AKTIVITAS HEMOLITIK TERIPANG ( Bohadschia graeffei ) DARI PANTAI MALALAYANG, SULAWESI UTARA PADA BEBERAPA SUHU DAN pH
Remy E.P. Mangindaan 1) , Fitje Losung 1)
1) Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Sam Ratulangi Jl. Kampus Unsrat, Manado 95115 email: remysang@yahoo.com ; vera.losung@yahoo.com

## ABSTRAK
Teripang ( Bohadschia graeffei ) merupakan salah satu sumber bahan hayati laut yang bermanfaat di bidang pangan maupun biomedik.  Hewan ini dilaporkan memiliki kandungan hemolisin, yaitu protein  aktif  yang  mampu  melisis  sel  darah  merah.    Pengembangan  potensi  hemolitiknya  dapat menjadikannya  sebagai  kandidat  obat  antitumor,  sitolisin  ataupun  bahan  dalam  bidang  kajian biomedik.    Namun  demikian,  hingga  saat  ini,  belum  banyak  penelitian  mengenai  hemolisin teripang  yang  berasal  dari perairan  Sulawesi  Utara.  Sampel  teripang    yang  diperoleh  diekstraksi mengikuti metode Kamiya et al . (1991) yang telah dimodifikasi.  Sampel teripang segar diblender dan  dilarutkan  dalam  larutan  Buffer  fosfat.    Setelah  diaduk,  campuran  disaring  dan  filtrat  yang diperoleh  disentrifus.    Pada  supernatan,  kemudian  dilakukan  proses salting  out dengan penambahan amonium sulfat.  Proses ini dibantu dengan penambahan aseton.  Ekstrak kasar yang diperoleh  dikeringkan  untuk  digunakan  dalam  uji  aktivitas  hemolitik        dengan  menggunakan suspensi  eritrosit  standar.  Unit  Hemolitik  (HU).  Hasil  pengujian  menampakkan  bahwa  aktivitas hemolitik teripang terjadi pada suhu dan pH  optimum berturut-turut yaitu  50  C dan 8. Nampak bahwa  suhu  optimum  cukup  tinggi  dan  tidak  terjadi  penurunan  aktivitas  yang  tajam  pada  suhu yang lebih tinggi.  Hal ini merupakan suatu hal yang unik dan masih harus diteliti lebih lanjut.
Kata kunci : aktivitas hemolitik, Bohadschia graeffei, hemolisin, pantai Malalayang
HEMOLYSIN ACTIVITY OF   SEA CUCUMBERS ( Bohadschia graffei ) FROM MALALAYANG COASTAL, NORTH SULAWESI ON DIFFERENT TEMPERATURES AND pH

## ABSTRACT
Sea cucumber ( Bohadschia graeffei ) is one of marine resource that useful in food and biomedical fields. This animal contains hemolysin; a protein is able to lysis red blood cells. Developing of its potential hemolytic activity can make this animal to be a candidate of antitumor drug, sitolisin or material  in  biomedical  researxh.    However,  until  now,  only  a  little  information  has  been  found about hemolysin from sea cucumbers from seas in North Sulawesi. Sea cucumbers samples were extracted  following  the  modified  method  of  Kamiya et  al .  (1991).  Samples  of  fresh  cucumber were blended and dissolved in phosphate buffer solution. After stirring, the mixture was filtered and  the  obtained  filtrate  was  centrifused.  Then,  supernatant  were  processed  salting  out  with adding ammonium sulfate. This process was aided by adding acetone. Crude extract obtained was dried to be used in hemolytic activity assay by using standard erythrocyte suspension. Test results showed that the hemolytic activity of sea cucumbers occured at optimum temperature and pH was respectively 50  C and 8. It appears that the optimum temperature is high enough and not sharp decline  in  activity  at  higher  temperatures.  This  is  a  unique  thing  and  needed  to  be  investigated further.
Keywords: hemolytic aktivity, Bohadschia graeffei, hemolysin, Malalayang coastal

