## Potensi Antiproliferasi Fraksi sari Ekstrak Metanol Daun Botto-botto (Chromolaena odorata L.) Terhadap Sel HeLa

## Antiproliferation potential of Botto-botto (Chromolaena odorata L.) leaves methanol extract fraction against HeLa Cell Line

## Muhammad Rusdi, Haeria, Nursalam Hamzah, Afrisusnawati Rauf, Faradibha Amriani
Jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar, Jl H.M. Yasin Limpo No.36 Kecamatan Sombaopu Kabupaten Gowa, Sulawesi Selatan
Kontak korespondensi: muhammad.rusdi@uin-alauddin.ac.id

## ABSTRAK
Botto-botto  ( Chromolaena  odorata L.)  adalah  salah  satu  tanaman  yang  secara  empiris  digunakan  daunnya oleh  masyarakat  Sulawesi  Selatan  sebagai  obat  luka  dan  antiinflamasi.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menguji potensi antiproliferasi  ekstrak metanol  daun  Botto-botto terhadap sel kanker (HeLa) dan sel  normal (Vero) dengan metode  MTT  ( Microculture  Tetrazolium  Salt ).  Daun  kering  diekstraksi  dengan  metode  maserasi  menggunakan pelarut  metanol,  filtrat  kemudian  dikeringkan.  Ekstrak  kemudian  dipartisi  dengan  pelarut  etil  asetat.  Ekstrak  etil asetat dari ekstrak metanol yang diperoleh difraksinasi menggunakan kromatografi kolom cair vakum menggunakan pelarut  yang  berbeda  tingkat  kepolarannya.  Setiap  fraksi  kemudian  diuji  aktivitas  antiproliferasi  menggunakan metode MTT pada sel kanker HeLa dan sel normal Vero dengan parameter persen penghambatan pertumbuhan sel. Indeks  selektivitas  dihitung  dari  rasio  persen  penghambatan  pertumbuhan  sel  kanker  dibanding  sel  normal.  Hasil penelitian ini menunjukkan  bahwa fraksi  A, B, C, D, E, F, dan G dari  hasil fraksinasi  ekstrak etil  asetat memiliki indeks selektivitas pada sel HeLa masing-masing sebesar 0,845; 3,387; 2,004; 1,508; 1,625; 1,284; 1,299. Hasil ini membuktikan  bahwa  fraksi  B  dari  ekstrak  metanol  daun  Botto-botto  berpotensi  dikembangkan  sebagai  agen kemoterapi dalam meningkatkan efektivitas pengobatan kanker leher rahim.
Kata Kunci: Antikanker, Chromolaena odorata Linn; Uji MTT; Sel HeLa

## ABSTRACT
Botto-botto (Chromolaena  odorata  L.) was one of  plants that its leaves used empirically in  South  Sulawesi society  as  wound  and  anti-inflammatory  drugs. This  study  aimed  to  determine  the  potential  of  Botto-botto toward cancer cells (HeLa Cells) and normal cells (Vero cells) using the MTT assay method (Microculture Tetrazolium Salt Method). Ethyl acetate extract from methanol extract being fractionated by vacuum liquid chromatography method by  a  different  polarity  level  of  solvent.  Cytotoxic  effect  test  was  using  MTT  method  to  cancer  cells  (HeLa),  and normal  cells  (Vero)  with  the  percent  parameter  of  cell  growth  inhibition.  Selectivity  index  was  determined  from percentage of cancer cell growth inhibition ratio of cancer cells to normal cells. The results showed that A, B, C, D, E, F, and G fractions had a selectivity index on HeLa cells at 0.845, 3.387, 2.004, 1.508, 1.625, 1.284, 1.299. This result  proved  that  B  fraction  of  methanol  extract  of  Botto-botto  leaves  had  a  potential  to  be  developed  as chemotherapy agents in increasing the effectiveness treatment of cervix cancer.
Keywords: Chromolaena odorata L.; HeLa Cell Line; MTT Assay

