Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan

## UPAYA PENINGKATAN KUALITAS TANAMAN KEDELAI
( Glycine max L. Merill) MELALUI PEMANFAATAN BIOTEKNOLOGI DALAM MENGATASI KELANGKAAN PANGAN
(Efforts to Improve Quality of Soybean Plant (Glycine max L. Merill) Through the use of Biotechnology in Overcoming Food Scarcity)
1) Edi Tando dan 2) Muh. Afif Juradi
1) Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Sulawesi Tenggara
2) Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Sulawesi Tengah

## ABSTRACT
Population  growth  the  rapidly  is  currently  a  major  challenges  to  business  world  food  supply.  The development of biotechnology begins with technology genetically engineered has accelerated. Products of biotechnology plants resembling plants provenance, but having the characteristics of certain that causes those  plants  better.  Plant  products  of  biotechnology  which  has  been  approved  for  food  as  having  the nature  of  :  1)  resistance  to  pests  and  disease  ,  2)  resistance  to  herbicide,  3)  nutrition  changes  and  4) content  increased  save  resources.  The  purpose  of  drafting  this  paper  is  to  provide  information  about improving the quality of the soybean plant (  Glycine max l .Merill ) through the use of biotechnology in addressing  scarcity  of  food.The  genetically  engineered  in  plants  soybean  ,  includes  extraction  process dna ( modification ctab ) method of the leaves of plants tangential and soybean R1 R2. Fragments of dna the  genome  of  0.8  kb  involved  in  tolerant  asam-al  at  b  .  Japonicum  38  has  successfully  isolated  using inverse PCR technique, Fragments of dna has been successfully diklon into plasmid vector pgemt-easy ( ~ 3kb ) produce recombinant plasmid pgemt-38 a ~ 3.8 family planning. Ttransfer genes pinii in plants soy has successfully done through a . Tumefaciens with one of his event at1 ( tidar ) showing the pcr positive on pinii genes. Protocol best for soybean through the transformation of a . Tumefaciens is using eksplan cotyledon young  with  the density  of bacteria  1 x  108  / cell  mls  inoculation  /  long  90  minutes  and  long kokultivasi  5  days.  The  soybean  plant  AT1R1  (  tidar  )  transformation  through  a  result.  Tumefaciens  a little more resistant to pest borer rather than the pods the soybean plant  nontransgenik (control).
Keyword : quality; biotechnology; soybean.

## PENDAHULUAN
TanamanKedelai  ( Glycine  max L. Merill) di Indonesia ialahkomoditas strategis  ketiga  setelah  padi  dan  jagung, karena  setiap  hari  dikonsumsi  hampir sebagian masyarakat  dengan  tingkat konsumsi  rata  -  rata  8,12  kg/kapita/tahun (Sudaryanto dan Swastika, 2007). Sementara,  kebutuhan  kedelai  akan  terus meningkat  sejalan  dengan  bertambahnya jumlah  penduduk.  Hal  ini  tercermin  dari
permintaan  kedelai  dalam  sepuluh  tahun terakhir  yang  terus  meningkat,  jauh melampaui  produksi  dalam  negeri.    Oleh karena  itu  upaya  peningkatan  produksi harus  diupayakan  melalui  perluasan  areal tanam (Harsono, 2008).
Pertumbuhan penduduk yang semakin  pesat  saat  ini  menjadi  tantangan besar  bagi  usaha  penyediaan  pangan dunia.  Badan  pangan  dunia  atau  FAO, memperkirakan  akan  terjadi  kelangkaan
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
pangan  dunia  pada  tahun  2050.  Sektor pertanian sebagai penyedia pangan dituntut lebih produktif dalam mengimbang itingginya kebutuhan pangan dunia  yang  meningkat  hingga  70%. Suryanegara  (2011)  menyatakan  bahwa salah satu upaya untuk menjawab tantangan  tersebut,  antara  lain  melalui penerapan  bioteknologi  melalui  rekayasa genetika.
Perkembangan
bioteknologi diawali dengan teknologi rekayasa genetika  menjadi  semakin  cepat.  Dalam dogma sentral atau pemahaman dasar ilmu biologi  diketahui  bahwa  cetak  biru kehidupan  DNA  menyimpan  informasi yang  pemanfaatannya  dilakukan  melalui perubahan informasi  ke materi baru yaitu RNA.  Proses  ini  disebut  transformasi. Selanjutnya RNA juga dirubah informasinya  ke  dalam  materi  akhir  yaitu protein  dalam  proses  translasi.  Dari  alur informasi  dalam  dogma  sentral  itu  bisa dipahami  bahwa  rekayasa  DNA/genetika membawa implikasi pada perubahan RNA sebagai materi pertengahan maupun kepada protein sebagai produk akhir.
Rekayasa genetika merupakan usaha manusia dengan sengaja mengubah, memodifikasi dan atau menambahkan  susunan  suatu  gen  dengan
material  baru  kedalam  suatu  organisme untuk mendapatkan generasi sesuai tujuan yang diinginkan. Rekayasa genetika merupakan solusi untuk mengatasi kelangkaan  pangan  dengan  ditemukannya teknologi tanaman transgenic atau Genetically  Modified  Organism (GMO) (Karmana, 2009).
