Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.154
Hasil Penelitian J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 24 No. 2 Th. 2013 ISSN: 1979-7788 Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012

## Lactobacillus plantarum PADA FESES INDIVIDU DEWASA SEHAT YANG MENGONSUMSI Lactobacillus plantarum IS-10506 DARI DADIH
[Lactobacillus plantarum in Stool of Apparently Healthy Adults Consuming Lactobacillus plantarum IS-10506 from Dadih]
Azmier Adib 1) *, Mardiastuti H. Wahid 1) , Pratiwi Sudarmono 1) dan Ingrid S. Surono 2)
1) Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta
2) Food Technology Study Program, Faculty of Engineering, Bina Nusantara University / SEAMEO RECFON, Universitas Indonesia, Jakarta
Diterima 08 Mei 2013 / Disetujui 19 November 2013

## ABSTRACT
A  placebo  double  blind  pre-post  human  study  was  conducted  in  apparently  healthy  adults.  There  were  two  treatment  groups  consisting  of Group A and B representing probiotic and placebo group, respectively. Twenty four participants were randomly assigned, each supplemented with either placebo or probiotic  Lactobacillus plantarum  IS-10506. The micro  encapsulated powder  was given at  a dose of 2.6x10 10 CFU/day for 21 consecutive days. Stool samples were collected before and after the supplementation. The fresh stool samples were analyzed for the viability of Lactobacillus sp. by conventional plate count method in MRS agar. Some stool samples were kept frozen to be analyzed by using real time PCR to trace  back  the  availability  of  Lactobacillus  plantarum  with  species  specific  primer.  The  Lactobacillus  sp.  in  stools  of  healthy  adults  given microencapsulated  probiotic  Lactobacillus  plantarum  IS-10506  powder  was  significantly  more  than  those  who  consumed  microencapsulated placebo powder. Molecular detection by qPCR confirmed the availability of Lactobacillus plantarum in fecal samples of the probiotic group after given the supplementation for 21 days. The molecular detection validation confirmed that probiotic  Lactobacillus plantarum was available in the fecal samples of the probiotic group of healthy adults. However, the availability and viability of Lactobacillus plantarum were not consistently found in the intestinal tract.
Keywords: availability, Lactobacillus plantarum IS-10506, probiotic, qPCR, viability

## ABSTRAK
Penelitian ini menggunakan placebo double blind pre-post treatment design, yang dilakukan pada subjek individu dewasa sehat. Terdapat 2 kelompok perlakuan yang terdiri atas kelompok A dan B, yaitu kelompok perlakuan yang diberikan probiotik Lactobacillus plantarum IS-10506 dan kontrol (plasebo). Dua puluh empat orang telah dipilih secara acak, masing-masing diberi plasebo atau probiotik Lactobacillus plantarum IS-10506. Bubuk  kering  dalam  wadah  kapsul  diberikan  sebagai  suplemen  dengan  dosis  2.6x10 10 CFU/hari  selama  21  hari  berturut-turut.  Sampel  feses diambil  sebelum  dan  sesudah  suplemen  diberikan.  Sampel  feses  segar  dikultur  pada  media  MRS  dan  dilakukan  hitung  jumlah  bakteri  secara konvensional  ( plate  count )  untuk  mengetahui  viabilitas Lactobacillus sp.  Sebagian  sampel  dibekukan  untuk  pemeriksaan real  time PCR  untuk melihat keberadaan Lactobacillus plantarum IS-10506 dengan primer spesifik. Keberadaan Lactobacillus sp pada feses orang dewasa sehat yang diberi kapsul berisi probiotik Lactobacillus plantarum IS-10506 lebih banyak secara signifikan dibandingkan individu yang diberi bubuk plasebo. Deteksi  molekuler  mengkonfirmasi  dan  memvalidasi  bahwa Lactobacillus  plantarum IS-10506  berada  dalam  feses  kelompok  probiotik  setelah pemberian suplemen selama 21 hari. Namun, keberadaan dan viabilitas Lactobacillus plantarum IS-10506 tidak ditemukan secara konsisten dalam saluran cerna.
Kata kunci: availabilitas, Lactobacillus plantarum IS-10506, probiotik, real time PCR, viabilitas

