…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. ISSN 2798-3471 (Cetak)
ISSN 2798-3641 (Online)
PENGARUH PERBANDINGAN DOSIS  KOMBINASI EKSTRAK DAUN MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) DAN BIJI JINTEN HITAM (Nigella sativa L)

## TERHADAP ASMA ALERGI DENGAN PARAMETER HITUNG JUMLAH SEL
EOSINOFIL PADA MENCIT BALB/C
Oleh Suzi Martina Wati 1 , Khamdiyah Indah K 2 , Silma Kaffah 3
1 Universitas Setia Budi, Surakarta, Indonesia
2,3 Universitas Harapan Bangsa, Purwokerto, Indonesia Email: 2 khamdiyah@uhb.ac.id , 3 silma@uhb.ac.id

## Abstract
Asthma is characterized by chronic inflammation of the respiratory tract. Black cumin seeds and leaves of the god's crown are proven to be used as antiasthma. Mahkota dewa is proven to contain alkaloids, saponins and polyvenols that can be used as antiasthma. This study aims to determine the  effect  of  the  combination  of  black  cumin  seed  extract  and  Mahkota  Dewa  leaf  on  allergic asthma  in  Balb/c  mice  with  the  parameter  of  counting  the  number  of  eosinophil  cells  in  the bronchi of Balb/c mice. The test animals used were male Balb/c mice which were divided into 7 treatment groups, namely positive control, negative control, 3 combined doses and 2 single doses. The  combined  doses  given  in  this  treatment  were  25/25  mg,  37.5/12.5  mg,  and  12.5/37.5  mg. Seven  groups  were  sensitized  to  ovalbumin  in  Al  (OH)3,  day  0  and  14  intraperitoneally.  The administration  of  extracts  and  Profilas®  was  carried  out  from  the  1st  to  the  27th  day.  OVA aerosol exposure, days 21, 23, 25, 27. On day 28, bronchial tissue was prepared and stained with Haematoxylin  Eosin  and  then  observed  with  a  light  microscope  to  count  the  number  of eosinophils. The results obtained were analyzed using the Kruskal-Wallis test. The most effective dose obtained was the combination dose of black cumin seed extract 37.5 mg and Mahkota dewa leaf 12.5 mg/20 g BW.
Keywords: Asthma, Mahkota dewa leaf, black cumin seeds

## PENDAHULUAN
Asma  adalah  suatu  penyakit  yang ditandai  degan  adanya  kelainan  berupa peradangan  kronik  pada  saluran  pernafasan yang  menyebabkan  hipereaktivitas  bronkus terhadap  berbagai  rangsangan  yang  ditandai dengan gejala episodik berulang berupa mengi, batuk,  sesak  nafas  dan  rasa  berat  didada terutama  pada  malam  atau  dini  hari  yang umumnya bersifat  reversibel baik  dengan atau tanpa  pengobatan.  Penyakit  asma  bersifat fluktuatif  (hilang  timbul)  artinya  dapat  tenang tanpa  gejala  tidak  mengganggu  aktifitas  tetapi dapat eksaserbasi dengan gejala ringan sampai berat  bahkan  dapat  menimbulkan  kematian (Depkes 2009).
Salah  satu  tanda  penyakit  asma  alergi adalah infiltrasi pada jaringan dengan
peningkatan  jumlah  eosinofil  (Wardlaw  et  al 2010).  Inhalasi  alergen  akan  menyebabkan peningkatan jumlah eosinofil (Rahmawati et al 2003).  Eosinofil  bentuk  diferensiasi  terminal (end-stage)  banyak  terdapat  di  dalam  jaringan sub  mukosa.  Jumlah  eosinofil  di  dalam jaringan jauh lebih besar dari jumlah eosinofil di  dalam  sirkulasi  darah.  Di  dalam  sirkulasi darah orang dewasa normal, eosinofil terdapat sekitar  1-3%  dari  jumlah  luekosit.  Hitung eosinofil  darah  biasanya  meningkat  pada reaksi alergi (Rothenberg 1998).
Biji  jinten  hitam  (Nigella  sativa  L.) minyak dan herbanya diyakini bisa mengobati penyakit  yang  berhubungan  dengan  sistem pernapasan,  saluran  pencernaan,  gangguan lambung  dan  lever  serta  untuk  meningkatkan sistem  kekebalan  tubuh.  Biji  jinten  hitam
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. Journal of Innovation Research and Knowledge
mengandung  minyak  atsiri,  saponin,  tannin, alkaloid,  dan  polifenol  (Anonim  1979). Minyak  atsiri  dari  biji  jinten  hitam  berkhasiat sebagai  bronkodilator,  imunomodulator  (Kadi & Kandil 1987), antifungal (Khan et al 2003), antiinflamasi,  spasmolitik,  hepatoprotektor (Mahmoud et al 2001).
Mahkota  dewa  (Phaleria  macrocarpa (Scheff.)  Boerl.)  merupakan  tumbuhan  obat yang  sudah  dikenal  dan  saat  ini  semakin diminati  masyarakat.  Tumbuhan  yang  berasal dari  Papua  berkhasiat  untuk  mengobati  luka, diabetes,  lever,  flu,  alergi,  sesak  nafas, desentri,  penyakit  kulit,  jantung,  ginjal, kanker, darah tinggi, asam urat dan penambah stamina  (Rohyami  2008).  Menurut  Harmanto (2001)  buah  mahkota  dewa  mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, dan polifenol dan ekstrak  daunnya  dapat  memberikan  efek antihistamin (Siswono 2001).
Pengkombinasian  tanaman  obat  disini dimaksud agar diperoleh efek yang lebih baik. Diharapkan terjadi efek yang saling mendukung  untuk  memberikan  efek  sebagai antiasma  alergi.  Pada  penelitian  sebelumnya ekstrak  biji  jinten  hitam  menunjukan  efek imunomodulator  yang  membuktikan  bahwa biji  jinten  hitam  dapat  menghambat  respon imun  yang  berperan  pada  terjadinya  asma (Kusumawahyuni  et  al  2010).  Pada  penelitian daun  mahkota  dewa  mengandung  polifenol yang  dapat  berperan  sebagai  antihistamin (Widowati 2005).
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui  Pengaruh  perbandingan  dosis kombinasi ekstrak daun mahkota dewa dan biji jinten  hitam  yang  mempunyai  efek  terhadap asma  alergi  yang  diuji  dengan  menggunakan parameter  hitung  jumlah  granul  eosinofil bronkus pada mencit Balb/c

