Jurnal Pharmascience, Vol. 10, No.1, Februari 2023, hal: 36-50 ISSN-Print. 2355 – 5386 ISSN-Online. 2460-9560 https://ppjp.ulm.ac.id/journal/index.php/pharmascience Research Article

## Isolasi Fungi Tanah Muara Sungai Desa Kalinaun Sulawesi Utara serta Skrining Antibakteri terhadap
Pseudomonas aeruginosa
Muhammad Habiburrohman 1 , Nafa Rosyida Zanuba 1 , Muhammad Zainul Arifin 2 , Saeful Akhmad Tauladani 2,3 , Gani Asri Muharam 4 , Asia 5 , Dwi Koko Pratoko 1 , Bawon Triatmoko 1 , Ari Satia Nugraha 1 *
1 Drug Utilisation and Discovery Research Groups, Fakultas Farmasi, Universitas Jember, Jember, Jawa Timur, Indonesia
2 Politeknik Kelautan dan Perikanan Bitung, Bitung, Sulawesi Utara, Indonesia 3 Australian National Centre for Ocean Resources and Security (ANCORS), University of Wollongong, Australia
4 Balai Pendidikan dan Pelatihan Perikanan Aertembaga, Bitung, Sulawesi Utara, Indonesia 5 Politeknik Kelautan dan Perikanan Bone, Bone, Sulawesi Selatan, Indonesia Email: arisatia@unej.ac.id

## ABSTRAK
Penyakit  infeksi  merupakan  salah  satu  penyakit  yang  menyebabkan  mortalitas dan morbiditas di dunia yang dapat diterapi menggunakan antibotik. Adanya resistensi dapat mengancam efektivitas antibiotik. Penelitian ini bertujuan untuk mencari kandi- dat antibiotik yang bersumber dari fungi tanah muara yang diuji aktivitasnya terhadap bakteri Pseudomonas  aeruginosa.  Ekosistem tanah muara   mangrove  memiliki  kondisi ekstrem  sehingga  menuntut  mikroorganisme  untuk  bertahan  hidup  dengan memproduksi senyawa antibiotik untuk bersaing dengan mikroorganisme lain. Sampel tanah diambil dari Muara Sungai Desa Kalinaun, Kecamatan Likupang Timur, Kabu- paten Minahasa Utara, Provinsi Sulawesi Utara. Sampel tanah yang didapat sebanyak empat isolat fungi berpotensi dalam menghambat bakteri uji, yaitu IS2-BTG11-1-1, IS2- BTG11-2-1, IS2-BTG11-2-2, IS2-BTG11-2-3. Keempat isolat tersebut dilakukan fermen- tasi selama 14 hari lalu diekstraksi dengan pelarut etil asetat. Setelah didapatkan ekstrak etil  asetat,  dilakukan  skrining  fitokimia dan  didapatkan  hasil  bahwa  keempat  ekstrak mengandung  senyawa  golongan  terpenoid.  Setelah  dilakukan  skrining  fitokimia,  dil- akukan uji aktivitas antibakteri menggunakan metode mikrodilusi. Uji mikrodilusi dil- akukan  dengan  konsentrasi  tunggal  50  µg/mL.  Berdasarkan  uji  mikrodilusi,  keempat ekstrak  fungi  tanah  muara  memberikan  aktivitas  penghambatan  berturut-turut  dari terbesar ke terkecil : IS2-BTG11-2-3 (50,9% ± 7,6); IS2-BTG11-2-1 (49,8% ± 13,5); IS2- BTG11-1-1  (34,4%  ±  2,4);  IS2-BTG11-2-2  (37,2%  ±  7,7).  Pada  penelitian  ini  senyawa yang  berperan  sebagai  antibakteri  belum  bisa  dipastikan,  sehingga  membutuhkan penelitian lebih lanjut.
Kata Kunci: Antibakteri, Pseudomonas aeruginosa, Fungi Tanah Muara, Mikrodilusi,

## Desa Kalinaun

## ABSTRACT
Infectious diseases are one of the leading causes of mortality and morbidity in the world that  can be treated with antibiotics. The existence of resistance can threaten the ef- fectiveness of  antibiotics.  This  study aims to  find  new antibiotic candidates from  fungi in estuary soils and tested the activity against Pseudomonas aeruginosa bacteria. Estuary soil ecosystems have extreme conditions that require microorganisms to be able to survive Soil samples were taken from the Estuary of the Kalinaun Village, East Likupang District, North Minahasa Regency, North Sulawesi Province. Soil samples obtained were 4 isolates of fungi that  had  the  potential  bacteria  inhibition,  namely  IS2-BTG11-1-1,  IS2-BTG11-2-1,  IS2- BTG11-2-2, IS2-BTG11-2-3. Four isolates were fermented for 14 days and extracted with ethyl acetate solvent. Phytochemical screening of the extract was carried out and the results showed  that  the  four  extracts  contained  terpenoid  compounds.  Antibacterial  activity  was tested using the microdilution methods with a single concentration of 50 µg/mL. Based on the microdilution test, four estuary soil fungal extracts gave inhibitory activity from the larg- est  to  the  smallest:  IS2-BTG11-2-3  (50.9%  ±  7.6);  IS2-BTG11-2-1  (49.8%  ±  13.5);  IS2- BTG11-1-1 (34.4% ± 2.4); IS2-BTG11-2-2 (37.2% ± 7.7). In this study, the compound that acts as an antibacterial has not been determined, so it requires further research.
Keywords: Antibacterial, Pseudomonas aeruginosa, Estuary Soil Fungi, Microdilution, Ka- linaun Village

