## ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERIOSIN YANG DIHASILKAN OLEH Lactobacillus lactis DARI SEDIMEN LAUT

## Isolation and Characterization of Bacteriosin from Lactobacillus lactis Isolated from Marine Sediment
Rofiq Sunaryanto 1* dan Tarwadi 1
1 Balai Pengkajian Bioteknologi  BPPT. Gd. 630  Kawasan PUSPIPTEK  Serpong,  Tangerang  Selatan,  Banten, Indonesia *  Korespondensi  Penulis:  rofiq.sunaryanto@bppt.go.id
Diterima: 9  Februari 2015; Disetujui: 21 April 2015

## ABSTRAK
Telah  dilakukan  isolasi  dan  karakterisasi  bakteriosin  yang  dihasilkan  oleh Lactobacillus  lactis yang berasal  dari sedimen  laut. Karakterisasi  bakteriosin meliputi  uji  aktivitas  antimikroba, stabilitas terhadap  suhu,  pH,  penambahan  enzim,  surfaktan,  dan  stabilitas  bakteriosin  terhadap  penyinaran lampu UV. Aktivitas antimikroba bakteriosin diuji melawan bakteri uji Escherichia coli ATCC  25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus subtilis ATCC 66923, Staphyllococcus aureus ATCC 25923, Lactobacillus  plantarum , Lactobacillus  bulgaricus , Lactobacillus  casei, dan Candida albican .  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  bakteriosin  mampu  menghambat  pertumbuhan E.coli ATCC 25922, E. faecalis ATCC 29212, S. aureus ATCC 25923 dan B. subtilis ATCC 66923, namun  demikian  tidak  mampu  menghambat  pertumbuhan L.  plantarum , L.  bulgaricus , L.  casei, dan C.  albican. Bakteriosin  yang  dihasilkan  oleh Lactobacillus  lactis stabil  terhadap  pemanasan sampai  dengan  suhu  70  °C  dan  stabil  pada  rentang  pH  3  sampai  dengan  7. Aktivitas  bakteriosin hilang  dengan  penambahan  tripsin,  pepsin,  dan  proteinase-K,  namun  aktivitas  bakteriosin  stabil terhadap  penambahan  -amilase.  Penambahan  tween  20,  tween  80,  dan  EDTA  mampu meningkatkan  aktivitas  bakteriosin  sebesar  1,1  sampai  dengan  1,2  kali  dibandingkan  dengan tanpa  penambahan surfaktan. Penyinaran lampu UV selama 15 menit  tidak berpengaruh terhadap aktivitas  bakteriosin.
KATA KUNCI: bakteriosin, Lactobacillus lactis, antimikroba, sedimen

## ABSTRACT
Isolation  and  characterization  of  bacteriocin  from  marine  Lactobacillus  lactis  covering antimicrobial  activity,  stability  of  temperature,  pH,  enzymes,  and  surfactant  of  bacteriocin  have been  conducted.  Antimicrobial  activity  have  been  tested  to  Escherichia  coli  ATCC  25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus  subtilis ATCC 66923, Staphylococcus aureus ATCC 25923,  Lactobacillus  plantarum,  Lactobacillus  bulgaricus,  Lactobacillus  casei,  and  Candida albican.  The  result  showed  that  the  bacteriocin  inhibited  the  growth  of  E.  coli  ATCC  25922,  E. faecalis  ATCC  29212  and  S.  aureus  ATCC  25923  and  most  effective  inhibited  the  growth  of  B. subtilis ATCC 66923, but did not inhibit the growth of L. plantarum, L. bulgaricus, L. casei, and C. albican.  The  bacteriocin  produced  by  Lactobacillus  lactis  was  stable  to  heat  until  70  °C  and stable at pH ranging from  3 to 7. Bacteriocin activity was  lost with  the addition  of trypsin, pepsin, and  proteinase-K,  however  bacteriocin  was  stable  against  -amylase.  Addition  of  a  surfactant tween  20,  tween  80,  and  EDTA  were  able  to  increase  bacteriocin  activity  until  1.1  to  1.2  times compared  to  no  addition  of  surfactant.  Irradiating  by  UV  light  for  15  minutes  did  not  affect  the bacteriocins  activity.
KEYWORDS: bacteriocin, Lactobacillus lactis, antimicrobial, sediment

