## Research Article
Potensi  Senyawa  Nitazoxanide  dan  Arbidol  sebagai Antivirus SARS-CoV-2 terhadap Reseptor NSP5 (7BQY dan 2GZ7) dan ACE2 (3D0G dan 1R4L)
Ami  Fini  Faqiha 1 ,  Yen  Yen  Ari  Indrawijaya 1 ,  Arief  Suryadinata 1 ,  Muhammad  Amiruddin 1 dan  Roihatul Mutiah 1*)
1 Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang, Indonesia
*  Corresponding author: Roihatul Mutiah | Email: roiha@farmasi.uin-malang.ac.id; Tel.: +62 896 1526 1991
Received: 13 November 2021; Revised: 1 Maret 2022; Accepted: 19 Maret 2022; Published: 28 Maret 2022
Abstrak: Nitazoxanide merupakan obat pro-drug untuk tizoxanide. Obat tersebut diketahui memiliki aktivitas antivirus  pada  MERS-CoV.  Arbidol  memiliki  aktivitas  antivirus  pada  H3N2  HA  yang  memiliki  kesamaan struktur dengan SARS-CoV-2. Reseptor target spesifik untuk obat-obat Anti SARS-CoV-2 saat ini adalah NSP5 (nonstructural protein) dan ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2). NSP5 memediasi replikasi dan transkripsi protein-protein  virus,  sedangkan  ACE2  sebagai  fasilitator  transport  asam  amino  dan  reseptor  tempat terikatnya  SARS-CoV  maupun  SARS-CoV-2.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  aktivitas antivirus SARS-CoV-2 dari senyawa Nitazoxanide dan Arbidol secara in silico. Senyawa nitazoxanide dan arbidol dipreparasi terlebih dahulu dengan melakukan pengunduhan kode PDB ID, penyiapan struktur 2D dan 3D, penentuan  minimal  energy,  pembuatan  kode  SMILES,  serta  prediksi  sifat  fisikokimia  dan  toksisitas.  Setelah dipreparasi,  proses  dilanjutkan  dengan  penambatan  molekul  menggunakan  aplikasi  PyRx-Vina®.  Hasil docking dianalisis dengan perangkat lunak PyMOL® dan Discovery Studio Visualizer®. Hasil profil fisikokimia menunjukkan  bahwa  senyawa  arbidol  dan  nitazoxanide  telah  memenuhi  hukum  lima  Lipinski  dan  masing- masing  senyawa  memiliki  nilai  LD 50 sebesar  1350  mg/kg  dan  340  mg/kg.  Hasil  penambatan  senyawa  uji dengan  reseptor  menghasilkan  interaksi,  yaitu  ikatan  hidrogen,  interaksi  hidrofobik,  dan  interaksi elektrostatik.  Interaksi  nitazoxanide  pada  reseptor  2GZ7  serta  arbidol  pada  reseptor  3D0G  dan  1R4L menunjukkan perbedaan yang signifikan masing-masing terhadap lopinavir dan chloroquine dengan nilai p < 0.05 sehingga senyawa tersebut diprediksi memiliki potensi antivirus yang lebih baik.
Keywords: COVID-19, Nitazoxanide, Arbidol, Fisikokimia, Toksisitas, dan In silico

## 1. PENDAHULUAN
Pada  11  Februari  2020,  WHO  mengumumkan  bahwa  telah  terjadi  pandemi  Coronavirus Disease (COVID-19) yang disebabkan oleh virus severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS- CoV-2) [1]. Coronavirus yang menjadi etiologi COVID-19 termasuk dalam genus betacoronavirus. Hasil analisis  filogenetik  menunjukkan  bahwa  virus  ini  masuk  dalam  subgenus  yang  sama  dengan coronavirus  yang  menyebabkan  wabah  severe  acute  respiratory  illness  (SARS)  pada  2002-2004  silam, yaitu  Sarbecovirus  [2]. Proses  replikasi  virus  COVID-19  yaitu  SARS-CoV-2  berikatan  dengan reseptor-reseptor  dan  membuat  jalan  masuk  ke  dalam  sel,  kemudian  glikoprotein  yang  terdapat pada  envelope spike  virus akan  berikatan dengan reseptor selular berupa ACE2 pada SARS-CoV-2.
SARS-CoV-2  akan  melakukan  duplikasi  materi  genetik  dan  mensintesis  protein-protein  yang dibutuhkan, kemudian membentuk virion baru yang muncul di permukaan sel [3].
Nitazoxanide  merupakan  salah  satu  obat  yang  diidentifikasi  sebagai  small  molecules  dalam FDA-approved  small  molecules  and  biologics.  Small  molecule  dipilih  agar  dapat  memastikan  bahwa kriteria hukum lima Lipinski terpenuhi. Salah satu kriterianya, yaitu Berat Molekul (BM), yang mana, apabila nilai BM lebih dari 500 Da, obat tersebut tidak dapat berdifusi menembus membran sel [4].
Nitazoxanide  menunjukkan  konsentrasi  IC 50 yang  sangat  tinggi,  yaitu  0.83  µg/ml  terhadap middle  east  respiratory  syndrome  coronavirus  (MERS-CoV)  [5].  Nitazoxanide  terbukti  menurunkan ekspresi  proinflammatory  cytokine  IL6  pada  infeksi  SARS-CoV-2  [6].  Hasil  evaluasi  genomik  isolasi pada 10 pasien yang dilakukan untuk menentukan kesamaan antara SARS-CoV-2 dengan SARS-CoV dan  MERS-CoV,  menunjukkan  hasil  bahwa  terdapat  kesamaan  (identik  88%)  dengan  bat_derived severe  acute  respiratory  syndrome  (SARS)-like  coronaviruses,  bat-SL-CoVZC45,  dan  bat-SLCoVZXC21. Ketiga virus tersebut memiliki kedekatan dengan SARS-CoV 79% dan dengan MERS-CoV 50% [7]. Pada penelitian sebelumnya, telah dilakukan molecular docking dan didapatkan nilai afinitas terhadap masing-masing reseptor, -6,9 kcal/mmol untuk M pro (6LU7); -7,6 kcal/mmol untuk 3CLpro (1UK4); - 7,5 kcal/mmol untuk ACE2 (6M0J); dan -7,6 kcal/mmol untuk NSP12 (6NUR) [8].
Salah satu obat small molecule inhibitors lainnya adalah Arbidol. Arbidol terbukti menghambat perubahan  konformasi  low-pH  dari  hemaglutinin  (HA)  dan  menghalangi  proses  fusi  [9].  Virus influenza  (H3N2)  HA  memiliki  kesamaan  rangkaian  atau  struktur  dengan  SARS-CoV-2  spike glycoprotein  [10,11].  Penelitian  molecular  docking  telah  dilakukan  sebelumnya  dan  menunjukkan bahwa arbidol berinteraksi dengan reseptor ACE2 (6LZG) sehingga dapat menghambat fusi membran SARS-CoV-2 ke sel inang [12]. Arbidol maupun nitazoxanide belum terdaftar di Indonesia berdasarkan web BPOM (cekbpom.pom.go.id). Oleh karena itu, berdasarkan literature mengenai indikasi arbidol dan nitazoxanide, kedua senyawa tersebut dapat berpotensi sebagai obat baru di Indonesia.
