Gambaran Histopatologi Hati Tikus Wistar Pasca Pemberian Ekstrak Etanol Rimpang Bangle ( Zingiber cassumunar Roxb.) pada Uji Toksisitas Akut
Histopathological Changes in the Wistar Rats Liver Treated with Bangle (Zingiber cassumunar Roxb.) Rhizome Ethanol Extract during Acute Toxicity Test
Kesy Sasta Handani 1 , Wiwien Sugih Utami 2 , Bagus Hermansyah 2 , Rena Normasari 3 1 Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Jember
2 Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember
3 Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jalan Kalimantan No. 37 Kampus Tegalboto, Jember 68121 e-mail korespondensi: rena_normasari@unej.ac.id ; kesyhandani@gmail.com

## Abstrak
Malaria masih menjadi penyakit infeksi yang belum bisa dieradikasi . Adanya kasus resistensi obat antimalaria mendorong timbulnya penelitian tentang berbagai ekstrak tanaman herbal yang diharapkan dapat menjadi obat terapi komplementer malaria, salah satunya yaitu ekstrak etanol rimpang bangle ( Zingiber cassumunar Roxb.) . Sebelum dapat menjadi sebuah fitofarmaka, ekstrak etanol rimpang bangle harus melalui banyak tahapan uji terlebih  dahulu,  salah  satunya  yaitu  uji  toksisitas  akut  yang  dapat  digunakan  untuk  mengetahui  adanya kemungkinan kerusakan organ akibat pemberian ekstrak secara akut. Organ yang paling mungkin mengalami kerusakan akibat paparan ekstrak yaitu hati karena proses biotransformasi obat terjadi di organ tersebut. Tujuan penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  pengaruh  pemberian  ekstrak  etanol  rimpang  bangle  ( Zingiber cassumunar Roxb.) terhadap gambaran histopatologi hati tikus Wistar pada uji toksisitas akut. Jenis penelitian ini  yaitu true  experimental  laboratories dengan  rancangan posttest  only  control  group  design dengan menggunakan empat kelompok perlakuan (diberi dosis 42,609 mg/200gBB + Tween 1%, 213,045 mg/200gBB + Tween 1%, 426,09 mg/200gBB + Tween 1%, dan 852,18 mg/200gBB + Tween 1%) dan satu kelompok kontrol (diberi Tween 1%). Masing-masing kelompok perlakuan terdiri dari lima tikus jantan dan lima tikus betina. Data berupa  rata-rata  akhir  skor  kerusakan  hepatosit  dianalisis  menggunakan  uji One-Way ANOVA  dan  diperoleh p=0,084.  Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  tidak  ada  perbedaan  hasil  gambaran  histopatologi  hati  secara signifikan antarkelompok uji.
Kata Kunci : malaria, rimpang bangle, uji toksisitas akut, histopatologi hati

## Abstract
Malaria is still an infectious disease that can not be eradicated. The presence of antimalarial drug resistance case encourages the research on various herbal plant extracts that are expected to be a complementary therapy drug of  malaria,  one  of  them  is  bangle  (Zingiber  cassumunar  Roxb.)  rhizome  ethanol  extract.  Before  it  can  be  a phytopharmaca, bangle rhizome ethanol extract must go through many stages of the test first, one of them is acute toxicity test that can be used to determine the possibility of organ damage after the giving of extract during acute period. The organ that is most likely to experience damage due to exposure to the extract is liver because drug  biotransformation  takes  place  there.  This  research  aimed  to  investigate  the  effect  of  bangle  (Zingiber cassumunar Roxb.) rhizome ethanol extract to the histopathological changes of Wistar rats liver during acute toxicity test. This research type was true experimental laboratories with posttest only control group design using four treatment groups (given dose 42,609 mg/200gBW + Tween 1%, 213,045 mg/200gBW + Tween 1%, 426,09 mg/200gBW + Tween 1%, and 852.18 mg/200gBW + Tween 1%) and one control group (given 1% Tween). Each treatment groups consisted of five male rats and five female rats. The final mean score of hepatocyte damage as the research data was analyzed by One-Way ANOVA test and showed that p=0,084. It indicated that there was no significant difference of liver histopathology results between groups.
