## IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI PENGHASIL ENZIM L-ASPARAGINASE DARI ALGA COKLAT

## SARGASSUM sp
Mashuri Masri*
*) Dosen pada Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Alauddin Makassar
Email :
Abstract: Molecular Identification of bacterial L-asparaginase activity from  Sargassum  sp  were  isolated  from  Barrang  Lompo  Island  South Sulawesi  in  2013.  Among  them  three  bacterial  strains  exhibiting glutaminase free L-asparaginase activity were identified as Pseudomonas putida,  Enterobacter  asburine  dan  Marinobacter  arcticus    on  the basis  of    16S  rRNA  gene  sequencing.    The  Highest  Max  Score  1358 and  Query  Cover  98  %  were    Pseudomonas  putida  furthermore identified  as  bacterial  L-asparaginase  activity  from  Sargassum  sp. Pseudomonas putida has Identities 756/765 (99%) with 778 bp Query length, Query cover 98% and Gaps 5/765 (0%).
Key words: L-Asparaginase, Sargassum sp. .

## I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
nteraksi  metabolit  sekunder  yang  dihasilkan  oleh  biota  laut  dengan  bakteri yang  berasosiasi  menyebabkan  kemungkinan  bakteri  terinduksi  untuk menghasilkan  suatu  metabolit  bioaktif  yang  spesifik.  Menurut  Nofiani (2008), bakteri tersebut memiliki kemampuan yang hampir sama dengan inangnya untuk menghasilkan senyawa bioaktif.
Makroalga  merupakan  salah  satu  organisme  laut  yang  berperan  dalam siklus  rantai  makanan  sebagai  produsen  primer.  Untuk  mempertahankan  diri dalam habitatnya, alga memproduksi berbagai senyawa yang terdiri dari senyawa primer  yang bersifat esensial bagi proses metabolisme  sel dan senyawa  sekunder yang  tidak  esensial  bagi  pertumbuhan  organisme  dan  ditemukan  dalam  bentuk yang  unik  (Deval  dkk.,  2001).  Metabolit  sekunder  berperan  sebagai  alat pertahanan  inang  (host)  terhadap  patogen,  parasit,  predator,  kompetitor  dan epibiota  dan  produksinya  sangat  tergantung  pada  kondisi  bio-geografi.  Sifat metabolit  sekunder  sebagai  alat  pertahanan  diri  organisme  laut  ternyata
I
242 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 2, Juli 2014 , hlm. 241 – 253
mempunyai  potensi  yang  sangat  besar  sebagai  sumber  bahan  obat  berbagai penyakit (Hay, 1996).
Sebagian  besar  alga  yang  memiliki  bioaktivitas  yang  berbeda-beda  mulai dari  antibakteri,  antifungi,  antikanker  dan  sebagainya  merupakan  kelompok  alga coklat,  terutama  dari  kelompok Sargassum dan Turbinaria. Beberapa  jenis  alga coklat  antara  lain Sargassum  cinereum,  Sargassum  hemiphyllum,  Sargassum polycystum , Sargassum  echinocarpum dan Turbinaria  decurrens ditemukan  di perairan Sulawesi Selatan (Rasyid, 2001).
Enzim  ialah  biopolimer  yang  sebagian  besar  molekulnya  berupa  protein. Enzim berperan sebagai katalis dalam reaksi-reaksi biokimia yang terjadi di dalam sel  makhluk  hidup  atau  disebut  pula  biokatalisator  yang  menurunkan  energi aktivasi  dalam  menguraikan  substratnya  dengan  sangat  spesifik.  Oleh  karena sifatnya  tersebut  dan  tanpa  efek  samping,  enzim  telah  banyak  dimanfaatkan  di luar  tubuh  dalam  skala  industri.  Medis  menggunakan  enzim  sebagai  bahan diagnosis  dan  pengobatan.  Salah  satu  enzim  yang  dimanfaatkan  dalam  dunia medis adalah L-Asparaginase.
L-Asparagin  merupakan  salah  satu  komponen  nutrisi  bagi  sel  kanker. Pemberian  L-Asparaginase  pada  sel  kanker  dapat  menguraikan  L-Asparagin, sehingga  diharapkan  dapat  menghambat  pertumbuhan  sel  tersebut.  L- Asparaginase  memberikan  manfaat  yang  besar  pada  terapi  kanker  (E-Moharam, dkk, 2010),  salah satunya berupa sel kanker mulut rahim.
L-Asparaginase adalah  salah  satu jenis  enzim hidrolase  yang mengkatalis reaksi hidrolisis L-Asparagin menjadi asam aspartat dan amonia dengan memutus ikatan amida.
L-Asparaginase (E.C.3.5.1.1) dapat dijumpai pada banyak jaringan hewan, bakteri,  tanaman,  dan  dalam  serum  tikus,  namun  tidak  dijumpai  pada  manusia. L-Asparaginase  dihasilkan  dengan  jumlah  yang  besar  oleh  beberapa mikroorganisme  termasuk E.coli,  Erwinia  cartova,  Enterobacter  aerogenes (El- Bessoumy,dkk, 2004).
Berdasarkan  latar  belakang  tersebut  maka  dilakukan  suatu  penelitian dengan  judul  “Identifikasi  Molekuler  Bakteri  Penghasil  Enzim  L-Asparaginase dari Alga Coklat Sargassum sp ”.

