## Ekspresi mRNA LMP2A Epstein-Barr Virus dari Biopsi Jaringan dalam Blok Parafin Berpotensi sebagai Biomarka dalam Diagnosis Karsinoma Nasofaring
Roni Afriansya 1 ,  Hendro Pramono 1 , Hidayat Sulistyo 2 , Daniel Joko Wahyono 1
1 Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto Fakultas Kedokteran, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto
Email: roniafriansya@gmail.com Korespondensi : daniel.joko@unsoed.ac.id

## Abstract
Nasopharyngeal  carcinoma  (NPC)  is  an  epithelial  tumor  located  in  the  nasopharynx  and  is  a  multifactorial  genetic disease. The main cause of NPC is the infection of Epstein-Barr virus (EBV). The existence of EBV in NPC patients can  be  identified  by  the  discovery  of  EBV  DNA  in  tissue  biopsy.  EBV  genome  and  the  expression  of  part  of  the product  of  the  latent  gene  of  this  virus  isconsistently  detected  in  almost  eachcancer cell of  NPC,  one  of  which is a Latent  Membrant  Protein  (LMP)gene.  The  activities  of  EBV  mRNA  better  reflect  a  real  pathogeneneityof  NPC compared to the serological diagnosis and measurement of EBV DNAin blood circulation. The study was conducted in  the  laboratory  of  genetics  and  molecular  Biology  Faculty  of  Unsoed  Purwokerto.  Analysis  of  mRNA  expression LMP2A  EBV  was  performed  using    one  step  RT-PCR  technique  and  RT-PCR  product  (amplicon  cDNA)  was visualized  in1%  agarose  gel  electrophoresis.  The  mRNA  LMP2A  EBV  can  be  expressedeither  form  samples  with lowRNA  concentration  or  samples  with  high  mRNA  concentration.    However,the  positivity  of    mRNA  LMP2A  EBV expression  was  moderate  positivity  (27.3%).  In  conclusion,  the  mRNA  expression  of  EBV  LMP2A  from  NPC  tumor biopsy  tissue  samples  preserved  in  paraffin  blocks  was  a  moderate  positivity,  so  tha  mRNA  expression  of  LMP2A EBV has a potentially be used as biomarker of NPC diagnosis.
Key  words : Nasopharyngeal  carcinoma , Virus  Epstein-Barr , Latent  Membrant  Protein 2A. iel  Joko  Wahyono, M.Biomed dan Dr. Hendro Pramono, M.S. Universitas Jenderal Soedirman,

## Abstrak
Karsinoma  nasofaring  (KNF)  merupakan  tumor  epitel  yang  terletak  di  nasofaring  dan  merupakan  penyakit  genetik multifaktor  yang  endemik.  Penyebab  utama  KNF  adalah  infeksi  oleh Virus  Epstein-Barr (EBV).  Keberadaan  EBV pada  penderita  KNF  dapat  diketahui  dengan  ditemukannya  DNA  EBV  dalam  spesimen  biopsi  jaringan  penderita KNF. Genom EBV dan ekspresi sebagian dari produk gen laten virus secara konsisten terdeteksi hampir di setiap sel dalam  kanker  ini,  salah  satunya  adalah  gen Latent  Membrant  Protein (LMP).  Aktivitas  mRNA  EBV  lebih mencerminkan  patogenesis  KNF  yang    sesungguhnya  dari  pada  diagnosis  serologi  dan  pengukuran  DNA  EBV  di sirkulasi.  Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium  PA  RSUD  Margono  Seokarjo,  Purwokerto/Lab  PA  Fakultas Kedokteran  dan  laboratorium  genetika/molekuler  Universitas  Jenderal  Soedirman  Purwokerto.  Analisis  Ekspresi mRNA  LMP2A  EBV  dengan  teknik one  step RT-PCR  dan  amplikon  cDNA      divisualisasi  dengan  elektroforesis  gel agarosa 1%. Hasil penelitian ini menunjukkan positivitas ekspresi mRNA LMP2A EBV dari biopsi jaringan KNF dalam blok  paraffin  adalah  sedang  (27,3%).  Kesimpulan,  ekspresi  mRNA  LMP2A  EBV  dari  biopsi  jaringan  tumor    KNF dalam  blok  paraffin  dengan  metode one  step RT-PCR  dengan    positivitas  sedang  (27,3%),  sehingga  berpotensi sebagai biomarka dalam diagnosis KNF
