## Aktivitas Enzim Tanin Asil Hidrolase pada Kondisi Optimum Fermentasi Lactobacillus plantarum Menggunakan Tepung Ganyong (Canna edulis Kerr) Sebagai Substrat
Azor Yulianus Tefa a , Marselina Theresia Djue Tea b a Fakultas Pertanian, Universitas Timor, Kefamenanu, TTU–NTT, Indonesia, email: azor.tefa29@gmail.com
b Fakultas Pertanian, Universitas Timor, Kefamenanu, TTU–NTT, Indonesia, email: marselina.yunitea@unimor.ac.id
Article Info Abstrak Article history: Received 1 O ktober 2022 Received in revised form 3 Oktober 2022 Accepted 6 Oktober 2022 Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  aktivitas  enzim  tanin  asil  hidrolase  yang  dihasilkan  pada  kondisi  optimum  fermentasi
Lactobacillus plantarum dengan substrat tepung ganyong ( Canna edulis Kerr). Prosedur pengujian dimulai dengan produksi enzim tanin asil hidrolase, dilanjutkan dengan isolasi enzim kasar, dan diuji aktivitas tanin asil hidrolase. Variasi volume inokulum pada penelitian ini adalah 1 mL, 3 mL, dan 5 mL pada massa substrat 2 gram. Variasi pH yang digunakan untuk mengukur aktivitas enzim adalah pH 4, pH 5, pH 6, dan pH 7, dan variasi suhu yang digunakan adalah 35°C, 40°C, 45°C, dan 50°C, serta variasi waktu inkubasi adalah 12 jam, 24 jam,  36  jam,  48  jam.  Hasil  penelitian  menunjukkan  aktivitas  enzim  tanin  asil  hidrolase  tertinggi  diperoleh  pada  1.13  U/mL  pada  pH optimum 6, 0.88 U/mL pada suhu optimum 45°C, dan 0.89 U/mL pada waktu inkubasi optimum 36 jam.
DOI:
https://doi.org/10.32938/sc.v7i04.1932 Keywords:
Ganyong
Lactobacillus Plantarum Tanin Asil Hidrolase

## 1. Pendahuluan
Enzim merupakan komponen protein yang berperan sebagai biokatalisator dalam berbagai reaksi kimia dalam sistem biologi. Semua proses biologis yang berlangsung  di  dalam  sel  membutuhkan  enzim  untuk  dilakukan  dengan  cepat. Reaktan dalam reaksi yang dikatalisis enzim disebut substrat dan diubah menjadi berbagai  produk.  Enzim  memiliki  aktivitas  spesifik  yang  mengkatalisis  hanya satu reaksi ( Robinson, 2015 ). Enzim dapat diproduksi oleh mikroorganisme dan diklasifikasikan  sebagai  enzim  ekstraseluler  dan  intraseluler.  Aktivitas  enzim ekstraseluler tinggi dan stabil, sehingga lebih mudah diproduksi dan diterapkan daripada enzim intraseluler ( Li et al ., 2019 ). Aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh pH, suhu, waktu inkubasi, konsentrasi inokulum, dan konsentrasi substrat ( Battestin & Macedo, 2007 )
Enzim tanin asil hidrolase merupakan golongan enzim ekstraseluler yang dapat menghidrolisis ikatan ester senyawa tanin menjadi asam galat dan glukosa (Murugan et al ., 2007 ). Tanin merupakan senyawa polifenol yang terdapat pada beberapa  tanaman  yang  biasa  digunakan  sebagai  bahan  makanan  dan  dapat berikatan  dengan  protein  membentuk  kompleks  tidak  larut  yang  mengganggu aktivitas  enzim-enzim  pencernaan (Obreque-Slier et al .,  2010 ).  Salah  satu tanaman yang mengandung tanin adalah ganyong. Pengolahan ganyong secara mikrobial dengan cara fermentasi pada kondisi yang optimum dapat menurunkan kadar senyawa tanin pada tanaman tersebut.
