## NurseLine Journal

## Vol. 1 No. 2 Nopember 2016 p-ISSN 2540-7937 e-ISSN 2541-464X
EKSTRAK ETANOLIK AWAR-AWAR ( Ficus septica ) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF

## SELEKTIF PADA BERBAGAI MACAM SEL KANKER
( ETHANOLIC  LEAVES  EXTRACT  OF  AWAR-AWAR  (Ficus  septica)  AS  SELECTIVE CHEMOPREVENTIVE AGENT ON VARIOUS CANCER CELLS )
Ika Rahmawati Sutedjo 1 *, Herwandhani Putri 2 , Edy Meiyanto 3
1 Laboratorium Biokimia, Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jl. Kalimantan No. 37 Jember 68121 *e-mail: ikarahmawati.fk@unej.ac.id 2,3 Cancer Chemoprevention Research Center, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada e-mail: ccrc@ugm.ac.id
Kata kunci:
Ficus septica HeLa MTT assay 4T1
MCF7/HER2 Vero WiDR

## Keywords:
Ficus septica HeLa MTT assay 4T1 MCF7/HER2 Vero WiDR

## ABSTRAK
Penggunaan agen kemoterapi dalam waktu lama menimbulkan berbagai efek samping, hal ini dikarenakan kurang selektifnya agen kemoterapi terhadap sel kanker. Agen kemopreventif yang  selektif diperlukan  untuk mengurangi  efek samping  dan meningkatkan  efektivitas terapi kanker. Awar-awar ( Ficus septica ) merupakan bahan alam yang berpotensi sebagai agen kemopreventif. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek sitotoksik ekstrak etanolik daun awar-awar (EFs) terhadap  sel kanker payudara 4T1 dan MCF7/ HER2, sel kanker kolon WiDR, sel kanker serviks HeLa, dan sel epitel normal Vero. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan MTT assay . Parameter yang diperoleh dari uji sitotoksik adalah IC50. Indeks selektifitas diperoleh dari rasio IC50 EFs pada sel kanker tertentu dibanding sel epitel normal Vero. Hasil penelitian ini menunjukkan EFs memiliki aktivitas sitotoksik pada semua sel kanker dan sel normal dengan IC50 sebesar 61,2 µg/mL untuk sel 4T1; 48 µg/mL untuk sel MCF7/HER2; 122,4 µg/mL untuk sel Hela; 75,9 µg/mL untuk sel WiDR; dan 394,8 µg/mL untuk sel Vero. Dapat disimpulkan bahwa EFs bekerja selektif pada berbagai sel kanker dengan indeks selektifitas >= 3. `

## ABSTRACT
Treatment of cancer such as surgery, radiotherapy and chemotherapy have many side effects such as cardiotoxicity, hepatotoxicity, and immune-suppressant, therefore selec- tive cochemopreventive agent is needed. Awar-awar (Ficus septica) is a traditional me- dicinal plant that is known as a potential cancer chemopreventive agent. The purpose of this study was to determine the cytotoxic effect of ethanolic leaves extract of awar-awar (EFs) against 4T1 and MCF7/HER2 breast cancer cells; WIDR colon cells cancer, HeLa cervix cells cancer,  and Vero normal cells.  The cytotoxic test was  performed by MTT assay. The parameter obtained from the cytotoxic test was IC50. Selectivity index was determined from IC50 ratio of cancer cells to normal cells Vero. The results showed that EFs  has  a  cytotoxic  activity  on  cancer  cell  line  with  IC50  61.2  µg/mL  on  4T1;  48 µg/mL on MCF7/HER2; 122.4 µg/mL on Hela; 75.9 µg/mL on WiDR; and 394.8 µg/ mL  on  Vero.  It  can  be  concluded  that    EFs  has  high  selectivity  on  various  cancer cells  with  selectivity  index  more  than  3.

