## 1. Pendahuluan
Madu  memiliki  banyak  khasiat,  salah satunya  adalah  efek  antioksidan  karena memiliki  zat  flavonoid  (Asari,  2009). Flavonoid  adalah  senyawa  polifenol  yang memiliki struktur  kimia  flavonol,  flavon, flavanon,  iso  flavon,  katekin, antosianidin dan kalkon. Saifulhaq (2006), membuktikan bahwa senyawa antioksidan yaitu flavonoid dapat  dipercaya  sebagai  imunomodulator karena dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh  terhadap  infeksi  penyakit,  luka  dan melawan radikal bebas.
Menurut  Abuharfeil  ( cit .,  Haryanto, 2009), bahwa madu dengan konsentrasi 0,1% dapat  menstimulasi  aktivitas  sel    limfosit. Adanya  aktivitas  limfosit  menunjukkan respon  kekebalan  tubuh  terhadap  infeksi khususnya  pada  luka.  Sel  limfosit menjalankan  tugas  menjaga  respon  imun spesifik  yang  meliputi  respon  imun  seluler (limfositik yang berkaitan dengan sel T) dan humoral (berkaitan dengan antibodi di dalam darah atau sel B) (Roitt, 1997).
Penelitian  ini  diharapkan  dapat memperjelas  pengaruh  madu  hutan  dalam
meningkatkan  sistem  imun  dengan  melihat peningkatan  proliferasi  limfosit  sehingga dapat diperoleh manfaat madu hutan sebagai imunomodulator.

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1. Alat
Alat  yang  digunakan  untuk  menguji proliferasi limfosit adalah spuit injeksi 1mL (Terumo),  jarum  berujung  tumpul,  pipa kapiler, Eppendorf ,  neraca  elektronik (Sartorius), incubator CO  5% 37˚C, sentrifus 2 (Sorvall  MC  12  V,  Dupont),  mesin  Vortex (Super Mixer-K), Laminar Air Flow Hood , Haemositometer    Nebaeur, Inverted Microscope (Olympus),  ELISA reader (BioRad), plate 96 well (Nunc), mikropipet, tip biru, tip kuning, pinset steril, freezer , dan tabung reaksi.
2.2. Bahan
Madu hutan yang digunakan berasal dari hutan Kalimantan yang diperoleh dari salah satu distributor madu di Yogyakarta. Hewan uji yang digunakan adalah tikus galur Wistar , jantan, umur 2-3 bulan dengan bobot badan
JURNAL FARMASI SAINS DAN KOMUNITAS, November 2012, hlm. 85-90
ISSN : 1693-5683

## PENGARUH PEMBERIAN MADU HUTAN TERHADAP PROLIFERASI LIMFOSIT PADA HEWAN UJI TIKUS JANTAN GALUR WISTAR

## KARTIKA SARI SENAS, YUNITA LINAWATI

## Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Abstract: Forest honey is produced by wild bees by taking nectars from several kinds of plant. One  of  active  chemicals  contained  within  honey  is  flavonoid.  It  is  believed  as  an immunomodulator due to it has role in fighting against free radicals and increasing body immune system   against   disease   infection. This research aimed to understand the influences of forest honey administration to the lymphocyte proliferation on male mice Wistar family. This research is a pure, experimental with one way, random research design. Total of 20 rats was divided into 4 groups. Each group was given honey forest with dose of 0,27; 0.54; 1.08 mL/200 g BW, and negative control group was given aquadest 2.5 mL/200 g BW. The lymphocyte proliferation is measured from the amount of lymphocyte based on Optical Density (OD) values, the read on ELISA reader at the wavelength of 550 nm. The result shown that the administration of forest honey has effect on significance increase the lymphocyte proliferation (p<0.05) than negative control on male mice Wistar family.
Key words : Foresthoney, lymphocyte proliferation, immunomodulator
100-300 g, yang diperoleh dari Laboratorium Penelitian  Pengujian  Terpadu  (LPPT) Universitas  Gadjah  Mada,  Antigen  yang digunakan  adalah  bakteri Staphylococcus e p i d e r m i d i s y a n g   d i p e r o l e h   d a r i Laboratorium  Balai  Kesehatan  Yogyakarta. Kloroform  70%, Roswell  Park  Memorial Institute  Medium (RPMI  1640)  (Sigma), HEPES (Sigma), Fetal Bovine Serum (FBS) 20,0  mL  (Gibco),  alkohol  70%  (v/v), akuabides  steril,  penisilin-streptomisin  4,0 mL  (Gibco),  fungizon  2,0  mL,  ammonium klorida, tris base , phytohaemagglutinin dan MTT (Sigma).

