## Research Article
Viabilitas dan Virulensi Fusarium oxysporum f. sp. cubense yang Dipreservasi dengan Liofilisasi
Viability and Virulence of Fusarium oxysporum f. sp. cubense after Preserved under Liophylization
Iqna Khayatina Rusli 1) * , Arif Wibowo 2) , & Christanti Sumardiyono 2)
1) Balai Karantina Pertanian Tanjung Priok Jln. Enggano No. 17, Tanjung Priok. Jakarta Utara 14310
2) Departemen Hama Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada Jln. Flora No. 1, Bulaksumur, Sleman, Yogyakarta 55281
*Penulis untuk korespondensi. E-mail: narusli13@gmail.com

## ABSTRACT
Wilt disease caused by Fusarium oxysporum f. sp. cubense ( Foc ) is still pose as constraint to banana production all over the world. The objective of this research was to examine the viability and virulence of Foc isolates which had been preserved with lyophilization for 18 years. The experiment used 19 isolates of Foc , which were Pekulo, Sukorejo, Kali Sepanjang, Kalibaru, Purwojoyo, Prembun, Mulyosari, Sidogede, Sidatan, Kemiri, Juwangen, A-17, A-11, PS-5, B4-3-1, Fo2.16.16., PS-10, A-2, and Irja. The results showed that 12 isolates could grow well on PDA medium, namely Pekulo, Sukorejo, Kali Sepanjang, Kalibaru, Purwojoyo, Prembun, Mulyosari, Sidatan, Juwangen, PS-5, B4-3-1, and Fo2.16.16. Meanwhile, seven isolates (Sidogede, Kemiri, A-17, A-11, PS-10, A-2, and Irja) could not grow or develop on PDA medium. The result of pathogenicity test showed that six tested Foc isolates had very high virulences, with disease severity index of about 2.14–2.71. Other three isolates revealed high virulences with disease severity index around 2.01– 2.07. Meanwhile, another three less virulent isolates demonstrated disease severity index in the range of 1.39–1.67
Keywords: isolate, pathogenicity, PDA

## INTISARI
Penyakit layu yang disebabkan oleh jamur Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) masih menjadi kendala dalam produksi pisang di seluruh dunia. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji viabilitas dan virulensi isolat Foc yang telah dipreservasi dengan liofilisasi selama 18 tahun. Penelitian menggunakan 19 isolat Foc yaitu Pekulo, Sukorejo, Kali Sepanjang, Kalibaru, Purwojoyo, Prembun, Mulyosari, Sidogede, Sidatan, Kemiri, Juwangen, A-17, A-11, PS-5, B4-3-1, Fo2.16.16., PS-10, A-2, dan Irja. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 12 isolat Foc mampu tumbuh dengan baik pada medium PDA yaitu Pekulo, Sukorejo, Kali Sepanjang, Kalibaru, Purwojoyo, Prembun, Mulyosari, Sidatan, Juwangen, PS-5, B4-3-1, dan Fo2.16.16. 7 isolat tidak mampu tumbuh pada medium PDA yaitu Sidogede, Kemiri, A-17, A-11, PS-10, A-2, dan Irja. Enam isolat Foc yang diuji memiliki virulensi sangat tinggi dengan indeks keparahan penyakit berkisar antara 2,14–2,71. Tiga isolat yang lain memiliki virulensi tinggi dengan indeks keparahan penyakit berkisar antara 2,01–2,07. Sedangkan 3 isolat lainnya memiliki virulensi yang lebih rendah dengan indeks keparahan penyakit berkisar antara 1,39–1,67.
Kata kunci: isolat, patogenisitas, PDA

## PENDAHULUAN
Penyakit layu yang disebabkan oleh jamur Fusarium oxysporum f. sp. cubense (E.F. Smith) Snyder and Hansen ( Foc ) masih menjadi masalah serius yang dapat menghambat produksi pisang di seluruh dunia. Penyakit ini dikenal sebagai Panama disease yang merupakan kendala utama pada pisang di daerah tropis maupun subtropis (Su et al ., 1986). Di Indonesia,
infeksi berat terjadi pada pertanaman pisang baik yang dikembangkan secara komersil ataupun tradi- sional (Nasir et al. , 2005).