## PENDAHULUAN
1
Seiring  semakin  meningkatnya  kesadaran  manusia  akan pentingnya  hidup  sehat  maka  meningkat  pula  penelitian  dan pemasaran  produk  makanan  yang  berpotensi  pemeliharaan kesehatan  tubuh.  Produk  makanan  yang  bermanfaat  bagi kesehatan  dikenal  sebagai  makanan  fungsional.  Salah  satu makanan  fungsional  adalah  makanan  yang  mengandung probiotik,  yaitu  mikroba  hidup  yang  bila  dikonsumsi  dapat
*Penulis Korespondensi:
Email: gue_gondronk@yahoo.com; Telp.: 082123289522
menimbulkan  efek  terapeutik  pada  tubuh  dengan  cara  mem- perbaiki  keseimbangan  mikroflora  dalam  saluran  pencernaan. Berbagai macam produk susu fermentasi telah diklaim sebagai produk  probiotik.  Adapun  definisi  probiotik  menurut  FAO  dan WHO,  yaitu  mikroba  hidup  yang  berpengaruh  positif  bagi kesehatan  ketika  dikonsumsi  dalam  jumlah  tertentu (Weichselbaum, 2009).
Mikroba  yang  berperan  sebagai  probiotik  di  antaranya bakteri  asam  laktat  (BAL),  yang  seringkali  digunakan  dalam fermentasi  makanan  atau  minuman.  Bakteri  probiotik  yang umumnya  ditambahkan  dalam  produk  fermentasi  susu  adalah Lactobacillus dan Bifidobacteria (de  Vrese  M et  al. 2011) .
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.154
Hasil Penelitian
Bakteri asam laktat memiliki kemampuan untuk bertahan hidup dan  membentuk  koloni  dalam  usus,  kemudian  memproduksi asam laktat dan senyawa metabolit lainnya, serta menstimulasi respon  kekebalan  tubuh  (Wells , 2011).  Beberapa  strain probiotik berperan menjaga keseimbangan mikrobiota usus, dan membantu  meningkatkan  sistem  kekebalan  tubuh.  Strain probiotik komersial yang berasal dari negara maju belum tentu cocok dan optimal fungsinya bagi orang Indonesia. Di Indonesia dikenal  beberapa  makanan  tradisional,  salah  satu  yang berpotensi  sebagai  makanan  fungsional  adalah  “dadih”,  yaitu hasil  fermentasi  susu  kerbau  yang  diolah  secara  tradisional  di Sumatra Barat, atau produk semacam yogurt (Surono, 2009).
Hasil  analisis  mikrobiologis  beberapa  jenis  BAL  yang  ter- kandung  di  dalam  dadih  meliputi Lactobacillus  plantarum, Streptococcus  thermophillus,  Leuconostoc,  Lactococcus  lactis subsp. cremoris (Surono,  2003).  Bagi  penderita  “ lactose intolerance ”,  mengonsumsi  dadih  merupakan  salah  satu alternatif  untuk  memperoleh  manfaat  dari  susu.  Adanya kandungan  BAL  seperti Lactobacillus,  Streptococcus, Leuconostoc dan Lactococcus membuat dadih memiliki khasiat kesehatan antara lain menyeimbangkan mikroba dalam saluran usus,  menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen  yang  me- nyebabkan diare, menurunkan terjadinya mutasi sel, menurun- kan kadar kolesterol darah dan meningkatkan sistem kekebalan tubuh.
Sebagai probiotik indigenous asal Indonesia, dadih terbukti tahan  terhadap  kondisi  ekstrim  asam  dan  garam  empedu  dan berpotensi sebagai probiotik yang tepat untuk orang Indonesia, sebab  sudah  sering  terpapar  bakteri  kontaminan  maupun patogen  yang  ada  di  Indonesia  (Collado et  al .  2007 b ). Kandungan  gizi  dan  manfaat  kesehatan  yang  dimiliki  dadih menjadikannya  sebagai  produk  pangan  yang  potensial  untuk dikembangkan sebagai industri pangan. Lactobacillus plantarum IS-10506,  memperlihatkan  kemampuan  untuk  melekat  yang tinggi  pada  senyawa  hidrokarbon,  dan  memiliki  kemampuan berautoagregasi,  artinya L.  plantarum IS-10506  asal  dadih tersebut  mempunyai  kemampuan  beradesi  atau  menempel pada sel epitel saluran cerna dengan baik (Collado et al . 2007 a ). Menurut  Collado et  al. (2007 a )  dinding  sel  bakteri  asam  laktat diketahui  dapat  mengikat  senyawa  mutagen  dan  karsinogen pemicu kanker dan membran selnya dapat menyerap kolesterol. Penggunaan Lactobacillus plantarum untuk pengobatan irritable bowel  syndrome telah  teruji,  terdapat  bukti  bahwa  mikroba  ini mengurangi  rasa  sakit,  mencegah  konstipasi  dan  kembung (Bixquert, 2009). Nissen et al. (2009), memperlihatkan secara in vitro bahwa L.  plantarum dapat  memperkuat  integritas  usus, serta  aktivitas  metabolik  sel  usus  dan  menstimulasi  respon imun.
Salah  satu  persyaratan  bakteri  asam  laktat  yang  dapat digunakan  sebagai  agensia  probiotik  adalah  kemampuannya untuk  tumbuh  dan  berkembang  dalam  saluran  pencernaan, sehingga  dapat  menjalankan  peranannya  menjaga  ke- seimbangan  flora  usus  dan  meningkatkan  kesehatan  tubuh. Seperti  telah  diketahui  tentang  pentingnya  viabilitas  probiotik, yaitu jumlah mikroba hidup harus cukup untuk memberikan efek positif bagi kesehatan dan mampu berkolonisasi sehingga dapat mencapai jumlah yang diperlukan. Viabilitas sel mikroba dalam produk  probiotik  harus  mencapai  10 7 -10 9 CFU/g,  karena
viabilitas  probiotik  akan  mengalami  penurunan  selama  pe- nyimpanan dan saat berada dalam sistem pencernaan. Hal ini disebabkan  karena  faktor  lingkungan  yang  tidak  menguntung- kan  bagi  kelangsungan  hidup  bakteri  probiotik,  diantaranya adalah  pH  rendah  dan  garam  empedu  dalam  sistem  pen- cernaan.
Mengingat Lactobacillus  plantarum IS-10506  berasal  dari makanan indigenous Indonesia  (dadih)  dan  mampu  melekat pada  saluran  cerna,  memungkinkan  bakteri  ini  dimanfaatkan sebagai  probiotik  lokal.  Oleh  karena  itu,  dibutuhkan  penelitian tentang  keberadaan  dan  peningkatan  jumlah Lactobacillus plantarum IS-10506  pada  saluran  cerna  yang  menunjukkan adanya  pertumbuhan,  sebagai  salah  satu  persyaratan  pe- manfaatan bakteri ini sebagai probiotik (Surono, 2003; Collado et al. 2007 a ).

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  utama  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah bakteri  probiotik Lactobacillus  plantarum IS-10506  asal  dadih. Real time PCR/qPCR (mesin PCR system BioRad ), High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche ® ), FastStart SYBR Green Master, primer plan F (5’ – CCG TTT ATG CGG AAC ACC TA – 3’ Forward) dan pREV (5’ – TCGGGA TTA CCA AAC ATC AC – 3’ Reverse ).