Tanaman produk bioteknologi telah  banyak  diperdagangkan  di  pasar. Tanaman  hasil  rekayasa  genetika  tersebut menyerupai tanaman asalnya, tetapi memiliki  sifat  –  sifat  tertentu  yang menyebabkan tanaman tersebut lebih baik. Tanaman  produk  bioteknologi  yang  telah disetujui untuk pangan merupakan tanaman  yang  direkayasa  untuk  memiliki sifat seperti : (1) ketahanan terhadap hama dan  penyakit,  (2)  ketahanan  terhadap herbisida, (3) perubahan kandungan nutrisi  dan  (4)  peningkatan  dayasimpan (Manuhara, 2006)
Tujuan  penyusunan  makalah  ini adalah  untuk memberikan informasi tentang upaya peningkatan kualitas tanaman  kedelai  ( Glycine  max L.  Merill) melalui  pemanfaatan  bioteknologi  dalam mengatasi kelangkaan
pangan.
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan

## PEMBAHASAN

## Peranan Bioteknologi
Bioteknologi  didefinisikan  sebagai penerapan  prinsip  -  prinsip  biologi, biokimia  dan  rekayasa  dalam  pengolahan bahan  dengan  memanfaatkan  agensia jasad hidup dan komponen - komponennya untuk menghasilkan barang dan  jasa.  Bioteknologi  selalu  berkaitan dengan  reaksi  -  reaksi  biologis  yang dilakukan  oleh  jasad  hidup  sebagai  suatu individu  atau  komponen  -  komponenya yang  dapat  berupa  organel,  sel  atau jaringan  atau  bahkan  molekul  -  molekul tertentu,  misalnya  DNA,  RNA,  protein atau enzim. Ilmu yang mendasari bioteknologi  ialah  mikrobiologi, genetika, biokimia, biologi molekuler, ilmu pangan, rekayasa kimia, rekayasa mekanik, teknologi pangan, elektronik dan computer (Yuwono, 2012)
Melaluiupayamemanfaatkan kemajuan  bioteknologi  seperti  rekayasa genetik,  gen-gen  yang  bermanfaat  dari sumber  yang  berbeda  seperti  bakteri  atau spesies  tanaman  lain  yang  sama  sekali tidak memiliki kekerabatan dapat diisolasi dan  gen  tersebut  dapat  dimasukkan  ke dalam  tanaman  yang  akan  diperbaiki melalui  metode  transfer  genetik  (Seraj,
2001).
Selanjutnya pemanfaatan teknologi  biologi  molekuler,  gen  yang diinginkan  dapat  dipotong  dari  suatu genom  tanaman  dan  disambung  ke  dalam genom  lain  melalui  suatu  eksperimen yang  unik,  tanpa  memindahkan  gen-gen yang  tidak  diinginkan  selama  proses (Fernandes dan Filho, 1993).
Tanaman  transgenik  merupakan suatutanaman  yang  memiliki  gen  atau telah disisipi gen dari organisme  lain, dan dapat  pula  disebut  sebagai Genetically Modified  Organism (organisme  yang termodifikasi  secara  genetik).  Penyisipan gen  ini  umumnyalebih  diarahkan  ke tanaman pangan untuk menciptakan kualitas  pangan  yang  lebih  baik  daripada sebelumnya.

## Rekayasa  Genetik  pada  Tanaman Kedelai
Salah  satu  jenis  tanaman  produk bioteknologi ialah kedelai. Kedelai merupakan  tanaman  penghasil  minyak yang  mempunyai  nilai  ekonomi  tinggi. Bijinya  mengandung  asam amino esensial lebih  tinggi  di  banding  daging,  sehingga merupakan  tanaman  pangan  yang  sangat penting saat ini.
Rekayasa  genetika  pada  tanaman mencakup  beberapa  tahapan,yaitu  :  1) Ekstraksi  DNA,    2)  Kloning  gen,  3)
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
Desain gen, 4) Transformasi genetika dan 5) Pemuliaan tanaman di lapangan.
Proses  rekayasa  genetika  pada tanaman  kedelai  ( Glycine  max L.  Merill), dalam  mengatasi  kelangkaan  pangan  saat ini  mencakup  beberapa  tahapan  atau proses, antara lain :

## 1. Ekstraksi DNA
Ekstraksi  DNA  atau  isolasi  DNA target merupakan prosedur umum dalammemisahkan  dan  mengumpulkan DNA  untuk  analisis  rekayasa  genetika, forensik, bioinformatika, komputasi, analisis  asal-usul  dan  antropologi.  Prinsip dasar Ekstraksi DNA adalah
mengeluarkan DNA dari sel.
Hasil  penelitian  Hadiarto et  al  .,
(2002) menunjukkan bahwa proses transfer  suatu  gen  asing  ke  dalam  genom suatu  tanaman  target  dimulai  dengan pemasukan gen asing ke dalam sitoplasma sel  tanaman  target.  Selanjutnya  gen  ini akan  masuk  ke  dalam  inti  sel  tanaman melalui  pori  -  pori  membran  inti  sel. Apabila gen asing tersebut berhasil masuk atau  menyisip  ke  dalam  kromosom tanaman  target  dan  berintegrasi  dengan baik  (berada  pada  bagian  yang  aktif ditranskripsi),  maka  gen  itu  akan  dapat diekspresikan  oleh  tanaman  transforman.
