Jurnal Farmasi Galenika ( Galenika Journal of Pharmacy ) 2018; 4 (1): 1 – 11 ISSN : 2442-8744 (electronic) http://jurnal.untad.ac.id/jurnal/index.php/Galenika/index
DOI : 10.22487/j24428744. 2018.v4.i1.9209
Kurkumin  Meningkatkan  Sensitivitas  Sel  Kanker  Payudara  terhadap Tamoksifen  Melalui  Penghambatan  Ekspresi  P-glikoprotein  dan Breast Cancer Resistance Protein
(Curcumin Increased Breast Cancer Cells Sensitivity to Tamoxifen Through Inhibition of P-glycoprotein and Breast Cancer Resistance Protein Expressions)
Erlia Anggrainy Sianipar 1 , Melva Louisa 2 dan Septelia Inawati Wanandi 3
1 Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya, Jakarta, Indonesia
2 Departemen Farmakologi dan Terapi, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta, Indonesia
3 Departemen Biokimia, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta, Indonesia
Article Info: Received : 12 Februari 2018 in revised form: 21 Maret 2018 Accepted: 30 Maret 2018
Available Online: 30 Maret 2018

## ABSTRACT
The decreasing of sensitivity or resistance to tamoxifen occured after long- term  treatment  in  breast  cancer.  One  of  the  major  factor  in  tamoxifen resistance is over expression of efflux transporter P-glycoprotein (P-gp) and Breast Cancer Resistance Protein (BCRP). Curcumin has known as inhibitor of P-gp and BCRP. The addition of curcumin to the tamoxifen resistant cells is  expected  to  increase  the  sensitivity  of  breast  cancer  cells  to  tamoxifen. This  study  aim  to  know  the  effect  of  curcumin  in  increasing  the  cell sensitivity  to  tamoxifen  through  inhibition  of  P-gp  and  BCRP  transporter efflux. MCF-7 breast cancer cell line was induced with tamoxifen 1 µM for 10  passage  (MCF-7(T)),  then  cell  viability  and  mRNA  expression  of  P-gp and BCRP were analyzed. To the MCF-7(T) cells, curcumin was given at of 5/10/20  µM  with  or  without  tamoxifen  for  5  days  and  cell  viability  and mRNA  expression  of  P-gp  and  BCRP  were  analyzed  on  day  5th.    As positive  control,  verapamil  50  µM  was  used  as  P-gp  inhibitor,  ritonavir  15 µM and nelfinavir 15 µM were used as BCRP inhibitor.  The results showed that MCF-7(T) cells sensitivity to tamoxifen  decreased with 11.8 times, the cell viability increased 10.82 fold and mRNA expression of P-gp and BCRP increased  4.04  fold.  Then  after  administration  of  curcumin  with  or  without tamoxifen  for  5  days,  the  cell  viability  and  the  mRNA  expression  of  P-gp and  BCRP  decreased.  As  conclusion,  curcumin  increased  the  sensitivity  of MCF-7(T) to tamoxifen characterized by the decreasing of cell viability and mRNA  expression  of  P-gp  and  BCRP.  However,  the  administration  of combination  of  curcumin  with  tamoxifen  was  more  potent  than  just curcumin. The increased sensitivity was estimated at least partly through the inhibition of P-gp and BCRP mRNA expression by curcumin.
Keywords : Tamoxifen Curcumin
P-gp
BCRP

## Corresponding Author:
Erlia Anggrainy Sinaipar Program Studi Farmasi, FK, Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya Jakarta, 14440, Indonesia
Mobile : 081210445684
Email: erlia.anggarainy@atmajaya.ac.id
Copyright © 2017 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.

## How to cite (APA 6th Style):
Sianipar,  E.A.,  et  al.  (2018).  Kurkumin  Meningkatkan  Sensitivitas  Sel  Kanker  Payu  Dara  Terhadap  Tamoksifen  Melalui Penghambatan ekspresi P-glikoprotein dan Breast Cancer Resistance Protein. Jurnal Farmasi Galenika : Galenika Journal of Pharmacy, 4(1), 1-11. doi:10.22487/j24428744.2018.v4.i1.9209

## ABSTRAK
Penurunan  sensitivitas  hingga  resistensi  terhadap  tamoksifen  sering  terjadi  dalam  pengobatan  kanker payudara  jangka  panjang.  Salah  satu  penyebab  utamanya  adalah  peningkatan  ekspresi  transporter  efluks  P- glikoprotein (P-gp) dan Breast Cancer Resistance Protein (BCRP). Kurkumin diketahui sebagai penghambat P- gp  dan  BCRP.  Pemberian  kurkumin  pada  sel  yang  telah  menurun  sensitivitasnya  terhadap  tamoksifen  mampu meningkatkan  sensitivitas  sel  kanker  payudara  terhadap  tamoksifen  melalui  penghambatan  kedua  transporter tersebut.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  efek  kurkumin  dalam  meningkatkan  sensitivitas  sel terhadap tamoksifen dengan cara menghambat kerja transporter effluks P-gp dan BCRP. Sel MCF-7 dipaparkan dengan  tamoksifen  1  µM  selama  10  pasasi  (sel  MCF-7(T)),  kemudian  dianalisis  perubahan  sensitivitas  sel terhadap tamoksifen melalui viabilitas sel dan ekspresi mRNA P-gp dan BCRP. Pada sel MCF-7(T), kurkumin diberikan dalam dosis 5;10;20 µM dengan atau tanpa tamoksifen selama 5 hari  dan dianalisis viabilitas sel dan ekspresi  mRNA  P-gp  dan  BCRP  pada  hari  ke-5.  Sebagai  kontrol  positif,  verapamil  50  µM  digunakan  sebagai penghambat  P-gp,  ritonavir  15  µM  dan  nelfinavir  15  µM  sebagai  penghambat  BCRP.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa sel MCF-7(T) telah menurun sensitivitasnya terhadap tamoksifen yang dibuktikan dengan terjadinya  pergeseran  CC 50 sebesar  11.8  kali,  peningkatan  viabilitas  sel  sebesar  10.82  kali,  dan  peningkatan ekspresi  mRNA  P-gp  dan  BCRP  sebesar  4.04  kali.  Kemudian  setelah  pemberian  kurkumin  dengan  atau  tanpa tamoksifen  selama  5  hari,  viabilitas  sel  dan  ekspresi  mRNA  P-gp  dan  BCRP  menjadi  menurun.  Kesimpulan penelitian  ini  adalah  kurkumin  meningkatkan  sensitivitas  sel  MCF-7(T)  terhadap  tamoksifen  yang  ditandai dengan penurunan  viabilitas sel dan ekspresi mRNA P-gp dan BCRP.  Namun demikian, pemberian kombinasi kurkumin  dengan  tamoksifen  lebih  kuat  dibandingkan  kurkumin  saja.  Peningkatan  sensitivitas  tersebut  diduga terjadi melalui penghambatan ekspresi mRNA P-gp dan BCRP oleh kurkumin.
Kata Kunci : Tamoksifen, Kurkumin, P-glikoprotein, BCRP

