# Korespondensi:  Balai  Riset  Perikanan  Budidaya  Air  Tawar  dan Penyuluhan  Perikanan.  Jl.  Sempur  No.  1,  Bogor  16129, Indonesia. Tel.  +  62  251  8313200 E-mail:    desysugiani@yahoo.co.id
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## VAKSIN KERING BEKU SEL UTUH BAKTERI Aeromonas hydrophila UNTUK PENCEGAHAN PENYAKIT MOTILE AEROMONADS  SEPTICEMIA PADA  IKAN LELE, NILA,  DAN GURAMI
Desy  Sugiani # ,  Taukhid,  Uni  Purwaningsih,  dan  Angela  Mariana  Lusiastuti
Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Jl. Sempur  No. 1, Bogor 16129
(Naskah diterima: 11 Januari 2018; Revisi final: 8 Mei 2018; Disetujui publikasi: 8 Mei 2018)

## ABSTRAK
Vaksinasi merupakan salah satu cara yang efektif untuk pencegahan penyakit infeksius pada budidaya ikan. Produk  vaksin  yang  tersedia  saat  ini  masih  berbasis  produk  cair  (water  based  vaccines),  yang  memiliki kekurangan dalam stabilitas produk yang tidak tahan lama jika disimpan dalam suhu ruang dan keterbatasan dalam  tranportasi.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengembangkan  metode  preparasi  sediaan  produk vaksin sel utuh Aeromonas hydrophila dalam bentuk kering beku (freeze dried) untuk pengendalian penyakit pada ikan lele (Clarias sp.), nila (Oreochromis niloticus), dan gurami (Osphronemus gouramy). Penelitian dilakukan dengan membuat produk vaksin kering beku pada suhu -100°C, uji mutu, uji keamanan, dan uji efikasi. Penelitian ini telah menghasilkan produk vaksin kering beku yang aman diaplikasikan pada ikan lele, nila, dan gurami, serta dapat menginduksi peningkatan level titer antibodi. Sediaan vaksin sel utuh A. hydrophila dengan metode kering beku dapat mereduksi berat produk vaksin cair 100 g menjadi serbuk sebesar 4,2 g. Efikasi vaksin menghasilkan tingkat sintasan relatif (RPS/relative percent survival) pada ikan nila (Oreochromis niloticus) 45,83%; ikan lele (Clarias sp.) 70%; dan ikan gurami (Osphronemus gouramy) 31,67%. Vaksin kering beku sel utuh bakteri Aeromonas hydrophila paling efektif diberikan pada ikan lele untuk mencegah penyakit Motile Aeromonads Septicemia.
KATA KUNCI: vaksin kering beku; Aeromonas hydrophila; lele; nila; gurami; RPS
ABSTRACT: The efficacy of freeze dried whole cell vaccine Aeromonas hydrophila against motile aeromonads septicemia on catfish, tilapia, and gouramy. By: Desy Sugiani, Taukhid, Uni Purwaningsih, and Angela Mariana Lusiastuti
Vaccination is one of the most effective methods to prevent disease outbreaks and distribution in aquaculture. Commercial fish vaccine products are mainly available in liquid-based products (water-based vaccines), which have several limitations such as stability issues of the products (durability) when stored at room temperature, bulky packaging, and transportation complexity during distribution. This study aimed to develop a method of vaccine preparation using the freeze-dried method as part of the management control of Aeromonads septicemia disease in freshwater aquaculture. The study consisted of several stages: the first stage was the production of freeze-dried Aeromonas hydrophila vaccine product at -100°C. The second stage was vaccine quality test followed by the third stage which was vaccine efficacy test. This research produced frozen dried vaccine products that were considered safe to be applied to catfish, tilapia, and gourami, and could increase the antibody titer. The formation of the whole cell vaccine of A. hydrophila using the freeze-dried method could reduce the weight of the liquid form of the vaccine product from 100 g to a powder weighing only 4.2 g. The results of the vaccine efficacy test showed the relative percent survivals (RPSs) of Clarias sp., Oreochromis  niloticus  and  Osphronemus  gouramy  were  70%,  45.83%,  and  31.67%,  respectively.  Freeze  dried vaccine of whole cells Aeromonas hydrophila are most effective in catfish to prevent Motile Aeromanads Septicemia.
KEYWORDS: freeze-dried vaccine; Aeromonas hydrophila; Oreochromis niloticus; Clarias sp.; Osphronemus gouramy; RPS

## PENDAHULUAN
Aeromonas hydrophila adalah bakteri gram negatif yang menyebabkan hemorrhagic septicemia atau motile aeromonads septicemia (MAS) dengan mortalitas tinggi pada spesies ikan air tawar dan stadia pertumbuhan yang  berbeda  (Liu  et  al.,  2015;  Wang  et  al.,  2015; Sugiani  et  al.,  2012).  Gejala  MAS  termasuk pembengkakan  jaringan,  luka  merah,  nekrosis, ulserasi, dan septikemia hemoragik. Spesies ikan yang paling sering terkena dampak MAS meliputi ikan nila, ikan lele, ikan mas (Salah et al., 2015), dan ikan gurami (Sugiani et al., 2016). Meskipun A. hydrophila biasanya dianggap  sebagai  patogen  sekunder  terkait  dengan wabah  penyakit,  bisa  juga  muncul  sebagai  patogen utama yang menyebabkan wabah pada budidaya ikan dengan tingkat kematian tinggi dan kerugian ekonomi yang serius terhadap akuakultur.