Suatucontoh proses ekstraksi DNA (modifikasi  metode  CTAB)  yaitu  DNA diekstrak  dari  daun  tanaman  kedelai transgenik  R1  dan  R2  yang  telah  ditanam di  rumah  kaca.  Ekstraksi  DNA  dilakukan dengan cara menggerus kurang lebih 0,5-2 g  daun  yang  telah  disimpan  dalam  ruang gelap  bersuhu  -20 o C  dengan  nitrogen  cair hingga menjadi serbuk halus. Serbuk daun ter-sebut  dipindahkan  ke  dalam  tabung corning  dan  ditambah  dengan  bufer ekstraksi  1  M  Tris  HCl  (pH  7,5);  0,5  M EDTA (pH 8); 5 M NaCl; 1% CTAB; 140 mM  Na-bisulfite.  Campuran  tersebut kemudian digoyang perlahan dan disimpan  pada  inkubator  65 o C,  selama  15 menit.  Setelah  didinginkan  pada  suhu ruang  selama  4  -  6  menit,  ekstraksi kemudian dilanjutkan dengan menambahkan 6  ml chloroform :  isoamil- alkohol  (24  :  1).  Campuran  tersebut digoyang  kembali  selama  20  menit. Setelah  supernatan  akhir  dipisahkan, campuran  kemudian  ditambahkan  2  vol. 95%  EtOH  dingin.  Setelah  dicampur merata,  kemudian  pelet  DNA  diambil dengan  pipet  pasteur  dan  dipindahkan  ke dalam  eppendorf  1,5  ml.  Endapan  DNA dicuci  dengan  alkohol  70%  dingin  (2 kali), kemudian dikeringkan dengan mesin evaporator  VWR  1410.  Endapan  DNA
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
kemudian  dilarutkan  dalam  1x  TE  bufer (10 mM Tris HCl pH 7,5; 0,1 mM EDTA pH  8).  Purifikasi  DNA  pelet  yang diperoleh, dilakukan dengan menambahkan  3  ml  RNase  dan        3  ml proteinase  K  (1  mg/ml)  37 o C,  60  menit. Kemudian  tambahkan  1/10  vol.  3M NaOAc. Tambahkan 2 vol. EtOH absolut, dicampur merata. Pelet DNA dipindahkan ke  eppendory  baru,  kemudian  dicuci dengan  EtOH  70%  (v/v),  selanjutnya dikeringkan  dan  dilarutkan  dalam  TE  (1 kali) dan disimpan dalam suhu -20 o C.
DNA  tanaman  sampel  yang  telah dimurnikan digunakan untuk analisisPCR. Volume  yang  digunakan  dalam  PCR untuk  1  kali  reaksi  adalah  25  ml  dengan komposisi  bahan  1  kali  bufer  PCR  yang mengandung  MgCl2  0,25  mM;  200  mM dNTP;  100  nM  primer  forward  dan reverse  pinII;  1,5  u/ml  enzim  Taq  DNA polymerase (Promega, Madison, Wisconsin, USA); 5 ng DNA hasil  isolasi dan  ddH2O  bebas  nuklease  ditambahkan agar  volume  reaksi  mencapai  25  ml. Primer  yang  digunakan  untuk  mendeteksi gen  pinII  mempunyaiurutan  basa  forward 5’GCCTTGGGCTCATCACTCTCTCTC CTTCAC-3’ dan reverse 5’- GGAAGTTAATTTCG TTGCTTACC-3’.
Deteksi  gen  pinII  melalui  PCR  ini
menggunakan  mesin  PCR  Programable
Thermal Controller (MJ Research Incorporation, Massachussetts, USA)
dalam  35  siklus  yang  terdiri  94 o C  selama 5  menit,  94 o C  selama    1  menit,  55 o C selama 2 menit, dan 72 o C selama 1 menit. Hasil  amplifikasi  PCR      kemudian  di- separasi dengan 0,8% (w/v) elektroforesis agarose  gel  dan  pewarnaan  dengan ethidium  bromide  (McGarvey  dan  Kaper, 1991;  Listanto et  al., 1996).  Hasil  PCR positif  ditunjukkan  dengan  munculnya pita  DNA  pada  gel  hasil  elektroforesis pada posisi 600 bp.
DNA total genom berhasil diisolasi  dengan  baik  dari  sampel  daun tanaman  kedelai  transgenik  R1,  R2,  dan non  transgenik.  Hal  ini  ditunjukkan dengan  hasil  kemurnian  DNA  yang  telah memenuhi  syarat,  yaitu  sekitar  1,5-2. Kemurnian  DNA  yang  baik  untuk  uji molekuler berkisar antara 1,6-1,8. Sampel DNA  murni  hasil  ekstraksi  tersebut selanjutnya  diseparasi  pada  gel  Agarose elektroforesis  (0,8%),  kemudian  hasilnya difoto  dengan  film  polaroid.  Dari  hasil foto  gel  terlihat  bahwa  DNA  semua sampel  dapat  muncul/terdeteksi.  Contoh hasil  foto  DNA  dari  beberapa  sampel tanaman dapat dilihat pada Gambar 1.
