1 Jurusan  Gizi  Politeknik  Kesehatan  Kemenkes  Palangka Raya, Indonesia
2 Fakultas Peternakan dan Pertanian, Universitas Diponegoro, Indonesia
3 Natural  Product  Laboratory-Centre  of  Research  and Services Universitas Diponegoro Semarang, Indonesia
4 Jurusan  Teknologi  Pangan,  Fakultas  Ilmu  Keperawatan dan  Kesehatan,  Universitas  Muhammadiyah  Semarang, Indonesia
Kandungan  beta  karoten,  polifenol  total  dan  aktifitas  “merantas”  radikal bebas  kefir  susu  kacang  hijau (Vigna  radiata )  oleh  pengaruh  jumlah  starter ( Lactobacillus bulgaricus dan Candida kefir) dan konsentrasi glukosa
Teguh Supriyono 1,2 , Retno Murwani 2,3 , Nurrahman 4

## ABSTRACT
Background: Kefir is a well known fermented dairy milk product which is functional for gut health. However kefir can also be made from vegetable milk such as soy or mungbean milk.
Objective: To study the chemical  and functional property of Mungbean milk (MBM) Kefir Methods: Mungbean  milk  was  fermented  into  MBM  Kefir  using  Lactobacillus  bulgaricus  and  Candida  kefir.  Three  levels  of cultures  and  glucose  concentration  were  tested  and  a  complete  randomized  design  experiment  was  employed.  The  resulting MBM  Kefir  were  tested  for  β-carotene  level,  total  polyphenol  content,  and  free  radical  scavenging  activity.  Beta  carotene level, total polyphenols and free radicals scavenging activity were determined by spectrophotometry, Folin-Ciocalteu method, and  DPPH  radical  scavenging  assay  respectively.  The  data  were  analyzed  by  ANOVA  and  when  the  result  of  ANOVA  was significant, Tukey’s multiple comparison was conducted.
Results: Culture  concentration  increased    β-carotene  level  (p  =  0.049),  total  polyphenol  (p  =  0.015)  and  free  radical scavenging activity (p = 0,000) of MBM kefir. Glucose concentration increased total polyphenol (p = 0.002), but had no effect on  free  radical  scavenging  activity  and  β-carotene  level.  However,  there  were  no  interaction  among  treatments  at  0.05 significance level. Total acid level  ranged from 1.57 to 2.54%, with the highest and level at 15% cultures concentration and 15% glucose concentration. Alcohol level ranged from 0.26 to 0.90% which was in accordance with the maximum standard for kefir (1%).
Conclusion: An optimal product of mungbean milk kefir with highest free radical scavenging activity can be obtained using 15% cultures (Lactobacillus bulgaricus and Candida kefir) and 10% glucose concentration.
Keywords: Lactobacillus bulgaricus, Candida kefir, β-carotene, totalpolyphenol, free radicals scavenging activity.

## ABSTRAK
Latar belakang : Fermentasi susu kacang hijau dengan penambahan kultur  Lactobacillus bulgaricus dan Candida kefir dapat meningkatkan sifat fungsionalnya. Sumber energi utama dari kedua mikroorganisme tersebut adalah laktosa, sementara susu kacang  hijau  tidak  mengandung  laktosa.  Kandungan  gula  dalam  susu  kacang  hijau  sebagai  sumber  energi  bagi mikroorganisme  sangat  terbatas,  sehingga  diperlukan  penambahan  glukosa  sebagai  sumber  energi  yang  dapat  langsung digunakan.
Tujuan : Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh jumlah starter (Lactobacillus bulgaricus dan Candida kefir) dan  konsentrasi  glukosa  terhadap  kadar  beta  karoten,  polifenol  total  dan  aktivitas  ”merantas”  radikal  bebas  kefir  susu kacang hijau.
Metode :  Penelitian  ini  adalah  eksperimen  murni.  Rancangan  percobaan  disusun  menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap. Kadar beta karoten ditentukan dengan spektrofotometer, polifenol total dianalisis menggunakan reagen Folin–Ciocalteu dan aktivitas  ”merantas”  radikal  bebas  ditetukan  dengan  DPPH  radical  scavenging  assay.  Data  yang  diperoleh  dianalisis menggunakan uji ANOVA, jika ada pengaruh yang signifikan dilajutkan dengan uji beda Tukey HSD.
Hasil penelitian : Jumlah starter berpengaruh nyata terhadap kadar beta karoten (p = 0,049), polifenol total ( p = 0,015) dan aktivitas  ”merantas”  radikal  bebas  (p  =  0,000).  Ada  pengaruh  konsentrasi  glukosa  terhadap  polifenol  total  (p  =  0,002), sedangkan aktivitas ”merantas” radikal bebas dan kadar beta karoten tidak dipengaruhi oleh konsentrasi glukosa dan tidak ada  interaksi  pada  semua  perlakuan.  Tingkat  signifikansi  yang  digunakan  adalah  0,05.  Kadar  total  asam  berkisar  1,57%  - 2,54%,  dengan  kadar  tertinggi  pada  perlakuan  jumlah  starter  15%  dan  konsentrasi  glukosa  15%,  sementara  untuk  kadar alkohol berkisar 0,26% - 0,90% sesuai dengan literatur yaitu maksimal 1%.
Simpulan :  Kefir  susu  kacang  hijau  dengan  sifat  fungsional yang  optimal  menggunakan  jumlah  starter  (Lactobacillus bulgaricus dan Candida kefir) 15 % dan konsentrasi glukosa 10 %.
Kata  kunci  :  Lactobacillus  bulgaricus,  Candida  kefir,  beta karoten, polifenol total, aktivitas ”merantas” radikal bebas.

