## ISSN: 0215-7950
*Alamat penulis korespondensi: Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Jalan Kamper, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680. Tel: 0251-8629364, Faks: 0251-8629362, Surel: srihendrastuti@apps.ipb.ac.id
Volume 16, Nomor 4, Juli 2020 Halaman 185–189 DOI: 10.14692/jfi.16.4. 185–189

## KOMUNIKASI SINGKAT

## Metode Kultur Meristem untuk Eliminasi Virus dari Umbi Bawang Merah

## Meristem Culture Method for Virus Elimination from Shallot Bulb
Prabawati Hyunita Putri , Diny Dinarti, Sri Hendrastuti Hidayat*

## Institut Pertanian Bogor, Darmaga, Bogor 16680

## ABSTRAK
Petani bawang merah di Indonesia menggunakan umbi hasil panen sebagai sumber benih untuk musim tanam berikutnya. Hal tersebut dapat menyebabkan akumulasi virus pada umbi meningkat dan menjadi penyebab terjadinya penurunan produktivitas tanaman. Penelitian dilakukan dengan tujuan mengoptimasi metode kultur meristem yang dikombinasikan dengan teknik termoterapi (30 ºC) untuk menghasilkan umbi bawang merah yang bebas virus. Umbi bawang merah cv. Bima Curut yang sudah dikonfirmasi  terinfeksi  Potyvirus  dan  Carlavirus  digunakan  sebagai  bahan  eksplan. Sterilisasi umbi dilakukan secara bertahap menggunakan bakterisida, fungisida, dan sodium hipoklorit. Tunas meristem berukuran 0.6 sampai 0.7 mm diisolasi dari umbi dan ditanam berturut-turut pada medium penginduksi tunas, akar, dan umbi sampai terbentuk umbi mini. Umbi mini selanjutnya ditanam di rumah kasa sampai terbentuk umbi mikro. Hasil deteksi virus dengan metode reverse transcription polymerase chain reaction mengonfirmasi bahwa plantlet pada tahap multiplikasi dan tanaman di rumah kasa bebas dari infestasi Potyvirus dan Carlavirus. Penelitian ini menunjukkan bahwa metode kultur meristem yang dikombinasi dengan termoterapi potensial menghasilkan umbi bawang merah bebas virus.
Kata kunci: Carlavirus, Potyvirus, termoterapi, umbi makro, umbi mini

