ISSN: 1410-8917
e-ISSN: 2597-9914
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (3) (2017): 123-129
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi

## Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Flavonoid dari Ekstrak Etanol Daun Johar ( Senna siamea Lamk)
Dita Widia Ningrum a* , Dewi Kusrini a , Enny Fachriyah a
a Organic Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: ditawidian@gmail.com A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t Keywords: Johar leaves, Flavonoids, Antioxidant This research is conducted about the isolation flavonoid compounds from ethanol extract of  johar  leaves (Senna  siamea Lamk)  and  antioxidant  activity  test.  This  study  aims  to obtain flavonoid isolate, identify and test the antioxidant activity of flavonoid isolate from ethanol extract of johar leaves. Research methods divided into four stages, the first stage is  isolation  of  flavonoid  compounds.  The  second  stage  is  the  separation  of  flavonoid compounds using vacuum liquid chromatography, gravitational column chromatography and preparative thin layer chromatography. The third stage is identification of flavonoid isolate using UV-Vis spectrophotometer and FTIR. The fourth stage is antioxidant activity test  by  DPPH  method.  The  result  of  flavonoid  isolation  was  found  flavonoid  isolate weighing  0.006  gram  (0.004%).  Identification  of  flavonoid  isolate  using  UV-Vis spectrophotometer  showed  that  flavonoid  isolate  has  the  basic  structure  of  flavon compound with maximum absorption at wavelength band I (350 nm) and band II (255 nm and 267 nm) and analysis using FTIR showed flavonoid isolate has functional groups such as O-H, C-H aliphatic, C=O, C=C aromatic, C-O ether and C-O alcohol so that the flavonoid isolate  has  the  basic  structure  of  the  substituted  luteolin  compound.  The  result  of antioxidant activity from flavonoid isolate showed IC50 value is 139.8373 mg / L.
.

## A b s t r a k
Kata kunci: Daun johar, Flavonoid, Antioksidan Telah  dilakukan  penelitian  tentang  isolasi  senyawa  flavonoid  dari  ekstrak  etanol  daun johar (Senna siamea Lamk) serta uji aktivitas antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat flavonoid, mengidentifikasi dan menguji aktivitas antioksidan isolat flavonoid dari ekstrak etanol daun johar. Metode penelitian dibagi menjadi empat tahap, tahap  pertama  yaitu  isolasi  senyawa flavonoid.  Tahap  kedua  yaitu  pemisahan  senyawa flavonoid  menggunakan  kromatografi  cair  vakum,  kromatografi  kolom  gravitasi  dan kromatografi  lapis  tipis  preparatif.  Tahap  ketiga  yaitu  identifikasi  isolat  flavonoid menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  dan  FTIR.  Tahap  keempat  adalah  uji  aktivitas antioksidan  dengan  metode  DPPH.  Hasil  isolasi  flavonoid  didapatkan  isolat  flavonoid seberat  0,006  gram  (0,004%).  Identifikasi  isolat  flavonoid  dengan  menggunakan spektrofotometer UV-Vis menunjukkan bahwa isolat flavonoid memiliki struktur dasar senyawa flavon dengan serapan maksimum pada panjang gelombang pita I (350 nm) dan pita  II  (255  nm  dan  267  nm)  dan  analisis  menggunakan  FTIR  menunjukkan  isolat flavonoid memiliki gugus fungsi O-H, C-H alifatik, C=O, C=C aromatik, C-O eter dan C-O alkohol sehingga diduga isolat flavonoid memiliki struktur dasar senyawa luteolin yang tersubstitusi. Hasil uji aktivitas antioksidan isolat flavonoid menunjukkan IC50 sebesar 139,8373 mg/L.

