*) Peneliti  pada  Balai Besar Riset Pengolahan Produk dan  Bioteknologi  Kelautan  dan Perikanan;  Email: idjanuar@gmail.com
**) Pengajar  pada Magister  Ilmu  Lingkungan  Universitas  Diponegoro

## KELAYAKAN METODE METABOLOMIK PADA PENGKAJIAN LINGKUNGAN TERUMBU KARANG
Hedi Indra Januar *) , Boedi Hendrarto **) , dan Ekowati Chasanah *)

## ABSTRAK
Studi  ini  bertujuan  untuk  memaparkan  kelayakan  metode  metabolomik  sidik  jari  dan  penanda kimia  pada  pengkajian  kondisi  lingkungan  terumbu  karang.  Berdasarkan  telaah  pustaka,  kedua jenis  metabolomik dapat diterapkan pada pengkajian kondisi terumbu karang, dengan keunggulan dan  kelemahannya  masing-masing.  Metabolomik  sidik  jari  merupakan  pendekatan  yang  sangat komprehensif  dalam  menilai  kondisi  bioindikator  terumbu  karang  yang  mengalami  stressor lingkungan,  namun  memerlukan  instrumen  kimia  yang  canggih  dan  analisis  data  hasil  secara statistik  yang  cukup  rumit.  Sebaliknya,  keunggulan  metabolomik  penanda  kimia  lebih  sederhana dalam  penguj ian  dan  pengolahan  data  hasil,  namun  kelemahannya  adalah  tidak  secara komprehensif  menelaah  perubahan  metabolit  bioindikator.  Jika  diterapkan  pada  high  throughput screening  kondisi  terumbu  karang,  maka  secara  subjektif  analisis  metabolomik  penanda  kimia memiliki  potensi  lebih  baik.  Salah  satu  penanda  kimia  yang  potensial  dipergunakan  adalah cembranoid,  yaitu  senyawa  bioaktif  dari  karang  lunak.
ABSTRACT: Feasibility of metabolomic analysis in assessing coral reefs environments. By: Hedi Indra Januar, Boedi Hendrarto and Ekowati Chasanah
This  study  aimed  to  explain  the  feasibility  of  fingerprint  and  chemical  marker  metabolomic analysis  in  assessment  of  coral  reefs  environments.  Based  on  literature  review,  both  analysis might  be  implemented  on  coral  reef  environment  assessment,  with  their  specific  strength  and weakness.  Fingerprint  metabolomic  is  a  comprehensive  approach  in  assessing  the  condition  of coral reefs  bioindicator  that is having environmental stresses. It  require high technology chemical instrumentation  and  complicated  statistical  approach  in  post  data  analysis.  On  the  other  hand, chemical  marker  metabolomic  is  more  simplified  in  data  analysis  and  instrumentation,  but  not comprehensively  assess  the  metabolite  changes  of  bioindicator  that  is  having  environmental stresses. To apply as high throughput screening in coral reefs assessment, subjectively the chemical marker  method  would  be  more  feasible.  One  of  the  potential  chemical  marker  that  used  is cembranoids,  a  bioactive  compound  from  soft  corals.