## PENDAHULUAN
Lactobacillus dikenal sebagai bakteri asam laktat yang mampu menghasilkan senyawa aktif turunan protein  yang  disebut  bakteriosin.  Bakteriosin merupakan  senyawa  protein  yang  memiliki  efek
bakteriostatik  m aupun  bakterisidal  terhadap m ikroorganism e  lain.  Bakteriosin  m erupakan metabolit ekstraseluler berupa protein yang disintesis langsung di ribosom, serta memiliki aktivitas bervariasi dalam spektrum antimikroba yang luas (Jack et al ., 1995). Bakteriosin dapat dihasilkan dari bakteri Gram-
positif dan Gram-negatif. Bakteriosin dapat bersifat kationik, anionik, maupun netral.
Dalam aplikasinya bakteriosin bermanfaat bagi industri  makanan,  khususnya  industri  makanan fermentasi. Bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam  laktat  sangat  potensial    digunakan  sebagai pengawet  makanan  alami  (Singh et  al., 2013). Bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat diketahui mampu menghambat pertumbuhan bakteri pembusuk  makanan  dan  bakteri  patogen  pada makanan penyebab food borne disease (Chang & Chang,  2011;  Ahmad et  al. 2014).  Penambahan bakteriosin dalam makanan selain untuk mencegah terjadinya  pem busukan,  juga  berguna  untuk memperpanjang  waktu  penyimpanan  (Gautam  & Sharma,  2009; Yusuf, 2013).  Namun tidak  semua bakteri asam laktat mampu menghasilkan bakteriosin (Ashraf & Shah, 2011).
Dalam aplikasinya sebagai pengawet makanan, bak teriosin  m em ili ki  beberapa  keunggulan dibandingkan  sistem  pengawetan  secara  kimia, antara lain: (1)  bakteriosin tidak toksik dan mudah mengalami biodegradasi karena merupakan senyawa protein,  (2)  tidak  membahayakan  mikroflora  usus karena  mudah  dicerna  oleh  enzim-enzim  dalam saluran pencernaan, (3) penggunaan bakteriosin dapat mengurangi penggunaan bahan kimia pengawet, (4) dalam  aplikasinya sangat  fleksibel;    dapat  berupa strain kultur starter unggul yang terseleksi dan mampu menghasilkan  senyawa  antimikroba  (Gautam  & Sharma, 2009).
Beberapa jenis bakteriosin yang telah dikenal saat ini adalah nisin, diplococcin, acidophilin, bulgarican helveticins,  laktacins, dan plantaricins (Aly et  al., 2006).  Nisin  merupakan  bakteriosin  yang  secara komersial telah  diproduksi  dan  banyak tersedia  di pasaran.  Nisin memiliki aktivitas yang kuat melawan pertumbuhan bakteri Gram-positif.  Bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus efektif melawan bakteri mesofilik (Ogunbanwo et al ., 2003).
Beberapa bakteriosin yang dihasilkan oleh mikroba lokal Indonesia telah banyak dilaporkan. Sebagian besar  isolat  penghasil  bakteriosin  yang  telah dilaporkan diisolasi dari produk makanan fermentasi dan produk makanan olahan lainnya. Kusmarwati et al . (2014) telah melakukan isolasi bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat dari rusip. Rahayu et al. (2004) telah mendapatkan bakteri asam laktat penghasil bakteriosin yang diisolasi dari daging dan olahannya. Romadhon et  al. (2012)  mendapatkan bakteriosin dari bakteri asam laktat yang diisolasi dari usus  udang.  Namun  belum  banyak  dilaporkan bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus yang berasal dari sedimen laut.  Tujuan penelitian ini adalah
untuk mendapatkan bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus lactis yang diisolasi dari sedimen laut serta mendapatkan informasi karakteristik bakteriosin yang dihasilkannya.

## METODE

## Penyegaran Isolat Lactobacillus lactis dan Produksi Bakteriosin
Isolat bakteri asam laktat yang digunakan adalah Lactobacillus lactis yang berasal dari sampel sedimen laut yang merupakan kultur koleksi Balai Pengkajian Bioteknologi  BPPT.  Penyegaran  isolat  dilakukan menggunakan media MRS agar, dan untuk produksi bakteriosin digunakan media MRS broth . Produksi bakteriosin dilakukan  pada suhu 30 °C selama 72 jam dengan pH awal medium fermentasi pH 7.
Isolasi bakteriosin dilakukan sebagai berikut; kaldu hasil fermentasi disentrifus 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 °C dan disaring menggunakan filter ester  selulosa  0,45  mm.  Supernatan  dinetralkan sampai  dengan  pH  7  menggunakan  NaOH  1  M. Supernatan bebas sel dipekatkan dengan ammonium sulfat  sampai  dengan  80%  dalam  kondisi  dingin dengan suhu 4 °C. Endapan yang terbentuk disaring menggunakan  filter  ester  selulosa  0,45mm  dan dikeringkan  menggunakan freeze  dryer .  Endapan kering ini selanjutnya disebut sebagai ekstrak kering bakteriosin.  Ekstrak  kering  bakteriosin  kemudian dilarutkan kembali dengan buffer potasium fosfat pada pH 7 untuk mendapatkan suspensi bakteriosin yang digunakan  untuk  karakterisasi  dan  uji  antimikroba pada tahap selanjutnya.

