## EKSPRESI COX-2 SETELAH PEMBERIAN EKSTRAK METANOLIK GETAH BIDURI PADA GINGIVA TIKUS  WISTAR
(EXPRESSION OF COX-2 AFTER METHANOLIC EXTRACTS OF BIDURI LATEX ADMINISTRATION ON GINGIVAL WISTAR RAT)

## Zahara Meilawaty
Bagian Biomedik Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Jember Jl. Kalimantan No.37 Jember E-mail: zhr_mel@yahoo.com

## Abstract
Inflammation  is  a  living  organism’s  tissue  reaction  to  all  kinds  of  wound.  Inflammation  can  cause  the  increasing  of cyclooxygenase  enzyme  on  the  wounded  area.  Biduri    is  a  bush  plant.  The  extracts  of  this  plant  can  be  used  as antiinflamation,  and  also  help wound  healing. This research  aimed to  investigate the  effect of  systemic administration methanolic  extracts  of  latex  of  Biduri  ( C.  gigantea )  on  the  expression  of  COX-2  in  inflammation  model  by immunohistochemical on the experimental animal (Wistar rat).  The amount of samples used in this study was 51 male rats, three month age with body weigth 200-300 grams, which divided into 4 groups.  Three rats as normal control, which were not given any treatment. The remains, 48 were treated in being wounded on the mucosal gingival mandible into the bone, using punch biopsy (Ө 2,5 mm). After that, the rats divided into three groups, they were; (1) twelve as the negative control, were not given medicine; (2) twelve as the positive control, were given ibuprofen 108 mg/kg b.w.; (3) twenty four as the treated group, twelve were given extracts of biduri latex 50 mg/kg b.w. and twelve were given extracts of biduri latex  500  mg/kg  b.w.  On  the  2 nd and  4 th day’s  decapitation  was  done  to  take  the    mandible,  after  that  the immunohistochemical observation was done. The result showed that the COX-2 express on the 4 th day was increased in all groups.  In conclusion, the methanolic extracts of biduri latex did not inhibit the expression of COX-2.
Keywords: methanolic extracts, expression of COX-2, wistarat

## Abstrak
Inflamasi adalah reaksi jaringan hidup terhadap semua bentuk jejas. Inflamasi dapat menyebabkan terjadinya peningkatan ekspresi enzim siklooksigenase di daerah luka. Biduri  merupakan tanaman perdu. Ekstrak tanaman ini dapat digunakan sebagai antiinflamasi, dan  juga dapat mempercepat penyembuhan  luka. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek pemberian secara sistemik ekstrak metanolik getah biduri ( C. gigantea ) terhadap ekspresi COX-2 pada model inflamasi secara imunohistokimia pada  binatang percobaan (tikus putih strain  wistar ).  Jumlah sampel penelitian adalah 51 ekor tikus putih  jantan, umur 3 bulan dengan berat badan 200-300 gram, yang dibagi menjadi 4 kelompok besar. Tiga ekor tikus putih diambil secara acak sebagai kelompok normal, yaitu tidak diberi perlakuan apapun. Empat puluh delapan ekor tikus putih sisanya dibuat perlukaan pada mukosa gingiva rahang bawah menggunakan punch biopsy (Ө 2,5 mm) sampai menyentuh tulang, selanjutnya dibagi lagi menjadi 3 kelompok secara acak; yaitu (1) kontrol negatif (-) sebanyak 12 ekor, tidak diberi obat; (2) kontrol positif (+) sebanyak 12 ekor, diberi ibuprofen dosis 108 mg/kg BB ; (3) kelompok perlakuan sebanyak 24 ekor, 12 ekor diberi ekstrak getah biduri 50 mg/kg BB, dan 12 ekor diberi ekstrak getah biduri 500 mg/kg BB. Pada hari ke-2  dan  ke-4  dilakukan dekapitasi untuk diambil rahang bawahnya, selanjutnya dilakukan pengamatan imunohistokimia.    Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ekspresi COX-2 pada  hari  ke-4  mengalami  peningkatan  pada semua kelompok. Kesimpulannya, pemberian ekstrak getah biduri tidak dapat menghambat ekspresi COX-2 .
