## PENDAHULUAN
Kebutuhan benih udang galah unggul dirasa semakin mendesak, seiring pesatnya budidaya  udang galah di Indonesia dan tuntutan pengembangan sistem budidaya yang  kompetitif.  Benih  dengan  potensi  tumbuh  yang cepat diharapkan dapat menekan biaya produksi dan meningkatkan  kapasitas  produksi  tahunan  kolam
budidaya, tentunya dengan durasi pemeliharaan yang lebih  cepat.  Mekanisme  produksi  benih  unggul  telah ditempuh melalui pendekatan breeding program, baik seleksi  maupun hibridisasi,  meskipun hasilnya  belum signifikan memberikan sumbangsih bagi peningkatan produksi udang galah nasional. Teknologi terkini, yang diharapkan  dapat  mempercepat  pembentukan  strain udang  galah  dengan  potensi  tumbuh  cepat  adalah transgenesis, karena telah terbukti mampu meningkatkan potensi  tumbuh  berbagai  jenis  ikan  hingga  200% (Sarmasik, 2003).
Perkembangan  metode  transgenesis  telah  me- mungkinkan transfer gen (TG) dilakukan dengan berbagai cara, yaitu mikroinjeksi, elektroforesis, TG menggunakan bantuan  vektor,  dan  TG  menggunakan  bantuan  sel (Alimuddin et al., 2003). Transgenesis pada ikan dilakukan melalui  berbagai  metode,  yang  sudah  cukup  lama berkembang melalui transfer DNA asing, baik ke inti sel telur, sitoplasma embrio yang berkembang, dan telur yang sudah terbuahi. Elektroforesis fragmen DNA asing ke telur yang sudah terbuahi adalah teknik yang lebih populer bila dibandingkan teknik mikroinjeksi konvensional, dengan beberapa  kelebihan,  yaitu  lebih  sederhana,  tingkat keberhasilan tinggi, dan efisien (Sarmasik, 2003). Namun demikian, kehandalan transfer gen melalui elektroforasi pada  telur  yang  sudah  terbuahi  masih  belum  cukup menjanjikan untuk telur dalam jumlah banyak (Shi-Shen Li & Huai-Jen Tsai, 2000).

## Transgenesis  pada  Ikan
Selama ratusan tahun manusia berusaha meningkat- kan kualitas induk ikan melalui program seleksi. Beberapa program  seleksi  telah  menunjukkan  keberhasilan peningkatan  performa  tumbuh  ikan  dengan  rata-rata perbaikan  genetik  (genetic  gain)  sebesar  10%-20%  per generasi (Gjedrem & Baranski, 2009). Namun demikian, seiring  kebutuhan  industrialisasi  akuakultur  yang menuntut efisiensi biaya dan waktu maka pengembangan bioteknologi  yang  memungkinkan  percepatan  sistem produksi melalui penggunaan benih dengan performa tumbuh “super cepat” terus digalakkan.

## ABSTRAK
Teknologi transfer gen, yang lebih dikenal sebagai transgenesis,  diharapkan  dapat  menjadi  salah satu solusi guna mempercepat penyediaan induk ikan dan udang unggul di Indonesia. Pada banyak spesies ikan, keberhasilan teknologi transgenesis telah  mampu  membentuk  strain  ikan  dengan performa tumbuh hingga 200% dari ikan normal. Agar teknologi transfer gen dapat dilakukan, maka teknik  fertilisasi  dan  penetasan  buatan  harus dikuasai dengan baik. Spesifik pada udang galah, produksi larva hampir selalu dilakukan dengan sistem  pemijahan  dan  penetasan  telur  alami, karena dirasa lebih mudah dan menguntungkan sehingga  teknologi  inseminasi  dan  penetasan buatan  kurang berkembang.  Namun  demikian, mengingat persyaratan tahap transgenik tersebut maka teknologi inseminasi dan penetasan telur buatan pada udang galah harus segera dikuasai sehingga program transfer gen dapat dilakukan di Indonesia. Informasi keberhasilan pengambilan sperma, preservasi  sperma, transfer  gen, pem- buahan buatan, dan penetasan buatan pada udang galah merupakan hal menarik yang akan penulis uraikan dalam artikel ini. Tujuan utama transfer gen pada udang galah adalah mendapatkan strain udang galah tumbuh cepat dan tahan penyakit sehingga  mampu  mendukung  peningkatan produksi udang galah nasional.
