## INSERSI GEN pncA KE DALAM PLASMID
pGEM-T

## Eli Hendrik Sanjaya
Jurusan Kimia, FMIPA Universitas Negeri Malang email: eli.hendrik.fmipa@um.ac.id
Received 3 Juli 2016 Accepted 30 November 2016

## Abstrak
Multidrug-resistant  tuberculosis  (MDR-TB) merupakan  sesuatu  yang  paling  berbahaya  di antara kasus pandemik resistensi terhadap antibiotik. Sebagai obat lini pertama, pirazinamida sering dipakai untuk mengobati pasien TB sehingga semakin banyak pula kasus TB resisten terhadap  pirazinamida.  Penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa  isolat  L20  MDR-TB mengalami  mutasi  T539C.  Mutasi  tersebut  dimungkinkan  sebagai  penyebab  resistensi  pada level  genetik.  Untuk  memastikan  mekanisme  resistensi  tersebut,  harus  didapatkan  PZAse murni kemudian dikristalisasi dan ditentukan struktur Kristal 3D-nya menggunakan defraksi sinar X. Langkah pertama untuk mendapatkan PZAse murni adalah melakukan kloning gen pncA  ke  plasmid  pGEM-T.  Prosedur  untuk  melakukan  kloning  tersebut  adalah  amplifikasi, insersi  gen  pncA  ke  plasmid  pGEM-T,  dan  transformasi  melalui  seleksi  koloni  biru putih.Langkah  terakhir  adalah  isolasi  plasmid  rekombinan  (pGEM-T-pncA)  diikuti  dengan elektroforesis.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  gen  pncA  isolat  L20  telah  berhasil diinsersi  ke  plasmid  pGEM-T.  Hal  ini  ditunjukkan  pada  hasil  seleksi  koloni  biru  putih  dan hasil  elekteroforesis  plasmid  rekombinan.  Elektroforegram  menunjukkan  bahwa  panjang plasmid  rekombinan  pGEM-T-pncA  dari  koloni  putih  lebih  panjang  sekitar  0,7  kb dibandingkan plasmid kontrol pGEM-T. Perbedaan ini sama dengan panjang gen pncA yang diinsersikan (0,72 kb).
Kata kunci: kloning, pGEM-T, gen pncA, pirazinamida (PZA)

## Abstract
Multidrug-resistant  tuberculosis  (MDR-TB)  is  among  the  most  worrisome  elements  of  the pandemic of  antibiotic resistance. As the first line drug, pyrazinamide is often used to treat TB desease so there are many case of TB resistant to pyrazinamide. The previous research show that pncA gene of isolate L20 MDR-TB have mutated T539C. That mutation propose as the cause of resistance M. tuberculosis to pyrazimanide at the genetic level. For make sure the resistance mechanism, we have to get the pure PZAse and then crystallize it, and the 3D structure can be determined by X-ray defraction. The first step to get pure PZAse is cloning the pncA gene to the plasmid. The aim of this research is to know that is the pncA gene can be cloned to pGEM-T plasmid. The prosedure for cloning the pncA gene to the pGEM-T plasmid is  amplification,  follow-ed  by  insert  the  pncA  gene  to  the  pGEM-T  plasmid,  and transformation  by  a  selection  of  blue  and  white  colony.  The  last  step  are  isolation  of recombinantplasmid (pGEM-T-pncA) followed by electrophoresis. The result of the research showed that pncA gene from isolate L20 was successfully cloned to pGEM-T plasmid. It was showed  on  blue  and  white  colony  and  the  result  of  isolation  and  electrophoresis  pGEM-T- pncA. The electrophoregram showed that the length of pGEM-T-pncA from white colony is
different with pGEM-T standart abaut 0,7 kb. It is similar with the length of pncA gene (0,72 kb).
Keywords: cloning, pGEM-T, pncA gene, pyrazinamide ( PZA )

