Jurnal Farmasi Sains dan Terapan (Journal of Pharmacy Science and Practice) pISSN 2338-8404 and eISSN 2657-2311 Journal Homepage: http://journal.wima.ac.id/index.php/JFST/ DOI: 10.33508/jfst.v9i2.4079
Deteksi populasi Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+ T-regulator pada Limpa Mencit  Galur Balb/c dan Swiss-webster yang  Mudah  dan  Cepat dengan Metode Flow Cytometry
Detection  of  Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+  T-regulator  Populations  in  Balb/c  and Swiss-webster Mice’s Spleen Easy and Quickly with Flow Cytometry Method
Yudy Tjahjono a) , Hendy Wijaya a) *, Senny Yesery Esar a) , Caroline a) , Nico Jafet a) , I Made Andika Bara Kusuma a) , Oryza Chrisantia a) , Maria Theresia Primadewi Bhendy a) , Sindi Siska Palpialy a) , Shellin Soehadi a) Yufita Ratnasari Wilianto a)
a) Fakultas Farmasi, Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya, Indonesia
Article info: Received Date : 30/08/2022 Revised Date   : 09/10/2022 Accepted Date : 14/10/2022 Abstrak: Sel  T-regulator  (Treg)  memainkan  peran  kunci  dalam  mengendalikan autoimunitas, respon alergi, peradangan, dan respons terhadap infeksi. Sel T Cd4+ yang secara konstitutif mengekspresikan Cd25 dan protein forkhead  3 (Foxp3;  yaitu,  Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+)  atau  disebut  juga sebagai Treg fungsional, telah terbukti memainkan peran utama dalam pemeliharaan  toleransi  dan  homeostasis  imun,  sehingga  deteksi  Treg fungsional  sangat  penting  dilakukan  sebagai  salah  satu  parameter imunomodulasi. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi populasi sel Treg  (Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+)  pada  organ  limpa  mencit  galur Balb/c dan Swiss-webster dengan  menggunakan  metode  yang  mudah,  cepat, serta terjangkau. Metode deteksi sel Treg dilakukan dengan cara isolasi organ  limpa  mencit Balb/c dan Swiss-webster kemudian  dilakukan preparasi dan deteksi sel menggunakan instrumen flow cytometry . Hasil populasi  sel  Treg  yang  didapatkan  berturut-turut  pada  mencit Balb/c dan Swiss-webster adalah 2,02  ±  0,36% dan 3,14  ±  1,64% dari  total populasi yang dideteksi dengan hanya membutuhkan waktu 145 menit sejak  pembedahan. Berdasarkan  hasil  tersebut  dapat  disimpulkan bahwa  pengamatan  populasi  sel  Treg  pada  splenosit  mencit  galur Balb/c dan Swiss-webster dengan flow  cytometry dapat  dilakukan dengan mudah dan praktis dengan pewarnaan kombinasi antibodi yang tertera  pada  manuskrip ini.  Selain  itu, metode  pewarnaan  yang tertera dapat  digunakan  sebagai  salah  satu  acuan  untuk  mendeteksi imunomodulator pada berbagai model hewan coba yang menggunakan mencit  galur Balb/c dan Swiss-webster ,  khususnya  yang  berhubungan dengan populasi sel Treg.

## Abstract
Regulatory  T  cells  (Tregs)  play  a  key  role  in  controlling  autoimmunity, allergic  responses,  inflammation,  and  responses  to  infection.  Cd4+  T cells  that  constitutively  express  Cd25  and  forkhead  3  protein  (Foxp3; that is, Cd3+ Cd4+Cd25+Foxp3+) have been shown to play a major role in the maintenance of self-defense and immune homeostasis. This study aims  to  detect  the  presence  of  a  population  of  Tregs  cells ( Cd3+ Cd4+Cd25+Foxp3+)  in  the  spleen  of Balb/c and Swiss-webster mice using an easy, quickly and affordable method. Tregs cell detection method  was  carried  out  by  isolating  the  spleen  organs  of Balb/c and Swiss-webster mice,  then  preparation  and  cell  detection  were  carried out  using  flow  cytometry  instruments.  The  results  of  the  Tregs  cell
Key Words: T-Regulator Cell Spleen Flow cytometry Isolation Corresponding Authors:
Fakultas  Farmasi  Universitas  Katolik  Widya Mandala  Surabaya,  Jl.  Raya  Kalisari  Selatan No. 1, Surabaya E-mail: hendy_wijaya@ukwms.ac.id
population  obtained  in Balb/c and Swiss-webster mice,  respectively, were 2.02  ±  0.36% and 3.14  ±  1.64% of  the  total  population,  which were detected only 145 minutes since surgery. Based on observation of Tregs cells in splenocytes of mice strains Balb/c and Swiss-webster , this can  be  done  using  the  flow  cytometry  method,  where  from  the  results obtained the method of detecting the expression of Cd3+ Cd4+Cd25+Foxp3+.

