Copyright © 2022 by Authors, published by Journal of Food Technology and Industry This is an open-access article distributed under the CC BY-SA 4.0 License https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

## Potensi Probiotik Bakteri Asam Laktat Asal Madu dari Tiga Jenis Lebah yang Berbeda

## [Probiotic Potential of Lactic Acid Bacteria from Honey of Three Different Type Honeybees]
Iffa Illiyya Fatma 1) , Lilis Nuraida 2,3) *, dan Didah Nur Faridah 2)
1) Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana, IPB University, Bogor, Indonesia
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB University, Bogor, Indonesia
3) South-East Asia Food & Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center, IPB University, Bogor, Indonesia
Diterima 13 Juli 2022 / Disetujui 15 Desember 2022

## ABSTRACT
Certain  strains  of  Lactic  acid  bacteria  (LAB)  especially  from  the  genus  of  Lactobacillus  and Bifidobacteria have been recognized to have health beneficial effect as probiotics. Honey has been known to  have  health  beneficial  effects  and  contains  lactic  acid  bacteria.  However,  information  pertaining  the characteristics of LAB from honey is still limited. The present research aimed to isolate LAB from different types  of  honey  and  to  evaluate  their  potency  as  probiotic.  The  LAB  were  enumerated  and  isolated  from honey produced by three different honeybees: Apis cerana, Heterotrigona itama, and Trigona laeviceps. The results  showed  the  count  of  LAB  in  three  different  honey  ranged  from  5.0x10 1 to  2.3x10 7 CFU/mL  and affected by different time of sampling. The highest of average LAB count was found in honey of Heterotrigona itama. There were 48 Gram positive catalase-negative bacterial isolates obtained from the three different honey types. Twelve isolates were selected based on their survival in bile salt. The twelve selected isolates were capable of growing in MRSB pH 2.5, and MRSB containing 0.3% bile salt. They also exhibited strong antibacterial  activity  against  pathogenic  bacteria.  Identification  based  on  16S  rRNA  revealed  that  of  the twelve  isolates,  nine  were  identified  as  Lactiplantibacillus  plantarum  and  three  others  as  Pediococcus acidilactici.  The  twelve  isolates  showed  high  survival  at  low  pH  dan  bile  salt  and  exhibited  antimicrobial activity against pathogen, hence they are considered as probiotic candidates.
Keywords : honey, lactic acid bacteria, lactobacillus, pediococcus, probiotic

## ABSTRAK
1
Strain  tertentu  BAL  terutama  dari  genus  Lactobacillus  dan  Bifidobacteria  telah  diketahui  memiliki manfaat kesehatan sebagai probiotik. Madu diketahui memiliki khasiat yang bermanfaat bagi kesehatan dan mengandung  BAL,  namun  informasi  mengenai  karakteristik  BAL dari  madu  masih  terbatas.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengisolasi  BAL  dari  jenis  madu  yang  berbeda  dan  mengevaluasi  potensinya  sebagai probiotik. BAL dihitung dan diisolasi dari madu yang dihasilkan oleh  tiga jenis lebah madu yang berbeda: Apis cerana, Heterotrigona itama, dan Trigona laeviceps . Hasil penelitian menunjukkan jumlah BAL pada tiga  madu  yang  berbeda  berkisar  antara  5,0x10 1 sampai  2,3x10 7 CFU/mL  yang  dipengaruhi  oleh  waktu pengambilan contoh yang berbeda, dengan jumlah BAL tertinggi pada madu Heterotrigona itama . Terdapat 48 isolat bakteri Gram positif katalase-negatif yang diperoleh dari tiga jenis madu yang berbeda. Dua belas isolat dipilih berdasarkan ketahanan hidup dalam garam empedu. Kedua belas isolat terpilih ditumbuhkan pada MRSB pH 2,5, dan MRSB dengan garam empedu 0,3%, serta menunjukkan aktivitas antibakteri yang kuat terhadap bakteri patogen. Identifikasi berdasarkan 16S rRNA mengungkapkan bahwa dari 12 isolat, sembilan  isolat  diidentifikasi  sebagai Lactiplantibacillus  plantarum dan  tiga  lainnya  sebagai Pediococcus acidilactici .  Kedua  belas  isolat  BAL  asal  madu  memiliki  ketahanan  yang  tinggi  terhadap  pH  rendah  dan garam  empedu  serta  mampu  menghambat  bakteri  patogen,  sehingga  kedua  belas  isolat  ini  merupakan kandidat probiotik.
Kata kunci: bakteri asam laktat, lactobacillus, madu, pediococcus, probiotik

## PENDAHULUAN
Bakteri  asam  laktat  (BAL)  adalah  sekelompok mikroorganisme  yang  menghasilkan  asam  laktat sebagai  produk  utama  dalam  metabolisme  karbo- hidrat.  Strain  tertentu  dari  BAL  terutama  dari  genus Lactobacillus dan Bifidobacteria memiliki fungsi seba- gai  probiotik,  sehingga  strain  tersebut  dapat  mem- berikan  manfaat  kesehatan  terutama  kesehatan saluran pencernaan. Probiotik merupakan mikroorga- nisme hidup yang jika dikonsumsi dalam jumlah yang memadai dapat memberikan manfaat kesehatan bagi konsumen (Hill et al., 2014).
BAL  terdapat  dalam  makanan  fermentasi  atau- pun  non-fermentasi.  Madu  dapat  mengandung  BAL dalam jumlah yang dapat mencapai 10 8 CFU/g  madu segar  (Olofsson et  al., 2016)  Pada  saluran  pencer- naan lebah madu telah dilaporkan terdapat BAL dari genus Lactobacillus dan Bifidobacterium (Olofsson et al., 2016).  BAL  dalam  madu  berasal  dari  nektar bunga  yang  merupakan  bahan  baku  pembentukan madu.  Nektar  bunga  berperan  pada  keanekaraga- man pada kualitas madu, keamanan, dan kesehatan koloni (Mattila et al., 2012).
Bakteri  menguntungkan  yang  ditemukan  ber- simbiosis  dengan  lebah  madu  dan  berada  dalam madu  di  antaranya  beberapa  jenis  bakteri  asam laktat . L. kunkeei , L. plantarum , L. apis , L. Paraplan- tarum, dan L.  helsingborgensis merupakan  mikroba utama  dari  spesies Lactobacillus yang  ditemukan pada  berbagai madu jenis Apis, bumblebees , sweat bees , dan stingless bees (Endo dan Salminen, 2013, Mudroňová et  al., 2011 , Olofsson et  al., 2014 , Parichehreh et al., 2018). Madu memiliki pH rendah yaitu antara pH 3,2 hingga 4,5 yang disebabkan oleh adanya  asam  organik  (Almasaudi,  2021),  sehingga BAL  yang  dapat  bertahan  dan  tumbuh  pada  madu memiliki potensi untuk bertahan pada saluran pencer- naan. Salah satu persyaratan sebagai bakteri probio- tik  adalah  ketahanannya  terhadap  pH  rendah  pada lambung.
Indonesia  merupakan  salah  satu  negara  peng- hasil madu dengan produksi cukup tinggi yang diha- silkan  oleh  berbagai  spesies  lebah  yang  berbeda. Setidaknya  ada  dua  jenis  lebah  potensial  penghasil madu yaitu lebah apini (lebah madu) dan meliponini (lebah  tanpa  sengat)  dari  famili Apidae (Mokaya et al., 2022).  Lima  dari  sembilan  species  lebah  madu merupakan  asli  Indonesia  yaitu Apis  andreniformis, A.  dorsata , A.  cerana , A.  koschevnikovi dan A. nigrocincta (Karyawati et  al., 2018).  Lebah  tanpa sengat yang menghasilkan madu di antaranya adalah lebah  madu Heterotrigona  itama dan Trigona laeviceps (Mokaya et  al., 2022).  Meryandini et  al. (2020) telah mengisolasi L. rhamnosus yang berpo- tensi sebagai probiotik dari Apis dorsata yang meru- pakan lebah liar di NTT. Oleh karena itu, penelitian ini menjadi  penting  dilakukan  untuk  memperoleh  infor-
masi mengenai keragaman BAL dalam madu, karena madu yang mengandung BAL akan memiliki manfaat tambahan selain dari sifat fisiko kimianya. Eksplorasi BAL yang berasal dari madu penting untuk mengeta- hui keanekaragaman mikroorganisme simbion madu utamanya dari jenis BAL dan mengetahui potensinya sebagai  probiotik.  Tujuan  dari  penelitian  ini  untuk memperoleh  informasi  jumlah  dan  keragaman  BAL pada madu dari lebah yang berbeda dan memperoleh isolat BAL asal madu yang memiliki potensi sebagai probiotik.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah madu  segar  yang  diambil  dari  sarang  madu  di  dua peternakan lebah madu di Kabupaten Bogor Provinsi Jawa  Barat  yaitu  madu Apis  cerana asal  Perum Perhutani Pusat Perlebahan Nasional (Pusbahnas) di Desa  Ciomas  Kecamatan  Tenjo,  sedangkan  madu Heterotrigona itama dan Trigona laeviceps dikumpul- kan dari peternak madu lokal di Desa Bojong Keca- matan  Kemang.  Proses  pengambilan  madu  dilaku- kan  dengan  cara  mengambil  madu  beserta  sarang lebah  atau  sisiran  madu  yang  dikumpulkan  secara acak  dari  lima  (5)  sarang lebah  yang  berbeda  pada masing-masing  spesies  lebah.  Masing-masing  sam- pel disimpan dalam kontainer pada suhu ruang sebe- lum dianalisis. Pengambilan sampel dilakukan seba- nyak 3 kali ulangan. Medium untuk isolasi dan identifi- kasi  terdiri  dari  medium  MRS  ( de  Man  Rogosa Sharpe )  Agar  dan  broth  (Oxoid,  UK),  Oxgall  (Difco, USA),  NB  ( Nutrient  Broth ),  gliserol,  aquadest,  H 2 O 2 3%,  mikroba  uji Escherichia  coli,  Salmonella Typhi- murium ,  Listeria  monocytogenes,  Bacillus  subtilis, yang  diperoleh  dari  Lab  Mikrobiologi  SEAFAST Center  IPB, dan kit Genomic DNA  Purification (Pro- mega, Amerika Serikat).

