## MANFISH JOURNAL
Marine, Environment and Fisheries e-ISSN: 2721-2939, p-ISSN: 2721-2815 Vol. 4, No. 1, (2023), Hal. 50-71. https://ejurnal.polnep.ac.id/index.php/manfish/about

## Ekstraksi Enzimatik Kitin dan Kitosandari Limbah Udang
Kristina Novalina Nainggolan 1
1 Program Studi Teknologi Pengolahan Hasil Perikanan, Jurusan Ilmu Kelautan dan Perikanan, Politeknik Negeri Pontianak, Indonesia *Email : nainggolankristina2@gmail.com

## ARTICLE INFO ABSTRACT
Article history: Received : February 22, 2023 Revised : March 24, 2023 Accepted : April 16, 2023 Chitin is a biopolymer that compiles the shells of insects and crustaceans and the cell walls of fungi, diatoms, bacteria, and algae, while chitosan is chitin derivate. Both of the products have essential roles in various industrial fields. Chitin and chitosan are often produced chemically from shrimp waste (head and the shell). However, chemical residues and poor product characteristics are the weaknesses of this method. Another alternative method is to extract the products enzymatically. This review examines the effectiveness of chitin and  chitosan  extraction  from  shrimp  waste  based  on  research  results  of various  related  scientific  articles.  So  far,  microbial  strains  or  enzyme  and fermentation  conditions  that  can  extract  shrimp  waste  into  chitin  with reasonable effectiveness have been found (demineralization value > 90% and deproteination  >  80%).  Deacetylation  of  shrimp  shell  chitin  with  A.  niger capable of producing chitosan with a degree of deacetylation 86%. Moreover, the  by-products  of  enzymatic  extraction  are  rich  in  high-quality  protein, carotenoids (especially astaxanthin), and minerals (especially calcium). Keywords:
Chitin,  Chitosan,  Extraction, Enzymatic, Shrimp shell

## ABSTRAK
Kata Kunci: Kitin, Kitosan, Ekstraksi Enzimatik, Kulit udang Kitin  merupakan  salah  satu  biopolimer  penyusun  cangkang  serangga  dan krustasea, serta dinding sel fungi, diatom, bakteri, dan alga, sedangkan kitosan merupakan turunan kitin. Kedua produk ini punya peran penting di berbagai bidang  industri.  Kitin  dan  kitosan  sering  diproduksi  secara  kimiawi  dari limbah  (kepala  dan  kulit)  udang.  Residu  bahan  kimia  dan  karakter  produk yang  kurang  baik  menjadi  kelemahan  dari  metode  ini.  Metode  alternatif lainnya  adalah  dengan  mengekstraksi  produk  secara  enzimatik.  Review  ini bertujuan mengkaji efektivitas ekstraksi kitin dan kitosan dari limbah udang berdasarkan  hasil  riset  dari  berbagai  artikel  ilmiah  terkait.  Sejauh  ini  telah ditemukan strain mikroba atau enzim, serta kondisi fermentasi yang mampu mengekstraksi  limbah  udang  menjadi  kitin  dengan  tingkat  efektivitas  yang baik (nilai demineralisasi >90% dan deproteinasi >80%). Deasetilasi kitin dari kulit  udang  dengan A.  niger mampu  menghasilkan  kitosan  dengan  derajat deasetilasi  86%.  Selain  itu,  hasil  samping  ekstraksi  enzimatik  kaya  akan protein  bermutu  tinggi,  karotenoid  (khususnya  astaxanthin),  dan  mineral (khususnya kalsium).

## 1. PENDAHULUAN
Kitin,  salah  satu  biopolimer  terbanyak  di alam  selain  selulosa,  merupakan  polisakarida yang mengandung nitrogen dengan struktur kimia β-1,4-linked N-acetylglucosamine. Kitin ditemukan  sebagai  bahan  penyusun  cangkang atau  rangka  luar  serangga  dan  krustasea,  serta penyusun  dinding  sel  fungi,  diatom,  bakteri  dan alga (Bastiaens et al ., 2019). Karakter kitin yang kaku  dan  keras,  serta  keberadaannya  sebagai bahan  penyusun  rangka  luar  atau  dinding  sel
beberapa  jenis  makhluk  hidup  diduga  terkait peran kitin sebagai templat untuk biomineralisasi kalsium  dan  silika,  dimana  fase  kalsifikasi  dan silikafikasi  berpusat  pada  area  keberadaan  kitin (Ehrlich, 2010). Produk turunan kitin yang punya peran  penting  di  berbagai  industri  (kesehatan, pangan, kosmetik, agrokimia, pengolahan air, dan lainnya) adalah kitosan, yaitu senyawa kitin yang terdeasetilasi sehingga bersifat lebih mudah larut dalam air (Bastiaens et al ., 2019).
Secara  umum  ekstraksi  kitin  dan  produk turunannya  di  industri  menggunakan  metode
kimiawi.  Proses  ekstraksi  kitin  dari  kulit  udang dilakukan menggunakan larutan asam kuat pekat (biasanya  HCl)  di  suhu  ruang  untuk menghilangkan mineral, diikuti dengan penggunaan basa kuat (umumnya NaOH) di suhu sekitar 100°C untuk melepas protein dan pigmen warna. Hasilnya diperoleh serbuk kitin berwarna putih.  Kitosan  diperoleh  melalui  ekstraksi  lebih lanjut  α-kitin  dengan  larutan  alkali  (umumnya NaOH berkonsentrasi 40–50%) pada suhu proses 120–150°C sehingga terjadi deasetilasi (pemutusan gugus asetil) pada kitin (Kurita, 2006; Younes & Rinaudo, 2015).
Kelemahan  dari  ekstraksi  secara  kimiawi adalah polusi dari residu bahan kimia (khususnya residu  asam-basa  kuat),  kebutuhan  energi  yang cukup besar dari penggunaan suhu tinggi, adanya efek  negatif  terhadap  karakter  produk  akibat reaksi  dari  penggunaan  asam-basa  kuat,  serta kesulitan  mengambil  senyawa-senyawa  hasil samping  lainnya  (protein,  mineral,  lipid,  atau senyawa  pigmen)  saat  proses  ekstraksi  (Duan et al ., 2012; Kaur & Dhillon, 2015).
Penelitian  menunjukkan  ekstraksi  kitin  dan produk turunannya secara enzimatik menghasilkan  produk  yang  lebih  baik  dan terkontrol  (Hongkulsup et  al .,  2016;  Rao et  al ., 2000).  Selain  itu,  ekstraksi  secara  enzimatik bersifat  ramah  lingkungan,  menggunakan  suhu proses yang relatif rendah (umumnya mendekati suhu  ruang),  serta  dimungkinkan  mengekstraksi senyawa  lain  yang  ada  di  substrat  (Cahú et  al ., 2012;  Kaur  &  Dhillon,  2015;  Rao et  al .,  2000). Meski di sisi lain, waktu proses yang relatif lebih panjang  dibanding  ekstraksi  kimiawi  dan  biaya produksi  enzim  yang  cukup  tinggi  menjadi kelemahan  dari  ekstraksi  enzimatik  (Kaczmarek et  al .,  2019).  Salah  satu  solusi  yang  dilakukan untuk  menekan  biaya  produksi  enzim  adalah penggunaan enzim dari limbah ikan atau udang, serta  dari  bakteri  atau  mikroba  lain  yang  ada  di
alam  (Kaczmarek et  al .,  2019;  Younes et  al ., 2014).
Limbah udang (kepala dan kulit) merupakan salah  satu  sumber  bahan  baku  penghasil  kitin yang mudah diperoleh dan berlimpah ketersediaannya di alam. Porsi tubuh udang yang tidak dapat dimakan (termasuk kepala, kulit, dan ekor)  dapat  mencapai  46%  (Arancibia et  al ., 2014), dengan nilai ekonomi yang sangat rendah. Kandungan  kitin  pada  kulit  udang  berkisar  15- 40%.  Selain  itu  kulit  udang  juga  mengandung protein  sebesar  20-40%  dan  mineral  30-60% (Bastiaens et  al .,  2019;  Kurita,  2006).  Adapun jenis  kitin  penyusun  kulit  udang  adalah  α-kitin, yaitu  kitin  dengan  struktur  kristalinitas  yang sangat  kuat  dikarenakan  adanya  dua  ikatan intramolekul  dan  antar(inter)molekul  yang tersusun  secara  anti-pararel  di  tiap  unit  sel  kitin yang  memungkinkan  terbentuknya  ikatan hidrogen yang maksimum.
Hal  ini  membuat  α-kitin  memiliki  karakter bahan yang lebih kaku dan stabil  dibanding jenis kitin lainnya, bersifat tidak reaktif, dan tidak larut air (Bastiaens et al ., 2019; Kurita, 2006; Minke & Blackwell,  1978).  Struktur  kristal  tersebut membuat  perlu  ada  perlakuan  khusus  untuk mengekstrak  kitin  dari  kulit  udang.  Namun, apakah  metode  enzimatik  dapat  secara  efektif mengekstrak kitin dan kitosan dari limbah udang. Review ini berfokus mengkaji efektivitas ekstraksi kitin  dan  kitosan  dari  limbah  udang  secara enzimatik  berdasarkan  hasil  riset  dari  berbagai artikel ilmiah terkait.

## 2. TINJAUAN PUSTAKA: KULIT UDANG, KITIN, DAN KITOSAN

## 2.1 Struktur dan Kandungan Kulit Udang
Udang  merupakan  bagian  dari  filum Arthropoda, dengan subfilum Crustasea.
Kelompok udang dengan nilai ekonomis penting umumnya  termasuk  dalam  keluarga  Penaeidae, yang merupakan turunan dari kelas Malacostraca, ordo  Decapoda,  sub-ordo  Dendrobranchiata  (De Grave et  al .,  2009;  Kannupandi et  al .,  2003). Secara  morfologi,  tubuh  udang  berbentuk memanjang yang terdiri atas kepala (toraks), perut dengan  enam  ruas,  dan  ekor.  Segmen  perut terakhir  disebut  telson.  Toraks  memiliki  tulang belakang  yang  disebut  mimbar,  sepasang  mata, dua pasang antena, tiga pasang rahang atas untuk makan,  dan  lima  pasang  kaki  untuk  berjalan. Setiap  segmen  perut  kecuali  telson  memiliki pleopod,  yaitu  sepasang  sirip  yang  berfungsi sebagai kaki renang (Evans, n.d.; Kannupandi et
al .,  2003).  Anatomi  tubuh  udang  dapat  dilihat pada Gambar 1.
Bagian paling luar tubuh udang dilapisi oleh kulit yang keras yang disebut kutikula. Susunan kutikula secara berurutan dari bagian paling luar ke  dalam  adalah  epikutikula,  eksokutikula, endokutikula,  dan  lapisan  membran.  Kutikula Crustasea  disusun  oleh  60%  senyawa  anorganik dan  40%  senyawa  organik.  Senyawa  anorganik tersebut  adalah  kalsium,  klorida,  tembaga, magnesium, mangan, fosfor, kalium, dan sulfur. Sedangkan  senyawa  organik  penyusun  kutikula Crustasea  adalah  lipid,  glikoprotein,  protein, glikosaminoglikan, mukopolisakarida, karbohidrat, dan kitin (Promwikorn et al ., 2005; Roer & Dillaman, 1984).
Gambar 2. Ilustrasi matriks protein-kitin-mineral (Chitosanlab, n.d.; Poulicek et al ., 1986)
Gambar 3. Susunan kutikula kulit udang (Hülsey, 2018)
Epikutikula  merupakan  lapisan  tipis  yang bersifat kedap air oleh adanya lapisan lipoprotein. Fungsi  utama  epikutikula  sebagai  pelindung tubuh  Crustasea  dari  dunia  luar,  diantaranya mencegah penguapan air dan penghalang mekanis dari serangan mikroba (Grunenfelder et al ., 2014; Roer  &  Dillaman,  1984).  Tidak  seperti  lapisan kutikula  lainnya,  epikutikula  mengandung  lipid serta  tidak  mengandung  serat  kolagen  dan  kitin (Promwikorn et  al .,  2005).  Eksokutikula  dan endokutikula  sama-sama  disusun  oleh  molekul kitin  terkristalisasi  yang  terbungkus  protein membentuk agregat nanofibril kitin-protein yang matriksnya diisi oleh mineral. Molekul nanofibril ini  tersusun  dalam  bentuk  lembaran-lembaran planar  yang  terangkai  menyerupai  struktur Bouligand atau kayu lapis terpilin (Fabritius et al ., 2011;  Grunenfelder et  al .,  2014).  Poulicek et  al menggambarkan  struktur  protein-kitin-mineral tersebut  menyerupai  roti  lapis  ( sandwich )  (lihat Gambar  2),  hal  ini  khususnya  untuk  cangkang moluska  (Poulicek et  al .,  1986). Lapisan membran  terkadang  dikenal  dengan  istilah hipodermis atau epitelium karena terletak diantara endokutikula dan epidermis. Lapisan kutikula ini juga kaya akan serat kolagen, protein, karbohidrat dan kalsium (Promwikorn et al ., 2005). Susunan kutikula kulit udang terilustrasikan pada Gambar 3.
Kutikula  udang  secara  periodik  akan terkelupas dan berganti dengan kulit baru setiap kali  ukuran  tubuh  udang  bertumbuh  melebihi ukuran kulitnya. Proses tersebut disebut molting. Kutikula mengalami perubahan komposisi kimia seiring  dengan  tahapan  molting.  Siklus  molting terdiri  dari  empat  fase,  yaitu: premolt , molt (ecdysis),  postmolt,  intermolt .  Di  fase premolt terjadi  pembentukan  dua  lapisan  kutikula  baru, yaitu epikutikula dan eksokutikula. Kutikula baru yang terbentuk masih sangat lembut karena tidak mengandung  kalsium,  namun  sebagian  mineral dari  kutikula  lama  diabsorbsi  kembali  untuk kepentingan  pembentukan  kutikula  baru.  Fase selanjutnya  adalah  fase molt ,  dimana  terjadi pelepasan  kulit  udang  (kutikula)  lama.  Fase tersebut diikuti dengan fase postmolt , yang mana lapisan kutikula lainnya, endokutikula dan lapisan membran, mulai terbentuk diikuti dengan proses kalsifikasi pada semua lapisan kutikula sehingga kutikula mulai mengeras oleh adanya pertumbuhan jaringan kalsium karbonat (CaCO 3 ). Kemudian,  di  fase intermolt kutikula  sudah sepenuhnya terkalsifikasi. Kebanyakan Decapoda dewasa  berada  di  fase intermolt (Dang et  al ., 2018; Promwikorn et al ., 2005; Roer & Dillaman, 1984).  Perubahan  kulit  udang  selama  siklus molting terilustrasikan pada Gambar 4.
Gambar 4. Ilustrasi perubahan kutikula udang selama siklus molting (Roer & Dillaman, 1984)

