DOI 10.33323/indigenous.v5i2.302
Volume 5(2) 2022 (63-72)
ISOLASI DAN KARAKTERISASI AMILOLITIK Bacillus sp . DARI TANAH RHIZOSFER DESA TEGALWATON KABUPATEN SEMARANG
( ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF AMYLOLYTIC Bacillus sp . FROM THE RHIZOSPHERE SOIL OF TEGALWATON VILLAGE, SEMARANG REGENCY )
Henokh Christian Prasgi 1 Theresia Avilla Jessica Puspitasari 1
1 Program Studi Biologi, Fakultas Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana Corresponding author : henokhchristianprasgi@gmail.com

## Abstrak
Bakteri amilolitik yang memiliki kemampuan menghidrolisis pati menjadi glukosa sebagai sumber energi bagi pertumbuhan  bakteri,  dapat  ditemukan  di  lingkungan  terestrial  termasuk  lapisan  tanah  rhizosfer.  Enzim amilase  berguna  secara  luas  dalam  industri,  sehingga  diperlukan  eksplorasi  dan  penelitian  terkait  bakteri yang  memiliki  kemampuan  amilolitik.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  dan  mengkarakterisasi bakteri  amilolitik  genus Bacillus yang  ditemukan  pada  tanah  rhizosfer  Desa  Tegalwaton,  Kabupaten Semarang.  Metode  dilakukan  secara  eksperimental  di  Laboratorium  Mikrobiologi,  Fakultas  Biologi, Universitas  Kristen  Satya  Wacana  meliputi  isolasi  dan  uji  karakter  morfologi,  biokimia  dan  fisiologi.  Hasil penelitian diperoleh 3 isolat bakteri dengan kode A1, A2 dan A3 yang teridentifikasi sebagai genus Bacillus dan  memiliki  kemiripan  dengan Bacillus  thuringiensis ,  termasuk  dalam  bakteri  kelompok  batang  ( rods ) amilolitik yang motil, Gram positif dan memiliki spora. B. thuringiensis dapat memfermentasi glukosa, dapat mengubah  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )  menjadi  H 2 O  dan  O 2 .  Sebaliknya  tidak  dapat  memanfaatkan  sitrat sebagai sumber karbon, tidak dapat mengoksidasi glukosa dan tidak dapat membentuk asetil metil karbinol. Bacillus  thuringiensis dapat  dikembangkan  menjadi  galur  industri  untuk  enzim  amilase.  Diperlukan  uji molekuler untuk mengidentifikasi spesiesnya secara spesifik.
Kata kunci: Bakteri Amilolitik , Bacillus sp , Isolasi , Uji Morfologi, Biokimia dan Fisiologi

## Abstract
Amylolytic bacteria have the ability to hydrolyze starch into glucose as an energy source for bacterial growth, can be found in terrestrial environments including the rhizosphere soil layer.  Amylase enzymes are widely used in industry, so exploration and research are needed related to bacteria which have amyolytic abilities. This study aims to isolate and characterize amylolytic bacteria of the genus Bacillus found in the rhizosphere soil of Tegalwaton Village, Semarang Regency. Experiments carried out experimentally in the Microbiology Laboratory, Faculty  of Biology,  Satya Wacana Christian University include  isolation and character  tests of morphology, biochemistry and physiology. The results of the study showed 3 bacterial isolates with codes A1,  A2  and  A3  identified  as Bacillus genus  and  have  similarities  to Bacillus  thuringiensis ,  including  in  the amylolytic rods group bacteria, Gram positive and have spores. B. thuringiensis can ferment glucose, convert hydrogen  peroxide  (H 2 O 2 )  into  H 2 O  and  O 2 .  Instead  it  cannot  utilize  citrate  as  a  carbon  source,  it  cannot oxidize  glucose  and  cannot  forms  acetyl  methyl  carbinol. Bacillus  thuringiensis can  be  developed  into  an industrial strain for amylase enzymes. Molecular tests are needed to identify the specific species.
Keywords: Amylolytic Bacteria, Bacillus sp, Isolation, Morphology, Biochemical and Physiology Test

