## ISSN: 0215-7950
Tel: 022-2786245, Surel: aww_28@yahoo.com
Volume 17, Nomor 2, Maret 2021
Halaman 49–57
DOI: 10.14692/jfi.17.2. 49–57

## Pengaruh Kombinasi Perlakuan Air Panas dan Kultur Jaringan terhadap Infeksi Virus pada Bawang Merah

## Effect of Combination of Hot Water Treatment and Tissue Culture on Virus Infections in Shallot
Astri Windia Wulandari 1,2 * , Sobir 1 , Sri Hendrastuti Hidayat 1 1 Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680
2 Balai Penelitian Tanaman Sayuran, Bandung 40391

## ABSTRAK
Sebagian besar petani bawang merah di Indonesia menggunakan umbi sebagai bahan perbanyakan meskipun banyak penyakit diketahui ditularkan melalui umbi. Perlakuan air atau udara panas pada organ aktif seperti biji atau umbi adalah metode yang umum digunakan untuk menghasilkan tanaman bebas virus. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan umbi bawang merah bebas virus melalui perlakuan air panas dikombinasikan dengan kultur jaringan. Deteksi virus sebelum perlakuan menggunakan Dot immuno binding assay (DIBA) untuk memastikan infeksi genus Potyvirus ( Onion yellow dwarf virus /OYDV), Carlavirus ( Shallot latent virus /SLV dan Garlic common latent virus /GCLV) dari umbi. Penelitian disusun menggunakan rancangan acak lengkap dengan tiga faktor, yaitu kultivar (Sumenep dan Bima Curut), suhu (45 °C, 50 °C, dan suhu kamar), dan waktu pemanasan (15 dan 30 menit). Secara umum, perlakuan air panas yang dikombinasikan dengan kultur jaringan tidak memengaruhi kemampuan tumbuh dan jumlah daun planlet. Berdasarkan deteksi virus menggunakan RT-PCR, suhu 45 °C selama 15 menit mampu mengeliminasi 100% Potyvirus dan Carlavirus pada bawang merah ‘Bima Curut’; sedangkan pada bawang merah ‘Sumenep’ perlakuan air panas pada suhu 50 °C selama 15 menit mampu mengeliminasi 100% Potyvirus dan 33.33% Carlavirus .
Kata kunci: bebas virus, 'Bima Curut', Carlavirus , Potyvirus , 'Sumenep'

## ABSTRACT
Most shallot farmers in Indonesia use bulbs as their propagative materials despite many diseases were known to be transmitted through bulbs. Heat treatment is a common method used to produce virus- free plants, i.e. using hot water or hot air treatment which is generally applied on the dormant organs such as seeds or bulbs. Research was conducted to get virus free shallot bulbs through hot water treatment combined with tissue culture. Detection of the virus before treatment using Dot immuno binding assay confirmed the infection of Potyvirus ( Onion yellow dwarf virus /OYDV), Carlavirus ( Shallot latent virus / SLV and Garlic common latent virus /GCLV) from bulb. The experiment was done using a completely randomized design with three factors, i.e. cultivar (Sumenep and Bima Curut), temperature (45 °C, 50 °C, and room temperature), and heating time (15 and 30 min).  In general, hot water treatment combined with tissue culture did not affect the ability of plantlets to grow and the number of leaf. Based on virus detection using RT-PCR, 100% elimination of Potyvirus and Carlavirus on cultivar Bima Curut was observed at temperature of 45 °C for 15 minutes; whereas on cultivar Sumenep hot water treatment at 50 °C for 15 minutes was able to eliminate 100% Potyvirus and 33.33% Carlavirus .
Keywords: 'Bima Curut', Carlavirus , Potyvirus , 'Sumenep', virus free

## PENDAHULUAN
Salah satu penyebab rendahnya produksi bawang merah di Indonesia ialah ketersediaan benih yang berkualitas tinggi. Kualitas benih bawang merah ditentukan antara lain oleh status kesehatan benih. Benih yang berkualitas adalah benih yang bebas patogen termasuk  bebas  dari  infeksi  virus.  Tanaman bawang merah dapat terinfeksi oleh virus dari genus Potyvirus ( Onion yellow dwarf virus / OYDV, Shallot yellow stripe virus /SYSV, dan Leek yellow stripe virus/LYSV),  Carlavirus
( Shallot latent virus /SLV dan Garlic common latent virus/GCLV),  dan Allexivirus  ( Shallot mite borne latent virus/MbLV, Gar-V-B, Gar- V-C, Gar-V-D dan Garlic mosaic virus/GMV)
(Fajaro et al. 2001;  Shahraeen et al. 2008). Jenis virus yang menginfeksi bawang merah di Indonesia dilaporkan oleh Duriat (1990), Duriat et al. (1990), dan Sutarya et al. (1993) terdiri atas OYDV, LYSV, dan SLV dengan insidensi penyakit berkisar antara 29.75– 76.36%.
