UJI AKTIVITAS ENZIM PROTEASE DARI ISOLAT Bacillus sp. ENDOFIT TANAMAN KELAPA SAWIT ( Elaeis quinensis )

## Atika Marnolia, Yuli Haryani, Fifi Puspita
Mahasiswa Program S1 Kimia FMIPA-Universitas Riau Dosen Jurusan Kimia FMIPA-Universitas Riau Dosen Jurusan Agroteknologi FAPERTA-Universitas Riau Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia E-mail: atikamarnolia@gmail.com

## ABSTRACT
Proteolytic bacteria are able to hydrolyze proteins into amino acid and smaller peptides. The objective of this study to determine the abilty of three Bacillus sp. isolated from leaf (BD), root (BA), and stem (BP) of palm oil to produce protease.  The  proteolytic  activity  was  determine  based  on  the  amount  of  tyrosin  liberated  in  Unit/mL,  while  the specific activity was indicated by activity per unit weight of proteins. Protein concentration of enzymes extracts was determined by Lowry method. The results showed that all isolates were able to produce protease. Protease activity of Bacillus sp. BD, BA and BP was (711,260 ± 0,735) x 10 -3 U/mL, (708,536 ± 0,918) x 10 -3 U/mL and (710,027 ± 0,091) x 10 -3 U/mL in optimal production times of 24 hours, repectively.
Keywords: Bacillus sp, protease, protein, proteolytic bacteria.

## 1. PENDAHULUAN
Protease  merupakan  enzim  yang  berfungsi menghidrolisis ikatan peptida menjadi oligopeptida dan asam amino. Protease merupakan salah satu enzim industri yang paling penting  dan  memiliki  nilai  komersial  mencapai 60%  dari  total  penjualan  enzim  seluruh  dunia serta  merupakan  salah  satu  produk  andalan  dari enzim  termofilik  yang  banyak  dipakai  pada industri  pengolahan  makanan,  detergen  dan farmasi (Uyar et al., 2011).
Enzim  yang  digunakan  dalam  bidang industri  di  Indonesia  masih  diimpor.  Padahal Indonesia  mampu  menghasilkan  enzim  protease dengan mencari sumber-sumber mikroorganisme penghasil  enzim  tersebut.  Salah  satu  bakteri penghasil protease, khususnya protease ekstraselular  banyak  diproduksi  oleh  spesies Bacillus (Fatoni et al., 2008).
Pada  penelitian  ini,  isolat Bacillus sp.  yang digunakan  adalah  bakteri  endofit  yang  berasal dari  tanaman  kelapa  sawit.  Bakteri  endofit merupakan  bakteri  yang  dapat  perkembang  dan tumbuh  pada  jaringan  tumbuhan  tanpa  merusak inangnya  (Pujianto et  al., 2010).  Isolat  yang digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  isolat Bacillus sp.  endofit  tanaman  kelapa  sawit  yang diisolasi  dari  bagian  akar  (BA),  pelepah  (BP) dan  daun  (BD)  yang  merupakan  koleksi laboratorium Penyakit Tanaman Jurusan Agroteknologi  Fakultas  Pertanian,  Universitas Riau.

## 2. METODOLOGI PENELITIAN Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah Autoclave (All  American  Model  No. 2X),  pH  meter  210  A  orion, Waterbath thermostat  ( Shibata  Scientific  Technologamy Ltd.) Spektrofotometer UV-Vis (Thermoscientific  Genesys 10S), Vortex  mixer
(H-VM-300), Shaking incubator (Labtech Model  LSI-3016R  Serial  No.  B110221102), Microsentrifuge (Hareous  Instrument  Biofuge Pico  D-37520  Osterode),  peralatan  standar lainnya  yang  digunakan  dilaboratorium  sesuai dengan prosedur kerja.
Bahan-bahan yang digunakan adalah Nutrient  broth (Merck),  susu  skim  (Diamond), pepton,  NaCl,  agar  batang,  kasein,  L-tirosin (Merck),  kertas  saring  (Gf/C Whatman ), Whatman  syringe filters 0,45  µm, bovine  serum albumin , reagen Folin-Ciocalteau (Merck), serta bahan  kimia  lainnya  sesuai  dengan  prosedur kerja.

