## ISOLASI ASAM LEMAK DAN  KADAR PIGMEN RUMPUT LAUT  COKELAT Sargassum crassifolium SEBAGAI SUMBER ANTIOKSIDAN ALAMI
Grace Sanger*, Verly Dotulong, Lena Jeane Damongilala
1 Jurusan Pengolahan Hasil Perikanan, Program Studi Teknologi Hasil Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Sam Ratulangi Manado Diterima: 8 September 2022/Disetujui: 20 Desember 2022 *Korespondensi: sanger.grace@unsrat.ac.id
Cara sitasi (APA Style 7 th ) : Sanger,  G., Dotulong, V.,   & Damongilala, L. J. (2022). Isolasi asam lemak dan kadar pigmen rumput cokelat Sargassum crassifolium sebagai sumber antioksidan alami. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia, 25(3), 475-493. http://dx.doi.org/10.17844/jphpi.v25i3.43033
Abstrak
Sargassum adalah produk hasil laut, sumber senyawa bioaktif yang memiliki  aktivitas biologi, terutama sebagai antioksidan dan antikanker.  Ekstrak maupun isolat Sargassum telah  dimanfaatkan sebagai produk kesehatan pada berbagai industri pangan, obat-obatan, dan kosmetik.  Asam lemak (E)-11- octyloxacyclododec-10-en-2-one ,  telah diisolasi dari fraksi etil asetat rumput laut cokelat S. crassifolium dan menunjukkan aktivitas antioksidan. Tujuan penelitian yaitu mengisolasi senyawa asam lemak, mengukur kadar pigmen, dan aktivitas antioksidan S. crassifolium .  Metode pemurnian dan isolasi sebagai berikut: Sargassum diekstraksi dengan metanol menggunakan kolom kromatografi (KK), kemudian dipartisi dengan heksana, etil asetat, setelah itu dibilas dengan metanol.  Fraksi etil asetat kemudian dimurnikan dan diisolasi menggunakan KK dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang digunakan untuk memonitor dan mengobservasi  kehadiran senyawa bioaktif.  Isolat senyawa murni fraksi etil asetat S. crassifolium (FEtSar) dikarakterisasi menggunakan NMR, FTIR dan ESMS dan dibandingkan dengan literatur terkini. Ekstrak, fraksi dan  isolat murni  diuji kadar pigmen (karotenoid dan fuko-xantin) dan aktivitas  antioksidan 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH). Hasil studi menunjukkan bahwa ekstrak, fraksi dan isolat murni (E)- 11-octyloxacyclododec-10-en-2-one (FEtSar). S. crassifolium mengandung senyawa  antioksidan. Aktivitas antioksidan tertinggi adalah fraksi heksana (IC 50 2,657±0,338 mg mL -1 ) dengan kadar fuko-xantin dan karotenoid masing-masing 33,04±3,348 dan 24,911±2,4231 µg g -1 . S. crassifolium potensial dimanfaatkan sebagai sumber antioksidan alami  dan di masa depan dapat dimanfaatkan sebagai produk kesehatan.
Kata kunci: antioksidan, asam lemak, isolasi, pigmen
Isolation of Fatty Acid and Pigment Content of Sargassum crassifolium as A Source of Natural Antioxidant Abstract Sargassum is a marine product, source of bioactive compound with many divers biological activity, especially as antioxidant and anticancer. The bioactive  compound of Sargassum have   been utilized as health product in many industry such as food, medicine, and cosmetic.  Fatty acids, (E)-11- octyloxacyclododec-10-en-2-one were isolated from ethyl acetic fraction of brown seaweed Sargassum crassifolium .  The aim of the research is to isolate and purified the fatty acid compound and measure the pigmen content and antioxidant activity of S. crassifolium . The method of reasearch as followed; Sargassum extracted using methanol followed by partitioned with hexane and ethyl acetic and rinsed with methanol using Colomn Chromatography (CC). Ethyl acetic was purificated  and isolated using CC and Thin Layer Chromatography (TLC) was using to monitored and observed the compounds.   Isolate of pure compounds of etil acetic  fraction of S. crassifolium (FEtSar) was elucidated by basic NMR spectroscopy, FTIR and ESMS and compared with previous literature.  The extract, fractions and isolated compound were tested for their pigment content (carotenoid and fucoxanthin) and antioxidant activity  using DPPH. The result of study shown, extract, fraction and pure compound of ethyl acetate fraction of S. crassifolium ,  (FEtSar), (E)-11- octyloxacyclododec-10-en-2-one  revealed  have an antioxidant compound. Therefore S. crassifolium is potencial as a source of natural antioxidant and in the future could be explored as health product.
Keyword: antioxidant, fatty acids, isolation, pigment
Available online: journal.ipb.ac.id/index.php/jphpi
Isolasi asam lemak dan kadar pigmen rumput laut cokelat, Sanger et al.
Asam lemak adalah sebuah komponen struktur sel yang tersebar luas  bagi banyak reaksi biokimia di dalam tubuh termasuk hormonal dan aktivitas energi. Selain itu asam lemak berperan penting dalam menyeimbangkan sebuah sawar lipid di dalam kulit untuk menahan zat-zat iritan dan infeksi yang memasuki tubuh. Beberapa jenis asam lemak mempunyai pengaruh yang bermanfaat untuk kesehatan manusia yaitu melindungi jantung, sitotoksik, antimitotik, antikanker, dan aktivitas antimutagenik (Prabhakar et al ., 2011; Freitas, 1995). Rumput laut cokelat  teridentifikasi mengandung  berbagai jenis pigmen (klorofil, karotenoid, fukosantin, pikoeritrin dan pikosianin (Sanger et al. , 2022) dan polifenol (asam fenolik, flavonoid, tanin). Kandungan metabolit  sekunder rumput laut cokelat terdiri atas alkaloid, glikosida, tanin, dan steroid yang berfungsi sebagai antioksidan, antimutagenik, anti koagulan, antitumor, dan metabolisme lipid, yang bermanfaat untuk pengobatan dan industri farmasi (Jeeva et al. , 2012). Penggunaan antioksidan sintetis dalam produk pangan telah terbukti memberikan efek samping yang membahayakan bagi kesehatan. Oleh karena itu pemanfaatan produk alami menjadi perhatian besar saat ini. Berbagai hasil penelitian menunjukkan rumput laut cokelat berpotensi sebagai antioksidan alami (Edison et al ., 2020, Nurjanah et al ., 2019; Dolorosa et al ., 2019; Yanuarti et al ., 2017; Nurjanah et al ., 2016; Ganapathi et al ., 2013;
Firdaus et al ., (2012); dan Foon et al., 2013). Sargassum dilaporkan memiliki metabolit sekunder yaitu phlorotannin , fukosantin, fukoidan, dan meroterpenoid dengan aktivitas biologi, yaitu  antioksidan (Nurjanah et al ., 2017; Costa et al ., 2010;), antikanker (Praiboon et al .,  2017  ;
Murphy et al ., 2014; Pádua et al ., 2015; Mehdinezhad et al. ,  2016);  antiinflamasi (Dar et al ., 2007; Joung et al ., 2017), antijerawat  (Kok et al .,  2016),  antikoagulan (Zoysa et al ., 2008), antibakteri (Zubia et al ., 2008;
Vijayabaskar et al ., 2012;  Sidauruk et al ., 2021).

## PENDAHULUAN
Komoditas unggulan perikanan salah satunya adalah rumput laut yang tumbuh tersebar di perairan Indonesia, merupakan komoditas ekspor potensial untuk dikembangkan sebagai pangan fungsional, obat-obatan dan kosmetik. Salah satu jenis rumput laut yang potensial adalah Sargassum (Kementerian Kelautan dan Perikanan [KKP], 2017). Sargassum adalah satu genera terbesar dari rumput laut cokelat, ditemukan paling melimpah di   kawasan Indo-Pasifik  dari Jepang sampai Selandia Baru. Sargassum tergolong ordo Fucales, kelas Phaeophyceae dan suku Sargassaceae dan telah ditemukan lebih dari 100 spesies Sargassum di seluruh dunia  (Praiboon et al. , 2017). Makroalga atau rumput laut mendapat
perhatian yang besar dari para peneliti dan ahli nutrisi karena kandungan kalori yang rendah dan tinggi  vitamin, mineral dan serat  yang potensial untuk diolah menjadi produk kesehatan.   Rumput laut  adalah sumber senyawa bioaktif yang potensial yaitu karotenoid, asam lemak n-3, dan polyunsaturated fatty acids (PUFA) yang merupakan karakteristik unik dari lemak organisme (Stengel et al. , 2011). Kandungan PUFA, terutama  α-linolenat (18:3n3), asam oktadekatetraenoat (18:4n-3), arakidonat (20:4n-6), dan asam eikosapentaenoat (20:5n3) alga laut  telah menarik perhatian yang penting  karena dianggap sebagai senyawa nutrisi esensial untuk manusia dan hewan.   Asam  lemak ini penting dalam mencegah penyakit kardiovaskular  dan kanker, anti-athrogenic dan antitrombotik juga mengontrol    reumatoid  artritis  dan  hipertensi (Tsape et al ., 2010; Bahkar et al ., 2017). Lemak rumput laut  memiliki  molekul bioaktif asam lemak konjugasi, pigmen- pigmen, dan terutama fukosantin yang memberikan pengaruh pada pengobatan tumor  dan masalah kanker (Kohno et al. , 2004). Pigmen rumput laut mempunyai nutraceutical penting termasuk antioksidan dan respons kualitas biologi.  PUFA menyumbang lebih dari 30% dari total asam lemak di dalam diatom atau rumput laut (Nomura et al ., 1997).
