ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 16 (1) (2013) : 27 – 32
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Analisis Kimiawi Fraksi n-Heksana dari Tanaman Purwoceng ( Pimpinella Alpina Molk)
Zahroul Umami Qodri a , Bambang Cahyono a* , Meiny Suzery a
a Organic Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: cahyono@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t Keywords: Pimpinella alpina, antioxidants, coumarin
Quantification  of  total  phenolate  content,  total  flavonoids,  antioxidant  activity  test (DPPH),  and  chromatographic  identification  of  phenolic  compounds  of  the  coumarin class in the p-nan hexane fraction of Pimpinella alpina Molk have been performed. The results showed that the total phenolic compound content of n-hexane fraction was 45.04 mg equivalent of galic acid/gram of dry fraction. While the total flavonoid content of the n-hexane fraction was 5.58 mg equivalent of quercetin/gram of dry fraction. Antioxidant activity with DPPH method obtained IC 50 is 13485 ppm. The identification of the coumarin class  of  column  chromatography  yielded  11  fractions,  based  on  the  KLT  profile  results after being sprayed with NH3 color reagent and viewed under a 365 nm UV lamp. It has been found that the positive F 1 fraction contains a class of coumarin compounds exhibited by yellow-green stains. However, the chemical structure of the compound can not yet be proposed.

## A b s t r a k
Kata kunci: Pimpinella alpina, antioksidan, kumarin Telah  dilakukan  kuantifikasi  kandungan  fenolat  total,  flavonoid  total,  uji  aktivitas antioksidan (DPPH), serta identifikasi secara kromatografi senyawa fenolat dari golongan kumarin dalam fraksi n-heksana Pimpinella alpina Molk. Hasil penelitian menunjukkan bahwa  kandungan  senyawa  fenolat  total  fraksi  n-heksana  ,  yaitu  45,04  mg  ekuivalen asam galat/gram fraksi kering. Sedangkan kandungan flavonoid total fraksi n-heksana yaitu  5,58  mg  ekuivalen  kuersetin/gram  fraksi  kering.  Aktivitas  antioksidan  dengan metode  DPPH  diperoleh  IC 50 yaitu  13485  ppm.  Identifikasi  dari  golongan  kumarin  dari kromatografi kolom dihasilkan 11 fraksi, berdasarkan hasil profil KLT setelah disemprot dengan pereaksi warna NH 3 dan dilihat di bawah lampu UV 365 nm, ditunjukkan bahwa fraksi  F 1 positif  mengandung  golongan  senyawa  kumarin  yang  ditunjukkan  oleh  noda berwarna hijau kuning. Bagaimanapun struktur kimia dari senyawa tersebut hingga saat ini belum dapat diusulkan.

## 1. Pendahuluan
Purwoceng  ( Pimpinella  alpina Molk)  merupakan salah  satu  tanaman  obat  Indonesia  yang  hanya  dapat ditemukan  secara  endemik  di  dataran  tinggi  Dieng, Wonosobo, Jawa Tengah. Secara taksonomi, tanaman ini termasuk famili Apiaceae dari genus Pimpinella , beberapa spesies lain adalah P. anissum, P. Saxifraga, P. thellungiana, P. villosa, dan lain-lain. Tumbuhan dari famili Apiaceae ini
memiliki  aktivitas  biologis  sebagai  antimalaria, antimikroba, antijamur, dan antioksidan [1, 2].
Tumbuhan genus Pimpinella diketahui mengandung metabolit  sekunder  seperti  minyak  atsiri,  fenolat, stigmasterol, flavonoid, saponin, dan senyawa aromatik lainnya  yang  berfungsi  sebagai  afrodisiak,  antijamur, antibakteri, antikanker, dan antiinflamasi [3, 4]. Analisis praklinis  terhadap  tanaman  ini  dilakukan  untuk senyawa-senyawa yang larut dalam etanol.
Eksplorasi  terhadap  fraksi  non  polar,  seperti  n- heksana,  terhadap  tanaman  Purwoceng  hingga  saat  ini belum  pernah  dilakukan.  Hal  ini  penting  dilaksanakan mengingat  dalam  fraksi  n-heksana  diduga  megandung pula  senyawa-senyawa  bioktif  yang  memiliki  sifat farmakologis  yang  menarik.  Pada  penelitian  ini  akan difokuskan pada analisis fenolat total, flavonoid total dan aktivitas  antioksidan  terhadap  fraksi  n-heksana,  serta usaha  memperoleh  informasi  terhadap  salah  satu komponen  aktif  yang  terkandung  didalamnya  melalui pemurnian  kromatografi.  Senyawa  kumarin  ditemukan hampir  di  setiap  bagian  tumbuh-tumbuhan  mulai  dari akar, batang, daun sampai bunga dan juga buah [5]. Jenis senyawa  kumarin  dalam Pimpinella  alpina Molk belum diketahui  dan  belum  banyak  dilakukan  penelitian. Tertarik  akan  hal  tersebut,  maka  perlu  dilakukan penelitian  untuk  melakukan  isolasi  dan  identifikasi kandungan  senyawa  kumarin  pada Pimpinella  alpina Molk.  Hal  ini  perlu  dilakukan  sebagai  upaya  untuk pengembangan formulasi obat tradisional di Indonesia.

