## ISSN: 0215-7950
Volume 17, Nomor 3, Mei 2021
Halaman 121–129 DOI: 10.14692/jfi.17.3. 121–129
Karakter Molekuler Gen AB- FAR 1 Nematoda Aphelenchoides besseyi Asal Lima Varietas Padi Molecular Characters of AB-FAR Gene 1 of Aphelenchoides besseyi from Five Rice Varieties
Fitrianingrum Kurniawati * , Efi Toding Tondok, Yayi Munara Kusumah, Abdul Munif Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680

## ABSTRAK
Aphelenchoides besseyi merupakan nematoda penyebab penyakit pucuk putih yang terbawa benih padi.  Gen AB  FAR-1  diketahui  sebagai  gen  penting  yang  mengendalikan  patogenisitas A. besseyi . Penelitian  dilakukan  untuk  mengetahui  karakter  gen AB  FAR-1  yang  diisolasi  dari  nematoda  yang berasal  dari  benih  padi.    Ekstraksi  nematoda  dilakukan  dengan  metode  corong  Baerman  dari  benih 5 varietas padi “Ciherang“, “Inpari Sidenuk“, “Sintanur“, “Hibrida Prima“ dan “Pak Tiwi“.  Ekstraksi DNA  total  nematoda  menggunakan  metode  CTAB  dilanjutkan  dengan  amplifikasi  gen  AB  FAR-1 menggunakan primer spesifik FAR-F1/R1 dan analisis urutan nukleotidanya. Pita DNA spesifik gen AB  FAR-1  berukuran  150  pb  berhasil  diamplifikasi  dari  semua  sampel  nematoda. Analisis  sikuen menunjukkan bahwa gen AB FAR-1 tersebut memiliki homologi tertinggi (92.5%–100%) dengan aksesi Genbank JQ686690.1, yaitu gen AB FAR-1 A. besseyi asal Cina. Walaupun memiliki homologi yang tinggi, terdapat beberapa perbedaan nukleotida pada sampel gen AB FAR-1 A. besseyi asal “Ciherang“, “Inpari Sidenuk“ dan “Hibrida Prima“. Analisis pohon filogenetika lebih lanjut mengelompokkan gen AB FAR-1 A. besseyi menjadi 2 grup, yaitu grup 1 terdiri atas gen AB FAR-1 A. besseyi asal Cina, “Sintanur“, “Hibrida Prima“ dan “Pak Tiwi“ dan grup 2 gen AB FAR-1 A. besseyi asal “Ciherang“, dan “Inpari Sidenuk“.
Kata kunci: amplifikasi, analisis sekuen, homologi, patogenisitas, terbawa benih

## ABSTRACT
Aphelenchoides besseyi is  known  as  nematode  species  that  causes  seed-transmitted  white  shoot disease in rice. One important gene that has been reported to control the pathogenicity of A. besseyi is AB FAR-1. The study was conducted to determine the character of the AB FAR-1 gene of A. besseyi extracted from rice seeds. Nematode extraction was carried out using Baerman funnel method from the seeds of 5 rice varieties, i.e. “Ciherang”, “Inpari Sidenuk”, “Sintanur”, “Prime Hybrid” and “Pak Tiwi”. Total DNA extraction of nematodes was conducted using CTAB method, followed by amplification of the AB FAR-1 gene using specific primers FAR-F1/R1 and nucleotide sequence analysis. Specific DNA band of AB FAR-1 gene measuring 150 bp was successfully amplified from all nematode samples. Sequence analysis showed that the AB FAR-1 gene had the highest homology (92.5 – 100%) with the Genbank accession no. JQ686690.1, which is the AB FAR-1 gene of A. besseyi from China. Despite having high homology, there were some nucleotide differences in the AB FAR-1 gene samples of A. besseyi from  "Ciherang",  "Inpari  Sidenuk"  and  "Prime  Hybrid".  Further  phylogenetic  tree  analysis differentiated the AB FAR-1 A. besseyi gene into 2 groups, i.e.  group 1 consisting of the AB FAR-1 gene A. besseyi from China, "Sintanur", "Prime Hybrids" and "Pak Tiwi" and group 2 gene AB FAR-1 A. besseyi from "Ciherang", and "Inpari Sidenuk".
