## Perkembangan Awal

## Protocorm Anggrek Phalaenopsis amabilis secara In Vitro setelah Penambahan Zat Pengatur Tumbuh α-Naphtaleneacetic Acid dan Thidiazuron
Eka Fitriana Candra Ningrum 1 , Ikhsanudin Nur Rosyidi 1 , Rizka Riliant Puspasari 1 dan  Endang Semiarti 1 1 Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta Email : ikhsanudin.nur.r@mail.ugm.ac.id

## Abstract
Phalaenopsis  amabilis (L.)  Blume  is  one  of  nature  orchids  with  a  high  commercial  value.  The  orchid  cultivation  is difficult  because  the  seeds  are  microscopic  and  do n’t  have  the  endosperm,  so  it  needs  to  be  done  with in  vitro culture.  This  cultivation  need  medium  that  supports  the  growth  of  the  orchids  for  example  with  the  addition  kind  of plant  growth  regulator  that  is  auxin  and  cytokinin.  This  study  was  aimed  determining  effect  of  the  plant  growth regulator  of  early  development  of P.  amabilis orchid  protocorm in  vitro aspects  of  morphology  and  anatomy.Then protocorm  sub  cultured  on  medium  with  NAA  and  TDZ  combinations  at  various  concentrations  and  incubated  in  a room  temperature.  Protocorm  orchid  is  then  observed  for  2  weeks  which  includes  the  percentage  of  growth, percentage  protocorm  the  forming  buds  and  absorbing  hair.  Making  the  anatomical  preparations  made  by  taking protocorm  every  week,  stored  in  70%  alcohol  solution  and  made  preparations  anatomy  using  Parafin  method  with safranin staining. The results showed the addition of NAA and TDZ protocorm growth reached 100%. The protocorm percentage of the forming buds  as follows (0: 0, 0: 0.2, 0.5: 0, 0.5: 0.2, 1: 0 and 1: 0.2) ppm was 24%, 22%, 32%, 40%, 40%  and  38%  while  the  protocorm  observed  which form  absorbing  hair  included  10%,  18%,  14%,  24%,  16% and 0%. The cell diameter ranged from 39.2 ± 0.47μm, 0.97μm ± 44.4, 39.08 ± 0.5μm, 0.2μm ± 38.83, 39.5 ± 0.39μm and 39.75 ± 0.28μm. Therefore we can conclude that the most optimal medium in P. amabilis orchid growing in vitro is medium NP with a combination of NAA and TDZ (0.2: 0.5) ppm.
Key words : anatomy, in vitro cultivation, morphology, Phalaenopsis amabilis

## Abstrak
Phalaenopsis amabilis (L.) Blume merupakan salah satu anggrek alam dengan nilai komersial yang tinggi. Budidaya anggrek  ini  cukup  sulit  dilakukan  karena  biji  bersifat  mikroskopis  dan  tidak  memiliki  endosperm,  sehingga  perlu dilakukan  kultur in  vitro .  Dalam  budidaya  ini  diperlukan  medium  pendukung  pertumbuhan  anggrek  secara  optimal misalnya  dengan  penambahan  Zat  Pengatur  Tumbuh  (ZPT)  dari  golongan  auksin  dan  sitokinin.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  penambahan  ZPT  tersebut  terhadap  perkembangan  awal protocorm (pertumbuhan embrio anggrek) P. amabilis secara in vitro dari aspek morfologi  dan anatomi. Protocorm disubkultur pada  medium  NP  dengan  kombinasi  ZPT  NAA  dan  TDZ  pada  berbagai  konsentrasi  dan  diinkubasi  pada  suhu ruangan. Dilakukan pengamatan selama 2 minggu yang mencakup persentase pertumbuhan, persentase protocorm yang  membentuk  tunas  dan absorbing  hair .  Pembuatan  preparat  anatomi  dilakukan  dengan  mengambil protocorm setiap minggunya, disimpan dalam larutan alkohol 70% dan dibuat preparat anatomi menggunakan metode Parafin dengan  pewarnaan  safranin . Hasil  penelitian  menunjukkan  pada  penambahan  NAA  dan  TDZ  pertumbuhan protocorm mencapai  100%.  Persentase protocorm yang  membentuk  tunas  berturut  turut  (0:0,0,2:0,  0:0,5,  0,2:0,5, 0:1,  dan  0,2:1)  ppm  adalah  24%,  22%,  32%,  40%,  40%  dan  38%  sedangkan  untuk  pengamatan protocorm yang membentuk absorbing  hair sebesar  10%,  18%,  14%,  24%,  16%,  dan  0%.  Untuk  diameter  sel  berukuran 39.2±0.47µm, 44.4±0.97µm, 39.08±0.5µm, 38.83±0.2µm,39.5±0.39µm dan 39.75±0.28µm. Dapat disimpulkan bahwa medium  yang  paling  optimal  dalam  pertumbuhan  anggrek P.  amabilis secara in  vitro adalah  medium  NP  dengan kombinasi NAA dan TDZ (0.2 : 0.5) ppm.
