## 51 | A c t a   P h a r m a c i a e   I n d o n e s i a September 2018, 6(2) 51-59 ; E-ISSN: 2621-4520
Penapisan  Senyawa  Antikanker  dari  Batang  Brotowali  ( Tinospora  crispa L ) dan Uji Aktivitas Sitotoksik pada Kultur Sel WiDr
Screening of Anticancer Compounds from Brotowali ( Tinospora crispa L. ) Bark and Cytotoxic Activity on WiDr Cells Culture

## ABSTRAK   ABSTRAK
Warsinah*, Harwoko
*Jurusan Farmasi Fakultas Ilmu-Ilmu Kesehatan Universitas Jenderal Soedirman warsinahapt@gmail.com
Kata kunci: Tinospora crispa , antikanker, sel WiDr
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  melakukan  penapisan  profil  senyawa,  uji aktivitas  sitotoksik,  dan  induksi  apotosis  dari  ekstrak  batang  brotowali ( Tinospora  crispa L.).  Ekstraksi  dilakukan  dengan  maserasi menggunakan  etanol  96%  kemudian  di  fraksinasi  dengan n -heksan, kloroform,  etil  asetat  berdasarkan  tingkat  polaritas.  Uji  dilanjutkan kromatografi  lapis  tipis  menggunakan  fase  diam  silika  gel  GF  254  dan fase gerak campuran. Spot yang ada dilihat di bawah UV 254 nm dan 366 nm  serta  disemprot  dengan  reagen  penampak  noda.  Ekstrak  dan  fraksi kemudian diuji aktivitas sitotosiknya dengan metode MTT, serta induksi apoptosis  dengan  metode double  staining dan flowcytometri .  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanolik  batang  brotowali mengandung  senyawa  flavanoid,  fenolik,  dan  terpenoid.  Ekstrak mempunyai efek sitotoksik dengan IC 50 sebesar 314 µ g/ml dan fraksi  F3 sebagai  fraksi  aktif  mempunyai efek  sitotoksik  dengan  IC 50 sebesar  148 µ g/ml. Pada konsentrasi 25 µ g/ml, fraksi mampu menginduksi apoptosis sebesar 28,9 %, kontrol sel 17,90% dan doksorubisin 63,12%. Pemacuan apoptosis  ditunjukkan  dengan  adanya  warna  orange  dan  terjadinya banyak  badan  apoptosis  pada  sel  WiDr  dengan  perlakuan  ekstrak  yang lebih banyak  dibandingkan dengan kontrol sel. Keywords: Tinospora  crispa,    anticancer,  cell WiDr The  purpose  of this  study  is  to  screen  and  to  evaluate  cytotoxic  activity and  apotosis  induction  of  brotowali  (Tinospora  crispa)  bark  extract. Brotowali  barks  were  extracted  by  maceration  using  ethanol  then fractionated by using n-hexane, chloroform, ethyl acetate based on their polarity. Fractions then were examined by thin-layer chromatography by using  the  stationary  phase  silica  gel  GF  254  and  the  mobile  phase mixture.  The  presence  of  spot  was  detected  under  UV  254  nm  and  366 nm,  then  was  sprayed  by  using  staining  reagent.  Extract  and  fraction were  tested  with  MTT  assay  to  evaluate  cytotoxic  activity,  as  well  as double  staining  and  flowcytometri  method  to  evaluate  induction  of apoptosis. The results showed that the ethanolic extract of brotowali bark contains  compounds  flavonoids,  phenolics,  steroids,  and  reductor compounds. The extract and the active fraction (F3) have cytotoxic effects with IC 50 value 314 µ g/ml and 148 µ g/ml, respectively. F3 concentration at 25 µ g/ml was able to induce apoptosis by 28.9%, compared to control by  17.90%  and  doxorubicin  by  63.12%.  Apoptosis  induction  was indicated by the color orange and the occurrence of apoptosis bodies in extract treatment compared to control cells.

