Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Singkong ( Manihot esculenta ) terhadap Histopatologi Hepar Tikus Putih Galur Wistar
Acute Toxicity of Ethanol Leaves Extracts of Cassava (Manihot esculenta) on Liver Histopathology of Wistar Rats
Sheillavi Fauziah Alex Saddamiah 1 , Rena Normasari 2 , Cholis Abrori 3
1 Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran Universitas Jember
2 Laboratorium Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Jember
3 Laboratorium Farmakologi, Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jalan Kalimantan No. 37 Kampus Tegalboto, Jember 68121 e-mail korespondensi: rena_normasari@unej.ac.id ; alexsheillavi@gmail.com

## Abstrak
Daun  singkong  ( Manihot  esculenta )  mengandung  racun  berupa  glikosida  sianogenik.  Glikosida  sianogenik dapat dihidrolisis menjadi glukosa dan aseton sianohidrin yang kemudian didekomposisi menjadi sianida. Daun singkong  dimanfaatkan  oleh  masyarakat  sebagai  sumber  pangan  dan  obat  tradisional.  Namun,  terdapat laporan  mengenai  kejadian  intoksikasi  dan  kematian  akibat  konsumsi  singkong  di  Kenya.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  ekstrak  etanol  daun  singkong  dosis  toksik  terhadap  gambaran histopatologi  hepar  tikus  Wistar.  Penelitian  ini  dilakukan  melalui  dua  tahap  yakni  uji  pendahuluan  dan  uji utama  dengan  dosis  sebesar  2000  mg/kgBB  yang  diberikan  satu  kali  di  awal  uji.  Uji  utama  terdiri  dari  dua kelompok  yaitu  kelompok  kontrol  yang  diberi  larutan  Na-CMC  0,5%  dan  kelompok  perlakuan  yang  diberi ekstrak etanol daun singkong dosis 2000 mg/kgBB. Semua hewan diamati selama 14 hari.  Data yang didapat berupa nilai skor histopatologi hepar. Hasil uji Mann Whitney menunjukkan p= 0,009 (p<0,05) sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa ekstrak etanol daun singkong dosis 2000 mg/kgBB dapat menyebabkan perubahan gambaran  histopatologi  hepar  tikus  Wistar  berupa  degenerasi  parenkimatosa,  degenarasi  hidropik,  dan nekrosis pada sebagian sel.
Kata Kunci: daun singkong, toksisitas akut, histopatologi hepar

## Abstract
Cassava  leaves  (Manihot  esculenta)  contain  cyanogenic  glylcoside  as  toxicant.  Cyanogenic  glycoside  can  be hydrolized into glucose and cyanohydrin acetone which is then decomposed into cyanide. Cassava leaves are used by the community as a source of food and traditional medicine. However, there is a report of incidents of intoxication and death from cassava consumption in Kenya. This research is intended to know the effect of toxic dose ethanol extract of cassava leaves to liver histopathology of Wistar rats. This study was conducted through two stages, sighting study and main study. Both studies used initial dose level 2000 mg/kg and given once at the first day of each study. Main study consists of two groups, control group given 0,5% Na-CMC and treatment group given ethanol extract of cassava leaves dose 2000 mg/kg. All animals were observed for 14 days. Liver histopathology  scores  were  obtained.  Mann  Whitney  test  showed  that  p=  0,009  (p<0,05)  so  that  can  be concluded that ethanol extract of cassava leaves dose 2000 mg/kg can cause histopathological changes in the liver of Wistar rats represented by cloudy swelling degeneration, hydropic degeneration, and necrosis in some cell.
Keywords: cassava leaves, acute toxicity, liver histopathology

## Pendahuluan
Daun  siingkong  ( Manihot  esculenta )  mengandung zat-zat  nutrien  dan  antioksidan  dan  racun  yakni glikosida  sianogenik.  Telah  terdapat  laporan mengenai kejadian intoksikasi dan kematian akibat konsumsi  singkong  di  Kenya.  Delapan  anggota keluarga  dirawat  di  rumah  sakit  setelah mengonsumsi  singkong  (Cardoso et  al .,  2005).
