Majalah Farmasetika, 4 (Suppl 1) 2019, 28 – 33 https://doi.org/10.24198/mfarmasetika.v4i0.25887

## Perbandingan Metode Spektrofotometri UV Dan HPLC pada Penetapan Kadar Kafein dalam Kopi

## Abstrak
Kafein merupakan salah satu alkaloid yang terkandung dalam kopi. Konsumsi kafein dalam jumlah besar bisa berdampak pada kesehatan manusia. Kebiasaan orang-orang jamun dulu minum kopi tradisional, maupun orang jaman sekarang minum kopi dengan berbagai varian tentu akan berpengaruh pada kondisi kesehatan. Sehingga perlu diketahui kandungan kafein dalam kopi. Peneliti terdahulu telah melakukan penetapan kadar kopi dengan metode HPLC maupun Spektrofotometri. Namun belum ada yang membandingkan kedua metode. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan metode spektrofotometri UV dan HPLC dalam penetapan kadar kafein dalam kopi. Sampel yang digunakan adalah sediaan kopi hijau dan kopi hitam. Perbandingan metode dilakukan dengan membandingkan data hasil validasi metode antara spektrofotometri UV dan HPLC. Metode spektrofotometri dilakukan dengan pelarut air, absorbansi kafein dibaca pada panjang gelombang 272 nm. Metode HPLC dilakukan dengan fase diam C18, fase gerak matanol-air (69:40 v/v) flow rate 1 ml/menit dan detector UV 272 nm. Hasil validasi metode analisis kafein secara spektrofotometri adalah sebagai berikut : linearitas (R= 0,9965), presisi (RSD= 0,899%), akurasi (recovery = 98,46%) LOD= 1,12 ug/ml, LOQ=3,75 ug/ml. Hasil validasi metode HPLC adalah: linearitas (R= 0,998), Presisi (RSD= 2,49%), akurasi (Recovery= 84%), LOD=0,565 ug/ml, LOQ= 1,88 ug/ml. Kadar kafein dalam sampel kopi hijau sediaan dan kopi hitam sediaan, secara Spektrofotometri UV bertrurut-turut (dalam %) adalah : (0,155± 0,053) dan (0,696 ± 0,014). Kadar kafein dalam kopi hijau sediaan, kopi hitam sediaan, secara HPLC berturut-turut (dalam %) adalah ; 0,121 dan 0,421. Metode spektrofotometri UV direkomendasikan sebagai metode pilihan pada penetapan kadar kafein dalam sampel kopi.
Kata kunci: Spektrofotometri UV, HPLC, kafein, kopi

## Outline
• Pendahuluan
• Metode
• Hasil dan Pembahasan
• Kesimpulan
• Ucapan Terima Kasih
• Daftar Pustaka
Hari Susanti*, Nisa Putri Mujaadillah Araaf, Dede Gunanto, Aprilia Kusbandari
Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan
* Email korespondensi : hari.susanti@pharm.uad.ac.id
(Submit 15/03/2019,  Revisi 05/09/2019,  Diterima 20/12/2019)

## Pendahuluan
Kopi merupakan salah satu minuman yang sangat sering dikonsumsi oleh seluruh masyarakat dunia.. Namun perlu menjadi perhatian dalam hal mengkonsumsi kopi, karena kafein yang terkandung dalam kopi mampu untuk meningkatkan terjadinya penyakit jantung, LDL serta meningkatkan tekanan darah jangka pendek (Freedman et al , 2012). Penikmat kopi biasanya meminum kopi 3-4 kali sehari (Maramis, dkk., 2013). Salah satu senyawa yang terkandung dalam kopi adalah kafein (gambar 1) (Mulato, 2001). Untuk menjamin keamanan kopi yang beredar di pasaran, Badan Standarisasi Nasional (BSN) telah menetapkan standar untuk kadar kafein dalam kopi berkisar 0,45- 2% b/b (SNI 01-3542-2004). Sehingga jika ada kopi yang mengandung kadar kafein yang tinggi perlu dilakukan dekafeinisasi, untuk menekan aktivitas kafein di dalam tubuh (Sofiana, 2011).

