Abstrak — Liofilisasi  adalah  teknik  konservasi  dengan  proses sublimasi  cepat  dalam  kondisi  vakum  yang  dapat  diterapkan untuk produksi biofertilizer komersial. Liofilisasi menghasilkan produk  bakteri  kering  yang  stabil  secara  struktur,  viabilitas bakteri  yang  tinggi  pada  penyimpanan  lama  dan  mudah ditransportasikan. Salah satu tahapan penting dalam liofilisasi adalah  kultur  bakteri  dan  agen  lioprotektan  yang  menjaga viabilitas  sel  selama  penyimpanan.  Tujuan  studi  literatur  ini adalah  untuk  mencari  medium  pertumbuhan  alternatif  yang ekonomis,  serta  mencari  agen  lioprotektan  terbaik.  Data  dari jurnal, prosiding dan laporan penelitian, disusun dan dianalisis secara  deskriptif.  Hasil  studi  literatur  menunjukkan  bahwa lentil  hitam  (Vigna  mungo),  kacang  hijau  (Vigna  radiata), splitpea  yellow  (Pisum  sativum),  kacang  tunggak  (Vigna unguiculata),  ubi  kuning  (Ipomea  batatas)  dan  ubi  ungu (Dioscorea  alata)  mampu  menjadi  medium  alternatif  sumber nutrisi. Jumlah pertumbuhan bakteri di medium tersebut lebih banyak  daripada  medium  paten  nutrient  broth  dan  nutrient agar.  Sedangkan  agen  lioprotektan  terbaik  adalah  sukrosa  5- 10% dan skim milk 10-20% untuk sel tidak terimobilisasi atau skim milk 6-10% untuk sel terimobilisasi.
Kata  Kunci—Agen  Lioprotektan,  Biofertilizer,  Liofilisasi, Preservasi Sel.

## I. PENDAHULUAN
IOFILISASI  atau freeze  drying merupakan  teknik pengeringan  beku  yang  dilakukan  secara  cepat  melalui sublimasi  dalam  kondisi  vakum  [1].  Liofilisasi  diketahui telah  banyak  diaplikasikan  pada  berbagai  macam  industri, seperti  industri  farmasi  dan  industri  pangan.  Di  industri farmasi,  untuk  pembuatan  obat,  antibiotik  dan  vaksin, sedangkan di industri pangan untuk mempreservasi makanan [2]. Selain itu, teknik liofilisasi juga berpotensi untuk industri pertanian,  seperti  untuk  pembuatan  biofertilizer.  Teknik  ini dapat  mengeringkan  bakteri  dalam  biofertilizer  dengan struktur  dan  stabilitas  yang  tetap  terjaga,  walau  disimpan lama.  Bakteri kering  ini  mudah  ditransportasikan  dan  dapat dihidupkan kembali [3].
Namun  teknik  liofilisasi  memiliki  beberapa  kekurangan, yaitu antara lain biaya alat dan operasional yang mahal, serta dapat  menyebabkan  kerusakan  struktur  protein  sel.  Untuk mengurangi kerusakan struktur sel ini, maka dibutuhkan agen lioprotektan  sebagai  pelindung  sel  [2].  Selain  itu,  agen lioprotektan  pada  bakteri  juga  berfungsi  untuk  mengurangi terbentuknya  es  kristal  pada  bagian  dalam  maupun  luar  sel [4].
Salah  satu  tahapan  penting  dalam  teknik  liofilisasi  untuk bakteri adalah pembiakan bakteri pada medium pertumbuhan yang  dapat  membuat  bakteri  tumbuh  optimal  dan penambahan  senyawa  lioprotektan  untuk  menjaga  sel  agar tetap bertahan hidup selama penyimpanan.
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  melakukan  studi literatur tentang medium pertumbuhan bakteri alternatif yang bernilai ekonomis dan agen lioprotektan terbaik untuk bakteri tanah.

## II. METODOLOGI

## A. Waktu dan Tempat Penelitian
Selama  masa  pandemi  global  virus  Corona  19  ada kebijakan  Pemerintah  secara  nasional  untuk  belajar  dan bekerja di rumah, sehingga studi literatur ini pun dilakukan di rumah pada bulan Februari 2021 hingga Mei 2021.

## B. Jenis Penelitian
Penelitian  ini  merupakan  jenis  penelitian  studi  literatur dengan  memperoleh  data-data  melalui  sumber  pustaka  atau dokumen.  Studi  literatur  merupakan  penelitian  yang mengkaji  atau  meninjau  secara  kritis  pengetahuan,  gagasan atau  temuan  yang  terdapat  di  dalam  literatur  berorientasi akademik,  serta  merumuskan  kontribusi  teoritis  dan metodologisnya untuk topik tertentu [5].

## C. Sumber Data
Sumber  data  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  berupa buku,  jurnal  dan  review  mengenai,  pengertian biofertilizer dan peranannya; prinsip kerja, mekanisme, dan viabilitas sel bakteri  pada  preservasi  liofilisasi;  faktor-faktor  yang mempengaruhi  preservasi  liofilisasi; jenis-jenis dan mekanisme  kerja  agen lioprotektan;  agen  lioprotektan  yang digunakan pada genus bakteri Pseudomonas sp., Bacillus sp., Rhizobium sp., Azotobacter sp.  dan Azospirillum sp.; kandungan  media  pertumbuhan  bakteri;  dan  media pertumbuhan bakteri alternatif yang bernilai ekonomis.

