Abstrak —Limbah  cair  industri  kertas  mengandung  lignin dalam  konsentrasi  tinggi.  Polimer  organik  tersebut  sulit didegradasi  di  lingkungan.  Lignin  dapat  didegradasi  oleh  enzim ligninolitik  yang  merupakan  enzim  pendegradasi    lignin. Degradasi limbah cair kertas oleh enzim ligninolitik ini akan lebih efisien jika dilakukan imobilisasi terlebih dahulu terhadap enzim ligninolitik yang digunakan. Imobilisasi enzim ligninolitik dengan menggunakan bentonit  akan dilakukan pada penelitian ini untuk melihat  pengaruhnya  terhadap  aktivitas  enzim  ligninolitik  dari konsorsium  kapang  Gliomastix  sp.  dan  Mycelia  sterilia.  Teknik imobilisasi  yang  digunakan dalam penelitian ini adalah adsorpsi. Berdasarkan  hasil  penelitian  didapatkan  hasil  aktivitas  tertinggi enzim  ligninolitik  terimobilisasi  bentonit  yaitu  laccase    849,54 U/ml, LiP 1227,6 U/ml dan MnP 199,72 U/ml.
Kata Kunci —Bentonit,
Imobilisasi enzim, Kapang, Ligninolitik.

## I. PENDAHULUAN
IGNIN  merupakan  polutan  organik  tinggi  yang  sulit didegradasi  di  lingkungan  karena  memiliki  struktur  kimia yang  kompleks  [1].  Beberapa  penelitian  menunjukkan  bahwa lignin  dapat  didegradasi  oleh  kapang  penghasil  enzim ligninolitik  [2].  Berdasarkan  Penelitian  [3],  diketahui  bahwa Gliomastix  sp.  dan  Mycelia  sterilia  merupakan  kapang  yang mempunyai  kemampuan  dalam  mendegradasi  lignin  sebesar 1.4  cm  dan  1.29  cm  pada  medium  padat  lignin  agar chlorampenicol (LAC)   dan sebesar 46.96% dan 44.76% pada medium  cair  lignin  chlorampenicol  (LC).  Menurut  [4], produksi enzim ligninolitik dari konsorsium terbaik menggunakan medium bagase tebu.
Enzim  pendegradasi  lignin  merupakan enzim ligninolitik, yang  merupakan  enzim  oksidatif    atau    enzim    non-spesifik yang    bekerja    melalui    mediator    bukan  protein.    Enzim  ini secara umum terdiri dari dua  kelompok  utama  yaitu  Laccase (Lac)  dan    Peroksidase.    Peroksidase    terdiri    dari  lignin peroksidase  (LiP)  dan  mangan peroksidase  (MnP)  [5].
Penggunaan    enzim    dalam    kondisi  bebas  pada  degradasi polutan  industri  sangat  tidak  ekonomis  karena  memiliki stabilitas yang rendah, serta pemanenan dan purifikasi produk yang  lebih  sulit,  dan  tidak  dapat  digunakan  dalam  proses teknologi yang sinambung [6]. Oleh karena itu perlu dilakukan imobilisasi  terlebih  dahulu.  Imobilisasi  adalah  pengikatan enzim  secara  fisik  pada  suatu  tempat  tertentu  yang  masih memiliki aktivitas katalitik [7]. Beberapa tahun terakhir, telah terjadi  peningkatan  pemanfaatan  mineral  lempung  alam untuk
proses  ini.  Salah  stu  jenis  mineral  lempung  tersebut  adalah bentonit.  Bentonit  memiliki  potensi  untuk  digunakan  sebagai support  material  imobilisasi  karena  memiliki  nilai  ekonomis yang  rendah  serta  tersedia  secara  alami.  Selain  itu,  bentonit juga  memiliki  luas  permukaan  yang  tinggi  yang  baik digunakan dalam metode adsorpsi imobilisasi enzim [8].
Pada  penelitian  ini  dilakukan  imobilisasi  enzim  lignolitik dengan  menggunakan  bentonit  untuk  melihat  pengaruhnya terhadap  aktivitas  enzim  ligninolitik  dari  konsorsium  kapang Gliomastix sp. dan Mycelia serilia dalam mendegradasi lignin.

## II. METODOLOGI

## A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret s.d Juli 2016. Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium  Mikrobiologi  dan Bioteknologi,  Jurusan  Biologi,  Fakultas  Matematika  dan Ilmu Pengetahuan  Alam,  Institut  Teknologi  Sepuluh  Nopember, Surabaya.
