## STUDI KOMPUTASI INTERAKSI  ISOFLAVON DENGAN RESEPTOR ESTROGEN  β
MENGGUNAKAN  METODE ONIOM

## Budi Mulyati
Jurusan Teknik Industri, Fakultas Teknik  Universitas Nurtanio, Jl.  Pajajaran  No. 219  Bandung e-mail:  b.mulyati@yahoo.com
Abstract: Estrogen  receptor  (ER)  β  is an important target of the world seek treatment for hormone  replacement  in  postmenopausal  women  and  chemotherapy  drugs  against  cancer. Isoflavones are phytoestrogens that can be attached to both types of estrogen receptors with varying  affinities.  The  purpose  of  this  study  was  to  determine  the sequence of ligands that interact  more  strongly  to  the  ER  β  and  determine  the  functional groups that play an active role  and  the  type  of  interaction  that  occurs  between  the ligand and receptor. The research begins  with  optimization  of  RE  β  structure  (PDB  code  1QKM)  then  do  the  receptor  and ligand  docking  simulations  using  Autodock  Vina.  The  ligands  used  in  this  study  is a Factor 2,  Daidzein,  Genistein,  Glisitein,  Kakkatin,  Biochanin  A,  6,4'-dihydroxy-7-metoksiisoflavon. Used  as the natural ligand Estrogen. The results of this study indicate energy RE affinity of Factor  β  2,  Daidzein,  Genestein,  Kakkatin,  6,4'-dihydroxy-7-metoksiisoflavon,  Glisitein, Biochanin A, respectively -6.7 kcal / mol;  -6.5 Kcal / mol; -6.3 Kcal / mol; -5.9 Kcal / mol; - 5.4 Kcal / mol;  -4.8 Kcal / mol and -3.2 kcal / mol. While the order of the estrogenic potency of calculation oniom on Estrogen Receptor β is a factor 2> Genestein> Daidzein> Kakkatin> biochanin  A> Glisitein>  6,4'-dihydroxy-7-metoksiisoflavon.
Keywords : Estrogen Receptor β; Isoflavones; ONIOM
Abstrak: Reseptor Estrogen (RE) β merupakan target penting dalam dunia pengobatan untuk mencari  hormon  pengganti  pada  wanita  menopause  dan  obat  kemoterapi  melawan  kanker. Isoflavon  merupakan  fitoestrogen  yang  dapat  terikat  pada  kedua  jenis  estrogen  reseptor dengan  afinitas  yang  bervariasi.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  menentukan  urutan ligan  yang  berinteraksi  lebih  kuat  terhadap  RE  β  serta  menentukan  gugus  fungsi  yang berperan  aktif  dan  jenis  interaksi  yang  terjadi  antara  ligan  dan  reseptor.  Tahap  penelitian dimulai  dengan  optimasi  struktur  RE  β  (PDB  kode  1QKM)  kemudian  dilakukan  simulasi docking dan  ligan  dengan  menggunakan autodock Vina dan ditentukan energi afinitasnya. Ligan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  Faktor  2,  Daidzein,  Genistein,  Glisitein, Kakkatin,  Biochanin  A,  6,4’-dihidroksi-7-metoksiisoflavon.  Sebagai  pembanding  digunakan ligan  alami Estrogen. Hasil  penelitian  ini menunjukkan energi afinitas RE β terhadap Faktor 2,  Daidzein,  Genestein,  Kakkatin,  6,4’-dihidroksi-7-metoksiisoflavon,  Glisitein,  Biochanin A,  berturut-turut  adalah  -6,7  kkal/mol;  -6,5  kkal/mol;    -6,3  kkal/mol;  -5,9  kkal/mol;  -5,4 kkal/mol;  -4,8  kkal/mol  dan  -3,2  kkal/mol.  Untuk  mengetahui  residu  asam  amino  yang berikatan  dengan  ligan,  hasil autodock vina diproses menggunakan Ligplus. Urutan potensi estrogenik dari perhitungan ONIOM pada Reseptor Estrogen β adalah Faktor 2 > Genestein > Daidzein>  Kakkatin > Biochanin  A > Glisitein  > 6,4’-dihidroksi-7-metoksiisoflavon.