## I.PENDAHULUAN
Selama 20 tahun terakhir, penyakit infeksi  termasuk  4  dari  10  penyakit penyebab kematian di dunia dengan jumlah kasus yang meningkat setiap tahunnya dan diperkirakan akan terus mengalami pening- katan (WHO, 2020). Pada tahun 2019, telah dilaporkan  data  kematian  sebanyak  13,7 juta orang akibat penyakit infeksi (Murray et al ., 2022). Pada tahun 2019 hingga 2022 juga  telah  dilaporkan  angka  kematian  aki- bat infeksi dari Covid-19 mencapai 6,6 juta jiwa (WHO, 2022). Hal tersebut menunjuk- kan  bahwa  penyakit  infeksi  berkontribusi secara substansial pada angka kematian  di dunia. Penyakit infeksi akibat bakteri dapat
diterapi  menggunakan  antibiotik.  Namun demikian, adanya resistensi dapat mengan- cam efektivitas antibiotik. Menurut Komite Pengendalian Resistensi Antimikroba, ting- kat  resistensi  bakteri  di  Indonesia  terus meningkat  dari  tahun  2013  (40%),  2016 (60%),  hingga  2019  (60,4%)  (Nurmala  & Gunawan,  2020).  Salah  satu  bakteri  pato- gen yang sudah  mengalami resistensi  ada- lah Pseudomonas aeruginosa .
Pseudomonas  aeruginosa merupa- kan  bakteri  patogen  gram  negatif  yang menjadi  penyebab  infeksi  saluran  kemih, infeksi  luka,  infeksi  saluran  pernafasan bawah  pada  pasien immunocompromised (Mittal et al ., 2006). Bakteri ini mempunyai
kemampuan  untuk  hidup  dan  berkembang biak dalam berbagai lingkungan hidup. Hal ini  menyebabkan  bakteri  ini  merupakan agen  infeksius  yang  menyebabkan  mu- dahnya muncul wabah bakteri MDR (multi drug resistance) di rumah sakit, khususnya ICU (Lee & Zhang, 2014). Pengembangan dan  penelitian  lebih  lanjut  tentang  pen- carian obat tentunya sangat dibutuhkan un- tuk  mengatasi  keganasan  bakteri  tersebut. Pencarian  antibiotik  baru  bisa  bersumber dari fungi yang ada di dalam tanah muara.
Tanah muara sungai adalah ekosistem  yang  masih  terpengaruh  oleh ekosistem laut. Misalnya pasang surut, ge- lombang laut, aliran air tawar dan sedimen dari  muara sungai  yang  mengarah ke laut. Di ekosistem tersebut terkandung berbagai macam  fungi  (Khandavilli,  2016).  Secara ekologis,  tanah  merupakan  sumber  yang subur  untuk  ditumbuhi  berbagai  macam mikroorganisme yang mampu menghasilkan  antimikroba  karena  adanya persaingan  perebutan  nutrisi  dan  wilayah yang kuat (Karwehl & Stadler, 2016). Salah satu contoh kawasan yang berada di bagian muara sungai adalah hutan mangrove.
Ekosistem  mangrove  merupakan habitat  berbagai  macam  fungi.  Fungi  ini berperan  penting  dalam  melakukan  siklus nutrisi  sehingga  mampu  menyokong ekosistem  mangrove.  Vegetasi  mangrove yang  memiliki  kondisi  ekstrem  semacam salinitas  tinggi,  kecepatan  angin  tinggi,
suhu  tinggi  serta  tanah  liat  anaerob menuntut  mikroorganisme  harus  mampu bertahan dan menyesuaikan diri (Thatoi et al ., 2013). Salah satunya dengan memproduksi  senyawa  antibiotik  untuk bersaing dengan mikroorganisme lain.
Kita ketahui bersama bahwa penelitian terhadap potensi tanah muara di Indonesia  relatif  masih  sedikit.  Tanah Muara  Sungai  Desa  Kalinaun,  Kecamatan Likupang  Timur,  Kabupaten  Minahasa Utara, Provinsi Sulawesi Utara merupakan tanah  muara  pada  ekosistem  mangrove yang  dapat  digunakan  sebagai  sampel  da- lam penelitian ini untuk mengetahui aktivi- tas  antibakteri  pada Pseudomonas  aeru- ginosa. Pengujian antibakteri pada penelitian  ini  menggunakan  menggunakan metode mikrodilusi dengan single concen- tration 100  µg/mL  pada  metode  mikrodi- lusi.  Persen  penghambatan  ekstrak  etil asetat  hasil  fermentasi  fungi  tanah  muara digunakan sebagai parameter aktivitas anti- bakteri dalam penelitian ini.

## II. METODE

## A. Alat
Neraca  analitik  (OHAUS ® ), hot plate (HEIDOLPH ® ), Laminar  Air  Flow (THERMO  CIENTIFIC ® 1300  SERIES A2), spreader , autoklaf (B-ONE ® ), centri- fuge , vortex (GENE-2 ® ), shaker  incubator (B-ONE ® ),  jarum  ose,  jangka  sorong (TRICLE  BRAND ® ),  mikroskop  (Digimi
13D ® ), micropipet (SOCOREX ® ), micro- plate  96-well , microplate  reader (CO- RONA SH-100 ® ), Chamber KLT (CAMAG ® ),  spektrofotometer  (Biobase BK-UV1000 ® )  UV-Vis,  corong  pisah (SCHOTT DURAN ® ), dan detektor ultravi- olet (SPECTROLINE ENF-240C/FE).