## 1. Pendahuluan
Indonesia  merupakan  negara  yang  terletak  di kawasan tropis yang terkenal dengan kekayaan alamnya yaitu terdapat berbagai jenis tumbuhan yang berkhasiat obat. Keampuhan pengobatan secara tradisional banyak dibuktikan  melalui  berbagai  pengalaman.  Salah  satu tanaman yang digunakan dalam pengobatan tradisional adalah  tanaman Senna  siamea Lamk  atau  yang  dikenal sebagai  tanaman  Johar[1].  Tanaman  johar  telah digunakan  secara  tradisional  sebagai  obat  penyakit kuning, sakit perut, nyeri haid, dan juga digunakan untuk mengurangi  kadar  gula  dalam  darah  [2].  Ekstrak  daun johar  dilaporkan  memiliki  bioaktivitas  sebagai antimalaria,  antioksidan  [1],  antibacterial  [3]  dan antidiabetes  [4].  Penelitian  lain  melaporkan  dalam ekstrak metanol, etanol, dan etil asetat dari daun johar mengandung  senyawa-  senyawa  metabolit  sekunder yaitu  alkaloid,  flavonoid,  saponin,  tanin,  fenol, antrakuinon, antosianin, dan glikosida jantung [5]. Jenis flavonoid yang berhasil diisolasi dari ekstrak etanol daun johar  adalah  luteolin  [6].  Uji  aktivitas  antioksidan  dari isolat flavonoid ekstrak etanol daun johar belum banyak dilakukan.  Oleh  karena  itu,  pada  penelitian  ini  akan dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid dari ekstrak etanol daun johar serta uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH.

## 2. Metode Penelitian

## Bahan dan alat
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu daun johar (Senna siamea Lamk), etanol 96%, etil asetat teknis, n-heksana teknis, eter teknis, butanol teknis, etil asetat  p.a.  (Merck),  etanol  p.a.  (Merck),  n-heksana  p.a. (Merck),  akuades,  asam  klorida  2  N  (Merck),  besi  (III) klorida  p.a.,  serbuk  magnesium,  pereaksi  Dragendorf, pereaksi  Meyer,  pereaksi  Libermann-Buchard,  amil alkohol, amoniak 25% (Merck), kloroform p.a. (Merck), besi  (III)  klorida  1%,  asam  sulfat  pekat  10%  (Merck), metanol  p.a.  (Merck),  plat  KLT  silika  gel  60  GF254 (Merck), plat KLT silika gel F254 20x20 cm tebal 2,0 mm (Merck), silika gel 60 GF (Merck), silika gel 60 H (Merck), DPPH (1,1-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (Sigma-Aldrich), dan kuersetin (Sigma-Aldrich).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari erlenmeyer, pipet tetes, gelas beker, corong gelas, corong pisah,  botol  vial,  pipa  kapiler,  tabung  reaksi,  pengaduk kaca, penangas air, cawan penguap, wadah pengembang, blender,  kertas  saring,  lampu  detektor  UV  254  nm  dan 365 nm (CAMAG UV Cabinet 4), rotary vaccum evaporator (Buchi-B480),  satu  set  alat  kromatografi  cair  vakum, satu  set  alat  kromatografi  kolom  gravitasi,  neraca analitik (Kern-870), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV- 1280), FTIR (Perkin Elmer 10.4.00).

## Preparasi dan Penapisan fitokimia
Sampel penelitian berupa daun johar yang diperoleh dari  daerah  Purworejo.  Daun  johar  yang  diperoleh dibersihkan, dikeringkan dan dihaluskan menjadi serbuk dan diuji penapisan fitokimia.

## Isolasi Flavonoid
Sebanyak  1475  gram  serbuk  daun  johar  dimaserasi dengan etanol 96% hingga jernih. Ekstrak yang diperoleh kemudian  dievaporasi  sampai  mendapat  ekstrak  etanol dan  ditimbang.  Ekstrak  etanol  dilarutkan  dalam  etanol selanjutnya  dilakukan  penghilangan  klorofil  dengan menambahkan akuades (1:1), didiamkan selama 24 jam, lalu  disaring.  Filtrat  diekstraksi  dengan  n-  heksana. Fraksi  etanol-air  dihidrolisis  dengan  HCl  2  N  selama  1 jam  dalam  suhu  85°C  [7].  Fraksi  hasil  hidrolisis difraksinasi dengan etil asetat hingga didapatkan fraksi etil  asetat  kemudian  dievaporasi  untuk  menghilangkan pelarutnya lalu ditimbang.

