## Pengaruh pH Terhadap Stabilitas Daun Pacar Kuku Sebagai Counterstain Alternatif pada Pewarnaan Gram
Sunita Damayanti 1 , Dhiah Novalina 1 , Wahid Syamsul Hadi 1
1 Program Studi Sarjana Terapan Teknologi Laboratorium Medis, Universitas „Aisyiyah Yogyakarta

## Abstrak
Identifikasi bakteri pewarnaan gram dilakukan dengan metode konvensional atau molekuler secara mikroskopis. Pewarnaan gram memiliki kemampuan menyeleksi bakteri gram positif dengan bakteri gram negatif berdasarkan peptidoglikannya.Pewarnaan  gram  menggunakan  safranin  sebagai  cat  penutup.Safranin  merupakan  pewarna kationyang bersifat karsinogenik dan menimbulkan permasalahan bagi lingkungan dan kesehatan manusia. Oleh sebab itu, perlu dikembangkan pewarna alternatif dari bahan alami yang sama dengan safranin. Daun pacar kuku merupakan  senyawa  fenolik  dan  termasuk  dalam  protein  yang  memberikan  kemampuan  pewarnaan  yang  baik. Penelitian ini memiliki tujuanmenentukan pengaruh antara variasi pHdengan stabilitas daun pacar kuku sebagai counterstain alternatif pewarnaan gram dan  membuat inovasi baruberbahan dasar alami  untuk pewarnaan gram yang stabil dan lebih ramah lingkungan. Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimen dengan uji stabilitas untuk mengukur absorbansi. Selanjutnya, setelah pewarnaan diamati dibawah mikroskop perbesaran 100x. Hasil penelitian menunjukkan bahwa zat warna pada pH 3 lebih stabil dibanding dengan zat warna pada pH 7 dan pada pewarnaan  dengan  ekstrak  daun  pacar  kuku  bakteri Staphylococcus  aureus lebih  terwarnai  dan  terlihat  jelas dibanding dengan bakteri Esherichia coli yangtidak terwarnai oleh ekstrak daun pacar kuku.
Kata Kunci : Daun pacar kuku, Pewarna penutup, Pewarnaan gram, pH

## The effect of pH on the stability of henna nail leaves as an alternative counterstain to gram staining

## Abstract
Identification  of  gram  staining  bacteria  is  done  by  conventional  or  molecular  methods  microscopically.  Gram staining has the ability to select gram positive bacteria with gram negative bacteria based on their peptidoglycan. Gram staining uses safranin as a covering paint. Safranin is a cation dye that is carcinogenic and causes problems for  the  environment  and  human  health.  Therefore,  it  is  necessary  to  develop  alternative  dyes  from  natural materials that are the same as safranin. Henna nail leaves are phenolic compounds and are included in proteins that  provide  good  coloring  ability.  This  study  aims  to  determine  the  effect  between  pH  variations  and  the stability of henna nail leaves as an alternative counterstain for gram staining and to make new innovations based on natural ingredients for gram staining that are stable and more environmentally friendly. This research method was  conducted  experimentally  with  a  stability  test  to  measure  absorbance.  Furthermore,  after  staining  was observed under a 100x magnification microscope. The results showed that the dye at pH 3 was more stable than the dye at pH 7 and in staining with henna nail leaf extract, Staphylococcus aureus bacteria were more stained and clearly visible than Esherichia coli bacteria which were not stained by henna nail leaf extract.
Keywords : Henna nail , Counterstain, Gram staining, pH
Korespondensi: Sunita Damayanti, Program Studi Sarjana Terapan Teknologi Laboratorium Medis, Universitas „Aisyiyah Yogyakarta, Jl. Ringroad Barat No. 63, Area Sawah, Nogotirto, Kec. Gamping, Kabupaten Sleman, Daerah Istimewah Yogyakarta, mobile 081263854468, email sunitadmn67@gmail.com

## Pendahuluan
Identifikasi  bakteri  dilakukan  dengan metode konvensional atau molekuler.
