ISSN: 1907-9931 (print), 2476-9991 (online)

## ANALISIS BAKTERI PEREDUKSI KONSENTRASI LOGAM TIMBAL Pb(CH3COO) 2

## MENGGUNAKAN GEN 16S Rrna
ANALYSIS OF BACTERIA IN THE REDUCTION OF THE CONCENTRATION OF LEAD METAL Pb(CH3COO) 2 USING GEN 16S Rrna
Yudi Nurul Ihsan 1* , Kalysta Fellatami 2 , Rega Permana 3 , Yeni Mulyani 1 , Tri Dewi K Pribadi 4
1 Departemen Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Padjadjaran
2 Fisheries College, Ocean University of China
3 Departemen Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Padjadjaran
4 Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran *Corresponding author e-mail: yudi.ihsan@unpad.ac.id/+6282127615924
Submitted: 17 May 2020 / Revised: 08 August 2020 / Accepted: 11 August 2020
http://doi.org/10.21107/jk.v13i2.7285

## ABSTRACT
This study aims to obtain the type and capabilities of bacteria in the reduction of the concentration of lead metal Pb(CH3COO) 2 from sediments of the Karangsong Coast, Indramayu. Methods used namely exploratory  methods and  the  resulting  data  is  analyzed  in  the  descriptive.  In  molecular  identification methods using 16S rRNA Gene which is a universal primer for bacterium. Bacterial sequences obtained from GenBank data analyzed by NCBI ( National Center of Biotechnology Information ) sites.The results of this research show that eleven isolates of bacteria that the pore water of sediment derived from the highest reduction of lead metal Pb(CH3COO) 2 concentration of 1.5 mgL - 1 be 0.364 mgL - 1 with a value of efficiency reached 75.7%. Four isolates bacterial with the highest density values were identical to the Albirhodobacter marinus strain N9 (ACC. No. NR 126203.1) with identity value 98% and kinship value 100%,  Pseudoalteromonas  tetraodonis  strain  NBRC  103034  (ACC.  No.  NR  114187.1)  with  identity value  81%  and  kinship  value  84%,  Pseudoalteromonas  lipolytica  strains  LMEB  39  (ACC.  No.  NR 116629.1) with identity value 98% and kinship value 96%. Pseudoalteromonas lipolytica strains LMEB 39 (ACC. No. NR 116629.1) with identity value 93% and kinship value 93%.
Keywords: Bacteria, Bioremediation, 16S rRNA gene, Lead Metal

## ABSTRAK
Riset  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  jenis  dan  kemampuan  bakteri  dalam  mereduksi  konsentrasi logam  timbal  Pb(CH3COO) 2 dari  sedimen  Pantai  Karangsong,  Indramayu.  Metode  yang  digunakan yaitu  metode  eksploratif  dan  data  yang  dihasilkan  dianalisis  secara  deskriptif.    Metode  identifikasi secara  molekular  menggunakan  Gen  16S  rRNA  yang  merupakan  primer  universal  untuk  bakteri. Sekuens bakteri yang didapatkan dianalisis dengan data GenBank dari situs NCBI (National Center of Biotechnology Information). Hasil riset ini menunjukkan bahwa sebelas isolat bakteri yang berasal dari air pori sedimen paling tinggi mereduksi logam timbal Pb(CH3COO) 2 dari konsentrasi 1,5 mgL -1 menjadi 0,364  mgL -1 dengan  nilai  efisiensi  mencapai  75,7%.  Empat  isolat  bakteri  dengan  nilai  kepadatan tertinggi identik dengan Albirhodobacter marinus strain N9 (Acc. No. NR 126203.1) dengan nilai identity 98% dan nilai kekerabatan 100%, Pseudoalteromonas tetraodonis strain NBRC 103034 (Acc. No. NR 114187.1) dengan nilai identitiy 81% dan nilai kekerabatan 84%, Pseudoalteromonas lipolytica strain LMEB  39  (Acc.  No.  NR  116629.1)  dengan  nilai  identity  98%  dan  nilai  kekerabatan  96%. Pseudoalteromonas lipolytica strain LMEB 39  (Acc. No. NR 116629.1) dengan nilai identity 93% dan nilai kekerabatan 87%.
Kata Kunci: Bakteri, Bioremediasi, Gen 16S rRNA, Logam Timbal

## PENDAHULUAN
Pencemaran  di  wilayah  pesisir  merupakan kasus yang sering terjadi, sumber pencemaran
dan kerusakan di wilayah pesisir ini berasal dari kegiatan yang ada di daratan dan lautan. Salah satu bahan pencemar yang mencemari wilayah pesisir  yaitu  logam  timbal  (Pb).  Jenis  logam
tersebut termasuk logam nonessensial sehingga  keberadaannya  tidak  memberikan pengaruh  baik.  Badan  perairan  yang  telah tercemar  logam  timbal  (Pb),  jika  melebihi konsentrasi  yang  semestinya  maka  dapat mengakibatkan  kematian  bagi  biota  perairan tersebut (Wulandari et al., 2009).
Untuk  meminimalisir  kadar  logam  timbal  (Pb) yang  tinggi  dibutuhkan  agen  bioremediasi salah  satunya  yaitu  bakteri.  Bakteri  tersebut dikenal sebagai bakteri indigenou s atau bakteri asal ekosistem yang telah beradaptasi dengan lingkungan  asalnya  sehingga  memungkinkan memiliki kemampuan reduksi dalam penanganan lingkungan  yang  tercemar  logam timbal  (Pb)(Ahmad  2018).  Bakteri  tersebut dapat diketahui kemampuannya dalam mereduksi  konsentrasi  logam  timbal  (Pb) dengan  pengujian  secara  eksperimental. Selain itu dapat diketahui jenis dan kekerabatannya  melalui  identifikasi  molekular menggunakan  teknik  PCR  ( Polymerase  Chain Reaction ) menggunakan Gen 16S rRNA. Riset ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  jenis  bakteri dan  sejauh  man  kemampuan  bakteri  tersebut dalam  mereduksi  konsentrasi  logam  timbal (Pb) dari sedimen Pantai Karangsong, Indramayu, Jawa Barat.

## MATERI DAN METODE Pengambilan Sampel
Riset  ini  dilakukan  pada  bulan  April  sampai dengan November 2018. Pengambilan sampel dan data perairan dilakukan melalui pengukuran secara langsung ( in situ ). Sampel sedimen  diambil  dari  dekat  dermaga  Pantai Karangsong  pada  4  April  2018.  Adapun koordinat  pengambilan  sampel  sedimen  yaitu pada 6°15' – 6°40' LS dan 107°52'–108°36' BT. Pengambilan sampel porewater pada sedimen yang tercemar dilakukan dengan menggunakan pistoncore pada kedalaman 30- 60  cm  sebanyak  3  kali  pengulangan.  Sampel air  pori yang  diambil  menggunakan  suntikan berukuran  3  ml,  kemudian  dimasukkan  pada botol  steril  dan  disimpan  dalam cool  box . Setelah  itu  dilakukan  pengambilan  data parameter  kualitas  perairan  meliputi  suhu, salinitas,  pH,  dan  DO  ( Dissolved  Oxygen ), serta dilakukan pengukuran kadar logam timbal (Pb) terlarut di Pantai Karangsong.

