## SENYAWA ASAM 2- METILESTER-1-H-PIROL-4-KARBOKSILAT DALAM EKSTRAK ETIL ASETAT BUAH SALAK VARIETAS BONGKOK SEBAGAI ANTIOKSIDAN DAN ANTIHYPERURICEMIA
[Studies on 2-Methylester-1-H-Pyrolle-4-Carboxylic Acid Compound in Ethylacetate Extract of Snake Fruit Variety
Bongkok as Antioxidant and Anthyperuricemic]
Leni Herliani Afrianti 1) *, Elin Yulinah Sukandar 2) , Slamet Ibrahim 3) , dan I Ketut Adnyana 2) .
1) Departemen Teknologi Pangan Universitas Pasundan, Bandung.
2) Farmakologi-Farmasi Klinik, Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung. 3) Farmasi kimia Research Group, Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung.
Diterima  1 Juli 2009 / Disetujui 20 Mei  2010

## ABSTRACT
The aim of the study was to determine the antioxidant and antihyperuricemia activity of ethyl acetate extract of snake fruit (Salacca edulis Reinw.)  var.  Bongkok.  The  research  methods  used  in  this  study comprised    of  three  stages.  First  stage,  the  isolation  processes,  consist  ed  of maceration, fractionation, and purification using several techniques of chromatography. The chemical structures of the isolated compounds were determined based on UV, IR, 1-D NMR, and 2-D NMR spectral data. The ethyl acetate extract of snake fruit var. Bongkok isolated was a new compound 2-methylester-1-H-pyrolle-4- carboxylic acid. In the second stage the antioxidant activity of the extract and the isolated compounds were measured by 1,1 diphenol  (DPPH) method. The antioxidant activity of the extracts and the isolated compounds were expressed as IC 50, The ethyl acetate  extracts  at  concentrations  of  0.2,  2,  20,  200,  400,  and  2000  µg/mL  showed  inhibition  of  9.67,  4.47,  41.89,  96.06,  82.54,  and  90.60  % respectively, with an IC 50 of 1.6 µg/mL. Ascorbic acid standards at the same concentration range showed an  IC 50 of 0.54 µg/mL. Meanwhile, at the same  concentrations  the  2-methylester-1-H-pyrolle-4-carboxylic  acid  showed  free  radical  inhibition  of  17.48,  21.48,  18.14,  31.87,  and  62.34  % respectively, with an  IC 50 of 3.27  µg/mL. During the third stage,  the antihyperuricemic properties of the extracts and the isolated compound were examinated in vitro using inhibition of xanthin oxidase method. The ethyl acetate extracts at concentrations of 0.01, 0.02, 0.2, 2, and 2000  µg/mL showed xanthin oxidase inhibition of 49.24, 49.58, 50.28 and 52.26 % respectively, with an  IC 50 of 24.75 µg/mL. At the same concentrations, the 2- methylester-1-H-pyrolle-4- carboxylic acid, showed xanthin oxidase inhibition of 27.7, 30.5, 37.3, 50.27 and 50.55 % respectively, with an IC 50 of 48.86 µg/mL.  Allopurinol as a standard drug showed an IC 50 of 0.92 µg/mL.
Keyword  :  2-methylester-1-H-pyrolle-4-  carboxylic  acid  compound,  ethyl  acetate  extract  of  snake  fruit  var.  Bongkok,  antioxidant  activity, antihyperuricemia, IC 50 .

## PENDAHULUAN
Kajian  terhadap  senyawa  aktif  buah  salak  dari  berbagai varietas  masih  belum  banyak  diketahui.  Buah  salak  var. Manonjaya  mengandung  beberapa  asam  antara  lain  asam suksinat,  asam  askorbat,  asam  adipat,  asam  malat  dan  asam sitrat  (Muchtadi,  1978).  Menurut  Leong  dan  Shui  (2002),  rata- rata  buah  salak  mengandung  asam  askorbat  2,4  ±  1,5 mg/100g.  Sedangkan  kadar  asam  askorbat  pada  buah  salak Bongkok  adalah  8,37  mg/100  g  berat  bahan  (Afrianti et  al., , 2006).    Menurut  Supriyadi et  al., (2002), 1 salak  var.  Pondoh mengandung sukrosa, glukosa, fruktosa, metil ester dari asam butanoat,  2-asam  metil  butanoat,  asam  heksanoat,  asam pentanoat dan asam karboksilat lainnya.
Pada umumnya buah-buahan mengandung zat antioksidan yang mempunyai struktur kimia berbeda seperti asam askorbat, asam  amino,  β  karoten,  likopen,  melanoidin,  asam  organik tertentu,  zat  pereduksi,  peptida,  fosfatida,  polifenol,  tanin,
Korespondensi penulis : *E-mail : leni_priyatno@yahoo.com
tokoferol,    polifenol  dan  flavonoid    (Benavente-Gracia et  al ., 1997; Ferrari dan Torres, 2003; Singh et al ., 1995; Leong dan Shui,  2001;  Marin et  al. 2002).  Senyawa  antioksidan  dalam buah-buahan  dapat  digunakan  untuk  mencegah  dan memelihara  sistem  kekebalan  tubuh,  memperlambat  proses penuaan,  mengatasi  stress,  mencegah  penyakit  degeneratif seperti  kanker,  jantung,  disfungsi  otak,  dan  katarak  (Zhu et al .,2004; Feskanich et al ., 2000).
