## OPTIMASI DAN VALIDASI METODE ANALISIS DALAM PENENTUAN KANDUNGAN TOTAL FENOLIK PADA EKSTRAK
DAUN GEDI HIJAU ( Abelmoschus manihot L.) YANG DIUKUR

## DENGAN SPEKTROFOTOMETER UV-VIS
Thesalonika Grinifh Arikalang 1) , Sri Sudewi 1) , Johnly A. Rorong 2)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
1) Jurusan Kimia FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
This  study  aims  to  optimize  and  validate  the  analytical  methods  in  determining  the  total phenolic  content  of  green    gedi  leaf  extract  (Abelmoschus  manihot  L.).  Optimization  is  done  by varying  the  volume  of  Folin-Ciocalteu  reagents  is  1.5;  2;  and  2.5  mL  with  some  concentration variation is 25; 50; and 75 % and Sodium Carbonate (Na 2 CO 3 ) with variation of solvent volume 1.2; 2.0;  and  4.0  mL  with  some  variation  of  concentration  5.0;  7.5;  and  10  %.  Validation  parameter  of analysis  method  is  done  by  determining  accuracy,  precision,  LOD  and  LOQ,  and  linearity.  The optimization result of analysis method showed that 1.5 mL of Folin-Ciocalteu reagent 25  % and 1.2 mL  of  Sodium  Carbonate  (Na 2 CO 3 )  5  %  showed  maximum  absorbance  of  0.432.  Validity  values  of validation parameters of analytical methods obtained accuracy results at concentrations of 30, 40, 50 µg/mL,  respectively  is  88.786;  93.635;  83.636  %,  precise  with  the  value  of  Relative  Standard Deviation (RSD) equal to 0.06 %, LOD equal to 22.363 µg/mL and LOQ 74.545 µg/mL and linearity obtained correlation coefficient r 2 = 0.993. The total content of phenolic in the green gedi leaf extract of  Manado,  North  Minahasa,  and  Southeast  Minahasa  respectively  are  913.65  ±  0.005;  788.16  ± 0.009;  and  286.35  ±  0.001  µg  GAE/g.  While  the  total  phenolic  content  in  the  fraction  of  n-hexane, ethyl  acetate  and  aquadest  were  Manado  129.09  ±  0.017;  440.9  ±  0.009;  and  55.45  ±  0.003  µg GAE/g,  North  Minahasa  88.18  ±  0.002;  260  ±  0.002;  and  38.18  ±  0.003  µg  GAE/g  and  Southeast Minahasa  82.72  ±  0.014;  168.18  ±  0.037;  and  20  ±  0.004  µg  GAE/g.  As  concluded  that  the concentration, volume and solvent used produce the optimal total phenolic content and validity values that meet the requirements to give reliable results.
Keywords: Optimization, Validation of Analysis Methods, Total Phenols, Green Gedi.

