Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra
# Korespondensi:  Balai  Riset  Perikanan  Budidaya  Air  Tawar  dan Penyuluhan  Perikanan.
Jl.  Sempur  No.  1,  Bogor  16129,  Indonesia Tel.  +  62  251  8313200 E-mail:  fida.annisa@gmail.com

## IMUNOGLOBULIN  YOLK  ANTI  Streptococcus  agalactiae  UNTUK  IMUNOTERAPI PENYAKIT STREPTOCOCCOSIS PADA IKAN NILA (Oreochromis niloticus)
Tatik  Mufidah # ,  Uni  Purwaningsih,  Nunak  Nafiqoh,  dan  Angela  Mariana  Lusiastuti
Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan Jl. Sempur  No. 1, Bogor 16129
(Naskah diterima: 8 Oktober 2019; Revisi final: 19 Februari 2020; Disetujui publikasi: 19 Februari 2020)

## ABSTRAK
Serangan penyakit Streptoccocus agalactiae pada ikan nila dapat menimbulkan kerugian yang besar. Salah satu cara pencegahan dan penanggulangan Streptococcosis adalah melalui vaksinasi, baik vaksinasi aktif maupun vaksinasi pasif. Immunoglobulin yolk (IgY) merupakan salah satu jenis antibodi yang dapat digunakan untuk vaksinasi pasif. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan immunoglobulin yolk (IgY) yang spesifik terhadap  Streptococcus  agalactiae  untuk  imunoterapi  penyakit  streptococcus  pada  ikan  nila.  IgY  anti S. agalactiae dihasilkan dari telur ayam yang divaksinasi dengan bakteri S. agalactiae inaktif. Dalam penelitian ini dilakukan preparasi dan perbanyakan S. agalactiae, imunisasi ayam, koleksi telur ayam, dan purifikasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa IgY yang diproduksi terbukti spesifik terhadap S. agalactiae dengan uji immunoblotting dan dot blot. Uji biologis menggunakan cairan peritoneum mencit menunjukkan aktivitas opsonisasi oleh makrofag yang meningkat dibanding cairan peritoneum tanpa pemberian IgY. Hasil aplikasi IgY pada ikan nila menunjukkan IgY dapat digunakan untuk pencegahan dan pengobatan terhadap infeksi S. agalactiae. IgY anti-S. agalactiae yang diproduksi dapat digunakan untuk imunoterapi dan mengendalikan streptococcosis yang disebabkan oleh S. agalactiae pada nila baik untuk pencegahan maupun pengobatan.
KATA KUNCI: imunoglobulin yolk (IgY); S. Agalactiae; ikan nila (Oreochromis niloticus)
ABSTRACT: Immunoggobulin yolk anti Streptococcus agalactiae for immunnotheraphy of Streptococcosis disease in tilapia (Oreochromis niloticus). By: Tatik Mufidah, Uni Purwaningsih, Nunak Nafiqoh, and Angela Mariana Lusiastuti
The infection of Streptococcus agalactiae in an aquaculture system can cause significant economic losses to the fish farmers. An efficient method to prevent the infection and control the distribution of Streptococcosis is through either active or passive vaccination. The use of immunoglobulin yolk as one of the passive antibodies has shown a promising result. This study’s aim was to obtain immunoglobulin yolk (IgY) specific to S. agalactiae for immunotherapy of streptococcus disease in tilapia. IgY was produced from vaccinated chicken eggs using inactivated S. agalactiae bacteria. In the present study, preparation and propagation of S. agalactiae, immunization of chickens, and collection of chicken eggs and purification were carried out. The result show that produced IgY was proved to be specific to S. agalactiae through immunoblotting and dot blot tests. Biological tests using mice peritoneum fluid to determine macrophages opsonization activity showed increased opsonization activity compared to peritoneal fluid without IgY administration. The application of IgY on reared tilapia showed that IgY anti-S. agalactiae protected the fish against S.  agalactiae  infection.  The  produced  IgY  anti-S.  agalactiae  can  be  used  for  immunotherapy  and  controlling streptococcosis caused by S. agalactiae in tilapia both for prevention and treatment.
KEYWORDS: immnoglobulin yolk (IgY); S. Agalactiae; tilapia (Oreochromis niloticus)