Virus yang menginfeksi jaringan tanaman akan terus berkembang sehingga dapat memengaruhi kualitas bahan tanaman yang dihasilkan. Salah satu teknik yang dapat mengeliminasi virus dari jaringan umbi bawang merah ialah teknik kultur jaringan (Gunawan 1987).  Efisiensi  teknik  kultur  jaringan  untuk mengeliminasi virus dapat ditingkatkan dengan  kombinasi  perlakuan  fisik  seperti terapi pemanasan dan kimiawi menggunakan senyawa antiviral sintetik. Metode yang umum digunakan untuk menghasilkan tanaman bebas virus, antara lain dengan perlakuan air panas ( hot water treatment ) dan udara panas ( hot air treatment )  yang  diterapkan  pada  organ  aktif seperti benih atau umbi (Hadidi et al. 1998).
Almaarri et al . (2012) melaporkan bahwa perlakuan termoterapi pada suhu sekitar 37±1 °C selama 40 hari dapat mengeliminasi Potato virus Y pada  kentang  ‘Binella’  dan ‘Burren’ berturut-turut sebesar 81% dan 75%. Upaya mengeliminasi virus dari umbi bawang merah perlu dilakukan karena kebutuhan benih sehat akan terus meningkat seiring dengan target produktivitas bawang
merah nasional. Kombinasi teknik kultur jaringan dan perlakuan fisik maupun kimiawi diharapkan dapat menjadi metode yang tepat untuk menghasilkan benih bawang merah bebas virus. Penelitian dilakukan dengan tujuan untuk mempelajari potensi perlakuan air panas dan teknik kultur jaringan dalam menekan  infeksi  virus  pada  umbi  bawang merah.

## BAHAN DAN METODE
Percobaan ini menggunakan dua kultivar bawang merah, yaitu ‘Sumenep’ yang berasal dari daerah Pacet, Bandung, Jawa Barat dan  ‘Bima  Curut’  dari  Brebes,  Jawa  Tengah dengan umur benih sekitar 60 sampai 80 hari setelah panen. Kegiatan diawali dengan mengenali kedua kultivar umbi bawang merah dari  karakter  morfologinya.  Selanjutnya mendeteksi virus yang ada pada umbi melalui daun tunasnya. Percobaan dilakukan menggunakan planlet bawang merah dari dua kultivar umbi yang disediakan melalui proses kultur jaringan. Proses perbanyakan planlet diawali dengan pemberian perlakuan panas pada umbi bawang merah dan perbanyakan eksplan melalui umbinya.
Pengamatan Karakter Kultivar Bawang Merah Dua  kultivar  bawang  merah  (‘Sumenep’ dan  ‘Bima  Curut’)  dianalisis  karakternya. Sebanyak 10 umbi bawang merah diukur diameter umbi, jumlah lapisan pada umbi, dan kekerasan umbinya.

## Deteksi Virus Bawang Merah
Sebanyak 15 umbi per kultivar bawang merah ditanam pada medium tanah dan pupuk kandang steril (1:1). Setelah tanaman berumur 30 hari, daun yang tumbuh dipotong. Setiap kultivar diambil sebanyak 0.1 g. Virus di dalam daun bawang merah dideteksi menggunakan metoda dot immunobinding assay (DIBA) (Anggraini dan Hidayat 2014) dengan duplo.
Target virus pada tahap deteksi terdiri atas OYDV,  SLV,  dan  GCLV.  Jaringan  tanaman dilumatkan dalam tris  buffer  saline (TBS)
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Wulandari et al.
[Tris HCl 0.02 M, NaCl 0.5 M pH 7.5] dengan konsentrasi  1:20  (b/v).  Cairan  perasan  daun diteteskan pada membran nitroselulosa (Bio- rad) dan dibiarkan pada suhu ruang selama 3 menit. Membran kemudian direndam dalam larutan blocking non fat milk (50 mL TBS ditambah 2% Triton X-100 dan 2% skim milk) selama 1 jam sambil digoyang pada multi shaker EYELA MMS dengan kecepatan 50 rpm pada suhu ruang. Membran selanjutnya dicuci 5 kali masing-masing selama 5 menit dalam dH 2 O sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm, kemudian direndam dalam 20 mL TBS yang mengandung 20 mL antibodi pertama  OYDV/SLV/GCLV  ditambah non fat milk dengan  konsentrasi  akhir  2%  dan diinkubasi selama satu malam pada suhu 4 °C. Membran kemudian dicuci sebanyak lima kali masing-masing dalam 1× tris  buffer  saline tween dengan 0.05% Tween 20 (TBST) selama 5 menit sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm, kemudian direndam dalam 20 mL TBS yang mengandung konjugat (antibodi kedua) sebanyak 40 mL untuk OYDV/SLV dan  20  mL  untuk  GCLV  ditambah non fat milk dengan konsentrasi akhir 2%. Membran diinkubasi selama 60 menit sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm, kemudian dicuci kembali dalam TBST sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Khusus untuk deteksi SLV, membran selanjutnya direndam dalam 20 mL TBS yang mengandung 20 mL antibodi ketiga ditambah non fat milk dengan konsentrasi  akhir  2%,  kemudian  diinkubasi selama 60 menit sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm, selanjutnya dicuci kembali dengan TBST.
