## FORTECH 1 (1) 2016
FORTECH
http://ejournal.upi.edu/index.php
PEMANFAATAN TEPUNG GADUNG (DIOSCOREA HISPIDA DENNST.) PADA  PRODUKSI AMILASE MENGGUNAKAN BACILLUS SP.
Yam (Dioscorea Hispida Dennst.) Flour Application on Production of Amylase Using Bacillus Sp.
Eha Julaeha 1* , Sarina Rustiyaty 2 , Novi Nurmaliah Fajri 3 , Fadhilah Ramdlani 4 , Reres Tantra G 5 1,2,4 Program Studi Pendidikan Teknologi Agroindustri Fakultas Pendidikan Teknologi dan Kejuruan Universitas Pendidikan Indonesia
3 Departemen Pendidikan Biologi Fakultas Pendidikan MIPA Universitas Pendidikan Indonesia 5 Departemen Pendidikan Kimia Fakultas Pendidikan MIPA Universitas Pendidikan Indonesia *Korespondensi: eha.j@student.upi.edu

## ABSTRAK
Gadung  ( Dioscorea  hispida  Dennst.) merupakan  tanaman  umbi  yang  mengandung  dioskorin, senyawa  alkaloid  yang  beracun  bagi  manusia  tetapi  berpotensi  dalam  peningkatan  produksi amilase  yang  menggunakan  bakteri.  Amilase  adalah  salah  satu  enzim  yang  banyak  digunakan dalam  industri  makanan  minuman  juga  bidang  bioteknologi.  Produksi  enzim  amilase  dapat menggunakan berbagai sumber karbon, salah satunya dari umbi gadung. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui tingkat produksi enzim amilase yang menggunakan bakteri Bacillus sp. dengan substrat tepung gadung. Penelitian ini menggunakan desain eksperimen dengan Rancangan Acak Lengkap  2 perlakuan yaitu penambahan substrat tepung gadung 5%, pati gadung 5% dan tapioka 5%.  Hasil  penelitian  menunjukkan  pengaruh  penggunaan  tepung  gadung  yang  tidak  dilakukan perendam  atau  perlakuan  dan  banyak  mengandung  senyawa  dioskorin  menghasilkan  kadar  gula reduksi  yang  tinggi  sehingga  total  aktivitas  dan  rendemen  enzim  amilase  yang  didapatkan  juga tinggi  dibandingkan  dengan  sampel  yang  lainnya  yaitu  dari  tepung  dan  pati  gadung  yang  lebih sedikit mengandung dioskorin.
Kata kunci: gadung, amilase, bacillus sp.

## ABSTRACT
Gadung  ( Dioscorea  hispida  Dennst .)  is  a  tuber  that  has  dioscorin,  an  alkaloid  compound  that poisonous for human but has a potency to increase the production of amylase that use bacterium. Amylase  is  one  of  the  enzyme  that  mostly  used  in  food  and  beverage  industry  and  also  in biotechnology.  The  amylase  production  processed  by  any  carbon  source,  one  of  them  is  from gadung.  This  research  aims  to  dicover  the  amylase  production  level  that  use  Bacillus  sp.  by  the gadung substrate flour. This research used experimental design by Random Complete 2 treatment by adding 5% of gadung substrate flour, 5 % of gadung extract, and 5% of tapioca. The research result  shows  how  the  effect  from  the  use  of  unsoaked  gadung  flour  with  lots  of  diosclorin  had producted a high value of sugar reduction, so the total of activity and amylase yield is higher than the other sampel that came from gadung flour and extract with less dioscorin.
Keywords : yam, amylase, bacillus sp

