## OPTIMASI FASE GERAK PADA ANALISIS CAMPURAN CIPROFLOXACIN HCL DAN METRONIDAZOL MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
1 Aqnes Budiarti, 2 Ibnu Gholib Gandjar
1 Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang
2 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

## ABSTRAK
Penggunaan  ciprofloxacin  (CIP)  untuk  terapi  penyakit  infeksi  saat  ini  sering dikombinasi  dengan  obat  anti  bakteri  lain  karena  keterbatasannya  melawan  bakteri anaerob,  salah  satunya  dengan  metronidazol  (MDZ).  CIP  berada  dalam  bentuk  kationik pada kondisi asam (pH kurang dari 4,68) sehingga akan berikatan dengan residu silanol yang bermuatan negatif pada pH di atas 3,0 , akibatnya dapat menyebabkan tailing . Hal ini dapat  dicegah  dengan  penambahan  reagen  pasangan  ion  yang  akan  berikatan  dengan residu  silanol.  Reagen  pasangan  ion  yang  sering  digunakan  dalam  analisis  senyawa kationik adalah amin tersier, seperti trietilamin (Anonim, 2010).
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengoptimasi  fase  gerak  pada  analisis  campuran CIP.HCl dan MDZ menggunakan KCKT dengan penambahan trietilamin sebagai reagen pasangan  ion.  Fase  diam  yang  digunakan  adalah  C 18 dan  fase  gerak  berupa  campuran dapar  fosfat  0,05  M  dan  asetonitril  dengan  perbandingan  sesuai  dengan  hasil  optimasi. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pemisahan  optimum  diperoleh  pada  fase  gerak berupa  campuran  dapar  fosfat  0,05  M  pH  3,5  dan  asetonitril  (80:  20,  v/v)  dengan kecepatan laju alir 1,2 mL/menit dan kadar trietilamin 0,05 Molar.
Kata kunci :  Optimasi fase gerak, ciprofloxacin HCl,metronidazol,Kromatografi     Cair Kinerja Tinggi

## PENDAHULUAN
CIP  merupakan  antibiotik  golongan  kuinolon  yang  paling  luas  penggunaannya dengan aktivitas melawan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Penggunaan CIP untuk terapi  penyakit  infeksi  saat  ini  sering  dikombinasi  dengan  obat  anti  bakteri  lain  karena keterbatasannya  melawan  bakteri  anaerob.  Infeksi  yang  disebabkan  oleh  campuran bakteri aerob dan anaerob misalnya pada intra abdominal membutuhkan terapi kombinasi (Hermsen dkk., 2005). Kombinasi CIP dengan metronidazol MDZ yang  merupakan anti bakteri anaerob sering digunakan secara klinik.
Vega dkk. (1999) telah melakukan validasi metode analisis kuantitatif campuran sediaan  intravena  CIP.HCl  dan  MDZ  menggunakan  kromatografi  cair  kinerja  tinggi (KCKT) fase terbalik dengan detektor UV-Vis. Fase diam yang digunakan adalah C 18 dan fase geraknya berupa campuran dapar fosfat 0,1 M pH 3,3  + 0,1 dan asetonitril (80: 20, v/v).  Metode  yang  divalidasi  dapat  memisahkan  CIP.HCl  dan  MDZ  (resolusi  atau  R  = 2,03) dengan waktu retensi masing-masing sebesar 6,54 menit dan 4,49 menit. Meskipun demikian, masih terlihat adanya tailing pada puncak kromatogram CIP.HCl.
Elkady  dan  Mahrouse  (2011)  menetapkan  kadar  CIP.HCl  dan  MDZ  dalam sediaan  tablet  Ciprodiazole  produksi  Minapharm  Pharmaceuticals  Cairo  menggunakan KCKT fase terbalik dengan detektor UV pada 280 nm. Fase diam berupa C 18 dengan fase gerak terdiri atas campuran dapar fosfat 0,05 M pH 3,0 dan asetonitril (65: 35, v/v). Pada penelitian  ini  ditambahkan  sodium  oktansulfonat  (SOS)  0,05  M  ke  dalam  fase  gerak
sebagai reagen pasangan ion untuk mencegah terjadinya tailing pada puncak CIP.HCl dan memperbaiki resolusi. Penelitian ini dapat memisahkan CIP.HCl dan MDZ secara baik (R = 6,26) dengan waktu retensi masing-masing 5,41 menit dan 3,47 menit.
CIP  berada  dalam  bentuk  kationik  pada  kondisi  asam  (pH  kurang  dari  4,68) sehingga  akan  berikatan  dengan  residu  silanol  yang  bermuatan  negatif  pada  pH  di  atas 3,0 , akibatnya  dapat  menyebabkan tailing .  Hal  ini  dapat  dicegah  dengan  penambahan reagen  pasangan  ion  yang  akan  berikatan  dengan  residu  silanol.  Reagen  pasangan  ion yang  sering  digunakan  dalam  analisis  senyawa  kationik  adalah  amin  tersier,  seperti trietilamin (Anonim, 2010).
Penggunaan  trietilamin  untuk  mengurangi tailing pada  puncak  kromatogram CIP.HCl  telah  dilakukan  oleh  beberapa  peneliti.  Sachan  dkk.  (2010)  menetapkan  kadar CIP.HCl  dan  ofloksasin  menggunakan  KCKT  fase  terbalik  dengan  fase  gerak  yang mengandung  trietilamin  1  %,  v/v.  Penambahan  zat  ini  menghasilkan  nilai  faktor tailing 1,2 pada puncak CIP.HCl. Muchohi dkk . (2011) juga menambahkan trietilamin  pada fase gerak  untuk  menetapkan  kadar  CIP.HCl  dalam  plasma  darah  menggunakan  KCKT  fase terbalik.  Nilai  faktor tailing pada  puncak  kromatogram  CIP.HCl  yang  dihasilkan  adalah 1,05.
Meskipun  demikian,  pengembangan  metode  untuk  analisis  campuran  CIP.HCl dan MDZ secara simultan menggunakan KCKT dengan penambahan trietilamin sebagai reagen pasangan ion belum pernah dilakukan. Penetapan kadar CIP.HCl dan MDZ secara simultan sangat berguna untuk pengembangan sediaan obat yang mengandung campuran kedua obat ini, mengingat di Indonesia belum ada sediaan tersebut.

