## AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK DAUN KAYU BULAN

## ( Pisonia alba )
Heryanto Matheos 1) , Max Revolta John Runtuwene 2) , dan Sri Sudewi 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
2) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Kayu bulan (Pisonia alba Span. ) is a plant native to Indonesian, generally  this plant is only used  as  an  ornamental  plant  are  unwittingly  have  a  high  enough  potential  in  curing  various diseases. The potential can be partially attributed to the antioxidant activity of existing plants. The purpose of this study was to test the antioxidant activity of the leaf extract of kayu bulan (Pisonia  alba Span. ). The  method  of  extraction  in  this  study  using  maceration  with  ethanol 40, 60 and 80%. The extract obtained is determined phenolic content and antioxidant activity assay  with  DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Based  on  the  results  obtained  in  leaf  of kayu bulan has a total phenolic content of 12.45, 16.22, 28.67 (mg / kg) to extract 40, 60 and 80 %, respectively. Based on the results of the calculation of IC 50 showed that extract had IC 50 values  are 544.44, 478.12 and 236.50 ppm for 40, 60 and 80 %, respectively
Key words : leaf of kayu bulan, test phytochemicals, antioxidants, DPPH.

## ABSTRAK
Kayu bulan (Pisonia alba Span.) merupakan tanaman asli Indonesia. Umumnya tanaman ini hanya digunakan sebagai tanaman hias saja yang tanpa disadari memiliki potensi yang cukup tinggi  dalam  menyembuhkan  berbagai  macam  penyakit.  Potensi  tersebut  diduga  karena aktivitas  antioksidan  yang  ada  pada  tumbuhan  tersebut.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari ekstrak daun kayu bulan (Pisonia alba Span.). Metode ekstraksi dalam penelitian ini menggunakan maserasi dengan pelarut etanol 40, 60 dan 80 %. Ekstrak yang diperoleh ditentukan kandungan fenolik dan diuji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Berdasarkan hasil yang didapat daun kayu bulan memiliki kandungan total fenolik  12.45, 16.22, 28.67 (mg/kg)  untuk ekstrak 40, 60 dan 80 %.  Berdasarkan  hasil  perhitungan  IC 50 menunjukan  bahwa  ekstrak  memiliki  nilai  IC 50 berturut-turut yaitu 544.44, 478.12, dan 236.50 ppm.
Kata kunci : daun kayu bulan, uji fitokimia, antioksidan, DPPH.

## PENDAHULUAN
Beberapa    penyakit  kronis  yang lazim  dijumpai  dan  diderita  masyarakat Indonesia  diantaranya  kanker,  jantung, artritis,  diabetes,  liver,  inflamasi  dan penyakit-penyakit degeneratif. Ada berbagai macam teori yang dapat menjelaskan penyebab penyakit degeneratif. Salah satu teori yang dianggap cukup signifikan adalah teori reaksi radikal bebas.  Berdasarkan  teori  ini,  penyebab penyakit degeneratif ialah akibat timbulnya  radikal  bebas  (hidroksil)  dalam mekanisme biokimia yang terjadi di dalam tubuh (Oeinitan, 2013).
Radikal bebas ( free radical ) adalah suatu atom atau molekul yang mempunyai elektron  tidak  berpasangan.  Radikal  bebas dianggap berbahaya karena menjadi sangat reaktif dalam upaya mendapatkan pasangan elektronnya, dapat pula terbentuk radikal bebas baru dari atom atau molekul  yang  elektronnya  didonor  untuk berpasangan dengan radikal bebas sebelumnya.  Sifat  yang  sangat  reaktif  dan aktivitas  yang  tidak  beraturan  oleh  radikal bebas, dapat menimbulkan kerusakan pada bagian-bagian  sel  dalam  tubuh  (Muhilal, 1991; Auroma, 1994).
Proses oksidasi radikal bebas dapat dihambat atau dinetralkan dan dihancurkan oleh  senyawa  yang  tergolong  antioksidan. Antioksidan  adalah  senyawa  kimia  yang dapat digunakan untuk melindungi komponen  biologi  seperti  lipida,  protein, vitamin  dan  DNA  melalui  perlambatan kerusakan,  ketengikan  atau  perubahan warna  yang  disebabkan  oleh  oksidasi (Suryanto, 2012). Sumber-sumber
antioksidan  dapat  berupa  antioksidan sintetik maupun antioksidan alami (Gordon,  1994).  Saat  ini  penggunaan antioksidan  sintetik  mulai  dibatasi  karena dari  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan, antioksidan sintetik seperti
BHT ( Butylated Hydroxy Toluena ) dapat meracuni  dan  bersifat  karsinogenik.  Oleh karena  itu,  industri  makanan  dan  obat- obatan  beralih  pada  pengembangan  dan pencarian sumber-sumber antioksidan
alami  yang  baru  (Takashi  dan  Takayuni, 1997).
Kayu  bulan  merupakan  salah  satu tanaman  yang  terdapat  dibagian  timur Indonesia dan diduga mengandung senyawa  antioksidan.  Secara  empiris, rebusan  daun  Kayu  bulan  atau  ( Pisonia alba Span .) sering  digunakan  sebagai bahan herbal dalam penyembuhan penyakit seperti, bisul, bengkak, penebalan kulit,  mata  ikan,  dan  poliuria.  Salah  satu kandungan kimia yang terdapat pada Kayu bulan  yaitu  fenolik  (Hembing,  1994). Senyawa  fenolik  mempunyai  struktur  dan sifat  yang  khas,  yaitu  memiliki  satu  atau lebih  gugus  hidroksil  yang  terikat  pada satu  atau  lebih  cincin  aromatik  benzena, sehingga  senyawa  ini  dapat  teroksidasi. Kemampuannya membentuk radikal fenoksi  yang  stabil  pada  proses  oksidasi, menyebabkan senyawa ini banyak digunakan  sebagai  antioksidan  (Suryanto, 2012).
Pada  penelitian  ini,  ekstrak  yang diperoleh  menggunakan  cara  maserasi dengan konsentrasi etanol 40, 60 dan 80% bertujuan  untuk  mengetahui  penarikan kandungan  terbaik  dari  daun  Kayu  Bulan. Penggunaan  varian  konsentrasi  pelarut dilakukan karena semakin tinggi konsentrasi  etanol  maka  semakin  rendah tingkat  kepolaran  pelarut  yang  digunakan (Shadmani,  dkk,  2004).  Oleh  sebab  itu, rendemen  yang  dihasilkan  merupakan jumlah  senyawa  yang  terekstrak  oleh berbagai  macam  pelarut  dengan  tingkat kepolaran  yang  berbeda  (Syahbirini  dkk, 2005).  Pengujian  kandungan  fitokimia, fenolik  dan  antioksidan  dengan  metode DPPH dilakukan untuk menentukan kualitas  ekstrak.  Setelah  itu  potensi  dan aktivitas  ekstrak sebagai antioksidan dibandingkan dengan vitamin c.
Tujuan  penelitian  yaitu  mengetahui kandungan metabolit sekunder pada ekstrak  etanol  daun  Kayu  Bulan  ( Pisonia alba Span. ) pada konsentrasi  40,  60  dan 80%,  mengetahui  kandungan  total  fenolik ekstrak  etanol  daun  Kayu  Bulan  ( Pisonia alba Span.)  dan  mengetahui  aktivitas
antioksidan  ekstrak  etanol  daun  Kayu Bulan ( Pisonia alba Span.)

