94 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6

## Aktivitas  Enzimatis  Isolat  Bakteri  Asam  Laktat  dari  Saluran  Pencernaan Kepiting Bakau (Scylla spp.) Sebagai Kandidat Probiotik
Activity Enzymatic of Isolate Lactic Acid Bacteria from the Digestive Tract of Mud Crab (Scylla spp.) as a Candidate Probiotics
Pipin Suciati 1 *, Wahju Tjahjaningsih 2 , Endang Dewi Masithah 2 dan Heru Pramono** 2 1 Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga, Surabaya 2 Departemen Kelautan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga, Surabaya * pipin-s-11@fpk.unair.ac.id **heruiwak@gmail.com

## Abstrak
Probiotik  dapat  didefinisikan  sebagai  mikroba  hidup  yang  ditambahkan  dalam  jumlah  tertentu  yang mampu bertahan  hidup  dalam  ekosistem saluran pencernaan. Enzim  yang  dihasilkan  oleh  mikroba yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan dapat digunakan sebagai probiotik. Enzim proteolitik ekstraseluler secara alami diproduksi oleh mikroba untuk menghidrolisis polipeptida dalam media menjadi peptida dan asam  amino.  Bakteri  asam  laktat  dapat  menghasil  enzim  seperti  protease, α -amilase,  fitase,  kitinase, lipase.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  isolat  bakteri  asam  laktat  dari  saluran  pencernaan kepiting  bakau  ( Scylla spp.)  yang  mempunyai  aktivitas  proteolitik.  Penelitian  ini  menggunakan  metode deskriptif berupa aktivitas enzimatis dan karakterisasi uji biokimia isolat bakteri asam laktat dari saluran pencernaan  kepiting  bakau  ( Scylla spp.).  Jumlah  kepiting  bakau  yang  digunakan  adalah  10  ekor.  Hasil penelitian didapatkan tiga isolat bakteri asam laktat yang memiliki aktivitas proteolitik kuat, yaitu WK 28, WK 33, dan WK 53. Hasil uji biokimia isolat WK 28 termasuk  ke  dalam genus Pediococcus sp., isolat WK 33 termasuk ke dalam Lactobacillus sp., dan isolat WK 53 termasuk ke dalam genus Streptococcus sp.  WK  28  ( Pediococcus sp.)  dan  WK  33  ( Lactobacillus sp.)  mempunyai  aktivitas  proteolitik  dan aktivitas  lipolitik.  Isolat  WK  53  ( Streptococcus sp.)  mempunyai  aktivitas  enzimatis  yaitu  aktivitas proteolitik, amilolitik, dan lipolitik.
Kata kunci: Kepiting bakau, proteolitik, amilolitik, lipolitik

## Abstract
Probiotics  are  defined  as  live  microbes  are  added  in  a  certain  amount  that  is  able  to  survive  in  the digestive tract ecosystem. Enzymes produced by microbes isolated from the digestive tract of fish can be used as probiotics. Extracellular proteolytic  enzymes  naturally produced by the  microbes to  hydrolyze a polypeptide in a media into peptides and amino acids. Lactic acid bacteria can produce enzymes such as protease s,  α -amylase,  phytase,  chitinase,  lipase.  This  study  aims  to  get  the  lactic  acid  bacteria  isolates from the gastrointestinal tract of mangrove crab ( Scylla spp.) That have proteolytic activity. This research uses descriptive  method such as enzymatic activity and biochemical characterization  of isolates  of lactic acid bacteria from the digestive tract of mangrove crab ( Scylla spp.). Amount of mud crab used is 10 fish. The result showed three isolates of lactic acid bacteria that have a strong proteolytic activity, namely WK 28  WK  33  and  WK  53.  The  results  of  biochemical  tests  WK  28  isolates  belonging  to  the  genus Pediococcus sp., Isolate WK 33 belonging to the Lactobacillus sp., And WK 53 isolates belonging to the genus Streptococcus sp.  WK  28  ( Pediococcus sp.)  And  WK  33  ( Lactobacillus sp.)  Have  proteolytic activity and  lipolytic activity. Isolates WK 53 ( Streptococcus sp.) Have  enzymatic activity  is proteolytic activity, amylolytic, and lipolytic.
Keywords: Mud crab, lactic proteolytic, amylolytic, lipolytic
95 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6

## Pendahuluan
Salah  satu  upaya  untuk  meningkat- kan fungsi fisiologis ikan, terutama kemam- puan  dalam  mencerna  pakan  adalah  dengan menambahkan  probiotik  dalam  pakan.  Pe- nambahan  probiotik  dalam  pakan  diharap- kan  dapat  masuk  dalam  saluran  pencernaan komoditas  budidaya  (Jusadi  dkk.,  2004). Probiotik  didefinisikan  sebagai  mikroba  hi- dup yang ditambahkan dalam jumlah terten- tu  yang  mampu  bertahan  hidup  dalam  eko- sistem saluran pencernaan. Mikroba probio- tik memiliki peran positif pada inang. Peran mikroba  tersebut  berpengaruh  terhadap  ke- sehatan  dan  nutrisi  inang  (Gismondo et  al., 1999).  Probiotik  bermanfaat  dalam  menga- tur keseimbangan mikroba pada saluran pen- cernaan  dan  menghambat  perkembangan mikroba  patogen  pada  saluran  pencernaan (Salminen et al., 1999) serta  mensekresikan enzim  yang  membantu  proses  pencernaan makanan.  Peningkatan  daya  cerna  menun- jukkan  semakin  tinggi  nutrisi  yang  tersedia untuk diserap tubuh (Jusadi dkk., 2004).
Menurut  Lengkey  dan  Soeharsono (2010),  mikroba  probiotik  adalah  bakteri Gram  positif,  contohnya  genus Lactobacil- lus dan Bifidobacterium. Bakteri  yang digunakan  sebagai  probiotik  antara  lain  ter- masuk  dalam  spesies Lactobacillus ( Lacto- bacillus  acidophilus,  Lactobacillus  lactis,
Lactobacillus  plantarum ), Bifidobacterium ( Bifidobacterium  bifidum,  Bifidobacterium thermophilum ),  dan Streptococcus  lactis. Menurut  Chotimah  (2009), Streptococcus thermophillus dan Lactobacillus  bulgaricus tergolong dalam bakteri asam laktat (BAL).
Menurut  Hardiningsih  dkk.  (2006), bakteri  asam  laktat  tidak  bersifat  patogen dan  aman  bagi  kesehatan  sehingga  sering digunakan  pada  industri  pengawetan  maka- nan,  minuman  serta  berpotensi  sebagai produk  probiotik.  Seiring  dengan  perkem- bangan  penggunaan  probiotik  dalam  kegia- tan  budidaya,  perlu  dilakukan  penelitian mengenai  aktivitas  enzimatis  isolat  bakteri asam laktat dari saluran pencernaan kepiting bakau  ( Scylla spp.)  dalam  memproduksi enzim yang berperan dalam pencernaan.