## Pemisahan Flavonoid
Fraksi  etil  asetat  sebanyak  7,95  gram  dilakukan pemisahan  flavonoid  dengan  kromatografi  cair  vakum menggunakan  fasa  diam  silika  gel  60  GF254  dan  fasa gerak menggunakan gradien tingkat kepolaran [7]. Fasa gerak  yang  digunakan  yaitu  kloroform,  etil  asetat  dan etanol.  Eluat-eluat  yang  dihasilkan  dari  kolom ditampung  setiap  100  mL  dalam  botol  vial.  Masing- masing  botol  vial  dianalisis  menggunakan  KLT  dengan penambahan penampak bercak uap amoniak. Eluat-eluat yang  menghasilkan  pola  noda  yang  sama  digabungkan menjadi satu (Fraksi I). Fraksi I dipisahkan lebih lanjut dengan kromatografi kolom gravitasi menggunakan fasa diam  silika  gel  60  H  dan  fasa  gerak  berupa  campuran kloroform,  etil  asetat,  butanol  (7:2,5:0,5).  Eluat-eluat yang  dihasilkan  dari  kolom  ditampung  setiap  15  mL dalam  botol  vial.  Masing-masing  botol  vial  dianalisis dengan  KLT.  Eluat-eluat  yang  menghasilkan  pola  noda yang  sama  digabungkan  menjadi  fraksi-fraksi  besar (fraksi  besar  A,B,C,D,E,  dan  F)  kemudian  dilakukan analisis  flavonoid  menggunakan  metode  KLT  dengan penambahan  penampak  bercak  uap  amoniak.  Fraksi positif  flavonoid  dilakukan  pemisahan  dengan  KLT preparatif menggunakan fasa diam plat silika gel 60 F254 ukuran 20 cm x 20 cm, ketebalan 0,5 mm-2,0 mm dan fasa  gerak  berupa  campuran  kloroform:  metanol  (9:1) hingga didapatkan isolat flavonoid.

## Uji Kemurnian
Uji  kemurnian  isolat  flavonoid  dilakukan  dengan KLT berbagai eluen tunggal dan campuran serta KLT dua dimensi dengan eluen campuran hingga diperoleh noda tunggal.

## Identifikasi Struktur
Isolat  flavonoid  yang  telah  murni  diidentifikasi strukturnya menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR.

## Uji Aktiviitas Antioksidan
Isolat  flavonoid  dilakukan  uji  aktivitas  antioksidan dengan  menggunakan  metode  KLT.  Sampel  ditotolkan pada plat KLT kemudian dielusi menggunakan fasa gerak yang  cocok.  Lempeng  plat  dikeringkan  dan  disemprot dengan  larutan  DPPH  0,1  mM.  Pengujian  aktivitas antioksidan terhadap isolat flavonoid dilanjutkan dengan metode  DPPH  dan  digunakan  kuersetin  sebagai pembanding. Isolat flavonoid dibuat variasi konsentrasi
20, 40, 60, 80 dan 100 ppm. Masing-masing konsentrasi dari  isolat  flavonoid  sebanyak  0,2  mL  dimasukkan  ke dalam botol vial, kemudian ditambahkan 3,8 mL larutan DPPH  0,1 mM.  Campuran dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit dalam ruangan gelap, kemudian diukur absorbansinya  pada  panjang  gelombang  515,5  nm. Perlakuan  yang  sama  dilakukan  terhadap  kuersetin dengan  variasi  konsentrasi  (5,  10,  15,  20  dan  25  ppm). Nilai  absorbansi  dari  larutan  uji  dengan  berbagai konsentrasi  digunakan  untuk  menghitung  aktivitas peredaman  radikal  DPPH  (%  inhibisi)  dengan menggunakan persamaan berikut
Besarnya  aktivitas  antioksidan  ditentukan  dengan nilai  IC50 yang  dihitung  dengan  menggunakan persamaan  yang  diperoleh  dari  kurva  regresi  linier dengan  sumbu  x  adalah  konsentrasi  larutan  uji, sedangkan  sumbu  y  adalah  persentase  aktivitas peredaman  radikal  DPPH  (%  inhibisi).  Nilai  IC50 merupakan  konsentrasi  sampel  untuk  dapat  meredam 50% aktivitas radikal DPPH.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Penapisan  fitokimia  bertujuan  untuk  mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam serbuk dan ekstrak etanol daun johar. Hasil penapisan fitokimia dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel l. Hasil uji penapisan fitokimia serbuk dan ekstrak etanol daun johar Uji Hasil Serbuk Ekstrak Etanol Flavonoid + + Alkaloid + + Steroid + + Triterpenoid + + Saponin + + Tanin + + Kuinon + +