## B. Bahan
Tanah  muara  Sungai  Desa  Kali- naun,  Kecamatan  Likupang  Timur,  Kabu- paten  Minahasa  Utara,  Provinsi  Sulawesi Utara  yang  didapat  dari  bapak  Saeful  A. Tauladani,  air  laut,  aqua  demineral  (HY- DROBATT), aquabidest steril, Potato Dex- trose  Agar (PDA)  (HIMEDIA), Potato Dextrose Broth (PDB) (HIMEDIA),
Mueller  Hinton  Agar (MERCK), Mueller Hinton Broth (HIMEDIA), NaCl 0,9%, eta- nol  70%,  etil  asetat  pa,  DMSO  (Emsure), MgCl 2 (Brataco),  CaCl 2 (Sigma),  BaCl 2 ,
H 2 SO 4 ,  gentamisin  sulfat,  bakteri Pseudo- monas aeruginosa , lempeng KLT (Kroma- tografi Lapis Tipis), silika gel F 254 , reagen Dragendorff ,  reagen  Vanilin-H 2 SO 4 ,  rea- gen FeCl 3 .
C. Prosedur Kerja
1. Preparasi media
Ada beberapa media yang digunakan  pada  penelitian  ini  diantaranya yaitu media PDA, PDB, PDAC, MHA, dan CAMHB.  Media  PDA,  PDB,  dan  PDAC digunakan  sebagai  media  pertumbuhan
jamur,  sedangkan  media  MHA  digunakan untuk  peremajaan  bakteri  uji.  Media CAMHB digunakan sebagai basis suspensi bakteri pada pengujian mikrodilusi. Media PDA dibuat dengan melarutkan 9,75 gram PDA  dalam  250  mL  air  laut  pada  er- lenmayer. Media PDB dibuat dengan mela- rutkan 4,8 gram PDB dalam 200 mL aqua demineral  pada  erlenmayer.  Media  PDAC dibuat dengan melarutkan 9,75 gram PDA dalam  250  mL  air  laut  pada  erlenmayer. Media MHA dibuat dengan melarutkan 6,8 gram MHA dalam 200 mL air laut pada er- lenmayer . Media CAMHB merupakan me- dia campuran dari MHB steril dengan dan ditambahkan kation Mg 2+ sebanyak 225 µL dan  kation  Ca 2+ sebanyak  450  µL.  Semua media  disterilkan  menggunakan  autoklaf dengan  suhu  121℃  selama  15  menit  dan semua  proses  dilakukan  secara  aseptis dibawah LAF.

## 2. Preparasi sampel tanah
Sampel tanah yang didapat, diambil secukupnya  dan  dimasukkan  kedalam  ta- bung  sentrifus  dan  disuspensikan  dengan menggunakan  10  mL  aquabidest  steril. Kedua  campuran  tersebut  dihomogenkan menggunakan vortex selama  3  menit  dan disentrifus  dengan  kecepatan  1.000  rpm selama 10 menit. Supernatan yang didapat diambil 100 µL untuk dikultur pada media PDA dan diratakan menggunakan spreader .  Semua  proses  dilakukan  secara
aseptis diabawah LAF dan biakan yang te- lah  dibuat kemudian  diinkubasi pada  suhu 28 ± 2˚C selama 7 hari.

## 3. Isolasi fungi tanah muara
Isolat fungi yang tumbuh kemudian diamati  pertumbuhannya  secara  makros- kopis.  Isolasi  dilakukan  dengan  cara memindahkan  isolat  fungi  ke  media  PDA yang  baru  berdasarkan  perbedaan  morfol- ogi  seperti  warna,  tekstur,  dan  bentuk hingga menjadi isolat fungi tunggal.

## 4. Skrining awal aktivitas antibakteri
Skrining  awal  aktivitas  antibakteri dilakukan dengan menggunakan uji kontak langsung  (Metode  difusi)  bakteri  dengan isolat  jamur  Proses  tersebut  dilakukan dengan  mengontakkan  langsung  isolat fungi  tanah  muara  tunggal  pada  media MHA yang sebelumnya sudah dikultur bak- teri uji. Bakteri dikultur dengan menginokulasikan 100 µL suspensi bakteri Pseudomonas aeruginosa dalam NaCl fisi- ologis  ke  media  MHA. Uji  antagonis  dil- akukan secara  aseptis dan  diinkubasi pada suhu 37 ± 2˚C selama 18 – 24 jam.
5. Fermentasi fungi tanah muara
Fermentasi  pada  penelitian  ini menggunakan  metode batch  fermentation dengan memasukkan sejumlah 5 plug atau cakram isolat  fungi  tanah  muara  tunggal pada  media  PDA  dalam  200  media  PDB steril. Campuran yang telah dibuat diinku- basi  pada  suhu  28  ±  2˚C  selama  14  hari dengan bantuan shaker kecepatan 125 rpm.

## 6. Ekstraksi fungi tanah muara
Proses  ekstraksi  dilakukan  pada penelitian  ini  merupakan  ekstraksi  partisi cair–cair  dengan  cara  menambahkan  pela- rut etil asetat kedalam media hasil fermen- tasi dengan perbandingan 1:1 sebanyak 2– 3  kali  replikasi.  Campuran  etil  asetat  dan hasil  fermentasi  fungi  tanah  dipisahkan hingga  membentuk  dua  fase  air  yang  be- rasal  dari  media  fermentasi  dan  fase  eti- lasetat  yang  mengandung  ekstrak  fungi tanah. Fase etil asetat ditampung kemudian diuapkan  dan  diambil  ekstrak  yang dihasilkan,  ditimbang  bobotnya,  dihitung % rendemennya dan disimpan dalam lemari pendingin.

