DOI : 10.35311/jmpi.v10i1.478

## Sintesis  Heksapeptida  Linear  Prolin-Leusin-Lisin-Leusin-Fenilalanin- Fenilalanin (PLKLFF) dan Aktivitas Antimikrobanya
Indriana  Tasya 1 ,  Regina  Purwita  Sari 1 ,  Agusto  Jeremia  Giawa 1 ,  Wirhanuddin 1 ,  Gymnastiyar Kama Tasawa 2 , Hanggara Arifian 2,3 , Laode Rijai 2,3 , Agung Rahmadani 1*
1 Program  Studi  Sarjana  Pendidikan  Kimia,  Fakultas  Keguruan  dan  Ilmu  Pendidikan,  Universitas Mulawarman
2 Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Mulawarman
3 Laboratorium Penelitian dan Pengembangan Farmaka Tropis, Fakultas Farmasi, Universitas Mulawarman

## ABSTRAK
Resistensi  terhadap  antibiotik  konvensional  memiliki  tingkat  kejadian  yang  cukup tinggi.  Dibutuhkan  pengembangan  antibiotik  baru  salah  satunya  golongan  senyawa peptida yang merupakan kandidat yang potensial sebagai agen antimikroba. Penelitian ini  bertujuan  untuk  mensintesis  peptida  baru  dan  mengevaluasi  aktivitas antimikrobanya.  Peptida  antimikroba  dapat  didesain  menggunakan machine  learning iAMPpred dengan menganalisis nilai tertinggi probabilitas antibakteri dan antijamur. Peptida disintesis secara kimia di laboratorium menggunakan metode sintesis peptida fase  padat  dan  diuji  aktivitas  antimikrobanya  dengan  menggunakan  metode  dilusi untuk  menghitung  nilai Minimum  Inhibitory  concentration (MIC).  Hasil  penelitian menunjukkan  desain  heksapeptida  linear  Prolin-Leusin-Lisin-Leusin-Fenilalanin- Fenilalanin  (PLKLFF)  memiliki  nilai  probabilitas  tertinggi  dengan  nilai  probabilitas antibakteri  0,87  dan  probabilitas  antijamur  0,91.  Heksapeptida  linear  ini  berhasil disintesis menggunakan metode sintesis peptida fase padat dengan rendemen sebesar 93,32%. Keberhasilan sintesis dikonfirmasi menggunakan spektrofotometer infra merah dan  spektroskopi  massa.  Senyawa  heksapeptida  linear  PLKLFF  memiliki  aktivitas antijamur/fungistatik sedang terhadap jamur C. albicans ATCC 10231 dengan nilai MIC 312,5 µg/mL dan tidak aktif terhadap bakteri E. coli ATCC 11229 dan S. aureus ATCC 6538.
Kata Kunci : Antimikroba, Heksapeptida, iAMPpred, PLKLFF, Sintesis Peptida

## ABSTRACT
Resistance to conventional antibiotics has a fairly high incidence rate. It is necessary to develop new antibiotics, one of which is the peptide compound class which is a potential candidate  as  an  antimicrobial  agent.  Antimicrobial  peptides  can  be  designed  using iAMPpred  machine  learning  by  analyzing  the  highest  antibacterial  and  antifungal probability values. Peptides are chemically synthesized in the laboratory using the solid phase peptide synthesis method and tested for antimicrobial activity using the dilution method  to  calculate  the  Minimum  Inhibitory  Concentration  (MIC)  value.  The  results showed  that  the  linear  hexapeptide  Proline-Leucine-Lysine-Leucine-Phenylalanine- Phenylalanine (PLKLFF) design had the highest probability value with an antibacterial probability value of 0.87 and an antifungal probability of 0.91. This linear hexapeptide was  successfully  synthesized  using  the  solid  phase  peptide  synthesis  method  with  a yield  of  93.32%.  The  success  of  the  synthesis  was  confirmed  using  infrared spectrophotometer  and  mass  spectroscopy.  The  linear  hexapeptide  PLKLFF  has moderate antifungal/fungistatic activity against the fungus C. albicans ATCC 10231 with an MIC value of 312.5 µg/mL and is not active against the bacteria E. coli ATCC 11229 and S. aureus ATCC 6538.