## Uji Reduksi Logam Berat Timbal (Pb)
Bakteri pada air pori sedimen dimasukkan pada larutan Pb(CH3COO) 2 dengan kadar  0,5 mgL - 1 ,  1,0  mgL -1 ,  dan  1,5  mgL -1 .  Masing-masing konsentrasi  tersebut  dibuat  menjadi  lima
larutan dan diamati pada jam ke-0 (T0), jam ke- 6 (T2), jam ke-12 (T3), jam ke-24 (T4) dan jam ke-48 (T5). Penghentian metabolisme dilakukan  dengan  cara  menyuntikkan  larutan alkohol  95%  pada  setiap  waktu  pengamatan yang  telah  ditentukan.  Kemudian  dilakukan pengukuran konsentrasi logam timbal Pb(CH3COO) 2 mengunakan SSA
(Spektrofotometri  Serapan  Atom)  Himedia, serta  perhitungan  kepadatan  bakteri  dengan metode TPC ( Total Plate Count ).
Kultur  dan  Pemurnian  Bakteri  Pereduksi Konsentrasi Logam Timbal Pb(CH3COO) 2
Kultur dan pemurnian bakteri pereduksi logam timbal  dilakukan  untuk  mendapatkan  isolat bakteri  murni  yang  akan  dilakukan  identifikasi secara  molekular.  Sumber  yang  digunakan berasal  dari  air  pori  yang  terkandung  pada larutan  logam  timbal  Pb(CH3COO) 2 pada pengamatan jam ke-48. Bakteri yang terkandung  pada  sumber  tersebut  merupakan bakteri yang mampu tumbuh pada konsentrasi logam  timbal  yang  telah  ditentukan.  Kultur bakteri  dilakukan  dengan  metode pour  plate , dan  sumber  diencerkan  hingga  10 -5 dengan suhu  37ºC  selama  24  jam.  Pemurnian dilakukan dengan metode cawan gores dengan menggunakan  medium  padat  NA  (Nutrien Agar).

## Pewarnaan Gram Bakteri
Pewarnaan  gram  bakteri  bertujuan  untuk mengetahui sifat gram bakteri (gram positif atau gram negative)  serta melihat bentuk morfologi sel  bakteri.  Zat  yang  digunakan  adalah  kristal violet sebagai zat pewarna gram gram negatif. Sifat  gram  bakteri  positif  ditunjukkan  dengan warna  biru,  sedangkan  sifat  gram  negatif ditunjukkan dengan warna ungu.

## Uji Tantang Bakteri Terhadap Logam Timbal Pb(CH3COO) 2
Uji  tantang  ini  bertujuan  untuk  melihat ketahanan  dan  pertumbuhan  bakteri  terhadap larutan  yang  mengandung  logam  timbal Pb(CH3COO) 2 .  Uji  tantang  ini  dilakukan dengan  menginokulasikan  bakteri  ke  dalam medium  cair Nutrien  Broth (NB)  yang  telah mengandung  logam  timbal  Pb(CH3COO) 2 dengan  konsentrasi 1,5  mgL -1 .  Metode  yang digunakan  pada  uji  tantang  ini  merujuk  pada riset  yang  telah  dilakukan  Lewaru  dkk  (2012). Isolat bakteri diinokulasi pada incubator shaker pada  suhu  37 o C  selama  18  jam.  Kemudian diukur menggunakan spektrofotometer TECAN pada jam ke-0 dan jam ke-18 dengan panjang gelombang 600 nm.

## Ekstraksi DNA bakteri
Ekstraksi DNA bakteri bertujuan untuk memisahkan komponen DNA dengan komponen sel lainnya. Metode yang digunakan yaitu fenol-kloroform, dengan tahap homogenisasi  (tahap  lisis  sel)  menggunakan reagen dari TRIsure. Prosedur yang digunakan berdasarkan  protokol  ekstraksi  DNA  bakteri dari TRIsure BIOLINE. Tahapan ekstraksi DNA meliputi homogenisasi, fase pemisahan, presipitasi  DNA,  pencucian  DNA,  dan Re- dessolving DNA.  Selanjutnya  DNA  diukur kemurnian dan konsentrasinya secara spektrofotometri dengan
menggunakan spektrofotmetri  pada  panjang  gelombang  ( ʎ) 260 nm dan 280 nm.
Amplifikasi DNA (PCR)
DNA tamplate yang  sudah  diisolasi  kemudian diamplifikasi dengan metode PCR ( Polymerase Chain Reaction ). Amplifikasi ini bertujuan untuk memperbanyak  jumlah  DNA  secara in-vitro . Metode yang digunakan dalam amplifikasi DNA ini  mengacu  pada  riset  yang  telah  dilakukan oleh Mihdir et al., (2016). Proses PCR dimulai dengan  amplifikasi  menggunakan  primer  9F ( 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) dan 1542R ( 5’AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’).

## Elektroforesis
Pada  tahap  ini  menggunakan  gel  agarosa dengan konsentrasi yaitu 1% untuk elektroforesis  DNA  hasil  amplifikasi.  Staining gel  yang  digunakan  adalah Syber  Safe dari Thermofisher  dengan  perbandingan  1:10.000. DNA ladder yang  digunakan  berukuran  1  kb (10.000  bp)  sebanyak  2  µl  dengan  target ukuran  pita  DNA  yaitu  ±1500  bp.  DNA ladder yang  digunakan  berukuran  1  kb  (10.000  bp) sebanyak 2 µl dengan target ukuran pita DNA yaitu  ±1500  bp.  DNA  sampel  hasil  amplifikasi dielektroforesis sebanyak 2,5 µl dan dicampur dengan loading  dye (pemberat)  sebanyak  0,5 µl. Proses elektroforesis dijalankan selama 30 menit dengan tegangan 100 volt dan arus 100 mA. Setelah itu gel agarosa dipindahkan pada UV transluminator untuk diamati pita band yang terbentuk.

## Sequencing & BLAST (Basic Local

## Alignment Search Tool)
Sekuensing  DNA  atau  pengurutan  basa  DNA ini  bertujuan  untuk  menentukan  urutan  basa nitrogen  (adenin,  guanin,  sitosin  dan  timin) dalam  suatu  sampel.  Metode  yang  digunakan adalah metode Sanger dilakukan oleh Perusahaan First  Base di  Singapore.  Hasil
sequencing  didapatkan  sekuens  yang  akan diolah menggunakan software Bioedit. Selanjutnya  hasil  pengolahan  data  dilakukan BLAST  pada  situs  NCBI  ( National  Center  of Biotechnology Information ).