Penelitian lain telah dilakukan pada 81 kasus (45 kasus kelompok umifenovir/arbidol dan 36 kasus kelompok kontrol) COVID-19 sedang atau berat dengan membandingkan hasil CT scan setelah pemberian dan hasil menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan perubahan nilai CT dalam 1 minggu sehingga  menunjukkan bahwa pemberian  umifenovir tidak memberikan hasil yang lebih baik atau tidak dapat mempersingkat lamanya pengobatan pada pasien COVID-19. Namun, karena penelitian ini adalah single-centre (studi retrospektif dengan jumlah sample yang sedikit), yang mana studi ini memiliki bias dan kesimpulannya bisa subjektif, maka perlu dilakukan verifikasi lebih lanjut dalam uji klinis acak terkontrol [13].
Pada penelitian ini digunakan dua reseptor target, yaitu NSP5 dan ACE2. Reseptor NSP5 (nonstructural  protein)  dikenal  dengan  M pro [14]  dan  3-chymotrypsin  like  protease  (3CLpro)  [15]. Reseptor ini dipilih karena mekanismenya dalam memediasi replikasi dan transkripsi protein virus [16].    Reseptor ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2) memiliki tiga fungsi fisiologis, yaitu sebagai negative  regulator  pada  sistem  renin-angiotensin,  fasilitator  transport  asam  amino,  dan  reseptor tempat terikatnya SARS-CoV maupun SARS-CoV-2 [17].
Untuk  menentukan  keefektifan  ligan  yang  diuji  sebagai  obat  baru,  dalam  penelitian  ini, dilakukan penambatan molekul, uji fisikokimia, dan toksisitas. Selain itu, dilakukan perbandingan nilai binding affinity senyawa pembanding lopinavir terhadap nitazoxanide dan senyawa pembanding chloroquine  terhadap  arbidol.  Penelitian  ini  penting  untuk  dilakukan  karena  dalam  pengembangan obat COVID-19, diperlukan prediksi sifat (ADME), toksisitas, dan gambaran interaksi obat dengan
reseptor. Uji fisikokimia menggambarkan kelarutan/solubilitas suatu senyawa, larut atau tidaknya dalam  air  (hidrofobik)/lemak  (hidrofilik),  dan  sifat  kelarutan  ini  diperlukan  untuk  menembus membran  sel  oleh  pergerakan  obat  dari  konsentrasi  tinggi  ke  rendah  (difusi  pasif)  [4].  Toksisitas merupakan kemampuan suatu zat kimia untuk menimbulkan kerusakan pada organisme baik pada saat digunakan maupun pada saat berada dalam lingkungan [18].

## 2. BAHAN DAN METODE

## 2.1. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah PyRx 0.8®, Discovery Studio Visualizer®, PyMOL®, dan AutoDockTools-1.5.6®.

## 2.2. Alat
Alat  perangkat  keras  yang  digunakan  berupa  satu  set  laptop  dengan  spesifikasi  processor Intel® Celeron® CPU N3350 @ 1,10GHz, RAM sebesar 2 GB, serta perangkat lunak sistem operasi Windows 10 Pro 64-bit (10,0, Build 19041).

## 2.3. Preparasi Ligan dan Senyawa Pembanding
Preparasi sampel diawali dengan pengunduhan ligan dan senyawa pembanding dari situs Protein Data Bank https://www.rcsb.org d engan format *pdb. Untuk data visualisasi berupa struktur dua dimensi, senyawa digambar menggunakan program ChemDraw 19.0 ® . Proses persiapan ligan untuk menjadi berkas siap pakai dengan format struktur kimia 3D dilakukan menggunakan fasilitas konversi  AutoDockTools-1.5.6®.  Ligan  yang  digunakan  adalah  nitazoxanide  dan  arbidol,  serta senyawa pembandingnya, yaitu lopinavir dan chloroquine. Kemudian, file kompleks ligan yang telah diunduh  akan  dibuka  dalam  format  pdb.  Langkah  selanjutnya  adalah  preparasi  ligan  dengan eliminasi pelarut (air), semua residu, dan  small molecule, kemudian disimpan dalam  bentuk pdbqt (Protein Data Bank, Partial Charge (Q), & Atom Type (T)).

## 2.4. Preparasi Reseptor
Preparasi reseptor diawali dengan pengunduhan struktur reseptor NSP5 (7BQY dan 2GZ7) dan ACE2 (3D0G dan 1R4L) pada situs Protein Data Bank (PDB) dalam format pdb. Preparasi protein reseptor  dilakukan  menggunakan  aplikasi  PyMOL®.  Pada  tahap  ini,  dilakukan  eliminasi  pelarut (air) dan  small molecule. Setelah itu, file disimpan dalam  bentuk pdbqt (Protein Data Bank, Partial Charge (Q), & Atom Type (T)).

## 2.5. Penentuan Minimal Energy
Penentuan  minimal  energy  dilakukan  menggunakan  program  Chem3D  19.0®.  Dilakukan replikasi  sebanyak  tiga  kali  dengan  metode  Merck  Molecular  Force  Field  94  (MMFF94),  tetapi dilakukan pengunduhan struktur tiga dimensi terlebih dahulu dari situs https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ dengan  format  *sdf.  Setelah  itu,  dilakukan  kalkulasi minimal energy  melalui  Chem3D  19.0®  dengan  cara  import  file  >  calculation  >  MMFF94  >  Perform  MMFF94 Minimization.

## 2.6. Penentuan Grid Box Center dan Sizes
Penentuan  grid  box  center  dan  sizes  dilakukan  dengan  blind  docking  tools  secara  otomatis menggunakan  aplikasi  CB-Dock®.  CB-Dock®  memprediksi  daerah  pengikatan  reseptor, menghitung  center  dan  sizes  dengan  pendekatan  deteksi  cavity  berbasis  curvature  [19].  Ligan  dan reseptor  dengan  format  pdb  diunggah  dalam  situs  http://cao.labshare.cn/cb-dock/  dan  kemudian dilakukan kalkulasi. Hasil yang didapatkan berupa interaksi antara ligan dan reseptor dalam bentuk 3D  dan  tabel  berisikan  nilai  vina  score,  ukuran  cavity,  center,  dan  size.  Hasil  tersebut  kemudian disimpan atau disalin ke dalam Microsoft Word.

## 2.7. Validasi Metode
Proses  validasi  dalam  uji  in  silico  ini  dilakukan  melalui  re-docking  native  ligand  yang  telah diunduh melalui situs Protein Data Bank https://www.rcsb.org dan ada beberapa native ligand yang dipreparasi  menggunakan  aplikasi  Discovery  Studio  Visualizer®.  Validasi  reseptor  dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan menggunakan aplikasi PyRx-Vina®. Parameter yang diamati pada tahap ini adalah nilai RMSD (root mean square deviation) yang dihasilkan dari re-docking native ligand dengan proteinnya [20]. Metode dikatakan valid dan baik apabila nilai RMSD yang dihasilkan < 2 Å [21].