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
1-23 urutan sampel daun AT1-1 sampai AT1-23, tanda panah Menunjukkan posisi pita DNA sampel
Gambar 1  Foto DNA total dari sampel daun kedelai transgenik R1 event AT1( Agrobacterium ) pada gel agarose 1%
Sedangkan  hasil  isolasi  DNA seluruh sampel tanaman kedelai transgenik disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Hasil isolasi DNA total daun tanaman kedelai transgenic dan non transgenic.
Event Generasi Metode Jumlah Hasil Tanaman Tanaman Transformasi Sampel DNA WP2 R1 Penembakan 57 bagus WP1 R2 Penembakan 18 bagus TP1 R2 Penembakan 9 bagus TP2 R2 Penembakan 16 bagus AT1 R1 Agrobacterium 27 bagus Wilis Kontrol Non Transformasi 1 bagus Tidar Kontrol Non Transformasi 1 bagus Bagus = Kemurnian DNA antara 1.5 – 2
Sampel  DNA  ini  selanjutnya  siap digunakan  untuk  deteksi  gen pin II menggunakan teknik PCR.

## 2. Kloning Gen
Kloning  merupakan  salah  satu langkah  yang  dapat  digunakan  untuk mengembangkan tanaman transgenik. Kloning gen bertujuan untuk
memperbanyak gen interest yang diharapkan.
Sebagai  contoh  dalam  tanaman kedelai bahwa efektivitas sistem simbiosis antara  bakteri  bintil  akar  (BBA)  dengan tanaman  legum  sangat  dipengaruhi  oleh kondisi tanah. Dalam simbiosisnya dengan  tanaman  legum,  BBA  berperan untuk memfiksasi nitrogen dan
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
mengubahnya menjadi amonia yang dapat digunakan  oleh  tanaman.  Beberapa  galur
BBA kedelai tumbuh lambat,
Bradyrhizobium  japonicum, yang  efektif dalam menambat nitrogen dapat memenuhi  lebih  kurang  74%  pasokan nitrogen yang dibutuhkan tanaman kedelai tanaman  kedelai  (Yutono,  1985).  Oleh karena  itu,  telaah  mengenai  gen  yang bertanggung jawab terhadap sifat toleransi asam-Al  tersebut  penting  diketahui  untuk menelaah  lebih  lanjut  respons  fisiologi dan  karakter  molekuler  yang  berperan dalam  sifat  toleransi  asam-Al  pada B. japonicum.
Hasil  penelitian  Astuti et  al.,
(2002)  menunjukkan  bahwa  fragmen DNA  genom  sebesar  0.8  kb  yang  terlibat dalam toleran asam-Al pada B. japonicum
38 telah berhasil diisolasi dengan menggunakan teknik inverse PCR, melalui  mutagenesis  transposon  mini- Tn5Km1. Fragmen DNA tersebut berhasil diklon  ke  dalam  plasmid  vector  pGEMT- Easy (~3kb) menghasilkan plasmid rekombinan pGEMT-38 yang berukuran ~ 3.8 kb.
Kloning  fragmen  DNA  genom pengapit transposon telah berhasil diligasi kedalam  vektor  plasmid  pGEM-T  Easy membentuk plasmid rekombinan pGEMT- 38 dan ditransformasi ke dalam sel E. coli DH5α.  Koloni  putih  hasil  transformasi setelah  diekstrak  plasmid  rekombinannya, dipotong  dengan Eco RI,  dan  dipisahkan dengan  elektroforesis  gel  agarosa  1%, hasilnya tertera pada Gambar 2.
Gambar  2.    A)  Hasil  elektroforesis  gel agarosa  1%  dari  DNA  genom  pengapit transposon  yang  diamplifikasi  dengan inverse PCR  dari  genom  mutan  AAS38.
Sumur 1: marker DNA (1 kb ladder plus ), sumur 2: DNA hasil inverse PCR. B)Hasil elektroforesis  plasmid  pGEMT-38  yang dipotong  dengan  enzim Eco RI.Sumur  2
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
dan 3 terdapat dua pita yang berukuran ~3 kb  (pGEMT-Easy)  dan  ~0.8  kb    (DNA genom pengapit transposon) hasil pemotongan Eco RI.
Hasil  pemotongan  dengan  enzim Eco RI didapatkan dua pita yang
menunjukkan  adanya  plasmid  vektor pGEM-T  (~3  kb)  dan  DNA  sisipan  yaitu fragmen DNA genom pengapit transposon yang terlibat dalam toleransi asam-Al (0.8 kb). Peta plasmid rekombinan pGEMT-38 (~3.8 kb) dapat dilihat pada Gambar 3 .
Gambar 3  Peta Plasmid rekombinan pGEMT-38 (~3.8 kb) hasil ligasi fragmen DNA genom yang terlibat dalam toleransi asam-Al (~0.8 kb) dengan pGEMT- Easy (~3kb).