## PENDAHULUAN
Tanah  merupakan  sumber  mikroorganisme  pengurai  pati  yang  sangat  berlimpah.  Berbagai jenis  tanah  mengandung  berbagai  jenis  mineral  dan  nutrisi  di  dalamnya  yang  memengaruhi diversitas  mikroorganisme,  sehingga  beberapa  penelitian  tentang  mikroorganisme  terkait penguraian pati dari berbagai sumber tanah dengan aktivitas amilase  sangat bervariasi dalam uji morfologi,  biokimia  dan fisiologi  (Serin et  al .,  2012).  Amilase  diproduksi  oleh  berbagai  organisme mulai dari prokariota (bakteri) sampai eukariota (tanaman dan manusia), diekstraksi dari beberapa mikroorganisme  termasuk  ragi,  bakteri,  actinomycetes  dan  jamur.  Amilase  yang  diekstraksi  dari bakteri dan jamur telah mendominasi berbagai aplikasi di industri berbasis bioteknologi. α-amilase yang  dihasilkan  dari Bacillus spp.  memutus  ikatan α-1,4  pada endo  fashion ,  enzim  dari B. licheniformis digunakan dalam mencairkan pati dan tepung maizena, B. halodurans berperan dalam sakarifikasi  (Schallmey et  al .,  2004).  Pernyataan  tersebut  diperkuat  oleh  Souza  dan  Magalhaes (2010)  bahwa  enzim  amilase  hanya  dapat  ditemukan  dari  berbagai  jenis  makhluk  hidup  seperti tanaman,  hewan, manusia,  sampai mikroba. Enzim amilase yang berasal dari mikroba umumnya
mempunyai spektrum yang lebih luas dalam industri sebab sifatnya lebih stabil jika dibandingkan yang  berasal  dari  tanaman  dan  hewan.  Banyak  mikroorganisme  yang  berpotensi  menghasilkan amilase  antara  lain Bacillus  thuringiensis , Bacillus  subtilis , Bacillus  megaterium , Bacillus steriothermophilus dan lain-lain (Pokhrel et al ., 2013). Saat ini diketahui sekitar 3000 enzim tetapi hanya  sedikit  yang  telah  dimanfaatkan  di  industri,  terutama  enzim  hidrolitik  ekstraseluler  yang mendegradasi polimer alami seperti protein, selulosa, pektin dan pati menjadi monomer yang lebih sederhana  (Alariya et  al .,  2013).  Amilase  adalah  enzim  penting  untuk  digunakan  dalam  industri pengolahan  pati  untuk  konversi  polisakarida  (pati)  menjadi  monosakarida  (glukosa).  Beberapa sektor  industri  menggunakan  enzim  amilase  dalam  produksi  seperti  glukosa  dan  fruktosa  dalam pembuatan sirup. Pati mengalami pengurangan berat molekul supaya mendapatkan viskositas dan kemanisan  dalam  industri,  mampu  bertindak  dalam  proses  hidrolisis  bersama-sama  dengan selulase, protease dan lipase (koktail enzimatik) Van der Maarel et al., (2002). Amilase dimanfaatkan untuk  menghasilkan  etanol,  dibuat  dari  substrat  seperti  pati  melalui  proses  hidrolisis  enzimatik. Substrat tersebut melimpah di alam dengan biaya produksi yang rendah (Chi et al ., 2009).
Langkah  identifikasi  bakteri  amilolitik  sangat  diperlukan  agar  isolat  yang  didapatkan  bisa dikembangkan  sebagai  galur  industri  melalui  serangkaian  uji  karakteristik  meliputi  morfologi, biokimia  dan  fisiologi,  seperti  pewarnaan  spora,  KOH  string  dan  pewarnaan  gram.  Spora  pada bakteri  biasa  disebut  dengan  endospora  dan  terbentuknya  endospora  dalam  kultur  bakteri  dapat dideteksi  dengan  pewarnaan  malachite  green.  Lapisan  endospora  yang  sangat  keras mengakibatkan  diperlukannya  penguapan  untuk  memungkinkan  penetrasi  zat  warna  (Sandle, 2016).  Tes  kalium  hidroksida  (KOH)  merupakan  uji  untuk  membuktikan  bakteri  gram  negative. Dengan adanya tes ini mengakibatkan dinding sel gram negatif rusak melepaskan bahan kromosom kental, ini menyebabkan suspensi bakteri menjadi tebal dan berserat, sehingga dapat melisiskan sel termasuk DNA bakteri tersebut (Public Health England, 2018).
Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengkarakterisasi  dan  mendapatkan  isolat Bacillus sp.  dari rhizosfer yang memiliki kemampuan amilolitik

## METODE PENELITIAN Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Maret - April 2022. Sumber isolat berasal dari tanah rhizosfer di Desa Tegalwaton, Kabupaten Semarang, Provinsi Jawa Tengah. Uji karakter morfologi, biokimia dan  fisiologi  dilakukan  di  Laboratorium  Mikrobiologi,  Fakultas  Biologi,  Universitas  Kristen  Satya Wacana,  Kota  Salatiga. Isolasi  bakteri  amilolitik dilaksanakan  pada  tanggal  3 – 8 Maret 2022, uji hidrolisis  pati  dilaksanakan  tanggal  9 –  15  Maret  2022  serta  uji  morfologi,  biokimia  dan  fisiologi dilaksanakan tanggal 26 Maret – 5 April 2022.

