## KINETIKA  REAKSI ENZIMATIS  EKSTRAK  KASAR ENZIM SELULASE BAKTERI  SELULOLITIK  HASIL  ISOLASI  DARI BEKATUL
Dyah Ayu Saropah, Akyunul Jannah, Anik Maunatin
UIN  Maulana Malik  Ibrahim  Malang Jurusan Kimia,  Fakultas Sains dan Teknologi,

## ABSTRACT
Bran  rice  is  a  by-product  of  rice  into  rice  milling  process,  the  cellulose  content  of  40-60%,  so  the potential as a carbon source for the growth of microorganisms such as bacteria to produce enzymes particularly cellulolytic  bacteria.  The  purpose  of  the  study  was  to   determine  the  diversity  of  the  characters  from  the cellulolytic  bacterial  isolates  and  optimum  conditions  enzyme  (cellulase  enzymes  rough)  so  that  they  can hydrolyze  the  cellulose  to  glucose  with  either rice bran. The characterization includes the determination of pH, temperature  and  time  of  optimum  crude  extract  of bacterial cellulolytic enzyme cellulase, determination of Vmax and Km  and molecular  mass determination  of cellulase.
Research  methods  include  making  media,  regeneration  of  isolates,  bacterial  growth  curve manufacturing,  production  of cellulase enzymes from bacterial cellulolytic rough at the optimum conditions, the kinetics  of  enzymatic  reaction:  substrate  concentration  factor  of  the  reaction  rate  (with  variation  of  the concentration of 0.50%,  0.75%,  1 , 00%,  1.25%  and 1.50%  (w / v)) followed  by calculating the Vmax  and Km.
The  results  showed  that  the enzyme cellulase of cellulolytic bacteria isolated from rice bran result that has  optimum  conditions  at  pH  7.5,  temperature  50  °  C,  40  min  incubat ion  time  to  produce Vmax 0.0086 units / mL  and Km  1.694%.
Key  words : k inetics of enzymatic reaction, selullase enzyme and rice bran

## ABSTRAK
Bekatul  merupakan  hasil  samping  dari  proses  penggilingan  padi  menjadi  beras,  dengan  kandungan selulosa  40-60% sehingga berpotensi sebagai sumber karbon bagi pertumbuhan mikroorganisme seperti bakteri yang  dapat  menghasilkan  enzim khususnya  bakteri  selulolitik.  Tujuan  dari  penelitian  ini  untuk  mengetahui keragaman  karakter  dari  isolat-isolat  bakteri  selulolitik  dan  kondisi  optimum  enzim  (enzim  selulase  kasar) tersebut  sehingga  dapat  menghidrolisis  selulosa  dalam  bekatul  menjadi  glukosa  dengan  baik.  Kinetika  reaksi enzimatis  dengan mengukur Vmaks  dan Km.
Metode  penelitian  meliputi  pembuatan  media,  peremajaan  isolat,  pembuatan  kurva  pertumbuhan bakteri , produksi  enzim  selulase  kasar  dari  bakteri  selulolitik  pada  kondisi  optimum , kinetika  reaksi  enzimatis  : faktor konsentrasi  substrat terhadap laju reaksi (dengan variasi konsentrasi 0,50 %; 0,75 %; 1,00 %; 1,25 % dan 1,50  % (b/v)) dilanjutkan dengan menghitung Vmaks  dan Km.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  enzim  selulase  dari  bakteri  selulolitik  hasil  isolasi  dari  bekatul yang  mempunyai  kondisi  optimum  pada  pH  7,5  ,  suhu  50  °C  ,  waktu  inkubasi  40  menit  dengan  menghasilkan V max 0,0086  Unit/mL  serta K m 1,694  %.
Kata  kunci : k inetik a reak si enzimatis, enzim selulase dan bek atul

