Analisis Filogenetik dan DNA Barcode Ektoparasit Octolasmis cor yang terifestasi pada Kepiting Bakau Scylla spp.
Sutianto Pratama Suherman* 1 ; Sulastri Arsad 2
1. *Jurusan  Budidaya  Perairan.  Fakutas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan  Universitas Negeri  Gorontalo,  Jl.  Jenderal  Sudirman  No.  06,  Kota  Gorontalo 96128,  Gorontalo,
Indonesia
2. Program  Studi  Manajemen  SumberDaya  Perairan,  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya, Jl. Veteran Malang 65145, Jawa Timur, Indonesia *Korespodensi : sutiantopratama@ung.ac.id
(Diterima 02-07-2020; Direvisi 05-07-2020 Dipublikasi 25-07-2020)

## ABSTRAK
Indentifikasi morfologi memiliki keterbatasan dan hanya bisa diaplikasikan pada saat memasuki fase remaja atau dewasa, Identifikasi menggunakan sekuens DNA merupakan alternative yang dipakai dalam mengungkapkan taksonomi. Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui komposisi DNA dari gen 18s rRNA ektoparasit Octolasmis  cor dan  menganalisis  filogenetik  serta  identifikasi  spesies.  Hasil  menunjukan karakteristik  molekuler  18  rRNA  dari  sampel  parasit O.cor yang  ditemukan  di  wilayah  Sulawesi  Selatan diperoleh panjang DNA 1500 bp dengan komposisi basa Adenin 354 (23,6 %), Guanin 444 (29,6 %), , Timin 360 (24 %) dan Citosin 342 (15,1%).  Berdasarkan hasil analisis filogentik menunjukan jarak 0,004 yang artinya memiliki kedekatan hubungan atau kemungkinan dari spesies yang sama
Kata Kunci : Analisis Filogenetik ; Octolasmis cor ; 18s rRNA
Phylogenetic Analysis and DNA of Ectoparasite Octolasmis cor manifested on Mud Crab Scylla spp .  in South Sulawesi Waters

## ABSTRACT
Morphological identification has limitations and can only be applied when entering the adolescent or adult phase, identification using DNA sequences is an alternative used in expressing taxonomy. The purpose of this study was to determine the DNA composition of the 18s rRNA ectoparasite Octolasmis cor gene and analyze phylogenetic and species identification. The results showed 18 rRNA molecular characteristics from O.cor parasite samples found in South Sulawesi region obtained DNA length 1500 bp with base composition of Adenine 354 (23.6%), Guanin 444 (29.6%), Thymine 360 (24% ) and Citosin 342 (15.1%). Based on the results of the phylogentic analysis, it shows a distance of 0.004, which means it has a close relationship or possibility of the same species
Keyword : Analisis Filogenetik; Octolasmis cor; 18s rRNA
DOI: https://doi.org/10.37905/jfpj.v2i2.6969

## PENDAHULUAN
Kepiting  bakau  ( Scylla spp)  merupakan komoditas  perikanan  yang  hidup  diperairan banyak  digemari  oleh  konsumen domestik  dan mancanegara. Sehingga kepiting bakau menjadi salah  satu  komoditas  ekspor  yang  bernilai ekonomis (Domitilla et al . 2020). Namun benih kepiting bakau di Indonesia masih mengandalkan hasil tangkapan alam, terutama di  Sulawesi  Selatan.  Kekurangan  dari  benih tangkapan  alam  sangat  mungkin  terinfestasi berbagai  jenis  parasit  antara  lain Octolasmis spp.
Octolasmis spp  adalah  jenis  parasit  dari kelas  Maxillopoda  yang  sering  dijumpai  pada beberapa  jenis  crustacean  seperti  kepiting, lobster  dan  udang.  Parasit  ini  terdiri  dari peduncle  dan  capitulum  yang  di  bungkus cangkang  (Praptiasih,  2010)  Parasit  ini  dapat berkembang pada lingkungan budidaya. karena siklus  hidupnya  tidak  memerlukan  inang perantara (Jeffries et al 1995).
Kondisi  padat  penebaran  tinggi  disertai dengan  menurunnya  kualitas  air  dapat meningkatkan  infestasi.  Hal  ini  di  buktikan Irvansyah et  al (2012)  dengan  melihat  tingkat intesitas  serangan  parasit Octolasmis spp  dari benih  kepiting  tangkapan  alam  mencapai 65,259  %  ketika  dibesarkan  dalam  tambak. Infestasi Octolasmis spp  yang  berat  diduga
merupakan potensi ancaman terhadap perkembangan  budidaya  kepiting  bakau, sehingga  dapat  memberikan  dampak  negatif terhadap  pendapatan  ekonomi  masyarakat terutama petambak kepiting bakau.