## PENDAHULUAN
Kanker  merupakan  salah  satu  penyebab utama  kematian  di  dunia,  kurang  lebih  8,2  juta kematian setiap tahun disebabkan oleh  penyakit ini. Kanker  paru,  hati,  kolorektal,  dan  payudara  adalah penyebab  kematian  tersering,  selain  itu  kanker payudara  dan  serviks  merupakan  kanker  dengan prevalensi  terbanyak  di  Indonesia  (Kemenkes  RI, 2015).  Agen  kemoterapi  merupakan  agen  yang mencegah atau menghambat pertumbuhan sel kanker. Metode  kemoterapi  dilakukan  dengan  memberikan senyawa kimia untuk membunuh sel kanker. Namun penggunaan  agen  kemoterapi  berkepanjangan menyebabkan melemahnya sistem imun dan resistensi sel kanker karena kurang selektifnya agen kemoterapi terhadap sel kanker. Hal tersebut merupakan penyebab utama kegagalan terapi kanker (Staerk et al., 2002). Oleh  karena  itu,  diperlukan  pengembangan  agen kokemoterapi atau kemopreventif yang lebih aman dan selektif.
Saat ini agen kemopreventif dari bahan alam telah  menjadi  alternatif  pilihan  dalam  pengobatan kanker,  salah  satunya  adalah  awar-awar  ( Ficus septica ). Awar-awar banyak ditemukan di Jawa dan Madura, tumbuh pada daerah dengan ketinggian 1200 m dpl, banyak ditemukan di tepi jalan, semak belukar dan hutan terbuka (Syamsuhidayat & Hutapea, 1993). Awar-awar secara tradisional dimanfaatkan daunnya untuk  obat  penyakit  kulit,  radang  usus  buntu, mengatasi bisul, gigitan ular berbisa dan sesak napas. Akarnya  dimanfaatkan  untuk  penawar  racun  dan antiasma.  Getahnya  dimanfaatkan  untuk  mengatasi bengkak-bengkak dan kepala pusing sedangkan buah untuk pencahar. Tumbuhan ini mengandung alkaloid fenanthroindolisidin  yang  diketahui  mempunyai aktivitas sitotoksik melalui inhibisi protein dan sintesis asam nukleat (Lansky & Paavilainen, 2011). Beberapa analog  tylophorine  menunjukkan  inhibisi  signifikan pada aktivator protein-1 (AP-1), cyclic AMP response elements dan nuclear faktor-B (NF-kB) (Gao, 2011). Awar-awar  telah  terbukti  bersifat  sitotoksik  pada beberapa  macam  sel kanker  diantaranya  sel  kanker payudara  MCF7  dan  T47D  dengan  nilai  IC  50 berturut-turut  sebesar  13  µg/mL  dan  6  µg/mL (Mubarok et al., 2008; Pratama et al., 2011). Akan tetapi  belum  pernah  dibuktikan  apakah  efektifitas sebagai  antikanker  tersebut  bersifat  selektif,  yaitu hanya  bekerja  pada  sel  kanker  dan  aman  dari  efek samping merugikan  pada sel normal.
Penelitian ini mempelajari aktivitas sitotoksik ekstrak etanolik daun awar-awar pada beberapa sel kanker lain, yaitu sel kanker payudara metastasis 4T1
dan MCF7/HER2, sel kanker kolon WiDR, serta sel kanker serviks HeLa. Selektitivitas ekstrak etanolik awar-awar  pada  berbagai  sel  kanker  dibuktikan dengan  membandingkan  efek  sitotoksik  pada  sel kanker dengan sel normal Vero melalui parameter nilai SI ( selectivity index ). Data-data ilmiah tersebut akan menjadi dasar penggunaan  awar-awar sebagai agen kemopreventif yang efektif dan selektif untuk berbagai jenis kanker.