## PENDAHULUAN
Sel  T-regulator  (Treg)  membentuk  sekitar 2-20%  dari  total  populasi  sel  limfosit-T  Cd4+ memainkan  peran  kunci  dalam  mengendalikan respon  autoimun,  alergi,  peradangan,  dan pertahanan  tubuh  terhadap  infeksi  atau  disebut juga  dengan  imunomodulator  (Sakaguchi, et  al ., 2008).  Secara  garis  besar  sel  Treg  dibedakan menjadi  dua  jenis  yakni  sel  Treg  natural  dan  sel Treg  dari  hasil  induksi.  Sel  Treg  natural merupakan populasi sel T-limfosit yang mengekspresikan  molekul  Cd25.  Molekul  Cd25 merupakan  rantai  alfa  dari  reseptor  IL-2  yang berperan  sebagai  marker  yang  biasa  ditemukan pada sel Treg (Wing, et al ., 2019). Sel Treg natural ditandai dengan Cd4+Cd25+ (nT reg).
Protein Foxp3 ( forkhead protein-3 ) merupakan protein faktor transkripsi yang banyak ditemukan di beberapa sub populasi Treg. Mutasi terhadap  protein  Foxp3  menghasilkan  defisiensi Cd4+Cd25+  sel  Treg  di  timus  dan  di  perifer,  dan menyebabkan  gangguan  ada  sistem  imun  dan memicu  terjadinya  autoimun,  baik  pada  mencit maupun manusia (Bennett, et al ., 2001; Brunkow, et al ., 2001). Knock-out terhadap gen Foxp3 pada mencit  menyebabkan  deplesi  populasi  sel  Treg, sehingga dapat disimpulkan bahwa Foxp3 marker penanda adanya Treg yang fungsional, di samping Cd4  dan  Cd25  (Georgiev, et al .,  2019).  Dari tinjauan  di  atas,  maka  untuk  mendeteksi  secara spesifik  sel  Treg  Cd4+  fungsional  dapat menggunakan  marker  yang  mengekspresikan glikoprotein  intermembran  Cd25  dan  protein intraseluler forkhead -3 (Foxp3), selain juga Cd4+ dan  Cd3+  sebagai  karakter  sel  limfosit  T  itu sendiri.
Salah  satu  cara  yang  paling  mudah  dan diakui dalam dunia diagnostika untuk mendeteksi populasi  sel  Treg  adalah  dengan flow  cytometry dikarenakan  jumlahnya  yang  sangat  sedikit,  dan perlunya  menggunakan  lebih  dari  dua  marker seluler  berbeda  (Lambert, et  al .,  2020; Santegoets, et al ., 2015). Pada umumnya, populasi sel  Treg  Cd4+  pada flow  cytometry disebut sebagai  populasi  sel  Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+. Deteksi  populasi  sel  Treg  Cd4+  sudah  banyak dilakukan,  baik  pada  manusia  maupun  pada mencit  (Josefowicz, et  al .,  2012,  Okeke, et  al ., 2013, Singh, et al., 2015). Namun deteksi populasi sel  Treg  Cd4+  pada  jurnal-jurnal  tersebut menggunakan  panel  antibodi  dari  perusahaan terkemuka,  yang  apabila  diimpor  di  Indonesia
harganya  sangat  mahal  sehingga banyak membebani peneliti dalam dunia imunologi untuk mendeteksi  dan  mempelajari  populasi  sel  Treg Cd4+.  Selain  itu,  untuk  mendeteksi marker protein  intraselular  Foxp3,  berbagai  publikasi menggunakan  campuran  detergen  permeabilisasi yang  cukup  kompleks,  sehingga  mengurangi efisiensi dalam mendeteksi Foxp3 (Gregorczyk, et al ., 2019).
Pada manuskrip ini, kami mendemonstrasi- kan  cara  cepat,  praktis,  dan  lebih  terjangkau dalam  mendeteksi  populasi  sel  Treg  Cd4+  pada kelenjar limpa mencit Balb/c dan Swiss-webster . Keterjangkauan  deteksi  populasi  sel  Treg  Cd4+ terletak  pada  panel  antibodi  yang  kami  gunakan, menggunakan  panel  antibodi  Cd3+Cd4+Cd25+ Foxp3+  merk  Elabscience  (Houston,  United States) yang harganya jauh lebih murah daripada panel  antibodi  dari  merk  lainnya.  Selain  itu, hanya  dengan  menggunakan  0,1%  detergen saponin,  kami  mampu  mendeteksi  populasi  sel Treg  Cd4+  hingga  4,96%  dari  jumlah  seluruh populasi T-limfosit. Diharapkan metode dan hasil pada penelitian ini dapat dijadikan referensi bagi para  peneliti  dalam  bidang  imunologi  untuk menginvestigasi  populasi  sel  Treg  Cd4+  dan menepis  anggapan  bahwa  deteksi  populasi  sel Treg Cd4+ khususnya pada kelenjar limpa mencit Balb/c dan Swiss-webster merupakan  hal  yang rumit. Metode pewarnaan yang tertera juga dapat digunakan  sebagai  salah  satu  acuan  untuk mendeteksi  efek  imunomodulator  pada  berbagai model  hewan  coba  yang  menggunakan  mencit galur Balb/c dan Swiss-webster ,  khususnya  yang berhubungan  dengan  populasi  sel  Treg  fung- sional.