## Pendahuluan
Fenomena  pergeseran  pola  hidup, termasuk perubahan pola makan dengan menu rendah serat dan tinggi kolesterol,
akan  terus  menambah  angka  kejadian kanker  kolon.  Berdasarkan  data  dari National Cancer Institute , angka kematian  kanker  kolon  diperkirakan lebih dari 33 % pada tahun 2008 (Ries et al ., 2004) dan di Amerika kanker kolon menempati  peringkat  tiga  besar  setelah kanker  payudara  dan  kanker  paru-paru (Calvert dan Frucht, 2002).
Beberapa  usaha  pengobatan  kanker secara  intensif  telah  dilakukan  meliputi pengobatan  secara  fisik,  pembedahan, maupun  dengan  senyawa  kimia  atau kemoterapi  (Saphiro et  al .,  1999  dan Schneider et  al .,  1997).  Namun  usaha- usaha  tersebut  belum  memberikan  hasil yang  memuaskan,  sehingga  perlu  digali potensi bahan alam. Salah satu tanaman potensial  untuk  dikembangkan  yaitu brotowali  yang  mengandung  senyawa columbine , tinokrisposid, alkaloid, saponin,  tanin,  polifenol,  pati,  glikosida dan flavonoid (Triastuti, 2010)
Eksplorasi  penelitian  tanaman  brotowali sebagai antikanker alami telah dilakukan Warsinah  (2014),  yang  menunjukan bahwa  ekstrak  brotowali  mempunyai aktivitas  antiproliferatif  terhadap  sel kanker payudara (MCF7), HeLa, Caov-3 dan  HepG2  (Zulkhairi et  al. ,  2008). Berdasarkan  penemuan  adanya  potensi antikanker  pada  tanaman  brotowali ( Tinospora  crispa )  tersebut,  maka  perlu dilakukan  penelitian  penapisan  senyawa antikanker dari batang brotowali
( Tinospora crispa ) dan uji aktivitas pada kultur  sel  WiDr  untuk  mengungkap senyawa  yang  bertanggung  jawab sebagai agen kemoterapi pada pengobatan kanker kolon.

## Bahan dan Metode

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah  Batang  brotowali  diambil  dari
Kecamatan Baturraden, Kabupaten
Banyumas,  etanol  (teknis),  toluen  (E.
Merck),  etil  asetat  (E.  Merck),  asam asetat (E. Merck), asam  fosfo-molibdat, KOH etanolik, anisaldehida asam sulfat, amonia,   dan   sitroborat.    Bahan   untuk uji aktivitas antikanker kultur sel WiDr, medium  RPMI  1640,  MTT  reagen (3- (4,5-dimetiltiazol)  2,5-difeniltetrazolium bromide), reagen  stopper ,  pereaksi akridine  orange-etidium  bromida,  PBS dan kit aneksin V.

## Pembuatan simplisia
Bahan  yang  diambil  yaitu  batang  yang dicuci  dengan  air  yang  mengalir  untuk menghilangkan kotoran yang menempel, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 40-50 o C. Simplisia tersebut kemudian diserbuk menggunakan
grinder.

## Pembuatan ekstrak
Tanaman  brotowali  yang  telah  dibuat serbuk, ditimbang sebanyak 500 gram di ekstrak selama 3 x 24 jam menggunakan pelarut  etanol  dengan  cara  maserasi. Ekstrak  disaring  kemudian  diuapkan dengan  evaporator  hingga  didapatkan ekstrak  bebas  pelarut,  kemudian  ekstrak tersebut ditimbang (Harborne, 1987).

## Fraksinasi ekstrak etanol metode partisi
Ekstrak  difraksinasi  dengan  pelarut n - heksan,  kloroform  dan  etil  asetat menggunakan  metode  partisi  dan dilanjutkan  dengan  kromatografi  lapis tipis.  Fraksi  yang  diperoleh  kemudian

## 53 | A c t a   P h a r m a c i a e   I n d o n e s i a
September 2018, 6(2) 51-59 ; E-ISSN: 2621-4520
diidentifikasi  dengan  reagen  penampak noda dan diuji sitotoksiknya terhadap sel kanker  WiDr  dengan  menggunakan metode MTT.