## Analisis Filogenetik
Analisis  filogenetik  dari  sekuen  nukleotida bertujuan  untuk  mengetahui  nenek  moyang dan  kekerabatan  organisme  (Ward,  1998). Untuk konstruksi pohon filogenetik menggunakan software MEGA X.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Kondisi Umum Perairan
Kondisi  pengambilan  sampel  memiliki  tekstur sedimen  jenis  lumpur,  berwarna  abu-abu, berbau  menyengat,  dan  memiliki  bekas-bekas tumpahan  minyak  diatas  perairan  bekas pembuangan  kapal-kapal  yang  berlabuh. Kondisi ini sama seperti sedimen yang berada di bagian barat Teluk Jakarta yang mengandung  kadar  logam  berat  tergolong tinggi  dengan  karakter  sedimen  yang  berupa lumpur  halus  dengan  permukaan  hitam  abu- abu dan berbau busuk (Rochyatun et al., 2006).
Selain  kondisi  lokasi  pengambilan  sampel, adapun  data  parameter  kualitas  perairan  di Pantai  Karangsong  yaitu  nilai  suhu  sebesar 32 o C  Kondisi  suhu  di  perairan  ini  masih tergolong  wajar  untuk  perairan  tropik.  Variasi suhu  perairan  tropik  tergolong  wajar  apabila nilainya  berkisar  antara  25,6-32,3ºC  (Patty, 2013).  Pengukuran  suhu  pada  riset  ini dilakukan pada bulan April dimana pada bulan tersebut  termasuk  kedalam  musim  pancaroba awal tahun sehingga suhu yang didapat tinggi. Kemudian  salinitas  yang  didapat  dari  riset lapangan rata-rata adalah 29,7 ppt. menandakan lokasi tersebut merupakan kawasan yang masih dipengaruhi oleh daratan seperti  adanya  percampuran  air  tawar  dari aliran sungai (Patty, 2013). Nilai pH 6,8 dimana nilai tersebut dianggap sebagai batas aman pH perairan  untuk  kehidupan  biota  (Susana, 2009).  dan  nilai  DO  yaitu  5,62.  Rendahnya kadar oksigen dikarnakan stasiun dekat muara sungai  (estuari)  yang  erat  kaitannya  dengan kekeruhan air laut dan juga diduga disebabkan semakin
bertambahnya aktivitas
mikroorganisme untuk menguraikan zat organik menjadi zat anorganik yang menggunakan  oksigen  terlarut  (bioproses)  di perairan ini (Patty, 2013).
Uji Reduksi Logam Timbal Pb(CH3COO) 2 dan Pertumbuhan Kepadatan Bakteri
Uji  reduksi  dilakukan  untuk  mengetahui seberapa  besar  kemampuan  bakteri  dalam
menurunkan konsentrasi logam timbal Pb(CH3COO) 2  . Hasil  uji  reduksi  tertera  pada Gambar 1 di bawah ini.
Gambar 1. Hasil uji reduksi logam timbal Pb(CH3COO) 2
Berdasarkan Gambar 1, dapat diketahui bahwa bakte ri yang terkandung pada air pori sedimen dapat  mereduksi  logam  timbal  Pb(CH3COO) 2 pada  jam  ke-0  hingga  jam  ke-48.  Mulai  dari perlakuan  A  dengan  konsentrasi  0,5  mgL -1 menjadi  0,202  mgL -1 ;  perlakuan  B  dengan konsentrasi  1,0  mgL -1 menjadi  0,277  mgL -1 ; serta  perlakuan  C  dari  konsentrasi  1,5  mgL -1 menjadi 0,364 mgL -1 selama 48 jam. Penurunan  konsentrasi  tersebut  menunjukkan bahwa  bakteri  yang  terkandung  pada  air  pori
sedimen mampu mereduksi konsentrasi logam timbal Pb(CH3COO) 2 .
Hal ini sesuai dengan riset yang telah dilakukan oleh  Satya  dan  Larashati  (2012),  yang membuktikan  bahwa  bakteri  yang  resisten terhadap timbal juga dapat menurunkan kadar konsentrasi  timbal  dari  15  mgL -1 menjadi  0 mgL -1 dengan  efisiensi  penurunan  kadarnya mencapai 100%.
Gambar 2. Grafik pertumbuhan koloni bakteri
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 12 24 36 48 K on sent ra si ( m g/ L) Jam ke- Konsentrasi Logam Berat Timbal Konsetrasi Timbal A Konsetrasi Timbal B Konsetrasi Timbal C
0 30 60 90 120 150 180 210 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Ju m la h b akt e ri x 1 0 5 m L) Jam ke- Pertumbuhan Bakteri Perlakuan A Perlakuan B Perlakuan C
Berdasarkan Gambar 2, dapat diketahui bahwa terjadi pertumbuhan
bakteri seiring bertambahnya waktu dan seiring bertambahnya konsentrasi logam timbal Pb(CH3COO) 2  . Konsentrasi  0,5  mgL -1 terjadi pertumbuhan  bakteri  dari  10  cfu  x  10 -5 ml menjadi  91  cfu  x  10 -5 ml.  Sedangkan konsentrasi  1,0  mgL -1 terjadi  pertumbuhan bakteri dari 4 cfu x 10 -5 ml menjadi 62 cfu x 10 - 5 ml.  Serta  pada  konsentrasi  1,5  mgL -1 terjadi pertumbuhan  bakteri  dari  3  cfu  x  10 -5 ml menjadi 89 cfu x 10 -5 ml.
Merujuk pada Khoiroh (2014) salah satu bakteri pereduksi  logam  timbal  Pb(CH3COO) 2 yaitu
Pseudomonas
pseudomallei diketahui pertumbuhannya  meningkat  pada  larutan
logam  timbal  Pb(CH3COO) 2 di  hari  ke-20 jumlah  bakteri  6  cfu  x  10 -8 ml  kemudian menurun  di  hari  ke-30  jumlah  bakteri  menjadi 1,72 cfu x 10 -8 ml, namun kembali naik di hari ke-40  menjadi  2,43  cfu  x  10 -8 ml  namun  tidak terlihat jelas fase kematiannya.
Kultur  dan  Pemurnian  Bakteri  Pereduksi Logam Timbal Pb(CH3COO) 2
Hasil  kultur  dari  tiga  perlakuan  konsentrasi logam  timbal  Pb(CH3COO) 2 0,5  mgL -1 ;  1,0 mgL -1 dan 1,5 mgL -1 , didapatkan sebelas isolat bakteri  yang  memiliki  ciri  morfologi  yang berbeda.  Bakteri  tersebut  belum  diketahui sudah  murni  sebelum  dilakukan  pengamatan bentuk sel dari hasil pengujian gram.
Gambar 3. Hasil kultur dan pemurnian bakteri