Keywords : malaria, bangle rhizome, acute toxicity test, liver histopathology

## Pendahuluan
Malaria masih menjadi penyakit infeksi yang belum bisa  dieradikasi  hingga  saat  ini. World  Health Organization (WHO)  dalam World  Malaria  Report tahun  2015  melaporkan  bahwa  telah  terdapat sekitar 214 juta kasus baru malaria dengan 438.000 orang di antaranya mengalami kematian dan masih ada  sekitar  3,2  miliar  orang  di  dunia  berisiko terinfeksi malaria. Sebanyak  88% kasus malaria  di dunia terjadi di Afrika, sedangkan 10% kasus terjadi di  Asia  Tenggara,  dan  2%  kasus  terjadi  di  wilayah Mediterania  Timur  (WHO,  2015b).  Indonesia memiliki  nilai Annual  Parasite  Incidence (API) malaria  sebesar  0,85  pada  tahun  2015  dengan kasus terbanyak ditemukan di Papua (Kemenkes RI, 2016).
Penggunaan  klorokuin  sebagai  obat  lini  pertama untuk malaria sudah dianggap kurang efektif akibat banyaknya kasus resistensi terhadap obat tersebut (Kombonglangi, 2015). Oleh karena itu, Artemisinin-based Combination Therapy (ACT) kini menjadi obat terapi lini pertama malaria di seluruh dunia  (WHO,  2015a).  Namun,  berdasarkan penelitian  efikasi  terapi  malaria  pada  beberapa daerah  di  Thailand,  telah  dilaporkan  adanya kegagalan terapi serta pemanjangan klirens parasit dalam penggunaan ACT (Yusuf, 2014). Hal tersebut mengindikasikan  adanya  kemungkinan  resistensi terhadap penggunaan ACT.
Adanya kasus resistensi terhadap obat antimalaria mendorong timbulnya penelitian-penelitian tentang tanaman herbal yang nantinya diharapkan dapat  menjadi  terapi  komplementer  untuk penyakit malaria. Salah satu tanaman herbal yang telah  diteliti  untuk  menjadi  terapi  komplementer malaria yaitu bangle ( Zingiber cassumunar Roxb.). Armiyanti et  al .  (2013)  menyatakan  bahwa kombinasi  pemberian  ekstrak  rimpang  bangle dengan  Artemisin  menunjukkan  efek  yang  sinergi dibuktikan  dengan  adanya  penurunan  derajat parasitemia dan TNF- α serta peningkatan kapasitas fagositosis  dan  produksi  NO  yang  penting  untuk eliminasi  parasit.  Pada  uji  aktivitas  antimalaria ekstrak etanol rimpang bangle terhadap Plasmodium berghei secara in vivo , didapatkan hasil IC 50 sebesar 6,087 mg/20 gram (Andika, 2017).
Untuk  menjadi  sebuah  fitofarmaka  (sediaan  obat yang  telah  dibuktikan  keamanan  dan  khasiatnya), ekstrak  bangle  harus  melewati  beberapa  tahap pengujian  terlebih  dahulu.  Salah  satunya  yaitu  uji toksisitas untuk mengetahui apakah zat aktif dalam tanaman  memberikan  efek  toksik  pada  dosis tertentu. Uji toksisitas dibagi menjadi uji toksisitas akut,  subakut,  kronik,  dan  spesifik.  Uji  toksisitas
akut merupakan prasyarat formal keamanan calon fitofarmaka untuk dapat  digunakan pada manusia (Kemenkes RI, 1992).
Hati  merupakan  organ  utama  dalam  proses biotransformasi  obat  sehingga  efek  toksik  obat dapat terjadi pada organ tersebut. Kerusakan hati akibat zat toksik dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu jenis zat kimia yang terlibat, besarnya dosis  yang  diberikan,  serta  lamanya  paparan  zat. Berdasarkan hal tersebut, peneliti ingin mengamati apakah terdapat perubahan gambaran histopatologi  hati  hewan  coba  pascapemberian ekstrak  etanol  rimpang  bangle  pada  uji  toksisitas akut.