## PENDAHULUAN
Serangan  penyakit  terbukti  sebagai  salah  satu penyebab utama kegagalan produksi pada beberapa komoditas  unggulan  perikanan  budidaya.  Kerugian
akibat  serangan  penyakit  antara  lain  penurunan produksi, produktivitas kualitas, efisiensi, penurunan daya saing, penolakan pasar, menghambat intensifikasi, dan  ekstensifikasi  budidaya  karena  usaha  budidaya menjadi berisiko tinggi dan tidak berkelanjutan. Salah satu penyakit yang sering menyerang budidaya ikan nila adalah Streptoccosis (Evans et al., 2009). Penyakit ini merupakan penyakit yang disebabkan oleh bakteri gram  positif  yang  berbentuk  coccus.  Barnes  &  Ellis
(2004) melaporkan beberapa agen penyebab yang pa- ling sering ditemukan menjadi penyebab streptococco- sis adalah Streptococcus iniae, Sreptococcus agalactiae, dan Lactococcus garviae.
Usaha pengendalian penyakit ikan merupakan hal yang  memerlukan  perhatian  besar  karena  akan berkaitan dengan penyebaran penyakit, mortalitas ikan yang tinggi, dan kerugian ekomoni yang besar (Dunn et  al.,  1990).  Manajemen  kesehatan  yang  baik merupakan  hal  yang  sangat  penting  dalam  usaha pencegahan penyakit ikan. Vaksinasi merupakan salah satu cara yang efektif dalam mencegah streptococcosis, karena terapi dengan antibiotik dapat menyebabkan resistensi dan residu. Oleh karena itu, perlu mencari metode alternatif yang lebih luas dalam arti mampu mengobati ikan sakit tapi juga mampu menekan dan mencegah terjadinya infeksi S. agalactiae.
Tindakan  vaksinasi  adalah  upaya  agar  ikan mempunyai  kekebalan  terhadap    penyakit  tertentu. Antibodi  spesifik  dibentuk  oleh  tubuh  ikan  sendiri melalui vaksinasi aktif atau diberikan secara langsung melalui vaksinasi pasif. Dewasa ini produksi antibodi melalui  koleksi  telur  ayam  yang  telah  divaksinasi dengan antigen tertentu menjadi salah satu pillihan. Antigen yang diperoleh dari kuning yang disebut im- munoglobulin  yolk  (IgY).  Produksi  antibodi  melalui kuning  telurnya  menjadi  alternatif  karena membutuhkan biaya yang relatif lebih murah dan bisa mendapatkan  antibodi  dengan  jumlah  yang  lebih banyak dibanding jika memanen antibodi dari hewan uji lain seperti kelinci, mencit, maupun hewan besar seperti  kuda  atau  domba. Di  samping  itu,  produksi antibodi melalui kuning telur juga lebih diterima dari sisi  animal  welfare  (Nakai  et  al.,  1994).  Berkenaan dengan  animal  welfare  dan  efisiensi  biaya  maka penggunaan antibodi dalam telur lebih bisa diterima dibanding  dengan  penggunaan  hewan  percobaan mamalia (Svendsen et al., 1995).
Penelitian  ini  bertujuan untuk  memproduksi  IgY yang spesifik terhadap S. agalactiae dan memanfaatkan potensinya  sebagai  bahan  imunisasi  pasif  untuk pengendalian penyakit Streptococcosis, yang disebabkan oleh S. agalactiae pada ikan nila (Oreochromis niloticus).

## BAHAN DAN METODE

## Produksi  IgY anti  S.  agalactiae
Produksi IgY  anti S. agalactiae dilakukan  dengan terlebih  dahulu  melakukan  preparasi  perbanyakan bakteri  S.  agalactiae  sebagai  bahan  untuk  vaksinasi ayam petelur. Isolat bakteri S. Agalactiae yang digunakan berasal  dari  Instalasi  Riset  Pengembangan Pengendalian Penyakit Ikan BRPPBAT Bogor. Suspensi bakteri dicuci tiga kali dengan PBS steril pH 7,2 dan
konsentrasi  dibuat 1  x  10 9 cfu/mL.  Isolat  kemudian dilemahkan dengan pemanasan 100°C selama 60 menit dan  diuji  kembali  viabilitasnya.  Resuspensi  Pelet dengan 5 mL NaCl fisiologis dan diukur pada panjang gelombang pada  620 nm dengan transmisi 10% untuk mendapat konsentrasi sel bakteri 10 9 cfu/mL. Suspensi selanjutnya siap digunakan untuk vaksinasi pada ayam petelur.
Produksi IgY  anti S. agalactiae dilakukan  dengan melakukan vaksinasi pada ayam petelur yang dipelihara dalam kandang baterai dan diberi makan standar dan air  minum  secara  ad  libitum.  Vaksinasi  dilakukan dengan  cara  yaitu  pada  minggu  ke-1  ayam  petelur divaksinasi dengan 1 mL suspensi S. agalactiae secara intra vena selama tiga hari berturut-turut. Pada minggu kedua vaksinasi dilakukan injeksi secara intra muskular suspensi antigen dalam freund’s complete adjuvant (FCA) sebesar 0,5 mL. Booster dilakukan secara intramuskular dengan dosis antigen 0,5 mL dalam freund’s incomplete adjuvan (FIA) pada empat lokasi (0,25 mL tiap lokasi) dan diulang sebanyak tiga kali. Telur dikoleksi setelah minggu  pertama  vaksinasi  sampai  akhir  masa percobaan.