## Rancangan Penelitian
Isolat Bacillus sp.  Endofit  tanaman  kelapa sawit  diremajakan  terlebih  dahulu  pada  media Nutrient  Broth (NB).  Kemudian  isolat  diuji aktivitas proteolitiknya pada media selektif Skim
Milk  Agar (SMA)  dan  kemudian  diproduksi pada media cair Horikoshi.

## Inokulasi isolat pada media selektif SMA
Isolat  diuji  aktivitas  proteolitiknya  pada media  spesifik Skim  Milk  Agar  ( SMA).  Media SMA terdiri dari pepton 0,1% (w/v), NaCl 0,5% (w/v),  agar  batang  2,0%  (w/v)  dan  susu  skim 10%  (v/v)  (Chu,  2006).  Isolat  yang  sebelumnya telah  diinokulasikan  pada  media  NB  diambil sebanyak  satu  ose  dan  diinokulasikan  pada media  SMA.  Inokulum  selanjutnya  diinkubasi pada suhu 37°C selama ± 24 jam.

## Produksi enzim protease
Sebanyak  satu  ose  isolat  diinokulasikan  ke dalam  50  mL  NB  dan  diinkubasi  dalam Shaker incubator dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 37°C selama ± 24 jam. Inokulum tersebut diukur kekeruhan  sel  bakterinya  atau Optical  Density (OD) pada panjang gelombang 600nm.
Media  produksi  Horikoshi  yang  terdiri  dari glukosa  1%,  ekstrak  ragi  0,5%,  KH 2 PO 4 0,1%, MgSO 4 0,02%,  Na 2 CO 3 1%  dilarutkan  dengan 1L  akuades  lalu  diautoklaf  dan  didiamkan selama  selama  ±  24  jam  (Tari  dkk.,  2005). Inokulasi  inokulum  pada  media  NB  ke  media produksi  sebanyak  10%  dari  media  produksi Horikoshi  dalam  erlenmeyer  100mL.  Jumlah OD  untuk  setiap  inokulum  disamakan  menjadi 0.1.  Media  produksi  lalu  diinkubasi  dalam Shaker  incubator dengan  kecepatan  150  rpm pada suhu 37°C selama ± 24 jam.

## Isolasi ekstrak kasar enzim
Media kultur yang berisi enzim didinginkan pada  suhu  10 0 C  selama  kurang  lebih  1  jam. Setelah  1  jam,  enzim  protease  yang  terdapat dalam  media  produksi  dipisahkan  dari  sel isolatnya  dengan  cara  disentrifugasi  dalam keadaan  dingin  dengan  kecepatan  9500  rpm selama  10  menit.  Supernatan  disaring  dengan filter  glass  fiber (Whatman  GF/C)  dan disterilisasi  dengan Whatman  sterile  syringe filter 0,45  µm.  Jika  enzim  tidak  langsung digunakan untuk analisis aktivitas enzim, enzim ditambahkan  NaN 3 hingga  konsentrasi  larutan  1 mM ke dalam setiap larutan supernatan.