Kata kunci : anatomi, kultur in vitro, morfologi, Phalaenopsis amabilis

## Pendahuluan
Salah  satu  spesies  tumbuhan  dengan keanekaragaman  yang  tinggi  di  Indonesia  adalah anggrek. Beberapa jenis anggrek mempunyai nilai komersial  yang  tinggi  karena  bentuk  bunga  yang indah,  unik,  dapat  bertahan  tahan  lama,  tidak mudah layu, dan memiliki waktu mekar yang lama sehingga  banyak  dicari  untuk  diperdagangkan (Chugh  et  al,  2009).  Salah  satu  anggrek  yang potensial untuk dikembangkan yaitu Phalaenopsis amabilis, yang  ditetapkan  sebagai  satu  dari  tiga Bunga Nasional Indonesia. Berdasarkan
Keputusan  Presiden  No.  4  Tahun  1993, P. amabilis disebut sebagai Puspa Pesona Indonesia.  Spesies  ini  memiliki  kelopak  berwarna putih,  bentuk  bunga  yang  eksotis  serta  bentuk bunga seperti kupu-kupu (Phalaenos) dan bentuk labellum  yang  khas  seperti  antena.  Hal  tersebut menyebabkan P.  amabilis banyak  dipilih  sebagai induk silangan untuk menghasilkan hibrida-hibrida unggul  terutama  anggrek  bulan  putih  di  dunia. Namun,  popularitas P.  amabilis sebagai  bunga asli Indonesia justru meredup karena keberadaannya  di  alam  semakin  sukar  dijumpai
akibat  eksploitasi  yang  berlebihan  maupun kerusakan hutan. Kendala pengembangan anggrek  ini  di  Indonesia  antara  lain  terbatasnya bibit  unggul,  teknologi  yang  digunakan  masih sederhana, dan kurangnya dukungan pemerintah.  Oleh  karena  itu,  diperlukan  upaya budidaya  yang  lebih  efektif  dan  efisien  untuk meningkatkan produktivitas spesies anggrek ini di alam.
Budidaya yang telah dilakukan para peneliti anggrek  adalah  kultur  jaringan  secara in  vitro . Kultur  jaringan  merupakan  metode  perbanyakan tanaman  dengan  menggunakan  bagian  vegetatif tanaman dan ditumbuhkan dalam medium buatan serta  dilakukan  di  tempat  steril  (Razdan,  2003). Metode  ini  sebagai  alternatif  untuk  mendapatkan propagasi klon tanaman dalam waktu singkat dan jumlah  besar.  Kultur in  vitro dapat  dilakukan dengan 3 cara, yaitu pembentukan tunas adventif, poliferasi tunas lateral dan embriogenesis somatic.  Setiap  tunas  yang  dihasilkan  dapat dijadikan sebagai sumber eksplan untuk penggandaan tunas selanjutnya sehingga diperoleh  tunas  yang  banyak  dalam  waktu  yang relatif singkat (Kosmiatin et al, 2005). Faktor-faktor
penentu keberhasilan perkecambahan  secara in  vitro yaitu  genotip tanaman,  kondisi  fisiologis  tanaman,  jenis  dan kondisi  medium,  lingkungan  kultur,  dan  Zat Pengatur  Tumbuh  (ZPT)  (Zhang  et  al,  2000). Senyawa-senyawa  ZPT  memiliki  karakteristik yang sama seperti hormon tetapi diproduksisecara  eksogen.  Pertumbuhan  dan morfogenesis  secara in  vitro diatur  oleh  hormon tanaman  dan  hormon  eksogen.  Pemberian hormon  eksogen  dapat  menaikkan  tekanan osmotik,  meningkatkan  sintesa  protein  dan permeabilitas  sel  terhadap  air,  serta  menurunkan tekanan dinding sel  sehingga air dapat masuk ke dalam  sel  dan  sel  mengalami  pertumbuhan (George  dan  Sherington,  1984).  Hormon-hormon yang sering digunakan untuk kultur in vitro adalah auksin dan sitokinin, salah satunya α- Naphtaleneacetic  Acid  (NAA)  (Utami  et  al,  2007; Wijayani et al, 2007) dan Thidiazuron (TDZ) (Feng dan  Chen,  2014).  NAA  merupakan  golongan auksin yang berfungsi dalam induksi
pemanjangan sel, dormansi apikal, penghambatan  pucuk  aksilar  dan  adventif,  serta inisiasi  pengakaran  (Wattimena,  1992).  TDZ merupakan  golongan  sitokinin  yang  bertugas dalam menstimulasi pembelahan sel dan multiplikasi  tunas  ketika  tahap  pembentukan struktur globular dan hati dalam proses embriogenesis (Lu, 1993).