Kata kunci : Karsinoma nasofaring, Virus Epstein-Barr , Latent Membrant Protein 2A. PurwokertoEmail: roniafriansya@gmail.com

## Pendahuluan
KNF  mempunyai  sifat  berbeda  dibandingkan dengan  keganasan  pada  kepala  leher  yang  lain, karena  sifatnya  yang  sangat  invasif  dan  sangat mudah  bermetastasis  (Liu et  al .,  2003;  Jiang et al .,  2004;  Ma et  al .,  2007;  Tang et  al .,  2008). Salah  satu  penyebab  KNF  adalah  infeksi  oleh Epstein-Barr Virus (EBV) (Gu et al ., 2012; Shen et al .,  2015).  EBV  adalah  herpesvirus  limfotropik yang dapat menginfeksi dan bereplikasi dalam sel epitel  dan  limfosit  B.  Infeksi  EBV  pada  sel  B  dan tumor  KNF  ditandai  dengan  terekspresinya  gen fase  laten  dan  gen  fase  litik  EBV  (Steven et  al ., 2006).  Gen  fase  laten  yaitu  EBNA1,  EBNA2,
EBNA3,  LMP1,  LMP2,  EBER  dan  gen  fase  litik yaitu BRLF1, BZLF1, BALF1, BCLF1.
Kanker KNF
secara konsisten mengekspresikan  sebagian  dari  produk  gen  laten EBV, salah satunya adalah gen Latent Membrane Protein  (LMP)  (Raab-Traub  and  Flynn.,  1986; Pittaluga et  al .,  1992).  Ekspresi  gen  LMP  yang terdiri  dari  LMP-1  dan  -2  adalah  onkogen  EBV yang  ekpresinya  lebih  tinggi  pada  pasien  usia muda  (<30  tahun)  dan  mengindikasikan  replikasi virus  yang tinggi dalam sel. Ekspresi gen LMP ini juga berkaitan dengan progresifitas lokal dari KNF (Adham et  al .,  2012).  Gen  LMP2A  memainkan peran penting dalam menjaga kondisi infeksi laten EBV  pada  sel  B  dan  berpartisipasi  dalam  induksi
transformasi sel epitel tumor KNF (Dawson et al ., 2012).  Nakaya et  al .,  (2013)  melaporkan  bahwa gen  LMP2A  memiliki  fungsi  onkogen,  yaitu mampu  melakukan  transformasi  sel  normal menjadi sel tumor pada KNF, melalui peningkatan ekskresi  side  population  (SP)  yang  tergantung pada  aktivasi    Stat3,  MEK/ERK,  jalur  PI3K  dan peningkatan  ekspresi  HMGA2.  Oleh  karena  itu, analisis  ekspresi  gen  laten  LMP2A  dapat digunakan untuk melihat patogenesi dan menegakkan  diagnosis  KNF  guna  meningkatkan efisiensi dalam penanganan KNF.
Pengukuran  aktivitas  mRNA  EBV  di  lokasi tumor  primer  secara  langsung  pada  daerah nasofaring  perlu  dilakukan,  karena  aktivitas mRNA  EBV  lebih  mencerminkan  patogenesis KNF  yang  sesungguhnya  dari  pada  diagnosis serologi  dan  pengukuran  DNA  EBV  di  sirkulasi. Pada  saat  ini,  analisis  ekspresi  mRNA  EBV menggunakan teknik
Reverse TranscriptasePolymerase  Chain  Reaction (RT- PCR),  karena  teknik  ini  lebih  sensitif  dan  efisien untuk  mendeteksi  mRNA  dibandingkan  teknik terdahulu  yaitu Northern  Blot .  Teknik  RT-PCR mampu  mendeteksi  mRNA  yang  mengalami proses pembuangan intron ( spliced mRNA) dalam jumlah kecil dan memerlukan jumlah sampel klinis lebih sedikit. Tujuan penelitian ini untuk mengetahuiapakah metode
Reverse Transcriptase  Polymerase  Chain  Reaction (RT- PCR)  dapat  mendeteksi  ekspresi  mRNA  LMP2A EBV  pada  penderita  KNF  dan  melihat  positivitas ekspresi mRNA LMP2A EBV pada penderita KNF.