Lactobacillus  plantarum merupakan  salah  satu  bakteri  yang  dapat menghasilkan enzim tanin asil hidrolase pada suhu optimum ( Aguilar-Zarate & Aguilar,  2014 ).  Menurut Curiel et al .,  (2009) ,  pH  dan  suhu  optimum  untuk produksi enzim tanin asil hidrolase pada Lactobacillus plantarum berturut-turut adalah  7,0  dan  40°C.  Sementara  itu, Matsuda et al .,  (2016) mengemukakan bahwa pH optimum enzim tanin asil hidrolase adalah 5.0 – 6.0, dan Jiménez et al .,  (2014) menyatakan  bahwa  temperatur  optimum  enzim  tanin  asil  hidrolase adalah 30°C.  Berdasarkan penjelasan  tersebut  maka  dilakukan  penelitian yang tujuannya  ialah  mengetahui  aktivitas  enzim  tanin  asil  hidrolase  pada  kondisi optimum  fermentasi Lactobacillus  plantarum menggunakan  tepung  ganyong sebagai substrat.

## 2. Metode
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium  Biokimia  Fakultas  MIPA Universitas Brawijaya pada bulan Mei – Juli 2018, dengan menggunakan tepung ganyong  sebagai  substrat  fermentasi,  MRS  Broth,  asam  tanat,  etanol  95%, larutan  buffer  sitrat,  dan  aquades.  Mikroorganisme  yang  digunakan  adalah Lactobacillus  plantarum .  Peralatan  yang  digunakan  yakni  erlenmeyer,  batang pengaduk,  inkubator  merek Haraeus  Type  B  50042 ,  pH  meter  merek inoLab WTW , autoclave merek all American Model 20X , dan spektrofotometer UV-Vis merek Thermo  Scientific  Genesys  20 .  Penelitian  ini  dilakukan  menggunakan metode eksperimen dengan 3 perlakuan (pH, temperatur, waktu inkubasi) dan 3 ulangan.

## 2.1 Produksi enzim tanin asil hidrolase
Produksi  enzim  tanin  asil  hidrolase  dilakukan  dengan  mengacu  pada  metode Arian et al .,  (2007) . Crude enzim  tanin  asil  hidrolase  diisolasi  dengan  cara mengekstrak  media  fermentasi.  Sebanyak  50  mL  aquades  yang  mengandung polisorbat  80  0,01%  ditambahkan  ke  dalam  media  fermentasi  dan  diaduk menggunakan magnetic  stirrer kemudian  dipisahkan  melalui cara  sentrifugasi. Supernatan yang dihasilkan disaring menggunakan kertas Whatman No. 1.

## 2.2 Uji aktivitas enzim tanin asil hidrolase
Pengujian  aktivitas  enzim  tanin  asil  hidrolase  dilakukan  menggunakan spektrofotometer sesuai metode Rajakumar & Nandy (1983) . Sebanyak 0.5 mL larutan  enzim  dimasukkan  ke  dalam  2  mL  asam  tanat  0.35  %  kemudian ditambahkan  ke  dalam larutan buffer  sitrat  0.05  M dengan  pH  6.  Selanjutnya, diambil sebanyak 0,1 mL larutan tersebut lalu ditambahkan 10 mL etanol 95%
dan dikocok selama 30 detik untuk menghentikan reaksi enzimatik. Campuran tersebut  kemudian  diukur  absorbansinya  pada  panjang  gelombang  310  nm. Aktivitas  enzim  ditunjukkan  dalam international  unit (IU),  dengan  satu  unit didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang  dibutuhkan  untuk  menghidrolisis  1 µmol ikatan ester permenit.
.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  dilakukan,  volume  inokulum  yang digunakan untuk memproduksi enzim tanin asil hidrolase yakni 3 mL sesuai yang ditunjukkan pada Gambar 1 di bawah ini.