Untuk  mengendalikan  MAS,  ikan  yang  terinfeksi dapat diobati dengan antibiotik melalui pakan maupun perendaman. Namun, praktek ini mahal dan biasanya tidak efektif karena ikan sakit cenderung tidak mau makan.  Selain  itu,  MAS  yang  disebabkan  oleh  A. hydrophila termasuk infeksi akut yang menyebabkan mortalitas dalam 24 jam (Pridgeon & Klesius, 2011). Selanjutnya,  hanya  ada  tiga  antibiotik  saat  ini  yang disetujui  penggunaannya  secara  terbatas  oleh pemerintah Indonesia berdasarkan Permen KP No. 52 Tahun 2014 di antaranya golongan tetrasiklina dengan nama  zat  aktif  klortetrasiklina,  oksitetrasiklina, tetrasiklina. Selain itu, ada juga golongan makrolida dengan zat aktif eritromisina, dan golongan kuinolon dengan  nama  zat  aktif  enrofloksasina.  Meluasnya penggunaan  antibiotik  untuk  mengobati  penyakit bakteri  dalam  akuakultur  telah  menyebabkan berkembangnya  resistensi  antibiotik  terhadap berbagai  jenis  patogen  ikan  di  seluruh  dunia.  Oleh karena  itu,  metode  pengendalian  alternatif  sangat dibutuhkan dalam industri akuakultur.
Vaksinasi  telah  terbukti  menjadi  strategi pencegahan penyakit yang efektif dengan kemampuan untuk  mengurangi  wabah  penyakit  (Pridgeon  et  al., 2012; Sugiani et al., 2013; 2015). Ada beberapa vaksin yang  telah  dikembangkan  untuk  melindungi  ikan terhadap penyakit yang disebabkan oleh A. hydrophila yaitu vaksin inaktif dari bakteri yang dilemahkan dan vaksin sub-unit (Caipang et al., 2014). Meskipun vaksin suntik  dapat  mengembangkan  kekebalan  protektif untuk A. hydrophila (Dash et al., 2011; Sugiani et al., 2014),  namun  pengembangan  aplikasi  vaksin  pada pembudidaya ikan di Indonesia kurang efektif sehingga memengaruhi tingkat keberhasilan kegiatan vaksinasi ikan.
Beberapa vaksin bakteri telah dikembangkan dan diuji  coba  secara  eksperimental.  Sebagian  besar
vaksin bakteri memberikan tanggap kebal pada inang terhadap  uji  tantang  patogen.  Meskipun  sebagian besar vaksin bakteri terbukti efisien, upaya penelitian masih diperlukan untuk membuat vaksin yang benar- benar  efektif  untuk  ikan.  Pemahaman  tentang mekanisme  kekebalan  ikan  selama  vaksinasi  akan menghasilkan desain dan metode vaksinasi yang lebih baik,  yang  pada  akhirnya  dapat  menghasilkan kemampuan  proteksi  yang  lebih  tinggi  bila  terjadi infeksi bakteri di fasilitas akuakultur (Caipang et al., 2014).
Sediaan vaksin saat ini lebih banyak dalam bentuk cair, hal ini tentu saja menambah biaya kirim produk dan  berimbas  pada  meningkatnya  harga  vaksin. Penyimpanan vaksin dalam bentuk cair biasanya hanya bertahan  selama  satu  tahun  dalam  suhu  4°C.  Jika disimpan dalam suhu ruang disinyalir produk vaksin akan cepat rusak. Sugiani et al. (2016) melakukan survai ke pembudidaya dan diperoleh informasi bahwa jenis sediaan vaksin kering (powder) diminati pembudidaya untuk digunakan dalam aplikasi vaksinasi sama halnya dengan vaksin cair. Bakteri dapat dikeringkan pada suhu rendah  (freeze  dried)  dengan  dua  metode,  yaitu pengeringan semprot (spray drying) dan pengeringan vakum  (vacuum  drying)  dengan  tujuan  untuk meningkatkan daya tahan dalam proses lama waktu penyimpanan (Chavez & Ledeboer, 2007). Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode preparasi sediaan  produk vaksin  melalui  metode kering  beku (freeze  dried)  dengan  pengeringan  vakum  untuk pengendalian penyakit ikan lele, nila, dan gurami.

## BAHAN DAN METODE

## Isolat Bakteri dan  Ikan  Uji
Bakteri  yang  digunakan  sebagai  sumber pembuatan vaksin (master seed) adalah isolat bakteri Aeromonas hydrophila AHL0905-2 yang dikultur pada media Tryptic Soy Agar (TSA). Ikan  uji menggunakan ikan  air  tawar  yaitu  ikan  nila  (Oreochromis  niloticus) berukuran 35 ± 0,5 g; ikan lele (Clarias sp.) berukuran 15  ±  0,5  g;  dan  ikan  gurami  (O.  gouramy  Lac.) berukuran 25 ± 1,5 g.  Semua ikan yang digunakan sudah melewati masa aklimatisasi selama 14 hari.