## Pewarnaan Gram Bakteri
Sifat  gram  kedelapan  isolat  bakteri  bersifat gram  negatif.  Selain  itu,  bentuk  sel  bakteri
beragam,  yaitu  berbentuk  bulat  dan  filamen. Hasil  pewarnaan  gram  bakteri  tertera  pada Gambar 4.
Gambar 4. Hasil pewarnaan gram bakteri
Uji Tantang Bakteri Terhadap Logam Timbal Pb(CH3COO) 2
Bakteri  yang  dilakukan  uji  tantang  merupakan bakteri  terpilih  yang  benar-benar  murni,  yakni isolat bakteri Pb 1, Pb 2, Pb 3, Pb 4, Pb 5, Pb 6, Pb 10 dan Pb 11. Delapan isolat bakteri yang
dianggap  murni  selanjutnya  dilakukan  uji tantang terhadap logam timbal Pb (CH3COO) 2. Kemudian isolat bakteri diukur nilai OD ( Optical Density ) dan kepadatannya pada jam ke-0 dan jam  ke-18.  Hasil  uji  tantang  tertera  pada Tabel 1.
Tabel 1. Nilai optical density (OD) pada t=0 dan t=1
Sampel Nilai (OD) awal Nilai (OD) akhir NIlai Perubahan (OD) Kontrol 0.0000 0.0000 0.0000 Pb 1 0.0714 1.4088 1.3374 Pb 2 0.0821 1.1470 1.0649 Pb 3 0.0823 1.9767 1.8944 Pb 4 0.0716 1.8754 1.8038 Pb 5 0.0821 1.0508 0.9687 Pb 6 0.0861 1.1734 1.0873 Pb 10 0.0737 1.7441 1.7604 Pb 11 0.0863 1.9642 1.8779 Hasil pengujian ini diukur dengan menggunakan spektrofotometer untuk mengetahui  nilai  kekeruhan  bakteri  tersebut. Hasil  nilai  kekeruhan  (Optical  Density)  yang didapatkan kemudian diubah menjadi cells/mL untuk  mengetahui  kepadatan  sel  bakteri. Berdasarkan  hasil didapatkan  4  isolat  dengan nilai  Optical  Density  (OD)  tertinggi  yaitu  Pb  3
sebesar 1,8944 ; Pb 4 sebesar 1,8038 ; Pb 10 sebesar  1,6704  dan  Pb  11  sebesar  1,8779. Selain  itu,  keempat  isolat  bakteri  ini  memiliki nilai  kepadatan  sel  bakteri  tertinggi  yaitu  Pb 3 sebesar 1,52 x 109 ; Pb 4 sebesar 1,44 x 109 ; Pb 10 sebesar 1,34 x 109 dan Pb 11 sebesar 1,5 x 109.
Gambar 5. Grafik Nilai Kepadatan Bakteri
Pengukuran  nilai Optical  Density (OD)  dan perthitungan kepadatan sel bakteri ini menunjukkan  hasil  yang  saling  berhubungan. Semakin tinggi nilai Optical Density (OD) maka jumlah  bakteri  juga  semakin  banyak.  Menurut Lizayana et  al .,  (2016)  semakin  besar  nilai Optical  Density (OD)  artinya  semakin  banyak cahaya  yang  diserap  bakteri  tersebut  dan sangat  sedikit  cahaya  yang  terlewatkan. Sehingga  dari  data  tersebut  dapat  dikatakan bahwa isolat bakteri tersebut mampu beradaptasi  dan  tahan  terhadap  logam  timbal (Pb).
Hal ini diperkuat oleh Hughes dan Rolle (1989) yang menyatakan bahwa adanya bakteri yang mampu  mengadsorbsi  logam  berat  2pada dinding  selnya  melalui  proses  adsorbsi, produksi  senyawa  ekstraseluler  atau  sistem enzimatis.Isolat bakteri yang telah diuji tantang selanjutnya  dipilih  4  bakteri  dengan  tingkat kepadatan tertinggi untuk dilanjutkan ke tahap identifikasi dengan metode molekular menggunakan  gen  16S  rRNA.  Isolat  bakteri tersebut adalah isolat Pb 3, Pb 4, Pb 10 dan Pb 11.
0 1,07 0,852 1,52 1,44 0,775 0,87 1,34 1,5 0 1,07 0,852 1,52 1,44 0,775 0,87 1,34 1,5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 cel l/ m l x 1 0 ^9 Sampel Bakteri Grafik Nilai Perubahan Kepadatan Bakteri

## Ekstraksi DNA
Ekstraksi  DNA  genom  bakteri  merupakan langkah pertama untuk mengidentifikasi bakteri.  Menurut  Madigan  (1997)  metode identifikasi molekuler merupakan metode yang akurat dalam mengidentifikasi bakteri. Ekstraksi DNA ini bertujuan untuk memisahkan  DNA  dengan  komponen –
komponen  lainnya  seperti  protein  dan  RNA.
Proses ekstraksi DNA merupakan uji kuantitaif pada analisis molekular karena dapat diketahui kemurnian dan konsentrasi dari DNA yang  telah  diekstraksi.  Kemurnian  DNA  yang baik  ditentukan  oleh  kontaminasi  protein maupun  RNA  pada  larutan.  Hasil  kemurnian dan konsentrasi DNA tertera pada Tabel 2.

## Tabel 2. Kemurnian dan Konsentrasi DNA
Sampel A260 A280 Kosentrasi ng/  L Kemurnian (260/280) Pb 3 0.1569 0.0921 156.9 1.70 Pb 4 0.2087 0.1086 208.7 1.92 Pb 10 0.2048 0.1192 204.8 1.72 Pb 11 0.1520 0.0850 152 1.79 Nilai kemurnian dari 4 DNA sampel menunjukan  3  DNA  sampel  tidak  baik  dan hanya  1  DNA  sample  yang  sesuai  dengan kualitas  DNA  yang  ditetapkan  sebesar  1.8 – 2.0.  Menurut  Fatchiyah et  al .,  (2011)  nilai kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung  nilai  absorbansi  260  nm  dibagi dengan  nilai  absorbansi  280  (A260/A280), dengan nilai kemurnian DNA berkisar 1.8 – 2.0. DNA  sampel  yang  tidak  baik  artinya  belum murni  dan  masih  mengandung  komponen protein.  Hal  ini  sesuai  dengan Termos  Fisher Scientific (2008)  jika  DNA  yang  memiliki  nilai dibawah  1.8  artinya  terkontaminasi  protein sedangkan nilai diatas 2.0 artinya terkontaminasi  RNA.  Adanya  kontaminasi protein  pada  DNA  sampel  ini  diduga  karena kurang maksimalnya pada saar prepitasi DNA sampel.
Konsentrasi  DNA  sampel  yang  dihasilkan bervariasi  antara  152  -  208,7  ng/µL.  Hal  ini diduga  adanya  bahan  campuran  dalam  suatu produk  mempengaruhi  konsentrasi  DNA  yang didapatkan.  Menurut  (Wardani et  al .,  2017) bahan yang ditambahkan dalam produk olahan
menyebabkan DNA yang diekstraksi tercampur dengan  senyawa  kontaminan  lain  seperti oligopeptida,  polisakarida  protein  dan  bahan organik lainnya.

