Uji Toksisitas Akut Miristisin Terhadap Mencit Putih Betina ( Mus musculus )

## Acute Toxicity Test of Myristicin on Female White Mice (Mus musculus)
Clara Prasidya Maharani Putri, Hery Muhamad Ansory * , Inaratul Rizkhy Hanifah
Universitas Setia Budi Surakarta
Corresponding author: Hery Muhamad Ansory: Email: hery.ansory89@setiabudi.ac.id
Submitted: 18-01-2023 Revised: 03-04-2023 Accepted: 02-05-2024

## ABSTRAK
Miristisin memiliki aktivitas antidepresan, antioksidan, dan antibakteri, namun sampai saat ini  belum  ada  data  ilmiah  mengenai  toksisitas  dari  senyawa  miristisin.  Uji  toksisitas  akut  oral dilakukan  untuk  mendeteksi  efek  toksik  yang  muncul  dalam  waktu  singkat  setelah  pemberian sediaan  ujiTujuan  penelitian  ini  adalah  mengetahui  toksisitas  akut  miristisin  dari  tanaman  pala (Myristica fragrans) terhadap mencit putih betina (Mus musculus) . M etode yang digunakan adalah fixed dose berdasarkan Organization for  Economic Co-Operation and Development (OECD). Sampel pada penelitian ini adalah miristisin dari minyak pala dengan dosis 5, 50, 300 dan 2000 mg/kg BB. Hasil penelitian menunjukkan hingga dosis 2000 mg/kg BB tidak terdapat kematian namun pada dosis tersebut terdapat gejala toksisitas berupa grooming , lemas, dan nafas abnormal pada sebagian hewan uji sehingga miristisin dikatakan tidak toksik. Hasil analisis paired t test menunjukkan bahwa terdapat bermakna pada perubahan berat badan mencit antar kelompok pada hari pertama dan hari ke-3 pengamatan (p<0,05) yang diduga karena berkurangnya nafsu makan.
Kata Kunci : miristisin; OECD; toksisitas akut

## ABSTRACT
Myristicin has antidepressant, antioxidant and antibacterial activity, but until now, there has been  no  scientific  data  regarding  the  toxicity  of  myristicin  compounds.  Therefore,  the  acute  oral toxicity test was carried out to detect toxic effects that appeared in a short time after administration of  the  test  preparation.  This  study  aimed  to  determine  myristicin's  acute  toxicity  from  nutmeg ( Myristica fragrans ) to female white mice ( Mus musculus ). The method used is a fixed dose based on the Organization for Economic Co-Operation and Development (OECD). The samples in this study were myristicin from nutmeg oil at doses of 5, 50, 300, and 2000 mg/kg BW. The results showed that up to a dose of 2000 mg/kg BW, there was no death, but at that dose, there were symptoms of toxicity such as grooming, weakness, and abnormal breathing in some test animals, so myristicin was said to be non-toxic. The results of the paired t-test analysis showed that there was a significant change in the weight of the mice between groups on the first and third days of observation (p <0.05), which was thought to be due to reduced appetite.
Keywords : Acute toxicity; myristicin; OECD

## PENDAHULUAN
Miristisin merupakan senyawa khas tanaman pala ( Myristica fragrans ) dengan dosis 3 mg/kg BB  efektif  memberikan  efek  antidepresan  terhadap  penurunan  waktu  imobilitas  hewan  uji (Prajindra, 2021). Miristisin memiliki aktivitas antioksidan dalam minyak atsiri pala dengan nilai 𝐼𝐶 50 sebesar 189 mg/L (Ansory et al., 2020). Turunan miristisin kalkon diduga sebagai senyawa yang ampuh melawan target protein molekuler kanker kulit dengan cara docking molekuler (Ansory et al ., 2021). Minyak atsiri dapat diekstraksi dari biji tanaman pala dengan miristisin sebagai salah satu komponen utamanya dan mampu memberikan aktivitas antibakteri untuk bakteri E. coli dan bakteri S.  aureus (Ansory et  al. ,  2018).  Miristisin  memiliki  potensi  besar  untuk  dieksplorasi  dalam kedokteran  untuk  digunakan  sebagai  pengobatan  klinis  untuk  patologi  karena  memiliki  aktivitas sebagai antiinflamasi dan antiproliferatif (Seneme et al ., 2021).
Satu  hingga  tiga  buah  pala  atau  5-30  gram  biji  pala  dapat  menimbulkan  efek  psikogenik, sedangkan  bubuk  pala  minimal  sebanyak  5  gram  dianggap  sebagai  dosis  toksik  (Green,  1959). Stimulasi otak ringan pada otak manusia yang disebabkan oleh 400 mg miristisin setara dengan 15