Saat  ini  indentifikasi  spesies  octolasmis spp  hanya  dilihat  jumlah capitular , scutum , tergum dan carina (Jeffries et al ., 2005). Metode ini  memiliki  keterbatasan  dan  hanya  bisa diaplikasikan  pada  saat  parasit  ini  memasuki fase remaja atau dewasa, sedangkan pada fase larva  atau cryprid teknik  ini  belum  dapat diaplikasikan.  Hal  ini  disebabkan  pada  fase cypird karakteristik  morfologi  belum  terbentuk sehingga  cukup  sulit  diidentifikasi.  Alternative lain  untuk  metode  Identifikasi  adalah  dengan menggunakan  sekuens  DNA,  yaitu  Salah  satu penanda  molekuler  yang  dipakai  dalam mengungkapkan  taksonomi  suatu  spesies dengan mengamati kode batang DNA atau DNA barcoding (Chippindale et al ., 1999). Dari sekian banyak  teknik  penanda  DNA,  salah  satunya adalah ribosomal RNA (rRNA). Menurut Baker et al .,  (2001)  identifikasi  spesies  pada  sub  unit rRNA  paling  banyak  digunakan  sebagai molecular  chronometer sebab  dengan  panjang 1600-2000 bp dapat memberikan informasi yang cukup tentang hubungan evolusi antar spesies.
Perkembangan teknik molekuler berdasarkan 18S rRNA telah berkembang pada tahun  1996  dan  sangat  jarang  digunakan
sebagai alat indentifikasi organisme terutama di Indonesia,sehingga diharapkan dapat memberikan  kontribusi  besar  bagi  ilmu pengetahuan,  selain  itu  juga  untuk  menambah informasi tentang karakter nukleotida 18s rRNA parasit Octolasmis spp serta mendesain pohon filogenetik molekulernya.

## METODE PENELITIAN
Waktu dan tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  tahun lalu  di  laboratorium  parasit  dan  penyakit  ikan Universitas  Hasanuddin  Makassar.  Sampel diawetkan  semenjak  tahun  2013  yang merupakan  parasit  yang  mengifestasi  kepiting bakau.
Alat dan bahan.
Adapun alat yang digunakan penelitian ini adalah  botol eppendrof , Thermal  Cycle (PCR), sumur  gel  eletroforesis,  mikropipet,  mesin  ABI 3130xl Genetic Analyzer dan UV transluminator .
Sedangkan  bahan  yang  digunakan  adalah Parasit Octolasmis  cor, etanol,  DNA  mini  kit (Qiagen), primer, larutan TBE 0,5x, loading dye dan akuades
Prosedur Penelitian
DNA  mini  kit  (Qiagen)  digunakan  untuk extraksi  DNA  dari Octolasmis  cor dengan mengikuti  prosedur.  Amplifikasi  DNA  dengan menggunakan metode Reaksi Rantai Polimerase  (PCR)  sedangkan  primer  yang
digunakan  dirancang  dengan  menggunakan software clustalW untuk  daerah  yang terkonservasi  berdasarkan  sekuen  referensi GenBank  di  NCBI  dan  selanjutnya  software pearlprimer digunakan  dalam  menentukan primer pada daerah yang terkonservasi tersebut dari region 18S. kondisi PCR 94°C 5 menit ( initial Denaturation ), 30 siklus denaturasi dengan suhu 94°C 1 menit, annealing suhu 45°C 1 menit, dan ekstension disuhu  72°C  1,5  menit  dan final extension pada suhu 72°C 7 menit
Produk  PCR  selanjutnya  dielektroforesis dalam gel agarose 1% dalam larutan TBE 0.5X. Sebanyak  10  μL  DNA  hasil  PCR  dicampur dengan 2 μL loading dye kemudian dimasukkan dalam  sumur  gel  elektroforesis.  Elekrtoforesis dijalankan  pada  tegangan  100  volt  selama  30 menit.  Selanjutnya  gel  hasil  elektroforesis diletakkan  diatas  UV  transluminator  dan didokumentasikan menggunakan GelDoc (Sambrook et al . 1989).