## Amplifikasi DNA
Amplifikasi  merupakan  tahap  lanjut  dalam mengidentifikasi  bakteri.  Tujuan  amplifikasi menurut
(Nursyirwani, 2007) yaitu penggandaan  jumlah  molekul  DNA  secara eksponensial  dalam  waktu  yang  relative singkat. Amplifikasi ini dengan metode Polymerase  Chain  Reaction (PCR)  sebanyak 29  siklus.  Keberhasilan  proses  amplifikasi genom  DNA  bakteri  bergantung  pada  urutan primer  dan  suhu annealing yang  digunakan.
Primer  yang  digunakan  pada  proses  PCR  ini yaitu  16S  rRNA  (9F  &  1542R)  dengan  target ukuran  pita  DNA  yaitu  1500  bp.  Marker  DNA yang  digunakan  yaitu  DNA ladder 1  kb,  serta dielektroforesis  dengan  konsentrasi  agar  1%. Hasil  elektroforesis  DNA  divisualisasikan dengan sinar UV dan menunjukkan hasil positif, yaitu terbentuknya pita DNA pada gel agarose dengan ukuran yang sesuai target.
Gambar 6. Hasil elektroforesis gel agarose 1%
M 1       2        3        4 1500 bp 1000 bp
Ket : 1   : Isolat Pb 3
2 : Isolat Pb 4
3 : Isolat Pb 10 4 : Isolat Pb 11
DNA hasil Amplifikasi Berdasarkan Gambar 5, diketahui  bahwa  proses  amplifikasi  gen  16S rRNA  menunjukkan  hasil  positif  dan  berjalan dengan  baik  karena  dapat  dilihat  bahwa  pita DNA  yang  terbentuk  berada  pada  ukuran  ± 1500  bp.  Menurut  Nikunjkumar  dan  Dhruvil (2012) gen 16S rRNA ini memiliki ukuran yang cukup panjang jika digunakan untuk keperluan bioinformatika  (±  1500  bp)  dan  dapat mengaplifikasi  daerah  16S  rRNA  dari  seluruh bakteri.  Selain  itu,  suhu annealing yang  telah dioptimasi  pada  program  PCR  untuk  proses amplifikasi DNA juga berjalan dengan baik.
Pada  sampel  DNA  Pb  11  pita  yang  terbentuk tidak terlalu tebal dibandingkan dengan sampel DNA Pb 3, Pb 4 dan Pb 10. Hal tersebut terjadi karena hasil dari pengukuran konsentrasi pada sampel  DNA  Pb  11  konsentrasinya  lebih rendah dibandingkan sampel DNA lainnya. Hal tersebut  sesuai  dengan  pendapat  Weeden et al., (1992)  yang  menyatakan  bahwa  smear tersebut  bisa  merupakan  kontaminan  bahan organik seperti protein dan RNA serta sisa dari
larutan-larutan  yang  masih  terbawa  selama proses ekstraksi.Selain itu, meskipun pita DNA terbentuk  dengan  baik  tetapi  masih  terdapat smear yang  terbentuk  dibawah  pita  DNA. Terdapatnya smear ini  disebabkan  karena adanya kontaminan protein dan bahan lain saat proses ekstraksi  (Azizah et al., 2015).
Analisis  Pensejajaran  Urutan  Nukleotida Hasil Sekuensing Dengan Database
GenBank NCBI
Sebanyak 4 sampel hasil PCR gen 16S rRNA telah disekuensing oleh 1 st BASE di Singapura berhasil  diidentifikasi  urutan  basa  nukleotida. Data yang diperoleh dari sekuensing ini berupa urutan  basa  nukleotida  sekuen forward dan reverse .  Data  sekuens forward dan reverse diolah menggunakan piranti lunak BioEdit yang kemudian dilakukan identifikasi dengan program  BLAST (Basic  Alignment  Search Tools) pada  situs  NCBI  ( National  Center  for Biotechnology Information ). Data hasil sekuensing tertera pada Tabel 3.

## Tabel 3. Hasil Identifikasi Isolat Gen 16S dengan Program BLAST
Sampel Query Cover E-value Identity Spesies Accession PB 3 96% 0.0 98% Albirhodobacter marinus strain N9 16S ribosomal RNA gene, partial sequence NR 126203.1 PB 4 87% 0.0 81% Pseudoalteromonas tetraodonis strain NBRC 103034 16S ribosomal RNA gene, partial sequence NR 114187.1 PB 10 95% 0.0 98% Pseudoalteromonas lipolytica strain LMEB 39 16S ribosomal RNA gene, partial sequence NR 116629.1 PB 11 92% 0.0 93% Pseudoalteromonas lipolytica strain LMEB 39 16S ribosomal RNA gene, partial sequence NR 116629.1
Hasil  dari  Blast  menunjukkan  spesies  bakteri untuk  isolat  Pb  3  memiliki  kemiripan  dengan spesies bakteri Albirhodobacter marinus strain N9 dengan nilai Query Cover 96% dan Identity sebesar 98%. Persentase tersebut menunjukkan  bahwa  dari  seluruh  sekuen  gen 16S  rRNA  sanpel  Pb  3  yang  berhasil dicocokkan sebanyak 96%.dan dari 96% Query Cover tersebut 98% memiliki kemiripan dengan spesies bakteri Albirhodobacter marinus strain N9 .  Untuk  isolat  Pb  4  memiliki  kemiripan dengan  spesies  baktri Pseudoalteromonas tetraodonis strain  NBRC  103034 dengan  nilai Query  Cover 87%  dan Identity sebesar  81%. Untuk isolat Pb 10 memiliki kemiripan dengan bakteri  spesies Pseudoalteromonas  lipolytica strain LMEB 39 dengan nilai Query Cover 95% dan Identity sebesar  98%.  Sedangkan  untuk isolat  Pb  11  adalah Pseudoalteromonas
lipolytica  strain  LMEB  39 dengan  nilai Query Cover 93% dan Identity sebesar 92%.
Selain itu, E-value dari masing – masing sampel bernilai  0.0  menunjukkan  semakin  signifikan penjajaran  dengan  hasil  BLAST.  Menurut Sabbathini et  al., (2017)  nilai  0,0  mengartikan sekuens dari isolat tidak memiliki kemungkinan lain  pada  kesempatan  penjajaran  sekuens yang  dilakukan.  Maka  apabila  nilai  E-value yang  didapatkan  semakin  tinggi  menunjukkan tingkat  homologi  antar  sekuens  semakin rendah, sedangkan nilai E-value yang semakin rendah  menunjukkan  tingkat  homologi  antar sekuens semakin tinggi.
Hasil BLAST dua dari empat isolat memiliki nilai identifikasi  diatas  angka  97%  sehingga  dapat diartikan  data  tersebut  baik  dan  penyejajaran yang  signifikan.  Menurut  Stackebrandt  dan
Goebel  (1995)  spesies  bakteri  yang  memiliki homologi  atau Identtity lebih  dari  atau  sama dengan 97% dapat dikatakan sama. Isolat Pb 4 dan isolat Pb 11 memiliki Identtity yang rendah yaitu 81% dan 92%. Menurut  Drancourt et al., (2000) berdasarkan data urutan gen 16S rRNA, identity  ≤  97%  dapat  dinyatakan  bahwa  isolat yang  dibandingkan  berada  pada  genus  yang sama.  Sedangkan  identity  antara  89-93% menunjukkan  famili  yang  berbeda.  Diduga isolat  Pb  4  merupakan  spesies  baru  dengan famili  yang  berbeda  dan  Pb  11  merupakan spesies  baru  dengan  genus  yang  sama Pseudoalteromonas lipolytica strain LMEB 39 .
Menurut    Janda  dan  Abbott  (2002) identifikasi taksonomi  bakteri  untuk  lebih  validasi  dan akurasi  ilmiah  perlu  dilakukan  berdasarkan polyphasic approach yaitu pendekatan dengan menggunakan kombinasi dari metode pengujian  fenotip  (uji  biokimia,  analisis  asam lemak  dan  analisis  numerik)  dan  metode pengujian genotip.

