## ALCHEMY Journal of Chemistry

## Artikel Penelitian
Kopling Oksidatif Eugenol Menggunakan Ekstrak Enzim Peroksidase Akar Tanaman Sawi Hijau dan Uji Bioaktivitasnya
Bayu Ardiansah, Antonius Herry Cahyana*, Wahyudi Priyono Suwarso, Rianti Maryana, Siti Merly
Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia, Depok, Indonesia
INFO ARTIKEL

## ABSTRAK
Sejarah artikel: Revisi 15 Desember 2016 Diterima 30 Maret 2017 Tersedia online 09 Mei 2017 Peroxidase has been successfully extracted from root of mustard greens ( Brassica  juncea L.  Czern).  The  root  partially  purified  using  ammonium sulfate.  This  enzyme  was  applied  as  biocatalyst  to  coupling  reaction  of eugenol.  The  product  was  analyzed  optical  properties  and  antioxidant activity. Structure elucidation of product was conducted by FTIR, UV-vis, and  GC-MS.  Protein  content  and  specific  activities  of  peroxidase  were 0.747  mg/mL  and  0.244  U/mg,  respectively.  Peroxidase  was  applied  as biocatalyst  for  green  oxidative  coupling  reaction  of  eugenol  to  produce dimeric  form  of  eugenol,  an  orange  crystal  (84%  yields).  The  optical property of dimeric eugenol was Ra-configuration. Furthermore, biological activity of the product as antioxidant has been evaluated resulting in IC 50 values  of  32.14  and  42.43  ppm  for  dimeric  and  monomeric  eugenol, respectively.
Keywords: peroxidase, Brassica juncea , oxidative coupling, eugenol Enzim peroksidasi telah berhasil diekstraksi dari akar sawi hijau ( Brasicca juncea L. Czem).  Pemurnian enzim peroksidase dilakukan secara parsial menggunakan amonium sulfat. Enzim ini diaplikasikan sebagai biokatalis pada reaksi kopling eugenol. Produk yang dihasilkan dianalisis sifat optik dan  aktivitas  antioksidannya.  Elusidasi  struktur  produk  dilakukan menggunakan  instrumentasi  FTIR,  UV-Vis,  dan  GC-MS.  Kadar  protein dan  aktivitas  spesifik  peroksidase  masing-masing  0,747  mg/mL  dan 0,244  U/mg.  Enzim  peroksidase  diaplikasi  sebagai  biokatalis  reaksi kopling  oksidatif  senyawa  eugenol  untuk  membentuk  dimer  eugenol berupa kristal kuning (hasil 84%).  Aktivitas optik dimer eugenol memiliki konfigurasi Ra. Nilai IC 50 untuk dimer dan monomer eugenol adalah 32,24 dan 42,43 ppm, berturut-turut.
Kata Kunci: peroksidase, Brassica juncea , kopling oksidatif, eugenol
*Penulis korespondensi Email: herrykim@ui.ac.id

