## IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 3 No 1 - Januari 2016
Hibiscus tiliaceus Arthemia salina Leach Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) ( Hibiscus tiliaceus Artemia Salina Leach Brine Shrimp Lethality Test (BST) Ivontia Is Iriyanti 1 , Siwi Hastuti 2 1,2 Prodi Farmasi Poltekkes Bhakti Mulia Sukoharjo Email: ivoenhm19@gmail.com ; siwihastutiapt@gmail.com
Abstract : Cancer is one of the leading causes of death in the world. A wide variety of compounds have plant that having pharmacological activity and has been shown empirically to have anticancer activity
toxicity testing using a hibiscus leaf ethanol extract dose variation with 10 serial dilutions of the dose.
with seawater. The number of dead larvae werecounted after 24 hours. Toxic effects of ethanol extract between hibiscus leaf extract given by thedeath of the larvae. The results of the probit analysis showed
of hibiscus has the potential to be developed as a new anticancer drugs.

## Keywords
Abstrak : Kanker merupakan salah satu penyakit penyebab kematian utama di dunia. Berbagai macam senyawa telah dikembangkan untuk melawan kanker, tetapi sebagian besar mempuyai efek samping. Daun waru ( ) merupakan tanaman memiliki aktivitas farmakologisdan telah terbukti
triterpenoid.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  potensi  ketoksikan  dengan  menghitung  LC 50 ekstrak  etanol  daun  waru  terhadap  larva  udang  ( dengan  metode Brine  Shrimp (BST). Ekstrak etanol daun waru diperoleh dengan remaserasi. Pengujian toksisitas akut ekstrak etanol daun waru menggunakan variasi dosis dengan 10 seri pengenceran dosis. Dosis tertinggi
laut. Jumlah larva yang mati dihitung setelah 24 jam. Efek toksik ekstrak etanol daun waru ditunjukkan terhadap  kematian  larva  udang.Penelitian  ini  menunjukkan    adanya  hubungan  yang  berartiantara ekstrak daun waru yang diberikan dengan kematian larva. Hasil dari analisis probit menunjukkan harga
IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 3 No 1 - Januari 2016

## I.
Penyakit  kanker  merupakan  penyebab kematian  terbesar  kedua  setelah  kardiovaskuler. Pengobatan  konvensional  yang  umum  dilakukan pada penyakit kanker antaranya dengan pembedahan, kemoterapi dan radioterapi. Namun, terapi  kanker  secara  pembedahan  tidak  dapat dilakukan  khususnya pada sel kanker  yang telah menyebar (metastasis), sementara penyembuhan dengan  kemoterapi  dan  radioterapi    memberikan hasil yang baik tetapi menimbulkan efek samping dan toksisitas yang besar, hal ini dikarenakan sel yang normal juga ikut mati sehingga pertumbuhan sel normal terganggu (Parmadi, 2000). Efek yang tidak  diinginkan  dari  kemoterapi  dan  radioterapi ini,  maka  sebagian  penderita  membutuhkan alternatif lain dengan memanfaatkan bahan alam sebagai obat tradisional (Sukardiman dan Pratiwi, 2004).
Obat tradisional merupakan pilihan pengobatan  yang  kini  makin  diminati,  terlebih lagi  dengan  kesadaran  untuk  kembali  ke  alam, bahkan  dengan  perkembangan  yang  kini  ada makin mendapat perhatian bagi alternatif pelayanan  kesehatan.  Menurut  penelitian  terkini, obat-obat  tradisional  memang  bermanfaat  bagi kesehatan  dan  kini  digencarkan  penggunaannya karena  lebih  mudah  dijangkau  masyarakat,  baik harga  maupun  ketersediaannya.  Obat  tradisional pada  saat  ini  digunakan  karena  menurut  banyak penelitian  tidak  terlalu  banyak  efek  samping,
LC 50 dari ekstrak etanol daun waru adalah358,415 µg/ml.Pemberian ekstrak etanol  daun  waru pada penelitian  ini,  menunjukkan  efek  toksisitas  akut terhadap  larva menurut  metode BST.  Hal  ini  ditunjukkan  dengan  harga  LC  50  <1000  µg/ml.  Sehingga  ekstrak  etanol  daun  waru mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai obat antikanker yang baru.