## 2.2 Sejarah Kitin dan Kitosan
Penyelidikan  tentang  kitin  telah  dimulai lebih dari dua ratus tahun lalu dimulai dari catatan Charles Hatchett, ahli kimia asal Inggris, di tahun 1799 mengenai suatu bahan yang dihasilkan dari proses  dekalsifikasi  cangkang  kepiting,  lobster, udang prawn ,  dan  udang  karang  ( crayfish ) menggunakan  sejumlah  asam  mineral.  Hatchett melaporkan  material  tersebut  tidak  bereaksi (resistan)  terhadap  senyawa  kimia  biasa, berwarna  putih  kekuningan,  dan  seperti  tulang
rawan  (Crini,  2019).  Di  tahun  1811,  Henri Braconnot, ahli kimia asal Perancis, mengekstrak sejumlah  fungi  menggunakan  larutan  alkali hangat  dan  memperoleh  fraksi  bahan  yang bersifat  tidak  larut  alkali  serta  mengandung nitrogen.  Braconnot  menamai  bahan  tersebut fongine (Crini,  2019;  Muzzarelli et  al .,  2012). Namun istilah kitin (tepatnya chitine ) disebutkan pertama  kali  oleh  Auguste  Odier  melalui publikasinya  yang  terbit  di  tahun  1823,  guna merujuk pada fraksi bahan tidak larut alkali yang diisolasi  dari  kumbang cockchafer melalui
Tabel 1. Perbedaan α-, β-, dan γ-kitin
Jenis Kitin dan Sumber Struktur Kristal α-kitin
§ Paling  berlimpah  di  alam (Saito et al ., 1995).
§ Sumber: dinding sel fungi, tendon kepiting dan
lobster, kulit/cangkang udang  dan  kepiting  (Saito et  al .,  1995),  kutikula serangga  (Saito et  al ., 2000),  tombak  ( harpoon ) siput  kerucut  (Rinaudo, 2006).
§ Setiap  unit  selnya  memiliki  dua  rantai  yang  rantai-rantainya dikepak secara berlawanan arah (anti-paralel) (Saito et al ., 1995) § Memiliki  struktur  kristal  paling  stabil  karena  adanya  ikatan hidrogen intra- dan intermolekul yang tersusun anti-paralel (Jang et al ., 2004).
§ Ikatan hidrogen di α-kitin lebih pendek dibanding γ-kitin, yang membuat ikatan intermolekuler α-kitin lebih kuat dibanding β- dan γ-kitin (Kaya et al ., 2017).
§ Tiap  unit  sel  kitin  memiliki  dua  ikatan  hidrogen  intramolekul yang dihubungkan oleh C(3)―OH···O―C(5) dan C(6)―OH···O═C; dan dua ikatan hidrogen antarmolekul yang dihubungkan melalui NH···O═C dan dan C(6)―OH···OH―C(6)  (Kameda et  al .,  2005;  Minke  & Blackwell, 1978) β-kitin
§ Paling  sedikit  di  alam (Saito et al ., 1995).
§ Ditemukan pada cangkang dalam  cumi  ( squid  pens ),
tabung  pogonophora  dan vestimentifera (cacing tabung raksasa), seta ( chaetae )  A phrodite ,  duri ( spine )  beberapa  diatom (Saito et al ., 1995).
§ Kristal  β-kitin  anhidrat  memiliki  sistem  monoklinik  (padatan kristal dengan 3 sumbu, dua pasang diantaranya tegak lurus, satu pasang lainnya tidak seperti pada prisma jajaran genjang) (Saito et al ., 1995).
§ Tiap  unit  selnya  mengandung  satu  rantai  yang  kristal mikrofibrilnya tersusun sejajar (paralel) (Saito et al ., 1995)
§ Memiliki kestabilan struktur kristal paling rendah dibanding jenis kitin lainnya karena hanya memiliki ikatan hidrogen intramolekul (Jang et  al .,  2004),  yang  dihubungkan  oleh  N―H···O═C  grup amida (Gardner & Blackwell, 1975; Jang et al ., 2004).
§ Penelitian lain menyatakan β-kitin anhidrat memiliki satu ikatan hidrogen intramolekul yang terhubung melalui O(3)―H···O(5), dan  dua  ikatan  hidrogen  antarmolekul  yang  terhubung  melalui O(6)―H···O(7) dan N(2)―H···O(7) (Sawada et al ., 2012).
γ-kitin
§ Ditemukan  pada  serat kepompong kumbang Ptinus ,  perut Loligo (Jang et al ., 2004), dan kepompong ngengat ( Orgyia  dubia )  (Kaya et al ., 2017).
§ Ada yang menganggap sebagai bentuk lain dari α-kitin (Rinaudo,
2006; Zargar et al ., 2015).
§ Rantai-rantainya  tersusun  dengan  pola  dua  rantai  tersusun sejajar,  dan  satu  rantai  tersusun  berlawanan  arah  (Jang et  al .,
2004).
§ Kestabilan  struktur  kristalnya  lebih  rendah  dibanding  α-kitin, namun lebih kuat dibanding β-kitin (Jang et al ., 2004).
§ Memiliki  ikatan  hidrogen  intramolekul  yang  terbentuk  melalui CH 2 OH---OH  dan  ikatan  hidrogen  antarmolekul  melalui CH 2 OH--- CH 2 OH (Kaya et al ., 2017).
perlakuan  dengan  larutan  kalium  kaustik  panas (Crini, 2019).
Penelitian tentang kitin terus bergulir, hingga di  tahun  1956,  Charles  Rouget  melaporkan tentang  bahan  yang  dia  beri  nama  ” chitine modifée” atau  kitin  termodifikasi  yang  bersifat larut dalam larutan encer asam organik, berbeda dengan kitin yang belum termodifikasi. Bahan ini juga  menghasilkan  warna  yang  berbeda  dengan kitin ketika dilarutkan dalam larutan iodium asam. Fraksi  bahan  tersebut  diperoleh  melalui  proses refluksi dengan mendidihkan kitin dalam larutan kalium  hidroksida  (KOH)  pekat.  Bahan  tersebut kemudian dinamakan kitosan oleh Hoppe-Seyler di tahun 1894. Kitosan merupakan turunan utama dari  kitin,  dan  penemuan  kitosan  membuka peluang  pemanfaatan  kitin  lebih  lanjut  (Crini, 2019).
Penelitian tentang kitin semakin berkembang setelah  semakin  jelas  struktur  polisakaridanya, yang  berbeda  dengan  selulosa,  yang  terungkap menggunakan  analisa  X-ray  (sinar-X).  Di  tahun 1930an, mulai muncul paten berbahan dasar kitin dan  kitosan,  diantaranya  film  dan  serat  dari
kitosan  (dipatenkan  oleh  George  W.  Rigby  di tahun  1936-1937),  pemanfaatan  kitin-kitosan untuk  industri  kertas,  tekstil,  fotografi,  dan sebagai perekat (Crini, 2019).

## 2.3 Jenis Kitin
Di  alam,  kitin  ditemui  dalam  tiga  bentuk polimorfik kristal, yaitu α, β, dan γ (Jang et al ., 2004). Perbedaan struktur kristal tersebut terletak pada  pola  pengepakan  dan  polaritas  rantai  yang berdekatan.  Sumber  kitin  diperoleh  akan mempengaruhi  jenis  kitin  yang  dihasilkan menurut  struktur  kristalnya  (Jang et  al .,  2004; Minke  &  Blackwell,  1978).  Perbedaan  struktur kristal tersebut biasanya diidentifikasi menggunakan  kristalografi  sinar-X  (Blackwell, 1982), yang diperjelas karakternya menggunakan Spektroskopi  Inframerah  Transformasi  Fourier ( Fourier Transform Infrared S pectroscopy /FTIR) dan  NMR  ( Nuclear  Magnetic  Resonance ) spektroskopi  serta  metode  lainnya  (Fernando et al ., 2021; Jang et al ., 2004).
Gambar 5. Ilustrasi orientasi rantai (gambar atas) dan pola ikatan hidrogen (gambar bawah) pada α-, β-, dan γ-kitin (Fernando et al ., 2021). Arti simbol gambar terjabar pada kotak paling bawah
Kestabilan  struktur  kristal  tiap  jenis  kitin ditentukan  oleh  ikatan  hidrogen  intra-  dan antarmolekul  pada  lembaran  sel  kitin  yang umumnya  dihubungkan  melalui  grup  amida  dan karbonil (Fernando et al ., 2021). Perbedaan α-, β- , dan γ-kitin terjabarkan pada Tabel 1. Sedangkan orientasi rantai dan pola ikatan hidrogen pada α-, β-, dan γ-kitin terilustrasikan pada Gambar 5.