## 2.3. Tata Cara Penelitian
2.3.1. Tahap penentuan dosis madu hutan
Dosis madu hutan untuk tikus 200 g yaitu : 0,018 x 15 mL  =   0,27 mL/200 g BB.

## 2.3.2. Tahap praperlakuan hewan uji
Semua hewan uji ditimbang beratnya dan diadaptasikan  selama  satu  hari  untuk penyesuaian diri terhadap lingkungannya.

## 2.3.3. Tahap percobaan
Dosis  madu  hutan  pada  tahap  orientasi yang dapat meningkatkan proliferasi limfosit pada hewan uji secara signifikan digunakan sebagai  dosis  pertama.  Kelompok  dosis kedua  dan  ketiga  ditetapkan  dengan mengalikan dua kali faktor peringkat dosis. Tikus jantan galur Wistar sejumlah 20 ekor, umur  2-3  bulan,  bobot  badan  100-300  g dibagi  secara  random  menjadi  4  kelompok dengan masing-masing kelompok berjumlah sebanyak  5  ekor.  Kelompok-kelompok tersebut antara lain :
a. Kelompok  kontrol  negatif:  kelompok tikus yang diberi akuades dengan volume pemberian 2,5 mL/200 g BB.
b. Kelompok  perlakuan  1:  kelompok  tikus yang  diberi  larutan  madu  hutan  dengan dosis 0,27 mL/200 g BB, dengan volume pemberian 0,675 mL/200 g BB.
c. Kelompok  perlakuan  2:  kelompok  tikus yang  diberi  larutan  madu  hutan  dengan dosis 0,54 mL/200 g BB, dengan volume pemberian 1,35 mL/200 g BB.
d. Kelompok  perlakuan  3:  kelompok  tikus yang  diberi  larutan  madu  hutan  dengan dosis 1,08 mL/200 g BB, dengan volume pemberian 2,7 mL/200 g BB.

## 2.3.4. Isolasi limpa dan kultur sel limfosit
Pada  hari  ke-18  tikus  dikorbankan dengan  cara  dibius  inhalasi  menggunakan kloroform,  lalu  diletakkan  dengan  posisi terlentang di atas papan gabus. Kulit bagian perut  dan  selubung  peritoneum  dibuka kemudian limpa diambil dan dibersihkan dari lemak yang masih menempel.
Limpa diletakkan pada cawan petri yang berisi 5 mL RPMI ( Roswell Park Memorial Institute ),  kemudian  RPMI  disemprot kedalam limpa untuk mendapatkan suspensi sel  tunggal.  Suspensi  sel  dimasukkan kedalam tabung sentrifus dan disentrifugasi pada 3000 rpm (Sorvall MC 12 V, Dupont) selama  5  menit  untuk  mendapatkan  pellet. Pellet  yang  didapat  disuspensikan  dalam  1 mL dapar amonium klorida untuk melisiskan eritrosit. Sel dicampur dengan menggunakan pipet dan didiamkan pada suhu kamar selama 5  menit.  Pellet  dicuci  2  kali  menggunakan RPMI  dengan  cara  dipipet  berulang-ulang dan  disentrifugasi  pada  3000  rpm  (Sorvall MC 12 V, Dupont) selama 5 menit. Sel yang didapat  ditambah  media  RPMI  komplit sebanyak  2  mL.  Sel  limfosit  dihitung jumlahnya  menggunakan  haemositometer dan  pewarna  biru  trifan,  kemudian diresuspensikan lagi dengan medium RPMI komplit  sehingga  didapatkan  suspensi  sel
6 dengan kepadatan 1,5 x 10 /mL . Suspensi sel yang  telah  dihitung  kemudian  dimasukkan kedalam  sumuran-sumuran  pada  lempeng mikrotiter  sebanyak  200  µl  tiap  sumuran. Selanjutnya  dikultur  dengan  penambahan RPMI  komplit  dan  PHA  ( Phytohae- magglutinin ) pada tiap sumuran. Suspensi sel diinkubasi pada inkubator C0  5% pada suhu 2 37˚C selama 24 dan 48 jam.
Uji  pertumbuhan  dan  proliferasi  sel limfosit  menggunakan  metode  MTT assay . Suspensi sel yang telah diinkubasi selama 24 dan  48  jam  kemudian  ditambahkan  10,0  µl larutan  MTT  5  mg/mL.  Selanjutnya,
KARTIKA SARI SENAS, YUNITA LINAWATI
diinkubasi  pada  suhu  37˚C  pada  inkubator C0  5% selama 4 jam. Sel yang hidup akan 2 bereaksi  dengan  MTT  membentuk  warna ungu.  Reaksi  MTT  dihentikan  dengan menambahkan reagen stopper , yaitu larutan SDS  10%  dalam  asam  klorida  0,01  N sebanyak  100  µl  pada  tiap  sumuran. Selanjutnya,  diukur Optical  Density (OD) menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 550 nm (Wahyuniari, 2009).

