## KAJIAN REVERSIBILITAS INTERAKSI MARMIN TERHADAP
RESEPTOR HISTAMIN H 1 , ASETILKOLIN MUSKARINIK Ach-M 3 dan β 2 -ADRENERGIK
Yance Anas 1) , Agung Endro Nugroho 2) , Sugeng Riyanto 3)
1) Bagian Farmakologi dan Farmasi Klinik Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang
2) Bagian Farmakologi dan Farmasi Klinik Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
3) Bagian Kimia Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

## ABSTRAK
Penelitian  terdahulu  menyimpulkan  bahwa  marmin  (7-(6’,7’-dihidroksigeranil-oksi)  kumarin) dapat menghambat kontraksi otot polos trakea marmut terisolasi melalui efeknya sebagai antagonis reseptor H 1 dan Ach-M 3 . Marmin juga sedikit meningkatkan efek relaksasi otot polos trakea yang diinduksi  oleh  isoproterenol  melalui  interaksinya  terhadap  reseptor  β 2 -adrenergik.  Penelitian  ini bertujuan untuk mengevaluasi efek reversibelitas interaksi marmin terhadap reseptor H 1 , Ach-M 3 dan  β 2 -adrenergik.    Penelitian  ini  menggunakan  metode  percobaan  organ  terisolasi.  Uji reversibilitas  dilakukan  setelah  perlakuan  marmin  (10  dan  100  μM)  terhadap  kontraksi/relaksasi otot  polos  trakea  yang  diinduksi  oleh  agonis  (histamin,  metakolin  dan  isoproterenol).  Otot  polos trakea dicuci selama 30 menit dengan penggantian larutan bufer Krebs setiap lima menit.  Setelah dicapai  kondisi  yang  stabil,  selanjutnya  dilakukan  pengukuran  kontraksi  atau  relaksasi  kembali dengan pemberian konsentrasi bertingkat histamin (10 -8 – 10 -3 ) M, metakolin (10 -8 – 10 -3 ) M dan isoproterenol  (1  x  10 -7 –  3  x  10 -3 M).  Data  disajikan  dalam  bentuk  nilai  pD 2 (rata-rata  ±  SEM) yang  diperoleh  dari  kurva  hubungan  negatif  logaritma  konsentrasi  agonis  yang  menghasilkan setengah  respon  (kontraksi/relaksasi)  maksimal.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  interaksi marmin  terhadap  protein  reseptor  H 1 ,  Ach-M 3 ,  dan  β 2 -adrenergik  otot  polos  trakea  bersifat reversibel. Hasil analisis varian satu jalan menyimpulkan perbedaan nilai pD 2 histamin, metakolin dan isoproterenol sebelum dan setelah perlakuan marmin tidak bermakna secara statistik (p>0,05). Kata  Kunci :  Farmakodinamik  marmin,  uji  reversibelitas,  reseptor  H 1 ,  Ach-M3  dan  β 2 – adrenergik, percobaan organ terisolasi

## ABSTRACT
Previous  studies  concluded  that  amarmin(7  -  (6  ',  7'-dihidroxygeranyl-oxy)  coumarin)  shown  to inhibit isolated guinea-pig tracheal smooth muscle contraction through its effect as an H 1 and Ach- M 3 receptor's antagonist. Marmin also slightly increases tracheal smooth muscle relaxation induced by  isoproterenol  through  its  interaction  on  β 2 -adrenergic  receptor.  The  purpose  of  this experimental study was to evaluate the reversibility of marmin interaction on H 1 , Ach-M 3 and β 2 - adrenergic  receptors.The  study  conducted  using  in  vitro  isolated-trachea  experimental. Reversibility  studies  performed  after  marmin  (10  and  100)  μM  treatment  on  tracheal  smooth muscle  contraction/relaxation  induced  by  agonists  (histamine,  methacholine  and  isoproterenol). Trachea  was  washed  for  30minuteswith  Krebs  buffer  solution  replacement  every  five  minutes. Furthermore, trachea contracted or relaxed with series histamine (10 -8 – 10 -3 ) M; methacholine (10 - 8 – 10 -3 ) M and isoproterenol (10 -7 – 3.10 -3 ) M. Data were expressed as mean±SEM. The pD 2 values are  derived  from  the  negative  logarithm  to  base  10  of  the  agonist's  concentration  which  cause  a half  maximal  response  to  the  contraction  or  relaxation.The  results  showed  that  the  marmin interaction on H 1 , Ach-M 3 , and β 2 -adrenergic receptors are reversible. One-way Anova concluded that histamine, metacholine and isoproterenol pD 2 value before and after marmin (10 and 100) μM treatments are not different statistically (p>0.05).