Salah  satu  penyakit  generatif  adalah  pirai,  penyakit  ini ditandai  dengan  terjadinya  hiperurikemia  yaitu  kondisi asimtomatik  dimana  kadar  asam  urat  dalam  darah  melebihi normal.  Kadar  normal  asam  urat  dalam  darah  seorang  pria adalah 3,4-7,0 mg/dL, sedangkan wanita lebih rendah yaitu 2,4- 5,7 mg/dL. Asam urat merupakan produk akhir dari metabolisme purin.  Tingginya  kadar  asam  urat  di  dalam  darah  disebabkan banyaknya  sisa-sisa  pembuangan  hasil  metabolisme  purin, sedangkan  ekskresi  asam  urat  melalui  urin  terlalu  sedikit (Katzung,2002).
Enzim  penting  yang  berperan  dalam  sintesis  asam  urat adalah  xantin  oksidase  yang  sangat  aktif  bekerja  dalam  hati, usus halus dan ginjal. Tanpa bantuan enzim ini, asam urat tidak
dapat  dibentuk.  Xantin  oksidase  adalah  kompleks  metalo- flavoprotein  yang    mengoksidasi  hipoksantin  menjadi  xantin, dan  xantin  menjadi  asam  urat  (Fields et  al .,  1996).    Selama proses oksidasi terjadi pembentukan radikal-radikal bebas yang dapat  meningkatkan  aktivitas  xantin  oksidase  dan  kadar  asam urat  dalam  tubuh  akan  meningkat  pula.  (Al-Qirim et  al .,  2002; Fields et al .,1996; Vogel et al., 1996; Zhu et al ., 2004).
Dari  penelusuran  pustaka,  buah  salak  secara  umum memiliki  aktivitas  antioksidan.  Beberapa  varietas  buah  salak mengandung  senyawa  bioaktif  berupa  senyawa  antioksidan (Muchtadi, 1978; Suter, 1988; Leong dan Shui, 2002; Supriyadi et al., 2002). Kapasitas antioksidan buah tropis seperti mangga adalah  46,7±4,7  µmol/g  dan  salak  adalah  72,9±7,4  µmol/g (Leontowicz et al ., 2006).  Akan tetapi sampai saat ini pengujian aktivitas antioksidan dan antihiperurikemia dari buah salak var. Bongkok belum dilaporkan.
Oleh  karena  itu  timbul  suatu  pertanyaan  komponen  aktif apakah  dari  buah  salak  var.  Bongkok  yang  dapat  berpotensi sebagai  antioksidan  dan  bagaimana  menelaah  mekanisme kerja antihiperurikemia dari komponen aktif buah salak ( Salacca edulis Reinw.)  varietas  Bongkok.  Dengan  demikian  kajian seperti tersebut di atas sangat perlu dilakukan.
Mengacu  pada  tinjauan  pustaka  terhadap  komponen  kimia dan  aktivitas  biologi  buah  salak  secara  umum,  maka  dapat diajukan  hipotesis  bahwa  :  (1).  Buah  salak  ( Salacca  edulis Reinw.) varietas Bongkok diduga memiliki aktivitas antioksidan dan  (2).    Berdasarkan  aktivitas  antioksidan  dalam  buah  salak Bongkok  diduga  memiliki  efek  untuk  menghambat  aktivitas xantin  oksidase,  yang  pada  gilirannya  memiliki  efek antihiperurikemia.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengungkap struktur komponen aktif yang berkhasiat antioksidan dan antihiperurikemia dari komponen aktif dalam ekstrak etil asetat buah salak  ( Salacca edulis Reinw.) var. Bongkok. Pendekatan  yang  dilakukan  untuk  mewujudkan  tujuan penelitian  di  atas  meliputi  isolasi,  penentuan  struktur  senyawa hasil  isolasi  ditetapkan  berdasarkan  data  spektroskopi,  yang meliputi  spektrum  UV,  IR,  RMI  1-D,  dan  RMI  2-D,    pengujian aktivitas  antioksidan  secara in  vitro pada  ekstrak  dan  isolat dengan  mengukur  serapan  DPPH  ( 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) (Hsu et al., 2003), dan antihiperurikemia dengan metode inhibisi enzim  xantin  oksidase  (Vogel,  1996;  Punchard,  1996;  Zhu, et al ., 2004).

## METODOLOGI

## Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah Buah salak varietas Bongkok yang  berasal  dari  desa  Conggeang,  kabupaten  Sumedang. Buah  salak  Bongkok  dipanen  5  bulan  setelah  pembungaan, mempunyai kulit buah mengkilap dan susunan sisiknya tampak merenggang, bila dipetik mudah terlepas dari tandannya. DPPH ( 2,2-Diphenyl-1-picrilyidrazyl ),  xantin  oksidase  dari  Sigma (USA),  xantin    dari  Sigma  (USA),  air  suling,  etil  asetat,  dan bahan-bahan  kimia  serta  pereaksi-pereaksi  yang  digunakan untuk analisis profil fitokimia dari laboratorium SINDO. Peralatan yang  digunakan  adalah  neraca  analisis,  tunnel  drier,  tabung
maserasi,  bejana  kromatografi,  rak  tabung,  lemari  pendingin, spektrofotometer  (Spectronic  21  D),  spektrofotometer  (HP 8453),  alat  penguap  vakum  putar,  oven,  tanur,  Spektrum ultraviolet  (UV)  diukur  dengan  menggunakan  alat spektrofotometer  Cary  Varian  100  Conc.,  spectrum  inframerah ditetapkan  dengan  menggunakan  alat  spektrometer  Perkin Elmer  Spectrum  One  FT-IR,  spectrum 1 H  NMR  dan 13 C  NMR diukur dengan menggunakan spektrometer JEOL LTD. ECP400 dan  ECP500  DELTA_NMR,  beroperasi  pada  399,78  MHz  ( 1 H) dan 100,53 MHz ( 13 C).

