Hasil Penelitian

## KARAKTERISTIK FISIK, KIMIA, MIKROBIOLOGI WHEY KEFIR DAN AKTIVITASNYA TERHADAP PENGHAMBATAN ANGIOTENSIN CONVERTING ENZYME (ACE)
[Physical, Chemical and Microbiological Characteristics of Whey Kefir and Its Angiotensin Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Activity]
Andi Febrisiantosa 1) *, Bagus Priyo Purwanto 2) , Irma Isnafia Arief 2) dan Yantyati Widyastuti 3)
1) Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
3) Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI, Bogor
Diterima 14 Maret 2013 / Disetujui 28 Oktober 2013

## ABSTRACT
This study was conducted to evaluate the characteristics of whey-based kefir products and their activity to inhibit the angiotensin converting enzyme (ACE). Kefir was produced by using many types of whey, namely SK: skim milk based kefir (control); WK: gouda cheese whey based kefir; and WKB: commercial whey powder based kefir. The experimental design was a completely randomized design. Each treatment was conducted in triplicates.  Kefirs  were  evaluated  for  physical  and  chemical  properties  (pH,  total  titratable  acidity,  viscosity,  protein,  fat,  lactose,  and  alcohol), microbiological  (lactic  acid  bacteria  and  yeast)  population,  peptide  concentration,  ACE  inhibition,  IC 50 and  Inhibition  Efficiency  Ratio  (IER).  The results showed that the types of whey used for kefir productions significantly affected the physical and chemical characteristics of the products (p<0.05). Total lactic acid bacteria and yeast population of the products were not significantly different among the whey types (p>0.05). The peptide concentration and ACE inhibitory activity of WK, 1.54±0.02 mg/mL and 73.07±0.91%, was significantly higher (p<0.05) than those of the control and WKB. The IC 50 of WK was 0.83±0.02 mg/mL, significantly lower than that of control (1.05±0.01 mg/mL) and WKB (0.96±0.01 mg/mL). The IER of WK (47.35±0.09% per mg/mL) was not significantly different (p>0.05) from the control (47.19±0.09% per mg/mL) but was significantly higher (p<0.05)  than  that  of  WKB  (45.75±0.18%  per  mg/mL).  This  research  indicated  that  whey  kefir  is  a  potential  source  of  bioactive  peptide  for antihypertention agent.
Keywords: angiotensin converting enzyme, bioactive peptide, whey kefir

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  karakteristik  produk kefir berbahan  baku whey serta  kemampuannya  dalam  menghambat  kerja Angiotensin  Converting  Enzyme (ACE).  Produk kefir yang  dibuat  dalam  penelitian  ini  berasal  dari  bahan  baku whey yang  berbeda  sebagai perlakuan yang dikerjakan dalam eksperimen Rancangan Acak Lengkap 3 perlakuan dengan 3 kali ulangan, yaitu SK: Kefir berbahan baku susu skim sapi (kontrol); WK: kefir berbahan baku whey keju gouda; dan WKB: kefir berbahan baku whey bubuk komersial. Kualitas fisik dan kimia (pH, keasaman, viskositas, protein, lemak, laktosa dan alkohol), mikrobiologis (populasi bakteri asam laktat dan khamir kapang), konsentrasi peptida, penghambatan ACE, IC 50 , dan Inhibition Efficiency Ratio (IER) dari kefir yang dihasilkan kemudian diamati. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jenis bahan baku whey yang digunakan berpengaruh nyata terhadap kualitas fisik dan kimia produk whey kefir yang diperoleh. Populasi bakteri asam laktat dan khamir kapang tidak berbeda nyata ( p> 0.05) pada semua produk whey kefir penelitian. Konsentrasi peptida dan penghambatan ACE WK berturut–turut adalah 1.54±0.02 mg/mL dan 73.07±0.91%; secara signifikan lebih tinggi ( p< 0.05) dibandingkan dengan kontrol dan WKB. IC 50 WK adalah 0.83±0.02 mg/mL, lebih rendah ( p< 0.05) dibandingkan dengan kontrol (1.05±0.01 mg/mL) dan WKB (0.96±0.01 mg/mL). IER WK sebesar 47.35±0.09% per mg/mL tidak berbeda nyata ( p> 0.05) dibandingkan dengan kontrol (47.19±0.09% per mg/mL) tetapi secara nyata lebih tinggi  ( p< 0.05)  dibandingkan  dengan  WKB  (45.75±0.18%  per  mg/mL).  Berdasarkan  hasil  penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa whey kefir berpotensi sebagai sumber peptida bioaktif antihipertensi.
Kata kunci: angiotensin converting enzyme, peptida bioaktif , whey kefir

## PENDAHULUAN
*
Proses  penggumpalan  susu  dalam  pembuatan  keju  meng- hasilkan  produk  ikutan  berupa whey .  Pada  beberapa  industri, whey dibuang sebagai limbah. Akumulasi limbah tersebut dapat mencemari lingkungan. Whey memiliki kandungan biochemical
*Penulis Korespondensi: Email: andifebrisiantosa@gmail.com;
oxygen  demand (BOD)  dan chemical  oxygen  demand (COD) tidak memenuhi batas  aman  yang diperbolehkan, yaitu 50.000 mg/L  (BOD)  dan  80.000  mg/L  (COD)  (Guimarães et  al .  2010) karena whey masih  mengandung  nutrisi  atau  bahan  organik diantaranya  adalah  protein,  laktosa  (gula  susu)  dan  mineral. Bahan organik yang terkandung dalam whey merupakan media yang  baik  bagi  pertumbuhan  mikroorganisme.  Hal  ini  ber- pontensi  untuk  pemanfaatan whey sebagai  media  fermentasi yang menghasilkan produk dengan nilai ekonomis lebih baik.
