E-ISSN:
2548-1398 Published by: Ridwan Institute
Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia p–ISSN: 2541-0849 e-ISSN: 2548-1398 Vol. 7, No. 4, April 2022

## EFEKTIVITAS RAMUAN EKSTRAK REMPAH SEBAGAI IMUNOSTIMULAN TERHADAP TIKUS PUTIH JANTAN GALUR SPRAGUE DAWLEY

## Mario Yohanes Winarto, Dwi Indriati, Nisa Najwa Rokhmah
Program Studi Farmasi, FMIPA Universitas Pakuan, Bogor, Indonesia Email: marioyohanes26@gmail.com,  dwiindriati16@gmail.com, nisanajwarokhmah@gmail.com

## Abstrak
Imunostimulan  berhubungan  dengan  peningkatan  sistem  imun  tubuh  secara  non spesifik maupun spesifik. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan dosis efektif ramuan  ekstrak  rempah  sebagai  imunostimulan  terhadap  aktivitas  fagositosis berdasarkan metode bersihan karbon dan bobot relatif organ limfoid. Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Sprague dawley sebanyak 24 ekor (6  kelompok,  4  ulangan).  Kelompok  pertama  kontrol  negatif  Na-CMC  0,5%. Kelompok  kedua  kontrol  positif  Stimuno ® Forte  (1,26  mg/200  g  BB  tikus). Kelompok ketiga (dosis I (60,12 mg/200 g BB tikus)), keempat (dosis II (120,24 mg/200  g  BB  tikus)),  dan  kelima  (dosis  III  (180  mg/200  g  BB  tikus))  adalah ramuan  ekstrak  7  rempah.  Kelompok  keenam  (dosis  IV  (tunggal)  (56  mg/200  g BB  tikus))  adalah ekstrak  buah  cabe  jawa.  Hasil  penelitian  membuktikan  bahwa dosis III paling efektif sebagai imunostimulan karena nilainya mendekati kontrol positif,  tidak  berbeda  nyata,  juga  mendapati  hasil  angka  terbesar  (jika dibandingkan  kelompok  I,  II,  dan  IV),  berdasarkan  metode  bersihan  karbon (indeks fagositosis = 2,789) dan bobot relatif organ limfoid (hati = 3,954%; limpa = 0,466%; kelenjar timus = 0,167%) .
Kata Kunci : imunostimulan; ramuan ekstrak tujuh rempah; tikus jantan

## Abstract
Immunostimulants are associated with increasing the body's immune system both non-specific and specific. This study aims to determine the effective dose of herb extract  as  an  immunostimulant  against  phagocytic  activity  based  on  the  carbon clearance and the relative weight of lymphoid organs  method. The experimental animals used were 24 male white rats of the Sprague dawley strain (6 groups, 4 replications). The first group was a negative control Na-CMC 0,5%. The second group was a positive control Stimuno® Forte (1,26 mg/200 g BW rats). The third group  (dose  I  (60,12  mg/200  g BW  rats)),  fourth  (dose  II  (120,24  mg/200  g  BW rats)), and fifth (dose III (180 mg/200 g BW rats)) is a 7 spice extract herb. The sixth group (dose IV (single) (56 mg/200 g BW rats) was extract of javanese chili fruit.  The  results  showed  that  dose  III  was  the  most  effective  as  an immunostimulant  because  the  value  were  close  to  positive  control,  not significantly  different,  also  found  the  largest  number  (compared  to  groups  I,  II, and  IV),  based  on  the  carbon  clearance  (phagocytosis  index  =  2,789)  and  the relative  weight  of  lymphoid  organs  method  (liver  =  3,954%;  spleen  =  0,466%;
thymus gland = 0,167%).

## Keywords: immunostimulant; seven spice extract herb; male rat

## Pendahuluan
Rempah-rempah  merupakan  sumber  daya  alam  Indonesia  yang  memiliki  efek positif terhadap daya tahan tubuh yaitu imunostimulan. Manusia memiliki pertahanan yaitu sistem imun yang melindungi tubuh. Menurut (Ismail, Handayany, & Surwanti, 2015) ,  imunostimulan  adalah  senyawa  yang  berhubungan  dengan  peningkatan mekanisme  kekebalan  tubuh  secara  spesifik  dan  non  spesifik.  Masa  kini,  pola  hidup masyarakat  yang  buruk  menyebabkan  sistem  imun  menurun.  Sehingga  dengan mengkonsumsi  olahan  ramuan  rempah  dapat  memberikan  efek  imunostimulan  yang memaksimalkan  kerja  organ  limfoid  dan  meningkatkan  aktivitas  fagositosis  terhadap zat asing.
Menurut (Faishal,  Utomo,  &  Retnoningrum,  2017) ,  rempah  kulit  kayu  manis (Cinnamomum  burmannii)  meningkatkan  aktivitas  fagositosis  pada  dosis  100  mg/kg BB  tikus  jantan  galur  Wistar.  Terkandung  minyak  atsiri  eugenol,  sinamaldehid,  dan tannin di dalam kulit kayu manis (Hariana, 2008) .
Kandungan  minyak  atsiri  rempah  bunga  cengkeh  (Syzygium  aromaticum  L.) didominasi eugenol, trans-β-kariofilen, dan trimetoksi asetofenon (Prianto, Retnowati, &  Juswono,  2013) .  Ekstrak  daun  cengkeh  dosis  15;  75;  dan  150  mg/kg  BB/hari meningkatkan  limfosit  dan  berat  limpa  pada  mencit  jantan  galur  Balb/C (Wael, Mahulette, Watuguly, & Wahyudi, 2018) .
Piper  retrofractum  Vahl.  (rempah  cabe  jawa)  memiliki  kandungan  piperin, pipereidine,  sesquiterpenes,  dan  terpenes (Ghosh,  Darin,  Nath,  &  Deb,  2014) .  Pada penelitian (Roseno, Sudaryat, & Widyastiwi, 2019) , ekstrak etanol rempah cabe jawa memiliki  aktivitas  imunostimulan  pada  dosis  5,6  mg/20  g  BB  kepada  mencit  jantan galur Balb/C.
Menurut (Necib et al., 2015) , rempah bunga lawang (Illicium verum) memiliki aktivitas  fagositosis  tertinggi  dosis  50  mg/kg  BB  tikus  galur  Wistar.  Menurut (Benmalek, Yahia, Belkebir, & Fardeau, 2013) , bunga lawang mengandung flavonol, polifenol, dan tanin sebagai imunostimulan.
Rempah  jahe  gajah    memiliki  kandungan  senyawa  kimia  gingerol,  polifenol, flavonoid,  dan  alkaloid (Adji  Suranto,  2004) . (Wilasrusmee,  Siddiqui,  Bruch,  & Wilasrusmee,  2002) meneliti  akan  mencit  yang  diberikan  pakan  ekstrak  etanol  jahe gajah dosis 25 mg/kg BB selama 1 minggu menunjukkan adanya peningkatan jumlah titer antibodi.
Rempah  kapulaga  Amomum  compactum  Soland.  ex  Maton  mempunyai minyak  atsiri  cineole,  monoterpenes,  dan  sesquiterpenes (Evizal,  2013) .  Rempah kapulaga  juga  mengandung  terpen  1,8-cineol  yang  dapat  meningkatkan  kemampuan fagositosis dari makrofag (Serafino et al., 2008) .
Ekstrak rempah lada hitam memiliki peran imunostimulan (Park et al., 2012) .
Rempah  Piper  nigrum  dalam  ekstrak  aquoeous  positif  tannin,  fenol,  dan  alkaloid (Kadam, Yadav, Patel, Karjikar, & Patil, 2013) .
Tujuan  penelitian  ini  menentukan  dosis  ramuan  ekstrak  rempah  yang  paling efektif  sebagai  imunostimulan  terhadap  aktivitas  fagositosis  berdasarkan  metode bersihan  karbon  (carbon  clearance)  dan  bobot  relatif  organ  limfoid  pada  tikus  putih jantan galur Sprague dawley.

