Syntax Idea: p–ISSN: 2684-6853 e-ISSN: 2684-883X Vol. 2, No. 12, Desember 2020

## OPTIMASI  REVERSED-PHASE  LIQUID  CHROMATOGRAPHY  RESIDU PESTISIDA  PADA  VARIASI  LAJU  ALIR  DAN  KONDISI  ISOKRATIK MENGGUNAKAN SPREADSHEE

## Budi Yasri, Harmoko dan Amalia Rakhmawati
Akademi Metrologi dan Instrumentasi, Direktorat Standardisasi dan Pengendalian Mutu Kementerian Perdagangan Jawa barat, Indonesia. Email: budiyasri@gmail.com, mokoindonesia@gmail.com dan amelchantique@gmail.com.

## Abstract
The  multiresidue  method  (MRM)  in  pesticide  analysis  using  LC-MS/MS  and  /  or GC-MS/MS  is  generally  used  for  pesticide  residue  analysis  because  of  the  large number  of  registered  and  permitted  pesticides  circulating  on  the  market.  The process  of  separating  analytes  in  a  reversed  phased  liquid  chromatography  (RP- LC)  system  were  affected  by  several  factors,  one  of  which  was  the  mobile  phase flow  rate.  Optimization  was  carried  out  to  find  the  separation  conditions  for  the optimum isocratic elution by changing the flow rate and composition of the organic mobile  phase.  In  this  study,  optimization  was  carried  out  with  the  help  of  Excel spreadsheets  for  9  mixtures  of  pesticide  residue  compounds  and  the  optimization results  were  tested  against  the  separation  of  120  mixtures  of  pesticide  residue compounds. The optimal separation obtained in isocratic elution is at flow rate (F) =  0.3  mL/min  and  the  organic  mobile  phase  composition  φ  =  0.40.  However,  the optimum isocratic conditions obtained were less suitable when used for separation of  120  mixtures  of  pesticide  residue  compounds,  because  many  compounds  were eluted at the beginning and at the same time.

## Keywords: pesticide residue, RP-LC, optimization, isocratic elution, flow rate, mobile phase composition

## Abstrak
Metode  multiresidu  pestisida  (MRM)  menggunakan  LC-MS/MS  dan  atau  GC- MS/MS  secara  umum  digunakan  untuk  analisis  residu  pestisida  dalam  karena banyaknya  jumlah  pestisida  terdaftar  dan  diijinkan  beredar  di  pasaran.  Proses pemisahan  analit  dalam  sistem reversed  phased  liquid  chromatography (RP-LC) dipengaruhi oleh beberapa faktor dimana salah satunya adalah laju alir fase gerak. Optimasi  dilakukan  untuk  mencari  kondisi  pemisahan  pada  elusi  isokratik  yang optimum dengan melakukan perubahan terhadap laju alir dan komposisi fase gerak organik. Pada penelitian ini dilakukan optimasi dengan bantuan  Excel Spreadsheet terhadap  9  campuran  senyawa  residu  pestisida  dan  hasil  optimasi  diuji  terhadap pemisahan  120  campuran  senyawa  residu  pestisida.  Pemisahan  optimal  yang diperoleh  dalam  elusi  isokratik  yaitu  pada  laju  alir  (F)  =  0,3  mL/menit  dan komposisi  fase  gerak  organik  φ  =  0,40.  Namun,  kondisi  isokratik  optimum  yang diperoleh  tersebut  kurang  cocok  jika  digunakan  untuk  pemisahan  terhadap  120
campuran  senyawa  residu  pestisida,  karena  banyak  senyawa  terelusi  di  awal  dan pada waktu yang bersamaan.
