## KADAR MDA SPERMATOZOA SETELAH PROSES PEMBEKUAN
Khairatul Insani 1) , Sri Rahayu 2) , Agung Pramana 3) , Aries Soewondo 4) .
1),2),3),4) Laboratorium Biomolekuler dan Seluler, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang 65145, Jawa Timur, Indonesia.
E-mail: 1) Khairatul.if@gmail.com , 2) srahayu@ub.ac.id , 3) junstone21@yahoo.com , 4) soewondo@ub.ac.id

## ABSTRAK
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  efek  lama  pembekuan  semen  terhadap  kadar  MDA spermatozoa  dan  persentase  viabilitas  spermatozoa.  Sampel  yang  digunakan  berupa    semen  beku  sapi Limousin  dengan  lama  pembekuan  2  bulan  dan  3  bulan  yang  dikoleksi  dari  BBIB  Singosari.  Semen  beku yang  telah  di  thawing  diencerkan  dengan  Phosphate  Buffer  Saline  (PBS)  kemudian  disentrifugasi  untuk memisahkan  spermatozoa  dan  seminal  plasma.  Kadar  MDA  spermatozoa  diukur  dengan  menggunakan  uji TBA dan spektrofotometer. Pengamatan viabilitas spermatozoa dilakukan dengan menggunakan pewarnaan eosin-negrosin.  Data  berupa  kadar  MDA  spermatozoa  dan  persentase  viabilitas  dianalisis  dengan  uji-t berpasangan  dan  korelasi  pearson  menggunakan  spss 16.0.  Hasil  analisis  menunjukkan  bahwa  kadar MDA spermatozoa pada lama pembekuan 2 bulan (0,0777±0,008 nM) dan 3 bulan (0,0919±0,016 nM) tidak berbeda nyata (p<0,05). Terdapat korelasi negatif antara persentase viabilitas dan kadar MDA pada spermatozoa.

## Kata kunci: MDA, semen beku, spermatozoa

## ABSTRACT
The aim of this research was  to determine the effect of long-term freezing on MDA levels of spermatozoa and spermatozoa  viability.  Frozen  semen  of  cattle  limousine  that  had  been  stored  for  2  and  3  months  were collected  from  BBIB  Singosari  used  in  this  study.  The  frozen-thawed  semen  was  diluted  with  Phosphate Buffer Saline (PBS) and then centrifuged to separate the spermatozoa and seminal plasma. The MDA levels of spermatozoa  were  measured  by  TBARS  Assay  and  spectrophotometer.  Spermatozoa  viability  was  assessed using  Eosin-Negrosin  staining.  The  data  such  as  MDA’s  level  and  viability  percentage  were  analyzed  using paired t-test and Pearson correlation employing SPSS 16.0 for Windows. The result showed that MDA levels of spermatozoa for 2 months storage (0.0777 ± 0.008 nM) and 3 months storage (0.0919 ± 0.016 nM) were not significant  differences  (p<0.05).  There  is  negative  correlation  between  the  percentage  of  viability  andMDA levels of spermatozoa.