## METODE

## Bahan Tanaman
Bahan yang digunakan adalah daun tumbuhan awar-awar yang diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan  pelarut  etanolik 70%.  Proses  ekstrak tersebut dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO)  Tawangmangu,  Indonesia.  Determinasi tanaman telah dilakukan oleh bagian Biologi Farmasi, Fakultas  Farmasi  Universitas  Gajah  Mada, Yogyakarta.
Sel Line Kanker
Sel kanker manusia yang digunakan adalah sel kanker payudara 4T1 dan MCF7/HER2, sel kanker serviks HeLa, sel kanker kolon WiDR, dan sel epitel normal Vero yang merupakan koleksi CCRC ( Can- cer  Chemoprevention  Research  Center )  Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta Bahan Kimia
Etanolik  70%,  media  RPMI  1640  dan DMEM hi-glucose (Gibco),  Fetal  Bovine  Serum (FBS)  (Sigma),  penisilin-streptomisin  (Sigma), Fungizone  (Sigma),  Dimethyl  sulfoxide  (DMSO), tripsin-EDTA  (Sigma)  (tripsin  0,25%),  tripan  blue (Sigma), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) difenil tetrazolium bromida (MTT) (Sigma), Sodium Duodecyl Suphate (SDS) dan Phosphat Buffer Saline (PBS) (Invitrogen). Uji Sitotoksisitas Dengan Metode MTT Assay Sel didistribusikan ke dalam sumuran (10.000 sel/sumuran  untuk  sel  HeLa  dan  Vero,  12.000  sel/ sumuran  untuk  sel  MCF7/HER2  serta  5.000  sel/ sumuran  untuk  sel  4T1  dan  WiDR),  kemudian diadaptasikan hingga normal kembali. Sel diinkubasi dengan berbagai seri konsentrasi senyawa uji selama 24 jam pada inkubator 5% CO2  dengan suhu 37°C. Pada  akhir  inkubasi,  media  dalam  masing-masing sumuran diganti dengan suspensi 100 µl MTT 5 mg/ mL. Diinkubasi kembali selama 4 jam. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper (HCl 10% dalam SDS), kemudian diinkubasi semalam pada suhu  kamar.  Serapan dibaca  dengan  ELISA reader pada alfa 595 nm (Mosmann, 1983).

## Analisis Data 1. Perhitungan IC50
Data absorbansi dikonversi menjadi viabilitas sel  (persen  sel  hidup)  yang  dihitung  menggunakan rumus:
Nilai  viabilitas  sel  pada  perlakuan  ekstrak  dengan konsentrasi tertentu dianalisis menggunakan regresi linier untuk mendapatkan  nilai IC50  (Fresney, 2005). 2. Perhitungan SI untuk selektifitas
Selektifitas ditentukan dengan menggunakan parameter SI ( Selectivity Index ) dengan rumus:
IC50 pada sel kanker
Ekstrak dikatakan mempunyai selektifitas yang tinggi apabila nilai SI >= 3, dan dikatakan kurang selektif apabila nilai SI< 3 (Prayong, 2008).

## HASIL
Hasil uji sitotoksisitas ekstrak etanolik awar- awar (EFs) terhadap sel 4T1, MCF7/HER2, WiDR, HeLa dan Vero menunjukkan EFs bersifat toksik dan dapat menghambat pertumbuhan berbagai sel kanker tersebut dengan fenomena dose dependent , yaitu efek toksik  meningkat  seiring  peningkatan  konsentrasi (gambar  1).  Melalui  pengamatan  menggunakan mikroskop  dapat  diketahui  bahwa  perlakuan  EFs memberikan perubahan terhadap morfologi sel kanker (gambar  2).  Hasil  analisis  dengan  regresi  linier diperoleh nilai IC50 masing-masing sel kanker, yang ditunjukkan pada tabel 1. Penelitian ini menunjukkan EFs  bersifat  poten  terhadap  sel  kanker  payudara MCF7/HER2  &  4T1  serta sel  kanker  kolon WiDR (Tabel 1).  Prayong et  al. menyatakan  senyawa dari bahan  alam  dapat  disebut  poten  jika  memiliki  nilai IC50 kurang dari 100 µg/mL. Sedangkan IC50 EFs pada sel Hela lebih dari 100 µg/mL. Selektifitas EFs dievaluasi dengan menggunakan parameter selectiv- ity index (SI). Hasil analisis selektifitas menunjukkan bahwa EFs selektif terhadap semua sel line yang diuji. Hal tersebut  terlihat  dari  nilai  SI  yang  lebih  dari  3 (Tabel 2).

