Pengaruh  Volume Substrat Terhadap Kerja Enzim Katalase Menggunakan Respirometer Ganong Sebagai Rekonstruksi Desain Kegiatan Praktikum Siswa
Dita Amalia 1 , Nisrina Nur Rahmi 2 , Nor Hidayati 3 , Rina Oktaviana 4 , Zevira Fransisca Aurora 5 , Bambang Supriatno 6 , Sri Anggraeni 7
(1,2,3,4,5,6,7) Universitas Pendidikan Indonesia, Jalan Dr. Setiabudi No.229, Bandung, 40154
ditaamaliao1@gmail.com (1), nisrinanurrahmi1223@gmail.com (2), norhidayatinr@gmail.com (3), rinaoktaviana043@gmail.com (4), virafransisca@gmail.com (5) bambangs@upi.edu (6) anggraeni_said@yahoo.co.id (7)

## ABSTRAK
Praktikum  menguji  enzim  katalase  di  sekolah  menggunakan  tabung  reaksi  masih  bersifat  kualitatif  dalam mengukur tekanan dari reaksi yang dihasilkan substrat dan enzim menghasilkan gelembung. Oleh karena itu, penelitian ini menggunakan respirometer ganong untuk melihat pengukuran bersifat kuantitatif pada tekanan oksigen  yang  dihasilkan  dan  lamanya  nyala  bara  api.  Penelitian  ini  merupakan  penelitian  deskriptif kuantitatif dengan melakukan praktikum enzim menggunakan respirometer ganong serta melakukan analisis sesuai dengan indikator Novak Gowin yang terdiri atas tiga komponen yaitu: 1) relevansi, 2) kompetensi, dan 3) konstruksi. Berdasarkan hasil yang didapatkan terdapat adanya perubahan terhadap jumlah substrat dengan tekanan  oksigen  yang  dihasilkan  dan  lamanya  bara  api  yang  menyala.  Pada  perbedaan  jumlah  substrat membuktikan  bahwa  salah  satu  faktor  yang  mempengaruhi  kinerja  reaksi  enzim  katalase  adalah  jumlah substrat.  Substrat  pada  reaksi  enzim  memiliki  senyawa  hidrogen  peroksida  ( )  yang  bersifat  racun. Banyak  dan  sedikitnya  senyawa  hidrogen  pada  penelitian  ini  sangat  mempengaruhi  kinerja  enzim  katalase. Terjadinya  reaksi  antara dan  katalase  dapat  diuraikan  menjadi  air  dan  oksigen  yang  tidak  berbahaya dengan ditandai timbunya gelembung dan nyala bara api apabila dibakar .
Kata Kunci : Substrat, Respirometer Ganong, Enzim Katalase, Praktikum

## ABSTRACT
The  practicum  of  testing  the  catalase  enzyme  at  school  using  test  tubes  is  still  qualitative  in  measuring  the pressure of the reaction produced by the substrate and the enzyme producing bubbles. Therefore, this study used a ganong respirometer to see quantitative measurements of the oxygen pressure produced and the length of  the  flame.  This  research  is  a  quantitative  descriptive  study  by  conducting  enzyme  practicum  using  a ganong  respirometer  and  analyzing  according  to  the  Novak  Gowin  indicator  which  consists  of  three components, namely: 1) relevance, 2) competence, and 3) construction. Based on the results obtained, there is a change  in the amount of substrate with the resulting oxygen pressure and the length of the burning coals. The difference  in the  number of substrates proves that one of the  factors that affect the performance of the catalase enzyme reaction is the number of substrates. The substrate in the enzyme reaction contains hydrogen peroxide ( ) which is toxic. The amount and lack of hydrogen compounds in this study greatly affected the performance of the  catalase enzyme. The reaction  between
and catalase can  be  broken down  into harmless water and oxygen by marked bubbling and burning coals when burned.
Keywords : Substrate, Ganong Respirometer, Enzyme Catalase, Practicum
Amalia Dita, Nur Rahmi N, Hidayati N, Oktaviana R, Fransisca Aurora Z, Supriatno B, Anggraeni S  :  Pengaruh  Volume  Substrat  Terhadap  Kerja  Enzim  Katalase  Menggunakan  Respirometer Ganong Sebagai Rekonstruksi Desain Kegiatan Praktikum Siswa