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengoptimasi  dan  memvalidasi  metode  analisis  dalam penetapan  kandungan  total  fenolik  ekstrak  daun  gedi  hijau  ( Abelmoschus  Manihot L ).  Optimasi dilakukan  dengan  memvariasikan  volume  reagen  Folin-Ciocalteu  yaitu  1,5;  2;  dan  2,5  mL    dengan beberapa variasi konsentrasi yaitu 25; 50; dan 75 % dan Natrium Karbonat (Na 2 CO 3 ) dengan variasi volume pelarut 1,2; 2; dan 4,0  mL dengan beberapa variasi konsentrasi 5; 7,5; dan 10 %. Parameter validasi  metode  analisis  dilakukan  dengan  menentukan  nilai  akurasi,  presisi,  LOD  dan  LOQ,  serta linearitas.  Hasil  optimasi  metode  analisis  menunjukkan  bahwa  1,5  mL  reagen  Folin-Ciocalteu  25  % dan 1,2 mL Natrium Karbonat (Na 2 CO 3 ) 5 % menunjukkan absorbansi yang maksimal yaitu sebesar 0,432.  Nilai  validitas  dari  parameter-parameter  validasi  metode  analisis  memperoleh  hasil  akurasi pada  konsentrasi  30,  40,  50  µg/mL  secara  berturut-turut  yaitu  88,786;  93,635;  83,636  %,  presisi dengan  nilai  Relatif  Standar  Deviasi  (RSD)  sebesar  0,06  %,  LOD  sebesar  22,363  µg/mL  dan  LOQ 74,545  µg/mL  serta  linearitas  diperoleh  koefisien  korelasi  r 2 =  0,993.  Kandungan  total  fenolik  pada ekstrak  daun  gedi  hijau  kota  Manado,  Minahasa  Utara  dan  Minahasa  Tenggara  secara  berturut-turut yaitu  913,65 ± 0,005; 788,16 ± 0,009; dan 286,35 ± 0,001 µg GAE/g. Kandungan total fenolik pada fraksi n-heksan, etil asetat dan aquades secara berturut-turut yaitu Manado 129,09 ± 0,017 ; 440,9 ± 0,009; dan 55,45 ± 0,003 µg GAE/g, Minahasa  Utara 88,18 ± 0,002; 260 ± 0,002; dan 38,18 ± 0,003 µg  GAE/g  serta  Minahasa  Tenggara  82,72  ±  0,014;  168,18  ±  0,037;  dan  20  ±  0,004  µg  GAE/g. Konsentrasi, volume serta pelarut yang digunakan menghasilkan kandungan total fenolik yang optimal dan nilai validitas yang memenuhi persyaratan.
Kata kunci : Optimasi, Validasi Metode Analisis, Total fenol, Gedi hijau.

## PENDAHULUAN
Tanaman  gedi  ( Abelmoschus manihot
L.)  suku  Malvaceae,  merupakan  tumbuhan tahunan  yang  berbatang  tegak  dengan  tinggi sekitar  1,2  –  1,8  m.  Tanaman  gedi  mudah tumbuh  dengan  cara  stek  batang  pada  tanah gembur. Daun gedi hijau dapat dimanfaatkan oleh  masyarakat  Manado  sebagai  bahan makanan (Mamahit dan Soekarno, 2010).
Senyawa  fenolik  adalah  senyawa yang memiliki gugus hidroksil yang menempel  pada  cincin  aromatik  (Vermerris dan Nicholson, 2006). Penetapan kadar fenol total  dalam  ekstrak  dapat  dilakukan  dengan pereaksi  Folin  Ciocalteu  (Ravangpai,  2011). Metode  Folin-Ciocalteu  merupakan  metode yang  umum  digunakan  sebagai  standar penentuan  kandungan  fenolik  total  karena merupakan metode yang cepat dan sederhana yang  dinyatakan  sebagai  masa  ekuivalen asam galat tiap mg sampel (Fu et al., 2011). Untuk melakukan pengembangan metode  analisis,  perlu  dilakukan  optimasi metode  analisis  untuk  menghasilkan  kondisi yang  ideal.  Setelah  suatu  metode  analisis dioptimasi  dan  berbagai  variabel  yang  akan ditentukan  telah  disesuaikan  dengan  kriteria yang diharapkan, metode analisis selanjutnya divalidasi  untuk  memastikan  bahwa  metode analisis  sesuai  dengan  tujuannya.  Validasi metode analisis dilakukan terhadap ketepatan (accuracy) , presisi, Batas Deteksi (LOD) dan batas  kuantifikasi  (LOQ),  serta  Linieritas. Suatu  metode  analisis  harus  divalidasi  untuk melakukan  verifikasi  bahwa  parameter- parameter kinerjanya mampu untuk mengatasi problem analisis (Rohman, 2007).