## Metode Penelitian
1. Alat
Alat-alat  yang  digunakan  meliputi  timbangan  analitik,  oven,  tanur,  panci infundasi, blender, spektrofotometer UV-Visible, CO 2 chamber, sterilisasi sinar UV, inkubator,  alat-alat  gelas,  mikropipet, dehumidifier  (heat  pump  dryer) ,  kandang tikus, spuit , jarum sonde, alat bedah, restrainer, dan heat lamp .
2. Bahan
Bahan-bahan  dalam  penelitian  ini  adalah  kulit  kayu  manis,  bunga  cengkeh, cabe  jawa,  bunga  lawang,  jahe  gajah,  buah  kapulaga,  buah  lada  hitam,  Stimuno ® Forte  (kapsul),  Na-CMC  0,5%,  tikus  putih  jantan  galur Sprague  dawley (24  ekor), pellet Voer-512, serbuk kayu, akuades, etanol 96%, amil alkohol, HCl, serbuk Mg, serbuk  Zn,  gelatin  10%,  FeCl 3 3%,  NaCl,  H 2 SO 4 p,  asam  asetat,  pereaksi  ( Mayer , Dragendorff , & Bouchardat ), heparin, NaCl 0,9%, dan tinta karbon V-TEC ® . 3. Cara Kerja

## Pembuatan Ekstrak 7 Rempah
Serbuk simplisia kulit kayu manis, bunga cengkeh, cabe jawa, bunga lawang, jahe gajah, buah kapulaga, dan buah lada hitam masing-masing ditimbang sebanyak 100  gram.  Kemudian  masing-masingnya  diekstraksi  infundasi  dengan  pelarut akuades 1 liter selama 15 menit, suhu 90°C (sesekali diaduk). Selanjutnya disaring hingga didapati filtrat dan dibuat ekstrak kental pada dehumidifier bersuhu 50°C.
4. Uji Karakteristik Simplisia 7 Rempah
a. Penetapan Kadar Air
Penentuan  kadar  air  serbuk  dan  ekstrak  simplisia  tujuh  rempah  dilakukan menggunakan  metode  gravimetri  dengan  menimbang  masing-masing  2  g  pada cawan  uap  yang  telah  ditara  15  menit.  Kemudian  dioven  suhu  105°C  (5  jam). Kedua sampel ditimbang dioven kembali (1 jam) sampai bobot konstan (secara duplo) (selisih berat tidak lebih dari 0,0025 g atau 0,25%) (Kemenkes, 2017 )
b. Penetapan Kadar Abu
Penetapan  kadar  abu  dilakukan  dengan  menimbang  serbuk  dan  ekstrak simplisia tujuh rempah masing-masing sebanyak 2 g, kemudian  dimasukkan ke dalam  krus  silikat  berbeda  yang  telah  ditara.  Dipijarkan  kembali  suhu  600°C dalam tanur hingga arang habis, didinginkan, dan ditimbang hingga bobot tetap (secara duplo) (Depkes, 2000)
5. Uji Fitokimia Simplisia 7 Rempah
Uji  fitokimia  dilakukan  terhadap  serbuk  dan  ekstrak  simplisia  tujuh  rempah.
Jika  dengan  pereaksi Mayer endapan  putih  kekuningan, Dragendorff endapan berwarna  jingga  kecokelatan,  dan Bouchardat endapan  cokelat  sampai  kehitaman maka  positif  alkaloid (Depkes,  1995) .  Jika  dengan  serbuk  Mg,  HCl  p,  dan  amil alkohol warna jingga pada lapisan amil alkohol maka positif flavonoid (Farnsworth, 1966) . Jika dengan air panas (kocok) dan HCl busa stabil (< 10 menit) maka positif saponin (Depkes,  1995) .  Jika  dengan  larutan  penguji  gelatin  10%  endapan  putih, FeCl 3 3%  perubahan  warna  menjadi  biru-hitam,  larutan  NaCl  dan  gelatin  endapan putih  maka  positif  tanin (Hanani,  2015) .  Jika  dengan  asam  asetat  anhidrat  dan H 2 SO 4 p perubahan warna ungu menjadi hijau, maka positif steroid (Kumoro, 2015) . Jika dengan kloroform dan H 2 SO 4 p perubahan warna cokelat kemerahan pada batas antar lapisan, positif terpenoid (Kumoro, 2015) .
6. Larutan Pembanding dan Larutan Uji
a. Pembuatan Larutan Kontrol Negatif
Dipanaskan  lumpang,  dikeringkan,  dan  dituang  10  mL  akuades  panas.
Kemudian ditaburkan 0,5 g Na – CMC, didiamkan hingga mengembang selama 15 menit, digerus, dan dituang ke dalam labu ukur 100 mL. Sisa yang tertinggal ditambahkan akuades, dituang kembali, dan suspensi disimpan.
b. Pembuatan Larutan Kontrol Positif
Sebanyak  10  kapsul  Stimuno ® Forte  dibuka  cangkangnya,  dituang  isinya ke lumpang, digerus ad halus, dan ditimbang sejumlah yang dibutuhkan. Serbuk yang  diambil  untuk  ditimbang,  digerus  kembali  sambil  diberi  Na-CMC  0,5% yang sudah disuspensikan menjadi larutan sedikit demi sedikit sampai 100 mL.
c. Pembuatan Larutan Tinta Karbon
Disterilisasi  tinta  karbon  pada  sinar  UV,  kemudian  dituang  cairan  tinta karbon  sebanyak  1,6  mL  pada  lumpang,  ditambahkan  larutan  NaCl  0,9% (fisiologis) secukupnya, dan dihomogenkan. Lalu dituang pada labu ukur 10 mL dan  dicukupkan  larutan  fisiologis  ad  tanda  batas  (konsentrasi  16%) (FARADILLA & IWO, 2014) . Tinta karbon diberikan kepada hewan coba tikus pada suhu 37°C.
d. Pembuatan Larutan Uji
Pembuatan  larutan  uji  menggunakan  ekstrak  kental  dari  masing-masing ramuan 7 rempah. Pembuatan ini berdasarkan dosis empiris (pengalaman) yaitu 10 g. Berikut pembagian formula ekstrakkental tujuh rempah (Tabel 1).
Tabel 1