## METODE

## Hewan Coba
Mencit  galur Balb/c dan Swiss-webster usia  12  minggu  yang  dibeli  di  Pusat  Veteriner Farma (Pusvetma), Ketintang, Kecamatan Gayungan,  Surabaya.  Pemeliharaan  hewan  coba berdasarkan  dengan  Keterangan  Kelaikan  Etik Nomor:  001/EC-FKH/Eks./2022  di  mana  hewan coba yang baru saja datang dilakukan aklimatisasi selama  7  hari.  Hewan  coba  dipelihara  dalam kandang  yang  kandang  yang  terbuat  dari  bak plastik  dan  ditutupi  kawat  pada  bagian  atasnya pada suhu ruangan berkisar antara 22-25°C bebas dari  kebisingan,  dengan  kelembaban  sekitar  50-
60%,  dan  pencahayaan  ruangan  dikendalikan dengan  12  jam  siklus  terang  dan  12  jam  siklus gelap  serta  pengantungan  ventilasi  yang  baik namun  tidak  ada  jendela  yang  terbuka.  Mencit diberikan  pakan  standar  BR-2  sebanyak  10-15 gram/ekor/hari.  Air  minum  yang  diberikan adalah  air  mineral  secara ad  libitum .  Pakan  dan air  minum  diganti  setiap  hari  sedangkan  sekam dan kandang diganti setiap 2 kali sehari.

## Alat dan Bahan
Reagen  yang  dibutuhkan  terdiri  dari: buffer  ACK  (NH 4 Cl,  KHCO 3 ,  dan  Na 2 EDTA); buffer PBS ( Phosphate Buffer Saline ); DNAse dan kolagenase  dibeli  dari  Worthington;  RPMI-1640 dibeli  dari  Gibco;  Permeabilization  Buffer  (1X Permeabilization  Buffer  mengandung  0,1% Saponin  dan  0,09%  Sodium  azide)  dibeli  dari Invitrogen;  BSA,  PE Anti-mouse CD3  (17A2), PerCP/Cyanine5.5 Anti-mouse CD4 (GK1.5), FITC Anti-mouse CD25  (PC-61.5.3),  APC Anti-mouse Foxp3 (3G3) dibeli dari
Elabscience;
Formaldehid;  Buffer  A  (PBS/0,5%BSA);  Buffer  B (0,01%  Formaldehid  dalam  PBS/0,5%BSA); Buffer C (0,1% Formaldehid
dalam PBS/0,5%BSA);  Permeabilization  buffer  (2x Permeabilization buffer dalam Buffer B).