## Materi dan Metode

## Alat dan Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  pene- litian  yaitu  kepiting  bakau  ( Scylla spp.) dewasa  dengan  ukuran  7-10  cm  dan  berat 90-100  gram  sebanyak  10  ekor  yang  dida- patkan  dari  pedagang  pengumpul  kepiting bakau  di  hutan  bakau  Wonorejo  Surabaya. Bahan  yang  digunakan  yaitu  media  selektif de  Man  Rogosa  Sharpe  (MRS),  0,5% CaCO 3 ,  air  laut,  alkohol  70%,  kapas,  kertas pH, skim  milk, bacto agar,  amilum,  lugol,
96 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
minyak  zaitun, paper  disk  blank ,  larutan NaCl fisiologis, akuades dan air laut. Media untuk uji  biokimia  yaitu  media  MIO,  media TSIA, media uji O/F parafin, media glukosa, zat  warna  Gram, paper  oksidase, dan  H 2 O 2 3%. Peralatan  yang digunakan dalam proses isolasi  yaitu  pinset,  alat  seksio,  Petri dish , tabung  reaksi,  autoklaf,  pipet  ukur,  pipet tetes,  Beaker glass ,  bunsen,  mikrotub, pinset,  oven,  timbangan  analitik,  tabung Erlenmeyer, Ose, dan Refraktometer.

## Prosedur Penelitian
Penelitian  yang  dilakukan  menggu- nakan  metode  deskriptif  (Rohy  dkk.,  2014) berupa  aktivitas  enzimatis  dan  karakterisasi uji  biokimia  isolat  bakteri  asam  laktat  dari saluran  pencernaan  kepiting  bakau  ( Scylla spp.).

## Pembuatan Media
Media  yang  digunakan  untuk  isolasi bakteri asam  laktat adalah  media  MRS agar yang ditambahkan 0,5% CaCO 3 (Khunajarkr et  al., 2008).  Media  MRS  sebanyak  10,4 gram, bacto  agar sebanyak  tiga  gram  dan satu gram CaCO 3 dilarutkan dengan air  laut 200  ml  ke  dalam  Erlenmeyer.  Media  MRS agar dengan penambahan CaCO 3 disterilisasi dengan  menggunakan  autoklaf  pada  suhu 121ºC,  tekanan  1  atm  selama  15  menit, kemudian dituang pada Petri dish .

## Pengambilan Sampel Saluran Pencernaan Kepiting Bakau
Pengambilan  sampel  saluran  pencer- naan  kepiting  bakau  ( Scylla spp.)  dewasa baik  jantan  dan  betina  dari  10  ekor  sebagai sumber inokulum. Sampel saluran pencerna- an  diambil  dengan  cara  membuka  karapas kepiting  bakau  kemudian  pada  saluran  pen- cernaan  dipotong  mulai  dari  anterior  lam- bung sampai pada posterior usus.

## Penanaman Bakteri
Sampel  diambil  sebanyak  0,5  gram untuk  diencerkan  dengan  4,5  ml  air  laut yang  steril  dalam  tabung  reaksi  (10 -1 ).  Pe- ngenceran  dilanjutkan  hingga  seri  pengen- ceran  10 -2 .  Metode  penanaman  dilakukan dengan  metode  permukaan  ( surface/spread plate ) (Sumarsih dkk., 2010). Sampel diam- bil  1  ml  dan  diinokulasi  pada  media  MRS agar  yang  telah  ditambah  0,5%  CaCO 3 . Inkubasi  dilakukan  pada  suhu  30ºC  selama satu  sampai  dua  hari  dengan  posisi  cawan Petri terbalik (Setyadi dan Subagiyo, 2012).

## Pemurnian Isolat Bakteri
Pemurnian  isolat  bakteri  dilakukan dengan  metode streak  plate pada  media MRS agar yang telah ditambah 0,5% CaCO 3 kemudian diinkubasi pada suhu 30ºC selama 24  jam.  Media  MRS  merupakan  media
97 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
selektif  untuk  pertumbuhan  bakteri  asam laktat (Yelnetty et al. , 2014).

## Seleksi Bakteri Asam Laktat Proteolitik
Seleksi  bakteri  asam  laktat  proteoli- tik dilakukan dengan uji aktivitas proteolitik pada  media  agar  dengan  menggunakan  1% skim  milk (Nespolo et  al. ,  2010).  Uji  akti- vitas  proteolitik  dilakukan  dengan  prosedur Benson  (2001)  yaitu  kultur  cair  isolat  yang diperoleh dari hasil isolasi diinokulasikan ke paper  disc  blank yang  kemudian  ditempat- kan  pada  media skim  milk agar  (1%),  diin- kubasi  pada  suhu  30ºC  selama  1-3  hari. Inokulasi  bakteri  dilakukan  dengan  cara memasukkan paper disc ke dalam kultur cair isolat bakteri menggunakan pinset.
Aktivitas proteolitik tampak dari ter- bentuk zona jernih di sekitar paper disc . Uji aktivitas  proteolitik  pengamatan  dilakukan selama  tiga  hari.  Berdasarkan  tingkat  ke- mampuan menghidrolisis protein  yang diha- silkan  oleh  masing-masing  isolat  ditunjuk- kan  berupa  zona  jernih,  dipilih  tiga  isolat dengan kemampuan  menghidrolisis tiga ter- besar (Triyanto dkk., 2009). Hasil seleksi uji aktivitas proteolitik, tiga  isolat bakteri asam laktat  selanjutnya  dilakukan  karakterisasi yaitu dengan uji biokimia.
Uji Biokimia Uji Katalase
Uji katalase dilakukan dengan mene- teskan  beberapa  larutan  H 2 O 2 3%  pada  kul- tur bakteri. Sifat reaksi terhadap uji katalase ditentukan dengan  terbentuk  gelembung gas yang  memberikan  indikasi  pembentukan  air dan oksigen dari  hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) (Benson, 2001).