Keywords:  amplification, homology, pathogenicity, seed-transmitted, sequence analysis

## PENDAHULUAN
Aphelenchoides besseyi merupakan nematoda  ektoparasit  terbawa  benih  padi dan  menyebabkan  penyakit  pucuk  putih. Dalam  proses  perkembangan  dan  reproduksi A. besseyi dikendalikan oleh protein spesifik, yaitu fatty acid and retinoid binding protein gene (gen AB FAR-1). Protein spesifik tersebut dapat  dimanfaatkan  untuk  pengendalian A. besseyi. Pengendalian  terhadap A. besseyi yang  melibatkan  protein  spesifik  tersebut telah  dikembangkan  di  Cina.  Pengendalian A. besseyi dengan RNA interference (RNAi) merupakan  mekanisme  yang  terjadi  secara alami  di  dalam  sel  yang  dapat  menghambat ekspresi gen. Mekanisme ini dipicu oleh RNA untai ganda (dsRNA).
Perlakuan  dsRNA  selama  48  jam mengakibatkan efisiensi pembungkaman AB- FAR-1  mencapai  maksimum  dan  reproduksi nematoda  paling  sedikit.  Hal  ini  disebabkan protein  FAR  dapat  berikatan  dengan  asam lemak  dan  retinol.  Retinol  dianggap  penting untuk  sintesis  kolagen  dan  perkembangan embrio.  Penurunan  regulasi AB  FAR-1  oleh RNAi menyebabkan pengikatan retinol lebih sedikit  sehingga  reproduksi  pada A. besseyi berkurang (Cheng et al . 2013) . Di Indonesia teknologi pengendalian dengan  RNAi  ini  belum  pernah  dilakukan sehingga  karakterisasi  gen  AB-FAR  1  perlu dilakukan  untuk  pengendalian  terhadap nematoda A. besseyi .

## BAHAN DAN METODE
Bahan Lima  varietas  yang  digunakan  ialah  padi var. “Ciherang”, “Inpari Sidenuk”, “Sintanur”, “Hibrida Prima”, dan “Pak Tiwi” yang dibeli dari kios pertanian di Kabupaten Bogor.
Ekstraksi Nematoda dengan Metode Modifikasi Corong Baermann Sebanyak  250  butir  benih  padi  dipotong ujung dan pangkalnya, dituangkan ke dalam saringan  berukuran  0.25  mm  dan  diisi  40 mL  air.  Selanjutnya  nematoda  diinkubasi
24  jam  pada  suhu  kamar  (25  ±  2  ºC)  dalam ruangan gelap, kemudian disaring. Nematoda dituangkan  ke  cawan  hitung  dan  didiamkan selama 20 menit. Nematoda jantan dan betina diidentifikasi  dengan  mikroskop  majemuk pada perbesaran 40 X (Remeeus dan Pelazza 2014; EPPO 2017).
Pengukuran  Morfometrik  Nematoda A. besseyi Pengukuran morfometrik nematoda dilakukan  pada  nematoda  betina  (masing- masing 10 ekor) mengikuti metode Chalanska et al . (2011) dan parameter yang diukur mengikuti formula De Man (1880).