Key Word :  Marmin reversibility studies, H 1 , Ach-M 3 and β 2 -adrenergic receptors, isolated organ experimen

## PENDAHULUAN
Salah satu gejala alergi adalah kontraksi otot polos trakea yang mengakibatkan penyempitan saluran pernafasan. Histamin dan asetilkolin
memainkan  peranan  penting  dalam  kontraksi otot  polos  saluran  pernafasan.  Aktivasi reseptor  histamin  (H 1 )  oleh  histamin  dapat menginduksi penyumbatan saluran pernafasan pada  subjek  manusia  sehat  (Taylor-Clark, et.al .  2005).    Begitu  juga  dengan  asetilkolin, efek  asetilkolin  yang  dilepaskan  oleh  ujung syaraf  parasimpatis  dan  berbagai  sel  epitel bronkus  adalah  terjadinya  hipereaktivitas saluran  pernafasan,  kontraksi  otot  polos, bronkokonstriksi,  peningkatan  sintesis  dan sekresi mukus selama reaksi inflamasi, seperti yang  dialami  oleh  para  penderita  asma  alergi dan chronic  obstruction  pulmonary  disease (COPD) (Sonar dan Renz, 2009).  Oleh karena itu,  salah  satu  strategi  terapi  yang  dapat dilakukan  dalam  mengatasi  gejala  alergi  pada saluran pernafasan adalah dengan menghambat  interaksi  histamin  dan  atau asetilkolin  dengan  reseptor  spesifiknya,  yaitu dengan antagonis reseptor histamin (antihistamin) dan antagonis reseptor asetilkolin muskarinik (antikolinergik). Selanjutnya, untuk mempercepat efek pemulihan  saluran  pernafasan,  otot  polos saluran pernafasan direlaksasi dengan
menggunakan  agonis  reseptor  β 2 -adrenergik (Barnes, 1989).
Marmin  (gambar  1)  merupakan  salah satu  senyawa  turunan  kumarin  dengan subsitusi  atom  O  pada  atom  C  nomor  7 struktur  induk  kumarin.    Marmin  dilaporkan sangat  poten  menghambat  pelepasan  histamin dari kultur sel RBL-2H3 melalui penghambatan Ca 2+ uptake secara in  vitro . Marmin  juga  diduga  memiliki  potensi  yang baik  untuk  dikembangkan  sebagai  antagonis reseptor  histamin  H 1 dan  antagonis  reseptor asetilkolin  muskarinik  (Ach-M 3 ).    Isolat marmin  dari Aurantii  Fructus  Immaturus memiliki  efek  relaksasi  terhadap  ileum marmut  terisolasi  yang  dikontraksi  oleh asetilkolin dan histamin (Takase, et.al ., 1994). Marmin  dilaporkan  menghambat  kontraksi otot  polos  trakea  marmut  terisolasi  melalui efeknya  sebagai  antagonis  reseptor  H 1 dan Ach-M 3 .  Marmin  juga  sedikit  meningkatkan efek relaksasi otot polos trakea yang diinduksi oleh isoproterenol melalui interaksinya dengan reseptor  β 2 -adrenergik (Nugroho, et.al ., 2011).Penelitian ini mencoba untuk
menelusuri  lebih  lanjut  tentang  interaksi marmin terhadap reseptor H 1 , Ach-M 3 dan β 2 - adrenergik  otot  polos  trakea  terisolasi  dengan cara  melihat  kemampuan  disosiasi  ikatan marmin  dengan  ketiga  reseptor  tersebut setelah  dilakukannya  pencucian  otot  polos trakea dengan penggantian larutan bufer Krebs setiap lima menit selama 30 menit.
Gambar 1. Struktur Kimia marmin atau atau (7-(6’,7’-dihidroksigeranil-oksi) kumarin)

## METODE PENELITIAN

## Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  marmin  yang  diisolasi  dari  kulit batang Aegle  marmelos Correa  pemberian Prof. Dr. Sugeng Riyanto, M.S., Apt., (Bagian Kimia  Farmasi  Fakultas  Farmasi  Universitas Gadjah Mada Yogyakarta).  Hewan percobaan yang  digunakan  adalah  marmut  jantan  ( Cavia porcellus ), berat badan antara 400 – 500 gram yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Fakultas
Farmasi  UGM.  Bahan  kimia  yang  digunakan adalah bufer Krebs dengan kualitas farmasetis, gas  karbogen  mengandung  95%  oksigen  dan 5%  karbondioksida  (PT.  Aneka  Gas  dan Industri Semarang Cabang  Yogyakarta),
agonis reseptor histamin, metakolin,
isoproterenol  (Sigma,  USA),  dan  akuades
(Laboratorium  Kimia  Instrumental,  Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada).