## Penentuan Aktivitas Antimikroba
Uji aktivitas antimikroba dilakukan menggunakan metode  difusi  sumur  (Rahayu et  al. ,  2000  yang dimodifikasi).  Mikroba  uji  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah E.coli ATCC 25922, E. faecalis ATCC  29212, B.  subtilis ATCC  66923, S.  aureus ATCC  25923, L.  acidophillus,  L.  plantarum , L. bulgaricus , L.  casei, dan C.  albican . Sebanyak  50 ml  kultur  yang  mengandung  mikroba  uji  dengan konsentrasi 10 8 cfu/ml dituangkan ke dalam cawan petri bersamaan dengan medium Nutrient Agar dalam kondisi hangat yang telah disterilisasi. Selanjutnya didinginkan pada suhu 4 °C selama 1 jam sampai mengeras. Media Nutrient Agar yang sudah mengeras dibuat sumur dengan diameter 4 mm. Sepuluh mikro liter suspensi bakteriosin diteteskan pada sumur agar dan diinkubasi pada  suhu 4 °C selama  1 jam  dan dilanjutkan inkubasi pada suhu 30 °C selama 24 jam. Zona  bening  yang  terbentuk  diukur  diameternya menggunakan jangka sorong ( Vernier Caliper ).

## Penentuan Aktivitas Bakteriosin
Pada penentuan aktivitas bakteriosin digunakan metode  difusi  sumur  (Rahayu et  al. ,  2000  yang dimodifikasi). Sebanyak 50 ml mikroba uji dengan konsentrasi 10 8 cfu/ml dalam larutan garam fisiologis dimasukkan  dalam  medium Nutrient  Agar dalam kondisi hangat yang sudah disterilisasi. Selanjutnya didinginkan pada suhu 4 °C selama 1 jam sampai mengeras.  Mikroba  uji  yang  digunakan  sebagai indikator untuk penentuan aktivitas bakteriosin dalam penelitian ini adalah E. coli ATCC 25922. Mikroba uji ini telah diketahui mampu dihambat oleh bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat. Media agar yang telah mengeras dibuat sumur dengan diameter 4  mm.  Sepuluh  mikro  liter  suspensi  bakteriosin diteteskan pada sumur agar dan diinkubasi pada suhu 4 °C selama 1 jam dan dilanjutkan inkubasi pada suhu 30 °C selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk diukur  diameternya  menggunakan  jangka  sorong ( Vernier Caliper ).  Aktivitas penghambatan bakteriosin dinyatakan dengan Arbitrary  Units per  ml  (AU/ml) (Simonova & Laukova, 2007).  Satu AU/ml merupakan luas  daerah  hambat  per  satuan  volume  sampel bakteriosin uji (mm 2 /ml) (Usmiati & Marwati, 2007). Secara  matematis  dituliskan  persamaan  sebagai berikut:
Aktivitas bakteriosin (mm 2 /ml) =
Dimana : Lz = Luas zona bening (mm 2 ) Ls = Luas sumur (mm 2 ) V  = Volume contoh (ml)

## Karakterisasi Bakteriosin
Karakterisasi bakteriosin meliputi uji kestabilan terhadap  variasi  pH,  suhu,  penambahan  enzim, surfaktan, dan penyinaran UV. Metode uji masing- masing perlakuan dijelaskan sebagai berikut;

## Uji kestabilan bakteriosin terhadap pH
Uji kestabilan bakteriosin terhadap pH dilakukan dengan membuat suspensi ekstrak kering bakteriosin dalam 50 mM buffer asetat pH 2 dan pH 3; 50mM buffer potasium fosfat pH 4, 5, 6, 7; 50 mM buffer Tris-HCl pH 8, 9; 50mM buffer borax-NaOH pH 10, 11. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 °C selama 4 jam. Setelah inkubasi selesai, suspensi bakteriosin dinetralkan kembali dengan penambahan HCl 6 M untuk  pengasaman,  dan  penambahan  NaOH  6  M untuk pembasaan. Aktivitas bakteriosin ditentukan
menggunakan  prosedur  yang  telah  dijelaskan sebelumnya.