## Pembagian Formula Dosis Empiris (Pengalaman)
Rempah-rempah F1 (3,34 gram) F2 (6,68 gram) F3 (10 gram) F4 (2,8 gram) Kapulaga 0,33 0,66 1 - Cengkeh 0,17 0,34 0,5 - Cabe Jawa 0,67 1,34 2 2,8 Jahe Gajah 0,5 1 1,5 - Lada Hitam 0,67 1,34 2 - Bunga Lawang 0,17 0,34 0,5 - Kulit Kayu Manis 0,83 1,66 2,5 -
Dosis ramuan rempah hewan coba tikus dibagi 4 perlakuan. Dosis I, II, dan III merupakan campuran ramuan ekstrak 7 rempah, didasari dosis empirisnya 10 g (pada dosis III (F3)). Dosis I (F1) dan II (F2) merupakan hasil perhitungan 1 / 3 dan 2 / 3 dari  10  g.  Dosis  IV  hanya  berisi  cabe  jawa  (tunggal)  dari  hasil perhitungan  larutan  stock  berdasarkan  dosis  efektif  (5,6  mg/20  g  BB  untuk mencit ke tikus) pada penelitian (Roseno et al., 2019) . Ekstrak kental ditimbang dan digerus sambil ditambahkan suspensi  Na-CMC 0,5% menjadi larutan stock 100 mL.
7. Pengujian Imunostimulan Hewan Coba
Pengujian ini menggunakan tikus putih jantan galur Sprague dawley sebanyak 24  ekor  dan  telah  disetujui  Komite  Etik  Universitas  Pakuan  No.  004/KEPHP- UNPAK/04-2021.  Hewan  coba  dibagi  6  kelompok  perlakuan  dengan  4  ekor  tikus sebagai ulangan, diaklimatisasi 7 hari dalam kandang (pemberian makan dan minum ad libitum) pada kondisi Laboratorium Farmasi FMIPA Universitas Pakuan, Bogor. Pembagian kelompok perlakuan hewan coba dapat dilihat pada Tabel 2.

## Tabel 2 Kelompok Perlakuan
Kelompok Perlakuan yang Diberikan Kontrol (-) Suspensi Na-CMC 0,5% Kontrol (+) Suspensi Stimuno ® Forte dosis 1,26 mg/200 g BB tikus Dosis I Suspensi ekstrak 7 rempah dosis 60,12 mg/200 g BB tikus Dosis II Suspensi ekstrak 7 rempah dosis 120,24 mg/200 g BB tikus Dosis III Suspensi ekstrak 7 rempah dosis 180 mg/200 g BB tikus Dosis IV Suspensi ekstrak cabe jawa dosis 56 mg/200 g BB tikus

## 8. Metode Bersihan Karbon (Carbon Clearence)
Selama 6 hari, hewan coba tikus dalam kelompok pada Tabel 2 di atas diberi perlakuan  sekali  sehari  peroral  masing-masing  2  mL.  Hari  ke-7,  ekor  tikus dihangatkan  (agar  pembuluh  darah  vena  berdilatasi)  dan  disterilkan  tisu  alkohol 70%. Kemudian bagian belakang ekor tikus dilukai dan darah ditampung plat tetes yang  telah  diberi  sedikit  heparin,  lalu  dihomogenkan.  Darah  diambil  75  μL  dan dilisiskan  dengan 4 mL  asam asetat  1% (sebagai  blanko menit  ke-0).  Selanjutnya sebanyak 0,1 mL/kg BB tikus (konsentrasi 16%) tinta karbon disuntikkan pada ekor (intravena), darah diambil 75 μL menit ke-3, 6, 9, 12, dan 15, dilisiskan 4 mL asam asetat  1%,  dan  diukur  absorbansinya  pada  spektrofotometer  UV-Visible  panjang gelombang (λ) 650 nm (Aldi, Oktavia, & Yenni, 2016) .

## 9. Metode Bobot Relatif Organ Limfoid
Pada  hari  ke-8,  hewan  coba  tikus  ditimbang  dan  dikorbankan  pada  CO 2 chamber.  Lalu  dilakukan  pembedahan  pada  organ  hati,  limpa,  dan  kelenjar  timus. Kemudian  organ  tersebut  dibersihkan  dari  lemak  yang  menempel  dan  ditimbang (Aldi et al., 2016) .