## 1. Pendahuluan
Eugenol  merupakan  senyawa  bahan  alam fenolik  yang  ditemukan  dalam  jumlah  besar  pada daun  dan  bunga  cengkeh  ( Syzygium  aromaticum ) (Sudarma  &  Ulfa,  2009).  Senyawa  tersebut  telah dilaporkan  memiliki  beberapa  aktivitas  biologi
seperti antijamur (Wang, Zhang, Chen, Fan, & Shi, 2010),  antibakteri  (Catherine,  Deepika,  &  Negi, 2012),  antioksidan  (Mahboub  &  Memmou,  2015; Nam & Kim, 2013) dan antikanker (Abdel-Hameed et  al.,  2014;  Yoo  et  al.,  2005).  Pada  dekade terakhir,  modifikasi  eugenol  dilakukan  dengan
tujuan  mensintesis  senyawa  turunan  eugenol dengan  struktur  molekul  baru  dan  aktivitas  biologi yang  semakin  beragam  (Hidalgo  et  al.,  2009; Mikhailovskii, Surikova, Limanskii, & Vakhrin, 2012; Sadeghian, Seyedi, Saberi, Arghiari, & Riazi, 2008). Salah  satu  tipe  reaksi  organik  untuk  memodifikasi senyawa fenolik seperti fenol, eugenol, isoeugenol, katekol, guaiakol dan timol adalah kopling oksidatif dengan  bantuan  katalis  kimia  (Barve  et  al.,  2015) maupun biokatalis (Cheng & Harper Jr, 2012).
Gambar 1 . Reaksi kopling oksidatif eugenol menggunakan peroksidase
Biokatalis  lebih  diminati  beberapa  peneliti untuk  transformasi  senyawa  organik  karena bersifat  ramah  lingkungan,  tersedia  dalam  jumlah memadai  di  alam  dan  memiliki  selektivitas  yang baik  (Luan  &  Chen,  2014;  Taboada-Puig  et  al., 2016).  Berkaitan  dengan  reaksi  kopling  oksidatif, enzim  peroksidase  adalah  salah  satu  biokatalis kelas  oksidoreduktase  yang  dapat  memfasilitasi penggabungan  molekul  fenolik  menjadi  bentuk dimer  maupun  polimer  (Onsa,  bin  Saari,  Selamat, & Bakar, 2004). Pada penelitian terdahulu, guaiakol dapat  mengalami  dimerisasi  yang  dikatalisis  oleh enzim  peroksidase  dari Brassica  oleracea var alboglabra (Anita, Widiyarti, & Abbas, 2014). Selain itu,  polimerisasi  fenolik  menjadi  3,14’-bihispidinil juga  pernah  dilakukan  (Lee  &  Yun,  2008). Berdasarkan  hal  tersebut,  pada  penelitian  ini bertujuan untuk mengaplikasikan enzim peroksidase dari akar tanaman sawi hijau ( Brassica juncea L.  Czern)  sebagai  biokatalis  pada  reaksi kopling oksidatif eugenol dengan bantuan hidrogen peroksida. Selain itu, akan dipelajari pula sifat optik dan aktivitas antioksidannya.

## 2. Bahan dan metode

## 2.1. Bahan
Bahan utama adalah akar sawi hijau ( Brassica juncea L.  Czern)  dari  perkebunan  Bulevar  Hijau, Bekasi.  Bahan  lain  yang  digunakan  meliputi  4- aminoantipirin  (Sigma-Aldrich),  amonium  sulfat, bovine  serum  albumin  (Sigma-Aldrich),  eugenol (Merck),  DPPH  (difenilpikrilhidrazil)  (Sigma- Aldrich),  fenol  (Merck),  hidrogen  peroksida  30% (Merck) dan pereaksi Folin (Sigma-Aldrich).
2.2. Isolasi dan pemurnian parsial peroksidase
Sebanyak  350  g  potongan  akar  sawi  hijau ditambahkan larutan bufer K-fosfat pH 7 kemudian diblender  dalam  keadaan  dingin  (0-5°C).  Setelah itu,  homogenat  disaring  dengan  kain  katun  dan filtrat  disentrifugasi  dengan  kecepatan  1100  rpm selama 20 menit. Supernatan ekstrak enzim kasar dipisahkan dari residu padat.
Pemurnian  ekstrak  kasar  dilakukan  secara fraksinasi  (fraksi  I  –  III)  menggunakan  amonium sulfat  dengan  tingkat  kejenuhan  0-30%,  30-50% dan  50-70%  (b/v).  Penambahan  garam  dilakukan secara  sedikit  demi  sedikit  dalam  keadaan  dingin (0-5°C)  di  atas  pengaduk  magnet  selama  2  jam. Larutan  didiamkan  selama  satu  malam  dan endapan  yang  terbentuk  (ekstrak  enzim  fraksi  I) dipisahkan  dan  dilakukan  pemurnian  dengan konsentrasi  amonium  sulfat  yang  lebih  pekat. Ekstrak  kasar  enzim  yang  digunakan  sebagai katalis  pada  penelitian  ini  adalah  ekstrak  kasar peroksidase  fraksi  III,  yaitu  hasil  pemurnian menggunakan amonium sulfat 50-70% (b/v).
Penentuan  kadar  protein  enzim  dilakukan menggunakan  metode  Lowry  (Redmile-Gordon, Armenise,  White,  Hirsch,  &  Goulding,  2013). Aktivitas spesifik peroksidase diukur menggunakan pereaksi  4-aminoantipirin  dan  serapan  diamati pada  510  nm menggunakan spektrofotometer UV- Vis.
Sebanyak 1,4 mL larutan 4- aminoantipirin/fenol  dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi  yang  berisi  1,5  mL  hidrogen  peroksida 0,0017  M  dan  dikocok.  Campuran  tersebut ditambahkan  0,1  mL  ekstrak  enzim  kasar  dan dibiarkan bereaksi selama 1 menit. Reaksi tersebut dihentikan  dengan  cara  memanaskan  tabung reaksi  pada  100°C  selama  3  menit.  Aktivitas enzimatik dinyatakan sebagai unit aktivitas (U/mg), dimana U/mg adalah serapan pada 510 nm dibagi dengan (6,58 x kadar protein, mg/mL).