## Keywords: MDA, frozen semen, spermatozoa

## PENDAHULUAN
Berbagai  metode  bioteknologi  reproduksi telah  digunakan  dalam  meningkatkan  kuantitas hewan  ternak,  salah  satunya  adalah    inseminasi buatan  [1].  Inseminasi  Buatan  (IB)  merupakan salah  satu  usaha  penerapan  teknologi  tepat  guna dan  menjadi  pilihan  utama  untuk  meningkatkan populasi  serta  mutu  genetik  ternak.  Guna peningkatan  populasi  ternak  tersebut  maka  yang dapat  dilakukan  adalah  dengan  memanfaatkan teknologi reproduksi peternakan melalui teknik IB dengan menggunakan semen beku [2].
Semen  beku  adalah  semen  yang  diencerkan kemudian  dibekukan  dan  disimpan  didalam nitrogen  cair  pada  suhu  -1960C[3].  Semen  beku memiliki  kelebihan  diantaranya  dapat  disimpan
dalam waktu tidak terbatas, semen dapat dikoleksi setiap  saat  dan  dapat  digunakan  sewaktu dibutuhkan [4]. Namun pembekuan dapat mengakibatkan  menurunnya  viabilitas,  fungsi mitokondria dan motilitas sperma [5].
Pembekuan sel dapat menyebabkan terbentuknya  kristal-kristal  es  dan  penumpukan elektrolit  serta  bahan  terlarut  lainnya  di  dalam larutan  atau  di  dalam  sel.  Kristal  es  intraseluler dapat merusak sperma secara mekanik. Konsentrasi  elektrolit  yang  berlebihan  akan melarutkan  selubung  lipoprotein  membran  sel sperma  sehingga  permeabilitas  membran  sel sperma akan mengalami perubahan dan menyebabkan  kematian  sel  [6].  Spermatozoa manusia akan mengalami penurunan motilitas dari 40,  2%  sebelum  pembekuan  menjadi  24,8%
setelah pembekuan [5]. Spermatozoa manusia juga mengalami penurunan viabilitas dari 80% sebelum dibekukan  menjadi  50%  setelah  pembekuan  [7]. Penelitian sebelumnya membuktikan bahwa penurunan  motilitas  sperma  beku  setelah  thawing berhubungan  dengan  destabilisasi  membran  yang mengakibatkan peningkatan permeabilitas terhadap ion-ion  [8]  dan  produksi  ROS  [9].  Produksi  ROS pada  sperma  adalah  sebagai  hasil  proses  fisiologi normal  untuk  reaksi  akrosom  dan  kapasitasi sperma  [10].  Namun  produksi  ROS  berlebih  pada sperma akan menjadi bahaya diakibatkan oleh efek merugikan pada jumlah sperma fungsional [11].
Membran  spermatozoa  mamalia  rentan teroksidasi oleh keberadaan ROS dikarenakan kaya akan  asam  lemak  tak  jenuh  [12].  Reaksi  rantai peroksidasi  lipid  ini  berlangsung  terus  menerus (autokatalitik)  karena  setiap  reaksi  menghasilkan radikal  bebas  baru  yang  mengakibatkan  reaksi peroksidasi  lipida  baru  hingga  akhirnya  merusak seluruh  membran  plasma  sel  spermatozoa  [13]. Peroksidasi    lipid  dapat  menyebabkan  terjadinya perubahan  fungsi  membran  yang  berakibat terhadap penurunan metabolisme sperma, morfologi  sperma,  motilitas  sperma  dan  fertilitas [14].
Malondiladehid (MDA) adalah suatu senyawa  aldehid  hasil  dari  peroksidasi  lipid  yang bersifat  toksik  terhadap  sel.  Senyawa  MDA menyebabkan  kerusakan  membran  spermatozoa dan  penurunan  integritas  membran  spermatozoa sehingga  terjadi  penurunan  kualitas  sperma  [15]. Hasil  penelitian  Chen  et  al.  (16)  menunjukkan bahwa  lama  penyimpanan  semen  dalam  kondisi beku berpengaruh terhadap kadar MDA. Penyimpanan selama 73 bulan menunjukkan kadar MDA  lebih  tinggi  (  3.22    ±0.05nmol/  mgprot) dibandingkan penyimpanan 26 bulan (2.48 ± 0.19) dan 13 bulan (2.06 ± 0.16).

## METODE PENELITIAN

## Sampel Penelitian
Sampel  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah  5  semen  yang  dibekukan  selama  2  bulan dan  5  semen  yang  dibekukan  selama  3  bulan  sapi Limousin  yang  dikoleksi  dari  Balai  Besar Inseminasi Buatan (BBIB) Singosari, Malang.
Evaluasi Viabilitas Spermatozoa Setelah Pmebekuan Viabilitas  sperma  pada  penelitian  ini diketahui dengan menggunakan metode berdasarkan  [17]  Partodiharjo  (1992).  Satu  tetes semen diteteskan pada gelas objek dan ditambahkan  satu  tetes  larutan  eosin  negrosin. Dilakukan smear dan ditutup dengan kaca penutup untuk  kemudian  diamati  dengan  menggunakan mikroskop  perbesaran 400x.  Diamati  kurang  lebih 200  spermatozoa  dan  dihitung  spermatozoa  yang hidup  (tidak  menyerap  warna)  dan  spermatozoa yang  mati  (menyerap  warna)  kemudian  dihitung persentasenya.