B. Alat, Bahan dan Cara Kerja

## 1) Subkultur Isolat Uji
Isolat  kapang  yang  digunakan  adalah  Gliomastix  sp.  (LM 1020) dan Mycelia sterilia (1041) kultur koleksi Laboratorium Mikrobiologi  dan  Bioteknologi  Jurusan  Biologi  Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya. Kedua isolat tersebut disubkultur  pada  medium  PDA-C  miring  (slant  agar)  dalam tabung reaksi secara duplo. Satu  kultur untuk kultur stok dan yang  lainnya  untuk  kultur  kerja.  Kultur  tersebut  diinkubasi selama 5-8 hari pada suhu kamar dalam kondisi aerob. Kultur stok  kemudian  disimpan  dalam  lemari  es  pada  suhu  4°C selama  30  hari  untuk  sediaan  biakan,  sedangkan  kultur  kerja digunakan dalam proses selanjutnya [9].
2) Pembuatan Medium Basal –Chloramphenicol
Medium basal dalam 1 L akuades dibuat dengan komposisi sebagai  berikut  (g/L)  :  ekstrak  yeast  2  g;  KH2PO4,  1,5  g; MgSO4.7H2O  1g;  CaCl2.2H2O  0.2  g;  FeSO4.7H2O  0,2  g; MnSO4.H2O 0,2 g serta Mn2+ 248 µM.  Komposisi medium

## Imobilisasi Enzim Ligninolitik Kapang Tanah pada Bentonit
Dian Dwiyanti dan N. Dwianita Kuswytasari
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
e-mail : kuswytasari@bio.its.ac.id
L
Gambar 1. (a). Subkultur isolat Gliomastix sp . , (b). Subkultur isolat Mycelia sterilia
Gambar 2. (a). Starter kontrol, (b). Starter konsorsium kapang
Gambar 3. Pertumbuhan konsorsium kapang pada medium produksi, (a). Tampak depan (b).Tampak atas
Gambar 4. Aktivitas Enzim Laccase Terimobilisasi Bentonit
disiapkan dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 1000 ml, setelah itu ditambahkan akuades hingga volume 1 L. Medium dipanaskan menggunakan magnetic stirrer hingga homogen selanjutnya dikondisikan hingga pH 5. Dilakukan sterilisasi
Gambar 5. Aktivitas Enzim LiP Terimobilisasi Bentonit menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121˚C , 1,5 atm.  Penambahan  0,5  g  chloramphenicol  dilakukan  sebelum sterilisasi [9].
1) Tahap Pre-Treatment Bagase Tebu
Bagase  tebu  diberikan  perlakuan  sebelum  digunakan sebagai  media  pertumbuhan.  Substrat  sebanyak  2  kg dikeringkan di bawah sinar matahari, kemudian dipotong kecil ±  3  cm.  Substrat  digiling  dengan  menggunakan  mesin penggiling.  Kemudian  dioven  pada  suhu  75°C  selama  2  hari. Selanjutnya  substrat  disimpan  untuk  kemudian  digunakan sebagai medium pertumbuhan [9].

## 2) Pembuatan Starter
Kultur Gliomastix sp. dan Mycelia sterilia usia 5-8 hari pada agar  miring  disuspensikan  dengan  menambahkan  1,5  ml aquades. Kultur diinokulasikan ke dalam 25 ml medium basal serta  Mn2+  248  µM  dan  5  gram  substrat  bagase    tebu. Komposisi  medium  ini  merupakan  medium    padat  yang dimodifikasi  dari  metode  fermentasi  media  padat  (solid  state fermentatition). Selanjutnya starter diinkubasi pada suhu ruang sampai  6  hari  hingga  miselium  penuh.  Selanjutnya,  kapang yang tumbuh pada medium  ini disebut sebagai starter kapang [10].

## 3) Tahap Produksi Enzim Ligninolitik
Substrat  bagase  tebu    sebanyak  50  gram  dimasukkan  ke dalam  botol  kaca  500  ml.  Medium  basal  pH  5  sebanyak  250 ml  serta  Mn2+  248  µM  kemudian  ditambahkan  pada  botol kaca.  Medium  disterilkan  dengan  autoklaf  pada  temperatur 121°C  tekanan  1,5  atm  selama  15  menit.  Setelah  medium mencapai  suhu    ruang,  starter  diinokulasikan  ke  dalam medium dan diinkubasi selama 21 hari [11][12].
4) Ekstraksi Enzim Kasar
Biakan kapang yang telah tumbuh pada bagase tebu setelah diinkubasi  selama    21    hari  diambil  sebanyak  30  gram, kemudian digerus dalam  mortar bersama 120 ml buffer fosfat pH  7.  Setelah  itu  dimasukkan  ke  tabung  Eppendorf  dan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit pada suhu  -4°C.  Supernatan  dipisahkan  dari  pelet  lalu  dimasukkan ke  tabung  Eppendorf  yang  lain.  Supernatan  yang  diperoleh merupakan  ekstrak enzim kasar  [12].