Kata kunci : ekstrak metanolik, COX-2, tikus putih Edisi Cetak Dentika Dental Journal, Juli 2012 (ISSN: 1693-671X)

## PENDAHULUAN
Perlukaan  yang  banyak  terjadi  di  kedokteran  gigi adalah  luka  pada  jaringan  lunak  yang  disebabkan karena pencabutan gigi. Respons awal semua jaring- an  hidup  terhadap  semua  bentuk  luka  adalah  infla- masi, yaitu suatu proses yang melibatkan reaksi vas- kuler,  humoral,  dan  seluler  pada  tempat  terjadinya luka. Kerusakan sel yang dihubungkan dengan pro- ses  inflamasi  menyebabkan  leukosit  yang  terdapat pada  membran  sel  mengeluarkan  enzim  lisosomal, asam arakidonat, dan disintesisnya berbagai eikosa- noid. 1
Proses  inflamasi  diperlukan  sebagai  pertahanan tubuh  terhadap  mikroorganisme  yang  masuk  ke dalam  tubuh,  dan  penyembuhan  luka  yang  mem- butuhkan  komponen  seluler  untuk  membersihkan debris  pada  lokasi  cidera,  serta  diperlukan  untuk meningkatkan perbaikan jaringan. Fase inflamasi ini biasanya  berlangsung  selama  lima  hari  setelah  ter- jadinya cidera pada jaringan. 2
Inflamasi  adalah  reaksi  jaringan  hidup  terhadap semua  bentuk  jejas,  dalam  proses  ini  ikut  berperan pembuluh darah,  saraf, cairan, dan  sel-sel inflamasi di tempat jejas. Proses inflamasi meliputi pemusnah- an,  pelarutan  atau  pembatasan  terhadap  agen  pe- nyebab  jejas.  Inflamasi disebabkan oleh  eukasinoid dan  sitokin  yang  dilepaskan  oleh  jaringan  yang terluka  atau  terinfeksi,  salah  satunya  adalah  prosta- glandin  yang  dapat  menyebabkan  demam  dan  di- latasi pembuluh darah yang berhubungan dengan in- flamasi. Lepasnya prostaglandin ke daerah luka me- nyebabkan  meningkatnya  enzim  siklooksigenase  di daerah tersebut. 3,4
Penggunaan obat antiinflamasi nonsteroid (AINS) sangat efektif untuk mengurangi  inflamasi dan  rasa sakit.  Enzim siklooksigenase ( COX ) merupakan tar- get utama obat antiinflamasi  nonsteroid, COX me- rupakan enzim yang berperan dalam merubah asam arakidonat  menjadi  prostaglandin  yang  bertang- gungjawab terhadap terjadinya inflamasi, rasa sakit, proliferasi  sel  dan  respons  biologis  lainnya.  Semua obat AINS, salah satunya ibuprofen bekerja sebagai antiinflamasi  dengan  menghambat  sintesis  prosta- glandin dengan cara menghambat enzim COX yang mengkatalis  reaksi  asam  arakidonat  menjadi  se- nyawa  endoperoksidase.  Ibuprofen  merupakan  de- rivat  asam  propionat,  salah  satu  kelompok  obat AINS nonselective  COX  inhibitor yang  biasa  di- gunakan.  Obat  ini  diindikasikan  untuk  luka  pada jaringan  lunak,  fraktur,  ekstraksi  gigi,  vasektomi, pasca  melahirkan,  pasca  operasi;  dapat  menekan terjadinya inflamasi. Tetapi, penggunaan obat AINS dapat   menimbulkan   efek   samping,  di  antaranya
dapat  menyebabkan  terjadinya  perdarahan  gastro- intestinal,  memperlama  waktu  perdarahan,  serta dapat  merusak  fungsi  ginjal. 5-7 Oleh  karena  itu, masih  perlu  dicari  bahan  alam  atau  bahan  lain sebagai  obat  antiinflamasi  dengan  efek  samping yang minimal.
