## Analisis Polimorfisme Gen Reseptor Bradykinin B2 pada Pasien Hipertensi di Rumah Sakit Dr. Saiful, Anwar Malang
Johan Aloysius 1)* , Widodo 2)
1) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya
Johan Aloysius: aloysius.johan@gmail.com

## ABSTRAK
Hipertensi  masih  menjadi  masalah  kesehatan  utama  di  dunia.  Ketika  volume  darah  rendah,  sel-sel juxtaglomerular  pada  ginjal  mengaktifkan  prorenin  dan  mengeluarkan  renin  ke  dalam  sirkulasi  darah. Plasma  renin  mengkonversi  angiotensinogen  yang  dirilis  oleh  hati  menjadi  Angiotensin  I,  yang  kemudian diubah  menjadi  Angiotensin  II  oleh  enzim  Angiotensin  Converting  Enzyme  (ACE)  yang  terdapat  di endothelium  pembuluh  paru.  Angiotensin  II  menyebabkan  pembuluh  darah  menyempit,  sehingga  tekanan darah  meningkat.  ACEi  bekerja  menghambat  terbentuknya  Angiotensin  I  menjadi  Angiotensin  II,  dan mengaktifkan  kembali  Bradykinin  (BK),  yang  menyebabkan  pembuluh  darah  melebar,  sehingga  tekanan darah menurun. Namun, pemberian ACEi secara berkala menyebabkan akumulasi jumlah BK di pembuluh paru  yang  menyebabkan  terjadinya  inflamasi  (batuk)  pada  sebagian  orang  yang  diduga  dimediasi  oleh  gen reseptor Bradykinin B2 (BK2R). Subyek penelitian berjumlah 11 pasien, DNA diekstrasi dari sel darah putih (leukosit)  sebanyak 200 µL dari  volume darah  total  dengan menggunakan QIAamp  Mini kit (QiaGen).  Gen BK2R  diamplifikasi  dengan  metode  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)  dengan  primer  F  (5- GCAGAGCTCAGCTGGAGGCG-3),  dan  R  (5-CCTCCTCGGAGCCCAGAAG-3).  Diidentifikasi  dengan metode Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP). Hasil penelitian menunjukkan 3 genotipe berbeda yaitu CC, CT, dan TT.
Kata Kunci: ACE inhibitors, Batuk, B2 Receptor, SSCP

## ABSTRACT
Hypertension is a major health problem in the world. When blood volume is low, juxtaglomerular cells in the kidneys secrete renin and prorenin activates the blood circulation. Plasma renin converts angiotensinogen released  by  the liver into angiotensin I, which is then converted to angiotensin II by the  enzyme  angiotensin converting enzyme (ACE) located in the pulmonary vascular endothelium. Angiotensin II causes blood vessels to  constrict,  resulting  in  increased  blood  pressure.  ACEi  inhibit  the  formation  of  angiotensin  I  into angiotensin  II,  and  activate  Bradykinin  (BK),  which  causes  blood  vessels  to  dilate,  thereby  reducing  blood pressure. However, administration of  ACEi  periodically  cause the accumulation of BK in pulmonary vessels that cause inflammation (cough) in some people who suspected mediated by Bradykinin B2 receptor (BK2R) gene.  Total of the subjects in  this study is 11 subjects, DNA  extracted from white blood  cells (leukocytes) as much as 200 mL from whole blood by using the QIAamp kit (Qiagen). Gene BK2R in humans amplified by the  method  of  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)  method  using  the  following  primers  F  (5- GCAGAGCTCAGCTGGAGGCG-3),  and  R  (5-CCTCCTCGGAGCCCAGAAG-3)  and  identified  by  the method  of  Single  Strand  Conformation  Polymorphism  (SSCP).  Results  of  this  study  shows  three  different genotypes there are CC, CT, and TT.
Keywords : ACE inhibitors, B2 Receptor, Cough, SSCP

## PENDAHULUAN
Angiotensin  Converting  Enzyme  inhibitors (ACEi) telah banyak digunakan dalam terapi untuk hipertensi  dan  penyakit  jantung  secara  luas,  dan beberapa  uji  klinis  telah  menunjukkan  bahwa ACEi mampu mengurangi mortalitas dan morbiditas  pada  pasien  dengan  gagal  jantung  [1]. ACEi  menghambat  terbentuknya  Angiotensin  I menjadi  Angiotensin  II,  yang  berperan  sebagai Vasokonstriktor  dalam  meningkatkan  tekanan darah  [2],  dan  mengaktifkan  kembali  peran  BK sebagai  Vasodilator,  sehingga  tekanan  darah menurun.  Namun,  ACEi  juga  memiliki  efek samping yaitu batuk kering [3].