## Gambar 1. Struktur kimia kafein
Saat ini, banyak metode analisis yang telah dikembangkan untuk menetapkan kadar kafein seperti titrimetri, spektrofotometri, Gas chromatography (GC), NIRS dan Mass Spektroskopi. Namun, sebagian besar metode di laporkan memiliki banyak masalah dalam hal deteksinya (Chowdhurry et al, 2012). Berdasarkan penelitian Arwangga, dkk., (2016) dalam menetapkan kadar kafein pada kopi dengan metode sperktofotometri UV- Vis. Dari beberapa metode tersebut, metode HPLC merupakan metode yang paling selektiv dalam memisahkan senyawa yang terkandung dalam kopi. Berdasarkan uraian diatas, peneliti tertarik untuk menetapkan kadar kafein dalam kopi metode spekstrofotometri UV dan HPLC.

## Metode

## A. Bahan
Bahan yang digunakan adalah sediaan kopi hijau dan kopi hitam, Kloroform, NH 4 OH, CaCO3, pereaksi Mayer, pereaksi Wagner, pereaksi Dragendorf, pereaksi Parry dan Pereaksi Mureksid. Metanol for HPLC , aquabidest

## B. Alat
Alat alat yang digunakan dalam penelitian antara lain glassware, neraca analitik EXT 200 (Ohaus), HPLC Shimadzu LC 20 AT, kolom LiChrospher® 100 RP-18 endcapped (5µm) panjang 25cm, diameter dalam 4 mm (E. Merck), Spektrofotometer Pharmaspec UV 1800 (Shimadzu)

## C. Prosedur Penelitian
1. Pengumpulan Sampel
Sampel kopi hitam dan kopi hijau siap seduh yang digunakan adalah kopi yang banyak beredar di pasaran.
2. Analisis Kualitatif
a. Uji Parry
Analisis metode Parry dilakukan dengan cara sejumlah zat dilarutkan dalam alkohol, kemudian ditambahkan reagen Parry dan ammonia encer. Larutan berwarna biru tua/hijau menyatakan terdapat kafein (DepKes, 1995).
b. Uji Dragendorff
Sebanyak 1 g sampel dilarutkan dalam 10 ml kloroform dan 4 tetes NH 4 OH, kemudian disaring dan filtratnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan 6 ml H 2 SO4 2 M dan lapisan asamnya dipisahkan ke dalam tabung reaksi yang lain ditambah 3 tetes larutan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan warna merah jingga (Harborne 1987). c. Uji kualitatif dengan membandingkan tR standar kafein dengan sampel serta membandingkan spectra sampel dengan spectra standar kafein pada spektrofotometer UV.
3. Validasi metode Spektrofotometri UV

## a. Penentuan Spesifisitas
Dibuat larutan strandar kafein 5µg/ml dalam akuades. Discan panjang gelombang dari 200-300 nm. Larutan sampel hasil ekstraksi discan panjang gelombang dari 200-300 nm. Dilihat kesesuaian profil spektra.
b. Penentuan linearitas
Dibuat larutan standar kafein 1-10 5µg/ml , dibaca absorbansi pada 272 nm. Dibuat kurva regresi antara konsentrasi vs absorbansi
c. Penentuan akurasi
Tambahkan sejumlah standar kafein yang setara dengan 80-120% dari kadar kafein dalam sampel, perlakukan seperti preparasi sample. Hitung % recovery .
4. Validasi Metode analisis HPLC a. Instrumentasi dan kondisi kromatografi
Kolom yang digunakan C18, resistensi pH (4.5 mm x 250 nm; 5 um ). Detector di atur pada 272 nm dan run time 20 menit dengan flowrate 1ml/menit dalam suhu ruangan b. Pemilihan Fase gerak
Kombinasi antara air dan methanol grade HPLC dengan rasio 60:40 menggunakan flow rate 1 ml/menit dan run time di atur 8 menit.
c. Linearitas
Timbang kafein 20 mg kemudian larutkan dengan aquadest sampai 100 ml (larutan stok). Untuk linearita, ambil larutan stok dengan 3 sampai 7 ml larutkan dalam 50 dengan konsentrasi 12-28 ug/ml dan gunakanlah kalibrasi.
d. Presisi
Larutan standar kafein konsentrasi 16, 20 dan 24 ug/ml diinjeksikan ke dalam HPLC (replikasi 3 kali). Dihitung % RSD.
e. Akurasi
Dalam penelitian ini menggunakan konsentrasi 80%, 100%, 120% kafein larutkan dalam 100 ml aquadest. Larutan di analisis dengan HPLC 272 nm. Prosedur ini di replikasi sebanyak 3x.
f. LOD dan LOQ Limit of detection (LOD) and Limit of quantification (LOQ) menggunakan persamaan LOD=3.3 x s0/b
LOQ = 10x s0/b
Dimana S0 dan b merupakan SD dan Slop e dari garis kalibrasi.