## D. Analisa Data
Data  yang  telah  dipublikasi  di  jurnal,  prosiding  atau laporan penelitian, disusun dan dianalisa secara deskriptif.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Kebutuhan Nutrisi Mikroorganisme
Nutrisi  merupakan  hal  yang  penting  untuk  kebutuhan fisiologi  mikroorganisme.  Setiap  mikroorganisme  memiliki kebutuhan  nutrisi  dengan  kadar  yang  berbeda-beda.  Nutrisi utama  yang  dibutuhkan  oleh  mikroorganisme  berupa makronutrisi,  mikronutrisi,  vitamin  dan  mineral  [6]. Makronutrisi  merupakan  nutrisi  yang  dibutuhkan  dalam jumlah yang relatif besar, seperti karbon (C), hidrogen (H), oksigen (O) nitrogen (N), fosfor (P), belerang (S), potasium (K), magnesium (Mg), kalsium (Ca), dan natrium (Na) [7].
Mikronutrisi  adalah  senyawa  yang  dibutuhkan  oleh mikroorganisme dalam jumlah yang lebih kecil dibandingkan

## L

## Studi Literatur Tentang Teknik Liofilisasi untuk Preservasi Bakteri
Shifa Syafira Rachmat dan Maya Shovitri Departemen Biologi, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) email : maya@bio.its.ac.id
dengan makronutrisi dan berperan dalam mendukung fungsi enzim  serta  pemeliharaan  struktur  protein  [8].  Mikronutrisi terbagi  menjadi trace  element dan growth  factor.  Trace element berfungsi  sebagai  kofaktor  enzim  seperti  besi  (Fe), mangan  (Mn),  tembaga  (Cu),  koblat  (Co),  seng  (Zn),  nikel (Ni),  dan  molibdenum  (Mo)  [9]. Growth  factor merupakan senyawa  organik  yang  tidak  dapat  disintesis  secara  spesifik dan  berperan  untuk  mendukung  pertumbuhan  suatu mikroorganisme  yang  terdiri  atas  asam  amino,  purin  dan pirimidin,  serta  vitamin  [6].  Tidak  semua  bakteri membutuhkan growth  factor seperti, E.  coli memiliki kemampuan untuk mensintesis seluruh purin, pirimidin, asam amino  dan  vitamin  esensial  sehingga  tidak  membutuhkan growth factor. Sedangkan Lactobacillus, Streptococcus, dan Leuconostoc membutuhkan growth factor sebagai pendukung pertumbuhannya [8].
B. Media Pertumbuhan Bakteri
Media buatan adalah campuran nutrien untuk menumbuhkan mikroorganisme. Media pertumbuhan mengandung air untuk menjaga kelembaban dan pertukaran zat; sumber makronutrisi dan mikronutrisi; keadaan tekanan osmotik  yang  seimbang;  derajat  keasaman  (pH)  yang umumnya  netral;  dan  steril  [10].  Setiap  media  memiliki kompleksitas kandungan yang berbeda-beda bergantung pada kebutuhan dan jenis mikoorganisme yang akan ditumbuhkan [11] .
Media dapat diklasifikasikan berdasarkan tiga kelas yaitu, bentuk  fisik,  komposisi  kimia  dan  tipe  fungsional.
Berdasarkan bentuk fisik, media terbagi menjadi media cair, media semi padat, dan media padat. Berdasarkan komposisi kimia, media terbagi menjadi media tertentu ( defined media ) dan  media  kaya  ( complex  media ) . Berdasarkan  tipe  fungsi yang  disesuaikan  dengan  tujuan  penggunaan  media,  ada media  untuk  isolasi  bakteri;  enumerasi  bakteri;  diferensiasi terhadap  kelompok-kelompok  bakteri;  menjaga  kultur  di dalam  lab;  serta  menentukan  biokimia  dan  karakteristik pertumbuhan bakteri [12].
Nutrient  agar dan nutrient  broth merupakan  contoh  dari complex  media .  Per  liter, nutrient  agar mengandung beef extract (3  g),  pepton  (5  g),  dan  agar  (15  g),  sedangkan nutrient broth mengandung beef extract (3 g) dan pepton (5 g)  tanpa  mengandung  agar.  Komposisi nutrient  agar dan nutrient  broth sebagai  media  pertumbuhan  bakteri  dapat disubstitusi  dengan  bahan  alternatif  yang  memiliki kandungan  nutrisi  yang  relatif  sama  dalam  mendukung pertumbuhan bakteri.
Hasil  studi  literatur  mengenai  bahan  alternatif  yang berpotensi untuk menggantikan nutrient broth pada Tabel 1 adalah  lentil  hitam  ( Vigna  mungo );  kacang  hijau  ( Vigna radiata ); dan splitpea yellow ( Pisum sativum ).  Sebanyak 2 gr  bahan  baku  media  direndam  semalaman  dalam  air sebanyak 20 ml dan kemudian disaring.