## 7. Skrining kandungan senyawa
Skrining  kandungan  senyawa  yang terkandung  dalam  ekstrak  etil  asetat  hasil fermentasi  fungi  tanah  muara  dengan menggunakan  metode  KLT.  Ekstrak  yang didapat  dilarutkan  menggunakan  metanol dan  ditotolkan  pada  lempeng  KLT kemudian  dieluasi  menggunakan  eluen diklorometana  :  metanol  (9,5  :  0,5). Lempeng KLT yang telah dieluasi dideteksi dengan penampak noda  dragendorff untuk analisis alkaloid, vanilin-H 2 SO 4 untuk ana- lisis  terpenoid,  dan  FeCl 3 Untuk  analisis fenolat.
8. Uji aktivitas antibakteri
Uji  aktivitas  antibakteri  dengan menggunakan metode mikrodilusi yang dil- akukan  pada  penelitian  ini  mengacu  pada
CLSI  M07-A09  ( Clinical  and  Laboratory Standards  Institute ,  2012).  Konsentrasi suspensi  bakteri Pseudomonas  aeruginosa yang  digunakan  adalah  1  ×  10 6 CFU/mL dalam media CAMHB dan pada setiap well berisi 50 µLLarutan kontrol positif, kontrol negatif,  dan  ekstrak  yang  digunakan  pada penelitian  ini  sebanyak  50  µL  pada  setiap sumuran.  Kelompok  perlakuan  pada  pen- gujian ini berisi ekstrak dengan konsentrasi 50  µg/mL  yang  dilarutkan  dalam  DMSO 1% sebanyak 50 µL dan bakteri dalam me- dia  CAMHB  sebanyak  50  µL.  Kontrol ekstrak  terdiri  dari  ekstrak  dalam  DMSO 1%  sebanyak  50  µL  dan  media  CAMHB sebanyak 50 µL. Kontrol positif terdiri dari gentamisin  yang  dilarutkan  dalam  media CAMHB dengan konsentrasi akhir 1µg/ml sebanyak  50  µL  dan  bakteri  dalam  media CAMHB  sebanyak  50  µL.Kontrol  gen- tamisin  terdiri  gentamisin  yang  dilarutkan dalam media CAMHB dengan konsentrasi akhir  1µg/ml  sebanyak  50  µL  dan  media CAMHB  tanpa  bakteri  sebanyak  50  µL  . Kontrol negatif ekstrak terdiri dari DMSO
1% dalam media CAMHB sebanyak 50 µL
dan  bakteri  dalam  media  CAMHB sebanyak 50 µL. Kontrol DMSO terdiri dari DMSO  1%  dan  media  CAMHB  sebanyak 50  µL.  Kontrol  negatif  terdiri  dari  media CAMHB  sebanyak  50  µL  dan  bakteri  da- lam  media  CAMHB  sebanyak  50  µL. Kontrol media terdiri dari media CAMHB sebanyak  100  µL. Microplate yang  telah
berisi larutan uji kemudian diinkubasi pada suhu  35  ±  2˚C  selama  18–20  jam  dengan bantuan shaker kecepatan 120 rpm.

## 9. Analisis data
Hasil yang didapat dalam pengujian ini adalah nilai absorbansi. Data absorbansi yang didapat kemudian dimasukkan dalam rumus % penghambatan sebagai berikut: %Penghambatan: 1- (Abs C - Abs D) x 100% (Abs A - Abs B)
Keterangan:
Abs: absorbansi A: kontrol negatif ekstrak/gentamisin B: kontrol DMSO 1% /media CAMHB C:larutan uji ekstrak/gentamisin D: kontrol ekstrak/gentamisin

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembiakan dan Isolasi Sampel Fungi Sampel tanah diambil di desa Kali- naun,  Sulawesi  Utara  dengan  tiitk  koordi- nat  1.599379,  125.142623  yang  ditunjuk- kan pada Gambar 1.
Gambar 1. Maps lokasi pengambilan sam- pel tanah
Tanah  yang  didapatkan  dilakukan sentrifugasi dan supernatan yang dihasilkan dari campuran tanah dan air steril kemudian ditumbuhkan  dalam  media  PDA  dengan pelarut air laut. Media PDA merupakan me- dia  yang  cocok  untuk  penumbuhan  fungi, karena  kandungan  sari  pati  kentang  dan dextrose yang mampu mendorong sporulasi fungi (Nevalainen  et al., 2014).  Parameter yang diamati selama masa inkubasi adalah variasi  pertumbuhan  fungi.  Variasi  fungi yang tumbuh kemudian dipisahkan dengan melakukan  isolasi  kembali  dalam  media PDA baru berdasarkan perbedaan morfolo- gis  seperti  warna,  tekstur,  dan  bentuk (Gambar 1). Secara visual terdapat 3 variasi pertumbuhan  fungi  dan  dari  3  perbedaan tersebut diisolasi ke media PDA baru. Hasil akhir  didapat  7  isolat  fungi  tanah  muara seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2. Hasil biakan awal sampel tanah muara.
B. Identifikasi Makroskopis dan