Fukosantin tergolong   xantofil yang termasuk famili karotenoid adalah pigmen utama mempunyai aktivitas antiproliferasi yang kuat melawan berbagai jenis kanker, (Miyashita, 2006; Hosokawa et al ., 2004;
Pádua et al. , 2015), antiobesitas  (Miyashita,
2006; Maeda et al .,  2005)  dan  antidiabetes (Maeda et al. , 2007). Fukosantin dilaporkan berfungsi melalui penguatan docosahexaenoic acid (DHA, C22:6ω3)  (Tsukui et al. ,  2007).
Banyak penelitian menunjukkan bahwa berbagai jenis polisakarida yang diisolasi dari rumput laut cokelat menunjukkan aktivitas antikanker (Ko et al. , 2012; Murphy et al ., 2014; Pádua et al. , 2015). Fukoidan yang diisolasi dari Spiraea thunbergii mempunyai aktivitas antikanker dan antitumor (Moghadamtousi et al ., 2014)
Isolasi tentang senyawa aktif  rumput laut cokelat S. crassifolium yang tumbuh di perairan Indonesia belum ditemukan terutama tentang komponen asam lemaknya. Sebab itu dalam penelitian ini dipelajari proses ekstraksi pemurnian dan isolasi senyawa aktif, kadar pigmen, dan kapasitas antioksidannya, dengan tujuan untuk dimanfaatkan sebagai sumber antioksidan alami bagi kesehatan di masa depan.

## BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah S. crassifolium , metanol, heksana, etil asetat, etanol (Merck), 93 µM DPPH (1,1-difenil- 2-pikrilhidrasil) (Sigma Aldrich), 0,1 M bufer fosfat (Merck), 1% K 3 Fe(CN) 6 (Merck),
10% TCA (Merck), 0,1% FeCl 3 (Merck) dan akuabides. Alat-alat yang digunakan terdiri dari: spektrofotometer UV/ Visible (Shimadzu tipe 1240, Jepang), mikropipet 1 mL dan 0,5 mL (Jerman) dan peralatan gelas (Pyrex). Merck’s gel silika 60 No.7734  dan ODS (oktadesil silika)  digunakan untuk absorben kolom kromatografi.  Gel silika 60 F254, 0,25 mm untuk TLC (Merck), NMR (Bruker spektrofotometer 400 MHz, untuk  1H NMR, dan 100 MHz, untuk 13C NMR), FTIR
( Fourier Transform Infra Red ) (Shimadzu,
Jepang)  dan ESMS ( Electro Spray Mass Spectra ) menggunakan instrumen ACQ- TOD, Water TQ detector Tune mass lynx 4.1
Scn 714,  PHOMO Microplate reader , Autobio model SPR-960, Lampu UV 254 and 365 nm, dan evaporator vakum putar (Buchi, Jepang).

## Metode Ekstraksi dan isolasi
Rumput laut  dikeringkan di tempat terbuka, tanpa sinar matahari langsung selama dua hari, setelah itu digiling sampai halus.  Sampel kemudian diekstraksi dengan
MeOH (1:2 b/v) sebanyak tiga kali ekstraksi (satu  hari untuk setiap ekstraksi). Ekstrak metanol   kemudian dipartisi dengan  partisi kolom,  dengan fase diam silika G 60 F254
(200 g) dan fase gerak : n-heksan-EtOAc (sebanyak 600 mL) dan dibilas dengan
Tabel 1 Partisi kolom ekstrak metanol rumput laut S. crassifolium menggunakan berbagai pelarut Fraksi Volume pelarut (mL) Massa (g) Total massa (g) Heksana EtOAc MeOH 1 600 0 0 0,611 Fraksi heksana (0,6424) 2 600 0 0 0,027 3 600 0 0 0,0043 4 0 600 0 1,8276 Fraksi etil asetat (2,1591) 5 0 600 0 0,2255 6 0 600 0 0,1060 7 0 0 600 7,3519 Residu metanol (14,0027) 8 0 0 600 4,3679 9 0 0 600 2,2829
Isolasi asam lemak dan kadar pigmen rumput laut cokelat, Sanger et al.
metanol,  (perbandingan pelarut dapat dilihat pada Tabel 1. Semua ekstrak dan fraksi dipekatkan menggunakan evaporator vakum putar dengan suhu 40 o C.  Fraksi etil asetat kemudian dimurnikan dengan  kromatografi kolom sebanyak tiga kali  sampai mendapatkan senyawa murni. Kolom kromatogafi 1: fraksi etil asetat (2,1591 g) dimurnikan menggunakan silika G 60 F254 (20 g), fase gerak n-heksana:EtOAc (35 mL, gradien 2,5%). Kolom kromatografi 2:  Sub fraksi   F5 (294,5 mg)  hasil kolom kromatografi 1 dimurnikan menggunakan   fase diam:  ODS (2,945 g) gradien 2,5%, m  fase gerak H 2 O : MeOH (10 mL). Kolom kromatografi 3:  Sub Fraksi F25 (80 mg) dari kolom kromatografi ke-2 dimurnikan menggunakan ODS (1 g) gradien
5% H 2 O : MeOH (9 mL). Proses ekstraksi dan Isolasi  dapat dilihat pada Gambar 1. Fraksi yang dihasilkan dengan massa yang besar dan terdeteksi ada senyawa dari setiap pemurnian dalam kolom kromatografi dimonitor dengan TLC. Keberadaan senyawa  diamati di bawah sinar pada 254 dan 365, serta TLC yang disemprot dengan H 2 SO 4 . Penyemprotan TLC dengan DPPH  untuk mendeteksi  keberadaan senyawa antioksidan.  Karakterisasi senyawa murni menggunakan FTIR, ESMS san NMR.
Analisis kadar pigmen Kandungan pigmen ekstrak metanol fraksi heksana dilakukan menggunakan UV- visible spektrofotometer melalui pembacaan pada panjang gelombang spesifik sesuai jenis pigmen. Metode analisis karotenoid menggunakan panjang gelombang 480 dan 510 nm dan analisis fukosantin mengunakan panjang gelombang 470, 631, 581, dan 664 nm, mengacu pada Sudhakar et al .  2013;
Sanger et al . 2019. Perhitungan kadar masing- masing pigmen mengikuti formula sebagai berikut:

## Analisis aktivitas peredam radikal DPPH
Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitas mengacu pada metode Laponik et al. 2004 dengan sedikit modifikasi. Prosedurnya sebagai berikut: fraksi etil asetat setelah dimurnikan dengan kolom kromatografi (KK) kemudian di-KLT menggunakan fase diam: gel silika  G 60 F254;  fase gerak: n-heksan- EtOAc (9:1)  dan metanol: H 2 O (9:1)  setelah itu KLT disemprot dengan larutan 0,05 mM DPPH dalam metanol. Uji positif yang bersifat anti radikal bebas hasil KLT menghasilkan bercak (spot)  kuning.
Analisis kuantitatif DPPH dilakukan pada ekstrak metanol, fraksi heksana dan etil asetat mengacu pada Sanger et al . (2019) dengan modifikasi. Prosedurnya sebagai berikut: ekstrak rumput laut sebanyak 0,5 mL  (0,2-8 mg/mL) ditambahkan 2 mL larutan DPPH dalam metanol (93 µM), dihomogenkan menggunakan vortex, diinkubasi dalam ruangan gelap selama 30 menit. Kontrol positif menggunakan BHT (0,05-0,2 mg/mL). Pengukuran absorbansinya dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan menggunakan rumus sebagai berikut:

## Analisis Data
Penelitian ini menggunakan ulangan sebanyak tiga kali pada setiap parameter pengujian. Data yang diperoleh dipresentasikan dalam nilai rata-rata dan standar deviasi (±SD) dalam bentuk Tabel atau Gambar. Data diolah menggunakan Microsoft Excel 2010.