## 2. Metodologi

## Alat & Bahan
Peralatan  yang  digunakan  yaitu  seperangkat  alat soklet, tabung reaksi, gelas ukur, labu takar, pipet tetes, pipet gondok, pipa kapiler, pipet mikro, gelas beaker , plat tetes, erlenmeyer ,  corong  kaca,  corong  pisah,  kolom kromatografi,  botol  vial,  botol  semprot, chamber KLT, neraca  analitik  (Kern-870) ,  statif  dan  klem,  kertas saring, kompor listrik, vakum rotary evaporator (Buchi- B480) ,  lampu detektor UV (Spectroline  ENF-24/F) ,  dan spektrofotometer UV-Vis (Optizen UV2120).
Bahan  yang  digunakan  adalah  sampel  penelitian berupa tanaman Pimpinella alpina Molk kering, H 2 SO 4 p.a. (merck),  HCl  p.a. (merck),  serbuk  Mg  p.a.,  amil alkohol p.a.,  FeCl 3 p.a.  (merck),  anhidrida  asam  asetat  p.a (merck), NH 3 , pereaksi  Meyer, pereaksi  Dragendroff, akuades, etanol 96%, eter p.a., touluena p.a., asam asetat 10  %,  kloroform  p.a.,  etil  asetat  p.a.,  aseton  p.a., diklorometana  p.a.,  metanol  p.a.,  dan  n-heksana  p.a., asam  galat  (merck),  kuersetin  (merck),  reagen Folin- Ciocalteu ,  1,1-difenil-2-pikrilhidrazil  p.a.  (merck), larutan  AlCl 3 ,  larutan  potasium  asetat,  larutan  Na 2 CO 3 , NaOH,  plat  silika  gel  60  GF 254 (merck),  silika  gel  60  G (merck)  untuk  kromatografi  kolom,  plat  KLT  dengan silika gel 60 (tanpa indikator fluoresen) ukuran 5x20 cm dengan  ketebalan  silika  sebesar  0,25  mm  untuk preparatif.

## Penyiapan Sampel
Sampel Pimpinella alpina Molk kering diperoleh dari kelompok  tani  Desa  Sikunang,  Dieng,  Wonosobo,  Jawa Tengah. Sampel kemu-dian dibersihkan dan dihaluskan untuk mendapat serbuk Pimpinella alpina Molk.
Pembuatan Ekstrak Pimpinella alpina Molk
Serbuk Pimpinella  alpina Molk dibungkus  dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam soklet yang telah dilengkapi  dengan  kondensor  serta  pelarut  etanol  96% ke  dalam  labu  alas  bulat,  proses  sokletasi  dilakukan selama  ±  8  jam.  Hasil  sokletasi  kemudian  diuapkan
pelarutnya  (etanol  96%)  dengan rotary  vacuum evaporator hingga sepertiga volume untuk mendapatkan ekstrak  kental.  Ekstrak  ini  kemudian  dipartisi  dengan pelarut  n-heksana  di  dalam  corong  pisah,  selanjutnya dilakukan  analisis  senyawa  fenolat  total,  senyawa flavonoid  total,  uji  aktivitas  antioksidan,  dan  isolasi senyawa  kumarin  melalui  pemurnian  kromatografi dalam fraksi n-heksana.

## Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat
Larutan asam galat (dalam akuades) dibuat dengan konsentrasi  30,  40,  50,  60  dan  70  ppm.  Dari  masing- masing  konsentrasi  tersebut,  dipipet  0,05  mL ditambahkan  0,4  mL  akuades  dan  2  mL  reagen Folin- Ciocalteu lalu  dikocok  sampai  homogen  dan  terbentuk larutan  berwarna  kuning  jernih.  Larutan  didiamkan selama 8 menit, kemudian ditambahkan 1,6 mL larutan Na 2 CO 3 7,5%,  lalu  dikocok  hingga  homogen.  Larutan kembali  didiamkan  selama  30  menit  pada  suhu  kamar hingga  terbentuk  warna  biru.  Serapan  larutan  diukur dengan  spektrofotometer UV-Vis pada  panjang gelombang  765  nm  [6],  lalu  dibuat  kurva  kalibrasi hubungan antara konsentrasi asam galat (mg/L) dengan absorbansi.

## Penentuan Kandungan Fenolat Total
Larutan fraksi n-heksana dibuat dengan konsentrasi 2000 ppm dalam akuades. Sebanyak 0,05 mL dari larutan ekstrak ditambahkan dengan 0,4 mL akuades dan 2 mL reagen Folin-Ciocalteu ,  dikocok  sampai  homogen  dan terbentuk larutan berwarna  jernih kekuningan. Larutan didiamkan selama 8 menit, selanjutnya ditambahkan 1,6 mL larutan Na 2 CO 3 7,5% lalu dikocok  sampai homogen. Larutan kembali didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar  hingga  terbentuk  warna  biru.  Serapan  larutan diukur  dengan  spektrofotometer UV-Vis pada  panjang gelombang  765  nm  [6].  Kadar  fenol  yang  diperoleh merupakan  mg  ekuivalen  asam  galat/gram  sampel kering.

## Pembuatan Kurva Kalibrasi Kuersetin
Larutan  kuersetin  (dalam  metanol)  dibuat  dengan konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Dari masing- masing  konsentrasi  dipipet  0,5  mL  dan  dicampurkan dengan  1,5  mL  metanol  dan  0,1  mL  AlCl 3 10%.  Setelah didiamkan selama 6 menit, larutan ditambahkan dengan 0,1  mL  potasium  asetat  1M  dan  didiamkan  kembali selama 6 menit. Kemudian larutan diencerkan hingga 5 mL.  Larutan  digojog  kemudian  didiamkan  selama  30 menit. Selanjutnya absorbansi larutan diukur menggunakan  spektrofotometer UV-Vis pada  panjang gelombang 415 nm [7].

## Penentuan Kandungan Flavonoid Total
Kandungan  senyawa  flavonoid  total  ditentukan berdasarkan  metode  kerja  Soltani dkk. [7],  [8].  Larutan fraksi  n-heksana  (dalam  metanol)  dibuat  dengan konsentrasi  5000  ppm.  Dari  larutan  fraksi  tersebut dipipet 0,5 mL dan dicampurkan dengan 1,5 mL metanol dan 0,1 mL AlCl 3 10%. Setelah didiamkan selama 6 menit, larutan ditambahkan dengan 0,1 mL potasium asetat 1M dan  didiamkan  kembali  selama  6  menit.  Kemudian
larutan  diencerkan  hingga  5  mL.  Larutan  digojog kemudian  didiamkan  selama  30  menit.  Selanjutnya absorbansi larutan
diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada  panjang  gelombang  415 nm.  Kadar  flavonoid  yang  diperoleh  merupakan  mg ekuivalen kuersetin/gram sampel kering.

## Uji Aktivitas Antioksidan
Fraksi n-heksana dalam metanol dibuat konsentrasi 2000, 4000, 6000, 8000, 10000, 12000, dan 14000 ppm. Untuk  menentukan  aktivitas  antioksidan,  masing- masing  konsentrasi  dipipet  sebanyak  1  mL  dan dimasukkan ke dalam botol vial, kemudian ditambahkan 3  mL  larutan  DPPH  0,1  mM.  Campuran  dihomogenkan dan  dibiarkan  selama  30  menit  di  tempat  gelap  hingga warna  ungu  larutan  berkurang  atau  terbentuk  larutan warna merah muda atau kekuningan. Absorbansi larutan diukur  dengan spektrofotometer UV-Vis pada  panjang gelombang  517  nm  [9].  Kemampuan  untuk  meredam radikal  DPPH  (inhibisi)  dihitung  menggunakan persamaan :
Selanjutnya  dilakukan  perhitungan  IC 50 yang merupakan  konsentrasi  sampel  untuk  dapat  meredam 50%  aktivitas  radikal  DPPH.  Nilai  IC 50 diperoleh  dari perpotongan  garis  antara  50%  daya  inhibisi  dengan konsentrasi sampel.