## Enumerasi, isolasi dan identifikasi awal BAL
Sebanyak  25  g  masing-masing  sampel  madu dimasukkan ke dalam 225 mL larutan garam fisiologis (NaCl 0,85%) dan dihomogenkan (Vázquez-Quiñones et  al., 2018).  Suatu  seri  pengenceran  (10 -1 -10 -6 ) dibuat  untuk  masing-masing  sampel.  Satu  mL  dari pengenceran yang sesuai dituang MRS agar (Oxoid, UK)  yang  disuplementasikan  dengan  CaCO 3 3% (Merck,  Germany).  Semua  cawan  diinkubasi  pada 35 ° C  selama  24-48  jam  (Karyawati et  al., 2018) Penghitungan dilakukan pada cawan yang berisi 25- 250  koloni  sesuai  BAM  (2001),  kultur  kemudian diisolasi  dengan  mengambil  20  koloni  dari  cawan yang bisa dihitung lalu digoreskan pada MRS agar + CaCO 3 untuk memperoleh kultur murni BAL.
Setelah  kultur  murni  diperoleh,  selanjutnya, disegarkan  untuk  pewarnaan  Gram  sesuai  dengan
prosedur baku (Varghese dan Joy, 2014) dan pengu- jian  katalase  (Varghese  dan  Joy,  2014).  Isolat  yang menunjukkan  hasil  pewarnaan  Gram  biru-ungu  dan hasil uji katalase negatif disimpan dalam MRS broth yang mengandung 30% gliserol sebagai stok kultur. Penyimpanan jangka panjang isolat terpilih dilakukan liofilisasi.

## Ketahanan terhadap garam empedu
Pengujian ketahanan isolat BAL terhadap garam empedu dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama pengujian  pertumbuhan  isolat  dilakukan  terhadap garam empedu. Isolat yang memiliki koefisien inhibisi rendah atau ketahanan tinggi, selanjutnya, dianalisis perubahan  jumlahnya  setelah  paparan  terhadap garam empedu.

## Pertumbuhan pada garam empedu
Kemampuan  isolat  untuk  tumbuh  pada  media mengandung garam empedu ditentukan berdasarkan metode  yang  dilakukan  oleh  Yazdi et  al. (2017). Setiap  isolat  diinokulasi  ke  dalam  MRS broth dan diinkubasi selama 24 jam pada 35 ° C. Isolat selanjut- nya diinokulasi (1% v/v) ke dalam 10 mL MRS broth mengandung  0,3%  (w/v)  garam  empedu  (Difco). Kultur  diinkubasi  pada  35 ° C  selama  6  jam.  Absor- bansi diukur pada 600 nm dan dibandingkan dengan kultur  yang  ditumbuhkan  dalam  MRS broth tanpa garam  empedu  serta  dihitung  koefisien  inhibisinya dengan rumus berikut:
K inh = (∆T 6 -T 0 kontrol -∆T 6 -∆T 0 perlakuan) ∆T 6 -T 0 kontrol …………(1)
Δ  =  perbedaan  absorbansi  antara  T 0 (pembacaan absorbansi  pada  jam  ke-0)  dan  T 6 (pembacaan absorbansi pada jam ke-6). Berdasarkan perhitungan koefisien inhibisi (K inh ) isolat diklasifikasikan menjadi resisten  (K inh 0),  tingkat pertumbuhan  rendah  (0,2  < K inh < 0,4), dan rentan K inh > 0,4.
Perubahan  jumlah  BAL  setelah  terpapar  garam empedu
Kultur  BAL  pada  MRSB  berumur  24  jam  diino- kulasikan  sebanyak  1%  (v/v)  ke  dalam  MRSB  yang mengandung garam Oxgall 0,3% dan diinkubasi pada suhu 35 ° C selama 6 jam. Penghitungan jumlah BAL dilakukan  pada  0  dan  6  jam  dengan  menggunakan media  MRSA  dan  diinkubasikan  pada  suhu  35 ° C selama 48 jam. Ketahanan terhadap garam empedu ditentukan  dengan  membandingkan  antara  populasi awal  (0  jam)  dan  populasi  BAL  setelah  paparan  (6 jam) (Tokatli et al., 2015).

## Ketahanan terhadap pH rendah
Isolat  yang  dapat  tumbuh  pada  MRSB  dengan garam  empedu,  diuji  ketahanannya  terhadap  pH rendah.  Sebanyak  1  mL  kultur  yang  ditumbuhkan
pada MRS selama 24 jam diinokulasikan ke dalam 9 mL  PBS  ( Phosphate  Buffer  Saline )  pH  2,5  dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 35 ° C selama 3 jam. Setelah  inkubasi,  populasi  BAL  yang  bertahan dihitung dengan cara ditumbuhkan pada media MRS agar  (Oxoid,  UK)  setelah  diencerkan  dengan  NaCl 0,85% dan diinkubasikan pada suhu 35 ° C selama 48 jam. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan secara duplo. Ketahanan terhadap pH rendah diten- tukan dengan membandingkan antara populasi awal (0 jam) dan populasi BAL setelah pemaparan terha- dap pH rendah (3 jam) (Tsai et al., 2008).
Uji  daya  hambat  isolat  BAL  terhadap  bakteri patogen uji
Inokulum disiapkan dengan menumbuhkan BAL pada  MSR  broth  selama  18  jam.  Inokulum  bakteri patogen  uji Escherichia  coli,  Salmonella Typhimu- rium ,  Listeria  monocytogenes ,  dan Bacillus  subtilis disiapkan  dengan  menumbuhkan  sebanyak  1  ose dalam 10 mL BHIB selama 18 jam pada suhu 35 ° C. Sejumlah  25  μL  kultur  dari  setiap  bakteri  patogen disebarkan  pada  cawan  berisi  25  mL  nutrient  agar. Sumur berukuran 6 mm dibuat pada agar mengguna- kan cork  borer dan  50  µL  kultur  BAL  uji  diinokulasi pada  sumur.  Cawan  diinkubasikan  selama  24  jam pada suhu 35 ° C. Penghambatan ditandai dengan ter- bentuknya  zona  bening.  Diameter  zona  pengham- batan diukur dari 3 sisi berbeda dan  nilainya dirata- ratakan.  Pengukuran  diameter  penghambatan  diha- silkan dengan  mengukur diameter setelah dikurangi diameter sumur. Daya hambat diklasifikasikan seba- gai berikut: kekuatan penghambatan lemah (0-3 mm), sedang (3-6 mm), kuat (6-9 mm), dan sangat kuat (>9 mm) (Pan et al., 2009).