## I. PENDAHULUAN

## 1. Latar Belakang
Penggunaan tabung reaksi dinilai masih bersifat kualitatif karena pengukuran hasil reaksi berupa  tekanan  akibat  adanya  oksigen  yang  dilihat  dari  timbulnya  gelembung  dirasakan dengan  menggunakan  tangan  bersifat  kualitatif.  Hal  ini  dapat  mempengaruhi  unsur subjektif  bagi  peneliti  yang  melakukan  percobaan  tersebut.  Oleh  karena  itu,  melakukan suatu  penelitian  seharusnya  memiliki  hasil  percobaan  yang  bersifat  objektif  dan  dapat diperhitungkan  (kuantitatif).  Penggunaan  alat  respirometer  ganong  memiliki  skala pengukuran  yang  dinilai  secara  kuantitatif  untuk  melihat  tekanan  yang  dihasilkan  dari timbulnya gelembung hasil reaksi enzim katalase dengan substrat yakni senyawa hidrogen peroksida  ( .  Enzim  merupakan  protein  yang  berperan  sebagai  katalis  dalam metabolisme makhluk hidup. Enzim berperan untuk mempercepat reaksi kimia yang terjadi di dalam tubuh makhluk hidup, tetapi enzim itu sendiri tidak ikut bereaksi. Oleh sebab itu, enzim  disebut  sebagai  salah  satu  katalisator  alami  (Agrios,  1997).  Enzim  atau biokatalisator adalah  katalisator organik yang dihasilkan oleh  sel. Enzim sangat penting dalam kehidupan,  karena semua reaksi metabolisme dikatalis  oleh enzim. Jika tidak ada enzim,  atau    aktivitas  enzim  terganggu  maka  reaksi    metabolisme  sel  akan  terhambat hingga  pertumbuhan sel juga terganggu  (Valko, 2007). Enzim katalase adalah salah satu jenis  enzim  yang  umum  ditemui  di  dalam  sel  –  sel  makhluk  hidup.  Enzim  katalase berfungsi  untuk  merombak  Hidrogen  Peroksida  (H 2 O 2 )  yang  bersifat  racun  yang merupakan  sisa/hasil  sampingan  dari  proses  metabolisme.    Apabila  H 2 O 2 tidak  diuraikan dengan enzim ini, maka akan menyebabkan kematian pada sel – sel. Oleh sebab itu, enzim katalase  untuk  merombak  H 2 O 2 menjadi substansi  yang  tidak  berbahaya,  yaitu  berupa  air dan  oksigen.  Selain  bekerja  secara  spesifik  pada  substrat  tertentu.  Enzim  juga  bersifat termolabil  (rentan  terhadap  perubahan  suhu)  serta  merupakan  suatu  senyawa  golongan protein  (Valko,  2007).  Melalui  berbagai  reaksi    metabolisme,  oksigen  dapat  diubah menjadi  bentuk  molekul  yang  sangat  reaktif    seperti  singlet  oksigen  (O 2 ),  hidrogen peroksida  (H 2 O 2 ),  superoksida  (O 2 )  dan  radikal    hidroksil  (OH).  Superoksida  dapat berubah    bentuk  menjadi  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 ),    radikal  ini  dapat  menyebabkan kerusakan  melalui beberapa cara yaitu memutus ikatan rantai protein, merusak membran lemak dan  bereaksi dengan DNA sehingga menyebabkan mutasi sel (Untari, 2014). Cara kerja  yang  dilakukan  enzim  yaitu  molekul  selalu  bergerak  dan  saling  bertumbukan  satu sama lainnya. Jika ada molekul substrat menumbuk molekul enzim yang tepat maka akan menempel pada enzim. Tempat menempelnya molekul substrat tersebut disebut dengan sisi aktif.  Kemudian  terjadi  reaksi  dan  terbentuk  molekul  produk.  Enzim  katalase  bekerja secara  optimal  pada  suhu  kamar  (±30  C)  dan  suasana  netral.  Hal  ini  dapat  dilihat  pada suasana  asam,  basa,  dan  suhu  tinggi,  laju  reaksi  menjadi  sangat  lambat.  Bahkan  terhenti sama sekali. Indikasinya adalah sedikitnya gelembung  yang dihasilkan dan bara api tidak menyala. Sedangkan pada suhu normal dan pH netral, reaksi berjalan dengan lancar  (West and  Tood,  1961).  