DNA  dipurifikasi  dengan Qiagen  PCR Purification  Kit berdasarkan  petunjuk  kit. Kemudian  hasil  PCR  yang  sudah  dipurifikasi disekuen  dengan  menggunakan  sekuensing otomatis mesin ABI 3130xl Genetic Analyzer di Laboratorium 1 st Base di Singapura. Selanjutnya dilakukan BLAST pada situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.  Hal  ini bertujuan  memastikan  primer  memotong  tepat pada bagian dan untuk mengidentifikasi spesies
Octolasmis spp. yang tersimpan dalam database NCBI untuk menentukan homolog (Sulistijowati dan Mile, 2016).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Octolasmis cor dari region 18S rRNA  telah  berhasil  diamplifikasi  dengan panjang  1500  bp.  Hal  ini  dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Gambar  1.  Elektroforegram    amplifikasi  gen  18s  rRNA specimen Octolasmis cor dalam 1% gel agarose (Keterangan: 1kb = DNA Ladder, Octolasmis cor =O.cor).
Hasil  perhitungan  (Gambar  2)    jumlah basa nukleotida, diperoleh panjang DNA 1500bp dengan komposisi yaitu Adenin berjumlah 354 ( 23,6 %), Guanin 444 (29,6 %), , Timin 360 (24 %) dan Citosin 342 (15,1%). Dari semua jumlah kandungan basa nukleotida terbanyak mencapai 29,9  %.  Yaitu  Guanin,  akan  tetapi  jumlah tersebut  tidak  jauh  berbeda  dengan  basa nukleotida yang lain.
Hasil blasting (Tabel  1)  tingkatan kemiripan  dimiliki  oleh Octolasmis  cor dengan
max score 2760 dan totaly score 2670, query cover 100%, E-value 0.0  dan Ident 99,87  %. Menurut Tindi (2017) bahwa nilai E-value sama dengan 0.0  menunjukkan pensejajaran  sekuen yang  signifikan  artinya  sekuen  specimen  yang dicari  melalui  situs  NCBI    pada  penelitian  ini berasal  dari  genus  yang  sama  atau    identik. Sehingga  dapat  dipastikan  bahwa  specimen O.cor adalah Octolasmis  cor karena  memiliki tingkat kemiripan atau per.indent 99,87 %
Hasil analisis pohon filogenetik  (Gambar
3)  dengan  menggunakan  metode neighbor joining ditemukan jarak genetik sampel dengan Octolasmis cor menunjukan nilai 0,004. Menurut Tallei et  al. (2016),  nilai  jarak  genetik  yang semakin  kecil  antara  dua  organisme menunjukan  kedekatan  hubungan  kekerabatan artinya  semakin  kecil  jaraknya  maka  semakin dekat  pula  hubungan  kekerabatan  antara keduanya.  Hasil  di  atas  menandakan  bahwa kemukinan  besar  bahwa  spesies  parasit  yang ditemukan  di  wilayah  Sulawesi  Selatan  adalah Octolasmis cor (Marcoz et al 2008)
Gambar 2. Consensus DNA parasit Octolasmis cor asal perairan Sulawesi Selatan Specimen O.cor.
Tabel 1. Hasil BLASTING Specimen O.cor di Bank gen NCBI (3 teratas).
Description Max Score Total Score Query Cover E value Per. Ident Accession Octolasmis cor 18S ribosomal RNA gene 2760 2760 100 % 0,0 99,87 % EU082407.1 Octolasmis sp. 18S ribosomal RNA gene 2726 2726 100 % 0,0 99.47% EU082408.1 Temnaspis amygdalum 18S ribosomal RNA  2721 2721 100 % 0,0 99.40% AB551730.1
Sumber: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Gambar 3. Rekonstruksi pohon filogenetik beberapa jenis kerabat Octolasmis spp. berdasarkan 18S rRNA gen dengan metode neighbor joining
Hasil pengamatan morfologi dari sampel parasit yang  ditemukan  memiliki  kesamaan  dengan Octolasmis cor (Chan et al .2012). Hal ini bisa dilihat  dari  jumlah  cabang scutum,  tergum  dan carina  pada  kedua  gambar  parasit  itu. Octolasmis cor memiliki jumlah cabang scutum terdiri dari 2 cabang dan 1 carina (Gambar 4a), salah satu ciri khas dari bentuk cabang scutum daro Octolasmis cor agak melebar.
