Aktivitas Antibakteri dari Melanin Tinta Sotong, Fitrial et al. Available online: journal.ipb.ac.id/index.php/jphpi

## AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI MELANIN TINTA SOTONG DAN CUMI-CUMI

## Yuspihana Fitrial*, Iin Khusnul Khotimah
Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Lambung Mangkurat. Jl. A.Yani Km 36 Kotak Pos 6 Banjarbaru 70714, Kalimantan Selatan
Telepon/Fax: 0511-4772124 *Korespodensi: yuspihana@gmail.com
Diterima: 30 Mei 2017/ Disetujui: 6 Agustus 2017
Cara sitasi: Fitrial Y, Khotimah IK. 2017. Aktivitas antibakteri dari melanin tinta sotong dan cumi-cumi. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia. 20(2): 266-274.
Abstrak
Kelas Cephalopoda (seperti cumi-cumi dan sotong) memiliki tinta sebagai pertahanan dirinya. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan aktivitas antibakteri melanin dari tinta sotong ( Sepia sp.) dengan tinta cumi-cumi ( Loligo sp.) terhadap Escherichia coli . Ekstraksi dan pemurnian terhadap tinta sotong dan cumi-cumi dilakukan untuk mendapatkan melanin dengan menggunakan HCl 0,5 M secara mekanik. Melanin yang diperoleh diuji aktivitasnya terhadap E. coli dengan metode kontak langsung antara melanin dan E. coli di dalam nutrient broth . Total mikroba dihitung dengan metode hitungan cawan. Tinta yang berasal dari Sepia sp. ataupun Loligo sp. juga diuji aktivitasnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa melanin dari tinta sotong dan cumi-cumi memiliki aktivitas penghambatan pada konsentrasi 10 mg/mL dan 20 mg/mL, secara berturut-turut mencapai 99,99% terhadap E. coli . Tinta dari kedua jenis Cephalopoda tersebut pada konsentrasi yang sama dengan melanin,tidak menunjukkan adanya aktivitas penghambatan terhadap E. coli .  Melanin dari Sepia sp. memiliki aktivitas antibakteri terhadap E. coli lebih tinggi dibandingkan melanin dari Loligo sp.
Kata kunci: aktivitas antibakteri, E. coli , Loligo sp., melanin, tinta, Sepia sp.

## Antibacterial Activity of Melanin from Cuttlefish and Squid Ink
Abstract
Class Cephalopods (such as squid and cuttlefish) have ink as are notable for their defences. This study aims to compare the antibacterial activity of melanin from cuttlefish ink ( Sepia sp.) with squid ink ( Loligo sp.) against E. coli . Extraction and purification studies were carried out on Sepia and Loligo melanin using a hydrochloric acid 0,5M treatment under mechanical.The melanins were obtained and further evaluated their activity by direct contact methods between melanin and E. coli in nutrient broth.Total microbes was counted by total plate count.Both inks also was tested their activity against E. coli . The results showed that melanin from cuttlefish and squid inks had inhibitory activity at concentrations of 10 mg/ml and 20 mg/ ml, respectively reaching 99.99% against E. coli .The inks of both Cephalopods at the same concentration as melanin, did not show any inhibitory activity against E. coli .  The melanin of Sepia sp. have a higher antibacterial activity than the melanin of Loligo sp.
Keywords: antibacterial activity, cuttlefish, E. coli , Loligo sp., melanin, Sepia sp.
DOI: http://dx.doi.org/10.17844/jphpi.v20i2.17907

## PENDAHULUAN
Kelas  Cephalopoda  seperti  sotong ( Sepia sp.) dan cumi-cumi ( Loligo sp.) merupakan komoditi hasil tangkapan perikanan laut yang pemanfaatannya masih sangat terbatas, sementara untuk sotong hanya dikonsumsi dalam bentuk segar.
Tinta cumi-cumi ataupun sotong di daerah Kalimantan Selatan yang menjadi daerah pengambilan sampel biasanya dibuang atau tidak dimanfaatkan sebagai bagian dari olahan cumi-cumi.