## I. PENDAHULUAN
Limbah  pertanian  berupa  selulosa dan hemiselulosa merupakan masalah penting  di  Indonesia,  ha1  ini  disebabkan kandungan material selulosa yang melimpah  namun  sulit  didegradasi.  Salah satu  dari  limbah  tersebut  adalah  bekatul. Bekatul  merupakan  hasil  samping  dari proses  penggilingan  padi  menjadi  beras. Departemen  Pertanian  (2007)  menyebutkan
bahwa konsumsi beras masyarakat Indonesia masih tergolong tinggi yaitu 139.15 Kg per kapita per tahun. Peningkatan  produksi  dan  konsumsi  padi ini  berimbas  pula  pada  peningkatan  produk samping  penggilingan  padi,  salah  satunya adalah bekatul. Sampai saat ini pemanfaatan  bekatul  masih  sangat  terbatas, yaitu hanya
sebagai pakan
ternak.  Sehingga,
perlu adanya
pemanfaatan  limbah  padi  (Bekatul).
Irawadi  (1990),  menyatakan  bahwa limbah pertanian seperti bekatul dan tongkol jagung mengandung selulosa (40−60  %),  hemiselulosa  (20−30  %),  dan lignin  (15−30  %).  Selain  itu  juga  menurut Ardiansyah  (2010),  bekatul  mengandung 14,9  %  protein;  12,5  %  lemak;  32,8  % selulosa;  42,8  %  hemiselulosa;  24,4  % lignin;  2,1  %  abu;  dan  3,6  %  air,  sehingga dapat  digunakan  sebagai  bahan  pakan ternak,  sumber  energi,  sebagai  sumber karbon  bagi  pertumbuhan  mikroorganisme seperti  bakteri  yang  dapat  menghasilkan enzim  khususnya  bakteri  selulolitik.
Enzim dapat diproduksi oleh mikroorganisme  seperti  fungi  dan  bakteri. Salah satu jenis enzim  yang  banyak dihasilkan oleh mikroorganisme adalah enzim  selulase.  Mikroorganisme  penghasil selulase  dari  kelompok  bakteri  memiliki tingkat  pertumbuhan  yang  cepat  sehingga waktu  yang  dibutuhkan  untuk  memproduksi selulase  menjadi  lebih  pendek  (Alam et  al., 2004).  Cendawan  diketahui  paling  baik dalam  mendegradasi  selulosa,  tetapi  bakteri menjadi  pilihan  utama,  ha1  ini  dikarenakan bakteri  memiliki  ukuran  molekul  selulase yang lebih kecil dibandingkan dengan cendawan  sehingga  lebih  mudah  untuk berdifusi kejaringan tumbuhan yang mengandung  selulosa  (Li  & Gao 1997).
Enzim  selulase  yang  dihasilkan  oleh mikroorganisme mempunyai karakteristik yang  berbeda-beda,  hal  ini  dipengaruhi  oleh faktor lingkungan seperti, suhu, pH lingkungan tempat enzim bekerja, konsentrasi  substrat  tertentu  dan  waktu inkubasi. Semua  enzim  bekerja  dalam rentang  suhu  tertentu  pada  tiap  jenis mikroorganisme. Sebagian besar enzim memiliki aktivitas optimum pada suhu 20−50  °C  termasuk  dalam  golongan mesozim (Volk dan Wheeler, 1984). Peningkatan  suhu  eksternal  secara  umum akan  meningkatkan  kecepatan  reaksi  kimia enzim,  tetapi  kenaikan  suhu  yang  terlalu tinggi akan menyebabkan terjadinya denaturasi  enzim  yaitu  berubahnya  struktur
protein  enzim,  terutama  perubahan  pada ikatan ionik dan ikatan hidrogennya sehingga menyebabkan terjadinya
penurunan  kecepatan  reaksi  yang  dikatalisis oleh  enzim  tersebut.
Ekstrak  kasar  enzim  selulase  dari isolat  bakteri  selulolitik  diduga  memiliki potensi  dalam  mendegradasi  bekatul  yang merupakan hasil samping dalam penggilingan padi menjadi glukosa sehingga  dapat  digunakan  sebagai  bahan baku  yang  potensial  untuk  dijadikan  pangan fungsional.  Oleh  karena  itu,  Diperlukan enzim  selulase  dengan  aktivitas  tinggi  yang dapat  diambil  dari  bakteri  selulolitik  untuk mendegradasi  limbah  tersebut.
Aktivitas enzim selulase sangat berhubungan  dengan  kinetika  enzim.  Ngili (2010) menyatakan kinetika enzim berkaitan  dengan  pengukuran  laju  reaksi enzimatik  serta  dengan  faktor-faktor  yang mempengaruhi  laju  tersebut.  Faktor-faktor penting  yang  mempengaruhi  laju  reaksi enzimatik  adalah  konsentrasi  substrat  dan enzim,  pH,  suhu  dan  adanya  kofaktor  sera ion  logam.  Penting  untuk  memepelajari mengenai  faktor-faktor  ini.
Pada pembahasan ini akan mempelajari  kinetika  enzim  selulase  dari isolat  bakteri  selulolitik  hasil  isolasi  dari bekatul yang memiliki potensi dalam hidrolisis  selulosa  dalam  bekatul  menjadi glukosa  (Jannah  dan  Maunatin,  2011) sehingga  dapat  digunakan  sebagai  bahan baku  yang  potensial  untuk  dijadikan  pangan fungsional.  Kinetika  enzim  selulase  ditinjau dari  pengaruh  konsentrasi  substrat  terhadap laju  reaksi  enzimatis.  Analisis  kuantitatif kinetika  reaksi  enzim  dilakukan  dengan asas  pendekatan  yaitu  asas  keseimbangan menurut  Michaelis-Menten.

## Bekatul
Di  Indonesia,  proses  penyosohan beras  umumnya  dilakukan  hanya  dalam satu  tahap  saja.  Dengan  demikian,  hasil samping  dari  sosohan  tersebut,  yaitu  dedak dan bekatul,  bercampur  menjadi  satu, sehingga  limbah  penggilingan  padi  yang berupa dedak berarti pula bekatul.
komposisi kimia bekatul cukup  tinggi: 14,9%  protein;  12,5%  lemak  ;  32,8% selulosa; 42,8% hemiselulosa; 24,4% lignin; 2,1% abu; 3,6%
air (Ardiansyah,2010).

## Enzim  Selulase
Enzim  selulase  merupakan  enzim yang  memegang  peranan  penting  dalam proses  biokonversi  limbah-limbah  organik berselulosa  menjadi  glukosa  (Chalal,  1983). Enzim selulase dapat diperoleh dari berbagai  sumber  seperti  tanaman,  insekta dan  mikroorganisme  (Maranatha.  2007). Bakteri  selulotik  ditemukan  di  berbagai ekosistem.  Contoh  bakteri  selulotik  adalah Cellumonas sp, celvibrio sp., Microbispora bispora , Thermomonospora sp., Acentivibrio cellulolyticus , Bacteriodes
cellulosolvent , Bacteriodes  succinogenes , Ruminococcus
albus , Ruminococcus
flavefaciens dan Clostridium  termocellum  . Enzim selulosa dapat dihasilkan oleh berbagai  bakteri  dan  fungi,  aerob  dan anerob,  mesofil  dan  termofil.  (Bhat  and Bhat,  1997) . Enzim
selulase kasar yang digunakan  merupakan  hasil  isolasi  dari bekatul  dengan  menggunakan  media  umum nutrien agar. Berdasarkan  hasil  isolasi bakteri yang telah dilakukan maka diperoleh  8  isolat  dan  didapatkan  satu  isolat terbaik  dengan  rasio  zona  bening  sebesar 1,6  (BK  7).  Hasil  pengamatan  morfologi koloni  secara  makroskopis  bakteri  pada media  umum  tampak  semua  koloni  bakteri mempunyai  warna  kekuningan,  putih  susu, krem  dan  transparan,  sedangkan  bentuk morfologi pada semua koloni bakteri mempunyai  ciri-ciri  bentuk  koloni  bulat, elevasinya    berbentuk  cembung  (convex) dan  bertepi  rata  ( entire) .  Hasil  pengujian pewarnaan gram menunjukkan gram negatif.  Hasil  uji  katalase  menunjukkan hasil positif (adanya gelembung O 2 ).
pewarnaan
endospora menunjukkan endospora  positif  (warna  merah  pada  sel vegetatif.