## Isolasi Organ Limpa (Splenektomi)
Sebelum  pembedahan,  berat  badan  mencit ditimbang  untuk  menghitung  massa  indeks. Isolasi  organ  limpa  diawali  dengan  melakukan euthanasia  pada  mencit  dengan  menggunakan Ketamin  (90  mg/kg)  dan  Xylazine  (10  mg/kg). Melakukan pembedahan dengan alat bedah minor lalu  mengisolasi  organ  limpa.  Organ  limpa ditimbang  terlebih  dahulu  untuk  menghitung massa  indeks  organ.  Sel  splenosit  yang  dibiarkan selama  16  jam  paska  splenektomi  pada  suhu ruang  masih  mampu  menunjukkan  ekspresi  Treg tinggi (Zhou, et al ., 2010).

## Isolasi Sel Splenosit
Organ limpa diinkubasi dalam plat 6-Wells pada  inkubator  CO 2 (37 o C/5%  CO 2 )  selama  30 menit  dengan  campuran  yang  berisi  Kolagenase Tipe  IV  340  U/mg  dengan  konsentrasi  100U/ml sebanyak 1 ml, DNAse 0,2% sebanyak 250 µl, dan medium  RPMI  hingga  volume  total  pada  plat  2,5 ml  untuk  tiap wells .  Kolagenase  dan  DNAse disuntikkan  ke  dalam  organ  bertujuan  agar  sel Splenosit  dapat  terdisosiasi  sehingga  akan memudahkan dalam pengamatan dan perhitungan  konsentrasi  sel.  Setelah  inkubasi, organ  limpa  dihancurkan  dengan syringe bagian plunger untuk mendapatkan splenosit. Setelah itu resuspensi dengan mikropipet, menyaring dengan menggunakan cell-strainer 70  µm pada  tabung sentrifugasi.  Sentrifugasi  1500  rpm  selama  5
menit, membuang supernatan.

## Penyiapan Sel Splenosit
Buffer  ACK  sebanyak  3  mL  dimasukkan untuk  tiap  tabung  sentrifugasi  dan  didiamkan selama  2  menit  dalam  es.  Pemberian  ACK bertujuan untuk menghancurkan sel darah merah. Sentrifugasi 1500 rpm selama 5 menit, membuang supernatan.  Resuspensi  dengan  1  ml  PBS/0,5% BSA.

## Perhitungan  Konsentrasi  Sel  Splenosit dengan Mikroskop
Sebanyak  100  µL  masing-masing  suspensi sel diencerkan 1:8 PBS/0,5%BSA. Hasil pengenceran  tersebut  diambil  20  µL  dan diencerkan  lagi  dengan  trypan  blue  1:5  untuk digunakan    dalam  pengamatan  menggunakan mikroskop. Dimasukkan sebanyak 10 µL/sisi pada Neubauer-Chamber.  Melakukan  perhitungan  dan didapatkan  konsentrasi  sel. Hasil  yang  diperoleh dikalikan  dengan  40  kali  pengenceran  dan didapat  hasil  dalam  satuan  sel/µl.  Kemudian satuan akhir yang diperoleh menjadi sel/ml.