## METODOLOGI PENELITIAN
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam  penelitian  ini  yaitu:  daun  Kayu bulan (Pisonia  alba Span. ) ,  etanol  40,  60, dan 80%, larutan natrium karbonat, reagen Folin-Ciocalteu , 1,1
difenil-2- pikrilhidrazil (DPPH), asam askorbat, besi (III)  klorida  ,  asam  sulfat  2  M,  reagen Mayer ,  asam  klorida  pekat,  serbuk magnesium dan aquades.
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu:  pisau,  alat-alat  gelas ( pyrex ), botol kaca transparan, mikro pipet, blender,  spatula,  vortex,  saringan,  oven ( memmerf ),  rotari  evaporator  ( eyla  N- 1000 ),  spektrofotometer  ( Shimadzu  1800 ), timbangan ( A&D company limited ).

## Pengambilan Sampel
Sampel  diambil  dari  daerah  Kepulauan Sangihe Kecamatan Tahuna Timur.  Bahan yang  digunakan  adalah  bagian  daun  yang berwarna kuning cerah.

## Identifikasi Tanaman
Identifikasi tanaman dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Jurusan  Biologi  Fakultas  Matematika  dan Ilmu  pengetahuan  Alam,  Universitas  Sam Ratulangi Manado.

## Preparasi Sampel
Daun Kayu bulan di cuci pada air mengalir kemudian  di  rajang  menjadi  bagian  yang lebih  kecil,  lalu  dikeringkan.  Setelah kering  daun  Kayu  bulan  dihaluskan dengan blender.

## Ekstraksi
Ekstraksi  daun  Kayu  bulan  menggunakan pelarut  etanol  40,  60  dan  80%.  Ekstraksi dilakukan  dengan  cara  maserasi  selama  5 hari.  Ditimbang  sebanyak  100  gram  daun Kayu  bulan  lalu  ditambahkan  pelarut  500 mL  dengan  perbandingan  (1:5)  hingga daun  Kayu  bulan  terendam  seluruhnya. Ekstraksi dilakukan selama 5 hari terlindung  dari  cahaya  dan  dilakukan
pengadukan  1x24  jam.  Pada  hari  ke  3 larutan disaring untuk dilakukan remaserasi  sehingga  menghasilkan  filtrat untuk  tiap  remaserasi.  Filtrat  yang  didapat pada  tiap  pergantian  pelarut  digabungkan kemudian  masing-masing  hasil  ekstrak diuapkan  menggunakan  rotari  evaporator hingga diperoleh ekstrak dari Kayu bulan.
Penentuan Kandungan Fitokimia (Harborne, 1987).

## Uji Alkaloid
Sebanyak  4  mL  ekstrak  daun  Kayu  bulan dimasukan  ke    dalam  tabung  reaksi kemudian  ditambahkan  2  mL  kloroform dan  2,5  mL  amonia  10  %,  lalu ditambahkan  10  tetes  asam  sulfat  2  M untuk memperjelas pemisahan terbentuknya  2  fase  yang  berbeda.  Bagian atas  dari  fase  yang  terbentuk  diambil, kemudian  ditambahkan  reagen Mayer .
Keberadaan alkaloid dalam sampel ditandai  dengan  terbentuknya  endapan merah.

## Uji Flavonoid
Ekstrak daun Kayu bulan  sebanyak 1  mL diambil dan ditambahkan serbuk magnesium secukupnya dan 10 tetes asam klorida pekat. Keberadaan flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna hitam kemerahan pada larutan.

## Uji Tanin
Sebanyak  1  mL  ekstrak  daun  Kayu  bulan ditambahkan  dengan  10  mL  air  panas, kemudian  ditetesi  menggunakan  besi  (III) klorida. Keberadaan tanin dalam sampel di tandai  dengan  timbulnya  warna  hijau kehitaman.

## Uji Saponin
Sebanyak  1  mL  ekstrak  daun  Kayu  bulan ditambahkan  dengan  10  mL  aquades kemudian  dikocok  kuat  selama  kurang lebih  1  menit.  Selanjutnya  didiamkan selama  10  menit  dan  diamati  buih  atau busa yang terbentuk. Keberadaan senyawa saponin  dalam  sampel  ditandai  dengan
terbentuknya  buih  yang  stabil  selama  10 menit dengan tinggi 3 cm.