Identifikasi  konvensional  dapat  dilakukan secara  mikroskopis  melalui  pewarnaan  gram. Peptidoglikan merupakan dasar dalam pewarnaan bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif(Wulandari & Purwaningsih 2019). Pewarnaan gram ialahtahappertamauntuk tindakan  karakterisasidan  klasifikasi  bakteri. Meskipun  teknologi  medis  saat  ini  rumit  dan mahal, metode pewarnaan Gram tetap merupakan  alat  yang  penting  dan  sederhana dalam diagnosis bakteriologis medis. Pewarnaan tersebutmerupakan prosedur penting dalam  mengidentifikasi  bakteri  berdasarkan karakteristik pewarnaan. Pewarnaan gram tetap eksis dan efektif untuk tes diagnostik meskipun telah  ditemukan  satu  abad  lebih  (Harindana dkk, 2021).
Pewarnaan Gram merupakan suatu metode  dimana  organisme  dikelompokkan menjadi  gram  positif  maupungram  negatif. Pengelompokannya  didasarkan  pada  komposisi kimia  dan  integritas  struktural  dinding  sel bakteri.  Pewarnaan  gram  dapat  difaktori  oleh reaksi  dinding  sel  bakteri  terhadap  safranin sertakristal  violet.  Pewarna  yang  digunakan dalam  proses  pewarnaan  gram  dapat  bersifat basa  atau  asam.  Kromofor  yang  merupakan pewarna basa dan bermuatan positif, bertanggung  jawab  untuk  menciptakan  warna. Sebaliknya,  warna  negatif  yang  bermuatan negatif  memberi  warna  karena  adanya  muatan yang berlawanan (Papalanggi, 2023).
Pewarnaan  gram  terdiri  dari  4  jenis pewarnaan sintetik. Menurut Abdulrrahman dkk (2020),  “pewarnaan  gram  A  berwarna  ungu karena  mengandung  kristal  violet,  pewarnaan gram  B  berwarna  coklatmengandung  iodium, pewarnaan  gram  C  tidak  berwarna/bening, pewarnaan gram D berwarna merah mengandung safranin.”
Safranin  merupakan  pigmen  yang  dapat digunakan dalam pewarnaan gram negatif untuk mewarnai  dinding  sel  bakteri,  salah  satunya Escherichia  coli .  Kandungansafranin  adalah antosianin  yang  memberi  warna  merah  pada pewarna safranin. Antosianin merupakan senyawa yang berasal dari polifenol dan banyak ditemukan  pada  tumbuhan.  Senyawa  ini bertanggung  jawab  pada  warna  merah  dalam buah, bunga, dan makanan. Sedangkan menurut Prisma  dkk  (2018),  “Antosianin  ialahpigmen larut dalam air dan dapat berwarna merah, biru dan  ungu  tergantung  pada  kondisi  pH.”
Safranin  merupakan  pewarna  basa  yang  kuat dan  dapat  terwarnai  dengan  baik  jika  jaringan difiksasi  dengan  larutan  Fleming,  namun safraninmudah rusak, sulit disimpan, danproses pewarnaannya lambat. pH yang umum digunakan untuk larutan safranin pada pewarnaan  Gram  adalah  antara  7,2  dan  7,4 (Izzati, 2017).
Safranin  merupakan  pewarna  sintetik yang  sering  digunakan  dalam  pewarnaan  gram untuk  memberi  warna  merah  pada  sediaan. Namun  jumlah  safranin  yang  ada  terbatas karena  harga  safranin  saat  ini  cukup  tinggi, selain  itu  safranin  sulit  disimpan  dan  mudah rusak  jika  terkena  sinar  matahari.  Kelemahan safranin  lainnya  adalah  bersifat  karsinogenik, artinya  zat  yang  dapat  memicu  kanker.  Zat karsinogenik pada pewarna sintetikbisa menimbulkan
permasalahan terhadap
lingkungan dan kesehatan bagi manusia. Karena kelemahan tersebut, maka perlu dicari alternatif pewarna  alami  dari  beberapa  tumbuhan  di Indonesia  yang  dapat  digunakan  sebagai pewarna,  seperti  safranin  (Sa'adah,  2023). Selain  itu  safranin  mempunyai  beberapa kelemahan  lain  yaitu  harganya  yang  mahal, sulit  diserap  pada  sediaan  tertentu,  sulit disimpan  dan  mudah  rusak  (Karlina  dan Rosanty, 2020).