## Identifikasi isolat dengan gen 16S rRNA
Ekstraksi DNA dilakukan dengan mengekstraksi DNA genom dari masing-masing  isolat BAL dengan kit ekstraksi DNA (Promega, USA). Proses ekstraksi dilakukan  dengan  mengikuti  instruksi  manual  yang tersedia. Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) mengguna- kan  primer 27F  (5’  AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’)  dan  1495R  (5’CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’) mengacu pada metode (Liu et al., 2012). Campuran reaksi  dengan  total  volume  30  µL  terdiri  atas  15  µL Go Taq® Green Master Mix 2x (Promega, USA), 0,6 µL primer 27F, 0,6 µL primer 1495R, 1,2 µL template dan  12,6  µL Nuclease  Free  Water (NFW).  Kontrol negatif dibuat dengan cara yang sama namun 1,2 µL template digantikan  dengan  1,2  µL  NFW.  Kondisi reaksi PCR yang digunakan adalah denaturasi awal 94 ° C  5  menit,  30  siklus  penempelan  primer  94 ° C  1 menit  dan  perpanjangan  pada  suhu  58 ° C  2  menit, 72 ° C 2 menit, dan tahap akhir 72 ° C 10 menit. Produk PCR kemudian diambil dan disimpan pada suhu 4 ° C untuk  selanjutnya  diperiksa  dengan  mengunakan
elektroforesis agarose dan  diamati  menggunakan sinar UV menggunakan Gel Doc (Bio-Rad, USA).
Produk PCR kemudian disekuensing di 1 st Base Laboratories , Malaysia.  Data  hasil  sekuensing  lalu dianalisis  pada  program komputer  Mega  11,0  untuk dicari  homogennya  melalui Basic  Local  Alignment Search  Tool (BLAST)  pada  pusat  data  GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).  Sebuah  pohon  filo- genetik  berdasarkan  gen  16S  rRNA  kemudian dikonstruksi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Enumerasi, Isolasi dan Identifikasi Awal BAL
BAL  dalam  madu  dari  tiga  jenis  lebah  yang berbeda bervariasi berdasarkan tiap masing-masing bulan  pengambilan  sampel  madu  menunjukkan antara  5x10 1 sampai  2,3x10 7 CFU/mL  dengan kisaran rata-rata jumlah BAL antara 2,9x10 3 sampai 8,9x10 6 CFU/mL, dengan jumlah BAL tertinggi pada madu H. itama (Tabel 1). Standar deviasi yang tinggi pada  setiap  jenis  madu  menunjukkan  jumlah  BAL pada  jenis  madu  yang  sama  dari  peternakan  yang sama  yang  diambil  dalam  waktu  yang  berbeda sangat bervariasi. Jumlah dan keragaman BAL pada madu yang berbeda dari waktu ke waktu dipengaruhi oleh  tahap  pengembangan  madu  (Martinson et  al., 2012).  Hal  lainnya  yang  dapat  mempengaruhi  ber- variasinya jumlah BAL pada madu yang sama adalah sumber asupan nektar dan polen (spesies bunga dan kandungan  nutrisi),  kesehatan  lebah  madu,  mikro- biota usus antar lebah pada koloni (ratu, pekerja, dan larva), nutrisi (Saraiva et al., 2015), kontrol kesehatan lebah madu (Guimarães-cestaro et al., 2016), lokasi di  dalam  usus  (Powell et  al., 2014),  sistem  pencer- naan  (Anderson et  al., 2013),  tahap  ontogenetik
(Hroncova et al., 2015; Ludvigsen et al., 2015). Per- bedaan jumlah BAL pada madu yang berbeda dipe- ngaruhi  juga  oleh  spesies  lebah  (Ahn et  al., 2012), keragaman genetik lebah madu (Mattila et al., 2012), namun  demikian  dalam  penelitian  ini  tidak  terdapat perbedaan  nyata  antar  jenis  spesies  lebah.  Faktor lingkungan seperti lokasi geografis (Hroncova et al., 2015;  Ludvigsen et  al., 2015),  suhu  udara,  serta  k- eberadaan  mikroorganisme  lain  dalam  nektar  yang terkumpul  (Russell  dan  McFrederick,  2021)  meme- ngaruhi  komposisi  dan  jumlah  BAL  yang  ada  pada madu. Pada penelitian ini nampaknya waktu pengam- bilan madu yang menyebabkan terjadinya perbedaan jumlah BAL walaupun pada spesies yang sama. Jum- lah  sampel  yang  diambil  pada  setiap  pengambilan cukup mewakili yaitu 5 buah sarang lebah yang berisi madu.
Sebanyak 48 BAL Gram positif katalase-negatif dengan  zona  bening  di  sekitar  koloni  pada  MRSA yang  disuplementasi  CaCO 3 berhasil  diisolasi,  yang terdiri dari, 23 isolat asal madu Apis cerana , 21 isolat asal  madu Heterotrigona  itama ,  dan  4  isolat  asal madu Trigona laeviceps (Tabel 1). Isolat BAL didomi- nasi  bentuk  batang.  Hasil  pengamatan  mikroskopik menunjukkan 18 isolat dari madu A. cerana berben- tuk batang (basil) sedangkan 5 isolat lainnya berben- tuk bulat (kokus), 16 isolat dari madu H. itama berbe- ntuk batang (basil) sedangkan 5 isolat lain berbentuk bulat (kokus), dan 2 isolat dari madu T. laeviceps ber- bentuk  batang  (basil),  sedangkan  2  isolat  lain  ber- bentuk  bulat  (kokus).  Perbedaan  jumlah  isolat  yang diperoleh antar madu disebabkan karena kemudahan tumbuh  pada  medium  sintetik  isolat  asal A.  cerana dan H. itama dibandingkan isolate asal T. laeviceps . Hal ini juga konsisten dengan jumlah BAL dari madu jenis T.  laeviceps yang  lebih  rendah  dari  madu lainnya (Tabel 1).
Tabel 1.  Total BAL pada madu dari tiga jenis lebah berbeda dan morfologi isolat yang diperoleh Table 1.  Total LAB counts in three different types of honey and morphology of the isolates
Jenis Lebah ( Types of Honeybee ) Bulan Pengambilan ( Sampling Time ) Jumlah BAL (CFU/mL) ( Total LAB (CFU/mL ) Rerata Jumlah BAL (CFU/mL) ( Mean of LAB Count (CFU/mL) ) Rerata Jumlah BAL (log CFU/mL) ( Mean of LAB Count (CFU/mL) ) Karakteristik Isolat yang Diperoleh ( Isolate Characteristics )
Gram Positif, Batang, Katalase Negatif ( Gram Positive, Bacilli, Catalase Negative ) Gram Positif, Kokus, Katalase Negatif ( Gram Positive, Cocci, Catalase Negative ) Apis cerana Mei ( May ) 1.3x10 6 4.3±7.5x10 5 4.00±1.88 18 5 Juni ( June ) 1.2x10 3 Juli ( July ) 4.7x10 2 Heterotrigona itama Mei ( May ) 5.0x10 1 8.9±1.2x10 6 5.44±2.87 16 5 Juni ( June ) 2.3x10 7 Juli ( July ) 3.7x10 6 Trigona laeviceps Mei ( May ) 1.6x10 2 2.9±3.5x10 3 3.20±0.73 2 2 Juni ( June ) 7.0x10 3 Juli ( July )
1.7x10 3
Keterangan:  Hasil  ditampilkan  dengan  ±  standar  deviasi  dari  tiga  kali  pengambilan  sampel;  Pada  setiap  pengambilan sampel, madu diambil dari 5 sarang lebah
Note:  Means ± standard  deviations  of  triplicate  sampling  are  shown;  For  each  sampling,  honey  was  taken  from  5 honeycomb

