Deteksi Penyakit WSSV (White Spot Syndrome Virus) pada Udang Vannamei (Litopenaeus vannamei) dengan Metode PCR Konvensional dan Real Time PCR (qPCR) Menggunakan Hydrolisis Probe
Heppi Maryati, Sudarto, dan Reni Nurjasmi Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Respati Indonesia

## Abstrak
Diagnosa  WSSV  yang  menyerang  udang  vannamei  dapat  dilakukan  secara  dini menggunakan  metode  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)  baik  secara  konvensional maupun real time PCR (qPCR), sehingga dapat diambil tindakan pencegahan khususnya pada benur udang yang akan ditebar. Kedua metode tersebut mampu mendeteksi virus melalui keberadaan DNA virus namun memiliki efektivitas yang berbeda, namun belum diketahui  sejauh  mana  efektivitas  kedua  metode  tersebut  mampu  mendeteksi  virus khususnya  penyebab  WSSV.  Tujuan  penelitian  adalah  mengetahui  efektivitas  metode PCR  konvensional  dan  Metode  real  time  PCR  (qPCR)  menggunakan  hydrolisis  probe mendeteksi penyakit pada udang Vannamei (Litopnaeus vannamei).
Metode  penelitian  menggunakan  metode  eksperimen  bersifat  kualitatif dilaksanakan  di  Laboratorium  Biomolekuler  di  Balai  Uji  Standar  Karantina  Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKIPM). Sampel udang vannamei diambil dari tambak udang di Kecamatan Blanakan Subang Jawa Barat yang terdiri atas masing-masing 6 ekor udang berumur 20 hari atau udang yang belum mengalami gejala klinis dan udang berumur 45 atau udang yang sudah mengalami gejala klinis, kemudian dilakukan ekstraksi DNA sampel udang. DNA udang diamplifikasi menggunakan metode konvensional  PCR  dan  real  time  PCR.  Data  hasil  amplifikasi  dianalisis  menggunakan metode  deskriptif  komparatif  yaitu  metode  pembahasan  yang  memaparkan  atau menggambarkan  kegiatan  yang  dilakukan  serta  membandingkan  dengan  literatur. Analisis data sesuai dengan software real-time PCR yang digunakan.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  metode  konvensional  PCR  memberikan hasil  negatif  pada  sampel  udang  berumur  20  hari  dan  positif  pada  udang  berumur  45 hari  sedangkan  metode  real  time  PCR  memberikan  hasil  positif  pada  sampel  udang berumur 20 hari dan 45 hari, sehingga dapat disimpulkan bahwa metode real time PCR (qPCR)  lebih  efektif  mendeteksi  penyakit  WSSV  pada  udang  vannamei  dibandingkan metode PCR konvensional.
Kata kunci:  udang vannamei, penyakit WSSV, PCR konvensional, real time PCR

## 1. PENDAHULUAN
Indonesia  merupakan  negara  yang  memiliki  garis  pantai  yang  terpanjang  di dunia,  sehingga  membuat  budidaya  udang  menjadi  mudah  dikembangkan.Udang merupakan  salah  satu  hasil  budidaya  perikanan  yang  mempunyai  nilai  ekonomis  dan permintaan pasar yang tinggi. Produksi udang nasional pada tahun 2011adalah 400.385 ton kemudian meningkat  pada tahun 2012 menjadi 457.600 ton. Produksi udang pada tahun  2014  diharapkan  naik  74,75%  menjadi  699.000  ton.  Dalam  sektor  ekspor perikanan, ekspor udang menyumbang devisa bagi negara sebesar 3,9 miliar dollar AS. Tahun  2013,  kontribusi  udang  mencapai  40%  dari  total  nilai  ekspor  perikanan  yang ditargetkan mencapai 5 miliar dollar AS (Anonim, 2013).