## Isolasi Flavonoid
Serbuk  daun  johar  sebanyak  1475  gram  setelah dimaserasi  dengan  pelarut  etanol  96%,  disaring  dan dievaporasi  hingga  diperoleh  ekstrak  kental  etanol berwarna coklat kehitaman pekat sebanyak 133,33 gram (8,89%).  Ekstrak  kental  etanol  setelah  dihilangkan klorofilnya  menghasilkan  fraksi  etanol-air,  kemudian difraksinasi menggunakan n-heksana. Fraksi etanol-air hasil  fraksinasi  dihidrolisis  dengan  metode  refluks menggunakan  HCl  2  N  yang  bertujuan  untuk  memutus ikatan  O-glikosida  pada  kerangka  flavonoid,  sehingga terbentuk  flavonoid  bebas  dan  gula.  Flavonoid  bebas dalam  campuran  dapat  diambil  dengan  fraksinasi menggunakan  etil  asetat.  Fraksi  etil  asetat  diuapkan untuk menghilangkan pelarut dan didapatkan fraksi etil asetat sebanyak 7,95 gram (0,53%).

## Pemisahan Flavonoid dan Uji Kemurnian
Pemisahan  flavonoid  pada  fraksi  etil  asetat dilakukan  dengan  menggunakan  metode  kromatografi cair vakum dengan fasa diam silika gel 60 GF254 dan fasa gerak  berdasarkan  gradien  tingkat  kepolaran,  dimulai dari  kloroform/etil  asetat,  etil  asetat,  dan  etil asetat/etanol.  Eluat  yang  dihasilkan  sebanyak  21  botol vial,  kemudian  masing-  masing  botol  vial  dianalisis dengan  KLT  menggunakan  fasa  gerak  kloroform:  etil asetat (7:3) yang ditunjukkan pada gambar 1.
Gambar 1. Profil KLT fraksi etil asetat daun johar dengan kromatografi cair vakum menggunakan fasa gerak kloroform: etil asetat (7:3) pada UV X 365 nm
Fraksi 10-21 digabung menjadi satu (Fraksi I) karena memiliki  kemiripan  pola  noda  dan  juga  menunjukkan positif  flavonoid  pada  penampak  bercak  uap  amoniak. Fraksi  I  dilakukan  pemisahan  flavonoid  menggunakan kromatografi  kolom  gravitasi  dengan  fasa  gerak kloroform: etil asetat: butanol (7:2,5:0,5) dan fasa diam berupa silika gel 60 H. Eluat yang dihasilkan sebanyak 61 botol  vial.  Masing-masing botol  vial  tersebut  dianalisis menggunakan  KLT  dengan  fasa  gerak  kloroform:  etil asetat:  butanol  (7:2,5:0,5).  Hasil  KLT  diberi  penampak bercak  uap  amoniak,  yang  mempunyai  pola  noda  yang sama digabung dan diperoleh 6 fraksi besar yaitu fraksi A,B,C,D,E dan F seperti yang ditunjukkan pada gambar 2 dan tabel 2.
Gambar 2. Profil KLT fraksi I hasil kromatografi kolom gravitasi dengan fasa gerak kloroform:etil asetat:butanol (7:2,5:0,5) pada UV X 365 nm
Tabel 2. KLT fraksi I hasil kromatografi kolom gravitasi dengan fasa gerak kloroform: etil asetat: butanol (7:2,5:0,5) pada UV X 365 nm Fraksi Jumlah Vial Wujud dan Warna Fraksi Jumlah Noda A 1-14 Minyak (Bening) 2 B 15-19 Minyak (Kuning) 3 C 20-31 Minyak (Kuning Pekat) 5 D 32-37 Minyak (Kuning Pekat) 3 E 38-46 Minyak (Kuning) 3 F 47-61 Minyak (Kuning) 2
Fraksi A, B, C dan D menunjukkan positif flavonoid setelah  diberi  penampak  bercak  uap  amoniak,  namun fraksi C memberikan hasil flavonoid yang lebih dominan dan  terlihat  jelas  dibandingkan  fraksi-fraksi  lainnya. Fraksi  C  selanjutnya  dipisahkan  menggunakan  metode KLT preparatif dengan fasa diam plat silika gel 60 F254 ukuran 20 cm x 20 cm, ketebalan 0,5 mm-2,0 mm dan fasa  gerak  berupa  campuran  kloroform:  metanol  (9:1). Hasil KLT preparatif fraksi C ditampilkan pada gambar 3.
Gambar 3. Profil KLT preparatif fraksi C dengan fasa gerak kloroform: metanol (9:1) (A: pada UV X 254 nm ;
B: pada UV X 365 nm)
Pita C3 selanjutnya dikerok, dilarutkan, dan disaring hingga  didapat  isolat  flavonoid  C3.  Isolat  flavonoid  C3 diuji  kemurniannya dengan  berbagai  eluen  tunggal dan campuran seperti yang disajikan pada gambar 4.
Keterangan: Fasa gerak (A) = kloroform, Fasa gerak (B) = etil asetat, Fasa gerak (C) = metanol, Fasa gerak (D) = kloroform: metanol (9:1), Fasa gerak (E) = kloroform: Methanol (1:1)
Gambar 4. Profil KLT uji kemurnian isolat flavonoid C3 dengan berbagai fasa ge rak pada UV X 365 nm
Uji  kemurnian  dil  anjutkan  menggunakan  metode KLT  dua  dimensi  seperti  yang  ditunjukkan  pada gambar 5.
Gambar 5. Profil KLT dua dimensi pada uji kemurnian isolat flavonoid C3 dengan berbagai fasa gerak pada UV
X 365 nm
Keterangan:
1. Kloroform: metanol (9:1)
2. Kloroform: metanol (10:1)
Pada  gambar  4  dan  5,  terlihat  hasil  KLT menunjukkan noda tunggal. Hal ini diduga bahwa isolat flavonoid  C3  telah  murni.  Noda  pada  KLT  dua  dimensi berwarna  flouresensi  hijau  kebiruan  setelah  diberi penampak  bercak  uap  amoniak  yang  diduga  isolat flavonoid  C3  termasuk  ke  dalam  flavonoid  jenis  flavon, flavonol  atau  flavanon,  sesuai  dengan  tabel  penafsiran warna  bercak  dari  segi  struktur  flavonoid  [7].  Isolat flavonoid  C3  diuapkan  dan  diperoleh  isolat  flavonoid sebanyak 0,006 gram.

