## PRODUKSI EPIGALLOCATECHIN GALLATE PADA  KULTUR IN VITRO KALUS CAMELLIA SINENSIS SEBAGAI KANDIDAT PANGAN FUNGSIONAL
PRODUCTION Epigallocatechin gallate in Vitro Camellia sinensi s Culture Callus as Functional Food Substitute
Sutini*)
Agrotechnology Department of Agriculture Faculty UPN ”Veteran” East Java Email :tien_basuki@yahoo.com

## ABSTRACT
Epigallocatechin  gallate (EGCG)  were  secondary  metabolite  in  tea  (Camellia sinenis)  as  anti  obecity  dan  degenerative  syndrom.  EGCG  in  tea  act  as  bioactive  by hydroxyl group and galoil that could act as functional food substitute. Problem to find epigallocatechin gallate from tea were season dependent, need a large area, and low productivity.  By  these  mean epigallocatechin  gallate production  by  in  vitro  culture. These technique could overcaming all that problem above. General purpose of these research  were  to  find invitro EGCG  production  technique.  Method  to  gain  these purpose were : (1)  Callus induction by explant sprout tea leaves in media  with  many variance  grown  culture  (2)  Sub  culture  callus  by  using  same  media  in  induction method  (3)  qualitative  analisys  EGCG  callus  compound.  Result  of  these  research; callus  hand  retention  time  (tR)  on  High  Performance  Liquid  Chromatography  for  6 minutes, same as EGCG standart. EGCG had potential as aditive functional food and baverage  that had astringent or bitter taste
Key words : Epigallocatechin gallate, HPLC, retention time, Camellia sinensis

## ABSTRAK
Epigallocatechin  gallate (EGCG) adalah  metabolit  sekunder  yang  terdapat pada  tanaman  teh  (Camellia  sinensis  )    sebagai  bahan  anti  obesitas  dan  penyakit degeneratif. EGCG  dalam   teh  bertindak sebagai senyawa bioaktif karena memiliki gugus  hidroksil  dan  galoil  yang  dapat  sebagai kandidat  pangan fungsional.    Kendala memperoleh epigallocatechin  gallate dari  tanaman  teh  diantaranya:  sangat tergantung  musim,  memerlukan  lahan  yang  luas,  dan    tingkat  produksinya  relatif rendah.  Oleh  karena  itu  produksi epigallocatechin  gallate perlu  dikembangkan dengan  teknik kultur in vitro . Teknik ini dapat  mengatasi kendala-kendala tersebut  di atas.  Tujuan  penelitian  secara  umum  adalah  memperoleh  teknik  produksi EGCG secara  invitro  melalui  teknik  kultur  kalus . Metode  yang  dilakukan  untuk  mencapai tujuan  tersebut  adalah:  (1)  induksi  kalus  dengan  menanam  eksplan  potongan  pucuk daun  teh  pada  media  dengan  berbagai  zat  pengatur  tumbuh,  (2)  Sub  kultur    kalus menggunakan  media  yang  sama  seperti  saat  induksi    (3)  Analisis  kualitatif  senyawa EGCG  kalus.  Hasil  penelitian  ini  berupa  kalus  yang  memiliki  waktu  retensi  (t R )  pada High-Performance Liquid Chromatography  selama 6 menit  yang sama dengan  waktu retensi  EGCG    standar.    Senyawa  EGCG    berpotensi    sebagai  bahan  adtif  pada minuman-makanan fungsional terkait dengan rasa kelat atau pahit.