Kata Kunci : Reseptor Estrogen β; Isoflavon; ONIOM

## PENDAHULUAN
Hormon adalah senyawa-senyawa kimia alami dan dikeluarkan oleh kelenjar  endokrin  ke  dalam  sirkulasi darah.  Salah  satu  contoh  hormon  pada manusia adalah estrogen. Estrogen mempengaruhi pertumbuhan, merangsang  perkembangan  ciri  kelamin sekunder  wanita  dan  berfungsi  pada berbagai macam target di jaringan,
termasuk  jaringan  sistem  reproduktif  pria dan  wanita  seperti  payudara,  uterus, ovarium,  testis  dan  prostat.  Estrogen  juga berperan penting dalam  pemeliharaan tulang  dan  sistem  kardiovaskular  dimana estrogen  mempunyai  efek  kardioprotektif tertentu  (Clark et al. 1992).
Reseptor  estrogen  merupakan  salah satu anggota reseptor inti yang memperantarai  aksi  hormon  estrogen  di dalam tubuh. Estrogen bekerja meregulasi  pertumbuhan  dan  diferensiasi sel-sel  sistem  reproduksi  baik  pada wanita dan pria, serta dapat
meningkatkan  kadar  kolesterol  HDL  dan menurunkan  LDL  sehingga  berpotensi mengurangi
resiko penyakit kardiovaskuler.
Estrogen
berperan penting pada perkembangan otak, penyakit autoimun, dan metabolisme
tulang  dan  pada  sisi  lain,  estrogen  dapat memicu  pertumbuhan, proliferasi dan
metastase kanker payudara (Prawiroharsono 2001).
Reseptor estrogen  terdiri  dari  2  subtipe  yaitu, estrogen  α  (RE  α)  dan  estrogen  ß  (REß). Kedua  reseptor  ini  dibentuk  oleh  rantai tunggal  polipeptida  dengan  565  asam amino  untuk  RE  α  dan  530  asam  amino pada RE  β.
Proses pengikatan hormon pada reseptor  estrogen  di  membran  sel,  dan ikatan  tersebut  berikatan  dalam  bentuk dimer.  Setelah  hormon  berikatan  dengan reseptornya,  reseptor  berpindah  ke  inti  sel dan  kemudian  reseptor  tersebut  berikatan ERE  ( estrogen  response  element )  dan kompleks  tersebut  akan  berikatan  dengan koaktivator  sehingga  faktor  transkripsi menjadi  aktif  yang  dapat  mengubah ekspresi gen. Selanjutnya regulasi transkripsi  gen  akan  menghasilkan  suatu protein  spesefik  yang  terlibat  dalam fungsi  biologis  tertentu.
Isoflavon  adalah  sejenis fitonutrien , yang  kaya  dalam  kacang  kedelai  dan produk kacang kedelai itu sendiri. Isoflavon  terdiri  dari  empat  jenis,  yaitu daidzein,  genestein,  glisitein  dan  faktor  2. Struktur  dari  isoflavon  sama  dengan struktur  kimia  dari  estrogen.  Estrogen  itu
sendiri memiliki peran yang sangat penting dan aktif didalam proses penyembuhan  penyakit  yang  disebabkan oleh  hormon.  Menurut  Allred  (2004) sebuah  penelitian  menunjukkan  bahwa bangsa  Asia,  khususnya  Jepang,  memiliki resiko  yang  lebih  rendah  untuk  terserang penyakit  kanker  payudara  dan  gejala menopause,  dibanding  dengan  bangsa Eropa  dan  sekitarnya.  Hal  Ini  disebabkan oleh  banyaknya  konsumsi  kacang  kedelai di  kalangan  Asia.  Isoflavones  dapat mengurangi  kadar  kolesterol,  yang  dapat mengakibatkan atherosclerosis dan penyempitan  pembuluh  darah  sehingga dapat menurunkan resiko serangan jantung  dan stroke.
Tanaman  yang  banyak  terdapat  di Indonesia dan sudah diketahui mengandung  senyawa  isoflavon  dengan kadar  tinggi  selain  kedelai  adalah  kunyit, laos,  dan  temu  hitam  (Asih  2009).  Pada kacang kedelai banyak mengandung Genestein, Daidzein dan Glisitein (Kuiper,  1998),  sedangkan  pada  kunyit, laos dan temu hitam mengandung kakkatin, Biochanin A dan 6,4’- dihidroksi-7-metoksiisoflavon (Murata 1985).    Pada  tahun  1964  Gyorgy  dkk. menemukan  isoflavon  yang  diisolasi  dari tempe  tradisional  yaitu  faktor  2  (6,7,4’- trihidroksiisoflavon).