Selain  itu,  daun  singkong  mengandung  glikosida sianogenik  10  kali  lebih  besar  dari  umbi (Montagnac et al ., 2009).
Kandungan  glikosida  sianogenik  daun  singkong berada  dalam  level  yang  berpotensi  toksik  yang terdiri  dari  linamarin  (95%  total  kandungan sianogen)  dan  lotaustralin  (5%).  Linamarin merupakan  glikosida  sianogenik  yang  disimpan dalam  setiap  sel  tumbuhan  singkong  terutama pada  daun.  Linamarin  kemudian  dihidrolisis menjadi  glukosa  dan  aseton  sianohidrin  yang dapat didekomposisi menjadi aseton dan hidrogen sianida  (HCN)  (OECD,  2009).  Sianida  dapat mengikat  bagian  aktif  dari  enzim  sitokrom oksigenase  yang  mengakibatkan  metabolisme  sel secara  aerobik  terhenti  dan  bergeser  menjadi metabolisme  anaerobik.  Paparan  sianida  pada manusia melalui jalur  oral menyebabkan jaringan- jaringan  tubuh  seperti  hepar,  otak,  limpa,  darah, ginjal,  dan  paru-paru  mengandung  sianida.    HCN akan mengurangi ketersediaan energi dan oksigen di  semua  sel  terutama  hepar  karena  hepar memiliki peranan penting dalam proses metabolisme (Baskin dan Thomas, 1997).
Adanya  informasi  mengenai  kasus  intoksikasi singkong menyebabkan perlunya dilakukan penelitian  tentang  keamanan  daun  singkong karena  daun  singkong  merupakan  tempat biosintesis  glikosida  sianogenik  terutama  pada hepar.  Hal  tersebut  memerlukan  pembuktian secara  ilmiah  mengenai  pengaruh  ekstrak  etanol daun  singkong  dosis  toksik  tehadap  gambaran histopatologi hepar. Penelitian ini dirancang untuk menjawab permasalahn tersebut dengan menggunakan tikus Wistar sebagai hewan coba.

## Metode Penelitian
Ekstrak  etanol  daun  singkong  dibuat  melalui proses  pengeringan  dengan  bantuan  cahaya matahari  dan  angin.  Daun  kering  kemudian dihaluskan  menjadi  simplisia  lalu  dimaserasi dengan  pelarut  etanol  70%.  Hasil  maserasi  dibuat menjadi ekstrak menggunakan rotary evaporator .
Jenis  penelitian  yang  digunakan  adalah  penelitian eksperimental  murni  ( true  experimental )  dan
menggunakan  desain postest  only  control  group design .  Populasi  pada  penelitian  ini  adalah  tikus putih  galur  Wistar  betina  umur  8-12  minggu dengan  berat  100-200  gram, nullipara ,  sehat,  dan belum pernah digunakan dalam penelitian. Sampel yang digunakan pada penelitian ini diambil dengan teknik simple random sampling dari populasi tikus.
Jumlah  sampel  yang  digunakan  sebanyak  10 sampel  yang  diperoleh  berdasarkan  pedoman OECD  420  tentang  uji  toksisitas  akut  oral  (OECD, 2001).  Penelitian  ini  dilakukan  melalui  dua  tahap yakni uji pendahuluan dan uji utama dengan dosis sebesar 2000 mg/kgBB yang diberikan satu kali  di awal  uji.  Uji  pendahuluan  terdiri  dari  satu  ekor tikus  yang  diberi  ekstrak  etanol  daun  singkong dosis  2000  mg/kgBB.  Uji  utama  terdiri  dari  dua kelompok  yaitu  kelompok  kontrol  yang  diberi larutan  Na-CMC  0,5%  dan  kelompok  perlakuan yang  diberi  ekstrak  etanol  daun  singkong  dosis 2000  mg/kgBB.  Semua  hewan  diamati  selama  14 hari.  Tikus  dikorbankan  dan  diambil  heparnya kemudian  dibuat  sediaan  histologis  untuk pengamatan  histopatologi  hepar.  Skoring  derajat histopatologi  hepar  yang  digunakan  dalam penelitian ini mengacu  pada penelitian yang telah dilakukan  oleh  Tamad et al (2011). Data nilai skor histopatologi hepar kemudian dianalisis menggunakan uji Mann Whitney .

