PRODUCTION OF AMYLOCELLULOLYTIC ENZYMES AND THEIR VIABILITY ON CARRIER MEDIA BY Bacillus sp. U4 AND Pseudomonas sp. U3
Salma Shavira Rahma Khofifah, Enny Zulaika*
Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Analitika Data, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Teknik Kimia, Keputih, Kec. Sukolilo, Kota Surabaya, Jawa Timur 60111 *Email: enny@bio.its.ac.id

## ABSTRACT
Amylase  and  cellulase  are  enzymes  that  are  amyocellulolytic.  Both  are  extracellular enzymes that can degrade organic materials, namely starch and cellulose. The purpose of this  study  was  to  determine  whether Bacillus sp.  U4  and Pseudomonas sp . U3  could produce amylocellulolytic enzymes and determine their viability after being incubated for 2 hours on the husk, peat, and sawdust carrier media. Screening for the presence of amylase was carried out on a selective medium, namely nutrient agar-amylum 0.5 %, and cellulase on carboxymethyl cellulose-agar medium. Both isolates were inoculated into sawdust, husk, peat  carrier  media and  incubated  for 2  hours.  Viability  was  observed  using  the  total  plate count  method. Bacillus sp.  U4  and Pseudomonas sp . U3  can  produce  amylase  and cellulase.  The  best  isolate  viability  after  incubation  for  2  hours  was  found  in  husk  carrier media with 2.13 x 105 CFU/gr of husk media.
Keywords: amylase, carrier media, cellulose.

## PENDAHULUAN
Bahan  organik  di  dalam  tanah  memiliki peranan  penting  dalam  meningkatkan dan  menjaga  kesuburan  tanah  sehingga akan meningkatkan produktivitas tanaman dan  keberlanjutan  penggunaan  lahan pertanian (Muzaiyanah  & Subandi,  2018). Mikroorganisme memiliki  peranan  penting dalam  mendegradasi bahan  organik yang dapat  mempercepat  proses  dekomposisi sisa tanaman sehingga dapat meningkatkan  kesuburan  tanah.  Enzim ekstraseluler dapat diproduksi oleh bakteri untuk  mengubah  senyawa  berukuran besar  menjadi  lebih  kecil  dan  larut  dalam air,  kemudian  akan ditransfer   ke   bagian sel   yang   membutuhkan (Saraswati dkk., 2006).    Enzim    ekstraseluler    seperti amilase    dan    selulase    dapat  diproduksi selama proses fermentasi aerobic (Santos, 2014).
Enzim  amiloseluloltik  terdiri  dari  dua enzim,  yakni  amilase  dan  selulase. Amilase  merupakan  enzim  yang  dapat
mengkatalisis ikatan α-1,4-glikosidik internal  dalam  amilum  (Indriati et  al. , 2018),  menjadi  gula  sederhana  seperti maltose,  dekstrin,  dan  glukosa.  Amilase terdiri  atas α-amilase,  β-amilase,  and  γ- amilase  dengan  memanfaatkan  substrat amilum (Swandi, 2020). Beberapa bakteri dapat memproduksi  amilase, antara lain Bacillus subtilis , B. licheniformis dan B.  stearothermophilus ,
Streptomyces sp., Saccharomycopsis filbugera ,  dan Pseudomonas  stutzeri (Singh et  al. ,  2011).  Enzim  selulase adalah  enzim  yang  dapat  menghidrolisis selulosa  dengan  memutus  ikatan β-1,4 glikosida  dalam  selulosa,  selodektrin, selobiosa,  dan  turunannya  (Soeka et  al. , 2019),  menjadi  monomer  glukosa  (Razie dkk . , 2011). Beberapa genus bakteri yang dapat  menghidrolisis  selulosa  antara  lain genus Bacillus ,  dan Pseudomonas (Liang et al. , 2014).
Media pembawa adalah media penyimpan yang dapat digunakan sebagai   media  pertumbuhan, pengemas, dan  dapat  memperpanjang waktu  simpan agen biologis (Shariati et al. , 2013). Media pembawa  harus  mengandung  unsur  hara organik  yang  mendukung  viabilitas  dan pertumbuhan mikroba yang diinokulasi ke dalamnya  (Rohmah  &  Muslihatin,  2016). Syarat  media  pembawa  antara  lain  (1) tidak bersifat toksik bagi agen biologis, (2) dapat menyerap air yang baik, (3) mudah penggunaannya, (4) mudah proses sterilisasinya, (5) mudah diperoleh karena  ketersediaannya  cukup,  (6)  dan murah (Muraleedharan et al ., 2010).
Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui  apakah Bacillus sp.  U4  dan
Pseudomonas sp.
U3
dapat menghasilkan enzim amilase dan selulase serta mengetahui viabilitasnya pada media  pembawa  sekam,  gambut  dan serbuk gergaji.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan Januari  sampai  dengan  Juni  2021  di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Departemen Biologi, Fakultas  Sains  dan    Analitika  Data (FSAD), Institut
Teknologi Sepuluh Nopember (ITS), Surabaya