## Mikroskopis
Hasil  identifikasi  makroskopis  dan mikroskopis pada keseluruhan  fungi  tanah
pada  penelitian  ini  adalah  jenis  fungi yeast /khamir yang dapat dilihat pada Gam- bar 3.
Gambar  3. Hasil  isolasi sampel  fungiber- turut-turut (A) IS2-BTG11-1-1; (B)  IS2-BTG11-1-2;  (C)  IS2-
BTG11-2-1;  (D)  IS2-BTG11-
2-2;  (E)  IS2-BTG11-2-3;  (F)
IS2-BTG11-3-1; (G) IS2- BTG11-3-2
Ciri  makroskopis  koloni  khamir memiliki  ciri-ciri  permukaan  yang  halus, tidak  berfilamen,  tidak  mengkilap,  serta warna  koloni  yang  bervariasi  dari  putih, putih  kekuningan,  hingga  kuning.  Se- dangkan  kapang  memiliki  ciri  koloni dengan permukaan yang kasar, berfilamen,
IS1-BTG11-2 IS1-BTG11-3 IS1-BTG11-1
tepinya berwarna lebih pudar dibandingkan dengan  bagian  pusat  koloninya  yang berwarna  lebih  gelap  (Hernández-Montiel et  al., 2010).  Selain  itu,  berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh (Jumiyati et al. ,  2012).  menunjukkan  khamir  memiliki morfologi koloni yang cenderung berwarna putih susu, putih kekuningan dan bertekstur halus.  Sedangkan  ciri  mikroskopis  khamir diantaranya  uniseluler,  berbentuk  bulat, oval.  Sel  khamir  memiliki  nukleus  karena merupakan organisme eukariotik. (Dangi et al. , 2014). Pengamatan mikroskopis menunjukkan bahwa khamir selnya cender- ung berbentuk oval hingga bulat (Dangi et al ., 2014).
Gambar 4. Hasil Mikroskopis isolat  aktif berturut-turut  (A)  IS2-BTG11- 1-1;  (B)  IS2-BTG11-1-2;  (C) IS2-BTG11-2-1; (D) IS2- BTG11-2-2; (E) IS2-BTG11-2- 3; (F) IS2-BTG11-3-1; (G) IS2-
BTG11-3-2

## C. Skrining Awal Pengujian Aktivitas Antibakteri
Skrining  awal  pada  penelitian  ini mengamati  zona  bening  yang  terbentuk disekitar isolat saat dilakukan uji antagonis. Berdasarkan  hasil  uji  antagonis,  zona bening  yang  terbentuk  tidak  terlalu  jelas. Hambatan  yang  dihasilkan  tidak  terlalu kuat karena pada pengujian ini hanya men- gontakkan isolat fungi dengan jumlah yang kecil  pada  bakteri  uji.  Hal  tersebut  ber- pengaruh terhadap metabolit sekunder yang dihasilkan, bisa saja metabolit sekunder be- lum  cukup  dihasilkan  atau  konsentrasinya belum  cukup  untuk  menghambat  pertum- buhan  bakteri.  Hal  ini  dibuktikan  dengan penelitian  yang  dilakukan  oleh  Sara-Ram- iez  (Dangi et  al .,  2014),  hambatan  yang dihasilkan dalam bentuk ekstrak pada per- tumbuhan  bakteri  akan  jauh  lebih  besar dibandingkan  pada  saat  masih  dalam  ben- tuk isolat fungi. Pada penelitian ini, dari 7 isolat yang terisolasi terdapat 4 isolat aktif yang terdapat dalam Tabel I.

## D. Fermentasi  dan  Ekstraksi  Fungi
Tanah
Fermentasi merupakan suatu proses yang  bertujuan  untuk  memperbanyak  bio- massa  isolat  fungi  tanah  muara.  Pada penelitian kali ini, dipilih metode batch fer- mentation karena  prosesnya  yang  mudah dibandingkan  dengan  metode  fermentasi yang  lain  yaitu  dengan  menginokulasikan
langsung  fungi  tanah  muara  dalam  media pada volume tertentu, selain itu fermentasi pada metode ini resiko kontaminasinya ren- dah  (Jagschies et  al., 2018). Media  PDB dipilih  karena  memiliki  kandungan  pati kentang yang menyediakan unsur nitrogen, vitamin  dan  mineral  yang  dibutuhkan  da- lam  pertumbuhan  fungi  (Swapna  &  Lal- chand,  2016).  Selama  proses  fermentasi dibantu dengan agitasi untuk
menghomogenkan  nutrisi  yang  ada  pada media  menggunakan shaker incubator dengan  kecepatan  125  rpm.  Pemilihan waktu 14 hari untuk fermentasi disesuaikan dengan  fase  logaritmik  dan  pertumbuhan stasioner  pada  fungi  karena  berpengaruh terhadap metabolit sekunder yang dihasilkan,  hasil  fermentasi  bisa  dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5 .  Hasil  fermentasi fungi selama 14 hari. Berturut-turut (A) IS2- BTG11-1-1; (C) IS2-BTG11-2- 1;  (D)  IS2-BTG11-2-2;  (E) IS2-BTG11-2-3
Tabel I. Hasil uji antagonis 7 isolat fungi tanah muara umur 7 hari terhadap bakteri uji Pseudomonas aeruginosa pada media
MHA dengan suhu 37°C selama 24 jam Nama Fungi Hasil Uji Zona Hambat (mm) IS2-BTG11-1-1 + 16,87 IS2-BTG11-1-2 - - IS2-BTG11-2-1 + 8,67 IS2-BTG11-2-2 + 10,75 IS2-BTG11-2-3 + 8,75 IS2-BTG11-3-1 - - IS2-BTG11-3-2 - -
Metabolit  sekunder  dan  enzim dihasilkan  oleh  isolat  fungi  selama  proses fermentasi  berlangsung  yang  ditandai dengan perubahan warna pada media PDB (Swapna & Lalchand, 2016).
Ekstraksi  merupakan  suatu  proses untuk  menyaring  metabolit  sekunder  yang dihasilkan  oleh  isolat  fungi  selama  proses fermentasi.  Digunakan  etil  asetat  sebagai pelarut  dalam  proses  ekstraksi  karena  si- fatnya  yang  kurang  toksik,  mudah  men- guap, dan semi  polar sehingga diharapkan dapat  menarik  metabolit  sekunder  yang bersifat  polar  maupun  nonpolar  dengan maksimal.  Dari  proses  ekstraksi  didapat  2 fase, yaitu fase air dan fase etil asetat. Fase etil  asetat  ditampung  dalam  mangkok  dan diuapkan hingga didapat ekstrak fermentasi isolat  fungi  tanah  muara.  Ekstrak  yang dihasilkan kemudian dimasukkan ke dalam
vial  dan  dihitung  %  rendemennya.  Hasil perhitungan % rendemen ekstrak etil asetat fungi tanah muara dapat dilihat pada Tabel II.

