Jurnal Perikanan dan Kelautan
Volume 10 Nomor 1. Juni 2020
Halaman :  43 – 54
Vaksin Bivalen Aeromonas hydrophila untuk Meningkatkan Ketahanan Tubuh Ikan Patin Siam ( Pangasius hypophthalmus) Terhadap Serangan Motile aeromonas septicemia
(Aeromonas hydrophila Bivalen Vaccines to Improve Body Resistance catfish (Pangasius hypophthalmus) Against Attacks Motile Aeromonas Septicemia)
1*) Dwi Mailani, 2) Olga, 1,2) Fatmawati, 1,2) Noor Arida Fauzana
1) Program Studi Magister Ilmu Perikanan, Universitas Lambung Mangkurat
2) Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Lambung Mangkurat
*) Korespondensi : dwi.mailani@ulm.ac.id
Diterima : 8 Juni 2020 / Disetujui : 24 Juli 2020

## ABSTRAK
Penyakit Motile  Aeromonas  Septicemia/ MAS  akibat  infeksi Aeromonas  hydrophila merupakan  kendala  dalam  budidaya  ikan  patin  siam  ( Pangasius  hypophthalmus ). Pengendalian MAS dapat dilakukan dengan pemberian vaksin. Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan dosis vaksin bivalen yang tepat dan efektif untuk pengendalian MAS pada  patin  Siam  ( Pangasius  hypophthalmus ).  Kedua  isolat  yang  akan  dijadikan  vaksin adalah  strain  lokal  bakteri A.  hydrophila CASO.01.G  dan  SBMI.2.    Keduanya  diisolasi dari  ikan  patin  siam  sakit  di  kolam  budidaya  desa  Cindai  Alus  dan  Sungai  Batang Kabupaten  Banjar  Kalimantan  Selatan.  Vaksin  dibuat  secara  pemanasan  ( heat  killed ) pada suhu 100 o C selama 60 menit. Sebanyak  13 ekor patin siam uji berukuran 9-13 cm dimasukan  dalam  tiap  akuarium.  Rancangan  yang  digunakan  adalah  rancangan  acak lengkap dengan 5 perlakuan dan 3 ulangan, yaitu vaksin bivalen dengan dosis 10 9 sel/ml, 10 8 sel/ml,  10 7 sel/ml,  10 6 sel/ml,  dan  kontrol  (larutan  PBS  pH  7,0).  Titer  antibodi tertinggi  pada  ikan  yang  divaksinasi  dengan  dosis  10 7 sel/ml  (1.706,67).  Efektivitas vaksin dapat dilihat dengan tingginya nilai RPS perlakuan dosis 10 9 sel/ml (97,22%); 10 8 sel/ml (100%); 10 7 sel/ml (97,22%); dan 10 6 sel/ml (100%). Nilai RWK kontrol adalah 1 hari  dengan  kematian  sebanyak  97,43%,  sedangkan  pada  perlakuan  vaksin  dosis  10 7 sel/ml, nilai RWK ulangan ada yang 1 hari, tetapi hanya 1 ekor ikan yang mati. Kualitas air  selama  penelitian  masih  mendukung  untuk  kehidupan  ikan  dan  bukan  penyebab kematian ikan selama uji tantang.
Kata Kunci : Aeromonas hydrophila, dosis, Pangasius hypophthalmus , vaksin bivalen

## ABSTRACT
Motile aeromonas septicemia/MAS diseases due to Aeromonas hydrophila infection is an obstacle  in  cultivation  of  catfish  (Pangasius  hypophthalmus).  MAS  control  can  be  done by  administering  vaccines.  The  purpose  of  this  research  is  to  get  the  right  and  effective dose  of  bivalent  vaccine  for  controlling  MAS  at  catfish.  Both  isolates  will  be  used  as vaccines  are  local  strains  of  A.  hydrophila CASO.01.G and  SBMI.2. Both  of  them  were isolated from disease catfish in the aquaculture ponds in Cindai Alus and Sungai Batang villages, Banjar Regency, South Kalimantan. Vaccines are made by heating (heat killed) at 100 o C for 60 minutes. A total of  13 test  catfish measuring 9-13 cm were  included in
each aquarium. The design used was a completely  randomized design with 5 treatments and 3 replications, namely bivalent vaccine with a dose of 10 9 cells/ml, 10 8 cells/ml, 10 7 cells/ml,  10 6 cells/ml,  and  control  (PBS  solution  pH  7.0).  The  highest  antibody  titers  in treatments vaccinated fish at a dose of 10 7 cells / ml (1,706.67). The effectiveness of the vaccine can be seen by the high RPS value of the treatment dose 10 9 cells/ml (97.22%); 10 8 cells/ml  (100%);  10 7 cells/ml  (97.22%); and  10 6 cells/ml  (100%).  The  control  MTD value  was 1 day  with 97.43% mortality,  while in the  vaccine  treatment  with dose of 10 7 cells/ml, there  was a MTD repeat value for 1 day, but only 1 fish died. Water quality  of this research are supportive and not a cause of fish death during the challenge test.
Keywords: Aeromonas hydrophila, bivalent vaccine, dose, Pangasius hypophthalmus

## PENDAHULUAN
Ikan  patin  ( Pangasius  hypophthalmus )  adalah  salah  satu  produksi  ikan  air tawar  yang  banyak  digemari  oleh  masyarakat  Indonesia,  saat  ini  sistem pembudidayaan telah berkembang menjadi budidaya intensif, karena meningkatnya  permintaan  konsumen  (Fariedah et  al. 2018).  Hal  ini  dapat meningkatkan  resiko  wabah  penyakit  pada  ikan.  Penyakit  yang  disebabkan  oleh bakteri  merupakan  salah  satu  kendala  dalam  budidaya  ikan  patin,  karena  dapat menyebabkan  kematian  massal  dan  merusak  kualitas  ikan.  Bakteri  yang  sering menyerang ikan patin diantaranya A. hydrophila (Quswa et al. 2016).