## Uji Toksisitas Akut Miristisin Terhadap Mencit Putih Betina
g  bubuk  pala  (Stein et  al .,  2001).  Dalam  dosis  400  mg  (sesuai  dengan  6-7  mg/kg  BB),  miristisin menghasilkan "stimulasi otak ringan" pada 4 dari 10 subjek manusia (Hallstrom & Thuvander, 1997). Beberapa keracunan telah dilaporkan setelah konsumsi sekitar 5 gram pala sesuai dengan sekitar 1- 2 mg myristicin/kg BB (Hallstro & Thuvander, 1997). Alasan terjadinya hal tersebut adalah karena efek  gabungan  antara  miristisin  dan  senyawa  lain  yang  terkandung  pada  pala  (Hallstrom  & Thuvander, 1997).
Pengetahuan  masyarakat  terkait  khasiat  dan  keamanan  obat  herbal  di  Indonesia  terbatas pada penggunaan secara empiris dari masa lampau yang diwariskan ke generasi selanjutnya (Hafid, 2019). Miristisin dapat menimbulkan toksisitas jika digunakan dalam dosis besar, namun hingga saat ini belum diketahui dosis miristisin yang dapat menimbulkan efek toksik (Mounangga et al ., 2015). Uji toksisitas akut dilakukan selama 24 jam untuk menemukan seberapa besar dosis toksik miristisin, hal tersebut dilakukan untuk menetapkan potensi ketoksikan akut, potensi kisaran 𝐿𝐷 50 atau dosis toksik  obat  terkait,  pada  satu  jenis  hewan  uji  atau  lebih  (Peraturan  BPOM,  2022).  Data  yang dikumpulkan dikatakan data kualitatif jika dilihat dari gejala fisiologis, mekanisme toksik, dan gejala klinis  (Jenova,  2009).  Gejala  toksisitas  yang  timbul  dan  kematian  hewan  uji  ditetapkan  sebagai parameter akhir, hewan yang menunjukkan rasa nyeri, sakit dan distres dapat dikorbankan lebih dini sejalan prinsip kesejahteraan hewan (Peraturan BPOM, 2022). Uji toksisitas akut oral metode fixed  dose dilakukan  untuk  mengamati  efek  toksik  yang  muncul  dalam  waktu  singkat  setelah pemberian sediaan uji dan menggunakan lebih sedikit hewan uji (Merdana et al ., 2020).
Belum  ditemukan  adanya  penelitian  mengenai  toksisitas  menggunakan  sampel  miristisin, penelitian  yang  terdahulu  mengasumsikan  dosis  toksisitas  miristisin  dari  kandungan  miristisin dalam serbuk pala dan minyak atsiri pala. Berdasarkan latar belakang berikut maka penelitian ini dilaksanakan untuk memberikan informasi mengenai toksisitas akut miristisin.

## METODE
Alat dan Bahan Alat Timbangan digital (SF-499), spuit oral 1 mL, kandang mencit (75 cm x 50 cm x 20 cm), labu ukur (pyrex), pipet volume (pyrex).
Bahan Miristisin yang diperoleh dari penelitian sebelumnya (Ansory et al., 2020), mencit putih betina ( Mus musculus ) galur swiss berusia 2-3 bulan dengan berat badan berkisar 20-30 gram, PG 100% (USP DOW), aquadest, pakan mencit.

## Jalannya Penelitian
Pembuatan Larutan Uji Miristisin Miristisin sebanyak 100 mg dilarutkan dalam labu ukur 100 mL menggunakan propilen glikol 10%, sehingga didapatkan larutan miristisin 1000 mg/L. Kemudian membuat larutan uji miristisin dengan seri konsentrasi 5, 50, 300, dan 2000 mg/kg BB.