Berdasarkan  pertumbuhan  24  jam  bakteri,  terlihat  bahwa lentil  hitam  ( V.  mungo ),  kacang  hijau  ( V.  radiata )  dan splitpea yellow ( P. sativum ) lebih mendukung pertumbuhan bakteri genus Staphylococcus daripada media nutrient broth tertera pada Tabel 1. Pertumbuhan dapat mencapai kekeruhan
Tabel 1. Bahan media alternatif pengganti nutrient broth Bahan Media Genus Pertumbuhan Bakteri (OD) Media Alternatif Nutrient Broth Lentil hitam* ( V . mungo ) Staphylococcus 1,25 0,57 E. coli 0,62 0,77 Kacang hijau* ( V. radiata ) Staphylococcus 0,69 0,57 E. coli 0,47 0,77 Yellow Gram/splitpea yellow* ( P. sativum ) Staphylococcus 1,35 0,57 E. coli 1,02 0,77 *Pengolahan bahan baku media alternatif dengan perendaman Tabel 2. Bahan media alternatif pengganti nutrient agar Bahan Media Alternatif Genus Pertumbuhan Bakteri (CFU/ml) Media Alternatif Nutrient Agar Kacang Tunggak** ( V. unguiculata ) Klebsiella 4,8 x 10 5 2,4 x 10 5 Enterobacter 3,5 x 10 4 1,92 x 10 4 Ubi Kuning** ( I. batatas ) E. coli 2,84 x 10 7 1,71 x 10 7 Ubi Ungu** ( D. alata ) E. coli 1,73 x 10 7 1,71 x 10 7
**Pengolahan bahan baku media alternatif dengan perebusan
Tabel 3. Harga bahan baku media alternatif cair dibandingkan dengan nutrient broth Kuantitas Harga Media Lentil Hitam ( V. mungo ) Yellow Gram/Splitpea Yellow ( P. sativum ) Kacang Hijau ( V. radiata ) NB Per-kg Rp 83.000 Rp 45.000 Rp 30.000 Rp 3.600.000 Kebutuhan per-liter 100g/1000ml 100g/1000ml 100g/1000ml 13g/1000ml Produksi skala besar per-liter Rp 8.300 Rp 4.500 Rp 3.000 Rp 46.800 Tabel 4. Harga bahan baku media alternatif cair dibandingkan dengan nutrient agar Kuantitas Harga Media Kacang Tunggak ( V. unguiculata ) Ubi Kuning ( I. batatas ) Ubi Ungu ( D. alata ) NA Per-kg (Rp) Rp 40.000 Rp 11.500 Rp 15.000 Rp 3.300.000 Kebutuhan per-liter 30g/1000ml 300g/1000ml 300g/1000ml 28g/1000ml besar per-liter Rp 1.200 Rp 3.450 Rp 4.500 Rp 92.400
sel  pada  OD  600  nm  hingga  >  1,00  pada  media  alternatif tersebut.  Namun  pertumbuhan  bakteri E.  coli relatif  lebih rendah atau sama, bila menggunakan media alternatif. Hal ini menunjukkan  bahwa  pertumbuhan  dan  kelimpahan  bakteri bergantung  pada  makro  dan  mikro  nutrisi  yang  terkandung dalam media pertumbuhannya [13].
Lentil  hitam,  kacang  hijau  dan splitpea  yellow termasuk kedalam kelompok tanaman legum yang memiliki kandungan kaya akan protein dan karbohidrat. Kandungan protein pada lentil hitam sebesar 27,13 – 34,41%; kacang hijau 24 – 26% dan splitpea yellow 28%. Kandungan karbohidrat pada lentil hitam  sebesar  51,48  –  58,73%;  kacang  hijau  51%;  dan splitpea yellow 48% [14]. Kandungan protein dan karbohidrat yang  tinggi  dapat  berperan  dalam  memenuhi  kebutuhan makronutrisi C dan N bakteri [15].
Berdasarkan hasil studi literatur yang tertera pada Tabel 2, pembuatan media alternatif padat dapat menggunakan kacang tunggak  ( Vigna  unguiculata ),  ubi  kuning  ( Ipomea  batatas ) dan ubi ungu ( Dioscorea alata ). Pembuatan media alternatif padat berbahan baku kacang tunggak direbus terlebih dahulu sebanyak  2  g  dalam  100  ml  air.  Kemudian  biji  kacang dikeringkan  dan  ditumbuk  lalu  disaring  bertingkat  dengan kertas saring ukuran 2 mm dan ukuran 0,2 mm. Bubuk kacang yang  didapatkan  akan  digunakan  dalam  pembuatan  media alternatif [16]. Sedangkan media alternatif berbahan baku ubi kuning dan ubi ungu direbus sebanyak 30 g dalam 100 ml air dan  disaring.  Air  filtrat  rebusan  tersebut  digunakan  untuk pembuatan media alternatif [27].
Tabel  2  menunjukan  bahan  baku  kacang  tunggak  ( V. unguiculata ), ubi kuning ( I. batatas ) dan ubi ungu ( D. alata ) mampu  mendukung  pertumbuhan  bakteri  genus Klebsiella, Enterobacter, dan E.  coli yang lebih  tinggi  dari pertumbuhannya pada media nutrient agar. Berdasarkan data tersebut,  kacang  tunggak,  ubi  kuning  dan  ubi  ungu  diduga memiliki  makro  dan  mikro  nutrisi  yang  lebih  sesuai  untuk kebutuhan  pertumbuhan  mikroorganisme.  Kacang  tunggak, ubi kuning dan ubi ungu memiliki kandungan karbohidrat dan protein yang bervariasi. Kacang tunggak mengandung 25.38 –  27,56%  protein  dan  45,64  –  57,12%  karbohidrat.  Ubi kuning dan ubi ungu mengandung karbohidrat sebesar 14,86 – 38,92% dan 31,36 – 39,39%. Namun, kedua ubi tersebut memiliki kandungan protein yang rendah yaitu 1,97 – 4,09 % untuk  ubi  kuning  dan  1,05  –  1,81  untuk  ubi  ungu  [17]. Karbohidrat  dapat  menjadi  sumber  elemen  makro  karbon yang  dapat  mendukung  pertumbuhan  bakteri  untuk berproliferasi.  Sedangkan  kandungan  protein  berfungsi sebagai  sumber  makro  elemen  nitrogen  bagi  bakteri  [18]. Elemen  nitrogen  dibutuhkan  oleh  bakteri  untuk  proses sintesis  asam amino dan  nukleotida.  Selain karbohidrat dan protein,  bahan  baku  media  alternatif  tersebut  juga mengandung  beberapa  elemen  makronutrisi,  mikronutrisi, trace element dan vitamin lainnya [6].