## Ketahanan BAL terhadap garam empedu
Hasil pengujian pertumbuhan BAL dalam media yang  mengandung  garam  empedu  menunjukkan  46 dari 48 isolat bakteri asam laktat asal madu memiliki kemampuan  tumbuh  dan  bertahan  pada  garam empedu  0,3%  selama  6  jam  dengan  rata-rata  ke- naikan absorbansi 0,8726 dengan rentang kenaikan absorbansi  dari  0,447-1,3950.  Isolat  Hi2b1  merupa- kan isolat dengan kenaikan absorbansi tertinggi yaitu 1,3950.  Perbedaan  ketahanan  terhadap  garam  em- pedu dapat dikarenakan galur bakteri yang berbeda. Hal  ini  diperkuat  dengan  penelitian  yang  dilakukan oleh  Nuraida et  al. (2011)  yang  menyatakan  bahwa ketahanan  BAL  terhadap  garam  empedu  bersifat strain  dependent. Ketahanan  masing-masing  galur terhadap  garam  empedu  mungkin  diinduksi  keha- diran  beberapa  protein.  Toleransi  garam  empedu pada  tiga  strain L.  plantarum berkorelasi  dengan enam  protein  (GshR1,  GshR4,  Cfa2,  Bsh1,  OpuA, dan  AtpH)  yang  mungkin  penting  terhadap  respon dan adaptasi garam empedu pada L. plantarum (Oh dan Jung, 2015).
Kemampuan mentoleransi garam empedu 0,3% merupakan  karakteristik  yang  penting  dimiliki  oleh bakteri  probiotik  yang  merupakan  prasyarat  untuk dapat  melewati  saluran  pencernaan  dan  sampai  di kolon,  sehingga  digunakan  sebagai  seleksi  awal dengan  melihat  kenaikan  absorbansi  dan  nilai  koe- fisien inhibisinya (K inh ). Isolat terpilih diseleksi dengan dengan melihat nilai absorbansi pada garam empedu 0,3%  selama  6  jam  diatas  rata-rata  dan  nilai  K inh. Berdasarkan  nilai  K inh tidak  ada  isolat  yang  rentan terhadap  garam  empedu  (nilai  K inh di  bawah  0,4) bahkan  2  isolat  menunjukkan  resisten  terhadap garam  empedu  (Tabel  2).  Sebanyak  12  isolat  yaitu isolat Ac1b9, Ac1b10, Ac2b1, Ac3b4, Ac3b5, Ac3k6,
Hi2b1,  Hi2b2,  Hi3b4,  Hi3b7,  Hi3k2,  Ti2k3  terpilih berdasarkan  dua  kriteria  tersebut  untuk  digunakan pada  pengujian  selanjutnya.  Dari  madu A.  cerana terpilih  enam  isolat,  dari  madu H.  itama sebanyak lima isolat dan dari madu T. laeviceps sebanyak satu isolat .

## Perubahan  jumlah  BAL  setelah  paparan  garam empedu
Hasil  pengujian  BAL  terhadap  garam  empedu menunjukkan  ketahanan  hidup  semua  isolat  >99%, ditandai  oleh  kemampuan  untuk  tumbuh  dan  mem- perbanyak diri dalam media yang mengandung 0,3% garam empedu. Rata-rata konsentrasi garam empe- du pada usus manusia  yaitu 0,3% (w/v)  (Guo et al., 2012).  Semakin  tinggi  persentase  ketahanan  BAL maka semakin baik karakteristiknya sebagai kandidat probiotik. Penelitian Mulaw et al. (2019) menunjukkan bahwa semua isolat BAL yang diisolasi dari makanan fermentasi tradisional Etiopia menunjukkan toleransi yang tinggi terhadap kondisi garam empedu dengan tingkat  ketahanan  hidup  berkisar  antara  91,37- 97,22%.
Penurunan  atau  kenaikan  jumlah  kedua  belas isolat  BAL  setelah  inkubasi  selama  6  jam  berkisar antara  -0,1  sampai  0,1  log  CFU/mL  dan  secara statistik  tidak  berbeda  nyata  (Tabel  3).  Hal  ini menunjukkan tidak ada perbedaan dalam ketahanan terhadap  garam  empedu  dan  semua  isolat  tahan terhadap  garam  empedu.  Hal  ini  konsisten  dengan pertumbuhan isolat BAL pada MRSB dengan garam empedu. Ketahanan BAL asal madu terhadap garam empedu telah diuji pada tiga isolat BAL asal sarang lebah madu A. dorsata , ketiga isolat tersebut mampu tumbuh  dan  bertahan  pada  kondisi  garam  empedu 0,3% selama 6 jam (Meryandini et al., 2020).
Tabel 2.  Morfologi dan nilai K inh kedua belas isolat bakteri asam laktat asal madu Table 2.  Morphology and K inh values of the twelve LAB isolates Kode Isolat ( Isolate
Code ) Asal Madu ( Honey Origin ) Morfologi ( Morphology ) Nilai K inh * K inh Value Ac1b9 Apis cerana Batang ( Bacilli ) 0.2 b Ac1b10 Apis cerana Batang ( Bacilli ) 0.1 c Ac2b1 Apis cerana Batang ( Bacilli ) 0.3 a Ac3b4 Apis cerana Batang ( Bacilli ) 0.2 b Ac3b5 Apis cerana Batang ( Bacilli ) 0.3 a Ac3k6 Apis cerana Kokus ( Cocci ) 0.0 d Hi2b1 Heterotrigona itama Batang ( Bacilli ) 0.1 c Hi2b2 Heterotrigona itama Batang ( Bacilli ) 0.2 b Hi3b4 Heterotrigona itama Batang ( Bacilli ) 0.3 a Hi3b7 Heterotrigona itama Batang ( Bacilli ) 0.2 b Hi3k2 Heterotrigona itama Kokus ( Cocci ) 0.0 d Ti2k3 Trigona laeviceps Kokus ( Cocci ) 0.2 bc
Keterangan: *Berdasarkan nilai koefisien inhibisi (K inh ) isolat diklasifikasikan menjadi resisten (K inh ≈ 0), tingkat pertumbuhan rendah  (0.2<K inh <0.4),  dan  rentan  K inh >0,4.  Nilai  pada  kolom  yang  sama  yang  diikuti  oleh  huruf superskrip yang berbeda menunjukkan berbeda nyata pada uji Duncan ( p >0,05) Note: * Based on the calculated coefficient of inhibition (C inh ) isolates were classified into (C inh ≈0), low growth (0.2<C inh <0.4), and sensitive (C inh > 0.4). Values in similar column followed by the same letters are not significantly different in Duncan’s test (p>0.05)

## Tabel 3. Ketahanan isolat BAL pada pH 2,5 selama 3 jam dan garam empedu 0,3% selama 6 jam
Table 3. Survival of LAB isolates in pH 2.5 for 3 h and in 0.3% bile salts for 6 h
Keterangan: Nilai pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf superskrip yang berbeda menunjukkan berbeda nyata pada uji Duncan ( p >0,05) Note: Values in similar column followed by the same letters are not significantly different in Duncan’s test (p>0.05)
Yao et  al. (2018)  melaporkan  bahwa  BAL mempunyai  enzim bile  salt  hydrolase (BSH)  yang mampu  mengkatalisis  dekonjugasi  (pemecahan) garam empedu dengan menghidrolisis  ikatan amida asam amino taurin atau glisin. BAL asal kefir memiliki ketahanan  yang  lebih  lemah  dari  BAL  isolat  asal madu,  dengan  penurunan  sebesar  0,69-1,59  log CFU/mL  (Yusuf et  al., 2020).  Mikroenkapsulasi dengan Cellulose  microfiber dapat  meningkatkan ketahanan  terhadap  garam  empedu  (Pato et  al., 2022).