## Materi dan Metode
Objek  penelitian  ini  adalah  biopsi  jaringan tumor  penderita  KNF  dengan  diagnosis  pasti  dari hasil  pemeriksaan  Patologi  Anatomi  di  RSUD Prof. dr. Margono Soekarjo, Purwokerto. Penelitian  dilakukan  selama  6  bulan  dari  bulan Maret  2016  sampai  dengan  bulan  Agustus  2016 di Poli Patologi Anatomi - RSUD Prof.Dr. Margono Soekarjo Purwokerto, Lab. PA Fakultas Kedokteran dan Laboratorium Genetika/Molekuler Fakultas  Biologi  Univeritas  Jenderal  Soedirman Purwokerto.

## Isolasi RNA
Sampel  biopsi  jaringan  KNF  dari  Laboratorium Patologi  Anatomi  Poli  THT  RSUD  Prof.  dr. Margono Soekarjo kemudian di potong 8-10 slise, kemudian  dimasukkan  ke  tube  untuk  proses isolasi RNA. Isolasi RNA dilakukan menggunakan kit FFPE PureLink RNA Isolation Kit – Invitrogen.

## Analisis ekspresi mRNA LMP2A EBV
Analisis  dilakukan  dengan  teknik one  step RT- PCR  dan  menggunakan  kit  (SuperScript™  III One-Step  RT-PCR  System with  Platinum™  Taq DNA  Polymerase –  Invitrogen).Desain  primer dilakukan  dengan software Primer3  dari the
GenBank  Sequence  Database-NCBI ( accession number NC_007605.1; GeneID: 17494231 ). Dengan primer forward 5’- CTTCTGGCTCTTCTGGGAAC- 3’ dan primer reverse 5’- TCTGCCCGCTTCTTCGTATA- 3’. Campuran
PCR  ( PCRmix )  dibuat  dalam  PCR tube 0,2  ml dengan volume akhir 15 µL yang bebas nuclease dan dikerjakan di dalam es dengan komposisi 7,5 µm  (2x Reaction  Mix (a buffer  containing 0.4 mM of  each  dNTP,  3.2  mMMgSO4),  1  µm  ( template RNA),  1  µm ( Primer  forward dan primer  reverse ), 2 µm (SuperScrift ™ III RT/Platinum ™ Taq Mix), 2,5 µm ddH2o ( Autoclaved distilled water ). Campuran PCRmix dimasukkan  dalam  mesin  PCR  ( Peqlab, Primus  standard  25  well ).  Tahap  amplifikasi dilakukan  pada  mesin  PCR  sebanyak  35  siklus dengan  kondisi  PCR  siklus  pertama cDNA synthesis dan pre-denaturation dengan  kondisi PCR  45°C  selama  30  menit  dan  94°C  selama  2 menit.  Tahap  denaturasi  suhu  94°C  selama  15 detik, annealing 63,4°C selama 30 detik, extention suhu  68°C  selama  1  menit  dan final  extention 68°C selama 5 menit.