## 10. Perhitungan Konstanta Fagositosis
Menurut (Aldi et al., 2016) , rumus perhitungan konstanta fagositosis adalah :
Keterangan:
a. K = Konstanta Fagositosis b. A(n) = Absorbansi waktu ke n c. A(n-1) = Absorbansi waktu ke n-1 d. T = Menit ke-3, 6, 9, 12, dan 15 e. n = Periode ke-1, 2, 3, 4, dan 5 11. Perhitungan Indeks Fagositosis
Menurut (Aldi et al., 2016) , rumus perhitungan indeks fagositosis adalah :
Keterangan:
a. IF = Indeks Fagositosis b. Tikus X = Tikus yang diuji 12. Perhitungan % Bobot Relatif Organ Limfoid
Menurut (Rahman, Aldi, & Mayanti, 2016) , rumus perhitungan % bobot relatif organ hati, limpa, dan kelenjar timus adalah :

## 1. Analisis Data
Data  diolah  statistik  menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap  metode  uji ANOVA satu arah lalu uji lanjut Duncan .

## Hasil Dan Pembahasan
1. Hasil Pembuatan Serbuk Simplisia dan Ekstrak 7 Rempah
Bobot  serbuk  simplisia  buah  cabe  jawa,  rimpang  jahe  gajah,  dan  buah  lada hitam  berturut-turut  sebanyak  832gram,  787  gram,  dan  381  gram,  sehingga diperoleh rendemen serbuk sebesar 28,95%, 16,64%, dan 25,99%. Kemudian karena panen kering maka hanya diperoleh simplisia kering, sehingga simplisia kulit kayu manis, bunga cengkeh, buah bunga lawang, dan buah kapulaga tidak dapat dihitung rendemen serbuknya, dengan bobot simplisia kering yang diperoleh secara berurutan sebesar 2913 gram, 1896 gram, 1492 gram, dan 1935 gram.
Ekstrak kental dari hasil ekstraksi metode infundasi simplisia kulit kayu manis, bunga  cengkeh,  buah  cabe  jawa,  buah  bunga  lawang,  rimpang  jahe  gajah,  buah
kapulaga,  dan  buah  lada  hitam  berturut-turut  sebanyak  29,31  gram;  23,77  gram; 26,37  gram;  20,18  gram;  28,56  gram;  22,16  gram;  dan  21,82  gram,  sehingga diperoleh  rendemen  ekstrak  masing-masing  simplisia  sebesar  29,19%;  23,68%; 26,29%;  20,08%;  28,44%;  22,13%;  dan  21,77%.  Hasil  rendemen  ekstrak  kental sesuai literatur Farmakope Herbal Edisi II (Kemenkes, 2017) , karena simplisia kulit kayu  manis,  bunga  cengkeh,  buah  cabe  jawa,  buah  bunga  lawang,  rimpang  jahe gajah,  buah  kapulaga,  dan  buah  lada  hitam  secara  berurutan  tidak  kurang  dari 25,4%; 10%; 8,3%; 10%; 5,9%; 5,1%; dan 11,3%.

## Gambar 1 Serbuk Simplisia dan Ekstrak Kental Tujuh Rempah
Keterangan:  a.  kulit  kayu  manis,  b.  bunga  cengkeh,  c.  buah  cabe  jawa,  d.  buah bunga lawang, e. rimpang jahe gajah, f. buah kapulaga, g. buah lada hitam

## 2. Hasil Penetapan Kadar Air
Penetapan  kadar  air  bertujuan  mengetahui  jumlah  kandungan  air  dalam simplisia. Menuru t (Depkes, 2000) , pengurangan kadar air sangat diperlukan supaya mikroorganisme dan kapang tidak tumbuh. Hasil penetapan kadar air pada Tabel 3 di bawah ini sudah sesuai persyaratan Farmakope Herbal Edisi II (Kemenkes, 2017) .

## Tabel 3

## Hasil Data Kadar Air Serbuk Simplisia dan Ekstrak 7 Rempah
Nama Simplisia dari 7 Rempah-rempah Hasil Serbuk Simplisia (%) Hasil Ekstrak Kental (%) Persyaratan Kadar Air Serbuk (%) Ekstrak (%) Kulit Kayu Manis 4,81 11,89 < 10 < 16 Bunga Cengkeh 4,84 6,28 < 10 < 10 Buah Cabe Jawa 3,84 7,42 < 10 < 15 Buah Bunga Lawang 4,09 9,58 < 10 < 10 Rimpang Jahe Gajah 3,24 7,05 < 10 < 10 Buah Kapulaga 7,70 7,44 < 10 < 27,3 Buah Lada Hitam 4,62 6,34 < 10 < 14

## 3. Hasil Penetapan Kadar Abu
Penetapan  kadar  abu  bertujuan  melihat  cemaran  anorganik  dan  senyawa mineral  logam  dalam  simplisia.  Zat  yang  tersisa  itu  disebut  abu,  dimana  jika
a
. b . c . d. e . f .
g.
a. b. c. d. e. f. g
.
kandungannya  tinggi  berdampak  buruk  saat  dikonsumsi  manusia (Depkes,  2000) .
Hasil  penetapan  kadar  abu  (Tabel  4)  sudah  sesuai  persyaratan  Farmakope  Herbal Edisi II (Kemenkes, 2017) .

## Tabel 4 Hasil Data Kadar Abu Serbuk Simplisia dan Ekstrak 7 Remp
Nama Simplisia dari 7 Rempah- rempah Hasil Serbuk Simplisia (%) Hasil Ekstrak Kental (%) Persyaratan Kadar Abu Serbuk (%) Ekstrak (%) Kulit Kayu Manis 7,41 0,25 < 10,5 < 0,3 Bunga Cengkeh 4,04 5,95 < 10 < 10 Buah Cabe Jawa 2,12 0,89 < 6,7 < 1 Buah Bunga Lawang 4,56 3,92 < 10 < 10 Rimpang Jahe Gajah 4,01 1,27 < 4,2 < 7,6 Buah Kapulaga 7,59 4,26 < 12,3 < 6 Buah Lada Hitam 1,35 1,35 < 6,1 < 1,7

## 4. Hasil Uji Fitokimia
Pengujian fitokimia bertujuan mengetahui adanya golongan senyawa metabolit sekunder yang terkandung pada sampel tertuju. Hasil uji fitokimia pada Tabel 5 di bawah ini memiliki golongan senyawa metabolit sekunder yang beragam.