## Metode
Penelitian  ini  terbagi  dalam  tiga  tahap.  Tahap  pertama, pembuatan  serbuk  simplisia  dilanjutkan  dengan  ekstraksi, fraksinasi,  isolasi  dan  pemurnian,  kemudian  karakterisasi struktur senyawa. Tahap kedua dilakukan pengujian antioksidan secara in vitro pada ekstrak dan isolat. Tahap ketiga pengujian antihiperurikemia  secara  in  vitro  dari  ekstrak  dan  isolat  yang berkhasiat antioksidan.

## Ekstraksi, Fraksinasi dan Isolasi ekstrak etil asetat
Buah  salak  Bongkok  dilakukan  pengeringan,  penggilingan untuk  mendapatkan  serbuk  simplisia  buah  salak  Bongkok. Serbuk  kering  simplisia  buah  di  ekstraksi  dilakukan  dengan maserasi-perkolasi pada suhu kamar dengan pelarut etil asetat selama  3  x  @  24  jam.  Selanjutnya  difraksinasi  dengan kromatografi  dengan  kromatografi  cair  vakum  (KCV) menggunakan  silica  gel.  Langkah  awal  fraksinasi  KCV  adalah dengan  analisis  komponen  menggunakan  KLT  (kromatografi Lapis Tipis) dengan mengamati bercak dari golongan senyawa yang  menjadi  tujuan  isolasi.  Pengamatan  bercak  dapat digunakan di bawah lampu UV panjang gelombang 254 nm dan bantuan  pereaksi  penyemprot  yaitu  serium  sulfat  dan  asam sulfat 10%. Pemurnian dilakukan untuk memisahkan fraksi yang mengandung  hanya  satu  komponen  utama  yaitu  KCV, Kromatografi  tekan  (KT)  dan  KLT  preparatif;  semuanya menggunakan  silikia  gel  sebagai  adsorben.  Elusidasi  struktur menggunakan  instrumen  spektrofotometri  UV-Visibel  untuk menganalisis adanya gugus kromofor dan gugus fungsi melalui profil spektrum, posisi panjang gelombang absorpsi maksimum dan  absortivitanya  pelarut  tertentu,  juga  didukung  dari  data spektrum infra merah, dan NMR.

## Pengujian Aktivitas Antioksidan
Aktivitas  antioksidan  diuji  berdasarkan  daya  peredaman radikal  bebas 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH).  Ekstrak,  isolat atau  pembanding  asam  askorbat,  dilarutkan  dalam  air  suling sehingga diperoleh konsentrasi 0,2; 2,0; 20; 200; 400 dan 2000 μg/mL.  Zat  uji  terhadap  aktivitas  radikal  bebas  DPPH  1  M dilakukan  dengan  mengukur  daya  meredam  radikal  bebas DPPH secara spektrofotometri dengan panjang gelombang 517 nm. Dari persen peredaman yang diperoleh dihitung persamaan regresinya  terhadap  konsentrasi  larutan  uji,  mengikuti persamaan :
Y = aX + b Dimana : Y  = % peredaman radikal bebas /DPPH (absorbansi) X  = log konsentrasi larutan uji
Dari semua data hasil percobaan kemudian ditentukan IC 50 yaitu konsentrasi inhibisi larutan uji yang mampu meredam 50% radikal bebas DPPH.

## Uji Antihiperurikemia secara
in vitro Uji antihiperurikemia dari isolat dan ekstrak etil asetat yang berkhasiat    antioksidan  secara in  vitro .  Sampel  uji  diinkubasi dengan  xantin  oksidase,  EDTA  dan  bufer  fosfat  (pH  7,8)  dan xantin pada 37 o C selama 15 menit. Bahan uji dalam meredam aktivitas  xanthin  oksidase  menggunakan  spektrofotometri dengan  panjang  gelombang  293  nm.  Larutan  kontrol  tanpa sampel  uji,  larutan  pembanding  adalah  alopurinol.  Penentuan inhibisi xantin oksidase ditentukan terhadap larutan blanko (Zhu et al .,2004).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakterisasi dan elusidasi senyawa  Asam metil-pirol-2,4- dikarboksilat
Data  spektrum  UV  senyawa  1  (Gambar  1)  menunjukkan serapan maksimum pada daerah panjang gelombang max 217 dan  270  nm  yang  mengindikasikan  adanya  kromofor. Penambahan  pereaksi  NaOH  menyebabkan  pergeseran batokromik ke panjang gelombang yang lebih tinggi yaitu pada
max 227  dan  314  nm.  Ester  metil  pada  senyawa  tersebut bereaksi  dengan  NaOH  terjadi  peristiwa  hidrolisis  yang membentuk ion karboksilat.