Keywords : Antimicrobial, Hexapeptide, iAMPpred, PLKLFF, Peptide Synthesis
Sitasi: Tasya, I., Sari, R. P., Giawa, A. J., Wirhanuddin, Tasawa, G. K., Arifian, H., Rijai, L., & Rahmadani, A. (2024). Sintesis Heksapeptida Linear Prolin- Leusin-Lisin-Leusin- Fenilalanin-Fenilalanin (PLKLFF) dan Aktivitas Antimikrobanya. Jurnal Mandala Pharmacon Indonesia, 10(1), 89-97. https://doi.org/10.35311/jmpi .v10i1.478
Submitted: 22 Februari 2024 Accepted: 13 Mei 2024 Published: 26 Juni 2024
*Penulis Korespondensi: Agung Rahmadani Email: agungrahmadani@fkip.unm ul.ac.id
Jurnal Mandala Pharmacon
Indonesia is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License

## PENDAHULUAN
Sejalan  dengan  perkembangan  dan penggunaan  antibiotik,  munculnya  resistensi terjadi dikarenakan penggunaan obat antibiotik yang  tidak  prosedural  dan  tidak  terkontrol sehingga  mikroba  patogen  menjadi  resisten (Rahman,  2019;  Uddin et  al .,  2021).  Tingginya kejadian resistensi terhadap antibiotik konvensional  menyebabkan  dibutuhkannya pengembangan  golongan  antibiotik  baru. Peptida  antimikroba  (PAM)  merupakan  salah satu kandidat antibiotik yang ideal (Huan et al ., 2020; Luong et al ., 2020).
Sebagian  besar  PAM  bekerja  langsung pada  membran  bakteri,  sehingga  bakteri  sulit mengembangkan  kekebalan  terhadap  peptida antimikroba (Kumar et al ., 2018). Tidak seperti kebanyakan  antibiotik  konvensional,  peptida antimikroba  dapat  meningkatkan  kekebalan dengan  bertindak  sebagai  imunomodulator (Viruly, 2022). Kekuatan terapeutik PAM yang utama adalah karena sifat litiknya. PAM dapat menyebabkan  pembentukan  pori-pori  atau pecahnya membran sel pada sel patogen. PAM telah  terbukti  membunuh  berbagai  macam mikroba,  termasuk  bakteri,  jamur,  dan  bakteri yang  resisten  terhadap  obat.  PAM  bekerja dengan  pembentukan  pori-pori  multimerik dalam  membran  sel  yang  menyebabkan  lisis (Kumar et al ., 2018; Luong et al ., 2020).
Desain  dan  perancangan  PAM  sintetik dapat  dilakukan  melalui machine  learning . Sebuah  aplikasi machine  learning CAMP R4 dan iAMPpred  dapat  melakukan  prediksi  peptida yang bersifat antimikroba berdasarkan database peptida  alami  dan  sintetik  yang  diketahui memiliki sifat antimikroba (Gawde et al ., 2023; Meher et al ., 2017). Adanya machine learning ini dapat  membantu  dalam  perancangan/desain peptida  sintetik  yang  memiliki  aktivitas antimikroba  sebagai  dasar  sintesis  peptida secara kimia di laboratorium.
Salah satu metode sintesis peptida, yaitu sintesis  peptida  fase  padat  (Maharani,  2018). Keuntungan  umum  dari  sintesis  fase  padat adalah pemurnian yang mudah dan pembentukan  intermediet  peptida  linear  yang cepat (Ferrazzano et al ., 2022; Isidro-Llobet et al .,
2019).  Rahmadani et  al .  (2021)  berhasil mensintesis heksapeptida linear Prolin-Leusin- Prolin-Leusin-Fenilalanin-Fenilalanin (PLPLFF) sebagai  prekursor  peptida  siklik  antimikroba eksumolida  B  menggunakan  metode  sintesis peptida  fase  padat.  Heksapeptida  linear  ini dapat dijadikan dasar perancangan heksapeptida  linear  yang  memiliki  aktivitas antimikroba.
Berdasarkan  uraian  latar  belakang diatas,  maka  perlu  dikembangkan  senyawa heksapeptida  linear  baru  dan  mengevaluasi aktivitas antimikrobanya. Dalam penelitian ini, perancangan/desain heksapeptida linear menggunakan machine  learning iAMPpred  dan sintesis  senyawa  heksapeptida  linear  sebagai kandidat  peptida  antimikroba  menggunakan metode  sintesis  peptida  fase  padat  serta menguji  aktivitas  antimikroba  (MIC)  dari heksapeptida  linear  tersebut.  Adapun  tujuan penelitian  ini  adalah  untuk  memperoleh senyawa heksapeptida linear hasil sintesis yang memiliki aktivitas antimikroba.

## METODE PENELITIAN Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian adalah  tabung  sintesis  (reaktor)  peptida  fase padat  (tabung  SPPS), rotary  evaporator , rotary suspension mixer , magnetic stirrer , Reverse Phase - High  Performance  Liquid  Chromatography (RP- HPLC) merk Waters 1500 series, detektor Photo Diode Array (PDA), Spektrofotometer inframerah (FTIR) (Nicolet
Summit Thermoscientific),  Spektroskopi  massa  (HR- TOF-MS)  Lockspray  Waters,  Spektrofotometer UV-Vis Genesys 10, labu filtrasi, laminar air flow , cawan  petri  dan  alat  gelas  yang  umum digunakan di laboratorium.