## Uji kestabilan bakteriosin terhadap suhu
Sebanyak 5 ml suspensi bakteriosin dalam buffer potassium fosfat pH 7 dipanaskan menggunakan water bath dalam interval suhu 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, dan 100  °C dengan  rentang  waktu 10, 30, dan 45 menit. Suspensi bakteriosin yang telah mengalami perlakuan  pemanasan  selanjutnya  ditambahkan larutan buffer potassium fosfat pH 7 sampai diperoleh volume 5 ml dan diuji aktivitas bakteriosinnya.

## Uji kestabilan bakteriosin terhadap enzim
Uji  kestabilan  aktivitas  bakteriosin  terhadap penambahan enzim seperti pepsin, tripsin,  -amilase, dan proteinase-K dilakukan sebagai berikut; sebanyak 500 ml suspensi bakteriosin ditambah 500 mg enzim dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 °C. Enzim yang digunakan adalah pepsin (Sigma-Aldrich) aktivitas  enzim  91  U/ml,  tripsin  (Sigma-Aldrich) aktivitas enzim 14 U/ml , proteinase-K (Merck) aktivitas enzim 30 U/ml,  -amilase (Sigma-Aldrich) aktivitas enzim 0,6 U/ml. Setelah inkubasi selesai selanjutnya dilakukan uji aktivitas bakteriosinnya.

## Uji kestabilan bakteriosin terhadap surfaktan
Uji  kestabilan  bakteriosin  terhadap  beberapa surfaktan dilakukan dengan menambahkan surfaktan (tween  20,  tween  80,  EDTA)  ke  dalam  suspensi bakteriosin  sebesar  1%.  Selanjutnya  dilakukan inkubasi pada suhu 30 °C selama 60 menit, dan diuji aktivitas bakteriosinnya.

## Pengaruh penyinaran UV terhadap kestabilan bakteriosin
Lima milliliter suspensi bakteriosin ditempatkan dalam cawan petri, selanjutnya disinari dengan lampu UV  15  Watt  50  Hz,  panjang  gelombang  340  nm dengan jarak 30 cm selama 15 menit. Selanjutnya diuji  aktivitas bakteriosinnya.

## HASIL DAN BAHASAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa Lactobacillus lactis mampu menghasilkan bakteriosin yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri  Gram-positif dan Gram-negatif. Hasil uji antimikroba bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus lactis terhadap beberapa bakteri Gram-positif dan Gram-negatif disajikan dalam Tabel 1.
Lz-Ls V
1 AU/ml =