Dari Spektrum IR (Gambar 2) nampak adanya serapan yang lebar  pada  daerah  bilangan  gelombang max 3100-2500  cm -1 yang berasal dari regang ulur ( streching ) gugus OH asam dan serapan  pada max 3260  dan  3474  cm -1 yang  berasal  dari regang  ulur  ( streching )  gugus  N-H  amina  sekunder. Selanjutnya,  nampak  adanya  serapan  dengan  intensitas  kuat dan  tajam  pada max 1659  dan  1582  cm -1 ,  yang  berasal  dari regang  ulur  ( streching )    dua  gugus  C=C  alifatik  yang  berbeda substituen, sehingga muncul pada daerah yang berbeda. Pada daerah  bilangan  gelombang max 1612  cm -1 nampak  adanya sinyal  doblet  yang  sangat  kuat  dan  tajam  yang  berasal  dari regang  ulur  ( streching )  gugus  karbonil  asam  dan  ester.  Selain itu,  spektrum  IR  juga  menunjukkan  serapan  dari  regang  ulur ( streching )  gugus C-N yang muncul pada max 1283 cm -1 dan regang ulur ( streching ) gugus C-O-C ester ansimetri dan simetri berturut-turut pada max 1228 dan 1142 cm -1 .
Gambar  1.  Spektrum  UV  senyawa 1 ,  ( a )  pelarut  metanol,  ( b )  pelarut metanol + NaOH
Gambar 2.  Spektrum infra merah senyawa 1
Spektrum 1 H-RMI  senyawa  ( 1) (Gambar  3)  menunjukkan adanya  tiga  sinyal  proton  singlet  yang  terdiri  yaitu,  satu  sinyal proton  singlet  teroksigenasi  yang  berasal  dari  gugus  metoksi pada H 4,41 (OCH 3 ) ppm dan dua sinyal proton singlet vinilik pada H 6,49  (H-3)  dan  7,94  (H-4)  ppm.  Selain  itu,  dari spektrum 1 H-RMI  nampak  adanya  sinyal  singlet  yang  berasal dari  proton  amina  (NH)  pada H 5,60  (NH)  ppm.  Berdasarkan analisis  spektrum  COSY,  nampak  bahwa  ketiga  sinyal  proton tersebut  tidak  menunjukkan  korelasi  antara  satu  dengan  yang lain, sehingga dapat disimpulkan bahwa proton-proton tersebut tidak bertetangga.
Gambar 3.  Spektrum 1 H-RMI senyawa (1)
Dari  data  spektrum 13 C-RMI  (Gambar  4)  nampak  adanya enam sinyal yang mewakili tujuh atom karbon yaitu, satu karbon sp 3 dan enam karbon sp 2 .  Satu sinyal karbon sp 3 yang muncul pada C 61,1  ppm  berasal  dari  sinyal  atom  karbon  metoksi (OCH 3 ), sedangkan enam sinyal karbon sp 2 muncul antara lain berasal dari, dua sinyal atom karbon metin vinilik pada C 110,7 (C-3)  dan  140,9  (C-5)  ppm,  dua  sinyal  atom  karbon  kuartener vinilik  pada C 110,69  (C-4)  dan  147,3    (C-2)  ppm;  serta  dua sinyal atom karbon karbonil pada geseran kimia C 176,8 (C=O asam)  dan  170,3  (C=O  ester)  ppm.  Berdasarkan  data-data tersebut  dan  data  spektrum  IR  yang  mengindikasikan  adanya gugus amina, maka dapat diduga bahwa keempat karbon vinilik dan  satu  gugus  amina  tersebut  membentuk  suatu  cincin pentasiklik. Korelasi antara proton dan karbon yang terjadi pada senyawa ( 1 ) selanjutnya akan dijelaskan berdasarkan spektrum HMBC.
%T
Gambar 4.  Spektrum 13 C-RMI senyawa (1)
Gambar 5.  Spektrum C-H HMBC 2D senyawa (1)
Berdasarkan spektrum HMBC (Gambar 5), nampak adanya korelasi  antara  atom  karbon  pada  δ C 170,3  (C=O  ester)  ppm dengan  proton  H-3,  dan  H-metoksi,    yang  menetapkan  posisi gugus  metoksi  terikat  pada  atom  C-karbonil  ester,  sedangkan korelasi antara proton δ H 6,49 (H-3) ppm dengan atom karbon C-2, C-metoksi dan C-karbonil ester, serta korelasi antara atom karbon C-2 dengan proton H-3, telah menetapkan posisi gugus karbonil  ester  terikat  pada  atom  C-2.  Penetapan  posisi  gugus karbonil  ester  pada  C-2  tersebut  berdasarkan  korelasi  antara atom karbon C-metoksi dengan proton H-3 yang memiliki posisi paling  dekat  dengan  gugus  C-metoksi.  Selain  itu,  korelasi antara  atom  karbon  pada  δ C 176,8  (C=O  asam)  ppm  dengan proton  H-3  dan  H-5,  telah  menetapkan  posisi  atom  karbon karbonil asam tersebut terikat pada C-4 (Gambar 6).