## PENDAHULUAN
Tanaman gadung adalah tanaman umbi-umbian yang termasuk kedalam golongan sumber  pangan  dan  belum  banyak  dikenal  oleh  masyarakat  luas.  Gadung  ( Dioscore hispida dennst ) mengandung karbohidrat yang cukup tinggi. Pemanfaatan  umbi  gadung terkendala  akan  kandungan  senyawa  toksik  berupa senyawa alkaloid ( dioscorin ) yang dapat menimbulkan keracunan pada manusia (Hartati dkk, 2010).
Dioskorin tergolong senyawa alkaloid, yang ditunjukkan dengan sifatnya yang basa, mengandung  satu  atau  lebih  nitrogen  heterosiklik,  dan  mumnya  beracun  bagi  manusia. Namun  dibalik  kandungan  senyawa  dioskorin  yang  merupakan  racun,  senyawa  tersebut bisa  dimanfaatkan  sebagai  potensi  sumber  karbon  bagi  mikroba  dalam  menghasilkan amilase. Amilase merupakan enzim yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase  dapat  diperoleh  dari  berbagai  sumber  seperti  tanaman,  binatang  dan mikroorganisme.
Sekitar  25-33%  produk  amilase  di  pasar  dunia  berasal  dari  mikroorganisme seperti Bacillus dan Aspergillus (Jensen  dan  Olgen,  1999).  Jenis Bacillus secara  luas digunakan  untuk  produksi  komersial  amilase  termostabil,  dimana  karakteristik    penting dari  termostabil  adalah  mampu  menghasilkan  enzim  termostabil  dengan  stabilitas operasional  yang  tinggi  (Niehaus  et  al.,  1999).  Gadung  juga  memiliki  potensi  untuk digunakan sebagai substrat bagi Aspergillus niger dalam memproduksi amilase (Suraya, 2009).  Tujuan  dari  penelitian  ini  untuk  mengoptimalkan  pemanfaatan  gadung  yang mengandung racun dioskorin sebagai sumber karbon bagi Bacillus dalam meningkatkan produksi amilase.

## METODE
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu tepung gadung, tapioka, maizena, ekstrak  ragi, bacto  pepton ,  K 2 HPO 4 ,  MgSO 4 7H 2 O,  CaCl 2 2H 2 O,  larutan  DNS,  NaOH  2M, Ka-Na  tartrate,  glukosa,  aquades,  alkohol,  cling  wrap,  tisu,  dan  mikroba Bacillus  sp. Sedangkan alat yang digunakan yaitu pisau, grinder, ayakan tyler, blender, baskom, labu enlenmeyer, beaker glass , inkubator, cawan petri, kertas pH, label, tabung reaksi, bunsen, ose,  mikroskop,  micro  cup,  sarung  tangan, water  bath, oven,  timbangan,  spatula, autoclav , laminar airflow, dan counting chamber.
Metode  penelitian  yang  digunakan  adalah  desain  eksperimen  dengan  dua  kali ulangan. Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yaitu :

## Pembuatan tepung dan pati gadung
Pembuatan tepung gadung dilakukan melalui pengecilan ukuran, perendaman dan tanpa  perendaman,  pengeringan  dan  pengayakan  hingga  100  mesh.  Sedangkan pembuatan  pati  gadung  dilakukan  dengan  cara  basah  yaitu  dengan  merendam  bubur umbi gadung hingga diperoleh endapan sari pati gadung yang kemudian dikeringkan.

## Pengujian HCN
Kandungan  HCN  pada  gadung  diuji  dengan  metode  Argentometri  Volhard menggunakan destilasi. Sampel tepung maupun pati gadung masing – masing ditimbang sebanyak  20  gram  kemudian  dimasukkan    ke    dalam    labu  destilasi,  ditambah  10  ml larutan  asam  tartrat  5%  dan  100  ml  aquadest  lalu  didestilasi.  Destilat  ditampung  dalam labu  ukur  100  ml  yang  telah  diisi    dengan  20,0  ml  AgNO 3 0,02  N  +  1  ml  HNO 3 encer. Disiapkan  kertas  saring  yang  berbentuk  lingkaran  kemudian  dicelupkan  dalam  larutan asam  pikrat  jenuh.  Setelah  kering  dibasahi  dengan  larutan  Na 2 CO 3 8%.  Kemudian tetesan  destilat  disentuhkan  pada  kertas  saring  tersebut. Apabila  warna  kuning  dari
kertas  pikrat  berubah  menjadi  warna merah berarti HCN positif.