Penelitian  perkembangan  awal  protokorm pada P. amabilis  sebelumnya  pernah  dilaporkan. Utami  et  al  (2007)  meneliti  pengaruh  NAA terhadap  embriogenesis  somatik  anggrek  bulan. Wijayani et al (2007) menelitin pengaruh NAA dan kinetin  terhadap  protokorm Grammatophyllum
scriptum .  Feng  dan  Chen  (2014)  meneliti pengaruh  TDZ  terhadap  embriogenesis P. aphordite. Quainoo  dan  Dwomo  (2012)  meneliti pengaruh  kombinasi  NAA  dan  TDZ  terhadap berbagai jenis genotip embriogenesis coklat.
Berdasarkan  uraian  di  atas,  penelitian  ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penambahan  kombinasi  ZPT  TDZ  dan  NAA secara in  vitro terhadap  perkembangan  morfologi dan  anatomi  protokorm  anggrek P.  amabilis dan menentukan  konsentrasi  TDZ  dan  NAA  yang paling optimum untuk meningkatkan pertumbuhan dan perkembangan anggrek P. amabilis secara in vitro.

## Metode
Penelitian  dilakukan  selama  dua  bulan  (26 Agustus –  25  September  2016)  di  Laboratorium Bioteknologi  dan  Laboratorium  Struktur  dan Perkembangan Tumbuhan Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada. Penelitian ini menggunakan protocorm anggrek P.  amabilis yang  telah  berumur  2  bulan. Protocorm diperoleh dari  Windy  Mose  peneliti  S2  Fakultas  Biologi UGM.
Penggunaan medium dalam yang penelitian  ini  yaitu  media  NP  dengan  kombinasi konsentrasi  zat  pengatur  tumbuh  NAA  dan  TDZ. Dicampurkan  komponen  media  NP,  sukrosa,  dan akuades  hingga  500  ml  secara  berurutan  ke dalam  erlenmeyer  500  ml  dan  di stirrer sampai sukrosa larut. Medium dibagi rata dan ditambahkan kombinasi konsentrasi zat pengantur tumbuh  NAA  dan  TDZ  (Tabel  1).  Perlakuan medium  diukur  pHnya  menggunakan  indikator universal  dan  disesuaikan  hingga  pH  larutan medium  5,2-6  dengan  penambahan  KOH  0,1  N atau  HCl  0,1  N.  Medium-medium  tersebut ditambahkan  agar  dan  dididihkan.  Larutan medium  disterilisasi  menggunakan autoclave (121 o C;1  atm)  selama  15  menit  lalu  dituang  ke dalam petridish steril di dalam LAF dan didiamkan beberapa  menit  hingga  menjendal.  Petridish ditutup dengan seal plastic . Subkultur protocorm anggrek  yang  telah berumur  2  bulan  dilakukan  di  dalam  LAF. Protocorm ditanam  dalam  perlakuan  medium dengan  mengatur  jarak  antar  eksplan  yang ditanam  dan  diinkubasikan  di  dalam  ruang inkubator. Pengamatan morfologi dilakukan setiap minggu  selama  2  minggu  untuk  mengetahui pertumbuhan  dan  perkembangan protocorm anggrek.
