Journal of Parasite Science                                                                                           Vol.4 No.1 Maret 2020 eISSN : 2656-5331 , pISSN : 2599-0993
Cross Reaction of Haemonchus contortus Antigen with Anti- Fasciola gigantica Serum by Using Western Blot Technique
Reaksi Silang Antigen Haemonchus contortus dengan Serum Anti – Fasciola gigantica Menggunakan Teknik Western Blot
1) Firman Hadi Fanani, 2) Kusnoto, 2) Poedji Hastutiek, 2) Setiawan Koesdarto, 2) Endang Suprihati
1) Student, Faculty of Veterinary Medicine, Universitas Airlangga,
2) Department of Veterinary Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, Universitas Airlangga.
Received: 25-06-2020, Accepted: 25-06-2020, Published Online: 29-06-2020 Corresponding email : hadifirman339@gmail.com

## Abstract
The purpose of this research to know cross reaction of Haemonchus contortus protein with anti- Fasciola gigantica serum by using the Western Blot technique. The result can be used  as Haemonchosis serologic  diagnostic.  This  research  was  conducted  using Haemonchus  contortus worms  obtained  from  abomasum,  especially  cow  worms  and Fasciola  gigantica worms  obtained  from  the  bile  duct  and  gall  bladder.  The  worms  were crushed  and  added  with  Phosphate  Buffer  Saline  (PBS)  to  make  homogenates  and  then centrifuged at 3500 rpm for 15 minutes. Homogenate Fasciola gigantica was immunized to mice to get anti- Fasciola gigantica serum at a dose of 200 μg/mice and booster 3 times with a  span  of  two  weeks.  Homogenates  were  carried  out  using  the  SDS-PAGE  technique  to analyze proteins using a brilliant blue dye. Cross reaction of Haemonchus contortus protein with anti- Fasciola gigantica serum byusing Western blot technique and obtained 3 protein bands are 94.9, 52.7, 46.7 kDa.
Keywords : Haemonchus contortus , Fasciola gigantica , Cross reaction, WesternBlot

## Pendahuluan
Cacing merupakan organisme multiseluler yang  mengandung  berbagai  macam  protein, baik  protein  spesifik  maupun  protein  non- spesifik  yang  memicu  respon  inang  untuk membentuk  antibodi  yang  beragam,  sehingga memungkinkan  terjadi  reaksi  silang  saat dilakukan  diagnosis  dengan  uji  serologis (Kusnoto,  2009).  Ternak  dapat  terinfeksi  lebih dari  satu  jenis  cacing  yang  memungkinkan terjadi reaksi silang antara antigen dan antibodi terhadap  cacing  yang  berbeda  kelas  (Kusnoto, 2010).  Telah  banyak  penelitian  tentang  reaksi silang,  namun  belum  pernah  dilakukan penelitian  tentang  reaksi  silang  antigen Haemonchuscontortus terhadap  serum  anti- Fasciola gigantica dengan menggunakan teknik Western blot.
Haemonchosis merupakan penyakit cacing  saluran  pencernaan  yang  disebabkan oleh H.  contortus pada  domba  dan  kambing yang  menyebabkan  kerugian  ekonomi  yang sangat  besar.  Predileksi  cacing  ini  terdapat pada  abomasum,  infeksi  berat  pada  cacing  ini dapat  menimbulkan bottle  jaw (Kusnoto  dkk.,
2015).  Kerugian  ekonomi  tersebut  meliputi penurunan  produktivitas  hewan,  penurunan berat  badan,  diare  dan  pada  kasus  berat mengakibatkan kematian(Githigia dkk., 2001).
