## Pengaruh Nebulisasi N-acetylcysteine Terhadap Pembentukan Biofilm Bakteri Pada Pipa Endotrakeal Pada Pasien yang Terpasang Ventilator di ICU
Shila Suryani 1* , Untung Widodo 2 , Abu Tholib Aman 3
1.  Departemen Anestesiologi dan Terapi Intensif, Fakultas Kedokteran, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto, Indonesia
2.  Departemen Anestesiologi dan Terapi Intensif, Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat dan Keperawatan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia
3.  Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat dan Keperawatan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia

## ABSTRAK
Latar Belakang : Kemampuan bakteri membentuk biofilm merupakan salah satu penyebab resistensi antibiotik dan menurunkan angka keberhasilan terapi. N-acetylcysteine merupakan obat mukolitik yang juga memiliki efek menghambat produksi dari matriks polisakarida ekstraseluler, sehingga dapat mencegah pembentukan biofilm. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh nebulisasi N-acetylcysteine terhadap pertumbuhan biofilm pada pipa endotrakeal pada pasien yang terpasang ventilator.
Metode: Rancangan  penelitian  ini  uji  klinis  acak  terkontrol,  ketersamaran  ganda.  Kriteria  inklusi subjek penelitian adalah usia 18-70 tahun, menggunakan ventilator dengan pipa endotrakeal H-0, dan setuju menjadi subyek penelitian, kriteria eksklusi adalah pasien yang mempunyai penyakit paru sebelum intubasi dan pasien sulit intubasi, kriteria drop out adalah pipa endotrakeal ekspulsi atau autoextubasi, meninggal < 48 jam, dan ekstubasi > 96 jam. Pasien dibagi menjadi dua kelompok. kelompok A mendapatkan nebulisasi N-acetylcysteine dan kelompok B yang mendapatkan nebulisasi akuades setiap delapan jam hingga ekstubasi. Sampel diambil berupa apusan ujung ET pasien yang terpasang ventilator 48-96 jam.
Hasil: Total  subjek  berjumlah  122  pasien,  12 drop out .  Sampel  yang  didapatkan  berjumlah  110, 55 sampel kelompok A dan 55 kelompok B. Terdapat perbedaan karakteristik sampel pada faktor komorbid  sepsis  dan  jenis  oprasi.  Tidak  didapatkan  perbedaan  bermakna  secara  statistik  pada bakteri pembentuk biofilm ringan dan sedang, namun dijumpai perbedaan bermakna pada bakteri pembentuk biofilm kuat.
Simpulan : pemberian nebulisasi N-acetylcysteine pada pasien yang menggunakan ventilator dengan pipa ET 48-96 jam tidak mencegah terbentuknya biofilm namun dapat menghambat pembentukan biofilm kuat.
Kata Kunci : biofilm; N-acetylcysteine ; pipa endotrakeal; ventilator
11
*penulis korespondensi
DOI: 10.55497/majanestcricar.v42i1.322

## ABSTRACT
Background: The  formation  of  biofilms  can  lead  to  antibiotic  resistance  thereby  reduce  the success of therapy. N-acetylcysteine is a mucolytic drug which has an effect inhibit the production of  the  extracellular  polysaccharide  matrix,  thereby  preventing  biofilm  formation.  This  study  aim to  determined  the  effect  of  N-acetylcysteine  nebulization  on  bacteria  biofilms  formation  on  the endotracheal tube in patients with ventilators more than 48 hours. Methods: Design of this study was a randomized control trial with double blindness. The inclusion criteria  subjects were 18-70 years old, using  ventilator with endotracheal tube H-0  and signed informed  consent,  exclusion  criteria  were  patients  with  lung  disease  before  intubation  and  had difficult intubation, drop out criteria were expulsed or auto extubated, died < 48 hours, and had extubation > 96 hours. Patients were randomized into two groups. Group A got N-acetylcysteine and group B got aquadest every 8 hours until they extubated. Samples were taken in ET tip smears from patients who were attached to a ventilator for 48-96 hours. Results: 122 patients obtained, 12 patients dropped out, total samples were 110, 55 samples in each group. There were differences in sample characteristics on sepsis and types of surgery. There were no statistically significant differences in weak and moderate biofilm-forming bacteria, but significant differences were found in strong biofilm-forming bacteria. Conclusion: Administration of nebulized N-acetylcysteine to patients on ventilators with ET tubes does not prevent the formation of biofilms but can inhibit the formation of strong biofilms.
Keywords: biofilms; endotracheal tube; N-acetylcysteine; ventilators
ORIGINAL ARTICLE
*corresponding author