## Penentuan aktivitas enzim protease
Kasein  digunakan  sebagai  substrat  untuk menentukan  aktivitas  enzim  protease  dan sebagai  standar  digunakan  larutan  tirosin  pada berbagai  konsentrasi  (5,  10,  20,  40,  dan  50 µg/ml)  (Cupp  dan  Enyard,  2008).  Tabung  uji diisi dengan 5 mL larutan substrat kasein 0,65% yang  dilarutkan  pada  bufer  pospat  0,05  M  pH 7,5.  Tabung  uji  kemudian  diinkubasi  selama  5 menit  di  dalam waterbath dengan  suhu  37 0 C. Enzim  diencerkan  terlebih  dahulu  dengan mencampurkan  1  mL  enzim  ditambah  4  mL larutan  bufer,  selanjutnya  ditambahkan  1  mL enzim  yang  sudah  diencerkan  tadi  kedalam tabung  dan  inkubasi  dilanjutkan  selama  10 menit.
Tabung  untuk  kontrol  (dari  awal  5  menit pertama)  diisi  dengan  5  mL  larutan  substrat kasein 0,65% yang dilarutkan pada bufer pospat 0,05  M  pH  7,5  dan  diinkubasi  seperti  pada sampel  tanpa  penambahan  enzim  selama inkubasi 10 menit.
Setelah  10  menit,  ke  dalam  masing-masing tabung  ditambahkan  5  mL  reagen  trikloroasetat (TCA)  lalu larutan  dihomogenasi. Kemudian  ke dalam  tabung  kontrol  ditambahkan  larutan enzim sebanyak 1 mL. Semua tabung diinkubasi kembali  pada  suhu  37 0 C  selama  30  menit. Larutan  dalam  tabung  kontrol  dan  tabung  uji disaring  dan  diambil  filtratnya  sebanyak  2  mL. Sebanyak 5 mL Na 2 CO 3 dan 1 mL reagen Folin- Ciocalteau ditambahkan pada tabung kontrol dan tabung  uji.  Semua  tabung  diinkubasi  kembali pada  suhu  37 0 C  selama  30  menit,  kemudian diukur absorbansinya pada 660 nm. Pengukuran aktivitas  enzim  dilakukan  masing-masing  tiga kali pengulangan untuk setiap sampel. Aktivitas enzim  dihitung  dengan  menggunakan  rumus berikut:
Aktivitas Enzim =
X= enzim x volume inkubasi x waktu Mr tirosin kontrol tirosin µmol - uji tirosin µmol
= X µmol tirosin/mL menit
= X unit/mL ekstrak kasar enzim
Satu unit aktivitas enzim protease didefinisikan  sebagai  banyaknya  enzim  yang melepaskan 1 µmol tirosin permenit.
707 708 709 710 711 712 BD BA BP A k ti v it a s E n zi m ( x 1 0 -3 U /m L ) Kode Isolat
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Nilai  OD  dari  masing-masing  inokulum untuk  setiap  isolat  diukur dengan  menggunakan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  600 nm.  Inokulum  dengan  OD  yang  sama  yaitu  0,1 dimasukkan ke media produksi sehingga volume inokulum  yang  dimasukkan  ke  dalam  media produksi berbeda-beda.
Inokulum untuk masing-masing isolat dibuat agar  dapat  dihitung  jumlah  selnya  dengan  cara menentukan nilai Optical Density (OD) suspensi dalam  media  cair Nutrient  Broth .  Perbedaan nilai  OD  masing-masing  isolat  disebabkan  oleh perbedaan  jumlah  sel.  Semakin  keruh  suatu suspensi  atau  semakin  besar  nilai  OD,  maka semakin  banyak  jumlah  sel.  Berdasarkan Maniatis  dkk.  (1989),  OD 660nm denagn  nilai  2 setara  dengan  1,6  x  10 9 sel/mL  kurva  standar yang  menyatakan  hubungan  OD  dengan  jumlah sel per mL.
Inokulum  yang  telah  dimasukkan  ke  media produksi diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C  dengan  kecepatan  150  rpm  sehingga diperoleh  ekstrak  kasar  enzim.  Ekstrak  kasar enzim  inilah  yang  selanjutnya  diuji  aktivitas proteolitiknya.  Aktivitas  enzim  dinyatakan sebagai  jumlah  asam  amino  tirosin  yang dilepaskan oleh substrat kasein persatuan waktu. Aktivitas protease Bacillus sp. BD, BA, dan BP dapat dilihat pada Tabel 1.