KEYWORDS: environmental  metabolomics,  coral  reefs  assessments,  soft  corals, cembranoid

## PENDAHULUAN
Komunitas terumbu karang Indonesia merupakan wilayah dengan biodiversitas tinggi sehingga menjadi salah  satu  sumber  terbaik  untuk  mendapatkan senyawa kimia baru yang memiliki aktivitas biologis. Namun  peningkatan  stressor  antropogenik  dan pemanasan  global  pada  habitat  terumbu  karang berpotensi  sebagai  ancam an  tinggi  terhadap biodiversitas terumbu karang (Rajendran et al., 2001). Sebagai efeknya, metabolisme dalam hewan laut akan beradaptasi terhadap kondisi lingkungannya. Fluktuasi kadar  m etabolit  y ang  beradaptasi  terhadap lingkungannya tersebut menjadi dasar high throughput screening dalam mengetahui kondisi lingkungan, dan dikenal dengan analisis metabolomik lingkungan (Lin et  al.,  2006).  Melalui  cara  metabolomik,  kondisi lingkungan terumbu karang dapat diketahui dengan
cepat.  Selain  itu,  kadar  metabolisme  sekunder terumbu karang yang seringkali merupakan senyawa bioaktif akan memperlihatkan kekayaan diversitas plasma nutfah suatu wilayah terumbu karang. Hal ini menjadi sangat penting bagi konservasi lingkungan laut di Indonesia yang telah dicanangkan seluas 10 juta hektar pada tahun 2010 ini (Poernomo, 2009). Efektifitas  peningkatan  kualitas  kawasan  terumbu kar ang  akibat   keberadaan  konserv asi  y ang dicanangkan harus dilakukan secara berkala. Kondisi terumbu  karang  Indonesia  saat  ini  secara  umum buruk, hanya sebesar 6% saja yang berada dalam kondisi  baik  (Cappenberg  &  Salatalohy,  2008). Namun,  untuk  melakukan  penelaahan  terhadap kondisi terumbu karang, terlebih jika dilakukan secara berkala,  dibutuhkan  sumberdaya  yang  besar (Estradivari et al., 2007). Penyederhanaan melalui metode metabolomik dapat menjadi high throughput
screening  dalam  pengkajian  efektivitas  daerah perlindungan laut, untuk mengetahui dengan cepat kondisi  lingkungan,  dan  efektiv itas  penjagaan kandungan plasma nutfah dari biota-biota yang ada di dalamnya.
Hal inilah yang akan dijelaskan di dalam makalah ini. Berdasarkan telaah pustaka, makalah ini bertujuan untuk memaparkan fisibilitas metabolomik lingkungan menggunakan penanda kimia senyawa bioaktif dari karang lunak dalam menelaah kondisi terumbu karang dan  lingkungannya.  Pada  tahapan  awal  akan dijelaskan  metode  dalam  analisis  metabolomik lingkungan, selanjutnya secara subjektif akan dipilih metode yang paling fisibel dalam aplikasi pengkajian kondisi perairan terumbu karang. Pada penelaahan selanjutnya,  akan  dipaparkan  fisibilitas  senyawa bioaktif dari karang lunak sebagai penanda kimia.

## ANALISIS METABOLOMIK LINGKUNGAN
Secara garis besar, terdapat dua macam metode analisis metabolomik yaitu metabolomik sidik jari dan penanda  kimia.  Perbedaan  mendasar  di  antara keduanya  adalah  metabolomik  sidik  jari  akan menelaah  metabolisme  dari  bioindikator  secara
keseluruhan,  sedangkan  metode  penanda  kimia hanya akan melakukan kuantifikasi terhadap senyawa target tertentu yang kadarnya berkorelasi terhadap perubahan  lingkungan.  Kedua  metode  ini  akan dijelaskan sebagai berikut:

## Metabolomik Sidik Jari Bioindikator
Pengukuran  sidik  jari  metabolisme  dilakukan dengan  mengekstrak  bioindikator  menggunakan pelarut  tertentu,  misalnya  metanol,  kemudian langsung dianalisis menggunakan teknik spektroskopi ultraviolet, infra merah, massa, proton-NMR (Nuclear Magnetic  Resonance),  dan  lain-lain.  Teknik spektroskopi  massa  dan  proton-NMR  merupakan teknik yang paling sering digunakan karena mampu mendeteksi metabolit dalam wilayah yang lebar dan memiliki reproduksibilitas yang baik (Lin et al., 2006). Spektra  massa atau  proton  dari  keseluruhan  hasil metabolit tersebut diproses menggunakan analisis statistik  faktorial  dan  diplot  pada  grafik  Principal Component Scores (PCS). Contoh dari penggunaan metode sidik jari terhadap stres biologis dari biota flatfish disajikan pada Gambar 1 (Viant et al., 2003 dalam Lin et al., 2006). Score plot pada Gambar 1 memperlihatkan  bahwa  penggunaan  metabolomik sidik  jari  akan  mengelompokkan  ikan  yang  sehat,
Gambar 1.   Plot Principal Component Scores  pada  ekstrak otot (a), kelenjar  pencernaan (b), darah (c), dan kumulatif ketiganya (d) dari flatfish sehat, pertumbuhan terhambat, dan sakit.
Sumber: Viant et al., 2003 dalam Lin et al., 2006.
pertumbuhannya  terhambat,  maupun  yang  sakit. Aplikasi metode ini di bidang lingkungan akan baik dilakukan pada dampak perubahan metabolisme yang disebabkan  oleh racun  kimiawi lingkungan  seperti pestisida (Schizas et al., 2001), logam berat (Santos et al., 2010), dan lain-lain.