## Preparasi  Vaksin  Kering  Beku
Preparasi vaksin stok A. hydrophila dengan metode tanam kering di media agar. Bakteri A. hydrophila hasil postulat koch  diinokulasi  dalam  media  TSA,  dikultur secara  merata  di  seluruh  permukaan  media  agar, diinkubasi dalam inkubator selama ± 24 jam pada suhu 27°C.  Koloni  bakteri  yang  tumbuh  dikoleksi menggunakan jarum  ose dan  dimasukkan ke  dalam botol volume 150 mL yang berisi 100 mL larutan salin steril  (NaCl  0,845%).  Selanjutnya  suspensi  bakteri
diinaktifasi dengan menambahkan NBF (neutral buffer formalin) 3% (v/v), melalui pengadukan selama ± 6 jam. Pengukuran  kepekatan  suspensi  stok  vaksin menggunakan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang  660  nm  dan  dilakukan  platting  untuk mengetahui kepadatan sel (cell forming unit) (cfu). Stok vaksin yang telah diperoleh kemudian disimpan dalam freezer  dengan  suhu  -60°C  selama  ±  24  jam.  Stok vaksin beku dikeringkan dalam mesin pengering vakum pada suhu -100°C (CoolSafe™ freeze dryer) selama 36- 48  jam.  Setelah  kering  sempurna,  vaksin  disimpan dalam suhu 4°C, sedangkan untuk penyimpanan jangka panjang vaksin disimpan dalam suhu -20°C.

## Uji  Sterilitas  dan  Keamanan  Vaksin
Uji  sterilisasi  stok  bakteri  dilakukan  dengan mengkultur  sediaan  vaksin  dalam  media  TSA  dan diinkubasi  pada  suhu  27°C  selama  24  jam  untuk mengetahui  ada  tidaknya bakteri  yang  tumbuh  dari jenis  A.  hydrophila  maupun  bakteri  kontaminan.  Uji keamanan  vaksin  dilakukan  pada  setiap  perlakuan masing-masing  menggunakan  ikan  lele,  nila,  dan gurami sebanyak 100 ekor dengan tiga kali ulangan. Setiap ekor ikan disuntik intraperitoneal dengan 0,2 mL vaksin. Setelah tujuh hari pemeliharaan dilakukan reisolasi bakteri untuk mendeteksi A. hydrophila dari ikan perlakuan. Vaksin dikatakan aman jika hasil dari reisolasi  tidak  diperoleh  bakteri  aktif  yang  sama dengan isolat vaksin dan tidak terjadi kematian ikan pasca vaksinasi.

## Uji Efikasi  Vaksin dan  Uji Tantang
Pengujian  efikasi  vaksin  kering  beku  dilakukan pada tiga jenis ikan yang berbeda (nila, lele, dan gurami) dengan tiga ulangan dan kontrol tanpa vaksin. Vaksin kering  beku  diencerkan  menggunakan  larutan  salin steril (NaCl 0,845%) sebanyak 100 mL, hingga suspensi terlarut sempurna. Setiap ekor ikan diinjeksi intrap- eritoneal dengan 0,2 mL suspensi vaksin. Pemeliharaan ikan  setelah  divaksin  dilakukan  selama  21  hari  dan waktu uji tantang salama 14 hari. Uji tantang dengan menggunakan bakteri A. hydrophila virulen pada dosis LD 50 (1  x  10 7 cfu  mL -1 ).  Ikan  diamati  setiap  minggu untuk gambaran hematologi dan diamati setiap hari untuk sintasan (SR), kemudian dihitung menjadi nilai relative  percent  survival  (RPS)  untuk  menentukan efektivitas  vaksinasi.

## HASIL DAN BAHASAN

## Vaksin  A.  hydrophila  Kering  Beku
Hasil  produk  vaksin  kering  beku  sel  utuh  A. hydrophila disimpan dalam wadah tabung kaca volume 15 mL dilengkapi dengan penutup dan diisi sediaan vaksin  sebanyak  5-7  mL.  Lama  waktu  pengeringan
dengan kepadatan sel bakteri 3 x 10 11 cfu mL -1 adalah ± 42 jam tanpa henti hingga diperoleh sediaan vaksin kering  beku  yang  sempurna.  Hasil  sediaan  vaksin kering beku A. hydrophila dari yang semula berbentuk cair dengan berat 100 g terdehidrasi menjadi serbuk berwarna putih kemerahan dengan berat 4,2 g. Vaksin dalam  bentuk  serbuk  tersebut  lebih  mudah  dalam pengemasan dan proses pengiriman. Menurut Toledo et  al.  (2010),  bakteri  yang  dikeringkan  dapat menghasilkan  produk  yang  terdehidrasi  dan  stabil selama penyimpanan. Vaksin dalam bentuk kering yang telah terdehidrasi diharapkan akan lebih tahan lama jika  dibandingkan  dengan  produk  cair  dan  dapat disimpan pada suhu ruang untuk jangka waktu tertentu.
