Jurnal Pharmascience, Vol. 06 , No.02, Oktober 2019, hal: 48 - 54 ISSN-Print. 2355 – 5386 ISSN-Online. 2460-9560 https://ppjp.ulm.ac.id/journal/index.php/pharmascience

## Research Article

## Pengujian Toksisitas Seluler SNEDDS Ekstrak
Daun Kangkung ( Ipomoea reptans , Poir) Terstandar
Lutfi Chabib 1,2 *, Farida Hayati 1,2 , Rizki Awaluddin 3 , Muh Iqbal Pangestu 2
1 Prodi Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta
2 Prodi Profesi Apoteker, Fakultas MIPA, Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta 3 Program Ilmu Biomedik, Fakultas Kedokteran Kesehatan Masyarakat dan Keperawatan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
* Email: lutfi.chabib@uii.ac.id

## ABSTRAK
Kangkung  darat  ( Ipomea reptans Poir)  adalah  salah  satu  tanaman  di  Indonesia yang  secara  empiris  telah  dimanfaatkan  oleh  masyarakat  sebagai  obat  untuk  terapi Diabetes  Melitus  (DM).    Riset  sebelumnya  telah  dilakukan  untuk  memperoleh  data ilmiah  dari  pemanfaatan  kangkung  darat  sebagai  terapi  DM,  dan  pengembangannya dalam  bentuk  sediaan Self  Nano  Emulsifying  Drug  Delivery  System (SNEDDS). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui sitotoksisitas sediaan SNEDDS ekstrak daun kangkung  terstandar  dengan  menggunakan  metode  MTT  (Methyl-Thiazolyl- Tetrazolium).  Pengujian  MTT  dilakukan  dengan  cara well  plate diplotkan  terlebih dahulu untuk sampel uji 70 sumuran ( well) , kontrol sel 6 sumuran, dan kontrol media 6 sumuran.    Terakhir  tiap  sumuran  ditambahkan stopper SDS  sebanyak  100µl.  Plate dibungkus alumunium  foil dan  diinkubasi  semalaman  pada  suhu  ruang.  Hari berikutnya  dilakukan  pembacaan  absorbansi  sampel,  kontrol  media,  dan  kontrol  sel menggunakan ELISA reader. Uji sitotoksik SNEEDS kangkung pada sel vero diperoleh hasil  bahwa  SNEEDS  kangkung  tidak  menyebabkan  kematian  pada  sel  uji.  Pada pengujian  sel  dilakukan  pemaparan  sampel excipient dari  SNEEDS  kangkung  sebagai pembanding,  dengan  hasil  menyebabkan  kematian  <50%  sel  uji  pada  dua  kadar tertinggi  dari  sampel excipient .  Namun  pada  hasil  uji  SNEEDS  kangkung  diperoleh data  bahwa  toksisitas excipient pada  kadar  tersebut  tidak  mempengaruhi  timbulnya toksisitas pada sampel SNEEDS kangkung. Sehingga berdasarkan uji in vitro, SNEEDS kangkung tidak toksik terhadap sel vero.
Kata kunci: Ipomoea reptans, sitotoksisitas, SNEDDS

## ABSTRACT
Kangkong ( Ipomea reptans Poir) is a type of Indonesian plant empirically utilized by many people to treat diabetes mellitus (DM). A study has been conducted to obtain scientific  data  from  the  use  of  kangkong  for  DM  treatment  as  well  as  to  develop
kangkong  in  SNEDDS  preparation.  This  current  study  aimed  to  examine  the cytotoxicity of kangkong leaf standardized extract in SNEDDS preparation through the MTT  (Methyl-Thiazolyl-Tetrazolium)  method.  MTT  assay  was  performed  by  initially plotting well plates for test sample (70 wells), control cell (6 wells), and control medium (6 wells). As much as 100µl SDS stopper was added into each well, and then plates were wrapped  in  aluminum  foil  and  incubated  all  night  at  ambient  temperature.  On  the following  day,  the  absorbance  of  test  sample,  control  medium,  and  control  cell  was identified using ELISA reader. The cytotoxicity test of kangkong SNEDDS on Vero cell lines  showed  that  kangkong  SNEDDS  did  not  cause  cell  death.  The  cell  was  tested through  exposure  of  excipient  sample  from  kangkong  SNEDDS  as  a  comparison, resulting  in  <50%  cell  death  by  the  two  highest  concentrations  of  excipient  sample. However, the test result of kangkong SNEDDS indicated that excipient toxicity at such concentrations  did  not  affect  kangkong  SNEDDS.  Therefore,  based  on in  vitro test, kangkong SNEDDS is not toxic against Vero cell lines.

