JPHPI 2012, Volume 15 Nomor 1
Protease bakteri tumbuhan rawa, Baehaki, A. et al.

## KARAKTERISASI PROTEASE DARI ISOLAT BAKTERI ASAL TUMBUHAN RAWA DARI INDRALAYA

## Characterization of Protease from Plant Bacteria In Indralaya Swamp
Ace Baehaki*, Rinto
Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya
Diterima 7 Oktober 2011/Disetujui 27 Desember 2011

## Abstract
Proteases constitute one of the most important groups of industrial enzymes, therefore screening of these proteases from bacteria is important. The aim of this study was to characterize proteases from plant swamp bacteria. The result of  proteolytic assays revealed three isolates possesed proteolytic index >1.00 (T1P4, H1P4 and K1P4). The optimum fermentation time of each isolate was 48 hours. The optimum pH of proteases from T1P4, H1P4 and K1P4 was 8.0; 7.5; and 8.0,  respectively. The optimum temperature of T1P4, H1P4 and K1P4 protease was 50 ° C; 40 ° C;  and 50 ° C, respectively. Metal ions (Fe, K, Mn, and Zn) inhibited T1P4 protease except Fe 2+ (5 mM), H1P4 protease except  Zn 2+ (5 mM),  K1P4 protease except Fe 2+
(1 and 5 mM). Effect of inhibtor specific (EDTA) shown EDTA inhibit all proteases. Study on the effect of metals ion and spesific inhibitors indicated that all protease were  metaloprotease. The moleculer weights of T1P4, H1P4 and K1P4 proteases were determinited by using SDS-PAGE and zymography technique were 151; 138; and 127 kD, respectively.
Key words:  bacteria, characterization, protease, swamp

## Abstrak
Enzim protease merupakan salah satu  enzim industri yang penting, sehingga pencarian sumber bakteri penghasil protease penting dilakukan. Tujuan penelitian adalah melakukan karakterisasi protease bakteri yang diisolasi dari tumbuhan rawa. Hasil penapisan dengan uji proteolitik menunjukkan bahwa tiga isolat yaitu T1P4, H1P4 dan K1P4 memiliki indeks proteolitik yang lebih dari 1. Waktu produksi enzim protease yang optimum ketiga isolat tersebut adalah 48 jam. Enzim protease yang diisolasi dari T1P4 dan K1P4 mempunyai  pH  optimum  8,0  sedangkan  yang  berasal  dari  H1P4  mempunyai  pH  optimum  7,5.  Suhu optimum protease protease asal isolat T1P4 dan K1P4  adalah 50 o C, untuk protease asal isolat H1P4 pada suhu 40 ° C.  Ion logam Fe, K, Mn, and Zn menghambat aktivitas protease dari semua isolat bakteri kecuali Fe 2+ (5 mM) untuk protease T1P4, Zn 2+ (5 mM) untuk protease H1P4 dan Fe 2+ (1 dan 5 mM) untuk protease K1P4.  EDTA menghambat semua protease isolat bakteri tumbuhan rawa. Hasil pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik ini menunjukkan bahwa semua protease termasuk metaloprotease. Hasil estimasi berat molekul menggunakan SDS-PAGE dan zimogram menunjukkan protease T1P4 memiliki berat molekul sekitar 151 kD, protease H1P4 memiilki berat molekul sekitar 138 kD dan protease K1P4 memiliki berat molekul sekitar 127 kD.
Kata kunci : bakteri, karakterisasi, protease, rawa