## Hasil dan Pembahasan
Penelitian  ekspresi  LMP2A  EBV  pada penderita  KNF  menggunakan  22  sampel  yang diambil  di  Laboratorium  Patologi  Anatomi  RSUD Dr.  Margono  Soekardjo  Purwokerto.  Karakteristik umur  sampel  penelitian  berdasarkan  usia  dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Distribusi sampel berdasarkan usia
Usia Jumlah (n) Persentase (%) 0 – 10 tahun 0 0 11 – 20 tahun 0 0 21 – 30 tahun 2 9,1 31 – 40 tahun 4 18,2 41 – 50 tahun 6 27,3 51 – 60 tahun 7 31,8 >60 tahun 3 13,6 Total 22 100
Pada tabel 1 dapat dilihat distribusi sampel penderita  KNF  tertinggi  yaitu  pada  rentang  usia 51-60  tahun  yaitu  7  pasien  (31,8%),  dan terbanyak  kedua  yaitu  rentang  usia  41-50  tahun yaitu  6  pasien  (27,3%).  Mayoritas  penderita  KNF pada  usia  lebih  dari  40  tahun,  karena  pada  usia tersebut  diperkirakan  sudah  terjadi  akumulasi paparan  faktor  lingkungan  berupa  bahan-bahan karsinogen  yang  sudah  melebihi  batas  ambang terjadinya tumorigenesis.  Hasil penelitian ini juga sesuai  dengan  hasil  penelitian  Adham et  al , (2012)  yang  memperoleh  data  distribusi  KNF  di Rumah  sakit  Cipto  Mangunkusomo  yaitu  rentang usia 41-50 sebanyak 32,4%, usia 31-40 sebanyak 23,4%, dan usia 51-60 sebanyak 16,4%.
Infeksi  KNF  ini  juga  dipengaruhi  oleh  jenis kelamin.Beberapa
penelitian terdahulu menunjukkan  bahwa  penderita  KNF  bersifat dominan  pada  jenis  kelamin  laki-laki.  Pada penelitian ini, proporsi jeniskelamin penderita KNF yang  diperoleh  adalah  pada  laki-laki  sebanyak 63,6% dan penderita perempuan sebanyak 36,4% atau  dengan  berbandingan  1,8:1.  Perbandingan proporsi  infeksi  antara  laki-laki  dan  perempuan dapat  di  lihat  pada  gambar  1.  Hasil  penelitian  ini sesuai dengan penelitian terdahulu yang menunjukkan  bahwa  kejadian  infeksi  KNF  lebih banyak  pada  laki-laki  dibanding  perempuan, dengan rasio 2-3:1 (Mutiarangura et al ., 1997).
Gambar 1. Presentase  Penderita  KNF  berdasarkan Jenis Kelamin
Gambar 2.  Hasil  visualisasi  Ekspresi  mRNA  LMP2A EBV  dengan  teknik  RT-PCR  pada  sampel biopsi jaringan KNF dalam blok paraffin (M =  Marker  DNA  100  pb;  1  sampai  10= urutan  sumuran;  *  =  Sampel  positif ekspresi  mRNA  LMP2A  dengan  nomor sampel  3(2487),  5(2465),  6(2558),  8(840), 9(713), 10(2822); *
≠ sampel negatifekspresi mRNA LMP2A1(2142), 2(2721), 4(3738) dan 7(4010).
Hasil  analisis  ekspresi  mRNA  LMP2A  EBV dengan  menggunakan  teknik one  step RT-PCR tertera  pada  Gambar  2.  Pada  Gambar  2  dapat dilihat bahwa mRNA  LMP2A EBV dapat terekspresi  pada  sampel  nomo  nomor  3(2487), 5(2465),  6(2558),  8(840),  9(713),  10(2822)  dan negatif  nomor  1(2142),  2(2721),  4(3738)  dan 7(4010). Hasil positif ekspresi mRNA LMP2A EBV menunjukkan  ketebalan  pita  yang  tidak  sama terutama  disebabkan  oleh   kadar  ekspresi mRNA LMP2A  EBV  pada  konsentrasi template RNA yang  sama  pada  tiap  masing-masing  sampel. Hasil  negatif  ekspresi  mRNA  LMP2A  EBV terutama  disebabkan  oleh  tidak  terekspresinya mRNA  LMP2A  EBV.  Namun,  beberapa  faktor
yang  memungkinkan  tidak  terkespresi  mRNA LMP2A  EBV  yaitu  tidak  terjadi  proses  sintesis cDNA  (suhu  terlalu  tinggi),  kontaminasi Rnase , dan RNA yang telah rusak atau terdegradasi.