Bahan
Bahan  yang  digunakan  adalah  resin  2- klorotritilklorida (2-CTC), Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Phe-OH,  Fmoc-Leu-OH,  Fmoc-Lys(Boc)- OH,  HATU,  HOAt, N,N -dimethylformamide (DMF),  Diisopropiletilamina  (DIPEA),  4- metilpiperidin, larutan kloranil, asam trifluoroasetat  (TFA),  asetonitril  (MeCN), metanol, diklorometana (DCM),
dimetilsulfoksida (DMSO), nutrien broth , biakan bakteri E. coli ATCC 11229, S. aureus ATCC 6538 dan jamur C. albicans ATCC 10231.

## Perancangan Heksapeptida Linear
Desain  atau  perancangan  heksapeptida linear  dengan  dasar  sekuens  Prolin-Leusin- Prolin-Leusin-Fenilalanin-Fenilalanin (PLPLFF). Selanjutnya dilakukan variasi penggantian  salah  satu  sekuens  dengan  asam amino  lisin.  Desain  sekuens  yang  dirancang disimulasikan  menggunakan machine  learning iAMPpred (http://cabgrid.res.in:8080/amppred/). Machine learning akan melakukan prediksi sekuens yang berpotensi sebagai peptida antimikroba dengan melihat  nilai  probabilitas  PAM.  Semakin mendekati  nilai  1,  maka  sekuens  peptida memiliki  probabilitas  terbaik  sebagai  peptida antimikroba.  Peptida  terpilih  sebagai  dasar untuk dilakukan sintesis menggunakan metode sintesis peptida fase padat.
Sintesis  Heksapeptida  Linear  Prolin-Leusin- Lisin-Leusin-Fenilalanin-Fenilalanin
(PLKLFF)
Sebanyak 0,3 g resin 2-klorotritil klorida (0,99 mmol/g) disuspensikan dalam DCM pada reaktor  SPPS,  kemudian  dikocok  selama  5 menit  dan  disaring.  Larutan  0,6  mmol  Fmoc- AA1-OH  dan  1,2  mmol  DIPEA  dilarutkan dalam  4  mL  DCM  dan  ditambahkan  ke  resin yang  kemudian  dikocok  selama  4  jam  pada suhu  ruang.  Resin  disaring,  kemudian  dicuci dengan  DMF  dan  DCM.  Sebanyak  5  mL campuran larutan DCM/metanol/DIPEA (7:2:1) ditambahkan ke resin yang kemudian dikocok selama  2x10  menit.  Resin  dicuci  dengan  DMF dan DCM lalu disaring. Reagen pelepas gugus pelindung  Fmoc  (20%  4-metilpiperidin  dalam DMF) ditambahkan hingga resin terendam dan campuran  reaksi  dikocok  selama  2x5  menit yang kemudian reagen pelepas gugus pelindung  dikeluarkan  dengan  cara  filtrasi. Dilakukan  pengujian  kloranil  terhadap  sedikit resin untuk mengetahui lepasnya gugus Fmoc. Kloranil  akan  menghasilkan  warna  resin  biru kehitaman. Setelah itu resin dicuci dengan DMF dan DCM.
Sebanyak  Fmoc-Phe-OH  (3  ek.),  HATU (3  ek.),  HOAt  (3  ek.),  DIPEA  (6  ek.) ditambahkan  4  mL  DMF  dan  dikocok  hingga larut.  Larutan  direaksikan  selama  4  jam. Keberhasilan  sintesis  ditunjukkan  dengan  uji kloranil.  Hasil  uji  negatif  (reaksi  kopling sempurna)  ditunjukkan  dengan  larutan  tidak berwarna  dengan  butiran  resin  berwarna kekuning-kuningan.  Selanjutnya  resin  dicuci menggunakan DMF dan DCM. Lalu dilanjutkan  ke  tahap  pelepasan  gugus  Fmoc. Asam  amino  selanjutnya  AA3  hingga  AA6 disusun  menggunakan  prosedur  kopling  dan pelepasan  gugus  pelindung  Fmoc  hingga didapatkan rantai peptida yang sesuai. Peptida yang telah disusun kemudian dilepas dari resin menggunakan  10  mL  campuran  TFA:  aquades (95:5) dan diaduk selama 2x60 menit pada suhu ruang.  Lepasnya  peptida  dari  resin  ditandai dengan berubahnya warna resin menjadi hitam. Resin  disaring  dan  dicuci  menggunakan diklorometana. Filtrat yang diperoleh dipekatkan  menggunakan rotary  evaporator . Padatan  peptida  yang  diperoleh  kemudian dianalisis  dengan  RP-HPLC  analitik  dan dikarakterisasi  menggunakan  spektroskopi massa  dan  spektrofotometer  infra  merah (FTIR).