## PENDAHULUAN
Keanekaragaman  hayati  laut  dapat dimanfaatkan  untuk  berbagai  keperluan,  di antaranya keperluan biomedik.  Perairan laut
Sulawesi  Utara  dikenal  sebagai  kawasan yang  memiliki  keanekaragaman  hayati  yang tinggi, antara lain teripang.  Tiensongrusmee & Pontjoprawiro (1988) menyatakan
perairan    Sulawesi  Utara  merupakan  salah satu  wilayah  potensial  bagi  pengembangan budidaya  teripang.  Sebagai  salah  satu invertebrata laut, teripang dilaporkan mengandung  senyawa  protein  aktif  yang mampu  melisis  sel  darah  merah  (eritrosit). Senyawa ini dikenal sebagai hemolisin, yang merupakan  salah  satu  produk  metabolit sekunder  (Russell,  1965;  Hashimoto,  1979; Shiomi et al ., 1986; Kamiya et al ., 1991). Jenis teripang tertentu dapat
mengeluarkan  serabut  getah  dari  dalam rongga  tubuhnya  yang  bersifat  toksik terhadap  ikan,  hewan  laut  lainnya  dan  pada manusia  (Hashimoto  1979).    Russell  (1965) menyatakan bahwa beberapa spesies teripang  memiliki  sejumlah  tubula  yang berwarna  putih,  merah  muda  atau  merah yang berfungsi sebagai organ-organ pertahanan  khusus,  yang  disebut  organ “cuvierian”.    Apabila  organ  ini  teriritasi, tubula-tubula akan dikeluarkan melalui anus menyerupai benang yang sangat lengket dan dapat menjerat predator yang menyerangnya. Materi  ini  merupakan  suatu  massa  protein tidak  berbentuk  dengan  sifat  pelekatan sangat kuat.  Hashimoto (1979) menyatakan bahwa toksin yang dikandung teripang pada dasarnya  adalah  saponin  triterpenoid  yang merupakan  komponen  utama  toksin  pada Echinodermata.
Tu (1988) melaporkan, selain holothurin,  jenis-jenis  toksin  lain  yang dikandung  teripang,  yaitu  bohadschiosida,
stichoposida,  thelenotosida  dan  holotoksin.
Toksin teripang bersifat ichtiotoksik,
hemolitik,  sitotoksik,  antifungi  (Hashimoto, 1979), antiviral (Wright, 1984),
antimetabolik,  neurotoksik  (Russell,  1965), dan antitumor (Florkin & Scheer, 1969). Hemolisis merupakan peristiwa luruhnya membran eritrosit yang mengakibatkan  keluarnya  isi  sel  diikuti lepasnya molekul hemoglobin yang terkandung  di  dalamnya.    Boorman et  al .
(1988)  menyatakan  bahwa  pada  peristiwa lisis  membran  eritrosit  tetap  dalam  keadaan tidak  terurai,  tetapi  pada  bagian  membran tertentu
terjadi kebocoran yang menyebabkan  keluarnya  isi  sel  karena mekanisma  komplemen  pada  gabungan antigen-antibodi. Mekanisma hemolisin melisis  sel  darah  merah  dari  beberapa bakteri    yaitu  dengan  membentuk  pori-pori pada membran sel (Chalneau et al ., 2010).
Hemolisin, sebagai senyawa penyebab hemolisis,  ditemukan  pada  beberapa  biota laut  misalnya  anemon  laut  ( Anthopleura japonica )  (Shiomi et  al .,  1986),  ular  laut ( Tugali  gigas )  dan  teripang  ( Holothuria polii )  (Kamiya et  al .,  1991),  bakteri  dan jamur  (Humm  &  Lane,  1974).  Aktivitas hemolitik dapat diukur dengan menggunakan  satuan  hemolitik  unit  (HU). Satu  hemolitik  unit  merupakan  jumlah hemolisin  yang  dapat  melisis  setengah  dari keseluruhan  jumlah  eritrosit  pada  suspensi eritrosit  standar  yang  digunakan  (Humm  & Lane, 1974).
Metabolit  sekunder  dari  invertebrata laut  dapat  diekstraksi  lanjut  untuk  dijadikan bahan  baku  obat  (Wright,  1984;  Humm  & Lane,  1974).    Demikian  pula,  hemolisin pada teripang dapat dikembangkan potensinya  sebagai  sitolisin,  kandidat  obat antitumor  ataupun  bahan  untuk  bidang kajian  biomedik.  Di  beberapa  negara  maju, jenis-jenis teripang tertentu selain dimanfaatkan  sebagai  bahan  pangan,  juga telah  dimanfaatkan  sebagai  bahan  baku dalam  industri  obat-obatan.  Namun,  di Sulawesi Utara pemanfaatan teripang belum terlalu  berkembang  dan  informasi  ilmiah mengenai  hemolisin  pada  teripang  belum tersedia.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengukur  suhu  dan  pH  optimum    bagi aktivitas  hemolitik  dari  ekstrak  hemolisin teripang ( Bohadschia graeffei ).