## Tabel 5

## Hasil Uji Fitokimia Serbuk Simplisia dan Ekstrak 7 Rempah
Nama Serbuk dan Ekstrak Hasil Identifikasi Senyawa Alkaloi d Flavonoi d Saponi n Tanin  Steroid Terpenoi d Kulit Kayu Manis + + - + + + Bunga Cengkeh - + + + + + Buah Cabe Jawa + + - - + + Buah Bunga Lawang - + - - + + Rimpang Jahe Gajah + + - - + + Buah Kapulaga + + + + + + Buah Lada Hitam + + - + + +
Keterangan:  (+)  yaitu  mengandung  senyawa  tertuju,  (-)  yaitu  tidak  mengandung senyawatertuju
5. Hasil Pengujian Carbon Clearance Hewan Coba
Dalam penelitian imunostimulan ini menggunakan pengujian metode bersihan karbon  yang  merupakan  standar  uji  eliminasi  gambaran  umum  proses  fagositosis terhadap  zat  asing  dalam  darah (Tambusai,  2018) .  Metode  bersihan  karbon memanfaatkan  teknologi  spektrofotometer  UV-Visible  untuk  mendeteksi  laju eliminasi partikel tinta karbon.
Tabel 6

## Hasil Nilai Rata-rata Absorbansi
Kelompok Perlakuan Nilai Rata-rata Absorbansi Pada Menit Ke- X ± SD 3 6 9 12 15 Kontrol (-) 1,198 1,191 1,018 1,225 1,136 1,142 ± 0,179 ab Kontrol (+) 1,732 1,546 1,371 1,271 1,231 1,439 ± 0,093 c Dosis I 1,061 0,941 1,081 0,700 1,311 0,989 ± 0,098 a Dosis II 1,270 1,350 0,923 1,012 1,216 1,121 ± 0,140 ab Dosis III 1,791 1,774 1,509 1,172 1,008 1,465 ± 0,132 c Dosis IV 1,459 1,441 1,054 1,191 1,298 1,300 ± 0,092 bc
Keterangan: Angka yang ditambahkan huruf superskrip (a, b, c) berbeda pada kolom yang sama menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata (Sig. < α 0,05)
Proses  fagositosis  terhadap  tinta  karbon  disebut  respon  imun  non  spesifik (alamiah)  karena  merupakan  pertahanan  pertama  dalam  menangkal  zat  asing  yang masuk  dengan  cepat  mengeliminasinya.  Keberadaan  tinta  karbon  dalam  darah digunakan  sebagai  parameter  untuk  diamati.  Nilai  absorbansi  kadar  tinta  karbon akan  berkurang  jumlahnya  seiring  bertambahnya  waktu  karena  terjadi  aktivitas fagositosis (penelanan sampai penghancuran) dari sel-sel leukosit terutama monosit, makrofag,  dan  eosinofil (Aldi  et  al.,  2016) .  Dari  Tabel    6    di  atas    didapati    hasil terbaik  pada  kelompok  dosis  III  (campuran)  karena  nilai  absorbansi  menurun disetiap  waktunya  dan  mendekati  kontrol  positif  jika  dibandingkan  dengan  kontrol negatif,  dosis  I  (campuran),  II  (campuran),  dan  IV  (tunggal),  sehingga  proses fagositosis  terjadi  secara  optimal.  Hasil  analisis  dari  uji  ANOVA  satu  arah menunjukkan  perbedaan  pengaruh  nyata  antara  dosis  terhadap  nilai  absorbansi karena nilai Sig. Dosis = 0,001 < α 0,05 (Tolak H0, Terima H1). Kemudian hasil uji lanjut Duncan menunjukkan kontrol positif, dosis III, dan IV memberikan pengaruh sama juga tidak berbeda nyata terhadap nilai absorbansi.
Tabel 7 Hasil Nilai Rata-rata Indeks Fagositosis Kelompok Perlakuan Nilai Rata-rata Indeks Fagositosis Menit Ke- X ± SD 3 6 9 12 15 Kontrol (-) 1 1 1 1 1 1 ± 0,772 ab Kontrol (+) 4,676 2,822 4,808 1,550 1,923 3,156 ± 0,984 c Dosis I 0,162 -1,022 0,807 -2,952 2,147   -0,172 ± 0,763 a Dosis II 1,956 1,867 -1,303 -0,223 0,769 0,613 ± 1,068 ab Dosis III 3,824 3,622 5,542 1,020 -0,065 2,789 ± 2,402 bc Dosis IV 1,765 2,067 -0,570 0,857 2,154 1,254 ± 2,416 abc
Keterangan: Angka yang ditambahkan huruf superskrip (a, b, c) berbeda pada kolom yang sama menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata (Sig. < α 0,05)
Indeks  fagositosis  merupakan  aktivitas  fagositosis  dalam  mengeliminasi  tinta karbon.  Adanya  efek  imunostimulan  7  rempah  dapat  diketahui  dari  nilai  rata-rata indeks  fagositosis  yang  diperoleh.  Semakin  tinggi  nilai  rata-rata  indeks  fagositosis maka  semakin  meningkat  kerja  sel-sel  fagosit,  sehingga  daya  tahan  tubuh  lebih optimal  (begitu  juga  sebaliknya).  Menurut  teori (Wagner,  1988) ,  jika  dihasilkan nilai  indeks  fagositosis  <  1  maka  imunostimulan  lemah,  jika  1-1,5  maka imunostimulan  sedang,  dan  jika  >  1,5  maka  imunostimulan  kuat.  Namun,  teori Kresno dalam (Handayani, 2018) mengemukakan bahwa jika nilai indeks fagositosis <  1  maka  imunosupresan.  Dari  Tabel  7  di  atas  diperoleh  hasil  terbaik  pada kelompok  dosis  III  yaitu  nilai  indeks  fagositosis  mendekati  kontrol  positif  namun lebih baik dari dosis IV karena jumlah dosis 180 mg/200 g BB tikus meningkatkan respon imun tubuh kategori imunostimulan kuat. Hasil analisis dari uji ANOVA satu arah  menunjukkan  perbedaan  pengaruh  nyata  antara  dosis  terhadap  nilai  indeks fagositosis  karena  hasil  nilai  Sig.  Dosis  =  0,006  <  α  0,05  (Tolak  H0,  Terima  H1). Kemudian hasil uji lanjut Duncan menunjukkan kontrol positif, dosis III, dan dosis IV  memberikan  pengaruh  sama  juga  tidak  berbeda  nyata  terhadap  nilai  indeks fagositosis.
6. Hasil Pengujian Bobot Relatif Organ Limfoid Hewan Coba
Pengujian  bobot  relatif  organ  limfoid  berhubungan  erat  dengan  bersihan karbon  karena  merupakan  pengujian  respon  imun  spesifik  (adaptif),  yaitu pertahanan  kedua  dalam  menangkal  zat  asing.  Proses  fagositosis  juga  terjadi  pada organ  limfoid  hati,  limpa,  dan  kelenjar  timus  karena  terbawa  darah  lalu  masuk  ke dalamnya (tidak sepenuhnya terfagositosis di dalam darah) (Tizard, 2008) .