Pembuatan  preparat  anatomi protocorm hasil  induksi  dengan  penambahan  kombinasi konsentrasi  NAA  dan  TDZ  (Tabel  1)  selama  2 minggu  menggunakan  metode  parafin  dengan pewarnaan  tunggal.  Embrio  somatik  yang  telah ditanam  dalam  perlakuan  medium  difiksasi dengan larutan FAA selama 24 jam. Embrio dicuci
berturut-turut dengan alkohol bertingkat mulai dari alkohol  (70%;  80%;  95%;  100%  I;  100%  II) masing-masing  selama  30  menit.  Dealkoholisasi protocorm menggunakan  campuran  alkohol  dan xilol  dengan  perbandingan  1:3,  1:1,  3:1  masing- masing  selama  30  menit.  Infiltrasi  dilakukan dengan  memasukkan  embrio  somatik  ke  dalam campuran  xilol:parafin  (1:9)  dengan  parafin  murni 57°C  selama  2x24  jam.  Blok  parafin  dibuat setelah  perendaman  sampel  selama  1  jam  dan diiris  menggunakan rotary  microtom dengan ketebalan 10  μm.  Irisan-  direkatkan  pada  gelas benda  yang  sudah  diolesi  dengan  campuran gliserin-  albumin  dan  akuades,  lalu  dipanaskan dalam hot  plate .  Sebelum  dilakukan  pewarnaan, dilakukan  deparafinisasi  dengan  cara  berturut- turut preparat dimasukkan ke dalam xilol II, xilol I, alkohol/xilol  (1:3),  alkohol/xilol  (1:1),  alkohol/xilol (3:1),  alkohol  100%,  alkohol  100%,  alkohol  95%, alkohol  80%,  dan  alkohol  70%,  masing-masing selama  3  menit.  Selanjutnya,  gelas  benda dimasukkan  dalam  safranin  1%  dalam  alkohol 70%  selama  24  jam.  Preparat  direndam  dalam alkohol  70%,  80%,  95%,  100%  I,  100%  II, alkohol/xilol  (3:1),  alkohol/xilol  (1:1),  alkohol/xilol (1:3),  serta  xilol  masing-masing  selama  1  menit. Preparat  ditetesi  dengan  balsam  kanada  dan dikeringkan. Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya dan Optilab.
Data  yang  diperoleh  dianalisis  secara kualitatif dan kuantitatif untuk mengetahui pengaruh penambahan kombinasi konsentrasi zat pengatur  tumbuh  NAA  dan  TDZ  (Tabel  1) terhadap  pertumbuhan  dan  perkembangan  awal protocorm  anggrek P.  amabilis secara in  vitro
yang  telah  berumur  2  bulan.  Pengamatan dilakukan  selama  2  minggu.  Analisis  secara morfologi dilakukan dengan melakukan pengamatan ukuran eksplan serta jumlah protocorm  yang  telah  membentuk  tunas  dan absorbing  hair .  Kedua  pengukuran  digunakan untuk  menentukan  persentase  pertumbuhan protocorm  anggrek.  Analisis  secara  anatomi dilakukan pengamatan berupa pengukuran panjang  sel  bagian  tengah  potongan  melintang protocorm.
Tabel 1.  Kombinasi  Konsentrasi  ZPT  NAA  dan
TDZ ZPT NAA (ppm) TDZ (ppm) 0 0,2 0 N 0 T 0 N 0 , 2 T 0 0,5 N 0 T 0,5 N 0,2 T 0,5 1 N 0 T 1 N 0,2 T 1 Keterangan : NAA = Naptalene Acetic Acid (ppm), TDZ = Thidiazuron (ppm).

## Hasil Dan Pembahasan
Hasil  pengamatan  morfologi  dan  anatomi protocorm,  diperoleh  perubahan  morfologi  dan anatomi  embrio  anggrek P.  amabilis dengan variasi  kombinasi  konsentrasi  NAA  dan  TDZ (Tabel  3)  serta  persentase  pembentukan  tunas dan absorbing  hair pada protocorm (Tabel  4). Hasil  persentase  pertumbuhan  tersebut  dapat digunakan  dalam  menentukan  konsentrasi  NAA dan TDZ yang optimal untuk pertumbuhan embrio anggrek P. amabilis .
Tabel  2.  Persentase  Pertumbuhan  Protokorm  Anggrek P.amabilis pada  medium  dengan  penambahan kombinasi NAA dan TDZ.
Keterangan : NAA = Naptalene Acetic Acid (ppm), TDZ = Thidiazuron (ppm).
