## ANALISIS CEMARAN BAKTERI Coliform DAN IDENTIFIKASI Escherichia coli PADA ES BATU BALOK DI KOTA KARAWANG
Himyatul Hidayah * , Iin Lidia Putama Mursal, Hawa Ayu Susaningsih, Surya Amal
Fakultas Farmasi, Universitas Buana Perjuangan Karawang, Jawa Barat, Indonesia. *Penulis Korespondensi: himyatul.hidayah@ubpkarawang.ac.id

## ABSTRAK
Es batu merupakan salah satu produk pangan yang sudah dikenal oleh masyarakat luas dan telah dianggap aman untuk dikonsumsi. Tujuan dilakukan penelitian ini yaitu untuk melihat cemaran bakteri Coliform dan  adanya Escherichia  coli pada  es  batu  balok.  Metode  pengujian  yang digunakan  yaitu  antara  lain : uji Coliform  dan Identifikasi  Bakteri Escherichia  coli .  Hasil penelitian menunjukkan  2  dari  6  sampel  positif  mengandung  bakteri coliform dan  bakteri Escherichia coli dengan nilai MPN di atas batas aman. Kesimpulan penelitian ini adalah es batu balok  yang  digunakan  oleh  para  pedagang  di  sekitaran  kota  Karawang  memiliki  kualitas mikrobiologis  yang  tidak  layak  untuk  dikonsumsi  oleh  masyarakat  dan  tidak  memenuhi persyaratan mutu mikrobiologis Standar Nasional Indonesia 01-3839-1996 tentang es batu yaitu Total Bakteri Coliform melebihi 0/100 mL.
Kata Kunci: Es batu balok, Coliform, Escherichia coli .

## ABSTRACT
Ice cubes are one of the food products that are well known by the public and are considered safe for consumption. The Aim of this research is to see the contamination of Coliform bacteria and the  presence  of Escherichia  coli in  ice  cubes.  Test  methods  used  include: Coliform test  and identification of  Escherichia  coli bacteria.  The  results  showed  that  2  of  the  6  positive  samples contained Coliform bacteria and Escherichia coli bacteria with MPN values above the safe limit. The  conclusion  of  this  study  is  that  the  ice  cubes  used  by  the  perpetrators  around  the  city  of Karawang  have  microbiological  quality  that  is  not  suitable  for  consumption by  the  public  and does  not  comply  with  the  microbiological  quality  requirements  of  the  Indonesian  National Standard  01-3839-1996  regarding  ice  cubes,  namely  the  Total Coliform Bacteria  exceeds  0/ 100mL.
Keywords: Ice cubes, Coliform, Escherichia coli .

## PENDAHULUAN
Es  batu  merupakan  salah  satu produk pangan yang sudah dikenal oleh masyarakat  luas  dan  telah  dianggap aman untuk dikonsumsi. Menurut
Sukawaty  pada  tahun  2016,  es  batu merupakan  salah  satu  produk  pangan yang  terbuat  dari  air  yang  melalui proses  pembekuan.  Biasanya  dalam pemakaian  es  batu  ini  dicampurkan pada minuman sebagai bahan pelengkap sehingga minuman tersebut terasa segar (Yullia Sukawaty, et al ., 2016). Bakteri Coliform yang  terkandung  di  dalam  es batu  dapat  menjadi  sumber  pembawa penyakit,  terutama  penyakit  enterik sehingga  es  batu  tersebut  tidak  layak untuk dikonsumsi (Hadi et al ., 2014).
Indikator pencemaran mikroba air minum  adalah  total Coliform dan
Escherichia coli . Total Coliform adalah suatu kelompok bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran. Total Coliform yang  berada  di  dalam makanan  atau  minuman  menunjukkan kemungkinan  adanya  mikroba  yang bersifat enteropatogenik dan atau toksigenik yang berbahaya bagi kesehatan. Air olahan DAM harus bebas dari  kandungan  total Coliform dan E. coli .  Bakteri Escherichia,  Shigella, Salmonella,  Enterobacter,  Klebsiella,
Serratia dan Proteus termasuk ke dalam golongan Enterobacteriaceae yang sering  mengontaminasi  air  dan  dapat penyebab infeksi saluran cerna  (Hadi et al ., 2014) .
Hadi et  al melakukan  penelitian pada  tahun  2014  di  Kota  Padang menunjukkan adanya  cemaran  bakteri Coliform pada  8  dari  9  sampel  es  batu rumah  tangga  yang  dijual  di  pasaran. Indeks Most  Probable  Number (MPN) yang  dimiliki  oleh  es  batu  tersebut sekitar 9 sampai > 979/100 mL. Bakteri Coliform yang  terkandung  di  dalam  es batu  dapat  menjadi  sumber  pembawa penyakit,  terutama  penyakit  enterik sehingga  es  batu  tersebut  tidak  layak untuk dikonsumsi (Hadi et al ., 2014).