## 2.4 Struktur Kitin dan Kitosan
Kitin  merupakan  polisakarida  yang  terdiri dari rangkaian residu (1→4) -linked -2- acetamido - 2- deoxy - β - D - glucopyranose (Zargar et al ., 2015). Nama tersebut menunjukkan bahwa kitin disusun oleh  rangkaian  unit  D-glukopiranosa,  yaitu enansiomer D-glukosa berbentuk cincin piranosa ( pyranose )  dengan  enam  atom  penyusun  utama (satu atom Oksigen dan lima atom Carbon), yang pada atom karbon nomor dua/C(2) terikat dengan grup  asetamida  ( acetamide )  menggantikan  grup hidroksil (OH) pada glukosa secara umum. Unit- unit glukosamin tersebut terikat satu dengan yang lainnya di atom C(1) dan C(4) melalui ikatan β-
glukosa,  yaitu  bentuk  ikatan  yang  sama  dengan unit glukosa penyusun selulosa.
Grup  asetamida  (CH 3 CONH 2 ) merupakan senyawa amida sederhana yang berasal dari asam asetat  (CH 3 COOH).  Hal  tersebut  membuat struktur  asetamida  menyerupai  asam  asetat, namun  gugus  hidroksil  (‒OH)  pada  asam  asetat tergantikan  dengan  gugus  amina  (‒NH 2 )  di asetamida.  Itu  sebabnya  unit  glukosa  penyusun kitin  disebut  juga  N-asetilglukosamin  ( N - acetyl - D - glucosamine , GlcNAc).
Secara struktur, molekul kitin serupa dengan molekul  selulosa,  namun  atom  C(2)  pada  unit selulosa  berikatan  dengan  hidroksil,  sedangkan pada kitin berikatan dengan asetamida (Jang et al ., 2004;  Zargar et  al .,  2015).  Perbedaan  N- asetilglukosamin  (monomer  pada  kitin)  dan glukosa  (monomer  pada  selulosa)  dapat  dilihat pada  Gambar  6.  Kitosan  (GlcN, Glucosamine ) merupakan polimer turunan kitin dengan struktur kimia  yang  serupa,  hanya  saja  mayoritas  residu glukopiranosa-nya  dalam  bentuk  terdeasetilasi (grup  amida  pada  C(2)  glukosamin  tidak  terikat dengan  grup  asetil  atau  tidak  dalam  bentuk
Gambar 6. Struktur N-asetilglukosamin dan glukosa
Gambar 7. Struktur Kitin dan Kitosan (Zargar et al ., 2015)
asetamida). Perlu diketahui, sangat jarang ditemui kitin yang keseluruhan molekulnya dalam bentuk N-asetilglukosamin,  serta  kitosan  yang  semua molekulnya merupakan glukosamin. Selain itu, di alam  kitin  selalu  terikat  dengan  senyawa  lain, seperti polisakarida, protein, atau mineral (Zargar et  al .,  2015).  Suatu  polimer  glukosamin dinyatakan sebagai kitin apabila lebih dari lebih dari  50%  molekulnya  dalam  bentuk  N- asetilglukosamin, namun jika lebih dari setengah molekul  glukosamin  terdeasetilasi  maka  disebut kitosan  (Kasaai,  2009;  Morin-Crini et  al .,  2019; Zargar et  al .,  2015).  Struktur  kitin  dan  kitosan dapat dilihat pada Gambar 7.

## 2.5 Karakteristik Kitin dan Kitosan
Perbedaan  struktur  kitin  dan  kitosan menghasilkan  perbedaaan  karakter  pada  kedua biopolimer  tersebut.  Derajat  asetilasi  ( degree  of acetylation /DA) pada kitin atau derajat deasetilasi ( degree  of  deacetylation /DD)  pada  kitosan merupakan  salah  satu  karakteristik  fisikokimia penting  yang  sangat  mempengaruhi  sifat  fisik, kimia, dan biologi dari kitin dan kitosan (Chatelet et al ., 2001; Kasaai, 2009; Philibert et al ., 2017). Sifat  kimia  tersebut  meliputi:  kelarutan ( solubility ),  fleksibilitas,  konformasi  polimer, viskositas,  kristalinitas,  luas  permukaan  yang tinggi  ( high  surface  area ),  porositas,  kekuatan tarik ( tensile strength ), konduktivitas, fotoluminesensi. Sedangkan sifat biologi meliputi:  biodegradabilitas,  biokompatabilitas, mukoadhesif,  hemostatik,  analgesik,  penguat adsorpsi  ( adsorption  enhancer ),  antimikroba, antikolesterolemia,  dan  antioksidan  (Philibert et al ., 2017).
Derajat asetilasi (DA) menunjukkan persentase  N-asetilglukosamin  (GlcNAc)  pada biopolimer  kitin  (Chatelet et  al .,  2001).  Derajat deasetilasi  (DD)  menunjukkan  hal  sebaliknya, yaitu  proporsi  glukosamin  (GlcN)  pada biopolimer  kitosan.  Semakin  tinggi  DA  atau semakin  rendah  DD,  maka  akan  semakin  stabil
biopolimer tersebut atau dengan kata lain semakin sulit  bereaksi  dengan  senyawa  lain,  begitu  pula sebaliknya.  Itu  sebabnya  kitosan  lebih  reaktif dibanding  kitin  karena  kitosan  memiliki  DD diatas  50%,  sedangkan  DD  kitin  dibawah  50%. Kitosan  dianggap  memiliki  DD  rendah  jika memiliki persentase glukosamin (GLcN) berkisar 55–70%, DD sedang jika GLcN berkisar 70–85%, DD  tinggi  jika  GLcN  berkisar  85–95%,  dan sangat tinggi jika GLcN berkisar 95–100% (He et al ., 2016; Rkhaila et al ., 2021).
Analisa DA atau DD kitin atau kitosan dapat dilakukan  menggunakan  tiga  kelompok  besar metode, yaitu spektroskopi (H NMR, C NMR, N NMR, IR, near-IR, dan UV); secara konvensional (berbagai prosedur menggunakan titrasi koloidal, titrasi  konduktometri,  titrasi  potensiometri,  and uji  ninhidrin);  dan  secara  destruktif  (analisis unsur,  hidrolisis  dengan  asam  atau  enzim  yang diikuti oleh kolorimetri atau analisis HPLC, dan analisis termal menggunakan DSC). Waktu yang dibutuhkan untuk pengukuran DA menggunakan kelompok  metode  konvensional  dan  destruktif lebih lama dibandingkan menggunakan kelompok spektroskopi.  Diantara  semua,  H  NMR  dan  UV spektrometri dianggap paling cocok untuk analisa DA atau DD secara kuantitatif. H NMR mampu menghasilkan  data  yang  akurat  dengan  tingkat variasi  hasil  yang  rendah,  sedangkan  UV spektrometri  dapat  menganalisa  sampel  tanpa terpengaruh oleh adanya kontaminasi protein dan kelembaban  (kadar  air)  pada  sampel.  Pada beberapa  metode  lain,  adanya  unsur-unsur  lain ( impurities )  dalam  sampel  dapat  menciptakan gangguan  dan  memberikan  variasi  yang  besar pada hasil percobaan. Hal yang perlu diperhatikan pada  analisa  DA  atau  DD  secara  kuantitatif adalah: waktu pengukuran, ketepatan metode, dan keakuratan hasil (Kasaai, 2009).
Pada  kondisi  asam  (pH  3–6)  gugus  amino pada  kitosan  akan  terprotonasi  (pada  pH  3  akan sepenuhnya  terprotonasi;  pKa  6,3),  yang membuat rantai polimer, khususnya gugus amina, bermuatan  positif  (Gambar  8).  Kondisi  tersebut
Gambar 8. Protonasi dan deprotonasi gugus amino kitosan yang diinduksi oleh kondisi asam dan basa (Sampath et al ., 2017)
memungkinkan  kitosan  membentuk  kompleks dengan  molekul-molekul  bermuatan  negatif, seperti  molekul  sulfat,  fosfat,  polimer  anionik, polisakarida,  protein,  pewarna,  lipid,  enzim,  sel
Tabel 2. Karakter umum kitin dan kitosan
Parameter Kitin Kitosan Derajat Asetilasi (DA) - DA  di  atas  50%  (Kasaai,  2009; Morin-Crini et al ., 2019; Zargar et al .,
2015).
- DA dibawah 50%. - Produk  komersial  umumnya  memiliki DA  10–20%  (Gonçalves et  al .,  2021;
Mourya et al ., 2011). - Semakin  rendah  DA  semakin  baik interaksi kitosan terhadap sel (Chatelet et al ., 2001).
Berat Molekul ( Molecular Weight /MW) (LMW: Low MW; HMW: High MW)
- MW  30–3000  kDa  (1  kDa  =  1000 g/mol) (Mourya et al ., 2011). - Umumnya  MW  kitin  yang  diekstrak kimiawi  dari  cangkang  krustasea ≥1300  kDa  (HMW  kitin)  (Zhang et al ., 2018).
- MW  kitin  mempengaruhi  kestabilan polimer,  LMW  kitin  lebih  mudah terurai (Zhang et al ., 2018).
- LMW  kitin  memiliki  aktivitas antitumor yang cukup kuat (Salah et
al ., 2013). - MW kebanyakan produk komersial 50– 2000  kDa    (Gonçalves et  al .,  2021; Mourya et al ., 2011) - Dikelompokkan menjadi : LMW (< 50 kDa),  medium  MW  (50–250  kDa),
HMW (> 250 kDa) (Kumari & Kishor,
2020).
- LMW Kitosan memiliki sifat antibakteri,  antifungi,  antitumor,  dan mukoadhesif (Kumari & Kishor, 2020).
Kelarutan ( solubility ) - Tidak larut pada semua jenis larutan umum  (air,  pelarut  organik,  larutan asam  atau  basa  encer)  (Mathur  & Narang, 1990; Rinaudo, 2006).
- Dapat  larut  dalam  larutan  asam mineral  (asam  inorganik)  pekat (Kumari  &  Kishor,  2020;  Mathur  & Narang, 1990).
- Pelarut  umum  untuk  kitin  adalah campuran DMAc (Dimetilasetamida) dengan  LiCl  (Litium  Klorida) (Rinaudo,  2006).  Metanol  yang dijenuhkan  dengan  kalsium  klorida dihidrat  juga  dapat  melarutkan  kitin
(Kurita, 2006).
- Tidak  larut  dalam  air  dan  senyawa organik umum (Kurita, 2006; Zargar et al ., 2015).
- Larut  dalam  larutan  asam  organik (seperti asam asetat,  asam format, asam laktat, asam piruvat, dan asam oksalat) dan  asam  inorganik  (asam  klorida  dan asam nitrat) yang menghasilkan larutan kental (Kurita, 2006; Mathur & Narang, 1990; Zargar et al ., 2015). Biodegradabi litas - Kitin  dan  kitosan  di  alam  dapat  terurai  secara  alami  oleh  enzim  kitinase  pada bakteri, jamur, tanaman, dan saluran pencernaan di banyak hewan (Kurita, 2006). - Kitin  dan  kitosan  tidak  tercerna  oleh  saluran  pencernaan  mamalia  (Rinaudo, 2006).
Toksisitas - Kitin dan kitosan memiliki sifat toksisitas rendah (Kurita, 2006; Rinaudo, 2006). Catatan:
- Parameter yang paling mempengaruhi sifat fisik, kimia, dan biologi kitin dan kitosan adalah DA, derajat polimerisasi (DP; menunjukkan jumlah monomer dalam suatu polimer), dan MW (Basa et al ., 2020; Sreekumar et al ., 2022; Zargar et al ., 2015).
- DA, DP, dan MW kitin atau kitosan yang rendah dikorelasikan dengan reaktivitas biopolimer yang semakin baik.
- Ada hipotesa yang menyatakan pola asetiliasi ( Pattern of Acetylation /PA; pola kehomogenan atau keheterogenan distribusi asetil pada polimer kitin atau kitosan) mempengaruhi sifat fisikokimia dan biologi kitosan (Basa et al ., 2020; Sreekumar et al ., 2022), dan juga kitin.
tumor, protein dinding sel bakteri, DNA dan RNA (Mathur  &  Narang,  1990;  Philibert et  al .,  2017; Roy et al ., 2017; Zargar et al ., 2015). Hal tersebut juga menjelaskan mengapa kitosan mampu larut pada senyawa asam organik. Kitosan juga mampu mengkelat (berikatan) dengan berbagai ion logam karena  adanya  gugus  hidroksil  dari  residu  D- glukosamin (Philibert et al ., 2017).
Kitin  memiliki  kestabilan  yang  tinggi dikarenakan  adanya  disposisi  ekuatorial  yang stabil dari semua substituen kitin. Selain itu kitin juga  memiliki  cincin  piranosa  yang  terhubung melalui ikatan β glikosidik yang memungkinkan terbentuknya  struktur  rantai  lurus  berdekatan dengan  ikatan  hidrogen  antar  rantai  yang  kuat (Mathur & Narang, 1990). Grup asetamida pada N-asetilglukosamin  berperan  penting  terhadap kestabilan  ikatan  hidrogen  pada  kitin  (Rinaudo, 2006; Roy et al ., 2017).
Secara  fisik,  penampakan  kitin  dan  kitosan terlihat  sama,  yaitu  berupa  serbuk  kristal  atau amorf  tanpa  pigmen  warna  (Mathur  &  Narang, 1990),  yang  berwarna  putih  atau  putih kekuningan,  dan  tidak  berbau  (Amelia  & Herdyastuti,  2017;  Natalia et  al .,  2021).  Hanya, secara  kimia  dan  biologi  kitin  dan  kitosan memiliki  karakter  berbeda.  Garis  besar  karakter umum kitin dan kitosan terjabar pada Tabel 2.