## ABSTRACT
Shallot farmers in Indonesia have commonly grown bulbs from the previous planting season as seed sources for the next season. This may cause the accumulation of viruses in bulbs which in turn lowering plant productivity. A research was conducted to optimize the meristem culture method combined with thermotherapy (30 ºC) to produce virus-free shallot bulbs. Shallot bulbs of cv. Bima Curut that had been confirmed infected by Potyvirus and Carlavirus were used as explant sources. Bulb sterilization was carried out using bactericides, fungicides, and sodium hypochlorite. Meristem shoots of 0.6 to 0.7 mm in size were isolated from bulbs and plant successively in the shoot, root, and bulb induction medium to form mini bulbs. The mini bulbs were then planted in the screen house for 2 to 2.5 months until micro bulbs were formed. Virus detection by reverse transcription-polymerase chain reaction method confirmed that plantlets at the multiplication stage and plants in the screen house were free of Potyvirus and Carlavirus infestations. This study showed that the meristem culture method combined with thermotherapy is a potential approach for producing virus-free shallot bulbs.
Keywords: Carlavirus, macro bulb, mini bulb, Potyvirus, thermotherapy
Bawang merah ( Allium cepa var. aggreggatum ) merupakan komoditas hortikultura yang penting di Indonesia. Sebagian besar petani bawang merah di Indonesia mengguna- kan umbi sebagai bahan perbanyakan. Hal ini disebabkan produksi biji secara generatif ( true shallot seed /TSS) sulit dilakukan karena hambatan kondisi iklim. Penggunaan umbi sebagai bahan perbanyakan dapat meningkat- kan risiko penularan penyakit, terutama yang disebabkan oleh virus (Saputri et al. 2018). Beberapa spesies virus, Onion yellow dwarf virus (OYDV), Garlic common latent virus (GCLV), dan Shallot latent virus (SLV)  di- laporkan bersifat tular umbi dengan efisiensi yang sangat tinggi (Harti et al. 2018; Wulandari et al . 2015). Metode perbanyakan in vitro menggunakan kultur meristem merupakan metode yang banyak digunakan untuk menghasilkan umbi bebas virus (Al Maarri et al. 2012). Kultur meristem dapat dikombinasikan dengan teknik lain, seperti termoterapi, kemoterapi, elektroterapi, dan krioterapi untuk meningkat- kan keberhasilan memperoleh umbi bebas virus. Teknik termoterapi dan kemoterapi merupakan teknik yang paling banyak diguna- kan untuk mengeliminasi virus dari bahan kultur jaringan (Rout et al. 2006). Upaya mengeliminasi virus dari umbi bawang merah kultivar lokal Indonesia perlu dilakukan dalam rangka penyediaan umbi sehat sebagai bahan perbanyakkan. Putri et al. (2019) berhasil mendapatkan plantlet bawang merah cv. Bima Brebes dan cv. Bima Curut melalui metode kultur meristem yang dikombinasi dengan termoterapi. Sebagai kelanjutan dari penelitian tersebut dilakukan optimasi kombinasi metode kultur meristem dan termoterapi untuk menghasilkan umbi mini yang bebas virus.
Sampel umbi bawang merah cv. Bima Curut diperoleh dari petani di Brebes, Jawa Tengah. Sampel umbi tersebut telah berada 60–70 hari di tempat penyimpanan ketika di- ambil. Sebanyak 100 sampel umbi ditumbuh- kan selama 1 minggu di ruangan dengan suhu dingin (16 o C) sampai muncul daun tunas. Daun tunas dari masing-masing umbi
dikumpulkan dan digunakan sebagai bahan deteksi virus yang dilakukan menggunakan teknik dot blot immunobiding assay (DIBA) (Asniwita et al . 2012). Hasil deteksi dengan DIBA menunjukkan bahwa infeksi OYDV, GCLV, dan SLV pada sampel bawang merah cv. Bima Curut tergolong tinggi, yaitu berkisar antara 96% dan 100%. Sampel umbi tersebut selanjutnya digunakan sebagai bahan eksplan untuk kultur meristem. Umbi bawang merah dicuci bersih dengan air dan lapisan luar umbi dibuang. Umbi dicuci kembali dengan deterjen, kemudian dibilas dengan air. Sterilisasi umbi dilakukan melalui beberapa tahapan, diawali dengan merendam umbi dalam 2 g L -1 fungisida (Mancozeb  80%) dan 2 g L -1 bakterisida (Streptomycon Sulfat 20%) selanjutnya diinkubasi semalam. Umbi kemudian direndam dalam larutan sodium hipoklorit 20% sambil digoyang (150 rpm) selama 20 menit. Tahap selanjutnya dilakukan di bawah laminar air flow , yaitu berturut-turut membilas umbi dengan air steril sebanyak 3 kali, membuang 2 lapisan terluar umbi, me- rendam umbi dalam larutan sodium hipoklorit 10% selama 10 menit, dan membilas kembali umbi dengan air steril sebanyak 3 kali. Persiapan bahan eksplan juga dilakukan di bawah laminar  air  flow , yaitu berturut-turut memotong umbi hingga ukuran 5 mm, potong- an umbi dicelupkan ke dalam larutan sodium hipoklorit 5% selama 5 menit kemudian ditanam sementara dalam medium MS ( Murashige- skoog) untuk menghindari kerusak- an eksplan. Setiap potongan umbi dipotong menjadi ukuran lebih kecil (±0.6–0.7 mm) menggunakan ujung jarum steril di bawah mikroskop binokuler.
Bahan eksplan ditumbuhkan pada medium penginduksi tunas dengan komposisi medium MS yang ditambah dengan 2ip (2 ppm), GA3 (0.3 ppm), sukrosa 0.3%, dan Gelrite 2 g L -1 . Eksplan ditumbuhkan pada kondisi suhu 30 ºC; setiap 3 sampai 4 minggu dilakukan subkultur dan multiplikasi pada medium MS yang ditambah dengan 2ip (4 ppm), NAA (0.4 ppm), sukrosa 0.3%, and Gelrite 2 g L -1 . Plantlet yang bertahan hidup dipindahkan ke medium penginduksi akar dengan komposisi