Serbuk vaksin kering beku yang dihasilkan dalam penelitian ini belum dapat terlarut sempurna ketika proses pengenceran kembali sebelum digunakan untuk perlakuan vaksinasi, diduga karena sel bakteri yang terlalu  kering  dan  tidak  terenkapsulasi  sehingga menghambat proses kelarutan suspensi. Pembuatan sediaan  vaksin  kering  beku  selanjutnya  dapat menggunakan filler untuk membantu daya larut dalam air. Chavez & Ledeboer (2007) mengemukakan bahwa bakteri  dapat  dikeringkan  pada  suhu  rendah  (freeze dried) untuk meningkatkan masa waktu penyimpanan. Bakteri kering dapat bertahan selama lebih dari tiga bulan  pada  suhu  30°C.  Penambahan  protein  dan karbohidrat sebagai pembawa (filler) dapat menambah masa  waktu  penyimpanan  dan  efektivitasnya  dapat dipertahankan optimal. Penggunaan protein kedelai dan  maltodekstrin  atau  susu  skim  dan  gum  acacia (gummi  arabicum)  dapat  menghasilkan  tingkat ketahanan bakteri kering terbaik selama penyimpanan.

## Sterilitas  dan  Keamanan  Vaksin
Hasil uji sterilitas pada sediaan vaksin kering beku setelah dilakukan preparasi gores pada media triptone soya agar (TSA) dan platting cair pada media triptic soy broth  (TSB)  menunjukkan  tidak  ada  bakteri  yang tumbuh  dari  jenis  A.  hydrophila  maupun  bakteri kontaminan.
Hasil  uji  keamanan  vaksin  (Gambar  1) memperlihatkan bahwa ikan nila, lele, dan gurami yang telah diinjeksi melalui intraperitoneal dengan sediaan vaksin  kering  beku  tersebut  menunjukkan  tingkat kematian ikan  hanya 0,33%-0,67% selama  tujuh hari pascainjeksi. Hasil pengamatan gerakan renang nor- mal, nafsu makan stabil, dan tidak menunjukkan gejala peradangan ataupun tukak di area bekas injeksi. Gejala perubahan tingkah laku dan kerusakan di area bekas injeksi tersebut biasanya akan muncul jika ada efek toksik dari sediaan vaksin terhadap ikan (vaksin tidak aman).  Selama  masa  uji keamanan  vaksin  tidak  ada ikan yang menunjukkan gejala terinfeksi A. hydrophila.
Hasil re-isolasi terhadap beberapa ikan pascavaksinasi juga  tidak  ditemukan  adanya  pertumbuhan  bakteri yang  sama  dengan  A.  hydrophila.  Dengan  demikian vaksin kering beku yang dihasilkan pada pengujian ini dapat  dinyatakan  aman  untuk  ikan  uji  dan  bersifat steril.

## Efikasi  Vaksin
Hasil titer antibodi menunjukkan bahwa perlakuan vaksin kering beku pada masa induksi vaksin sampai minggu  ke-2  untuk  kelompok  ikan  lele,  nila,  dan gurami  ternyata  lebih  tinggi  dalam  membentuk respons  imun  dengan  nilai  5-8  (log  2).  Selanjutnya semua  perlakuan  mengalami  penurunan  nilai  titer antibodi  pada  masa  minggu  ke-3  dan  pada  saat dilakukan uji tantang. Pada masa pemulihan yaitu dua minggu  setelah  uji  tantang  terlihat  bahwa  titer antibodi  mengalami  sedikit  peningkatan  yang kemudian diikuti adanya penurunan kembali (Gambar 2).
Titer antibodi mencerminkan kemampuan tubuh ikan  terhadap  infeksi  bakteri  melalui  respons  imun spesifik.  Semakin  tinggi  nilai  titer  antibodi  maka diharapkan kemampuan perlindungan terhadap infeksi juga  menjadi  tinggi.  Antibodi  yang  beredar  dalam sirkulasi  darah  akan  menetralisasi  molekul antifagositik dan eksotoksin lainnya yang diproduksi bakteri.  Hasil  penelitian  terhadap  respons  humoral pada nila merah terhadap A. hydrophila yang diinaktivasi dengan formalin dan diberikan dengan injeksi intrap- eritoneal  dapat  menginduksi  titer  antibodi  pada 925,87 ± 467,92 dan 4.983,47 ± 1.832,74 masing- masing  pada  respons  imun  primer  dan  sekunder (Prasad & Areechon, 2010).
Ikan  dapat  membentuk  pertahanan  diri  apabila terjadi  suatu  serangan  patogen  atau  benda  asing. Respons  imun  ini  bersifat  alami  yang  melibatkan sirkulasi dan perbaikan jaringan melalui respons fagosit granulosit  (neutrofil  dan  eosinofil  sel  granular) monosit, dan sel makrofag. Respons imun alami ini hanya dapat bertahan dan berfungsi dengan baik pada beberapa hari atau minggu setelah adanya invasi bakteri ke dalam tubuh dan berfungsi sebagai respons imun anti-infeksi  fase  awal.  Caruso  et  al.  (2002) mengemukakan bahwa selama infeksi bakteri sedang berlangsung, adanya respons pertahanan ikan ditandai dengan banyaknya leukosit yang ditransfer sehingga akan  nampak  adanya  peningkatan  jumlah  leukosit dalam  darah  yang  berfungsi  untuk  mengeliminasi serangan bakteri.
