Produksi dan Pengukuran Aktivitas Protease dari Isolat Bakteri BKL-1 dan BKU-31
(Production and Measurement of Protease Activity of BKL-1 and BKU-31 Bacteria Isolates)
Wiwit Artika
Dosen Program Studi Pendidikan Biologi FKIP Unsyiah Darussalam Banda Aceh E-mail: artikaw@gmail.com

## Abstract
BKL-1  and  BKU-31  bacteria  isolates  were collected from  digestive  tract  of  kerapu lumpur  (Epinephelus  tauvina)  and  identified  as Serratia  marcescens  biogp  1 dan Serratia marcescens respectively. BKL-1 crude protease were obtained after 27 hours incubation period in Nutrient  Broth  (NB)  medium  added  with  peptone  0.5%,  NaCl  0.5%,  lactose  0.1%,  and  CaCl 2 0.1%.  BKU-31  crude  proteases were  obtained  in  NB  medium  added  with  0.1%  skimmed  milk (NBS) for 18 hours incubation period. The highest activity of proteases of S. marcescens biogp 1 BKL-1 reached after 27 hours of incubation, namely 0.002 U/ml with protein concentration 0.064 mg/ml. The proteases of S. marcescens BKU-31, on the other hand, reached their highest activity (0.064  U/ml)  at  24  hours  of  incubation  with  protein  concentration 0.056  mg/ml.The  optimum temperature  crude  BKL-1  proteases were  30°C,  whereas  BKU-31  proteasess  had  the  optimum temperature of 50 ºC.

## Key Words: Production, Protease Activity, Serratia marcescens

## PENDAHULUAN
Enzim  proteolitik  semula  dikenal  karena kaitannya  dengan  proses  pencernaan.  Di dalam  tubuh  ikan,  bakteri  penghasil  enzim proteolitik  umumnya  hidup  di  dalam  jaringan ikan termasuk saluran pencernaan. Citrobacter sp.  (Ariana  2003), Bacillus sp. (Fitri  2003; Sukma  2003)  merupakan  bakteri yang diketahui terdapat pada saluran pencernaan ikan.
Enzim proteolitik (protease) banyak diaplikasikan  dalam  industri  pangan  maupun nonpangan.  Dalam  industri  pangan,  protease digunakan antara lain untuk menjernihkan bir, mengempukkan  daging,  memperbaiki  tekstur adonan  roti  dan  lain-lain  (Rao et  al 1998; Suhartono  1992).  Sedangkan  pada  industri nonpangan  digunakan  untuk  meningkatkan fungsi  detergen  dalam  membersihkan  noda, membantu  penyamakan  kulit  (Crueger  & Crueger  1984)  dan  di  bidang  farmasi, misalnya kolagenase atau subtilisin digunakan untuk  perawatan  luka  bakar  dan  protease alkalin  yang  menggantikan tripsin asal hewan (Rao et al. 1998).
Protease (proteinase dan peptidase) termasuk ke dalam kelompok enzim hidrolase karena  dalam  reaksinya  melibatkan  air  pada ikatan substrat spesifik. Berdasarkan mekanisme kerjanya, protease dibedakan atas: (a)  protease  serina  yang  memiliki  residu serina  pada  sisi  aktifnya  dan  dihambat  oleh
diisopropilfluorofosfat (DFP) dan fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF); (b)
protease  sisteina  yang  memiliki  gugus  tiol (-SH) pada sisi aktifnya dan  hanya akan aktif jika ada senyawa pereduksi  seperti HCN atau sisteina;  (c)  metaloprotease  yang  aktivitasnya tergantung  dari  kation  divalen  dan  dihambat oleh
senyawa pengkelat etilendiaminatetraasetat  (EDTA);  (d)  protease asam  aspartat  yang  memiliki  residu  asam aspartat  pada  sisi  aktifnya  dan  dihambat  oleh diazoasetil-DL-norleusin  metil  ester  (DAN) (Rao et al. 1998).
Protease dapat  dihasilkan  dari  hewan (tripsin, pepsin), tumbuhan (papain, bromelin),  dan  mikrob.  Protease  asal  mikrob antara  lain Serratia  marcescens NRRL  B- 23112  asal  tanah  (Salamone  &  Wodzinski 1997) Bacillus sp.  dari  kulit  ikan  kakap (Rosdiana et  al. 2002),  dan Photorhabdus sp. asal nematoda azorean (Cabral et al. 2004).
Serratiopeptidase  juga  dikenal  sebagai serratia peptidase, serrapeptidase, atau serrapeptase merupakan enzim peptidase yang diisolasi  dari Serratia sp. HY-6  (Lane  2004) dan  nonpatogen enterobacteria Serratia E-15 (Rao et al. 1998) asal saluran usus ulat sutera Jepang.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  melakukan produksi dan uji aktivitas protease ekstraseluler  dari  isolat  bakteri  BKL-1  dan BKU-31  asal  saluran  pencernaan  ikan  kerapu
lumpur,  serta  mengidentifikasi  isolat  BKL-1 dan BKU-31.