## 2.8. Proses Penambatan
Proses penambatan dilakukan antara ligan dan senyawa pembanding pada masing-masing reseptor melalui perangkat lunak PyRx-Vina®. Reseptor maupun senyawa yang telah dipreparasi dimasukkan  ke  dalam  aplikasi  PyRx  0.8®  dalam  bentuk  pdbqt.  Reseptor  kemudian  diset  menjadi makromolekul, sedangkan senyawanya diset menjadi ligan. Ligan dan reseptor akan tersimpan di komputer secara otomatis  dan  akan tertera di  navigator  bagian “AutoDockTools-1.5.6®”. Reseptor dan  ligan  yang  telah  tersimpan  tadi  dimasukkan  pada  control  bagian  Vina  Wizard  pilihan  select molecule. Kemudian, dipilih tombol forward dan diatur grid box center dan sizes dari hasil aplikasi CB- Dock®.  Lalu,  dilakukan  pencatatan  informasi  vina  search  space  (center  dan  dimension),  dan  data  ini digunakan  dalam  kebutuhan  administrative,  validasi,  dan  saat  analisis  posisi  relatif.  Selanjutnya, dipilih  Run  Vina  dan  didapatkan  hasil  berupa  nilai  afinitas  dan  nilai  RMSD  untuk  kebutuhan validasi.

## 2.9. Prediksi Sifat Fisikokimia dan Toksisitas
Prediksi sifat fisikokimia ligan dilakukan dengan mengecek Kode SMILE ligan dan senyawa pembanding yang didapatkan dari aplikasi ChemDraw 19.0 ®. Kode SMILE diunggah ke dalam situs SwizzADME  http://www.swissadme.ch/.  Hasil  dianalisis  dengan  berlandaskan  hukum  lima Lipinski. Lipinski ini berupa lima aturan yang harus dipenuhi ligan agar dapat dilanjutkan ke tahap simulasi  docking.  Senyawa  dikatakan  tidak  memenuhi  aturan  Lipinski  apabila  terdapat  kesalahan lebih dari satu kriteria [4], dengan cara analisis Berat Molekul (BM), logaritma koefisien partisi (Log P (XLogP3)), hydrogen bond acceptors (HBA), hydrogen bond donors (HBD), dan molar refractivity. Untuk memprediksi  toksisitas  ligan  berdasarkan  nilai  LD 50, skin  sensitization,  Ames  toxicity,  dan hepatotoxicity, dilakukan penginputan code SMILES yang telah disiapkan tadi melalui situs pkCSM online tools https://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/prediction dan situs Protox II online tools https://tox- new.charite.de/protox_II/ untuk memprediksi nilai LD 50 .

## 3. HASIL DAN DISKUSI
Struktur kimia senyawa nitazoxanide dan arbidol serta senyawa pembanding lopinavir dan chloroquine dapat dilihat pada Gambar 1. Penentuan minimal energy pada senyawa nitazoxanide dan arbidol dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan perhitungan yang lebih akurat tentang molekul  dan  konformasi  akhir  yang  lebih  stabil  [22].  Hasil  rerata  minimal  yang  didapatkan  pada senyawa nitazoxanide dan arbidol masing-masing sebesar 12.148 kkal/mol dan 72.0405667 kkal/mol. Energi tersebut merupakan energi seminimal mungkin pada bentuk stereokimia dan bentuk paling stabil untuk dilakukan docking.
Proses  validasi  dilakukan  dengan  tujuan  untuk  memastikan  metode  yang  digunakan tervalidasi  dan  didapatkan  metode  yang  baik  sehingga  dapat  dilanjutkan  pada  tahap  penelitian berikutnya.  Parameter  yang  diamati  pada  tahap  ini  adalah  nilai  RMSD  yang  dihasilkan  dari  re- docking  native  ligand  dengan  proteinnya  [21].  RMSD  adalah  proses  pengukuran  dua  pose  dengan membandingkan posisi atom antara struktur eksperimental dengan struktur protein yang di-docking
[23]. Metode dikatakan valid dan baik apabila nilai RMSD yang dihasilkan  2 Å [21]. Hasil validasi docking dapat dilihat pada Tabel 1.
(a) (b) (c) (d)
Gambar 1. Struktur kimia senyawa (a) nitazoxanide dan (b) arbidol, serta senyawa pembanding (c) lopinavir dan (d) chloroquine
PyRx-Vina®  menghasilkan  dua  jenis  RMSD  yaitu  RMSD  lower  dan  RMSD  upper.  Namun, yang  dianalisis  hanyalah  nilai  dari  RMSD  lower,  karena  RMSD  lower  didapatkan  dari  pencarian semua  kemungkinan  atom  dalam  molekul  simetris  [24].  Artinya,  RMSD  lower  dihitung  dari pendekatan  konformasi  native  ligand  dalam  semua  simetri.  Menurut  Meli  dan  Biggin,  atom  yang tidak dapat dibedakan akan memberikan hasil yang benar dengan mengoreksi simetri sehingga nilai RMSD lower dapat lebih tepat [25].
Tabel 1. Hasil validasi docking dari nilai RMSD
Reseptor Native Ligand RMSD Lower (Å) RMSD Upper (Å) 7BQY Native ligan 1 1.751 ± 0.060 3.469 ± 0.736 2GZ7 Native ligan 2 0.185 ± 0.009 2.950 ± 0.093 3D0G Native ligan 3 1.846 ± 0.047 2.202 ± 0.079 Native ligan 4 1.852 ± 0.029 5.257 ± 0.034 1R4L Native ligan 5 1.356 ± 0.668 2.279 ± 0.458 Native ligan 3 1.805 ± 0.157 2.276 ± 0.214
Native  ligan  1  :  n-[(5-methylisoxazol-3-yl)carbonyl]alanyl-l-valyl-n~1~-((1r,2z)-4-(benzyloxy)-4-oxo-1-{[(3r)-2-
oxopyrrolidin-3-yl]methyl}but-2-enyl)-l-leucinamide
Native ligan 2 : 2-[(2,4-dichloro-5-methylphenyl) sulfonyl]-1,3- dinitro-5-(trifluoromethyl) Benzene Native ligan 3 : 2-acetamido-2-deoxy-beta-D-glucopyranose
Native ligan 4 : 2-acetamido-2-deoxy-alpha-D-glucopyranose
Native ligan 5 :(s,s)-2-{1-carboxy-2-[3-(3,5-dichloro-benzyl)-3h-imidazol-4-yl]-ethylamino}-4-methyl-pentanoic acid
Berdasarkan  proses  validasi,  diperoleh  nilai  RMSD.  Nilai  tersebut  berbeda,  kemungkinan karena  molekul  yang  dianalisis  adalah  molekul  yang  simetris  sehingga  potensi  substrukturnya sesuai  dengan  posisi  dalam  molekul  (tidak  semua  dengan  posisi  yang  sama)  [24].  Keenam  native ligand diketahui memenuhi standar validasi dengan nilai RMSD  2 Å sehingga docking senyawa uji pada reseptor masing-masing dapat dilakukan.