Kata kunci: Epigallocatechin gallate, HPLC, waktu retensi , Camellia sinensis
PENDAHULUAN Senyawa Epigallocatechin gallate (EGCG) adalah senyawa metabolit  sekunder    yang  ada  dalam pucuk  daun  teh  muda,  berkerangka dasar  C 6 -C 3 -C 6 termasuk  struktur 2- phenylbenzopyran
yang mudah
dioksidasi  pada  cincin  B  (Marais  2007), menyebabkan pembukaan atom oksigen (Caffin  dkk.,  2004)  sehingga  bersifat meningkatkan  reaktivitas  terhadap:  (1) ikatan  polimer  biologi  (2)  ikatan  dengan logam berat (3) mengkatalis transportasi elektron  (4)  menangkap  radikal  bebas. Keempat sifat tersebut membuat  EGCG bersifat  bioaktif,  memiliki  kasiat  anti obesitas  yang    berperan  sebagai  zat untuk menghancurkan lemak (Rahardjo,
2005), juga antioksidan yang
memberikan  efek  penetralisasi  kuat terhadap senyawa radikal bebas endogen  dan  eksogen  (Murphy  Coman,
1999). Radikal bebas tersebut menyerang  sistem  intraseluler  dalam berbagai jaringan tubuh sehingga menyebabkan munculnya
tumor,
kanker, dan berbagai
penyakit degeneratif lainnya. Melalui  Kementrian  Pertanian Republik  Indonesia    Rencana  Strategis Kementrian 2010 ditetapkan teh sebagai salah satu Komoditas Unggulan Nasional. Menurut Julian 2008,
Indonesia  adalah  negara  pengekspor teh  yang  mendapat  peringkat  ke  3  di tingkat  internasional  dengan  kontribusi sebesar  5  % dari  produk  teh  dunia, namun  kontribusi  ini    masih  di  bawah kontribusi  Cina  dan  Vietnam.  Namun nenurut Nurunisa 2011, subsistem
budidaya agribisnis teh Indonesia sedang dihadapkan oleh kondisi penurunan  luas  area  perkebunan.  Hal ini  tentu  berpengaruh  terhadap  volume produksi  teh Indonesia.  Selama  periode 2000-2009  telah  terjadi  penurunan  luas area  perkebunan  teh  sebesar  2,18 persen  setiap  tahun.  Penurunan  luas areal  ini  kemudian  berdampak  pada penurunan produksi teh nasional, dimana  selama  tahun  2000  hingga tahun  2010  terjadi  penurunan  produksi
rata-rata  sebesar  0,83  persen.  Di  sisi lain,  penurunan  kinerja  di  subsistem budidaya  tersebut  juga  mempengaruhi subsistem  pemasaran  teh  Indonesia. Pangsa  pasar  teh  Indonesia  cenderung terus menurun akibat adanya kecenderungan penurunan volume ekspor  teh  dari  tahun  ke  tahun. Berbagai  kendala  yang  dihadapi  oleh para  produsen  teh  nasional  nyatanya saling  terkait  antar  subsistem.  Oleh karena  itu  produksi  metabolit  sekunder epigallocatechin  gallate (EGCG)  perlu dikembangkan  salah  satu  alternatifnya dengan    teknik  kultur in  vitro melalui kultur kalus.
Kultur  kalus  adalah    biakan  dari bagian  atau  jaringan  tanaman  yang telah  dipisahkan  dari  tanaman  asalnya yang ditumbuhkan dalam keadaan steril pada  suatu  media  buatan,  dengan penambahan nutrisi sehingga sel-selnya mampu tumbuh dan mengadakan pembelahan  menjadi  masa  sel  yang tidak terdeferensiasi yang disebut kalus. Kalus  adalah  kumpulan  sel-sel  yang terbentuk  dari  sel-sel  parenkhim  yang membelah  secara  terus  menerus  dan tidak  terorganisir.  Di  alam  ( in  vivo) fenomena  pembentukan  kalus  terjadi pada  penyakit  tumor  tanaman  yang disebabkan infeksi oleh mikroorganisme bakteri Agrobacterium tumefaciens pada bagian  tanaman  yang  terluka  akibat gigitan  serangga  atau  nematoda.  Kalus yang  diinisiasi  dan  dipelihara  dalam media  secara in  vitro dapat  digunakan untuk  tujuan  mempelajari  pertumbuhan dan perkembangan tanaman atau untuk mendapatkan metabolit sekunder
