## Metode Alternatif Penyimpanan Udang Segar dengan Nisin dari Lactococcus lactis sebagai Pengawet Alami

## Dyah Fitri Kusharyati dan P. Maria Hendrati
Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto

## Abstract
Nisin  is  a Lactococus  lactis metabolite, one of natural  preservatives  against  microbes.  The antimicrobial  inhibition  is  influenced  by  its  concentration  and  contact  time  with  the  targeted microbes. The aim of the study was to know the concentration of L. lactis extract and optimal time of  soaking  the  growing  shrimp  bacterial  in  refrigerator temperature  for  nine  days.  This  study  was conducted  experimentally  applying  factorial  design.  The  first  factor  was  soaking  duration,  i.e.  0 minute  (P 0 ),  30  minutes  (P 1 ),  60  minutes  (P 2 ),  and  90  minutes  (P 3 ),  while  the  second  factor  was concentration levels of metabolite of L. lactis extract. The results showed that the metabolite has an inhibitory effect on  shrimp  bacterioal in dosed dependent way.  The best performance of inhibition was detected at 60 minute-soaking duration.
Keywords : antimicrobe, Lactococus.lactis , nisin

## Pendahuluan
Udang  merupakan  komoditas  ekspor  utama  dari  sektor  perikanan  dan  diketahui sebagai salah satu bahan pangan yang cepat membusuk karena termasuk bahan pangan berprotein  dan  berkadar  air  tinggi.  Penurunan  mutu  udang  dapat  terjadi  setelah penangkapan dan dapat disebabkan oleh kontaminasi bakteri selama penanganan bahan baku,  pengolahan  hingga  pemasaran.  Oleh  karena  itu,  perlu  penanganan  yang  tepat, antara lain dengan cara pengawetan. Salah satu prinsip pengawetan pangan yang dapat diterapkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba pada bahan pangan adalah dengan penambahan zat antimikroba ( Fardiaz, 1992).
Senyawa antimikroba yang dihasilkan Lactococus lactis dikenal dengan nama nisin. Senyawa  ini  merupakan  satu-satunya  bakteriosin  yang  diizinkan  penggunaannya  oleh WHO sebagai pengawet dalam bahan makanan  Nisin dalam bentuk kering stabil selama beberapa tahun, sedangkan dalam bentuk larutan kestabilitasnya dapat diperbaiki dengan menaikkan pH. Nisin mempunyai aktivitas maksimum pada pH 6,5 dan sensitif khususnya terhadap  enzim  proteolitik  seperti  tripsin,  pankreatin,  enzim salivary dan  enzim pencernaan  kecuali  renin  (Luck  dan  Jagger,  1997).  Selain  itu,  nisin  sebagai  bahan pengawet  alami stabil terhadap pemanasan serta suhu penyimpanan yang rendah, tidak menimbulkan  rasa  dan  bau  yang  tidak  enak  serta  tidak  menimbulkan  kerusakan  nutrisi pada  makanan,  tidak  toksik  dan  tidak  mempengaruhi  keberadaan  flora  normal  dalam saluran pencernaan (Tian, 2003 dalam Li dan Hong, 2005).
Kusnadi  (1999)  membedakan  istilah  bakteriosin  dan  antibiotik  berdasarkan  atas proses  sintesisnya.  Sintesis  antibiotik  umumnya  terjadi  pada  fase  stasioner,  sedangkan bakteriosin  disintesis  pada  akhir  fase  logaritmik.  Nisin  digolongkan  ke  dalam  bakteriosin karena disintesis pada akhir fase logaritmik
Nisin  adalah  antimikroba  tipe  polipeptida  yang  sintesisnya  dipengaruhi  oleh ribosom,  tetapi  biosintesisnya  belum  diketahui  secara  pasti  (Ray dan  Daeschel , 1992; Agustin,  1999).  Kerja  senyawa  antimikroba  seperti  nisin  dipengaruhi  oleh  konsentrasi, waktu  kontak,  serta  jumlah  dan  jenis  bakteri.  Pada  konsentrasi  yang  tinggi  suatu
antimikroba yang semula hanya bersifat bakteriostatik dapat menjadi bersifat bakterisidal (Volk dan Wheeler,1988)
Dengan mempertimbangkan hal tersebut di atas, perlu dilakukan penelitian tentang cara  penyimpanan  udang  dengan  nisin  sebagai  pengawet  alami.  Produk  nisin  dengan metode  bertingkat  dan  lama  kontak  perendaman  udang  pada  ekstrak  metabolit  ini diharapkan mampu mengatasi masalah kesegaran udang selama penyimpanan. Dengan demikian,  proses  kerusakan  udang  akibat  autolisis,  oksidasi,  ataupun  kontaminasi  oleh mikroba dapat dikurangi.