## PENDAHULUAN
Diperkirakan lebih dari satu juta orang di seluruh dunia  menderita  kanker  payudara  dan  lebih  dari 400.000  kematian  terjadi  setiap  tahunnya  (Zhou et  al ,  2012).  Pengobatan  dengan  antiestrogen tamoksifen  merupakan  terapi  lini  pertama  untuk sebagian besar pasien kanker payudara (Lykkesfeldt et  al ,  1994).  Namun  dalam  tiga dasawarsa terakhir, ribuan wanita yang mendapat pengobatan  tamoksifen  mengalami  penurunan respon  atau  bahkan  tidak  memberikan  respon terhadap pengobatan kemoterapi kanker payudara.  Hal  ini  mungkin  terjadi  karena timbulnya  resistensi  (University  of  California, 2011). Sekitar 40% pasien akhirnya kambuh dan meninggal karena resistensi setelah terapi selama 7-10  bulan  (Ring et  al ,  2004  &  Wind et  al , 2011).
Beberapa  studi  telah  menunjukkan  bahwa resistensi  tamoksifen  berkaitan  dengan  multi- drug  resistance  (MDR).  MDR  adalah  suatu fenomena  resistensi  terhadap  sejumlah  bahan kemoterapeutik yang strukturnya berbeda setelah pemaparan  suatu  obat  anti  kanker  (Choi et  al , 2007). Peningkatan ekspresi transporter efluks P- gp  dan  BCRP  diduga  menjadi  penyebab  utama
terjadinya  MDR  pada  kanker  payudara  (Zhou et al , 2012).
Telah  dilaporkan  bahwa  sekitar  30%  dari  MDR disebabkan oleh over ekspresi P-gp dan kejadian pada  kanker  payudara  lebih  dari  50%  (Zhou et al ,  2012  &  Bansal et  al ,  2009).  Selain  itu, pemaparan obat kemoterapi atau terapi hormonal setelah kurang lebih 7-10 bulan telah menunjukkan  peningkatan  ekspresi  P-gp  pada kanker payudara sebesar 1.8 kali lipat. 1.5 BCRP bekerja  sebagai  pompa  efluks  di  sel  tumor, timbulnya  BCRP  yang  terekspresi  berlebihan mengakibatkan  peningkatan  konsentrasi  obat  di dalam  sel  dan  menurunkan  efek  sitotoksik. Secara  klinis  telah  dilaporkan  korelasi  positif antara ekspresi BCRP berlebihan dan penurunan efek  antikanker  terhadap  pasien  di  hematologi dan  tumor  padat  (Mao et  al ,  2005.  Ee et  al , 2004).
Penghambat P-gp atau BCRP biasanya diberikan untuk  meningkatkan  akumulasi  dan  efikasi  obat antikanker  dalam  kemoterapi  (Anuchapreeda et al , 2002). Salah satu senyawa sintetik yang telah diidentifikasi  sebagai  penghambat  P-gp    adalah verapamil sedangkan yang merupakan penghambat BCRP yaitu ritonavir dan nelfinavir.
Namun,  pada  studi  hewan  coba  dan  uji  klinik efikasi dari senyawa-senyawa tersebut berkurang karena  bersifat  toksik  (Mao et  al ,  2005  & Anuchapreeda et al , 2002)
Kurkumin  merupakan  salah  satu  penghambat  P- gp  dan  BCRP  yang  poten  (Shukla et  al ,  2009). Kurkumin  memiliki  aktivitas  biologis  dan farmakologi yang sangat luas seperti antioksidan, antiinflamasi  dan  antikanker.  Hal  ini  penting untuk mengatasi peningkatan ekspresi transporter  efluks  dan  meningkatkan  sensitivitas sel  kanker  payudara  terhadap  antikanker  dalam kemoterapi (Anuchapreeda et al , 2002).
Kurkumin  adalah  suatu  senyawa  polifenol, berupa  pigmen  berwarna  kuning  yang  terdapat dalam    rhizome Curcuma  longa .  Kandungan polifenol  ini  mengindikasikan  bahwa  kurkumin dapat mencegah dan mengobati kanker. Kurkumin  bekerja  dengan  menurunkan  ekspresi P-gp  dan  menurunkan  efluks  yang  dimediasi oleh P-gp pada sel kanker yang resisten terhadap suatu  obat.  Kurkumin  juga  secara  langsung berinteraksi  dengan  P-gp  (Anuchapreeda et  al , 2002, Aggarwal et al , 2003)
Wind (2011) dalam studinya menjelaskan bahwa kurkumin  mampu  menghambat  overekspresi BCRP  yang  diinduksi  oleh  mitoxantrone  dan pheophorbide  A  pada  sel  kanker  payudara (MCF-7).  Selain  itu,  Shukla  (2009)  juga  telah meneliti  tentang  penghambatan  transporter efluks  BCRP  oleh  kurkumin  pada  mencit  yang diinduksi sulfasalazin dan menyimpulkan bahwa kurkumin  dapat  meningkatkan  absorbsi  dan distribusi obat yang dipengaruhi oleh BCRP. Sugiarti  (2012)  telah  melakukan  penelitian mengenai  pencegahan  penurunan  sensitivitas  sel kanker  payudara  (MCF-7)  terhadap  tamoksifen oleh kurkumin. Penelitian tersebut menunjukkan bahwa  telah  terjadi  penurunan  sensitivitas  sel dengan  pemberian  tamoksifen  1  µM  selama  12 hari  yang  ditandai  dengan  peningkatan  ekspresi mRNA  P-gp  dan  viabilitas  sel.  Namun  dengan pemberian  kurkumin  sejak  awal,  ekspresi  P-gp dan viabilitas sel tersebut menurun.
Oleh  karena  itu,  dalam  penelitian  ini  kurkumin diharapkan  dapat  meningkatkan  sensitivitas  sel kanker  payudara  (MCF-7)  terhadap  pemberian
antikanker  tamoksifen  jangka  panjang  selama kurang  lebih  10  pasasi.  Di  samping  itu,  ingin diketahui  apakah  peningkatan  sensitivitas  sel tersebut diperantarai oleh penghambatan transporter  efluks  P-gp  dan  BCRP  oleh kurkumin.

## METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Biosafety  Cabinet  Class  II  (Biohazard), inkubator  CO 2 (Esco  Memmert),  mikroskop inverted  (Zeiss),  Haemocytometer  Improved Neubauer
Chamber, Thermo
Scientific Centrifuge  Eppendorf  Sorval®  Legend  Micro 17,  Centrifuge  Sorval®  Legend  RT,  Biorad Chromo  4  Real  Time  PCR  Detection  System,
Ultrospec 4300 pro UV/Visible Spectrophotometer, Microplate reader
Benchmark Biorad.
Galur  sel  kanker  payudara  MCF-7 (Makmal  Terpadu  Imunoendokrinologi  FKUI). Tamoksifen  (Santa  Cruz  (USA)).  Kurkumin, verapamil,  ritonavir  dan  dimethylsulfoxide (DMSO)  (Sigma-  Aldrich  Ltd  (Singapura)). Nelfinavir (PT Kimia Farma). Dulbecco Minimal Essential  Medium  (DMEM)  dan  Fetal  Bovine Serum (FBS), Penisilin/Streptomisin,
Gentamisin,  Fungizone,  Dubelco  Phosphate Buffer  Solution  (D-PBS),  dan  Tryple  Express (Gibco Ltd (Singapura)).
Reagen  isolasi  total  RNA  Mini  Kit Tripure  Isolation  Reagent  diperoleh  dari  Roche Diagnostics  (Singapura).  Primer  P-gp,  BCRP, dan  β-mikroglobulin  diperoleh  dari  1st  BASE Ltd  (Singapura).  KAPA  SBYR  Fast  one-step qRT-PCR  kit  Universal  diperoleh  dari  KAPA Biosystem (USA).

## Metode Kultur sel MCF-7
Sel  MCF-7  dikultur  dengan  menggunakan medium  DMEM  yang  disuplementasi  dengan 10%  FBS,  2  mM  L-glutamin,  1%  penisilin  dan streptomisin,  0,5%  gentamisin  dan  1%  fungizon kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C, 5% O 2 .

## Pemaparan tamoksifen 1 µM pada sel MCF-7
Sel MCF-7 diberi perlakuan dengan memaparkan  tamoksifen  1  µM  secara  terus menerus  selama  10  pasasi,  sel  ini  selanjutnya dinamakan sel MCF-7(T).

## Perlakuan sel MCF-7(T) dengan kurkumin
Sel MCF-7(T) dibagi menjadi beberapa kelompok  perlakuan  antara  lain  pemberian tamoksifen  1  µM  saja,  pemberian  kombinasi tamoksifen 1 µM dengan kurkumin 5;10;20 µM, kombinasi tamoksifen 1µM dengan verapamil 50 µM/ritonavir 15 µM/nelfinavir 15 µM, pemberian  kurkumin  5;10;20  µM  saja,  dan pemberian  verapamil  50  µM,  ritonavir  15  µM, nelfinavir  15  µM  saja  selama  5  hari.  Analisis viabilitas  sel  dan  ekspresi  mRNA  P-gp  dan BCRP  masing-masing  kelompok  perlakuan dilakukan  pada  hari  ke-5.  Masing-masing perlakuan  dilakukan  dalam  dua  kali  percobaan rangkap dua.

## Hitung  sel  menggunakan  Tryphan  Blue Exclusion Method
Sel yang telah konfluen 80-90%, dipanen dengan  cara  ditripsinisasi  dengan  menggunakan Tryple  Express  selama  5  menit,  kemudian ditambahkan  medium  DMEM.  Suspensi  sel diambil sebanyak 20 µL dan ditambahkan 10 µl trypan  blue.  Sel  dihitung  dengan  menggunakan kamar  hitung  Neubaeuer.  Sel  yang  dihitung adalah  sel  yang  hidup  yaitu  sel  yang  tidak diwarnai oleh trypan blue.