Jumlah monosit, neutrofil, dan limfosit mengalami fluktuasi membentuk suatu homeostasi total leukosit dengan rata-rata terlihat adanya peningkatan jumlah limfosit dan monosit, serta adanya penurunan jumlah neutrofil jika dibandingkan dengan kontrol (Gambar 3, 4, 5).
Hal ini menunjukkan adanya aktivitas pertahanan non-spesifik  dari  ikan  berupa  peningkatan  monosit darah yang berfungsi sebagai sel fagosit (makrofag) yang  akan  memfagositosis  antigen  bakteri  dalam tubuh ikan. Peningkatan jumlah limfosit menunjukkan bahwa ada aktivitas pertahanan selular spesifik yang memungkinkan  adanya  pembentukan  antibodi  atau memori pada ikan yang dapat bertahan dari infeksi A. hydrophila.
Bailonea  et  al.  (2010)  memperoleh  hasil  bahwa vaksinasi polivalen (Aeromonas hydrophila, Pseudomo-
Gambar 1. Sintasan ikan nila, lele, dan gurami pada uji keamanan vaksin kering beku A. hydrophila.
Figure 1. Survival  rates  of  tilapia,  catfish,  and  gouramy  on  freeze-dried  vaccine safety tests. 98.8 99 99.2 99.4 99.6 99.8 100 100.2 1 2 3 4 5 6 7 Si n ta sa n /S ur vi va l r at e (% ) Hari ke- (Days) Nila (Tilapia) Lele (Catfish)
Gurami (Gouramy)
Nila (Tilapia)               Lele (Catfish)               Gurami (Gouramy)
Gambar 2. Titer antibodi ikan lele, nila, dan gurami pasca vaksinasi dengan vaksin kering beku dan setelah uji tantang dengan A. hydrophila.
Figure 2. Titer antibodies of catfish, tilapia, and gouramy post vaccination using freeze-dried vaccine  and after challenge test with A. hydrophila.
Gambar 3. Keragaan total limfosit pada ikan lele, nila, dan gurami selama vaksinasi dengan vaksin kering beku dan setelah uji tantang dengan A. hydrophila.
Figure 3. Performance  of  total  lymphocytes  of  catfish,  tilapia,  and  gouramy  during  vaccination using freeze-dried vaccine and after challenge test with A. hydrophila.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3
4 6 8 12 Masa induksi vaksin minggu ke- Weeks of the induction of vaccine Masa setelah uji tantang minggu ke- Weeks of the induction of vaccine after challenge Masa induksi vaksin minggu ke-
Weeks of the induction of vaccine T it er an ti b o d i A nt ib od y ti tr e (l o g 2 ) Waktu pengamatan (Observation time) Lele (Catfish) Nila (Tilapia) Gurami (Gouramy) Lele (Catfish)
Nila (Tilapia)
Gurami (Gouramy) Masa induksi vaksin minggu ke- Weeks of  the induction of vaccine Masa induksi vaksin minggu ke-
Weeks of  the induction of vaccine
Masa setelah uji tantang minggu ke- Weeks of  the induction of vaction after challenge
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 2 3 4
6 8 Masa induksi vaksin minggu ke- Weeks of the induction of vaccine Masa setelah uji tantang minggu ke-
Weeks of the induction of vaccine after challenge D iffe re nsi al le uk osi t (L im fo si t % ) D iffe re nt ia l l eu coc yt es (Ly m ph oc yt es % ) Waktu pengamatan (Observation time) Lele (Catfish) Nila (Tilapia) Gurami (Gouramy) Lele (Catfish)         Nila (Tilapia)          Gurami (Gouramy) Masa induksi vaksin minggu ke-
Weeks of  the induction of vaccine
Masa setelah uji tantang minggu ke-
Weeks of  the induction of vaction
after challenge
nas  aeruginosa,  dan  Enterococcus  durans)  dapat memengaruhi respons aglutinasi hematologi dan se- rum pada ikan nila yang ditantang dengan Aeromonas hydrophila dengan dua dosis; 1 x 10 4 cfu mL -1 dan 1 x 10 8 cfu mL -1 . Ikan diuji tantang sepuluh hari setelah vaksinasi secara intraperitoneal dengan A. hydrophila LD 50 -96 jam (1 x 10 7 cfu mL -1 ). Sebelum dan sesudah uji tantang, jumlah total leukosit dan jumlah limfosit
menunjukkan  nilai  tertinggi  pada  ikan  yang divaksinasi.  Penelitian  tersebut  juga  menunjukkan bahwa 10 hari setelah imunisasi terjadi peningkatan eritrosit,  leukosit,  trombosit,  dan  produksi  limfosit dalam darah.
