INDUKSI KALUS EMBRIOGENIK TANAMAN TEBU ( SACCHARUM OFFICINARUM L.)

## PADA BERBAGAI KOMBINASI 2,4D DAN BAP SECARA IN VITRO
Induction of Embryogenic Callus in Sugarcane (Saccharum officinarum L.) in Various Combinations of 2.4D and BAP Through in Vitro
Riski Busaifi, Hirjani
Staf Pengajar Fakultas Pertanian Universitas Nahdlatul Wathan Mataram Jl. Kaktus 1-3 Mataram e-mail: qq_chilli@yahoo.com

## ABSTRAK
Untuk  mendukung  program  pemerintah  tentang  produksi  tujuh  komoditas  Strategi  Nasional  yakni beras, jagung, kedelai, daging sapi, bawang merah, cabai merah, dan gula pasir. Perbanyakan tanaman tebu dalam  jumlah  banyak  secara  cepat  dapat  dilakukan  dengan  menggunakan  metode  perbanyakan  melalui induksi  kalus.  Induksi  kalus  memiliki  presentase  hasil  yang  lebih  tinggi  dan  sangat  dipengaruhi keberhasilannya oleh pembentukan kalus embriogenik. Zat pengatur  tumbuh (ZPT)  merupakan faktor yang paling mempengaruhi perkembangan kalus embriogenik menjadi embrio somatik. Kombinasi antara Auksin dan  Sitokinin  mempunyai  peran  penting  untuk  menginduksi  kalus  dimana  2,4  D  dan  BAP  merupakan merupakan  kombinasi  yang  digunakan  dalam  perbanyakan  tanaman  secara  in-vitro.  Tujuan  dari  penellitian ini  adalah  untuk  menemukan  metode  in  vitro  yang  cepat  untuk  tebu  melalui  induksi  kalus  embriogenik. Eksplan yang digunakan dari gulungan daun muda diisolasi dari tanaman tebu yang sehat berasal dari lapang kemudian ditumbuhkan pada media MS dengan kombinasi 2,4-D (0, 2, 4, dan 6 ppm) dan BAP (1, 2, dan 3 ppm) untuk menginduksi kalus embriogenik. Variabel yang diamati meliputi saat pelengkungan daun (hari), persentase  saat  pelengkungan  daun,  saat  pembengkakan  (hari),  persentase  saat  pembengkakan,  serta Tampilan fisik kalus seperti warna dan strukturnya. Luaran penelitian ini dapat berupa publikasi ilmiah pada jurnal lokal dan bahan ajar untuk pembelajaran pada mata kuliah Kultur Jaringan Tanaman.

## ABSTRACT
To  support  the  government's  program  on  the  production  of  seven  National  Strategy  commodities, namely  rice,  corn,  soybeans,  beef,  shallots,  red  chili, and  granulated  sugar.  Multiplication  of  sugar  cane  in large  quantities  quickly  can  be  done  using  the  method  of  propagation  through  callus  induction.  Callus induction  has  a  higher  yield  percentage  and  is  strongly  influenced  by  its  success  by  embryogenic  callus formation.  Growth  regulating  substances  (ZPT)  are  the  factors  that  most  influence  the  development  of embryogenic callus into somatic embryos. The combination of Auxin and Cytokinin has an important role to induce callus where 2,4 D and BAP is a combination used in in vitro plant propagation. The purpose of this research is to find a fast-in vitro method for sugarcane through the induction of embryogenic callus. Explants used  from  young  leaf  rolls  isolated  from  healthy  sugarcane  plants  from  the  field  were  then  grown  on  MS media with a combination of 2,4-D (0, 2, 4, and 6 ppm) and BAP (1, 2, and 3 ppm) to induce embryogenic callus.  Variables  observed  included  leaf  curvature  (days),  percentage  of  leaf  curvature,  swelling  (days), percentage  of  swelling,  and  physical  appearance  of  callus  such  as  color  and  structure.  The  output  of  this study  can  be  in  the  form  of  scientific  publications  in  local  journals  and  teaching  materials  for  learning  in Plant Tissue Culture courses.
_________________________________________________________________________________
Kata Kunci : in vitro, induksi kalus, tebu, embriogenik, Saccharum officinarum L. Keywords: in vitro, induction of callus, sugar cane, embryogenic, Saccharum officinarum L.