## Isolasi RNA
Sel  yang  telah  konfluen  dipanen  dan RNA  total  diekstraksi  menggunakan  Tripure Isolation  Reagent  sesuai  prosedur  yang  telah diberikan  oleh  produsen.  Kadar  RNA  total dikuantifikasi  menggunakan  Spektrofotometer Ultrospec 4300 pro UV/Visible dengan mengukur serapan pada panjang gelombang 260 nm dikalikan dengan konstanta 40 ng/µl.
Analisis  ekspresi  mRNA  P-gp  dan  BCRP menggunakan qRT PCR
Sekuens  primer  yang  digunakan  pada qRT  PCR  yaitu  β2-microglobulin  (F:5’- CCAGCAGAGAATGGAAAGTC-3’; R:3’- CATGTCTCGATCCCACTTAAC-5’),
P-gp
(F:5’-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3’; R:3’-TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA-5’), BCRP  F:5’AGATGGGTTTCCAAGCGTTCAT- 3’;  R:3’-CCAGTCCCAGTACGACTGTGACA- 5’) (Albermann et al , 2005).
Sampel dipersiapkan dengan mencampurkan 200 nM masing-masing primer, 5 µL KAPA SYBR® Fast  qPCR  Master  Mix,  0,2  µL  KAPA  RT  Mix (50x), 0,2 µL dUTP, 500 ng RNA template, dan RNAse  free  water  hingga  10  µL.  Sampel kemudian  diinkubasi  pada  mesin  qRT-PCR dengan  kondisi  sebagai  berikut:  untuk  sintesis cDNA  dilakukan  pada  suhu  42 o C  selama  5 menit,  kemudian  5  menit  pada  suhu  95 o C  untuk inaktivasi  enzim  reverse  transcriptase,  dan  40 siklus  yang  terdiri  dari  3  detik  pada  suhu  95 o C untuk tahap denaturasi, 20 detik pada suhu 60 o C untuk  tahap  annealing  dan  20  detik  pada  suhu 72 o C  untuk  tahap  ekstensi.  Setelah  itu, dilanjutkan  untuk  tahap  melting  curve  yaitu dimulai pada suhu 60 o C sampai dengan 95 o C.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  pengamatan  viabilitas  sel  MCF-7(T) menunjukkan  bahwa  tamoksifen  masih  dapat menekan  pertumbuhan  sel  pada  pasasi  ke-1, namun  mulai  dari  pasasi  ke-2  efek  tamoksifen menurun  sehingga  tidak  dapat  membunuh  sel kanker  (Gambar  1A).  Terjadi  peningkatan ekspresi  mRNA  transporter  efluks  P-gp  dan BCRP  pada  sel  MCF-7(T)  yaitu  berturut-turut sebesar  10.82  kali  dan  4.04  kali  dibandingkan terhadap kontrol (Gambar 1B).

## Analisis viabilitas sel MCF-7(T)
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh  dari  analisis viabilitas  sel  terlihat  bahwa  tidak ada  perbedaan bermakna  antara  sel  MCF-7(T)  baik  yang dipaparkan  kombinasi  kurkumin  dan tamoksifen maupun  kurkumin  saja.  Kurkumin  mampu menurunkan viabilitas sel pada hari ke-5 secara
A. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 20 40 60 80 100 120 MCF-7+TAM 1 uM DMSO Pas as i ke- P e r s e n ta s e s e l h id u p M CF -7 ( % ) d ib a n d in g k a n t e r h a d a p k o n tr o l B. Kont rol P-gp Kont rol BC R P 0 2 4 6 8 10 12 14 *** *** Ra si o ek sp re si m RN A (d in or m al is as i te rh ad ap B 2 -m ik ro g lo bu li n se ba g ai h o u se k e e p in g g e n e )
Gambar 1. (A). Persentase sel hidup MCF-7 yang dipaparkan dengan tamoksifen 1 µM pada pasasi ke-1 hingga pasasi ke-10. Kontrol adalah sel MCF-7 yang dipaparkan DMSO. (B). Perubahan tingkat ekspresi mRNA P-gp dan BCRP pada sel MCF- 7(T). Kontrol adalah sel MCF-7 yang tidak diinduksi tamoksifen 1 µM. Tanda (***) menyatakan bermakna pada p<0,001 setelah uji ANOVA dilanjutkan dengan multiple comparison metode Tukey. Hasil disajikan dalam rerata ± SD yang diperoleh dari dua kali percobaan terpisah rangkap dua.