## Pengelompokan Hewan Uji
Hewan  uji  dikelompokkan  secara  acak  ke  dalam  6  kelompok  sehingga  masing-masing kelompok terdapat 5 ekor mencit putih betina. Kelompok pertama adalah kelompok kontrol normal, kelompok kedua adalah kelompok  kontrol negatif, kelompok ketiga, keempat, kelima, dan keenam adalah  kelompok  dosis  5,  50,  300,  dan  2000  mg/kg  BB.  Sebelum  dilakukan  pengujian,  mencit diadaptasikan selama 7 hari. Selama pengujian, pakan dan minum disediakan secara ad libitum dan setiap kelompok dikandangkan tersendiri (Peraturan BPOM, 2022).
Uji Pendahuluan
Uji pendahuluan pada penelitian ini menggunakan 1 ekor mencit untuk mencari dosis awal yang sesuai untuk uji utama. Dosis awal pada uji pendahuluan dipilih dari tingkatan fixed dose : 5, 50, 300 dan 2000 mg/kg BB sebagai dosis yang diharapkan dapat memberikan gambaran efek toksik (Peraturan BPOM, 2022).
Uji Utama
Dosis  yang  digunakan  dalam  uji  utama  dipilih  dengan  memperhatikan  tingkat  dosis  yang menimbulkan kematian dan atau gejala klinis pada uji pendahuluan. Pengujian tidak diteruskan pada dosis selanjutnya sampai diketahui apakah hewan masih bertahan hidup atau mati. Sedangkan uji batas 5000 mg/kg BB dapat dilakukan dengan pertimbangan bahwa dosis tersebut sangat relevan dengan kepentingan untuk melindungi manusia, hewan atau lingkungan (Peraturan BPOM, 2022).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengamatan uji pendahuluan secara intensif yang dilakukan selama 24 jam pada waktu jam ke 0, 1, 2, 3, 4, dan 24 untuk melihat gejala toksiknya. Gejala toksik yang diamati pada hewan uji berupa  perubahan  perilaku  pada  hewan  uji.  Perubahan  tingkah  laku  seperti grooming ditandai dengan kebiasaan mencit membersihkan diri dengan cara menjilati tubuhnya (Amal et al ., 2022). Jika frekuensi  dari grooming meningkat  maka  hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  terjadinya  tekanan sistem  saraf  pusat.  Perubahan  tingkah  laku  terjadi  pada  hewan  uji  mulai  dari  dosis  5  mg/kg  BB, sehingga dosis pertama pada uji utama adalah 5 mg/kg BB Hewan  uji  yang  sering  digunakan  dalam  percobaan  salah  satunya  adalah  mencit  karena memiliki kelebihan seperti mudah bereproduksi, siklus hidup relatif pendek, penanganan mudah, karakteristik reproduksi mirip dengan hewan mamalia lain, struktur anatomi, fisiologis dan genetik yang hampir sama dengan manusia (Mutiarahmi et al ., 2021). Hasil pengamatan uji utama toksisitas akut ditentukan menurut penggolongan klasifikasi Hodge dan Sterner, 1995 yang tercantum dalam peraturan  BPOM  2022.  Kriteria  penggolongan  tersebut  digunakan  untuk  penentuan  kategori toksisitas akut, seperti pada tabel I.
Dikarenakan tidak terdapat kematian pada dosis tertinggi 2000 mg/kg BB, maka miristisin memiliki kisaran dosis 𝐿𝐷 50 lebih dari 2000 mg/kg BB. Berdasarkan BPOM 2022, miristisin adalah tergolong bahan yang memiliki toksisitas ringan.