Penanggulangan  dengan  berbagai  cara  terhadap  bakteri  sudah  diterapkan oleh  pembudidaya  ikan  termasuk  perbaikan  pengelolaan  dan  penggunaan  obat- obatan,  tetapi  hasilnya  kurang  maksimal.  Peningkatan  kekebalan  melalui vaksinasi  merupakan  alternatif  untuk  penanggulangan  penyakit  yang  lebih  aman (Ellis  1988).  Vaksinasi  memberikan  solusi  yang  efektif  namun  murah  untuk memerangi  resiko  penyakit  dalam  budidaya  ikan.  Rezim  vaksinasi  yang  tepat untuk  mencegah  penyakit  bakteri  memberikan  solusi  terhadap  efek  bahaya  dari aplikasi antibiotik (Mohd-Aris et al . 2019)
Strategi  vaksinasi  yang  diperlukan  harus  memenuhi  kriteria  berikut  ini, seperti  penyakit  spesifik  yang  akan  memapar,  jenis  vaksin,  metode  vaksinasi, pemilihan waktu vaksinasi dan perlakuan vaksinasi ulangan ( booster ) (Sugiani et al .  2015).  Ciri  khas  vaksinasi  adalah  mengandung  zat  yang  berfungsi  sebagai antigen,  yang  merangsang  sistem  imun  adaftif  apabila  terpapar  antigen  patogen, sehingga  dalam  paparan  berikutnya  sistem  kekebalan  akan  meningkatkan  respon perlindungan yang cepat terhadap patogen yang sama (Ma et al . 2019). Vaksinasi ikan  umumnya  dilakukan  untuk  meningkatkan  daya  tahan  tubuh  ikan  terhadap penyakit  tertentu.  Akan  tetapi  sejalan  dengan  perkembangan  vaksin,  mulai dikembangkan  vaksin  bivalen  yang  diharapkan  mampu  melindungi  ikan  secara serempak  terhadap  infeksi  dua  strain  bakteri  patogen,  karena  vaksin  ini mengandung  dua  jenis  patogen  tertentu.  Menurut  Toranzo et  al. (2009)  Vaksin bivalen  harus mampu  memberi  perlindungan  terhadap  semua  serotipe  dari  setiap patogen yang menyebabkan penyakit tertentu.
Beberapa  penelitian  vaksin  bivalen  pada  ikan  menunjukkan  hasil  yang bervariasi, dan memberikan perlindungan yang baik pada ikan. Nugrahawati et al. (2019) menyatakan bahwa vaksin bivalen mampu melawan black body syndrome (BBS)  pada  kakap  putih  ( Lates  calcarifer) menunjukkan  nilai relative  percent survival (RPS)  80,00%,  selanjutnya  Mahardika et  al. (2018)  menyatakan  vaksin
bivalen pada juvenil kerapu sunu dapat mencegah infeksi virus dan bakteri, yang dibuktikan  dari  nilai  RPS  sebesar  71,5%.  Menurut  Sugiani et  al. (2015)  vaksin bivalen A.  hydrophila dan Mycobacterium  fortuitum melalui  injeksi  dapat mencegah  penyakit  pada  gurami  ( Osphronemus goramy),  memberikan  nilai  RPS 100% setelah ditantang dengan A. hydrophila dan 56,7 % ketika ditantang secara koinfeksi.  Sedangkan  vaksin  monovalen A.  hydrophila maupun S.  agalactiae hanya mampu memproteksi terhadap bakteri homolog, dan tidak ada perlindungan silang diantara keduanya.
Bakteri A.  hydrophila mempunyai  banyak  strain.  Strain-strain  inilah  yang mempengaruhi  tingkat  patogenisitas  pada  inang  dan  terkadang  tidak  mengenali strain  lainnya.  Dengan  demikian,  perlu  dibuat  vaksin  bivalen  dengan menggabungkan  2  strain  yang  berbeda  (Mulia et  al .  2015).  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mendapatkan  dosis  vaksin  bivalen A.  hydrophila yang  tepat  dan mengetahui efektivitasnya untuk pengendalian MAS pada benih ikan patin siam.

## METODE PENELITIAN

## Ikan Uji
Hewan uji  yang digunakan adalah ikan patin siam yang berukuran panjang 9-13  cm.  Ikan  patin  siam  diperoleh  dari kolam  pembesaran  di  Desa  Cindai  Alus Kabupaten  Banjar.  Ikan  dipelihara  di  dalam  akuarium  berukuran  50x20x20  cm dengan kepadatan 13 ekor/ akuarium.
Peningkatan Virulensi Isolat A. hydrophila CASO.01.G dan SBMI. 2 Isolat  bakteri  yang  dipergunakan  untuk  membuat  vaksin  adalah  bakteri A. hydrophila CASO.01.G  dan  SBMI.  2  yang  merupakan  isolat  lokal  hasil  isolasi dari  ikan  patin  siam  yang  diperoleh  dari  desa  Cindai  Alus  dan  Sungai  Batang Kabupaten Banjar Kalimantan Selatan.