## Skrining Enzim Amilase dan Selulase
Skrining  enzim  amilase  dilakukan dengan cara  isolat  bakteri  digores  pada  medium Starch  Agar  (Medium  NA-amilum  0,5%  ). Isolat bakteri diinkubasi selama 24-48 jam pada  suhu  37o  C.  Selanjutnya  ditetesi beberapa  tetes  Gra m’s  iodine  pada biakan  bakteri,  dan  diamati  zona  bening yang terbentuk (Iftita dkk., 2014). Skrining enzim selulase dilakukan dengan menginokulasi  isolat  pada  permukaan medium  CMC  Agar  dengan  metode  titik dan  diinkubasi  48  jam  pada  suhu  ruang. Selanjutnya,  permukaan  medium  CMC Agar  digenangi congo  red 0,1%  selama 15  menit.  Pewarna congo  red dibuang
dan  dibilas  menggunakan  NaCl  1  M. Hidrolisis  selulosa  ditunjukkan  dengan terbentuknya  zona  bening  di  sekeliling koloni bakteri (Lay et al ., 2015).

## Media Pembawa Inokulan Persiapan media padat
Media  pembawa  yang  digunakan  adalah serbuk  gergaji,  sekam,  dan  gambut. Ketiga  media  pembawa  ditimbang,  dan dimasukkan ke  wadah plastk klip masing- masing  100  g  dan  disterilkan  dengan autoklaf selama 15 menit (121oC, 1 atm).

## Starter inokulan
Tiga ose penuh masing-masing isolat dari media  subkultur  diinokulasikan  kedalam 20  ml  medium Nutrient  Broth (NB), diinkubasi  diatas rotary  shaker (100 rpm, 24 jam) pada suhu ruang. Selanjutnya 20 ml kultur tersebut dimasukkan  ke  dalam  180  ml  medium NB,  diinkubasi  diatas rotary  shaker (100 rpm,7 jam) sampai  mencapai fase eksponensial  yang  sesuai dengan penelitian  yang  dilakukan  oleh  Solikhah dan Zulaika (2018) atau sampai
kepadatan  sel  mencapai  108    sel/ml yang merupakan jumlah minimum inokulan  yang  harus  ada  dalam  media pembawa  per  gram  nya  (Solikhah,  & Zulaika, 2016; Noviana, & Raharjo, 2009). Pengukuran  kepadatan sel menggunakan Hemocytometer Improve Nauber .

## Pencampuran inokulan
Starter  isolat  yang  sudah  mencapai  108 digunakan sebagai inokulan dengan konsentrasi  5%  dan 10%.  Inokulan diencerkan dengan akuades steril dengan perbandingan  volume  1:1,  dan  media tanpa  inokulan  sebagai  control.  Inokulan dicampur  dengan  media  pembawa  yang sudah  steril  di  dalam Laminair  Air  Flow, semua  kemasan  media  pembawa  yang berisi  inokulan,  diinkubasi  di  ruangan terbuka dengan sirkulasi udara yang baik, penyimpanan dilakukan sampai  dengan  1 bulan.

