Submitted : 24 February 2017 Revised : 27 April 2017 Accepted : 2 May 2017
PRODUKSI ASAM SITRAT OLEH Aspergillus niger PADA KULTIVASI MEDIA CAIR
Kirana Sanggrami Sasmitaloka 1*
1 Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian Jl. Tentara Pelajar No. 12, Cimanggu, Bogor, Indonesia, 16114
* Email: kirana.sanggrami@gmail.com

## Abstrak
Asam  sitrat  merupakan  asam  organik  yang  banyak  digunakan  dalam  industri  makanan,  minuman,  farmasi, kosmetik,  pertanian,  dan  kimia.  Asam  sitrat  dapat  diproduksi  melalui  proses  fermentasi  mikroorganisme penghasil  asam  sitrat. Aspergilus  niger merupakan  salah  satu  mikroorganisme  yang  dapat  digunakan  pada proses  produksi  asam  sitrat.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mempelajari  proses  produksi  asam  sitrat  oleh Aspergillus  niger menggunakan  kultivasi  media  cair.  Pengamatan  dilakukan  terhadap  pH,  biomassa,  gula  sisa (substrat  sisa),  absorbansi,  total  asam  dan  rendemen (yield) yang  dihasilkan.  Sumber  karbon  yang  digunakan adalah gula pasir, sedangkan sumber nitrogen yang digunakan adalah (NH 4 ) 2 SO 4 . Hasil penelitian menunjukkan produksi  asam  sitrat  maksimum  sebesar  11,904  g/l  pada  hari  ke-4,  laju  pertumbuhan  spesifik  maksimum sebesar 0,03 hari-1,  Y p/x adalah 1,881 g asam sitrat/g biomassa, Y p/s adalah 1,881 g asam sitrat/ppm substrat, dan Y x/s adalah 0,016 g biomassa/ppm substrat.
Kata Kunci : Asam Sitrat, Aspergillus niger , Kultivasi Cair

## Abstract
Citric acid is the most widely used organic acid in  food, beverage, pharmacy, cosmetics, agriculture, and chemical industries. Citric acid can be produced by fermentation of microorganisms producing citric acid. Aspergillus niger is a microorganism which can be used in production of citric acid. This research aimed to study the process of citric acid’s production by Aspergillus niger using  submerged cultivation medium. Observations were carried out on the pH,  biomass,  residual  sugar  (residual  substrate),  absorbance,  total  acid  and  yield. Carbon  source  used  was  sugar, while nitrogen source used was (NH 4 ) 2 SO 4 . The results showed maximum citric acid production was 11,904 g/l on day-4, maximum  specific  growth  rate  was  0,03  on  day-1,  Yp/x  1,881  g  citric  acid/g  biomass,  Yp/s  1,881  g  citric acid/ppm substrates, and  Yx/s 0,016 g biomass/ppm substrates.
Keywords : Aspergillus niger, Citric Acid, Submerged Cultivation

## 1. PENDAHULUAN
Asam  sitrat  merupakan  salah  satu  produk komersial yang penting di dunia maupun di Indonesia. Di  Indonesia,  65%  konsumsi  asam  sitrat  berada  di industri  makanan  dan  minuman,  20%  berada  di industri deterjen rumah tangga dan sisanya berada di industri  tekstil,  farmasi,  kosmetik  dan  lainnya. Besarnya  pemanfaatan  asam  sitrat  pada  industri makanan  dan  minuman  karena  sifat  asam  sitrat menguntungkan  dalam  pencampuran,  yaitu  kelarutan relatif tinggi, tak beracun dan menghasilkan rasa asam yang  disukai.  Kegunaan  lain,  yaitu  sebagai  pengawet,
pencegah  kerusakan  warna  dan  aroma,  menjaga turbiditas,  penghambat  oksidasi,  penginvert  sukrosa, penghasil  warna  gelap  pada  kembang  gula,  jam  dan jelly, pengatur pH.