Pewarna sintetis seperti safranin umumnya digunakan dalam pengamatan melalui miskroskop.Safraninmerupakan pewarna  kationik  berbahaya  yang  sering ditemukan  dalam  limbah  pembuatan  kain  serta farmasi.  Safranin  berbahaya  karena  termasuk faktor pusing, sakit kepala, alergi, demam,gangguan pencernaan, gangguan pernapasan,  gangguan  kardiovaskular,  anemia, hingga  masalah  kulit  karena  susah  diuraikan dan memiliki sifat karsinogenik (Dafrita & Sari, 2020).
Oleh  sebab  itu,  untuk  mendapatkan  pH seperti Safranin, dikembangkan pewarna alami. Menurut Zainab dkk (2016) “Lawsonia inermis (daun  pacar  kuku)  yang  memiliki  senyawa flavonoid (apigenin, luteolin, glikosida), kumarin (fraxitin, esculatin, scopoletin), saponin dan tanin di dalamnya” sehingga cocok untuk  dijadikan  pewarna  alami.  Selain  itu menurut  Lestari  (2022),  “Daun  pacar  kuku ( Lawsonia  inermis )  juga  mengandung  glukosa, steroid,  asam  galat,  menitol,  lemak,  resin, protein,  karbohidrat  dan  senyawa  fenolik.” Daun  pacar  kukumemiliki  kandungan  pada pewarna  dasar  Lawson  yaitu  2-hidroksi  serta 1,4-naphthoquinone dengan konsentrasi sebesar 1,0-1,4%,  flavonoid,  kumarin  dan  steroid.  Raja
dkk  (2013)  menemukan  kandungan  senyawa tannin,  glikosida,  flavonoid,  fitosterol,  dan steroiddalam skrining fitokimianya.
Daun  pacar  kuku  termasuk  senyawa fenolik  dan  kandungan  antosianin  yang  tinggi yaitu  500g/L  dengan  kelompok  protein  yang memiliki potensi pewarnaan kategori baik.Septiana  (2015)  mengungkapkan,“daun pacar  kuku  mempunyai  pigmen  warna  yang berbeda-beda  yaitu  kuning  tua,  merah,  merah anggur,  coklat  kemerahan  hingga  coklat”. Selain  itu,  daun  pacar  kuku  belum  banyak dimanfaatkan  di  laboratorium  karena  masih dianggap  sebagai  tanaman  hias  (Niken  dan Yulia, 2023).
Terdapat keterbatasandalam pengaplikasian  pewarna  sintetis  dengan  sifat karsinogenik  serta  membahayakan  lingkungan, maka  diperlukan  pewarna  alternatif  pada pewarnaan  gram  yang  lebih  efektif,  ramah lingkungan  dan  harganya  relatif  lebih  murah. Beberapa  peneliti  terdahulu  telah  meneliti konteks  serupaseperti  Azizah  dan  Syafaatullah (2018) mengatakan,“daun pacar kuku mengandung  lawson  yang  dapat  digunakan dalam  pewarnaan  bakteri  dan  Ektraksi  daun pacar  kuku  dan  daun  tarum  dengan  metode UAE  dari  segi  waktu  lebih  efektif  dan  efisien dari  pada  menggunakan  sokletasi.”Kemudian pada  penelitian  Niken  &  Yulia  (2023) mengatakanpada  pewarnaan  gram,  safranin dapat  digantikan  oleh  ekstrak  dari  daun  pacar kuku.  Faktor  yang  mempengaruhi  kestabilan serta merusak kandungan zat warna daun pacar kuku antara lain pH, oksigen,serta cahaya. Pada penelitian sebelumnya belum dilakukan penelitian  lebih  mendalamtentang  pH  yang berpengaruh  pada  stabilitas  pewarna  ekstrak daun  pacar  kuku.  Berdasarkan  permasalahan tersebut peneliti tertarik untuk meneliti pengaruh variasi pH terhadap stabilitas pewarna ekstrak daun pacar kuku.
Tujuan  penelitian  iniuntuk,  mengetahui pengaruh  variasi  pH  terhadap  stabilitas  daun pacar  kuku  sebagai counterstain alternatif pewarnaan  gram  dan  membuat  inovasi  baru berbahan  dasar  alami  untuk  pewarnaan  gram yang stabil dan lebih ramah lingkungan.