## METODE PENELITIAN Variabel penelitian
Variabel  bebas  dalam  penelitian  ini adalah  kombinasi  antara  ekstrak  etanol  96% biji  jinten  hitam  dan  daun  mahkota  dewa dengan  berbagai  konsentrasi  kombinasi  yang
berbeda  Variabel  tergantung  dalam  penelitian ini  adalah  parameter  hitung  jumlah  sel eosinofil  pada  bronkus  mencit  Balb/c  jantan setelah  diberi  perlakuan,  yang  sebelumnya diinduksi

## Prosedur Penelitian
Penelitian  dilakukan  di  Universitas Setia  Budi.  Sample  biji  jinten  hitam  (Nigella sativa  L.)  yang  diperoleh  dari  daerah Tawangmangu, Kabupaten Karanganyar, Jawa Tengah  sedangkan  daun  mahkota  dewa (Phaleria  macrocarpa  (Scheff.)  Boerl.)  yang diperoleh  dari  daerah  Triharjo,  Sleman, Yogyakarta.
Biji  jinten  hitam  dan  daun  mahkota dewa  yang  sudah  didapat  kemudian  disortasi dan  dicuci  bersih,  kemudian  dikeringkan dalam  almari  pengering  pada  suhu  40ºC sampai kering.
Pembuatan  ekstrak  biji  jinten  hitam dilakukan  dengan  cara  meserasi.  Serbuk  biji jinten  hitam  ditimbang  sebanyak  300gram dimasukkan  kedalam  botol  coklat,  ditambah etanol  96%  sebanyak  2250  ml  dan  digojog selama  10  sampai  15  menit.  Selanjutnya campuran  tersebut  didiamkan  selama  kurang lebih  lima  hari  dengan  sesekali  digojog. Ekstrak maserasi yang didiamkan selama lima hari  tersebut  disaring  kemudian  dipekatkan dengan  water  bath  sampai  kental  kemudian ditimbang  untuk  mengetahui  bobot  ekstrak kental yang diperoleh.
Tikus dibuat manjadi 7 kelompok yaitu kelompok  kontrol  positif,  kontrol  negativ,  3 kelompok  dosis  kombinasi  dan  2  kelompok dosis  tunggal  yang  dimana  masing  maisng kelompok  terdiri  dari  5  tikus.  Total  Dosis kombinasi  ekstrak  yang  diberikan  kepada mencit adalah 50 mg/20 g BB mencit. Dimana masing-  masing  dosis  kombinasi  antara minyak biji jintan hitam dengan daun mahkota dewa  adalah  20:  20/  20kg  BB,  37,5:  12,5/20 kg BB, dan 12,5:37,5/ 20 Kg BB.
Pembuatan Model Mencit Asma Alergi
Pembuatan  mencit  model  asma  alergi dilakukan sensitisasi pada mencit
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..
intraperitoneal  pada  hari  ke-0  dan  hari  ke-14 dengan  menimbang  2,5  mg  OVA  dan dilarutkan  dalam  7,75  ml  Al  (OH)3.  Dosis untuk  tiap  mencit  adalah  0,15  cc/  mencit/ intraperitoneal.  Pemaparan  OVA  aerosol  500 mg  dalam  5  ml,  Aquabides  (Perbandingan 10:1) diberikan pada hari ke-21, 23, 25, dan 27 (Diding 2007).