## Kromatografi lapis tipis
Ekstrak  etanolik  dan  masing-masing fraksi  ditotolkan  pada  lempeng  KLT silika  gel  F254.  Kemudian  dielusi dengan  fase  gerak    toluen:  etil  asetat: asam    asetat  (5:4:1)  dan  disemprot dengan    pereaksi    asam  fosfomolibdat, kemudian    diuapi   amonia  (Jork et  al , 1989)  dan  pereaksi  semprot  KOH etanolik  untuk  mengetahui  adanya kumarin  (Machek,    1972).  Untuk mengetahui golongan flavonoid, lempeng KLT diuapi dengan amonia dan disemprot  dengan  pereaksi    sitroborat (Wagner et  al ,  1996),  dan  pereaksi anisaldehida  asam  sulfat  untuk  melihat senyawa lainnya.
Uji  aktivitas  sitotoksik  terhadap    kultur sel WiDr
Sel kanker WiDr ditanam dalam medium RPMI  1640  yang  mengandung  L- glutamin  dan  10%  fetal  bovine  serum, 100  unit/ml  penisilin  dan  100  µg/ml streptomisin (Dai, 1998).
Uji  sitotoksik  dengan  metode  MTT (Febriansah et al., 2014)
Sebanyak  100 µ l  suspensi  sel  WiDr dengan kepadatan 2x10 4 /100 µ l
didistribusikan  ke  dalam  sumuran  pada plat  96-sumuran,  ditambah  sampel  uji dengan  kadar  masing-masing  1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5  µg/ml.  Sebagai  kontrol  digunakan 100  ml  suspensi  sel.  Selanjutnya diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu 37 o C.  Setelah  inkubasi  ditambah  10  ml campuran  MTT  5  mg/ml.  Kemudian diinkubasi 4 jam pada suhu 37 ◦ C. Reaksi
MTT dihentikan dengan reagen stopper.
Kemudian diikubasi semalam pada suhu kamar, serapan dibaca dengan mikroplate reader pada panjang gelombang 550 n m. Uji induksi apoptosis melaluii pengecetan  etidium  bromida-akridin orange
Sel  (kepadatan  1,5  x  10 4 sel/sumuran) ditanam  pada coverslips dalam  plat  24- sumuran  sampai  50%  konfluen.  Sehari sebelum  perlakuan,  medium  diganti kemudian  diinkubasi  dengan  senyawa uji  selama  24  jam.  Medium  dalam sumuran  diambil  kemudian coverslips yang  memuat  sel  diangkat,  diletakan  di atas objek glass dan ditambah dengan 10 µl  campuran  etidium  bromida  –  akridin oranye,  didiamkan  selama  5  menit,  dan segera  diamati  di  bawah  mikroskop flouresens.
Uji induksi apoptosis secara flowcytometri
Mikroplate  6  sumuran  diisi  dengan  500 µ l suspensi sel dengan kepadatan 5x10 4 , kemudian  diinkubasi  dalam  inkubator CO 2 pada  suhu  37 o C.  Sel  diberi perlakuan  500 µ l  fraksi  kloroform dengan  konsentrasi  setengah  IC 50 atau doksorubisin  (1 µ g/ml)  dan  sebagai kontrol negatif ditambah media, kemudian diinkubasi lagi selama 24 jam.
Pada  akhir  inkubasi,  sel  disentrifugasi selama  3  menit  dengan  kecepatan  3000 rpm.  Supernatannya  dibuang,  pelet  sel ditambah PBS dan diresuspensi. Suspensi  dipindah  ke  dalam  mikrotube dan disentrifugasi, selanjutnya supernatan  dibuang,  kemudian  sel dipanen  dengan  tripsin.  Sel  dipindah  ke mikrotube kemudian disentrifugasi selama  3  menit  dengan  kecepatan  3000 rpm,  supernatan  dibuang  dan  sel  dibilas

## 54 | A c t a   P h a r m a c i a e   I n d o n e s i a
September 2018, 6(2) 51-59 ; E-ISSN: 2621-4520
dengan  PBS  dan  disentrifugasi  lagi, kemudian PBS dibuang.
Endapan  sel  di  dalam  microtube kemudian  difiksasi  dengan  etanol  70%
pada -20 o C, diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang kemudian disentrifugasi.  Endapan  dicuci  dengan PBS  sebanyak  dua  kali  kemudian ditambahkan  reagen  PI  dan  aneksin  V. Mikrotube dibungkus dengan aluminium foil  dan  diinkubasi  dalam  ruang  gelap selama 15 menit. Suspensi sel dihomogenkan kemudian  dipindah  ke tabung flowcytometer dengan  filter nilon,  selanjutnya  dianalisis  dengan flowcytometer.