% Penghambatan = [A Kontrol – A sampel / A Kontrol] x 100%
Keterangan:
A = Absorbansi Karotenoid (µg/g) = [7,6 (A480) – 1,49 (A510) V] / (1000×W) Fuko-xantin(mg/g) = A470 −1,239 (A631+A581−0,3 ×A664) – 0,0275×A664 /141 Keterangan: A = Absorbansi pada panjang gelombang spesifik Karotenoid (µg/g) = [7,6 (A480) – 1,49 (A510) V] / (1000×W) Fuko-xantin(mg/g) = A470 −1,239

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Ekstraksi dan Isolasi Rumput laut S. crassifolium 4 kg diekstrak menggunakan metanol.  Ekstrak metanol sebanyak 20 g  setelah dipartisi menghasilkan fraksi n-heksana (0,6424 g), etil asetat (2,1591 g) dan residu ekstrak metanol (14,0027 g). Proses pemurnian (Gambar 1) sebagai berikut: kolom kromatografi 1 berupa fraksi etil asetat  F1 (2,1591 g)  dimurnikan dengan silika gel dielusidasi dengan sistem gradien 2% menggunakan heksana: etil asetat (mulai 35: 0 sampai 14:21) menghasilkan 25 fraksi (F1-F26). Fraksi (F1-F8) yang dihasilkan dimonitor melalui analisis TLC (Gambar 2). Kolom kromatografi 2 dilakukan pada F5 (361,2 mg) dimurnikan menggunakan  ODS gradien 2,5%  H 2 O : MeOH (dimulai 7:3 sampai 0:10)  menghasilkan 29 fraksi (F1-F29), kemudian F21-27 dimonitor dengan TLC (Gambar 3).  Kromatografi kolom 3  dilakukan pada F25,  dimurnikan menggunakan  ODS gradien 5% H 2 O : MeOH (mulai 0:9 sampai 9:0) (Gambar 4) menghasilkan 21 fraksi (F1-
Gambar 1 Proses ekstraksi dan isolasi senyawa murni fraksi etil asetat S. crassifolium
Gambar 2 Analisis TLC pada kromatografi kolom (F1-F8); fase diam: silika G 60 F254, fase gerak n-heksana:EtOA (9:1)  diobservasi dibawah lampu UV 254 and  365 nm sesudah disemprot dengan  H 2 SO 4 (dalam metanol  10%) dan DPPH  (dalam metanol 0,05%)
Gambar 3 Analisis TLC pada kromatografi kolom (F1-F8); fase diam: silika G 60 F254 S , fase gerak n-heksana:EtOA (9:1)   diobservasi dibawah lampu UV 254 and  365 nm sesudah disemprot dengan  H 2 SO 4 (dalam metanol  10%) dan DPPH  (dalam metanol 0,05%)
Isolasi asam lemak dan kadar pigmen rumput laut cokelat, Sanger et al.
F21). Kemudian F15-F21, dimonitor dengan TLC,  pada  F20 terdeteksi terdapat senyawa murni sebanyak 5,4 mg. Senyawa murni fraksi etil asetat Sargassum (FEaSar)  kemudian di karakterisasi menggunakan FTIR, MS dan NMR.
Penentuan Struktur Senyawa Analisis inframerah
Pengukuran serapan gelombang inframerah dalam suatu penentuan struktur bertujuan untuk mengetahui gugus fungsi yang terdapat pada suatu molekul. Identifikasi gugus fungsi tertentu ditunjukkan oleh serapan khas pada bilangan gelombang tertentu, yang merupakan hasil transisi antara tingkat energi vibrasi (getaran) dari setiap interaksi atom-atom dalam suatu molekul, baik berupa bending ataupun stretching . Spektrum inframerah senyawa murni  (FEaSar) dapat dilihat pada Gambar 5. Berdasarkan Gambar 5, terdapat serapan pada bilangan gelombang 3.002,81 cm -1 menunjukkan adanya regang C-H ikatan rangkap sedangkan bilangan gelombang 2.921,87 dan 2.852,65 cm -1 membuktikan adanya gugus CH ikatan tunggal. Kemudian bilangan gelombang 1.741,63 merupakan ciri khas dari karbonil. Tafsiran secara keseluruhan dari spektrum inframerah dapat dilihat pada Tabel 2.
Gambar 4 Analisis TLC pada kromatografi kolom (F1-F8); fase diam: silika G G 60 F254S, fase gerak : n-heksana-EtOAc (9:1) diobservasi dibawah lampu  UV 254 dan  365 nm, sesudah disemprot dengan  H 2 SO 4 (di dalam metanol 10%)
Gambar 5 Spektrum infra merah senyawa murni  (FEaSar)
Tabel 2 Tafsiran spektrum infra merah murni (FEaSar)) Bilangan gelombang (cm -1 ) Bentuk puncak Intensitas Dugaan struktur/ gugus fungsi 3.002,81 tajam rendah CH sp 2 2.921,27 tajam tinggi CH sp 3 2.852,65 tajam tinggi CH sp 3 1.741,63 tajam tinggi CH=O
Menurut Supratman (2010) dan  Socrates (1994), serapan karbonil pada gugus fungsi aldehid 1.740-1.720 cm -1 , asam karboksilat 1.705–1.725 cm -1 , keton 1.705-1.725 cm -1 , ester 1.740-1.710 cm -1 .
Analisis Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Senyawa murni  (FEaSar) berupa padatan amorf berwarna putih yang larut dalam kloroform. Berdasarkan data spektrum 13 C- dan 1 H-NMR, FEaSar memiliki 19 atom karbon, 36 atom hidrogen dan 2 atom oksigen dengan rumus molekul C 19 H 36 O 2 . Dengan mengetahui dugaan rumus molekul tersebut, maka dapat diperoleh dugaan nilai atau harga ( double bond equivalen ) DBE dari senyawa 1 dengan rumus sebagai berikut:
Berdasarkan perhitungan rumus DBE tersebut, diperoleh harga DBE senyawa murni yaitu tiga, artinya senyawa diduga memiliki satu buah karbonil, satu ikatan rangkap dan satu siklik.
FEaSar diukur menggunakan spektrometer NMR untuk mengetahui jumlah, jenis, dan lingkungan proton/hidrogen dan untuk mengetahui jumlah, jenis serta pemecahan sinyal karbon yang tergantung dari jumlah proton yang terikat (metin, metilen, metil dan karbon kuarterner). Data spektrum 13 C-NMR pada Gambar
6, memperlihatkan adanya 19 sinyal karbon, yang terdiri dari  enam belas karbon ikatan tunggal (Csp3) pada daerah pergeseran kimia di bawah 100 ppm dan tiga karbon rangkap
dua (Csp2) pada daerah pergeseran kimia di atas 100 ppm yang merupakan ciri khas karbonil. Dari data tersebut telah diketahui jumlah dan jenis karbon-karbon yang terdapat pada senyawa.
Umumnya sinyal karbon FEaSar   adalah karbon ikatan tunggal (C sp 3 ) kecuali sinyal karbon pada δC 174,2 (C-1) merupakan ciri khas dari karbon karbonil (C=O) dan dua sinyal yang berhimpit pada pergeseran kimia 129,4 yang merupakan karbon ikatan rangkap (C sp 2 ). Semua sinyal karbon ikatan tunggal FEaSar (Gambar 7) merupakan karbon metilena kecuali karbon pada ppm δC 13,1 (C-19) merupakan ciri khas dari karbon metil (CH 3 ). Sedangkan lima belas sinyal karbon pada daerah 22-51 ppm merupakan karbon metilena (CH 2 ) yaitu: 50,6 (C-4), 33,4(C- 5); 31,7(C-6); 29,4(C-7 & C-8); 29,3(C-9 & C-10); 29,1(C-11 & C-12); 29,0(C-13 & C-14); 28,9(C-15); 26,8(C-16); 24,7(C-17) dan 22,4(C-18) ppm. Spektrum 1 H-NMR menginformasikan jumlah, jenis dan lingkungan dari setiap proton-proton yang terdapat pada suatu senyawa. Pada Gambar 8 dapat diilihat jumlah dan jenis hidrogen yang terdapat pada senyawa murni. Jumlah proton atau hidrogen ditentukan dengan nilai integrasi, sedangkan jenis lingkungan ditentukan oleh nilai pergeseran kimia dan multiplisitasnya.
Multiplisitas singlet menunjukkan tidak adanya proton tetangga, doblet menunjukkan memiliki satu proton tetangga, triplet menunjukkan memiliki dua proton tetangga, kuartet menunjukkan memiliki tiga proton tetangga dan multiplet menunjukkan memiliki lebih dari empat proton tetangga.
Gambar 6 Spektrum 13 C-NMR senyawa-senyawa murni (125 MHz dalam metanol-D4)
DBE=∑atom C- -                +             +1 ∑ atom H 2 ∑ atom N 2 ∑ halogen 2
Isolasi asam lemak dan kadar pigmen rumput laut cokelat, Sanger et al.