Kata Kunci : Hibiscus tiliaceus, Artemia salina, toksisitas, BST, LC 50
karena  masih bisa dicerna  oleh  tubuh. Indonesia merupakan  Negara  yang  kaya  akan  berbagai tumbuhan. Penggunaan tumbuhan sebagai obat  di  Indonesia  telah  berlangsung  sejak  lama dan  masyarakat  menggunakannya  secara  turun temurun berdasarkan pengalaman, masih terbatas tradisional,  belum  banyak  diketahui  kandungan senyawa dan manfaat lainnya.
Banyak  orang  beranggapan  penggunaan obat  tradisional  relatif  lebih  aman,  namun  bukan berarti  obat  tradisional  tidak  memiliki  efek samping  yang  merugikan,  bila  penggunaannya kurang  tepat.  Agar  penggunaannya  optimal, perlu  diketahui  informasi  yang  memadai  tentang kelebihan  dan  kelemahan  serta  kemungkinan penyalahgunaan  obat  tradisional  (Ramadhani, 2009).  Terdapat  berbagai  obat  tradisional  dari tanaman dan telah banyak diteliti kandungan kimia dan  khasiatnya.  Namun  masih  banyak  tanaman yang belum diketahui kadar toksisitasnya, sehingga perlu diteliti lebih lanjut.
Tanaman  yang  telah  banyak  dikenal  dan digunakan secara luas oleh masyarakat Indonesia adalah  daun  waru  ( Hibiscus  tiliaceus L.).  Daun waru    mudah  sekali  ditemukan  dan  didapatkan hampir  di  seluruh  Indonesia,  terutama  di  sekitar pantai (DirjenPOM, 2001). Tulisan-tulisan ilmiah  mengenai  tanaman  waru  masih  terbatas, terutama  daunnya  yang  sangat  bermanfaat untuk  kesehatan.  Inilah    yang  mengundang banyak penelitian mengenai daun waru mulai dari
IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 3 No 1 - Januari 2016
kandungan  kimia  yang  ada  didalamnya  sampai manfaat  atau  khasiat  yang  dapat  diperoleh  dari daun waru sendiri.
Waru  merupakan  tanaman  menahun  yang banyak  tumbuh  dan  dikenal  oleh  masyarakat indonesia. Daun  waru  mengandung  saponin,
(Dirjen  POM,  2001)  selain  itu  mengandung hibiskusin,    hibiskus    amida , asam    vanilat, asam p-hidroksibenzoat , asam siringit, p-hidroksibenzaldehid,  skopoletin,
hibiskon,    hibiskokinon,    lapakhol,    gossipol, gossipetin,  manosonon,  hyperoside,  kaemferol, kuersetin,    gossipitin, gossitrin ,  para-kumarat, asam    fumarat  (Narender  et  al,  2009)  dan triterpenoid (Sharma et al , 2010).
Daun  waru  digunakan  untuk  pengobatan demam,  obat  bisul  dan  obat  amandel.  Selain  itu berkhasiat sebagai  antiradang, antitoksik, peluruh dahak,  dan  peluruh  kencing  (Dirjen  POM,  2001). Ekstrak metanol bunga dan daun waru telah diteliti, memiliki aktivitas antioksidan (Kumar et al , 2008).
Ekstrak  metanol,  petroleum  eter,  dan  kloroform dari  daun  waru  diketahui  memiliki,  aktivitas
et al ,  2009). Ekstrak etanol daun  waru  juga  memiliki  aktivitas    pertumbuhan rambut  (Rakhmawati,  2006).  Akarnya  pun  telah diteliti  memiliki  aktivitas  antitumor  (Sunilson et al ,  2008).  Chen et al (2006)  melakukan  isolasi beberapa senyawa yang ada di kulit batang waru yaitu  skopoletin  baru  (habiscusin),  amida  baru (hibiscusamide)  bersama  11  senyawa  lain  dari uji sitotoksik senyawa-senyawa tersebut terdapat tiga seyawa yang mempunyai aktivitas antikanker sangat  baik  terhadap  sel  P-388  dan  sel  HT-29
secara in vitro dengan nilai LC 50 < 4< µg/ml.
Daun  waru  mengandung  triterpenoid,
2001).  Senyawa  yang  diduga  memiliki  aktivitas antikanker ini harus diujikan terlebih dahulu pada hewan  percobaan.  Salah  satu  metode  yang digunakan untuk menentukan toksisitas senyawa adalah
(BST) dengan
menggunakan  larva  udang
sebagai hewan uji. Artemia ini merupakan organisme  sederhana,  mudah  berkembang  biak dan  menetas  dalam  kondisi  normal  laboratorium (Kanwar, 2007). Metode ini merupakan salah satu metode  yang  banyak  digunakan  untuk  pencarian senyawa  antikanker  baru  yang  berasal  dari tanaman.  Senyawa  dari  suatu  tanaman  dapat dikatakan  berpotensi  sebagai  antikanker  apabila senyawa  tersebut  memiliki  sifat  toksik  terhadap sel (sitotoksik). Hasil uji toksisitas dengan metode ini  telah  terbukti  memiliki  korelasi  dengan  daya sitotoksis senyawa anti kanker. Selain itu, metode ini  juga  mudah  dikerjakan,  murah,  cepat  dan cukup akurat (Rahman et al ., 2006).