## B. Tujuan Penelitian
Berdasarkan Latar Belakang dan Tinjauan Pustaka maka tujuan yang ingin dicapai  dalam  penelitian  ini  adalah  untuk  Mengidentifikasi  Bakteri  Simbion Makroalga Sargassum Sp dengan Metode BLAST.
Mashuri Masri , Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase …_ 243

## II. TINJAUAN PUSTAKA

## A. Tinjauan Alga Coklat
Alga  sering  disebut rumput  laut yang  merupakan  terjemahan  dari  istilah Inggris  ”sea  weed”.  Penelitian  tentang  kandungan  metabolit  sekunder  dari  alga menunjukan  bahwa  tanaman  ini  berpotensi  sebagai  produser  metabolit  bioaktif yang  beragam  dengan  aktivitas  yang  sangat  luas  sebagai  antibakteri,  antijamur, antivirus, dan sitotastik (Zainuddin dan Malina, 2009).
Alga  coklat  seperti Sargassum tumbuh  subur  pada  daerah  tropis  dengan kedalaman 0,5-10 m, suhu perairan 27,25 °C - 29,30 °C dan salinitas 32-33,5 %. Tumbuh membentuk rumpun besar dengan panjang thalli utama mencapai 1-3 m. Umumnya alga ini tumbuh secara liar dan masih belum dimanfaatkan secara baik, bahkan  sering dianggap  sebagai  sampah  laut pada  musim  tertentu,  sebab banyak yang hanyut di permukaan laut dan terdampar di pantai akibat tercabut atau patah akibat ombak yang besar atau karena perubahan musim (Kadi, 2005).

## B. Tinjauan Bakteri Simbion Makro Alga
Bakteri  simbion  adalah  bakteri  yang  hidup  menetap  pada  suatu  inang, biasanya  menghasilkan  senyawa  bioaktif  yang  sama  seperti  inangnya  (Peres- Matos  dkk,  2007).  Inang  menjadi  tempat  hidup  bagi  bakteri  yang  dalam  hal  ini berupa Makro Alga.
Lee  dkk.,  (2001)  juga  melaporkan  bahwa  metabolit  yang  dihasilkan  oleh spons  merupakan  hasil  biosintesis  bakteri  simbionnya.  Dengan  demikian,  spons dapat mengandung komponen bioaktif yang sama dengan simbionnya.
Hasil  eksplorasi  metabolit  bioaktif  bakteri  laut  merupakan  salah  satu sumber potensial bahan baku obat.  Berdasarkan cara hidupnya, bakteri penghasil metabolit  bioaktif  dapat  berasal  dari  bakteri  yang  hidup  bebas,  bakteri  laut  yang terdapat  pada  sedimen,  bakteri  yang  berasosiasi  dengan  permukaan  alga,  atau bakteri  yang  berasosiasi  dengan  invertebrata. Bakteri  yang  hidup  berikatan dengan  partikel  tertentu  menghasilkan  metabolit  bioaktif  5-10  kali  lebih  tinggi dibandingkan dengan bakteri yang hidup bebas (Long dan Azam , 2001).