Tinta cumi-cumi maupun tinta sotong mengandung melanin, protein, lemak dan
glikosaminoglikan. Tinta cumi-cumi dapat berperan sebagai obat pelindung sel pada pengobatan kanker dengan cara kemoterapi, melalui peningkatan jumlah sel leukosit dan sel nucleat sumsum tulang, yang jumlahnya menurun akibat penggunaan obat pembunuh sel tumor tersebut. Melanin dari tinta cumi- cumi mempunyai aktivitas anti-tumor dengan menghambat aktivitas plasmin untuk meningkatkan thromboxan dan meningkatkan sistem imun untuk membunuh sel kanker (Zhong et al. 2009). Melanin juga berperan sebagai antioksidan (Lei et al. 200 7a ), anti-radiasi (Lei et al. 2007 b ), dan anti- rotavirus (Rajaganapathi et al. 2007). Hasil penelitian menyebutkan bahwa tinta sotong dan atau cumi-cumi memiliki aktivitas antibakteri (Nair et al. 2011).  Aktivitas melanin sendiri sebagai antibakteri belum banyak diungkap. Beberapa peneliti telah melakukan pengujian aktivitas antibakteri hanya terhadap ekstrak  dari  tinta  sotong  dan  atau  cumi-cumi. Nithya et al. (2011) meneliti aktivitas antibakteri ekstrak heksan tinta sotong ( Sepia pharaonis) yang dipurifikasi dengan dietil eter. Hasil penelitian ini menunjukkan ekstrak tersebut memiliki aktivitas penghambatan terhadap Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus epidermidis , Klebsiella pneumoniae dan E. coli . Yuvaraj et al. (2015) membuktikan bahwa tinta cumi-cumi ( Loligo duvauceli) tidak memiliki aktivitas penghambatan terhadap E. coli . Hasil penelitian tersebut, dilakukan pengujian aktivitas antibakteri dengan melakukan pendekatan terhadap kemampuan komponen tinta yaitu melanin dalam  mengkelat  logam.  Hasil  penelitian Chen et al. (2009) menunjukkan bahwa melanin dari tinta cumi-cumi ( Ommastrephes bartrami ) memiliki kemampuan menyerap Cd(II) dan Pb(II) oleh gugus fungsi yang terdapat di molekul melanin. Gugus fungsi tersebut adalah fenolik hidroksil (OH), karboksil (COOH) dan amina (NH). Kemampuan melanin menyerap ion logam inilah yang akan diamati melalui pengujian aktivitasnya terhadap pertumbuhan sel bakteri terutama bakteri Gram negarif seperti E. coli . Bakteri Gram negatif pada membran terluar selnya mengandung ion Mg 2+ dan Ca 2+
yang berperan penting dalam melindungi kestabilan struktur luar sel.
E. coli merupakan bakteri Gram negatif, bersifat patogen bagi manusia dan umumnya bukan merupakan bakteri indigenous pada ikan (Arias 2009). Adanya E. coli pada daging ikan akibat kontaminasi selama pemanenan, pengolahan ataupun penyimpanan. Meskipun demikian beberapa ahli menggolongkannya sebagai salah satu bakteri yang menyebabkan pembusukan pada bahan pangan (Dave dan Ghaly 2011). Penelitian terkait aktivitas antibakteri melanin dari tinta sotong dan cumi-cumi terhadap E. coli penting dilakukan untuk mendapatkan informasi tentang  potensi melanin jika akan dikembangkan sebagai pengawet alami untuk produk perikanan.

## BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah (tinta) cumi-cumi dan sotong yang diperoleh dari Pelabuhan Perikanan Muara Kintap Kabupaten Tanah Laut, Kalimantan Selatan.
Bahan lain yang digunakan antara lain HCl 0,5M (Merck), aseton (Merck), akuades, Nutrient Broth (NB) (Merck), Nutrient Agar (NA) (Merck), EMBA (Merck), Syringe filter sterile -EO (Sartorius Minisart pore size 0,20 µm), Microbact TM GNB12A/B/E, 24E Identification Kits (oxoid) dan alkohol 70%. Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah refrigerated centrifuge (Labogene Scanspeed 1580R), Freeze dryer (Model Christ alpha 2-4 LD Plus), autoklaf (Pressure Steam Sterilizer Electric Model No.25X-2), laminar flow (Biobase), inkubator (Memmert), coloni counter (Quebec), incubator shaker (Wisd), spektrofotometer (Genesys 10uv) dan peralatan gelas lainnya.

## Metode Penelitian
Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi isolasi E. coli dari daging ikan busuk, ekstraksi dan purifikasi melanin dari tinta sotong dan cumi-cumi. Analisis rendemen dilakukan terhadap ekstrak kasar tinta dan pengujian aktivitas melanin dilakukan terhadap pertumbuhan bakteri uji yaitu E. coli serta uji kebocoran sel bakteri uji.
Aktivitas Antibakteri dari Melanin Tinta Sotong, Fitrial et al.