## Preparasi sampel
Setelah  memperoleh  izin  kelayakan  riset  ( etical  clearance ) dari Komite Etik Penelitian FKUI, dan mendapatkan persetujuan subjek ( Informed of Consent atau IOC) yang memenuhi kriteria inklusi dilakukan seleksi secara consecutive sampling terhadap subjek orang dewasa sehat di komunitas dengan menggunakan formulir skrining.
Cara  pengambilan  sampel  feses  subjek  adalah  sebagai berikut:  toilet  disiram  dengan  karbol  terlebih  dahulu  dan  feses tidak boleh terkena/terendam dalam air di toilet selanjutnya ±2 g feses  dimasukkan  ke  dalam  pot  feses  bersendok  untuk dianalisis  kandungan  bakteri  asam  laktat  dalam  feses  segar dalam  waktu  1-2  jam.  Selama  penelitian  berlangsung  subjek tidak  diperbolehkan  mengonsumsi  antibiotik  selama  21  hari. Feses  dimasukkan  ke  dalam  pot  feses  yang  dimasukkan  ke dalam  kotak  pendingin  beserta dry  ice untuk  menyimpan sampel  kemudian  dikirim  ke  Laboratorium  Mikrobiologi  Klinik untuk dilakukan kultur dan pemeriksaan real time PCR.
Sampel feses dibagi menjadi 2 secara asepsis, yaitu 1 gram untuk kultur media sebagai screening Lactobacillus sp dan 200 mg  untuk  pemeriksaan  qPCR.  Sampel  untuk  pemeriksaan qPCR  dimasukkan  ke  dalam  tabung  eppendorf  dan  disimpan pada  suhu  -80°C  sampai  dilakukan  analisis.  Sampel  untuk kultur  media  ditimbang  hingga  didapat  1  gram  feses  dan  di- tambahkan  dengan  9  mL  PBS.  Selanjutnya  sampel  divorteks sampai homogen dan diencerkan dari pengenceran 10 -1 hingga 10 -10 .
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.154
Hasil Penelitian
Uji saring Lactobacillus sp dengan media MRS Media pembiakan sebagai screening Lactobacillus sp yang digunakan  adalah  MRS  (deMan  Rogosa  Sharpe)  untuk  meng- hitung viabilitas Lactobacillus sp dalam feses. Sejumlah 1 gram sampel  feses  diencerkan  secara  berseri.  Pengencer  yang digunakan  adalah  fosfat buffer atau  PBS  1x.  Sampel  berupa feses  dimasukkan  ke  dalam  tabung screw  cap berisi  PBS  1  x dengan  pengenceran  berseri  dari  10 -1 sampai  dengan  10 -10 . Dari  pengenceran  10 -5 sampai  dengan  10 -8 diambil  masing- masing 1 mL untuk dilakukan pour plate technique pada MRS agar  yang  diberi  indikator Brom  Cresol  Purple .  Kemudian diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  dua  hari  (Bujalance et  al . 2006).  Setelah  48  jam  akan  terlihat  koloni  bewarna  kuning, kemudian dilakukan pemeriksaan mikroskopik untuk pewarnaan Gram dan uji katalase.

## Identifikasi bakteri asam laktat
Identifikasi  dilakukan  dengan  pewarnaan  Gram  dan  uji katalase.  Beberapa  mikroorganisme  memiliki  enzim  katalase yang  dapat  memecah  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )  menjadi oksigen  dan  air.  Ketika  koloni  diberikan  H 2 O 2 ,  akan  timbul gelembung  atau bubble maka  disebut  katalase  positif  dan sebaliknya.

## Isolasi DNA
Isolasi  DNA  pada  penelitian  ini  menggunakan High  Pure PCR  Template  Preparation  Kit (Roche ® ).  Sebanyak  500-1000 µL PBS ditambahkan ke tabung eppendorf yang berisi sampel tinja beku, kemudian divorteks selama 30 detik sampai 1 menit hingga  homogen.  Sampel  sebanyak  200  µL  dimasukkan  ke dalam tabung eppendorf steril baru yang telah dilabel, kemudian ditambahkan  200  µL  binding buffer dan  40  µL  Proteinase  K. Larutan  dicampur  secepatnya  dan  diinkubasi  pada  suhu  72°C selama  15  menit.  Setelah  inkubasi,  100  µL  isopropanol ditambahkan,  dilarutkan  dan  dimasukkan  ke  dalam High  pure filter  tube ,  kemudian  disentrifus  8000  x  g  selama  1  menit. Collection  tube dibuang  beserta  larutannya,  diganti  dengan yang  baru  dan  ditambahkan  500  µL Inhibitor  Removal  Buffer , disentrifus  8000  x  g  selama  1  menit. Collection  tube dibuang beserta larutannya, diganti dengan yang baru dan ditambahkan 500 µL wash buffer , lalu disentrifus 8000 x g selama 1 menit. Collection  tube dibuang  beserta  larutannya,  diganti  dengan yang  baru  dan  ditambahkan  500  µL wash  buffer .  Selanjutnya high  pure  filter  tube disentrifus  13000  x  g  selama  10  detik; collection  tube dibuang. High  pure  filter  tube dimasukkan kedalam  tabung  eppendorf  steril  dan  ditambahkan  200  µL elution  buffer ,  disentrifus  8000  x  g  selama  1  menit; high  pure filter  tube dibuang.  Tabung  eppendorf  berisi  DNA  disimpan  ke dalam pendingin dengan suhu di bawah 20°C.

## Optimasi
Pada  penelitian  ini  dilakukan  optimasi  berbagai  kondisi reaksi  termasuk  optimasi  suhu annealing primer,  spesifisitas primer. Kedua pasang primer planF (5’ – CCG TTT ATG CGG AAC ACC TA – 3’ Forward) dan pREV (5’ – TCGGGA TTA CCA AAC  ATC  AC  –  3’ Reverse )  digunakan  untuk  deteksi  DNA L. plantarum .  Optimasi  suhu annealing untuk  DNA L.  plantarum menggunakan mesin PCR system Biorad , pada suhu 62; 61.5;
60.3; 58.4; 55.9; 54.1; 52.8 dan 52°C. Penentuan suhu gradien berdasarkan  perhitungan  masing-masing Tm ( melting temperature ) primer yaitu berkisar 60°C.
Hal  yang  pertama  kali  dilakukan  adalah  membuat master mix PCR  kemudian  dilakukan  penambahan  cetakan  DNA  dan terakhir penambahan kontrol positif DNA L. plantarum (Torriani et  al. 2001), Real  time PCR  pada  penelitian  ini  dilakukan dengan membuat campuran utama PCR ( master mix solution ). Master mix solution dipersiapkan, terdiri dari larutan Fast Start SYBR  Green  Master sebanyak  12.5  µL ,  Water  PCR  Grade sebanyak  7.192  µL,  Primer  plan  F  sebanyak  0.1  µL,  Primer pREV sebanyak 0.208 µL . Volume master mix untuk satu kali reaksi  adalah  20  µL.  Campuran  tersebut  dicampur  sampai homogen dan dibagi ke dalam tabung PCR dalam jumlah yang tepat.  Cetakan  (DNA)  yang  telah  diisolasi  dari  sampel dimasukkan ke dalam campuran sebanyak 5 µL. Tabung PCR yang  berisi  PCR mix dan  cetakan  kemudian  dimasukkan kedalam  mesin  PCR system  Biorad dengan  siklus  sebagai berikut initial PCR activation selama 10 menit pada suhu 95°C; denaturasi  pada  suhu  95°C  selama  15  detik; annealing atau penempelan  primer  pada  suhu  58.5°C  selama  30  detik; extensión atau pemanjangan selama 30 detik pada suhu 72°C dengan jumlah siklus 40 siklus.