Hasil  dari  molecular  docking  molekul  pada  penelitian  meliputi  nilai  binding  affinity  beserta RMSD-nya. Afinitas pengikatan adalah kekuatan interaksi antara dua atau lebih molekul yang terikat secara  reversibel  [26]. Menurut  Adelina,  skor  merupakan  parameter  kekuatan  afinitas  pengikatan ligan uji terhadap reseptor [27]. Makin stabilnya interaksi ligan-protein akan dicerminkan dengan makin rendahnya skor (minus). Apabila ikatan ligan dengan reseptor makin stabil, dapat diprediksi bahwa aktivitasnya juga makin besar [28]. Hasil docking dengan menggunakan aplikasi PyRx-Vina® pada  senyawa  nitazoxanide,    senyawa  pembanding  lopinavir,  dan  native  ligand  terhadap  reseptor 7BQY  dan  2GZ7,  maupun  senyawa  arbidol,  senyawa  pembanding  chloroquine,  dan  native  ligand terhadap reseptor 3D0G dan 1R4L ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil docking senyawa uji, senyawa pembanding, dan native ligan terhadap masing-masing reseptor
Reseptor Senyawa Afinitas (kcal/mol) Center Size (x*y*z) X Y Z NSP5 (7BQY) Nitazoxanide* -5.7 ± 0 -6 ± 0 2 ± 0 9.7 ± 0.929 21*21*21 Lopinavir (Senyawa Pembanding) -5.633 ± 0.058 9 ± 0 3 ± 0 9.2 ± 1.701 26*26*26 Native ligan 1 -5.467 ± 0.208 9 ± 0 3 ± 0 5.6 ± 3.650 29*29*29 NSP5 (2GZ7) Nitazoxanide** -6.667 ± 0.153 -1 ± 0 37 ± 0.058 14.4 ± 2.223 21*21*21 Lopinavir (Senyawa Pembanding) -7.8 ± 0.1 -1 ± 0 -37 ± 0 15 ± 4.114 26*26*26 Native ligan 2 -5.6 ± 0 -23 ± 0.058 -40 ± 0.058 14.1 ± 0.305 21*21*21 ACE2 (3D0G) Arbidol*** -6.567 ± 0.208 19 ± 0.058 39 ± 0.058 68.4 ± 0.889 22*22*22 Chloroquine (Senyawa Pembanding) -4.1 ± 0.1 47 ± 0.058 -11 ± 0.058 77.6 ± 3.980 24*24*24 Native ligan 3 -3.367 ± 0.058 61 ± 0 17 ± 0 68.2 ± 0.346 18*32*18 Native ligan 4 -5.3 ± 0.1 19 ± 0 39 ± 0 76.4 ± 0.265 18*18*18 ACE2 (1R4L) Arbidol**** -8.1 ± 0 46 ± 0 5 ± 0 28.1 ± 0 35*22*35 Chloroquine (Senyawa Pembanding) -6.667 ± 0.115 46 ± 0 5 ± 0 18.7 ± 2.285 35*24*35 Native ligan 5 -9.167 ± 0.058 46 ± 0 2 ± 0 26.7 ± 1.4 35*23*35 Native ligan 3 -6.267 ± 0.058 46 ± 0 5 ± 0 27.3 ± 0.153 35*18*35
Nilai signifikansi antara senyawa uji dengan senyawa pembanding pada tiap-tiap reseptor
* : 0.114 kkal/mol
** : 0.000 kkal/mol ***  : 0.000 kkal/mol ****  : 0.034 kkal/mol
Tabel  2  menujukkan  bahwa  terdapat  senyawa  dengan  native  ligan  yang  memiliki  data replikasi  binding  affinity  yang  berbeda  dan  perbedaan  ini  diprediksi  karena  adanya  perbedaan pengikatan  ligan  dengan  asam  amino  pada  reseptor  [29].  Pada  reseptor  7BQY,  nitazoxanide memperoleh nilai binding affinity sebesar -5.7 kcal/mol, lopinavir sebesar -5.633 kcal/mol, dan native ligand sebesar -5.467 kcal/mol. Dari nilai tersebut, diketahui nitazoxanide memiliki nilai binding affinity paling baik sehingga senyawa tersebut lebih efektif (sebagai obat) dan mampu menghambat proses replikasi virus SARS-CoV-2 lebik baik. Sementara itu, pada reseptor 2GZ7, nitazoxanide memperoleh nilai binding affinity sebesar -6.667 kcal/mol, lopinavir sebesar -7.8 kcal/mol, dan native ligand sebesar - 5.6 kcal/mol. Dari nilai tersebut, diketahui lopinavir memiliki nilai binding affinity paling baik sehingga senyawa pembanding tersebut lebih efektif (sebagai obat) dan mampu menghambat proses replikasi virus SARS-CoV-2 lebik baik. Namun, nitazoxanide memilki nilai binding affinity lebih baik daripada native ligand.
Pada  reseptor  3D0G,  arbidol  memperoleh  nilai  binding  affinity  sebesar  -6.567  kcal/mol, chloroquine sebesar -4.1 kcal/mol, native ligand pertama sebesar -3.367 kcal/mol, dan native ligand kedua sebesar -5.3 kcal/mol. Dari nilai tersebut, diketahui arbidol memiliki nilai binding affinity paling baik sehingga senyawa tersebut diprediksi lebih efektif sebagai obat dan mampu menghambat perlekatan virus ke reseptor ACE2 lebih baik. Sementara itu, native ligand kedua diketahui memiliki nilai binding affinity  yang  lebih  baik  daripada  native  ligand  pertama.  Lebih  lanjut,  pada  reseptor  1R4L,  arbidol memperoleh  nilai  binding  affinity  sebesar  -8.1  kcal/mol,  chloroquine  sebesar  -6.667  kcal/mol,  native ligand  pertama  sebesar  -9.167  kcal/mol,  dan  native  ligand  kedua  sebesar  -6.267  kcal/mol.  Dari  nilai tersebut, diketahui native ligand pertama dengan nama (s,s)-2-{1-carboxy-2-[3-(3,5-dichloro-benzyl)-3h- imidazol-4-yl]-ethylamino}-4-methyl-pentanoic  acid  memiliki  nilai  binding  affinity  paling  baik  sehingga senyawa tersebut lebih efektif (sebagai obat) dan mampu menghambat perlekatan virus ke reseptor ACE2  lebih  baik.  Namun,  arbidol  memilki  nilai  binding  affinity  lebih  baik  daripada  senyawa pembanding, yaitu chloroquine.
Ikatan  hidrogen  adalah  ikatan  yang  terjadi  antara  atom  hidrogen  (H)  pada  molekul  yang satu dengan  salah satu unsur atom (F,  O, N) pada molekul lainnya, yang  merupakan  gaya dipol- dipol paling kuat [30]. Dalam sistem biologis, atom nitrogen atau oksigen merupakan donor serta akseptor,  khususnya  atom  dalam  gugus  amina  (-NH2)  dan  hidroksil (-OH).  Karena  bersifat  polar antara ikatan N-H dan O-H, atom H-nya dapat berikatan hidrogen dengan atom akseptor [31]. Ikatan hidrogen akan stabil dan memiliki ikatan yang kuat  apabila memiliki panjang ikatan  2.7  Å [32]. Makin kecil jarak ikatan hidrogen antara ligan dengan gugus asam, nilai afinitasnya makin besar [33]. Makin kecil jarak ikatan, maka ikatan makin kuat dan tidak mudah terlepas, begitu pula sebaliknya [34].
Ikatan hidrofobik merupakan molekul nonpolar tidak mengandung ion yang terhidrasi atau memiliki  momen  dipol.  Hal  tersebut  terjadi  karena  dalam  air,  molekul  tersebut  tidak  larut  atau hampir tidak larut [31]. Ikatan ini penting pada proses penggabungan daerah nonpolar ligan dengan daerah nonpolar reseptor. Daerah nonpolar molekul yang tidak larut air dan molekul air yang berada disekelilingnya  akan  bergabung  melalui  ikatan  hidrogen  membentuk  struktur  quasi-crystaline (icebergs)  [35].  Ikatan  hidrofobik  merupakan  parameter  dari  kuatnya  interaksi  asam  amino  antara ligan  dengan  reseptor  yang  berguna  dalam  membantu  mempertahankan  konformasi  pengikatan [32].