## C. Tinjauan Enzim L – Asparaginase
Fungsi  suatu  enzim  ialah  sebagai  katalis  untuk  proses  biokimia  yang terjadi dalam  sel maupun di  luar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 10 8 sampai  10 11 kali  lebih  cepat  dari  pada  apabila  reaksi  tersebut  dilakukan  tanpa katalis       (Poedjiadi, 1994).
L  –  Asparaginase  mengkatalisis  hidrolisis  L  –  Asparagin  menjadi  L  – Aspartat dan ammonia, seperti pada Gambar 1.
244 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 2, Juli 2014 , hlm. 241 – 253
Gambar 1. Reaksi hidrolisis oleh L – Asparaginase (El-Bessoumy dkk, 2004).
Aplikasi penting dari enzim  L  – Asparaginase adalah penerapannya pada pengobatan  leukemia  limfoblastik  akut  (umumnya  pada  anak-anak),  penyakit Hodgkin,  leukemia  myelositik  akut,  leukemia  myelomonositik  akut,  leukemia limfositik  kinis,  terapi  lymfosarkoma,  reticulasarbom  dan  melanosarkoma (Verma  dkk,  2007)  serta  Kanker    Mulut  Rahim.  Peran  L  –  Asparaginase  pada terapi  sel  leukemia  limfositik  didasarkan  pada  fakta  bahwa  sel  ini  tidak memproduksi  L  –  Asparagin  namun  memperolehnya  dari  luar  sel  (Duval  dkk, 2002).  Enzim  L–  Asparaginase  akan  mereduksi  suplai  L  –  Asparagin  ke  sel kanker  dengan  merubahnya  menjadi  asam  aspartat  dan  amoniak,  seperti  yang ditunjukkan pada Gambar 1.

## III. METODELOGI PENELITIAN

## A. Desain Penelitian
Penelitian bersifat eksploratif menggunakan metode eksperimental dengan teknik fermentasi substrat padat.

## B. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan September 2013 sampai Februari 2014 di  Laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Hasanuddin, Laboratorium  Biokimia  FMIPA  Universitas  Hasanuddin, Laboratorium Mikrobiologi dan laboratorium biokimia UIN alauddin Makassar.

## C. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat Penelitian
Alat yang digunakan adalah cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, jarum  ose,  oven,  laminary  air  flow,  perangkat  UV  light,  sarung  tangan,  masker, bunsen,  tangkai  pengaduk,  erlenmeyer,  pH  meter,  hot  plate,  magnetic  stirrer,
Mashuri Masri , Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase …_ 245
lemari pendingin, pinset, mikropipet, timbangan analitik, mikroskop, kaca obyek, kaca penutup,  autoclave, frezer.  Mikropipet + tip filter, tabung effendorf 1,5 µl, rak  tabung  effendorf,  vortex  shaker,  sentrifuge,  gene  cycler,  gel  doc,  alat elektroforesis. PCR.
2. Bahan Penelitian
Alga coklat Sargassum sp, Media Nutrient Broth, NaCl fisiologis, Media M-9 yang mengandung 6 g/L Na 2 HPO 4 .2H 2 O, 3 g/L KH 2 PO 4 , 10 g/L NH 4 Cl, 0,5
g/L  NaCl,  1,0  g/L  CaCl 2 .2H 2 O,  10  g/L  L  –  Asparagin,  1,0  g/L  MgSO 4 .7H 2 O,  3 g/L glukosa 20 g/L agar dan 0,05 g/L indikator fenol red  dengan pH optimal 7.0. Sepasang primer yang digunakan U1 dan U2, dengan sekuen untuk semua bakteri. Sekuen primer U1 adalah 5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3' pada nukleotida 518-537  dari  gen  16S  rRNA  E.coli,  dan  U2  adalah  5'-ATCGG  (C  /  T) TACCTTGTTACGACTTC-3',  sesuai  dengan  nukleotida  1.513-1.491  dari  gen yang  sama.    Template  DNA, Taq DNA  polymerase  (Perkin-Elmer,  Norwalk, Conn.), PCR  Mix,  Triton  X-100,  Tris,  EDTA,  Tris-HCl,  KCl,  MgCl 2 ,  ,  parafin, deoxynucleoside  triphosphate ,    polyacrylamide  gel,  agarose,  Ethidium  Bromide, akuades.
D. Populasi dan Sampel Penelitian