Asam  sitrat  dapat  diproduksi  melalui  ekstraksi sederhana, proses fermentasi menggunakan mikroorganisme,  dan  proses  sintesa  secara  kimia. Proses  ekstraksi  sederhana  telah  lama  ditinggalkan seiring  dengan  pengembangan  metode  fermentasi. Sedangkan sintesa secara kimia belum bisa sepenuhnya  diterima  konsumen  karena  faktor keamanan  pangan  produk  yang  dihasilkan.  Produksi

## JURNAL INTEGRASI PROSES
Website: http://jurnal.untirta.ac.id/index.php/jip
asam  sitrat  melalui  proses  fermentasi  menggunakan mikroba  dinilai  prospektif  untuk  diterapkan  di industri.
Asam sitrat dapat diproduksi dengan memanfaatkan  aktivitas  mikroorganisme  melalui proses  fermentasi  (Darouneh et  al. ,  2009;  Pallares et al., 1996;  Manafaati  2011;  dan  Demirel et  al. ,  2005). Mikroorganisme  yang  banyak  digunakan  dalam produksi asam sitrat diantaranya Penicillium glaucum, Candida  oleophila (Anastasisdis  dan  Rehm,  2005) ,  A. niger (Angumeenal  dan  Venkappayya,  2005;  Cevrimli et al. , 2009; Cevrimli et al. , 2010; Dhillon et al., 2013) , Aspergillus  awamori (Max et  al. ,  2010) ,  Aspergillus nidulans (Max et al ., 2010), Hansenula anamola (Soccol et al., 2006) dan Yarrowia lipolytica (Wojtatowics et al. , 1993; Karasu Yalcin et al., 2010).
Aspergillus  niger merupakan  mikroorganisme utama  yang  digunakan  di  industri  untuk  produksi asam  sitrat  karena  menghasilkan  lebih  banyak  asam sitrat  per  satuan  waktu  dan  juga  kemampuannya untuk  memproduksi  asam  sitrat  dari  bahan  yang murah  (Soccol et  al., 2006).  Papagianni  (2007) menyebutkan  bahwa  secara  teori,  produksi  asam sitrat menggunakan Aspergillus niger dapat menghasilkan rendemen 70%.
Pembentukan  asam  sitrat  secara  fermentasi dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor  yang  dapat memberikan  pengaruh  pada  komposisi  medium,  baik komponen  makro  maupun trace  element yang  dapat mempengaruhi  proses  ekskresia  asam  sitrat  oleh mikroba.  Sumber  karbon  yang  digunakan  adalah  gula pasir  dan  ekstrak  tauge,  sedangkan  sumber  nitrogen yang  digunakan  adalah    (NH 4 ) 2 SO 4 .  Produksi  asam sitrat menggunakan kultivasi cair banyak diaplikasikan  di  industri.  Hal  ini  karena  kultivasi  cair memiliki  beberapa  keunggulan,  yaitu  rendemen  yang dihasilkan  tinggi,  waktu  fermentasi  lebih  singkat, biaya perawatan murah, dan resiko kontaminasi yang lebih kecil.
Penelitian  tentang  produksi  asam  sitrat  oleh Aspergillus  niger telah  banyak  dilakukan.  Akan  tetapi, penelitian  tentang  fenomena  pertumbuhan  mikroba pada produksi asam sitrat menggunakan kultivasi cair belum  banyak  dilakukan.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mempelajari  fenomena  pertumbuhan  mikroba pada  proses  produksi  asam  sitrat  oleh Aspergillus niger menggunakan  kultivasi  cair,  meliputi  laju pertumbuhan  spesifik,  koefisien  Yp/s,  koefisien  Yx/s, dan koefisien Yp/x.

