Skrining Senyawa Antibakteri dari Minyak Atsiri Rimpang Temu Kunci ( Boesenbergia pandurata ) terhadap Staphylococcus aureus dengan Metode Bioautografi Kontak
Indah Christiana dan Lisa Soegianto*

## Fakultas Farmasi, Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya, Indonesia
Rimpang temu kunci di masyarakat umumnya digunakan sebagai obat rematik, radang lambung, radang selaput lendir,  peluruh  air  seni,  malaria,  gangguan  usus  besar,  perut  kembung,  penyakit  kulit, diare, sariawan, dan cacingan. Minyak atsiri yang terdapat pada rimpang temu kunci umumnya digunakan sebagai antibakteri. Tujuan dari  penelitian  ini  adalah  menentukan  ada  daya  antibakteri  minyak  atsiri  rimpang  temu  kunci  terhadap Staphylococcus  aureus dan  golongan  senyawa  dalam  minyak  atsiri  rimpang  temu  kunci  ( Boesenbergia pandurata )  yang  mempunyai  aktivitas  antibakteri  terhadap Staphylococcus  aureus dengan  metode  bioautografi kontak. Minyak atsiri rimpang temu kunci diperoleh dengan metode destilasi Stahl. Penentuan golongan senyawa berkhasiat dilakukan dengan uji bioautografi kontak dan dianalisa menggunakan  skrining  fitokimia anisaldehid asam  sulfat dan vanillin  sulfat .  Hasil  penetapan  kadar  minyak  atsiri  dengan  destilasi  Stahl  diperoleh  kadar minyak  atsiri  rimpang  temu  kunci  segar  sebesar  0,38%.  Hasil  pengujian  bioautografi  kontak  menunjukkan golongan monoterpen yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus .
Kata kunci: Temu    kunci    ( Boesenbergia    pandurata ),   minyak    atsiri,   aktivitas     antibakteri, Staphylococcus aureus, bioautografi kontak

