Abstract  : Punica  granatum  L.,  commonly  known  as  pomegranate,  has  emerged  as  a  medicinal  plant  with potential  antimicrobial  activity.  This  study  aims  to  identify this  activity  against  the  bacteria Mycobacterium tuberculosis. Pomegranate leaf extract is made using solvents (ethanol 96%), then partitioned using n-butanol solvents and fractionated using vacuum liquid chromatography method. After obtaining the fractional results, the inhibitory activity effect of the fraction was studied using the Mycobacterium tuberculosis H37RV strain and compared  to  commercial  antibiotic  Isoniazid  using  the  MODS  method.  Pomegranate  leaf  fraction  shows antibacterial  activity  against  Mycobacterium  tuberculosis  at  a  concentration of  1000  ppm, as  seen  from  the absence of cord at such concentrations. Therefore this plant can be an important source of new antimicrobial compounds to treat the bacteria Mycobacterium tuberculosis.

## Keywords :  Mycobacterium tuberculosis; Fraction of Pomegranate Leaf
Abstrak : Punica granatum L., umumnya dikenal sebagai delima, telah muncul sebagai tanaman obat dengan potensi aktivitas antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi aktivitas ini terhadap bakteri Mycobacterium  tuberculosis .  Ekstrak  daun  delima  dibuat  menggunakan  pelarut  (etanol  96%),  kemudian dipartisi menggunakan pelarut n-butanol dan difraksinasi menggunakan metode kromatografi cair vakum. Setelah  mendapatkan  hasil  fraksi,  efek  aktivitas  penghambatan  fraksi  dipelajari  menggunakan Mycobacterium  tuberculosis strain  H 37 RV  dan  dibandingkan  dengan  antibiotik  komersial  Isoniazid menggunakan  metode  MODS.  Fraksi  daun  delima  menunjukkan  aktivitas  antibakteri  terhadap Mycobacterium  tuberculosis pada  konsentrasi  1000 ppm,  terlihat  dari  tidak  adanya cord pada  konsentrasi tersebut.  Oleh  karena  itu  tanaman  ini  dapat  menjadi  sumber  penting  senyawa  antimikroba  baru  untuk mengobati bakteri Mycobacterium tuberculosis .
Kata Kunci : Mycobacterium tuberculosis; Fraksi Daun Delima

## AKTIVITAS PENGHAMBATAN FRAKSI DAUN DELIMA (Punica granatum L.) TERHADAP BAKTERI Mycobacterium tuberculosis
1| Afrisusnawati Rauf, 2| Nurshalati Tahar, 3| Resnia Email Korespondensi : afrisusnawati.rauf@uin-alauddin.ac.id Jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Alauddin Makassar

