## ACUTE TOXICITY TEST OF ETHANOL EXTRACT OF PAKIS

## TANGKUR ( Polypodium Feei MEET) ROOT FROM TALAGA BODAS MOUNTAIN ON SWISS WEBSTER MICE
Dani Sujana 1 , Deden Winda Suwandi 2 , Taofik Rusdiana 3 , Anas Subarnas 3
1 Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Karsa Husada Garut Jl. Subyadinata No. 9, Jayaraga, Tarogong Kidul, Garut.
2 Fakultas MIPA Universitas Garut, Jl. Jati no 42B, Tarogong Kaler, Garut.
3 Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran Jl. Sumedang Bandung Raya KM 21, Jatinangor.
Corresponding author: Dani Sujana (dani.sujana87@gmail.com)

## ARTICLE HISTORY
Received: 15 May 2020                           Revised: 20 July 2020                    Accepted: 28 July 2020

## Abstract
The  use  of  herbal  medicinal  products  has  increased from  plants  because  of  the availability of materials that are easily obtained. The roots of Pakis Tangkur used by local people for treating various kinds of diseases, such as arthritis, hypertension and as afrodisiaka. According to the United States of Food and Drug Administration (FDA) even though natural products are considered relatively safe by some groups of users, toxicological screening must be carried out for compounds that have the potential for drugs  to  see  and  describe  the  toxic  effects  so  that  a  Lethal  dose  (LD 50 )  value  is obtained. The acute toxicity test of the LD 50 values obtained were more than 5000 mg / kgBB. Due to the highest dose in the study, which is 5000 mg / kgBB, there are no animals that died, so it can be concluded that the extract of the fern root is included in the practical category is not toxic.
Key words: Pakis Tangkur Root Extract, Acute Toxicity

## UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK ETANOL AKAR PAKIS
TANGKUR ( Polypodium Feei MEET) DARI GUNUNG TALAGA BODAS PADA MENCIT SWISS WEBSTER

## Abstrak
Meningkatnya  minat  masyarakat  terhadap  penggunaan  bahan  alam  dari  tanaman terjadi karena ketersediaan bahan yang mudah didapat. Cara tersebut terus dilakukan oleh masyarakat, serta diwariskan secara turuntemurun mengingat penggunaannya dianggap  relatif  aman  serta  efek  samping  yang  minimal.  Bagian  akar  dari  pakis tangkur  digunakan  oleh  masyarakat  setempat  untuk  mengobati  berbagai  jenis penyakit,  antara  lain  rematik,  hipertensi  dan  sebagai  afrodisiaka.  Menurut United States of Food and Drug Administration (FDA) meskipun bahan alam dianggap relatif aman  oleh  sebagian  kelompok  penggunanya,  tetap  harus  dilakukan  skrining toksikologi  terhadap  senyawa  yang  berpotensi  obat  untuk  melihat  serta menggambarkan  efek  toksik  sehingga  diperoleh  nilai  Dosis  letal  (LD 50 ).  Dari  hasil penelitian toksisitas akut ini nilai LD 50 yang diperoleh yaitu lebih dari 5000 mg/kgBB. Dikarenakan  pada  dosis  paling  tinggi  pada  penelitian  yaitu  5000  mg/kgBB  tidak
terdapat  hewan  yang  mati,  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  akar  pakis tangkur termasuk kedalam kategori praktis tidak toksik.
Kata kunci : Ekstrak Akar Pakis Tangkur, Toksisitas Akut

## Pendahuluan
Pengobatan dengan tanaman yang bersumber dari alam telah banyak digunakan sebagai  obat  tradisional  untuk  mengobati  berbagai  macam  penyakit 1 .  Terdapat sumber  daya  alam  yang  melimpah  serta  keanekaragaman  spesies  tanaman  yang tumbuh  tersebar  di  Indonesia,  sehingga  banyak  potensi  yang  dapat  digali  terkait pengembangan metabolit sekunder dari bahan alam untuk keperluan industri farmasi 2 .  Salah  satu  tanaman asal  Indonesia  yang  berpotensi  sebagai  bahan obat adalah pakis tangkur.
Pakis  tangkur  ( Polypodium  feei MEET)  tumbuh  secara  liar  Di  daerah  Gunung Talaga Bodas, Garut, Jawa Barat. Bagian akar dari pakis tangkur oleh masyarakat setempat  biasa  digunakan  untuk  mengobati  berbagai  jenis  penyakit  di  antaranya rematik,  hipertensi  dan  berkhasiat  sebagai  afrodisiaka 3 .  Proantosianidin, shellegueain A yang terkandung pada akar tanaman pakis tangkur diduga memiliki aktivitas analgesik-antiinflamasi, atioksidan dan antihipeurisemia 4 .
Meningkatnya  minat  masyarakat  terhadap  penggunaan  bahan  alam  dari tanaman terjadi karena ketersediaan bahan yang mudah didapat. Cara tersebut terus dilakukan  oleh  masyarakat,  serta  diwariskan  secara  turun-temurun  mengingat penggunaannya dianggap relatif aman serta efek samping yang minimal 5 . Menurut United States of Food and Drug Administration (FDA) meskipun bahan alam dianggap relatif  aman  oleh  sebagian  kelompok  penggunanya,  tetap  harus  dilakukan  skrining toksikologi  terhadap  senyawa  yang  berpotensi  obat  untuk  melihat  serta menggambarkan efek toksik sehingga diperoleh nilai Lethal dose (LD50) 6 . Pengujian toksisitas akut dilakukan untuk menentukan efek dosis tunggal pada spesies hewan. Dalam pengujian toksisitas akut, bahan diberikan dengan dosis yang berbeda  pada  hewan  coba,  dan  efeknya  diamati  selama  14  hari 7 .    Selama percobaan, dilakukan pengamatan perubahan berat badan, uji prilaku, gejala-gejala toksik, kematian dan bobot organ 8 . Penelitian  ini  dilakukan  secara in  vivo dengan  menggunakan  mencit Swiss Webster betina, hal tersebut dengan pertimbangan selain melihat efek toksik berupa mortalitas,  penurunan  berat  badan  serta  efek  terhadap  organ  vital  seperti  ginjal, limpa, hati, jantung, paru-paru, otak, lambung dan ovarium. Perubahan bobot badan baik sebelum perlakuan selama 5 hari dan sesudah perlakuan dipantau setiap 24 jam selama  14  hari,  serta  berbagai  gejala  klinis  melalui  skrining  farmakologi  setelah pemberian dosis tunggal ekstrak etanol akar pakis tangkur.