Hasil Penelitian
Produk-produk susu fermentasi yang mengandung probiotik dan  prebiotik  serta  memiliki  dampak  kesehatan  mulai  diminati konsumen saat ini (Ozer dan Kirmaci, 2010). Salah satu produk susu  fermentasi  adalah kefir .  Secara  tradisional, kefir dibuat dengan menambahkan starter kefir pada susu segar. Kefir telah dianjurkan untuk dikonsumsi oleh orang sehat di negara-negara Soviet  untuk  menurunkan  risiko  penyakit  kronis,  hipertensi, Ischeamic  Heart  Disease (IHD)  dan  alergi  (Farnworth,  2005). Starter kefir memiliki  komposisi  protein,  polisakarida  dan campuran  beberapa  jenis  mikroba.  Bakteri  asam  laktat  dan kapang yang terdapat pada starter kefir hidup bersimbiosis dan berfungsi  pada  proses  fermentasi  asam  laktat  dan  alkohol. Starter kefir dapat memecah laktosa  sehingga starter kefir ter- sebut  dapat  digunakan  pula  untuk  fermentasi whey dari  hasil pengolahan keju, yang juga kaya akan laktosa.
Peningkatan  nilai  ekonomis whey dapat  dilakukan  dengan memproduksi  peptida  bioaktif  sebagai  bahan  suplemen  yang memiliki  fungsi  kesehatan  tertentu  bagi  manusia.  Peptida tersebut memiliki peran penting dalam fungsi fisiologi dan juga fungsi  regulatori  dalam  tubuh  manusia  (Tavares et  al. 2011). Hidrolisis enzimatik, fermentasi atau kombinasi keduanya dapat menghasilkan  golongan  peptida  tersebut.  Pemanfaatan  lebih lanjut  dari  peptida  bioaktif  adalah  sebagai  bahan  formulasi untuk  pangan  fungsional  dan  nutraceutical  (Madureira et  al. 2010). Salah satu fungsi peptida tersebut adalah sebagai peng- hambat  aktivitas  ACE  yang  bertanggungjawab  pada  proses kemunculan  ( on  set )  hipertensi,  terutama  terkait  dengan penyakit  diabetes  tipe  2.  Beberapa  penelitian  telah  mem- perlihatkan  peran  susu  fermentasi  dalam  mengontrol  tekanan darah. Penelitian yang dilakukan Donkor et al . (2007) terhadap BAL  dalam  produk  susu  memperlihatkan  kemampuan  BAL dalam  menghambat  aktivitas  ACE.  Keju  Cheddar  yang  dibuat dari  starter Lactococcus dan  bakteri  probiotik  menghasilkan peptida  penghambat  ACE  (Ong  dan  Shah,  2008).  Peptida penghambat ACE juga ditemukan dalam yogurt, keju dan susu yang difermentasi oleh Lactobacillus casei ssp. rhamnosus dan strain bifidobakteria.
Informasi ilmiah yang berkaitan dengan pemanfaatan whey melalui  proses  fermentasi  menggunakan  starter kefir untuk melihat  manfaat  fungsional  antihipertensi  belum  banyak dipublikasi,  karena  itu  penelitian  ini  penting  dilakukan.  Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari karakteristik fisik, kimia, mikrobiologi kefir berbahan  baku whey serta  mengetahui aktivitasnya terhadap penghambatan ACE.

## BAHAN DAN METODE
Bahan  kultur bulk  kefir adalah  koleksi  laboratorium  mikro- biologi  Bagian  Teknologi  Hasil  Ternak,  Fakultas  Peternakan Institut Pertanian Bogor (IPB). Bulk kefir disiapkan berdasarkan metode  dalam  Magalhaes et  al .  (2011)  yaitu  dengan  cara mengkultivasi  starter kefir dalam  susu  segar  yang  telah  di- pasteurisasi,  disegarkan  setiap  hari  selama  7  hari.  Setelah  itu bulk kefir dipisahkan dari starter kefir sebelum diinkolulasikan ke media yang baru. Media fermentasi adalah susu skim sapi dari unit  proses  pengolahan  susu  Fakultas  Peternakan  IPB, whey hasil  ikutan  proses  pembuatan  keju  Gouda  di  PT  Bukit  Baros
Cempaka,  Sukabumi  dan whey bubuk  komersial  (Tillamook County Creamery).

## Rancangan percobaan dan analisa data
Rancangan percobaan  yang digunakan adalah Rancangan Acak  Lengkap  dengan  3  perlakuan  dilakukan  3  ulangan.  Per- lakuan  yang  diberikan  adalah:  SK  (kontrol)  yaitu Kefir (bahan baku  susu  skim  sapi);  WK= Kefir (bahan  baku whey cair); WKB= Kefir (bahan  baku whey bubuk).  Data  dianalisa  dengan Sidik  Ragam  (ANOVA),  perbedaan  nyata  yang  terjadi  di- lanjutkan dengan uji lanjut menggunakan uji Tukey.
Pembuatan whey kefir (WK) Pembuatan  WK  mengacu  pada  Magalhaes et  al .  (2011) yang  dimodifikasi.  Sejumlah  500  mL whey dipasteurisasi  pada suhu  83–85°C  selama  30  menit,  kemudian  didiamkan  sampai suhu  mencapai  ±27°C,  kemudian  diinokulasi  dengan  5%  v/v kultur  starter bulk  kefir secara  aseptik,  diinkubasi  (28°C,  20 jam). Kefir selanjutnya  diperam  (24  jam,  4°C),  lalu  dilakukan penyaringan menggunakan kain saring ukuran 100 mesh untuk memisahkan WK dan starter kefir .

## Jumlah bakteri asam laktat dan kapang khamir
Jumlah  bakteri  asam  laktat  ditentukan  dengan  metode hitungan  cawan  menurut  metode  Maturin  dan  Peeler  (2001). Sampel  dan  Buffered  Peptone  Water  (BPW)  diencerkan beberapa seri dilanjutkan dengan inokulasi pada media deMan Rogosa  Sharpe  Agar (MRSA)  pada  suhu  37°C  selama  24-48 jam.  Hasil  penghitungan  dilaporkan  menggunakan  metode Standard  Plate  Count (SPC).  Jumlah  kapang  khamir  dihitung berdasarkan  metode  yang  dijelaskan  oleh  Maturin  dan  Peeler (2001).  Media  yang  digunakan  adalah  PDA  ( Potato  Dextrose Agar ). Sebanyak 5 mL sampel kefir diencerkan bersama 45 mL larutan  BPW  dan  dihomogenisasi  menggunakan  vorteks  untuk mendapatkan pengenceran P-1 sampai P-7. Inokulasi dilakukan secara  aseptik  pada  suhu  ruang  selama  24  jam.  Setelah mencapai  waktu  inkubasi  24  jam,  jumlah  khamir  yang  tumbuh kemudian dihitung.