Isolat  strain  CASO.01.G  dan  SBMI.2  ditingkatkan  virulensinya  dengan penyuntikkan secara intramuskular suspensi bakteri dengan kepadatan 10 9 sel/ml pada  5  ekor  ikan  patin  siam  berukuran  panjang  9-13  cm.  Bakteri  diisolasi  dari ikan  uji  yang  telah  diinfeksi,  kemudian  dikultur  di  medium  selektif Aeromonas Pseudomonas (GSP agar; Merck), selanjutnya satu koloni yang berwarna kuning dikultur  ke  medium  agar  cair Tryptone  Soya  Agar (TSA;  Merck)  sebagai  media kultur awal bakteri dan diinkubasi pada suhu kamar selama 18-24 jam, kemudian diinfeksi  lagi  ke  ikan  sehat.  Setiap  ada  kematian  ikan,  dosis  untuk  reinfeksi semakin diturunkan dan dilihat gejala dan waktu kematian.

## Pembuatan vaksin
Vaksin  dibuat  mengacu  metode  Mulia et  al. (2012)  dengan  cara  antigen bakteri A. hydrophila dibuat dengan cara mengkultur bakteri medium Tryptone Soy  Broth  ( TSB;  Merck)  dengan  volume  10  ml  selama  18-24  jam.  Suspensi bakteri  yang  tumbuh  dalam  medium  TSB  dikultur  ke  dalam  media  TSA  pada cawan petri besar dan diinkubasi kembali selama 18-24 jam. Kultur dipanen dan diinaktivasi  dengan  pemanasan  ( heat  killed )  100 o C  selama  1  jam  menggunakan waterbath. Disentrifuge dengan kecepatan 3.000 rpm selama 10 menit dan dicuci dengan  larutan Phosphate  Buffered  Saline (PBS)  pH  7,0  sebanyak  3  kali.
Selanjutnya  dilakukan  uji  viabilitas  untuk  mengetahui  apakah  bakteri  yang  telah diinaktifkan masih aktif atau tidak.

## Vaksinasi
Vaksinasi  dilakukan  dengan  menyuntikkan  ikan  uji  secara  intramuskular dengan dosis 0,1 sel/ml/ekor sesuai dosis perlakuan. Kontrol disuntik larutan PBS pH 7,0 steril sebanyak 0,1 ml/ekor. Seminggu kemudian dilakukan vaksin booster dengan  dosis  yang  sama  seperti  yang  diberikan  pada  vaksin  awal.  Pada  minggu ke-0,1,2,3,  dan  4  dilakukan  pengambilan  darah  ikan  untuk  uji  titer  antibodi. Pengukuran titer antibodi dilakukan mengacu pada metode Anderson (1974). Uji tantang  dilakukan  dua  minggu  setelah  vaksinasi.  Kepadatan  bakteri  tantang berdasarkan  hasil  LD 50 ,  setelah  uji  tantang  ikan  dipelihara  selama  14  hari  untuk mengamati  sintasan,  RPS  dan  rerata  waktu  kematian.  Ikan  diberi  pakan  buatan berupa  pelet  komersial  secara  terus  menerus  sampai  ikan  tidak  mau  makan  lagi ( ad libitum ) selama penelitian.

## Parameter dan Analisis Data
Penelitian  ini  menggunakan  metode  eksperimental.  Rancangan  yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak lengkap (RAL) dengan 5 perlakuan dan 3 ulangan. Perlakuan tersebut adalah pemberian vaksin bivalen A. hydrophila dengan  dosis  10 9 sel/ml,  10 8 sel/ml,10 7 sel/ml,  10 6 sel/ml  dan  kontrol PBS pH 7,0.
Parameter  yang  diamati  meliputi  titer  antibodi, relative  percent  survival (RPS),  sintasan,  rerata  waktu  kematian  (RWK)  dan  mortalitas.  Pengamatan  titer antibodi mikrotiter, diamati sebanyak 5 kali. Adapun data, RPS dan RWK diamati setelah uji tantang. Rumus yang digunakan untuk perhitungan adalah:
Tingkat Perlindungan Relatif ( Relative Percent Survival / RPS) (Johnson et al . 1982) dihitung sebagai berikut:
Rerata  waktu  kematian  (RWK)  /Mean  to  death  (MTD)  dihitung  mengacu dalam Olga (2012) sebagai berikut:
Keterangan:
a = waktu kematian (hari)
b = jumlah ikan yang mati (ekor)
Parameter  penunjang  lainnya  yang  diamati  adalah  kualitas  air  (DO,  CO 2 , NH 3 ,  pH  dan  suhu)  dilakukan  pada  awal  perlakukan  (vaksinasi  awal),  vaksinasi booster , uji tantang pertama, dan akhir penelitian (setelah uji tantang).
Titer antibodi  diamati  dengan  metode  deskriptif  dan  kuantitatif.  Data  yang terkumpul  dari  uji  titer  antibodi  ditransformasikan  ke  dalam  bentuk  logaritma (data  log  2),  kemudian  dianalisis  dengan  analisis  sidik  ragam  (ANOVA).  Data lainnya  yang  diperoleh  setelah  uji  tantang  seperti  sintasan,  RPS  dan  RWK  juga dianalisis  dengan  ANOVA.  Apabila  berbeda  nyata  akan  dilanjutkan  dengan  uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf uji 5 % dan 1 %.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Titer Antibodi
Titer  antibodi  sebelum  vaksinasi  menunjukkan  bahwa  kekebalan  spesifik pada  patin  siam  belum  terbentuk  titer  antibodi  yang  ditunjukkan  nilai  sebesar  1. Satu  minggu  setelah  vaksinasi,  rerata  titer  antibodi  ikan  perlakuan  dosis  vaksin meningkat,  yaitu  10 9 sel/ml  (224,00);  10 8 sel/ml  (298,67);  10 7 sel/ml  (1.706,67); 10 6 sel/ml (460,80), dan kontrol sebesar 1. Minggu kedua setelah setelah vaksinasi booster ,  rerata  titer  antibodi  ikan  uji  yang  divaksin  dengan  dosis  10 6 sel/ml (1.408,00),  10 7 sel/ml  (1.365,33)  diikuti  10 8 sel/ml  (384,00)  dan  10 9 sel/ml (138,67),  sedangkan  pada  kontrol  adalah  1,00.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa perlakuan vaksinasi menggunakan Ag O dari strain  yang berbeda mampu memproduksi  titer  antibodi.  Pada  minggu  pertama  pasca  vaksinasi,  titer antibodi ikan  mulai  meningkat,  selanjutnya  semakin  meningkat  pada  minggu  berikutnya. Dengan  demikian  vaksin  bivalen  bakteri A.hydrophila dapat  memberikan imunogenisitas secara signifikan pada benih patin siam. Kemampuan ikan dalam memproduksi  titer  antibodi  pada  masing-masing  perlakuan  menunjukkan  hasil yang berbeda terlihat pada Gambar 1.