Rata-rata kematian ikan setelah uji tantang untuk ikan nila tervaksin 14,44%; ikan nila kontrol 26,67%; ikan lele tervaksin 10%; ikan lele kontrol 33,33%; ikan
Gambar 4. Keragaan total neutrofil pada ikan lele, nila, dan gurami selama vaksinasi dengan vaksin kering beku dan setelah uji tantang dengan A. hydrophila.
Figure 4. Performance of total neutrophils of catfish, tilapia, and gouramy during vaccina- tion freeze-dried vaccine and after challenge test with A. hydrophila.
Gambar 5. Keragaan  total  monosit  pada  ikan  lele,  nila,  dan  gurami  selama  vaksinasi dengan vaksin kering beku dan setelah uji tantang dengan A. hydrophila. Figure 5. Performance of total monocytes of catfish, tilapia, and gouramy during vaccination freeze-dried vaccine and after challenge test with A. hydrophila.
0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 4 6 8 Masa induksi vaksin minggu ke- Weeks of the induction of vaccine
Masa setelah uji tantang minggu ke- Weeks of the induction of vaccine after challenge D if fe re n si al le u ko si t (N eu tr o fi l % ) D iffe re nt ia l l eu coc yt es (N eu tr op hi ls % ) Waktu pengamatan (Observation ime) Lele (Catfish) Nila (Tilapia) Gurami (Gouramy)
-5 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 6 8 Masa induksi vaksin minggu ke-
Weeks of the induction of vaccine Masa setelah uji tantang minggu ke- Weeks of the inductionof vaction after challenge D if fe re n si al le uk o si t (M o n o si t %) D iffe re nt ia l l eu coc yt es (M on oc yt es %) Waktu pengamatan (Observation time) Lele (Catfish) Nila (Tilapia) Gurami (Gouramy) Masa induksi vaksin minggu ke- Weeks of  the induction of vaccine Masa setelah uji tantang minggu ke- Weeks of  the induction of vaction after challenge Lele (Catfish)       Nila (Tilapia)       Gurami (Gouramy) Lele (Catfish) Nila (Tilapia) Gurami (Gouramy) Masa induksi vaksin minggu ke-
Weeks of  the induction of vaccine
Masa setelah uji tantang minggu ke- Weeks of  the induction of vaction after challenge
gurami  tervaksin  45,56%;  dan  ikan  gurami  kontrol 66,67%.  Hasil  tersebut  memperlihatkan  adanya perbedaan  kematian  ikan  sebesar  12,23%  untuk kelompok ikan nila; 23,33% untuk kelompok ikan lele; dan  21,11%  untuk  kelompok  ikan  gurami.  Sintasan tertinggi  diperoleh  kelompok  ikan  nila  dengan vaksinasi  dan  yang  terendah  adalah  kelompok  ikan gurami tanpa vaksin. Gambar 6 memperlihatkan bahwa kelompok perlakuan vaksin ikan nila, lele, dan gurami setelah  diuji  tantang  dengan  bakteri  homolog berdasarkan  jenis  vaksin  yang  diberikan  memiliki sintasan yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan tanpa vaksinasi.
Nilai  RPS  ikan  nila,  lele,  dan  gurami  pasca  uji tantang  menunjukkan  hasil  yang  berbeda  nyata (Tabel  1).  Nilai  RPS  tertinggi  (70%)  didapat  dari
perlakuan  vaksin  kering  beku  A.  hydrophila  yang diberikan pada ikan lele dan diuji tantang oleh bakteri tunggal A. hydrophila homolog. Tingkat sintasan relatif (RPS) ikan nila yang divaksinasi menggunakan vaksin A. hydrophila yang diinaktivasi dengan formalin (0,3%) setelah  uji  tantang  adalah  49,99-66,66%  pada  6-10 minggu pascavaksinasi (Salah et al., 2015).
Persyaratan  dari  Kementerian  Kelautan  dan Perikanan bahwa nilai RPS untuk produk vaksin ikan yang  dapat  dikatakan  baik  dan  dapat  diedarkan  ke pembudidaya adalah yang memiliki RPS > 50%, akan tetapi  nilai  RPS  pada  ikan  nila  (45,83%)  dan  gurami (31,67%)  masih  rendah,  capaian  nilai  RPS  ini  masih dapat ditingkatkan lagi dengan cara pembuatan produk vaksin menggunakan teknologi kering beku dengan memberikan tambahan perlakuan enkapsulasi pada sel
Gambar 6. Sintasan ikan nila, lele, dan gurami pasca uji tantang dengan A. hydrophila. Figure 6.
Survival rate of tilapia, catfish, and gouramy after challenge test with A. hydrophila.