## Analisis data
Data  kromatogram  hasil  KLT  dianalisis secara  deskriftif  kualitatif. Data  yang didapat  dari  uji  sitotoksisitas  dihitung dengan rumus:
(Abs P- Abs M)
% kematian sel = -------- x 100% (Abs K-Abs M)
Keterangan: Abs P : absorbansi perlakuan Abs K : absorbansi sel kontrol Abs M : absorbansi media
Kemudian  dilanjutkan  analisis  statistik dengan  uji  korelasi  menggunakan persamaan garis regresi dan menentukan nilai  IC 50. Pada  uji  induksi  apoptosis , data berupa morfologi sel, dibandingkan antara kontrol dan perlakuan sampel.

## Hasil dan Pembahasan

## Ekstraksi, fraksinasi, dan profil KLT
Simplisia  batang  brotowali  yang  di ekstrak  dengan  menggunakan  etanol 96%  menghasilkan  rendemen  terhadap berat  serbuk  sebesar  13,23%  b/b.  Hasil ini  lebih  besar  dari  hasil  penelitian  lain yaitu 12,10% (Irianti el al , 2011). Hal ini
dapat disebabkan karena adanya pengaruh  lingkungan  hidup  tanaman brotowali sebagai sampel yang dibuktikan  dengan  daerah  pengambilan sampel yang berbeda.
Hasil  ini  juga  lebih  kecil  dari  pada rendemen  ekstrak  menggunakan  etanol 70%  yaitu  sebesar  11,10%  b/b (Warsinah et  al .,  2014).  Hal  ini kemungkinan  karena  senyawa  yang terdapat  pada  batang  brotowali  lebih banyak  yang  bersifat  polar  dibanding senyawa  non  polarnya.  Hasil  fraksinasi (Tabel  1)  diperoleh  senyawa  dengan jumlah  yang  besar  cenderung  ke senyawa polar.
Tabel 1. Hasil pengelompokkan fraksi
Gambar  1. Kromatogram  ekstrak  etanolik batang  brotowali  dan  fraksinya  sebelum  dan setelah  disemprot  anisaldehida  asam  sulfat.  A. sinar  tampak,  B.  UV  254,  C.  UV  366m  (A,  B dan  C  dilihat  sebelum  disemprot),  D  sinar tampak  dan  E  UV  366  setelah  disemprot,  1. Ekstrak etanol, 2. Fraksi kloroform, 3. Fraksi n- heksan  dan  4.  fraksi  etilasetat.  Adanya  senyawa terpenoid ditunjukkan dengan tanda panah
Pada kromatogram (Gambar 1D) menunjukkan  adanya  bercak  warna  biru lemah pada pengamatan sinar tampak di No Fraksi Berat Fraksi (mg) Warna 1 n-heksan 156 kuning 2 kloroform 497 Hijau 3 etilasetat 212 Kuning lemah 4 residu 3430 Coklat tua