## Ketahanan BAL terhadap pH rendah
Hasil  pengamatan  uji  ketahanan  BAL  pada  pH rendah menunjukkan kedua belas isolat BAL mampu bertahan >95%  bahkan sedikit meningkat (100,68%) pada pH 2,5 selama 3 jam (Tabel 3). Penurunan jum- lah BAL tertinggi sebesar 0,3 log CFU/mL. Walaupun secara  statistik  berbeda,  namun  penurunan  dengan kisaran  0-0,3  log  CFU/mL  menunjukkan  ketahanan yang sangat baik yang diperlukan oleh BAL sebagai kandidat  probiotik.  Tidak  ada  kecenderungan  BAL dari madu mana yang lebih tahan terhadap paparan pH  rendah.  Kemampuan  isolat  BAL  bertahan  pada pH rendah berkorelasi dengan pH madu yaitu sekitar 3,2  hingga  4,5  (Almasaudi,  2021).  Dibandingkan dengan isolat BAL asal kefir yang mengalami penu- runan sebesar 0,57  and 2,04  log CFU/mL (Yusuf et al., 2020), ketahanan BAL asal madu lebih tahan pH rendah. Ketahanan BAL terhadap pH dapat diperbaiki dengan enkapsulasi dalam cellulose microfiber (Pato et  al., 2022),  namun  BAL  asal  madu  tanpa  enkap- sulasi telah memiliki ketahanan terhadap asam yang sangat baik.
Total  penurunan  BAL  akibat  paparan  terhadap pH rendah dan garam empedu dari kedua belas isolat
BAL  kurang  dari  0,5  log  CFU/mL,  sementara  penu- runan  BAL  asal  kefir  karena  paparan  asam  dan garam empedu berkisar antara 1,69-3,28 log CFU/mL (Yusuf et  al . , 2020).  Hal  ini  mengindikasikan  kedua belas  BAL  asal  madu  ini  akan  mampu  melewati lambung dan usus halus serta mencapai kolon dalam keadaan  hidup.  Ketahanan  BAL  terhadap  paparan asam  dan  garam  empedu  diperlukan  untuk  dapat mempertahankan  viabilitas  ketika  mencapai  kolon. Dengan penurunan sebesar 0,5 log CFU/mL, jumlah BAL yang mencapai kolon di atas 8 log CFU.  Jumlah di  atas  7,0  log  CFU  yang  dapat  mencapai  kolon diperlukan untuk memberikan manfaat terapi (Pato et al . , 2022). Kedua belas isolat ini berpotensi sebagai probiotik. Namun demikian, pengujian in vitro lainnya seperti  resistensi  terhadap  antibiotik,  kemampuan menempel  pada  sel  epitel  masih  harus  dilakukan, sebelum  uji  efikasi  secara in  vivo dan  uji  klinis, sehingga  isolat  dapat  dinyatakan  sebagai  bakteri probiotik.

## Kemampuan  daya  hambat  isolat  BAL  terhadap bakteri patogen uji
Kemampuan untuk menghambat patogen berva- riasi antar isolat dan bakteri uji. Secara keseluruhan, sebanyak sembilan isolat memiliki daya hambat yang kuat  dari  madu A.  cerana dan H.  itama ,  2  isolat memiliki daya hambat sedang dan satu isolat (Ti2k3 ) yang  berasal  dari  madu T.  laeviceps memiliki  daya hambat  yang  lemah  terhadap  patogen  uji  (Tabel  4). Empat  isolat  yaitu  Ac1b9,  Ac1b10,  Ac2b1,  H2b1 memiliki  kemampuan  menghambat  kuat  sampai sangat  kuat  terhadap B.  subtilis, L.  monocytogenes dan E.  coli. Isolat  Ac1b10  dan  Ac1b9  yang  berasal dari  madu Avis  cerana secara  keseluruhan  memiliki daya hambat yang paling kuat.
Isolat BAL
( LAB Isolate ) Ketahanan BAL pada pH 2,5 ( LAB Survival at pH 2.5 ) Ketahanan BAL pada Garam Empedu ( LAB Survival in Bile Salts ) Total ∆ Jumlah Sel (log CFU/mL ) ( Total ∆ of Cell Count (log CFU/mL) ) Rata- rata ∆ (log CFU/mL) ( ∆ Mean (log CFU/mL)) Rata-rata Ketahanan Hidup (%) ( Mean of Survival (%) ) Rata- rata ∆ (log CFU/mL) ( ∆ Mean (log CFU/mL) ) Rata-rata Ketahanan Hidup (%) ( Mean of Survival (%)) Ac1b9 -0.2±0.06 a 97.26±0.70 a -0.0±0.02 a 99.53±0.25 a -0.3 a Ac1b10 0.0±0.08 c 100.27±0.87 d 0.1±0.07 a 100.92±0.81 a 0.1 c Ac2b1 -0.1±0.04 abc 98.80±0.47 abcd -0.0±0.06 a 99.64±0.75 a -0.1 abc Ac3b4 0.0±0.14 c 100.28±1.60 d 0.0±0.04 a 100.29±0.51 a 0.0 bc Ac3b5 -0.3±0.03 a 96.86±0.35 a 0.0±0.08 a 99.98±0.93 a -0.3 a Ac3k6 0.0±0.04 bc 99.54±0.46 bcd 0.1±0.06 a 101.03±0.65 a 0.1 bc Hi2b1 -0.2±0.09 ab 98.06±0.99 abc 0.0±0.06 a 100.37±0.68 a -0.1 abc Hi2b2 0.1±0.02 c 100.68±0.18 d 0.0±0.09 a 100.37±1.05 a 0.1 c Hi3b4 0.0±0.12 bc 99.65±1.44 cd 0.1±0.05 a 100.70±0.64 a 0.0 bc Hi3b7 0.0±0.05 bc 99.68±0.56 cd 0.0±0.05 a 100.12±0.55 a 0.0 bc Hi3k2 -0.1±0.11 ab 98.65±1.30 abcd 0.1±0.13 a 101.09±1.57 a 0.0 abc Ti2k3 -0.2±0.18 a 97.58±2.02 ab 0.1±0.06 a 100.59±0.68 a -0.2 ab

## Tabel 4.  Kemampuan daya hambat isolat BAL terhadap bakteri patogen uji
Table 4.  The inhibitory activity of LAB against pathogenic bacteria
Keterangan: Hasil pengukuran diameter daya hambat (setelah dikurangi diameter sumur), diklasifikasikan sebagai berikut:
1) kekuatan penghambatan lemah (0-3 mm), 2) sedang (3-6 mm), 3) kuat (6-9 mm), dan 4) sangat kuat (>9 mm); Nilai pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf superskrip yang berbeda menunjukkan berbeda nyata pada uji Duncan ( p >0,05)
Note: The results of the measurement of the inhibition diameter (after deducting the diameter of the well), were classified as follows: 1) weak inhibition (0-3 mm), 2) medium (3-6 mm), 3) strong (6-9 mm), and 4) very strong (>9 mm). Values in similar column followed by the same letters are not significantly different in Duncan’s test (p>0.05)
Kedua belas isolat hanya memiliki kemampuan yang  sedang  untuk  menghambat S. Typhimurium. Isolat  BAL  yang  berasal  dari  granula  kefir  memiliki daya  hambat  kuat  terhadap S. Typhimurium  dan E. coli (Yusuf et  al., 2020).  Diantara  bakteri  uji, penghambatan  terbesar  oleh  isolat  BAL  asal  madu ditunjukkan terhadap L. monocytogenes yang meru- pakan  bakteri  Gram  positif  seperti  halnya  bakteri asam  laktat .  Pediococcus  pentosaceus strain  2397 yang  berasal  dari  dadih  dilaporkan  memiliki  daya hambat yang kuat terhadap L. monocytogenes (Pato et al., 2021). Aktivitas antibakteri BAL terjadi melalui beberapa  mekanisme  seperti  produksi  metabolit seperti asam laktat, asam asetat, hidrogen peroksida, dan  bakteriosin  (Chen et  al., 2019),  namun  dalam penelitian ini belum diketahui antimikroba lain selain asam laktat yang diproduksi oleh kedua belas isolat. Kompetisi  terhadap  nutrisi  dalam  medium  pertum- buhan merupakan salah satu mekanisme pengham- batan  (Chen et  al., 2019).  Aktivitas  antagonis  yang ditunjukkan  oleh  spesies  BAL  juga  dapat  berbeda dipengaruhi  oleh  sumber  dari  mana  galur  tertentu diisolasi  serta  jenis  asam  organik  yang  diproduksi (Ołdak et al., 2017; Hu et al., 2019).  Secara umum, asam organik yang merupakan metabolit utama bak- teri asam laktat adalah asam laktat. Pada penelitian ini sebagian besar isolat adalah L. plantarum (Tabel 5) yang merupakan bakteri asam laktat homofermen- tatif  yang  menghasilkan  asam  laktat  sebagai  meta-
bolit utama dari fermentasi gula. Bervariasinya daya hambat  terhadap  bakteri  uji  mengindikasikan  dipro- duksinya  senyawa  antimikroba  lain  selain  asam, terutama  yang  menghambat L.  monocytogenes . Beberapa  isolate  bakteri  asam  laktat  yang  berasal dari dadih memproduksi bakterosin yang mengham- bat L. monocytogenes (Pato et al., 2020).