## Cara Penelitian
Penyediaan  larutan  uji,  marmin  dibuat dalam  larutan  stok  2  x  10 -2 M,  yaitu  dengan cara menimbang marmin (BM : 332,38 g/mol) secara  seksama  seberat    33,2  mg  dan dilarutkan  ke  dalam  4,994  mL  DMSO. Larutan stok marmin 2 x 10 -3 M dibuat dengan mengencerkan larutan stok marmin 2 x 10 -2 M
dengan larutan bufer Krebs.  Sebagai senyawa uji,  marmin  diberikan  dalam  konsentrasi  10 dan 100 µM.  Larutan stok marmin konsentrasi 2  x  10 -2 M  diinjeksikan  sebanyak  100  µL  ke dalam organ  bath yang  telah  berisi  organ trakea dan larutan bufer Krebs 20,0 mL untuk mencapai marmin konsentrasi 100 µM. Penelitian dilakukan dengan menggunakan  metode  organ  terisolasi,  otot polos trakea yang telah dipreparasi sedemikian rupa dimasukkan ke dalam alat organ bath 20,0 mL yang  telah  berisi  larutan  bufer  Krebs.  Uji reversibilitas dilakukan untuk melihat kemampuan organ untuk kembali pada kondisi semula, atau pada kondisi sebelum dilakukannya  pengenalan  histamin,  metakolin dan isoproterenol (agonis reseptor).
Tahap  pertama  yang  dilakukan  dalam penelitian  ini  adalah  mengukur  respon kontraksi otot polos trakea yang diinduksi oleh seri konsentrasi histamin dan metakolin (10 -8 – 10 -3 M),  serta  respon  relaksasi  otot  polos trakea  yang  diinduksi  oleh  isoproterenol  (10 -7 –  3.10 -3 M)  setelah  dikontraksi  dengan metakolin  10 -4 M.  Respon  kontraksi/relaksasi otot  polos  trakea  tercatat  pada  rekorder.  Pada tahap  ini  didapatkan  data  kurva  hubungan logaritma konsentrasi histamin, metakolin dan isoproterenol terhadap % respon
kontraksi/relaksasi  otot  polos  trakea  (kontrol). Selanjutnya,  dilakukan  pencucian  otot  polos trakea  selama  30  menit  dengan  penggantian larutan bufer Krebs setiap lima menit.
Tahap  kedua,  dilakukan  uji  aktivitas marmin (10 dan 100 μM). Marmin diberikan 5 menit  sebelum  pemberian  seri  konsentrasi agonis  reseptor  (histamin,  metakolin  dan isoproterenol) dan dilanjutkan dengan pemberian  seri  konsentrasi  agonis  reseptor dengan konsetrasi dan cara yang sama dengan pengukuran pertama kalinya. Tahap selanjutnya, kembali dilakukan pencucian otot polos  trakea  selama  30  menit  dengan
penggantian  larutan  bufer  Krebs  setiap  lima menit.
Tahap  ketiga  adalah  uji  reversibelitas marmin.  Setelah  dicapai  kondisi  yang  stabil pada pencucian otot polos trakea tahap kedua, selanjutnya dilakukan pengukuran kontraksi/relaksasi  otot  polos  trakea  kembali melalui  pemberian  seri  konsentrasi  histamin, asetilkolin dan isoproterenol dengan konsentrasi  dan  cara  yang  sama  pada  saat
pengukuran respon kontraksi otot polos trakea pertama  kali.    Pada  uji  reversibilitas  ini, didapatkan  data  kurva  hubungan  logaritma konsentrasi histamin, metakolin dan isoproterenol terhadap % respon kontraksi/relaksasi  otot  polos  trakea.  Data kurva hubungan logaritma konsentrasi histamin,  metakolin  dan  isoproterenol  dengan % respon  kontraksi/relaksasi otot polos  trakea sebelum  dan  setelah  perlakuan  marmin  (10 dan  100  μM)  kemudian  dibandingkan  secara statistik.