Tabel 3. Perkembangan Morfologi dan Anatomi Protokorm Anggrek P.ambalis secara In Vitro
Keterangan : NAA = Naptalene Acetic Acid (ppm), TDZ = Thidiazuron (ppm). Bar Morfologi = 1 mm, Bar Anatomi = 50 µm.
Persentase pertumbuhan
protocorm anggrek P.  amabilis dalam  Tabel  2  pada  minggu ke  8-10  hampir  mencapai  100%  di  berbagai medium perlakuan dengan penambahan konsentrasi  ZPT  NAA  dan  TDZ  kecuali  pada medium  dengan  konsentrasi  NAA:TDZ  (0:0.5) ppm  dan  (0:1)  ppm  pada  minggu  ke-10.  Hal  ini disebabkan  karena  adanya  kerusakan  pada medium  sehingga  protocorm  yang  terdapat  pada bagian tersebut tidak dapat mengalami pertumbuhan secara optimal.
Tabel 3 menunjukkan perkembangan morfologi  dan  anatomi  protocorm  anggrek P. amabilis dari  minggu  ke  8-10.  Penambahan  NAA dengan  konsentrasi  0,2  ppm  dapat  mempercepat pertumbuhan  melalui  pembentukan absorbing hair . Absorbing hair merupakan struktur menyerupai  rambut  yang  digunakan  oleh  eksplan untuk menyerap nutrisi yang ada dilingkungannya. Absorbing  hair salah  satu  parameter  yang  dapat digunakan untuk mengetahui kecepatan pertumbuhan  dari  eksplan,  pada  medium  yang sesuai eksplan akan membentuk banyak absorbing hair . Konsentrasi NAA yang lebih tinggi pada  eksplan  akan  membentuk  lebih  banyak absorbing  hair sesuai  dengan  fungsi  senyawa
NAA  yaitu  mengoptimalkan  pertumbuhan  dengan menginisiasi  pembentukan  RAM  ( Root  apical meristem )  atau  yang  biasa  disebut  sebagai  calon akar. Namun, konsentrasi  NAA  yang terlalu tinggi justru  menghambat  pertumbuhan  karena  NAA bekerja pada konsentrasi yang rendah.
Penambahan TDZ dapat menambah ukuran  protocorm  melalui  pembentukan  tunas. TDZ  merupakan  salah  satu  golongan  sitokinin yang banyak diteliti dibidang kultur jaringan untuk mempercepat pembelahan sel. Penambahan TDZ pada konsentrasi yang sesuai dapat meningkatkan  proses  pertumbuhan  pada  eksplan melalui pembentukan SAM ( Shoot apical meristem )  atau  tunas.  Berdasarkan  hasil  yang diperoleh  (Tabel  3),  penambahan  TDZ  dengan konsentrasi 0.5 ppm dapat menunjukan persentase  pembentukan  tunas  lebih  tinggi dibanding  kontrol  dan  konsetrasi  lain.  Hal  ini disebabkan  karena  TDZ  merupakan  salah  satu fitohormon  yang  dibutuhkan  oleh  tanaman  dalam konsentrasi yang relatif rendah. Pada konsentrasi yang  terlalu  tinggi  penambahan  zat  ini  dapat menghambat pertumbuhan tanaman dan cenderung tidak berpengaruh.
Tabel 4. Persentase Protokorm Anggrek P.amabilis yang membentuk Tunas dan Absorbing hair
Medium ∑ protokorm yang diamati ∑ protokorm yang membentuk tunas Persentase protokorm yang membentuk tunas ∑ protokorm yang membentuk absorbing hair Persentase protokorm yang membentuk absorbing hair NP + N 0 + T 0 50 12 24 % 5 10 % NP + N 0,2 + T 0 50 11 22 % 9 18 % NP + N 0 + T 0,5 50 16 32 % 7 14 % NP + N 0,2 + T 0,5 50 20 40 % 12 24 % NP + N 0 + T 1 50 20 40 % 8 16 % NP + N 0,2 + T 1 50 19 38 % 10 20 %
Keterangan :  NP = New Phalaenopsis Medium, N=NAA, T=TDZ
Persentase  pembentukan absorbing  hair dan  tunas  paling  baik  terjadi  pada  konsentrasi NAA:TDZ (0,2 : 0,5) ppm disebabkan karena NAA dan  TDZ  bekerja  secara  sinergis  dalam  memacu pertumbuhan  tanaman.  Selain  itu,  konsentrasi TDZ  yang  optimum  berperan  penting  dalam translokasi dan distribusi NAA serta diakumulasikan  pada  sel-sel  yang  memiliki totipotensi  tinggi  (Murch  dan  Saxena,  2001). Penambahan  NAA  tanpa  TDZ  hanya  akan memicu pembentukan absorbing hair . Begitu pula penambahan  TDZ  tanpa  NAA  hanya  akan memicu pembentukan SAM.