Ikatan  elektrostatik  menggambarkan  gaya  antara  atom  polar  dan  biasanya  diwakili  oleh potensial  Coulomb.  Umumnya,  terdapat  dua  pendekatan  fungsi  penilaian  untuk  interaksi  ikatan hidrogen: (i) dengan menggunakan parameter berbasis medan gaya spesifik yang terkait dengan van der Waals dan potensi energi elektrostatik; (ii) dengan menggunakan suku arah, di mana kontribusi ikatan hidrogen merupakan fungsi dari deviasi parameter geometri dari ikatan hidrogen ideal [36]. Interaksi hidrofobik dan interaksi elektrostatik dapat meningkatkan kestabilan konformasi [37]. Jenis interaksi dalam bentuk tiga dimensi ditunjukkan pada Gambar 2.
(a) (b) (c) (d)
Gambar  2.  Bentuk  tiga  dimensi  (a)  nitazoxanide(cyan)-lopinavir(ungu)  terhadap  reseptor  7BQY  (b) nitazoxanide(cyan)-lopinavir(ungu)  terhadap  reseptor  2GZ7  (c)  arbidol(cyan)-chloroquine(ungu) terhadap reseptor 3D0G (d) arbidol(cyan)-chloroquine(ungu) terhadap reseptor 1R4L
Hasil  visualisasi  3D  menunjukkan  nitazoxanide-lopinavir  pada  reseptor  2GZ7  dan  arbidol- chloroquine pada reseptor 1R4L memiliki posisi penambatan yang sama sehingga dapat diprediksi bahwa senyawa uji memiliki aktivitas penghambatan replikasi (2GZ7) atau perlekatan (1R4L) virus SARS-CoV-2. Sementara itu, nitazoxanide-lopinavir pada reseptor 7BQY dan arbidol-chloroquine pada reseptor 3D0G tidak memiliki kemiripan posisi dan sudut dari setiap atomnya. Kemiripan pose ligan dengan  senyawa  pembanding  dapat  dipengaruhi  dari  nilai  RMSD,  yang  mana  nilai  RMSD  yang mendekati  nol  akan  menyebabkan  kemiripan  pose  antara  keduanya  [34].  Jenis  interaksi  dalam bentuk tiga dimensi ditunjukkan pada Gambar 3.
(a)
(b)
…lanjutan Gambar 3
(c) (d) (e) (f) (g) (h)
Gambar 3. Bentuk dua dimensi (a) Nitazoxanide-7BQY (b) Lopinavir-7BQY (c) Nitazoxanide-2GZ7 (d) Lopinavir- 2GZ7 (e) Arbidol-3D0G (f) Chloroquine-3D0G (g) Arbidol-1R4L (h) Chloroquine-1R4L
Gambar  3  menunjukkan  garis-garis  putus.  Garis  putus-putus  tersebut  merupakan  jarak ikatan [34]. Ikatan hydrogen ditandai dengan garis putus-putus berwarna hijau lime dan hijau telur asin;  interaksi  elektrostatik  ditandai  dengan  garis  putus-putus  berwarna  oranye  serta  interaksi hidrofobik ditandai dengan garis putus-putus berwarna ungu, neon pink dan pink.
Pada Gambar 3(a) dan 3(b), terlihat senyawa nitazoxanide lebih stabil, didukung oleh adanya ikatan  hydrogen  dengan  asam  amino  Asn  151,  Arg  298,  Thr  111,  dan  Asp  295;  dan  interaksi hidrofobik dengan asam amino Ile 106 dan Val 104. Sementara, senyawa pembanding lopinavir hanya memiliki  dua  ikatan  hydrogen  dengan  asam  amino  Lys  5  dan  Lys  137;  dan  interaksi  hidrofobik dengan asam amino Arg 4. Sementara itu, pada Gambar 3(c) dan 3(d), terlihat senyawa pembanding lopinavir lebih stabil, didukung oleh adanya ikatan hidrogen dengan asam amino Gln 110 (2), Thr 111, dan Asp 295; dan interaksi hidrofobik dengan asam amino Leu 202 (2), Ile 249, His 246, Phe 294, dan Pro 293. Nitazoxanide memiliki ikatan hidrogen dengan asam amino Thr 111, Thr 292, Asn 203, Gly 109, dan Pro 293; dan hanya memiliki dua interaksi hidrofobik dengan asam amino Leu 202 dan Phe 294.
Pada Gambar 3(e) dan 3(f), terlihat senyawa arbidol lebih stabil, didukung oleh adanya ikatan hidrogen  dengan  asam  amino  Arg  273,  Glu  375,  dan  Glu  402;  interaksi  hidrofobik  dengan  asam amino His 374, Phe 274 (3), dan Pro 346; dan interaksi elektrostatik dengan asam amino Arg 273 (2). Sementara itu, chloroquine hanya memiliki dua ikatan hidrogen dengan asam amino Asp 216 dan Asp 225;  dan  hanya  memiliki  tiga  interaksi  hidrofobik  dengan  asam  amino  His  228  dan  Lys  577  (2). Selanjutnya,  pada  Gambar  3(g)  dan  3(h),  terlihat  senyawa  chloroquine  lebih  stabil,  didukung  oleh adanya ikatan hidrogen dengan asam amino Asp 367, Asp 269, Thr 371, dan Glu 375; dan interaksi hidrofobik  dengan  asam  amino  His  374,  Phe  274  (3),  dan  Pro  346  (2).  Sementara,  arbidol  hanya
memiliki tiga ikatan hidrogen dengan asam amino Thr 371 (2) dan Arg 518; dan hanya memiliki lima interaksi hidrofobik dengan asam amino Phe 274 (4) dan Pro 346.
Prediksi  sifat  fisikokimia  dilakukan  dengan  mengecek  ligan  nitazoxanide  dan  arbidol,  serta senyawa pembanding lopinavir dan chloroquine. Senyawa dikatakan tidak memenuhi apabila terdapat kesalahan lebih dari satu kriteria [4], dengan cara analisis Berat Molekul (BM), logaritma koefisien partisi  (Log  P  (XLogP3)),  hydrogen  bond  acceptors  (HBA),  hydrogen  bond  donors  (HBD),  dan  molar refractivity. SwissADME dipilih karena platform ini tidak mengeluarkan biaya dan berfungsi dalam menghitung sifat molekuler ligan berdasarkan aturan lima Lipinski [38]. Dengan menggunakan alat ini,  profil  farmakokinetik  senyawa  seperti  absorpsi,  distribusi,  dan  metabolisme  ligan  dapat dievaluasi [39]. Hasil screening sifat fisikokimia pada senyawa  nitazoxanide dan arbidol, serta pada senyawa pembanding lopinavir dan chloroquine dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3. Hasil pembacaan sifat fisikokimia dengan menerapkan hukum lima Lipinski terhadap senyawa protein reseptor
Senyawa Ketentuan Lima Lipinski Hasil BM (Dalton) LogP HBD HBA MR Nitazoxanide 307.28 2.04 1 6 76.65 Ya Arbidol 477.41 4.43 1 4 122.69 Ya Lopinavir 628.80 5.92 4 5 187.92 Tidak Chloroquine 319.87 4.63 1 2 97.41 Ya
BM : Berat Molekul  500 Dalton
LogP  : Koefisien Partisi  5 HBD  : Hydrogen Bond Donor  5 HBA  : Hydrogen Bond Acceptor  10
MR : Molar Refractivity (40  MR  130)
Dari  tabel  3,  senyawa  nitazoxanide,  arbidol,  dan  chloroquine  sama-sama  memiliki  berat molekul yang kurang dari 500 Dalton, nilai LogP kurang dari 5, nilai hydrogen bond donor kurang dari 5,  nilai  hydrogen  bond  acceptor  kurang  dari  10,  nilai  molar  refractivity  diantara  40  dan  130.  Dengan demikian,  senyawa  arbidol  dan  chloroquine  memenuhi  hukum  lima  Lipinski  dan  dapat  dikatakan mudah untuk diabsorpsi dan memiliki permeabilitas yang tinggi. Oleh karenanya, senyawa di atas dapat diadministrasikan secara oral [40].