## Effect N-acetylcysteine Nebulation on Bacteria Biofilms Formation on Endotracheal Tube in Patients with Ventilators in ICU
Shila Suryani 1* , Untung Widodo 2 , Abu Tholib Aman 3
1.  Department  of  Anesthesiology  and  Intensive  Therapy,  Faculty  of  Medicine,  Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto, Indonesia
2.  Departement of Anesthesiology and Intensive Therapy, Faculty of Medicine Public Health and Nursing, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia
3.  Departement of Microbiology, Faculty of Medicine Public Health and Nursing, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia
DOI: 10.55497/majanestcricar.v42i1.322
Pipa endotrakeal (ET) merupakan salah satu tempat yang baik dan ideal bagi bakteri untuk melekat dan membentuk biofilm baik di dalam maupun diluar lumen. Sesaat setelah intubasi, bakteri patogen akan berkumpul di permukaan ET  terutama  disepertiga  distal.  Pasien  yang terpasang ET lebih dari 24 jam, 97% sudah terbentuk  biofilm. 1,2 Biofilm  adalah  struktur tiga  dimensi  yang  terbentuk  dari  substansi Extracelluler Polymeric Substances (EPS) yang disekresikan oleh bakteri yang melekat pada permukaan .3,4 Terbentuknya kolonisasi bakteri merupakan salah satu faktor terjadinya infeksi dan diperkirakan 65% dari infeksi bakteri berhubungan dengan terbentuknya biofilm. 5 Adanya biofilm merupakan salah satu faktor penyulit dalam keberhasilan memberikan terapi pada infeksi bakteri, karena dapat menyebabkan resistensi terhadap  antibiotik,  sehingga  dibutuhkan konsentrasi  obat  antibiotik  10-100  kali  lipat dibandingkan pada bakteri dalam bentuk plankton.  Selain  itu,  terbentuknya  biofilm  juga menyebabkan terjadinya reinfeksi yang dapat terjadi beberapa minggu atau bulan kemudian. 6 N-acetylcysteine (NAC) merupakan obat mukolitik  yang  biasa  digunakan  pada  terapi penyakit paru. Beberapa studi menyebutkan NAC  juga  memiliki  efek  anti  bakterial  dengan mekanisme kerja dapat menghambat produksi dari matriks polisakarida ekstraseluler sehingga mencegah terbentuknya biofilm. 7

## PENDAHULUAN

## METODE PENELITIAN
Rancangan  penelitian  ini  adalah  uji  klinis acak terkontrol eksperimental paralel dua kelompok dengan ketersamaran ganda. 8 Subjek penelitian dirandomisasi dengan teknik random sederhana menjadi dua kelompok, kelompok A  mendapatkan  nebulisasi  NAC  100  mg/ml,  3 ml dan kelompok B mendapatkan nebulisasi akuades 3 ml. Nebulisasi diberikan setiap 8 jam mulai dari subyek terintubasi hingga ekstubasi pada  rentang  waktu  48-96  jam.  Kriteria  inklusi meliputi  pasien  berumur  18-70  tahun  yang menggunakan  ventilasi  mekanik  dengan  pipa trakeal  hari  ke  0  (surgikal  maupun  medikal) dan  setuju  menjadi  subjek  penelitian.  Kriteria
eksklusi yaitu pasien yang menderita infeksi paru sebelum  terpasang  ET  dan  ventilasi  mekanik, dan  pasien  sulit  intubasi  (usaha  intubasi  >  3x/ false route ).  Pasien  yang  mengalami  ekspulsi/ autoekstubasi, meninggal kurang dari 48 jam, dan ekstubasi lebih dari 96 jam akan di drop out . Sampel yang diambil berupa apusan ujung ET intra dan ekstra lumen kemudian dilakukan pencampuran pada tabung reaksi dan kemudian ditanam di media agar. Bakteri yang tumbuh dilakukan  dilakukan  identifikasi  bakteri  dan pemeriksaan  biofilm  secara  tidak  langsung dengan teknik microplate titer assay . 9 Penilaian biofilm  dilakukan  dengan  mengukur  densitas optikal biofilm. Analisa data untuk karakteristik sampel menggunakan tes Fisher karena syarat Chi-Square  tidak  terpenuhi  dan  perbandingan biofilm  kedua  kelompok  menggunakan  Mann- Whitney karena distribusi data tidak normal.