## Metode Penelitian
Jenis  penelitian  yang  digunakan  ialah true experimental laboratories dengan  rancangan posttest  only  with  control  group  design .  Proses pemeliharaan tikus, pemberian ekstrak secara oral, dan  pengambilan  organ  hati  dilaksanakan  di Laboratorium  Farmakologi  Fakultas  Kedokteran Universitas  Jember  (UNEJ),  proses  pembuatan ekstrak  dilaksanakan  di  Laboratorium  Farmasetika dan  Biologi  Fakultas  Farmasi  UNEJ,  proses pembuatan preparat histopatologi hati dilaksanakan  di  Laboratorium  Patologi  Anatomi Fakultas  Kedokteran  Hewan  UGM,  dan  proses pengamatan  histopatologi  hati  dilaksanakan  di Laboratorium  Patologi  Anatomi  FK  UNEJ.  Jumlah sampel yang digunakan yaitu sebanyak 50 ekor tikus putih ( Rattus norvegicus ) galur Wistar dengan berat 150-250 gram yang diambil secara simple random sampling dan  dibagi  menjadi  lima  kelompok  yaitu kelompok  kontrol  (K n )  yang  diberi  larutan  Tween 1%,  kelompok  perlakuan  1  (K 1 )  yang  diberi  dosis ekstrak bangle 42,609 mg/200 gBB dengan pelarut Tween  1%,  kelompok  perlakuan  2  (K 2 )  yang  diberi dosis ekstrak bangle  213,045 mg/200 gBB dengan pelarut Tween 1%, kelompok perlakuan 3 (K 3 ) yang diberi  dosis  ekstrak  bangle  426,09  mg/200  gBB dengan pelarut Tween 1%, dan kelompok perlakuan 4  (K 4 )  yang  diberi  dosis  ekstrak  bangle  852,18 mg/200  gBB  dengan  pelarut  Tween  1%.  Masing- masing kelompok terdiri dari lima tikus jantan dan lima tikus betina.
Pembuatan  ekstrak  dilakukan  dengan  metode maserasi  dengan  menggunakan  pelarut  berupa etanol  96%.  Remaserasi  dilakukan  sebanyak  dua kali. Filtrat dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator kemudian hasilnya dioven dengan suhu 50 o C  agar  pelarut  yang  tersisa  dapat  menguap secara sempurna.
Tikus  yang  sudah  dikelompokkan  terlebih  dulu dipuasakan  3  jam  (hanya  diberi  minum  saja)  lalu diukur  berat  badannya,  kemudian  disonde.  Tikus kembali  diberi  makan  secara ad  libitum satu  jam setelah penyondean. Peneliti mengamati kematian dan  gejala  keracunan  pada  tikus  setelah penyondean pada 30 menit pertama dan tiga jam setelah  penyondean.  Gejala  keracunan  yang diamati  yaitu  perubahan  warna  kulit,  bulu,  mata, perdarahan  anus  dan  saluran  urin,  kejang,  salvasi berlebih,  diare,  berjalan  secara  tidak  normal,  dan penurunan  kesadaran.  Pada  hari  kedelapan,  tikus diterminasi  dengan  dimasukkan  ke  dalam  wadah yang telah berisi kapas yang telah diberi dietil eter terlebih  dahulu.  Setelah  tikus  mati,  tikus  dibedah untuk  diambil  organ  hatinya  lalu  organ  tersebut langsung ditaruh dalam wadah berisi formalin 10%.
Pengamatan  histopatologi  hati  dilakukan  secara double-blind dan  dikonfirmasi  oleh  ahli.  Preparat diteliti  dalam  lima  lapang  pandang  dengan perbesaran 400x. Setiap lapang pandang diamati 20 hepatosit dan masing-masing hepatosit diklasifikasikan menjadi normal, mengalami degenerasi  parenkimatosa,  mengalami  degenerasi hidrofik, atau mengalami nekrosis.