## PENDAHULUAN
Tebu  ( Saccharum  officinarum L.) merupakan  tanaman  penting  yang  bernilai ekonomi  tinggi  di  berbagai  negara,  terutama di  negara  berkembang  yang  beriklim  tropis seperti  Indonesia  karena  kandungan  gulanya yang  tinggi  pada  bagian  batangnya.  Batang tebu  dimanfaatkan  terutama  sebagai  bahan dasar  utama  dalam  industri  gula  dan  bahan baku  industri  lainnya  seperti  farmasi,  kimia, pakan  ternak,  pupuk,  jamur,  dan  lain-lain. Oleh sebab itu, pemerintah Indonesia memasukkan tanaman tebu sebagai salah satu dari  tujuh  komoditas  Strategi  Nasional  yakni beras,  jagung,  kedelai,  daging  sapi,  bawang merah,  cabai  merah,  dan  gula  pasir.  Farid (2003)  menyatakan  bahwa,  pengembangan industri  gula  saat  ini  tidak  hanya  berperan penting  dalam  pertumbuhan  perekonomian negara, tetapi juga berkaitan langsung dengan pemenuhan kebutuhan pokok rakyat.
Untuk merealisasikan komoditas
Strategi  Nasional  tersebut  maka  pemerintah Nusa Tenggara Barat (NTB) ikut serta dengan memprogramkan tanaman tebu sebagai komoditi  unggulan  NTB  dalam  bidang perkebunan  serta  adanya  perusahaan  gula yang sedang dikembangkan  sejak tahun  2015 oleh pemerintah NTB. Dengan adanya pabrik gula  membuat  kebutuhan  akan  bibit  unggul tanaman tebu semakin meningkat.
Hal  ini  membutuhkan  bibit  dalam jumlah  yang  besar  dan  pertumbuhan  yang
seragam dalam waktu yang singkat. Untuk itu diperlukan  suatu  metode  perbanyakan  yang dapat  memecahkan  permasalahan  bibit,  salah satunya  melalui  metode  in  vitro.  Metode  ini dapat  menghasilkan  bibit  dalam  jumlah  yang besar  tanpa  memerlukan  jumlah  induk  yang banyak,  waktu  yang  relatif  singkat  dan  bibit yang  dihasilkan  bebas  patogen.  Metode  ini banyak  digunakan  untuk  menciptakan  variasi genetic  yang  disebut  variasi  somaklonal. Kultur  in-vitro  pada  dasarnya  merupakan suatu  sistem  pertumbuhan  sel-sel  sebelum berdiferensiasi (kalus dan suspensi), sehingga mampu menghasilkan tanaman baru.
Regenerasi  tanaman  dapat  dilakukan melalui dua cara yaitu organogenesis (melalui pembentukan  organ  langsung  dari  eksplan) dan embryogenesis somatic (Purnamaningsih, 2006).  Kalus  dapat  dihasilkan  dari  semua bagian tanaman seperti akar, batang dan daun, tetapi  organ  yang  berbeda  memberikan pembentukan  kalus yang berbeda  pula (Musa dan Munir, 2002).
Embriogenesis  somatik  merupakan perkembangan  sel-sel  somatik  (yaitu  sel-sel tubuh  seperti  batang,  daun,  dan  lainnya  baik haploid  maupun  diploid)  menjadi  tumbuhan dengan  membentuk  embrio  namun  tanpa melalui  fase  menyatunya  gamet  (Suprasanna et  al ,  2005).  Embriogenesis  somatik  terbagi menjadi  dua  jalur  yaitu  secara  langsung  dan tidak langsung. Embriogenesis somatic secara langsung  terbentuk  tanpa  melewati  fase
pengkalusan, sedangkan embriogenesis somatik  secara  tidak  langsung  terbentuk melalui fase pengkalusan (Percy et al , 2000).
Williams dan Maheswaran (1986) menyebutkan bahwa biasanya hanya sejumlah kecil embrio somatik yang berhasil didapatkan  melalui  embriogenesis  somatik secara  langsung.  Namun  berbeda  dengan embriogenesis somatik secara tidak langsung, hasil  embrio  somatik  tinggi  telah  dilaporkan pada  embriogenesis  somatic  secara  tidak langsung. Perkembangan embriogenesis somatic  terbagi  menjadi  dua  tahap  utama, yaitu  diferensiasi  sel  somatic  menjadi  sel kompeten
embriogenik kemudian berproliferasi  sebagai  sel  embriogenik.  Fase utama  kedua  yaitu  sel  embriogenik  tersebut menunjukkan  kompetensi  embriogeniknya dan  berdiferensiasi  menjadi  embrio  somatik (Jimenez,  2001).  Keberhasilan  embriogenesis somatik tidak langsung dapat tercapai dengan terbentuknya kalus embriogenik.
Kemampuan  kalus untuk beregenerasi sangat ditentukan oleh media yang digunakan dan  komposisi  zat  pengatur  tumbuh  dalam media. Winata (1987) menyatakan bahwa dua golongan  zat  pengatur  tumbuh  yang  sangat penting dalam kultur jaringan tanaman adalah auksin dan sitokinin. George dan Sherrington (1984),  menyatakan  bahwa  inisiasi  tunas  dan akar diatur oleh interaksi auksin dan sitokinin yang  diberikan  ke  dalam  media.  Demikian juga  interaksi  masing-masing  auksin  atau
sitokinin eksogen dengan auksin dan sitokinin endogen yang dikandung oleh eksplan. Hal ini diperkuat  dengan  beberapa  penelitian  yang menggunakan  kombinasi  zpt.  Kombinasi antara  BAP  dan  2,4D  pada  kalus  jarak  pagar dengan hasil yang optimal (Andaryani, 2010). Menurut  Indah  dan  Dini  (2013)  mengatakan bahwa kombinasi 0,5pp, 2,4 D + 2 ppm BAP kombinasi paling optimum dam menumbuhkan kalus daun nyamplung dengan berat segar 19,78.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui pengaruh dari pemberian kombinasi 2,4D dan BAP  pada  induksi  kalus embrigenik  tanaman tebu

## METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan tempat
Penelitian  ini  akan  dilaksanakan  pada bulan  Agustus  2018  sampai  Februari  2019 bertempat  di  Laboratorium  Kultur  Jaringan BPTP Nrmada, Lombok Barat NTB.

## Alat dan bahan
Alat-alat yang digunakan dalam melaksanakan penelitian ini yaitu: laminar air flow  cabinet (LAFC),  autoklaf,  kompor  gas, botol  kultur,  alat  disetting  set  (pinset, skalpel), rak dorong, rak penyimpanan media, petridish, erlenmeyer, gelas ukur, handsprayer,  lampu  bunsen,  gunting,  beaker glass,  timbangan  digital,  timbangan  analitik, hot  plate,  magnetik  stirrer,  pH  meter,  kulkas, pipet  tetes,  pipet,  pipet  mikro,  poci  ukur, panci,  spatula,  shaker,  sendok,  alat  pencuci,
stopwatch,  ember,  sprayer,  alat  tulis  dan kamera.
Bahan-bahan yang digunakan pembuatan  media  perlakuan:  media  MS,  zpt 2,4D  dan  BAP  dengan  beberapa  konsentrasi, allumunium foil, tunas mikro kentang varietas Margahayu,  alkohol  70%  dan  96%,  mata pisau,  tissu  steril,  tissu  gulung,  air  bersih, spiritus,  plastik  wrapping,  korek  api,  kertas label, spidol, kertas saring.

