## Analisis Variasi Genetik Gen L1 HPV-52 Menggunakan RFLP secara in Silico
Wahyu Mustika Rani 1* , Rika Dea Puspita 2 , Nadia Sefina 3 , Nailus Sa’adah 4 , Afifatul Achyar 5
1,2,3,4 Jurusan Biologi, Departemen Biologi, Universitas Negeri Padang, Kota Padang, Indonesia. * E-mail: wayawrani18@gmail.com
Article Info: Received: 7 Desember 2023 in revised form: 29 Januari 2024 Accepted: 26 Februari 2024
Available Online: 10  Maret 2024

## ABSTRACT
Around the world, cervical cancer is fourth in the amount of deaths caused by cancer. The main risk factor of cervical cancer is  a  persistent  oncogenic  Human  Papillomavirus  (HPV) infection. According to DNA genotyping, HPV-52 and HPV-58 were the most prevalent oncogenic HPV types in China when it  came  about  the  prevalence  of  HPV-related  cervical  cancer infections.  HPVs  can  be  classified  as  low  risk  (LR-HPV), potential high risk (pHRHPV), and high risk (HR-HPV) based on their correlation with precursor lesions and cervical cancer. The  homogeneity  of  the  L1  main  capsid  protein  and  DNA sequences is the foundation for HPV classification. Variants in genetics and mutations can be identified by in silico techniques. This study used in silico RFLP to explore the genetic variation in the L1 HPV 52 gene sequence from NCBI PopSet 378724952. DNA  sequences  are  digested  by  restriction  enzymes  for  the purpose  of  screening.  RFLP  using  the  Benchling  facility  in silico. Analyzing genetic variability with MEGA 11. The point mutation  that  resulted  in  the  creation  of  A1  and  A2  allele fragments  was  identified  in  the  5'-TCGA-3'  restriction recognition site using in silico RFLP results obtained with the TaqI  enzyme.  The  A1  allele  is  the  result  of  mutations  who change the A2 allele's nucleotide base. These genetic changes also impact the recognition of restriction sites and the length of DNA fragments that are released. In silico RFLP by Allele A1 estimated  the  variation  in  genetics  within  the  Chinese population PopSet 378724952, whose percentage was 15%. Keywords : Gene L1;
Variation  in genetics;
RFLP; In silico

## Corresponding Author:
Wahyu Mustika Rani Jurusan Biologi Departemen Biologi Universitas Negeri Padang Kota Padang
Indonesia E-mail:
wayawrani18@gmail.com
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.
How to cite (APA 6 th Style): Rani,W.M., Puspita,R.D., Sefina, N., Sa’adah, ., Achyar, A. (2024). Analisis Variasi Genetik Gen L1 HPV-52 Menggunakan RFLP secara in Silico . Indonesian Journal of Pharmaceutical  (e-Journal), 4 (1), 82-96.
Indonesian Journal of Pharmaceutical Education (e-Journal) 2024; 4 (1): 82 – 96 ISSN : 2775- 3670 (electronic) Journal Homepage: http://ejurnal.ung.ac.id/index.php/ijpe/index DOI: 10.37311/ijpe.v4i1.24496

## ABSTRAK
Kanker  serviks  adalah  penyebab  utama  kematian  keempat  akibat  kanker di  seluruh  dunia. Penyebab  utama  kanker  serviks  adalah  infeksi  persisten Human  Papillomavirus (HPV) onkogenik.  Prevelensi  kasus  infeksi  kanker  serviks  yang  disebabkan  oleh  HPV  di  China berdasarkan genotipe DNA ditemukan tipe HPV onkogenik paling umum adalah HPV-52 dan HPV-58.  Berdasarkan  hubungan  mereka  dengan  kanker  serviks  dan  lesi  prekursor,  HPV diklasifikasikan menjadi low risk (LR-HPV), potential high risk (pHRHPV), dan high risk (HR- HPV).  Klasifikasi  HPV  berdasarkan  pada  tingkat  homogenitas  sekuen  DNA  dan  protein kapsid major L1. Metode in silico digunakan untuk mengetahui mutasi dan variasi genetik. Tujuan penelitian ini untuk mengeksplorasi variabilitas genetik pada gen L1 HPV 52 sekuen dari  NCBI  PopSet  378724952  menggunakan  RFLP  secara in  silico. Skrining  enzim  restriksi menggunakan situs restriction enzyme digest of DNA . RFLP secara in silico menggunakan situs Benchling .  Varibilitas  genetik  menggunakan  aplikasi  MEGA  11.  Hasil  RFLP  secara in  silico menggunakan enzim TaqI situs pengenalan restriksi 5'-TCGA-3' menunjukkan adanya mutasi titik yang menghasilkan fragmen alel A1 dan A2. Alel A1  merupakan hasil perubahan susunan basa nukleotida dari Alel A2 akibat terjadinya mutasi turut merubah pengenalan restriction sites dan hasil panjang fargmen DNA. Keragaman genetik berdasarkan RFLP secara in silico oleh Alel A1 sebesar 15%  pada populasi China PopSet 378724952.