## Pembuatan Inokulum
Mikroorganisme  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  isolat  bakteri  termofil Bacillus  Stearothermophilus .  Media  yang  digunakan  untuk  regenerasi  bakteri  adalah media  cair.  Komposisi  media  yang  digunakan  adalah  tepung  gadung  1%,  ekstrak  ragi 0,5%,  bacto  pepton  0,5%,  K 2 HPO 4 0,05%,  MgSO 4 7H 2 O  0,05%,  dan  CaCl 2 2H 2 O  0,1%. Inkubasi regenerasi bakteri dilakukan di dalam inkubator pada suhu 60°C, selama 24 jam, dan biakan tersebut siap digunakan untuk produksi  enzim amilase. Sebelum diinkubasi, semua peralatan yang digunakan disterilisasi terlebih dahulu.

## Fermentasi
Media  fermentasi  terdiri  dari  sampel  yang  akan  diuji  yaitu  tepung  gadung  tanpa perendaman, tepung gadung yang sudah melalui perendaman, pati gadung, dan tapioka sebagai kontrol. Masing-masing bahan tersebut ditimbang sebanyak 5% dan dimasukkan ke  dalam  labu  enlenmeyer  250  ml  kemudian  dilakukan  pengaturan  konsentrasi  media hingga mencapai pH 7-7,5. Setelah itu dilakukan sterilisasi kemudian fermentasi dengan penambahan  media  enrichment  3  ml  kedalam  media  fermentasi.  Selanjutnya  diinkubasi dalam  inkubator  shaker  selama  42  jam,  agitasi  120  rpm  pada  suhu  60 o C.  Setelah fermentasi dilakukan perhitungan sel bakteri yang tumbuh dengan cara pengenceran 10 -1 - 10 -4 kemudian sel dihitung menggunakan mikroskop.

## Pembuatan larutan DNS dan larutan stock glukosa
Larutan DNS dibuat dengan cara melarutkan 1 gram DNS serbuk, 20 ml NaOH 2M, 30 gram Ka-Na tartrate sampai volume 100 ml. Kemudian larutan disimpan dalam lemari pendingin.  Larutan  stock  glukosa  untuk  kurva  standar  dibuat  dengan  menggunakan larutan  glukosa  konsentrasi  0,25;  0,5;  0,75;  1;  1,25;  1,5  ppm.  Pembuatan  kurva  standar diawali  dari  pembuatan  larutan  glukosa  dengan  melarutkan  sebanyak  250  mg  glukosa dengan  aquades hingga volume 50 ml.

## Pengujian jumlah Gula Reduksi
Pengujian gula reduksi dilakukan dengan mengambil 1 ml sampel kedalam tabung, kemudian  ditambahkan  1  ml  reagen  DNS  dan  2  ml  aquadest,  ditambahkan  pada  tiap tabung reaksi menggunakan pipet. Tabung reaksi dipanaskan di dalam water bath selama 5  menit  agar  terjadi  reaksi  antara  glukosa  dengan  DNS.  Absorbansi  tiap  larutan  diukur pada  540  nm  (Ceirwyn,  1995).  Nilai  absorbansi  yang  diperoleh  diplotkan  pada  kurva standar untuk mengetahui konsentrasi glukosa pada sampel.