## Albirhodobacter marinus strain N9
Nupur et  al., (2013)  pertama  kali  menemukan Albirhodobacter marinus di laut Vishakhapatnam,  Andhra  Pradesh,  India. Spesies bakteri Albirhodobacter marinus strain N9  masuk  kedalam  genus Albirhodobacter , ordo
Rhodobacteraceae, kelas Alphaproteobacteria dan  filum Proteobacteria . Kelas  dari Alphaproteobacteria ini  mencakup kebanyakan proteobakter oligotrof yaitu bakteri yang  mampu  tumbuh  pada  kadar  nutrient rendah. Alphaproteobacteria dapat memanfaatkan  nutrisi  dalam  berbagai    cara seperti  fiksasi  nitrogen,  kemoheterotrof,  atau kemoautotrof.  Beberapa  bakteri  ini  mampu menggunakan  hidrogen,  ammonia,  metana, asam  lemak  volatile  sebagai  substratnya (Hidayat et al., 2018)
Bakteri Albirhodobacter marinus ini merupakan bakteri  gram  negatif,  berbentuk  basil  (batang) dan  anaerob  fakultatif.  Lebar  sel  sekitar  0,5 – 0,8  µm  dan  panjang  sekitar  2-3  µm,  koloni berbentuk lingkaran,  berdiameter  2-4  mm  dan berwarna putih kekuningan. Bakteri ini tumbuh pada suhu berkisar antara 30°C - 37°C dengn suhu optimum sebesar 30°C dan pH optimum sebesar  7,5. Albirhodobacter  marinus mampu hidup pada salinitas 2 - 9%. Berdasarkan ciri – ciri  tersebut  bakteri Albirhodobacter  marinus sesuai dengan isolat bakteri hasil pengamatan morfologi  dan  pewarnaan  gram  yang  telah dilakukan.
Pseudoalteromonas tetraodonis strain NBRC 103034
Bakteri Pseudoalteromonas  tetraodonis ini pertama  kali  ditemukan  oleh  Simidu et  al.,
(1990) pada lendir permukaan ikan buntal yang menghasilkan tetrodotoxin .  Spesies  bakteri
Pseudoalteromonas  tetraodonis strain  NBRC 103034 masuk kedalam genus Pseudoalteromonas ,  ordo Alteromonadales,
kelas Gammaproteobacteria dan filum Proteobacteria.  Kelas Gammaproteobacteria ini kebanyakan kemolitoautotrof dimana bakteri ini memperoleh energi menggunakan senyawa anorganik. Gammaproteobacteria memiliki potensi untuk mengoksidasi karbon, sulfur, besi dan nitrogen (Lefèvre et al., 2011).
Pseudoalteromonas  tetraodonis merupakan bakteri gram negatif, berbentuk basil (batang), berukuran  1,0  µm –  2,4  µm.  Bakteri
Pseudoalteromonas  tetraodonis ini  tumbuh pada  suhu  4 –  35  °C  (Simidu et  al., 1990). Selain  itu  bakteri  ini  mampu  menghasilkan tetrodotoxin ,  enzim  gelatinase  dan  lipase.
Menurut Deskawati (2014) Tetrodotoxin merupakan neurotoxin yang  memiliki  berat molekul  rendah (319,27)   bersifat  racun  tetapi dapat  dimanfaatkan  terutama  pada  bidang farmasi. Genus Pseudoalteromonas ini diusulkan oleh Gauthier et al., (1995) mewakili sekelompok  bakteri  laut  yang  dikelompokkan oleh hubungan filogentik berdasarkan gen 16S rRNA. Genus Pseudoalteromonas ini merupakan  bakteri  gram  negatif,  bersifat aerobik,  sel  berbentuk  batang  dan  memiliki metabolisme chemoheterotrophic (Bowman dan McMeekin, 2005).

## Pseudoalteromonas  lipolytica  strain  LMEB
39
Menurut Wu et al ., (2010) Pseudoalteromonas lipolytica pertama  kali  ditemukan  di  muara sungai Yangtze dekat laut Cina Timur. Spesies bakteri Pseudoalteromonas  lipolytica strain LMEB 39 masuk kedalam genus Pseudoalteromonas ,  ordo Alteromonadales, kelas Gammaproteobacteria dan filum
Proteobacteria .
Bakteri  ini  merupakan  bakteri  gram  negatif, berbentuk basil (batang) dan anaerob fakultatif. Lebar  sel  sekitar  0,5 –  0,8  mm  dan  panjang sekitar 1-2 mm, koloni berbentuk lingkaran dan halus, berdiameter 1-2 mm dan berwarna putih kekuningan.  Bakteri  ini  tumbuh  pada  suhu berkisar  antara  30°C  -  37°C  dengan  suhu optimum sebesar 30°C dan pH optimum
sebesar  7,0 –  8,0. Pseudoalteromonas lipolytica mampu hidup pada salinitas 0,5 - 15%
Karakteristik biokimia dari Pseudoalteromonas lipolytica ini  mampu  menghidrolisis  lemak, mampu  mengoksidasi  dan  katalase,  mampu mereduksi nitrat.