## PENDAHULUAN
Fermentasi  merupakan  teknik  yang  tidak  saja  murah namun juga alami untuk menghasilkan dan mengawetkan  makanan.  Dalam  proses  fermentasi dengan  adanya  aktifitas  enzim  dari  mikroba, komponen-komponen  seperti  pati,  lemak,  protein,  zat toksik  dan  senyawa  anti  gizi  dapat  dipecah.  Teknik fermentasi  ini  memunculkan  banyak  ketertarikan untuk  diaplikasikan  pada  bahan  pangan  kacang  – kacangan karena adanya efek peningkatan zat gizi dan pengaruh yang baik bagi kesehatan. 1
Produk fermentasi susu dapat berupa yoghurt atau kefir,  tergantung  dari  jenis  mikroorganisme  yang digunakan  selama  fermentasi.  Kefir  adalah  produk yang  dihasilkan  dari  fermentasi  susu  sapi  yang  telah dipasteurisasi  kemudian  ditambahkan starter berupa butir atau biji kefir ( kefir grain/kefirgranule ).
Kefir  dapat  pula  dibuat  menggunakan  bahan  baku susu  nabati  yaitu  dari  kacang-kacangan.  Kelebihan susu  nabati  sebagai  bahan  baku  susu  fermentasi adalah  kandungan  lemak  yang  rendah  dan  tidak mengandung  kolesterol.  Kacang  hijau  merupakan bahan  pangan  lokal  yang  dapat  digunakan  sebagai bahan baku susu fermentasi. Kacang hijau mengandung senyawa - senyawa fungsional diantaranya  β - karoten  dan  polifenol.  Senyawa  – senyawa  ini  telah  diketahui  memiliki  sifat  fungsional sebagai antioksidan dan immunomodulator. Kemampuan β - karoten sebagai antioksidan ditunjukkan  dalam  mengikat  radikal  oksigen  ( 1 O 2 ), “merantas”  atau  merapuhkan  radikal  peroksil  dan menghambat  oksidasi  lipid,  sedangkan  polifenol mampu  ”merantas”  oksigen  dan  radikal  alkil  dengan memberikan  donor  elektron  sehingga  terbentuk radikal fenoksil yang relatif stabil. 2 Satu hal yang penting pada fermentasi menggunakan  bakteri  asam  laktat  (BAL)  dengan bahan  baku  dari  susu  kacang-kacangan  adalah  jenis karbohidratnya yang berbeda dengan karbohidrat pada susu  sapi.  Susu  kacang-kacangan  mengandung oligosakarida  dan  polisakarida  sedangkan  pada  susu sapi  adalah  laktosa. 3 Kandungan  gula  yang  terdapat dalam  susu  kacang  hijau  yang  dapat  dimanfaatkan oleh  mikroorganisme  yang  berperan  dalam  proses pembuatan kefir sangat terbatas, oleh karena itu perlu dilakukan penambahan gula sebagai sumber karbon.
Glukosa adalah gula dalam bentuk sederhana yang dapat  langsung  dimanfaatkan  oleh  mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Diharapkan dengan penambahan glukosa pertumbuhan Lactobacillus bulgaricus dan Candida kefir dapat dipacu . Pembuatan  kefir  dengan  bahan  baku  susu  kacang hijau belum pernah dilakukan sebelumnya, danperubahan  β - karoten  dan  senyawa  polifenol selama  fermentasi  kefir  kacang  hijau,  serta  sifat
fungsional kefir kacang hijau sebagai antioksidan juga belum  diketahui,  sehingga  dilakukan  kajian  terhadap perubahan  kandungan  β - karoten,  polifenol  total  dan aktifitas  ”merantas”  radikal  bebas  kefir  susu  kacang hijau akibat proses fermentasi.