## Antibacteria Compound Screening of Fingerroot

## ( Boesenbergia pandurata ) Essential Oil against Staphylococcus aureus with The Contact Bioautography Method
Fingerroot  are  generally  used  as  a  remedy  for  rheumatism,  gastroenteritis,  mucositis,  diuretic,  malaria,  bowel disorders,  flatulence,  skin  diseases,  diarrhea,  mouth  sores,  and  intestinal  worms.  Essential  oils  found  in Fingerroot are generally used as antibacterial. The purpose of this study is to determine the antibacterial activity of Fingerroot  essential  oils  against Staphylococcus  aureus and  to  determine  the  antibacterial  compound  of Fingerroot essential oils ( Boesenbergia pandurata ) using contact biautography methods. Fingerroot essential oil was obtained by the Stahl distillation method. Determination of the class of efficacious compounds was carried out  by  contact  bioautography  method  and  anisaldehyde-sulfuric  acid  and  vanillin  sulfate  were  used  as  spray reagent. The Fingerroot essential oil yields 0.38% and monoterpenes was determined as an antibacterial agent against Staphylococcus aureus .
Keywords:    Fingerroot    ( Boesenbergia    pandurata ),    essential    oil,    antibacterial    activity, Staphylococcus aureus, contact bioautography.
*Corresponding author: Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya, Jl. Raya Kalisari Selatan No. 1 Surabaya, e-mail: lisa.soegianto@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Sumber  utama  infeksi Staphylococcus aureus adalah  pada  luka  -  luka  yang  terbuka, benda - benda yang terkontaminasi luka tersebut, serta  saluran  napas  dan  kulit  manusia  (Jawetz, Melnick  dan  Adelburg,  2001).  Indonesia  kaya akan  sumber  bahan  obat  alam  dan  obat tradisional  yang  telah  digunakan  oleh  sebagian besar  rakyat  Indonesia  secara  turun  temurun. Pada  umumnya  minyak  atsiri  yang  terdapat dalam  rimpang  temu  kunci  adalah  yang berkhasiat  sebagai  antimikroba  (Heyne,  2006). Temu  kunci  di  masyarakat  digunakan  sebagai obat,  yaitu  untuk  mengobati  rematik,  radang lambung,  radang  selaput lendir, u n t u k peluruh air seni, u n t u k m e n g o b a t i malaria,  ganguan  usus  besar,  perut  kembung, penyakit  kulit,  diare,  sariawan,  dan  cacingan (Rukmana, 2008). Penggunaan minyak atsiri dari bahan  alam  sebagai  obat  semakin  diminati masyarakat,  seiring  dengan  gerakan  kembali  ke alam ( back to  nature ) yang  dilakukan masyarakat.    Minyak    atsiri    dikenal    dengan nama    minyak    eteris    atau  minyak  terbang ( essential oil, volatile ) yang merupakan salah satu hasil  metabolisme  sekunder  pada  tanaman. Minyak atsiri bersifat mudah menguap pada suhu kamar,  mempunyai  rasa  getir,  berbau  wangi sesuai  dengan  bau  tanaman  penghasilnya  dan larut dalam pelarut organik dan tidak larut dalam air (Sudaryani dan Sugiharti, 1990).
Dari hasil  penetapan  kadar  minyak  atsiri dengan    alat Stahl diperoleh  kadar  minyak atsiri  rimpang  temu  kunci  segar  sebesar  0,19% v/b  dan  dianalisis  menggunakan  GC-MS  hasil menunjukkan minyak atsiri temu kunci ( Boesenbergia  pandurata )  yang  diperoleh  dari rimpang  temu  kunci  segar  menunjukkan  31 komponen  dan  terdapat  11  senyawa  sebagai komponen utama yaitu: kamfor 21,20%, 1,8-sineol 14,83%, nerol 10,48%, metil sinamat8,28%, trans- β-osimen  8,22%,  kamfen  6,83%,  sitral  5,12%, limonen  4,39%,  kamfen  hidrat  4,18%,  linalool 3,91%,  z-sitral  2,39%  (Simbolon,  2014).  Fraksi etanol  rimpang  temu  kunci  ( Boesenbergia pandurata )  mempunyai  aktivitas  antibakteri terhadap Salmonella  typhi menghasilkan  harga KBM  2%  sedangkan  terhadap Streptococcus hemolytic  α  -  non  pneumoniae menghasilkan harga  KBM 3% (Harlianti, Kuswandi dan  Iravati, 2011).  Nurhayati  (2015)  menyatakan  bahwa ekstrak metanolik Boesenbergia rotunda memperlihatkan  potensi  aktivitas  antibakteri  dan antispora  terhadap  sel  vegetatif  serta  spora Bacillus cereus dan Bacillus subtilis.
Bioautografi    adalah    suatu    cara    untuk mengetahui  aktivitas  senyawa   antimikroba  dan antifungi    dengan    menggunakan    kromatografi planar    (Kusumaningtyas,    Astuti    d a n Darmono,  2008).    Menurut    Mardiyah et  al. (2011)    menggunakan    metode  bioautografi kontak setelah 30 menit dan diinkubasi pada suhu 37°C  selama  24  jam,  terbentuk  zona  hambatan
pada  lempengan  KLT  yang  dikontakkan  pada lempengan  agar.  Pada  penelitian  ini  akan ditentukan  ada  atau  tidaknya  daya  antibakteri minyak  atsiri  dari  rimpang  temu  kunci ( Boesenbergia
pandurata ) terhadap Staphylococcus  aureus dan  golongan  senyawa dalam  minyak  atsiri  Temu  kunci  ( Boesenbergia pandurata )    yang    mempunyai    aktivitas antibakteri    terhadap Staphylococcus    aureus dengan metode bioautografi kontak.

## METODE PENELITIAN

## Alat
Alat  destilasi  Stahl,  inkubator  ( Memmert, Germany ), autoclave ( All    American,    model 25X ),    lemari    es  ( Hitachi    R-528H,    Japan ), penangas    air,    oven    ( Memmert,  Germany ), timbangan    analitik    ( Shimadzu  Electronic Balance  Ex-200A,  Kyoto,  Japan ),  mikroskop monokuler  dan  perlengkapannya  ( Carlton, Jerman ), lemari aseptis, lemari asam, mikropipet ( Eppendorf  pipette  20  μl  &  Socorex,  No.381.05, Switzerland ),  termometer,  jangka  sorong  ( Tricle Brand,  China ),  Bunsen,  spiritus  brander,  cawan petri (Iwaki,  Japan )    diameter  15  cm,    kawat inokulasi,  perforator,  pinset,  pipa  kapiler  5  μl, Bejana kromatografi ( Camag, Swiss ), refraktometer  Abbe,  lampu  UV  254  nm  dan  366 nm.

## Bahan
Media Mueller  Hinton  Agar (MHA) ( Merck,  Germany ),  Media Mueller  Hinton Broth (MHB) ( Merck, Germany ), tetrasiklin HCl, DMSO( Merck,  Germany ), Plat silika gel 60 F254 ( Merck,  Germany ), anisaldehid  asam  sulfat dan vanillin sulfat .