## Uji Steroid
Sebanyak  1  mL  ekstrak  daun  Kayu  bulan diambil  dan  ditambahkan  dengan  2  mL kloroform.  Setelah  itu  campuran  dikocok. Kemudian filtrat ditambahkan asetat anhidrat  dan  asam  sulfat  pekat  masing- masing  sebanyak    2  tetes.  Reaksi  positif ditunjukan  pada  perubahan  warna  merah pada  larutan  pertama  kali  kemudian berubah menjadi biru dan hijau.

## Penentuan Kandungan Total Fenolik
Kandungan  total  fenolik  ekstrak  daun
Kayu bulan ( Pisonia alba Span.)  ditentukan  menggunakan  metode Folin  Ciocalteu (Conde,  dkk,  1997). Sebanyak  0,1  mL  larutan  ekstrak  dengan konsentrasi  1000  ppm  dimasukkan  dalam tabung  reaksi,  lalu  ditambahkan  0,1  mL reagen Folin  Ciocalteu 50%.  Campuran tersebut  divortex,  lalu  ditambahkan  2  mL larutan  natrium  karbonat  2%.  Selanjutnya, campuran  diinkubasi  dalam  ruangan  gelap selama  30  menit.  Pembacaan  absorbansi pada panjang gelombang 750 nm menggunakan spektrofotometer.
Kandungan  total  fenol  dinyatakan  sebagai mg ekivalen asam galat/kg ekstrak.
Penentuan
Aktivitas

## Penangkap Radikal Bebas Dengan DPPH
Penentuan  aktivitas  penangkal  radikal bebas  DPPH  menurut  Burda  dan  Olezek (2001).  Sebanyak  1  mL  masing-masing ekstrak  dengan  konsentrasi  50,  150,  200, 250,  500  dan  550  ppm  ditambahkan dengan  1  mL  larutan 1,1  difenil-2- pikrilhidrazil (DPPH)  dalam  etanol  dan divortex  selama  2  menit.  Berubahnya warna  larutan  dari  ungu  menjadi  kuning menunjukkan  efisiensi  penangkal  radikal bebas.  Selanjutnya  pada  5  menit  terakhir menjelang  30  menit  inkubasi,  absorbansi diukur  pada  panjang  gelombang  520  nm dengan  menggunakan  spektrofotometer UV-Vis. Kemudian diamati
perbandingannya dengan vitamin C sebagai standar.
Aktivitas  penangkapan  radikal  bebas dihitung  sebagai  persentase  berkurangnya warna DPPH dengan menggunakan persamaan :
Aktivitas penangkal radikal bebas (%) = 1 - x100%
Penentuan Nilai IC 50 Nilai  IC 50 dihitung  dari  interpolasi pada  grafik  hubungan  antara  konsentrasi larutan  uji  dan  daya  antioksidan  pada konsentrasi  50,  100,  150,  200,  250, kemudian  dibandingkan  dengan  nilai  IC 50 larutan  standar  vitamin  C  yang  dihitung dari  interpolasi  pada  grafik  hubungan antara  konsentrasi  vitamin  C  dan  daya antioksidan. Nilai IC 50 merupakan konsentrasi  penghambatan  50%  terhadap radikal  bebas  DPPH  dari  senyawa  ekstrak daun Kayu bulan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Identifikasi Sampel
Identifikasi  sampel  daun  Kayu  bulan dilakukan  di  Laboratorium  Taksonomi Tumbuhan Program Studi Biologi Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas Sam Ratulangi Manado. Tujuan  dilakukan  identifikasi  sampel adalah  untuk  membuktikan  kebenaran sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian ini benar merupakan tumbuhan daun Kayu bulan (Pisonia alba Span.).

## Preparasi Sampel
Sampel yang akan digunakan dibersihkan  dengan  menggunakan  air mengalir  lalu  dirajang  hingga  kecil kemudian  sampel  dikering  anginkan. Sampel  kering  tersebut dihaluskan  dengan menggunakan  blender.  Setelah  itu  serbuk yang  didapat  diayak,  tujuannya  agar ukuran  partikel  bersifat  homogen,  dimana homogenitas partikel ini merupakan parameter utama yang akan mempengaruhi
keseragaman  tahapan  ekstraksi  bahan aktif,  yang  tergantung  pada  kecepatan difusi  zat  aktif  serbuk  (simplisia)  menuju pelarut,  waktu  kontak  dan  kecepatan pelarut  melewati  bahan  serbuk  tanaman obat (Saifuddin, dkk, 2011)