Amplifikasi Gen AB FAR-1  Nematoda Asal Benih Padi Ekstraksi  DNA  nematoda  asal  lima varietas padi dilakukan menggunakan metode cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) (Doyle  dan  Doyle  1990)  yang  dimodifikasi. Sebanyak 40 mL bufer ekstraksi (2 mL EDTA, 5 mL Tris-HCl, 12.6 mL NaCl, 20.4 mL dH 2 O) ditambah merkaptoetanol 1%, lalu dipanaskan pada suhu 60 °C selama 10 menit. Sebanyak 15 ekor A. besseyi dari masing-masing lokasi digerus  kemudian  ditambah  500  µL  bufer ekstraksi panas. Suspensi gerusan nematoda dimasukkan  ke  tabung  eppendorf  1.5  mL, kemudian diinkubasi dalam penangas air pada suhu  60  °C  selama  2  jam  (tabung  dibolak- balik setiap 10 menit untuk membantu proses lisis). Siapan suspensi nematoda selanjutnya didinginkan  pada  suhu  ruang  selama 3–5  menit.  Sebanyak  500  µL  campuran klorofom  dan  isoamil  alkohol  (24:1) ditambahkan dalam suspesni dan dicampurkan hingga  homogen  dengan  digoyang  dengan kuat selama 5 menit. Suspensi nematoda disentrifugasi  pada  kecepatan  11  000  rpm selama 20 menit. Supernatan hasil sentrifugasi diambil  secara  hati-hati  dan  dihitung volumenya.  Supernatan  ditambahi  1/10 CH 3 COONa  3M,  pH  5.2  dan  2/3  volume isopropanol  dari  total  volume.  Selanjutnya tabung  diinkubasi  pada  suhu  -20  °C  selama semalam.  Tabung  disentrifugasi  pada kecepatan  12  000  rpm  selama  15  menit,
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Kurniawati et al. supernatannya  dibuang,  kemudian  ditambah 500  µL  etanol  80%.  Tabung  disentrifugasi kembali  pada  kecepatan  12  000  rpm  selama 15  menit.  Supernatan  dibuang  dan  peletnya dikeringkan  selama  1–2  jam,  lalu  ditambahi 30 µL bufer Tris-EDTA, pH 8.5 dan disimpan pada suhu -20 °C sampai digunakan. Sebanyak 1 µL suspensi DNA ditambahkan ke dalam campuran yang terdiri atas 12.5 µL Go tag green PCR master mix , 1 µL primer FAR-F1 5’-GAGACTTTCCCGCAAATCACC-3’,
1  µL  primer  FAR-R1.5’-GCAGATGATTGT GACCGTTTAGTTC-3’  dan  9.5  µL  ddH 2 O sehingga didapat volume 25 µL pada masing- masing  tabung  mikro.  Reaksi  amplifikasi terdiri atas denaturasi pada suhu 95 °C selama 30 detik, penempelan pada suhu 55 °C selama 30 detik, dan pemanjangan pada suhu 72 °C selama  90  detik.  Siklus  ini  berlangsung sebanyak 44 kali dengan pemanjangan terakhir pada suhu 72 °C selama lima menit.
Visualisasi pita DNA dilakukan melalui proses  elektroforesis.  Sebanyak  0.3  g  gel agarosa  1%  dilarutkan  dalam  30  mL  larutan bufer (Tris-HCl 45 mM, asam  borat 45 mM, EDTA 1 mM). Larutan gel agarosa dipanaskan pada  mikrogelombang  selama  dua  menit dengan  tingkat  pemanasan  sedang.  Gel agarosa  yang  telah  dingin  dituangkan  ke dalam cetakan dan dibiarkan hingga mengeras. Pengukuran DNA menggunakan DNA ladder 100 pb. Sebanyak 5 µL sampel DNA dimasukkan  ke  dalam  sumuran  yang  telah dibentuk  pada  gel  agarosa.  Elektroforesis dilakukan pada tegangan 50 V DC selama 50 menit. Hasil elektoforesis direndam di dalam larutan etidium bromida selama 30 menit lalu dalam air steril selama 1 menit. Visualisasi dilakukan menggunakan transluminator UV dan dokumentasi menggunakan kamera.
Analisis Sekuensing dan Konstruksi Pohon Filogenetika Fragmen DNA hasil amplifikasi dikirimkan ke 1 st BASE  Laboratories  Malaysia  untuk dirunut DNA-nya. Hasil perunutan dianalisis menggunakan program basic local alignment search tool (BLAST) dengan program optimasi  untuk  mendapatkan  urutan  basa
DNA yang terdapat dalam situs national center for biotechnology information (NCBI). Sekuen  nukleotida  yang  diperoleh  dianalisis menggunakan penyejajaran berganda Clustal W pada perangkat lunak Bioedit sequence alignment editor versi 7.1.3.  Hubungan kekerabatan antargalur nematoda dikontruksi menggunakan perangkat lunak molecular evolutionery genetic analysis versi  10.0 (MEGA X) dengan bootstrap 1000×.