## Alat dan Bahan

## Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : Neraca  anatitik  (Mettler  Toledo,  AL204  ®),  maserator  modifikasi  botol  kaca  gelap, corong  (Pyrex®),  blender  (Miyako®),  penangas  air  (Memmert®),  pH  meter  (Metler Toledo®), piknometer (Pyrex®), rotary evaporator (IKA Rotavapor 10®), sonde oral, spuit  1  ml  (onemed®),  mortar  dan  stamper,  stopwatch  (Casio®),  cawan  porselen (haldenwanger®), tabung reaksi (Pyrex®), batang pengaduk (Iwaki®) serta alat gelas lain yang umum digunakan di laboratorium farmakologi dan bahan alam.

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : Akar  pakis  tangkur,  Etanol  96%, aquadestilata,  pulvis  gummosus  (PGS),  ammonia 10%, asam klorida 2N, kloroform, pereaksi mayer, pereaksi dragendrof, amil alkohol, serbuk magnesium, larutan gelatin 1%, pereaksi besi (III) klorida, pereaksi vanillin- sulfat (larutan vanillin 10% dalam H 2 SO 4 pekat), eter, natrium hidroksida 1 N.

## Prosedur Lengkap Pengumpulan Bahan
Sampel  uji  yaitu  pakis  tangkur  yang  diambil  secara  lengkap  dari  hutan  sekitar Gunung Talaga Bodas, Garut, Jawa Barat. Selanjutnya dideterminasi di Herbarium Bandungense, Institut Teknologi Bandung.

## Persetujuan Etik
Permohonan  persetujuan  etik  dilakukan  kepada  Komite  Etik  Penelitian Kesehatan,  Riset Teknologi dan Pendidikan Tinggi Universitas Padjadjaran.

## Pembuatan Ekstrak
Penyiapan dan pengolahan simplisia dimulai dari pemanenan akar pakis tangkur, selanjutnya  dilakukan  sortasi  basah  untuk  memisahkan  pengotor  yang  berukuran kecil  maupun  besar  yang  terbawa  saat  proses  pemanenan,  setelah  itu  dilakukan pencucian  dengan  menggunakan  air  mengalir  sampai  bersih  untuk  membuang pengotor yang tidak terpisahkan pada saat sortasi basah. Setelah bersih, dilakukan perajangan  dengan  cara  diiris  melintang  supaya  akar  pakis  tangkur  kering  secara merata  pada  saat  pengeringan.  Suhu  pengeringan  diatur  kurang  lebih  50 0 C  pada lemari pengering modifikasi dengan sumber cahaya lampu pijar. Proses pengeringan dilakukan  sampai  bobot  simplisia  konstan.  Setelah  simplisia  kering  selanjutnya diblender  hingga  diperoleh  serbuk  simplisia.  Pembuatan  ekstrak  dilakukan  dengan metode maserasi dengan cara serbuk simplisia akar pakis tangkur direndam dengan etanol  96  %  selama  3  x  24  jam  pada  suhu  kamar.  Setiap  24  jam  pengadukan dilakukan  sebanyak  dua  kali  pada  waktu  yang  sama  serta  dilakukan  penggantian pelarut.  Ekstrak  disaring  kemudian  dipisahkan  dengan  ampas.  Ekstrak  cair  yang diperoleh selanjutnya duiapkan dengan penguap vakum putar pada suhu dibawah 70 o C  hingga  diperoleh  ekstrak  kental.  Ekstrak  kental  yang  diperoleh  selanjutnya dilakukan  penguapan  pada water  bath dengan  suhu  dibawah  70 o C  untuk menghilangkan sisa pelarut sehingga diperoleh ekstrak pekat.

## Skrining Fitokimia
Skrining  fitokimia  dilakukan  terhadap  serbuk  simplisia  dan  ekstrak  pekat  akar pakis  tangkur meliputi  pemeriksaan  alkaloid,  flavonoid,  saponin,  tanin,  kuinon,  dan steroid/triterpenoid.