## 1. Populasi
Populasi  pada  penelitian  ini  adalah  semua Sargassum sp.  yang  terdapat diperairan Pulau Barrang Lompo, Sulawesi Selatan.
2. Sampel
Sampel pada penelitian ini adalah bagian dari populasi terjangkau.

## E. Definisi Operasional
1. Bakteri  simbion  Makro  Alga Sargassum sp  adalah  bakteri  yang  hidupnya menetap  pada  Makro  Alga Sargassum sp  yang  menghasilkan  senyawa bioaktif yang sama seperti inangnya.
2. Enzim  L  Asparaginase  adalah  salah  satu  jenis  enzim  hidrolase  yang mengkatalis reaksi hidrolisis L Asparagin menjadi asam aspartat dan amonia dengan memutus ikatan amida.
3. Universal  primer  adalah  primer  yang  digunakan  untuk  mengamplifikasi DNA semua jenis bakteri.
4. Sekuensing  adalah  proses  pengurutan  nukleotida  RNA  forward  sampel bakteri
5. Sekuen adalah urutan nukleotida sampel bakteri.
246 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 2, Juli 2014 , hlm. 241 – 253

## IV. PROSEDUR KERJA

## A. Preparasi Sampel
Sampel  alga  yang  telah  dikumpulkan  kemudian  dibersihkan  dari  kotoran yang  menempel  dan  disimpan  dalam cool  box .  Selanjutnya  sampel  disegarkan dalam  media Nutrient  Broth .  Sebanyak  15  gram  sampel  alga  dibilas  dengan  30 mL  NaCl  fisiologis.  Selanjutnya,  alga  yang  telah  dibilas  dihaluskan  dengan menggunakan  blender  dan  ditambahkan  NaCl  fisiologis.  Suspensi  kemudian dimasukkan  ke  dalam  30  mL  media nutrient  broth lalu  dikocok  menggunakan shaker pada suhu kamar selama 24-48 jam.

## B. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Simbion Makroalga
Sampel  diambil  sebanyak  1  mL  dan  dilakukan  pengenceran  bertingkat untuk  memperoleh  pengenceran  yang  sesuai.  Selanjutnya  sebanyak  0,1  mL  dari pengenceran tersebut disebarkan ke dalam medium agar dan ditumbuhkan selama 24  jam.  Pemurnian  bakteri  dilakukan  dengan  menumbuhkan  koloni  bakteri  yang berbeda-beda  dari  kultur  sebelumnya  ke  dalam  cawan  petri  yang  mengandung media  selektif  M-9.    Medium  disterilkan  dalam  autoclave  selama  15  menit  pada suhu  121 0 C  tekanan  1  atm.  Diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu  37 o C.    Pada medium  ini  L  –  Asparagin  digunakan  sebagai  sumber  nitrogen.  Produksi  L  – Asparaginase oleh bakteri akan melepaskan  amoniak sehingga  meningkatkan pH medium pembiakan. Perubahan pH membentuk warna pink disekitar koloni yang memproduksi L – Asparaginase  (Gashemi, dkk., 2008).