## Hitung Eosinofil Pada Bronkus
Diambil jaringan bronkus utama didekat  percabangan  (bifurcation)  sepanjang 1,5 cm, selanjutnya jaringan bronkus direndam dalam  larutan  formalin  10%  selama  10  jam, kemudian  dibuat  blok  paraffin.    Selanjutnya dilakukan  pewarnaan  dengan  Haematoxylin Eosin  (HE)  untuk  melihat  dan  menghitung jumlah eosinofil bronkus, kemudian diidentifikasi dengan mikroskop cahaya.  Pada pengamatan  eosinofil  dengan  pengecatan Haematoxylin  Eosin  (HE)  terlihat  keunguan dengan  sitoplasma  granuler,  inti  biasanya berlobus  dua  dihubungkan  benang  sitoplasma yang  tipis.    Jumlah  eosinofil  bronkus dinyatakan  dalam  jumlah  sel  pada  setiap lapangan pandang besar (10x40)sama tidaknya variansi-variansi dua buah distribusi atau lebih dengan  Levene’s  test.  Syarat  uji  beda  dengan uji t adalah data harus berdistribusi normal dan harus  homogen.  Setelah  memenuhi  syarat maka digunakan uji t paired sample test karena data  kuantitatif  yang  diperoleh  berpasangan, jumlah  data  kurang  dari  30,  dan  merupakan data rasio.