## Bakteri Uji
Staphylococcus   aureus ATCC   6538   yang didapat    dari    Laboratorium    Mikrobiologi Farmasi  Fakultas  Farmasi  Universitas  Katolik Widya Mandala Surabaya.

## Tahapan Penelitian
Pengamatan   Makroskopik   Dan   Mikroskopik Temu   kunci   (Boesenbergia   pandurata) Rimpang  temu  kunci  ( Boesenbergia  pan- durata )  yang  digunakan  diperoleh  dari  per- kebunan   desa Kalisari, kecamatan Randublatung Kabupaten  Blora,  Jawa  Tengah.  Pemeriksaan makroskopis  dilakukan  dengan  cara  temu  kunci diperiksa  secara  organoleptis  terdiri  dari pengamatan terhadap warna, bau, rasa, serta ciri - ciri  morfologisnya.  Pengamatan  mikroskopik dilakukan  melalui  pengamatan  penampang melintang  dari  temu  kunci  dan  diamati  bagian- bagian yang spesifik.

## Ekstraksi Minyak Atsiri Temu Kunci
Temu  kunci  yang  masih  segar  diekstraksi dengan  menggunakan  destilasi  stahl,  sebanyak 300 gram  temu  kunci  yang telah  dipotong kecil  -
kecil dimasukkan ke dalam labu destilasi. Setelah semua  bahan  masuk,  tambahkan  akuades  2/3 volume  labu  alas  bulat  1000  ml  atau  hingga seluruh bahan terendam kemudian labu dipanaskan. Selama 6 jam alat destilasi dijalankan hingga  seluruh  minyak  atsiri  dalam  temu  kunci terdestilasi.  Minyak  atsiri  kemudian  ditampung dan  dipisahkan  dari  air.  Tambahkan  natrium sulfat  anhidrat  untuk  mengikat  sisa-sisa  air  pada minyak  atsiri  temu  kunci.  Setelah  terpisah  dari air,  volume  minyak  diukur  dan  ditentukan persentase rendemennya.

## Spesifikasi Minyak Atsiri Temu kunci
a.   Pengamatan organoleptis Pengamatan    organoleptis    minyak    atsiri Temu    kunci    meliputi    warna,    bau    dan    rasa (Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia, 2000).
b.   Penetapan indeks bias Penentuan  indeks  bias  dilakukan  dengan menggunakan    alat    refraktometer    Abbe    (De- partemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000).
20 D N = t d N + 0,00041 (t - 20 )
Dimana : 20 D N =     indeks bias pada suhu 20ο C.
t d N =     indeks bias yang teramati pada t (suhu ruang).
c.   Pemeriksaan kelarutan
Hasil  pemeriksaan  kelarutan  minyak  atsiri rimpang  temu  kunci  ( Boesenbergia pandurata ) dalam  alkohol 70% adalah 1:2 dan dalam alkohol 96% adalah 1:1 (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000; Guenther,1952).
Pembuatan  Suspensi  Bakteri  Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus yang telah mencapai  pertumbuhan  optimal,  berumur  24 jam  pada  media  MHA  miring  dibuat  suspensi pada media cair steril MHB sebanyak 5 ml dengan mengambil sedikit dari koloni mikroorganisme uji dengan  kawat  ose  steril,  kemudian  diinokulasi pada media cair steril, divortex sampai homogen, dilakukan penyetaraan kekeruhan bakteri dengan larutan  ½ Mc  Farland I.  Suspensi  bakteri  yang mempunyai  kekeruhan  setara  dengan  larutan  ½ Mc Farland I diperkirakan memiliki populasi 1,5 x 108 CFU/ml (Lorian, 1991).