## 2.3.5. Analisa Hasil
Data proliferasi limfosit dianalisis secara statistik dengan uji normalitas menggunakan metode uji Kolmogorov-Smirnov. Data yang terdistribusi  normal  (p  >  0,05)  dilanjutkan dengan uji parameter menggunakan one way ANOVA  dengan  taraf  kepercayaan  95%, kemudian jika data terdapat perbedaan yang bermakna dilanjutkan dengan uji Tuckey.

## 3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Pengukuran Proliferasi Limfosit setelah Pemberian  Madu  Hutan  pada  Inkubasi 24 jam
H a s i l   u j i K o l m o g o ro v - S m i r n o v menunjukkan  bahwa  hasil  terdistribusi normal dengan nilai p = 0,433 (p>0,05).
Hasil uji statistik one way ANOVA (Tabel I) menunjukkan p = 0,002 (p<0,05), hal ini
berarti  bahwa  kelompok  kontrol  maupun perlakuan memiliki proliferasi limfosit yang berbeda bermakna.
Terdapat  perbedaan  yang  bermakna (p<0,05)  antara  kelompok  kontrol  negatif (akuades  2,5  mL/200  g  BB)  terhadap kelompok madu hutan dosis 0,54 mL/200 g BB  (Tabel  II).  Namun,  terdapat  perbedaan yang  tidak  bermakna  antara  kelompok kontrol negatif (akuades 2,5 mL/200 g BB) terhadap  kelompok  madu  hutan  dosis  0,27 mL/200  g  BB  dan  kelompok  madu  hutan dosis  1,08  mL/200  g  BB.  Pada  Tabel  III menunjukkan  peningkatan  proliferasi limfosit pada madu hutan dosis 0,54 mL/200 g BB sebesar 13,99%. Pada madu hutan dosis 0,27 mL/200 g BB sebesar 3,497% dan madu hutan dosis 1,08 mL/200 g BB sebesar 7,23% menunjukkan penurunan proliferasi limfosit. Berdasarkan  hasil  analisis  tersebut  dapat dibuktikan  bahwa  pemberian  madu  hutan pada  dosis  0,54  mL/200  g  BB  berpengaruh terhadap  proliferasi  limfosit  yaitu  berupa peningkatan proliferasi limfosit.
Pada madu hutan dosis 0,27 mL/200 g BB dan  dosis  1,08  mL/200  g  BB,  secara  uji statistik menunjukkan perbedaan yang tidak bermakna terhadap kontrol negatif (akuades 2,5  mL/200  g  BB).  Pada  kelompok  kontrol negatif  (akuades  2,5  mL/200  g  BB)
KARTIKA SARI SENAS, YUNITA LINAWATI 87
Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas
Kelompok n
Rata-rata OD ± SD p Akuades 2,5 mL/200 g BB 5 0,429 ± 0,032 Dosis 0,27 mL/200 g BB 5 0,414 ± 0,040 0,002 (b) Dosis 0,54 mL/200 g BB 5 0,489 ± 0,060 Dosis 1,08 mL/200 g BB 5 0,460 ± 0,072 Kelompok Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 Kontrol - 0,886 0,020 b 0,394 Dosis 1 0,886 - 0,002 b 0,107 Dosis 2 0,020 b 0,002 b - 0,490 Dosis 3 0,394 0,107 0,490 -
Tabel I. Hasil Rerata Optical Density (OD) Proliferasi Limfosit setelah
Pemberian Madu Hutan pada Inkubasi 24 jam