Kata Kunci: Gen L1; Variasi genetik; RFLP; In silico

## 1. Pendahuluan
Menurut laporan data GLOBOCAN proyek dari International Agency for Research on Cancer (IARC), pada tahun 2020 diperkirakan 604.000 wanita didiagnosis menderita kanker  serviks  secara  global  yang  diantaranya  342.000  wanita  meninggal  akibat penyakit tersebut. Kanker serviks adalah kanker yang sering  ditemukan pada wanita dan  penyebab  utama  kematian  keempat  akibat  kanker  setelah  kanker  payudara, kolorektal, dan paru-paru di seluruh dunia [1]. Penyebab utama kanker serviks adalah infeksi persisten dari HPV onkogenik yang ditularkan melalui kontak seksual. Negara China  dan  India  memiliki  lebih  dari  sepertiga  kasus  kanker  serviks  secara  global (106.000 di China dan 97.000 di India)  [2]. Tingginya prevelensi kasus kanker serviks pada  negara  berkembang  dikarenakan  terbatasnya  akses  skrining  dan  pengobatan akibatnya sebagian pasien sudah keadaan stadium lanjut [3].
Keseluruhan  prevelensi  kasus  infeksi  kanker  serviks  yang  disebabkan  oleh Human Papillomavirus di China adalah HPV-52 (4,3%), HPV-58 (3,5%), HPV-16 (2,2%) HPV-39  (2,0%),  HPV-18  (1,2%),  serta  1,0%  untuk  tipe  HPV  lainnya  baik  untuk perhitungan wanita ataupun pria. Tipe HPV onkogenik yang umum ditemukan pada wanita  adalah  HPV-52  (6,6%),  HPV-58  (3,5%),  HPV-16  (3,4%),  sedangkan  pada  pria sering  dijumpai  HPV-58  (3,5%),  HPV-52  (1,5%),  HPV-39  (0,9%).  Hasil  meta  analisis terhadap  satu  juta  wanita  di  lima  benua  secara  umum  ditemukan  HPV-16,  HPV-18, HPV-52, sedangkan pada pria tipe yang paling sering dijumpai adalah HPV-58, HPV- 52, dan HPV-39. Prevelensi HPV onkogenik lebih tinggi pada wanita dibandingkan pria yang kemungkinan disebabkan perbedaan riwayat alami HPV pada kedua jenis kelamin [4].  Hasil  serupa  ditemukan  pada  penelitian  yang  dillakukan  oleh  Mai et  al .  (2021), subtipe  HPV  yang  paling  umum  ditemukan  adalah  HPV-52  dan  HPV-58  di  wilayah timur Asia. Studi epidemiologis menemukan bahwa distribusi HPV tipe spesifik dapat berbeda antar belahan dunia. Hal ini dapat disebabkan oleh faktor demografi seperti etnis, status sosial ekonomi, kondisi kesehatan, dan tingkat pendidikan [5].
Gambar 1. Skema genom HPV (Freitas et al. , 2021)
Human Papillomavirus (HPV) merupakan virus berukuran kecil dengan diameter 45-55  nm,  memiliki  genom  sirkular  dengan double  stranded DNA  dengan  kapsid berbentuk icosahedral dan tidak memiliki selubung ( nonenvelop ) termasuk dalam famili Papovaviridae. Virus ini sangat spesifik jaringan dan menginfeksi kulit dan membran mukosa epitel [6]. Organisasi genom HPV terdiri dari 3 region yaitu early gene (E1 – E7), late  gene (L1  dan  L2)  dan Upper  Regulating  Region (URR).  URR  mempunyai  tempat berikatan dari berbagai reppresor dan aktivator pada saat terjadinya transkripsi. Late gene (L1 dan L2) berperan dalam mengkode protein kapsid virus selama stadium akhir virion terbentuk. Early gene (E1, E2, E4, E5, E6 dan E7) berperan untuk mengkode protein yang sangat penting untuk replikasi, transkripsi, transformasi, dan imortalisasi [7]. Dari berbagai  penelitian,  protein  mayor  L1  dan  minor  L2  berperan  penting  dalam  proses perlekatan virus pada membran basal, menginisiasi infeksi, dan masuknya virus ke sel epitel kulit dan mukosa [8].
Berdasarkan urutan kapsid protein L1, lebih dari 200 jenis HPV yang berbeda telah diidentifikasi dan sekitar 30-40 dapat menginfeksi lapisan epitel saluran anogenital dan area mukosa lainnya pada tubuh manusia. Berdasarkan hubungan mereka dengan kanker  serviks  dan  lesi  prekursor,  HPV  dapat  diklasifikasikan  menjadi low  risk (LR- HPV), potential high risk (pHR-HPV), dan high risk (HR-HPV). Terdapat beberapa HPV tipe high risk diantaranya HPV- 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 dan 82 beresiko  dalam  menyebabkan  kanker  serviks;  dan  beberapa  HPV  tipe low  risk diantaranya  HPV-  6, 11, 40, 42,  43, 44, 54, 61, 70, 72, dan 81  [9]  [10].  Klasifikasi HPV dilakukan berdasarkan pada tingkat homogenitas DNA. International Committee on the Taxonomy  of  Viruses (ICTV)  mengelompokkan Papillomavirus ke  dalam  keluarga Papillomaviridae. Famili Papillomaviridae memiliki lebih dari 50 genus dimana hanya 5 diantaranya yang berhubungan dengan infeksi pada manusia, yaitu Alphapapilloma virus,  Betapapi  lloma  virus,  Gammapapillomavirus,  Mupapillomavirus,  dan Nupapillomavirus.  Namun  yang  paling  sering  ditemukan  pada  pasien  adalah  genus Alphapapillomavirus [10].