## Uji viabilitas
Uji  viabilitas  digunakan untuk  mengetahui kemampuan  hidup  bakteri  selama  masa penyimpanan.  Viabilitas  dilakukan  pada semua  isolat  setelah  diinkubasi  2  jam. Kepadatan  sel  dihitung  menggunakanan metode  TPC  ( Total  Plate  Count )  dengan metode pengulangan duplo. Sebanyak 1 g masing masing media pembawa diencerkan pada 9  ml  akuades steril,  dan dihomogenkan, diencerkan kembali sampai  dengan  10-3.  Substansi  kultur sebanyak  100 μl  diinokulasikan ke dalam NA-agar  cawan  dengan  metode pour plate, diinkubasi  24  jam,  dan  dihitung jumlah  koloninya.  Koloni  yang memenuhi standar  perhitungan  mikrobiologi  adalah 30-300  CFU/gr  (Capuccino,  &  Natalie, 2000).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Produksi Enzim Amilase dan Selulase
Bacillus sp. U4 dan Pseudomonas sp. U3 mampu  menghasilkan  enzim  amilase, ditandai dengan terbentuknya zona degradasi  amilum di sekitar koloni
(Gambar  1).  Keberadaan  zona  degradasi di sekitar koloni disebabkan oleh terjadinya  hidrolisis  amilum  oleh  isolat yang menyebabkan terdegradasinya amilosa    sehingga    tidak    mampu membentuk  kompleks  dengan    reagen iodin. Menurut Indriati et al (2018), bakteri yang  memiliki  aktivitas  enzim  amilase dapat menghidrolisis amilum yang terkandung  pada  media starch  agar (Indriati et al ., 2018). Besar kecilnya zona degradasi amilum ditentukan jumlah monomer  glukosa  yang    diproduksi  dari proses hidrolisis amilum. Amilum terhidrolisis  oleh  enzim  amilase  menjadi dekstrin,  kemudian  terhidrolisis  menjadi maltosa  dan  terhidrolisis  lagi  menjadi glukosa  (Swandi,  2020).  Enzim  amilase dapat  memecah  ikatan  glikosida  yang terdapat  pada  polimer  amilum  menjadi sumber  karbon  dan  energi  (Swandi, 2020). Daerah pada   media  yang   masih berwarna    biru    setelah    ditetesi    iodin diindikasikan    amilum    pada    media belum  terdegradasi  oleh  enzim  amylase (Indriati et al ., 2018).
Pseudomonas U3                                          Bacillus U4
k k
zd                                                                     zd
Gambar 1. Skrining amilase pada Bacillus sp. U4 dan Pseudomonas sp. U3 (zd: zona degradasi, k: koloni).
Pseudomonas U3                                          Bacillus U4
k                                                                       k zd                                                                      zd
Gambar 2. Skrining selulase pada Bacillus sp. U4 dan Pseudomonas sp. U3
(zd : zona degradasi, k: koloni).
Bacillus sp. U4 dan Pseudomonas sp. U3 mampu  memproduksi  selulase  ditandai dengan  terbentuknya  zona  degradasi  di sekitar koloni (Gambar 2). Zona degradasi muncul  setelah  media  digenangi congo red 1% dan dibilas dengan NaCl 10%, hal ini  disebabkan    adanya  aktivitas  enzim selulase  yang  menghidrolisis  selulosa menjadi glukosa. Reaksi antara congo red dan    ikatan β-1,4-    glikosidik    yang terkandung    pada    polimer    selulosa menyebabkan munculnya zona degradasi.  Menurut  Soeka et  al (2019), bakteri  dapat  menghidrolisis  selulosa
menjadi  glukosa  karena  aktivitas  enzim selulase (Soeka et al ., 2019).

## Viabilitas Media Pembawa
Media  pembawa  yang  digunakan  pada penelitian  ini    adalah    gambut,    serbuk gergaji, dan  sekam  yang disterilisasi dan diberi  inokulan  (Gambar  3).  Sterilisasi media pembawa bertujuan untuk meminimalkan  adanya mikroorganisme yang tidak dikehendaki (kontaminan) serta untuk    meminimalisasi  kerusakan  media pembawa  yang  dapat  mempengaruhi kualitas inokulan (Nurrobifahmi dkk., 2017).