Kata kunci: residu pestisida, RP-LC, optimasi, elusi isokratik, laju alir, komposisi fase gerak

## Pendahuluan
Pestisida  hingga  saat  ini  masih  digunakan  pada  hampir  semua  jenis  tanaman pangan  untuk  menanggulangi  hama  dan  penyakit.  Karena  toksisitas  dari  pestisida tersebut  terhadap  kesehatan,  maka  ditetapkan Maximum  Residue  Limits (MRLs) berdasarkan risk  assessment .  Uni  Eropa  yang  merupakan  importir  produk  pertanian Indonesia,  secara  kontinu  melakukan  kajian  dan  merevisi  MRL  menjadi  lebih  rendah. MRLs  sebagian  besar  residu  pestisida  ditetapkan  berdasarkan Limit  of  Determination (LOD)  yaitu  sebesar  0,01  mg/kg.  Pada  tahun  2020,  dalam Commission  Regulation European Union (EU) 2020/1085 ( Commission Regulation (EU) 2020/1085, 2020), EU menurunkan  MRL  untuk  pestisida chlorpyrifos dan chlorpyrifos  methyl menjadi  0,01 mg/kg untuk semua bahan pangan. Sedangkan Indonesia berdasarkan Peraturan Menteri Pertanian  Republik  Indonesia  Nomor  55/Permentan/KR.040/11/2016  (Kementrian kesehatan  RI,  2018)  menetapkan  MRL chlorpyrifos dan chlorpyrifos  methyl berbeda- beda  untuk  setiap  komoditi  dan  nilainya  jauh  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  EU MRLs. Ekspor produk pertanian Indonesia masih mendapatkan notifikasi terkait residu pestisida dari European RASSF hingga akhir tahun 2018. Publikasi terkait kadar residu pestisida  pada  produk  pertanian  Indonesia  sangatlah  sedikit.  Pada  komoditi  biji  kopi, beberapa  pestisida  masih  ditemukan  pada  kadar  di  atas  0,01  ppm  (Harmoko, Kartasasmita, & Tresnawati, 2015). Anthraquinone juga ditemukan melebihi 0,02 ppm pada teh (Kartasasmita et al., 2020).
Dengan  banyaknya  jumlah  pestisida  terdaftar  dan  diijinkan  beredar  di  pasaran, maka  penggunaan  metode  pengujian multi-residue  method (MRM)  yang  mampu menganalisis  sejumlah  besar  pestisida  dalam  satu single-run adalah  pendekatan  yang paling  umum  dan  paling  efisien.  Beberapa  metode  standar  resmi  MRM  seperti  EN 15662:2008 (EN 15662:2008, 2008) yang dipublikasikan oleh the European Committee for  Standardization (CEN)  atau  AOAC  2007.01  (AOAC Official  Method 2007.01.,
2007)  yang  dikeluarkan  oleh Association  of  Official  Analytical  Chemists (AOAC) International menggunakan  instrumen  analisis gas  chromatography  coupled  to  mass spectrometry (GC-MS)  dan/atau liquid  chromatography  coupled  to  tandem  mass spectrometry (LC-MS/MS)  telah  digunakan  secara  luas  di  seluruh  dunia  untuk pengujian residu pestisida dari berbagai golongan dan dari beragam matriks sampel.