## Hasil Penelitian
Selama  pengamatan  berlangsung  tidak  ditemukan tanda  klinis  (kejang,  posisi  lateral,  tremor,  sesak nafas,  dan  vokalisasi)  dan  kematian  hewan  coba. Hasil pengamatan jaringan hepar secara mikroskopis  menunjukkan  hepar  tikus  yang terpapar ekstrak etanol daun singkong dosis  2000 mg/kgBB  mengalami  perubahan  struktur.  Hepar tikus  kelompok  perlakuan  yang  diamati  di  bawah mikroskop cahaya terdapat degenerasi parenkimatosa, degenerasi hidropik, dan nekrosis. Gambaran  histopatologi  secara  umum  pada masing-masing  kelompok  dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Berdasarkan  hasil  pengamatan  sel  hepar  secara mikroskopis  yang  dilakukan  pada  dua  kelompok didapatkan  data  berupa  nilai  skor  histopatologi hepar.  Nilai  skor  histopatologi  hepar  tikus dianalisis data dengan mecari median dan modus. Median  dan  modus  nilai  skor  kelompok  kontrol sebesar  1,025  dan  1,00.  Sedangkan  median  dan modus nilai skor kelompok perlakuan sebesar 1,94 dan  1,60.  Uji Mann  Whitney dilakukan  antara kelompok kontrol dan perlakuan untuk mengetahui signifikansi perbedaan nilai skor  pada
kedua  kelompok.  Hasil  uji Mann  Whitney antara kelompok  kontrol  dan  perlakuan  menunjukkan bahwa nilai p < 0,05 yakni 0,009. Artinya, terdapat
perbedaan  yang  bermakna  antara  kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan.
Gambar 1.  Degenerasi  parenkimatosa  ditunjukkan  dengan  panah  berwarna  kuning,  degenerasi  hidropik  ditunjukkan dengan panah berwarna biru, dan nekrosis ditunjukkan dengan panah berwarna hitam. Gambar (a) merupakan kelompok kontrol. Gambar (b) dan (c) merupakan kelompok perlakuan.

## Pembahasan
Berdasarkan  analisis  data  yang  telah  dilakukan, peningkatan  median  dan  modus  nilai  skor histopatologi  hepar  kelompok  perlakuan  memiliki perbedaan  yang  signifikan  dengan  kelompok kontrol.  Artinya,  terjadi  kerusakan  hepatosit  pada kelompok  kontrol  setelah  pemberian  ekstrak etanol daun singkong dosis 2000 mg/kgBB per oral secara  akut.  Hal  ini  sesuai  dengan  teori  yang menyatakan  bahwa  glikosida  sianogenik  pada daun singkong dapat mengganggu fungsi mitokondria  sehingga  menyebabkan  terjadinya degenerasi dan nekrosis. Daun singkong ( Manihot esculenta )  mengandung  glikosida  sianogenik  yang dengan cepat dihidrolisis menjadi aseton sianohidrin  yang  kemudian  dipecah  menjadi hidrogen  sianida  dan  aseton.  Sianida  dapat bergabung  dan  menghambat  enzim-enzim  dalam tubuh.  Sianida  yang  berikatan  dengan  sitokrom oksidase  akan  mencegah  terjadinya  transpor elektron sehingga mencegah produksi ATP. Hal ini menyebabkan  hipoksia  seluler  dan  sitotoksik anoksia  yang  akhirnya  dapat  menyebabkan kematian sel  (Bhandari et ., 2014; Auerbach et al ., 2016).
