Optimasi Produksi Embrio Somatik Pinus merkusii Jungh. et de Vriese Menggunakan Teknik Kultur Cair
Optimization of Pinus merkusii Jungh. et de Vriese Somatic Embryos in Suspension Culture
Nurcahyo Widyodaru Saputro 1*)
1*) Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Singaperbangsa Karawang Jl. HS Ronggowaluyo, Teluk Jambe Timur, Kab. Karawang 41361 *Penulis untuk korespondensi: nurcahyo.widyodaru@staff.unsika.ac.id
Diterima 21 Desember 2016/Disetujui 25 Januari 2017

## ABSTRACT
Somatic embryogenesis are known as an artificial process in-vitro techniques that can accelerated provision of seeds and genotype propagation on coniferous plants. In somatic embryogenesis, somatic embryos formed from single cell or group of somatic cell. Previous studies shows that somatic embryos were successfully induced through cooling techniques  in  in-vitro  propagation,  but  the  number  of  somatic  embryos  produced  are  not  optimal.  The  aim  of  this research  is  to  obtain  the  optimum  conditions  of  somatic  embryos  Pinus  merkusii  Jungh.  et  de  Vriese  growth  using tissue culture techniques in a liquid medium (Suspension culture). Liquid medium used is a modification of the DCR medium without agar and by addition of plant growth regulator (PGR) 4,5μM 2,4-D and 2μM BAP. Explants used is clone Pinus merkusii Jungh. et de Vriese callus (PMC): PMC 1, PMC 2, PMC 4, PMC 6 and PMC 11 because it has shown  a  good  response  in  previous  studies.  This  process  is  repeated  5  times  in  the  dark  and  on  a  shaker  with  the speed 125RPM. After 15 days, explants of callus Pinus merkusii Jungh. et de Vriese reveals the response to increased volume of sediment somatic embryo. This study shows that the use of a liquid medium in the tissue culture technique can accelerate and multiply the results of the somatic embryo.
Keyword:  Somatic  embryogenesis,  Pinus  merkusii  Jungh.  et  de  Vriese,  somatic  embryos,  tissue  culture  techniques, PGR, 2,4-D, BAP

## ABSTRAK
Embriogenesis  somatik  dikenal  sebagai  salah  satu  proses  buatan  dalam  teknik  in-vitro  yang  dapat mempercepat penyediaan benih dan propagasi genotipe pada tanaman konifer. Pada embriogenesis somatik, embrio somatik  terbentuk  dari  satu  sel  atau  sekelompok  sel  somatik.  Penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa  embrio somatik berhasil diinduksi melalui teknik pendinginan dalam propagasi in-vitro, namun jumlah embrio somatik yang dihasilkan  tidak  optimal.  Tujuan  dari  penelitan  ini  adalah  untuk  mendapatkan  kondisi  optimum  pertumbuhan  klon embrio  somatik  Pinus  merkusii  Jungh.  et  de  Vriese  dengan  menggunakan  teknik  kultur  jaringan  pada  media  cair (Teknik  Kultur  Cair).  Media  cair  yang  digunakan  merupakan  modifikasi  dari  media  DCR  tanpa  agar  dan  diberi penambahan zat  pengatur tumbuh  (ZPT) berupa  4,5µM  2,4-D dan 2µM BAP. Eksplan  yang digunakan adalah  klon kalus  dari  Pinus  merkusii  Jungh.  et  de  Vriese  (PMC):  PMC  1,PMC  2,  PMC  4,  PMC  6  dan  PMC  11  karena  telah menunjukan respon yang baik pada penelitian sebelumnya. Proses ini diulang sebanyak 5  kali dalam kondisi  gelap dan  diatas  shaker  dgn  kecepatan  125RPM.  Setelah  15  hari  eksplan  kalus  Pinus  merkusii  Jungh.  et  de  Vriese menunjukan  respon  dengan  bertambahnya  volume  endapan  embrio  somatik.Penelitian  ini  menunjukan  bahwa penggunaan medium cair pada teknik kultur jaringan dapat mempercepat dan memperbanyak hasil embrio somatik.