Tahap terakhir, membran direndam selama 5 menit dalam 10 mL bufer AP (Tris-HCl 0.1 M, NaCl  0.1  M,  MgCl 2 5 mM dan air) yang mengandung 1 tablet nitro blue tetrazolium dan bromochloroindolil phosphate (NBT+BCIP). Bila  reaksi  positif  akan  terjadi  perubahan warna membran menjadi ungu pada tempat cairan tanaman diteteskan yang menunjukkan bahwa sampel yang diuji terinfeksi virus dan reaksi dapat dihentikan dengan merendam membran dalam dH 2 O.

## Kultur Jaringan untuk Menyediakan Planlet Bebas Virus
Umbi  bawang  merah  ‘Sumenep’  dan ‘Bima Curut’ yang diketahui positif terinfeksi OYDV,  SLV  dan  GCLV  digunakan  untuk menghasilkan planlet bebas virus. Sebanyak 30 umbi dimasukkan ke dalam kantung jala plastik, kemudian direndam dalam penangas air pada suhu dan lama waktu tertentu sesuai perlakuan, yakni suhu 45 °C atau 50 °C dan masing-masing suhu selama 15 atau 30 menit. Umbi yang sudah diberi perlakuan air panas kemudian dikeringanginkan dan digunakan untuk kultur jaringan.
Propagasi tanaman secara in vitro dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan, Pusat Kajian Hortikultura Tropika, IPB. Umbi bawang merah sebagai bahan eksplan yang telah diberi perlakuan panas, dikupas kemudian dicuci dengan larutan deterjen. Umbi  direndam  di  dalam  fungisida  dengan bahan aktif Streptomisin sulfat dan Benomyl 1 g L -1 selama 24 jam, lalu bilas dengan air steril sebanyak 2–3 kali.
Selanjutnya sterilisasi dilakukan di laminar air flow cabinet , umbi bawang merah direndam di dalam larutan kloroks 30% selama 30 menit, lalu dibilas dengan air steril sebanyak 2–3 kali. Selanjutnya lapisan umbi dikupas kembali sampai diperoleh lapisan berwarna putih,  lalu  direndam  dalam  kloroks  20% selama 20 menit, kemudian dibilas dengan air steril sebanyak 2–3 kali. Lapisan dikupas lagi sampai diperoleh bagian yang paling dalam (meristem tip) dan direndam dalam kloroks 10% selama 10 menit kemudian dibilas dengan air steril sebanyak 2–3 kali.
Eksplan direndam dalam povidone iodine pekat selama 10 menit, selanjutnya ditanam pada medium MS (Murashige dan Skoog 1962) yang dimodifikasi dengan penambahan 30 g gula. Setiap botol ditanami dua eksplan yang selanjutnya diinkubasi di ruang kultur bersuhu 20–22 °C, dengan lama pencahayaan 16 jam terang dan 8 jam gelap (Budiono 2004). Medium perbanyakan menggunakan medium MS ditambah zat pengatur tumbuh N6-(2-Isopentenyl)adenine (2ip) 2 ppm L -1
dan Gibberellic acid (GA3) 0.3 mg L -1 . Selanjutnya pertumbuhan planlet diamati. Penelitian disusun dalam rancangan acak lengkap  faktorial  dengan  3  faktor.  Faktor pertama ialah kultivar bawang merah dengan dua taraf, yaitu ‘Bima Curut’ dan ‘Sumenep’. Faktor kedua ialah suhu pemanasan dengan tiga taraf, yaitu 45 °C, 50 °C dan suhu ruang (kontrol). Faktor ketiga ialah waktu pemanasan dengan  dua  taraf,  yaitu  15  dan  30  menit. Masing-masing ulangan terdiri atas enam botol dan diulang tiga kali. Pengamatan dilakukan terhadap insidensi virus, daya tumbuh eksplan dan jumlah daun. Insidensi  virus  dikonfirmasi  dengan  metode RT-PCR  ( reverse transcription–polymerase chain reaction ). Data dianalisis menggunakan program SAS v9. Jika terdapat perbedaan nyata antar perlakuan, maka dilakukan uji Tukey pada taraf nyata 5%.