## METODE PENELITIAN

## Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian  ini  yaitu  :  Alumunium  voil (Best  Fresh),  Cawan  petri  (Pyrex), bunsen  blup,  hot  plate  (Heidolph), jarum ose (Rofa), kaca objek (Microscope Slide), miksroskop (Smic), Laminar  Air  Flow  (LAF),  Inkubator (Memmert), timbangan analitik (Vortex),  rak  tabung  reaksi,  tabung reaksi  (Pyrex),  autoklaf  (ALP),  pipet
(Pyrex), micropipet (Dragon Lab), pipet volume (Pyrex).

## Bahan
Bahan  penelitian  yang  digunakan dalam penelitian ini antara lain : es batu balok  dari  sekitaran  kota  Karawang, Jawa Barat, media Nutrient Agar (NA), media Lactose  Broth ,  medium  MRVP, media  agar Eosin  Methylene  Blue , medium Sulfide  Indole  Motility ,  media agar Simmons  Citrate  Agar ,  Kristal Violet,  lugol,  alkohol  70%,  minyak imersi,  aquadest,  aquabidest,  spirtus, NaCl fisiologis, reagen kovac’s, safranin, methyl  red ,  iodine,barritt’s  A atau alfa naflol 5%, dan KOH 40%.

## Cara Kerja
Pengambilan Sampel
Es  batu  balok  yang  digunakan sebagai  sampel  diambil  sebanyak  6 sampel    yang  berasal  dari  tempat distributor  es  balok  dan  dari  pedagang minuman  kaki  lima  di  sekitar  pasar tradisional kota Karawang dan  blangko yang  digunakan  adalah  aquadest  steril yang  berfungsi  sebagai  pembanding. Sampel  es  batu  balok  yang  telah didapatkan,  kemudian  disimpan  di dalam  plastik  klip  steril  dan  disimpan pada suhu 25-30°C.  Sampel yang akan
diuji di laboratorium tidak lebih dari 24 jam.

## Pembuatan Media Pertumbuhan
Nutrient Agar (NA) Miring
Media Nutrient Agar (NA) ditimbang  sebanyak  1,69  gram  lalu dilarutkan  dalam  60  mL  aquadest kemudian  diaduk  hingga  homogen sambil dipanaskan dengan menggunakan hot  plate . Nutrient  Agar kemudian diambil sebanyak ±5 mL dan dimasukan pada tabung reaksi. Medium disterilisasi dengan menggunakan autoklaf  pada  suhu  121°C  selama  15 menit,  kemudian  setelah  disterilisasi media  dimiringkan  45°  dan  dipadatkan (Rafika dan Pratiwi, 2014).

## Lactose Broth (LB)
Menimbang
Lactose Broth sebanyak  1  gram  dan  dilarutkan  dalam 60  mL  aquadest  kemudian  diaduk hingga  homogen  sambil  dipanaskan dengan menggunakan hot plate . Kemudian  mengambil  10  mL  media lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang  sebelumnya  telah  berisi  tabung durham, kemudian disterilisasikan dengan  menggunakan  autoklaf  pada suhu  121°C  selama  15  menit  (Rafika dan Pratiwi, 2014).

## Eosin Mthylene Blue Agar (EMBA)
Menimbang Esosin  Methylene Blue  Agar (EMBA)  sebanyak  1,090 gram  kemudian  dilarutkan  dengan menggunakan aquadest sebanyak 1 liter lalu  diaduk  hingga  homogen  sambil dipanaskan  dengan  menggunakan hot plate .  Medium  yang  telah  dipanaskan kemudian disterilisasikan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Andrian et al ., 2014).

## Sulfide Indole Motility (SIM)
Menimbang Sulfide Indole Motility sebanyak  1,087  gram,  dan
dilarutkan dengan
menggunakan aquadest  sebanyak  30  mL  lalu  diaduk hingga  homogen  sambil  dipanaskan dengan menggunakan hot plate .
Kemudian  menggambil  ±15  mL  dan dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi. Medium disterilisasikan dengan autoklaf  pada  suhu  121°C  selama  15 menit (Ismail dan Fariedah, 2014).

## Methyl Red-Voges Proskauer (MRVP)
Menimbang MRVP sebanyak
0,52 gram lalu dilarutkan dengan 30 mL aquadest  kemudian  diaduk  hingga homogen dan dipanaskan dengan menggunakan hot plate . Medium diambil sebanyak ±5 mL dan dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi.
Medium kemudian disterilisasikan dengan  menggunakan  autoklaf  pada suhu  121°C  selama  15  menit  (Sari  dan Apridamayanti, 2014).