## Tabel 1.
Nilai aktivitas rata-rata enzim protease Bacillus sp. B1D, B3A, dan B3P dengan waktu produksi 24 jam. Kode
Isolat
Aktivitas  Rata-rata  Enzim  Protease  (x 10 -3 U/mL)* BD 711,260 ± 0,735 a BA 708,536 ± 0,918 b BP 710,027 ± 0,091 ab
Catatan:*)  Nilai  aktivitas  enzim  rata-rata  dari tiga kali pengulangan. Pangkat huruf yang tidak sama menyatakan  berbeda  secara  nyata  pada  tingkat  5% (p<0.05)  pada  kolom  yang  sama  berdasarkan  uji Duncan jarak berganda.
Hasil  ANOVA  dan  uji  Duncan  jarak berganda untuk aktivitas enzim dari ketiga isolat Bacillus sp. yang dianalisis dari tanaman kelapa sawit ( Elaeis quinensis ) tertinggi dihasilkan oleh
isolat BD sebesar (711,260 ± 0,735) x 10 -3 U/mL dan  berbeda  nyata  (p<0.05)  dengan  aktivitas enzim pada dua isolat lainnya, yaitu BA sebesar (708,536  ±  0,918)  x  10 -3 U/mL  dan  BP sebesar (710,027 ± 0,091) x 10 -3 U/mL.
Gambar 1. Grafik aktivitas rata-rata enzim protease.
Media  produksi  Horikoshi  mengandung MgSO 4 .7H 2 O,  KH 2 PO 4 ,  dan  Na 2 CO 3 yang merupakan  mineral  yang  dibutuhkan  untuk produksi  enzim  protease.  Logam-logam  yang terdapat  pada  senyawa  tersebut  merupakan kofaktor  bagi  aktivitas  enzim  protease.  Fosfat dan  sulfat  berperan  dalam  pembentukan  asam amino.
Ekstrak  kasar  enzim  diperoleh  dengan  cara mensentifugasi  media  produksi  dalam  keadaan dingin  (10°C)  yang  bertujuan  agar  enzim  tidak terdenaturasi. Supernatan yang diperoleh kemudian  disaring  dengan filter  glass  fiber (Whatman  GF/C)  agar  ekstrak  kasar  enzim terpisah  dengan  substrat  yang  masih  terdapat dalam supernatant. Estrak kasar enzim kemudian disterilisasi  dengan whatman  syringe  filter selulosa asetat 0,45 µm. Sterilisasi ini bertujuan untuk  menghilangkan  bakteri  dan  endospora bakteri yang kemungkinan masih terdapat dalam ekstrak kasar enzim.
Penentuan  aktivitas  protease  dari  ekstrak kasar enzim protease dilakukan dengan menggunakan substrat kasein 0,65% dan larutan standar  tirosin.  Enzim  protease  yang  diuji  akan memecah  kasein  sehingga  menyebabkan  asam amino  tirosin  dilepas  dengan  asam  amino lainnya  dan  peptida.  Reagen  Folin  kemudian bereaksi  dengan  asam  amino  tirosin  bebas menghasilkan  kromofor  berwarna  biru.  Warna
biru  inilah  yang  dihitung  nilai  absorbansinya dengan  menggunakan  spektrofotometer  pada panjang gelombang 660 nm.
Nilai aktivitas yang diperoleh pada penelitian  ini  lebih  tinggi  dibandingkan  nilai aktivitas  enzim  protease Bacillus sp.  B2  asal tanaman  sawi  yang  memiliki  nilai  aktivitas (15,2885  ±  0,0030)  x  10 -3 U/mL  pada  media Horikoshi pada waktu produksi 24 jam (Yuniati, 2015). Hal ini dapat disebabkan oleh konsentrasi protein  yang  terdapat  dalam  tanaman  kelapa sawit lebih banyak dibandingan konsentrasi pada tanaman  sawi.  Patel  dkk.  (2004)  melaporkan aktivitas  enzim  protease Bacillus sp.  Vel memiliki  nilai  aktivitas  protease  maksimum sebesar  397  U/mL  pada  media  gelatin  cair  dan Nilegaonkar  dk.  (2006)  melaporkan  bahwa enzim  protease Bacillus  cereus MCM  B-326 yang  diisolasi  dari  kulit  kerbau  memiliki aktivitas  maksimum  sebesar  126,87  U/mL. Tingginya  aktivitas  yang  diperoleh  pada penelitian  ini  diperkirakan  disebabkan  oleh pemilihan media produksi yang sesuai.
Komposisi  media  produksi  enzim  sangat mempengaruhi  aktivitas  enzim  yang  dihasilkan. Menurut  Meryandini  dk.  (2009),  perbedaan pertumbuhan  antara  isolat  bakteri  berdasarkan atas kemampuannya dalam mendegradasi substrat dan komposisi yang ditambahkan dalam media. Menurut penelitian Banarjee dkk. (1999), penambahan  logam  Mg 2+ 1  mM  dapat menurunkan  aktivitas  enzim  protease Bacillus brevis sebesar 9 %, sedangkan Nascimento dkk.
(2004)  melaporkan  bahwa  penambahan  logam Mg 2+ juga menurunkan aktivitas enzim  protease Bacillus sp.  39%.  Pada  penelitian  ini,  nilai aktivitas  dan  aktivitas  spesifik  enzim  terbesar terdapat  pada  isolat Bacillus sp.  BD  (daun),  hal ini dapat disebabkan oleh banyaknya kandungan protein  pada  bagian  daun  tumbuhan  tanaman kelapa  sawit.  Tumbuhan  menyerap  unsur-unsur hara  dalam  tanah  melalui  akar  dan  disalurkan keseluruh  bagian  tanaman  sampai  ke  daun sehingga  tumbuhan  membentuk  protein  dan melakukan  perombakan  (proses  katabolisme) (Zulhijah, 2012).