## PENDAHULUAN
Enzim  protease  [serine  protease  (EC. 3.4.21),  cysteine  (thiol)  protease  (EC 3.4.22),  aspartic  proteases(EC  3.4.23)  dan metalloprotease      (EC  3.4.24)]  merupakan
salah  satu    group  dari  enzim  industri  yang penting,  kira-kira  60%    total  pasar  enzim adalah  protease  (Nunes  dan  Martins  2001; Singh  et  al.  2001).  Diantara  berbagai  enzim protease,  protease  asal  bakteri    merupakan yang paling banyak digunakan, dibandingkan dengan  protease hewan dan kapang  (Ward 1985)  dan  diantara  berbagai  bakteri,
*Korespondensi:  Jl.  Palembang  Prabumulih  KM.  32 Indralaya,  Ogan  Ilir  Sumatera  Selatan,  E-mail:  ace76_ none@yahoo.com
Bacillus sp.  adalah  produsen  spesifik  dari protease  ekstraselular  (Priest  1977).  Enzim ini  mempunyai  aplikasi  yang  luas  pada bidang  industri,  termasuk    industri  farmasi, industri barang dari kulit, pembuatan protein hidrolisat, industri makanan dan pada proses limbah  industri (Pastor et al. 2001). Sumber  enzim  dari  mikroorganisme perlu digalakkan untuk memenuhi kebutuhan industri  baik  industri  produk  pertanian, kimia  dan  medis.  Salah  satu  sumber  enzim ini  adalah  mikroorganisme  tumbuhan  dari rawa  Indralaya,  Sumatera  Selatan.  Penelitian enzim  dari  mikroba  rawa  masih  sedikit, Baehaki et  al. (2011)  berhasil  mengisolasi bakteri  dari  tanah  rawa  yang  menghasilkan enzim protease. Tujuan penelitian ini adalah melakukan  karakterisasi  protease  dari  isolat bakteri dari tumbuhan rawa Indralaya.

## MATERIAL DAN METODE Bahan dan alat
Bahan  utama  adalah  tiga  isolat  bakteri T1P4, H1P4 dan K1P4 yang memiliki indeks proteolitik  yang  tinggi  dari  hasil  pemilihan tumbuhan rawa Indralaya, Sumatera Selatan.

## Metode Penelitian
Isolasi Mikroba Rawa
Isolasi  mikroba  dilakukan  dengan mengambil  sampel  bagian  batang,  daun  dan akar  tanaman  rawa  dari  daerah  Indralaya Sumatera  Selatan  secara  aseptik.  Batang, daun  dan  akar  tanaman  rawa  diambil  dan dilarutkan secara aseptik dalam larutan garam fisiologis  (NaCl  0,85%)  kemudian  ditumbuk dengan  mortal.  Sebanyak  0,1  mL  larutan tersebut  ditumbuhkan  dalam  cawan  petri dengan media Luria Bertani Agar (LBA) pada pengenceran dari 10 -1 sampai 10 -5 . Isolat murni yang  didapatkan  diuji  aktivitas  proteolitik menggunakan media skim milk agar (SMA).

## Uji Proteolitik
Uji  proteolitik  dilakukan  menggunakan media  skim  milk  agar  (SMA)  yaitu  media LBA  yang  ditambah  susu  skim  2%.  Isolat
ditusukkan dalam media SMA, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C selama 56 jam. Aktivitas  proteolitik  dari  bakteri  rawa  yang ditumbuhkan  pada  media  SMA  ditunjukkan dengan terlihatnya areal bening yang muncul di  sekitar  koloni  yang  terbentuk.  Indeks proteolitik  dihitung  dengan  cara  mengukur diameter  areal  bening  dan  diameter    koloni bakteri. Perhitungan indeks proteolitik adalah perbandingan  diameter  areal  bening  dengan diameter koloni bakteri.

## Penentuan  Waktu  Optimum  Produksi Protease
Bakteri diinokulasi sebanyak 1-2 ose pada media LB dengan komposisi tripton 1%, NaCl 1%  dan yeast  extract 0,5%.  Proses  diawali dengan  penentuan  umur  prekultur  produksi protease (dalam media LB). Produksi protease dilakukan  pada  suhu  37 0 C.  Pengamatan dilakukan  dengan  mengukur optical  density (OD) sampai nilai OD = 0,8 pada λ = 620 nm.
Sebanyak 10% inokulum (dari jumlah media) dimasukkan  ke  dalam  media  LB  yang  baru sebagai media untuk memproduksi protease. Pengambilan  sampel  dilakukan  setiap  8  jam selama  56  jam,  kemudian  diukur  nilai  OD- nya.  Enzim  protease  diekstrak  dengan  cara sentrifugasi  media  pertumbuhan  bakteri dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit pada  suhu  4 0 C.  Supernatan  merupakan ekstrak  enzim  yang  akan  diuji  aktivitas protease dan kadar proteinnya.