## Batas deteksi
Batas  deteksi L.  plantarum dilakukan  berdasarkan  pe- ngenceran  berseri  suspensi L.  plantarum dalam  PBS  1x dilakukan dengan pengenceran 1/10 kali suspensi L. plantarum dari  suspensi  sel  dari  10 -1 hingga  10 -10 .  Untuk  setiap  pe- ngenceran diambil 200 µL untuk kultur media dan untuk qPCR. Kultur  dilakukan  pada  media  MRS  yang  ditambahkan brom cresol purple kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 14– 16  jam,  kemudian  dilakukan  hitung  koloni  (CFU/mL)  pada pengenceran  10 -5 hingga  10 -10 .  Sementara,  untuk  qPCR  di- lakukan  isolasi  DNA  dari  masing-masing  pengenceran  dengan kit  Roche ® High  Pure  PCR  Template  Preparation  Kit .  Total reaksi  PCR  yang  digunakan  adalah  25  µL  per  tabung  PCR dengan volume cetakan 5 µL.
Optimasi dilakukan terhadap adanya inhibitor pada sampel feses  dengan  menggunakan  cara  kerja  yang  sama  dengan batas  deteksi  baik  untuk  kultur  media  maupun  qPCR,  namun didahului  dengan  sentrifus  sampel  feses  pada  14000  x  g selama  15  menit,  supernatan  diambil  dan  dibuat  suspensi dengan  volume  masing-masing  tabung  adalah  200  µL.  Pada tabung  pertama  yang  telah  berisi  supernatan  feses  ditambah- kan kultur murni Lactobacillus plantarum .

## Uji spesifisitas primer
Pada penelitian ini dilakukan uji spesifisitas primer terhadap 12  bakteri,  yaitu L.  plantarum,  E.  coli,  Pseudomonas aeuroginosa, Klebsiella pneumoniae, Bifidobacteria sp , Bacillus subtilis,  Proteus  mirabilis,  Serratia  marcescens,  Enterobacter aerogenes,  Salmonella  Typhi,  Shigella sp,  dan Bacteroides fragilis . Isolasi DNA dilakukan dengan High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche ® ). Total reaksi PCR yang digunakan per tabung PCR adalah 25 µL dengan volume cetakan 5 µL.
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.154
Hasil Penelitian