KATA KUNCI: inseminasi  buatan,  sperma, transgenesis, udang galah

## Ikhsan Khasani
Balai Penelitian Pemuliaan Ikan Jl. Raya Sukamandi No. 2, Subang 41256 E-mail:  ikhsankhasani@yahoo.com

## KRIOPRESERVASI SPERMATOFOR DAN INSEMINASI BUATAN PADA UDANG GALAH, TAHAP AWAL TRANSGENESIS UDANG GALAH
Dalam dua dekade, transgenesis telah dilakukan pada lebih dari 35 spesies ikan. Sebagian besar transgenesis tersebut  diarahkan  untuk  meningkatkan  karakter pertumbuhan (Beaumont & Hoare, 2003), melalui trans- fer  konstruksi  gen  GH  (growth  hormon),  karena pertumbuhan merupakan parameter terpenting dalam produksi ikan. Karakter lain yang menjadi sasaran pro- gram transgenesis pada ikan adalah ketahanan terhadap penyakit, ketahanan terhadap suhu rendah, dan toleran terhadap  salinitas  (Nam  et al.,  2001).  Dalam  perkem- bangannya, berbagai metode transfer gen telah berhasil diciptakan,  seperti  mikroinjeksi  dan  elektroforasi. Keberhasilan  transgenesis  sangat  ditentukan  oleh karakter objek yang akan ditransfer gen asing tersebut, yaitu sel sperma, sel telur, atau telur yang telah terbuahi (embrio telah berkembang). Pemilihan metode yang tepat berdasarkan karakter-karakter biologis tersebut akan menjamin efektivitas keberhasilan transfer gen.
Elektroforesis fragmen DNA asing ke telur yang sudah terbuahi adalah teknik yang populer bila dibandingkan teknik  mikroinjeksi  konvensional,  dengan  beberapa kelebihan, yaitu lebih sederhana, tingkat keberhasilan tinggi, dan efisien. Namun demikian, kehandalan trans- fer  gen  melalui  elektroforasi  pada  telur  yang  sudah terbuahi masih belum cukup tinggi untuk telur dalam jumlah banyak dan dalam waktu pendek (Shi-Shen Li & Huai-Jen Tsai, 2000).
Terkhusus pada hewan air, ketertarikan sistem trans- fer  gen  melalui  media  sperma  semakin  meningkat dikarenakan  beberapa  keuntungan  yang  diberikan. Pertama,  transfer  gen  melalui  sperma  (TGMS)  dapat diaplikasikan  untuk  telur  dalam  jumlah  sangat  besar. Kedua, TGMS lebih efektif dibandingkan transfer gen konvensional  karena  pada  transfer  gen  konvensional sering  dihadapkan  pada  kendala  karakter  telur  yang buram, tebal, mengapung, dan memiliki pelapis (chorion) yang tebal. Ketiga, DNA asing yang dibawa melalui sperma akan  ditransfer  masuk  ke  nukleus  (inti  sel)  sehingga peluang berhasilnya lebih tinggi. Pada sistem elektroforasi masih ada kendala bila volume blastodisc sangat kecil, misalnya  pada  telur  yang  sudah  terbuahi,  sehingga peluang  fragmen  DNA  tertransfer  masuk  ke-blastodisc sangat kecil. Keempat, sperma ikan dan udang dapat diaktivasi  dengan  menambahkan  air  sehingga  dapat diawetkan  (cryopreservasi).  Jadi  sperma  selalu  siap digunakan setiap waktu (SI-Shen Li & Huai-Jen-Tsai, 2000).