## METODE DAN BAHAN
Materi  yang  digunakan  adalah  kacang  hijau,  air minum,  susu  sapi  segar,  kultur  murni  dari  bakteri Lactobacillus bulgaricus dan khamir Candida kefir.

## Produksi susu kacang hijau
Pembuatan Susu Kacang Hijau dilakukan menurut metode  Widowati  dan  Masgiyarta(2007). 4 Kacang hijau yang telah dipisahkan dari kotoran dan biji rusak direndam  dalam  air  dengan  perbandingan  air  dengan kacang  hijau  3  :  1  selama  8  jam.  Kacang  hijau ditiriskan dan dididihkan selama 20 menit. Kemudian kacang  hijau  digiling  menggunakan waring  blender . Bubur ( slurry )  kacang  hijau  yang  diperoleh  ditambah air  mendidih  sehingga  jumlah  air  secara  keseluruhan mencapai  8  kali  lipat  bobot  kacang  hijau  kering. Bubur  encer  disaring  dengan  kain  kasa  dan  filtratnya merupakan  susu  kacang  hijau.  Susu  kacang  hijau dipasteurisasi pada suhu 85 o C selama 30 menit.

## Pembuatan Starter Kefir
Medium  yang  digunakan  untuk  membuat starter kefir  yaitu  susu  sapi  yang  dipasteurisasi  pada  suhu 85˚C selama 30 menit. Susu didinginkan sampai suhu ruang  dan  kemudian  ditambahkan  kultur  murni  dari bakteri Lactobacillus bulgaricus dan khamir Candida kefir dengan  rasio  1  :  1 . Susu  diinkubasi  pada  suhu ruang selama 20 jam dandidinginkan pada suhu 10 o C selama 2 hari untuk pematangan. Jumlah mikroorganisme  pada  starter  (CFU/ml)  dihitung dengan  metode  TPC  ( Total  Plate  Count )  sehingga diketahui jumlah mikroorganisme yang akan ditambahkan. Starter yang  digunakan  memiliki jumlah mikroorganisme 4,0 x 10 6 cfu/ml.

## Pembuatan Kefir Susu Kacang Hijau
Susu  kacang  hijau  dipanaskan  pada  suhu  85˚C selama  30  menit,  dan  ditambahkan  glukosa  sesuai perlakuan yaitu 5%, 10% dan 15%. Susu kacang hijau selanjutnya  didinginkan  pada  suhu  ruang.Setelah dingin  ditambahkan starter kefir  yang  mengandung kultur  murni Lactobacillus  bulgaricus dan Candida kefir sesuai  perlakuan  yaitu  sebanyak  5  %,  10  %  dan 15  %.  Susu  kacang  hijau  yang  telah  ditambahkan dengan starter diinkubasi pada suhu 43,5 o C selama 6 jam  dalam  inkubator.  Kefir  susu  kacang  hijau  yang dihasilkan  kemudian  didinginkan  pada  suhu  10˚C selama  2  hari  untuk  menghambat  pembentukan alkohol  oleh  khamir.  Setelah  itu  kefir  susu  kacang hijau langsung dianalisis.

## Rancangan Penelitian
Rancangan  percobaan  disusun  menggunakan Rancangan Acak Lengkap pola faktorial 2 x 3, dimana masing-masing  satuan  percobaan  diulang  sebanyak  3 kali.  Faktor    I  adalah  jumlah starter dan  Faktor  II adalah  konsentrasi  glukosa,  masing-masing  faktor terdiri  dari  3  (tiga)  level.  Untuk  melihat  pengaruh perlakuan  yaitu  jumlah starter dan  konsentrasi glukosa  terhadapβ-karoten,  polifenol  total,  dan aktifitas  ”merantas”  radikal  bebaskefir  susu  kacang hijau,  datadiujistatistik  menggunakan Analysis  of Varians (ANOVA)  dan software SPSS  11.5.Apabila diantara  perlakuan  terdapat  pengaruh  nyata  maka dilanjutkan  dengan  uji  beda  dengan  mengunakan  uji Tukey Honestly  Significance  Difference (HSD)  pada taraf 5 %. 5
Pengukuran kadar  -carotene 6
Sampel  kefir  sebanyak  1  ml  ditambah  aquades  8 ml  dan  dihomogenkan  dengan  vortex.  Dua  ml  dari campuran diambil 2 ml dan dimasukkan dalam tabung reaksi,  ditambahkan  2  ml  alkohol  96%  dan  10  ml petroleum  eter  (PE).  Setelah  dikocok  selama  2  menit dengan  vortex,  dipisahkan  menggunakan  sentrifus. Lapisan  PE  diambil  dan  sisanya  diekstrak  kembali dengan  PE  10  ml  dan  dipisahkan  kembali  seperti sebelumnya. Kedua lapisan PE disatukan dan diambil 2  ml  untuk  dibaca  pada  Spektrofotometer  pada panjang gelombang 450 nm. Kadar  -karoten (µg/100 ml) ditentukan dengan rumus (A x F x 100/0.04)x0,5. A  adalah  absorbansi  dalam  pelarut  PEdan  F  adalah faktor konversi.