## Uji pendahuluan Kumarin
Prosedur  deteksi  kumarin  dalam  tanaman  dengan metode Farnsworth [10] yaitu dengan memasukkan 1 mL sampel dalam tabung reaksi, tutup tabung reaksi dengan kertas  saring  yang  dibasahi  dengan  larutan  NaOH. Kemudian  tempatkan  di  dalam  penangas  air  mendidih selama  beberapa  menit,  kertas  di  angkat  dan  dilihat  di bawah  lampu UV 365  nm.  Uji  positif  kumarin  ditandai dengan  terbentuknya  fluorosensi  hijau-kuning  yang muncul dalam beberapa menit.
Prosedur uji kumarin mengunakan KLT [11, 12], yaitu dengan menotolkan fraksi n-heksana ke adsorben pada plat  KLT,  kemudian  plat  KLT  dimasukkan  ke  dalam chamber KLT yang berisi fase gerak n- heksana:diklorometana:etil asetat 8:1:6 [12], sedangkan Wagner dan Bladt [11] meggunakan toluena:eter 1:1 yang dijenuhkan dengan asam asetat 10% sebagai fase gerak. Noda  dilihat  dengan  lampu UV 365  nm.  Untuk memperjelas warna noda dari metode Chakraborty, plat KLT  disemprot  dengan  NH 3 [13],  kemudian  plat  dilihat kembali  di  bawah  lampu  ultraviolet.  Adanya  senyawa kumarin  ditandai  dengan  fluoresensi  yang  berwarna hijau-kuning .

## Pemisahan dengan Kromatografi Lapis Tipis
Terhadap fraksi n-heksana dilakukan kromatografi lapis tipis dan KLT preparatif dengan pelarut etil asetat p.a.,  diklorometana  p.a.,  metanol  p.a.,  dan  n-heksana p.a.,  serta  campuran  pelarut  dengan  perbandingan tertentu  dan  fase  diam  berupa  silika  gel  60  GF254. Selanjutnya  dilakukan  kromatografi  kolom  dengan
pelarut n-heksana. Fase diamnya berupa silika gel 60 G. Masing-masing  fraksi  dianalisis  dengan  metode  KLT. Fraksi-fraksi  dengan  pola  pemisahan  noda  yang  sama digabung diberi notasi A, B, C, D dan seterusnya.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Kurva Kalibrasi Asam Galat
Kurva  kalibrasi  asam  galat  telah  dibuat  sebagai pembanding  ekivalen  senyawa  fenolat  total  yang berguna untuk menentukan senyawa fenolat total dalam fraksi  n-heksana Pimpinella  alpina Molk  melalui persamaan  regresi  yang  didapatkan  seperti  disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. Kurva kalibrasi asam galat dengan reagen Folin-Ciocalteu pada panjang gelombang 765 nm
Hasil  analisis  terhadap  larutan  asam  galat didapatkan kurva kalibrasi dengan persamaan regresi y = 0,00047x - 0,008 dan harga koefisien korelasi (R 2 ) yaitu 0,998.  Persamaan  regresi  menyatakan  hubungan matematis  antara  konsentrasi  asam  galat  dan absorbansinya pada pengukuran menggunakan spektrofotometer UV-Vis .  Sedangkan  harga  koefisien korelasi  (R 2 )  menyatakan  keeratan  hubungan/  korelasi antara konsentrasi (sumbu x) dan absorbansi (sumbu y). Harga  R 2 yang  mendekati  angka  1  menyatakan  bahwa persamaan regresi tersebut adalah linier dan konsentrasi mempengaruhi absorbansi sebesar 99%.

## Penentuan Kandungan Senyawa Fenolat Total
Hasil  analisis  kandungan  senyawa  fenolat  total fraksi n-heksana Pimpinella alpina Molk adalah 45,04 mg ekuivalen asam galat/gram fraksi kering.