Gambar 8 menunjukkan bagaimana jenis dan lingkungan proton/hidrogen pada senyawa  murni. Sinyal hidrogen pada pergeseran kimia 0,88 (3H, t ) merupakan hidrogen metil yang bertetangga dengan metilena. Hal ini ditunjukan dengan sinyal triplet yang berarti tiga hidrogen metil ini memiliki dua buah hidrogen tetangga yaitu hidrogen pada metilena. Sinyal hidrogen dengan intensitas tinggi pada 1,29(42H; s ) merupakan ciri khas dari sinyal hidrogen asam lemak. Hal ini disebabkan banyaknya hidrogen metilena yang memiliki lingkungan yang sama sehingga sinyalnya menumpuk (bertumpang tindih). Interpretasi dari sinyal ini ditunjukan dengan fragmen berwarna hitam (rantai 12 karbon metilena). Sinyal hidrogen 1,57(2H; q ) merupakan hidrogen metilena yang diapit karbon metilena dan metin. Hal ini diduga karena bentuk sinyalnya kuartet yang berarti hidrogen ini memilki tiga buah hidrogen tetangga. Sinyal hidrogen pada pergeseran kimia 2,00(2H; t ) yang juga merupakan sinyal dari metilena (CH 2 ). Karena bentuk sinyalnya triplet, diduga hidrogen pada metilena ini memiliki dua buah hidrogen tetangga yang berasal dari hidrogen metilena dan karbon yang di sisi lainnya adalah karbon kuarterner. Sinyal hidrogen yang berbentuk triplet juga terdapat pada 2,29 dan 5,32 ppm. Sinyal pada 2,29 (2H, t ) diduga adalah metilena yang terikat pada karbon kuarterner dan metilena lainnya sedangkan sinyal hydrogen pada 5,32 (1H, t ) ppm adalah
Gambar 7 Spektrum 13 C-NMR senyawa-senyawa murni (125 MHz dalam metanol-D4)
Gambar 8 Spektrum 1 H-NMR senyawa-senyawa murni (500 MHz dalam metanol-D4)
metin yang bertetangga dengan metilen dan karbon kuarterner (bukan karbonil) pada sisi lainnya. Sinyal hidrogen yang terakhir adalah sinyal pada pergeseran 3,62 (2H, s ) merupakan hidrogen dari metilena teroksigenasi yang diapit oleh suatu karbon kuarterner. Tabel 3 menyajikan fragmen-fragmen  (Gambar 9)
yang dimiliki senyawa murni.
Berdasarkan data IR dan NMR yang telah diuraikan, didapat dugaan strukur dari senyawa murni (FEaSar)   berupa senyawa golongan asam lemak yang ditunjukkan pada Gambar 10.
Data perbandingan nilai pergeseran kimia 1 H- dan 13 C-NMR senyawa murni (FEaSar) dengan senyawa pembandingnya yaitu metil oleat (Ruksilp, 2020) dapat dilihat pada Tabel 4 dan gambar senyawa pembanding dapat dilihat pada Gambar 11.
Data pergeseran kimia senyawa murni mirip dengan data pergeseran kimia metil oleat. Adapun perbedaan pergeseran kimia ini disebabkan oleh perbedaan adanya gugus metilena teroksigenasi yang menggantikan metoksi pada metil oleat. Karean ada perbedaan
Tabel 3 Data pergeseran kimia 1 H-, 13 C- dan 2D-NMR senyawa (FEaSar)
Posisi
Nomor karbon δ C 125 MHz (ppm) δ H (Int., mult., J =Hz) 500 MHz (ppm) 1 1 174,0 - 2 5 33,4 2,29 (2H; t ) 3 17 24,7 1,57 (2H; q ) 4 13
29,0 1,29 (2H; s ) 5 15
28,8 1,29 (2H; s ) 6 16
26,8 1,29 (2H; s ) 7 9
29,3 1,29 (2H; s ) 8 7
29,4 2,00 (2H; t ) 9 2 129,4 - 10 3 129,4 5,32 (1H; t ) 11 10
29,3 1,29 (2H; s ) 12 8
29,4 1,29 (2H; s ) 13 11
29,1 1,29 (2H; s ) 14 6 31,7 1,29 (2H; s ) 15 14
29,0 1,29 (2H; s ) 16 12 29,1 1,29 (2H; s ) 17 18 22,4 1,29 (2H; s ) 18 19 13,1 0,88 (3H; t ) -CH 2 -O 4 50,6 3,62 (2H; s ) Gambar  9 Fragmen-fragmen FEaSar
Gambar 10 Dugaan senyawa murni  (FEaSar)
Gambar  11 Fragmen-fragmen FEaSar
Isolasi asam lemak dan kadar pigmen rumput laut cokelat, Sanger et al.
gugus ini menyebabkan bentuk struktur senyawa murni dan metil oleat berbeda.
Selain itu pelarut yang digunakan pada saat mengukur NMR dan daya alat spektroskopi NMR yang digunakan juga berbeda. Semakin besar daya alat yang digunakan, semakin sensitif data yang diberikan. Sehingga diduga senyawa murni (FEaSar)   termasuk golongan ester oleat. (Gambar 12)

## Analisis Spektrum Massa
Untuk memperkuat dugaan struktur, maka senyawa murni (FEaSar)   dikarakterisasi dengan menggunakan spektroskopi massa.
Terlihat adanya puncak m/z 295 yang diduga merupakan bobot molekul senyawa murni (FEaSar) (Gambar 13). Hal ini sesuai dengan dugaan struktur senyawa isolat fraksi etil asetat yakni asam ester oleat yang memiliki rumus molekul (E)-11-octyloxacyclododec-10- en-2-one . Rumput laut mengandung lemak yang rendah dan bukan sumber energi utama. Komposisi asam lemak paling banyak rumput laut kaya akan PUFA (Nomura et al .,  2013). Komposisi kimia asam lemak S. wightii yang tertinggi adalah asam oleat (27%)  asam arakidonat (17%), asam linoleat  (11%), asam miristat (9%) dan asam palmitat  (5,67). Asam arakidonat  adalah komponen utama membran sel dan berperan penting dalam Gambar  12 Struktur senyawa murni (FEaSar) S. crassifolium
Tabel 4 Data 1
H-, 13 C-NMR senyawa 1 (FEaSar) dan metil oleat Nomor karbon δ C (ppm) δ H (Int., mult., J =Hz) 500 MHz (ppm)
a metil oleat b Senyawa 1 a metil oleat b Senyawa 1 1 173,9 174,0 - - 2 34,1 33,4 2,30 (2H) 2,29 (2H; t ) 3 25,1 24,7 1,60 (2H) 1,57 (2H; q ) 4 29,2 29,0 1,29 (2H; s ) 1,29 (2H; s ) 5 29,2 28,8 1,29 (2H; s ) 1,29 (2H; s ) 6 29,2 26,8 1,29 (2H; s ) 1,29 (2H; s ) 7 29,8
29,3 1,29 (2H; s ) 1,29 (2H; s ) 8 29,9 29,4 1,90 (2H) 2,00 (2H; t ) 9 130,0 129,4 5,25 (1H) - 10 129,7 129,4 5,25 (1H) 5,32 (1H; t ) 11 29,8 29,3 1,90 (2H) 1,29 (2H; s ) 12 29,9 29,4 1,29 (2H; s ) 1,29 (2H; s ) 13 29,5 29,1 1,29 (2H; s ) 1,29 (2H; s ) 14 32,1 31,7 1,29 (2H; s ) 1,29 (2H; s ) 15 29,4 29,0 1,29 (2H; s ) 1,29 (2H; s ) 16 29,8 29,1 1,29 (2H; s ) 1,29 (2H; s ) 17 22,8 22,4 1,29 (2H; s ) 1,29 (2H; s ) 18 14,2 13,1 0,80 (3H; r ) 0,88 (3H; t ) -CH 2 -O 51,3 50,6 3,50 (3H; s ) 3,62 (2H; s )
produksi prostagladin.   Eikosanoid dari  asam arakidonat dapat meningkatkan aktivitas platelet dan respons  imun (Knothe, 2005). Hal ini berbeda dengan penelitian yang dilaporkan oleh Praiboon et al . 2017  bahwa asam lemak utama S. oligocystum asam lemak jenuh yaitu hampir 50% dari total asam lemak. Hal ini juga sama dengan S. polycystum dari Malaysia yang dilaporkan (Matanjun et al ., 2009) dan S. muticum dari  Spanyol (Conde et al. , 2015). Kandungan asam lemak rumput laut bervariasi baik oleh karena lingkungan maupun genetik yang berbeda (Nomura et al ., 2013). Balboa et al. (2016) melaporkan bahwa tingkat ketidakjenuhan terutama tergantung pada temperatur air.
Rumput laut yang dipanen pada daerah dingin mempunyai kandungan PUFA dan tingkat kejenuhan lebih tinggi daripada yang dipanen pada perairan tropis.
Kandungan PUFA S. binderi dan S. duplicatum lebih tinggi  (33-37%) dari  SFA
(29-31%), dan kandungan MUFA yang rendah (13-15%). Konsentrasi omega-3 (n-3) PUFA S. binderi (20%) dan S. duplicatum (12%). Tetapi  omega-6 (n-6) PUFA S. binderi (17%) lebih rendah dari S. duplicatum (21%).  PUFA/ SFA S. binderi (1.2%) hampir sama dengan S. duplicatum (1.1%). Rasio  PUFA/SFA 1:1 sampai 1:2.  merupakan suatu perbandingan yang baik  karena banyak asosiasi gizi merekomendasikan rasio 1:1. PUFA, terutama n-3 dan  n-6 PUFA, yang dikenal sebagai asam lemak esensial dan memberikan pengaruh pada penyembuhan dan pencegahan penyakit kardiovaskular, perkembangan saraf bayi, kanker  dan mengontrol glikemik lemak
(Corner, 1997). S. duplicatum dan S. binderi mengandung komponen lemak fungsional seperti fukosantin,  masing-masing sebesar 0,73±0,39 1,01±0,10 (mg/g berat kering) (Noviendri, 2011). Produk rumput laut adalah sumber penting akan omega 3 dan 6 yang merupakan komponen utama pembentukan lipid struktural penting dan elemen membran sel (Dawczyski et al .,  2007;
Sánchez-Machado et al ., 2004).  Rasio sebesar 1 untuk  n6:n3   bermanfaat untuk kesehatan. Jumlah  n-6 PUFA yang tinggi dan sangat tingginya rasio n6:n3  mengakibatkan patogenesis banyak penyakit kardiovaskular, kanker,  peradangan, dan penyakit  autoimun (Simopoulus, 2002).  Konsumsi makanan kaya n-3 PUFA memberikan pengaruh yang positif pada komposisi lemak darah  karena dapat mencegah aterosklerosis (Murata et al ., 2002).