Sementara itu, lopinavir tidak memenuhi hukum lima Lipinski karena terdapat tiga kriteria yang  tidak  terpenuhi,  yaitu  nilai  berat  molekulnya  sebesar  628.80  Da  (BM    500  Da),  nilai  LogP sebesar 5.92, dan nilai molar refractivity-nya sebesar 187.92 (40  MR  130). Senyawa dapat dikatakan tidak  memenuhi  apabila  terdapat  lebih  dari  satu  kriteria  yang  menyimpang.  Syarat  nilai  LogP (XLogP3) adalah -0.4-5. Makin besar atau positif nilai log P, Makin hidrofobik molekul tersebut. Jika sifatnya terlalu hidrofobik, tingkat toksisitasnya juga  akan tinggi karena akan tertahan lebih lama pada  lipid  bilayer  atau  dasar  struktur  membran  sel  dan  terdistribusi  lebih  luas  di  dalam  tubuh sehingga selektifitas ikatan terhadap enzim target menjadi berkurang [4]. Molar refractivity yang tidak sesuai  dengan  persyaratan  akan  menyebabkan  senyawa  nonpolar  tidak  dapat  membentuk momentum  sehingga  tidak  dapat  berikatan  dengan  reseptor,  dan  sifat  polarnya  tidak  dapat mengekskresikan sisa dari metabolisme senyawa [41]. Oleh karenanya, senyawa lopinavir akan sulit diabsorpsi dan permeabilitasnya rendah.
Toksisitas  merupakan  kemampuan  suatu  zat  kimia  untuk  menimbulkan  kerusakan  pada organisme  baik  pada  saat  digunakan  atau  pada  saat  berada  dalam  lingkungan  [18].  Uji  toksisitas dilakukan  apabila  telah  diketahui  bahwa  senyawa  memiliki  aktivitas  prediksi  yang  lebih  baik dibandingkan  senyawa  pembanding  berdasarkan  persamaan  Hubungan  Kuantitatif  Struktur  dan Aktivitas (HKSA) [42]. Macam-macam penilaian toksisitas yang dilakukan pada uji ini, yaitu LD 50 , skin sensitization, Ames toxicity, dan hepatotoxicity. Globally Harmonized System mengklasifikasikan LD 50 menjadi 6 kelas, yaitu kelas I (fatal jika tertelan): LD 50 ≤ 5mg/kg; kelas II (fatal jika tertelan): 5 LD 50 ≤  50  mg/kg;  kelas  III  (beracun  jika  tertelan):  50    LD 50 ≤  300  mg/kg;  kelas  IV  (berbahaya  jika tertelan): 300  LD 50 ≤ 2000 mg/kg); kelas V (bisa berbahaya jika tertelan): 2000  LD 50 ≤ 5000 mg/kg; dan kelas VI (tidak beracun): LD 50 5000 mg/kg [43]. Hasil dari prediksi toksisitas ditunjukkan pada Tabel 4.
Tabel  4.  Hasil  prediksi  sifat  toksisistas  senyawa  protein  nitazoxanide  dan  arbidol,  serta  pada  senyawa pembanding lopinavir dan chloroquine menggunakan pkCSM Online Tools dan Protox II Online Tools senyawa protein reseptor
Senyawa
Kategori Toksisitas Hasil (GHS)
LD 50
(mg/kg) *
skin sensitization ** Ames toxicity* * hepatot oxicity ** Nitazoxanide 1350 Tidak Ya Ya 4 Arbidol 340 Tidak Tidak Tidak 4 Lopinavir 5000 Tidak Tidak Ya 5 Chloroquine 750 Tidak Ya Ya 4 * Dengan Protox II Online Tools
** Dengan pkCSM Online Tools
Berdasarkan  tabel  4,  hasil  yang  didapatkan  untuk  semua  senyawa  adalah  terbukti  tidak  memiliki toksisitas  pada  analisis  skin  sensitization  sehingga  semua  senyawa  tidak  menimbulkan  sensitisasi  pada  kulit. Untuk hasil uji Ames toxicity, terdapat dua senyawa yang positif, yaitu nitazoxanide dan chloroquine, yang artinya, kedua  senyawa  tersebut  bersifat  mutagenik  dan  oleh  sebab  itu,  dapat  bertindak  sebagai  karsinogen  [44].
Kemudian,  uji  hepatotoxicity  menunjukkan  hasil  positif  pada  senyawa  protein  nitazoxanide  dan  senyawa pembanding lopinavir dan chloroquine sehingga dapat diprediksi bahwa ketiga senyawa tersebut toksik terhadap hepar. Selain itu, untuk toksisitas per oral pada hewan coba (LD 50 ), dilakukan pengujian dan pengklasifikasian toksisitas melalui situs Protox II Online Tools. Lethal dose 50 (LD 50 ) merupakan data statistik suatu besaran untuk menyatakan dosis tunggal suatu senyawa yang diperkirakan menyebabkan kematian atau menimbulkan efek toksik pada 50% hewan coba setelah perlakuan. Makin kecil nilai toksik, makin toksik suatu senyawa, demikian juga dengan sebaliknya [45,18]. Dari pengujian tersebut, dapat diprediksi senyawa nitazoxanide memiliki nilai LD 50 pada  hewan  coba  sebesar  1350  mg/kg,  sedangkan  senyawa  arbidol  sebesar  340  mg/kg  dan  senyawa pembanding chloroquine sebesar 750 mg/kg sehingga ketiga senyawa tersebut diklasifikasikan pada kelas 4 GHS (300    LD 50 ≤  2000  mg/kg),  yang  berarti  senyawa  tersebut  memiliki  efek  toksisitas  yang  relatif  rendah  [46].
Sementara itu, senyawa pembanding lopinavir diprediksi memiliki nilai sebesar 5000 mg/kg sehingga senyawa tersebut diklasifikasikan pada kelas 5 GHS (2000  LD 50 ≤ 5000 mg/kg), yang artinya mempunyai efek toksisitas
akut yang rendah. Makin besar nilai toksik, makin tidak toksik suatu senyawa, demikian juga dengan sebaliknya [45,18].

## 4. KESIMPULAN
Senyawa  nitazoxanide  pada  reseptor  7BQY  tidak  memiliki  perbedaan  nilai  binding  affinity yang signifikan dengan senyawa pembanding lopinavir, sedangkan nitazoxanide pada reseptor 2GZ7 dan arbidol pada reseptor 3D0G dan 1R4L memiliki perbedaan nilai  binding affinity yang signifikan masing-masing  terhadap  senyawa  pembanding  lopinavir  dan  chloroquine.  Namun,  hasil  binding affinity arbidol kurang efektif daripada native ligan dari reseptor 1R4L, sehingga penelitian selanjutnya direkomendasikan  untuk  menguji  arbidol  pada  reseptor  ACE2  dengan  kode  yang  lain.  Untuk mengembangkan  potensi  antivirus  SARS-CoV-2,  ligan  perlu  diamati  melalui  analisis  dinamika molekuler pada tahap selanjutnya.