## Bahan dan Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, kapas, ose, jarum, batang L ( spreader ), bunsen spirtus, mikroskop merek Olympus CX22, autoklaf merek  Hirayama,  vortex  merek  Termoline, cover  glass , objek  glass merek  Sail  Brand,  korek  api, pilius,  pipet  ukur  merek  HBG,  plastik  wrap  (cling),  spidol  permanen,  solasi.  Bahan  yang  akan digunakan dalam penelitian ini yaitu medium NA, medium Simon Citrate, medium TSA, medium SIM, medium cair MR-VP ( glucose phosphate broth ), malachit green, kristal violet (Gram A), iodin (Gram B), alkohol + aseton (Gram C), safranin (Gram D), KOH, barit A, barit B, metil red, akuades, larutan garam fisiologis.

## Prosedur Penelitian
a.  Sterilisasi alat dan bahan
Alat dibungkus menggunakan kertas HVS atau plastik tahan panas, diikat lalu dimasukkan ke dalam autoklaf selama 30 menit pada suhu 121°C untuk disterilisasi (Artha et al ., 2019).

## b.  Pembuatan medium isolasi dan identifikasi
Pembuatan  medium  isolasi  dan  identifikasi  mengikuti  prosedur  dari  Bergey et  al .,  (2009) dengan  modifikasi  untuk  tahapan  isolasi  (NA),  uji  hidrolisis  pati  (NA- starch ),  uji  katalase,  Simon Citrate, fermentasi glukosa, MR-VP dan motilitas. Setiap bahan medium ditimbang, diberi akuades lalu dipanaskan dengan hotplate sampai semua komponen medium terlarut. Selanjutnya didiamkan agar hangat, dituang ke cawan petri ataupun tabung (medium miring), diamkan agar mengeras