LC-MS/MS  adalah  instrumen  analisis  yang  sangat  baik  digunakan  dalam penetapan  kadar  residu  pestisida. Liquid Chromatography (LC) lebih  disukai  daripada Gas  Chromtography (GC)  karena  pestisida  yang  digunakan  saat  ini  cukup  polar,  labil secara termal atau tidak mudah menguap, dan akibatnya terdeteksi dengan tidak baik di GC (Farré,  Picó,  &  Barceló,  2014). Oleh  karena  itu,  LC-MS/MS  telah  menjadi  salah satu alat yang paling baik  untuk analisis senyawa organik pada tingkat sub mg/L yang
menyediakan  sensitivitas,  selektivitas,  dan  spesifisitas  diperlukan  untuk  memenuhi regulasi negara importir seperti Uni Eropa untuk analisis pestisida dalam sampel air dan makanan.  Dalam  LC,  RPLC  merupakan  sistem  yang  umum  digunakan  dalam pemisahan  multiresidu  pestisida  seperti  juga  terlampir  pada  metode  standar EN 15662:2008  dan  AOAC  2007.01.  (Lehotay,  2007)  Pada  sistem  RPLC,  beberapa pestisida  terelusi  dalam  waktu  singkat  dan  memiliki  bentuk peak yang  buruk.  Hal  ini mengindikasikan  bahwa  pestisida  tersebut  tidak  tertahan  didalam  kolom  pada  saat proses  pemisahan  menggunakan  sistem  LC.  Buruknya  pemisaahan  tersebut menyebabkan berkurangnya akurasi pada saat dilakukan kuantisasi hasil pengujian dan memungkinkan  diperoleh Limit  of  Quantification (LOQ)  atau Reporting  Limit (RL) lebih  tinggi  dari  nilai Maximum  Residue  Limits (MRLs)  yang  ditetapkan.  Beberapa brand instrumen  LC-MS/MS  telah  melakukan  beberapa  penelitian  melalui  eksperimen yang dipublikasikan melalui Application Note untuk mengatasi masalah tersebut dengan cara  yang  berbeda-beda  seperti  penggunaan divert  valve (Kokkalis,  E.,  et.  al,  2012), optimasi temperature values  for  the ESI source  and  HSID  temperature (Dalmia et  al., 2018), robust online dilution (Mastovska et al., 2017).
Optimasi  dalam  pemisahan  kromatografi  merupakan  hal  yang  penting  untuk mencari resolusi terbaik yang diinginkan dalam waktu minimum. Di dalam melakukan optimasi pada sistem RPLC, ada dua hal yg dilakukan yaitu meningkatkan retensi dan memaksimalkan peak  shape (Nikitas  &  Pappa-Louisi,  2009).  Beberapa  parameter operasional  telah  dipelajari  melalui  eksperimen  di  laboratorium terhadap  150  pestisida menggunakan  LC-MS/MS.  Parameter  operasional  dipelajari  pengaruhnya  terhadap waktu retensi, peak shape , dan ionisasi. Namun pada penelitian tersebut digunakan pada laju alir konstan. (Kmellár, Pareja, Ferrer, Fodor, & Fernández-Alba, 2011). Pendekatan kemometri  telah  digunakan  untuk  optimasi  pemisahan  enam  (6)  persitida  karbamat. Laju alir dan persentase fase gerak organik merupakan faktor yang paling berpengaruh terhadap pemisahan kromatografi  (Ouertani, El Atrache, & Hamida, 2016).Temperatur kolom  tidak  memberikan  pengaruh  signifikan  terhadap  pemisahan  (Kmellár  et  al., 2011), (Ouertani et al., 2016). Di dalam variabel fase gerak organik sendiri, komposisi fase  gerak  (Rafferty,  Siepmann,  &  Schure,  2011)  dan modifier juga  berpengaruh terhadap  optimasi  pemisahan  dalam  sistem  RPLC  (Pappa-Louisi,  Agrafiotou,  & Georgiadis, 2011). Beberapa software packages dapat digunakan untuk simulasi proses kromatografi  seperti  DryLab,  PREOPT-W,  OSIRIS,  MICHROM,  CHROMSWORD (Zisi,  Mangipa,  Boutou,  &  Pappa-Louisi,  2018).  Simulasi  proses  pemisahan kromatografi juga dapat dilakukan menggunakan Matlab (Nilsson, Borgqvist, Axelsson, & Zacchi, 1999) dan Excel (Fasoula, Nikitas, & Pappa-Louisi, 2017). Software berbasis Excel Spreadsheet tersebut  telah  aplikasikan  pada  pemisahan  campuran  senyawa benzena  dan  fenol  (Fasoula  et  al.,  2017)  dan  campuran  senyawa  ionik  dan  non-ionik (Zisi et al., 2018).