Banyak  faktor  yang  mempengaruhi  kerja enzim  katalase,  salah satunya adalah substrat. Jumlah substrat atau  senyawa Hidrogen Peroksida (H 2 O 2 ) memiliki peran dalam  aktivasi  kerja  enzim  katalase.  Reaksi  enzim  katalase  dengan  senyawa  Hidrogen Peroksida  (H 2 O 2 )  dapat  diuraikan  menjadi  air  (H 2 O)  dan  oksigen  (O 2 )  yang  tidak berbahaya  ditandai  dengan  timbulnya  gelembung.  Ada  tidaknya  gelembung  merupakan indikator adanya air dalam wujud uap. Sedangkan menyala atau tidaknya bara merupakan indikator  adanya  gas  oksigen  dalam  tabung  tersebut.  Pada  uji  katalase  dapat  dinyatakan positif  apabila  sumber  katalase  yang  di  tetesi  dengan    H 2 O 2 maka  akan  menimbulkan gelembung.  Sumber  katalase  yang  tidak    mengasilkan  gelembung  dapat  dinyatakan sebagai  katalase  negatif  (Cappucino  dan  Sherman,  2001).  Terjadinya  reaksi  antara  H 2 O 2
Amalia Dita, Nur Rahmi N, Hidayati N, Oktaviana R, Fransisca Aurora Z, Supriatno B, Anggraeni S  :  Pengaruh  Volume  Substrat  Terhadap  Kerja  Enzim  Katalase  Menggunakan  Respirometer Ganong Sebagai Rekonstruksi Desain Kegiatan Praktikum Siswa
dibantu  enzim  katalase  menjadi  oksigen  dan  air  ditandai  dengan  adanya  gelembung  dan menyala  apabila  dibakar.  Ada  tidaknya  gelembung  sebagai  indikasi  adanya  air  dalam wujud  uap.  Sedangkan  menyala  atau  tidaknya  bara  merupakan  indikator  adanya  gas oksigen dalam tabung tersebut. Keterlibatan H 2 O 2 pada reaksi enzim menggunakan jumlah yang  berbeda  yakni  0  ml;  0,5  ml;  1  ml;  1,5  ml;  2  ml;  2,5  ml;  3  ml;  3,5  ml;  dan  4  ml. Tekanan  oksigen  yang  dihasilkan  dari  reaksi  enzim  katalase  dapat  diukur  menggunkan tabung  ganong,  pada  ganong  menerapkan  prinisp  manometer.  Manometer  adalah  sebuah alat  yang  digunakan  untuk  mengukur  tekanan  udara  melalui  perubahan  tekanan  fluida diamana  prinsip  kerja  alat  ini  adalah  dengan  memanfaatkan  tekanaan  fluida  tntuk mengukur  tekakan  udara  (Janice  Vancleave,  2004).  Persamaan  yang  menghubungkan tekanan  dengan  kedalaman  fluida:  Po  =  Pa  +  selisih  tinggi.  Po  adalah  tekanan  di permukaan,  dan  Pa  adalah  tekanan  luar  (76  cmHg).  Ganong  adalah  alat  yang  dapat digunakan  untuk  menentukan  angka  secara  kuantitatif  dalam  suatu  peristiwa.  Bagian- bagian  alat  yang  penting  ialah:  tabung  berturup  yang  volumnya  kurang  lebih  100  ml, bagian  yang  menggembung  sampai  pada  lehernya  bervolume  75  ml  +  2  ml  merupakan lekukan  kecil.  Pada  tutup  terdapat  lubang  kecil  untuk  menghubungkan  atau  memutuskan hubungan udara dalam tabung dan udara luar. Pipa bagian bawah berskala mulai dari 75 ml hingga  100  ml;  di  bawah  skala  100  ml  masih  tersedia  ruang  kurang  lebih  10  ml,  dan dihubungkan  dengan  pipa  karet  dengan  pipa  kaca  yang  berujung  terbuka.  Pipa  ini  dapat dinaik-turunkan pada waktu menyamakan permukaan zat cair pada kedua pipa. Penelitian ini menguji jumlah substrat yang berbeda dapat mempengaruhi kerja enzim yang hasilnya berupa tekanan oksigen dan dapat diukur secara kuantitatif menggunakan alat respirometer ganong.  Penggunaan  alat  respirometer  ganong  pada  kegiatan  praktikum  merupakan  suatu inovasi  yang belum dilakukan di penelitian sebelumnya  yakni dengan mengkuantitatifkan tekanan  dan  hal  ini  dapat  sejalan  dengan  hakekat  penelitian  yang  membuat  siswa  dapat berpikir secara objektif, karena penilaian subjektif dalam melakukan suatu penelitian dapat menghasilkan ketidakakuratan data sehingga data tidak dapat dipertanggungjawabkan .