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  positivitas ekspresi  mRNA  LMP2A  EBV  sebesar  27,3%  (6 dari  total  22  sampel)  termasuk  positivitas  sedang ( moderate positivity ) berkisar 10-50 % (Middeldorp et  al, 2003).    Hasil  penelitian  ini berbeda  dengan  penelitian  terdahulu  pada  kasus KNF  menggunakan  metode  RT-PCR yang menunjukkan  positivitas  ekspresi  mRNA  LMP2A EBV pada biopsi jaringan tumor KNF segar ( fresh biopsy )  lebih  dari  98  %  (Brooks et  al .,  1992; Busson et  al ,  1992).  Rendahnya  hasil  positivitas ekspresi  mRNA  LMP2A  EBV  dalam  penelitian  ini diperkirakan  disebabkan  oleh  sampel  yang digunakan  berasal  dari  biopsi  jaringan  tumor dalam  blok  paraffin  yang  sudah  terkontaminasi dengan  formalin  (formaldehid).  Formalin  adalah fiksatif  tradisional  yang  telah  digunakan  selama beberapa  dekade untuk mengawetkan jaringan di patologi  (Chu et  al .,  2002).  Fiksasi  formalin  yang bukan  buffer  formalin  10  %  dalam  teknik  patologi anatomi  dapat  menyebabkan  asam  nukleat terfragmentasi,  sehingga  kualitas  RNA  yang diperoleh sangat rendah (Lahr et al ., 2002).  RNA yang  berasal  dari  spesimen  tersebut  secara signifikan  mengalami  degradasi,  karena  formalin menyebabkan cross-link antara asam nukleat dan protein.  Penyimpanan  sel  atau  jaringan  dalam periode waktu yang panjang sebelum dilakukannya  isolasi  RNA  juga  meningkatkan degradasi RNA, karena sifat dari molekul ini yang sangat labil (Catts et al ., 2005). Berdasarkan hasil penelitian  Jarzab et  al ,  (2008)  yang  menyatakan bahwa hasil isolasi RNA dari sampel blok paraffin menunjukkan kualitas RNA yang diperoleh sangat buruk yang disebabkan oleh degradasi RNA yang tinggi.  Oleh  karena  itu,  dapat  diduga  bahwa kualitas RNA yang rendah pada sampel penelitian ini  telah  menjadi  penyebab  tidak  terekspresinya mRNA  LMP2A  pada  beberapa  sampel  penelitian yang  digunakan,  meskipun  secara  kuantitas konsentrasi RNA hasil isolasi cukup tinggi.

## Simpulan
Ekspresi  mRNA  LMP2A  EBV  dari  biopsi jaringan  tumor    KNF  dalam  blok  paraffin  dengan metode one  step RT-PCR  dengan    positivitas sedang  (27,3%),  sehingga  berpotensi  sebagai biomarka dalam diagnosis KNF.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada Direktorat  Penelitian  &  Pengadian  Masyarakat – Kemenristekdikti  atas  pendanaan  penelitian  ini melalui  Hibah  Penelitian  Fundamental  Tahun 2015-2016  dan  LPPM  Unsoed  sebagai  pengelola pendaanan penelitian ini..
64% 36%

## Jenis Kelamin

## Laki-laki
Perempuan

## Daftar Referensi
Adham,  M.,  Kurniawan,  A.N.,  Muhtadi,  A.I., Roezin,  A.,  Hermani,  B.,  Gondhowiardjo,  S.,
Tan, I.B., Middeldorp, J.M.
2012. Nasopharyngeal  Carcinoma  in  Indonesia:
Epidemiology, Incidence, Signs, and Symptoms at  Presentation. Chinese Journal Cancer 31(4): 185-196.
Brooks,  L.,  Yao,  Q.Y.,  Rickinson,  A.B.,  and Young,  L.S.  1992.  Epstein-Barr  Virus  Latent Gene Transcription in Nasopharyngeal Carcinoma  Cells:  Coexpression  of  EBNA1, LMP1,  and  LMP2  Transcripts.  Journal  of virology 66(5): 2689-2697.