## HASIL
Karakter Morfologi Nematoda A. besseyi Nematoda A. besseyi berhasil  diekstrak dari  padi  var.  “Ciherang”,  “Inpari  Sidenuk”, “Sintanur”, “Hibrida Prima”, dan “Pak Tiwi”. Nematoda ini memiliki ciri bentuk vermiform dengan tubuh lurus atau sedikit melengkung. Ukuran tubuh nematoda betina lebih panjang daripada jantan. Nematoda ini memiliki stilet yang  relatif  kecil  dengan  pangkal  sedikit membesar  yang  disebut  stomatostilet  dan bulbus  median  yang  besar  berbentuk  oval serta kelenjar esofagus saling tumpang tindih (Gambar  1a).  Vulva  terdapat  pada  bagian posterior  nematoda  betina  (Gambar  1b)  dan spikula  yang  berbentuk  seperti  duri  mawar terdapat  pada  nematoda  jantan  (Gambar 1c).  Ciri  khas  lainnya  ialah  ekor  meruncing berbentuk  kerucut  dan  memiliki  mukro (Gambar  1c).  Bagian  ekor  nematoda  betina terdapat dua mukro. Tubuh nematoda ramping dan berbentuk seperti cacing (Gambar 1d).
Hasil Pengukuran Morfometrik A. besseyi Berdasarkan hasil morfometrik A. besseyi isolat  Indonesia  yang  berasosiasi  dengan varietas  “Pak  Tiwi”,  “Sintanur”,  “Hibrida Prima,  “Ciherang”  dan  Inpari  Sidenuk” memiliki karakter dalam kisaran yang berbeda-beda  (Tabel  1).  Karakter A. besseyi yang  diamati  meliputi  panjang  tubuh  (L), diameter  tubuh  maksimum  (W),  panjang stilet (S), persentase jarak vulva dari anterior terhadap  panjang  tubuh  (V),  dan  persentase T  merupakan  perbandingan  panjang  gonad anterior  dengan  panjang  tubuh  (T).  Panjang tubuh,  panjang  stilet,  dan  persentase  jarak
vulva  dari  anterior  terhadap  panjang  tubuh dari A. besseyi yang berasal dari lima varietas ini  menunjukkan  tidak  berbeda  nyata  (Tabel 1).  Diameter  tubuh  maksimum  dan  panjang ekor A. besseyi dari varietas “Ciherang”, “Pak Tiwi”, dan “Sintanur” berbeda nyata dengan A. besseyi dari varietas ”Hibrida Prima” dan “Inpari Sidenuk”.
Hasil  Amplifikasi  Gen  AB-FAR-1  dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) Amplifikasi gen AB FAR-
1 berhasil dilakukan menggunakan pasangan primer spesifik forward (5’-GAGACTTTCCCGCAAATCACC-3’) dan reverse (5’-  GCAGATGATTGTGA CCGTTTAGTTC  -3’).  Kelima  varietas  padi mengandung gen AB FAR-1 dengan pita DNA berukuran sekitar 150 pb (Gambar 2).
Hasil Analisis Sekuensing dan Konstruksi Pohon Filogenetika Gen AB FAR-1 A. besseyi isolat Indonesia dari  varietas  “Ciherang”,  “Inpari  Sidenuk”, “Sintanur”, “Hibrida Prima”, dan “Pak Tiwi” berhasil  dirunut  dengan  panjang  nukleotida
Tabel 1  Karakter morfometrik Aphelenchoides besseyi dari lima varietas padi
A. besseyi pada varietas padi Karakter morfometrik L W S V T Ciherang 553 a 14.536 b 12.833 a 72.016 a 36.527 b Pak Tiwi 636 a 14.350 b 11.716 a 70.280 a 35.840 b Sintanur 630 a 13.733 b 12.216 a 70.973 a 30.673 b Hibrida Prima 667 a 18.993 a 12.323 a 68.383 a 45.593 a Inpari Sidenuk 636 a 18.013 a 12.273 a 69.043 a 46.806 a
Keterangan: L, Panjang tubuh (µm); W, Diameter tubuh maximum (µm); S, Panjang stilet (µm); V, Persentase jarak vulva dari anterior terhadap panjang tubuh (%); dan T, Perbandingan panjang gonad anterior dengan panjang tubuh (%).