Setelah sediaan uji diberikan, maka pengamatan terhadap gejala toksisitas yang terjadi pada hewan  uji  akan  dilakukan  pada  satu  jam  pertama,  lebih  dari  50  %  hewan  uji  dari  semua  dosis melakukan grooming dan rearing hal tersebut dapat disebabkan oleh rasa tidak nyaman karena telah diberikan sediaan melalui pemberian oral.  Pada jam ke-2 grooming dan rearing yang dilakukan oleh hewan uji mulai  berkurang  dan tidak menunjukkan efek toksik, beberapa mencit  mulai bergerak aktif,  namun  pada  dosis  50,  300,  dan  2000  mg/kg  BB  durasi grooming dan rearing tetap  seperti sebelumnya,  pada  dosis  2000  mg/kg  BB  terdapat  1  hewan  uji  yang  menunjukkan  nafas  yang terengah-engah, dan terdapat 1 hewan uji yang lemas. Pada jam ke-3 mencit yang diberikan dosis 5 mg/kg  BB  mulai  menunjukkan  tingkah  laku  yang  normal  dan  bergerak  aktif,  untuk  mencit  yang diberikan dosis 50 mg/kg BB terdapat 1 mencit yang menunjukkan nafas terengah-engah, dan mencit yang lain melakukan grooming namun tidak dalam waktu yang lama, untuk mencit yang diberikan dosis 300 mg/kg BB beberapa mencit masih terlihat menunjukkan perilaku grooming , untuk mencit yang  diberikan  dosis  2000  mg/kg  BB  2  mencit  masih  didapati  lemas.  Pada  jam  ke  4  masih  ada beberapa  mencit  yang  melakukan grooming namun  frekuensinya  menurun,  dan  pada  dosis  2000 mg/kg  BB  terdapat  mencit  yang  lemas  dan  nafas  yang  terengah  engah.  Perilaku grooming bisa disebabkan karena perlakuan saat pemberian sediaan  oral yang menyebabkan hewan uji  merasa tidak nyaman. Perilaku nafas abnormal dan lemas yang terjadi pada hewan uji dosis 2000 mg/kg BB bisa dikarenakan karena kondisi awal hewan uji yang berbeda beda. Untuk pengamatan pada jam selanjutnya, hewan uji terlihat bergerak aktif seperti biasa dan aktif. Untuk semua dosis tidak terjadi kematian, dan tidak terjadi tanda toksisitas lainnya seperti diare, salivasi, bulu rontok, agresif, dan koma.
Berat badan hewan uji pada saat sebelum diberikan sediaan dan setelah pemberian sediaan uji dimonitor setiap hari selama 14 hari. Grafik dibawah merupakan hasil pengamatan berat badan mencit selama 14 hari. Secara umum, perubahan berat badan pada hewan uji dapat menandakan toksisitas  yang  terjadi  setelah  terpapar  zat  toksik.  Perubahan  berat  badan  merupakan  salah  satu indikator adanya efek samping dari suatu obat atau senyawa kimia dan menurun secara signifikan apabila berat badan berkurang 10% dari berat awal hewan uji. Error bar pada grafik menunjukkan nilai untuk mengukur jarak data terhadap rata-rata berat badan mencit (Haley & Freeman, 2018).
Data  di  bawah  cenderung  tidak  berfluktuasi  karena  simpangan  antara  data  tidak  terlalu  jauh sehingga rata-rata berat badan mencit tidak saling berbeda signifikan.