Busson,  P.,  McCoy,  R.,  Sadler,  R.,  Gilligan,  K., Tursz,  T.,  Raab-Traub,  N.  1992.  Consistent Transcription of the Epstein-Barr Virus LMP2 Gene in Nasopharyngeal Carcinoma. Journal of virology 66(5): 3257-3262.
Catts,  V.  S.,  Catts,  S.  V.,  Fernandez,  H.  R., Taylor,  J.  M.,  Coulson,  E.  J.,  and  Lutze- Mann,  L.  H.  2005.  A  Microarray  Study  of Post-mortem  mRNA  Degradation  in  Mouse Brain Tissue.Molecular brain research 138(2): 164-177.
Chu,  W.S.,  Furusato,  B.,  Wong,  K.,  Sesterhenn, I.A.,  Mostofi,  F.K.,  Wei,  M.Q.,  Zhu,  Z., Abbondanzo, S.L., Liang, Q. 2005. Ultrasound-accelerated  Formalin  Fixation  of Tissue  Improves  Morphology,  Antigen  and mRNA Preservation. Modern pathology 18(6): 850-863.
Dawson,  C.W.,  Port,  R.J.,  Young,  L.S.  2012.  The Role  of The  EBV-encoded  Latent Membrane
Proteins LMP1 and LMP2 in The
Pathogenesis  of  Nasopharyngeal  Carcinoma (NPC). Seminar in Cancer Biology 22(2): 144- 153.
Fles,  R.,  M.A.Wildemen.,  Beni  S.,  Sofia,  M.H.,  I. Bing,  T.  2010.  Knowledge  of  General Practitioners  About  Nasopharyngeal  Cancer at The Puskesmas in Yogyakarta, Indonesia. BioMed Central Medical Education 10(81): 1- 6.
Gu,  A.D.,  Zeng,  M.S.,  Qian,  C.N.  2012.  The Criteria  to  Confirm  the  Role  of  Epstein-Barr
Virus in Nasopharyngeal Carcinoma Initiation.International  Journal  of  Molecular Sciences 13(10): 13737-13747.
Jarzab,  M.,  Rozanowski,  P.,  Kowalska,  M.,
Zebracka,  J.,  Rudnicka,  L.,  Stobiecka  E., Jarzab,B., Stachura, J. Pawlega, J. 2008.Optimization  of  the  Method  of  RNA Isolation  from  Paraffin  Blocks  to  Assess
Gene  Expression  in  Breast  Cancer.Polish Journal of Pathology 59(2): 85 –91. Jian,  G.T.,  Xuan, I.,  Ping,  C.  2004. Expression  of Matrix Metallo-proteinase-9 in
Nasopharyngeal  Carcinoma  and  Associated with  Epstein  Barr  Virus  Infection.  Journal  of Zheijiang  University  Sciences  5(10):  1304- 1412.
Lahr,  G.,  Starzinski-Powitz,  A.  and  Mayer,  A. 2002.  Analysis  of  Specific  Gene  Expression. In:  Conn  PM  (Ed).  Methods  in  Enzymology 356:  271 –281.  Academic  Press,  San  Diego, USA.
Liu,  M.T.,  Hsieh,  C.Y.,  Chang,  T.H.,  Lin,  J.P.,
Huang,  C.C.,  Wang,  A.J.  2003.  Prognostic Factors Affecting the Outcome of
Nasopharyngeal Carcinoma. Japanese Journal of Clinical Oncology 2(10): 501-508.
Lu, J., Cooper, J.S., M. Lee Anne W.M. 2010. The Epidemiology of Nasopharyngeal Carcinoma. In:  Nasopharyngeal  Cancer.  Berlin:  Springer 1-9.
Nakaya,  T.,  Kikuchi,  Y.,  Kunita,  A.,  Ishikawa,  S., Matsusaka,  K.,  Hino,  R.,  Aburatani,  H., Fukayama, M. 2013. Enrichment of Stem-like Cell  Population  Comprises  Transformation
Ability of Epstein-Barr Virus Latent Membrane  Protein  2A  for  Non-transformed Cells. Virus Research 174(1-2): 108-115.