## BAHAN DAN METODE

## Alat dan Bahan
Isolat  bakteri  yang  digunakan  pada penelitian  ini berasal  dari  saluran  pencernaan ikan  kerapu  lumpur  bagian  lambung  untuk BKL-1  (Ariana  2003)  dan  bagian  usus  untuk BKU-31  (Fitri  2003).  Isolat  bakteri BKL-1 dan  BKU-31    yang  digunakan  merupakan koleksi
Laboratorium
Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB.

## Peremajaan Isolat
Biakan  murni  disimpan  dan  diremajakan pada  media  agar  nutrien.  Sebanyak  satu sengkelit  koloni  digores  dengan  metode kuadran pada media Nutrient Agar (NA) yang mengandung  susu  skim  1%  dan  diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C.

## Ciri-ciri Morfologi dan Fisiologi Bakteri
Ciri-ciri  Morfologi  bakteri  diamati  secara konvensional melalui pengamatan mikroskopik  (bentuk  sel  dan  pewarnaan gram). Pengujian fisologi (biokimia) dilakukan  dengan  menggunakan Microbact (Microgen, Australia). Sebanyak 2-3 sengkelit biakan berumur 24 jam dipindahkan ke dalam 9  ml  larutan  garam  fisiologis  (NaCl  0.85%) kemudian  dimasukkan  ke  dalam  sumur Microbact dan diinkubasi selama 24 jam.

## Penyiapan Inokulum dan Penentuan Kurva Turbiditas Pertumbuhan
Sebanyak  2-3 sengkelit  isolat  bakteri BKU-31  yang  berumur  24  jam  ditumbuhkan dalam  20  ml  media  cair Nutrient  Broth (NB) ditambah  dengan  0.1%  susu  skim  (Anlene, New Zealand) disebut media NBS. Sedangkan  sebanyak  2-3  sengkelit  isolat bakteri  BKL-1  berumur  24  jam  ditumbuhkan dalam  20  ml  media  cair  NB  modifikasi dengan  komposisi  NB  +  pepton  0.5%,  NaCl 0.5%,  laktosa  0.1%,  dan  CaCl 2 0.1%.  Kedua biakan  dikocok  dengan  kecepatan  140  rpm selama  periode  waktu  masing-masing  isolat, yaitu  sampai  jumlah  sel  mencapai  ±  1x10 8 sel/ml atau  OD=0.341 pada isolat BKL-1 dan OD=0.390  pada  isolat  BKU-31  pada  suhu ruang. Biakan yang ditumbuhkan dalam kedua media ini disebut inokulum.
Kemudian sebanyak 10% inokulum dimasukkan ke dalam 200  ml media produksi protease  yang  memiliki  komposisi  sama seperti  media  inokulum.  Kurva  turbiditas
pertumbuhan  sel  diperoleh  dengan  mengukur nilai OD setiap 3 jam selama 24-30 jam pada panjang  gelombang  620  nm.  Selama  selang waktu  tersebut  sebanyak  5-6  ml  dari  media produksi  disentrifugasi  dengan  kecepatan 10000 rpm selama 5 menit sehingga diperoleh protease  ekstrak  kasar.  Selanjutnya  dilakukan pengujian aktivitas protease.

