Analisis Polimorfisme Gen BMP-15(Bone Morphogenetic Protein-15) dengan Metode PCR-RFLP dan Hubungannya dengan Performan Reproduksi Sapi Friesian Holstein (FH)
Lutfiatun Izzatul Lailiya 1 , Sri Rahayu 1 , Widya Ayu Prasdini 2 , Gatot Ciptadi 3
1) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
2) UPT. Balai Besar Pelatihan Peternakan, Songgoriti, Batu
3) Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya
Jl. Veteran n0.169 Malang, Email : llailiya@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  adanya  polimorfisme  gen  BMP-15  (Bone  morphogenetic  protein-15) dengan  menggunakan  teknik  PCR-RFLP  dan  hubungannya  dengan  performan  reproduksi  sapi  Friesian  Holstein (FH).  Sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  10  sapi  FH  betina  yang  diambil  dari  UPT.  Balai  Besar Pelatihan  Peternakan,  Songgoriti,  Batu.  Isolasi  DNA  dari  darah  dengan  menggunakan  metode  salting  out. Amplifikasi gen BMP-15 dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer forward 5’GCTCTGGAATCACAAGGGG3’  dan  Primer  reverse  5’AGAGATGGGGAGCGAT  GAT  3’.  Polimorfisme  gen BMP-15  dianalisis  dengan  teknik  PCR-RFLP  menggunakan  enzim  restriksi  HaeIII.  Amplifikasi  gen  BMP-15 menghasilkan amplikon dengan panjang 360bp. Analisis PCR-RFLP menghasilkan dua haplotip yang menunjukkan adanya  polimorfisme.  Haplotip  I  memiliki  ukuran  fragmen  DNA  90bp  dan  190bp.  Haplotip  II  memiliki  ukuran fragmen  90bp,  190bp,  290bp,  dan  350bp.  Data  performan  reproduksi  10  sapi  fertil  yang  digunakan  adalah  3  sapi bunting  dan 7 sapi  memiliki data   calving interval  pada  range 13-16 bulan, days open pada range 3-7  bulan dan 2 sapi  beranak  kembar.  Berdasarkan  data  yang  ada,  diketahui bahwa  sapi  yang  termasuk  dalam  haplotip  II  memiliki data performan reproduksi yang bervariasi. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa polimorfisme gen BMP-15 yang ada, tidak menunjukkan adanya hubungan dengan performan reproduksi sapi FH.

## Kata Kunci : Gen BMP-15, Performan reproduksi,  Polimorfisme

## ABSTRACT
The aim of this research was to determine the BMP-15 gene polymorphism in FH  cattle using PCR-RFLP method and it’s correlation with performance reproduction. Samples of ten (10) FH cattle  were taken randomly from UPT. Training Center of Animal Husbandry, Songgoriti, Batu. Whole genome DNA was isolated from blood using salting out  method.  BMP-15  gene  was  amplified  using  specific  primer  of  BMP-15,  forward  primer 5’GCTCTGGAATCACAAGGGG 3’ and reverse primer 5’ AGAGATGGG GAGCGATGAT 3’. The result of PCR was  a  specific  single  band  with  fragment  size  360bp.  The  amplicon  of  BMP-15  gene  was  digested  by  restriction enzyme  HaeIII. The product of PCR-RFLP was two (2) haplotypes.  Haplotype  1  with 2 fragment DNA (90bp and 190bp) and haplotype 2 with 4 fragment DNA (90bp, 190bp, 290bp and 350bp).  Data of performance reproduction consist of  3 pregnancy cattles and 7 cattles have a calving interval about 13-16 months, days open about 3-7 months and  2  cattles  left  have  twin  offspring.  This  study  show  that  there  is  polymorphism  of  FH  cattle  BMP-15  gene. However, there is no correlation between BMP-15 gene polymorphism with performance reproduction of FH cattle.
Keywords : BMP-15 gene, Performance reproduction, Polymorphism