## Pengolahan dan Analisis Data
Pengolahan  data  untuk  analisis  produksi  amilase  dilakukan  secara  matematis menggunakan Microsoft Excel. Analisis data dilihat dari kandungan HCN dan gula reduksi yang terdapat di dalam sampel kemudian dilakukan analisis total aktivitas enzim dengan rumus sebagai berikut :
Total Aktivitas Enzim Amilase
Keterangan :
Gh = Kadar gula reduksi hasil hidrolisis enzimatis Fp = Faktor pengenceran ekstrak enzim kasar V larutan = Volume larutan sampel (ml) V enzim = Volume enzim yang ditambahkan (ml) t = Waktu inkubasi (menit)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel  gadung  yang  diuji  kadar  HCN  terdiri  dari  tiga  sampel  yaitu  pati  gadung, tepung gadung yang direndam dan tepung gadung tanpa perendaman seperti tersaji pada tabel 1
Tabel 1. Hasil Analisis Kadar HCN No. Kode Sampel Satuan Hasil 1. Pati Gadung mg/Kg 26,11 2. Tepung Gadung (Direndam) mg/Kg 39,98 3. Tepung Gadung (Tanpa Perendaman) mg/Kg 66,94
Analisis kadar HCN ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh pertumbuhan bakteri yang menghasilkan amilase menggunakan berbagai jenis perlakuan substrat gadung yaitu mulai  dari  pati  gadung,  tepung  gadung  yang  direndam,  dan  tepung  gadung  tanpa perendaman. Hasil analisis menunjukkan bahwa kadar HCN tertinggi yaitu terdapat pada tepung  gadung  tanpa  perendaman.  Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  tepung  gadung tanpa  perlakuan  (perendaman)  masih  banyak  mengandung  HCN  yang  berarti  masih banyak mengandung racun yang lainya salah satunya dioskorin.
Perhitungan jumlah sel bakteri yang tumbuh dilakukan pada pengenceran dari 10 -1 - 10 -5 dan  dengan  menggunakan  mikroskop.  Namun  untuk  sampel  yang  diambil  pada penelitian ini yaitu pada pengenceran 10 -3 yang tersaji pada tabel 2.
Tabel 2. Jumlah Sel Bakteri yang tumbuh (Penelitian Ulangan) Sampel Sel bakteri yang terhitung Total sel bakteri A1,1 202 202.000 A1,2 130 130.000 A2,1 131 131.000 A2,2 423 42.300 A3,1 109 10.900 A3,2 108 10.800 A4,1 114 11.400 A4,2 79 7.900
Dari tabel tersebut bisa dilihat bahwa jumlah sel bakteri yang paling banyak tumbuh yaitu pada media yang menggunakan substrat tepung gadung tanpa perendaman (banyak mengandung  racun)  karena  gadung  tidak  mendapatkan  perlakuan  perendaman  untuk menghilangkan  racun.  Selanjutnya,  pada  pemeriksaan  aktivitas  enzim  dilakukan pengukuran  kadar  glukosa.  Larutan  stock  glukosa  untuk  kurva    standar  dibuat  dengan menggunakan  larutan  glukosa  konsentrasi  0,25;  0,5;  0,75;  1;  1,25;  1,5  ppm.  Dari pengukuran secara spektrofotometri diperoleh data sebagai berikut.
Tabel 3. Kurva Standar
No.  Konsentrasi  Absorbansi 1. 0,25 0,09 2. 0,5 0,205 3. 0,75 0,36 4. 1 0,4 5. 1,25 0,52 6. 1,5 0,7
Gambar 1. Absorbansi Kurva Standar Glukosa
Dari  gambar  1.  diperoleh  persamaan  matematis  x  =  (y  +  0.0243)/0.4611  dimana  x adalah konsentrasi glukosa dan y merupakan nilai absorbansi dari glukosa pada panjang gelombang  540  nm.  Kemudian  dilakukan  pengukuran  kadar  glukosa  pada  sampel penelitian yang terdiri dari empat sampel yang menggunakan jenis substrat yang berbeda- beda  yaitu  sampel  A1  (tepung  gadung  tanpa  perendaman),  A2  (tepung  gadung  yang direndam),  A3  (pati  gadung),  A4  (tapioka/sebagai  kontrol).  Dari  pengukuran  secara spektrofotometri diperoleh data sebagai berikut.
Tabel 4. Hasil Absorbansi Sampel Penelitian Ulangan
No.  Sampel Absorbansi Rata-rata Ulangan I  Ulangan II 1. A1 1,21 0,94 1,075 2. A2 1,07 0,91 0,99 3. A3 0,82 0,82 0,82 4. A4 0,74 0,74 0,74
Berdasarkan  gambar  2.  diperoleh  persamaan  matematis  x  =  (y  +  0.0023)/0.4507 dimana x adalah konsentrasi glukosa dan y merupakan nilai absorbansi dari glukosa pada panjang  gelombang  540  nm.  Setelah  diketahui  nilai  absorbansinya,  kemudian  dilakukan analisis  total  aktivitas  enzim.  Total  aktivitas  enzim  amilase  ditentukan  dengan  mengacu pada Nandutu et al (2000) yakni dengan mengukur produk reaksi enzimatis berupa  gula reduksi    menggunakan    metode Dinitrosalycylic    Acid (DNSA)  (Bernfeld,  1955)  dalam Mudrikah  (2014).  Gula  reduksi  ini    merupakan  hasil  aktivitas  hidrolisis  enzim  amilase terhadap substrat yang ditambahkan.