## Pendahuluan
Tuberkulosis  (TB)  masih  merupakan masalah  kesehatan  masyarakat  yang menjadi  tantangan  global.  Saat  ini Indonesia  telah  turun  dari  urutan  ketiga menjadi urutan kelima negara dengan beban TB  tertinggi  di  dunia.  Meskipun  program pengendalian  TB  nasional  telah  berhasil mencapai  target  MDG,  akan  tetapi penatalaksanaan  TB  terutama  di  sebagian besar  rumah  sakit,  klinik  dan  praktek swasta belum sesuai dengan strategi DOTS atau-pun standar pelayanan sesuai International  Standards  for  Tuberculosis Care (ISTC).  Demikian  pula  ketersediaan fasilitas  laboratorium,  penerapan  standar pencegahan  infeksi  nosokomial  serta kolaborasi  TB-HIV  yang  belum  optimal berkontribusi
terhadap munculnya tantangan  TB  resisten  obat  terutama multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) di Indonesia (Utarini, A. dkk., 2011).
MDR-TB  merupakan  hal  yang  paling berbahaya  pada  pasien  penderita  TB  yang resisten  antibiotik.  Resistensi  TB  terhadap antibiotik  biasanya  disebabkan  oleh kegagalan  menyelesaikan  kemoterapi  de- ngan penanganan dan kombinasi obat yang tepat  (Dye,  C.  &  Williams,  B.B.,  2000). Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  sejak tahun  1990-an,  MDR-TB  di  Haiti  terus meningkat.  Tidak  kurang  dari  1,0%  pen- derita  TB  baru  merupakan  TB  resisten terhadap  isoniazid  and  rifampisin.  Hal serupa terjadi di Republik Dominika, 10,2% dari  total  kasus  TB  adalah  MDR-TB  dan 6,6%  MDR-TB  dari  kasus  TB  baru (Ocheretina et.al. , 2012). Beberapa  negara  maju  telah  berhasil mengeliminasi  TB  tetapi  resiko  TB  tetap ada  disebabkan  oleh  adanya  imigran  yang berpotensi  membawa  kuman  TB.  Setelah kemoterapi selesai dan pasien sembuh maka pasien  masih  memiliki  TB  laten.  Sekitar 10% pasien TB laten akan menjadi TB aktif
kembali  (Kenyorini  dkk.,  2006).  TB  laten akan  menjadi  aktif  kembali  ketika  daya tahan tubuh pasien tersebut lemah.
Pada  tahun  2012,  Direktur  ECDC menyatakan  bahwa  tingkat  resiko  orang- orang  eropa  terjangkit  TB  meningkat. Memerangi TB semakin sulit karena selain sulit  didiagnosa,  TB  juga  sulit  ditangani. Gejala klasik dari TB yang pertama adalah mudah  kecapekan,  demam,  dan  batuk. Padahal gejala-gejala tersebut juga merupakan  gejala  yang  sama  untuk beberapa  penyakit  yang  lainnya.  Untuk memastikan  bahwa  pasien  terkena  TB adalah  melakukan  tes  dengan  cara mengirim sampel spuntum ke laboratorium dengan  peralatan  dan  keahlian  yang  tepat. Apabila peralatan dan keahlian laboratorium  kurang  memadai  maka  hasil diagnosa  bisa  salah  ataupun  terlambat  se- hingga  TB  bisa  menyebar.  Hasil  analisis genotipe  menunjukkan  bahwa  beberapa kasus  resistensi  TB  terhadap  antibiotik disebabkan  oleh  adanya  mutasi  gen sehingga  protein  target  menjadi  tidak  aktif kembali  terhadap  antibiotik  (Gillespie, 2002).  Akan  tetapi,  meskipun  mutasi  pada gen  yang  menjadi  target  obat  dipercaya menjadi  mekasnisme  primer  terjadinya resistensi,  mekanisme  tersebut  tidak  bisa menjadi  mekanisme  tunggal  (Motiwala et al ., 2010). The  Broad  Institute KZN  XDR sequencing  project menemukan  bahwa terjadi mutasi pada MDR-XDR tetapi tidak bisa  digeneralisasi  bahwa  mutasi  pada MDR  terjadi  secara  spesifik  (Gupta et  al. , 2010). Menurut Motiwala, et al., 2010, ada mekanisme  alternatif,  yaitu efflux  pumps . Efflux  pumps merupakan  kemampuan protein membran plasma untuk mengeluarkan berbagai macam antimikroba dari  dalam  sel  sehingga  antimikroba  bisa bekerja  untuk  mematikan  mikroba.  Salah satu  gene  yang  mengkode  protein  yang
berfungsi sebagai efflux pumps adalah efpA (Rv2846c). Gen efpA (Rv2846c) mengkode protein efflux pumps terhadap INH.
Indonesia  merupakan  salah  satu  negara dengan  kasus  TB  yang  sangat  tinggi. Seperti di negara yang lainnya di dunia, sala satu obat yang dipakai di Indonesia adalah pirazinamida.  Dengan  demikian  kasus resistensi M. tuberculosis terhadap pirazinamida  juga  banyak  terjadi.  Hasil penelitian  yang  menunjukkan  bahwa resistensi M.  tuberculosis terhadap  pi- razimanida  dapat  disebabkan  oleh  adanya mutasi  pada  gen pncA .  Hasil  riset menunjukkan adanya mutasi pada gen pncA T539C  isolat  L20 MDR - M.  tuberculosis yang  diduga  menjadi  penyebab  resistensi M.  tuberculosis terhadap  pirazinamid  pada tingkat genotipe (Sanjaya, 2012).
Mutasi substitusi T539C mengakibatkan terjadinya  perubahan  residu  asam  amino penyusun  pirazinamidase  pada  posisi  ke- 180, yaitu dari valin menjadi alanin. Asam amino valin dan serin sama-sama memiliki rantai  samping  nonpolar  alifatik.  Rantai samping  valin  berupa  gugus  isopropil sedangkan  pada  alanin  metil.  Perbedaan rantai  samping  ini  dimungkinkan  tidak mengubah  struktur  3D  protein  pi- razinamidase secara signifikan dan mengubah  aktivitasnya  karena  selain  letak perubahan  asam  amino  jauh  dari  daerah pusat  katalitik,  sifat  kedua  asam  amino tersebut sama-sama non polar. Akan tetapi, hal  ini  harus  diuji  secara  eksperimen. Informasi  mengenai  residu  katalitik PZA se dan  mekanisme  reaksi PZA se  sangat diperlukan  untuk  kajian  resistensi M. tuberculosis terhadap PZA .  Selain  itu, analisis  efek  perubahan  asam-asam  amino pada
PZA se terhadap aktivitas enzimatiknya  juga  diperlukan  untuk mengetahui penyebab resistensi M.
tuberculosis terhadap PZA .
Resistensi  memang  menjadi  masalah yang  sangat  sulit,  akan  tetapi  setelah ditemukannya metode kloning dan penentuan  struktur  3D  protein,  pembuatan obat  menjadi  lebih  terarah,  spesifik,  dan efektif.  Untuk  mengetahui  penyebab  sifat
resistensi suatu obat dapat diketahui dengan cara menentukan struktur 3D protein target dari  obat  tersebut.  Gen pncA merupakan target dari obat pirazimamida (Mathema, et al. ,  2006).  Pada M.  tuberculosis gen pncA diekspresikan
menjadi enzim
pirazinamidase.  Pirazinamidase  merupakan target  dari  pirazinamida.  Dengan  demikian untuk  mendeteksi  apakah M.  tuberculosis resisten  terhadap  pirazinamida  atau  tidak dapat  dilakukan  dengan  cara  uji  genotipe pada  gen pnca .  Kemudian  dapat  dianalisis dengan  cara  membandingkan  dengan urutan nukleotida gen pnca pada M. tuber- culosis strain  H37Rv  ( wild  type ).  Tahap berikutnya  dianalisis  pada  tingkat  urutan asam amino dan protein.
Pada  tingkatan  yang  lebih  tinggi  adalah desain  obat.  Desain  obat  perlu  dilakukan analisis  protein  target  obat.  Apabila M. tuberculosis resisten terhadap pirazinamida maka  perlu dilakukan analisis struktur 3D enzim  pirazinamidase.  Dengan  demikian berdasarkan  analisis  sisi  aktifnnya  dapat dilakukan  desain  obat.  Untuk  analisis struktur  3D  suatu  protein  diperlukan produksi protein yang dapat diawali dengan melakukan kloning gen pncA melalui teknik DNA  rekombinan.  Permasalahan  dalam penelitian ini adalah apakah gen pncA Isolat L20 MDR- M. tuberculosis resisten pirazinamid  dapat  diinsersikan  ke  dalam plasmid  pGEM-T  melalui  teknik  DNA rekombinan.
Penelitian yang melibatkan rekombinasi DNA  sudah  dilakukan  sejak  tahun  1946 oleh  Ledderberg  dan  Tatum.  Teknologi DNA  rekombinan  atau  rekayasa  genetika merupakan  suatu  metode  yang  dilakukan untuk  memanipulasi  DNA  suatu  makhluk hidup  tertentu  guna  memperoleh  sifat-sifat tertentu  dalam  organisme  tersebut.  Pada umumnya dalam teknologi DNA rekombinan, peneliti berusaha
menambahkan  sifat-sifat  unggul  ke  dalam suatu  organisme,  sehingga  diharapkan menjadi  organisme  yang  menguntungkan kehidupan  manusia  (Susanti  dan  Ariani, 2004).
Ada  empat  komponen  penting  yang harus ada pada saat melakukan rekombinasi DNA,  yaitu  enzim  restriksi,  vektor,  enzim ligase dan gen target yang akan diinsersikan ke  vektor.  Gen  target  dan  vektor  harus memiliki  sisi  pemotongan  yang  sama sehingga fragmen gen target bisa masuk ke dalam vektor. Selain itu, enzim yang dipilih harus memotong pada satu sisi pemotongan saja,  kecuali  bila  ujung-ujung  gen  target dipotong  oleh  enzim  yang  sama  sehingga fragmen  gen  yang  bisa  masuk  ke  vektor adalah fragmen yang diinginkan.
Apabila  gen  target  berasal  dari  hasil amplifikasi  menggunakan  proses  PCR maka  sebelum  diinsersi  ke  vektor  ekspresi maka  harus  diinsersikan  ke  vektor  kloning seperti pGEM-T atau pJET. Hasil PCR bisa diligasi ke vektor pGEM-T secara langsung karena  hasil  PCR  urutan  nuleotidanya memiliki  ujung-ujung  basa  A,  sedangkan pGEM-T  ujung-ujungnya  memiliki  urutan nukleotida  T.  Hasil  PCR  akan  bergabung dengan vektor pGEM-T membentuk vektor rekombinan. Peta vektor pGEM-T diperlihatkan pada Gambar 1.
Gambar  1. Peta  vektor  pGEM-T.  Vektor pGEM-T  memiliki  panjang  3000  bp  yang memiliki  beberapa  sisi  pemotongan  enzim (Promega, 2009).
Seleksi  plasmid  rekombinan  hasil  ligasi dilakukan melalui seleksi koloni biru putih, hasil  ligasi  ditransformasi  terlebih  dahulu ke  sel  inang  ( host ) E.  coli  top10’F yang kemudian  ditumbuhkan  di  media  LB  + Ampisilin  yang  telah  di  beri  IPTG  dan  X- Gal. E.  coli  top10’F yang  telah
tertransformasi  dapat  tumbuh  membentuk koloni  biru  dan  putih.  Pada  proses  ligasi, fragmen  hasil  PCR  yang  ujung-ujungnya memiliki  basa  A  akan  masuk  ke  pGEM-T yang  memiliki  ujung  basa  T.  Daerah pGEM-T yang dimasuki ini merupakan gen lacZ yang me-ngode enzim β -galaktosidase yang dapat merubah warna medium X-Gal menjadi  berwarna  biru.  Apabila  gen lacZ ini  terinsersi  maka  enzim β -ga-laktosidase tidak dapat dihasilkan. Dengan demikian E. coli  top10’F yang  membawa  plasmid pGEM-T  yang  terinsersi  dengan  fragmen hasil  PCR  akan  membentuk  koloni  putih, sedangkan E. coli top10’F yang membawa plasmid pGEM-T yang tidak terinsersi akan membentuk koloni biru.

## Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Peralatan  yang  dipakai  pada  penelitian ini  adalah  cawan  petri,  gelas  beaker,  gelas ukur,  erlenmeyer,  labu  takar,  botol  reagen, pipet  mikrobeserta  tip  pipet  mikro  ukuran 2,5  µL,  10  µL,  100  µL,  dan  1000  µL, tabung mikro ukuran 500 µL dan 1500 µL, vortex , spatula, kaki tiga, kasa dan bunsen. Peralatan  lain  yang  digunakan  adalah  alat pengukur  massa,  yaitu  neraca  analitik digital Explorer ( Ohaus ,  AS), Autoclave Electric  Presure  Steam  Sterilized , shaker incubator , deep  freezer ,  alat  PCR, elektroforesis  gel  agarosa,  lampu  UV dengan  panjang  gelombang  312  nm,  dan kamera digital.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bahan pembuatan media tanam mikroba  untuk  keperluan  kloning  (tripton 1% (b/v), ekstrak ragi 0,5% (b/v), NaCl 1% (b/v),  bakto  agar  2%  (b/v),    dH 2 O, antibiotik ampisilin 0,01% (b/v), X-Gal 5% (b/v),  IPTG  1%  (b/v),  CaCl 2 0,1  M,  2µL pellet  paint ,  NaAc  3M,  etanol  100%  p.a., dan  ddH 2 O  steril);  bahan  untuk  proses elektroforesis  (gel  agarosa  1,5%  (b/v),    10 mg  mL -1 EtBr,  bufer  TAE  dan loading buffer ,dan  penanda  (marker)  pada  gel elektroforesis  digunakan  plasmid  pUC19/ HinfI 300  ng  µL -1 );  dan  bahan  untuk keperluan  insersi  gen pncA ke  plasmid
pGEM-T  ( pGEM-T  Vector  Assay (Merck),
T4 DNA ligase, dan 2x rapid bufer ligasi). Ada  beberapa  tahapan  penelitian  yang dilakukan  pada  proses  kloning,  diawali dengan  amplifikasi  dengan  mesin  PCR untuk  keperluan  insersi  fragmen  gen pncA ke  vektor  pGEM-T.  Ujung  5’  dan  3’  hasil PCR mengandung basa A sedangkan vektor pGEM-T  ujung  5’  dan  3’  adalah  basa  T maka  hasil  PCR  bisa  langsung  diligasi  ke pGEM-T.  Berikut  ini  beberapa  prosedur preparasi untuk keperluan proses kloning.