Menurut  penelitian  Kuiper  (1998) fitoestrogen
meliputi genistein , coumestrol dan zearalenone menstimulasi  aktivitas  transkripsi  kedua tipe  estrogen  reseptor  pada  konsentrasi  1- 10  nM.  Peringkat  potensi  estrogenik fitoestrogen terhadap  reseptor  estrogen  α adalah  sebagai  berikut:  Estradiol  >> zearalenone  =  coumestrol  >  genistein  > daidzein >  apigenin  =  phloretin  > biochanin  A  =  kaempferol  =  naringenin  > formononetin  =  ipriflavone  =  quercetin  = chrysin.  Sedangkan  potensi  estrogenik fitoestrogen  terhadap  reseptor  estrogen  β adalah Estradiol >> genistein = coumestrol  >  zearalenone  >  daidzein  > biochanin  A  =  apigenin  =  kaempferol  = naringenin > phloretin=  quercetin  = ipriflavone  = formonetin  = chrysin.
ONIOM merupakan  singkatan  dari Our  own  N-layered Integrated molecular Orbital and molecular Mechanic .
Singkatnya, ONIOM adalah  suatu  teknik perhitungan dengan membagi sistem menjadi  beberapa  lapisan  (layer),  bisa menjadi  dua  atau  tiga  lapisan  dengan metode  kimia  komputasi  yang  berbeda. Untuk  lapisan  yang  dalam  atau  ikatan antara  ligan  dan  residu  dari  reseptor estrogen  α  dan  β  disebut  sebagai  “ high layer ”.    Pada  high  layer  ini  optimasi  dan energi dihitung menggunakan metode QM ( Quantum  Mechanics )  sedangkan
lapisan  yang  tidak  berikatan  langsung dengan  ligan,  disebut  lapisan  “ low  layer ”.
Lapisan low  layer ini  optimasi  dan  energi dihitung  menggunakan  MM  ( Molecular Mechanics ).

## METODE
Perangkat  keras  yang  digunakan  pada penelitian  ini  adalah  Komputer  server ITB High Performance Computer ( HPC ) dan  sistem  operasi  Linux  Mandriva  2009 dan  perangkat  komputer  dengan  sistem operasi Windows 2010. HPC  ITB mempunyai  20 nodes dimana  setiap
nodes mempunyai  24 cores  intel  prosesor 16  GB  dengan  sistem  operasi Rocks Cluster .
Perangkat  Lunak  yang  digunakan dalam penelitian ini adalah untuk keperluan simulasi yaitu ACD/Chemsketch digunakan untuk
membuat  struktur  dua  dimensi  dan  tiga dimensi seluruh ligan. Avogadro digunakan  untuk  visualisasi  struktur  tiga dimensi ligan dari
hasil ACD/ChemSketch  maupun  Gaussian-09. Untuk membuat input data dan menentukan  “ low  layer ”  dan  “ high  layer ”
pada Gaussian-09 dengan metode
ONIOM digunakan Gaussview 5.0, sedangkan  untuk  keperluan  visualisasi adalah  VMD  digunakan  untuk  visualisasi dan  preparasi  input  yang  akan  digunakan
untuk  simulasi  pada  NAMD.  VMD  juga digunakan  untuk  menganalisa output dari hasil perhitungan simulasi NAMD. NAMD digunakan untuk optimasi struktur protein. Autodock Vina digunakan untuk simulasi docking
Reseptor  Estrogen  β  dengan  seluruh ligan.  Pymol  digunakan  untuk  visualisasi hasil proses docking juga hasil perhitungan dengan metode  ONIOM pada Gaussian-09.

## Optimasi  Struktur  Ligan  dan  Reseptor Estrogen
Ligan yang digunakan pada penelitian  ini  sebanyak  delapan  buah yaitu Estrogen, Genistein, Daidzein,
Glisitein,  Biochanin  A,  6,4’-dihidroksi-7- metoksiisoflavon,  Kakkatin  dan  Faktor  2. Struktur  ligan  digambar  menggunakan ACD/Chemsketch kemudian dibuat tampilan tiga dimensi. Input dibuat menggunakan
Avogadro untuk
selanjutnya  dilakukan  simulasi  optimasi geometri menggunakan Gaussian-09. Optimasi  geometri  diset  pada  temperatur 310  K  dengan  basis  6-31  G  (d)  dan  teori B3LYP.

