## Fraksinasi dan Identifikasi Senyawa Antioksidan pada Ekstrak Etanol Daun Sirsak (
Annona muricata L.) secara Kromatografi Kolom
Diyan Maya Sari (a) , Sumi Wijaya (a)* , Henry Kurnia Setiawan (a)
Annona muricata L. merupakan salah satu tanaman dari familia Annonaceae yang mengandung antioksidan alami yang dapat digunakan untuk pengobatan berbagai jenis penyakit. Berdasarkan kemampuannya  yang memiliki  daya  antioksidan  tersebut,  maka  dilakukan  pemisahan  senyawa  antioksidan  dan  uji  untuk  mem- bandingkan aktivitas daya antioksidan dari ekstrak etanol dengan fraksinya. Pemisahan senyawa antioksidan dengan  menggunakan  kromatografi  kolom  dan  pengujian  aktivitas  antioksidan  dengan  metode  DPPH  ( 1,1- diphenyl-2-picrylhidrazyl ). Berdasarkan hasil data KLT, spektrum UV-Vis dan spektroskopi IR dapat disimpul- kan  bahwa senywa antioksidan  mengandung flavonoid. Hasil  pengujian  aktivitas antioksidan  menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirsak memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai 0,25 ± 0,037 mg/mL, sedang- kan hasil dari fraksi menunjukkan bahwa aktivitas antioksidannya lebih besar dengan nilai 0,14 ± 0,011 mg/ mL.  Golongan  metabolit  sekunder  dalam  fraksi  etanol  daun  sirsak  yang  dapat  berfungsi  sebagai  senyawa antioksidan  adalah  flavonoid  dan  fraksi  etanol  tersebut  memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  lebih  besar  di- bandingkan dengan aktivitas antioksidan ekstrak etanol.
Kata kunci: Annona muricata L., antioksidan, kromatografi kolom, DPPH.

## Fractionation and Identification Antioxidant Compound from Ethanol Extract of Annona muricata Leaves using Column Chromatography
Annona muricata L. is one of the familia Annonaceae plants that have a natural source of antioxidants that can  be  used  for  treatment  of  various  types  of  diseases.  From  this  ability,  the  research  was  conducted  to separate the antioxidant compound and to compare the antioxidant power from the ethanol extract with the fractions.  The  separation  of  compounds  using  column  chromatography  method  and  the  measurement  of antioxidant activity by DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl) method. Based  on TLC data, UV-VIS spectropho- tometry and IR data, it was concluded that flavonoids is the antioxidant compound. The result of antioxidant activity assay showed that the ethanol extracts of soursop leaves has an antioxidant activity with IC50 values of 0,25 ± 0,037 mg/mL whereas of the fraction has the greater antioxidant activity with IC50 values of 0,14 ±  0,011  mg/mL.  The  antioxidant  compounds  in  soursop  leaf  ethanol  extract  are  flavonoids.  Whereas,  the result of antioxidant activity assay showed that the ethanol fraction of soursop leaves has the greater antioxi- dant activity than the ethanol extract itself.
Keywords: Annona muricata L, antioxidant, column chromatography, DPPH.
(a) Fakultas Farmasi, Universitas Katolik Widya Mandala, Surabaya, Indonesia

## PENDAHULUAN
Pesatnya perkembangan ilmu pengetahuan dan  teknologi  serta  berubahnya  pola  hidup  ma- syarakat  berdampak  pada  munculnya  berbagai penyakit  degeneratif.  Pola  hidup  yang  tidak  be- nar tersebut menyebabkan terbentuknya radikal bebas  (oksidan)  dalam  tubuh.  Oksidan  ini  akan menjadi racun bagi tubuh yang selanjutnya me- rusak fungsi sel tubuh dan dapat mengakibatkan penyakit degeneratif. Untuk mengatasi hal terse- but, tubuh memerlukan antioksidan dalam jum- lah yang memadai (Hernani dan Raharjo, 2005). Daun  sirsak  atau Annona  muricata L.  meru- pakan salah satu tanaman  dari familia Annona- ceae  yang  memiliki  sumber  antioksidan  alami yang dapat digunakan untuk pengobatan berbagai jenis  penyakit.  Pada  penelitian  sebelumnya diketahui adanya potensi antioksidan pada daun sirsak  di  berbagai  model  penelitian in  vitro (Baskar et  al. ,  2007).  Pada  penelitian  ini  akan dilakukan fraksinasi ekstrak etanolik daun sirsak dengan metode kromatografi kolom yang selan- jutnya  dilakukan  pengujian  daya  antioksidan dengan  menggunakan  DPPH.  Fraksi  yang diperoleh,  dibandingkan  daya  antioksidannya dengan ekstrak etanol daun sirsak menggunakan metode DPPH.