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 5(2) 2022

## c.  Pengambilan sampel
Sampel  didapatkan  dari  tanah  rhizosfer  Desa  Tegalwaton,  Kabupaten  Semarang,  Provinsi Jawa Tengah. Tanah diambil dari kedalam 15 cm dari permukaan tanah, ditimbang sebanyak 1,0 gram, dibuat 2 kali ulangan (tanah A dan B) (Setyati dan Subagiyo, 2012). d.  Isolasi bakteri amilolitik dari tanah rhizosfer
1,0 gram tanah rhizosfer disuspensikan ke larutan garam fisiologis 9 mL pada tabung reaksi. Selanjutnya diencerkan secara bertingkat sampai 10 -4 , diambil 0,1 mL larutan suspensi dan disebar ke  permukaan  medium  NA,  lalu  diinkubasi  selama  24 –  48  jam  (Setyati  dan  Subagiyo,  2012). Langkah  tersebut  diulangi  untuk  tanah  B.  Teknik  goresan  ( streak )  dilakukan  untuk  mendapatkan isolat murni, lalu dilakukan uji morfologi, biokimia dan fisiologi.
e.  Uji morfologi, biokimia dan fisiologi isolat
Uji biokimia dimulai dengan uji hidrolisis pati, pertama diinokulasikan isolat ke medium NA- starch , diinkubasi selama 24 – 48 jam. Ditetesi lugol pada permukaan koloni, amati terbentuknya zona  terang  (berlaku  reaksi  positif)  (Setyati  dan  Subagiyo,  2012).  Pada  uji  dengan  pewarnaan gram, langkah pertama yang dilakukan adalah objek glass yang berisi isolat bakteri ditetesi dengan Gram  A,  kemudian  didiamkan  selama  1  menit  dibuang  dan  dibilas,  setelah  itu  ditetesi  Gram  B, didiamkan selama 1 menit dibuang dan dibilas. Lalu, ditetesi dengan Gram C dibiarkan mengalir dan dibilas. Tahap terakhir, ditetesi dengan Gram D kemudian dibuang, dibilas dengan akuades. Larutan  Gram  yang  berlebih  diseka  dengan  tisu  lalu  isolat  pada  gelas  objek  diamati  di  bawah mikroskop (warna biru/ungu adalah Gram  positif) (Wulandari dan Purwaningsih,  2019). Pada uji dengan  spora,  langkah  yang  dilakukan  adalah objek  glass yang  sudah  berisikan  isolat  bakteri dipanaskan. Selama pemanasan, ditetesi dengan malachit green selama 15 menit dan malachit green jangan sampai kering, diamati di bawah mikroskop (warna hijau menunjukkan bagian spora (generatif) (Wulandari dan Purwaningsih, 2019). Pada uji dengan KOH string test, langkah pertama yang dilakukan adalah mengambil sedikit isolat bakteri dari cawan petri dan dipindahkan ke objek glass yang sudah berisi KOH. Kemudian, ose diangkat sedikit dan diamati apakah terdapat seperti serat putih yang mengental atau tidak (Vetbact, 2017). Pada uji dengan katalase,  langkah yang harus dilakukan adalah medium TSA ditetesi dengan H 2 O 2 dan nantinya menghasilkan gelembung atau tidak (Capucino dan Sherman, 1983; Lay, 1994). Pada uji MR dan VP, langkah yang dilakukan MR adalah ditetesi sebanyak 5 tetes metil red dan pada VP ditetesi menggunakan barit A dan barit B sebanyak 5 tetes. Kemudian, divortex agar tercampur rata, diamati terjadi perubahan warna (+) (Libretexts, 2021a). Pada uji fermentasi glukosa, diinokulasikan ose yang terdapat isolat bakteri ke tabung  reaksi  berisi glucose  phosphate  broth ,  diamati  selama  48  jam  terjadi  perubahan  warna disertai kemunculan gas (Libretexts, 2021b). Pada uji motilitas, media dalam tabung reaksi ditusuk, kemudian ditunggu apakah selanjutnya terdapat penyebaran pada daerah tusukan tersebut. Pada uji  Simon  Citrate,  langkah  yang  dilakukan  adalah  isolat  bakteri  dari  cawan  petri  dipindahkan  ke tabung reaksi dengan cara dikorek. Kemudian saat pemindahan ke tabung reaksi yang sudah berisi reagen Simon Citrate digoreskan di dalamnya dan ditunggu selama 2 hari apakah warna berubah atau tidak (Wulandari dan Purwaningsih, 2019).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Bakteri Amilolitik dari Tanah Rhizosfer
Isolasi  dari  2  ulangan  tanah  rhizosfer  (A  dan  B)  menggunakan  teknik  goresan  ( streak ) mendapatkan 3 tipe koloni yang dikode A1, A2 dan A3. Isolat murni didapatkan setelah dilakukan streak bertingkat sebanyak dua kali. Masing-masing isolat diinokulasikan pada medium NA- starch untuk  uji  hidrolisis  pati,  didapatkan  hasil  kualitatif  termasuk  kelompok  bakteri  amilolitik  (dapat membentuk zona terang di sekitar koloni) ( Gambar 1 ). Setelah uji hidrolisis pati, dilanjutkan dengan uji karakter morfologi, biokimia dan fisiologi yang dideskripsikan pada Tabel 1 dan Tabel 2 untuk menentukan genus ataupun spesies isolat bakteri tersebut. Perbandingan hasil dengan pustaka dari Bergey et al ., (2009); Adwitiya et al ., (2008) dan Luang-In et al ., (2019) menunjukkan bahwa ketiga isolat mengindikasikan bakteri Bacillus sp . dan memiliki kemiripan dengan Bacillus thuringiensis .
Tabel  1 .  Persamaan  karakter  morfologi,  biokimia  dan  fisiologi  isolat  (A1,  A2  dan  A3)  terhadap
Bacillus thuringiensis berdasarkan pustaka. Karakter atau uji Isolat (A1, A2 dan A3) Bacillus thuringiensis Morfologi Bentuk koloni Bulat ( round )/ irregular Bulat ( round )/ irregular Margin Bergelombang ( undulate ) Bergelombang ( undulate ) Tekstur Rough Rough Transparansi Tidak tembus cahaya Tidak tembus cahaya Warna Putih Putih Tampilan koloni (Chai et al ., 2016)
Bentuk sel
Batang ( rod ), diplobacilli Batang ( rod ), diplobacilli Zakeel et al ., (2009) Gram Positif (ungu) Positif (ungu) Spora Ya Ya Biokimia Simmon Citrate (S. Cit) Negatif Negatif (Abirami et al ., 2016) Methyl Red (MR) Negatif Negatif (Charen et al ., 2014) Voges Proskauer (VP) Negatif Negatif (Abirami et al ., 2016) Katalase (Cat.) Positif Positif (Abirami et al ., 2016) KOH Negatif Negatif (Afriani et al ., 2018) Hidrolisis Pati Positif Positif (Abirami et al ., 2016) Fisiologi Motilitas (Mot.) Positif Positif (Abirami et al ., 2016) Persamaan (%) 100 100

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 5(2) 2022
Tabel 2 . Identifikasi isolat bakteri amilolitik berdasarkan uji morfologi, biokimia dan fisiologi.
Kode Isolat S. Cit. Mot. F. Glu. MR VP Cat. KOH  Spores  Gram A1 - + + (A), - (G) - - + - + + A2 - + + (A), - (G) - - + - + + A3 - + + (A), - (G) - - + - + + Pengamatan secara visual Kode Isolat S. Cit. Mot. F. Glu.
A1, A2, A3 Kode Isolat MR
VP Cat. A1,
A2, A3
Paling kanan: kontrol Paling kanan: kontrol Kode Isolat KOH Spores Gram
A1, A2, A3 A1 A3 A2 A1 A3 A2 Mor. Col.
A1 A2 A3
Intepretasi hasil
A1 Bacillus thuringiensis A2 Bacillus thuringiensis A3 Bacillus thuringiensis
Keterangan : S. Cit. (Simon Citrate), Mot. (motilitas), F. Glu. (fermentasi glukosa), MR (metil merah), VP (Voges Proskauer), Cat. (katalase), KOH (KOH string ), Spores (cat spora), Gram (pewarnaan Gram), Mor. Col. (morfologi koloni), A (acid), G (gas)