## Pengukuran kadar polifenol total 7
Sampel  kefir  sebanyak  1  ml  ditambah  aquades  75 ml.  Kemudian  ditambahkan  reagen  Folin-Ciocalteu sebanyak  5  ml.  Selanjutkan  ditambahkan  sodium karbonat  jenuh  sebanyak  10  ml  dan  100  ml  aquades. Larutan dihomogenkan  menggunakan  shaker.  Sampel selanjutnya  dibaca  pada  Spektrofotometer  pada panjang  gelombang  760  nm.  Sebagai  standar digunakan asam tanat dengan konsentrasi 0-9 mg/ml.

## Pengukuran Aktifitas merantas radikal bebas
8
Sampel  kefir  sebanyak  200  ml  ditambah  dengan 1ml etanol dan 800 ml buffer Tris-HCl 100 mM pH  7.  Kemudian  ditambahkan  1  ml  DPPH  500mM. Larutan  campuran  dikocok  sampai  homogen  dan didiamkan  selama  20  menit  dalam  ruang  gelap. Selanjutnya  larutan  dibaca  absorbansinya  pada spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  517  nm. Sebagai standar antioksidan digunakan asam askorbat dengan  konsentrasi  0,16-1,28  mg/ml.  Aktifitas merantas  sampel  (%)  dihitung  dengan  rumus  (1-  A
sampel 517nm /A blanko 517 nm ) x 100

## Pengukuran Total Asam dan Kadar Alkohol 9
Seluruh  sampel  diukur  total  asamnya  (asam laktat) 10 dan kadar alkohol dengan metode distilasi. 9

## HASIL

## Kadar β -Caroten
Kadar  beta  karoten  kefir  susu  kacang  hijau  oleh pengaruh  jumlah starter ( L.  bulgaricus  dan  C.  kefir ) dan  konsentrasi  glukosa  disajikan  pada  Gambar2. Kadar  beta  karoten  kefir  susu  kacang  hijau  berkisar antara  18,24–46,75  g/100  ml.  Secara  umum  terjadi peningkatan  kadar  beta  karoten  setelah  fermentasi dibandingkan sebelum susu kacang hijau difermentasi (17  g/100 ml) dan lebih tinggi dibandingkan dengan kefir susu sapi (12,75  g/100 ml).
Jumlah  beta  karoten  yang  ada  menurun  karena telah digunakan dalam reaksi penetralan radikal bebas tersebut. Hal ini juga berhubungan dengan total fenol yang  menurun  pada  jumlah starter yang  semakin banyak  (Tabel  2.).Analisis  statistik  menunjukkan bahwa jumlah starter berpengaruh terhadap kadar beta karoten  (p  =  0.049)  dan  jumlah  glukosa  tidak berpengaruh.  Kadar  beta  karoten  meningkat  pada jumlah starter 10 % dan menurun pada jumlah starter 15 %. Kadar beta karoten yang tertinggi didapat pada perlakuan dengan jumlah starter 10% dan konsentrasi glukosa 10% dibandingkan dengan perlakuan lain.

## Polifenol Total
Polifenol  total  kefir  susu  kacang  hijau  oleh  pengaruh jumlah starter ( L.  bulgaricus  dan  C.  kefir )  dan konsentrasi  glukosa  disajikan  pada  Gambar  2. Polifenol total kefir susu kacang hijau berkisar 0,0384 mg/ml  –  0,054  mg/ml.  Terjadi  peningkatan  polifenol total  selama  fermentasi  dibandingkan  dengan  susu kacang  hijau  sebelum  fermentasi  (0,035  mg/ml)  dan lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  kefir  susu  sapi (0,017 mg/ml). Analisis statistik menunjukkan bahwa jumlah starter dan  jumlah  glukosa  berpengaruh terhadap kadar total polifenol (p = 0,015).

