## PENGEMBANGAN METODE PENENTUAN ISOFLAVON KADAR RENDAH DALAM LIMBAH CAIR TAHU MENGGUNAKAN ENZIM NADH OKSIDASE
Purbowatiningrum Ria Sarjono 1 , Hasim 2 , Dyah Iswantini 2
1) Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia FMIPA UNDIP Semarang 50275
2) Fakultas MIPA-KIMIA Institut Pertanian Bogor

## ABSTRAK
Penentuan isoflavon asal limbah tahu telah dilakukan.Ekstrak kasar isoflavon asal limbah tahu diperoleh dengan cara menghidrolisis menggunakan HCl 4 N diperoleh rendemen sebanyak 4,81 g/l. Kadar  isoflavon  diukur  menggunakan  metode  Graham  (1999)  yang  sebelumnya  dilakukan  optimasi enzim NADH oksidase diperoleh panjang gelombang optimum pada 327 nm pada suhu 35°C, pH 5, konsentrasi  substrat optimum  100  μM,  konsentrasi  enzim  optimum  0,3  U/ml.  Kadar isoflavon dalam limbah tahu 0,123x10 3 ppm sedangkan kadar isoflavon kedelai sebesar 0,5921x10 3 ppm. Sehingga kadar isoflavon limbah tahu adalah sebesar 20% dibanding kadar isoflavon kedelai.
Kata kunci: isoflavon, limbah tahu, NADH Oksidase

## DETERMINATION OF ISOFLAVONES FROM TOFU WASTE USING NADH OXIDASE ENZYME METHODE

## ABSTRACT
The research of determination of isoflavones from tofu waste had been done. Isoflavones were hydrolized by HCl 4 N and produced crude extract 4,81 g/l. Content of isoflavones were measured with graham  (1999)  methode,  before  this  measure  was  done  NADH  Oxidase  enzyme  optimate.  Obtained optimum wave length at 327 nm, optimum temperature at 35°C, pH 5, optimum substrat consentration at  100  μM,  optimum  enzyme  consentration  at  0,3  U/ml.  Content  of  isoflavones  liquid  tofu  waste 0,123x10 3 ppm and content of isoflavones soybean 0,591 x 10 3 ppm. Content of isoflavones liquid tofu waste is 20% than isoflavones soybean.
Keywords: isoflavones, tofu waste, NADH Oxidase