Kultur in  vitro tanaman  yang dipelihara  di  bawah  kondisi  lingkungan nutrisi,  dan  zat  pengatur  tumbuh  yang terkontrol dijamin
menghasilkan metabolit  yang  kontinyu  (Mondal  dkk., 2004).  Alasan  penggunaan    Kultur in vitro yang  berbentuk  kalus  dalam produksi metabolit
sekunder epigallocatechin  gallate diantaranya:  (a) jaringan  kalus    tidak  berbentuk,  tidak terorganisasi, (b) dapat  digunakan pada kegiatan  kultur  selanjutnya  tanpa  harus
menginisiasi  ulang,  (c)  dapat  disimpan pada keadaan
tertentu/sesuai kebutuhan    kalus  tersebut  misal  untuk plantlet hingga  tanaman  dewasa,  (d)
pembelahan  sel  terus  menerus  terjadi sehingga berpotensi tinggi untuk diproduksi.  Produksi  senyawa    EGCG pada  kultur in  vitro tercapai  tertinggi pada  kondisi  kalus  tua  (umur  4  bulan) dan  pada  umur  kalus  4  bulan  ini diperoleh  kadar  yang  tertinggi.  Kondisi ini    menunjukkan  bahwa  kultur in  vitro mempunyai prospek untuk dikembangkan menjadi sebuah teknologi  produksi    EGCG  (Sutini, 2009). Penelitian  ini  bertujuan  seperti tersebut berikut: 1) Mendapatkan kondisi  pertumbuhan  kalus  teh  untuk produksi  senyawa epigallocatechin gallate .  2)  Mendapatkan  kondisi  optimal untuk  memperoleh  konsentrasi  ZPT dalam  media  produksi    kalus  secara in vitro.  3) Memperoleh  kondisi  optimal untuk produksi senyawa epigallocatechin gallate , kemudian mengisolasi,  mengidentifikasi  kalus    ( in vitro )    secara    kualitatif    sebagai  upaya untuk  mendapatkan  produk  metabolit sekunder  EGCG  yang  berperan  untuk menunjang keberadaan zat aditif makanan-minuman fungsional yang berguna untuk meningkatkan kesehatan. Substansi organik metabolit
sekunder EGCG ini  dapat  diisolasi   dari kultur kalus (Mulabagal dkk., 2004), dan dapat  diidentifikasi  menggunakan  High- Performance  Liquid  Chromatography (HPLC).

## BAHAN METODE Bahan
Bahan  yang  digunakan  yaitu: bahan  jaringan  pucuk  daun  muda  dan kalus Cameliia  sinensis  L, standar EGCG,  bahan  kimia  kultur  in  vitro: media  Murashige  &  Skoog  diantaranya: makronutrien,  mikronutrien,  myoinositol,
Vitamin B5, dan sukrosa. 2.4- Diklorofenoksi-asetat (2,4D), kinetin, fenilalanin,  asam  salisilat,  etanol,  Na-
hypoklorit, akuades steril, larutan banlate  5%.  Untuk  ekstraksi:  metanol, akuades,  kloroform,etil  asetat.  Untuk HPLC:  asam  asetat,  metanol-aqua  pro injeksi( 15:85).
Alat-alat: 1.  High-performance liquid chromatography (HPLC) Agilent 1100 series  low  pressure  gradient  dengan detektor Spektrofotometer UV-ST diode  array,  kolom  RP  18 Waters  µ Bondapak 10 µm, 3.3 x 300mm 2.  Pengaduk Vortex (Vortex Mixer) 3.  Ultrasonik (Julabo Labortechnik GMBH) 4.  Sentrifuge (Hettich) 5.  Neraca  analitik Direct  Reading  micro Balance (Shimadzu), kepekaan 0,001 mg  dan “  Nylon membran filter “  0,2 μm ( Whatman ).

## METODE  PENELITIAN
1.  Optimasi  penumbuhan  kalus  pada medium  MS,  dengan    komposisi medium MS   dengan berbagai jenis ZPT  dan    variasi  konsentrasi  ZPT: NAA:K  masing  0,5  ppm,      2,4-D:K masing-masing  1  ppm,  NAA:2IP masing masing 0,5 ppm dan   2,4-D :BAP masing masing 0,5:1 ppm.