## Metode Analisi
Data  dianalisis  dengan  Uji  Kruskal Wallis untuk membandingkan perbedaan mean atau kelompok.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  hitung  jumlah  granul  sel  eosinofil bronkus
Parameter yang diamati dalam penelitian  ini  adalah  eosinofil.    Eosinofil merupakan  mediator  utama  pada  reaksi inflamasi  asmatik. Adanya  akumulasi eosinofil  memberikan  efek  yang  merugikan,
karena eosinofil merupakan efektor yang poten dalam  mengakibatkan  peradangan  berat  pada jaringan.    Inhalasi  ovalbumin  sebagai  alergen akan menyebabkan peningkatan jumlah eosinofil pada saluran pernapasan
Salah  satu  gambar  eosinofil  pada preparat jaringan bronkus masing-masing kelompok  perlakuan  yang  dilihat  dengan mikroskop  cahaya  dengan  perbesaran  10x40 dapat dilihat pada gambar berikut. (Gambar 1-3)
Gambar 1. Kontrol Negatif(CMC 0,5%)
Gambar 2. Kontrol Positif (Profilas®)
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. Journal of Innovation Research and Knowledge
Gambar 3.   Ekstrak Kombinasi
Eosinofil  bercirikan  memiliki  warna biru  atau  ungu  didalam  inti  sel.    Warna  pada eosinofil disebabkan oleh pengecatan Haematoxylin Eosin.
Pengecatan Haematoxylin Eosin adalah gabungan  pengecatan  dengan  pewarna  asam yaitu  Haematoxylin  dan  pewarna  basa  Eosin. Pada susunan Haematoxylin terdapat potassium alumunium sulfat berfungsi sebagai mordan,  yaitu  suatu  substansi  yang  dapat mendiksir  atau  mengikat  zat  warna  pada jaringan yang diwarna. Zat warna Haematoxylin bersifat asam sehingga pada sel ia akan mewarnai sitoplasma. Pada pewarnaan eosinofil  bronkus  sitoplasma  akan  berwarna flouresen, biru, jingga, atau ungu.  Sedangkan eosin digunakan sebagai background stain atau disebut  juga  counterstain  yaitu  pewarna  yang berfungsi  memberikan  warna  kontras  dengan zat  warna  yang  diberikan  terlebih  dahulu. Setelah pewarnaan menggunakan Haematoxylin Eosin, preparat bronkus diamati melalui  mikroskop  cahaya  dengan  perbesaran 10x40,  kemudian  dihitung  jumlah  eosinofil pada 3 lapangan pandang.  Hasil hitung jumlah eosinofil dapat dilihat pada table 1
Tabel 1. Hasil Hitung eosinofil
Pada  tabel  8  terlihat  kelompok  dosis perlakuan III, IV, V, VI, dan VII menunjukkan penurunan jumlah eosinofil daripada kelompok  kontrol negatif.    Sedangkan kenaikan  jumlah  eosinofil  dapat  dilihat  pada kelompok  kontrol  negatif.    Jumlah  eosinofil yang  lebih  banyak  pada  kontrol  negatif mengindikasikan  bahwa  gejala  inflamasi masih  terjadi  pada  saluran  nafas.    Penurunan jumlah  eosinofil  paling  besar  dari  kombinasi terbaik  yaitu  kelompok  dosis  perlakuan  IV menunjukkan  penurunanyang  mendekati  sama besar dengan penurunan jumlah eosinofil pada kelompok  kontrol  positif.    Penurunan  jumlah eosinofil ini mengindikasikan bahwa inflamasi pada  jalan  napas  telah  berkurang  sehingga gejala  asma  juga  berkurang.    Dari  kombinasi kelompok  dosis  perlakuan  III  menunjukkan jumlah  yang  lebih  kecil  dari  kelompok  IV. Penurunan  jumlah  eosinofil  terkecil  dari kombinasi adalah kelompok dosis perlakuan V tetapi  jumlah  eosinofil  masih  lebih  sedikit daripada  kelompok  kontrol  negatif.    Hal  ini menunjukkan  bahwa  kelompok  perlakuan dengan pemberian ekstrak biji jinten hitam dan daun  mahkota  dewa  memiliki  potensi  sebagai antiasma.
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..
ISSN 2798-3641 (Online)
Keterangan:
Gambar  4.  Histogram  rata-rata  jumlah eosinofil bronkus mencit dengan parlakuan Sensitisasi  menggunakan  ovalbumin dilakukan untuk memunculkan respon inflamasi.  Ovalbumin  sebagai  bahan  yang dapat  merangsang  pembentukan  respon  imun ke  arah  Th2  dominan  dan  merupakan  salah satu alergen yang bertanggung jawab terhadap terjadinya  reaksi  alergi  tipe  1  pada  manusia. Reaksi  alergi  ini  termasuk  inflamasi  bronkus kronis  dengan  eosinofilia  (Sugimoto  1999). Sensitisasi  ovalbumin  akan  menunjukkan infiltrasi  eosinofil  yang  signifikan  dalam saluran  pernapasan  pada  24  jam  setelah pernapasan (Shimizu et el 2000).
Rute  pemberian  ovalbumin  secara  intra peritoneal  merupakan  metode  yang  sering
dipakai  karena  rongga  peritoneal  yang  relatif besar sehingga volume antigen yang diinjeksikan  dapat  lebih  banyak  dibanding teknik  lain.    Sensitisasi  ovalbumin  dilakukan setelah  7  hari  pengkondisian  pada  masing- masing kelompok mencit dan dihitung sebagai hari  ke-0  karena  alergen  pertama  kali dikenakan  ke  dalam  tubuh.    Sensitisasi  kedua dilakukan pada hari ke 14 secara intraperitoneal, sedangkan pada hari ke 21, 23, 25 dan 27 sensitisasi dilakukan secara aerosol, Ovalbumin  diberikan  dengan  aerosol  pada mencit yang berada didalam wadah sensitisasi kedua  sampai  dengan  pemberian  Ovalbumin aerosol  dimaksud  agar  hewan  uji  yang disensitisasi akan mengalami hyperresponsiveness  saluran  napas  (Kips  et  al 2003). Hewan uji dikorbankan pada hari ke-28 setelah  24  jam  sensitisasi  terakhir  untuk diambil  jaringan  bronkus  kemudian  dibuat preparat imunohistokimia dan dicat menggunakan Haematoxylin Eosin.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Data  yang  diperoleh  dari  penelitian dianalisa  statistik  dengan  menggunakan  uji Kruskal-Wallis, sebelum dilakukan uji Kruskal-Wallis  terlebih  dahulu  dilakukan  uji Kolmogorov-Smirnov.    Uji  ini  dilakukan untuk  mengetahui  data  yang  diperoleh terdistribusi  secara  normal  atau  tidak.    Data terdistribusi  normal  jika  nilai  signifikansi (asymp.Sig.)>0,05.    Hasil  uji  data  dari penelitian  menunjukkan  bahwa  data  tersebut terdistribusi normal karena nilai signifikansinya  (asymp.Sig.)>0,05  (0,101). Selanjutnya  dilakukan  uji  Kruskal-Wallis untuk  mengetahui  kebermaknaan  lebih  dari dua  kelompok  perlakuan.  Data  dianalisa dengan uji Kruskal-Wallis untuk menunjukkan adanya  perbedaan  yang  signifikan  diantara ketujuh  perlakuan  yeng  ditandai  dengan  nilai signifikansi  sebesar  0,000  (P<0,05).    Pada  uji Kruskal-Wallis  didapatkan  kesimpulan  ada beda nyata.
Pada  penelitian  ini  dapat  dinyatakan bahwa  ekstrak  etanol  biji  jinten  hitam  dan
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. Journal of Innovation Research and Knowledge
daun  mahkota  dewa  terbukti  memberi  efek antiasma terhadap mencit Balb/c yang disensitisasi  menggunakan  ovalbumin  dan dosis  kombinasi  yang  paling  efektif  sebagai antiasma  yaitu  pada  dosis  ekstrak  biji  jinten hitam 37,5 mg dan ekstrak daun mahkota dewa 12,5  mg/20  g  BB  mencit  ditunjukkan  dengan adanya  penurunan  jumlah  sel  eosinofil  dan memiliki beda nyata terhadap kontrol negatif. Kandungan  senyawa  pada  ekstrak  biji  jinten hitam  berdasarkan  uji  kualitatif  adalah polifenol, minyak atsiri, dan saponin. Kandungan  senyawa  pada  ekstrak  daun mahkota  dewa  berdasarkan  uji  kualitatif adalah  alkaloid,  saponin,  flavonoid,  dan polifenol.    Menurut  penelitian  Kawai  et  al (2007)  flavonoid  mampu  menghambat  proses inflamasi  dengan  sebagai  inhibitor  IL-4  dan CD4+  pada  aktivasi  sel.    Penghambatan  IL-4 dan  CD4+  berpengaruh  terhadap  aktivasi eosinofil, yang menyebabkan terjadinya penekanan terhadap akumulasi eosinofil didalam  jaringan  sehingga  gejala  asma  akan berkurang.