Genus Klebsiella, E. coli, Staphylococcus , dan Enterobacter berhasil  ditumbuhkan  dengan  menggunakan media  alternatif  [16].  Selain  itu,  genus Azotobacter, Azospirillum, dan  bakteri  pelarut  fosfat  juga  berhasil  di tumbuhkan  pada  media  alternatif,  dimana  media  alternatif tersebut berhasil meningkatkan 10-100x pertumbuhan bakteri Azotobacter dan bakteri pelarut fosfat dibandingkan dengan menggunakan nutrient broth .
Pengolahan  bahan  baku  seperti  perendaman  dan perebusan,  terlaporkan  juga  dapat  mengurangi  nutrisi  yang terkandung  pada  media  alternatif  dan  mempengaruhi pertumbuhan  bakteri.  Bahan  baku  yang  diolah  dengan perendaman  dan  perebusan  akan  mengeluarkan  kandungan nutrisi  ke  dalam  air  olahan.  Legum  yang  dimasak  dengan perendaman kemudian dilanjutkan dengan perebusan hingga bertekstur halus mengalami penurunan kandungan karbohidrat  sebanyak  26,70  –  36,86%;  protein  14,78  – 21,83%;  dan  mineral  18,99  –  39,50%  [19].  Selain  itu,  ubi kuning yang direbus selama 20 menit mengalami penurunan kandungan karbohidrat sebanyak 9,32%; protein 0,65%; dan lemak 0,01% [20]. Penurunan kadar protein dan lemak akibat perebusan dapat terjadi karena adanya denaturasi protein dan kerusakan  struktur  lemak  yang  disebabkan  oleh  suhu  yang tinggi [21]. Pengurangan kandungan nutrisi pada suatu bahan juga dapat dipengaruhi oleh lama waktu pengolahan.
Walaupun  kandungan  bahan  baku  media  alternatif mengalami  reduksi  nutrisi,  bahan-bahan  tersebut  tetap memiliki  kemampuan  untuk  menumbuhkan  bakteri  dengan angka  pertumbuhan  bakteri  yang  lebih  tinggi  dari  media nutrient broth dan nutrient agar seperti yang ditunjukan oleh Tabel 1 dan Tabel 2.
Konsentrasi agar yang digunakan dalam pembuatan media alternatif padat juga menjadi pertimbangan untuk mendukung pertumbuhan  bakteri.  Konsentrasi  agar  yang  digunakan dalam  pembuatan  media  dapat  mempengaruhi  tingkat kepadatan media yang berpengaruh pada difusi oksigen dan laju  pertumbuhan  mikroorganisme  [37].  Konsentrasi  agar yang  terlalu  tinggi  akan  mengurangi  ketersediaan  oksigen pada  media.  Konsentrasi  agar  yang  umum  digunakan  pada nutrient  agar dengan  merek  HiMedia  dan  Difco  adalah sebesar 15 gram/liter [22].
Semua  bahan  pembuat  media  alteratif  tersebut  (lentil hitam, kacang hijau, splitpea yellow , ubi kuning, ubi ungu dan kacang tunggak) mudah didapat dan murah harganya. Total harga  untuk  membuat  1  liter  media nutrient  broth dan nutrient agar adalah sekitar Rp 50,000 pada Tabel 3 dan Rp 100,000 yang tertera pada Tabel 4. Bila dibandingkan dengan media  alternatif,  maka  harga  produksi  media  alternatif menurun menjadi hanya Rp 1,000– Rp 8,000 per-liter. Hal ini menunjukkan  bahwa  penggunaan  bahan  media  alternatif dapat  menurunkan  biaya  produksi  secara  signifikan  untuk menumbuhkan  mikroorganisme  dalam  skala  produksi. Penggunaan  media  alternatif  tersebut  hanya  membutuhkan biaya sebesar 2-3% dari harga media komersil nutrient broth.

## C. Mekanisme Liofilisasi Sel Bakteri
Preservasi mikroorganisme merupakan suatu usaha untuk menyimpan  sel  agar  tetap  viabel  dengan  mengurangi  laju metabolisme  sel.  Liofilisasi  atau freeze  drying merupakan salah satu teknik preservasi mikroorganisme yang terdiri atas beberapa tahapan yaitu, pengkulturan sel bakteri; penambahan  kultur  bakteri  dengan  agen  protektan; pembekuan; liofilisasi/ freeze drying; penyimpanan; rehidrasi; dan pemulihan sel [23].
Freeze  drying memiliki  tiga  fase  pengeringan  yaitu pre- freezing , primary  drying dan secondary  drying [24]. Pre- freezing merupakan  proses  pembekuan  sel  dengan menurunkan  dan  memastikan  suhu  sampel  berada  dibawah suhu  eutektik  agar  mencegah  terjadinya  kerusakan  sel  saat
liofilisasi [25]. Suhu eutektik merupakan titik leleh terendah pada  suatu  substansi.  Kemudian  dilanjutkan  dengan  proses primary  drying dimana  terjadi  proses  berlangsungnya sublimasi yaitu penghilangan air pada sel yang merubah fase air  dalam  bentuk  padat  menjadi  gas  tanpa  melalui  fase  cair dengan suhu dan tekanan dibawah triple point . Triple point merupakan  kondisi  suhu  dan  tekanan  air  dimana  fase  cair, padat  dan  gas  berada  dalam  kesetimbangan  termodinamika yaitu berada pada suhu 0,01°C dengan tekanan 0,00603 atm [26].  Seiring  berjalannya  waktu,  suhu primary  drying pada freeze dryer akan terus meningkat hingga memasuki proses secondary  drying . Secondary  drying merupakan  proses berlangsungnya  desorpsi,  yaitu  penyerapan  residu  air  yang tersisa pada sel dengan meningkatkan suhu freeze dryer [24]. Selanjutnya  sel  yang  telah  diliofilisasi  disimpan  di  tempat penyimpanan dengan suhu yang dingin agar sel tetap terjaga [27]. Sel  hasil  preservasi  yang  ingin  digunakan  harus dipulihkan terlebih dahulu melalui proses rehidrasi [28].