## Karakteristik fisik dan kimia
pH  produk  diukur  menggunakan  metode  standar  AOAC (2005)  menggunakan  pH  meter  (Hanna).  Persentase  asam laktat diukur melalui metode titrasi menggunakan 0.1 N NaOH. Jumlah  asam  yang  diproduksi  selama  fermentasi  dihitung dengan rumus:
m l k      k o  p n  n    n x        x       x       x
Kekentalan  diukur  menggunakan  alat viscometer (Rion Viscotester  VT-04F).  Sebanyak  50  mL  sampel  dimasukkan  ke dalam  tempat  yang  tersedia  pada  alat  dan  suhu  diatur  pada suhu ruang. Satuan kekentalan disajikan dalam centipoise (cP). Penentuan  kadar  protein  menggunakan  metode  semimikro Kjeldahl  dengan  faktor  konversi  6.25  (AOAC,  2005).  Kadar laktosa diukur menurut metode Reagen Teles. Sampel diencer- kan 50 kali, direaksikan dengan 0.2 mL zink sulfat 5% dan 0.2 mL barium hidroksida 4.5%. Sampel dibaca pada absorban 520 nm.  Kadar  alkohol  diukur  menggunakan  metode  mikro  difusi
Hasil Penelitian
conway  menggunakan  2  mL  sampel  yang  direaksikan  dengan larutan  mikro  difusi  conway  (0.37  g  K 2 Cr 2 O 7 dalam  15  mL  air dan 28 mL H 2 SO 4 pekat diencerkan hingga 50  mL), kemudian dibaca pada absorban 605 nm. Kadar lemak ditentukan meng- gunakan  metode  dalam  BSN  (2009).  Lemak  dalam  sampel dihidrolisa  dengan  amonia  dan  alkohol  kemudian  diekstraksi dengan  eter.  Ekstrak  eter  yang  diperoleh  kemudian  diuapkan sampai  kering  dalam  pinggan  alumunium  dan  kadar  lemak dihitung secara gravimetri.
Pembuatan ekstrak whey kefir Kefir dihomogenkan, kemudian pH kefir dikondisikan hingga mencapai  4.0. Kefir kemudian  dipanaskan  dengan waterbath (45°C) selama 10 menit diikuti dengan sentrifugasi (5.000 g, 10 menit  4°C).  Selanjutnya,  larutan  NaOH  0.1  M  ditambahkan hingga pH mencapai 7.0. Supernatan disentrifugasi lagi (5.000 g,  10  menit  4°C)  dan  supernatan  disimpan  pada  suhu  -20°C sampai dibutuhkan untuk analisa.
Konsentrasi  peptida,  penghambatan Angiotensin  Convert- ing Enzyme (ACE), IC 50 dan Inhibition Efficiency Ratio (IER) Pengukuran  konsentrasi  peptida  ekstrak  WK  dilakukan menggunakan  metode  uji  o-phthaldialdehyde  (OPA).  Ekstrak WK  (30  µl)  ditambahkan  pada  1  mL  reagen  OPA  di  dalam cuvette 1.5  mL.  Larutan  dicampurkan  secara  cepat  dengan pembalikan cuvette dan diinkubasi pada  suhu ruang selama 2 menit.  Pembacaan  absorbansi  dilakukan  pada  panjang gelombang  340  nm  menggunakan  Spectrophotometer (Shimadzu  UV-1601  PC).  Konsentrasi  peptida  diestimasikan terhadap  kurva  standar  tripton.  Pengukuran  aktivitas  inhibitor ACE  pada  penelitian  ini  mengacu  pada  metode  Hayes et  al. (2007)  yang  telah  dimodifikasi  dalam  hal  konsentrasi  enzim, substrat, dan bahan pelarut lainnya yang digunakan untuk uji in vitro .  Substrat  enzim  yang  digunakan  untuk  uji in  vitro peng- hambatan ACE adalah Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine (HHL).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik mikrobiologi whey kefir Mikroflora  pada kefir sangat  kompleks  dan  bervariasi. Fermentasi  yang  berlangsung  pada  proses  pembuatan kefir melibatkan  bakteri  asam  laktat  dan  khamir.  Populasi  bakteri asam  laktat  dan  khamir  produk kefir penelitian  ini  ditampilkan pada  Gambar  1.  Terlihat  bahwa  populasi  bakteri  asam  laktat pada  ketiga  jenis  produk kefir berbahan  baku  skim, whey dan whey bubuk  tidak  berbeda  nyata  ( p >0.05).  Populasi  bakteri asam  laktat  berkisar  antara  9.67–11.20  log 10 CFU/mL.  Hasil penelitian ini lebih tinggi daripada hasil penelitian Gronnevik et al . (2011), Fontan et al . (2006), dan Irigoyen et al . (2005) yang menyatakan bahwa populasi kultur starter Lactococcus spp. dan Lactobacillus spp. berturut-turut adalah 8 dan 8.5 log 10 CFU/mL. Populasi  bakteri  kultur  starter  dalam  produk kefir yang  di- syaratkan  dalam  CODEX  STAN  234-2003  adalah  minimal  7 log 10 CFU/mL.  Berdasarkan  hal  tersebut,  produk kefir hasil penelitian  ini  memenuhi  persyaratan  CODEX.  Populasi  bakteri asam  laktat  tinggi  diduga  disebabkan  kondisi  lingkungan  dan nutrisi  dalam  media  fermentasi  yang  baik  bagi  pertumbuhan
bakteri  asam  laktat.  Bakteri  asam  laktat  dapat  melakukan regenerasi dengan cepat. Menurut Giraffa (2004), Lactobacillus adalah bakteri dominan yang ditemukan dalam hampir seluruh produk  susu  fermentasi  dengan  populasi  berkisar  antara  6.28 log 10 CFU/mL  hingga  8.32  log 10 CFU/mL. Acetobacter ,  bakteri mesofilik  aerob, Leuconostoc dan Lactococcus menunjukkan pertumbuhan  yang  sama  berkisar  antara  6.00  log 10 CFU/mL sampai 8.00 log 10 CFU/mL (Magalhaes et al . 2010).