## Optimasi Antibodi
Mengambil  sel  dengan  konsentrasi  0,5x10 7 sel/ml,  masukkan  5  µl  anti-Cd25  FITC ( Fluorescein  Isothiocyanate ) dan  inkubasi  20 menit  dalam  ruang  tertutup  gelap.  Setelah inkubasi,  menambahkan  5  µl  anti-Cd3 dan  5  µl anti-Cd4,  lalu  inkubasi  kembali  20  menit  dalam ruang  tertutup  gelap.  Menambahkan  1  ml  buffer A,  sentrifugasi  1800  rpm  selama  5  menit  lalu membuang  supernatan.  Setelah  proses  tersebut selesai, lakukan inkubasi Foxp3 dengan memasukkan  250  µl  buffer  B,  250  µl permeabilization  buffer,  resuspensi,  dan  inkubasi 10 menit dalam ruang tertutup gelap. Memasukkan  500  µl  buffer  A,  sentrifugasi  1800 rpm selama 5 menit, lalu membuang supernatan. Memasukkan 200 µl buffer A, memindahkan pada tabung flow  cytometer ,  menambahkan  5  µl  anti- Foxp3,  inkubasi  selama  20  menit  pada  ruang tertutup  gelap.  Memasukkan  1  ml  buffer  A, sentrifugasi 1800 rpm selama 5 menit, membuang supernatan,  menambahkan  500  µl  buffer  C  lalu melakukan pembacaan hasil pada flow cytometer .
Analisis Flow Cytometry
Sel  yang  telah  dipreparasi  dan  diisolasi selanjutnya dianalisis dengan alat flow cytometry merk BD Facs-Calibur untuk mendeteksi populasi sel  Treg  fungsional  (Cd4 + Cd25 + Foxp3).  Analisis dilakukan  dengan  mengatur  parameter  yang diperlukan  untuk  dianalisis.  Hasil  analisis  yang didapatkan akan diolah dengan program Flowing Software 2 TM .
Gambar 1. Skema Kerja Flow cytometry untuk mendeteksi sel Treg
Strategi Gating Strategi gating dilakukan  dengan  cara memasukkan data pada plot grafik, lalu dilakukan gating R1  dengan  memilih  daerah  dengan populasi yang banyak dan padat. Dari hasil gating R1  tersebut,  dimasukkan  pada  plot  grafik berikutnya  dengan  parameter  Cd4  vs  Cd3.  Pada plot grafik tersebut dilakukan pembagian kuadran dengan  menempatkan  titik  tengah  garis  pembagi pada  populasi  sel  yang  padat  sehingga  akan diperoleh  4  kuadran.  Selanjutnya  melakukan gating R2  pada  kuadran  P2.  Hasil gating R2 dimasukkan  kedalam  plot  grafik  ketiga  dengan parameter  Foxp3  vs  Cd25.  Langkah  selanjutnya sama  seperti  plot  grafik  sebelumnya  yaitu dilakukan pembagian kuadran dengan menempatkan titik tengah dari garis pembagi dan mendapatkan  4  kuadran.  Dari gating tersebut Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+ atau Cd4+ Treg diamati pada kuadran Q2.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  penelitian  ini,  sel  Treg  fungsional yang  ditandai  dengan  populasi  Cd3+Cd4+Cd25+ Foxp3+ berhasil dideteksi. Hasil yang didapatkan pada  (Tabel  1)  menunjukkan  indeks  organ terhadap  konsentrasi  sel  mencit Balb/c dengan Swiss-webster .  Hasil  perhitungan  penentuan indeks organ untuk mencit Balb/c adalah sebesar 0,326 ± 0,06% dan mencit Swiss-webster adalah 0,309 ±  0,21% ,  sedangkan  untuk  konsentrasi  sel yang  didapatkan  berdasarkan  hasil  pengamatan dengan  mikroskop  berturut-turut  untuk  mencit Balb/c dan Swiss-webster adalah 0,701 x  10 7 ± 0,65 sel/ml  dan 1,382 x  10 7 ±  0,26 sel/ml. Perbedaan  indeks  organ  yang  dihasilkan  dapat disebabkan  oleh  ukuran  dan  berat  dari  organ limpa dari Balb/c lebih  kecil dibandingkan organ limpa  mencit  galur Swiss-webster. Ukuran  dan berat  dari  limpa  dapat  disebabkan  oleh  beberapa faktor seperti, adanya variasi spesies, hiperplasia, stres, dan EMH ( Extramedullary Hematopoiesis )