Pada  penelitian  ini  dilakukan  optimasi  pemisahan  terhadap  9  campuran  senyawa residu  pestisida  pada  sistem  gradien  RP-LC  menggunakan Software berbasis  Excel Spreadsheet yang  telah  dikembangkan  sebelumnya  (Fasoula  et  al.,  2017).  Optimasi
dilakukan pada variasi laju alir komposisi fase gerak pada kondisi isokratik dan single linear  organic  modifier-gradients .  Kondisi  pemisahan  yang  optimum  kemudian diaplikasikan  pada  pemisahan  120  pestisida  dalam  matriks  kopi,  kakao,  lada,  dan  teh yang  termasuk  dalam difficult  or  unique matriks  grup  komoditi  ( Document No SANTE/11813/2017,  2017).  Keempat  komoditi  tersebut  merupakan  produk  pertanian Indonesia yang diekspor ke EU.

## Metode Penelitian
a. Bahan Kimia dan Reagen
Standar analisis pestisida dibeli dari Sigma Aldrich - Amerika Serikat (AS) dan Chem  Service- AS.  Metanol  ( grade HPLC),  asetonitril  ( grade HPLC),  asam  format, asam asetat, heptana, etil asetat diperoleh dari Merck  - Jerman. Bulk sorben natrium klorida  (NaCl),  amina  sekunder  primer  (PSA),  Bondesil  C18,  MgSO4,  dibeli  dari Agilent - AS. Sistem pemurnian air Arioso (Cole-Parmer Scientific - AS) digunakan untuk menghasilkan air Ultrapure .
b. Larutan Pestisida
Larutan  standar  stok  individu  pestisida  dengan  konsentrasi  sekitar  1000  mg/L disiapkan dengan menimbang sekitar 10 mg dalam labu ukur 10 mL dan dilarutkan dalam  asetonitril.  Larutan  standar  disimpan  dalam  gelap  pada  suhu  -20 ⁰ C. Selanjutnya  dibuat  1  mg/L  campuran  9  pestisida  dan  120  pestisida  dengan mengencerkan  larutan  standar  stok  dengan  asetonitril.  Setelah  itu,  larutan  standar campuran  10  mg/L  yang  digunakan  dalam  percobaan  laboratorium  awal  dibuat dengan  mengencerkan  larutan  standar  1  mg/L.  Sembilan  pestisida  yang  digunakan dalam  perilaku  kromatografi  adalah cyromazine,  methamidophos,  imidacloprid, acetamiprid, thiacloprid, propoxur, carbaryl, bupirimate, dan azoxystrobine .
c. Ekstraksi Sampel
Ekstrak  sampel  biji  kopi  hijau,  biji  kakao,  lada  hitam,  dan  teh  dibuat  dengan metode  QuEChERS  termodifikasi.  Metode  pengujian  (Harmoko  et  al.,  2015) Digunakan untuk mendapatkan sampel ekstrak biji kopi hijau, biji kakao, lada hitam, dan  teh  yang  bersih.  Selanjutnya,  larutan  campuran  standar  120  pestisida  dalam setiap  matriks  sampel  dibuat  dengan  pengenceran  larutan  standar  1  mg/L  dengan ekstrak  sampel  bersih.  Larutan  standar  ini  kemudian  digunakan  untuk mengkonfirmasi kondisi pemisahan optimal yang diperoleh dari hasil optimasi.
d. LC
Pemisahan residu pestisida dilakukan dengan menggunakan sistem Ultra HPLC 1290 Infinity (UHPLC)  (Agilent  Technologies  -  AS)  dan  kolom  HPLC  100-3  mm dengan  penutup  ujung  Chromolith®  Performance  RP-18  (Merck  -  Jerman).  Fase gerak  A  adalah  air  yang  mengandung  asam  format  0,1%  dan  fase  gerak  B  adalah asetonitril. Temperatur kolom dijaga pada suhu konstan 25 ⁰ C. Perilaku kromatografi zat terlarut diselidiki melalui percobaan laboratorium pada laju aliran fase gerak 0,2, 0,3,  dan  0,5  mL/menit.  Proses  isokratik dilakukan  dengan  fraksi  volume  fase  gerak organik  yang  berbeda  (φ  =  0,4,  0,5,  dan  0,6)  dalam  laju  alir  yang  berbeda.  Proses
single linear organic modifier-gradients dilakukan dari fraksi volume awal φ 0 = 0,2 hingga yang terakhir φ f = 1,0. Waktu gradien ditetapkan 10, 15, dan 20 menit dengan waktu mulai ( t in = 0 menit).