Gambar 1. Pengaruh volume inokulum terhadap aktivitas enzim tanin asil hidrolase
Komposisi medium cair dan substrat dapat mempengaruhi laju produksi enzim oleh mikroorganisme ( Anto et al ., 2006 ). Volume medium cair yang tinggi dapat menyebabkan perubahan struktur substrat pada yang digunakan sehingga menurunkan  aktivitas  perpindahan  oksigen.  Demikian  juga  apabila  volume medium cair rendah dapat menyebabkan kelarutan substrat berkurang sehingga produksi enzim tidak optimal (Aida & Hanan, 2016 ). Aktivitas enzim tanin asil hidrolase optimal pada pH 6, yakni sebesar 1.13 U/mL sebagaimana ditunjukkan pada Gambar 2 .
Gambar 2. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim tanin asil hidrolase
Pada Gambar 2 di atas terlihat bahwa aktivitas enzim tanin asil hidrolase mencapai optimum  pada pH 6.  Hasil  uji beda nyata terkecil  (BNT)  (α  = 5%)
menunjukkan  aktivitas  enzim  tanin  asil  hidrolase  pada  pH  6  berbeda  nyata dengan aktivitas enzim tanin asil hidrolase pada pH 4, pH 5, dan pH 7. Penelitian terdahulu  yang  dilakukan  oleh Sharma et al .,  (1999) juga  menunjukkan  hasil yang sama dengan menggunakan Aspergillus niger untuk menghasilkan enzim tanin asil hidrolase. Aktivitas katalitik dari suatu enzim dapat dipengaruhi oleh perubahan  pH  melalui  berbagai  cara.  Sama  halnya  dengan  protein,  enzim mempunyai  gugus  yang  mudah  terionisasi  sehingga  menyebabkan  perubahan struktur  pada  gugus  tersebut.  Perubahan  struktur  ini  mengakibatkan  enzim kehilangan aktivitasnya.
Gambar 3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim tanin asil hidrolase
Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas enzim tanin asil hidrolase optimum  pada  suhu  45°C  yakni  sebesar  0.88  U/mL  seperti  yang  ditunjukkan pada Gambar 3 . Hasil uji BNT (α = 5%) menunjukkan aktivitas enzim tanin asil hidrolase  berbeda  nyata  pada  setiap  variasi  suhu  fermentasi.  Pada  penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Mahendran et al ., (2006) disebutkan bahwa enzim tanin asil hidrolase memiliki suhu optimum antara 30 – 50°C, sedangkan Sabu et al ., (2006) juga menyimpulkan bahwa suhu optimum enzim tanin asil hidrolase berada pada 30 – 40°C. Penelitian yang dilakukan oleh Ramírez-Coronel et al .,
(2003) menyebutkan  bahwa  suhu  optimum  enzim  tanin  asil  hidrolase  ada  di antara  60  –  70°C,  ini  disebabkan  oleh  perbedaan  isolat  mokroorganisme  yang digunakan  untuk  produksi  enzim  tanin  asil  hidrolase.  Setiap  mikroorganisme memiliki suhu maksimum, suhu minimum dan suhu optimum untuk metabolisme dan pertumbuhannya ( Shao et al ., 2020 ). Hal ini disebabkan karena di atas suhu maksimum atau di bawah suhu minimum, aktivitas enzim yang dihasilkan oleh suatu  organisme  akan  terhenti,  dan  pada  suhu  yang  sangat  tinggi  akan  terjadi denaturasi enzim. Waktu inkubasi memiliki peranan yang penting pada aktivitas metabolik  mikroorganisme,  pertumbuhan,  serta  biosintesis  berbagai  enzim ( Sedrah, 2020 ). Pengaruh lama waktu inkubasi saat proses fermentasi terhadap aktivitas enzin tanin asil hidrolase pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 3 di bawah ini.