## 2. METODE PENELITIAN

## 2.1. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini terdiri dari  tiga  bagian,  yaitu  mikroorganisme,  medium propagasi,  dan  medium  fermentasi.  Mikroorganisme yang  digunakan  adalah Aspergillus  niger .  Medium propagasi  yang  digunakan  adalah  gula  pasir  15  gram, ekstrak  tauge  20%  (b/v)  11  ml,  (NH 4 ) 2 SO 4 450  mg, KH 2 PO 4 225  mg.  Bahan-bahan  tersebut  dilarutkan dalam  100  ml  akuades,  pH  diatur  menjadi  6.  Medium fermentasi  yang  digunakan  adalah  gula  pasir  15% (b/v),  (NH 4 ) 2 SO 4 0,6%  (b/v),  KH 2 PO 4 0,3%  (b/v)
dengan  pH  6.  Sedangkan  alat  yang  digunakan  adalah tabung  reaksi,  otoklaf,  labu  erlenmeyer,  neraca, inkubator  goyang,  kertas  saring,  spektrofotometri visible (Spektro Vis), buret, dan gelas kimia.

## 2.2. Metode
Sebelum  dipropagasi,  dilakukan  pengecekan apakah Aspergillus  niger siap  digunakan.  Pada umumnya  digunakan Aspergillus  niger dalam  agar miring  yang  berumur  5  hari.  Media  propagasi  dibuat dengan  komposisi  tersebut  dengan  memisahkan antara  gula  dari  bahan  lainnya.  Selanjutnya  sterilisasi pada  suhu  121 o C  selama  15  menit  dan  didinginkan. Inokulasi dilakukan dengan suspensi spora Aspergillus niger sebanyak  2%  (v/v).  Hasil  inokulasi  media propagasi yang  telah diinkubasi ini disebut inokulum. Inkubasi  dilakukan pada inkubator goyang pada suhu 29  ±  1 o C  (suhu  kamar)  selama  24  jam.  Media fermentasi  disiapkan  dan  disterilisasi  pada  suhu 121 o C  selama  15  menit  dan  didinginkan.  Inokulum diinokulasikan    sebanyak  2%.  Sampel  diambil  setiap hari selama 5 hari. Parameter yang diamati meliputi:
 pH pH cairan fermentasi diukur menggunakan pH meter.
 Biomassa Cairan  fermentasi  disaring  menggunakan kertas  saring  yang  telah  dikeringkan  dan diketahui bobotnya. Biomassa dihitung sebagai bobot  residu  kering  hasil  penyaringan  per  ml cairan kultivasi
 Gula sisa Gula  sisa  diukur  menggunakan  metode  DNS dengan  mengukur  absorbansi  menggunakan spektrofometri  visible  (Spektro  Vis)  pada panjang gelombang 550 nm.
 Total asam Pengukuran  asam  organik  dilakukan  dengan metode  titrasi.  Penentuan  kadar  total  asam organik tertitrasi adalah :

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Proses    fermentasi  asam  sitrat  merupakan  salah satu  cabang  bioteknologi  yang  memanfaatkan  agen biologis  (mikroba)  antara  lain  jamur.  Proses fermentasi  tersebut,  terdiri  dari  dua  tahap  yaitu  fasa pertumbuhan  miselium  dan  fasa  pembentukan produk.  Kedua  tahap  ini  dibedakan  berdasarkan  laju penyerapan karbohidrat (gula total). Media fermentasi untuk  produksi  asam  sitrat  terdiri  dari  nutrien  yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba terutamasumber  karbon,  unsur  kelumit (trace element), nitrogen, dan fosfor, juga diperlukan air dan
udara.  Kondisi  proses  yang  berpengaruh  adalah  pH, suhu,  kecepatan  pengadukan  dan  aerasi.  Produksi asam  sitrat  dapat  dilakukan  melalui  permukaan (surface  fermentation) maupun  fermentasi  terendam (submerged fermentation).
Proses  fermentasi  ini diharapkan  mampu menghasilkan  asam  sitrat  yang  optimum  melalui presos  produksi  yang  efisien  dan  memperbesar  nilai tambah yaitu dengan bahan baku yang murah didapat produk yang lebih banyak nilainya. Reaksi pembentukan asam sitrat adalah:
( Syamsuriputra et al. , 2006 )
Secara  alami  asam  sitrat  merupakan  produk metabolisme primer, tidak diekskresi oleh mikroorganisme dalam jumlah yang cukup berarti dan penggunaan A spergillus niger dapat menekan produk- produk  samping  yang  tidak  diinginkan  seperti  asam oksalat,  asam  isositrat  dan  asam  glukonat.  Selain  itu pemilihan bahan baku perlu dilakukan, agar yield yang didapatkan tinggi, yaitu bahan dengan kandungan gula total tinggi (Sumo et al. ,1993) .