Tabel II. Hasil Analisis Tukey Pengukuran Proliferasi Limfosit setelah Pemberian Madu Hutan pada Inkubasi 24 jam
Keterangan:  b : berbeda signifikan (p<0,05).
Keterangan:
Kontrol : akuades 2,5 mL/200 g BB Dosis 1 : madu hutan dosis 0,27 mL/200 g BB Dosis 2 : madu hutan dosis 0,54 mL/200 g BB Dosis 3 : madu hutan dosis 1,08 mL/200 g BB b : berbeda signifikan (p<0,05)
Kelompok 24 jam Dosis madu hutan 0,27 mL/200 g BB -3,497% Dosis madu hutan 0,54 mL/200 g BB 13,99% Dosis madu hutan 1,08 mL/200 g BB 7,23% Tabel III. Persentase Pengukuran Proliferasi Limfosit setelah Pemberian Madu Hutan pada Inkubasi 24 jam
Kelompok
n Rata-rata OD ± SD p Akuades 2,5 mL/200 g BB 5 0,366 ± 0,019 Dosis 0,27 mL/200 g BB 5 0,361 ± 0,053 0,000 (b) Dosis 0,54 mL/200 g BB 5 0,432 ± 0,065 Dosis 1,08 mL/200 g BB 5 0,432 ± 0,067 Kelompok Kontrol Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 Kontrol - 0,996 0,014 b 0,014 b Dosis 1 0,996 - 0,008 b 0,008 b Dosis 2 0,014 b 0,008 b - 1,000 Dosis 3 0,014 b 0,008 b 1,000 - Kelompok 48 jam Dosis madu hutan 0,27 mL/200 g BB -1,366% Dosis madu hutan 0,54 mL/200 g BB 18,03% Dosis madu hutan 1,08 mL/200 g BB 18,03% Tabel V. Hasil Analisis Tukey Pengukuran Proliferasi Limfosit setelah Pemberian Madu Hutan  pada Inkubasi 48 jam
Keterangan: Kontrol : akuades 2,5 mL/200 g BB
Dosis 1 : madu hutan dosis 0,27 mL/200 g BB Dosis 2 : madu hutan dosis 0,54 mL/200 g BB Dosis 3 : madu hutan dosis 1,08 mL/200 g BB b : berbeda signifikan (p<0,05)
Tabel IV . Hasil Rerata-rata OD Proliferasi Limfosit setelah Pemberian Madu Hutan pada Inkubasi 48 jam
Tabel VI. Persentase Pengukuran Proliferasi Limfosit setelah Pemberian Madu Hutan pada Inkubasi 48 jam
Keterangan:  b : berbeda signifikan (p<0,05).
Gambar 1. Histogram Hasil Pengukuran Proliferasi Limfosit setelah Pemberian Madu Hutan pada Inkubasi 24 jam
Gambar 2. Histogram Hasil Pengukuran Proliferasi Limfosit setelah Pemberian Madu Hutan pada Inkubasi 48 jam KARTIKA SARI SENAS, YUNITA LINAWATI Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas 88
menunjukkan  peningkatan  proliferasi limfosit  dibanding  kelompok  madu  hutan dosis  0,27  mL/200  g  BB.  Hal  ini  bisa disebabkan karena saat antigen dipejankan ke tubuh  tikus  sistem  imun  bawaan  yang responnya cepat dan relatif non spesifik akan memberikan pertahanan awal, sehingga akan meningkatkan  proliferasi  limfosit  pada kelompok  kontrol  negatif  (akuades  2,5 mL/200 g BB). Berdasarkan hasil penelitian maka  dapat  dibuktikan  bahwa  madu  hutan pada  dosis  kedua  (0,54  mL/200  g  BB) memiliki  efek  imunomodulator  terhadap proliferasi limfosit.