Gambar 4. Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim tanin asil hydrolase
Pada Gambar  4 di  atas  terlihat  bahwa  semakin  lama  waktu  yang dibutuhkan untuk proses fermentasi, aktivitas enzim tanin asil hidrolase semakin meningkat. Hasil uji BNT (α = 5%) menunjukkan adanya pengaruh variasi waktu inkubasi  terhadap  aktivitas  enzim  tanin  asil  hidrolase.  Aktivitas  tertinggi ditunjukkan pada  saat  diinkubasi  selama  36  jam,  yakni  sebesar  0.89  U/mL,  di mana hasil ini berbeda nyata dengan perlakuan  waktu  inkubasi 12 jam dan 24 jam tetapi  tidak  berbeda  nyata  dengan  perlakuan  waktu  inkubasi  48  jam yang juga  menghasilkan  aktivitas  enzim  tanin  asil  hidrolase  sebesar  0.89  U/mL. Apabila perlakuan dengan jumlah waktu lebih sedikit tetapi memiliki pengaruh yang  sama  dengan  perlakuan  dengan  jumlah  waktu  lebih  banyak  dalam meningkatkan  aktivitas  enzim  tanin  asil  hidrolase,  maka  perlakuan  dengan jumlah  waktu  lebih  sedikit  tersebut  lebih  baik  dari  perlakuan  dengan  jumlah
waktu lebih banyak, sehingga dapat dikatakan bahwa waktu inkubasi optimum aktivitas enzim tanin asil hidrolase adalah 36 jam.

## 4. Simpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan,  dapat  disimpulkan bahwa aktivitas tertinggi enzim tanin asil hidrolase sebesar 1.13 U/mL pada pH optimum 6, 0.88 U/mL pada suhu optimum 45°C, dan 0.89 U/mL pada waktu inkubasi optimum 36 jam.

## Pustaka
Aguilar-Zarate,  P.,  &  Aguilar,  C.  N.  (2014).  Bacterial  Tannases:  Production, Properties  and  Applications. Revista  Mexicana  de  Ingenieria  Quimica ,
13 (1). www.redalyc.org/html/620/62031166005/
Aida,  M.  F.,  &  Hanan,  M.  A.  N.  (2016).  Production,  optimization  and characterization  of  extracellular  amylase  from  halophilic  Bacillus lichineformis  AH214. African  Journal  of  Biotechnology , 15 (17),  670– 683. https://doi.org/10.5897/ajb2015.15073
Anto, H., Trivedi, U., & Patel, K. (2006). Alpha amylase production by Bacillus cereus MTCC 1305 using solid-state fermentation. Food Technology and Biotechnology , 44 (2), 241–245.
Arian,  Y.,  Anwar,  S.,  & Artika,  I.  M.  (2007).  The  Production of  Tannin  Acyl Hydrolase from Aspergillus niger. Microbiology Indonesia , 1 (2), 94–97. Battestin, V., & Macedo, G. A. (2007). Effects of temperature, pH and additives on the activity of tannase produced by Paecilomyces variotii. Electronic Journal of Biotechnology , 10 (2), 191–199. https://doi.org/10.2225/vol10- issue2-fulltext-9
Curiel, J. A., Rodríguez, H., Acebrón, I., Mancheño, J. M., De Blanca Rivas, L., &  Muñoz,  R.  (2009).  Production  and  physicochemical  properties  of recombinant Lactobacillus plantarum tannase. Journal of Agricultural and Food Chemistry , 57 (14), 6224–6230. https://doi.org/10.1021/jf901045s Jiménez, N., Esteban-Torres, M., Mancheño, J. M., De las Rivas, B., & Muñoza, R. (2014). Tannin degradation by a novel tannase enzyme present in some Lactobacillus plantarum strains. Applied and Environmental Microbiology , 80 (10),  2991–2997.  https://doi.org/10.1128/AEM.00324- 14
