Jurnal Mandala Pharmacon Indonesia, Vol. 8 No.1  Juni 2022 Avaiable online at www.jurnal-pharmaconmw.com/jmpi p -ISSN : 2442-6032 e -ISSN :  2598-9979
Analisis Multi Linear Regression (MLR) pada Fingerprint Kromatografi Andrografolid untuk Memprediksi Efek Anti Kanker
I Gede Bagus Indra Marangyana 1 , Putu Yudha Ugrasena 2 , Ni Luh Gde Mona Monika 1 1 Program Studi D3 Farmasi, Akademi Kesehatan Bintang Persada
2 Program Studi S1 Farmasi, Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Bali Wisnu Dharma

## ABSTRAK
Andrographis  paniculata  (Burm.  F.)  Nees  (AP)  dikenal karena rasanya yang pahit dan sudah umum digunakan sebagai  obat  tradisional.  Studi  fitokimia AP menunjukkan  bahwa  andrografolid  adalah  senyawa bioaktif  utama.  Berdasarkan  penelitian,  andrografolid memiliki  efek  sebagai  antikanker  dengan  berbagai mekanisme.  WHO  telah  memperkenalkan  teknik kromatografi  sidik  jari  ( Fingerprint )  yang  dapat digunakan untuk penilaian keamanan dan kualitas obat herbal.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  memprediksi efek antikanker AP menggunakan analisis Brine Shrimp Lethality  Test dan  MLR  dengan  beberapa  prediktor seperti  AUC  dari  kromatogram  sidik  jari,  ketinggian geografis,  dan  IC50.  Desain  penelitian  ini  adalah eksperimental laboratorik menggunakan AP dari daerah
berbeda  yaitu  Tawangmangu  (Twg),  Bandung  (Bdg), Denpasar  (Dps).  Hasil  BSLT  menunjukkan  bahwa  AP dari Twg memiliki nilai toksisitas lebih tinggi dari Bdg dan Dps dengan LC 50 5,08 mg/L. AUC kromatogram AP dan  ketinggian  geografis  menunjukkan  korelasi  yang kuat  terhadap  potensi  efek  sitotoksik  antikanker berdasarkan LC 50 dengan nilai R 2 0,984 dan dengan nilai p  <0,05.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  metode  analisis MLR  dapat  digunakan  untuk  memprediksi  respon farmakologi  AP  sitotoksik  (LC 50 )  terhadap  beberapa prediktor seperti AUC, LC 50 , dan ketinggian geografis.
Kata Kunci : Andrographis Paniculata , Fingerprint , Multi Linear Regression

## ABSTRACT
Andrographis paniculata (Burm. F.) Nees (AP) is known because its bitter taste and has been commonly used as a traditional medicine. The AP phytochemical study shows that  andrographolide  is  the  main  bioactive  compound. Based  on  research  andrographolide  has  effect  as anticancer  with  various  mechanism.  WHO  has introduced a fingerprint chromatography technique that can  be  used  for  the  assessment  safety  and  quality  of herbal medicines. The purpose of this research is predict the  effect  anticancer  of  AP  using  BSLT  and  MLR analyisis  with  several  predictor  such  as  AUC  from fingerprint chromatogram, geographic height, and IC 50. The  research  design  was  laboratory  experimental  used AP                       from                       differences                          region
Tawangmangu,  Bandung,  Denpasar.  The  results  Brine Shrimp Test show that AP from Twg has more toxicity than  AP  from  Bdg  and  Dps  with  LC 50 5,08  mg/L.  The AUC  of  the  AP  chromatogram  and  geographic  height showed  a  strong  correlation  to  potential  anticancer cytotoxic  effects  based  on  the  LC 50 with  R 2 0.984  and with  a  p-value  <0.05.  This  shows  that  the  multi  linear regression  analysis  method  can  be  used  to  predict  a pharmacological  response  of  cytotoxic  AP  (LC 50 )  to several predictors such as the AUC of fingerprint, IC 50 , and altitude.
Keywords  : Andrographis  Paniculata ,    Fingerprint, Multi Linear Regression
Penulis Korespondensi : Informasi Artikel I Gede Bagus Indra Marangyana Submitted : 5 April 2022 Program Studi D3 Farmasi,  Akademi Kesehatan Bintang Persada Accepted : 6 Juni 2022 Published : 30 Juni 2022 E-mail : bagusindramrgyn@gmail.com

## PENDAHULUAN
Andrographis paniculata (Burm. F.)
Nees  (AP)  sudah  umum  digunakan sebagai obat tradisional (Tan et al., 2016). AP  dikenal  sebagai  sambiloto  di Indonesia. Tanaman ini tumbuh di daerah tropis  seperti  Asia  Selatan  dan  Tenggara termasuk  India,  Sri  Lanka,  Pakistan  dan Indonesia  (Pandey  et  al.,  2019).  Kajian fitokimia AP menunjukkan bahwa andrografolid merupakan senyawa bioaktif  utama  yang  termasuk  dalam golongan  diterpen  lakton  dan  juga ditemukan  golongan  senyawa  aktif lainnya  seperti  terpenoid,  glikosida, flavonoid (Zou et al., 2016; Warditiani et al., 2017). Beberapa aktivitas farmakologi andrografolid    yang  telah  dilaporkan adalah antimikroba, antiprotozoa, antiinflamasi, antioksidan, imunostimulan,  sitotoksik,  antimalaria, antidiabetik  dan  kanker  pada  manusia (Dai  et  al.,  2019;  Garima  Pandey,  2018; Mishra  et  al.,  2016;  Mittal  et  al.,  2016). WHO  merilis  pada  tahun  2016  bahwa kanker  merupakan  penyebab  kematian keenam di dunia dengan 1,7 juta kematian. Indonesia  pada  tahun  2019  terdapat 348.809  kasus  kanker  dengan  angka kematian  yang  besar  yaitu  207.210  jiwa (Bray et al., 2018).