## 4. KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa isolat Bacillus sp.  BD,  BA,  dan  BP  memiliki  nilai aktivitas  enzim  secara  berturut  adalah  (711,260 ±  0,735)  x  10 -3 U/mL,  (708,536 ±  0,918)  x  10 -3 U/mL  dan  (710,027 ±  0,091)  x  10 -3 U/mL  pada waktu produksi 24 jam.

## DAFTAR PUSTAKA
Benarjee, U.C., Sani, R.K., Azmi, W., dan Soni,
R.  1999.  Thermostable  alkaline  protease from Bacillus brevis and its characterization  as  a  laundry  detergent additive. Process  Biochemistry . 35 :  213-
219.
Chu,  W.H.  2006.  Optimization  of  Extracellular Alkaline Protease Production From Species of Bacillus. J Ind Microbiol Biotechnol . 34: 241-245.
Cupp,  C  dan  Enyard.  2008.  Sigma’s  Non- specific  Protease  Activity  Assay  –  Casein as  a  Substrate. Journal  of  Visualized Experiments . 19: 899-904.
Fatoni,  Amin.,  Zusfahair.,  dan  Lestari,  Puji. 2008.  Isolasi  dan  Karakterisasi  Protease Ekstraseluler  dari  Bakteri  dalam  Limbah Cair Tahu. Jurnal Natur Indonesia . 10 : 83- 88.
Meryandini,  A.,  Widosari,  W.,  Maranatha,  B., Sunarti, T.C., Rachmania, N., dan Satria, H. 2009. Isolat bakteri selulolitik dan karakterisasi  enzimnya. Makara  Sains . 13 : 33-38.
Nascimento, W.C.A., dan Martins, M.L.L. 2004. Production and properties of an extracellular  protease  from  thermophilic Bacillus sp. Brazillian Journal of Microbiology . 35: 91-96.
Nilegaonkar, S.S., Zambare, V.P., Kanekar, P.P.,
Dhakephalkar,  P.K.,  dan  Saranik,  S.S.
2006.
Production and partial
characterization  of  dehairing  protease  from Bacillus  cereus MCM  B-326. Bioresource Technology . 98: 1238-1245.
Patel,  R.,  Dodia,  M.,  dan  Singh,  S.P.  2004.
Extracellular  alkaline  protease  from  a newly isolated haloalkaliphilic Bacillus sp.:
production  and  optimization. Process Biochemistry . 40 : 3569-3575.
Tari,  C.,  Genckal,  H.,  dan  Tokatl,  F.  2005.
Optimization of a Growth Medium Using a Statistical  Approach  for  The  Production  of an  Alkaline  Protease  From  a  Newly Isolated Bacillus sp . L21. Process
Biochemistry . 41 : 659-665.
Uyar, Fikret., Porsuk, Ilknur., Kizil, Goksel., dan
Yilmaz, Ebru Ince. 2011. Optimal Conditions  for  Production  of  Extracellular
Protease  from  Newly  Isolated Bacillus cereus Strain  CA15. Eurasian  Journal  Of Biosciences . 5 : 1-9.
Yuniati,  Rani.  2015.  Uji  Aktivitas  Enzim Protease  dari  Isolat Bacillus sp.  Galur Lokal Riau. Skripsi . FMIPA, UR.
Pekanbaru.
Zulhijah,  S.  2012.  Protein  pada  tanaman. http://dzoelhizz.blogspot.com. Diakses
pada 1 September 2015.