A. Ta m 1 u M Ta m 1u M+ Ve r 5 0u M Ta m 1u M+ Ri t 1 5 u M Ta m 1u M+ Ne l 1 5 u M
Ta m 1u M+ Ku r 5 u M
Ta m 1u M+ Ku r 1 0 u M Ta m 1u M+ Ku r 2 0 u M 0 50 100 150 *** *** *** *** *** *** Per sentase sel hidup (% ) B. Ta m 1 u M Ve r 5 0 uM Ri t 1 5 uM Ne l 1 5 uM Ku r 5 u M Ku r 1 0 uM Ku r 2 0 uM 0 50 100 150 *** *** *** *** *** *** Per sentase sel hidup (% )
Gambar 2. Persentase sel hidup MCF-7(T) setelah pemaparan kurkumin selama 5 hari dengan atau tanpa pemberian tamoksifen. (A). Viabilitas sel MCF-7(T) setelah pemaparantamoksifen 1 µM + kurkumin 5/10/20 uM. (B). Viabilitas sel MCF-7(T) padapemaparan kurkumin 5;10;20 µM.  Tiap percobaan merupakan hasil dari dua percobaan rangkap dua. Hasil disajikan dalam rerata ± SD. Tanda (***) menyatakan bermakna pada p<0,001 setelah uji ANOVA dilanjutkan dengan multiple comparison metode Tukey dibandingkan terhadap tamoksifen 1 µM.
A1.
Ta m 1 uM Ta m 1 uM +Ver 50 uM Ta m 1 uM +K ur 5 uM Ta m 1 uM +K ur 10 uM Ta m 1 uM +K ur 20 uM 0 5 10 15 ** ** * ** Ti ng ka t e ks pr es i m RN A P- gp (d in or m al is as i t er ha da p B 2- m ik ro gl ob ul in se ba ga i ho us ek ee pi ng g en e )
A2. Ta m 1 uM Ver 5 0 uM K ur 5 uM K ur 10 uM K ur 20 uM 0 5 10 15 * * ** ** T in gk at e k sp re si m RN A P -g p (d in or m al is as i t er ha da p B 2- m ik ro gl ob ul in se ba ga i h ou se ke ep in g ge n e ) B1. Ta m 1 uM Ta m 1 uM +Rit 1 5 uM Ta m 1 uM +Nel 15 uM Ta m 1 uM +K ur 5 u M Ta m 1 uM +K ur 1 0 uM Ta m 1 uM +K ur 2 0 uM 0 2 4 6 ** * ** *** * T in gk at e k sp re si m RN A B CR P (d in or m al is as i t er ha da p B 2- m ik ro gl ob ul in se ba ga i h ou se ke ep in g ge n e ) B2. Ta m 1 uM Rit 1 5 uM Nel 15 u M K ur 5 uM K ur 10 uM K ur 20 uM 0 2 4 6 *** * ** ** * T in g k at e k sp re si m RN A B CR P (d in or m al is as i te rh ad ap B 2 -m ik ro g lo bu li n se ba g ai h ou se ke ep in g ge n e )
Gambar 3. Ekspresi mRNA P-glikoprotein dan BCRP setelah pemaparan kurkumin selama 5 hari dengan atau tanpa pemberian tamoksifen pada sel MCF-7(T). (A1). Ekspresi mRNA P-gp pada sel MCF-7(T) yang dipaparkan dengan tamoksifen 1 µM + kurkumin 5;10;20 uM. (A2). Ekspresi mRNA P-gp pada sel MCF-7(T) yang dipaparkan dengan kurkumin 5;10;20 uM. (B1). Ekspresi mRNA BCRP pada sel MCF-7(T) yang dipaparkan dengan tamoksifen 1 µM + kurkumin 5;10;20 uM. (B2). Ekspresi mRNA BCRP pada sel MCF-7(T) yang dipaparkan dengan kurkumin 5;10;20 uM.  Tiap percobaan merupakan hasil dari dua percobaan rangkap dua. Hasil disajikan dalam rerata ± SD. Tanda (*) menyatakan bermakna pada p<0,05; (**)/(***) bermakna pada p<0,001 setelah uji ANOVA dilanjutkan dengan multiple comparison metode Tukey dibandingkan terhadap tamoksifen 1 µM. .
proporsional  sesuai  kadar,  bermakna  secara statistik.  Penurunan  viabilitas  sel  tertinggi dicapai  pada  kurkumin  dengan  dosis  20  µM yaitu  sekitar  67%,  lebih  besar  dibandingkan kontrol  positif  verapamil,  nelfinavir,  dan ritonavir  yang  hanya  mampu  menurunkan viabilitas  sel  berturut-turut  sebesar  25%,  16%, dan 28% (Gambar 2).