Plasmid  rekombinan  hasil  ligasi antara  vektor  pGEMT-Easy  dengan  DNA sisipan  merupakan  alat  penting  untuk telaah  molekuler  lebih  lanjut.  Plasmid rekombinan yang ditransformasi ke dalam sel E.  coli DH5α  ini  dimaksudkan  untuk pembentukan  klon,  yaitu  sel-sel  individu yang mengandung molekul DNA rekombinan  yang  dapat  dipropagasi  dan disimpan  untuk  memproduksi  molekul DNA  rekombinan  dalam  jumlah  besar sehingga dapat digunakan untuk mempelajari  karakter  fisiologis  tertentu ataupun  untuk  mengkonservasi  molekul DNA  rekombinan  dalam  keadaan  stabil (Dawson et al . 1996). Plasmid
rekombinan  ini  juga  dapat  digunakan untuk  menganalisis  sekuen  DNA  sisipan (DNA yang terlibat dalam toleransi asam- Al),  sehingga  dapat  ditemukan  sekuen homologinya  dengan  sekuen  organisme lain  pada database GeneBank.  Selain  itu juga  dapat  digunakan  untuk  mengetahui protein  yang  disandikan  oleh  sekuen  gen tersebut  dengan cara membandingkan dan mensejajarkan  data  urutan  asam  amino DNA sisipan dengan data GeneBank.

## 3. Desain Gen
Kegiatan  desain  gen  dilakukan dengan  merubah susunan basa dalam area kode  ( encode  region )  gen  yang  akan menentukan  produksi  protein  tertentu
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
yang  diinginkan.  Dalam  rekombinasi DNA dilakukan pemotongan dan penyambungan  DNA,  melibatkan  enzim tertentu.  Enzim  pemotong  yaitu  enzim restriksi endonuklease dan enzim penyambung  yaitu  enzim  ligase.  Hasil sambungan  DNA  dikenal  sebagai  DNA rekombinan. yaitu enzim ligase.
Hasil  penelitian  Susilawati  (2013) menunjukkan  bahwa  penyakit  hawar bakteri ( bacterial blight ) merupakan salah satu  penyakit  penting  pada  tanaman kedelai  dan  dapat  menyebabkan  kerugian mencapai  11-  20%.  Identifikasi  penyebab penyakit  perlu  dilakukan  secara  dini  agar pengendalian  penyakit  lebih  mengena sasaran.  Identifikasi  penyebab  penyakit hawar  bakteri  dilakukan  yaitu  dengan Polymerase  Chain  Reaction (PCR).  Pada PCR,  kespesifikan  primer  merupakan salah  satu  kunci  keberhasilan  PCR. Patogen  penyebab  penyakit  hawar  bakteri diketahui  memiliki  gen  spesifik  yaitu  gen coronafacate ligase ( cfl) yang membedakannya dari spesies lain. Kekhususan  gen  pada  bakteri  target  yang diidentifikasi dapat dijadikan dasar sebagai  pembeda  antar  spesies.  Penelitian ini  bertujuan  untuk  mendesain  primer yang  spesifik  terhadap  gen cfl dan mengamplifikasi  sekuensi  gen cfl dengan
PCR  menggunakan  primer  spesifik  yang di desain.
Tahap  pertama  dalam  desain primer  dilakukan  eksplorasi  sekuensi  gen cfl dari  gen  Bank  NCBI  dan  diperoleh lima jenis bakteri dari patovar P. syringae dan  dua  jenis  bakteri  lain  yang  memiliki gen cfl .  Perbedaan  urutan  sekuensi nukleotida  dari  masing-masing  jenis bakteri selanjutnya di uji multiple alignment  dengan  software  ClustalX,  dan diperoleh  lima  patovar P.  syringae yang memiliki  area  homologi  yang  tinggi.  Dari lima  kandidat  patovar P.  syringae yang diketahui area homologi tertinggi, selanjutnya  dipilih  satu  sekuensi  spesifik P. syringae pv. glycinea. Urutan nukleotida  gen cfl dari P.  syringae pv. glycinea didesain  primernya  dengan  tool bioinformatika  Primer3  dan  diperoleh lima  kandidat  primer.  Lima  kandidat primer  tersebut  di  uji  kembali  dengan software  AmplifX dan dipilih  satu pasang primer  yang sesuai dengan kriteria primer spesifik.  Primer  yang  digunakan  dalam amplifikasi  sekuensi  gen cfl yaitu  primer PSG_ cfl 2-F dengan sekuensi 5' TTCCTACGGTACGACGGAGTCT 3' dan  PSG_ cfl 2-R  dengan  sekuensi  3' CCCACTGGTAGTACGCAACAGA  5'. Hasil amplifikasi sekuensi gen cfl
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
terhadap P.  syringae pv. glycinea dengan menggunakan  primer  PSG_ cfl 2  adalah negatif,  hal  ini  ditunjukkan  dengan ketidakmunculan  pita  DNA  pada  gel elektroforesis. Ketidakmunculan pita DNA hasil amplifikasi gen cfl kemungkinan  disebabkan  karena  bakteri target  tidak  memiliki  gen cfl .  Hal  ini sesuai  dengan  temuan  yang  menyatakan bahwa  tidak  semua P.  syringae pv. glycinea memiliki gen cfl . Untuk membuktikan  ketiadaan  gen cfl pada P. syringae pv. glycinea maka  dilakukan  uji pendekatan induksi hipertropi pada jaringan  kentang.  Pengujian  tersebut  juga memberikan  hasil  negatif  yang  ditandai dengan tidak terbentuknya hipertropi pada jaringan  kentang  yang  ditetesi  dengan suspens P. syringae pv. glycinea. Berdasarkan  pada  nekrosis  yang  lemah pada uji  virulensi dan patogenesitas, tidak terbentuknya  hipertropi  pada  jaringan kentang  dan  tiadanya  pita  gen cfl pada elektroforesis  produk  PCR  disimpulkan bahwa P.  syringae pv. glycinea tidak memiliki gen cfl.