Salah satu metode yang dapat digunakan untuk analisis variasi genetik adalah Restriction  Fragment  Length  Polymorphism (RFLP).  RFLP  adalah  teknik  yang memanfaatkan enzim restriksi untuk memotong DNA pada lokasi spesifik yang disebut situs restriksi. Panjang fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan enzim restriksi dapat  digunakan  untuk  membedakan  variasi  genetik  pada  tingkat  DNA.  Perbedaan dalam  urutan  DNA  homolog  yang  dapat  dideteksi  dengan  adanya  fragmen  dengan panjang  yang  berbeda  setelah  pemotongan  sampel  DNA  yang  bersangkutan  dengan endonuklease  restriksi  spesifik.  RFLP,  sebagai  marker  molekuler,  spesifik  untuk
kombinasi  restriksi  enzim/klon  tunggal.  Sebagian  besar  marker  RFLP  bersifat  ko- dominan  (kedua  alel  dalam  sampel  heterozigot  akan  terdeteksi)  dan  sangat  spesifik lokus. Probe RFLP adalah urutan DNA berlabel yang hibridisasi dengan satu atau lebih fragmen  sampel  DNA  yang  dipotong  setelah  dipisahkan  oleh  elektroforesis  gel, sehingga mengungkapkan karakteristik pola blotting unik untuk genotipe tertentu pada lokus  tertentu.  Klon  DNA  genom  atau  cDNA  salinan  pendek,  tunggal  atau  rendah biasanya digunakan sebagai probe RFLP [11]. RFLP dapat digunakan untuk mendeteksi adanya  variasi  genetik,  hubungan  kekerabatan,  spesiasi  dan  domestikasi,  pemetaan genom, tagging gen, pustaka cDNA, dan lain-lain [9].
Variasi  genetik  merupakan  perubahan  yang  terjadi  pada  nukleotida,  gen, kromosom, dan genom pada suatu organisme. Variasi genetik pada suatu populasi akan berpengaruh  terhadap  kemampuan  bertahan  hidup  suatu  individu.  Semakin  tinggi variasi  genetik  yang  terdapat  pada  suatu  populasi,  maka  semakin  baik  kemampuan individu dalam beradaptasi terhadap perubahan lingkungan [12]. Variasi genetik dapat dikaji secara in silico menggunakan sekuen gen yang tersedia pada data genebank NCBI. Dalam konteks analisis variasi genetik, RFLP dapat dilakukan secara in silico dengan menggunakan  perangkat  lunak  atau  alat  bioinformatika  untuk  mensimulasikan pemotongan DNA dengan enzim restriksi tertentu. Variasi genetik pada protein mayor L1 dapat mempengaruhi sifat biologis dan epidemiologis virus serta respon imun  inang terhadap infeksi HPV [13]. Berdasarkan uraian tersebut, penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi  dan  menganalisis  variabilitas  genetik  pada  sekuen  gen  L1  HPV  52 menggunakan RFLP secara in silico.

## 2.  Metode Bahan
Sekuen gen L1 HPV 52 yang digunakan untuk uji in silico diunduh dalam format FASTA dari NCBI dengan PopSet 378724952 yang dikirimkan oleh Chen,Q., Luo,Z.-Y., Lin,M.,  Zheng,J.-K.,  Yang,L.,  Yang,L.-Y.  and  Ju,G.-Z  dalam  studinya  yang  berjudul
“Evaluation of HPV 52  genetic variability in eastern  Guangdong”
( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JN874436.1 ). Dalam PopSet tersebut terdapat 21 sekuen gen pengkode protein L1 HPV 52 berukuran 1.590 bp ( complete cds ) dengan accession number JN874416.1 – JN874436.1.  Chen et al. (2011), mendeskripsikan bahwa sekuen tersebut diisolasi dari sel serviks manusia berupa DNA genom di The Central Laboratory, Chaozhou Central Hospital, Guangdong, China.

## Skrining Kandidat Enzim Restriksi
Skrining  enzim  restriksi  yang  akan  digunakan  pada  RFLP in  silico dengan menggunakan situs ( http://insilico.ehu.es/restriction/ ). Situs ini dapat menampilkan perbandingan  pola  restriksi  dari  sampel  sekuen  DNA  yang  diuji. Sekuen  DNA yang sudah diperoleh dalam format FASTA dari data genebank NCBI, kemudian diunggah pada slot yang sudah disediakan. Selanjutnya akan terlihat hasil alignment sekuen. Jika sekuen  tersebut  memiliki  susunan  dan  panjang  sekuen  DNA  yang  sama,  maka  akan dibuang  untuk  mempermudah  analisis.  Langkah  selanjutnya  yaitu  “onl y  restriction enzymes with known bases (no N,R,Y…)” digunakan agar memperoleh kandidat enzim restriksi dengan sisi pengenala n yang pasti. Kemudian “get the list restriction enzyme” dipilih untuk memperoleh enzim restriksi yang akan digunakan.