## PENDAHULUAN
Kanker  adalah  penyakit  yang  ditandai dengan pertumbuhan sel yang tidak terkontrol.  Diperkirakan  ada  kasus  baru sekitar  18,1  juta  dan  kematian  yang diakibatkan  oleh  penyakit  ini  sekitar  9,6  juta
ISSN: 2654-7392, E-ISSN: 2654-6973 Vol. 3, No. 2, Desember 2020, Hal. 83 – 89 DOI: 10.24252/djps.v3i2.14051
jiwa  dan  lebih  dari  setengahnya  akan  terjadi di  Asia  pada  tahun  2018  (Bray,  et  al.,  2018). Salah satu kanker yang paling membahayakan adalah  kanker  leher  rahim  yang  menempati peringkat  kedua  penyakit  yang  menimpa wanita  di  Indonesia.  Kanker  leher  rahim ( cervix )  adalah  kanker  ganas  yang  berasal dari sel epitel skuamosa yang disebabkan oleh infeksi Human  Papilloma  Virus  (HPV) (Andrijono, 2007).
Di Amerika, kanker leher rahim merupakan  kanker  urutan  kedua  yang membunuh wanita (Siegel, Miller, & Ahmedin Jemal, 2017). Di Indonesia, terdapat sekitar 32.469 kasus kanker leher rahim yang di  diagnosa  setiap  tahunnya  dan  umumnya dialami  wanita  yang  berusia  15  hingga  44 tahun (Bruni, et al., 2019).
Di  dalam  karsinoma  leher  rahim  manusia terdapat sel yang mempunyai pembelahannya cepat  dan  mudah  ditumbuhbiakan,  yang dinamakan sel HeLa. Siklus sel Hela biasanya selama 20 jam dan bermitosis hanya satu jam (Marks & Mark, 2000) . Sel ini dapat tumbuh secara  agresif  di  media  RPMI  1640-serum yang  terdiri  nutrisi  (asam  amino,  vitamin, garam-garam  anorganik,  dan  glukosa)  serum yang  mampu  memacu  pertumbuhan  sel  dan albumin  sebagai  kofaktor  enzim  (Freshney, 1986).
Kemoterapi merupakan terapi kanker yang masih  digunakan  sampai  saat  ini,  akan  tetapi masih  menyisahkan  masalah  berupa  efek samping  obat.  Anemia,  neutropenia,  dan trombositopenia  dialami  beberapa  pasien
kanker di Filipina setelah pemberian kemoterapi. Hal ini menunjukkan kemoterapi dapat menginduksi timbulnya penyakit tersebut  (Tia,  Lui,  Chua,  &  Strebel,  2015) . Selain  itu,  pemberian  kemoterapi  ini  paling menonjol  pada  sistem  hematopoietik  dan saluran  gastrointestinal  (GI)  dikarenakan jaringan  ini  cepat  memperbarui  dan  memiliki kompartemen  sel  punca  yang  jelas  yang memainkan peran penting dalam homeostasis, dan  dalam  cedera  akut  akibat  pengobatan dosis terbatas (Yu, 2013)
Daun  Botto-botto  merupakan  salah  satu pengobatan  alternatif  yang  digunakan  oleh masyarakat  Sulawesi  selatan  sebagai  obat tradisional.  Beberapa  penelitian  dari  daun Botto-botto  sebagai  antikanker  diantaranya ekstrak metanol daun Botto-botto menyebabkan  penghambatan  yang  nyata terhadap  sel  kanker  HT-29  (Adedapo, Oyagbemi,  &  Yakubu,  2016).  Penelitian  lain melaporkan  bahwa  ekstrak  larut  n-heksan memiliki  aktifitas  sitotoksik  terhadap  sel kanker  Cal51,  MCF7  dan  MDAMB-468 (Kouamé, et al., 2013).  Selanjutnya, fraksi C dari  ekstrak  etil asetat  Botto-botto  berpotensi sebagai  agen  anti  kanker  dengan  aktivitas LC 50 sebesar  4,697  μg/ml  terhadap Artemia salina Leach  (Mukhriani,  Edy,  Ilyas,  & Leboe,  2016).  Dalam  penelitian  lainnya, ekstrak  etil  asetat  daun  Botto-botto  memiliki aktivitas antiproliferasi terhadap sel leukemia L1210  dengan  nilai  IC 50 sebesar  9,3  μg/mL (Fitrah, 2016).
Penelitian  beberapa  aktivitas  antikanker dari  tanaman  Botto-botto  sangat  bermanfaat dalam mengembangkan potensi tanaman obat ini,  mengatasi  efek  samping  obat  dan menguatkan penelitian penelitian sebelumnya.  Oleh  karenanya,  dilakukan penelitian  potensi  akitvitas  farmakologis  dari fraksi ekstrak etil asetat Daun Botto-botto.