## Analisis  ekspresi  mRNA  P-gp  dan  BCRP pada sel MCF-7(T)
Ekspresi mRNA P-gp dan BCRP pada sel MCF- 7(T)  yang  diberi  perlakuan  dengan  kurkumin dengan  atau  tanpa  tamoksifen  selama  5  hari dapat  dilihat  pada  Gambar  3.  Kontrol merupakan  sel  MCF-7(T)  yang  diberi  diberi tamoksifen 1 µM.
Pada  analisis  ekspresi  mRNA  P-gp, pemberian  kurkumin  berbagai  kadar  termasuk kontrol positif verapamil 50  µM baik dikombinasi  dengan  atau  tanpa  tamoksifen, dapat  menurunkan  ekspresi  P-gp.  Pada  hari  ke- 5,  paparan  kombinasi  kurkumin  dengan tamoksifen pada kadar yang lebih besar yaitu 10 µM dan 20 µM menurunkan ekspresi mRNA P- gp secara bermakna yaitu menjadi 5,5 kali dan 6 kali. Sedangkan pada kelompok yang dipaparkan  kurkumin  saja,  hanya  kurkumin  20 µM yang dapat menurunkan ekspresi mRNA P- gp  secara  bermakna  yaitu  menjadi  7,25  kali. Kontrol  positif  verapamil  50  µM  juga menurunkan  ekspresi  mRNA  P-gp  secara bermakna  pada  hari  ke-5  (Gambar  3A1  dan 3A2).
Pada  analisis  ekpresi  mRNA  BCRP, pemberian  kurkumin  5,  10,  dan  20  µM  dan kontrol positif ritonavir 15 µM dan nelfinavir 15 µM,  baik  dikombinasi  dengan  atau  tanpa tamoksifen,  sama-sama  mempengaruhi  ekspresi mRNA  BCRP  pada  hari  ke-5.  Kombinasi kurkumin dengan tamoksifen dapat menurunkan ekspresi  mRNA  BCRP  menjadi  2,46  kali  pada dosis 20 µM sedangkan dengan paparan dengan kurkumin  saja  ekspresi  mRNA  BCRP  menurun menjadi  3,01  kali.  Kontrol  positif  ritonavir  15 µM  dan  nelfinavir  15  µM  juga  menurunkan
ekspresi  mRNA  BCRP  secara  bermakna  pada hari ke-5 (Gambar 3B1 dan 3B2).
Meningkatnya  viabilitas  mulai  dari pasasi  ke-2  pada  pemaparan  tamoksifen  1  µM selama  10  pasasi  (±  44  hari)  pada  galur  sel kanker  payudara  MCF-7  menunjukkan  bahwa sel  MCF-7  telah  menurun  sensitivitasnya terhadap  pemberian  tamoksifen.  Penurunan sensitivitas  ini  terlihat  mulai  pasasi  ke-2  (hari ke-6) dan menetap hingga pasasi ke-10. Namun, model  penelitian  ini  belum  dapat  memastikan apakah peningkatan viabilitas sel tersebut sudah stabil dan dapat dikatakan resisten karena waktu pemaparan  tamoksifen  yang  relatif  singkat.  Hal ini  sejalan  dengan  penelitian  yang  dilakukan Kurniawan et al (2012) dan Sugiarti et al (2012) dimana pemberian tamoksifen 1 µM sudah tidak dapat  menekan  pertumbuhan  sel  MCF-7  mulai pada hari ke-6. Penggunaan tamoksifen kadar 1 µM  juga  sejalan  dengan  penelitian  Motahari et al , 2005  pada  sel  kanker  T47D  dan Lykkesfeldt et  al ,  1994  pada  sel  MCF-7  yang telah  resisten  terhadap  tamoksifen.  Keduanya menyatakan  bahwa  kadar  tamoksifen  1  µM merupakan  kadar  dimana  viabilitas  sel  masih cukup baik yaitu ± 65% pada T47D dan ± 50% pada sel MCF-7. Penelitian oleh Motahari et al (2005), mengungkapkan untuk dapat menghasilkan  sel  MCF-7  resisten  yang  stabil maka  sel  MCF-7  harus  dipaparkan  dengan tamoksifen minimal selama 3 bulan.  Louie et al , 2010dalam  penelitiannya  juga  mengembangkan sel  MCF-7  yang  resisten  terhadap  tamoksifen (MCF-7 TamR) dengan memaparkan tamoksifen  pada  konsentrasi  10  µM  selama kurang  lebih  6  bulan.  Resistensi  sel  MCF- 7TamR  ini  ditandai  dengan  cepatnya  laju pertumbuhan  sel  dibandingkan  dengan  sel MCF-7 apabila dipaparkan tamoksifen, sedangkan  pada  kondisi  normal  tanpa  paparan tamoksifen  laju  pertumbuhan  sel  MCF-7TamR dan MCF-7 sama.
Peningkatan ekspresi mRNA P-gp sebesar  10,82  kali  pada  sel  MCF-7(T)  juga sejalan dengan penelitian Kurniawan et al , 2012 dan Sugiarti et al , 2012 dimana ekspresi mRNA P-gp pada sel MCF-7 yang diinduksi tamoksifen
meningkat  pada  hari  ke-6    sebesar  1,10  kali. Selain  itu  penelitian  oleh  Sane  et  al  juga menyatakan bahwa besarnya peningkatan ekspresi  mRNA  P-gp  pada  sel  hepatosit manusia  HepG2  dan  sel  kanker  kolon  LS174T yang  masing-masing  dipaparkan  tamoksifen pada kadar 1 µM, 2.5 µM, dan 5 µM selama 72 jam adalah berturut-turut sebesar 1.17 kali, 1.37 kali,  dan  1.60  kali  pada  sel  HepG2  dan  1.46 kali, 1.9 kali, dan 2.98 kali pada sel LS174T.