Cacing F.  gigantica juga  mengakibatkan penyakit  helminthiasis  pada  ruminansisa. Tingkat  infeksi  fasciolosis  cenderung  lebih tinggi ditemukan pada hewan dewasa dibandingkan dengan hewan muda. Fasciolosis banyak menimbulkan kerugian ekonomi berupa  penurunan  berat  badan  dan  karkas, produksi  susu,  gangguan  reproduksi  hingga kematian  (Kurniasih,  2007).  Hal  ini  menjadi perhatian penting terlebih lagi cacing Fasciola yang  bersifat  zoonosis.  Pemeriksaan yangdapat  dilakukan  secara  dini  yaitu  uji serologi, dengan mengukur banyaknya antibodi yang berada dalam serum (Sriasih dkk., 2013). Uji  laboratorium  yang  direkomendasikan untuk  membantu  meneguhkan  diagnosis  salah satunya yaitu uji serologik. Uji serologis adalah pengujian  yang  menggunakan  serum  sebagai sampel. Prinsip uji serologis adalah dengan cara mereaksikan  antigen  dan  antibodi  yang  sesuai, antigen  dapat  diperoleh  dari Whole  Worm
Extract (WWE) cacing H. contortus (Yoshihara dkk.,  1993). Western  Blot merupakan  metode yang digunakan untuk mengidentifikasi antibodi  spesifik  pada  suatu  protein  dengan berat  molekul  tertentu  yang  telah  diseparasi (Agmar,  2012).  Diagnosis  secara  serologis  telah dianggap  lebih  akurat  dibanding  diagnosis secara  konvensional.  Metode Western  blot dapat memperlihatkan protein dengan mereaksikan  antibodi  dan  antigen  yang kemudian digunakan untuk mengetahui adanya reaksi silang.

## Materi dan Metode Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  1  Maret sampai 30 Juli 2018. Pengambilan sampel cacing H.  contortus dan F.  gigantica stadium  dewasa dilakukan  pada  sapi  yang  dipotong  di  Rumah Potong  Hewan  (RPH)  Pegirian  Surabaya  yang sudah diperiksa sebelumnya dan sapi didiagnosis  menderita  haemonchosis  dan fasciolisis, Laboratorium Parasitologi Universitas Airlangga untuk pembuatan homogenat H.  contortus dan F.  gigantica ,  Unit Layanan  Biologi  Fakultas  Sains  Teknologi Universitas  Airlangga  Surabaya  untuk  running kadar  protein,  Laboratorium  Teknobiologi Purifikasi  dan  Biologi  Molekuler  Universitas Surabaya  untuk  pemeriksaan  SDS-PAGE  dan Western blot.

## Alat dan Bahan Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  cawan  petri,  nampan  plastic, object glass,  cover  glass ,  alat-alat  bedah  (pinset anatomis,  pisau scalpel ,  dan  gunting  bedah), beaker  glass ,  tabung  erlenmeyer,  gelas  ukur, thermometer, penangas air, stopwatch , incubator,  ELISA reader , microplate ELISA, spektrofotometer,  alat  pewarnaan Commasie Briliant  Blue , spuit  disposable ,  jarum,  kertas tisu, microtube 2 mL, rak tabung reaksi, corong, penyaring  teh,  pipet  plastic,  pipet  ependorf, mortar,  stanfer,  tabung  sentrifus,  tabung konikal,  alat  penimbang  digital,  Ph  meter, membrane nitroselulose, chamber untuk proses running SDS-PAGE,  perangkat  elektroferesis (SDS-PAGE), electroblotter , trans blotter , kertas Whatmann , kertas absorben, waterbath, shaker, yellow  tip,  blue  tip ,  mikroskop compound, freezer , sonikator, dan alat sentrifugasi.
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  menggunakan  6  mencit  jantan  dewasa, protein Whole Worm  Extract (WWE) cacing F. gigantica dan H. contortus stadium
dewasa . Bahan  penelitian  yang  dibutuhkan antara  lain  : Phospate  Buffer  Saline (PBS), aquadest , formalin 10%, NaCl fisiologis, alkohol 70%, complete  Freund’s  adjuvant (CFA)  ( Sigma cat no.  F5881), incomplete  Freund’s  adjuvant (IFA), larutan Bradford.
Identifikasi  protein  dengan  teknik  SDS- PAGE  menggunakan  bahan-bahan,yang  terdiri dari  larutan  penyangga  elektroforesis,  larutan penyangga Laemli ,  larutan separating  gel 12%, larutan stacking  gel 5%.  Larutan  penyangga Laemli terdiri  dari  10  g  atau  mL gliserin (Merck),  0,154  g  10  mM Dithioerythrit ,  23 mLSDS  10%,  12,50  mL  0,5  M  Tris-HCl  dengan pH  6,8  yang  dilarutkan  dalam  100mL aquadest (Merck),  dan  beberapa  tetes Bromphenolblue (Merck).