Udang  Vannamei  mulai  dibudidayakan  secara  intensif  di  indonesia  sejak  tahun 2001  berdasarkan  Surat  Keputusan  Menteri  Kelautan  dan  Perikanan  No.  14/2001 tanggal  12  juli  2001  (Adiwidjaya,  2008).  Udang  vannamei  memiliki  kelebihan  yaitu memiliki  pertumbuhan  yang  cepat,  dapat  dibudidayakan  dengan  kepadatan  tinggi  dan harga  pasar  yang  cukup  tinggi  (Nuraini  dkk.,  2007).  Produksi  udang  vannamei  sendiri meningkat  sejak  tahun  2005  dari  280.629  ton  menjadi  400.300  ton  di  tahun  2010, namun  pada  tahun  2009  mengalami  penurunan  dari  produksi  sebelumnya  sebesar 61.490 ton (KKP, 2010b). Pertumbuhan budidaya  udang vannamei yang semakin pesat serta  perubahan  iklim  lokal  membuat  keseimbangan  lingkungan  berubah.  Hal  ini menyebabkandaya  tahan udang  menurun,  sehingga  mudah  terkena  penyakit. Penyakit infeksi  dapat  timbul  karena  lingkungan  hidup  yang  tidak  sehat  atau  hilangnya keseimbangan  antara  patogen,  lingkungan  dan  inang,  yang  menyebabkan  stress  pada udang.  Faktor-faktor  penyebab  menurunnya  ketahanan  tubuh  organisme  udang terhadap serangan penyakit, karena kualitas lingkungan yang buruk, jika hal ini dibiarkan secara terus-menerus maka kematian secara masal akanterjadi sehingga populasi akan menurun.
Salah satu penyakit udang yang mematikan adalah White Spot Syndrome Virus (WSSV). Penyakit ini mempunyai inang yang sangat luas, tidak hanya jenis udang penaid namun  bisa  menyerang  decapoda  (Lo  et  al.,  1996a,  Lo  et  al.,  1996b).  WSSV  dapat menyebabkan  kerugian  secara  ekonomis  yang  sangat  besar.  Kerugian  yang  telah ditimbulkan  sejak  pertama  kali  wabah  di  Asia  pada  tahun  1992  hingga  tahun  2001 adalah  sebesar  4  hingga  6  juta  dollar  AS  (Lightner,  2003).  Kematian  udang  pada  umur satu sampai dua bulan di tambak sudah menjadi hal yang umum sebagai akibat serangan virus bercak  putih, yang mengakibatkan ribuan hektar tambak tidak dapat berproduksi lagi. Hal ini berdampak terhadap kerugian Negara yang diperkirakan mencapai 2,5 triliun rupiah per tahun (Ditjen Perikanan Budidaya, 2004).
Wabah  WSSV  dilaporkan  telah  menyerang  udang  Windu  di  Sidoarjo  yang mengakibatkan  petambak  mengalami  kerugian  besar.  Selain  menyerang  udang  Windu, wabah ini juga menyerang udang vannamei dan telah mewabah lebih dari satu dekade terakhir  (Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan,  2014).  Oleh  sebab  itu,  diperlukan metode diagnosa dini yang cepat, sensitif dan akurat sebagai langkah pencegahan awal terhadap penyebaran penyakit ini.
Usaha  mengatasi  WSSV  adalah  melakukan  diagnosa  dini  dalam  deteksi  WSSV yang  menyerang  udang  vannamei.  Kegiatan  diagnosa  meliputi  pengujian,  deteksi  dan identifikasi  untuk  mengetahui  jenis  virus  yang  menyerang  secara  spesifik.  Salah  satu pendekatan yang dapat digunakan adalah biologi molekuler menggunakan metode PCR Konvensional dan metode Real Time PCR. Virus yang menginfeksi udang dalam jumlah sedikit  dan  belum  menimbulkan  gejala  penyakit  pada  udang  dapat  dideteksi  dengan menggunakan alat PCR. Keberadaan virus dapat dilacak sejak dini karena bahan genetik virus  yang  jumlahnya  sedikit  dapat  digandakan  dengan  PCR  sehingga  keberadaannya segera  dilacak  dan  dapat  diambil  tindakan  pencegahan  khususnya  pada  benur  udang yang akan ditebar.