## Analisis Kadar MDA
Preparasi untuk Memisahkan antara

## Spermatozoa dan Seminal Plasma
Semen  beku  yang  akan  dipreparasi  terlebih dahulu    di  thawing    yaitu    dengan    cara dimasukkan  ke  dalam  water  bath  yang  berisi  air bersuhu  37-380C  selama  15  detik.  Digunting kemasan  semen  beku    pada    ujung    dan    juga sedikit    pada    bagian    tengahnya,    kemudian diteteskan  pada  tube[18].  Untuk  memisahkan antara  seminal  plasma  dengan  spermatozoa  pada semen  beku  dilakukan  dengan  cara  sentrifugasi pada  1800  x  g  selama  10  menit  dan  diresuspensi dalam 2 ml phosphat buffered saline (PBS pH 7,2) [19].

## Pembuatan Kurva Standar MDA
Pembuatan  kurva  standar  MDA  yaitu dengan  100ul  kit  MDA  dengan  konsentrasi 0,1,2,3,4,5,6,7,8  mg/ml  kemudian  ditambahkan 550 ml akuades dan 100ul asam trikloroasetat 20% dan  dilakukan  homogenasi  selama  30  detik. Kemudian  ditambahkan  dengan  250ul  HCL  1N, dihomogenkan, ditambah 100ul natrium thiobarbiturat 1%, dihomogenkan kemudian disentrifugasi  pada  kecepatan  500  rpm  selama  10 menit.  Supernatan  diambil  diinkubasi  pada penangas  air  1000C  selama  30  menit,  dibiarkan pada  suhu  ruang.  Sampel  yang  berubah  warna diamati  dengan  menggunakan  spektrofotometer
pada  panjang  gelombang  533  nm.  Diperoleh  nilai absorbansi standar dan kurva standar MDA [20].

## Penghitungan Kadar MDA Spermatozoa
Kadar  MDA  spermatozoa  diketahui  dengan cara  uji  TBA  menurut  Serafini-Cessi  dan  Cessi (1968)  yang  telah  dimodifikasi  oleh  Morte  et  al. [21]. Masing-masing tube hasil preparasi (spermatozoa)  sebanyak  450µl  ditambahkan  2ml reagen  TTH  (18,8  ml  TCA  40%  dingin,  28,7  ml TBA 1%, 0,25N HCl). Campuran spermatozoa dan reagen  TTH  dipanaskan  dalam  penangas  air bersuhu  100oC  selama  10  menit.  Setelah  dingin, disentrifugasi  pada  1500x  g  selama  10  menit. Sampel  yang  telah  berubah  warna  selanjutnya diamati  dengan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang 532 nm.