## Pengukuran Aktivitas Protease
Aktivitas  protease  diukur  berdasarkan metode Bergmeyer et al . (1983) menggunakan substrat  kasein  Hammerstein  2%  (b/v). Aktivitas protease diukur dengan mereaksikan
0,2  mL  enzim  dengan  1  mL  substrat  kasein Hammerstein  dan  1  mL  bufer.  Campuran diinkubasi  pada  suhu  37  ºC selama  10 menit,  kemudian  ditambahkan  0,2  M  asam trikoloasetat  (TCA).  Larutan  kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37 0 C selama 10 menit,  dilanjutkan  dengan  sentrifugasi  pada kecepatan  5000  rpm  10  menit.  Supernatan
JPHPI 2012, Volume 15 Nomor 1
Protease bakteri tumbuhan rawa, Baehaki, A. et al.
hasil  sentrifugasi  ditambahkan  ke  dalam tabung  reaksi  yang  berisi  Na 2 CO 3 0,4  M, kemudian ditambah pereaksi folin Ciocalteau
(1:2) dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama
20  menit.  Hasil  inkubasi  diukur  dengan spektrofotometer  pada  λ=578  nm.  Satu unit  aktivitas  protease  didefinisikan  sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu μmol produk tirosin per menit pada kondisi optimum pengukuran.

## Karakterisasi  Protease
Uji  karakterisasi  protease  meliputi pengaruh pH (6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9) dilakukan menggunakan buffer Tris-HCl 0,2 M; pH 8,0; pengaruh suhu (30; 40; 50; 60; 70 0 C); ion logam (NaCl,  KCl,  MnCl 2 ,  ZnCl 2 ,  dan  FeCl 2 )  dan inhibitor  spesifik  (EDTA).    Konsentrasi  ion logam dan inhibitor spesifik yang digunakan masing-masing adalah 1 dan 5 mM.

## Penentuan Berat Molekul
Penentuan  berat  molekul  dilakukan menggunakan SDS PAGE (Laemmli 1970) dan zimogram (Choi et al . 2001).  Pewarnaan pada metode  SDS  PAGE  dilakukan  dengan silver staining. Gel  direndam  dalam  larutan  fiksasi
(25% metanol dan 12% asam asetat) selama 1 jam,  dilanjutkan  dengan  perendaman  dalam 50% etanol selama 20 menit. Larutan tersebut diganti  dengan  30%  etanol  selama  2  x  20 menit, kemudian diganti dengan enhancer dan dicuci dengan akuades. Gel yang telah dicuci ditambahkan  larutan  silver  nitrat  selama  30 menit, dicuci lagi dengan akuades 2 x 20 detik, ditambahkan larutan campuran Na 2 CO 3 dan formaldehida  dan  terakhir  dengan  larutan fiksasi. Prosedur zimogram adalah gel akrilamid 8%  dikopolimerisasi  dengan  substrat  kasein 2%, selanjutnya dilakukan elektroforesis. Gel selanjutnya  direndam  dengan  Triton  X-100 2,5% selama 1 jam dan diinkubasi dalam buffer
Tris-Cl 10 mM, pH 8 selama 24 jam. Gel yang telah  diinkubasi  diwarnai  dengan  pewarna Comassie Brilliant Blue R-250 hingga muncul zona bening.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi dan Uji Proteolitik Bakteri Penghasil Protease
Proses  isolasi  menghasilkan  12  isolat, yang  kemudian  diuji  indeks  proteolitiknya. Aktivitas  proteolitik  dari  bakteri  rawa  yang ditumbuhkan  pada  media  SMA  terlihat  dari adanya  areal  bening  di  sekitar  koloni  yang terbentuk.  Indeks  proteolitik  isolat  bakteri dari tanaman rawa Indralaya yang mempunyai nilai  >1  dipilih    untuk  dianalisis  aktivitas proteasenya (Tabel 1).

## Penentuan Waktu Optimum Produksi Protease
Protease  diproduksi  dari  ketiga  isolat, yaitu T1P4, H1P4, dan K1P4. Enzim tersebut diproduksi  seiring  dengan  meningkatnya jumlah  sel  (OD),  dan  mencapai  optimum pada waktu inkubasi 48 jam, menjelang fase stasioner.  Diantara  ketiga  enzim  tersebut, protease  yang  berasal  dari  isolat  T1P4 mempunyai aktivitas paling tinggi yaitu 0,384 U/mL (Gambar 1).
Penelitian  lain  pada  produksi  protease bakteri  didapatkan  bakteri    dengan  waktu produksi  protease  optimum  yang  sama dengan  protease  isolat  yang  diperoleh  dari penelitian  (48  jam)  adalah Bacillus  subtilis PE-11 (Adinarayana et al . 2003) dan Bacillus licheniformis Lbbl-11  (Olajuyigbe  dan  Ajele 2008).