## Prosedur Penelitian Pembuatan Media LB
Media  LB  cair  dibuat  dengan  cara mencampurkan  tripton  1%  (b/v),  ekstrak ragi 0,5% (b/v), NaCl 1% (b/v), bakto agar 2%  (b/v)  dan  H 2 O.  Campuran  disterilkan dengan autoclave pada temperature 110 o C selama  15  menit.  Setelah  itu,  media dituangkan  ke  dalam  cawan  petri  steril secara  aseptik.  Media  dibiarkan  hingga menjadi  padat,  kemudian  dapat  langsung digunakan  atau  disimpan  pada  temperatur 4°C  tetapi  harus  diinkubasi  pada  37 o C sebelum  digunakan.  Media  LB  cair  dibuat dengan  metoda  yang  sama  dengan pembuatan  media  padat  tetapi  tanpa penambahan bakto agar.
Pembuatan  Media  LB  Padat/Amp  dan  LB Padat/ Amp/X
Metode pembuatan media LB
Padat/Amp  dan  LB  Padat/Amp/X  adalah dengan  cara  yang  hampir  sama  dengan pembuatan  media  LB  padat  tetapi  ada penambahan  reagen  lain  seperti  ampisilin dan  X-Gal.  Media  LB  padat/Amp ditambahkan  antibiotik  ampisilin  0,01%
(b/v),  dapat  dilakukan  dengan  cara  men- campurnya  sesaat  sebelum  media  dituang (hangat) atau disebarkan dengan merata ke atas  permukaan  media  yang  sudah  padat. Sedangkan  pada  media  LB  padat/Amp/X- Gal/IPTG  dibuat  dengan  cara  yang  sama dengan  pembuatan  media  LB  padat/Amp tetapi ditambahkan dengan X-Gal 5% (b/v) dan IPTG 1% (b/v) dengan cara disebarkan di  atas  permukaan  media  LB  padat  yang
sudah mengeras. Penambahan ini dilakukan 30 menit sebelum media ini digunakan.
Pembuatan Media LB Cair/Amp
Pembuatan media LB cair/Amp dilakukan  dengan  cara  yang  sama  dengan metode pembuatan media LB cair tetapi ada penambahan ampisilin 0,01% setelah media LB cair disterilkan.