## Purifikasi  Imunoglobulin  dan  Pemeriksaan Titer  Antibodi
Purifikasi  dan  perhitungan  konsentrasi  protein hasil purifikasi dengan promegas EGGstract IgY purifi- cation system teknik dilakukan sesuai dengan prosedur kit. Konsentrasi IgY diukur dengan absorban 280 nm, menggunakan extinction coefficient 1,33 dan konsentrasi dalam mg/mL.
Pemeriksaan titer antibodi ayam petelur dilakukan untuk mengetahui keberadaan antibodi pada serum. Antibodi  tersebut  kemudian  diteruskan  ke  kuning telur  yang  akan  dipanen.  Pengukuran  titer  antibodi sesuai  metode  yang  dikembangkan  oleh  Roberson (1990).  Metode  ini  menggunakan  teknik  aglutinasi langsung dengan menggunakan microtitre plate. Proses aglutinasi diamati dengan bantuan mikroskop inverted pada pembesaran 100-400 kali. Serum yang diperiksa adalah serum ayam minggu sebelum vaksinasi, serum minggu  kesatu  setelah  vaksinasi  hingga  minggu ke-12.

## SDS Page  dan Uji Spesifisitas IgY anti S. agalactiae
Pemisahan protein antigen bakteri S. agalactiae dan IgY anti S. agalactiae dilakukan dengan SDS-PAGE, uji spesifisitas IgY dilakukan dengan uji imunobloting dan dot blot. Konjugat yang dipakai pada western blot adalah chicken anti rabbit, pewarna menggunakan DAB. Block- ing dilakukan dengan inkubasi membran nitrocelulose semalaman dengan skim.

## Uji  Aktivitas  IgY  dengan  Reaksi  Opsonisasi
Uji  aktivitas  IgY  dilakukan  menurut  metode Wibawan et al. (1999) dengan modifikasi. Peritonium mencit BALB C (Fakultas  Kedokteran Universitas In- donesia)  dicuci  dengan  PBS,  15  menit  kemudian dibedah bagian perutnya, cairan peritoneum dipanen dan  dihitung  dengan  haemositometer  jumlah makrofag yang tersedia. Inkubasi 100 ìg/mL IgY; 0,5 x 10 6 sel/mL suspensi makrofag dan bakteri S. agalactiae 0,5  x  10 8 cfu/mL  selama  satu  jam  pada  suhu  37°C, kemudian  disentrifugasi  dan  dibuat  preparat  ulas dengan  Giemsa,  selanjutnya  diamati  di  bawah mikroskop.  Penentuan  nilai  aktivitas  dan  kapasitas fagositosis dihitung sebagai berikut:

## Aplikasi  IgY  Spesifik  Anti  S.  agalactiae  pada Ikan  Nila
Metode  aplikasi  IgY  pada  ikan  mengacu  pada penelitian yang dilakukan oleh Li et al. (2006). Setiap grup  terdiri  atas  20  ekor  ikan  nila  yang  telah dikohabitasi dengan rerata bobot badan 30 ± 1,8 g. Grup-I  merupakan  perlakuan  IgY  untuk  untuk pencegahan infeksi bakteri, sedangkan grup-II adalah perlakuan pemberian IgY untuk pengobatan infeksi S. agalactiae.  Kedua  perlakuan  tersebut  diuji  tantang dengan  isolat  S.  agalactiae  yang  telah  diuji  dengan postulat KOCH. Pada aplikasi IgY untuk pencegahan, ikan yang telah diadaptasi diberikan injeksi IgY secara intraperitoneal dengan dosis 0,25 mL (5 mg/mLIgY); 0,5 mL (10 mg/mL IgY), dan 0,75 mL (15 mg/mL IgY). Pada ikan kontrol diinjeksi dengan PBS steril 0,25 mL. Setelah  empat  jam  semua  ikan  uji  diinjeksi  secara intraperitoneal dengan isolat S. agalactiae 0,1 mL (1 x 10 3 cfu/mL). Pada aplikasi IgY untuk terapi dilakukan infeksi  S.  agalactiae  terlebih  dahulu  dengan menyuntikkan isolat S. agalactiae 0,1 mL (1 x 10 3 cfu/ mL)  secara  intra  peritoneal  dan  setelah  empat  jam ikan uji diberikan injeksi IgY 0,25 mL (5 mg/mL IgY); 0,5 mL (10 mg/mL IgY) dan 0,75 mL (15 mg/mL IgY) dan  untuk  kelompok  ikan  kontrol  disuntikkan  PBS steril dengan volume 0,25 mL. Reisolasi bakteri pada ikan uji dilakukan pada organ otak ikan nila pada hari kelima setelah infeksi yang kemudian ditanam pada media  BHIA  (Li  et  al.,  2006).  Penghitungan  jumlah bakteri  dilakukan  dengan  metode  total  plate  count (TPC).