## Metabolomik Penanda Kimia Bioindikator
Berbeda  dengan  pengukuran  sidik  jari  yang melibatkan  analisis  metabolit  bioindikator  secara keseluruhan, metabolomik penanda kimia hanya akan menganalisis satu atau beberapa senyawa target dari bioindikator. Terdapat banyak senyawa yang dapat diaplikasikan sebagai penanda kimia. Oleh karena itu, pengetahuan mengenai fungsi  dari penanda kimia terhadap  bioindikator  penghasil  menjadi  hal  yang sangat penting dan harus dibuktikan terlebih dahulu. Misalnya  pada  lingkungan  perairan  dengan  kadar oksigen rendah, biota laut akan meningkatkan kadar senyawa betaines untuk menyeimbangkan kehilangan asam amino yang teroksidasi dari media intraselular (Viant et al.,  2003).  Proses  awal analisis  penanda kimia  serupa  dengan  teknik  sidik  jari,  yaitu mengekstrak  bioindikator  menggunakan  pelarut tertentu. Selanjutnya, penanda kimia dipisahkan dari metabolit  lain  menggunakan  teknik  kromatografi, seperti  High  Performace  Liquid  Chromatography (HPLC) atau Gas Chromatography (GC). Kadar dari penanda  kimia  ditentukan  berdasarkan  luas  area puncak  kromatogram  hasil  analisis  kromatografi tersebut.  Senyawa  lain  yang  berpotensi  untuk diaplikasikan sebagai penanda kimia dalam analisis metabolomik    lingkungan    terumbu    karang    di Indonesia adalah senyawa bioaktif dari invetebrata laut, terutama golongan octocoral atau karang lunak.

## SENYAWA BIOAKTIF KARANG LUNAK SEBAGAI PENANDA  KIMI A  PE NGKAJIAN  KONDISI TERUMBU KARANG
Golongan  biota  octocoral  atau  karang  lunak mendominasi wilayah perairan Pasifik (Sammarco & Coll,  1992)  karena  memiliki  ketahanan  terhadap predator  ikan  karang (Fabricius,  1995).  Kelompok senyawa  umum  yang  berperan  dalam   hal  ini m er upak an  senyawa  cem bran  diterpenoid/ cembranoid yang diketahui toksik dan diduga memiliki fungsi  ekologis  sebagai  antipredator  ikan  karang, antifouling  terhadap  alga  (Coll,  1992),  dan  juga sitotoksik  untuk  memenangkan  persaingan  ruang hidup di wilayah bentik perairan (Kopp et al., 2001). Senyawa cembranoid telah dilaporkan terisolasi dari ber bagai  kar ang  l unak ,  m isalny a  Sinular ia, Sarcophyton, atau Nephthea sp. (Qin et al., 2008; Bonnard et al., 2010; Januar et al., 2010).
Fungsi  dari  cembranoid  inilah  yang  mendasari metabolomik penanda kimia menggunakan senyawa tersebut pada pengkajian lingkungan terumbu karang. Secara ekologis, berdasarkan adanya korelasi yang positif antara lingkungan terumbu karang yang baik dengan jumlah spesies ikan karang yang terdapat di dalamnya (Bell & Galzin, 1984), maka jika kuantitas ikan karang tinggi akibat lingkungan terumbu karang yang  baik,  kadar  senyawa  antipredator  juga  akan berbanding lurus. Koop et al. (2001) menerangkan bahwa peningkatan kadar senyawa cembranoid pada karang  lunak  dapat  menjadi  indikator  terjadinya kenaikan kebutuhan untuk pertahanan dari predator (kuantitas ikan karang  yang banyak), peningkatan persaingan ruang hidup (diversitas hewan bentik yang tinggi),  atau  terjadinya  stres  secara  fisiologis  dari karang lunak tersebut.
Korelasi berbanding lurus ini dibuktikan secara in situ pada percobaan Hoover et al. (2008) yang dapat dilihat pada Gambar 2. Dari Gambar 2 dapat dilihat bahwa,  r espon  peni ngkatan  kadar  11b- asetoksipukolide karang lunak Sinularia polydactyla terlihat  pada  predasi  artifisial  di  wilayah  terumbu karang.  Peningkatan  kadar  11b-asetoksipukolide dalam  jumlah  yang  besar  saat  terdapat  predator menunjukkan bahwa penggunaan senyawa tersebut sebagai penanda kimia sangat baik dalam analisis metabolomik.