## Uji Morfologi dan Pewarnaan Gram
Pewarnaan  Gram  bertujuan  untuk mengamati  morfologi  bentuk  koloni,  warna koloni, elevasi koloni, dan bentuk sel (bulat, bulat  batang,  tetrad,  batang)  serta  menen- tukan  kelompok  bakteri  yaitu  bakteri  Gram negatif  dan  bakteri  Gram  positif  (Benson, 2001).

## Produksi Hidrogen Sulfida
Pengujian  produksi  hidrogen  sulfida bertujuan  untuk  menentukan  sifat  produksi H 2 S dan fermentasi karbohidrat. Media yang digunakan  adalah  media  TSIA.  Produksi H 2 S  ditandai  dengan  terbentuk  warna  hitam pada  dasar  media.  Fermentasi  karbohidrat menyebabkan  warna  media  berubah  dari oranye  kemerahan  menjadi  warna  kuning (Benson, 2001).

## Motilitas
Pengujian  motilitas  bertujuan  untuk mengetahui bakteri bersifat motil atau tidak. Uji  motilitas  dilakukan  dengan  cara  menu-
98 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
sukkan  inokulasi  bakteri  pada  media soft agar  (MIO).  Bakteri  bersifat  motil  akan terlihat  penyebaran  bakteri  pada  media (Benson, 2001).

## Oksidase
Tujuan  uji  oksidase  adalah  untuk membedakan  kelompok  bakteri  dengan menggunakan paper  oksidase .  Pengelom- pokan bakteri dengan uji oksidase  diketahui adanya  perubahan  warna  yang  terjadi  pada paper  oksidase. Reaksi  uji  oksidase  positif apabila terjadi  perubahan warna pada paper oksidase menjadi  biru  yang  nampak  dalam waktu 10-15 detik (Benson, 2001).

## Oksidatif / Fermentatif
Uji O/F medium (oksidatif/fermenta- tif) bertujuan untuk mengetahui sifat oksida- si  atau  fermentasi  bakteri  terhadap  glukosa. Bakteri oksidatif memanfaatkan oksigen un- tuk  menghasilkan  karbondioksida  dan  air, memanfaatkan  glukosa  sebagai  donor  elek- tron  dan  oksigen  sebagai  sumber  elektron utama.  Bakteri  bersifat  oksidatif  apabila media  uji  O/F  berwarna  biru.  Bakteri  fer- mentatif  memanfaatkan  glukosa  sebagai sumber energi, dengan menghasilkan produk akhir  karbondioksida  dan  air.  Bakteri  ber- sifat  fermentatif  apabila  media  uji  O/F berwarna kuning (Benson, 2001).

## Uji Glukosa
Uji  glukosa  bertujuan  untuk  menen- tukan  kemampuan  bakteri  dalam  menfer- mentasikan glukosa dan  menghasilkan asam organik serta menghasilkan gas. Uji glukosa positif apabila terjadi perubahan warna men- jadi kuning pada media uji glukosa (Benson, 2001).

## Uji Aktivitas Proteolitik II
Uji  aktivitas  proteolitik  pada  media agar  dengan  menggunakan  1% skim  milk (Nespolo et  al. ,  2010).  Uji  aktivitas  proteo- litik  dilakukan  dengan  prosedur  Benson (2001),  yaitu  kultur  cair  isolat  yang  dipero- leh dari hasil isolasi diinokulasikan ke paper disc blank yang kemudian ditempatkan pada media skim milk agar (1%), diinkubasi pada suhu 30ºC selama 1-3 hari. Inokulasi bakteri dilakukan  dengan  cara  memasukkan paper disc ke  dalam  kultur  cair  isolat  bakteri menggunakan  pinset.  Aktivitas  proteolitik tampak dari  terbentuk  zona  jernih  di sekitar paper disc . Uji aktivitas proteolitik II penga- matan dilakukan selama tujuh hari.

## Aktivitas Amilolitik
Uji aktivitas amilolitik dilakukan pa- da  media  agar  dengan  1%  amilum  atau  pati (Fossi et  al., 2005).  Uji  aktivitas  amilolitik dilakukan  dengan  prosedur  Benson  (2001),
99 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
yaitu  kultur  cair  isolat  bakteri  asam  laktat proteolitik  diinokulasikan  ke paper  disc blank yang kemudian ditempatkan pada me- dia agar dengan 1% amilum, kemudian diin- kubasi  pada  suhu  30ºC  selama  24-48  jam. Inokulasi bakteri dilakukan dengan cara me- masukkan paper  disc ke  dalam  kultur  cair isolat bakteri menggunakan pinset. Hasil ak- tivitas enzim amilase ekstraseluler ditunjuk- kan  oleh  terbentuk  zona  jernih  di  sekitar koloni.  Pengamatan  zona  jernih  di  sekitar koloni  dilakukan  dengan  penambahan  lugol pada media (Fossi et al., 2005).