## 2.3. Reaksi kopling oksidatif eugenol
Ekstrak  kasar  enzim  peroksidase  sebanyak  4 mL  dimasukkan  dalam  gelas  kimia,  kemudian ditambah  1  mL  eugenol  dan  1,67  mL  hidrogen peroksida 30%. Campuran diaduk selama 30 menit pada  suhu  0-5°C.  Produk  berwarna  diekstraksi menggunakan  etil  asetat.  Setelah  penguapan, padatan  yang  terbentuk  dimurnikan  dengan  teknik kromatografi  kolom  dengan  pelarut  n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 9:1, 8:2 dan 7:3.

## 2.4. Penentuan sudut rotasi optik
Sebanyak  5  mg  produk  dimerisasi  dilarutkan dengan  etil  asetat  pada  labu  ukur  25  mL  dan diencerkan  sampai  tanda  batas.  Selanjutnya larutan  dimasukkan  ke  kuvet  polarimeter  2  dm yang  telah  dilengkapi  lampu  natrium.  Rotasi  optik dibaca sebagai sudut yang memutar ke kanan atau ke kiri dari bidang normal.

## 2.5. Uji aktivitas antioksidan
Aktivitas  antioksidan  diukur  menggunakan metode penangkapan radikal bebas DPPH dengan modifikasi (Bandgar, Gawande, Bodade, Gawande, & Khobragade, 2009). Sebanyak 1 mL DPPH 0,001 M ditambah dengan 1 mL sampel dengan berbagai variasi  konsentrasi  (25,  50  dan  100  ppm), kemudian  diencerkan  dengan  metanol  hingga volume total menjadi 5 mL. Serapan/absorbansi (A) larutan uji diukur pada 517 nm dan dicatat hasilnya setiap  5  menit  selama  35  menit.  Larutan  kontrol digunakan DPPH dalam metanol tanpa penambahan  sampel.  Aktivitas  antioksidan  dalam bentuk persen inhibisi diukur dengan Persamaan 1.
Inhi isi ( ) kontrol -   sampel kontrol 100 (1)