Andrografolid dilaporkan berpotensi sebagai  agen  kemopreventif  dengan menekan pertumbuhan sel kanker dengan menghambat NF-κB, PI3K/AKT dan jalur kinase lainnya serta dengan menginduksi
apoptosis (Mishra et al., 2016).  Khan et al (2018) berdasarkan penelitiannya, andrografolid  menurunkan  viabilitas  sel HT-2 dan menginduksi apoptosis pada sel
HT-29 sehingga memiliki efek antiproliferatif  dan  induksi  apoptosis terhadap  sel  HT-29  untuk  kanker  usus besar.  Paul  et  al  (2019)  menunjukkan bahwa  sel  melanoma  tikus  B16  yang diberikan  AP  menunjukkan  tingkat transkripsi  dan  translasi  yang  lebih rendah  dari  ekspresi  VEGF  dan  HIF-1α. Mekanisme  penurunan  regulasi  HIF  1α mungkin  melalui  perubahan  ekspresi faktor  transkripsi  yang  terlibat  dalam kaskade  pensinyalan  hipoksia  sehingga andrografolid  berpotensi  sebagai  agen antikanker. Uji toksisitas kultur sel kanker menunjukkan  bahwa  ekstrak  AP  bersifat toksik  terhadap  sel  HeLa  &  MCF-7 (Nivedheedha & Sivasubramaniyan, 2017). Berkaitan dengan aktivitas sebagai senyawa antoksidan dilaporkan bahwa AP menunjukkan  penghambatan  radikal bebas  dari  uji  DPPH,  ABTS,  dan  FRAP (Therasa et al., 2020). Peran antioksidan andrografolid untuk menetralisir
kelebihan radikal bebas, untuk melindungi  sel  terhadap  efek  toksiknya, dan  berkontribusi  pada  pencegahan penyakit salah satunya kanker. Peningkatan  senyawa  radikal  bebas menyebabkan  stres  oksidatif  memicu perkembangan  penyakit  akut  dan  kronis mulai  dari  infeksi,  diabetes,  kanker,  dan
penyakit kardiovaskular (Das & Srivastav, 2014).
Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) telah  mengakui  penggunaan  Pengobatan Tradisional  Cina  (TCM)  dari  170  Negara Anggota  sebagai  perawatan  kesehatan primer dan jumlah negara yang
sebenarnya
menggunakan TCM kemungkinan  besar  akan  lebih  tinggi (Welz  et  al.,  2018;  WHO,  2019). Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) telah menetapkan  pedoman  yang  tepat  untuk mengevaluasi keamanan, kemanjuran dan kualitas obat-obatan herbal (WHO, 2019). Pentingnya metode kualitatif dan kuantitatif untuk mengkarakterisasi sampel,  kuantifikasi  biomarker  dan pendekatan  aktvitas  farmakologi  dengan tujuan  memastikan  keselamatan  pasien. Sangatlah  penting  untuk  menggunakan obat  tradisional  yang  telah  diidentifikasi dan  dievaluasi  kualitasnya  (Kumari  & Kotecha,  2016).  Saat  ini  dibutuhkan metode  standardisasi  sebagai  kontrol kualitas  salah  satunya  teknik  analisis multivariat.  Penerapan  kemometri  pada data  sidik  jari  dapat  mengekstraksi informasi dan pengetahuan yang tercakup dari  sistem  kimia  dengan  pemodelan matematis, yang merupakan arah potensial  untuk  penilaian  kualitas  obat herbal  (Huang  et  al.,  2016;  Li  et  al., 2020a).  Kombinasi  profil  kimia  bahan herbal dan analisis multivariate memberikan  terobosan  alat  kontrol kualitas untuk mengkarakterisasi sampel,
kuantifikasi  biomarker  dan  /  atau penanda  kimiawi  dan  profil  sidik  jari (Indrayanto, 2018).
Lokasi geografis (ketinggian) tanaman obat juga berpengaruh terhadap kualitas dan kuantitas metabolit sekunder (Li  et  al.,  2020b).  WHO  telah memperkenalkan  teknik  kromatografi sidik  jari  yang  dapat  digunakan  untuk penilaian  obat  herbal  (WHO,  2019). Kombinasi  kromatografi  sidik  jari  dan pendekatan  kemometrik  memungkinkan evaluasi  yang  cepat  sampel  herbal  yang memiliki potensi farmakologis (Tistaert et al.,  2012).  Salah  satunya  adalah  metode analisis  statistik  multikomponen  yaitu multi linear regression (MLR) yang dapat digunakan  dalam  analisis  kromatografi sidik jari obat herbal karena dapat dibuat untuk  menggambarkan  hubungan  antara puncak  penanda  kromatogram  dengan potensi farmakologis tanaman herbal obat (Nothnagel,  2012).  Aktivitas  antikanker ekstrak  AP  ditentukan  berdasarkan penapisan aktivitas dengan metode BSLT dengan  mencari  konsentrasi  mortalitas (LC 50 )  ekstrak  menggunakan  metode grafik  %  (persen)  mortalitas  terhadap larva Artemia  Salina  Leach .  Penelitian Mayilsamy  and  Geetharamanan  (2016) menunjukkan bahwa metode BSLT dapat digunakan  untuk  skrining  antikanker  AP dan  memberikan  nilai  LC 50 <100  ppm (sitotoksik)  pada  ekstrak  AP.  Analisis MLR  diharapkan  dapat  memprediksi potensi respon farmakologi andrografolid
(LC 50 )  berdasarkan  sidik  jari  AP  (nilai AUC),  ketinggian  geografis  (Ketinggian) pertumbuhan AP dan nilai IC 50 .

## METODE PENELITIAN

## Desain Penelitian
Desain  penelitian  yang  digunakan adalah  eksperimental  laboratorik  dengan melihat  potensi  antikanker  ekstrak  AP melalui  AUC  senyawa  andrografolid, ketinggian  geografis,  dan  IC 50 dengan analisis  MLR.  AP  yang  digunakan  dari ketinggian  geografis  yang  berbeda  yaitu dari  Tawangmangu  (Twg)  Jawa  Tengah, Bandung (Bdg) Jawa Barat, dan Denpasar Barat  (Dps)  Bali.  Potensi  antikanker dengan  melihat  aktivitas  berdasarkan LC 50 menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Uji IC 50 dilakukan terhadap  aktivitas  antioksidan  masing- masing ekstrak AP.