5) Uji  Aktivitas  Enzim  Ligninolitik  dari  Medium  Produksi Enzim Laccase
Larutan  sampel  yang  akan  dianalisis  dibuat  dengan  0,4  ml filtrat enzim dicampur dengan 0,5 ml buffer asetat 0,5 M pH 5 dan  0,1  ml  ABTS  1mM.  Campuran  ini  dimasukkan  ke  dalam
a b a b a b
kuvet kemudian dihomogenkan. Setelah dihomogenkan larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 420 nm dengan interval  waktu  0  sampai  30  menit.  Aktivitas  enzim  diukur dengan persamaan berikut :
Aktivitas Enzim U/ml=((At-Ao)  × Vtotal× 〖 10 〗 ^9)/(ϵ_max  × d × V enzim × t) Keterangan : At  = Absorbansi pada menit ke 30 Ao  = Absorbansi pada menit ke 0 ε_max  = Absorptivitas molar ABTS (36000 M-1 cm-1) D = Tebal kuvet (cm) T  = Waktu (menit) Vtotal  = Volume total bahan (ml) Venzim  = Volume filtrat enzim (ml)
Satu  unit  aktivitas  enzim  Laccase  didefinisikan  sebagai jumlah  enzim  yang  menyebabkan  pengubahan  1  mikromol (1μmol= 〖 10 〗 ^(-6 ) mol) ABTS per menit.
6) Enzim Lignin Peroksidase (LiP)
Aktivitas  LiP  diukur  berdasarkan  reaksi  dengan  veratryl alcohol.  Sebanyak  0,2  ml  filtrat  enzim,  0,05  ml  H2O2  5mM; 0,1ml veratryl alcohol 8mM; 0,2 ml buffer asetat 0,05 M pH 3 dan  0,45  ml  akuades  dimasukkan  kedalam  kuvet  kemudian dikocok. Larutan tersebut dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  310  nm  pada interval waktu 0 dan 30 menit [13].
Aktivitas enzim dihitung berdasarkan persamaan berikut: Aktivitas Enzim U/ml=((At-Ao)× V total × 〖 10 〗 ^9)/(ϵ_max  × d × V enzim × t) Keterangan : At  = Absorbansi pada menit ke 30 Ao  = Absorbansi pada menit ke 0 ε_max  = Absorptivitas molar veratyl alcohol (9300 M-1 cm-1) D = Tebal kuvet (cm) T  = Waktu (menit) Vtotal  = Volume total bahan (ml) Venzim  = Volume filtrat enzim (ml)
Satu  unit  aktivitas  enzim  LiP  didefinisikan  sebagai  jumlah enzim yang menyebabkan pengubahan 1 mikromol (1μmol= 〖 10 〗 ^(-6 ) mol) veratryl alcohol per menit.
7) Enzim Mangan Peroksidase (MnP)
Aktivitas  MnP  diukur  berdasarkan    reaksi  dengan  guaiakol pada  panjang  gelombang  465  nm.  Komposisi  bahan  adalah sebagai  berikut  :  0,2  filtrat  enzim;  0,3  ml  aquades;  0,1  ml buffer Sitrat fosfat 50 mM pH 4,5; 0,1 ml H2O2 1 mM; 0,2 ml MnSO4  1  mM  dan  0,1  ml  guaiakol  4  mM.  Semua  bahan dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml, kemudian dikocok perlahan dan absorbansinya dibaca dengan spektrofotometer pada 0 dan 30  menit  (A(U)).  Aktivitas  MnP  didapat  dengan  mengulang reaksi tanpa MnSO4 dengan penambahan aquades menjadi 0,5 ml  (B(U))  [14].  Aktivitas  enzim  dihitung  berdasarkan persamaan berikut:
Aktivitas  Enzim  U/ml=((At-Ao)×Vtotal× 〖 10 〗 ^9)/(ϵ_max    ×d ×Venzim×t)
Keterangan : At  = Absorbansi pada menit ke 30 Ao  = Absorbansi pada menit ke 0
ε_max  = Absorpsivitas molar Guaiakol (12100 M-1cm-1) d  = Tebal kuvet (cm) t  = Waktu (menit) Vtotal  = Volume total bahan (ml) Venzim  = Volume filtrat enzim (ml)
8) Imobilisasi Enzim Ligninolitik
Bentonit dicampurkan dengan sulphuric acid, dibilas dengan aquades  dan  dikeringkan  pada  suhu  100°C  selama  2  jam. Bentonit  40 gram dicampurkan dengan enzim ligninolitik 200 ml,  di  rotary  shaker  selama  2  jam  dalam  suhu  ruang. Padatan disaring  dan  dibilas  dengan  akuades  untuk  menghilangkan enzim yang tidak teradsorbsi.
Enzim ligninolitik dalam bentonit sebanyak diambil dengan 100 µl syringe dan ditambahkan secara perlahan  pada larutan hexane  jenuh  selama  1  menit.  Imobilisasi  dilakukan  pada  ice bath [8] [15].