## Penyiapan Suspensi Uji
Pembuatan  suspensi  dosis  300  mg/kgbb  dengan  konsentrasi  30  mg/mL  yaitu dengan menimbang 300 mg ekstrak kemudian disuspensikan kedalam suspensi PGS 1% sampai 10 mL, dosis 1000 mg/ kgbb dengan konsentrasi 100 mg/mL yaitu dengan menimbang 1 g ekstrak kemudian disuspensikan kedalam suspensi PGS 1% sampai 10 mL, dosis 2000 mg/kgbb dengan konsentrasi 200 mg/mL yaitu dengan menimbang 2 g ekstrak kemudian disuspensikan kedalam suspensi PGS 1% sampai 10 mL, dosis 4000 mg/kgbb dengan konsentrasi 400 mg/mL yaitu dengan menimbang 4 g ekstrak kemudian disuspensikan kedalam suspensi PGS 1% sampai 10 mL, sedangkan dosis 5000 mg/kgbb dengan konsentrasi 500 mg/mL yaitu dengan menimbang 5 g ekstrak kemudian disuspensikan kedalam suspensi PGS 1% sampai 10 mL.

## Penyiapan Hewan Uji
Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit putih betina ( Mus musculus ) galur Swiss  Webster .  Hewan  percobaan  ditempatkan  dalam  kandang  plastik  yang diberi alas sekam dan berada dalam ruangan dengan suhu 23-25 o C, kelembaban 70- 85%, serta cahaya diatur 12 jam terang dan 12 jam gelap. Hewan dalam kondisi sehat dan diseleksi secara acak, selanjutnya dibagi ke dalam 6 kelompok. Masing-masing kelompok  terdiri  dari  4  ekor  mencit  kemudian  ditandai  untuk  mempermudah identifikasi. Selanjutnya mencit diaklimatisasi selama 5 hari sebelum diberi perlakuan. Diamati perubahan bobot badan setiap hari sampai dengan 5 hari.

## Pengujian Toksisitas Akut
Kelompok  mencit  masing-masing  diberi  perlakuan  yaitu  diberikan  suspensi ekstrak etanol akar pakis tangkur rute oral dengan volume 0,2 ml/gram berat badan. Berikut pembagian kelompok hewan uji:
Tabel 1. Pengelompokan Hewan Uji Toksisitas Akut
Kelompok hewan uji Perlakuan Kontrol normal Diberi suspensi PGS 1% Dosis I Diberi suspensi ekstrak etanol 300 mg/kgBB Dosis II Diberi suspensi ekstrak etanol 1000 mg/kgBB Dosis III Diberi suspensi ekstrak etanol 2000 mg/kgBB Dosis IV Diberi suspensi ekstrak etanol 4000 mg/kgBB Dosis V Diberi suspensi ekstrak etanol 5000 mg/kgBB
Hewan  uji  diobservasi  secara  individual  pada  30  menit  pertama  setelah pemberian  sediaan  uji,  dan  secara  periodik  setiap  4  jam  selama  24  jam  pertama, selanjutnya  sehari  sekali  selama  14  hari  baik  skiring  farmakologi  dan  perubahan bobot.    Pengaruh  gejala  toksik  berupa  skrining  farmakologi  setelah  pemberian suspensi  ekstrak  akar  pakis  tangkur  terhadap  mencit  betina  diamati  meliputi  efek pada aktivitas motorik diantaranya   straub, piloereksi, ptosis, refleks pineal, refleks kornea    dan  lakrimasi.  Sikap  tubuh  meliputi  retablisment,  fleksi,  hafner,  mortalitas, grooming. Efek saluran pencernaan diantaranya defekasi, urinasi, salivasi, vokalisasi. Pernafasan, tremor, kejang, writhing , katalepsi, menggelantung, jengukan. Setelah 14 hari pengamatan semua hewan uji dikorbankan dengan cara dislokasi leher, kemudian dilakukan pembedahan untuk mengambil organ otak, jantung, paru- paru,  hati,  limpa,  lambung,  ginjal,  dan  uterus,  kemudian  dilakukan  penimbangan bobot organ mencit. Bobot organ dibuat dalam persentase indeks organ dengan cara dibagi  dengan  bobot  badan  masing-masing  mencit.  Data  persentase  indeks  organ mencit yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan menggunakan uji ANOVA dan uji lanjut perbandingan berganda Least Significant Difference (LSD).