## Pelaksanaan Penelitian Sterilisasi alat dan bahan
Sterilisasi  alat  dan  bahan  dilakukan dengan  menggunakan  autoklaf  pada  tekanan 15-17  psi  dan  temperatur  121oC  selama  20 menit.  Alat-alat  yang  disterilisasi  dengan menggunakan  autoklaf,  ialah  tabung  reaksi berisi  media  MS  +  perlakuan,  scalpel,  dan pinset  yang  telah  terbungkus  alumunium  foil serta  peralatan  berupa  glass  ware  disungkup kertas  hanya  pada  bagian  terbuka.  Laminar Air  Flow  Cabinet  dibersihkan  dengan menggunakan  alkohol  90  %  dan  lampu  UV
untuk membersihkan sumber-sumber kontaminan.
Pembuatan larutan
stok (larutan
persediaan) hara media MS
Pembuatan larutan stok hara dimaksudkan mempermudah  membuat  larutan  hara  dalam konsentrasi  yang  diinginkan  dengan  jumlah timbangan  hara  yang  sedikit.  Komposisi berbagai  macam  hara  telah  tercantum  dalam tabel pada lampiran.
Pembuatan  stok  hara  sebagai  berikut: menyiapkan  alat  dan  bahan,  melakukan identifikasi  bahan  kimia,  menimbang  bahan kimia  sesuai  dengan  kebutuhan,  mengambil erlenmeyer  lalu  memasukkan  air  1/3  bagian beserta  kapsul  pengaduk,  kemudian  letakkan diatas hot plate magnetic stirrer. Hidupkan hot plate  magnetic  stirrer,  tunggu  hingga  larutan larut  secara  homogen.  Matikan  hot  plate magnetic stirrer, kemudian angkat larutan dari atas  hot  plate  magnetic  stirrer  dan  masukan larutan  kedalam  gelas  ukur  untuk  ditera sampai volume larutan 100 ml. Setelah ditera, tuangkan  kedalam  erlenmeyer  200  ml, kemudian letakkan  di atas hot plate magnetic stirrer.  Hidupkan  hot  plate  magnetic  stirrer sampai larutan tercampur, kemudian tuangkan lagi/campurkan  dengan  larutan  bahan  kimia lainnya,  tunggu  hingga  larutan  homogen selama  2  menit.  Kemudian  matikan  hot  plate magnetic stirrer dan angkat larutan, kemudian tuangkan  lagi  kedalam  gelas  ukur  500  ml untuk ditera sampai volume 200 ml. Masukan ke  dalam  botol  jars  (tutup),  kemudian masukan ke dalam lemari es.
Pembuatan stok (larutan persediaan) 2,4D dan BAP.
Mengambil dengan pipet 2,4D dengan kandungan  bahan aktif sebesar sebesar 1 mg, kemudian dilarutkan dalam akuades sebanyak 1000 ml dengan magnetik stirer (lampiran 3). Larutan disimpan dalam lemari pendingin.
Pembuatan media MS + perlakuan Pembuaan media MS menurut Helgeson  (1979  dalam  Rina  2009)  sebanyak 1,8-liter,  500  ml  akuades  dituangkan  dalam beaker  glass  2-liter,  48  g  sukrosa  ditimbang kemudian  ditambahkan  pada  akuades  sambil diaduk  sampai  larut.  Lalu  ditambahkan larutan  stok  A,  B,  G,  H  C,  D,  E,  F  masing- masing  10  ml/l  atau  5  ml/l  sesuai  kepekatan stok  yang  tersedia,  Volume  larutan  dijadikan mendekati 1-liter ukur sampai angka pH 5,6 – 5,8.  Penambahan  HCl  1  M,  jika  terlalu  basa dan  penambahan  KOH,  jika  terlalu  asam. Media  ditepatkan  menjadi  1-liter  dengan menambahkan  akuades.  Kemudian  media dituang ke dalam panci, ditambahkan agar 9,6 gram,  dipanaskan  hingga  agar  larut,  dan tampak bening. Menambahkan dalam masing- masing  beaker  glass  perlakuan  masing- masing  konsentrasi  2,4D  dan  BAP.  Menuang media  +  perlakuan  dalam  tabung  reaksi sebanyak 15 ml, kemudian disterilisasi dalam autoklaf dengan suhu 121oC selama 20 menit.
Inokulasi Eksplan Tebu
1. Penyiapan alat dan bahan yang digunakan
2. Pemilihan eksplan mulai pucuk sepanjang 40-60 cm
3. Dipotong  dari  bagian  bawah  hingga terlihat  batas  antar  ruas  yang  keras  dan batasan gulungan daun muda pada batang sehingga muncul warna kuning
4. Dipotong  dari  batas  bawah  yang  terlihat warna kuning sekitar 20 cm ke atas
5. Cuci menggunakan air bersih
6. (Sterilisasi  dalam  Laminar)  merendam pada alkohol 70% selama 2 menit.
7. Merendam  pada  larutan  HgCl  0,2% selama 4menit diulang sebanyak 2 kali
8. Merendam  menggunakan  aquades  steril selama 4 menit diulang sebanyak 2 kali
9. Membuka  lapisan  hingga  eksplan  yang digunakan berdiameter 0.3-0.5 cm menggunakan pinset
10. Potong  mulai  dari  bagian  bawah  yang paling muda sepanjang 0.2 cm
11. Tanam pada media MS + 2,4 D 3 ppm + air Kelapa 10% dengan 3 eksplan/ botol 12. Pemberian label nama penanam,
komoditas tanaman, tanggal penanaman
13. Simpan  pada  rak  penyimpanan  di  ruang pertumbuhan
14. Bersihkan  alat  dan  ruangan  yang  telah digunakan

## Rancangan Penelitian
Kegiatan ini bertujuan untuk mengetahui  pengaruh  2,4D  dan  BAP  dalam memacu  induksi  kalus  embriogenik  tanaman tebu.  Penelitian  ini  disusun  menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL)
Rancangan  yang  digunakan  adalah rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  faktorial dengan  2  (dua)  faktor  yaitu  4  konsentrasi 2,4D  dan  3  konsentrasi  BAP.  Penelitian  ini terdapat 12 (dua belas) perlakuan dan 3 (tiga) ulangan.  Setiap  ulangan  terdiri  dari  2  botol. Jadi  keseluruhan  eksplan  yang  digunakan berjumlah  12  x  (3  x  4)  =144  eksplan.
Penempatan  sampel  dilakukan  secara  acak agar semua sampel untuk berbagai konsentrasi  paclobutrazol  mendapat  kondisi yang  sama.  Perlakuan  dalam  penelitian  ini, sebagai berikut:
Faktor I:
P1 = 0 ppm 2,4D (kontrol)
P2 = 2 ppm 2,4D
P3 = 4 ppm 2,4D P4 = 6 ppm 2,4D Faktor II:
B1 = 1 ppm BAP B2 = 2 ppm BAP
B3 = 3 ppm BAP

## Tabel 1 Perlakuan Konsentrasi 2,4D dan BAP
Perlakuan B1 B2 B3 P1 P1B1 P1B2 P1B3 P2 P2B1 P2B2 P2B3 P3 P3B1 P3B2 P3B3 P4 P4B1 P4B2 P4B3