## Tabel 1. Hasil uji antimikroba bakteriosin terhadap mikroba uji
Table 1. Antimicrobial assay of bacteriocin against to microbial test
Mikroba Uji/Microbial Test Diameter Zona Hambatan/ Zone of inhibition Diameter (mm) E. coli ATCC 25922 6.5 S. aureus ATCC 25923 6.0 B. subtilis ATCC 66923 7.5 E. faecalis ATCC 29212 6.0 L. acidophillus - L. plantarum - L. bulgaricus - L. casei - C. albican -
Tabel 1 menunjukkan bahwa bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus lactis mampu menghambat pertumbuhan E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923, B. subtilis ATCC 66923 , dan E. faecalis ATCC 29212, namun tidak menghambat pertumbuhan L. plantarum, L. bulgaricus, L. casei, dan L. acidophillus serta C. albican. Bakteriosin ini menghambat pertumbuhan B.subtilis ATCC 66923 paling kuat. Zona hambat yang terbentuk adalah paling tinggi dengan diameter hambatan sebesar 7,5 mm. Menurut Gulluce et al. (2013) beberapa bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri Gram-positif memiliki aktivitas hambatan  dengan spektrum luas, namun bakteriosin tersebut tidak mampu menghambat mikroba penghasil bakteriosin itu sendiri. Hal yang sama dilakukan oleh Rajaran et al . (2010). Bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus lactis yang diisolasi dari sedimen laut di Pantai Sagar Paschimi India mampu menghambat sebagian besar pertumbuhan mikroba uji bakteri Gram-positif dan bakteri Gram- negatif.
Hasil karakterisasi kestabilan bakteriosin terhadap pemanasan menunjukkan bahwa bakteriosin stabil pada pemanasan sampai dengan 70 °C selama 45 menit. Aktivitas bakteriosin tidak mengalami penurunan dibandingkan kontrol (bakteriosin yang tidak dipanaskan). Pada pemanasan sampai dengan 80 °C selama 10 menit belum terjadi penurunan aktivitas bakteriosin, namun pemanasan pada suhu yang sama selama 30 menit menurunkan aktivitas bakteriosin sebesar 593 AU/ml atau menjadi 1570 AU/ ml, dan pada pemanasan pada suhu yang sama selama 45 menit penurunan aktivitas bakteriosin mencapai 869 AU/ml atau menjadi 1294 AU/ml. Penurunan aktivitas ini diduga berkaitan dengan terjadinya deformasi protein bakteriosin. Aktivitas
bakteriosin hilang sama sekali pada pemanasan suhu 90 °C selama 30 menit atau lebih dan pemanasan suhu 100 °C. Berbeda halnya dengan bakteriosin yang dilaporkan oleh Leelavatcharamas et al. (2011), bakteriosin yang dihasilkan oleh Pediococcus acidilactic bersifat termotoleran yang mampu bertahan sampai dengan pemanasan suhu 121 °C selama 30 menit. Pengaruh pemanasan terhadap aktivitas bakteriosin disajikan dalam Gambar 1.
Hasil uji kestabilan aktivitas bakteriosin terhadap perubahan pH disajikan dalam Gambar 2. Bakteriosin masih stabil pada rentang pH 3 sampai dengan pH 7, namun pada pH di bawah 3 dan di atas 7 mengalami penurunan aktivitas. Tampak bahwa aktivitas bakteriosin tahan terhadap suasana asam, karena sampai dengan  pH 3 belum terjadi penurunan aktivitas. Hal yang sama terjadi pada bakteriosin yang dihasilkan L.bulgaricus . Menurut Reddy et al. (1984) bulgarican dan lactobulgarican yang dihasilkan oleh L.bulgaricus menunjukkan aktivitas paling tinggi dan stabil pada pH 3 dan 4.
Dalam aplikasinya, bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus lactis mampu bekerja pada pH asam sampai dengan pH netral, dan suhu yang diperbolehkan agar bakteriosin ini bekerja secara optimal adalah di bawah suhu 80 °C. Dari kedua profil ini, bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus lactis cocok digunakan sebagai pengawet makanan alami yang tidak membutuhkan pemanasan dan bekerja pada pH asam atau netral. Sebagai contoh bakteriosin tersebut dapat digunakan sebagai pengawet daging, produk olahan susu, produk pangan asam ( salad dressing ), sosis, dan makanan dalam kaleng. Menurut Fawzya (2010)  nisin yang merupakan salah satu bakterisoin yang bekerja pada