Penelitian yang dilakukan meliputi uji  toksisitas  dari  ekstrak  etanol  daun  waru menggunakan metode BST. Bentuk ekstrak dipilih dengan  harapan  akan  didapatkan  kandungan senyawa  aktif  yang  ada  dalam  daun  waru.  Hasil penelitian  ini  diharapkan  dapat  dijadikan  bahan informasi  tentang  potensi  toksisitas  pada ekstrak etanol  daun  waru  sebagai  salah  satu  tanaman yang telah dikenal secara luas oleh masyarakat.
Daun  waru  mengandung  triterpenoid,
2001).  Senyawa  yang  diduga  memiliki  aktivitas antikanker ini harus diujikan terlebih dahulu pada hewan  percobaan.  Salah  satu  metode  yang
IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 3 No 1 - Januari 2016
digunakan untuk menentukan toksisitas senyawa
adalah (BST) dengan
menggunakan  larva  udang sebagai hewan uji. Artemia ini merupakan organisme  sederhana,  mudah  berkembang  biak dan  menetas  dalam  kondisi  normal  laboratorium (Kanwar, 2007). Metode ini merupakan salah satu metode  yang  banyak  digunakan  untuk  pencarian senyawa  antikanker  baru  yang  berasal  dari tanaman.  Senyawa  dari  suatu  tanaman  dapat dikatakan  berpotensi  sebagai  antikanker  apabila senyawa  tersebut  memiliki  sifat  toksik  terhadap sel (sitotoksik). Hasil uji toksisitas dengan metode ini  telah  terbukti  memiliki  korelasi  dengan  daya sitotoksis senyawa anti kanker. Selain itu, metode ini  juga  mudah  dikerjakan,  murah,  cepat  dan cukup akurat (Rahman et al ., 2006).
Penelitian yang dilakukan meliputi uji  toksisitas  dari  ekstrak  etanol  daun  waru menggunakan metode BST. Bentuk ekstrak dipilih dengan  harapan  akan  didapatkan  kandungan senyawa  aktif  yang  ada  dalam  daun  waru.  Hasil penelitian  ini  diharapkan  dapat  dijadikan  bahan informasi  tentang  potensi  toksisitas  pada ekstrak etanol  daun  waru  sebagai  salah  satu  tanaman yang telah dikenal secara luas oleh masyarakat.

## II.
Penyarian. Serbuk  daun  waru  ditimbang 200  gram  lalu  dimasukkan  kedalam  backerglas ditambah  etanol  96%  (1:5).  Campuran  ini kemudian  diaduk-aduk  supaya  tercampur  rata selama  6  jam    dan  didiamkan  selama  18  jam.. Setelah  18  jam  campuran  ini  kemudian  disaring
yang  diperoleh kemudian  diuapkan  di  atas water bath untuk  menghilangkan  pelarutnya  sehingga
didapatkan ekstrak kental.
Penetasan  Telur. Penetasan  telur Artemia salina dilakukan  dengan  cara  air  lautdisaring sehinggadidapat  air  laut  yang  jernih,  lalu dimasukkan  dalam  botol  aqua  500  ml.  Telur A temia  salina ditaburkan  secukupnya  diatas  air laut tersebut dan dibiarkan dalam keadaan terbuka Setelah 48 jam telur akan menetas menjadi larva udang  yang  disebut  nauphlii.  Nauphlii  tersebut siap digunakan untuk penelitian.
.  Ekstrak  kental yang diperoleh kemudian dibuat larutan stok kon- sentrasi  5%  atau  dosis  50  mg/ml,  yaitu  dengan cara mencampur 500 mg ekstrak kental ditambah DMSO sebanyak 0,1 ml ditambah air laut sampai volume 10 ml dengan labu takar. Larutan uji dibuat dari larutan stok dipipet 1 ml dilakukan pengencer- an  dengan  penambahan  air  laut  sampai  10  ml dikocok sebagai larutan P1. Larutan P1 sebanyak 5 ml dipipet dan ditambahkan air larut sampai 10 ml dikocok sebagai larutan P2. Begitu seterusnya dilakukan pengenceran sampai 10 kali.