## PENDAHULUAN
Kebutuhan susu di Indonesia setiap tahunnya  mengalami  peningkatan.  Hal  ini sejalan  dengan  pertambahan  jumlah  penduduk yang terus meningkat. Ditjennak [1], menginformasikan  bahwa  kebutuhan  susu  sejak tahun 2010 hingga 2012 belum tercukupi. Salah
satu  upaya  untuk  mencukupi  kebutuhan  susu  di Indonesia  yaitu  dengan  meningkatan  jumlah populasi sapi perah. Peningkatan populasi ternak bergantung pada keberhasilan reproduksi. Keberhasilan proses reproduksi sapi dipengaruhi oleh  beberapa  faktor,  salah  satunya  yaitu keberhasilan  proses  ovulasi  yang  diawali  proses folikulogenesis.  Pada  proses  folikulogenesis
terdapat  beberapa  protein  yang  berperan,  antara lain TGF β superfamily [2].
Bone  morphogenetic  protein-15  (BMP-15) merupakan  salah  satu  protein  yang  termasuk dalam  kelompok  TGF β superfamily.  Protein  ini berperan  dalam  mengatur  proliferasi  dan differensiasi  sel  granulosa,  menahan  ekspresi FSH  dan  menstimulasi  ekspresi  kit  ligand  [3]. Pada mamalia, protein BMP-15 berperan sebagai faktor  pertumbuhan  sel  granulosa  dan  berperan dalam  menghambat  sensitivitas  folikel  terhadap FSH [4].
Menurut  Dube  dkk  [5],  BMP-15  berperan dalam  pematangan  oosit  dan  perkembangan folikel  sebagai  homodimer  dan  membentuk heterodimer  dengan  GDF-9.  BMP-15  yang terekspresi  pada  folikel  primer  dalam  ovarium menunjukkan  bahwa  transkripsi  BMP-15  telah ditranslasikan pada tahapan awal folikulogenesis.  BMP-15  yang  terekspresi  pada folikel  berperan  penting  dalam  rekruitmen folikel  awal,  menstimulasi  proliferasi  sel-sel granulosa dalam folikel-folikel preantral melalui mekanisme yang tergantung pada FSH [6].
Pada  mencit,  berdasarkan  penelitian  Yan dkk[7],  dengan  menginaktivasi  gen  BPM-15 menunjukkan  hasil  bahwa  tikus  tidak  menjadi steril,  namun  menurunkan  laju  ovulasinya  saja. Adanya mutasi gen BMP-15 menjadi faktor yang berpengaruh  pada  fisiologis  ovarium,  selain  itu juga  dapat  mengakibatkan  peningkatan  laju ovulasi.  Pada  domba,  mutasi  gen  BMP-15  pada betina  heterozigot  dapat  menyebabkan  kenaikan laju  ovulasi,  sedangkan  mutasi  pada  betina homozigot dapat menyebabkan kegagalan proses folikulogenesis  yang  dikarenakan  kerusakan ovarium [8].
Sampai saat ini, penelitian tentang polimorfisme  gen  BMP-15  pada  sapi  FH  belum diteliti.  Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan penelitian  untuk  mengetahui  polimorfisme  gen BMP-15 yang dihubungkan dengan data performan reproduksi sapi yang digunakan.

## METODE PENELITIAN

## Pengambilan sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak  10  sapi  betina  FH.  Pengambilan  data performan  reproduksi  sapi  dilakukan  secara deskriptif antara lain calving interval, days open, dan  keterangan  anak  kembar  pada  masing- masing  sapi  FH.  DNA  dari  darah  diisolasi dengan metode salting out. Kuantitas DNA hasil
isolasi diukur dengan menggunakan spektrofotometer, sedangkan kualitas DNA hasil isolasi diketahui dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 0.8%.

## PCR-RFLP
DNA  diamplifikasi  dengan  menggunakan primer  yang  di  adopsi  dari  Zhang  dkk  [9],  yaitu primer forward: 5’-GCTCTGGAATCA CAAGGGG-3’  dan  Primer  reverse  5’-AGA GATGGGGAGCGATGAT-3’.  Program  PCR meliputi beberapa tahapan, yaitu denaturasi awal pada  suhu  95 º C  selama  5  menit,  selanjutnya diikuti  dengan  amplifikasi  34  siklus.  Setiap siklus  terdiri  dari  tahap  denaturasi  95 º C  selama 30  detik,  annealing  58 º C  selama  30  detik  dan ekstensi  72 º C  selama  30  detik,  dan  diikuti dengan ekstensi akhir pada suhu 72 º C selama 10 menit.    Hasil  PCR  dielektroforesis  dengan  gel agarosa  1.5%.  PCR-RFLP  dilakukan  dengan menggunakan  enzim  restriksi  HaeIII.  Hasil PCR-RFLP  dielektroforesis  dengan  gel  agarosa 2%.