Deteksi Insidensi Virus pada Planlet Menggunakan Metode RT-PCR Planlet hasil kultur jaringan dideteksi dengan  metode  RT-PCR  digunakan  untuk memastikan bahwa planlet sudah bebas virus. Ekstraksi RNA dilakukan mengikuti metode cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) (Doyle & Doyle 1990). Produk ekstraksi RNA total digunakan sebagai templat untuk sintesis cDNA. Sintesis cDNA terjadi melalui proses transkripsi balik RNA. Reaksi dibuat dalam tabung mikro dengan total volume 10 mL yang  mengandung  2  mL  bufer  RT,  0.50  mL 10 mM dNTP ( deoksiribonukleotida triphosphat ), 0.35 mL 50 mM DTT ( dithiothreitol ), 0.35 mL RNAse Inhibitor , 0.35 mL MMuLV ( Moloney Murine Leukimia Virus ), 3.70 mL dH 2 O, 0.75 mL Primer Poty 1
(5’-GGATCCCGGGTTTTTTTTTTTTT TTTTV-3’)  dan  2  mL  RNA  total.  Sintesis cDNA  dilakukan  pada  suhu  65  °C  selama 2 menit, kemudian tabung mikro direndam dalam es, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37  °C  selama  60  menit,  dan  terakhir  pada suhu  70  °C  selama  2  menit.  Produk  RT- PCR  selanjutnya  digunakan  untuk  tahapan amplifikasi PCR. Reaksi pembanding kontrol positif digunakan cDNA dari tanaman sakit. Program amplifikasi sebanyak 1 siklus pada 95 °C selama 1 menit, selanjutnya 35 siklus dengan tahapan denaturasi pada 94 °C selama 20 detik, aneling pada 56 °C selama 1 menit, dan  sintesis  pada  72  °C  selama  1  menit, kemudian khusus untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis 72 °C selama 3 menit. Amplifikasi DNA target masing-masing virus (Tabel 1) dilakukan menggunakan mesin Veritiâ Thermal Cycler ( Applied Biosystem ) dengan kondisi reaksi yang spesifik. DNA hasil amplifikasi divisualisasi dengan elektroforesis  pada  tegangan  50  Volt  selama 50 menit menggunakan 1% gel agarosa yang dilarutkan dalam bufer 0.5x Tris-Borate EDTA (TBE). Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan etidium bromida selama 15 menit, dan dilanjutkan dengan pengamatan di bawah UV transilluminator . Penanda ukuran DNA yang digunakan ialah 1 kb DNA Ladder (Thermo). Infeksi virus pada planlet dideteksi dengan primer universal Potyvirus dan Carlavirus. Pita spesifik Potyvirus berukuran 750  pb  berhasil  diamplifikasi  dari  bawang merah  ‘Bima  Curut’  dan  ‘Sumenep’.  Pita spesifik Carlavirus berukuran 716 pb berhasil diamplifikasi dari bawang merah ‘Bima Curut’ dan ‘Sumenep’.
Tabel 1  Primer yang digunakan untuk amplifikasi virus bawang merah menggunakan metode PCR
Virus target Pasangan primer (5’…….3’) Ukuran DNA target (pb) Sumber pustaka Potyvirus (U341) R :  GGATCCCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTV F :  CCGGAATTCATGRTITGGTGYATIGAIAAYGG 600–850 (Langeveld et al. 1991) Carlavirus (Alcar) R :  GGATCCCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTV F :  TGCTGCYTTTGATACYTTCGAT 715 (Gambley 2012) Allexivirus (PGV3t) R : GGATCCCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTV F : TGGNCNTGCTACCACAANGG 950 (Chen et al. 2004)
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Wulandari et al.

## HASIL
Tiga karakter morfologi umbi yang diukur menunjukkan bahwa bawang merah ’Sumenep’ dan  ‘Bima  Curut’  mempunyai  karakter  yang berbeda nyata (Tabel 2). Kultivar Sumenep mempunyai diameter lebih besar dibandingkan dengan  kultivar  Bima  Curut;  demikian  pula jumlah lapisan pada kultivar Sumenep lebih banyak dibandingkan dengan kultivar Bima Curut. Nilai kekerasan umbi kultivar Sumenep lebih rendah dibandingkan dengan kultivar Bima Curut yang menunjukkan bahwa umbi kultivar Sumenep lebih lunak dibandingkan dengan  kultivar  Bima  Curut.  Berdasarkan hasil uji serologi dengan metode DIBA, infeksi virus ditemukan lebih tinggi pada kultivar Sumenep dibandingan dengan pada kultivar Bima Curut. Infeksi OYDV, SLV dan GCLV mencapai 86.67% sampai 100% pada bawang merah ’Sumenep’ dan ’Bima Curut’ (Tabel 3). Pengaruh perlakuan suhu dan waktu pemanasan terhadap pertumbuhan eksplan diukur berdasarkan daya tumbuh dan jumlah daun eksplan. Kombinasi kultivar, suhu dan waktu pemanasan tidak berpengaruh terhadap daya tumbuh eksplan. Kombinasi kultivar dengan suhu pemanasan berpengaruh nyata terhadap daya tumbuh eksplan dan kombinasi kultivar dengan waktu pemanasan berpengaruh nyata terhadap daya tumbuh eksplan pada 11– 18 HST (Tabel 4).
