JFFI. 2018; 5(1) 253-257 www.jurnal.farmasi.umi.ac.id/index.php/fitofarmakaindonesia

## ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT DARI LIMBAH CAIR RENDAMAN KACANG KEDELAI
Zakiyah Zahra Nur Amaliah 1 , Saiful Bahri 2 , dan Puteri Amelia 1
1 Prodi Farmasi, Fakutas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2 Prodi Farmasi, Institut Sains dan Teknologi Nasional, Srengseng Sawah, Jakarta Selatan
1 puteri.amelia@uinjkt.ac.id

## ABSTRACT
Tempe is an Indonesia traditional food, which in the manufacturers have a liquid waste that no use again namely soybean soaking water. Lactic Acid Bacteria  (LAB) has been known at every stage of tempeh production, included at soaking soybeans. This study aimed to isolate and characterize LAB contained in soybean soaking water liquid waste. After serial dilution to 10-7, soybean soaking water liquid waste was inoculated on the MRSA contained 1%  CaCO3.  After  incubation,  there  are  8  isolates  which  produce  clear  zone  around  their  colonies  with  different colony morphology suspected as LAB. Morphological, physiological and biochemical characteristics were employed to identify LAB. All isolates were non-spore forming, non-motile, catalase negative, grow well at 37° and 45°C, could be able to grow in the presence of 4% and 6.5% sodium chloride. The results of safety test showed all isolates negative for  hemolytic  activity.  Seven  of  eight  isolates  are  Gram-positive,  while  one  is  a  Gram-negative.  But  only  Gram- positive were chosen as they represent the LAB characteristic. Seven isolates were identified as Lactobacillus with heterofermentative as the type fermentation. In this study, Lactobacillus casei ATCC 393 used as reference strain
Keywords: Characterization, isolation, lactic acid bacteria, soybean soaking water

## I. PENDAHULUAN
Proses  fermentasi  merupakan  salah  satu metode  pengawetan  yang  dapat  dideskripsikan sebagai suatu proses perubahan secara biokimia pada bahan  pangan  oleh  aktivitas  mikroorganisme (Hidayat  dan  Sri,  2006).  Mikroorganisme  tersebut memanfaatkan  beberapa  komponen  bahan  dasar pangan  sebagai  substrat  untuk  menghasilkan  energi dan  komponen  seluler,  meningkatkan  populasi,  dan menghasilkan beberapa produk yang tidak digunakan sebagai  produk  akhir  yang  disekresikan  ke lingkungan.
Proses fermentasi dapat  meningkatkan nilai gizi bahan yang berkualitas rendah, yang merupakan suatu  cara  untuk  menghilangkan  zat  antinutrisi  dan racun  yang  terkandung  dalam  suatu  bahan  makanan (Sopandi dan Wardah, 2014).
Pangan yang diperoleh dari proses fermentasi banyak berasal dari biji-bijian, salah satu diantaranya  kacang  kedelai  yang  banyak  digunakan sebagai  bahan  dasar  dari  pangan  fermentasi  seperti tempe, kecap, dan tauco. Tempe adalah makanan hasil fermentasi tradisional Indonesia.
Banyak penelitian dan review telah dilakukan  mengenai  tempe  serta  keberadaan  dari BAL pada tempe pun telah dilaporkan (Kormin, et al., 2001;  Moreno,  et  al.,  2002). Pada  tahun  2013  dan 2015,  Pisol, et  al .berhasil    mengisolasi  BAL  dari
tempe,  dimana  dilakukan  tidak  hanya  pada  produk tempe  namun  pada  tiap  langkah  pembuatan  tempe, namun didapatkan hasil yang berbeda.
Pada  proses  pembuatan  tempe  di  pabrik, dilakukan  terlebih  dahulu  perebusan  kacang  kedelai lalu  didiamkan  selama  semalaman,  setelah  itu  baru dilakukan  proses  pembuatan  tempe  selanjutnya.  Air rendaman tersebut biasanya tidak digunakan kembali sehingga  akan  dibuang  begitu  saja  atau  terkadang digunakan  juga  sebagai  pakan  cair  ternak.  Melihat ketersediaannya yang banyak serta tidak dimanfaatkan kembali, air rendaman kedelai tersebut atau  limbah  cair  ini  dapat  diteliti  lebih  lanjut mengenai  kandungan  Bakteri  Asam  Laktat  (BAL) didalamnya.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi BAL dari limbah cair rendaman kacang kedelai yang diharapkan  dapat  memberi  informasi  mengenai keberadaan  dan  karakteristik  BAL  dari  limbah  cair rendaman kacang kedelai pada produsen tempe.