## Mekanisme Kerja Enzim  Selulase
Hidrolisis  selulosa  terdiri  dari  dua tahap,  yaitu  degradasi  selulosa  menjadi selobiosa oleh endo-1,4-glukanase dan ekso-1,4  glukanase  kemudian  dilanjutkan dengan  pemecahan  selobiosa  oleh  β-1,4 glukosidase(Juhasz  dkk., 2003).
Gambar 1. Mekanisme kerja enzim selulase.
Mekanisme di atas merupakan proses  hidrolisis  selulosa  oleh  bakteri  yang dilakukan dengan bantuan enzim ekstraselular  yaitu  Endo  β-1,4-glukanase, Ekso  β-1,4-glukanase  dan  β-glukosidase. Enzim Endo β-1,4-glukanase menghidrolisis  polimer  secara  acak  dan menghasilkan  molekul  sellulosa  sederhana. Sedangkan Ekso β-1,4-glukanase menghidrolisis  dua  subunit  glukosa  pada bagian ujung sehingga menghasilkan selobiosa  disakarida.  Enzim  β-glukosidase menghidrolisis  selobiosa  menjadi  glukosa. Enzim  memiliki  kekhasan  dalam  mengenali dan mengikat substrat, karena enzim memiliki  sisi  aktif  yang  digunakan  untuk mengikat  substrat,  sisi  aktif  yang  dimiliki enzim sangat spesifik. Enzim selulase memiliki gugus aktif –COOH yang merupakan  gugus  aktif  dari  asam  amino jenis  asam  aspartat  (Whithers,  1995  dalam Andamari,  2003).

## Kinetika  Reaksi Enzimatis
Enzim merupakan protein yang mengkatalis reaksi  biokimia  yang secara
kolektif membentuk metabolisme perantara. Laju  awal  (Vo)  dari  reaksi  yang dikatalisis enzim meningkat dengan bertambahnya  konsentrasi  substrat  hingga dicapai keadaan dimana penambahan substrat  tidak  lagi  meningkatkan  laju  awal reaksi  dan  bila  semua  enzim  dalam  keadaan ES  (jenuh  oleh  substrat)  maka  laju  reaksi akan mencapai  nilai  maksimum  (Vmaks).
Laju  reaksi  bergantung  pada  kondisi larutan  dan  konsentrasi  substrat.  Kondisi- kondisi yang menyebabkan denaturasi protein seperti
temperatur
tinggi, konsentrasi  garam  yang  tinggi,  dan  nilai  pH yang  terlalu  tinggi  atau  terlalu  rendah  akan menghilangkan  aktivitas  enzim.  Sedangkan peningkatan  konsentrasi  substrat  cenderung meningkatkan aktivitasnya. Untuk menentukan kelajuan maksimum suatu reaksi enzimatik, konsentrasi substrat ditingkatkan sampai laju pembentukan produk  yang  terpantau  menjadi  konstan (Radzicka  dan Wolfenden,  1995).
Pada kelajuan yang maksimum ( V max ),  semua  tapak  aktif  enzim  akan berikatan  dengan  substrat,  dan  jumlah kompleks  ES  adalah  sama  dengan  jumlah total enzim  yang  ada.  Namun, V max hanyalah  salah  satu  konstanta  kinetika enzim.  Jumlah  substrat  yang  diperlukan untuk mencapai nilai kelajuan reaksi tertentu jugalah penting.
Hal
ini
diekspresikan  oleh konstanta  Michaelis- Menten ( K m ),  yang  merupakan  konsentrasi substrat  yang  diperlukan  oleh  suatu  enzim untuk mencapai setengah kelajuan maksimumnya.  Setiap  enzim  memiliki  nilai K m yang  berbeda-beda  untuk  suatu  subtrat, dan ini dapat menunjukkan seberapa kuatnya pengikatan substrat ke  enzim (Radzicka  dan Wolfenden,  1995).
Hasil eksperimen menunjukkan
bahwa  dengan  konsentrasi  enzim  yang tetap, maka pertambahan konsentrasi substrat  akan  menaikkan  kecepatan  reaksi. Akan  tetapi  pada  batas  konsentrasi  tertentu, tidak  terjadi  kenaikan  kecepatan  reaksi walaupun  konsentrasi  substrat  diperbesar. Hal  ini  berdasar  hukum  Michaelis-Menten yang  menyatakan  bahwa  kecepatan  reaksi
akan meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat.
Kecepatan  reaksi  akan  terus  meningkat dengan  nilai  yang  semakin  kecil  hingga mencapai  titik  batas  dimana  enzim  jenuh dengan  substrat  (Poedjiadi,  2007).  Titik batas  ini  disebut  kecepatan  maksimum (V max ) (Lehninger,  1997).
Gambar 2 Pengaruh konsentrasi substrat pada laju  aktivitas enzim  (Poedjiadi,  2007)
Menurut Leonor Michaelis dan Maud  Menten,  penggabungan  enzim  (E) dengan  substrat  (S)  merupakan  reaksi  yang dapat  balik  dan  berlangsung  relatif  cepat membentuk  kompleks  enzim-substrat  (ES). Selanjutnya  terurai  dan  membentuk  produk reaksi  (P)  dan  enzim  bebas  (E)  (Palmer, 1985). k 1 k 2 E + S           ES           E + P k -1
Laju  reaksi  persamaan  di  atas  dapat didefinisikan  dalam  persamaan:
V = k 2 [ES]
[ES]  biasanya  merupakan  besaran yang  tidak  dapat  diukur.  Besaran  yang dapat  diukur  adalah  konsentrasi  substrat dan  konsentrasi  enzim  total,  yaitu  jumlah enzim  bebas  dan  enzim  dalam  kompleks ES:
[E] t = [E]  + [ES]
Pada  keadaan  steady  state,  laju pembentukan  dan  penguraian  kompleks  ES sama:
k 1 [E][S]  = k -1 [ES]  + k 2 [ES] [ES] = [E][S]
Kemudian konstanta laju reaksi digabungkan  menjadi  satu  konstanta,  yaitu K M :
K M =
Sehingga  dapat ditulis:
K M [ES] = [E][S]
K M [ES] = [E] t [S] – [ES][S]
[ES](K M + [S]) = [E] t [S]
[ES] =
Selanjutnya:
V =
Saat laju reaksi mencapai kecepatan maksimum  (V max ), nilai  K M >> [S] Maka:
V max = k 2 [E] t
Akan didapat persamaan Michaelis- Menten:
V =
Persamaan  Michaelis-Menten  yaitu hubungan kuantitatif antara  laju  reaksi enzim  dan  konsentrasi  substrat,  bila  V max dan  K M diketahui.  Karena  sangat  sulit  untuk mencari  harga  V max dan  K M secara langsung,  maka  persamaan  tersebut  harus ditransformasikan dengan
metode
Lineweaver-Burk  yang  merupakan  bentuk penyederhanaan  terhadap  rumus  Michaelis (Murray, et al ., 1999):
Gambar  3  Grafik  hubungan  antara  1/V dengan 1/[S]
Data  untuk  menghitung  harga  V max dan  K M adalah  dengan  membuat  grafik hubungan  antara vs sehingga diperoleh  persamaan  linear,  y  =  ax  +  b, dimana  y  = dan  x  = .  Intersep  garis (b)  yang  didapat  dari  persamaan  linear adalah dan  slope  (a)  merupakan
(Suharto,  1995).