Gambar 1  Ciri nematoda Aphelenchoides besseyi. a, Stilet bertipe stomato stilet dan berbentuk seperti tombak, bibir sedikit melekuk, dan bulbus median berukuran besar; b, Vulva nematoda betina; C, Spikula pada nematoda jantan berbentuk seperti duri mawar dan mukro pada ujung ekor berjumlah 2; dan d, Tubuh nematoda.
Bibir set off Stilet Bulbus median Vulva Spikula Mukro a b c d
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Gambar 2  Hasil amplifikasi Gen AB-FAR-1 Aphelenchoides besseyi pada lima galur padi menggunakan primer spesifik: 1, DNA ladder 100 pb (Thermoscientific, US); 2, “Ciherang”; 3,”Pak Tiwi”; 4, “Hibrida Prima”; 5, “Sintanur”; 6, “Inpari Sidenuk”.
±150 pb 1000 pb 500 pb 200 pb 100 pb 1 2 3 4
5 6
sekitar 120 pb. Tingkat homologi nukleotida gen AB FAR-1 isolat dari varietas “Pak Tiwi” dan  “Sintanur”  dengan  isolat A. besseyi dari Cina sebesar 100%, sedangkan pada varietas “Ciherang”  95%,  “Hibrida  Prima”  98.3%, “Inpari Sidenuk”  92.5%. Hal ini menunjukkan bahwa A. besseyi dari padi asal Indonesia berkerabat  dekat  dengan  JQ686690.1  dari Cina (Tabel 2). Tingkat homologi asam amino gen AB FAR-1 isolat dari varietas ‘Pak Tiwi”, “Sintanur”  dengan  isolat A. besseyi dari Cina sebesar 100%, sedangkan pada varietas “Ciherang” dan “Inpari Sidenuk” 89.7%, dan “Hibrida Prima” 94.8%. (Tabel 2).
Runutan  nukleotida  Gen  AB  FAR-1 A. besseyi Indonesia  pada  varietas  “Ciherang” berbeda dengan A. besseyi Cina  JQ686690.1, “Pak  Tiwi”,  dan  “Sintanur”  pada  posisi nukleotida ke-4, 8, 13, 14, dan 15. A. besseyi Indonesia  varietas  “Inpari  Sidenuk”  berbeda dengan A. besseyi Cina    JQ686690.1  ,  “Pak Tiwi”, dan “Sintanur” pada posisi nukleotida 6, 8, 11, 12, 14, 15, 17, dan 19, sedangkan A.
besseyi Indonesia  varietas  “Hibrida  Prima” berbeda dengan A. besseyi Cina  JQ686690.1, “Pak  Tiwi”,  dan  “Sintanur”  pada  posisi nukleotida ke-95 dan 115 (Gambar 3). Runutan asam  amino  gen AB  FAR-1 A. besseyi pada varietas “Ciherang” berbeda dengan A. besseyi Cina  JQ686690.1, “Pak Tiwi”, dan “Sintanur” pada posisi ke-2, 3, 5, dan 18, sedangkan A. besseyi Indonesia  varietas  “Inpari  Sidenuk” terjadi  perbedaan  pada  posisi  ke-3,  4,  5, dan  6,  serta  pada  “Hibrida  Prima”  terdapat perbedaan asam amino pada urutan ke-32 dan 38 (Gambar 4).
Analisis  filogenetika  dari  runutan nukleotida dan asam amino menunjukkan bahwa  terdapat  dua  grup A. besseyi. Grup  1 terdiri atas AB  FAR-1 “Cina  JQ686690.1”, “Pak Tiwi”, “Sintanur”, dan “Hibrida Prima”. Grup 2 terdiri atas AB FAR-1 “Ciherang” dan “Inpari Sidenuk”. A. fragariae berada di luar pengelompokkan dikarenakan A. fragariae merupakan outgroup yang digunakan dalam analisis pohon filogenetika (Gambar 5 dan 6).