Perlakuan suhu pemanasan berpengaruh nyata terhadap daya tumbuh eksplan pada 11–18 HST, sementara waktu pemanasan berpengaruh nyata terhadap daya tumbuh eksplan pada 18 HST. Daya tumbuh eksplan tertinggi terjadi pada kultivar Bima Curut. Jumlah daun berbeda nyata lebih tinggi kultivar Sumenep dibandingkan dengan kultvar Bima Curut pada 28 HST. Perlakuan suhu pemanasan berpengaruh nyata terhadap jumlah daun, sementara waktu pemanasan tidak berpengaruh terhadap jumlah daun. Kombinasi kultivar dengan suhu pemanasan berpengaruh nyata terhadap jumlah daun berturut-turut pada 21 HST dan 28 HST. Kombinasi kultivar dengan waktu pemanasan berbeda nyata terhadap jumlah daun pada 21–28 HST, sedangkan kombinasi kultivar, suhu dan waktu pemanasan berpengaruh nyata terhadap jumlah daun pada 28 HST (Tabel 4). Infeksi  virus  pada  plantlet  setelah perlakuan pemanasan dideteksi dengan metode  RT-PCR  (Tabel  5).  Insidensi  virus pada kultivar Sumenep cenderung lebih tinggi dibandingkan dengan pada kultivar Bima  Curut.  Perlakuan  suhu  45  °C  selama 15  menit  pada  kultivar  Bima  Curut  dapat menekan insidensi Potyvirus dan Carlavirus sampai 100%.  Perlakuan suhu 50 °C selama 15 menit pada kultivar Sumenep dapat menekan Potyvirus sampai  100%  (Tabel  5). Allexivirus tidak ditemukan pada semua
Tabel 2  Morfologi umbi bawang merah kultivar Sumenep dan Bima Curut
Parameter Kultivar Hasil uji T * Sumenep Bima Curut Diameter umbi (mm) 17.93 15.19 Positif Jumlah lapis 3.3 2.2 Positif Kekerasan umbi (mm/152 g. 5 detik) 1.32 2.10 Negatif
*Nilai t hitung positif = ada perbedaan bermakna apabila t hitung > t tabel; Nilai t hitung negatif = ada perbedaan bermakna apabila t hitung < t tabel
Tabel 3  Rata-rata infeksi virus pada daun bawang merah berumur 30 hari setelah tanam berdasarkan hasil deteksi dengan metode DIBA
Kultivar Jumlah sampel terinfeksi/jumlah sampel yang diuji (%) OYDV SLV GCLV Bima Curut 15/15 (100) 15/15 (100) 13/15 (86.67) Sumenep 15/15 (100) 15/15 (100) 15/15 (100)

## PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  mengkonfirmasi  bahwa bawang  merah  'Bima  Curut'  dan  'Sumenep' terinfeksi  berbagai  jenis  virus,  yaitu  OYDV, SLV  dan  GCLV.  Dilaporkan  sebelumnya
sampel diduga karena tidak ada infeksi virus tersebut pada tanaman dan umbi bawang merah di lapangan. Perbedaan respons antarkultivar terhadap suhu dan waktu pemanasan dapat dipengaruhi oleh ukuran umbi, jumlah lapisan, dan kekerasan umbi.
Tabel 4  Daya tumbuh dan jumlah daun eksplan bawang merah 'Bima Curut' dan 'Sumenep'
Perlakuan Daya tumbuh eksplan (%) Jumlah daun 11 HST* 18 HST 26 HST 21 HST 28 HST Kultivar Bima Curut (K1) 82.41 a** 85.19 a 89.82 a 1.09 a 1.35 b Sumenep (K2) 54.63 b 59.26 b 76.85 b 1.43 a 1.81 a Suhu pemanasan : 45 °C (S1) 59.73 b 59.73 b 81.95 a 0.99 b 1.32 b 50 °C (S2) 62.50 ab 65.28 b 84.72 a 0.94 b 1.28 b Suhu ruang (S3) 83.33 a 91.67 a 83.34 a 1.86 a 2.14 a Waktu pemanasan : 15 menit (W1) 62.96 a 64.82  b 85.19 a 1.17 a 1.43 a 30 menit (W2) 74.07 a 79.63a 81.48 a 1.36 a 1.73 a Interaksi : Kultivar x Suhu K1S1 94.45 a 94.45 a 94.45 a 1.42 ab 1.42 b K1S2 69.45 ab 77.78 a 86.12 ab 0.80 b 1.19 b K1S3 83.34 a 83.34 a 88.89 ab 1.06 b 1.44 b K2S1 25.01 b 25.01 b 69.45 b 0.56 b 1.22 b K2S2 55.55 ab 52.78 ab 83.33 ab 1.08 b 1.36 