## Metode
Penelitian inimerupakan penelitian eksperimenmenggunakan  perlakuan  dengan variasi  pH  3  dan  pH  7  dan  pengulangan sebanyak  3  kali.  Subjekpenelitian  adalah  daun pacar  kuku  sebagai  alternatif  pewarnaan gram.Lokasi penelitian di Laboratorium
Mikrobiologi Universitas „Aisyiyah Yogyakarta selama bulan
Februari-November 2023.Populasi  pada  penelitian  ini  adalah  daun pacar  kuku  yang  dapat  digunakan  sebagai counterstain alternatif pewarnaan gram. Populasi  ini  mencakup  daun  pacar  kuku  dalam kondisi  segar  dan  berwarna  hijau,  sehingga kualitas ekstrak yang didapatkan baik. Sedangkan sampel penelitian berupa daun pacar kuku  dari  pekarangan  rumah  warga  yang tumbuh daun pacar kuku.
Penelitian  ini  membutuhkan  alat  alat, yaituneraca  analitik,  erlenmeyer,  cincin,  gelas ukur,  mikroskop,  ose  pipet  ukur,  cawan  petri, objeck  glass,  pinset,  rak  pewarnaan,  lampu spiritus,  kuvet,  oven,  spektrofotometer  UV- VIS,  thermometer,  pH  indikator,  bubuk  daun pacar  kuku,  kristal  violet,  lugol,  alkohol, safranin,  kertas  saring  watt  man  No.1,  etanol, aquades,  buffer  sitrat  pH  3  dan  pH  7,  biakan murni bakteri Esherichia coli dan Staphyloccocus aureus .
Prosedur  kerja  penelitianyaitu  tahap pertama  pembuatan  bubuk  ekstrak  daun pacarkuku  dengan  memisahkan  daun  pacar kuku  sebanyak  2,7  kg  dari  tangkainya  dan dioven selama 4 hari di suhu 50°C hingga kadar air  daun  yang  tersisa  <10%  dari  berat basah.Selanjutnya  diblender  hingga  menjadi bubuk.
Tahap  kedua  pembuatan  ekstrak  daun pacar  kuku  yaitu  maserasi  dengan  96%  pelarut ethanol absolut, direndam dalam pelarut selama 4 hari setelah itu dilakukan penyaringan dengan kertas Whatman no.1  untuk  memisahkan maserat  dari  ampasnya.  Hasil  maserat  diupkan dengan hotplate sampai  tersisa  residu  kental daun pacar kuku.
Tahap  ketiga  yaitu  Pengujian  stabilitas pHdilakukan perlakuan dengan variasi pH 3 dan pH  7  dengan  pengulangan  sebanyak  3  kali, dengan  membuat  larutan  pewarna  sebanyak  1 ml  dari  ekstrak  daun  pacar  kuku  yang dilarutkan 30 ml aquadest, kemudian ditambahkan  buffer  sitrat  hingga  mencapai  pH 3 dan pH 7 yang diukur dengan kertas indikator pH.  Seluruh  sampel  diukur  absorbansinya dengan  spektrofotometer  UV-Vis,  kemudian gambar  grafik  hubungan  antara  pH  terhadap absorbansi zat warna.
Tahap  keempat  yaitu  pengecatan  bakteri Esherichia  coli dan Staphylococcus  aureus dengan  metode  pewarnaan  gram.  Sediaan bakteri yang sudah difiksasi kemudian diteteskan larutan kristal violet hingga menutupi  seluruh  kaca  bagian  bakteri  diamkan selama  satu  menit,  dan  bilas  dengan  aquades
hingga  kristal  violet  pada  kaca  hilang.  Setelah itu  teteskan  larutan  lugol  hingga  menutupi seluruh  bakteri  selama  satu  menit  dan bilasdengan  aquades  hingga  lugol  pada  kaca hilang.  Teteskan  larutan  alkohol  sampai  warna luntur  dan  bilas  denganaquades.  Teteskan larutansafranin selama 30 detik sebagai kontrol, sedangkansebagai  percobaan  maka  safranin diganti  dengan  larutanpewarna  dari  ekstrak daun  pacar  kuku  dengan  pH  3  dan  pH  7. Kemudian  keringkan  sediaan,  setelah  kering lakukan pengamatan dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x.