Bahan-bahan  yang  digunakan  untuk melakukan  uji  karakterisasi Western  blot yaitu gel SDS-PAGE yang telah di running mengandung  protein  yang  dianalisis, transfer buffer (Tris  aminomethan  (Sigma cat no.  172- 2051) 15,15 g, glisin 72 g, methanol 1000 mL dan ditambahkan  5000  mL aquadest (Merck),  HCL pH  6,8,  creamer  4%,  antibodi  poliklonal F. gigantica dan  protein H.  contortus, etanol, washing  buffer , Western  blue ,  konjugat  (IgG antimouse), dan substrat (BCIP/NBT).

## Prosedur Penelitian
Koleksi  cacing H.  contortus didapatkan pada  organ  abomasum  sapi  dan  untuk mendapatkan  cacing F.  gigantica pada  organ hati  sapi.  Cacing  yang  didapatkan  dimasukkan kedalam cawan petri yang telah berisi Phospate Buffer  Saline (PBS).  Cacing  yang  sudah diperoleh dipindahkan dalam cawan petri yang berisi  PBS  kemudian  diinkubasi  di  dalam incubator dengan suhu 37 o C (Kusnoto, 2011). Cacing F.  gigantica dan H.  contortus stadium  dewasa,  diidentifikasi  sesuai  dengan bentuk morfologi masing-masing cacing tersebut  (Soulsby,  1986).  Cacing  dewasa  yang telah disimpan di dalam NaCl fisiologis diambil satu  persatu.  Identifikasi  tubuh  cacing  dewasa dengan  meletakkan  di object  glass dan  dijepit dengan cover  glass lalu  identifikasi  dibawah mikroskop perbesaran 100x.
Cacing H.  contortus  dan  F.  gigantica stadium  dewasa  masing  masing  digerus  secara terpisah dengan alat penggerus hipofisa sampai halus.  Hasil  gerusan  ditambah  dengan  larutan PBS  3  mL.  Larutan  dimasukkan  ke  dalam tabung  sentrifus  kemudian  disonikasi  pada frekuensi  35  kHz  dengan  pola  3  x  60  detik dengan interval 60 detik. Kemudian
Journal of Parasite Science                                                                                           Vol.4 No.1 Maret 2020 eISSN : 2656-5331 , pISSN : 2599-0993
disentrifugasi  dengan  kecepatan  3.000  rpm selama  15  menit.  Pelet  dan supernatant dipisahkan  kemudian  diukur  konsentrasinya dengan spekrofotometer dengan metode Bradford (Kusnoto dkk., 2011) Sebanyak  200  μL  larutan Bradford dimasukkan  ke  dalam  tabung  steril.  Tabung yang  telah  berisi  200  μL  larutan Bradford ditambahkan 790 μL aquadest dan ditambahkan  10  μL  sampel  WWE  cacing F. gigantica dan H.  contortus stadium  dewasa . Blanko  digunakan  tabung  reaksi  steril  yang telah  diisi800  μL aquadest dan  200  μL  larutan Bradford .  Besar  protein  dihitung  berdasarkan kurva  standar  konsentrasi  protein  yang  dibuat berdasarkan  absorbansi  konsentrasi  standar menggunakan spektrofotometer dengan panjang  gelombang  590  nm  dengan  metode Bradford (Kusnoto dkk., 2011).
Pembuatan  antibodi  poliklonal  dilakukan dengan cara menyuntikkan protein F. gigantica pada  mencit  dengan  dosis  200  μg  per  ekor (Hanly  dkk.,  1995).  Daerah  penyuntikan terlebih  dahulu  didesinfeksi  dengan  alkohol 70%, kemudian protein F. gigantica disuntikkan pada bagian
subkutan.
Penyuntikan  pertama,  homogenate  ditambah CFA  sama  banyak,  selanjutnya  dilakukan booster sebanyak  3  kali  dengan  interval  2 minggu. Pada saat booster , homogenat ditambah  IFA  sama  banyak.  Pada  minggu kedua  setelah  booster  terakhir  dilakukan, dilakukan  pengambilan  darah  melalui  ekor sebanyak  0,5  mL  dan  disentrifugasi  dengan kecepatan  3000  rpm  selama  5  menit  untuk mendapatkan  serum  anti- F.  gigantica (Kusnoto dkk., 2005).