b K2S3 83.32 a 100.00 a 77.78 ab 2.67 a 2.83 a Kultivar x Waktu K1S1 85.19 a 85.19 a 90.74 a 1.20 a 1.55 a K1S2 79.63 a 85.19 a 88.89 a 0.98 b 1.15 b K2S1 40.74 ab 44.44 ab 79.63 a 1.13 a 1.29 ab K2S2 68.52 a 74.08 a 74.07 a 1.74 a 2.32 a Kultivar x Suhu x Waktu K1S1W1 94.45 a 94.45 a 94.45 a 1.56 a 1.44 ab K1S1W2 94.45 a 94.45 a 94.45 a 1.28 a 1.39 ab K1S2W1 77.78 a 77.78 a 88.89 a 1.00 a 1.78 ab K1S2W2 61.12 a 77.78 a 83.34 a 0.61 a 0.61 b K1S3W1 83.34 a 83.34 a 88.89 a 1.06 a 1.44 ab K1S3W2 83.34 a 83.34 a 88.89 a 1.06 a 1.44 ab K2S1W1 5.56  a 5.56 a 72.22 a 0.22 a 0.33 b K2S1W2 44.46 a 44.46 a 66.67 a 0.89 a 2.11 ab K2S2W1 33.34 a 27.78 a 88.89 a 0.50 a 0.72 b K2S2W2 77.77 a 77.78 a 77.78 a 1.67 a 2.00 ab K2S3W1 83.32 a 100.00 a 77.78 a 2.67 a 2.83 a K2S3W2 83.32 a 100.00 a 77.78 a 2.67 a 2.83 a Koefisien keragaman 32.44 26.37 10.5 42.31 33.1
*HST, hari setelah tanam
**Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji BNJ taraf 5%
Jurnal Fitopatologi Indonesia
bahwa beberapa jenis virus berhasil dideteksi dari  satu  umbi  bawang  merah.  Infeksi kompleks beberapa virus tersebut dapat menyebabkan keparahan penyakit yang lebih besar dibandingkan bila tanaman hanya terinfeksi  satu  jenis  virus  (Wulandari et al. 2015). Gunaeni et al. (2011) melaporkan adanya infeksi OYDV, SYSV, dan gabungan OYDV dan SYSV pada bawang merah berturut-turut sebesar  85%, 95%, dan 85%.
Kombinasi perlakuan pemanasan dan kultur jaringan berpotensi untuk menekan infeksi  beberapa  jenis  virus  dengan  suhu dan  waktu  pemanasan  tertentu.  Walaupun demikian, perlu dipastikan lebih dahulu pengaruh pemanasan terhadap pertumbuhan tanaman. Dalam hal ini diharapkan bahwa tanaman dapat tetap tumbuh dengan baik pada perlakuan  pemanasan  tetapi  infestasi  virus dapat ditekan. Jumlah eksplan yang tumbuh pada  bawang  merah  'Bima  Curut'  cenderung lebih banyak, hal tersebut menunjukkan bahwa kultivar tersebut lebih toleran terhadap perlakuan pemanasan dibandingkan dengan bawang merah 'Sumenep'.
Hasil penelitian lebih lanjut menunjukkan bahwa pertumbuhan eksplan dengan perlakuan pemanasan  pada  suhu  50  °C  menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan perlakuan  pemanasan  pada  suhu  45  °C. Hal ini karena perlakuan pemanasan yang diikuti dengan kultur meristem mampu
mengembalikan potensi pertumbuhan planlet yang terganggu akibat keberadaan virus pada jaringan tanaman. Hasil penelitian Sulistio et al .  (2015);  Supenti  dan  Marlina  (2011) menyatakan bahwa pertumbuhan planlet dengan perlakuan termoterapi selama tiga minggu yang diikuti dengan kultur meristem mampu mengembalikan potensi pertumbuhan planlet yang terganggu akibat keberadaan virus pada jaringan tanaman.
Pemanfaatan  termoterapi  untuk  menekan infeksi  virus  telah  dilaporkan  pada  berbagai jenis tanaman dan virus yang berbeda. Perlakuan pemanasan yang dikombinasikan dengan kultur jaringan pada bawang merah dapat mengeliminasi SLV dan OYDV (Fletcher et al. 2010). Lebih lanjut, penerapan metode kombinasi termoterapi pemanasan dan kultur meristem dilakukan untuk mengurangi tingkat kesulitan aplikasi. Metode kombinasi ini dilaporkan lebih efektif untuk mengeliminasi beberapa jenis virus dibandingkan dengan metode tunggal, yaitu kultur meristem atau termoterapi.