## METODE PENELITIAN
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu  00780),  Komputer  pengolah  data (Hp),  timbangan  analitik  (ADAM),  alat-alat gelas  (iwaki),  Blender  (Nanotec),  corong
pisah,  Vortex  (Mixer  Hwashin),  Rotary Evaporator (RV 10 gigital V), Rotary shaker (Infors HT), dan mikropipet (Ecopippete).

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  yaitu: simplisia  kering  daun  gedi  hijau  Kota Manado, Kabupaten Minahasa Utara, Kabupaten Minahasa Tenggara, Asam Galat, reagen  Folin-Ciocalteu,  Etanol  teknis  96  %, Natrium  Karbonat  (Na 2 CO 3 )  Pro  analisis (Merck), n-heksan, etil asetat, dan akuades.

## METODE PENELITIAN

## 1. Pengambilan Sampel
Sampel daun Gedi Hijau
( Abelmoschus  manihot L . )  diambil  dari perkebunan Kota Manado, Kabupaten Minahasa  Utara  dan  Kabupaten  Minahasa Tenggara,  Selanjutnya  setiap  sampel  daun gedi  hijau  ( Abelmoschus  manihot L . )  dibuat simplisia.

## 2. Ekstraksi
Sebanyak  250  gram  simplisia  dari masing-masing daerah dimasukkan ke dalam labu  alas  bulat,  selanjutnya  ditambahkan etanol 96 %. Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi selama 24 jam dengan menggunakan rotary  shaker .  Ekstrak  hasil maserasi  kemudian  diuapkan  dengan rotary evaporator  hingga  terbentuk  ekstrak  kental daun gedi hijau.

## 3. Optimasi Metode Analisis
Sebanyak  10,0  mg  asam  galat diencerkan  dengan  akuades  sampai  volume 10,0  mL.  Larutan  asam  galat  sebanyak  300 µL  ditambahkan  beberapa  variasi  volume reagen Folin-Ciocalteau yaitu 1,5; 2; dan 2,5 mL    dengan  beberapa  variasi  konsentrasi yaitu 25; 50; dan 75 % kemudian digojog dan didiamkan  selama  3  menit.  Selanjutnya ditambahkan  Natrium  karbonat  dengan variasi  volume  pelarut  1,2;  2;  dan  4  mL dengan  beberapa  variasi  konsentrasi  5;  7,5; dan  10  %  pada  masing-masing  campuran.
Larutan  diinkubasi  selama  30  menit  dan absorbansi larutan dibaca dengan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang 750  nm.  Setelah  absorbansi  larutan  dibaca, volume  dan  konsentrasi  reagen  Folin- Ciocalteau  dan  pelarut  Natrium  karbonat yang  hasil  absorbansinya  paling  baik  akan digunakan  sebagai  standar  pada  penentuan kandungan total fenolik.