Pada  analisa  PCR  konvensional  deteksi  keberadaan  DNA  dilakukan  pada  akhir reaksi  dan  pengamatan  keberadaan  DNA  hasil  amplifikasi  dilakukan  di  gel  agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan real time PCR pengamatan hasil pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat
diamati  pada  grafik  yang  muncul  sebagai  hasil  akumulasi  fluoresensi  dari  probe (penanda).

## 2. TUJUAN PENELITIAN
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efektivitas metode PCR konvensional dan Metode real time PCR (qPCR) menggunakan hydrolisis probe mendeteksi penyakit pada udang Vannamei (Litopnaeus vannamei).

## 3. BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  adalah  pengukur  konsentrasi  asam  nukleat  berbasis spektrofotometri,  freezer  (-20°C  atau  lebih  rendah),waterbath,laminar  air  flow,  mesin real-time PCR, mini mixer, mikropipet ukuran 0,1µl-1.000µl, pinset, gunting, rak blok es, sentrifus,  masker,penggerus,sarung  tangan,  tabung  dan  mikro  ukuran  0,2  ml;  1,5  ml-2 ml.Bahan yang digunakan yaitu buffer tris EDTA (TE) (konsentrasi 10 mM Tris HCl 1 mM EDTA pH 7,5), nuclease -free water, etanol p.a, filtered microtip berbagai ukuran 10 µl – 1 000  µl,  isopropanol  (2-propanol),  kloroform, kit  real-time PCR  komersial compatible dengan TaqMan ® probe ,  larutan  ekstraksi  DNA  komersial,  larutan DNAse , plasmid standar positif, 1 set primer dan probe ( PrimerWSSV270:5'- ACCATGGAGAAGATATGTACAAGCA-3';PrimerWSSV345:5'-GGCATGGACAGTCAGGTCTTT- 3';WSSV296T probe :5'-FAM- TTACAGTGATGGAATTTCGTTTATC-TAMRA).

## 3.1.  Metode Penelitian
Metode penelitian menggunakan metode eksperimen kualitatif  dilaksanakan di Laboratorium Biomolekuler di Balai Uji Standar Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKIPM).
a. Persiapan Sampel
Sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalahsampel  udang  vannamei yang diperoleh dari tambak udang yang berasal dari daerah Blanakan kabupaten Subang Jawa  Barat,  jumlah  sampel  yang  di  siapkan  sebanyak  6  ekor  udang  yang  belum mengalami gejala klinis dengan umur udang 20 hari, kemudian sampel sebanyak 6 ekor udang berumur 45 hari yang sudah mengalami gejala klinis. Sampel udang yang masih berupa  fiksatif  dimasukkan  ke  dalam  larutan  alkohol  96%.  Selanjutnya  dilakukan nekropsi pada sampel berupa pengambilan organ target sampel yaitu kaki renang yang akan di ekstraksi DNA.