## II. METODE PENELITIAN A. Bahan
Bahan  utama  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah sampel limbah cair air rendaman kacang  kedelai  dari  satu  produsen  tempe  yang berlokasi di Pancoran, Jakarta Selatan. Bahan lainnya yaitu NaCl, kalsium karbonat (CaCO3), media MRS
Agar (Merck), media MRS broth (Conda pronadisa), media  SIM  (Merck),  pepton  water  (Merck),  media blood  agar,  pewarna  Gram,  pewarna  endospora, aquadest,  hidrogen  peroksida  (H2O2)  3%,  minyak imersi, dan alkohol 70%.

## B. Peralatan
Peralatan  yang  digunakan  pada  penelitian adalah  kaca  objek,  jarum  ose,  batang  spreader, pembakar spirtus, kaca objek, tabung reaksi, beaker glass, erlenmeyer, cawan petri,  mikropipet (Thermo Scientific),  termometer,  vortex,  timbangan  analitik (Ogawa  Seiki),  anaerobic  jar  (Oxoid),  mikroskop optik,  pH  meter  (Horiba,  Jepang),  autoklaf  digital (Ogawa  Seiki),  inkubator  (France  Etuves),  laminar air  flow,  lemari  pendingin  (GEA),  dan  oven (Memmert).
C. Prosedur
1. Isolasi Bakteri Asam Laktat Sebanyak  1  mL  dari  sampel  secara  aseptis ditambahkan  ke  dalam  9  mL  pepton water steril (0,1%, b/v) dan dihomogenkan. Kemudian, dilakukan pengenceran bertingkat
sampai
pengenceran ke-7. Diambil 0,1 mL cuplikan dari tiga seri pengenceran terakhir dan dikulturkan pada MRS Agar  tersuplementasi  CaCO3  1%  menggunakan metode spread plate . Diinkubasi selama 48 jam pada inkubator  suhu  37°C.  Koloni  yang  tumbuh  dihitung dan  jumlah  totalnya  dihitung  menggunakan  metode total plate count (TPC).

## 2. Pemurnian
Koloni  yang  tumbuh  dengan  zona  bening disekelilingnya dilakukan pemurnian sel dengan cara menggoreskan  pada  media  MRSA  tersuplementasi CaCO3  1%  dengan  metode  kuadran  diinkubasi selama  24  jam  pada  inkubator  suhu  37°C  agar diperoleh koloni tunggal untuk selanjutnya disubkultur kembali sebagai isolat tunggal murni.