## PENDAHULUAN
Punica  granatum L.  (Punicaceae),  umumnya  dikenal  sebagai  delima,  buahnya dibudidayakan secara komersial untuk dimakan di daerah kering di Asia Tenggara, wilayah Mediterania, dan Amerika Serikat (Yuan T 2012). Delima telah dikenal selama ratusan tahun karena  berbagai  manfaat  kesehatannya,  termasuk  aktivitas  antimikroba  (A.  Howell  2013). Minat  yang  cukup  besar  telah  meningkat  terhadap  penggunaan  sumber  tanaman  yang menghambat  bakteri  patogen  yang  resistan  terhadap  beberapa  obat  sebagai  pengobatan alternatif  (AlMatar  2019).  Berbagai  ekstrak  /  konstituen  dari  berbagai  bagian  tanaman  ini memiliki sejumlah aktivitas biologis seperti antitumor, antibakteri, antijamur, dan antiulcer (Celik  I  2009). Punica  granatum menunjukkan  aktivitas  antibakteri  melalui  efek bakteriostatik  dan  bakteriosidal  (Braga  LC  2005).  Penelitian  lain  juga  telah  membuktikan bahwa kehadiran ellagitannins dan punicalagin bertanggung jawab atas efek antibakteri dan kulitnya  sering  dilaporkan  lebih  efektif  daripada  ekstrak  biji  (Miguel  MG  2010).  Aktivitas antimikroba  delima  telah  dilaporkan  dengan  berbagai  ekstrak  pada  manusia  dan  murine model (Al-Zoreky 2009). Melendez dan Capriles juga melaporkan bahwa ekstrak dari buah Punica  granatum memiliki  aktivitas  antibakteri  in  vitro  yang  kuat  terhadap  banyak  strain bakteri  yang  diuji  (Melendez  and  Capriles  2006).  Daun  delima  sejauh  ini  belum  banyak dieksplorasi untuk aktivitas antimikroba.
Mycobacterium  tuberculosis (MTB)  menyebabkan  spektrum  penyakit  yang  luas  pada kelompok  pasien  yang  berbeda  (Rockwood  2016).  Tuberkulosis  (TB)  adalah  prioritas
kesehatan  masyarakat  global,  menjadi  penyebab  utama  kematian  oleh  infeksi  bakteri  dan penyebab  kematian  kedua  oleh  penyakit  menular  (Russel  2013).  Pada  2012,  diperkirakan ada  8,6  juta  kasus  baru  TB  (kisaran  8,3-9  juta)  secara  global,  setara  dengan  kejadian  122 kasus per 100.000 penduduk. TB adalah penyebab 1,3 juta kematian di seluruh dunia setiap tahun (WHO 2013).Pengobatan tuberkulosis (TB) adalah disiplin yang matang, dengan lebih dari  60  tahun  pengalaman  klinis  yang  bertambah  di  seluruh  dunia.  Namun,  pengobatan multidrug yang diperlukan untuk TB yang rentan terhadap obat, bertahan enam bulan dan tidak pernah dioptimalkan sesuai dengan standar saat ini (Mitnick 2009).
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  aktivitas  penghambatan  fraksi daun delima terhadap bakteri Mycobacterium tuberculosis .

## METODE

## Penyiapan sampel
Daun  segar  delima  (500  g)  dibersihkan  dengan  cara  sortasi  basah  untuk menghilangkan  kotoran  atau  partikel  kotor  yang  ada  di  permukaan.  Daun  dibersihkan dengan  air  dan  dikeringkan  dengan  udara  kering.  Bahan  tanaman  yang  telah  kering kemudian  dihancurkan  menggunakan  blender  listrik  untuk  mendapatkan  bubuk  halus  dan selanjutnya disaring untuk mendapatkan partikel yang lebih halus. Sampel bubuk disimpan dalam wadah plastik bersih sampai diperlukan untuk analisis. (Segun, 2013).

## Prosedur

## Metode Maserasi
500  g  bubuk  tanaman  ditimbang  dengan  timbangan  dan  direndam  dalam  1500  ml etanol  pada  suhu  kamar  selama  48  jam  dengan  pengocokan  kuat  pada  interval  reguler. Residu  diekstraksi  ulang  sebanyak  tiga  kali  untuk  memastikan  proses  ekstraksi  telah lengkap. Ekstrak disaring dan diuapkan sampai kering menggunakan rotary evaporator dan konsentratnya digunakan untuk partisi cair-padat.

## Partisi Cair-Padat
Ekstrak  Delima  ditimbang  sebanyak  100  gram,  dimasukkan  ke  dalam  lumping  dan ditambahkan  N-butanol  lalu  digerus,  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  tabung  sentrifugasi. Disentifugasi dengan kecepatan 300 rpm kemudian dipisahkan antara bagian yang larut n- butanol dengan yang tidak larut n-butanol.