## Karakteristik Ekstrak Kasar Protease pH Optimum
Profil  aktivitas  pH  dari  suatu  enzim menggambarkan pH pada saat gugus pemberi atau penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada dalam tingkat ionisasi yang  diinginkan.  Protease  isolat  T1P4  dan
Tabel  1  Hasil  uji  proteolitik  bakteri  dari tanaman rawa Isolat Indeks proteolitik T1P4 1,1 H1P4 1,2 K1P4 1,1
K1P4 memiliki pH optimum 8,0;  sedangkan isolat H1P2 memiliki pH optimum pada pH 7,5. Pengaruh pH disajikan pada Gambar 2.
Isolat  T1P4  dan  K1P4  memiliki  pH optimum pada pH 8,0 ini menunjukkan pada pH  8  gugus  pemberi  dan  penerima  proton yang  penting  pada  sisi  katalitik  isolat  ini
berada pada tingkat ionisasi yang diinginkan sehingga  pada  pH  tersebut  aktivitas katalitiknya  tertinggi.  Isolat  H1P2  memiliki pH otimum 7,5; pada pH ini gugus pemberi dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik isolat ini berada pada tingkat ionisasi yang  diinginkan  sehingga  pada  pH  tersebut aktivitas  katalitiknya  tertinggi.  Penelitian yang  sama  menunjukkan  protease  bakteri P. aeruginosa aktif pada pH 7-9 (Rao et al . 1998).

## Suhu Optimum
Hasil  pengukuran  aktivitas  enzim  pada berbagai suhu, menunjukkan bahwa protease asal  bakteri  isolat  T1P4  dan  K1P4  memiliki suhu optimum 50 °C, sedangkan isolat H1P4 memiliki  suhu  optimum  40  °C.  Aktivitas protease  pada  berbagai  suhu  disajikan  pada Gambar 3. Aktivitas  enzim  menurun  seiring peningkatan  suhu  setelah  melewati  suhu optimum.  Hal  ini  dapat  disebabkan  oleh denaturasi  protein  enzim  yang  dapat mengubah  konformasi  struktur  molekul sehingga enzim kehilangan sifat alamiahnya. Aktivitas  enzim  rendah  pada  suhu  yang lebih  rendah  dari  suhu  optimum,  hal  ini disebabkan  rendahnya  energi  aktivasi  yang tersedia.  Energi  tersebut  dibutuhkan  untuk menciptakan  kondisi  tingkat  kompleks  aktif, baik dari molekul enzim maupun dari molekul substrat.
Penelitian  lain  menunjukkan  bahwa protease  bakteri  laut Alteromonas sp  strain O7 memiliki suhu optimum 60 °C (Miyamoto
A B

## C
Gambar  1  Waktu  produksi  optimum  protease  dari  isolat  bakteri  tanaman  rawa,
pengukuran optical density dilakukan pada panjang gelombang 620 nm (A= isolat T1P4, B= isolat H1P4 dan C= Isolat K1P4)
Gambar 1 Waktu produksi optimum protease dari isolat bakteri  tanaman  rawa,  pengukuran optical density dilakukan  pada  panjang  gelombang
620 nm (A= isolat T1P4, B= isolat H1P4 dan
C= Isolat K1P4)
A

## B                                         C
Gambar  2  Pengaruh  pH  pada  protease  dari  bakteri  tumbuhan  rawa  (A=  isolat
T1P4, B=H1P2 dan C=K1P4)
Gambar 2 Pengaruh pH pada protease dari bakteri tumbuhan rawa (A= isolat T1P4, B=H1P2 dan C=K1P4).
Protease bakteri tumbuhan rawa, Baehaki, A. et al.
et  al .  2002)  dan  protease Chromohalobacter memiliki  suhu  optimum  75  °C  (Vidyasagar et  al. 2009).  Suhu  optimum  kedua  enzim tersebut  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan suhu  optimum  protease  asal  isolat  bakteri tanaman rawa.

## Pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik
Pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik (EDTA)  terhadap  aktivitas  protease  bakteri isolat tumbuhan rawa disajikan pada Gambar 4.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ion K + Mn 2+ menghambat  aktivitas  protease semua isolat bakteri, sedangkan ion Fe 2+ dan Zn 2+ menghambat sebagian protease. Inhibitor  spesifik  (EDTA)  digunakan untuk  menentukan  penggolongan  protease dan  memperkuat  adanya  pengaruh  logam. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  EDTA (1  mM  dan  5  mM)  dapat  menghambat
protease  isolat  bakteri  tumbuhan  rawa sehingga  protease  ini  digolongkan  sebagai metaloprotease (protease logam) (Gambar 4). Penelitian yang dilakukan Baehaki et al. (2008) menunjukkan  bakteri P.  aeruginosa dapat dihambat  oleh  EDTA  dan  PMSF  sehingga digolongkan sebagai serin metaloprotease.

## Penentuan  berat  molekul  dengan  SDS PAGE dan Zimogram
Penentuan  berat  molekul  dilakukan dengan  teknik  SDS-PAGE  (Sodium  Dodesil Sulfat-Poliakrilamide Gel Elektroforesis) dan zimogram  merupakan  metode  yang  sudah digunakan secara luas. Hasil SDS-PAGE dan zimogram protease isolat bakteri tanah rawa disajikan pada  Gambar 5.
Hasil  analisis  SDS-PAGE  pada  protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat T1P4 memiliki 3 pita dengan berat molekul 33 kD

## B                                              C
Gambar  2  Pengaruh  pH  pada  protease  dari  bakteri  tumbuhan  rawa  (A=  isolat T1P4, B=H1P2 dan C=K1P4) A B                                              C Gambar  3  Pengaruh  suhu  pada  protease  dari  bakteri  tumbuhan  rawa  (A=  isolat T1P4, B=H1P2 dan C=K1P4) A B C
Gambar  4  Pengaruh  ion  logam  pada  protease  dari  bakteri  tumbuhan  rawa.
Konsentrasi ion logam 1 mM (    ) dan konsentrasi 5 mM (    )(A= isolat T1P4, B=H1P2 dan C=K1P4).
Gambar 3 Pengaruh suhu pada protease dari bakteri tumbuhan rawa (A= isolat   T1P4, B=H1P2 dan C=K1P4).
Gambar 4 Pengaruh ion logam pada protease dari bakteri tumbuhan rawa. Konsentrasi ion logam 1 mM ( □ ) dan konsentrasi 5 mM ( ■ )(A= isolat T1P4, B=H1P2 dan C=K1P4).
sampai dengan 151 kD, protease isolat H1P2 didapatkan  7  pita  dengan  berat  molekul  18 kD sampai 138 kD dan isolat K1P4 memiliki 6  pita  dengan  BM  sekitar  19-127  kD.    Hasil analisis  zimogram  menunjukkan  protease asal isolat T1P4 memiliki berat molekul 151 kD,  asal isolat H1P2 memiliki berat molekul 138  kD  dan  asal  isolat  K1P4  memiliki  berat molekul  sekitar  127  kD.  Berat  molekul metaloprotease  dari  bakteri Alteromonas sp. strain  O-7  adalah  56  kD  (Miyamoto et  al . 2002)  dan  metaloprotease  dari Heliobacter pyori memiliki berat molekul yang tinggi yaitu 200 kD (Windle dan Kelleher 1997).

## KESIMPULAN
Enzim protease asal isolat dari tumbuhan rawa  diproduksi  secara  optimum  dengan waktu  inkubasi  48  jam.  Enzim  tersebut memiliki  karakteristik  sebagai  berikut:  suhu optimum 50 °C (T1P4 dan K1P4) dan 40 °C (H1P4),  pH  optimum  8  (T1P4  dan  K1P4) dan  7,5  (H1P4).  Ion  logam  K + dan  Mn 2+ menghambat  aktivitas  semua  protease  asal isolat  sedangkan  Fe 2+ dan  Zn 2+ menghambat sebagian  protease.  Enzim  protease  tersebut termasuk golongan metaloprotease.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  berterima  kasih  kepada Direktorat  Jenderal  Pendidikan  Tinggi Depdiknas  yang  telah  membiayai  penelitian ini  melalui  program  Hibah  Bersaing  tahun 2008 dan 2009.