## 3. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat
Karakterisasi  isolat  meliputi  morfologi, fisiologi,  dan  biokimia.  Karakterisasi  morfologi terdiri dari pewarnaan Gram, pewarnaan endospora, dan  uji  motilitas,  sedangkan  karakterisasi  fisiologi dan biokimia teridiri dari uji katalase, produksi gas, suhu, dan garam.
a. Pewarnaaan  Gram:  diteteskan  NaCl  fisiologis pada kaca ojek isolat lalu diambil satu ose isolat dari agar miring. Isolat tersebut disebarkan pada kaca  objek  lalu  difiksasi.  Gentian  violet diteteskan  diatas  preparat  dan  biarkan  selama  1 menit.  Preparat  dicuci  dengan  air  mengalir. Cairan  lugol  diteteskan  pada  preparat  kemudian dibiarkan kembali selama 1 menit. Preparat dicuci
dan  diteteskan  dengan  alkohol  96%  selama  30 detik.  Preparat  dicuci  dengan  air  mengalir. Terakhir, preparat diteteskan dengan safranin dan dibiarkan selama 45-60 detik. Preparat dicuci dan dikeringkan  untuk  diamati  dibawah  mikroskop. Bakteri  Gram  positif  akan  berwarna  ungu  dan bakteri Gram negatif berwarna merah.
b. Pewarnaan  endospora:  Preparat  yang  telah difiksasi  diletakkan  diatas  penangas  air  lalu ditutup  dengan  kertas  saring.  Malakit  hijau diteteskan dan dibiarkan selama 5 menit. Preparat dicuci  dengan  air  mengalir.  Dilakukan  kembali pewarnaan  dengan  safranin  kemudian  biarkan selama 60 detik. Preparat dicuci, hasilnya diamati dibawah  mikroskop.  Endospora  akan  berwarna hijau  sedangkan  sel  vegetatif  akan  berwarna merah (Harley, 2005)
c. Uji  motilitas  dilakukan  dengan  media  setengah padat,  diambil  sebanyak  satu  ose  isolat  bakteri dan  diinokulasikan  secara  vertikal  pada  media SIM.  Kemudian  diinkubasi  selama  48  jam  pada suhu  37°  C.  Hasil  uji  motilitas  bakteri  positif dapat dilihat dengan adanya pertumbuhan bakteri pada  permukaan  media  atau  tidak  hanya  bekas pada  tusukan,  sedangkan  bakteri  non  motil tumbuh sepanjang tusukan (Harley, 2005).
d. Uji  katalase  dilakukan  dengan  menggunakan hidrogen  peroksida  (H2O2)  3%.  Isolat  diambil dari stok kultur dan diletakkan pada kaca objek. Satu sampai dua tetes H2O2 3% ditambahkan ke isolat. Jika terbentuk gelembung
mengindikasikan bakteri positif katalase, dan jika tidak  maka  mengindikasikan  bakteri  negatif katalase (Harley, 2005).
e. Uji produksi gas dilakukan dengan menumbuhkan  kultur  isolat  dalam  media  MRS broth  dalam  tabung  reaksi  yang  diberi  tabung durham dengan keadaan terbalik untuk menangkap gas yang dihasilkan. Lalu diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37° C (Romadhon, et al., 2012).
f. Ditumbuhkan  pada  temperatur  yang  berbeda- beda dengan menggunakan MRS broth kemudian diinkubasi  selama  2x24  jam  dengan  seri temperatur  10°C,  37°C,  dan  45°C.  Adanya pertumbuhan  diamati  dengan  adanya  kekeruhan dalam tabung (Anastiawan, 2014).
g. Untuk  pertumbuhan  pada  konsentrasi  garam  4% dan  6.5%,  satu  ose  kultur  dimasukkan  ke  dalam MRS  broth  yang  tersuplementasi  NaCl  masing- masing  berkonsentrasi  4%  dan  6.5%.  Lalu diinkubasi pada temperatur 37°C selama 24 jam. Kekeruhan  menandakan  adanya  pertumbuhan (Thakkar, et al., 2015).

## 4. Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat
Isolat  BAL  diuji  keamanannya  dengan blood  agar yang  mengandung  5%  darah  domba. Isolat  dari  agar  miring  diambil  satu  ose  lalu diinokulasi  ke  media blood  agar .  Media  tersebut kemudian diinkubasi secara anaerob pada suhu 37°C selama  48  jam.  Pengamatan  dilakukan  terhadap koloni  yang  tumbuh,  jika  terdapat  zona  jernih disekitar  koloni  maka  menunjukkan  reaksi  positif beta  hemolisis.  Pada  uji  ini, Staphylococcus  aureus digunakan  sebagai  kontrol  positif  (Thakkar, et  al .,
2015).

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri Asam Laktat
Pada tahap awal isolasi, sampel  diinokulasi ke dalam  media  MRSA  tersuplementasi  CaCO 3 1%. Didapatkan data total plate count (TPC) keseluruhan bakteri yang tumbuh sebanyak 4,99 × 10 9 koloni/mL  sedangkan  TPC  BAL  sebanyak 9,17 × 10 8 koloni/mL. Dari keseluruhan kultur bakteri yang tumbuh  terpilih  delapan  isolat  BAL  yang  memiliki karakteristik secara makroskopik berbeda.
Isolat  yang  dipilih  merupakan  isolat  yang memiliki zona bening disekitar koloni, zona tersebut terbentuk karena produksi asam organik dari bakteri sehingga  CaCO 3 pada  media  MRSA  terhidrolisis (Sun, et al., 2014; Pisol, et al ., 2015).

## Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat
Setelah  didapatkan  stok  kultur,  kedelapan isolat serta strain acuan dikarakterisasi dimana BAL memiliki ciri-ciri katalase negatif, Gram positif, non motil,  dan  tidak  membentuk  spora  (Bulut,  2003; Surono,  2004;  Sun, et al.,  2014).  Pewarnaan  Gram merupakan tahapan penting untuk mengkarakterisasi apakah isolat adalah BAL atau bukan.
Satu  isolat  berwarna  merah  pada  selnya yang berarti  merupakan  Gram  negatif dimana isolat ini  tidak  memenuhi  syarat  BAL.  Ketujuh  isolat berwarna  ungu pada selnya  yang berarti  merupakan Gram positif sehingga dilakukan uji selajutnya yaitu uji katalase.
Uji  katalase  digunakan  untuk  mengetahui adanya  enzim  katalase  pada  isolat  bakteri.  Hasil  uji katalase  menunjukkan  hasil  yang  negatif  pada kedelapan  isolat  dan strain acuan,  dimana  tidak terdapatnya gelembung gas yang terbentuk. Pada uji ini  digunakan Staphylococcus  aureus yang  sudah diketahui  memiliki  enzim  katalase  sebagai  kontrol positif,  hasil  uji  katalase  pada  bakteri  ini menunjukkan  terbentuknya  gelembung  gas  setelah diteteskan H 2 O 2 3% (Dewi, 2013).
Hasil  uji  pewarnaan  spora  menunjukkan ketujuh  isolat  bakteri  serta strain acuan  tidak membentuk  spora.  Ketujuh  isolat  dan strain acuan memberikan hasil uji motilitas yaitu non motil, yang berarti bakteri tidak memiliki flagela. Hasil ini dapat dilihat dari tidak menyebarnya pertumbuhan bakteri pada  media  SIM,  melainkan  hanya  tumbuh  pada bekas tusukan jarum inokulum saja.
Uji  produksi  gas  dilakukan  untuk  melihat aktivitas metabolisme BAL, dimana dikelompokkan menjadi  dua  sub  grup  yaitu  homofermentatif  dan heterofermentatif. Dari  hasil  uji  didapatkan strain acuan tidak memproduksi gas yang berarti memiliki tipe  fermentasi  homofermentatif.  Sedangkan,  tujuh isolat uji lainnya memproduksi gas atau termasuk ke dalam tipe fermentasi heterofermentatif.
Uji  fisiologis  selanjutnya  adalah  uji ketahanan  hidup  bakteri  pada  suhu  yang  berbeda- beda yaitu 10°, 37°, dan 45°C, didapatkan data yang seragam yakni tidak adanya pertumbuhan pada suhu 10°C  dan  tumbuh  pada  suhu  37°  serta  45°C. Uji ketahanan  hidup  bakteri  pada  konsentrasi  garam berbeda-beda  dilakukan  pada  kondisi  lingkungan dengan  konsentrasi  NaCl  4%  dan  6,5%.  Hasil  yang didapatkan  pada  uji  ini  pun  seragam  yaitu  ketujuh isolat  serta strain acuan  dapat  hidup  pada  kedua konsentrasi tersebut.
Berdasarkan hasil pengujian sifat morfologi, fisiologi,  dan  biokimia  bakteri  yang  diisolasi  dari limbah  cair  rendaman  kacang  kedelai,  diduga  jenis bakteri yang terdapat di dalamnya merupakan bakteri asam laktat. Data  hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel  1,  dengan  melakukan  penelusuran  pada  buku Bergey’s  Manual  of  Determinative  Bacteriology , ketujuh isolat tersebut merupakan genus Lactobacillus .
Tabel 1. Karakteristik Isolat BAL dan Strain Acuan
Pengamatan Isolat L. casei ARK 5.1.a ARK 5.3.b ARK 6.1.c ARK 6.1.d ARK 6.3.f ARK 7.2.g ARK 7.3.h Morfologi Sel Pewarnaan Gram + + + + + + + + Bentuk Sel B B B B B B B B Pewarnaan Endospora - - - - - - - - Motilitas - - - - - - - - Biokimia Katalase - - - - - - - - Tipe Fermentasi Ho He He He He He He He Fisiologis Suhu: - 10°C - - - - - - - - - 37°C + + + + + + + + - 45°C + + + + + + + +
NaCl: - 4%
+ + + + + + + +
- 6,5%
+ + + + + + + +
Keterangan:
+ : hasil pewarnaan positif/motil/adanya pertumbuhan bakteri - : hasil pewarnaan negatif/non motil/tidak adanya pertumbuhan bakteri
B: Batang, Ho: Homofermentatif, He: Heterofermentatif

## Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat
Seperti  yang  disyaratkan  oleh  FAO/WHO pada tahun 2002, probiotik tidak boleh menyebabkan reaksi  berbahaya  dan  aman  terhadap  sistem  imun (dinyatakan aman atau status GRAS). Salah satu cara untuk  melihat  kemanan  dari  isolat  BAL  ini  dengan melakukan  uji  aktivitas  hemolisis  menggunakan media blood  agar . Pada  uji  aktivitas  hemolisis digunakan Staphylococcus  aureus sebagai  kontrol positif, dengan  hasil terdapat zona bening di sekitar koloni.
Zona  bening  yang  terbentuk  merupakan tanda  adanya  hemolisin,  yaitu  enzim  yang  bersifat toksik,  dapat  melisiskan  sel  darah  merah,  berperan dalam  meningkatkan permeabilitas sel,  sehingga  sel lebih  rentan  terhadap  agen  infeksi  (Khusnan et  al ., 2002). Pada  penelitian  ini,  kedelapan  isolat  BAL tidak menunjukkan terjadinya hemolisis, baik terjadi perubahan  warna  media  maupun  terbentuk  zona bening  di  sekitar  koloni  yang  menandakan  isolat BAL  termasuk  gamma  hemolisis  atau  merupakan bakteri non patogen.

## IV. KESIMPULAN
Dalam penelitian “Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri  Asam  Laktat  Dari  Limbah  Cair  Rendaman Kacang  Kedelai”  diperoleh  delapan  isolat  yang berhasil  diisolasi  dari  limbah  cair  rendaman  kacang kedelai,  tujuh  diantaranya  teridentifikasi  sebagai
Bakteri  Asam  Laktat  (BAL)  yang  diduga  sebagai anggota genus Lactobacillus .