Nasution et al. (2017) menguraikan bahwa perlakuan termoterapi pada bawang putih memberikan pengaruh nyata terhadap persentase hidup eksplan. Perlakuan suhu terlalu  tinggi  berpengaruh  negatif  terhadap pertumbuhan eksplan. Eliminasi menggunakan metode elektroterapi pada berbagai tingkat arus listrik memperlihatkan tidak berpengaruh
Tabel 5  Insidensi infeksi virus pada plantlet bawang merah setelah kombinasi perlakuan pemanasan dan kultur jaringan berdasarkan hasil deteksi dengan metode RT-PCR
Kultivar Perlakuan pemanasan (suhu; waktu) Insidensi infeksi virus* (%) Potyvirus Carlavirus Allexivirus Bima Curut 45 °C; 15’ 0/3 (0) 0/3 (0) 0/3 (0) 45 °C; 30’ 1/3 (33.33) 0/3 (0) 0/3 (0) 50 °C; 15’ 1/3 (33.33) 1/3 (33.33) 0/3 (0) 50 °C; 30’ 0/3 (0) 1/3 (33.33) 0/3 (0) Kontrol 1/3 (33.33) 2/3 (66.67) 0/3 (0) Sumenep 45 °C; 15’ 1/1 (100) 1/1 (100) 0/1 (0) 45 °C; 30’ 1/3 (33.33) 1/3 (33.33) 0/3 (0) 50 °C; 15’ 0/3 (0) 2/3 (66.67) 0/3 (0) 50 °C; 30’ 2/3 (66.67) 3/3 (100) 0/3 (0) Kontrol 0/3 (0) 3/3 (100) 0/3 (0)
*Insidensi infeksi virus merupakan nisbah antara jumlah sampel dengan reaksi positif pada hasil deteksi dengan jumlah total sampel yang diuji.

## nyata terhadap persentase tanaman bebas virus.
Perlakuan suhu 33 °C mampu menghasilkan tanaman bebas OYDV pada kultivar Lumbu hijau  hingga  60%  dan  kultivar  Sangga Sembalun  40%.    Pada  tanaman  nilam  kultur meristem apikal berhasil mengeliminasi virus sebanyak 33.3–99.9% (Noveriza et al. 2012). Perendaman setek batang nilam menggunakan air  panas  pada  suhu  50–60  °C  selama  10– 30 menit tidak dapat mengeliminasi Potyvirus . Perlakuan pemanasan dalam inkubator di kondisi hari panjang pada suhu 38–40 °C selama 3 minggu yang diikuti kultur meristem dapat  membebaskan  100%  plantlet  krisan dari  infeksi Chrysanthemum Virus-B (CVB) (Budiarto et al. 2008). Perlakuan pemanasan umbi  bawang  merah  pada  suhu  45  °C selama 45 menit mampu menekan insidensi penyakit  sebanyak  64.35%  dan  berpengaruh meningkatkan produksi tanaman bawang merah  sebesar  55–71%  (Harti et al. 2018). Dapat disimpulkan bahwa sebagian besar umbi bawang merah yang beredar di lapangan dan digunakan sebagai sumber benih sudah terinfeksi  oleh  beberapa  jenis  virus  (OYDV, SLV,  dan  GCLV).  Upaya  untuk  memperoleh umbi bebas virus sebagai benih sehat dapat dilakukan melalui kombinasi perlakuan suhu dan kultur jaringan. Perlakuan pemanasan pada  suhu  45  °C  selama  15  menit  dapat mengeliminasi Potyvirus dan Carlavirus sampai 100% pada bawang merah 'Bima Curut'. Perlakuan air panas pada suhu 50 °C selama 15 menit dapat mengeliminasi Potyvirus sebesar  100%  tetapi  hanya  dapat  menekan Carlavirus sebesar  33.33%  pada  bawang merah 'Sumenep'. Hasil ini mengindikasikan bahwa perlakuan yang terbaik untuk menekan infeksi  virus  dapat  berbeda  untuk  setiap kultivar bawang merah.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian didanai oleh Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Proyek kerjasama Institut Pertanian Bogor (IPB) dan Australian Centre for International Agricultural Research  (ACIAR  Project  HORT-2009-056) dan Pusat Kajian Hortikultura Tropika, IPB.

## DAFTAR PUSTAKA
Almaarri K, Massa R, Albiski F. 2012.
Evaluation of some therapies and meristem culture to eliminate Potato Y Potyvirus from infected potato plants. Plant Biotechnology. 29:237–243. DOI: https://doi.org/10.5511/ plantbiotechnology.12.0215a.
Anggraini S, Hidayat SH, 2014. Sensitivitas metode serologi dan polymerase chain reaction untuk mendeteksi Bean common mosaic potyvirus pada kacang panjang. J Fitopatol Indones. 10(1):17–22. DOI: https://doi.org/10.14692/jfi.10.1.17.
Budiarto K, Y. Sulyo, IB. Rahardjo, D. Pramanik. 2008. Pengaruh durasi pemanasan terhadap keberadaan Chrysanthemum Virus-B pada tiga varietas krisan terinfeksi. J Hort. 18(2):185–192.