## A                                  B                                  C
Gambar 3. Media pembawa yang telah disterilisasi (A. gambut; B. serbuk gergaji;
C. sekam).
BU4 SG 10%                            BU4 S 10%                                BU4 G 10%
PU3 SG 10%
BU4 S 10%                               BU4 G 10%
Gambar 4 . Viabilititas  isolat  di  media  pembawa  setelah  2  jam  Inkubasi (P  U3: Pseudomonas sp. U3;  B  U4: Bacillus sp. U4; SG: serbuk gergaji; S: sekam; G: gambut).
Media  pembawa  dengan  inokulan  yang mempunyai viabilitas tinggi adalah sekam, sedangkan media dengan viabilitas rendah  adalah  media  gambut.  Jumlah koloni  dengan  pengenceran  10-3  pada media  pembawa  ditunjukkan  pada  Tabel 1.
Menurut  Simanungkalit et  al (2006), standar baku mutu pembumbuhan mikroorganisme  yang  dapat  digunakan untuk biofertilizer adalah minimal mencapai konsentrasi ≥107
(Simanungkalit  dkk.,  2006).  Pada  uji viabilitas  bakteri  setelah  2  jam  ikubasi belum mencapai kisaran 107 dikarenakan bakteri  belum  menyerap  nutrisi  media pembawa dengan baik sehingga jumlahnya belum dapat dikatakan sebagai jumlah  standar biofertilizer. Uji  viabilitas pada  media  pembawa  dengan  inokulan 0% beberapa koloni isolate masih tumbuh yang  menandakan  bahwa  media  tersebut belum sepenuhnya steril.

## Tabel 1. Jumlah CFU pada media pembawa setelah inkubasi 2 jam
No Media Pembawa Isolat Konsentrasi (%) CFU/gr 1 Serbuk Gergaji Pseudomonas sp. U3 0 0,00 5 7,2 x 10 4 10 9,7 x 10 4 Bacillus sp. U4 0 4,0 x 10 3 5 1,5 x 10 4 10 3,4 x 10 4 2 Sekam Pseudomonas sp. U3 0 4,1 x 10 4 5 30,2 x 10 4 10 30,9 x 10 4 Bacillus sp. U4 0 1,8 x 10 4 5 30,4 x 10 4 10 30,8 x 10 4 3 Gambut Pseudomonas sp. U3 0 3,0 x 10 2 5 4,0 x 10 2 10 4,2 x 10 3 Bacillus sp. U4 0 1,4 x 10 3 5 3,8 x 10 3 10 3,3 x 10 3

## KESIMPULAN
Bacillus sp. U4 dan Pseudomonas sp. U3 dapat  menghasilkan  enzim   amilase  dan selulase  sehingga  berpotensi  digunakan sebagai  dekomposer  bahan  organik. Media pembawa yang dapat menghasilkan  viabilitas  terbaik  setelah diinkubasi  2  jam  adalah  sekam  dengan konsentrasi  inokulan  10%.  Viabilitasnya
30,8 x 104 pada Bacillus sp. U4 dan 30,9 x 104 Pseudomonas sp. U3.