Jamur Foc memiliki empat ras yang berbeda-beda virulensinya. Setiap ras memiliki strain dengan variasi genetik sangat spesifik serta menyerang berbagai pisang dengan genom yang berbeda (Bentley et al ., 1998). Klasifikasi ras didasarkan pada patogenisitas-
Diterima 6 Juni 2017; diterima untuk diterbitkan 26 September 2017
nya terhadap inang. Jamur ini juga mampu bertahan dalam tanah tanpa tanaman inang selama 40 tahun (Fourie et al. , 2009). Ras 1 bersifat patogenik terhadap pisang  bergenom  AAA,  AAAA,  AAB,  ras  2 menyerang pisang dengan genom ABB dan AAAA, ras 3 menyerang Heliconia caribea , sedangkan ras 4 adalah ras paling ganas karena menyerang semua jenis pisang yang juga diserang oleh ras 1 dan 2. Ras-ras dari patogen Foc tidak ditentukan secara genetik,  tetapi  merupakan  kelompok  isolat  yang menyerang kultivar tanaman pisang yang berbeda di lapangan (Bentley et al. , 1998).
Perubahan sifat yang sangat mudah terjadi pada suatu mikroorganisme mengharuskan adanya suatu metode penyimpanan agar jamur tetap dalam kondisi baik. Salah satu metode penyimpanan mikroorganisme jangka  panjang  adalah  liofilisasi.  yaitu  metode penyimpanan yang paling populer dan banyak di- gunakan untuk penyimpanan jangka panjang mikroba. Metode ini cocok untuk menyimpan berbagai jenis mikroorganisme termasuk jamur (Clark, 2006 cit. Machmud, 2001).
Metode  penyimpanan L-drying dalam  ampul pada  suhu  5ºC  telah  terbukti  dapat  menyimpan koleksi mikroba seperti bakteri, aktinomisetes, khamir, dan jamur pada rentang waktu lima hingga 20 tahun dengan tingkat kematian yang rendah (Nagai et al ., 2005). Koleksi dan penyimpanan mikroba diperlu- kan sebagai bahan pengkajian lebih lanjut, sumber
biodiversitas, dan koleksi plasma nutfah mikroba (Riyadi et al., 2008).
Isolat Foc koleksi  Laboratorium Teknologi Pengendalian Universitas Gadjah Mada yang telah diliofilisasi belum pernah dilakukan penumbuhan kembali. Penelitian ini bertujuan untuk menguji viabilitas dan virulensi beberapa isolat Fusarium oxysporum f. sp. cubense yang telah dipreservasi dengan liofilisasi.

## BAHAN DAN METODE
Penyiapan Isolat Foc
Isolat Fusarium oxysporum f.sp. cubense yang digunakan ditampilkan pada Tabel 1.

## Pengamatan Kemampuan Tumbuh (Viabilitas)
Isolat yang telah disimpan dengan cara liofilisasi ditumbuhkan pada medium Potato Dextrose Agar (PDA)  dalam  cawan  petri  dan  diinkubasi  selama tujuh hari. Pengamatan dilakukan dengan mengamati viabilitas isolat. Apabila isolat mampu tumbuh, kemudian diremajakan kembali pada medium PDA.

## Uji Virulensi pada Planlet Pisang Ambon Kuning
Uji  virulensi  dilakukan  dengan  menggunakan isolat yang masih memiliki kemampuan tumbuh kemudian diinokulasi secara langsung pada planlet pisang ambon kuning berumur 9 bulan dalam botol kultur. Masing-masing perlakuan terdiri dari 4 ulangan.