## Uji Morfologi Bakteri Amilolitik
Karakter  morfologi  diidentifikasi  melalui  pengamatan  secara  makroskopis  (morfologi  koloni isolat) dan mikroskopis (morfologi sel melalui pewarnaan spora dan Gram). Seluruh isolat (A1, A2 dan A3) merupakan bakteri bentuk batang ( rods ), Gram positif (berwarna ungu) dan memiliki spora (bentuk  bulat  berwarna hijau  akibat  pewarnaan malachite ).  Ketiga  isolat  menunjukkan kesamaan dengan Bacillus thuringiensis karena memiliki bentuk koloni bulat ataupun tidak beraturan ( irregular ), tepi  koloni  bergelombang,  warna  koloni  putih  dengan  tekstur  permukaan  kasar,  tidak  tembus pandang, Gram positif dan memiliki spora (Astuti et al ., 2018; Bergey et al ., 2009). Dinding sel B. thuringiensis memiliki peptidoglikan tebal yang mengandung polimer anionik bermuatan tinggi (asam teikoat), terdiri dari pengulangan alditol fosfat sehingga saat pengecatan Gram berwarna ungu/biru. Prevalensi asam dinding teikoat dengan D-alanin sangat tinggi pada Gram positif berkaitan dengan
Spora bakteri

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 5(2) 2022
interaksi bakteri pathogen dengan inangnya (Kamar et al ., 2017). Pada pengamatan ketiga isolat melalui pewarnaan spora menggunakan pewarna green malachite di bawah mikroskop ( Tabel 2 ), ditemukan  adanya  endospora  (spora  yang  terbentuk  di  dalam  sel)  yang  terwarnai  hijau  dan berbentuk  oval/bulat,  sesuai  dengan  penelitian  Kassogue et  al .,  (2015)  bahwa B.  thuringiensis memiliki spora internal yang terwarnai hijau dan sel vegetatif terwarnai merah (safranin).
Tabel 3 . Karakteristik morfologi koloni dan sel isolat bakteri amilolitik Karakteristik morfologis A1 A2 A3 Bentuk koloni  Bulat ( round ) / irregular Bulat ( round ) / irregular Bulat ( round ) / irregular Margin Bergelombang ( undulate ) Bergelombang ( undulate ) Bergelombang ( undulate ) Tekstur Rough Rough Rough Transparansi Tidak tembus cahaya Tidak tembus cahaya Tidak tembus cahaya Warna Putih Putih Putih Tampilan koloni
5-6 mm 5 mm 4-5 mm Bentuk sel Batang ( rod ), diplobacilli Batang ( rod ), diplobacilli Batang ( rod ), diplobacilli Gram Positif (ungu) Positif (ungu) Positif (ungu) Spora Ya Ya Ya