## DAFTAR PUSTAKA
Anastiawan. 2014. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik  yang  Berasal  dari  Usus  Itik Pedaging Anas domesticus. Skripsi: Universitas Hasanudin Makassar.
Aron, Nicoleta Maftei, Monica (Găureanu) Boev, dan
Gabriela Bahrim. Probiotics and Therapeutic  Effect  in  Clinical  Practice  – Review. Romanian Biotechnological
Letters, Vol. 20, No. 1, 2015. Breed,  Robert  S.,  E.G.D.  Murray,  dan  Nathan  R.
Smith.  1957.  Bergeys’s  Manual  of
Determinative Bacteriology Seventh
Edition.    United  States  of  America:  The Williams & Wilkins Company.
Bulut,  Çisem.  2003.  Isolation  and  Molecular Characterization  of  Lactic  Acid  Bacteria From  Cheese.  Tesis:  Biotechnology  and
Bioengineering, İzmir Institute of Technology Turkey. Desai,  Ankur.  2008.  Strain  Identification,  Viability and  Probiotics  Properties  of  Lactobacillus casei.  Tesis:  School  of  Biomedical  and Health Sciences Victoria University Australia.
Dewi,  Amalia  Krishna.  2013.  Isolasi,  Identifikasi, dan  Uji  Sensitivitas  Staphylococcus  aureus
terhadap  Amoxicillin  dari  Sampel  Susu Kambing  Peranakan  Ettawa  (PE) Penderita Mastitis di Wilayah Girimulyo, Kulonprogo, Yogyakarta.  Jurnal  Sain  Veteriner  31  (2), ISSN: 0126-0421.
Gogineni  VK,  Morrow  LE,  Gregory  PJ,  Malesker
MA (2013)  Probiotics: History and Evolution.  J  Anc  Dis  Prev  Rem  1:107. doi:10.4172/2329-8731.1000107
Harley  JP.  Laboratory  Exercises  in  Microbiology, Sixth Edition. New York: The McGraw-Hill Companies, Inc; 2005
Hidayat,  Nur  dan  Sri  Suhartini.  Mikrobiologi Industri.  Teknik  Industri  Pertanian  FTP Universitas Brawijaya Malang;2006.
Khusnan, Wahyu Prihtiyantoro, dan Mitra Slipranata.
Identifikasi  dan  Karakterisasi  Fenotipe Staphylococcus aureus Asal Kasus
Bumblefoot  dan  Arthritis  pada  Broiler. Jurnal  Kedokteran  Hewan  Vol.  6  No.  2, September 2012 ISSN: 1978-225X.
Kormin,  Salasiah,  Gulam  R,  Son  R,  and  Foo  HL. Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria Isolated  from  Traditional  Fermented  Food. Malays J Med Sci. 2001 Jan; 8(1): 63–68. Moreno  M.R.F,  J.J.  Leisner,  L.K.  Tee,  C.  Ley,  S. Radu, G. Rusul, M. Vancanneyt, and L. De Vuyst.  Microbial  Analysis  of  Malaysian Tempeh,  and  Characterization  of  Two Bacteriocins  Produced  by  Isolates  of Enterococcus  faecium.  J  Appl  Microbiol. 2002;92(1):147-57. Ozyurt  VH,  Ötles  S.  Properties  of  probiotics  and encapsulated  probiotics  in  food.  Acta Sci.Pol. Technol. Aliment., 2014, 13.4: 413- 424. DOI: 10.17306/J.AFS.2014.4.8 Pisol  B,  Noriham  A,  Khalillah  AK,  dan  Lilis  N. Isolation  and  Identification  of  Lactic  Acid Bacteria from Different Stages of Traditional  Malaysian  Tempeh  production. Mal. J. Microbiol. Vol 11(4) 2015, pp. 358- 364. Pisol, B, Lilis N, Noriham A, Suliantari, dan Khalilah
AK. Isolation and Characterization of Lactic Acid  Bacteria  from  Indonesian  Soybean Tempe.
IPCBEE vol.58 DOI: 10.7763/IPCBEE. 2013. V58. 7 Romadhon,  Subagiyo,  Sebastian  M.  Isolasi  dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Usus Udang Penghasil Bakteriosin Sebagai Agen Antibakteria  Pada  Produk-Produk  Hasil Perikanan. Jurnal Saintek Perikanan Vol. 8. No. 1 . 2012. Sopandi T dan Wardah. Mikrobiologi Pangan – Teori dan Praktik. Yogyakarta: Penerbit ANDI;2014.
Sun, Yalian, Xiuyu Lou, Xuan Zhu, Han Jiang, Qing Gu. 2014. Isolation and Characterization of Lactic Acid Bacteria Producing Bacteriocin from  Newborn  Infants  Feces.  .  J  Bacteriol Mycol. 2014;1(2): 7.
Syafiq,  A,  Sauriasari  R,  Fikawati  S,  Amelia  P, Soemijati  A,  Christy  M,  dan  Saragih  F. 2015.  Effect  of  Inulin  Supplemented  UHT
Milk Consumption on Faecal
Bifidobacterium  sp.  And  Lactobacillus  sp. Of  Healthy  Children  in  Depok,  Indonesia. Malaysian Journal of Nutrition 2015 Vol.21 No.2 pp.219-230 ref.19
Thakkar P, H.A. Modi, dan J.B. Prajapati. Isolation, Characterization, and Safety Assessment of
Lactic Acid Bacterial Isolates from Fermented Food Products. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci  (2015)  4(4): 713-725
Vandenplas  Y,  Huys  G,  Daube  G.  Probiotics:  an update. J Pediatr (Rio J). 2015;91:6---21.