## Penentuan Eluen
Eluen  ditentukan  berdasarkan  profil  KLT  yang  diperoleh  dari  metode  kromatografi  lapis tipis.  Kemudian  dielusi  dengan  menggunakan  perbandingan  eluen  tertentu  dari  tingkat kepolaran  terendah  hingga  tertinggi.  Penampakan  noda  eluen  diamati  dibawah  lampu  UV 254  dan  366  nm  serta  penyemprotan  dengan  H 2 SO 4 pada  lempeng.  Lempeng  kemudian dipanaskan  dalam  oven  hingga  noda  tampak.  Pemilihan  eluen  didasarkan  pada  kepolaran dengan prinsip Like Disolves Like

## Fraksinasi
Fraksinasi  menggunakan  kromatografi  cair  vakum  kemudian  dilanjutkan  dengan penggabungan fraksi-fraksi. Digabungkan fraksi yang memiliki noda yang sama atau hampir sama.

## Skrining Fitokimia
Identifikasi Alkaloid (Uji Wagner)
Ekstrak  ditetesi  dengan  3-5  tetes  reagen  Wagner  (1,27  g  yodium  dan  2  g  kalium  yodium dalam 100 ml air) dan diamati untuk pembentukan endapan coklat kemerahan.
Identifikasi Steroid (Uji Liebermann- burchard)
1  ml  ekstrak  ditetesi  dengan  kloroform,  anhidrida  asetat  dan  conc.  H 2 SO 4 dan  diamati pembentukan warna merah muda gelap atau merah.
Identifikasi Fenol (Uji besi klorida)
1  ml  ekstrak  ditotolkan  pada  lempeng  kemudian  ditetesi  dengan  FeCl 3 5%  dan  diamati pembentukan warna biru atau hitam.
Identifikasi Flavonoid (Uji pereaksi basa)
2 ml ekstrak ditetesi dengan beberapa tetes larutan natrium hidroksida 20%. Pembentukan warna  kuning  yang  intens,  yang  menjadi  tidak  berwarna  pada  penambahan  asam  klorida encer menunjukkan adanya flavonoid.
Identifikasi Tannin (Uji Braymer)
2  ml  ekstrak  ditetesi  dengan  larutan  besi  klorida  alkohol  10%  dan  diamati  untuk pembentukan larutan warna biru atau kehijauan.

## Uji Aktivitas Antituberculosis

## Pembuatan Media Cair Middlebrook 7H9
Ditimbang  0,327  middleBrook  7H9  dan  casitone  0,069  g  kemudian  dimasukkan  ke dalam  wadah,  ditambahkan  0,172  ml  gliserol  ke  dalam  wadah  dan  dicukupkan  dengan aquadest  hingga  50  ml.  Dikocok  sampai  homogen,  disterilisasi  menggunakan  autoklaf  ±  20 menit pada suhu 121 ℃ .

## Pembuatan Larutan Stok Fraksi
Dibuat  larutan  stok  fraksi  1000  ppm,  kemudian  diencerkan  dengan  konsentrasi  250  ppm, 500 ppm dan 750 ppm, kemudian dihomogenkan dengan magnetic stigner. Sampel disimpan sebagai larutan stok fraksi.

## Pembuatan Suspensi Bakteri Mycobacterium Tuberculosis
Diambil larutan media cair MiddleBrook 7H9 sebanyak 25 ml, ditambahkan OADC 0,5 ml  dan  dihomogenkan.  Kemudian  ditambahkan  bakteri  Mycobacterium  tuberculosis  H 37 RV sebanyak 1 ml, disuspensikan ke dalam tabung steril yang berisi 25 ml media MiddleBrook 7H9 dan dihomogenkan.