Sodium  Dodecyl  Sulphate  Poly  Acrylamide Gel  Electrophoresis merupakan  teknik  untuk menganalisis protein cacing. Bahan dari larutan separating  gel 12%  dimasukkan  ke  dalam gel plate dengan  posisi  vertikal.  Bagian  atas gel plate yang  telah  tercampur  larutan separating gel 12% diberi butanol hingga mengeras, setelah mengeras  butanol  dibuang  dan  bilas  dengan PBS  selanjutnya  dikeringkan  dengan  kertas Whatmann . Gel  plate yang  telah  mengering tambahkan larutan stacking gel 4% danmasukkan  pada comb hingga  mengeras (Farghaly, 2009).
Karakterisasi protein dengan Western Blot Homogenat  cacing H.  contortus di- running dengan  SDS-PAGE  kemudian  gel  yang telah mengandung fragmen protein dilepas dari
glass  plate kemudian  direndam  2  x  20  menit dalam buffer  transblot dan  siap  ditransfer  ke membran nitroselulosa .  Kertas Whatmann ukuran 10 x 12 cm sejumlah 3 lembar direndam dengan buffer transblot selama 2 x 20 menit dan diletakkan  rata  sempurna  pada  transblotter, setelah  itu  selembar  membrane nitroselulose dibasahi  dengan  etanol  selama  1  menit  dan direndam buffer  transblot 2  x  20  menit, kemudian  diletakkan  rata  sempurna  diatas kertas Whatman . Gel yang telah siap ditransfer diletakkan  rata  sempurna  diatas  membran nitroselulosa ,  kemudian  gel  ditutup  dengan  3 lembar  kertas Whatman yang  sudah  direndam dengan buffer transblot selama 2 x 20 menit dan diletakkan  rata  sempurna.  Proses  transfer dilakukan  dengan  tegangan  konstan  100V  dan kuatarus 40 mA selama 90 menit (Intan, 2008).
Penentuan  berat  molekul  antigen  atau antibodi  dilakukan  dengan  menghitung  nilai Retardation  factor (Rf)  dari  masing-masing  pita dengan  rumus  Rf  =  Jarak  /  Panjang  Gel; Keterangan:  Jarak  =  Jarak  pergerakan  protein dari  tempat  awal;  Panjang  Gel  =  Jarak pergerakan  zat  warna  dari  tempat  awal.  Massa molekul  relatif  ditentukan  dengan  cara mengkonversi data nilai Rf dan  massa molekul relatif dari marker . Nilai Rf disimbolkan dengan X,  sedangkan  Y  adalah  nilai  logmassa  molekul relative marker .  Kemudian  mencari  persamaan regresi  yang  sesuai.  Setelah  persamaan  regresi didapat,  nilai  X  (Rf)  sampel  dimasukan  ke dalam  persamaan.  Selanjutnya  hasil  dari persamaan dicari nilai anti-log untuk mendapatkan  nilai  massa  molekul  relatif protein (Kusnoto dkk., 2011).

## Analisis Data
Data  dalam  penelitian  ini  berupa  pita ( band )  ikatan  antara  protein H.  contortus dengan  serum  anti -F.  gigantica yang  terjadi pada  protein  tertentu  ditampilkan  secara deskriptif, akan tetapi untuk menghitung berat molekul  menggunakan  SPSS  ( Statistical Product and Service Solution ).

## Hasil dan Pembahasan
Hasil  reaksi  silang  protein H. contortus dengan  serum  anti F .  gigantica  didapatkan  3 pita  protein  dengan  BM  46,7,  52,7  dan  94,9 kDa,  umtuk  lebih  jelas  dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Gambar 1. Hasil reaksi silang antigen Haemonchus contortus dengan serum anti- Fasciola gigantica dengan  teknik Western blot.  M: Marker ,S:  Reaksi  silang Haemonchus  contortus dengan Fasciola gigantica .