## RFLP secara in Silico
RFLP adalah metode analisis sekuen nukleotida menggunakan enzim restriksi tertentu  sehingga  diperoleh  polimorfisme  berupa  perbedaan  panjang  fragmen  hasil restriksi atau pemotongan. RFLP dilakukan secara in silico atau restriksi secara virtual menggunakan  situs  ( https://www.benchling.com/ ).  Tahap  awal  yang  dilakukan adalah  meng-impor  sekuen  DNA  yang  sudah  diunduh  dari  NCBI  ke  dalam  folder project  di  situs Benchling .  Selanjutnya  mengklik  tanda  gunting  pada  pojok  kanan. Kemudian  tools  “find  enzyme”  dipilih  dan  nama -nama  enzim  restriksi  yang  sudah ditentukan sebelumnya pada saat skrining, diketik pada kolom. Selanjutnya, klik menu “run  digest”  untuk  restriksi.  Dengan  tools  “virtual  digest”  dapat  melihat  gambar elektroforegram.

## 3.  Hasil dan Pembahasan Alignment Sekuen DNA
Semua  sekuen  DNA  yang  telah  dikumpulkan dari  genebank NCBI kemudian dialignment.  Alignment  sekuen  DNA  dilakukan  menggunakan  MEGA11 software CLUSTALW.  Clustal  adalah  perangkat  lunak  yang  digunakan  untuk  penyelarasan urutan  ganda  karena  skalabilitas  dan  kemampuan  untuk  menangani  keberpihakan skala besar secara efisien. Alignment diperlukan untuk mengetahui tingkat homologi, variabilitas genetik, dan identifikasi sekuen yang berpotensi sebagai barcode. Sekuen yang berpotensial sebagai DNA barcode adalah sekuen pendek yang unik dan berbeda dengan yang lain [14][15].
Rani et al., 2024; Indonesian Journal of Pharmaceutical Education (e-Journal); 4(1): 82-96
Rani et al., 2024; Indonesian Journal of Pharmaceutical Education (e-Journal); 4(1): 82-96
Gambar 2. Hasil alignment sekuen gen L1 menggunakan software CLUSTALW Mutasi genetik terjadi pada urutan basa ke-14, 207, 247, 264, 345, 375, 408, 444, 519, 546, 620, 621, 654, 879, 921, 975, 999, 1023, 1134, 1137, 1192, 1200, 1230, 1246, 1260, 1353, 1377, 1404, 1488, 1548, dan 1569
Hasil alignment merupakan pensejajaran urutan sekuen DNA. Homologi DNA ditunjukkan  oleh  tanda  (.)  dan  bagian  yang  diblock  merah  merupakan  mutasi  titik (Gambar 2). Secara ringkas hasil alignment dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 1. Frekuensi mutasi basa nukleotida Basa Nukleotida A T C G A - 1,92 1,14 25,92 T 1,85 - 9,63 1,34 C 1,85 16,31 - 1,34 G 35,65 1,92 1,14 - Total (%) 87,69 12,31 Keterangan: Substitusi transisi = tulisan bold Substitusi tranversi   = tulisan italic Source: Tamura et al., 2021
Berdasarkan hasil frekuensi mutasi yang ditunjukkan Tabel.1 bahwa perubahan basa nitrogen yang terjadi merupakan mutasi titik yang bersifat substitusi transisi dan substitusi tranversi. Mutasi titik dikenal juga Single Nucleutide Polymorphism (SNP). Nilai substitusi  transisi  berkisar  87,69%  dan  substitusi  tranversi  berkisar  12,31%    yang didominansi oleh mutasi substitusi transisi. Hal ini disebabkan ikatan hidrogen antara pasangan  basa  nitrogen  yang  lemah  [16].  Substitusi  transisi  adalah  perubahan  basa nitrogen dari basa sejenis (purin-purin) atau (pirimidin-pirimidin). Substitusi tranversi adalah perubahan basa nitrogen berbeda jenis (purin-pirimidin) atau (pirimidin-purin). Menurut  Ubaidilah  dan  Sutrisno  (2009),  setiap  perubahan  basa  nukleotida  dapat menunjukkan karakter pembeda dari spesies tersebut dan kemungkinan bersifat unik yang  mengarah  ke  proses  spesiasi.  Pada  saat  pewarisan  keturunan  nenek  moyang, terdapat  sekuen  DNA  yang  bersifat  tetap  ( conserve )  dan  ada  yang  terpisah  melalui perubahan basa nukleotida karena adanya mutasi [17].
