## Diversitas dan Uji Potensi Bakteri Kitinolitik dari Limbah Udang
Imanda Nurul Setia 1) , Suharjono 2)
1),2) Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Brawijaya, Jalan Veteran Malang, Jawa Timur, Indonesia
Email: 1) imandanurulsetia@yahoo.com & 2) calistus@ub.ac.id

## ABSTRAK
Proses pengolahan udang dari industri akan menghasilkan limbah cair dan padat sebanyak 30 – 75 % dari berat udang. Limbah udang mengandung 20 – 60 % kitin sehingga dapat menjadi sumber bakteri kitinolitik.  Tujuan  penelitian ini adalah  untuk  mengetahui  diversitas bakteri kitinolitik dan  mengetahui potensi  bakteri  yang  memiliki  aktivitas  kitinolitik  yang  tinggi  pada  limbah  udang.  Tahapan  penelitian meliputi  isolasi  bakteri  pada  media  CCA  (Colloidal  Chitin  Agar),  penghitungan  diversitas  bakteri kitinolitik,  dan  seleksi  isolat  berdasarkan  indeks  kitinolitik.  Diversitas  bakteri  kitinolitik  dihitung menggunakan indeks diversitas Simpson. Penelitian uji potensi kitinolitik menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga kali ulangan. Data indeks kitinolitik dianalisis menggunakan analisis ragam dilanjutkan  uji  Games-Howell  (α  =  0,05).  Indeks  diversitas  limbah  padat  lebih  tinggi  (0,646)  daripada limbah cair (0,213). Dua dari 18 isolat yaitu isolat  PBK 2 (berasal dari limbah cair) dan SA 1.2 (berasal dari  limbah  padat)  memiliki  indeks  kitinolitik  tertinggi  yaitu  secara  berturut-turut  sebesar  2,069  dan 2,084.
Kata kunci : bakteri kitinolitik, limbah cair, limbah padat, kitin, udang

## ABSTRACT
Shrimp  processing  from  industrial  activity  produce  solid  waste  and  wastewater  30  –  75  %  from shrimp weight. Shrimp waste contains 20 – 60 % chitin and possible to be source of chitinolytic bacteria. The objectives of this research was to observe diversity of chitinolytic bacteria and to analyze potency of bacteria which have high activity of chitin degradation in shrimp waste. The research consist of isolation of  bacteria  using  Colloidal  Chitin  Agar  (CCA)  medium,  quantification  of  chitinolytic  bacteria  diversity, and  screening  of  bacteria  based  on  chitinolytic  index.  Diversity  of  chitinolytic  bacteria  quantified  with Simpson diversity index. Chitinase assay carried out according Complete Randomized Design with three replications. Diameter of clear zone data was analyzed using analysis of variance continued with Games- Howel test (α = 0.05). Diversity index of solid waste more higher (0.646) than wastewater (0.213). Only two of  eighteen isolates of chitinolytic bacteria (PBK 2 and SA 1.2 isolates) showed highest chitinolytic index.
Key words: chitinolytic bacteria, chitin, shrimp, waste

## PENDAHULUAN
Udang merupakan komoditas utama ekspor  perikanan  Indonesia  sehingga  banyak industri yang menyediakan produk olahan udang [1].  Umumnya  udang  diekspor  dalam  bentuk beku  tanpa  kepala  atau  tanpa  kepala  dan  kulit, sehingga dari produksi tersebut akan menghasilkan  limbah  organik  sebanyak  30  – 75%  dari  berat  udang.  Limbah  organik  tersebut dapat  berupa  limbah  padat  kulit  dan  kepala maupun  limbah  cair  sisa  proses  pengolahan udang  [2]  [3].  Pengolahan  limbah  udang  secara biologi  lebih  banyak  digunakan  pada  skala industri  karena  lebih  murah  dan  efisien.  Salah satu  contohnya  yaitu  sistem  lumpur  aktif (activated sludge) dengan memanfaatkan indigenous microorganism (mikroorganisme
yang secara alami tumbuh pada limbah tersebut) sebagai agen pendegradasinya [4].
Bakteri kitinolitik merupakan bakteri yang mampu  menghasilkan  enzim  kitinase  untuk mendegradasi  kitin  menjadi  monomer  N- asetilglukosamin  [5].  Bakteri  kitinolitik  dapat diperoleh  dari  limbah  krustasea  baik  limbah padat  maupun  cair  karena  mengandung  20  –  60 %  kitin  [6]  [7].  Berdasarkan  latar  belakang tersebut,  maka  limbah  organik  hasil  pengolahan udang  tersebut  diduga  dapat  menjadi  sumber isolat  bakteri  kitinolitik.  Oleh  karena  itu, penelitian ini dilakukan untuk memperoleh isolat bakteri  kitinolitik  unggul  dari  limbah  industri udang  untuk  dapat  meningkatkan  kemampuan degradasi limbah tersebut.