Pada proses produksi asam sitrat dengan kultivasi cair, diperlukan adanya sumber karbon, nitrogen, dan mineral. Menurut Dulmage dan Rhodes (1971), karbon adalah  bahan  utama  untuk  mensistesis  sel  baru  atau produk  sel.  Sumber  karbon  yang  digunakan  selama proses kultivasi adalah gula pasir.
Nitrogen yang dibutuhkan mikroorganisme biasanya dipenuhi oleh garam amonium. Dalam hal ini sering  nitrogen  organik  harus  disediakan  dalam bentuk  asam  amino  tunggal  atau  bahan  kompleks termasuk asam nukleat dan vitamin. Sumber nitrogen yang  digunakan  selama  proses  kultivasi  adalah (NH 4 ) 2 SO 4 .
Pada kultivasi cair, parameter yang diamati adalah pH,  total  asam,  gula  sisa,  biomassa,  dan  absorbansi. Kurva  hasil  pengamatan  terhadap  pH,  total  asam  dan biomassa  pada  produksi  asam  sitrat  dengan  kultivasi cair disajikan pada Gambar 1.
pH  medium  dalam  proses  fermentasi  sangat penting. Hal ini karena penurunan pH mengindikasikan  terbentuknya  asam  sitrat.  Pada proses  awal  fermentasi  diketahui  bahwa  pH  medium sebesar  6  kemudian  menurun  pada  hari  ke-1  sebesar 5.  Nilai  pH  mengalami  penurunan  kembali  pada  hari ke-2  sampai  hari  ke-5  menjadi  sebesar  3,0. Berdasarkan  data  pada  Gambar  1,  penurunan  pH selama waktu kultivasi mengindikasikan terbentuknya asam sitrat dalam kultivasi cair
pH  pada  media  juga  mempengaruhi  produksi asam  sitrat  dari Aspergillus  niger karena  beberapa enzim  yang  berperan  dalam  siklus  TCA  sensitif terhadap  pH.  Produksi  asam  sitrat  akan  optimal dengan  pH  sekitar  2.  Jika  kondisi  tersebut  tidak diperoleh  hasil  produksi  akan  berkurang  (Mattey, 1992). Papagianni (1995) dan Papagianni et al. (1999) melaporkan  bahwa  pH  mempengaruhi  morfologi  dan produktivitas  asam  sitrat  dari Aspergillus  niger dari hasil  data  kuantitatif.  Morfologi  dengan  agregat  yang kecil  dan  filamen  yang  pendek  berkaitan  dengan meningkatnya  produksi  asam  sitrat  pada  pH  sekitar 2,0  ±  0,2.  Pada  pH  1,6  morfologi  akan  berkembang abnormal  ( bulbous  hyphae )  dan  produksi  asam  sitrat akan  menurun  secara  drastis.  Pada  pH  3,0  agregat mempunyai bentuk perimeter yang lebih panjang dan terbentuk asam oksalat.
Produksi  asam  sitrat  meningkat  selama  proses fermentasi  dan  maksimum  pada  hari  ke-4  sebesar 11,904  g/l.  Pada  hari  ke-5,  produksi  asam  sitrat mengalami penurunan menjadi 11,520 g/l. Penurunan tersebut  disebabkan  karena  berkurangnya  substrat dan  nutrien  yang  diperlukan  mikroba  dalam memproduksi  asam  sitrat.  Sehingga  pada  hari  ke-5, mikroba mengalami fase penurunan (kematian).