## Aktivitas Lipolitik
Uji aktivitas  lipolitik dilakukan pada media  MRS  agar  dengan  penambahan  2  ml minyak  zaitun  dalam  100  ml  media  MRS agar (Svetlitshnyl et al ., 1996). Uji aktivitas lipolitik  dilakukan  dengan  cara  kultur  cair isolat  bakteri  asam  laktat  proteolitik  diino- kulasikan  ke paper  disc  blank dari  kertas saring  kemudian  ditempatkan  pada  media MRS agar dengan penambahan 2 ml minyak zaitun. Inkubasi pada suhu 30ºC selama 24- 48  jam  (Benson,  2001).  Inokulasi  bakteri dilakukan  dengan  cara  memasukkan paper disc ke  dalam  kultur  cair  isolat  bakteri menggunakan pinset. Aktivitas enzim lipase bakteri  asam  laktat  ditandai  dengan  ter- bentuk  zona  jernih  di  sekitar  koloni  yang
menunjukkan  bahwa  media  larut  atau  ter- hidrolisis.

## Parameter Penelitian
Parameter  dalam  penelitian  ini  ada- lah  aktivitas  enzimatis  dan  karakterisasi isolat  bakteri  asam  laktat.  Aktivitas  enzi- matis  tersebut  meliputi  aktivitas  proteolitik, amilolitik,  dan  lipolitik.  Karakterisasi  bak- teri  asam  laktat  yaitu  dengan  uji  biokimia. Pengamatan  dilakukan  secara  makroskopik dan secara mikroskopik.

## Analisa Data
Data hasil uji aktivitasi enzimatis dan karakterisasi  isolat  bakteri  asam  laktat  Di- analisis secara deskriptif. Data diperoleh da- ri hasil uji aktivitas enzimatis yaitu aktivitas proteolitik,  amilolitik,  dan  lipolitik  serta  uji biokimia kemudian dianalisis dan dilengkapi dengan Tabel dan Gambar.

## Hasil dan Pembahasan
Hasil  Isolasi  dan  Seleksi  Bakteri  Asam Laktat
Hasil  isolasi  10  ekor  kepiting  bakau ( Scylla spp.) diperoleh 96 isolat bakteri yang tumbuh pada  media de  Man Rogosa Sharpe (MRS)  agar  dengan  penambahan  0,5%  Ca- CO 3 . Hasil permurnian isolat diperoleh seba- nyak 65 isolat bakteri asam laktat, kemudian dilanjutkan  seleksi  bakteri  asam  laktat proteolitik.
100 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6

## Seleksi Bakteri Asam Laktat Proteolitik
Seleksi  bakteri  asam  laktat  proteo- litik  dilakukan  dengan  uji  aktivitas  proteo- litik  dari  65  isolat  bakteri  asam  laktat  hasil pemurnian.  Berdasarkan  hasil  uji  aktivitas proteolitik  didapatkan  tiga  isolat  bakteri asam  laktat  yang  mempunyai  aktivitas  pro- teolitik kuat ditandai  dengan terbentuk zona jernih.  Zona  jernih  di  sekitar  koloni  meru- pakan  hasil  aktivitas  hidrolisis  protein  pada media oleh enzim protease ekstraseluler, tiga isolat  tersebut  yaitu  WK  28,  WK  33,  dan WK  53.  Lebar  diameter  zona  jernih  isolat WK 28 adalah 12 mm, isolat WK 33 adalah 9 mm, dan isolat WK 53 adalah 10 mm.

## Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat Proteolitik
Karakterisasi  bakteri  asam  laktat dilakukan  dengan  uji  morfologi  dan  uji biokimia.  Dari  hasil  uji  morfologi  koloni (Gambar  1)  dan  uji  biokimia  dibandingkan dengan buku Bergey’s Determinative Bacteriologi (Holt et  al., 1994)  didapatkan kecocokan  karakteristik  isolat  pada  jenis bakteri Pediococcus sp., Lactobacillus sp., dan Streptococcus sp (Tabel 1.).
Ciri-ciri morfologi isolat bakteri WK 28  ( Pediococcus sp.)  yaitu  bentuk  koloni bulat dengan tepian bergerigi berwarna putih susu  dengan  elevasi  cembung.  Sel Pedio-
coccus sp. berbentuk bulat tersusun berantai pendek  atau sepasang. Isolat bakteri WK 33 ( Lactobacillus sp.) mempunyai ciri-ciri ben- tuk koloni bulat berwarna putih susu dengan elevasi  cembung. Sel Lactobacillus sp. Ber- bentuk  batang  dan  lurus  tersusun  berpa- sangan. Isolat bakteri WK 53 ( Streptococcus sp.) mempunyai bentuk koloni bulat beruku- ran kecil berwarna putih susu dengan elevasi cembung.  Sel Streptococcus sp.  berbentuk bulat tersusun berantai pendek.
a.                           b.
c.
Gambar 1. Morfologi koloni bakteri.
K eterangan: a. Isolat WK 28, b. Isolat

## WK 33, c. Isolat WK 53
Hasil uji  biokimia  menunjukkan  iso- lat bakteri WK 28 ( Pediococcus sp.), WK 33 ( Lactobacillus sp.), dan WK 53 ( Streptococ- cus sp.)  bersifat  positif  terhadap  pewarnaan Gram,  katalase  negatif,  oksidase  negatif, glukosa  positif, metil  red (MR)  negatif, voges  proskauer (VP)  negatif,  tidak  meng-
101 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
hasilkan  gas  dan  H 2 S  serta  bersifat  fermen- tatif  pada  uji  O/F.  Bakteri Pediococcus sp. dan Lactobacillus sp. bersifat non motil, se- dangkan  bakteri Streptococcus sp.  bersifat
motil.  Hasil  pewarnaan  Gram  isolat  bakteri WK  28  ( Pediococcus sp.),  WK  33  ( Lacto- bacillus sp.), dan WK 53 ( Streptococcus sp.) dapat dilihat pada Gambar 2.
Tabel 1. Hasil uji biokimia Isolat TSIA  Gas H 2 S  O/F  Glukosa  Motilitas  Oksidase Katalase Gram WK 28 ( Pediococcus sp. )
WK 33
( Lactobacillus sp.)
WK 53
( Streptococcus sp.) - - - - - - - - - F
F F
+ + +
- - + - - - - - - + + +