Isolasi E. coli dari daging ikan yang busuk
Daging ikan busuk dilarutkan dalam larutan garam fisiologis 0,85% dengan perbandingan 1: 10. Larutan daging sebanyak 1 mL di tumbuhkan dalam media EMB ( Eosin Methylene Blue ) Agar, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C. Media EMBA merupakan media selektif dan diferensiasi. Eosin akan membedakan antara dua koliform utama, yaitu E. coli (koloni kecil dan hijau metalik) dan Enterbacter aerogenes (koloni berukuran besar, berwarna merah jambu). Methylene Blue secara selektif menghambat Gram positif, sehingga yang dapat tumbuh di media tersebut hanya Gram negatif.
Ekstraksi dan purifikasi melanin dari tinta cumi-cumi
Ekstraksi dan purifikasi melanin pada tinta cumi-cumi dan sotong dilakukan menurut metode Magarelli et al. (2010).
Tahapan ekstraksi dan purifikasi dilakukan dalam media asam. Preparasi tinta dilakukan dengan mengambil habis tinta dari kantong tinta segar. Tinta sebanyak 50 g ditambahkan 100 mL HCl 0,5M dalam kondisi kedap cahaya. Larutan diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer selama 30 menit, selanjutnya disimpan selama 24 jam pada suhu 10 °C. Endapan dipisahkan dari supernatan dengan menggunakan sentrifius (10.000 rpm pada suhu 5 °C selama 15 menit). Endapan (padatan) dicuci atau disuspensikan kembali dengan larutan HCl 0,5M sebanyak 3 kali, dilanjutkan dengan akuades, aseton dan terakhir dengan akuades. Tahap selanjutnya dilakukan liofilisasi selama kurang lebih 24 jam untuk memisahkan pelarut hingga diperoleh melanin kering dan di simpan dalam freezer sebelum dilakukan pengujian lebih lanjut.
Perlakuan tinta (kontrol), tinta diambil dari kantong tinta, lalu dilakukan liofilisasi dengan freeze dryer seperti sampel melanin.

## Pengujian aktivitas melanin terhadap bakteri uji
Pengujian aktivitas melanin dilakukan dengan metode kontak langsung antara melanin dengan bakteri uji dalam media cair nutrient broth (NB) (modifikasi dari Murhadi
(2002)). Pengujian dilakukan dengan membuat seri pengujian di dalam tabung kecil berisi 2,970 mL NB steril ditambah 0,030 mL suspensi bakteri uji sehingga total larutan dalam tabung uji 3,000 mL. Melanin (dalam bentuk serbuk) ditambahkan ke dalam tabung uji sehingga konsentrasi melanin dalam tabung 0,000; 0,002; 0,006; 0,010 g/mL. Pembuatan seri tabung uji ke-1 (konsentrasi melanin 0,000 g/mL), digunakan 2,970 mL NB steril + 0,000 g melanin. Tabung seri ke-2 (konsentrasi melanin 0,002 g/mL), dibuat dengan cara menambahkan 2,964 mL NB steril + 0,006 g melanin, dan seterusnya. Bakteri uji yang telah disegarkan kemudian disiapkan dan diinkubasi 24 jam (10 8 -10 9 CFU/mL) pada 37 °C, lalu diencerkan 10 kali. Tabung uji tersebut diinokulasikan dengan 0,030 mL suspensi bakteri uji, dikocok dengan alat vortex selama 1-2 menit, kemudian diinkubasi pada incubator shaker suhu 37 °C selama 24 jam. Perhitungan jumlah bakteri dilakukan dengan metode hitungan cawan (TPC, Total Plate Count ).
Persentase penghambatan bakteri ditentukan dengan modifikasi metode Cappaso et al. (1995) yang dinyatakan: 100 – (Nt x 100/No), Nt adalah jumlah bakteri CFU/ mL dalam perlakuan penambahan melanin, sedangkan No adalah jumlah bakteri CFU/ mL dalam kontrol (inokulum awal).
Pengujian aktivitas melanin terhadap pertumbuhan E. coli Pengujian penghambatan melanin terhadap pertumbuhan E. coli dilakukan dengan cara yang sama dengan pengujian aktivitas melanin di atas, yaitu dengan konsentrasi 0,010 g/mL (yaitu konsentrasi melanin dimana persen penghambatan relatif nya terhadap jumlah mikroba awal mendekati 100%). Pengamatan dilakukan per tiga jam selama 24 jam.

## Pengujian kebocoran sel bakteri uji
Pengujian ini untuk melihat akibat dari aktivitas melanin tinta sotong terhadap mikroba uji mengacu pada Bunduki et al.