Penambahan  NAA  dilihat  secara  anatomi dapat meningkatkan ukuran sel, terutama pemanjangan  sel  pada  konsentrasi  rendah.  NAA dapat  meningkatkan  plastisitas  dinding  sel sehingga  sel  akan  mengalami  pembentangan dengan lebih cepat ketika pertumbuhan berlangsung. NAA dapat menginisiasi pemanjangan  sel  dan  memacu  protein  tertentu yang  terdapat  pada  membran  plasma  sel tumbuhan untuk memompa ion H + ke dinding sel. Ion  H + mengaktifkan  enzim  tertentu  sehingga mampu memutus beberapa ikatan silang hidrogen rantai molekul selulosa penyusun dinding sel. Sel tumbuhan  akan  memanjang  akibat  air  yang masuk  secara  osmosis  (Wattimena,  1988). Penambahan NAA sebesar 0.2 ppm menyebabkan  ukuran  sel  menjadi  lebih  panjang pada  pengamatan  minggu  ke-10  dibanding kontrol.  Penambahan  TDZ  dapat  meningkatkan pembelahan  sel  karena  TDZ  memiliki  struktur menyerupai  basa  nukleotida    adenin  sebagai salah  satu  precursor  pembelahan  sel.  Sel  yang aktif membelah dicirikan dengan nukleus berukuran  besar,  sitoplasma  berukuran  kecil, banyak  mengandung  amilum,  memiliki  dinding primer  dan  lamela  yang  tipis  dengan  vakuola kecil.
Parameter  yang  dapat  digunakan  untuk mengetahui  pengaruh  ZPT  NAA  dan  TDZ  adalah melalui  penyerapan  zat  warna  safranin.  Safranin merupakan  senyawa chloride yang  digunakan dalam  pembuatan  preparat  anatomi  maupun histologi  organisme.  Senyawa  ini  akan  mewarnai
inti  sel  dari  sampel  yang  akan  diamati  dengan memberikan  warna  merah.  Sel  yang  aktif membelah  akan  menunjukkan  penyerapan  warna yang  paling  optimal  dibandingkan  sel  yang  lain. Hal ini disebabkan karena inti sel  yang berukuran besar.  Berdasarkan  hasil  pengamatan  preparat anatomi  yang  telah  dilakukan,  adanya  perbedaan penyerapan  warna  oleh  sel  pada  bagian  apikal, tengah  dan  basal.  Pada  medium  NP  tanpa perlakuan  dan  preparat  anatomi  minggu  ke-8  sel memiliki  intensitas  warna  yang  sama  karna  sel baru  disubkultur  dan  belum  melakukan  adaptasi dengan medium yang baru. Sel mulai menunjukkan adanya perbedaan intensitas warna mulai  minggu  ke-9  karena  sel  telah  mengalami adaptasi  dan  telah  mengalami  pertumbuhan. Pada  minggu  ke-10  sel  bagian  basal  terpulas lebih  gelap  dibandingkan  sel  disekitarnya.  Hal tersebut  menunjukkan  bahwa  pada  bagian tersebut  sel  aktif  melakukan  pembelahan  dan diperkirakan  selanjutnya  sel  akan  membentuk RAM. Sedangkan pada konsentrasi NAA 0,2 ppm secara  umum  peningkatan  intensitas  warna  baik pada sel apikal maupun sel basal di minggu ke-9 dan  peningkatan  intensitas  warna  paling  baik terlihat  pada  kombinasi  NAA  dan  TDZ  (0,2  :  0,5) ppm  karena  sel  terpulas  paling  jelas.  Sedangkan untuk  penambahan  ZPT  dari  golongan  TDZ secara  umum  dapat  terlihat  bahwa  sel  yang mempunyai  intensitas  warna  yang  paling  baik yaitu  sel  apikal  yang  selanjutnya  akan  menjadi SAM.