## Pengujian Aktivitas Antimikroba
Uji  aktivitas  antimikroba  dilakukan dengan  menggunakan  metode  mikrodilusi untuk  menentukan  konsentrasi  terendah  dari senyawa uji yang dapat menghambat pertumbuhan  mikroba.  Bakteri E.  coli ATCC 11229, S.  aureus ATCC  6538  dan  jamur C. albicans ATCC 10231 yang telah diinokulasikan ke  dalam  media  pertumbuhan  dimasukkan  ke dalam media nutrient broth (NB) dengan standar McFarland  0,5. Loading sampel  heksapeptida linear  PLKLFF  dilarutkan  dalam  DMSO  2% dengan  konsentrasi  5  mg/mL  (5000  ppm)  dan diencerkan  secara  bertingkat.  Selanjutnya sampel diinkubasi pada 96- well microplates pada suhu  37 o C  selama  24  jam.  Pembacaan  data diukur  menggunakan  spektrofotometer  pada panjang  gelombang  600  nm.  Penentuan Minimum Inhibitory Concentratio n (MIC) diukur dengan  menghitung  presentasi  penghambatan
(pertumbuhan) mikroba pada 96- well microplates (Maharani et al ., 2021).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  tahap  awal  penelitian  dilakukan perancangan/desain heksapeptida linear menggunakan machine  learning iAMPpred dengan  dasar  sekuens  Prolin-Leusin-Prolin- Leusin-Fenilalanin-Fenilalanin (PLPLFF), dimana  dari  sekuens  dasar tersebut  dilakukan variasi penggantian salah satu sekuens dengan asam  amino  lisin.  Penggantian  dengan  asam amino  lisin  bertujuan  untuk  mendapatkan desain  peptida  yang  memiliki  aktivitas antimikroba  yang  lebih  baik.  Lisin  merupakan asam amino kationik yang dapat meningkatkan
aktivitas antimikroba dari peptida (Luong et al ., 2018; Luong et al ., 2020). Machine learning akan melakukan  prediksi  sekuens  yang  berpotensi sebagai  peptida  antimikroba  dengan  melihat nilai  probabilitas  PAM  (antibakteri  dan antijamur) . Semakin  mendekati  nilai  1,  maka sekuens  peptida  memiliki  probabilitas  terbaik sebagai  peptida  antimikroba  (PAM).  Hasil iAMPpred  menunjukkan  desain  heksapeptida linear  (PLKLFF)  memiliki  nilai  probabilitas antimikroba yang paling tinggi yaitu antibakteri (0,87) dan antijamur (0,91), sehingga desain  ini  yang  dipilih  untuk  disintesis.  Hasil perancangan/desain  heksapeptida  linear  pada machine  learning iAMPpred  dapat  dilihat  di Tabel 1.
Tabel 1. Hasil perancangan heksapeptida linear dengan machine learning iAMPpred No. Sekuens Antibakteri Antijamur 1 PLPLFF (dasar) 0,77 0,74 2 PLPLF K 0,86 0,78 3 PLPL K F 0,86 0,78 4 PLP K FF 0,77 0,82 5 PL K LFF 0,87 0,91 6 P K PLFF 0,77 0,81 7 K LPLFF 0,86 0,90
Sintesis  senyawa  target  heksapeptida linear PLKLFF dilakukan menggunakan metode  sintesis  peptida  fase  padat  dengan strategi penggunaan gugus pelindung Fmoc/Boc dan resin 2-klorotritil klorida (CTC). Fmoc-Phe-OH  sebagai  asam  amino  C-terminal direaksikan  dengan  resin  2-CTC  yang  telah dilakukan  pengembangan  terlebih  dahulu menggunakan  diklorometana  (DCM).  Reaksi ini  berlangsung  selama  4  jam  dalam  kondisi basa  DIPEA  dan  pelarut  DCM.  Reaksi pengikatan  asam  amino  Fmoc-Phe-OH  pada resin  merupakan  reaksi  SN 1 yang  melibatkan atom  O  pada  gugus  karboksil  asam  amino sebagai nukleofil dan C tersier pada gugus tritil pada  resin  sebagai  karbokation  (elektrofil) untuk  membentuk  ikatan  ester.  Hidrogen  dari karboksilat asam amino
dideprotonasi/diabstraksi  oleh  basa  DIPEA membentuk  nukleofilik.  Selanjutnya,  nukleofil menyerang  C  tersier  gugus  tritil  klorida  resin dan  atom  Cl  menjadi  gugus  pergi.  Fmoc-Phe- OH yang terikat pada resin 2-CTC dikuantifikasi  dengan  mengukur  absorbansi resin  yang  telah  dilarutkan  pada  20%  4- metilpiperidin  dalam  DMF  pada  panjang gelombang  290  nm  (Maharani,  2018).  Pada pengikatan  asam  amino  pertama  didapatkan nilai Loading  Resin sebesar  0,65  mmol/g.  Nilai Loading  Resin yang  baik  berkisar pada rentang 0,20-1,30  mmol/g  (Maharani et  al .,  2021).  Hal tersebut menunjukkan bahwa reaksi pengikatan  asam  amino  pertama  (Fmoc-Phe- OH)  terhadap  resin  berlangsung  dengan  baik (Gambar 1).