## Kurva Kalibrasi Kuersetin
Kurva  kalibrasi  kuersetin  telah  dibuat  untuk menentukan kadar senyawa flavonoid total dalam fraksi n-heksana Pimpinella  alpina Molk  melalui  persamaan regresi yang didapatkan. Seperti disajikan pada Gambar 2.
% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 = 𝐴 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 − 𝐴 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝐴 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜
× 100%
Gambar 2. Kurva kalibrasi kuersetin dengan reagen AlCl3 dan potasium asetat pada panjang gelombang 415 nm
Hasil analisis terhadap larutan kuersetin didapatkan kurva kalibrasi dengan persamaan regresi y = 0,009x + 0,196 dan harga koefisien korelasi (R 2 ) yaitu 0,995.

## Penentuan Kandungan Senyawa Flavonoid Total
Hasil  analisis  kandungan  senyawa  flavonoid  total pada fraksi n-heksana Pimpinella alpina Molk adalah 5,58 mg ekuivalen kuersetin/gram fraksi kering.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  fraksi  n- heksana Pimpinella alpina Molk  mengandung  senyawa- senyawa fenolat dan flavonoid sehingga dapat digunakan untuk  analisis  fenolat  total  dan  flavonoid  total  pada fraksi  etanolnya.  Fraksi  etanol Pimpinella  anisum mengandung fenolat total yaitu 77,5 mg ekuivalen asam galat/gram  fraksi  kering.  Menurut  Pramono  [4]  yang telah  menentukan  flavonoid  total  dari  fraksi  etil  asetat Pimpinella alpina yaitu 0,78 mg ekuivalen epigenin/gram fraksi kering. Perbedaan fenolat total dan flavonoid total dalam  fraksi  n-heksana Pimpinella  alpina Molk  dengan fenolat  total  dan  flavonoid  total  dalam  fraksi  etanol Pimpinella anisum dan fraksi etil asetat Pimpinella alpina ini disebabkan oleh perbedaan distribusi senyawa fenolat dan  flavonoid  yang  cenderung  akan  banyak  terlarut dalam pelarut polar seperti etanol dan etil asetat.

## Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH
Penentuan  aktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan uji DPPH  (1,1-difenil-2-pikrilhidrasil)  terhadap  fraksi etanol  dan  n-heksana.  Pengurangan  intensitas  warna ditandai  dengan  penurunan  absorbansi  pada  panjang gelombang 517 nm [14]. Reaksi peredaman radikal DPPH dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Reaksi peredaman radikal DPPH
Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH pada fraksi n-heksana diperoleh  IC 50 sebesar 13485 ppm. Hal ini disebabkan karena fraksi n-heksana Pimpinella alpina Molk memiliki  senyawa-senyawa  fenolat/  flavonoid yang menurut Liu dkk. [15] memiliki peran penting dalam peredaman radikal DPPH.
Penelitian ini telah berhasil dilakukan analisis total fenolat,  total  flavonoid  dan  uji  aktivitas  antioksidan terhadap  fraksi  n-heksana  yang  diduga  mengandung senyawa  fenolat  lain.  Data  ini  penting  dilakukan  guna memberikan  gambaran  mengenai  aplikasi-aplikasi fraksi etanol dan n-heksana dari Pimpinella alpina Molk sebagai  bahan  sediaan  yang  bermanfaat  untuk antioksidan.

## Identifikasi Senyawa Kumarin
Keberadaangolongan  kumarin  sebagai  salah  satu senyawa  fenolat  ditunjukkan  dengan  metode  yang dilakukan oleh Farnsworth [10] dan metode KLT menurut Chakraborty dkk. [12].  Uji  kumarin  menunjukkan  hasil yang  positif  pada  ekstrak  etanol  dan  fraksi  n-heksana dengan terbentuknya warna fluoresensi hijau kuning di bawah lampu UV 365 nm pada kertas saring jenuh NaOH 10%  yang  telah  diuapi  sampel  [10],  seperti  yang ditunjukkan pada Gambar 4.
Gambar 4. Uji fitokimia kumarin pada eksrtak etanol dan fraksi n-heksana dengan metode Farnsworth [10]
Memurut  metode  Chakraborty dkk. [12]  yang dilakukan dengan KLT dilakukan dengan pengembang n- heksana:diklorometana:etil  asetat  8:1:6,  noda  dilihat dengan  lampu UV 365  nm.  Untuk  memperjelas  warna noda  dari  kumarin  plat  KLT  disemprot  dengan  NH 3 sebagai  pereaksi  warna  [13],  kemudian  plat KLT dilihat kembali  di  bawah  lampu UV 365  nm.  Adanya  kumarin ditandai  dengan  flouresensi  yang  berwarna  hijau kekuningan [11], seperti disajikan pada Gambar 5.
Gambar 5. Profil noda KLT fraksi n-heksana
Keterangan:
(A) pengembang  toluen:eter  dijenuhkan  dengan 10% asam asetat [11],
(B) pembanding kumarin [11],
N N NO 2 NO 2 O 2 N N N NO 2 NO 2 O 2 N 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (radikal bebas) 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin (bukan radikal) Pendonor atom H H
(C) pengembang  n-heksana:  diklorometana:etil asetat 8:1:6 dan pereaksi warna NH 3 [12, 13]
Kromatografi kolom bertujuan untuk mendapatkan komponen  senyawa  yang  terdapat  di  fraksi  n-heksana. Kemudian  dilakukan  analisis  manggunakan  metode kromatografi lapis tipis (KLT), pada pola noda yang sama digabungkan  sehingga  diperoleh  beberapa  fraksi  yang selan-jutnya disebut sebagai fraksi A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, dan K. Hasil dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Profil noda fraksi A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, dan K dengan pengembang n-heksana: diklorometana
2:1 di bawah lampu UV 365 nm
Hasil dari pengelompokan fraksi diperoleh 11 fraksi, yang kemudian disebut dengan fraksi A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, dan K. Analisis selanjutnya dilakukan pada F 1 (D dan E) karena jumlahnya lebih banyak dari yang lainnya.
Analisis  dengan  KLT  preparatif  selanjutnya dilakukan  pada  isolat  F 1 dengan  pengembang  n- heksana:dikolorometana:etil asetat 8:1:6 yang mempunyai  pola  pemisahan  terbaik  setelah  melalui analisis  berbagai  pelarut.  Noda  yang  diduga  golongan kumarin ditunjukkan dengan warna hijau kuning [11] di bawah lampu UV 365 nm, seperti yang ditunjukkan pada Gambar  7,  kemudian  dilakukan  uji  kemurnian  dengan berbagai pelarut.
Gambar 7. Profil noda KLT preparatif dengan pengembang n-heksana:dikolo-rometana:etil asetat 8:1:6 di bawah lampu UV 365 nm
Hasil  uji  kemurnian  dengan  berbagai  pelarut menunjukkan adanya satu noda yang ditunjukkan pada Gambar 8.
Gambar 8. Hasil uji kemurnian isolat F1 dengan berbagai pengembang dengan pereaksi warna NH 3 , dilihat di bawah lampu UV 365 nm
Keterangan:
(1) n-heksana,
(2) aseton,
(3) kloroform,
(4) n-heksana:diklorome-tana:etil asetat 8:1:6,
Uji kemurnian menggunakan berbagai pengembang terhadap  noda  uji  hasil  KLT  preparatif  menunjukkan adanya  noda  tunggal  yang  berwarna  hijau  kuning, setelah plat KLT disemprot dengan pereaksi warna NH 3 dan dilihat di bawah lampu UV 365 nm, sehingga dapat noda  hasil  KLT  prparatif  F 1 merupakan  golongan senyawa  kumarin.  Senyawa  kumarin  yg  diperoleh  dari KLT  preparatif  tidak  dilakukan  analisis  mengingat kuantitasnya  sangat  terbatas.  Bagaimanapun  juga struktur lengkap kumarin belum dapat dibuktikan secara lengkap.