## Pengujian  Aktivitas  dengan  Metode  MODS  (Microscopically  Observed  Drug Susceptibility)
Disiapkan  plat  24  well  untuk  strain  H 37 RV.  Dipipet  50  µl  fraksi  pada  masing-masing konsentrasi  (triplo),  kemudian  ditambahkan  950  µl  media  cair  H 37 RV  dan  bakteri Mycobacterium tuberculosis. Dipipet 50 µI DMSO, ditambahkan 950 µl media cair H 37 RV dan bakteri Mycobacterium tuberculosis sebagai kontrol negatif. Dipipet 50 µl obat isoniazid 0,4 ppm, ditambahkan 950 µl media cair H 37 RV dan bakteri Mycobacterium tuberculosis sebagai
kontrol positif. Kemudian diinkubasi selama 7 hari dengan suhu 30 0 C dan diamati dibawah mikroskop.

## HASIL

## Hasil identifikasi golongan senyawa
Pada  pengujian/  identifikasi  golongan,  hasil  fraksi  daun  delima  menunjukkan  adanya kandungan senyawa flavonoid, tannin, dan alkaloid.

## Hasil uji kativitas penghambatan fraksi daun delima
Aktivitas  penghambatan  bakteri Mycobacterium  tuberculosis  dapat  diketahui  dengan mengamati ada atau tidak adanya cord yang terlihat dengan menggunakan mikroskop.

## Tabel 1. Hasil pengujian aktivitas penghambatan fraksi Daun Delima (Punica granatum L) terhadap Bakteri Mycobacterium tuberculosis
Keterangan:
- : Tidak ada pertumbuhan + : Ada pertumbuhan (sedikit)  < 10 cord
++ : Ada pertumbuhan (banyak) >10 cord
+++ : Ada pertumbuhan (sangat banyak)

## Hasil pengamatan menggunakan mikroskop
Gambar 1. Konsentrasi 1000 ppm Gambar 2. Konsentrasi 750 ppm Perlakuan Fraksi  larut  n-butanol  Daun  Delima (Punica granatum L) 1 2 3 Kontrol negatif ++ ++ ++ Kontrol positif (Isoniazid) - - - Konsentrasi 1000 ppm - - - Konsentrasi 750 ppm + + + Konsentrasi 500 ppm ++ ++ ++ Konsentrasi 250 ppm +++ +++ +++ Cord Cord Cord
Gambar 3. Konsentrasi 500 ppm
Gambar 4. Konsentrasi 250 ppm
Gambar 5. Kontrol Positif