## METODOLOGI

## Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  adalah  alat maserasi,  kolom  cair  vakum, Laminar  Air Flow ,  hemasitometer, ELISA  reader , 96  well plate ,  inkubator  CO 2 ,  mikroskop, rotavapor , membran non pirogenik.
Bahan-bahan  yang  digunakan  adalah  daun Botto-botto,  etil  asetat,  metanol,  n-heksan, lempeng silika gel 60 F 254 , sel normal (Vero), sel  kanker cervix (HeLa),  reagen  MTT
(3-(4,5-  dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil  tetra- zolium  bromida),  media  kultur  ( RPMI  1640- serum ), phosphate-buffered  saline ,  tripsin, reagen  Dragendorf,  Mayer,  wagner,  reagen Lieberman  Bouchard,  reagen  AlCl 3 ,  reagen FeCl 3 ,  larutan  SDS  (10% sodium  dodecyl sulfate yang dilarutkan dalam 0,01 N HCl)

## Ekstraksi, Partisi dan Fraksinasi
Daun  Botto-botto  diambil  di  daerah Sungguminasa  Kabupaten  Gowa  Provinsi Sulawesi Selatan. Daun dibersihkan, dikeringkan  dan  diserbukkan.  Serbuk  daun diekstraksi  menggunakan  metode  maserasi dengan pelarut metanol. Remaserasi dilakukan  sebanyak  dua  kali.  Ekstrak  cair
selanjutnya dipekatkan dengan rotavapor dan dikeringkan. Ekstrak metanol kering selanjutnya dipartisi dengan pelarut n–heksan. Ekstrak n-heksan disisihkan dan ekstrak yang tidak  larut  selanjutnya  dipartisi  dengan pelarut  etil  asetat  dan  filtrat  dikeringkan. Ekstrak etil asetat difraksinasi dengan metode kromatografi cair vakum dengan menggunakan  gradient  kepolaran.    Fraksi yang  memiliki  profil  yang  sama  digabung menjadi fraksi gabungan.

## Uji Aktivitas Penghambatan Sel Kanker

## Penyiapan Sampel Uji
Sampel uji fraksi etil asetat (A, B, C, D, E, F, dan G) daun Botto-botto dibuat konsentrasi 500  ppm  kemudian  dimasukkan  ke  dalam sumuran mikroplate yang  berbeda  untuk pengujian terhadap sel HeLa

## Pengujian Sampel dengan Metode MTT
Larutan stok MTT disiapkan dalam larutan buffer fosfat (PBS, pH 7,2)(50 mg/10 ml dan disaring dengan membran.
Suspensi  sel  HeLa  sebanyak  100  μl  ke dalam 96-well plate dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C. Sampel pengujian (500 ppm)  ditambahkan  ke  dalam 96-well  plate dan  diinkubasi  selama  24  jam.  Selanjutnya seluruh  cairan 96-well  plate dibuang  dan ditambahkan larutan MTT 10 μL dan medium RPMI 100 μL. Setelah inkubasi selama 4 jam pada 37 °C, ditambahkan 100 µL larutan SDS ke 96-well  plate. Setelah  inkubasi  selama  24 jam, 96-well  plate dibaca  dengan ELISA reader pada  595  nm  untuk  memperoleh  nilai
absorbansi.  Pengujian  ini  juga  dilakukan dengan prosedur yang sama untuk sel Vero.

## Uji Identifikasi Golongan Senyawa
Fraksi  etil  asetat  yang  memiliki  nilai selektifitas  tinggi  diidentifikasi  golongan senyawanya  menggunakan  pereaksi  warna. Pereaksi  warna  yang  digunakan  untuk mengidentifikasi  golongan  senyawa  alkaloid, terpenoid, fenolik dan flavonoid.