## Materi  Dan Metode
Penelitian  dilaksanakan  secara  eksperimen  dengan  Rancangan  Acak  Lengkap (RAL) pola faktorial.
Peremajaan  isolat L.  lactis FNCC0086  dilakukan  dari  kultur  kering  yang ditumbuhkan  dalam  5  ml  media  MRS  Broth  dan  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  24 jam.  Selanjutnya,  kultur  cair  ini  dipindahkan  ke  media  MRS-agar  tegak  dengan  cara tusukan tegak, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C.
Persiapan  kultur L.  lactis FNCC0086  (Shimizu et  al. ,  1999)  dilakukan  dengan beberapa tahap, yaitu kultur pembenihan  ( seed culture) dengan L. lactis sebanyak 50 µl yang diinokulasikan ke dalam 10 ml medium kultur pembenihan dan diinkubasi statis pada suhu 30°C selama 6 jam; prakultur ( pre-culture ) menggunakan 100µl L. lactis FNCC0086 dari  kultur  pembenihan  yang  diinokulasikan  ke  dalam  100  ml  medium  prakultur  dan selanjutnya  diinkubasi  statis  pada  suhu  30 0 C  selama  10  jam;  kultur  primer (primary culture ) dengan L. lactis FNCC0086 sebanyak 100µl dari prakultur yang diinokulasikan ke dalam 100 ml medium kultur primer dan diinkubasi statis pada suhu 30°C selama 10 jam.
Produksi  metabolit L.  lactis FNCC0086  (Shimizu et  al. ,1999)  didapatkan  dari media  kultur  primer  yang  diinokulasikan  ke  dalam  100  ml medium  produksi  metabolit L. lactis .  Inkubasi  dilakukan  pada  inkubator  statis  suhu  30°C  selama  11  jam.  Medium produksi dipertahankan pada pH 6 dengan penambahan NaOH 0,1 N.
Pemanenan metabolit L.lactis FNCC0086 (Shimizu et al. ,1999) dilakukan setelah 11 jam  inkubasi  pada  medium  produksi  dengan  cara  disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000 xg  selama  15  menit.  Supernatan  yang  diperoleh  dipekatkan  menggunakan freeze  drier. Ekstrak metabolit inilah yang disebut dengan nisin.
Pembuatan  larutan  metabolit L.  lactis FNCC0086  (Shimizu et  al. ,  1999)  dilakukan sebagai berikut. Nisin dilarutkan dalam 10 ml HCl 0,02N yang mengandung 0,75% NaCl (Chung et  al. ,  1989)  pada  pH  6.  Larutan  ekstrak dibuat  dengan  variasi  konsentrasi  0%,
5%, 10%, 15%, dan 20% dan disterilisasi menggunakan membrane filter. Aplikasi ekstrak metabolit L. lactis secara in vitro terhadap bakteri udang  dilakukan sebagai  berikut.  Satu  ose  isolat  bakteri  udang  diinokulasikan  ke  dalam  medium  NB, selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 24 jam. Suspensi diambil 1 ml kemudian diinokulasi  ke  medium  NA  steril  pada  cawan  petri  secara  penaburan (spread  plating) . Kertas cakram  steril  berdiameter  13  mm  dicelupkan  ke  dalam  larutan  ekstrak metabolit. Kertas  cakram  selanjutnya  diletakkan  di  tengah  medium  NA  yang  telah  diinokulasikan dengan  bakteri  udang.  Inkubasi  dilakukan  pada  suhu  30°C selama  48  jam  dan  diamati diameter zona jernih yang terbentuk.
Aplikasi  ekstrak  metabolit L.  lactis secara in  vivo terhadap  bakteri  udang  pada udang segar dilakukan sebagai berikut.  Udang segar disimpan dalam kontainer bersuhu rendah 0 0 C dan segera dibawa ke laboratorium untuk diberi perlakuan. Udang dicelupkan ke dalam larutan ekstrak metabolit L .lactis , masing-masing dengan konsentrasi 0%, 5%, 10%,  15%,  dan  20%.    Lama  perendaman  masing-masing  konsentrasi  adalah  0,  30,  60, dan  90  menit.  Udang  setelah  direndam  dalam  larutan  tersebut  ditiriskan  dan  disimpan dalam refrigerator selama 9 hari. Pada hari ke-0, bakteri pada udang didapatkan dengan memaserasi  udang  dan  dibuat  suspensi  pada  pengenceran  10 -2 dan  10 -3 .  Selanjutnya, dilakukan inokulasi secara spread plating pada medium NA. Kultur diinkubasi pada suhu
30 °C selama 2 hari dan jumlah koloni bakteri dihitung dengan metode Total Plate Count (TPC).