Penggunaan  tanaman  atau  ekstrak tanaman  untuk pengobatan telah berlangsung beribu-ribu tahun, dan herbalisme  serta  obat  rakyat  baik  yang  kuno  mau- pun modern merupakan sumber terapi yang banyak gunanya.  Beberapa  tanaman  obat  yang  dikenal  di Indonesia  ada  yang  dapat  digunakan  sebagai  obat alternatif  untuk  antiinflamasi  dan  sakit  gigi,  salah satunya  adalah  tanaman  biduri  ( C.  gigantea ). Tanaman ini merupakan jenis tumbuhan semak liar yang  banyak  ditemukan  di  daerah  bermusim  ke- marau panjang, termasuk di Indonesia. 8 Getah biduri mengandung  enzim bakteriolitik,  kalotropin  (enzim proteolitik  yang  menyerupai  papain)  yang  mem- perlihatkan anti tumor terhadap sel epidermis karsi- noma  nasofaring,  dan  juga  berperan  pada  proses inflamasi  serta  juga  dapat  menurunkan  waktu  koa- gulasi  plasma  sehingga  dapat  mempercepat  proses penyembuhan. 9,10 Getah  biduri  dapat  digunakan untuk  menyembuhkan ulser dan  mempercepat penyembuhan. 11,12 Walaupun  demikian  mekanisme kerja  getah  biduri  itu  sendiri  terhadap  ekspresi enzim COX-2 , yaitu enzim yang berperan pada saat terjadinya inflamasi sampai saat ini belum diketahui. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  efek pemberian  secara  sistemik  ekstrak  metanolik  getah biduri  terhadap  ekspresi COX-2 pada  model  infla- masi  secara  imunohistokimia  pada  gingiva  hewan coba.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni, menggunakan 51 ekor tikus putih strain  wi- star , umur 3 bulan dengan berat 200-300 gram. Pe- nelitian ini telah mendapatkan kelaikan etik ( ethical clearance )  dari  Komisi  Etik  Penelitian  Kedokteran dan  Kesehatan  Fakultas  Kedokteran  Universitas Gadjah Mada.
Tanaman  biduri diperoleh  dari  daerah  sekitar candi  Prambanan  Yogyakarta.  Tanaman  diidentifi- kasi di Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Far- masi  Universitas  Gadjah  Mada.  Pembuatan  ekstrak dilakukan  dengan  cara  maserasi  menggunakan  pe- larut  metanol. Getah  biduri  diperoleh  dengan  cara memotong batangnya. Getah yang didapat direndam dalam  metanol,  disimpan  terlindung  dari  cahaya langsung  selama  3  hari,  setelah  itu  getah  disaring menggunakan  kertas  saring.  Hasil  penyaringan di-
uapkan  di  atas  kompor  menggunakan water  bath sampai  diperoleh  ekstrak  kental.  Proses  ini  me- merlukan waktu selama kurang lebih 5 jam. 13
Tikus dianastesi dengan menggunakan  ketalar se- cara  intra  muskular,  kemudian  perlukaan  dibuat dengan  cara  melakukan punch  biopsy (Ө  2,5  mm) pada  mukosa  gingiva  rahang  bawah. Punch  biopsy ditekan sambil diputar pada mukosa gingiva sampai menyentuh tulang.
Tikus  putih  terlebih  dahulu  diadaptasikan  dengan lingkungan  laboratorium  selama  1  minggu,  diberi pakan standar dan minum ad libitum .  Tikus dibagi menjadi 4 kelompok  besar  secara  acak,  yaitu  (1) kelompok  normal,  tidak  diberi  perlakuan  apapun; (2) kontrol negatif (-) sebanyak 12 ekor tikus putih, di punch  biopsy tetapi  tidak  diberi  obat;  (3)  kontrol positif  (+)  sebanyak  12  ekor  tikus  putih,  di- punch biopsy dan diberi ibuprofen dengan dosis 108 mg/kg BB; (4) kelompok perlakuan sebanyak 24 ekor tikus putih,  12  ekor  di punch  biopsy lalu  diberi  ekstrak getah  biduri  50  mg/kg  BB,  dan  12  ekor  di punch biopsy lalu  diberi  ekstrak  getah  biduri  500  mg/kg BB.  Pada  hari  ke-2  dan  ke-4,  dilakukan  dekapitasi untuk diambil rahang bawahnya, selanjutnya dibuat sediaan  jaringan  untuk  pengamatan  imunohisto- kimia.

## HASIL
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  semakin lama  waktu  pengamatan  dan  semakin  besar  dosis ekstrak biduri (500mg/kg BB) maka rerata ekspresi COX-2 yang terlihat semakin besar (Tabel 1). Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Gambar 1. Hasil  uji   Anova   menunjukkan   bahwa  ekspresi COX-2 pada masing-masing perlakuan mempunyai perbedaan  yang  bermakna  (p<0.05), membuktikan
bahwa  ekstrak  getah  biduri  berpengaruh  terhadap ekspresi  COX-2  (Tabel  2).  Hasil  analisis  dengan LSD  menunjukan  bahwa  terdapat  perbedaan  yang bermakna  pada semua kelompok perlakuan, kecuali pada kelompok kontrol positif (+) hari ke-4 dengan kelompok biduri 50 mg/kg BB hari ke-2 (Tabel 3).