Berdasarkan  hasil  studi  literatur,  suhu  dan  waktu pembekuan yang terbaik adalah berkisar antara -20 hingga - 30°C untuk pendinginan lambat yang berlangsung selama 2 – 3 jam atau 24 jam. Sedangkan suhu untuk pendinginan cepat adalah -196°C. Proses pembekuan terbagi menjadi dua, yaitu proses pendinginan lambat  ( slow  freezing ) dan pendinginan cepat  ( quick  freezing ) . Pendinginan  lambat  memerlukan waktu pembekuan yang lama, sedangkan pendinginan cepat memerlukan  waktu  pembekuan  yang  cepat  bahkan  dapat dihitung  dalam  hitungan  detik.  Secara  umum  pendinginan lambat  pada  liofilisasi  memiliki  suhu  diatas  -24°C  dan pendinginan cepat memiliki suhu antara -40°C hingga -196°C begantung  pada  jenis  sampel  yang  digunakan  [57,58]. Pendinginan lambat menghasilkan ukuran es kristal pada sel yang  besar  sehingga  porositas  sel  juga  akan  membesar  dan meningkatkan permeabilitas sel serta perpindahan massa uap air.  Oleh  karena  itu  penggunaan  pendinginan  lambat  untuk proses freezing dapat mengurangi waktu dan biaya liofilisasi. Sedangkan pendinginan cepat menghasilkan ukuran es kristal yang  lebih  kecil  sehingga  membutuhkan  waktu  liofilisasi yang lebih lama [23].
Suhu freeze  drying berdasarkan  hasil  studi  literatur  yang terbaik adalah -20 hingga -80°C yang berlangsung dibawah suhu  eutektik  untuk  menghindari  kehancuran  sel.  Secara umum suhu euktektik untuk material biologis berada diantara -10 hingga -25°C, sehingga liofilisasi pada umumnya dimulai pada suhu -50 hingga -80°C [27].
Selain  suhu,  waktu  saat freeze  drying juga  perlu diperhatikan.  Waktu freeze  drying berdasarkan  hasil  studi literatur  yang  terbaik  adalah  20  atau  24  jam.  Lama  waktu freeze-drying dapat  dipengaruhi  oleh  jenis  dan  volume sampel serta wadah yang digunakan. Semakin besar volume maka  waktu  yang  dibutuhkan  dalam  melangsungkan freeze drying akan  semakin  lama.  Namun,  waktu  tersebut  juga dipengaruhi  oleh  wadah  yang  digunakan.  Semakin  besar wadah  maka  akan  menyebabkan  luas  permukaan  sampel menjadi  lebih  besar  mengikuti  besarnya  wadah,  sehingga waktu  melangsungkan freeze  drying akan  lebih  cepat dibandingkan  dengan  wadah  yang  kecil  dengan  jumlah volume  sampel  yang  sama.  Waktu  yang  digunakan  secara umum untuk melangsungkan freeze drying adalah selama 24 jam [29].
Suhu penyimpanan terbaik berdasarkan hasil studi literatur adalah  4°C.  Sel  yang  telah  melalui  proses  liofilisasi  harus disimpan pada freezer agar suhu sel tetap terjaga. Sel pasca liofilisasi  umumnya  disimpan  pada freezer dengan  suhu antara 4-8°C. Penyimpanan sel pada suhu yang rendah dapat memperpanjang  kelangsungan  hidup  sel.  Semakin  tinggi suhu tempat penyimpanan semakin cepat produk terdegradasi [27].
Media  rehidrasi  yang  digunakan  untuk  memulihkan  sel pasca liofilisasi bervariasi. Namun, media hasil studi literatur ini  menyebutkan  bahwa Phosphate  Buffer  Saline (PBS) bagus  untuk  digunakan,  karena  memiliki  kemampuan memulihkan  sel  dengan  mempertahankan  pH  sehingga mengurangi terjadinya kerusakan sel [30].

## D. Liofilisasi Bakteri menggunakan Agen Protektan dan Imobilisasi Gel
Tekanan osmotik dan pembentukan es kristal yang terjadi selama berlangsungnya liofilisasi berpotensi merusak DNA, protein  dan  membran  sel  serta  menyebabkan  denaturasi enzim  [31].  Kerusakan  tersebut  dapat  dikurangi  dengan penambahan senyawa agen protektan dan imobilisasi sel [32]. Agen  protektan  berfungsi  untuk  menggantikan  air  yang terdapat  pada  sel  agar  es  kristal  tidak  terbentuk  pada intraseluler maupun ekstraseluler pada suhu dingin sehingga menghasilkan  sel  yang  tetap  utuh  ( intact )  [33].  Selain  itu, agen  protektan  juga  memberikan  perlindungan  pada  sel dengan menstabilkan membran dan menjaga struktur sel agar tetap berpori [34].
Agen protektan terbagi menjadi dua, yaitu agen protektan penetrasi  dan  non-penetrasi.  Mekanisme  agen  protektan penetrasi memberikan perlindungan pada intraseluler dengan menembus lapisan membran sel. Sedangkan mekanisme agen protektan  non-penetrasi  memberikan  perlindungan  pada bagian ekstraseluler yang tidak dapat menembus membran sel karena memiliki berat molekul yang besar [34].