Pengolahan  dan  analisis  data  pada penelitian  ini  berdasarkan  pada  analisis  data hasil  pengujianstabilitas  yang  disajikan  dalam bentuk grafik pengaruh pH terhadap absorbansi ekstrak  daun  pacar  kuku  pada  panjang gelombang600-640 nm.Kemudian hasil pengamatan dilihat dibawah mikroskop
perbesaran  100x  pada  bakteri Esherichia  coli dan Staphylococcus  aureus menggunakan pewarnaan  gram  dengan  ekstrak  daun  pacar kuku dan kontrol safranin.

## Hasil
Pengujian  kestabilan  pHpewarnaan  gram dari zat pewarna ekstrak daun pacar kuku pada pH 3 serta pH 7 dapat dilihat sebagai berikut:

## Gambar 1. Grafik Pengaruh pH Terhadap
Absorbansi Ekstrak Daun Pacar Kuku .
Berdasarkan  gambar  1terjadi  penurunan absorbansi pada pH 3 dan pH 7 sehinggadidapatkan  hasil  zat  warna  pada  pH  3 lebih  stabil  dibanding  dengan  zat  warna  pada pH  7,  semakin  rendah  nilai  pH  maka  warna bakteri akan  semakin  terlihat jelas(Edyani  dkk, 2020).
Tabel 1. Hasil Pewaarnaan Gram dengan Zat Pewarna Ekstrak Daun Pacar Kuku pada Esherichia
coli secara Mikroskopis
Perlakuan Gambar Keterangan Kontrol dengan Safranin Terlihat bakteri berbentuk basil berwarna merah pH 3 Terlihat bakteri berbentuk basil transparan pH 7 Terlihat bakteri berbentukbasil transparan
Tabel 2. Hasil Pewaarnaan Gram dengan Zat Pewarna dari Ekstrak Daun Pacar Kuku pada
Staphylococcus aureus Secara Mikroskopis Perlakuan Gambar Keterangan Kontrol dengan Safranin Terlihat bakteri coccus berwarna ungu pH 3 Terlihat bakteri coccus berwarna biru keunguan pH 7 Terlihat bakteri coccus berwarna biru keunguan
Berdasarkan  table  1  dan  2  didapatkan hasil,  pewarnaan  dengandaun  pacar  kuku bakteri Staphylococcus  aureus lebih  terwarnai dan  terlihat  jelas  dibanding  dengan  bakteri Esherichia  coli yang  terlihat  transparan  dan tidak terwarnai oleh ekstrak daun pacar kuku.

## Pembahasan
Sampel ekstrak daun pacar kuku menghasilkan  bakteri  berwarna  merah  atau jingga  dikarenakan  adanya  zat  lawson  (2- hidroksi, 1,4-naphthoquinone) dengan konsentrasi  1,0-1,4%,  (Supriningrum  dkk, 2018).  Safranin  pada  pewarnaan  gram  dalam pewarnaan bakteri positif dan negatif digunakan sebagai  kontrol  dan  ekstrak  daun  pacar  kuku sebagai counterstain alternatif dibagi menjadi 2 perlakuan pH yaitu pH 3 dan 7.
Untuk  uji  kestabilan  pH  pada  penelitian ini  digunakan  larutan  pewarna  ekstrak  daun pacar kuku dan diukur stabilitasnya menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Pengujian stabilitas menunjukkan adanya penurunan stabilitas dari pH 3 ke pH 7 dengan Panjang  gelombang  antara  600-640  nm.  Daun pacar  kuku  merupakan  pewarna  alami  yang berwarna  kuning  kemerahan  sebagai  hasil diekstraksi. Berlandaskan skala spektral cahaya tampak,  biru  ialah  warna  yang  diserap  dan rentang  panjang  gelombangnya  kurang  lebih 600-640  nm.  Ketika  cahaya  polikromatis mengenai  suatu  zat,  maka  Cahaya  dengan Panjang gelombang tertentu saja lah yang akan diserap.  Menurut  Lashmin  dkk  (2018),jika dalam  zat  menyerap  cahaya  tampak  (visibel) maka  akan  terjadi  perpindahan  elektron  dari keadaan dasar menjadi keadaan tereksitasi.