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Putri et al. medium MS yang mengandung sukrosa 0.3% dan Gelrite 2 g L -1 . Plantlet dengan 2 sampai 3 daun selanjutnya dipindahkan ke medium penginduksi umbi dengan komposisi medium MS yang ditambahkan vitamin B5 dan sukrosa 120 g L -1 . Plantlet ditumbuhkan pada kondisi suhu 30 ºC sampai terbentuk umbi mini, yaitu sekitar 8 sampai 10 minggu.
Tahap aklimatisasi diawali dengan sterilisasi umbi mini, yaitu menyelupkan umbi mini dalam campuran bakterisida (2 g L -1 ) dan fungisida (2 g L -1 ) selama 5 menit, kemudian umbi mini dikeringkan menggunakan kertas steril. Masing-masing umbi mini ditanam pada pot yang berisi medium tumbuh dengan komposisi tanah : arang sekam : kompos (1:1:1). Pot ditempatkan di dalam ruang pertumbuhan (50% cahaya matahari) selama 2–3 minggu, diberikan perawatan, yaitu disiram dengan cairan MS setiap 2 atau 3 hari dan pupuk daun 1 minggu sekali. Umbi mini yang sudah mulai bertunas selanjutnya dipindahkan ke pot baru berisi medium tumbuh dengan komposisi medium yang sama dan diletakkan di rumah kasa. Perawatan tanaman terdiri atas penyiram- an dengan air setiap 4 atau 7 hari (tergantung kondisi cuaca) dan pemupukan secara bertahap, yaitu 10 g NPK tiap tanaman setiap 2 minggu selama 30 hari pertama dan 3 sampai 5 g NPK ditambahkan 5 sampai 7 g KCl tiap tanaman setiap 2 minggu selama 30 hari berikutnya. Tanaman ditumbuhkan sampai terbentuk umbi mikro, yaitu sekitar 2 sampai 2.5 bulan. Indeksasi virus dilakukan melalui deteksi virus menggunakan metode reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) pada tahap multiplikasi plantlet dan pembentukan umbi mikro. Ekstraksi RNA total mengikuti protokol Doyle dan Doyle (1987); sedangkan RT-PCR dilakukan dengan target Potyvirus dan Carlavirus berturut-turut menggunakan primer (U341/Poty1) dan (AlcarF/Poty1)
(Chen et al. 2001; Langeveld et al. 1991). Perlakuan suhu 30 ºC (termoterapi) yang dikombinasikan dengan kultur meristem tidak mengganggu pertumbuhan plantlet . Sebanyak 47 plantlet dari total 47 eksplan yang ditanam berhasil tumbuh. Tahapan sterilisasi yang di lakukan juga tergolong efektif karena tidak
ditemukan kontaminasi pada medium per- tumbuhan plantlet . Sebanyak 24 plantlet digunakan sebagai bahan indeksasi virus dan hasil deteksi menunjukkan bahwa seluruh plantlet bebas virus. Pita DNA virus target, yaitu Potyvirus dan Carlavirus tidak ter- amplifikasi  dari plantlet yang diuji. Plantlet yang sudah terbukti bebas virus dilanjut- kan untuk tahap pembentukan umbi mini, aklimatisasi, sampai pembentukan umbi mikro. Sebanyak 14 plantlet berhasil bertahan sampai pada tahap pembentukan umbi mikro; hasil indeksasi virus menunjukkan bahwa seluruh tanaman asal plantlet tersebut bebas dari infestasi virus target, yaitu Potyvirus dan Carlavirus . Jumlah umbi yang terbentuk dari setiap tanaman bebas virus berkisar antara 1 dan 8 umbi, dengan diameter umbi dan bobot kering umbi berturut-turut berkisar antara 1.3 dan 3.2 cm serta 3.24 dan 7.40 g (Tabel 1 dan Gambar 1).
Metode kultur meristem telah dilaporkan mampu mengeliminasi virus pada berbagai jenis tanaman. Pada tanaman ubi jalar, per- lakuan termoterapi 39 sampai 42 ºC terhadap umbi selama 4 minggu dan dilanjutkan dengan isolasi kultur pucuk meristem ber- ukuran 0.25 mm berhasil mengeliminasi Sweetpotato feathery mottle virus (SFMV), dengan persentase tunas yang tumbuh sebesar 96% (Mervat dan Ashoub 2009). Kombinasi termoterapi dan kultur meristem dalam penelitian ini juga berhasil mendapatkan tanaman bawang merah cv. Bima Curut yang bebas dari infeksi Potyvirus dan Carlavirus . Umbi yang dihasilkan oleh tanaman bawang merah bebas virus yang ditanam pada kondisi terkontrol di rumah kasa tersebut diharapkan juga bebas virus. Keberhasilan eliminasi virus melalui kombinasi metode kultur meristem dan termoterapi dapat dijelaskan dari beberapa aspek. Bagian meristem tanaman dengan ukuran kurang dari 1.0 mm relatif bebas virus karena plasmodesmata yang merupakan jalur perpindahan virus antar sel belum terbentuk pada bagian ini. Perlakuan suhu panas yang diberikan selama pertumbuhan plantlet dapat menyebabkan plasmodesmata menyempit sehingga menghambat distribusi
virus. Termoterapi juga dapat mengaktifkan pertahanan tanaman terhadap virus berupa RNA silencing (Wang et al. 2008). Penggunaan umbi bawang merah bebas virus merupakan salah satu langkah yang efektif untuk mengurangi inokulum awal di lapangan.  Walaupun reinfeksi virus di lapangan dapat terjadi, namun perkembangan penyakit dapat diperlambat.  Metode kultur meristem, dengan ukuran eksplan <1 mm yang
dikombinasi dengan teknik termoterapi (suhu 30 ºC) merupakan metode yang potensial untuk menghasilkan umbi bawang merah bebas virus.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Australian Centre for International Agricultural Research yang mendanai penelitian ini melalui
Tabel 1  Tinggi tanaman bawang merah yang ditanam di rumah kasa dan jumlah, diameter serta bobot kering umbi yang dihasilkan
Kode tanaman Tinggi tanaman (cm) Jumlah umbi Diameter umbi (cm) Bobot kering umbi (g) 6.5 21.3 1 1.3 3.24 5.7 46.5 5 2.5 7.40 5.8 (1) 41.2 2 3.2 5.84 5.8 (2) 46.1 2 3.0 4.30 4.7 (1) 42.3 8 3.1 5.62 4.7 (2) 40.1 7 3.0 4.89 4.7 (3) 39.8 3 2.8 5.00 6.3 (1) 45.7 4 3.0 6.10 6.3 (2) 46.3 2 2.8 6.35 4.2 51.2 4 3.1 7.35
Gambar 1  Umbi mikro bawang merah yang dihasilkan oleh tanaman bebas virus yang ditanam di rumah kasa. Umbi kering (atas); umbi basah (bawah).
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Putri et al. kerjasama penelitian (HORT 2009/056 Project) “Sustainable productivity improvements in alliums and solanaceous vegetable crops in Indonesia and sub-tropical Australia”.