No Kode Isolat Kultivar Asal Isolat Tahun Liofilisasi 1. Pekulo Ambon Banyuwangi, Jawa Timur 24-06-1999 2. Sukorejo Ambon Banyuwangi, Jawa Timur 24-06-1999 3. Kali Sepanjang Ambon Banyuwangi, Jawa Timur 08-06-1999 4. Kalibaru Ambon Banyuwangi, Jawa Timur 24-06-1999 5. Purwojoyo Ambon Banyuwangi, Jawa Timur 08-06-1999 6. Prembun Ambon Kebumen, Jawa Tengah 10-07-1999 7. Mulyosari Ambon Kebumen, Jawa Tengah 24-06-1999 8. Sidogede Ambon Kebumen, Jawa Tengah 08-06-1999 9. Sidatan Ambon Kulon Progo, DIY 24-06-1999 10. Kemiri Ambon Purworejo, Jawa Tengah 24-06-1999 11. Juwangen Uter Sleman, DIY 08-06-1999 12. A-17 Ambon Sleman, DIY 24-05-1999 13. A-11 Ambon Sleman, DIY 24-05-1999 14. PS-5 Ambon Sleman, DIY 01-05-2002 15. B4-3-1 Ambon Sleman, DIY 24-05-1999 16. Fo2.16.16 Ambon Sleman, DIY 24-05-1999 17. PS-10 Ambon Sleman, DIY 01-05-2002 18. A2 Ambon Sleman, DIY 24-05-1999 19. Irja Ambon Irian Jaya 24-06-1999 Tabel 1. Daftar isolat Foc yang digunakan dalam penelitian
Juwangen, PS-5, B4-3-1-, dan Fo2.16.16. Isolat yang tidak mampu tumbuh adalah Sidogede, Kemiri, A-17, A-11, PS-10, A2, dan Irja. Waktu yang diperlu- kan jamur untuk tumbuh kembali pada medium PDA setelah diliofilisasi berkisar antara 2−5 hari. Isolat yang paling cepat tumbuh adalah Kali Sepanjang, sedangkan yang paling lama tumbuh adalah Purwo- joyo dan isolat Fo2.16.16.
Hilangnya  viabilitas  pada  beberapa  isolat  uji dapat disebabkan faktor teknis, misalnya pada saat penyimpanan  atau  pada  proses  pengampulan. Kematian isolat mikroba pada penyimpanan kering beku umumnya tidak disebabkan oleh faktor fisio- logis seperti dehidrasi atau kekeringan sel, tetapi lebih disebabkan oleh derajat dan jumlah air residu yang  terdehidrasi  pada  saat  proses  pengampulan (Mikata, 1999).
Menurut Ilyas (2007), perbedaan tingkat viabilitas antar  isolat  dapat  disebabkan  adanya  perbedaan variasi dalam jenis dan umur isolat yang digunakan. Adanya  variasi  dalam  jenis  akan  mempengaruhi perbedaan  karakter  fisiologis  dan  morfologis, termasuk di dalamnya kemampuan viabilitas dan tingkat toleransi terhadap adanya perubahan kondisi lingkungan. Secara umum, isolat jamur yang baik disimpan dalam ampul adalah yang telah dewasa dan telah matang sporanya. Secara morfologis dan fisiologis, spora yang telah matang sempurna me- miliki ketahanan yang tinggi terhadap perubahan kondisi lingkungan sehingga secara alamiah dapat melakukan proses dormansi tanpa kehilangan ke- mampuan  viabilitasnya.  Sebaliknya,  penggunaan kultur yang sporanya belum matang secara sempurna dapat menyebabkan spora lebih rentan terhadap perubahan lingkungan sehingga mudah kehilangan viabilitasnya.
Virulensi Isolat Fusarium oxysporum f. sp. cubense ( Foc )
Pengukuran tingkat keparahan penyakit dapat di- lakukan dengan membandingkan daun yang ber- gejala  dengan  seluruh  daun  pada  tanaman  yang diamati. Pada penelitian ini, dengan melihat keparahan penyakit pada daun planlet pisang ambon kuning terlihat adanya variasi tingkat virulensi. Pada Tabel 5 terlihat bahwa enam isolat Foc yang diuji menyebab- kan infeksi sangat parah (sangat virulen) dengan indeks keparahan  penyakit  pada  daun  yang  tinggi  yaitu Sukorejo, Kali Sepanjang, Kalibaru, Prembun, PS-5, dan Fo2.16.16, dengan nilai DSI (Disease Severity Index) berkisar antara 2,10 hingga 2,71. Isolat Pekulo,

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Viabilitas Isolat Fusarium oxysporum f.sp. cubense ( Foc )
Isolat Foc yang telah dipreservasi dalam bentuk liofilisasi selama 18 tahun berjumlah 19 isolat. Dua belas isolat masih mampu tumbuh dengan baik, sedangkan tujuh isolat yang lain tidak mampu tumbuh pada medium PDA (Tabel 4).