## METODE PENELITIAN
Pembuatan Koloidal Kitin . Sebanyak 20 gram kitin  dilarutkan  pada  200  ml  HCl  pekat  (37  %), distirer  selama  2  jam,  kemudian  ditambah  1  L etanol  absolut  dingin  sambil  distrirer  hingga terbentuk koloid putih kental. Selanjutnya koloid diatur  hingga  pH  7  dan  disentrifugasi.  Endapan dikeringkan  hingga  berbentuk  serbuk.  Serbuk koloidal kitin tersebut digunakan sebagai substrat media sebagai sumber karbon dan nitrogen [8].
Isolasi  Bakteri  Kitinolitik  dari  Limbah Udang.  Limbah  padat  dan  cair  diperoleh  dari industri  pengolahan  udang  PT.  Bumi  Menara Internusa. Bakteri kitinolitik diisolasi menggunakan  media  CCA  (Colloidal  Chitin Agar)  yang  terdiri  dari  (g/L):  Na 2 HPO 4 (6); KH 2 PO 4 (3);  NH 4 Cl  (1);  NaCl  (0.5);  ekstrak khamir (0,05); agar (15) dan koloidal kitin 0,5 % (b/v)  dengan  metode  spread  plate  kemudian diinkubasi  selama  48  –  72  jam  pada  30  °C. Bakteri  kitinolitik  ditandai  dengan  adanya  zona bening  di  sekitar  koloni  [5].  Isolat  yang  didapat selanjutnya  dimurnikan,  ditumbuhkan  pada media agar miring sebagai stok, dan dikarakterisasi  secara  makroskopis  melalui karakter morfologi koloni dan secara mikroskopis melalui pewarnaan Gram [9].
Penghitungan  Indeks  Diversitas.  Keragaman komunitas  bakteri  kitinolitik  ditentukan  melalui indeks  diversitas  Simpson.  Diversitas  bakteri kitinolitik  dihitung  melalui  jumlah  sel  masing- masing isolat yang didapatkan [10].
D = 1 − ( ) ( ) (1)
Keterangan : D  = Indeks Diversitas Simpson n   = Jumlah individu jenis ke-i N  = Jumlah total individu s   = Jumlah total spesies di dalam komunitas
Seleksi  Bakteri  Kitinolitik.  Seleksi  bakteri dilakukan dengan difusi cakram dengan tiga kali ulangan.  Sebanyak  satu  ose  kultur  bakteri ditumbuhkan  pada  media  cair  (1  %  koloidal kitin) dan diinkubasi selama 24 jam, 180 rpm, 30 °C. Kultur cair masing-masing isolat bakteri (10 7 sel/ml) diinokulasikan pada paper disc steril (d = 5  mm,  Whattman  No.1)  dan  diletakkan  pada permukaan  media  agar  (1  %  koloidal  kitin) menggunakan  pinset  steril  [11].  Selanjutnya diinkubasi  selama  72  jam  pada  30  °C  dan dilakukan  pengukuran  zona  bening  dan  koloni bakteri  hingga  7  hari  untuk  menghitung  indeks
kitinolitik.  Indeks  kitinolitik  diperoleh  melalui perbandingan  antara  diameter  zona  bening  yang terbentuk  dengan  diameter  koloni  [8].  Data dianalisis menggunakan analisis ragam dilanjutkan uji Games-Howell (α = 0,05).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Bakteri  Kitinolitik  Hasil  Isolasi  dari  Limbah Udang. Sebanyak 18 isolat didapatkan dari hasil isolasi  limbah  udang,  14  isolat  didapatkan  dari limbah  cair  udang  (KBA  2,  KBA  3,  KBA  5, KBA 6, KBA 6.1, KBA 7, KBA 8, KBA 9, KBK 1, KBK 2, KBK 3, KBK 4, PBK 1, PBK 2) dan 4 isolat  berasal  dari  limbah  padat  udang  (SA  1.2, SA 3.2, SK 1.1, SK 3.2). Limbah  cair mendapat perlakuan  aerasi  sehingga  dapat  mendukung pertumbuhan  bakteri  lebih  banyak.  Bakteri tersebut akan tumbuh dan bertahan hidup dengan cara  menggunakan  oksigen  untuk  memecah senyawa pada limbah [12].