## Analisa Data
Data  yang  diperoleh  dalam  penelitian ini  berupa  data  kontraksi  atau  relaksasi  otot polos  trakea  yang  terekam  pada  rekorder akibat  pemberian  agonis  reseptor.    Data tersebut  diubah  menjadi  data  persentase  (%) respon  kontraksi  atau  relaksasi  terhadap respon  maksimum  yang  dicapai  kontrol. Selanjutnya,  data  terebut  disajikan  dalam bentuk  kurva  hubungan  antara  logaritma konsentrasi agonis reseptor (histamin, metakolin,  dan  isoproterenol)  terhadap  % respon  kontraksi  atau  relaksasi  otot  polos trakea.  Dari  kurva  tersebut  dihitung  pD 2 histamin,  pD 2 metakolin,  pD 2 isoproterenol sebelum  dan  setelah  perlakuan  marmin  dan dibandingkan secara statistik.  Analisa statistik yang  digunakan  adalah  analisa  varian  satu jalan  yang  dilanjutkan  dengan  uji  Tukey  pada taraf kepercayaan 95%.

## HASIL PENELITIAN
Marmin telah terbukti memiliki aktivitas  sebagai  antagonis  resptor  H 1 dan Ach-M 3 ,  dan  mampu  meningkatkan  efek relaksasi  isoproterenol  pada  otot  polos  trakea marmot  terisolasi.  Penelitian  ini  ditujukan untuk  mengamati  kemampuan  disosiasi  ikatan marmin  dengan  reseptor  H 1 ,  Ach-M 3 dan  β 2 - adrenergik otot polos trakea setelah dilakukannya  pencucian  otot  polos  trakea
dengan penggantian larutan bufer Krebs setiap lima menit selama 30 menit.
Uji Reversibilitas Marmin terhadap Reseptor H 1 Otot Polos Trakea Tujuan uji reversibilitas marmin
terhadap  reseptor  H 1 adalah  untuk  melihat kemampuan  disosiasi  ikatan  marmin  dengan reseptor  H 1 otot  polos  trakea  setelah dilakukannya  pencucian  otot  polos  trakea dengan penggantian larutan bufer Krebs setiap lima  menit  selama  30  menit.    Sifat antagonisme  marmin  dikatakan  reversibel apabila  pemberian  seri  konsentrasi  histamin setelah praperlakuan otot polos trakea terisolasi  dengan  marmin  menghasilkan  profil kurva  %  respon  kontraksi  yang  persis  sama dengan  profil  kurva  sebelum  praperlakuan marmin.  Kurva % respon kontraksi otot polos trakea  pada  uji  reversibilitas  marmin  10  dan 100 μM dapat dilihat pada gambar 2.
Hasil  uji  reversibilitas  menunjukkan bentuk profil kurva hubungan respon kontraksi otot  polos  trakea  terisolasi  histamin  (kontrol), reversibilitas  marmin  10  dan  100  μM  yang
relatif  sama,  sehingga  dapat  disimpulkan marmin  memiliki  kemampuan  disosiasi  yang baik  setelah  berinteraksi  dengan  reseptor  H 1 dan  interaksi  marmin  dengan  reseptor  H 1 bersifat  reversibel.  Tidak  adanya  penurunan respon  kontraksi  maksimal  otot  polos  trakea pada saat uji reversibilitas marmin menujukkan  bahwa  pencucian  otot  polos trakea  dengan  penggatian  larutan  bufer  Krebs setiap  lima  menit  selama  30  menit  mampu melepaskan  semua  ikatan  marmin  dengan reseptor  H 1 otot  polos  trakea.    Selain  itu, interaksi  marmin  dengan  reseptor  H 1 tidak mengakibatkan  kerusakan  atau  berkurangnya jumlah  reseptor  H 1 yang  aktif  pada  otot  polos trakea.  Pergeseran nilai pD 2 histamin pada uji reversibilitas  marmin  tersaji  pada  gambar  3. Dari  hasil  uji  statistik,  disimpulkan  bahwa nilai pD 2 histamin tidak mengalami penurunan yang  bermakna  pada  saat  uji  reversibilitas marmin,  sehingga  secara  keseluruhan  dapat disimpulkan  bahwa  marmin  bertindak  sebagai reversibel antagonis kompetitif terhadap reseptor H 1 .