## Hasil
Tabel 2. Rendemen Ekstrak Etanol Serbuk simplisia Ekstrak pekat Rendemen 10 kg 1.960 kg 19,6 %
Tabel 3. Hasil Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak Akar Pakis Tangkur
Metabolit Sekunder Hasil Penapisan Simplisia Ekstrak Alkaloid - - Flavonoid + + Saponin + + Tanin + + Steroid - - Kuinon + +
Keterangan : (+) = (terdeteksi) (-)  =  tidak terdeteksi
Gambar 1 .  Grafik Rata-Rata Bobot Badan Mencit Selama Aklimatisasi
Gambar 2 .  Grafik Rata-Rata Bobot Badan Mencit Setelah Pemberian Sediaan 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 H1 H2 H3 H4 H5 Ra ta -r at a Bob ot Ba d an ( gr am ) Waktu (hari) Kontrol Dosis I Dosis II Dosis III Dosis IV Dosis V 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10H11 H12H13H14 Ra ta -r at a Bob ot Ba d an ( gr am ) Waktu (hari) Kontrol Dosis I Dosis II Dosis III Dosis IV Dosis V
Tabel 3 . Hasil Pengamatan Prilaku pada Uji Toksisitas Akut Efek yang diamati Kontrol Dosis I Dosis II 0 30 270  510  H14 0 30 270  510  H14 0 30 270  510  H14 Aktivitas Motorik Normal (%) 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Naik (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Turun (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diam (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Straub (%) 0 0 20 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 0 0 Piloereksi (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ptosis (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 0 Refleks pineal (%) 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Refleks kornea (%) 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Lakrimasi (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Sikap tubuh Normal (%) 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 TN (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Retablisment (%) 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100 80 80 Fleksi (%) 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Hafner (%) 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Mortalitas (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Grooming (%) 20 20 0 0 60 20 20 0 0 40 60 20 0 60 60 Defekasi Normal (%) 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 TN(%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Urinasi (%) 100 80 20 0 20 20 80 20 40 20 100  100 60 20 20 Salivasi (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Vokalisasi (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pernafasan Cepat (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Sesak (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Normal (%) 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Tremor (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Kejang (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Writhing (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Katalepsi (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Menggelantung (%) 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100 60 100 100 Jengukan (%) 100  100  100  100 100 80 100  100  100 100 100 40 80 40 40
Efek yang diamati Dosis III Dosis IV Dosis V 0 30 270  510  H14 0 30 270  510  H14 0 30 270  510  H14 Aktivitas Motorik Normal (%) 100 100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Naik (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Turun (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diam (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Straub (%) 0 0 0 0 0 0 0 20 20 0 0 0 0 0 0 Piloereksi (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ptosis (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Refleks pineal (%) 100 100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Refleks kornea (%) 100 100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Lakrimasi (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Sikap tubuh Normal (%) 100 100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 TN (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Retablisment (%) 100 100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Fleksi (%) 100 100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Hafner (%) 100 100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Mortalitas (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Grooming (%) 20 60 0 0 60 40 20 0 40 0 100 0 0 0 20 Defekasi Normal (%) 100 100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 TN(%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Urinasi (%) 20 0 20 40 20 100 0 20 0 40 0 0 0 20 0 Salivasi (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Vokalisasi (%) 0 0 0 20 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0 Pernafasan Cepat (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Sesak (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Normal (%) 100 100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100  100  100 100 Tremor (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Kejang (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Writhing (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Katalepsi (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Menggelantung (%) 100 100  100  100 100 100  100  100  100 100 100  100 80 100 100 Jengukan (%) 100 100  100  100 80 100  100  100 40 0 80 80 60 100 0 Keterangan  :  Dosis I =  300 mg/kgBB Dosis II =  1000 mg/kgBB Dosis III =  2000 mg/kgBB Dosis IV =  4000 mg/kgBB Dosis V =  5000 mg/kgBB
Tabel 4 . Indeks organ mencit betina uji toksisitas akut ekstrak akar pakis tangkur Kelompok Ginjal Limpa Hati Jantung Paru-paru Uterus Otak Lambung Kontrol 1.42±0.19 1.86±0.71 7.77±1.31 0.61±0.09 0.96±0.16 1.71±0.34 1.57±0.25 2.93±0.80 Dosis I 1.37±0.10 1.60±0.40 7.18±0.74 0.58±0.22 1.03±0.28 1.47±0.28 1.41±0.12 2.56±0.34 Dosis II 1.39±0.16 1.29±0.52 6.61±0.83* 0.69±0.19 1.10±0.33 1.27±0.33 1.50±0.18 2.13±0.82* Dosis III 1.39±0.12 1.35±0.51 6.30±0.66* 0.70±0.24 1.29±0.47 1.81±0.28 1.41±0.17 2.23±0.39 Dosis IV 1.39±0.18 1.24±0.33 5.94±0.42* 0.73±0.05 1.04±0.16 1.99±0.47* 1.58±0.22 2.09±0.45* Dosis V 1.46±0.16 1.92±0.77 7.05±0.93 0.63±0.09 1.19±0.20 1.46±0.12 1.53±0.10 1.99±0.17* Keterangan  :  Dosis I =  300 mg/kgBB Dosis II =  1000 mg/kgBB Dosis III =  2000 mg/kgBB Dosis IV =  4000 mg/kgBB Dosis V =  5000 mg/kgBB
*  =  hasil berbeda dan bermakna (Sig < 0,05)
Gambar 3. Diagram Batang Rata-Rata Pesentase Indeks Organ Mencit