## 3. Hasil dan pembahasan
3.1. Isolasi dan penentuan aktivitas peroksidase
Proses  isolasi  enzim  peroksidase  dilakukan pada  suhu  rendah  dan  pada  pH  7 yang  bertujuan untuk  mencegah  terjadinya  degradasi  proteolitik yang  disebabkan  oleh  enzim-enzim  protease. Proses  pemisahan  sel  debris  dilakukan penyaringan  dan  sentrifugasi.  Supernatan  hasil sentrifugasi disebut ekstrak kasar (EK).
Peroksidase  merupakan  suatu  protein  enzim yang  mempunyai  variasi  kelarutan  yang dipengaruhi  oleh  konsentrasi  garam.  Karakter  ini melibatkan  interaksi  spesifik  antara  muatan  rantai
samping  dan  ion-ion  dalam  larutan.  Penambahan amonium  sulfat  terhadap  ekstrak  kasar  (EK) menyebabkan  adanya  proses salting  out ,  yaitu berkurangnya  kelarutan  suatu  protein  karena penambahan  suatu  zat  (garam).  Protein  enzim yang  mengalami  proses salting  out akan mengendap  tetapi  strukturnya  tidak  terdenaturasi. Hal ini yang menjadi dasar pemurnian peroksidase menggunakan  metode  penambahan  amonium sulfat  dengan  berbagai  tingkat  konsentrasi  larutan garam.
Fraksinasi dilakukan untuk memisahkan enzim peroksidase  dari  ekstrak  kasar  (EK)  dengan  cara pengendapan  berdasarkan  bobot  molekulnya. Protein  dengan  bobot  molekul  yang  lebih  besar akan  mengendap  terlebih  dahulu,  diikuti  protein dengan  bobot  molekul  yang  lebih  ringan.  Proses fraksinasi dilakukan selama 2 jam pada suhu 4°C dengan penambahan garam amonium sulfat sesuai persentase  kejenuhan  sedikit  demi  sedikit. Endapan  yang  diperoleh  dari  hasil  fraksinasi  ke-3 (pemurnian  dengan  amonium  sulfat  50-70%) kemudian  disuspensikan  kembali  dalam  larutan bufer  K-fosfat  pH  7  sampai  larut.  Ekstrak  enzim peroksidase  fraksi  ini  disebut  peroksidase  EK-III dan digunakan untuk tahap selanjutnya.
Aktivitas enzim diukur dengan 4-aminoantipirin dengan  fenol  sebagai  substrat  dan  hidrogen peroksida  sebagai  penerima  elektron  (Metelitza, Karasyova, Grintsevich, & Thorneley, 2004).  Pada tahap  inisiasi,  enzim  peroksidase  dalam  bentuk tereduksi  akan  memberikan  elektron  kepada hidrogen  peroksida.  Hal  ini  mengakibatkan penguraian  hidrogen  peroksida  menjadi  air  dan oksigen. Di sisi lain, peroksidase berubah menjadi enzim  peroksidase  dalam  bentuk  yang  teroksidasi (Gambar  2,  Persamaan  2).  Enzim  peroksidase dalam bentuk teroksidasi akan mengoksidasi fenol dan 4-aminoantipirin (substrat) sehingga menghasilkan  bentuk  radikalnya,  sedangkan peroksidase  menjadi  bentuk  teroksidasi  lainnya yang  ditunjukkan  pada  Persamaan  3  dan  3’ (Gambar  2).  Pada  tahap  terminasi,  radikal  fenol dan  4-aminoantipirin  akan  bergabung  membentuk senyawa adduct kuinonimina yang berwarna merah darah  (Gam ar  2,  Persamaan  5’’).  Peru ahan intensitas  warna  larutan  diukur  dengan  UV-Vis pada  510  nm  dan  dihasilkan  serapan  1,2. Berdasarkan  hasil  pengukuran  kadar  protein didapatkan  bahwa  ekstrak  peroksidase  EK-III mengandung  0,747  mg/mL  sehingga  didapatkan aktivitas spesifik peroksidase sebesar 0,244 U/mg.
Gambar 2 . Reaksi-reaksi yang terlibat pada penentuan aktivitas peroksidase