9) Uji Aktivitas Enzim Ligninolitik Terimobilisasi Bentonit
Metode  pengujian  sama  dengan  uji  aktivitas  enzim ligninolitik  dari    medium    produksi.  Pada  pengujian  ini dilakukan pengukuran sebanyak 7 kali selama 1 minggu.

## 10) Uji Kontrol Bentonit
Metode  pengujian  sama  dengan  uji  aktivitas  enzim ligninolitik  dari    medium    produksi.  Pada  pengujian  ini penggunaan enzim diganti dengan bentonit.

## 11) Penentuan Stabilitas Enzim dari Aktivitas Enzim Sisa Ligninolitik
Kestabilan  enzim  dapat  dilihat  dari  aktivitas  enzim  sisa, Aktivitas  enzim  sisa  ligninolitik  ditentukan  dengan  cara mencari  persentase  hasil  bagi  aktivitas  enzim  setelah penyimpanan  dan  sebelum  penyimpanan,  yaitu  sebagai berikut:
% Aktivitas Sisa = (Aktivitas enzim setelah
penyimpanan)/(Aktivitas  enzim  sebelum  penyimpanan)  x 100%                                           [16]

## C. Rancangan Penelitian
Penelitian  ini  mengkaji  aktivitas  dari  enzim  ligninolitik konsorsium    kapang  Gliomastix  sp.  dan  Mycelia  sterilia  yang terimobilisasi  pada  bentonit.  Komponen  enzim  yang  diukur adalah  enzim  Laccase,  Lignin  Peroksidase,  dan  Mangan Peroksidase.

## D. Analisis Data
Data  penelitian  dianalisa  secara  deskriptif  kualitatif.  Uji dilakukan  untuk  mengetahui  aktivitas  dari  enzim  ligninolitik konsorsium  kapang  Gliomastix  sp.  dan  Mycelia  sterilia  yang terimobilisasi pada bentonit.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat  murni  Gliomastix  sp.    (LM  1020)    dan    Mycelia sterilia  (LM  1041)  yang  tersedia  dalam  sediaan  biakan disubkultur  kedalam  medium  PDA-Chloramphenicol.  PDA (Potato  Dextrose  Agar)  merupakan  medium  yang  kaya  nutrisi untuk  pertumbuhan  kapang,  serta  mengandung  dekstrosa sebagai  sumber  karbon  yang  berasal  dari  fermentasi karbohidrat [17]. Antibiotik Chloramphenicol digunakan untuk
menghambat pertumbuhan
bakteri. Menurut [18], Chloramphenicol  merupakan  broad-spectrum  antibiotic  yang dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri  namun  tidak menghambat  pertumbuhan  kapang.  Subkultur  isolat  dilakukan selama  5-8  hari  dimana  hasil  menunjukkan  bahwa  isolat Gliomastix  sp.  lebih  cepat  tumbuh  memenuhi  tabung dibandingkan dengan Mycelia sterilia. Gambar 1 menunjukkan pertumbuhan  miselium  masing-masing  isolat  Gliomastix  sp. dan  Mycelia  sterilia  yang  telah  diinkubasi  selama  5-8  hari. Dari  gambar  tersebut  dapat  dilihat  secara  makroskopis bahwa kedua  miselium  isolat  berwarna  putih.  Isolat  Gliomastix  sp. dan  Mycelia  sterilia  yang  telah  tumbuh  memenuhi  tabung selanjutnya digunakan untuk pembuatan starter.
Pembuatan  starter  menggunakan  medium  basal  yang ditambahkan  bagase  tebu  dengan  pH  5.  Menurut  [4],  bagase tebu  dan  pH  5  merupakan  medium  fermentasi  padat  serta  pH yang  optimal  untuk  menghasilkan  aktivitas  enzim  ligninolitik tertinggi  dari  konsorsium  kapang  Gliomastix  sp.  dan  Mycelia sterilia.  Medium  basal  yang  digunakan  mengandung    ekstrak yeast  yang  berisi  asam  glutamat  sebagai  sumber  nitrogen. Metabolisme  nitrogen  berperan  dalam  pengaturan  degradasi lignin sebagai bagian dari metabolisme sekunder kapang [19]. Selain  ekstrak  yeast  terdapat  juga  KH2PO4,  MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O,  FeSO4.7H2O,  dan  MnSO4.H2O  sebagai makronutrien yang mendukung pertumbuhan kapang Gliomastix sp. dan Mycelia sterilia [20].