## E. Skrining Kandunga Senyawa
Skrining  kandungan  senyawa  pada ekstrak isolat fungi tanah muara dilakukan untuk mendeteksi golongan  senyawa yang terkandung  dalam  ekstrak  etil  asetat.  Dari hasil  optimasi  eluen  didapatkan  eluen diklorometana  :  metanol  (9,5  :  0,5)  dan hasil elusi golongan senyawa
menggunakan lempeng KLT pada panjang gelombang  254  nm  dan  365  nm  ditunjuk- kan pada Gambar 6 dengan nilai Rf secara berurutan  (A)  0,625;  (B)  0,65;  (D)  0,575; (E) 0,55 . Kondisi analisis yang digunakan pada  penelitian  ini  adalah  fase  diam lempeng  KLT  F 254 ,  fase  gerak  diklorome- tana  :  metanol  (9,5  :  0,5),  jarak  pengem- bangan 4 cm, penampak noda Dragendorff, vanilin H 2 SO 4 , dan FeCl 3 . Tabel III menun- jukkan hasil identifikasi golongan senyawa pada ekstrak isolat fungi tanah muara.
a b
Gambar 6. Hasil elusi ekstrak etil asetat menggunakan eluen diklorometana : metanol (9,5 : 0,5). Panjang gelombang secara berurutan (a) 254 nm dan (b)365 nm
Tabel II. . Data persen rendemen ekstrak etil asetat enam isolat fungi tanah muara
Sampel Volume media (mL) Bobot ekstrak (g) Pesen rendemen (%g/mL) IS2-BTG11-1-1 200 0,0195 0,0096 IS2-BTG11-2-1 200 0,026 0,013 IS2-BTG11-2-2 200 0,228 0,114 IS2-BTG11-2-3 200 0,182 0,091
A C D E A C D E
Tabel III. Identifikasi golongan senyawa ekstrak etil asetat fungi tanah muara
Sampel Hasil Uji Alkaloid Terpenoid/ Steroid IS2-BTG11-1-1 - + IS2-BTG11-2-1 - + IS2-BTG11-2-2 - + IS2-BTG11-2-3 - + IS2-BTG11-1-1 - +