## Identifikasi isolat dengan 16S rRNA
Hasil  sekuensing  kedua  belas  isolat  menun- jukkan  potongan  gen  sekitar  1439  pasang  basa (Tabel  5).  Setelah  disejajarkan  ( alignment )  dan mencari  homologi  potongan  gen  tersebut  pada GenBank , diperoleh hasil yang menunjukkan seluruh isolat memiliki kesamaan urutan basa 100% dengan strain yang berada pada GenBank . Isolat yang memi- liki kesamaan  urutan  basa  ≥97%  dapat  dianggap sebagai  spesies  yang  sama  (Huang et  al., 2018). Isolat dengan kode Ac3k6, Hi3k2, dan Ti2k3 diidentifi- kasi sebagai Pediococcus acidilactici strain DHR013 yang sama dengan strain 5541 (100%),  empat isolat yaitu  Ac1b9,  Ac3b4,  Ac3b5,  dan  Hi2b1  terkait  erat dengan  strain Lacticplantibacillus  plantarum strain 7232  dan  strain  2877  dengan  kesamaan  sebesar (100%)  dan  sebanyak  lima  isolat  yaitu,  Ac1b10, Ac2b1, Hi2b2, Hi3b4, dan Hi3b7 sangat dekat hubu- ngan  kekerabatannya  dengan Lacticplantibacillus plantarum strain  3360  dan  strain  2964  dengan  nilai kesamaan sebesar (100,00%).
Isolat BAL ( LAB Isolate ) Diameter Zona Hambat (mm) ( Diameter of Inhibition Zone (mm) ) Rerata ( Mean ) Daya Hambat ( Inhibition Strength ) B. subtilis L. monocytogenes E. coli S. Typhimurium Ac1b9 7.7±0.68 g 9.4±0.12 ef 6.2±0.61 bc 5.6±0.12 de 7.2±0.1 fg Kuat ( Strong ) Ac1b10 7.8±0.65 g 9.1±0.53 e 7.6±1.36 c 5.6±0.12 de 7.5±0.3 g Kuat ( Strong ) Ac2b1 6.8±1.53 fg 8.6±0.12 d 6.1±0.51 bc 5.8±0.42 e 6.9±0.4 ef Kuat ( Strong ) Ac3b4 6.5±1.00 efg 9.7±0.20 f 5.6±0.17 bc 5.5±0.00 de 6.8±0.2 ef Kuat ( Strong ) Ac3b5 5.0±1.62 cdef 9.7±0.29 f 6.5±1.76 bc 4.5±1.00 bc 6.4±0.6 de Kuat ( Strong ) Ac3k6 2.0±0.40 ab 4.6±0.10 b 3.4±0.12 a 3.5±0.06 a 3.4±0.1 b Sedang ( Medium ) Hi2b1 6.7±1.33 fg 8.6±0.10 d 6.2±0.64 bc 3.5±0.89 a 6.3±0.4 de Kuat ( Strong ) Hi2b2 4.5±1.78 cde 8.5±0.06 d 6.2±0.61 bc 5.7±0.40 de 6.2±0.3 de Kuat ( Strong ) Hi3b4 5.8±0.58 defg 7.6±0.12 c 5.0±1.08 ab 5.6±0.12 de 6.0±0.4 d Kuat ( Strong ) Hi3b7 4.0±1.80 bcd 8.6±0.17 d 6.8±2.00 bc 4.8±0.58 cd 6.1±0.2 d Kuat ( Strong ) Hi3k2 3.3±0.17 bc 4.5±0.00 b 4.8±0.83 ab 4.6±0.12 bc 4.3±0.2 c Sedang ( Medium ) Ti2k3 1.0±0.87 a 2.8±0.35 a 3.6±0.85 a 3.8±0.58 ab 2.8±0.5 a Lemah ( Weak ) Rerata  Zona
Hambat (mm)
( Mean of  Inhibition Zone (mm) ) 5.1±2.35 7.6±2.26 5.7±1.49 4.9±0.94 5.8±1.5
MT611900.1 Lactiplantibacillus plantarum strain 2964 MT613643.1 Lactiplantibacillus plantarum strain 3360
Hi3b7 Hi3b4
Hi2b2 Ac2b1
Ac1b10 Ac1b9 Ac3b4 Ac3b5
Hi2b1 MT611839.1 Lactiplantibacillus plantarum strain 2877 MT645511.1 Lactiplantibacillus plantarum strain 7232 Ac3k6 Hi3k2 MT012259.1 Pediococcus acidilactici strain DHR013 MT463550.1 Pediococcus acidilactici strain 5541
Ti2k3 62 100
BAL yang memiliki ketahanan garam dan empe- du dari madu A. cerana dan H. itama didominasi oleh Lactiplantibacillus plantarum . Spesies ini merupakan nama spesies baru yang tadinya Lactobacillus planta- rum (Zheng et al., 2020). Spesies Lactiplantibacillus diisolasi  dari  berbagai  pangan  fermentasi  dan  juga ditemukan  pada  habitat  insekta  atau  pada  saluran pencernaan  vertebrata  (Zheng et  al . , 2020).  Keber- adaan L. plantarum pada madu juga dilaporkan oleh peneliti lainnya ( Mudroňová et al., 2011 ; Parichehreh et  al., 2018 ). Keberadaan Pediococcus  acidilactici pada  madu  belum  pernah  dilaporkan  oleh  peneliti
lainnya. BAL ini berada pada ketiga jenis madu dan tahan terhadap paparan asam dan garam empedu.

## Kekerabatan  isolat  BAL  berdasarkan  pohon filogenetik
Konstruksi  pohon  filogeni  dibentuk  dari  12  se- kuen  BAL  asal  madu  ditambah  tiga  sekuen  yang homolog  dari GeneBank, serta  satu  isolat  pemban- ding di luar grup. Gambar 1 menunjukkan rekonstruk- si pohon filogeni yang membentuk dua cabang yaitu cabang Lantiplantibacillus plantarum dan P. Acidilac- tici dengan nilai bootstrap sebesar 100% (Gambar 1).
Tabel 5.  Identitas 12 isolat asal tiga jenis madu yang berbeda berdasarkan 16S rRNA Table 5. Identity of 12 isolates from three different types honey based on 16S rRNA Kode Isolat
( Isolate Code )
Homologi dengan GenBank / Accession Number ( Homology with GenBank/Accession Number ) Pasang Basa ( Base Pairs ) Tingkat Kesamaan (%) ( Acidity (%) ) Ac1b9 Lactiplantibacillus plantarum strain 7232/MT645511.1 dan strain 2877/MT611839.1 1439 100.00 Ac1b10 Lacticplantibacillus plantarum strain 3360/MT613643.1 dan strain 2964/MT611900.1 1439 100.00 Ac2b1 Lacticplantibacillus plantarum strain 3360/MT613643.1 dan strain 2964/MT611900.1 1439 100.00 Ac3b4 Lactiplantibacillus plantarum strain 7232/MT645511.1 dan strain 2877/MT611839.1 1439 100.00 Ac3b5 Lactiplantibacillus plantarum strain 7232/MT645511.1 dan strain 2877/MT611839.1 1439 100.00 Ac3k6 Pediococcus acidilactici strain 5541/MT463550.1 dan strain DHR013/MT012259.1 1449 100.00 Hi2b1 Lactiplantibacillus plantarum strain 7232/MT645511.1 dan strain 2877/MT611839.1 1439 100.00 Hi2b2 Lacticplantibacillus plantarum strain 3360/MT613643.1 dan strain 2964/MT611900.1 1439 100.00 Hi3b4 Lacticplantibacillus plantarum strain 3360/MT613643.1 dan strain 2964/MT611900.1 1439 100.00 Hi3b7 Lacticplantibacillus plantarum strain 3360/MT613643.1 dan strain 2964/MT611900.1 1439 100.00 Hi3k2 Pediococcus acidilactici strain 5541/MT463550.1 dan strain DHR013/MT012259.1 1449 100.00 Ti2k3 Pediococcus acidilactici strain 5541/MT463550.1 dan strain DHR013/MT012259.1 1449 100.00
Gambar 1.  Pohon  filogenetik  berdasarkan  homologi  sekuen  gen  16S  rRNA  metode neighbor-joining dari 12  isolat BAL asal madu
Figure 1.   Phylogenetic tree based on the homology of 16S rRNA gene sequence by neighbor-joining method of 12 LAB isolates from honey
0.0050
J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 33(2): 189-199 Th. 2022
Nilai bootstrap pada percabangan menunjukkan persentase  nilai  akurasi  percabangan  dengan  per- hitungan sebanyak 1000 kali pengacakan (Tamura et al., 2007).  Nilai bootstrap menunjukkan  divergensi dan  pemisahan  percabangan  tersebut  akurat,  kon- sisten,  dan  tidak  akan  berubah  walaupun  dilakukan dengan  metode  rekonstruksi  lain,  percabangan  ter- sebut bersifat permanen atau signifikan (Yonatika et al., 2021).