## Uji Biokimia Bakteri Amilolitik
Uji biokimia pada penelitian ini meliputi uji hidrolisis pati, Simon Citrate, fermentasi glukosa, uji MR-VP, katalase serta uji KOH string ( Tabel 2 ) dan didapatkan bahwa ketiga isolat (A1, A2 dan A3) merupakan  bakteri  amilolitik.  Bakteri  amilolitik  memiliki  enzim  beta  1,4  glukosidase  yang  dapat memfermentasi glukosa. Enzim glukosidase ini akan memecah ikatan beta 1,6 pada rantai cabang dan dekstrin menjadi glukosa (Enny, 2008), kemudian dapat mengubah hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) menjadi  H 2 O  dan  O 2 ;  sebaliknya  tidak  dapat  memanfaatkan  sitrat  sebagai  sumber  karbon,  tidak dapat  mengoksidasi  glukosa  dan  tidak  dapat  membentuk  asetil  metil  karbinol.  Tes  biokimia merupakan langkah penting dalam penentuan kelompok bakteri berdasarkan berbagai reaksi kimia yang  dapat  bernilai  positif  dan  negatif.  Berdasarkan  perbandingan  antara  hasil  dengan  pustaka Bergey et al ., (2009); Adwitiya et al ., (2009) serta Luang-In et al ., (2019), didapatkan bahwa ketiga isolat memiliki kesamaan dengan bakteri Bacillus thuringiensis didasarkan pada uji hidrolisis pati, katalase dan glukosa (asam) bernilai positif (+) serta uji Simon Citrate, glukosa (gas), uji MR-VP, dan KOH-string bernilai negatif (-). Pada uji hidrolisis pati, tepi koloni B. thuringiensis menghasilkan daerah atau zona bening dengan luasan yang kecil, diduga karena kemampuan setiap spesies yang berbeda  dalam  menghidrolisis  pati.  Hasil  penelitian  dibandingkan  dengan  Luang-In et  al .,  (2019) ditunjukkan pada Gambar 2 .
Gambar 2 . Perbandingan luasan zona bening pada hidrolisis pati. Kiri: isolat bakteri amilolitik, kanan: kode 3.2AL1 = B. thuringiensis IARI-IIWP-38, kode 2.3AL8 = Bacillus cereus DFT-1 (Luang-In et al ., 2019)
Pada pengujian Simon Citrate pada medium agar miring ( slant tube ), warnanya tetap sama (hijau) sehingga berlaku reaksi negatif. Hal tersebut disebabkan karena ketiga isolat bakteri tidak menggunakan  sitrat  sebagai  sumber  karbon  tunggal.  Mac-Williams,  (2009)  menjelaskan  bahwa pada saat asam organik sitrat digunakan sebagai sumber karbon dan energi tunggal, karbonat alkali dan bikarbonat akan dihasilkan, lalu mengubah indikator pH yang membuat warna medium berubah menjadi biru (berlaku reaksi positif). Uji fermentasi glukosa berlaku positif menunjukkan bahwa B. thuringiensis dapat  memanfaatkan  glukosa  dalam  fermentasi  menjadi  sumber  energi  dan  karbon (enzim yang berperan glukoksidase). KOH-string negatif memberikan nilai berlawanan dengan uji Gram, sehingga uji Gram positif maka KOH-string negatif. Aryal, (2019) menjelaskan bahwa prinsip tes KOH-string yaitu potassium hidroksida dapat melarutkan peptidoglikan yang tipis (Gram negatif) dan  sebaliknya  bagi  Gram  positif,  sehingga  kromosom  dan  DNA  terlisiskan  dan  mengental, memunculkan  benang  saat  ose  dinaik-turunkan.  Uji  MR-VP  digunakan  untuk  mengetahui kemampuan  bakteri  dalam  mengoksidasi  glukosa  dengan  menghasilkan  asam  sebagai  produk akhir, sehingga kondisi pH berubah dan apabila ditetesi metil merah akan mengubah warnanya dari kuning ke merah (reaksi berlaku positif). Pada uji katalase, enzim katalase menginisiasi pemecahan hidrogen peroksida menjadi oksigen dan air, sehingga dihasilkan gelembung (reaksi berlaku positif) (Aryal, 2019)

## Uji Fisiologi Bakteri Amilolitik
Karakter  fisiologis  dapat  dilihat  melalui  uji  motilitas  (pergerakan  sel)  ( Tabel  2 )  di  mana didapatkan pada ketiga isolat menunjukkan reaksi positif (koloni mengalami pergerakan dari tengah medium  ke  pinggir).  Aryal,  (2019)  menjelaskan  bahwa  bakteri  motil  akan  melewati  medium  SIM ( Sulphate Indole Motility ) sehingga dalam interval waktu tertentu akan mengalami kekeruhan atau bagian koloni tengah yang menjalar ke pinggir.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil dan pembahasan penelitian, dapat disimpulkan bahwa isolat bakteri tanah rhizosfer  dari  Desa  Tegalwaton  Kabupaten  Semarang  dengan  kode  A1,  A2  dan  A3  merupakan bakteri  genus Bacillus sp . dan  memiliki  kemiripan  dengan Bacillus  thuringiensis berdasarkan  uji morfologi,  biokimia  dan  fisiologi.  Ketiga  isolat  menunjukkan  hasil  positif  pada  hidrolisis  pati, fermentasi glukosa, katalase, cat spora dan Gram serta motilitas, dan berlaku negatif pada uji MR- VP,  sitrat  dan  KOH-string.  Ketiga  isolat  memiliki  kemampuan  amilolitik  dan  berpotensi  untuk dikembangkan menjadi strain bakteri skala industri untuk enzim amilase.

## SARAN
Diperlukan penggunaan metode lain terkait isolasi dan karakterisasi bakteri amilolitik seperti uji indole, urease dan fermentasi TSI dan berbagai sumber glukosa agar penentuan spesies semakin tepat. Selain itu, dapat dilakukan penelitian lanjutan mengenai aktivitas enzimatik lainnya (selulolitik, lipolitik, dan sebagainya) yang dimiliki oleh kelompok Bacillus sp . dari Desa Tegalwaton, Kabupaten Semarang.