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik subjek dan sampel
Karakteristik  umur  dari  23  subjek  pada  penelitian  ini menunjukkan  rata–rata  36.54  tahun  dengan  rentang  22-51 tahun  dan  nilai  tengah    (median)  adalah  37  tahun.  Distribusi subjek  berdasarkan  jenis  kelamin  menunjukkan  12  orang adalah  berjenis  kelamin  wanita  dan  11  orang  adalah  laki-laki. Sampel yang dikumpulkan selama periode Oktober 2009–Maret 2010  dinilai  pemenuhan  kriteria  inklusinya.  Selama  periode tersebut  diperoleh  35  sampel,  yang  terdiri  atas  23  sampel memenuhi kriteria inklusi, sedangkan 12 sampel tidak.
Keberadaan Lactobacillus sp pada media kultur Dari 23 sampel fases yang diperiksa per minggu, 10 sampel positif mengandung Lactobacillus sp pada medium MRS. Hasil pemeriksaan  mikroskopik  terhadap  koloni  yang  tumbuh  pada media  MRS  menunjukkan  Gram  positif  batang  dan  hasil  uji katalase  adalah  negatif.  Data  hasil  pemeriksaan  kultur  pada penelitian  ini  menunjukkan  adanya  peningkatan  jumlah  koloni Lactobacillus sp setelah diberi perlakuan hingga minggu ke dua. Namun  peningkatan  tersebut  secara  statistik  tidak  nyata ( p >0.05).
Kondisi qPCR optimum untuk pengujian L. plantarum Optimasi suhu annealing primer yang digunakan pada real time PCR  dilakukan  untuk  mendapatkan  suhu  optimal  agar mendapatkan  hasil  yang  diharapkan.  Optimasi  yang  dilakukan menggunakan  DNA L.  plantarum IS-10506  yang  dipakai sebagai kontrol positif.
Pada penelitian ini, suhu annealing yang digunakan adalah suhu  62;  61.5;  60.3;  58.4;  55.9;  54.1;  52.8;  52°C.  Suhu annealing yang optimal dari pasangan primer planF dan pREV, adalah  suhu  58.4°C  atau  suhu  58.5°C  (Gambar  1),  dimana pada  suhu  lainnya  terdapat  primer  dimer  ketika  dikonfirmasi dengan agarose di geldox (Gambar 2) dan pada melting curve terlihat perbedaan posisi peak dengan kontrol positif.
Optimasi  batas  deteksi  dilakukan  dengan  menggunakan real  time PCR  dan  kultur  media L.  plantarum .  Batas  deteksi yang  dilakukan  berdasarkan  serial  pengenceran  berseri  dari suspensi bakteri L. plantarum dalam PBS 1x dalam media MRS terdapat  pada  pengenceran  10 -7 dengan  jumlah  koloni  4 CFU/mL, sedangkan pada qPCR pada pengenceran 10 -10 DNA masih  terdeteksi.  Hasil  tersebut  membuktikan  bahwa  metode real time PCR lebih sensitif dalam mengidentifikasi L. plantarum dibandingkan dengan culture dependent .
Hasil  uji  simulasi  dengan  menggunakan  supernatan  feses sebagai larutan pengencer yang kemudian diberikan bakteri L. plantarum pada  media  MRS  didapat  hasil  yang  sama,  yaitu bakteri  tidak  tumbuh  pada  pengenceran  10 -8 ,  namun  nilai Ct pada qPCR lebih sensitif hingga pengenceran 10 -10 , DNA masih terdeteksi.
Penentuan  spesifisitas  kedua  pasang  primer  (planF  dan pREV) dilakukan terhadap DNA L. plantarum, Escherichia coli, Pseudomonas aeuroginosa, Klebsiella pneumonia, Bifidobacteria sp ,  Bacillus  subtilis,  Proteus  mirabilis,  Serratia marcescens,  Enterobacter  aerogenes,  Salmonella  Typhi,
Shigella sp, dan Bacteroides fragilis . Hasil PCR semua bakteri di atas menunjukkan hasil negatif, kecuali L. plantarum.
Gambar 1.  Optimasi  suhu annealing primer  dengan  menggunakan DNA L. plantarum IS-10506 (Marker 1000 bp baris M, suhu 61.5°C baris 1, 60.3°C baris 2, 58.4°C baris 3, 62°C baris 4)
Gambar 2.  Primer-dimer  yang  timbul  pada  saat  optimasi  suhu annealing primer dengan menggunakan DNA L. plantarum IS-10506  (Marker  1000  bp  baris  M,  suhu  52°C  baris  1, 52.8°C baris 2, 54.1°C baris 3, 55.9°C baris 4 58.4°C)
Hasil pemeriksaan real time PCR pada sampel subjek
Pada  penelitian  ini,  sampel  subjek  yang  diberi  probiotik menunjukkan peningkatan jumlah Lactobacillus sp. dari minggu ke  minggu,  namun  dalam  analisis  statistik  tidak  menunjukkan peningkatan yang signifikan. Perbandingan jumlah Lactobacillus sp pada kultur media MRS antara sampel partisipan yang diberi probiotik dan plasebo juga tidak signifikan, p >0.05. Pemeriksaan  dengan real  time PCR  dinyatakan  positif  bila hasil  menunjukkan  nilai Ct ( cycle  threshold )  lebih  kecil  dari Ct kontrol  negatif  (jika  kontrol  negatif  menunjukkan  nilai Ct )  atau dinyatakan dalam melting curve dengan peak yang sama pada kontrol  positif.  Hasil  qPCR  terhadap  partisipan  yang  diberikan probiotik Lactobacillus  plantarum IS-10506  dicantumkan  pada Tabel  1  sedangkan  Hasil  qPCR  terhadap  partisipan  yang diberikan plasebo dicantumkan pada Tabel 2.
M 1 2 3 4 318 bp 400 bp Primer-Dimer M 1 2 3 4 K + Kontrol Positif 400 bp 318 bp 58.4°C
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.154
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Tabel 1.  Hasil  qPCR  terhadap  partisipan  yang  diberikan  probiotik
Lactobacillus plantarum IS-10506 Probiotik No Sampel Minggu I Minggu II Minggu III Minggu IV 1 ‐ + ‐ + 6 ‐ + + + 9 ‐ + + + 11 + + + + 19 ‐ + ‐ + 22 + + + + 29 ‐ + + + B ‐ ‐ ‐ ‐ D + + + + F ‐ + + +
Tabel 2. Hasil qPCR terhadap partisipan yang diberikan plasebo
Placebo No Sampel Minggu I Minggu II Minggu III Minggu IV 2 ‐ ‐ ‐ ‐ 4 ‐ ‐ ‐ ‐ 8 + + ‐ ‐ 15 ‐ ‐ ‐ ‐ 17 + ‐ ‐ ‐ 18 ‐ ‐ ‐ ‐ 23 ‐ ‐ ‐ ‐ 24 + + + + 25 ‐ + ‐ + 26 ‐ ‐ ‐ + 28 ‐ + + ‐ 5a ‐ ‐ ‐ ‐ E ‐ ‐ ‐ ‐ Suhu annealing optimum Pemeriksaan Real  Time PCR/qPCR  pada  penelitian  ini menggunakan  primer  yang  digunakan  pada  penelitian  Torriani et al . (2001) yaitu primer spesifik L. plantarum (planF 5’ – CCG TTT ATG CGG AAC ACC TA – 3’ Forward dan pREV 5’ – TCG GGA TTA CCA AAC ATC AC – 3’ Reverse ). Menurut Torriani et al. (2001),  primer  spesifik  untuk L.  plantarum ,  planF  terletak pada  posisi  9  hingga  28  nukleotida  dan  pREV  terletak  pada nukleotida  posisi  308-327.  Dari  perhitungan  yang  telah dilakukan untuk menentukan suhu annealing , diperoleh nilai T m 60°C. T m ( melting temperature ) merupakan suatu suhu dimana kemungkinan  50%  dari  ikatan  hidrogen  terbentuk.  Suhu annealing yang  digunakan  untuk  suatu  oligonukleotida  ( T a ) umumnya 5°C di bawah atau di atas T m (Mackay, 2007). T m ( melting  temperature )  dari  produk  PCR  tergantung komposisi buffer dan konsentrasi garam. Nilai T m yang didapat dengan menggunakan Fast Start SYBR Green Master reagents (Roche)  kemungkinan  akan  berbeda  dengan  menggunakan reagen  yang  berbeda  (Mackay,  2007).  Pada  kenyataannya suhu annealing yang  diperoleh  pada  penelitian  ini  adalah adalah suhu 58.4°C atau suhu 58.5°C. Seperti telah disebutkan di atas menggunakan metode PCR konvensional dengan primer yang sama, namun mendapatkan suhu annealing 55°C. Hal ini
kemungkinan disebabkan karena metode yang digunakan pada kedua penelitian berbeda.
Dalam  mendapatkan  suhu annealing diambil  nilai Ct ( Threshold  cycle )  yang  terbaik  dalam  suhu  gradien.  Nilai Ct merupakan nilai yang menunjukkan adanya peningkatan deteksi oleh fluorescence .  Konsentrasi  primer  mempengaruhi  nilai Ct , namun  juga  mempengaruhi  spesifisitas  reaksi.  Konsentrasi primer yang tinggi dapat menyebabkan nilai Ct menjadi rendah, namun  juga  dapat  menyebabkan  atau  meningkatkan  produk non spesifik seperti primer–dimer.
Penggunaan melting  curve untuk  melihat  adanya  primer dimer,  serta  reaksi  positif  dapat  dilakukan  dengan  cara mengatur  suhu  dari  suhu  terendah  (55°C)  hingga  tertinggi 95°C.  Pada  suhu  rendah  semua  produk  PCR  masih  dalam keadaan untai ganda, sehingga Fast Start SYBR Green Master dapat  berikatan  dengan  untai  ganda  DNA.  Sebagai  akibatnya fluorescence meningkat.  Sedangkan  pada  suhu  tinggi,  produk PCR  telah  terdenaturasi  dan  mengakibatkan fluorescence menurun.  Jika peak pada melting  curve tidak  sejajar  dengan kontrol positif, maka akan terjadi primer–dimer (Mackay, 2007).
Penggunaan Fast Start SYBR Green Master pada penelitian ini  terdapat  kelebihan  dan  kekurangan  sebagai  berikut:  1) kelebihan: murah dan mudah digunakan, memiliki  kemampuan lebih kuat daripada ethidium bromide, tidak menghalangi reaksi amplifikasi,  dan  tidak  terpengaruh  oleh  mutasi  dalam  DNA target;  2)  kekurangan:  dapat  menyebabkan  positif  palsu, memerlukan  optimasi  secara  luas,  sensitivitas  tinggi  namun kurang spesifik.
Hasil  penenlitian  ini  memperlihatkan  persamaan  dalam terjadinya  peningkatan  jumlah L.  plantarum di  kultur  media maupun  dengan  qPCR  dari  minggu  ke  minggu.  Hasil  kultur memperlihatkan  jumlah  yang  lebih  banyak.  Hal  ini  disebabkan pada  kultur  bakteri  yang  terdeteksi  bukan  hanya L.  plantarum melainkan Lactobacillus sp.  Deteksi  dengan  qPCR menunjukkan  nilai Ct yang  cukup  besar,  yang  artinya  hanya sedikit jumlah DNA L. plantarum yang terdeteksi. Namun, pada sampel  subjek  yang  diberi  probiotik  menunjukkan  peningkatan yang  signifikan  pada  jumlah  DNA L.  plantarum saat  di  deteksi dengan qPCR, p <0.05.