## METODE PENELITIAN
Alat Perkolator,  penggiling  simplisia, chamber ,  ko- lom kromatografi, Spektrofotometer UV-Vis tipe UV-1201 (Shimadzu, Jepang), Multiscan GO (Ther- moscientific, Finlandia), kuvet, timbangan analitik (Sartorius,  Germany),  cawan  porselen,  batang pengaduk, vial, mikropipet, corong pisah, mikro- kapiler, infrared  mouisture  balance (Kett,  Ger- many), alat penyemprot DPPH, infrared spectro- photometer FTIR-8400 S (Shimadzu, Jepang), dan alat gelas yang lain .

## Bahan
Daun sirsak, Etanol 96%, DPPH (Sigma, Germany), KLT silika gel 60 F254 (Merck KGaA, Germany), Silika  Gel  60  70-230  mesh  (0,063-0,200  mm) (Merck KGaA, Germany), metanol p.a. (pro analysis), kuersetin (Sigma, Germany), kloroform, n -heksan, etil asetat ( pharmaceutical grade ) .

## Tahapan Penelitian

## Penyiapan Bahan
Daun sirsak dicuci bersih dan dikeringkan dengan diangin-anginkan, kemudian digiling sampai ter- bentuk serbuk simplisia. Satu kg serbuk dimase- rasi selama 1 hari terlebih dahulu dengan pelarut etanol  96%.  Selanjutnya  serbuk  dipindahkan  ke dalam  perkolator  sampai  didapat  ekstrak  cair. Ekstrak  etanol  daun  sirsak  dipekatkan  dengan menggunakan  pemanas  diatas water  bath pada suhu 50°C sampai didapatkan ekstrak kental.
Pemilihan Fase Gerak
Ekstrak kental kemudian dilakukan standardisasi
ekstrak dan dilakukan pemilihan fase gerak meng- gunakan beragam jenis ( n -heksan, kloroform, etil asetat dan etanol) dan komposisi (1:9 ; 5:5 ; 9:1) eluen.  Fase  gerak  yang  terpilih  digunakan  pada kromatografi kolom.

## Kromatografi Kolom
Untuk pemisahan komponen dengan menggunakan kromatografi kolom, dimasukkan bubur silika gel 70-230 mesh sambil diaduk agar tidak terdapat rongga udara di tengah-tengah kolom. Timbunan bubur silika gel dalam kolom mencapai tiga per- empat tinggi kolom. Ekstrak daun sirsak dimasuk- kan ke dalam kolom kromatografi yang telah dila- rutkan  dengan  sedikit  larutan  pengelusi  sambil kran kolom dibuka, kemudian fraksi ditampung dalam vial per 10 mL. Setiap fraksi akan dianalisa daya antioksidannya secara kualitatif dengan me- tode KLT. Fraksi-fraksi tersebut ditotolkan pada fase diam silika gel 60 F254, dieluasi dengan fase gerak terpilih dan disemprot dengan larutan DPPH 0,2% b/v. Fraksi yang memiliki daya antioksidan akan memberikan noda berwarna kuning pada latar belakang ungu. Fraksi yang mempunyai nilai Rf dan  daya  antioksidan  yang  sama  dikumpulkan menjadi satu dan selanjutnya akan diuji daya anti- oksidannya secara kuantitatif dengan metode DPPH yang  dibandingkan  dengan  ekstrak  etanolnya (Markham, 1988).

## Identifikasi Golongan Senyawa
Fraksi terpilih dilarutkan dengan etanol kemudian dianalisa  dengan  spektrofotometri  UV-Vis  pada λ 200-400  nm.  Identifikasi  dilanjutkan  dengan pereaksi geser AlCl3 5%, dan diidentifikasi dengan spektroskopi  inframerah  untuk  mengetahui golongan metabolit sekunder dari ekstrak etanol daun sirsak.

