatan  ke-10  yakni sebesar 12,5%  dan meningkat hingga 100% pada hari pengamatan ke-42. Rerata kerapatan konidium M. anisopliae yang dibawa oleh imago O. rhinoceros untuk dapat menginfeksi dan mengakibatkan larva O. rhinoceros mati adalah 6,35×10 6 konidium/ml (Sartono, 2014).
Kerapatan  konidium  yang  digunakan  untuk perlakuan dalam penelitian ini adalah 10 7 konidium/ ml dengan cara mencelupkan larva ke dalam suspensi M. anisopliae ( dipping method ). Dengan metode tersebut, diduga konidium tidak menempel seluruhnya pada kutikula larva, berbeda dengan metode tular tanah  menggunakan  medium  jagung  yang  akan menyebabkan terjadinya kontak langsung dengan
kutikula serangga sehingga jumlah konidium jamur yang menempel pada kutikula juga lebih banyak. Semakin tinggi jumlah atau kerapatan konidium, maka akan semakin tinggi pula tingkat infeksi dari jamur tersebut.
Berdasarkan uji molekuler, isolat MaOr terletak pada grup yang berbeda ( out group ) dengan isolat MaLs dan MaBl. Isolat jamur M. anisopliae yang berasal dari larva O. rhinoceros (MaOr) dan larva L. stigma (MaLs) merupakan isolat virulen, sedangkan isolat yang berasal kumbang B. longissima (MaBl) tidak virulen terhadap O. rhinoceros .

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 1980. Pedoman Hama dan Penyakit Tanaman Kelapa . Direktorat Jenderal Perkebunan Departemen Pertanian, Jakarta. 100 p.
Bedford. 1980. Biology, Ecology, and Control of Palm Rhinoceros Beetles. Annual Review Entomology 25: 309−339. Destéfano,  S.H.R.,  S.A.L.  Destéfano.,  &  C.L. Messias. 2004. Detection Metarhizium anisopliae var. anisopliae within Infected Sugarcane Borer Diatraea saccharalis (Lepidoptera, Pyralidae) Using Specific Primer. Genetic Molecular Biology 27: 245−252.
Freed, S., J. Feng-Liang, & R. Shun-Xiang. 2011. Determination  of  Genetic  Variability  among  the Isolates of Metarhizium anisopliae var. anisopliae from Different Geographical Origins. World Journal of Microbiology and Biotechnology 27: 359−370. Hidayat, T. & A. Pancoro. 2006. Sistematika dan Filogenetika Molekuler. Kursus Singkat Aplikasi Perangkat  Lunak  PAUP  dan  MrBayers  untuk Penelitian Filogenetika Molekuler . Institut Teknologi Bandung, Bandung. 9 p.
Liu, L., R. Zhan, L. Yang, C. Liang, D. Zeng, & J. Huang. 2012. Isolation and Identification of Metarhizium anisopliae from Chillo  venosatus (Lepidoptera: Pyralidae) cadaver. African Journal of Biotechnology 30: 1−9.
Marheni, Hasanuddin, Pinde, & W, Suziani. 2013. Uji Patogenesis Jamur Metarhizium anisopliae dan Jamur Cordyceps militaris terhadap Larva Penggerek Pucuk Kelapa Sawit ( Oryctes rhinoceros ) (Coleoptera: Scarabaeidae) di Laboratorium. Jurnal Universitas Sumatera Utara 1: 32−41. Marwoto.  1992. Masalah  Pengendalian  Hama Kedelai di Tingkat Petani . Balai Penelitian Tanaman Pangan, Malang. 65 p. Muraji, S. & S. Nakahara, S. 2001. Phylogenetic Relationships among Fruit Flies, Bactrocera (Diptera, Tephritidae),  Based  on  the  Mitochondrial  rDNA Sequences. Insect Molecular Biology 6: 549−559.
Pattemore,  J.A.,  J.K.  Hane,  A.H.  Williams,  B.A. Wilsom, B.J. Stodart, & G.J. Ash. 2014. The Genome Sequence of the Biocontrol Fungus Metarhizium anisopliae and Comparative Genomics of Metarhizium Species. BMC Genomics Journal 15: 660−674.
Prayogo,  Y.,  T.  Wedanimbi,  &  Marwoto.  2005. Pemanfaatan Cendawan Entomopatogen Metarhizium anisopliae untuk  Mengendalikan  Ulat  Grayak Spodoptera litura pada Kedelai. Jurnal Penelitian dan Pengembangan Pertanian 1: 19−26.
Rahman. 2010. Major Pests of Oil Palm . http:// www. aarsb.com.my/wp-content/Publication/Newsletter/ PDF/2010-Apr.pdf, diakses 7/10/14. Subandiyah, S. 2003. Cara Kerja Ekstraksi DNA Menggunakan CTAB. Workshop dan Training Course on Molecular Detection for Plant and Environmental
Protection . Fakultas Pertanian. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 15−20 Desember 2003.
Sartono, A.N. 2014. Potensi Metarhizium anisopliae sebagai Pengendali Oryctes rhinoceros . Skripsi. Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. 43 p. Tangthirasunun, N., S. Poeaim, K. Soytong, P.  Sommartya, & S. Popoonsak. 2010. Variation in Morphology and Ribosomal DNA among Isolates of Metarhizium anisopliae from Thailand. Journal of Agricultural Technology 2: 317−329. Thungrabeab,  M.,  B.  Peter,  &  S.  Chen.  2006. Possibilities  for  Biocontrol  of  the  Onion  Thrips Thrips tabaci Lindeman (Thys., Thripidae) Using Different Entomopathogenic Fungi from Thailand. Journal Mitteilungen der Deutsche Entomologischen Gesselchaft Basel 15: 299−304. Untung, K. 2001. Pengantar Pengelolaan Hama Terpadu . Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. 348 p.
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia                                                                Vol. 19 No. 1 18