## Simmons Citrate-Agar
Mengambil Media Simmons Citrate Agar untuk ditimbang sebanyak 0,70 gram  kemudian dilarutkan dengan aquadest  sebanyak  1  liter  kemudian diaduk hingga homogen lalu dipanaskan dengan hot plate . Kemudian mengambil ±7  mL  medium simmons  citrate agar dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi. Kemudian medium disterilsasikan  sama  seperti  media  agar sebelumnya.  Setelah  disterilisasikan tabung  reaksi  berisi  medium  kemudian dimiringkan 45° dan dipadatkan (Irianto, 2006).

## Uji Coliform
Uji Penduga  (Confirmative Test)
Uji  penduga  ( Presumtive  Test ) dengan  menggunakan  9  tabung  reaksi (dengan  menggunakan  seri  3-3-3). Masing-masing  tabung  reaksi  berisikan media lactose  broth sebanyak  10  mL dan  dilengkapi  dengan  tabung  durham dalam  keadaan  posisi  yang  terbalik. Sampel  es  batu  balok  yang  sebelumnya telah dicairkan kemudian diambil sebanyak  10  mL,  1  mL,  0,1  mL.  3  seri
pertama  diisikan  sampel  es  batu sebanyak  10  mL  dengan  bantuan  pipet volum,  3  seri  tabung  reaksi  kedua diisikan  sebanyak  1 mL  sampel  es  batu balok,  dan  3  seri tabung  ketiga  diisikan sampel es batu sebanyak 0,1 mL dengan menggunakan  mikropipet.  Pengisian sampel dilakukan secara aseptis. Semua tabung  reaksi  yang  sudah  berisikan sampel  kemudian  diinkubasi  pada inkubator  pada  suhu  37°C  dan  diamati hasilnya. Hasil positif jika terbentuk gas berupa  rongga  kosong  pada  tabung durham(Bambang et  al .,  2014;  Hadi et al ., 2014)

## Uji Penguat (Confirmative Test)
Tabung  yang  menunjukan  hasil positif  pada  uji  penduga  sebelumnya kemudian dilanjutkan dengan uji penguat.  Mengambil  1-2  ose  kemudian digoreskan  pada  cawan  yang  berisi medium  EMBA  dan  diinkubasi  pada inkubator  dengan  suhu  37°C  dan ditunggu 1×24 jam. Bakteri yang diduga E.  coli memiliki  koloni  yang  berwarna hijau metalik (Widyanti et al , 2004).

## Uji  Pelengkap (Completed Test)
Tabung  yang  pada  uji  penguat menghasilkan  hasil  positif  kemudian diambil sebanyak 1 ose  dan diinokulasi
dalam Lactose  Broth dengan  jarum inokulasi  secara  aseptik  dan  diinkubasi dengan  menggunakan  inkubator  pada suhu  37°C  selama  1  ×  24  jam.  Jika terbentuk  gelembung  pada  tabung durham maka hasilnya positif dan untuk membedakan bakteri golongan Coli dari bakteri  golongan Coli Fekal  dengan cara menginkubasi medium NA dengan posisi  dimiringkan  pada  suhu  37°C (untuk  golongan Coli )  dan  diinkubasi pada  suhu  42°C  (untuk  golongan Coli Fekal) dan hasil bakteri yang tumbuh di Nutrient  Agar dilakukan  uji  pewarnaan (Widyanti et al , 2004).

## Identifikasi Bakteri Escherichia coli Pewarnaan Gram
Bakteri  yang  sebelumnya  sudah diinokulasi  pada  media Nutrient  Agar (NA)  miring  dan  sudah  diinkubasi selama  1x24  jam  pada  suhu  36-37°C, kemudian diambil ± 1 ose lalu diletakan pada  gelas  objek.  Gelas  objek  difiksasi dengan  cara  dilewatkan  apusan  di  atas api  bunsen.  Apusan  ditetesi  dengan larutan  kristal  violet  lalu  didiamkan selama 1 menit kemudian dicuci dengan air  mengalir  dan  dikeringkan  dengan cara dianginkan. Apusan ditetesi dengan beberapa  tetes  larutan  iodine,  dibiarkan selama  1  menit  setelah  itu  dicuci
kembali  dengan  menggunakan  air mengalir  dan  dikeringkan  dengan  cara dianginkan.  Apusan  ditetesi  dengan alkohol  lalu  didiamkan  selama  30  detik kemudian  dicuci  dengan  air  mengalir dan dikeringkan dengan cara dianginkan.  Kemudian  apusan  diberi beberapa  tetes  safranin  lalu  didiamkan selama  30  detik  dan  dicuci  dengan menggunakan air yang mengalir setelah itu  dikeringkan  dengan cara  dianginkan dan  diamati  dibawah  mikroskop  (Sari dan Apridamayanti, 2014).