Western  blot merupakan  pemindahan makromolekul dari medium gel polyakrilamida ke  atas  membran  nitroselulosa  setelah  proses elektroforesis.  Teknik  ini  sangat  efektif  untuk mendeteksi  antigen  yang  mempunyai  ukuran kecil  dalam  larutan  yang  banyak  mengandung protein. Western  blot digunakan  untuk identifikasi  antigen  spesifik  yang  dikenal  oleh antibodi  monoklonal  ataupun  poliklonal. Western blot mengkombinasi antara kemampuan  pemisahan  SDS-PAGE  dengan pengenalan imunologi spesifik terhadap antibodi  (Setiawan,  2012).  Antibodi  yang digunakan  dalam  teknik  ini  harus  mempunyai spesifikasi  tinggi  dan  memiliki  daya  ikat  stabil (Rantam,  2003).  Hasil  running  SDS-PAGE dipengaruhi  oleh  beberapa  hal  antara  lain, kebersihan,  tingkat  kemurnian  dan  kadar protein  dalam  homogenat.  Kadar  homogenat yang  cukup  akan  menghasilkan  pita  protein yang  cukup  dan  jelas  sehingga dapat memudahkan analisis berat molekul (BM) yang terbentuk (Kusnoto, 2003).
Antibodi merupakan protein yang muncul sebagai  respon  terhadap  infeksi  atau  imunisasi dan  mempunyai  kemampuan  untuk  bereaksi secara  spesifik  dengan  epitop.  Antibodi  yang berbeda  mengikat  epitop  yang  berbeda sehingga  setiap  individu  mempunyai  jutaan antibodi  yang  berbeda.  Antibodi  spesifik  yang berikatan  dengan  epitop  antigen  jika  terjadi suatu  paparan  akan  membentuk  memori, sehingga  suatu  hari  jika  terjadi  paparan  ulang akan  menghasilkan  antibodi  yang  lebih  tinggi. Paratop  atau  yang  biasa  disebut  dengan antigen-binding  site merupakan  bagian  dari antibodi  yang  berikatan  dengan  antigen,  yaitu epitop  (Goldsby  dkk.,  2003).  Paratop  tertentu akan  berikatan  dengan  epitop  yang  tidak berhubungan begitu sebaliknya sehingga  dapat terjadi reaksi silang antara antigen dan antibodi (Frank,  2002).Antigen  dengan  kadar  protein yang  optimal  juga  sangat  diperlukan  untuk menghasilkan pita protein yang baik. Homogenat cacing yang berasal dari telur, larva dan  cacing  dewasa  akan  memberikan  reaksi
Journal of Parasite Science                                                                                           Vol.4 No.1 Maret 2020 eISSN : 2656-5331 , pISSN : 2599-0993
yang  optimal  jika  mengandung  protein  lebih dari 800µg/ml (Kusnoto, 2003).
Penelitian ini menggunakan protein WWE H.  contortus dengan  serum  anti- Fasciola gigantica yang didapatkan dari protein WWE F. gigantica yang diimunisasikan pada mencit dan dilakukan  booster  sebanyak  3  kali  dengan interval  2  minggu.  Hasil  reaksi  silang  antara protein H.  contortus dengan  serum  anti- F. gigantica menggunakan  teknik western  blot diperoleh 3 pita protein dengan BM antara lain 94,9,    52,7  dan    46,7  kDa.  Berdasarkan penelitian  Rani  (2017)  mengenai  reaksi  silang protein H.  contortus dengan  serum  anti-L2 Toxocara  vitolorum menggunakan  teknik western  blot menghasilkan  protein  dengan  BM antara  lain  141,3,  81,3,  64,6,  51,3,  46,8  dan  38 kDa.  Antigen H.  contortus dapat  mengenali serum  anti- F.  gigantica dan  L2 T.vitolorum pada  protein  dengan  BM  sama  yaitu  46.  Pada penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan  oleh Arisandy  (2005)  menghasilkan  protein  dengan BM  antara  lain  33,5  dan  29,4  kDa.  Sedangkan yang tidak terjadi reaksi silang antara lain 42,3, 39,3, 28,9, 24,4 dan 13,9 kDa.