Data  yang  dianalisis  berupa  rata-rata  akhir  skor kerusakan hepatosit antarpelaku double-blind . Skor kerusakan  hepatosit  diperoleh  dari  proses transformasi data ordinal berupa derajat kerusakan hepatosit  menjadi  data  interval  menggunakan Method  of  Successive  Interval (MSI).  Data  ordinal dapat  dikonversi  menjadi  data  interval  agar  dapat dilakukan  perhitungan  lebih  lanjut  (Asdar  dan Badrullah,  2016).  Masing-masing  hepatosit  diberi skor sesuai dengan hasil transformasi data dengan MSI.  Selanjutnya,  peneliti  mencari  rata-rata  skor hepatosit per tikus. Rata-rata akhir skor kerusakan hepatosit  per  tikus  diperoleh  dengan  merata-rata hasil data pelaku double-blind I dan double-blind II. Data  berupa  rata-rata  akhir  skor  kerusakan hepatosit  diuji  normalitas Saphiro-Wilk dan homogenitasnya  terlebih  dahulu,  lalu  dianalisis dengan uji One-Way ANOVA.

## Hasil Penelitian
Penelitian  telah  berhasil  dilakukan  dan  tidak  ada sampel  yang  mengalami  kematian  maupun  gejala keracunan. Hasil gambaran histopatologi hati yang mewakili  setiap  kelompok  uji  dapat  dilihat  pada Gambar 1A-1E.
1A (        ): sel hepatosit normal
1B (        ): sel hepatosit dengan degenerasi parenkimatosa
1C (        ): sel hepatosit dengan degenerasi parenkimatosa
1E (        ): sel hepatosit yang mengalami nekrosis Gambar 1 . Gambaran histopatologi hati A.  kelompok  kontrol  (K n ),  B.  kelompok perlakuan 1 (K 1 ), C. kelompok perlakuan 2  (K 2 ),  D.  kelompok  perlakuan  3  (K 3 ),  E. kelompok perlakuan 4 (K 4 ). Pengamatan pada perbesaran 400x dengan pewarnaan HE.
Mean data  (rata-rata  akhir  skor  kerusakan hepatosit) tiap kelompok dapat dilihat pada Tabel 1 dan Gambar 2.
Tabel 1 . Mean data tiap kelompok penelitian
Kelompok Mean data (rata-rata akhir skor kerusakan hepatosit) K n
K 1 K 2 K 3 K 4 1,30540 ± 0,075981 1,35060 ± 0,057318 1,31820 ± 0,050512 1,36060 ± 0,045412 1,37420 ± 0,073492
Hasil uji normalitas dan homogenitas menunjukkan p>0,05 yang menunjukkan bahwa data terdistribusi normal  dan  memiliki  varian  yang  sama.  Data kemudian  dianalisis  dengan  uji One-Way ANOVA. Hasil  uji One-Way ANOVA menunjukkan  bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik antara  kelompok  K n ,  K 1 ,  K 2 ,  K 3 ,  dan  K 4 (p=0,084). Hasil uji dikatakan signifikan jika p<0,05.
Gambar 2. Grafik batang mean data tiap kelompok penelitian

## Pembahasan
Gambaran  histopatologi  hati  antarkelompok  uji tidak  mengalami  perbedaan  secara  signifikan. Bentuk  tingkat  kerusakan  hepatosit berupa hepatosit  normal,  hepatosit  yang  mengalami degenerasi parenkimatosa, hepatosit yang mengalami degenerasi hidrofik, dan hepatosit yang mengalami  nekrosis  dapat  dijumpai  pada  masing- masing kelompok uji.