## g. Preparasi sampel
Sebanyak 1 gram bubuk kopi dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan 150 mL akuades panas kedalamnya sambil diaduk. Larutan kopi panas disaring melalui corong dengan kertas saring ke dalam Erlenmeyer, kemudian 1,5 g kalsium karbonat(CaCO3) dan larutan kopi tadi dimasukkan ke dalam orong pisah lalu diekstraksi sebanyak 4 kali, masing-masing dengan penambahan 25 mL kloroform. Lapisan bawahnya diambil, kemudian ekstrak (fase kloroform) ini diuapkan dengan rotari evaporator hingga kloroform menguap seluruhnya. Ekstrak kafein bebas pelarut dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, diencerkan dengan akuades hingga garis tanda dan dihomogenkan. Larutan kemudian ditentukan kadarnya dengan spektrofotometri UV dan HPLC (Fitri, 2008).

## Hasil dan Pembahasan
Hasil uji kualitatif menunjukkan bahwa semua sampel kopi yang digunakan mengandung alkaloid kafein (tabel 1)
Tabel 1. Rangkuman hasil uji kualitatif
Baik secara uji tabung maupun membandingkan tR di HPLC serta spectra pada spektrofotometer, kesemua sampel menunjukkan positif mengandung kafein. Hasil validasi metode analisis kafein secara spektrofotometri UV dan HPLC seperti tersaji pada tabel 2.

## Tabel 2. Hasil validasi metode
Berdasar data pada tabel 2 terlihat bahwa baik metode HPLC maupun spektrofotometri UV memiliki linearitas yang baik dan memenuhi persyaratan FDA (Snyder et al, 2000) metode HPLC memiliki sensitifitas yang lebih baik dibanding spektrofotometri UV. Hal ini terlihat dari nilai LOD dan LOQ yang lebih rendah. Metode spektrofotometri memiliki nilai presisi dan akurasi yang memenuhi syarat dan lebih baik dibanding HPLC. Dari keseluruhan hasil validasi, dalam penelitian ini lebih direkomendasikan metode spektrofotometri UV. Selain lebih mudah, murah, ternyata memiliki parameter validasi yang lebih baik dibandingkan HPLC, terutaman dalam akurasi metode.
Sampel Jenis uji Parry Dragendorf tR (HPLC) Spektra Standar kafein + + + + Kopi hitam + + + + Kopi Hijau + + +
+
Parameter
Metode HPLC Spektrofotometri UV Linearitas (R) 0,99807 0,9965 Slope: intersep 49.923,569x; 46.702,389 0,0549X; 0,1622 rentang 1-10 1-15 LOD/LOq (ug/ml) 0,565243/1,884142 1,12506/3,750199 Presisi (%RSD) 2,49 0,89 Recovery (%) 84,00 98,46

## Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel
Penetapan kafein dalam sampel didahului dengan ekstraksi kandungan kafein dalam sampel. Ekstraksi dilakukan dengan membuat suasana basa pada suspense sampel dalam air. Hal ini bertujuan untuk melkukan salating out domana kafein dalam kopi biasanya berada dalam bentuk garam diubah menjadi dalam bentuk basa. Ekstraksi selanjutnya dilakukan dengan pelarut kloroform untuk mengambil kafein (base) yang bersifat larut kloroform. Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel dengan metode HPLC dan spektrofotometri UV tersaji pada tabel 3.
Tabel 3.  Hasil penetapan kadar kafein dalam sampel

## *Data dinyatakan dalam rata-rata ± SD
Dari hasil penelitian (tabel 3) terlihat bahwa kadar kafein pada sampel kopi hitam lebih tinggi daripada kopi hijau, baik secara HPLC maupun spektrofotometri UV.