## 2.6 Pemanfaatan Kitin dan Kitosan
Kitin  dan  kitosan  digunakan  secara  luas dalam  berbagai  industri.  Philibert et  al , menyatakan  ada  lebih  dari  dua  ribu  bentuk pemanfaatan kitin dan turunannya dalam berbagai bidang  industri,  seperti  bioteknologi,  pertanian, kesehatan,  pengolahan  air,  kosmetik,  fotografi, oftalmologi (terkait kesehatan mata), dan pangan (Philibert et  al .,  2017).  Pemanfaatan  kitin  dan kitosan  tidak  lepas  dari  karakter  biopolimer tersebut yang dipengaruhi oleh DA, DP, MW, dan mungkin  juga  PA.  Sejauh  ini  kitosan  lebih  luas pemanfaatannya dikarenakan reaktivitasnya yang lebih  baik  disbanding  kitin.  Garis  besar pemanfaatan kitin dan kitosan terjabar pada Tabel 3.

## 3. METODE

## 3.1 Ekstraksi kitin secara kimiawi
Secara umum tahapan ekstaksi (isolasi) kitin terdiri  atas  tiga  tahapan  utama,  yaitu  :  pra- perlakuan  ( pre‐treatment ),  demineralisasi,  dan deproteinasi.  Selanjutnya,  untuk  memperoleh
kitosan  dilanjutkan  dengan  tahapan  deasetilasi. Tahapan  tersebut  berlaku  baik  untuk  proses ekstraksi  secara  kimiawi  maupun  enzimatik (Arnold et  al .,  2020).  Tahapan  pra-perlakuan bertujuan  untuk  mempersiapkan  bahan  baku sehingga mempermudah proses ekstraksi. Khusus untuk  bahan  baku  dari  krustasea,  tahapan  pra- perlakuan dapat meliputi : pencucian, perebusan, pencacahan atau penggilingan untuk mengurangi ukuran partikel bahan baku, penyaringan ukuran partikel  bahan  baku,  dan  pengeringan.  Tahapan ini tidak semuanya dilakukan di berbagai proses ekstraksi  kitin  atau  kitosan.  Ada  yang  hanya melakukan  beberapa  proses,  seperti  pencucian dan pengeringan (Bastiaens et al ., 2019).
Mengingat  kitin  pada  krustasea  tersusun berikatan  dengan  protein  dan  mineral  (lihat gambar 2 dan 3) dengan jumlah komponen protein dan  mineral  yang  cukup  tinggi,  maka  perlu  ada tahapan  demineralisasi  dan  deproteinasi  yang dilakukan  secara  berurutan.  Kebanyakan  isolasi kitin  melalui  proses  demineralisasi  terlebih dahulu,  lalu  dilanjutkan  deproteinasi.  Meski demikian,  kedua  tahap  tersebut  dapat  ditukar urutannya (Bastiaens et al ., 2019).
Demineralisasi adalah tahapan penghilangan mineral  seperti  kalsium  karbonat  dan  kalsium fosfat. Untuk proses demineralisasi secara kimia, pelarut yang umum digunakan adalah HCl, HNO 3 , H 2 SO 4 ,  CH 3 COOH,  and  HCOOH;  namun diantara  semua,  HCl  merupakan  pelarut  yang paling  sering  digunakan  (Bastiaens et  al .,  2019; Kumari  &  Kishor,  2020).  Berikut  reaksi demineralisasi  kalsium  karbonat  menggunakan asam klorida (Kumari & Kishor, 2020) :
𝐶𝑎𝐶𝑂 ! + 2 𝐻𝐶𝑙 → 𝐶𝑎𝐶𝑙 " + 𝐻 " 𝑂 + 𝐶𝑂 " Proses  demineralisasi  matriks  kitin  dengan HCl akan menghasilkan garam kalsium larut air. Selanjutnya  bahan  yang  telah  mengalami demineralisasi tersebut disaring, dicuci dengan air distilasi hingga pH netral, dan dikeringkan. Proses demineralisasi  akan  berbeda-beda,  tergantung pada  jenis  bahan  baku,  waktu  ekstraksi,  suhu, ukuran cangkang atau kulit, konsentrasi asam, dan rasio  antara  solut  (zat  terlarut)  dan  solven (pelarut).  Namun  perbandingan  solut/solven sebaiknya didasarkan pada stoikiometri, misalnya 2  mol  asam  klorida  untuk  menguraikan  1  mol kalsium karbonat. Proses demineralisasi biasanya dilakukan  pada  suhu  tinggi  agar  pelarut  lebih mudah berdifusi ke dalam matriks kitin (Kumari & Kishor, 2020).
Tabel 3. Pemanfaatan kitin dan kitosan
Industri Bentuk Pemanfaatan Pangan dan minuman - Food  and  Drug  Administration (FDA)  menyetujui  penggunaan  kitosan  sebagai komponen  bahan  tambahan  makanan  ( food  additives ),  serat  makanan  (yang  memiliki efek  hipokolesterolemia),  dan  bahan  makanan  fungsional.  Jepang  dan  Korea  telah menyetujui penggunaan kitosan untuk bahan tambahan makanan sejak 1990an (Morin- Crini et  al .,  2019).  Kitosan  mampu  menurunkan  kolesterol  dengan  menghalangi penyerapan lemak dan kolesterol makanan (Philibert et al ., 2017).
- Kitosan  dan  turunannya  bersifat  antimikroba,  merupakan edible  film dengan  sifat mekanik yang baik, dapat digabungkan dengan zat fungsional lain seperti vitamin, serta memiliki  sifat  permeabilitas  selektif  terhadap  gas,  sehingga  cocok  menjadi  bahan pengemas makanan yang memiliki fungsi pengawetan sekaligus nutrasetikal (Hamed et al ., 2016; Morin-Crini et al ., 2019). Meski demikian, sifat hidropilik kitosan menjadi kekurangan yang perlu diatasi (Morin-Crini et al ., 2019).
- Kitosan memiliki sifat nutrasetikal seperti: antibakteri, anti-inflamasi, antioksidan,  anti- karsinogenik,  antiulcer  (mengurangi/menghambat  produksi  asam  lambung),  serta sebagai serat pangan (Morin-Crini et al ., 2019).
- Pada  produksi  anggur,  kitosan  dapat  dimanfaatkan  sebagai  bahan  penjernih;  de- asidifikasi (pengurangan tingkat keasaman anggur); stabilisasi; pembersih ochratoxin A (mikotoksin dari spesies Aspergillus dan Penicillium ), enzim, logam, pestisida, atau zat- zat  tidak  diinginkan  lainnya.  Kitosan  juga  digunakan  sebagai  koagulan  ramah lingkungan pada penjernihan markisa, dan flokulan alami untuk penjernihan bir (Morin- Crini et al ., 2019). Kesehatan  - Sifat  biodegradabilitas,  biokompatibilitas,  biodistribusi,  dan  nontoksisitas  kitin  dan kitosan  membuatnya  digunakan  secara  luas  di  bidang  kesehatan  seperti  onkoterapi (terapi/pengobatan  kanker)  (Ding  &  Guo,  2022).  Kitosan  khususnya,  merupakan polimer bermuatan positif yang mampu berikatan dengan kebanyakan jaringan hidup yang bermuatan negatif, seperti: permukaan luar sel sebagian mikroba, jaringan kulit, tulang, dan rambut. Kemampuan mengikat ( binding capacity ) kitosan tersebut menjadi karakter penting untuk penerapannya di bidang biomedis (Kumari & Kishor, 2020).
- Onkoterapi:  kitosan  cocok  digunakan  sebagai  nanocarrier  obat  kemoterapi ( chemotherapeutic drugs-delivery ), gen terapi, terapi fotodinamik, atau terapi lainnya. Kitosan  juga  digunakan  sebagai  adjuvan  vaksin  ( bahan  yang  ditambahkan  ke  dalam vaksin untuk meningkatkan imunogenesitas) untuk mengatur lingkungan mikro tumor ( tumor microenvironment /TME). Penelitian menunjukkan kitosan dapat mengaktifkan sel dendritik (DC) untuk memperkuat aktivitas antitumor dari sel natural killer (NK) dengan  meningkatkan  produksi  IFN-γ  (sitokin  yang  berperan  penting  dalam menginduksi dan memodulasi berbagai respon imun). Kitosan juga dapat menginduksi apoptosis (program kematian sel) dari sel abnormal melalui beberapa mekanisme (Ding & Guo, 2022).
- Farmasi:  kitosan  cocok  digunakan  sebagai  bahan  pembawa  obat  ( drug  delivery )  baik dalam bentuk implant maupun injeksi, untuk bahan penyembuh luka, buccal (terkait area pipi  dan  mulut) karena  sifat  mukoadhesif-nya,  dan  vaksin.  Film  dan  serat  kitin  dan kitosan cocok digunakan untuk kepentingan rekayasa jaringan organ ( tissue engineering ) dan  penyembuhan  luka.  Bahan  pembalut  luka  berbasis  kitosan  sudah  banyak  beredar secara komersial (Morin-Crini et al ., 2019).
- Kedokteran gigi: kitosan mampu menghalangi penetrasi asam ke enamel dan mencegah kehilangan  mineral  enamel  yang  membuatnya  berperan  penting  pada  kedokteran  gigi preventif. Kitosan merupakan salah satu komponen pembuat pasta gigi, obat kumur, dan permen  karet.  Kitosan  berbentuk  gel/hidrogel  dapat  digunakan  untuk  pengobatan periodontitis (infeksi gusi) kronis dan sariawan (Morin-Crini et al ., 2019).
Kosmetik  - Kitin,  kitosan,  dan  turunannya  banyak  digunakan  dalam  kosmetik  terutama  karena memiliki  fungsi  antioksidan,  pembersihan,  perlindungan,  humektan  (zat  higroskopis untuk menjaga kelembaban), dan antioksidan (Casadidio et al ., 2019).
- Kitosan telah digunakan sebagai komponen produk perawatan rambut, sampo, produk pewarna, hairspray ,  krim  dan  losion  (wajah,  tangan,  dan  tubuh),  pewarna  kosmetik (makeup, cat kuku, eye shadow , dan lipstik), produk deodoran, dan mikro-enkapsulasi zat aktif produk kosmetik (Morin-Crini et al ., 2019). Pertanian Sifat  chelating  kitosan  sangat  baik  sebagai  bahan  anti-fungi.  Kitosan  juga  bersifat bakterisidal (membunuh bakteri) dan bakteriostatik (menghambat pertumbuhan bakteri). Kitosan mampu mengaktifkan respon pertahanan tanaman dan berfungsi sebagai elisitor (pemicu terbentuknya metabolit sekunder sebagai fungsi pertahanan diri), sehingga sering digunakan dalam pengendalian penyakit tanaman. Fungsi tersebut membuat kitosan sering digunakan sebagai komponen biosida dan biopestisida. Kitosan juga digunakan sebagai pelapis benih, buah, sayuran; dan pupuk hayati ( bio fertilizer ) (Morin-Crini et al ., 2019). Industri tekstil Kitosan  digunakan  sebagai  bahan  pengikat  pewarna,  laminasi  atau  pelapis  komponen tekstil, agen pengikat bahan non-tenun, modifikasi permukaan tekstil, komponen pencetak tekstil, bahan pengawet dan deodoran tekstil, serat non-alergi, pemberi sifat anti-mikroba, dan benang bedah (Morin-Crini et al ., 2019). Lingkung an
Kitosan  mampu  mengikat  polutan  dengan  selektivitas  sangat  baik  sehingga  sering digunakan sebagai biosorben (bahan biologis pasif penghilang polutan larutan), matriks polimer  adsorben  penghilang  pewarna,  agen  koagulasi  dan  flokulasi  untuk penjernihan/pemurnian air dan pengolahan limbah cair (Morin-Crini et al ., 2019).
Bioteknol ogi - Kitin dan kitosan cocok digunakan sebagai bahan pendukung ( support ) untuk imobilisasi enzim (Krajewska, 2004; Verma et al ., 2020).
- Bead dari kitosan dapat dibuat menjadi berbagai ukuran dan porositas sehingga cocok sebagai bahan imobilisasi enzim (Kumari & Kishor, 2020).
- Kitin  dan  kitosan  cocok  digunakan  sebagai  biosensor.  Nanokomposit  kitosan  dan Graphene  Oxide mampu  secara  sensitif  dan  cepat  mendeteksi  adanya  tifus  melalui pendeteksian DNA (Moura et al ., 2016).
- Imunosensor  elektrokimia  berbasis  kitosan  telah  digunakan  sebagai  biomarker  untuk mendeteksi hepatitis B, berbagai kanker, kehamilan, kandungan besi darah, ochratoxin A, dan bakteri Shigella flexneri pemicu diare (Suginta et al ., 2013).
- Kitosan  juga  digunakan  untuk  komponen  instrumen  analisa  di  laboratorium,  seperti untuk  pemisahan  protein,  matrix  untuk  afinitas  dan  permeasi  gel,  dan  kromatografi (Morin-Crini et al ., 2019)
Gambar 9. Mekanisme deasetilasi kitin dalam larutan alkali (contoh: NaOH) (Bastiaens et al ., 2019; Novikov et al ., 2023; Vicente et al ., 2021)
Tahap deproteinasi bertujua untuk melepaskan komponen protein dari kitin. Proses deproteinasi cukup sulit mengingat protein terikat dengan  kitin  melalui  beberapa  bentuk  ikatan hidrogen, termasuk ikatan kovalen. Deproteinasi kimiawi  umumnya  dilakukan  menggunakan pelarut  alkali  seperti  NaOH,  Na 2 CO 3 ,  NaHCO 3 , KOH,  K 2 CO 3 ,  Ca(OH) 2 ,  Na 2 SO 3 ,  NaHSO 3 , CaHSO 3 ,  Na 3 PO 4 ,  dan  Na 2 S,  dengan  NaOH sebagai  pilihan  utama.  Efektifitas  deproteinasi kimiawi  tersebut  dipengaruhi  oleh  suhu  proses, konsentrasi  alkali,  dan  rasio  solut/solven.  KOH atau NaOH punya kecenderungan memecah rantai polimer (depolimerisasi). Selain itu, deproteinasi kimiawi  dapat  menyebabkan  deasetilasi  pada sebagian unit rantai kitin di krustasea. Bahan yang telah  mengalami  deproteinasi  biasanya  dicuci hingga  pH  netral  dan  dikeringkan  (Bastiaens et al ., 2019; Kumari & Kishor, 2020). Proses demineralisasi dan deproteinasi akan menghasilkan  kitin  mentah.  Kitosan  dapat diperoleh  dengan  memproses  lebih  lanjut  kitin mentah  menggunakan  alkali  guna  memutuskan ikatan  asetil  pada  grup  asetamida  kitin (deasetilasi).  Deasetilasi  merupakan  reaksi substitusi  nukleofilik  dua  langkah.  Langkah pertama, terjadi penambahan nukleofilik hidroksida  (OH ― )  pada  gugus  karboksi  (C═O). Langkah  kedua,  amina  terbentuk  (GlcNAc menjadi  GlcN)  ketika  asetat  (CH 3 COO ― ) dipisahkan.  Reaksi  mengikuti  kinetika  pseudo- orde  pertama  selama  periode  awal  ketika konsentrasi  basa  tinggi  (Bastiaens et  al .,  2019).
Mekanisme  deasetilasi  kitin  terilustrasikan melalui Gambar 9.
Dari  sudut  pandang  kimia,  pelarut  asam ataupun  basa  dapat  digunakan  untuk  memutus grup  asetil  pada  kitin.  Namun  mengingat  ikatan glikosidik sangat rentan terhadap asam, membuat proses  deasetilasi  lebih  sering  dilakukan menggunakan larutan alkali (Younes & Rinaudo, 2015), khususnya NaOH atau KOH. Di industri, proses deasetilasi umumnya dilakukan menggunakan  alkali  berkonsentrasi  40–50% (w/v)  pada  suhu  tinggi  (100–160°C).  Hasilnya adalah  deasetilasi  heterogen,  yaitu  gugus  asetil terdistribusi secara heterogen pada rantai polimer, diantaranya  membentuk  pola  blok  deasetil  pada polimer kitosan (Bastiaens et al ., 2019).