Pada pengamatan mikroskopis hepar tikus tampak perubahan  histopatologi  hepatosit  pada  semua kelompok  perlakuan.  Perubahan  yang  tampak yaitu  degenerasi  parenkimatosa,  degenerasi hidropik, dan nekrosis. Degenerasi parenkimantosa  terjadi  akibat  kegagalan  oksidasi yang  menyebabkan  pembengkakan  sel  dan pengeruhan sitoplasma dengan munculnya granul- granul  dalam  sitoplasma  karena  endapan  protein. Degenerasi  hidropik  memiliki  derajat  yang  lebih berat  daripada  degenerasi  parenkimatosa.  Pada degenerasi  ini  tampak  vakuola  berisi  air  dalam
sitoplasma  karena  terjadinya  gangguan  transpor aktif  yang  menyebabkan  sel  tidak  mampu memompa ion Na + keluar sehingga konsentrasi ion Na + di  dalam  sel  naik.  Pengaruh  osmosis  ini menyebabkan  influks  air  ke  dalam  sel  sehingga terjadi  perubahan  morfologis  yaitu  sel  tampak bengkak  (Robbins et  al. ,  2007;  Mitchell et  al. , 2008). Kondensasi kromatin inti yang tampak pada mikroskop  merupakan  hasil  dari  penurunan  pH karena  glikolisis  anaerob  yang  disebabkan  oleh deplesi  ATP.  Fragmentasi  kromatin  disebabkan oleh  aktivasi  endonuklease  yang  disebabkan  oleh peningkatan  Ca 2+ sitosol  karena  deplesi  ATP (Kumar et al ., 2013).
Selama  proses  pembuatan  ekstrak,  sebanyak  350 gram  simplisia  daun  singkong  menghasilkan  33 gram  ekstrak.  Artinya,  sebanyak  9,428%  simplisia daun  singkong  menjadi  ekstrak.  Jika  berat  badan tikus  170  gram,  maka  peneliti  membutuhkan  340 mg  ekstrak  yang  berasal  dari  3,6  gram  simplisia daun  singkong  untuk  dapat  mencapai  dosis  2000 mg/kgBB  pada  tikus.  Apabila  dosis  ini  dikonversi untuk  manusia  dengan  berat  badan  50  kg,  maka diperlukan  100  gram  ekstrak  yang  diperoleh  dari 1,06  kg  simplisia  daun  singkong  untuk  mencapai dosis  2000  mg/kgBB  yang  dapat  menyebabkan kerusakan hepatosit.
Selama pengamatan berlangsung tidak didapatkan tanda  klinis  dan  kematian  pada  kelompok perlakuan.  Hal  ini  berbeda  dengan  hasil pengamatan  gambaran  histopatologis  hepar  yang menunjukkan adanya perubahan struktur hepatosit yang signifikan pada kelompok perlakuan.  Menurut  peneliti,  kurangnya  waktu pengamatan yang tidak dapat dilaksanakan selama 24  jam  penuh  dalam  14  hari  dapat  menyebabkan tanda  klinis  tidak  terdeteksi  secara  menyeluruh.
Sesuai  pedoman  OECD  (2001),  peneliti  hanya mengamati  tanda  klinis  pada  30  menit  setelah pemajanan  sediaan  uji,  4  jam  pertama,  dan pengamatan  selanjutnya  dilakukan  setiap  hari secara rutin namun tidak 24 jam penuh.