Pada  penelitian  ini  dapat  dilihat  pada grafik gambar 1. Bahwa terjadi penurunan nilai absorbansi  pH  3  ke  pH7.  pH  3  lebih  stabil dibandingkan  dengan  pH  7  pada  pewarnaan ekstrak  daun  pacar  kuku  sejalan  dengan penelitian  yang  dilakukan  oleh  edyani  dkk (2020), “total antosianin dari ekstrak daun pacar kuku  di  perlakuan  pH  3  tidak  berbeda  dengan kontrol,  sedangkan  di  perlakuan  pH  7  berbeda dengan  kontrol.Hal  ini  menunjukkanantosianin lebih  stabil  dalam  kondisi  asam  dibanding netral  maupun  basa.  Dalam  pH  asam, antosianin  pada  kerangka  garam  flavilium berwarna kemerahan, akan lebih stabil.
Besarnya pH akan menentukan tampak tidaknya serta membirunya warna ekstrasi pada antosianin. Miftahul (2021) berpendapat, stabilitas  antosianin  juga  dapat  mempengaruhi warna.  Stabilitas  antosianin  dipengaruhi  oleh beberapa  faktor  antara  lain  pH,  suhu,  cahaya dan  oksigen  yang  juga  dapat  merusak  warna antosianin pada proses maserasi.
Pada table 1 , selama proses pewarnaan gram, warna  kristal  violet  tidak  dapat dipertahankan  bakteri  gram  negatif Esherichia coli selama  proses  pewarnaan  gram  sehingga
mikroba  berubah  merah.  Bakteri  gram  negatif mempunyai batang berbentuk bulat, oval, lurus, dengan  dinding  sel  tipis.  Menurut  Aruan  & Andreas (2024), “saat proses pewarnaan dengan safranin  bakteri  gram  negatif  akan  menerima pewarna  safranin  yang  hasilnya  tampak berwarna merah.”
Pendapat  Aruan  &  Andreas  berbanding terbalik  dengan  hasil  penelitian  pada  tabel  1 yang menunjukan,“bakteri gram negatif Escherichia coli bakteri tidak terwarnai dengan sempurna  oleh  zat  pewarna  daun  pacar kuku.”Penelitiandifaktorivariable seperti proporsi  konsentrasi  antara  daun  pacar  kuku dan  pelarut  yang  masih  belum  ideal  hingga pencucian  dengan  cairan  yang  terlalu  lama, sehingga  menyebabkan  semua  warna  keluar dari sel bakteri baik pada mikroba gram positif maupun  mikroba  gram  negatif.  Hal  ini  akan menyebabkan kesulitan dalam mengenali kedua jenis  mikroba  tersebut.  pH  yang  tidak  stabil atau waktu yang tidak tepat, strategi pewarnaan dapat  mempengaruhi  hasil  akhir.  Namun berdasarkan  literatur  dari  Edyani  dkk  (2020), bahan  pewarna  alami  yang  paling  efektif digunakan  sebagai  pengganti  safranin  dalam pewarnaan gram negatif adalah daun pacar kuku. Sedangkanpada table 2 bakteri Staphylococcus aureus dapat terlihat lebih jelas morfologinya yaitu berbentuk bulat atau coccus gram  positif,  susunan  sudah  tersebar  tidak bergerombol,  ukuran  07-1.2  µm,  lapang pandang  dan  latar  belakang  jelas,  masih  bisa diidentifikasi  dengan  baik.Pada  bakteri  gram positif Staphylococcus  aureus memiliki  tebal 20-80 nm dan didominasi peptidoglikan dengan ketebalan 2-7 nm. Bentuknya bisa berupa bola, batang  atau  filamen.  Menurut  Koentjoro  & Biotech  (2020),  “bakteri  gram  positif  yang memiliki  dinding  sel  yang  lebih  tebal  daripada bakteri gram negatif sehingga struktur inimemungkinkan bakteri gram positif mempertahankan kristal violet selama pencuciandengan alkohol.”
Menurut  Tyasningrum  (2021),  “daun pacar  kuku  dapat  digunakan  sebagai  pewarna alternatif  dalam  pewarnaan  gram.”  Daun  pacar kuku  mengandung  warna  antosianin,  yang merupakan  tempat  berkumpulnya  flavonoid, senyawa fenol. Senyawa ini memiliki kemiripan dengan  zat  dalam  permata  violet.  Dalam perenungan, organisme mikroskopis Staphylococcus aureus dapat terikat pada warna daun  pacar  kuku  karena  pembatas  selnya, peptidoglikan  dari  mikroba  gram  positif,  dapat mengasimilasi pengaturan dengan pH basa.