## Peremajaan Bakteri E. coli Top10 F’ pada Media Padat
Mengambil koloni tunggal E. coli Top10 F’ pada  media  padat  sebelumnya menggunakan jarum ose kemudian digoreskan pada media LB padat yang baru secara  aseptik.  Kemudian  kultur  bakteri diinkubasi pada suhu 37 o C selama 18 jam. Peremajaan  dari  stok  gliserol  dilakukan dengan cara mengambil sebanyak 30 µL sel kemudian  di- spread pada  media  LB  padat dengan  menggunakan  batang  L.  Setelah inkubasi  selama  18  jam,  kultur  disimpan suhu 4 o C.
Pembuatan Kultur E. coli Top10 F’ Kultur E.  coli  Top10  F’ dibuat  dengan cara  mengambil  koloni  tunggal E.  coli Top10  F’ dari  media  LB  padat  dan menumbuhkannya  pada  media  LB  cair  5 mL  secara  aseptik.  Kemudian  kultur diinkubasi  pada  suhu  37°C  dan  150  rpm selama 18 jam ( overnight ). Kultur ini dapat langsung  digunakan  atau  disimpan  pada temperatur 4°C.
Penyiapan Sel Kompeten E. coli Top10 F’ dengan CaCl 2 Sel E.  coli  Top10  F’ kompeten  dibuat dengan  cara  menumbuhkan  kembali  0,25 mL  inokulum overnight  culture yang  telah dibuat sebelumnya di dalam 25 mL LB cair, diinkubasi selama 2-3 jam pada 37° C dan 150  rpm  hingga  OD 600 mencapai  0,4-0,6.
Kultur sel dipindah ke tabung sentrifuga 60 mL,  diamkan  dalam  es  selama  30  menit, sentrifuga  pada  4°C,  4.000  rpm  (2.700g) selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet dicuci  dengan  5  mL  CaCl 2 0,1  M  (dingin dan steril), diamkan di es selama 10 menit, kemudian disentrifuga lagi pada 4°C, 4000 rpm (2.700 g) selama 10 menit. Supernatan
dibuang  dan  pellet  diresuspensi  dengan  1 mL  CaCl 2 0,1  M  (dingin  dan  steril), aliquote 100 µ L  dan  simpan  kultur  pada 4°C  selama  2-24  jam.  Sel  kompeten  siap dipakai untuk transformasi.