## HASIL DAN BAHASAN

## Produksi IgY  Anti S.  agalactiae
Ayam  yang  divaksinasi  dengan  suspensi  S. agalactiae  dan  adjuvan  mulai  menunjukkan  reaksi
positif seminggu setelah vaksinasi. Adjuvan digunakan untuk meningkatkan induksi respon imun pada ayam. Reaksi positif tersebut dapat dilihat dari hasil uji ti- ter antibodi (Tabel 1). Antibodi anti S. agalactiae dalam serum  masih  terdeteksi  sampai  delapan  minggu setelah  booster  terakhir  (minggu  ke-12).  Hal  yang berbeda didapat  pada ayam yang  dijadikan kontrol, dari awal perlakuan sampai berumur delapan minggu masih menunjukkan reaksi negatif.
Antigen  yang  diimunisasikan  pada  ayam memberikan  respons  yaitu  terbentuknya  antibodi. Antibodi  terhadap  antigen  terbentuk  selama  satu minggu.  Hal  ini  sejalan  dengan  pernyataan  Tizard (1998) dan Subowo (1993), bahwa antibodi terhadap satu antigen  terbentuk selama satu  minggu setelah antigen tersebut diimunisasikan. Faktor-faktor yang memengaruhi  terbentuknya  antibodi  di  antaranya adalah umur hewan percobaan yang digunakan, ukuran molekul antigen, kerumitan struktur kimiawi antigen, konstitusi genetik, metode pemasukan antigen, dan dosis antigen yang digunakan (Subowo, 1993).
Konsentrasi IgY dalam kuning telur pada dasarnya konstan selama pematangan oosit pada telur. Pada telur yang telah matang konsentrasi IgY sekitar 10-20 mg/ mL  (Carlendar,  2002).  Antibodi  akan  ditransfer  ke kuning  telur  sebagai  kekebalan  maternal  untuk anaknya. Proses transfer ini terdiri atas dua tahap yaitu IgY ditransfer ke serum menuju kuning telur dengan proses yang analog dengan proses transfer antibodi (IgY)  pada  fetus  melalui  plasenta  pada  mamalia, kemudian antibodi (IgY) ditransfer ke kantung embrio- embrio yang sedang berkembang.

## Eksktraksi IgY dari Kuning Telur
Pada ekstraksi menggunakan kit promegas EGGstract IgY purification system didapat 40-80 mg IgY dengan kemurnian 75% per satu butir telur. Kemurnian dapat ditingkatkan hingga 90% dengan melakukan presipitasi lagi, hasil purifikasi didapatkan konsentrasi IgY adalah 60,701  mg/mL.  Zhang  (2003)  menyebutkan  bahwa dalam sebutir  telur ayam  mengandung 100-150  mg IgY. Hal ini berbeda dengan Schade et al. (1996) dalam laporan  penelitian  ECVAM  bahwa  jumlah  antibodi unggas adalah 50-100 mg dalam satu butir telur. Hal senada juga disebutkan oleh Carlendar (2002) bahwa satu butir telur ayam dapat menghasilkan 100 mg IgY. Perbedaan jumlah IgY yang dihasilkan diduga karena perbedaan metode ekstraksi. Identifikasi kemurnian IgY dilakukan dengan analisis pita protein dengan So- dium  Dodecyl  Sulphte  Polyacrilamide  Gel  Electophoresis (SDS-PAGE)  dan  diwarnai  dengan  Fast  Coomasive  ® stain.  Berdasarkan  karakterisasi  protein  IgY  dengan elektroforesis SDS-PAGE diketahui bahwa IgY terdiri atas  sekurang-kurangnya  enam  jenis  protein  utama
100% x otal makrofag t Jumlah aktif makrofag Jumlah makrofag
Aktivitas 
yang masing-masing berukuran 225 kD; 150kD; 100kD; 75 kD; 57,5kD; serta 35 kD. Pita dengan berat molekul 180 kD diduga sebagai protein IgY yang tersusun atas dua rantai berat dengan berat molekul 70 kD dan dua rantai  ringan  dengan  berat  molekul  20  kD (Gambar  1).  Pita  rantai  berat  dan  rantai  ringan merupakan  subunit  IgY  yang  belum  dirakit  dalam kuning telur. Penelitian ini belum memberikan tingkat kemurnian yang terbaik. Terlihat dari keberadaan pita protein selain IgY dan subunitnya.

