## PEMBUATAN KITOSAN DARI CANGKANG KEPITIN MENGGUNAKAN MIKROBA

## Andi Artiningsih
Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, Universitas Muslim Indonesia Jl. Urip Sumohardjo km.5 makassar, Indonesia 90231 andiartiningsihningsih@yahoo.com

## INTISARI
Telah  dilakukan  penelitian  tentang  biokonversi  kitosan  dari  cangkang  kepiting  dengan  menggunakan mikroba  Thermofilik.  Hasil  yang  diperoleh  bahwa  Isolat  M-l  menghasilkan  enzim  kitin  deasetilase  dan kitinase  pada  hari  ke-4  dengan  kondisi  55  °C  dan  pH  7.  Kitin  dari  gkang  cankepiting  dapat  dikonversi menjadi  kitosan  oleh  enzim  kitin  deasetilasi  yang      berasal  dari  isolat  M-l  dan  telah  difraksinasi  dengan amonium sulfat 40% b/v.
Kata Kunci : Kitosan, Kulit, Kitin, Fermentasi.

## ABSTRACT
Enzymatic bioconversion of chitosan from crab shell chitin using thermophillic bacterium has been carried out. With chitinolytic optimum activity, called M-l isolator, at 550C and pH 7.0, the microbe could grow best at fourth day of fermentation  with  O.D.  of  0.62  as  well  as  the  enzyme  at  7.03  UA/mL.  With  the  same  optimum  condition, deacetylated chitin enzyme, utilised for converting chitin into chitosan, was also  produced at 7.95 UA/mL. After further purification with ammonium sulfate 40%, chitosan was produced, examined, and confirmed accordingly.
Keywords : chitin, shell, chitosan, fermentation

## 1. PENDAHULUAN
Indonesia merupakan negara yang memiliki  wilayah  perairan  yang  lebih  luas  dari daratan,  sehingga  hasil  perikanannya  melimpah ruah.  Salah  satu  hasil  yang  lebih  banyak dibudidayakan  dan  potensial  adalah  budidaya kepiting.  Dari  hasil  pengolahan  kepiting  ini dihasilkan  limbah  berupa  cangkang  yang  tidak dapat  dimanfaatkan  keseluruhannya  sehingga mengganggu lingkungan.
Saat  ini  limbah  dari  pabrik  pengolahan kepiting  umumnya  dibuat  sebagai  campuran makanan  ternak,  pupuk  dan  pakan,  namun jumlah  yang  dimanfaatkan  tidak  seberapa  jika dibandingkan  dengan  jumlah  limbah  yang  ada. Pemanfaatan  lain  limbah  kepiting  adalah ekstraksi khitin, untuk pembuatan kitosan, yang mengandung l5% dari limbah tersebut (Permadi, l998).  Di  Jepang  dan  Amerika  Serikat,  kitin  dan produk-produk  turunannya  telah  diproduksi
secara  komersial  sebagai  bahan  dasar  berbagai industri  modern  seperti  farmasi,  bioteknologi, kosmetik,  pertanian,  industri  tekstil,  industri kertas,  industri  pangan,  pengolahan  air  limbah dan sebagainya.
Indonesia  sebagai  Negara  Maritim,  sangat berpotensi  menghasilkan  kitin  dan  produk turunannya.  Limbah  cangkang  rajungan  di Cirebon  saja  berkisar  10  ton  perhari  yang  berasal dari  sekurangnya  20  industri  kecil.  Kitosan tersebut  masih  menjadi  limbah  yang  dibuang  dan menimbulkan  masalah  lingkungan.  Data  statistik menunjukkan  negara  yang  memiliki  industri pengolahan  kerang  menghasilkan  sekitar  56.200 ton  limbah  per  tahun  (Sandford  2003  dalam Meidina et. al 2006).
Pasar  dunia  menunjukkan  bahwa  harga internasional  untuk  kitosan  berkisar  antara  USD 40 per kg sampai USD 100 per kg (Anonim 2007).
Walaupun  tersebar  luas  di  alam,  sumber  utama kitin yang  dapat digunakan dalam pengembangan lebih  lanjut  adalah  limbah  kepiting    berupa cangkang  dikarenakan  limbah  ini  mudah  didapat dalam  jumlah  besar  sebagai  limbah  hasil pengolahan Kepiting. Limbah ini juga mengandung  protein,  CaCO3,  serta astaxanthin (Suptijah et  al. 1992).  Kulit  golongan crustacea merupakan  sumber  kitin  yang  paling  kaya, kandungannya  dapat  mencapai  40–60  %  berat kering.