Tabel I. Kriteria penggolongan sediaan uji (BPOM., 2022) Tingkat Toksisitas LD 50 oral Klasifikasi 1 ≤5 mg/Kg Super toksik Sangat toksik Toksik Toksik sedang Toksik ringan Tidak toksik
2 5-50 mg/Kg 3 >50-500mg/Kg 4 >500-2000mg/Kg 5 >2000-5000mg/Kg 6 >5000mg/Kg Tabel II. Kematian mencit Kelompok Dosis (mg/kg BB) Jumlah mencit Hidup Mati KN - 5 0 K- PG 10% 5 0 D1 5 5 0 D2 50 5 0 D3 300 5 0 D4 2000 5 0 Tabel III. Pengamatan tingkah laku 6 kelompok hewan uji (n = 30) Pengamatan Kelompok 1j 2j 3j 4j H2-H14 Grooming KN 1* - - - - K- 4* - - - - D1 3* - - - - D2 3* - - - - D3 2* - - - - D4 5* - - - - Lemas KN - - - - - K- - - - - - D1 - - - - - D2 - - - - - D3 1* - - - - D4 1* 1* 1* 1* - Nafas abnormal KN - - - - - K- - - - - - D1 - - - - - D2 1* - - - - D3 1* 1* - - - D4 1* 1* 1* - - Piloereksi Semua kelompok - - - - - Konvulsi - - - - - Feses N N N N N Salivasi - - - - - Lakrimasi - - - - - Hiperaktivitas - - - - - Mortalitas - - - - -
Keterangan : N = Normal; v = Terdapat perilaku toksik; * = Jumlah mencit dengan efek toksik; = Tidak terdapat perilaku toksik; H2-H14 = Kondisi hewan uji normal dan tidak terdapat perubahan tingkah laku
Perubahan berat badan ini normal seiring dengan bertambahnya umur hewan uji. Penurunan yang cukup signifikan dialami oleh mencit yang diberikan dosis 300 mg/kg BB dan 2000 mg/kg BB pada  hari  ke  2  sampai  hari  ke  4,  penurunan  bobot  mencit  bisa  dikarenakan  nafsu  makan  yang berkurang, pemberian pakan yang tidak seragam, dan kondisi hewan uji (stress) (Sireeratawon et al ., 2010). Pada hari selanjutnya berat badan mencit kembali naik, hal ini menunjukkan bahwa nafsu makan  mencit  telah  kembali  normal.  Dari  hasil  analisis  statistik,  diketahui  bahwa  terdapat perbedaan yang bermakna pada perubahan berat badan mencit antar kelompok pada hari pertama dan hari ke-3 pengamatan dengan nilai sig (p<0,05).
Truitt et al., (1960) melakukan suatu eksperimen untuk menguji toksisitas akut miristisin menggunakan 25 tikus putih jantan dengan tingkatan dosis 200-1000 mg/kg BB, hasil menunjukkan bahwa  dosis  besar  menimbulkan  hiper  ereksibilitas  diikuti  oleh  depresi  sistem  saraf  pusat,  dan disimpulkan  bahwa 𝐿𝐷 50 dalam  penelitian  tersebut  adalah  1000  mg/kg  BB.  Dilakukan  uji  uji toksisitas subakut  kepada 12 tikus putih yang diberikan miristisin setiap hari dengan dosis 10 mg/kg BB dalam makanan selama 26 hari, tidak ada perbedaan berat badan antara kelompok dosis dan kelompok kontrol, studi histologis hati/ginjal menunjukkan tidak ada kelainan yang  dapat dikaitkan dengan miristisin. Pala telah digunakan secara eksternal untuk mengobati infeksi kulit, rematik dan kelumpuhan (Abourashed, 2010) dan untuk pengobatan psikologis gangguan (Antonio et al ., 2013) Pala dalam dosis yang cukup dilaporkan bersifat psikoaktif dengan halusinasi, perasaan euforia, dan delusi (Zaheer et al. , 2016)