## Identifikasi Struktur Flavonoid
Isolat  flavonoid  C3  dilarutkan  dalam  metanol, kemudian  dianalisis  menggunakan  spektrofotometer UV-Vis  dan  diperoleh  spektrum  yang  disajikan  pada gambar 6.
Gambar 6. Spektrum UV-Vis isolat flavonoid C3 dalam metanol
Isolat  flavonoid  C3  yang  dianalisis  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  menghasilkan  tiga  serapan panjang gelombang, yaitu pita I (350 nm) dan pita II (255 nm  dan  267  nm).  Pita  I  pada  flavonoid  menunjukkan absorbsi  pada  cincin  B  sinamoil  dan  pita  II  adalah absorbsi  cincin  A  benzoil.  Menurut  [7]  dilihat  dari spektrum  yang  diperoleh  diduga  isolat  flavonoid  C3 memiliki  struktur  dasar  senyawa  flavon,  karena  flavon memiliki rentang serapan pita I (310-350 nm) dan pita II
(255-280  nm).  Hal  ini  sesuai  dengan  hasil  identifikasi awal  menggunakan  KLT  dengan  diberi  uap  amoniak. Menurut  penelitian  [1],  jenis  flavonoid  yang  terdapat pada daun johar (Senna siamea L.,) adalah luteolin, yang merupakan salah satu senyawa yang termasuk golongan flavon.  Peneliti  lain  [8] telah  melakukan  penelitian mengenai  luteolin  yang  juga  dianalisis  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis.  Luteolin  memiliki  panjang gelombang pada pita I (348 nm) dan pita II (254 dan 266 nm). Spektrum isolat flavonoid C3 dibandingkan dengan spektrum senyawa luteolin menurut penelitian [8] yang dapat dilihat pada gambar 7 (spektrum UV-Vis nomor 4).
Gambar 7. Spektrum UV-Vis fosfolipid (1), campuran fisik luteolin dan fosfolipid (2), kompleks luteolin- fosfolipid (3), dan luteolin (4)[8]
Isolat  flavonoid  C3  memiliki  kemiripan  pola spektrum  dan  serapan  panjang  gelombang  pada  pita  I dan pita II dengan senyawa luteolin hasil penelitian [8]. Oleh  sebab  itu  dapat  diduga  bahwa  isolat  flavonoid  C3 memiliki struktur dasar senyawa luteolin.
Isolat  flavonoid  C3  diidentifikasi  menggunakan spektrofotometer inframerah untuk menunjukkan gugus fungsi  yang  terdapat  pada  isolat.  Spektrum  inframerah dapat dilihat pada gambar 8.
Gambar 8. Spektrum Spektrum FTIR isolate flavonoid C3
Dari hasil analisis isolat flavonoid C3 memiliki pita serapan  pada  bilangan  gelombang  3436,19  cm -1 yang menunjukkan  adanya  vibrasi  ulur  O-H  yang  dapat membentuk ikatan hidrogen. Pita serapan pada 2926,95 cm -1 dan 2858,88 cm -1 yang menunjukkan adanya vibrasi ulur C-H alifatik. Pita serapan pada bilangan gelombang 1737,71  cm -1 menunjukkan adanya  vibrasi  ulur C=O dan pita  serapan  pada  bilangan  gelombang  1628,70  cm -1 menunjukkan  adanya  vibrasi  ulur  C=C  aromatik.  Pita serapan  pada  bilangan  gelombang  1166,00  cm -1 menunjukkan  vibrasi  ulur  C-O  eter  (jembatan  O),  pita serapan  pada  bilangan  gelombang  1047,31  cm -1