## Spesifisitas  IgY
Imuno blot  blot dan  dot blot  merupakan  sebuah teknik analisis yang digunakan untuk mendeteksi pro-
tein tertentu, teknik ini menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli oleh 3-D struktur atau protein di denaturasi dengan panjang polipeptida. Protein tersebut kemudian dipindahkan ke membran nitroselulosa dan terdeteksi menggunakan antibodi spesifik untuk protein target. Protein dari bakteri S. agalactiae  yang  telah  dipindah  ke  membran nitroselulosa berikatan dengan IgY anti S. agalactiae. Ikatan  antigen  dan  antibodi  tersebut  kemudian dikenali  oleh  antibodi  sekunder  yang  kemudian bereaksi dengan substrat Diaminobenzidine (DAB). Hasil uji dot blot dan imunoblot menunjukkan hasil bahwa IgY yang dihasilkan spesifik terhadap S. agalactiae, band tampak pada konsentrasi IgY 10 -10 , 10 -40 , dan 10 -160 , hal
Tabel 1. Uji titer antibodi serum ayam dalam 12 minggu Tabel 1. Chicken antibody serum test for12 weeks
Keterangan: A= serum ayam kontrol minggu ke-1; B= serum ayam kontrol minggu ke-8. C= serum ayam perlakuan-1 minggu ke-1; D= serum ayam perlakuan-2 minggu ke-1; E= serum ayam perlakuan-1 minggu ke-6; F= serum ayam perlakuan-2 minggu ke-8; G= serum ayam perlakuan-1 minggu ke-14; H= serum ayam perlakuan- 2 minggu ke-14
Note: A= control chicken serum in 1 st week; B= control chicken serum 2 nd week; C= chicken serum of treatment 1 in 1 st week; D= chicken serum of 2 nd treatment in  2 nd week; E= chicken serum of  1 st treatment in  6 th week;  F= chicken serum of 2 nd treatment in 8 th week; G= chicken serum of treatment 1 in 14 th week; H= chicken serum of 2 nd treatment in 14 th week 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A - - - - - - - - - - - - B - - - - - - - - - - - - C +++ ++ + + - - - - - - - - D ++ ++ + - - - - - - - - - E +++ +++ +++ ++ + + - - - - - - F +++ +++ ++ + + - - - - - - - G +++ ++ + + - - - - - - - - H +++ ++ ++ + - - - - - - - - Periode koleksi telur (Collecting eggs periode)
Serum
Keterangan: SA= sel bakteri S.  agalactiae; 1-2= IgY 10 mL; 3= IgY 15 mL; 4-5= IgY 20 mL
Notes: SA = S. agalactiae; 1-2 = IgY 10 mL; 3 = IgY 15 mL; 4-5 = IgY 20 mL)
Gambar 1. Hasil SDS PAGE bakteri S. agalactiae dan IgY anti S. agalactiae. Figure 1. SDS PAGE of S. agalactiae and IgY anti-S. agalactiae.
M       1         2       3 M          1           2            3 180 kDa 70 kDa 21 kDa 200 67 116 45 29 21 12.5 6.5
yang sama terlihat pada uji dot blot, di mana terdapat dot positif hingga pengenceran IgY 10 -160 (Gambar 2). Uji dot blot dan imunoblot selama ini dikenal luas banyak digunakan  dalam  diagnosa  pada  patogen.  Kedua metode  ini  dikenal  sensitif  dan  spesifik  karena berdasarkan prinsip ikatan antigen dan antibodi.
Dari hasil tersebut diketahui bahwa antigen yang diimunisasikan  pada  ayam  memberikan  respons dengan terbentuknya antibodi. Hal ini terjadi karena adanya ikatan antara antigen dan antibodi homolog yang menghasilkan garis presipitasi pada daerah agar antara antigen-antibodi. Terjadi reaksi antara antigen dan  antibodi  dalam  kondisi  yang  tepat  dalam  gel membentuk  kompleks  yang  tidak  larut  (prespitat) berupa garis keruh pada daerah dicapainya proporsi optimal.  Dari  hasil  terlihat  bahwa  terdapat  garis presipitasi  antara  sumur  antigen  dengan  serum maupun  IgY.  Sehingga  dapat  dikatakan  bahwa imunoglobulin yang dihasilkan adalah spesifik untuk S. agalactiae.
IgY yang dipurifikasi dari kuning telur pada dasarnya merupakan antibodi yang terjadi sebagai respons imun dan  terdapat  pada  serum  kemudian  ditransfer  ke kuning  telur.  Proses  transfer  terdiri  atas  dua  tahap yaitu  IgY  ditransfer  ke  serum  menuju  kuning  telur dengan  proses  yang  analog  dengan  proses  transfer antibodi  (IgY)  pada  fetus  melalui  plasenta  pada mamalia, kemudian antibodi (IgY) tersebut ditransfer ke  kantung  embrio  yang  sedang  berkembang. Menurut  Carlendar  (2002),  konsentrasi  IgY  dalam
kuning  telur  pada  dasarnya  konstan  selama pematangan  oosit  pada  telur.  Pada  telur  yang  telah matang konsentrasi IgY sekitar 10-20 mg/mL, antibodi yang dihasilkan akan ditransfer ke kuning telur sebagai kekebalan maternal untuk anaknya.