yaitu  kondisi  di  mana  terjadi  pembentukan  sel darah  merah  di  luar  sumsum  tulang  (Parker, 2017).
Pada  penelitian  ini  akan  dilihat  proporsi jumlah dari Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+ pada mencit ( Mus musculus ) galur Balb/c dan Swiss-webster . Data  yang  didapatkan  dari  hasil  deteksi  sel  Treg dengan  analisis flow  cytometry kemudian  diolah dengan  aplikasi flowing  software  2 TM untuk mendapatkan  populasi  sel.  Analisa  tersebut dilakukan dengan melakukan strategi gating pada populasi  sel  yang  padat  (R1)  (Gambar  2).  Pada hasil gating awal  (R1)  didapatkan  populasi  sel sebanyak  10.000  sel  diamati  pada  strategi  gating untuk  mendapatkan  masing-masing  parameter berdasarkan galur Balb/c dan Swiss-webster . Setelah  dilakukan  penentuan gating R1, hasil gating tersebut  akan  dilakukan gating kembali  untuk  mendeteksi  adanya  ekspresi  dari Cd3+Cd4+pada  splenosit  tiap  galur  mencit, dimana  hasil gating Cd3+Cd4+  akan  digunakan untuk gating ekspresi Cd25+Foxp3+.
Berdasarkan  hasil  yang  didapatkan  ekspresi populasi  Cd4  dan  Cd3  pada  bagian  kanan  atas ( upper right ) (Gambar 3) yang dideteksi berturut- turut untuk mencit Balb/c didapatkan 13,50% dan mencit Swiss-webster sebesar  19,24%  dari  total populasi  R1.  Dari  hasil gating R1  dilanjutkan dengan  analisis  ekspresi  Cd25+Foxp3+ pada bagian kanan atas ( upper right ) (Gambar 3) yang menunjukan  hasil  berturut-turut  pada  mencit Balb/c dan Swiss-webster adalah 2,02  ±  0,36% dan 3,14  ±  1,64% dari  total  populasi  yang dideteksi.
Dari  hasil  deteksi  tersebut  dapat  dilihat bahwa  metode  yang  digunakan  yaitu flow cytometry
dengan panel antibodi
Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+ merk Elabscience dengan  harga  terjangkau  mampu  mendeteksi keberadaan sel   Treg  pada splenosit mencit  galur Balb/c dan Swiss-webster sehingga  merupakan metode yang praktis dan cepat dengan waktu yang
ditempuh  cukup  singkat  yaitu  145  menit. Hasil pada penelitian ini dapat dijadikan referensi bagi para  peneliti  dalam  bidang  imunologi  untuk menginvestigasi  populasi  sel  Treg  Cd4+  dan menepis  anggapan  bahwa  deteksi  populasi  sel Treg Cd4+ khususnya pada kelenjar limpa mencit Balb/c  dan Swiss-webster merupakan  hal  yang
rumit. Metode pewarnaan yang tertera juga dapat digunakan  sebagai  salah  satu  acuan  untuk mendeteksi  efek  imunomodulator  pada  berbagai model  hewan  coba  yang  menggunakan  mencit galur  Balb/c  dan Swiss-webster ,  khususnya  yang berhubungan dengan populasi sel Treg
fungsional.
Tabel 1 . Indeks organ terhadap konsentrasi sel mencit Balb/c dan Swiss-webster Parameter Balb/c * Swiss-webster * Indeks Organ Konsentrasi Sel 0,326 ± 0,06% 0,701 x 10 7 ± 0,65 sel/ml 0,309 ± 0,21% 1,382 x 10 7 ± 0,26 sel/ml *n=3
Tabel 2 . Parameter jumlah Cd3+, Cd4+, Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+ Treg mencit Balb/c dan Swiss-webster Parameter Balb/c * Swiss-webster * Cd3+ Cd4+ Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+ T-reg 20,72 ± 0,62% 18,01 ± 0,39% 2,02 ± 0,36% 32,78 ± 3,47% 25,33 ± 1,95% 3,14 ± 1,64%
*n=3
Gambar 2. Strategi gating
Gambar  3. Populasi  Cd3+,  Cd4+,  dan  Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+  Treg  mencit Balb/c dan Swiss-webster