## 3.2 Ekstraksi kitin dari kulit udang secara enzimatik
Pada  ekstraksi  secara  enzimatik,  proses demineralisasi  dan  deproteinasi  kulit  udang dilakukan  melalui  proses  fermentasi.  Proses demineralisasi  enzimatik  umumnya  dilakukan menggunakan  bakteri  asam  laktat  seperti Lactobacillus spp. (Khanafari et al ., 2008; Sixto- Berrocal et  al .,  2023;  Xu et  al .,  2008).  Hal  ini mengingat hasil utama metabolisme bakteri asam laktat  adalah  senyawa  asam  laktat  yang  dapat bereaksi dengan kalsium (mineral dominan pada kulit  udang)  membentuk  kalsium  laktat  (lihat gambar 10) (Sixto-Berrocal et al ., 2023; Xu et al ., 2008).
Gambar 10. Reaksi asam laktat dengan kalsium karbonat menghasilkan kalsium laktat
Gambar 11. Deasetilasi kitin menjadi kitosan dengan enzim kitin deasetilase (Tsigos et al ., 2000)
Proses  deproteinasi  limbah  udang  secara enzimatik  dilakukan  dengan  bakteri  proteolitik dari berbagai sumber seperti : daging giling (Xu et al ., 2008), Bacillus spp (Ghorbel-Bellaaj et al ., 2013; Manni et al ., 2010; Pachapur et al ., 2016; Younes et  al .,  2012,  2014a), Lactobacillus  spp (Rao et  al .,  2000) ,  Paenibacillus  woosongensis (Paul et al ., 2015) , Micromonospora chaiyaohumensis (Mhamdi et  al .,  2017) , Exiguobacterium  profundum (Xin et  al .,  2020) , Bifidobacterium (Sixto-Berrocal et  al .,  2023). Selain  itu,  deproteinasi  juga  dilakukan menggunakan  enzim  dari  berbagai  sumber, seperti: isi perut ikan (Nasri et al ., 2011; Sila et al .,  2014),  enzim  udang  itu  sendiri  ( indigenous enzyme )  (Arancibia et  al .,  2014;  Cahú et  al ., 2012),  enzim  papain  (Gartner et  al .,  2010; Gopalakannan et  al .,  2000;  Pérez et  al .,  2022), enzim  bromelain  (Pérez et  al .,  2022),  enzim tripsin  dan  ficin  (Marzieh et  al .,  2019),  dan protease  aspartat  (proteases  A,  B,  papain,  rNpl, alcalase)  (Deng et  al .,  2020;  Synowiecki  &  Al- Khateeb, 2000).

## 3.3 Deasetilasi kitin menjadi kitosan secara enzimatik
Deasetilasi  kitin  secara  enzimatik  untuk mendapatkan  kitosan  dilakukan  menggunakan enzim  atau  strain  mikroba  penghasil  kitin deasetilase (EC 3.5.1.41). Enzim ini menghidrolisis  grup  asetamida  pada  kitin  dan menghasilkan unit glukosamin (GlcN) dan asam asetat  (lihat  gambar  11).  Enzim  tersebut merupakan  salah  satu  anggota  keluarga karbohidrat esterase 4 (CE-4s). Disebutkan enzim ini berperan terhadap sintesa dinding sel dengan mengubah  kitin  menjadi  kitosan.  Organisme penghasil  kitin  deasetilase  adalah  fungi (diantaranya: Mucor  rouxii , Absidia  coerulea , Rhizopus circinans , Rhizopus nigricans , Colletotrichum  lindemuthianum , Aspergillus nidulans , Aspergillus  fumigatus , Saccharomyces cerevisiae );  serangga  (diantaranya: Anopheles gambiae , Apis
mellifera , Drosophila melanogaster , Helicoverpa  armigera , Mamestra configurata , Tribolium  castaneum , Trichoplusia ni ); dan bakteri laut (Vibrionaceae: Vibrio cholera dan Photobacterium ). Sebagian besar enzim kitin deasetilase ekstraseluler memiliki pH optimum di area netral atau basa (pH 7–12), sedangkan kitin deasetilase  intraseluler  ber-pH  optimum  di kisaran  4,5–6.  Suhu  optimum  enzim  ini  adalah 50–60°C (Zhao et al ., 2010).