Gambar  4.  a)  Morfologi Octolasmis  cor pada kepiting  bakau  yang  tertangkap  di Sulawesi selatan; b) Gambar O.cor (Chan et al .2012)

## SIMPULAN
Karakteristik  molekuler  18  rRNA  dari sampel parasit O.cor yang ditemukan di wilayah Sulawesi Selatan diperoleh panjang DNA 1500 bp dengan komposisi basa Adenin 354 (23,6 %), Guanin  444  (29,6  %),  ,  Timin  360  (24  %)  dan Citosin 342 (15,1%).  Berdasarkan hasil analisis filogentik  menunjukan  jarak  0,004  yang artinya memiliki kedekatan hubungan atau kemungkinan  dari  spesies  yang  sama.  Saran untuk  penelitian  ini  diharapkan  untuk  dapat
mengidentifikasi karakteristik DNA parasit pada gen 28S atau COI .

## DAFTAR PUSTAKA
Baker,  G.C.,  Shabarni-Gaffar,  Cowon,  D.C., Suharto, A.R. 2001. Microbial community analysis of Indonesian hot-springs. FEMS Microbial Lett . 103-9.
Chan,  K.K.,  Prabowo,  Romanus,  Lee,  Kwen- Shen.  2012. Octolasmis  cor (Aurivillius, 1892). http://barnacle.biota.biodiv.tw/pages/1059 [diakses tanggal 14 agustus 2013].
Chippindale,  P.T.,  Dave,  V.K,  Whitmore,  D.H., Robinson,  J.V.  1999.  Phylogenetic relationships of North American Damselflies  of  the GenusIschnura (Odonata:  Zygoptera:  Coenagrionidae) based  on  sequences of  three mitochondrial genes. Molecular Phylogenetics  and  Evolution. 11 (1):  110- 121.
Domitila,  Ohoiulun.,  Marthinus,  I.  H.  H.  2020. Analisis  Morfometrik  Kepiting  Bakau ( Scylla  Serrata) Hasiltangkapan  Dari Perairan Desa Warwut Kabupaten Maluku Tenggara. Jambura  Fish  Processing Journal . 2(1) : 28-35.
Irvansyah,  M.,  Yusuf,  Nurlita  A.,  Gunanti  M. 2012. Identifikasi dan intensitas ektoparasit  pada  kepiting  bakau  ( Scylla serrata )  stadia  kepiting  muda  di pertambakan kepiting, kecamatan Sedati, Kabupaten  Sidoarjo. Jurnal  Sains  Dan Seni ITS 1(1).
Jeffries,  William,  B.,  Harold,  K.,  Voris,  P.N., Somsak, P. 2005. Pedunculate Barnacles of  the  symbiotic  genus Octolasmis ( Cirripedia:  Thoracica:  Poecilasmatidae )
from  the  Northern  Gulf  of  Thailand  The Natural History. Journal of Chulalongkorn University 5(1): 9-13.
Jeffries, William, B., Harold, K., Voris, Sombat, P.,  Heil,  L.C.  1995.  The  live  cycle Lepadhormorph barnacle, Octolasmis cor and  methods  for  their  laboratory  culture. Phuket Marine Biol. Cent. Bull. 29-35.
Marcos  P´erez-Losada,  Jens,  T.,  Hoeg,  Keith, A.,  Crandall.  2004.  Unraveling  the evolutionary  radiation  of  the Thoracican barnacles
using molecular and morphological evidence: A comparison of several  divergence  time  estimation approaches. Society  of  Systematic Biologists . 53(2):244 – 264.
Praptiasih, Indah. 2010.  Mengenal Octolasmis,
parasit leher angsa pada Crustacea . Info Karikan,  edisi  ketujuh.  Pusat  Karantian Ikan.
Sambrook,  J.,  Fritsch,  E.F.,  Maniatis,  T.  1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press. 113 – 127 p.
Sulistijowati, R., Mile, L.. 2016. Identification of Lactic Acid  Bacteria  Isolates  from  Intestine  of Milkfish  (Chanos-Chanos)  Potential  Activity against  Pathogen  Bacteria  Used  PCR  18s Rrna  Methode. International  Journal  of  Bio- Science and Bio-Technology . 8(3).
Tallei,  T.E.,  Rembet,  R.E.,  Pelealu,  J.J., Kolondam, B.J. 2016. Sequence variation and phylogenetic analysis of Sansevieria trifasciata ( Asparagaceae ). Bioscience Research. 13(1): 01-07.
Tindi, Monalisa, N., Gustaf, F., Mamangkey, Stenly,
W.  2017.  DNA barcode dan  analisis filogenetik  molekuler beberapa  jenis bivalvia asal  perairan    Sulawesi  Utara  berdasarkan gen Coi . Jurnal Pesisir dan Laut Tropis . 1: 2.