## Pembahasan
Berdasarkan  hasil  determinasi  Nomor:  1152/11.CO2.2/PL/2018  identitas  dari sampel merupakan famili polypodiaceae , spesies Selliguea feei bory dengan sinonim Polypodium  feei METT  dan  di  Indonesia  dikenal  dengan  nama  pakis  tangkur. Persetujuan etik pada penelitian ini, telah disetujui dengan Nomor: 1382/UN6.KEP/EC/2018  yang  diterbitkan  oleh  Komite  Etik  Penelitian  Kesehatan, Riset Teknologi dan Pendidikan Tinggi Universitas Padjadjaran.
Proses  ekstraksi  dilakukan  dengan  cara  maserasi,  mengingat  senyawa  target yaitu proantosianidin bersifat termolabil, sebagaimana yang telah dilakukan subarnas (2000),  Muchtaridi  (2006)  dan  Kristiani  (2013)  menggunakan  metode  yang  sama, akan  tetapi  pada  ekstraksi  kali  ini  digunakan  etanol  96%  sebagai  penyari  dengan pertimbangan lebih praktis, aman, dan memiliki polaritas yang luas sehingga dapat menarik senyawa nonpolar sampai polar 9 .
Hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada tabel  2, menunjukan bahwa senyawa tetap  stabil  sebelum  maupun  setelah  dilakukan  proses  ekstraksi  yaitu  terdeteksi seyawa flavonoid, tannin, saponin dan kuinon dari sampel berupa serbuk dan ekstrak yang diperoleh. Penentuan  metode ekstraksi menjadi penting dengan
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 In d e ks or ga n ( % ) Kelompok Organ Kontrol Dosis I Dosis II Dosis III Dosis IV Dosis V
mempertimbangkan  karakteristik  fisikokimia  dari  suatu  sampel.  Pemilihan  pelarut yang  sesuai  akan  mendapatkan  hasil  ekstrak  yang  diinginkan  sehingga  diperoleh senyawa kimia yang stabil selama proses atau tidak terjadi degradasi senyawa yang terkandung didalamnya 10 .
Dari  hasil  pengamatan  bobot  badan  mencit  selama  5  hari  aklimatisasi, menunjukan perkembangan dan peningkatan bobot badan dengan profil yang hampir sama  pada  semua  kelompok  dosis  hewan  uji.  Selama  pengamatan  mencit  tetap dalam  keadaan  sehat,  namun  pada  beberapa  hari  terjadi  penurunan  berat  badan, tetapi  penurunan  tersebut  tidak  signifikan.  Hal  tersebut  dikarenakan  faktor  stress yang  dialami  oleh  hewan  uji.  Respon  terhadap  stress  ini  dapat  ditunjukan  dengan perubahan berat badan dan hormonal. Stress pada hewan coba ini dapat disebabkan karena perlakuan, lingkungan serta karena proses pembersihan kandang 11 . Secara keseluruhan bobot mencit termasuk kategori layak untuk digunakan sebagai subjek penelitian karena variasi rata-rata bobot tidak melebihi 20% 12 .
Selama  14  hari  pengamatan  untuk  melihat  angka  kematian,  dilakukan  juga terhadap prilaku hewan uji. Dilakukan 5 pengamatan refleks pada mencit diantaranya ptosis, pineal, korneal, haffner dan fleksi. Efek ptosis diamati secara langsung kelopak mata sekurang-kurangnya 50% menuju terpejam. Untuk refleks pineal, pengamatan dilakukan dengan cara menggelitik bagian belakang telinga mencit. Refleks korneal, pengamatan  dilakukan  untuk  mengetahui  ada  atau  tidaknya  refleks  pada  mata. Sedangkan refleks fleksi dilakukan untuk melihat ada atau tidaknya gerakan refleks pada kaki. Untuk uji refleks yang terakhir yaitu haffner, pengamatan visual dengan perlakuan  memberi  tekanan  pada  bagian  ekor  mencit  dibagian  pangkal  dengan pinset,  respon  berpaling  atau  mencicit  merupakan  ciri  mencit  yang  normal.  Sikap tubuh diuji dengan cara kecepatan respon membalikan badan seperti semula setelah diterlentangkan. Lakrimasi diamati ada atau tidaknya  pengeluaran air mata, dengan indikator  basah  disekitar  mata.  Uji  gelantung  diamati    dengan  cara  mencit digelantungkan pada kawat memanjang horizontal, bila dalam waktu lima detik tidak mampu memanjat kawat maka dianggap terjadi penurunan  kemampuan secara fisik dalam mengatur  keseimbangan.  