## 4. Validasi Metode Analisis
a. Ketepatan ( Accuracy)
Ke  dalam  sampel  ekstrak  daun  gedi hijau ditambahkan asam galat baku sebanyak 30, 40, dan 50 µg/mL dari rerata kadar asam galat  yang  terdapat  pada  sampel,  kemudian dianalisis dengan prosedur yang sama seperti pada  sampel.  Hasil  dinyatakan  dalam  persen perolehan  kembali  (% recovery ).  Persen perolehan  kembali  dihitung  menggunakan rumus sebagai berikut:
Keterangan: A 1 =  Kadar  analit  sebelum  penambahan Asam galat baku
A 2 =  Kadar  analit  yang  diperoleh  setelah penambahan Asam galat baku
B  = Kadar Asam galat baku yang ditambahkan
b. Presisi
Larutan  asam  galat  1000  µg/mL dibuat  konsentrasi  20  µg/mL,  selanjutya larutan  baku  asam  galat  dengan  konsentrasi 20  µg/mL  tesebut  didiamkan  selama  waktu operating time kemudian dibaca absorbansinya  pada  panjang  gelombang  750 nm.  Uji  ketelitian  ini  dilakukan  sebanyak  5 kali  pengulangan.  Uji  presisi  ditentukan dengan  parameter  RSD  (Relatif  Standard Deviasi) berdasarkan rumus sebagai berikut:
Keterangan:
SD = Standar deviasi/simpangan baku
x = Kadar rerata
c.  Batas  Deteksi  ( Limit  of  Detection, LOD)
dan Batas Kuantifikasi ( Limit of
Quantification, LOQ)
Batas  deteksi  dan  batas  kuantifikasi dapat dihitung secara statistik melalui regresi linier  dari  kurva  kalibrasi  dengan  membuat larutan baku kerja dengan konsentrasi 20; 30; 40;  50;  dan  60  µg/mL  lalu  dipipet    masing- masing  300  µL  dan  dimasukkan  ke  dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 1,5 mL reagen  Folin  Ciocalteau  25  %  dan  digojog. Didiamkan  selama  3  menit  kemudian ditambah 1,2 mL larutan Natrium Karbonat 5 %,  setelah  itu  diinkubasi  selama  30  menit, absorbansi  dari  larutan  pembanding  diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang  gelombang  750  nm.  Setelah  diukur absorbansinya  kemudian  dihitung  nilai Limit Of Detection dan Limit Of Quantitation.
Limit  Of  Detection dan Limit  Of Quantitation ditentukan  dengan  rumus  yang sebagai berikut:
LOD =
LOQ =
d. Linearitas (Kurva Baku)
Linearitas dilakukan dengan membuat larutan  stok  dengan  larutan  asam  galat dengan  konsentrasi  20;  30;  40;  50  dan  60 µg/mL. Kemudian dipipet 300 µL selanjutnya  ditambahkan  1,5  mL  reagen Folin-Ciocalteu  25  %,  1,2  mL  natrium karbonat  5  %  setelah  itu  diinkubasi  selama 30 menit, absorbansi dari larutan pembanding diukur menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang  maksimum.  Kurva  kalibrasi dibuat  kemudian  ditentukan  persamaan regresi  linier  serta  koefisien  korelasi  untuk mengevaluasi  linearitas.  Berdasarkan  nilai
koefisien korelasi dapat diketahui linieritasnya baik atau tidak.
5.  Penentuan Kandungan Fenolik Total Ekstrak Daun Gedi Hijau ( Abelmoschus manihot L.)
a. Penentuan Operating Time
Sebanyak  300  µL  larutan  asam  galat konsentrasi  30  µg/mL  ditambah  1,5  mL reagen  Folin  Ciocalteu  25  %,  kemudian digojog  dan  didiamkan  selama  3  menit.  Ke dalam  larutan  tersebut  ditambahkan  1,2  mL larutan  Natrium  Karbonat  (Na 2 CO 3 )  5    %, digojog  homogen,  dan  diukur  absorbansinya dalam  rentang  waktu  0-90  menit  pada panjang gelombang 750 nm.
b.  Penentuan  panjang  gelombang  absorbansi maksimum
Sebanyak  300  µL  larutan  asam  galat konsentrasi  30  µg/mL  ditambah  1,5  mL reagen  Folin-Ciocalteau  25  %,  kemudian digojog  dan  didiamkan  selama  3  menit.  Ke dalam  larutan  tersebut  ditambah  1,2  mL larutan  Natrium  karbonat  5  %,  digojog homogen,  dan  didiamkan  pada  suhu  kamar pada  range operating  time, kemudian absorbansinya diukur pada panjang gelombang 700-800 nm.
c.  Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak  300  µL  larutan  asam  galat konsentrasi  20,  30,  40,  50,  dan  60  µg/mL masing-masing dimasukkan ke dalam tabung,  kemudian  ditambah  1,5  mL  reagen Folin  Ciocalteau  25  %  dan  digojog.  Setelah didiamkan  selama  3  menit,  masing-masing larutan  ditambah  1,2  mL  larutan  Natrium Karbonat  5  %,  digojog  homogen  dan didiamkan  pada  range operating  time pada suhu kamar. Semua larutan diukur absorbansinya  pada  panjang  gelombang absorbansi  maksimum,  kemudian  di  buat kurva  kalibrasi  hubungan  antara  konsentrasi asam galat (µg/mL) dengan absorbansi. d.  Penentuan kandungan total fenolik ekstrak daun gedi hijau
Sebanyak  10,0  mg  ekstrak  dari masing-masing  ekstrak  daun  gedi  hijau dilarutkan  sampai  volume  10,0  mL  akuades. Larutan  ekstrak  yang  diperoleh  dipipet sebanyak  300  µL,  dan  ditambah  reagen  1,5 mL  Folin-Ciocalteau  25  %  dan  digojog, didiamkan selama 3 menit, ditambah 1,2 mL pelarut Natrium Karbonat (Na 2 CO 3 ) 5 % dan didiamkan  lagi  pada  range  operating  time pada suhu kamar. Absorbansi  ekstrak diukur pada panjang gelombang maksimum. Perhitungan kandungan fenolik total menggunakan rumus berikut:
TPC =
Keterangan: c  = konsentrasi fenolik (nilai x)
v  = volume ekstrak yang digunakan (mL)
fp  = faktor pengenceran g  = berat sampel yang digunakan

## HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Ekstraksi
Ekstrak daun gedi hijau yang diperoleh  dari  Kota  Manado,  Kabupaten Minahasa  Utara  dan  Kabupaten  Minahasa Tenggara  secara  berturut-turut  yaitu  9,0618; 7,7565;  dan  32,4675  gram. Cairan  penyari yang  digunakan  untuk  ekstraksi  pada penelitian  ini  adalah  etanol  96  %.  Pemilihan pelarut etanol berdasarkan sifat kepolarannya yang  dapat  melarutkan  senyawa  metabolit sekunder  bersifat  semi  polar  hingga  polar, termasuk  senyawa  fenolik  dalam  daun  gedi hijau  sehingga  senyawa  yang  terekstraksi diharapkan lebih maksimal. Kelebihan etanol sebagai  pelarut  yaitu  aman,  tidak  toksik, netral, tidak berbahaya bagi lingkungan, serta titik  didihnya  relatif  rendah  sehingga  mudah diuapkan (Andersen dan Markham, 2006).

## 2. Optimasi Metode Analisis
Gambar 1.  Optimasi Metode Analisis
dengan memvariasikan konsentrasi dan volume Folin- Ciocalteu dan Natrium karbonat Optimasi
bertujuan untuk mendapatkan  hasil  yang  maksimal  dengan tingkat  sensitivitas  yang  tinggi  untuk memperoleh  kondisi  optimum  pada  suatu proses  yang  menghasilkan  nilai  terbaik  dari kriteria  kerja.  Berdasarkan  hasil  absorbansi yang  diperoleh  menunjukan  bahwa  1,5  mL reagen  Folin-Ciocalteu  25  %  dan  1,2  mL Natrium  Karbonat  (Na 2 CO 3 )  5  %    memiliki hasil  yang  paling  baik  dengan  hasil absorbansi 0,432.

## 3. Operating time
Dari  hasil  yang  diperoleh,  absorbansi yang stabil  pada menit  ke-30 sehingga dapat disimpulkan Operating time untuk penetapan kandungan  total  fenolik  ekstrak  daun  gedi hijau  adalah  30  menit.  Tujuan  penetapan operating  time untuk  mendapatkan  waktu pengukuran  pada  saat  reaksi  telah  berjalan optimal  yang  ditandai  dari  absorbansi  yang stabil, sehingga dapat memaksimalkan pengukuran.  Kenaikan  absorbansi  secara terus-menerus  dari  menit  ke  menit  tidak dapat  dijadikan  sebagai operating  time karena  perubahan  absorbansi  masih  terus berjalan, sehingga pengukuran menjadi tidak maksimal jika dilakukan pada waktu tersebut.  Sebaliknya  ketika  absorbansi  mulai stabil merupakan waktu  yang tepat dijadikan sebagai operating time (Pangestuty, 2016).
4.  Penentuan Panjang Gelombang