## KESIMPULAN
Pemberian  ekstrak  etanol  96%  tunggal dan  kombinasi  dari  biji  jinten  hitam  (Nigella sativa  L.)  dan  daun  mahkota  dewa  (Phaleria macrocarpa  (Scheff.)  Boerl.)  mempunyai  efek antiasma  pada  model  asma  alergi  dengan penurunan parameter hitung jumlah granul  sel eosinofil bronkus pada mencit Balb/c.
kombinasi  biji  jinten  hitam  (Nigella sativa  L.)  dan  daun  mahkota  dewa  (Phaleria macrocarpa  (Scheff.)  Boerl.)  dengan  dosis ekstrak  biji  jinten  hitam  37,5  mg  dan  daun mahkota dewa 12,5 mg/20 g BB mencit paling efektif  menurunkan  jumlah  sel  eosinofil  pada model asma alergi dengan penurunan parameter  hitung  jumlah  granul  sel  eosinofil bronkus pada mencit Balb/c Saran
Pertama,  perlu  dilakukan  uji  toksisitas akut dan kronis untuk mengetahui kemungkinan  adanya  efek  samping  jika dipakai  dalam  jangka  panjang  pada  manusia.
Kedua,  perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut tentang  senyawa  aktif  yang  mempunyai aktifitas sebagai antiasma

## DAFTAR PUSTAKA
[1] [Depkes RI]. 2009. Pedoman Pengendalian Penyakit  Asma.  Jakarta:  Departemen Kesehatan Republik Indonesia
[2] Harmanto  N.  2001.  Mahkota  Dewa:  Obat Pusaka  Para  Dewa.  Jakarta:  Agromedia Pustaka.
[3] Kartikawati  H.  2003.  Pengaruh  Polifenol Teh  Hijau  Terhadap  Respon  Alergi  Pada Mencit Balb/c yang Disensitisasi Ovalbumin [Tesis]. Semarang: Ilmu Biomedik, Universitas Diponegoro. Semarang.
[4] Rohyami  Y.  2007.  Identifikasi  flavonoid dari ekstrak metanol daging buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa Boerl) Menggunakan  Spektrofotometer  UV-Vis dan  FT-IR,  Laporan  Penelitian  PDM DIKTI 2007
[5] Rothenberg  ME.  1998.  Eosinophilia.  N Eng J Med. 338: 1592-1600.
[6] Siswono.  2001.  Mahkota  Dewa  ‘Racun” Irian  yang  Berkhasiat,  Gizi.net  4  Oktober 2001
Siswono.  2001.  Mahkota  Dewa  ‘Racun” Irian  yang  Berkhasiat,  Gizi.net  4  Oktober 2001