Gambar 1.  Pengikatan asam amino pertama (Fmoc-Phe-OH) pada resin 2-klorotritil klorida dengan bantuan basa DIPEA
Tahap  selanjutnya  adalah capping resin untuk  menonaktifkan  gugus  aktif  resin  yang tidak  bereaksi  dengan  asam  amino  pertama. Pada  tahap  ini,  ditambahkan metanol, DIPEA, dan DCM dengan rasio 2 : 1 : 7 ke dalam resin. Campuran  resin  kemudian  di shaker selama 2x15  menit.  Gugus  Fmoc  pada  fenilalanin dideproteksi  dengan  menggunakan  20%  4- metilpiperidin  dalam  DMF  selama  2x5  menit. Selanjutnya,  resin  dicuci  dengan  DCM  dan DMF  secara  bergantian,  dan  dikeringkan. Reaksi deproteksi berlangsung melalui mekanisme  beta  eliminasi  karbanion  (Gambar 2).  Atom  hidrogen  C-16  teraktivasi  oleh aromatisitas  kedua  cincin  benzena,  anion karboksilat  sebagai  gugus  pergi.  Abstraksi proton C-16 oleh basa 4-metilpiperidin (sebagai nukleofilik) menyebabkan delokalisasi elektron.  Delokalisasi  elektron  menyebabkan lepasnya  gas  karbondioksida  (dekarboksilasi) dan  Fmoc-4-metilpiperidin  yang  membentuk kesetimbangan menjadi dibenzofulvena (Maharani, 2018). Keberhasilan tahap ini dapat dimonitoring  dengan  uji  kloranil  untuk mendeteksi  adanya  gugus  amina  sekunder bebas. Sedikit resin direaksikan dengan larutan kloranil,  dan  deproteksi  Fmoc  berhasil,
dikarenakan  resin  berubah  dari  warna  kuning menjadi hitam.
Gugus  amino  bebas  hasil  deproteksi pada  fenilalanin-resin  (NH 2 -Phe-resin)  di coupling dengan asam amino kedua (Gambar 3), yaitu  Fmoc-Phe-OH.  Sebanyak  Fmoc-Phe-OH (6 ek.), HATU (6 ek.), HOAt (6 ek.), DIPEA (12 ek.),  ditambahkan  DMF:DCM  (1  :  1)  dan dikocok  hingga  larut,  selanjutnya  direaksikan dengan NH 2 -Phe-resin selama 4 jam pada suhu ruang. Reagen  HATU diketahui dapat mengaktivasi  gugus  karboksilat  pada  asam amino  dengan  membentuk  intermediet  ester yang  lebih  aktif.  Gugus  ester  yang  terbentuk akan  memiliki  sifat  sebagai  gugus  pergi  yang baik  dalam  kondisi  basa,  sehingga  dapat memicu  nukleofil  amino  dari  NH 2 -Phe-resin untuk  menyerang  gugus  karboksilat  yang teraktivasi dan membentuk ikatan peptida/amida. Selain itu, reagen kopling aditif HOAt  berfungsi  agar  reaksi  pembentukan peptida lebih terbatasi oleh ruang, dengan cara membentuk  interaksi  hidrogen  intramolekular dengan  gugus  Nα -amino  dari  asam  amino kedua  sehingga  laju  rasemisasi  dapat  ditekan. Asam  amino  lisin  memerlukan  waktu  reaksi coupling yang  lebih  lama  (Maharani,  2018; Rahmadani et al ., 2021).
Gambar 2.  Reaksi deproteksi gugus Fmoc menggunakan 4-metilpiperidin
Fmoc N H O O Fmoc N H O O N N N N N N O PF 6 Fmoc N H O O N N N N N N O Fmoc H N O O N PF 6 O O H 2 N N N O HPF 6 O O N N H O O O O H N O N H Fmoc HOAt H N Fmoc N N N N Fmoc-Phe-OH H N 20% 4-metil piperidin O O H N O NH 2 N N HOAt DIPEA Resin-Phe-NH 2 HATU Resin-Phe-Phe-NH 2 Interaksi hidrogen
Gambar 3. Mekanisme kopling pembentukan ikatan amida pada sintesis peptida fase padat menggunakan kombinasi reagen kopling HATU/HOAt dan basa DIPEA serta reaksi deproteksi menggunakan 20% 4- metil piperidin dalam DMF (Maharani, 2018; Rahmadani et al ., 2021)
Keberhasilan  reaksi coupling amida dengan  metode  sintesis  peptida  fase  padat dapat  ditingkatkan  dengan  penambahan jumlah  ekuivalen  (ek.)  asam  amino,  reagen pengkopling  dan  basa  DIPEA  karena  reaksi berlangsung  pada  dua  fase  yang  berbeda. Keberhasilan coupling asam  amino  dalam sintesis peptida dapat dimonitoring dengan uji kloranil  yang  menunjukkan  hasil  uji  negatif dengan  resin  tetap  berwarna  kuning.  Tahap selanjutnya adalah deproteksi gugus pelindung Fmoc  menggunakan  20%  4-metilpiperidin dalam  DMF  selama  2x5  menit.  Setelah  itu, coupling asam  amino  ketiga  yang  dilakukan berulang  hingga  asam  amino  keenam  sampai diperoleh  heksapeptida  linear  pada  resin. Tahap  terakhir,  yaitu  pelepasan  semua heksapeptida linear (cleavage) dilakukan dalam kondisi reaksi TFA:aquades (95 : 5) selama 2x60 menit.  Larutan  dari  hasil  reaksi  kemudian ditampung  pada  wadah  dan  dilakukan evaporasi dengan menggunakan rotary evaporator hingga dihasilkan padatan heksapeptida linear PLKLFF. Skema dan reagen dalam  sintesis  heksapeptida  linear  PLKLFF dapat dilihat pada Gambar 4.