## PENDAHULUAN
Isoflavon  adalah  salah  satu  jenis  fitoestrogen yang  mempunyai  struktur  kimia  serupa  dengan estradiol.  Dalam  usus  halus,  isoflavon  akan dihidrolisis oleh beta-glukosidase dan menghasilkan aglikones, daidzein, genistein dan glisitein  yang  selanjutnya  akan  diabsorpsi  dan berikatan  dengan  asam  glukuronik,  kemudian mencapai siklus enterohepatik dan disekresikan melalui  kantung  empedu.  Fitoestrogen  dapat berkaitan dengan reseptor spesifik estrogen pada nukleus  sel  dan  berdampak  menyerupai  respon hormon estrogen (Setchell). Kandungan isoflavon  banyak  terdapat  dalam  tanaman sayuran, buah-buahan, padi-padian dan kacang- kacangan  terutama  banyak  pada  kedelai. Isoflavon yang utama terkandung dalam kedelai adalah  genistein  dan  daidzein.  Biochanin  A
banyak terdapat pada semanggi (Peterson 1998). Pada dosis 37  M genistein mampu menghambat tirosin kinase (Messina 1991).
Salah  satu  produk  olahan  kedelai  yang  banyak dikonsumsi  masyarakat  adalah  tahu.  Dari  data diketahui bahwa isoflavon dalam tahu 336  g/g protein lebih kecil jika dibanding dengan kedelai yang tidak dimasak 1891  g/g protein (Anderson 1992).  Jadi  diperkirakan  isoflavon  terdapat dalam limbah tahu yang terbuang selama proses pembuatan.  Hal  ini  diperkuat  dengan  sifat isoflavon  yang  terikat  glukosa  (glikon)  lebih polar sehingga bersifat larut air (Harborne 1996). Kemungkinan isoflavon banyak terbuang bersama  limbah  cair  tahu.  Limbah  cair  yang dimaksud adalah bagian fraksi susu kedelai yang tidak  ikut  terkoagulasi  pada  pembuatan  tahu. Taher (2003) melaporkan konsentrasi isoflavon
sekitar  0,2418  g/l  terbuang  dalam  limbah  cair dari proses pembuatan tahu, dengan modifikasi metode  Nugroho  (2004)  memperoleh  hasil 4,2929  g/l.  Setiap  harinya  volume  limbah  cair yang terbuang dari pabrik tahu yang berkapasitas mengolah 1 ton kedelai perhari dapat mencapai 5000 liter limbah perhari.
Isoflavon telah dibuktikan sebagai senyawa yang memiliki  kemampuan  dalam  melindungi  LDL dari  oksidasi  yang  diinduksi  oleh  Cu 2+ secara invitro  (Taher  2003)  dan  sebagai  penghambat tirosin  kinase  suatu  enzim  penyebab  kanker (Messina 1991). Karena penggunaan limbah cair tahu  selama  ini  masih  sangat  terbatas  yaitu sebagian  kecil  digunakan  sebagai  biang  tahu pada pembuatan tahu selanjutnya atau digunakan sebagai  media  pertumbuhan  beberapa  jenis bakteri, maka pada penelitian ini mencoba untuk memanfaatkan lebih lanjut isoflavon dari limbah tahu tersebut.
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan mengukur kadar isoflavon asal limbah cair tahu menggunakan metode enzimatis yang dikembangkan oleh Graham (1999).
Keuntungan  metode  enzimatis  adalah  dapat menentukan  kadar  isoflavon  dalam  jumlah relatif  rendah  (sampai  M)  dan  dapat  dipakai sekaligus untuk macam isoflavon dan kadarnya (kualitatif dan kuantitatif).
Aktivitas  suatu  enzim  dipengaruhi  oleh  faktor suhu,  pH,  konsentrasi  substrat  dan  konsentrasi enzim (Dixon). Sehingga perlu diketahui kondisi optimum  metoda  enzimatis  ini,  yaitu  dengan cara menentukan suhu, pH, konsentrasi substrat dan konsentrasi enzim yang dapat menyebabkan aktivitas  optimum  enzim  dengan  melakukan percobaan  pada  berbagai  variasi  faktor-faktor tersebut.

## METODE PENELITIAN
Berdasarkan  tujuan  yang  ingin  dicapai,  maka penelitian  ini  terdiri  dari  beberapa  tahap  yaitu tahap ekstraksi limbah cair tahu, optimasi enzim
NADH  oksidase,  pengukuran  kadar  isoflavon dari limbah cair tahu.

## Ekstraksi Isoflavon Limbah Cair Tahu
Limbah cair tahu sebanyak 1000 ml dipekatkan dengan  rotavapor  vakum  selama  6  jam, dihidrolisis dengan HCl 4 N selama 2 jam. Hasil hidrolisis kemudian diekstrak dengan etil asetat.