## 55 | A c t a   P h a r m a c i a e   I n d o n e s i a
September 2018, 6(2) 51-59 ; E-ISSN: 2621-4520
fraksi  etil  asetat.  Warna  biru  lemah merupakan  petunjuk  adanya  senyawa terpenoid  dalam  ekstrak  etanolik,  fraksi kloroform, dan fraksi etil asetat (Jork et al ., 1989) .
Hasil  KLT  pada  Gambar  1D  dan  1E menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanolik dan  fraksi  kloroform  tampak  bercak menjadi berwarna ungu setelah disemprot  anisaldehida  asam  sulfat dibanding  bercak  awal.  Stahl  (1985) menyatakan penggunaan pereaksi anisaldehida asam sulfat untuk mengetahui  adanya  senyawa  terpenoid dan  bercak  (awalnya  tidak  berwarna) setelah disemprot akan menjadi berwarna  ungu,  biru,  merah,  abu-abu atau hijau. Anisaldehid dapat memperpanjang  sistem  kromofor  pada senyawa  dan  pada  ekstrak  etanolik  juga fraksi  kloroform  dan  etil  asetat menunjukkan adanya senyawa golongan terpenoid.
Deteksi  keberadaan  senyawa  golongan flavonoid  lempeng  KLT  diuapi  dengan amonia dan disemprot dengan sitroborat (Gambar 2). Semua flavonoid menyebabkan  pemadaman,  sehingga terlihat  bercak  biru  gelap  dengan  latar belakang  kuning  pada  lempeng  KLT dibawah  UV254.  Sedangkan  pada UV366 flavonoid berfluoresensi kuning, ungu,  biru,  dan  hijau  (Wagner et  al ., 1984).
Gambar  2. Kromatogram  ekstrak  etanolik  batang brotowali  dan  fraksinya  pada  fase  diam  silika  gel F254,  fase  gerak toluen:etil  asetat:asam asetat  (5:4:1) A,  sinar  tampak,  B.  UV  254  dan  C  UV  366 sebelum disemprot  sitroborat,  D  UV  254  stelah  disemprot,  E, UV 366 setelah disemprot, tanda panah menunjukkan adanya senyawa flavanoid.
Pada  gambar  2,  kromatogram  di  bawah sinar UV254 terlihat pemadaman bercak pada ekstrak etanolik; n -heksan,
kloroforn  dan  etilasetat.  Suatu  senyawa yang  meredam  pada  UV254  memiliki gugus  karbonil,  fenolik,  atau  gugus  lain yang mengandung setidaknya dua ikatan rangkap terkonjugasi. Pengamatan UV366  terlihat  bercak  berfluoresensi kuning  kehijauan  (Gambar  2C)  pada ekstrak  etanolik.  Hal  ini  menunjukkan adanya  kandungan  flavonol  tanpa  5-OH bebas  atau  flavonol  dengan  5-OH tersubsitusi.    Fraksi  n-heksana  tampak bercak berfluroresensi orange kemerahan. Pada UV366 bercak berfluororesensi  menunjukkan  adanya ikatan  rangkap  terkonjugasi  yang  lebih panjang  (Wagner et  al ,  1996).  Setelah dilakukan penyemprotan dengan pereaksi  sitroborat pada  gambar  2C  dan 2D  menunjukkan  bahwa  pada  ekstrak etanolik, fraksi kloroform dan etil asetat terlihat  warna  kuning  yang  lebih  intens pada pengamatan sinar tampak.
Pengamatan UV366 terlihat bercak pada ekstrak  etanolik  dan  fraksi  etil  asetat berfluoresensi  kuning  orange  (Gambar 2D).  dengan  deteksi  menggunakan penampak  noda  sitoborat  tersebut dimungkinkan  ekstrak  mengandung senyawa golongan flavonoid.
Gambar.3 Kromatogram  ekstrak  etanolik batang  brotowali  dan  fraksinya  sebelum  dan setelah disemprotasam fosfomolibdat.  A. sinar tampak, B.  UV 254, C UV 366m (A,B dan C dilihat  sebelum  disemprot),    D  setelah disemprot,  1.  Ekstrak  etanol,  2.  Fraksi kloroform,  3.  Fraksi  n-heksan  dan  4.  fraksi etilasetat.  Adanya  senyawa reduktor  (kumarin) ditunjukkan dengan tanda panah.

## 56 | A c t a   P h a r m a c i a e   I n d o n e s i a
September 2018, 6(2) 51-59 ; E-ISSN: 2621-4520
Kromatogram pada Gambar 3C menunjukkan  adanya  bercak  warna  biru lemah pada pengamatan sinar tampak di fraksi  etilasetat  dengan  hRf  0  (totolan awal),  ekstrak  etanolik  dan  fraksi kloroform dengan hRf 44 dan 50. Warna biru  lemah  merupakan  petunjuk  adanya senyawa kumarin yang bersifat reduktor lemah karena dengan pereaksi fosfomolibdat tidak memberikan reduksi yang  kuat  dan  berupa  campuran oksidator berwarna biru abu-abu (Jork et al .,  1989). Sedangkan  kromatogram pada  gambar  3D  memperlihatkan  fraksi etil  asetat  (hRf  0),  ekstrak  etanolik  dan fraksi  etil  asetat  (hRf  44)  menunjukkan fluororesensi  hijau  pada  UV366  yang merupakan  adanya  senyawa  golongan kumarin.  Golongan  senyawa  seperti kumarin,  pada  kondisi  alkalis  cincin lakton akan terbuka dan terbentuk anion asam  kumarinat  kemudian  terjadi siklisasi menjadi lakton. Dengan adanya sinar  UV,  maka  anion  asam  kumarinat akan  mengalami  isomerisasi  menjadi bentuk  trans  yaitu  anion  asam-o- kumarat.  Bercak  yang  mengandung anion asam-o-kumarat
terlihat berfluororesensi hijau, hijau biru, kuning atau  coklat  di  bawah  sinar  UV366 (Machek, 1972).