## Simulasi Docking Reseptor Estrogen β – Ligan dan Penentuan Residu Aktif
Program Autodock  Vina digunakan untuk  menggabungkan  setiap  ligan  ke  RE
β. Autodock  dapat  menggabungkan
molekul ligan ke molekul protein globular yang rigid berdasarkan algoritma Lamarkian  genetic .  Model  ini mengkombinasikan kecepatan evaluasi energi menggunakan prekalkulasi kisi ( grid )  energi  afinitas  atomik  setiap  tipe atom  dalam  molekul  reseptor  dengan variasi algoritma pencarian untuk menemukan posisi pengikatan yang sesuai  untuk  ligan  dimana  pada  penelitian ini  digunakan genetic algorithm (GA).
Model  estrogen  reseptor  digunakan sebagai molekul target. Program Autodock  Vina 4.0  digunakan  untuk mengkalkulasikan  muatan  parsial  atom dalam  molekul  target.  Kisi  kubus  ( grid box )  (18  x  18  x  18)  dari  interaksi karbon,
hidrogen dan oksigen. Dilakukan penambahan  hidrogen  polar  pada  REα
menggunakan AutoDock  Vina .  Proses
docking REα-ligan juga dilakukan
menggunakan AutoDock  Vina .  REα  yang digunakan  adalah  REα  dalam  bentuk kristalnya  sebelum  dioptimasi  dan  REα dalam  bentuk  solvasi  setelah  optimasi. Hasil docking  dianalisis  menggunakan Pymol.  Untuk  menentukan  residu  asam amino yang aktif yang berikatan langsung  dengan  ligan  maka  digunakan software  Ligplot  dengan  memasukkan data PDB hasil  dari  autodock  Vina.

## ONIOM
Hasil  Docking  dari  autodock  Vina yang berbentuk PDB, divisualisasi dengan  Gaussview  5.0  kemudian  residu asam  amino  yang  berikatan  langsung dengan ligan dipilih menjadi  lapisan pertama  atau  “high  layer”  dan  dihitung menggunakan  metode  Density  Functional Theory  (DFT)    dan  basis  set  6-31G. Sedangkan residu lain yang tidak berikatan  langsung  dengan  ligan  dipilih sebagai  lapisan  kedua  atau  “Low  layer” dengan perhitungan Universal Force Field (UFF). Setelah persiapan di Gaussview 5.0 kemudian dihitung muatan  mulliken,  optimasi,  energi  pada low  layer  dan  high  layer  menggunakan Gaussian-09.

## HASIL  DAN PEMBAHASAN

## Optimasi Struktur Ligan
Komputasi  kimia  dapat  menjelaskan dengan  teliti  sifat  dan  parameter  yang  ada dalam sistem kimia. Beberapa diantaranya yaitu penentuan struktur/geometri,  frekuensi  vibrasi  dan spektra  berbagai  molekul.  Tahap  awal dari  studi  komputasi  adalah  menentukan optimasi geometri. Optimasi  geometri bertujuan  untuk  mendapatkan  struktur molekul tiga dimensi dengan energi minimum (keadaan paling stabil).
Penentuan optimasi geometri molekul diawali  dengan  perkiraan  awal  struktur yang  dinyatakan  dalam  Z-matrik.
Ligan  adalah  senyawa  organik  atau anorganik  yang  berperan  dalam  interaksi pada  domain  pengikatan  ligan  protein dan  dapat  mempengaruhi  aktivitas  pada protein  tersebut.  Ligan  dapat  berupa substrat, regulator, inhibitor,  kofaktor maupun  efektor  lain.  Dalam  penelitian  ini ligan  yang  berupa  senyawa  organik  yang berinteraksi  dengan  sisi  aktif  protein sebagai  molekul  pembawa  pesan  untuk mengaktifkan  reseptor  untuk  melakukan tahap  transkripsi.    Ligan  ini  dioptimasi agar  didapat  energi  elektronik  seminimal mungkin. Perhitungan ini dilakukan dengan pendekatan DFT ( Density Functional  Theory ),  yaitu  pendekatan untuk menghitung atau menentukan geometri  struktur  optimal  pada  molekul dengan  banyak  atom  secara  Quantum Mechanics  (QM).  Perhitungan  ini  juga dilakukan dengan pendekatan Born-
Oppenheimer  yaitu  inti  atom  dianggap diam  pada  saat  meninjau  gerak  elektron. Sehingga  energi  elektronik  yang  dihitung merupakan penjumlahan dari energi potensial  elektron  dan  energi  kinetik elektron. Ketika didapat geometri molekul  berada  pada  posisi  jarak  dan sudut  yang  paling  stabil.  Molekul  ini merupakan  bentuk  yang  paling  optimal
pada  simulasi  yang  menyerupai  sistem yang  sebenarnya.