## Gambar 5. Kontrol Negatif

## PEMBAHASAN
Tuberkulosis  masih  menjadi  salah  satu  penyakit  menular  yang  paling  mematikan  bagi manusia. Sekitar 9,2 juta orang tercatat sebagai penderita aktif setiap tahun, sementara 1,7 juta  kasus  mengakibatkan  kematian  pada  periode  yang  sama.  Tanaman  obat  menawarkan harapan  untuk  mengembangkan  obat-obatan  alternatif  untuk  pengobatan  TBC  (Rajandeep Kaur 2015).
Penggunaan  bahan  alam sebagai  substitusi  agen  terapi  kimia  untuk  mendapatkan  aktivitas penghambatan  terhadap  beberapa  bakteri  patogen  dengan  mekanisme spesifik  merupakan tujuan utama dari banyak penelian saat ini. (Hemani 2018). Selama bertahun-tahun telah ada banyak penelitian kecil yang dilakukan di berbagai daerah di dunia tentang efek bakterisida dari  buah  delima  pada  sejumlah  jenis  bakteri  patogen  dan  bakteri  yang  resistan  terhadap obat (A. B. Howell 2013).
Pada  identifikasi  golongan  yang  telah  dilakukan,  hasil  fraksi  menunjukkan  adanya kandungan  flavonoid,  tannin,  dan  alkaloid.  Telah  diketahui  bahwa  tanaman  delima mengandung  beberapa  zat  aktif  yang  dapat  berfungsi  sebagai  antibakteri,  diantaranya flavonoid,  fenol,  dan  tannin.  Flavonoid  merupakan  suatu  bahan  yang  mempunyai  struktur fenol dengan satu carbonil group. Senyawa ini telah diketahui disintesis oleh tanaman dalam responnya  terhadap  infeksi  mikroba.  Aktivitas  flavonoid  kemungkinan  disebabkan  oleh kemampuannya  untuk  membentuk  kompleks  dengan  protein  ekstraseluler  maupun  yang terlarut,  serta  dapat  membentuk  kompleks  dengan  dinding  sel.  Semakin  lipofilik  suatu flavonoid,  kemampuannya  dalam  merusak  dinding  sel  dari  bakteri  akan  semakin  kuat. Senyawa kedua yang teridentifikasi pada fraksi adalah senyawa golongan tannin, Senyawa ini mampu  menghambat  enzim  DNA-topoisomerase,  dengan  dihambatnya  aktifitas  enzim  ini, akan  mengakibatkan  terhambatnya  proses  replikasi  bakteri  tersebut  (Prihantoro  2006). Alkaloid  bekerja  sebagai  antibakteri  dengan  cara  mengganggu  komponen  penyusun peptidoglikan pada sel bakteri sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan terjadinya kematian sel (Amalia 2017).
Metode Microscopic Observation Drug Susceptibility (MODS) merupakan metode pengujian dengan  alat  berbiaya  rendah  dan  berteknologi  sederhana  untuk  deteksi  TB  dan  MDRTB berkinerja  tinggi.  Uji  MODS  didasarkan  pada  tiga  prinsip:  1)  Mycobacterium  tuberculosis tumbuh  lebih  cepat  dalam  media  cair  daripada  pada  media  padat  2)  pertumbuhan Mycobacterium  tuberculosis  mikroskopis  dapat  dideteksi  lebih  awal  dalam  media  cair
dibanding  pertumbuhan  makroskopis  koloni  pada  media  padat,  dan  karena  pertumbuhan Mycobacterium  tuberculosis    yang  spesifik  memungkinkannya  untuk  dibedakan  dari mikobakteri  atipikal  atau  kontaminasi  jamur  atau  bakteri  3)  obat  isoniazid  dan  rifampisin dapat  dimasukkan  ke  dalam  uji  MODS  untuk  memungkinkan  deteksi  langsung  simultan MDRTB,  menghindarkan  perlunya  subkultur  untuk  dilakukan  tes  kerentanan  obat  tidak langsung (Brady 2008).
Fraksi  larut  n-butanol  yang  telah  diperoleh  diujikan  pada  bakteri  Mycobacterium tuberculosis  strain  H 37 RV.  Pengujian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  apakah  hasil  fraksi dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri  dengan  cara  mengamati  pertumbuhan  bakteri (cord) pada well plate dengan konsentrasi yang berbeda-beda yaitu konsentrasi 1000 ppm, 750 ppm, 500 ppm, dan 250 ppm. Perbedaan konsentrasi dibuat untuk mengetahui tingkat aktifitas fraksi yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada konsentrasi 1000 ppm memperlihatkan aktivitas yang paling baik dengan tidak adanya pertumbuhan cord. Aktivitas penghambatan senyawa dari  fraksi  dapat  dilihat  dari  ada  atau  tidaknya  cord  yang  terbentuk  yang  dapat  diamati dengan  menggunakan  mikroskop.  Cord  (Trehalosa  dimikolat)  adalah  salah  satu  penyusun dinding  sel  Mycobacterium  tuberculosis.  Cord  terlibat  pada  mekanisme  imunomodulator utama yang bertanggung jawab untuk virulensi Mycobacterium tuberculosis, sehingga pada saat  pengamatan  mikroskop  cord  inilah  yang  akan  terlihat.  Cord  berbentuk  ekor  dengan warna terang mengkilap.