## Analisa Statistik
Data berupa kadar MDA dan viabilitas diuji statistika  dengan  menggunakan  uji-t  berpasangan dengan  taraf  nyata  5%  dan  korelasi  pearson menggunakan program SPSS 16.0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pengaruh Lama Pembekuan pada Viabilitas Spermatozoa
Pengukuran  kadar  MDA  spermatozoa  pada semen  dengan  pembekuan  2  bulan  dan  3  bulan ditunjukkan pada tabel 1. Kadar MDA spermatozoa pada semen yang dibekukan selama 2 bulan adalah 0,0777±0,008 nM dan 3 bulan adalah 0,0919±0,016  nM.  Berdasarkan  hasil yang didapatkan,  kadar  MDA  spermatozoa  yang dibekukan  selama  2  bulan  berbeda  dengan  yang dibekukan  selama  3  bulan,  namun  hasil  analisis statistika  menunjukkan  perbedaan  yang  tidak signifikan(p<0,05).  Hasil  berbeda  ditemukan  pada hasil  penelitian  sebelumnya  [22]  bahwa  pada pembekuan 0 jam kadar MDA spermatozoa adalah 99,83±2,69  (nM/10 9 )  dan  kadar  MDA  seminal plasma  191.98±11.58  nM  yang  meningkat  tajam setelah 96 jam pembekuan. Hal ini menunjukkanbahwa lama pembekuan akan berpengaruh terhadap kadar MDA.
Tabel 1. Kadar MDA Spermatozoa
Lama pembekuan Kadar  MDA Spermatozoa Viabilitas spermatozoa (nM) (%) 2 Bulan 0,0777±0,008  64±1,29 3 Bulan 0,0919±0,016  45,0±1,40
Penelitian  sebelumnya  oleh  Partyka  et  al. [23]  berpendapat  bahwa  kadar  MDA  spermatozoa pada  semen  segar  ayam  hutan  adalah  0.28±0.11 nmol/50  x  10 6 spermatozoa  dan  pada  semen  beku (24  jam)  0.33±0.11  nmol/50  x  10 6 spermatozoa. Waktu penyimpanan sperma berpengaruh signifikan  pada  kualitas  sperma  setelah  thawing [16].  Tingginya  kadar  MDA  spermatozoa  dan seminal  plasma  setelah  pembekuan  diakibatkan oleh  aktivitas  ROS  yang  menyerang  lipid  pada membran  spermatozoa  pasca  thawing.  Adanya cold  shock  akan  menyebabkan  kerusakan  struktur dan  fungsi  sel.  Membran  akan  kehilangan permeabilitasnya sehingga menye-babkan terlepasnya  banyak  komponen  seluler  diantaranya lipid,  protein  dan  ion  [24].  Hal  ini  menyebabkan spermatozoa  rentan  terhadap  serangan  oksidatif dikarenakan  besarnya  jumlah  asam  lemak  tak jenuh  pada  membrannya  [25].  Selain  itu  seminal plasma  sebagai  sumber  utama  antioksidan  untuk mekanisme pertahanan telah terpapar pada kondisi aerobik  selama  proses  sebelum  pembekuan. Sperma  akan  memiliki  sedikit  antioksidan  untuk menjaga dari aktivitas ROS yang tidak menguntungkan. Sehingga
mengakibatkan
terjadinyastress oksidatif dan mengawali adanyaperoksidasi  lipid  yang  hasilnya  dapat diketahui  melalui  terbentuknya  MDA  [26]. Peroksidasi lipid (pembentukan MDA) berkorelasi positif  dengan  abnormalitas  sel  yang  dapat  dilihat dari morfologi dan motilitasnya [27].

## Hubungan Antara Viabilitas dan Kadar MDA
Persentase  viabilitas  spermatozoa  dapat dilihat dari jumlah spermatozoa hidup dibandingkan  dengan  spermatozoa  yang  mati  dari 200  spermatozoa.  spermatozoa  hidup  memiliki kepala spermatozoa yang berwarna putih sedangkan  spermatozoa  mati  diketahui  dengan melihat kepala spermatozoa berwarna ungu setelah diwarnai  dengan  eosin-negrosin  (Gambar  1).  Hal ini  disebabkan  oleh  membran  kepala  spermatozoa yang  telah  mati  mengalami  kerusakan  sehingga permeabel terhadap pewarna eosin-negrosin [28].

