## EKSPLORASI GEN ENZIM LIPASE PADA TANAH PENGOLAHAN LIMBAH KELAPA SAWIT DENGAN PENDEKATAN METAGENOMIK
Sri Sumarsih * , A ndre Pratama, Afaf Baktir
Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya
* email: sri-sumarsih@fst.unait.ac.id, srimarish@yahoo.com
Received 20 Pebuari 2017 Accepted 20 April 2017

## Abstrak
Enzim lipase merupakan bagian dari enzim hidrolase yang bekerja pada ikatan ester. Enzim ini  juga  mengkatalisis  beberapa  jenis  reaksi  sehingga  merupakan  enzim  yang  potensial diaplikasikan ke berbagai bidang seperti industri tekstil, kulit, deterjen, makanan, dan lain- lain.  Salah  satu  cara  mendapatkan  enzim novel ialah  dengan  pendekatan  secara metagenomik dari sampel lingkungan tanpa melalui kultur di dalam laboratorium. Sampel lingkungan  yang  biasa  diteliti  ialah  memiliki  keadaan  ekstrem  atau  memiliki  sumber substrat enzim yang ingin dieksplorasi. Pada penelitian ini dilakukan eksplorasi gen enzim lipase  pada  tanah  hasil  pengolahan  limbah  kelapa  sawit  (POME)  melalui  pendekatan metagenomik  menggunakan  desain  primer degenerate untuk  gen  enzim  lipase  untuk golongan HSL. Didapatkan fragmen gen lipase yang memiliki ukuran 250-300 pasang basa dan  dilakukan  kloning  ke  dalam  plasmid  pET-30a(+)  dengan  sel  inang E.  coli TOP10 menghasilkan pustaka fragmen lipase limbah sawit (PFL2S) sebanyak 26 klon.
Kata kunci: Lipase, metagenomik, tanah, POME, primer degenerate

## Abstract
Lipase  is  a  hydrolase  enzymes  that  cleavage  on  the  ester  bond.  This  enzyme  is  catalyze several reactions so this is a potential enzyme that applied to various fields such as textile, leather,  detergents,  food,  and  others.  One  of  the  method  to  get  a  novel  enzyme  is metagenomic  approach  from  environmental  samples  without  culturing  in  the  laboratory. Environmental sample commonly studied is have an extreme environment or have a source of the enzyme substrate that researcher want explored. In this research, exploration lipase gene  on  the  soil  the  processing  of  palm  oil  mill  effluent  (POME)  through  metagenomic approach  using  design  of  degenerate  primers  for  lipase  gene  fragment  for  HSL  group. Obtained  lipase  gene  fragment  size  of  250-300  base  pairs  and  cloned  into  pET-30a(+) plasmid with the E. coli TOP10 as a host cells to produce libraries of lipase fragment gene of palm oil mill effluent (PFL2S) that have a 26 clones.
Keywords: Lipase, metagenomic, soil, POME, primer degenerate

## Pendahuluan
Industri  besar  dan  industri  rumahan yang  menggunakan  katalis  sekarang  ini sangat  bergantung  dengan  yang  namanya
enzim.  Karena  enzim  dapat  melakukan konversi  dalam  hitungan  menit  maupun detik  (Otten and Quax,  2005).  Selain  itu, enzim juga dapat mengkatalis reaksi yang
sulit  dilakukan  metode  kimiawi  seperti hidrolisis atau adisi enansioselektif maupun  ragioselektif  senyawa  kiral. Kondisi  reaksi  dari  enzim  pun  secara umum  bisa  dalam  temperatur  ruang  dan ada  enzim  yang  tahan  pada  suhu  yang ekstrem  serta  kebanyakan  bereaksi  dalam pelarut  air    sehingga  penelitian  dan permintaan  biokatalis  terus  berkembang pesat (Schoemaker, 2003).