## DAFTAR PUSTAKA
AlMatar,  Manaf.  "Evaluation  of  Polyphenolic  Profile  and  Antibacterial  Activity  of  Pome- granate  Juice  in  Combination  with  Rifampin  (R)  against  MDR-TB  Clinical  Isolates." Current Pharmaceutical Biotechnology 20, no. 0 (2019).
Al-Zoreky,  N.  "Antimicrobial  activity  of  pomegranate  (Punica  granatum  L.)  fruit  peels." International journal of food microbiology 134 (2009): 244-248.
Amalia, Alfi. "Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etil Asetat Daun Sembung (Blumea balsamifera L.) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Meticillin Resistant Staphylococcus Aureus." Prosiding Seminar Nasional Biotik 2017. 2017.
Brady.  "The  MODS  method  for  diagnosis  of  tuberculosis  and  multidrug  resistant tuberculosis." J Vis Expo 11, no. 17 (2008).
Braga  LC,  Leite  AAM,  Xavier  KGS,  Takahashi  JA,  Bemquerer  MP,  Chartone-  Souza  E,  et  al.
"Synergic  interaction  between  pomegranate  extract  and  antibiotics  against Staphylococcus aureus." Can J Microbiol 51, no. 7 (2005): 541.
Celik  I,  Temur  A,  ISIK  I.  "Hepatoprotective  role  and  antioxidant  cap-  acity  of  pomegranate (Punica granatum) flowers infusion against trichloro- acetic acid-exposed in rats." Food Chem Toxicol. 47 (2009): 145–149.
Hemani.  "EVALUATION  OF  ANTIMICROBIAL  PROPERTY  OF  EXTRACT  OF  PUNICA GRANATUM (L.) ON ORAL PATHOGENS." Int. J. Life Sci. Pharma Res 8, no. 3 (2018): 35- 40.
Howell,  Ami.  "The  Pomegranate:  Effects  on  Bacteria  and  Viruses  That  Influence  Human Health." Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine (Hindawi Publishing Corporation), 2013: 1-11.
Howell,  Amy  B.  "The  Pomegranate:  Effects  on  Bacteria  and  Viruses  That  Influence  Human Health." Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine (Hindawi Publishing Corporation), 2013.
Melendez,  P.A.,  and  V.A  Capriles.  "Antibacterial  properties  of  tropical  plants  from  Puerto Rico." Phytomedicine 2006, 13 (2006): 272-276.
Miguel MG, Neves MA, Antunes MD. "Pomegranate (Punica granatum L.): A medicinal plant with  myriad  biological  properties-A  short  review." J  Medicinal  Plants  Res 4,  no.  25 (December 2010): 2836.
Mitnick,  Carole  D.  "Tuberculosis  pharmacotherapy:  strategies  to  optimize  patient  care." Expert Opin Pharmacother 10, no. 3 (2009): 381–401.
Prihantoro,  Teguh.  "Antibacterial  Effect  of  Pomegranate's  (Punica  granatum)  Rind  Extract Againts Shigella disentriae in Vitro." Jurnal Kedokteran Brawijaya 22, no. 3 (2006).
Rajandeep  Kaur,  Harpreet  Kaur.  "Antitubercular  Activityand  Phytochemical  Screening  of Selected Medicinal Plant." Oriental Journal of Chemistry 31, no. 1 (2015): 597-600.
Rockwood,  Neesha.  "Assessment  of  treatment  response  in  tuberculosis." Expert  Rev  Respir Med 10, no. 6 (2016): 643–654.
Russel, DG. "Graduation time." Nature , 2013: 502.
Segun.  "Comparison  of  Efficiency  of  Different  Solvents  used  for  the  Extraction  of Phytochemicals from the." International Journal of Science and Research (IJSR) 4, no. 7 (2013): 835-838.
WHO. Global Tuberculosis Report 2013. 2013.
Yuan  T,  Ding  YQ,  Wan  CP,  Li  LY,  Xu  JL,  Liu  K,  Slitt  A,  Ferreira  D,  Khan  IA,  Seeram  NP. "Antidiabetic ellagitannins from pomegranate flowers: inhibition of alpha-glucosidase and lipogenic gene expression." Org Lett 14 (2012): 5358–5361.