## HASIL PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan setelah persetujuan etik dari komite etik Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat dan Keperawatan UGM diterbitkan dengan No KE/FK/1231/EC/2022.  Subyek yang mengikuti penelitian berjumlah 122 pasien, 12 subyek drop out karena ekspulsi, meninggal kurang dari 48 jam dan menggunakan ventilator lebih  dari  96  jam,  sehingga  didapatkan  110 sampel yang dilanjutkan ke pemeriksaan biofilm dan  identifikasi  bakteri.  Data  karakteristik sampel dapat dilihat pada Tabel 1. Pada tabel tersebut dapat dilihat tidak terdapat perbedaan bermakna pada karakteristik usia, indeks massa tubuh (IMT) dan durasi intubasi, namun terdapat perbedaan pada komorbid sepsis (p< 0,05). Isolat bakteri yang tumbuh pada media biakan dilakukan  pemeriksaan  biofilm  dan  hasilnya dapat dilihat pada tabel 3 dan Gambar 1. Dari tabel tersebut dapat dilihat bahwa semua isolat bakteri yang tumbuh merupakan bakteri pembentuk  biofilm.  Perbandingan  derajat pembentukan biofilm kedua kelompok dari hasil uji  statistik  menggunakan  Chi-Square.  Tidak dijumpai perbedaan bermakna pada bakteri pembentuk  biofilm  lemah  dan  dan  sedang, namun dijumpai perbedaan bermakna pada bakteri  pembentuk  biofilm  kuat.  Keterangan antibiotik  yang  digunakan  subyek  dapat  dilihat pada Tabel 4.

## Tabel 1. Data karakteristik subjek penelitian
Variabel Grup A n (%) Grup B n (%) p Usia 48,58 ± 12,36 50,45±14,43 0,421 IMT Underweight 4 (7,3) Normoweight 51 (92,7) 32 (58,2) 0,11 Overweight 4 (7,3) 16 (29,1) Obesitas1 1 (1,8) Obesitas2 2 (3,6) Penyakit penyerta (komorbid) Hipertensi 20 (36,4) 13 (23,6) 0,145 Diabetes Melitus 0(0) 4 (7,3) 0,059 Penyakit ginjal kronik 0(0) 2(3,6) 0,248 Sepsis 0(0) 6(10,9) 0,027 Penyakit jantung 0(0) 2(3,6) 0,248 Riwayat stroke 0(0) 4(7,3) 0,059 Gangguan hepar 2(3,6) 0(0) 0,059 Indikasi Ventilator Operasi Kraniotomi tumor otak 43 (78,2) 24(43,6) 0,001 Kraniotomi Trauma  Brain Injury 5 (9,1) 19(34,5) 0,000 Laparotomi 3 (5,5) 10 (18,2) 0,014 Non operasi (edema paru, asma status epileptikus 4 (7,3) 2 (3,6%) 0,248 Penggunaan steroid > 10 hari 2(3,6) 0,495 Durasi intubasi 57 ±13,9 63,2 ± 15,9 0,132

## Tabel 2. Perbandingan pembentukan biofilm bakteri kedua kelompok
Kemampuan membentuk biofilm Grup A n (%) Grup B n (%) P RR IK (95%) Lemah 4 (7,2) 2(3,6) 0,728 2,03 0,027-1,428 Sedang 23 (41,8) 14 (25,5) 0,073 1,65 0,121- 1,184 Kuat 28 (50,9) 39 (70,9) 0,03 0,72 0,075- 0,245

## Gambar 1. Diagram perbandingan persentase bakteri yang tumbuh kedua kelompok
0 10 20 30 40 50 60 Persentase bakteri  yang tumbuh Grup A (NAC) Grup B (Aquades)
Tabel 3. Isolat bakteri yang tumbuh pada apusan pipa trakeal pada kedua kelompok
Jenis Bakteri Grup A (%) Grup B (%) P Enterococcus. faecalis 27 (49,1) 17 (30,9) 0,052 Klebsiella. Pneumoniae 24 ( 43,6) 26 (47,3) 0,848 Pseudomonas. Aeroginosa 12 (21,8) 15 (27,3) 0.495 Staphylococcus. Aureus 11 (20) 16 (29,1) 0,268 Acinetobacter. Baumanii 1 (1,8) 9 (16,4) 0,008 Eschericia. Coli 8 (14,5) 10 (18,2) 0,606 Proteus. Mirabillis 0 (0) 1 (1,8) 0,315 Tabel 4. Penggunaan antibiotik kedua kelompok
Antibiotik Grup A (%) Grup B (%) Ceftriakson 96 89 Ceftazidim 4 3 Ciprofloksasin 2 Metronidazol 3 Meropenem 3