Enzim  lipase  merupakan  bagian  dari enzim  hidrolase  yang  bekerja pada  ikatan ester. Lipase dapat menghidrolisis trigliserida
menjadi
digliserida, monogliserida,  asam  lemak,  dan  gliserol. Selain  menghidrolisis  ikatan  ester,  lipase juga dapat mengkatalisis reaksi esterifikasi, interesterifikasi, dan transesterifikasi  pada  media  tanpa  air (Momsia  and  Momsia,  2013).  Kegunaan enzim  lipase  ini  membuatnya  menjadi enzim  yang  potensial  untuk  diaplikasikan ke  berbagai  bidang.  Sehingga,  sangat menarik untuk menemukan dan memproduksi enzim lipase dengan aktivitas  tertentu  karena  banyak  sekali potensi dari enzim lipase untuk diaplikasikan pada berbagai bidang. Pendekatan secara metagenomik merupakan aplikasi dari genomik
molekular  untuk  konsorsium  mikroba yang  tidak  dapat  dikultur  dan  dapat dipergunakan untuk mencari enzim industri  yang  baru  karena  keragaman materi genetik yang dianalisis (JunGang et al., 2010; Kakirde et al., 2010; Lämmle et al., 2007; Lorenz and Eck, 2005; Steele et al.,
2009). Lebih dari 99%
mikroorganisme  tidak  dapat  dikultur (Handelsman et  al., 1998),  akibat  kondisi pertumbuhannya  yang  belum  diketahui atau pertumbuhannya memerlukan konsorsium  mikroba.  Berbagai  macam lipase  telah  diisolasi  melalui  pendekatan metagenomik  selama  beberapa  dekade (Glogauer et  al., 2011;  JunGang et  al.,
2010; Kakirde et al., 2010; Lämmle et al., 2007; Liaw et  al., 2010; Lorenz and Eck,
2005; Simon and Daniel, 2009; Uchiyama and  Miyazaki,  2009).  Salah  satu  sampel
lingkungan yang menarik untuk dianalisis enzim lipase dengan pendekatan metagenomik  ialah  sampel  tanah  dari limbah pengolahan kelapa sawit atau biasa disebut POME ( Palm Oil Mill Effluent ). Pada penelitian ini dilakukan eksplorasi gen  enzim  lipase  pada  tanah  hasil pengolahan  limbah  kelapa  sawit  (POME) melalui pendekatan metagenomik. Sampel diambil  dari  tanah  milik  PT.  Agro  Bukit Central  Kalimantan,  Sampit,  Kalimantan Tengah,  yang  merupakan  tempat  proses biologis  dari  limbah  pengolahan  kelapa sawit  yang  salah  satunya  mengandung minyak.  Metode  yang  digunakan  ialah metode ekstraksi DNA berbasis SDS (Hurt et al., 2001) termodifikasi, DNA metagenom  diekstraksi  secara  langsung dari  sampel  tanah  dengan  pengayaan mikroba  terlebih  dahulu  dalam  media Luria Bertani. Konstruksi pustaka metagenom dilakukan dengan cara kloning gen  hasil  PCR  menggunakan  vektor plasmid pET-30a(+) dan sel  inang E. coli TOP10.  Koleksi  klon  merupakan  pustaka fragmen  gen  lipase  dari  sumber  tanah limbah pengolahan kelapa sawit.

## Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Alat utama yang digunakan antara lain: autoklaf, laminar  air  flow , shaker incubator , sentrifuga, nano drop spectrophotometer, Thermocycler , perangkat  elektroforesis  DNA, Gel  Doc , pipet mikro berbagai ukuran, serta alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium mikrobiologi dan biokimia.
Bahan  penelitian  yang  digunakan meliputi: Escherichia  coli TOP10,  pET- 30a(+),2-merkaptoetanol, Tris-HCl, NaCl, cetyltrimethylammonium bromide
[CTAB],  NaH 2 PO 4 ,  Na 2 HPO 4 ,  EDTA, sodium  dodecyl  sulphate  (SDS),  nitrogen cair,  isopropanol,  polietilen  glikol  (PEG 6000), kloroform, isoamil alcohol,
GenElute tm Bacterial  Genomic  DNA  Kit (Sigma Aldrich). KAPA2G Fast ReadyMix with  Dye (Boston,  Massachusetts,  United States). QIAquick  PCR  purification  kit
(Qiagen), tripton, yeast extract, bacto agar, dan  minyak  zaitun,  gel  loading  buffer, marker  DNA,  agarosa,  etidium  bromida (EtBr),  asam  asetat  glasial,  glukosa, NaOH, CaCl 2 , natrium asetat, etanol 70%, dH 2 O, dan ddH 2 O.