## Ligasi Sel
Hasil amplifikasi bisa langsung diligasi,
tetapi  sebaiknya  dimurnikan  terlebih dahulu. Fragmen hasil amplifikasi ditambahkan 2µL pellet paint , 1/10 volume NaAc  3M,  2  volume  etanol  100%  p.a. Dicampur  hingga  homogen,  inkubasi  pada temperatur  ruang  selama  2  menit. Kemudian  sentrifuga  dengan  kecepatan 13000  rpm  selama  15  menit.  Supernatan dibuang,  pellet  dicuci  dengan  etanol  70% dan sentrifuga pada 13000 selama 15 menit. Supernatan  dibuang  dengan  cara  dekantasi dan  pelet  dikeringkan  dengan  cara  mem- buka  tutup  tabung microcentrifuge dan dibiarkan  hingga  tidak  berbau  etanol  (bisa di  suhu  ruang  atau  37 o C).  Kemudian ditambahkan  5  µL  H 2 O  pada  pellet  DNA dan  diresuspensi  hingga  pelet  DNA  larut. Fragmen  DNA  siap  diligasi.  Akan  tetapi pada  penelitian  ini  hasil  PCR  langsung diligasi tanpa proses pemurnian. Komposisi komponen-komponen  yang  diperlukan untuk proses ligasi dapat dilihat pada Tabel 1.
.
Tabel 1. Komposisi komponen-komponen yang diperlukan untuk proses ligasi (Promega, 2008)
No. Komponen Sampel Kontrol Positif Kontrol Negatif 1 2x rapid ligation buffer 5 µ L 5 µ L 5 µ L 2 pGEM-T 1 µ L 1 µ L 1 µ L 3 Produk PCR X µ L - - 4 Control DNA insert - 2 µ L - 5 T 4 DNA ligase (3 Weiss Unit/µL) 1 µ L 1 µ L 1 µ L
6 Deionized water hingga volume total 10 µ L 10 µ L 10 µ L
Hasil  yang  didapatkan  pada  saat  PCR dipekatkan  menggunakan  alat freeze  dry agar konsentrasi yang diperoleh mencukupi untuk  1x  reaksi  ligasi.  Sebanyak  10  µL
master  mix untuk  ligasi  diperoleh  dengan mencampurkan  5  µL  2x rapid  ligation buffer ,  50  ng  vektor  pGEM-T,  1  µL  T4 DNA  Ligase  (3  Weiss  unit/µL)  dan  3µL hasil PCR. Semua komponen dicampurkan dengan  memipet  pada  suhu  ruang  dan diinkubasi  pada  suhu  4°C  selama  12  jam. Untuk  menganalisa  gen pncA sudah terinsersi  ke  dalam  pGEM-T  atau  belum dilakukan proses gel elektroforesis. Jumlah hasil  PCR  yang  diperlukan  untuk  proses ligasi  dihitung  dengan  menggunakan persamaan berikut: Jumlah hasil PCR (ng) =
Massa vektor (ng) x ukuran DNA sisipan (kb)
Ukuran vektor (kb) x ratio molar vektor sisipan DNA

## Transformasi dengan Metode Heat Shock
Transformasi  dilakukan  dengan  cara memasukkan  100  µL  sel E.coli Top10  F’ kompeten  ke  dalam  tabung  1,5  mL  dingin dan  ditambahkan  2  µL  hasil  ligasi. Kemudian campuran diinkubasi di dalam es selama  30  menit. Heat  shock dilakukan dengan  inkubasi  pada  suhu  42  °C  selama 60-90  detik  dilanjutkan  inkubasi  di  dalam es  selama  2  menit.  Sel  diresuspensi  dan ditambahkan  900  µL  media  LB  cair, kemudian  diinkubasi  pada  37°C,  150  rpm selama 1-2 jam. Suspensi disentrifuga pada 4°C, 12.000 rpm selama 2 menit. Pelet sel diresuspensi  dengan  media  LB  cair  yang tersisa,  kemudian  disebarkan  pada  media LB padat/Amp/X-Gal/ IPTG dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 18 jam. Koloni biru dan putih yang tumbuh diamati.

## Skrining
Skrining dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan koloni putih yang mengandung  sisipan  dan false  positive . Koloni  putih  ditumbuhkan  untuk  diisolasi plasmidnya menggunakan metode miniprep .  Hasil  isolasi  plasmid  dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa. Sedangkan  untuk  mengetahui  ukuran plasmid rekombinan dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi yang bisa memotong satu sisi pemotongan pada plasmid tersebut. Pada penelitian ini memakai enzim restriksi
NdeI .  Setelah  diketahui  ukuran  plasmid rekombinan  sesuai  dengan  yang  di- harapkan,  maka  dilakukan  isolasi  plasmid rekombinan  memakai  Kit  isolasi  plasmid produksi Geneaid.