## Analisis Data
Nilai  absorban  yang  diperoleh  selanjutnya dihitung  jumlah  sel  yang  hidup  (%  SH) masing masing sampel uji. Selanjutnya persen penghambatannya  ( %  IC )  dihitung  dengan rumus:
% 𝐼𝐶 = % 𝑆𝐻 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − %𝑆𝐻 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 % 𝑆𝐻 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑥 100%
Selanjutnya dihitung indeks selektifitas (S) masing-masing sampel uji dengan rumus:
𝑆 = % 𝐼𝐶 𝑠𝑒𝑙 𝑘𝑎𝑛𝑘𝑒𝑟 𝐻𝑒𝑙𝑎
% 𝐼𝐶 𝑠𝑒𝑙 𝑉𝑒𝑟𝑜
Indeks selektifitas yang tinggi menunjukkan  bahwa  fraksi  tersebut  lebih efektif  dalam  menghambat  sel  kanker  dan toksisitas  yang  rendah  terhadap  sel  normal
(Vero).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Daun  Botto-botto  yang  telah  dikeringkan dan  diserbukkan  diekstraksi  dengan  metode maserasi.  Beberapa  penelitian  sebelumnya menggunakan  metode  ini  karena  lebih sederhana  dan  mudah  dalam  pengerjaannya serta  tekstur  daun  yang  lunak  sehingga  tidak membutuhkan  metode  panas.  Pelarut  yang digunakan dalam mengekstraksi adalah metanol karena pelarut tersebut dapat menarik senyawa  nonpolar  dan  senyawa  polar. Rendamen  ekstrak  yang  diperoleh  sebesar 5,46  %.  Ekstrak  metanol  yang  sudah kering/kental  sebanyak  24  g  dipartisi  dengan menggunakan  pelarut  n-heksan,  sehingga diperoleh  ekstrak  yang  tidak  larut  n-heksan dan  ekstrak  larut  n-heksan.  Ekstrak  larut  n- heksan  disisihkan  dan  dikeringkan,  diperoleh sebanyak  0,34  g.  Ekstrak  yang  tidak  larut  n- heksan  selanjutnya  dipartisi  menggunakan pelarut etil asetat. Diperoleh ekstrak etil asetat sebanyak  3,95  g.  Ekstrak  yang  terlarut  pada pelarut  nonpolar  (n-heksan)  lebih  sedikit dibandingkan  yang  terlarut  pada  ekstrak  etil
Tabel   1.  Persentase rendamen ekstrak, ekstrak partisi dan fraksinasi daun Botto-botto
Sampel Berat (g) Persen rendamen (%) Ekstrak metanol 163,8 5,46 Ekstrak partisi n-heksan 0,34 1,41 Ekstrak partisi etil asetat 3,95 16,46 Fraksi A 0,099 2,51 Fraksi B 0,821 20,78 Fraksi C 0,765 19,36 Fraksi D 0,255 6,45 Fraksi E 0,121 3,06 Fraksi F 0,202 5,11 Fraksi G 0,425 10,76
asetat.
Berdasarkan penelitian sebelumnya, potensi antikanker paling besar adalah ekstrak etil  asetat  (Mukhriani,  Edy,  Ilyas,  &  Leboe, 2016;  Fitrah,  2016).  Oleh  karenanya,  ekstrak etil  asetat  difraksinasi  dengan  menggunakan kromatografi  cair  vakum.  Eluen  yang digunakan  adalah  n-heksan  :  etil  asetat  dan dilanjutkan  dengan    etil  asetat  :  metanol dengan  berbagai  perbandingan.  Pemilihan eluen  dalam  kromatografi  kolom  digunakan berdasarkan  profil  kromatografi,  dan  dimulai dari  eluen  yang  sifatnya  nonpolar  sampai yang  sifatnya  polar.  Hasil  fraksinasi  dari ekstrak  etil  asetat  diperoleh  7  fraksi  yaitu Fraksi  A,  B,  C,  D,  E,  F,  dan  G.  Hasil ekstraksi, ekstrak partisi dan Fraksinasi Daun Botto-botto dapat dilihat pada tabel 1.
Fraksi A, B, C, D, E, F dan G selanjutnya diuji  potensi  farmakologinya,  dalam  hal  inbi pengujian  aktivitas  sitotoksik  dengan  metode Microculture  Tetrazolium  Salt atau  MTT. MTT  ini  adalah  metode  kolorimetri,  yang memiliki  keakuratan  yang  tinggi,  digunakan untuk  mengetahui  sitotoksik  suatu  senyawa. Adanya  reaksi  reduksi  oleh  sistem  reduktase suksinat  tetrazolium  yang  sifatnya  larut  air