Konflik kepentingan: Tidak terdapat konflik kepentingan pada penelitian ini.

## Referensi
1. World Health Organization. Report Of The Who On Coronavirus Disease 2019 (COVID-19); World Health Organization: Geneva, 2020.
2. Zhu, N.; Zhang, D.; Wang, W.; Li, X.; Yang, B.; Song, J.; Zhao, X.; Huang, B.; Shi, W.; Lu, R.; Niu, P.; Zhan, F.;  Ma,  X.;  Wang,  D.;  Xu,  W.;  Wu,  G.;  Gao,  G.  F.;  Tan,  W.  A  Novel  Coronavirus  from  Patients  with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med 2020, 382(8), 727-33. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa2001017.
3. Susilo, A.; Rumende, C. M.; Pitoyo, C. W.; Santoso, W. D.; Yulianti, M.; Herikurniawan, H.; Sinto, R.; Singh, G.; Nainggolan, L.; Nelwan, E. J.; Chen, L. K.; Widhani, A.; Wijaya, E.; Wicaksana, B.; Maksum, M.; Annisa, F.; Jasirwan, C. O. M.; Yunihastuti, E. Coronavirus Disease 2019: Tinjauan Literatur Terkini. Jurnal Penyakit Dalam Indonesia 2020, 7 (1).
4. Lipinski, C. A.; Lombardo, F.; Dominy, B. W. Experimental and corlianimputational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Advanced Drug Delivery Reviews 1997, 23 (1± 3), 3 ±25.
5. Rossignol, J. F. Nitazoxanide, a new drug candidate for the treatment of Middle East respiratory syndrome coronavirus. J. Infect. Public Health 2016, 9 (3), 227–230.
6. Risner, K. H.; Tieu, K. V.; Wang, Y.; Bakovic, A.; Alem, F.; Bhalla, N.; Nathan, S.; Conway, D. E.; Macklin, P.; Narayanan, A. 2020. Maraviroc inhibits SARS-CoV-2 multiplication and s-protein mediated cell fusion in cell culture. bioRxiv. DOI: https://doi.org/10.1101/2020.08.12.246389
7. Lu, R.; Zhao, X.; Li, J.; Niu, P.; Yang, B.; Wu, H.; Wang, W.; Song, H.; Huang, B.; Zhu, N.; Bi, Y.; Ma, X.; Zhan, F.; Wang, L.; Hu, T.; Zhou, H.; Hu, Z.; Zhou, W.; Zhao, L.; Chen, J.; Meng, Y.; Wang, J.; Lin, Y.; Yuan, J.; Xie, Z.; Ma, J.; Liu, W. J.; Wang, D.; Xu, W.; Holmes, E. C.; Gao, G. F.; Wu, G.; Chen, W.; Shi, W.; Tan, W. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet 2020, 395, 565-74.
8. Oliveira, M. D. L. de; Oliveira, K. M. T. de. Comparative Docking of SARS-CoV-2 Receptors Antagonists from  repurposing  drugs.  ChemRxiv,  Cambridge  Open  Engage,  Cambridge,  2020.  DOI: https://doi.org/10.26434/chemrxiv.12044538.v4.
9. Kadam,  R.  U.;  Wilson,  I.  A.  Structural  basis  of  influenza  virus  fusion  inhibition  by  the  antiviral  drug Arbidol. Proc. Natl Acad. Sci. USA 2017, 114 (2), 206–214.
10. Wrapp, D.; Wang, N.; Corbett, K. S.; Goldsmith, J. A.; Hsieh, C.; Abiona, O.; Graham, B. S.; McLellan, J. S. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 2020, 367 (6483), 1260– 1263.
11. Vankadari,  N.  Arbidol:  A  potential  antiviral  drug  for  the  treatment  of  SARS-CoV-2  by  blocking trimerization of the spike glycoprotein. International Journal of Antimicrobial Agents 2020, 56, 105998.
12. Padhi, A. K.; Seal, A.; Khan, J. M.; Ahamed, M.; Tripathi, T. Unraveling the mechanism of Arbidol binding and  inhibition  of  SARS-CoV-2:  Insights  from  atomistic  simulations.  European  Journal  of  Pharmacology 2021, 5 (894), 173836.
13. Lian, N.; Xie, H.; Lin, S.; Huang, J.; Zhao, J.; Lin, Q. Umifenovir treatment is not associated with improved outcomes  in  patients  with  coronavirus  disease  2019:  a  retrospective  study.  Clinical  Microbiology  and Infection 2020, 26, 917-921
14. Wu, C.; Liu, Y.; Yang, Y.; Zhang, P.; Zhong, W.; Wang, Y.; Wang, Q.; Xu, Y.; Li, M.; Li, X.; Zheng, M.; Chen, L.;  Li,  Hua.  Analysis  of  therapeutic  targets  for  SARS-CoV-2  and  discovery  of  potential  drugs  by computational methods. Acta Pharmaceutica Sinica B 2020, 10 (5), 766-788.
15. Zhang, L.; Lin, D.; Sun, X.; Curth, U.; Drosten, C.; Sauerhering, L.; Becker, S.; Rox, K.; Hilgenfeld, R. Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved a-ketoamide inhibitors. Science 2020, 368 (6498), 409-412. DOI: https://doi.org/10.1126/science.abb3405.
16. Jin, Z.; Du, X.; Xu, Y.; Deng, Y.; Liu, M.; Zhao, Y.; Zhang, B.; Li, X.; Zhang, L.; Peng, C.; Duan, Y.; Jing Yu, Lin Wang, Kailin Yang, Fengjiang Liu, Rendi Jiang, Xinglou Yang, Tian You, Xiaoce Liu, Xiuna Yang, Fang Bai,  Hong  Liu,  Xiang  Liu,  Luke  W.  Guddat,  Wenqing  Xu,  Gengfu  Xiao,  Chengfeng  Qin,  Zhengli  Shi, Hualiang Jiang, Zihe Rao, Haitao Yang. Structure  of Mpro  1 from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors. bioRxiv 2020. DOI: https://doi.org/10.1101/2020.02.26.964882.
17. Gheblawi, M.; Wang, K.; Viveiros, A.; Nguyen, Q.; Zhong, J.; Turner, A. J.; Raizada, M. K.; Grant, M. B.; Oudit,  G.  Y.  AngiotensinConverting  Enzyme  2:  SARS-CoV-2  Receptor  and  Regulator  of  the  Renin- Angiotensin System: Celebrating the 20th Anniversary of the Discovery of ACE2. Circulation research 2020, 126, 1456-1474. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.120.317015.
18. Priyanto. Toksikologi: Mekanisme, Terapi Antidotum dan Penilaian Resiko; Leskonfi: Depok, Indonesia, 2009.
19. Trott,  O.;  Olson  A.  J.  Software  news  and  update  AutoDock  Vina:  Improving  the  speed and accuracy  of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem 2009, 31, 455–61.