## Keywords: Ipomoea reptans, cytotoxicity, SNEDDS

## I. PENDAHULUAN
Obat  tradisional  merupakan  alternatif pengobatan  hiperglikemia  yang  dipilih oleh masyarakat. Data WHO menyebutkan bahwa  80%  populasi  di  Afrika  dan  Asia pada  tataran  pelayanan  kesehatan  primer masih  bergantung  pada  penggunaan  obat tradisonal  (Sahoo et  al .,  2010).  Penelitian sebelumnya  telah  berhasil  menentukan tahapan  standarisasi  dari  proses  tanam sampai  pembuatan  ekstrak  sehingga  dapat diperoleh ekstrak  yang berkualitas (Hayati et all. , 2014 a , 2015 a ).
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang telah  dilakukan,  maka  kangkung  memiliki potensi  untuk  dikembangkan  sebagai  obat alternative  untuk  mengatasi  Diabetes Melitus.    Namun  belum  dilakukan  kajian formulasi  untuk  mendapatkan  bentuk sediaan terbaik, dan belum dilakukan studi fitokimia  yang  menelusuri  senyawa  aktif
yang  berperan  dalam  menimbulkan  efek anti  DM.  Salah  satu  metode  formulasi nanoemulsi yang berupa campuran isotropik  minyak,  surfaktan  dan  ko- surfaktan  yang  secara  cepat  dan  mudah membentuk nanoemulsi pada pencampuran dengan air disebut Self Nano Emulsifying Drug Delivery system (SNEDDS)  (Patel, et  al .,  2011).  Proses self-nano-emulsifying terjadi secara spontan karena tidak memerlukan tambahan  perlakuan  atau  energi  dari  luar. Nanoemulsi  yang  terbentuk  biasanya memiliki  ukuran  20-200  nm  (Gutiérrez et al ., 2008).   SNEDDS memiliki komponen utama  berupa  minyak,  surfaktan,  dan  ko- surfaktan.  Minyak  sebagai  fase  pembawa obat, surfaktan sebagai pengemulsi minyak ke  dalam  air,  dan  ko-surfaktan  untuk membantu tugas surfaktan sebagai pengemulsi.  Kelebihan  sediaan  SNEDDS,
diantaranya  dapat  mempercepat  waktu kelarutan senyawa lipofilik, mampu mengurangi metabolisme lintas pertama di hati, dan meningkatkan absorpsi (Kyatanwar  et  al.,  2010).  Teknik  ini  juga relatif  murah  dan  mudah  untuk  dilakukan (Azeem  et  al.,  2009),  sehingga  sangat potensial untuk diaplikasikan.
Salah  satu  metode  untuk  mengetahui toksisitas sel terhadap sampel ialah dengan uji  sitotoksik  terhadap  sel  mammalia  dan sejauh  ini  belum  pernah  dilakukan penelitian  uji  sitotoksisitas  ekstrak  daun kangkung khususnya dalam bentuk sediaan  SNEDDS.  Sehingga  penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  konsentrasi ekstrak  yang  tidak  membunuh  sel.  Oleh karenanya  diperlukan  pengujian  efek sitotoksik  ekstrak  etanolik  daun  kangkung dengan metode MTT.