## METODOLOGI

## Bahan Penelitian
Bahan  yang  digunakan  adalah  tablet  yang  mengandung  CIP.HCl  500  mg  dan MDZ  500  mg,  baku  pembanding  Ciprofloxacin  HCl  anhidrat  (Zhejiang  Guobang Pharmaceutical Co., LTD, China), baku pembanding Metronidazole EP 5 (Wuhan Wuyao Pharmaceutical  Co.,  LTD,  China),  trietilamin  (Merck).  Pereaksi  derajat  pro  analisis (Merck)  diantaranya:  natrium  dihidrogen  fosfat,  asam  fosfat  dan  metanol.  Pelarut asetonitril derajat KCKT (Merck) dan air suling (PT. Otsuka Indonesia).

## Alat Penelitian
Peralatan  yang  digunakan  adalah  seperangkat  KCKT  (Knauer)  yang  dilengkapi dengan detektor UV Spectra System (UV-6000 LP), Chromgate 3.1.4 software , Rheodyne Loop Injector 20 μL, Kolom KCKT: C 18 (Waters) (150 x 3,9 mm, 5 μm) dan C 8 (Nova- Pak) (150 x 4,6 mm, 10 μm), penyaring membran 0,45 μm, penyaring membrane 0,2 μm (GVS),  kertas  saring  (Whatman  No.  41),  Spektrofotometer  UV-Vis  (Shimadzu  UV- 1700),  pH  meter  (Hanna  pH  21I),  pompa  vakum,  penangas  ultrasonik  (Branson  1510), timbangan analitik (Mettler Toledo AB 204-5, kepekaan 0,1mg), pipet mikro ukuran 50 – 200  μL  (Gilson)  dan  ukuran  200  –  1000  μL  (Gilson),  serta  alat-alat  gelas  yang  lazim digunakan di laboratorium analitik.