## 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian  menunjukkan  kitin  dari  limbah udang  dapat  diisolasi  sepenuhnya  secara enzimatik. Hal ini terlihat dari nilai demineralisasi yang mencapai 88–99% dan deproteinasi 81–88% setelah  proses  fermentasi.  Pada  metode-metode tersebut  bahan  kimia  hanya  digunakan  untuk mengatur  pH  fermentasi.  Review  metode  dan hasil riset tersebut dapat dilihat pada Tabel 4.
Di  sisi  lain, proses  isolasi  kitin  secara enzimatik  dari  limbah  udang  yang  dilakukan secara  parsial,  khususnya  di  tahap  deproteinasi dapat  menurunkan  jumlah  protein  limbah  udang hingga  >80%–94%  (Xu et  al .,  2008;  Rao et  al ., 2000;  Ghorbel-Bellaaj et  al .,  2013;  Pachapur et al .,  2016;  Younes et  al .,  2012;  Mhamdi et  al ., 2017; Xin et al ., 2020; Sixto-Berrocal et al ., 2023; Marzieh et al ., 2019; Deng et al ., 2020). Enzim papain  berhasil  menarik  protein  di  kulit  udang antara 70–82%, sedangkan bromelain menurunkan  74–87%  porein  kulit  udang tergantung ukuran partikel kulit yang digunakan (Pérez et  al .,  2022).  Deproteinasi  limbah  udang dengan  enzim indigenous mampu  menurunkan lebih  dari  80%  protein  limbah  udang,  namun fermentasi  selama  24  jam  menghasilkan  produk berbau busuk kuat (Rao et al ., 2000).
Penelitian  mengenai  deasetilasi  kitin, khususnya dari limbah udang, dengan enzim kitin deasetilasi tidak banyak. Hal ini mungkin terkait rendahnya kitin yang terdeasetilasi menggunakan enzim  ini.  Harmsen et  al melaporkan  bahwa hanya sekitar 10% grup asetil dari kitin, baik jenis α  maupun  β,  yang  terlepas  ketika  deasetilasi dilakukan  menggunakan  enzim  kitin  deasetilasi. Penelitian  tersebut  dilakukan  untuk  proses fermentasi selama 10 hari (suhu 37°C, substrat 5 mg/mL,  enzim  5  μM,  pH  8.0,  kecepatan pengadukan 800 rpm). Lebih lanjut disebutkan, di alam  kitin  terdegradasi  oleh  enzim  glikosida hidrolase  dan  litik  polisakarida  monooksigenase (Harmsen et  al .,  2019).  Sixto-Berrocal et  al berhasil  mengekstraksi  kitosan  dari  kulit  udang secara enzimatik menggunakan enzim koktail dari A.  niger dengan  derajat  deasetilasi  (DD)  86%, yang  termasuk  kategori  DD  tinggi.  Meski demikian,  kitosan  tersebut  hanya  memiliki  nilai kelarutan  25%  dalam  larutan  asam  asetat  1,0  N (Sixto-Berrocal et al ., 2023).
Penelitian terkait ekstraksi kitin dan kitosan dari limbah udang secara enzimatik telah banyak dilakukan. Ada yang mencoba melakukan proses enzimatik  hanya  di  tahap  demineralisasi (Khanafari et al ., 2008). Sebagian besar memilih
tahapan  deproteinasi  sebagai  prioritas  utama Tabel 4. Metode dan hasil ekstraksi kitin dari limbah udang secara enzimatik
Referensi dan Bahan baku Metode Hasil (Rao et al ., 2000) Limbah kepala dan kulit udang Fermentasi dengan Lactobacillus plantarum (kondisi  inkubasi  optimum: glukosa  5%  w/w;  inoculum  10%  v/w; pH  awal  6,0  disesuaikan  dengan  asam sitrat; suhu 30°C; waktu 12–24 jam). Nilai  deproteinisasi  88%  dan demineralisasi  91%,  namun larutan  substrat  menjadi  seperti bubur kental dan setelah 24 jam ada tanda pembusukan .
(Xu et al ., 2008) Kulit Penaeus monodon dan Crangon crangon - Deproteinasi dengan bakteri proteolitik dari daging giling (kondisi inkubasi:  15  g  serbuk  kulit,  250  mL larutan  inokulum  3–5×10 6 koloni/mL, suhu 37°C, kecepatan pengadukan 110 rpm, waktu 68 jam untuk P. monodon dan 50 jam untuk C.crangon ) - Demineralisasi  dengan Lactobacillus casei yang  diisolasi  dari  yogurt komersial (kondisi inkubasi: inokulum 5,74×10 7 koloni/mL,  suhu  37°C,
kecepatan pengadukan 110 rpm, waktu 47 jam untuk P. monodon dan 46 jam untuk C.crangon ) - Deproteinisasi  kulit Penaeus monodon 81%, Crangon crangon 33% (kandungan protein P.  monodon tiga  kali lebih  tinggi  dibanding C. crangon )
- Demineralisasi  kulit Penaeus monodon 97%, Crangon crangon 98% (kandungan kalsium P.  monodon lebih rendah dari C. crangon )
(Ghorbel-Bellaaj et al ., 2013) Kulit M etapenaeus monoceros Fermentasi  dengan Bacillus  pumilus
(kondisi  inkubasi:  100  mL  larutan fermentasi, komposisi 70 g/l kulit udang;
50 g/l glukosa; pH 5,0; inokulum 0.225 OD pada 600 nm; suhu 35◦C; 6 hari).
- Nilai  deproteinisasi  94%  dan demineralisasi 88% - Rendemen kitin 27%
(Pachapur et  al ., 2016) Campuran kulit kepiting,  lobster, dan
udang- udangan  ( shrimp , prawn , dan krill )
- Fermentasi dengan Bacillus licheniformis dan Bacillus  subtilis (kondisi inkubasi: air laut berisi 8 g/L limbah  kulit;  10  g/L  glukosa;  0,1% ekstrak  ragi;  10%  v/v  inokulum;  pH awal 7,0); - Dilakukan  pula  ekstraksi  kitin  secara kimia - Nilai  deproteinisasi B. subtilis
84% dan B. licheniformis 74% (inkubasi 24 jam; E/S=2 U/mg)
- Nilai  demineralisasi  54,5– 62,5% (inkubasi 5–15 hari). - Ekstraksi kimiawi: nilai deproteinasi <80% dan demineralisasi 98% (dengan air tawar)  dan  93%  (dengan  air laut) (Sixto-Berrocal et al ., 2023) Kulit Litopenaeus vannamei - Fermentasi  dengan Lactobacillus delbrueckii dan Bifidobacterium lactis (kondisi  inkubasi  optimum:  100  g/L potongan kulit udang, 50 g/L glukosa, demineralisasi  24  jam  dengan L. delbrueckii ,  lalu  ditambah  35  g/L
glukosa ( pulse ), di jam ke-48 ditambah
B.  lactis ,  pH  awal  7,2  dan  dijaga minimal 6,0 dengan NaOH 6 M, suhu 40°C, 200 rpm, total 72 jam) - Deasetilasi  kitin  (membuat  kitosan) dengan crude enzim koktail deasetilases dari Aspergillus niger (1 g crude kitin  pH  5,0  dengan  buffer asetat,  10  mL  enzim-35  U/ml,  suhu
40°C, 200 rpm, 24 jam) - Nilai  deproteinisasi  87%  dan demineralisasi 99% - Derajat deasetilasi (DD) kitosan 86%
perlakukan  enzimatik  untuk  memperoleh  kitin (Deng et  al .,  2020;  Gopalakannan et  al .,  2000; Manni et al ., 2010; Marzieh et al ., 2019; Mhamdi et al ., 2017; Nasri et al ., 2011; Paul et al ., 2015; Pérez et  al .,  2022;  Sila et  al .,  2014;  Xin et  al ., 2020; Younes et al ., 2012, 2014b). Ada pula yang sepenuhnya mengisolasi kitin dan kitosan secara enzimatik  (Tabel  4).  Sangat  disayangkan penelitian-penelitian tersebut menunjukkan bahwa  dibanding  secara  kimiawi,  nilai deproteinasi  limbah  udang  yang  diproses  secara fermentasi  lebih  rendah  dengan  rendemen  dan derajat deasetilasi kitin yang juga lebih rendah.
Guna  memperoleh  hasil  ekstraksi  yang optimum,  beberapa  penelitian  tersebut  mencoba mengawinkan  deproteinasi  enzimatik  dengan mild -demineralisasi  menggunakan  bahan  kimia yang lebih ramah lingkungan (asam asetat, asam sitrat, asam laktat) dan suhu proses cukup rendah (suhu ruang hingga maksimal 60°C) (Marzieh et al ., 2019; Pérez et al ., 2022; Rao et al ., 2000). Ada pula  yang  memperkuat  proses  deproteinasi menggunakan  strain  bakteri  penghasil  protease termutasi  (Xin et  al .,  2020),  atau  menggunakan strain bakteri protease yang termostabil (Mhamdi et  al .,  2017).  Semua  upaya  tersebut  mampu menurunkan  nilai  protein  dan  mineral  dalam limbah  udang  antara  88–98%.  Namun  waktu inkubasi yang cukup lama atau perlu adanya tahap persiapan  strain  bakteri  sebelum  digunakan menjadi hal yang perlu dipertimbangkan.
Hingga  kini,  proses  ekstraksi  kitin  dan kitosan  skala  industri  masih  dilakukan  secara kimiawi.  Waktu  proses  yang  pendek  (dari  30 menit  hingga  maksimal  6  jam),  sistem  ekstraksi standar  yang  mudah  diatur  dan  disesuaikan, dengan  hasil  yang  optimum  (umumnya  nilai demineralisasi dan deproteinasi >85%; rendemen dan DD  kitin yang tinggi) merupakan kelebihan dari  proses  kimiawi  tersebut.  Terlebih  bahan kimia utama yang umumnya digunakan hanyalah NaOH  dan  HCl,  yang  tentu  membuat  proses kimiawi  cukup  ekonomis.  Ini  berbeda  dengan kitin  dan  kitosan  yang  diekstraksi  secara enzimatik karena membutuhkan waktu fermentasi yang  cukup  panjang  (umumnya  minimal  6  jam hingga beberapa hari), jumlah enzim yang cukup banyak (rasio E/S ≥5 U/mg protein), dengan juga harus mempertimbangkan kondisi optimum kerja enzim (pH, suhu dan waktu inkubasi, rasio E/S, serta faktor penghambat kerja enzim) dan metode recovery enzim.  Terlebih  jika  proses  fermentasi dilakukan  menggunakan  strain  mikroba  hidup, maka  perlu  diperhatikan  asupan  karbon  serta
masa  keberlangsungan  hidup  mikroba  tersebut. Bahkan deasetilasi kitin secara enzimatik menjadi kitosan  sejauh  ini  belum  membuahkan  hasil berarti karena tingkat keberhasilannya yang boleh dibilang masih rendah.
Di sisi lain, keuntungan dari proses ekstraksi secara  enzimatik  adalah  dapat  menghasilkan produk  sesuai  kondisi  alaminya  (Deng et  al ., 2020),  dengan  proses  yang  lebih  ramah lingkungan.  Selain  itu,  senyawa-senyawa  di substrat  yang  menjadi  hasil  samping  proses ekstraksi  dapat  diisolasi  dan  dimanfaatkan  lebih lanjut.  Beberapa  penelitian  menunjukkan  bahwa proses  fermentasi  limbah  udang  menghasilkan larutan  yang  kaya  akan  protein,  karotenoid (khususnya  astaxanthin),  mineral  (khususnya kalsium),  dan  lemak.  Protein  hasil  fermentasi tersebut  juga  kaya  akan  asam  amino  esensial (Arancibia et  al .,  2014;  Armenta-López et  al ., 2002;  Deng et  al .,  2020).  Hal  tersebut menunjukkan  proses  ekstraksi  limbah  udang secara  enzimatik  tidak  hanya  menghasilkan produk utama, yaitu kitin dan kitosan, namun juga produk-produk  lain  yang  tak  kalah  manfaat  dan nilainya  dibanding  produk  utama,  yaitu  protein bermutu tinggi, karotenoid, kalsium, dan mungkin saja lemak bermutu tinggi (yang kaya akan asam lemak  tak  jenuh).  Produk-produk  tersebut  dapat dimanfaatkan  lebih  lanjut  untuk  produksi  pakan atau  pangan  bermutu  tinggi,  pangan  fungsional, atau  untuk  kepentingan  terkait  dunia  kesehatan. Hal yang juga perlu diapresiasi adalah penelitian yang  ada  sejauh  ini  sudah  cukup  berhasil menemukan  strain  mikroba  atau  enzim,  serta kondisi  yang  diperlukan  guna  secara  efektif mengekstaksi kitin dari kulit udang. Di sisi lain, meski  deasetilasi  kitin  menjadi  kitosan  masih perlu  eksplorasi  lebih,  namun  penelitian menunjukkan modifikasi kitin atau kitosan secara enzimatik  akan  menghasilkan  produk  yang  jelas strukturnya,  khususnya  dari  sisi  pola  asetilasi (PA)  polimer  atau  oligomer.  Hal  tersebut  tidak dapat    diperoleh  melalui  proses  kimiawi.  Lebih lanjut  disebutkan,  PA  mempengaruhi  aktivitas biologi kitosan. Dan proses enzimatik memungkinkan  untuk  mendapatkan  kitosan dengan PA tertentu dengan aktivitas yang sangat baik (Basa et al ., 2020; Hamer et al ., 2015).
Meski demikian, ekstraksi kitin dan kitosan secara  enzimatik  masih  memiliki  tantangan tersendiri yang masih harus diselesaikan sehingga prosesnya  layak  digunakan  di  ranah  industri. Diantaranya,  berupaya  memperpendek  masa fermentasi dengan hasil optimum. Lalu mencoba
mengaplikasikan  hasil  di  laboratorium  ke  skala yang  lebih  besar  untuk  melihat  kemungkinan penerapannya di ranah industri serta memperoleh protocol  standar  yang  efisien  dan  efektif.  Tentu saja,  upaya  menemukan  strain  mikroba  atau enzim  baru  yang  termostabil  dengan  aktivitas enzim yang kuat untuk proses demineralisasi dan deproteinasi  substrat,  yang  juga  mampu  bekerja baik  dalam  berbagai  rentang  pH  tetap  perlu dilakukan untuk memperluas kemungkinan hasil yang  lebih  baik.  Untuk  proses  deasetilasi  kitin secara enzimatik, ada baiknya mempertimbangkan penggunaan enzim glikosida hidrolase atau litik polisakarida monooksigenase selain enzim kitin deasetilasi untuk memperoleh hasil yang lebih optimal.