## PEMBAHASAN
Pada kondisi lingkungan kurang menguntungkan atau mengancam kehidupan, bakteri akan mencari tempat ideal untuk melekat, membuat koloni  dan  membentuk  biofilm  baik  pada permukaan  hidrofilik  maupun  hidrofobik.  ET merupakan alat berbahan polyvynyl yang lebih mudah melekat dibanding metal. 10 Pada tabel 2 dapat dilihat bahwa, semua isolat bakteri dominan yang tumbuh pada media mampu membentuk  biofilm  baik  pada  kelompok  yang diberikan  nebulisasi NAC maupun yang tidak. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian nebulisasi NAC  tidak  menghambat  total  dari  produk EPS. Bakteri masih mampu memproduksi dan mensekresikan EPS sehingga biofilm terbentuk. Tidak dijumpai perbedaan pembentukan biofilm lemah dan sedang antara kedua kelompok, namun dijumpai perbedaan pada pembentukan biofilm  kuat.  Hal  ini  kemungkinan  disebabkan oleh EPS yang dihasilkan bakteri pada kelompok A lebih sedikit dibandingkan kelompok B. Perhitungan nilai RR pun menunjukkan bahwa semua  subyek  penelitian,  baik  yang  diberikan NAC  maupun  yang  tidak  kemungkinan  risiko terbentuknya  biofilm  lemah  dan  sedang  sama, namun  kemungkinan  terbentuknya  biofilm kuat pada pasien yang terpapar NAC lebih kecil dibandingkan plasebo.
Penelitian  sebelumnya  terkait  pengaruh  NAC terhadap biofilm telah banyak dilakukan secara invitro,  seperti  Zhao  dan  Liu  pada  tahun  2010 melakukan penelitian tentang efek NAC terhadap pertumbuhan biofilm P. aeruginosa sebagai agen tunggal  dan  kombinasi  dengan  ciprofloxacin. Dalam  penelitian  tersebut  didapatkan  bahwa NAC secara agen tunggal mampu menghambat pertumbuhan  biofilm  hingga  44,9%  dan didapatkan  hasil  optimal  pada  pemberian  NAC kombinasi  dengan  ciprofloxacin. 7 Olofsson et al .  juga  melakukan  penelitian  efek  NAC pada  pertumbuhan  biofilm  pada  permukaan yang keras mendapatkan hasil bahwa NAC dapat menurunkan produksi EPS, pembentuk biofilm dari bakteri P.aeroginosa , S aureus dan A.baumanii . 11 Costa  juga  melakukan  penelitian serupa pada permukaan alat dan mendapatkan hasil yang sama bahwa NAC dapat menghambat perlekatan dan pembentukan biofilm. 12
Beberapa  penelitian in-vivo juga mendapatkan hasil yang sama seperti penelitian oleh Qu pada tahun 2016 yang mendapatkan hasil ketebalan biofilm  bakteri  dari  apusan  ET  lebih  tipis  pada pasien yang diberikan inhalasi NAC dibandingkan dengan placebo. 13 Eroshenko dalam studinya juga mendapatkan hal yang sama dimana pemberian NAC inhalasi dapat menghambat pembentukan  biofilm  bakteri E. faecalis , S.aureus . 14 Kelemahan studi invivo adalah strain bakteri yang tumbuh setiap pasien kemungkinan tidak  sama.  Barat  melakukan  studi Methicillin Resistance Staphylococcus Aureus (MRSA) pada ET dengan strain yang sama mendapatkan bakteri pembentuk biofilm lemah secara invitro dapat menjadi kuat secara invivo. Hal ini karena efek sinergis dari akumulasi sekret pada traktus sistem respirasi, kemampuan kolonisasi dan nutrisi yang tersedia. 15