e. Mass Spectrometry (MS)
Analisis  MS  dilakukan  dengan  menggunakan  spektrometer  massa triple quadrupole ,  AB  Sciex  3500  (AB  Sciex  -  AS).  MRM  dioperasikan  dalam  mode ionisasi positif. Parameter operasi Collision gas (CAD), Curtain gas (CUR), tegangan IonSpray (IS) dan temperatur (TEM) dari sumber ion masing-masing ditetapkan pada 8V, 10 V, 5000 dan 500. Tegangan IonSpray (IS) dan suhu (TEM) dari sumber ion ditetapkan  masing-masing  pada  5000  dan  500.  Sumber  Ion  gas  1  (GS1)  dan  gas  2 (GS2) ditetapkan masing-masing pada 40 dan 60.

## Hasil dan Pembahasan
a. Pengaruh Laju Aliran Fase Bergerak terhadap Retensi Residu Pestisida Faktor  rentensi  k  zat  terlarut  terhadap  variasi  laju  aliran  pada  konstanta  dapat dijelaskan dengan persamaan (1) (Nikitas & Pappa-Louisi, 2009).
di  mana  t o1 adalah  waktu  penahanan  kolom.  Tabel  1  di  bawah  ini  menunjukkan pengaruh  laju  alir  pada  retensi  residu  pestisida.  Data  percobaan  dalam  kondisi isokratik  dilakukan  pada  laju  alir  0,2,  0,3,  dan  0,4  mL/menit  pada  φ  ACN  =  0,4, 0,5, dan 0,6. Zat terlarut dielusi lebih cepat ketika laju alir dan komposisi fase gerak organik  meningkat.  Pada  laju  alir  0,4  mL/menit,  lebih  banyak  zat  terlarut  yang dielusi pada waktu yang sama atau berdekatan. Hal ini akan mempengaruhi resolusi serta respon sinyal ke instrumen ( signal supressio n).

## Tabel 1

## Waktu retensi eksperimental isokratik (dalam menit) dari residu pestisida yang diperoleh pada laju alir dan komposisi fase gerak organik yang berbeda
Zat Terlarut Laju Alir 0,2 mL/menit Laju Alir 0,3 mL/menit Laju Alir 0,4 mL/menit φ =0,4 φ =0,5 φ =0,6 φ =0,4 φ =0,5 φ =0,6 φ =0,4 φ =0,5 φ =0,6 Cyromazin 2,82 2,8 2,75 1,89 1,85 1,84 1,41 1,39 1,36 Methamidophos 3,19 3,18 3,16 2,13 2,13 2,11 1,59 1,59 1,58 Imidacloprid 4,09 3,69 3,49 2,69 2,46 2,32 2,02 1,84 1,73 Acetamiprid 4,13 3,71 3,49 2,79 2,5 2,33 2,08 1,86 1,74 Thiacloprid 4,71 3,97 3,63 3,15 2,67 2,42 2,37 2,0 1,81 Propoxur 6,39 4,84 4,1 4,25 3,22 2,72 3,19 2,4 2,04 Carbaryl 7,36 5,15 4,26 4,87 3,42 2,83 3,64 2,58 2,11 Bupirimate 9,29 6,05 4,87 6,15 4,03 3,22 4,63 3,02 2,41 Azoxystrobine 17,61 8,17 5,37 11,71 5,46 3,56 8,9 4,08 2,67
b. Optimasi dengan Variasi Laju Alir
Optimasi pemisahan campuran zat terlarut dengan bantuan komputer (Zisi et al.,  2018),  (Fasoula  et  al.,  2017)  dilakukan  dengan  studi  eksperimen  laboratorium tentang  perilaku  kromatografi  zat  terlarut  pada  beberapa  kondisi  isokratik; penentuan  parameter  model  retensi  yang  dapat  disesuaikan  dengan  menyesuaikan data  retensi  eksperimen  dari  masing-masing  analit;  pemodelan  bentuk peak setiap analit;  penentuan  kondisi  pemisahan  optimal,  uji  akurasi  kondisi  optimal  dengan membandingkan kromatogram eksperimental dan kromatogram prediksi.