Pada  pembentukan  asam  sitrat  dalam  proses fermentasi dibatasi oleh ketersediaan beberapa unsur kelumit  (P,  Mn,  Zn).  Peranan  ion  logam  dalam  proses ini  belum  diketahui  secara  menyeluruh.  Nilai  pH optimum sekitar 1,7 – 2,0. Jika pH lebih tinggi (alkalis) menyebabkan pembentukan asam  – asam oksalat dan glukonat dalam jumlah banyak. Karenanya pengendalian kondisi proses secara cermat merupakan prasyarat untuk mempertahankan keteraturan metabolik  dan mendukung pembentukan asam  sitrat  yang  lebih  banyak.  Kondisi  yang  sesuai tersebut  memungkinkan  stimulasi  glikolisis  untuk penyediaan  aliran  karbon  yang  tidak  terbatas  ke dalam metabolisme antara. Akumulasi sitrat selanjutnya  tergantung  pada  pemasokan  oksaloasetat (Mangunwidjaja dan Suryani, 1994).
Kekurangan  mangan  akan  menurunkan  aktivitas enzim  dalam  siklus  asam  trikarboksilat  yang  diikuti oleh  penurunan  anabolisme.  Gangguan  metabolisme ini  menyebabkan  perbedaan  tingkat  ion  amonium intraselluler  yang  dapat  membantu  menghilangkan penghambatan  enzim  fosfofruktose  oleh  sitrat. Mangan  juga  terlibat  dalam  biokimia  permukaan  sel dan  morfologi  hifa.  Kebutuhan  oksigen  yang  tinggi memungkinkan  reoksidasi  sitoplasma  NADH  tanpa pembentukan  ATP  dan  melibatkan  suatu  cabang respirasi  alternatif  yang  berbeda  dari  rantai  respirasi normal.
Bobot  kering  biomassa  yang  dihasilkan  berkisar 0,37 – 1,03 g/l. Pada hari ke-1 kultivasi, bobot kering biomassa  yang  dihasilkan  sebesar  0,37  g/l.  Bobot kering  biomassa  mengalami  kenaikan  yang  signifikan pada  hari  ke-3,  yaitu  sebesar  1,03  g/l.  Hal  ini disebabkan karena pada awal kultivasi substrat masih tersusun  dalam  rantai  karbon  panjang.  Adanya  enzim yang  dihasilkan  akan  menghidrolisis  pati  yang terkandung  dalam  substrat,  sehingga  substrat
terdegradasi  menjadi  rantai-rantai  karbon  yang  lebih pendek.
Bobot  kering  biomassa  mengalami  penurunan pada  hari  ke-4  menjadi  sebesar  1,0  g/l  dan  terus menurun  pada  hari  ke-5  menjadi  sebesar  0,58  g/l. Pengukuran  terhadap  bobot  kering  biomassa  tidak hanya  mengukur  sel  hidup  saja,  tapi  juga  sel  mati, spora.  Setelah  mencapai  pertumbuhan  optimal  pada akhir fase stasioner dapat pula mengindikasikan mulai terjadinya  fase  kematian.  Pada  fase  ini  sel-sel Aspeergillus niger mengalami lisis sehingga mengurangi  bobot  biomassa  yang  terukur.  Hal  ini disebabkan karena massa sel yang telah lisis tersebut sebagian  akan  hilang  dikonversi  menjadi  energi  yang dimanfaatkan  oleh  sel-sel  yang  masih  hidup  sebagai sumber energi untuk pertumbuhannya.
Penurunan  bobot  biomassa  kering  di  atas  dapat juga  terjadi  karena  mulai  berkurangnya  substrat sehingga sel-sel Aspergillus niger mengalami kekurangan  sumber  makanan  dan  energi  untuk pertumbuhan dan perkembangannya.
Tabel 1. Hasil Pengamatan Gula Sisa dan Absorbansi (λ = 550 nm) pada Produksi Asam Sitrat dengan
Kultivasi Cair Hari ke- Absorbansi Gula Sisa (ppm) 1 0,99 23,47 2 0,98 23,30 3 0,83 19,94 4 0,83 19,90 5 0,81 19,50
Pengukuran  gula  sisa  selama  kultivasi  bertujuan untuk mengetahui keberadaan substrat pada kultivasi. Berdasarkan  Gambar  1,  gula  sisa  (substrat)  pada kultivasi  cair  mengalami  penurunan  selama  waktu kultivasi  berlangsung.  Pada  hari  pertama,  gula  sisa sebesar  23,47  ppm.  Sedangkan  pada  hari  ke-5,  gula sisa  berkurang  menjadi  19,50  ppm.  Pengukuran  gula sisa  berkorelasi  dengan  nilai  absorbansi  yang diperoleh.  Gula  sisa  berbanding  lurus  dengan  nilai absorbansinya (Tabel 1).