Gambar 1.  Pengaruh pemanasan terhadap aktivitas bakteriosin.
Figure 1.  Heating effect on activity of bacteriocin.
pH asam, lebih sesuai digunakan sebagai bahan pengawet produk-produk fermentasi maupun produk ikan dalam kaleng dengan medium saus dalam tomat yang bersifat asam.
Bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus lactis juga diuji aktivitasnya terhadap penambahan enzim protease dan amilase. Hasil uji terhadap penambahan beberapa jenis enzim disajikan pada Tabel 2.
Dari Tabel 2 terlihat bahwa  penambahan α -amilase tidak berpengaruh terhadap aktivitas bakteriosin. Namun penambahan pepsin, proteinase-K dan tripsin
Gambar 2.  Pengaruh pH terhadap aktivitas bakteriosin.
Figure 2.  pH effect on activity of bacteriocin.
sangat berpengaruh terhadap aktivitas bakteriosin. Terlihat dengan penambahan ketiga jenis enzim protease mampu menghilangkan aktivitas bakteriosin. Enzim amilase merupakan enzim yang menghidrolisis ikatan-ikatan glukosa (1,4- α -glikosidik) dan tidak menghidrolisis ikatan peptida dalam protein, sehingga tidak mempengaruhi konformasi ikatan peptida maupun gugus aktif dalam bakteriosin. Lain halnya dengan pepsin, proteinase-K dan tripsin yang termasuk dalam enzim proteolitik, mampu menghidrolisis ikatan-ikatan peptida dan berpengaruh terhadap konformasi protein dalam bakteriosin. Hasil
2500 2000 1500 1000 500 0 Kontrol/ Control 30 40 50 60 70 80 90 Aktivitas bakteriosin/ Bacteriocin activity (AU/ml) 100 Temperatur/ Temperature (°C) 10 menit 30 menit 40 menit
Aktivitas bakteriosin/ Bacteriocin activity (AU/ml) 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 12
pH
percobaan menunjukkan bahwa penambahan pepsin, proteinase-K dan tripsin mengakibatkan hilangnya aktivitas bakteriosin. Hal yang sama disampaikan oleh Francois et al. (2013). Bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus plantarum 29V sensitif terhadap hidrolisis enzim protease namun masih stabil terhadap hidrolisis enzim lipase dan amilase. Demikian juga dengan hasil penelitian Rajaran et al. (2010). Bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus lactis tidak tahan terhadap aktivitas enzim proteolitik seperti pepsin dan proteinase-K. Dalam aplikasinya sebagai bahan pengawet alami, bakteriosin sensitif terhadap enzim protease. Beberapa jenis buah-buahan dan makanan diketahui mengandung enzim proteolitik (papain dan bromelin) seperti papaya, kiwi, dan nanas. Dengan demikian  jenis makanan ini tidak dapat dicampurkan dengan bahan pengawet seperti bakteriosin. Saat ini enzim proteolitik papain dan bromelin banyak digunakan sebagai bahan pengempuk daging. Hal ini tidak dapat dikombinasikan dengan bahan pengawet alami seperti bakteriosin.
Bakteriosin yang diperoleh dari hasil penelitian ini juga diuji aktivitasnya terhadap surfaktan dan penyinaran lampu UV. Hasil uji kestabilan bakteriosin
terhadap surfaktan tween 20, tween 80, EDTA dan penyinaran lampu UV disajikan dalam Tabel 3. Penambahan surfaktan berpengaruh positif terhadap peningkatan aktivitas bakteriosin. Tabel 3 menunjukkan bahwa pada penambahan tween 20 dan tween 80 mengakibatkan meningkatnya aktivitas bakteriosin sebanyak 1,1 kali dan penambahan EDTA meningkatkan aktivitas bakteriosin sebesar 1,2 kali. Peningkatan aktivitas bakteriosin ini diduga berkaitan dengan interaksi gugus hidrofil maupun lipofil bakteriosin dengan sel mikroba uji. Dengan adanya surfaktan, kontak antara bakteriosin dengan membran sel mikroba uji menjadi lebih efektif. Menurut Chen & Yanagida (2006), surfaktan berpengaruh terhadap sistem permeabilitas sel membran dalam cairan sel. Hal yang sama dijelaskan oleh Elayaraja et al. (2014). Surfaktan khususnya EDTA yang bertindak sebagai Metal Chelating Agent (MCA) mampu menurunkan stabilitas lapisan lipopolisakarida (LPS layer ) yang berada dalam membran sel dengan cara mengikat ion- ion divalensi seperti Mg 2+ dan Ca 2+ dengan membentuk ikatan komplek. Adanya penurunan stabilitas pada lapisan luar membran sel, membuat bakteriosin menjadi lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen (Altuntas, 2013).