## KESIMPULAN
Pengamatan  populasi  sel  Treg  pada splenosit  mencit  galur Balb/c dan Swiss-webster dapat  dilakukan  dengan  menggunakan  metode flow  cytometry ,  di  mana  dari  hasil  yang  telah didapatkan  metode  ini  mampu  mendeteksi
ekspresi Cd3+Cd4+Cd25+Foxp3+ dengan  mudah dan cepat, hanya membutuhkan waktu 145 menit mulai dari pembedahan. Metode pewarnaan yang tertera  juga  dapat  digunakan  sebagai  salah  satu acuan  untuk  mendeteksi  efek  imunomodulator pada  berbagai  model  hewan  coba  yang
menggunakan  mencit  galur Balb/c dan Swiss- webster ,  khususnya  yang  berhubungan  dengan populasi sel Treg.

## UCAPAN TERIMA KASIH
RSUD  Dr.  Soetomo  Surabaya,  Prof.  Dr.  Jusak Nugraha,  dr,  MS.,  SpPK(K)  selaku  staf  pengajar
Spesialis  Patologi  Klinik  Divisi  Imunologi Fakultas  Kedokteran    Universitas    Airlangga. Penelitian    ini  didanai  oleh  Lembaga  Penelitian dan  Pengabdian  Masyarakat  (LPPM)  Universitas Katolik  Widya  Mandala  Surabaya,  nomor 5308/WM01/N/2021  yang  diketuai  oleh  Senny Yesery Esar.

## DAFTAR PUSTAKA
Georgiev,  P.,  Charbonnier,  L.M.,  and  Chatila,  T.A.,  2019, Regulatory  T  Cells:  The  Many  Faces  of  Foxp3, Journal  of Immunology , 39(6) : 1-18.
Gregorczyk,  I.,  Maślanka,  T.,  2019,  Effect  of  selected  non- steroidal  anti-inflammatory drugs on activation induced CD25 expression  on  murine  CD4+  and  CD8+  T  cells:  an  in  vitro study, Experimental immunology , 44(22) : 109-118.
Josefowicz,  S.Z.,  Lu,  L.F.,  and  Rudensky,  A.Y.,  2012, Regulatory  T  Cells:  Mechanisms  of  Differentiation  and Function, Annual Review of Immunology, 30 : 531 – 564.
Okeke,  E.B.,  Okwor,  I.,  Mou,  Z.,  Jia,  P.,  Uzonna,  J.E.,  2013, CD4+  CD25+  regulatory  T  cells  attenuate  lipopolysaccharide- induced  systemic  inflammatory  responses  and  promotes survival in murine Escherichia coli infection, Shock , 40(1) : 65- 73.
Parker,  G.A.,  2017,  Immunology  in  Toxicology  and  Drug Development, USA: Humana Press.
Santegoets,  S.J.,  Dijkgraaf,  E.M.,  Battaglia,  A.,  Beckhove,  P., Britten,  C.M.,  Gallimore,  A.,  and  van  der  Burg,  S.H.,  2015, Monitoring regulatory T cells in clinical samples: consensus on an essential marker set and gating strategy for regulatory T cell analysis  by  flow  cytometry, Cancer  Immunology,  Immuno- therapy , 64(10) : 1271-1286.
Singh,  K.,  Hjort,  M.,  Thorvaldson,  L.,  and  Sandler,  S.,  2015, Concomitant  analysis  of  Helios  and  Neuropilin-1  as  a  marker to  detect  thymic  derived  regulatory  T  cells  in  naive  mice, Scientific Reports , 5(1) : 1-10.
Wing,  J.B.,  Tanaka,  A.,  and  Sakaguchi,  S.,  2019,  Human FOXP3 + Regulatory  T  Cell  Heterogeneity  and  Function  in Autoimmunity and Cancer, Immunity, 80 : 302-316.
Zhou, Z., Wang, J., Shi, W., Brand, D.D., Liu, Z., Fan, H., Zhen, S.G., 2010, Isolation of Purified and Live Foxp3+ Regulatory T Cells  using  FACS  Sorting  on  Scatter  Plot, Molecular  Cell Biology, 2(3) : 164-169.