## Aktivitas  IgY  dengan  Reaksi  Opsonisasi
Uji  opsonisasi  dilakukan  untuk  mengetahui aktivitas  IgY  dalam  mekanisme  sistem  imun  seluler yaitu  dalam  mengeliminasi  antigen  bakteri  S. agalactiae.  Opsonisasi  merupakan  salah  satu kemampuan antibodi untuk melapisi antigen sehingga aktivitas fagositosis oleh sel makrofag akan meningkat (Abbas et al., 2012). Dari hasil percobaan didapatkan aktivitas  makrofag  pada  bakteri  yang  telah diopsonisasi  oleh  IgY  mempunyai  aktivitas  sebesar 55% dan aktivitas makrofag tanpa proses opsonisasi IgY pada S. agalactiae sebesar 35% (Gambar 3).
Peningkatan  aktivitas  fagositosis  oleh  makrofag yang tidak begitu besar jika dibandingkan kontrol (20%) bisa terjadi  karena bagian Fab IgY  anti S.  agalactiae tidak  memiliki  afinitas  yang  besar.  Fab  sendiri merupakan bagian dari molekul imunoglobulin di mana terdapat reseptor  epitop antigen yaitu  tempat anti- gen dapat dikenali oleh antibodi sedangkan afinitas merupakan daya ikat antibodi terhadap antigen (Abbas et al., 2012).
Hal lain yang bisa terjadi adalah karena bagian frag- ment  crystallizable  region  (Fc)  dari  antibodi  yang berperan  dalam  fungsi  efektor  dari  suatu  molekul
Gambar 2. Hasil uji immunobloting (A) dan hasil dot blot (B). Figure 2. Result of immunoblotting (A) and result of dot blot test (B).
1    2     3    4    5    6 1      2      3     4      5     6 1     2    3     4    5     6                                   1       2       3       4       5      6

## A                                                         B
Keterangan: Pengenceran IgY 10 -2 (1); pengenceran IgY= 10 -40 (2); pengenceran IgY= 10 - 160 (3); pengenceran IgY= 10 -320 (4); pengenceran IgY= 10 -640 (5); pengenceran
IgY= 10 -1280 (6) Notes: Dilution of IgY 10 -2 (1); dilution of IgY= 10 -40 (2); dilution of IgY= 10 -160 (3); dilution of IgY= 10 -320 (4); dilution of IgY= 10 -640 (5); dilution of IgY= 10 -1280 (6)
antibodi tidak berjalan optimal. Bagian Fc dari antibodi akan  berikatan  dengan  resptor  Fc  di  permukaan makrofag dan aktivasi komplemen. Jika fungsi efektor tidak berjalan optimal maka opsonisasi oleh IgY pada sel  bakteri  tidak  akan  menghasilkan  peningkatan fagositosis  oleh  sel  makrofag  secara  optimal. Kemungkinan  lain  yang  bisa  terjadi  adalah  waktu inkubasi IgY dengan S. agalactiae dan makrofag perlu ditambah.

## Efektivitas IgY
Hasil  pengujian  efektivitas  IgY  terhadap  infeksi bakteri  S.  agalactiae  pada  ikan  uji  disajikan  pada Tabel 2.
Tabel 2 menunjukkan bahwa perlakuan IgY untuk pengobatan terhadap infeksi S. agalactiae memberikan pengaruh yang lebih besar pada nilai SR (80%) dengan pemberian IgY 0,25 mL(± 5 mg/mL IgY) dan 0,5 mL (± 10 mg/mL IgY) bila dibandingkan dengan perlakuan IgY sebagai pencegahan dengan sintasan (SR) sebesar 60% dengan dosis yang sama. Pemberian IgY 0,75 mL (15  mg/mL  IgY)  menghasilkan  nilai  SR  hanya  20%. Pertumbuhan koloni bakteri menunjukkan hasil yang berbeda,  di  mana  pada  kelompok  kontrol  koloni bakteri yang tumbuh lebih banyak (80 ± 2.47 x 10 6 ) dibanding kelompok dengan pemberian IgY 0,75% (83 x 10 4 ). Koloni bakteri yang tumbuh pada IgY 0, 25 mL dan 0,5 mL hampir sama. Pada grup-II nilai SR ikan uji
Gambar 3. Aktivitas fagositosis makrofag dengan opsonisasi oleh IgY (A) dan aktivitas fagositosis makrofag tanpa opsonisasi oleh IgY (B).
Figure 3. Phagocytic activity of macrophages with opsonization by IgY (A) and phagocytic activity of macrophages without opsonization by IgY (B).
Gambar 4. Mekanisme  opsonisasi. Figure 4. Opsonization mechanism.