Penelitian ini menemukan bahwa ekspresi  mRNA  BCRP  pada  sel  MCF-7(T) meningkat  sebesar  4.04  kali.  Farabegoli et  al , 2010 dalam penelitiannya, membuktikan bahwa pada  sel  MCF-7  yang  resisten  terhadap tamoksifen terdapat peningkatan ekspresi mRNA  P-gp  dan  BCRP,  kemudian  setelah diberi  perlakuan  dengan Epigallocatechin-3- gallate (EGCG)  pada  dosis  100  ug/ml  selama 48  jam  maka  ekspresi  mRNA  P-gp  dan  BCRP tersebut  menurun  sebesar  53%  dan  20%.  Jika dibandingkan  dengan  hasil  yang  didapat  dalam penelitian  ini,  ditemukan  bahwa  lamanya paparan/induksi  dengan  tamoksifen  sangat mempengaruhi  peningkatan  ekspresi  mRNA  P- gp  dan  BCRP.  Semakin  lama  waktu  induksi dengan  tamoksifen,  maka  akan  memberikan peningkatan  ekspresi  mRNA  P-gp  dan  BCRP yang lebih tinggi.
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh  dari analisis viabilitas sel, efek pemberian kurkumin dengan  maupun  tanpa  tamoksifen  pada  sel MCF-7(T)  selama  5  hari  membuktikan  bahwa kurkumin  mampu  menekan  viabilitas  sel. Menurut  Shehzad et  al ,  2010  kurkumin  dapat menekan  pertumbuhan  sel  kanker  melalui berbagai  cara  seperti  menghambat  faktor transkripsi  (NF-kB  dan  AP-1),  menghambat enzim  (COX-2  dan  MMPs),  menghambat sitokin  dan  STAT,  menghambat  cyclin  D1, menginduksi apoptosis, dan lain sebagainya.
Pada  analisis  tingkat ekspresi  mRNA  P- gp  dan  BCRP,  pemberian  kombinasi  kurkumin dengan  tamoksifen  lebih  kuat  menurunkan ekspresi  mRNA  P-gp  dan  BCRP  dibandingkan terhadap  pemberian  kurkumin  saja.  Hasil  ini menunjukkan  bahwa  kemungkinan  pemberian
kombinasi kurkumin dengan tamoksifen menghasilkan  efek  sinergis  sehingga  lebih  kuat menekan  ekspresi  mRNA  P-gp  dan  BCRP dibandingkan  terhadap  pemberian  kurkumin saja.  Jiang et  al ,  2013  dalam  penelitiannya mengenai  kurkumin  meningkatkan  sensitivitas tamoksifen  pada  sel  kanker  payudara  MCF- 7/LCC2  dan  MCF-7/LCC9  mengemukakan bahwa  pemberian  kombinasi  kurkumin  dengan tamoksifen  dapat  meningkatkan  sensitivitas  sel MCF-7  terhadap  tamoksifen  sebesar  2.4  kali dibandingkan  dengan  pemberian  tamoksifen saja.
Penurunan  ekspresi  mRNA  P-gp  dan BCRP oleh kurkumin dalam penelitian ini, tidak sebanding  dengan  penurunan  viabilitas  sel MCF-7  (T),  baik  pada  pemberian  kombinasi maupun  dengan  kurkumin  saja.  Berdasarkan hasil  tersebut,  maka  dapat  disimpulkan  bahwa pemberian kurkumin dapat meningkatkan sensitivitas sel MCF-7 (T) terhadap tamoksifen, namun  bukan  hanya  melalui  penghambatan transporter  efluks  P-gp  dan  BCRP.  Hal  ini kemungkinan disebabkan karena dosis kurkumin  yang  digunakan  kurang  tinggi  atau waktu paparan yang kurang lama sehingga efek kurkumin  dalam  menurunkan  ekspresi  mRNA P-gp dan BCRP belum terlihat maksimal. Selain itu, diduga bahwa terdapat mekanisme transporter  lain  yang  mempengaruhi  kerja kurkumin  dalam  menghambat  P-gp  dan  BCRP tersebut.  Chearwae et  al ,  2005  dalam  studinya menemukan bahwa kurkumin dapat menurunkan  ekspresi  transporter  efluks  MRP-1 pada  galur  sel  embrionik  ginjal  manusia HEK293 sehingga meningkatkan sensitivitasnya terhadap  etoposide.  Krisnamurti et  al ,  2013 dalam  penelitiannya  juga  menunjukkan  bahwa kurkumin  mampu menurunkan ekspresi  mRNA MRP-2  secara  bermakna  setelah  pemaparan selama 5 hari.
Mekanisme kurkumin dapat menurunkan ekspresi mRNA P-gp dan BCRP tidak dipelajari dalam  penelitian  ini.  Kemungkinan  mekanisme yang  terlibat  antara  lain  seperti  dalam  studi Anuchapreeda et  al (2002)  yang  menguji  efek kurkumin  terhadap  aktivitas  ATPase  dan
pengikatan  terhadap  P-gp  melalui  fotoafinitas analog  dari  substrat,  mengindikasikan  bahwa kurkumin  menghambat  P-gp  pada  tahap imunoreaktif  protein  dan  menurunkan  ekspresi pada  tahap  mRNA.  Selain  itu,  studi  oleh Aggarwal et  al ,  2006  melaporkan  bahwa kurkumin merupakan inhibitor yang sangat kuat terhadap faktor transkripsi AP-1, yang berkorelasi  positif  dalam  mengatur  ekspresi  P- gp.  Pada  penelitian  Waiwut et  al ,  2002 dikatakan bahwa mekanisme kurkumin menghambat P-gp kemungkinan karena kurkumin dapat menghambat translokasi NF-kB dan aktivitas dan ekspresi dari c-jun/AP1.
Penelitian  ini  merupakan  penelitian pertama  yang  meneliti  tentang  efek  kurkumin dalam  menghambat  transporter  efluks  BCRP pada  sel  MCF-7  yang  resisten  terhadap tamoksifen. Penelitian sebelumnya oleh Chearwae et  al ,  2006  menyatakan  bahwa kurkumin merupakan penghambat fungsi BCRP yang  poten,  namun  bukan  bekerja  pada  tingkat protein  tetapi  kurkumin  menstimulasi  hidrolisis ATP dari transporter BCRP.