Namun  tidak  semua  senyawa  pada  golongan senyawa aktif pada karang lunak berpotensi sebagai penanda kimia untuk mengetahui dampak terhadap stressor  lingkungan  di  wilayah  terumbu  karang. Contohny a kadar senyawa cem branoid sarcophytoxide  dari  Sarcophyton  ehrenbergi  tidak berasosiasi dengan nutrient enrichment di wilayah terumbu  karang  (Koop  et  al.,  2001).  Peningkatan jumlah nutrien di kawasan terumbu karang merupakan parameter stressor lingkungan yang penting karena dapat menyebabkan pelemahan terumbu karang dan menghambat recruitment coral baru (Szmart, 2002). Hal ini juga diperkuat oleh penelitian yang dilakukan oleh Chasanah et al. (2007) yang berhasil mengisolasi senyawa sarcophytoxide dari beberapa Sarcophyton sp.  di  perairan  Kepulauan  Seribu  yang  tidak berasosiasi terhadap kondisi lingkungannya. Namun pada jenis lain, contohnya adalah Nephthea sp. yang dik etahui  m em iliki   beberapa  jenis  seny awa cembranoid dengan bioaktivitas sitotoksik (Chasanah et  al.,  2007),  dapat  ditemukan  senyawa  yang berpotensi  sebagai  penanda  kimia.  Senyawa  3,4 epoksi nephthenol asetat yang diisolasi dari Nephthea sp. dari Kepulauan Seribu ditemukan memiliki korelasi terhadap kuantitas terumbu karang (Januar, 2010).

## POTENSI APLIKASI METABOLOMIK LINGKUNGAN PADA PENGKAJIAN KONDISI TERUMBU KARANG
Pada pengkajian kondisi terumbu karang, kedua jenis analisis metabolomik dapat diterapkan, dengan keunggulan  dan  kelemahannya  masing-masing. Metabolomik sidik jari melibatkan analisis terhadap keseluruhan metabolit, sehingga menjadi pendekatan yang  sangat  komprehensif  dalam  menilai  kondisi suatu bioindikator terumbu karang yang mengalami stressor lingkungan. Namun, kelemahan dari metode ini adalah persyaratan yang harus dipenuhi dalam pengolahan  data  hasil.  Secara  statistik,  metode principal component merupakan bagian dari analisis faktorial  yang  harus  memenuhi  persyaratan  data variabel  yang  layak/measure  sampling  adequecy (MSA) > 0,5; korelasi KMO > 0,5; dan Bartlett test yang signifikan pada batas 95% (SPSS, 2006). Jika terdapat variabel yang tidak memenuhi persyaratan di  atas,  maka  scores  plot  yang  dihasilkan  tidak memiliki reliabilitas yang baik. Selain itu, peralatan instrumentasi spektrometer massa direct inject dan NMR  yang  dipergunakan  relatif  jauh  lebih  mahal dibandingkan dengan HPLC yang digunakan pada metabolomik penanda kimia. Sebaliknya, walaupun metabolomik penanda kimia akan memiliki simplifikasi dalam pengujian, namun kelemahannya adalah tidak secara komprehensif menelaah perubahan metabolit bioindikator. Hal ini terlihat pada Gambar 2, bahwa selain peningkatan 11b-asetoksipukolide, perubahan kadar juga terlihat pada metabolit yang terelusi antara menit ke 2,5–5.
Sumber: Hoover et  al.  (2008)
Namun  secara  subjektif  metabolomik  penanda kimia,  terutam a  jika  m enggunakan  senyawa cembranoid dari karang lunak, akan baik digunakan dalam  high  troughput  screening  untuk  mengkaji kondisi  terumbu  karang,  karena  simplifikasinya. Laporan dari beberapa penelitian mengenai kadar senyawa dalam golongan tersebut terlihat memiliki korelasi  yang  positif  terhadap  kondisi  lingkungan terumbu karang maupun jumlah ikan karang sebagai predatornya. Hal ini menunjukan bahwa aplikasi ini sangat potensial. Selain itu, penggunaan senyawa bioaktif seperti antipredator, sitotoksik, dan lainnya, sebagai penanda kimia juga akan menggambarkan kekayaan level biodiversitas plasma nutfah yang ada di dalam bioindikator terumbu karang. Akan tetapi, jika dibutuhkan dampak yang komprehensif dalam perubahan  metabolisme  suatu  bioindikator  yang terpapar stressor lingkungan tertentu, maka analisis sidik jari akan lebih baik.