Spesies makroalga laut umumnya mengandung zat gizi yang penting yaitu
C18 dan C20 PUFA termasuk juga n-3 PUFA yang penting sebagai antiarrhythmic , anti  peradangan,  dan  anti  trombotik (Kumari et al ., 2013; Gillies et al ., 2011).
Mohammed et al . (2004) melaporkan bahwa asam oleat memiliki pengaruh melawan komplikasi kardivaskular dan diabetes  karena dapat mengontrol kadar glutation (GSH), total lipid, triasilgliserol (TAG) dapat terkontrol. Asam lemak dapat melindungi jaringan dari risiko trombosis (Alturfan et al .,  2002). Alga laut juga kaya akan sumber PUFA dan asam lemak ini yang berfungsi menghalangi pertumbuhan penyebaran sistemik kanker payudara (Deveri et al ., 2001).
Gambar 13 Spektrum massa senyawa murni  (FEaSar) S. crassifolium
Isolasi asam lemak dan kadar pigmen rumput laut cokelat, Sanger et al.

## Kadar Pigmen
Hasil analisis kadar pigmen ekstrak metanol, fraksi heksana dan etil asetat dapat dilihat pada Tabel 5. Ekstrak metanol mempunyai kadar fukosantin dan karotenoid tertinggi, masing masing 37,74±2,407 dan 54,493±3,0921 µg/g.   El-Din & El-Ahwany 2016 menyatakan bahwa karotenoid Pyropia yezoensis sebesar 1,44±0,03 mg/g . Karotenoid berperan penting  sebagai photo-protection dari kerusakan ROS di bawah energi cahaya yang kuat. Karotenoid mempunyai berbagai manfaat untuk kesehatan manusia, misalnya sumber β-karoten, α-karoten, dan β-cryptosantin. Lutein dan  zeasantin menurunkan risiko  penuaan  dini  degenerasi  otot (Koizumi et al .,  2018). Senyawa-senyawa yang mempunyai daya reduksi mengindikasikan fungsi donor elektron dan dapat mereduksi intermediat teroksidasi dari proses peroksidasi lipida. Senyawa tersebut dapat berfungsi sebagai antioksidan primer dan antioksidan sekunder.
Fukosantin adalah salah satu karotenoid yang melimpah pada rumput laut cokelat misalnya   wakame ( Undaria pinnatifida ) dan kombu ( Laminaria japonica ). Fukosantinol merupakan bentuk aktif   fukosantin dan mempunyai aktivitas penghambatan yang kuat terhadap lini sel kanker manusia yaitu sel kanker kantong kemih dan kanker serviks (HeLa). Fukosantin memperbaiki efikasi kemoterapi  dengan memperkuat induksi apoptosis (Ecorlano et al ., 2019). S. olygocystum mempunyai kandungan fukosantin dan fenol masing-masing 1,84±0,28 dan 4,97±1,21 (mg g −1 dw) dengan aktivitas antikanker melawan adriamycin-resistant  carcinoma sel kanker paru manusia  dengan ekstrak etanol dan ekstrak lipolitik masing-masing sebesar (GLC4/Adr) 92,06±0,83d 31,14±0,83 μg mL −1
(Praiboon et al. , 2017). Ekstrak heksana, etil asetat, kloroform dan etil asetat S. polycystum mengandung metabolik sekunder  steroid, tanin, alkaloid, triterpenoid, glikosida, dan menunjukkan sitotoksisitas melawan sel kanker kolon HCT, paru A549   dengan nilai IC 50 21,3–33,4 µg/mL  (Arsianti et al. , 2019).

## Aktivitas Antioksidan DPPH
Aktivitas  antioksidan DPPH ekstrak metanol, fraksi heksana dan etil asetat masing- masing  IC 50 4,587±0,386; 2,657±0,338 dan 5,246±0,423 mg mL -1 (Tabel 5). Aktivitas DPPH S. angustifolium 0,23  mg/L,
S. oligocystum 0,61 mg/L dan S. boveanum
0,49 mg/L (Mehdinezhad et al., 2016).
Aktivitas antioksidan rumput laut cokelat disebabkan oleh senyawa polifenol terutama florotanin serta mempunyai aktivitas biologi melawan kanker. Florotanin adalah kelompok senyawa fenolik yang dibentuk oleh polimerasi unit monomer floroglusinol (1,3,5 trihidroksibenzena) dan disintensis dalam jalur asetat malonat dalam makroalga (Arnold & Target, 2000).   Koivikko et al .
(2005) membagi florotanin ke dalam tiga bagian,florotanin terlarut dari matriks alga atau florotanin sitoplasma; florotanin yang berikatan dengan dinding sel; dan  florotanin yang melekat pada membran dinding sel dan dapat terlepas dan terbawa oleh air laut. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa  kadar    total  fenol  sangat  bervariasi. S. mangarevense dari  Tahit  ~2,85%  dw (Zubia et al ., 2008), S. vulgare (0,56– 3,61% dw) dari Brazil (Plouguerné et al. ,  2012) S. muticum (1,15 mg g −1 dw) dari  Denmark (Farvin & Jacobsen, 2013).  Kadar total fenol bervariasi tergantung pada musim, habitat, geografi dan talus yang ada di dalam rumput laut (Plouguerné et al ., 2012; Tanniou et al ., 2014).
Tabel 5 Kadar fuko-xantin dan karotenoid  serta aktivitas antioksidan (DPPH) S. crassifolium Sampel Fuko-xantin (µg g -1 ) Karotenoid (µg g -1 ) Aktivitas antioksidan (DPPH) mg/mL Ekstrak Metanol 37,74±2,407 54,49±3,092 4,587±0,386 Fraksi heksana 33,04±3,348 18,37±1,695 2,657±0,338 Fraksi etil asetat 14,65±1,002 43,23±3,254 5,246 ±0,423 BHT - - 0,672±0,0572
Ekstrak etil asetat S. polycystum mengandung total  fenol sebesar 548,61 µg/ mL, diikuti oleh ekstrak  etanol  sebesar
123,21 µg/mL. Sedangkan kadar  flavonoid sebesar 14,456 µg/mL pada ekstrak etanol dan etil asetat sebesar 40,06 µg/mL. Ekstrak etil S. polycystum dan etanol masing-masing mempunyai aktivitas DPPH  IC 50 298,32 dan 624,76 µg/mL Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat mempunyai hubungan dengan kandungan fenolik dan flavonoid. Ekstrak S. polycystum menunjukkan aktivitas antikanker serviks yang kuat dengan kisaran IC 50 38,3–112,8 µg/ mL (Arsianti et al ., 2020). Sifat antioksidan fenol adalah kemampuannya bekerja sebagai senyawa pereduksi, donor hidrogen, dan peredam radikal bebas (Devi et al ., 2008).  Fenolik juga dapat berperan sebagai pengkelat logam. Terdapat beberapa jenis hidrofilik polifenol misalnya epigallo katekin,  epikatekin galat dan florotanin (Boonchum et al. , 2011). Aktivitas antioksidan daya reduksi S. swartzii dan Cystoseira myrica pada fraksi metanol yaitu 73,92±12,36 dan 50,95±4,33 mmol
FeII/100 g ekstrak kering pada konsentrasi 10 ppm mempunyai aktivitas yang paling tinggi dibandingkan dengan fraksi heksan, etil asetat dan kloroform, yang sejalan dengan kadar total fenol tertinggi yaitu sebesar 12,00±0,55 dan 10,08±1,13 (g asam galat/100 g ekstrak) (Sadati et al. , 2011).  Kandungan total fenol Sargassum polycystum yaitu 8.287,18 mg GAE/g. Aktivitas antioksidan DPPH dengan nilai IC 50 1,9-9,6 3,4 mg/L, FRAP  105,357 µmol troloks/g dan CUPRAC (Cu reduction antioxidant capasity ) 201 µmol troloks/g ekstrak (Diachanty et al ., 2017). Beberapa rumput laut cokelat seperti S. kjelmanianum , S. siliquastrum ,  dan
S. microcantum mempunyai  kemampuan dalam menghambat peroksidasi  dengan mendonorkan protonnya sehingga mempercepat proses terminasi radikal bebas  (Wei et al. , 2003; Firdauz et al ., 2012, Raghavendran et al. , 2005).  Heo et al. (2005) melaporkan  bahwa ekstrak rumput laut cokelat dapat mencegah kerusakan LDL, DNA, dan peroksidasi lemak pada sel hati.