20. Putri,  P.  V.  P.;  Susanti,  N.  M.  P.;  Laksmiani,  N.  P.  L.  Senyawa  Kuersetin  sebagai  Agen  Antikanker Kolorektal Secara In Silico. Journal of Chemistry 2019, 13 (2), 166 – 171.
21. Khelfaoui,  Hadjer;  Harkati,  D.;  Saleh,  B.  A.  Molecular  docking,  molecular  dynamics  simulations  and reactivity, studies on approved drugs library targeting ACE2 and SARS-CoV-2 binding with ACE2. Journal of Biomolecular Structure
and Dynamics
2021, 39 (18), 7246-7262. DOI: https://doi.org/10.1080/07391102.2020.1803967.
22. Carvalho, I.; Monica T. P.; Áurea D. L. B.; Lilian S. C. B. Introduction to molecular modeling of drugs in the experimental course of pharmaceutical chemistry. New Chemistry 2003, 26 (03), 1-38.
23. Lestari,  T.  Studi  Interaksi  Senyawa  Turunan  1,3-Dibenzoiltiourea  sebagai  Ribonukleotida  Reduktase Inhibitor. Jurnal Farmasi Indonesia 2015, 7, 163 – 169.
24. Bell, E. W.; Zhang, Yang. DockRMSD: an open-source  tool  for atom mapping and RMSD calculation  of symmetric  molecules  through  graph  isomorphism.  J  Cheminform  2019,  11  (40).  DOI: https://doi.org/10.1186/s13321-019-0362-7.
25. Meli, R.; Biggin, P. C. Spyrmsd: Symmetry-Corrected RMSD Calculations in Python. J Cheminform 2020, 12 (49). DOI: https://doi.org/10.1186/s13321-020-00455-2.
26. Kastritis, P. L.; Bonvin, A. M. J. J. On the binding affinity of macromolecular interactions: daring to ask why proteins interact. J R Soc Interface 2012, 10, 20120835. DOI: http://dx.doi.org/10.1098/rsif.2012.0835.
27. Adelina,  R.  Uji  Molecular  Docking  Annomuricin  E  dan  Muricapentocin  pada  Aktivitas  Antiproliferasi. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 2014, 12 (1). ISSN 1693-1831.
28. Hardjono,  S.  Modifikasi  Struktur  1-(Benzoiloksi)urea  dan  Hubungan  Kuantitatif  Struktur-Aktivitas Sitotoksiknya. Disertasi, Universitas Airlangga, Surabaya, 2012.
29. Frimayanti, N.; Djohari, M.; Khusnah, A. N. Molekular Docking Senyawa Analog Kalkon sebagai Inhibitor untuk  Sel  Kanker  Paru-Paru A549.  Jurnal  Ilmu  Kefarmasian  Indonesia  2021,  19  (1).  ISSN:  1693-1831,  E- ISSN: 2614-6495.
30. Effendy.  Teori  VSEPR  Kepolaran  dan  Gaya  Antarmolekul;  Bayumedia  Publishing:  Malang,  Indonesia, 2006.
31. Lodish, H.; Berk, A.; Zipursky, S. L.; Matsudaira, P.; Baltimore, D.; Darnell, J. Molecullar Cell Biology 4th Edition; W.H. Freeman Company: New York, 2000.
32. Chairunnisa, A.; Runadi, D. Aktivitas Kalkon Terhadap Reseptor Esterogen Β (Er-Β) Sebagai Antikanker Payudara Secara In Vitro Dan In Silico. Farmaka 2016, 14 (2), 1–8.
33. Qoonita,  F.;  Daryono,  H.T.  Hubungan  Kuantitatif  Struktur  Dan  Aktivitas  Senyawa  Turunan  3- Haloasilaminobenzoilurea Sebagai Inhibitor Pembentukan Mikrotubulus. Acta Pharmaceutica Indonesia 2012, 27, 76-80.
34. Rachmania, R. A.; Hariyanti H.; Zikriah, R.; Soultan, A. Studi In Silico Senyawa Alkaloid Herba Bakung Putih (Crinum Asiaticum L.) pada Penghambatan Enzim Siklooksigenase (COX). Jurnal Kimia VALENSI 2018, 4 (2), 124-136.
35. Siswandono. Kimia medisinal I, ed kedua; Airlangga University Press: Surabaya, 2016.
36. Guedes,  I.  A.;  Pereira,  F.  S.  S.;  Dardenne,  L.  E.  Empirical  Scoring  Functions  for  Structure-Based  Virtual Screening:  Applications,  Critical  Aspects,  and  Challenges.  Front.  Pharmacol  2018,  9,  1089.  DOI: https://doi.org/10.3389/fphar.2018.01089.
37. Syahputra,  G.;  Ambarsari,  L.; Sumaryada,  T.  Simulasi  Docking  Kurkumin  Enol,  Bisdemetoksikurkumin Dan Analognya Sebagai Inhibitor Enzim 12- Lipoksigenase. Jurnal Biofisika 2014, 10(1), 55-67.
38. Lipinski,  C.  A.  Drug-like  properties  and  the  causes  of  poor  solubility  and  poor  permeability. J.Pharmacol.Toxicol.Methods 2000, 44(1), 235–249.
39. Daina, A.; Zoete, V. A. BOILED-Egg to Predict Gastrointestinal Absorption and Brain Penetration of Small Molecules. ChemMedChem 2016, 11(11), 1117–1121.
40. Adriani.  Prediksi  Senyawa  Bioaktif  dari  Tanaman  Sanrego  (Lunasia  Amara  Blanco)  Sebagai  Inhibitor Enzim Siklooksigenase-2 (COX-2) Melalui Pendekatan Molecular Docking. Jurnal Ilmiah Pena 2018, 1 (1), 6-11.
41. Bachtiar; K. R.; Susanti, S.; Mardianingrum, R. Uji Aktivitas Antiinflamasi Senyawa dalam Minyak Atsiri Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb) Secara In Silico. Journal of Pharmacopolium 2021, 4 (1).
42. Pires, D. E.; Blundell, T. L.; Ascher, D. B. pkCSM: Predicting Small-Molecule Pharmacokinetic and Toxicity Properties Using Graph-Based Signatures. J. Med. Chem. 2015, 58 (9), 4066-4072.
43. El-Din, H. M. A.; Loutfy, S. A.; Fathy, N.; Elberry, M. H.; Mayla,  M. A.; Kassem, S.; Naqvi, A. Molecular docking based screening of compounds against VP40 from Ebola virus. Bioinformation 2016, 12 (3), 192- 196.
44. Kesuma,  D.;  Siswandono;  Purwanto,  B.  T.;  Hardjono,  S.  Uji  In  silico  Aktivitas  Sitotoksik  dan  Toksisitas Senyawa Turunan N-(Benzoil)-N’- feniltiourea Sebagai Calon Obat Antikanker. Journal of Pharmaceutical Science and Clinical Research 2018, 3 (1), 01-11. DOI: https://doi.org/10.20961/jpscr.v3i1.16266.
45. Hodgson, E.; Levi P. E. A Textbook of Modern Toxicology; Mc Graw-Hill Higher Education: Singapore, 2000.
46. Hodge, H.C.; Sterner, J.H. Tabulation of Toxicity Classes. Journal American Industrial Hygiene Association Quarterly 1949, 10 (4), Issue 4, 93-96.
© 2022 by the authors. Submitted for possible open access publication under the terms and  conditions  of  the  Creative  Commons  Attribution  (CC  BY)  license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).