Gambar 1.  Populasi  bakteri  asam  laktat  dan  khamir  kapang  pada produk WS, WK dan WKB. Notasi huruf yang sama di atas grafik batang artinya tidak berbeda nyata ( p >0.05), n = 9
Populasi khamir pada ketiga jenis produk kefir tidak berbeda nyata  ( p >0.05).  Menurut  CODEX  STAN  234-2003,  populasi khamir minimal 10 4 CFU/g. Rata-rata populasi khamir pada awal fermentasi adalah 6.00 log 10 CFU/mL dan meningkat 7.31 log 10 CFU/mL  pada  akhir  fermentasi  selama  24  jam  (Giraffa,  2004). Magalhaes et  al .  (2010)  menyatakan  bahwa  populasi  khamir pada  produk kefir adalah  5–6  log 10 CFU/mL.  Populasi  khamir kefir dari  sari  kedelai  yang  diinokulasi  dengan  starter kefir adalah  3.20  log 10 CFU/mL  (Kasenkas et  al. 2011).  Populasi khamir  pada kefir hasil  penelitian  ini  sesuai  dengan  standar CODEX  dan  lebih  tinggi  dari  hasil  penelitian  Giraffa  (2004), Magalhaes et  al .  (2010),  dan  Kasenkas et  al .  (2011).  Selama fermentasi,  pertumbuhan  khamir  distimulasi  oleh  kondisi  asam yang  diakibatkan  aktivitas  bakteri  asam  laktat,  sebaliknya  per- tumbuhan bakteri dapat distimulasi dengan keberadaan khamir khususnya  khamir  yang  dapat  mensintesis  komponen  penting bagi  pertumbuhan  bakteri  seperti  vitamin  dan  nitrogen  terlarut (Almeida et al. 2007).
Komposisi  populasi  bakteri  asam  laktat  dan  khamir  pada produk kefir penelitian ini relatif  seimbang yaitu 1:1. Stepaniak and  Fetlinski  (2002)  menyatakan  bahwa  distribusi  mikro- organisme dalam matriks pada  starter kefir tidak seragam. Lb. kefiranofaciens terdistribusi  menyebar  pada  starter kefir tetapi populasinya paling tinggi di tengah-tengah, sedangkan Lb. kefir pada  umumnya  tumbuh  di  permukaan  starter kefir .  Komposisi spesifik  mikroflora  dari  starter kefir sangat  tergantung  pada negara asal, cara kultivasi, dan teknik penyimpanan, tetapi per- bandingan  jumlah  khamir  dan  bakteri  asam  laktat  (BAL)  relatif stabil.
Karakteristik fisik dan kimia whey kefir Sifat fisik dan kimia kefir meliputi total solid, laktosa, protein, lemak,  mineral,  alkohol,  pH,  viskositas  dan  keasaman  produk dianalisa. Rataan nilai hasil analisa disajikan pada Tabel 1.
9.67±1.12 a 11.20±0.36 a 10.56±0.23 a 9.98±0.05 a 10.09±0.66 a 10.66±0.16 a 0 2 4 6 8 10 12 14 SK WK WKB (lo g 10 C FU /m L) BAL Khamir
Hasil Penelitian
Tabel 1.  Karaketristik fisik dan kimia produk kefir berbahan baku susu skim segar, whey segar dan whey bubuk Parameter Produk Kefir SK WK WKB pH 3.95±0.07 a 4.00±0.01 a 4.74±0.04 b Viskositas (cP) 1.550.00±180.28 b 350.00±0.00 a 350.00±0.00 a Asam laktat (%) 1.11±0.04 a 1.13±0.00 a 1.11±0.02 a Total padatan (%) 8.92±0.14 a 14.64 ±0.13 b 20.17±1.84 c Laktosa (% bb) 0.34±0.10 a 1.82±0.29 b 2.69±0.48 c Protein (% bb) 3.31±0.15 a 2.63±0.72 a 2.93±0.21 a Lemak (% bb) 0.46±0.18 a 1.70±0.14 b 0.45±0.09 a Mineral (% bb) 0.83±0.02 a 1.15±0.06 b 1.78±0.08 c Alkohol (%) < 0.5 < 0.5 < 0.5
Keterangan:  SK: Kefir berbahan  baku  susu  skim;  WK: Whey  kefir berbahan baku whey segar;  WKB: Whey  kefir berbahan  baku whey bubuk.  Angka- angka pada baris yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji lanjut Tukey), n = 9
Berlangsungnya proses fermentasi ditandai dengan terjadi- nya  penurunan  pH.  Kultur  starter  yang  diberikan  pada  media fermentasi  menghasilkan  asam  laktat  dalam  jumlah  tertentu sehingga  menurunkan  pH  sehingga  mencapai  pH  3.8–4.2. Produk kefir pada  penelitian  ini  memiliki  pH  berkisar  antara 3.95–4.74. Whey kefir yang dibuat dari bahan baku whey (WK) menghasilkan  pH  akhir  4.00.  pH kefir yang  dibuat  dari  sari kedelai  berkisar  antara  4.58–4.65  (Kesenkas et  al .  2011). Ismaiel et al . (2011) menyatakan bahwa pH kefir dengan bahan baku kelapa, sari kedelai, dan whey berturut–turut adalah 3.21; 3.11 dan 3.01.
Keasaman kefir dihitung sebagai % asam laktat. Kefir yang dihasilkan pada penelitian ini memiliki keasaman antara 1.11% sampai  1.13%.  Kadar  asam  laktat  meningkat  karena  aktivitas mikroba  selama  proses  fermentasi  yang  menguraikan  laktosa menjadi glukosa dan galaktosa  untuk kemudian dimetabolisme menjadi asam laktat. Oleh karena itu, kadar laktosa produk kefir yang  dihasilkan  menurun  seiring  dengan  peningkatan  ke- asaman. Kefir dalam penelitian ini memiliki kadar laktosa 0.34- 2.69%.  Berdasarkan  CODEX  STAN  234-2003,  keasaman sebagai % asam laktat pada kefir minimal 0.6%, kadar laktosa kefir berkisar  3.0–3.9%  dan  kadar  asam  laktat  0.73–1.15%. Menurut  Purnomo  dan  Muslimin  (2012),  kadar  laktosa kefir berbahan baku susu kambing adalah 4.3% dengan kadar asam laktat 0.76%.