## Gambar 1.   Spermatozoa  dengan  Pewarnaan
Eosin-Negrosin, Perbesaran 400x

## Keterangan:  (A) Spermatozoa hidup (B) Spermatozoa mati
Viabilitas  sperma  semen  beku  dengan  lama pembekuan  2  bulan  dan  3  bulan  setelah  thawing ditunjukkan pada tabel 1. Dari tabel 1 dapat terlihat bahwa  viabilitas  spermatozoa  semen  beku  dengan lama  pembekuan  2  bulan  dan  3  bulan  tidak signifikan,  yakni  64±1,29  nM  pada  semen  beku  2 bulan  dan  pada  semen  beku  3  bulan  sebesar 45,0±1,40 nM. Hasil analisis dengan menggunakan SPSS  16.0  menunjukkan  bahwa  terdapat  korelasi negatif antara  viabilitas  dan  kadar MDA spermatozoa.  Semakin  tinggi  viabilitas,  semakin rendah  kadar  MDA  spermatozoa.  Hal  ini  sesuai dengan  hasil  penelitian  Guthrie  dan  Welch  [29] yang membuktikan bahwa terdapat korelasi negatif antara  viabilitas  sperma  dan  kadar  MDA  semen babi.
Hasil penelitian sebelumnya oleh Martorana  dan  Kelly  [30]  membuktikan  bahwa semakin  besar  motilitas  dan  viabilitas  sperma menunjukkan semakin kecil peroksidasi lipid yang terjadi. Hal tersebut mengindikasikan ketidaksesuaian  dengan  data  yang  terdapat  pada tabel  1.  Viabilitas  spermatozoa  pada  semen  yang dibekukan  selama  2  bulan  dan  semen  yang dibekukan  selama  3  bulan  menunjukkan  tidak adanya  perbedaan  secara  signifikan.  O'Connell  et al. [5] membuktikan bahwa proses pembekuan dan thawing pada sperma manusia dapat menyebabkan menurunnya  morfologi  sperma,  motilitas  dan viabilitas.
Pembekuan semen menyebabkan kerusakan ultrastruktural, biokemikal dan
fungsional  pada  spermatozoa  [31].  Berbagai organel  sperma  diketahui  rentan  terhadap  efek pembekuan  diantaranya  terjadinya  perubahan fungsi mitokondria, kegagalan dekondensasi kromatin  dan  induksi  reaksi  akrosomal  dini  oleh karena  perubahan  permeabilitas  membran  plasma, sehingga  dapat  berpengaruh  pada  viabilitas  dan fertilitas sel sperma [32]. Terjadinya kerusakan ini oleh  karena  terbentuknya  kristal  es  ekstraseluler dari  air  dalam  medium  pembekuan  semen. Pembentukan  kristal  es  ekstraseluler  ini  dapat meningkatkan  konsentrasi  terlarut  diantaranya gula,  garam  dan  protein.  Terjadinya  tekanan gradien  osmotik  ini  menyebabkan  air  dalam spermatozoa  akan  dikeluarkan  dari  bagian  kepala melewati plasma membran semi-permeabel disebabkan  air  dalam  spermatozoa  lebih  lambat membentuk  kristal  es  daripada  air  dalam  medium sehingga  mengakibatkan  spermatozoa  menjadi dehidrasi [33].
Plasma  membran  spermatozoa  rentan terhadap  peroksidasi  lipid  oleh  aktivitas  ROS. Proses  peroksidasi  lipid  ini  terjadi  pemecahan asam  lemak  tak  jenuh  (PUFA)  sebagai  penyusun terbesar  membran  plasma  yang  mengelilingi  sel dan  organel  sel.  PUFA  terutama  terletak  dalam fosfolipid  membran  plasma  spermatozoa  dan rentan  terhadap  serangan  ROS  [34].  Untuk menanggulangi efek kerusakan dari ROS, berbagai macam  antioksidan  telah  tersedia  dalam  seminal plasma dan spermatozoa [35].