Tabel 2  Matriks homologi sekuen nukleotida dan asam amino gen AB-FAR1 Aphelenchoides besseyi pada varietas benih padi asal Indonesia dibandingkan dengan asal Cina
No AB FAR-1 varietas Negara asal No Aksesi Homologi sekuen nukleotida (%) Nukleotida Asam amino 1 “Cina JQ686690.1” Cina JQ686690.1 100 100 2 “Ciherang” Indonesia Na 95 89.70 3 “Hibrida Prima” Indonesia Na 98.30 94.80 4 “Inpari Sidenuk” Indonesia Na 92.50 89.70 5 “Pak Tiwi” Indonesia Na 100 100 6 “Sintanur” Indonesia Na 100 100 Keterangan: Na (belum ada nomor aksesi).
Gambar  3    Hasil  analisis  penyejajaran  runutan  nukleotida  gen AB  FAR-1 Aphelenchoides besseyi pada  lima  varietas  padi  menggunakan  program  ClustalW  (tanda  *  menunjukkan nukleotida yang identik).
Gambar 5  Pohon filogenetika Aphelenchoides besseyi dari benih padi galur “Ciherang”, “Inpari Sidenuk”,  “Sintanur”,  “Hibrida  Prima”,  dan  “Pak  Tiwi”  dengan  outgroup Aphlelenchoides fragariae berdasarkan perunutan nukleotida AB FAR-1 menggunakan program MEGA v.10.0 dengan metode Maximum Likelihood dengan boostrap 1000×.
A. besseyi Pak Tiwi Aphlelenchoides fragariae A. besseyi Sintanuri A. besseyi Cina JQ686690.1 A. besseyi Hibrida Prima A. besseyi Ciherang A. besseyi Inpari Sidenuk
Gambar  4    Hasil  analisis  penyejajaran  runutan  asam  amino  gen AB  FAR-1  menggunakan program ClustalW (tanda * menunjukkan asam amino yang identik).
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Gambar 6  Pohon filogenetika Aphelenchoides besseyi dari benih padi galur “Ciherang”, “Inpari Sidenuk”, “Sintanur”, “Hibrida Prima”, dan “Pak Tiwi” berdasarkan perunutan asam amino AB FAR-1  menggunakan  program  MEGA  v.10.0  dengan  metode  Maximum  Likelihood  dengan boostrap 1000×.
A. besseyi Pak Tiwi Aphlelenchoides fragariae A. besseyi Sintanuri A. besseyi Cina JQ686690.1
A. besseyi Hibrida Prima
A. besseyi Ciherang

## A. besseyi Inpari Sidenuk

## PEMBAHASAN
PCR  merupakan  salah  satu  teknik identifikasi  molekuler  suatu  gen  target  dari suatu spesies dengan menggunakan primer spesifik.  Gen  yang  menjadi  target  dalam identifikasi  nematoda  parasit  tumbuhan,  di antaranya ialah gen CO1, daerah ITS rDNA, SSU rDNA, dan gen AB-FAR 1. Primer  FAR-F1 dan FAR-R1 merupakan primer  spesifik  untuk  mengamplifikasi  gen AB-FAR  1 A. besseyi dengan ukuran target sebesar  150  pb.  Pasangan  primer  dianggap spesifik  hanya  jika  tidak  memiliki  amplikon pada target apa pun selain template yang digunakan  dalam  ambang  kekhususan  yang ditentukan oleh pengguna. Jika tidak, primer tersebut  dianggap  tidak  spesifik. Amplifikasi spesifik dari target yang dituju mensyaratkan bahwa  primer  tidak  memiliki  kecocokan dengan target lain dalam orientasi tertentu dan dalam jarak tertentu yang memungkinkan amplifikasi  yang  tidak  diinginkan  (Ye at al . 2012).  Dalam  mendesain  primer,  banyak kondisi  yang  harus  dipertimbangkan  secara seksama,  yaitu  panjang  primer,  perbedaan panjang  pasangan  primer,  kandungan  GC primer, komposisi nukleotida pada ujung primer  3,  (yaitu  GC  clamp),  ukuran  produk PCR, konsentrasi reagen buffer PCR, struktur sekunder  yang  stabil  (eliminasi dimer dan