Gambar  1. Reseptor Estrogen β (1QKM)  dengan Estrogen
Pada penelitian  ini  seluruh  ligan fitoestrogen dan estrogen dioptimasi menggunakan Gaussian-09.
Optimasi
geometri seluruh ligan berhasil dilakukan. Kerapatan elektron pada setiap  atom  dalam  molekul  juga  dapat ditentukan.  Struktur  RE  β  dan    ligan estrogen  sesudah  dioptimasi  dapat  dilihat pada Gambar  1.

## Docking
Proses  Docking  dilakukan  pada  RE  β yang  sudah  dioptimasi  dengan  ligan  yang sudah  dioptimasi  pula.  Pada  proses docking,  protein  reseptor  diasumsikan sebagai  molekul  yang  kaku,  sedangkan ligan  diasumsikan  sebagai  molekul  yang memiliki  beberapa  derajat  kebebasan, terutama  dalam  sudut  torsional,  karena beberapa parameter lainnya seperti
panjang  ikatan  dan  sudut  ikatan  memiliki nilai  konstan  untuk  konformasi  molekul yang  berbeda.  Oleh  karena  itu,  hasil  yang didapat  setelah  tahap docking adalah berbagai  energi  afinitas  interaksi  ligan yang dapat terikat pada domain pengikatan  ligan  RE  β.  Energi  afinitas ligan  terhadap  RE  diberikan  pada  Tabel 1.  Bila  dianggap  interaksi  pembentukan kompleks  estrogen  dengan  REβ  yang sudah  dioptimasi  dalam  kondisi  berair adalah  100%,  maka  persentasi  interaksi pembentukan    reseptor  estrogen  β  dapat dilihat  pada Tabel  2.
Tabel  1. Energi  Afinitas Ligan terhadap RE  β
Nama  Ligan Energi  Afinitas (Kkal/mol) Estrogen -6,8 Faktor 2 -6,7 Daidzein -6,5 Genistein -6,3 Kakkatin -5,9 Biochanin A -5,4 6,4  - dihidroksi - 7 – metoksiisoflavon -4,8 Glisitein -3,2
Tabel  2. Perbandingan persentase estrogenik dari isoflavon terhadap estrogen berdasarkan binding energi pada Reseptor Estrogen β Nama  Ligan Persentasi Interaksi Estrogen 100% Faktor 2 * 98,53  % Daidzein 95,59  % Genistein 92,65% Kakkatin  * 86,76  % Biochanin A 79,41  % 6,4  - dihidroksi - 7 – metoksiisoflavon* 70,59  % Glisitein* 47,05  % Keterangan:  Untuk  ligan  yang  bertanda  *  belum ada data eksperimen
Berdasarkan urutan potensi estrogenik  yang  tidak  sama  menunjukkan bahwa  hasil  pemodelan  struktur  reseptor- ligan  secara  komputasi  tidak  sejalan dengan  hasil  eksperimen  yang  dilakukan oleh  Kuiper  et  al,  namun  perbedaannya hanya  terletak  pada  urutan  daidzein  dan genestein.  Hal  ini  dikarenakan  adanya gugus  OH  yang  lebih  elektronegatif  pada gugus aromatik pada ligan  daidzein menyebabkan  adanya  ikatan  hidrogen antara  ligan  dengan  reseptor  estrogen lebih  stabil,  dan  menyebabkan  energi afinitas  antara  daidzein  dan  reseptor estrogen  menjadi  rendah.
Meskipun  terdapat  perbedaan  urutan potensi  estrogenik  antara  daidzein  dan genestein, akan tetapi perbedaannya hanya  2,94%  pada  reseptor  estrogen  β, sehingga perbedaanya tidak terlalu signifikan.  Sementara  itu,  untuk  ligan faktor 2, kakkatin, 6,4-dihidroksi-7- metoksiisoflavon  dan  glisitein  belum  ada data eksperimen.