## Absorbansi Maksimum
Gambar 2. Scanning Panjang  gelombang absorbansi maksimum
Panjang gelombang maksimum merupakan  panjang  gelombang  yang  dapat memberikan absorbansi maksimum pada saat pengukuran  (Sambadha,  2011).  Berdasarkan hasil scanning panjang gelombang maksimum pada konsentrasi 30 µg/mL asam galat diperoleh panjang gelombang maksimum  750  nm  dengan  hasil  absorbansi 0,443.

## 5. Validasi Metode Analisis
a. Ketepatan ( Accuracy)
Tabel 2. Data uji akurasi
A 1 B (µg/mL) A 2 Recovery (%) ± SD 25,818 30 52,454 88,786 % ± 0,016 40 63,272 93,635 % ± 0,005 50 67,636 83,636 % ± 0,024
Keterangan:
A 1 : Kadar ekstrak sebelum penambahan asam galat;
A 2 : Kadar ekstrak setelah penambahan asam galat;
B  : Kadar asam galat yang ditambahkan ke dalam ekstrak (µg/mL)
Persen  perolehan  kembali  ini  dapat diterima  karena  memenuhi  syarat  akurasi yaitu pada rentang rata-rata persen perolehan kembali  80-110  %  (Harmita,  2004).  Hal  ini menunjukkan  bahwa  parameter  akurasi
0,432 0,348 0,386 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1,5 mL FC 25% & 1,2
mL Na2CO3 5%
2 mL FC 50% dan 2 mL Na2CO3 7,5% 2,5 mL FC 75% dan 4 mL Na2CO3 10% A b sor b an si Optimasi 0,443 0,4 0,42 0,44 0,46 680 700 720 740 760 780 A b sor b an si Panjang gelombang (nm)
dalam  penetapan  kandungan  ekstrak  daun gedi hijau memenuhi syarat validasi.
b. Presisi Presisi  diukur  sebagai  simpangan
baku atau simpangan baku relatif berdasarkan penelitian yang dilakukan terhadap  replikasi  sampel  yang  diambil  dari campuran  yang  homogen.  Presisi  dapat menghasilkan  nilai  rata-rata  yang  sangat dekat dengan nilai yang sebenarnya, simpangan  baku  relatif  (RSD)  sebagai parameter ukur.
Hasil  perhitungan  simpangan  baku (SD)  dari  data  yang  diperoleh  sebanyak  5 kali pengulangan pada konsentrasi 20 µg/mL sebesar 0,0032 dengan nilai simpangan baku relatif  (RSD)  sebesar  0,06  %.  Menurut Harmita (2004), nilai simpangan baku relatif (RSD)  <  2%  menunjukkan  bahwa  parameter presisi  memberikan  keterulangan  yang  dapat diterima dengan baik.
c.    Batas  Deteksi  ( Limit  of  Detection, LOD) dan Batas Kuantifikasi ( Limit of Quantification, LOQ)
Setelah  mendapatkan  kurva  kalibrasi yang memenuhi persyaratan analisis, selanjutnya data yang diperoleh dari konsentrasi  tiap  analit  yang  memberikan absorbansi berbeda diolah untuk menentukan batas  deteksi  (LOD)  dan  batas  kuantifikasi (LOQ). Batas deteksi merupakan konsentrasi analit  terendah  dalam  sampel  yang  masih dapat  dideteksi  (Harmita,  2004).  Penentuan batas deteksi dan batas kuantifikasi