b. Ekstraksi DNA
Contoh uji sebanyak 20 mg dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml kemudian ditambahkan  600  µl  larutan  kit  ekstraksi  DNA  komersial Dodecyl  trimethyl  bromide (DTAB) dan dihomogenkan menggunakan penggerus pelet. Larutan diinkubasi pada suhu 75°C  selama  5  menit  lalu  didinginkan  sampai  suhu  ruang,  kemudian  ditambahkan Kloroform sebanyak 700 µl ke dalam tabung lalu divortex sampai tercampur rata selama 20  detik.  Sisa-sisa  jaringan  diendapkan  dengan  sentrifugasi  padakecepatan  12.000 rpmselama  5  menit.Supernatan  atau  cairan  lapisan  paling  atas  dipindahkan  ke  dalam tabung  baru  sebanyak  200  µl,  kemudian  ditambahkan  larutan  kit  ekstraksi Cetyl Trimethylammonium  Bromide (CTAB)  sebanyak  100  µl  dan  ddH 2 O  sebanyak  900  µl setelah itu divortexdan inkubasi pada suhu 75°C selama 5 menit, lalu didinginkan sampai suhu  ruang,  DNA  diendapkan  dengan  sentrifugasi  padakecepatan  12000  rpm  selama 5 menit.  Larutan  bening  hasil  sentrifugasi  kemudian  dipindahkan  kedalam  tabung  mikro
baru  yang  sudah  berisi  300  µl  etanol  95%,  lalu  larutan  dihomogenkan  kemudian disentrifugasi  pada  12000  rpm  selama  5  menit.  Supernatan  dibuang  lalu  pelet  dicuci dengan dengan 200 µl etanol 75% laludisentrifugasi pada kecepatan  7.500 rpmselama 2 menit.  Pelet  dikeringkan  kemudian  dilarutkan  dengan  50  –  100  µl  dd2H2O  atau  TE buffer, lalu  simpan  larutan  DNA  pada  suhu  -20°C  apabila  segera  digunakan  dan  untuk penyimpanan  lebih  lama  pada freezer dengan  suhu  yang  lebih  rendah  (<-40°C)  dalam bentuk alikuot.
3.2.  Pemeriksaan dengan Metode PCR Konvensionl
a. Amplifikasi PCR
Kegiatan amplifikasi ini bertujuan untuk menggandakan DNA yaitu melalui 2 kali proses amplifikasi, pada amplifikasi pertama atau First Step PCR dibutuhkan komponen yaitu:
Tabel 1. Komposisi First Step PCR No. Komponen Volume/reaksi (μl) 1. Go Taq Green 12 2. Primer Forward (10 Μm) 1 3. Primer Reverse (10 Μm) 1 4. Template DNA 4 5. NFW (Nucleous Free Water) 7 Total Volume 25 Tabel 2. Profil Amplifikasi Single Step PCR Pre Heat 94 o C, 4 Menit 55 o C, 1 Menit
72 o C, 2 Menit 40 Siklus Denaturasi Annealing Ekstensi 94 o C, 60 detik 55 o C, 60 detik
72 o C, 2 menit Final ekstensi 72 o C, 5 menit Hold/End 4 o, Amplicon 1447 bp
Dengan membuat Master Mix yang merupakan campuran dari primer F, R, Go Taq Green dan NFW sesuai dengan jumlah reaksi uji ditambah 2 kontrol (+) dan kontrol (-), semua komposisi di tabel I dicampur menjadi 1 tube dihomogenkan dengan divortex lalu  di  spindown.  Setelah  itu  di  amplifikasi  dalam  mesin  PCR  sesuai  dengan  profil  PCR WSSV pada tabel 2. Proses amplifikasi pertama akan menghasilkan produk First PCR atau yang biasa disebut amplicon , dan sebanyak 1-2 µl produk amplicon ini akan digunakan sebagai sampel untuk amplifikasi kedua dari metode Nested PCR. Tabel 3. Komposisi Nested PCR No. Komponen Volume/reaksi (μl) 1. Go Taq Green 12 2. Primer NF (10 Μm) 1 3. Primer NR (10 Μm) 1 4. Template DNA 2 5. NFW (Nucleous Free Water) 9
No. Komponen Volume/reaksi (μl) Total Volume 25 Tabel 4. Profil Amplifikasi Nested PCR Pre Heat 94 o C, 4 Menit 55 o C, 1 Menit 72 o C, 2 Menit 40 Siklus Denaturasi Annealing Ekstensi 94 o C, 60 detik 55 o C, 60 detik 72 o C, 2 menit Final ekstensi 72 o C, 5 menit Hold/End 4 o, Amplicon 941 bp
Dengan  membuat Master  Mix yang  merupakan  campuran  dari  primer  NF,  NR, Go  Taq  Green  dan  NFW  sesuai  dengan  jumlah  reaksi  uji  ditambah  2  kontrol  (+)  dan kontrol (-), semua komposisi di tabel I dicampur menjadi 1 tube dihomogenkan dengan divortex  lalu  di  spindown.  Setelah  itu  di  amplifikasi  dalam  mesin  PCR  sesuai  dengan profil PCR WSSV pada tabel 4. Proses amplifikasi kedua atau Nested PCR ini merupakan proses  akhir  dari  kegiatan  amplifikasi  WSSV  dan  kemudian    akan  dilakukan  proses selanjutnya yaitu elektroforesis.