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  toksisitas  akut  dapat  diambil  kesimpulan  bahwa  miristisin masuk kedalam kategori sedikit toksik karena hewan uji menunjukkan gejala toksisitas pada hari pertama. Namun sampai dosis 2000 mg/kg BB tidak didapati kematian

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Yayasan Pendidikan Setia Budi dan CV ANSChem yang sudah memberikan bantuan dana dan bahan pada penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Abourashed EA, Khan IA (2010) Nutmeg. In: Khan IA, Abourashed EA (eds) Leung’s encyclopedia of common natural ingredients used in food, drugs and cosmetics, 3rd edn. Wiley. Hoboken , 467 – 470
Amal,  S.,  Sri  Gunarti,  N.,  &  Sintia  Saragih,  D.  (2022).  Uji  Toksisitas  Akut  Ekstrak  Etanol  Daun
Gambar 1. Penurunan berat badan 6 kelompok hewan uji (n = 30)

## Uji Toksisitas Akut Miristisin Terhadap Mencit Putih Betina
Tempuyung (Sonchus arvensis L.) pada Mencit Betina dengan Metode Fixed Dose. Journal of Pharmacopolium , 5 (2), 190 – 198.
Ansory,  H.  M.,  Fitriani,  I.  N.,  Handayani,  S.,  &  Aznam,  N.  (2021).  Synthesis  of  a  novel  chalcone derivative from myristicin for skin cancer preventive activity. Rasayan Journal of Chemistry ,
14 (3), 1493 – 1498.
Ansory, H. M., Putri, P. K. K., & Nilawati, A. (2018). Analisis Senyawa Minyak Atsiri Biji Pala Secara Gc- Ms Dan Uji Aktivitas Antibakteri Terhadap Escherichia coli. Prosiding SNST , 4 , 19 – 25. Ansory, H. M., Sari, E. N., Nilawati, A., Handayani, S., & Aznam, N. (2020). Sunscreen and Antioxidant Potential of Myristicin in Nutmeg Essential Oils (Myristica fragrans) . 26 , 138 – 142.
Antonio, R. L., Kozasa, E. H., Galdurõz, J. C. F., Dawa, Dorjee, Y., Kalsang, T., Norbu, T., Tenzin, T., &
Rodrigues, E. (2013). Formulas used by Tibetan doctors at Men-Tsee-Khang in India for the treatment  of  neuropsychiatric  disorders  and  their  correlation  with  pharmacological  data.
Phytotherapy Research , 27 (4), 552 – 563.
Boukandou Mounanga, M., Mewono, L., & Aboughe Angone, S. (2015). Toxicity studies of medicinal plants  used  in  sub-Saharan  Africa.  Journal  of  Ethnopharmacology,  174(June),  618 – 627. https://doi.org/10.1016/j.jep.2015.06.005 Green, R. K. (1959). Nutmeg Poisoning. Natural Toxins , 171 , 166 – 168.
Hafid, R. (2019). Pengetahuan Lokal Tentang Pemanfaatan Tanaman Obat Pada Masyarakat Tolaki Di Kabupaten  Konawe Sulawesi Tenggara. Pangadereng : Jurnal Hasil Penelitian Ilmu Sosial Dan Humaniora , 5 (1), 46 – 63. Haley, W. E., & Freeman. (2018). 乳鼠心肌提取 HHS Public Access. Physiology & Behavior , 176 (1), 139 – 148. https://doi.org/10.1109/TVCG.2014.2346298. Hallstrom, H., & Thuvander, A. (1997). Toxicological evaluation of myristicin. Natural Toxins , 5 (5), 186 – 192. https://doi.org/10.1002/19970505nt3
Merdana, I. M., Azizati, S. K. N., Arjana, A. A. G., Adi, A. A. A. M., & Sudira, I. W. (2020). Penilaian Potensi Toksisitas Akut Dermal Obat Hewan Alami Minyak Rajas pada Tikus Wistar. Buletin Veteriner Udayana , 21 , 205.
Mutiarahmi,  C.  N.,  Hartady,  T.,  &  Lesmana,  R.  (2021).  Use  of  Mice  As  Experimental  Animals  in Laboratories That Refer To the Principles of Animal Welfare: a Literature Review. Indonesia Medicus Veterinus , 10 (1), 134 – 145.
Peraturan  BPOM.  (2022).  Peraturan  Badan  Pengawas  Obat  Dan  Makanan  Nomor  10  Tahun  2022 Tentang Pedoman Uji Toksisitas Praklinik Secara In Vivo. Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik Indonesia , 1 – 220.
Seneme, E. F., Dos Santos, D. C., Silva, E. M. R., Franco, Y. E. M., & Longato, G. B. (2021). Pharmacological and therapeutic potential of myristicin: A literature review. Molecules , 26 (19), 1 – 15.
Sireeratawon, S., Piyabha, P., Singhala, T., Wongkrajan, Y., Temsiririrkku, R., Punsrira, J., Ruangwise, N., Saray, S., Lerdvuthisopo, N., & Jaijo, K. (2010). Toxicity evaluation of sappan wood extract in rats. Journal of the Medical Association of Thailand , 93 (SUPPL 7), 50 – 57.
Stein, U., Greyer, H., & Hentschel, H. (2001). Nutmeg (myristicin) poisoning - Report on a fatal case and a series of cases recorded by a poison information centre. Forensic Science International , 118 (1), 87 – 90. https://doi.org/10.1016/S0379-0738(00)00369-8. Truitt, E. B. (1961). The pharmacology of myristicin. A contribution to the psychopharmacology of nutmeg. Journal of Neuropsychiatry , 2 , 205 – 210.
Zaheer, I., Rahman, S. Z., Khan, R. A., & Parveen, M. (2016). An experimental study of ethanolic extract of Myristica fragrans in morphine dependence. Bangladesh Journal of Medical Science , 15 (2),
224 – 229.