Kitin  merupakan  homopolimer  dari  residu N  -  asetil  -  D  –  glukosamin  yang  terikat  melalui ikatan  þ-  l,4  glikosidik  dan  merupakan  sumber daya  alam  yang  dapat  diperbaharui  dan  paling melimpah  setelah  selulosa.  Sebagai  contoh, diperkirakan  bahwa  setiap  tahun  di  dunia, ditemukan 37.300 ton kubik kitin yang berasal dari pengolahan  invertebrata  laut.  Jumlah  kitin  yang berlimpah di alam ini memungkinkan dimanfaatkan  secara  luas  terutama  dalam  bidang bioteknologi dan industri (Wang dan Chang, 2000).
Kitosan  sebagai  polimer  alami  dapat dihasilkan dari hewan berkulit keras terutama dari laut seperti kulit udang, rajungan, kepiting, cumi- cumi dengan kadar kitosan antara 10–15 %. Selain dari kulit hewan laut, kitosan juga dapat diperoleh dari dinding sel jamur antara lain Aspergillus niger (Hardjito  2006).  Kitosan  adalah  biopolimer  alami yang  diperoleh  dari  eksoskeleton  c rustacea dan Arthropoda dimana polimernya terbentuk dari unit- unit β -(1,4)-2- acetamido-2-deoxy-D-glukosa dan β - (1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glukosa (Nan et. al 2006).
Kitosan
merupakan
biopolimer
karbohidrat  alami  yang  dibuat  dari  deasetilasi kitin,  komponen  mayor  pada  cangkang crustacean seperti  kepiting  dan  udang  (No  dan  Meyer  1989 dalam  Kim  2004).  Kitosan  juga  merupakan  fiber seperti  halnya  selulosa.  Cangkang  udang mengandung protein (30–40 %), kalsium karbonat (30-50  %)  dan  kitin  (20-30  %)  pada  basis  kering (Johnson  dan  Peninston  1982  dalam  Kim  2004). Jumlah  kandungan  tersebut bervariasi tergantung dari spesies dan musim
Struktur dan sifat kitosan Kitosan  merupakan  turunan  dari  kitin yang  dideasetilasi  dapat  larut  pada  larutan  asam seperti  asam  asetat  atau  asam  format.  Isolasi secara  tradisional kitin dari limbah/kulit crustacea melewati  tiga  tahapan  yaitu,  demineralisasi, deproteinase  dan  dekolorisasi.  Tiga  tahapan
tersebut  merupakan  standar  prosedur  pada pembuatan  kitin  (No  1989  dalam  Kim  2004). Karakteristik  kitosan  adalah  non  toksik,  polimer biodegradable pada  bobot  molekul  yang  tinggi  dan sangat mirip dengan selulosa. Struktur kimia kitin dan kitosan dapat dilihat pada Gambar -1 dibawah ini:
Gambar-1, Struktur kimia selulosa, kitin dan kitosan (Kim 2004)
Kitosan pada umumnya tidak larut dalam air  tetapi  larut  dalam  pelarut  asam  dengan  pH  di bawah  6  seperti  asam  asetat,  asam  format  dan asam  laktat  yang  digunakan  sebagai  pelarut kitosan dan yang sering digunakan adalah  pelarut asam asetat 1 % (Nadarajah 2005). Kitosan dapat dikelompokkan berdasarkan BM dan kelarutannya (Janesh dan Alonso 2003), yaitu:
a. Kitosan larut asam dengan BM 800.000 Dalton sampai 1.000.000 Dalton,
b. Kitosan  mikrokristalin  (larut  air  dengan  BM sekitar 150.000 Dalton
c. Kitosan  nanopartikel  (larut  air)  dengan  BM 23.000  Dalton  sampai 70.000  Dalton,  dapat berfungsi sebagai imunomodulator.