## F. Uji Aktivitas Antibakteri
Pengujian  aktivitas  antibakteri  dil- akukan  dengan  menggunakan  ekstrak  etil asetat  isolat  fungi  tanah  muara  yang  diuji terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa. Digunakan  metode  pengujian  mikrodilusi untuk mendapatkan  data % penghambatan sesuai  dengan  protokol pada  Clinical  and Laboratory Standard Institute (CLSI). Me- dia  CAMHB  ( Cation  Adjusted  Mueller Hinton  Broth )  digunakan  pada  pengujian ini sebagai standarisasi kadar kation seperti Mg2+ dan Ca2+ dalam media Mueller Hin- ton  Broth .  Adanya  kation  sangat  ber- pengaruh terhadap pengujian aktivitas anti- bakteri karena  dapat mempengaruhi  integ- ritas  membran  sel  bakteri.Kontrol  positif dan kontrol negatif dalam pengujian diper- lukan  sebagai  pembanding  hasil  pen- gujian.Pada  penelitian  ini  digunakan  gen- tamisin sebagai kontrol positif dan DMSO
sebagai kontrol negatif. Sesuai dengan per- syaratan  pada  CLSI,  konsentrasi  gen- tamisin  yang  digunakan  adalah  1  µg/mL dengan % penghambatan pada metode pen- gujian mikrodilusi ≥ 80%. Tabel 4 merupa- kan hasil % penghambatan dari gentamisin sebagai kontrol positif dan DMSO sebagai kontrol negatif terhadap bakteri Pseudomo- nas aeruginosa.
DMSO sebagai kontrol negatif juga digunakan  sebagai  kosolven  ekstrak  etil asetat  dalam  media  CAMHB.  Sesuai dengan  protokol  yang  ditetapkan  pada CLSI, konsentrasi DMSO yang digunakan adalah 1%. Hal ini dikarenakan DMSO ter- masuk  kosolven  surfaktan  yang  dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri  apabila konsentrasinya melebihi 1%. Hasil % peng- hambatan  ekstrak  etil  asetat  hasil  fermen- tasi  fungi  tanah  muara  dicantumkan  pada Tabel IV dan diagram batang pada Gambar 7.
Tabel IV. Tabel penghambatan ekstrak fungi tanah muara
Kode Fungi Rerata Penghambatan Per- tumbuhan Bakteri (%) SD CV (%) Kontrol Positif 97,8 0,5 0,5 Kontrol Negatif 14,8 2,4 16,4 IS2-BTG11-1-1 34,4 2,4 17,8 IS2-BTG11-2-1 49,8 13,5 27,1 IS2-BTG11-2-2 37,2 7,7 20,7 IS2-BTG11-2-3 50,9 7,6 15,0
Hasil  dari  pengujian  aktivitas  anti- bakteri dengan metode mikrodilusi ekstrak etil  asetat  fungi  tanah  muara  memiliki  ak- tivitas antibakteri terhadap bakteri Pseudo- monas  aeruginosa didapat  hasil  persen penghambatan tertinggi yaitu pada ekstrak dengan  kode  IS2-BTG11-2-3  sebesar 50,9%  ±  7.6.  Sedangkan  nilai  pengham- batan terkecil ada pada isolat IS2-BTG11- 1-1  sebesar  34,4%  ±  2,4.  Ekstrak  dengan nilai  persen penghambatan  lebih  dari 50% diduga memiliki nilai IC 50 berada di bawah 50 µg/ml sehingga sampel IS2-BTG11-2-3 dapat  diteliti  lebih  lanjut  untuk  dilakukan isolasi senyawa aktif dan penentuan IC 50 .
Berdasarkan hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak etil asetat fungi tanah muara, keempat ekstrak dapat dipas- tikan  mengandung  senyawa  golongan  ter- penoid. Keempat ekstrak tersebut ada pada sampel  IS2-BTG11-1-1,  IS2-BTG11-2-1, IS2-BTG11-2-2, IS2-BTG11-2-3. Senyawa tunggal  yang  bertanggung  jawab  terhadap aktivitas  antibakteri  belum  secara  pasti
diketahui.  Maka,  diperlukan  isolasi  dan karakterisasi  senyawa  aktif  ekstrak  fungi. Fungi memiliki beberapa metabolit sekunder  yang  memiliki  aktivitas  antibak- teri,  di  antaranya  alkaloid,  terpenoid,  ster- oid, poliketida, lipid dan peptida (Rateb & Ebel,  2011).  Terpenoid  merupakan  sen- yawa  metabolit  sekunder  yang  diproduksi oleh tumbuhan. Selain pada tumbuhan, ter- penoid juga ditemukan pada beberapa jenis fungi,  salah  satunya  fungi marine .  Terpe- noid yang dihasilkan marine fungi memiliki berbagai  macam  aktivitas  biologis  seperti sitotoksik,antibakteri,  antifungi,  antivirus, antiinflamasi, dan inhibitor aktivitas enzim (Jiang et  al .,  2020).  Terpenoid  memiliki efek  melemahkan  dinding  sel  bakteri hingga sel bakteri menjadi lisis (Di Pasqua et al., 2007). Terpenoid yang diisolasi dari tanaman Aspergillus  versicolor memiliki mekanisme antibakteri dengan menipiskan lipid bilayer membrane , sehingga berakibat pada rusaknya membran sel dan sel menjadi lisis (Harnvoravongchai et al ., 2018).
Gambar 7. Diagram batang nilai persen penghambatan ekstrak etil asetat fungi tanah muara Desa Kalinaun Sulawesi Utara

## IV.KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil dan pembahasan dari  penelitian  yang  telah  dilakukan,  ada empat  isolat  yang  memiliki  aktivitas  anti- bakteri  berdasarkan  uji  antagonis  yaitu:
IS2-BTG11-1-1, IS2-BTG11-2-1, IS2- BTG11-2-2,  IS2-BTG11-2-3.  Berdasarkan skrining  golongan  senyawa  ekstrak  fungi tanah  muara,  menunjukkan  hasil  positif pada  uji  terpenoid.  Namun  menunjukkan hasil negatif pada uji alkaloid. Nilai peng- hambatan    ekstrak  etil  asetat  fungi  tanah muara  terhadap  penghambatan  pertum- buhan  bakteri Pseudomonas  aeruginosa berturut-turut terbesar hingga terkecil : IS2- BTG11-2-3 (50,9% ± 7,6); IS2-BTG11-2-1 (49,8% ± 13,5); IS2-BTG11-1-1 (34,4% ± 2,4); IS2-BTG11-2-2 (37,2% ± 7,7).