Ira Handayani (2006) telah melakukan penelitian docking menggunakan  Autodock  virtual  screening dgn menggunakan NAMD. Hasil penelitian  tersebut  menunjukkan  bahwa faktor  2  mempunyai  afinitas  pengikatan terhadap  ER  β  jauh  lebih  tinggi dibandingkan  isoflavon  lainnya  sebagai agonis  ER  β,  dimana  afinitas  faktor  2
terhadap  ER  β  adalah  83,61%,  sedangkan untuk  isoflavon  lain  seperti  kakkatin, genistein, daidzein, 6,4-dihidroksi-7- metoksiisoflavon,  glisitein,  dan  biochanin A  secara  berturut-turut  prensentasenya adalah  sebagai  berikut:  80,29%,  79,29%, 78,95%, 77,51%, 77,40%, dan 76,74%.
Dari  kedua  penelitian  dapat  diambil kesimpulan  bahwa  dibandingkan  dengan isoflavon  lain,  faktor  2  memiliki  afinitas yang  paling  tinggi  hal  ini  dikarenakan struktur  faktor  2  mempunyai  tiga  gugus hidroksil  pada  posisi  C-6  ,  C-7  dan  C-4 sehingga  probabilitas  untuk  berinteraksi secara  ikatan  hidrogen  tinggi.  Ikatan hidrogen  penting  dalam  pengikatan  ligan dan  reseptor.  Struktur  dan orientasi docking dari  interaksi  secara  ikatan hidrogen  dari  faktor  2  menyebabkan banyak terbentuknya ikatan hidrogen antara  faktor  2 dan reseptor  estrogen.

## Gugus  fungsi  yang  berperan  pada Reseptor Estrogen β
Berdasarkan  Tabel  1  dapat  diketahui bahwa  energi  afinitas  estrogen  paling rendah  dibandingkan  ligan  lain.  Hal  ini disebabkan  karena  estrogen  mempunyai gugus  fenol  pada  posisi  C-3  dalam  cincin aromatik  A,  inti  hidrokarbon  yang  relatif kaku  dan  gugus  fungsi  alkohol  pada posisi  C-17.  Hidroksil  dari  C-3  berfungsi sebagai  donor  ikatan  hidrogen    dan  C-17
hidroksi berfungsi sebagai akseptor ikatan   hidrogen.
Inti  hidrokarbon  yang  relatif  datar menyebabkan energi afinitas  estrogen rendah,  hal  inilah  yang  menyebabkan kecocokan  geometri  dari  kedua  molekul pada  RE  β.  Estrogen  yang  terikat  dengan RE  β  memiliki  energi  afinitas  paling negatif yaitu  sebesar  -6,8  kkal/mol. Gugus hidroksi fenolik membentuk ikatan  hidrogen  dengan  Leu  476  dengan panjang  ikatan  3.07  Å.  Dua  ikatan hidrogen  yang  lain  terbentuk  dari  gugus hidroksi fenolik membentuk ikatan hidrogen  dengan  Arg  346  dan  Glu  305. Berdasarkan  hasil  perhitungan  dengan menggunakan  metode ONIOM ,  terdapat muatan  mulliken  pada  Arg  346  dan  Leu 476.  Hal  ini  menguatkan  bahwa  residu Arg  346  dan  Glu  305  mempunyai peranan  sebagai  residu  katalitik  dalam pengikatan ligan estrogen dengan reseptornya.
Gambar  2. Hasil ligplus Interaksi RE  β dengan Estrogen
Dibandingkan  dengan  isoflavon  lain, faktor  2  memiliki  afinitas  ikatan  jauh lebih  tinggi.  Hal  ini  dikarenakan  secara struktural  faktor  2  memiliki  tiga  gugus hidroksil  pada  posisi  C-6,  C-7  dan  C-4 sehingga  probabilitas  untuk  membentuk ikatan hidrogen tinggi. Terbentuknya tujuh ikatan hidrogen inilah yang menyebabkan faktor 2 lebih stabil sehingga  energi  afinitas  dari  faktor  2  ini rendah  bahkan  mendekati  energi  afinitas estrogen  yaitu  -6,7  kkal/mol.  Berdasrkan hasil  perhitungan  dengan  menggunakan metode ONIOM terdapat muatan mulliken pada,  Arg  346  serta  Glu  305.
Hal  ini  menunjukkan  bahwa  Arg  346 serta  Glu  305  merupakan  residu  katalitik dalam pengikatan ligan dengan reseptornya.
Gambar  3. Hasil ligplus Interaksi RE  β dengan Faktor 2
Energi Binding dengan metode ONIOM
ONIOM merupakan perhitungan optimasi  energi  antara    ligan  dan  REβ dimana  letak  ligan  telah  ditentukan  dari hasil  docking autodock vina pada  energi afinitas  yang  paling  rendah,  kemudian dioptimasi untuk menentukan energi yang  paling  rendah,  dan  diketahui  muatan mulliken untuk  menentukan  sisi  aktif  dari RE β.