Pada  umumnya,  kitin  dengan  derajat deasetilasi  di  atas  70  %  dapat  dikatakan  sebagai kitosan  (Li et  al. 1997  dalam  Nadarajah  2005). Pada  proses  deasetilasi,  gugus  asetil  dari  rantai molekuler  kitin  dihilangkan  menjadi  bentuk gugusamino.  Temperatur  dan  konsentrasi  dari larutan  natrium  hidroksida  berpengaruh  terhadap penghilangan  gugus  asetil  dari  kitin,  yang menghasilkan  kitosan  yang  berbeda  tergantung dari  aplikasi  yang  akan  digunakan  (Baxter et  al. 1992  dalam  Nadarajah  2005,  Mima et  al. 1983 dalam Nadarajah 2005). Konversi kitin dan kitosan dapat  dilihat  pada  Gambar  2. Gambar  2. Konversi kitin menjadi kitosa

## Aplikasi kitosan
Kitosan  telah  dimanfaatkan  dalam berbagai  keperluan  industri  seperti  industri  kertas dan tekstil sebagai zat aditif, industri pembungkus makanan  berupa  film  khusus,  industri  metalurgi sebagai  absorban  untuk  ion-ion  metal,  industri kulit untuk perekat, fotografi, industri cat sebagai koagulan, pensuspensi dan flokulasi, serta industri makanan sebagai aditif
Enzim pendegradasi kitin secara  langsung adalah  kitinase  dan  kitin  deasetilase.  Kitinase adalah  enzim  yang  dapat  menghidrolisis  kitin secara  acak  pada  ikatan  glikosidiknya,  sedang kitin      deasetilase  adalah  enzim  yang  dapat mengkonversi  kitin  menjadi  kitosan  (Gooday, l990).  Teknik  produksi  kitosan  secara  ensimatik, dibanding  secara  termokimia,  relatif  lebih  baik karena  mudah  dikendalikan,  terurai  biologis (biodegradable), dan sesuai lingkungan (biocompatible),  serta  dapat  membentuk  oligomer atau polimer (Tsigos, 2000).
Kitosan  adalah  senyawa  polimer  alam turunan kitin yang diisolasi dari limbah perikanan, seperti kulit. udang dan cangkang kepiting dengan kandungan  kitin  antara  65-70  persen.  Sumber bahan  baku  kitosan  yang  lain  di  antaranya kalajengking, jamur, cumi, gurita, serangga, laba - laba  dan  ulat  sutera  dengan  kandungan  kitin antara  5-45  persen.  Kitosan  merupakan  bahan kimia  multiguna  berbentuk  serat  dan  merupakan kopolimer  berbentuk  lembaran  tipis,  berwarna putih  atau  kuning,  tidak  berbau.  Kitosan merupakan  produk  deasetilasi  kitin  melalui  proses kimia menggunakan basa natrium bidroksida atau proses  enzimatis  menggunakan  enzim chitin deacetylase .  Serat  ini  bersifat  tidak  dicerna  dan tidak diserap tubuh. Sifat menonjol kitosan adalah kemampuan  mengabsorpsi  lemak  hingga  4-5  kali beratnya
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pemanfaatan cangkang
kepiting
untuk menghasilkan  kitosan  dengan  menggunakan mikroba termofilik.

## 2. METODE PENELITIAN
Bahan  yang  digunakan  adalah  mikroba termofilik,  serbuk  kitin  (rajungan),  glukosamin (Sigma-Aldrich),  glikol  kitin,  HCl  pekat,  NaOH pekat,  bakto  agar,  yeast  ekstrak,  NaCl,  (NH4)2
SO4,  K2HPO4,  MgSO47H2O,  CaCl2,  Indole, amonium sulfamat, amonium sulfat.
Alat  yang  digunakan  antara  lain Inkubator  (Memmert®),  Spektrofotometer  UV- VIS  Hewlett  Packard,  Model  340,  Shaker  batch (Aureus®), kulkas (Samsung), otoclaf (Model No. l925x),  vibrator  (Janke  &  Kunkel,  Type  VF2), timbangan  analitik  (Chyo),  timbangan  kasar (Chyo),  oven  (Ohaus),  sentrifugasi  dingin (Aureus),  magnetik  stirer  (Fisher)  dan  peralatan gelas yang biasa digunakan dalam laboratorium.
Tahapan penelitian terdiri dari pembuatan  substrat,  peremajaan  mikroba termofilik,  penyiapan  inokulum,  dan  penentuan waktu  produksi  optimum,  kemudian  dilakukan produksi    pada    kondisi  optimum.selanjutnya dilakukan  biokonversi  kitin  menjadi  kitosan secara enzimatik.