## Gambar 2. Absorbansi Sampel Ulangan

## Hasil Perhitungan Total Aktivitas Enzim Amilase
Jumlah gula reduksi hasil hidrolisis ditentukan berdasarkan absorbansi pada kontrol dan analisis sampel gula reduksi hasil hidrolisis menggunakan persamaan kurva standar glukosa yang telah diperoleh.
Persamaan kurva standar glukosa,  y = 0,4507x - 0,0023 Ak (Absorbansi Kontrol) 0 menit = 0,385; 0,15; 0; 0 As (Absorbansi Sampel) 5 menit = 1,075; 0,99; 0,82; 0,74 Kadar  gula  reduksi  awal  (mg/ml), atau kadar glukosa ( 𝐺 k ) Gk =
Gk 1 = = 0,888 mg/ml Gk 2 = = 0,378 mg/ml Gk 3 = = 0,053 mg/ml Gk 2 = = 0,053 mg/ml
Rata-rata Gk = 0,343 mg/ml
Kadar  gula  reduksi  akhir  (setelah hidrolisis  enzimatis)  (mg/ml),  atau kadar glukosa 5’ ( 𝐺 s ) Gs =
Gs 1 = = 2,390 mg/ml Gs 2 = = 2,202  mg/ml Gs 3 = = 1,824 mg/ml
Gs 4 =
=  1,647 mg/ml
Kadar gula reduksi hasil hidolisis enzimatis (mg/ml), G h = Kadar gula reduksi akhir - Kadar gula reduksi awal Gh = Gs – Gk Gh 1 = Gs 1 – Gk = 2,390  - 0,343 = 2,047 mg/ml Gh 2 = Gs 2 – Gk = 2,202 - 0,343 = 1,859 mg/ml Gh 3 = Gs 3 – Gk = 1,824 - 0,343 = 1,481 mg/ml Gh 4 = Gs 4 – Gk = 1,647 - 0,343 = 1,304 mg/ml
Total Aktivitas Enzim Amilase = ] x A1 = ] x = 454,434 U/gr A2 = ] x = 412,698 U/gr A3 = ] x = 329,448 U/gr A4 = ] x = 289,488 U/gr
Dari  hasil  analisis  perhitungan  total  aktivitas  enzim  menunjukkan  bahwa  total aktivitas  enzim  sampel  A1  (substrat  tepung  gadung  tanpa  perendaman)  mendapatkan hasil yang paling tinggi yaitu sebesar 454,434 U/gr. Total aktivitas enzim amilase disajikan dalam satuan unit aktivitas per g gadung (U/g gadung). Satu unit aktivitas (U) ditentukan sebagai  jumlah  enzim  yang  diperlukan  untuk  menghasilkan  1  µmol  gula  reduksi  (setara dengan  glukosa)  yang  dihasilkan  selama  reaksi  enzim  amilase  per  menit  pada  kondisi pengujian.
Enzim  amilase  dapat  dihasilkan  oleh  berbagai  mikroba  dan  salah  satunya  yaitu bakteri Bacillus (Khairul Anam, 2010). Pada penelitian ini, proses produksi enzim amilase menggunakan  tepung  dan  pati  gadung  sebagai  substratnya.  Penggunaan  substrat bertujuan untuk dapat menginduksi bakteri agar menghasilkan enzim amilase. Hasil yang didapatkan  yaitu  bahwa  substrat  yang  masih  banyak  mengandung  racun  ternyata  lebih berpotensi menghasilkan nilai total aktivitas enzim yang lebih tinggi dibandingkan dengan substrat  lainnya.  Jal  tersebut  menunjukkan  bahwa  umbi  gadung  yang  banyak mengandung  racun  baik  itu  HCN  dan  dioskorin  mempunyai  potensi  untuk  digunakan sebagai  sumber  karbon  atau  substrat  dalam  proses  produksi  enzim  amilase menggunakan bakteri Bacillus sp.

## KESIMPULAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  pengaruh  penggunaan  tepung  gadung  yang  tidak dilakukan  perendam  dan  banyak  mengandung  senyawa  dioskorin  menghasilkan  kadar gula  reduksi  yang  tinggi  sehingga  total  aktivitas  dan  rendemen  enzim  amilase  yang didapatkan  juga  tinggi  dibandingkan  dengan  sampel  lainnya  yaitu  dari  tepung  dan  pati gadung yang lebih sedikit mengandung racun. Penelitian yang dihasilkan ini mempunyai prospek yang baik untuk dikembangkan karena sampel gadung yang dijadikan media atau substrat pertumbuhan bakteri Bacillus sp. ternyata memiliki kadar gula reduksi yang tinggi sehingga aktivitas enzim yang dihasilkan cukup memuaskan.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  ingin  menyampaikan  terima  kasih  kepada  Direktorat  Pengembangan  dan Penelitian  RI  (DIKTI)  untuk  dukungan  dana  dan  kesempatan  melakukan  penelitian. Penelitian  ini  merupakan  bagian  dari  Program  Kreatifitas  Mahasiswa.  Juga  kepada  ibu Mustika N.H., S.T.P., M.Pd. atas bimbingan dan arahannya.

## DAFTAR PUSTAKA
Hartati, Indah (2010). Isolasi Alkaloid Dari Tepung Gadung (Dioscorea Hispida Dennst). Khairul  Anam.  (2010).  Produksi  Enzim  Amilase. Mikroba  dan  Potensinya. Bioteknologi. Sekolah Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor
Mudrikah.  2014.  Aktivitas  Enzim  Amilase  Ubi  Jalar  Putih  (Ipomoea  batatas)  Varietas Soponyono. Skripsi. Prog  Studi  Teknologi  Pangan  dan  Hasil  Pertanian.  Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Gajah Mada. Yogyakarta.
Ndaru,    Hasri    (2011).    Umbi    Gadung    ( Dioscorea    hispida    Dennst .)    Universitas Diponegoro.
Ratna, Siwi dkk. (-). Umbi  Gadung ( Dioscorea  Hispida  Dennst ) sebagai Bahan Pangan Mengandung  Senyawa  Bioaktif  :  Kajian  Pustaka.  Universitas Brawijaya Malang.
Suraya. (2009).  Prospek Umbi  Gadung ( Dioscorea  hispida  Dennst .)  sebagai sumber karbon    bagi    Aspergillus    niger    dalam    produksi    amilase.    Institut  Teknologi Bandung. Bandung.
Trismilah  dan  Budiasih  Wahyuntari.  2009.  Pemanfaatan  berbagai  Jenis  Pati sebagai Sumber  Karbon  untuk  Produksi α -Amilase    Ekstraseluler    Bacillus  Sp  Sw.  Jurnal Penelitian.    Bidang    Teknologi    Biokatalis,    Pusat    Teknologi  Bioindustri,  BPPT. Serpong.
.