(1995). Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakan Spektrofotometer Double Beam pada panjang gelombang 280
dan 260 nm. Panjang gelombang 280 nm digunakan untuk mengukur kadar nitrogen dari protein sel, sedangkan panjang gelombang 260 nm untuk mengukur kadar nitrogen asam nukleat sel. Kultur murni sebanyak 10 mL disentrifus pada 10.000 rpm selama 10 menit. Filtrat dibuang lalu ditambahkan 5 mL larutan garam fisiologis (0,85% NaCl) dalam endapan sel pada tabung reaksi, kemudian divorteks agar sel homogen dalam larutan fisiologis.
Selanjutnya ditambahkan melanin dengan konsentrasi 0; 0,005; 0,010; 0,015; 0,020 g/ mL  dan dibiarkan pada suhu kamar selama 24 jam.  Suspensi kemudian disentrifus pada 10.000 rpm selama 10 menit dan supernatan disaring dengan kertas saring ( Syringe filter sterile 0,20 µm) untuk memisahkan selnya. Analisis dilakukan dengan mengamati OD ( Optical Density ) dari supernatan bebas sel.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi E. coli Koloni yang diduga E. coli yaitu yang berwarna hijau metalik diuji sifat biokimianya dengan menggunakan microbact identification kits (oxoid). Hasil pengujian dengan microbact
kit menunjukkan lisin (+), ornitin (+), H 2 S (-), glukosa (+), manitol (+), xilosa (+), ONPG
(+), Indol (+), urease (-), V-P (-), citrate (-), dan TDA (-). Hasil identifikasi menunjukkan Escherichia coli (96,39%).
Rendemen Tinta dari Sepia sp. dan Loligo sp. Sepia sp. memiliki kantong tinta yang panjang dan besar, sementara kantong
tinta Loligo sp. berukuran kecil sehingga tinta  yang  dihasilkan  juga  lebih  sedikit (Gambar 1). Tinta yang terdapat dalam kantong sangat ditentukan oleh kondisi terakhir sebelum ditangkap, jika sebelum ditangkap sudah banyak tinta yang dikeluarkan maka hanya sedikit yang tersisa di kantong. Analisis rendemen dari tinta berdasarkan perbandingan berat kantong (berisi tinta) terhadap berat badan per ekor yang dihasilkan oleh kedua sampel. Berat utuh Loligo sp. yaitu 116,6±40,36 g dan berat kantong tinta 0,6±0,1 g, sedangkan Sepia sp. memiliki berat utuh 173,0±19,6 g dan berat kantong tinta 4,0±1,4 g. Hasil analisis rendemen terlihat bahwa jenis Sepia memiliki rendemen tinta yang lebih besar (2,3%) dibandingkan tinta dari jenis
Loligo (0,5%). Nair et al. (2011) menyatakan bahwa tinta Sepia terdiri atas granula melanin dalam media yang kental tidak berwarna. Pigmen melanin diolah dalam sel mature kelenjar tinta, terutama pada bagian dasar kantong tinta yang terus-menerus memproduksi tinta. Akhir proses pematangan, sel-sel kelenjar tinta menyimpannya dalam kantong tinta yang berperan sebagai penampung. Setiap kantung tinta Sepia mengandung ~
1 g melanin (Derby 2014), dan banyaknya melanin ~ 15% dari berat basah total tinta (Wang et al. 2014). Melanin Sepia terbentuk oleh banyak kelompok agregat. Agregat- agregat ini terbentuk juga oleh butiran bola kecil dengan distribusi ukuran yang berbeda. Diameter butiran kecil berkisar 100-200 nm (Mbonyiryivuze et al. 2015). Ukuran butiran bola melanin pada cumi-cumi, berkisar antara
Gambar 1 Jenis chepalopoda dan kantong tinta yang digunakan pada penelitian ini. (a) jenis sotong ( Sepia sp.), kantong tinta dari jenis Sepia sp., (b) jenis cumi-cumi ( Loligo sp.), kantong tinta dari jenis Loligo sp.
(a) (b)
Aktivitas Antibakteri dari Melanin Tinta Sotong, Fitrial et al.
50–150 nm (Chen et al. 2009). Berdasarkan hasil pengamatan, tinta Loligo sp. memiliki tekstur yang halus, sedangkan tinta Sepia sp. memiliki tekstur yang kasar.
Aktivitas Melanin Tinta Sepia sp. dan Loligo sp.