Gambar  2. Kurva  hubungan  logaritma  konsentrasi  histamin  (M)  terhadap  %  respon  kontraksi  otot  polos trakea terisolasi pada uji reversibilitas marmin 10 dan 100 μM terhadap reseptor H 1 . Persentase respon kontraksi disajikan dalam bentuk rata-rata ± SEM (n = 5 - 8)
Uji Reversibilitas Marmin terhadap Reseptor Ach-M 3 Otot Polos Trakea Uji  reversibilitas  marmin  terhadap reseptor Ach-M 3 dilakukan setelah uji pengaruh  praperlakuan  marmin  terhadap respon  kontraksi  otot  polos  trakea  terisolasi yang diinduksi oleh seri konsentrasi metakolin.  Sebelum uji reversibilitas dimulai, otot  polos  trakea  dicuci  dengan  penggantian larutan  bufer  Krebs  setiap  lima  menit  selama 30  menit.    Tujuan  uji  reversibilitas  marmin terhadap  reseptor  Ach-M 3 adalah  untuk
melihat  kemampuan  disosiasi  ikatan  marmin dengan  reseptor  Ach-M 3 otot  polos  trakea setelah  dilakukannya  pencucian  otot  polos trakea.    Kurva  %  respon  kontraksi  otot  polos trakea  pada  uji  reversibilitas  marmin  (10  dan 100)  μM  terhadap  reseptor  Ach-M 3 dapat dilihat  pada  gambar  4.    Pergeseran  nilai  pD 2 metakolin  pada  uji  reversibilitas  marmin terhadap reseptor Ach-M 3 tersaji pada gambar 5.
Hasil  uji  reversibilitas  menunjukkan bahwa profil kurva hubungan respon kontraksi
otot  polos  trakea  terisolasi  uji  reversibilitas marmin  (10  dan  100)  μM  sedikit  bergeser  ke arah  kanan    dibandingkan  profil  kurva metakolin  (kontrol),  dan  pergeseran  kurva tersebut  mengakibatkan  penurunan  harga  pD 2 metakolin.      Hasil  uji  statistik  dengan  Anava satu jalan menyimpulkan bahwa tidak terdapat
perbedaan  yang  bermakna  antara  nilai  pD 2 metakolin (kontrol) dengan nilai pD 2 metakolin  hasil  uji  reversibilitas  marmin  (10 dan  100)  μM,  sehingga  dapat  disimpulkan bahwa  interaksi  marmin  dengan  protein reseptor  Ach-M3  otot  polos  trakea  bersifat reversibel.
Gambar  3. Pergeseran nilai pD 2 histamin pada uji reversibilitas marmin 10 dan 100 μM terhadap reseptor H 1 .  Nilai  pD 2 disajikan  dalam  bentuk  rata-rata  ±  SEM  (n  =  5–8).    Hasil  analisa  varian  satu jalan  tidak  menunjukkan  perbedaan  yang  bermakna  (p>0,05)  terhadap  nilai  pD 2 histamin/control
Gambar 4. Kurva hubungan logaritma konsentrasi metakolin (M) terhadap % respon kontraksi otot polos trakea  terisolasi  pada  uji  reversibilitas  marmin  10  dan  100  μM  terhadap  reseptor  Ach-M 3 . Persentase respon kontraksi disajikan dalam bentuk rata-rata ± SEM (n = 5 – 8).
Gambar  5. Pergeseran nilai pD 2 metakolin pada uji reversibilitas marmin 10 dan 100 μM terhadap reseptor asetilkolin  Ach-M 3 .  Nilai  pD 2 disajikan  dalam  bentuk  rata-rata  ±  SEM  (n  =  5  –  8).    Analisa varian  satu  jalan  tidak  menunjukkan  perbedaan  yang  bermakna  (p>0,05)  terhadap  nilai  pD 2 metakolin/control
Uji Reversibilitas Marmin terhadap Reseptor β 2 -Adrenergik Otot Polos Trakea
Uji  reversibilitas  marmin  terhadap reseptor  β 2 -adrenergik  dilakukan  setelah  uji pengaruh  praperlakuan  marmin  terhadap
respon  relaksasi  otot  polos  trakea  terisolasi yang diinduksi oleh seri konsentrasi isoproterenol.    Sebelum  uji  reversibilitas dimulai,  otot  polos  trakea  dicuci  dengan penggantian  larutan  bufer  Krebs  setiap  lima menit  selama  30  menit.    Kurva  %  respon relaksasi otot polos trakea pada uji reversibilitas marmin 10 dan 100 μM terhadap reseptor  β 2 -adrenergik  dapat  dilihat  pada gambar  6.    Pergeseran  nilai  pD 2 metakolin pada  uji  reversibilitas  marmin  terhadap reseptor Ach-M 3 tersaji pada gambar 7.