## Gambar 2 Organ Limfoid
Keterangan: a. organ hati, b. organ limpa, c. organ kelenjar timus
Adanya efek imunostimulan 7 rempah diketahui dari nilai rata-rata persentase bobot  relatif  organ  limfoid.  Semakin  besar  nilai  saat  dibandingkan  dengan  kontrol negatif dan positif maka semakin baik dosis yang digunakan. Pada Tabel 8 di bawah ini  merupakan  hasil  nilai  rata-rata  bobot  organ  limfoid  yang  akan  digunakan  pada perhitungan persentase bobot relatif organ limfoid (Tabel 9).
a. b. c.
Tabel 8 Hasil Nilai Rata-rata Bobot Organ Limfoid Organ Limfoid Pada Kelompok Perlakuan Bobot Organ Hati (g) Bobot Organ Limpa (g) Bobot Organ Timus (g) Organ Limfoid K (-) 8,278 ± 1,732 c 0,888 ± 0,246 b 0,260 ± 0,056 a Organ Limfoid K (+) 8,970 ± 0,877 c 1,118 ± 0,397 b 0,355 ± 0,093 a Organ Limfoid Dosis I 8,355 ± 1,706 c 0,980 ± 0,282 b 0,245 ± 0,079 a Organ Limfoid Dosis II 8,248 ± 0,419 c 0,900 ± 0,192 b 0,220 ± 0,054 a Organ Limfoid Dosis III 10,400 ± 1,276 c 1,233 ± 0,341 b 0,438 ± 0,133 a Organ Limfoid Dosis IV 9,688 ± 1,764 c 1,098 ± 0,474 b 0,400 ± 0,111 a
Keterangan: Angka yang ditambahkan huruf superskrip (a, b, c) berbeda pada kolom yang sama menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata (Sig. < α 0,05)
Tabel 9

## Hasil Persentase Nilai Rata-rata Bobot Relatif Organ Limfoid
Kelompok Perlakuan % Bobot Relatif Hati % Bobot Relatif Limpa % Bobot Relatif Timus Kontrol (-) 3,327 ± 0,474 a 0,358 ± 0,087 a 0,105 ± 0,016 a Kontrol (+) 3,571 ± 0,150 a 0,443 ± 0,140 a 0,141 ± 0,035 a Dosis I (Campuran) 3,408 ± 0,422 a 0,397 ± 0,083 a 0,099 ± 0,025 a Dosis II (Campuran) 3,471 ± 0,206 a 0,377 ± 0,069 a 0,092 ± 0,020 a Dosis III (Campuran) 3,954 ± 0,251 a 0,466 ± 0,104 a 0,167 ± 0,048 a Dosis IV (Tunggal) 3,805 ± 0,577 a 0,424 ± 0,159 a 0,156 ± 0,033 a
Keterangan:  Angka  yang  ditambahkan  huruf  superskrip  (a,  b,  c)  sama  pada  kolom yang sama menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata (Sig. > α 0,05)
Pada Tabel 9 di atas dapat dilihat bahwa dosis III adalah kelompok perlakuan terbaik karena pada jumlah dosis tersebut mampu memberikan efek imunostimulan lebih  baik  jika  dibandingkan  kontrol  negatif,  positif,  dosis  I,  II,  dan  IV.  Hasil analisis  uji  ANOVA  satu  arah  pada  %  bobot  relatif  organ  limfoid  (Tabel  9), berdasarkan  dosis  menunjukkan  bahwa  tidak  ada  perbedaan  pengaruh  nyata  antara dosis terhadap % bobot relatif organ limfoid karena didapati nilai Sig. Dosis = 0,999 > α 0,05 (Terima H0, Tolak H1), sehingga tidak bisa dilanjutkan uji lanjut Duncan (Terima H0). Sedangkan, ditahap uji ANOVA berdasarkan organ limfoid (Tabel 8), didapati  nilai  Sig.  Organ  Limfoid  =  0,000  <  α  0,05  (Tolak  H0,  Terima  H1)  yang berarti  ada  perbedaan  pengaruh  nyata  antara  organ  limfoid  terhadap  bobot  organ. Kemudian  hasil  uji  lanjut  Duncan  bobot  organ  limfoid  menunjukkan  organ  hati, limpa, dan kelenjar timus memberikan pengaruh berbeda nyata.
Adanya  peningkatan  bobot  karena  pada  organ  hati,  terjadi  peningkatan proliferasi sel kupffer (sel makrofag terfiksasi), lalu organ limpa terjadi peningkatan proliferasi  juga  diferensiasi  sel  limfosit  T  yang  mengaktifkan  makrofag  sebagai Antigen Presenting Cell (APC) dalam menyajikan zat asing untuk dihancurkan dan sel  limfosit  B  yang  melepas  antibodi (FARADILLA  &  IWO,  2014) ,  kemudian peningkatan produksi hormon pematangan sel limfosit T pada organ kelenjar timus yang  berperan  dalam  sistem  pertahanan  tubuh.  Senyawa  metabolit  sekunder  juga
mempengaruhi  sistem  imun  tubuh  (imunostimulan).  Flavonoid  mengaktivasi  sel Natural Killer (NK) untuk merangsang proses produksi Interferon gamma (IFN- 𝛾 ), dimana itu merupakan sitokin utama Macrophage Activating Cytokine (MAC) yang berfungsi  dalam  sistem  imun  spesifik,  yang  kemudian  IFN- 𝛾 mengaktifkan makrofag  sehingga  meningkatkan  kerja  fagositosis  terhadap  partikel  asing  yang masuk ke dalam tubuh (Baratawidjaja, 2010) . Flavonoid dan alkaloid mengaktifkan terjadinya  pelepasan  sitokin  IL-12  oleh  sel  T  (Shen  and  Louine  dalam (Handoyo, 2013) , dimana IL-12 ini bermanfaat dalam perangsangan pemproduksian Interferon gamma  (IFN- 𝛾 )  oleh  sel  Natural  Killer  (NK),  kemudian  IFN- 𝛾 berfungsi  sebagai pengaktivasian  sel  makrofag (Handoyo,  2013) .  Saponin  meningkatkan  daya  tahan tubuh  dengan  produksi  sitokin  yaitu  interferon  dan  interleukin (Tambusai,  2018) .
Lalu  tanin  berfungsi  dalam  aktivitas  fisiologi  yaitu  meningkatkan  kerja  sel fagositosis (Tambusai,  2018) .  Kemudian  steroid  dan  terpenoid  memiliki  berperan dalam pengaktivasian sel-sel fagosit seperti makrofag.