## DAFTAR PUSTAKA
Adinarayana    K,  Sllaiah  P,  Prasad  DS.  2003. Production  and  partial  characterization of  thermostable  serine  alkaline  protease from a newly isolated Bacillus subtilis PE- 11. AAPS PharmSciTech 4:E56-64.
Baehaki    A,    Suhartono  MT,    Palupi  NS, Nurhayati  T.  2008.  Purifikasi  dan karakterisasi protease dari bakteri patogen Psudomonas aeruginosa . Jurnal Teknologi dan  Industri  Pangan 19(1):80-86.
Baehaki A, Rinto, Budiman A. 2011.  Isolasi dan  karakterisasi  protease  dari  bakteri tanah  rawa  Indralaya  Sumatera  Selatan. Jurnal  Teknologi  dan  Industri  Pangan 22(1): 40-45. Bergmeyer HU, Bergmeyer J, Graβl M. 1983. Methods  of  Enzymatic  Analysis Vol  2.
Weinheim: Verlag Chemie.
Choi  NS,  Yoon  KS,    Lee  JY,  Han  KY,  Kim SH.  2001.  Comparision  of  three substrates (casein, fibrin, and gelatin) in zimographic  gel. Journal  of  Biochimistry
Molecular  Biology 34:531-536. Laemmli  UK.  1970.    Cleavage  of  structural protein during the assembly of the heat of bacteriophag T4. Nature 227:680-685. Miyamoto  K,  Tsujibo  H,  Nukui  E,  Itoh  H, Kaidzu Y, Inamori Y. 2002.  Isolation and characterization  of  the  genes  encoding two  metalloproteases  (MprI  and  MprII) from  a  marine  bacterium, Alteromonas sp. strain  O-7. Bioscience  Biotecnology Biochemistry 66(2):416-21.
M       T1P4       H1P2        K1P4                  M      T1P4         H1P2         K1P4
A B
Gambar 5  Hasil SDS PAGE  dan Zimogram protease isolat bakteri tumbuhan  rawa (M=marker, A=SDS-PAGE, B=Zimogram) 66 KDa 45 KDa 30 KDa 97 KDa
Gambar  5  Hasil  SDS  PAGE  dan  Zimogram  protease  isolat  bakteri  tumbuhan  rawa  (M=marker,  A=  SDS-PAGE, B=Zimogram).
Protease bakteri tumbuhan rawa, Baehaki, A. et al.
Nunes  AS,  Martins  MLL.  2001.  Isolation, properties  and  kinetics  of  growth  of  a thermophilic  Bacillus. Brazilian  Journal of Microbiology 32:271-275. Olajuyigbe  FM,  Ajele  JO.  2008.    Some properties of extracelullar protease from
Bacillus licheniformis Lbbl-1 isolated from ’iru’,  a  traditionally  fermented  African locust  bean  condiment. Global  Journal Biotechnology Biochemistry 3 (1): 42-46. Pastor  MD,  Lorda  GS,  Balatti  A.  2001. Protease obtention using Bacillus subtilis 3411 and amaranth seed meal medium at different aeration rates. Brazilian Journal of Microbiology 32: 1-8. Priest FG. 1977. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriology Review 41: 711-753.
Rao  MM,  Tanksale  AM,  Gatge  MS, Desphande  VV.  1998.    Molecular  and
biotechnological  aspects  of  microbial proteases. Microbiology  and  Molecular Biolology  Review 62(3):597-635.
Singh J, Batra N, Sobti CR. 2001. Serine alkaline protease from a newly isolated Bacillus sp.
SSR1. Process  Biochemistry 36:  781-785. Vidyasagar M, Prokash S, Mahajan V, Shouche
YS,  Screermulu  K.  2009.  Purification and  characterization  of  an  extreme halothermophilic  protease  from  a halophilic  bacterium Chromohalobacter sp.  TVSP101. Brazilian  Journal  of Microbiology 40(1):12-19
Ward  OP.  1985.    Proteolytic  enzymes.  Di dalam:    Moo-Young  M, et  al ,  editor. Comprehensive Biotechnology 3:789-818. Windle  HJ,  Kelleher  D.  1997.    Identification and characterization of a metalloprotease activity  from Helicobacter  pylori . Infect Immunology 65(8): 3132-3137.