H N OCH 3 O O OH 2 3 4 5 1 H H
Gambar 6.  Korelasi spesifik spektrum C-H HMBC 2D senyawa (2)
Tabel 1.  Data Spektrum 1 H, 13 C dan 2D RMI senyawa 1 No 1 H RMI H (multi.) ppm 13 C RMI C (ppm) HMBC 1 - - - 2 - 147,3 5, 3, OCH 3 3 6,49 ( s ) 110,7 OCH 3 4 - 110,7 - 5 7,94 ( s) 140,9 - C=O (asam) - 176,8 3, 5 C=O (ester) - 170,3 3, OCH 3 OCH 3 4,41 ( s ) 61,1 3
Asam  metil-pirol-2,4-dikarboksilat  (1) diperoleh  sebagai kristal jarum berwarna coklat muda, t.l. 63-68 o C. Spektrum UV (MeOH) max (nm); 217, 270, 227 dan 314. Spektrum IR (KBr)
maks (cm -1 );  3100-2500  (OH),  3260,  3474,  1283  (NH  amia sekunder), 1659, 1582 (C=C), 1612 (C=O), 1228 dan 1142 (C- O-C).  Spektrum 1 H  RMI  (aseton- d ,  500  MHz)  δ H (ppm);  6,49 (1H, s, H-4), 7,94 (1H, s , H-5), 4,41 (3H, s, H-OCH 3 ). Spektrum 13 C  RMI  (aseton- d ,  125  MHz)  δ C (ppm);  147,31  (C-2),  110,69 (C-3), 110,69 (C-4), 140,90 (C-5), 176,78 (C=O, asam), 170,34 (C=O,ester), 61,12 (OCH 3 )
Data  tersebut  sesuai  dengan  kerangka  struktur  senyawa siklik lima amina yang mempunyai dua pasang ikatan rangkap dua  dari  golongan  pirol.  Berdasarkan  data-data  tersebut  dan hasil penelusuran data base dari Chemfinder dapat disimpulkan bahwa,  senyawa  2  adalah  senyawa  turunan  pirol  yang  baru pertama kali diisolasi dari tumbuhan yaitu asam metil-pirol-2,4- dikarboksilat,  dan  kerangka  strukturnya  ditunjukkan  pada Gambar 6.
H N OCH 3 O O OH 2 3 4 5 1 Gambar 6 . Asam metil-pirol-2,4- dikarboksilat
Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  dan  Senyawa  Asam  metil- pirol-2,4-dikarboksilat
Hubungan  antara  ekstrak  dan  isolat  dengan  aktivitasnya sebagai antioksidan, akan lebih teliti dengan mempertimbangkan konsentrasi peredaman radikal bebas oleh ekstrak  atau  isolat  tersebut  dengan  menggunakan  nilai  IC 50 (Hsu et al ., 2003). Konsentrasi inhibisi 50% dari masing-masing ekstrak dan isolat dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2.  IC 50 ekstrak dan isolat buah salak  Bongkok S alacca edulis einw) dalam menghambat radikal bebas DPPH
Sampel IC 50 (µg/mL) Ekstrak etil asetat Asam askorbat 2-metilester-1-H-pirol-4-asam karboksilat 1,60 ±0,9 0,54±0,23 3,27±2,12
Pada  Tabel  2,  senyawa  asam  metil-pirol-2,4-dikarboksilat mempunyai  IC 50 pada  konsentrasi  3,27  μg/mL  dan  ekstrak  etil asetat 1,60 μg/mL,  sehingga dapat dikatakan bahwa senyawa asam  metil-pirol-2,4-dikarboksilat  dan  ekstrak  etil  asetat  efektif sebagai  antioksidan.  Asam  askorbat  sebagai  pembanding memiliki  IC 50 sebesar  0,54  µg/ml.Menurut  Desvia  (2007),  IC 50 ekstrak  air  buah  salak  Bongkok  adalah  192,68  µg/mL. Sedangkan menurut Indraswari (2007) IC 50 ekstrak etanol buah salak Bongkok adalah 4,29 µg/mL.
Asam  askorbat  merupakan  antioksidan  yang  berfungsi sebagai reduktor mudah mengalami oksidasi oleh radikal bebas karena  mempunyai  ikatan  rangkap  dengan  2  gugus  -OH  yang terikat pada ikatan rangkap tersebut, radikal bebas DPPH akan mengambil  satu  atom  hidrogen  gugus  hidroksil  dan menyebabkan  terbentuknya  radikal.  Radikal  oksigen  yang terbentuk  tersebut  selanjutnya  akan  bereaksi  lagi  dengan  satu molekul  DPPH,  sehingga  menghasilkan  senyawa  yang  stabil dan  tidak  membahayakan  melalui  delokalisasi  elektron. Semakin kecil nilai IC 50 maka senyawa uji tersebut mempunyai keefektifan sebagai penangkap radikal yang lebih baik.
Reaksi  penangkapan  radikal  bebas  DPPH  oleh  senyawa asam  metil-pirol-2,4-dikarboksilat,  dapat  diusulkan  melalui mekanisme seperti ditunjukkan pada Gambar 7. Radikal bebas DPPH akan menangkap atom hidrogen yang terikat pada atom nitrogen  gugus  pirol,  menghasilkan  senyawa  radikal  ( 2a )  dan senyawa DPPH 2 yang stabil. Selanjutnya senyawa radikal ( 2a ) yang terbentuk ini, akan mengalami resonansi berkesetimbangan untuk memindahkan elektron radikal ke atom N  dan  menghasilkan  senyawa  radikal  ( 2b ).  Senyawa  radikal ( 2b ) ini, selanjutnya akan bereaksi dengan satu molekul DPPH, melalui  atom  hidrogen  yang  terikat  pada  gugus  asam, menghasilkan senyawa ( 2c ) dan DPPH 2 yang stabil. Dari reaksi Gambar  7,  nampak  bahwa  satu  molekul  asam  metil-pirol-2,4-
dikarboksilat  dapat  menangkap  dua  molekul  radikal  bebas DPPH, sehingga dapat diharapkan bahwa Asam metil-pirol-2,4- dikarboksilat  memiliki  kemampuan  yang  sama  dengan  asam askorbat.  Namun  berdasarkan  hasil  pengukuran  aktivitas antioksidan,  nampak  bahwa  asam  askorbat  memiliki  nilai  IC 50 yang  lebih  kecil  dibandingkan  dengan  asam  metil-pirol-2,4- dikarboksilat, hal ini dapat dilihat dari perbedaan nilai IC 50 yang 10 kali lebih tinggi dibandingkan dengan asam askorbat.