## Variabel Penelitian
Pengamatan dilakukan sejak awal induksi kalus hingga percobaan berakhir.
Variabel yang diamati meliputi:
1. Induksi  Pembentukan  kalus  (hari).
Pembentukan kalus diamati setiap hari setelah  Inokulasi  sampai  terjadinya
pelengkungan 2. Saat pembengkakan/Pertumbuhan
kalus (hari). Pertumbuhan kalus
diamati  setiap  dua  hari  sekali  setelah
inokutanam sampai terjadinya pembengkakan.
3. Morfologi  Kalus:  Morfologi  kalus berupa  visualisasi  dari  kalus  yakni warna dan struktur dari kalus, di mana diamati  dengan  langsung  melihat visualisasi dari kalus
Tampilan  fisik  kalus  seperti  warna  dan strukturnya  diperkirakan  secara  visual pada  akhir  tahapan  induksi  kalus sebelum transplantasi ke media regenerasi
4. Bobot  segar.  Berat  atau  bobot  dari kalus dengan ditimbang tiap sampel

## Analisis Data
Data  yang  diperoleh  seperti;  induksi pembentukan  kalus,  pertumbuhan  kalus, morfologi  kalus,  dan  berat  segar  kalus dianalisis secara deskriptif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pembentukan Kalus
Munculnya kalus pada eksplan ditandai dengan munculnya jaringan berwarna putih  bening  seperti  lendir  pada  bekas  irisan eksplan  dan  sayatan  di  permukaan  eksplan yang kemudian berkembang menjadi bulatan- bulatan kecil yang jelas.
Konsentrasi 2,4D Konsentrasi BAP B1 B2 B3 P1 5 4 6 P2 4 3 3 P3 3 7 7 P4 2 7 8
Gambar  1.  Grafik  pembentukan  kalus untuk hari setelah inokulasi
Perlakuan 2,4-D 6 ppm dengan BAP 1 ppm  menghasilkan  inisiasi  kalus  dengan waktu  tercepat  yaitu  2  HSI  (hari  setelah inokluasi),  dan  juga  untuk  perlakuan  dengan penambahan 2,4-D 2 ppm yang
dikombinasikan dengan BAP 1; 2; 3, di mana bila  dibandingkan  dengan  perlakuan  yang lain.
Berdasarkan  gambar  1  di  atas,  dapat disimpulkan  bahwa  penambahan  2,4-D  yang tinggi yaitu 2 ppm dan atau lebih baik dengan diikuti  penambahan  BAP  1,2  dan  3  ppm menghasilkan  rerata  saat  inisiasi  kalus  yang cepat. Sedangkan perlakuan dengan
konsentrasi 2,4-D yang rendah akan mengakibatkan inisiasi kalus semakin lambat. Yelnititis (2012), mengatakan bahwa
pembentukan  kalus  dari  eksplan  daun  ramin membuktikan bahwa semakin tinggi konsentrasi  2,4-D  yang  digunakan,  induksi kalus semakin cepat terjadi karena 2,4-D lebih mudah  berdifusi  ke  dalam  jaringan  tanaman akibat adanya luka irisan sehingga 2,4-D yang
ditambahkan akan membantu auksin endogen untuk menstimulasi atau merangsang pembelahan  sel  terutama  sel  disekitar  area luka.
Keberhasilan eksplan dalam merespon komposisi  media  untuk  menginisiasi  kalus juga  tergantung  pada  kondisi  eksplan.  Bakti (2005)  menyatakan  bahwa  musim  ketika eksplan diambil, kualitas tanaman keseluruhan,  kondisi  aseptik  media  dan eksplan,  ukuran  eksplan  dan  umur  fisiologis tanaman  mempengaruhi  keberhasilan  kultur. Keberhasilan  untuk  menginduksi  kalus  lebih besar  bila  eksplan  yang  digunakan  bersifat meristematik (aktif membelah).

## Pertumbuhan Kalus
Salah satu indikator adanya pertumbuhan  dalam  kultur in  vitro adalah munculnya kalus pada eksplan. Pada penelitian  ini,  kalus  pertama  kali  terbentuk pada  sayatan  eksplan  yang  kontak  dengan media.  Diawali  dengan  pembengkakan  pada eksplan kemudian sayatan eksplan bergelombang ( swelling ). Kalus yang dihasilkan  melalui  kultur  secara in  vitro terbentuk  karena  adanya  perlukaan  pada jaringan  dan  respon  terhadap  zat  pengatur tumbuh (ZPT). Munculnya kalus pada bagian yang terluka diduga karena adanya rangsangan  dari  jaringan  pada  eksplan  untuk menutupi lukanya.
Konsentrasi Konsentrasi BAP
2,4D B1 B2 B3 P1 11 7 7 P2 8 10 10 P3 17 8 7 P4 18
Pada  Gambar  2  menunjukkan  bahwa kalus  tumbuh  pada  beberapa  perlakuan. Beberapa  dari  perlakuan  tersebut  juga  tidak dapat  menghasilkan  atau  tumbuhnya  kalus. Kalus  yang  tidak  tumbuh  ini  dimungkinkan karena  kombinasi  ZPT  pada  media  belum mampu  menumbuhkan  kalus,  dengan  kata lain  eksplan  mempunyai  kandungan  sitokinin dan  auksin  endogen  yang  rendah,  sehingga masih  membutuhkan  tambahan  sitokinin eksogen yang lebih banyak pada media kultur.