Imobilisasi  merupakan  teknik  pelekatan  sel  atau  partikel pada  material  pendukung  yang  berfungsi  untuk  melindungi dan  memberikan  stabilitas  sel  terhadap  stres  lingkungan. Imobilisasi  pada  teknik  liofilisasi  menggunakan  jenis pelekatan  enkapsulasi,  yaitu  penyalutan  sel  dengan  suatu bahan  penyalut  khusus  yang  memiliki  kemampuan  untuk melindungi sel dari faktor-faktor penyebab kerusakan selama proses  pengolahan  dan  penyimpanan  [35].  Fungsi  utama enkapsulasi  adalah  untuk  melindungi  sel  dari  stres lingkungan  luar,  seperti  tingkatan  pH  yang  terlalu  asam maupun  basa  serta  suhu  dingin  pada  saat freeze  drying dan suhu  panas  pada  saat spray  drying sehingga  dapat  menjaga viabilitas sel [36].
Alginat  dan K-carrageenan termasuk  kedalam  polimer alami  yang  paling  banyak  digunakan  sebagai  material enkapsulasi  yang  bersifat  tidak  toksik.  Alginat  merupakan polimer  yang  terbuat  dari  alga  cokelat  dan  tersusun  atas monomer ß(1,4)-D-mannuronic acid dan α(1,4)-L-guluronic acid .  Sedangkan K-carrageenan merupakan  polisakarida yang  terbuat  dari  alga  merah  dan  tersusun  atas  unit D- galactose-4-sulphate dan 3,6-anhydro-D-galactose yang terikat oleh ikatan ß1-4 glycosidic [37].
Penggabungan  agen  protektan  dan  imobilisasi  sel  saat liofilisasi  dapat  memberikan  perlindungan  ekstra  terhadap kondisi  yang  ekstrim  sehingga  presentase  viabilitas
mikroorganisme  meningkat  [32].  Namun  di  sisi  lain, diketahui  bahwa  konsentrasi  dan  jenis  senyawa  agen protektan serta material imobilisasi sel yang digunakan dapat mempengaruhi  tingkat  viabilitas  sel  suatu  mikroorganisme [38].  Tingkat  viabilitas  sel  juga  dipengaruhi  oleh  jenis mikrooganisme  bahkan strain dari  spesies  tertentu  yang digunakan.
Berdasarkan hasil studi literatur, agen protektan yang dapat mendukung viabilitas sel bakteri relatif tinggi adalah sukrosa dan skim  milk, dimana konsentrasi  sukrosa  5-10%  dapat medukung viabilitas sel bakteri sekitar 50,8% - 102,3%. Dan konsentrasi skim milk 10-20% dapat mendukung viabilitas sel bakteri  sekitar  60%  -  90%,  baik  digunakan  secara  tunggal ataupun  ditambahkan  dengan  agen  protektan  lain  seperti glutamat,  meso  inositol,  dan  sukrosa.  Selain  itu,  hasil  studi literatur  juga  menghasilkan  agen  protektan  yang  paling banyak  digunakan  pada  sel  yang  terimobilisasi  adalah skim milk 6-10%  dengan  kemampuan  mendukung  viabilitas  sel hingga  89,48%  -  92,50%.  Secara  umum  konsentrasi  agen protektan  yang  digunakan  untuk  memberikan  efek  optimal pada  sel  saat  liofilisasi  berkisar  antara  5-20%,  dimana konsentrasi  10%  merupakan  angka  yang  cukup  untuk memberikan efek proteksi sel rata-rata [32].
Skim milk merupakan susu tak berlemak yang mengandung lemak  sekitar  0,6-1,25%;  protein  34-37%;  laktosa  49-52%; dan Abu 8,2-8,6% [39]. Skim milk tergolong pada jenis agen protektan  nonpenetrasi,  yaitu  memproteksi  sel  dengan melapisi bagian ekstraseluler tanpa menembus ke dalam sel yang  dilaporkan  dapat  digunakan  secara  tunggal  atau ditambah  dengan  agen  protektan  lain  seperti  laktosa  [40]. Skim  milk bersifat  higroskopis  yang  memiliki  kemampuan untuk  mengikat  air  dalam  jumlah  yang  banyak.  Selain  itu, kandungan  kalsium  pada skim  milk dapat  meningkatkan viabilitas sel dan kandungan fosfat serta sitrat dapat bersifat sebagai  larutan  penyangga  untuk  menstabilkan  pH  dan menjaga sel saat liofilisasi [41].
Sukrosa  (C 12 H 22 O 11 )  merupakan  disakarida  yang  terdiri atas glukosa dan fruktosa. Sukrosa tergolong pada jenis agen protektan  “penetrasi  pada  dinding  sel”,  yaitu  memiliki kemampuan  proteksi  dengan  menempel  pada  dinding  sel [40]. Sukrosa dapat menstabilkan membran dan protein pada sel  dengan  menggantikan  air  pada  sel  atau  disebut  juga dengan teori “ water replacement” , yaitu pembentukan ikatan hidrogen  antara  sukrosa  sebagai  agen  protektan  dengan protein  atau  fosfolipid  yang  menggantikan  ikatan  hidrogen antara protein atau fosfolipid dengan air [41]. Penggantian air oleh  sukrosa  dapat  mencegah  terbentuknya  es  kristal  yang menyebabkan  kerusakan  sel  pada  saat  liofilisasi.  Selain  itu, sel  yang  ditambahkan  oleh  sukrosa  akan  membentuk  fase amorphous atau glassy  matrix sehingga  memberikan stabilitas pada membran sel [32].
Keberhasilan  penggunaan  agen  protektan  dan  imobilisasi dapat dilihat dengan presentase viabilitas sel pasca liofilisasi diatas  50%.  Berdasarkan  hasil  studi  literatur,  konsentrasi skim  milk 6-10%  pada  sel  terimobilisasi  serta  konsentrasi sukrosa  5-10%  dan skim  milk 10-20%  pada  sel  yang  tidak terimobilisasi  sukses  memproteksi  sel  pada  saat  liofilisasi dengan  presentase  viabilitas  yang  relatif  tinggi  yaitu  diatas 50%.