Hasil  uji  reversibilitas  menunjukkan bahwa profil kurva hubungan respon kontraksi
otot polos trakea terisolasi pada uji reversibilitas  marmin  10  dan  100  μM  terlihat hampir  berhimpitan  dengan  profil  kurva kontrol.   Hasil uji statistik dengan Anava satu jalan  menyimpulkan  bahwa  tidak  terdapat perbedaan  yang  bermakna  antara  nilai  pD 2 isopreterenol  (kontrol)  dengan  nilai  pD 2 isoproterenol pada uji reversibilitas marmin 10 dan  100  μM  (p  <  0,05),  sehingga  dapat disimpulkan  bahwa  interaksi  marmin  dengan protein  reseptor  β 2 -adrenergik  otot  polos trakea bersifat reversibel.
Gambar 6. Kurva hubungan logaritma konsentrasi isoproterenol (M) terhadap % respon relaksasi otot polos trakea  terisolasi  pada  uji  reversibilitas  karena  pengaruh  marmin  10  dan  100  μM  terhadap reseptor β 2 -adrenergik.  Persentase respon kontraksi disajikan dalam bentuk rata-rata ± SEM (n = 5-8).
Gambar 7. Pergeseran  nilai  pD 2 isoproterenol  pada  uji  reversibilitas  marmin  10  dan  100  μM  terhadap reseptor β 2 -adrenergik. Nilai pD 2 disajikan dalam bentuk rata-rata ± SEM (n = 5 – 8).  Analisa varian  satu  jalan  tidak  menunjukkan  perbedaan  yang  bermakna  (p>0,05)  terhadap  nilai  pD 2 isoproterenol/kontrol

## Diskusi dan Pembahasan
Takase, et.al . (1994) melaporkan bahwa marmin  memiliki  efek  relaksasi  terhadap  otot polos  ileum  marmut  terisolasi  yang  diinduksi oleh  histamin  dan  asetilkolin.  Penelitian sebelumnya mengungkap marmin dapat menghambat  kontraksi  otot  polos  trakea marmut  terisolasi  melalui  efeknya  sebagai
antagonis  reseptor  H 1 dan  Ach-M 3 .  Marmin juga  sedikit  meningkatkan  efek  relaksasi  otot polos trakea yang diinduksi oleh isoproterenol melalui  interaksinya  dengan  reseptor  β 2 - adrenergik  (Nugroho, et.al .,  2011).  Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari efek reversibelitas interaksi marmin dengan reseptor H 1 , Ach-M 3 dan β 2 -adrenergik.
Penelitian  kajian  reversibelitas  marmin terhadap  reseptor  H 1 ,  Ach-M 3 dan  β 2 - adrenergik ini dilakukan dengan menggunakan preparat otot polos trakea dalam media larutan buffer Krebs pada alat organ terisolasi. Metode organ  terisolasi  merupakan  metode  klasik dalam  percobaan  farmakologi  yang  dapat digunakan untuk menganalisa hubungan dosis- respon  suatu  senyawa  obat.    Dengan  metode ini,  konsentrasi  agonis  dan  antagonis  reseptor pada  tingkat  jaringan  dapat  diketahui  secara pasti.    Metode  ini  mempunyai  kemampuan untuk  mengukur  efek  sampai  pada  efek dengan  intensitas  maksimum.    Hal  ini  tidak sepenuhnya dapat dilakukan
ketika menggunakan  organisme  utuh  (pengujian secara in  vivo ).    Selain  itu,  metode  ini  juga dapat  mengukur  konsentrasi  agonis  terkecil yang dapat menginduksi respon biologis.
Metode ini memiliki beberapa kelemahan dan kurang menggambarkan kondisi  di  dalam  tubuh  manusia  yang sebenarnya.    Larutan  bufer  Krebs  yang digunakan  tidak  sepenuhnya  sama  dengan cairan  fisiologis  dalam  tubuh,  sehingga  lama kelamaan  akan  berpengaruh  buruk  terhadap jaringan.    Selain  itu,  isolasi  organ  dalam  alat ini  akan  mengakibatkan  hilangnya  fungsi regulasi fisiologis pada organ tersebut (Lullmann, et.al ., 2000).  Pencucian otot polos trakea  dengan  pergantian  larutan  bufer  Krebs selama  45  menit  pada  fase  ekuilibrasi  akan menghilangkan  pengaruh  senyawa  relaksan seperti  nitrogen  oksida  (NO)  dan  berbagai enzim  yang  dilepaskan  oleh  sel  epitel  trakea terhadap  rangsangan  senyawa  spasmogen (Barnes,  1989).  Fungsi  regulasi  dari  enzim yang  terlibat  dalam  degradasi  histamin  dan asetilkolin  (induktor  kontraksi  otot  polos trakea)  juga  akan  hilang  pada  fase  ekuilibrasi ini.  Pada akhirnya, respon kontraksi-relaksasi otot  polos  trakea  yang  merupakan  fungsi homeostasis  normal  pada  organ  ini  tidak terbaca lagi pada detektor.