## KESIMPULAN
Pemberian  kurkumin  dengan  atau  tanpa tamoksifen  dapat  mensensitisasi  kembali  sel kanker  payudara  MCF-7  terhadap  tamoksifen sehingga menurunkan viabilitas sel dan ekspresi mRNA  P-gp  dan  BCRP.  Namun  temuan  ini perlu diklarifikasi lebih lanjut dengan melakukan pengukuran kadar tamoksifen ekstraseluler untuk memastikan kerja penghambatan  P-gp  dan  BCRP  oleh  kurkumin. Hasil  penelitian  ini  mendukung  penggunaan kombinasi  tamoksifen  dan  kurkumin  pada  sel kanker yang telah resisten.

## DAFTAR PUSTAKA
Aggarwal,  BB.,  Kumar,  A.,  Bharti,  AC.  (2003).
Anticancer Potential of Curcumin:
Preclinical  and  Clinical  Studies. Anticancer Research , 23, 363-398.
Aggarwal,  BB.,  Shishodia,  S.  (2006).  Molecular targets  of  dietary  agents  for  prevention  and
therapy of cancer.
Biochemical Pharmacology , 7,1397-1413.
Albermann,  N.,  Winnenthal,  FHS.,  Graggen,  KZ.,
Volk, C., Hoffmann, MM., Haefeli, WE., et al .  (2005).  Expression  of  the  drug transporters MDR1/ABCB1, MRP1/ABCC1, MRP2/ABCC2, BCRP/ABCG2,  and  PXR  in  peripheral blood mononuclear cells and their relationship  with  the  expression  in  intestine and  liver. Biochemical  Pharmacology ,  70, 949-958.
Anuchapreeda,  S.,  Leechanachai,  P.,  Smith,  MM., Ambudkar,  SV.,  Limtrakul,  P.  (2002). Modulation  of  P-glycoprotein  Expression and  Function  by  Curcumin  in  Multidrug- Resistant  Human  KB  Cells. Biochemical Pharmacology , 64, 573-582. Bansal,  T.,  Jaggi,  M.,  Khar,  RK.,  Talegaonkar,S.. (2009). Emerging Significance of
Flavonoids  as  P-glycoprotein  Inhibitors  in Cancer  Chemoterapy. Journal  of  Pharmacy &Pharmaceutical Sciences , 12, 46-78.
Chearwae,  W.,  Wu,  CP.,  Chu,  HY.,  et  al.  (2005).
Curcuminoids purified from turmeric powdermodulate  the  function  of  human multidrug  resistance  protein  1(ABCC1),
Cancer  Chemotherapy  and  Pharmacology , 57, 376–388.
Chearwae, W., Shukla, S., Limtrakul, P., Ambudkar,
SV.  (2006).  Modulation  of  the  function  of the multidrug resistance-linked ATP-binding cassete  transporter  ABCG2  by  the  cancer chemopreventive agent curcumin. Molecular Cancer Therapeutics , 5(8),1995-2004.
Choi,  HK.,  Yang,  JW.,  Roh,  SH.,  et  al.  (2007).
Induction of Multidrug Resistance Associated Protein 2 in Tamoxifen-Resistant Breast  Cancer  Cells. Endocrine-  Related Cancer , 14, 293-303.
Ee,  PLR.,  He,  X.,  Ross,  DD.,  Beck,  WT.  (2004). Modulation  of  Breast  Cancer  Resistance Protein  (BCRP/ABCG2)  Gene  Expression Using RNA  Interference. Molecular Cancer Therapeutics , 3, 1577-1583.
Farabegoli,  F.,  Papi,  A.,  Bartolini,  Ostan,  R., Orlandi,  M.  (2010).  (-)-Epigallocatechin-3- gallate  downregulates  P-gp  and  BCRP  in  a Tamoxifen  Resistant  MCF-7  Cell  Line. Phytomedicine , 17, 356-362.
Jiang,  M.,  Huang,  O.,  Zhang,  X.,  Xie,  Z.,  Shen,  A., Liu, H., et al. (2013). Curcumin induces cell
death  and  restores  tamoxifen  sensitivity  in the  antiastrogen-resistant  breast  cancer  cell lines  MCF-7/LCC2  and  MCF-7/LCC9. Molecules , 18, 701-720.
Krisnamurti, DGB. (2013). Peningkatan Sensitivitas
Sel  Kanker  Payudara  Terhadap  Antikanker Tamoksifen oleh Kurkumin Melalui Penghambatan  Transporter  Efluks:  Studi  in vitro pada Sel MCF-7, Universitas
Indonesia, Jakarta. Kurniawan,  SV.  (2012). Peran  piperin  sebagai penghambat P-glikoprotein dalam pencegahan  resistensi  sel  kanker  payudara terhadap  tamoksifen ,  Universitas  Indonesia, Jakarta.
Louie,  MC.,  McClellan,  A.,  Siewit,  C.  (2010). Estrogen receptor regulates E2F1 expression to  mediate  tamoxifen  resistance. Molecular Cancer Research , 8,343-352.
Lykkesfeldt, AE., Madsen, MW., Briand, P. (1994). Altered  Expression  of  Estrogen  Regulated Genes  in  a  Tamoxifen  Resistant  and  ICI 164,384  and  ICI  182,780  Sensitive  Human Breast  Cancer  Cell  Line,  MCF-7/TAM R -1. Cancer Research , 54, 1587-1595.
Mao,  Q.,  Unadkat,  JD.  (2005).  Role  of  the  Breast
Cancer Resistance Protein (ABCG2) in Drug
Transport. American Association ofPharmaceuticalScientistsJournal , 7, E118- 129.
Motahari,  Z.,  Etebary,  M.,  Azizi,  E.  (2005).
Studying  the  role  of  P-glycoprotein  in resistance  to  tamoxifen  in  human  breast cancer T47D cells by immunocytochemistry, International  Journal
of Pharmacology , 1, 112-117.
Ring,  A.,  Dowset,  M.  (2004).  Mechanism  of Tamoxifen  Resistance .  Endocrine-  Related
Cancer, 11, 643-648.
Shukla, S., Zaher, H., Hartz A, Bauer, B., Ware, JA., Ambudkar,  SV.  (2009).  Curcumin  Inhibits the Activity of ABCG2/BCRP1,A Multidrug Resistance-Linked ABC Drug Transporter in Mice. Pharmaceutical  Research ,  26  (2), 480-486.
Sugiarti,  L.  (2012). Penghambatan  MDR1  dengan
Kurkumin  Sebagai  Usaha  Pencegahan
Resistensi Terhadap Antikanker Tamoksifen ,
Universitas Indonesia, Jakarta..
Sane,  RS.,  Buckley,  DJ.,  Buckley,  AR.,  Nallani, SC.,  Desai,  PB.  (2008).  Role  of  human pregnane  X  receptor  in  tamoxifen  and  4-
hydroxytamoxifen-mediated CYP3A4 induction in primary human hepatocytes and LS174T cells. The Journal of Pharmacology and  Experimental  Therapeutics ,  36,  946- 954.
Shehzad, A., Wahid, F., Lee, YS. (2010). Curcumin in cancer chemoprevenion: Molecular targets,  pharmacokinetics,  bioavailability, and  clinical  trials. Arch  Pharm  Chemistry  In Life Sciences , 9, 489-499.
University  of  California  -  San  Francisco.  (2011,
November  14).Tamoxifen  Resistance  and How  to  Defeat  it. ScienceDaily ,  Retrieved from http://www.sciencedaily.com/releases/2011/
11/111113141409.htm
Waiwut, P., Anuchapreeda, S., Limtrakul, P. (2002).
Curcumin inhibit the P-glycoprotein level in carcinoma  of  cervix  cells  (KB-carcinoma cell  lines)  induced  by  vinblastine. Chiang Mai MedicalJournal , 41, 139-145.
Wind,  NS.,  &Holen,  I.  Multidrug  Resistance  in
Breast  Cancer:  From  In  Vitro  Models  to Clinical Studies. (2011). International Journal of Breast Cancer , 2011, 1-10. Zhou, G., & Zhang, X. (2012). Multidrug Resistance and Breast Cancer, Targeting New Pathways and Cell Death in  Breast Cancer. Available from http://www.intechopen.com/books/targeting- new-pathways-and-cell-death-in-breast- cancer/multidrugresistance-and-breast- cancer