## 3.2. Reaksi kopling oksidatif eugenol
Penambahan  peroksidase  pada  campuran eugenol  dan  hidrogen  peroksida  menyebabkan terjadinya  proses dimerisasi yang ditandai dengan pembentukan  larutan  berwarna  kuning  pekat. Setelah  dimurnikan  menggunakan  kromatografi kolom dengan meningkatkan kepolaran fasa gerak secara  bertahap  kemudian  diuapkan,  didapatkan kristal  berwarna  kuning  dengan  titik  leleh  105- 106°C. Analisis dengan FTIR menunjukkan adanya vibrasi  gugus  OH  pada  3448  cm -1 .  Serapan  pada 3051  dan  2990  cm -1 menandakan  bahwa  pada senyawa  terdapat  C-H  sp 2 aromatik  dan  dan  C-H sp 3 dari  gugus  metoksi.  Puncak  yang  tajam  di daerah  sekitar  1540  cm -1 mengindikasikan  vibrasi dari cincin aromatik.
Konfirmasi  keberhasilan  reaksi  dimerisasi (kopling  oksidatif)  eugenol  dilakukan  dengan menggunakan  GC-MS.  Berdasarkan  kromatogram GC dihasilkan puncak tertinggi pada waktu retensi 16,15 menit dengan luas area 83,64% (Gambar 3). Setelah  dilakukan  pengukuran  MS,  muncul fragmen  utama  dengan  [M + ]  sebesar  326  g/mol. Nilai ini merupakan hasil penggabungan 2 molekul eugenol  (berat  molekul  eugenol  164  g/mol)  yang terjadi  melalui  C-C  dimerisasi  dengan  mekanisme radikal bebas.
Konsekuensi  dari  dimerisasi  molekul  eugenol akan  menambah  jumlah  ikatan  rangkap  yang terkonjugasi  dalam  senyawa  produk.  Sesuai dengan  teori  orbital  molekul,  semakin  banyak ikatan  rangkap  akan  memperkecil  perbedaan energi  orbital  HOMO  dan  LUMO  sehingga  transisi elektronik  dapat  diamati  pada  panjang  gelombang yang  lebih  besar.  Hal  ini  dikonfirmasi  dari
pengukuran  panjang  gelombang  maksimum  untuk eugenol  dan  dimer  eugenol.  Monomer  eugenol memberikan  serapan  maksimum  pada  302  nm sedangkan bentuk dimernya pada 312 nm.
Produk reaksi diukur dengan polarimeter yang bertujuan  mempolarisasi  cahaya  dan  mengukur sudut rotasi optik spesifik bidang polarisasi cahaya oleh  suatu  senyawa  optik  aktif.  Dimer  eugenol termasuk  kelompok  turunan  senyawa  bifenil  yang mempunyai  sifat  kiralitas  yang  disebabkan  oleh sumbu  ( chiral  axis ).  Pada  sampel  kristal  (0,0002 g/mL)  yang  diukur  mempunyai  α  pengukuran sebesar  +0,1.  Polarimeter  yang  digunakan mempunyai  panjang  tabung  20  cm  sehingga besarnya  sudut  rotasi  spesifik  dimer  eugenol terhitung sebesar +25°. Berdasarkan data tersebut dapat  disimpulkan  bahwa  molekul  produk  reaksi memutar bidang polarisasi ke kanan (Ra) (Gambar 4).

## 3.3. Uji aktivitas antioksidan
Senyawa fenolik merupakan salah satu sumber antioksidan  yang  menghambat  reaksi  radikal dengan  cara  bereaksi  dengan  radikal  bebas tersebut,  memberikan  hidrogen,  dan  membentuk radikal  bebas  fenolik  yang  terstabilkan  oleh resonansi.  Eugenol  dan  dimer  eugenol  termasuk senyawa  fenolik  yang  berpotensi  mendonorkan atom  hidrogen  untuk  menetralkan  radikal  bebas. Metode  yang  dipakai  pada  penentuan  aktivitas antioksidan  adalah  metode  penangkapan  radikal DPPH (difenil pikrilhidrazil).