## PEMBAHASAN
Uji  sitotoksisitas  terhadap  sel  kanker merupakan  pengujian  dasar  pada  obat  antikanker maupun senyawa kemopreventif. Melalui parameter
IC50, dapat dilihat potensi toksik senyawa/bahan yang diujikan. Salah  satu metode  yang umum  digunakan untuk uji sitotoksisitas secara in vitro adalah metode MTT.  Berdasarkan  nilai  absorbansi  yang  diperoleh dilakukan  penentuan  persen  viabilitas.  Selanjutnya bersama dengan data kadar sampel yang digunakan dilakukan penentuan nilai IC50 (Fresney, 2005). Pada penelitian ini EFs terbukti bersifat sitotoksik terhadap sel 4T1, MCF7/HER2, HeLa, WiDR, dan Vero.
Penelitian  lain  menyebutkan  bahwa  awar- awar menghambat pertumbuhan berbagai sel kanker, yaitu cell lines carcinoma KB-VI ( multidrugs resis- tance  cell )  dan  KB-3-1  ( sensitive  cell ).  Salah  satu komponen  fenantroindolisidin  berupa  6-O- desmethylantofine dari Tylophora tanakae mempunyai IC50 7 ± 3 nM untuk sel KB-3-1dan IC50 10 ± 4 nM untuk sel KB-VI (Staerk et al., 2002). Batang Ficus septica yang  terbukti  mengandung  alkaloid fenantroindolisin  mempunyai  aktivitas  sitotoksik terhadap sel kanker nasofaring HONE-1 ( human na- sopharyngeal  carcinoma )  dan  sel  kanker  lambung NUGC ( human gastric cancer ) (Prayong et al.,2008). Kandungan  kimia  lain  yang  diisolasi  dan  diduga berperan sebagai zat aktif dari daun awar-awar adalah senyawa  flavonoid  genistin  dan  kaempferitrin, kumarin,  senyawa  fenolik  pirimidin  dan  alkaloid antofin, 10S,13aR-antofin N-oxide, dehidrotylophorin, ficuseptin A, tylophorin, 2-Demetoksitylophorin, 14?- Hidroksiisotylopcrebin N-oxide, saponin triterpenoid, serta sterol (Damu et al., 2005; Lansky et al., 2008). Mekanisme  sitotoksisitas  kandungan  isoflavonoid genistin  mampu  memacu  apoptosis  melalui peningkatan aktivitas caspase 3 (Choi et al., 2007). Kumarin  umbelliprenin  dan  senyawa  fenolik resveratrol juga diketahui memiliki aktivitas sitotoksik. Kumarin eskuletin mampu menginduksi apoptosis dan menurunkan ekspresi protein Bcl-2 (Chu et al., 2001), senyawa  fenolik  resveratrol  menginduksi  apoptosis melalui down-regulation NF?B pada penghambatan jalur  signaling  PI3K/Akt  yang  mengakibatkan penurunan  ekspresi  protein  Bcl-2  (Guisado  et  al., 2005).
Perbedaan nilai IC50 antar sel terjadi karena adanya  perbedaan  karakteristik  masing-masing  sel yang digunakan. MCF7/HER2 atau MCF7/ clone 18 merupakan sel line MCF7 yang ditransfeksi gen yang menyebabkan overekspresi protein HER2/neu. Liang et  al.(2003)  menyisipkan  fragmen  cDNA  HER2 dengan  vektor  pcDNA3.0  pada  sel  MCF7  untuk memperoleh sel ini. Sel line MCF7 sendiri mempunyai karakteristik  merupakan  sel  karsinoma  payudara duktal invasif yang diambil dari cairan efusi pleura, mempunyai  reseptor  untuk  hormon  esterogen  dan
% sel hidup = Abs. Sel perlakuan – Abs. Kontrol media x 100%
Abs. Kontrol sel – Abs. Kontrol media
SI = IC50 pada sel Vero