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan  bahwa  pembekuan  semen  selama  2 bulan  dan  3  bulan  menunjukkan  tidak  adanya perbedaan kadar MDA secara signifikan. Terdapat korelasi  negatif  antara  viabilitas  dan  kadar  MDA spermatozoa. Semakin kecil viabilitas spermatozoa, semakin besar kadar MDAnya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  pihak  Balai  Besar Inseminasi  Buatan  (BBIB)  Singosari  yang  telah memberikan izin melakukan koleksi semen.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] ISAA. 2013. Pocket K No. 40: Biotechnology for the Livestock Industry .http://www.isaaa.org/resources/publications
/pocketk/40/default.asp. Diakses pada tanggal 24 Desember 2013.
[2] Said, S., Gunawan M., Kaiin E.M. dan Tappa B. 2005. Daya Tahan Sperma Cair Sapi Simental yang Disimpan dalam Straw pada Temperatur 5°C. Pusat Penelitian Bioteknologi. LIPI. Buletin Peternakan. 16:58-73.
[3] BSN. 2014. Semen beku - Bagian 2: Kerbau. http://sisni.bsn.go.id/index.php?/sni_main/sn i/detail_sni/7785. Diakses pada tanggal 20 Agustus 2014.
[4] Supriatna, I., dan F. Pasaribu. 1992. In vitrofertilization, transfer embrio dan pembekuan embrio. PAU-IPB, Bogor.
[5] O'Connell, M., N. McClure and S.E. Lewis. 2002. The Effects of Cryopreservation on Sperm Morphology, Motility and Mitochondrial Function. Hum.Reprod. 17(3): 704-709.
[6] Toelihere. M. R.1993. Inseminasi Buatan Pada Ternak. Penerbit Angkasa. Bandung.
[7] Boitrelle F., Martine A., Claire T., Fatma F., Marianne B., Franc, Ois V., Robert W., Marc B. and Jacqueline S. 2012.
Cryopreservation of Human Spermatozoa Decreases the Number of Motile Normal Spermatozoa, Induces Nuclear Vacuolization and Chromatin Decondensation. Journal of Andrology, Vol. 33 (6): 1371-1378.
[8] Hafez, E.S.E. 2004. X-and Y-Chromosome- Bearing Spermatozoa. In Reproduction in Farm Animal. 8th ed. Lea and Febiger Philadelphia. USA.
[9] Awda, Basim J, Meghan Mackenzie-Bell and Marry M. Buhr. 2009. Reactive Oxygen Species and Boar Sper Function. Journal Biolreprod. 81:553 – 561.
[10] Herrero, M.B., de Lamirande E. and Gagnon C. 1999. Nitric Oxide Regulates Human Sperm Capacitation and Protein-Tyrosine Phosphorylation in Vitro. Biology of Reproduction 61. 575–581.
[11] Rath, D., Bathgate R., Rodriguez-Martinez H., Roca J., Strzezek J. and Waberski D. 2009. Recent Advances in Boar Semen Cryopreservation.Society of Reproduction and Fertility Supplement. 66:51–66.
[12] Aitken, R.J., Buckingham D.W., Carreras A. and Irvine  D.S. 1996. Superoxide dismutase in human sperm suspensions: relationships with cellular composition, oxidative stress and sperm function. Free Radical
Biologyand Medicine. 21:495–504
[13] Holt, W.V. 2000. Basic Aspects of Frozen Storage of Semen. Animal Reproduction Science, v.62. p.3-22.
http://www.ejpau.media.pl/volume10/issue2 /art-08.html. Diakses pada tanggal 16 Juli 2014.
[14] Cummins, J.M., Jequier A.M. and Kan R. 1994. Molecular Biology of Human Male Infertility: Links with Aging, Mitochondrial Genetics and Oxidative Stress. Mol Reprod Dev. 37:345-62.
[15] Sanocka D. and kurpisz M. 2004. Reactive oxygen species and sperm cells. Reprod Biol Endocrinol  2 : 12-19.
[16] Chen Y.K., Qing Hua Liu, Jun Li, Zhi Zhong Xiao, Shi Hong Xu, Xue Hui Shi and Dao Yuan Ma. 2010. Effect of long-term cryopreservation on physiological characteristics, antioxidant activities and lipid peroxidation of red seabream (Pagrus major) sperm. Cryobiology. 61:189-193.