Berdasarkan  CODEX  STAN  234-2003,  komposisi  protein kefir minimal  2.7%.  Komposisi  protein kefir pada  penelitian  ini berkisar  antara  2.63-3.31%.  Hasil  penelitian  Kesenkas et  al . (2011)  memperlihatkan  bahwa  kadar  protein kefir berbahan baku  susu  sapi  adalah  4.10%  sedangkan kefir berbahan  baku campuran  susu  dan  sari  kedelai  (rasio  1:1)  adalah  4.03%. Kadar  protein  WK  (2.63%)  yang  lebih  rendah  dibandingkan standar  dalam  CODEX  dan  Kesenkas et  al .  (2011)  karena kandungan protein bahan baku whey yang juga rendah. Selain itu, protein whey bersifat sukar untuk didegradasi dibandingkan protein  kasein  (Kesenkas et  al .  2011).  Kadar  lemak  yang ditetapkan  dalam  CODEX  STAN  234-2003  adalah  kurang  dari 10%.  Kadar  lemak  produk kefir dalam  penelitian  ini  berkisar antara  0.45–1.7%  memenuhi  ketentuan  dalam  CODEX.  Kadar lemak  tersebut  jauh  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  hasil penelitian Kesenkas et al . (2011), yaitu 3.05%.
Viskositas kefir SK lebih tinggi dibandingkan WK dan WKB. Terlihat bahwa semakin rendah pH menghasilkan kefir dengan viskositas  semakin  tinggi.  Hal  tersebut  berkaitan  dengan aktivitas  mikroba  yang  tumbuh  pada  saat  fermentasi  dan komposisi bahan baku (Ismaiel et al. 2011). Iličić et al . (2008) menyatakan  bahwa  viskositas  dan  struktur  gel  pada  produk susu  fermentasi  dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor  yaitu komposisi  susu,  konsentrasi  kasein,  suhu  inkubasi,  perlakuan panas, keasaman serta jenis kultur yang digunakan.
Komponen  penting  pada  susu  adalah  kasein.  Selama proses fermentasi terjadi penggumpalan kasein dan peningkat- an  kekentalan  produk.  Susu  skim  sebagai  bahan  baku  yang digunakan  pada  SK  kaya  akan  kasein  sedangkan whey untuk WK  dan  WKB  telah  kehilangan  banyak  kasein.  Peningkatan viskositas  produk  susu  fermentasi  diperoleh  pada  produk dengan  rasio  kandungan  kasein  dan  protein whey sebanyak 80:20  (Bonisch et  al .  2006).  Rasio  kasein  dan  whey  pada produk hasil penelitian ini lebih rendah khususnya pada produk WK dan WKB. Selain itu, menurut Ismaiel et al . (2011), massa molar  dari  eksopolisakarida  diduga  kuat  mempengaruhi viskositas produk susu fermentasi, polimer yang memiliki massa molar tinggi menjadikan produk dengan viskositas tinggi. Pada kefir eksopolimer  dapat  diperoleh  jika  terdapat  mikroba  peng- hasil  eksopolimer  seperti Acetobacter sp . Keberadaan  1% Acetobacter  pasteurianus dari  total  mikroba  pada  starter kefir memegang  peranan  penting  dalam  meningkatkan  rasa  dan konsistensi kefir melalui  peningkatan  viskositas.  Bakteri  jenis Acetobacter kemungkinan  tumbuh  lebih  banyak  pada  SK dibandingkan WK dan SKB.
Kandungan  alkohol  produk kefir pada  penelitian  ini  kurang dari  0.1%  (Tabel  1). Kefir yang  sudah  matang  mengandung 0.8–1% asam laktat. Kefir tradisional yang diproduksi langsung dari  starter kefir mengandung  etanol  sampai  2%  sedangkan produk kefir dari industri mengandung 0.04–0.15% asam asetat, 0.4%  CO 2 ,  1-4  mg/L  diasetat  dan  beberapa  mg/L  asetaldehid (Stepaniak  dan  Fetlinski,  2002).  Kandungan  alkohol  yang rendah disebabkan waktu pematangan setelah inkubasi kurang. Menurut  Stepaniak  dan  Fetlinski  (2002),  produksi  alkohol  juga berlangsung  selama  proses  pematangan  dan  penyimpanan  di suhu  rendah.  Alkohol  merupakan  produk  akhir  dari  aktivitas khamir.  Khamir  tumbuh  baik  pada  lingkungan  dengan  suhu lebih rendah. Suhu inkubasi yang digunakan pada penelitian ini adalah  28°C.  Hasil  penelitian  Purnomo  dan  Muslimin  (2012) menunjukkan kefir yang  diinkubasi  pada  suhu  24°C  memiliki kadar  alkohol  0.94%.  Stepaniak  dan  Fetlinski  (2002)  juga menyatakan  bahwa Candida  kefyr menstimulasi  pertumbuhan Lb. kefir . Produksi etanol dari Can. kefyr lebih tinggi jika khamir tersebut berkembang bersamaan dengan Lb. kefir . Kultur starter yang  digunakan  pada  penelitian  ini  memiliki  komposisi Lactobacillus sp.  35.4%, Streptococcus sp.  58.3%  dan  khamir 6.3%.  Interaksi Can.  kefyr dan Lb.  kefir untuk  menghasilkan kadar  alkohol  tinggi  tidak  terjadi  sehingga  kadar  alkohol  yang dihasilkan rendah.
Kandungan  mineral  produk kefir dalam  penelitian  ini  ber- kisar  antara  0.83–1.78%.  Belum  ada  standar  yang  mengatur kadar  mineral  dalam  produk kefir .  Menurut  Robinson et  al . (2002), aktivitas metabolisme kultur probiotik dapat meningkat- kan produksi atau bioavailabilitas beberapa vitamin dan mineral
Hasil Penelitian
serta  memperbaiki  kecernaan  protein.  Peningkatan  vitamin dalam kefir telah  diteliti  oleh  Stepaniak  dan  Fetlinski  (2002) yang  menyatakan  bahwa  kandungan  vitamin  B 1 ,  B 2 dan  asam folat pada kefir lebih tinggi dibandingkan pada susu.