## Pelaksanaan Metode Bioautografi kontak
Lempengan  agar  dibuat  dari  25  ml  media MHA diinokulasi dengan 0,25 ml suspensi bakteri Staphylococcus  aureus yang  setara  dengan  ½ McFarland  I  (1,5  x  10 8 CFU/ml)  dan  di prainkubasi  selama  1,5-2  jam.  Minyak  atsiri rimpang  temu  kunci  ( Boesenbergia  pandurata ) dilakukan  kromatografi  lapis  tipis  dengan  fase diam  plat  silika  gel  60  F254  dan  fase  gerak n -
heksan  :  etil  asetat  (8:2)  kemudian  plat  KLT dihilangkan fase geraknya dan dikontakkan ke ke lempengan  agar  selama  30  menit.  Inkubasi lempengan  agar  pada  suhu  37°C  selama  24  jam. Amati zona bening yang ada pada lempengan agar tempat dimana plat KLT di kontakkan .
Penentuan  Golongan  Senyawa  Antibakteri  pada Minyak Atsiri
Larutan  minyak  atsiri  dengan  konsentrasi 20000  ppm  (2%)  dan  eugenol  10000  ppm  (1%), ditotolkan  dengan  volume  5  μl  pada  lempeng Silika  60  F254  berukuran  10  cm  ×  4  cm  dan dieluasi dengan fase gerak adalah n -heksana : etil asetat dengan perbandingan masing-masing 8 : 2. Noda  yang  dihasilkan  diamati  dengan  sinar  UV 254  nm  dan  366  nm.  Penentuan  golongan senyawa  minyak  atsiri  yang  memiliki  aktivitas antibakteri Staphylococcus  aureus dilakukan dengan menggunakan skrining fitokimia penampak  noda anisaldehid  asam  sulfat dan vanilin sulfat berdasarkan warna yang ditimbulkan. Penampak noda disemprotkan pada plat  KLT  hasil  eluasi,  kemudian  diamati perubahan  warna  dan  dibandingkan  harga Rf ( Retention factor ) nya dengan Daerah Hambatan Pertumbuhan  (DHP)  hasil  bioautografi  kontak terhadap Staphylococcus  aureus, bila  terdapat noda  senyawa  yang  sama  harga Rf nya  dengan hasil  bioautografi kontak  maka   senyawa tersebut dapat  diduga  memiliki  aktivitas  antibakteri terhadap bakteri uji. Penentuan jenis senyawayang  berkhasiat  ditinjau  dari  harga Rf dan  perubahan  warna  pada  hasil  penyemprotan penampak  noda anisaldehid  asam  sulfat dan vanilin sulfat .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Minyak  atsiri  yang  diperoleh  dari  destilasi Stahl ditentukan karakteristiknya dengan pengamatan  sifat  fisika  minyak  atsiri  untuk mengetahui  mutu  dari  minyak  atsiri  hasil  isolasi menggunakan  alat  destilasi  Stahl  ( steam  - water  destilation ).  Standarisasi  spesifik  sifat fisika  kimia  minyak  atsiri  meliputi  pengamatan organoleptis,  penetapan  indeks  bias,  dan kelarutan. Secara organoleptis minyak atsiri temu kunci  berwarna  jernih  kekuningan,  berbau  khas temu  kunci,  memiliki  rasa  getir.  Penetapan kelarutan  diperoleh  hasil  dalam  alkohol  70% kelarutan 1 : 2 dan dalam alkohol 96% kelarutan 1 :  1  pada  penetapan  kelarutan  minyak  atsiri  temu kunci  sesuai  dengan  pustaka  (Standar  Nasional Indonesia,  2001)  yaitu  dalam  alkohol  70% kelarutan 1 : 2 dan dalam alkohol 96% kelarutan 1 :  1.  Hasil  indeks  minyak  atsiri  temu  kunci  yaitu 1,4806  yang  dihasilkan  dari  penentuan  dengan menggunakan alat refraktometer Abbe.
Pada  pengujian  bioautografi  dapat    dili- hat    adanya    penghambatan    pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus oleh minyak  atsiri temu  kunci.  Hal  tersebut  diamati  dengan terbentuknya    Daerah    hambatan    pertumbuhan
(DHP)  yang  ditandai  adanya  zona  jernih  pada media MHA yang kontak dengan noda hasil eluasi minyak  atsiri  rimpang  temu  kunci,  terdapat  tiga Daerah  Hambatan  Pertumbuhan  (DHP)  yang terbentuk pada kromatogram bioautografi (gambar  1).  Penentuan  golongan  senyawa  aktif dari  minyak  atsiri  temu  kunci  yang  dilakukan dengan  menggunakan  penampak  noda,  yaitu anisaldehid  asam  sulfat  dan  vanillin  sulfat . Menurut  Wagner  dan  Bladt  (1996), anisaldehid asam  sulfat  dan  vanilin  sulfat merupakan  salah satu  pereaksi  yang  universal  yang  digunakan untuk  identifikasi  golongan  senyawa  kimia komponen  minyak  atsiri.  Noda  minyak  atsiri temu  kunci  yang  memiliki  aktivitas  antibakteri terhadap Staphylococcus  aureus yang di semprot dengan anisaldehid asam sulfat pada Rf 0,18, Rf 0,61  dan Rf 0,73  menunjukkan  penampak  noda berwarna  ungu  yang  menunjukkan  golongan monoterpene  (gambar  1,  tabel  1).  Pereaksi semprot anisaldehid asam sulfat akan menunjukkan perubahan warna senyawa monoterpen  alkohol  dan  esternya,  sineol,  sitral, aldehid,  sitronelal  menjadi  biru  atau  biru – ungu pada  sinar  tampak  (Wagner  dan  Bladt,  1996; Wagner, Bladt dan   Zgainski, 1984). Noda minyak atsiri  temu  kunci  yang  memiliki  aktivitas antibakteri  terhadap Staphylococcus  aureus setelah  disemprot  dengan  penampak  noda Vanillin  sulfat dengan  harga Rf 0,18, Rf 0,61, dan Rf 0,73  menunjukkan  noda  yang  berwarna ungu  yang  berarti    terdapat    adanya    golongan monoterpen (gambar 1, tabel 1).
Pereaksi vanillin  sulfat digunakan  untuk deteksi  senyawa  terpenoid,  steroid,  komponen minyak  atsiri  seperti  senyawa  alkohol  dan  fenol,
hasil positif ditunjukkan dengan perubahan warna bercak  menjadi  biru,  hijau,  merah  atau  coklat  di bawah  sinar  tampak  (Wagner  dan  Bladt,  1996; Wagner,  Bladt  dan  Zgainski,  1984).  Berdasarkan penampak  noda anisaldehid  asam  sulfat dan vanillin  sulfat menunjukkan  golongan  senyawa monoterpen.  Monoterpen  merupakan  senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari dua satuan isoprena  dan  dengan  rumus  empiris  C10H16. Monoterpen  dapat  berupa  hidrokarbon  tidak jenuh  atau  dapat  mempunyai  gugus  fungsi,  dan berupa alkohol, aldehid atau keton (Padmawinata, 1995).  Menurut  Mekanisme  kerja  minyak  atsiri yang  mengandung  senyawa  monoterpen  dalam membunuh bakteri adalah dengan cara mengubah permeabilitas  membran  sel,  menghilangkan  ion  - ion  dalam  sel,  menghalangi  proton  -  pump,  dan menurunkan  produksi  adenosin  trifosfat  (ATP). Minyak  atsiri  bersifat  lipofilik  yang  dapat melewati  dinding  bakteri  karena  dinding  bakteri terdiri  atas  polisakarida,  asam  lemak,  dan fosfolipid. Hal ini dapat mengakibatkan kerusakan dinding sel sehingga dapat membunuh bakteri.  Mekanisme  kerja  minyak  atsiri  adalah dengan  menghambat  stabilitas  membran  sel bakteri  dan  menyebabkan  material  sitoplasma menghilang (Cowan, 1999).