Gambar  1.    Produksi  titer  antibodi  benih  patin  siam  selama  penelitian.  Axis  x menunjukkan  waktu  sampling  sebelum  vaksinasi  (x=0),  vaksinasi booster (x = 1), uji tantang pertama (x=2), uji tantang kedua (x=3), dan panen (x=4). Axis y menunjukkan data statistik titer antibodi.
Minggu  ketiga  (seminggu  setelah  vaksinasi booster ),  terjadi  peningkatan yang sangat pesat pada  titer antibodi ikan. Rerata  titer antibodi tertinggi terlihat pada 10 6 sel/ml (1.408,00), diikuti 10 7 sel/ml (1.194,67); 10 8 sel/ml (298,6); dan 10 9 sel/ml  (106,67),  sedangkan  pada  kontrol  mengalami  peningkatan,  yaitu sebesar  2,00.  Hasil  ANOVA  perlakuan  tidak  berbeda  nyata  (P>0,05).  Minggu keempat  (sebelum  uji  tantang)  rerata  titer  antibodi  tertinggi  terlihat    pada  10 7 sel/ml  (1.706,67);  diikuti  10 6 sel/ml    (1.536,00);  10 8 sel/ml   (554,67);  10 9 sel/ml (405,33); dan kontrol sebesar 1,67. Hasil ANOVA berbeda nyata (P<0,1), dimana rerata produksi titer antibodi antara perlakuan ikan yang divaksin (perlakuan A, B, C  dan  D)  dengan  kontrol  berbeda  nyata.  Menurut  Mulia  (2012)  booster  dapat memicu  peningkatan  antibodi,  meningkatnya  titer  antibodi  terjadi  dikarenakan ikan uji telah memiliki memori imunitas, sehingga dengan booster atau vaksinasi ulangan dapat menghasilkan respon imun yang lebih tinggi. Wintoko et al. (2013) pemberian  vaksin,  secara  tidak langsung  dapat meningkatkan  respon  imun  alami
yang ditandai dengan peningkatan sel fagosit berupa monosit dan limfosit. Sel–sel fagosit tersebut memiliki hubungan korelasi terhadap uji titer antibodi yang telah dilakukan, yaitu sel fagosit berfungsi sebagai pengenalan antigen atau vaksin yang diberikan  pada  tubuh  ikan.  Dengan  demikian  sel  fagosit,  yaitu  limfosit  dapat mengenali  antigen,  dan  dapat  merangsang  sel  memori,  dan  sel  B  untuk menghasilkan  antibodi,  yang  peningkatannya  terlihat  pada  reaksi  agglutinasi dengan  uji  titer  antibodi.  Antibodi  tidak  saja  meningkatkan  pertahanan  humoral tetapi  juga  pertahanan  seluler  sehingga  hasil  kerja  masing-masing  maupun  hasil kerja antara pertahanan humoral dan seluler meningkat.
Hasil  penelitian  ini  sesuai  dengan  penelitian  Mulia et  al. (2016)  yang menyatakan  bahwa  vaksin heat  killed A.  hydrophila dapat  meningkatkan  titer antibodi  pada  ikan  lele  hingga  mencapai  512,  sedangkan  pada  kontrol  mencapai 5,03. Selanjutnya, menurut  Mulia et al. (2015) potensi imunogenisitas bakteri A. hydrophila strain GPL-05 dan GL-02 sebagai kandidat vaksin menghasilkan rata- rata titer antibodi yang sama, yaitu sebesar 841,62, sedangkan kontrol 6,41. Rata- rata  titer  antibodi  pada  penelitian  ini  mengalami  peningkatan,  titer  antibodi tertinggi  dihasilkan  pada  dosis  10 6 sel/ml.  Menurut  Bellanti  (1993)  dosis  vaksin dapat  mengubah  imunogenisitas  dan  ada  dosis  tertentu  dari  suatu  antigen  yang dapat  menimbulkan  respon  antibodi  maksimal.  Taukhit et  al. (2014)  tingginya nilai  titer  antibodi  tidak  sepenuhnya  menggambarkan  level  proteksi  mutlak terhadap  patogen  target,  tetapi  secara  umum  dapat  dinyatakan  bahwa  semakin tinggi  nilai  nilai  titer  antibodi  mengindikasikan  adanya  pembentukan  respon tanggap  kebal  yang  berkorelasi  positif  dengan  kemampuan  menangkal  infeksi patogen target.