## DAFTAR PUSTAKA
Al Maarri K, Massa R, Albinski F. 2012. Evaluation of some therapies and meristem culture to eliminate Potato Y Potyvirus from infected potato plants. Plant Biotechnol. 29(3):237–243. DOI: https://doi.org/10. 5511/plantbiotechnology.12.0215a.
Asniwita, Hidayat SH, Suastika G, Sujiprihati S,
Susanto S, Hayati I. 2012. Eksplorasi isolat lemah Chili veinal mottle potyvirus pada pertanaman cabai di Jambi, Sumatera Barat, dan Jawa Barat. J Hort . 22(2): 181–186. DOI: https://doi.org/10.21082/ jhort.v22n2.2012.p181-186.
Chen JJ, Chen, Adam MJ. 2001. Molecular characterization of a complex mixture of viruses in garlic with mosaic symptoms in China. Arch Virol. 146:1841–1853. DOI: https://doi.org/10.1007/s007050170037. Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull . 19:11–15. Harti H, Sobir, Wiyono S, Hidayat SH.  2018. Perlakuan air panas pada umbi bawang merah ( Allium cepa var. ascalonicum ) untuk menekan infeksi virus di lapangan J Hort Indones. 9(3):149–157. DOI: http:// dx.doi.org/10.29244/jhi.9.3.149-157.
Langeveld SA, Dore JM, Memelink J, Derks AFLM, van der Vlught CIM, Asjes CJ, Bol JF. 1991. Identification of potyviruses using the polymerase reaction with degenerate
primers. J Gen Virol. 72(7):1531–1541. DOI:  https://doi.org/10.1099/0022-1317- 72-7-1531.
Mervat MME, Ashoub A. 2009. Utility of thermotherapy and meristem tip for freeing sweetpotato from viral infection. Aust J Basic Appl Sci. 3(1):153–159.
Putri PH, Hidayat SH, Dinarti D. 2019. Elimination of Potyvirus and Carlavirus from infected shallot bulbs. J Appl Hort. 21(1):42–46. DOI: https://doi.org/10. 37855/jah.2019.v21i01.07.
Rout GR, Mohanpatra A, Jain MS. 2006. Tissue culture of ornamental pot plant: A critical review on present scenario and future prospect. Biotechnol Adv. 24(6):531–560. DOI:  https://doi.org/10.1016/j.biotechadv. 2006.05.001.
Saputri AS, Tondok EF, Hidayat SH.  2018. Insidensi virus dan cendawan pada biji dan umbi bawang merah. J Fitopatol Indones. 14(6):222–228. DOI: https://doi. org/10.14692/jfi.14.6.222 . Wang Q, Cuellar WJ, Rajamäki M, Hirata Y, Valkonen JPT. 2008. Combined thermotherapy and cryotherapy for efficient virus eradication: relation of virus distribution, subcellular changes, cell survival and viral RNA degradation in shoot tips. Mol Plant Pathol. 9(2):237–250. DOI:  https://doi.org/10.1111/j.1364-3703. 2007.00456.x.
Wulandari AW, Hidayat SH, Sobir. 2015. Deteksi virus pada bawang merah ( Allium cepa var. ascalonicum ) dengan metode dot immuno binding assay .  J Hort. 25(4): 350–356. DOI: https://doi.org/10.21082/ jhort.v25n4.2015.p350-356.