## 2. Perumusan Masalah
Perumusan  masalah  pada  penelitian  ini  adalah  bagaimana  pengaruh  volume  substrat terhadap  kerja  enzim  menggunakan  respirometer  ganong  sebagai  rekonstruksi  kegiatan praktikum siswa?.

## 3. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh volume substrat terhadap kerja enzim dan merekonstruksi kegiatan praktikum siswa menggunakan respirometer ganong.

## 4. Manfaat Penelitian
Penelitian  ini  dapat  bermafaat  untuk  rujukan  bagi  guru  dan  sekolah  dalam  menrancang kegiatan praktikum yang bersifat kuantitatif

## II. METODE Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fisiologi, Universitas Pendidikan Indonesia. Pada tanggal 29 Maret 2022.

## Rancangan Penelitian atau Model
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  deskriptif  kuantitatif  dengan  melakukan  pengujian pengaruh  jumlah  substrat  terhadap  kerja  enzim  katalase  pada  materi  biologi  mengenai enzim dan metabolisme.
Amalia Dita, Nur Rahmi N, Hidayati N, Oktaviana R, Fransisca Aurora Z, Supriatno B, Anggraeni S  :  Pengaruh  Volume  Substrat  Terhadap  Kerja  Enzim  Katalase  Menggunakan  Respirometer Ganong Sebagai Rekonstruksi Desain Kegiatan Praktikum Siswa

## Bahan dan Peralatan
Alat  yang  dibutuhkan  dalam  penelitian  adalah  ganong,  gelas  ukur  10  ml,  gelas  baker 100ml,  korek  api,  corong  kaca,  blender,  kain  kasa,  tabung  reaksi,tempat  tabung  reaksi. Sedangkan  bahan  yang  dibutuhkan  dalam  penelitian  adalah  hati  ayam,  aquades,  H2O2, vaseline.