Kata kunci: Pinus merkusii Jungh. et de Vriese, embrio somatik, teknik kultur jaringan, ZPT, 2,4-D, BAP

## PENDAHULUAN
Pinus  merupakan  tumbuhan  konifer  yang menjadi  komoditas  utama  bagi  bahan  baku  industri pulp  dan  kertas,  selain  itu  pinus  juga  merupakan penghasil  gondorukem  dan  terpentin  (Hidayat  & Hansen,  2001).  Pinus  dengan  berbagai  macam jenisnya  dapat  tumbuh  di  berbagai  belahan  bumi. Salah  satu  species  Pinus  yang  tumbuh  di  Indonesia adalah Pinus merkusii Jungh. et de Vriese. Menurut
data statistik Perum Perhutani tahun 1999-2015, Pinus merkusii merupakan pohon penghasil kayu terbesar di pulau jawa, pendapatan tahunan yang didapatkan oleh perhutani  berasal  dari  gondorukem  yaitu  produk olahan  getah  pinus  (Perum  Perhutani,  2015).  Namun hasil  tersebut  masih  belum  mencukupi  kebutuhan gondorukem dunia.
Indonesia  menduduki  peringkat  kedua  setelah China dalam memproduksi gondorukem (Sukmananto, 2012). Saat ini perbanyakan Pinus masih
menggunakan  teknik  perbanyakan  menggunakan  biji (Hidayat  &  Hansen,  2001).  Teknik  ini  membutuhkan waktu  yang  relatif  lama,  baik  untuk  pengadaan  bibit pinus  dalam  jumlah  besar  maupun  untuk  memperoleh bibit  yang  berkualitas.  Proses  pembentukan  biji  pada Pinus,  mulai  dari  penyerbukan  hingga  biji  matang dengan keadaan embrio siap berkecambah membutuhkan  waktu  sekitar  2  tahun  (Gupta,  1988). Dalam  usaha  pemercepatan  waktu  produksi  pohon Pinus,  penerapan  teknik in  vitro dengan  mikro propagasi  dalam  budidaya  conifer  termasuk  Pinus telah  banyak  dilakukan.  Namun  keberhasilannya masih dianggap belum optimal.
Teknik in vitro (Mikropropagasi) yang digunakan pada penelitian ini adalah teknik kultur cair menggunakan  media  cair  DCR  untuk  melihat kecepatan proliferasi pada klon kalus Pinus merkusii (PMC).  Media Douglas  Cotyledon  Reserve (DCR) dikembangkan  oleh  Gupta  dan  Durzan  (Gupta  & Durzan,  1985).  Media  DCR  terbukti  lebih  efektif dalam  menginduksi  embrio  somatik  dibandingkan Murashige  &  Skoog (MS)  (Gupta,  1988).  Media  ini telah  berhasil  digunakan  dalam  menginduksi  embrio somatik pada Pinus nigra (Salajova et al ., 1995), Pinus ellottii (Newton et al ., 1995), Pinus lambertiana (Gupta,  1995), Pinus  pinaster (Bercetche  &  Paques, 1995) dan Pinus strobus (Kaul, 1995).
Pada penelitian yang telah dilakukan sebelumnya,  embrio  somadalam  biji  Pinus  telah berhasil  diinduksi  dan  berploriferasi  menghasilkan  14 klon  kalus Pinus  merkusii (PMC).  14  klon  tersebut dikembangkan  dalam  media  DCR  dengan  komposisi ZPT 9 µM 2,4-D dengan 2 µM BAP dan 9 µM 2,4-D dengan  4  µM  BAP  (Rusfiandi,  2007;  Dinar,  2007; Rahmadani,  2007),  namun  embrio  somatik  yang terinduksi  tersebut  hasilnya  belum  optimal.  Embrio somatik merupakan hasil dari perkembangan embriogenesis somatik. Embriogenesis somatik didefinisikan  sebagai  bagian  dari  perkembangan tanaman  yang  terjadi  pada  kantung  embrio  pada ovulum  atau  biji  yang  masih  muda  (Taiz  &  Zeiger, 1998)
Teknik  perbanyakan  klon  embrio  somatik dengan menggunakan media cair telah diterapkan pada Pinus  pinaster (Ramarosandratana et  al ,  2001). Penggunaan teknik ini dapat menghasilkan sekumpulan  massa  embrio  dari  satu  genotip  dengan cepat dan juga dapat menghasilkan sekumpulan massa embrio  yang  banyak.  Penelitian  ini  dilakukan  untuk memperbanyak  dan  mempercepat  hasil  klon  embrio somatik Pinus merkusii sehingga didapatkan klon yang potensial  untuk  dilakukan  proses  pematangan  sel embrio,  sehingga  nantinya  dapat  di  lanjutkan  pada proses  pembentukan  plantlet  untuk  nantinya  di perbanyak dilapangan.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  dilaksanakan  di  Ruang  Kultur
Jaringan Laboratorium Fisiologi
Tumbuhan
Universitas Pendidikan Indonesia.