## Relative Percent Survival (RPS) dan Sintasan
Tingginya  sintasan  pada  perlakuan  ikan  bervaksin  yang  disajikan  pada Tabel 1, membuktikan bahwa ketika terjadi serangan MAS, ikan yang divaksinasi lebih  mampu  untuk  bertahan  hidup  dibandingkan  ikan  yang  tidak  divaksinasi. Sedangkan  nilai  tingkat  perlindungan  relatif  (RPS)  benih  patin  siam  dalam penelitian  ini  berkisar  antara  97,22  -  100  %  (Tabel  1).  Berdasarkan  ANOVA rerata nilai RPS antara perlakuan berbeda sangat nyata. Menurut Olga  dan Aisiah (2007),  hal  ini  kemungkinan  disebabkan  setiap  individu  ikan  dalam  ulangan perlakuan  mempunyai  tingkat  respon  imun  yang  berbeda  dalam  menanggapi serangan  bakteri A.  hydrophila pada  saat  uji  tantang.  Banyak  penelitian  vaksin bivalen telah dilakukan pada jenis ikan yang berbeda dan kombinasi bakteri yang berbeda  pula.  Diantaranya  Bastardo et  al. (2012)  menyatakan  bahwa  vaksin bivalen  efektif  terhadap  infeksi A.  hydrophila dan Lactococcus  garvieae pada rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum) menghasilkan nilai RPS 95,3 %. Hasil  penelitian  Sugiani et  al. (2015)  vaksin  bivalen A.  hydrophila dan Mycobacterium  fortuitum menghasilkan  nilai  RPS  56,33%  pada  ikan  gurami ( Osphronemus goramy ).
Nilai  RPS  dalam  penelitian  ini  berkisar  antara  97,22–100%.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  vaksin  bivalen  yang  dibuat  dengan  cara  pemanasan  ( heat killed )  efektif  dalam  melindungi  ikan  selama  uji  tantang.  Menurut  Kementerian Kelautan  dan  Perikanan  persyaratan  untuk  produksi  vaksin  ikan  yang  dapat dikatakan baik dan dapat diedarkan ke pembudidaya harus memiliki RPS > 50%
(Sugiani et al . 2018). Dengan demikian vaksin bivalen dalam penelitian ini layak untuk digunakan.
Tabel  1.  Rerata  RPS  benih  patin  siam  setelah  uji  tantang  dengan  bakteri A.
hydrophila . Perlakuan Dosis Sintasan (%) Relative Percent Survival (%) 10 9 sel/ml 97,43 b 97,22 b 10 8 sel/ml 100 a 100 a 10 7 sel/ml 97,43 b 97,22 b 10 6 sel/ml 100 a 100 a Kontrol 2,57 c
Keterangan :    Rerata dalam satu kolom yang diikuti dengan huruf superscript yang sama tidak berbeda nyata (P>0,01)
Dosis 10 8 sel/ml dan dosis 10 6 sel/ml memiliki sintasan 100 %, sedangkan dosis 10 9 sel/ml dan dosis 10 7 sel/ml memiliki sintasan 97,43%, hal ini disebabkan karena pemberian dosis vaksinasi dapat meningkatkan level ketahanan tubuh ikan dalam  pembentukan  antibodi  lebih tahan terhadap  serangan  bakteri A.hydrophila pada benih ikan patin siam. Menurut Anderson (1992) faktor imunosupresi adalah salah  satu  yang  mempengaruhi  respon  kekebalan  non  spesifik  dan  spesifik. Imunosupresi  disebabkan  oleh  dosis  yang  terlalu  rendah  atau  tinggi,  sehingga tubuh  ikan  tidak  mampu  merespon  rangsangan  antigenik  yang  masuk  ke  dalam tubuh ikan. Menurut Tatang (2014) respon kekebalan spesifik akan mulai muncul jika  ikan  mampu  bertahan  hidup.  Selanjutnya  akan  terbentuk  antibodi  spesifik terhadap agen infeksi pada level titer protektif dan terbentuk pula sel-sel memori. Pada saat terjadinya reinfeksi oleh agen penyakit sejenis, maka ikan tersebut akan mampu menahan infeksi karena respon kekebalan sekunder akan terjadi.

## Rerata Waktu Kematian (RWK) dan Mortalitas
Berdasarkan hasil penelitian, salah satu ulangan dalam perlakuan ikan yang divaksin  dosis  10 9 sel/ml  ada  yang  mati  pada  hari  kedua  sebanyak  1  ekor, sehingga  memberikan  nilai  RWK  selama  2  hari,  sedangkan  ulangan  lainnya  dan perlakuan dosis 10 8 sel/ml, serta 10 6 sel/ml tidak ada yang mati. Selanjutnya ada nilai RWK satu ulangan perlakuan dosis 10 7 sel/ml sama dengan nilai RWK pada seluruh perlakuan kontrol, selama 1 hari. Adanya persamaan nilai RWK ikan yang divaksin dengan dosis 10 7 sel/ml dengan perlakukan kontrol, karena ikan di kedua perlakuan  tersebut  mati  di  hari  yang  sama.  Meskipun  demikian,  ikan  yang  mati dalam ulangan perlakuan dosis 10 7 sel/ml hanya 1 ekor di hari pertama setelah uji tantang, sedangkan pada kontrol 97,43% ikan mati pada hari pertama.
Data mortalitas yang disajikan di Tabel 2 menunjukkan bahwa 97,43% ikan patin siam perlakuan kontrol mati setelah diuji tantang, sedangkan patin siam pada perlakuan  dosis  vaksin  menunjukkan  mortalitas  yang  relatif  sangat  rendah dibandingkan  kontrol.  Banyaknya  jumlah  ikan  perlakuan  kontrol  yang  mati dibandingkan ikan perlakuan vaksin, karena ikan-ikan tidak memiliki sel memori yang  mampu  mengenali  paparan  antigen  spesifik  yang  masuk  ke  dalam  tubuh. Selanjutnya, adanya ikan perlakuan vaksin yang mati menunjukkan bahwa adanya respon  imun  yang  berbeda  setiap  ikan  dalam  menanggapi  tantangan.  Diduga
respon imun ikan yang mati rendah dan ada faktor lain yang mungkin terjadi pada saat penanganan, sehingga ikan pada perlakuan dosis 10 7 sel/ml mati.