## II. METODE PENELITIAN
1. Pembuatan  Media
1.a. Pembuatan  Media CMC Agar Media  yang  digunakan  adalah  media
CMC  agar  yang  terdiri  dari  1  gr  CMC; 0,04 g  MgSO 4 .7H 2 0;  0,15  g    KNO 3; 0,1  g K 2 HP0 4; 0,004  g  CaCl 2 . 2H 2 0;  0,4  g yeast extract ;  dan  3,4  agar.  Semua  bahan dimasukkan  dalam  beaker  gelas  250  ml  dan dicampur  dengan  aquades  sebanyak  100 mL,  dipanaskan  sampai  mendidih  sambil diaduk hingga larut, kemudian media
tersebut  dimasukkan  ke  dalam  enlenmeyer dan  ditutup  kapas,  kemudian  disterilisasi dalam  autoklaf  menggunakan  suhu  121  °C dan tekanan  1 atm  selama  15 menit.

## 1b. Pembuatan  Media CMC Cair
Media  yang  digunakan  adalah  media CMC  yang  terdiri  dari  1  gr  CMC;  0,04  g
MgSO 4 .7H 2 0; 0,15 g  KNO 3; 0,1 g K 2 HP0 4;
0,004  g  CaCl 2 . 2H 2 0;  dan  0,4  g yeast extract .  Semua  bahan  dimasukkan  dalam beaker  gelas  250  ml  dan  dicampur  dengan aquades  sebanyak  100  mL,  dipanaskan sampai  mendidih  sambil  diaduk  hingga larut,  kemudian  media  tersebut  dimasukkan ke  dalam  enlenmeyer  dan  ditutup  kapas, kemudian disterilisasi dalam autoklaf menggunakan  suhu  121  °C  dan  tekanan  1 atm  selama  15 menit.
2. Peremajaan  Isolat Peremajaan bakteri dilakukan dengan  mengambil  1  ose  bakteri selulolitik
hasil isolasi dari bekatul kemudian digoreskan  pada  media  CMC  agar  miring  1 %  (prosedur  3.5.1.1)  dan  diinkubasi  selama 24  jam  pada  suhu  ruang  (Nurhamida, 2008).  Hasil  peremajaan  digunakan  untuk penentuan kurva tumbuh dan kurva aktivitas  selulase.
3. Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri dan Aktivitas  Selulase Pembuatan kurva pertumbuhan
dilakukan  dengan  cara  menginokulasikan sebanyak  2  ose  isolat  hasil  peremajaan  ke dalam  200  mL  medium  CMC broth 1  %
(prosedur 3.5.1.2) kemudian diinkubasi pada shaker incubator dengan  kecepatan 125  rpm  pada  suhu  ruang  selama  18  jam, diambil  sebanyak  25  mL  dan  dipindahkan dalam  250  mL  medium  CMC broth 1  %, kemudian  diambil  4  mL  tiap  4  jam  sekali dan  diukur  densitas  optik  (OD)  dan aktivitas  selulasenya  hingga  mencapai  fase awal  kematian.  Densitas  optik  (OD)  diukur menggunakan spektrofotometer Uv-vis pada  panjang  gelombang  600  nm.  Kurva pertumbuhan  ditentukan  dengan  membuat plot  antara  waktu  dan  densitas  optiknya. Sedangkan aktivitas selulase ditentukan dengan  mengukur    kadar  gula  reduksi dengan  metode  Nelson-Somogyi.