## KESIMPULAN
Madu mengandung BAL yang bervariasi dengan jumlah antara 5,0x10 1 sampai 2,3x10 7 CFU/mL. BAL asal  madu  yang  memiliki  ketahanan  tinggi  terhadap garam  empedu  dan  pH  rendah  didominasi  oleh Lactiplantibacillus  plantarum (sembilan  isolat)  dan berasal  dari  madu A.  cerana dan H.  itama . P. acidilactici yang  memiliki  ketahanan  tinggi  terhadap garam empedu dan pH rendah terdapat pada ketiga jenis madu. Kedua belas isolat asal madu dari lebah yang berbeda berpotensi sebagai probiotik. Peneliti- an lebih lanjut diperlukan untuk menguji persyaratan lainnya  untuk  dapat  dikategorikan  sebagai  probiotik dan mengidentifikasi sifat fungsionalnya dalam men- dukung kesehatan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Direk- torat  Riset  dan  Pengabdian  Masyarakat,  Direktorat Jendral  Penguatan  Riset  dan  Pengembangan  Ke- menterian  Riset,  Teknologi,  dan  Pendidikan  Tinggi yang  telah  mendanai  penelitian  ini  dalam  skema pendanaan  penelitian  dan  pengabdian  kepada masyarakat  tahun  anggaran  2018  Pendidikan Magister  Menuju  Doktor  untuk  Sarjana  Unggul (PMDSU)  [nomor:  4427/IT3.11/PN/2018].  Ucapan terimakasih  juga  disampaikan  kepada  Sdr.  Ainis Nurlaila, SSi dan Sdr. Ariyanti yang telah membantu teknis penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahn J, Hong I, Bok J, Kim B, Song J, Weon H. 2012. Pyrosequencing  analysis  of  the  bacterial communities  in  the  guts  of  honey  bees Apis cerana and Apis mellifera in Korea. J Microbiol 50:  735-745. https://doi.org/10.1007/s12275- 012-2188-0
Almasaudi  S.  2021.  The  antibacterial  activities  of honey. Saudi J Biol Sci 28: 2188-2196. https:// doi.org/10.1016/j.sjbs.2020.10.017
Anderson  KE,  Sheehan  TH,  Mott  BM,  Maes  P,
Snyder  L,  Schwan  MR,  Walton  A,  Jones  BM, Corby-Harris V. 2013. Microbial ecology  of the hive and pollination landscape:  Bacterial asso- ciates from floral nectar, the alimentary tract and stored  food  of  honey  bees  ( Apis  mellifera ).
PLoS  One  8:  1-16. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0083125
[BAM] Bacteriological Analytical Manual. 2001. Aero- bic Plate Count. https://www.fda.gov/food/labo ratory-methods-food/bam [22 Maret 2019].
Chen  CC,  Lai  CC,  Huang  HL,  Huang  WY,  Toh  HS, Weng TC, Chuang YC, Lu YC, Tang HJ. 2019. Antimicrobial  activity  of Lactobacillus species against  carbapenem-resistant Enterobacteria- ceae . Front Microbiol 10: 1-10. https://doi.org/10. 3389/fmicb.2019.00789
Endo A, Salminen S. 2013. Honeybees and beehives are  rich  sources  for  fructophilic  lactic  acid bacteria.  Syst  Appl  Microbiol  36:  444-448. https://doi.org/10.1016/j.syapm.2013.06.002
Guimarães-cestaro L, Serrão JE, Message D. 2016. Simultaneous  detection  of Nosema spp., Ascosphaera  apis and Paenibacillus  larvae in honey bee products. J Hymenopt Res 49: 43-50. https://doi.org/10.3897/JHR.49.7061
Guo C, Zhang L, Li J, Zhang Y, Xue C, Yi H, Du M, Han  X.  2012.  Screening  of  bile  salt  hydrolase- active lactic acid bacteria for potential cholesterol-lowering  probiotic  use.  Adv  Mater Res 345: 139-146. https://doi.org/10.4028/www. scientific.net/AMR.345.139
Hill  C,  Guarner  F,  Reid  G, Gibson  GR,  Merenstein DJ, Pot  B,  Morelli  L,  Canani  RB,  Flint  HJ, Salminen  S, Calder P, Sanders ME. 2014. The international  scientific  association  for  probiotics and prebiotics consensus statement on the sco- pe and appropriate use of the term probiotic. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 11: 506-514. https:// doi.org/10.1038/nrgastro.2014.66
Hroncova Z, Havlik J, Killer J, Doskocil I, Tyl J, Kamler M.  2015.  Variation  in  honey  bee  gut  microbial diversity affected by ontogenetic stage, age, and geographic location. PLoS One 10: 1-17. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0118707
Hu CH, Ren LQ, Zhou Y, Ye BC. 2019. Characteriza- tion  of  antimicrobial  activity  of  three Lactoba- cillus  plantarum strains  isolated  from  Chinese traditional  dairy  food.  Food  Sci  Nutr  7:  1997- 2005. https://doi.org/10.1002/fsn3.1025
Huang  CH,  Li  SW,  Huang  L,  Watanabe  K.  2018. Identification and classification for the Lactoba- cillus  casei group.  Front  Microbiol  9:  1-13. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01974
Karyawati  AT,  Nuraida  L,  Lestari  Y,  Meryandini  A. 2018. Characterization of abundance and diver- sity  of  lactic  acid  bacteria  from Apis  dorsata hives  and  flowers  in  East  Nusa  Tenggara, Indonesia.  Biodiversitas  19:  845-851. https:// doi.org/10.13057/biodiv/d190319
Liu W, Bao Q, Jirimutu, Qing M, Siriguleng, Chen X, Sun  T,  Li  M,  Zhang  J,  Yu  J,  Bilige  M,  Sun  T, Zhang  H.  2012.  Isolation  and  identification  of lactic acid bacteria from Tarag in Eastern Inner Mongolia of China by 16S rRNA sequences and DGGE  analysis.  Microbiol  Res  167:  110-115. https://doi.org/10.1016/j.micres.2011.05.001
Ludvigsen  J,  Rangberg  A,  Avershina  E,  Sekelja  M, Kreibich  C,  Gro  A,  Rudi  K.  2015.  Shifts  in  the midgut/pyloric  microbiota  composition  within  a honey  bee  apiary  throughout  a  season. Microbes  Env  30:  235-244. https://doi.org/10. 1264/jsme2.ME15019
Martinson  VG,  Moy  J,  Moran  NA.  2012.  Establish- ment of characteristic gut bacteria during deve- lopment  of  the  honeybee  worker.  Appl  Envi- romental  Microbiol  78:  2830-2840. https://doi. org/10.1128/AEM.07810-11
Mattila  HR,  Rios  D,  Walker-Sperling  VE,  Roeselers G,  Newton  ILG.  2012.  Characterization  of  the active microbiotas associated  with honey  bees reveals  healthier  and  broader  communities when  colonies  are  genetically  diverse.  PLoS One  7:  e32962. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0032962
Meryandini  A,  Karyawati  AT,  Nuraida  L,  Lestari  Y.
2020.  Lactic  acid  bacteria  from Apis  dorsata hive  possessed  probiotic  and  angiotensin- converting  enzyme  inhibitor  activity.  Makara  J Sci  24:  Article  7. https://doi.org/10.7454/mss. v24i1.11728
Mudroňová  D,  Toporčák  J,  Nemcová  R,  Gancarčí ková  S,  Hajdučková  V,  Rumanovská  K.  2011. Lactobacillus sp. as a potential probiotic for the prevention  of Paenibacillus  larvae infection  in honey bees. J Apic Res 50: 323-324. https://doi. org/10.3896/IBRA.1.50.4.11
Mulaw G, Sisay T, Muleta D, Tesfaye A. 2019. In vitro evaluation  of  probiotic  properties  of  lactic  acid bacteria  isolated  from  some  traditionally  fer- mented Ethiopian food products. Int J Microbiol