## II. METODE

## A. Alat dan Bahan
Alat  yang digunakan dalam penelitian ini  adalah : timbangan analitik, pengaduk kaca, pisau, lemari pengering, toples kaca, Rotary  Evaporator (Heidolph-  L4000),,
Mikropipet  200,  1000  μL,  Tabung  reaksi kecil,  96-well  plate,  Conical  tube,  Yellow tip  dan  blue  tip,  incubator  CO2  dan ELISA  reader.  Bahan  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  :  daun kangkung darat yang diperoleh dari daerah Dusun Turen, Desa Sardonoharjo,
Kecamatan  Ngaglik,  Kabupaten  Sleman. Tanaman kangkung dipanen pada umur 21 hari, etanol 96% , akuabidestilata,  etanol, asam nitrat, natrium klorida 0,9% Phosphat  Buffer  Saline  1x,    Media  Kultur (MK)  (RPMI),  DMSO,  MTT  5mg/mL PBS  (50  mg  MTT  and  10  mL  PBS),  SDS 10% dalam 0,1 N HCl

## B. Jalannya Penelitian
Bagian ini memuat jalannya penelitian  yang  secara  spesifik  digunakan dalam penelitian. Alur kerja yang sederhana  tidak  perlu  dibuat  skema.  Cara kerja  yang  sudah  umum  tidak  perlu dijelaskan  secara  detail.      Langkah penelitian  yang  panjang  dapat  dibuat dalam  sub  sub  bab  tahapan-tahapan penelitian dengan numbering angka arab.
1. Pengumpulan dan Determinasi
Tumbuhan
Tanaman  kangkung  darat  organik dipanen  dari  daerah  Dusun  Turen,  Desa Sardonoharjo, Kecamatan Ngaglik, Kabupaten  Sleman  pada  pagi  hari  setelah tanaman  berusia  21  hari.  Pemanenan langsung menggunakan tangan yang bersih dan  langsung  dicuci  dari  sisa  tanah. Pelaksanaan  determinasi  dilakukan  di laboratorium  Biologi  Farmasi  Universitas Islam  Indonesia  dengan  seluruh  hasil pemanenan tumbuhan kangkung darat.
2. Sortasi dan Pengeringan Daun
Kangkung Darat
Tumbuhan yang telah dipanen kemudian  dicuci  dengan  air  bersih  dan disortasi  antara  batang  dan  daunnya, bagian  tumbuhan  yang  dipakai  hanyalah bagian  daunnya  saja.  Daun  yang  telah disortasi  kemudian  dirajang  halus  dan dikeringkan pada lemari pengering selama ±1 hari.
3. Ekstraksi Serbuk Simplisia
Serbuk  simplisia  kering  diekstraksi dengan  metode  maserasi  menggunakan pelarut  etanol  96%.  Proses  ektraksi dilakukan  kurang  lebih  selama  12  hari dengan remaserasi  pada  hari ke 6. Setelah didapatkan  ekstrak  cair  maka  dapat dilakukan pemekatan ekstrak menggunakan  rotary  evaporator  sampai didapatkan  ekstrak  kental.  Ektrak  kental yang  didapat  akan  digunakan  untuk dilakukan  uji  parameter  spesifik  dan  non spesifik. 13
4. Pembuatan  sediaan  SNEDDS  Ekstrak
Daun Kangkung
Metode  formulasi  nanoemulsi  yang berupa campuran isotropik minyak, surfaktan  dan  ko-surfaktan  yang  secara cepat  dan  mudah  membentuk  nanoemulsi pada  pencampuran  dengan  air  hingga terbentuk  SNEDDS.  Proses  self-nano- emulsifying  terjadi  secara  spontan  karena tidak  memerlukan  tambahan  perlakukan atau  energi  dari  luar.  Nanoemulsi  yang terbentuk biasanya memiliki ukuran tetesan  yang  kecil  yaitu  kurang  dari  100
nm.  SNEDDS  memiliki  komponen  utama berupa  minyak,  surfaktan,  dan  ko- surfaktan.  Minyak  sebagai  fase  pembawa ekstrak kangkung, surfaktan sebagai pengemulsi  minyak  ke  dalam  air,  dan  ko- surfaktan untuk membantu tugas surfaktan sebagai pengemulsi.
5. Pengujian sitotoksisitas
Sesuai dengan protokol Uji Sitotoksisitas  dengan  metode  MTT  yang dikeluarkan  oleh  CRCC  dengan  no dokumen CCRC-02-010-00