Bradykinin  (BK)  adalah  neuropeptida  alami (protein  plasma),  yang  merupakan  kinin  aktif secara farmakologi, berperan dalam kardioprotektif atau  agen  proinflamasi.  Didalam  tubuh,  BK berperan  sebagai  Vasodilator  yang  menyebabkan pembuluh  darah  melebar,  sehingga  tekanan  darah menurun.Terdapat dua jenis reseptor BK, yaitu B1 dan  B2.  Reseptor  B1  berperan  penting  dalam peradangan dan hiperalgesia, aktivasi dan akumulasi  sel  darah  putih,  dan  mengendalikan tekanan  darah.  Reseptor  B2  berperan  dalam penyempitan  batang  tenggorokan,  regulasi  aliran darah lokal, hipotensi, reaksi inflamasi akut, nyeri, dan hiperalgesia [4].
Efek  samping  batuk  dari  penggunaan  ACEi ini  bervariasi  dari  0.7%  sampai  dengan  53%  di seluruh  dunia  dan  dilaporkan  lebih  tinggi  pada populasi Asia dibandingkan populasi Kaukasia [5]. Polimorfisme gen reseptor Bradykinin B2 (BK2R) diduga memiliki hubungan yang signifikan dengan efek samping batuk pada pasien hipertensi dengan terapi ACEi [6].
Hingga  saat  ini,  masih  belum  ada  data  di Indonesia  mengenai  polimorfisme  gen  BK2R  ini. Oleh  karena  itu  penelitian  ini  diadakan  untuk meneliti  distribusi  polimorfisme  dari  gen  BK2R dengan  subyek  pasien  di  Rumah  Sakit  dr  Saiful Anwar (RSSA), Malang .

## METODE PENELITIAN
Populasi
Penelitian.
Penelitian ini
dilaksanakan pada bulan April 2013 – April 2014. Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium  Biologi Molekuler,
Jurusan
Biologi, Universitas
Brawijaya, Malang. Seluruh prosedur pengambilan
darah  dan  pengujian  yang  dilakukan  pada penelitian ini sudah disetujui oleh Komisi Etik dari RSSA. Populasi dalam penelitian ini adalah pasien hipertensi primer dengan terapi ACEi yang datang ke  Poliklinik  Jantung  RSSA,  Malang  dan  masuk dalam  kriteria  inklusi.  Kriteria  Inklusi  pada penelitian  ini  sebagai  berikut:  pasien  hipertensi yang  telah  menggunakan  terapi  ACEi  setidaknya selama  8  minggu.  Setelah  8  minggu  pasca  terapi ACEi,  subyek  diberi  kuisioner  untuk  mengetahui efek samping batuk  yang terjadi. Teknik sampling yang  digunakan  adalah  random  sampling.  Jumlah subyek  hipertensi  pada  penelitian  ini  adalah  11 subyek.
Amplifikasi  Daerah  Promotor  gen  BK2R. DNA  diekstrasi  dari  sel  darah  putih  (leukosit) sebanyak  200 µL dari  volume  darah  total  dengan menggunakan  QIAamp  kit  [7].  Primer  untuk amplifikasi polymerase chain reaction (PCR) pada penelitian  ini  adalah  sebagai  berikut  F  (5- GCAGAGCTCAGCTGGAGGCG-3),  dan  R  (5- CCTCCTCGGAGCCCAGAAG-3),  yang  terletak di daerah promotor [8]. Total volume reaksi adalah 20  µL  dalam  campuran  terkandung  8  µL  ddH 2 O, 10  µL  PCR  mix  (Qiagen  kit)  dengan  konsentrasi tiap primer 10 pmol, 1 µL primer (0.5 µL forward dan  0.5  µL  reverse),  dan  1  µL  DNA  murni. Kondisi siklus PCR sebagai berikut pre denaturasi 95 0 C  selama  5  menit,  denaturasi  95 0 C  selama  1 menit,  annealing  63 0 C  selama  30  detik,  ekstensi 72 0 C  selama  1  menit,  dan  post-ekstensi  72 0 C selama 10 menit, untuk 35 siklus.