## 4. Transformasi Genetika
Transformasi  genetik  merupakan suatu  perpindahan  ( transfer )  gen  asing yang diisolasi dari tanaman, virus, bakteri atau  hewan  ke  dalam  suatu  genom  baru
( new  genetic  background )  (Webb  dan Morris,
1992). Beberapa teknik transformasi yang dikenal adalah
elektroforesis, gene-gun dan
mempergunakan  bakteri Agrobakterium tumefaciens .
Penggerek polong ( Etiella zinckenella Tr.)  merupakan  salah  satu hama  penting  kedelai  dan  masih  sulit dikendalikan secara konvensional. Penggunaan  varietas  tahan  merupakan strategi  terbaik  dan  relative  aman,  namun hingga  saat  ini  sumber  gen  ketahanan tersebut  belum  ditemukan  pada  plasma nutfah  kedelai  yang  ada.  Perakitan tanaman kedelai transgenik tahan penggerek  polong  merupakan  alternatif terbaik  untuk  mengatasi  masalah  ini. Metode  transfer  gen  pada  tanaman  yang paling  banyak  digunakan  adalah  dengan perantara  vector  Agrobakterium.  Karena sangat  sederhana  dan  murah,  pada prinsipnya  gen  interest  disisipkan  ke plasmid  T-DNA  Agrobacterium  lalu diinokulasikan  ke  jaringan  target  yang telah  dilukai.  Namun,  tidak  semua  jenis tanaman dapat diinfeksi oleh Agrobacterium sehingga aplikasinya terbatas pada  beberapa  jenis tanaman  saja (Hinchee et al., 1988).
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
Pardal et  al., (2004)  menyatakan bahwa  transfer  gen pin II  pada  tanaman kedelai telah berhasil dilakukan melalui A. tumefaciens dengan  dihasilkannya  satu event tanaman AT1 (Tidar) yang menunjukkan  hasil  PCR  positif  terhadap gen pin II. Protokol terbaik untuk
transformasi kedelai melalui A.
tumefaciens adalah menggunakana eksplan kotiledon  muda dengan kerapatan bakteri  1  x  10 8 sel/ml/  lama  inokulasi  90
menit  dan        lama  kokultivasi  5  hari. Tanaman  kedelai  AT1R1  (Tidar)  hasil transformasi  melalui A.  tumefaciens sedikit lebih tahan terhadap hama penggerek  polong  daripada  tanaman kedelai nontransgenik (Kontrol).
Ada  pun  proses  transformasi genetika  pada  tanaman  kedelai  dengan perantara  bakteri A.  tumefaciens secara rinci disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2  Persentase gus positif pada eksplan embrio dan kotiledon muda kedelai Wilis hasil transformas dengan A. Tumefaciens
Jenis eksplan/ Jumlah Lama inokulasi 60 menit Lama inokulasi 90 menit Kerapatanbakteri  eksplan Inoculation time (60 min) Inoculation time (90 min) Explan type/ Explant 3 hari kokultivasi 5 hari kokultivasi 3 hari kokultivasi  5 hari kokultivasi (OD 600 ) Embriomuda 0.5 6 2 2 1 1 (33.3) (33.3) (16.7) (16.7) 1 6 3 4 4 5 (50) (66.7) (66.7) (83.3) 1.5 6 0 1 3 1 (0) (16.7) (50) (16.7)
Keterangan : OD 600 = 1 setaradengan 1x108 sel/ml. Angkadalamkurungadalahpersentase.
Tabel  2,  menunjukkan  bahwa eksplan  embrio  dan  kotiledon  muda kedelai sangat responsive terhadap infeksi A. tumefaciens .
Sementara  hasil  transfer  gen pin II pada eksplan kedelai melalui A.
tumefaciens disajikan pada Tabel 3.
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
Tabel 3    Hasil regenerasi dan seleksi tanaman dari eksplan kotiledon muda kedelai Wilis dan Tidar yang diinokulasi dengan A. tumefaciens yang mengandung gen pin II.
Varietas Jumlaheksplan Jumlahembrio somatik Jumlahplantet  Jumlahtanaman  Kodetanaman varieties Explant number Somatic embryo number Plantet number Plant number Plant Code Wilistransformasi 1.539 17 15 8 AW1-4 1.1 0.9 0.5 Wilisnontransformasi + 30 1 1 0 kanamisin 200 mg/l 3.3 3.3 0 Wilisnontransformasi + 30 16 9 4 AW1-4 tanpakanamisin 53.3 30 13.3 Tidartransformasi 984 21 3 1 AT1 2.1 0.3 0.1 Tidartransformasi 30 0 0 0 kanamisin 200 mg/l 0 0 0 Tidartransformasi 30 24 16 6 AT1-6 tanpakanamisin 80 53.3 20
Tabel  3,  menunjukkan  bahwa  varietas Wilis  memberikan  jumlah  planlet  dan tanaman  yang  lebih  banyak  (8  tanaman)
dari pada Tidar yang
hanya
menghasilkan1 tanaman. Hal ini
disebabkan embrio somatik yang dihasilkan  dari  eksplan  Wilis  berukuran lebih besar dan bentuknya lebih sempurna sehingga  mudah  dikecambahkan  menjadi planlet/tanaman  (Gambar  2).  Embrio  dari
eksplan  Tidar,  walaupun  jumlahnya  lebih banyak  daripada  Wilis,  tetapi  ukurannya lebih kecil dan kurang sempurna sehingga banyak  yang  gagal  berkecambah  dan akhirnya  hanya  diperoleh  satu  tanaman saja    (Gambar  4).  Tanaman  hasil regenerasi  berhasil  diaklimatisasikan  dan tumbuh  normal  di  rumah  kaca  serta menghasilkan polong yang berbiji (fertil).