Gambaran-gambaran  histopatologi  hati  pada penelitian  ini  tersusun  atas  hepatosit  dalam berbagai  tingkat  kerusakan.  Hepatosit  normal berbentuk  poligonal  dan  sitoplasmanya  berwarna merah  homogen.  Hepatosit  yang  mengalami degenerasi  parenkimatosa  memiliki  sitoplasma keruh  serta  batas  antara  inti  sel  dan  sitoplasma kurang jelas. Degenerasi ini terjadi akibat gangguan oksidasi yang menyebabkan penumpukan endapan protein  dalam  sitoplasma  sehingga  terlihat sitoplasma tampak keruh. Degenerasi parenkimatosa merupakan degenerasi yang paling ringan  dan  bersifat  reversibel.  Degenerasi parenkimatosa yang berlanjut dapat menyebabkan degenerasi  hidrofik.  Hepatosit  yang  mengalami degenerasi hidrofik akan membengkak dan tampak vakuola-vakuola yang berisi air dalam sitoplasmanya. Penyebab kerusakan hepatosit yang terus  menetap  dapat  menyebabkan  robekan membran  plasma  dan  perubahan  inti  sehingga hepatosit mengalami nekrosis. Selain  itu, nekrosis dapat terjadi akibat adanya metabolit kimia reaktif yang  mengikat  protein  nukleofilik  hepatosit  atau adanya metabolit dengan rantai bebas yang dapat berikatan  secara  kovalen  pada  protein  dan  asam lemak  tak  jenuh  membran  sel  sehingga menyebabkan  peroksidasi  lipid  dan  kerusakan membran yang akhirnya mengakibatkan kematian hepatosit (Amalina, 2009; Setyowati, 2010).
Hasil  uji One-Way ANOVA menunjukkan  bahwa tidak  ada  perbedaan  gambaran  histopatologi  hati yang  signifikan  secara  statistik  antarkelompok  uji. Tidak  adanya  perubahan  perbedaan  gambaran histopatologi hati pada penelitian ini sesuai dengan penelitian  Koontongkaew et  al .  (2014)  yang melakukan pemberian dosis tunggal ekstrak etanol rimpang  bangle  5000  mg/kgBB  dan  dinyatakan bahwa tidak ada perubahan secara signifikan pada gambaran mikroskopis hati hewan coba. Pemberian  dosis  berulang  ekstrak  etanol  rimpang bangle  pada  penelitian  ini  hingga  dosis  852,18 mg/200  gBB  pun  juga  tidak  menghasilkan perbedaan gambaran histopatologi hati secarasignifikan  antarkelompok  uji.  Hal  ini menandakan  bahwa  dosis  ekstrak  etanol  rimpang bangle  sebesar  852,18  mg/200  gBB  secara  akut
tidak  menimbulkan  perubahan  mikroskopis  hati secara signifikan.
Ekstrak  etanol  rimpang  bangle  memiliki  sifat hepatoprotektor (Suparto et al . dalam Afarah et al . 2004). Dalam penelitian Afarah et al . (2004), tikus jantan  yang  diberi  fraksi  etil  asetat  bangle  30 mg/kgBB  memiliki  rata-rata  kadar  SGOT  sekitar 32,59  U/I  dan  rata-rata  kadar  SGPT  sekitar  12,28 mg/kgBB  lebih  rendah  dari  kontrol  negatif  yang hanya  diinduksi  CCl 4 0,1  mL/kgBB  per  oral  tanpa diberi  sediaan  uji  lainnya.  SGOT  dan  SGPT merupakan  enzim  yang  akan  dikeluarkan  jika  sel hati  mengalami  kerusakan.  Berdasarkan  hal tersebut,  ada  kemungkinan  bahwa  dosis  ekstrak etanol rimpang bangle 852,18 mg/200 gBB pada uji toksisitas akut ini masih memiliki sifat hepatoprotektor  sehingga  belum  menimbulkan perubahan  secara  signifikan  pada  gambaran histopatologi hati antarkelompok uji.

## Kesimpulan
Tidak  terdapat  perbedaan  hasil  gambaran histopatologi  hati  tikus  Wistar  antarkelompok  uji pascapemberian  ekstrak  etanol  rimpang  bangle ( Zingiber  cassumunar Roxb.)  dengan  dosis  42,609 mg/200 gBB; 213,045 mg/200 gBB; 426,09 mg/200 gBB;  dan  852,18  mg/200  gBB  pada  uji  toksisitas akut.  Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  diperoleh maka perlu dilakukan uji toksisitas subakut ekstrak etanol  rimpang  bangle  ( Zingiber  cassumunar Roxb.).