Energi binding antara  ligan  dan reseptor  ditentukan  dengan  melakukan perhitungan  energi  RE  β  dengan  ligan kemudian  dikurangi  hasil  penjumlahan energi  reseptor  α  tanpa  ligan  dengan energi  ligan.
Urutan potensi estrogenik fitoestrogen  pada  RE  β  dari  percobaan Kuiper et  al. (1998)  adalah  sebagai berikut : Estradiol  >>  genistein  = coumestrol  >  zearalenone  >  daidzein  > biochanin  A  =  apigenin  =  kaempferol  = naringenin > phloretin=  quercetin  = ipriflavone = formonetin = chrysin. Urutan  potensi  estrogen  pada  RE  β adalah  Faktor  2  >  Genistein  >    Daizein  > Kakkatin  >  Biochanin  A  >  Glisitein  >
6,4’-dihidroksi-7-metoksiisoflavon. Dari hasil perhitsungan ONIOM ternyata urutan  potensi  estrogenik  yang  sama menunjukkan bahwa hasil  pemodelan struktur  reseptor-ligan  secara  komputasi
sejalan  dengan  dengan  hasil  penelitian Kuiper  (1998).
Tabel  3. Hasil  Energi Binding RE β dari metode ONIOM
Nama  Ligan Energi  (kKal) Estrogen -30,15 Faktor-2* -29,80 Genestein -29,41 Daidzein -28,89 Kakkatin* -28,31 Biochanin A -27,56 Glisitein* -26,52 6,4 –dihidroksi-7- metoksiisoflavon* -25,36
Keterangan  :  Untuk  ligan yang bertanda * belum ada data eksperimen
Akan tetapi, adanya perbedaan urutan  persentase  estrogenik  dari  hasil autodock  Vina dan  hasil  dari ONIOM menunjukkan bahwa Autodock  Vina merupakan  perhitungan  secara  kasar  dan belum memperhitungkan interaksi elektronik  antara  ligan  dan  reseptor. Sementara  itu,  pada  metode ONIOM terdapat  dua  perhitungan  dimana,  pada interaksi  antara  ligan  dan  sisi  aktif  pada RE  β  dihitung  secara quantum  mechanics (QM)  yaitu  interaksi  elektronik  dan fungsi  polarisasi  antara  ligan  dan  reseptor diperhitungkan,  sehingga  sangat  relevan dengan  struktur  dalam  molekul.
Perbandingan urutan potensi
estrogenik fitoestrogen berdasarkan
energi  afinitas  metode Autodock  Vina dan metode ONIOM belum bersesuaian secara  kualitatif.  Hal  ini  disebabkan  oleh ketelitian yang lebih baik untuk perhitungan secara ONIOM , yang ditunjukkan  oleh  kesesuaian  yang  lebih baik  dengan  data percobaan.

## KESIMPULAN
Faktor  2  (a.l  terdapat  di  tempe) mempunyai  potensi  yang  paling  baik sebagai hormon pengganti karena mempunyai  energi  afinitas  yang  paling tinggi  diantara  isoflavon  lain  terhadap  RE β  dengan  potensi  estrogenik    98,83  % .Kakkatin  yang  terdapat  pada  temu  hitam dan  laos  mempunyai  potensi  yang  cukup baik  untuk  berinteraksi  dengan  RE  β yaitu  86,76% .
Perbandingan urutan potensi estrogenik fitoestrogen berdasarkan energi  afinitas  metode Autodock  Vina dan metode ONIOM belum bersesuaian secara  kualitatif  hal  ini  disebabkan  oleh ketelitian yang lebih baik untuk perhitungan secara ONIOM , yang ditunjukkan  oleh  kesesuaian  yang  lebih baik  dengan  data percobaan.

## DAFTAR  RUJUKAN
Achadiat, C.M. 2003, Klinik  Net,
( http://situs.keseproInfo/aging/jul/20
03/ag01).
Allred,  D  Craig.,  Powel  Brown,  Daniel Medina.  2004,    The  Origin  of Estrogen  Receptor  alpha-positive  and estrogen alpha-negative human breast  cancer.  Texas,  USA. Breast
Cancer  Research ,  vol.  6,  hh.  240-
245.