## Uji IMViC (Indol, Methyl Red, Voges
Proskauer, Simmons Citrate) Uji Indol
Bakteri  uji  yang  sebelumnya
sudah ditumbuhkan pada media
Nutrient  Agar (NA)  dengan  posisi miring  diambil  sebanyak  1  ose  dan diinokulasikan  kedalam  media Sulfide Indole  Motility (SIM)  dengan  kontrol satu  tabung  yang  tidak  diinokulasikan bakteri. Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C, lalu menambahkan 5 tetes reagen kovac’s ke dalam masing-masing tabung dan didiamkan  selama  10  menit.  Jika terbentuk  lapisan  berwarna  merah  pada permukaan  biakan  menandakan  reaksi
indol  positif  (Sari  dan  Apridamayanti, 2014).

## Uji Methyl Red
Bakteri uji yang telah ditumbuhkan  pada Nutrien  Agar (NA) dengan  posisi  miring  diambil  sebanyak 1  ose  dan  diinokulasikan  ke  dalam media  MR-VP  dengan  blangko  satu tabung  berisi  media  MR-VP  yang  tidak diinokulasikan  bakteri  dan  diinkubasi pada  suhu  37°C  selama  24  jam. Menambahkan  3  tetes  pereaksi methyl red. Hasil  uji  positif  ditandai  dengan adanya perubahan warna media menjadi merah,  dapat  diartikan  bahwa  telah terbentuk asam (Sari dan
Apridamayanti, 2014).
Uji Voges Proskauer Bakteri uji yang telah ditumbuhkan pada media Nutrient Agar (NA)  dengan  posisi  miring,  kemudian diambil sebanyak 1 ose dan diinokulasikan ke dalam media MR-VP yang  tidak  diinokulasikan  bakteri. Kemudian  diinkubasi  selama  48  jam pada  suhu  37°C  dengan  ditambahkan alfa  naftol  5%  sebanyak  0,6  mL  dan KOH  40%  sebanyak  0,2  mL  kemudian didiamkan.  Hasil  uji  positif  ditandai
dengan  terbentuknya  cincin  warna merah muda (SNI, 1992).

## Uji Simmons Citrate
Mengambil  bakteri  uji  yang  telah ditumbuhkan  sebelumnya  pada  media Nutrient  Agar (NA)  dengan  posisi miring sebanyak 1 ose dan
diinokulasikan ke dalam media Simmons  Citrate dengan  blangko  satu tabung  berisi  media Simmons  Citrate yang  tidak  diinokulasikan  bakteri, kemudian  diinkubasikan  selama  24  jam pada  suhu  37°C.  hasil  positif  ditandai dengan  adanya  perubahan  warna  pada medium biakan menjadi biru (Hadioetomo, 1993; Sudarsono, 2008).
Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Mengambil bakteri uji yang sebelumnya  sudah  ditumbuhkan  pada media Nutrient  Agar (NA)  dengan posisi  miring  sebanyak  1  ose  dan diinokulasikan  ke  dalam  media  TSIA dengan  cara  menusuk  tegak  lurus  pada bagian butt (tusuk)  dan  cara  zig  zag pada  bagian slant (miring)  dengan menggunakan blangko satu tabung yang berisikan  media  TSIA  yang  tidak
diinokulasikan  oleh  bakteri.  Kemudian diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu 37°C.  Diamati  perubahan  yang  terjadi pada  warna  medium.  Apabila  pada bagian slant berubah  warna  menjadi merah  dan butt menjadi  warna  kuning maka  bakteri  mampu  memfermentasi glukosa, sedangkan apabila pada bagian slant dan butt tidak  berubah  warna menjadi  kuning  maka  bakteri  mampu memfermentasi  sukrosa  dan  laktosa (Yusuf, 2009).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Uji Penduga
Hasil    penelitian  menunjukkan bahwa  nilai Most  Probable  Number (MPN) dari  sampel  es  batu  balok mengandung  bakteri coliform dan bakteri Escherichia  coli. Tabel  1 menunjukan  hasil  uji  penduga  dari sampel  D  dan  E  yang  berasal  dari pedagang  es  memiliki  total  bakteri Coliform terendah  yaitu  <100  mL, sedangkan  sampel  B  yang  berasal  dari distributor  es  batu  balok  memiliki  total bakteri  Co liform tertinggi  yaitu  >100 mL,  hal  tersebut  menandakan  bahwa sampel  B  es  batu  balok  tidak  layak untuk dikonsumsi oleh masyarakat luas.
Tabel 1. Nilai Most Probable Number (MPN) sampel es batu balok Kode Sampel Jumlah coliform SNI 01-3839-1995 A >100 mL 0/100 mL B >100 mL 0/100 mL C 0/100 mL 0/100 mL D <100 mL 0/100 mL E <100 mL 0/100 mL F 0/100 mL 0/100 mL
Keterangan:  A=  Sampel  Pabrik  Es  Batu  Blok  Kopel;  B=  Sampel  Distributor  Es  Batu Balok  Adiarsa;  D=  Sampel  Pabrik  Es  Batu  Balok  Adiarsa;  E=  Sampel  Es  Batu  Balok pedagang minuman; C&F= Blangko aquadest.
Dari hasil positif yang ditunjukkan pada tabel di atas kemudian tahap selanjutnya yaitu dihitung dengan menggunakan  perhitungan  MPN  ( Most Probable Number ), sebagai berikut :
MPN/g = (∑ ) 𝑔𝑗 (∑ ×  ∑ ) 1/2 (𝑡𝑗−𝑚𝑗) 𝑡𝑗𝑚𝑗 MPN/g = 6 (0,99  × 0,003) 1 2
MPN/g = 6 0,054