## KESIMPULAN
Kandungan  dalam  minyak  atsiri  rimpang temu  kunci  ( Boesenbergia  pandurata )  yang mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus adalah golongan monoterpen.
Gambar 1. Hasil uji minyak atsiri temu kunci ( Boesenbergia pandurata )
(a) pada KLT bioautografi (b)  pada UV 254 nm, (c)  pada UV 366 nm, (d) plat KLT yang disemprot dengan penampak bercak anisaldehid-asam sulfat dan (e) plat KLT yang disemprot dengan penampak bercak vanilin sulfat ; TK: Temu Kunci; E: Eugenol
Tabel 1. Hasil pengamatan harga Rf pada Kromatografi Lapis Tipis minyak atsiti temu kunci
(Boesenbergia pandurata)
Harga Rf Sebelum penyemprotan Sesudah penyemprotan DHP - KLT bioau- tografi UV 254 nm UV 366 nm Penampak bercak anesaldehid asam sulfat Penampak bercak Vanilin sulfat T.K E T.K E T.K E T.K E 0,00 –0,10 0,06 (u) 0,06 (u) 0,11 –0,20 0,18 0,18 0,18 (u) 0,12 (b) 0,18 (u) 0,15 (b) 0,21 –0,30 0,25 0,21 (u) 0,25 (u) 0,31 –0,40 0,41 –0,50 0,43 (u) 0,43 (h) 0,51 –0,60 0,52 (h) 0,58 (ck) 0,61 –0,70 0,61 0,61 0,62 0,61  0,62 0,61 (u) 0,61 (u) 0,71 –0,80 0,73 0,73 0,73 (u) 0,73 (u) 0,81 –0,90 0,80 0,87 (u) 0,87 (u) 0,91 –1,00 0,93 Keterangan:  T.K  : Temu kunci; E : Eugenol; b: biru; h : hijau; ck: coklat kekuningan ; u : ungu