## Prosedur Peneltian Pengambilan sampel dan ekstraksi DNA
Sampel  tanah  dari Palm  Oil  Mill Effluent diambil  dari  pabrik  pengolahan kelapa sawit milik PT. Agro Bukit Central Kalimantan yang terletak di jalan Sudirman  Km  106  Sampit,  Kalimantan Tengah (2°33'55.3"S, 112°46'03.5"E) pada  bulan  Januari  2016.  Ekstraksi  DNA metagenom  dilakukan  dengan  metode Hurt  et  al.  (2001)  termodifikasi.  sampel tanah  sebanyak  5  gr  juga  dilakukan pengayaan  terlebih  dahulu  menggunakan 100  ml  media  LB  (Luria  Bertani)  cair dengan  minyak  zaitun  1%  dan  shaker selama  semalam.  Sampel  dan  hasil pengayaan  ditambahkan  9  ml  buffer ekstraksi (100 mM natrium fosfat [pH 7,0], 100  mM  Tris-HCL  [pH  7,0],  100  mM EDTA  [pH  8,0],  1,5  M  NaCl,  1%  CTAB dan  2%  SDS)  dan  diinkubasi  selama  30 menit  pada  65°C  sambil  diaduk  tiap  10 menit  lalu  disentrifugasi  pada  1800  x  g selama  10  menit.  Supernatan  ekstraksi langsung  sampel  tanah  dituangkan  ke dalam  tabung  berpenangas  es  yang mengandung  20  ml  aliquot  dari  25:24:1 fenol-kloroform-isoamil alkohol.
Sedangkan supernatan ekstraksi dari hasil pengayaan dimurnikan dengan GenElute tm Bacterial Genomic DNA Kit .

## Desain primer fragmen gen lipase
Untuk  mendapatkan  gen  target  pada proses  amplifikasi  gen  dengan  PCR, dibutuhkan sepasang primer yang spesifik yaitu dengan cara dilakukan desain primer forward  dan  primer  reverse  (Shi  et  al., 2009).  Primer  degenerate  yang  di  desain untuk  amplifikasi  fragmen  gen  lipase berdasarkan  lipase  golongan  HSL  yang telah dipublikasikan pada NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/).
Daerah lestari asam amino yang potensial diidentifikasi  menggunakan  Clustal  W. Kemudian  di  awal  basa  dari  primer  yang didesain,  ditambahkan  beberapa  basa pijakan  dan  urutan  basa  dari  enzim restriksi Sac I  untuk  forward  dan HindI II untuk reverse.

## Konstruksi pustaka fragmen gen lipase
Proses  amplifikasi  gen  fragmen  lipase menggunakan teknik PCR dan kit KAPA2G Fast ReadyMix with Dye dengan primer  CLF  dan  CLR.  PCR  dilakukan sebanyak  35  siklus  sebagai  berikut:  pre- denaturasi pada suhu 95 o C selama 3 menit, denaturasi  suhu  95 o C  selama  15  detik, annealing  suhu  63,2 o C;  64,4 o C;  66,8 o C; 68oC,  dan  69,5 o C  selama  15  detik, elongasi  suhu  72 o C  selama  15  detik  dan pasca-elongasi suhu 72 o C selama 1 menit. hasil  PCR  dimurnikan  menggunakan QIAquick  PCR  purification  kit (Qiagen). Untuk  konstruksi  pustaka  fragmen  gen lipase,  hasil  purifikasi  PCR  dilakukan kloning  gen  dengan  vektor  pET-30a(+) dan transformasi ke dalam E. coli TOP10 melalui heat shock .

## Hasil dan Pembahasan
Sampel  tanah  diambil  sedalam  3  cm dari  permukaan  tanah  dan  berasal  dari  2 titik yaitu dasar kolam dan pinggir kolam. Pengambilan pada 2 titik ini bertujuan agar mikroorganisme yang didapatkan merupakan  mikroorganisme  aerob  dan anaerob.  Karakteristik  tanah  secara  fisik berupa  tanah  liat  berwarna  hitam  (dasar kolam) dan coklat (pinggir kolam).