## Kemampuan Aktivitas Proteolitik II Isolat Bakteri Asam Laktat
Berdasarkan  hasil  seleksi  aktivitas proteolitik isolat bakteri asam laktat diperoleh tiga isolat bakteri asam laktat yang mempunyai aktivitas proteolitik kuat ditandai  dengan  terbentuk  zona  jernih,  tiga isolat  tersebut  yaitu  WK  28,  WK  33,  dan WK 53. Hasil uji morfologi dan uji biokimia isolat bakteri asam laktat proteolitik dibandingkan dengan buku Bergey’s Determinative  Bacteriologi (Holt et  al.,
1994)  didapatkan  kecocokan  karakteristik bakteri isolat WK 28 termasuk dalam Genus Pediococcus sp.,  isolat  WK  33  termasuk
dalam  Genus Lactobacillus sp.,  dan  isolat WK  53  termasuk  dalam  Genus Streptococ- cus sp.  Tiga  isolat  tersebut  kemudian  dila- kukan  uji  aktivitas  proteolitik  II.  Uji  akti- vitas  proteolitik  II  dilakukan  pengamatan selama tujuh hari untuk mengetahui kemam- puan  bakteri  dalam  menghasilkan  enzim protease  ekstraseluler  berupa  zona  jernih  di sekitar  koloni  yang  merupakan  hasil  hidro- lisis  enzim  protease  (Gambar  3).  Hasil  uji aktivitas  proteolitik  II  dapat  dilihat  pada Tabel 2.
Kemampuan  Aktivitas  Amilolitik  dan Aktivitas Lipolitik
102 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
a. b.
c.

## Gambar 2. Pewarnaan Gram isolat bakteri asam laktat
Keterangan  : a. Isolat bakteri WK 28 ( Pediococcus sp.), b. Isolat bakteri WK 33 ( Lactobacillus sp.),
c. Isolat bakteri  WK 53 ( Streptococcus sp.).
Hasil  uji  aktivitas  amilolitik  isolat WK  28  ( Pediococcus sp.),  WK  33  ( Lacto- bacillus sp.), dan WK 53 ( Streptococcus sp.) menunjukkan bahwa isolat WK 53 ( Strepto- coccus sp.)  mampu  menghasilkan  enzim amilase  ekstraseluler  ditunjukkan  dengan terbentuk zona jernih di sekitar koloni. Zona
jernih  di  sekitar  koloni  merupakan  hasil aktivitas hidrolisis amilum oleh amilase eks- traseluler.  Isolat  WK  28  ( Pediococcus sp.) dan  WK 33  ( Lactobacillus sp.)  tidak  meng- hasilkan  enzim  amilase  ekstraseluler  ditan- dai  dengan  tidak  terbentuk  zona  jernih  di sekitar koloni (Gambar 4).
Tabel 2. Data diameter zona jernih uji aktivitas proteolitik II
No . Isolat Diameter zona jernih (mm) H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 H-7 1. WK 28 ( Pediococcus sp.) 18 18 19 24 28 28 28 2. WK 33 ( Lactobacillus sp.) 13 14 14 18 22 26 30 3. WK 53 ( Streptococcus sp.) 11 14 14 30 30 30 32
103 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6

## AB   C Gambar 3. Uji aktivitas proteolitik
Keterangan: A. Zona jernih, B. Koloni bakteri,
C. Media tidak terhidrolisis.

## AB       C
Gambar 4. Uji aktivitas amilolitik
Keterangan: A. Zona jernih, B. Koloni bakteri,
C. Media tidak terhidrolisis.
Hasil  uji  aktivitas  lipolitik  menun-jukkan terbentuk  zona  jernih  di  sekitar  koloni  pada media  MRS  agar  dengan  penambahan  2  ml minyak  zaitun  (Gambar  5).  Isolat  WK  28 ( Pediococcus sp.),  WK  33  ( Lactobacillus sp.),  dan  WK  53  ( Streptococ-cus sp.) mampu menghasilkan enzim lipase ekstraseluler.
Isolasi  bakteri  adalah  memisahkan bakteri  dari  lingkungan  dan  menumbuhkan sebagai  biakan  pada  media  buatan  (Suryani dkk.,  2010).  Menurut  Khunajarkr et  al. (2008), isolasi bakteri asam laktat dilakukan
dengan  menggunakan  media  MRS  agar dengan  penambahan  0,5%  CaCO 3 .  Koloni bakteri  asam  laktat  yang  tumbuh  memben- tuk zona jernih di sekitar pertumbuhan kolo- ni  pada  media  MRS  agar  dengan  penam- bahan  0,5%  CaCO 3 .  Zona  jernih  terbentuk karena  bakteri  menghasilkan  metabolit  se- kunder  berupa  asam  laktat  yang  berlebih sehingga  kelebihan  asam  laktat  ditunjukkan dengan  terbentuk  zona  jernih  (Melliawati dkk., 2015).