## C. Identifikasi Molekuler Isolat Bakteri simbion
Identifikasi  bakteri  simbion  penghasil  L-Asparaginase    dideterminasi dengan  menggunakan  sekuen  16S-rRNA.  Analisis  cluster  pada  sekuens  tersebut dilakukan dengan program BLAST (Basic Local Aligmnet Search Tool) dari NCBI (National  Center  for  Biotechnologhy  Information. Adapun  langkah-langkahnya sebagai berikut :

## 1. Ekstraksi DNA
Sampel  sekitar  10 5 cfu  dilarutkan  dengan  200  µL PBS .    Sampel dipanaskan  dalam  waterbath  pada  suhu  90˚C  selama  25-30  menit.    Sampel disentrifuge  selama  10-15  menit dengan  kecepatan  13.000  rpm  lalu  100  µL supernatan siap diamplifikasi pada mesin PCR.

## 2. Pembuatan gel agarose
Untuk target DNA < 1000 bp digunakan  agarose 2 %  yakni 2  gr/100 mL akuades.    Gel  agarosa  ditimbang  sebanyak  2  gram  lalu  dilarutkan  dalam  100  ml
Mashuri Masri , Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase …_ 247
10  Tris  borate  EDTA  (TBE)  dan  dipanaskan  bersama  stirer  sampai  mendidih. Dibiarkan memadatkan bersama sisir sumur.  Selanjutnya direndam dalam larutan ethidium bromide.

## 3. Amplifikasi PCR
Melarutkan  kit  primer  U1  351,8  µL  dan  U2  308,1  µL  masing-masing dengan 100 µM nuclease free water.  Membuat  master mix  yang mengandung 1 µL  U1, 1 µL U2, 5 µL 10 X buffer, 2 µL MgCl 2 25 mM, 1 µL dNTP 10 mM, hot start 0,25 µL, H 2 O 29,75 µL dan DNA 10 µL.  Melarutkan 10 µL supernatant dan 40  µL  master  mix  sehingga  total  volume  sampel  50  µL  kemudian  dimasukkan dalam mesin PCR.  Sampel didenaturasi pada suhu 95˚C selama 15 menit.  Proses PCR melalui 35 siklus, denaturasi pada suhu 95˚C selama 1 menit, annealing pada suhu 55˚C  selama  1  menit  dan  extension pada  suhu 72˚C  selama  2  menit  lalu diinkubasi pada  suhu 72˚C  selama  10  menit.    Produk  PCR  sebanyak  2 µL dilarutkan dengan 1,5 µL loading dye lalu dielektroforesis pada gel agarose 2 %. Untuk  mengetahui  ukuran  produk  PCR  maka  digunakan  marker  pada  sumur pertama  dan  terakhir.    Gel  agarose  dimasukkan  dalam  gel  doc  untuk  melihat produk PCR dengan pita yang jelas yang berukuran 150 bp.

## 4. Sekuensing
RNA  forward  sampel  dikirim  ke  MacroGen  Korea  untuk  disekuensing. Hasilnya  berupa  sekuen  nukleotida  sepanjang  ±  150  nukleotida.    Nukleotida tersebut  dimasukkan  dalam  program  BLAST  untuk  dicocokkan  dengan  data spesies pada GenBank, keidentikan yang digunakan pada range 80-100 %.

## V. HASIL DAN PEMBAHASAN
Setelah  melakukan  sekuensing  di  laboratorium  MacroGen  Korea, diperoleh hasil sebagai berikut :
248 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 2, Juli 2014 , hlm. 241 – 253
Gambar 2. Hasil BLAST
Dari  gambar 2 dinyatakan bahwa panjang basa nukleutida sampel bakteri simbion makro alga Sargassum sp sebesar 778 bp yang dinyatakan dengan Query length.
Mashuri Masri , Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase …_ 249
Gambar 3. Deskripsi hasil Identifikasi dari berbagai jenis kemungkinan bakteri