Hasil sintesis kemudian dianalisis kemurniannya  dengan  RP-HPLC  analitik. Kromatogram RP-HPLC analitik pada Gambar
5  menunjukkan  senyawa  heksapeptida  linear PLKLFF berada pada waktu retensi 24,8 menit dengan  kemurnian  senyawa  sebesar  90,85%. Nilai  kemurnian  diatas  90%  menunjukkan senyawa  ini  memiliki  kemurnian  yang  cukup tinggi.  Dari  hasil  sintesis  dihasilkan  padatan putih  heksapeptida  linear  PLKLFF  sebanyak 139 mg. Rendemen sintesis heksapeptida linear PLKLFF sebesar 93,32%.
Karakterisasi  senyawa  heksapeptida linear PLKLFF dilakukan menggunakan spektrofotometer inframerah (FTIR) dan spektroskopi massa. Spektrum FTIR (Gambar 6) menunjukkan stretching NH (amina sekunder) pada  bilangan  gelombang  3279  cm-1  dan stretching C=O (karbonil amida) pada bilangan gelombang  1628  cm-1.  Diperkuat  dengan adanya  bending  NH  (amida)  pada  bilangan gelombang 1530 cm-1 dan stretching C-N pada bilangan  gelombang  1130  dan  1180  cm-1 (Nandiyanto  et  al.,  2023).  Bilangan  gelombang ini  merupakan  penciri  adanya  ikatan  peptida dalam  struktur  senyawa  PLKLFF.  Begitu  pula adanya  bilangan  gelombang  1393  cm-1  yang menandakan  keberadaan  isopropil  dari  leusin serta  bilangan  gelombang  2954  dan  3067  cm-1 yang  menandakan  adanya  stretching  CH  sp3. Sedangkan  hasil  analisis  spektroskopi  massa (Gambar  7)  menunjukkan  nilai  m/z  764,8555
sebagai  [M+H]+  dengan  rumus  molekul C41H61N7O7+.  Nilai  ini  sesuai  dengan  massa molekul senyawa PLKLFF, sehingga berdasarkan  analisis  FTIR  dan  spektroskopi massa  maka  dapat  dibuktikan  senyawa PLKLFF telah berhasil disintesis.
Gambar 4.   Skema dan reagen sintesis heksapeptida linear PLKLFF.
Keterangan reagen dan kondisi: (a) (1) Fmoc-Phe-OH, DIPEA, DCM, 4 jam, suhu kamar; (2) MeOH/DCM/DIPEA (2:7:1), (3)  20%  4-metilpiperidin  dalam  DMF,  (b)  Fmoc-Phe-OH,  HATU,  HOAt,  DIPEA,  DMF,  4  jam,  suhu  kamar  (2)  20%  4- metilpiperidin dalam DMF, (c) Fmoc-Leu-OH, HATU, HOAt, DIPEA, DMF, 4 jam, suhu kamar, (2) 20% 4-metilpiperidin dalam DMF, (d) Fmoc-Lys(Boc)-OH, HATU, HOAt, DIPEA, DMF, 2x4 jam, suhu kamar, (2) 20% 4-metilpiperidin dalam DMF, (e) (1) Fmoc-Leu-OH, HATU, HOAt, DIPEA, DMF, 4 jam, suhu kamar (2) 20% 4-metilpiperidin dalam DMF (f) Fmoc- Pro-OH, HATU, HOAt, DIPEA, DMF, 4 jam, suhu kamar (2) 20% 4-metilpiperidin dalam DMF (g) TFA:aquades (95:5), 2x60 menit, suhu kamar.