Diversitas Bakteri Kitinolitik. Indeks diversitas merupakan hasil dari kombinasi antara kekayaan dan kesamaan spesies [10]. Berdasarkan Gambar 1,  limbah  padat  memiliki indeks  diversitas  lebih tinggi  daripada  limbah  cair.  Hal  ini  dikarenakan terdapat  dominasi  satu  atau  beberapa  spesies bakteri  yang  ada  pada  limbah  padat,  sedangkan pada  limbah  cair  lebih  banyak  beragam  spesies bakteri namun tidak terjadi dominasi antarspesies tersebut.

## Gambar  1.  Diversitas  bakteri  kitinolitik  pada  limbah padat dan limbah cair
Indeks  diversitas  Simpson  digunakan untuk  mengetahui kompleksitas suatu komunitas yang memiliki populasi tak terhingga. Indeks ini berkisar antara 0  – 1. Semakin mendekati angka 1  maka  komunitas  semakin  kompleks  [10]. Pertumbuhan mikroorganisme selain dipengaruhi oleh  nutrisi  juga  dipengaruhi  oleh  faktor lingkungan. Diversitas bakteri kitinolitik dipengaruhi  oleh  berbagai  faktor  seperti  faktor ligkungan.  Faktor  lingkungan  dapat  dibagi  atas
faktor  biotik  dan  faktor  abiotik  yang  ikut berperan dalam menentukan
tingkat pertumbuhan  dan  aktivitas  mikrobia  tersebut [13].
Aktivitas  Kitinolitik  berdasarkan  Indeks Kitinolitik dan Karakteristik Fenotip Bakteri. Zona  bening  yang  terbentuk  di  sekitar  koloni mengindikasikan  adanya  aktivitas  pemecahan kitin  pada  media.  Zona  bening  terbentuk  karena terjadi  pemutusan  ikatan  β-1,4  homopolimer  N- asetilglukosamin pada kitin oleh kitinase menjadi monomer  N-asetilglukosamin  (Gambar  2)  [8]. Untuk  itu,  dilakukan  seleksi  bakteri  kitinolitik untuk  mengetahui  kemampuan  bakteri  tersebut dalam  mendegradasi  kitin  berdasarkan  indeks kitinolitik.
Indeks  kitinolitik  bernilai  tinggi  apabila lebih dari dua (CZ/CS >2), sedangkan dinyatakan bernilai rendah apabila kurang dari 2 (CZ/CS  <2)  [7].  Terdapat  dua  isolat  dengan aktivitas kitinolitik tertinggi yaitu PBK 2 dan SA 1.2 dengan indeks kitinolitk secara berturut-turut sebesar  2,069  dan  2,084;  sedangkan  isolat  KBA 2  memiliki  akivitas  kitinolitik  terendah  dengan indeks kitinolitik sebesar 1,07 (Gambar 3). Isolat PBK  2  dan  SA  1.2  dapat  digunakan  sebagai kandidat  agen  pendegradasi  limbah  yang mengandung senyawa kitin.
Gambar 2.   Seleksi primer kultur cair isolat unggul (a) isolat PBK 2 (b) isolat SA 1. 2 (Keterangan = 1. Diameter koloni
2. Diameter zona bening 3. Media CCA)
Gambar  3.  Indeks  kitinolitik  masing-masing  isolat selama 7 hari inkubasi
Dua  isolat  bakteri  kitinolitik  unggul memiliki karakter koloni yang berbeda (Tabel 1), sedangkan berdasarkan pengecatan Gram diketahui  bahwa  isolat  PBK  2  berbentuk coccibacil  dan  Gram  negatif,  sedangkan  isolat SA  1.2  memiliki  sel  yang  berbentuk  batang  dan Gram positif (Gambar 4).
Tabel  1.  Karakter  morfologi  koloni  isolat  unggul bakteri kitinolitik dari limbah udang Karakter Fenotip PBK 2 SA 1.2 Bentuk koloni - Bulat + + Elevasi Koloni - Cembung + + Konfigurasi - Menyeluruh + + Tekstur - Berkontur + + Ciri Optik - Pendaflour - Iridesens + - - + Warna Koloni - Krem + + Bentuk Sel - Batang - Coccibacil - + + - Gram - Positif - Negatif - + + -
Keterangan: (+) memiliki dan (-) tidak memiliki karakter yang disebutkan
Gambar 4.Morfologi sel bakteri isolat unggul bakteri kitinolitik dengan pewarnaan Gram (a) isolat PBK 2 (b) isolat SA 1.2
Komposisi  komunitas  mikroorganisme yang  hidup  dengan  memanfaatkan  nutrisi  dari kitin akan menentukan kecepatan degradasi kitin. Bakteri Gram  positif  merupakan konsumen kitin yang  lebih  banyak  menggunakan  N-asetil glukosamin  pada  proses  anabolisme  untuk mensintesis  murein  yang  berfungsi  dalam pembentukan  dinding  sel  bakteri  tersebut, sedangkan bakteri Gram negatif lebih menggunakan  substrat  tersebut  untuk  proses katabolisme [14].