## Batas deteksi
Untuk  pemeriksaan  batas  deteksi,  bakteri  ditumbuhkan dalam media MRS selama 14 hingga 16 jam pada suhu 37°C kemudian dimasukkan ke dalam PBS 1 x dengan pengenceran berseri  (10 -1 hingga  10 -10 ).  Sebanyak  200  µL  volume  dari masing-masing  pengenceran  diambil  untuk  kultur  dan  200  µL untuk qPCR. Hasil plating pada kultur didapat 4 CFU/mL pada pengenceran 10 -7 . Metode penelitian ini pernah dilakukan oleh Bujalance et  al .  (2006),  namun  terdapat  perbedaan  pada volume yang dipakai untuk pengenceran dan media pengencer- nya.  Bujalance et  al .  (2006)  memakai skim  milk ,  dimana  susu merupakan  bahan  pangan  yang  relatif  sempurna  dan  me- rupakan media yang baik untuk pertumbuhan bakteri.
Pemeriksaan  qPCR  pada  penelitian  ini  memiliki  batas deteksi  serial  pengenceran  lebih  dari  10 -10 .  Dari  pemeriksaan batas  deteksi  menggunakan  qPCR,  dapat  dikatakan  bahwa qPCR lebih sensitif daripada pemeriksaan kultur media. Pada uji simulasi  inhibitor  dalam  sampel  feses  memperlihatkan  nilai Ct
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.154
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
yang  lebih  besar,  hal  ini  karena  feses  mengandung  banyak komponen yang juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Batas deteksi real time PCR dan  kultur media MRS dicantum- kan pada Tabel 3.
Tabel 3. Batas deteksi real time PCR dan kultur media MRS
Pengen- ceran Ct qPCR dari Kultur Ct qPCR dari Simulasi Adanya Inhibitor dalam Feses Jumlah CFU/mL dalam Kultur (Pengencer PBS 1x) Jumlah CFU/mL dalam Kultur (Pengencer Supernatant Feses) 10 -5 18.57 27.46 86 81 10 -6 26.85 28.05 48 39 10 -7 27.44 29.33 4 3 10 -8 29.31 31.82 - - 10 -9 32.64 32.04 - - 10 -10 34.49 33.27 - -