Tabel 3. Pengaruh surfaktan dan penyinaran UV terhadap aktivitas bakteriosin. Table 3. Effect of surfactant and UV radiation on bacteriocin activity
(*) = tanpa penambahan surfaktan & penyinaran UV/ without addition of surfactant and UV radiation
Tabel 2. Pengaruh penambahan enzim terhadap aktivitas bakteriosin.
Table 2. Effect of enzymes to bacteriocin activity (*) = tanpa penambahan enzim/ without addition of enzyme
Perlakuan / Konsentrasi Enzim/ Aktivitas Bakteriosin/ Treatment Enzymes Concentration (mg/ml) Bacteriocin Activity (AU/ml) Kontrol (-)* 2163  -amilase 0.1 2163 Pepsin 0.1 0 Proteinase K 0.1 0 Tripsin 0.1 0 Perlakuan/ Konsentrasi Surfaktan Aktivitas Bakteriosin/ Treatment Surfactant Concentration (%) Bacteriocin Activity  (AU/ml) Kontrol/ Control (-)* - 2163 Tween 20 1 2373 Tween 80 1 2373 EDTA 1 2590 Penyinaran UV - 2163
Penyinaran UV pada suspensi bakteriosin tidak berpengaruh terhadap aktivitas bakteriosin. Sebelum dan sesudah penyinaran UV, aktivitas bakteriosin tetap sebesar 2163 AU/ml. Hal ini menunjukkan bahwa ikatan-ikatan peptida maupun gugus aktif penyusun konformasi protein dalam bakteriosin masih stabil terhadap penyinaran lampu UV. Hal yang sama disampaikan oleh Fatima & Mebrouk (2013), bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus plantarum dan Pediococcus pentosaceus tetap stabil dan aktivitas bakteriosin tidak berubah akibat penyinaran lampu UV selama 75 menit.
Lactobacillus lactis termasuk dalam genus Lactobacillus , Family Lactobacillaceae , order Lactobacillales . Dalam taksonomi terbaru Lactobacillus lactis masuk dalam sub spesies Lactobacillus delbrueckii , sehingga sering disebut sebagai Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (Weis et al., 1983; Hammes & Vogel, 1995). Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis diketahui mampu menghasilkan bakteriosin Lacticin yang memiliki karakteristik sensitif atau tidak tahan terhadap aktivitas enzim proteolitik dan tahan terhadap pemanasan sampai dengan 60 °C selama 10 menit (Toba et al ., 2008). Boris et al. (2001) telah melakukan karakterisasi parsial bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis UO004. Bakteriosin yang diperoleh tahan terhadap pemanasan sampai dengan 100 °C selama 30 menit, namun demikian akan terjadi penurunan aktivitas bakteriosin dengan adanya penambahan enzim proteolitik. Perbedaan karakteristik bakteriosin dari dua kasus tersebut di atas mengindikasikan adanya beberapa jenis bakteriosin dengan karakteristik yang berbeda yang dihasilkan oleh Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis.
Dalam satu Order Lactobacillales terdapat spesies Lactococcus lactis ( Lc.lactis ) yang mampu menghasilkan nisin sebagai salah satu bakteriosin yang telah banyak digunakan dalam industri pengawet makanan. Lactococcus lactis termasuk dalam genus Lactococcus , Family Streptococcaceae dan order Lactobacillales . Walaupun memiliki nama spesies yang mirip dengan Lactobacillus lactis , Lactococcus lactis tidak termasuk dalam satu Genus maupun Family dengan Lactobacillus lactis . Lactococcus lactis tergolong bakteri asam laktat mesofilik, sedangkan Lactobacillus lactis tergolong bakteri asam laktat termofilik (Barbara et al ., 2000).