## MPN/g = 111 g
Berdasarkan  hasil  perhitungan dapat  dikatakan  bahwa    sampel  yang memiliki  indeks  MPN  /100  mL  tinggi yang  melebihi  batas  normal  yang tercantum  pada  SNI  01-3839-1995 tentang  es  batu  sebesar  0/100  mL  yaitu pada  sampel  A  dan  B  dan  pada  sampel C  dan  F  memiliki  indeks  yang  rendah dikarenakan  sampel  tersebut  dijadikan blangko yang digunakan sebagai
pembanding  berupa  larutan  aquadest. Hasil uji penduga menunjukan 4 sampel es batu dengan kode sempel A, B, D, E tidak  layak  untuk  dikonsumsi  karena melewati  batas  maksimum  cemaran bakteri Coliform pada  es  batu.  Sampel es  batu  yang  tidak  layak  untuk dikonsumsi  perlu  diwaspadai  dalam penggunaannya, hal
tersebut dikarenakan  untuk  menghindari  efek yang  merugikan  bagi  masyarakat  yang mengkonsumsinya

## Uji Penguat
Pada uji penduga yang menunjukkan  hasil  positif  kemudian dilakukan  pengujian  selanjutnya  yaitu uji penguat. Sampel yang telah dinyatakan  positif  pada  media  uji penduga  kemudian  sampel  tersebut ditumbuhkan pada media Eosin Mthylene  Blue  Agar (EMBA)  dengan cara zigzag. Sampel yang menunjukkan hasil positif mengandung bakteri E. coli
ditandai  dengan  adanya  koloni  yang tumbuh  pada  media,  koloni  yang
tumbuh berwarna hijau metalik ditunjukkan pada Tabel 2. Tabel 2. Hasil uji penguat Kode Sampel Karakteristik koloni E. coli pada EMB Agar Hasil Kemenkes RI No.97/MENKES/SK/VII/2002 A Koloni berwarna hijau metalik + - B Koloni berwarna hijau metalik +
-
Gambar 1. Hasil uji penguat
Hasil uji penguat yang
ditunjukkan  pada  tabel  2  dan  gambar  1 bahwa  koloni  berwarna  hijau  metalik yang  menandakan  bahwa  pada  es  batu balok  mengandung  bakteri E. coli ,
berdasarkan Kemenkes RI No. 907/MENKES/SK/VII/2002
tentang syarat  dan  pengawasan  kualitas  air minum berdasarkan
persyaratan mikrobiologis  terhadap  bakteri E.  coli adalah 0/100 mL. Hal tersebut menunjukan bahwa es batu balok  yang
diujikan  tidak  layak  untuk  dikonsumsi dan hal ini dapat menyebabkan patogen bagi masyarakat yang mengkonsumsinya.

## Uji Pelengkap
Sampel  yang  menunjukan  hasil positif  pada  uji  penguat  kemudian diinokulasikan  pada  media Lactose Broth untuk membuktikan bahwa bakteri  yang  tumbuh  pada  uji  penguat merupakan bakteri Coliform dan E. coli .
Tabel 3. Hasil uji pelengkap Kode Sampel Suhu Hasil SNI 01-3839-1995 A 37°C + -
B
37°C
+
-
Gambar 2. Hasil uji pelengkap pada suhu 37°C.
Hasil uji pelengkap yang
ditunjukan  pada  tabel  3  menunjukan bahwa  sampel  positif  bakteri  coliform dan  bakteri E.  coli .  Sampel  yang  diuji menunjukkan  positif  bakteri  golongan coli  sehingga,  sampel  es  batu  yang digunakan  positif  tercemar  bakteri coli . Es batu yang telah tercemar bakteri coli dapat  dikatakan  bahwa  air  yang digunakan  sebagai  bahan  pembuatan utama  es  batu  balok  tidak  higienis  dan tidak  memenuhi  syarat  air  minum  yang diperbolehkan.