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah eksplan klon kalus Pinus merkusii , media DCR, akuades,  hormon  2,4-D,  hormon  BAP,  spirtus,  etanol 96%,  NaOH  10%,  Agar,  NaOH  0,1  M,  tisu  gulung, aluminium foil dan karet gelang. Alat yang digunakan laminar  air  flow  cabinet (LAFC),  autoklaf, Hot  plate with magnetic stirrer , Shaker , refrigerator , timbangan analitik,  pH  meter,  botol  kultur,  gunting, Erlenmeyer , gelas  ukur,  sendok  kimia,  kaca  arloji,  cawan  petri, pinset,  pisau  bedah,  lampu  spiritus,  hand  sprayer, pipet,  serta  rak  kultur  yang  dilengkapi  dengan  lampu fluoresen sebagai sumber cahaya.
Penelitian  menggunakan  5  klon  PMC  yang menunjukan  hasil  terbaik  dari  14  klon  PMC  pada penelitian  sebelumnya.  Masing-masing  perbanyakan klon di ulang 5 kali.

## Tahap Persiapan
Pelaksanaan  penelitian  dimulai  dengan  melakukan sterilisisasi  basah  dengan  autoklaf  pada  suhu  121 0 C dan  tekanan  1,5  atm  untuk  seluruh  alat  penanaman, seperti  :  pisau,  cawan  petri,  kertas  saring,  pinset, Erlenmeyer dan botol kultur, serta akuades steril untuk pencucian dan pembilasan eksplan. Eksplan diperbanyak  dalam  media  padat  DCR  dengan kombinasi ZPT 9 µM 2,4-D dengan 2 µM BAP dan 9 µM  2,4-D  dengan  4  µM  BAP,  sehingga  stok  untuk melakukan  penelitian  tercukupi. Laminar  air  flow cabinet (LAFC)  yang akan digunakan untuk  inokulasi eksplan  disemprot  dan  dibersihan  menggunakan alkohol 95%.
Selama  masa  perbanyakan  eksplan,  hanya  5 klon saja yang di perbanyak (PMC 1, PMC 2, PMC 4, PMS  6  dan  PMC  11),  karena  9  klon  lainnya  selama masa  pra-penelitian  menujukan  hasil  yang  kurang optimal  pada  saat  diperbanyak  dalam  media  padat DCR.

## Pembuatan Media
Media  yang  digunakan  adalah  media  DCR  . dalam  pembuatan  media  tersebut,  terlebih  dahulu dibuat  larutan  stok  untuk  macronutrien,  mikronutrien, NaFe  EDTA,  vitamin,  larutan  N-organik,  dan  larutan stok  untuk  ZPT.  Masing-masing  larutan  stok  dibuat dengan  kepekatan  10x  ,  sementara  larutan  stok  ZPT dibuat dengan konsentrasi 10 -3 M. Seluruh larutan stok disimpan dalam refrigerator . Media DCR terdiri  dari: KNO 3 340mg/l,  NH 4 NO 3 400mg/l,  Ca(NO 3 ) 2 .4H 2 O 556mg/l, CaCl2.2H 2 O 85mg/l, MgSO 4 .7H 2 O 370mg/l, KH 2 PO 4 170mg/l,
MnSO 4 .4H 2 O
22,3mg/l,
ZnSO 4 .7H 2 O  8,6mg/l,  H 3 BO 3 6,2mg/l,  KI  0,83mg/l, CoCl 2 .6H 2 O  0,025mg/l,  CuSO 4 .5H 2 O  0,25mg/l, NaMoO 4 .2H 2 O 0,25mg/l, NiCl 2
0,025mg/l, FeSO 4 .7H 2 O  27,8mg/l,  Na 2 EDTA  37,8mg/l,  Myo- Inositol  200mg/l,  Asam  nikotin  0,5mg/l,  Pyridoxsin- HCl  0,5mg/l,  Thiamin-HCl  1,0mg/l,  L-Glisin  2,0mg/l dan  L-Glutamin  730mg/l  (Gupta  &  Durzan,  1985). Setelah seluruh media DCR larut, ditambahkan