## Kesimpulan
Dosis  III  (180  mg/200  g  BB  tikus)  paling  efektif  sebagai  imunostimulan terhadap  aktivitas  fagositosis  karena  nilainya  mendekati  kontrol  positif,  tidak  berbeda nyata, juga mendapati hasil angka terbesar (jika dibandingkan kelompok dosis I, II, dan IV), berdasarkan metode bersihan karbon (indeks fagositosis = 2,789) dan bobot relatif organ  limfoid  (hati  =  3,954%;  limpa  =  0,466%;  kelenjar  timus  =  0,167%)  pada  tikus putih jantan galur Sprague dawley.

## BIBLIOGRAFI
Adji  Suranto,  Spa.  (2004). Khasiat  &  Manfaat  Madu  Herbal .  Agromedia. Google Scholar
Aldi,  Yufri,  Oktavia,  Sri,  &  Yenni,  Sirda.  (2016).  Uji  Efek  Immunomodulator  Dari Ekstrak  Daun  Manggis  (Garcinia  Mangostana  L.)  Dengan  Metode  Carbon Clearence Dan Menghitung Jumlah Sel Leukosit Pada Mencit Putih Jantan. Jurnal Farmasi Higea , 8 (1), 20–31. Google Scholar
Baratawidjaja, K. G. (2010). Dan Rengganis. I. Imunologi Dasar . Google Scholar
Benmalek,  Yamina,  Yahia,  Ouahiba  Ait,  Belkebir,  Aicha,  &  Fardeau,  Marie  Laure. (2013). Anti-Microbial And Anti-Oxidant Activities Of Illicium Verum, Crataegus Oxyacantha  Ssp  Monogyna  And  Allium  Cepa  Red  And  White  Varieties.
Bioengineered , 4 (4), 244–248. Google Scholar
Depkes,  R.  I.  (1995).  Materia  Medika  Indonesia. Health  Department  Of  Republic  Of Indonesia Jilid Vi Jakarta . Google Scholar
Depkes,  R.  I.  (2000).  Parameter  Standar  Umum  Ekstrak  Tumbuhan  Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia , 3–30. Google Scholar
Evizal,  Rusdi.  (2013). Tanaman  Rempah  Dan  Fitofarmaka .  Lembaga  Penelitian Universitas Lampung. Google Scholar
Faishal,  Luthfi  Fathin,  Utomo,  Astika Widy,  &  Retnoningrum,  Dwi.  (2017).  Pengaruh Pemberian Ekstrak Kayu Manis (Cinnamomum Burmani) Terhadap Aktivitas Dan Kapasitas  Fagositosis  Studi  Eksperimental  Pada  Tikus  Wistar  Yang  Dipapar Staphylococcus  Aureus. Diponegoro  Medical  Journal  (Jurnal  Kedokteran Diponegoro) , 6 (2), 772–781. Google Scholar
Faradilla,  Meutia,  &  Iwo,  Maria  Immaculata.  (2014).  Immunomodulatory  Effect  Of Polysaccharide  From  White  Turmeric  [Curcuma  Zedoaria  (Christm.)  Roscoe)] Rhizome. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia , 12 (2), 273–278. Google Scholar
Farnsworth,  Norman  R.  (1966).  Biological  And  Phytochemical  Screening  Of  Plants. Journal Of Pharmaceutical Sciences , 55 (3), 225–276. Google Scholar
Ghosh,  Rajat,  Darin,  Katon,  Nath,  Payel,  &  Deb,  Panchali.  (2014).  An  Overview  Of Various  Piper  Species  For  Their  Biological  Activities. International  Journal  Of Pharma Research & Review , 3 (1), 67–75. Google Scholar
Hanani,  Endang.  (2015). Analisis  Fitokimia.  Penerbit  Buku  Kedokteran  Egc .  Jakarta.
Google Scholar
Handayani,  Nestri.  (2018).  Uji  Aktivitas  Fagositosis  Makrofag  Ekstrak  Etanol  Daun Suji  (Dracaena  Angustifolia  (Medik.)  Roxb.)  Secara  In  Vitro. Jurnal  Farmasi Medica/Pharmacy Medical Journal (Pmj) , 1 (1). Google Scholar
Handoyo,  M.  ..  (2013). Efek  Ekstrak  Etanolik  Buah  Labu  Air  (Langenaria  Siceraria (Mol.)  Standley)  Sebagai  Imunomodulator  Melalui  Pengamatan  Kapasitas  Dan Indeks  Fagositosis  Makrofag  Pada  Tikus  Jantan  Sprague  Dawley  Yang  Dipejani Doksorubisin.  Fakultas  Farmasi.  Yogyakarta:  Unive .  Universitas  Sanata  Dharma.
Google Scholar
Hariana,  Arief.  (2008).  Tumbuhan  Obat  Dan  Khasiatnya  Seri  2. Depok:  Penebar Swadaya , 114 . Google Scholar
Ismail,  Asrul,  Handayany,  Gemy  Nastity,  &  Surwanti,  Besse.  (2015).  Uji  Efek Imunomodulator  Kombinasi  Ekstrak  Etanol  Kasumba  Turate  (Carthamus Tinctorius  L.)  Dan  Ekstrak  Etanol  Jintan  Hitam  (Nigella  Sativa). Jurnal  Farmasi Uin Alauddin Makassar , 3 (4), 187–192. Google Scholar