## C. Analisis Data
Hasil  absorbansi  yang  didapat  dari pengujian  sitotoksik  digunakan  untuk mengetahui  persentase  jumlah  sel  yang hidup, dengan persamaan:
Persentase  penghambatan  sel  yang diperoleh  dianalisis  untuk  menentukan presentase  viabilitas  (kemampuan  hidup sel) terhadap ekstrak Centella asiatica

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji  sitotoksik  SNEEDS  kangkung dilakukan  pada  sel  vero  menggunakan metode Methyl-Thiazolyl-Tetrazolium (MTT). Uji sitotoksik merupakan
pengujian  kemampuan  suatu  senyawa mengakibatkan  toksisitas  pada  sel  uji. Metode  MTT  menjadi  salah  satu  metode uji sitotoksik yang sering dilakukan karena prosedurnya yang relatif sederhana.
Metode  MTT  dapat  menilai  toksisitas suatu  senyawa  terhadap  sel  dengan  cara reagen  MTT  yang  berwarna  kuning mereduksi enzim mitokondria dehidrogenase pada sel yang masih hidup, sehingga hasil reduksi tersebut menghasilkan kristal formazan yang berwarna  ungu.  Jika  diperoleh  hasil  uji berwarna  kuning,  maka  kemungkinan banyak sel uji yang mati akibat pemaparan sampel.    Intensitas  warna  ungu  pada  hasil uji  berbanding  lurus  dengan  jumlah  sel yang masih hidup.
Gambar 1. Reaksi MTT (1)
Pengujian MTT dilakukan dengan cara well  plate diplotkan  terlebih  dahulu  untuk sampel uji 70 sumuran ( well) , kontrol sel 6 sumuran,  dan  kontrol  media  6  sumuran. Sumuran untuk sampel ekstrak dan kontrol sel dibuat dengan menumbuhkan sel dalam
plate sebanyak  10 4 sel  vero  tiap well , sedangkan untuk kontrol media hanya diisi dengan media kultur. Well plate diinkubasi selama  24  jam.  Media  kultur  M199  untuk sel  vero  yang  telah  dicampur  dengan sampel  ekstrak  ditambahkan  pada  setiap well sampel uji sebanyak 100µl, kemudian diinkubasi kembali selama 24 jam. Seluruh media  pada plate dibuang  kemudian ditambahkan 100µl reagen MTT pada tiap sumuran,  diinkubasi  selama  4  jam. Terakhir tiap sumuran ditambahkan stopper SDS  sebanyak  100µl.  Plate dibungkus alumunium  foil dan  diinkubasi semalaman pada suhu ruang. Hari berikutnya dilakukan pembacaan absorbansi  sampel,  kontrol  media,  dan kontrol  sel  menggunakan  ELISA reader.
Hasil  absorbansi  yang  didapat  digunakan untuk  mengetahui  persentase  jumlah  sel yang hidup, dengan persamaan:
Gambar  2. Hasil  pengamatan  p late hasil uji  MTT  pada  sel  vero  :  1)
Excipient, 2)SNEDDS ekstrak  daun  kangkung,  3) Kontrol  Sel,  4)  Kontrol Media
Uji sitotoksik SNEEDS kangkung pada sel  vero  diperoleh  hasil  bahwa  SNEEDS kangkung  tidak  menyebabkan  kematian pada sel  uji. Pada pengujian sel  dilakukan pemaparan sampel excipient dari SNEEDS kangkung  sebagai  pembanding,  dengan hasil menyebabkan kematian <50% sel uji pada  dua  kadar  tertinggi  dari  sampel excipient .  Namun  pada  hasil  uji  SNEEDS kangkung  diperoleh  data  bahwa  toksisitas excipient pada  kadar  tersebut  tidak mempengaruhi  timbulnya  toksisitas  pada sampel  SNEEDS  kangkung.  Sehingga berdasarkan uji in vitro, SNEEDS kangkung tidak toksik terhadap sel vero.
Tabel I. Persen hidup sel vero vs sampel uji (SNEEDS kangkung dan excipient ) Excipient (%) SNEEDS
(%)
66.37 287.76 87.92 291.52 134.57 313.39 129.86 265.69 170.50 230.49 187.29 159.73 172.07 132.32
Gambar 3 . Sel Vero terpapar SNEEDS daun kangkung
Tabel  II. Hasil  pengamatan  rata-rata absorbansi  eksipien,  sediaan
SNEDDS, dan kontrol Kelompok Rata-Rata % ± SD Eksipien 1,18 ± 0,27 SNEEDS kangkung 0,929 ± 0,09 Kontrol Sel 0,72 ± 0,023 Kontrol media 0,086 ± 0,008