Konsentrasi  peptida,  penghambatan Angiotensin  Convert- ing Enzyme (ACE), IC 50 dan Inhibition Efficiency Ratio (IER) ACE  memegang  peranan  penting  fungsi  regulasi  tekanan darah dalam tubuh. Pada kondisi abnormal, kerja ACE berlebih sehingga  dapat  menimbulkan  dampak  tekanan  darah  tinggi. Penghambatan ACE adalah salah satu cara untuk menurunkan risiko  terjadinya  tekanan  darah  tinggi.  Beberapa  jenis  peptida fungsional  yang  berperan  dalam  penurunan  tekanan  darah, absorbsi  kalsium  dan  regulasi  kolesterol  serum  darah  telah berhasil  diisolasi  dari  susu  dan  hidrolisat  kedelai  (Kim et  al. 2011). Konsentrasi peptida yang dibutuhkan untuk menghambat 50%  kerja  ACE  disebut  IC 50 .  Konsentrasi  peptida,  peng- hambatan  ACE,  IER,  dan  IC 50 ekstrak whey  kefir dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2.  Konsentrasi  peptida,  penghambatan  ACE,  Inhibition Efficiency Ratio (IER) dan IC 50 ekstrak produk whey kefir Konsentrasi Peptida (mg/mL) Penghambatan ACE (%) IC 50 (mg/mL) IER (% per mg/mL) SK 0.97±0.02 a 45.94±0.81 a 1.05±0.01 c 47.19±0.09 b WK 1.54±0.02 c 73.07±0.91 c 0.83±0.02 a 47.35±0.09 b WKB 1.25±0.02 b 57.04±1.11 b 0.96±0.01 b 45.75±0.18 a
Keterangan: Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji lanjut Tukey), n = 9
Jenis bahan baku whey yang digunakan berpengaruh nyata ( p <0.05)  pada  konsentrasi  peptida  ekstrak whey  kefir . Konsentrasi  peptida  tertinggi  dicapai  untuk  WK  (1.54±0.02 mg/mL).  Konsentrasi  peptida  tinggi  diduga  berkaitan  dengan pertumbuhan  biomassa  mikroba kefir yang  tinggi  pula  pada media whey . Sintesis protein mikroba yang berkembang selama proses  fermentasi  memberikan  kontribusi  pada  peningkatan konsentrasi peptida produk whey kefir .
Jenis bahan baku whey yang digunakan berpengaruh nyata ( p <0.05)  pada  penghambatan  ACE  ekstrak whey  kefir .  Peng- hambatan  ACE  tertinggi  dicapai  untuk  WK  (73.07±0.91%). Penghambatan  ACE  sebanding  dengan  konsentrasi  peptida whey  kefir hasil  penelitian  ini.  Peptida  bioaktif  yang  terdapat pada  WK  diduga  merupakan  peptida  yang  memiliki  sifat fungsional  menghambat  kerja  ACE.  Menurut  Quiros et  al . (2005),  potensi  terbesar  peptida  penghambat  ACE  dihasilkan dari  protein  susu  yang  difermentasi  dengan  beberapa  strain isolat Lactobacullis  helveticus atau  kombinasi  dengan  khamir Saccharomyces cereviceae . Aktivitas penghambatan ACE pada kefir berkaitan  juga  dengan  kombinasi  protein  sel  beberapa strain bakteri asam laktat dan khamir yang berkembang selama proses susu fermentasi. Hirota et al . (2007) menyatakan bahwa hidrolisat  yang  mengandung  asam  amino  Val-Pro-Pro  dan  Ile- Pro-Pro  menunjukkan  perbaikan  disfungsi endothelial  vascular pada pasien hipertensi. Saat ini, peptida antihipertensi dapat di- produksi  menggunakan  teknologi  DNA  rekombinan,  yaitu  fusi protein rekombinan diekspresikan dalam Escherichia coli , untuk
kemudian dipurifikasi dan dirombak oleh enzim proteinase dari L. helveticus terseleksi (Losacco et al. 2007). IC 50 menggambarkan  konsentrasi  peptida  yang  diperlukan untuk menghambat 50% kerja ACE. Nilai IC 50 dihitung dengan cara  memasukkan  nilai  50  pada  persamaan  linear  hubungan nilai  konsentrasi  peptida  dan  penghambatan  ACE.  Jenis whey yang  digunakan  berpengaruh  nyata  ( p< 0.05)  pada  nilai  IC 50 ekstrak whey kefir penelitian ini. IC 50 terendah dicapai untuk WK (0.83±0.02  mg/mL).  Nilai  IC 50 berbanding  terbalik  dengan  nilai IER.  Hal  tersebut  menggambarkan  bahwa  peptida  yang  ter- kandung  dalam  WK  adalah  peptida  aktif  yang  memiliki  sifat penghambatan  ACE.  Nilai  IC 50 WK  lebih  rendah  jika  di- bandingkan  dengan  SK  dan  WKB  sebab  proses  fermentasi yang  terjadi  pada  WK  menghasilkan  lebih  banyak  peptida sederhana  penghambat  ACE.  Papadimitriou et  al .  (2007) melaporkan nilai IC 50 ekstrak larut air dari yoghurt susu berkisar antara  1.49–1.62  mg/mL.  Ekstrak  larut  air  dari kefir susu kambing memiliki nilai IC 50 sebesar 0.365 mg/mL (Quiros et al. 2005).  Hasil  penelitian  Tavares et  al .  (2011)  memperlihatkan b hw   hid oli     “ whey  protein  concentrate ”  (WPC)  m miliki nilai  IC 50 sebesar  52.9±2.   μ /mL,  tetapi  fraksi  peptidanya dengan  berat  molekul  di  bawah  3  kDa  menunjukkan  nilai  IC 50 sebesar 23.6±1.  μ /mL. Ditemukan pula 3 jenis peptida yang berpotensi  sebagai  peptida  antihipertensi  diantaranya  berasal dari  α-lactalbumin  f(16–26)  dengan  sekuen  KGYGGVSLPEW yang memiliki nilai IC 50 0.80±0.  μ /mL, α-lactalbumin f(97–104) sekuen  DKVGINYW  dengan  nilai  IC 50 25.2±1.   μ /mL  dan  α- lactoglobulin f(33–42) sekuen DAQSAPLRVY dengan nilai IC 50 13.0±1.  μ /mL.