Untuk  produksi  enzim  pada  medium fermentasi, l0 ml medium inokulum untuk l00 ml medium  fermentasi  diinokulasikan  bakteri  yang terpilih sebanyak 4-5 ose, selanjutnya diinkubasikan  pada  suhu  55  °C,  l70  rpm  selama l2-l8 jam. Komposisi medium adalah (NH4)2SO4 0,7%; K2HPO4 0,l%; NaCl   0,l%; MgSO4. 7H2O 0,0l%;  yeast  ekstrak  0,05%;  CaCl2  0,025%;  dan koloidal  kitin  0,5%  (Natsir,2000).  Inokulum  lalu dituang  ke  dalam  medium  fermentasi  (medium produksi) yang komposisinya sama dengan medium inokulum, kemudian diinkubasi pada kondisi yang sama selama 4 hari. Penarikan contoh tiap 24 jam dilakukan  untuk  pengukuran  o.d  (optical  density) pada 660 nm, uji  protein  menggunakan  pereaksi uji  biuret  (Saleh,  2002)  dan  uji  aktivitas  kitinase serta  kitin deasetilase (Natsir, 2000).
Filtrat  kultur  (enzim  ekstrak  kasar) diperoleh  dengan  sentrifugasi  contoh  pada kecepatan  3000  rpm,  suhu  4  oC  selama  l5  menit. Pengukuran  dilakukan  selama  4  hari  untuk menentukan pencapaian kondisi optimum.
Ensim  ekstrak  kasar  difraksinasi  dengan amonium  sulfat  teknis  pada  berbagai  konsentrasi yang dimulai dari 30, 40, 50,  dan 60%. Perlakuan ini  dilakukan  dengan  cara  sebagai  berikut:  Ensim ekstrak kasar ditambahkan amonium sulfat sedikit demi  sedikit  sambil  diaduk  dengan magnetic  stirer hingga  larut  sempurna  dan  dibiarkan  semalam pada  suhu  4 °C.  Filtrat  ensim  dipisahkan  dengan sentrifugasi 5000 rpm selama 30 menit dengan suhu 4  °C,  kemudian  dilarutkan  dalam  buffer  sitrat fosfat 0,lM pH 7,0.
ISSN = 2527-4457
Untuk  produksi  kitosan,  ensim  ekstrak kasar  difraksinasi  menggunakan  amonium  sulfat ditambahkan  dengan  substrat  koloidal  kitin (serbuk  kitin)  0,3  %  yang  sebelumnya  sudah dilarutkan  dalam  buffer  sitrat  fosfat  0,lM  pH  7,0 dengan  perbandingan  l:l,  l:2,  dan  l:3  (b/v), diinkubasi  pada  suhu  55oC,  sentrifugasi  pada  l70 rpm  selama  60  menit,  dan  endapan  diambil. Kitosan  yang  diperoleh  ditimbang  dan  disimpan pada  suhu  dingin  untuk  analisis  dan  pengujian lebih lanjut.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Mikroba  termofilik  diperoleh  dari  hasil skrining  sampel  air  laut  panas  yang  berasal  dari Manado  Sulawesi  Utara.  Mikroba  termofilik tersebut  merupakan  isolat  M-l  yang  memiliki aktivitas  kitinolitik  dan  dapat  tumbuh  secara optimal pada kondisi temperatur 55 oC dengan pH 7,0.  Isolat  M-l  ditumbuhkan    pada    medium    cair dan  medium  padat dengan menggunakan koloidal kitin 2.0 % sebagai substratnya.
Isolat M-l di tumbuhkan lebih lanjut pada medium  fermentasi  untuk  mengetahui  kondisi optimal produksi, sebab dalam medium fermentasi pertumbuhan mikroba dan produk yang dihasilkan dapat  dipantau  dengan  baik  sesuai  kondisi  yang optimal.  Pertumbuhan  isolat  M-l  medium fermentasi meningkat terus hingga hari ke – 4 dan mulai  menurun pada hari ke – 5 (Gambar-l).