menunjukkan vibrasi ulur C-O alkohol dan pita serapan pada  bilangan  gelombang  849,88  cm -1 menunjukkan adanya  vibrasi  tekuk  C-H  keluar  bidang  yang menandakan  adanya  substitusi  cincin  aromatic  [9]. Spektrum FTIR isolat flavonoid C3 dibandingkan dengan spektrum FTIR luteolin standar yang dapat dilihat pada gambar 9.
Gambar 9. Spektrum FTIR luteolin standar
Spektrum  FTIR  luteolin  standar  menunjukkan adanya pita serapan pada 4307 cm -1 , 1656 cm -1 , 1610 cm - 1 ,  1134  cm -1 ,  dan  820  cm -1 .  Pita  serapan  pada  4307  cm -1 menunjukkan  adanya  gugus  O-H  pada  benzena,  pita serapan pada 1656 cm -1 menunjukkan adanya gugus C=O, pita serapan pada 1610 cm -1 menunjukkan adanya gugus C=C aromatik, pita serapan pada 1134 cm -1 menunjukkan adanya  gugus  C-O  eter,  pita  serapan  pada  1025  cm -1 menunjukkan  adanya  gugus  C-O  alkohol  dan  pita serapan pada 820 cm -1 menunjukkan adanya gugus C-H keluar bidang yang menandakan adanya substitusi cincin aromatik. Perbandingan bilangan gelombang dan gugus fungsi isolate flavonoid C3 dengan gugus fungsi luteolin standar dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3. Perbandingan bilangan gelombang dan gugus fungsi isolat flavonoid C3 dengan gugus fungsi luteolin
standar Gugus Fungsi Bilangan Gelombang Isolat Flavonoid C3 (cm -1 ) Bilangan Gelombang Luteolin Standar (cm -1 ) O-H ulur 3436,19 4307 -C-H ulur alifatik 2926,95, 2858,88 - C=0 ulur 1737,71 1656 C=C aroinatik 1628,70 1610 C-O eter (jembatan O) 1166,00 1134 C-O alkohol 1047,31 1025 C-H tekuk keluar bidang 849,88 820 (substitusi benzena)
Hasil  perbandingan  antara  spektrum  FTIR  isolat flavonoid  C3  dengan  spektrum  FTIR  luteolin  standar menunjukkan  adanya  satu  perbedaan  puncak  serapan diantara keduanya. Pada spektrum FTIR isolat flavonoid C3 menunjukkan adanya pita serapan pada 2926,95 dan 2858,88 cm -1 yang menunjukkan keberadaan gugus C-H alifatik, sedangkan pada spektrum FTIR luteolin standar tidak  menunjukkan  pita  serapan  pada  bilangan gelombang  tersebut.  Dengan  keberadaan  gugus  C-H
alifatik  tersebut  diduga  isolat  flavonoid  C3  memiliki struktur dasar senyawa luteolin yang tersubstitusi, akan tetapi  posisi  gugus  O-H  yang  tersubstitusi  tidak  dapat diketahui sehingga struktur lengkap dari isolat flavonoid C3 belum dapat diajukan.