## Spesifisitas primer
Spesifisitas  PCR  sangat  tergantung  pada  desain  primer. Amplifikasi dan deteksi target dengan real time PCR dilakukan secara serempak. Pada uji spesifisitas primer terhadap bakteri uji  seperti L.  plantarum,  E.  coli,  Pseudomonas  aeuroginosa, Klebsiella  pneumoniae,  Bifidobacteria sp ,  Bacillus  subtilis, Proteus  mirabilis,  Serratia  marcescens,  Enterobacter aerogenes,  Salmonella  Typhi,  Shigella sp,  dan Bacteroides fragilis dalam  penelitian  ini,  primer  spesifik  hanya  untuk L. plantarum .  Pengujian  spesifisitas  primer  spesifik L.  plantarum dengan Lactobacillus sp  lainnya  sebagai  bakteri  uji  telah dibuktikan oleh Torriani et al. (2001).
Hasil pemeriksaan real time PCR pada sampel partisipan Dari  hasil  pemeriksaan  qPCR  terhadap  sampel  partisipan, pada  minggu  pertama  atau  sebelum  diberikan  perlakuan, beberapa  sampel  partisipan  menunjukkan  hasil  positif, kemudian  menjadi  negatif  di  minggu-minggu  berikutnya  dan sebaliknya. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor seperti diet dan  kontaminasi.  Diet  merupakan  salah  satu  faktor  penentu komposisi  bakteri  usus,  disamping  faktor  dalam  saluran pencernaan  itu  sendiri.  Beberapa  penelitian  membuktikan populasi bakteri  ”jahat” dalam feses orang yang mengonsumsi diet  makanan  barat  (tinggi  lemak  dan  protein,  rendah  serat) lebih  tinggi  dibandingkan  makanan  Asia  yang  lebih  banyak mengonsumsi  sayuran. L.  plantarum terdapat  dalam  berbagai makanan, sayuran dan buah, seperti asinan kubis, timun, buah markisa, sourdough. Kontaminasi  dapat  terjadi  pada  semua tahapan  kerja  mulai  dari  pengolahan  spesimen,  isolasi  DNA, maupun  pembuatan master  mix PCR . Kontaminasi  ini  terjadi jika  alur  kerja  dalam  melakukan  qPCR  tidak  dipatuhi. Pembuatan master  mix ,  penambahan  cetakan  dan penambahan kontrol positif telah dikerjakan pada ruangan dan menggunakan  alat–alat  yang  berbeda.  Di  samping  itu,  setiap pekerjaan  dilakukan  pada biosafety  cabinet .  Hal-hal  tersebut dilaksanakan  untuk  menghindari  kontaminasi.  Pada  penelitian ini  selalu  menggunakan  kontrol  positif L.  plantarum ,  kontrol master  mix dan  kontrol  isolasi  untuk  mengetahui  adanya kontaminasi.
Pada  penelitian  ini  tidak  terjadi  peningkatan  jumlah Lactobacillus sp  secara  signifikan  dalam  sampel  subjek  yang mengonsumsi  probiotik.  Peningkatan  jumlah Lactobacillus sp antara  subjek  yang  diberi  probiotik  atau  plasebo  juga  tidak menunjukkan  perbedaan  yang  bermakna.  Hal  yang  mem- pengaruhi  hasil  pemeriksaan  kultur  antara  lain  media  per- tumbuhan dan kepatuhan subjek.
Dalam  media  MRS  agar,  dengan  penambahan  indikator brom  cresol  purple , Lactobacillus sp  membentuk  koloni berukuran 2-3 mm, cembung, berwarna kuning setelah 48 jam diinkubasi  pada  suhu  37°C.  Warna  kuning  disebabkan  karena kemampuan Lactobacillus sp  memproduksi  asam.  Pada penelitian ini media MRS yang digunakan hanya untuk melihat pertumbuhan Lactobacillus sp secara keseluruhan pada sampel feses  baik  dari  partisipan  yang  diberikan  probiotik  maupun plasebo.  Jumlah Lactobacillus sp  dalam  feses  setiap  subjek bervariasi,  kisaran  jumlah Lactobacillus sp  bervariasi  untuk setiap individu mulai dari 5.1 hingga 8.3 log CFU / g. Saxelin et al .  (2010)  memperlihatkan  bahwa  komposisi  dari indigenous microflora bervariasi dari suatu periode hingga beberapa bulan. Untuk  dapat  memberikan  efek  probiotik, Lactobacillus sp harus dapat menempel dan mengkolonisasi permukaan mukosa lebih  lama.  Pelekatan  pada  mukosa  memperpanjang  waktu probiotik untuk berperan dalam sistem imun saluran pencerna- an,  kemampuan  melekat  pada  permukaan  usus  berhubungan dengan  efektivitas  strain  probiotik  dalam  memberikan  manfaat kesehatan.  Proses  terjadinya  pelepasan  dari  penempelan bakteri  dipermukaan  mukosa  dideskripsikan  dengan  hubungan sebagai berikut: w ashout rate = Specific growth rate = dilution rate. Dilution rate yang berlaku disini merupakan keseimbangan antara dilutionof  intestinal  water yang  menumpuk  pada  per- mukaan mukosa oleh air dan makanan yang dikonsumsi  serta kemampuan  bakteri  untuk  dapat  bertahan  dari  pelepasan  di permukaan mukosa.
Untuk dapat bertahan di permukaan mukosa, bakteri harus dapat  tumbuh  dan  membelah  diri  dengan  rata–rata Specific growth rate yang sama dengan dilution rate yang berlaku. Hal ini  menegaskan  bahwa  di  samping  berkompetisi  secara langsung dengan bakteri lain untuk melekat, laju pertumbuhan menentukan  kemampuan  probiotik  untuk  dapat  berkolonisasi dan  menetap  pada  permukaan  usus.  Konsentrasi  yang  tinggi dari  probiotik  yang  dikonsumsi  meningkatkan  kemampuan bakteri probiotik untuk menempel pada permukaan usus (Lee et al .  2004).  Namun,  bakteri  probiotik  tidak  berkolonisasi  secara tetap,  pemberian  probiotik  dapat  dideteksi  pada  feses  selama beberapa  hari  atau  minggu  setelah cessation dan  akan  ber- kurang  secara  bertahap,  artinya  hanya  terjadi  kolonisasi sementara (Surono, 2004).
Kepatuhan  partisipan  dalam  penelitian  sangatlah  penting. Kekurangpatuhan  partisipan  dalam  meminum  kapsul  yang diberikan.  Terjadinya  tukar–menukar  kapsul  antara  partisipan yang  diberikan  probiotik  dan  plasebo,  cara  pengambilan sampel, penanganan selama perjalanan ke laboratorium mem- pengaruhi  hasil  pemeriksaan  baik  kultur  maupun  qPCR.  Pada hasil pemeriksaan qPCR nilai Ct masih jauh dari nilai Ct pada kontrol positif ( Ct kontrol positif berkisar antara 25 sampai 28). Walaupun  dinyatakan  positif  namun  nilai Ct yang  jauh  lebih
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.2.154
Hasil Penelitian
besar  daripada  nilai Ct kontrol  positif  memperlihatkan  jumlah DNA sampel yang sangat sedikit.
Penelitian  ini  memiliki  beberapa  kelemahan  seperti  tidak dipakainya  media  pertumbuhan  spesifik  untuk  kultur L. plantarum, kekurang  pahaman  subjek  dalam  hal  pemahaman akan pentingnya penelitian, pemakaian Fast Start SYBR Green Master memiliki  sensitivitas  yang  tinggi  namun  spesifisitasnya rendah.  Untuk  mengatasi  kelemahan  ini  dapat  dilakukan penelitian  lanjutan  dengan  memakai  media  pertumbuhan  yang spesifik dan penggunaan probe untuk PCR.