Li, Y., Sun, L. L., Sun, Y. Y., Cha, Q. Q., Li, C. Y., Zhao, D. L., Song, X. Y., Wang, M., McMinn, A., Chen, X. L., Zhang, Y. Z., & Qin, Q. L. (2019). Extracellular  Enzyme  Activity  and  Its  Implications  for  Organic  Matter Cycling in Northern Chinese Marginal Seas. Frontiers in Microbiology , 10 (September), 1–13. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02137
Mahendran,  B.,  Raman,  N.,  &  Kim,  D.  J.  (2006).  Purification  and characterization  of  tannase  from  Paecilomyces  variotii:  Hydrolysis  of tannic  acid  using  immobilized  tannase. Applied  Microbiology  and Biotechnology , 70 (4),  444–450.  https://doi.org/10.1007/s00253-005- 0082-y
Matsuda,  M.,  Hirose,  Y.,  Kanauchi,  M.,  Hatanaka,  S.,  &  Totsuka,  A.  (2016). Purification and characteristics of tannase produced by lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum H78. Journal of the American Society of Brewing Chemists , 74 (4), 258–266. https://doi.org/10.1094/ASBCJ-2016-4298-01 Murugan, K., Saravanababu, S., & Arunachalam, M. (2007). Screening of tannin acyl  hydrolase  (E.C.3.1.1.20)  producing  tannery  effluent  fungal  isolates using simple agar plate and SmF process. Bioresource Technology , 98 (4),
946–949. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2006.04.031
Obreque-Slier, E., Lopez-Solis, R., Peña-Neira, Á., & Zamora-Marín, F. (2010).
Tannin-protein  interaction  is  more  closely  associated  with  astringency than tannin-protein precipitation: Experience with two oenological tannins and  a  gelatin. International  Journal  of  Food  Science  and  Technology , 45 (12), 2629–2636. https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2010.02437.x Rajakumar,  G.  S.,  &  Nandy,  S.  C.  (1983).  Isolation,  Purification,  and  Some
Properties  of  Penicillium  chrysogenum  Tannase. Applied  and Environmental Microbiology , 46 (2), 525–527. https://doi.org/10.1128/aem.46.2.525-527.1983 Ramírez-Coronel,  M.  A.,  Viniegra-González,  G.,  Darvill,  A.,  &  Augur,  C. (2003).  A  novel  tannase  from  Aspergillus  niger  with  β-glucosidase activity. Microbiology , 149 (10), 2941–2946. https://doi.org/10.1099/mic.0.26346-0
Robinson, P. K. (2015). Enzymes: principles and biotechnological applications.
Essays in Biochemistry , 59 , 1–41. https://doi.org/10.1042/BSE0590001 Sabu,  A.,  Augur,  C.,  Swati,  C.,  &  Pandey,  A.  (2006).  Tannase  production  by Lactobacillus  sp.  ASR-S1  under  solid-state  fermentation. Process
Biochemistry , 41 (3), 575–580. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2005.05.011
Sedrah,  Z.  (2020).  Optimization  of  Tannase  Production  By  Local  Isolate  of Aspergillus Aculeatus. Plant Archives , 20 (2), 6980–6984.
Shao, Y., Zhang, Y. H., Zhang, F., Yang, Q. M., Weng, H. F., Xiao, Q., & Xiao, A.  F.  (2020).  Thermostable  tannase  from  aspergillus  Niger  and  its application  in  the  enzymatic  extraction  of  green  tea. Molecules , 25 (4). https://doi.org/10.3390/molecules25040952
Sharma,  S.,  Bhat,  T.  K.,  &  Dawra,  R.  K.  (1999).  Isolation,  purification  and properties of tannase from Aspergillus niger van Tieghem. World Journal of Microbiology and Biotechnology , 15 (6), 673–677. https://doi.org/10.1023/A:1008939816281