## Bahan
AP  dari  tiga  daerah  berbeda berdasarkan ketinggian geografis Tawangmangu,  Bandung,  Denpasar.  Etil asetat,  n-heksana,  96%  ethanol,  70% ethanol aquadest, etanol -PA, Metanol-PA, Kloroform-PA  ,  Larva Artemia  salina , asam askorbat, tween 80, air laut, DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), TLC-
Plate GF 254

## Metode
1. Ektraksi sampel
AP  disortir  dan  dicuci  dengan  air mengalir,  dikeringkan  pada  suhu  kamar kemudian  dijadikan  serbuk.  2  kg  serbuk
AP (Twg, Bdg, Dps) dimaserasi dengan 10 L  etanol  90%  selama  2  hari.  Selanjutnya dimaserasi  ulang  dengan  5  L  etanol  90% selama 1 hari dan diulang kembali dengan 5  L  etanol  90%  selama  1  hari.  Maserat yang  diperoleh  diuapkan  hingga  kental kemudian  dicuci  dengan  N-heksana dengan  perbandingan  1:20.  Ekstrak  yang diperoleh  dicuci  kembali  dengan  etil asetat dengan perbandingan 1:10. Kemudian  ekstrak  hasil  pencucian  etil asetat  dicuci  kembali  dengan  air  panas sampai  air  menjadi  jernih.  Ekstrak diuapkan kembali hingga kental kemudian ditambahkan etanol
secukupnya (Warditiani et al. 2020).
2. Uji DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) dan IC 50 Aktivitas antiradikal bebas AP (Twg, Bdg,  Dps)  terhadap  DPPH  ditentukan secara spektrofotometri.  Larutan 0,1 mM DPPH dibuat dengan melarutkan 0,0039 mg DPPH dalam 100 ml etanol pa. Ekstrak (2,5ml) dengan konsentrasi yang bervariasi  dan  larutan  DPPH  (3,5ml) dicampur  dalam  tabung  reaksi.  Tabung reaksi  diinkubasi  di  tempat  gelap  selama 20  menit  pada  suhu  kamar.  Asam askorbat  digunakan  sebagai  standar referensi. Absorbansi dibaca pada 517 nm (Do et al., 2014).
3. KLT-Spektrofotodensitometri Sidik Jari Andrographis  Paniculata (Burm.
F.) Nees.
Ekstrak etanol AP ditimbang masing-masing 0,5 g dan dilarutkan 5 mL dengan  etanol  pa.  diencerkan  dua  kali,
dipipet  0,5  mL  kemudian  ditambahkan hingga 5 mL dengan etanol pa. Larutan uji AP ditotolkan di plat KLT GF 254 dengan TLC  sampler  4 (ATS)  otomatis.  Larutan standar  andrografolid  juga  ditotolkan pada  plat  yang  sama.  Elusi  dilakukan dengan fase gerak kloroform pa: metanol pa  (9:  1).  Plat  dipindai  dengan densitometer TLC  Scanner  4 pada panjang  gelombang  210  nm.  Kemudian spektrum  dipindai  dan  semua  titik dipindai pada panjang gelombang maksimum 232 nm.
4. Uji Toksisitas dengan Metode BSLT
Telur Artemia  salina ditetaskan dalam  wadah  transparan  berisi  air  laut. Sebuah  bola  lampu  dengan  daya  40-60 watt  digunakan  proses  penetasan  untuk mencegah  suhu  dalam  25 0 C  -30 0 C.
Oksigen  disuplai  dengan  menggunakan aerator.  Larva  dengan  rentang  hidup  48 jam  digunakan  dalam  uji  toksisitas. Konsentrasi  yang  digunakan  pada  uji BSLT  adalah  10  mg/L,  50  mg/L,  100 mg/L, 500 mg/L, 1000 mg/L dan kontrol negatif.  Larutan  stok  ekstrak  dibuat dengan melarutkan 20 mg ekstrak dalam 2  ml    etanol  96%  untuk  menghasilkan 10.000  ppm.  Larutan  stok  kemudian dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi.  Setiap  konsentrasi  dilakukan pengulangan  3  kali.  Tabung  reaksi diangin-anginkan untuk mengeringkan
sampel  di  dalamnya.  Tabung  reaksi ditambahkan  Twen  80  dan  5  ml  air  laut. Kontrol tidak berisika sampel didalamnya. Proses dilanjutkan dengan menambahkan sepuluh  larva Artemia  salina ke  setiap tabung  reaksi.  Pengamatan  dilakukan selama  24  jam.  Uji  toksisitas  ditentukan berdasarkan  jumlah  larva  yang  mati (Marzuki et al., 2019).