## Gambar 3 . Kromatogram GC-MS pada analisis dimer eugenol
Gambar 4 . Ilustrasi konfigurasi Ra dimer eugenol
Senyawa  DPPH  adalah  senyawa  radikal  yang memberikan  warna  ungu  dengan  serapan maksimum  pada  517  nm.  Senyawa  yang  dapat mendonorkan  atom  hidrogen  seperti  fenolik  akan bereaksi untuk menetralkan senyawa model DPPH radikal yang menyebabkan berkurangnya intensitas warna ungu DPPH dan berangsur berubah menjadi kuning.  Pengurangan  intensitas  warna  ungu menjadi  dasar  pengukuran  aktivitas  antioksidan secara  kuantitatif  senyawa  eugenol  dan  dimer eugenol pada penelitian ini.
Gambar 5 . Profil absorbansi (pada 517 nm) akibat penambahan  sampel  (A)  eugenol  dan (B) dimer eugenol dengan (larutan kontrol), (25  ppm), (50  ppm) dan (100 ppm)
0 10 20 30 0 0.5 1 1.5 A A b so rb a n si Waktu (menit) 0 10 20 30 0 0.5 1 1.5 B Waktu (menit) A b so rb a n si
Aktivitas  antioksidan  eugenol  dan  dimer eugenol ditampilkan pada Gambar 5. Berdasarkan gambar  tersebut  dapat  dilihat  bahwa  kedua senyawa  tersebut  bersifat  antioksidan.  Hal  ini ditunjukkan  dengan  adanya  pengurangan  nilai serapan  DPPH  yang  mengindikasikan  bahwa senyawa  dapat  menetralkan  radikal.  Semakin besar konsentrasi sampel yang ditambahkan maka akan  menyebabkan  penangkapan  (netralisasi) radikal bebas yang semakin besar pula.
Kemampuan  inhibisi  (IC 50 )  dimer  pada  35 menit  sebesar  32,14  ppm,  sedangkan  eugenol mempunyai  nilai  inhibisi  sebesar  42,43  ppm.  Hal tersebut  menunjukkan  bahwa  dimer  eugenol  lebih aktif sebagai zat antioksidan dibandingkan dengan eugenol.  Aktivitas  dimer  eugenol  yang  lebih  baik dimungkinkan  karena  dalam  struktur  molekulnya mengandung  dua  atom  hidrogen  fenolik  sehingga secara kualitatif akan mendonorkan atom hidrogen lebih  banyak  dibandingkan  eugenol  dalam menetralkan radikal bebas .
4. Kesimpulan
Enzim  peroksidase  dari  akar  sawi  hijau memiliki  kandungan  protein 0, 747  mg/mL  dan aktivitas  spesifik    0,244  U/mg.  Enzim  ini  diaplikasikan pada  reaksi  kopling  eugenol  sebagai  dan  dihasilkan produk  dimer  eugenol.  Dimer  eugenol  memiliki  sifat optik berupa konformasi Ra. Aktivitas antioksidan dimer eugenol dan monomer eugenol masing-masing memiliki nIlai IC 50 sebesar 32,24 dan 42,43 ppm. Ekstrak  kasar  enzim  peroksidase  dapat dimanfaatkan  sebagai  biokatalis  murah  pada transformasi  oksidatif  eugenol  menjadi  eugenol yang dilangsungkan dalam pelarut air. Reaksi yang ramah  lingkungan  dengan  dikatalisis  peroksidase sangat  menjanjikan  untuk  transformasi  organik  di masa  depan  dalam  rangka  mensintesis  struktur senyawa baru yang aktif secara biologi.