Berdasarkan  serangkaian  pengujian  transgenesis pada kelompok krustase, hanya ada sedikit metode yang terbukti  efektif.  Gendreau  &  Clleagus  (1995)  dalam
SI-Shen  Li  &  Huai-Jen-Tsai,  2000 melaporkan  bahwa teknik ballistik walau dapat digunakan untuk mentransfer gen asing ke Artemia sp. namun membutuhkan investasi yang sangat besar dengan capaian yang kurang memadai untuk  skala  massal.  Bensheg  &  khoo  (1997)  dalam SI-Shen  Li  &  Huai-Jen-Tsai,  2000 juga  telah  berhasil mentransfer  gen  tertentu  dalam  udang  tawar, Macrobrachium  lanchesteri,  namun  demikian  teknik mikroinjeksi tersebut bersifat laboratoris, memerlukan waktu lama, dan hanya kurang efektif untuk telur dalam jumlah banyak. Selanjutnya, SI-Shen Li & Huai-Jen-Tsai (2000) menjelaskan ada teknik yang efektif dan akurat diterapkan untuk transfer gen pada udang galah. Terkait metode trangenesis tersebut, maka serangkaian teknik pendukung harus dikuasai dengan baik sehingga produksi udang galah super growth dapat terwujud. Teknik-teknik terkait tersebut adalah teknik pengambilan sperma (arti- ficial ejaculation), pemijahan buatan (artificial insemination), dan pengawetan sperma (sperm cryopreservation).

## Teknik Pengambilan Sperma
Beberapa penelitian untuk meningkatkan keragaan reproduksi udang galah telah dilakukan dan menunjukkan kemajuan, di antaranya melalui manipulasi lingkungan, yang dapat diaplikasikan pada sistem pemijahan udang galah yaitu teknik pemijahan buatan (artificial insemina- tion). Pemijahan buatan, melibatkan intervensi manusia dalam proses pemijahan, berguna untuk melindungi biota dari pemangsa dan kondisi yang tidak menguntungkan seperti perubahan suhu secara fluktuatif, mengupayakan kondisi yang lebih baik untuk udang dapat tumbuh dan bertahan hidup, serta menghasilkan tingkat pembuahan dan penetasan yang lebih baik. Teknik pemijahan buatan dapat meningkatkan produktivitas pembenihan karena dapat memproduksi larva di luar musim pemijahannya. Pemijahan buatan juga dapat diterapkan untuk program kawin silang (Soundarapandian & Kannupandi, 2000), yang pada  beberapa  kasus  udang  dari  alam  belum  dapat dipijahkan secara alami di kolam budidaya (Khasani, 2009, tidak dipublikasikan).
Salah satu faktor yang mempengaruhi keberhasilan pemijahan  adalah  kualitas  sperma.  Toelihere  (1981) menyatakan bahwa kualitas sperma merupakan faktor penting  yang  dapat  menentukan  pemijahan,  yaitu kemampuan  dalam  membuahi  sel  telur.  Pengambilan sperma pada induk jantan dapat dilakukan dengan cara manual,  yaitu  menekan  spermatofor  secara  hati-hati sampai spermatofor keluar dari  lubang genital (Gwo, 2000). Selain itu, spermatofor juga dapat dikeluarkan dengan menggunakan kejutan listrik (Jerry, 2001).