Tabel 1. Nilai sintasan relatif (RPS) ikan nila, lele, dan gurami pascavaksinasi dengan vaksin kering beku A. hydrophila
Table 1. Relative percent survival (RPS) value of tilapia, catfish, and gouramy post vaccina- tion with freeze dried vaccine A. hydrophila
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata pada taraf uji P>0,05
Remarks: The  numbers  followed  by  different  letters  in  the  same  column  show significantly  different  at  the  P>0.05  test  level Perlakuan jenis ikan Fish type per treatment RPS Relative percent survival  (%) Nila (Oreochromis niloticus ) 45.83 a Lele (Clarias  sp.) 70.00 b Gurami (Osphronemus gouramy ) 31.67 c
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Si n tas an /S ur vi va l r at e (% ) Uji tantang (Hari ke-) / Days of challenge Nila vaksinasi (Tilapia vaccine) Lele vaksinasi (Catfish vaccine) Gurami vaksinasi (Gouramy vaccine) Nila kontrol (Tilapia control)
Lele kontrol (Catfish control) Gurami kontrol (Gouramy control)
Nilai vaksinasi (Tilapia vaccine)
Gurami vaksinasi (Gouramy vaccine) Lele kontrol (Catfish control) Lele vaksinasi (Catfish vaccine) Nila kontrol (Tilapia control) Gurami kontrol (Gouramy control)
bakteri sebelum dilakukan proses pengeringan untuk melindungi  sel  bakteri  dan  untuk  meningkatkan tingkat kelarutan produk, dan dibuat dalam sediaan multivalen. Sediaan vaksin dalam bentuk bivalen atau polivalen  akan  lebih  meningkatkan  RPS  ikan dibandingkan  dengan  vaksin  monovalen  dalam melindungi ikan dari serangan infeksi tunggal maupun ko-infeksi (Sugiani et al., 2013; 2015).
Hasil penelitian pencegahan penyakit Streptococ- cosis akibat infeksi Streptococcus iniae pada nila merah (Oreochromis niloticus x O. mossambicus) menggunakan vaksin  bakteri  yang  diinaktivasi  formalin  dengan perlakuan 1% vaksin kering beku yang dicampur pakan komersil yang diberikan secara oral menunjukkan hasil titer  antibodi  pada  minggu  ke-1  (0,70  ±  0,17)  dan minggu  ke-4  (0,40  ±  0,46).  Kematian  ikan  selama masa  induksi  vaksin  9,75%  dengan  nilai  persentase sintasan relatif (RPS) sebesar 41,46% (Suanyuk & Itsaro, 2011).
Penggunaan vaksin kering beku pada ikan salmon untuk  penyakit  furunkulosis  memperlihatkan  nilai persentase  sintasan  relatif  (RPS)  sebesar  70%-100% pada aplikasi lapang, akan tetapi nilai RPS turun lebih rendah  30%-40%  setelah  diuji  tantang  secara eksperimental.  Formulasi  vaksin  kering  beku  telah diuji kemampuannya dan dapat memberikan respons yang  baik  untuk  proliferasi  limfosit  dan  produksi antibodi. Vaksin kering beku  memiliki masa simpan yang lebih panjang dengan potensi yang sama seperti bakteri  yang  baru  tumbuh,  menunjukkan  bahwa potensi tersebut ada untuk vaksin hidup yang layak diproduksi  untuk  digunakan  dalam  akuakultur (Marsden et al., 1998).

## KESIMPULAN
Sediaan  vaksin  sel  utuh  A.  hydrophila  dengan metode kering beku dapat  mereduksi berat produk vaksin cair 100 g menjadi serbuk sebesar 4,2 g. Efikasi vaksin menghasilkan tingkat sintasan relatif (RPS/rela- tive percent survival) pada ikan nila (Oreochromis niloticus) 45,83%;  ikan  lele  (Clarias  sp.)  70%;  dan  ikan  gurami (Osphronemus gouramy) 31,67%.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini telah terlaksana dengan sumber dana dari  DIPA  BPPBAT  T.A.  2016,  Kementerian  Kelautan dan Perikanan dengan judul “Preparasi sediaan vaksin melalui enkapsulasi dan freeze dried untuk pengendalian penyakit ikan”. Penulis mengucapkan terima kasih atas kerja  sama  dalam  pelaksanaan  kegiatan  penelitian kepada  Bapak  Setiadi,  Edy  Farid  Wadjdy,  Ahmad Wahyudi, dan Johan Afandi.

## DAFTAR  ACUAN
Bailonea, R.L., Martinsa, M.L., Mourinoa, J.L.P., Vieiraa, F.N.,  Pedrottia,  F.S.,  Nunesa,  G.C.,  &  Silvaa,  B.C. (2010). Hematology and agglutination titer after polyvalent immunization and subsequent challenge with  Aeromonas  hydrophila  in  Nile  tilapia (Oreochromis  niloticus).  Archivos  de  Medicina Veterinaria, 42, 221-227.
Caipang, M.A.C., Lucanas, J.B., & Lay-yag, C.M. (2014).
Updates on the vaccination against bacterial dis- eases in tilapia, Oreochromis spp. and Asian seabass, Lates calcarifer. AACL Bioflux, 7(3), 184-193.
Caruso,  D.,  Schlumberge,  O.,  Dahm,  C.,  &  Proteau, J.P.  (2002).  Plasma  lysozyme  levels  in  sheatfish Silurus  glanis  L.  subjected  to  stress  and  experi- mental infection with Edwardsiella tarda. Aquacul- ture Research, 33, 999-1008.
Chavez,  B.E.,  &  Ledeboer,  A.M.  (2007).  Drying  of probiotics: Optimization of formulation and pro- cess  to  enhance  storage  survival.  Journal  Drying Technology, 25(7-8), 1193-1201.