sukrosa  20g/l  kemudian  ditambahan  ZPT  dengan kombinasi 9 µM 2,4-D dengan 2 µM BAP dan 9 µM dan  2,4-D  dengan  4  µM  BAP  dan  agar  8g/l  untuk medium  padat  DCR,  penambahan  agar  dilakukan setelah  kadar  pH  5,8+0,1,  lalu  larutan  digenapkan hingga  1  liter.  Media  dipanaskan  hingga  agar  larut. Sebanyak  10  ml  media  dituang  kedalam  masing- masing  botol  kultur,  diikat  dengan  karet  gelang, disterilisasi  dengan  autoklaf  pada  suhu  121 0 C  pada tekanan  1,5atm  selama  15  menit.  Botol  lalu  ditutup dengan  aluminium foil Lalu  untuk  medium  cair  DCR komposisi ZPT  yang digunakan adalah 4,5 µM 2,4-D dan  2  µM  BAP  tanpa  menambahkan  agar.  Seluruh larutan media digenapkan menggunakan akuades steril hingga  1  liter.  Kemudian  dituang  dalam Erlenmeyer sebanyak masing-masing 10 ml.

## Pemindahan eksplan
Proses  pemindahan  eksplan  dilakukan  dalam laminar  air  flow  cabinet (LAFC).  Kalus  embrio somatik yang telah berproliferasi dalam medium padat DCR  diambil  sebanyak  200mg,  lalu  dipindahkan dalam  medium  cair  DCR.  Kalus  dalam  medium  cair kemudian  dihomogenkan  agar  embrio  somatik tersebar  secara  merata.Embrio  somatik  diinkubasi  di atas shaker dengan  kecepatan  rotasi  125  RPM  dalam keadaan gelap.
Analisis  hasil  penelitian  dilakukan  dengan  cara mengamati  penambahan  volume  dalam  medium  cair DCR  dengan  waktu  yang  diperlukan  untuk  volume medium  cair  DCR  bertambah.  Pengamatan  dilakukan dengan  memasukan  kultur  dalam  gelas  ukur,  diamkan selama +15 hingga embrio somatik mengendap. Endapan embrio  somatik  ini  yang  nanti  di  ukur  pertambahan volumenya.  Pengamatan  dilakukan  setiap  3  hari  sekali dalam  kurun  waktu  15  hari.  Hasil  dari  pengamatan tersebut nantinya di buat kurva tumbuh.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ditemukan bahwa komposisi ZPT menunjukan respon  yang  baik  dalam  tahap  prapenelitian  adalah  9 µM 2,4-D dengan 4 µM BAP. Dari komposisi tersebut tingkatnya  di  turunkan  ½  menjadi  4,5μM  2,4-D and2μM  BAP . Hal  ini  dikarenakan  penggunaan hormon  yang  terlalu  banyak  pada  medium  cair  dapat menyebabkan pertumbuhan eksplan  yang kurang  baik (Taryono, 2003). Pada hari ke 0 embrio somatik Pinus merkusii masih  berbentuk  sekumpulan  sel  yang memiliki  vakuola  besar  dan  belum  memiliki  kepala embrio  serta  suspensor  (Gambar  1).  embrio  somatik pada  tahap  ini  masih  melakukan  adaptasi  dengan media  tumbuhnya,  karena  adanya  perpindahan  dari media padat DCR ke media cari DCR (Zoglauger dan Reuther, 1996).
Embrio  somatik  sudah  terbentuk  menjadi sekumpulan polyembryony (Gambar 2) pada hari ke 3. Polyembryony merupakan  sesuatu  kejadian  yang terjadi pada species konifer selama masa
embryogenesis invitro dan in vivo (Singh, 1978). Pada hari ke 10 penanaman, embryo somatik mulai berpisah ditandai dengan terjadinya clavage embryony (Gambar 3). clavage  embryony terjadi  dikarenakan  adanya pertumbuhan  pada  sel  embrio  potensial,  sel  embrio potensial  memiliki  kemampuan  untuk  melakukan pembelahan, pertumbuhan dan diferensiasi sel menuju pematangan (Vashista, 1983).