2019: 7179514. https://doi.org/10.1101/574194
Nuraida L, Winarti S, Prangdimurti E. 2011. Evaluasi in  vitro terhadap  kemampuan  isolat  bakteri asam  laktat  asal  air  susu  ibu  untuk  mengasi- milasi  kolesterol  dan  mendekonjugasi  garam empedu. J Teknol Industri Pangan 22: 46-52.
Oh  YJ,  Jung  DS.  2015.  Evaluation  of  probiotic  pro- perties of Lactobacillus and Pediococcus strains isolated  from Omegisool ,  a  traditionally  fer- mented millet alcoholic beverage in Korea. Food Sci  Technol  63:  437-444. https://doi.org/10.10 16/j.lwt.2015.03.005
Ołdak  A,  Zielińska  D,  Rzepkowska  A,  Kołozyn- Krajewska D. 2017. Comparison of antibacterial activity  of Lactobacillus  plantarum strains isolated  from  two  different  kinds  of  regional cheeses from Poland: Oscypek and Korycinski cheese. Biomed Res Int 2017: 1-10. https://doi. org/10.1155/2017/6820369
Olofsson  TC,  Alsterfjord  M,  Nilson  B,  Butler  È,
Vásquez  A.  2014. Lactobacillus  apinorum sp. nov., Lactobacillus  mellifer v  sp.  nov., Lacto- bacillus  mellis sp.  nov., Lactobacillus  melli- ventris sp. nov., Lactobacillus kimbladii sp. nov., Lactobacillus  helsingborgensis sp.  nov.  and Lactobacillus  kullabergensis sp.  nov.,  isolated from the honey stomach of the honeybee Apis mellifera .  Int  J  Syst  Evol  Microbiol  64:  3109- 3119. https://doi.org/10.1099/ijs.0.059600-0
Olofsson  TC,  Butler  È,  Markowicz  P,  Lindholm  C, Larsson  L,  Vásquez  A.  2016.  Lactic  acid  bac- terial symbionts in honeybees - an unknown key to  honey’s  antimicrobial  and  therapeutic  acti- vities. Int Wound J 13: 668-679. https://doi.org/ 10.1111/iwj.12345
Pan  X,  Chen  F,  Wu  T,  Tang  H,  Zhao  Z.  2009.  The acid,  bile  tolerance,  and  antimicrobial  property of Lactobacillus  acidophilus NIT.  Food  Control 20:  598-602. https://doi.org/10.1016/j.foodcont. 2008.08.019
Pato U, Yusuf Y, Fitriani S, Jonnadi NN, Wahyuni MS, Feruni JA, Jaswir I. 2020. Inhibitory  activity  of crude  bacteriocin  produced  by  lactic  acid  bac- teria isolated from dadih against Listeria mono- cytogenes . Biodiversitas 21: 1295-1302. https: //doi.org/10.13057/biodiv/d210404
Pato U, Yusuf Y, Fitriani S, Tartila, Yeni R, Fadillah F,
Husnaini L. 2021. Optimization of the prowth of Pediococcus  pentosaceus Strain  2397  in inhibiting  pathogenic Listeria  monocytogenes . IOP  Conf.  Series:  Earth  and  Environmental Science  757:  012056. https://doi.org/10.1088/ 1755-1315/757/1/012056
Pato U, Ayu DF, Riftyan E, Restuhadi F, Pawenang WT,  Firdaus  R,  Rahma  A,  Jaswir  I.  2022. Cellulose  microfiber  encapsulated  probiotic: Viability, acid and bile tolerance during storage at  different  temperature.  Emerg  Sci  J  6:  106- 116. https://doi.org/10.28991/ESJ-2022-06-01-
08
Parichehreh  S,  Tahmasbi  G,  Sarafrazi  A,  Imani  S, Tajabadi N. 2018. Isolation and identification of Lactobacillus bacteria found in the gastrointes- tinal  tract  of  the  dwarf  honey  bee, Apis  florea Fabricius,  1973  (Hymenoptera :  Apidae). Apidologie 49: 430-438. https://doi.org/10.1007/ s13592-018-0569-z
Powell JE, Martinson VG, Urban-Mead K, Moran NA. 2014. Routes of acquisition of the gut microbiota of Apis  mellifera .  Appl  Environ  Microbiol  80: 7378-7387. https://doi.org/10.1128/AEM.0186 1-14
Russell  KA,  McFrederick  QS.  2021.  Elevated  tem- perature  may  affect  nectar  microbes,  nectar sugars,  and  bumble  bee  foraging  preference. Microb  Ecol  84:  473-482. https://doi.org/10. 1007/s00248-021-01881-x
Saraiva  MA,  Zemolin  APP,  Franco  JL,  Boldo  JT, Stefenon  VM,  Triplett  EW,  Camargo  FA  de  O, Roesch  LFW.  2015.  Relationship  between honeybee  nutrition and their microbial commu- nities. Antonie Van Leeuwenhoek 107: 921-933. https://doi.org/10.1007/s10482-015-0384-8
Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4:
Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24: 1596-1599. https://doi.org/10.1093/molbev/ms m092
Tokatli M, Gülgör G, Elmacı SB, İşleyen NA, Özçelik F. 2015. In vitro properties of potential probiotic indigenous lactic acid bacteria originating from traditional pickles. Biomed Res Int 2015: 1-8. https://doi.org/10.1155/2015/315819
Tsai  C,  Lin  P,  Hsieh  Y.  2008.  Three Lactobacillus strains from healthy infant stool inhibit enteroto- xigenic Escherichia coli grown in vitro . Anaerob 14:  61-67. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe. 2007.11.003
Varghese  N,  Joy  PP.  2014.  Manual  Microbiology. India: Karala Agricultural University.
Vázquez-Quiñones  CR,  Moreno-Terrazas  R,  Nativi dad-Bonifacio  I,  Quiñones-Ramírez  EI,  Váz quez-Salinas  C.  2018.  Microbiological  assess- ment of honey in México. Rev Argent Microbiol 50:  75-80. https://doi.org/10.1016/j.ram.2017.0 4.005
Yao L, Seaton SC, Ndousse-Fetter  S, Adhikari  AA, DiBenedetto  N,  Mina  AI,  Banks  AS,  Bry  L, Devlin  AS. 2018.  A selective gut bacterial bile salt hydrolase alters host metabolism. Elife 17: e37182. https://doi.org/10.7554/eLife.37182
Yazdi  MKS,  Davoodabadi  A,  Zarin  HRK,  Ebrahimi MT,  Dallal  MMS.  2017.  Characterisation  and probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from Iranian traditional  yogurts. J Anim Sci 16: 185-188. https://doi.org/10.1080/1828051X.201 6.1222888
Yonatika NO, Widiasih N, Hamidah M, Nurhakim MD,
Budiarto H, Bintang DMC, Sani LMI, Lestari DF, Setyaningsih  WA,  Subhan  B,  Madduppa  H . 2021.  Genetic  structure  and  phylogenetic  rela- tionships  of Phyllidiellapustulosa species  from Seribu Islands, North Sulawesi, Halmahera, and West  Papua.  IOP  Conf  Ser:  Earth  Environ Sci. 944 012028. https://doi.org/10.1088/1755- 1315/944/1/012028
Yusuf D, Nuraida L, Dewanti-Hariyadi R, Hunaefi D.
2020. In  vitro characterization  of  lactic  acid bacteria from Indonesian kefir grains as probio- tics with cholesterol-lowering effect. J Microbiol Biotechnol  30:  726-732. https://doi.org/10.401 4/jmb.1910.10028
Zheng J, Wittouck S, Salvetti E, Franz CMAP, Harris HMB, Mattarelli P, O’Toole PW, Pot B,  Vandam me  P,  Walter  J,  Watanabe  K,  Wuyts  S, Felis GE, Gänzle MG, Lebeer S. 2020. A taxonomic note on the genus Lactobacillus : Description of 23  novel  genera,  emended  description  of  the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae . Int J Syst Evol Microbiol 70: 2782-2858. https://doi. org/10.1099/ijsem.0.004107