## 4. Produksi  Enzim  Selulase Kasar dari Bakteri Selulolitik
Isolat bakteri selulolitik
diinokulasikan  sebanyak  2  ose  dalam  200
mL  media  CMC broth 1  %  (prosedur
3.5.1.2), dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu ruang hingga mencapai fase eksponensial (prosedur
3.5.3).  Ekstrak  kasar  enzim  diperoleh dengan mensentrifugasi kultur pada kecepatan  3.000  rpm  selama  15  menit  pada suhu  4  °C  (Heck et  al .,  2002),  supernatan yang  diperolah  adalah  ekstrak  kasar  enzim selulase,  dan  digunakan  untuk  pengujian karakterisasi  enzim  selulase.
5. Kinetika Reaksi Enzimatis : Penentuan  V max dan  K m Ekstrak  Kasar Selulase
Penentuan  V max dan  K m ditentukan dengan  cara  menguji  aktivitas  selulase  pada konsentrasi substrat dengan variasi konsentrasi  0,50  %;  0,75  %;  1,00  %;  1,25 %  dan  1,50  %  (b/v)  dan  dilakukan  pada suhu  50 ° C,  pH  7,5,  dan  waktu  inkubasi selama  40 menit.
Sebanyak  1  mL  substrat  CMC  0,50 %;  0,75  %;  1,00  %;  1,25  %  dan  1,50  % (b/v)  yang  sudah  dilarutkan  dalam  larutan buffer  dengan  pH  7,5  dimasukkan  dalam  5 tabung  reaksi  yang  berbeda,  kemudian ditambah  1  mL  ekstrak  kasar  selulase  pada masing-masing  tabung  reaksi  (Khabbah, 2007).
Masing-masing sampel kemudian diinkubasi  pada  suhu  50 ° C  dengan  waktu inkubasi  40  menit.  Setelah  itu  dididihkan selama 15 menit  untuk  menginaktivasi enzim  tersebut  kemudian  didinginkan  pada suhu  ruang.  Aktivitas  enzim  pada  variasi konsentrasi substrat tersebut dianalisis dengan menggunakan metode Nelson-
Somogyi.
6. Pengukuran Aktivitas
Enzim
Selulase 5a.   Penentuan  panjang  Gelombang Optimum  Larutan  Glukosa dengan

## Metode Nelson-Somogyi
Larutan  stok  glukosa  standart  100 ppm  (10  mg  glukosa  anhidrat/  100  mL aquades)  kemudian  dipipet  1  mL,  lalu dimasukkan  dalam  tabung  reaksi,  kemudian
ditambahkan 1 mL reagen Nelson (Lampiran  2), lalu  tabung  tersebut  ditutup. Tabung  reaksi  yang  berisi  sampel tersebut dididihkan selama 20 menit, kemudian didinginkan hingga mencapai suhu  25 ○ C.  Langkah  selanjutnya  adalah menambahkan  1  mL  reagen  arsenomolibdat (Lampiran  2),  kemudian  dihomogenkan. Sampel kemudian diencerkan dengan aquades 7 mL, setelah itu diukur absorbansinya pada  panjang  gelombang 200–800  nm.  Blanko  dibuat  sama  kecuali sampel  diganti  dengan  air.  Lalu  dibuat kurva  antara  panjang  gelombang  pada sumbu  X dengan  absorbansi  pada sumbu  Y.
5b.Pembuatan  Kurva  Baku Glukosa dengan Metode Nelson-Somogyi (Apriyantono,  dkk., 1989)
Larutan  stok  glukosa  standart  100 ppm  (10  mg  glukosa  anhidrat/  100  mL aquades) diencerkan hingga didapatkan larutan  glukosa  standart  dengan  konsentrasi 5,  20,  35,  50,  dan  65  ppm.  Sampel  yang telah  diencerkan  tersebut  dipipet  1  mL,  lalu dimasukkan  dalam  tabung  reaksi,  kemudian ditambahkan 1 mL reagen Nelson (Lampiran  2), lalu  tabung  tersebut  ditutup. Tabung  reaksi  yang  berisi  sampel tersebut dididihkan selama 20 menit, kemudian didinginkan hingga mencapai suhu  25 ○ C.  Langkah  selanjutnya  adalah menambahkan  1  mL  reagen  arsenomolibdat (Lampiran 2), kemudian dihomogenkan hingga semua endapan Cu 2 O terlarut sempurna.  Campuran  selanjutnya  ditambah dengan  7  mL  aquades  dan  dikocok, kemudian diukur absorbansinya pada panjang  gelombang  751  nm.  Kurva  baku dibuat dengan menghubungkan antara konsentrasi  larutan  baku  glukosa  dengan absorbansinya.
5c.  Analisis  Kadar  Glukosa  dengan
Metode Nelson-Somogyi
Sampel yang akan dianalisis dimasukkan  dalam  tabung  reaksi,  kemudian ditambahkan 1 mL reagen Nelson
(Lampiran  2),  lalu  tabung  tersebut  ditutup rapat.  Sampel  kemudian  dididihkan  selama
20  menit.  Langkah  selanjutnya  sampel didinginkan  hingga  mencapai  suhu  25 ○ C lalu ditambahkan 1 mL reagen arsenomolibdat  (Lampiran  2)  dan  dikocok sehingga  endapan  Cu 2 O  larut  sempurna. Kemudian  ditambahkan  6  mL  aquades  lalu dikocok  hingga  homogen  kemudian  diukur absorbansinya  dengan  panjang  gelombang 751  nm.  Blanko  dibuat  sama  tetapi  tidak menggunakan enzim  (Apriyantono,  dkk, 1989).

## III. HASIL  DAN PEMBAHASAN
Penentuan  kondisi  optimum  ekstrak kasar selulase bakteri selulolitik hasil isolasi dari bekatul dilakukan melalui beberapa  tahap,  yakni:  peremajaan  isolat, pembuatan kurva pertumbuhan dan produktivitas gula reduksi untuk
mengetahui fase pertumbuhan bakteri dengan  produksi  gula  reduksi  tertinggi  yang kemudian  digunakan  sebagai  waktu  panen atau  produksi  enzim  selulase  kasar,  serta penentuan  kondisi  optimum  enzim  yang meliputi  pH,  suhu,  waktu  inkubasi  serta konsentrasi substrat. Aktivitas selulase diukur  berdasarkan  kadar  gula  reduksi  yang dihasilkan  menggunakan  metode  Nelson- Somogyi.