Nilai  RWK  pada  penelitian  ini  lebih  rendah  dari  penelitian  Olga  dan  Rini (2006) yang menyatakan bahwa nilai RWK jambal siam yang divaksinasi dengan sel  utuh A.  hydrophila berkisar  antara  2,56-2,72  hari.  Selanjutnya  Olga et  al. (2007)  yang  memberikan  vaksin  protein A.  hydrophila dengan  dosis  yang berbeda, dalam penelitian tersebut nilai RWK ikan jambal siam bervaksin berkisar antara  2,19-3,50  hari,  sedangkan  pada  kontrol  1,23  hari.  Kamiso  dan  Triyanto (1992)  mengungkapkan  bahwa  vaksinasi  hanya  melindungi  ikan  dari  serangan bakteri  spesifik.  Jika  ikan  bervaksin  dapat  diserang,  berarti  perlakuan  vaksinasi tidak  berdampak  nyata  terhadap  perkembangan  penyakit,  sehingga  rerata  waktu kematiannya tidak berbeda dengan ikan yang tidak bervaksin.
Tabel  2.  Rerata  Waktu  Kematian  dan  Mortalitas  benih  patin  siam  setelah  uji
tantang dengan bakteri A. hydrophila . Perlakuan Dosis Rerata Waktu Kematian (hari) Rerata (hari) Mortalitas Ulangan 1 2 3 10 9 sel/ml 0 2 0 0,67 a 2,57 10 8 sel/ml 0 0 0 0 a 0 10 7 sel/ml 1 0 0 0,33 a 2,57 10 6 sel/ml 0 0 0 0 a 0 Kontrol 1 1 1 1 b 97,43
Keterangan :    Rerata dalam satu kolom yang diikuti dengan huruf superscript yang sama tidak berbeda nyata (P>0,01)
Menurut  Munang’andu et  al. (2013)  perbedaan  utama  antara  ikan  yang divaksinasi  dan  ikan  kontrol  adalah  bahwa  pada  ikan  yang  divaksinasi  sudah muncul  antibodi  sebagai  respon  terhadap  vaksinasi  dari  vaksin inactive sebelum ikan  diuji  tantang,  sedangkan  pada  ikan kontrol,  respon  muncul terhadap  bakteri setelah  ditantang.    Oleh  karena  itu,  umumnya  ikan  kontrol  tidak  dapat  bertahan pasca  diuji  tantang.  Peningkatan  kadar  antibodi  ini  berhubungan  dengan penurunan  tingkat  infeksi  secara  keseluruhan.  Sebaliknya,  pada  ikan  yang divaksinasi,  antibodi  dapat  melindungi  pasca  diuji  tantang.  Peningkatan  kadar antibodi ini berhubungan dengan penurunan tingkat infeksi secara keseluruhan.

## Kualitas Air
Hasil pengamatan kualitas air selama penelitian menunjukkan bahwa kadar oksigen terlarut (DO) berkisar 3,58-7 ppm, suhu udara 26-31 0 C, suhu air 25,5-29
0 C,  CO 2 bebas  2,6-2,75  ppm,  NH 3 -N  0,14-0,17  ppm,  dan  pH  5,73-5,75.  Selama masa  penelitian,  kadar  oksigen  terlarut  (DO)  berkisar  3,58-7  ppm  masih  sesuai SNI 01-6483.5-2002. Wangni et al. (2019) mengungkapkan standar produksi ikan patin siam, suhu udara 26-31 0 C, suhu air 25,5-29 0 C, Kisaran suhu yang optimal untuk  benih  ikan  patin  berdasarkan  SNI  01-6483.4-2000  yaitu  27-30°C.  CO 2 bebas  2,6-2,75  ppm,  NH 3 -N  0,14-0,17  ppm,  dan  pH  5,73-5,75  Nilai  pH  yang optimal  untuk  pertumbuhan  benih  ikan  patin  siam  berdasarkan  SNI  01-6483.4- 2000,  yaitu  6,5-8,5.  Secara  keseluruhan  nilai  kisaran  kualitas  air  masih
mendukung untuk kehidupan benih patin siam dan bukan penyebab kematian ikan uji selama penelitian

## KESIMPULAN
Vaksin  bivalen A.  hydrophila dengan  dosis  10 9 sel/ml,  dosis  10 8 sel/ml, dosis  10 7 sel/ml,  dan  dosis  10 6 sel/ml  dapat  digunakan  sebagai  vaksin  untuk mengendalikan  MAS.  Dosis  10 6 sel/ml  merupakan  dosis  efektif  karena imunogenisitasnya setara dengan 10 9 sel/ml dan dapat menimbulkan respon imun yang baik.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih  yang  sebesar-besarnya  kepada  Alm  Dr.  Ir.  Muhammad,  MP atas bimbingan yang sangat besar selama proses penelitian dan penulisan sampai akhir  hayat  beliau.  Ucapan  terimakasih  juga  kepada  ibu  Olga,  S.Pi,  M.Si  yang telah  memfasilitasi  penelitian  dan  membimbing  tanpa  pamrih  serta  meluangkan waktu dan pikirannya selama penelitian dan penulisan sampai selesai.

## DAFTAR PUSTAKA
Anderson  DP.  1974. Fish  Immunology . In S.F.  Snieszko,  H.R  Axelrod  (ED). Disease of Fishes. TFH publication Ltd., Hongkong.