Gambar  1.  Embrio  Somatik Pinus  merkusii Jungh.  et  de Vriese pada hari ke 0
Gambar  2.  Embrio  Somatik Pinus  merkusii Jungh.  et  de Vriese pada hari ke 3
Diketahui  bahwa  PMC  11  memiliki  tingkat pertumbuhan  paling  baik  diantara  keempat  PMC lainnnya dari hasil kurva tumbuh (Gambar 4). PMC 4 memiliki  tingkat  pertumbuhan  yang  lebih  rendah dibandingkan dengan PMC lainnya. Pada PMC 4 fase lag  dimulai  dari  hari  ke  3  sampai  dengan  hari  ke  9, selanjutnya fase log dimulai dari ke 10 sampai dengan hari ke 11. PMC 4 mengalami penurunan pertumbuhan pada  hari  ke  12  sampai  dengan  masa  pengamatan berakhir.
Penyebab penurunan pertumbuhan pada PMC 4 karena  genotip  yang  dimiliki  tidak  cocok  untuk diperbanyak  pada  medium  cair.  Pada  media  padat DCR  PMC  4  juga  menunjukan  pertumbuhan  yang rendah  saat  fase  perbanyakan.  Pola  tumbuh  PMC  1, PMC  2,  PMC  11  dari  awal  pertumbuhan  sampai dengan  hari  ke  15  menunjukan  kurva  tumbuh  yang berbentuk  sigmoid.  PMC  1  dan  PMC  2  menunjukan perkembangan yang hampir serupa.
Gambar 4. Kurva tumbuh dari ke 5 PMC
Pada  hari  ke  10  rata-rata  volume  pertumbuhan embrio somatik dari PMC1 dan PMC 2 mencapai titik yang  sama,  dikarenakan  kenaikan  jumlah  rata-rata volume  embrio  somatik  pada  PMC  1  dan  PMC  2. PMC  6  menunjukan  fase  lag  sampai  dengan  hari  ke 12, hal ini dikarenakan lambatnya kemampuan embrio somatik pada PMC 6 untuk menyesuaikan diri dengan media  tumbuhnya.  Pertumbuhan  PMC  1,  PMC  2  dan PMC  11  pada  media  cair  DCR  tidak  dapat  dibedakan antara  fase  eksponensial  dan  stationer  setelah  masa inkubasi 15 hari

## KESIMPULAN
Klon  kalus Pinus  merkusii yang  paling  baik pertumbuhannya  dalam  media  cair  DCR  adalah  PMC 11  dengan  lama  pertumbuhan  lebih  15  hari,  hal  ini dikarenakan  klon  ini  memiliki  tingkat  adaptasi  yang tinggi  terhadap  media  tumbuhnya.  Sedangkan  pada klon  lain  terjadi  penurunan  tingkat  produksi  embrio somatik setelah 15 hari. Klon-klon PMC yang berbeda memiliki  laju  pertumbuhan  yang  berbeda  pula  dan tidak menunjukan bentuk kurva yang sigmoid

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada bapak Dr.rer.nat.Adi rahmat, M.Si dan ibu Dr.Sariwulan  Diana,  M.Si  selaku  pembimbing  yang telah  membimbing  dan  memberikan  arahan  untuk penelitian  ini.  Ucapan  terima  kasih  juga  disampaikan kepada  kepala  laboratorium  Biologi  Universitas Pendidikan Indonesia untuk kerjasama dan bantuannya dalam memfasilitasi kegiatan ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Bercetche,  J  and  Paques,  M.  1995.  Somatic Embryogenesis  in  Maritime  Pine  ( Pinus pinaster ). Dalam S. Jain, P.K. Gupta & Newton (eds).  Somatic  Embryogenesis  in  Woody  Plant vol.  3.  Kluwer  Academic  Publisher.  Dordrecht Netherlands.