Optimalisasi  juga  dilakukan  pada  tahap  ini  dengan menambahkan  ion  logam  Mn2+  248  µM  yang  berdasarkan penelitian [4] dapat meningkatkan pertumbuhan serta aktivitas enzim  ligninolitik  yang  dihasilkan  oleh  konsorsium  kapang Gliomastix  sp.  dan  Mycelia  sterilia.  Beberapa  enzim memerlukan  ion-ion  logam  tertentu  untuk  meningkatkan aktivitasnya.  Pada  konsentrasi  tertentu,  ion  logam  dapat bertindak sebagai aktivator dan pada konsentrasi tertentu pula dapat  bertindak  sebagai  inhibitor.  Ion  logam  Mn2+    dapat berperan  dalam  pengikatan  enzim  dengan  substrat  untuk menstabilkan  konformasi  aktif  enzim  [21].  Pertumbuhan starter  konsorsium  kapang  ditunjukkan  dalam  gambar  2 dimana dihasilkan miselium kapang konsorsium Gliomastix sp. dan  Mycelia  sterilia  berwarna  putih  yang  tumbuh  memenuhi medium starter.
Pertumbuhan  konsorsium  kapang  Gliomastix  sp.  dan Mycelia  sterilia  dalam  medium  produksi  ditunjukkan  dalam gambar  3  dimana  dapat  dilihat  miselium  konsorsium  kapang Gliomastix  sp.  dan  Mycelia  sterilia  yang  berwarna  putih tumbuh pada bagian atas medium produksi.
Setelah  21  hari  dilakukan  ekstraksi  enzim  dari  medium produksi  konsorsium  kapang  Gliomastix  sp.  dan  Mycelia sterilia.  Menurut  [22],  ekstraksi  menggunakan  buffer  fosfat berfungsi  untuk  menjaga  kestabilan  pH  enzim  sehingga mencegah  terjadinya  denaturasi.  Ekstraksi  enzim  dilakukan dengan sentrifugasi untuk mendapatkan enzim kasar yang akan digunakan  untuk  analisis  aktivitas  dan  imobilisasi  enzim.  Hal tersebut sesuai dengan [2] yang menyatakan enzim ligninolitik merupakan  enzim  ekstraseluler  yang  dapat  dideteksi  melalui
enzim kasar yang didapat dari supernatan hasil sentrifugasi.
Enzim  ligninolitik  kasar  yang  telah  diperoleh  kemudian dianalisis  aktivitasnya,  terdapat  tiga  enzim  ligninolitik  yang dianalisis  yaitu  enzim  Laccase,  Lignin  Peroksidase,  dan Mangan Peroksidase. Laccase dianalisis dengan menggunakan substrat ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulphonic  acid))  yang  berperan  sebagai  mediator  untuk oksidasi  komponen  non  fenolik  [23].  Lignin  Peroksidase berfungsi  bersama  kofaktor  veratryl  alkohol  yang  melindungi enzim  dari  inaktivasi  oleh  H2O2  berlebih,  namun  juga berperan sebagai mediator redoks selama oksidasi molekul lain [24].  Sedangkan  Mangan  Peroksidase  menggunakan  guaiacol sebagai mediator pada reaksinya [25]. Analisis aktivitas enzim dilakukan  dengan  menggunakan  spektrofotometer  pada panjang  gelombang  tertentu  yang  disesuaikan  dengan  subtrat atau  mediator  yang  digunakan.  Panjang  gelombang  420  nm untuk  enzim  laccase,  dimana  panjang  gelombang  tersebut merupakan  panjang  gelombang  maksimum  untuk  analisis aktivitas  laccase  dengan  menggunakan  substrat  ABTS  [26]. Lignin  Peroksidase  diukur  dengan  menggunakan  panjang gelombang  310  dan  Mangan  Peroksidase  pada  panjang gelombang 465 karena jumlah guaiakol yang hilang saat reaksi dapat dideteksi pada panjang gelombang tersebut [25].
Selanjutnya  dilakukan  imobilisasi  enzim  ligninolitik  kasar dengan  menggunakan  bentonit.  Imobilisasi  enzim  dilakukan untuk  mempertahankan  stabilitas  enzim.  Imobilisasi  enzim merupakan  penjebakkan  enzim  dalam  matriks  polimer  atau pengikatan  enzim  pada  suatu  material  pembawa  [27].  Namun tetap  mempertahankan  sifat  katalitiknya  [28].  Bentonit merupakan  mineral  lempung  alam  yang  digunakan  sebagai material  support  imobilisasi  enzim  ligninolitik  karena strukturnya  inert,  termostabil,  dan  memiliki  kemampuan pertukaran  ion.  Imobilisasi  enzim ligninolitik dengan bentonit menggunakan  teknik  adsorpsi  dimana  gaya  interaksi  yang terjadi  antara  material  support  dan  senyawa  dapat  merupakan ikatan  hidrogen,  gaya  Van  Der  Waals  serta  interaksi hidrofobik [29].
Imobilisasi  enzim  ligninolitik  dianalisis  aktivitasnya  setiap hari  selama  masa  simpan  7  hari  untuk  diketahui  pengaruh imobilisasi terhadap aktivitasnya.