Uji  Toksisitas .  Uji  pendahuluan  dilakukan pada  dosis  tertinggi  pada  dosis  10  mg/ml.  selain itu  dilakukan  uji  kelarutan  500  mg  ekstrak  daun waru dalam 0,1 ml DMSO. Larutan uji dibuat dari larutan  stok   dipipet  1 ml dilakukan  pengenceran dengan  penambahan air laut sampai  10  ml  diko- cok sebagai larutan A. Larutan P1 sebanyak 5 ml dipipet  dan  ditambahkan  air  larut  sampai  10  ml dikocok  sebagai  larutan  P2.  Begitu  seterusnya dilakukan pengenceran sampai 10 kali.
Pengujian  toksisitas  terhadap  larva  udang dilakukan pada masing masing larutan yang telah dibuat  dimasukkan 10 ekor larva udang. Vial dib- iarkan terbuka pada suhu kamar  dan setelah 24 jam jumlah larva udang yang mati dihitung. Laru-
tan kontrol dibuat tanpa penambahan larutan ek- strak, DMSO  sebanyak  0,1 ml  dilarutkan  dengan air laut ad 5 ml kedalam vial dimasukkan 10 ekor larva udang.
Perhitungan  larva  udang  yang  mati  ha- rus  dilakukan  dengan  teliti  menggunakan  bantu- an  pipet. Kriteria mati bagi  larva udang  bila  tidak menunjukkan  gerakan  sama  sekali  selama  pen- gamatan,  bila  masih  ada  sedikit  gerakan  maka dianggap masih hidup.

## III.
Pada  remaserasi  dengan  etanol  96%, rendemen  yang  diperoleh  sebesar  3,12%  b/b. Organolepis  ekstrak  etanol  daun  waru  berwarna hijau kehitaman, bentuk ekstrak kental berminyak dan bau harum.
Uji toksisitas . Efek yang ditimbulkan karena pemberian  ekstrak  etanol  daun  waru  adalah kematian  larva  udang.  Rata-rata  kematian  larva udang  pada  setiap  perlakuan  disajikan  dalam tabel 1.
Tabel 1 . Pengaruh Berbagai Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Waru Terhadap Larva Artemiasalina .
Jumlah Kema- tian Rata-Rata± SEM 5000 100 10±0 2500 82 8,2±0,179 1250 74 7,4±0,131 625 62 6,2±0,148 313 44 4,4±0,159 156 34 3,4±0,206 78 20 2±0 39 10 1±0,667 20 4 0,4±1,291 9 2 0,2±2,108 0 0 0±0
replikasi  adalah  100.  Jumlah    total  larva  udang yang  digunakan  adalah  1000  ekor.  Jumlah kematian  larva  diperoleh  dengan  menjumlahkan larva yang mati pada setiap konsentrasi. Hasil uji toksisitas  berupa  jumlah  kematian  larva  udang kemudian  dibuat  persentase  kematian  larva dari  masing-masing  kelompok  perlakuan  yang ditunjukkan dalam Gambar 1.
Tabel  7 .  Toksisitas  Ekstrak  Etanol  Daun  Waru Terhadap Kematian Larva Udang

## IV. PEMBAHASAN
Ekstrak  Ekstrak etanol daun waru  memiliki prosentase  kematian  pada  dosis  0  µg/ml,  9  µg/ ml, 20 µg/ml, 39 µg/ml, 78 µg/ml, 156 µg/ml, 313 µg/ml,  625  µg/ml,  1250  µg/ml,  dan  5000  µg/ml terhadap  larva  udang  berturut  turut  adalah  0%, 2%, 4%, 10%, 20%, 34%, 44%, 62%, 74%, 82%, 100%.    Gambar  1  menunjukkan  bahwa  semakin besar  nilai    konsentrasi  ekstrak,  mortalitas  pada Artemia salina juga semakin besar. Hal ini sesuai dengan  Harborne  (1994),  yang  menyebutkan bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  ekstrak  maka
IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 3 No 1 - Januari 2016
Artemia  salina
µg/ml
Gambar 2 . Grafik probit ekstrak etanol daun waru terhadap kematian larva
Data dianalisis dengan  menggunakan probit dengan  melakukan transformasi data konsentrasi ke  bentuk  logaritma  seperti  yang  disajikan  pada gambar  3. Dengan bantuan  program SPSS  versi menunjukkan harga LC 50 sebesar 356,703  µg/ml.  Suatu  ekstrak  menunjukkan aktivitas ketoksikan dalam BSLT jika ekstrak dapat menyebabkan  kematian  50%  hewan  uji  pada
2009).  Berdasarkan  pernyataan  tersebut  ekstrak etanol  daun  waru  bersifat  toksik  terhadap  larva udang,  sehingga  dapat  dikembangkan  sebagai bahan alam untuk antikaknker.