Tabel 2. Parameter analisis variasi genetik sekuen gen L1 Sampel NCBI Posisi basa ke- Mutasi titik (SNP) Implikasi Missense mutation JN874416.1 - - - - JN874417.1 207 G>A Synonymous substitution - JN874418.1 - - - - JN874419.1 207; 408; 546; 654; 1137; 1200; 1230; 1260; 1353;
1488
G>A; C>T; A>G; A>G;
G>T; C>T; G>A;
T>C; A>C; A>G
Synonymous substitution - JN874420.1 620 A>C Missense mutation Asparagine > Threonine JN874421.1 1404 A>C Missense mutation Glutamic acid > Aspartic acid JN874422.1 1230 G>A Synonymous substitution - JN874423.1 264; 375; 620; 621; 999;
1192
A>G; A>G; A>C; T>C; A>G; G>A Missense mutation; synonymous substitution Asparagine > Threonine; Glutamic acid > Lysine
JN874424.1 14; 207; 345;
408; 519; 546; 879;
1134; 1137; 1200; 1230; 1260;
1488; 1548
T>C;
G>A;
A>G;
C>T;
G>A; A>G; C>T; G>A: G>T; C>T;
G>A; T>C;
A>G; G>A;
Missense mutation; synonymous substitution Leucine > Serine JN874425.1 1569 G>A Synonymous substitution - JN874426.1 264 A>G Synonymous substitution - JN874427.1 247; 444; A>G; G>A; Missense mutation; synonymous substitution Serine > Glycine
921; 975; A>G; T>A
JN874428.1 1246; 1377 G>A; A>G Missense mutation; synonymous substitution Aspartic acid > Asparagine JN874429.1 - - Synonymous substitution - JN874430.1 1023 G>A Synonymous substitution - JN874431.1 14; 207; 345; 408; 519; 546; 879;
1134; 1137;
1200; 1230; 1260;
1488; 1548 T>C; G>A;
A>G;
C>T;
G>A; A>G; C>T; G>A; G>T; C>T; G>A;
T>C;
A>G; G>A
Missense mutation; synonymous substitution Leucine > Serine JN874432.1 - - Synonymous substitution - JN874433.1 - - Synonymous substitution - JN874434.1 519; 546; 879 G>A; A>G; C>T Synonymous substitution - JN874435.1 519; 546; 879 G>A;
A>G;
C>T Synonymous substitution - JN874436.1 207; 921 G>A; A>G Synonymous substitution - Total 65 mutasi titik 8 mutasi missense Keterangan:
Tulisan bold pada kolom ke-3 menggambarkan terjadinya mutasi missense
Mutasi titik sering terjadi pada sampel accession number JN874419.1, JN874424.1, dan JN874431.1. Mutasi tidak terjadi pada sampel JN874416.1, JN874418.1, JN874429.1, JN874431.1, dan JN874433.1. Dari total 65 mutasi titik, 8 diantaranya merupakan mutasi missense yang  menyebabkan  terjadinya  perubahan  translasi  asam  amino  protein sebagaimana yang ditunjukkan oleh Tabel 2.  Pada accession number JN874423.1 terjadi perubahan asam amino dari Glutamic acid menjadi Lysine sehingga partikel virus dapat berikatan pada reseptor primer sel penjamu (HSPGs dan non-HSPGs protein). Interaksi reseptor primer HSPGs yang bermuatan negatif dimediasi oleh Lysine pada permukaan kapsid  L1  virus  yang  bermuatan  positif  yang  menyebabkan  terjadinya  perubahan
konformasi dalam kapsid sehingga reseptor HSPGs menyalurkan transfer partikel virus ke  reseptor  sekunder  yaitu  integrin.  Asam  amino Lysine banyak  ditemukan  pada permukaaan protein kapsid mayor L1 HPV yang diduga memiliki kaitan dalam proses pengikatan  dengan  reseptor  primer  heparin  sulfat  proteoglikan.  Selain  itu,  protein mayor  L1  memiliki  region conserve yang  tersusun  dari Cystein dan Lysine yang  juga berkaitan  dalam  proses  pengikatan  antara  virion  dan  reseptor  host.  Hal  ini  dapat berimplikasi  pada  variabilitas  genetik  dan  bagaimana  respon  imun  sel  penjamu terhadap virus [18][19].

## Skrining Kandidat Enzim Restriksi
Berdasarkan output yang diperoleh dari skrining kandidat enzim restriksi pada situs  ( http://insilico.ehu.es/restriction/ ),  terdapat  banyak  sisi  pengenalan  enzim restriksi kemudian dipilih salah satunya yaitu T'CG_A yang dikenal sebagai enzim TaqI. Enzim  ini  dipilih  karena  memiliki  polimorfisme  fragmen  restriksi  cukup  tinggi, kodominan, dan hasil konsisten antar laboratorium. Hasil skrining enzim restriksi Taq1 dapat memotong di dua urutan sekuen yaitu ke-198 dan 1199 pada gen L1 HPV-52 dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Skrining enzim restriksi secara in silico Enzim TaqI adalah restriksi endonuklease yang mengenali dan memotong DNA pada  situs  pengenalan  spesifik  yang  terdiri  dari  sekuens  nukleotida  tertentu.  TaqI mengenali sekuens 5'-TCGA-3'. Hasil pemotongan adalah potongan DNA dengan ujung tumpul ( blunt ends ) pada kedua ujungnya. Enzim restriksi TaqI sering digunakan dalam teknik analisis DNA, pemotongan DNA, analisis restriksi, dan teknik rekayasa genetika. Salah satu penggunaan paling terkenal dari enzim TaqI adalah dalam teknik PCR, di mana  enzim  TaqI  DNA polimerase ,  yang diisolasi  dari  bakteri Thermus  aquaticus yang sama, digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA tertentu.