Gambar 1. Kurva pH, Total Asam dan Biomassa pada Produksi Asam Sitrat dengan Kultivasi Cair
Gambar 2. Kurva Laju Pertumbuhan Spesifik pada Produksi Asam Sitrat dengan Kultivasi Cair
Gambar 3. Kurva Yp/x pada Produksi Asam Sitrat dengan Kultivasi Cair
Gambar 4. Kurva Yp/s pada Produksi Asam Sitrat dengan Kultivasi Cair
Gambar 5. Kurva Yx/s pada Produksi Asam Sitrat dengan Kultivasi Cair
Apabila  nilai  gula  sisa  mengalami  penurunan, maka  nilai  absorbansinya  juga  akan  mengalami penurunan.  Data  pada  Tabel  1  menunjukkan  bahwa nilai  absorbansi  pada  asam  sitrat  akan  menurun selama  waktu  kultivasi.  Hal  ini  mengindikasikan bahwa gula telah dikonsumsi mikroba.
Teknik  evaluasi  suatu  populasi  mikroba  baik secara  kuantitatif  maupun  kualitatif  dapat  digunakan untuk memantau dan mengkaji fenomena pertumbuhan. Fenomena pertumbuhan mikroba dapat dilihat  melalui  laju  pertumbuhan  spesifiknya.  Kurva laju  pertumbuhan  spesifik  pada  produksi  asam  sitrat dengan kultivasi cair disajikan pada Gambar 2.
Berdasarkan Gambar 2, dinyatakan bahwa y = a + bx,  dimana  b  adalah slope dan  dapat  dinyatakan sebagai  laju  pertumbuhan  spesifik  maksimal  (µ maks ). Sehingga  nilai  µ maks pada  kultivasi  cair  adalah  0,03 hari -1 .  Selain  menentukan  µ maks ,  dari  data  yang  ada juga  dapat  diperoleh  nilai  rendemen  produk  per biomassa  (Yp/x),  rendemen  produk  per  substrat (Yp/s),  dan  rendemen  biomassa  terhadap  substrat (Yx/s).  Kurva  Yp/x  disajikan  pada  Gambar  3.  Kurva Yp/s  disajikan  pada  Gambar  4  dan  kurva  Yx/s disajikan pada Gambar 5.
Yield dapat  diperoleh dari slope pada kurva. Pada kurva  diperoleh  persamaan  y  =  bx  +  a.  Nilai  b merupakan slope dan  dinyatakan  sebagai yield .    Pada Gambar  3  diperoleh  persamaan  y  =  1,881x  –  1,92, maka  nilai  Yp/x  adalah  1,881  g  asam  sitrat/g biomassa. Berdasarkan data tersebut, dapat diketahui bahwa  setiap  penambahan  biomassa  yang  dihasilkan sebesar  1  gram  akan  terjadi  penurunan  jumlah  asam sitrat  yang  dihasilkan  sebesar  1,881  gram.  Semakin tinggi  jumlah  biomassa  yang  dihasilkan  maka  akan menurunkan jumlah asam sitrat yang dihasilkan. Oleh karena itu produksi biomassa dalam pembuatan asam sitrat  harus  dibatasi  sehingga  akan  didapatkan  nilai rendemen yang tinggi.
Yp/s  menunjukkan  perbandingan  antara  produk yang  dihasilkan  dengan  asam  sitrat  yang  terbentuk. Pada  Gambar  4  diperoleh  persamaan  1,881x  –  1,92, maka  nilai  Yp/s  adalah  1,881  g  asam  sitrat/ppm substrat.  Hal  ini  menujukkan  bahwa  dalam  1  ppm glukosa  akan  didapatkan  produk  asam  sitrat  sebesar 1,881  gram.  Semakin  tinggi  konsentrasi  nutrisi  maka jumlah  asam  sitrat  yang  dihasilkan  akan  semakin tinggi.