## Isolasi Plasmid Hasil Rekombinasi
Isolasi plasmid metode miniprep diawali dengan membuat 3-5 mL overnight culture , diambil  1  mL  dan  masukkan  pada  tabung mikro 1,5 mL, sentrifuga pada 12.000 rpm selama  30  detik.  Pellet  yang  dihasilkan diresuspensi dengan 500 µL buffer STE dan dihomogenkan dengan cara vortex , disentrifuga  pada  10.000  rpm  selama  30 detik,  ditambahkan  300  µL  larutan  A (glukosa 17 mM, Tris-Cl 8 mM pH 8, liso- zim  2  mg/mL,  NaOH  0,13M  dan  SDS 0,2%) pada pellet yang dihasilkan, diinversi hingga  homogen.  Langkah  berikutnya diambahkan  150  mL  larutan  III  (60mL KOAc 5M, 11,5 mL asam asetat glasial dan 20,5 mL ddH 2 O), kemudian dihomogen dan disentrifugasi  pada  14.000  rpm  selama  5 menit.  Supernatan  diambil  400  µL  dan dimasukkan  pada  tabung  mikro  1,5  mL yang  baru,  800  µL  etanol  p.a  (2x  volume) ditambahkan, kemudian campuran dihomogenkan  dan  didiamkan  selama  5 menit  dan  disentrifugasi  pada  12.000  rpm selama  5  menit.  Supernatan  dibuang  dan dicuci pellet yang dihasilkan dengan etanol 70%  dengan  cara  meresuspensi,  kemudian sentrifuga pada 12.000 rpm selama 3 menit. Pelet  yang  dihasilkan  dikeringkan  dengan dengan cara membuang supernatan membiarkan hingga pellet tidak mengandung etanol (bisa di suhu ruang atau
37 o C).  Kemudian  ditambahkan  25  µL ddH 2 O  pada  pellet  DNA  plasmid  dan resuspensi  hingga  pellet  DNA  plasmid larut. Larutan DNA plasmid siap digunakan sebagai  templat  untuk  keperluan  PCR  dan sekuensing. Templat disimpan pada suhu - 20 °C.

## Hasil dan Pembahasan
Insersi gen pncA ke dalam plasmid pGEM- T Gen pncA hasil  PCR  telah  berhasil diinsersikan ke vektor pGEM-T.
Keberhasilan insersi dapat dilihat pada hasil seleksi  koloni  biru  putih  pada  Gambar 2.Kontrol  negatif  di  media  LB  +  ampisilin (Gambar  2.a)  menunjukkan  bahwa  tidak ada  koloni  yang  tumbuh  sehingga  dapat dipastikan  bahwa  media  telah  positif mengandung  ampisilin  yang  aktif  mem- bunuh mikroba wild type . Pada Gambar 2.b,
E.  coli  tumbuh  baik  karena  media  tanpa ampisilin,  hal  ini  sesuai  dengan  target bahwa E. soli yang dipakai memang dalam kondisi yang baik. Kontrol positif di media LB  +  ampisilin  ditumbuhi  banyak E. coliTop 10 F’ , hal ini menunjukkan bahwa E. coli Top10 F’ resisten terhadap ampisilin sehingga  bisa  dipakai  sebagai  sel  inang untuk proses transformasi. Gambar 2.d dan 2.e  menunjukkan  adanya  koloni  biru  dan koloni  putih,  hal  ini  menunjukkan  bahwa proses  insersi  gen  pncA  berhasil  diinsersi ke  dalam  plasmid  pGEM-T.  Koloni  yang mengandung plasmid pGEM-T rekombinan akan menghasilkan warna putih sedangkan yang  tidak  mengandung  plasmid  pGEM-T rekombinasi  menghasilkan  koloni  warna biru.  Dengan  demikian  yang  akan diproduksi  dan  diisolasi  dikarakterisasi plasmid rekombinannya adalah koloni yang berwarna biru.

## Isolasi  dan  karakterisasi  plasmid  pGEM-T rekombinan
Setelah  hasil  skrining  insersi  gen  pncA ke  plasmid  pGEM-T  menunjukkan  hasil yang  positif  maka  langkah  selanjutnya adalah isolasi plasmid pGEM-T rekombinan  dan  dilakukan  karakterisasi menggunakan elektroforesis. Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  isolasi plasmid  pGEM-T  rekombinan  telah berhasil.  Keberhasilan  insersi  dan  iso-lasi dapat  dilihat  pada  elektroforegram  hasil elektroforesis pGEM-T- pncA dengan pembanding/  kontrol  pGEM-T  kosong (Gambar 3).
d.  Hasil Ligasi (pGEM-T-pncA) tanpa pengenceran
Terlihat ada koloni putih dan biru e.  Hasil Ligasi (pGEM-T-pncA) pengenceran 100x Terlihat ada koloni putih dan biru Beberapa contoh koloni putih a. Kontrol Negatif (-) di Media LB + Ampisilin Tidak terlihat adanya koloni yang tumbuh b.  Kontrol Negatif (-) di Media LB tanpa Ampisilin Tumbuh koloni ( E. coli) yang sangat rapat c.  Kontrol Positifdi Media LB + Ampisilin Tumbuh koloni ( E. coli) yang sangat rapat Beberapa contoh koloni biru
Gambar  2. Hasil  insersi  gen  pncA  ke  dalam  plasmid  pGEM-T:  a.  Kontrol  Negatif  (-)  di Media LB + Ampisilin; b. Kontrol Negatif (-) di Media LB tanpa Ampisilin; c. Kontrol positif di Media LB + Ampisilin; d. Hasil Ligasi (pGEM-T-pncA) tanpa pengenceran; dan e.  Hasil Ligasi (pGEM-T-pncA) pengenceran 100x.
Gambar  3. Elektroforegram  hasil  insersi gen pncA ke vektor pGEM-T.
Gambar  lajur  1  adalah  marker λ / HindIIII ,  sedangkan  lajur  2,  3,  dan  4 masing-masing  p-GEM-T  kosong.  pGEM- T- pncA koloni 1, dan pGEM-T- pncA koloni
15 yang telah dipotong oleh enzim restriksi NdeI .  Kondisi  elektroforesis  adalah  gel agarosa  0,7%,  bufer  TAE  1x,  tegangan  75 volt, lama elektroforesis 60  menit. Marker dan hasil amplifikasi yang di- load masing- masing 5 µL.