## Aktifitas ”Merantas” Radikal Bebas
Aktifitas  ”merantas”  radikal  bebas (free  radical scavenging  activity) adalah  kemampuan  antioksidan sebagai  “ scavenger ”  radikal  bebas  seperti  peroksida, hidroperoksida atau peroksil lipid sehingga menghambat mekanisme oksidasi (Prakash,
2001).Aktifitas  “merantas”  radikal  bebas  kefir  susu kacang  hijau  oleh  pengaruh  jumlah  starter  ( L. bulgaricus  dan  C.  kefir )  dan  konsentrasi  glukosa disajikan pada Gambar 3. Analisis statistik menunjukkan  bahwa  jumlah starter berpengaruh terhadap kadar total polifenol  (p = 0,015) dan jumlah glukosa tidak berpengaruh.
Tabel 1. Total Asam Kefir Susu Kacang Hijau Jumlah Stater (%) Konsentrasi Glukosa 5% 10% 15% 5 % 1,57 ± 0,11590 1,76 ± 0,47260 2,07 ± 0,22743 10 % 1,64 ± 0,03055 1,80 ± 0,19468 2,15 ± 0,07095 15 % 1,96 ± 0,15100 2,06 ± 0,07638 2,54 ± 0,29094 Rata-rata 1,72 ± 0,20280 1,87 ± 0,17770 2,25 ± 0,23286 Tabel 2. pH Kefir Susu Kacang Hijau Jumlah Stater (%) Konsentrasi Glukosa 5% 10% 15% 5 % 4,35 ± 0,08000 4,22 ± 0,10693 3,90 ± 0,18502 10 % 4,27 ± 0,10017 4,16 ± 0,19296 3,82 ± 0,19672 15 % 4,01 ± 0,10970 3,96 ± 0,06658 3,74 ± 0,05508 Rata-rata 4,21 ± 0,17741 4,11 ± 0,16417 3,82 ± 0,15425

## Total Asam
Tabel  1  dan  2  menunjukkan  total  asam  kefir kacang  hijau  akibat  perlakuan  jumlah starter ( Lactobacillus  bulgaricus dan Candida  kefir )  dan konsentrasi  glukosa.  Pada  kefir  kacang  hijau,  selain Lactobacillus  bulgaricus yang  membentuk  asam  – asam  organik, Candida  kefir juga  mempunyai kontribusi  dalam  pembentukan  asam  organik  seperti asam  asetat  dan  asam  laktat,  sehingga  pH  kefir  susu kacang  hijau  menjadi  rendah.  Sebagian  besar,  total asam  kefir  susu  kacang  hijau  memenuhi  Standar Nasional Indonesia (SNI) yang dalam hal ini mengacu pada  SNI  yoghurt  karena  SNI  untuk  kefir  belum ada.Analisis  statistik  menunjukkan  bahwa  jumlah starter dan jumlah glukosa tidak berpengaruh terhadap total asam dan pH.

## Kadar Alkohol
Pengaruh jumlah starter ( Lactobacillus bulgaricus dan Candida  kefir )  dan  konsentrasi  glukosa  terhadap kadar alkohol kefir kacang hijau disajikan pada Tabel 3.  Analisis  statistik  menunjukkan  bahwa  jumlah starter dan  jumlah  glukosa  tidak  berpengaruh terhadap kadar alkohol.