Gambar  4    Hasil  uji  GUS  pada  ekspaln  kedelai  hasil  transformasi  dengan  Agrobacterium  tumefaciens tampak  bercak  biru  pada  eksplan  embrio  (kiri)  dan  kotiledon  muda  (kanan)
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
Gambar  5        Pertumbuhan  embrio  somatic  dan  eksplan  kotiledon muda  kedelai  varietasWilis  (kiri)  dan Tidar (kanan) hasil transformasi melalui Agrobacterium tumefaciens pada media seleksi yang mengandungkanamisin 200 mg/l
Gambar  6      Perkecambahan  embrio  somatic  dan  aklimatisasi  tanaman  kedelai  Tidar  (AT 1 )  hasil transformasi melalui Agrobacterium tumefaciens; a = planlet, b = aklimatisasi dalam pot, c = tanaman AT 1 di rumah kaca
Analisi molekuler tanaman kedelai hasil transformasi disajikan pada Gambar 7.
Gambar  7    Hasil  PCR  sampel  DNA  tanaman  kedelai  R 0 hasil  transformasi  dengan  gen pin II melalui Agrobacterium tumefaciens; M = 1 kb, 1 = air, 2 = AT 1 , 3-10 = AW 1 – AW 8, 11 =gen pin II, 12 = Tidarnontransformasi,13 = Wilis non-transformasi.
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
Hasil analisis molekuler
menunjukkan  bahwa  hanya  satu  sampel tanaman  yang  menghasilkan  pita  sebesar 600  bp  (positif),  yaitu  AT  1  (Tidar), sehingga  tanaman  ini  kemungkinan  besar mengandung  gan pin II.  Delapan  sampel tanaman  Wilis  (AW1-AW8)  tidak  satu pun  menghasilkan  pita  600  bp  (negatif), sehingga  tanaman  tersebut  kemungkinan besar tidak mengandung gen pin II.
Herman et  al., (2001)  telah melakukan  pengujian  bioasai  tanaman kedelai  hasil  transformasi  terhadap  larva E.  zinckenella Treit.  Beberapa  individu yang  diuji  (khususnya  WP1  dan  AT1) memiliki  ketahanan  terhadap  hama  ini yang  ditunjukkan  dengan  rendahnya tingkat  kerusakan  pada  polong/biji.  Biji yang  sehat  selanjutnya  dikoleksi  untuk pengujian  lebih  lanjut.  Pada  kegiatan analisis  molekuler, telah  berhasil  diisolasi DNA  total  dari  semua  individu  R1  pada semua event menggunakan  sampel  daun muda  dengan  metode  modifikasi Saghai-
Maroof (CTAB). DNA sampel  yang telah dimurnikan  selanjutnya  digunakan  untuk deteksi  gen pin II  menggunakan  teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)
dengan  primer  spesifik  untuk  gen pin II.
Hasil check PCR  menunjukkan  adanya beberapa  sampel  positif  gen pin II,  yaitu
pada  pita  berukuran  600  bp,  di  antaranya AT1-7,  AT1-11,  AT1-21,  AT1-22,  AT1- 25,  dan  WP2.  Benih  tanaman  yang  PCR positif  akan  diteruskan  untuk  analisis generasi berikutnya.

## KESIMPULAN
1. Rekayasa  genetika  alternatif  dalam meningkatkan kualitas tanaman kedelai dengan mengubah,
memodifikasi  susunan  gen  dengan material baru kedalam tanaman kedelai.
2. Rekayasa  genetika  pada  tanaman kedelaimencakup  :  Ekstraksi  DNA,
Kloning gen, Desain gen,
Transformasi  genetika  dan  Pemuliaan tanamandi lapangan.
3. Ttransfer  gen pin II  pada  tanaman kedelai telah berhasil dilakukan melalui A. tumefaciens dengan dihasilkannya satu event tanaman AT1 (Tidar)  yang  menunjukkan  hasil  PCR positif terhadap gen pin II.
4. Protokol  terbaik  untuk  transformasi kedelai  melalui A.  tumefaciens adalah menggunakana eksplan kotiledon muda dengan kerapatan bakteri 1 x 10 8 sel/ml/  lama  inokulasi  90  menit  dan lama kokultivasi
5 hari.
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
5. Tanaman kedelai  AT1R1 (Tidar) hasil transformasi  melalui A.  tumefaciens sedikit  lebih  tahan  terhadap  hama penggerek  polong  daripada  tanaman kedelai nontransgenik (Kontrol).

## DAFTAR PUSTAKA
Astuti  R.I.  M.  Dewi  dan  F.  Sarah  Asih.