5. Analisis Multi  Linear  Regression (MLR)
Nilai  AUC  senyawa  andrografolid dari  kromatogram  AP,  nilai  IC50,  dan ketinggian  geografis  masing-masing  AP digunakan sebagai prediktor dan variabel LC 50 sebagai respons dianalisis menggunakan  metode  analisis  MLR dengan  SPSS  20.  Analisis  dilakukan dengan  melihat  korelasi  nilai  AUC  dan IC 50 terhadap respons LC 50 dan AUC serta ketinggian geografis AP terhadap LC 50 .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  KLT  ekstrak  AP  dari  tiga daerah  dengan  ketinggian  berbeda (berdasarkan  koordinat Google  Earth ), yaitu  Twg  (1.115  mdpl),  Bdg  (795  mdpl), Dps  (18  mdpl)  menunjukkan  angka andrografolid yang berbeda pada densitogram KLT. Senyawa andrografolid ditentukan dengan membandingkan spektrum  antara  standar  andrografolid dan sampel AP. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1. Dari kiri ke kanan : KLT Sidik Jari AP dari tiga daerah yang berbeda; plat  KLT  di  bawah  sinar  UV  254  nm  (lingkaran  kuning: andrografolid); spektrum andrografolid
Pada Gambar 1. Sidik jari AP menunjukkan pola yang identik dan pada Rf  =  0,54  menunjukkan  adanya  puncak senyawa andrografolid.   Seiring     dengan
peningkatan konsentrasi penotolan, terjadi  peningkatan  AUC  dari  masing- masing  AP.  Nilai  korelasi  antara  volume dan AUC ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Korelasi volume bercak dengan AUC puncak andrografolid
No. Asal Volume Totolan (µL) AUC AND (AU) Persamaan Regresi Linier Reg. Coef 1 Twg 2 4 8 567,8 954,5 1554,6 y = 162,4x + 267,7 0,995 2 Bdg 2 4 8
469,5 605,8 935,9 y = 78,41x + 304,4 0,997 3 Dps 2 4 8
344,9 383,6 768,9 y = 74,33x + 152,2 0,938 Tabel  1  Menunjukkan  persamaan regresi linier berkorelasi positif, ditunjukkan  dengan  peningkatan  volume terhadap nilai puncak AUC andrografolid. Selanjutnya  berdasarkan  nilai  Rf  =  0,54 dan spektra identik, senyawa andrografolid  terdapat  dalam  ekstrak  AP dari  tiga  lokasi  geografis  pada  puncak kromatogram  dan  berdasarkan  nilai  Rf. Metode  ini  dapat  digunakan  untuk menentukan senyawa marker dari AP dan sebagai kontrol kualitas untuk selanjutnya dikaitkan  dengan  respon  farmakologis
(Sharma  &  Sharma,  2013;  Warditiani  et al., 2020; Wirasuta et al., 2017).
Ekstrak  yang  digunakan  dalam  uji BSLT  adalah  ekstrak  dengan  teknik pemurnian untuk mendapatkan kandungan  andrografolid  yang  lebih banyak.  Pemurnian  dalam  ekstraksi khususnya  diperlukan  untuk  penemuan senyawa aktif dan penyaringan pengotor. Sebagian besar senyawa target ditemukan dalam  matriks  yang  sangat  kompleks  (Li et al., 2014).
Tabel 2. AUC, IC 50 , Tinggi Geografis, LC 50 dari Tiga Daerah AP Berbeda
Berdasarkan  tabel  3  nilai  LC 50 terbaik adalah AP dari daerah Twg dengan nilai  5,08  ppm.  Dilanjutkan  dengan  Bdg dan Dps dengan nilai 6,01 dan 10,67 ppm. Nilai LC 50 merupakan konsentrasi senyawa  atau  ekstrak  yang  dapat membunuh  larva Artemia  salina hingga 50%  dibandingkan  dengan  kontrol.  Nilai LC 50 yang lebih rendah menunjukkan efek sitotoksik  yang  lebih  tinggi  (Bhatt  et  al., 2016). Tingkat toksisitas ekstrak dikategorikan  sebagai  berikut:  LC 50 > 1000 mg/L (Tidak toksik), LC 50 500-1000 mg/L  (Toksik  Rendah),  LC 50 100-500 mg/L (Toksik Sedang), LC 50 0- 100 mg/L (Toksik  tinggi).  Tingkat  toksisitas  suatu ekstrak  dipengaruhi  oleh  kandungan metabolit  sekunder  yang  mempengaruhi aktivitas farmakologi tanaman.
Mayilsamy  and  Geetharamanan  (2016) menunjukkan bahwa AP memiliki aktivitas toksisitas yang kuat dengan nilai LC 50 <  100  mg/L.  Pemilihan  metode ekstraksi termasuk pelarut mempengaruhi  hasil  metabolit  sehingga mempengaruhi  nilai  LC 50 .  Penelitian
Daniel  and  Ibok  (2019)  menjelaskan bahwa perbedaan pelarut ekstrak memberikan perbedaan nilai LC 50 dengan ekstrak  etanol  dari  AP  yang  memiliki aktivitas  toksisitas  tertinggi.  Metode  uji sitotoksisitas
BSLT menggunakan Artemia salina merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui bioaktivitas suatu sampel. Uji ini berguna untuk  mengetahui  berbagai  aktivitas biologis  pada  tanaman  seperti  aktivitas sitotoksik,  aktivitas  fototoksik,  pestisida, penghambatan  enzim,  dan  regulasi  ion (Thangapandi  &  Pushpanathan,  2014). Janakiraman  and  Johnson  (2016)  juga menyatakan  bahwa  uji  BSLT  dapat digunakan  sebagai  dasar  pengujian toksisitas  garis  sel,  aktivitas  anti  tumor dan anti kanker.
Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan  untuk  mengetahui  nilai  IC 50 . Metode  yang  digunakan  adalah  DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). DPPH bereaksi  dengan  senyawa  antioksidan yang  dapat  menyumbangkan  hidrogen dan  dengan  demikian  DPPH  berkurang.
No. Asal Volume totolan (µL) AUC IC 50 (mg/L) Ketinggian Geografis (Mdpl) LC 50 (mg/L) 1 Twg 2 567.8 AU 7074,6667 1115 5.08 4 954.5 AU 8 1554.6 AU 2 Dps 2 344.9 AU 1200,6655 18 10.67 4 383.6 AU 8 768.9 AU 3 Bdg 2 469.5 AU 1663,8800 795 6.01 4 605.8 AU 8 935.9 AU
Perubahan  warna  larutan  (dari  ungu  tua menjadi kuning muda) diukur. Intensitas warna kuning tergantung pada jumlah dan sifat  penangkap  radikal  yang  ada  dalam sampel dan senyawa standar.