OECD  (2000)  menyebutkan  bahwa  seharusnya pengamatan  terhadap  tanda  klinis  hewan  coba dilakukan  saat  periode  aktifnya,  sedangkan  tikus merupakan  hewan  nokturnal  dan  cenderung menghabiskan  waktunya  untuk  tidur.  Sebaiknya pengamatan terhadap tanda klinis dan perubahan perilaku  tikus  dilakukan  saat  malam  hari  atau dengan  menggunakan  cahaya  lampu  berwarna merah.  Namun  karena  keterbatasan  waktu  dan biaya, peneliti melakukan pengamatan tanda klinis dan perubahan perilaku tikus saat siang hari. Tidak tercatatnya  tanda  klinis  selama  penelitian  ini berlangsung  dapat  disebabkan  oleh  sulitnya membedakan  tikus  yang  sedang  tertidur  dengan tidak munculnya tanda vokalisasi.
Hal  lain  yang  dapat  menyebabkan  belum munculnya  tanda  klinis  adalah  jumlah  hepatosit yang  mengalami  kerusakan.  Menurut  Barton (2007),  diperlukan  setidaknya  75%  massa  hepar yang  rusak  sebelum  timbul  gejala  klinis.  Sebagai contoh, munculnya kejang dan tremor merupakan tanda  telah  terjadinya  ensefalopati  hepatik  akibat hiperamonemia  yang  disebabkan  oleh  disfungsi hepar  akut  (Al  Sibae  dan  McGuire,  2009).  Karena selama  penelitian  berlangsung  tidak  ditemui kejang  dan  tremor,  peneliti  berpendapat  bahwa kerusakan  hepatosit  yang  terjadi  pada  kelompok perlakuan tidak lebih dari 75% massa hepar. Hal ini yang mendasari peningkatan nilai skor histopatologi  hepar  kelompok  perlakuan  secara signifikan  namun  tidak  diiringi  dengan  munculnya tanda  klinis.  Jadi  penelitian  ini  menunjukkan bahwa  konsumsi  ekstrak  etanol  daun  singkong sebanyak  2000  mg/kgBB  dapat  menimbulkan kerusakan hepatosit.
Menurut  pedoman  OECD  (2001),  adanya  bukti toksisitas pemberian ekstrak etanol daun singkong pada  dosis  2000  mg/kgBB  menunjukkan  bahwa ekstrak  etanol  daun  singkong  termasuk  dalam kategori  5  klasifikasi Globally  Harmonised  System of  Classification (GHS).  Bukti  toksisitas  yang dimaksud  peneliti  yaitu  kerusakan  hepatosit  yang bermakna  pada  kelompok  perlakuan.  Artinya, bahan  ekstrak  etanol  daun  singkong  memiliki kemungkinan  toksisitas  akut  yang  relatif  rendah, namun dalam keadaan tertentu dapat membahayakan populasi rentan (OECD, 2001).
Menurut peneliti, saat ini tidak perlu dilakukan uji toksisitas  akut  ekstrak  etanol  daun  singkong dengan yang dosis lebih  besar dari 2000 mg/kgBB
karena  belum  ada  penelitian  yang  menunjukkan manfaat  ekstrak  etanol  daun  singkong  untuk pengobatan  dengan  dosis  mencapai  2000 mg/kgBB. Penelitian-penelitian yang menunjukkan manfaat  daun  singkong  untuk  pengobatan  yang telah  dilakukan  oleh  Bokanisereme et  al .  (2013), Bahekar  dan  Kale  (2015),  dan  Normasari et  al.
(2017)  tidak  melampaui  dosis  2000  mg/kgBB. Sehingga,  Penggunaan  dosis  tambahan  sebesar 5000  mg/kgBB  dapat  dipertimbangkan  jika terdapat  kemungkinan  kuat  bahwa  hasil  uji  yang dilakukan  akan  mampu  melindungi  keselamatan hewan dan manusia. Keputusan ini diambil dengan mempertimbangkan  keselamatan  hewan  sesuai dengan pedoman OECD (2001).