berdasarkan kemiringan ( slope ) kurva kalibrasi.  Hasil  pengujian  batas  deteksi dalam  penentuan  kandungan  total  fenolik pada  ekstrak  daun  gedi  hijau  menunjukkan nilai  limit  deteksi  sebesar  22,363  µg/mL sedangkan  batas  kuantifikasi  yang  diperoleh 74,545 µg/mL.
d. Kurva Baku dan Linearitas
Gambar 3. Kurva kalibrasi
Persamaan kurva kalibrasi merupakan hubungan  antara  sumbu  x  dan  sumbu  y. Sumbu  x  dinyatakan  dengan  konsentrasi yang diperoleh sedangkan sumbu y merupakan  absorbansi  atau  serapan  yang diperoleh  dari  hasil  pengukuran  sehingga persamaan  regresi  linier  dari  kurva  kalibrasi yang  diperoleh  adalah  y=0,011x  +  0,123 dengan  koefisien  korelasi  r 2 =  0,993.  Harga koefisien  korelasi  menyatakan  hubungan yang linier antara konsentrasi dengan serapan yang  dihasilkan.  Berdasarkan  hasil  r 2 yang diperoleh bahwa koefisien korelasi memberikan  hasil  yang  linear  karena memenuhi  kriteria  yang  dapat  diterima  yaitu 0,99 (Miller dan Miller, 2005).
6.  Penentuan  Kandungan  Total  Fenolik Pada Ekstrak Daun Gedi Hijau
Gambar 4. Kandungan total fenolik pada ekstrak daun gedi hijau
y = 0,011x + 0,123 R² = 0,993 0 0,5 1 0 20 40 60 80 A b sor b an si Konsentrasi (µg/mL) 913,65 ± 0,017 788,16 ± 0,002 286,35 ± 0,014 Manado Minut Mitra K and u n gan to tal fen ol ( µ g GAE /g) Daerah
Berdasarkan    hasil  yang  diperoleh, total  fenolik  pada  kota  Manado  lebih  tinggi yaitu sebesar 913, 65 µg GAE/g, diikuti oleh Minahasa  Utara  yaitu  sebesar  788,16  µg GAE/g  dan  Minahasa  Tenggara  sebesar 286,35  µg  GAE/g.  Pertumbuhan  tanaman dipengaruhi  oleh  banyak  faktor,  diantaranya yaitu  suhu,  kelembaban,  curah  hujan  dan tempat  tumbuh.  Kondisi  tanah  pada  ketiga daerah  tersebut  menyebabkan  terjadinya perbedaan  kandungan  senyawa  fenolik  dari tanaman  gedi  hijau  yang  tumbuh  di  daerah tersebut.
Menurut  Alfian  dan  Susanti  (2012) penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan menggunakan reagen Folin- Ciocalteu. Reagen Folin-Ciocalteu digunakan karena  senyawa  fenolik  dapat  bereaksi dengan  Folin  membentuk  larutan  berwarna yang  dapat  diukur  absorbansinya.  Prinsip dari  metode  Folin  adalah  terbentuknya senyawa  kompleks  berwarna  biru.  Senyawa fenolik  bereaksi  dengan  reagen  Folin- Ciocalteu  hanya  dalam  suasana  basa  agar terjadi disosiasi proton pada senyawa fenolik menjadi ion fenolat. Untuk membuat kondisi basa digunakan Natrium karbonat.