1. Aktivitas Enzim Laccase Terimobilisasi Bentonit
2. Aktivitas enzim laccase terimobilisasi bentonit ditunjukan dalam grafik (gambar 4).
Berdasarkan  grafik  di  atas  dapat  diketahui  bahwa  aktivitas enzim  laccase  terimobilisasi  bentonit  memiliki  aktivitas  yang tidak terlalu tinggi. Aktivitas tertinggi didapat pada hari ke-nol dengan  nilai  sebesar    849,54  U/ml,  sedangkan  aktivitas terendah  terdapat  pada  hari  ketujuh  sebesar  152,78  U/ml. Enzim  laccase  yang  terimobilisasi  bentonit  mengalami penurunan  yang  cukup  tinggi,  dimana  penurunan  tertinggi sebesar 180.56 U/ml terjadi pada hari keenam. Enzim laccase yang  terimobilisasi  bentonit  memiliki  kestabilan  yang  rendah dengan  nilai  aktivitas  enzim  sisa  sebesar  17,98%,  aktivitas enzimnya  pun  menurun  seiring  waktu  penyimpanan.  Hal  ini dapat dikarenakan karena perubahan konformasi enzim laccase
setelah  diimobilisasi  dan  terbatasnya  fleksibilitas  enzim laccase tersebut pada bentonit [15].
Enzim  laccase  yang  terimobilisasi  bentonit  aktivitas tertingginya  masih  dibawah  enzim  laccase  bebas  karena mengalami  penurunan  aktivitas  setelah  diimobilisasi  yang disebakan  oleh  perubahan  struktural  enzim  [30].  Namun meskipun  aktivitasnya  lebih  rendah,  stabilitas  enzim  laccase yang  terimobilisasi  bentonit  lebih  tinggi  dibanding  stabilitas enzim  laccase  bebas,  dimana  nilai  aktivitas  enzim  sisanya 7,66%.  Hal  ini  menyebabkan  aktivitas  enzim  laccase  bebas pada  penyimpanan  hari  ketiga  hingga  hari  ke  tujuh  lebih rendah  dari  aktivitas  enzim  laccase  terimobilisasi  bentonit [16].
1. Aktivitas  Enzim  Lignin Peroksidase (LiP) Terimobilisasi Bentonit
2. Aktivitas  enzim  LiP  terimobilisasi  bentonit  ditunjukan dalam grafik (gambar 5).
Berdasarkan  grafik  diatas  dapat  diketahui    bahwa  aktivitas enzim  lignin  peroksidase  (LiP)  terimobilisasi  bentonit mengalami  penurunan  setiap  harinya  selama  masa  simpan tujuh  hari.  Aktivitas  enzim  LiP  yang  terimobilisasi  bentonit memiliki  nilai  tertinggi  sebesar  1227,6  U/ml  pada  hari  ke-nol dan aktivitas terendah pada hari ketujuh sebesar 250.9 U/ml.
Aktivitas  enzim  LiP  terimobilisasi  bentonit  lebih  rendah dibandingkan  dengan  aktivitas  enzim  LiP  bebas,  dimana  nilai aktivitas  enzim  LiP  bebas  tertinggi  adalah  4094,48  U/ml sedangkan  aktivitas  terendahnya  sebesar  232,975  U/ml.  Hal tersebut  dapat  disebabkan  akibat  denaturasi  enzim  selama proses  imobilisasi  atau  rendahnya  afinitas  substrat  terhadap enzim  terimobilisasi  bentonit  [31].  Namun  meskipun aktivitasnya  lebih  rendah,  stabilitas  enzim  LiP    yang terimobilisasi  bentonit  lebih  tinggi  dibanding  stabilitas  enzim LiP  bebas,  dimana  nilai  aktivitas  enzim  LiP  sisa    yang terimobilisasi  bentonit  adalah  8,76%.  Sedangkan  aktivitas enzim  LiP  bebas  sisa    adalah  5,68%.  Hal  ini  menyebabkan aktivitas enzim LiP bebas pada hari ketujuh lebih rendah pada dari aktivitas enzim LiP terimobilisasi bentonit [16].
1. Aktivitas Enzim Mangan Peroksidase (MnP)
Terimobilisasi Bentonit
2. Aktivitas  enzim  MnP  terimobilisasi  bentonit  ditunjukan dalam grafik (gambar 6).
Berdasarkan  grafik  di  atas  dapat  diketahui  bahwa  aktivitas enzim  MnP  terimobilisasi  bentonit  tertinggi  didapatkan  pada hari  ke-nol  dengan  nilai  sebesar  199.72  U/ml  dan  aktivitas terendah pada hari ketujuh dengan nilai sebesar 41.32 U/ml.