## Analisis Filogenetik
Pohon filogenetik ini diperoleh dengan metode neighbor-joining dengan Bootstrap 1000
ulangan  dalam  program  MEGA  (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) software Versi 6.0 (Tamura et al., 2013) (Gambar 7).
Gambar 7. Pohon filogeni isolat bakteri Pb 3, Pb 4, Pb 10 dan Pb 1 berbasis sekuen 16S rRNA metode neighbour-joining, bootstrap 1000x
Menurut Muzzazinah (2017) metode neighbor- joining merupakan  dasar  pembuatan  pohon filogenetik  berdasarkan  perbedan  antara  dua sekuen  dimana  pohon  filogenetik  dengan  nilai bootstrap  tinggi  setidaknya  diatas  70% merupakan  pohon  filogenetik  yang  baik. Berdasarkan pohon filogenetik tersebut sekuens  Pb  3  menunjukkan  membentuk  garis keturunan  filogenetik  yang  ketat  dengan Albirhodobacter  marinus strain  N9T.  Hal  ini dibuktikan  oleh  nilai bootstrap antara  kedua sekuen  tersebut  yang  tinggi  yaitu  100%  dan
max  identity  sebesar  98%.  Persentase  nilai bootstrap 100% menandakan bahwa dari 1000 kali  rekonstruksi  pohon  filogenetik  ini,  sekuen MI.P1.B mempunyai kekerabatan 100% dengan spesies bakteri Albirhodobacter marinus strain N9.
Sekuens Pb 4 tidak menunjukkan kekerabatan yang dekat dengan
spesies Pseudoalteromonas  tetraodonis strain  NBRC 103034.  Nilai  bootstrap  diantara  kedua sekuens  tersebut  yakni  84%  dengan  nilai identity 81%, artinya dari 1000 kali rekonstruksi
pohon  filogeni  sekuens  Pb  4  memiliki kekerabatan 84% dengan Pseudoalteromonas tetraodonis strain NBRC 103034.
Sekuens  Pb  10  memiliki  kekerabatan  yang dekat  dengan  spesies Pseudoalteromonas lipolytica strain  LMEB  39.  Nilai  bootstrap diantara  kedua  sekuens  tersebut,  yakni  90% dengan nilai identity 98%, artinya dari 1000 kali rekonstruksi  pohon  filogeni  sekuens  Pb  10 memiliki kekerabatan 90% dengan Pseudoalteromonas lipolytica strain LMEB 39.
Sekuens  Pb  11  memiliki  kekerabatan  yang dekat  dengan  spesies Pseudoalteromonas lipolytica strain  LMEB  39.  Nilai  bootstrap diantara  kedua  sekuens  tersebut,  yakni  83% dengan nilai identity 92%, artinya dari 1000 kali rekonstruksi  pohon  filogeni  sekuens  Pb  11 memiliki kekerabatan 83% dengan Pseudoalteromonas lipolytica strain LMEB 39.

## KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan
Bakteri  dari  air  pori  sedimen  dari  Pantai Karangsong  mampu  mereduksi  logam  timbal (Pb)  dari  konstrasi  1,5  mgL -1 menjadi  0,364 mgL -1 dengan  nilai  efisiensi  sebesar  75,7%. Terdapat  empat  isolat  bakteri  pereduksi konsentrasi  logam  timbal  (Pb)  asal  sedimen pantai  Karangsong,  yakni  isolat  Pb  3  identik dengan Albirhodobacter  marinus strain  N9 (Acc.  No.  NR  126203.1)  dengan  nilai identity 98%  dan  nilai  kekerabatan  100%,  isolat  Pb  4 dengan Pseudoalteromonas tetraodonis strain NBRC 103034 (Acc. No. NR 114187.1) dengan nilai identitiy 81%  dan  nilai  kekerabatan  84%, isolat  Pb  10  dengan Pseudoalteromonas lipolytica strain  LMEB  39  (Acc.  No.  NR 116629.1)  dengan  nilai identity 98%  dan  nilai kekerabatan  96%  dan  isolat  Pb  11  dengan Pseudoalteromonas  lipolytica strain  LMEB  39 (Acc.  No.  NR  116629.1)  dengan  nilai identity 93% dan nilai kekerabatan 87%.