b. Elektroforesis
Amplicon yang didapat dari hasil amplifikasi dianalisa lebih lanjut dengan Elektroforesis  gel  agarose  untuk  menunjukkan  hasil  dari  WSSV  pada  udang  vannamei. Berikut  langkah-langkah  proses  elektroforesis  adalah  pembuatan  agarose  dengan konsentrasi 1,5% dengan cara menimbang agarose sebanyak 0,75g lalu dilarutkan dalam 50ml TAE ( Tris Acis ADTA) Buffer 1x, kemudian dipanaskan dalam microwave sampai gel agarose benar benar larut dan berwarna bening. Kemudian didinginkan sampai suhu 50 o C lalu ditambahkan 4 µl SYBR Safe, agarose yang telah larut dimasukkan didalam bejana elektro tunggu sampai agarose mengeras, setelah itu larutan TAE buffer 1x  dituang ke dalam  bejana  elektroforesis  kemudian  masukkan  ke  dalam  lubang  sumuran  gel  secara berurutan  marker/ladder,  kontrol  positif,  kontrol  negatif    dan  amplicon  sampel. Kemudian dialiri listrik dengan tegangan 100 volt selama ± 30 menit sampai  pita turun dengan ditandai dengan berpindahnya amplicon ke bagian bawah gel agarose. Setelah bands turun  kemudian  gel  agarose  dipindahkan  ke  dalam mesin UV  Transmilluminator yang sudah dikoneksikan dengan PC dengan program UVITEC untuk dapat melihat dan membaca hasilnya.
3.4.2 Pemeriksaan dengan Metode Real Time PCR
a. Amplifikasi Real Time PCR DNA template ,  Quantitect  2x  PCR  Master  Mix,  primer, probe ,  Nuclease- free water dibiarkan  cairdengan  meletakkan  bahan  tersebut  di  atas  rak  blok  es.  Preparasi master mix dibuatsesuai yang disajikan pada Tabel 5. Volume mastermix n+1 (n= setiap 10  jumlah  reaksi)  disiapkan  lebih  banyak  dari  yang  dibutuhkan.  Contoh  uji  minimal dianalisissecara  duplo.  Semua  bahan master  mix dihomogenkan  dan  distribusikan  ke dalam masing-masing tabungPCRoptikal kemudian dimasukkan 2 μl template DNA (10 ng
– 100 ng) contoh uji,  kontrol  positif ekstraksi ; kontrol negatif ekstraksi, kontrol positif
amplifikasi  (DNA);    kontrol  negatif  amplifikasi  (NTC);  dan  4  standar  positif  (10 copies ; 10 2 copies ; 10 3 copies ; 10 4 copies ). Setelah itu, dilakukan amplifikasi dengan real time PCR, dengan kondisi sesuaiTabel 6.