## Jalannya Penelitian
1. Pembuatan Larutan Stok Baku CIP HCl
2. Pembuatan Larutan Stok Baku MDZ
3. Pembuatan Larutan Dapar Fosfat 0,05 M
4. Pembuatan fase gerak
5. Penentuan Panjang Gelombang
6. Pengukuran Sistem KCKT yang akan dioptimasi
7. Optimasi Laju Alir, PH, dan komposisi Fase Gerak
8. Optimasi kadar trietilamin

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

## Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Hasil scanning larutan  campuran  CIP.HCl  dan  MDZ  dalam  fase  gerak  (dapar fosfat  dan  asetonitril)  dengan  perbandingan  75:  25,  v/v,  masing-masing  menunjukkan serapan  maksimum  pada  panjang  gelombang  279,5nm  dan  319,8  nm.  Sedangkan  hasil gabungan  spectra  kedua  senyawa  menunjukkan  titik  potong  pada  panjang  gelombang 297,7  nm.  Panjang  gelombang  inilah  yang  digunakan  untuk  analisis  kedua  zat  dengan KCKT. Hasil scanning dapat dilihat pada Gambar 1 di bawah ini.
Gambar 1. Spektrum overlay CIP 279,5 nm dan MDZ 319,8 nm Optimasi Fase Gerak
Sistem KCKT yang digunakan untuk optimasi kondisi fase gerak adalah sebagai berikut:
Fase gerak Campuran  dapar  fosfat  0,05  M  dan  asetonitril  dengan perbandingan 80: 20, v/v. Fase diam C 18 (Merck) (100 x 4,6 mm, 10 μm) Laju alir 1,2  mL/menit Volume injeksi 20 µL Suhu operasional 30°C Detektor UV 297 nm
Hasil optimasi kondisi KCKT dengan parameter meliputi waktu retensi, resolusi atau  keterpisahan  (Rs),  efisiensi  (N)  dan  efisiensi  kolom  (HETP)  dari  berbagai  variasi komposisi dan kecepatan alir fase gerak.  Prioritas pertama pemilihan metode adalah nilai resolusi  yang  dihasilkan  yaitu  Rs  >  1,5.  Nilai  ini  menunjukkan  bahwa  kedua  puncak terpisah secara sempurna. Prioritas kedua adalah waktu retensi, semakin cepat maka akan semakin baik karena waktu analisis yang diperlukan akan semakin cepat.
Optimasi  pH  fase  gerak  dapat  dilihat  pada  tabel  IV.  Berdasarkan  tabel,  dapat dilihat bahwa fase gerak yang mengandung dapar fosfat pH 3,5 memiliki jumlah lempeng teoritis  (N)  terbesar  dan  nilai  HETP  terkecil  dibandingkan  yang  lainnya.  Kromatogram pada masing-masing pH dapar fosfat dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Optimasi pH Fase Gerak
Tabel IV. Hasil Optimasi PH Fase Gerak
pH Fase Gerak dapar fosfat 0,05 M: ACN (80: 20, v/v) Waktu retensi N HETP Rs Ket MDZ CIP 3,0 1,870 3,143 7,45 13,42 2,09 3,5 2,083 4,057 46,52 2,15 2,56 Optimum 4,0 2,227 4,160 26,56 3,9 2,72
Hasil optimasi  laju  alir  fase  gerak  pada Tabel V  dapat  dilihat  bahwa fase  gerak dengan  komposisi  dapar  fosfat  0,05  M  PH  3,5:  asetonitril  (80:  20)  dengan  laju  alir  1,4 mL/menit  memiliki  jumlah  lempeng  teoritis  terbesar  dan  HETP  terkecil  dibandingkan yang  lainnya.  Namun  pada  laju  alir  ini  luas  kromatogran  CIP  dan  MDZ  paling  kecil sehingga  bukan  kondisi  yang  optimum.  Dengan  demikian,  laju  alir  1,2  mL/menit  yang digunakan sebagai kondisi optimum. Kromatogram masing-masing laju alir dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Optimasi Laju Alir Fase Gerak
Tabel V. Hasil Optimasi Laju Alir Fase Gerak
Laju alir Fase Gerak dapar fosfat 0,05 M pH 3,5: ACN (80: 20, v/v) Waktu retensi N HETP Ket MDZ CIP 1,0 2,463 4,503 184,64 0,54 1,2 2,083 4,057 186,09 0,54 Optimum 1,4 1,847 3,963 186,79 0,535
Optimasi komposisi fase gerak dapat dilihat pada Gambar 4 yang dijabarkan pada Tabel IV.
Gambar 4. Optimasi Komposisi Fase Gerak
Tabel VI. Optimasi Komposisi Fase Gerak
Komposisi Fase Gerak (dapar fosfat pH 3,5 0,05 M: ACN) dan laju alir 1,2 mL/menit Waktu retensi Rs Ket MDZ CIP 70: 30 1,380 1,493 1,38 75: 25 1,707 2,310 0,98 80: 20 1,907 3,460 1,87 Optimum 85: 15 2,443 8,170 2,89
Berdasarkan  tabel  VI  terlihat  bahwa  pada  fase  gerak  dengan  komposisi  dapar fosfat  0,05  M  pH  3,5:  asetonitril    (85:  15,  v/v)  memiliki  nilai  resolusi  paling  besar. Namun,  berdasarkan  kromatogram,  puncak  CIP  paling  lebar  sehingga  kondisi  optimum dicapai pada perbandingan 80: 20.
Optimasi  kadar  trietilamin  sebagai  reagen  pasangan  ion  tersaji  pada  tabel  VII. Kromatogram  masing-masing  kadar  dapat  dilihat  pada  gambar  5.  Berdasarkan  tabel  VII dapat  dilihat  bahwa  trietilamin  kadar  0,05  M  merupakan  kondisi  yang  optimum  dengan nilai faktor tailing (T) = 1,61
Gambar 5. Optimasi Kadar Trietilamin
Tabel IV. Hasil Optimasi PH Fase Gerak
Kadar Trietilamin Pada Fase Gerak dapar fosfat pH 3,5 0,05 M: ACN (80: 20, v/v) dan laju alir 1,2 mL/menit Waktu retensi T Ket MDZ CIP 0,0025 3,050 12,800 -- 0,005 2,250 4,410 1,60 Optimum 0,01 2,150 3,153 1,67