## Kesimpulan
Hasil validasi metode analisis kafein secara spektrofotometri adalah sebagai berikut : linearitas (R= 0,9965), presisi (RSD= 0,899%), akurasi (recovery = 98,46%) LOD= 1,12 ug/ml, LOQ=3,75 ug/ml. Hasil validasi metode HPLC adalah: linearitas (R= 0,998), Presisi (RSD= 2,49%), akurasi (Recovery= 84%), LOD=0,565 ug/ml, LOQ= 1,88 ug/ml. Kadar kafein dalam sampel kopi hijau sediaan dan kopi hitam sediaan, secara Spektrofotometri UV bertrurut-turut (dalam %) adalah : (0,155± 0,053) dan (0,696 ± 0,014),. Kadar kafein dalam kopi hijau sediaan, kopi hitam sediaan, secara HPLC berturut-turut (dalam %) adalah ; 0,121 dan 0,421. Metode spektrofotometri UV direkomendasikan sebagai metode pilihan pada penetapan kadar kafein dalam sampel kopi

## Ucapan Terima Kasih
Penulis mengucapkan terimakasih kepada LPP UAD yang telah menyediakan dana penelitian ini dengan skim Hibah penelitian Fundamental.

## Daftar Pustaka
1. Chowdhury, Sharmin Reza., Maleque, Mahfuza., and Shihan, Mahbubul hoque,. 2012, Development and Validation of a Simple RP-HPLC Method for Determination of Caffeine in Pharmaceutical Dosage Forms. University of Bangladesh
2. Dalimartha, S.2000. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia . Trubus Agrowidya. Bogor
3. Ditjend POM. 1989. Materia Medica Indonesia. Jilid kelima.DepKes RI, Jakarta.Hal.534-540.
4. Dirjen POM. 1979. Farmakope Indonesia .Edisi ketiga. DepKes RI. Jakarta
5. Fridewald, NT., RI Levy, RI Frieddericson. 2001. Estimation Of The Concentration Of Low Density Lipoprotein Cholesterol Plasma Without Use The Prepagative
Sampel
Kadar kafein (%)* HPLC Spektrofotometri UV Kopi hijau sediaan 0,121 ± 4,815 0,155± 0,053 Kopi hitam sediaan 0,421± 4,51 0,696 ± 0,014
Ultracentrifugation. Clinical Chemistry 1972: 18; 499-502
6. Harborne, J. B. 1996. Metode Fitokimia Penuntun Cara Menganalisis Tumbuhan. Terjemahan
Padmawiyata, K., dan Soediro, I. ITB. Bandung. Hal.69-94 7. Jackman, R. L. Dan Smith, J. L. 1996. Anthocyanins and Betalains.Natural Food Colorants .Second Edition.Chapman and Hall. London. Hal.183-241 8. Kumar, vinay.Cotran, Ramzi S. Robbins, Stanley L. 1997. Robbins Basic Pathology Edition 7 th . USA: Saunders
9. Lee, M. P., Abdullah, R. Dan Hung, K. L. 2011.Thermal Degradation of Blue Anthocyanin Extract of Clitoria termatea Flower.International Conference on Biotechnology and Food Science IPCBEE . 7:49-53
10. Maramis, R.K.,, Citaningtyas, G., Wehantouw ,F., 2013, Analisis Kafein dalam kopi bubuk di kota Manado Menggunakan Spektrofotometri UV-Vis, Pharmacon , Vol 2 No 4: 122-128
11. Muntiha, M. 2001. Teknik Pembuatan Preparat Histopatologi Dari Jaringan Hewan Dengan Pewarnaan Hemaktosilin dan Eosin (H&E). Balai Penelitian Veteriner. Bogor
12. Price, Sylvia A. Wilson, Lorraine M. 2005. Patofisiologi: Konsep Klinis Proses- proses penyakit. Jakarta: EGC
13. Sari, P. Agustina. F., Komar, M., Unus, Fauzi., M., dan Lindriati, T. 2005. Ekstraksi dan Stabilitas Antosianin Dari Kulit Buah Duwet (Syzgium cumini). Jurnal Teknol. dan Industri Pangan . XVI (2): 142-146
14. Sirait, A M. 2001. Analisa Varians (ANOVA) dalam Penelitian Kesehatan. Jurnal Media Litbang Kesehatan. Vol XI No 2 P:39-43.