## Ekstraksi Daun Kayu Bulan
Tujuan  utama  penggunaan  metode maserasi disebabkan karena sifat antioksidan  yang  tidak  tahan  panas  dan fungsinya untuk menyari senyawa metabolit sekunder. Akibat adanya
perendaman,  pelarut  akan  mempunyai
waktu  interaksi  yang  lebih  lama  dengan sampel, sehingga memungkinkan terjadinya  proses  pemecahan  dinding  dan membran sel sampel. Hal ini terjadi karena perbedaan tekanan antara bagian dalam sel dan  luar  sel  sehingga  senyawa  metabolit sekunder  yang  ada  didalam  sitoplasma akan  keluar  dan  terlarut  dalam  pelarut organik.  Pada  proses  ini  digunakan  media kaca  karena  kaca  merupakan  media  yang tahan terhadap reaksi kimia sehingga tidak membuat  ekstrak  mudah  terkontaminasi (Tobo F, dkk, 2001).
Gambar 5. Rendemen hasil ekstraksi
Hasil  rendemen  yang  didapatkan  dari ekstraksi  maserasi  dengan  pelarut  etanol dapat  dilihat  pada  gambar  5  dan  lampiran 1.  Rendemen  yang  dihasilkan  dari  pelarut etanol  dengan  konsentrasi  80%  lebih banyak,  dibandingkan  dengan  pelarut etanol  40%.  Rendemen  pada  konsentrasi etanol  60  %  tidak  berbeda  jauh  dengan etanol 80%, sehingga warna yang dihasilkan  yaitu  hijau  pekat  untuk  ekstrak 80%  dan  hijau  agak  kekuningan  untuk ekstrak  60%.  Etanol  80%  diduga  dapat melarutkan  senyawa  fitokimia  secara maksimal  dan  mampu    menarik  beberapa senyawa fitokimia seperti alkaloid, flavonoid, glikosida flavonoid serta klorofil yang terlarut dalam pelarut polar. Senyawa-senyawa yang diekstrak oleh pelarut etanol 80% cukup banyak dan
menghasilkan  rendemen  yang  tinggi.  Hal ini  didukung  oleh  ekstrak  yang  berwarna hijau  pekat  dan  bau  rendemen  yang  tajam sehingga  diduga  bahwa  minyak  atsiri juga ikut terlarut (Melodita, 2011).
Berbeda dengan rendamen dari ekstrak  etanol  40%  dan  60%  yang cenderung  lebih  berwarna  kuning  dari pada hijau dan terjadi penurunan rendemen yang  cukup  banyak.  Rendemen  yang dihasilkan  merupakan  jumlah  senyawa yang  terekstrak  oleh  berbagai  macam pelarut  dengan  tingkat  kepolaran  yang berbeda (Syahbirini, dkk, 2005).

## Skrining Fitokimia
Hasil  uji  skrining  fitokimia  ekstrak daun  Kayu  bulan  dengan  konsentrasi  40,
8.00% 8.20% 8.40% 8.60% 8.80% 9.00% EE 40% EE 60% EE 80% Rendem en (%) Sampe l 8.89% 8.82% 8.89% 8.41%
60 dan 80 % menunjukkan bahwa terdapat senyawa bioaktif yaitu,
alkaloid,
flavonoid,  tanin,  dan  saponin  (lihat  tabel 1).
Tabel 1. Uji fitokimia Ekstrak Etanol Daun Kayu Bulan
UJI FITOKIMIA 40% 60% 80% INDIKATOR Alkaloid - + +++ Terbentuk endapan merah Flavonoid ++ ++ +++ Perubahan warna menjadi hitam kemerahan Tanin ++ ++ ++ Perubahan warna hitam kehijauan/kuning Steroid/Terpenoid - - - Tidak terjadi perubahan warna Saponin + ++ +++ Terbentuk busa yang stabil Keterangan : (+++)   = Kuat (++) = Sedang (+) = Lemah (-) = Tidak mengandung senyawa yang dimaksud Alkaloid Pada  pengujian  alkaloid,  yang  positif mengandung alkaloid hanya pada konsentrasi  ekstrak 60% dan  80%. Prinsip dari  metode  analisis  ini  adalah  reaksi pengendapan  yang  terjadi  karena  adanya penggantian  ligan.  Atom  nitrogen  yang mempunyai  pasangan  elektron  bebas  pada alkaloid  dapat  mengganti  ion  iodo  dalam pereaksi Wagner .    Pereaksi Wagner mengandung  kalium  iodida  dan    merkuri klorida  kalium  tetraiodomerkurat  (II). Namun  menurut  Sastroamidjojo  (1996), metode    ini  memiliki  kelemahan  yaitu pereaksi-  pereaksi  tersebut  bukan  hanya mengendapkan  alkaloid  tetapi  juga  dapat mengendapkan  beberapa  jenis  senyawa lain  seperti,  protein,  kumarin,    α-piron, hidroksi flavon, dan tanin.
Hasil  negatif  pada  ekstrak  etanol  40% disebabkan  karena  kandungan  ekstrak yang lebih banyak mengandung pelarut air dari  pada  etanol.  Salah  satu  sifat  dari alkaloid yaitu tidak larut dalam air (Fengel dan Wegener, 1984).

## Flavonoid
Flavonoid  merupakan  senyawa  polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil.  Oleh  karena  itu,  umumnya
flavonoid  larut dalam pelarut  polar seperti etanol. Etanol berfungsi sebagai pembebas flavonoid dari bentuk garamnya. Penambahan  asam  sulfat  2  N  berfungsi untuk protonasi flavonoid hingga terbentuk garam flavonoid. Setelah penambahan  bubuk  magnesium,  hasil positif  ditunjukkan  dengan  perubahan warna  larutan  menjadi  hitam  kemerahan. Warna  hitam  kemerahan  yang  dihasilkan menandakan  adanya  flavonoid  akibat  dari reduksi  oleh  asam  klorida  pekat  dan magnesium (Harborne, 1987).

## Saponin
Pada  hasil  uji  saponin,  masing-masing sampel  menunjukan  hasil  yang  positif yakni memiliki busa yang stabil selama 10 menit. Saponin merupakan bentuk glikosida  dari  sapogenin  sehingga  akan bersifat  polar.  Saponin  adalah  senyawa yang  bersifat  aktif  permukaan  dan  dapat menimbulkan  busa  jika  dikocok  dalam  air (Kristanti  dkk,  2008).  Timbulnya  busa pada  uji  saponin  menunjukkan  adanya glikosida  yang  mempunyai  kemampuan untuk  membentuk  buih  dalam  air  yang terhidrolisis menjadi  glukosa dan senyawa lainnya (Marliana dkk, 2005).

## Steroid
Pada  pengujian  ini  hasil  yang  diperoleh negatif  karena  tidak  adanya  reaksi  yang terjadi.  Pada  pengujian  steroid  dan triterpenoid,  analisis  senyawa  didasarkan pada kemampuan senyawa tersebut membentuk  warna  dengan  H 2 SO 4 pekat dalam pelarut asam asetat anhidrat (Ciulei, 1984).