Anonim.  2010, ACD/Chemsketch  12.0 for  Microsoft  Windows.  Reference
Manual. Comprehensif
Interface
Description. Advance Chemistry
Development,  Inc.  United  States . Hh.
131-171.
Asih,  I.  A.R.  Astiti.  2009,  Isolasi  dan Identifkasi  Senyawa  Isoflavon  dari Kacang Kedelai (Glycine max).
Jurusan  Kimia  FMIPA  Universitas Udayana,  Bukit  Jimbaran., Jurnal Kimia, vol.  3, no. 1, hh.  33-40.
Barz,  W.,  Heskamp,  Klus,  K.,  Rehms,  H.
dan  Steinkamp,  R.  1993,  Recent Aspect of  Protein,  Phytate  and
Isoflavone Metabolism by Microorganisms Isolated from Tempe-Fermentation, Tempo
Workshop, Jakarta, 15 Februari  1993.
Barz,  W.  Ang  G.B.  Papendorf  1991,
Metabolism of isoflavones and
formation  of  factor-2  by  tempeh producing microorganism. Tempeh Workshop, Cologne , 20 May  1991.
Bennion, B.J. 2005, Computational
Characterization  and  Prediction  of
Estrogen
Receptor Coactivator Binding  Site  Inhibitors, Lawrence Livermore  National  Laboratory.
Gyorgy,  P.,  K.  Murata,  and  H.  Ikehata 1964,  Antiokxidants  isolated  from fermented  soybeans  tempeh. Nature.
203, hh.  872-875.
Handayani,  Ira.  2006, Studi  Komputasi Interaksi  6,7,4’-trihidroksiisoflavon (faktor2)  dengan  Estrogen  Reseptor
β, Tesis  tidak  diterbitkan,  Institut
Teknologi  Bandung.
Hanwell,  Marcus  D.,  Geoff  Hutchison, Tim Vandermeersch
2010,
Avogadro:  Molecule  Editor  and Visualizer .
Humphrey,  W.,  Dalke,  A.  and  Schultenn, K  2011,  VMD  –  Visual  Molecular Dynamics.J.  Molec. Graphics  1996 .
vol.  14, no. 1, hh.  33-38.
Kuiper, George G.J.M. 1998, ENDOCRINOLOGY:  Interaction  of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen
Receptor  β, The    Endocrine  Society .
139, hh.  4252-4263.
Murata, K. 1985, Formation of antioxidant  and  nutrient  in  tempe. Asian  Symposium  on  Non-salted Soybean Fermentation , Tsukuba,
Japan, July  14-16.
Naim,  M.  1973,  A  new  isoflavone  from soybeans. Phytochemistry ,  vol.  12,
hh.  169-171.
Prawiroharsono,  S.  2001, Prospek  dan
Manfaat  isoflavon  untuk  kesehatan,
diakses 8 Februari 2005, (http://www.tempo.co.id/medika/arsi
p/042001/pus-s.htm).
Philips, James, Tim isgro, Marcos
Sotomayor,  Elisabeth  Villa  2010, NAMD tutorial . University of Illinois  at Urbana-Champaign.  7-35.
Siliger,  Daniel,  Bert  L.  de  Groot  2010,
L igand  Docking  and  Binding  Site Analysis  With  Pymol  and  Autodock Vina. Computational Biomoleculer
Dynamics
Group, Max-Planck- Institute  for  Biophysical  Chemistry,
112, hh.  625-632.
Schrodinger, LLC. 2010, Maestro Command Reference Manual.
Version  9.1. New York, hh.  5-30. Trott  O,  Olson  A.  2010,  Autodock  Vina:
Improving  The  Speed  and  Accuracy of  Docking  with  A  New  Scoring Function,  Efficient  Optimization  and Multithreading, J  Comp  Chem ,  vol.
31, hh.  455-461.
Wang, C. &  M.S.  Kurzer  2003,
Phytoestrogen
Concentration Determines Effects on DNA synthesis in  Human  Breast  Cancer  Cells. Nutrition and Cancer , 28 (3).
Wan.Y,  Man.  W.G,  et  al.  2008,  The  Red
Clover (Trifolium pratense)
Isoflavone Biochanin A inhibits aromatase  activity  and  expression, British  Journal  of  Nutrition ,  vol.  99, hh.  303-310.
Zilleken,  F.  1986, First  draft  meeting  on biotechnology, BPP Teknologi,
Jakarta, 11 Maret  1986.