## Ucapan terima kasih
Terima kasih diucapkan kepada DRPM Universitas Indonesia atas proyek penelitian PITTA 2016.

## Daftar pustaka
Abdel-Hameed, E.-S. S., Bazaid, S. A., Al-Zahrani, O., El-Halmouch, Y., El-Sayed, M. M., & El- Wakil,  E.  (2014).  Chemical  composition  of volatile  components,  antimicrobial  and anticancer activity of n-hexane extract and essential oil from Trachyspermum ammi L.
seeds. Oriental Journal of Chemistry , 30 (4),
1653–1662.
Anita,  Y.,  Widiyarti,  G.,  &  Abbas,  J.  (2014). Synthesis  and  elucidation  structure  of  O- para dehydroguaiacol prepared by crude of Brassica oleracea var alboglabra peroxdase-catalyzed  oxidation. Journal  of Applied Pharmaceutical Science , 4 (4), 62– 65.
Bandgar,  B.  P.,  Gawande,  S.  S.,  Bodade,  R.  G.,
Gawande,  N.  M.,  &  Khobragade,  C.  N. (2009). Synthesis and biological evaluation of a novel series of pyrazole chalcones as anti-inflammatory  ,  antioxidant  and antimicrobial  agents. Bioorganic  & Medicinal  Chemistry , 17 (24),  8168–8173. http://doi.org/10.1016/j.bmc.2009.10.035. Barve, B. D., Wu, Y.-C., El-Shazly, M., Korinek, M.,
Cheng,  Y.-B.,  Wang,  J.J.,  &  Chang,  F.-R. (2015).  Copper-catalyzed  selective  C-O ond formation  y o idative α-C(sp3)-H/O- H  coupling  between  ethers  and salicylaldehydes. Tetrahedron , 71 (15), 2290–2297.
Catherine, A. A., Deepika, H., & Negi, P. S. (2012).
Antibacterial  activity  of  eugenol  and peppermint  oil  in  model  food  systems. Journal  of  Essential  Oil  Research , 24 (5),
481–486.
Cheng,  W.,  &  Harper  Jr,  W.  F.  (2012).  Chemical kinetics  and  interactions  involved  in horseradish peroxidase-mediated oxidative polymerization  of  phenolic  compounds. Enzyme  and  Microbial  Technology , 50 (3), 204–208.
Hidalgo,  M.  E.,  De  la  Rossa,  C.,  Carrasco,  H.,
Cardona, W., Gallardo, C., & Espinoza, L. (2009).  Antioxidant  capacity  of  eugenol derivatives. Quimica  Nova , 32 (6),  1467– 1470.
Lee,  I.  K.,  &  Yun,  B.  S.  (2008).  Peroxidase- mediated  formation  of  the  fungal polyphenol  3,14’-bihispidinyl. Journal  of Microbiology  and  Biotechnology , 18 (1),
107–109.
Luan,  J.,  &  Chen,  M.  (2014).  Preliminary biodegradation  of  cygon  with  lignin peroxidase  as  biocatalyst  and  further removal  of  cygon  with  carbon  nanotube- Gd2YbSbO7  as  nanocatalyst. Journal  of Biotechnology , 185 (Supplement), S104.
Mahboub,  R.,  &  Memmou,  F.  (2015).  Antioxidant activity and kinetics studies of eugenol and 6-bromoeugenol. Natural Products
Research , 29 (10), 966–971.
Metelitza, D. I., Karasyova, E. I., Grintsevich, E. E.,
&  Thorneley,  R.  N.  F.  (2004).  Peroxidase- catalyzed  co-o idation  of  3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine  in  the  presence  of substituted phenols and their polydisulfides. Journal of Inorganic Biochemistry , 98 , 1–9. Mikhailovskii, A. G., Surikova, O. V., Limanskii, E.
S.,  &  Vakhrin,  M.  I.  (2012).  Synthesis  of isoquinoline  alkaloid  derivatives  from eugenol. Chemistry  Natural  Compounds ,
48 (2), 285–287.
Nam,  H.,  &  Kim,  M.-M.  (2013).  Eugenol  with antioxidant  activity  inhibits  MMP-9  related to metastasis in human fibrosarcoma cells. Food  and  Chemical  Toxicology , 55 ,  106– 112.
Onsa, G. H., bin Saari, N., Selamat, J., & Bakar, J.
(2004). Purification and characterization of membrane-bound peroxidases from Metroxylon  sagu. Food  Chemistry , 85 (3), 365–376. Redmile-Gordon, M. A., Armenise, E., White, R. P.,
Hirsch, P. R., & Goulding, K. W. T. (2013). A  comparison  of  two  colorimetric  assays, based  upon  Lowry  and  Bradford techniques, to estimate total protein in soil extracts. Soil Biology and Biochemistry , 67 ,
166–173.
Sadeghian,  H.,  Seyedi,  S.  M.,  Saberi,  M.  R., Arghiari, Z., & Riazi, M. (2008). Design and synthesis  of  eugenol  derivatives  as  potent 15-lipoxygenase  inhibitors. Bioorganic  & Medicinal Chemistry , 16 (2), 890–901.
Sudarma, I. M., & Ulfa, M. (2009). Synthesis of 4- allyl-2-methoxy-6-aminophenol from natural  eugenol. Indonesian  Journal  of Chemistry , 9 (1), 84–88.
Taboada-Puig, R., Eibes, G., Lloret, L., Lu-Chau, T. A., Feijoo, G., Moreira, M. T., & Lema, J. M. (2016).  Fostering  the  action  of  versatile peroxidase  as  highly  efficient  biocatalyst for  the  removal  of  endocrine  disrupting compounds. New  Biotechnology , 33 (1), 187–195. Wang, C., Zhang, J., Chen, H., Fan, Y., & Shi, Z.
(2010).  Antifungal  activity  of  eugenol against  Botrytis  cinerea. Tropical  Plant Pathology , 35 (3), 137–143. Yoo, C.-B., Han, K.-T., Cho, K.-S., Ha, J., Park, H.- J.,  Nam,  J.-H.,  …  Lee,  K.-T.  (2005). Eugenol  isolated  from  the  essential  oil  of Eugenia  caryophyllata  induces  a  reactive oxygen species-mediated apoptosis in HL- 60  human  promyelocytic  leukemia  cells. Cancer Letters , 225 (1), 41–52.