2.  Subkultur  (subkultur  pertama)  pada media baru.
Subkultur  dilakukan    dengan
cara  memindahkan  kalus  pada  media baru  secara  aseptis  diinkubasi  dalam ruang  kultur  pada  suhu  25  C  selama  4 minggu  dengan  pencahayaan  untuk pemeliharaan  kalus  dan  perbanyakan eksplan  sehingga  mendapatkan  materi yang  cukup  untuk  analisis  senyawa flavan-3-ol.  Kalus  yang  disubkulturkan dipilih  bagian  yang  berwarna  putih kehijauan  karena  pada  bagian  tersebut sel-selnya masih aktif mengalami pembelahan. Kalus hasil subkultur diinkubasi  lagi    digunakan  sebagai bahan ekstraksi.
3.  Ekstraksi
Ekstraksi  adalah    suatu  metode pemisahan  didasarkan    dari  dua  cairan yang tidak saling campur bila
ditambahkan zat yang dapat larut dalam keduanya,  maka  zat  tersebut  akan terdistribusi dalam kedua sistem dengan perbandingan yang
tetap pada temperatur tertentu. Ekstraksi dipengaruhi  oleh  koefisien  distribusi, volume  cairan  dan  jumlah  pengulangan ekstraksi. Untuk
mendapatkan
epigallocatechin gallate ekstraksi
dilakukan  menurut  metode  Shirai et  al.,
(1994).  Hasil  ekstraksi  yang  diperoleh diamati menggunakan HPLC.
Ekstraksi  kalus  teh  dilakukan dengan cara kalus dihaluskan
kemudian    ditimbang  dengan  teliti (kalus  telah  ditentukan  kadar  airnya dengan metode gravimetri) dan ditambah  aquades  panas  temperatur 70-80 ºC, didiamkan selama ± 30 menit. Setelah  dingin  disaring,  lalu  dimasukan ke  dalam  labu  ukur  50,0  mL.  Ampas kalus  teh  dibilas  dengan  10  mL  air panas  sebanyak  2  kali,  didiamkan  ±  30 menit  kemudian  disaring.  Hasil  ekstrak kedua  dan  ketiga  dikumpulkan  pada labu ukur yang sama, kemudian ditambahkan  aquades  sampai  50,0  mL. Larutan  ekstrak  teh,  diambil  25,0  mL kemudian  dikocok  pelan  dengan  25  mL kloroform  dalam  corong  pisah  maka akan  terbentuk  fase  air.  Dari  fase  air yang didapat, diambil sebanyak 25,0 mL kemudian diekstraksi dengan 25 mL etil asetat  sebanyak  3  kali  terbentuk  fase etil  asetat.  Fase  etil  asetat    ditampung dan  diuapkan  di  dalam  almari  asam sampai  kering,  maka akan  diperoleh ekstrak  EGCG  dari  fraksi  etil  asetat. Ekstrak  EGCG  dilarutkan  dalam  5.0  mL metanol (Karlina 2006).
4.  Identifikasi  kalus  EGCG  dengan HPLC
Identifikasi
epigallocatechin gallate kalus  teh  dengan  High- Performance  Liquid  Chromatography (HPLC),  mekanismenya  berdasarkan proses  adsorbsi  dan  partisi,  yaitu pemisahan  ditentukan  oleh  distribusi solut  dalam  dua  fase  gerak    atau ditentukan oleh kelarutan solut. Optimalisasi  kondisi  HPLC  seperti:  (1) penentuan  fase  gerak  berdasar  sifat
fisika  kimia epigallocatechin  gallate yaitu bersifat polar sehingga
epigallocatechin  gallate sangat  mudah larut dalam air. Untuk itu digunakan fase gerak  yang  relatif  polar    seperti  asam asetat/air  (98:2  v/v)  dalam  reservoir  A, dan  asetonitril  dalam  reservoir  B,  asam asetat  berguna  untuk  menghilangkan ekor dari peak/puncak.  Fase gerak lain seperti  metanol : air : asam asetat = 20 :  75  :  5  v/v/v  juga  dapat  digunakan (Sakata et  al .,  2001).  (2)  Penggunaan kolom  yang  relatif  non  polar,  seperti kolom  µbondapak  C 18 ,  (3)  pengukuran dengan  detektor  foto  diode  array  (PDA) dengan  panjang  gelombang  antara  200 dan 500 nm, karena biasanya Epigallocatechin gallate panjang maksimum  yang  digunakan  sekitar  UV 280  nm.  (4)  Penentuan    gradien  elusi pada  kecepatan  aliran  1ml/menit  pada temperatur 35°C.