Berdasarkan Tabel 4, isolat yang mampu tumbuh dengan baik adalah Pekulo, Sukorejo, Kali Sepanjang, Kalibaru, Purwojoyo, Prembun, Mulyosari, Sidatan,
∑ (skor × jumlah daun pada skor tersebut)
∑ (jumlah semua daun yang diuji)
Isolat Foc yang berumur 7 hari pada medium PDA dipotong menggunakan bor gabus berdiameter 0,5 cm. Inokulasi dilakukan dengan cara meletakkan empat potong isolat Foc ke dalam botol yang berisi 4 planlet pisang ambon kuning. Kemudian diinkubasi pada growth chamber dengan suhu 22°C.

## Pengamatan Gejala Layu/Kuning pada Daun
Pengamatan  dilakukan  setiap  hari  mulai  hari ketiga setelah inokulasi selama 4 minggu dengan mengamati dan menghitung jumlah daun yang me- nunjukkan gejala layu atau kuning, kemudian di- lakukan  analisis  berdasarkan  indeks  gejala  layu pada tanaman (LSI: Leaf Symptom Index ) mengikuti metode Mak et al. (2004) yang dimodifikasi (Tabel 2).
Setelah indeks layu pada daun diperoleh kemudian dihitung DSI ( Disease Severity Index ) menggunakan rumus Mak et al. (2004) (Tabel 3):
Tabel 2. Indeks Layu pada Daun Leaf Symptom Index (LSI) Tabel 3. Keterangan Disease Severity Index (DSI) Skor Keterangan 0 Tidak ada gejala layu/tanaman sehat 1 1−2 daun kuning/layu 2 3 daun kuning/layu 3 5 daun kuning/layu 4 >5 daun kuning/layu DSI Keterangan 0 Avirulen 0,1−1 Moderat 1,1−2 Virulen 2,1−3 Sangat Virulen
sumber: Mak et al . (2004) sumber: Mak et al . (2004)
Rusli et al. : Viabilitas dan Virulensi Fusarium oxysporum f. sp. cubense yang Telah Dipreservasi dengan Liofilisasi 169
Purwojoyo,  dan  Mulyosari  menyebabkan  infeksi parah (virulen) dengan indeks keparahan penyakit lebih rendah berkisar antara 2,01 hingga 2,07. Isolat Juwangen, Sidatan, dan B4-3-1 menyebab-kan infeksi ringan (moderat) dengan indeks keparahan penyakit berkisar antara 1,39 hingga 1,67.