Zat warna lawsone pada daun pacar kuku ialah  senyawa  fenolik  dan  termasuk  kelompok protein  dengan  potensi  baik  dalam  pewarnaan yang baik, selain dulu terdapatnya kadar 500g/l antosianin.  Menurut  Septiana  (2015),  “daun pacar  kuku  memiliki  zat  warna  yang  beragam, yaitu  kuning  tua,  merah,  merah  anggur,  coklat kemerahan  hingga  coklat.”  Selain  itu,  daun pacar  kuku  belum  banyak  digunakan  di laboratorium  karena  masih  dianggap  sebagai tanaman hias (Ratnawati dkk, 2018).
Kesimpulan  penelitian  ini  ialah  estrak daun  pacar  kuku  dapat  digunakan  sebagai pewarna
penutup safranin dalam pewarnaangram.Pada bakteri Eschericia coli dengan ekstrak daun pacar kuku mendapatkan  hasil  pewarnaan  yang  tidak kontras  terhadap  sel  bakteri.  Sedangkan  pada pewarnaan gram bakteri Staphylococcus aureus dengan  ekstrak  daun  pacar  kuku  didapatkan hasil  pewarnaan  kontras  yang  membedakan dengan sel bakteri di dalam media. Dan pada uji kestabilan  ekstrak  daun  pacar  kuku  pada  pH  3 lebih  stabil  dibandingkan  pH  7,  yang  ditandai dengan penurunan absorbansi pada pH 7.
Saran  penelitian  ini  ialahmenambah beberapa  variabel  penelitian,  yaitu:  variasi konsentrasi,  lama  penyimpanan  dan  suhu.  Dan dapat  dilakukan  pembuatan  daun  pacar  kuku dengan  metode  selain  maserasi  agar  hasil  yang didapat lebih sempurna.

## Daftar Pustaka
Abdulrrahman,  S.,  Shaleh,  A.,  &  Adriana,  F. (2020).  Pengaruh  Variasi  Konsentrasi
Esktrak Bunga Kembang Sepatu ( Hibiscus  Rosa-Sinensis L.)  Dan  Daun Miana  ( Coleus  Atropurpureus  Benth ) Sebagai Zat Pewarna Alternatif Pengganti  Safranin  Pada  Pewarnaan Gram. Jurnal MediLab Mandala Waluya , 4 (I), 1-7.
Aruan,  M.,  &  Andareas,  P.  (2024). Teknik Dasar Dalam Bakteriologi . Media
Pustaka Indo.
Azizah,  N.,  &  Syafaatullah,  A.  Q.  (2018). Ekstraksi  Zat  Warna  Alami  dari  Daun Pacar  Kuku  ( Lawsonia  inermis )  dan Daun Tarum ( Indigofera tinctoria )
dengan  Metode  Ultrasound  Assisted Extraction  (Doctoral  dissertation,  Institut Teknologi Sepuluh Nopember).
Dafrita, I. E., & Sari, M. (2020). Senduduk dan ubi  jalar  ungu  sebagai  pewarna  preparat squash akar bawang merah. JPBIO (Jurnal Pendidikan Biologi) , 5 (1), 46-55.
Edyani,  J.  S.,  Widyantara,  A.  B.,  &  Novalina,
D. (2020). Systematic Review: Pemanfaatan  Bahan  Alami  Sebagai Pewarna  Alternatif  Pengganti  Safranin Pada Pewarnaan Gram (Doctoral dissertation, Universitas „Aisyiyah
Yogyakarta).
Harindana, P. Y. A., Iswari, I. S., Setyojatmiko, I.,  &  Fatmawati,  N.  N.  D.  (2021). Kesesuaian  pewarnaan  gram  dengan kultur darah sebagai prediktor nilai kritis kasus bakteremia di Rumah Sakit Umum Pusat  Sanglah,  Denpasar. Intisari  Sains Medis , 12(2), 494-499.
Izzati,  M.  (2017).  Kualitas  Preparat  Mitosis Allium  cepa  Menggunakan  Pewarna Ekstrak  Kulit  Buah  Naga  Merah  dengan Pelarut  Akuades  dan  Asam  Sitrat  10%.