## RFLP secara in Silico
RFLP  adalah  penanda  DNA  pertama  yang  dihasilkan  dari  perbedaan  sekuen nukleotida yang berbeda. Perbedaan tersebut muncul karena mutasi yang terjadi pada waktu  lalu  dan  dideteksi  sebagai  variasi  (polimorfisme  pada  perbedaan  fragmen restriksi). Mutasi yang terjadi seperti subsititusi, delesi, insersi pada sekuen DNA akan merubah  tempat  pemotongan  enzim  endonuklease  sehingga dapat  merubah  panjang fragmen DNA yang dihasilkan dan dideteksi sebagai penanda yang mewakili genotipe suatu individu. Variasi panjang fragmen DNA hasil pemotongan enzim restriksi dapat digunakan  sebagai  profil  untuk  identifikasi  individu  yang  dikenal  dengan  DNA fingerprint  [9]. Restriksi  dan  visualisasi  fragmen  hasil  restriksi yang  bertujuan  untuk memprediksi hasil genotyping sebelum melakukan RFLP secara nyata di  laboratorium dapat  dilakukan secara in silico . Uji in silico dapat  digunakan sebagai metode untuk mendekati kondisi nyata ke dalam simulasi berbasis  komputer  menggunakan program aplikasi atau perangkat lunak tertentu [20]. Aplikasi RFLP dapat dilakukan secara nyata
salah satunya penelitian yang dilakukan Af’idzatuttama et al. (2023), mengenai studi keragaman  genetik  karakter  galur  bakteri  busuk  hitam  ( Xanthomonas  campestris  pv. campestris ) pada kubis berdasarkan gen 16S rRNA [21]. RFLP secara in silico pada sekuen ge9n L1 HPV 52 menggunakan enzim TaqI divisualisasikan dengan elektroforesis gel virtual seperti pada Gambar 3.
Gambar 3. Hasil elektroforogram restriksi dengan enzim TaqI secara in silico Kiri: Ladder 1 kb, (1) JN874416.1, (2) JN874417.1, (3) JN874418.1, (4) JN874419.1, (5)
JN874420.1,  (6)  JN874421.1,  (7)  JN874422.1,  (8)  JN874423.1,  (9)  JN874424.1,  (10)
JN874425.1, (11) JN874426.1, (12) JN874427.1, (13) JN874428.1, (14 JN874429.1, (15) JN874430.1, (16) JN874431.1, (17) JN874432.1, (18) JN874433.1, (19) JN874434.1, (20) JN874435.1, (21) JN874436.1
Restriksi dengan enzim Taq1 pada gen L1 HPV-52 menghasilkan dua variasi alel, yaitu alel A1 menghasilkan dua pita DNA berukuran 199 bp dan 1.391 bp dan alel A2 menghasilkan  tiga  pita  DNA  berukuran  199  bp,  1.001  bp,  dan  1.200  bp  seperti  yang ditunjukkan Tabel 3.
Tabel 3. Frekuensi alel gen L1 HPV-52 menggunakan enzim TaqI Situs Pengenalan Daerah Terpotong Ukuran Fragmen (bp) Alel Jumlah Kehadiran Fragmen (N=21) Persentase Kehadiran Fragmen (%) Frekuensi Alel T'CG_A ke-199 199 bp 1.391 bp A1 3 15% 0,15 ke-199 ke-1.200 199 bp 390 bp 1.001 bp A2 18 85% 0,85
Tingginya tingkat mutasi pada sampel accession number JN874424.1,  JN874431.1, dan JN874419.1 tidak hanya mengakibatkan perubahan basa nukleotida tunggal, tetapi juga mempengaruhi pengenalan situs restriksi T'CG_A khususnya pada basa ke-1200. Akibatnya,  sampel  diatas  menghasilkan  dua  pita  DNA  (alel  A1),  sedangkan  pada sampel  lainnya  menghasilkan  tiga  pita  DNA  (alel  A2).  Hal  ini  menandakan  adanya keragaman  genetik  pada  alel  A1  yang  berpotensial  terbentuknya  subtipe  baru. Persentase  variasi  genetik  menunjukkan  tingkat  keanekaragaman  genetik  suatu organisme  yang  juga  menunjukkan  kisaran  toleransi  organisme  tersebut  untuk beradaptasi  dalam  suatu  populasi  demi  kelangsungan  hidupnya.  Organisme  yang memiliki  keanekaragaman  tinggi  lebih  mudah  beradaptasi  dibandingkan  organisme yang  mempunyai  keanekaragaman  rendah  [12].  Dari  21  sekuen  fragmen  yang dihasilkan, alel A1 memiliki persentase kehadiran fragmen 15% dan alel A2 memiliki persentase  kehadiran  fragmen  85%.  Dengan  adanya  dominansi  oleh  alel  A2  artinya
1.001 bp 390 bp 199 bp 199 bp 1.391 bp
masih tinggi jumlah dan distribusi spesies origin HPV 52 di China.