Dash, S., Das, S.K., Samal, J., Ojha, P.K., Patra, J.K., & Thatoi, H. (2011). Dose dependence specific and non-specific  immune  responses  of  indian  major carp  (L.  rohita  ham)  to  intraperitoneal  injection of formalin killed Aeromonas hydrophila whole cell vaccine.  Veterinary  Research  Communications,  35, 541-552.
Liu, L., Gong, Y.-X., Zhu, B., Liu, G.-L., Wang, G.-X., & Ling,  F.  (2015).  Effect  of  a  new  recombinant Aeromonas  hydrophila  vaccine  on  the  grass  carp intestinal  microbiota  and  correlations  with  im- munological responses. Fish Shellfish Immunology, 45, 175–183.
Marsden,  M.J.,  Vaughan,  L.M.,  Fitzpatrick,  R.M., Fosterm,  T.J.,  &  Secombes,  C.J.  (1998).  Potency testing  of  a  live,  genetically  attenuated  vaccine for salmonids. Vaccine, 16(11-12), 1087-1094.
Prasad, S., & Areechon, N. (2010). Efficacy of forma- lin-killed Aeromonas hydrophila and Streptococcus sp. vaccine in red tilapia. Our Nature, 8, 231-240.
Pridgeon, J.W., Klesius, P.H., Mu, X., & Song, L. (2011). An in vitro screening method to evaluate chemi- cals as potential chemotherapeutants to control Aeromonas hydrophila infection in channel catfish. Journal of Applied Microbiology, 111, 114-124.
Pridgeon,  J.W.,  Yildirim-Aksoy,  M.,  Klesius,  P.H., Srivastava,  K.K.,  &  Reddy,  P.G.  (2012).  Attenua- tion of  a virulent  Aeromonas  hydrophila  with  no- vobiocin and pathogenic characterization of the novobiocin-resistant strain. Journal of Applied Mi- crobiology, 113, 1319-1328.
Salah, M.A, Aqel, S.A., Arshad, H.R., & Nashwa, M.A.A.
(2015).  The  response  of  new-season  nile  tilapia to Aeromonas hydrophila vaccine. International Jour- nal of clinical, 8(3), 4508-4514.
Suanyuk,  N.,  &  Itsaro,  A.  (2011).  Efficacy  of  inacti- vated  Streptococcus  iniae  vaccine  and  protective effect of  b-(1.3/1.6)–glucan  on the  effectiveness of vaccine in red tilapia Oreochromis niloticus x O. mossambicus. Songklanakarin Journal of Science and Technology, 33(2), 143-149.
Sugiani,  D.,  Sukenda,  Harris,  E.,  &  Lusiastuti,  A.M. (2012). Pengaruh ko-infeksi bakteri Streptococcus agalactiae dengan Aeromonas hydrophila terhadap gambaran hematologi dan histopatologi ikan tila- pia (Oreochromis niloticus). Jurnal Riset Akuakultur, 7(1), 85-91.
Sugiani,  D.,  Sukenda,  Harris,  E.,  &  Lusiastuti,  A.M. (2013).  Vaksin  ikan  tilapia  (Oreochromis  niloticus) menggunakan vaksin monovalen dan bivalen untuk pencegahan penyakit motile aeromonas septicemia dan streptococcosis. Jurnal Riset Akuakultur, 8(2), 229-239.
Sugiani,  D.,  Lusiastuti,  A.M.,  Sukenda,  &  Harris,  E. (2014). Profil protein vaksin Aeromonas hydrophila dan Streptococcus agalactiae hasil inaktivasi dengan
formalin:  Diuji  menggunakan  sodium  dodecyl  sul- phate-polyacrylamide gel electrophoresis. Jurnal Riset Akuakultur, 9(3), 449-461.
Sugiani,  D.,  Aryati,  Y.,  Mufidah,  T.,  &  Purwaningsih,
U.  (2015).  Efektivitas  vaksin  bivalen  Aeromonas hydrophila  dan  Mycobacterium  fortuitum  untuk pencegahan  infeksi  penyakit  pada  ikan  gurami (Osphronemus  gouramy).  Jurnal  Riset  Akuakultur, 10(4), 567-577.
Sugiani, D., Arifin, O.Z., Purwaningsih, U., & Wadjdy, E.F.  (2016).  Uji  aplikasi  lapang  vaksin  bivalen hydrofortyVac dan vaksin monovalent (HydroVac dan  MycofortyVac)  pada  benih  ikan  gurami (Osphronemus  gouramy).  Media  Akuakultur,  11(2), 111-119.
Toledo,  N.,  Ferrer,  J.,  &  Bórquez,  R.  (2010).  Drying and storage  stability of a probiotic  strain incor- porated into a fish feed formulation. Journal Dry- ing Technology, 28(40), 508-516.
Wang,  N.,  Wu,  Y.,  Pang,  M.,  Liu,  J.,  Lu,  C.,  &  Liu,  Y. (2015). Protective efficacy of recombinant hemol- ysin  co-regulated  protein  (hcp)  of  Aeromonas hydrophila in common carp (Cyprinus carpio). Fish Shellfish Immunol., 46, 297-304.