## PENUTUP
Analisis metabolomik sidik jari dan penanda kimia merupakan  uji  yang  memiliki  fisibilitas  baik  untuk dipergunakan dalam pengkajian kondisi lingkungan ter um bu  karang.  Penguji an  m enggunakan metabolomik sidik jari akan memberikan gambaran yang komprehensif dari renspon metabolit bioindikator terhadap  kondisi  lingkungan  terumbu  karangnya, sedangkan  metabolomik  penanda  kimia  akan memperlihatkan  respon  produksi  senyawa  kimia ter tent u  dal am   bioindikator  ak ibat  kondisi
H.I. Januar, B. Hendrarto, dan E. Chasanah
Gambar 2.  Kromatogram HPLC dari ekstrak Sinularia polydactyla yang diberi predasi artifisial (bawah) dan ekstrak kontrol (atas).
lingkungannya. Secara subjektif berdasarkan telaah pustaka, metabolomik penanda kimia menggunakan senyawa  bioaktif  dari  invertebrata  laut  akan  lebih potensial  dalam  high  troughput  screening  untuk mengkaji kondisi terumbu karang, karena simplifikasi pengujiannya dan kemampuannya menggambarkan kekayaan level biodiversitas plasma nutfah di wilayah terumbu karang. Selanjutnya, jika dibutuhkan dampak yang komprehensif dalam perubahan metabolisme suatu bioindikator yang terpapar stressor lingkungan tertentu, maka analisis sidik jari akan lebih baik.

## DAFTAR PUSTAKA
Bell, D.  and Galzin, R. 1984. Influence of live coral cover on  coral  reef  fish  communities.  Marine  Ecology.  15: 265–274.
Bonnard,  I.,  Jhaumeer-Laulloo,  S.B.,  Bontemps,  N., Banaigs,  B.,  and  Aknin,  M.  2010.  New  lobane  and cembrane    diterpenes    from    two    comorian    soft corals. Marine Drugs.  8  (2):  359–372.
Cappenberg,  H.A.W.  dan  Salatalohy,  A.  2008.  Study Baseline  Ekosistem  Terumbu Karang di  Lokasi DPL Kabupaten  Raja  Ampat  Ta hun  2008.  Laporan Program  Kerja  CRITC  (Coral  Reef  Research  and Training  Centre)-COREMAP  (The  Coral  Reef Rehabilitation  and  Management  Program)-LIPI (Lembaga  Ilmu  Pengetahuan  Indonesia).
Chasanah, E., Januar, H.I., Liptrot, C., Doyle, J., Nielson,
C., Tapiolas, D., Motti, C., Wright, A.D., and Battershill, C.  2007.  Ex ploration  of  Indonesian  Marine Biodiversity  for  Biotechnological  Cemmercialization, PSLP  (AusAID    Public  Sector    Lingkage  Program)- Indonesia  Proj ec t  ROU  3711 8,  Collaborative Biodiscovery  Research  between  Indonesian  Marine and  Fisheries  Researc h  Center  for  Produc ts Processing  and  Biotechnology–Australian  Institute of  Marine  Science,  Townsville  QLD, Australian.
Coll,  J.C. 1992.  The  chemistry  and  chemical  ecology  of octocorals  (Coelenterata,  Anthozoa,  Octocorallia). Chemical  Review.  92:  613–631.
Estradivari, Syahrir, M., Susilo, N., Yusri, S., dan Timotius,
S.  2007.  Te rumbu  Karang  J ak arta–Laporan Pengamatan  J angka  Panjang  Terumbu  Karang Kepulauan  Seribu  (2004-2005).  Yayasan  Terumbu Karang  Indonesia–The  David  and  Lucile  Packard Foundation.
Fabricius, K.E. 1995. Slow population turnover in the soft coral  genera  Sinularia  and  Sarcophyton  on  mid-and outer-shelf  reefs  of  the  Great  Barrier  Reef.  Marine Ecology Progress Series. 126:  145–152.