Gambar 5.   Kromatogram RP-HPLC analitik heksapeptida linear PLKLFF (Rt = 24,8 menit). Metode elusi gradien dengan fase gerak 0% B (0-5 menit), 5% (5-10 menit), 95% (10-40 menit), 95% (40-45 menit). A= 0,1% TFA/H 2 O; B = MeCN. Laju alir 1 mL/menit, detektor PDA λ 210 nm
Gambar 6.  Spektrum FTIR senyawa heksapeptida linear PLKLFF
Gambar 7.  Spektrum massa senyawa heksapeptida linear PLKLFF
Senyawa  heksapeptida  linear  PLKLFF yang  telah  dikarakterisasi  selanjutnya  diuji aktivitas  antimikrobanya  terhadap  bakteri E. coli ATCC  11229, S.  aureus ATCC  6538  dan jamur C.  albicans ATCC  10231  menggunakan metode dilusi. Aktivitas antimikroba heksapeptida linear PLKLFF ditunjukkan pada Tabel  2.  Dari  nilai Minimum  Inhibitory
Concentration (MIC) yang dihasilkan
menunjukkan  heksapeptida  linear  PLKLFF memiliki aktivitas antijamur/fungistatik sedang terhadap  jamur C.  albicans ATCC  10231 sedangkan terhadap bakteri E. coli ATCC 11229 dan S.  aureus ATCC  6538  tidak  aktif  sebagai antibakteri.  Kategori  berdasarkan  nilai  MIC  > 1000 µg/mL (tidak aktif), MIC 512-1000 µg/mL (aktivitas  rendah),  MIC  128-512  µg/mL (aktivitas sedang), MIC 32-128 µg/mL (aktivitas
baik), MIC 10-32 µg/mL (aktivitas kuat), MIC < 10  µg/mL  (aktivitas  sangat  kuat)  (Ramic et  al ., 2021).  Aktivitas  antijamur  dimungkinkan keberadaan  asam  amino  lisin  yang  ada  pada sekuens PLKLFF. Keberadaan asam amino lisin memberikan  muatan  kationik  pada  peptida.
Akibatnya  peptida  akan  lebih  selektif  pada membran  fosfolipid  yang  bermuatan  negatif dan memberi jalan dalam perusakan membran sehingga  akan  mengalami  lisis  dan  kematian (Luong et al ., 2020).
Tabel 2.  Nilai MIC (µg/mL) senyawa PLKLFF
Senyawa E. coli ATCC 11229 S. aureus ATCC 6538 C. albicans ATCC 10231 PLKLFF 2500 1250 312,5

## KESIMPULAN
Senyawa  heksapeptida  linear  Prolin- Leusin-Lisin-Leusin-Fenilalanin-Fenilalanin (PLKLFF)  berhasil  disintesis  menggunakan metode  sintesis  peptida  fase  padat  dengan rendemen sintesis sebesar 93,32%. Keberhasilan sintesis  PLKLFF  ditandai  pembentukan  ikatan peptida  dengan  adanya  spektrum  FTIR  yang menunjukkan stretching NH  sekunder  pada 3279  cm -1 dan stretching C=O  (karbonil  amida) pada  1628  cm -1 ,  diperkuat  dengan  adanya bending NH  (amida)  pada  1530  cm -1 dan stretching C-N  pada  1130  dan  1180  cm -1 serta spektrum  massa  dengan  nilai  m/z  764,8555. Senyawa PLKLFF memiliki aktivitas antijamur/fungistatik sedang terhadap jamur C. albicans ATCC 10231 dengan MIC sebesar 312,5 µg/mL  dan  tidak  aktif  terhadap  bakteri E.  coli ATCC 11229 dan S. aureus ATCC 6538.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih atas
Hibah Pendanaan Program Kreativitas Mahasiswa Riset Eksakta (PKM-RE) tahun 2023 dari Direktorat Pembelajaran dan Kemahasiswaan Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset dan Teknologi. Penulis juga mengucapkan terimakasih
kepada
Laboratorium  Sentral  Universitas  Padjadjaran atas  pengukuran  FTIR dan RP-HPLC  analitik serta Laboratorium
Biomedik
Fakultas Kedokteran  Universitas  Padjadjaran  atas pengukuran spektroskopi massa.

## DAFTAR PUSTAKA
Ferrazzano,  L.,  Catani,  M.,  Cavazzini,  A., Martelli,  G.,  Corbisiero,  D.,  Cantelmi,  P., Fantoni,  T.,  Mattellone,  A.,  De  Luca,  C.,
Felletti,  S.,  Cabri,  W.,  &  Tolomelli,  A.
(2022). Sustainability in Peptide Chemistry: Current Synthesis and
Purification  Technologies  and  Future Challenges. Green  Chemistry,  24 (3),  975 – 1020. https://doi.org/10.1039/d1gc04387k
Gawde,  U.,  Chakraborty,  S.,  Waghu,  F.  H.,
Barai,  R.  S.,  Khanderkar,  A.,  Indraguru, R., Shirsat, T., & Idicula-Thomas, S. (2023). CAMPR4:  a  Database  of  Natural  and Synthetic Antimicrobial Peptides. Nucleic Acids Research , 51 (1), 377 – 383.
https://doi.org/10.1093/nar/gkac933
Huan,  Y.,  Kong,  Q.,  Mou,  H.,  &  Yi,  H.  (2020).