## DAFTAR PUSTAKA
Cowan,  M.M.  1999.  Plant  Products  as  Antimicrobial  Agents, Clinical  Microbiology  Reviews . 12(4): 564-82.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar  Umum  Ekstrak  Tumbuhan Obat , cetakan  I, Jakarta, hal. 11-12, 67.
Guenther, E. 1952. The Essential Oil , 5 th ed, Krieger Publ. Co, Malabar. hal 130-131.
Harlianti,  Mariska  S.,  Kuswandi,  dan  Iravati,  S.  2011. Aktivitas  antibakteri  fraksi  etanol  temu  kunci  ( Boesenbergia pandurata )  terhadap Salmonella  typhi dan Streptococcus hemolytic α non pneumonia.  Jurnal pharmacon. 12(2):65-68.
Heyne,  K.,  2006. Tumbuhan  Berguna  Indonesia Jilid  I. Jakarta: Yayasan Sarana wana jaya.
Jawetz,    E.,    Melnick,    J.    L.,    dan    Adelberg,    E.    A.    2001, Mikrobiologi    Kedokteran ,    (Bagian  mikrobiologi  Fakultas Kedokteran  Universitas  Airlangga,  penerjemah),  Penerbit Salemda Medika, Jakarta, pp. 316-350.
Kusumaningtyas,  E.,  Astuti,  E.,  Darmono.  2008.  Sensitivitas Metode  Bioautografi  Kontak  dan Overlay dalam   Penentuan Senyawa  Antikapang, Jurnal  Ilmu  Kefarmasian  Indonesia , 6(2):75-79.
Lorian,  V.  1991 .  Antibiotics  in  Laboratory  Medicine ,  3 rd edition.  The  Williams  &  Wilkins  Company,  Baltimore,  pp. 12, 18.
Mardiyah Mustary, M.Natsir  Djide,  Ilham  Mahmud,  Nursiah Hasyim.    2011,  Uji  aktivitas  hambat  dan  analisis  KLT bioautografi perasan  buah  sawo  manila  ( Achras  zapota  linn )
terhadap bakteri  uji Salmonella thyposa, Jurnal  MKMI . 7(I): 3-4.
Nurhayati,   P.   2015.   Potensi   aktivitas   antibakteri   ekstrak temukunci  ( Boesenbergia    rotunda )  terhadap  sel  vegetative serta  spora Bacillus  cereus dan Bacillus        subtilis , Jurnal Universitas    Pendidikan Indonesia . 11(2):7-9.
Padmawinata,  K. 1995. Pengantar  Kromatografi ,  Edisi  ke- 2,    ITB,    Bandung, Terjemahan: Introduction  to Chromatografi ,  Gritter,  R.J.,  Bobbitt,  J.M.,  and  Schwarting, A.E., 1985, Holden Day Inc, USA. hal. 109-175.
Rukmana,  R.  2008. Temu-temuan  Apotik  Hidup  di Perkarangan . Kanisius. Yogyakarta. Standar Nasional Indonesia. 2001. Minyak daun cengkeh[online].http://Pasarargo.com. diakses pada 4 Januari 2017.
Simbolon,  K.  S.  2014.  Isolasi  dan  analisis  komponen  minyak atsiri  rimpang  temu  kunci  ( Boesenbergia  rotunda (L.) Mansf.)   secara   segar   dan   kering  secara    GC-MS, Skripsi , Sarjana Farmasi, Universitas Sumatra Utara.
Sudaryani,  T.  dan  Sugiharti,  E.  1990. Budiaktivitas  dan Penyulingan Nilam . Penebar Swaaktivitas, Jakarta.
Wagner,  H.  dan  Bladt,  S.  1996. Plant  Drug  Analysis:  A Thin  Layer  Chromatography  Atlas, Second edition , Springer Science, Munchen.
Wagner,   H.,   Bladt,   S.,   dan  Zgainski,   E.M.   1984. Plant Drug    Analysis;    A    Thin    Layer  Chromatography  Atlas , Second  edition,  Springer-Verlag  Berlin  Hiedelberg,  New York; 23-26.