## B
Gambar 1. Kurva linieritas persen viabiltas masing- masing sel kanker terhadap konsentrasi EFs pada: A. Sel kanker payudara 4T1, B. Sel kanker  payudara  MCF7/HER2, C. Sel kanker serviks HeLa, D. Sel kanker kolon WiDR, E. Model sel epitel normal Vero
. . .
Gambar 2. Morfologi sel akibat: A. Perlakuan EFs dengan konsentrasi 75 µg/mL pada sel 4T1, B. Perlakuan EFs dengan konsentrasi 75 µg/mL pada sel MCF7/HER2, C. Perlakuan EFs dengan konsentrasi 100 µg/ mL pada sel HeLa, D. Perlakuan EFs dengan konsentrasi 100 µg/mL pada sel WiDR, E. Perlakuan EFs dengan konsentrasi 500 µg/mL pada sel Vero
: -----> Sel viabel
: -.-.-> Sel non viabel, mengalami perubahan morfologi menjadi bulat
A B C D E
progesteron,  dan  termasuk  tipe  sel  epitel  luminal (Anonim,  2007).  HER2/neu  merupakan  protein dengan  berat  185  kDa,  produk  dari  protoonkogen HER2/cErBB2. Protein ini berperan sebagai reseptor tirosin kinase transmembran (anggota famili EGFR), bekerja dengan  memfosforilasi kompleks heterodimer untuk  aktivasi  jalur  sinyal  melalui  PI3K/Akt  atau MEK/ERK pathway yang bertanggungjawab terhadap proliferasi  dan survival  sel  kanker. Sekitar  15-20% kanker  payudara  mengekspresikan  HER2,  hal  ini berkaitan dengan prognosis kanker yang lebih buruk seperti ukuran yang lebih besar, grade nuclear yang tinggi,  fraksi  fase  S  yang  tinggi,  aneupleuidi,  dan penurunan reseptor esterogen (Ménard et al., 2001). Sel  kanker  payudara  metastasis  4T1  merupakan kanker  payudara  epitel  duktus  (positif  E-cadherin), mengekspresikan p63, smooth muscle actin /SMA, & cytokeratin 5/6, bermetastasis jauh  ke beberapa or- gan, antara lain paru, hati, otak, dan tulang (Tao et al, 2008). 4T1 juga merupakan sel dengan level pro- tein P53 rendah dan tidak mengekspresikan  protein MMP2 (Tao et al, 2008; Yerlikaya et al.,2011). Sel kanker  serviks  HeLa  mengekspresikan  2  onkogen, yaitu E6 dan E7. Protein E6 berikatan dengan tumor supresor protein p53 dan mempercepat degradasi p53 yang diperantarai ubiquitin dan menstimulasi aktivitas enzim  telomerase.  Sedangkan  protein  E7  mengikat bentuk  aktif  terhipofosforilasi  dari  p105Rb  dan anggota lain dari famili Rb. Ikatan ini menyebabkan destabilisasi Rb dan pecahnya kompleks Rb/E2F yang berperan  menekan  transkripsi  gen  yang  diperlukan untuk cell cycle progression (DeFillippis et al., 2003). sel HeLa juga mempunyai gen p53 dan p105Rb dalam bentuk  wild  type  (Goodwin  &  DiMaio,  2000).  Sel
WiDr  merupakan  sel  kanker  kolon  manusia  yang diisolasi dari kolon seorang wanita berusia 78 tahun. Salah  satu  karakteristik  dari  sel  WiDr  ini  adalah ekspresi sikolooksigenase-2 (COX-2) yang tinggi yang memacu proliferasi sel WiDr (Palozza et al., 2005). Pada  sel WiDr,  terjadi  mutasi  p53  pada  posisi  273 sehingga  terjadi  perubahan  residu  arginin  menjadi histidin. Apoptosis pada sel WiDr dapat terjadi melalui jalur  independent p53,  diantaranya melalui  aktivasi p73 (Levrero et al., 2000).  Sel Vero merupakan sel line yang berasal dari ginjal monyet hijau afrika ( Af- rican green monkey ). Sel Vero berbentuk  poligonal dan  pipih,  merupakan  sel  monolayer  dan  termasuk jenis epithelial-like .  Sel  ini  menempel  dengan  kuat pada  lapisan  substrat  yang  berbahan  polistiren  dan membentuk ikatan kovalen (Sons, 2008).
Selektifitas agen kemopreventif artinya hanya sel kanker saja yang diserang, sementara sel normal tidak diserang. Mekanisme ini berbeda dengan cara kerja  kemoterapi  yang  menyerang  baik  sel  kanker maupun sel normal. Akibatnya sel normal ikut mati sehingga timbul berbagai macam efek samping. Cara agen kemopreventif membedakan sel kanker dan sel normal adalah berdasar kebutuhan sel akan ATP (Ad- enosine Triphosphate). Karena sel kanker bergerak, tumbuh  dan  berduplikasi  lebih  cepat  dan  aktif dibanding sel normal, maka sel kanker membutuhkan energi ATP dalam jumlah yang lebih banyak. Hal ini dideteksi oleh agen kemopreventif, selanjutnya bahan tersebut  masuk  ke  dalam  sel  kanker  dan  menempel pada  dinding  dalam  mitokondria  untuk  memblok produksi ATP.  Akibatnya  suplai  energi  untuk  sel kanker  terhenti, sel  kanker menjadi  lemah dan  mati (Alali  et  al.,  1999).  Pada  penelitian  ini  awar-awar
Tabel 1. Nilai IC50 EFs pada berbagai sel line kanker dan sel normal
Tabel 2. Selektifitas EFs pada berbagai sel kanker
Sampel Nilai IC 50 (µg/mL) 4T1 MCF7/HER2 HeLa WiDR Vero Ekstrak etanolik awar-awar 61,2 48 122,4 75,9 394,8 Jenis sel Nilai SI Interpretasi 4T1 6,45 Selektif MCF7/HER2 8,23 Selektif HeLa 3,23 Selektif WiDR 5,20 Selektif
terbukti selektif bekerja pada sel 4T1, MCF7/HER2, HeLa, dan WiDR.