## Analisis data
Data  hasil  PCR-RFLP  di  analisis  secara deskriptif  berdasarkan  pola  pita  DNA  yang didapatkan  dan  dikorelasikan  dengan  data performan reproduksi sapi FH.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## PRC-RFLP gen BMP-15
Hasil  amplifikasi  gen  BMP-15  pada  10 sampel  sapi  FH  diperoleh  1  pita  DNA  yang spesifik dengan ukuran 360bp (Gambar 1).
Gambar  1.  Hasil  Amplifikasi  Gen  BMP-15. M:DNA  ladder  10.000bp.  1-10: fragmen  DNA  hasil  amplifikasi  Gen BMP-15.
Ukuran pita DNA hasil amplifikasi gen BMP- 15 yang diperoleh pada penelitian ini mendekati ukuran  amplikon  pada  penelitian  Zhang  dkk  [9]
yakni  sebesar  371bp.  Hal  ini  dikarenakan penggunaan  primer  yang  sama  dan  sampel penelitian  yang  termasuk  dalam  satu  spesies. Sapi  FH  tergolong  dalam  sapi  eropa  yang merupakan kelompok Bos taurus [12].
PCR-RFLP gen BMP-15 dengan menggunakan enzim restriksi HaeIII menunjukkan  bahwa  semua  fragmen  gen  BMP- 15 hasil amplifikasi terpotong dan diperoleh dua tipe  haplotip.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa terdapat  sisi  pengenalan  restriksi  pada  DNA hasil  amplifikasi  (Gambar  2  dan  Tabel  1). Adanya  variasi  haplotip  menunjukkan  adanya polimorfisme gen BMP-15 pada sapi FH.
Gambar 2. Hasil PCR-RFLP gen BMP-15 menggunakan  enzim  restriksi  HaeIII.  M:  DNA ladder  10.000bp. 1-10 DNA hasil PCR-RFLP.
Penelitian tentang polimorfisme gen BMP-15 juga  dilakukan  pada  sapi  PO.  Pada  penelitian Damayanti  &  Sri  Rahayu  [10]  yang  berjudul Analisis  polimorfisme  gen  BMP-15  (Bone Morphogenetic  Protein)  Sapi  PO  (Bos  indicus) dan hubungannya dengan keberhasilan inseminasi buatan, mengatakan bahwa polimorfisme gen BMP-15 yang terjadi pada sapi PO tidak menunjukkan adanya hubungan dengan keberhasilan  Inseminasi  Buatan.  Polimorfisme gen  dapat  terjadi  akibat  adanya  perubahan susunan  nukleotida  pada  gen  yang  dapat dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor,  misalnya adanya  seleksi  alam  atau  buatan  dan  pengaruh perkawinan. Adanya perubahan susunan nukleotida, dapat berpengaruh terhadap perubahan fenotip suatu organisme [11].
Tabel  1.  Haplotip  gen  BMP-15  Sapi  FH  dengan
menggunakan enzim restriksi HaeIII Haplotip Jumlah restriksi Ukuran fragmen Nomor Sampel 1 2 90bp, 190bp 1 2 4 90bp, 190bp, 2,3,4,5, 6,7,8,9,
290bp, 350bp 10
Menurut  Galloway  dkk  [14],  bahwa  gen BMP-15  dianggap  sebagai  gen  penting  yang memiliki  peran  dalam  fekunditas  domba,  yang terletak  pada  kromosom  X  dengan  panjang sekuens  6648  nukleotida  dengan  2  exon.  Pada penelitian  Nawas  dkk  [16]  menjelaskan  bahwa terjadinya  polimorfisme  gen  BMP-15  pada domba Balochi berkaitan dengan fekunditas. Hal lain  juga  ditemukan  pada  keturunan  kambing Balochi  yaitu  terjadinya  delesi  dan  insersi  yang berhubungan dengan fekunditas.

## PERFORMAN REPRODUKSI DAN
POLIMORFISME Gen BMP-15
Data  performan  reproduksi  dari  sepuluh  sapi FH  yang  digunakan  antara  lain  calving interval, days open, dan keterangan anak kembar (Tabel 2 dan  Tabel  3).  Berdasarkan  data  performan reproduksi  terdapat  3  sapi  bunting  dan  7  sapi memiliki  data  calving  interval  dan  days  open yang  bervariasi.  Sepuluh  sapi  yang  digunakan hanya  satu  sapi  yang  termasuk  dalam  tipe haplotip  1  dengan  nilai  days  open  5  bulan  dan calving  interval  15  bulan,  sedangkan  sapi  yang termasuk  dalam  tipe  haplotip  2  memiliki  data days  open  dan  calving  interval  yang  bervariasi (Tabel 2).