Deteksi Polimorfisme Promotor Gen BK2R.  Produk  PCR  di  elektroforesis  dengan metode  single  strand  conformation  polymorphism (SSCP).  Prosedur  SSCP  dilaksanakan  dengan langkah  sebagai  berikut:  5  µL  aliquot  dari  produk PCR  diencerkan  dengan  5  µL  formamide, didenaturasi  pada  95°C  selama  10  menit,  dan dirunning  pada  gel  poliakrilamid  18.5%  dengan komposisi  gel  sebagai  berikut:  ddH 2 O  1  ml,  10X TBE  1ml, 80% gliserol 1ml, 30% poliakrilamid 5 ml, APS 100 µL, dan TEMED 5 µL. Elektroforesis dilakukan  di  2X  TBE  buffer  pada  suhu  ruang dengan  tegangan  150  V  selama  ±  210  menit,  dan pewarnaan  gel  yang  digunakan  adalah  silver- staining  [9].  Hasil  SSCP  dianalisis  secara deskriptif.
Identifikasi  Polimorfisme  Gen  BK2R. Untuk  menginterpretasi  pita-pita  yang  muncul pada  gel  hasil  SSCP  dan  mengetahui  titik  mutasi yang  terjadi  pada  fragmen  DNA  maka  dilakukan analisa  DNA  Sequencing.  Produk  PCR  yang menunjukkan pita-pita berbeda pada SSCP dikirim beserta primer F, sebanyak 20 µL tiap tube, ke PT Genetika  Science  Indonesia  untuk  kemudian disekuensing di 1st BASE, Malaysia.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi  Gen  BK2R.  Pasangan  primer yang  telah  didesain  sesuai  dengan  daerah promotornya dapat mengamplifikasi secara spesifik  Gen  BK2R  pada  pasien  hipertensi (Gambar  1.)  dengan  panjang  pasangan  basa  (bp) sekitar 112 bp. Hasil yang didapatkan sama halnya dengan penelitian di Jepang [6].
Gambar  1.Amplifikasi  Gen  BK2R  pasien  hipertensi pada  gel  agarosa  1,5%.  No.  1-2:  subyek tidak  batuk,  No.  3-11:  subyek  batuk.  L: DNA Ladder. Hasil amplifikasi Gen BK2R berada pada 112 panjang basa.
Deteksi  Polimorfisme  dari  Gen  BK2R. Terdapat  polimorfisme  pada  Gen  BK2R  dengan adanya tiga genotipe  yang  berbeda  yaitu: CC, TT, dan  CT  (Gambar  2.).  Menurut  penelitian  serupa pada  populasi  Jepang  [6],  pita  pertama  dan  ketiga dari  atas  adalah  cytosine.  Pita  kedua  dan  keempat dari atas adalah thymine.
Gambar  2.  SSCP  Gen  BK2R  pada  pasien  hipertensi dalam  gel  poliakrilamid  18,5%.  No.  1-10: subyek  batuk.  Nomor  11:  subyek  tidak batuk.  ddDNA  mengindikasikan  double- stranded DNA.
Dasar  metode  analisis  SSCP  adalah  bahwa perubahan  yang  terjadi  pada  nukleotida  meskipun terjadi  hanya  pada  satu  basa,  akan  mempengaruhi bentuk  (conformation)  dari  fragmen  DNA  pada kondisi  untai  tunggal.  Namun,  dalam  metode  ini juga terdapat, yaitu kurangnya landasan teori untuk mendukung  terjadinya  mutasi  yang  dideteksi, kesulitan  interpretasi  pita-pita  DNA  yang  muncul pada  gel  akrilamid,  tidak  dapat  memberikan informasi  yang  jelas  terhadap  posisi  mutasi  yang terjadi pada fragmen DNA, dan pola migrasi SSCP tidak  dapat  dikonversi  atau  dinotasikan  menjadi alel  yang  definitif  sampai  posisi  mutasinya  dapat ditemukan [10]. Untuk memastikan dan mengetahui basa mana yang berubah pada metode SSCP maka dilakukan metode DNA sequencing.