## Penentuan Daya Antioksidan
Fraksi  yang  terpilih  disiapkan  dengan  rentang antara 0,211-103.10 -6 mg/mL. Kuersetin yang di- gunakan  sebagai  kontrol  positif  juga  disiapkan dalam tujuh rentang konsentrasi antara 1-156.10 -4 mg/mL. Pipet sampel ke dalam 96-well plate se- banyak  20  µL  kemudian  ditambahkan  dengan reagen  DPPH  sebanyak  180  µL.  Campuran didiamkan  pada    suhu  ruang  dengan  kondisi gelap  selama  30  menit.  Selanjutnya,  campuran sampel  dan  DPPH  dicek  absorbansinya  pada λ 517 nm  (Cavin et  al. ,  1998).  Aktivitas  antioksi- dan  dinyatakan  dengan  nilai  IC50  yang  didapat- kan  dari  kurva  regresi  linier  antara  konsentrasi dengan  persen  aktivitas  antioksidan  (%  AA).  Ak- tivitas a n t i -
oksidan  dapat  dihitung  dengan  menggunakan rumus :

## TABEL
1. Hasil Penetapan Standardisasi Ekstrak Etanol Daun Sirsak
TABEL 2 . Hasil Puncak Spektrum IR Fraksi dari Ekstrak Etanol Daun Sirsak
TABEL 3 . Hasil Penentuan Nilai IC 50 Ekstrak Etanol Daun Sirsak
GAMBAR 1. Profil KLT fraksi ekstrak etanol daun sirsak setelah disemprot DPPH ( 1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl ).
GAMBAR 2. Spektrum UV-Vis fraksi ekstrak etanol daun sirsak.
Keterangan : fraksi dalam etanol dengan λ maks 229,5 nm (pita II).
Pada hasil pemeriksaan organoleptis dida- patkan  warna  hijau  kehitaman  dengan  bentuk ekstrak  kental.  Pada  pemeriksaan  kadar  air diperoleh hasil 6,26%. Hal ini sesuai dengan ba- tas  persyaratan  yaitu  kurang  dari  10%  (DirJen POM  RI,  2000).  Pemeriksaan  kadar  air  ini  ber- tujuan  untuk  mengetahui  besarnya  kandungan air  dalam  ekstrak etanol.  Pada  penetapan  kadar abu ekstrak diperoleh hasil 5,78%. Penetapan ini ber-tujuan  untuk  mengetahui  gambaran  kand- ungan mineral yang berasal dari simplisia kering sampai terbentuknya ekstrak. Dari hasil skrining fito-kimia  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol positif  mengandung  tanin,  flavonoid  dan  alka- loid.  Sedangkan  untuk  saponin  menunjukkan hasil nega-tif. Hasil tersebut sesuai dikarenakan pada  pene-litian  lain  dikatakan  bahwa  ekstrak daun  sirsak  memiliki  kandungan  alkaloid,  fla- vonoid,  dan  ta-nin  (Albuquerque et  al. ,  2010; Baskar et al. , 2007; De Sousa et al. , 2010).
Dari beberapa variasi fase gerak yang dico- bakan,  didapatkan  hasil  bahwa  kloroform  :  etil asetat merupakan fase gerak terpilih yang dapat memberikan keterpisahan noda yang banyak dan memberikan  spektrum  daya  antioksidan  yang paling luas. Eluen yang terpilih tersebut akan di- gunakan  untuk  fraksinasi  dengan  metode  kro- matografi kolom. Dari proses pemisahan didapat- kan  fraksi  yang  kemudian  ditotolkan  dan  diuji secara kualitatif menggunakan larutan DPPH 0,2%, sehingga didapatkan satu fraksi yang paling aktif sebagai antioksidan ( Gambar 1 ).
Berdasarkan hasil identifikasi senyawa dila- kukan pada fraksi menggunakan spektrofotome- ter UV-Vis dan spektroskopi infrared. Hasil spek- trofotometer UV-Vis memberikan serapan maksi- mum  pada  panjang  gelombang  229,5  nm  untuk fraksi dari ekstrak etanol daun sirsak yang dapat dilihat pada Gambar  2 . Setelah ditambahkan de- ngan  pereaksi  geser  AlCl 3 menunjukkan  perge- seran  sebesar  12,5  nm  yang  dapat  ditunjukkan pada Gambar  3 . Dari penafsiran panjang gelom- bang  yang  dihasilkan,  maka  fraksi  termasuk golongan  flavonoid  sesuai  dengan  penafsiran spektrum pada senyawa tersebut untuk panjang gelombang  maksimum  pita  II  pada  flavonoid (Markham, 1988).
Selanjutnya, dilakukan identifikasi senyawa spektrum inframerah yang bertujuan untuk me- ngetahui gugus fungsi yang terdapat dalam golo- ngan  senyawa  metabolit  sekunder  yang  didapat dari hasil spektrum UV-Vis. Pada hasil analisa in- framerah  menunjukkan  gugus  fungsi  dari  fraksi memberikan  spektrum  pada  gelombang  3390 nm (OH), 2842 (CH), 2052 (CO), 1641 (C=C) ( Ta- bel 2 ; Gambar 4 ).
Dari  hasil  penentuan  uji  daya  antioksidan dengan  DPPH  0,2%  diperoleh  nilai  IC50  yang dapat dilihat pada Tabel  3 . Dari hasil penelitian yang didapat bahwa nilai IC50 dari ektrak etanol daun sirsak dibandingkan dengan kuersetin lebih rendah kemampuannya dalam meredam radikal bebas. Untuk fraksi kemampuannya dalam me-
Parameter Hasil Keterangan Organoleptis Warna Hitam Kecoklatan Bau Tidak Berbau Tekstur Semi Solid Kadar Air 6,26 % Memenuhi Persyaratan Kadar Abu 5,78 % Skrining Kualitatif Tanin Hijau Kehitaman Positif Flavonoid Coklat Positif Alkaloid Warna Merah pada Daerah Totolan Positif Saponin  Tidak Timbul Busa - Gugus Fungsi Bilangan Gelombang (cm -1) Senyawa OH 3390 CH 2842 CO 2052 C = C 1641 Sampel IC 50 (mg/ml) Ekstrak Etanol 0,249 ± 0,037 Fraksi 0,142 ± 0,011 Pembanding (Kuersetin) 0,036 ± 0.006
GAMBAR 3. Spektrum UV-Vis fraksi No. 61 ekstrak etanol daun sirsak dengan penambahan AlCl 3 .
Keterangan : fraksi dalam etanol+AlCl 3 dengan λ maks 242 nm (pita II).
GAMBAR  4. Profil  analisa  infrared  pada  fraksi  dari  ekstrak etanol daun sirsak.
redam radikal bebas lebih tinggi bila dibanding- kan dengan ekstrak etanol daun sirsak.