## METODE PENELITIAN

## a. Tempat dan Waktu Penelitian
Sampel  teripang  ( B.graeffei )  berasal dari Pantai Malalayang, Sulawesi Utara. Uji aktivitas hemolitik dilakukukan di Laboratorium  Kimia  Bahan  Hayati  Laut, Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan, Universitas  Sam  Ratulangi  –  Manado. Penelitian    dilaksanakan  pada  April  2012 hingga Juni 2012.

## b. Bahan dan Cara kerja

## Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel
B.graeffei
dilakukan di daerah subtidal Pantai Malalayang.    Sampel  yang  diperoleh  lalu dibungkus  secara  terpisah  dengan  plastik pembungkus ( cliploc ) segera setelah
pengambilan.  Sampel  kemudian  dibawa  ke laboratorium untuk diekstraksi.

## Ekstraksi Hemolisin
Ekstraksi hemolisin mengikuti metode Kamiya et  al .  (1991)  yang  dimodifikasi. Sampel  teripang  digiling  dengan blender hingga  halus  lalu  diaduk  dalam  larutan 0,06 M PB (pH 7) selama 24 jam pada suhu 5 0 C  lalu  disaring.  Selanjutnya,  filtrat disentrifus (3500 rpm; 60 min) diikuti proses salting  out dengan  50%  amonium  sulfat (NH 4 ) 2 SO 4 dalam  supernatan.    Pengendapan ekstrak    kasar  dibantu  dengan  penambahan aseton.  Ekstrak  kasar  dikeringkan  dengan vakum  evaporasi,  ditimbang  dan  disimpan dan siap digunakan saat pengujian hemolisis.

## Penyiapan Eritrosit
Darah  manusia  (golongan  O)  dari pendonor  sebanyak  100  ml,  yang  telah disimpan  di  dalam  kantung  Terumo  di lemari  es,  dimasukkan  dalam  tabung  lalu disentrifus  pada  3000  rpm  selama  3  menit.
Selanjutnya, leukosit ( buffy coat ) dan plasma darah  dikeluarkan.  Larutan  PBS  pH  7 sebanyak dua kali volume ditambahkan pada presipitat  eritrosit  kemudian  disentrifus kembali  pada  3500  rpm  selama  3  menit. Pencucian ini dilakukan tiga kali. Selanjutnya  eritrosit  disuspensikan  kembali dalam  PBS  (50  x  volume)  sehingga diperoleh suspensi eritrosit dengan kepadatan sel 2 %.
Uji  Aktivitas  Hemolitik  pada  Beberapa Suhu
Ekstrak kasar kering sebanyak 0,56 g dilarutkan  dalam  100  ml  0,06  M  PB    pada pH  7.    Lalu,  sebanyak  1  ml  larutan  ekstrak tersebut  ditambahkan  ke  dalam  7  tabung yang  masing-masing berisi 9 ml larutan PB. Tabung-tabung ini lalu diinkubasi selama 30 menit,  masing-masing  pada  suhu  25 0 C, 30 0 C,  40 0 C,  50 0 C,  60 0 C,  70 0 C,  dan  80 0 C. Setelah  diinkubasi,  tabung-tabung  tersebut dikembalikan pada suhu ruang (25 0 C)  untuk uji  aktivitas  hemolitik.    Selanjutnya,  uji aktivitas  hemolitik  dilakukan  dengan  cara menambahkan  0,1  ml  larutan  ekstrak  ke dalam 2,9 ml suspensi eritrosit 2 %.  Setelah campuran  diaduk  dengan  vorteks, campuran diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang.
Campuran  yang  telah  diinkubasi  kembali diaduk  dengan  vorteks  dan  disentrifus  pada kecepatan  3000  rpm  selama  3  menit. Pengukuran nilai absorban supernatan dilakukan pada spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.