Setelah  kondisi  optimal,  sampel diinjekkan  pada  HPLC  sesuai  kondisi pada  saat  optimasi  sehingga  diperoleh kromatogram,  yang  terdiri  dari  profil puncak-puncak  komponen  sampel  yang disuntikkan. Dari puncak-puncak tersebut,  diperoleh  data  waktu  retensi dan  tinggi  puncak  atau  area  puncak. Waktu  retensi  (t R )  yaitu  waktu  yang diperlukan  sampel  mulai  saat  injeksi sampai  keluar  dari  kolom  dengan sinyal/kromatogram spesifik yang terdeteksi  oleh  detektor.  Waktu  retensi dapat digunakan untuk analisis kualitatif.
Kondisi  operasional  HPLC:  (1) temperatur    diseting  30ºC,    (2)  panjang gelombang  274,8  nm,    (3)  fase  gerak terdiri  dari  metanol:  air  :  asam  asetat  = 20:75:5  (4)  laju alir  fase gerak  1 mL/ menit.  (5)  Pembuatan  larutan  standar EGCG dengan berbagai macam konsentrasi dengan kadar 5, 10, 15, 20, dan  25  ppm,  kemudian  masing-masing konsentrasi disuntikkan sebayak 100 µ L pada  instrumen  HPLC  dengan  kondisi operasional yang sudah di seting,  maka akan  didapat  kromatogram  dengan waktu retensi(t R ). (6) Pembuatan larutan ekstrak  kalus  EGCG  dalam  metanol disonikasi selama 5 menit untuk
menghilangkan  gas-gas  yang  terdapat dalam  larutan  agar  tidak  menyumbat kolom, kemudian larutan disaring dengan  kertas  saring  Whatmann  0,2 m.    Untuk  memperjelas  puncak kromatogram,  pada  larutan  ekstrak kalus  ditambahkan  standar  15  ppm kemudian    disuntikkan  sebayak  100 µ L pada  instrumen  HPLC  dengan  kondisi operasional yang sudah di seting, maka akan  didapat  kromatogram  dengan waktu retensi.
Identifikasi dapat dilakukan  dengan cara membandingkan waktu  retensi  standar  EGCG  dengan ekstrak kalus EGCG.

## HASIL dan PEMBAHASAN
Hasil Hasil optimasi respon pertumbuhan kalus dari berbagai berbagai  jenis  ZPT  dan    variasi konsentrasi  ZPT:  NAA:K  masing  0,5 ppm,      2,4-D:K  masing-masing  1  ppm, NAA:2IP  masing  masing  0,5  ppm  dan 2,4-D  :BAP  masing  masing  0,5:1  ppm terdapat pada Tabel 1.
Hasil  Induksi  kalus  teh  pada umur  empat  minggu  setelah  induksi, kalus  terbentuk  pada  bagian  tepi    yang dipotong  kemudian  melebar  sampai seluruh permukaan eksplan membentuk kalus  semua.  Hasil  induksi  kalus  teh seperti tersebut pada Gambar 1(a-b)
Hasil subkultur kalus hasil subkultur pertama
menampakkan perubahan diameter yang mudah
diamati  diameter  kalus    mencapai    ±  1 cm  pada  umur  empat  minggu  setelah tanam  (Gambar 2)
Tabel  1.  Respon  pertumbuhan  kalus  ekplan pucuk  daun  dengan    variasi  ZPT  dan konsentrasi ZPT (ppm) Respon minggu ke 1 2 3 4 2,4-D:K (1:1) 2,4-D:K (1:1) NAA:2IP (0.5:0.5) 2,4-D :BAP (0.5:1) Hijau meng gembung
Hijau meng gembung Hijau pucat Hijau meng gembung
Luka tepi mun cul kalus
Luka tepi muncul kalus Luka tepi muncul kalus Luka tepi mun cul kalus kalusø 0.1 cm
kalus ø 0.5 cm
Keco klatan
kalus ø 0.5 cm Membu suk
kalus Ø 1 cm Me nge ring kalus ø 0.5 cm
Gambar:  1a. kalus terbentuk pada
bagian tepi  yang dipotong
Gambar:  1b. Kalus melebar sampai seluruh permukaan
eksplan membentuk kalus semua .