Tabel 1.  Rerata  dan  simpangan  baku  ekspresi COX-2 berdasarkan  kelompok    perlakuan  dan  waktu dekapitasi
Waktu Dekapitasi Rerata dan Simpangan baku ekspresi COX-2 Kontrol Negatif (-) Kontrol positif (+) Biduri 50 mg/kg BB Biduri 500 mg/kg BB Hari ke-2 19,33 ±1,527 29,00 ±1,73 63,00 ±2,64 81,33 ±1,52 Hari ke-4 45,33 ±6,02 62,67 ±8,15 71,00 ±1,73 96,33 ±0,57 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Ekspresi COX-2 kontrol (-) kontrol (+) biduri 50 mg/kgBB biduri 500 mg/kgBB Kelompok Perlakuan hari ke-2 hari ke-4
Gambar1. Gambaran rerata ekspresi COX-2 pada jaringan gingiva tikus putih yang  terinflamasi  pada  masing- masing kelompok
Tabel 2.  Hasil uji two-way Anova efek pemberian secara sistemik ekstrak metanolik getah biduri terhadap ekspresi COX-2 pada model inflamasi
F Sig. Waktu dekapitasi 169.901 0.000 Kelompok 243.646 0.000 Waktu dekapitasi * kelompok 12.928 0.000
Tabel 3.  Rangkuman  hasil  uji LSD efek  pemberian  secara  sistemik  ekstrak  metanolik  getah  biduri  terhadap  ekspresi COX-2 pada model inflamasi
K(-)2 K(-) 4 K(+) 2 K(+) 4 B(50) 2 B(50) 4 B(500) 2 B(500) 4 K(-)2 -26.0000* -9.6667* -43.3333* -43.6667* -51.6667* -62.0000* -77.0000* K(-) 4 16.3333* -17.333* -17.6667* -25.6667* -36.0000* -51.0000* K(+) 2 -33.6667* -34.0000* -42.0000* -52.3333* -67.3333* K(+) 4 -.3333 -8.3333* -18.6667* -33.6667* B(50) 2 -8.0000* -18.3333* -33.3333* B(50) 4 -10.3333* -25.3333* B(500)2 -15.0000* B(500) 4 Keterangan:  K(-) 2 : kontrol negatif (-) hari ke-2 K(-) 4 : kontrol negatif (-) hari ke-4
K(+) 2 : kontrol positif (+) hari ke-2 K(+) 4 : kontrol positif (+) hari ke-4 B(50) 2 : biduri 50 mg/kg BB hari ke-2 B(50) 4 : biduri 50 mg/kg BB hari ke-4 B(500) 2 : biduri 500 mg/kg BB hari ke-2 B(500) 4 : biduri 500 mg/kg BB hari ke-4 * : signifikansi
Secara  mikroskopis  gambaran  ekspresi COX-2 dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2.  Gambaran  mikroskopis  ekspresi COX-2 ke- lompok  biduri  500  mg/kg  BB,  pembesaran 1000x.  Tanda  panah  menunjukkan  ekspresi COX-2 pada  hari  ke-2  (A)  lebih  sedikit daripada hari ke-4 (B)

## PEMBAHASAN
Proses  inflamasi  atau  kaskade  inflamasi  dimulai dari  suatu  stimulus  yang  akan  mengakibatkan  ke- rusakan sel, sebagai reaksi terhadap kerusakan maka sel  tersebut  akan  melepaskan  beberapa  fosfolipid yang  di  antaranya  adalah  asam  arakidonat.  Setelah asam  arakidonat  tersebut  bebas  beberapa  enzim akan  segera  diaktifkan,  di  antaranya  lipoksigenase dan  siklooksigenase.  Enzim  siklooksigenase  meng- ubah  asam  arakidonat  ke  dalam  bentuk  yang  tidak stabil  (hidroperoksid  dan  endoperoksid)  yang  se- lanjutnya dimetabolisir menjadi prostaglandin, pros- tasiklin,  dan  tromboksan.  Keadaan  inflamasi  mem- buat  ekspresi COX akan  meningkat,  baik COX  1 maupun COX-2 . COX  1 merupakan  enzim  yang ditemukan  di  banyak  sel  dan  jaringan  normal,  se- dangkan COX-2 baru  akan  terbentuk  setelah  di- induksi oleh sitokin dan mediator inflamasi lainnya di daerah inflamasi. 14
Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Arya 15 menjelas- kan  bahwa  ekstrak  getah Calotropis  procera (tum- buhan  yang  satu  jenis  dengan  biduri)  diketahui mempunyai  efek  antiinflamasi  yaitu  dengan  meng- hambat  mediator-mediator  inflamasi  seperti  bradi- kinin, histamin, dan prostaglandin. Getah biduri ( C. Gigantea )  sama  seperti  getah C.  procera diketahui memiliki  kandungan  kalotropin,  sejenis  enzim  pro- teolitik  yang  hampir  sama  dengan  papain  yang berkhasiat sebagai antiinflamasi. 9,12 Daya proteolitik dalam  asam  amino  pada  enzim  protease  dapat  di- gunakan  sebagai  obat  anti  bengkak,  selain  itu  pro- tease merupakan  golongan  enzim  yang  relatif  kuat. Enzim proteolitik getah biduri termasuk dalam jenis sistein  protease,  sebagaimana  enzim  protease  dari kebanyakan tanaman (papain dan bromelin). 10,16
Enzim  proteolitik  bekerja  dengan  memotong rantai  protein,  apabila  tubuh  atau  jaringan  meng- alami  luka  maka  tubuh  akan  merespons  terjadinya
inflamasi.  Inflamasi  yang  berlebihan  akan  me- nyebabkan proses penyembuhan menjadi terhambat. Enzim proteolitik dapat mengurangi inflamasi yang terjadi  dengan  menetralkan  bradikinin  dan  eukasi- noid pro-inflammatory ke level dimana proses repair dan  regenerasi  jaringan  yang  luka  dapat  dimulai, serta dapat memicu terjadinya koagulasi darah. 10,17
Dari  hasil  uji  KLT  diketahui  bahwa  terdapat  gli- kosida  dan  steroid  dalam  kandungan  ekstrak  me- tanol getah biduri. Glikosida ini mempunyai struktur dan  kelarutan  yang  sama  dengan  saponin  steroid. Senyawa  ini  diketahui  juga  dapat  menghambat  de- hidrogenase  jalur  prostaglandin.  Selain  itu  steroid juga  dapat  menghambat  sintesis  leukotrien  melalui penghambatan  enzim  lipoksigenase  yang  juga  di- keluarkan pada saat inflamasi. 1
Hasil  penelitian  yang  terlihat  pada  Tabel  1  me- nunjukkan  bahwa  rerata  ekspresi COX-2 setelah pemberian ekstrak biduri menunjukkan kecendrung- an  semakin  meningkat  dengan  semakin  lamanya waktu  pengamatan.  Uji  t wo-way  Anova (Tabel  2) menunjukkan bahwa pemberian ekstrak getah biduri 50  dan  500  mg/kg  BB  mempunyai  pengaruh  yang bermakna  terhadap  peningkatan  ekspresi COX-2 . Gambar  1  juga  memperlihatkan  bahwa  ekstrak getah biduri 50 dan 500 mg/kg BB mempunyai pola yang  sama  dengan  ibuprofen  dalam  peningkatan ekspresi COX-2 .  Hal  ini  juga  menunjukkan  bahwa ibuprofen,  ekstrak  getah  biduri  50  dan  500  mg/kg BB  tidak  menghambat  ekspresi COX-2 pada  in- flamasi  yang  terjadi.  Hasil  ini  tidak  sesuai  dengan hipotesis  penulis  yang  menyatakan  bahwa  pem- berian  ekstrak  getah biduri dapat menghambat  eks- presi COX-2 pada inflamasi.
Berdasarkan  apa  yang  diuraikan,  penulis  me- ngasumsikan bahwa kemungkinan mekanisme kerja biduri dalam menghambat  inflamasi  adalah dengan menghambat biosintesis prostaglandin melalui  jalur selain COX-2 ,  sehingga  ekspresi COX-2 nya  tidak mengalami  penurunan  setelah  pemberian  ekstrak getah  biduri.  Secara  farmakologis,  kemungkinan lain yang menyebabkan tidak terhambatnya COX-2 adalah  mungkin  karena  kandungan  steroid  yang juga  dimiliki  oleh  biduri,  sehingga  efek  antiinfla- masi  yang  dimiliki  biduri  mirip  seperti  obat  anti- inflamasi  steroid,  yaitu  dengan  menghambat  leu- kotrien  melalui  jalur  lipoksigenase.  Hal  lain  yang mungkin  dapat  menghambat  terjadinya  inflamasi setelah  pemberian  ekstrak  getah  biduri  adalah  ada- nya growth  factor dan  enzim  bakteriolitik  dalam getah  biduri.  Enzim  bakteriolitik  dapat  mencegah dan  mematikan  mikroorganisme  yang  ada  pada daerah  inflamasi  sehingga  dapat  menghambat  in- flamasi  dan  akhirnya  dapat  mempercepat  pe- nyembuhan luka.