Kejutan listrik terjadi jika medan listrik mengenai sel hidup.  Paparan  medan  listrik  ini  merupakan  faktor eksternal dari lingkungan berupa rangsangan melalui induksi kejutan listrik. Menurut Nair (1989), induksi pada benda hidup disebabkan adanya muatan-muatan listrik bebas yang terdapat pada ion kaya cairan seperti darah, getah bening, otot, dan syaraf yang dapat terpengaruh gaya yang dihasilkan oleh aliran arus listrik. Oleh karena itu, diharapkan rangsangan lingkungan berupa induksi kejutan listrik yang diterima oleh ganglion otak dapat membantu kerja Organ Y yaitu organ penghasil hormon perangsang  gonad  (Gonad  Stimulating  Hormone,  GSH) dalam pembentukkan sperma pada induk jantan udang galah.  Keberhasilan  induksi  kejutan  listrik  ini  meng- andalkan kisaran voltase yang digunakan mengingat besar dan kecilnya aliran arus listrik dapat mempengaruhi ion kaya cairan seperti darah, getah bening, otot, dan syaraf.
Teknik pengambilan sperma melalui kejutan listrik telah berhasil dilakukan di Balai Penelitian Pemuliaan Ikan, Sukamandi, dengan voltase optimal sebesar 9 V, yang memberikan data keberhasilan pengambilan spermatofor 100%, viabilitas sperma norma, abnormalitas sperma 0%, dan kematian induk 0% (Mutiasari, 2010). Pengambilan spermatofor  melalui  kejutan  dilakukan  dengan  me- nempelkan salah elektroda (menggunakan electrostimulation 25 mV) dipangkal kaki jalan kelima, dan satu elektroda lainnya disentuhkan selama 1 detik pada pangkal kaki jalan kelima lainnya. Kejutan dilakukan dalam 3-5 ulangan. Posisi bagian yang diberi perlakuan kejutan ditampilkan pada Gambar 1.
Kejutan listrik dapat mempengaruhi sistem koordinasi yang terdapat dalam tubuh udang. Sistem koordinasi pada
hewan meliputi sistem saraf beserta indera dan sistem endokrin (hormon). Pada udang adanya rangsangan dari luar akan diterima oleh sistem syaraf pusat (SSP) dan selanjutnya diteruskan ke organ Y, kemudian organ Y akan menyekresikan  gonado  somatic  hormone  (GSH)  yang berfunsi  untuk  merangsang  hormon  androgen  dalam mengatur pengeluaran sperma (Gambar 2).
Rangsangan  induksi  kejutan  listrik
Sistem  syaraf  pusat  otak Thoracic  ganglion Organ Y GSH Hormon  androgen Pengeluaran sperma
Gambar 2. Proses  rangsangan  induksi  kejutan  listrik
Gambar 1. Posisi kelamin udang galah jantan (kiri) dan perlakuan kejutan listrik (kanan), (1. Petasma, 2. Elektroda negatif,  3.  Elektroda  positif)
3 2 1

## Inseminasi  Buatan
Udang galah termasuk hewan yang heteroseksual yaitu mempunyai jenis kelamin jantan dan betina yang terpisah. Organ reproduksi utama dari udang jantan adalah testes, vasa derefensia, apendiks maskulina, dan petasma. Petasma merupakan modifikasi bagian endopodit pasangan kaki renang pertama. Sistem reproduksi udang galah betina terdiri atas sepasang ovarium, sepasang oviduk, lubang genital, dan thelycum. Thelycum terletak di bagian ventral dada pada pasangan kaki jalan ketiga terdiri atas lempeng kecil anterior dan sepasang plat (lempeng) yang agak besar. Thelicum berongga tetapi tertutup rapat oleh ketiga lempeng tersebut. Rongga ini berfungsi sebagai tempat menyimpan sperma yang ditempelkan udang jantan bila terjadi perkawinan. Lempeng-lempeng penutup thelicum cukup keras  tetapi transparan sehingga  ada tidaknya sperma di dalam dapat terlihat bila diterawang.