## Tanin
Tanin  dibagi  menjadi  dua  golongan  dan masing-masing golongan memberikan reaksi warna  yang berbeda terhadap FeCl 3 1%.  Golongan  tannin  terhidrolisis  akan menghasilkan  warna  biru  kehitaman  dan tannin  kondensasi  akan  menghasilkan warna hijau kehitaman. Pada saat penambahannya, diperkirakan FeC1 3 bereaksi dengan salah satu gugus hidroksil yang  ada  pada  senyawa  tannin.  Hasil reaksi  itulah  yang  akhirnya  menimbulkan warna.  Pereaksi  FeCl 3 digunakan  secara luas untuk mengidentifikasi senyawa fenol termasuk  tannin.  Oleh  sebab  itu,  diduga bahwa  hasil  positif  juga  dapat  disebabkan oleh  adanya  senyawa  fenolik  lain  dalam sampel (Harborne, 1987).

## Penentuan Kandungan Total Fenolik
Berdasarkan  uji  fitokimia  kandungan ekstrak  daun  Kayu  bulan,  maka  dapat diketahui  kandungan  yang  terdapat  dalam ekstrak  dengan  konsentrasi  etanol  40,  60 dan  80%  yaitu  flavonoid,  alkaloid,  tanin dan  saponin.  Flavonoid  dalam  ekstrak daun  Kayu  bulan  diduga  berupa  aglikon maupun  glikosida.  Aglikon  umumnya mempunyai daya antioksidan dan penangkap  radikal  lebih  tinggi  daripada glikosida  flavonoid.  Hal  ini  disebabkan karena  pada  glikosida  flavonoid  gugus hidroksi  fenolik  yang  merupakan  gugus aktif  antioksidan  maupun  penangkap radikal telah mengikat gugus gula flavonoid  dan  derivat  polifenol  yang merupakan senyawa yang berfungsi sebagai  antioksidan.  Senyawa  tersebut adalah  senyawa-senyawa  fenol,  yakni senyawa  dengan  suatu  gugus  –OH  yang
terikat  pada  karbon  cincin  aromatik. Produk radikal bebas senyawa-senyawa ini stabil  secara  resonansi  dan  tidak  reaktif jika  dibandingkan  dengan  kebanyakan radikal bebas lain, sehingga dapat berfungsi  sebagai  antioksidan  yang  efektif (Fessenden dan Fessenden, 1994) Berdasarkan  hasil  pengukuran,  kadar total fenol dapat dilihat pada gambar 7 dan lampiran  2.  Pengujian  aktivitas  total  fenol merupakan  dasar  dilakukannya  pengujian aktivitas  antioksidan,  karena  diketahui bahwa  senyawa  fenolik  berperan  dalam mencegah  terjadinya  peristiwa  oksidasi. Pengukuran total antioksidan bahan pangan  asal  tanaman  dapat  dilakukan dengan  mengukur  kadar  total  fenolik menggunakan  reagen Folin-ciocalteau . Hal  ini  disebabkan  karena  sebagian  besar antioksidan  dalam  bahan  asal  tanaman merupakan senyawa polifenol.
Menurut  Shahidi  dan  Marian  (1995) pengujian  total  fenol  bertujuan  untuk menentukan  total  senyawa  fenolik  yang terkandung  di  dalam  sampel,  sehingga diduga bila kandungan senyawa fenolik di dalam  sampel  tinggi  maka  aktivitas antioksidannya  akan  tinggi.  Dari  hasil ekstrak  etanol  konsentrasi  1000  ppm pengukuran  yang  didapat  menunjukkan adanya peningkatan yang cukup signifikan.
Diduga  dengan  adanya  peningkatan total fenol maka terdapat aktivitas antioksidan  yang berlangsung.  Kandungan total  fenol  dapat  dihasilkan  dari  sejumlah molekul  sederhana  yaitu  senyawa  fenolik, sampai  dengan  molekul  yang  kompleks (Stevi G. dkk, 2012). Hal ini menunjukkan adanya  senyawa-senyawa  fenolik  pada ekstrak  daun  Kayu  bulan.  Akan  tetapi kandungan  total  fenol  tidak  berkorelasi positif  dengan  aktivitas  antioksidan  yang terdapat  dalam  ekstrak  daun  Kayu  bulan. Tidak semua senyawa fenol yang diekstrak dalam  pelarut  etanol  merupakan  senyawa fenol  yang  dapat  berfungsi  sebagai antioksidan  ( Fessenden dan Fessenden, 1994).
Pengujian Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH
Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak daun Kayu bulan ini menggunakan radikal bebas 1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazil (DPPH). Pengukuran antioksidan dengan metode DPPH
merupakan metode pengukuran antioksidan  yang  sederhana,  cepat  dan tidak  membutuhkan  banyak  reagen  seperti halnya  metode  lain.  Hasil  pengukuran dengan metode DPPH menunjukkan kemampuan  antioksidan  sampel  secara umum,  tidak  berdasarkan  jenis  radikal yang dihambat (Juniarti, dkk . , 2009).
Konsentrasi  ekstrak  sampel  daun Kayu  bulan yang  digunakan  adalah  50, 100,  150,  200,  250,  500    dan  550  ppm. Masing-masing  konsentrasi  dipipet  1  mL
dan  dicampurkan  dengan  1  mL  larutan DPPH  100  μM.  Campuran  tersebut diinkubasi  selama  30  menit  pada  tempat gelap,  kemudian  diukur  absorbansinya dengan  menggunakan  spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum (520 nm). Pada tiap konsentrasi  dilakukan  2  kali  pengulangan, vitamin  C  (asam  askorbat)  digunakan sebagai pembanding dengan konsentrasi 2,