hairpin ),  suhu  leleh  primer,  dan  perbedaan suhu  leleh  pasangan  primer  (Yuryev et al . 2002; Housley et al . 2006; Andreson et al . 2008 ; Boyle et al . 2009). Nematoda A. besseyi merupakan patogen terbawa  benih  yang  ditemukan  pada  benih varietas  “Pak  Tiwi”,  “Sintanur”,  “Hibrida Prima”,  “Ciherang”,  dan  “Inpari  Sidenuk”. Benih  varietas  “Pak  Tiwi”,”Sintanur”,  dan “Cina  JQ686690.1”  memiliki  homologi atau  kemiripan  yang  sama  baik  dari  sikuen nukleotida maupun asam amino. Jika sikuen nukleotida atau sikuen asam amino suatu protein dari suatu organisme yang dibandingkan  memiliki  kemiripan,  maka kedua sikuen tersebut diduga diturunkan dari sikuen nenek moyang yang sama ( common ancestor ). Analisis penyejajaran sikuen nukleotida akan menunjukkan di mana posisi sikuen yang tidak  berubah  atau  terkonservasi  dan  mana yang berubah atau bervariasi dan berkembang menjadi berbeda dari nenek moyang yang sama. Penyejajaran sikuen jamak ( multiple sequence alignment ) nukleotida dan asam amino dapat dilakukan dengan program Clustal W yang tersedia pada software “BioEdit sequence alignment editor versi  7.1.3”.  Penyejajaran sikuen jamak merupakan penyejajaran tiga  atau  lebih  sikuen  nukleotida  dan  asam amino (Mount 2004). Penyejajaran ini dapat
digunakan  untuk  melihat  homologi  baik secara  keseluruhan  ataupun  parsial,  yang nanti  hasilnya  dapat  digunakan  untuk melihat  kekerabatan  antar spesies (Mount 2004). Tujuan dari analisis penyejajaran ialah  mencocokkan  urutan  nukleotida  yang homolog,  yang  mempunyai  nenek  moyang yang sama (Kemena dan Notredame 2009), sehingga  dapat  melihat  hubungan  evolusi antar sikuen (Mount 2004).
Pada  analisis  penyejajaran,  AB  FAR-1 varietas  “Hibrida  Prima”,  “Ciherang”,  dan “Inpari  Sidenuk”  mengalami  perubahan basa  nitrogen  pada  beberapa  posisi tertentu.  Adanya  perubahan  tersebut  akan mempengaruhi  pembentukan  asam  amino sehigga berpengaruh pula pada pembentukan protein.  Dalam  analisis  filogenetika  data sikuen nukleotida atau protein diolah sehingga dapat menggambarkan hubungan kekerabatan evolusi  suatu  kelompok  organisme  (Hidayat dan  Pancoro  2008).  Hasil  perunutan nukleotida digunakan untul menganalisis filogenetika  nematoda A. besseyi sehingga dapat mengetahui asal usulnya. Karakterisasi suatu gen AB FAR-1 secara lengkap  perlu  dilakukan  untuk  mengetahui keberhasilan  pengendalian  menggunakan RNA- i .  RNA- i . Hal ini merupakan teknik menghambat  atau  mencegah  ekspresi  gen melalui  pemanfaatan  sifat  komplemen (berpasangan)  RNA  dengan  potongan nukleotida  atau  RNA  berukuran  pendek (sekitar 21–23 nukleotida) (Cheng et al . 2013).
Ada tiga mekanisme RNA- i dalam melakukan inaktivasi  terhadap  gen,  yaitu  mendorong terjadinya  degradasi  akibat  terbentuknya kompleks  gen  dengan  RNA- i ,  menghambat terjadinya  translasi  akibat  terhalangnya RNA  ribosom  membaca  urutan  gen  karena terbentuknya  kompleks  RNA-gen,  serta induksi modifikasi kromatin dengan promoter sehingga gen mengalami inaktivasi (Cheng et al .  2013).  Gen  FAR  memiliki  peranan  yang sangat  penting  dalam  proses  perkembangan infeksi  nematoda  parasit  tumbuhan  dan mengganggu  reaksi  pertahanan  tanaman terhadap  nematoda.  Dengan  demikian, penghambatan  gen  FAR  berpotensi  sebagai
salah satu cara pengendalian A. besseyi (Cheng et al . 2013). Gen  AB-FAR  1  berhasil  diamplifikasi menggunakan  primer  spesifik  FAR-F1 dan  FAR-R1.  Analisis  penyejajaran  dan filogenetika  juga  telah  dilakukan  untuk mengetahui  runutan  nukleotida  dan  asam amino gen AB FAR-1 A. besseyi pada beberapa varietas benih padi. Hasil ini dapat digunakan dalam karakterisasi lanjut pengendalian A. besseyi dengan inaktivasi gen AB FAR-1 .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  Kementerian  Riset, Teknologi,  dan  Pendidikan  Tinggi  Republik Indonesia untuk dana penelitian melalui Skema Penelitian PDUPT tahun 2018 dengan kontrak no. 1744/IT3.11/PN/2018. Terima kasih kepada Ade Indra Maulana Sembiring, Derma  Erni  Harefa,  dan  Maurice  Yosua Hutauruk  untuk  bantuan  dalam  ekstraksi nematoda dan DNA.