Hasil  panen  pelet  dilakukan  ekstraksi menggunakan buffer ekstraksi DNA tanpa melalui  ekstraksi  DNA  secara  fisik  serta dilakukan  perbandingan  hasil  dengan menggunakan kit. Supernatant diambil dan dilakukan  pemurnian  DNA  metagenom menggunakan kolom GenElute tm Bacterial Genomic DNA  Kit  (Sigma  Aldrich). Didapatkan DNA metagenome dari kedua media  kultur  pada  kondisi  yang  berbeda. Dapat  dilihat  dari  hasil  elektroforesis
berupa elektroforegram dengan band DNA berkisar ~20 kb (Gambar 1).
Gambar 1 . Elektroforegram DNA metagenom dari sampel tanah. (I)  dengan  isopropyl  alkohol,  (P)  dengan PEG  6000,  (E)  dengan  etanol,  (R 1 ,  R 2 ) suhu  ruang,  (T 1 ,  T 2 )  suhu  tinggi,  (M) Marker DNA λ/ Hind III.
Tingkat  kemurnian sampel  DNA metagenom  dari  kedua  media  kultur  bisa dikatakan murni karena memenuhi rentang kemurnian  DNA  yang  baik  (Tabel  1). sehingga  dapat  digunakan  pada  tahap selanjutnya. Konsentrasi DNA pada media bersuhu  tinggi  lebih  besar  dibandingkan media  pada  suhu  ruang.  Hal  ini  bisa disebabkan  karena  lingkungan  asli  tanah pada  kolam  limbah  ialah  bersuhu  tinggi (Rupani and Singh,
2010;
Soleimaninanadegani and Manshad, 2014) sehingga  lebih  banyak  mikroorganisme berkembang pada suhu tinggi (60 o C). Untuk  mendapatkan  gen  penyandi lipase, digunakan primer degenerate yang berasal  dari  lipase  golongan  HSL  atau hormone sensitive lipase (Shi et al ., 2009). Primer  degenerate  didesain  berdasarkan gen lipase golongan HSL dengan pencarian Entrez pada NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/). Dua daerah lestari pada H-G dan G-X- S-X-G  (X  merupakan  asam  amino) ditemukan  pada  kebanyakan  lipase  yaitu daerah lestari untuk lubang oksianion dan sisi aktif enzim (Jaeger et al ., 1994; Kim et al .,  2004).  Pada  lipase  golongan  HSL berdasarkan  6  mikroorganisme  yang disejajarkan  urutan  asam  aminonya. Didapat  2  daerah  lestari  pada  lubang oksianion  yaitu [V/L]-[F/Y/D]-[F/I]-H-G- G-[G/A]  dan  sisi  aktif  enzim  HSL  lipase yaitu
G-[D/V]-S-[A/V]-G-G-[N/C]-
[L/M/I]. Setelah itu, didesain primer yang komplemen  dengan  dua  daerah  lestari tersebut.  Untuk  mengecek  primer  yang didesain,  dilakukan  tes  pada  susunan  gen lipase yang diketahui dan membandingkan hasil  primer  dengan  susunan  gen  lipase yang  telah  terpublikasi  menggunakan
BLASTx (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Setelah beberapa  kali  dioptimasi,  didapatkan primer degenerate CLF  ( Cold  Lipase Forward ) dan CLR ( Cold Lipase Reverse ) (Tabel 2).
Tabel 1. hasil spektrofotometri nanodrop
Sample 230 260 280 260/280  260/230 ng/µl T 1 6,854 5,264 3,413 1,54 0,77 263,2 T 2 4,489 6,342 3,312 1,91 1,41 317,1 R 1 0,977 0,674 0,387 1,74 0,69 33,7 R 2 0,67 0,669 0,347 1,93 1 33,4 Manual PEG 6000 32,77 60,508 44,126 1,37 1,85 3025,4 I   P  E  R 1 R 2 T 1 T 2 M
23 kb 9.4 kb 6.5 kb 4.3 kb 2.3 kb 2.0 kb
Tabel 2. Primer degenerate lipase golongan HSL Primer Susunan ( 5’ ke 3’ ) a, b CLF ACGGAGCTCGTGGTGTAYTTYCAYGGBGG CLR TGTAAGCTTCAGGTTGCCRCCSGCRCTRTCNCC
a B: C, G/T; N: A, C, G/T; R: A/G; S: G/C; Y: C/T.
b Sisi restriksi ditandai dengan catak miring dan garis bawah.