Penelitian  ini  menyimpulkan  bahwa interaksi  marmin  dengan  reseptor  H 1 bersifat reversibel.    Uji  reversibilitas  menghasilkan profil  kurva  hubungan  logaritma  konsentrasi histamin  terhadap  %  respon  kontraksi  otot polos  trakea  yang  mirip  dengan  profil  kurva sebelum  dilakukan  uji  pengaruh  marmin (kontrol)  dan  perbedaan  nilai  pD 2 histamin pada  uji  reversibilitas  marmin  (10  dan  100) μM  tidak  berbeda  bermakna  dibandingkan kontrol.    Penelitian  Nugroho, et.al .  (2011)
menyimpulkan bahwa marmin memiliki afinitas  yang  relatif  lemah  terhadap  reseptor H 1 dengan  nilai  pA 2 sebesar  2,302  sehingga diperkirakan potensi marmin sebagai antagonis reseptor H 1 tidak terlalu tinggi.  Hal ini  dapat  diketahui  lebih  jelas  dengan  cara melihat  bentuk  ikatan  dan  kekuatan  ikatan antara  marmin  dengan  reseptor  H 1 ,  sehingga memerlukan  data  penelitian  lebih  lanjut. Walaupun  demikian,  potensi  marmin  sebagai antihistamin  dalam  mengurangi  gejala  alergi secara in  vivo perlu  dilakukan  karena  marmin juga telah diketahui mampu menekan pelepasan  histamin  dari  kultur  sel  mast (Nugroho, et.al ., 2008).
Berdasarkan  berbagai  laporan  hasil penelitian  terdahulu,  antihistamin  generasi pertama  juga  memiliki  aktivitas  sebagai antikolinergik  (Repka-Ramirez  dan  Baraniuk, 2002).  Reseptor  Ach-M 3 adalah  reseptor terikat  protein  G q dan  merupakan  subtipe reseptor  asetilkolin  muskarinik  utama  yang bertanggung  jawab  terhadap  kontraksi  otot polos  saluran  pernafasan  (Gosens, et.al ., 2006).
Penelitian  Nugroho, et.al. (2011)  juga menyimpulkan bahwa marmin memiliki aktivitas  sebagai  antagonis  reseptor  Ach-M 3 . Marmin  10  dan  100  μM  mampu  menurunkan nilai  pD 2 metakolin  secara  berturut  turut  dari 6,18  menjadi  5,71  dan  5,59  (p<0,05).    Akan tetapi,  peningkatan  konsentrasi  marmin  tidak dapat  menurunkan  pD 2 metakolin  secara bermakna  (p>0,05).    Analisa  Shild-Plot menghasilkan  nilai slope sebesar  0,  1906 (menjauhi angka satu) sehingga dapat disimpulkan  bahwa  mekanisme  antagonisme marmin  terhadap  reseptor  Ach-M 3 bukan melalui mekanisme antagonism secara kompetitif.  Marmin  mungkin  menghambat efek  metakolin  dengan  cara  berikatan  pada bagian  lain  di  luar  sisi  aktif  reseptor  Ach-M 3 , sehingga  akan  menghambat  fungsi  reseptor tersebut,  atau  bisa  diakibatkan  karena  marmin memediasi  perubahan  reaktivitas  reseptor terhadap metakolin.  Hasil uji reversibilitas ini menyimpulkan bahwa interaksi marmin dengan  reseptor  Ach-M 3 bersifat  reversibel dimana  profil  kurva  respon  kontraksi  otot polos  trakea  kembali  menyerupai  profil  kurva kontrol setelah dilakukan pencucian otot polos trakea dengan penggantian larutan bufer Krebs tiap lima menit selama 30 menit.