## Simpulan
Penambahan  kombinasi  NAA  dan  TDZ dapat  mempercepat  proses  pertumbuhan  dan perkembangan  protocorm  anggrek.  Kombinasi konsentrasi  NAA  dan  TDZ  yang  paling  optimal dalam meningkatkan pertumbuhan dan perkembangan protocorm anggrek secara morfologi dan anatomi adalah 0,2 : 0,5 ppm

## Ucapan Terima Kasih
Kami  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Dr. Budi  Setiadi  Daryono,  M.Agr.Sc.,  Dr.  rer.  nat.  Ari
Indrianto,  S.U.,  seluruh  staf  di  laboratorium Bioteknologi  Fakultas  Biologi  Universitas  Gadjah Mada, dan anggota BiOSC (Biology Orchid Study Club)  yang  telah  membantu  selama  penelitian.

## Daftar  Referensi
Bey, Y., Syafii, W., dan  Sutrisna. 2006. Pengaruh Pemberian Giberilin (GA3) dan Air Kelapa Terhadap  Perkecambahan  Bahan  Biji Anggrek  Bulan  (Phalaenopsis  amabilis BL)  Secara In  vitro .  Jurnal  Biogenesis. 2(2):41-46.
Chugh.  S.,  Guha,  S.,  and  Rao,  I.U.  2009. Micropropagation  of  orchids:  a  review  on the  potentialof  different  explants. Sci Hortic , 122(4): 507-520.
Comber, J.B. 1990. Orchids of Java . Charoen Slip Press. Bangkok. pp. 219.
Dressler,  R.L.  1993. Phylogeny  and  classification of  the  orchid  family .Dioscorides  Press, Portland, Oregon, USA.
George,  E.F  and  P.D.  Sherrington,  1984.  Plant propagation  by  tissue  culture.  Exegetics Ltd, England. 709 p
Islam,  M.O.,  Ichihashi.  S.,  and  Matsui,  S.  1998 Control  of  growth  and  development  of protokorm like body derived from callus by carbon  sources  in Phalaenopsis.  Plant Biotechnol 15: 183 –187.
Iswanto,  H.  2002.  Petunjuk  Perawatan  Anggrek. Jakarta : Agromedia Pustaka.
Lu,  C.,  1993.  The  use  of  thidiazuron  in  tissue culture. In vitro Cell Dev. Biol. 29 : 92-96.
Puspitaningtyas, D.M. 2010. Phalaenopsis amabilis,  Bunga  Nasional  Indonesia. http://pai.or.id/artikel/6-spesies/6-
phalaenopsis-amabilis-bunga-
nasionalindonesia.html. 7 September 2016 .
Razdan,  M.K.  2003. Introduction  to  Plant  Tissue Culture .2 nd ed.  Science  Publishers,  Inc.
India. P: 71, 72.
Semiarti,  E.,  A.  Indrianto,  A.  Purwantoro,  S. Isminingsih,  N.  Suseno,  T.  Ishikawa,  Y.
Yoshioka,  Y.  Machida,  and  C.  Machida. 2007. Agrobacteriummediated Transformation  of  The  Wild  Orchid Species Phalaenopsisamabilis. Plant Biotechnol 24 : 265-272.
Sutater,  T.  dan  D.S.  Badriah.  1994.  Koleksi  dan
Karakterisasi Anggrek Phalaenopsis amabilis. Bull. Penel. Tan. Hias. 2(1) : 57- 65
Sutrian,  Y.  2004.  Pengantar  Anatomi  Tumbuh- Tunbuhan  (Tentang  Sel  dan  Jaringan). Rineka Cipta. Jakarta. Hal.22, 32.
Wattimena  G.A.  1988.  Peranan  kultur  Jaringan dalam  Mempertinggi  Produksi  Pertanian di  Indonesia.  Makalah  pada  Seminar Kultur  Jaringan  Tanaman  FP.  Unibraw, Malang, 24 hal.
Wijayani  Y, Solichatun, and W. Mudyantini. 2007. The  Shoot  Growth  And  Anatomical Structure  Of  Protokorm  Like  Body  Of Grammatophyllum  Scriptum  (Lindl.)  Bl. After Kinetin And NAA Application. Bioteknology 4 (2): 33-40.
Zulkarnain.  2009.  Kultur  Jaringan  Tanaman;
Solusi Perbanyakan Tanaman Budi Daya.
Bumi Aksara, Jakarta.