Pada sistem pemijahan normal, udang galah dewasa berumur minimal 6 bulan dipelihara secara komunal di kolam dengan mencampurkan 2-3 jantan untuk 10 ekor betina (D’Abramo et al., 1995). Secara umum, di daerah tropis udang galah dapat memijah sepanjang tahun secara alami. Pengamatan bulanan terhadap populasi udang galah dewasa yang dipelihara secara bersamaan antara jantan dan betina akan diperoleh udang yang bertelur (sudah berhasil dibuahi) sekitar 25%-30%. Jadi, ketersediaan larva bukan merupakan kendala utama sistem produksi benih udang  galah  bila  tersedia induk  udang  dalam  jumlah memadai. Sebagai gambaran, induk udang galah dengan ukuran 30-40 g dapat menghasilkan larva sekitar 20-25 ribu ekor.
Pada kondisi lingkungan optimal, khususnya terkait suhu air dan ketersediaan nutrisi, maka udang galah jantan
mampu membuahi betina hingga 5 ekor dalam waktu hampir bersamaan, sehingga sistem pemijahan dengan rasio kelamin 1 jantan : 5 betina masih efektif untuk produksi larva (Ali, 2006). Dijelaskan oleh D’Abramo et al. (1995) bahwa pada sistem produksi larva secara alami, proporsi induk jantan capit biru, capit oranye, dan udang galah ukuran kecil yang dipijahkan harus tepat, yaitu untuk setiap jantan capit biru (Blue Claw, BC) harus ditempatkan 3-4 jantan capit oranye (Orange Claw, OC). Hal tersebut karena adanya potensi reproduksi yang berbeda antar jenis pejantan. Fenomena lain yang perlu diketahui adalah bahwa pada umur tertentu kapasitas reproduksi jantan BC sangat berkurang, dan baru akan aktif kembali setelah ganti kulit.
Di  samping  sistem  pemijahan  alami  sebagaimana diuraikan  di  atas,  telah  dirintis  teknik  pemijahan (inseminasi) buatan yang diharapkan akan berguna dalam mendukung program pemuliaan udang galah, khususnya transfer  gen.  Dikarenakan  kualitas  sperma  sangat berpengaruh  terhadap  derajat  fertilitas  telur,  maka pemilihan induk jantan dan teknik pengambilan sperma yang tepat harus dijalankan secara seksama.
Teknik  pemijahan  buatan  melibatkan  kegiatan reproduksi  induk  udang  jantan  yang  meliputi  proses penyatuan spermatofor udang jantan ke dalam tellicum udang  betina  sehingga  terjadi  proses  pembuahan. Spermatofor  memegang  peranan  penting  dalam pemindahan dan penyimpanan spermatozoa pada udang (Lante  &  Haryanti, 2005),  sehingga  kualitasnya  harus dijaga.  Salah  satu  ciri  spermatofor  yang  baik  adalah tidak terdapat melanisasi pada permukaannya. Proses penyatuan sperma di thelicum ditampilkan pada Gambar 3.
Gambar 3. Posisi lubang genitalia betina, thelicum (kiri) dan proses penempelan spermatofor pada thelicum (kanan)
Selain  ditentukan  oleh  kualitas  induk  jantan  dan sperma yang disiapkan, pemijahan buatan akan berhasil bila  dilakukan terhadap  induk betina  yang telah  siap memijah. Udang galah yang matang kelamin ditandai dengan adanya warna kuning pada ovarium yang teramati jelas  di  bagian  dorsal  cephalothorax,  disebut  tingkat kematangan  gonad  (TKG)  III,  selanjutnya  ovarium berkembang menjadi oranye, dan pada TKG V menjadi kemerahan.  Pada  saat  tersebut  udang  berganti  kulit (premating moult) dan tidak lama berselang siap dibuahi (New & Valenti, 2000). Jadi, guna mendapatkan induk betina untuk pemijahan buatan diperlukan persiapan dan pengamatan sejumlah induk betina, sehingga didapat induk betina yang baru premating moult.
Teknik pemijahan buatan pada golongan krustase telah dilakukan, di antaranya pada udang windu, vanamei, dan lobster. Akan tetapi, teknik pemijahan buatan pada udang galah belum banyak dilakukan, terutama di Indonesia. Inseminasi buatan pada udang galah telah dilakukan oleh Bart et al. (2006) yang melaporkan bahwa pemijahan buatan pada  udang  galah  menggunakan  spermatofor  hasil pembekuan memberikan hasil derajat pembuahan cukup tinggi, hingga 79,9% dari jumlah induk betina perlakuan. Proses embriogenesis telur dari hasil inseminasi buatan juga tergolong tinggi sehingga daya tetas telur mencapai 87,8%.

## Penyimpanan Sperma (Sperm Cryopreservation)
Kriopreservasi  atau  penyimpanan  gamet  sangat berperan  dalam  inseminasi  buatan,  program  seleksi, konservasi  gen,  dan  penyediaan  gamet  sesuai  waktu (Akarasanon  et  al.,  2004).  Kriopreservasi  gamet  pada organisme  akuatik  telah  dikuasai  dengan  baik  dan dilakukan pada lebih dari 200 spesies ikan tawar dan laut (Bart et al., 2006).
Selama ini, kriopreservasi sperma pada udang kurang mendapat perhatian karena pada industri penyediaan benih udang windu dan udang galah produksi larva dilakukan dengan  pemijahan  alami.  Namun  demikian,  terkait beberapa program pemuliaan dan konservasi gen maka inseminasi buatan harus dilakukan, sehingga ketersediaan sperma berkualitas baik juga harus diperhatikan. Beberapa teknik penyimpanan sperma telah dikuasai, baik untuk tujuan penyimpanan jangka pendek maupun penyimpanan jangka  panjang.  Dilaporkan  oleh  Chow  (1982)  dalam Akarasanon et al. (2004), bahwa sperma udang galah dapat disimpan  selama  96  jam  dalam  suhu  2°C,  dan  dapat bertahan  hingga 31  hari  bila  disimpan dalam  larutan nitrogen.
Persiapan sperma dilakukan dengan diawali pengam- bilan spermatofor melalui  kejutan listrik. Selanjutnya spermatofor yang diperoleh disimpan dalam micro tube volume 2 mL yang telah diisi bahan krioprotektan berupa gliserol  (G)  atau  etilen  gliserol  (EG).  Guna  keperluan jangka  pendek,  spermatofor  dalam  krioprotentan tersebut cukup disimpan dalam suhu -20°C, dan ternyata mampu mempertahankan kualitas sperma hingga 10 hari penyimpanan.  Sementara  itu,  apabila  sperma  akan disimpan dalam jangka waktu lebih lama, hingga 150 hari, maka penyimpanan  dilakukan pada  suhu -196°C.  Jadi efisiensi  penyimpanan  spermatofor  udang  galah ditentukan  oleh  jenis  bahan  krioprotektan  dan  suhu penyimpanan.

## KESIMPULAN
Upaya  pemenuhan  kebutuhan  protein  hewani ditempuh melalui penerapan bioteknologi dalam berbagai aspek, termasuk reproduksi. Keberhasilan transfer gen pada beberapa spesies ikan mendorong manusia untuk mengembangan teknik tersebut pada sejumlah spesies potensial lainnya, termasuk udang galah. Penguasaan teknik  penyediaan  dan  penyimpanan  sperma,  serta inseminasi buatan pada udang galah merupakan faktor penunjang menuju keberhasilan program transfer gen pada udang galah.

## DAFTAR ACUAN
Akarasanon,  K.,  Damrongphol,  P.,  &  Poolsanguan,  W. 2004. Long-term cryopreservation of spermatophore of  the  giant  freshwater  prawn,  Macrobrachium rosenbergii de Man. Aquaculture Research, 35: 1,415- 1,420.
Ali, F. 2006. Tingkat Produktivitas Induk Udang Galah (Macrobrachium  rosenbergii)  Pada  Budidaya  Dengan Sistem Resirkulasi. Limnotek, 13(1): 56-63.
Alimuddin, Yoshizaki, G., Carman, O., & Sumantadinata,
K. 2003. Aplikasi transfer gen dalam akuakultur. J. Akuakultur Indonesia, 2(1): 41-50.
Bart, A.N., Choosuk, S., & Thakur, D.P. 2006. Spermato- phore cryopreservation and artificial insemination of black tiger shrimp, Penaeus monodon (Fabricius). Aquaculture Research, 37: 523-528.
Beaumont, A.R. & Hoare, K. 2003. Biotechnology and genetics in fisheries and aquaculture. Blackwell Pub- lishing, Oxford, ix + 155 pp.
D’Abramo, L.R., Daniels, W.H., Fondren, M.W., & Brunson, M.W.  1995.  Management  Practices  for  culture  of freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) intem- perate climates. MAFES Bulletin 1030, 12 pp.
Gjedrem, T. & Baranski, M. 2009. Selective breeding in aquaculture: an introduction. Springer Science, Lon- don, 217 pp.
Gwo,  J.-C.  2000.  Cryopreservation  of  sperm  of  some marine fishes, in: Cryopreservation in Aquatic Species, Tiersch, T.R. & Mazik, P.M. (Eds.) Advances in World Aquaculture, 7, 138, 2000, Baton Rouge, LA, USA. World Aquaculture Society.
Harris, S.E. & Sandifer, P.A. 1986. Sperm Production and The Effects of  Electrically Induced Spermatophore Expulsion in The Prawn Macrobrachium rosenbergii de Man. J. of Crustaceans Biology, 6(4): 633-647.
Jerry, D.R. 2001. Electrical stimulation of spermatophore extrusion in the freshwater yabby (Cherax destructor). CSIRO Livestock Industries, Locked Bag 1, Armidale, NSW 2350, Australia.
Lante, S. & Haryanti. 2005. Keragaman sel sperma udang windu Penaeus monodon Fab. Asal laut dan tambak. J. Pen. Perik. Indonesia, 11(7): 13-18.
Mutiasari,  T.  2010.  Efektivitas  kejutan  listrik  terhadap pengeluaran  spermatophor  dan kualitas  sperma  udang galah. Skripsi. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan UNPAD, Bandung.
Nair, I. 1989. Biological Effects of Power Frequency Elec- tric and Magnetic Fields. Background Paper, Assesment
of Electric Power Wheeling and Dealing: Technologi- cal Consideration for Increasing Competition, OTA- BP-E-53, Washington DC: U.S. Government Printing Office.
Nam, Y.K., Noh, J.K., Cho, Y.S., Cho, H.J., Cho, K.N., Kim,
G., & Kim, D.S. 2001. Dramatically accelerated growth and extraordinary gigantism of transgenic mud loach Misgurnus mizolepis. Trans Res., 10: 353-362.
New, M.B. & Valenti, W.C. 2000. Freshwater prawn cul- ture:  The  farming  of  Macrobrachium  rosenbergii. Blackwell Science, Oxford, xix + 435 pp.
Sarmasik, A. 2003. Application of Gene Transfer Tech- nology  for  Genetic  improvement  of  Fish.  Turk.  J. Zool., 27: 1-6.
Soundarapandian, P. & Kannupandi, T. 2000. Larval pro- duction by crossbreeding insemination of freshwa- ter prawns. Indian J. Fish, 47(2): 97-101.
SI-Shen Li & Huai-Jen Tsai. 2000. Transfer of foreign gene to giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) by spermatophore-microinjection. Molecular Reproduc- tion and Developmen, 56: 149-154.
Toelihere, M.R. 1981. Fisiologi Reproduksi pada Ternak. Angkasa, Bandung, 237 hlm.