## PEMBAHASAN
Peningkatan  kadar  beta  karoten  setelah  fermentasi kemungkinan  berasal  dari  beta  karoten  yang diproduksi oleh Candida kefir . Candida kefir merupakan  khamir  seperti  fungi  ( yeast  like  fungi ) yang bersifat chromogenic dan menghasilkan berbagai pigmen antara lain pigmen hijau, kuning, oranye, dan hitam. 13,18 Diantara  khamir  yang  digunakan  dalam fermentasi  makanan  adalah  khamir  dari  famili Ascomycetous, khamir dari genus Candida dan genus Saccharomyces  cerevisiae. Kecenderungan  penurunan kadar beta karoten dengan semakin banyaknya jumlah
starter  karena  fermentasi  melibatkan  beragam  tipe reaksi  kimia  termasuk  proses  oksidasi. 11 Semakin banyak  jumlah  startersemakin  meningkatkan  reaksi oksidasi sehingga semakin banyak pula hasil samping oksidasi  berupa  radikal  bebas  seperti  singlet  oksigen. Beta  karoten  yang  ada  kemudianberperan  sebagai antioksidan  untuk  meredam  hasil  samping  reaksi oksidasi  tersebut  dan  bereaksi  dengan  radikal  bebas menjadi  senyawa  yang  lebih  stabil.  Selain  itu  bakteri asam  laktat  juga  menghasilkan  hidrogen  peroksida (H 2 O 2 )  yang  berperan  sebagai  prekusor  pembentukan radikal bebas selama fermentasi.
Peningkatan  kadar  polifenol  susu  kacang  hijau selama  fermentasi  oleh  mikroba  kefir  menandakan bahwa  mikroba  kefir  mampu  memproduksi  polifenol sebagai metabolit sekunder.
Total polifenol meningkat pada jumlah starter 10% dan  sedikit  menurun  pada  jumlah  starter  15%. Penurunan  polifenol  total  kemungkinan  disebabkan kondisi    asam  yang  semakin  meningkat  dengan semakin  banyaknya  penambahan  jumlah  starter  dan konsentrasi  glukosa.  Asam  yang  terbentuk  dihasilkan oleh Lactobacillus bulgaricus yaitu dengan mengkonversi glukosa menjadi asam laktat. Selain itu Candida  kefir juga  dapat  mengkonversi  glukosa menjadi asam laktat dan asetat.
Reaksi  oksidasi  dari  proses  fermentasi  ini  juga menghasilkan  hasil  samping  berupa  radikal  bebas seperti yang telah dikemukakan sebelumnya. Polifenol juga  akan  beraksi  sebagai  antioksidan  seperti  halnya beta  karoten  untuk  menetralkan  hasil  samping  reaksi oksidasi  tersebut.  Namun  disini  penurunan  ini  kecil sekali  dibandingkan  penurunan  yang  terjadi  pada kadar beta karoten (Gambar 1). Hasil ini menandakan bahwa beta karoten digunakan lebih banyak atau lebih tersedia sebagai antioksidan sistim pangan kefir. Untuk  pengaruh  kadar  glukosa  terhadap  kadar polifenol  hanya  terjadi  pada  jumlah  starter  5%.  Pada
jumlah starter 5% ini, kadar polifenol total meningkat dari  jumlah  glukosa  5%  ke  10%  namun  kemudian menurun kembali. Perubahan kadar total polifenol ini berhubungan  dengan  jumlah  substrat  yang  semakin tersedia  dengan  jumlah  glukosa  yang  meningkat. Penurunan  kembali  pada  jumlah  glukosa  15%  karena jumlah  starter  yang  hanya  5%  tidak  dapat meningkatkan  penggunaan  substrat  glukosa  yang  ada sehingga jumlah polifenol sebagai metabolit sekunder juga menurun kembali.
Pada  yoghurt,  kemampuan  “merantas”  terhadap radikal  bebas  dari Lactobacillus  bulgaricus lebih besar dibanding dengan Streptococcus thermoplillus. 12
Gambar  3  menunjukkan  aktifitas  merantas  radikal bebas  kefir  susu  kacang  hijau  oleh  pengaruh  jumlah starter ( Lactobacillus  bulgaricus dan Candida  kefir ) dan  konsentrasi  glukosa.  Semakin  banyak  jumlah starter menyebabkan  kemampuan  “merantas”  radikal bebas juga semakin besar Aktifitas”merantas” radikal bebas tertinggi didapat pada perlakuan dengan jumlah starter 15%.  Hal  ini  karena  sel  dari  kultur  bakteri asam  laktat  sendiri  memiliki  kemampuan  “merantas” radikal  bebas.  Sebagian  besar  komponen  antioksidan pada kefir terakumulasi pada biji kefir ( kefir grain ). 14