## 1. Peremajaan  Bakteri Selulolitik
Peremajaan bakteri selulolitik
dilakukan  pada  media  NA  ( Nutrient Agar ) miring sebagai media pertumbuhannya. Media ini mengandung nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri, dimana  semua  unsur  ini  dalam  bentuk persenyawaan  (Irianto,  2007).
Peremajaan  isolat  bertujuan  untuk meregenerasi  atau  memperbarui  sel  bakteri, menjaga  ketersediaan  nutrisi  dan  untuk menghindari adanya perubahan
karakteristik dari kultur murni yang ditanam. Peremajaan dilakukan secara aseptis untuk menghindari adanya kontaminan yang dapat mempengaruhi pertumbuhan  bakteri  yaitu  dengan  cara memijarkan  jarum  ose  di  atas  api  segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan  bakteri  serta  melewatkan  mulut
tabung  tempat  biakan  di  atas  api  segera sebelum  dan  sesudah  memasukkan  jarum dan  mengambilnya  serta  segera  mungkin menutup  tabung  (Sutedjo,  1996).
Peremajaan  isolat  dilakukan  dengan cara  mengambil  sebanyak  1  ose  bakteri selulolitik  dan  digoreskan  secara  aseptis pada media NA miring kemudian diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu  ruang. Inkubasi  dilakukan  selama  24  jam  karena pada  selang  waktu  tersebut  diasumsikan bakteri  telah  mengalami  fase  logaritmik atau  eksponensial  yang  ditandai  dengan meningkatnya  jumlah  sel  sehingga  bakteri siap  dipanen  (Dwijoseputro,  1994).
2. Kurva Pertumbuhan dan Produktivitas  Gula  Reduksi Kurva pertumbuhan dan
produktivitas  gula  reduksi  digunakan  untuk mengetahui  waktu  panen  enzim  selulase. Waktu  panen  enzim  ditentukan  berdasarkan kadar  gula  reduksi  tertinggi  yang  dihasilkan oleh  kultur  bakteri  selulolitik  pada  fase pertumbuhannya.
Kurva
pertumbuhan dan produktivitas  gula  reduksi  pada  penelitian ini  diperoleh  dengan  membuat  plot  antara waktu  inkubasi  dan  densitas  optiknya. Mula-mula  dibuat  inokulum  dengan  cara mengambil bakteri selulolitik hasil peremajaan  sebanyak  2  ose  secara  aseptis dan  diinokulasikan  ke  dalam  200  mL  media CMC  ( Carboxy  Methyl  Cellulose ) broth 1 %  untuk  memperpendek  fase  adaptasi  dari bakteri. Inokulum kemudian diinkubasi dalam  shaker  inkubator  pada  suhu  ruang dengan  kecepatan  150  rpm  selama  24  jam untuk  mengatur  aerasi  serta  memperlancar transfer  nutrisi  ke  dalam  sel.  Langkah selanjutnya,  diambil  inokulum  sebanyak  25 mL  dan  diinokulasikan  ke  dalam  250  mL media  serupa  untuk  media  produksi,  setelah itu  inokulum  diambil  sebanyak  4  mL  tiap  4 jam  sekali  dan  diukur  densitas  optiknya serta produktivitas gula reduksinya.
Densitas
optik diukur dengan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang 600 nm sedangkan produktivitas gula reduksi ditentukan
dengan mengukur kadar gula reduksi menggunakan  metode  Nelson-Somogyi. Kurva pertumbuhan dan
produktivitas  gula  reduksi  yang  diperoleh disajikan  pada Gambar  4.

## Gambar 4. Kurva pertumbuhan dan produktivitas  gula reduksi
Pertumbuhan bakteri selulolitik
(Gambar  4)  ditandai  dengan  meningkatnya nilai  densitas  (kekeruhan)  medium  sejalan dengan  meningkatnya  lama  waktu  inkubasi. Tahapan fase yang terjadi pada pertumbuhan bakteri selulolitik dalam medium  CMC  meliputi  fase  lambat  ( Lag Phase )  terjadi  pada  jam  ke-0  sampai  jam ke-4  karena  fase  ini  populasi  bakteri belum mengalami  perkembangbiakan,  dikarenakan sel  mengalami  adaptasi  dengan  medium yang  baru  (Hamdiyati,  2001).  Fase  ini  sel bakteri mulai membesar, tetapi  belum membelah  sehingga  tidak  ada  pertambahan populasi  (Hidayat,  dkk.,  2006),  dan  telah mempersiapkan diri untuk mensintesis berbagai  jenis  enzim  hidrolase  ekstraseluler (Brock, et al ., 1986).
Fase  logaritmik  ( Exponential  Phase ) terjadi  pada  jam  ke-4  hingga  jam  ke-20 yang  ditandai  dengan  bertambahnya  jumlah sel  dalam  populasi.  Hal  ini  karena  bakteri sudah  beradaptasi  dengan  media  dan  dapat melakukan  reproduksi  dengan  pembelahan sel (Astuti dan Rahmawati, 2010). Bertambahnya  jumlah  sel  bakteri  akan meningkatkan  sintesis  enzim  selulase  untuk proses  metabolisme  dalam  sel.  Akan  tetapi, setelah  selulosa  dalam  media  tumbuhnya mendekati habis maka bakteri akan
memanfaatkan  glukosa  yang  telah  diuraikan oleh  enzim  selulase  sebagai  sumber  energi dalam  selnya  (White,  2000),  yang  ditandai dengan  menurunnya  kadar  gula  reduksi yang  dihasilkan.
Fase  stasioner  ( Stationer  Phase ), terjadi  dari  jam  ke-20  hingga  jam  ke-48. Pada  fase  ini  mikroorganisme  tidak  lagi melakukan  pembelahan  sehingga  jumlah  sel cenderung  tetap  karena  persediaan  nutrisi terbatas  (Mangunwidjaja,  1994).  Pada  jam ke-48  kadar  gula  reduksi  yang  dihasilkan meningkat,  hal  ini  diduga  enzim  selulase telah mencapai waktu inkubasi yang optimal  sehingga  dapat  menghasilkan  gula reduksi  yang  tinggi  (Gal, et.al .,  1997). Setelah  melewati  jam  ke-48  absorbansi menurun yang mungkin disebabkan banyaknya  kematian  sel  dalam  media, sehingga kadar gula reduksi yang
dihasilkan juga mengalami penurunan (Dees, et.al .,  1995).  Berdasarkan  kurva pertumbuhan  dan  produktivitas  gula  reduksi pada  Gambar  4.1  waktu  panen  enzim adalah  pada  jam  ke-48 dengan  kadar  gula reduksi  tertinggi  yaitu  58,62 ppm.