## Uji sitotoksik ekstrak
Hasil  analisis  sitotoksik  menggunakan metode  MTT  menunjukkan  adanya hubungan  antara  konsentrasi  ekstrak etanol dengan viabilitas sel (Gambar 4). Semakin  tinggi  konsentrasi  ekstrak semakin  rendah  viabilitas  sel.  Hasil analisis  menunjukkan  bahwa  ekstrak etanol  bersifat  sitotoksik  dengan  nilai IC 50 sebesar  314 µ g/ml.  Ekstrak dikatakan  toksik  jika  mempunyai  IC 50 lebih  kecil  dari  1000 µ g/ml  (Mayer  dan Gustafson,  2008).  Sitotoksisitas  yang disebabkan  oleh  perlakuan  ekstrak etanol  dapat  juga  dilihat  dari  perubahan morfologi  sel  yang  terjadi  sejalan
dengan  peningkatan  konsentrasi  ekstrak (Gambar 6).
Gambar  4. Kurva  efek  sitotoksik  ekstrak metanol  terhadap  viabilitas  sel  dengan  metode MTT.  Uji  dilakukan  dengan  menginkubasi  sel dengan  kepadatan  1,5x  10 4 dalam  plat  96- sumuran  selama  24  jam  dalam  media  RPMI 1640  untuk  beradaptasi.  Sel  kemudian  diberi perlakuan  ekstrak  dengan  konsentrasi  1000, 500,  250,  125  dan  62,5 µ g/ml  dan  diinkubasi selama  24  jam.  Viabilitas  sel  diperoleh  dari konversi  absorban  formazan  yang  terbentuk akibat  perlakuan  MTT.  Profil  viabilitas  sel disajikan  dari  rata-rata  ±  standar  deviasi  (SD) dari 3 perlakuan

## Uji sitotoksik fraksi
Hasil pengamatan uji sitotoksik menunjukkan  bahwa  fraksi  kloroform memberikan efek sitotoksik yang paling kuat dengan nilai IC 50 sebesar 148 µ g/ml (Gambar 5).
Gambar  5. Kurva  efek  perlakuan  masing masing fraksi terhadap viabilitas sel WiDr. Sel kemudian  diberi  perlakuan  fraksi n- heksan, kloroform,  etil  asetat  dan  residu  dengan konsentrasi  500,  250,  125  dan  62,5  dan 31,25 µ g/ml  dan  diinkubasi  selama  24  jam.  Profil

## 57 | A c t a   P h a r m a c i a e   I n d o n e s i a
September 2018, 6(2) 51-59 ; E-ISSN: 2621-4520
viabilitas  sel  disajikan  dari  rata-rata  3 perlakuan.
Gambar 6. Morfologi sel WiDr dengan perlakuan kloroform dan diinkubasi selama 24 jam, A. kontrol sel, B. perlakuan 500 µ g/ml, C. perlakuan 250 µ g/ml, D. perlakuan 125 µ g/ml, E. perlakuan 62.5 µ g/ml
Fraksi n –heksan, etil asetat, metanol dan residu    mempunyai  aktivitas  yang  lebih rendah  dengan  IC 50 berturut-turut sebesar 563;  387;  358  dan  862 µ g/ml.
Fraksi kloroform  merupakan fraksi yang paling  aktif,  hal  ini  karena  fraksi kloroform mengandung senyawa terpenoid  dan  flavonoid  (senyawa fenolik).  Karena  adanya  senyawa  yang mengandung  gugus  hidroksi  tersebut mampu membunuh sel.
Aktivitas  fraksi  aktif  (fraksi  kloroform) terhadap  induksi  apoptosis  sel  WiDr metode double staining
Hasil  uji  induksi  apoptosis  dengan pengecatan  DNA  menggunakan  metode double staining dengan etidium bromida dan  akridin  orange  memperlihatkan warna  hijau  terang  pada  kontrol  sel, sedangkan  pada  sel  dengan  perlakuan fraksi  disamping  sel  berwarna  hijau terdapat  sel  yang  berwarna  orange. Adanya  warna  orange  mengindikasikan sel mengalami apoptosis (Gambar 7).