Gambar 1.   Kadar Β-caroten Kefir Susu Kacang Hijau oleh Pengaruh Jumlah Starter ( Lactobacillus bulgaricus dan Candida kefir )dan Konsentrasi Glukosa, dibandingkan dengan kefir susu kacang  hijau  tanpa  fermentasi  dan  kefir  susu  sapi.  Matriks  huruf  besar  yang  berbeda menunjukkan perbedaan nyata jumlah starter.
Gambar 2.   Total  Polifenol  Kefir  Susu  Kacang  Hijauoleh  Pengaruh  JumlahKonsentrasi  Glukosa. Matriks  huruf  besar  yang  berbeda,  menunjukkan  perbedaan  nyata  jumlah  starter. Matriks huruf kecil yang berbeda, menunjukkan perbedaan nyata kadar glukosa. Ket :
= Glukosa 5 %,   = Glukosa 10 %, = Glukosa 15 %
Tota l Pol if enol (% ) 0,07 0 5 % 10  % 15  %
Jumlah Stater (%)
0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 A B AB K ada r B et a Ka rot en (µg) 0 5 % 10  % 15  % Jumlah Stater (%) 70 60 50 40 30 20 10 AB A B Kefir susu sapi Kefir susu
KH tanpa fermentasi
Pada yoghurt, Lactobacillus bulgaricus memiliki efek sebagai  antioksidan,  “merantas”  hidroksil  radikal, hidrogen  peroksida  dan  malonaldehida  pada  reaksi oksidasi. Jumlah sel Lactobacillus bulgaricus sebanyak  10 8 cfu/mlmenghasilkan  kemampuan  yang tinggi  dalam  menghambat  oksidasi  asam  lemak. 12 Sedangkan Candida  kefir adalah  khamir  probiotik yang  berperan  menyediakan  nutrisi  seperti  asam amino  dan  vitamin  serta  mengkondisikan  pH  untuk pertumbuhan  mikroorganisme  lain, 13 karena  khamir mempunyai  kemampuan  lebih  besar  dalam  mencerna substrat dibanding dengan bakteri asam laktat. 14
Hanya  saja  pada  perlakuan  konsentrasi  glukosa 15%,  total  asam  kefir  susu  kacang  hijau  diatas  rata- rata SNI. Hal ini disebabkan konsentrasi glukosa yang lebih  tinggi  akan  menyebabkan  produksi  asam-asam organik semakin  meningkat.  Semakin banyak sumber gula yang dapat dimetabolisme maka semakin banyak pula asam-asam organik yang dihasilkan sehingga  pH juga akan semakin rendah. 15
Sebagian besar khamir memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya  dan  dengan  mengontrol  oksigen pertumbuhan  khamir  dapat  dikendalikan 13 .  Alkohol yang  terbentuk  selama  fermentasi  susu  kacang  hijau
menjadi  kefir  dihasilkan  oleh Candida  kefir . Candida kefir adalah golongan khamir yang mampu memfermentasi laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena dapat mensintesa enzim laktase dan menghasilkan  alkohol  dan  CO 2 . 16 Pada  pembuatan kefir  susu  kacang  hijau,  fermentasi  dilakukan  dalam keadaan  tertutup.  Hal  ini  dilakukan  agar  aktifitas khamir dapat dikendalikan sehingga dengan pembatasan oksigen dapat menghambat Candida kefir mengkonversi  glukosa  yang  ditambahkan  menjadi alkohol.  Selain  itu,  setelah  diinkubasi  selama  6  jam pada  suhu  43,5 o C,  kefir  susu  kacang  hijau  langsung dimasukkan  kedalam  pendingin  pada  suhu  10 o C. Perlakuan  ini  juga  dimaksudkan  untuk  menghambat aktifitas Candida kefir sehingga alkohol yang dihasilkan  selama  fermentasi  dapat  dikendalikan, 19 kefir  harus  disimpan  pada  suhu  rendah  agar  khamir tidak menghasilkan alkohol dan CO 2 yang berlebihan. Kadar  alkohol  kefir  susu  kacang  hijau  memiliki kisaran  0,26–0,90  %.  Kadar  alkohol  pada  susu fermentasi  dalam  Standar  Nasional  Indonesia  (SNI) belum  ada,  menghasilkan  kadar  alkohol  kefir sebanyak 0,5–1,0 %. 11
Tabel 3. Kadar Alkohol (%) Kefir Susu Kacang Hijau Jumlah Stater (%) Konsentrasi Glukosa 5% 10% 15% 5 % 0,26 ± 0,03055  0,36 ± 0,02517  0,49 ± 0,03055 10 % 0,53 ± 0,02517  0,63 ± 0,03000  0,72 ± 0,03215 15 % 0,62 ± 0,02517  0,81 ± 0,01528  0,90 ± 0,02646 Rata-rata 0,47 ± 0,16508  0,60 ± 0,20012  0,70 ± 0,18121
Gambar 3.  Aktifitas  “Merantas”  Radikal  Bebas  Kefir  Susu  Kacang  Hijauoleh  Pengaruh Jumlah  Starter  ( Lactobacillus  bulgaricus dan Candida  kefir )  dan  Konsentrasi Glukosa. Matriks huruf besar yang berbeda, menunjukkan perbedaan nyata jumlah starter. Ket: = Glukosa 5 %,   = Glukosa 10 %, = Glukosa 15 %
A kt iv it as “ m er an tas ” r adi ka l beb as ( % ) 70 60 50 40 30 20 10 0 5 %
10  %
15  % Jumlah Stater (%) A A B