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil uji sitotoksik SNEEDS ekstrak daun kangkung kangkung  tidak  menunjukkan  toksisitas pada  sel  Vero,  karena  tidak  menyebabkan kematian    pada  sel  vero  sebagai  sel  uji. Bahkan, pertumbuhan kultur sel meningkat pada  kelompok  yang  diberikan  sampel. Sehingga SNEEDS ekstrak daun kangkung dapat  dikembangkan  pada  penelitian  lebih lanjut

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terima  kasih  penulis  sampaikan kepada  DRPM  Kemenristekdikti  yang telah  mendanai  penelitian  ini  melalui Hibah Penelitian Terapan Unggulan
Perguruan  TinggiTahun  2017  melalui kontrak dengan nomer 032/ST- DirDRPM/70/DPPM/PenelitianTerapanUn ggulanPerguruanTinggi-PEMENRISTEK DIKTI/IV/2017

## DAFTAR PUSTAKA
Fotakis  G,  Timbrell  JA.  In  vitro cytotoxicity  assays:  Comparison  of LDH,  neutral  red,  MTT  and  protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride. Toxicol Lett. 2006;160(2):171–7.
HayatiF,Widyarini  S,  Helminawati.  Efek Antihiperglikemik  Infusa  Kangkung Darat  ( Ipomoea  reptans Poir)  pada mencit  jantan  galur  Swiss  yang diinduksi Streptozotocin. Jurnal Ilmiah Farmasi.2010. 7(1): 13-22
Hayati F, Murwanti R, Ningrum LS.Acute
Toxicity  Testof Ipomoea  reptans , Poir  Ethanolic  Extract  In  DDY  Male Mouse.Proceeding  1 st International Pharmacy  Conference  on  Research and  Practice  “Toward  Excellent  In
Natural Products: Preserving
Traditions, Embracing

## Innovations”.Yogyakarta.13-14
November 2012 : 127-131
Jenie  R.I.  dan  Meiyanto  E.  Aplikasi  ko- kemoterapi  fraksi  daun  sambung nyawa pada sel kanker payudara mcf- 7. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2009;VI(3):132–41.
SahooN,  Manchikanti  P,  Dey  S.  Herbal Drugs:  Standards  and  Regulation. Fitoterapia.  2010.  81: 462–471
Stockert  JC,  Blázquez-Castro  A,  Cañete M,  Horobin  RW,  Villanueva  Á.  MTT assay  for  cell  viability:  Intracellular localization of the formazan product is in  lipid  droplets.  Acta  Histochem. 2012;114(8):785–96.
Pal  SK,  Shukla  Y.  Herbal  Medicine:
Current  Status  and  The  future.Asian Pacific  J.  Cancer  Prev.  2003.  4:281-
288
Wibowo  JT,  Djuwarno  EN,  Hayati  F,
Prabowo H.Standardization of
Kangkong (Ipomea  reptans Poir) Ethanolic  Extract , proceeding  in The  1 st International  Pharmacy conference on Research and
Practice  “Toward  Excellent  In
Natural Product : Preserving Traditions, Embaracing Innovations”.Yogyakarta. 13-14 November . 2012 :132-136.