## 3. Produksi  Enzim  Selulase Kasar
Enzim selulase
dari bakteri selulolitik termasuk enzim ekstraseluler sehingga  dapat  diekstrak  melalui  dinding sel  dengan  cara  sentrifugasi.  Fungsi  utama enzim  ekstraseluler  ini  adalah  mengubah nutrien  disekitar  sel  dan  membawanya masuk  ke  dalam  sel  sebagai  energi  untuk pertumbuhan  sel  (Aulanni’am,  2005).
Produksi  enzim  selulase  dilakukan dengan  cara  mengambil  sebanyak  2  ose bakteri  hasil  peremajaan  secara  aseptis  dan diinokulasikan  ke  dalam  200  mL  media CMC broth 1  %  dan  dishaker  dengan kecepatan  150  rpm  pada  suhu  ruang  selama 24  jam  untuk  memperpendek  fase  adaptasi. Inokulum  kemudian  diambil  sebanyak  25 mL  dan  diinokulasikan  ke  dalam  250  mL media  CMC broth 1  %  dan  diinkubasi  pada suhu  ruang  selama  48  jam.  Inkubasi dilakukan  selama  48  jam  yang  merupakan fase  stasioner  dengan  kadar  gula  reduksi tertinggi  yaitu  58,62  ppm  dari  kurva
pertumbuhan  dan  produktivitas  gula  reduksi bakteri selulolitik yang terlampir  pada Lampiran  3.2.
Substrat CMC dalam produksi enzim  digunakan  sebagai  sumber  karbon bagi  bakteri  untuk  mencukupi  kebutuhan energi  sel  dan  produksi  enzim  (Ray,  2007). Dengan  kata  lain  semakin  banyak  sumber karbon  dalam  media  pertumbuhan  maka selulase yang dihasilkan semakin meningkat.  Akan  tetapi  kelebihan  sumber karbon  dapat  menghambat  pertumbuhan  sel karena  akan  mengurangi  jumlah  oksigen dalam media sehingga menurunkan produksi  selulase.  Oleh  karena  itu,  pada penelitian  ini  menggunakan  CMC  1  % berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan oleh Arifin, et al., (2006) dalam memproduksi  selulase  dari Bacillus  pumilus EB3.
Ekstrak  kasar  selulase  diperoleh dengan mensentrifugasi kultur bakteri dengan  kecepatan  3000  rpm  selama  15 menit  pada  suhu  4  °C  untuk  memisahkan sel-sel  mikroorganisme  yang  mengendap dan  supernatan  yang  merupakan  cairan yang berisi enzim. Dalam teknik sentrifugasi  pemilihan  kecepatan  dan  gaya berat  harus  diperhatikan  untuk  memisahkan supernatan  dari  selnya  (Rahayu,  1990). Supernatan  yang  dihasilkan  dari  250  mL inokulum  adalah  sebanyak  220  mL  ekstrak kasar  selulase  yang  kemudian  digunakan untuk  penentuan  kinetika  enzim  selulase dari  isolat  bakteri  selulolitik.
4.  Parameter  Kinetika  Ekstrak  Kasar Selulase : Penentuan  V max dan K m
Penentuan  laju  reaksi  maksimum (V max )  dan  konstanta  Michaelis-Menten (Km)  merupakan  hal  penting  yang  harus dilakukan  untuk  mengetahui  karakteristik enzim.  Nilai  V max menunjukkan  tingkat kejenuhan  enzim  oleh  substrat  sedangkan Km menunjukkan  efisiensi  katalis  dari enzim yang didefinisikan sebagai konsentrasi  substrat  tertentu  pada  saat kecepatan katalitik enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya
(Gultom,  2001).  Nilai  V max dan  Km ditentukan
dengan cara mengukur
kecepatan  awal  dan  aktivitas  selulase  pada kondisi  optimumnya  (pH  7,5,  suhu  50 ° C, dan  waktu  inkubasi  40  menit)  pada  variasi konsentrasi  substrat  0,50  %;  0,75  %;  1,00 %; 1,25 %; dan 1,50 %.
Berdasarkan  persamaan  Michaelis- Menten, hubungan antara konsentrasi substrat  dengan  aktivitas  selulase  dapat disajikan  pada Gambar  5.