Anderson  DP.  1992. Immunostimulans,  Adjuvants,  and  Vaccine  Corries  in  Fish Aplication  to  Aquaculture. U.S.  Fish  and  Wildlife  Service  Kearneysville, West Virginia, USA
Bastardo A, Ravelo C, Castro N, Calheiros J, Romalde JL. 2012. Effectiveness of Bivalent  Vaccines  Against Aeromonas  hydrophila and Lactococcus garvieae Infections  in  Rainbow  Trout Oncorhynchus  mykiss (Walbaum). Fish & Shellfish Immunology 32(5):756-761. DOI:
10.1016/j.fsi.2012.01.028
Bellanti  JA.  1993. Imunologi  III .  486.  diterjemahkan  oleh  Wahab  JA.  Fakultas Kedokteran  Universitas  Gadjah  Mada.  Gadjah  Mada  University. Yogyakarta.
Biller-Takahashi JD, Urbinati EC. 2014. Fish Immunology. The Modification and Manipulation  of  The  Innate  Immune  System:  Brazilian  Studies.  Anais  Da Academia  Brasileira  de  Ciencies 86(3):484-1506. DOI  :10.1590/0001- 3765201420130159
Ellis AE. 1988. General Principles of Fish Vaccination. In: Fish vaccination . A. E. Ellis (ed). Academic Press. London. Page 32-45
Fariedah  F,  Inalya  I,  Rani  Y,  A’yunin  Q,  Evi  T.  2018.  Penggunaan  Tanah  Liat untuk  Keberhasilan  Pemijahan  Ikan  Patin  Siam  ( Pangasianodon hypophthalmus ). Jurnal  Ilmiah  Perikanan  dan  Kelautan 10(2):91-94. http://dx.doi.org/10.20473/jipk.v10i2.10301
Johnson  KA,  Flynn  JK,  Amend  DF.  1982.  Onset  of  Immunity  in  Salmonid  Fry
Vaccinated  by  Direct  Immersion  in Vibrio  Anguillarum and Yersinia Ruckeri Bacterins. Journal Fish Diseases 5(3):197-205. DOI:10.1111/j.1365-2761.1982.tb00474.x
Kamiso  HN,  Triyanto.  1992.  Vaksinasi  Monovalen  dan  Polivalen  Vaksin  untuk Mengatasi  Serangan Aeromonas  hydrophilla pada  Ikan  Lele (Clarias sp).
Jurnal Ilmu Pertanian (Agriculture Science) . 4(8):447–464.
Ma  J,  Bruce  TJ,  Jones  EM,  Cain  KD.  2019.  A  Review  of  Fish  Vaccine Development Strategies: Conventional Methods and Modern Biotechnological Approaches. Microorganisms 7(11):569-586 . DOI:10.3390/microorganisms7110569.
Mahardika  K,  Mastuti  I.  2018.  Aplikasi  Vaksin  Bivalen  (Vaksin  Rekombinan Protein  VNN  dan  GSDIV)  pada  Juvenil  Kerapu  Sunu Plectropomus leopardus untuk  Pencegahan  Infeksi  Virus  dan  Bakteri. Prosiding Seminar Nasional  Kelautan  XIII,  Fakultas  Teknik  dan  Ilmu  Kelautan  Universitas
Hang Tuah, Page C1.81-89.
Mohd-Aris  A, Muhamad-Sofie MHN, Zamri SM, Daud HM, Ina-Salwany MdY.
2019.  Live Vaciines  Against Bacterial  Fish Diseases: A review, Veterinary World 12 (11) : 1806 - 1815. DOI : www.doi.org/10.14202/vetworld.2019.18006-1815. Mulia DS. 2007. Keefektifan Vaksin Aeromonas hydrophila untuk Mengendalikan  Penyakit  MAS  ( Motile  Aeromonas  Septicemia )  pada Gurami  ( Osphronemus  gouramy Lac.). Jurnal  Pembangunan  Pedesaan 7(1):43-52.
Mulia  DS,  Apriyanti  W,  Maryanto  H,  Purbomartono  C.  2012.  Imunogenisitas Antigen  Whole  Cell  Bakteri Aeromonas  hydrophila . Sains  Akuatik 14(1):
25-32.
Mulia DS, Khusniah A, Maryanto H. 2015. Potential Immunogenicity of Bacteria Aeromonas  hydrophila GPL-05  and  GL-02  Strain  as  a  Candidate  Vaccine. Aquasains ( Jurnal  Ilmu  Perikanan  dan  Sumberdaya  Perairan )  4(1):335- 345.
Mulia DS, Windarti C, Maryanto H. 2016. Imunogenisitas Heat Killed Aeromonas hydrophila Strain  GB-01,  GPd-02,  dan  GPI-05  sebagai  Kandidat  Vaksin.
Techno 17(2):94-100. DOI: 10.30595/techno.v17i2.1176
Munang’andu  HM,  Fredriksen  BN,  Mutoloki  S,  Dalmo  RA,  Evensen  O.  2013.
Antigen Dose and  Humoral Immune Response Correspond with Protection for  Inactivated  Infectious  Panceatic  Necrosis  Virus  Vaccines  in  Atlantic
Salmon ( Salmo salar L). Veterinary Research 44(1):7-22.
DOI:10.1186/1297-9716-44-7.
Nugrahawati  A,  Nurhayati  S,  Sukenda,  Rahman,  Brite  M,  Aditya  TW.  2019.