## 3.2. Pengukuran Proliferasi Limfosit setelah Pemberian  Madu  Hutan  pada  Inkubasi
48 jam
H a s i l   u j i K o l m o g o ro v - S m i r n o v menunjukkan  bahwa  data  terdistribusi normal dengan nilai p = 0,735 (p>0,05).
Hasil uji statistik one way ANOVA (Tabel IV)  menunjukkan  nilai  p  =  0,000  (p<0,05), hal  ini  berarti  bahwa  kelompok  kontrol maupun  perlakuan  memiliki  proliferasi limfosit yang berbeda bermakna.
Terdapat  perbedaan  yang  bermakna (p<0,05)  antara  kelompok  kontrol  negatif (akuades  2,5  mL/200  g  BB)  terhadap kelompok madu hutan dosis 0,54 mL/200 g BB  dan  kelompok  madu  hutan  dosis  1,08 mL/200  g  BB  (Tabel  V).  Namun,  terdapat perbedaan  yang  tidak  bermakna  antara kelompok  kontrol  negatif  (akuades  2,5 mL/200  g  BB)  terhadap  kelompok  madu hutan dosis 0,27 mL/200 g BB. Pada Tabel VI menunjukkan  peningkatan  proliferasi limfosit pada madu hutan dosis 0,54 mL/200 g BB dan madu hutan dosis 1,08 mL/200 g BB sebesar 18,03% dan 18,03%. Pada madu hutan  dosis  0,27  mL/200  g  BB  sebesar 1,366% menunjukkan penurunan proliferasi limfosit. Berdasarkan hasil analisis tersebut dapat  dibuktikan  bahwa  pemberian  madu hutan  pada  dosis  0,54  mL/200  g  BB  dan pemberian madu hutan dosis 1,08 mL/200 g BB  berpengaruh  terhadap  proliferasi limfosit, yaitu berupa peningkatan proliferasi limfosit.
Pada kelompok kontrol negatif (akuades 2,5 mL/200 g BB) menunjukkan peningkatan proliferasi  limfosit  dibanding  kelompok madu hutan dosis 0,27 mL/200 g BB. Hal ini bisa  disebabkan  karena  saat  antigen dipejankan  ke  tubuh  tikus  sistem  imun bawaan yang responnya cepat dan relatif non spesifik akan memberikan pertahanan awal, sehingga  akan  meningkatkan  proliferasi limfosit  pada  kelompok  kontrol  negatif (akuades  2,5  mL/200  g  BB).  Berdasarkan rata-rata  proliferasi  limfosit  setelah pemberian  madu  hutan  (Gambar  2)  pada kelompok madu hutan dosis 0,27 mL/200 g BB  terdapat  penurunan  proliferasi  limfosit dibanding kelompok madu hutan dosis 0,54 mL/200 g BB dan dosis 1,08 mL/200 g BB.
Pada  tahap  ini  pengujian  proliferasi limfosit  di  inkubasi  selama  24  jam  dan  48 jam.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa pemberian dosis madu hutan pada tiap waktu inkubasi  memberikan  efek  yang  sama terhadap kultur sel limfosit, yaitu sel limfosit menurun  seiring  dengan  lamanya  inkubasi. Pemberian dosis madu hutan 0,54 mL/200 g BB dan madu hutan dosis 1,08 mL/200 g BB menunjukkan  peningkatan  proliferasi limfosit  dibanding  kontrol  negatif  (2,5 mL/200 g BB). Menurut Bellanti (1993) hal ini  dapat  disebabkan  karena  adanya rangsangan dari antigen dalam jumlah yang optimal. Selain itu menurut penelitian Jiao et al .,  (2003),  disebutkan  bahwa  senyawa flavonoid  meningkatkan  aktivitas  IL-2  dan meningkatkan proliferasi limfosit. Hal inilah yang  mungkin  menyebabkan  peningkatan proliferasi  limfosit  pada  kelompok  madu hutan 0,54 mL/200 g BB dan kelompok madu hutan  1,08  mL/200  g  BB  dibanding kelompok kontrol negatif (2,5 mL/200 g BB).
Menurut  Pinchuk  (2002)  limfosit  yang aktif  menghasilkan  limfokin  dan  IL-2  yang berfungsi  memicu  proliferasi  limfosit.  IL-2 juga  berfungsi  sebagai  sitotoksik  sel  T  dan merangsang  produksi  IFN.  IL-2  diproduksi oleh  sel  T helper dan  dapat  dirangsang p r o d u k s i n y a   d e n g a n   p e m b e r i a n imunomodulator.  Hal  yang  sama  juga dinyatakan  oleh  Wijayanti  (2005)  bahwa
KARTIKA SARI SENAS, YUNITA LINAWATI 89
p e n a m b a h a n   b a h a n   y a n g   b e r s i f a t imunomodulator akan meningkatkan respon pada limfosit dan menyebabkan pembelahan sel sehingga terjadi proliferasi.
Hasil  penelitian  terhadap  proliferasi limfosit  ini  semakin  menegaskan  bahwa mengkonsumsi  madu  hutan  dapat  memberi efek  imunomodulator  karena  dapat meningkatkan  proliferasi  limfosit  dengan dosis 0,54 dan 1,08 mL/200 g BB.