IER menggambarkan rasio efisiensi penghambatan ekstrak whey  kefir terhadap  ACE.  Nilai  IER  diperoleh  dengan  cara membagi nilai penghambatan ACE dengan konsentrasi peptida. Semakin  tinggi  nilai  IER,  maka  semakin  tinggi  tingkat  efisiensi penghambatannya terhadap ACE. Jenis whey yang digunakan berpengaruh  nyata  ( p <0.05)  pada  nilai  IER  ekstrak whey  kefir penelitian ini. IER tertinggi dicapai untuk WK (47.35±0.09% per mg/mL),  berbeda  nyata  dengan  WKB  (45.75±0.18%  per mg/mL), namun tidak berbeda nyata dengan SK (47.19±0.09% per  mg/mL).  Selain  memiliki  sifat  penghambatan  ACE  yang tinggi,  WK  juga  memiliki  IER  yang  tinggi.  Hal  tersebut menunjukkan  bahwa  peptida  yang  terkandung  dalam  WK diduga  adalah  golongan  peptida  yang  memiliki  sifat  fungsional penghambat  ACE.  Menurut  Chen et  al. (2007),  peptida  peng- hambat  ACE  dari  susu  fermentasi  tersusun  atas  tiga  asam amino  yaitu  Gly-Thr-Trp  dan  Gly-Val-Trp  dengan  nilai  IC 50 berturut–turut  0.0884  mg/mL  dan  0.185  mg/mL.  Peptida  ter- sebut  dapat  menghambat  ACE  membentuk  angiotensin  II  dan mendegradasi  bradikinin  sebagai  subtrat  kompetitif  bagi  ACE (Brown  dan  Vaughan,  1998).  Lebih  lanjut  Chen et  al .  (2007) menyatakan  bahwa  terjadi  perbedaan  nyata  tekanan  darah diastolik  yaitu  tikus  percobaan  yang  mengonsumsi  susu fermentasi selama 8 minggu dengan dosis konsentrasi peptida 5 mg/mL per hari memiliki diastolik lebih rendah.
Hasil Penelitian

## KESIMPULAN
Whey dapat  dikembangkan  menjadi  produk whey  kefir melalui  proses  fermentasi. Whey  kefir yang  diproduksi  ber- potensi  dimanfaatkan  sebagai  sumber  peptida  bioaktif  anti- hipertensi.  Jenis whey yang  digunakan  menentukan  aktivitas penghambatan ACE secara in vitro whey kefir yang diproduksi. Whey kefir yang dibuat dari whey cair segar hasil ikutan pem- buatan  keju  Gouda  menunjukkan  kualitas  penghambatan  ACE sebanding  dengan kefir berbahan  baku  susu  skim  serta  lebih baik  dibandingkan whey  kefir berbahan  baku whey bubuk komersial.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menghaturkan  penghargaan  kepada  Ibu  Dr.  Ir. Rarah  Ratih  Adjie  Maheswari,  Alm.  dari  Fakultas  Peternakan IPB,  atas  arahan,  bimbingan  dan  nasihatnya.  Terima  kasih kepada Bapak Yuny Erwanto, SPt, MP, PhD. dari Laboratorium Teknologi  Hasil  Ikutan  dan  Lingkungan,  Fakultas  Peternakan UGM atas bantuannya pada analisis pengujian penghambatan ACE.

## DAFTAR PUSTAKA
Almeida  EG,  Rachid  CCTC,  Schwan  RF.  2007.  Microbial popul  ion p    n  in    m n  d b v      „  uim‟ p odu  d by Brazilian Amerindians. Int J Food Microbiol 120: 146-151. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2007.06.020.
[AOAC]  Association  of  Official  Analytical  Chemists.  2005. Official  Methods  of  Analysis  of  AOAC  International.  18 th Edition. Gaithersburg, USA:AOAC International: 2464.
Bonisch  MP,  Huss  M,  Lauber  S,  Kulozik  U.  2006.  Yoghurt  gel formation  by  means  of  enzymatic  protein  cross-linking during microbial fermentation. J Food Hydrocolloid 21: 585- 595. DOI: 10.1016/j.foodhyd.2006.07.002.
[BSN]  Badan  Standardisasi  Nasional.  2009.  SNI  2981:2009: Yoghurt. Badan Standardisasi Nasional, Jakarta.
Chen GW, Tsai JS, Pan BS. 2007. Purification of angiotensin I- converting enzyme inhibitory peptides and antihypertensive effect  of  milk  produced  by  protease-facilitated  lactic fermentation. Int Dairy J 17: 641-647. DOI: 10.1016/j.idairyj. 2006.07.004.
Donko     ,    n ik  on  A,     ilj vi   T,  Sh h   P   2  7   α- galactosidase and proteolytic activities of selected probiotic and  dairy  cultures  in  fermented  soymilk.  Food  Chem  104: 10-20. DOI: 10.1016/j.foodchem.2006.10.065.
Farnworth  ER.  2005.  Kefir  –  a  complex  probiotic.  Food  Sci Technol Bull: Functional Foods 2: 1-17. DOI: 10.1616/1476- 2137.13938.
Fontan  MCG,  Martinez  S,  Franco  I,  Carballo  J.  2006.
Microbiological  and  chemical  changes  during  the m nu    u    o   k  i   m d     om   ow ‟  milk,  u in commercial  starter  culture.  Int  Dairy  J  16:  762-767.  DOI: 10.1016/j.idairyj.2005.07.004.
Giraffa G. 2004. Studying the dynamics of microbial populations during food fermentation. FEMS Microbiol Rev 28: 251–260. DOI: 10.1016/j.femsre.2003.10.005.
Gronnevik H, Falstad M, Narvhus JA. 2011. Microbiological and chemical  properties  of  Norwegian  kefir  during  storage.  Int Dairy J 21: 601-606. DOI: 10.1016/j.idairyj.2011.01.001.