Tabel5- Komposisi koktail untuk Qpcr No. Komponen Volume/reaksi (μl) Konsentrasi akhir 1. Quantitect 2x PCR master mix 12,5 1 x 2. Primer Forward (20 Μm) 0,5 0,4 Μm 3. Primer Reverse (20 Μm) 0,5 0,4 Μm 4. Probe (10 Μm) 0,5 0,2 Μm 5. DNAase free water 9 - 6. Template DNA 2 10 ng-100 ng Total Volume 25 Tabel 6. Program amplifikasi Proses Suhu ( o C) Waktu PCR initial Activation 95 15 menit 1 Denaturasi 94 15 detik 40 Annealing/extention 60 60 detik 40

## b. Analisa Data
Data  dianalisis  menggunakan  metode  deskriptif  komparatif  yaitu  metode pembahasan  yang  memaparkan  atau  menggambarkan  kegiatan  yang  dilakukan  serta membandingkan  dengan  literatur.  Analisis  data  sesuai  dengan software  real-time  PCR yang digunakan. Contoh uji dinyatakan positif apabila terlihat naiknya kurva di atas garis threshold/cut off dan nilai Ct lebih kecil atau sama dengan LoD, semakin cepat naik atau munculnya kurva dan memotong garis threshold/cut off menunjukkan jumlah copy DNA virus  yang  semakin  banyak    atau  konsentrasinya  tinggi,  contoh  uji  dinyatakan  negatif apabila berada dibawah garis threshold/cut off dan nilai Ct lebih besar dari LoD dengan tingkat kepercayaan ( confident level) 95%.

## 4. HASIL DAN PEMBAHASAN Deskripsi Sampel Udang
Sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu  udang  yang  berasal  dari daerah  kecamatan  Blanakan  kabupaten  SubangJawa  Barat,  sampel  sebanyak  12  ekor udang  vannamei,  sampel  sebanyak  6  ekor  udang  yang  berumur  20  hari  belum mengalami tanda-tanda gejala klinis terinfeksi virus WSSV yang diberi kode B1, B2, B3, B4, B5 dan B6, sampel kedua sebanyak 6 ekor udang berumur 45 hari yang diberi kode A1, A2, A3, A4, A5 dan A6 dimana sampel udang tersebut sudah mengalami tanda tanda gejala klinis terinfeksi virus WSSV.

## Hasil Deteksi WSSV dengan PCR Konvensional
Hasil  deteksi  virus  WSSV  pada  sampel  udang  vannamei  umur  20  hari menggunakan  metode  uji  PCR  konvensional  keseluruhan  sampel  menunjukkan  negatif terinfeksi WSSV, ditandai dengan tidak adanya pita pada 941bp. Sampel udang B1, B2, B3, B4, B5 dan B6 (gambar 4) dinyatakan negatif terinfeksi virus WSSV.
Pada  udang  vannamei  usia  20  hari  terdiri  dari  enam  (6)  sampel  udang  yang diperiksa  dengan  menggunakan    PCR  konvensional  hasil  pengujian  negatif  terinfeksi
virus WSSV disajikan pada(gambar 4) terlihat bahwa sumur 1 adalah DNA Marker ladder 100  bp,  sumur  2  adalah  kontrol  positif  dan  sumur  3  adalah  kontrol  negatif  sedangkan sumur 4 sampai sumur 9 adalah sampel yang di uji, pada sumur 4 sampai sumur 9adalah sampel  kode  B1,B2,B3,  B4,  B5  dan  B6  tidak  menunjukkan  adanya  pita  DNA  WSSV. Menurut  Dwinanti  (2006),  pada  PCR  Konvensional  hasil  negatif  yang  salah  dapat disebabkan  karena  jumlah  kopian  DNA  yang  tidak  mencukupi  dan  tingkat  infeksi  yang terlalu rendah sehingga pita DNA berpendar redup atau bahkan tidak berpendar. Hal ini juga  berbeda    dengan  pendapat  Natividat et  al .,  2006  bahwa  sampel  yang  terinfeksi virus WSSV jika pada jalur DNA genom muncul pita DNA pada 211bp.