## Tabel    2.  Hubungan  haplotip  gen  BMP-15  dengan
performan reproduksi sapi FH
Sampel  Haplotip Performan reproduksi DO (bulan) CI(bulan) 3 2 3 13 4 2 4 13 5 2 5 14 1 1 5 15 9 2 6 15 2 2 6 16 10 2 7 16 6 2 Bunting 7 2 Bunting 8 2 Bunting
Sebanyak 7 ekor sapi yang digunakan sebagai sampel,  pernah  melahirkan  anak  kembar  dan anak  tidak  kembar  (Tabel 3).  Pada  tipe  haplotip 2  terdapat  2  sapi  yang  beranak  kembar  dan  4 sapi  tidak  beranak  kembar.  Data  tersebut  belum konsisten,  hal  ini  dilihat  dari  tipe  haplotip  2
dengan data performan reproduksi yang bervariasi.  Sehingga  adanya  variasi  tersebut menujukkan  bahwa  polimorfisme  gen  BMP-15 tidak berhubungan dengan performan reproduksi sapi FH.
Pada domba, mutasi gen BMP-15 pada betina heterozigot  dapat  berpengaruh  pada  laju  ovulasi dan  jumlah  anak  sekelahiran,  sedangkan  mutasi pada  betina  homozigot  dapat  menyebabkan infertil  [8].  Menurut  Hanrahan  dkk  [13],  bahwa mutasi pada gen BMP-15 berasosiasi dengan laju ovulasi  dan  litter  size  pada  Domba  Cambridge dan Berclare.