## III. HASIL PENELITIAN
Tabel 1. Hasil percobaan pengaruh jumlah substrat terhadap kerja enzim Nomor perlakuan
H 2 0 2 (ml) Awal Akhir Gelembung  Tekanan (ml) Nyala Api (detik) Gelembung  Tekanan (CmHg) Nyala api 1 0 - 90 - - 0 0 2 0,5 - 90 - + 9.03 13 3 1 - 90 - + 9.09 16 4 1,5 - 90 - ++ 9.09 29 5 2 - 90 - +++ 9.09 35 6 2,5 - 90 - +++ 9.12 46 7 3 - 90 - +++ 9.15 50 8 3,5 - 90 - ++++ 9.15 66 9 4 - 90 - ++++ 9.15 75 Keterangan Gelembung: -        : Tidak ada gelembung +       : Gelembung sangat sedikit
++     : Gelembung sedikit +++   : Gelembung banyak ++++ : Gelembung sangat banyak
Pada Tabel 1 menunjukkan bahwa setiap perlakuan yang melibatkan jumlah substrat  H 2 0 2 yang  berbeda  dapat  mempengaruhi  kerja  enzim  yang  dilihat  dari  tekanan  oksigen, keberadaan  gelembung  dan  lamanya  bara  api  yang  menyala.    Enzim  katalase  merupakan enzim  yang  mengkatalisa  penguraian  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )  menjadi  H 2 O  dan  O 2 . Hidrogen  peroksida  berssifat  toksik  terhadap  sel  karen  abahan  ini  menginaktifkan  enzim dalam  sel.  Hidrogen  peroksida  terbentuk  sewaktu  metabolisme  aerob,  sehingga mikroorgansme  yang  tumbuh  dalam  lingkungan  aerob  pasti  menguraikan  bahan  tersebut (Lay,  1994).  Katalase  ditemukan  di  beberapa  organ  tubuh  seperti  hepar,  ginjal,  sumsum tulang  dan  darah,  namun  yang  terbanyak  terdapat  di  hepar  (Kaushal,  2018).  Penguraian racun  dari  H 2 O 2 menjadi  H 2 O  dan  O 2 pada  percobaan  ditunjukkan  dari  gelembung  dan nyala  api  yang  terbentuk.  Gelembung  merupakan  uap  air  dan  nyala  api  terjadi  karena adanya oksigen. H 2 O dan O 2 merupakan produk dari H 2 O 2 sehingga semakin banyak H 2 O 2 maka semakin cepat kerja enzim katalase. Hal ini ditunjukkan dari banyaknya gelembung yang terbentuk dan lamanya nyala api. Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, pada perlakuan  ke-1  volume  enzim  katalase  sebanyak  3  ml  tanpa  ditambahkan  dengan  H 2 O 2 menunjukkan bahwa tidak terdapat gelembung maupun nyala api yang teriidentifikasi dan tidak terjadi juga perubahan tekanan pada ganong. Hal ini disebabkan tidak adanya reaksi yang terjadi dalam perlakuan ke-1 tersebut. Tanpa adanya substrat yakni H 2 O 2 maka enzim katalase  tidak  dapat  melakukan  rekasi  kimia.  Pada  perlakuan  ke-2  yaitu  volume  enzim katalase  sebanyak  3  ml  ditambahkan  dengan  volume  substrat  H 2 O 2 0,5  ml  menunjukkan
Amalia Dita, Nur Rahmi N, Hidayati N, Oktaviana R, Fransisca Aurora Z, Supriatno B, Anggraeni S  :  Pengaruh  Volume  Substrat  Terhadap  Kerja  Enzim  Katalase  Menggunakan  Respirometer Ganong Sebagai Rekonstruksi Desain Kegiatan Praktikum Siswa
adanya  gelembung  yang  sangat  sedikit  dan  tekanan  pada  ganong  yang  terbentuk  sebesar 9,03  cmHg.  Adanya  substrat  H 2 O 2 dalam  jumlah  yang  kecil  mempengaruhi  kerja  enzim katalase. Katalisis terjadi hanya jika enzim dan substrat membentuk suatu kompleks. Oleh sebab  itu,  laju  rekaksi  bergantung  pada  jumlah  enzim  dan  substrat  yang  berhasil membentuk kompleks. Hal ini menunjukkan bahwa telah terjadi pembentukan H 2 O dan O 2 yang mempengaruhi tekanan udara dalam ganong.
Selanjutnya  pada  perlakuan  ke-3  yaitu  volume  substrat  1  ml  menunjukkan  adanya gelembung  yang  sangat  sedikit  dan terdapat  perubahan tekanan  sebesar  9.0.9 cmHg  pada ganong.  Sama  halnya  dengan  perlakuan  ke-2,  adanya  substrat  H 2 O 2 dalam  jumlah  yang kecil mempengaruhi kerja enzim katalase. Pada perlakuan ke-4 yaitu 3 ml enzim katalase ditambahkan dengan 1,5 ml substrat menunjukkan adanya sedikit gelembung dan terdapat perubahan  tekanan  sebesar  9.0.9  cmHg  pada  ganong.  Pada  perlakuan  ke-5  yaitu  3  ml enzim katalase ditambahkan dengan 2 ml substrat menunjukkan adanya banyak gelembung dan  terdapat  perubahan  tekanan  sebesar  9.0.9  cmHg  pada  ganong.  Perubahan  tekanan dapat dilihat pada gambar 2.
Perubahan tekanan dapat dilihat pada gambar 2.