## Morfologi Kalus (Tekstur Dan Warna)
Indikator  pertumbuhan  eksplan  pada kultur in vitro berupa warna dan tekstur kalus menggambarkan  penampilan visual kalus sehingga  dapat  diketahui  kalus  yang  masih memiliki  sel-sel  yang  aktif  membelah  atau telah mati. Jaringan kalus yang dihasilkan dari suatu  eksplan  biasanya  memunculkan  warna yang  berbeda-beda.  Kualitas  kalus  yang  baik sebagai penghasil senyawa metabolit
sekunder yaitu mempunyai ciri-ciri warna dan tekstur yang sesuai dengan metabolit sekunder yang diinginkan.
Tabel  2  Struktur  kalus  yang  terbentuk  pada eksplan  tebu  dari  beberapa  taraf konsentrasi antara 2,4-D dan BAP. Konsentrasi 2,4 D (ppm) Konsentrasi BAP (ppm) 1 2 3 0 2 4 6 Kompak Kompak Kompak Remah Kompak Kompak Kompak Kompak Remah Remah
Berdasarkan  tekstur  dan  komposisi selnya,  kalus  dapat  dibedakan  menjadi  kalus yang  kompak  dan  remah.  Kalus  kompak mempunyai  tekstur  padat  dan  keras,  yang tersusun  dari  sel-sel  kecil  yang  sangat  rapat, sedangkan  kalus  remah  mempunyai  tekstur lunak  dan  tersusun  dari  sel-sel  dengan  ruang antar  sel  yang  banyak.  Perbedaan  struktur kalus menimbulkan adanya perbedaan kemampuan memperoduksi metabolit sekunder.
Kalus  yang  baik  untuk  digunakan sebagai  bahan  penghasil  metabolit  sekunder yaitu  memiliki  tekstur  kompak  ( non-friable ).
Tekstur  kalus  yang  kompak  dianggap  baik karena dapat mengakumulasi metabolit sekunder lebih banyak.
Pada  table  1  menunjukkan  bahwa semua  perlakuan  yang  terbentuk  kalus dominan membentuk kalus bertekstur
kompak.  Terbentuknya  kalus  yang  bertekstur kompak  menurut  (Andaryani,  2010)  dipacu oleh  adanya  hormon  auksin  endogen  yang diproduksi  secara  internal  oleh  eksplan  yang telah  tumbuh  membentuk  kalus  tersebut. Pemberian  zat  pengatur  tumbuh  dapat mempengaruhi  produksi  metabolit  sekunder, hal  ini  disebabkan  ZPT  yang  ditambahkan dapat  menyebabkan  perubahan  fisiologi  dan biokimia  tumbuhan  melalui  pengaturan  kerja enzim.  ZPT  berperan  dalam  pengikatan membran  protein  yang  berpotensi  untuk aktivitas enzim. Hasil pengikatan ini mengaktifkan  enzim  tersebut  dan  mengubah substrat  menjadi  beberapa  produk  baru. Produk baru yang terbentuk ini menyebabkan serentetan reaksi-reaksi sekunder salah satunya adalah pembentukan metabolit sekunder (Wardani, et al , 2004).
Beberapa pendapat mengatakan bahwa kalus  yang  berkualitas  adalah  kalus  yang berwarna  hijau.  Menurut  Fatmawati  (2008), warna  kalus  mengindikasikan  keberadaan klorofil  dalam  jaringan,  sehingga  semakin hijau  warna  kalus  semakin  banyak  pula kandungan klorofilnya.
Tabel  3  Warna  kalus  eksplan  Tebu  pada beberapa taraf konsentrasi 2,4-D dan
BAP secara in vitro. Konsentrasi 2,4 D (ppm) Warna Kalus Konsentrasi BAP (ppm) 1 2 3 0 2 4 6 Hijau Hijau Hijau Hijau Hijau Hijau Hijau Hijau Kuning Kuning
Pada  tabel  2,  menunjukkan  warna yang  terlihat  pada  kalus  tebu berbeda. Perbedaan  warna  yang  terjadi  pada  kalus menunjukkan  tingkat  perkembangan  kalus yang  berbeda-beda  pula,  hal  ini  dipengaruhi oleh  konsentrasi  zat  pengatur  tumbuh  yang diberikan  oleh  media  tumbuh. Hampir semua perlakuan  menunjukkan  warna  hijau  pada kalus yang terbentuk. Warna hijau pada kalus adalah akibat efek sitokinin dalam pembentukan  klorofil.  Menurut  Wattimena (1991), sitokinin berperan dalam memperlambat proses senesensi (penuaan) sel dengan  menghambat  perombakan  butir-butir klorofil dan protein dalam sel.
Pada  penambahan  sitokinin  dengan konsentrasi yang semakin meningkat cenderung  menunjukkan  warna  hijau  (cerah) pada  kalus  lebih  tahan  lama  (Hanifah,  2007). Kalus  dengan  warna  yang  hijau  tidak  hanya dimungkinkan  mengandung  banyak  pigmen klorofil akan tetapi, kalus yang terbentuk juga memiliki ukuran cukup besar yang menandakan bahwa kalus beregenerasi dengan  baik  dan  sel-selnya  masih  aktif membelah.
Selama  masa  perkembangannya  kalus yang semakin lama berada pada media tanam akan  mengalami  degradasi  fisiologis  atau penurunan  tingkat  fisiologi  tanaman  akibat kekurangan unsur hara atau hormon tumbuhnya.  Hal  ini  biasa  ditandai  dengan perubahan warna dari cerah menjadi kecoklatan ( browning) . Peristiwa pencoklatan terjadi  akibat  adanya  metabolisme  senyawa fenol  bersifat  toksik,  yang  sering  terangsang akibat  proses  sterilisasi  eksplan,  yang menghambat pertumbuhan atau bahkan kematian  jaringan  (Yusnita,  2004).  Selain menandakan  terjadinya  sintesis  senyawa fenol,  warna  coklat  disebabkan  oleh  semakin bertambahnya  umur  sel  atau  jaringan  kalus. Konsentrasi  yang  tinggi  oleh  2,4-D  dan  tidak adanya  penambahan  sitokinin  dalam  media juga  mampu  memacu  terjadinya senesensi yang  dapat  menghambat  proses  pertumbuhan kalus.

