Disetujui: 10 April 2018 Jl. Soekarno Hatta No. 9, Malang 65141, Indonesia © 2018 Politeknik Negeri Malang
E-mail: sghpolinema@yahoo.co.id

## Efektifitas Penggunaan Co immobilized - Lipase pada
Reaksi Esterifikasi Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa

## Sigit Hadiantoro*, Dwina Moentamaria, Muchamad Syarwani
Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri Malang, Jl. Soekarno Hatta No. 9, Malang 65141, Indonesia
*E-mail: sghpolinema@yahoo.co.id

## ABSTRAK
Kinerja  enzim  immobilisasi  dapat  ditingkatkan  dengan  penambahan co  immobilizer , hal  ini  dilakukan  agar ikatan  kovalen  antara  enzim  dan  matriks  lebih  kuat  dan  mempermudah  reaksi  dari  gugus  fungsional  yang  ada pada  matriks  sehingga  tidak  diperlukan  penambahan  bahan  kimia  sebagai  pembawa.  Pada  penelitian  ini digunakan  matriks polyurethane  foam (PUF)  dengan  penambahan co  immobilizer yang  terdiri  dari gelatin, lesitin,  MgCl 2 ,  dan polyethyleh  glycol (PEG)  6000.  Penelitian  ini  difokuskan  untuk  melihat  efektivitas co immobilized-lipase pada  reaksi  hidrolisis-esterifikasi.  PUF  direndam  dalam  larutan co  immobilizer dengan perbandingan 1:15; 1:20 dan 1:25 (b/b ) selama satu jam setelah itu dipanaskan dalam oven selama satu jam pada suhu 30°C. Selanjutnya,  matriks PUF direndam dalam lipase selama 24 jam dan dikeringkan dalam oven pada suhu  30°C  selama  24  jam  sehingga  terbentuk  matriks  lipase  terko-immobilisasi  pada  PUF  dengan  yang digunakan  untuk  reaksi  hidrolisis-esterifikasi  sebagai  biokatalis.  Pada  reaksi  hidrolisis  digunakan  10  gram minyak  yang  diemulsikan  dalam  air  dengan  variabel  rasio  minyak-air  1:0,6;  1:1;  1:3  dan  1:5  (b/b ) dan  waktu reaksi  5,  10,  15  dan  20  jam.  Kadar  FFA  minyak  kelapa  awal  sebesar  0,21%.  Produk  terbaik  reaksi  hidrolisis adalah asam lemak bebas dengan kenaikan kadar FFA menjadi 1,18% pada kondisi perbandingan minyak/air 1:5 (b/b ) .  Reaksi  esterfikasi  dilakukan  dengan  cara  mereaksikan  asam  lemak  hasil  terbaik  hidrolisis  dengan sitronelol  dan co  immobilized-lipase sebagai  biokatalis.  Reaksi  ini  dilakukan  dengan  variabel  asam  lemak: sitronelol  1:0,8  ;  1:1  dan  1:3  (b/b ) serta  waktu  reaksi:  5,  10,  15  dan  20  jam.  Produk  yang  dihasilkan  adalah perisa  alami  sebagai  ester.  Analisis  kadar  sitronelol  awal  dan  akhir  reaksi  esterifikasi  dilakukan  dengan menggunakan  GC-FID . Hasil  terbaik  dari  penelitian  ini  yaitu  konversi  sebesar  92,88%  diperoleh  pada ratio massa asam lemak/sitronelol 1:3. Kata kunci : Co immobilized , esterifikasi, hidrolisis, immobilisasi, polyurethane foam.

## ABSTRACT
Immobilized  enzyme  performance can be enhanced by the  addition of co-immobilizer, this is done so that the covalent  bond  between  the  enzyme  and  the  matrix  can  become  stronger  and  also  to  ease  the  reaction  of  the functional  groups  present  in  the  matrix  so  that  no  addition  of  chemical  as  carrier  is  required.  This  study  used Polyurethane Foam (PUF) as matrix with the addition of co-immobilizer which contain gelatin, lecithin, MgCl 2 , and PEG 6000. This study focused on looking at the effect of co-immobilized lipase on hydrolysis-esterification reactions. PUF is immersed in an co-immobilizer solution of 1:15; 1:20 and 1:25 ratio ( w/w ) for one hour and heated for another hour at 30°C. After that, PUF is immersed in the lipase for 24 hours, after which is heated at 30°C also for 24 hours. This research was conducted in 2 stages of reaction, which is hydrolysis then continued by esterification. In the hydrolysis reaction, we used variables such as oil-water ratio for 1:0.6; 1:1; 1:3 and 1:5 (w /w );  the  reaction  time  5,  10,  15  and  20  hours;  and  also  PUF:co-immobilized  ratio  in  1:15;  1:20  and  1:25 ( w/w ).  The  best  fatty  acid  obtained  from  hydrolysis  results  in  oil-water  ratio  of  1:5  ( w/w ),  with  FFA  1.18%. Next is esterification reaction which is done by reacting  fatty acid from hydrolyzed coconut oil with citronellol, with the addition of immobilized lipase (as a biocatalyst). This reaction was carried out with variables like mass ratio of fatty acids-citronellol 1:0.8; 1:1 and 1:3 and reaction time: 5, 10, 15 and 20 hours. The resulting product is  the  flavor  enhancer  as  ester.  The  analysis  of  the  percentage  of  initial  and  final  citronellol  on  the  end  of esterification  reaction  were  performed  using  GC-FID.  The  best  results  of  this  study,  conversion  percentage respectively 92.88% obtained at mass ratio of fatty acid-citronellol 1:3.
Keywords : Co immobilized, esterification, hydrolysis, immobilization, polyurethane foam.