2002. Kloning Fragmen DNA
Genom Yang Terlibat Dalam Toleransi  Asam  Aluminium  Pada Bradyrhizobium Japonicum . Available at : http://www.directory.umm.ac.id.  1  - 8.
Dawson  MT,  Powell  R,  Gannon  F.  1996.
Gene  Technology .  Graham  JM,
Billington  D,  Gilmartin  PM,  editor. Oxford:  BIOS  Scientific  Publ.  Ltd. 91 - 95.
Fernandes,  K.V.S.  and  J.X.  Filho.  1993.
Plant Molecular Biology and
Genetic  Engineering:  Prospects  for
The  Brazilian  Northeast.  R.  Bras.
Fisiol. Veg. (5) (2) : 187 - 191.
Hadiarto T. U. Tri Indraini R. P. Saptowo J  dan  M.  Herman.  2002  .Analisis Molekuler  Gen pin II  pada  Tanaman Kedelai  Transgenik  R2.  Prosiding
Seminar  Hasil  Penelitian  Rintisan dan  Bioteknologi  Tanaman.    133  - 140.
Harsono  A.  2008.  Strategi  Pencapaian
Swasembada Kedelai melalui Perluasan  Areal  Tanam  di  Lahan Kering  Masam.  Iptek  Tanaman
Pangan Vol. 3 No. 2 : 224-257.
Herman M. S.J. Pardal. E. Listanto. T.I.R. Utami  dan  D.  Damayanti.  2001. Evaluasi  Tanaman  Kedelai  Generasi
R1  Hasil  Transformasi  dengan  Gen Proteinase  Inhibitor II.  Prosiding Seminar  Hasil  Penelitian  Rintisan dan Bioteknologi Tanaman. 10 - 18.
Hinchee,  M.A.W.  D.V.  Connor  Ward.
C.A.  Newell.  R.E.  Mc  Donnel.  S.J. Sato.  C.S.  Gasser.  D.A.  Fischoff.
D.B.  Re.  R.T.  Fraley  and  R.B.
Horsch. 1988. Production of Transgenic  Soybean  Plants  Using Agrobacterium Mediated DNA Transfer. Bio. Tech. (6) : 915 - 922. Karmana I.W. 2009. AdopsiTanamanTransgenikdanBebe rapaAspekPerkembangannya. GaneC
Swara . (3) (2) : 12 - 21.
Listanto,  E.,  S.J.  Pardal,  and  Kan  Wang.
1996.  A  Simple  Method  of  DNA Isolation  From  Transgenic  Maize Plant for Polymerase Chain Reaction.  Indonesian  Journal  of Agricultural Biotechnology. (1) (1) : 33 - 38. Manuhara    S.W.  2006.  Pengembangan Metode Transformasi Genetik Tanaman Untuk Meningkatkan Kesejahteraan Hidup Manusia. Seminar Nasional Biodiversitas. UNAIR Surabaya. 1 – 11.
McGarvey,  P.  and  J.M.  Kaper.  1991.  A Simple  and  Rapid  Method  for Screening  Transgenic  Plants  Using the  PCR.  Biotechniques.  (11)  (4)  : 428 - 432.
Pardal SJ. G.A. Wattimena. A. Hajrial. M. Herman.  L.  Edy  dan  Slamet.  2004. Transfer  gen proteinase  inhibitor II pada Kedelai melalui vektor
Agrobacterium  tumefaciens untuk Ketahanan terhadap hama penggerak polong  ( Etiella  zinckenella Tr.).
Jurnal  Bioteknologi  Pertanian.  (9) (1) : 20 - 28.
Edi  Tando  :  Upaya  Peningkatan  Kualitas  Tanaman  Kedelai  (Glycine  max  L.  Merill)  melalui Pemanfaatan Bioteknologi dalam Mengatasi Kelangkaan Pangan
Seraj,  Z.  I.  2001.  The  Exciting  Future  of Biotechnology.  Daily  Star,  Edisi Selasa,  30 Januari 2001.
Sudaryanto,  T.  dan  D.K.S.  Swastika. 2007.  Kedudukan  Indonesia  dalam perdagangan  internasional  kedelai. p.  28  -  44. Dalam :  Sumarno et  al . ( Eds .). Kedelai:  teknik produksi dan
pengembangan. Puslitbang Tanaman Pangan. Bogor. Suryanegara I.W. 2011. OptimismedanPesimismeRekayasaG enetika.Available at : Susilawati  R.  2013.  Desain  Primer Spesifik untuk
Mengaplifikasi
Sekuensi  Gen Cfl ( Coronafacate Ligase ) pada Patogen Hawar Bakteri yang  Menginfeksi  Kedelai.  Skripsi Fakultas Pertanian Universitas Jember. Webb,  K.J.  and  Morris,  P.  (1992) Methodologies of Plant Transformation, In: Gatehouse, A.M.R.,  Hilder,  V.A.  and  Boulter, D. (ed). Plant Genetic Manipulation for  Crop  Protection .  C  A  B
International. United Kingdom/
Yutono.1985.  Inokulasi Rhizobium pada kedelai  .  Di  dalam:  Somaatmadja et al. (editor). Kedelai . Balai Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Bogor: Puslitbangtan
Yuwono T. 2012. Bioteknologi Pertanian.
Gadjah  Mada  University  Press.
Cetakan Ketiga. 1 - 284.