## DAFTAR PUSTAKA
Abirami, P., Pornima, K., Suguna P., Saranya, V., Selvanayagam, P. & Shenbagarathai, R. (2016). Phenotypic  Characterization  of  an  Indigenous  Bacillus  thuringiensis  Strain  ( B.t .  LDC  501) Expressing  Cancer  Cell  Killing  Protein. Journal  of  Experimental  Biology  and  Agricultural Sciences , 4 (2), 232-241. http://dx.doi.org/10.18006/2016.4(2).232.241 Adwitiya,  P.,  Ashwini,  P.,  Avinash,  K.  A.,  Badri,  R.,  Kajal,  D.,  Vomsi,  P.,  &  Srividya,  S.  (2009).
Mutagenesis of Bacillus thuringiensis IAM 12077 for increasing poly ( - β - ) hydroxybutyrate (PHB) production. Turk J Biol , 33 (2009), 225 –230. https://doi.org/10.3906/biy-0808-10

## Indigenous Biologi
Jurnal pendidikan dan Sains Biologi 5(2) 2022
Afriani, S. R., Pujiastuti, Y., Irsan, C., Damiri, N., Nugraha, S. & Sembiring, E. R. (2018). Isolation and  toxicity  test  of  Bacillus  thuringiensis  from  Sekayu  region  soil,  South  Sumatra  on Spodopteralitura. IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science , 102 (2018) 012066. doi :10.1088/1755-1315/102/1/012066
Alariya,  S.S.,  Sethi,  S.  &  Gupta,  B.L.  (2013).  Amylase  Activity  of  A  Starch  Degrading  Bacteria Isolated from Soil. Archives of Applied Science Research , 5 (1), 15-24. Aryal, S. (2019a). Potassium Hydroxide Test – Principle, Procedure, Uses and Interpretation. Online access. https://microbiologyinfo.com/potassium-hydroxide-test/.
Aryal, S. (2019b). Catalase Test- Principle, Uses, Procedure, Result Interpretation with Precautions.
Online  access.  https://microbiologyinfo.com/catalase-test-principle-uses-procedure-result- interpretation-with-precautions/.
Aryal,  S.  (2019c).  Motility  Test –  Principle,  Procedure,  Uses  and  Interpretation.  Online  access. https://microbiologyinfo.com/motility-test/.
Astuti,  D.  T.,  Pujiastuti,  Y.,  Suparman,  S.  H.  K.,  Damiri,  N.,  Nugraha,  S.,  Sembiring,  E.  R.,  & Mulawarman. (2018). Exploration of Bacillus thuringiensis Berl. from soil and screening test its toxicity  on  insects  of  Lepidoptera  order. International  Symposium  on  Food  and  Agro- Biodiversity , 102 (012063), 1 –8. https://doi.org/doi :10.1088/1755-1315/102/1/012063 Bergey, D. H., Whitman, W. B., De, V. P., Garrity, G. M., & Jones, D. (2009). Bergey's manual of systematic bacteriology: Vol. 3 . New York: Springer.
Capucino,  J.  G.  dan  Sherman,  N.  (1983). Microbiology  A  Laboratory  Manual .  New  York:  State University of New York.
Chai, P. F., Rathinam, X., Ghazali, A. H. & Subramaniam, S. (2016).  Characterization of a native Bacillus thuringiensis isolates from Malaysia that produces exosporium enclosed parasporal inclusion. Emirates Journal of Food and Agriculture , 28 (9), 653-659. doi: 10.9755/ejfa.2015- 09-714
Charen,  T.,  Vaishali,  P.,  Kaushalya,  M.,  Amutha,  K.,  Ponnusami,  V.,  &  Gowdhaman,  D.  (2014). Isolation  and  identification  of  polyhydroxybutyrate  producing  bacterial  strain  (Bacillus thuringiensis  GVP)  from  chlorine  contaminated  soil. International  Journal  of  ChemTech Research , 6 , 3197-3202.
Chi, Z., Chi, Z., Liu, G., Wang, F., Ju, L., & Zhang, T. (2009). Saccharomycopsis fibuligera and its applications in biotechnology. Biotechnology advances , 27 (4), 423-431.
Enny,  W.  (2008).  Peranan  Mikroba  Tanah  Pada  Kegiatan  Rehabilitasi  Lahan  Bekas  Tambang.
Jurnal Info Hutan , 5 (2), 151-160.
Kamar,  R.,  Réjasse,  A.,  Jéhanno,  I.,  Attieh,  Z.,  Courtin,  P.,  Nielsen-leroux,  C.,  Lereclus,  D.,  & Sanchis-borja,  V.  (2017).  DltX  of  Bacillus  thuringiensis  Is  Essential  for  D  -Alanylation  of Teichoic  Acids  and  Resistance  to  Antimicrobial  Response  in  Insects. Front.  Microbiol. , 8 (August), 1 –13. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01437