Koefisien Yx/s menunjukkan perbandingan antara nilai  biomassa  dengan  konsentrasi  media  yang digunakan.  Pada  Gambar  5,  diperoleh  persamaan  y  = 0,016x  +  0,292.  Maka  nilai  Yx/s  adalah  0,016  g biomassa/ppm substrat.    Hal ini menunjukkan bahwa dalam  konsentrasi  gula  sebesar  1  ppm  akan didapatkan jumlah biomassa sebesar 0,016 gram.
Produksi  asam  sitrat  akan  terus  meningkat sampai  nutrisi  yang  terkandung  dalam  media  habis. Jika nutrisi yang terkandung dalam media habis maka mikroba kan menghentikan fase  eksponensialnya dan akan  berubah  menjadi  fase  stasioner  kemudian  fase kematian.  Semakin  tinggi  konsentrasi  nutrisi  dalam media  yang  digunakan  maka  akan  didapatkan konsentrasi  atau  rendemen  produk  yang  tinggi.
Sementara  itu,  semakin  lama  waktu  fermentasi  yang berlangsung,  maka  kadar  nutrisi  yang  terkandung dalam  media  akan  semakin  habis  dan  kadar  gula  sisa yang  ada  dalam  media  akan  semakin  menurun.  Hasil pengamatan  menunjukkan  semakin  tinggi  jumlah biomassa  yang  dihasilkan  maka  akan  menurunkan jumlah asam sitrat. Semakin tinggi konsentrasi nutrisi maka  jumlah  asam  sitrat  yang  diperoleh  juga  akan semakin tinggi.

## 4. KESIMPULAN
pH  merupakan  indikator  penting  dalam  produksi asam  sitrat.  pH  akan  menurun  jika  terbentuk  asam sitrat.  Pada  kultivasi  cair,  nilai  pH  menurun  sampai  3 pada akhir kultivasi. Produksi asam sitrat ditunjukkan dengan  nilai  total  asam.  Produksi  asam  sitrat maksimum  sebesar  11,  904  g/l  pada  hari  ke-4.  Laju pertumbuhan  spesifik  maksimum  sebesar  0,03  hari -1 , Yp/x  adalah  1,881  g  asam  sitrat/g  biomassa.  Nilai Yp/s  adalah  1,881  g  asam  sitrat/ppm  substrat.  Nilai Yx/s adalah 0,016 g biomassa/ppm substrat.

## 5. DAFTAR PUSTAKA
Anastasisdis, S.; Rehm, H. J., Continuous Production of Citric  Acid  Secretion  by  A  High  Specific  pH Dependent  Active  Transport  System  in  Yeast Candida  oleophila ,  ATCC  20177.  Electronic Journal of  Biotechnology, 2005,  8, 26-42.
Angumeenal,  A.  R.;  Venkappayya,  D.,  Effect  of Transition  Metal  Ions  on  The  Metabolism  of Aspergillus niger in The Production of Citric Acid With  Molasses  as  Substrate.  Journal  of  Scientific and Industrial Research, 2005, 64, 125-128.
Cevrimli,  B.  S.;  Kariptas,  E.;  Ciftci,  H.,  Effects  of
Fermentation Conditions on Citric Acid
Production  from  Beet  Molasses  by Aspergillus niger ,  Asian  Journal  of  Chemistry,  2009,  21, 3211-3218.
Cevrimli, B. S.; Yasar, A.; Kariptas, E., Effect of O-Cresol, Resorcinol  and  Hydroquinone  on  Citric  Acid Productivity  by Aspergillus  niger in  Stirred Fermentor. Asian Journal of Chemistry, 2010, 22, 699-704.
Darouneh,  E.;  Alavi,  A.;  Vosoughi,  M.;  Arjmand,  M.; Seifkordi,  A.;  Rajabi,  R.,  Citric  Acid  Production: Surface  Culture  Versus  Submerged  Culture. African  Journal  of  Microbiology  Research , 2009, 3(9), 541-545.