Gambar 2. diameter kalus  mencapai  ±
1 cm pada umur empat minggu setelah tanam
Hasil  isolasi  dan  identifikasi kalus  EGCG  dengan  HPLC  dilakukan dengan  cara  membandingkan  waktu retensi  (t R ) standar EGCG, dan ekstrak kalus.  Hasil  identifikasi  standar  EGCG dapat  dilihat  pada  Tabel  2  dan kromatogram  standar  EGCG  dapat dilihat pada Gambar  3.  Hasil identifikasi ekstrak  kalus  EGCG  dapat  dilihat  pada Tabel 3 dan kromatogram ekstrak kalus EGCG dapat dilihat pada Gambar 4.
Tabel  2.Waktu  retensi  (t R )    standar EGCG
Tabel 3.Waktu retensi  (t R ) ekstrak kalus
EGCG No Konsentrasi EGCG standar waktu  retensi (t R ) EGCG standar 1 2 3 15ppm 20ppm 25ppm 6.38 6.32 6.36 Rata-rata 6.37
No Konsentrasi EGCG ekstrak kalus waktu retensi (t R ) EGCG ekstrak kalus 1 2 3 15ppm 20ppm 25ppm 6.07 6.06 6.17 Rata-rata 6.07
Gambar 3. Kromatogram EGCG standar

## PEMBAHASAN
Pada Tabel 1, respon pertumbuhan  kalus  ekplan  pucuk  daun dengan    variasi  ZPT  dan  konsentrasi pada umur satu sampai  umur 3 minggu pertumbuhan  kalus  mencapai  diameter kalus ± 0.1-0.5 cm. Namun setelah umur 4  minggu  pertumbuhan  kalus  sangat lambat  bahkan  kalus    dari  media  yang ditambah ZPT 2,4-D:K (1:1) membusuk. Sedangkan media yang ditambah
NAA:2IP (0.5:0.5) mengering. Selanjutnya  eksplan  dipilih  dari  pucuk daun  dengan    medium  MS  ditambah dengan 2,4-D 1 ppm + Kinetin  1 ppm.
Pada  Gambar  1a-b,  eksplan dari  pucuk  daun  pertumbuhan  kalus ditandai  dengan  proses  berturut-turut dari  penggembungan  eksplan  (1a), kemunculan  kalus  pada  tepi  eksplan yang  terpotong  hingga  mencapai  ke seluruh permukaan eksplan (1b). Gambar  1a-b  ini  menunjukkan  bahwa
jaringan parut/kalus terbentuk dari respon  perlindungan  tanaman  untuk memperbaiki  jaringan  yang  terluka. Data  ini  relevan  dengan  pendapat Evans et  al., (2003)  ketika  jaringan tanaman  dilukai  kemudian  ditempatkan diatas  media  padat,    kalus  akan terbentuk  pada  permukaan  organ  yang terpotong  untuk  merespon/melindungi sebagai  respon  perlindungan  tanaman untuk memperbaiki jaringan yang rusak. Pada  Gambar  2,  kalus  mulai terbentuk dengan terjadi diferensiasi sel ditandai  dengan  perkembangan  kalus. Relevan dengan penelitian  Aoshima, Y. (2005) penggunaan eksplan dari kecambah  pucuk  daun  teh  dapat meningkatkan deferensiasi kalus hingga mencapai 43%. Menurut  Evans et  al., (2003), induksi kalus diawali dengan menempatkan  eksplan  pada  media kultur  padat  secara  aseptis,  kemudian berproliferasi  mulai  dari  permukaan yang terluka/terpotong melebar ke seluruh permukaan kalus.
Menurut  peneliti  apabila  kalus sudah  mulai  berproliferasi  dengan  luas ±1-2  cm  sebaiknya  segera  dilakukan perbanyakan/sub kultur untuk
mendapatkan  masa  yang  lebih  banyak, menghindari  kontaminasi  dan  kematian sel (Sutini, 2010).