Pemberian  ekstrak  etanol  daun  waru menunjukkan  harga  LC 50 adalah  356,703  µg/ml yang  didapat  dari  hasil  analisa  probit,  sehingga dapat disimpulkan ekstrak daun waru menunjukkan potensi  toksisitas  terhadap  larva Artemia  salina Leach yang ditunjukkan dengan harga LC 50 kurang dari 1000 µg/ml menurut metode BST
Chen, J.J., Huang,S., Duh, C.Y., Chen, I.S., Wang, T.C., and Fang, H.Y. 2006. A New Cytotoxic Amide  From  The  Stem  Wood  Of Hibiscus tiliaceus , J  Plenta med 72(10) : 935-8.
Direktorat Jendral Pengawas Obat dan Makanan.
2001. Inventaris  Tanaman  Obat  Indonesia
. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik  Indonesia  Badan  Penelitian  dan Pengembangan Kesehatan.
Harborne,  J.B.  1994. Metode  Fitokimia .ITB.
Bandung
Kanwar, A.S. 2007. Brine Shrimp ( Artemia salina )
-  a  Marine  Animal  for  Simple  and  Rapid Biological  Assays. Journal of Chinese Clinical Medicine 2(4):236-240.
Kumar,  S.,  Kuma,  D.,  and  Prakash,  O.  2008.
Evaluation of Antioxidant Potential, Phenolic and Flavonoid Contents of Hibiscus tiliaceus J.  of  Enviromental Flowers. J.  of  Enviromental Electronic  J.
of  Enviromental,  Agricultural  and  Food Chemistry 7(4):2863-2871.

## Chemistry
Narender,  Kumar,  S.,  Kumar,  D.,  and  Kumar,
V.  2009.  Antinociceptive    And  Anti
Hibiscus  tiliaceus
Leaves. International J. Of Pharmacognosy And Phytochemical Research 1(1) : 15-17.

## IJMS – Indonesian Journal On Medical Science – Volume 3 No 1 - Januari 2016
Parmadi,  A.  2000.  Skrining  Fitokimia  Tanaman
yang Mempunyai Daya Sitotoksik Terbesar Terhadap
dari
Beberapa  Tanaman  Suku  Compositae.
Skripsi . Surabaya : Universitas Surabaya.
Rahman, A.S., Arslan,  I.,  Saha,  R., Talukder,  N., Khaleques , S., and Ali, A. 2006. Bioactivity Guided Cytotoxic Activity of Clitoria Ternatea
Utilizing Bioassay.
Bangladesh  J  Physiol  Pharmacol 22(1/2)  :
18-21.
Struktur  Senyawa  Bioaktif  Daun  Laban ( Vitex  pubescens Vahl.)  Asal  Kawasan Hutan Kalimantan Barat. Tesis . Yogyakarta:
Universitas Gadjah Mada.
Ramadhani,  A.N.  2009.  Uji  Toksisitas  Ekstrak Etanol  Daun  Sukun  ( Artocarpus  altilis )
Terhadap  Larva dengan Metode (BST).
Ilmiah . Semarang : Universitas Diponegoro Sharma, M.C., Sharma, S., and Kohli, D.V. 2010.
Phytochemical And Anti-Ulcer Investigations Of 95% Ethanolic-Benzene Chloroform Leaf Extract Of Hibiscus tiliaceus Linn. In albino Rat Model. Annals  Of Biological Research
1(1): 15-20.
Sukardiman,  R.,  dan  Pratiwi,  N.F.  2004.  Uji
Praskrining Aktivitas Antikanker Ekstrak Eter dan Ekstrak Metanol Marchantia cf. planiloba
Steph. Dengan Metode Uji Kematian Larva

## Majalah Farmasi Airlangga
Sunilson,  A.J.,  Mohan,  S.,  Mohamed,  M.A., Thomas,  J.,  and  Kumari,  A.G.  2008. Antitumour Activity of Hibiscus tiliaceus Linn
Roots. Iranian Journal of Pharmacology and Therapeutis 7(1): 123-125.