Aktivitas antioksidan S. crassifolium dianalisis secara kualitatif dapat dilihat pada Gambar 2 dan 3.  Isolat senyawa di KLT kemudian disemprot dengan 0,05%. DPPH yang terbentuk berwarna kuning, hal ini menunjukkan bahwa isolat asam lemak S. crassifolium terdapat senyawa antioksidan. Asam oleat, ester oleat dan metil oleat yang diisolasi dari Millettia utilis Dunn menunjukkan aktivitas antioksidant antioxidant  DPPH sebesar  IC 50 >50  dan ABTS sebesar  IC 50 39,50±1,57 µg/mL. Asam palmitat menunjukkan aktivitas yang tinggi melawan sel  kanker payudara  (MCF-7), kanker hati  (WRL-68),   dan kanker kolon (Caco-2),   dengan aktivitas masing-masing
IC 50 0,55; 1,0; 0,75 dan 0,35 µg/mL (Sasena e t al. , 2007).  Asam oleat   aktif  melalui 5α reduktase dengan nilai  IC 50 54,50±3,0 µg/ mL (Abe et al ., 2009). Turunan rantai cabang (metil, n-butil, fenil) dari  metil oleat  diuji  in- vitro untuk aktifitas  antiproliferatif melawan dua jenis lini sel  MCF-7 (payudara manusia) dan HT-29 (kolon manusia). Turunan rantai cabang  fenil turunan asam oleat menunjukkan aktivitas dengan nilai    IC 50 48 ppm melawan baik  MCF-7 dan HT-29 (Dailey et al .,  2011). Rumput laut cokelat mengandung pigmen β-karoten,  violansantin dan fukosantin Alga cokelat juga mengandung berbagai jenis sterol, fukosterol dan kolesterol. Kolesterol banyak terdapat pada rumput laut cokelat.  Senyawa-senyawa ini mempunyai aktivitas  melawan  berbagai  jenis  kanker (Majunder et al. , 2015).  Beberapa  peneliti melaporkan bahwa asam lemak alga laut yang mempunyai kemampuan mengkelat ion bersifat sebagai antikanker. Asam lemak sebagai molekul bioaktif yang mempunyai tingkat sitotoksik yang berbeda terhadap sel kanker (Kim et al ., 2006). Kriteria pengkelat logam berat adalah  dapat memasuki sel dengan mudah, dengan cara mengkelat logam dari kompleksnya dengan metalotionin atau protein lain dan meningkatkan ekskresi logam tanpa redistribusi pada organ atau jaringan lain. Jika antioksidan memiliki kriteria- kriteria ini maka senyawa pengkelat logam yang digunakan untuk terapi tidak akan ada efek samping (Swaran, 2009).
Isolasi asam lemak dan kadar pigmen rumput laut cokelat, Sanger et al.

## KESIMPULAN
Isolasi senyawa asam lemak fraksi etil asetat S. crassifolium tergolong ester oleat dengan rumus molekul (E)-11-octyloxacyclododec- 10-en-2-one . S. crassifolium mengandung fukosantin  dan karotenoid yang tinggi. Ekstrak metanol, fraksi heksana dan fraksi etil asetat S. crassifolium mempunyai aktivitas antioksidan.  Sebab itu perlu dilakukan penelitian di masa depan pada isolat murni fraksi heksana dan mengetahui aktivitas biologi dari isolat murni S. crassifolium , agar dapat dimanfaatkan sebagai produk kesehatan.
UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih kami ucapkan kepada Kemristek Dikti melalui Dana DRPM dan LPPM Unsrat yang telah membiayai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Abe, M., Ito, Y., Suzuki, A., Onoue, S., Noguchi,
H., & Yamada, S. (2009). Isolation and pharmacological characterization of fatty acids from saw palmetto extract. Analytical Sciences , 25, 553-557. doi: 10.2116/analsci.25.553 Arnold, T. M., & Target, N. M. (2000). Evidence formetabolic turnover of polyphenolics in tropicalbrown algae. Journal of Chemical Ecology , 26, 1393- 1408. DOI:10.1023/A:1005588023887 Arsianti, A.. Bahtiar, A., Wangsaputra, V. K. , Azizah, N. N.,  Fachri, W.,  Nadap, L. D., Fajrin, A. M., Tanimoto, H., & Kakiuchi, K. (2020). Phytochemical Composition and Evaluation of Marine Alga Sargassum polycystum for Antioxidant Activity and In Vitro Cytotoxicity on Hela Cells. Pharmacognosy Journal , 12(1),  88-94. DOI:10.5530/pj.2020.12.14 Arsianti, A., Fadilah, F., Bahtiar, A., Dewi, M. K., Adyasa, Z. M., Simadibrata, D. M., & Amartya, D. (2019).  Phytochemistry profile and in vitro cytotoxicity of seaweed macroalgae Sargassum polycystum against colon HCT-116 and lung A-549 cancer cells. International Journal of Green Pharmacy , 13 (2), 141-146. DOI: https:// doi.org/10.22377/ijgp.v13i2.2495 Athukorala, Y., Kim, K.N, &  Jeon, Y. J. (2006).  Antiproliferative and antioxidant properties of an enzymatic hydrolysate from brown alga, Ecklonia cava. Food and Chemical Toxicology ,  44(7), 1065–1074. https://doi.org/10.1016/j.fct.2006.01.011 Bakar, K., Mohamad, H., Latip, J., Tan, H. S.,  & Herng, G. M. (2017). Fatty acids compositions Of Sargassum granuliferum and Dictyota dichotoma and their anti- fouling activities. Journal of Sustainability Science and Management ,  12 (2), 8-16. Balboa, E. M., Gallego-Fábrega, C., Moure, A., & Domínguez, H. (2016). Study of the seasonal variation on proximate composition of oven-dried Sargassum miticum biomass collected in Vigo Ria,
Spain. Journal  Applied Phycology ,  28, 1943–1953. DOI:10.1007/s10811-015-
0727-x Boonchum, W. Y., Peerapornpisal, P., Vacharapiyasophon, J., Pekkoh, C., Pumas, U., Jamjai, D., Amornlerdpison, T., Noiraksar, T., & Kanjanapothi, D. (2011) Antioxidant activity of some seaweed from the Gulf of Thailand. International Journal Agriculture Biology , 13, 95-99. Chen, D., Liu, Y., Ma, G., Zhu, N., Wu, H., Wang, D.,  & Xu, X. (2015). Two new rotenoids from the roots of Millettia speciosa. Phytochemistry Letters , 12, 196-199. https://doi.org/10.1016/j. phytol.2015.04.003
Conde, E., Moure, A., & Domínguez, H.
(2015). Supercritical CO 2 extraction of fatty acids, phenolics and fucoxanthin from freeze-dried Sargassum muticum. Journal Applied Phycology , 27, 957–964. DOI:10.1007/s10811-014-0389-0 Corner, W. E. (1997). The beneficial effects of omega-3 fatty acids:cardiovascular disease and neurodevelopment. Curr. Opin. Lipidol , 8, 1-3. doi: 10.1097/00041433- 199702000-00001. Costa, L. S., Fidelis, G. P., Cordeiro, S. L., Oliveira, R. M., Sabry, D. A., Câmara, R. B. G., Nobre, L. T. D. B., Costa, M. S. S. P., Almeida-Lima, J., Parias, E. H. C., Leite, E. L., & Rocha, H. A. O. (2010). Biological activities of sulfated polysaccharide from tropical seaweed. Bibmedicine Pharmacology , 64, 21–28. doi: 10.1016/j.