## SIMPULAN
Ekstrak  etanolik  daun  awar-awar  ( Ficus septica )  dapat  menghambat  pertumbuhan  beberapa jenis sel kanker (4T1, MCF7/HER2, WiDR, HeLa) secara  selektif,  sehingga  ekstrak  ini  mempunyai potensi  untuk  dikembangkan  sebagai  agen kokemoterapi. Meskipun demikian, masih diperlukan penelitian lebih lanjut untuk dapat mengaplikasikan kesimpulan tersebut pada pasien kanker.

## SARAN
Perlu dilakukan identifikasi, pemisahan dan pengujian lebih lanjut senyawa aktif yang terkandung dalam  ekstrak  etanolik  daun  awar-awar. Pengembangan penelitian berikutnya dapat mengkaji sinergisitas  kombinasi  ekstrak  etanolik  daun  awar- awar dengan agen kemoterapi dan penelusuran jalur molekuler  yang  mendasari  efek  sitotosisitas  bahan tersebut.

## KEPUSTAKAAN
Alali,  F.Q.,  Liu,  X.X.,  &  McLaughlin,  J.L.,  1999. Annonaceous Acetogenins: Recent Progress. Journal of  Natural Product 62(3): 504-40. Anonim,  2007. ATCC Cell  Biology,  available  from http://www.atcc.org/common  /catalog/ n u m S e a r c h / n u m R e s u l t s . c f m ? a t c c Num=HTB-22, cited in 23 September 2016.
Choi, J. E., Kim, T., & Lee, M. S., 2007. Pro-apoptotic Effect  and  Cytotoxicity  of  Genistein  and Genistin in Human Ovarian Cancer SK-OV- 3 Cells. Life Sciences, 80: 1403-1408.
Chu, C. Y., Tsai, Y. Y., Wang, C. J., Lin, W. L., & Tseng, T.  H.,  2001.  Induction  of Apoptosis by Esculetin in Human Leukemia Cells. Eur J Pharmacol, 416(2):25-32.
Damu, A.G., Kuo, P.C., Shi, L.S., Li, C.Y, Kuoh, C.S., Wu, P.L., Wu, T.S., 2005.
Phenanthroindolizidine  Alkaloids  from  the
Stems of Ficus septica, J. Nat. Pro,. 68:1071- 1075.
DeFillippis, R.A,  Goodwin, E.C., Wu,  L., DiMaio,
D., 2003. Endogenous Human Papillomavirus
E6  and  E7  Proteins  Differentially  Regulate Proliferation,  Senescence,  and Apoptosis  in HeLa Cervical Carcinoma Cells. Journal of Virology 77 (2): 1551-1563.
Fresney, R.I., 2005. Culture of Animal Cell: A Manual of  Basic Technique.  5th  Ed.  John  Wiley  & Sons. 120-135.
Gao, H., Lamusta, J., Zhang, W.F., Salmonsen, R.,
Liu, Y.,O'Connell, E., et al.  2011. Tumor Cell Selective Cytotoxicity & Apoptosis Induction by an Herbal Preparation from Ficus septica.
N Am J Med Sci. 4(2):62-66.
Goodwin,  E.C. &  DiMaio,  D.  2000. Repression  of
Human  Papillomavirus  Oncogenes  in  HeLa Cervical Carcinoma Cells Causes the Orderly Reactivation of Dormant Tumor Suppressor Pathways. Biochemistry. 97:23.
Guisado, E. P., Merino, J. M., Navarro S. M., Benayas M. J., Centeno F., Barrientos A., and Salguero P. M., 2005. Resveratrol-induced Apoptosis in  MCF-7  Human  Breast  Cancer  Cells  In- volves  a  Caspase-independent  Mechanism with  Down-regulation  of  Bcl-2  and  NF- kappaB. Int J Cancer. 115: 74-84.
Kemenkes RI, 2015. Situasi Penyakit Kanker. Jakarta:
Pusat  data  dan  informasi  Kementrian Kesehatan RI.
Lansky, E. P. & Paavilainen, H. M. 2011. Traditional
Herbal Medicines for Modern Times Figs The Genus Ficus. New York: Taylor and Francis Group, LLC