Sedangkan hasil deteksi virus WSSV pada sampel udang vannamei umur 45 hari menggunakan  metode  uji  PCR  Konvensional  keseluruhan  sampel  menunjukkan  hasil positif terinfeksi WSSV, ditandai dengan adanya pitapada 941bp. Sampel A1, A2, A3,A4, A5dan A6 (gambar 5) dinyatakan positif terinfeksi WSSV. Pada udang vanname usia 45 hari terdiri dari enam (6) sampel udang yang diperiksa dengan menggunakan metode uji PCR  konvensional  hasil  pengujian  disajikan  pada  (gambar  5)  terlihat  bahwa  sumur  1 adalah  DNA  Marker  lodder  100bp,  sumur  2  adalah  kontrol  positif  dan  sumur 3  adalah kontrol negatif sedangkan sumur 4 sampai sumur 9 adalah sampel yang di uji yaitu kode A1,  A2,  A3,  A4,  A5  dan  A6  menunjukkan  hasil  positif  karena  terlihat  perpendaran  pita DNA WSSV  berada  pada 941 bp.  Hal ini sesuai dengan pendapat Natividat et  al ., 2006 bahwa  sampel  yang  terinfeksi  oleh White  Spot  Syndrome  Virus jika  pada  jalur  DNA genom muncul pita DNA pada 211bp.
Deteksi WSSV dengan Real Time PCR (qPCR)
Hasil deteksi real time PCR (qPCR)  pada  sampel  udang vannamei umur 20 hari menunjukkan keseluruhan sampel positif terinfeksi WSSV. Berdasarkan hasil uji real time PCR (qPCR) pada (gambar 6 dan Tabel 7) menunjukkan nilai cycle threshold (CT) masing- masing  sampel  kode  B1,  B2,  B3,  B4,  B5  dan  B6  adalah  33,  34,  35,  36,  35,  dan  35, konsentrasi  jumlah kopi salinan  virus WSSV  tersebut berkisar  antara 2,1–1,25x10 2 kopi. Nilai cycle threshold (CT) diperoleh berdasarkan adanya akumulasi sinar fluoresens dan melintasi base linethreshold (Koesharyani et al ., 2004). Kurva standar dengan tingkatan pengenceran DNA virus 10.000 dan grafik hasil amplifikasi disajikan pada Gambar 6 dan Tabel 7.
Tabel 7. Hasil amplifikasi WSSV sampel udang umur 20 hari
Hasil  deteksi terhadap  virus White  Spot Syndrome  Virus pada  udang  vannamei umur 45 hari dengan real time PCR (qPCR) keseluruhan sampel kode A1, A2, A3, A4, A5 dan A6menunjukkan hasil positif terinfeksi virus WSSV dengan nilai cycle threshold (CT) masing-masing  sampel  adalah  29,  32,  30,  30,15  dan  15,  Adapun  konsentrasi  masing- masing  sampel  berkisar  antara  1,5-8,1x10 7 kopi.  Kurva  standar  dengan  tingkatan pengenceran DNA virus 10.000 dan grafik hasil amplifikasi disajikan pada gambar 7 dan tabel 8. Deteksi terhadap virus WSSV menggunakan Real Time PCR (qPCR) pada sampel udang  vannamei  umur  45  hari  apabila  dilihat  pada  grafik  Amplifikasi  positif  control WSSV (kurva Standar) dan grafik amplifikasi sampel, menunjukkan hasil positif karena adanya  akumulasi  pada  signal  fluoresen  dan  melintasi baselane  threshold sedangkan NTC tidak melintasi baselane threshold yang menunjukkan hasil negatif, disajikan pada Tabel 8.