## Pengukuran  Aktivitas  Protease  dan  Kadar Protein
Aktivitas  protease  ditentukan  dengan metode  Walter  (1984)  yang  dimodifikasi. Kasein 1% digunakan sebagai substrat enzim.
Reaksi antara substrat dengan enzim berlangsung 10 menit pada suhu 37 0 C. Reaksi dihentikan  dengan  penambahan  asam  trikloro asetat  (TCA)  10%.  Ke  dalam  supernatan ditambahkan  Na 2 CO 3 0.5  M  dan  pereaksi Follin  Ciocalteau  (1:2).  Campuran  diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 578 nm. Satu unit  aktivitas  enzim  didefinisikan  sebagai jumlah  enzim  yang  membebaskan  1  µ mol tirosina per menit pada suhu dan pH optimum.
Kadar  protein  diukur  dengan metode
Bradford
microassay (Bradford 1976).
Sebanyak  0.4  ml  sampel  enzim  ditambahkan ke  dalam  4  ml  pereaksi  Bradford,  dikocok kuat dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang  lalu  diukur  dengan  spektrofotometer pada  panjang  gelombang  595  nm.  Kurva standar  dibuat  dengan  menggunakan bovine serum albumin (BSA) dengan kisaran konsentrasi 0.01-0.1 mg/ml protein. Aktivitas spesifik protease (U/mg) merupakan  nisbah  antara  aktivitas  protease (U/ml) dengan kadar protein (mg/ml).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Identifikasi biakan
Hasil  pengamatan  ciri-ciri  morfologi  dari isolat  BKL-1  yaitu  anaerob  fakultatif,  gram negatif,  dan  berbentuk  batang  pendek, sedangkan  isolat  BKU-31  memiliki  ciri-ciri morfologi  anaerob  fakultatif,  gram  negatif, dan berbentuk batang pendek.
Berdasarkan  hasil  pengujian  dengan  kit Microbact
(Tabel 1), isolat BKL-1
diidentifikasikan  sebagai Serratia  marcescens biogp  I dengan  tingkat  kebenaran  100% (percent probability). Sedangkan isolat  BKU- 31 diidentifikasikan sebagai Serratia marcescens dengan tingkat kebenaran 97.16%.

## Penyiapan Inokulum dan Penentuan Kurva Turbiditas Pertumbuhan
Pertumbuhan Serratia marcescens biogp 1 BKL-1  pada  media  modifikasi  (NB  +  pepton 0.5%,  NaCl  0.5%,  laktosa  0.1%,  dan  CaCl 2 0.1%)  selama  selang  waktu  inkubasi  30 jam menunjukkan  peningkatan  nilai  rapat  optis hingga  jam  ke-9,  selanjutnya  relatif  stabil sampai jam ke-30. Kurva turbiditas pertumbuhan S. marcescens BKU-31    pada media  NBS  selama  selang  waktu  24  jam, menunjukkan  peningkatan  nilai  rapat  optis yang  terjadi pada jam  ke-3  sampai  jam  ke-18 kemudian  menurun  pada  jam  ke-21  dan meningkat  kembali  pada  jam  ke-24.  Pada pengukuran  turbiditas  kedua  isolat,  inokulum sel  diperoleh  pada  saat  sel  berada  dalam  fase eksponensial (Gambar 1).
Tabel 1 Ciri-ciri morfologi dan fisiologi isolat BKL-1 dan  BKU-31 berumur 24 jam dan Serratia marcescens Ciri-ciri BKL-1 BKU-31 *Serratia marcescens Bentuk sel Batang pendek Batang pendek Batang pendek Pewarnaan gram Negatif Negatif Negatif Oksidase - - - Nitrat - + + Lysin - + + Ornitrin - + + H 2 S - - - Glukosa + + + Manitol + + + Xilosa - + - ONPG (O- Nitrophenyl-B- d- Galaktopyranosi de) - + + Indol - - - Urease + - [ - ] Voges Proskauer - + + Sitrat - + + TDA (Tryptophan Deaminase) - - - Gelatin + + + Malonat - - - Inositol + - [ + ] Sorbitol + + + Rhamnosa - - - Sukrosa + + + Laktosa - - - Arabinosa - - - Adonitol - + d Rafinosa - - - Salisin + + + Arginin + + -
* Holt et al. (1994),
[-]  =  11-25%  positif,  [+]  =  76-89%  positif,
d =11-89% galur positif