## Uji Aktivitas Antioksidan
Hasil aktivitas antioksidan isolat flavonoid C3 yang dilakukan  menggunakan  KLT  dengan  fasa  gerak campuran  kloroform:  metanol  (9:1)  menunjukkan perubahan  warna  dari  ungu  menjadi  kuning  pada  noda yang ditunjukkan pada gambar 10.
Gambar 10. Hasil uji aktivitas antioksidan isolat flavonoid C3 pada sinar tampak
Penentuan aktivitas antioksidan dilanjutkan dengan menggunakan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) terhadap  isolat  flavonoid  C3  dan  kuersetin  sebagai pembanding.  Flavonoid  akan  menghambat  aktivitas radikal  bebas  dari  DPPH  karena  memiliki  kemampuan untuk  mendonorkan  radikal  protonnya  yang  akan menyebabkan  terjadinya  reduksi  membentuk  DPPH nonradikal.  Reaksi  peredaman  radikal  bebas  oleh flavonoid  yang  mungkin  terjadi  dapat  dilihat  pada gambar 11.
Gambar 11. Reaksi peredaman radikal bebas oleh flavonoid [10]
Parameter uji aktivitas antioksidan adalah Inhibition Concentration  (IC50) yaitu  konsentrasi  suatu  zat antioksidan  yang  menyebabkan  50%  DPPH  kehilangan karakter radikal  atau  konsentrasi  suatu  zat  antioksidan yang  memberikan  persentase  penghambatan  sebesar 50%. Hasil perhitungan IC50 dapat dilihat pada tabel 4.
Tabel 4. Hasil perhitungan IC50 isolat flavonoid C3 dan
kuersetin Sampel IC50 (mg/L) Isolat Flavonoid C3 139.8373 Kuersetin 28,1485
Hasil uji aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa isolat  flavonoid  C3  memiliki  aktivitas  antioksidan  yang lebih rendah dari kuersetin. Harga IC50 yang baik yaitu di bawah 200 mg/L [11], oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa isolat flavonoid C3 memiliki aktivitas antioksidan. Tingginya  aktivitas  antioksidan  pada  kuersetin
disebabkan  kuersetin  yang  digunakan  merupakan senyawa  murni  yang  mempunyai  kemampuan  lebih besar  untuk  mendonorkan  protonnya.  Gugus  hidroksil sangat  berperan  dalam  meredam  radikal  bebas  dengan cara mendonorkan protonnya.