Aktivasi  reseptor  β 2 -adrenergik  yang terdapat  pada  otot  polos  trakea  akan
menginduksi  respon  relaksasi  yang  dapat melonggarkan  saluran  pernafasan.    Agonis reseptor  β 2 -adrenergik  merupakan  salah  satu obat  yang  digunakan  dalam  gangguan  saluran pernafasan, termasuk dalam mengobati kontraksi saluran nafas karena asma dan alergi (Johnson,  2006).    Penelitian  Nugroho, et.al . (2011)  menunjukkan  bahwa  marmin  marmin memiliki afinitas yang lemah terhadap reseptor β 2 -adrenergik,  sehingga  peningkatan  efek relaksasi  otot  polos  trakea  terisolasi  karena pemberian  seri  konsentrasi  isoproterenol belum  terlihat  signifikan.  Penelitian  ini  juga memperlihatkan  bahwa  interaksi  marmin dengan reseptor β 2 -adrenergik bersifat reversibel dimana profil kurva respon kontraksi otot polos trakea kembali menyerupai  profil  kurva  kontrol  setelah dilakukan  pencucian  otot  polos  trakea  dengan penggantian  larutan  bufer  Krebs  tiap  lima menit selama 30 menit.

## KESIMPULAN
Interaksi marmin terhadap protein reseptor H 1 , Ach-M 3 ,  dan  β 2 -adrenergik  otot  polos  trakea bersifat  reversibel.  Kurva  hubungan  respon kontraksi  /  relaksasi  otot  polos  trakea  marmut terisolasi  hasil  uji  reversibelitas  marmin  10 dan 100 μM memiliki profil yang hampir sama dengan  kurva  kelompok  kontrol  (histamin, metakolin  dan  isoproterenol).  Hasil  analisis varian  satu  jalan  menyimpulkan  perubahan nilai pD 2 histamin, metakolin dan isoproterenol  sebelum  dan  setelah  perlakuan marmin  tidak  bermakna  secara  statistik (p>0,05).

## DAFTAR PUSTAKA
Barnes, P.J., 1989, Airway Receptors, Postgrad. Med. J ., 65 : 532- 542
Gosens,  R.,  Zaagsma,  J,  Meurs,  H.  and
Halayko, A.J., 2006, Muscarinic Receptor Signaling in the Pathophysiology of Asthma and COPD, Respir.Res. 7 (1) : 73-87
Johnson,  M., 2006,  Molecular  Mechanisms  of Beta(2)-adrenergic  Receptor  Function, Response,  and  Regulation, J.  Allergy Clin. Immunol , 117 (1) : 18-24
Lullmann,  H.,  Mohr,  K.,  Ziegler,  A.  and
Bieger,  D.,  2000, Color  Atlas  of Pharmacology, Second Edition .,
Thieme, New York
Johnson,  M., 2006,  Molecular  Mechanisms  of Beta(2)-adrenergic  Receptor  Function, Response,  and  Regulation, J.  Allergy Clin. Immunol , 117 (1) : 18-24
Nugroho, A.E., Anas, Y, Arsito N.P, Wibowo, J.T., Riyanto, S and Sukari, M.A. 2011, Effects  af  Marmin,  a  Compound Isolated  from Aegle  Marmelos Correa, on  Contraction  of  The  Guinea  Pig- Isolated Trachea , Pak. J. Pharm. Sci., 24
(4) : 427-433
Repka-Ramirez,  M.S.    and  Baraniuk,  J.N., 2002, Histamine in Health and Disease , in  Simmons,  F.E.R,  Histamine  and  H 1 - antihistamines  in  Allergic  Desease, Second  Edition  Revised  and  Expanded, Mercel Dekker Inc. New York
Sonar,  S.  and  Renz,  H.,  2009, Biology  of Neurotrophins, Neuropeptides, and Muscarinic  Receptors  in  Asthma ,  in Allergy  Frontiers  :  Clasiffication  and Pathomechanism,  Vol.  2,  469-491,
Springer, Tokyo., 2009.
Takase,  H.,  Yamamoto,  K.,  Hirano,  H.,  Saito,
Y. and Yamashita, A., 1994, Pharmacological  Profile  of  Gastric Mucosal  Protection  by  Marmin  and
Nobiletin  from  a  Traditional  Herbal Medicine, Aurantii  fructus  immaturus , Jpn. J. Pharmacol , 66 (1) : 139-147
Taylor-Clark,  T.,  Sodha,  R.,  Warner,  B.  and Foreman, J., 2005, Histamine Receptors that  Influence  Blockage  of  the  Normal Human Nasal Airway, Br. J. Pharmacol , 144 (6) : 867-874