Budiono DP. 2004. Multiplikasi in vitro tunas bawang merah ( Allium ascalonicum L.) pada berbagai taraf konsentrasi air kelapa. J Agro. 8(2):75–80.
Doyle  JJ,  Doyle  JJ.  1990.  Isolation  of  plant DNA from fresh tissue. Focus. 12:13–15. DOI: https://doi.org/10.2307/2419362.
Duriat AS. 1990. Inventarization of pest and diseases on lowland vegetable in Madura, Bali dan Lombok. Bul Penel Hort. edisi khusus. 18:119–130.
Duriat AS, Sukarna E. 1990. Deteksi penyakit virus pada klon bawang merah. Bul Penel Hort. edisi khusus. 18:146–150.
Fajaro Thor VM, Nishijima M, Buso JA,
Torres  AC,  Avila  AC,  Resende  RO. 2001. Garlic viral complex: identification of  Potyviruses  and  Carlavirus  in Central  Brazil  [Internet]. Fito Brazil 26(3);  [diunduh  2011  Feb  6].  Tersedia pada: http:// www. Scielo.briscielo. php?pid=S0100-41582001000300007 script=sci  arttext.  DOI:  https://doi. org/10.1590/S0100-41582001000300007.
Fletcher PJ, Fletcher JD, Lewthwaite SL.
2010. In vitro elimination of onion yellow dwarf and shallot latent viruses in shallots ( Allium cepa var. ascalonicum L.). N Z J Crop Hortic Sci. 26(1):23–26. DOI: https:// doi.org/10.1080/01140671.1998.9514035.
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Wulandari et al.
Gunawan  LW.  1992. Teknik  Kultur  Jaringan Tumbuhan. Pusat Antar Univ. Bioteknologi. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Gunaeni  N,  Wulandari  AW,  Duriat  AS, Muharam A. 2011. Insiden penyakit virus tular umbi pada tigabelas varietas bawang merah asal Jawa Barat dan Jawa Tengah. J Hort. 21(2):164–172. DOI: https://doi. org/10.21082/jhort.v21n2.2011.p164-172.
Hadidi A, Khetarpal RK, Koganezawa H.
1998. Plant Virus Diseases Control . St. Paul (US): APS Pr.
Harti H, Sobir, Wiyono S, Hidayat SH. 2018.
Perlakuan air panas pada umbi bawang merah ( Allium cepa var. ascalonicum ) untuk menekan infeksi virus di lapangan. J Hortikultur Indones. 9(3):149–157. DOI: https://doi.org/10.29244/jhi.9.3.149-157. Langeveld SA, Dore JM, Memelink J. 1991. Identification  of  potyviruses  using  the polymerase chain reaction with degenerate primers. J General Virology. 72 : 1531– 1541. DOI: https://doi.org/10.1099/0022- 1317-72-7-1531.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium  for  rapid  growth  and  bio  assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum. 15(3):473–497. DOI: https:// doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962. tb08052.x.
Nasution SS, Dinarti D, Hidayat SH. 2017.
Pengaruh elektroterapi dan termoterapi secara in vitro terhadap eliminasi Onion yellow dwarf virus . J Fitopatol Indones. 13(6):199–206. DOI: https://doi. org/10.14692/jfi.13.6.199.
Noveriza R, Suastika G, Hidayat SH, Kartosuwondo U. 2012. Eliminasi Potyvirus penyebab penyakit mosaik pada tanaman nilam dengan kultur meristem apikal dan perlakuan air panas pada setek batang. J. Littri. 18(3):107–114. DOI: https://doi.org/10.21082/jlittri. v18n3.2012.107-114.
Shahraeen N, Lesemann DE, Gholbi T. 2008. Survey for viruses infecting onion, garlic and leek crops in Iran. Eppo Bulletin . 38(1):131–135. DOI: https://doi. org/10.1111/j.1365-2338.2008.01198.x. Sulistio M, Sulistyaningsih E, Subandiyah
S.  2015.  Elimination  of  shallot  bulb viruses through heat treatment. Indo J Biotechnol. 20(2):133–140. DOI: https:// doi.org/10.22146/ijbiotech.24196.
Supenti, Marlina N. 2011. Teknik pembebasan virus pada tanaman krisan. Bul Tek Pert. 16(2):64–67.
Sutarya R, Van Vreden, Korlina E, Gunaeni N, Duriat AS. 1993. Survei virus bawang merah pada beberapa lokasi di Kabupaten Brebes, Jawa Tengah. Bul Penel Hort. 26(1):97–106.
Wulandari  AW,  Hidayat  SH,  Sobir.  2015. Deteksi virus pada bawang merah ( Allium cepa var. ascalonicum ) dengan metode Dot Immuno Binding Assay . J Hort. 25(4):350– 356. DOI: https://doi.org/10.21082/jhort. v25n4.2015.p350-356.