## KESIMPULAN
Indeks  diversitas  limbah  padat  lebih  tinggi (0,646)  daripada  limbah  cair  (0,213).  Dua  dari 18 isolat yaitu isolat PBK 2 (berasal dari limbah cair)  dan  SA  1.2  (berasal  dari  limbah  padat) memiliki indeks kitinolitik tertinggi yaitu secara berturut-turut sebesar 2,069 dan 2,084.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terima  kasih  disampaikan  kepada  Bapak Suharjono dan Ibu Tri Ardyati yang telah banyak membantu  dalam  proses  penyelesaian  penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1].   Irianto, H.E. 2011. Strategi Pengembangan Produk Indikasi Geografis berbasis
Komoditas  Perikanan  Budaya.  Prosiding
Forum Inovasi Teknik Akuakultur.
[2].  Sachindra,  N.M.,  N.  Bhaskar,  dan  N.S. Mahendrakar. 2005. Carotenoids in
Different  Body  Components  of  Indian Shrimps. J. Sci. Food Agr. 85:167–172.
[3].    Manjang,  Y.  1993.  Analisa  Ekstrak Berbagai  Jenis  Kulit  Udang  Terhadap Mutu Khitosan. Jurnal Penelitian
Andalas (12):138 –143.
[4].  Oktavia,  D.A.,  D.  Mangunwidjaja,  dan  S. Wibowo.  2012.  Pengolahan  Limbah  Cair
Perikanan menggunakan Konsorsium Mikroba Indigenous Proteolitik dan Lipolitik. Agrointek 6(2):65–71.
[5].  Frändberg, E. 1997. Antifungal Compounds  of  Chitinolytic  Bacteria from Grain Ecosystems. Doctor's dissertation.  ISSN  1401-6249,  ISBN  91- 576-5275-9.
[6].   Herdyastuti,  N.,  T.J.  Raharjo,  Mudasir, dan  S.  Matsjeh.  2009.  Chitinase  and Chitinolytic  Microorganism:  Isolation, Characterization,  and  Potential [Review]. Indo. J Chem. 9(1):37–47.
[7].   Haliza,  W.  dan  M.T.  Suhartono.  2012. Karakteristik Kitinase dari Mikroba. Balai Teknologi Pascapanen Pertanian. 8(1).
[8].    Faramarzi,  M.A.,  M.  Fazeli,  M.T.  Yazdi, S. Adrangi, K.J. Al-Ahmadi, N.
Tasharrofi,  dan  F.A.  Mohseni.  2009. Optimization  of  Cultural  Condition  for Production  Chitinase  by  Soil  Isolate  of
Massilia  timonae.  Biotechnol.  8(1):93  – 99.
[9].    Cappuccino, J. G. 1983. Microbiology: A Laboratory  Manual.  Addison-Wesley. USA.
[10].  Ludwiq,  J.A.,  and  J.F.  Reynolds.  1988. Statistical Ecoloqy a Primer on Methods and  Computing.  John  Wiley  &  Sons. New York.
[11].  Jiang,  L.  2009.  Comparison  of  Disk Diffusion,  Agar  Dilution,  and  Broth Microdilution for Antimicrobial Susceptibility Testing of Five Chitosans. Thesis.  Fujian  Agricultural  and  Forestry
University.
[12].  Metcalf, L., H.P. Eddy, G. Tchobanoglous, F.L. Burton, H.D. Stensel. 2003. Wastewater  Engineering:  Treatment and  Reuse.  4 th Edition.  McGraw  Hill
International Editions. New York. [13].   Subba,  R.  1994.  Mikroorganisme  tanah dan Pertumbuhan tanaman. Terjemahan. UI Press. Jakarta. [14].  Beier, S. dan S. Bertilsson. 2013. Bacterial Chitin  Degradation—Mechanisms and Ecophysiological Strategies [Review Article]. Front. Microbiol. 4(149):1–12.