## DAFTAR PUSTAKA
Capuccino,  J.  G.,  &  Natalie,  S.  ( 2000).
Microbiology A Laboratory Manual . California: Benjamin Cummings Publishing Company.
Iftita,  W.  D.,  Shovitri,  M.,  &  Zulaika,  E. ( 2014).  Pengaruh  HgCl2  terhadap Viabilitas Bacillus S1  dan  Potensi Enzim Pendegradasi Senyawa Organik. Jurnal  Sains  dan  Seni ITS, 3(1): E26-E29.
Indriati,    G.,    Megahati,  R.    R.    P.,    & Rosba,    E.    (2018).    Potency    of Amylase-producing  Bacteria    and
Optimization  Amylase  Activities. In IOP  Conference  Series:  Materials
Science  and  Engineering, 35(1): 012023.
Lay,  Z.,  Than,  W.  M.  &  Myint,  M.
( 2015).  Study  on  the  Cellulase Enzyme  Producing  Activity  of Bacteria  Isolated  from  Manure Waste and Degrading Soil. International  Journal  of  Technical Research  and  Applications, 3(6):
165-169.
Liang, Y.-L., Zhang, Z., Wu, M., Wu, Y., & Feng, J.-X. (2014). Isolation, Screening,  and  Identification  of Cellulolytic  Bacteria  from  Natural
Reserves in the Subtropical Region  of  China  and  Optimization of Cellulase Production by Paenibacillus terrae ME27-1.
BioMed Research International, 1 – 13.
Muraleedharan,  H.,  Seshadri,  S.,  & Parumal,  K.  ( 2010). Biofertilizer (Phosphobacteria ).  Chennai:  Shri AMM Murungappa Chettiar Research Center. Muzaiyanah,  S.,  &  Subandi,  S.  (2018).
Peranan  Bahan  Organik  dalam Peningkatan  Produksi  Kedelai  dan Ubi  Kayu  pada  Lahan  Kering Masam. Iptek  Tanaman  Pangan , 11(2).
Noviana,  L.  &  Raharjo,  B.  (2009). Viabilitas  Rhizobakteri  Bacillus  sp. DUCC-BR-K1. 3 pada Media Pembawa Tanah Gambut Disubstitusi dengan Padatan Limbah Cair Industri Rokok. BIOMA , 11(1): 30-39.
Nurrobifahmi,  N.,  Lahan,  S.  D.,  Setiadi, Y.,  Ishak,  I.,  Isotop,  P.  A.,  &
Lebak,  R.  B.  T.  N.  N.  ( 2017). Pengaruh Metode Sterilisasi Iradiasi Sinar Gamma Co-60 terhadap  Bahan  Pembawa  dan Viabilitas Spora Gigaspora margarita. Jurnal  Tanah  dan  Iklim , 41(1).
Razie,  F.,  Anas,  I.,  Sutandi,  A.,  Gunarto,
L., & Sugiyanta, S. (2011). Aktivitas  Enzim  Selulase  Mikroba
Yang Diisolasi Dari Jerami Padi Di
Persawahan  Pasang  Surut  Di Kalimantan  Selatan. Jurnal  Ilmu
Tanah  dan  Lingkungan, 13(2)  43-
48.
Rohmah,  N.  &  Muslihatin,  W.  (2016).
Pengaruh Kombinasi Media
Pembawa  Pupuk  Hayati  Bakteri Penambat  Nitrogen  Tehadap  pH dan  Unsur  Hara  Nitrogen  dalam Tanah. Jurnal Sains dan Seni ITS, 5(2). Santos,    G.    (2014). Probiotics    An Essentials    Tool    in    Intensive Shrimp    Aquaculture .    England    :
5m Publishing.
Saraswati,  R.,  Santosa,  E.,  &  Yuniarti,  E.
( 2006). Organisme Perombak Bahan Organik . Bogor: Balai Litbang Sumberdaya Lahan Pertanian. Shariati, S., Alikhani, H.A. & Pourbabaei, A. (2013). Application  of  vermicompost  as  a carrier  of  phosphate      solubilizing bacteria ( Pseudomonas fluorescens )   in   increase   growth parameters of maize.
International  Journal  of  Agronomy and  Plant  Production, 4(8):  2010- 2017.
Simanungkalit,  R.  D.  M.,  Husein  E.,  & Saraswati.  (2006). Baku    Mutu
Pupuk    Hayati    dan    Sistem Pengawasannya .  Bogor  :  Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian. Singh, J. S,  Pandey, V. C., & Singh, D. P. (2011). Efficient soil microorganisms: a new dimension for sustainable agriculture andenvironmental development. Agric Ecosyst Environ, 140: 339 –353.
Soeka,  Y.  S.,  Suharna,  N.,  Triana,  E.,
& Yulinery, T. (2019). Characterization of cellulase enzyme  produced  by  two  selected strains of Streptomyces macrosporeus isolated  from  soil  in
Indonesia. Makara  Journal  of Science, 65-71.
Solikhah,  F.,  &  Zulaika,  E.  ( 2016).
Tinjauan Filogenetik Bakteri
Lignoselulolitik  Endogenik  Untuk Dekomposisi Serat Gambut. Tesis. Departemen  Biologi,  Fakultas  Ilmu
Alam  Institut  Teknologi  Sepuluh Nopember, Surabaya.
Swandi, M. K. (2020). Isolation,
Characterization  and  Activity  Test of  Soil  Origin  Bacteria  Amilage.
Biosfer:  Jurnal  Tadris  Biologi, 11(2): 181-189.