## Bobot Segar Kalus
Minimnya  bobot  segar  kalus  yang terbentuk  pada  rata-rata  perlakuan  lebih banyak  disebabkan  karena  eksplan  hanya menghasilkan  kalus  berupa  lendir  dan  berair yang  belum  berkembang  serta  akibat  eksplan browning.  Eksplan  yang  mengalami  mati fisiologis dan browning mengakibatkan
kematian  jaringan  sehingga  tidak  mampu
memproduksi kalus. Lizawati (2012),
mengatakan  bahwa  peristiwa  browning  pada kalus  akibat  adanya  metabolisme  senyawa
fenol  yang  bersifat  toksik  dan  dapat menghambat pertumbuhan atau bahkan menyebabkan  kematian  jaringan.  Hal  ini merupakan  tanda  terjadinya  kemunduran fisiologis  eksplan  dan  juga  menandakan terjadinya sintesis senyawa fenol dalam botol kultur.
Konsentrasi 2,4D Konsentrasi BAP B1 B2 B3 P1 0.782 0.371 0.128 P2 0.437 0.202 0.293 P3 0.188 0.066 0.057 P4 0.129

## KESIMPULAN DAN SARAN KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang telah  dilakukan  dapat  diambil  kesimpulan bahwa  pemberian  2,4-D  yang  cukup  tinggi mampu  mengurangi  penggunaan  BAP  pada media dan menghasilkan induksi dan proliferasi kalus yang optimal. Perlakuan 2,4- D  2  ppm  dengan  BAP  0  ppm  mampu menginisiasi  kalus  dengan  baik,  banyak, inisiasi yang cepat dan efisien (optimal).

## SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan variasi konsentrasi ZPT yang  berbeda  untuk  menghasilkan  kalus  tebu yang lebih baik.