## A                                                                 B
Sumber (Source): Abbas et al. (2012)
paling tinggi pada pemberian IgY 0,5 mL; akan tetapi jumlah koloni bakteri yang tumbuh tidak bisa dihitung pada  pengenceran  1  x  10 2 dan  tidak  tumbuh  pada pengenceran selanjutnya. Jika dibandingkan kontrol maka  pemberian  IgY  dengan  dosis  ini  signifikan memberikan  perlindungan,  akan  tetapi  data  secara seluler di mana jumlah koloni bakteri yang tumbuh kurang mendukung.
Dari hasil di atas, beberapa kemungkinan yang bisa terjadi adalah pemberian dosis IgY sebesar 0,75 mL adalah bersifat toksik, hal ini bisa juga terjadi karena pada IgY yang merupakan protein mudah terdegradasi dan  terkontaminasi  dan  dilarutkan  dalam  PBS ditambahkan zat natrium azide (NaN 3 ). Sebagaimana diketahui  NaN 3 bersifat  toksik  dan  harus  hati-hati dalam penggunaanya. Pada percobaan dengan isolasi otak ikan nila untuk ditumbuhkan dalam media agar dan  dilihat  hubungan  pemberian  IgY  dengan pertumbuhan  koloni  bakteri,  hasil  yang  diperoleh belum berkorelasi dengan baik dengan nilai SR ikan uji.  Pada  pelaksanaanya  prosedur  isolasi  telah dilakukan dengan cara yang aseptis, akan tetapi banyak faktor  yang  memengaruhi  di  antaranya  adalah penggunaan ose yang terlalu panas pada waktu kultur, penimbangan, dan  pengenceran organ  otak dengan PBS yang kurang tepat sehingga memengaruhi hasil kultur bisa terjadi.
Dari  hasil  aplikasi  IgY  dengan  suntikan  tersebut dapat disimpulkan bahwa efektivitas berkaitan dengan dosis  dan  aplikasi  pemberian  IgY.  Hal  yang  perlu diperhatikan adalah penyimpanan IgY, karena sebagai antibodi IgY mempunyai kerentanan terhadap suhu,
Tabel 2. Efektivitas IgY anti S. agalactiae pada ikan nila melalui penyuntikan Table 2. Effectivity of anti S. agalactiae IgY on tilapia through injection
maupun penurunan pH. Uji coba efektivitas IgY juga harus  memperhatikan  kondisi  hewan  pada  waktu vaksinasi  di  mana  harus  dihindari  ikan  stres  akibat penyuntikan/vaksinasi, berpindah wadah/ lingkungannya.
Pemanfaatan IgY yang diisolasi dari telur unggas belum  banyak  dilakukan  dan  terbatas  pada  skala laboratorium. Arasteh et al. (2004) melaporkan bahwa IgY spesifik terhadap Vibrio anguillarum yang diberikan secara  pasif  pada  rainbow  trout  mampu  menahan infeksi  bakteri  Vibrio  anguillarum.  Efek  yang  sama terhadap  Carassius  auratus  yang  diberi  imunisasi secara pasif IgY anti Aeromonas hydrophila (Xiao-liang et al., 2006).

## KESIMPULAN
IgY anti S. agalactiae yang diproduksi sensitif dan spesifik  terhadap  bakteri  S.  agalactiae  dan  dapat digunakan dalam pengendalian penyakit streptococ- cosis untuk imunoterapi infeksiyang disebabkan oleh S.  agalactiae  pada  ikan  nila  baik  untuk  pencegahan maupun untuk pengobatan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  disampaikan  kepada  Balai  Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan yang  telah  mendanai  penelitian  ini.  Penulis  juga mengucapkan  terima  kasih  kepada  Bapak  Dr.  Drs. Simson  Tarigan,  M.Sc.  dari  Balai  Besar  Penelitian Veteriner, dan tak lupa ucapan terima kasih juga untuk teman-teman  teknisi  yang  telah  membantu penelitian ini.
Keterangan (Note): TBUD= terlalu banyak untuk dihitung (TMTC= to many to count)
Sintasan Survival rate  (%) Rata-rata jumlah koloni bakteri Average number of bacterial colonies IgY 0.75 20 ± 2.74 83 x 10 4 ± 1.79 IgY 0.5 80 ± 1.87 28 x 10 6 ± 4.23 IgY 0.25 80 ± 3.41 45 x 10 6 ± 0,98 Kontrol (Control ) 60 ± 1.77 80 x 10 6 ± 2.47 IgY 0.75 40 ± 0.98 TBUD pada 1 x 10 2 dan tidak tumbuh pada pengenceran selanjutnya TMTC at 1 x 10 2 and did not grow on subsequent dilutions
IgY 0.5 80 ± 1.22 TBUD pada 1 x 10 2 dan tidak tumbuh pada pengenceran selanjutnya TMTC at 1 x 10 2 and did not grow on subsequent dilutions IgY 0.25 60 ± 3.11 15 x 10 4 ± 1.32 III Kontrol (Control ) 20 ± 1.73 TBUD pada 1 x 10 4 dan tidak tumbuh pada pengenceran selanjutnya TMTC at 1 x 10 4 and did not grow on subsequent dilutions
Grup (Group )
I II