Gambar 1.  Kurva Pertumbuhan OD terhadap Waktu Inkubasi
Pada  grafik  di  atas  terlihat  bahwa pertumbuhan optimal mikroba adalah pada hari ke
– 4 dengan nilai OD 0,62, dan menurun pada hari ke–5.  Hal  ini  mungkin disebabkan oleh  terjadinya penumpukan  produk  beracun  atau  kehabisan nutrien  sehingga  beberapa  sel  mati,  sedangkan yang  lain  tumbuh  dan  membelah.  Sejalan  dengan pengukuran  kurva  pertumbuhan  dilakukan  pula pengukuran  aktivitas  ensim  secara  optimal. Ternyata aktivitas ensim adalah optimal pada hari ke  –  4  (Gambar-2).  Hal  ini  seiring  dengan  enzim kitinase  yang  diproduksi  pada  hari  ke  –  4  dari isolat  K–  22  yang  telah  di  isolasi  dari  sumber  air panas  Kawah  Kamojang  Jawa  Barat  (Natsir, 2000).
Gambar 2, Grafik antara aktivitas kitin diasetilase dan waktu inkubasi
Dari  Gambar-2  di  atas  terlihat  bahwa aktivitas kitin diasetilase mencapai nilai optimum pada  pH  7,0  yaitu  9,75  UA/mL  pada  hari  ke  –4 (Gambar  5).  Pada  hari  ke-5,  aktivitas  kitin diasetilase  menurun  yaitu  7,95  UA/mL.  Enzim pendegradasi  kitin,  yaitu  kitinase  dan  kitin deasetilase  di  produksi  setelah  pertumbuhan mencapai  fase  stasioner,  yaitu  pada  hari  ke–4 waktu  fermentasi,  dimana  pada  fase  tersebut aktivitas  kitinase  dan  kitin  deasetilase  optimum. Hal ini kemungkinan di sebabkan oleh terjadinya kondisi  tertentu  di  dalam  medium,  yaitu  kondisi kerapatan  sel  dan  ketersediaan  nutrisi  dalam mediumnya semakin berkurang, sehingga kitinase dan kitin deaserilase disekresikan keluar sel dalam jumlah  yang  banyak  untuk  mendegradasi  kitin pada  dinding  sel  mikroba  tersebut.  Kemudian hasil  degradasinya  digunakan  sebagai  sumber nutrisi alternatif.
0 1 2 3 4 5 6 7 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Waktu inkubasi 0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 4 5 6 A kt iv ita s K itin Waktu inkubasi Aktivitas Kitin Waktu inkubasi
Enzim  pendegradasi  kitin  umumnya diproduksi  secara  ekstra  selular  menurut  Natsir (2000), enzim ekstraselular akan dikeluarkan oleh sel  dan  tertampung  pada  medium,  kemudian disentrifugasi  dengan  kecepatan  tertentu.  Enzim tersebut  akan  tersuspensi  pada  filtrat  atau supernatan  dan  terpisah  dari  sel.  Enzim  kitinase dan  kitin  diasetilase  yang  terdapat  pada
supernatan  hasil  sentrifugasi  3000  rpm,  4oC selama l5 menit merupakan enzim ekstrak kasar. Enzim  ini  difraksionasi  dengan  amonium  sulfat pada berbagai konsentrasi
Gambar 3.  Grafik hubungan antara aktivitas enzim  dengan konsentrasi ammonium sulfat
Fraksi  yang  memiliki  aktivitas  tertinggi selanjutnya  digunakan  untuk  penelitian  lebih lanjut,  aktivitas  teringgi  tercapai  pada  kondisi optimum  40%  b/v  yang  setara  dengan  kejenuhan 65%.  Salah  satu  cara  untuk  mengidentifikasi adanya  kitosan  ialah  melalui  test  warna  Van Wisselingh  (Bastaman,  l99l).  Pada  test  ini kalium yodida (KI-I2) akan    merubah    warna kitosan    menjadi  merah, kecoklatan dan dalam suasana  asam,  dengan  penambahan  asam  sulfat (H2SO4)  akan  berubah  menjadi  hitam.  Ini merupakan  uji  kualitatif  kitosan  yang  paling akurat.  Perubahan  warna  dapat  dilihat  pada table -1 dibawah ini.