Hoover, C.A., Slattery, M., Targett, N.M., and Marsh, A.G. 2008.  Transcriptome  and  metabolite  responses  to predation in a south pacific soft coral. Biology Bulletin. 214:  319–328.
Januar,  H.I.,  Chasanah,  E.,  Motti,  C.A.,  Tapiolas,  D.M., Liptrot,  C.H.,  and  W right,  A.D.  2010.  Cytotoxic
cembranes  from  Indonesia  specimens  of  the  soft coral Nephthea  sp.  Marine  Drugs  8: 2142–2152. Januar,  H.I.  2010.  Efek tivitas  Sis tem  Zonas i  Bagi Perlindungan  Te rumbu  Karang  dari  Stress or Antropogenik  di  Taman  Nasional  Laut  Kepulauan Seribu.  Tesis.  Magister  Ilmu  Lingkungan  Universitas Diponegoro,  Semarang.
Koop, K., Booth, D., Broadbent, A., Brodie, J., Bucher, D., Capone,  D.,  Coll,  J.,  Dennison,  W.,  Erdman,  M., Harrison,  P.,  Hoegh-Guldberg,  O.,  Hutching,  P., Jones,  G.B.,  Larkum, A.W.D.,  O’Neil,  J.,  Steven, A., Tentori, E., Ward, S., Williamson, J.,  and  Yellowless, D. 2001. ENCORE: The effect of nutrient enrichment on  coral  reefs  synthesis  of  results  and  conclusions. Marine  Pollution  Bulletin.  42  (2): 91–120.
Lin,  C.Y.,  Viant,  M.R.,  and  Tjeerdema,  R.S.  2006.
Metabolomics:  methodologies  and  application  in  the environmental  sc ienc es.  J ournal  of  Pes tic ides Science.  31  (3):  245–251.
Poernomo, S.H. 2009. Gubernur NTT Usulkan Laut Sawu s ebagai  Kawas an  Kons ervas i.  Siaran  Pers Kementerian Kelautan dan Perikanan. No. B.40/PDSI/ HM.310/IV/2009.
Rajendran,  N.,  Ravichandran,  S.,  Raghunathan,  S., Vijayalakshmi, L., Swaminathan, V., Senthilkumar, B., Subramanian,  A.,  and  Nagarajan,  R.  2001.  Coral Reefs  of  India.  Environmental  Information  System Centre. Centre  of Advanced Study in  Marine Biology. India.
SPSS.  2006.  Help  Topics  on  SPSS  Ver  15.  SPSS  Inc 1989–2006.  US.
Sammarco,  P.W .  and  Coll,  J .C.  1992.  Chemic al adaptations  in  the  Oc toc orallia:  evolutionary considerations. Marine Ecology  Progress Series. 88: 93–104.
Santos, E.M., Ball, J.S., Williams, T.D., Wu, H., Ortega, F., Van Aerle,  R.,  Katsiadaki, I., Falciani, F.,  Viant,  M.R., Chipman, J.K., and Tyler, C.R. 2010. Identifying health impacts  of  exposure  to  copper  using  transcriptomics and  metabolomics  in  a  fish  model.  Environmental Science Technology. 44:  820–826.
Schizas,  N.V.,  Chandler,  G.T.,  Coull,  B.T.,  Klosterhaus,
S.L.,  and  Quattro,  J.M.  2001.  Differential  survival  of three  mitochondrial  lineages  of  a  marine  benthic c opepod  exposed  to  a  pestic ide  mixture. Environmental  Science  Technology.  35:  535–538.
Szmart, A.M. 2002. Nutrient enrichment on coral reefs: is it a major cause of coral  reef decline? Estuarites.  25 (4B):  743–766.
Qin,  S.,  Huang,  H.,  and  Guo,  Y.W .  2008.  A  New Cembranoid  from  the  hainan  soft  coral  Sinuaria  sp. Journal of Asian Natural Products Research. 10 (11): 1075–1079.
Viant, M.R., Rosenblum, E.S., and Tjeerdema, R.S. 2003. NMR-Based  Metabolomics:  a  powerful  approach  for characterizing  the  effects  of  environmental  stressors on  organism  health.  Env ironmental  Sc ienc e Technologies.  37:  4982–4989.