Lansky, E. P., Paavilainen, H. M., Pawlus, A. D., and Newman, R. A., 2008. Ficus spp. (fig): Eth- nobotany and potential as anticancer and anti- inflammatory agents, Journal of Ethnopharmacology, 119 : 195-213.
Levrero, M., Laurenzi, V. De, Constanzo, A., Sabatini,
S.,  Gong,  J.,  Wang,  J.Y.J.  and  Melino,  G., 2000. The p53/p63/p73 Family of Transcrip- tion Factors: Overlapping and Distinct Func- tions, Journal of Cell Science, 113:1661-1670. Liang, K., Lu, Y., Jin, W., Ang, K.K., Milas, L. Fan, Z., 2003. Sensitization of Breast Cancer Cells to  Radiation  by  Trastuzumab.  Mol  Cancer Ther 2003; 2:1113-1120.
Ménard, S., Fortis, S., Castiglioni, F., Agresti, R., and Balsari, A., 2001. HER2 as a Prognostic Fac- tor in Breast Cancer. Oncology 2001;61 Suppl 2:67-72.
Mosmann,  T.,  1983.  Rapid  Colorimetric Assay  for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Jour- nal of Immunological Methods. 65: 55-63.
Mubarok,  M.F.,  Sekti,  D.A.,  Ainun,  W.,  2008.
Peningkatan Aktivitas  Sitotoksik  Doxorubi- cin  terhadap  Sel  MCF-7  Menggunakan Ekstrak  Etanolik  Daun  Awar-awar  (Ficus
197 NurseLine Journal Vol. 1 No. 2 Nopember 2016: 190-197
septica  Burm.  f.),  Prosiding  KONGRES ILMIAH XVI ISFI 2008. ISBN: 978- 979- 95107-6-2. Penerbit : Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia (In Indonesian). Palozza, P., Serini, S., Maggiano, N., Giuseppe, T., Navarra, P. and Ranelletti, F.O., 2005.  -Caro- tene  Downregulates  the  Steady-State  and Heregulin-a-Induced  COX-2  Pathways  in Colon Cancer Cells, J.Nutr., 135:129-136. Pratama,  R.H.,  Ikhtiarsyah,  Y.G., Anindyajati, A., Fitriasari, A.,  Ikawati,  M.,  Meiyanto,  E., 2011. Awar-awar  Leaves  Ethanolic  Extract Sinergistically Enhances Cytotoxic Effect of Doxorubicin on T47D Breast Cancer Cells. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 9, 67-71. Prayong, P., Barusrux, S., Weerapreeyakul, N., 2008.
Cytotoxic Activity Screening of some Indig- enous  Thai  Plants.  Fitoterapi.79(7-8):598- 601. doi: 10.1016/j.fitote.2008.06.007.
Sons, W.,J.,. 2008. Vero Cell. Curr Protoc. Microbiol
11:A.4E.1-A.4E.7.
Staerk, D., Lykkeberg, A.K., Christensen, J., Budnik,
B.A., Abe, F., & Jaroszewski, J.W., 2002. In Vitro Cytotoxic Activity of Phenanthroindolizidine  Alkaloids  from Cynanchum  vincetoxicum  and  Tylophora tanakae against Drug-Sensitive and Multidrug Resistant Cancer Cells, J. Nat. Prod, 65:1299- 1302.
Syamsuhidayat,  S.S.  dan  Hutapea,  J.  R.,  1993. Inventaris Tanaman Obat Indonesia, Jilid II, Departemen Kesehatan  Republik Indonesia,
Jakarta.
Tao,  K.,  Fang,  M., Alroy,  J.,Sahagian,  G.G.,  2008.
Imagable  4T1  Model  for  the  Study  of  Late Stage Breast Cancer. BMC Cancer, 8:228.
Yerlikaya, A.I., Okur, E., & Ulukaya, E., 2012.  The p53-independent  Induction  of Apoptosis  in Breast  Cancer  Cells  in  Response  to
Proteasome  Inhibitor  Bortezomib.  Tumour Biol.  5:1385-92.  doi:  10.1007/s13277-012- 0386-3.