B

## A

## B
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa  pemberian  ekstrak  metanolik  getah  biduri tidak  menurunkan  ekspresi  COX-2  pada  model  in- flamasi.  Namun,  masih  diperlukan  penelitian  lebih lanjut  mengenai  efek  pemberian  ekstrak  metanolik getah biduri terhadap mRNA COX-2 , ekspresi COX- 1 dan COX-3 ,  serta  efeknya  terhadap  enzim  lipok- sigenase  untuk  mengetahui  mekanisme  kerja  getah biduri sebagai antiinflamasi.

## Daftar Pustaka
1. Katzung BG. Basic & Clinical pharmacology, 9 th ed, Toronto: Mc Graw Hill,  2004: 576-87.
2. Baratawidjaja  KG.  Imunologi  dasar,  Edisi  ke-7, Jakarta:  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Indonesia, 2006: 140.
3. Robbins  SL.    Buku  ajar  patologi,  Alih  Bahasa:  Staf Pengajar  Laboratorium  Patologi  Anatomik  Fakultas Kedokteran  Universitas  Airlangga,  Edisi  ke-7, Jakarta: EGC, 2007: 35-66.
4. Raveinal.  Inflamasi  respon  awal  penyembuhan, Ethical  Digest  Semijurnal  Farmasi  dan  Kedokteran, 2007, No. 39: 52-55.
5. Tripathi KD.Essentials of medical pharmacology, 5 th ed, New Delhi: Jaypee Brothers,  2003: 156-84.
6. Lee Y, Rodriguez C, Dionne RA. 2005, The role of COX-2 in acute pain and the use of selective COX-2 Inhibitors  for  Acute  Pain  Relief,  <http:  //  www. bentham.org>(8 Maret 2011).
7. Vardar   S.  The   administration   of    non    steroidal
anti-inflammatory  drugs  and  selective  cyclo- oxygenase-2  inhibitors  in  dentistry,  <http://  www. bentham.org>, (8 Maret 2011) .
8. Dalimartha  S.  Atlas  tumbuhan  obat  Indonesia, Jakarta: Trubus Agriwidya,  2005:11-16.
9. Muscle  Rub  J.  Herbal  Monograph,  <http://  www. himalayahealthcare.com>, (20 Maret 2011).
10. Rajesh  R,  Gowda  CDR,  Nataraju  A,  Dhanan-jaya, BL,  Kemparaju  K.,  Vishwanath,  BS.  2005,  Pro- coagulant activity of Calotropis gigantea  latex asso- ciated with fibrin (ogen)olytic activity, <http:// www. sciencedirect.com>, (14 Maret 2011).
11. Hariana  A.Tumbuhan  obat  dan  khasiatnya.  Seri  3, Jakarta: Penebar Swadaya,  2006:160-1.
12. Schmidt,  R.J.,  Asclepiadaceae,  <http://www.  bodd. cf.ac.uk>, (24 Maret 2011).
13. Departemen Kesehatan RI. Parameter standar umum ekstrak  tumbuhan  obat,  Departemen  Kesehatan  RI Direktorat  Jenderal  Pengawas  Obat  dan  Makanan Direktorat  Pengawasan  Obat  Tradisional,  Jakarta, 2000: 10-12.
14. Goodman,  Gilman,  Goodman  &  Gilman’s  the pharmacological  basis  of  therapeutics.  10 th ed, Toronto: Mc Graw Hill,  2001: 687-71.
15. Arya  S,  Kumar  VL...  Antiinflammatory  efficacy  of extracts  of  latex  of  calotropis  procera  against different mediators of inflammation, <http: //www.hindawi.com> (3 April 2011).
16. Diwan  JJ.  Protein  degradation,  <http://  www. rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem> (3April 2011).
17. Baron  J.  Enzymes:  Part  3  of  3  <http://  www.rd. bcentral.com> (3 April 2011).