## 4. Kesimpulan
Pemberian  madu  hutan  berpengaruh terhadap proliferasi limfosit pada hewan uji tikus jantan galur Wistar berupa peningkatan proliferasi limfosit yang signifikan (p<0,05) dibanding kontrol negatif.

## Ucapan Terima Kasih
Kami mengucapkan banyak terima kasih kepada  Kepala  LPPT  UGM  dan  Balkes Yogyakarta:  Bu  Istini,  Pak  Sutari  dan  Bu Wardani  atas  semua  bantuan  teknis  yang telah diberikan.

## Daftar Pustaka
Asari,  2009. Efek  Pemberian  Madu  Terhadap Kerusakan  Sel  Hepar  Mencit  (Mus  musculus) akibat  paparan  parasetamol. Skripsi ,  6. Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Bellanti, 1993, Imunologi III , Penerjemah: A. Samik Wahab, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Haryanto, 2009, Penggunaan madu dalam perawatan luka , http://io.Ppijepang.Org/new/files/edisi/files_inov asi_Vol.15_XXI_NOV_2009, pdf # page = 38, diakses tanggal 11 November 2011. Jiao,  Y.,  Wen,  J.,  and  Yux,  2003. Influence  of Flavonoid,  of  Astragalus  membranaceus's  stam and  leaves  on  the  function  of  cell  mediated immunity  in  mice ,  Available  at:  URL:  http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed, diakses tanggal 25 Mei 2012.
Pinchuk,  G.,  2002, Theory  and  Problems  of Immunology. McGraw-Hill Companies inc., New York.
th Roitt,  I.,  1997, Essential  Immunology .  9 Edition, Blackwell Scientific Publications, London, pp.26. Saifulhaq, 2006. Pengaruh Pemberian Ekstrak Buah Mahkota  Dewa  Dosis  Bertingkat  Terhadap Proliferasi  Limfosit  Lien  Pada  Mencit  BALB/C. Skripsi , 4, Universitas Diponegoro, Semarang.
Wahyuniari,  I.,  2009. Minyak  Buah  Merah Meningkatkan  Aktivitas  Proliferasi  Limfosit Limpa  Mencit  setelah  Infeksi  Listeria monocytogenes. Jurnal Veteriner , 144-145. Wijayanti,  L.,  2005. Aktivitas  proliferasi  limfosit setelah  imunisasi  intranasal  protein  terlarut Toxoplasma  selama  infeksi  Toxoplasma  gondii.
Biosmart 7 (1), 9-13.
KARTIKA SARI SENAS, YUNITA LINAWATI