Jika  mencit  tidak  dapat  bergelantung  dan  terjatuh maka  dianggap  kehilangan  refleks  untuk  menggelantung.  Pada  saat  pengamatan, fenomena  straub  tarjadi  pada  kelompok  dosis  I  pada  menit  270  sebanyak  20%, sedangkan kelompok dosis IV mulai terjadi pada menit 270 sebanyak 20% sampai dengan menit 510. Efek tersebut ditandai dengan ekor mencit dalam keadaan tegang menyerupai  huruf  S  dan  menandakan  adanya  efek  neuroleptik 13 .  Penurunan retablisment terjadi pada dosis II dimulai menit 510 sampai hari ke 14 sebanyak 20%, dimana  sebelumnya  pada  menit  ke  270  terjadi  pula  penurunan  kemampuan menggelantung  sebanyak  40  %,  hal  tersebut  menandakan  bahwa  ada  hubungan terjadinya  penurunan  retablisment  dengan  kemampuan  gelatung.  Efek  tersebut manandakan  adanya  pengaruh  pada  sistem  saraf  pusat  yaitu  menurunnya  efek retablismen akan menurun pula kemampuan hewan pada saat bergelantung 8 , tetapi pada dosis V terjadinya penurunan efek gelantung sebesar 20% pada menit 270 tidak diiringi  dengan  terjadinya  penurunan  retablismen.  Grooming  terjadi  pada  semua kelompok  uji,  dimana  kelompok  dosis  I  sebanyak  20%  dan  III  60%  terjadi  setelah pemberian  ekstrak  antara  0  sampai  dengan  30  menit  pertama,  selanjutnya  terjadi peningkatan menjadi 40% hari ke 14. Pada dosis II terjadi sebanyak 60 % tetapi pada menit 270 menghilang, selanjutnya efek mencul kembali pada menit ke 510 hingga 14  hari  pengamatan  sebanyak  60%.  Pada  dosis  IV  mulai  terjadi  pada  menit  0 sebanyak  40%,  terjadi  penurunan  pada  menit  30  menjadi  20%,  selanjutnya meningkat  kembali  pada  menit  ke  510  sebanyak  40%.  Pada  dosis  V  dimana merupakan  dosis  paling  besar  yaitu  5000  mg/kgBB,  terjadi  efek  grooming  pada semua  hewan  uji  pada  menit  0  dan  menghilang  30  menit  kemudian,  selanjunya muncul kembali pada hari ke 14 sebanyak 20% dari total kelompok.  Efek grooming
dan  straub  menandakan  terjadinya  perangsangan  sistem  saraf  pusat  yang  akan nampak  pada  mencit  karena  pengaruh  saraf  simpatis 14 .  Sama  halnya  dengan grooming, urinasi terjadi pada semua kelompok uji. Pengeluaran urin rata-rata terjadi pada menit pertama setelah pemberian ekstrak kecuali kelompok dosis V terjadi pada menit  ke  510  sebanyak 20%.  Kelompok dosis  II  merupakan kelompok  yang paling banyak menghasilkan urin, dimana seluruh hewan uji pada menit 0 sampai 30 terjadi secara terus menerus. Sama halnya dengan dosis 4, semua hewan uji terjadi urinasi pada  menit  pertama  tetapi  berhenti  pada  menit  ke  30,  selanjutnya  menurun  pada menit ke 270 menjadi 20%, selanjutnya terjadi frekuensi urinasi kembali pada menit 510 menjadi 40%. Pada dosis V, urinasi terjadi mulai menit 510 dengan jumlah 20% dari  total  kelompok dosis  tersebut.  Efek urinasi  pada  hewan  uji  setelah  pemberian ekstrak menunjukan adanya pengaruh terhadap sistem saraf otonom, termasuk efek piloereksi,  salivasi  dan  lakrimasi 15 .  Vokalisasi  secara  kuat  terjadi  pada  kelompok dosis III dan IV, dimana pada dosis III terjadi pada menit 510 sebanyak 20% hewan uji.  Sedangkan  pada  dosis  IV  terjadi  pada  menit  270  sebanyak  20%  dan  terhenti dimenit 510. Efek Jengukan terjadi dosis I sebanyak 20% dan meningkat sampai hari ke  14.  Pda  dosis  II  seluruh  hewan  uji  terjadi  jengukan  setelah  pemberian  ekstrak, kemudian  menurun  pada  menit  30  menjadi  40%,  selanjutnya  terjadi  peningkatan menjadi 80% pada menit 270, dan menurun sampai hari ke 14 menjadi 40%. Pada dosis III jengukan terjadi pada semua hewan uji pada menit awal sampai menit 510, selanjunya menurun menjadi 80% pada hari ke 14. Pada dosis IV, semua hewan uji jengukan terjadi pada menit awal hingga menit 270, selanjutnya menurun pada menit 510 menjadi 40%. Pada dosis V, jengukan terjadi pada menit awal hingga 30 menit sebanyak  80%,  selanjunya  menurun  menjadi  60%  pada  menit  270,  dan  kembali meningkat pada menit 510 menjadi 100%. Aktivitas dari jengukan yang timbul pada hewan uji menandakan sifat keingintahuan 16 .