Perbanyakan  kalus  pada  media baru  disebut  subkultur.  Kalus  hasil subkultur  pertama  setelah  umur  empat minggu terlihat diameter kalus mencapai ±  1  cm.    Pada  umur  12  minggu  terlihat kalus  tumbuh  dengan  diameter  kalus mencapai  ± 2 cm (Gambar 18).
Pada  Tabel  2,  diperoleh    data bahwa waktu retensi  (t R ) EGCG standar antara  6.32-6.38  sehingga  rata-rata diperoleh  6.37,  data  ini  diperkuat dengan  Gambar 3.
Pada  Tabel  3  diperoleh    data bahwa  waktu  retensi    (t R )  ekstrak  kalus EGCG  rata-rata  6.07,  data  ini  terdapat perbedaan  0.30  dari  standar,    hal  ini dikarenakan  kalus  selain  mengandung EGCG  diduga  terdapat  senyawa  lain
Gambar 4. Kromatogram EGCG kalus yang diadisi  standar EGCG 15,20,25 ppm, dengan HPLC Agilent 1100
sehingga waktu retensi terdapat perbedaan yang kurang bermakna.
Pada  Tabel  2  &  3,    diperoleh informasi  bahwa  waktu  retensi  (t R )  dari standar  EGCG,  ekstrak  kalus  pada kisaran  6,    hal  ini  menunjukkan  bahwa sampel  ekstrak    kalus    mengandung EGCG.
Hasil analisa kualitatif kromatogram  ekstrak  daun  teh    yang disuntikkan pada HPLC dengan kolom µ bodapak  C 18 ,  dengan  fase  gerak metanol : air : asam asetat = 20 : 75 : 5 v/v/v,    terlihat  ada  beberapa  puncak dengan  (t R )  yang  berbeda.  Puncak kromatogram yang sesuai dengan standar EGCG yaitu 6.60 menit. Kromatogram  dengan  puncak  6.60 menit  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak daun  teh  mengandung  EGCG  (Sutini, 2010).
Hasil  penelitian  menunjukkan waktu  retensi  (t R )  dari  standar  EGCG, ekstrak  kalus,    ekstrak  daun  the  pada kisaran  6,  yang  sama  dengan  pada ekstrak daun the maka kalus
mengandung EGCG Senyawa metabolit sekunder EGCG yang terkandung dalam daun the dan  ekstrak  kalus  dapat  sebagai  zat aditif makanan-minuman fungsional yang  berguna  untuk  meningkatkan kesehatan.  Seperti  yang  ditulis  oleh Nurunisa  2011,  manfaat  yang  dapat diperoleh  dari  meminum  teh  secara teratur diantaranya adalah dapat menurunkan  munculnya  risikopenyakit kanker  dan  radiovaskular,  menurunkan berat  badan,  mencegah  osteoporosis dan  merupakan  sumber  mineral  dan vitamin.  Sangat  dianjurkan  meminum teh  secara  teratur  sebanyak  4-5  kali sehari,  masing-masing  100  ml  untuk dapat memperoleh manfaat dari senyawa yang terkandung dalam the. Lesschaeve  I.  dan    Noble  C. 2005, dalam penelitiannya menyebutkan  bahwa  senyawa  EGCG pada  the/  coklat  murni  dapat  digunakan sebagai senyawa aditif pada makanan/minuman  terkait  dengan  sifat adstringen/kekelatan dan rasa
kepahitan,  tetapi  untuk  masing-masing
orang  tingkat  preferensi  kekelatan  dan rasa kepahitan senyawa EGCG
bervariasi.
Sebagai minuman  fungsional dosis  oral  sehari  untuk  menurunkan kolesterol bervariasi  adalah antara 1-10 cangkir.  Untuk  orang  Asia  dosis  yang umum  dikonsumsi  sebanyak  3  cangkir per  hari  the  yang  setara  dengan  90  mg EGCG (A. Qasheesh, 2004

## KESIMPULAN
Diperoleh  waktu  retensi  standar  EGCG dan  ekstrak  kalus  antara  6.07-  6.37, dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  kalus megandung EGCG.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Kepada:  1. DP2M  Ditjen  Dikti telah  mendanai  Hibah  bersaing  ini    TH 2006/2009.  2.  Laboratorium  F.  Farmasi Unair.  3.  Laboratorium  F.Pertanian Unibraw.