## Pengukuran  Aktivitas  Protease  dan  Kadar Protein
Aktivitas  protease S. marcescens biogp  1 BKL-1  yang  ditumbuhkan  pada  media  NB modifikasi  membentuk  empat  puncak,  yaitu pada  umur  6,  12,  21,  dan  27  jam.  Aktivitas unit  protease  tertinggi  dicapai  pada  saat biakan  berumur  27  jam,  yaitu  sebesar  0.002 U/ml  dengan  kadar  protein  0.064  mg/ml. Aktivitas  spesifik  protease  tertinggi  yang dicapai pada saat umur biakan 27 jam sebesar 0.04 U/mg (Gambar 2).
Sedangkan S. marcescens BKU-31  yang ditumbuhkan  pada  media  NBS  memiliki aktivitas  protease  tertinggi  pada  jam  ke-18 dan  jam  ke-24  masing-masing  sebesar  0.056 U/ml  dan  0.064  U/ml.  Kadar  protein  dan aktivitas  spesifik  pada  jam  ke-18  yaitu  0.048 mg/ml dan 1.172 U/mg,  sedangkan pada jam ke-24  sebesar  0.056  mg/ml  dan  1.175  U/mg (Gambar 3).
Gambar  1.  Kurva  turbiditas S.  marcescens biogp  1 BKL-1  di  dalam  media NB  modifikasi  selama  30  jam dan S. marcescens BKU-31  di dalam  media  NBS  pada  pH  8.0, suhu 37 °C.
Gambar 2. Kurva aktivitas spesifik  dan kadar protein  protease S.  marcescens
0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.04 0.04 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Waktu (Jam ) A k ti v it a s s p e s if ik ( U /m g ) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 K a d a r p ro te in ( m g /m l) Aktivitas spesifik (U/mg) Kadar protein (mg/ml) 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Waktu (Jam) O D 6 2 0 n m OD sel BKL-1 OD sel BKU-31
biogp 1 BKL-1  yang  ditumbuhkan dalam  media  NB  modifikasi  pada pH 8.0, suhu 37 °C.
Gambar 3. Kurva aktivitas spesifik  dan kadar protein    protease S.  marcescens BKU-31  yang  ditumbuhkan  dalam media  NBS  pada  pH  8.0,  suhu  37 °C.
Pembahasan Sistem Microbact Gram Negatif merupakan produk dari Oxoid yang digunakan untuk  mengidentifikasi  bakteri  aerob  dan aerob  fakultatif  gram  negatif  (enterobakteria dan  bakteri  gram  negatif  miselia). Microbact menggunakan  sistem  mikro-substrat  yang didesain  berdasarkan  simulasi  konvensional substrat  biokimia  dalam  mengidentifikasi enterobakteria  dan  bakteri  gram  negatif miselia  (MGNB).  Identifikasi  organisme didasarkan pada perubahan pH dan penggunaan substrat (Oxoid 2004).