## KESIMPULAN
Kondisi  optimum    fase  gerak  untuk  analisis  campuran  CIP.HCl    dan  MDZ diperoleh  pada  fase  gerak  berupa  campuran  dapar  fosfat  0,05  M  pH  3,5  dan  asetonitril (80: 20, v/v) dengan kecepatan laju alir 1,2 mL/menit dan kadar trietilamin 0,05 Molar.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim,  2010,  Ion  Pair  Reagent  for  HPLC, http://www.tciamerica.com/useful-info/product- lit/A1084E.pdf , diakses tanggal 27 Juni 2011..
Elkady, E.F. and Mahrouse, M.A., 2011, Reversed-Phase Ion-Pair HPLC and TLC-Densitometric Methods  for  the  Simultaneous  Determination  of  Ciprofloxacin  Hydrochloride  and Metronidazole in Tablets, Chromatographia , 73 , 297-305. Hermsen,  E.D.,  Hovde,  L.B.,  Sprandel,  K.A.,  Rodvold,  K.A.,  and  Rotschafer,  J.C.,  2005, Levofloxacin  Plus  Metronidazole  Administered  Once  Daily  Versus  Moxifloxacin Monoterapy Against a Mixed Infection of Esherichia coli and Bacteriodes fragilis in an In Vitro Pharmacodynamic Model, Antimicrob.Agents.Chemother. , 49 (2), 685-689.
Muchohi,  S.N.,  Thuo,  N.,  Karisa,  J.,  Muturi,  A.,  Kokwaro,  G.O.,  2011,  Determination  of Ciprofloxacin  in  Human  Plasma  Using  High-Performance  Liquid  Chromatography Coupled  with  Fluorescence  Detection  ;  Application  to  a  Population  Pharmacokinetics Study in Children with Severe Malnutrition, J.Chromatogr.B. , 879 , 146-152.
Sachan,  N.,  Chandra,  P.,  Saraf,  S.K.,  Gupta,  R.C.,  2010.  Novel  Method  for  Simultaneous Estimation  of  Ciprofloxacin  Hydrochloride  and  Ofloxacin  by  Reverse  Phase-High Performance  Liquid  Chromatography  (RP-HPLC), Int.J.Pharm.Sci.Res. , 1 (7),  100- 107.
Vega, E., Dabbene, V., Nasseta, M., Sola, N., 1999, Validation of a Reversed-Phase LC  Method for Quantitative Analysis of Intravenous Admixtures of Ciprofloxacin and Metronidazole, J.Pharm.Biomed.Anal., 21 , 1003-1009.