Berdasarkan  hasil  RFLP in  silico diketahui  terdapat  variasi  genetik  dalam  sisi pengenalan  restriksi  enzim  TaqI  pada  gen  pengkode  protein  L1  yang  diisolasi  dan diamplifikasi dari swab sel serviks yang terinfeksi HPV 52 oleh Chen et al. (2011) di The Central  Laboratory,  Chaozhou  Central  Hospital,  Guangdong,  China.  Gen  L1  ini memiliki  laju  mutasi  yang  tinggi  dan  pada  saat  menginfeksi  manusia  kemungkinan DNA  HPV  tidak  menyisip  di  genom  manusia,  sehingga    kemungkinan  besar  HPV kehilangan  sebagian  besar  daerah gen  E1,  E2, L1 dan L2. Beberapa  gen  pada  genom HPV,  salah  satunya  gen  L1  lebih  rentan  mengalami  mutasi  sehingga  kemungkinan memiliki sisi pengenalan enzim yang dapat digunakan untuk deteksi cepat secara RFLP [22].  Selain  itu,  dapat  disebabkan  oleh  gaya  hidup,  geografis,  dan  faktor  lingkungan manusia  yang  notabene  merupakan  sel  penjamu  dari  virus.  Hal  ini  sesuai  dengan konsep  kompatibilitas  patogen-sel  penjamu  yang  menunjukkan  data  bahwa  suatu penyebaran preferensial tertentu garis keturunan populasi penjamu pada wilayah yang sama  dibandingkan  dengan  wilayah  lain  sehingga  terjadinya  mutasi  guna  adaptasi lingkungan yang secara tidak langsung dapat keragaman populasi virus  [13]. Variasi genom  HPV  intratipe  spesifik  berhubungan  dengan  infektivitas  virus,  patogenitas, potensi berkembang menjadi kanker serviks, perakitan partikel virus, dan respon imun penjamu [23].

## 4.  Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh  pada  screening  enzim  restriksi  dan pelaksanaan  RFLP  secara in  silico menggunakan  enzim  TaqI  (T'CG_A)  menunjukkan asosiasi antara karakteristik genetik penduduk populasi China PopSet 378724952 dan HPV 52 berdasarkan gen L1 yang ditandai keberadaan alel A1 dan alel A2.

## Referensi
[1] IARC, “Protection from a Single Dose of HPV Vaccine,” IARC Evid. Summ. Briefs , no.  4,  pp.  1 – 5,  2023,  [Online].  Available:  https://www.iarc.who.int/evidence- summary- briefs-series/.%0AFor
[2] Krakauer  EL,  Kwete  X,  Kane  K, et  al. ,  “Cervical  Cancer -Associated  Suffering: Estimating  the  Palliative  Care  Needs  of a  Highly  Vulnerable  Population,” JCO Glob. Oncol. , no. 7, pp. 862 – 872, 2021, doi: 10.1200/go.21.00025.
[3] Nurwijaya H, Andrijono, and Suheimi, Cegah dan Deteksi Kanker Serviks . Jakarta: Alex Media Komputindo, 2010.
[4] Wei  F, Yin  K,  Wu  X, et  al. , “Human  papillomavirus  prevalence  and associated factors  in  women  and  men  in  south  China:  a  population- based  study,” Emerg. Microbes Infect. , vol. 5, no. 1, pp. 1 – 8, 2016, doi: 10.1038/emi.2016.118.
[5] Mai Q, Yang X, Cheng H, Wu G, Wu Z , “Prevalence and genotype distribution of human  papillomavirus  among  women  with  cervical  lesions  in  Shenzhen  city, China,” Hum.  Vaccines  Immunother. ,  vol.  17,  no.  4,  pp.  965 – 971,  2021,  doi: 10.1080/21645515.2020.1805993.
[6] Rusmana D , “Aspek Onkologi Human Papillomavirus,” Jkm , vol. 9, no. 1', pp. 95 – 101, 2009.
[7] Amtarina R , “Organisasi Genom dan Varian Molekuler Human,” J. Ilm. Kedokt. , vol. Jilid 3, no. No.1, Maret 2009, pp. 6 – 13, 2017.
[8] Gultom  DA ,  “Patogenitas  Human  Papillomavirus  (HPV)  dalam  Onkogenesis Kanker Serviks ddan Pengembangan Vaksin Pencegahannya,” J. Pro-Life , vol. 8, no. 2, pp. 134 – 147, 2021, doi: https://doi.org/10.33541/jpvol6Iss2pp102.