4, 6, 8, 10, 12 dan 14 ppm.
Nilai konsentrasi penghambatan aktivitas  radikal  bebas  sebanyak  50% (IC 50 )  dihitung  dengan  menggunakan persamaan  regresi  yang  diperoleh  dari hubungan  antara  konsentrasi  sampel  dan persentase  penghambatan  aktivitas  radikal bebas.
Tabel 2. Perbandingan IC 50 ekstrak etanol 40%, 60%, 80% dan Vitamin C. Ekstrak Persamaan Grafik Nilai IC50 Ekstrak Etanol 80% y = 0.1493x + 14.691 R² = 0.9945 236.497 Ekstrak Etanol 60% y = 0.0812x + 11.177 R² = 0.9834 478.116 Ekstrak Etanol 40% y = 0.0775x + 7.8057 R² = 0.9704 544.443 Vitamin C y = 4.1534x - 3.6429 R² = 0.9799 11.161
Prinsip  metode  penangkapan  radikal ialah  pengukuran  penangkapan  radikal bebas  dalam pelarut organik  polar seperti etanol atau metanol pada suhu kamar oleh suatu  senyawa  yang  mempunyai  aktivitas antioksidan (Pokorny, 2001). Proses penangkapan radikal ini melalui mekanisme  pengambilan  atom  hidrogen dari  senyawa  antioksidan  oleh  radikal bebas  (Pire,  Stanley,  1988)  sehingga radikal  bebas  menangkap  satu  elektron dari  antioksidan.  Senyawa  DPPH  bereaksi dengan  senyawa  antioksidan  melalui pengambilan  atom  hidrogen  dari  senyawa antioksidan  untuk  mendapatkan  pasangan elektron (Pokorny, 2001).
Panjang gelombang serapan maksimum  (λ  maks)  DPPH  yang didapatkan dalam penelitian ini adalah 520 nm.  Dengan  digunakan operating  time selama  30  menit.  Sempurnanya  campuran DPPH  dan  ekstrak  dibantu  dengan perlakuan Ultra sonic selama 2 menit  tiap sampel.  Senyawa  yang  bereaksi  sebagai penangkap  radikal  akan  mereduksi  DPPH yang  dapat  diamati  dengan  adanya perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning.  Ketika  elektron  ganjil  dari  radikal DPPH  telah  berpasangan  dengan  hidrogen dari  senyawa  penangkap  radikal  bebas maka akan membentuk DPPH-H tereduksi (Molyneux, 2004).
Oleh  karena  terjadinya  reaksi  fenol dan  DPPH  (Gambar  9),  maka  radikal bebas  DPPH  akan  membentuk  senyawa bukan  radikal  yaitu  DPPH  idrazin  yang stabil  (Windono,  2001).  Perhitungan  yang digunakan  dalam  penentuan  aktivitas penangkap  radikal  adalah  nilai  IC 50 .  Nilai tersebut menggambarkan besarnya konsentrasi  senyawa  uji  yang  dapat menangkap radikal sebesar 50%. Nilai IC 50 diperoleh dengan menggunakan persamaan regresi  linier  yang    menyatakan  hubungan antara  konsentrasi  sampel  (senyawa  uji) dengan  aktivitas  penangkap  radikal  rata- rata.  Semakin  kecil  nilai  IC 50 maka senyawa  uji  tersebut  akan  semakin  efektif sebagai penangkap radikal. Hasil penelitian  menunjukkan  ekstrak  etanol memiliki  nilai  IC 50 544.51  g/mL,  477.99 g/mL,  236.50  g/mL  untuk  konsentrasi  40, 60 dan 80%.
Hasil  ini  sejalan  dengan  kandungan total  fenol  yang  menunjukkan  ekstraksi 80%  memiliki  kandungan  yang  lebih tinggi  daripada  ekstrak  lain.  Ekstrak menunjukan  kadar  fenol  yang  tinggi namun  aktivitas  antioksidannya  rendah. Diduga  fraksi  ini  banyak  mengandung klorofil  atau  lignin  karena  tidak  semua senyawa  fenol  yang  diekstrak  dalam pelarut  alkohol  merupakan  senyawa  fenol yang  dapat  berfungsi  sebagai  antioksidan. Contohnya  saja  lignin  yang  berfungsi sebagai  bahan  pembentuk  dinding  sel tanaman juga merupakan senyawa golongan  fenol  yang  fungsinya  sebagai antioksidan  belum  diketahui  (Maulida.  R. 2007).
Perubahan  warna  ungu  menjadi kuning  pada  uji  aktivitas  antioksidan menandakan terbentuknya radikal antioksidan.  Semakin  banyak  atom  H  dari antioksidan  yang  didonorkan  pada  DPPH maka  semakin  banyak  radikal  antioksidan yang terbentuk (Suryanto, 2012)
Vitamin C sebagai senyawa pembanding  memiliki  nilai  IC 50 11.161 g/mL (Tabel 2). Nilai IC 50 vitamin C lebih kecil  dibanding  dengan  nilai  IC 50 ekstrak etanol  80%  daun  Kayu  bulan  karena
merupakan senyawa yang murni dibandingkan  dengan  ekstrak  dengan konsentrasi  40%  dan  60%.  Molekul vitamin  C  mempunyai  2  tempat  abstraksi hidrogen  yang  terhubung  secara  internal, sehingga  ada  abstraksi  lanjutan  setelah abstraksi pertama . Jika dibandingkan dengan  IC 50 vitamin  C,  maka  senyawa ekstraksi cukup berpotensi sebagai antioksidan.  Vitamin  C  memiliki  aktivitas antioksidan  yang  tinggi  karena  vitamin  C memiliki 2 gugus hidroksil yang mengakibatkan lebih mudah dalam pendonoran hidrogen.
Menurut Sudarmadji  (1996),  vitamin  C  sebagai antioksidan  dapat  memberikan  satu  atau dua elektronnya untuk menstabilkan radikal bebas.