## Gambar 2. Grafik Perubahan Tekanan pada Ganong

## IV. KESIMPULAN
Jumlah  substrat  yang  diberikan  memiliki  volume  yang  berbeda-beda.  Setiap  volume substrat yang direaksikan dengan enzim katalase menghasilkan tekanan dan lama bara api menyala  yang  berbeda-beda.  Semakin  banyak  jumlah  volume  substrat  yang  diberikan maka tekanan oksigen, jumlah gelembung dan lama bara api menyala semakin meningkat. Pada  penelitian  ini  disimpulkan  bahwa  pemberian  substrat  dapat  mempengaruhi  kerja enzim  katalase.  Enzim  katalase  yang  diproduksi  di  dalam  hati  ayam  memiliki  sifat  racun yang berbahaya bagi tubuh. Pemberian substrat H 2 O 2 mampu memecah senyawa hidrogen peroksida  (H 2 O 2 )  menjadi  substansi  yang  tidak  berbahaya  berupa  air  dan  oksigen. Keberadaan  oksigen  dapat  dilihat  timbulnya  gelembung  pada  reaksi  tersebut,  sehingga terdapat tekanan oksigen di dalamnya.
0 9,03 9,09 9,09 9,09 9,12 9,15 9,15 9,15 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Perubahan Tekanan pada Ganong Volume substrat (ml) T eka n a n ( c m Hg)
Amalia Dita, Nur Rahmi N, Hidayati N, Oktaviana R, Fransisca Aurora Z, Supriatno B, Anggraeni S  :  Pengaruh  Volume  Substrat  Terhadap  Kerja  Enzim  Katalase  Menggunakan  Respirometer Ganong Sebagai Rekonstruksi Desain Kegiatan Praktikum Siswa

## DAFTAR PUSTAKA
Agrios,  G.  N.  1997. Ilmu  Penyakit  Tumbuhan .(Terjemahan)  Edisi  Ketiga.  UGMPress, Yogyakarta.
Cappucino,  J.G.,  dan  Sherman,  N.,  2001,  Microbiology  A  Laboratory  Manual,  Rockland Community College, State University of New York
Kaushal J, Mehandia S, Singh G, Raina A, Arya SK. 2018. Catalase Enzyme: Application in Bioremediation and Food Industry . Biocatal Agric Biotechnol, vol. 16, no. 8, pp. 192–199.
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium . PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Miller,  G.L.,  1958. Use  of  Dinitrosalicylic  Acid  Reagent  for  Determination  of  Reducing Sugar . Analytical Chemistry - ANAL CHEM , vol. 31, no. 3, pp. 426-428. Permanasari A R, Yulistiani F, Purnama R W, Widjaja T, Gunawan S. 2017. The Effect of Enzyme  and  Substrate  Concentration  on  the  Fructose  Syrup  Production  by Enzymatice Hydrolysis.
Poedjiadi,  A.  2006. Dasar-Dasar  Biokimia  Edisi  Revisi .  Jakarta:  UI  Press.  Poedjiadi,  A dan Supriyanti, F.M. 1992. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.
Suhara. 2009. Dasar-dasar Biokimia . Bandung: Prima Press Untari,  E.K.  Sri.  W.,  Agustia,  D.  2014. Efek  Fraksi    n-heksana  Kulit    Hylocereus polyrhizus  Terhadap    Aktivitas  Katalase  Tikus  Stres    Oksidatif .  Original  Article. Vol.1 No. 1
Valko  ,  Leibfritz  D,  Moncol  J,  Cronin.    MTD,  Mazur  M,  Telser  J.  2007. Review:  Free radicals  and    antioxidants  in  normal  physiological    functions  and  human  disease . The International Journal of  Biochemistry & Cell Biology, 39(1),  44-84
Van Cleave,Janice.2004. A+ Proyek Fisika: Perkara Jaya,Bandung
Volk  WA  and  MF  Wheeler.  1988. Mikrobiologi  Dasar .  Jilid  1.  S  Adisoemarto  (Ed.). Erlangga, Jakarta. Terjemahan dari Basic Microbiology
West,  ES  dan  Todd,  W.  R,  1961. Text  Book  of    Biochemistry  3th  Ed .  The  McMilan Company, New York.
Accepted Date Revised Date Decided Date Accepted to Publish 09 Juni 2022 10 Juni  2022 12 Juni 2022 Ya