## DAFTAR  ACUAN
Abbas, A.K., Lichtman, A.H., & Pillai S. (2012). Cellu- lar and molecular immunology. Elsevier Saunders.
Arasteh,  N.,  Aminirissehei,  A.H.,  Yousif,  A.N.,
Albright,  L.J.,  &  Durance,  T.D.  (2004).  Passive imunization  of  rainbouw  trout  (Onchorynchus mykiss)  with  chicken  egg  yolk  immunoglobulins (IgY). Aquaculture, 231, 23-36.
Barnes, A.C. & Ellis, A.E. (2004). Bacterial disease of fish.  where  do  we  go  from  here.  Yin,  L.K.  (Ed.). Current trends in the study of bacterial and viral fish  and  shrimp  disease.  Molecular  Aspect  of  Fish and Marine Biology, 3, 421 pp.
Carlendar, D. (2002). Avian IgY antibodi: In vitro and in vivo. Uppsala. Acta Universitatis Upsaliensis.
Dunn, E.J., Polk, A., Scarrett, D.J., Olivier, G., Lall, S., & Goosen, M.F.A. (1990). Vaccine in aquaculture: The search for efficient delivery system. Aquacul- ture Engineering, 9, 23-32.
Evans, J.J., Klesius, P.H., Pasnik, D.J., & Bosnsack, J.F. (2009). Human Streptococcus agalactiae isolate in nile tilapia (Oreochromis niloticus). Emerging Infec- tious Disease, 15(5), 774-778.
Li, X-L., Shuai, J-b., & Fang, W-h, (2006). Protection of  Carrasius  auratus  Gibelio  against  infection  by Aeromonas hydrophilla using specific immunoglo- bulin fron hen egg yolk. Journal of Zhejiang Univer- sity Science B, 7(11), 922-928.
Nakai, S., Li-chan, E., & Lo, K.V. (1994). Separation of immunoglobulin from egg yolk. In Egg uses and Processing  Technologies.  Sim,  J.S.  &  Nakai,  S. (Eds.). CAB Intl., p. 94-105.
Pareira,  U.P.,  Mian,  G.F.,  Oliviera,  I.C.M.,  Benchetrit, L.C.,  Costa,  G.M.,  &  Figueiredo,  H.C.P.  (2010). Genotyping of Streptococcus agalactiae strains iso- lated from fish, human, and cattle and their viru- lence potential in nile tilapia. Veterinary Microbiol- ogy, 140, 186-192.
Roberson, B.S. (1990). Bacterial agglutination in fish immunology  technical  communication  No.  1. Stolen,  J.S.,  Fletcher,  T.C.,  Anderson,  D.P., Roberson, B.S., & van Muiswinkel, W.B. (Eds.). Fair Haven. N.J.: SOS Publications, 197 pp.
Schade, R., Stack, C., Hendriksen, C., Erhard, M., Hugl, H.,  Koch,  G.,  Larsson,  A.,  .....,  &  Straughan,  D. (1996). The  production of  avian (egg  yolk) anti- bodies. IgY Alternatives to Laboratorium Animal, 24, 925-934.
Subowo.  (1993).  Imunologi.  Edisi  ke-2.  Bandung: Penerbit Angkasa.
Svendsen, L., Crowley, A., Ostergraard, L., Stodulski, H.G., & Hau, J. (1995). Development and compari- son of purification strategies for chicken antibo- dies from egg yolk. Lab. Anim. Sci., 45, 89-93.
Tizard.  (1998).  Pengantar  imunologi  veteriner. Surabaya: Airlangga University.
Wibawan, I.W.T, Pasaribu, F.H., Utama, I.H., Mawjood, A., & Laemmler, C.H. (1999). The role hyaluronic acid capsular material of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus  in  mediating  adherence  to  hela cells and in resisting phagocytosis. Res. Vet. Sci., 67, 131-135.
Zhang, W. (2003). The use of gene-spesific IgY anti- bodies  for  drag  target  discovery.  DDT,  8(8). Elsevier science Ltd.