## Terdapat  3  kemungkinan  bakteri  hasil  metode  BLAST,  yakni
Pseudomonas  putida,  Enterobacter  asburine dan Marinobacter  arcticus. Dari gambar  3  diperoleh  nilai  tertinggi  sebesar  1358  yang  dinayatakan  dengan  Max Score.    Persentase  basa  nukleutida  yang  terbaca  sebesar  98%  yang  dinayatakan dengan  Query  cover.    Sehingga  dari  hasil  tersebut  ditentukan  bahwa  bakteri Pseudomonas  putida strain  E16  16S  ribosomal  RNA  gene  merupakan  bakteri simbion makro alga Sargassum sp.
250 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 2, Juli 2014 , hlm. 241 – 253
Gambar 4. Urutan Basa Nukleutida Pseudomonas putida strain E16 16S ribosomal RNA gene dengan nomor akses KC820813.1
Mashuri Masri , Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase …_ 251
Gambar 5. Urutan Basa Nukleutida Pseudomonas putida strain E16 16S ribosomal RNA gene dengan nomor akses KC820813.1 (lanjutan).
Dari  gambar  4  dan  gambar  5  terlihat  bahwa  16S  Ribosomal  RNA  gene dinyatakan  dengan  sbjct  sedangkan  sampel  dinyatakan  dengan  Query.  Panjang 16S Ribosomal RNA gene yang digunakan sebesar 1419 bp dengan range 518 bp sampai  1277  bp.  Penggunaan  518  bp  sampai  1277  bp  oleh  system  karena  di bagian  tersebut  merupakan  bagian  yang  paling  mendekati  dengan  urutan nukleutida sampel dengan nilai Query cover 98%.
252 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 2, Juli 2014 , hlm. 241 – 253
Identities sebesar  756/765  (99%).    Hal  ini  berarti  bahwa  terdapat  756  bp yang  sama  antara  Query  dengan  Sbjct  dari  765  bp  Query.  Terdapat  9  perbedaan yang  berasal  dari  5  bp  yang  mengalami  insersi  dan  4  bp  yang  mengalami substitusi,  yakni    pada  Query  714  bp,  720  bp,  755  bp,  770  bp.    Substitusi  yang pertama  terjadi  pada  Query  714  bp  yang  berupa  A  tetapi  pada  Sbjct  1215  bp berupa G.  Substitusi ke dua terjadi pada Query 720  bp yang berupa A tetapi pada Sbjct 1221 bp berupa G. Substitusi ke tiga terjadi pada Query 755  bp yang berupa T tetapi pada Sbjct 1256 bp berupa C. Substitusi ke empat  terjadi pada Query 770 bp  yang  berupa    T  tetapi  pada  Sbjct  1270  bp  berupa  C  (tanda  berupa X pada gambar  4 dan 5).
Gaps sebesar  5/765  (0%).  Hal  ini  dimaksudkan  bahwa  Query  sepanjang 765 bp  dan Terdapat 5 gaps dengan Sbjct, yakni pada urutan 28 bp, 32 bp, 39 bp, 765 bp dan 775 bp  yang  terjadi  karena  insersi pada Query (terdapat pada Query namun tidak terdapat pada  sbjct). (tanda berupa . pada gambar  4 dan 5).

## VI. KESIMPULAN
Setelah  Melakukan  penelitian  ini  diperoleh  jenis  bakteri Pseudomonas putida strain  E16  16S  ribosomal  RNA  gene  yang  merupakan  bakteri  simbion makro alga Sargassum sp.