## Identifikasi Polimorfisme Gen BK2R. Hasil
DNA  sekuensing  dianalisis  dengan  menggunakan Sequence Scanner  dan BioEdit, untuk mengetahui letak  daerah  promoter  dan  perubahan  basa  yang terjadi pada subyek penelitian.
CC TT CT
Gambar  3.  Promoter  -58  T/C  Gen  BK2R  pada  pasien hipertensi dengan Sequence Scanner.
Single  Nucleotide  Polymorphism  (SNP)  pada daerah promoter Gen BK2R pada manusia terletak dititik -58 T/C (Gambar 3). Hasil yang didapatkan
100 bp 112 bp
sama  halnya  dengan  penelitian  di  Jepang  [6]  dan Korea Selatan [8].
Populasi  yang  digunakan  pada  penelitian  ini jumlahnya terbatas, sehingga diharapkan kedepannya  untuk  menggunakan  jumlah  populasi yang  lebih  banyak  lagi.  Penelitian  ini  diduga adanya keterkaitan genotipe pasien hipertensi yang menjalani terapi ACEi dengan efek samping batuk.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dari  11  subyek penelitian,  diperoleh  tiga  genotipe  pada  Gen BK2R,  yaitu  CC,  CT,  dan  TT,  yang  daerah promoternya terletak pada titik -58T/C.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didukung oleh
Tim
Kardiovaskular dan Hipertensi Universitas
Brawijaya dan didanai oleh Dokumen Pelaksanaan Anggaran  Rumah  Sakit  dr  Saiful  Anwar  (RSSA), Malang.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Kuoppala  A,  Lindstedt  KA,  Saarinen  J, Kovanen PT, Kokkonen JO (2000)
Inactivation  of  Bradykinin  by  Angiotensin- Converting Enzyme and by Carboxypeptidase N in human plasma. Am J Physiol Heart Circ Physiol 278: 1069-1074.
[2]  Sweitzer,  Nancy  K.  2003.  What  Is  an Angiotensin  Converting  Enzyme  Inhibitor? Journal  of  The  American  Heart  Association. Circulation.
[3]  Norman  MK  and  Burton  DR  (2000)  Major Side Effects of ACE Inhibitors. Diabetes Care 14: 34-39.
[4]  Yousef,  G.M.  and  Diamandis  E.P.  2007.  The New Human Tissue Kallikrein Gene
Family:Structure, Function and Association to
Disease. Endocri Rev 22: 184-204.
[5]  Zintzaras E, Raman G, Kitsios G, Lau J. 2008. Angiotensin-converting enzyme insertion/deletion gene polymorphic variant as a  marker  of  coronary  artery  disease:  a  meta- analysis.  Arch  Intern  Med  2008;  168:  1077-
1089.
[6]  Mukae, S., Aoki, S., Itoh, S., Iwata, T., Ueda, H.,  and  Katagiri,  T.  2000.  Angiotensin- Converting  Enzyme  Inhibitor  Related  Cough Receptor  Gene  Polymorphism  Is  Associated
With  Bradykinin  B2  Receptor.  Hypertension. 36:127-131.
[7]  Qiagen.  2012.  DNA  Mini  and  Blood  Mini Handbook. Page:26-28. http://www.qiagen.com/  Diakses  tanggal  15 November 2013.
[8]  Woo, S.W., Bang, S., Chung, M.W., Jin, S.K., Kim,  Y.S.,  Lee,  S.H.  2009.  Lack  of association  between  ACE  and  bradykinin  B2 receptor  gene  polymorphisms  and  ACE inhibitor-induced  coughing  in  hypertensive Koreans. Blackwell Publishing Ltd, Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 34, 561– 567.
[9]  Benbouza, H., Jacquemin, J.M., Baudoin, J.P., Mergeai, G.  2006. Optimization of  a reliable, fast,  cheap  and  sensitive  silver    staining method to detect SSR markers in polyacrylamide  gels. Biotechnol. Agron. Soc. Environ.2006 10 (2), 77 – 81.
[10]  Zhu,  X.  Niu,  N.,  Liu,  Y.,  Du,  Te.,  Chen,  D., Wang,  X.,  Gu,  H.G.  2006.  Improvement  of the  sensitivity  and  resolution  of  PCR-SSCP analysis with optimized primer concentrations in PCR products. Journal of Genetics, Vol. 85, No. 3.