Guimarães  PMR,  Teixeira  JA,  Domingues  L.  2010.  Fer- mentation  of  lactose  to  bio-ethanol  by  yeasts  as  part  of integrated  solutions  for  the  valorisation  of  cheese  whey. Biotechnol  Adv  28:  375–384.  DOI:  10.1016/j.biotechadv. 2010.02.002.
Hayes M, S  n on C, Sl     y  ,  ‟Sulliv n  ,  ill C, Fi z    ld GF,  Ross  RP.  2007.  Casein  fermentate  of Lactobacillus animalis DPC6134  contains  a  range  of  novel  propeptide angiotensin-converting  enzyme  inhibitors.  Appl  Environ Micrbiol 73: 4658-4667. DOI: 10.1128/AEM.00096-07.
Hirota T, Ohki K, Kawagishi R, Kajimoto Y, Mizuno S, Nakamura Y,  Kitakaze  M.  2007 . Casein  hydrolysate  containing  the antihypertensive  tripeptides  Val-Pro-Pro  and  Ile-Pro-Pro improves vascular endothelial function independent of blood pressure-lowering  effects:  contribution  of  the  inhibitory action of angiotensin-converting enzyme. Hypertens Res 30: 489–496. DOI: 10.1291/hypres.30.489.
Iličić MD, Caric MD, Milanovic SD, Dokic LP, Duric MS. Bosnjak GS,  Durakovic  KG.  2008.  Viscosity  changes  of  probiotic yoghurt  with  transglutaminase  during  storage.  Acta Periodica Technol 39: 1-19. DOI: 10.2298/APT0839011I.
Irigoyen  A,  Arana  I,  Castiella  M,  Torre  P,  Ibanez  FC.  2005.
Microbiological,  physicochemical,  and  sensory  charac- teristics  of  kefir  during  storage.  Food  Chem  90:  613-620. DOI: 10.1016/j.foodchem.2004.04.021.
Ismaiel  AA,  Ghaly  MF,  El-Naggar  AK.  2011.  Some physicochemical analyses of kefir produced under different fermentation conditions. J Sci Indust Res 70: 365-372.
Kesenkas H, Dinkci N, Seckin K, Kinik O, Gonc S, Ergonul PG, Kavas  G.  2011.  Physicochemical,  microbiological,  and sensory characteristics of soymilk kefir. Afr J Microbiol Res 5: 3737-3746. DOI: 10.5897/AJMR11.579.
Kim YK, Lim CW, Yeun SM, Lee MH, Moon HS, Cho HA, Yoon NY,  Yoon  DH,  Park  HY,  Lee  DS.  2011.  Dipeptide  (Tyr-Ile) acting  as  an  inhibitor  of  Angiotensin-I-Converting  Enzyme (ACE)  from  the  hydrolysate  of  jellyfish Nemopilema nomurai .  Fish  Aquat  Sci  14:  283-288.  DOI:  10.5657/FAS. 2011.0283.
Losacco  M,  Gallerani  R,  Gobbetti  M,  Minervini  F,  De  Leo  F. 2007. Production of active angiotensin-I converting enzyme inhibitory  peptides  derived  from  bovine  beta-casein  by recombinant DNA technologies. Biotech J 2: 11 1425–1434.
Madureira  AR,  Tavares  T,  Gomes  AMP,  Pintado  ME,  Malcata FX.  2010.  Invited  review:  physiological  properties  of bioactive peptides obtained from whey proteins. J Dairy Sci 93: 437–455. DOI: 10.3168/jds.2009-2566.
Magalhaes  KT,  Pereira  GVM,  Dias  DR,  Schwan  RF.  2010. Microbial  communities  and  chemical  changes  during fermentation  of  sugary  Brazilian  kefir.  World  J  Microbiol
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Biotechnol 26: 1241–1250. DOI: 10.1007/s11274-009-0294- x.
Magalhaes  TM,  Dragone  G,  Pereira  GVM,  Oliveira  JM, Domingues L, Teixeira JA, e Silva JBA, Schwan RF. 2011. Comparative study of the biochemical changes and volatile compound formations during the production of novel whey- based kefir beverages and traditional milk kefir. Food Chem 126: 249–253. DOI: 10.1016/j.foodchem.2010.11.012.
Maturin  L,  Peeler  JT.  2001.  Aerobic  Plate  Count.  BAM (Bacteriological  Analytical  Manual),  Chapter  3.  Food  and Drug Administration.
Ong  L,  Shah  NP.  2008.  Release  and  identification  of angiotensin-converting  enzyme-inhibitory  peptides  as influenced by ripening temperatures and probioticts adjuncts in cheddar cheeses. LWT-Food Sci Technol 41: 1555-1566. DOI: 10.1016/j.lwt.2007.11.026.
Ozer  BH,  Kirmaci  HA.  2010.  Functional  milks  and  dairy beverages.  Int  J  Dairy  Technol  63:  1–15.  DOI: 10.1111/j. 1471-0307.2009.00547.x.
Papadimitriou  CG,  Mastrojiannaki  AV,  Silva  SV,  Gomes  AM, Malcata FX, Alichanidis SV. 2007. Identification of peptides in  traditional  and  probiotic  sheep  milk  yoghurt  with angiotensin  I-converting  enzyme  (ACE)-inhibitory  activity. Food  Chem  105:  647-656.  DOI:  10.1016/j.foodchem.2007. 04.028.
Purnomo  H,  Muslimin  LD.  2012.  Chemical  characteristics  of pasteurised goat milk kefir prepared using different amount of  Indonesian  kefir  grains  and  incubation  times.  Int  Food Res J 19: 791-794.
Quiros A, Hernandez-Ledesma B, Ramos M, Amigo L, Recio I. 2005.  Angiotensin-converting  enzyme  inhibitory  activity  of peptides  derived  from  caprine  kefir.  J  Dairy  Sci  88:  3480- 3487. DOI: 10.3168/jds.S0022-0302(05)73032-0.
Tavares  T,  Contreras  MM,  Amorim  M,  Pintado  M,  Recio  I, Malcata  FX.  2011.  Novel  whey-derived  peptides  with inhibitory  effect  against  angiotensin-converting  enzyme:  In vitro  effect  and  stability  to  gastrointestinal  enzymes. Peptides  32:  1013-1019.  DOI:  10.1016/j.peptides.2011. 02.005.