## AB C D
Gambar 5. Uji aktivitas lipolitik
Keterangan: A. Zona jernih, B. Koloni bakteri,
C. Asam lemak bebas,  D. Media tidak
terhidrolisis.
Hasil  penelitian  isolasi  bakteri  asam laktat  dari  saluran  pencernaan  kepiting bakau  didapatkan  sebanyak  65  isolat  yang mempunyai zona jernih dan bersifat katalase negatif.  Menurut  Hardiningsih  dkk.  (2006), zona  jernih  yang  terbentuk  diduga  bakteri asam  laktat,  selanjutnya  dilakukan  uji  kata- lase.  Zona  jernih  yang  terbentuk  serta  kata-
WK 28 WK 53 WK 28 WK 33 WK 28 WK 33 WK 53
104 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
lase  negatif  merupakan  karakteristik  bakteri asam laktat.
Hasil  pemurnian  isolat  yaitu  seba- nyak  65  isolat  bakteri  asam  laktat  dilanjut- kan pada uji aktivitas proteolitik I. Hasil uji aktivitas proteolitik I dipilih tiga isolat yaitu isolat  WK  28  dengan  diameter  zona  jernih 12 mm, isolat WK 33 dengan diameter zona jernih  9  mm,  dan  isolat  WK  53  dengan diameter  zona  jernih  10  mm.  Isolat  bakteri asam  laktat  WK  28,  WK  33,  dan  WK  53 selanjutnya  dilakukan  karakterisasi  dengan uji  biokimia.  Hasil  uji  biokimia  pada  Tabel 1. dibandingkan dengan Bergey’s Manual of Determinative  Bacteriology (Holt et  al.,
1994) . Hasil  uji  biokimia  menunjukkan isolat  WK  28  termasuk  ke  dalam  genus Pediococcus sp.,  isolat  WK  33  termasuk  ke dalam Lactobacillus sp.,  dan  isolat  WK  53 termasuk ke dalam genus Streptococcus sp.
Menurut  Holt et.  al., (1994),  bakteri Pediococcus sp.  berbentuk  bulat  berantai pendek,  beberapa  berpasangan  dan  tidak membentuk  rantai.  Diameter  sel Pediococ- cus sp. 1.0- 2.0 μm. Bakteri Pediococcus sp. bersifat Gram positif, tidak membentuk spo- ra,  katalase  negatif,  tidak  menghasilkan nitrat.  pertumbuhan  optimum  pada  suhu 25º–40ºC. Menurut Holt et. al., (1994), bak- teri Lactobacillus sp.  berbentuk  batang  be- rantai pendek umumnya berukuran 0.5-1.2 x
1.0- 10.0 μm. Bakteri Lactobacillus sp.  Ber- sifat  Gram  positif,  tidak  membentuk  spora, dan  bersifat  mikroaefilik.  Bakteri Lacto- bacillus sp. tumbuh optimum pada suhu 30- 40ºC.  Menurut  Holt et.  al., (1994)  bakteri Streptococcus sp.  berbentuk  bulat,  diamater sel  berukuran  0.5- 2.0  μm. Bakteri Strepto- coccus sp.  bersifat  non  motil,  tidak  mem- bentuk  spora,  Gram  positif,  fakultatif  an- aerob,  katalase  negatif.  Bakteri Strepto- coccus sp. tumbuh pada kisaran  suhu 25-45 ºC, optimum pada suhu 37ºC.
Uji  aktivitas  proteolitik  II  menun- jukkan bahwa aktivitas proteolitik isolat WK 28 ( Pediococcus sp.), WK 33 ( Lactobacillus sp.),  dan  WK  53  ( Streptococcus sp.)  terus meningkat  sampai  pada  hari  ke  tujuh  ber- dasarkan  diamater  zona  jernih  yang  diha- silkan.  Menurut  Yusmarini  dkk.  (2009), aktivitas  proteolitik  yang  terus  mengalami peningkatan  hal  tersebut  karena  bakteri mampu  tumbuh  dan  berkembangbiak.  Bak- teri  pada  fase  pertumbuhan  menghasilkan metabolit primer berupa enzim protease eks- traseluler,  semakin  besar  zona  jernih  yang dihasilkan  menunjukkan  semakin  besar  ke- mampuan  isolat  tersebut  menghasilkan  en- zim protease.
Tujuan  uji  aktivitas  proteolitik  bak- teri  asam  laktat  adalah  untuk  mengetahui aktivitas  enzim  protease  ekstraseluler  pada
105 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
bakteri.  Enzim  protease  ekstraseluler  secara alami diproduksi oleh mikroba untuk meng- hidrolisis  polipeptida  dalam  media  menjadi peptida  dan  asam  amino  (Wilson and Remigio,  2012).  Asam  amino  selanjutnya digunakan  bakteri  untuk  pertumbuhan  teru- tama senyawa nitrogen yang akan masuk ke dalam  sel  bakteri  (Setyati  dan  Subagiyo, 2012).