## Uji IMViC
Hasil  uji  IMViC  menunjukkan bahwa  sampel  es  batu  balok  positif mengandung  bakteri E.  coli yang terlihat  dari  hasil  uji  indol  positif ditandai dengan lapisan merah terbentuk
pada media pada saat diteteskan larutan Kovac’s . Hasil uji methyl red menunjukkan  bahwa  media  berubah menjadi  warna  merah  ketika  diteteskan reagen methyl red hal tersebut menunjukan  bahwa  sampel  positif mengandung  bakteri E.  coli .  Pengujian Voges  Proskauer ini  dilakukan  dengan menambahkan  larutan  alfa-naftol  dan kalium  hidroksida  pada  media Voges Proskauer yang  telah  diinokulasikan bakteri.
Pada penelitian ini menunjukkan  bahwa  sampel  positif mengandung  bakteri E.  coli. Uji Simmons Citrate pada 2 sampel es batu balok  yang  dipilih  menunjukkan  hasil positif  atau  terjadi  perubahan  warna media menjadi berwarna biru.
Tabel 4. Hasil IMViC
Kode Sample Uji Indol Uji MR Uji VP Uji Simmons Citrate Hasil A + + + + Positif E. coli B + + + + Positif E. coli C - - - - Positif E. coli (blangko) D - - - - Positif E. coli (blangko)

## Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Hasil uji TSIA ( Triple Sugar Iron Agar ) menunjukkan bahwa sampel es batu yang positif mengandung bakteri E. coli ditandai dengan perubahan pada media agar menjadi kuning  pada slant dan deep dengan  menghasilkan  gas,  sehingga  media  terlihat  seperti terbelah atau pecah dan tidak menghasilkan.
Tabel 5. Hasil uji TSIA Kode Sampel Hasil Uji Keterangan A + E. coli B + E. coli C - Negatif E. coli (blangko) F - Negatif E. coli (blangko)

## Pewarnaan Gram
Hasil  pewarnaan  gram  pada  2 sampel  es  batu  balok  yang  diuji
menghasilkan  bakteri  yang  berbentuk basil pendek dan berwarna merah muda yang dapat dilihat pada Gambar 3.