Berdasarkan  nilai  IC 50 ,  AP  dari  Dps memberikan  nilai  IC 50 yang  lebih  baik daripada AP Twg dan AP Bdg. IC 50 adalah konsentrasi sampel yang dapat menangkap  50%  radikal  bebas  DPPH. Nilai  IC 50 yang  kecil  menunjukkan aktivitas  antioksidan  yang  tinggi.  AP dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan dengan  meningkatkan  mekanisme  enzim antioksidan dan menghambat peroksidasi lipid. Senyawa flavonoid sering dikaitkan dengan aktivitas penangkap radikal bebas (Gani et al., 2018; Okhuarobo et al., 2014). Berdasarkan  Agati  et  al  (2012)  hanya flavonoid  dengan  gugus  ortodihidroksi pada  cincin  B  memiliki  hubungan  yang signifikan dengan aktivitas ini. Penelitian Therasa et al (2020) menyebutkan ekstrak etanol  daun Andrographis  Paniculata memiliki  nilai  IC 50 205.58  mg/ml  dan semakin meningkatnya konsentrasi ekstrak semakin tinggi aktivitas antioksidan.  Disebutkan  pula  dengan
meningkatnnya konsetrasi ekstrak tingkat kematian sel kultur HEp-2 semakin tinggi. Berdasarkan penelitian Shofa et al (2021) ekstrak  etanol Andrographis  Paniculata nilai  IC 50 614.349    μg/mL  dan    memiliki aktivitas    antikanker  yang  kuat  terhadap sel HepG2. Antioksidan dari AP memberikan  ketahanan  terhadap  stres oksidatif  dengan  menangkap  senyawa radikal  bebas,  menghambat  peroksidasi lipid, dan dengan mekanisme lainnya (El Jemli et al., 2016).
Nilai  AUC  andrografolid  dari  ketiga wilayah  yang  berbeda,  nilai  IC 50 ,  dan ketinggian geografis merupakan prediktor/variabel independen. Nilai LC 50 menjadi  respon  farmakologis/variabel dependen.  Terdapat  dua  model  yang menggunakan  kelompok  prediktor  yang berbeda. Model analisis diuji menggunakan  nilai  AUC  dan  ketinggian geografis  sebagai  prediktor  nilai  respon LC 50 dan  yang  kedua  adalah  nilai  AUC dengan IC 50 sebagai prediktor LC 50 . Hasil penelitian menunjukkan tidak ada multikolinieritas  menggunakan  AUC, ketinggian  geografis,  dan  IC 50 sebagai prediktor.
Tabel 3. Multikolinieritas prediktor AUC dan IC 50 No. Predictor Sig. Colinierity tollerance VIF value Correlation Sig-1 tailed 1 AUC 0,668 0,646 1,549 0,45 2 IC 50 0,150 0,646 1,549

## Tabel 4. Multikolinieritas Prediktor AUC dan Ketinggian Geografis
No. Predictor Sig. Colinierity tollerance VIF value Correlation Sig-1 tailed AUC 0,454 0,691 1,447 0,60 Geo. Height <0,05 0,691 1,447
Tabel  3  dan  4  menunjukkan prediktor tidak multikolinearitas berdasarkan  nilai  VIF  dan  korelasinya. Jika  nilai  VIF  >  10  maka  dikatakan multikolinier  dan  tidak  dapat  dianalisis dengan regresi linier  berganda. Nilai VIF antar  prediktor  <  10  dikatakan  tidak
multikolinear.  Demikian  juga  nilai korelasi  antara  prediktor  AUC  dengan IC50  dan  AUC  dengan  ketinggian geografis  tidak  lebih  dari  0,8  sehingga tidak  terdapat  korelasi  yang  kuat  antar prediktor  (Aishah  et  al.,  2019;  Daoud, 2018).
Tabel 5. MLR untuk memprediksi LC 50 Model Predictor R Square Std. Error P-Value 1 AUC IC 50 0,496 2,12520 0,128 2 AUC Ketinggian geografis 0,984 0,37336 P <0,05
Penilaian model regresi linier untuk memprediksi aktivitas antikanker dengan LC 50 menunjukkan bahwa prediktor AUC dan  IC 50 memiliki  korelasi  sebesar  0,496 terhadap  LC 50 dengan  standar error 2.12520  dan  p-value  >  0,05.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  prediktor  AUC  dan IC 50 tidak dapat digunakan sebagai model dalam  memprediksi  respon  antikanker sitotoksik  dari  nilai  LC 50 .  Nilai  IC 50 akan dikaitkan dengan kandungan flavonoid AP (Gani  et  al.,  2018).  Pada  penelitian  ini digunakan  nilai  AUC  andrografolid sebagai  senyawa  penanda  dan  IC 50 dari ekstrak AP ketiga area yang dikategorikan aktivitas  antioksidan  lemah  (IC 50 >  500) (lihat tabel 3). Pada model 2 menggunakan AUC andrografolid dari tiga wilayah berbeda dan ketinggian geografis menunjukkan korelasi yang tinggi terhadap  aktivitas  sitotoksik  antikanker LC 50 , R 2 0,984 dengan standar error yang kecil  0,37336  dan  nilai  p  <0,05,  yang
menunjukkan pengaruh signifikan terhadap  prediktor.  Hubungan  antara AUC andrografolid dan ketinggian geografis berkorelasi kuat untuk
memprediksi aktivitas sitotoksik antikanker  dari  nilai  LC 50 (lihat  tabel  6). Berdasarkan  Pandey  et  al  (2019), perbedaan andrografolid yang dikumpulkan  dari  lokasi  yang  berbeda signifikan  secara  statistik.  Hal  tersebut menunjukkan  bahwa  andrografolid  dan metabolit sekunder lainnya dapat dipengaruhi  oleh  lingkungan,  faktor musim dan karakteristik tanah. Komposisi kimia  tanaman  bervariasi  tidak  hanya  di bagian  yang  berbeda  tetapi  juga  dengan faktor lain seperti daerah tumbuh, kondisi agroklimat, genetik (Pandey et al., 2019). Penelitian Royani et al (2014) menjelaskan bahwa variasi lokasi tumbuh termasuk ketinggian geografis AP menyebabkan  perbedaan  kandungan metabolit sekunder. Dalam penelitiannya
juga  menunjukkan  bahwa  ketinggian geografis AP berpengaruh terhadap kadar andrographolide.  Beberapa  AP  dengan lokasi pertumbuhan tinggi juga memberikan  level  andrografolid  yang tinggi.  Lingkungan  kondisi  seperti  sinar matahari,  curah  hujan,  ketinggian,  suhu, tanah,  kondisi  penyimpanan  serta  panen yang berbeda prosedur, waktu dan metode pengumpulan,  proses  pembuatan  seperti pemilihan, pengeringan, pemurnian, ekstraksi,  dan  variabilitas  genetik  dapat menciptakan variabilitas substansial dalam  kualitas  produk  dan  konsentrasi menanam  bahan  kimia  di  dalam  produk yang berbeda (Kumari & Kotecha, 2016).