## DAFTAR PUSTAKA
Andaryani, S. 2010. Kajian Berbagai konsentrasi  BAP  dan  2,4D  terhadap
Induksi  Kalus  Jarak  Pagar  (Jatropha
curcas  L.)  secara  In  Vitro.  Skripsi. Universitas Sebelas Maret. Surakarta.
Bakti,  C.  2005.  Embriogenesis  Somatik  Jahe ( Zingiber officinale Rosc.) Pada
Berbagai Zat Pengatur Tumbuh. Tesis.
Pascasarjana IPB. Bogor
Blackburn,  F.  1984.  Sugar  Cane.  Logman
Group.  London.  Jimenez  VM.  2001. Regulation of  in vitro somatic embryogenesis  with  emphasis  on  the role of endogenous hormones. R. Bras.
Fisiol. Veg. 13(2):196-223.
D.P. Wardani, Solichatun dan A.D. Setyawan, “Pertumbuhan  dan  Produksi  Saponin Kultur  Kalus  Talinum  paniculatum Gaertn.  Pada  Variasi  Penambahan Asam  2,4-Diklorofenoksi  Asetat  (2,4- D)  dan  Kinetin,  “Biofarmasi,  Vol.  2, No. 1 (2004) 35-43.
E.F.  George  and  P.D.  Sherrington,  Plant Propagation by Tissue Culture, England: Exegetis Limited (1984).
Farid, M.B. 2003. Perbanyakan tebu (Saccharum  officinarum  L.)  secara  in vitro  pada  berbagai  konsentrasi  IBA dan  BAP.  J.  Sains  dan  Teknologi 3(3):103- 109.
Gray, D.J. 2005. Propagation from nonmeristematic  tissue:  nonzygotic embryogenesis.  187-200. In :  R.N. Trigiano  and  D.J.  Gray  ( Eds ). Plant Development and Biotechnology . CRC Press. United States of America.
George,  E.  F.,  and  P.  D.  Sherrington.  1984.
Plant  Propagation  by  Tissue  Culture. Exegetic Limited. London
Gunawan, L.W. 1995. Teknik Kultur in Vitro dalam  Hortikultura.  Jakarta:  Penebar
Swadaya.
Indah,  PN  dan  Dini  E.  2013  Induksi  Kalus Daun Nyamplung (Calophyllum inophyllum L.) pada Beberapa
Kombinasi konsentrasi 6-
Benzylaminopurine  (BAP)  dan  2,4- Dichlorophenoxyacetic  Acid  (2,4-D). Jurnal  Sains  dan  Seni  Pomits.  Vol 2(1).
Lizawati.  2012.  Induksi  Kalus  Embriogenik dari  Eksplan  Tunas  Apikal  Tanaman Jarak  Pagar  ( Jatropha  curcas L.) dengan  Penggunaan  2,4-D  dan  TDZ. Menara  Perkebunan  FP Universitas Jambi 1(2): 75-87.
Musa,  Y  dan  Munir  (2002).  Pembiakan  In Vitro  dari  beberapa  varietas  tebu (Saccharum  officinarum  L.)  di  PTP XIV,  Gula  Takalar,  Sulawesi  Selatan.
Internal Report, PTP XIV Nusantara.IV Agronomis.
Percy  RE,  K  Klimaszweska  and  DR  Cyr. 2000.  Evaluation  of  Embriogenesis Somatic  for  Clonal  Propagation  of Western  White  Pine.  NRC  Research Press. Canada.
Purnamaningsih,  R.  2006.  Induksi  Kalus  dan Optimasi  Regenerasi  Empat  Varietas Padi  Melalui  Kultur  in  Vitro.  Jurnal AgroBiogen Vol. 2 (2): 74-80.
Rina,  S.  2009.  Penggunaan  Paclobutrazol
Terhadap Pertumbuhan Minimal
Kentang  (Solanum  tuberosum  L.)
Secara In Vitro. Surabaya: Universitas Negeri Surabaya.
Rusdianto  dan  A  Indrianto.  2012.  Induksi kalus embriogenik pada wortel (Daucus  carota  L.)  menggunakan  2,4- dichlorophenoxyacetic  Acid  (2,4-D).
Jurnal Bionature.13 (2):136-140.
S.  Andaryani,  “Kajian  Penggunaan  Berbagai Konsentrasi  BAP  dan  2,4-D  terhadap Induksi  Kalus  Jarak  Pagar  (Jatropha curcas  L.)  secara  In  Vitro,”  Skripsi,
Universitas  Sebelas  Maret,  Surakarta (2010).
Santoso,  U  dan  F  Kurnia.  2003.  Kultur Jaringan Tanaman. Yogyakarta: Universitas  Muhammadiyah  Malang Press. Santoso,  U  dan  Nursandi,  F.    2001.    Kultur Jaringan Tanaman. Universitas Muhammaiyah Malang: Malang. Suprasanna  P,  RS  Choudhary,  NS  Desai  and
VA  Bapat.  2005.  Regulation  of somatic embryogenesis by plant growth  regulators  in  sugarcane.  Sugar Tech 7(4):123-128.
Williams EG and Maheswaran. 1986. Somatic embryogenesis:  factors  influencing coordinated  behavior  of  cells  as  an embryogenic  group.  Ann  Botany 57:443- 462.
Winata,  L.  1987.  Teknik  Kultur  Jaringan Tanaman.  Lab.  Kultur  Jaringan.  PAU Bioteknologi  Institut  Pertanian  Bogor (IPB). Bogor.
Yelnititis.  2012 , Pembentukan  Kalus  Remah dari Eksplan Daun Ramin ( Gonystylus bancanus (Miq)  Kurz.). J.  Pemuliaan
Tanaman Hutan. 6(3): 181-194.