## Uji  Aktivitas  Hemolitik  pada  Beberapa pH
Setiap  tabung  yang  telah  diisi dengan 0,9 ml PB 0,06 M pada pH 3, 4, 5, 6, 7,  8,  9  dan  10  ditambahkan  0,1  ml  larutan ekstrak  dengan  konsentrasi  56 u g/  ml. Setelah  diaduk  dengan  vorteks,  larutan ekstrak diinkubasi selama 12 jam pada suhu 5 0 C.  Larutan  ekstrak  yang  telah  diberi perlakuan  pH  ini  lalu  diuji  aktivitas hemolitiknya  seperti  pada  pengujian  untuk melihat pengaruh suhu, dengan menggunakan  suspensi  eritrosit  2  %  dalam 0,06  M  PBS  pada  pH  7. Setiap  larutan ekstrak  yang  telah  diberi  perlakuan  suhu atau  pH  diuji  aktivitas  hemolitiknya  dengan tiga kali pengulangan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi B.graeffei sebanyak  100  g berat  basah  menghasilkan  filtrat  sekitar 80  ml.    Setelah salting  out dan  pengeringan diperoleh  ekstrak  kering  hemolisin  kasar berupa  tepung  berwarna  kuning-kecoklatan sebanyak 1,17 g dengan aroma khas.

## Pengaruh Suhu
Jumlah  hemolisin  yang  menyebabkan 50% hemolisis pada eritrosit standar didapat dari  rata-rata  nilai  absorbans  sampel  dibagi dengan  nilai  absorbans  50%  hemolisis  pada kurva  standar.    Nilai  aktivitas  hemolitik, dinyatakan  dengan  Satuan  Hemolitik  unit (HU),    yang  dihasilkan  pada  beberapa  suhu dapat dilihat pada Tabel 1.
Aktivitas  hemolitik  meningkat  seiring dengan  peningkatan  suhu.    Nilai  aktivitas optimum  berada  pada  suhu  50 C  dengan nilai  aktivitas  hemolitik  yaitu  1,  37  HU. Pemanasan  hingga  50 0 C  menyebabkan protein  lain  selain  hemolisin  menjadi tidak/kurang aktif sehingga hemolisin dapat bekerja secara optimal. Namun, pemanasan  di  atas  50 0 C  menyebabkan aktivitas hemolitik menurun akibat hemolisin  tidak/kurang  aktif.    Hasil  uji
pengaruh  suhu  terhadap  aktivitas  hemolitik disajikan pada Gambar 1.
Tabel 1. Nilai Aktivitas Hemolitik B.graeffei pada  beberapa Suhu
Suhu ( C) Aktivitas Hemolitik (HU)* 25 0,98 30 0,92 40 1,24 50 1,37 60 0,99 70 0,86 80 0,66
Keterangan: * Konsentrasi ekstrak kasar 56  g/ml