Tabel -1, Identifikasi Kitin dan Kitosan
Hasil Penambahan zat Uji Kitin/Kitosan Warna Isolat Serbuk Kitin KI-I 2 Merah jungga Merah Jingga Koloidal Kitin KI-I 2 Merah Jingga Coklat Susus Kitosan KI- I 2 +H2SO 4 Hitam Hitam
Derajat deasetilase kitosan adalah persentase  gugus  asetil  kitin  yang  berhasil
dihilangkan pada  proses deasetilase agar diperoleh kitosan.  Hasil  analisis  derajat  diasetilase  kitin menghasilkan  kitosan  dapat  dilihat  pada  table-2 dibawah ini.
Tabel -2, Hasil Analisis Derajat Deasetilase Kitin Menghasilkan Kitosan (%)
Perlakuan Derajat Deasetilase (%) E: SK (b/v) = 1:1 44 E: KK (b/v) = 1:1 59 E: KK (b/v) = 1:2 70 E: KK (b/v) = 1:3 63
Dari  tabel  di  atas  dapat  dilihat  bahwa pada  derajat  deasetilasi  l:2  KK  (b/v)  ternyata memberikan  hasil  yang  optimal  karena mempunyai  derajat  deasetilasi  yang  tinggi yaitu  70%  dibandingkan  dengan  nilai  derajat deasetilasi pada perbandingan  l:l  SK  (b/v),  l:l KK  (b/v),  dan  l:3  KK  (b/v).  Dari  hasil  analisis
0 20 40 60 80 100 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Kons ent ras i Amonium Sulfat (% )
ISSN = 2527-4457
gugus  fungsi  dengan  spektroskopi  infra  merah ditemukan puncak-puncak serapan yang merupakan karakteristik senyawa khitin
Tabel-3, Hasil absorpsi infra merah isolat yang bersesuaian dengan karakteristik khitin
Gugus Fungsi Frekuensi /Cm Karakteristik OH 3449 Kuat (s) CH-Streching 2880 Sedang (m) C=O 1670 Kuat (s) N-H 1550 Kuat (s) CH3 1327 Kuat (s) C-O-C 1072 Kuat (s)
Dengan demikian uji kualitatif, baik dengan test warna maupun dengan spektroskopi infra merah, keduanya menunjukkan  isolat  sebagai  khitin  yaitu  produk  usaha  biokonversi  yang  telah  dilakukan.

## 4. KESIMPULAN
1. Isolat M-l menghasilkan enzim kitin deasetilase dan kitinase pada hari ke-4 dengan kondisi 55 °C dan pH 7
2. Kitin dari kulit kepiting dapat dikonversi menjadi kitosan oleh enzim kitin deasetilasi yang     berasal dari isolat M-l dan telah difraksinasi dengan amonium sulfat 40% b/v. Sehingga dikatakan bahwa kitin dapat terdeteksi melalui uji kualitatif.

## DAFTAR PUSTAKA
Bastaman,  S;  l989. Mempelajari  Proses Degradasi  Dan Ekstraksi Chitin Dan Chitosan dari Kulit udang (Nephropsvior vegicus). The Institute for
Research  on  Chemistry  and  Multi Various Industry. Vol. 6 No. 2 p.l-8. Bastaman,  S;  Aprianita,  N  ;  dan  Hendarti, l990/l99l. Penelitian  Limbah  Udang Sebagai  Bahan  Industri  Chitin  dan Chitosan .  Balai  Besar  Penelitian  dan Pengembangan Industri Hasil Pertanian. Gooday  W.  Graham.  l990. The  Ecology  Of Chitin  Degradation  Advance  In
Microbial .  Ecot.  Vol.  ll  editor  K.C. Marshall
Tsigost, Lason. 2000. Aggeliki Martinou, Dimitris kafetzoupolos  and  Vassillis  Bouriotis. Chitin  deactylases:  New  Versatile tools in biotechnoligy . Natsir.  Hasnah,.  2000. Karakterisasi  dan Purifikasi  Sifat-Sifat  Biokimiawi Enzim Kitinase dan Kitin Deasetilase Yang Berasal Dari Mikroba
Asidofilik  Tanah  kawah  Kamojang ,
Jawa Barat. (Tesis) Permadi, Wisnu. l999. Produksi dan Kegunaan Kitin dan Kitosan . Makalah. Saleh,  Asri.  2002. Pengendalian  Pencemaran Limbah  Air  Kelapa  k  Mengurangi Dampak  Lingkungan  dan  Untuk Meningkatkan  Mutu  Pakan. Tesis Unhas.