## PENUTUP Kesimpulan
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan :
a. Daun  Kayu  bulan  ( Pisonia  alba Span.) memiliki aktivitas antioksidan yang kecil  tapi  cukup  baik  dalam  menangkal radikal bebas pada metode DPPH. Ekstrak etanol 80% menunjukkan aktivitas antioksidan  yang  paling  baik  dengan  nilai aktivitas  IC 50 236.50  g/mL,  sedangkan etanol  60%  bernilai  477.99  g/mL  dan etanol 40% bernilai 544.51 g/mL.
b. Daun  Kayu  bulan  ( Pisonia  alba Span.)  mengandung  fenolik  yang  cukup tinggi  yaitu  12.45,  16.22,  28.67  mg GAE/gr  untuk  konsentrasi  ekstrak  40,  60 dan 80%.
c. Pada skrining fitokimia daun Kayu bulan  mempunyai  kandungan  metabolit sekunder  yaitu  alkaloid,  flavonoid,  tannin dan saponin.

## Saran
Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut  terhadap  uji  antioksidan  ekstrak daun  Kayu  bulan  dengan  menggunakan metode uji antioksidan yang lain contohnya FRAP sehingga dapat diperoleh hasil  yang  maksimal  pada  pengujian antioksidan  dan  dapat  diuji  aktivitas
biologis  lainya  oleh  karena  masih  banyak khasiat  dari  daun  Kayu  bulan  yang  belum diketahui.