## Gambar 5. Hubungan konsentrasi substrat dengan aktivitas enzim
Berdasarkan  teori  kinetika,  semakin tinggi  konsentrasi  substrat  maka  semakin tinggi  pula  energi  dan  frekuensi  benturan antar  molekul  sehingga  semakin  banyak enzim selulase yang dapat mengikat selulosa untuk membentuk kompleks enzim-glikosil yang selanjutnya akan membentuk produk berupa glukosa (Gultom,  2001).  Hal  ini  dapat  ditunjukkan pada Gambar 4.6 bahwa dengan meningkatnya  konsentrasi  substrat  maka meningkat pula aktivitas enzim yang dihasilkan.
Meskipun demikian,
peningkatan  aktivitas  enzim  akan  berhenti ketika  enzim  sudah  jenuh  dengan  substrat karena jumlah molar substrat sudah melampaui  jumlah  molar  enzim  setelah  titik batas maksimum (V max ) dari reaksi enzimatis.
Nilai  V max dan  Km  dapat  ditentukan dengan mentransformasikan persamaan Michaelis-Menten ke dalam persamaan Lineweaver-Burk:
diperoleh  nilai  intersep  =
,  slope  =
, y =  , dan x =
Gambar 6. Grafik hubungan 1/V dengan 1/[S] berdasarkan persamaan Lineweaver-Burk
Berdasarkan  Grafik  4.7  diperoleh persamaan  linear  y  =  197,01x  +  115,78, sehingga nilai V max sebesar 0,0086
ppm/menit dan  Km sebesar  1,694  %.  Nilai V max sebesar 0,0086
ppm/menit menunjukkan  kecepatan  maksimum  enzim selulase  dalam  mengubah  substrat  selulosa menjadi  glukosa  sebesar  0,0086  ppm  per menitnya, sedangkan  konstanta  Michaelis- Menten  ketika  enzim  selulase  mencapai setengah dari kecepatan maksimumnya adalah  sebesar  1,694  %,  dengan  kata  lain nilai  K m berfungsi  sebagai  ukuran  konstanta disosiasi  (Kd)  suatu  enzim.    Kompleks enzim-substrat nilai  Kd  ini  berbanding terbalik  dengan  afinitas  enzim  terhadap substratnya  (Sadikin,  2002).  Semakin  kecil kecenderungan substrat dan enzim berdisosiasi  maka  semakin  besar  afinitas enzim  terhadap  substrat, maka   kompleks   ES sangat   mantap,   sehingga    kesetimbangan reaksi  kearah   kompleks  ES sehingga  produk yang   diperoleh   mepunyai yield yang  tinggi. Apabila   nilai   Km   besar   berarti  enzim mempunyai  afinitas   rendah  terhadap  substrat, sehingga         kesetimbangan   reaksi  kearah  E +  S.
1/V max

## IV. KESIMPULAN
Kinetika  reaksi  enzim  selulase  dari bakteri  selulolitik  hasil  isolasi  dari  bekatul yang  mempunyai  kondisi  optimum  pada  pH 7,5  ,  suhu  50  °C  ,  waktu  inkubasi  40  menit menghasilkan  V max 0,0086  Unit/mL  serta K m 1,694 %.

## V. DAFTAR PUSTAKA
Alam,  M.  Z.,  Manchulur,  M.  A.,  dan Anwar,  M.  N.  2004.  Isolation Purification,
Characterization of Cellulolytic  Enzyme  Produced  by the  Isolate Streptomyces omiyaensis .
Pakist J Biol Sci 7(10):16471653. Ardiansyah. 2004. Sehat dengan Mengkonsumsi Bekatul. Suara
Pembaruan  23 Agustus. Beguin,  P  dan  Aubert,  J.  P.  1992.  Cellulose.
Encyclopedia Microbiology. 467– 408. Budiman,  A  dan  Sigit,  S.  2008.  Pengaruh Konsentrasi Substrat, Lama Inkubasi  dan  pH  dalam  Proses Isolasi Enzim Xylanase dengan menggunakan  Media  Jerami  Padi.
Karya  Ilmiah .  Semarang  :  Teknik Kimia  Undip.
Chaplin,  M.  2002.  Glucose  from  Cellulose. Diakses  tanggal  23 Juni  2012. Dwijoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar
Mikrobiologi . Jakarta:  Djambatan.
Furnier,  F.  1995.  Current Protocols in Food
Analitical  Chemistry  Colorimetric Quantification  Of  Carbohidrates. Arberta Kanada: University Of Alberta.
Girindra,  A.  1993. Biokimia  1 .  Jakarta:  PT Gramedia.
Gultom,  T.  2001.  Biokimia  Struktur  dan Fungsi.  Yogyakarta:  UNY Press.
Irawadi,  T.  T.  1990. Selulase .  Bogor:  IPB PAU Bioteknologi.
Kim, H. 1995. Characterization and Substrate Specivicity of an EndoBetha-1,4-D-glukanase (Avicelase  I)  from  An  Extracelluler
Multienzyme  Complex  of  Bacillus
Circulans . J  Appl  Environ  Microbiol 61: 959965.
Lehninger,  A.  L.  1997. Biochemistry .  New York:  Worth  Publisher  Inc.
Indahsari,  M.  N.  2012.  Isolasi  Bakteri Selulolitik  dari  Bekatul  dan  Uji
Aktivitas Enzim Selulase pada Media  dengan  Berbagai  Sumber Nitrogen. Skripsi .  Tidak  diterbitkan. Kimia.  UIN Maliki  Malang. Palmer,  T.  1985. Understanding  Enzyme 3 rd . New York: Ellishorwood Publisher.
Pelczar,  M.  J.,  dan  Chan,  E.  C.  S.  2008.
Dasar-Dasar  Mikrobiologi Jilid  1 . Jakarta:  UI Press.
Perez,  J.,  Munos,  D.  J.,  Rubia,  T.,  Martinez,
J. 2002.
Biodegradation and Biological  Treatments  of  Cellulose, Hemicellulose  and  Lignin. J  Int Microbiol 5: 53–63.
Rahayu,  K.  1990. Isolasi  dan  Pengujian Aktivitas  Enzim.  PAU  Pangan  dan Gizi . Yogyakarta:  UGM Press. Rahman,  A.  1992. Teknologi  Fermentasi . Bogor:  Kerja  Sama  Penerbit  Arcan dengan Pusat Antar Universitas Pangan  dan Gizi  IPB. Somogyi,  M.  1952.  Notes  on  Sugar Determination. Journal of
Biological  Chemistry  vol. 200,  No.
1, 19-23.
Vogel,  A.  I.  1994. A  Text  Book  of  Macro and Semimicro Qualitative Inorganic Analysis. 4 th Ed .
Longmans:  Green  and Co Ltd. Whither,  S.G.  dan  R.  Aebersold.  1995.
Approaches to Labelling and Identification of Active Site Residues  in  Glucosidases. Jurnal  of
Protein Science 4: 361-372 Wong,  D.W.S.  1995. Food  Enzymes: Structur  and  Mechanism .  New York:  Chapman  & Hall.  104-106. Radzicka  A,  Wolfenden  R.  (1995).  "A proficient  enzyme". Science 6 (267):
90–931.
doi : 10.1126/science.7809611