## KONFLIK KEPETINGAN
Seluruh penulis menyatakan bahwa tidak  ada  konflik  kepentingan  dalam penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Clinical and Laboratory Standards Institute. (2012). Methods for Dilution Antimi- crobial Susceptibility Tests for Bacte- ria  That  Grow  Aerobically ;  Ap- proved  Standard  —  Ninth  Edition
(Vol. 32, Issue 2). Pennsylvania.
Dangi,  P.,  Sharma,  M.,  &  Choudhary,  M.
(2014). Actinomycetes: Source, Iden- tification, and Their Applications. In Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci (Vol. 3,
Issue 2). http://www.ijcmas.com Di Pasqua, R., Betts, G., Hoskins, N., Ed- wards, M., Ercolini, D., & Mauriello, G. (2007). Membrane toxicity of an- timicrobial  compounds  from  essen- tial oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry , 55 (12), 4863–4870. https://doi.org/10.1021/jf0636465
Harnvoravongchai,  P.,  Chankhamhaeng- decha, S., Ounjai, P., Singhakaew, S., Boonthaworn,  K.,  &  Janvilisri,  T. (2018).  Antimicrobial  effect  of  asi- atic acid against Clostridium difficile
is associated with disruption of mem- brane  permeability. Frontiers  in  Mi- crobiology , 9 (SEP), 2125. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.0
2125
Hernández-Montiel,  L.  G.,  Ochoa,  J.  L., Troyo-Diéguez,  E.,  &  Larralde-Co- rona, C. P. (2010). Biocontrol of post- harvest  blue  mold  (Penicillium  itali- cum  Wehmer)  on  Mexican  lime  by marine  and  citrus  Debaryomyces hansenii  isolates. Postharvest  Biol- ogy and Technology , 56 (2), 181–187. https://doi.org/10.1016/j.post- harvbio.2009.12.010
Jagschies,  G.,  Lindskog,  E.,  Lacki,  K.,  &
Galliher, P. (2018). Biopharmaceuti- cal processing: development, design, and  implementation  of  manufactur- ing processes .
https://www.google.com/books?hl=i d&lr=&id=b9F1DQAAQBAJ&oi=f nd&pg=PP1&dq=Biopharmaceuti- cal+Processing:+Development,+De- sign,+and+Implementa- tion+of+Manufacturing+Pro- cesses.+Development,+De- sain,+and+Implementation+of+Man- ufacturing+Pro- cesses&ots=B9VWD0bhDJ&sig=08 wOTsA_ZpJfvS6hvlijPwhUa8A
Jiang,  M.,  Wu,  Z.,  Guo,  H.,  Liu,  L.,  & Chen,  S.  (2020).  A  Review  of  Ter- penes  from  Marine-Derived  Fungi: 2015–2019. Marine  Drugs , 18 (6), 321. https://doi.org/10.3390/md18060321 Jumiyati,  Bintari,  S.  H.,  &  Mubarok,  I. (2012).  ISOLASI  DAN  IDENTIFI- KASI  KHAMIR  SECARA  MOR- FOLOGI  DI  TANAH  KEBUN
WISATA  PENDIDIKAN  UNIVER-
SITAS  NEGERI  SEMARANG. Bi- osaintifika: Journal of Biology & Bi- ology Education ,
4 (1). https://doi.org/10.15294/biosainti- fika.v4i1.2265
Karwehl, S., & Stadler, M. (2016). Exploi- tation  of  fungal  biodiversity  for  dis- covery  of  novel  antibiotics. Current
Topics  in  Microbiology  and  Immu- nology , 398 , 303–338. https://doi.org/10.1007/82_2016_49
6
Khandavilli,  R.  (2016).  Fungal  phyloge- netic diversity in estuarine sediments of  Gautami  Godavari  River,  Andhra Pradesh,  India. Current  Research  in Environmental & Applied Mycology ,
6 (4),
268–276. https://doi.org/10.5943/cream/6/4/4
Lee, J., & Zhang, L. (2014). The hierarchy quorum  sensing  network  in  Pseudo- monas aeruginosa. Protein and Cell ,
6 (1),
26–41. https://doi.org/10.1007/s13238-014-
0100-x
Mittal, R., Khandwaha, R. K., Gupta, V., & P. K. M., & Harjai, K. (2006). Pheno- typic characters of urinary isolates of Pseudomonas aeruginosa & their as- sociation with mouse renal coloniza- tion. Indian  J  Med  Res , 123 ,  67–72. https://www.researchgate.net/publi- cation/7211187_Phenotypic_charac- ters_of_urinary_isolates_of_Pseudo- monas_aeruginosa_their_associa- tion_with_mouse_renal_colonization Murray,  C. J. L., Ikuta, K.  S., Sharara, F.,
Swetschinski,  L.,  Aguilar,  G.  R., Gray,  A.,  Han,  C.,  Bisignano,  C., Rao, P.,  Wool, E., &  others. (2022). Global burden of bacterial antimicro- bial  resistance  in  2019:  a  systematic analysis. The  Lancet , 399 (10325), 629–655.
Nevalainen,  H.,  Kautto,  L.,  &  Te’O,  J. (2014).  Methods  for  isolation  and cultivation  of  filamentous  fungi. Methods in Molecular Biology , 1096 , 3–16.  https://doi.org/10.1007/978-1- 62703-712-9_1
Rateb, M. E., & Ebel, R. (2011). Secondary metabolites  of  fungi  from  marine habitats. In Natural Product Reports (Vol. 28, Issue 2, pp. 290–344). The Royal Society of Chemistry. https://doi.org/10.1039/c0np00061b Swapna,  P.  K., & Lalchand, P. D.  (2016).
Fungal  biodiversity  of  a  library  and
cellulolytic activity of some fungi. In- dian Journal of Pharmaceutical Sci- ences , 78 (6), 849–854.
https://doi.org/10.4172/pharmaceuti- cal-sciences.1000193
Thatoi, H., Behera, B. C., & Mishra, R. R.
(2013).  Ecological  role  and  biotech- nological  potential  of  mangrove fungi: A review. Mycology , 4 (1), 54– 71.
https://doi.org/10.1080/21501203.20
13.785448 World  Health  Organization.  (2020). The Top 10 Cause of Death .
https://www.who.int/news- room/fact-sheets/detail/the-top-10- causes-of-death World  Health  Organization.  (2022). WHO Coronavirus  (Covid-19)  Dashboard . https://covid19.who.int/