## DAFTAR PUSTAKA
Aruoma  O.I.  1994. Free  radicals  and antioxidant  strategies  in  sports. J Nutr Biochem 5:  370 - 381
Biradar,  Y.S.  2010. TLC  Densitometric Quantification of Vasicine, Vasicinone and Embelin from Adhatoda  zeylanica  Leaves  and Embelia ribes Fruits (Tesis).Halaman: 140.
Ciulei, J. 1984. Metodology for Analysis of vegetable  and  Drugs.B Faculty  of Pharmacy. pp 11-26.
Conde,  E.E.,  M.C.  Cadahia,  G.  Vallejo, B.F.D.  Simon  Dan  J.R.G.  Adrados. 1997. Low Molecular Weight Polyphenol  in  Cork  Oh  Querceus
Suber. J.  Agric.  Food  Chem . 45 :2695-2700.
Depkes  RI.  2000. Parameter  Standar Umum  Ekstrak  Tumbuhan  Obat . Cetakan  Pertama.  Jakarta  :  Depkes RI. Hal. 10-11.
Devasagayam TPA, Tilak JC, Boloor KK, Sane  KS,  Ghaskadbi  SS,  Lele  RD. 2004. Free Radical  and antioxidant in human health: Current status and future  prospect. JAPI 52(10):794- 804.
Fengel,  D.,  Wegener,  G.  1984.  Kayu  : Kimia, Ultrastruktur, Reaksi- Reaksi,  Terjemahan  oleh  Hardjono
Sastrohamidjojo, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta
Fessenden,  R  .J  dan  Fessenden,  J.  S  . 1986. Kimia  Organik.  Edisi  Ketiga . Jilid 2. Erlangga.
Gordon  I.  1994. Functional  Food,  Food Design,  Pharmafood .  New  York: Champman dan Hall.
Harborne,  J.B.  1987. Metode  Fitokimia , Penerbit ITB : Bandung.
Hatam  F.  2013.  Aktivitas  Antioksidan Dari  Ekstrak  Kulit  Nanas  ( Ananas Comosus (L)  Merr). Pharmacon
Jurnal  Ilmiah  Farmasi  F-Mipa Unsrat. 2 : 9-12. Hembing, WK. 1994. Tanaman Berkhasiat
Obat  Indonesia.  Jilid  3 .  Pustaka Kartini. Jakarta. Kardono, L.B.S., N. Artanti, I.D.
Dewiyanti, T. Basuki. 2003. Selected Indonesian medicinal plants. Monographs  and Descriptions.  Vol.
1. Gramedia Widiasarana Indonesia, Jakarta.hlm. 42-55.
Kristianti,  A.  N,  N.  S.  Aminah,  M. Tanjung,  B.  Kurniadi.  2008. Buku Ajar  Fitokimia. Surabaya:  Jurusan
Kimia Laboratorium Kimia Organik FMIPA Universitas Airlangga.
P. 47-48.
Ketaren,  S.  1986. Pengantar  Teknologi
Minyak dan Lemak Pangan . Cetakan  Pertama.  Jakarta  :  UI- Press.
Kikuzaki,  Nakatani.  1993  . Antioxidant effects of some ginger  constituents .
J. Food Science.
Juniarti, O.D., Yuhernita. 2009.
Kandungan  senyawa  kimia,  uji toksisitas  (BSLT)  dan  antioksidan (1,1-diphenyl-2-pikrilhydrazyl)  dari ekstrak  daun  saga .  Makara  Sains.
13(1) :50-54. Lapornik,  B.,Prosek,  M., Wondra,  A.G.  2005.
Comparison  of  Extracts  P r e p a r e d f r o m   P l a n t   b y – P r o d u c t s   Using Different Solvent and Ekstraktion
Time. Journal of FoodEngineering.
Marliana,  S.  D.,  V.  Suryanti,  Suyono. 2005. Skrining Fitokimia dan Analisis  Kromatografi  Lapis  Tipis Komponen  Kimia  Buah  Labu  Siam (Sechium  edule  Jacq.  Swartz.) dalam  Ekstrak  Etanol. Biofarmasi,
3 (1). Pp. 26-31. Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB,
Bandung.
Muhilal.  1991.  Teori  radikal  bebas  dalam gizi  dan  kedokteran. Cermin  Dunia Kedokteran . 73 : 9-11.
Maulida  R.  2007. Aktivitas  Antioksidan
Rumpul  Laut  Caulerpa  lentillifera. SKRIPSI. Universitas Institut Pertanian Bogor. Melodita, R. 2011. Identifikasi Pendahuluan  Senyawa  Fitokimia dan Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Cincau Hitam Dengan  Perlakuan  Jenis  Pelarut. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian.  Universitas  Brawijaya.
Malang.
Murray,  R.K.  2003. Biokimia  Klinik  Edisi 4 .  EGC: Jakarta
Molyneux, P. 2004 . The Use Of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl    (DPPH) For Estimating Antioxidant
Activity. J.  Sci.  Technol. 26  (2) : 211-219.  Narins,  D.M.C.  1996. Vitamin  Dalam  Krause’s  Food,
Nutrition and Diet Therapy .
Mahlan, L.K, hal 110-114. Narins,  D.M.C.  1996. Vitamin  Dalam Krause’s  Food,  Nutrition  and  Diet Therapy . Mahlan, L.K, hal 110-114. Oeinitan,  J.  2013. Daya  Antioksidan Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis (Garcinia  mangostana  Linn.) Hasil Pengadukan  Dan  Reflux.  Jurnal
Ilmiah  Mahasiswa  Surabaya. 1(2) :
1-2.
Pire, Stanley, 1988. Kimia Organik 1 . ITB
: Bandung
Pokorny  JN,  MY  anishlieva,  Gordon.
2001.Antioxidants  in  Food.Boca Raton Boston
New York Washington, DC:CRC Press. Rizvi,  S.J.H.,  V.Rizvi  .2008. Thin  Layer Chromatography in Phytochemistry , CRC Press. Page.60-66
Shadmani,  A.,  Azhar,  I.,  Mazhar,  F., Hassan, M.M., Ahmed, S.W., Ahmad,  I.,  Usmanghani,  K.,  and
Shamin,  S.  2004.  Kinetic  Studies On  Zingiber  Officinale. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences , Vol. 17 , hal. 47-54.
Syahbirini,  G;  I.  Batubara,  T.  Setiawati dan  L.  Nulhakim.  2005.  Senyawa
aktif  daun  picung  (Pangium  edule Reinw)  sebagai  insektisida  botani terhadap  ulat  grapyak  (Spodoptera litura  F)  (Lepidoptera  noctuida). Prosiding  Simposium    Nasional Kimia  Bahan  alam  XV .  Dep.Kimia, F.MIPA,IPB-HKBA, Bogor: 56-66. Sastrohamidjojo. H . 1996. Sintesis Bahan alam , Cetakan ke-1, Liberty,
Yogyakarta Saifuddin. 2010. Metode Penelitian . Yogyakarta: Pustaka Pelajar Offset. Sudarmadji,  S.,  Bambang  Haryono  dan Suhardi.  1996. Analisa  Bahan Makanan  dan  Pertanian .  Librty.
Yogyakarta.
Schetman,  G.  1989. The  Influence  of Smoking  on  Vitamin  C  Status  In Adult. Am.  J.  Public  Health. 79 : 158-162.
Shahidi,  F.  and  N.  Marian.  1995.  Food
Phenolics, Sources Chemistry Effects  Applications  Technomic Publ., Lancaster, Basel.
Scott  H.,  Jonathan  P.,  Mary  H.,  John  W.,
Ming  Qian.  2002.  Free    Radicals Scavenging  Properties  of  Wheat Extracts. J.Agric Food Chem . Suryanto E. 2012. Fitokimia Antioksidan .
Putra Media Nusantara, Surabaya.
Steenis,  C  .  1978. Flora .  Paradnya
Paramita. Jakarta.
Stevi G. Dungira., Dewa G. Katja., Vanda
S. Kamu. 2012. Aktivitas Antioksidan  Ekstrak  Fenolik  Dari Buah Manggis ( Garcinia mongostana L). Jurnal MIPA
ONLINE 1  (1) 11  –  15  .  UNSRAT Manado.
Takashi  Miyake,  Takayumi  Shibamoto.
1997. Antioxidant  Activities  of
Natural Compound Found in Plants .  J.  Agric.  Food.  Chem.  45.
1819-1822. Yu, Liangli.
Taylor,  A.  1993. Relationships  Between Nutrition  and  Oxidation. J.  Am. Coll. Nutr. 12 , 138-146. Tobo,  F,.Mufidah,  Taebe,  B.,  Mahmud, A.I. 2001. Buku Pegangan
Laboratorium Fitokimia I , UNHAS, Makassar, 1, 83.
Tomas-Barberán,  F.  A.,  Cienfuegos- Jovellanos, E., Marín, A., Muguerza,  B.,  Gil-Izquierdo,  A.,
Cerdá,  B.,  Zafrilla,  P.,  Morillas,  J., Mulero,  J.,  Ibarra,  A.,  Pasamar,  M. A., Ramón, D., & Espín, J. C. 2007. A New Process To Developa Cocoa Powder  with  Higher  Flavonoid Monomer  Content  and  Enhanced Bioavailability  in  Healthy  Humans.
J  Agric  Food  Chem, 55 (10) ,  3926- 3935.
Vallisuta,  O.  (2012 ).  Drug  Discovery Research in Pharmacognosy.
Shanghai : InTech. P. 30-32.
Yuliastuti  I.,  Jumina.  2002. “  Pemodelan dan  Sintesis  Senyawa  Penyerap Sinar  UV  3,4-Dimetoksi  Heksil Sinamat  Berdasarkan  Pendekatan
KimiaKomputasi.” Proceeding Seminar Nasional , FMIPA Universitas Negeri Yogyakarta. Windono, T., Soediman, S., Yudawati, U., Ermawati, E., Srielita, Erowati, T. I. Uji Peredam Radikal Bebas terhadap 1,1-Diphenyl-2- Picrylhydrazyl (DPPH) dari Ekstrak Kulit  Buah  dan  Biji  Anggur  (Vitis viniferaL.)  Probolinggo  Biru  dan Bali.  Artocarpus.  2001, 1 :  34-43