Keparahan penyakit berhubungan dengan virulensi patogen. Variasi virulensi selain disebabkan oleh variasi yang terjadi pada saat reproduksi aseksual, juga disebabkan oleh produksi toksin dari masing- masing isolat Foc yang diuji. Jamur Foc mampu
Tabel 4. Viabilitas isolat Foc yang telah dipreservasi selama 18 tahun
No Kode isolat Tahun liofilisasi Tanggal peremajaan Daya tumbuh Waktu tumbuh (Hari) 1. Pekulo 24-06-1999 19-04-2016 + 3 2. Sukorejo 24-06-1999 19-04-2016 + 3 3. Kali Sepanjang 08-06-1999 19-04-2016 + 2 4. Kalibaru 24-06-1999 19-04-2016 + 3 5. Purwojoyo 08-06-1999 19-07-2016 + 5 6. Prembun 10-07-1999 19-07-2016 + 3 7. Mulyosari 24-06-1999 19-07-2016 + 3 8. Sidogede 08-06-1999 14-10-2016 - - 9. Sidatan 24-06-1999 19-04-2016 + 3 10. Kemiri 24-06-1999 19-04-2016 - - 11. Juwangen 08-06-1999 14-10-2016 + 3 12. A-17 24-05-1999 14-10-2016 - - 13. A-11 24-05-1999 14-10-2016 - - 14. PS-5 01-05-2002 14-10-2016 + 3 15. B4-3-1 24-05-1999 14-10-2016 + 3 16. Fo2.16.16 24-05-1999 14-10-2016 + 5 17. PS-10 01-05-2002 14-10-2016 - - 18. A2 24-05-1999 14-10-2016 - - 19. Irja 24-06-1999 19-04-2016 - - Tabel 5. Indeks keparahan penyakit pada daun planlet pisang ambon kuning (30 HSI) Isolat Indeks keparahan penyakit (DSI) Keterangan DSI Pekulo 2,07 Virulen Sukorejo 2,71 Sangat virulen Kali Sepanjang 2,52 Sangat virulen Kalibaru 2,10 Sangat virulen Purwojoyo 2,04 Virulen Prembun 2,17 Sangat virulen Mulyosari 2,01 Virulen Juwangen 1,67 Moderat Sidatan 1,39 Moderat PS-5 2,10 Sangat virulen B4-3-1 1,46 Moderat Fo2.16.16 2,14 Sangat virulen Kontrol 0 -
memproduksi  toksin  asam  fusarat  (Groenewald, 2006). Asam fusarat dapat memengaruhi fungsi mitokondria, menghambat enzim katalase, serta mengganggu  membran  sel  yang  mengakibatkan kebocoran ion dan kematian sel (Ballio, 1981 cit. Jumjunidang et al ., 2011).
Perlakuan  kontrol  pada  uji  virulensi  ini  di- lakukan dengan planlet pisang ambon kuning tanpa inokulasi Foc. Pada tanaman kontrol tidak ditemukan adanya gejala menguning ataupun layu pada daun hingga akhir pengamatan (30 Hari Setelah Inokulasi). Jika dibandingkan dengan isolat yang diinokulasi Foc , terdapat perbedaan warna pada perakaran planlet (Gambar 1).
Berdasarkan Gambar 1, jika dibandingkan dengan planlet  tanpa  inokulasi Foc (kontrol),  perakaran tanaman yang diinokulasi dengan Foc terlihat berwarna hitam  dan  membusuk,  sedangkan  planlet  kontrol terlihat kokoh serta pada ujung akar berwarna putih menandakan  bahwa  tanaman  sehat  dan  tumbuh akar-akar yang baru. Hal ini menunjukkan bahwa adanya perubahan pada akar planlet yang terserang Foc berupa  kerusakan  akar  yang  menyebabkan tanaman menjadi bergejala. Foc menginfeksi pada akar, berkembang ke xylem, kemudian berlanjut ke bonggol dan batang semu yang mengakibatkan ter- ganggunya transportasi air sehingga muncul gejala penguningan pada daun (Ploetz et al., 2000).

## KESIMPULAN
Isolat Fusarium oxysporum f. sp. cubense ( Foc ) yang telah dipreservasi dengan liofilisasi memiliki viabilitas yang berbeda-beda dan mampu tumbuh pada 2−5 hari setelah inkubasi. Isolat Foc yang diuji memiliki tingkat virulensi yang bervariasi. Isolat Sukorejo, Kali Sepanjang, Kalibaru, Prembun, PS-5, dan Fo2.16.16, menyebabkan infeksi sangat parah (sangat virulen) dengan nilai Disease Severity Index (DSI) berkisar antara 2,10 hingga 2,71.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Badan Karantina Pertanian yang telah membiayai sebagian dari penelitian ini. Naskah ini merupakan bagian dari  tesis  berjudul  “Karakterisasi  Isolat Fusarium oxysporum f. sp. cubense yang telah Dipreservasi dengan Liofilisasi”.