## Gambar 1. Persentase aktivitas hemolitik
B.graeffei pada beberapa suhu
Martin et  al. (1985)  menyatakan bahwa  kenaikan  kecepatan  reaksi  di  bawah suhu  optimum  disebabkan  oleh  peningkatan energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi.    Apabila  suhu  tetap  ditingkatkan hingga  melampaui  suhu  optimum  maka energi kinetik molekul-molekul yang
bereaksi menjadi sedemikian besar sehingga melampaui penghalang energi untuk pemecahan  ikatan-ikatan  sekunder.  Hal  ini akan mengakibatkan protein/enzim kehilangan  struktur  sekunder  dan  tersier disertai kehilangan kemampuan
hemolitiknya.
Shiomi et  al .  (1986)  melaporkan bahwa hemolisin yang terdapat pada anemon laut  ( Anthopleura    japonica )  labil  terhadap pemanasan.    Pengujiannya  pada  beberapa suhu  (40,  60,  80  dan  100  °C)  menyebabkan aktivitas  hemolitik  anemon  laut  menurun secara  linear  terhadap  peningkatan  suhu. Penurunan  aktivitas  yang  dilaporkannya
secara  berturut-turut  sebesar  15,  90  dan 95  %,  sedangkan  suhu  100 0 C  merusakkan seluruh  aktivitasnya.    Demikian  pula, hemolisin ular laut ( Tugali gigas ) dilaporkan labil  pada  pengujian  panas  (Kamiya et  al ., 1991).
Hemolisin yang diekstraksi dari cairan coelomic teripang  ( Holothuria  polii )  terdiri dari dua jenis yaitu hemolisin yang labil dan yang  tidak  labil  terhadap  pemanasan (Kamiya et  al .,  199).  Florkin  &  Scheer
(1969)  juga  menyatakan  hal  serupa  bahwa, secara  umum,  saponin  tipe  holothurin  yang dihasilkan teripang tahan terhadap pemanasan.
Hasil  pengujian  pada  beberapa  suhu yang  diperoleh  dapat  dihubungkan  dengan suhu  optimum  yang  dibutuhkan  bagi aktivitas enzim pada sel-sel teripang.  Giese (1979) menyatakan bahwa umumnya aktivitas  enzim  sel-sel  organisme  di  daerah dingin  sangat  tinggi  bagi  enzim  bakteri termofilik pada suhu rendah, dan bagi enzim organisme  daerah  sedang  suhu  optimumnya sedang.
Teripang ( B. graeffei ) yang digunakan pada  pengujian  ini  hidup  pada  zona  fotik perairan.  Zona ini menerima banyak energi cahaya  matahari.    Jika  dihubungkan  dengan pernyataan Giese (1979) maka habitat hidup ini dapat mempengaruhi aktivitas enzim sel- selnya.  Diperkirakan,  aktivitas enzim sel-sel teripang  ini  membutuhkan  suhu  optimum sedang hingga relatif tinggi.  Hasil penelitian menunjukkan bahwa hemolisin pada teripang  ( B.graeffei )  cukup  tahan  terhadap pemanasan.

## Pengaruh pH
Hasil  pengujian  pada  beberapa  nilai  pH menampakkan  pH  8  adalah  pH  optimum bagi aktivitas hemolitik teripang (Gambar  2).  Aktivitas  hemolitik  meningkat seiring  dengan    peningkatan  pH  kemudian menurun  kembali.  Nilai  aktivitas  hemolitik pada    beberapa  pH  dapat  dilihat  pada Tabel 2.
Hasil penelitian ini lain halnya dengan jenis  hemolisin  (AJH-2)  yang  diisolasi  dari anemon  laut  ( A.japonica ).    Hemolisin  jenis ini  tidak  mengalami  perubahan  aktivitas selama  jangka  waktu  penyimpanan  1 minggu  pada  suhu  4 0 C  maupun  pada  suhu  - 20 0 C selama 6 bulan (Shiomi et al ., 1986).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 20 30 40 50 60 70 80 a k tiv ita s he m ol iti k (% )
Suhu (°C)
Tabel 2.  Nilai Aktivitas Hemolitik B.
graeffei pada beberapa pH Derajat Keasaman (pH) Aktivitas Hemolitik (HU) 3 0,14 4 0,19 5 0,18 6 0,20 7 0,27 8 0,61 9 0,29 10 0,27
Gambar 2.  Persentase aktivitas hemolitik
B. graeffei pada beberapa pH
Shiomi et  al . (1986)  memperoleh  dua jenis  hemolisin  pada  anemon  laut  tersebut.
Jenis  (AJH-2)  yang  stabil  pada  kisaran  pH yang  luas    (pH  2  -  11)  dan  jenis  (AJH-1) yang kehilangan 80%
aktivitas hemolitiknya  pada  pH  11.    Aktivitas hemolitik  yang  dihasilkan  hemolisin  ular laut ( T.gigas ) dinyatakan stabil pada kisaran pH  6  -  9,  namun  kehilangan  aktivitas hemolitiknya pada nilai pH ekstrim (Kamiya et al . 1991).
Pada  penelitian  ini  digunakan  pH yang  bervariasi  tetapi  konsentrasi  buffer (dapar) tetap.  Kecenderungan meningkatnya kemampuan  hemolitik  sesuai  peningkatan pH ini dapat dihubungkan dengan pernyataan  Martin et  al .  (1985),  jika kecepatan  reaksi  berubah  sebagai  fungsi pH pada  konsentrasi  buffer  tetap  maka  reaksi dikatakan  dikatalisis  basa  spesifik  (   pH  7) atau  asam  spesifik  (<  pH  7).  Didasarkan pada  pernyataan  tersebut  dapat  dikatakan bahwa  protein  pada  hemolisin B.  graeffei dikatalisis oleh basa spesifik.