Bakteri  gram  negatif  yang  termasuk  ke dalam  famili Enterobacteriaceae diketahui mampu mensekresikan sejumlah besar protease  ekstraseluler  ke  media  sekitarnya. Serratia sp. galur E-15 memiliki potensi yang tinggi  dalam  memproduksi  metaloprotease ekstraseluler  (Rao et  al.  1998). Serratia sp. asal  usus  ulat  sutera  Jepang  tergolong  ke dalam enterobacteria nonpatogen.  Supriyadi et  al. (2003)  melaporkan  bahwa Serratia marcescens dan Serratia sp.  yang  diisolasi dari  ginjal  ikan  patin  dan  mendominasi sampel  ikan  patin  asal  Jambi  bersifat nonpatogen.  Sehingga  diperkirakan  bahwa S. marcescens  biogp  1 BKL-1  dan S. marcescens BKU-31  tergolong  ke  dalam bakteri nonpatogen.
Produksi  enzim  protease S.  marcescens biogp  1 BKL-1  dilakukan  ketika  biakan berumur  27  jam  yang  diperkirakan  berada pada  fase  stasioner. Produksi  protease Bacillus pumilus Y1 meningkat saat mencapai
fase  stasioner  dan  mendekati  kematian, dengan  aktivitas  optimum  dicapai  pada  20-25 jam masa inkubasi (Suhartono 1996). Sintesis protease  ekstraseluler  biasanya  terjadi  pada fase  diam  (stasioner),  hal  ini  terkait  dengan mekanisme  represi  katabolit.  Selama  fase pertumbuhan eksponensial, sel akan mengalami hambatan represi katabolit,
sehingga  menurunkan  konsentrasi  cAMP intraseluler yang dapat mengaktifkan trankripsi mRNA penyandi protease.
Memasuki  fase  stasioner,  represi  katabolit mulai menurun sehingga mengaktifkan biosintesis  enzim  (Suhartono  1992).  Pola aktivitas protease yang fluktuatif juga dilaporkan  dalam  penelitian  Mubarik  & Wirahadikusumah  (1996).  Kadar  protein ekstrak  kasar S.  marcescens biogp  1 BKL-1 menunjukkan  nilai  yang  hampir  sama  pada setiap 3 jam masa inkubasi.
Berdasarkan  kurva  tumbuh S.  marcescens BKU-31  bahwa  produksi  enzim  optimum terjadi  pada  saat  sel  berada  dalam  fase eksponensial  atau  biakan  berumur  18  jam.
Pada genus
Bacillus, sintesis enzim ekstraseluler  dalam  jumlah  terbesar  secara normal  terjadi  pada  saat  sebelum  sporulasi, yaitu  pada  akhir  fase  eksponensial  atau  awal stasioner  (Suhartono  1992).  Chantawannakul et  al.  (2002)  melaporkan  bahwa B.  subtilis galur  38  semua  sel  bakteri  muncul  dalam bentuk  sel  vegetatif  selama  12  jam  pertama, kemudian  terbentuk  spora  antara  16  dan  24 jam periode inkubasi. Hasil ini mengindikasikan  bahwa  produksi  tertinggi protease dicapai selama fase eksponensial dan berlangsung konstan saat spora telah terbentuk (fase  stasioner).  Produksi  protease  pada  akhir fase  eksponensial  atau  awal  fase  stasioner telah dilaporkan oleh Mubarik & Wirahadikusumah  (1996). Kadar  protein ekstrak kasar S. marcescens BKU-31 menunjukkan nilai  yang  menurun sampai jam ke-16  dan  sedikit  meningkat  saat  memasuki jam ke-18.