Gambar 2. Pensejajaran asam amino dari mikroorganisme penghasil lipase golongan HSL pada  GenBank  (NCBI)  dengan  ClustalW.  (AAC38151) Pseudomonas  sp .  B11-1; (ABC25547) Pseudomonas sp . CL-61; (CAA37862) Moraxella sp . TA144; (ABR12515) Psychrobacter  sp .  2-17;  (AAF70342) Psychrobacter  sp .  St1;  (AAZ67909) uncultured bacteria dari sedimen laut. Dua daerah lestari pada lubang oksianion dan sisi aktif berada pada kotak biru.
Gambar  3. Hasil  amplifikasi  PCR  sampel  DNA  metagenom  R 1 ,  R 2 ,  T 1 ,  dan  T 2 dengan variasi suhu annealing . (M) Marker DNA λ Hind III, (1) suhu 63.2 o C, (2) suhu 64.4 o C, (3) suhu 66.8 o C, (4) suhu 68 o C, dan (5) suhu 69.5 o C.
Proses amplifikasi gen penyandi fragmen lipase dilakukan dengan
memvariasi  suhu penempelan primer atau annealing yaitu pada suhu 63,2 o C; 64,4 o C; 66,8 o C;  68 o C,  dan  69,5 o C.  Variasi  suhu
dilakukan
dengan tujuan untuk
menentukan suhu optimal dari primer agar dapat  menempel  pada  DNA  template secara  sempurna  sehingga  didapatkan fragmen  DNA  dari  gen  penyandi  lipase. Dari  hasil  variasi  tersebut,  fragmen  gen lipase  dapat  teramplifikasi  dengan  suhu annealing 63,2 o C dan 64,4 o C (Gambar 3). Amplikon yang di dapatkan dari hasil PCR dengan  menggunakan  primer  CLF  dan CLR  memiliki  ukuran  basa  sebesar  250- 300  pasang  basa.  Hal  ini  sesuai  pada penelitian yang telah dilakukan oleh Shi et al. (2009)  dan  Yan et  al. (2016).  Dari  4 sampel  DNA  metagenom,  hanya  sampel dari  pengayaan  pada  suhu  ruang  yang positif  menghasilkan  amplikon  fragmen gen  lipase  golongan  HSL.  Hal  ini menunjukkan bahwa tidak ada mikroorganisme penghasil lipase golongan HSL pada suhu tinggi karena mikroorganisme  golongan  HSL  ini  hidup pada suhu rendah (Shi et al., 2009). Hasil PCR kemudian dipurifikasi menggunakan kolom QIAquick  PCR  purification  kit (Qiagen). Lalu dilakukan kloning gen dan
menghasilkan klon yang tumbuh sebanyak 26 klon
Gambar 4. Hasil transformasi. (kiri) klon plasmid  rekombinan  fragmen  gen  lipase, (tengah)  kontrol  negatif,  (kanan)  kontrol positif.

## Kesimpulan
Tingkat kemurnian hasil ekstraksi DNA sampel  tanah  pengolahan  limbah  kelapa sawit  menggunakan  metode  Hurt et  al. (2001)  termodifikasi  mempunyai  rasio absorbansi  260/280  sebesar  1,93    serta ukurannya berkisar 20 bp. Primer degenerate CLF dan CLR dapat mengamplifikasi  fragmen  gen  lipase  dari sampel  tanah  pengolahan  limbah  kelapa sawit  dengan  ukuran  250-300  bp.  Hasil transformasi plasmid pET-30a(+) tersisipi fragmen gen  lipase menghasilkan pustaka klon  sebanyak  26  klon  yang  disebut pustaka  fragmen  lipase  limbah  sawit (PFL2S).