Dinar.  L.  2007.  Optimasi  Induksi  Embriogenesis Somatik Pinus  Merkusii Jungh.  et  de  Vriese. Melalui  Teknik  Pemotongan  Ujung  Kalaza
Eksplan.  Skripsi  Sarjana  Biologi  UPI.  Tidak diterbitkan
Gupta,  P.  K  and  Durzan,  D.  J.  1985.  Shoot Multiplication  From  Tree  of  Douglas-fir ( Pseudotsuga menziesii ) and Sugar Pine ( Pinus lambertiana ). Plant Cell Report 4:177-179
Gupta,  P.  K.  1988.  Advences  in  Biotechnology  of Conifers. Current Science 57(12): 629-637
Gupta,  P.  K.  1995.  Somatic  Embryogenesis  in  Sugar Pine  ( Pinus  lambertiana )  dalam  S.  Jain,  P.K. Gupta,
R. Newton (eds). Somatic Embryogenesis  in  Woody  Plant  vol.3.Kluwer Academic Publisher. Dordrecht Netherlands
Hidayat,  J  dan  Hasen,  C.  P.  2001.  Informasi  Singkat Benih Pinus  merkusii Jungh.  et  de  Vriese. Bandung : IFSP
Kaul,  K.  1995.  Somatic  Embryogenesis  in  Eastern
White Pine ( Pinus strobus L)dalam S. Jain, P.K. Gupta, R. Newton (eds). Somatic Embryogenesis  in  Woody  Plant  vol.3.Kluwer Academic Publisher. Dordrecht Netherlands
Newton,  R.  J.,  Marek-Swize,  K.  A.,  Magallanes- Cedeno, M. E., Dong, N., Sen, S. & Jain, S. M. 1995.  Somatic  Embryogenesis  in  Slash  Pine ( Pinus  elliottii )dalam  S.  Jain,  P.K.  Gupta,  R. Newton  (eds).  Somatic  Embryogenesis  in Woody Plant vol.4.Kluwer Academic Publisher. Dordrecht Netherlands .
16
Perum  Perhutani.  2015.  Menata  Proses  Bisnis  dan Meningkatkan  Akuntabilitas.  Annual  Report Perhutani.
Ramarosandratana,  A.,  Harvengt,  L.,  Bouvet,  A., Calvayrac, R. and Pâques, M. 2001. Effects of carbohydrate  source,  polyethylene  glycol  and gellan  gun  concentration  on  embryonal- suspensor  mass  (ESM)  proliferation  and maturation  of  maritime  pine  somatic  embryos, In  Vitro  Cellular  and  Development  Biology- Plant., 37, 29-34
Rahmadani, E. 2007. Optimasi Induksi Embriogenesis Somatik Pinus  Merkusii Jungh.  et  de  Vriese.
Melalui  Teknik  Pendinginan  Eksplan.  Skripsi Sarjana Biologi UPI. Tidak diterbitkan
Rusfiandi,  H.  2007.  Optimasi  Induksi  Embriogenesis Somatik Pinus  Merkusii Jungh.  et  de  Vriese.
Melalui  Kombinasi  Teknik  Pendinginan  dan Pemotongan  Ujung  Kalaza  Eksplan.  Skripsi Sarjana Biologi UPI. Tidak diterbitkan.
Salajova,  T.,  Salaj,  J.,  Jasic,  J.,  and  Kormutak,  A.
1995.  Somatik  Embryogenesis  in Pinus nigra Arndalam S. Jain, P.K. Gupta, R. Newton (eds). Somatic Embryogenesis in Woody Plant
vol.3.Kluwer Academic Publisher. Dordrecht Netherlands.
Signh,  H.  1978.  Embryology  of  Gymnosperms.
Somatic Embryogenesis in Woody Plants vol 4. Kluwer Academic Publisher. Dordrecht Netherlands.
Sukmananto,  B.  2012.  KBM  INK  Unit  I  Brumbung Ekspor  Gondorukem  Ke  China.  BINA.  Edisi 13- Maret 2012/th.XXXIX.
Taryono.  2000.  Somatishe  Embryogenese  und Transformation  bei  der  europaischen  ( Larix deciduas ). Dissertation, Humbold Universitatzu Berlin.
Taiz, L and Zeiger, E. 1998. Plant Physiology. Sinauer
Associates, inc. USA.
Vashista,  P.  C.  1983.  Gymnosperm.  S.  New  Delhi: Chand & Company.Ltd.
Zoglauger,  K  and  Reuther,  G.1996.  Somatishe Embryogenese  bei  der  Webitanne  ( Abies alba )Mitteilungen  der  Landesanstalt  fur  Wald- Und  Forstwirtshaft.Somatic  Embryogenesis  in
Woody Plant vol.4.Kluwer Academic Publisher. Dordrecht Netherlands.