Kadam,  P.  V,  Yadav,  K.  N.,  Patel,  F.  A.,  Karjikar,  F.  A.,  &  Patil,  M.  J.  (2013). Pharmacognostic,  Phytochemical  And  Physicochemical  Studies  Of  Piper  Nigrum Linn. Fruit (Piperaceae). International Research Journal Of Pharmacy , 4 (5), 189– 193. Google Scholar
Kemenkes,  R.  I.  (2017). Tata  Naskah  Dinas  Di  Lingkungan  Kementerian  Kesehatan (Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 14 Tahun 2017) . Google Scholar
Kumoro,  Andri  Cahyono.  (2015).  Teknologi  Ekstraksi  Senyawa  Bahan  Aktif  Dari Tanaman Obat. Yogyakarta: Plantaxia . Google Scholar
Necib,  Youcef,  Bahi,  Ahlem,  Derri,  Nesrine,  Merouane,  Fateh,  Bouadi,  Hala,  & Boulahrouf, Khaled. (2015). Immunomodulatory Activity Of Lectin Extracted From Bark Of The Black Mulberry (Morus Nigra) . Google Scholar
Park,  Ui  Hyun,  Jeong,  Hong  Suk,  Jo,  Eun  Young,  Park,  Taesun,  Yoon,  Seung  Kew, Kim, Eun Joo, Jeong, Ji Cheon, & Um, Soo Jong. (2012). Piperine, A Component Of Black Pepper, Inhibits Adipogenesis By Antagonizing Pparγ Activity In 3t3-L1 Cells. Journal  Of  Agricultural  And  Food  Chemistry , 60 (15),  3853–3860. Google Scholar
Prianto, Henny, Retnowati, Rurini, & Juswono, Unggul Pundjung. (2013). Isolasi Dan Karakterisasi Dari Minyak Bunga Cengkeh (Syzygium Aromaticum) Kering Hasil Distilasi Uap . Brawijaya University. Google Scholar
Rahman, Havizur, Aldi, Yufri, & Mayanti, Elda. (2016). Aktifitas Imunomodulator Dan Jumlah  Sel  Leukosit  Dari  Ekstrak  Kulit  Buah  Naga  Merah  (Hylocereus  Lemairei (Hook.)  Britton  &  Rose)  Pada  Mencit  Putih  Jantan. Jurnal  Farmasi  Higea , 8 (1), 44–58. Google Scholar
Roseno, M., Sudaryat, Y., & Widyastiwi, D. A. N. (2019). Aktivitas Immunomodulator Ekstrak Etanol Kemukus (Piper Cubeba), Kiseureuh (Piper Aduncum), Dan Cabe Jawa  (Piper  Retrofractum)  Pada  Mencit  Jantan  Galur  Balb/C. Jurnal  Farmasi
Indonesia , 17 (2), 255–261. Google Scholar
Serafino,  Annalucia,  Vallebona,  Paola  Sinibaldi,  Andreola,  Federica,  Zonfrillo, Manuela,  Mercuri,  Luana,  Federici,  Memmo,  Rasi,  Guido,  Garaci,  Enrico,  & Pierimarchi,  Pasquale.  (2008).  Stimulatory  Effect  Of  Eucalyptus  Essential  Oil  On Innate  Cell-Mediated  Immune  Response. Bmc  Immunology , 9 (1),  1–16. Google Scholar
Tambusai,  Nur  Ayuningsih.  (2018). Uji  Efek  Imunomodulator  Ekstrak  Etanol  Daun Afrika  (Vernonia  Amygdalina,  Delile.)  Terhadap  Aktivitas  Fagositosis  Sel  Imun Pada Mencit Jantan Dengan Metode Karbon Kliren . Google Scholar
Tizard,  I.  R.  (2008). Innate  Immunity:  The  Recognition  Of  Invaders.  In  ‘Veterinary Immunology:  An  Introduction’,  8th  Edn.(Ed.  Ir  Tizard.)  Pp.  11–20 .  Saunders: Philadelphia. Google Scholar
Wael,  Syahran,  Mahulette,  Ferymon,  Watuguly,  Theopilus  Wilhelmus,  &  Wahyudi, Didik.  (2018).  Pengaruh  Ekstrak  Daun  Cengkeh  (Syzygium  Aromaticum) Terhadap  Limfosit  Dan  Makrofag  Mencit  Balb/C. Tradit  Med  J , 23 (2),  79–83. Google Scholar
Wagner,  Hildebert.  (1988). Pharmazeutische  Biologie:  Drogen  Und  Ihre  Inhaltsstoffe . Gustav Fischer Verlag. Google Scholar
Wilasrusmee, Chumpon, Siddiqui, Josephine, Bruch, David, & Wilasrusmee, Skuntala. (2002).  In  Vitro  Immunomodulatory  Effects  Of  Herbal  Products. The  American Surgeon , 68 (10), 860. Google Scholar
Copyright holder: Immanuel Simanjuntak, Silvi Azmi, Daniel Maroloan Nainggolan (2022)

## First publication right:
Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia
This article is licensed under: