## POTENSI BAKTERI ASAM LAKTAT PROBIOTIK INDIGENUS SEBAGAI ANTIDIARE DAN IMUNOMODULATOR

## [Potency of Indigenous Probiotic Lactic Acid Bacteria as Antidiarrheal Agent and Immunomodulator]
Made Astawan 1) *, Tutik Wresdiyati 2) , Irma Isnafia Arief 3) , dan Dwi Febiyanti 1)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
2) Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor
3) Departemen Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor
Diterima 23 Juni 2010 / Disetujui 7 September 2011

## ABSTRACT
The  aim  of  the  study  was  to  observe  the  ability  of  indigenous  probiotic  lactic  acid  bacteria  (LAB)  Lactobacillus  plantarum  2C12  and Lactobacillus fermentum 2B4 as antidiarrheal agent in rats infected by Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), and also to observe their effect as immunomodulator (malonaldehyde level and proliferation of lymphocyte cell). A total of 90 male Sprague Dawley rats were used for this study and divided into 6 groups i.e.: (1) Negative Control (not infected with of EPEC), (2) LAB L. plantarum 2C12, (3) LAB L. fermentum 2B4, (4) LAB L. plantarum 2C12 + EPEC, (5) LAB L. fermentum 2B4 + EPEC, and (6) Positive Control (infected with EPEC). The treatment of LAB was undertaken from 1 st -21 st day, while infection of EPEC using 10 6 cfu/ml per day was undertaken during 8 th -14 th day. Groups administered with LAB L. plantarum 2C12 + EPEC, LAB L. fermentum 2B4 + EPEC, and positive control, showed decreased body weight during 12 th -21 st day. At the 21 st day, positive control group underwent acute diarrhea (fecal water content was 68.2 % b/b). Statistical analysis with Duncan Test showed that the treatment given to six groups of rats gave significant effect (p<0.05) toward PER value, number of lymphocyte cells and malonaldehyde level in liver and kidney of the rats.
Key words : L. plantarum 2C12, L. fermentum 2B4, EPEC, antidiarrheal agent, immunomodulator

## PENDAHULUAN 1
Diare  akut  merupakan  penyebab  utama  kematian  bayi  di negara-negara berkembang, termasuk Indonesia. Di Indonesia, diare masih menjadi masalah kesehatan dan penyakit ini dapat terjadi  pada  semua  golongan  usia.  Diare  dan  gastroenteritis karena infeksi tertentu menjadi urutan pertama penyebab rawat inap  di  rumah  sakit  di  Indonesia,  bahkan  pada  tahun  2006 penyakit  ini  menempati  urutan  ke-3  penyakit  utama  penyebab kematian  di  rumah  sakit  di  Indonesia,  setelah stroke dan perdarahan intrakranial (Anonim, 2008).
Salah satu penyebab diare adalah infeksi bakteri patogen di saluran pencernaan. Beberapa bakteri patogen penyebab diare yaitu Escherichia  coli , Shigella sp., Salmonella sp.,  dan Helicobacter pylori . Diare didefinisikan sebagai buang air besar bersama feses yang tidak berbentuk atau cair dengan frekuensi lebih dari 3 kali selama 24 jam. Penyebab diare terbesar adalah karena  infeksi  dan  intoksikasi  ( poisoning ).  WHO  menyatakan ada  sekitar  4  milyar  kasus  diare  infeksi  setiap  tahun  dengan tingkat mortalitas 3-4 juta per tahun (Zein et al., 2004).
Menurut Fuller (1989), probiotik merupakan mikroorganisme hidup  yang  dapat  dimanfaatkan  untuk  keseimbangan  populasi mikroba  dalam  usus.  Penelitian  para  ahli  telah  membuktikan bahwa  secara in  vitro bakteri  probiotik  galur Lactobacillus dan Bifidodobacteria dapat  menghambat  penempelan  dan  invasi bakteri  enteropatogen  penyebab  diare  (Bourlioux et  al. ,  2003;
* Korespondensi Penulis : Email : mastawan@yahoo.com
Ishibashi, Yamazaki, 2001). Beberapa peneliti juga melaporkan bahwa  mengonsumsi  bakteri  asam  laktat  (BAL)  golongan Lactobacillus mampu  meningkatkan  sistem  imun  seluler  dan humoral  di  antaranya  peningkatan  populasi  dan  proliferasi  sel limfosit,  produksi  sitokin  interferon-γ  (IFN-γ),  interleukin-12  (IL- 12), IL-10, sel imun Th, serta immunoglobulin (Ig) A, IgE, IgG, dan IgM (Gackowska et al. , 2006; dan Aattouri et al. , 2002). Arief et  al .  (2008)  telah  berhasil  mengisolasi  10  BAL indigenus  dari  daging  sapi  yang  berasal  dari  beberapa  pasar tradisional  di  daerah  Bogor.  Ke-10  BAL  tersebut  memiliki karakteristik  sebagai  bakteri  probiotik  dan  menghasilkan senyawa  antimikroba  yang  menghambat  pertumbuhan  bakteri Enteropathogenic  Escherichia  coli (EPEC) ,  Enterotoxigenic Escherichia  coli (ETEC) ,  Staphylococcus  aureus, dan Salmonella Typhimurium . Berdasarkan  hasil  identifikasi diketahui  bahwa L.  plantarum 2C12  dan L.  fermentum 2B4 memiliki  penghambatan  terbaik  terhadap  EPEC.  Namun demikian,  sifat  fungsional  lainnya  belum  diteliti,  terutama  sifat fungsionalnya  sebagai  pencegah  diare  akibat  infeksi  EPEC. Berdasarkan  beberapa  fakta  yang  telah  disebutkan  di  atas, dalam  penelitian  ini  dikaji  lebih  lanjut  mengenai  potensi  BAL, terutama L.  plantarum 2C12  dan L.  fermentum 2B4,  sebagai antidiare dan imunomodulator.
Penelitian  ini  dilakukan  secara in  vivo menggunakan  tikus percobaan. Hipotesis dari penelitian ini adalah BAL L. plantarum 2C12  dan L.  fermentum 2B4  memiliki  karakteristik  sebagai bakteri  probiotik  dan  menghasilkan  senyawa  antimikroba  yang secara in  vitro menghambat  pertumbuhan  bakteri  EPEC. Diduga,  secara in  vivo kedua  BAL  tersebut  dapat  mencegah
diare  yang  diakibatkan  oleh  EPEC  dan  dapat  mempengaruhi status  imun,  yang  dilihat  dari  profil  jumlah  sel  limfosit  organ limpa  dan  kadar  malonaldehida  (MDA)  organ  hati  dan  ginjal tikus percobaan.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan  utama  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah tikus  jantan Albino  Norway  Rats ( Rattus  norvegicus )  galur Sprague  Dawley umur  5-6  minggu  hasil  pengembangbiakan Badan  POM  RI,  ransum  tikus,  suspensi  EPEC,  suspensi L. plantarum 2C12,  suspensi L.  fermentum 2B4,  TEP  (1,1,3,3- tetraetoksipropana), Phosphat Buffer Saline (PBS) pH 7,4 yang mengandung  11,5  g  KCl/L  (disimpan  pada  suhu  2-5 o C),  HCL 0,25  N  yang  mengandung  15%  TCA,  0,38%  TBA,  dan  0,5% BHT,  alkohol  70%,  RPMI-1640  steril,  NH 4 Cl  0,85%  steril, pewarna tryphan blue .
Alat  utama  yang  digunakan  dalam  penelitian  adalah  oven, spektrofotometer  visible (SPECTRONIC  20D+),  mikroskop cahaya (OLYMPUS model CH20BIMF 200) dan hemasitometer Neubauer (BRIGHT LINE ® ).
Perlakuan  terhadap  hewan  percobaan  dan  pengambilan sampel
Tikus  dibagi  dalam  6  kelompok  perlakuan  (Tabel  1).  Tikus diare  dipersiapkan  dengan  cara  menginfeksi  tikus  dengan bakteri EPEC. Selama percobaan, semua kelompok tikus diberi pakan ransum standar.

## Tabel 1. Kelompok perlakuan tikus percobaan
Kelompok Tikus Perlakuan Kontrol negatif Tikus normal yang hanya diberi akuades BAL L. plantarum 2C12 Tikus yang diberi BAL L. plantarum 2C12 BAL L. fermentum 2B4 Tikus yang diberi BAL L. fermentum 2B4
BAL L. plantarum 2C12 + EPEC  Tikus yang diberi BAL L. plantarum 2C12, diselingi infeksi EPEC
BAL L. fermentum 2B4 + EPEC Tikus yang diberi BAL L. fermentum 2B4, diselingi infeksi EPEC Kontrol positif Tikus yang hanya diberi infeksi EPEC
Pemberian BAL dilakukan selama tiga minggu penuh, yaitu dari  hari  ke-1  hingga  ke-21,  secara  oral  menggunakan  sonde. BAL yang diberikan yaitu L. plantarum 2C12 dan L. fermentum 2B4  sebanyak  1  ml  dengan  populasi  10 8 cfu/ml.  Infeksi  EPEC dilakukan  dengan  populasi  10 6 cfu/ml  sebanyak  1  ml  per  hari selama  7  hari  (hari  ke-8  sampai  ke-14),  secara  oral menggunakan sonde.
Pembedahan  tikus  untuk  analisis  peubah  yang  diamati dilakukan pada hari ke-7, 14 dan 21 (Gambar 1). Organ hati dan ginjal diambil untuk dianalisis kadar malonaldehida (MDA) serta organ limpa diambil untuk diuji proliferasi sel limfositnya.
Gambar 1.   Bagan  perlakuan  pada  tikus  percobaan  T0  =  terminasi awal; T1 = terminasi hari ke-7; T2 = terminasi hari ke-14; T3  =  terminasi  hari  ke-21,  masing-masing  5  tikus  setiap kelompok.
Pengukuran bobot badan dan nilai PER ( Protein Efficiency Ratio )
Bobot  badan  tikus  ditimbang  setiap  tiga  hari  sekali  untuk mengetahui  perubahan  bobot  badan  tikus  selama  perlakuan. Nilai PER dihitung dengan persamaan:

## PER =

## Pengamatan terjadinya diare pada tikus terinfeksi EPEC
Kejadian diare tikus percobaan  dapat diamati dengan cara mengukur  kadar  air  feses  yang  dikoleksi  pada  hari  ke-14  dan ke-21.  Penentuan  kadar  air  feses  mengikuti  prosedur  analisis kadar air menurut AOAC (1989).
Analisis  kadar  malonaldehida  hati  dan  ginjal  (Conti et  al. , 1991)
Kadar  Malonaldehida  (MDA)  organ  hati  dan  ginjal  tikus percobaan  diukur  secara  kuantitatif  dengan  metode Thiobarbituric Acid Reactivity Test . Metode ini didasarkan pada reaksi  antara  MDA  dan  TBA  (Thiobarbituric  Acid)  dalam suasana  asam.  Kompleks  MDA-TBA  yang  terbentuk  memiliki warna  merah  jambu  dan  absorbansinya  dapat  diukur  pada panjang  gelombang  532  nm.  Organ  hati  atau  ginjal  ditimbang, kemudian ditambahkan larutan PBS dingin 2,5 ml dan digerus. Hasil  gerusan  kemudian  divorteks  dan  disentrifus  dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Supernatan sebanyak 1 ml  ditambah  4  ml  reagen,  kemudian  divorteks  dan  diinkubasi dalam water  bath 80 o C  selama  60  menit.  Setelah  diinkubasi, sampel  didinginkan  sampai  suhu  ruang,  kemudian  disentrifus 4000  rpm  selama  10  menit.  Pengukuran  absorbansi  sampel dilakukan  pada  λ  532  nm.  Kurva  standar  dibuat  dengan menggunakan TEP (1, 1, 3, 3-tetraetoksipropana) yang diencer- kan  menjadi  beberapa  seri  pengenceran,  kemudian  diukur absorbansinya pada λ 532 nm.

## Pengamatan jumlah sel limfosit (Tejasari, 2000)
Organ limpa tikus percobaan dicuci dalam RPMI-1640 steril, kemudian  dipindahkan  ke  dalam  cawan  petri  yang  berisi  3  ml RPMI-1640  steril.  Limpa  digerus  sehingga  didapat  sel  limfosit. Gerusan  disentrifus  dengan  kecepatan  3000  rpm  selama  10 menit.  Supernatan  dibuang,  sedangkan  pelet  sel  diberi  2  ml NH 4 Cl 0,85% steril selama 2 menit dan segera ditambahkan 3
Kenaikan berat badan (g)
Jumlah protein yang dikonsumsi H(-3) H(0) H(7) H(14) H(21) Adaptasi T0 T1 T2 T3 Cekok BAL Cekok EPEC
ml RPMI-1640. Suspensi kembali disentrifus 3000 rpm selama 10  menit.  Endapan  yang  mengandung  sel  limfosit  kemudian dicuci  dan  diencerkan  dengan  2  ml  RPMI-1640.  Jumlah  sel limfosit  yang  hidup  dihitung  dengan  hemasitometer  dan pewarna tryphan  blue .  Sel  yang  mati  akan  berwarna  biru, sedangkan sel limfosit hidup terlihat transparan.

## Rancangan percobaan
Penelitian  ini  menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap, dengan model matematika sebagai berikut:

## Yij = μ + αi +βj + ε ij
Yij   : pengaruh perlakuan ke-i dan ulangan ke-j μ  : nilai tengah perlakuan αi  : pengaruh perlakuan ke-i βj  : pengaruh ulangan ke-j εij   : galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
Data  dianalisis  dengan  menggunakan  ANOVA.  Jika terdapat  perbedaan  nyata  akan  diuji  lanjut  dengan  uji  Duncan Multiple Comparison Test (Steel dan Torrie, 1995).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Bobot badan tikus dan nilai PER
Pertumbuhan  bobot  badan  tikus  selama  percobaan  dapat dilihat  pada  Gambar  2.  Pada  umumnya  bobot  badan  tikus mengalami  kenaikan  selama  pemeliharaan.  Akan  tetapi,  pada tikus yang diberi EPEC yaitu tikus kelompok BAL L. plantarum 2C12  +  EPEC,  BAL L.  fermentum 2B4  +  EPEC  dan  kontrol positif,  mengalami  penurunan  bobot  badan  sejak  hari  ke-12 hingga  ke-21.  Hal  ini  disebabkan  tikus  tersebut  diduga mengalami  infeksi  saluran  pencernaan  oleh  EPEC,  sehingga proses  penyerapan  zat-zat  gizi  di  dalam  usus  menjadi terganggu.
Gambar 2. Pertumbuhan bobot badan tikus selama 21 hari percobaan
Adhesi  atau  pelekatan  bakteri  patogen  pada  permukaan mukosa menjadi tahap awal infeksi saluran usus. Pelekatannya pada  sel  epitelial  usus  akan  mengakibatkan  kolonisasi, kerusakan  sel,  gangguan  mekanisme  pengaturan  sel,  serta pertumbuhan dan perkembangbiakan intraselular (Coconnier et al. , 1993).
Penurunan bobot badan kelompok tikus yang diberi EPEC, diperkuat  dengan  nilai  PER  tikus  percobaan  (Gambar  3). Analisis  sidik  ragam  menunjukkan  bahwa  perlakuan  yang diberikan berpengaruh nyata (p<0,05) terhadap nilai PER tikus percobaan.  Tikus  kelompok  BAL L.  fermentum 2B4  memiliki nilai PER yang paling tinggi, sedangkan tikus kelompok kontrol positif memiliki nilai PER yang paling rendah. Uji lanjut Duncan menunjukkan  bahwa  nilai  PER  tikus  kelompok  BAL L. fermentum 2B4 + EPEC tidak berbeda nyata dengan nilai PER tikus  kelompok  BAL L.  plantarum 2C12  +  EPEC  dan  kontrol positif, namun berbeda nyata dengan kelompok tikus lainnya.
Nilai PER menunjukkan pengaruh penyerapan protein yang dikonsumsi  terhadap  berat  badan.  Rendahnya  nilai  PER kelompok  tikus  yang  diinfeksi  EPEC  bukan  disebabkan  oleh perbedaan  sumber  protein  pada  ransum,  tetapi  lebih disebabkan oleh pemberian EPEC.
Mekanisme  adhesi  yang  terjadi  pada  infeksi  EPEC melibatkan  gen EPEC  adherence  factor (EAF)  melalui Bundle Forming  Pili (BFP).  Mekanisme  ini  menyebabkan  perubahan konsentrasi  kalsium  intraseluler  dan  arsitektur  sitoskeleton  di bawah  membran  mikrovili,  sehingga  menyebabkan  terjadinya kerusakan  mikrovili  (Zein et  al .,  2004).  Dengan  rusaknya mikrovili,  menyebabkan  hilangnya  area  penyerapan  zat  gizi  di usus  halus.  Oleh  karena  itu  penyerapan  zat-zat  gizi,  termasuk protein, menjadi terganggu.
Gambar 3.   Nilai PER tikus percobaan pada berbagai perlakuan. Nilai yang  diikuti  oleh  huruf  yang  sama  menunjukkan  tidak berbeda nyata (p>0,05).

## Kejadian diare pada tikus terinfeksi EPEC
BAL  memberikan  manfaat  positif  bagi  kesehatan, khususnya  menjaga  keseimbangan  mikroflora  dan  saluran pencernaan.  Kementerian  Kesehatan  dan  Kesejahteraan Jepang  mengidentifikasi  12  komponen  bahan  pangan  yang dikategorikan  dapat  meningkatkan  kesehatan,  dan  BAL termasuk salah satu di antaranya (Surono, 2004).
Manfaat  kesehatan  yang  berkaitan  dengan  BAL  adalah mengendalikan  bakteri  patogen  dalam  saluran  pencernaan (Surono,  2004).  EPEC  merupakan  salah  satu  bakteri  patogen yang  dapat  menyebabkan  diare.  EPEC  melekat  pada  sel mukosa  usus  dan  menyebabkan  terjadinya  perubahan  struktur sel, kemudian melakukan invasi menembus sel mukosa.
Analisis  sidik  ragam  menunjukkan  bahwa  perlakuan  yang diberikan  kepada  tikus  percobaan  berpengaruh  nyata  (p<0,05) terhadap kadar air feses (%bb) tikus pada hari ke-14 dan ke-21 (Tabel  2).  Uji  lanjut  Duncan  pada  hari  ke-14  menunjukkan bahwa  kadar  air  feses  kelompok  kontrol  positif  (diberi  EPEC
0 50 100 150 200 250 H0 H1 H3 H6 H9 H12 H15 H18 H21 Bo bo t B ad an (g ) Periode Pemeliharaan (hari ke-)
Kontrol (-) L. plantarum 2C12 L. fermentum 2B4 L. plantarum 2C12 + EPEC L. fermentum  2B4 + EPEC Kontrol (+)
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 Kontrol (-) L.
plantarum 2C12 L. fermentum 2B4 L. plantarum 2C12 + EPEC L. fermentum 2B4 + EPEC Kontrol (+) PER b ab a c dc d
saja) berbeda nyata dengan kadar air feses kelompok lainnya, termasuk  kelompok L.  plantarum 2C12  +  EPEC  dan L. fermentum 2B4 + EPEC dan nilainya paling besar (63,95 %bb). Feses  tikus  kelompok  kontrol  positif  tampak  berlendir  sebagai tanda  telah  terjadi  infeksi  pada  saluran  pencernaannya, sedangkan feses pada kelompok tikus yang lain tidak berlendir.
Tabel 2. Kadar air feses tikus percobaan (%bb)
Kelompok Tikus Hari Ke-14 Hari Ke-21 Kontrol negatif 52,07 a 53,20 bc BAL L. plantarum 2C12 49,20 a 46,00 a BAL L. fermentum 2B4 49,16 a 48,30 ab BAL L. plantarum 2C12 + EPEC 48,22 a 57,75 c BAL L. fermentum 2B4 + EPEC 46,63 a 53,37 c Kontrol positif 63,95 b 68,92 d
Keterangan:   Nilai  yang  diikuti  oleh  huruf  yang  sama  menunjukkan  tidak berbeda nyata (p>0,05)
Uji lanjut Duncan pada hari ke-21 juga menunjukkan bahwa kadar air feses kelompok kontrol positif berbeda nyata dengan kadar  air  feses  kelompok  lainnya  dan  nilainya  meningkat menjadi  68,92  %bb.  Kadar  air  feses  kelompok L.  plantarum 2C12  +  EPEC  dan L.  fermentum 2B4  +  EPEC  tidak  berbeda nyata  satu  sama  lain  dan  juga  tidak  berbeda  nyata  dengan kelompok kontrol negatif.
Pada hari ke-21, kelompok tikus BAL L. plantarum 2C12 + EPEC,  BAL L.  fermentum 2B4  +  EPEC,  dan  kontrol  positif mengalami  diare.  Akan  tetapi,  kelompok  kontrol  positif mengalami  diare  yang  lebih  parah.  Kadar  air  feses  tikus kelompok  BAL L.  plantarum 2C12  +  EPEC  dan  BAL L. fermentum 2B4  +  EPEC  adalah  57,75  dan  53,37%bb.  Pada tikus  yang  sehat  (kelompok  kontrol  negatif,  BAL L.  plantarum 2C12,  dan  BAL L.  fermentum 2B4)  kadar  air  feses  berkisar 46,00-53,20%bb.  Penelitian  Nababan  (2011)  menunjukkan bahwa tikus sehat dan tikus yang diberi yogurt sinbiotik memiliki kadar air feses berkisar antara 55,93 sampai 56,01 %bb.
Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa pemberian EPEC mengakibatkan  terjadinya  diare,  ditandai  oleh  tingginya  kadar air  feses  tikus  kelompok  kontrol  positif  (diberi  EPEC  saja) dibandingkan  kelompok  tikus  lainnya.  Selain  itu,  pemberian L. fermentum 2B4  dan L.  plantarum 2C12  dapat  menekan terjadinya diare pada tikus yang diberi EPEC.

## Jumlah sel limfosit
Limfosit  adalah  sel  darah  putih  (leukosit)  yang  berukuran kecil,  berbentuk  bulat  dengan  diameter  7-15  µm.  Limfosit merupakan sel kunci dalam proses respon imun spesifik, untuk mengenali  antigen  yang  beragam.  Setiap  limfosit  hanya  dapat mengenal  satu  antigen  sehingga  dalam  proses  respon  imun, limfosit  saling  bekerja  sama  untuk  mengeliminasi  beragam antigen  yang  masuk  ke  dalam  tubuh  (Roitt,  1991).  Sel  limfosit terdiri atas sel T dan sel B yang keduanya bertanggung jawab dalam  respon  imun  spesifik  untuk  mengenali  antigen  melalui reseptor antigen. Sel limfosit juga mampu membedakan antigen dengan  komponen  tubuh  sendiri  atau  berfungsi  sebagai pengontrol sistem imun (Bellanti, 1993).
Proliferasi  merupakan  fungsi  biologis  mendasar  limfosit, yaitu proses diferensiasi dan pembelahan (mitosis) sel. Limfosit
merupakan  sel  tunggal  yang  bertahan  baik  pada  saat  dikultur dalam  media  sederhana.  Respon  proliferasi  kultur  limfosit digunakan  untuk  menggambarkan  fungsi  limfosit  dan  status imun individu (Tejasari, 2000). Jumlah sel limfosit pada hari ke- 21 yang diisolasi dari limpa tikus percobaan dapat dilihat pada Gambar 4. Analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perlakuan berpengaruh  nyata  (p<0,05)  terhadap  jumlah  sel  limfosit. Kelompok  tikus  BAL L.  fermentum 2B4  memiliki  jumlah  sel limfosit  paling  tinggi,  sedangkan  kelompok  tikus  kontrol  positif memiliki  jumlah  sel  limfosit  paling  rendah.  Uji  lanjut  Duncan menunjukkan  bahwa  jumlah  sel  limfosit  tikus  kelompok  kontrol positif berbeda nyata dengan kelompok kontrol negatif, BAL L. plantarum 2C12, BAL L. fermentum 2B4, dan BAL L. fermentum 2B4  +  EPEC,  namun  tidak  berbeda  nyata  dengan  kelompok BAL L. plantarum 2C12 + EPEC.
Gambar 4.   Jumlah  sel  limfosit  tikus  percobaan  (x10 4 /ml).  Nilai  yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata (p>0,05)
Kelompok  tikus  yang  diberi L.  plantarum 2C12  dan L. fermentum 2B4  memproduksi  sel  limfosit  yang  lebih  banyak dibandingkan  dengan  kelompok  tikus  yang  diberi  BAL  dan EPEC,  serta  yang  diberi  EPEC  saja  (kontrol  positif).  BAL terbukti  mampu  meningkatkan  jumlah  sel  limfosit.  Dengan demikian  dapat  dikatakan  bahwa  BAL  yang  digunakan  pada penelitian  ini,  yaitu L.  plantarum 2C12  dan L.  fermentum 2B4, mempunyai sifat sebagai imunomodulator.
Aattouri et  al. (2002)  melaporkan  hasil  penelitiannya  yang membuktikan  bahwa  konsumsi  BAL  golongan Lactobacillus mampu  meningkatkan  sistem  imun  seluler  dan  humoral,  di antaranya  peningkatkan  populasi  dan  proliferasi  sel  limfosit, produksi  sitokin  interferon-γ  (IFN-  γ),  interleukin-12  (IL-12),  IL- 10, sel imun Th, serta imunoglobulin (Ig)A, IgE, IgG serta IgM. Menurut  Surono  (2004),  BAL  yang  melekat  pada  sel  epithelial usus  manusia  dapat  mengaktifkan  makrofag.  Stimulasi  imun BAL  adalah  melalui  komponen  dinding  sel,  yaitu  peptidoglikan yang menginduksi permukaan mukosa. Glukan pada dinding sel bakteri  akan  merangsang  makrofag  memproduksi  interleukin, meningkatkan  aktivitas  proliferasi  sel  limfosit.  Sel  limfosit membelah  menjadi  limfosit  T  dan  limfosit  B.  Limfosit  T  akan melepaskan  interferon,  kembali  mengaktifkan  makrofag  dan limfosit B dalam memproduksi antibodi. Selain itu, glukan juga akan merangsang makrofag lebih banyak memproduksi lisozim. Antibodi  yang  dihasilkan  ini  merupakan  respon  mekanisme humoral dalam mekanisme kekebalan spesifik.

## Kadar malonaldehida hati dan ginjal
Menurut  Koltas  e t  al. (2006)  MDA  yang  merupakan  hasil peroksidasi lipida merupakan indikator terjadinya stres oksidatif
0 5000 10000 15000 20000 Kontrol negatif L. plantarum 2C12 L. fermentum 2B4 L. plantarum 2C12 + EPEC L. fermentum 2B4 + EPEC Kontrol positif Se l li m fo sit (x 10 4 /m l) ab a a bc ab c
pada jaringan dan sel. Stres oksidatif menggambarkan kondisi kerusakan  oksidatif  yang  terjadi  ketika  keseimbangan  antara radikal  bebas  dan  antioksidan  tidak  bertahan  dengan  baik (Lampe dan Cheryl, 2008). Biomarker stres oksidatif merupakan produk akhir reaksi antara radikal bebas dan komponen lipida, protein,  karbohidrat,  DNA,  dan  molekul  lainya  yang  potensial (Mayne, 2003).Tikus yang dipapar oleh EPEC akan mengalami diare.  Keadaan  ini  akan  mengganggu  sistem  imun  tikus  dan juga  menyebabkan  tikus  mengalami  stres.  Keadaan  stres memungkinkan  meningkatkan  radikal  bebas  dalam  tubuh. Secara  tidak  langsung,  jumlah  radikal  bebas  ditunjukkan  oleh kadar malonaldehida (MDA, C 3 H 4 O 2 ) dan keduanya berbanding lurus.  MDA  merupakan  salah  satu  produk  akhir  peroksidasi lipida yang terbentuk setelah aksi senyawa radikal. Itulah yang menyebabkan  MDA  dapat  digunakan  sebagai  indikator keberadaan radikal bebas dalam tubuh dan indikator kerusakan oksidatif membran sel (Astuti et al. , 2009).
Gambar 5 menunjukkan kadar MDA hati berbagai kelompok perlakuan  tikus  pada  hari  ke-21.  Analisis  sidik  ragam menunjukkan  bahwa  perlakuan  yang  diberikan  kepada  tikus percobaan  berpengaruh  nyata  (p<0,05)  terhadap  kadar  MDA hati. Uji lanjut Duncan menunjukkan bahwa hati tikus kelompok BAL L. fermentum 2B4 memiliki kadar MDA (0,0971 μmol/g hati) yang tidak berbeda nyata dengan kelompok tikus lainnya, tetapi berbeda  nyata  dengan  kelompok  BAL L.  plantarum 2C12  + EPEC (0,1307 μmol/g hati).
Gambar  5.  Kadar  MDA  hati  tikus  (μmol/g  hati)  pada  hari  ke-21 percobaan  Nilai  yang  diikuti  oleh  huruf  yang  sama menunjukkan tidak berbeda nyata (p>0,05)
Hal yang sangat menarik dari penelitian ini adalah adanya perbedaan  yang  nyata  antara  kadar  MDA  hati  tikus  kelompok BAL L.  plantarum 2C12  +  EPEC  (0.1307  μmol/g  hati)  dengan kelompok BAL L. fermentum 2B4 + EPEC (0,0886 μmol/g hati). Selain itu, kadar MDA hati tikus kelompok L. plantarum 2C12 + EPEC tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol positif. Hal ini  menunjukkan  bahwa  BAL L.  fermentum 2B4  lebih  efektif dalam  menekan  terbentuknya  MDA  akibat  pengaruh  infeksi EPEC dibandingkan BAL L. plantarum 2C12.
Gambar  6  menunjukkan  kadar  MDA  ginjal  berbagai kelompok perlakuan tikus pada hari ke-21. Analisis sidik ragam menunjukkan  bahwa  perlakuan  yang  diberikan  kepada  tikus percobaan  berpengaruh  nyata  (p<0,05)  terhadap  kadar  MDA ginjal.  Uji  lanjut  Duncan  menunjukkan  bahwa  ginjal  tikus kelompok perlakuan BAL L. fermentum 2B4 memiliki kadar MDA paling rendah (0,2233 μmol/gginjal) dan berbeda nyata dengan kelompok lainnya, tetapi tidak berbeda nyata dengan kelompok BAL L. plantarum 2C12 (0,2641 μmol/gginjal).
Mikelsaar dan Zilmer (2009) menemukan bahwa dua strain L.  fermentum memiliki  pengaruh  yang  kuat  sebagai  probiotik baru  dengan  sifat  fungsional  berupa  antimikrobial  dan antioksidatif. Jenis antimikrobial yang dimiliki antara lain berupa: asam asetat, asam laktat, asam suksinat, putrescine , NO, CO 2 , dan H 2 O 2.
Gambar  6.  Kadar  MDA  ginjal  tikus  (μmol/g  ginjal)  pada  hari  ke-21 percobaan.  Nilai  yang  diikuti  oleh  huruf  yang  sama menunjukkan tidak berbeda nyata (p>0,05)
Bakteri probiotik terbukti efektif dalam menangani berbagai penyakit  seperti  tukak  lambung,  diare,  intoleransi  terhadap laktosa,  alergi  makanan,  dan  juga  kanker  saluran  pencernaan (Zubillaga et  al. ,  2001). L.  plantarum dan L.  fermentum merupakan bakteri asam laktat yang tergolong strain probiotik.
Manfaat  kesehatan  BAL  di  antaranya  adalah  mengen- dalikan  bakteri  patogen  dalam  saluran  pencernaan  dan menstimulir sistem imun (Surono, 2004). Efek antagonisme atau antibakteri  BAL  terdiri  atas  dua  mekanisme,  yaitu  dengan menghasilkan  senyawa  metabolit  primer  seperti  asam  laktat, CO 2 , diasetil, asetaldehida, dan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ); dan dengan  menghasilkan  bakteriosin  yang  merupakan  senyawa protein yang menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri sejenis.  Menurut  Kaur et  al. (2002),  BAL  menjaga  kese- imbangan  mikroflora  saluran  pencernaan  dan  meningkatkan respon  imun  dengan  cara:  (1)  berkompetisi  dengan  patogen enterik,  (2)  memicu  sintesis  sitokin  dari  enterosit,  (3) memproduksi  metabolit  yang  bersifat  toksik  (H 2 O 2 ),  (4) memproduksi  asam  butirat  (meningkatkan turnover enterosit), (5) memulihkan mikroflora normal selama terapi antibiotik, dan (6) memproduksi bakteriosin.

## KESIMPULAN
Pemberian EPEC dengan dosis 10 6 cfu/ml selama tujuh hari pada  tikus  percobaan  dapat  menyebabkan  diare,  penurunan berat badan, dan penurunan nilai PER. Pemberian L. plantarum 2C12 dan L. fermentum 2B4 dengan dosis 10 8 cfu/ml pada tikus yang diberi EPEC dapat mencegah terjadinya diare.
Pemberian L. plantarum 2C12 dan L. fermentum 2B4 pada tikus  yang  diberi  EPEC  mempengaruhi  sifat  imunomodulator, yaitu  meningkatkan  jumlah  sel  limfosit  organ  limpa.BAL L. fermentum 2B4 dan L. plantarum 2C12 memiliki potensi sebagai antidiare dan meningkatkan sistem imun (imunomodulator). BAL L.  fermentum 2B4  lebih  berpotensi  sebagai  antidiare  dan imunomodulator dibandingkan L. plantarum 2C12.
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 Kontrol negatif BAL L. plantarum 2C12 BAL L. fermentum 2B4 BAL L. plantarum 2C12 + EPEC BAL L. fermentum 2B4 + EPEC Kontrol positif
Ka da r M D A (μ m ol/ g) b b b a b ab 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Kontrol negatif L. plantarum 2C12 L. fermentum 2B4 L. plantarum 2C12 + EPEC L. fermentum 2B4 + EPEC Kontrol positif K ad ar M D A (μ m ol/ g) ab bc c ab ab a

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terimakasih  kepada  Direktorat Jenderal  Pendidikan  Tinggi  Departemen  Pendidikan  Nasional Republik  Indonesia,  yang  telah  memberikan  dana  penelitian melalui  Hibah  Kompetensi,  Nomor  Kontrak:  409/SP  2 H/DP2M/VI/2010,  tanggal  11  Juni  2010,  atas  nama  Made Astawan.

## DAFTAR PUSTAKA
Aattouri  N,  Tome  BD,  Marcos  A,  Lemonnier  D.  2002.  Oral ingestion  of  lactic  acid  bacteria  by  rats  increases lymphocyte  proliferation  and  interveron-γproduction.  Br.  J. Nutr 87: 367-373.
Anonim.  2008.  Profil  Kesehatan  Indonesia  2007.  Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Astuti S, Muchtadi D, Astawan M, Purwantara B, Wresdiyati T. 2009.  Pengaruh  pemberian  tepung  kedelai  kaya  isoflavon terhadap  kadar  malonaldehid  (MDA),  aktivitas  superoksida dismutase  (SOD)  testis,  dan  profil  Cu,Zn-SOD  tubuli seminiferi testis tikus jantan. J Teknol dan Pangan 10: 129- 134.
AOAC. 1989. Official Methods of Analysis in The Association of Official  Agricultural  Chemist.  Association  of  Official Agricultural Chemist. Washington D.C.
Arief I, Maheswari RRA, Nuraini H. 2008. Aktivitas Antimikroba Bakteri  Asam  Laktat  yang  Diisolasi  dari  Daging  Sapi. Makalah  Seminar  Hasil  Penelitian  Departemen  IPTP.  Fak. Peternakan IPB.
Bellanti  JA.  1993.  Imunologi  III.  Gajah  Mada  University  Press.
Yogyakarta.
Bourlioux  P,  Koletzko  B,  Guarner  F,  Braesco  V.  2003.  The intestine and its microflora are partners for the protection of the host: report on the Danone Symposium ‘The Intelligent Intestine’,  Paris,  June  14 th 2002. Am. J  Clin  Nutr  78:  675- 683.
Coconnier  MH,  Bernet  MF,  Chauviere  G,  Servin  AL.  1993. Adhering heat killed human Lactobacillus acidophilus , strain LB,  inhibit  the  process  of  pathogenicity  of  diarrheagenic bacteria in cultured human intestinal cells. J Diarrhoeal Dis. Res 11:235-242
Conti M, Moramd PC, Levillaind P, Lemonnier A. 1991. Improve fluorometric determination of malonaldehyde. J Clin Chem. Soc 103:6472-6477.
Fuller R. 1989. Probiotics in man and animals. J Appl Bacteriol. 66: 365-378.
Gackowska L, Michalkiewicz J, Krotkiewski M, Helmin Basa A,
Kubiszewska I, Dzierzanowska D. 2006. Combiner effect of different lactic acid bacteria strain on the mode of cytokines pattern  expression  in  human  peripheral  blood mononuclearcells. J Physiol and Pharmacol 57 (9): 13-21.
Ishibasi N,Yamazaki S. 2001. Probiotics and safety. Am. J Clin Nutr 73 (suppl): 465S-470S.
Kaur  IP,  Chopra  K,  Saini  A.  2002.  Probiotics:  potential pharmaceutical applications. Eur. J Pharm Sci 15,1-9.
Koltas IS, Yucebilgic G, Bilgin R, Parsak CK., Sakman G. 2006. Serum  malondialdehyde  level  in  patients  with  Cystic Echinococcosis. J Saudi Med 2006. 27: 1703-1705.
Lampe, Johanna W, Cheryl L. Rock. 2008. Biomarkers and their use in nutrition intervention. Di dalam: Coulston, Ann M. dan Carol  Boushey.  Nutrition  in  The  Prevention  and  Treatment of  Disease.  Second  Edition.  Elsevier  Academic  Press. London.
Mayne St. 2003. Antioxidant nutrient and chronic disease: use of  biomarkers  of  exposure  and  oxidative  stress  status  in epidemiologic research. J Nutr 133(suppl 3), 933S-940S.
Mikelsaar M, Mihkel Zilmer. 2009. Lactobacillus fermentum ME- 3:  An  antimicrobial  and  antioxidative  probiotic.  Microbial Ecology in Health and Disease. 21: 1-27.
Nababan  YMS.  2011.  Pengaruh  Pemberian  Yogurt  sinbiotik Fungsional  Berbasis  Probiotik  Lokal  terhadap  Status Hematologi  Tikus  Percobaan.  [skripsi].  Departemen  Ilmu dan teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Roitt  IM.  1991.  Essential  Immunology.  Blackwell  Scientific Publications. Oxford, London, Edinburg, Boston, Melbourne, Paris.
Surono,  Ingrid  S.  2004.  Probiotik:  Susu  Fermentasi  dan Kesehatan.  Yayasan  Pengusaha  Makanan  dan  Minuman seluruh Indonesia, Jakarta.
Steel  RGD,  Torrie  JH.  1995.  Principles  and  Procedures  of Statistic.  A  Biometrical  Approach.  2 nd edition.  McGraw  Hill Book Co., New York.
Tejasari.  2000.  Efek  Komponen  Bioaktif  Oleoresin  Rimpang Jahe  ( Zingiber  officinale  Roscoe )  terhadap  Fungsi  Limfosit secara  In  Vitro  (Disertasi).  Program  Pascasarjana  IPB. Bogor.
Zein  U,  Kholid,  Josua.  2004.  Diare  Akut  Disebabkan  Bakteri. http://www.litbang.usu.ac.id/modules/php.  [06  Februari 2010].
Zubillaga M, Weill R, Postaire E, Golman C, Caro R, Boccio J. 2001. Effect of probiotics and functional foods and their use in different disease. Nutr Res 21: 569-579.