## Induksi  apoptosis  dengan  metode flowcytometri
Sel  yang  mengalami  induksi    apoptosis dapat  dikuantitatifkan  dengan  metode flowcytometri . Hasil analisis menunjukkan  bahwa  perlakuan  fraksi kloroform    dan  doksorubisin  dapat meningkatkan  kematian  secara,  hal  ini ditunjukan    oleh  adanya  peningkatan
apoptosis    pada  fraksi  kloroform dibanding  dengan  jumlah  sel  yang mengalami apoptosis pada kontrol (tabel 2 dan gambar 5) sedangkan peningkatan apoptosis terbesar terjadi pada
pemberian  doksorubisin  (tabel  2) .
Namun  demikian  disamping  terjadi apoptosis, fraksi kloroform juga
menyebabkan  kematian  secara  nekrosis yang  hampir  sama  dengan  sel  yang mengalami  apoptosis  yang  jumlahnya lebih  besar  daripada  kontrol  (18.02%), sedangkan  doksorubisin  menyebabkan nekrosis  lebih kecil dari pada perlakuan fraksi kloroform (tabel 2)
Gambar 7 . Hasil pengamatan morfologi sel WiDr dengan pengecatan DNA menggunakan akridine orange - etidium bromida. Pengamatan dilakukan dibawah  mikroskop  flouresens.  (a)  Sel  kontrol memperlihatkan  warna  hijau  terang  yang  sama dan  berbentuk  seperti  daun  (      )  yang menandakan  bahwa  sel  masih  hidup,  (b) perlakuan isolat aktif, sel WiDr terlihat berwarna orange  dengan  bentuk  yang  tidak  teratur  (        ) yang mengindikasikan sel mengalami  apoptosis.

## 58 | A c t a   P h a r m a c i a e   I n d o n e s i a
September 2018, 6(2) 51-59 ; E-ISSN: 2621-4520
Tabel 2 . Hasil analisis induksi apoptosis dengan metode flowcytometri Jenis sampel % hidup % apoptosis % nekrosis Kontrol 61,57 17, 90 18,02 Doksorubisin 1,55 68.12 26,77 Fraksi F3 46,77 29,8 28,29

## Simpulan
Ekstrak  etanol  yang  bersifat  sitotoksik terhadap sel WiDr   dengan IC 50 sebesar
314 µ g/ml.  Hasil  fraksinasi  dari  ektrak etanol adalah fraksi n -heksan, kloroform,  etil  asetat  dan  residu.  Fraksi paling  aktif  adalah  fraksi  kloroform dengan IC 50 sebesar 148 µ g/ml.
Berdasarkan identifikasi pada kromatogram  KLT  dengan  reagen penampak  noda  menunjukkan  bahwa ekstrak  mengandung  golongan  senyawa terpenoid,  flavanoid,  dan  kumarin  yang bersifat reduktor lemah.
Fraksi kloroform
menyebabkan kematian  sel  WiDr  secara  apoptosis. Pengamatan induksi apoptosis dilakukan secara  kualitatif  dengan  pengecatan etidium bromida-akridin orange pada sel WiDr.  Perlakuan  Fraksi  kloroform memberikan  warna orange dan  kontrol sel berwarna hijau.