## 4. Kesimpulan
Isolat  flavonoid  dari  ekstrak  etanol  daun  johar (Senna  siamea Lamk)  diperoleh  seberat  0,006  gram (0,004  %).  Identifikasi  isolat  flavonoid  daun  johar menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  dan  FTIR menunjukkan  bahwa  isolat  tersebut  diduga  memiliki struktur dasar senyawa luteolin yang tersubstitusi. Isolat flavonoid  daun  johar  memiliki  aktivitas  antioksidan ditunjukkan oleh harga IC50 sebesar 139,8373 mg/L.

## 5. Daftar Pustaka
[1] Mamadou  Kamagaté,  Camille  Koffi,  N’goran Mathieu Kouamé, Aminata Akoubet, N’guessan Alain Roland Yao, Henri Maxime Die-Kakou, Ethnobotany, phytochemistry,  pharmacology  and  toxicology profiles  of  Cassia  siamea  Lam, The  Journal  of Phytopharmacology , 3, 1, (2014) 57-76
[2]  Lakshmi  Narayana  Majji,  Ganga  Rao  Battu,  Ravi Kumar Jangiti, Mallikarjun Rao Talluri, Evaluation of In-Vitro Antibacterial Activity of Cassia
Siamealeaves, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences , 5, 3, (2013) 263-265
[3]  P.  Poovendran,  N.  Ramanathan,  N.  Prabhu, Evaluation  of  the  Antibacterial  Activity  of  Aegle marmelos  and  Cassia  siamea  Extracts  Against Biofilm and Extended Spectrum-Lactamase Producing Uropathogenic Escherichia coli, International Journal of Microbiological Research , 5, 3, (2014) 217-221 http://dx.doi.org/10.5829/idosi.ijmr.2014.5.3.9138
[4]  S.  Kumar,  V.  Kumar,  Om  Prakash,  Antidiabetic  and anti-lipemic effects of Cassia siamea leaves extract in streptozotocin induced diabetic rats, Asian Pacific Journal  of  Tropical  Medicine ,  3,  11,  (2010)  871-873 https://doi.org/10.1016/S1995-7645(10)60209-X
[5]  Usha Veerachari, A. K.  Bopaiah, Preliminary phyto- chemical evaluation of the leaf extract of five Cassia Species, Journal  of  Chemical  and  Pharmaceutical Research , 3, 5, (2011) 574-583
[6]  K. Ingkaninan, A. P. Ijzerman, R. Verpoorte, Luteolin, a  Compound  with  Adenosine  A1  Receptor-Binding Activity, and Chromone and Dihydronaphthalenone Constituents  from  Senna  siamea, Journal  of  Natural
Products , 63, 3, (2000) 315-317
http://dx.doi.org/10.1021/np9904152
[7]  K.  R.  Markham,  Techniques  of  flavonoid identification, Academic Press, 1982.
[8]  Keyong  Xu,  Benguo  Liu,  Yuxiang  Ma,  Jiquan  Du, Guanglei  Li,  Han  Gao,  Yuan  Zhang,  Zhengxiang Ning,  Physicochemical  Properties  and  Antioxidant Activities  of  Luteolin-Phospholipid  Complex, Molecules , 14, 9, (2009) 3486
[9]  Robert Milton Silverstein, Francis X. Webster, David J.  Kiemle,  Spectrometric  Identification  of  Organic Compounds, John Wiley & Sons, 2005.
[10] Amic  Dragan,  Davidovic-Amic  Dusanka,  Beslo Drago, Rastija Vesna, Lucic Bono, Trinajstic Nenad,
SAR  and  QSAR  of  the  Antioxidant  Activity  of Flavonoids, Current Medicinal Chemistry , 14, 7, (2007) 827-845 http://dx.doi.org/10.2174/092986707780090954
[11]  Marsden S. Blois, Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical, Nature , 181, (1958) 1199 http://dx.doi.org/10.1038/1811199a0