No.  Colour  Name Type Ct Given Conc (Copies) Calc Conc (Copies) 1 Standar WSSV 10 4 Standard 28.24 10,000.0 10,000.0 2 Sampel A1 Unknown  29.03 5,744.7 3 Sampel A2 Unknown  32.54 500.5 4 Sampel A3 Unknown  30.37 2,264.3 5 Sampel A4 Unknown  30.89 1,578.2 6 Sampel A5 Unknown  15.30 81,007,532,5 7 Sampel A6 Unknown  15.44 73,467,650.1 8 NTC Unknown
Perbandingan Hasil Pengujian PCR Konvensional dan Real Time PCR (qPCR) Hasil  pemeriksaan  udang  vannamei  umur  20  hari  dan  45  hari  yang  diduga terinfeksi virus WSSV menggunakan PCR Konvensional dan real time PCR,  menunjukkan hasil yang berbeda (Tabel 9).
No Kode Sampel PCR Konvensional Real Time PCR Nilai CT  Jumlah Kopi WSSV Rata-Rata 1. Kontrol (-) Negatif Negatif 0 0 2. Kontrol (+) Positif Positif 27.66 10.000 3. B1 Negatif Positif 33.96 125.3 70.3 4. B2 Negatif Positif 34.03 119.3 5. B3 Negatif Positif 35.03 59.4 6. B4 Negatif Positif 36.52 21.1 7. B5 Negatif Positif 35.20 53.0 8. B6 Negatif Positif 35.45 44.2 9. Kontrol (-) Negatif Negatif 0 0 10. Kontrol (+) Positif Positif 28.24 10.000 11. A1 Positif Positif 29.03 5,744.7 25.747.545 12. A2 Positif Positif 32.54 500.5 13. A3 Positif Positif 30.37 2,264.3 14. A4 Positif Positif 30.89 1,578.2 15. A5 Positif Positif 15.30 81,007.532.5 16. A6 Positif Positif 15.04 73,467.650.0 Ket: B= sampel udang vannamei berumur 20 hari A= sampel udang vannamei berumur 45 hari

## 5. KESIMPULAN
Real  Time PCR  (qPCR)  lebih  sensitif  dan  efektif  dalam  mendeteksi  adanya penyakit White  Spot  Syndrome  Virus pada  udang  vannamei  yang  berumur  20  hari, dibandingkan dengan metode PCR konvensional yang hanya mampu mendeteksi adanya virus White Spot Syndrome Virus pada udang vannamei umur 45 hari.
Tabel 9. Hasil Perbandingan Pengujian PCR Konvensional dengan Real Time PCR (qPCR)
Tabel 8. Hasil amplifikasi WSSV sampel udang umur 45 hari

## DAFTAR PUSTAKA
Adiwijaya,  D.,  Sucipto  dan  I.  Sumantri.  2008.  Penerapan  Teknologi  Budidaya  Udang Vannamei (L.  vannamei)  Semi  Intensif  Pada  Lokasi  Tambak  salinitas  Tinggi. Media  Budidaya  Air  Payau  Perekayasaan  Vol.  7.  Halaman  54  –  72.  Balai  Besar Pengembangan Air Payau Jepara.
Anonim,  2013. Real  Time  PCR .  http:/www.lab.biomol.com/2013/01/real-time-PCR- qPCR.html
Direktorat  Jenderal  Perikanan  Budidaya.  2006. Uji  Teknologi  Budidaya  Udang  Bebas Penyakit Bercak Putih . Mina Bahari, 3 (02):16-17. KKP  {Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan}.  2010b.  Target  produksi  udang  dikurangi, antisipasi penyakit, perizinan impor tetap disumbat. Agribisnis: Bisnis Indonesia. Selasa, 24 Agustus 2010.
Nur'aini,  Y.  L.,  H.  Bambang,  S.  Subyakto,  dan  T.  Gemi.  2007.  Active  Surveilance  of Infectious  Myonecrosis  Virus  (IMNV)  in  Pond-  Cultured  White  Shrimp ( Lithopenaeusvannamei ) in East Java and Bali. Jurnal Perikanan UGM. IX (1) : 25- 31.