## KESIMPULAN
1.  Berdasarkan hasil optimasi yang diperoleh menunjukan  bahwa  campuran  1,5  mL reagen  Folin-Ciocalteu  25  %  dan  1,2  mL pelarut  Natrium  karbonat  5  %    memiliki hasil  yang  paling  baik  dengan  hasil absorbansi paling tinggi yaitu 0,432.
2.  Validasi  metode  analisis  yang  dilakukan pada  parameter  uji  akurasi,  presisi,  LOD dan  LOQ,  serta  Linearitas  yang  diukur dengan  spektrofotometer  UV-Vis  telah memenuhi  syarat.  Nilai  validitas  dari parameter-parameter validasi metode analisis  memperoleh  hasil  akurasi  pada konsentrasi  30,  40,  50  µg/mL  secara berturut-turut yaitu 88,786; 93,635;
83,636  %,  presisi  dengan  nilai  Relatif
Standar  Deviasi  (RSD)  sebesar  0,06  %, LOD  sebesar  22,363  µg/mL  dan  LOQ sebesar  74,545  µg/mL  serta  linearitas diperoleh koefisien korelasi r 2 = 0,993.
3.  Kandungan  total  fenolik  ekstrak  etanol daun  gedi  hijau  di  kota  Manado  sebesar 913,  65  µg  GAE/g,  Minahasa  Utara  yaitu sebesar  788,16  µg  GAE/g  dan  Minahasa Tenggara sebesar 286,35 µg GAE/g.

## SARAN
Disarankan untuk melakukan penelitian  lebih  lanjut  tentang  aktivitas antioksidan  ekstrak  etanol  dan  fraksi  etil asetat daun gedi hijau ( Abelmoschus manihot L.).

## DAFTAR PUSTAKA
Alfian,  R.,  Susanti,  H.  2012.  Penetapan Kadar  Fenolik Total  Ekstrak Metanol Kelopak Bunga Rosella Merah
( Hibiscus  sabdariffa )  dengan  Variasi Tempat Tumbuh secara Spektrofotometri. Jurnal Ilmiah
Kefarmasian. 2(1): 73-80.
Andersen,  M.O.,  dan  Markham,  K.R.  2006.
Flavonoids : Chemistry,Biochemistry, and  applications. Taylor  &  Francis Group, USA.
Fu,L.,  Xu,  B.T.,  Gan,  R.Y.,  and  Zhang,  Y.
2011.  Total  Phenolic  Contents  and Antioxidant  Capacities  o  Herbal  and Tea Infusion. International Journal of Molecular Sciences. 12: 2112-2124.
Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu
Kefarmasian. 1 (3) : 117-135.
Mamahit L.P. dan Soekarno,N.H., 2010. Satu senyawa  organik  yang  diisolasi  dari daun  gedi  ( Albemoschus  manihot L. Medik) Asal Sulawesi utara. Chemistry Program . 3 (1) : P. 45
Miller,  J.C  and  Miller,  J.N.  2005. Statistic and  Chemometrics  for  Analytical
Chemistry, in Handbook of
Pharmaceutical  Analysis  by  HPLC.
Purdue Pharma, New York.
Pangestuty, A. 2016. Uji Aktivitas Antioksidan  dan  Penetapan  Kadar Fenolik  Total  Fraksi  Etil  Asetat Ekstrak  Etanol  Buah  Buni  Dengan Metode 2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazil (DPPH)  dan  Metode  Folin-Ciocalteu [skripsi]. Fakultas Farmasi, Yogyakarta. Ravangpai,  W.  2011.  Limonoids  from  seeds of  Thai Xylocarpus moluccenci.
Bioorganic  &  Medical  Chemistry Letters. 21: 4485-4489 Rohman,  A.  2007. Kimia  Farmasi  Analisis.
Pustaka pelajar, Yogyakarta. Sambadha,  D.L.E.  2011. Uji  Aktivitas
Antioksidan  menggunakan  Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhifrazil (DPPH) dan  Penetapan  Kandungan  Fenolik
Total  Fraksi  Air  Ekstrak  Daun
Selasih [skripsi].  Universitas  Sanata
Dharma, Yogyakarta. Sudjadi,  2007. Kimia  Farmasi  Analisis. PT
Pustaka Pelajar, Jakarta.
Vermerris,  W  dan    Nicholson,  R.  2006.
Phenolic  Compound  Biochemistry.
Spinger, Dordrecth.