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada dr. Wiwien  Sugih  Utami,  M.Sc.,  dr.  Rena  Normasari, M.Biomed., dan dr. Bagus Hermansyah, M.Biomed. yang  telah  membantu  dalam  penyusunan  naskah ini. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Lembaga  Penelitian  dan  Pengabdian  kepada Masyarakat  (LP2M)  UNEJ,  Fakultas  Kedokteran UNEJ, Fakultas Farmasi UNEJ, dan Kemenristekdikti yang  telah  memberikan  fasilitas  dalam  penelitian ini.

## Daftar Pustaka
WHO. 2015b. World Malaria Report 2015 . Geneva:
WHO Press.
Kemenkes  RI.  2016. Info  DATIN  Malaria .  Jakarta: PUSDATIN Kemenkes RI.
Kombonglangi  RS.  2015. Manajemen  Terapi Malaria Falciparum yang Resisten terhadap Klorokuin. J MAJORITY . 4(6): 27.
WHO.  2015a. Guidelines  for  the  Treatment  of Malaria . Geneva: WHO Press.
Yusuf  Y.  2014. Bukti  Munculnya  Malaria  Resisten Artemisinin  di  Asia.  Jurnal  Bionature . 14(2): 129.
Armiyanti  Y,  Utami  WS,  dan  Ameliana  L.  2013.
Pengembangan  Ekstrak  Rimpang  Bangle (Zingiber  cassumunar  Roxb.)  Terstandar menjadi  Granul  Efervesen  sebagai  Terapi Ajuvan  untuk  Mencegah  Komplikasi  pada Malaria .  (Online)  Jun.  http://repository. unej.ac.id/bitstream/handle/123456789/ 57892/Yunita_hb_dipa_26.pdf?sequence =1. [accessed on 10 June 2017]. Andika FFA. 2017. Uji Aktivitas Antimalaria Ekstrak Etanol Rimpang Bangle (Zingiber
cassumunar  Roxb.)  terhadap  Plasmodium berghei  secara  In  Vivo .  [Skripsi].  In  Press.
Fakultas  Kedokteran  Universitas  Jember, Jember.
Kemenkes RI. 1992. Keputusan Menteri Kesehatan RI  No.761/Menkes/SK/  IX/1992  tetang Pedoman Fitofarmaka . Jakarta: Kemenkes RI. Asdar  dan  Badrullah.  2016. Method  of  Successive
Interval  in  Community  Research  (Ordinal
Transformation  Data  to  Interval  Data  in
Mathematic Education Studies). International Journal of Social Science and Humanities Research . 4(2): 356-363.
Amalina  N.  2009. Uji  Toksisitas  Akut  Ekstrak Valerian  (Valeriana  officinalis)  terhadap Hepar  Mencit  Balb/c .  (Online)  Jun.
http://eprints.undip.ac.id/7439/1/nurika_ malina.pdf. [accessed on 12 June 2017].
Setyowati W. 2010. Uji Toksisitas Akut Monocrotophos Dosis Bertingkat Per Oral Dilihat dari Gambaran Histopatologi Hepar Mencit Balb/c . (Online) Sep.
download.portalgaruda.  org/article.php? article=73551&val=4695. [accessed on  28
September 2017].
Koontongkaew S, Poachanukoon O, Sireeratawong S,  Ayudhya  TDN,  Khonsung  P,  Jaijoy  K, Soawakontha  R,  dan  Chanchai  M.  2014. Safety  Evaluation  of  Zingiber  cassumunar Roxb. Rhizome Extract: Acute and Chronic Toxicity  Studies  in  Rats.  International Scholarly Research Notices . 2014(632608): 4-11.
Arafah E, Muchtadi D, Zakaria FR, Wresdiyati T, dan
Sidik.  2004. Pengaruh  Perlindungan Ekstrak Rimpang Bangle (Zingiber cassumunar  Roxb.)  terhadap  Kerusakan Hati  Tikus  yang  Diinduksi  CCl 4 .  Jurnal Teknologi dan Industri Pangan . 15(3): 216.