## KESIMPULAN
Dari hasil penelitian ini dapat diambil kesimpulan sebagai berikut; bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus lactis mampu menghambat
pertumbuhan E.coli ATCC 25922, E. faecalis ATCC 29212 dan S.aureus ATCC 25923, serta efektif menghambat pertumbuhan B. subtilis ATCC 66923 , namun tidak dapat menghambat pertumbuhan L. plantarum , L. bulgaricus , L. casei, L. acidophillus maupun C. albican. Bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus lactis stabil pada pemanasan sampai dengan 70 °C dan stabil pada rentang pH 3 sampai dengan 7. Aktivitas bakteriosin menjadi hilang dengan penambahan proteinase-K, tripsin dan pepsin, namun tetap stabil pada penambahan enzim α -amilase. Penambahan surfaktan tween 20, tween 80 dan EDTA, mampu meningkatkan aktivitas bakteriosin sebesar 1,1 sampai dengan 1,2 kali dibandingkan tanpa penambahan surfaktan. Karakteristik bakteriosin yang mampu bekerja di bawah suhu 80 °C dan pada rentang pH 3 sampai dengan 7, lebih sesuai diaplikasikan sebagai pengawet makanan alami seperti pengawet daging, produk olahan susu, produk pangan asam ( salad dressing ), sosis, produk fermentasi dan ikan dalam kaleng.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, V., Iqbal, A.N., Haseeb, M., & Khan, M.S. (2014).
Antimicrobial potential of bacteriocin producing Lysinibacillus jx416856 against food borne bacterial and fungal pathogens, isolated from fruits and vegetable waste. Anaerobe , (27), 87–95.
Altuntas, G. (2013). Bacteriocins: A natural way to combat with pathogens. In Méndez-Vilas A. Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education . Formatex Research Center. Badajoz. Spanyol.
Aly, S., Cheik, O.A.T., Imael, B.H., Traore, N., & Alfred, S. (2006). Bacteriocins and lactic acid bacteria-a minireview. Afr. J. Biotechnol , 5(9), 678–683.
Ashraf, R. & Shah, N.P. (2011). Antibiotic resistance of probiotic organisms and safety of probiotic dairy products. Inter. Food Res. , 18 (3), 837–853.
Barbara, M.L., Baird-Parker, T.C., & Gould, G.W. (2000). Microbiological Safety and Quality of Food . Volume I. Aspen Publishers Inc, Kluwer Company.
Boris, S., Jimenez-Diaz, R., Caso, J.L., & Barbe, C. (2001). Partial characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis UO004 an intestinal isolate with probiotic potential. J. Appl Microbiol , (91), 328–333.
Chang, J.Y. & Chang, H.C. (2011). Growth inhibition of food borne pathogens by kimchi prepared with bacteriocin-producing starter culture. J. Food Sci , 76 (1), 72–78.
Chen, Y.S. & Yanagida, F. (2006). Characteristics and effects of temperature and surfactants on bacteriocin- like inhibitory substance production of soil-isolated Lactobacillus animalis C060203. Curr Microbiol ,
Elayaraja, S., Annamalai, N., Mayavu, P., & Balasubramanian, T. (2014). Production, purification and characterization of bacteriocin from Lactobacillus murinus AU06 and its broad antibacterial spectrum. Asian Pac. J. Trop Biomed , 4(1), 305–311.
Fatima, D. & Mebrouk, K. (2013). Characterization and determination of the factors affecting anti-listerial bacteriocins from Lactobacillus plantarum and Pediococcus pentosaceus isolated from dairy milk products. Afr. J. Food Sci., 7(2), 35–44.
Fawzya, Y.N. (2010). Bahan pengawet nisin: aplikasinya pada produk perikanan. Squalen , 5(3), 79–85. Francois, Z.N., Marie, K.P., Huguette, T.A., & Emeric, G.W.R. (2013). Antimicrobial activity of a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum 29V and strain’s viability in Palm kernel oil. Inter J. Nutr Food Sci., 2 (3), 102–108.
Gautam, N. & Sharma, N. (2009). Bacteriocin: safest approach to preserve food products. Indian J. Microbiol. , 49 (3), 204–211.
Gulluce, M., Karaday, M., & Barýs, O. (2013). Bacteriocins: promising natural antimicrobials di dalam Méndez- Vilas A. Microbial Pathogens and Strategies for Combating them: Science, Technology and Education. Formatex Research Center. Badajoz. Spanyol.
Hammes, W.P. & Vogel, R.F. (1995). The genus
Lactobacillus . In Wood, B.J.B. dan Holzapfel, W.H. (ed.). The genera of lactic acid bacteria (p. 19–54) .
CRC Press Taylor & Francis Group Florida.
Jack, R.W., Tagg, J.R., & Ray, B. (1995).  Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Microbiol Rev. , 59 (2), 171– 200.
Kusmarwati, K., Arief, F.R., & Haryati, S. (2014). Eksplorasi bakteriosin dari bakteri asam laktat asal rusip Bangka dan Kalimantan. JPB Perikanan, 9 (1), 29– 40.
Leelavatcharamas, V., Arbsuwan, N., Apiraksakorn, J.,
Laopaiboon, P., & Kishida, M. (2011). Thermotolerant bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated from Thai local fermented foods and their bacteriocin productivity. Biocontrol Sci ., 16 (1): 33–40.
Ogunbanwo, S.T., Sanni, A.I., & Onilude, A.A. (2003). Characterization of bacteriocin produced by
Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis OG1. Afr. J Biotechnol., 2(8), 219–227.
Rahayu, E.S., Wardani, A.K., & Margino, S. (2004). Skrining bakteri asam laktat penghasil bakteriosin dari daging dan produk olahannya. Agritech, 24 (2), 74–78.
Rahayu, E.S., Margino, S., & Hermayani, E. (2000).
Produksi bakteriosin oleh Leuconostoc mesenteroides SM 22 menggunakan tetes sebagai sumber karbon. Prosiding Seminar Nasional Industri Enzim dan Bioteknologi II. Jakarta, 15-16 Februari 2000.
Rajaran.G., Manivasagan. P., Thilagavathi. B., & Saravnakumar, A. (2010). Purification and characterization of a bacteriosin produced by Lactobacillus lactis isolated from marine environment. Adv J. Food Sci Technol, 2(2), 138–144. Reddy, G.C., Shahani, K.M., Friend, B.A., & Chandan, R.C. (1984). Natural antibiotic activity of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus bulgaricus , production and partial purification of Bulgaricus culture. J. Dairy Product ., 8, 15–19.
Romadhon., Subagiyo., & Margino, S. (2012). Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari usus udang penghasil bakteriosin sebagai agen antibakteria pada produk-produk hasil perikanan. J. Saintek Perikanan , 8 (1), 59–64.
Simonov, M. & Laukova, A. (2007). Bacteriosin activity of Enterococci from rabbit. Vet.  Res. Commun. , (31), 143–152.
Singh, R., Sivasubramani, K., Jayalakshmi, S., Kumar, S.S., & Selvi, C. (2013). Isolation and production of bacteriocin by marine Lactobacillus fermentum SBS001. Int. J. Curr.Microbiol. App. Sci ., 2(4), 67–73. Usmiati, S. & Marwati, T. (2007). Seleksi dan optimasi proses produksi bakteriosin dari Lactobacillus sp. J.
Pascapanen, 4 (1), 27–37.
Weiss, N., Schillinger, U., & Kandler, O. (1983).
Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii and Lactobacillus bulgaricus subjective synonyms of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis comb. nov . and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus comb. nov . Syst. Appl. Microbiol ., (4), 552–557 Yusuf, M.A. (2013). Lactic acid bacteria: Bacteriocin producer: A mini review. IOSR J Pharm., 3 (4), 44–50.