Adanya  reaksi  silang  antara  antigen H. contortus dengan serum anti- Fasciola gigantica mengindikasikan  bahwa  protein  tersebut  tidak spesifik,  sehingga  spesifitas  dari  protein H. contortus rendah  dan  tidak  dapat  digunakan sebagai  bahan  diagnostik  secara  serologi terhadap haemonchosis karena dapat menyebabkan false  positif terhadap  Fasciolosis. Menurut  Kusnoto  (2008),  protein  yang  tidak spesifik  ini  dapat  dikembangkan  menjadi kandidat  vaksin  helminthiasis  dan  adanya protein  hasil  reaksi  silang  yang  menghasilkan BM  yang  sama  memberi  indikasi  bahwa  pada uji  imunodiagnosis  membutuhkan  bahan  uji yang lebih spesifik.
Protein  yang  tidak  terjadi  reaksi  silang kemungkinan  merupakan  protein  spesifik. Perlu  dilakukan  uji  spesifitas  lebih  lanjut menggunakan uji elusi untuk mendapatkan BM protein  spesifik  cacing H.  contortus .  Protein spesifik  yang  dihasilkan  dapat  dimanfaatkan sebagai  bahan  awal  pengembangan  diagnosis penyakithaemonchosis secara serologis.

## Kesimpulan
Reaksi
silang protein Haemonchus contortus dengan serum anti Fasciola gigantica didapatkan  3  pita  protein  yaitu  pada  Berat Molekul (BM) 46,7 ; 52,7 dan 94,9 kDa.

## Daftar Pustaka
Kusnoto. 2003. Isolasi dan Karakterisasi Protein Immunologi  Larva  Stadium  II Toxocara cati Isolat Lokal. [Tesis]. Program Pascasarjana UniversitasAirlangga.
Kusnoto.  2008.  Antigenesitas,  Sensitivitas  dan Spesifitas  Protein  27-28  kDa  dari  Material Excretory-Secretory (ES) Fasciola spp  pada
Diagnosis Distomatosis Serum Sapi dengan Teknik Indirect-Elisa .
Kusnoto.  2009.  Isolation  of  Specific  Protein  of Toxocara  canis  and  Its  the  Evaluation  to Diagnosis Toxocariasis at Animal
Experimental  with  ELISA  Technique. Media Kedokteran Hewan. 25 (3): 153-160.
Kusnoto.  2010.  Detection  of  Cross  Reaction between Toxocara  cati Antigens  against Anti- Toxocara  canis serum  used Western Blot Technique . Media Kedokteran Hewan. Universitas Airlangga. Surabaya.
Kusnoto.    2011.    Karakterisasi  Molekul  Protein Toxocara  cati dan Toxocara  canis untuk Pengembangan Diagnostik Toxocara canis dengan  Teknik  ELISA.  JBP  Universitas Airlangga. 12(1): 56-65.
Agmar SY. 2012. Western Blot.
Docstory.wordpress.  2012/03/17/western- blot/.[06 Agustus 2016]
Githigia  SM,  Thamsborg  SM,  Munyua  WKand MaingiN.  2001.  Impact  of  Gastrointestinal Helminths  on  Production  in  Goats  in Kenya. 42:22.
Yoshihara S, Furuya T dan Goto N. 1993. Use of body fluid of adult female Ascaris suum as an antigen in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for diagnosis  of  swine  ascariosis.  J  of Helminthologi. 67 (4): 279-286.
Intan.  2008.  Reaksi  Silang  Somatic,  Excretory Secretory  dan  Intestine  antigen Toxocara cati dengan  serum  anti Toxocara  canis . [Skripsi].  Program  sarjana  Kedokteran Hewan. Universitas Airlangga.
Setiawan IM. 2012. Beberapa Teknik Pemeriksaan Laboratorium BiologiMolekuler. Yayasan Puri Cipta Bina Karya. Jakarta. 16-49.
Rantam FA. 2003. Metode Imunologi. Airlangga University  Press.  Surabaya.  hal.  8-9;  145- 148; 150-156.
Soulsby  EJL.    1986.    Helminths,  Arthrophods and  Protozoa  of  Domesticated  Animals.
Bailliere  Tindall  and  Cassell  London.  7 th ed. 231-257.