## KESIMPULAN
Teripang  ( B.graeffei )  yang  diperoleh dari  Pantai  Malalayang,  Sulawesi  Utara memiliki aktivitas hemolitik yang tinggi dan berpotensi sebagai sumber hemolisin. Ekstrak  kasar  hemolisin  teripang B.graeffei bekerja  optimum  pada  50 0 C  dan  tahan hingga pada suhu 60 0 C. Nilai pH optimum aktivitas  hemolitik  teripang  ini  berada  pada pH 8.

## DAFTAR PUSTAKA
Boorman,  K.E.,  B.E.  Dodd    &  P.J.  Lincoln, 1988. Blood  Group  Serology ,  6 th Ed. Churchill Livingstone, New York.
Chalneau N., N. Monina, J. Shin, C. View & V.  Noireaux  .  2010. Hemolysin  pore formation into a supported
phospholipid  bilayer  using  cell-free expression . Elsevier.
Florkin,  M  &  T.  Scheer,  1969. Chemical Zoology .  Vol.  III.    Academic  Press, New York.
Giese,  A.C.  1979. Cell  Physiology .  5 th Ed. Topan Comp., Tokyo.
Hashimoto,  Y.  1979. Marine  Toxins  and Other  Bioactive  Marine  Metabolites . Jap. Sci. Soc. Press, Tokyo.
Humm,  H.J  &  C.E.  Lane.  1974. Bioactive Compounds  from  the  Sea .    Marcel Dekker, Inc., New York.
Kamiya, H., K. Muramoto & R. Goto. 1991. Naturally  Occuring  Hemolysin  in  the Marine Snail Tugali gigas. Bull. Jap. Soc. Sci. Fish . 57 (11) : p. 2109-2113.
Martin,  D.W.,  P.A.  Mayes,  D.K.  Granner, V.W. Rodwell & I.  Darmawan, 1987. Biokimia. Edisi 20.  EGC, Jakarta.
Russsell,  F.E.  1965 .    Marine  Toxins  and Venomous  and  Poisonous  Marine Animals .    Adv.  Mar.  Bio.  Vol.  3.  p. 255-384.
Shiomi,  K.,  M.  Takamiya,  H.  Yamanaka  &
T.  Kikuchi,  1986.    Physicochemical Properties  of  a  Lethal  Hemolysin Isolated
from Sea Anemon
Anthopleura japonica . Bull. Jap. Soc.
Sci. Fish . 52 (3) : p. 539-543.
0 5 10 15 20 25 30 35 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H emoli sis (% ) pH
Tiensongrusmee,  B  &  S.  Pontjoprawiro. 1988.    Budidaya  Teripang,  Potensi dan  Prospeknya .  S eafarming  Dev.
Proj. FAO/UNDP, Jakarta.
Tu, A.T. 1988. Marine Toxins and Venoms . Handbook  of  Natural  Toxins.  Vol.  3. Marcel Dekker, Inc., USA.
Wright,  J.L.C.1984. Biologically  Active Marine  Metabolites :  Some  Recent Examples.  Proc.  N.  S.  Inst.  Sci.  34:p. 131-161.