Pengaruh  tinta  dan  melanin  dari Sepia sp. dan Loligo sp. pada beberapa konsentrasi terhadap pertumbuhan E. coli dapat dilihat pada Tabel 1. Konsentrasi melanin semakin tinggi menghasillkan aktivitas penghambatan terhadap E. coli juga semakin besar. Melanin Sepia sp. pada konsentrasi 0,002 g/mL terlihat tidak ada aktivitas penghambatan, sementara pada  konsentrasi  yang  lebih  tinggi  yaitu 0,006 g/mL terlihat jumlah koloni setelah inkubasi 24 jam tidak berbeda dengan jumlah awal (sebelum inkubasi). Hal ini menunjukkan pada konsentrasi 0,006 g/mL sudah terjadi penghambatan terhadap pertumbuhan sel bakteri, hingga 24 jam inkubasi tidak terjadi peningkatan yang berarti pada jumlah sel bakteri. Konsentrasi yang lebih tinggi yaitu 0,010
g/mL, melanin mampu membunuh bakteri sehingga setelah inkubasi 24 jam hanya ada 1 sel yang hidup (penghambatan mencapai 99,99%). Melanin dari Sepia sp. memiliki aktivitas penghambatan yang lebih besar dibandingkan dengan melanin dari Loligo sp. Pada konsentrasi yang lebih rendah (1/2 dari konsentrasi melanin Loligo sp), melanin dari Sepia sp. mampu menghambat hampir 100%. Tabel 1 menunjukkan E. coli lebih sensitif terhadap melanin dari Sepia sp. dibandingkan dengan dari Loligo sp. Tinta Sepia sp. dengan konsentrasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan melaninnya tidak memiliki aktivitas penghambatan, sementra tinta Loligo sp. pada konsentrasi yang sama dengan melanin tidak memiliki aktivitas penghambatan terhadap E. coli . Hal ini disebabkan karena yang terkandung di dalam tinta tidak hanya melanin, melainkan ada komponen lain misalnya protein, lemak dan glikosaminoglikan yang diduga tidak memiliki aktivitas penghambatan terhadap E. coli , akan tetapi sebaliknya dapat meningkatkan pertumbuhan E. coli .
Tabel 1 Pertumbuhan E. coli pada media NB yang mengandung tinta dan melanin Sumber Konsentrasi (g/mL) Jumlah E. coli (CFU/mL) % Penghambatan relatif terhadap jumlah mikroba awal [100-(Ntx100/No)] Log Peng- hambatan Inkubasi 0 jam (Nol) Inkubasi 24 jam (Nt) Sepia sp. Tinta 0 8,6 x 10 5 1,6 x 10 10 - -4,27 0,013 8,6 x 10 5 6,2 x 10 9 - -3,86 0,017 8,6 x 10 5 5,6 x 10 9 - -3,81 0,020 8,6 x 10 5 4,4 x 10 9 - -3,71 Melanin 0,002 8,6 x 10 5 1,2 x 10 10 - -5,14 0,006 8,6 x 10 5 6,0 x 10 5 30,23 0,16 0,010 8,6 x 10 5 1,0 x 10 0 99,99 5,93 Loligo sp. Tinta 0 8,6 x 10 5 3,1 x 10 10 - -4,56 0,013 8,6 x 10 5 8,6 x 10 9 - -4,00 0,017 8,6 x 10 5 2,3 x 10 9 - -3,43 0,020 8,6 x 10 5 1,0 x 10 9 - -3,06 Melanin 0,013 8,6 x 10 5 2,1 x 10 4 97,56 1,61 0,017 8,6 x 10 5 2,1 x 10 3 99,76 2,61 0,020 8,6 x 10 5 1,4 x 10 2 99.87 3,79 Keterangan: (-) nilai negatif artinya tidak ada penghambatan dan terjadi peningkatan
Aktivitas Melanin Sepia sp. terhadap Pertumbuhan E. coli Aktivitas melanin dari Sepia terhadap pertumbuhan E. coli dapat  dilihat  pada
Gambar 2. Pertumbuhan E. coli yang diberi perlakuan melanin dari Sepia sp. sebanyak 10 mg/mL terlihat jumlah koloninya yang hidup mengalami penurunan lebih dari 1 log 10 setelah 6 jam inkubasi dan penurunan tersebut terus berlanjut hingga 2 log 10 setelah 21 jam inkubasi. Akibat aktivitas melanin, terjadi perpanjangan fase adaptasi dan menyebabkan terjadinya penurunan jumlah koloni yang hidup, setelah 24 jam inkubasi, tidak ada lagi koloni yang hidup (Gambar 2). Hal ini menunjukkan bahwa selain memperpanjang fase adaptasi, melanin juga mempercepat fase kematian pada sel bakteri. Pertumbuhan E. coli tanpa perlakuan melanin terjadi peningkatan jumlah koloni yang hidup lebih dari 4 log 10 (dari 10 5 menjadi 10 9 ). Pertumbuhan pada 3 jam pertama memasuki fase adaptasi dan pertumbuhan awal yang dilanjutkan dengan fase logaritmik setelah 6 jam inkubasi. Setelah 6 jam terjadi peningkatan jumlah koloni yang cepat hingga 2 log 10 , dan terus meningkat hingga jam ke-12 walaupun hanya sedikit terjadi pertambahan populasi (kurang dari 1 log 10 ). Pertumbuhan memasuki fase stasioner setelah jam ke-12 hingga jam ke-24.