Perbedaan kemampuan penangkapan radikal bebas DDPH antara  asam  askorbat  dan  asam  metil-pirol-2,4-dikarboksilat tersebut  kemungkinan  disebabkan  oleh  perbedaan  sifat  atom hidrogen dan proses penangkapan radikal bebas DPPH. Proses penangkapan radikal bebas DPPH tahap pertama sama dengan asam  askorbat,  karena  sifat  atom  hidrogen  gugus  amina memiliki sifat yang hampir sama dengan atom hidrogen gugus hiroksil  alkohol  asam  askorbat,  namun  pada  tahap  kedua, penangkapan  radikal  bebas  DDPH  dilakukan  oleh  atom hidrogen gugus hidroksil asam yang lebih bersifat elektropositif, sehingga  proses  ini  tidak  mudah  terjadi.  Berdasarkan  ulasan tersebut  maka  dapat  disimpulkan  bahwa,  perbedaan  aktivitas antioksidan  antara  asam  askorbat  dan  asam  metil-pirol-2,4- dikarboksilat,  disebabkan  karena  proses  penangkapan  radikal bebas DPPH yang efektif hanya terjadi pada tahap pertama.
Aktivitas  antioksidan  senyawa  terhadap  peredaman  radikal bebas  didasarkan  pada  nilai  IC 50 yang  merupakan  persen penangkap  radikal  oleh  senyawa  anti  radikal  terhadap  radikal DPPH sebesar 50%. Semakin kecil nilai IC 50 suatu ekstrak atau isolat  maka  semakin  besar  aktivitas  antiradikal  ekstrak  atau isolat  tersebut.  Senyawa  dikatakan  aktif  sebagai  antioksidan bila  memiliki  nilai  IC 50 <  200    µg/mL  (Thuong et  al .,2006). Senyawa yang dapat dikembangkan untuk diuji lebih lanjut sifat antioksidannya adalah asam metil-pirol-2,4-dikarboksilat.
+ N H 3 CO O O O H H + N H 3 CO O O O H N NO 2 O 2 N NO 2 N(C 6 H 5 ) 2 + N OCH 3 O O O +
N H 3 CO O O O H HN O 2 N NO 2 NO 2 N(C 6 H 5 ) 2 N NO 2 O 2 N NO 2 N(C 6 H 5 ) 2 ( 2a ) ( 2b ) ( 2c ) ( 2 ) ( DPPH ) ( DPPH 2 ) HN O 2 N NO 2 NO 2 N(C 6 H 5 ) 2 ( DPPH ) ( DPPH 2 )
Gambar 7.   Usulan mekanisme reaksi penangkapan radikal bebas DPPH oleh senyawa asam metil-pirol-2,4-dikarboksilat.
Menurut Tapiero et al ., (2004) senyawa yang  mengandung sebuah  atau  beberapa  ikatan  rangkap  seperti  golongan karotenoid,  vitamin,  flavanoid  atau  fenol  dapat  menghambat oksidasi  dan  menangkap  senyawa  reaktif  radikal  bebas (oksigen  singlet)    yang  merusak  sel.  Semakin  banyak  ikatan rangkapnya  semakin  kuat  daya  kerja  antioksidannya.  Oksigen singlet  adalah  molekul  yang  memiliki  elektron  π  yang  sangat reaktif.  Mekanisme  pelepasan  ( quenching) energi  dari  oksigen singlet  yang  elektron  terluarnya  sudah    berpasangan    dan memiliki  tingkat  energi  yang  tinggi  sehingga  oksigen  singlet mudah  bereaksi  dengan  molekul  organik  pada  senyawa  yang juga mempunyai elektron terluar berpasangan. Oksigen singlet bereaksi  dengan  senyawa  yang  mempunyai  struktur  dengan elektron pada ikatan rangkapnya. (Boff and Min,2002).
Menurut  Raharjo  (2006),  antioksidan  yang  berfungsi sebagai  reduktor,  mudah  mengalami  oksidasi  oleh  radikal bebas  karena  mempunyai  ikatan  rangkap  dan  dengan  adanya gugus  –OH  yang  terikat  pada  ikatan  rangkap  tersebut,  radikal bebas  akan  mengambil  atom  hidrogen  dan  menyebabkan terbentuknya  radikal  oksigen  yang  selanjutnya  akan didelokalisasi melalui resonansi, sehingga menghasilkan radikal yang stabil.
3.  Peredaman  Xantin  Oksidase  Oleh  Ekstrak  Etil  Asetat Dan Senyawa Asam Metil-Pirol-2,4-Dikarboksilat
Xantin  oksidase  adalah  kompleks  metalo-flavoprotein  yang mengoksidasi  hipoksantin  menjadi  xantin,  dan  xantin  menjadi asam urat (Fields et al ., 1996).  Selama proses oksidasi terjadi pembentukan  radikal-radikal  bebas  yang  dapat  meningkatkan aktivitas xantin oksidase dan kadar asam urat dalam tubuh akan meningkat pula. (Al-Qirim et al ., 2002; Fields et al .,1996; Vogel et  al., 1996;  Zhu et  al .,  2004).  Pada  proses  oksidasi  xantin oksidase  menghasilkan  superoksida  (O 2- )  yang  mengubah xantin  menjadi  asam  urat.  Untuk  menghambat  terbentuknya asam  urat  digunakan  alopurinol.  Alopurinol  (4-hidroksipirazol [3,4-d]  pirimidin)  adalah  suatu  analog  purin  yang  menghambat sintesis asam urat dengan jalan menghambat secara kompetitif enzim xantin oksidase (Fields et al ., 1996; Vogel et al., 1996). Alopurinol  digunakan  untuk  terapi  penderita  hiperurikemia  dan pirai, karena dapat menurunkan kadar asam urat dalam serum (Fields et al ., 1996).