## A                                               B
Gambar 3. Hasil Pewarnaan Gram bakteri E. coli sampel A dan B dengan kontrol pembesaran 40 x.
Pewarnaan  Gram  membutuhkan empat reagen, yaitu kristal violet, iodin, safranin,  dan  alkohol.  Kristal  violet memiliki  fungsi  yaitu  mewarnai  semua sel  menjadi  berwarna  ungu,  lalu menambahkan iodin untuk meningkatkan  afinitas  sel  terhadap  zat warna  dengan  membentuk  kompleks dengan  pewarna  pertama.  Alkohol digunakan  sebagai  pelarut  lipid  yang ada  pada  sel  dinding  bakteri  sehingga hal  tersebut  akan  membuat  dinding  sel bakteri gram positif akan tetap bertahan. Safranin  termasuk  ke  dalam  pewarna akhir  yang  akan  memberi  warna  pada bakteri  gram  negatif  sehingga  akan menjadi  warna  merah  muda  (Soenarto, 2009).  Hasil  pewarnaan  gram  pada sampel  es  batu  balok  sesuai  dengan literatur yang digunakan yaitu menunjukan  bahwa  bakteri E.  coli termasuk  ke  dalam  jenis  gram  negatif dan berbentuk batang.
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang telah  dilakukan  menunjukkan  bahwa cemaran Coliform pada  sampel  es  batu balok  memiliki  konsentrasi  melebihi batas  maksimum  yang  telah  ditetapkan oleh  Standar  Nasional  Indonesia  01- 3839-1996. Sampel D dan E merupakan cemaran  terendah  yaitu  <100mL  dan ceraman tertinggi didapatkan dari
sampel  A  dan  B  yaitu  >100mL. Pemeriksaan  bakteri  anggota  genus Escherichia  coli dilakukan  dengan menginokulasikan  sampel  pada  media selektif  yaitu Eosin  Methylene  Blue Agar (EMBA).  Media  ini  merupakan media  selektif  untuk  menumbuhkan bakteri  anggota  genus E.  coli .  Media EMBA mengandung laktosa, jika dalam biakan  terdapat  bakteri E.  coli maka asam  yang  dihasilkan  dari  fermentasi laktosa akan menghasilkan warna koloni  yang  spesifik  untuk  bakteri E. coli yaitu  koloni  yang  berwarna  hijau dengan  kilapan  logam.  Hasil  uji menunjukkan  bahwa  koloni  berwarna hijau  metalik  yang  berarti  bakteri tersebut  merupakan  anggota E.  coli (Gambar 1).
Cemaran  bakteri Coliform dan E. coli yang tertinggi yaitu dari sampel A dan  B,  hal tersebut  dapat  terjadi  karena baik pada saat proses pembuatan es batu balok  atau  dalam  penanganan  tidak higienis, sehingga menimbulkan cemaran  bakteri.  Sesuai  dengan  hasil observasi  menunjukan  bahwa  pada sampel  A  dan  B  penanganan  dilakukan di  ruang  terbuka  dan  menggunakan  air sungai yang merupakan sumber pencemaran  bakteri  seperti  dipinggir jalan  atau  parit.  Menurut  Hadi et  al
(2014),  dalam  pembuatan  es  batu  air yang digunakan harus higienis dan telah memenuhi  standar  sanitasi,  hingga  saat ini, belum terdapat peraturan pemberian izin atau rekomendasi mengenai kelayakan  usaha  es  batu  yang  baku ditinjau  dari  segi  higienis  dan  sanitasi, dikarenakan  usaha  es  batu  masih termasuk  ke  dalam  usaha  skala  kecil dan  termasuk  ke  dalam  usaha  rumah tangga, sehingga higienis dan sanitasinya masih diragukan. Pernyataan  ini  didukung  oleh  Vollaard
et al (2004) bahwa dengan
mengkonsumsi minuman
yang menggunakan campuran es batu sebagai bahan  pelengkap  dapat  menjadi  sumber pembawa  penyakit,  terutama  penyakit enterik.
Cemaran bakteri coliform ditemukan  pada  sampel  D  dan  E  yaitu memiliki  cemaran  yang  <100mL,  hal tersebut  dapat  terjadi  dikarenakan sampel  pada  saat  sebelum  digunakan disimpan  diwadah  yang  tertutup  dari polusi  udara.  Menurut  Jay et  al (2000),
Es  batu  memiliki  suhu  yang  rendah, sehingga  diduga  mampu  menghambat pertumbuhan  mikroorganisme,  di  mana semua reaksi metabolisme mikroorganisme  yang  telah  dikatalis oleh  enzim  tertentu  sangat  dipengaruhi
oleh  temperatur.  Berdasarkan  hasil observasi  ke  lapangan  didapat  bahwa pada  pedagang  minuman  menggunakan peralatan  yang  dibersihkan  terlebih dahulu sebelum digunakan untuk mengambil es batu balok.
Hasil  uji  IMViC  ( Indol  Metil Voges-Proskauer Citrate) menunjukkan bahwa  2  dari  4  positif  mengandung bakteri E. coli dan terbentuknya lapisan berwarna  merah  pada  media  ketika diteteskan reagen Kovac’s (Tabel 4). Uji indol dilakukan untuk melihat kemampuan organisme yang mendegradasi asam amino triptofan dan menghasilkan indol (Hemraj, 2013) dan isolate  yang  tidak  diisolasi  tidak memiliki kemampuan tersebut sehingga dapat  dikatakan  bahwa  bakteri  yang tumbuh  buat  bakteri  yang  berasal  dari anggota  spesies E.  coli namun  masih termasuk  anggota  genus Escherichia . Hasil  uji Methyl  red menunjukkan bahwa media berubah menjadi berwarna merah  ketika  diteteskan  reagen Methyl red yang  menandakan  bahwa  hasil  uji positif  mengandung  bakteri E.  coli .  Uji Methyl  red dilakukan  untuk  melihat kemampuan bakteri mengoksidasi glukosa  dengan  memproduksi  asam dengan  konsentrasi  tinggi  sebagai  hasil akhirnya dan hasil asam yang terbentuk
berubah menjadi merah dnegan
ditambahkannya reagen Methyl red .
Hasil uji Voges Proskauer
menunjukkan  hasil  positif  atau  terjadi perubahan pada media menjadi berwarna merah. Uji VP yang merupakan pengujian untuk mendeteksi asetoin  dalam  kultur  bakteri.  Pengujian ini  dilakukan  dengan  penambahan alpha-naftol  pada  media  VP  yang sebelumnya telah diinokulasikan bakteri.  Hasil  pewarnaan  gram  pada kedua  sampel  es  batu  balok  yang  diuji menunjukkan  bahwa  bakteri  memiliki bentuk  basil  pendek  dan  berwanra merah  muda  (Gambar  3).  Bakteri  yang terkandung  di  dalam  es  batu  balok merupakan  bakteri  yang  berasal  dari anggota  genus E.  coli yang  memiliki sifat gram negatif dan berbentuk batang. Sampel  uji  terkontaminasi  oleh  bakteri anggota genus E. coli dapat disebabkan oleh  faktor  lingkungan  khususnya  air. Air  merupakan  media  bakteri Coliform dan E.  coli untuk  bertahan  hidup (Alkandahri et  al .,  2020.  Munculnya kedua  bakteri  tersebut  pada  sampel  es batu balok dapat disebabkan oleh proses memasak  air  yang  kurang  matang sehingga  dapat  menyebabkan  bakteri tersebut tetap hidup di dalam sampel es batu balok.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  pengujian  yang telah  dilakukan  dan  sesuai  dengan perhitungan Most  Probable  Number (MPN)  dapat  disimpulkan  bahwa  es batu  balok  yang  digunakan  oleh  para pedagang  di  sekitaran  kota  Karawang memiliki  kualitas  mikrobiologis  yang tidak  layak  untuk  dikonsumsi  oleh masyarakat,  karena  dapat  menyebabkan penyakit  enterik  dan  tidak  sesuai dengan  persyaratan  mutu  mikrobiologis Standar  Nasional  Indonesia  01-3839- 1996 tentang es batu yaitu Total Bakteri Coliform melebihi 0/100mL.