Demirel, G.; Yaykaşli, K.O.; Yaşar, A., The Production of Citric  Acid  by  Using  Immobilized Aspergillus niger A-9 and Investigation of Its Various Effects. Food Chemistry, 2005, 89, 393-396.
Dhillon,  G.S.;  Satinder,  K.B.;  Surinder,  K.;  Mausam,  V., Bioproduction  and  Extraction  Optimization  of Citric  Acid  from Aspergillus  niger by  Rotating Drum  Type  Solid-State  Bioreactor.  Industrial Crops and Products, 2013, 41, 78 – 84.
Dulmage, H. T.; Rhodes, R.A., Production of Pathogens in  Artificial  Media,  In  :  Burges,  H.D.  (ed).
Microbial  Control  of  Pest  and  Plant  Diseases 1970-1980.  New  York:  Acad  Press,  1971,  hal. 507.
Karasu  Yalcin,  S.;  Bozdemir,  M.  T.;  Ozhas,  Effects  of Different  Fermentation  Conditions  on  Growth and  Citric  Acid  Production  Kinetics  of  Two Yarrowia  lipolytica Strains.  Chemical  and Biochemical  Engineering  Quarterly,  2010,  24, 347-360.
Manfaati,  R.,  Pengaruh  Komposisi  Media  Fermentasi terhadap  Produksi  Asam  Sitrat  oleh Aspergillus niger . Jurnal Fluida, 2011, 8(1), 23-27.
Mangunwidjaja,  D.;  Suryani,  A.,  Teknologi  Bioproses. Jakarta: Penebar Swadaya, 1994. Mattey,  M.,  The  Production  of  Organic  Acids.  Crit  Rev
Biotechnol, 1992, 12, 87–132.
Max,  B.;  Salgado,  J.M.;  Rodríguez,  N.;  Cortés,  S.;
Converti,  A.;  Domínguez,  J.M.,  Biotechnological Production  of  Citric  Acid.  Brazilian  Journal  of Microbiology, 2010, 41, 862-875.
Pallares,  J.;  Rodríguez,  S.;  Sanromán,  A.,  Citric  Acid
Production in Submerged and Solid State Culture of Aspergillus  niger .  Bioprocess  Engineering,
1996, 15, 31-33.
Papagianni, M.; Mattey, M.; Berovic, M.; Kristiansen, B.,
Aspergillus  niger Morphology  and  Citric  Acid Production  in  Submerged  Batch  Fermentation: Effects of Culture pH,  Phosphate and Manganese Levels.  Food  Technol  Biotechnol,  1999, 37,  165– 171. Papagianni, M., Morphology and Citric Acid Production of Aspergillus  niger in  Submerged  Culture.  Tesis Doktor, University of Strathclyde, 1995.
Papagianni,  M.,  Advances  in  Citric  Acid  Fermentation by Aspergillus  niger :  Biochemical  Aspects, Membrane Transport and Modeling. Biotechnology Advances, 2007, 25, 244-263.
Soccol, C.R.; Vandenberghe, L.P.; Rodrígues, C.; Pandey,
A.,  New  Perspective  for  Citric  Acid  Production and Application. Food Technology and Biotechnology, 2006, 44(2), 141-149.
Sumo;  Sumantri;  Subono,  Prinsip  Bioteknologi.
Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama, 1993.
Syamsuriputra,  A.A.;  Setiadi,  T.;  Kushandayani,  R.;
Yunus,  R.F.,  Pengaruh  Kadar  Air  Substrat  dan Konsentrasi  Dedak  Padi  pada  Produksi  Asam Sitrat  dari  Ampas  Tapioka  menggunakan Aspergillus  Niger ITBCCL  74.  Prosiding  Seminar Nasional Teknik Kimia Indonesia, Palembang,  19 – 20 Juli 2006.
Wojtatowics,  M.;  Marchin,  G.  L.;  Ericksen,  L.  E., Attempts  to  Improve  Strain  A-10  of Yarrow lipolytica for  Citric  Acid  Production  from  N- Parrafins.  Process  Biochemistry,  1993,  28,  453- 460.