Kemampuan  ekstrak  etil  asetat  dan  senyawa  asam  metil- pirol-2,4-dikarboksilat dalam meredam aktivitas xantin oksidase dilihat  dari  absorbansi  yang  memberikan  nilai  lebih  rendah dibandingkan  kontrol.    Meskipun  hasil  absorban  terhadap konsentrasi  ekstrak  menunjukkan  bahwa  ekstrak  mempunyai absorban  lebih  rendah  dibanding  kontrol  tetapi  pada  Tabel  3, persen peredaman ekstrak yang mampu meredam 50% enzim xantin oksidase,  ekstrak etil asetat konsentrasi 0,01; 0,02;  0,2; 2; dan 2000 µg/mL masing-masing adalah 36,27; 49,24;  49,58; 50,28;  dan  52,26%  dengan  IC 50 24,75  µg/mL,  sedangkan senyawa  asam  metil-pirol-2,4-dikarboksilat  mampu  meredam aktivitas xantin oksidase masing-masing yaitu 27,7;  30,5;  37,3; 50,27  dan  50,55%  dengan  IC 50 48,86  µg/mL.  Sementara  itu, pada  konsentrasi  yang  sama  pembanding  alopurinol  dapat menginhibisi  aktivitas  enzim  xantin  oksidase  masing-masing yaitu  38,02;    41,72;    44,30;    65,31;  dan  67,70  %  dengan  IC 50 0,92  µg/mL.  Peredaman  xantin  oksidase  oleh  senyawa
didasarkan pada nilai IC 50 , senyawa dikatakan aktif bila memiliki nilai IC 50 kurang dari 100 µg/mL (Thuong et al .,2006).
Tabel 3.  IC 50 ekstrak dan senyawa asam metil-pirol-2,4-dikarboksilat dalam  buah  salak  Bongkok  ( Salacca  edulis Reinw)  dalam
menghambat xantin oksidase Sampel IC 50 (µg/mL) Ekstrak etil asetat Alopurinol 2-metilester-1-H-pirol-4-asam karboksilat 24,75 ± 5,75 0,92 ± 0,79 48,86 ± 6,72
Golongan senyawa aromatik seperti flavonoid pada ekstrak daun Biota orientalis yaitu quersetin dan rutin dapat mencegah pembentukan  radikal  bebas  sehingga  menghambat  aktivitas xantin oksidase dan mengendalikan kenaikan kadar asam urat plasma tikus (Zhu et al .,2004; Al-Qirim et al., 2002). Flavonoid merupakan  senyawa  antioksidan  dan  termasuk  kelompok senyawa  aromatik.  Antioksidan  adalah  senyawa  yang  akan bereaksi  dengan  radikal  bebas  dengan  memberi  elektron membentuk  produk  yang  stabil.  Antioksidan  yang  telah kehilangan  elektron  tidak  akan  berubah  menjadi  radikal  baru, karena struktur stabil (Lee et al ., 2004). Suatu molekul organik yang mempunyai kelebihan elektron pada gugus aromatik dan adanya  ikatan  rangkap  akan  terjadi  interaksi  dengan  radikal bebas.  Mekanisme  pengikatan  antara  radikal  bebas  dengan ikatan  rangkap  pada  senyawa  tersebut  berdasarkan  transfer energi dari oksigen singlet ke molekul senyawa ikatan rangkap dalam kondisi triplet (Raharjo,2006).
Manfaat  dari  penelitian  ini  telah  mengungkap  beberapa kajian  yang  belum  tergali  dari  buah  salak  varietas  Bongkok. Adanya  senyawa  dari  ekstrak  etil  asetat  buah  salak  Bongkok yaitu  asam  metil-pirol-2,4-dikarboksilat.  Senyawa  asam  metil- pirol-2,4-dikarboksilat  merupakan  senyawa  baru  yang  berhasil diisolasi  dalam  ekstrak  etil  asetat  yang  mempunyai  aktivitas antioksidan  dan  dapat  menghambat  xantin  oksidase. Sementara itu,  ekstrak etil asetat buah salak Bongkok memiliki aktivitas  antioksidan  yang  dapat  menghambat  xantin  oksidase secara in vitro . Dengan adanya senyawa aktif dalam buah salak var. Bongkok ( Salacca edulis Reinw.),  maka dapat digunakan untuk pengembangan ekstrak buah salak var. Bongkok sebagai obat  dan  atau  pangan  fungsional.  Penelitian  lanjutan  yang dapat  dilakukan  untuk  pengembangan  obat  antihiperurikemia dan  atau  pangan  fungsional  adalah  uji  keamanan  dan pengembangan formulasi dari ekstrak dan atau senyawa yang aktif.