## KESIMPULAN
Golongan  metabolit  sekunder  yang  dapat berfungsi sebagai senyawa antioksidan pada eks- trak  etanol  daun  sirsak  adalah  flavonoid.  Ditin- jau dari harga IC50 fraksi etanol (0,14±0,011 mg/ mL)  memiliki  daya  antioksidan  lebih  besar  dari ekstrak etanolnya (0,25±0,037 mg/mL), sehingga dapat disimpulkan bahwa kemampuan antioksidan dari fraksi lebih baik daripada ekstrak etanolnya.

## DAFTAR PUSTAKA
Baskar R, Rajeswari V, dan Kumar TS, 2007, In  Vitro Anti- oxidant Studies in Leave of Annona Species, Indian  J  Exp Biol , 45, 480-485.
Cavin A, Kurt H, Wahjo D, dan Olivier P, 1998, Antioxidant and  Lipophylic  Constituents  of Tinospora  crispa , Planta Med , 64, 393-396.
de Sousa OV, Vieira GD, de Pinho JJRG, Yamamoto CH, dan Alves  MS,  2010,  Antinociceptive  and  Anti-Inflammatory Activities  of  the  Ethanol  Extract  of Annona  muricata L. Leaves in Animal Models, Int J Mol Sci , 11(5), 2067-2078. Direktorat Jenderal POM RI (DirJen POM RI), Depkes RI. Gomes  de  Melo  J,  de  Sousa  Araújo  TA,  Thijan  Nobre  de Almeida  e  Castro  V,  Lyra  de  Vasconcelos  Cabral  D,  do  De- sterro Rodrigues M, Carneiro do Nascimento S, Cavalcanti de Amorim EL, dan de Albuquerque UP, 2010, Antiproliferative Acti-vity, Antioxidant Capacity and Tannin Content in Plants of  Semi-Arid  Northeastern  Brazil, Molecules ,  15(12),  8534– 8542.
Hernani  dan  Rahardjo  M,  2005, Tanaman  Berkhasiat Antioksidan , Penebar Swadaya, Depok.