Senyawa  nitrogen  tidak  dapat  disin- tesis  oleh  bakteri  sehingga  membutuhkan dari  lingkungan  hidup  bakteri  (Benson, 2001).  Menurut  Pollack et  al. (2005), sumber senyawa nitrogen dipecah dari asam amino,  peptida,  pepton  dan  asam  nukleat. Senyawa  nitrogen  digunakan  bakteri  untuk memperbaiki sel yang rusak, nutrisi partum- buhan  bakteri,  dan  sintesis  DNA/RNA. Kemampuan  menghidrolisis  protein  sebagai salah satu kriteria seleksi bakteri probiotik.
Uji  aktivitas  amilolitik  bertujuan untuk  mengetahui  aktivitas  enzim  amilase ekstraseluler  pada  media  agar  dengan  1% amilum.  Kemampuan  isolat  dalam  mengha- silkan enzim  amilase ekstraseluler ditunjuk- kan  terbentuk  zona  jernih  pada  media  agar dengan  1%  amilum  (Sjofjan and Ardyati, 2011).  Hasil  uji  aktivitas  amilolitik  menun- jukkan bahwa isolat bakteri asam laktat WK 53  ( Streptococcus sp.)  yang  mempunyai aktivitas  amilolitik  dengan  menghasilkan
zona  jernih  di  sekitar  koloni.  Pengamatan zona  jernih  pada  media  agar  1%  amilum dengan  diteteskan  lugol  sehingga  terlihat zona  jernih  di  sekitar  koloni,  sedangkan daerah  lainnya  berwarna  biru  gelap.  Hal tersebut  karena  terjadi  ikatan  antara  gugus amilum dengan senyawa iodin/lugol (Frobisher, 1962).
Isolat  WK  53  ( Streptococcus sp.) mampu menghasilkan enzim amilase ekstraseluler.  Menurut  Benson  (2001), bakteri  menghasilkan  enzim  amilase  untuk menghidrolisis  amilum  menjadi  molekul maltosa,  glukosa,  dan  dekstrin.  Menurut Frazier and Westhof (1988), glukosa sebagai sumber  energi    untuk  pertumbuhan  bakteri. Isolat  WK  28  ( Pediococcus sp.)  dan  isolat WK  33  ( Lactobacillus sp.)  tidak  meng- hasilkan enzim amilase ektraseluler ditandai dengan tidak terbentuk zona jernih di sekitar koloni  pada  media strach agar.  Menurut Frazier and Westhof  (1988),  setiap  bakteri mempunyai  kemampuan  mensintesis  enzim di  dalam  sel,  tetapi  hanya  beberapa  bakteri yang mempunyai enzim ekstraseluler.
Uji aktivitas lipolitik bertujuan untuk mengetahui  aktivitas  enzim  lipase  ekstra- seluler  pada  isolat  bakteri  asam  laktat.  Uji aktivitas  lipolitik  pada  isolat  bakteri  asam laktat  WK  28  ( Pediococcus sp.),  WK  33 ( Lactobacillus sp.),  dan  WK  53  ( Strepto-
106 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
coccus sp.)  pada  media  MRS  dengan  pe- nambahan  2  ml  minyak  zaitun  mampu menghasilkan  zona  jernih.  Menurut  Telussa (2013),  enzim  lipase  akan  menghidrolisis minyak zaitun dan membentuk asam lemak. Enzim  lipase  menghidrolisis  asam  palmiat dalam  minyak  zaitun  menjadi  asam  lemak bebas berwarna kuning pada media.
Kemampuan  bakteri  menghidrolisis lemak  dengan  menghasilkan  enzim  lipase. Molekul lemak dihidrolisis menjadi molekul gliserol dan asam  lemak. Gliserol dan asam lemak  digunakan  bakteri  untuk  mensintesis lemak  pada  bakteri  dan  komponen  sel lainnya. Gliserol dan asam lemak teroksidasi menghasilkan  energi  dalam  kondisi  aerobik (Benson, 2001).
Isolat  bakteri  asam  laktat  WK  28 ( Pediococcus sp.) dan WK 33 ( Lactobacillus sp.)  diidentifikasi  memiliki  kemampuan dalam  menghidrolisis  protein  dan  lemak. Isolat  WK  53  ( Streptococcus sp.)  diiden- tifikasi  memiliki  kemampuan  dalam  meng- hidrolisis  protein,  amilum,  dan  lemak.  Se- hingga  dapat  digolongkan  sebagai  kandidat probiotik.  Menurut  Bairagi et  al. (2002), kriteria  bakteri  probiotik  antara  lain  mem- punyai  aktivitas  amilolitik,  selulolitik,  lipo- litik dan proteolitik.