## KESIMPULAN
Penelitian  ini  menunjukkan  bahwa metode KLT-Spektrofotodensitometri dan analisis  MLR  ( multi  linear  regression ) dapat digunakan sebagai kontrol kualitas metabolit sekunder andrografolid melalui kromatogram  sidik  jari  dan  spektrum. Metode  analisis  MLR  dapat  digunakan untuk  memprediksi  respon  farmakologi sitotoksik  AP  (LC 50 )  terhadap  beberapa prediktor seperti AUC kromatogram sidik jari,  IC 50 ,  dan  ketinggian  geografis.
Peningkatan  konsentrasi  AP  dari  ketiga daerah berbeda pada KLT juga menunjukkan  hubungan  linier  dengan nilai  AUC  pada  kromatogram  sidik  jari dengan  koefisien  regresi  >  0,9.  Uji Brine Shrimp  Lethality  Test menunjukkan bahwa  AP  dari  Twg  memiliki  toksisitas
lebih  dari  AP  dari  Bdg  dan  Dps  dengan LC 50 5,08  mg/L  (  LC 50 <  100).  AUC kromatogram AP dan ketinggian geografis menunjukkan korelasi yang kuat terhadap potensi efek sitotoksik antikanker berdasarkan  LC 50 dengan  nilai  R 2 0,984 dan dengan nilai p <0,05. Nilai AUC dan IC 50 menunjukkan  korelasi  yang  lemah terhadap potensi efek sitotoksik antikanker  berdasarkan  LC 50 dengan  R 2 0,496 dan p > 0,05.

## DAFTAR PUSTAKA
Adriawan, I. R., Andrie, M., Susilowati, R., Pramono, S., & Nugroho, A. E. (2015). Homa-Ir  Index  Evaluation  On Antidiabetes  Mellitus  Effect  Of Andrographis  paniculata  (Burm.  f.) Nees Purified Extract And Andrographolide. HOMA-IR  INDEX EVALUATION  ON  ANTIDIABETES MELLITUS EFFECT OF Andrographis  Paniculata  (Burm.  f.) Nees  PURIFIED  EXTRACT  AND ANDROGRAPHOLIDE , 19 (1), 19–23. https://doi.org/10.22146/tradmedj.8 086
Agati,  G.,  Azzarello,  E.,  Pollastri,  S.,  & Tattini,  M.  (2012).  Flavonoids  as antioxidants  in  plants:  Location  and functional significance. Plant Science , 196 ,
67–76. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.20
12.07.014
Aishah, A. F. Q. A., Ummu J, K., Zainuriah, M.  R.,  &  Norhilda,  A.  K.  (2019). Multiple  linear  regression  model analysis  in  predicting  fasting  blood glucose level in healthy subjects. IOP
Conference Series: Materials Science and Engineering , 469 (1). https://doi.org/10.1088/1757- 899X/469/1/012050
Bhatt, D., Jethva, K., & Zaveri, M. (2016). Cytotoxicity screening of the commonly used indigenous medicinal plants  using  brine  shrimp  lethality bio-assay. International  Journal  of
Pharmaceutical Sciences Review and Research , 37 (2), 147–150.
Bray,  F.,  Ferlay,  J.,  Soerjomataram,  I., Siegel, R. L., Torre, L. A., & Jemal, A. (2018). Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN  estimates  of  incidence and  mortality  worldwide  for  36 cancers  in  185  countries. CA:  A Cancer Journal for Clinicians , 68 (6),
394–424.
https://doi.org/10.3322/caac.21492 Dai,  Y.,  Chen,  S.  R.,  Chai,  L.,  Zhao,  J., Wang,  Y.,  &  Wang,  Y.  (2019).
Overview of pharmacological activities  of  andrographis  paniculata and its major compound andrographolide. Critical Reviews in Food  Science  and  Nutrition , 59 (0), S17–S29. https://doi.org/10.1080/10408398.2 018.1501657
Daniel,  I.  E.,  &  Ibok,  E.  N.  (2019). Toxicological  Evaluation  of  Different Extracts  of  Andrographis  paniculata. South  Asian  Research  Journal  of Natural Products , 2 (4), 1–10.
Daoud, J. I. (2018). Multicollinearity and Regression  Analysis. Journal  of Physics:  Conference  Series , 949 (1). https://doi.org/10.1088/1742-
6596/949/1/012009
Das,  P.,  &  Srivastav,  A.  K.  (2014). Phytochemical Extraction and Characterization  of  the  Leaves  of Andrographis Paniculata for Its Anti- Bacterial,  Anti-Oxidant,  Anti-Pyretic and Anti-Diabetic
Activity. International  Journal  of  Innovative Research  in  Science,  Engineering and  Technology , 03 (08),  15176– 15184. https://doi.org/10.15680/ijirset.201 4.0308016
Do,  Q.  D.,  Angkawijaya,  A.  E.,  Tran- Nguyen,  P.  L.,  Huynh,  L.  H., Soetaredjo, F. E., Ismadji, S., & Ju, Y. H. (2014). Effect of extraction solvent on  total  phenol  content,  total flavonoid  content,  and  antioxidant activity  of  Limnophila  aromatica. Journal of Food and Drug Analysis ,
22 (3), 296–302. https://doi.org/10.1016/j.jfda.2013.1 1.001
El  Jemli,  M.,  Kamal,  R.,  Marmouzi,  I.,
Zerrouki, A., Cherrah, Y., & Alaoui, K. (2016).  Radical-Scavenging  Activity and  Ferric  Reducing  Ability  of Juniperus thurifera  (L.), J. oxycedrus (L.), J. phoenicea (L.) and Tetraclinis articulata (L.). Advances in
Pharmacological  Sciences , 2016 , 6392656.