## 5. KESIMPULAN
Sejauh  ini  telah  ditemukan  strain  mikroba atau enzim, serta kondisi fermentasi yang mampu mengekstraksi  limbah  udang  menjadi  kitin dengan  tingkat  efektifitas  yang  baik  (nilai demineralisasi  >90%  dan  deproteinasi  >80%). Meski  deasetilasi  kitin  menggunakan A.  niger dilaporkan mampu menghasilkan kitosan dengan derajat deasetilasi 86%, namun tingkat kelarutan biopolimer  ini  hanya  25%.    Lebih  lanjut,  hasil samping  ekstraksi  enzimatik  limbah  udang  kaya akan  protein  bermutu  tinggi,  karotenoid (khususnya astaxanthin), dan mineral (khususnya kalsium)  yang  berpotensi  dimanfaatkan  lebih lanjut  untuk  kepentingan  berbagai  industri. Memperpendek  masa  fermentasi  dengan  hasil optimum,  meneruskan  hasil  di  laboratorium  ke skala yang lebih besar, mencoba enzim lain untuk kepentingan  deasetilasi  kitin  menjadi  langkah lanjutan yang perlu dilakukan.

## DAFTAR PUSTAKA
Amelia,  I.,  &  Herdyastuti,  N.  2017.  Kitin  Dari Cangkang Rajungan Yang Diperoleh Secara Enzimatik  Pada  Tahap  Deproteinasi. UNESA Journal of Chemistry . 6(2): 81–85.
Arancibia,  M.  Y.,  Alemán,  A.,  Calvo,  M.  M., López-Caballero,  M.  E.,  Montero,  P.,  & Gómez-Guillén, M. C. 2014. Antimicrobial and antioxidant chitosan solutions enriched with active shrimp (Litopenaeus vannamei) waste  materials. Food  Hydrocolloids .  35: 710–717.
Armenta-López, R., Guerrero, L. I., & Huerta, S. 2002.  Astaxanthin  extraction  from  shrimp
waste by lactic fermentation and enzymatic hydrolysis  of  the  carotenoprotein  complex. Journal of Food Science . 67(3): 1002–1006
Arnold, N. D., Brück, W. M., Garbe, D., & Brück, T.  B.  2020.  Enzymatic  modification  of native  chitin  and  conversion  to  specialty chemical products. Marine Drugs . 18(2): 1– 27.
Basa, S., Nampally, M., Honorato, T., Das, S. N., Podile,  A.  R.,  El  Gueddari,  N.  E.,  & Moerschbacher, B. M. 2020. The Pattern of Acetylation Defines the Priming Activity of Chitosan  Tetramers. Journal  of  the American Chemical Society . 142(4): 1975– 1986.
Bastiaens, L., Soetemans, L., D’Hondt, E., & Elst, K. 2019. Sources of chitin and chitosan and their  isolation.  In Chitin  and  Chitosan:
Properties and Applications . pp. 1–34.
Blackwell, J. 1982. Macromolecular organization of cellulose and chitin . 403–428. In: Brown, R.M.  (eds)  Cellulose  and  Other  Natural Polymer Systems. Springer, Boston, MA
Cahú, T. B., Santos, S. D., Mendes, A., Córdula,
C.  R.,  Chavante,  S.  F.,  Carvalho,  L.  B., Nader,  H.  B.,  &  Bezerra,  R.  S.  2012. Recovery of protein, chitin, carotenoids and glycosaminoglycans  from  Pacific  white shrimp  (Litopenaeus  vannamei)  processing waste. Process  Biochemistry .  47(4):  570– 577.
Casadidio, C., Peregrina, D. V., Gigliobianco, M. R.,  Deng,  S.,  Censi,  R.,  &  Di  Martino,  P. 2019. Chitin and chitosans: Characteristics, eco-friendly  processes,  and  applications  in cosmetic science. Marine Drugs 17(6).
Chatelet,  C.,  Damour,  O.,  &  Domard,  A.  2001. Influence  of  the  degree  of  acetylation  on some biological properties of chitosan films.
Biomaterials . 22(3): 261–268.
Chitosanlab.  (n.d.). Chitin .  [ONLINE].  From: https://chitosanlab.com/en/chitin/.  [Diakses pada 23 Maret 2023].
Crini,  G.  2019.  Historical  review  on  chitin  and chitosan biopolymers. Environmental Chemistry Letters . 17(4): 1623–1643.
Dang,  T.  T.,  Gringer,  N.,  Jessen,  F.,  Olsen,  K., Bøknæs,  N.,  Nielsen,  P.  L.,  &  Orlien,  V. 2018.  Emerging  and  potential  technologies
for  facilitating  shrimp  peeling:  A  review. Innovative  Food  Science  and  Emerging Technologies . 45: 228–240.
De Grave, S., Pentcheff, D., Ahyong, S. T., Chan, T.-Y.,  Crandall,  K.  A.,  Dworschak,  P.  C., Felder, D. L., Feldmann, R. M., Fransen, C. H. J. M., Goulding, La. Y. D., Lemaitre, R., Low, M. E. Y., Martin, J. W., Ng, P. K. L., Schweitzer, C. E., Tan, S. H., Tshudy, D., & Wetzer,  R.  2009.  A  classification  of  living and  fossil  genera  of  decapod  crustaceans. Raffles Bulletin of Zoology . 21: 1–109.
Deng, J. J., Mao, H. H., Fang, W., Li, Z. Q., Shi, D., Li, Z. W., Zhou, T., & Luo, X. C. 2020. Enzymatic  conversion  and  recovery  of protein, chitin, and astaxanthin from shrimp shell waste. Journal of Cleaner Production , 271, 122655.
Ding,  J.,  &  Guo,  Y.  2022.  Recent  Advances  in Chitosan  and  its  Derivatives  in  Cancer Treatment. Frontiers  in  Pharmacology , 13(April). 1–13.
Evans,  L.  (n.d.). Indian  white  prawn (Fenneropenaeus  indicus  Edwards,  1837) . In  Aquaculture  Feed  and  Fertilizer Resources  Information  System  (AFFRIS), Food  and  Agriculture  Organization  of  the United Nations. [ONLINE]. From: https://www.fao.org/fishery/affris/species- profiles/indian-white-prawn/indian-white- prawn-home/en/#:~:text=Morphological characteristics&text=Shrimp  have  a  head (thorax,five pairs of walking legs. [Diakses pada 27 Februari 2023].
Fernando,  L.  D.,  Dickwella  Widanage,  M.  C., Penfield,  J.,  Lipton,  A.  S.,  Washton,  N., Latgé, J. P., Wang, P., Zhang, L., & Wang, T. 2021. Structural Polymorphism of Chitin and  Chitosan  in  Fungal  Cell  Walls  From Solid-State NMR and Principal Component Analysis. Frontiers in Molecular Biosciences . 8: 1–12.
Gardner, K. H., & Blackwell, J. 1975. Refinement of  the  structure  of  β‐chitin. Biopolymers . 14(8): 1581–1595.
Gartner, C., Peláez, C. A., & López, B. L. 2010. Characterization  of  chitin  and  chitosan extracted  from  shrimp  shells  by  two methods. E-Polymers . 069: 1–16.
Ghorbel-Bellaaj,  O.,  Hajji,  S.,  Younes,  I.,
Chaabouni,  M.,  Nasri,  M.,  &  Jellouli,  K. 2013. Optimization of chitin extraction from shrimp  waste  with  Bacillus  pumilus  A1 using  response  surface  methodology. International Journal of Biological Macromolecules . 61: 243–250.
Gonçalves, C., Ferreira, N., & Lourenço, L. 2021. Production  of  low  molecular  weight chitosan  and  chitooligosaccharides  (COS):
A  review. Polymers .  13(15):  1–23. https://doi.org/10.3390/polym13152466
Gopalakannan, A., Indra Jasmine, G.,
Shanmugam,  S.  A.,  &  Sugumar,  G.  2000. Application  of  proteolytic  enzyme,  papain for  the  production  of  chitin  and  chitosan from shrimp waste. J. Mar. Biol. Ass. India , 42(2): 167–172.
Hamed, I., Özogul, F., & Regenstein, J. M. 2016. Industrial  applications  of  crustacean  by- products (chitin, chitosan, and chitooligosaccharides): A review. Trends in Food Science and Technology . 48: 40–50.
Hamer,  S.  N.,  Cord-Landwehr,  S.,  Biarnés,  X., Planas, A., Waegeman, H., Moerschbacher, B. M., & Kolkenbrock, S. 2015. Enzymatic production  of  defined  chitosan  oligomers with a specific pattern of acetylation using a combination  of  chitin  oligosaccharide deacetylases. Scientific Reports . 5: 1–9.
Harmsen, R. A. G., Tuveng, T. R., Antonsen, S. G., Eijsink, V. G. H., & Sørlie, M. 2019. Can we make Chitosan by Enzymatic Deacetylation of Chitin? Molecules . 24(21). https://doi.org/10.3390/molecules24213862
He, X., Li, K., Xing, R., Liu, S., Hu, L., & Li, P.
2016. The production of fully deacetylated chitosan by compression method. Egyptian Journal of Aquatic Research . 42(1): 75–81.
Hülsey,  M.  J.  2018.  Shell  biorefinery:  A comprehensive introduction. Green Energy and Environment . 3(4): 318–327.
Jang, M. K., Kong, B. G., Jeong, Y. Il, Lee, C. H., &  Nah,  J.  W.  2004.  Physicochemical characterization of α-chitin, β-chitin, and γ- chitin  separated  from  natural  resources.  In Journal  of  Polymer  Science,  Part  A: Polymer Chemistry . 42(14) : 3423–3432.
Kameda, T., Miyazawa, M., Ono, H., & Yoshida, M.  2005.  Hydrogen  bonding  structure  and stability  of  α-chitin  studied  by  13C  solid-
state  NMR. Macromolecular  Bioscience . 5(2) : 103–106.
Kannupandi,  T.,  Soundarapandian,  P.,  & Rajendran,  N.  2003. Prawns  and  Shrimps (Issue  June  2003,  pp.  308–320).  UNESCO International  Training  Course  on  Coastal Biodiversity  in  Mangrove  Ecosystem. https://www.researchgate.net/publication/2 83302406_Prawns_and_Shrimps/citations
Kasaai,  M.  R.  2009.  Various  methods  for determination of the degree of N-acetylation of chitin and chitosan: A review. Journal of Agricultural  and  Food  Chemistry .  57(5): 1667–1676.
Kaya, M., Mujtaba, M., Ehrlich, H., Salaberria, A. M.,  Baran,  T.,  Amemiya,  C.  T.,  Galli,  R., Akyuz, L., Sargin, I., & Labidi, J. 2017. On chemistry  of  γ-chitin. Carbohydrate Polymers . 176: 177–186.
Khanafari, A., Marandi, R., & Sanatei, S. 2008. Recovery of chitin and chitosan from shrimp waste  by  chemical  and  microbial  methods. Iranian  Journal  of  Environmental  Health Science and Engineering . 5(1): 19–24.
Krajewska,  B.  2004.  Application  of  chitin-  and chitosan-based  materials  for  enzyme immobilizations:  A  review. Enzyme  and Microbial Technology . 35(2–3): 126–139.
Kumari,  S.,  &  Kishor,  R.  2020.  Chitin  and chitosan: origin, properties, and applications.  In Handbook  of  Chitin  and Chitosan:  Volume  1:  Preparation  and
Properties .
INC.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-817970-
3.00001-8
Kurita, K. 2006. Chitin and chitosan: Functional biopolymers  from  marine  crustaceans. Marine Biotechnology . 8(3): 203–226.
Manni,  L.,  Ghorbel-Bellaaj,  O.,  Jellouli,  K., Younes, I., & Nasri, M. 2010. Extraction and characterization  of  chitin,  chitosan,  and protein  hydrolysates  prepared  from  shrimp waste by treatment with crude protease from bacillus  cereus  SV1. Applied  Biochemistry and Biotechnology . 162(2): 345–357.
Marzieh, M. N., Zahra, F., Tahereh, E., & Sara, K. N. 2019.
Comparison of the physicochemical and structural characteristics of enzymatic produced chitin and  commercial  chitin. International
Journal of Biological Macromolecules . 139:
270–276.
Mathur, N. K., & Narang, C. K. 1990. Chitin and chitosan,  versatile  polysaccharides  from marine  animals. Journal  Of  Chemical Education . 67(11): 938–942.