Dari  segi  luaran  pasien,  Qu  juga  mencatat insidensi VAP lebih rendah pada grup yang diberikan NAC dibanding plasebo. Terkait insidensi VAP, hasil yang sama juga didapatkan oleh Sharafkah pada tahun 2018 bahwa insidensi VAP lebih rendah pada pasien yang diberikan NAC oral dibandingkan plasebo. 16 Dari  kedua penelitian ini dapat dilihat adanya kemungkinan menurunnya insidensi VAP dikarenakan pengaruh dari pemberian NAC. Namun, pada pemberian secara oral Yin pada tahun 2018, mendapatkan hasil yang berbeda dimana pemberian NAC secara oral akan berinteraksi dengan serum ferritin tubuh yang meningkatkan pertumbuhan biofilm P.aeruginosa dan S.aureus . 17
Pada  penggunaan  klinis,  Guo  dalam  studinya tentang  pemberian  NAC  pada  tindakan bronchoscopy alveolar lavage pada pasien dengan VAP berat, didapatkan hasil waktu penggunaan  ventilasi  mekanik  dan  pemberian antibiotik menjadi lebih singkat. 18 Dibandingkan dalam  bentuk  plankton,  bakteri  dalam  biofilm lebih tahan terhadap sapuan dan pembersihan oleh saliva, kurangnya nutrisi, perubahan pH,  radikal  bebas,  desinfektan,  antibiotik  dan fagositosis.  Karena  itu,  bakteri  pembentuk biofilm rentan sekali terjadi resistensi antibiotik. Dari  studi-studi  diatas,  baik  secara  invitro maupun  invivo  NAC  selain  sebagai  mukolitik juga memiliki pengaruh terhadap pembentukan biofilm bakteri. 6
Mekanisme    kerja    NAC  dalam  menghambat biofilm secara pasti belum diketahui, beberapa teori menyebutkan NAC menghambat adesi  bakteri  dan  gugus  S-H  pada  NAC  akan menghambat produksi EPS dengan cara merusak ikatan  protein  disulfida  (S-S). 19 Pada  penelitian ini, semua bakteri yang tumbuh  merupakan bakteri yang sering menyebabkan pneumonia pada pasien yang terpasang ventilator associated pneumonia (VAP). Walaupun secara morfologi beberapa bakteri berbeda, namun hanya A.baumanii yang  secara  statistik terdapat perbedaan antara kedua kelompok. Secara morfologi, A.Baumanii tidak  memiliki flagela. Bakteri yang memiliki flagela lebih motil dibandingkan yangg tidak. Bakteri yang memiliki fimbria  (pili)  lebih  mudah  melekat  dan  ujung dari fimbria mengandung lektin yang berfungsi untuk mengikat manose dan juga untuk merekat dengan bakteri lain. A.baumanii merupakan bakteri  yang  tidak  memiliki  flagela  namun memiliki fimbrae. Selain fimbria beberapa bakteri seperti  pada S.Aureus memproduksi protein spesifik untuk melekatkan matriks ekstraseluler bakteri ke permukaan yang disebut Microbial Surface Component Recognizing Adhesive Matrix Molecules (MSCRAMMs).  Bakteri S.Aureus walaupun  tidak  memiliki  fimbria  namun  dapat melekat dan memiliki kemampuan membentuk biofilm. 6,10
Keterbatasan  penelitian  ini  adalah  tidak dilakukan  pengamatan  klinis  subjek  penelitian. Belum  dapat  dibuktikan  terbentuknya  biofilm tersebut juga berhubungan dengan insidensi VAP dan lama penggunaan antibiotik.