## DAFTAR PUSTAKA
Andreson  R,  Mols  T,  Remm  M.  2008. Predicting  failure  rate  of  PCR  in  large genomes. Nucleic Acids Res. 36(11):e66. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkn290 . Boyle  B,  Dallaire  N,  MacKay  J.  2009. Evaluation  of  the  impact  of  single nucleotide  polymorphisms  and  primer mismatches  on  quantitative  PCR.  BMC Biotechnol  9:75.  DOI:  https://doi. org/10.1186/1472-6750-9-75 .
Chalanska  A,  Labanowski  G,  Malewski  T. 2011.  Rapid  microscopic  and  molecular method Aphelenchoides species identification.  Comm  Agric  Appl  Biol Sci. 76(3):399–402.
Cheng  X,  Xiang  Y,  Xie  H,  Xu  LC,  Xie FT,  Zhang  C,  Li  Y.  2013.  Molecular characterization  and  functions  of  fatty acid  and  retinoid  binding  protein  gene (Ab-far-1)  in Aphelenchoides besseyi . PLoS One. 8(6):1–9. DOI: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0066011.
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Kurniawati et al.
Doyle JJ, Doyle JL. 1990. A rapid total DNA preparation  procedure  for  fresh  plant tissue. Focus. 12:13–15. DOI: https://doi. org/10.2307/2419362.
[EPPO]  European  and  Mediterranean Plant  Protection  Organization.  2017. Aphelenchoides besseyi .  EPPO  Bull. 47(3):384–400. DOI: https://doi. org/10.1111/epp.12432. Hidayat  T,  Pancoro  A.  2008.  Ulasan  kajian filogenetika  molekuler  dan  peranannya dalam menyediakan informasi dasar untuk meningkatkan  kualitas  sumber  genetik anggrek. J ArgoBiogen. 4(1):35-40. DOI: https://doi.org/10.21082/jbio.v4n1.2008. p35-40 . Housley DJE, Zalewski ZA, Beckett SE, Venta
PJ.  2006.  Design  factors  that  influence PCR amplification success of cross-species primers among 1147 mammalian primer pairs.  BMC  Genomics.  7(1):253.  DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2164-7-253 . Kemena  C,  Notredame  C.  2009.  Upcoming challenges for multiple sequence alignment methods  in  the  high-throughput  era.
Bioinformatics  25(19):2455–2465.  DOI: http://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btp452. Mount  DW.  2004. Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis .  New  York  (US): Cold Spring Harbor Laboratory. Remeeus PM, Pelazza N. 2014. Detection of Aphelenchoides besseyi on Oryza sativa. Annexe to chapter 7: Seed Health Testing Methods. Switzerland (CH): ISTA.
Ye J,  Coulouris G,  Zaretskaya I, Cutcutache I,  Rozen  S,  Madden  TL.  2012.  Primer- BLAST:  A  tool  to  design  target- specific  primers  for  polymerase  chain reaction. BMC Bioinformatics 13:134. DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2105- 13-134 . Yuryev A, Huang J, Pohl M, Patch R, Watson F,  Bell  P,  Donaldson  M,  Phillips  MS, Boyce-Jacino  MT.  2002.  Predicting  the success  of  primer  extension  genotyping assays using statistical modeling. Nucleic Acids Res. 30(23):e131. DOI: https://doi. org/10.1093/nar/gnf131 .