biopha.2009.03.005 Dailey, O. D., Wang, X., Chen, F., & Huang, G. (2011). Anticancer activity of branched- chain derivatives of oleic acid. A nticancer Research , 31(10), 3165-3170 Dar, A., Baig, H. S., Saifullah, S. M., Ahmad, V. U., Yasmeen, S., & Nizamuddin, M. (2007).   Effect of seasonal variation on the anti-inflammatory activity of Sargassum
wightii growing on the  N. Arabian Sea coast of  Pakistan. Journal  Experiment Marine Biology Ecology, 351, 1–9. https:// doi.org/10.1016/j.jembe.2007.03.019 Dawczynski, C., Schubert, R., & Jahreis, G. (2007). Amino acids, fatty acids, and dietary fibre in edible seaweed products. Food Chemistry , 103, 891-899. https://doi. org/10.1016/j.foodchem.2006.09.041 Devery, R., Miller, A.,  & Stanton, C. (2001). Conjugated linoleic acid and oxidative behavior in cancer cells. Biochemistry Society Transaction , 29, 341-344. DOI:10.1042/BST0290341 Devi, K. P., Suganthy, N., Kesika, P., & Pandian, S. K. (2008).  Bioprotective properties of seaweeds: In vitro evaluation of antioxidant activity and antimicrobial activity against food borne bacteria in relation to polyphenolic content. BMC Complementery and Alternative Medicine , 8(3), 882-888. doi: 10.1186/1472-6882-8- 38 Diachanty, S., Nurjanah, & Abdullah, A. (2017). Aktivitas Antioksidan Berbagai Jenis Rumput Laut Coklat Dari Perairan Kepulauan Seribu. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia ,  20(2),  305- 318. DOI: http://dx.doi.org/10.17844/ jphpi.v20i2.18013 Dolorosa, M. T., Nurjanah, Purwaningsih, S., Anwar, E., & Hidayat, T. (2017). Kandungan senyawa bioaktif bubur rumput laut Sargassum plagyophyllum dan Eucheuma cottonii sebagai bahan baku krim pencerah kulit. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia , 20(3), 633- 644. DOI:10.17844/jphpi.v20i3.19820 El-Din, S.M.M., & El-Ahwany, A. M. D. (2016). Bioactivity and phytochemical constituents of marine red seaweeds ( Jania rubens , Corallina mediterranea and
Pterocladia capillacea. Journal of Taibah University for Science , 10(2016), 471–484. DOI:10.1016/j.jtusci.2015.06.004 Ercolano, G., De, Cicco, P., & Ianaro, A. (2019). New Drugs from the Sea: ProApoptotic Activity of Sponges and Algae Derived Compounds. Marine Drug , 17(31), 1–31. doi: 10.3390/md17010031. Farvin, K. H. S., & Jacobsen, C. (2013). Phenolic compounds and antioxidant activities of selected species of seaweeds from Danish coast. Food Chemistry , 138, 1670–1681. DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.10.078 Firdaus, M., Astawan, M., Muchtadi, D., Wresdiyati, T., Waspadji, S., & Karyono, S. S. (2012). Toksisitas akut ekstrak metanol rumput laut cokelat Sargassum echinocarpum. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia , 15(2), 148- 155. https://doi.org/10.17844/jphpi. v15i2.6249 Foon, T. S., Ai, L. A., Kuppusamy, P., Yusoff, M. M., & Govindan, N. (2013). Studies on in- vitro antioxidant activity of marine edible seaweeds from the east coastal region of peninsular malaysia using different extract methods. Journal of Coastal Life Medicine , 1(3), 193-198. DOI:10.12980/ JCLM.1.2013C1189 Freitas, J. C., Sakamoto, M. L., & Caprara, L. (1995). Cardiac effects induced  of seaweed Bryopsis  pennata (Chlorophyta, caulerpales). Toxicon , 33(3),  301. Heo, S. J., Park, E. J., Lee, K. W., & Jeon, Y. J. (2005). Antioxidant activities of enzymatic extracts from brown seaweeds. Bioresource Technology , 96, 1613–1623. DOI: 10.1016/j.biortech.2004.07.013 Knothe, G.  (2005). The chemistry of oils and fats. Journal of the Science of Food and Agriculture , 85(13), 2325-2325. https:// doi.org/10.1002/jsfa.2337 Ganapathi, K., Subramanian, V., & Mathan, S. (2013). Bioactive potentials of brown seaweeds, Sargassum myriocystum , S.plagiophyllum and S. ilicifolium (Turner) J. Agardh. International Research Journal of Pharmaceutical and Applied Sciences , 3(5), 105-111. DOI:10.22270/jddt. v9i1.2199
Gillies, P. J., Harris, W. S., & Kris-Etherton,
Isolasi asam lemak dan kadar pigmen rumput laut cokelat, Sanger et al.
P. M.  (2011).  Omega-3-fatty acid in food and   pharma: the enabling role of biotechnology. Current  Atherosclerosis Rep. , 13, 467-473. DOI:10.1007/s11883- 011-0206-z Hosokawa, M., Kudo, M., Maeda, H., Kohno, H., Tanaka, T., & Miyashita, K. (2004). Fucoxanthin induces apoptosis and enhances the antiproliferative effect of the PPARγ ligand, troglitazone, on colon cancer cells. Biochemistry  Biophysic Acta , 1675, 113–119. DOI:10.1016/j. bbagen.2004.08.012 Jeeva, S., Marimuthu, J., Domettila, C., Anantham, & Mahesh, M. (2012). Preliminary phytochemical studies on some selected seaweeds from gulf of Mannar, India. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine , S30-S33. https:// doi.org/10.1016/S2221-1691(12)60125-7 Joung, E. J., Gwon, W. G., Shin, T., Jung, B. M., Choi, J., & Kim, H. R. (2017). Antiinflammatory action of the ethanolic extract from Sargassum serratifolium on lipopolysaccharide-stimulated mouse peritoneal macrophages and identification of active components. J Applied  Phycology , 29, 563–573. DOI:10.1007/s10811-016-0954-9 Kementerian Kelautan dan Perikanan. (2017). KKP sasar rumput laut sebagai komoditas unggulan budidaya. http:// www.kkp. go.id. Kim, K., Lee, K. W., Song, C. B., Ahn, C. B., & Jeon, Y. J. (2006). Cytotoxic activities of red algae collected from Jeju Island Against four  tumor cell lines. Journal food Science and Nutrition , 11, 3. DOI:10.3746/ jfn.2006.11.3.177 Kim, M. S.,  Kim, J. Y. W., Choi, H., & Lee, S. S.  (2008). Effects of seaweed supplementation on blood glucose concentration, lipid profile, and antioxidant enzyme activities in patients with type 2 diabetes mellitus. Nutrition Research  Practice ,  Summer 2(2), 62–67. DOI:10.4162/nrp.2008.2.2.62 Kohno, H., Suzuki, R., Yasui, Y., Hosokawa, M., Miyashita, K., & Tanaka, T. (2004). Pomegranate seed oil rich in conjugated linolenic acid suppresses chemically
induced colon carcinogenesis in rats. Cancer Science , 95, 481-486. DOI:10.1111/j.1349-7006.2004.tb03236.x Koizumi, B. J., Takatani, N. T.,  Kobayashi, N., Mikami, K., Miyashita, K., Yamano, Y.,  Wada, A., Maoka, T., &  Hosokawa, M. (2018). Carotenoid Profiling of a Red Seaweed Pyropia yezoensis : Insights into Biosynthetic Pathways in the Order
Mar Drugs , 16(11), 426. doi: 10.3390/ md16110426. Koivikko R. 2008. Brown algal phlorotannins: improving and applying chemical methods. University of Turku. doi:
10.3390/md16110426.
Kok, J. M. L., Jee, J. M., Chew, L.Y, & Wong, C. L. (2016).  The potential of the brown seaweed Sargassum polycystum against acne vulgaris. Journal  Applied  Phycology , 28, 3127–3133. DOI:10.1007/s10811- 016-0825-4 Kumari, P., Bijo, A. J.,  Mantri, V. A., Reddy, C. R. K., & Jha, B. (2013).  Fatty acid profiling of tropical marine macroalgae: An analysis from chemotaxonomic and nutritional perspectives. Phytochemistry, 86,44-56. DOI: 10.1016/j.phytochem.2012.10.015
Maeda, H., Hosokawa, M., Sashima, T.,
Funayama, K., & Miyashita, K. (2005). Fucoxanthin from edible seaweed,
Undaria pinnatifida , shows antiobesity effect through UCP1 expression in white adipose tissues. Biochemistry Biophysich  Research Communication , 332, 392–397.  https://doi.org/10.1016/j. bbrc.2005.05.002 Maeda, H., Hosokawa, M., Sashima, T., & Miyashita, K. (2007).  Dietary combination of fucoxanthin and fish oil attenuates the weight gain of white adipose tissue and decreases blood glucose in obese/diabetic KK-Ay mice. Journal Agriculture Food Chemistry , 55, 7701–7706. DOI:10.1021/ jf071569n Majumder, I., Chatterjee, S.,  & Kundu, R. (2015). A study on anti-proliferative property of some green algae on human cervical cancer cells (SiHa) in vitro. J. Algal
Biomass Util. ,  6, 21–25. at: https://www. researchgate.net/publication/282317683 Matanjun, P., Mohamed, S., Mustapha, N.