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan  studi  literatur  ini  dapat  disimpulkan  bahwa bahan baku lentil hitam ( Vigna mungo ), kacang hijau ( Vigna radiata )  dan yellow  gram/splitpea  yellow ( Pisum  sativum ) dapat  menjadi  bahan  media  alternatif  cair.  Kacang  tunggak ( Vigna  unguiculata ),  ubi  kuning  ( Ipomea  batatas )  dan  ubi ungu  ( Dioscorea  alata )  merupakan  bahan  media  alternatif padat.  Bahan  tersebut  mengandung  makro  dan  mikro  nutisi yang  sesuai  dan  mendukung  pertumbuhan  bakteri.  Agen lioprotektan yang potensial untuk digunakan adalah sukrosa 5-10%  dan skim  milk 10-20%  untuk  sel  yang  tidak terimobilisasi  dan skim  milk 6-10%  untuk  sel  yang terimobilisasi.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  R.  Anna,  “Function  Test  of  Radiopharmaceutical  Freeze  Dryer,”  in Prosiding Seminar BATAN. 2013.
[2]  P. Kumar, “Lyophilization: an important formulation technique,” Int. J. Res. , vol. 7, no. 9, pp. 11--15, 2019.
[3]  A.  Altuhaish  and  A.  Tjahjoleksono,  “Biofertilizer  effects  in combination with different drying system and storage period on growth and  production  of  tomato  plant  under  field  conditions,” Emirates  J. Food \& Agric. , vol. 26, no. 8, 2014.
[4]  S. Alonso, “Novel Preservation Techniques For Microbial Cultures. In Novel Food Fermentation Technologies,” in Novel Food Fermentation Technologies , Los Angeles, CA: Springer, 2016.
[5]  B.  T.  Arsyillah  and  A.  Muhid,  “Pendidikan  multikultural  dalam membentuk karakter pemuda di perguruan tinggi,” Al-Fikr J. Pendidik. Islam , vol. 6, no. 1, pp. 17--26, 2020.
[6]  M. T. MADIGAN, Brock Biology of Microorganisms , 11th ed. Upper Saddle River (NJ): Prentice Hall, 2005.
[7]  K.  Talaro,  B.  Chess,  D.  S.  Wiersema,  and  P.  Sen, Foundations  in Microbiology . California: McGraw-Hill, 2013.
[8]  E. Chan, “Microbial Nutrition and Basic Metabolism,” in Handbook of Water and Wastewater Microbiology , London: Elsevier, 2003, pp. 3-- 33.
[9]  S.  Hogg, Essential  Microbiology .  New  York:  John  Wiley  &  Sons, 2013.
[10]  M. Bonnet, J. C. Lagier, D. Raoult, and S. Khelaifia, “Bacterial culture through selective and non-selective conditions: the evolution of culture media  in  clinical  microbiology,” New  microbes  new  Infect. ,  vol.  34, 2020.
[11]  M. A. Oberhardt, R. Zarecki, S. Gronow, and E. Lang, “Harnessing the landscape of microbial culture media to predict new organism–media pairings,” Nat. Commun. , vol. 6, no. 1, pp. 1--14, 2015.
[12]  C.  T.  Welsh, Microbiology  a  Laboratory  Manual .  London:  Pearson, 2019.
[13]  K. . Raju, “Alternative culture media for cultivation of bacteria,” Int. J. Sci.  Res. ,  vol.  9,  no.  3,  2019,  [Online].  Available:  doi: 10.21275/SR20320131331.
[14]  Rezekikasari  and  R.  Harianto,  “Modifikasi  media  alternatif  dari sayuran  untuk  analisis  kuantitatif  pertumbuhan  mikroorganisme  asal tanah  gambut  Kalimantan  Barat  dengan  metode  TPC,” Perkeb.  dan Lahan Trop. , vol. 9, no. 1, pp. 1--8, 2019.
[15]  E. TAŞĞIN, “Macronutrients and micronutrients in nutrition,” Int. J. Innov. Res. Rev. , vol. 1, no. 1, pp. 10--15, 2017.
[16]  A.  Annan-Prah,  S.  Akorli,  and  K.  Sedofia,  “Growth  and  cultural characteristics  of  selected  bacteria  on  cowpea  agar  (Vigna unguiculata),” African  J.  Microbiol.  Res. ,  vol.  4,  no.  23,  pp.  2626-- 2628, 2010.
[17]  A. Sanoussi et al. , “Possibilities of sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam]  value  chain  upgrading  as  revealed  by  physico-chemical composition of ten elites landraces of Benin,” African J. Biotechnol. , vol. 15, no. 13, pp. 481--489, 2016.
[18]  P.  H.  Sukenda  and  E.  Harris,  “Pengaruh  pemberian  sukrosa  sebagai sumber karbon dan probiotik terhadap dinamika populasi bakteri dan kualitas air media budidaya udang vaname, Litopenaeus vannamei,” J. Akuakultur Indones. , vol. 5, no. 2, pp. 179--190, 2006.
[19]  N. Huma, M. Anjum, S. Sehar, M. I. Khan, and S. Hussain, “Effect of soaking  and  cooking  on  nutritional  quality  and  safety  of  legumes,” Nutr. \& Food Sci. , vol. 38, no. 6, 2008.
[20]  R.  Ogliari  and  J.  M.  Soares,  “Chemical,  nutritional  and  sensory characterization  of  sweet  potato  submitted  to  different  cooking methods,” Int. J. Res. , vol. 8, no. 10, pp. 147--156, 2020.