Aktivitas  enzim  MnP  terimobilisasi  bentonit  masih  lebih rendah  dibandingkan  dengan  aktivitas  enzim  MnP  bebas, dimana  nilai  aktivitas  enzim  MnP  bebas  tertinggi  adalah 4407,71U/ml sedangkan aktivitas terendahnya sebesar 165,289 U/ml.  Hal  ini  dapat  disebabkan  karena  terjadinya  perubahan kondisi  optimum  aktivitas  enzim  ligninolitik.  Setelah diimobilisasi, kondisi optimum aktivitas enzim, seperti pH dan temperatur    optimum    cenderung    berubah    dari    kondisi optimum  aktivitas  enzim bebas.  Umumnya  terjadi  kenaikan pH    dan    temperatur    untuk    mencapai    aktivitas  enzim  yang
hampir setara dengan aktivitas enzim bebas [32].

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan  data-data  yang  diperoleh  serta  pembahasan yang telah diberikan maka dapat disimpulkan bahwa:
1. Aktivitas  enzim  laccase  terimobilisasi  bentonit  tertinggi sebesar 849,54 U/ml.
2. Aktivitas enzim LiP terimobilisasi bentonit tertinggi yaitu sebesar 1227,6 U/ml.
3. Aktivitas  enzim  MnP  terimobilisasi  bentonit  tertinggi yaitu sebesar 199.72 U/ml.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] A. Faradilla, “Bioremediasi Limbah Cair Industri Kertas Menggunakan Teknik  Imobilisasi  Enzim  Kasar  Dan  Biomassa  Sel  Jamur”,  Skripsi. UGM : Yogyakarta (2013).
[2] R.T.  Howard,  E,  Abotsi,  E.L.,    Jansen  van  Rensburg,  and    Howard,  S. “Lignocellulose  Biotechnology  :  Issue  of  Bioconversion  and  Enzyme Production”. African Journal of Biotech. 2 (2003) 602 -619.
[3] Y.M.,  Rohmah,  N.D,    Kuswytasari,  dan  M.  Shovitri,  2011.  “Studi Potensi  Isolat  Kapang  tanah  dari  Wonerejo  Surabaya  dalam Mendegradasi  Lignin”.  Tugas  Akhir.  Biologi  FMIPA  ITS  :  Surabaya (2011).
[4] D.W.,  Intani,  dan  N.D.,  Kuswytasari,  “Aktivitas  Enzim  Ligninolitik Jamur  Gliomastix  sp.  dan  Mycelia  sterilia  dengan  Induksi  logam  pada Limbah Bagase”, Tugas Akhir. Biologi FMIPA ITS : Surabaya (2015).
[5] J. Perez, 2002. “Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose  and  lignin:  an  overview”.  Departement  of  Microbiology, Facultad  de  Ciencias,  Universidad  de  Granada,  Campus  Fuentenueva, 18071 Granada, Spain.
[6] A.,  Zubriene,  S.,  Budiene,  N.,  Romskevic  T.,  Gorochovceva,  E., Matulionis and Dienys G. “Immobilization of Hydrolases onto chitosan mircoparticles”. Chemical. 4 (2003) 14:21.
[7] I.,  Chibata  ed,  “Immobilized  Enzyme  Research  and  Development”, Halsted Press, New York (1978).
[8] Y.,  Yesiloglu,  “Utilization  of  bentonite  as  a  support  material  for immobilization  of  Candida  rugosa  lipase”,  Journal  of  Elsevier  Process Biochemistry, Vol. 40 (2005) 2155-2159.
[9] Sk.M.,  Hossain,  and  N.,  Anantharaman,  “Activity  Enhancment  of Ligninolytic  Enzyme  of  Trametes  versicolor  with  Bagase  Powder”, African  Journal  of  Biotechnology,  Vol  5  (2006)  pp.  180-194.  India: Departement of Chemical Engineering.
[10] J. Yang,  Y. Hong Li, W. He Xiang, and C. Wen Xin, “Purification and characterization  of  Lignin  Peroxidases  from  Penicillium  decumbens P6”,  Journal  of  Microbiology  and  Botechnology,  Vol.  21  (2005)  435- 440.
[11] D.S.  Arora,  M.  Chander,  and  P.Gill,  “Involvement  of  Lignin Peroxidase,  Manganase  Peroxidase  and  laccase  in  degradation  and Selective  Ligninolysis  of  Wheat  Straw,”  International  Biodeterioration & Biodegradation, Vol. 50 (2002) 115-120).
[12] R.I.  Syafrizal. 2007, “Aktifitas enzim ligninolitik fungi pelapuk putih Omphalina  sp.  dan  Pleurotus  ostreatus  pada  limbah  lignoselulosa, Skripsi. Bogor : Biokimia IPB (2007).
[13] M.  Tien,  and  T.  K.  Kirk,  “Lignin  Degrading  Enzyme  from Phanerochate  chrysossporium  :  Purification,  Characterization  and Catalycal  Properties  of  a  Unique  H2O2-requirung  Oxygenease”, Practice Natural Academy Science USA, Vol. 81 (1984) 2280-2284).