Skripsi . Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Karlina, P., & Rosanty, A. (2020). Pemanfaatan Sari  Buah  Pinang  (Areca  catechu  L) Sebagai  Alternative  Pewarnaan  Gram Pengganti Safranin (Doctoral dissertation, Poltekkes Kemenkes Kendari).
Koentjoro,  M.  P.,  &  Biotech,  M.  (2020).
Dinamika  Struktur  Dinding  Sel  Bakteri.
Jakad Media Publishing.
Lahsmin,  Y.  K.,  Iswadi,  I.,  Aisyah,  A.,  &
Rahmaniah, R. (2018). Pengaruh Konsentrasi  Pigmen  Warna  dari  Daun Pacar  Kuku  (Lawsonia  Inermis  L.) Terhadap  Efisiensi  Dye  Sensitized  Solar Cell (DSSC). Teknosains: Media Informasi Sains dan Teknologi , 12 (2).
Lestari,  W.  (2022). Pengaruh  Konsentrasi Ekstrak  Daun  Pacar  Kuku  (Lawsonia inermis  Linn)  Terhadap  Pertumbuhan Jamur  Malassezia  furfur  Sebagai  Bahan
Ajar Mikologi Dalam Bentuk Booklet (Doctoraldissertation, Universitas Jambi).
Miftahul,  K.  (2021). Identifikasi  Ekstrak  Ubi Jalar  Ungu  (Ipomea  Batatas  Poiret) Sebagai  Zat  Pewarna  Alternatif  Pada Pewarnaan  Gram (Doctoral  dissertation, Universitas Perintis Indonesia).
Niken,  N.,  &  Yulia,  I.  (2023).  Innovation  of extract  (Lawsonia  Inermis  L)  as  an alternative  dye  for Escherichia  coli bacterial  staining. International  Journal of  Multidisciplinary  Approach  Research and Science , 1 (03), 512-517.
Papalanggi,  K.  M.  (2023). Pengaruh  Perbedaan Variasi  Waktu  Rendaman  Daun  Bayam Merah  ( Amaranthus  tricolor  L.) Sebagai Alternatif  Pewarna  Pengganti  Safranin Pada  Pemeriksaan  Bakteri Escherichia coli (Doctoral  dissertation,  Politeknik 'Aisyiyah Pontianak).
Ratnawati,  D.,  Maryanti,  E.,  &  Sentani,  A.  M. 2018. Application  of  henna  leaf  extract (Lawsonia  Inermis  L)  as  a  preservative and dye natural Tofu. Gradient Journal, 8(1), 739-745.
Sa'adah,  A.  (2023). Pengaruh  Variasi  Wakyu Rendaman  Bunga  Rosella  (Hibiscus sabdariffa L.) Sebagai Pewarna Alternatif  Pengganti  Safranin (Doctoral dissertation, Politeknik 'Aisyiyah Pontianak). Setiana, Shella. 2015. The Effect of Concentrationof  Mordant  Lime  with Dyes of Dried Girlfriend Leaves
( Lawsonia Inermis L ) on Staining of Knit
Cotton  Fabrics  Using  the  Tie  Dye Technique. Journal  of  S1  Dressmaking , Vol. 4, No. 3.
Supriningrum, R., Fatimah, N., & Wahyuni, N.
R.,  2018. Determination  of  Flavonoid Levels  of  Ethanol  Extract  of  Girlfriend
Leaves  (Lawsonia  inermis  L.)  based  on Differences in Drying
Methods. Manuntung  Scientific  Journal,4(2), 156- 161 .
Tyasningrum,  N.  P.  (2021).  Ekstraksi  dan  Uji Stabilitas  Zat  Warna  Alami  Daun  Pacar
Kuku (Lawsonia inermis L.).
Wulandari,  D.,  &  Purwaningsih,  D.  (2019). Identifikasi  dan  karakterisasi  bakteri amilolitik pada umbi Colocasia esculenta
L.  secara  morfologi,  biokimia,  dan molekuler. Jurnal  Bioteknologi  dan Biosains Indonesia, 6(2), 247- 258.
Zainab, Sulistyani, & Nanik. (2016). Penetapan Parameter Standarisasi Non Spesifik Dan Spesifik Ekstrak Determination OfNon Specific And Specific Standardization Parameter Of Henna (Lawsonia inermis L .) Leaves Extract. Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan , 13, 212–226