Data  retensi  isokratik  tiap  zat  terlarut  pada  beberapa  laju  alir  selanjutnya dilengkapi  dengan  model  retensi  kuadrat  dalam  sistem  RPLC  (Persamaan  2). Dalam persamaan ini terdapat tiga parameter yang dapat diatur yaitu a, b, dan c.
Model peak kromatografi  Gaussian  dengan  tinggi,  lebar,  dan  parameter respon detektor adalah h, D, dan y, masing-masing, dinyatakan dalam Persamaan 3, digunakan  untuk  menyesuaikan  bentuk  peak  setiap  zat  terlarut  dalam  komposisi fase gerak organik yang berbeda, φ.
dimana
Nilai  parameter  yang  bisa  diatur  adalah  c 0 ,  c 1 ,  c 2 ,  h 0 ,  h 1 ,  h 2 ,  D 0 ,  D 1 ,  dan  D 2 kemudian ditransfer ke spreedsheet untuk digunakan dalam optimasi pada kondisi isokratik dan single linear organic modifier-gradients .
c. Optimasi dengan Kondisi Isokratik
Kondisi  optimum  pemisahan  yang  diperoleh  dari  optimasi  menggunakan spreadsheet pada kondisi isokratik adalah pada φ = 0,50 untuk aliran 0,2 mL menit, φ = 0,40 untuk aliran 0,3 mL/menit, φ = 0,36 untuk aliran 0,4 mL/menit. Laju alir 0,3 mL/menit memberikan  pemisahan terbaik dibandingkan dengan laju aliran 0,2 dan  0,4  mL/menit.  Gambar  1  di  awah  ini  menunjukkan  kromatogram  dari  9 pestisida (a) dan 120 pestisida (b) yang bekerja pada kondisi isokratik optimum (F = 0,3 mL/menit, φ = 0,40). Pada gambar terlihat bahwa multiplikasi pestisida tidak sesuai  untuk  kondisi  isokratik,  karena  banyak  zat  terlarut  yang  terelusi  pada  awal elusi dan bersamaan pada waktu yang sama.
Gambar 1.
Kromatogram LC-MS/MS dari campuran (A) 9 pestisida dan (B) 120 pestisida pada konsentrasi 10 µg/L diperoleh pada kondisi isokratik optimal (F = 0,3 mL/menit, φ = 0,40)

## Kesimpulan
Pemisahan optimal dalam elusi isokratik diperoleh pada F = 0,3 mL/menit dan φ = 0,40.  Namun,  kondisi  pemisahan  tersebut  kurang  sesuai  jika  digunakan  untuk pemisahan terhadap 120 senyawa, karena banyak senyawa terelusi pada awal elusi dan pada waktu yang bersamaan. Optimasi pemisahan pada kondisi gradien perlu dilakukan lebih lanjut.

## BIBLIOGRAFI
Dalmia,  Avinash,  Cudjoe,  Erasmus,  Astill,  Toby,  Jalali,  Jacob,  Weisenseel,  Jason  P., Qin, Feng, Murphy, Molly, Ruthenberg, Travis, Shelton, C. T., & Woodbridge, O. N. (2018). A Single Cannabis LC/MS/MS Method to Meet California Pesticide and Mycotoxin Residues Regulatory Requirements .
Farré,  M.,  Picó,  Y.,  &  Barceló,  D.  (2014).  Application  of  Ultra-High  Pressure  Liquid Chromatography  Linear  Ion-Trap  Orbitrap  to  Qualitative  and  Quantitative Assessment of Pesticide Residues. Journal of Chromatography A , 1328 , 66–79.