## SIMPULAN
Kefir  susu  kacang  hijau  memiliki  aktifitas merantas radikal bebas maksimal pada jumlah starter 15%  dan  jumlah  glukosa  10%  dengan  akhir  pH  3,96 dan  kadar  alkohol  0,81%.  Meskipun  pada  kondisi starter dan  kadar  glukosa tersebut  kadar  beta  karoten rendah  namun  kadar  polifenolnya  tetap  tinggi  dan menggambarkan  bahwa  beta  karoten  digunakan  lebih banyak  oleh  mikroba  kefir  sebagai  senyawa  penetral radikal  bebas  yang  muncul  selama  proses  oksidasi (fermentasi).

## DAFTAR PUSTAKA
1. Khalil  AA.  Nutritional  Improvement  of  an Egyptian  Breed  of  Mung  Bean  by  Probiotic Lactobacilli.  African  Journal  of  Biotechnology. 2006;5 (2): 206-212.
2. Mokgope  LB.  Cowpea  Seed  Coats    and  Their Extracts  :  Phenolic  Composition  and  Use  as Antioxidants  in  Sunflower  Oil.  South  Africa: Department  of  Food  Science.  University  of Pretoria; June 2006.
3. Yusmarini  dan  Efendi.  Evaluasi  Mutu  Soygurt yang  dibuat  dengan  Penambahan  beberapa  Jenis Gula.  Jurnal  Natur  Indonesia.  2004;  6(2):  104- 110.
4. Widowati,  S  dan  Misgiyarta.  Efektifitas  Bakteri Asam  Laktat  (BAL)  dalam  Pembuatan  Produk Fermentasi Berbasis Protein/Susu Nabati. Prosiding  Seminar  Hasil  Penelitian  Rintisan  dan Bioteknologi Tanaman. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian; 2007.
5. Steel  RGD,  Torrie  JH.  Prinsip  dan  Prosedur Statistika:  Suatu  Pendekatan  Biometrik.  Edisi Kedua. Dialihbahasakan oleh Bambang Sumantri. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama;
1993.
6. Nielsen  SS.  Introduction  to  the  Chemical Analysis of Food. New York: Chapman and Hall; 1995.
7. Shahidi  F,  Nazck  M.  Food  Phenolics.  Basel: Technomic Publishing Company, Inc; 1995.
8. Othman  A,  Ismail  A,  Ghani  NA,  Adenan  I. Antioxidant  capacity  and  phenolic  content  of cocoa  benas.  Food  Chemistry.  2007;  100:  1523- 1530.
9. James  CS.  Analysis  Chemistry  of  Food.  Great Britain:  Blackie  Academic  and  Professional; 1995.
10. Ranggana  S. Manual  Of  Analysis  of  Fruit  and Vegetables Product . Tata. New Delhi: MC. Graw
Publishing Company Limited; 1997.
11. Rahman  A,  Fardiaz  S,  Rahaju  WP,  Suliantari, Nurwitri  CC.  Teknologi  Fermentasi  Susu.  Pusat Antar  Universitas  Pangan  dan  Gizi.  Institut Pertanian Bogor; 1992.
12. Lin MY, Yen CL. Reactive Oxygen Species and Lipid  Peroxidation  Product-Scavenging  Ability of  Yogurt  Organisms.  Department  of  Food Science,  National  Chung  Hsing  University, Taichung  402,  Taiwan.  Journal  Dairy  Science. 2004;  82:1629–1634.
13. Battcock  M,  Azam-Ali  S.  Basic  Principles  of Fermentation. FAO Agricultural Services
Bulletin  No.  134.  United Kingdom:  Intermediate Technology,  Schumacher  Centre  for  Technology and Development; 1998.
14. Liu  JR,  Chen  MJ,  Lin  CW.  Antimutagenic  and Antioxidant  Properties  of  Milk−Kefir  and Soymilk−Kefir.  Department  of  Animal  Science, National  Taiwan  University  and  Institute  of BioAgricultural Sciences. 2004; 1 – 8.
15. Rahman A. Pengantar Teknologi Fermentasi. IPB Bogor: Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi; 1989.
16. Yusmarini,  Efendi  R.  Evaluasi  Mutu  Soygurt yang  dibuat  dengan  Penambahan  beberapa  Jenis Gula.  Jurnal  Natur  Indonesia.  2004;  6(2):  104- 110.
17. Seyis  I,Aksoz  N.  Production  of  Lactase  By Trichoderma  Sp.,  Food  Technol.  Biotechnol. 2004; 42 (2): 121–124.
18. Baumgartner  C,  Freydiere  AM,  Gille  Y.  Direct Identiﬁcation  and  Recognition  of  Yeast  Species from Clinical Material by Using Albicans ID and CHROM  agar  Candida  Plates.  Journal  Of Clinical Microbiology. 1996; 34(2): 454–456. 19. Surono  IS.  Probiotik,  Susu  Fermentasi  dan Kesehatan. Jakarta: Yayasan Pengusaha Makanan dan  Minuman  Seluruh  Indonesia  (YAPMMI). TRICK; 2004.