Kassogué, A., Maïga, K., Traoré, D., Dicko, A. H., Fané, R., Guissou, T., Faradji, F. A., Valicente, F. H.,  Hamadoun,  A.,  &  Babana,  A.  H.  (2015).  Isolation  and  characterization  of  Bacillus thuringiensis (Ernst Berliner) strains indigenous to agricultural soils of Mali. African Journal of Agricultural Research , 10 (28), 2748 –2755. https://doi.org/10.5897/AJAR2015.9848. Lay, B. W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium . Jakarta: PT Gradindo Persada.
Libretexts.  (2021a).  Lab:  8  Using  Biochemical  Testing  to  Identify  Bacteria.  Online  acces. https://bio.libretexts.org/Learning_Objects/Laboratory_Experiments/Microbiology_Labs/Micro biology_Labs_II/Lab_08%3A_Using_Biochemical_Testing_to_Identify_Bacteria.
Libretexts.  (2021b).  7.1:  Introduction  to  Biochemical  Tests  Part  1.  Online  access. https://bio.libretexts.org/Courses/North_Carolina_State_University/MB352_General_Microbio logy_Laboratory_2021_(Lee)/07%3A_Microbial_Metabolism/7.01%3A_Introduction_to_Bioch emical_Tests_Part_I.
Luang-In,  V.,  Yotchaisarn,  M.,  Saengha, W.,  Udomwong,  P.,  Deeseenthum,  S.,  &  Maneewan,  K.
(2019).  Isolation  and  identification  of  amylase-producing  bacteria  from  soil  in  Nasinuan community forest, Maha Sarakham, Thailand. Biomedical and Pharmacology Journal , 12 (3), 1061 –1068. https://doi.org/10.13005/bpj/1735 Mac-Williams,  M.  P.  (2009).  Citrate  Test  Protocol.  In American  Society  for  Microbiology (Issue December 2009, pp. 1 –7).
Pokhrel,  B., Wanjare,  P.,  Singh  S.  (2013). Isolation, screening  and  characterization  of  promising- amylase producing bacteria from sewage enriched soil. Int. J. Adv. Biotechnol. Res ., 4 (2), 286- 290. Public Health England. (2018). UK Standards for Microbiology Investigations Potassium hydroxide . (Issue December 2018, pp. 1-13).
Sandle, T. (2016). 9 – Microbial identification in Pharmaceutical Microbiology . (2016, pp. 103-113). Schallmey,  M.,  Singh,  A.,  & Ward,  O.  P.  (2004).  Developments  in  the  use  of  Bacillus  species for industrial production. Can. J. Microbial ., 50 (2004), 1-17. doi: 10.1139/W03-076
Souza, P.M. and Magalhães, P.O. (2010). Application of Microbial α-Amylase in Industry – A Review. Brazilian  Journal  of  Microbiology , 41 (4),  850-861.  https://doi.org/10.1590%2FS1517- 83822010000400004
Serin,  B.,  Akcan,  N.  and  Uyar,  F.  (2012) . Production and optimization of α-amylase from Bacillus circulans ATCC 4516 with solid state fermentation. J. Biol. Chem , 40 (4), 393-400.
Setyati  W.  A.  &  Subagiyo  S.  (2012).  Isolasi  dan  Seleksi  Bakteri  Penghasil  Enzim  Ekstraseluler (Proteolitik, Amilolitik, Lipolitik dan Selulolitik) yang Berasal dari Sedimen Kawasan Mangrove. Ilm. Kelaut. , 17 (3), 164−168. doi: 10.14710/ik.ijms.17.3.164-169
Van Der Maarel, M. J., Van der Veen, B., Uitdehaag, J. C., Leemhuis, H., & Dijkhuizen, L. (2002).
Properties and applications of starch- converting enzymes of the α-amylase family. Journal of biotechnology , 94 (2), 137-155.
Vetbact. (2017). Potassium Hydroxide Test. Online access. https://www.vetbact.org/. Wulandari,  D  dan  Purwaningsih,  D.  (2019).  Identifikasi  dan  Karakterisasi  Bakteri  Amilolitik  pada Umbi Colocasia esculenta L. Secara Morfologi, Biokimia dan Molekuler. Jurnal Bioteknologi dan Biosains , 6 (2), 247-258. https://doi.org/10.29122/jbbi.v6i2.3084 Zakeel, M. C. M., Dissanayake, D. M. D. & Weerasinghe, P. A. (2009). Molecular Characterization of  Bacillus  Thuringiensis  Strains  Isolated  from  A  Selected  Site  In  Nochchiyagama, Anuradhapura In Sri Lanka. Tropical Agricultural Research & Extension , 12 (1), 31-34.