Rani et al., 2024; Indonesian Journal of Pharmaceutical Education (e-Journal); 4(1): 82-96
[9] Erni  E,  Wathon  S ,  “PENGEMBANGAN  SISTEM  DETEKSI  HPV  (Human Papilloma  Virus)  BERBASIS  MARKA  MOLEKULER  PCR-RFLP  ELISA  ERNI, SYUBABBANUL WATHON,” BioTrends , vol. 9, no. 2, pp. 48 – 55, 2018.
[10]  Evriarti PR, Yasmon A , “Patogenesis Human Papillomavirus (HPV) pada Kanker Serviks,” J.  Biotek  Medisiana  Indones. ,  vol.  8,  no.  1,  pp.  23 – 32,  2019,  doi:
10.22435/jbmi.v8i1.2580.
[11]  Dai S, Long Y , “Genotyping Analysis using An RFLP Assay,” Methods Mol. Biol. , vol. 1245, pp. 93 – 99, 2015, doi: doi: 10.1007/978-1-4939-1966-6_7.
[12] Achyar A, Hindayageni A, Humaira F, Wijaya NN, Aqsha N, Zultsatunni’mah Z , “Analysis of Genetic Variations in Poly Gene Sequences in Dengue Virus 2 Using In- Silico  RFLP,” Bioscience ,  vol.  5,  no.  1,  pp.  80 – 86,  2021,  doi: 10.24036/0202151111916-0-00.
[13]  Fadhilah  FR,  Sahiratmadja  EK,  Safitri  R,  Maskoen  AM,  Susanto  H ,  “Analisis Filogenetik Gen L1 Human Papillomavirus 16 pada Penderita Kanker Serviks di Bandung,” Maj.  Kedokt.  Bandung ,  vol.  47,  no.  3,  pp.  174 – 178,  2015,  doi:
10.15395/mkb.v47n3.598.
[14]  Chenna R , “Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs,” Nucleic Acids Res. , vol. 31, no. 13, pp. 3497 – 3500, 2003, doi: 10.1093/nar/gkg500.
[15] Rohimah S, Mukarramah L, Sindiya V, S. VY, K. GA, Su’udi M, “Eksplorasi Jenis dan  Potensi  DNA  BARCODE  ANGGREK  Thrixspermum  Secara  In  Silico,” J. Biodjati , vol. 3, no. 2, pp. 50 – 58, 2018, doi: 10.15575/biodjati.v3i2.3409.
[16]  Mumtaz  JR , “Studi  Pendahuluan  Gambaran  Variasi  Gen  CYP2A6  pada  Pasien Laki- laki Infertil,” Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, 2020.
[17]  Ubaidillah  R,  Sutrisno  H, Pengantar  Biosistematika:  Teori  dan  Praktek .  Bogor: Museum Zoologi Bogoriensis-LIPI;, 2009.
[18]  Knappe M, Bodevin S, Selinka HC, et al. , “Surface -exposed amino acid residues of HPV16 L1 protein mediating interaction with cell surface heparan sulfate,” J. Biol.
Chem. , vol. 282, no. 38, pp. 27913 – 27922, 2007, doi: 10.1074/jbc.M705127200.
[19]  Dasgupta  J,  Bienkowska-Haba  M,  Ortega  ME, et  al. ,  “Structural  basis  of oligosaccharide  receptor  recognition  by  human  papillomavirus,” J.  Biol.  Chem. , vol. 286, no. 4, pp. 2617 – 2624, 2011, doi: 10.1074/jbc.M110.160184.
[20]  Kanaya ON, Achyar A , “Analisis Variasi Genetik Sekuen Gen PHT1 pada Padi (Oryza  sativa)  NCBI  Popset  240028097  Menggunakan  RFLP  Secara  In  Silico,” Serambi Biol. , vol. 8, no. 1, pp. 5 – 9, 2023.
[21] Af’idzatuttama,  A.  A.  Nawangsih,  and  Giyanto,  “Keanekaragaman  Karakter Galur-Galur  Bakteri  Penyebab  Busuk  Hitam  (Xanthomonas  campestris  pv. campestris)  pada  Kubis  terhadap  Campuran  Bahan  Aktif  Azoksistrobin  dan Difenokonazol,” J.  Fitopatol.  Indones. ,  vol.  19,  no.  2,  pp.  45 – 56,  2023,  doi: 10.14692/jfi.19.2.45.
[22]  Wahjudi  M,  Setiawan  E,  Tofinastri  EN ,  “Penggunaan  Gen  E6  Sebagai  Target Deteksi  Human  Papillomavirus  Tipe  11  dengan  Metode  Polymerase  Chain Reaction,” Indones.  J.  Clin.  Pharm. ,  vol.  9,  no.  3,  p.  205,  2020,  doi: 10.15416/ijcp.2020.9.3.205.
[23]  Yue Y, Yang H, Wu K, et al. , “Genetic Variability in L1 and L2 Genes of HPV -16 and  HPV- 58  in  Southwest  China,” PLoS  One ,  vol.  8,  no.  1,  2013,  doi: 10.1371/journal.pone.0055204.