https://doi.org/10.1155/2016/63926 56 Gani,  A.  P.,  Pramono,  S.,  Martono,  S.,  &
Widyarini, S. (2018). Radical Scavenging  Activity  Combination  of Sambiloto  (Andrographis  paniculata Nees.) and Patikan Kebo (Euphorbia hirta  L.)  Ethanolic  Extracts  on  2,2- Diphenyl-1-Picrylhidrazyl (DPPH). Majalah Obat Tradisional , 23 (3), 79. https://doi.org/10.22146/mot.31600 Garima Pandey, C. R. (2018). Andrographolide:  its  pharmacology, natural  bioavailability  and  current approaches to increase its content in andrographispaniculata.
International Journal of Complementary & Alternative Medicine , 11 (4), 355–360.
https://doi.org/10.15406/ijcam.2018 .11.00425
Huang, Y., Wu, Z., Su, R., Ruan, G., Du, F., & Li, G. (2016). Current application of chemometrics  in  traditional  Chinese herbal medicine research. Journal of
Chromatography B: Analytical Technologies  in  the  Biomedical  and Life Sciences , 1026 , 27–35. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2 015.12.050 Indrayanto, G. (2018). Recent development  of  quality  control methods  for  herbal  derived  drug preparations. Natural Product Communications , 13 (12), 1599–1606. https://doi.org/10.1177/1934578x18 01301208
Janakiraman,  N.,  &  Johnson,  M.  (2016). Ethanol Extracts of Selected Cyathea Species  Decreased  Cell  Viability  and Inhibited Growth in MCF 7 Cell Line Cultures.
JAMS Journal
of Acupuncture  and  Meridian  Studies , 9 (3),
151–155. https://doi.org/10.1016/j.jams.2016.
04.004
Khan, I., Khan, F., Farooqui, A., & Ansari,
I. A. (2018). Andrographolide
Exhibits Anticancer Potential Against Human  Colon  Cancer  Cells  by Inducing  Cell  Cycle  Arrest  and Programmed Cell Death via Augmentation of Intracellular
Reactive  Oxygen  Species  Level.
Nutrition  and  Cancer , 70 (5),  787– 803. https://doi.org/10.1080/01635581.2 018.1470649
Kumari,  R.,  &  Kotecha,  M.  (2016). Standardization of herbal medicines - A  review. International  Journal  of Biodiversity and Conservation , 7 (2). https://doi.org/10.5897/ijbc11.163
Li, Y., Shen, Y., Yao, C., & Guo, D. (2020a).
Quality assessment of herbal medicines based on chemical fingerprints combined
with chemometrics  approach:  A  review. Journal  of  Pharmaceutical  and Biomedical  Analysis , 185 ,  113215. https://doi.org/https://doi.org/10.1 016/j.jpba.2020.113215
Li, Y., Shen, Y., Yao, C. liang, & Guo, D. an.
(2020b).  Quality  assessment  of herbal  medicines  based  on  chemical fingerprints combined with chemometrics  approach:  A  review.
Journal  of  Pharmaceutical  and Biomedical  Analysis , 185 ,  113215. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2020. 113215 Li, Y., Wang, N., Zhang, M., Ito, Y., Zhang, H.,  Wang,  Y.,  Guo,  X.,  &  Hu,  P. (2014).  Development  of  a  method  to extract  and  purify  target  compounds from medicinal plants in a single step: Online hyphenation of expanded bed adsorption chromatography and countercurrent chromatography. Analytical  Chemistry , 86 (7),  3373– 3379. https://doi.org/10.1021/ac4035955
Marzuki, A., Rahman, L., & Mamada, S. S. (2019).  Toxicity  test  of  stem  bark extract  of  banyuru  (Pterospermum celebicum  miq.)  using  BSLT  (brine shrimp  lethality  test)  and  cream irritation  test. Journal  of  Physics: Conference Series , 1341 (7).
https://doi.org/10.1088/1742- 6596/1341/7/072018 Mayilsamy,  M.,  &  Geetharamanan,  K. (2016).  Cytotoxic  activity  of  certain medicinal plants extracts against sea monkey:  Artemia  salina. Journal  of Medicinal Herbs and Ethnomedicine , 19–25.
https://doi.org/10.19071/jmhe.2016. v2.3083
Mishra, S. K., Tripathi, S., Shukla, A., Oh, S.  H.,  &  Kim,  H.  M.  (2016). Andrographolide  and  analogues  in cancer  prevention. Frontiers  in
Bioscience , 7 (2), 292–304. https://doi.org/10.2741/e732
Mittal,  S.  P.  K.,  Khole,  S.,  Jagadish,  N.,
Ghosh,  D.,  Gadgil,  V.,  Sinkar,  V.,  &
Ghaskadbi, S. S. (2016). Andrographolide  protects  liver  cells from  H2O2  induced  cell  death  by upregulation of Nrf-2/HO-1 mediated via adenosine A2a receptor signalling. In Biochimica  et  Biophysica  Acta  - General  Subjects (Vol.  1860,  Issue 11). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.20
16.07.005
Nivedheedha, M., & Sivasubramaniyan, C. (2017).  Cytotoxicity  Studies  On Various  Extracts  Of  Andrographis Paniculata  And  Centella  Asiatica Against  Human  Cancer  Cell  Lines. IAJPR , 7 (04), 8354–8356. Nothnagel,  C.  (2012). Multivariate  data analysis using spectroscopic data of fluorocarbon alcohol mixtures .