## Hasil dan Pembahasan
Hasil  uji  ekstrak  metabolit L.  lactis terhadap  bakteri  udang  secara in  vitro menggunakan  kertas  cakram  yang  dicelupkan  ke  dalam  ekstrak  metabolit L.lactis menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri udang dapat dihambat. Hal ini ditunjukkan oleh adanya zona jernih seperti terlihat pada Gambar 1.  Zona jernih di sekitar kertas cakram terbentuk karena ekstrak metabolit bersifat single hit inactivation , yang berarti bahwa satu molekul  ekstrak  akan  membunuh  satu  sel  bakteri  udang  dan  besarnya  zona  jernih bergantung kepada kecepatan difusi antimikroba dan kecepatan pertumbuhan sel bakteri (Davidson dan Parish,1989).
Gambar1.  Zona  hambat  pertumbuhan  bakteri  udang  dengan  perlakuan  ekstrak  kasar metabolit L. lactis
Figure 1.  Inhibition zone of shrimp bacterial growth on media with gross axtract of L.lactis metabolite
Ekstrak metabolit yang digunakan diduga mengandung bakteriosin sehingga dapat menghambat  bakteri  pada  udang,  dan  terjadinya  penghambatan  dimungkinkan  karena adanya lapisan lemak pada dinding sel bakteri dari ekstrak metabolit L.lactis . Mekanisme pengambatan  diduga  karena  dinding  sel  bakteri  bersifat  permiabel  terhadap  ekstrak metabolit  tersebut  sehingga  ekstrak metabolit  tersebut  bergerak  bebas  melewati  dinding sel dan mengalami kontak dengan membran sitoplasma.
Pengaruh ekstrak metabolit terhadap bakteri yang berasal dari udang menunjukkan bahwa  konsentrasi  ekstrak  metabolit L.  lactis dan  lama  perendaman    memberikan pengaruh terhadap penurunan jumlah sel bakteri udang.  Makin tinggi konsentrasi ekstrak metabolit  dan  makin  lama  waktu  perendaman,  makin  menyebabkan  terjadinya penghambatan pertumbuhan sel sehingga terjadi penurunan jumlah sel dari 5,75 X10 7 sel (P0K0) menjadi 3,30 X 10 7 sel (P3K4) seperti terlihat pada Gambar 2.
Gambar  2  menunjukkan  bahwa  makin  tinggi  konsentrasi  nisin  yang  dicobakan, makin menurun  jumlah  bakteri  dari  udang.  Hal  ini  sesuai  dengan  pendapat  Li  dan  Hong (2005)  bahwa  pengaruh  penghambatan  nisin  akan  makin  meningkat  sejalan  dengan makin tingginya konsentrasi nisin. Selain itu, dikatakan bahwa kerja senyawa antimikroba seperti  nisin  dipengaruhi  oleh  konsentrasi,  waktu  kontak,  serta  jumlah  dan  jenis  bakteri. Pada  konsentrasi  yang  tinggi  suatu  mikroba  yang  semula  bakteriostatik  dapat  menjadi bakterisidal  (Volk  dan  Wheeler,  1989).    Efektivitas  kerja  nisin  dipengaruhi  oleh  cara penyimpanan antimikroba (Ray dan Daeschel, 1992).
0 1 2 3 4 5 6 7 K 0P 0 K 0 P2 K 1 P0 K 1 P2 K 2 P0 K 2 P2 K 3 P0 K 3 P2 K 4P 0 K 4P 2 PERLAKUAN JU M L A H SE L ( 1 0 7 CF U ) K0P0 K0P1
K0 P2
K0 P3 K1 P0
K1 P1 K1 P2 K1 P3 K2 P0 K2 P1 K2 P2
Gambar  2.  Jumlah  sel  bakteri  udang  pada  media  dengan  perlakuan  konsentrasi nisin/ekstrak kasar metabolit L. lactis 0% (K0), 5% (K 1 ), 10% (K 2 ), 15% (K 3 ), 20% (K 4 ), serta lama perendaman 0 menit (P 0 ), 30 menit (P 1 ), 60 menit (P 2 ), 90 menit (P 3 ).
Figure  2.    Number  of  shrimp  bacterial  cells  on  media  with L.  lactis metabolite  extract  at concentrations  of  0%  (K0),  5%  (K1),  10%  (K2),  15%  (K3),  20%  (K4),  and soaking  periods  of  0  minute  (P 0 ),  30  minutes  (  (P 1 ),  60  minutes  (  (P 2 ),  90 minutes ( (P 3 ).
Terjadinya  penghambatan  pertumbuhan  bakteria  diduga  karena  adanya  lapisan lemak pada dinding sel bakteri yang terdapat pada udang yang berperan sebagai reseptor masuknya  ekstrak  metabolit L  .lactis ke  dalam  sel  bakteri.  Bakteriosin  yang  bersifat kationik  akan  teradsorbsi  pada  molekul  ionik  yang  terdapat  di  permukaan  sel  (lapisan lemak).  Hal  ini  menyebabkan  perubahan  khusus  pada  dinding  sel.  Perubahan  ini memungkinkan masuknya bakteriosin melewati dinding sel, mengadakan  kontak dengan membran  sitoplasma,  dan  menimbulkan  efek  bakterisidal.    De  Vuyst  dan  Vandamme (1991) dalam Kim (1997) memperjelas bahwa target utama bakteriosin adalah membran sitoplasma  karena  reaksi  awal  bakteriosin  adalah  merusak  permiabilitas  membran sehingga menghambat produksi energi dan biosintesis protein .
Perlakuan  perendaman  dalam  ekstrak L.  lactis dengan  perlakuan  perendaman selama  60  menit  mulai  menunjukkan  penghambatan  pertumbuhan  bakteri  yang  cukup efektif,  yang  dapat  dilihat  dari  penurunan  jumlah  bakteri.  Dengan  demikian,  lama perendaman yang baik adalah dimulai dari 60 menit.