Vasantharaja et al. (2014) melaporkan bahwa ekstrak metanol tinta Sepiella inermis dengan menggunakan GC-MS menunjukkan adanya campuran dari struktur oligomer
yang merupakan gabungan antara dihidroksi indol-2-asam karboksilat dan dihidroksiindol. Ekstrak metanol ini memiliki aktivitas penghambatan terutama terhadap bakteri Gram negatif misalnya Proteus vulgaris ,
Pseudomonas aeruginosa dan E. coli . Neifar et al. (2009) melaporkan bahwa dihidroksiindol dan asam dikarboksilat dari Sepia officinalis memiliki aktivitas penghambatan terhadap mikroba. Melanin merupakan tirosinase yang telah diidentifikasi terdapat di dalam tinta cumi-cumi (Derby 2014). Tinta cumi-cumi terdiri atas suspensi granula eumelanin di dalam media yang viscous dan tidak berwarna. Eumelanin bersifat heterogen, umumnya polimer yang tidak larut yang berkembang melalui oksidasi enzimatis dari asam amino tirosin. Produksi eumelanin di dalam sel pigmen terjadi di dalam organel khusus yang disebut melanosome. Eumelanin tersusun dari unit 5,6-dihidroksiindol (DHI) sekitar 20% dan unit 5,6-dihidroksiindol- 2-asam karboksilat (DHICA) (Magarelli et al. 2010). Eumelanin alami dilaporkan merupakan molekul pigmen yang dapat mengadsorpsi logam pada konsentrasi tinggi. Kemampuan berikatan eumelanin dengan sisi dari logam merupakan parameter penting untuk  memahami  komplek  logam-melanin (Lei et al. 2008; Chen et al. 2009). Dinding sel bakteri mengandung banyak jenis kation termasuk Mg 2+ , Ca 2+ , Na+, dan K + . Ion-ion ini bertanggung jawab atas berbagai aktivitas bakteri, termasuk kerja enzim,
Gambar 2 Kurva pertumbuhan E. coli yang diinkubasi dengan melanin Sepia sp.   = kontrol (tanpa melanin),       = ditambah melanin.
Aktivitas Antibakteri dari Melanin Tinta Sotong, Fitrial et al.
pengaturan metabolik dan menjaga integritas lapisan luar. Mg 2+ dan ion Ca 2+ khususnya, berperan penting dalam melindungi kestabilan struktur luar (Ferrero et al. 2007; Peshenko et al. 2007). Lapisan paling luar dari membran luar pada bakteri Gram negatif adalah lipopolisakarida (LPS), secara individu, molekul ini bermuatan negatif. Kation divalen membantu menstabilkan dan menjaga integritas membran luar dengan mengikat molekul LPS yang berdekatan. Kation divalent ini berfungsi sebagai jembatan garam berikatan dengan molekul lipid yang bermuatan negatif (Raetz et al. 2007). Membran luar pada sel bakteri berfungsi sebagai penghalang masuknya senyawa-senyawa yang tidak diperlukan sel (seperti bakteriosin, enzim dan senyawa hidrofobik). Jika kation tersebut dapat diadsorpsi oleh gugus fungsi melanin, maka sistem metabolisme sel bakteri akan terganggu, akibatnya pertumbuhan sel bakteri juga terganggu.