## Kesimpulan dan Saran
Hasil seleksi bakteri asam laktat pro- teolitik  didapatkan  tiga  isolat  yaitu  WK  28, WK 33 dan WK 53. Hasil uji biokimia isolat WK  28  termasuk  ke  dalam  genus Pedio- coccus sp., isolat WK 33 termasuk ke dalam Lactobacillus sp.,  dan  isolat  WK  53  ter- masuk  ke  dalam  genus Streptococcus sp. WK  28  ( Pediococcus sp.)  dan  WK  33 ( Lactobacillus sp.)  mempunyai  aktivitas proteolitik  dan  lipolitik.  Isolat  WK  53 ( Streptococcus sp.)  mempunyai  aktivitas enzimatis  yaitu  aktivitas  proteolitik,  amilo- litik, dan lipolitik. Perlu dilakukan pengujian aktivitas  antagonistik  terhadap  bakteri  pato- gen,  pengujian  ketahanan  terhadap  paparan garam empedu dan beberapa uji lainnya un- tuk  memenuhi  kriteria  sebagai  bakteri  kan- didat probiotik.

## Daftar Pustaka
Bairagi, A., K.S. Ghosh, S. K. Sen and A. K. Ray.  2002.  Enzyme  Producing  Bac- terial Flora Isolated from Fish Diges- tive  Tracts.  Aquaculture  Internatio- nal, 10 : 109-121.
Benson.  2001.  Microbiological  Applica- tions.  Laboratory  Manual  in  General Microbiology. Eighth Edition.
McGraw-Hill  Science  Company  :
New York. pp. 72-175.
Chotimah, S.C. 2009. Peranan Streptococcus thermophillus dan Lactobacillus bul- garicus dalam  Proses  Pembuatan Yogurt. Jurnal Ilmu Peternakan. Vol. 4 (2) : 49.
107 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
Fossi,  B.T.,  F.  Tavea,  and  R.  Ndjouenkeu. 2005. Production and Partial Charac- terization Thermostable Amilase from  Ascomycetes  Yeast  Strain  Iso- lated  from  Starchy  Soils.  African Journal  of  Biotechnology,  4  (1)  : 14-18.
Frazier,  W.C.  and  D.C.  Westhoff.  1988. Food  Microbiology.  Fourth  Edition. McGraw-Hill : USA. pp. 11-80.
Frobisher, M. 1962. Fundamental of Micro- biology.  Seventh  Edition.  W.B. Saunders  :  USA.  pp.  99-106,  172- 177, 248-251.
Gismondo, M.R., L.Drago and A. Lombardi. 1999.  Review  of  Probiotics  Avai- lable to Modify Gastrointestinal  Flo- ra.  Internasional  Journal  of  Anti- microbial Agents, 12 : 287-292.
Hardiningsih,  R.,  R.N.R.  Napitupulu  dan  T.
Yulinery.  2006.  Isolasi  dan  Uji  Re- sistensi  Beberapa  Isolat Lactobacil- lus pada  pH  Rendah.  Biodiversitas,
7 (1) : 15-17.
Holt,  J.G.,  N.R.  Krieg,  P.H.A.  Sneath,  J.T. Staley, and S.T. Wiliams. 1994. Ber- gey’s Manual of Determinative Bac- teriology.  Williams  and  Wilkins  :
USA. pp. 530-566.
Jusadi,  D.,  E.  Gandara  dan  I.  Mokoginta. 2004. Pengaruh Penambahan Probio- tik Bacillus sp. pada Pakan Komersil terhadap  Konversi  Pakan  dan  Per- tumbuhan.  Jurnal  Akuakultur  Indo- nesia, 3 (1) : 15-18.
Khunajakr,  N.,  A.  Wongwicham,  D.  Moon- mangmee  and  S.  Tantipaiboonvut. 2008. Screening and Identification of Lactic Acid Bacteria Producing Anti- microbial  Compounds  From  Pig Gastrointestinal  Tracts.  KMITL  Sci. Tech. J., 8 (1) : 8-17.
Lenkey,  H.A.W.  dan  Soeharsono.  2010. Probiotik  sebagai  Makanan  Fung-
sional. Probiotik. Widya Padjadjaran: Bandung. hal. 66-106.
Melliawati,  R.,  A.C.  Djohan,  and  Yopi. 2015.  Seleksi  Bakteri  Asam  Laktat sebagai  Penghasil  Enzim  Protease. Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon, 1 (2) : 184-188.
Nespolo,  C.R.  and  A.  Brandelli.  2010. Production of Bacteriocin-Like Subs- tances  by  Lactic  Acid  Bacteria  Iso- lated  from  Regional  Ovine  Cheese. Brazilian  Journal  of  Microbiology, 41 : 1009-1018.
Pollack,  R.A.,  L.  Findlay,  W.  Mondschein and R.R. Modesto. 2005. Laboratory Exercises  in  Microbiology.  Second Edition.  John  Wiley  and  Sons,  Inc  :
New Zaeland. pp. 44-45.
Rohy,  G.S.,  B.S.  Rahardja  dan  Agustono. 2014.  Jumlah  Total  Bakteri  dalam Saluran  Pencernaan  Ikan  Gurami ( Osphronemus gouramy ) dengan Pemberian  Beberapa  Pakan  Komer- sial  yang  Berbeda.  Jurnal  Ilmiah Perikanan  dan  Kelautan,  6  (1)  :  21- 24.
Salminen,  S.,  A.  Ouwehand,  Y.  Benno  and Y.K.  Lee.  1999.  Probiotics.  Trends in Food Science and Technology, 10 : 107-110.
Setyati,  W.A.  dan  Subagiyo.  2012.  Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Enzim Ekstraseluler (Proteolitik, Amilolitik, Lipolitik  dan  Selulolitik)  yang  Bera- sal dari Sedimen Kawasan Manggro- ve. Ilmu  Kelautan, 17  (3) :        164- 168.
Sjofjan,  O.  and  T.  Ardyati.  2011.  Extra- cellular Amylase Activity of Amylo- lytic  Bacteria  Isolated  from  Quail’s ( Coturnix  japonica )  Intestinal  Tract in Corn  Flour Medium.  International Journal  of  Poultry  Science,  10  (5)  : 411-415.
108 | J I P K   V o l . 8   N o . 2 D i t e r i m a / s u b m i t t e d : 2 9   j a n u a r i   2 0 1 6 D i s e t u j u i / a c c e p t e d : 2 1   J u n i   2 0 1 6
Sumarsih,  S.,  B.  Sulistiyanto,  H.S.  Adi  dan C.S.  Utama.  2010.  Pengaruh  Aras Starter Lactobacillus sp.  terhadap Performa  Mikrobiologi  Silase  Ikan Dilihat  dari  Total  Bakteri,  Bakteri Asam Laktat dan Fungi. Jurnal Kese- hatan, 3 (1) : 43-50.
Suryani,  Y.,  Astuti,  B.  Oktavia  dan  S. Umniyati. 2010. Isolasi dan Karakte- risasi Bakteri Asam Laktat dari Lim- bah  Kotoran  Ayam  sebagai  Agensi Probiotikdan  Enzim  Kolesterol  Re- duktase. Prosiding Seminar Nasional Biologi.  Universitas  Negeri  Yogya- karta. hal. 138-147.
Svetlitshnyl,  V.,  F.  Rainey,  and  J.  Wiegel. 1996.  Thermosyntropha  Lipolytica Grn.  Nov.,  sp.  Nov.,  a  Lipolytic, Anaerobic,  Alkalitolerant,  Thermo- philic  Bacterium  Utilizing  Short  and Long Chain  Fatty  Acidin Syntrophic Coculture  with  a  Methanogenic  Ar- chaeum. International Journal of Sys- tematic Bacteriology, 46: 1131-1137.
Telussa,  I.  2013.  Isolasi  Bakteri  Penghasil Enzim  Lipase  dari Coco  Butter- Subtitute dan  Karakterisasi  Lipase- nya.  Prosiding  FMIPA  Universitas Pattimura. 10 hal.
Triyanto,  A.  Isnansetyo,  I.D.  Prijambada,  J. Widada  dan  A.  Tarmiawati.  2009. Isolasi,  Karakterisasi  dan  Uji  Infeksi Bakteri  Proteolitik  dari  Lumpur  Ka- wasan  Hutan  Bakau.  Jurnal  Peri- kanan ( J. Fish. Sci ), 11 (1): 13-18.
Wilson,  P.  and  Z.  Remigio.  2012.  Produc- tion and Characterisation of Protease Enzyme Produced by a Novel Mode- rate  Thermophilic  Bacterium  (EP- 1001) Isolated  from an  Alkaline Hot Spring,  Zimbabwe.  African  Journal of  Microbiology  Research,  6  (27)  : 5542-5551.
Yelnetty,  A.,  H.  Purnomo,  Purwadi,  A. Mirah.  2014.  Biochemical  Charac- teristics of Lactic Acid Bacteria with Proteolytic  Activity  and  Capability as  Starter  Culture  Isolated  from Spontaneous  Fermented  Local  Goat Milk.  Journal  of  Natural  Sciences Research, 4 (10) : 137-146.
Yusmarini,  R.  Indrati,  T.  Utami  dan  Y.
Marsono.  2009.  Isolasi  dan  Identi- fikasi  Bakteri  Asam  Laktat  Proteo- litik  dari  Susu  Kedelai  yang  Terfer- mentasi Spontan. Jurnal Natur
Indonesia, 12 (1) : 28-33.