Efficacy  of  Bivalent  Vaccine  Against Black  body  syndrome (BBS)  of Barramundi Lates calcalife r B. Jurnal Akuakultur Indonesia 18(2):172-181. http://biofisika.journal.ipb.ac.id/index.php/jai/article/viewFile/87187/17861. DOI : https://doi.org/10.19027/jai.18.2.172-181
Olga. 2012. Patogenisitas Bakteri Aeromonas hydrophila ASB01 pada Ikan Gabus ( Ophiocephalus striatus ). Sains Akuatik 14 (1):33-39.
Olga,  Rini  RK.  2006.  Penggunaan  Vaksin  Whole  Cell  untuk  Pengendalian Penyakit MAS ( Motile Aeromonas Septicemia ) pada Ikan Patin ( Pangasius hypophthalmus ). Agroscientiae 13(1):48-54
Olga, Aisiah S. 2007. Vaksin Protein Produk Ekstraseluler Aeromonas hydrophila untuk Meningkatkan Tanggap  Kebal ( Pangasius hypophthalmus ) Terhadap Motile Aeromonas Septicemia (MAS). Sains Akuatik 10(2): 105-110
Olga,  Rini  RK,  Akbar  J,  Isnansetyo  A,  Sembiring  L.  2007.  Protein Aeromonas hydrophila Sebagai  Vaksin  untuk  Pengendalian  MAS  ( Motile  Aeromonas Septicemia )  pada  Jambal  Siam  ( Pangasius  hypophthalmus ). Jurnal Perikanan (J. Fish.Sci) IX (1): 17-25. DOI:https://doi.org/10.22146/jfs.59.
Quswa  RGG,  Sasanti  AD,  Yulisman.  2016.  Pencegahan  Infeksi Aeromonas hydrophila pada Ikan Patin ( Pangasius sp.) Menggunakan Tepung Paci-paci ( Leucas  lavandulaefolia) . Jurnal  Akuakultur  Rawa  Indonesia 4(1):40-52. DOI: https://doi.org/10.36706/jari.v4i1.4425
Sugiani  D,  Sukenda,  Harris  E,  Lusiastuti  AM.  2012.  Respon  Imun  Ikan  Tilapia, Oreochromis  niloticus ,  terhadap  Vaksin  Bivalen  Sel  Utuh  dan  Ekstra Selular  Antigen Aeromonas  hydrophila dan Streptococcus  agalactiae . Prosiding Forum  Inovasi  Teknologi  Akuakultur  2012.    8-11  Juni  2012  di Hotel  Arya  Duta  Makassar,  Sulawesi.  Pusat  Penelitian  dan  Pengembangan Perikanan Budidaya. hlm 755‒763.
Sugiani  D,  Aryati  Y,  Mufidah  T,  Purwaningsih  U.  2015.  Efektivitas  Vaksin Bivalen Aeromonas  hydrophila dan Mycobacterium  fortuitum untuk Pencegahan Infeksi Penyakit pada Ikan  Gurami ( Osphronemus goramy ). J. Ris. Akuakultur 10 (4) : 5567 – 577 ; DOI: http://dx.doi.org/10.15578/jra.10.4.2015.567-577
Sugiani  D,  Arifin  OZ,  Purwaningsing  U,  Asependi,  Wadjdy  EF.  2016.  Uji Aplikasi  Lapangan  Vaksin  Bivalen  HydrofortyVac  dan  Vaksin  Monovalen (Hydrovac  dan  Mycofortyvac)  pada  Benih  Ikan  Gurami  ( Osphronemus goramy ). Media Akuakultur 11(2):111-119.
Sugiani D, Taukhid, Purwaningsing U, Lusiastuti AM. 2018. Vaksin Kering Beku Sel  Utuh  Bakteri A.  hydrophila untuk  Pencegahan  Penyakit Motile
Aeromonas  Septicemia pada  ikan  Lele,  Nila,  dan  Gurami. Jurnal  Riset Akuakultur 13(2):159-167. DOI: http://dx.doi.org/10.15578/jra.13.2.2018.159-167 Tatang.  2014.  Sistem  Kekebalan  Pada  Ikan. Fisheries  Extension  Worker on Januari 27, 2014.
Taukhid,  Lusiastuti  AM,  Sumiartu  T,  Sugiani  D,  Puwaningsih  U.  2014. Pengembangan  Vaksin  Bivalen  untuk  Pencegahan  Penyakit Motile Aeromonas  Septicemia (MAS)  dan Streptococcossis pada  Ikan  Nila ( Oreochromis niloticus) . Prosiding Seminar Hasil Penelitian Terbaik Tahun 2014. Badan Penelitian dan Pengembangan Kelautan dan Perikanan. Jakarta , hlm. 1-18.
Toranzo  AE,  Romalde  JL,  Magarinos  B,  Barja  JL.  2009.  Present  and  Future  of Aquaculture  Vaccines  Against  Fish  Bacterial  Diseases.  The  Use  of Veterinary  Drugs  and  Vaccines  in  Mediterranean  Aquaculture. Options Mediterraneennes A 86:155-176.
Wangni  GP,  Sugeng  P,  Sumantriyadi.  2019.  Kelangsungan  Hidup  dan Pertumbuhan Benih Ikan Patin Siam ( Pangasius hypophthalmus) pada Suhu Media  Pemeliharaan  Yang  Berbeda. Jurnal  Ilmu-ilmu  Perikanan  dan Budidaya Perairan 14 : 21 - 28. DOI: http://dx.doi.org/10.31851/jipbp.v14i2.3487
Wintoko  F,  Setyawan  A,  Hudaidah  S,  Mahrus  A.  2013.  Imunogenisitas  Heat Killed  Vaksin  Inaktif Aeromonas  salmonicida pada  Ikan  Mas  ( Cyprinus carpio ). e-Jurnal Rekayasa dan Teknologi Budidaya Perairan II:205-210.