## DAFTAR PUSTAKA
Alkandahri,  M.Y.,  Kusumawati,  A.H., and Fikayuniar, L. Antibacterial Activity  of  Zingiber officinale  Rhizome. International Journal of Psychosocial Rehabilitation . 2020, 24(7): 3702- 3706.
Bambang, AG., Fatimawali, dan Kojong, NS. 2014. Analisis Cemaran  Bakteri Coliform dan Identifikasi Escherichia  coli Pada Air  Isi  Ulang  Dari  Depot  di  Kota Manado. PHARMACON  Jurnal Ilmiah  Farmasi  UNSRAT .  2014, 3(3): 325-334.
Hadi,  B.,  Bahar,  E.,  dan  Semiarti,  R. 2014.  Uji  Bakteriologis  Es  Batu Rumah  Tangga  yang  Digunakan Penjual  Minuman  di  Pasar  Lubuk
Buaya Kota Padang. Jurnal
Kesehatan  Andalas .  2014,  3(2):
119-122.
Depkes RI. 1995. Farmakope Indonesia
Edisi IV . Jakarta: Direktorat Jenderal  Pengawasan  Obat  dan Makanan.
Depkes  RI.  2002.  Keputusan  menteri kesehatan RI Nomor 907/Menkes/SK/VII/2002  tentang Syarat-Syarat  dan  Pengawasan Kualitas Air Minum. Depkes  RI.  2010.  Keputusan  menteri kesehatan RI 492/MENKES/PER/IV/2010 tentang  Persyaratan  Kualitas  Air Minum. Departemen Kesehatan RI. 2010.
Keputusan  Menteri  Kesehatan  RI 492/Menkes/PER/IV/2010  tentang Persyaratan Kualitas Air Minum.
ITS.  2012. Eschrichia  coli .  United States: Integrated Taxonomic Information System.
James,  JH.  2015. Manual  of  Clinical Microbiology 11 th Edition. Washington,  DC:  ASM  PRESS, pp 685-699.
Jawetz, E., Melnick, JL., Adelberg, EA.,
Brooks,  GF.,  Butel,  JS.,  and
Ornston,  LN.  1995. Mikrobiologi Kedokteran . University of
California, San Francisco.
Jay,  JM,  Loessner,  MJ.,  and  Golden,
DA. 2005. Modern Food Microbiology . USA: Springer Science.
Johnson,  JR.  2002. Evolution  of
Pathogenic Escherichia coli . USA: Elsevier Science 55-77.
Mahon, CR., Donald, LC., and George, M. 2015. Diagnostic Microbiology 5th Edition, Missouri:  Saunders  Elsevier,  pp
421-451.
Michael,. Onggowidjaja, P., dan Rusumana,  D.  Bakteri Coliform
Dalam  Es  Batu  Pada  Tiga  Rumah Makan Ayam Goreng Siap Saji Di Bandung. JKM ,  2010,  9(2):124-
128.
Mirja,  MN.  Hygiene  Sanitasi  dan Jumlah Coliform Air  Minum. Jurnal  Kesehatan  Masyarakat .
2014, 9(2): 167-173.
Mishra,  SK.,  and  Agrawal,  D.  2012. A Concise  Manual  of  Pathogenic
Microbiology .  John  Wiley  & Sons, Inc. pp 71-75.
Nafees, A. 2014. Sherris Medical Microbiology  6th  Edition ,  Unites States:  McGraw  Hill  Education , pp.579-598.
Rahayu,
WP., Siti, NS., dan Komalasari, ES. 2021. Escherichia coli : Patogenitas, Analisis,  dan  Kajian  Risiko.  PT Penerbit IPB Press.
Sukawaty, Y., Kamil, M., dan Kusumawati,  E. Cemaran Uji Pada  Minuman Coliform Bakteri Jurnal Ilmiah . Air Tebu 253. - . 2016, 2(2): 248 Manuntung
Vollard,  AM.,  Soegianto,  A.,  Henri, AGH.,  Asten,  V.,  Suwandhi,  W., and  Leo  GV.  Risk  Factors  for Typhoid and Paratyphoid Fever in Jakarta, Indonesia. The Journal of American  Medical  Association . 2014, 291(21): 43-60.