(berwarna kuning) membentuk garam formazan  yang  tidak  larut  berwarna  ungu) (Doyle & Griffiths, 2000).
Hasil  uji  sitotoksisitas  terhadap  sel  kanker Hela  menunjukkan  fraksi  yang  memiliki persentase  sel  mati  yang  paling  tinggi  adalah fraksi  C  sebesar  75,11  atau  persentase  sel hidupnya  sebesar  24,89.  Hasil  uji  sitotoksitas terhadap  sel  normal  Vero  menunjukkan Fraksi  B  memiliki  presentase  sel  hidup  yang paling  tinggi  yaitu  sebesar  93,28  atau persentase  sel  matinya  sebesar  6,72.  Indeks selektifitas  fraksi  A,  B,  C,  D,  E,  F  dan  G berturut  turut  sebesar  0,85;  3,39;  2,00;  1,51; 1,63;  1,28  dan  1,30.  Hasil  uji  toksisitas  dan indeks  selektifitas  fraksi  dapat  dilihat  pada tabel 2.
Data diatas menunjukkan bahwa walaupun persentase  kematian  fraksi  C  yang  paling tinggi,  akan  tetapi  persentase  kematian terhadap sel normal juga tinggi sehingga nilai selektifitasnya hanya sebesar 2,00. Sedangkan fraksi  B  memiliki  selektifitas  yang  paling tinggi  dengan  nilai  selektifitas  sebesar  3,39. Nilai  selektifitas  dibawah  3  menunjukkan fraksi  tersebut  tidak  selektif  digunakan
Tabel   2.  Persentase sel HeLa dan Vero hidup serta Selektivitas terhadap sel Hela
Sampel Uji Sel Hela Hidup (%) Sel Vero Hidup (%) Indeks Selektivitas terhadap Sel Hela Keterangan Fraksi A 56,64 48,73 0,85 Tidak selektif Fraksi B 77,23 93,28 3,39 Selektif Fraksi C 24,89 62,54 2,00 Tidak selektif Fraksi D 65,69 77,25 1,51 Tidak selektif Fraksi E 61,03 76,02 1,63 Tidak selektif Fraksi F 81,24 85,39 1,28 Tidak selektif Fraksi G 25,18 42,44 1,30 Tidak selektif Kontrol Positif 46,78 52,87
sebagai  antikanker  karena  akan  mengganggu sel normal.
Fraksi  yang  memiliki  selektifitas  tinggi (fraksi  B)  selanjutnya  diidentifikasi  golongan senyawanya  menggunakan  pereaksi  warna. Fraksi diamati perubahan warna sebelum dan setelah penambahan pereaksi warna. Hasilnya menunjukkan  bahwa  fraksi  B  mengandung golongan  senyawa  terpenoid  (perubahan warna  dari  hijau  menjadi  kuning),  alkaloid (terdapat  pengendapan  setelah  penambahan dragendorf),  dan  Fenolik  (perubahan  dari hijau  menjadi  kuning).  Hal  ini  dapat  dilihat pada tabel 3.
Daun  laruna  yang  berbau  khas  karena memiliki kandungan minyak atsiri.
Komponen  utama  dari  minyak  atsiri  daun adalah  α-pinene  (42.2%),  β-pinene  (10.6%), germacrene D (9.7%), β-copaen-4α-ol (9.4%), (E)-caryophyllene
(5.4%),
and geijerene/pregeijerene  (7.5%)  (Owolabi,  et al.,  2010).  Ekstrak  metanol  dari  daun  Botto- botto mengandung alkaloid, sedangkan ekstrak airnya mengandung fenolik, terpenoid (Akinmoladun, Ibukun, & Dan-Ologe, 2007) .
Kandungan α-pinene ini memiliki aktivitas anti  kanker  dengan  menaikkan  kadar  Chk1 dan  Chk2  dan  menurunkan  kadar Cyclin  B ,
CDC25  dan  CDK1  (Chen,  et  al.,  2015). Beberapa alkaloid yang diisolasi dari tumbuhan memiliki sifat antiproliferasi seperti berberine, evodiamine, matrine, piperine,  sanguinarine,  dan  tetrandrine,  juga dapat dikembangkan menjadi obat antikanker (Lu, Bao, Chen, Huang, & Wang, 2012).

## KESIMPULAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa fraksi  B  dari  ekstrak  metanol  paling  selektif dalam  menghambat  sel  kanker  HeLa  dengan nilai  selektifitasnya  sebesar  3,39.  Hal  ini menunjukkan fraksi B berpotensi dikembangkan  sebagai  agen  kemoterapi dalam meningkatkan efektivitas pada pengobatan kanker leher rahim.

## DAFTAR PUSTAKA
Adedapo,  A.  A.,  Oyagbemi,  A.  A.,  & Yakubu,  M.  A.  (2016).  Evaluation  of Anticancer  Properties  of  The  Methanol Leaf  Extract  of  Chromolaena  odorata  on Ht-29 Cell Line. Journal of
Pharmacognosy and Phytochemistry,
30 (S1), 53-57.
Akinmoladun,  A.  C.,  Ibukun,  E.,  &  Dan- Ologe, I. (2007). Phytochemical constituents  and  antioxidant  properties  of extracts  from  the  leaves  of  Chromolaena odorata. Scientific  Research  and  Essay,
2 (6), 191-194.
Tabel   3.  Identifikasi Golongan Senyawa dari Fraksi B Pereaksi warna Hasil Keterangan Dragendorf + terdapat endapan merah bata Mayer + terdapat endapat putih Wagner - Tidak terdapat endapan coklat Lieberman Bouchardt + berubah warna menjadi kuning emas AlCl3 - Tidak berubah warna menjadi jingga FeCl3 + berubah warna menjadi hijau kehitaman
Andrijono.  (2007). Kanker  Serviks.  Edisi  I.
Jakarta: Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Bray, F., Ferlay, J., Soerjomataram, I., Siegel, R.  L.,  Torre,  L.  A.,  &  Jemal,  A.  (2018). Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN  estimates  of  incidence  and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA:  A  Cancer  Journal  for Clinicians, 68 (6), 394-424.
Bruni, L., Albero, G., Serrano, B., Mena, M., Gómez,  D.,  Muñoz,  J.,  .  .  .  Centre,  &.  I. (2019). Human Papillomavirus and Related  Diseases  Report. ICO/IARC  HPV Information Centre.
Chen, W., Liu, Y., Li, M., Mao, J., Zhang, L., Huang,  R.,  .  .  .  Ye,  L.  (2015).  Anti-tumor effect of α-pinene on human hepatoma cell lines  through  inducing  G2/M  cell  cycle arrest. Journal of Pharmacological Sciences, 127 (3), 332-328.
Doyle, A., & Griffiths, J. B. (2000). Cell and Tissue Culture for Medical Research. New York: John Willey and Sons.
Fitrah,  M.  (2016).  Identifikasi  Ekstrak  Daun
Kopasanda  (Chromolaena  Odorata  Linn)
Terhadap Sel Antiproliferasi Tikus
Leukemia  L1210. Jurnal  Farmasi  UIN Alauddin Makassar, 4 (3).
Freshney,  R.  I.  (1986). Animal  Cell  Culture,
A  Practical  Approach,. (1.  Ed,  Ed.)
Washington D.C.: IRL Press.
Kouamé,  P.  B.-K.,  Jacques,  C.,  Bedi,  G., Silvestre,  V., Loquet,  D.,  Barillé-Nion,  S.,
. . . Tea, I. (2013). Phytochemicals isolated from  leaves  of  Chromolaena  odorata: impact  on  viability  and  clonogenicity  of cancer  cell  lines. Phytotherapy  Research , 835-840.
Lu, J.-J., Bao, J.-L., Chen, X.-P., Huang, M.,
&  Wang,  Y.-T.  (2012).  Alkaloids  Isolated from  Natural  Herbs  as  the  Anticancer Agents. Evidence-Based  Complementary and Alternative Medicine . Marks,  D.  B.,  &  Mark,  A.  D.  (2000). “Biokimia  Kedokteran  Dasar:  Sebuah Pendekatan  Klinis”.  Jakarta:  EGC.
Jakarta: EGC.
Mukhriani, Edy, A. A., Ilyas, M. F., & Leboe,
D.  W.  (2016).  Analisis  Efektivitas  Daun Botto-botto  (Chromolaena  Odorata  L) Terhadap  Artemia  Salina  Leach  Yang
Berpotensi  Sebagai  Agen  Antikanker. Jurnal  Farmasi  UIN  Alauddin  Makassar, 4 (1).
Owolabi, M. S., Ogundajo, A., Yusuf, K. O., Lajide,  L.,  Villanueva,  H.  E.,  J.  A.,  & Setzer, W. N. (2010). Chemical composition and bioactivity of the essential oil of Chromolaena odorata from Nigeria. Records  of  Natural  Products,
4 (1), 72–78.
Siegel,  R.  L.,  Miller,  K.  D.,  &  Ahmedin Jemal,  D.  (2017).  Cancer  Statistics,  2017. CA:  A  Cancer  Journal  for  Clinicians,  67 , 7-30.
Tia, L. J., Lui, A. G., Chua, N. S., & Strebel, H.  M.  (2015).  Chemotheraphy-induced neutropenia, anemia and thrombocytopenia among  Filipino  breast  cancer  patients  on adjuvant  chemotehraphy. Acta  Medica Phillipina,, 49 (2).
Yu,  J.  (2013).  Intestinal  stem  cell  injury  and protection during cancer therapy. Translational  cancer  research,  2 (5),  384– 396.