Setelah 14 hari pengamatan, tidak terdapat satupun hewan uji yang mati pada masing-masing kelompok uji. Selanjutnya hewan uji dikorbankan untuk menentukan nilai  indeks  organ  serta  melihat  prediksi  berupa  efek  toksik  sediaan  uji  terhadap berbagai  organ  vital.  Dengan  menggunakan  statistika  ANOVA  dan  uji  lanjut perbandingan berganda Least Significant Difference (LSD), menunjukan hasil bahwa terdapat  perbedaan  bermakna  pada  organ  hati,  uterus  dan  lambung  dengan  nilai asumsi  signifikan  (p  ≤  0,05)  dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol  normal.  Nilai indeks organ hati pada kelompok dosis 1000, 2000, dan 4000 mg/kgBB dibandingkan dengan kelompok kontrol masing-masing dengan nilai asumsi signifikan 0,043; 0,012 dan 0.003 (p ≤ 0,05). Perbedaan yang bermakna terhadap berat organ pada mencit biasanya  menunjukan  sifat  toksisitas  berupa  lesi,  terutama  pada  organ  hati  terjadi perlemakan atau sirosis 17 . Diperlukan studi lebih lanjut untuk  mengetahui toksisitas dengan  skrining  biokimia  dan  histologis  terhadap  hati,  dimana  organ  ini  berperan penting  dalam  pengaturan  proses  fisiologis  dan  juga  terlibat  dalam  detoksifikasi berbagai  obat  dan  xenobiotik 18 .  Pada  organ uterus  terdapat  perbedaan  bermakna yaitu pada dosis 4000 mg/kgBB dibandingkan kelompok kontrol dengan nilai asumsi signifikan 0,024 (p ≤ 0,05). Organ uterus setelah diberikan dosis 4000 mg/kgbb terjadi pembesaran dibandingkan dengan indeks bobot kelompok kontrol, hal ini disebabkan oleh siklus estrus dari hewan uji sehingga bobot organ uterus menjadi lebih besar 19 . Sebagaimana yang dijelaskan Alfiyanti (2016), bahwa bobot uterus dipengaruhi oleh proliferasi  yang mengakibatkan inhibisi pelepasan  FSH dan LH 20 . Faktor lain yaitu lemak,  lapisan  endometrium,  dan  kelenjar  uterus  yang mempengaruhi  sekret  serta kadar  hormone  yang  dihasilkan,  dimana hormone  estrogen  yang berperan  penting dalam pengaturan sekret uterus 21 . Bobot uterus dipengaruhi oleh proses proliferasi pada  endometrium,  dimana    ketebalan  endometrium  yang  rendah  mengakibatkan penurunan    bobot  uterus 22 .  Pada  Organ  lambung  terdapat  perbedaan  bermakna pada dosis 1000, 4000, dan 5000 mg/kgBB dibandingkan kelompok kontrol normal
dengan nilai asumsi signifikan 0,031; 0.026; 0,013 (p ≤ 0,05) hal tersebut disebabkan karena  mekanisme  kerja  senyawa  proantosianidin  yang  telah  terbukti  menurut Subarnas (2000) sebagai inhibitor cyclooxygenase . Enzim tersebut pada jalur asam arakidonat  bertanggungjawab  diproduksinya  mediator  nyeri  yaitu  prostaglandin 23 . Disisi  lain  prostaglandin  merupakan  faktor  penting  sebagai  pelindung  mukosa lambung  dan  kehadirannya  diharapkan  pada  kondisi  tukak  peptik 24 .  Dengan demikian  terjadi  penghambatan  produksi  prostaglandin  ini  berkolerasi  dengan terjadinya  toksisitas  pada  lambung  ditandai  dengan  terjadinya  peradangan  yang mengakibatkan  peningkatan bobot  organ 25 .  Organ  lain  yaitu  ginjal,  limpa, jantung, paru-paru, dan otak tidak terdapat perbedaan yang bermakna.