Sahalan et al. (2013) menjelaskan ion Ca 2+ dan Mg 2+ berperan melindungi membran terluar pada sel bakteri terhadap Polymyxin B yang berinteraksi dengan kation divalent, dengan mengganti kation dari tempat pengikatannya di molekul lipopolisakarida (LPS). Hal ini menyebabkan disorganisasi komponen membran luar bakteri Gram negatif, akibat lepasnya komponen LPS dari permukaan bakteri yang menyebabkan kebocoran membran dan akhirnya menyebabkan kematian sel. Ca 2+ telah terbukti lebih efektif dalam melindungi sel bakteri dibandingkan Mg 2+ . Pengikatan gugus fungsi dari melanin yaitu gugus hidroksil fenolik (OH), karboksil  (COOH)  dan  grup  amina  (NH)
(Chen et al. 2009) terhadap ion Ca 2+ dan Mg 2+ pada membran luar mengakibatkan kebocoran pada membran bakteri Gram negatif dalam hal ini diwakili oleh E. coli . Kebocoran yang disebabkan oleh melanin terhadap sel E. coli dapat dilihat dari dihasilkannya supernatan bebas sel isi sel bakteri setelah diinkubasi selama 24 jam dengan melanin tinta Sepia sp. (Tabel 2). Tabel 2 menunjukkan hubungan antara konsentrasi melanin dengan supernatan bebas sel dari sel E. coli . Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakan Spektrofotometer Double Beam pada panjang gelombang 280 dan 260 nm. Panjang gelombang 280 nm digunakan untuk mengukur kadar nitrogen dari protein sel, sedangkan panjang gelombang 260 nm untuk mengukur kadar nitrogen asam nukleat sel. Semakin tinggi nilai OD baik pada panjang gelombang 260 nm maupun 280 nm menunjukkan semakin besarnya kebocoran sel akibat melanin. Semakin tinggi konsentrasi melanin, semakin besar tingkat kebocoran sel.
Hasil pengamatan terhadap spektrum Infra Red (IR) menggunakan FTIR spektrofotometer dari melanin tinta Sepia sp. dan Loligo sp. (data tidak dipublikasikan) menunjukkan kedua melanin memiliki pola spektrum yang sama, mengandung gugus fenolik, amina dan karboksil. Intensitas dari masing- masing gugus aktif tersebut yang berbeda diantara keduanya. Gugus fenolik, amina dan karboksil dari melanin Sepia sp. memiliki intensitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan melanin dari Loligo sp. Intensitas ini menunjukkan konsentrasi dari gugus aktif tersebut di dalam melanin. Hal inilah yang diduga mengakibatkan perbedaan aktivitas kedua melanin tersebut terhadap E. coli .
Tabel 2 Nilai OD dari supernatan bebas sel E. coli yang diinkubasi dengan melanin dari Sepia sp. Konsentrasi melanin (g/ml) OD pada 260 nm OD pada 280 nm 0 0,015 0,018 0,005 0,212 0,234 0,010 0,277 0,307 0,015 0,314 0,384 0,020 0,398 0,464

## KESIMPULAN
Melanin dari tinta sotong ( Sepia sp.) dan cumi-cumi ( Loligo sp) memiliki aktivitas penghambatan terhadap E. coli . Aktivitas penghambatan terhadap E. coli dari melanin tinta sotong lebih tinggi dibandingkan melanin dari cumi-cumi.  Tinta sotong dan cumi-cumi pada konsentrasi 0,013-0,020 g/
mL tidak memiliki aktivitas penghambatan terhadap E. coli .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Direktorat Riset dan Pengabdian
Masyarakat Direktorat Jenderal Penguatan Riset dan Pengembangan, Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi atas bantuan dana penelitian melalui hibah Fundamental (sesuai dengan Surat Perjanjian
Penugasan Pelaksanaan Program Penelitian Nomor:  024/SP2H/LT/DRPM/II/2016  tanggal 17 Februari 2016).

## DAFTAR PUSTAKA
Arias C. 2009. Chilled and Frozen Raw Fish. Di dalam: Fernandes R (editor) Microbiology
Handbook Fish and Seafood. United Kingdom (UK): Leatherhead Food International Ltd. Bunduki MMC, KJ Flanders and CW Donnelly. 1995. Metabolic and structural sites of damage in heat and sanitizer-injuried population of Listeria monocytogenes. Journal Food Protect . 58: 410-415. Cappaso R, Evidente A, Schivo L, Orru G, Marcialis MA, Cristinzio G. 1995. Antibacterial polyphenols from olive oil mill waste waters. Journal of Applied. Bacteriology . 79: 393-398. Chen S, Xue C, Wang J, Feng H, Wang Y, Ma Q, Wang D. 2009. Adsorption of Pb(II) and Cd(II) by squid Ommastrephes bartrami melanin. Bioinorganic Chemistry and Applications . 1-7 Dave D, Ghaly AE.2011. Meat spoilage mechanisms and preservation techniques: a critical review. American Journal of Agricultural and Biological Sciences. 6(4):
486-510.