M., & Muhammad, K. (2009). Nutrient content of tropical edible seaweeds, Eucheuma cottonii , Caulerpa lentillifera
and Sargassum polycystum. J Applied Phycology , 21, 75–80. DOI:10.1007/ s10811-008-9326-4 Mehdinezhad, N., Ghannadi, A., & Yegdaneh, A. (2016). Phytochemical and biological evaluation of some Sargassum species from Persian Gulf. Research in Pharmaceutical Sciences , 11(3), 243-249. Miyashita, K. (2006). Seaweed carotenoid, Fucoxanthin, with highly bioactive and nutritional activities. Journal  Marine Bioscience Biotechnology , 1,48–58 Moghadamtousi, S. Z., Karimian, H., Khanabdali, R., Razavi, M.,  Firoozinia, M.,  Zandi, K., & Kadi, H. A. (2014). Anticancer and antitumor potential of fucoidan and fucoxanthin, two main metabolites isolated from Brown Algae. Hindawi Publishing Corporation Scientific World Journal 768323, 10. http://dx.doi. org/10.1155/2014/768323  . Mohammed, A., Lai, O. M., Muhammad, S. K. S., Long, K., & Ghazali, H. M. (2003). Moringa oleifera potentially a new source of oleic acid-type oil for Malaysia. in: Hassan M.A., Editor. Investing in Innovation: Bioscience and Biotechnology. Selangor: Universiti Putra Malaysia Press, Serdang Press. Mona, Y., Tannourya, M. Y., Eliaa, J. M., Saabc, A. M., Hassane, Y., Makhloufb, H. Y., Jihad, S., Abboudd, J. S., Daou, & Chab, R. J. (2016).  Evaluation of cytotoxic activity of Sargassum vulgare From the Lebanese Coast Against Jurkat Cancer Cell Line. Journal of Applied Pharmaceutical Science , 6(06), 108-112, DOI:10.7324/ JAPS.2016.60619 Murata, M., Sano, Y., Ishihara, K., & Uchida, M. (2002). Dietary fish oil and Undaria pinnatifida (Wakame) synergistically decrease rat serum and liver triacylglycerol. Journal Nutrition , 132, 742-747. DOI:10.1093/jn/132.4.742 Murphy, C., Hotchkiss, S., Worthington, J., & McKeown, S. R. (2014). The potential of seaweed as a source of drugs for use in cancer chemotherapy. Journal  Applied
Phycology , 26, 2211–2264. DOI:10.1007/ s10811-014-0245-2 Nomura, T., Kikuchi, M., Kubodera, A., & Kawakami, Y. (2008).  Protondonative antioxidant activity of fucoxanthin with 1,1-diphenyl-2- pycrylhydrazyl (DPPH). Biochemical Molecul  Biology. International ,  42(2), 361-370.  https:// doi.org/10.1080/15216549700202761 Nomura, M., Kamogawa, H., Susanto, E., Kawagoe, C., Yasui, H., Saga, N., Hosokawa, M., & Miyashita, K. (2013). Seasonal variation of total lipids, fatty acid composition, and fucoxanthin contents of Sargassum horneri (Turner) and Cystoseira hakodatensis (Yendo) from the northern seashore of Japan. Journal Applied Phycology , 25, 1159–1169. DOI:10.1007/s10811-012-9934-x Noviendri, D., Jaswir, I., Salleh, H. M., Taher, M., Miyashita, K. & Ramli, N. (2011). Fucoxanthin extraction and fatty acid analysis of Sargassum binderi and S. duplicatum. Journal of Medicinal Plants Research , 5(11), 2405-2412. Nurjanah, Nurilmala, M., Anwar, E., Luthfiyana, N., Hidayat, T. (2017). Identification of bioactive compounds of seaweed Sargassum sp and E.cotonii as raw material suncreen cream. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences , 54(4), 311-318. Nurjanah, Nurilmala, M., Anwar, E., Luthfiyana, N., Hidayat, T. (2019). Utilization of seaweed porridge Sargassum sp. and Eucheuma cottonii as cosmetic in protecting skin. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science , 278(2019) 012055IOP. DOI:10.1088/1755-1315/278/1/012055 Pádua, D., Rocha, E., Gargiulo, D., & Ramos, A. A. (2015). Bioactive compounds from brown seaweeds: phloroglucinol, fucoxanthin and fucoidan as promising therapeutic agents against breast cancer. Phytochemistry Letter , 14, 91–98. DOI:10.1016/j.phytol.2015.09.007 Plouguerné, E., Cesconetto, C., Cruz, C. P., Pereira, R. C., & da Gama, B. A. P. (2012). Within-thallus variation in polyphenolic content and antifouling activity in
Isolasi asam lemak dan kadar pigmen rumput laut cokelat, Sanger et al.
Sargassum vulgare. Journal Applied Phycology , 24, 1629–1635. DOI:10.1007/ s10811-012-9826-0 Prabhakar, V., Anandan, R., Aneesh, T. P., Jayasree, N. B., Nair, S. V., & Halima, O. A. (2011). Fatty acid composition of Sargassum wightii and Amphiroa anceps collected from the Mandapam coast Tamil Nadu, India. Journal Chemistry Pharmacology Research , 3(1), 210-216. Praiboon, J., Palakas, S., Noiraksa, T., & Miyashita, K. (2018). Seasonal variation in nutritional composition and anti- proliferative activity of brown seaweed, Sargassum oligocystum. Jounal  Applied Phycology , 30,  101–11. DOI:10.1007/ s10811-017-1248-6 Raghavendran, H. R. B., Sathivel, A., & Devaki, T. (2005). Protective eff ect of Sargassum polycystum (brown alga) against acetaminopheninduced lipid peroxidation in rats. Phytotherapy Research , 19, 113-115.  doi: 10.1002/ ptr.1552. Sadati, N., Khanavi, M.,  Mahrokh, A., Nabavi, S. M. B., Sohrabipour, J., & Hadjiakhoondi, A. (2011). Comparison of antioxidant activity and total phenolic contents of some Persian Gulf marine algae. Journal Medicine Plants , 10(37), 73-79. Sánchez, M. D. I., López, C. J., López, H. J., & Paseiro, L. P. (2004). Fatty acids, total lipid, protein and ash contents of processed edible seaweeds. Food Chemistry , 85, 439-444. DOI:10.1016/j. foodchem.2003.08.001 Sanger, G., Rarung, L. K., Kaseger, B. E., Assa, J. R., & Agustin, A. T.  (2019). Phenolic content and antioxidant activities of five seaweeds from North Sulawesi, Indonesia. AACL Bioflux , 12(6), 2041–2050. Sasena, M., Faridi, U., Srivastava, S., Darokar, M., Mishra, R., Pal, A., & Khanuja, S. (2007). A cytotoxic and hepatoprotective agent from Withania somnifera and biological evaluation of its ester derivatives. Natural Product Communications , 2(7), 775-778. DOI:10.1177/1934578X0700200714 Sidauruk, S. W., Sar, N. I., Diharmi, A., & Arif, I.  (2013). Aktivitas antibakteri ekstrak Sargassum plagyophyllum
terhadap bakteri Listeria monocytogenes dan Pseudomonas aeruginosa. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia , 24(1), 27-37.  DOI:10.17844/jphpi. v24i1.33417 Simopoulus, A. P. (2002). The importance of the ratio of omega-6/omega3 essential fatty acids. Biomed. Pharmacother , 56, 365-379.  DOI:10.1016/S0753- 3322(02)00253-6 Socrates, G. (1994). Infrared Characteristik Group Frequency, Table and Charge, 2’nd edition. John Whisley & Sons. Stengel, D. B., Connan, S., & Popper, Z. A. (2011). Alga chemodiversity and bioactivity: Sources of natural variability and implications for commercial application. Biotechnology Advance , 29, 483-501. DOI:10.1016/j. biotechadv.2011.05.016 Supratman, U. (2010). Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Metoda Spektroskopi untuk Penentuan Struktur Senyawa Organik. Widya Padjadjaran. 404 hal. http://kin.perpusnas.go.id/DisplayData.

## FIGURE AND TABLE TITLES
Figure 1 The process of extraction and isolation of pure compounds of ethyl acetate fraction of S. crassifolium Figure 2 Analysis on column chromatography (F1-F8); Stationary phase: silica G 60 F254 , n-hexane motion phase:EtOA (9:1) observed under UV lamps 254 and 365 nm after spraying with H 2 SO 4 (in
10% methanol) and DPPH (in 0.05% methanol) Figure 3 TLC analysis on column chromatography (F1-F8); Stationary phase: silica G 60 F254 S , n-hexane motion phase:EtOA (9:1) observed under UV lamps 254 and 365 nm after spraying with H 2 SO 4 (in 10% methanol) and DPPH (in 0.05% methanol)
Figure 4 TLC analysis on column chromatography (F1-F8); Stationary phase: Silica G G 60
F254S, motion phase: n-hexane- EtOAc (9:1) observed under UV lamps 254 and 365 nm, after spraying with H 2 SO 4 (in 10%
methanol)
Figure 5  Pure compound infrared spectrum (FEaSar) Figure 6 Spectrum of 13 C-NMR pure compounds (125 MHz in methanol-D4) Figure 7 Spectrum of 13C-NMR pure compound compounds (125
MHz in methanol-D4)
Figure 8 Spectrum 1 H-NMR pure compound (FEaSar)) (500 MHz in methanol-D4) Figure 9 Fragments of pure compounds (FEaSar) Figure 10 Suspected pure compound (FEaSar) Figure 11 Methyl oleic structure Figure 12 Structure of S. crassifolium pure compound (FEaSar) Figure 13 Mass spectrum of S. crassifolium pure compounds (FEaSar) Table 1 Column  partitioning  of S. crassifolium seaweed methanol extract using various solvents Table 2 Interpretation of the infrared spectrum of pure compounds (FEaSar) Table 3 Chemical shift data of 1 H-, 13 C- and 2D-NMR compounds (FEaSar) Table 4 Data on 1 H- and 13 C-NMR compounds 1 (FEaSar) and methyl oleate Table 5 Fucoxanthin, carotenoid levels, and antioxidant activity (DPPH) of S. crassifolium