## Metode Pengukuran Kadar Isoflavon Limbah Cair Tahu
Metoda yang digunakan dalam penentuan kadar isoflavon dalam limbah cair tahu adalah metode enzimatis oleh Graham (1999). Pada metoda ini digunakan  enzim  NADH  oksidase.  Mula-mula disiapkan  larutan  stok  enzim  2,5  U/ml  NADH oksidase + buffer potassium fosfat 30 mM (pH 7,5)  mengandung  0,1%  bovin  serum  albumin (BSA).  Selanjutnya  dilakukan  optimasi  enzim NADH  oksidase  untuk  memperoleh  kondisi suhu,  pH,  konsentrasi  substrat,  dan  konsentrasi enzim  optimum.  Optimasi  Metoda  Enzim. Sebanyak  10  l  enzim  0,2  U/ml  diinkubasi selama  5  menit  dengan  500  l  buffer  phospat 100  mM,  100  l  sukrosa  3  M,  100  l  Mangan klorida 100 mM dan 100  l Genistein 100  M setelah 5 menit ditambahkan 100  l NADH 100  M pada pH 5 dan suhu 25°C. Dengan prosedur tersebut dilakukan penentuan panjang gelombang  maksimum  pada  300-500  nm. Penentuan  suhu  dilakukan  sama  pada  panjang gelombang  maksimum  dengan  variasi suhu  25, 30,  32,  35,  37,  40,  45,  50°C  dengan  panjang gelombang maksimum yang diperoleh. Prosedur penentuan pH optimum dilakukan sama dengan penentuan suhu, hanya saja suhu yang digunakan adalah  suhu  optimum  yang  diperoleh  dengan variasi pH pada 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5.  selanjutnya  optimasi  konsentrasi  substrat dengan  prosedur  yang  sama  dengan  variasi substrat  pada  0;15;25;  50;  100;  150;  200;  250  M,  dengan  konsentrasi  enzim  tetap.  Dengan menggunakan  konsentrasi  substrat  optimum yang  diperoleh dan  konsentrasi  enzim  divariasi
pada  0;0,05;  0,1;  0,3;  0,4;  0,5  unit/ml  akan diperoleh konsentrasi enzim maksimum.
Setelah  diperoleh  kondisi  optimum  enzim NADH oksidase dilanjutkan dengan pembuatan kurva  standar  genistein.  Dengan  cama  dengan optimasi  enzim  dengan  suhu,  pH,  konsentrasi enzim yang optimum dengan variasi genistein 0; 15; 25; 50; 100; 150; 200; 250; 500; 700; 1100; 1200;  1500  M  sebanyak  100  l.  kemudian diukur  pada  absorbansi  maksimum.  Setelah  itu penentuan  kadar  isoflavon  dilakukan  dengan langkah sama pada pembuatan kurva standar di mana genistein diganti dengan limbah tahu.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  Ekstraksi. Hasil  ekstraksi  awal  dari kedelai dan limbah cair tahu merupakan ekstrak kasar berbentuk pasta terdapat pada Tabel 1.
Tabel  1.  Hasil  ekstraksi  isoflavon  dari  kedelai dan limbah cair tahu
Sampel Bobot/ volume Awal Bobot Ekstrak (g) Kadar (%) Warna Kedelai 100 g 13,3893 13.39   Coklat Hitam Limbah cair tahu 1000 mL 4,81 481 Coklat Hitam
Pada Tabel tampak bahwa kadar ekstrak kedelai adalah  13,39%  (b/b)  sedang  ekstrak  isoflavon dari limbah cair tahu adalah 0,481% (b/v). Dari Nugroho  (2004)  diperoleh  hasil  pada  ekstrak kedelai  diperoleh  hasil  5.5%  (b/b).  Perbedaan hasil  ini  karena  pada  penelitian  Nugroho hidrolisis yang dilakukan menggunakan campuran  etanol  teknis  dan  HCl  4  N  teknis, sedangkan  pada  penelitian  ini  hidrolisis menggunakan campuran 500 ml air dan 500 ml HCl  4  N  p.a (pro  analyst).  Penggunaan  air  dan HCl  p.a  4  N  ternyata  lebih  efisien  pada  hasil kadar  ekstrak,  karena  isoflavon  dalam  kedelai berada  dalam  bentuk  terikat  dengan  glukosa (glikon)  sehingga  mudah  larut  dalam  air  yang lebih polar dibanding etanol. Untuk melepaskan
ikatan dengan glukosa digunakan HCl. Kemurnian  HCl  pada  ekstraksi  kedelai  ini berpengaruh  pada  besarnya  rendemen.  Pada ekstrak  isoflavon  dari  kedelai  diperoleh  hasil yang besar karena pada kedelai belum ada proses pengolahan lebih lanjut.
Optimasi NADH Oksidase. Sebelum digunakan  dalam  analisis  kuantitatif  kadar isoflavon  asal  limbah  cair  tahu  terlebih  dahulu ditentukan kondisi optimum dari enzim NADH oksidase.  Adapun  kondisi  optimum  yang dilakukan meliputi panjang gelombang maksimum,  suhu  optimum,  pH,  konsentrasi substrat NADH, dan optimasi konsentrasi enzim.