Derby CD.2014.Cephalopod ink: production,
chemistry, functions and applications.
Marine drugs . 12: 2700-2730. Ferrero MA, Martínez-Blanco H, Lopez- VelascoFF, Ezquerro-SáenzC, NavasaN, Lozano S & Rodríguez-Aparicio LB. 2007. Purification and characterization of GlcNAc-6-P 2-epimerase from Escherichia coli K92. Acta Biochimica Polonica . 54(2): 387-399. Lei M, Wang JF, Pang L.Wang YM, Chen SG, Xue CH. 2007a. Effects of Sepia on the metabolization of blood lipid and antioxidant ability in hyperlipidemia rats. The Chinese Journalof Marine Drugs. 3: 30-33. Lei M, Wang JF,Wang YM, Pang L, Wang Y, Xu W,Xue CH. 2007b. Study of theradio- protective effect of cuttlefish ink on hemopoietic injury. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition .16: 239-243.
Lei M, Xue CH, Wang YM, Li ZJ, Xue Y, Wang
JF. 2008. Effect of squid ink melanin-Fe on iron deficiency anemia remission.
Journal of Food Science. 73(8): 207-11. Mbonyiryivuze A, Nuru ZY, Diop Ngom B, Mwakikunga B, Simon Mokhotjwa Dhlamini SM, Park E, Maaza M. 2015. Morphological and chemical composition characterization of commercial Sepia melanin. American Journal of Nanomaterials . 3(1): 22-27. Murhadi. 2002. Isolasi dan Karakterisasi Komponen Antibakteri dari Biji Atung (Parinarium glaberrimum Hassk). [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Nair JR, Pillai D, Joseph SM, Gomathi P, Senan PV, and Sherief PM.2011. Cephalopod research and bioactive substances. Indian Journal of Geo-Marine Sciences .  40(1): 13-27. Neifar A, Rebah FB, Gargouri AF, Abdelmouleh A. 2009. Physicochemical characterization of Sepia officinalis ink and the effects of storage conditions on the coagulation process. Journal of the Marine Biological Association of the UK .
89(04): 803-807.
Nithya M, Ambikapathy V, Panneerselvam
A. 2011. Effect of pharaoh’s cuttlefish ink
Aktivitas Antibakteri dari Melanin Tinta Sotong, Fitrial et al.
against bacterial pathogens. Asian Journal of Plant Science and Research . 1 (4):49-55 Peshenko IV & Dizhoor AM. 2007. Activation and inhibition of photoreceptor guanylyl cyclase by guanylyl cyclase activating protein 1 (GCAP-1): The functional role of Mg 2+ /Ca 2+ exchange in EF-hand domains. The Journal of Biological Chemistry . 82(30): 21645-21652. Raetz C R, Reynolds CM, TrentMS &
BishopRE. 2007. Lipid: A modification systems in gram-negative bacteria. Annual Reviews Biochemistry . 76: 295- 329.
Rajaganapathi J, Thyagarajam SP, Edward JK. 2007. Study on cephalopod’s ink for anti-retroviral activity. Indian Journal of Experimental Biology . 38: 519-520. Sahalan AZ, Aziz AHA, Lian H & Ghani MKA. 2013. Divalent cations (Mg 2+ , Ca 2+ ) protect bacterial outer membrane damage by Polymyxin B. Sains Malaysiana . 42(3):
301–306.
Vasantharaja D, Ravitchandirane V and
Anandan V. 2014. Anti-microbial activity and spectro-chemical investigation of ink extracts of Sepiella inermis (Van Hasselt 1835). Notulae Scientia Biologicae . 6(3):273-275 Wang FR, XieZG, YeXQ, Deng SG, Hu YQ, Guo X, Chen SG. 2014. Effectiveness of treatment of iron deficiency anemia in rats with squid ink melanin-Fe. Food Funct. 5: 123–128. Yuvaraj D, Suvasini B, Chellathai T, Fouziya R, Ivo Romauld S and Chandran M. 2015. Anti-bacterial studies on the different body parts of Loligo duvauceli. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research .
7(6):406-408. Zhong JP, Wang G, Shang JH, Pan JQ, Li
K, Huang Y, Liu HZ. 2009. Protective effects of squid ink extract towards hemopoieticinjuries induced by cyclophosphamine. Marine Drugs . 7: 9-18.