Antimicrobial  Peptides:  Classification,
Design, Application and Research
Progress  in  Multiple  Fields. Front. Microbiol , 582779. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.582779 Isidro-Llobet, A., Kenworthy, M. N., Mukherjee, S., Kopach, M. E., Wegner, K., Gallou, F., Smith, A. G., & Roschangar, F. (2019).  Sustainability  Challenges  in Peptide Synthesis and Purification: From R&D  to  Production. Journal  of  Organic
Chemistry , 84 (8), 4615 – 4628. https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b03001
Kumar, P., Kizhakkedathu, J. N., & Straus, S. K.
(2018). Antimicrobial Peptides: Diversity,
Mechanism  of  Action  and  Strategies  to Improve the Activity and Biocompatibility  in  Vivo. Biomolecules,
8 (1). https://doi.org/10.3390/biom8010004
Luong, H. X., Kim, D. H., Lee, B. J., & Kim, Y. W. (2018).  Effects  of  Lysine-To-Arginine Substitution on Antimicrobial Activity of
Cationic Stapled Heptapeptides. Archives of  Pharmacal  Research , 41 (11),  1092 – 1097. https://doi.org/10.1007/s12272-018-1084-5
Luong, H. X., Thanh, T. T., & Tran, T. H. (2020). Antimicrobial  Peptides – Advances  in Development of Therapeutic Applications. Life  Sciences ,  260,  118407. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118407
Maharani.  (2018). Konstruksi  Peptida  Secara Kimia . Bitread Publishing. Bandung
Maharani,  R.,  Amrullah,  M.  H.,  Kurnia,  D.  Y., Hidayat, A. T., Nurlelasari, Harneti, D., & Supratman,  U.  (2021).  An  Improved Synthesis  of  Pentapeptide  (SCAP1e) Using Solid-Phase Method with Reduced Resin  Loading  Time. Egyptian  Journal  of
Chemistry , 64 (9), 4797 – 4801. https://doi.org/10.21608/ejchem.2021.5260
1.3085
Maharani,  R.,  Napitupulu,  O.  I.,  Dirgantara,  J.
M., Hidayat, A. T., Sumiarsa, D., Harneti, D., Nurlelasari, Supratman, U., & Fukase, K.  (2021).  Synthesis  of  Cyclotetrapeptide Analogues  of  C-PLAI  and  Evaluation  of Their  Antimicrobial  Properties. Royal Society  Open  Science , 8 (3),  201822. https://doi.org/10.1098/rsos.201822
Meher, P. K., Sahu, T. K., Saini, V., & Rao, A. R.
(2017). Predicting Antimicrobial Peptides with Improved Accuracy by Incorporating the Compositional, Physico-Chemical and Structural Features into Chou’s General  PseAAC. Scientific Reports , 7 , 42362.
https://doi.org/10.1038/srep42362
Nandiyanto, A. B. D., Ragadhita, R., & Fiandini,
M.  (2023).  Interpretation  of  Fourier
Transform  Infrared  Spectra  (FTIR):  A Practical Approach in the Polymer/Plastic
Thermal Decomposition.
Indonesian
Journal of Science and Technology , 8 (1), 113 – 126. https://doi.org/10.17509/ijost.v8i1.53297
Rahmadani,  A.,  Masruhim,  M.  A.,  Rijai,  L., Hidayat,  A.  T.,  Supratman,  U.,  & Maharani,  R.  (2021).  Total  Synthesis  of
Cyclohexadepsipeptides  Exumolides  A and B. Tetrahedron , 83 , 131987 https://doi.org/10.1016/j.tet.2021.131987
Rahman,  I.  (2019).  Resistensi  Antibiotik
Terhadap Salmonella Typhi pada Penyakit Demam Tifoid di Kota Makassar. Kieraha Medical Journal, 1 (2), 1- 5.
https://ejournal.unkhair.ac.id/index.php/

## kmj
Ramic,  A.,  Skocibušic,  M.,  Odžak,  R.,
Gašparovic,  A.  C.,  Milkovic,  L.,  Mikelic, A.,  Sovic ,  K.,  Primožic,  I.,  &  Hrenar,  T.
(2021).  Antimicrobial  Activity  of  Quasi- Enantiomeric
Cinchona Alkaloid Derivatives and Prediction Model Developed by Machine Learning. Antibiotics , 10 (6), 659. https://doi.org/10.3390/antibiotics1006065
9
Uddin,  T.  M.,  Chakraborty,  A.  J.,  Khusro,  A.,
Zidan, B. R. M., Mitra, S., Emran, T. Bin, Dhama, K., Ripon, M. K. H., Gajdács, M., Sahibzada,  M.  U.  K.,  Hossain,  M.  J.,  &
Koirala, N. (2021). Antibiotic Resistance in Microbes: History, Mechanisms, Therapeutic Strategies and Future Prospects. Journal  of  Infection  and  Public Health, 14 (12), 1750 – 1766. https://doi.org/10.1016/j.jiph.2021.10.020
Viruly, L. 2022. Peptida dari Biota Laut . Edisi ke- 1. Umrah Press: Tanjungpinang.