## Penentuan  panjang  gelombang  maksimum.
Hasil  optimasi  panjang  gelombang  maksimum terlihat  pada  Gambar  1.  Pada  optimasi  ini dilakukan pada kisaran panjang gelombang 300- 400  nm.  Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan serapan  maksimum  terjadi  pada  panjang gelombang  327  nm,  pada  literatur  serapan maksimum pada panjang gelombang 340 nm dan 360 nm. Terdapat perbedaan panjang gelombang maksimum karena buffer yang digunakan adalah buffer  phospat  sedang  pada  metode  Graham digunakan  buffer  MES.  Dengan  menggunakan buffer  yang  berbeda  maka  kerja  NADH Oksidase akan optimum pada panjang gelombang  327  nm.  Hasil  tersebut  digunakan pada pengukuran tahap selanjutnya.
Gambar  1.  Optimasi  panjang  gelombang  untuk analisis kuantitatif isoflavon.
Optimasi  suhu. Hasil  optimasi  suhu  terdapat pada Gambar 2. Suhu optimum pada 35° C. Pada
pengukuran  optimasi  suhu  ini  digunakan panjang gelombang 327 nm dengan range suhu 25,  30,  32,  35,  37,  40,  45,  50°C.  Suhu mempunyai dua pengaruh yang saling bertentangan. Disatu sisi suhu dapat meningkatkan  aktivitas  enzim,  disisi  lain  laju denaturasi  protein  enzim  juga  naik.  Suhu optimum merupakan titik kompromi kedua jenis pengaruh tersebut (Dixon 1979).
Gambar 2.  Optimasi suhu untuk analisis kuantitatif isoflavon.
Optimasi pH . Pada penentuan pH optimum ini digunakan  panjang  gelombang  327  nm  suhu inkubasi 35° C, kondisi yang lain sama pada saat penentuan panjang gelombang maksimum. Pada hasil  optimasi  pH  pada  Gambar  3,  dan  terlihat pH isoflavon optimum dengan buffer fosfat yang digunakan pada pH 5.
Gambar 2.  Optimasi pH untuk analisis kuantitatif.
Enzim  memiliki  pH  optimum  yang  khas,  yaitu pH yang menyebabkan aktivitas enzim maksimal.  pH  optimum  mengGambarkan  pH pada  saat  gugus  pemberi  atau  penerima  proton
yang penting pada sisi aktif enzim berada pada kondisi  ionisasi  yang  diinginkan  (Lehninger 1993).  Holme  (1983)  menyatakan  bahwa perubahan keadaan ionik dari residu asam amino dari  molekul  enzim  dan  substrat  oleh  pH  akan menyebabkan perubahan efisiensi ikatan substrat. Optimasi konsentrasi substrat . Pada penentuan konsentrasi NADH optimum menggunakan panjang gelombang 327 nm, ada suhu 35°C, pH 5 dan kondisi lainnya sama pada penentuan panjang gelombang maksimum. Dari Gambar  4  dapat  dilihat  bahwa  konsentrasi optimum substrat NADH pada 100  M. Sesuai
dengan kaidah Michaelis-Menten, maka peningkatan konsentrasi substrat akan meningkatkan laju reaksi katalitik enzim, hingga pada konsentrasi substrat tertentu enzim menjadi jenuh  oleh  substrat  dan  tidak  dapat  berfungsi lebih  cepat  lagi.  Laju  reaksi  pada  saat  itu dikatakan  sebagai  laju  aktivitas  maksimum enzim. Pada saat itu enzim berada dalam bentuk komplek  enzim-substrat  (Lehninger  1993; Dixon 1979).
Gambar  4.  Optimasi  konsentrasi  NADH  untuk analisis kuantitatif isoflavon.
Penentuan  konsentrasi  optimum  enzim NADH  Oksidase .  Pada  penentuan  konsentrasi optimum enzim digunakan kondisi seperti pada penentuan konsentrasi optimum substrat dengan konsentrasi  substrat  100  M.  Pada  Gambar  5 dapat  terlihat  bahwa  konsentrasi  optimum  dari enzim  NADH  oksidase  adalah  pada  0.3  U/ml. Konsentrasi  optimum  dari  enzim  menunjukkan
konsentrasi  yang  sesuai  untuk  membentuk komplek enzim substrat.
Gambar 5.  Optimasi  konsentrasi  enzim  NADH oksidase  untuk  analisis  kuantitatif isoflavon.
Penentuan  Kadar  Isoflavon.  Berdasarkan  hasil optimasi  yang  diperoleh  digunakan  untuk mencari  kurva  standar  genestein.  Fungsi  dari kurva  standar  genistein  ini  adalah  untuk menentukan  kadar  genistein  dalam  kedelai  dan limbah  cair  tahu,  dengan  mengukur  absorbansi dari  ekstrak  kemudian  diplotkan  ke  kurva standar  genistein.  Dari  kurva  tersebut  dapat dihitung  kadar  genistein  dari  limbah  cair  tahu. Dari hasil perhitungan diperoleh kadar genistein dalam 1 L limbah tahu adalah 0,123 x 10 3 ppm.
Dengan  menggunakan  metode  enzimatis  dalam mengukur  kadar  isoflavon  dalam  limbah  tahu yaitu  dalam  sekali  percobaan  dapat  ditentukan sekaligus  macam  isoflavon  dan  kadarnya tergantung  pada  standar  yang  digunakan, meskipun  dalam  jumlah  yang  relatif  kecil sampai  ukuran  pM  dan  genistein  merupakan aktivaktor  yang  paling  efektif  bagi  NADH Oksidase  sehingga  yang  terukur  benar-benar hanya genistein. Pada ekstrak kedelai diperoleh kadar  genistein  adalah  0,5921  x  10 3 ppm.
Kandungan  isoflavon  limbah  tahu  sebesar 20,77%  jika  dibanding  dengan  kandungan isoflavon kedelai.