[14] R. Fitria, “Optimasi Produksi Enzim Lignolitik oleh Isolat A-1 dan G. Lucidum  serta  Pemurnian  Parsial  dan  Karakteristik  Lakase”.  Skripsi. Jakarta: Universitas Indonesia (2005).
[15] M.E.  Sedaghat,  M.  Ghiacia,  H.  Aghaeia,  S.  Soleimanian-Zadba, “Immobilization of α-amylase on Na-bentonite and modified bentonite”, Applied Clay Science, (2009) 46125–130.
[16] I.M.  Isya,  A.  Roosdiana,  and  Sutrisno.  “Pengaruh  Suhu  dan  Lama Penyimpanan  terhadap  Kestabilan  Xilanase  Amobil  dalam  Kitosan”. Kimia.Student Journal, Vol. 2, (2014) No. 1, pp. 333 -339.
[17] J.  F.  MacFaddin,  “Media  for  the  Isolation-Cultivation  Identification- Maintenance  of  Medical  Bacteria,  Vol.1”.  Williams  and  Wilkins: Baltimore (1985).
[18] G.M.  Mueller,  G.F.  Bills.,  &  M.S.  Fosteer.  “Biodiversity  of  fungi  : Inventory  and  Monitoring  methods”,  Elsevier  Academic  Press  Inc:
Amsterdam (2004).
[19] A.  Fadilah,  S.  Distantina,  S.R.    Dwiningsih,  dan  D.  S.  Ma’rifah,
“Pengaruh  Penambahan  Glukosa  dan  Ekstrak  Yeast  terhadap Biodelignifikasi Ampas Batang”, EKUILIBRIUM  Vol. 8, (2009) No. 1. P: 29 –33.
[20] D. Komalasari, “Isolasi, identifikasi, dan pengujian kemampuan kapang selulolitik  dari  naskah  kuno  kertas    eropa  asal  keraton  kasepuhan cirebon”, Skripsi,  Biologi. FMIPA UI : Jakarta (2012).
[21] T. Palmer, “Understanding Enzymes”. Ellis Harwood : Chichester, West Sussex, England (1991).
[22] Y. A. Prasetya, “Enzim Merkuri reduktase pada Genera Bacillus sebagai pereduksi  merkuri  anorganik  (Hg2+)  menjadi  Merkuri  volatil  (Hg0)”, Tugas Akhir, ITS : Surabaya (2012).
[23] C.F.  Thurston,  “The  structure  and  function  of  fungal  laccases”, Microbiology 140: (1994) 19-26.
[24] M. Akhtar, R.A. Blanchette and T.K. Kirk,  “Fungal Delignification and Biochemical Pulping of wood”, Advance in Biotechnology, 57: (1997) 159-195.
[25] H.  Huang,  G.M.  Zeng,  L.  Tang,  H. Yu, X.M. Xi, Z.M. Chen and G.H. Huang,  “Effect  of  Biodelignification  of  Rice  Streaw  on  Humification and Humus Quality by Phanerochaete chrysosporium and Streptomyces badius,  International  Biodeterioration  and  Biodegradation,  61  :  (2008) 331-336.
[26] H.  Widiastuti,  dan  Tripanji,  “Pola  Aktivitas  Enzim  Ligninolitik Pleurotus  ostreatus  pada  limbah  Sludge  Pabrik  Kertas”,  Jurnal  menara perkebunan, Vol. 76 (2008) No.1, 47-60, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan : Bogor.
[27] Tischer  and  Wedekind,  “Immobilized  enzyme:  methode  and application”, Springer : Berlin, Heidelberg (1999).
[28] C. Spahn, & S. D. Minteer, “Enzyme Immobilization in Biotechnology”, Recent Patents on Engineering, Vol 2 (2008) No.3 : 195-200.
[29] R.G.  Burn,  “Interaction  of  enzymes  with  soil  minerals  and  organic colloids” , Soil Science Society of America, Madison, (1986) 439-452.
[30] M.Y.  Chang,  and  R.S.  Juang,  “Activities,  stabilities,  and  reaction kinetics  of  three  free  and  chitosan–clay  composite  immobilized enzymes”, Enzyme Microb. Technol, 36 (2005) 75–82.
[31] O.  Prakash  & N. Jaiswal, “Immobilization of a Thermostable Amylase on  Agarose  and  Agar  Matrices  and  its  Application  in  Starch  Stain Removal”, World Appl  Sci. J., 13 (2011) No.3 : 577-577.
[32] F. Sebayang, “Pengujian Stabilitas Enzim Bromelin yang Diisolasi dari Bonggol  Nenas  serta  Imobilisasi  Menggunakan  Kappa  Karagenan”, Jurnal Sains Kimia, 10 (2006) (1): 20-26.