## Kesimpulan
Makin  tinggi  konsentrasi  ekstrak  metabolit L.  lactis ,  makin  menghambat pertumbuhan  bakteri  dari  udang  dan  lama  perendaman  mulai  60  menit  merupakan perendaman  yang  efektif.  Agar  penghambatan  lebih  optimal  perlu  dilakukan  tambahan perlakuan pendinginan pada suhu 0 0 C terhadap udang segera setelah pemanenan..

## Daftar Pustaka
Agustin,  K.  W.  1999.  Purifikasi  dan  Karakterisasi  Bakteriosin  dari  Bakteri  Asam  Laktat. Tesis. Program Pascasarjana, UGM. Yogyakarta
Chung,  K.,  J.S.  Dikson  and  J.D.  Crouse.  1989.  Effect  of  nisin  on  growth  on  bacteria attached  to  meat.  Journal  Applied  and  Environmental  Microbiology  55  (6):  1329– 1333.
Davidson,  P.M.  and  M.E.  Parish.1989.  Methods  for  testing  the  efficacy  of  food antimicrobials. Journal Food Technology 1: 148-155
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Kusnadi,  J.  1999.  Produksi  dan  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Bakteriosin  Isolat Pediococcus sp.24  serta  Identifikasinya.  Tesis  (tidak  dipublikasikan).  Program  Pascasarjana Universitas GajahMada, Jogyakarta.
Kim, W.S.  1997.  Nisin  production  by Lactococcus  lactis using  two-phase  batch  culture. Letters in Applied Microbiology 25: 169-171
Li  ,  T.,  J.  Tao  and  F.  Hong.  2005.  Study  on  the  inhibition  effect  of  Nisin.  The  journal  of American Science 1 (2): 33-37
Luck,  E  and  M.  Jagger.  1997.  Antimicrobial  Food  Additives:  Characteristic,  Use  and Effects. Springer, London, UK.
Ray,  B.  and  M.  Daeschel.  1992.  Food  Biopreservatives  of  Microbial  Origin.  CRC  Press Inc., Boca Raton, Florida.
Shimizu,  H.;  Mizuguchi,  T.;  Tanaka,  F.  and  Shioya,  S..1999.  Nisin  production  by  mixed culture  system  consisting  of Lactococcus  lactis and Kyuveromces  marxianus . Journal Applied and Environmental Microbiology 65 (7): 3134-3141.
Volk , W.A. dan M.F. Wheeler. 1988. Mikrobiologi Dasar Jilid 1.  Erlangga, Jakarta