## SIMPULAN
Isolat BKL-1 dan BKU-31 masing-masing diidentifikasi  sebagai Serratia  marcescens biogp  1  dan Serratia  marcescens. Aktivitas protease S. marcescens biogp  1 BKL-1 tertinggi dicapai pada saat biakan berumur 27 jam,  yaitu  sebesar  0.002 U/ml  dengan  kadar protein 0.064 mg/ml. Sedangkan S. marcescens BKU-31 memiliki aktivitas protease  tertinggi  pada  jam  ke-24 yaitu 0.064 U/ml dan Kadar  protein  pada  jam  ke-24 sebesar  0.056  mg/ml. Ekstrak  kasar  protease
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 0 3 6 9 12 15 18 21 24 Waktu (Jam) A k ti v it a s s p e s if ik ( U /m g ) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 K a d a r p ro te in ( m g /m l)
Aktivitas spesifik (U/m g) Kadar protein (m g/m l)
Serratia marcescens biogp 1 BKL-1 memiliki suhu optimum 30°C, sedangkan
S. marcescens BKU-31  mempunyai  aktivitas optimum pada suhu 50 °C.

## DAFTAR PUSTAKA
Ariana.  2003.  Produksi  dan  karakterisasi protease Citrobacter sp.  galur  BKL-1 dari  saluran  pencernaan  ikan  kerapu lumpur  (Epinephelus  tauvinia)  [skripsi]. Bogor:  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan  Alam,  Institut  Pertanian Bogor.
Bradford  MM.  1976.  A  rapid  and  sensitive methode  for  quantitation  of  microgram quantities  of  protein  in  utilizing  the principle  of  protein  dye  binding. Anal Biochem 72:248-254.
Cabral CM, Cherqui A, Pereira A, Simoes N. 2004. Purification  and  characterization of two distinct metalloproteases secreted by  the  entomopathogenic  bacterium Photorhabdus sp.  strain  Az29. Appl Environ Microbiol 70:3831-3838.
Chantawannakul  P,  Onchalee  A, Klanbut  K, Chukeatirote  E,  Lumyong  S.  2002. Characterization of proteases of Bacillus subtilis strain 38 galured from traditionally fermented soybean in
Nothern  Thailand. Science  Asia 28:241- 245.
Crueger  W,  Crueger  A.  1984. Biotechnology: A  Textbook  of  Industrial  Microbiology. Madison: Science Tech Inc.
Fitri  SGS.  2003.  Karakterisasi  dan  produksi protease  ekstraseluler Bacillus sp.  galur BKU-10 dari saluran Epinephelus tauvinia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Lane  J.  2004.  Serratiopeptidase  [technical bulletin].http://www.sedonalabs.com/PD F/TBserratiopeptidase.pdf [6 Januari 2005].
Mubarik  NR,  Wirahadikusumah  M.  1996. Pemurnian  dan  karakterisasi  protease ekstraseluler Bacillus  subtilis ATCC 6633. Hayati 3:50-54.
Oxoid.  2004.  Gram  negative  identification system.http://www.oxoid.com/uk/indek. asp?mpage=productdetail&pre[24 Januari 2005].
Rao  MB,  Tanksale  AM,  Ghatge  MS, Deshpande  VV.  1998.  Molecular  and biotechnological  aspect  of  microbial proteases. Microbiol  Mol  Biol  Review 62:597-635.
Roosdiana  A,  Kartikaningsih  H,  Suharjono, Perangiangin R, Murdinah. 2002. Isolasi dan  karakterisasi Bacillus sp.  penghasil protease  dari  kulit  ikan  kakap  merah (Lutjanus  sanguineus). J  Ilmu-ilmu Hayati 14:202-210. Salamone PR, Wodzinski RJ. 1997. Production, purification and characterization of a 50-kDa
extracellular metalloprotease from
Serratia  marcescens. Appl  Microbiol
Biotechnol 48:317-324.
Suhartono  MT.  1992. Protease.  Bogor: Depdikbud, DIKTI, PAU IPB.
Suhartono MT, Satiawihardja B, Widjaja IPN. 1996. Characterization of protease enzyme produced from Bacillus pumilus Y1 galured from liquid tofu waste. J Mol
Biol Biotech 2:193-199.
Sukma  P.  2003.  Produksi  dan  karakterisasi protease Bacillus sp. galur  BBU-32  asal saluran pencernaan Parastromateus niger [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Supriyadi  H,  Taukhid,  Effendi  J.  2003. Identifikasi  jasad  penyebab  pada  benih ikan  patin  jambal  (Pangasius djambal) serta cara penanggulangannya. J Pen Per Indones 9:37-41.

## Walter  H-E.  1984. Proteinases  (Protein  as
Substrates).  Di  dalam  Bergmeyer  J, Graβl  M,  editor. Methods  of  Enzymatic Analysis.  Ed  ke-3.  Weinheim:  Verlag Chemic. hlm 270-278.