[17] Partodihardjo, S. 1992. Ilmu Reproduksi Hewan. Ed. Ke-3. Mutiara Sumber Widya. Jakarta.
[18] Rosida A., Husni A., Sri H. dan Pudji S. 2013. Kualitas Semen Beku Kambing Peranakan Etawa dalam Berbagai Macam Pengencer. Veterinary Medica. vol 6(1): 69-74.
[19] Mossa M.M., Dkhel Haussin H. and Azzawi M.H. 2011. The effect of oxidative stress on semen parameters of normal & infertile men in Tikrit city. Tikrit Medical Journal.
17(1):1-10.
[20] Alvarez, J.G. and Storey B.T. 1995. Differential Incorporation of Fatty Acids In to and Peroxidative Loss of Fatty Acids from Phospholipids of Human Spermatozoa Mol. Reprod. Dev. 42:334-345.
[21]  Morte, M.I., Ana M.R., Diana S., Ana S.R., Sandra G. and Joao R.S. 2008. The Quantification of Lipid and Protein Oxidation in Stallion Spermatozoa and
Seminal Plasma: Seasonal Distinctions and Correlations With DNA Strand Break. Animal Reproduction Science. 106 :36–47.
[22] Kumaresan, A., G. Kadirvel, K.M. Bujarbaruah, R.K. Bardoloi, Anubrata Das,
Satish Kumar and S. Naskar. 2008. Preservation of boar semen at 18 ◦ C induces lipid peroxidation and apoptosis like changes in spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. doi:10.1016/j.anireprosci.2008.01.006.
Diakses pada tanggal 8 Mei 2014.
[23] Partyka, Agnieszka, Ewa Łukaszewiczb, and Wojciech Niza˙ nski. 2012. Lipid Peroxidation and Antioxidant Enzymes Activity in Avian Semen. Animal
Reproduction Sci.
http://dx.doi.org/10.1016/j.anireprosci.2012. 07.007. Diakses pada tanggal 8 Mei 2014.
[24] Amann, R.P. 1999. Cryopreservation of sperm. Encyclopedia Reprod. 1(7):73–83.
[25] Maldjian, A., Pizzi F, Gliozzi T, Cerolini S. and Penny P. 2005. Changes in sperm quality and lipid composition during cryopreservation of boar semen.
Theriogenology. 63(2): 411–421.
[26] Foote, R.H., Brockett, C.C. and Kaproth, M.T. 2002. Motility and fertility of bull sperm in whole milk extender containing antioxidants. Anim Reprod Sci. 71(1-2):13- 23.
[27] Gomez, E., Irvine, D.S. and Aitken, R.J. 1998. Evaluation of a spectrophotometric assay for the measurement of malondialdehyde and 4- hydroxyalkenals in human spermatozoa: relationships with semen quality and sperm function. Int. J. Andro. 21:81–94.
[28] Garner, D.L. & E.S.E Hafez. 2000. Spermatozoa and Seminal Plasma. In: Reproduction in Farm animals. 7th Ed. Hafes E.S.E & B Hafez (Eds). Williams &
Wilkins: Baltomore.
[29] Guthrie, H.D. and Welch, G.R. 2012. Effects of reactive oxygen species action on sperm function in spermatozoa. Theriogenology. 78(8):1700-1708.
[30] Martorana and Kelly, M.S. 2014. Oxidative Studies in Cryopreserved Mammalian Spermatozoa. Dissertation and Thesis. http://gradworks.umi.com/15/53/1553358.ht ml. Diakses pada tanggal 19 Juli 2014.
[31] Leboeuf, B., Restall, B. and Salamon, S. 2000. Production and storage of goat semen for artificial insemination. Anim. Reprod.
Sci. 6 :113-141.
[32] Watson P.F. 2000. The causes of reduced fertility with cryopreservation semen. Animal Reproduction Science 60–61:481– 492.
[33] Andrabi S.M.H. 2007. Fundamental principles of cryopreservation of Bos taurus and Bos indicus bull spermatozoa. Mini review. Int. J. Agri. and Biol. 9:367-369
[34] Drevet J.R. 2006. The antioxidant glutathione peroxidase family and spermatozoa: a complex story. Mol Cell Endocrino. 250: 70–79.
[35] Lewis, S. E., Sterling, E. S., Young, I. S. and Thompson, W. 1997. Comparison of individual antioxidants of sperm and seminal plasma in fertile and infertile men.
Fertility and Sterility. 67:142–147