## Kesimpulan
Dari hasil penelitian toksisitas  akut ini nilai LD 50 yang diperoleh yaitu lebih dari 5000 mg/kgBB. Pada dosis paling tinggi tidak terdapat hewan uji yang mati, sehingga dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  akar  pakis  tangkur  termasuk  kedalam  kategori praktis tidak toksik.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapkan  terima  kasih  penulis  sampaikan  kepada  Prof.  Dr.  Anas  Subarnas, M.Sc.,Apt dan Taofik Rusdiana, M.Si., Ph.D., Apt yang telah memberikan motivasi, masukan, dan arahan selama penelitian.

## Daftar Pustaka
1.  Sujana D, Nurul N H. TR. Aktivitas Antidiabetes dan Kandungan Senyawa Kimia dari Berbagai Bagian Tanaman Alpukat (Persea americana) “Jurnal Review.” J
Med Cendikia [Internet]. 2019;6(Juni):76 –81. Available from:
https://doi.org/10.33482/medika.v6i01.104
2.  Sholikhah EN. Indonesian medicinal plants as sources of secondary metabolites for pharmaceutical industry. J Med Sci [Internet]. 2016;48(4):226 –39. Available from:
https://www.researchgate.net/profile/Eti_Sholikhah2/publication/312271498_Ind onesian_medicinal_plants_as_sources_of_secondary_metabolites_for_pharma ceutical_industry/links/5919ca45aca2722d7cfe6834/Indonesian-medicinal- plants-as-sources-of-secondary-metabo
3.  Subarnas  A,  Wagner  H.  Analgesic  and  anti-inflammatory  activity  of  the proanthocyanidin  shellegueain  A  from  Polypodium  feei  METT.  Phytomedicine [Internet].  2000;7(5):401 –5.  Available  from: http://dx.doi.org/10.1016/S0944- 7113(00)80061-6
4.  Kristiani RD, Rahayu D, Subarnas A. Aktivitas antihiperurisemia ekstrak etanol akar pakis tangkur (polypodium feei) pada mencit jantan. Bionatura-Jurnal Ilmu- ilmu Hayati dan Fis. 2013;15(3):156 –9.
5.  Makiyah A,  Tresnayanti S. Uji Toksisitas Akut yang Diukur dengan Penentuan LD50  Ekstrak  Etanol  Umbi  Iles-iles  (Amorphophallus  variabilis  Bl.)  pada  Tikus Putih Strain Wistar. Maj Kedokt Bandung. 2017;49(3):145 –55.
6.  Sasmito WA, Wijayanti AD, Fitriana I, Sari PW, Kesehatan F, Universitas M, et al.  Pengujian  Toksisitas  Akut  Obat  Herbal  Pada  Mencit  Berdasarkan Organization  for  Economic  Co-operation  and  Development  (OECD).  Penguji Toksisitas Akut Obat Herb Pada Mencit Berdasarkan Organ Econ Co-operation Dev. 2017;33(2):234 –9.
7.  Parasuraman  S.  Toxicological  screening.  J  Pharmacol  Pharmacother. 2011;2(2):74 –9.
8.  Nurfaat  DL.  Uji  Toksisitas  Akut  Ekstrak Etanol  Benalu  Mangga  (Dendrophthoe petandra)  Terhadap  Mencit  Swiss  Webster.  Indones  J  Pharm  Sci  Technol. 2016;3(2):53 –65.
9.  Dwi  Puspitasari  A,  Proyogo,  Lean  Syam.  Kadar  Fenolik  Total  Ekstrak  Etanol Daun Kersen (Muntingia Calabura). J Ilm Cendekia Eksakta. 2017;1 –8. 10.  Do QD, Angkawijaya AE, Tran-Nguyen PL, Huynh LH, Soetaredjo FE, Ismadji S, et al. Effect of extraction solvent on total phenol content, total flavonoid content, and  antioxidant  activity  of  Limnophila  aromatica.  J  Food  Drug  Anal  [Internet]. 2014;22(3):296 –302. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jfda.2013.11.001 11.  Foltz CJ, Ullman-Cullere M. Guidelines for Assessing the Health and Condition of Mice. Lab Anim (NY). 1999;28(4):28 –32.
12.  BPOM.  Pedoman  Uji  Toksisitas  Nonklinik  Secara  In  Vivo.  In:  Pedoman  Uji Toksisitas Nonklinik Secara In Vivo. 2014.
13.  Katrin  E,  Winarno  H,  Susanto.  The  Acute  Toxicity  of  Ethanol  Extract  from Irradiated  Temulawak  (Curcuma  xanthorrizha  Roxb.)  Which  Have  Anticancer Activity Ermin. A Sci J Appl Isot Radiat. 2011;7(1):41.
14.  Usman S, Ibrahim I. Uji Efek Anti Diare Dan Uji Efek Sistem Saraf Otonom (Sso) Infus Daun Tapak Dara ( Catharanthus Roseus L.) Terhadap Hewan Uji Mencit. Media Farm. 2018;14(1):91.
15.  Fadilah  NN.  Uji  Toksisitas  Akut  Selulosa  Mikrokristal  Dari  Tanaman  Rami (Boehmeria Nivea L. Gaud) Pada Mencit Galur Swiss Webster. Pharmacoscript. 2019;2(1):16 –22.
16.  Sutjiatmo AB, Sukandar EY, Candra C, Vikasari SN. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Air Herba Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis (L) VAHL) Pada Mencit Swiss Webster. Kartika J Ilm Farm. 2015;3(2):32 –7.
17.  Wahlang, B., Beier, JI, Clair, HB, Bellis-Jones, HJ, Falkner, KC, McClain, CJ, & Cave,  MC  terkait  toksik.  Patologi  toksikologis  ,  41  (2)  343 –360.  Toxicant- associated Steatohepatitis. Physiol Behav. 2018;176(1):139 –48. https://doi.org/10.1177/0192623312468517 .
18.  Singh T, Sinha N, Singh A. Biochemical and histopathological effects on liver due to acute oral toxicity of aqueous leaf extract of Ecliptaalba on female Swiss albino mice. Indian J Pharmacol. 2013;45(1):61 –5.
19.  Toyin YM, Olakunle AT, Adewunmi AM. Toxicity and Beneficial Effects of Some African  Plants  on  the  Reproductive  System  [Internet].  Toxicological  Survey  of African  Medicinal  Plants.  Elsevier  Inc.;  2014.  445 –492  p.  Available  from: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-800018-2.00015-7
20.  Alfiyanti A, Sitasiwi AJ, Mardiati SM, Program M, Biologi S, Biologi D, et al. Buletin Anatomi  dan Fisiologi  Volume 4  Nomor 1  Februari  2019 Pengaruh  Pemberian Ekstrak Etanol Daun Mimba ( Azadirachta indica A . Juss ) terhadap Berat Uterus dan  Tebal  Endometrium  Mencit  (  Mus  musculus  L  .)  The  Effect  of  Neem  Leaf Ethanol Extract ( Azad. 2019;4.
21.  Katherine  J.  Hamilton,  Sylvia  C.  Hewitt,  Yukitomo  Arao    and  KSK.  Estrogen Hormone Biology. Physiol Behav. 2019;176(3):139 –48.
22.  Steven  L.  Young.  Oestrogen  and  progesterone  action  on  endometrium:  a translational  approach  to  understanding  endometrial  receptivity.  Bone. 2013;23(1):1 –7.
23.  Nørregaard  R,  Kwon  TH,  Frøkiær  J.  Physiology  and  pathophysiology  of cyclooxygenase-2  and  prostaglandin  E2  in  the  kidney.  Kidney  Res  Clin  Pract [Internet]. 2015;34(4):194 –200. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.krcp.2015.10.004
24.  Kuna  L,  Jakab  J,  Smolic  R,  Raguz-Lucic  N,  Vcev  A,  Smolic  M.  Peptic  Ulcer
Disease: A Brief Review of Conventional Therapy and Herbal Treatment Options. J Clin Med. 2019;8(2):179.
25.  K.  H,  G.  V.  Study  of  gastrointestinal  toxicity  of  selective  COX-2  inhibitors  in comparison with conventional NSAIDs. Int J Res Med Sci. 2016;4(12):5180 –4.