## KESIMPULAN
Penelitian  ini  telah  mengungkap    aktivitas  antioksidan  dan antihiperurikemia  ekstrak  etil  asetat  dan  berhasil  diisolasi senyawa yaitu asam metil-pirol-2,4-dikarboksilat buah salak var. Bongkok.  Ekstrak    etil  asetat  memiliki  aktivitas  antioksidan dengan  IC 50 1,6  µg/mL  dan  senyawa  asam  metil-pirol-2,4- dikarboksilat  merupakan  senyawa  baru  dalam  tanaman  salak var.  Bongkok  yang  mempunyai  aktivitas  antioksidan  dengan IC 50 3,27  µg/mL.  Ekstrak  etil  asetat  yang  memiliki  aktivitas menghambat  xantin  oksidase  dengan  IC 50 24,75  µg/mL,  dan
senyawa  asam  metil-pirol-2,4-dikarboksilat  dengan  IC 50 48,86 µg/mL.

## DAFTAR PUSTAKA
Afrianti  LH,  Sukandar  EY,  Ibrahim  S,  Adnyana  IK.  2006. Aktivitas  antioksidan  ekstrak  daging  buah  salak  varietas Bongkok. J.Acta Pharmaceutica. ITB.2006.
Al-Qirim  TM,  Shahwan  M,  Zaidi  KR,  Uddin  Q,  Banu  N.  2002. Effect    of    khat,  its  constituent  and  restraint  stress  on  free radical metabolism of rats. J.Ethnopharm, 83: 245 -250.
Benavente-Garcia  O,  Castillo  J,  Marin  FR,  Ortuno  A,  Del  Rio JA. 1997. Uses of properties of citrus flavanoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry,45 (12). 4505-4515.
Boff J, Min DB. 2002. Chemistry and reaction of singlet oxygen in food. Comp Rev Food Sci. Safety, 1:58-72.
Desvia A. 2007. Pengaruh jumlah ekstrak salak dan konsentrasi gula  terhadap  karakteristik  soft  candy  salak  Bongkok sebagai  pangan  fungsional,  Skripsi,  Jurusan  Teknologi Pangan Universitas Pasundan Bandung, hal 48.
Ferrari CKB, Torres EAFS. 2003. Biochemical pharmacology of fungcional  foods  and  prevention  of  chronic  diseases  of aging. Biomedicine & Pharmacoterapy,  57. 251-260.
Feskanich D, Ziegler RG, Michaud DS, Giovannucci EL, Speizer FE, Willett WC, Colditz GA. 2000. Prospective study of fruit and vegetables consumption and risk of lung cancer among man  and  woman.  J.  of  the  nation  Cancer  Institute,  92, 1812-1823.
Fields M, Charles GL, Mark DL. 1996. Allopurinol, an inhibitor of xanthine oxidase, reduces uric acid levels and modifies the signs associated with copper deficiency in rats fed fructose, J. Free Radical  Biology  & Medicine, Vol 20, No 4, pp.595- 600.
Hsu  CL,  Chen  W,    Weng  YM,  Tseng.  2003.  Chemical composition, physical properties and antioxidant activities  of yam  flours  as  affected  by  different  drying  methods.  J.Food Chem.,83(1), 85-92.
Indraswari  FP.  2007.  Pengaruh  konsnetrasi  asam  sitrat  dan konsnetrasi  asam  tartrat  terhadap  karakteristik  tablet effervescent  dari  ekstrak  salak  (Salacca  edulis  Reiwn.) varietas  Bongkok.  Skripsi,  Jurusan  Teknologi  Pangan Universitas Pasundan Bandung, hal 43.
Katzung  BG.  2002.  Farmakologi  Dasar  dan  Klinik,  terjemahan Bagian  Farmakologi  Fakultas  Kedokteran  Universitas Indonesia, Salemba Medika, Jakarta, 487-493.
Leong  LP,  Shui  G.  2002.  An  Investigation  of  antioxidant capacity  of  fruits  in  Singapore  markets,  J.  Food  Chemistry 76. 69-75.
Marin  FR,  Martinez  M,  Uribesalgo  T,  Castillo  S,  Frutos  MJ. 2002, Changes in nutraceutical composition of lemon juices according  to  different  industrial  extraction  systems,  Food Chem.,  78.319-324.
Muchtadi  D.  1978.  Perubahan  Fisiko  Kimia  Buah  Salak Kalengan  Selama  Penyimpanan.  Tesis.  Institut  Pertanian Bogor. Bogor.
Raharjo  S.  2006.  Kerusakan  Oksidatif  pada  Makanan,  Gadjah Mada University Press, Yogyakarta
Supriyadi,  Suhardi,  Suzuki  M,  Yoshida  K,  Muto  T,  Fuujita  A,
Watanabe N. 2002. Changes in the volatile compounds and in  the  chemical  and  physical  properties  of  snake  fruit (Salacca  edulis  Reinw.)  cv.  Pondoh  during  maturation.  J. Agric.chem.,50;7627-7633Tapiero et al ., (2004)
Thuong  PT,  Na  MK,  Dang  NH,  Hung  TM,  Ky  PM,  Thanh  TV,
Nam  NH,  Thuan  ND,  Sok  DE,  Bae  KI.  2006.  Antioxidant activities  of  Vietnamese  medicinal  Plants,  J.  Natural Prod.Sci.12(1):29-37.
Vogel HG, Wolfgang HV. 1996. Drug discovery and evaluation pharmacological assay. Springer.Philadelphia.178-179.
Zhu ZX, Wang Y, Kong LD, Yang C, Zhang X. 2004. Effects of Biota  orientalis  extract  and  its  flavonoid  constituents, quercetin  and  rutin  on  serum  uric  acid  levels  in  oxonate- induced  mice  and  xanthine  dehydrogenase  and  xanthine oxidase  activities  in  mouse  liver.  J.    Ethnopharmacology 93:133-140.