## Kesimpulan
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa gen pncA Isolat L20 MDR- M. tuberculosis yang  resisten  terhadap  pirazinamida  telah berhasil  diinsersikan  ke  dalam  plasmid pGEM-T.  Hal  ini  dapat  diamati  dari  hasil skrining koloni biru putih dan elektroforegram hasil elektroforesis plasmid pGEM-T-pncA  yang  bila  dibandingkan dengan  plasmid  pGEM-T  kosong  uku- rannya  selisih  seitar  0,7  kb  (ukuran  gen pncA).

## Daftar Pustaka
Dye, C. & Williams, B.G. (2000): Criteria for  the  control  of  drug-resistant tuberculosis ,  Communicable  Disease Control,  Prevention  and  Eradication, World Health Organization, CH-1211
Geneva  27,  Switzerland  &  Council  for Scientific and Industrial Research, P.O. Box  91230,  Auckland  Park  2006, Johannesburg, South Africa.
ECDC  Director’s  Presentation.  (2012): Multidrug resistant tuberculosis in the EU ,  Exchange  of  views  with  the Committee on the Environment Public Health  and  Food  Safety  (ENVI), European Parliament, Brussels.
Gillespie,  S.  H.  (2002):  Evolution  of  Drug
Resistance in Mycobacterium tuberculosis :  Clinical  and  Molecular Perspective, American  Society  for Microbiology , 46, 267–274.
Gupta,  A.K.,  Reddy,  V.P.,  Lavania,  M., Chauhan,  D.S.,  Venkatesan,  K., Sharma, V.D., Tyagi, A.K., & Katoch, V.M.  (2010): jefA (Rv2459),  a  drug efflux gene in Mycobacterium tuberculosis confers  resistance  to isoniazid  &  ethambutol. Indian.  J. Med . Res. , 132, 176–188.
Kenyorini, Suradi, dan Surjanto (2006): Uji Tuberkulin, Jurnal Tuberkulosis
Indonesia , 3, 7–1.
Mathema, B., Kurepina, N. E., Bifani, P. J., & Kreiswirth, B. N. (2006): Molecular Epidemiology of Tuberculosis: Current Insights, American Society for
Microbiology , 19, 4.
Motiwala,  A.S.,  Dai,  Y.,  Jones-Lo,  E.C, Hwang, S.H., Lee, J.S., Cho, S.N., Via, L.E., Barry, C.E., & Alland, D. (2010): Mutations  in  Extensively  Drug Resistant Mycobacterium  tuberculosis That  Do  Not  Code  for  Known  Drug- Resistance  Mechanisms. The  Journal of  Infectious  Diseases:  America .  All rights reserved, 201, 881–888.
1           2          3           4 23.130 pb 9.416 pb 6.557 pb 4.361 pb 2.322 pb 2.127 pb
Ocheretina  O,  Morose  W,  Gauthier  M,
Joseph P, D’Meza R, & Escuyer VE, et al. (2012):
Multidrugresistant tuberculosis  in  Port-au-Prince,  Haiti.
Rev  Panam  Salud  Publica .,  31,  221–
225.
Promega. (2009): pGEM®-T and pGEM®- T  Easy  Vector  Systems:  Instructions for  Use  of  Products  A1360,  A1380, A3600 AND A3610. Technical Manual No. 042.Printed in USA.Revised 6/09. Sanjaya,  E.H.  (2012):  MUTASI  T539C
GEN pncA (Val180Ala)  ISOLAT KLINIS  L20 MDR  Mycobacterium tuberculosis . Jurnal Sains , 40, 47–53.
Susanti,  E.  dan  Ariani,  S.  R.  D.  (2004): Kloning  Gen  Penisilin  V  Asilase  dari Bacillus sp  BAC4  melalui  Pembuatan Pustaka Genom, Biodiversitas , 5, 1–6. Utarini,  A.,  Basri,  C.,  Faralina,  M., Laksono,  S.D.,  Boestan,  S.P.,  Lestari, T.,  &  Dinihari,  T.N.  (2011): Rencana Aksi Nasional: Programmatic Management  of  Drug  resistance Tuberculosis  Pengendalian  Tuber- kulosis Indonesia: 2011–2014 . Kementerian  Kesehatan  RI  Direktorat
Jenderal  Pengendalian  Penyakit  dan Penyehatan Lingkungan.