## DAFTAR PUSTAKA
Bentley, S., K. G. Pegg, , N. Y. Moore, R. D. Davis,, & I. W. Buddenhagen. 1998. Genetic Variation among  Vegetative  Compatibility  Groups  of Fusarium oxysporum f. sp. cubense Analyzed by DNA Fingerprinting. Phytopathology 88: 1283−
1293.
Gambar 1. Planlet pisang ambon kuning; planlet kontrol (A1.1), planlet yang telah diinokulasi dengan Foc isolat Kali Sepanjang pada 7 Hsi (A1.2), perakaran planlet kontrol (A2.1), perakaran planlet yang telah diinokulasi dengan isolat Kali Sepanjang pada 7 Hsi (A2.2), planlet kontrol (B1.1), planlet yang telah diinokulasi dengan isolat Kali Sepanjang pada 30 Hsi (B1.2), perakaran planlet kontrol (B2.1), perakaran planlet yang telah di- inokulasi dengan isolat Kali Sepanjang pada 30 Hsi (B2.2)
Fourie, G., E. T. Steenkamp, T. R. Gordon, & A. Viljoen. 2009. Evolutionary Relationships among the Fusarium oxysporum f. sp. cubense Vegetative Compatibility Groups. Applied and Environmental Microbiology 75: 4770–4781.
Groenewald, S. 2005. Biology, Pathogenecity, and Diversity of Fusarium oxysporum f. sp. cubense.
Requirement for the Degree of Magister Science in the Faculty of Natural and Agricultural Science. University of Pretoria, Pretoria. 176 p.
Ilyas, M. 2007. Uji Viabilitas Koleksi Kapang LIPI- MC dalam Ampul Penyimpanan Kering-beku L- drying setelah  Satu Tahun Penyimpanan  pada Suhu 5ºC. Biodiversitas 8: 20−22.
Jumjunidang, C. Hermanto, & Riska. 2011. Virulensi Isolat Fusarium oxysporum f. sp. cubense VCG 01213/16  pada  Pisang  Barangan  dari Varietas Pisang dan Lokasi yang Berbeda. Jurnal Hortikultura 21: 145−151.
Mahmud,  M.  2001.  Teknik  Penyimpanan  dan Pemeliharaan Mikroba. Buletin AgroBio 4: 24−32.
Mak, C., A.A. Mohamed, K.W. Liew, & Y.W. Ho 2004. Early Screening Technique for Fusarium Wilt Resistance in Banana Micropropagated Plants. Banana Improvement. http://www.fao.org/ docrep/ 007/ae216e00.htm, diakses 18/2/16.
Mikata, K. 1999. Preservation of Yeast Culture by L-drying: Viability after 15 Years Storage at 5ºC.
IFO Research Communications 19: 71−82.
Rusli et al. : Viabilitas dan Virulensi Fusarium oxysporum f. sp. cubense yang Telah Dipreservasi dengan Liofilisasi 171
Nagai, T., T. Tomioka,  K. Takeuchi, M. Iida, M. Kawada, &  T.  Sato.  2005.  Evaluation  of  Preservation Techniques of Microorganism Resources in the MAFF Genebank. Japan Agricultural Research Quarterly 39: 19–27.
Nasir, N., Jumjunidang. & Riska. 2005. Deteksi dan Pemetaan Distribusi Fusarium oxysporum f. sp. cubense pada Daerah Potensial Pengembangan Agribisnis Pisang di Indonesia. Jurnal Hortikultura 5: 50−57.
Ploetz, R.C. & K.G. Pegg. 2000. Fungal Disease of the Root, Corm, and Pseudostem, p. 143−172.
In D.R. Jones (ed.), Disease of Banana, Abaca, and Enset . CABI Publishing, USA.
Riyadi, A.S., L. Soesanto, & Kustantinah. 2008. Virulensi Fusarium oxysporum f. sp. zingiberi Isolat Boyolali dan Temanggung setelah Disimpan Enam  Tahun  dalam  Tanah  Steril. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia 14: 80 – 85.
Su, H.J., S.C. Hwang, & W.H. Ko. 1986. Fusarial Wilt  of  Cavendish  Bananas  in  Taiwan. Plant Disease 70: 814−818. Vol. 22 No. 2                                                               Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia 172