[21]  A. Lamid, Almasyhuri, and D. Sundari, “Pengaruh proses pemasakan terhadap  komposisi  zat  gizi  bahan  pangan  sumber  protein,” Media Penelit. dan Pengemb. Kesehat. , vol. 25, no. 4, 2015.
[22]  Z.  MJ  and  D.  Power, “Difco TM and  BBL TM Manual,”  Manual  of Microbiological Culture Media . Maryland: Becton Dickson, 1981.
[23]  C.  Morgan  and  G.  Vesey,  “Freeze-Drying  of  Microorganisms,” Encyclopedia  of  Microbiology .  Academic  Press,  2019,  [Online]. Available: https://doi.org/10.1016/B978-012373944-5.00114-0.
[24]  K.  A.  Gaidhani,  M.  Harwalkar,  D.  Bhambere,  and  P.  S.  Nirgude, “Lyophilization/freeze drying–a review,” World J. Pharm. Res. , vol. 4, no. 8, pp. 516--543, 2015.
[25]  A.  Molnar,  T.  Lakat,  A.  Hosszu,  B.  Szebeni,  and  A.  Balogh, “Lyophilization  and  homogenization  of  biological  samples  improves reproducibility  and  reduces  standard  deviation  in  molecular  biology techniques,” Amino Acids , vol. 53, no. 6, pp. 917--928, 2021.
[26]  A.  Baheti,  L.  Kumar,  and  A.  K.  Bansal,  “Excipients  used  in lyophilization of small molecules,” J. Excipients Food Chem. , vol. 1, no. 1, 2016.
[27]  Labconco, A  Guide  to  Freeze  Drying  for  the  Laboratory .  Kansas: LABCONCO, 2008.
[28]  G. F. de Valdez, G. S. de Giori, A. P. de Ruiz Holgado, and G. Oliver, “Effect  of  the  rehydration  medium  on  the  recovery  of  freeze-dried lactic  acid  bacteria,” Appl.  Environ.  Microbiol. ,  vol.  50,  no.  5,  pp. 1339--1341, 1985.
[29]  A.  Martin,  “Pengering  Bengkuang  dengan  Sistem  Pengeringan  Beku Vakum (Vacuum Freeze Drying System),” Departemen Teknik Mesin: Riau University, 2014.
[30]  A.  Rosdiana  and  Y.  E.  Hadisaputri,  “Studi  pustaka  tentang  prosedur kultur sel,” Farmaka , vol. 14, no. 1, pp. 236--249, 2016.
[31]  S. Kandil and M. El Soda, “Influence of freezing and freeze drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains,” Adv. Microbiol. , vol. 5, no. 6, 2015.
[32]  M. Halim, N. A. M. Mustafa, M. Othman, H. Wasoh, M. R. Kapri, and A. B. Ariff, “Effect of encapsulant and cryoprotectant on the viability of probiotic Pediococcus acidilactici ATCC 8042 during freeze-drying
and  exposure  to  high  acidity,  bile  salts  and  heat,” LWT-Food  Sci. Technol. ,  vol.  81,  pp.  210--216,  2017,  [Online].  Available: https://doi.org/10.1016/j.lwt.2017.04.009.
[33]  A. S. Carvalho, J. Silva, P. Ho, P. Teixeira, F. X. Malcata, and P. Gibbs, “Relevant  factors  for  the  preparation  of  freeze-dried  lactic  acid bacteria,” Int. Dairy J. , vol. 14, no. 10, pp. 835--847, 2004.
[34]  M. Darwin, A. de Wolf, and C. de Wolf, “Cryonics,” The Science of Cryonics , Arizona, 2007.
[35]  R. F. Hasrini, F. R. Zakaria, and D. R. Adawiyah, “Mikroenkapsulasi minyak sawit mentah dengan penyalut maltodekstrin dan isolat protein kedelai,” J. Teknol. dan Ind. Pangan , vol. 28, no. 1, pp. 10--19, 2017.
[36]  S. Iravani, H. Korbekandi, and S. V. Mirmohammadi, “Technology and potential  applications  of  probiotic  encapsulation  in  fermented  milk products,” J. Food Sci. Technol. , vol. 52, no. 8, 2015.
[37]  M.  Cassidy,  H.  Lee,  and  J.  Trevors,  “Environmental  applications  of immobilized microbial cells: a review,” J. Ind. Microbiol. Biotechnol. , vol. 16, no. 2, pp. 79--101, 1996.
[38]  D.  Stephan,  A.-P.  M.  Da  Silva,  and  I.  L.  Bisutti,  “Optimization  of  a freeze-drying process for the biocontrol agent Pseudomonas spp. and its influence on viability, storability and efficacy,” Biol. Control , vol. 94, pp. 74--81, 2016.
[39]  G. N. Handayani and N. Ida, “Pemanfaatan susu skim sebagai bahan dasar  dalam  pembuatan  produk  olahan  makanan  tradisional  dangke dengan  bantuan  bakteri  asam  laktat,” J.  Farm.  UIN  Alauddin Makassar , vol. 2, no. 2, pp. 56--61, 2014.
[40]  C. Soukoulis, S. Behboudi-Jobbehdar, L. Yonekura, and C. Parmenter, “Impact of milk protein type on the viability and storage stability of microencapsulated  Lactobacillus  acidophilus  NCIMB  701748  using spray drying,” Food Bioprocess Technol. , vol. 7, no. 5, 2014.
[41]  L. C. Ming, R. Abd Rahim, H. Y. Wan, and A. B. Ariff, “Formulation of protective agents for improvement of Lactobacillus salivarius I 24 survival rate subjected to freeze drying for production of live cells in powderized form,” Food Bioprocess Technol. , vol. 2, no. 4, pp. 431-- 436, 2009.