## KESIMPULAN
Ekstrak kasar dari 1 liter limbah cair tahu masih mengandung  isoflavon  sebesar  0,123x10 3 ppm sedangkan  pada  kedelai  sebesar  0,5921x10 3 ppm.  Dari  limbah  tahu  mengandung  20,77% isoflavon kedelai.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  dibiayai  oleh  Hibah  Bersaing  X atas nama Drh. Sulistiyani, M.Sc, Ph.D.

## DAFTAR PUSTAKA
Day RA, AL Underwood. 1989. Analisis Kimia Kualitatif.  Aloysius  HP,  Penerjemah.  Edisi kelima. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Quantitative Analysis.
Dixon M, EC Webb. 1979. Enzymes. 3 rd ed. New York: Academic Press.
Ernita  E.  1995.  Identifikasi  Senyawa-senyawa Isoflavon  dari  Limbah.  [Skripsi].  Bogor: IPB jurusan kimia.
Graham  TL,  MY  Graham.  1998.  Release  of genistein by an isoflavon-specific glucosidase  activates  a  peroxidase-like NADH  oxidase  which  triggers  the  defense competency  of  soybean  cells. Plant Peroxidase Newsletter .1.9.38.
Setchell, Kenneth D.R. 2001. Bioavailability of Pure  Isoflavones  in  Healthy  Humans  and Analysis  of  Commercial  Soy  Isoflavone Supplements. J.of  Nutrition. 131:  1362- 1375.
Taher  A.  2003.  Peran  Fitoestrogen  Kedelai sebagai Antioksidan Dalam Penanggulangan  Aterosklerosis.  [Tesis]. Bogor: IPB Program Pascasarjana.