## Saran
Saran dari hasil riset yang telah dilakukan yaitu perlu adanya riset lebih lanjut untuk mengetahui  mekanisme  reduksi  logam  timbal. Selain itu, bakteri pereduksi konsentrasi logam timbal  (Pb)  yang  telah  diketahui  jenis  dan kekerabatannya perlu dilakukan uji konsorsium.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad,  R.  Z.  2018. Mycoremediation  to Remove Heavy Metal Pollution in Post- Mining  Areas  for  Farmland  Utilization .
Jurnal Wartazoa , 28 (1), 41 –50.
Azizah,  S.  N.,  A.  Nuryanto,  &  H.  Pramono. 2015.  Karakterisasi  Molekuler  Ikan Gurami Soang (Osphronemus goramy Lac.)  berbeda  ukuran  menggunakan Pcr-Rflp  Gen  Sitokrom  C  Oksidase  1 . Biosfera 32 (3), 185-193.Ahmad, R. Z. (2018).  Mikoremediasi  menghilangkan polusi  logam  berat  pada  lahan  bekas tambang  untuk  lahan  peternakan. Wartazoa , 28 (1),  41 –50.  Retrieved from
http://medpub.litbang.pertanian.go.id/i ndex.php/wartazoa/article/view/1785/1 550
Azizah,  S.  N.,  A.,  Nuryanto,  &  H.  Pramono. (2015).  Karakterisasi  Molekuler  Ikan Gurami Soang (Osphronemus goramy Lac.)  berbeda  ukuran  menggunakan Pcr-Rflp  Gen  Sitokrom  C  Oksidase  1. Biosfera , 3 (32), 185 –193.
Bowman,  J.  P.,  &  McMeekin,  T.  A.  (2005).
Genus XI. Pseudoalteromonas Gauthier, Gauthier and Christen 1995a,  759VP.  In  Bergey’s  Manual  of Systematic Bacteriology (2nd ed.; D. J. Brenner, J. T. N. R. Krieg, Staley, & G. M. Garrity., Eds.). New York: Springer. Deskawati,  E.,  &  Purwaningsih,  S.  P.  (2014). Karakterisasi  Dan  Uji  Toksisitas  Ikan Buntal  Dari  Perairan  Pameungpeuk, Jawa Barat. Jurnal Ilmu Dan Teknologi Kelautan Tropis , 6 (1), 101 –107.
Drancourt, M. Bollet, C. Carlioz, A. Martelin, R. Gayral,  J.  Roult,  D.  (2000).  16S ribosomal  DNA  sequene  analysis  of  a large  collection  of  enviromental  and clinical unidentifiable bacterial isolates. J Clin Microbiol , 38 , 3623 –3630.
Fatchiyah, E. L., Arumingtyas, S., Widyarti, S.,
&  Rahayu.  (2011). Biologi  Molekuler Prinsip Dasar Analisis . Jakarta: Erlangga.
Gauthier,  G.,  Gauthier,  M.,  &  Christen,  R.
(1995).  Phylogenetic  analysis  of  the genera Alteromonas, Shewanella, and Moritella using genes coding for small- subunit  rRNA  sequences  and  division of  the  genus  Alteromonas  into  two genera,  Alteromonas  (emended)  and Pseudoalteromonas  gen.  nov.,  and proposal  of  tw. Int  Journal  Syst Bacteriol , 755 –761. Hidayat, N., Meitiniati, I., & Yuliana, N. (2018).
Mikroorganisme  dan  Pemanfaatannya (1st ed.). Malang, Indonesia: UB Press. Hughes,  M.  N.,  &  Rolle,  R.  K.  (1989). Metals and  Micro-organisms .  London,  UK: Chapman & Hall.
Janda, J. M., & Abbott, S. L. (2002). Bacterial
Identification  For  Publication: When  Is Enough  Enough? Journal  Of  Clinical
Microbiology , 40 (6), 1887 –1891. Https://Doi.Org/10.1128/JCM.40.6.188 7
Lefèvre,  C.  T.,  Viloria,  N.,  Schmidt,  M.  L., Pósfai, M., Frankel, R. B., & Bazylinski, D.  A.  (2011).  Novel  magnetite- producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The Isme Journal , 6 ,  440.  Retrieved  from https://doi.org/10.1038/ismej.2011.97 Lizayana, Mudatsir, & Iswadi. (2016). Densitas
Bakteri  pada  Limbah  Cair  Pasar Tradisional  . Jurnal  Ilmiah  Mahasiswa Pendidikan Biologi , 1 (1), 95 –106.
Madigan, M. T. M. J. M. P. J. (1997). Brock, the Biology  of  Microorganisms (8th  ed.). New Jersey: Upper sadlle River.
Mihdir,  A.  (2016).  Detection,  Identifiction  and
Characterization of Some Heavy Metals Tolerant Bacteria. Microbial and Biochemical  Technology , 8(3) ,  226 – 230.
Muzzazinah.  (2017).  Metode  filogenetik  pada indigofera. Prosiding Seminar Nasional Pendidikan Biologi Dan Biologi , 25 –40. Nikunjkumar,  B.,  &  Dhruvil.  (2012). Molecular Identification  of  Bacteria  Using  16S rDNA Sequencing . Gujarat University. Nupur, Vaidya, B., Tanuku, N. R. S., & Pinnaka, A.  K.  (2013).  Albirhodobacter  marinus gen.  nov.,  sp.  nov.,  a  member  of  the family Rhodobacteraceae isolated from sea  shore  water  of  Visakhapatnam, India. Antonie  van  Leeuwenhoek,
International  Journal  of  General  and Molecular  Microbiology , 103 (2),  347 – 355. https://doi.org/10.1007/s10482- 012-9814-z Nursyirwani, & Amolle, K. C. (2007). Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Hidrokarbonoklastik dari Perairan Dumai  dengan  Sekuen  16S  rDNA.
Jurnal Ilmu Kelautan , 12 (1), 12 –17. Rochyatun,  E.,  Kaisupy,  T.  M.,  &  Rozak,  A. (2006).  Distribusi  Logam  Berat  dalam Air  Dan  Sedimen  di  Perairan  Muara Sungai  Cisadane. Jurnal  Makara , 1 (10), 35 –40.
Sabbathini,  G.  C.,  Wijanarka,  Pujiyanto,  S.,  &
Lisdiyanti,  P.  (2017).  Isolasi  Dan Identifikasi Bakteri Genus Sphingomonas Dari Daun Padi ( Oryza Sativa ) Di Area Persawahan Cibinong. Jurnal Biologi , 6 (1), 59 –64.
Simidu, U., Kita-Tsukamoto, K., Yasumoto, T., & Yotsu, M. (1990). Taxonomy of Four Marine Bacterial Strains That Produce
Tetrodotoxin. International  Journal  of Systematic  Bacteriology , 40 (4),  331 – 336. https://doi.org/10.1099/00207713- 40-4-331
Stackebrandt,  E.,  &  B.M.  Goebel.  (1995).  A Place for DNA-DNA Reassociation and 16S  rRNA  Sequence  Analysis  in  The Present Species Definition in Bacteriology. International  Jurnal  of
Systematic  Bacteriology ,  (44),  846 – 849.
Susana, T. (2009). Tingkat Keasaman (Ph) Dan Oksigen  Terlarut  Sebagai  Indikator Kualitas Perairan Sekitar Muara
Sungai  Cisadane). Jurnal  Teknologi Lingkungan , 5 (2), 33 –39.
https://doi.org/10.1055/s-2008-
1067278
Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski,
A.,  &  Kumar  S.  (2013).  MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis  Version  6.0. Mol.  Bio  and
Evol , 30 , 2725 –2729.
Ward, D. . (1998). A natural spesies concepts for  procaryotes. MIcrobiology , 1 ,  271 – 277.
Wardani, A. K., Arlisyah, A., Fauziah, A., & Fa ’ida,  T.  N.  (2017).  Identifikasi  Gen Transgenik  pada  Produk  Susu  Bubuk Kedelai  dan  Susu  Formula  Soya dengan  Metode  PCR  (Polymerase Chain Reaction) Identification of Transgenic Genes in Soy Milk Powders and  Soy  Formulas  with  Polymerase Chain  Reaction  (PCR)  Technique.
AGRITECH ,
37 (3), 237 –245.
https://doi.org/10.22146/agritech.1665 6
Weeden,  N.  F.,  Timmerman,  G.M.,  Hemmat, M., Kneen, B. E., & Lodhi, M. A. (1992). Inheritance  and  reliability  of  RAPD markers  In  applications  of  RAPD technology to plant breeding.
Symposium  Proceedings. Madison, WI: Crop Science Society of America.
Wu, M., Wang, X.-G., Wang, C.-S., Wu, Y.-H.,
Xu,  X.-W.,  &  Gao,  X.-H.  (2010).
Pseudoalteromonas lipolytica sp. nov.,
isolated  from  the  Yangtze  River estuary. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology , 60 (9), 2176 –2181. https://doi.org/10.1099/ijs.0.017673-0 Wulandari SY, Yulianto B, Santosa GW,  dan S. K. (2009). Kandungan Logam Berat Hg dan  Cd  dalam  Air,  Sedimen  dan Kerang  Darah  (Anadara  granossa) dengan Menggunakan Metode Analisis Pengaktifan  Neutron  (APN). Ilmu Kelautan , 14 (3), 170 –175.