## DAFTAR PUSTAKA
A.  Qasheesh,  M.M.2004.  Herbs used for treatment of obesity. College of Pharmacy Department of Pharmacognosy.  King  Saud University: 50-61.
Caffin,  N.,  B. D’Arcy,  L.  Yao,  and    G. Rintoul.    2004.  Developing  an index  of  quality  for  Australian tea,  Rural  Industries  Research and  Development  Corporation, http://www.rirdc.gov.au.
Evans,  D.E.,  J.O.D.  Coleman,  and  A. Kearns.  2003.    Plant  Cell Culture, Bio Scientific Publishers, New York.
Julian.  2008.  Peran  jakarta Tea  Auction belum Optimal, Agro Indonesia. 2-8 September 2008. P. 21. Karlina 2006. Penetapan Kadar Epigallocatechin Gallate (EGCG)  Dalam  Daun  Teh Dengan  Metode  KCKT,  Skripsi Fakultas Farmasi Unair. Surabaya KementrianPertanianRepublikIndonesia. 2010. Rencana Strategis KementrianPertanian 2010-
2014.  Kementrian  Pertanian Republik Indonesia. Lesschaeve  I.  dan    Noble  C.  2005. Polyphenols:  factors  influencing their sensory properties and their effects  on  food  and  beverage preferences.
Marais,  J.P.J.,  B.E.  Deavours,  R.A.
Dixon,  and  D.  Ferreira.  2007. The stereochemistry of flavonoids.  In  The  Science  of Flavonoids  (ed),  E.  Grotewold, Springer, in press. Ohio. p. 1-47. Mondal TK, A. Bhattacharya, M. Laxmikumaran,    P.S.  Ahuja. 2004.  Recent  advances  of  tea ( Camellia sinensis ) biotechnology, Plant Cell,  Tissue and Organ Culture,76: 195 –254.
Mulabagal V, C. Lee, S. Lo, M.N. Satish, Y.  L.  Chien,  and  H.  Tsa.  2004. Studies  on  the  production  of some important secondary metabolites from medicinal plants  by  plant  tissue  cultures,
Botanical  Bulletin  of  Academia Sinica45:1-22. http://ejournal.sinica.edu.tw/bbas /content/2004/1/bot45101.pdf#se arch=%22elicitation%20review% 20plant%20camellia%20sinensis %2Bpdf%22. Murphy  Coman  Marjorie.  1999.  Plant
Products as Antimicrobial Agents Clinical, 12 (4):  564-582. Nurunisa,  V.  A.  2011.    Dayasaing  dan Strategi Pengembangan Agribisnis Teh Indonesia. Skripsi  Fakultas  Ekonomi  dan Manajemen  Institut  Pertanian Bogor.
Rahardjo  dan  Hermani. 2005. Tanaman Berkasiat  Anti Oksidan,  Penebar Swadaya. Jakarta.  p.82. Sakata, I., M. Ikeuchi, I. Maruyarna. and
T.Okuda.    2001.  Quantitative Analysis  of  (-)  Epigallocatechin Gallate in Tea Leaves by High- Performance Liquid Chromatography,    Yakugaku Zasshi, 111 (12) : 790-793. Sutini,  2009.  Studi  pembentukan kultur kalus Camellia sinensis L dan deteksi kandungan Epigallocatechin gallate -nya. Journal  of  Biological  Research. Unair. Surabaya. Sutini, 2010. Produksi Epigallocatechin Gallate Melalui Kalus Camellia Sinensis L , Dengan  Induksi
Elisitor,  Cu 2+ ,  Asam  Salisilat Dan Prekursor Fenilalanin. Disertasi. Program Pascasarjana Fakultas PertanianUniversitaBrawijayaM alang. Shirai,  T.,  Sato.  A.,  and  Hara  Y.
1994.   Epigallocatechin  gallate: the Major Causative  Agent of Green Tea- Induced  Asthma, Chest. 106 (18): 01-05. J. American  Society  for  Clinical Nutrition: 330S –5S.