## DAFTAR RUJUKAN
Deval,  A.  G.,  Platas,  G.,  Basilio,  A.,  Cabello,  A.,  Gorrochategui,  J.,  Suay,  I., Vicente, F., Portilllo, E., del Rio, M. J., Reina, G. G., and Pelaez, F., 2001, Screening  of  Antimicrobial  Activities  in  Red,  Green  and  Brown Macroalgae  from  Gran  Canaria  (Canary  Islands,  Spain) .  Int. Microbiologi , Vol. 4.
E-Moharam,  M.,  Gamal-Eldeen,  A.M.,  dan  El-Sayed,  S.T.,  2010, Production, Immobilization and Anti Tumor Activity of L – Asparaginase of Bacillus sp R36 , Journal of American Science, Vol. 6.
El-Bessoumy,  A.A.,  Sarhan,  M.,  dan  Mansour,  J.,  2004, Production,  Isolation, and  Purification  of  L  –  Asparaginase  from  Pseudomonas  Aeruginosa 50071  Using  Solid  state  Fermentation, Journal  of  Biochemistry  and Molecular Biology, Vol. 37.
Gashemi,  Y.,  Ebrahimi,  A.,  Rasoul-Amini,  S.,  Zarrini,  G.,  and  Ghoshon,  M.  B., 2008, An  Optimized  Medium  for  Screening  of  L  –  Asparaginase Production  by  Eschericia  coli ,  American  Journal  of  Biochemistry  an Biotechnology, Vol. 4.
Mashuri Masri , Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim L-Asparaginase …_ 253
Hadioetomo,  R.  S.,  1993, Mikrobiologi  Dasar  dalam  Praktek ,  PT.  Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Hay, M. E., 1996, Marine Chemical Ecology : What’s Known and What’s Next , J. Exp. Mar. Biol. Ecol., Vol. 200.
Kadi,  A.,  2005, Beberapa  Catatan  Kehadiran  Marga  Sargassum  di  Perairan Indonesia, Bidang Sumber daya Laut , Pusat Penelitian Oseanografi, LIPI, Jakarta, Vol. 30.
Kurnia,  D.  R.  D.,  2010, Studi  Aktivitas  Lipase  dari  Aspergillus  niger  sebagai Biokatalis pada  Proses Gliserolisis untuk Menghasilkan Monoasilgliserol
(Tesis), Universitas Diponegoro, Semarang
Lay, B. W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium , Rajawali Pers, Jakarta.
Lee,  Y.  K.,  Lee,  J.  H.,  Lee,  H.  K.,  2001, Microbial  Symbiosis  in  Marine Sponges,J. Microbiol , Vol. 30.
Long,  R.  A.,  and Azam ,  F.,  2001, Antagonistic  Interactions  among  Marine Pelagic Bacteria , Appl Environ Microbiol, Vol. 67.
Natsir, H., Patong, A. R., Suhartono, M. T., and Ahmad A., 2010, Production and Characterization  of  Chitinase  Enzyme  from  Sulili  Hot  Spring  in  South Sulawesi, Bacillus sp. HSA3-1a, Indo. J. Chem., Vol. 10.
Nofiani,  R.,  2008, Urgensi  dan  Mekanisme  Biosintesis  Metabolit  Sekunder Mikroba Laut , Jurnal Natur Indonesia.
Perez-Matos,  A.  E.,  Rosado,  W.,  Govind,  N.S.,  2007, Bacterial  Diversity Associated  with  the  Caribbean  Tunicate  Ecteinascidia  turbinata , Department of Marine Sciences University of Puerto Rico, Vol. 92.
Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia , Universitas Indonesia, Jakarta.
Rasyid,  A.,  2001, Potensi  Sargassum  Asal  Perairan  Kepulauan  Spermonde sebagai  Bahan  Baku  Alginat ,  Kandidat  Peneliti  Puslitbang  Oseanologi, LIPI, Jakarta.
Verma,  N.  K.,  Kumar,  G.,  Kaur,  and  Ariand,  S.,  2007, L-Asparaginase  :  A Promosing Chemotherapeutic Agent, Critical Review Biotechnology, Vol. 27.
Zainuddin, E. N., dan Malina, A. C., 2009, Skrining Rumput Laut Asal Sulawesi Selatan  sebagai  Antibiotik  melawan  Bakteri  Patogen  pada  Ikan ,  Laporan Penelitian Research Grant, Biaya IMHERE-DIKTI.