## Daftar Pustaka
Glogauer,  A.,  Martini,  V.P.,  Faoro,  H., Couto,  G.H.,  Müller-santos,  M., Monteiro,  R.A.,  Mitchell,  D.A., Souza,  E.M.  De,  Pedrosa,  F.O., Krieger,  N.,  2011.  Identification  and characterization  of  a  new  true  lipase isolated
through metagenomic approach. Microb. Cell Fact. 10, 54. Handelsman,  J.,  Rondon,  M.R.,  Brady, S.F.,  Clardy,  J.,  Goodman,  R.M., 1998.  Molecular  biological  access  to the  chemistry  of  unknown  soil microbes:  a  new  frontier  for  natural products. Chem. Biol. 5, R245–R249.
Hurt,  R.A.,  Qiu,  X.,  Wu,  L.,  Roh,  Y., Tiedje, J.M., Zhou, J., Hurt, R.A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y.U.L., Palumbo, A. V,  2001.  Simultaneous  Recovery  of RNA  and  DNA  from  Soils  and Sediments. Appl. Environ. Microbiol . 67.
Jun  Gang,  L.,  Ke  Gui,  Z.,  Wen  Jun,  H., 2010.  Cloning  and biochemical characterization  of  a  novel  lipolytic gene from activated sludge metagenome,  and  its  gene  product. Microb. Cell Fact. 9, 83.
Kakirde,  K.S.,  Parsley,  L.C.,  Liles,  M.R., 2010.  Size  does  matter:  Application- driven approaches for soil metagenomics.  Soil  Biol. Biochem. 42, 1911–1923.
Lämmle,  K.,  Zipper,  H.,  Breuer,  M., Hauer,  B.,  Buta,  C.,  Brunner,  H., Rupp, S., 2007. Identification of novel enzymes  with  different  hydrolytic activities  by  metagenome  expression cloning. J. Biotechnol. 127, 575–592.
Liaw, R. B., Cheng, M. P., Wu, M. C., Lee, C.  Y.,  2010.  Use  of  metagenomic approaches  to  isolate  lipolytic  genes from  activated  sludge. Bioresour. Technol. 101, 8323–9. Lorenz,  P.,  Eck,  J.,  2005.  Metagenomics and  industrial  applications. Nature 3, 510–516.
Momsia,  T.,  Momsia,  P.,  2013.  A  review on “ microbial lipase-versatile tool for industrial  applications  .” Int.  J.  life Sci. Biotechnol. pharma Res. 2. Otten,  L.G.,  Quax,  W.J.,  2005.  Directed evolution: selecting today’s biocatalysts. Biomol. Eng. 22, 1–9.
Schoemaker,  H.E.,  2003.  Dispelling  the Myths--Biocatalysis in Industrial
Synthesis. Science 299, 1694–1697.
Shi, P., Liu, W., Meng, K., Bai, Y., Wang, G.,  Zhan,  Z.,  Yao,  B.,  2009.  Lipase Diversity  in  Glacier  Soil  Based  on
Analysis  of  Metagenomic  DNA Fragments and Cell  Culture  19, 888– 897. Simon, C., Daniel, R., 2009. Achievements  and  new  knowledge unraveled by metagenomic approaches. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 85, 265–276.
Steele,  H.  L.,  Jaeger,  K.  E.,  Daniel,  R., Streit,  W.  R.,  2009.  Advances  in Recovery of Novel Biocatalysts from Metagenomes. J.  Mol.  Microbiol.
Biotechnol. 16, 25–37.
Uchiyama,  T.,  Miyazaki,  K.,  2009. Functional metagenomics for enzyme discovery:  challenges  to  efficient screening. Curr. Opin. Biotechnol. 20,
616–622.
Yan,  Q.,  Duan,  X.,  Liu,  Y.,  Jiang,  Z.,
Yang,  S.,  2016.  Biotechnology  for Biofuels Expression and
characterization  of  a  novel  1  ,  3  ‑ regioselective  cold  ‑  adapted  lipase from Rhizomucor endophyticus suitable for  biodiesel synthesis. Biotechnol. Biofuels 1–13 .