Ma,  J.,  Liu,  L.,  Tang,  L.,  Zong,  J.,  Lin,  A.,  Lu,  T., Cui, N., Cui, C., Li, L. 2007. Retropharyngeal Lymphnode  Metastasis  in  Nasopharyngeal Carcinoma:  Prognostic  Value  and  Staging Categories.  Clinical  Cancer  Research  13(5): 1445-1452.
Middeldorp,  J.M.,  Brink,  A.A.T.P.,  van  den  Brule, A.J.C.,  Meijer,  C.J.L.M.  Pathogenic  roles  for Epstein-Barr  virus  (EBV)  gene  products  in EBV-associated  proliferative  disorders.  Crit Rev Oncol Hematol 2003; 45 : 1-36.
Munir,  D.,Lutan,  R.,  Hasibuan,  M.,  Henny,  F. 2007.Ekspresi  Protein  p53  Mutan  pada Karsinoma  Nasofaring.Majalah  Kedokteran Nusantara 40(3): 167-172.
Mutiarangura A, Tanuyuttwongesse C, Porthanakasem  W,  Kerkhanjanarong  V, Sriuranphong  V.  1997.  Genomic  Alterations in  Nasopharyngeal  Carcinoma;  Loss  of Heterozygosity an Epstein-Barr Virus Infection. Journal Cancer 76: 770-776.
Pittaluga,  S.,  Loke,  S.L.,  So,  K.C.,  Cheung,  K.N., Ma,  L.  1992.  Clonal  Epstein –Barr  Virus  in Lymphoepithelioma-like  Carcinoma  of  the Stomach: Demonstration of Viral Genome by
in  Situ  Hybridization  and  Southern  Blot Analysis. Modern Pathology 5(6): 661 –664.
Raab-Traub N., and Flynn K., 1986. The Structure of  The  Termini  of The  Epstein –Barr Virus as a  Marker  of  Clonal  Cellular  Proliferation.Cell 47(6): 883 –889.
Shen,  Y.,  Zhang,  S.,  Sun,  R.,  Wu,  T.,  Qian,  J. 2015.Understanding  the  Interplay  Between Host Immunity and Epstein-Barr Virus in NPC Patients.Emerging Microbes Infections 4(20): 1-9.
Stevens,  S.  J.,  Verkuijlen,  S.  A.,  Hariwiyanto,  B., Harijadi.,  Paramita,  D.K.,  Fachiroh,  J., Adham,  M.,  Tan,  I.B.,  Haryana,  S.M., Middeldorp, J.M. 2006. Noninvasive Diagnosis  of  Nasopharyngeal  Carcinoma:
Nasopharyngeal  Brushings  Reveal  High Epstein Barr Virus DNA Load and
Carcinoma ‐ specific  Viral  BARF1  mRNA.
International  journal  of  cancer  119(3):  608- 614.
Tang, L.,  Li,  L.,  Mao,  Y.,  Liu, L.,  Liang, S.,  Chen, Y., Sun, Y., Liao, X., Tian, L., Lin, A., Liu, M., Ma,  J.  2008.  Retropharyngeal  Lymphnode Metastasis  in  Nasopharyngeal  Carcinoma Detected  by  Magnetic  Resonance  Imaging: Prognostic  Value  and  Staging  Categories. Cancer 113(2): 347-354.
Wildeman,  M.A.,  Renske,  F.,  Marlinda,  A.,  Ika,
D.M.,  Ilse,  L.,  Mara,  S.,  Andrew,  D.V., Faiziah, F., Zanil, M., Armiyanto., Middledorp, J.M.,  Geertin,  G.,  Ronny,  S.,  Tan,  I.B.  2012. Short-term  Effect  of  Different  Teaching Methods  on  Nasopharyngeal  Carcinoma  for General  Practicioners  in  Jakarta,  Indonesia. PLoS ONE 7(3).