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa  ekstrak  etanol  daun  singkong  dosis  2000 mg/kgBB dapat menyebabkan perubahan gambaran histopatologi hepar tikus Wistar berupa degenerasi  parenkimatosa,  degenerasi  hidropik, dan nekrosis pada sebagian sel hepar.

## Referensi
Auerbach,  P.,  T.  Cushing,  dan  N.  S.  Harris.  2016.
Auerbach’s  Wilderness  Medicine .  Seventh Edition. California: Elsevier.
Baskin,  S.  I.  dan  Thomas  G.  B.  1997.  Cyanide poisoning. Medical Aspects of Chemical and Biological Warfare 1(10): 271-286.
Bhandari,  R.  K.,  R.  P.  Oda,  I.  Petrikovics,  D.  E. Thompson,  M.  Brenner,  S.  B.  Mahon,  V.  S. Bebarta,  G.  A.  Rockwood,  dan  B.  A.  Logue. 2014.  Cyanide  toxicokinetics:  the  behavior of  cyanide,  thiocyanate  and  2-amino-2- thiazoline-4-carboxylic  acid  in  multiple animal  models. Journal  of  Analytical Toxicology 38(4): 218-225.
Cardoso A. P., E. Mairione, M. Ernesto, F. Massaza, J.  Cliff,  M.  R.  Haque,  dan  J.H.  Bradbury. 2005.  Processing  of  cassava  roots  to remove  cyanogens. Journal  of  Food Composition and Analysis 18: 451-460.
Kumar,  V.,  A.  K.  Abbas,  dan  J.  C.  Aster.  2013. Robbins  Basic  Pathology .  Ninth  Edition. Philadelphia: Elsevier, Inc.
Mitchell,  R.  N.,  V.  Kumar,  A.  K.  Abbas,  dan  N. Fausto.  2008. Adaptasi  Sel,  Jejas  Sel,  dan Kematian  Sel .  Dalam:  Buku  Saku  Dasar Patologi Penyakit. EGC: Jakarta.
Montagnac  J.  A.,  C.  R.  Davis,  dan  S.  A. Tanumihardjo. 2009. Processing techniques to  reduce  toxicity  and  antinutrients  of cassava  for  use  as  a  staple  food.
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 8(1): 17-27.
Organisation  for  Economic  Co-operation  and Development  (OECD).  2000. Guidance document  on  the  recognition,  assessment, and  use  of  clinical  signs  as  humane endpoints for experimental animals used in safety  evaluation .  Series  on  Testing  and
Assessment    No.  19.  Paris:  OECD Environment Directorate.
Organisation  for  Economic  Co-operation  and Development  (OECD).  2001. Acute  Oral Toxicity – Fized  Dose  Procedure .  OECD
Guideline for Testing of Chemicals No. 420.
Paris:  OECD  Environment,  Health,  and Safety Publications.
Organisation  for  Economic  Co-operation  and Development  (OECD).  2009. Consensus Document  on  Compositional  Consideratons for  New  Varieties  of  Cassava  (Manihot esculenta  Crantz):  Key  Food  and  Feed Nutrients,  Anti-nutrients,  Toxicants  and Allergens .  Series  on  the  Safety  of  Novel Foods  and  Feeds  No.  18.  Paris:  OECD
Environment, Health,
and Safety
Publications.
Robbins,  S.  L.,  R.  S.  Cotran,  dan  V.  Kumar.  2007.
Jejas,  Adaptasi,  dan  Kematian  Sel .  Dalam: Buku Ajar Patologi. EGC: Jakarta.
Tamad, F. S. U., Z. S. Hidayat, dan H. Sulistyo. 2011. Gambaran  histopatologi  hepatosit  tikus putih setelah pemberian jintan hitam dosis 500  mg/kgBB,  1000  mg/kgBB,  dan  1500 mg/kgBB  selama  21  hari  (subkronik). Mandala of Health 5(3).