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  serangkaian  analisis  terhadap tanaman Pinpinella  alpina Molk  memiliki  kandungan senyawa  total  fenolat  fraksi  n-heksana  yaitu  45,04  mg ekuivalen  asam  galat/g  fraksi  kering  dan  kandungan senyawa total flavonoid terbesar fraksi n-heksana yaitu 5,58  mg  ekuivalen  kuersetin/gram  fraksi  kering. Sedangkan  aktivitas  antioksidan  ditunjukkan  dengan (IC 50 ) 13485 ppm. Noda hasil KLT prparatif F 1 merupakan golongan senyawa kumarin.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Abbas  Ali  Dehpour,  Mohammad  Ali  Ebrahimzadeh, Nabavi  Seyed  Fazel,  Nabavi  Seyed  Mohammad, Antioxidant activity of the methanol extract of Ferula assafoetida and its essential oil composition, Grasas
y
aceites , 60, 4, (2009) 405-412
http://dx.doi.org/10.3989/gya.010109
[2]  K  Hüsnü  Can  Baser,  Nurhayat  Tabanca,  Nese Kirimer, Erdal Bedir, Ikhlas A Khan, David E Wedge, Recent  advances  in  the  chemistry  and  biological activities  of  the  Pimpinella  species  of  Turkey, Pure and  applied  chemistry ,  79,  4,  (2007)  539-556 http://dx.doi.org/10.1351/pac200779040539
[3]  M Suzery, Nurhasnawati E Ngadiwiyono, B Cahyono, Senyawa  stigmasterol  dari  Pimpinella  alpina  Molk, Media Medika Indonesiana, Suppl , 29, 1, (2004) 37-39
[4]  Suwijiyo  Pramono,  Efek  Antiinflamasi  Beberapa Tumbuhan  Umbelliferae, HAYATI  Journal  of Biosciences , 12, 1, (2005) 7-10 http://dx.doi.org/10.1016/S1978-3019(16)30316-3
[5]  Trevor  Robinson,  Kandungan  organik  tumbuhan tinggi, Bandung: ITB , 14, 3, (1995) 1-6
[6]  G.  K.  Jayaprakasha,  Tamil  Selvi,  K.  K.  Sakariah, Antibacterial  and  antioxidant  activities  of  grape (Vitis  vinifera)  seed  extracts, Food  Research
International , 36, 2, (2003) 117-122 http://dx.doi.org/10.1016/S0963-9969(02)00116-3 [7]  Saeid Soltani, Sara Saadatm, Ramzanali
Khavarinejad,  Taher  Nejadsattari,  Antioxidant  and antibacterial activities of Cladophora glomerata (L.)
Ktz.  in  Caspian  Sea  Coast,  Iran, African  Journal  of
Biotechnology , 10, 39, (2011) 7684-7689 http://dx.doi.org/10.5897/AJB11.491
[8]  Kamran  Ghasemi,  Yosef  Ghasemi,  Mohammad  Ali Ebrahimzadeh,  Antioxidant  activity,  phenol  and flavonoid  contents  of  13  citrus  species  peels  and tissues, Pak J Pharm Sci , 22, 3, (2009) 277-281
[9]  Saurabh  K  Banerjee,  CG  Bonde,  Total  phenolic content  and  antioxidant  activity  of  extracts  of Bridelia  Retusa  Spreng  Bark:  Impact  of  dielectric constant  and  geographical  location, Journal  of
Medicinal Plants Research , 5, 5, (2011) 817-822
[10] Norman R. Farnsworth, Biological and phytochemical  screening  of  plants, Journal  of Pharmaceutical  Sciences ,  55,  3,  (1966)  225-276 http://dx.doi.org/10.1002/jps.2600550302
[11]  Hildebert Wagner, Sabine Bladt, Plant drug analysis: a  thin  layer  chromatography  atlas,  2 th Edition  ed., Springer Science & Business Media, Germany, 1996.
[12] DD Chakraborty, V Ravi, P Chakraborty,
Phytochemical  evaluation  and  TLC  protocol  of various extracts of Bombax ceiba Linn, International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research , 1, 8,
(2010) 66-73
[13] TRABI Fézan, Purification and characterization of a coumarin  in  methanolic  leaf  extracts  of  Secamone afzelii (Asclepiedacea) from Côte d'Ivoire, Journal of Animal & Plant Sciences , 3, 2, (2009) 182-185
[14] S Banerjee, Judy Gopal, P Muraleedharan, AK Tyagi, Baldev Raj, Physics and chemistry of photocatalytic titanium  dioxide:  visualization  of  bactericidal activity  using  atomic  force  microscopy, Current Science , 90, 10, (2006) 1378-1383
[15] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Bao Yang, Yueming  Jiang,  Antioxidant  activity  of  methanolic extract  of  emblica  fruit  (Phyllanthus  emblica  L.) from six regions in China, Journal of Food Composition and Analysis , 21,
3, (2008) 219-228 http://dx.doi.org/10.1016/j.jfca.2007.10.001