## KESIMPULAN
Penelitian  terhadap  viabilitas  bakteri Lactobacillus sp  pada individu  dewasa  sehat  yang  diberi  perlakuan  terbukti  tidak berbeda  nyata  dalam  peningkatan  jumlah  koloni  bakteri Lactobacillus sp dibanding subjek yang diberikan plasebo pada pemeriksaan dengan kultur media pertumbuhan ( p >0.05). Data hasil  pemeriksaan  qPCR  menunjukkan  keberadaan  bakteri L. plantarum dari sampel subjek pada kelompok perlakuan terbukti terjadi  peningkatan  (nilai Ct )  nyata  dibanding  subjek  plasebo ( p <0.05).  Pada  pemeriksaan  qPCR,  keberadaan  bakteri L. plantarum dinyatakan  dalam  nilai Ct dan peak yang  sesuai dengan  kontrol  positif  pada  grafik melting  curve. Spesifisitas primer  dibuktikan  dengan  menguji  primer  dengan  berbagai bakteri uji seperti Escherichia coli, Pseudomonas aeuroginosa, Klebsiella  pneumonia,  Bifidobacteria sp ,  Bacillus  subtilis, Proteus  mirabilis,  Serratia  marcescens,  Enterobacter aerogenes,  Salmonella  Typhi,  Shigella sp,  dan Bacteroides fragilis dan  primer  dinyatakan  spesifik  untuk L.  plantarum IS- 10506.  Batas  deteksi  menggunakan  qPCR  lebih  sensitif daripada pemeriksaan kultur media.
Kegiatan penelitian lanjutan yang perlu dilakukan yaitu yang berkenaan  dengan  keberadaan  bakteri  asam  laktat  (BAL) sebagai  probiotik  dengan  menggunakan  media  pertumbuhan yang spesifik seperti LPSM ( L. plantarum Selective Media) dan pemakaian  probe  untuk real  time PCR  serta  stabilitas  bakteri dalam  kemasan.  Selain  itu,  bahan  penelitian  dapat  meng- gunakan minuman atau berupa yogurt dibandingkan kapsul.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  SEAMEO TROPMED, Regional  Center  for  Community  Nutrition – Universitas  Indonesia,  melalui  nomor  kontrak:  RUUI  No: 747Q/DRPM-UI/A/N1.4/2009  atas  biaya  penelitian  yang diberikan.

## DAFTAR PUSTAKA
Bixquert JM. 2009. Treatment of irritable bowel syndrome with probiotics:  an  etiopathogenic  approach  at  last.  Rev  Esp Enferm Dig 101: 553-564.
Bujalance  C,  Valera  MJ.  2006.  A  selective  differential  medium for Lactobacillus plantarum. J Microbial mehod 66: 572-575. DOI: 10.1016/j.mimet.2006.02.005.
Collado  MC,  Surono  IS,  Jussi  Meriluoto,  Seppo  Salminen. 2007 a .  Indigenous  dadih  lactic  acid  bacteria:  Cell-surface properties and interactions with  pathogens, J Food Sci 72: 89-93. DOI: 10.1111/j.1750-3841.2007.00294.x.
Collado  MC,  Surono  IS.  Jussi  M,  Seppo  S.  2007 b .  Potential probiotic  characteristics  of Lactobacillus and Enterococcus strains isolated from traditional dadih fermented milk against pathogen intestinal colonization. J Food Prot 70: 700–705. de Vrese M, Kristen H, Rautenberg P, Laue C, Schrezenmeir J. 2011. Probiotic Lactobacilli and Bifidobacteria in a fermented milk  product  with  added  fruit  preparation  reduce  antibiotic associated diarrhea and helicobacter pylori activity. J Dairy Res 78: 396-403. DOI: 10.1017/S002202991100063X.
Lee  YK,  Ho  PS.  Low  CS,  Arvilommi  H,  Salminen.  2004.
Lactobacillus is hindered by the slow rate of cell division in the  mouse  gut.  J  Appl  Environ  Microb  70:  670–674.  DOI: 10.1128/AEM.70.2.670-674.2004.
Mackay  IM.  2007.  Real  Time  PCR  in  Microbiology  from Diagnosis  to  Characterisation.  Caister  Academic  Press. Norfolk.
Nissen L, Chingwaru W, Sgorbati B. 2009. Gut health promoting activity  of  new  putative  probiotic/protective Lactobacillus spp.  Strains:  A  functional  study  in  the  small  intestinal  cell model.  J  Food  Microbiol  135:  288-94.    DOI:  10.1016/j. ijfoodmicro.2009.08.027.
Surono  IS.  2003. In  vitro probiotic  properties  of  indigenous dadih lactic acid bacteria. J Asian Anim 16: 726-731.
Surono  IS.  2004.  Probiotik  Susu  Fermentasi  dan  Kesehatan.
225-228. YAPMMI, Jakarta.
Surono  IS.  2009. In  vivo antimutagenicity  of  dadih  probiotic bacteria toward Trp-P1. J Anim Sci 22: 119-123.
Torriani  S,  Felis  GE.  2001.  Differntiation  of Lactobacillus plantarum, L. pentosus , and L. paraplantarum by rec A gene sequence  analisys  and  Multiplex  assay  with  rec  A  gen derived  primers.  J  Appl  Environ  Microb  3450-3454.  DOI: 10.1128/AEM.67.8.3450-3454.2001.
Wells JM. 2011. Immunomodulatory mechanisms of Lactobacilli . J Microb Cell Fact 10: S17. DOI: 10.1186/1475-2859-10-S1- S17.