Fasoula,  S.,  Nikitas,  P.,  &  Pappa-Louisi,  A.  (2017). Teaching  Simulation  and Computer-Aided Separation Optimization in Liquid Chromatography by Means of Illustrative Microsoft Excel spreadsheets . ACS Publications.
Harmoko,  Harmoko,  Kartasasmita,  Rahmana  Emran,  &  Tresnawati,  Astika.  (2015). QuEChERS  Method  for  the  Determination  of  Pesticide  Residues  in  Indonesian Green  Coffee  Beans  Using  Liquid  Chromatography  Tandem  Mass  Spectrometry. Journal of Mathematical and Fundamental Sciences , 47 (3), 296–308.
Kartasasmita, Rahmana E., Kurniawan, Fransiska, Amelia, Tasia, Dewi, Chandrini M., Harmoko, Harmoko, & Pratama, Yoga. (2020). Determination of Anthraquinone in Some Indonesian Black Tea and Its Predicted Risk Characterization. ACS Omega ,
5 (32), 20162–20169.
Kementrian kesehatan RI. (2018). Hasil utama riskesdas 2018 . 61.
Kmellár, Béla, Pareja, Lucía, Ferrer, Carmen, Fodor, Péter, & Fernández-Alba, Amadeo R.  (2011).  Study  of  The  Effects  of  Operational  Parameters  on  Multiresidue Pesticide Analysis by LC–MS/MS. Talanta , 84 (2), 262–273.
Lehotay,  S.  (2007).  AOAC  official  method  2007.01  Pesticide  Residues  in  Foods  by Acetonitrile  Extraction  and  Partitioning  with  Magnesium  Sulfate. Journal  of AOAC International , 90 (2), 485–520.
Mastovska, K., Zulkoski, J., Deal, E., Vaclavik, L., Koesukwiwat, U., Halbardier, J. F., Zweigenbaum,  J.,  &  Glauner,  T.  (2017). Improved  LC-MS/MS  pesticide  Residue Analysis  Using  Triggered  MRM  and  On-Line  Dilution. Application  Note  5991- 7193EN .
Nikitas,  Panagiotis,  &  Pappa-Louisi,  Adriani.  (2009).  Retention  Models  For  Isocratic and  Gradient  Elution  in  Reversed-Phase  Liquid  Chromatography. Journal  of Chromatography A , 1216 (10), 1737–1755.
Nilsson, Bernt, Borgqvist, Per, Axelsson, Anders, & Zacchi, Guido. (1999). Simulation of  Chromatographic  Processes  Using  MATLAB. Computers  &  Chemical Engineering , 23 , S715–S718.
Ouertani,  Randa,  El  Atrache,  Latifa  Latrous,  &  Hamida,  Néjib  Ben.  (2016). Chemometrically  Assisted Optimization and Validation  of Reversed Phase Liquid Chromatography  Method  for  The  Analysis  of  Carbamates  Pesticides. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems , 154 , 38–44.
Pappa-Louisi, Adriani, Agrafiotou, P., & Georgiadis, I. (2011). Separation Optimization in  Reversed-Phase  Liquid  Chromatography  by  Using  Alkanol  Additives  in  the Mobile Phase: Application to Amino Acids. Talanta , 85 (4), 2241–2245.
Rafferty, Jake L., Siepmann, J. Ilja, & Schure, Mark R. (2011). Mobile Phase Effects in Reversed-Phase Liquid Chromatography: A Comparison of Acetonitrile/Water and Methanol/Water  Solvents  as  Studied  by  Molecular  Simulation. Journal  of Chromatography A , 1218 (16), 2203–2213.
Zisi,  Chrysostomi,  Mangipa,  Athina  Maria,  Boutou,  Eleftheria,  &  Pappa-Louisi, Adriani. (2018). Separation Optimization of a Mixture of Ionized and Non-Ionized Solutes  Under  Isocratic  and  Gradient  Conditions  in  Reversed-Phase  HPLC  by Means of Microsoft Excel Spreadsheets. Separations , 5 (1), 19.