## Tabel  3.  Hubungan  haplotip  dengan  peristiwa beranak kembar
Sampel  Haplotip Keterangan 1 1 Tidak beranak kembar 2 2 Tidak beranak kembar 3 2 Beranak kembar 4 2 Tidak beranak kembar 5 2 Beranak kembar 9 2 Tidak beranak kembar 10 2 Tidak beranak kembar
Zhang dkk [9] melaporkan bahwa 8 jenis sapi yang diteliti menunjukkan adanya polimorfisme. Dua  genotip (AA  dan  AB)  ditemukan  pada sapi jenis  Luxi,  Qinchuan,  Nanyang,  Jinnan  dan Bohai  Black,  sementara  hanya  terdapat  satu genotip  (AA)  pada  sapi  Menggolian,  Holstein, dan  Simmental.  Pada  sapi  genotip  AB  tidak menunjukkan  adanya  penurunan  kesuburan. Selain itu, tidak menunjukkan bahwa kromosom X  berhubungan  dengan  kelahiran  anak  kembar atau  tingkat  ovulasi  pada  sapi  [9].  Menurut Maskur  &  Chairussyuhur  [15],  bahwa  BMP-15 merupakan  gen  overdominan  yang  terpaut  pada kromosom  X  yang  menyebabkan  sifat  infertil pada  individu  homozigot.  Adanya  mutasi  pada gen  BMP-15  dapat  menyebabkan  meningkatnya laju  ovulasi  dan  jumlah  anak  sekelahiran  pada ternak domba.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan dapat  disimpulkan  bahwa  terdapat  polimorfisme pada  gen  BMP-15  sapi  FH.  Polimorfisme  gen BMP-15  ini  tidak  ada    hubungannya  dengan performan reproduksi pada sapi FH.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  penulis  ucapkan  kepada penyandang dana untuk penelitian. Terima kasih pada  UPT.  Balai  Besar  Pelatihan  Peternakan, Songgoriti,  Batu  sebagai  lokasi  pengambilan sampel penelitian. Pada seluruh staff Laboratorium  Biologi  Seluler  dan  Molekuler, Jurusan  Biologi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Ditjennak.  2013.  Statistic  Peternakan  dan
Kesehatan Hewan 2013. Direktorat Jenderal
Peternakan dan Kesehatan Hewan
Kementerian Pertanian RI. Jakarta.
[2]  Chang,  H.,  C.W.  Brown.,  &  M.M.  Matzuk. 2002. Genetic Analysis  of The  Mammalian Transforming Growth Factor-Beta
Superfamily. Endocr Rev. 23 (6) : 787-823.
[3]  Ireland,  J.J.  &  G.W.  Smith.  2007.  BMP-15 An  Oocyte-Specific  Gene,  Play  a  Role  in Oocyte  and  Follicular  Development  in Cattle. PNAS. Vol 104.
[4]  Otsuka F., Z. Yao., T. Lee., S. Yamamoto.,
G.F.  Erickson.,  &  S.  Shimasaki.    2000. Bone Morphogenetic Protein-15
Identification of Target Cells and Biological Functions. J Biol Chem. 275(50).
[5] Dube, J,L., P. Wang., J. Elvin., K.M. Lyons., A.J.  Celest.,  &  M.M.  Matzuk.  1998.  The Bone Morphogenetic Protein-15 Gene Is X- Linked  and  Expressed  on  Oocytes.  Molec. Endocr.12:1809-1817.
[6]  Shimasaki,  S.,  R.K.  Moore.,  F.  Otsuka.,  & G.F. Erickson.
2004. The Bone Morphogenetic Protein System in Mammalian Reproduction. Endocrine Reviews. 25: 72–101.
[7]  Yan,  C.,  P.  Wang.,  J.  DeMayo.,  F.J. DeMayo.,  J.A.  Elvin.,  C.  Carino.  2001. Synergistic  Roles  of  Bone  Morphogenetic Protein-15 and Growth Differentiation Factor-9 in Ovarian Function. Mol Endocrinol. 15: 854–866.
[8]  Davis,  G.H.  2005.  Major  Genes  Affecting Ovulation Rate in  Sheep. Genet  sel  evol.  37: S11-S23.
[9]  Zhang,  L.P.,  Q.F.  Gan.,  X.H.  Zhang.,  H.D. Li., G.Y. Hou., J.Y. Li., X. Gao., H.Y. Ren., J.B.  Chen.,  &  S.Z.  Xu.  2009.  Detecting  a Deletion in the Coding Region of the Bovine Bone Morphogenetic Protein-15 gene (BMP-
15). J appl genet. 50(2): 145-148.
[10]  Damayanti.  E.U.  dan  S.  Rahayu.  2013.
Analisa  Polimorfisme  Gen  BMP-15(Bone
Morphogenetic  Protein)  Sapi  PO  (Bos indicus) dan Hubungannya dengan Keberhasilan  Inseminasi  Buatan.  Jurnal Biotropika. Vol.1(5): 216-220.
[11] Frankham, R., J.D. Ballou., & D.A. Briscoe. 2002.  Introduction  to Conservation  Genetics. Cambrigde University Press. Hal: 100-105.
[12]  Guntoro,  suprio.  2002.  Membudidayakan sapi bali. Kanisius. Yogyakarta.
[13]  Hanrahan,  J.P.  &  J.B.  Owen.  2004. Variation  and  Repeatability  of  Ovulation Rate in Cambridge Ewes. Anim Prod. 40:529.
[14]  Galloway,  S.M.,  K.P.  Mcnatty.,    L.M. Cambridge., M.P. Laitinen.,  S. Jennifer., R.J. Jokiranta.,  K.  Mclaren.,    K.G.  Luiro.,  G.W. Dodds.,  J.L.  Montgomery.,  A.E.  Beattie., G.H. Davis., & O. Ritvos. 2000. Mutations on an  Oocyte-Derived  Growth  Factor  Gene BMP-15 Cause Increased Ovulation Rate and Infertility  on  A  Dosage-Sensitive  Manner. Nat.Genet. 25: 279-283.
[15]  Maskur  dan  Chairussyuhur  Arman.  2010. Identifikasi  Mutasi  gen  BMPR-1b  dan BMP-15  pada  Domba  Ekor  gemuk.  JITV. Vol 15 (1): 16-21.
[16]  Nawaz,  A.K.,  E.B.  Masroor.,  N.  Asif.,  H. Tanveer.,  B.  Farah.,  J.  Khalid.,  &  M. Khushi.  2013.  Identification  of  Moleculer Markers  in  Bone  Morphogenetic  Protein- 15(BMP-15)  Gene  of  Balochi  Sheep.
Pakistan J.Zool. Vol.45(5): 1351-1357.