## SIMPULAN
Semua isolate bakteri yang diambil dari subyek penelitian  baik  pada  kelompok  yang  diberikan NAC maupun plasebo mampu membentuk biofilm.  Pemberian  nebulisasi N-acetylcysteine berkaitan dengan penuruan kemampuan isolate bakteri pembentuk biofilm kuat.

## KONFLIK KEPENTINGAN
Penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan dalam penulisan artikel ini.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Diaconu  O,  Siriopol  I,  Poloșanu  LI,  Grigoraș I. Endotracheal Tube Biofilm and its Impact on the Pathogenesis of Ventilator-Associated Pneumonia. J Crit Care Med (Targu Mures). 2018; 4(2):50-5.
2. Gil-Perotin S, Ramirez P, Marti V, Sahuquillo JM,  Gonzalez  E,  Calleja  I,  Menendez  R, Bonastre J. Implications of endotracheal tube biofilm  in  ventilator-associated  pneumonia response: a state of concept. Crit Care. 2012; 16(3):R93.
3. Jamal M, Ahmad W, Andleeb S, Jalil F, Imran M,  Nawaz  MA,  et  al.  Bacterial  biofilm  and associated  infections.  J  Chin  Med  Assoc. 2018; 81(1):7-11.
4. Fu J, Zhang Y, Lin S, Zhang W, Shu G, Lin J, et al. Strategies for Interfering With Bacterial Early  Stage  Biofilms.  Front  Microbiol. 2021;12:675843.
5. Kharel  S,  Bist  A,  Mishra  SK.  Ventilator- associated  pneumonia  among  ICU  patients in WHO Southeast Asian region: A systematic review. PLoS One. 2021;16(3):e0247832.
6. Jefferson  KK.  What  drives  bacteria  to produce  a  biofilm?.  FEMS  Microbiol  Lett. 2004;236(2):163-73.
7. Zhao T, Liu Y. N-acetylcysteine inhibit biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa. BMC Microbiol. 2010;10:140.
8.  Harun SR, Putra ST, Chair I, Sastroasmoro S.  Uji  Klinis.  In:  Sastroasmoro  S,  Ismael  S, editors.  Dasar-dasar  Metodologi  Penelitian Klinis. 5th ed. Jakarta: Sagung Seto; 2014.
9. Merrit  JH,  Kadouri  DEO.Toole  GA.  Current Protocols in Microbiology. Coico R, McBride A,  Quarles  JM,  Stevenson  B,  Taylor  RK, editors.  Current  Protocols  in  Microbiology. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc.; 2005.
10. Murray  PR,  Rosenthal  KS,  Michael  AP. Medical Microbiology. 9th ed. Philadelphia: Elsevier; 2016.
11. Olofsson  AC,  Hermansson  M,  Elwing H.  N-acetyl-L-cysteine  affects  growth, extracellular polysaccharide production, and bacterial biofilm formation on solid surfaces.
Appl Environ Microbiol. 2003;69(8):4814-22. 12. Costa F, Sousa DM, Parreira P, Lamghari M, Gomes  P,  Martins  MCL.  N-acetylcysteine- functionalized  coating  avoids  bacterial adhesion  and  biofilm  formation.  Sci  Rep. 2017;7(1). Doi: 10.1038/s41598-017-17310-
4.
13. Qu D, Ren XX, Guo LY, Liang JX, Xu WJ, Han YH, et  al.  [Effect  of  N-acetylcysteine  inhalation on ventilator-associated pneumonia caused by biofilm in endotracheal tubes]. Zhonghua Er Ke Za Zhi. 2016;54(4):278-82. Chinese.
14. Eroshenko  D,  Polyudova  T,  Korobov  V. N-acetylcysteine  inhibits  growth,  adhesion and biofilm formation of Gram-positive skin pathogens.  Microb  Pathog.  2017;105:145-
52.
15. Fernández-Barat  L,  Ben-Aicha  S,  Motos  A, Vila J, Marco F, Rigol M, et al. Assessment of in  vivo  versus  in  vitro  biofilm  formation  of clinical  methicillin-resistant  Staphylococcus aureus isolates from endotracheal tubes. Sci Rep. 2018;8(1):11906.
16. Sharafkhah M, Abdolrazaghnejad A, Zarinfar N,  Mohammadbeigi  A,  Massoudifar  A, Abaszadeh S. Safety and efficacy of N-acetyl- cysteine  for  prophylaxis  of  ventilator- associated  pneumonia:  a  randomized, double  blind,  placebo-controlled  clinical trial. Med Gas Res. 2018;8(1):19-23.
17. Yin S, Jiang B, Huang G, Zhang Y, You B, Chen Y, et al. The Interaction of N-Acetylcysteine and Serum Transferrin Promotes Bacterial Biofilm  Formation.  Cell  Physiol  Biochem. 2018;45(4):1399-409.
18. Guo  J,  Wang  P,  Ma  X.  Effect  of acetylcysteine  solution  combined  with fiberoptic  bronchoscopy  alveolar  lavage in  elderly  patients  with  severe  ventilator- associated pneumonia. Trop J Pharm Res. 2021;20(5):1061–6.
19. Guerini  M,  Condrò  G,  Friuli  V,  Maggi  L, Perugini  P.  N-acetylcysteine  (NAC)  and  Its Role in Clinical Practice Management of Cystic Fibrosis  (CF):  A  Review.  Pharmaceuticals (Basel). 2022;15(2):217.