Nugroho, A. E., Andrie, M., Warditiani, N. K.,  Siswanto,  E.,  Pramono,  S.,  & Lukitaningsih, E. (2012). Antidiabetic and  antihiperlipidemic  effect  of Andrographis  paniculata  (Burm.  f.) Nees  and  andrographolide  in  high- fructose-fat-fed  rats. Indian  Journal of  Pharmacology , 44 (3),  377–381. https://doi.org/10.4103/0253- 7613.96343
Okhuarobo,  A.,  Ehizogie  Falodun,  J., Erharuyi, O., Imieje, V., Falodun, A., &  Langer,  P.  (2014).  Harnessing  the medicinal properties of Andrographis paniculata for diseases and beyond: A review  of  its  phytochemistry  and pharmacology. Asian Pacific Journal
of  Tropical  Disease , 4 (3),  213–222. https://doi.org/10.1016/S2222- 1808(14)60509-0 Pandey,  A.,  Gulati,  S.,  Gupta,  A.,  & Tripathi,  Y.  (2019).  Variation  in andrographolide content among different  accessions  of  Andrographis paniculata. The  Pharma  Innovation Journal , 8 (4), 140–144.
Paul, T., Basu, S., Practice, N. S.-J. of C. R. and,  &  2019,    undefined.  (2019). Anticancer  effect  of  Andrographis paniculata  by  suppression  of  tumor altered  hypoxia  signaling  cascade  in mouse  melanoma  cells. Ejcrp.Org , 117–123. https://doi.org/10.4103/JCRP.JCRP
Royani, J. I., Hardianto, D., & Wahyuni, S. (2014). Analisa Kandungan Andrographolide  Pada  Tanaman Sambiloto (Andrographis paniculata)
Dari 12 Lokasi di Pulau Jawa. Jurnal Bioteknologi  &  Biosains  Indonesia (JBBI) , 1 (1), 15. https://doi.org/10.29122/jbbi.v1i1.54 7
Sharma,  M.,  &  Sharma,  R.  G.  (2013). Identification, purification and quantification  of  Andrographolide from Andrographis paniculata (Burm. F.) nees by HPTLC at different stages of  life  cycle  of  crop. Journal  of Current Chemical &  Pharmaceutical Sciences , 3 (1), 23–32. Shofa, A. F., Alam, T., & Nuralih. (2021).
Uji Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Polar, Semipolar,  dan  Non-Polar  Daun Sambiloto (Andrographis paniculata) terhadap  Sel  Kanker  Hati  (HepG2)
Cytotoxic.
Jurnal Kefarmasian Indonesia , 12 (1), 25–30.
Tan, M. C. S., Oyong, G. G., Shen, C. C., & Ragasa,  C.  Y.  (2016).  Secondary metabolites from Andrographis paniculata  (Burm.f.)  nees. Der Pharmacia Lettre , 8 (13), 157–160. Thangapandi,  V.,  &  Pushpanathan,  T.
(2014).  Comparison  of  the  Artemia salina  and  Artemia  fransiscana bioassays  for  toxicity  of  Indian medicinal  plants. Journal  of  Coastal Life Medicine , April . https://doi.org/10.12980/jclm.2.201 414j29
Therasa, S.  A., Sobiya, G., & Parimala, S. M.  (2020).  Leaves  of  Andrographis Paniculata  Is  an  Antioxidant  and Anticancer  Agent. Asian  Journal  of Pharmaceutical and Clinical Research , 13 (8), 213–217. https://doi.org/10.22159/ajpcr.2020
.v13i8.37014
Tistaert, C., Dejaegher, B., Chataigné, G., Rivière, C., Nguyen Hoai, N., Van, M. C.,  Quetin-Leclercq,  J.,  &  Vander
Heyden, Y. (2012). Potential antioxidant  compounds  in  Mallotus species fingerprints. Part II: Fingerprint  alignment,  data  analysis and  peak  identification. Analytica Chimica Acta , 721 , 35–43. https://doi.org/10.1016/j.aca.2012.0
1.058
Warditiani,  N.  K.,  Sari,  P.  M.  N.  A., Ramona,  Y.,  &  Wirasuta,  M.  A.  G. (2020).  Molecular  pharmacology study  of  andrographolide  extracted from  andrographis  paniculata  on atherosclerosis  preventive  effect. Systematic  Reviews  in  Pharmacy , 11 (9), 201–206.
https://doi.org/10.31838/srp.2020.9
.33
Warditiani,  N.  K.,  Susanti,  N.  M.  P., Arisanti, C. I. S., Putri, N. P. R. D., & Wirasuta,  I.  M.  A.  G.  (2017).
Antidyslipidemia  and  Antioxidant Activity of Andrographolide Compound From Sambiloto (Andrographis  Paniculata)  Herb. International  Journal  of  Pharmacy and  Pharmaceutical  Sciences , 9 (7),
59.
https://doi.org/10.22159/ijpps.2017 v9i7.18109
Welz,  A.  N.,  Emberger-Klein,  A.,  & Menrad,  K.  (2018).  Why  people  use herbal  medicine:  Insights  from  a focus-group study in Germany. BMC Complementary  and  Alternative Medicine , 18 (1), 1–9. https://doi.org/10.1186/s12906-018- 2160-6 WHO.  (2019).  WHO  Global  report  on traditional and complementary medicine  2019.  In World  Health Organization . Wirasuta, I. M. A. G., Srinadi, I. G. A. M.,
Dwidasmara, I. B. G., Ardiyanti, N. L. P.  P.,  Trisnadewi,  I.  G.  A.  A.,  & Paramita,  N.  L.  P.  V.  (2017). Authentication  of  Piper  betle  L. folium  and  quantification  of  their antifungal-activity. Journal of Traditional  and  Complementary Medicine , 7 (3), 288–295. https://doi.org/10.1016/j.jtcme.2016 .08.006 Zou, W., Xiao, Z., Wen, X., Luo, J., Chen,
S., Cheng, Z., Xiang, D., Hu, J., & He,
J.  (2016).  The  anti-inflammatory effect  of  Andrographis  paniculata (Burm. f.) Nees on pelvic inflammatory disease in rats through down-regulation  of  the  NF-ΚB pathway. BMC  Complementary  and Alternative  Medicine , 16 (1),  1–7. https://doi.org/10.1186/s12906-016- 1466-5