## Daftar Pustaka
Calvert  PM,  Frucht  H.,  2002,  The genetics  of  colorectal  cancer, Ann  Intern  Med. 137(7):603-12. doi: 10.7326/0003-4819-137-7- 200210010-00012
Dai  JR,  Hallock  YF,  Cardellina  JH, Boyd MR., 1998, HIV-inhibitory and cytotoxic oligostilbenes from the  leaves  of  Hopea  malibato. J Nat  Prod. 61(3):351-3.  doi: 10.1021/np970519h
Febriansah  R,  Putri  DD,  Sarmoko, Nurulita  NA,  Meiyanto  E, Nugroho  AE.,  2014,  Hesperidin as  a  preventive  resistance  agent in MCF-7 breast cancer cells line resistance  to  doxorubicin. Asian Pac J Trop Biomed. 4(3):228-33.
doi:
10.1016/S2221- 1691(14)60236-7 Harborne  JB,  1987, Metode  Fitokimia
Penuntun  Modern  menganalisis tumbuhan , Edisi II, Penerbit ITB.
Bandung. Irianti,  T.,  Andayana,  P.,  Suryani,  E., 2011,  Aktivitas  Penangkapan Radikal 2,2-Difenil-1- Pikrilhidrazil Oleh Ekstrak Etanolik Batang Brotowali ( Tinospora  crispa (L.)  Miers) Dan  Fraksi-Fraksinya, Majalah Obat  Tradisional 16(3):  139  – 146. doi: 10.22146/tradmedj.8850
Jork,  H.,  Funk,  W.,  Fischer,  W.,  dan Wimmer,  H.,  1989, Thin  Layer Chromatography  Reagents    and Detection  Methods ,  377,  Bassel, New York.
Machek,  K.,  1972, Pharmaceutical Application  of  Thin  Layer  and Paper  Chromatography ,  63-565, Elsevier  Publishing  Company, London.
Mayer  AM,  Gustafson  KR.  2008,
Marine  pharmacology  in  2005- 2006:  antitumour  and  cytotoxic compounds.  Eur  J  Cancer.  2008 Nov;44(16):2357-87. doi: 0.1016/j.ejca.2008.07.001
Ries  LAG,  Eisner  MP,  Kosary  CL, Hankey  BF,  Miller  BA,  Clegg  L, Mariotto  A,  Feuer  EJ,  Edwards BK  (eds). SEER  Cancer  Statistics Review, 1975-2002 , National
Cancer  Institute.  Bethesda,  MD, https://seer.cancer.gov/archive/csr/ 1975_2002/ ,  based  on  November 2004

## 59 | A c t a   P h a r m a c i a e   I n d o n e s i a
September 2018, 6(2) 51-59 ; E-ISSN: 2621-4520
Saphiro GI, Harper JW. 1999. Anticancer  Drugs  Targets,  Cell Cycle  and  Checkpoint  Control. J
Clin Invest . 104(12): 1645-53. doi: 10.1172/JCI9054 Schneider, K., A. 1997. Cancer genetics, encyclopedia  of  human  biology , second edition, 312-314. Academic Press. New York. Stahl,  E.,  1985, Analisis  Obat  Secara Kromatografi  dan  Mikroskopi, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata,  1-17,  Penerbit  ITB,
Bandung.
Triastuti,  A.,  2010,  Antiangiogenic Effect of the Chloroform Extract of  Tinospora  Crispa  (L.)  Miers Stem  in  the  Chick  Embryo Chorioallantoic Membrane
(CAM)  Induced  by  BFGF. Eksakta, 11(2). Wagner,  H.,  Bladt,  S.,  and  Zgainski, E.M., 1996, Plant Drug Analysis,
23-26,  Springer-Verlag  Berlin Hiedelberg, New York. Warsinah,  Baroroh,  H.  N.,  Harwoko,
2014, penelusuran Senyawa bioaktif  pada  Batang  Brotowali ( Tinospora  crispa L)  Sebagai Bahan Antikanker. Laporan Penelitian  Dasar.  Disimpan  di Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat, Universitas  Jenderal  Soedirman, Purwokerto. Zulkhairi,  A.,  Abdah,  A.,  Kamal,  N.H., Nursakinah,  Moklas  MA,  Hasnah,
B.,  Fazali  F.,  Khairunnur  T.A.,
Kamil K.H., Zamree M.S., Shahidan  MMA,  2008,  Biologial properties  of Tinospora  crispa (Akar Patawali) and its antiproliferative activities on selected  human  cancer  cell  lines,
Malays J Nutr. 14(2): 173-87.