Mhamdi,  S.,  Ktari,  N.,  Hajji,  S.,  Nasri,  M.,  & Sellami  Kamoun,  A.  2017.  Alkaline proteases from a newly isolated Micromonospora  chaiyaphumensis  S103: Characterization  and  application  as  a detergent  additive  and  for  chitin  extraction from  shrimp  shell  waste. International Journal of Biological Macromolecules . 94.
415–422.
Michael. 2023. Dwarf Shrimp External Anatomy . Shrimp  and  Snail  Breeder.  [ONLINE]. From:  https://aquariumbreeder.com/dwarf- shrimp-external-anatomy/. [Diakses pada 25 Februari 2023].
Minke, R., & Blackwell, J. 1978. The structure of alpha-chitin. Journal of Molecular Biology . 120(2): 167–181.
Morin-Crini,  N.,  Lichtfouse,  E.,  Torri,  G.,  & Crini,  G.  2019. Fundamentals  and Applications of Chitosan . https://doi.org/10.1007/978-3-030-16538-
3_2
Moura, D., Mano, J. F., Paiva, M. C., & Alves, N. M. 2016. Chitosan nanocomposites based on distinct  inorganic  fillers  for  biomedical applications. Science  and  Technology  of Advanced Materials . 17(1): 626–643.
Mourya, V. K., Inamdar, N. N., & Choudhari, Y.
M. 2011. Chitooligosaccharides: Synthesis, characterization  and  applications. Polymer Science - Series A . 53(7): 583–612.
Muzzarelli,  R.  A.  A.,  Boudrant,  J.,  Meyer,  D., Manno, N., Demarchis, M., & Paoletti, M. G.  2012.  Current  views  on  fungal chitin/chitosan,  human  chitinases,  food preservation, glucans, pectins and inulin: A tribute to Henri Braconnot, precursor of the carbohydrate polymers science, on the chitin bicentennial. Carbohydrate Polymers , 87(2): 995–1012.
Nasri,  R.,  Younes,  I.,  Lassoued,  I.,  Ghorbel,  S., Ghorbel-Bellaaj,  O.,  &  Nasri,  M.  2011.
Digestive Alkaline Proteases from Zosterisessor ophiocephalus, Raja clavata ,
and  Scorpaena  scrofa :  Characteristics  and Application in Chitin Extraction . Journal of Amino Acids , 2011 , 1–9.
https://doi.org/10.4061/2011/913616
Natalia, D. A., Dharmayanti, N., & Roswita Dewi, F.  2021.  Produksi  Kitosan  dari  Cangkang Rajungan (Portunus sp.) pada Suhu Ruang. Jurnal  Pengolahan  Hasil  Perikanan Indonesia . 24(3): 301–309.
Novikov,  V.  Y.,  Derkach,  S.  R.,  Konovalova,  I. N., Dolgopyatova, N. V, & Kuchina, Y. A. 2023.  Mechanism  of  Heterogeneous Alkaline  Deacetylation  of  Chitin :  A Review. Polymers . 15(7): 1–23.
Pachapur, V. L., Guemiza, K., Rouissi, T., Sarma, S. J., & Brar, S. K. 2016. Novel biological and  chemical  methods  of  chitin  extraction from  crustacean  waste  using  saline  water. Journal  of  Chemical  Technology  and Biotechnology . 91(8): 2331–2339.
Paul,  T.,  Halder,  S.  K.,  Das,  A.,  Ghosh,  K., Mandal,  A.,  Payra,  P.,  Barman,  P.,  Das Mohapatra, P. K., Pati, B. R., & Mondal, K. C. 2015. Production of chitin and bioactive materials from Black tiger shrimp (Penaeus monodon)  shell  waste  by  the  treatment  of bacterial protease cocktail. 3 Biotech . 5(4): 483–493.
Pérez, W. A., Marín, J. A., López, J. N., Burgos, M. A., & Rios, L. A. 2022. Development of a  Pilot-ecofriendly  Process  for  Chitosan Production  from  Waste  Shrimp  Shells. Environmental Processes . 9(3): 1–25.
Philibert,  T.,  Lee,  B.  H.,  &  Fabien,  N.  2017. Current  Status  and  New  Perspectives  on Chitin  and  Chitosan  as  Functional Biopolymers. Applied  Biochemistry  and Biotechnology . 181(4): 1314–1337.
Poulicek, M., Voss-Foucart, M. F., & Jeuniaux, C. 1986.  Chitinoproteic  Complexes  and Mineralization in Mollusk Skeletal Structures.  In Chitin  in  Nature  and Technology . 8:  7–12.
Promwikorn,  W.,  Boonyoung,  P.,  &  Kirirat,  P. 2005.  Histological  characterization  of cuticular depositions throughout the molting cycle  of  the  black  tiger  shrimp  (  Penaeus monodon ). Songklanakarin J. Sci. Technol. 27(3): 500–509.
Rao,  M.  S.,  Muñoz,  J.,  &  Stevens,  W.  F.  2000.
Critical  factors  in  chitin  production  by fermentation  of  shrimp  biowaste. Applied Microbiology  and  Biotechnology .  54(6):
808–813.
Rinaudo,  M.  (2006).  Chitin  and  chitosan: Properties  and  applications. Progress  in Polymer Science (Oxford) . 31(7): 603–632.
Rkhaila, A., Chtouki, T., Erguig, H., Haloui, N. El, & Ounine, K. 2021. Chemical proprieties of  biopolymers  (Chitin/chitosan)  and  their synergic  effects  with  endophytic  Bacillus species:
Unlimited applications in agriculture. Molecules . 26(4).
https://doi.org/10.3390/molecules26041117
Roer, R., & Dillaman, R. 1984. The structure and calcification  of  the  crustacean  cuticle. Integrative  and  Comparative  Biology . 24(4): 893–909.
Roy, J. C., Salaün, F., Giraud, S., Ferri, A., Chen, G.,  &  Guan,  J.  2017.  Solubility  of  Chitin: Solvents,  Solution  Behaviors  and  Their
Related Mechanisms. Solubility of
Polysaccharides .
https://doi.org/10.5772/intechopen.71385
Saito, Y., Okano, T., Chanzy, H., & Sugiyama, J. 1995. Structural study of α chitin from the grasping spines of the arrow worm (Sagitta spp.).  In Journal  of  Structural  Biology . (114)3: 218–228).
Saito,  Y.,  Okano,  T.,  Gaill,  F.,  Chanzy,  H.,  & Putaux,  J.  L.  2000.  Structural  data  on  the intra-crystalline  swelling  of  β-chitin.
International Journal of Biological Macromolecules . 28(1): 81–88.
Salah,  R.,  Michaud,  P.,  Mati,  F.,  Harrat,  Z., Lounici,  H.,  Abdi,  N.,  Drouiche,  N.,  & Mameri,  N.  2013.  Anticancer  activity  of chemically  prepared  shrimp  low  molecular weight  chitin  evaluation  with  the  human monocyte  leukaemia  cell  line,  THP-1. International Journal of Biological Macromolecules . 52 (1): 333–339.
Sampath, U. G. T. M., Ching, Y. C., Chuah, C. H., Singh,  R.,  &  Lin,  P.  C.  2017.  Preparation and  characterization  of  nanocellulose reinforced  semi-interpenetrating  polymer network  of  chitosan  hydrogel. Cellulose . 24(5): 2215–2228.
Sawada, D., Nishiyama, Y., Langan, P., Forsyth, V. T., Kimura, S., & Wada, M. 2012. Direct
determination  of  the  hydrogen  bonding arrangement  in  anhydrous  β-chitin  by neutron fiber
diffraction.
Biomacromolecules 13(1): 288–291.
Sila,  A.,  Mlaik,  N.,  Sayari,  N.,  Balti,  R.,  & Bougatef,  A.  2014.  Chitin  and  Chitosan Extracted  from  Shrimp  Waste  Using  Fish Proteases  Aided  Process:  Efficiency  of Chitosan  in  the  Treatment  of  Unhairing Effluents. Journal  of  Polymers  and  the Environment . 22(1): 78–87.
Sixto-Berrocal,  A.  M.,  Vázquez-Aldana,  M., Miranda-Castro, S. P., Martínez-Trujillo, M. A., & Cruz-Díaz, M. R. 2023. Chitin/chitosan extraction from shrimp shell waste  by  a  completely  biotechnological process. International Journal of Biological Macromolecules .  230  (October  2022). https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.123 204
Sreekumar, S., Wattjes, J., Niehues, A., Mengoni, T., Mendes, A. C., Morris, E. R., Goycoolea, F.  M.,  &  Moerschbacher,  B.  M.  2022. Biotechnologically produced chitosans with nonrandom acetylation patterns differ from conventional  chitosans  in  properties  and activities. Nature  Communications .  13(1). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34483- 3
Suginta, W., Khunkaewla, P., & Schulte, A. 2013. Electrochemical  biosensor  applications  of polysaccharides  chitin  and  chitosan.  In Chemical Reviews . 13(7): 5458–5479.
Synowiecki, J., & Al-Khateeb, N. A. A. Q. 2000. The recovery of protein hydrolysate during enzymatic  isolation  of  chitin  from  shrimp Crangon crangon processing discards. Food Chemistry . 68(2): 147–152.
Tsigos,  I.,  Martinou,  A.,  Kafetzopoulos,  D.,  & Bouriotis,  V.  2000.  Chitin  deacetylases : new , versatile tools in. TibTech , 18(1999): 129–135.
Verma, M. L., Kumar, S., Das, A., Randhawa, J. S., & Chamundeeswari, M. 2020. Chitin and chitosan-based support materials for enzyme immobilization and biotechnological applications. Environmental  Chemistry Letters . 18(2): 315–323.
Vicente, F. A., Huš, M., Likozar, B., & Novak, U. 2021.  Chitin  Deacetylation  Using  Deep
Eutectic  Solvents:  Ab  Initio-Supported Process  Optimization. ACS  Sustainable Chemistry  and  Engineering .  9(10):  3874– 3886.
Xin, R., Xie, W., Xu, Z., Che, H., Zheng, Z., & Yang, X. 2020. Efficient extraction of chitin from  shrimp  waste  by  mutagenized  strain fermentation  using  atmospheric  and  room- temperature  plasma. International  Journal of  Biological  Macromolecules .  155:  1561– 1568.
Xu,  Y.,  Gallert,  C.,  &  Winter,  J.  2008.  Chitin purification  from  shrimp  wastes  by microbial
deproteination and
decalcification. Applied  Microbiology  and Biotechnology . 79(4): 687–697.
Younes,  I.,  Ghorbel-Bellaaj,  O.,  Nasri,  R., Chaabouni,  M.,  Rinaudo,  M.,  &  Nasri,  M. 2012. Chitin and chitosan preparation from shrimp  shells  using  optimized  enzymatic deproteinization. Process  Biochemistry . 47(12): 2032–2039.
Younes,  I.,  Hajji,  S.,  Frachet,  V.,  Rinaudo,  M., Jellouli,  K.,  &  Nasri,  M.  2014a.  Chitin extraction  from  shrimp  shell  using enzymatic treatment. Antitumor, antioxidant and  antimicrobial  activities  of  chitosan. International Journal of Biological Macromolecules . 69: 489–498.
Younes,  I.,  Hajji,  S.,  Frachet,  V.,  Rinaudo,  M., Jellouli,  K.,  &  Nasri,  M.  2014b.  Chitin extraction  from  shrimp  shell  using enzymatic treatment. Antitumor, antioxidant and  antimicrobial  activities  of  chitosan. International Journal of Biological Macromolecules . 69: 489–498.
Younes,  I.,  &  Rinaudo,  M.  2015.  Chitin  and chitosan  preparation  from  marine  sources. Structure,  properties  and  applications. Marine Drugs . 13(3): 1133–1174.
Zargar,  V.,  Asghari,  M.,  &  Dashti,  A.  2015. A Review  on  Chitin  and  Chitosan  Polymers :
Structure , Chemistry, Solubility,
Derivatives, and Applications . 00 : 1–24.
Zhang, J., Feng, M., Lu, X., Shi, C., Li, X., Xin, J.,  Yue,  G.,  &  Zhang,  S.  2018.  Base-free preparation of low molecular weight chitin from  crab  shell. Carbohydrate  Polymers . 190: 148–155.
Zhao,  Y.,  Park,  R.  D.,  &  Muzzarelli,  R.  A.  A.
2010.  Chitin  deacetylases:  Properties  and applications. Marine Drugs . 8(1): 24–46.