## 1.  PENDAHULUAN
Penggunaan perisa sintesis semakin mendominasi produk makanan dan minuman  di  Indonesia.  Hampir  semua makanan dan minuman baik produk industri rumah  atau  skala  besar  mengandung  bahan perisa sintetis. Secara umum, perisa diproduksi  melalui  sintesis  kimia  atau diekstrak dari tanaman/ bahan lainnya. Menurut  SNI-01-7152-2006,  tentang  perisa, yang disebut perisa alami adalah perisa yang diperoleh  secara  fisik,  mikrobiologi,  atau enzimatik  dari  bahan  pangan  tanaman  atau hewan  secara  langsung  ataupun  melalui proses  pengolahan.  Perisa  alami  merupakan salah  satu  ester  yang  dapat  dibuat  dengan mereaksikan  asam  lemak  dengan  sitronelol, senyawa  alkohol  yang  disintesis  dari sotronelol,  yaitu  komponen  utama  minyak sereh.  Asam  lemak  diperoleh  dari  hidrolisis minyak  kelapa  dengan  biokatalis  lipase. Penggunaan lipase sebagai biokatalis memiliki  keunggulan,  yaitu  mempunyai aktivitas  yang  tinggi,  spesifik  dan  ramah lingkungan [1].
Penelitian  tentang  penggunaan  lipase  untuk produksi  perisa  telah  banyak  dilakukan. Lipase  digunakan  sebagai  biokatalis  karena kemampuannya  melakukan  reaksi  hidrolisis dan  esterifikasi.  Beberapa  mikroorganisme penghasil lipase dari bakteri adalah Bacillus sp.,  Pseudomonas  sp.,  Burkholderia  sp. dan Staphylococcus sp., dari kapang diantaranya adalah Rhizopus  sp.,  Aspergillus  sp., Geothricum  sp.,  Mucor  sp.,  Thricoderma reseei, Fusarium sp. dan Rhizomucor sp. Penelitian tentang  penggunaan lipase untuk produksi  perisa  telah  banyak  dilakukan. Lipase merupakan  enzim  yang  dapat melakukan  katalis  reaksi  hidrolisis  senyawa ester  antara  lain  triasilgliserol  menjadi gliserol  dan  asam  lemak. Lipase juga bekerja  secara reversible ,  berperan  dalam reaksi  esterifikasi  maupun  transesterifikasi dari  gliserol  dan  asam  lemak.  Oleh  karena lipase mampu  melakukan  berbagai  jenis reaksi, lipase bermanfaat  secara  luas  dalam industri  aplikasi  bioteknologi  [2].  Beberapa mikroorganisme  penghasil  enzim lipase
berasal  dari  kelas  fungi  ( Rizhopus  sp., Aspergillus  sp.,  Geothricum  sp.,  Mucor  sp., Thricordema  reseei,  Fusarium  sp.  dan Rizhomucor  sp .),  yeast  ( Candida  sp., Rhodotorula sp., Pichia sp., Saccharomyces crataegenesis,  Torulospora  globosa  dan Trichosporon asteroid ) dan bakteri ( Bacillus sp., Pseudomonas sp., Burkholderia sp. Dan Staphylococcus sp .) [3].
Penggunaan lipase pada  pembuatan  perisa dapat dilakukan dengan metode enzim bebas maupun  terimmobilisasi.  Lipase  dalam bentuk bebas tidak stabil terhadap perubahan  lingkungan  sekitar  seperti  pH, suhu,  dan  tidak  dapat  di- recovery serta digunakan secara berulang ( reusable ). Teknologi immobilisasi enzim telah dikembangkan  untuk  menjadi  alternatif efisiensi pada penggunaan enzim. Teknologi immobilisasi    enzim  dilakukan  dengan  cara mengkondisikan  enzim    secara  fisik  pada ruang tertentu sehingga enzim yang terimmobilisasi  dapat  digunakan  kembali untuk  reaksi    secara  berulang.  Teknologi immobilisasi  enzim  telah  banyak  digunakan pada  industri  makanan,  farmasi  dan  kimia dengan  menggunakan  berbagai  matriks diantaranya  karbon  aktif,  keramik,  resin polimer,  silika,  zeolit, polyurethane  foam (PUF), dan lain-lain [4].
Pada  penelitian  ini,  digunakan  matriks polyurethane foam (PUF) karena keunggulannya yaitu bersifat inert, mempunyai  porositas  97%,  bersifat  kaku dan  mempunyai  kemampuan  mengikat lipase secara kovalen [4]. Kinerja immobilisasi lipase dapat  ditingkatkan dengan  penambahan co  immobilized untuk mempermudah  reaksi  dari  gugus  fungsional yang  ada  pada  matriks  sehingga  tidak diperlukan penambahan bahan kimia sebagai carrier [5].  Pada  penelitian  ini  dilakukan penambahan  gelatin,  lesitin,  MgCl 2 ,  dan poliethylen  glycol (PEG)  6000  sebagai co immobilizer ,  seperti  yang  telah  dilakukan oleh Awang dkk. [6].
Pada  penelitian  Awang  dkk.  [6]  dilakukan immobilisasi  dengan  metode  perendaman PUF  pada co-immobilized  agent yaitu
lesitin,  gelatin,  PEG  dan  MgCl 2 selanjutnya dilakukan pengeringan. Selanjutnya ditambahkan lipase dan dikeringkan semalam.  Reaksi  esterifikasi  dilakukan dengan  mencampurkan  asam  oleat  dan  oleil alkohol  lalu  ditempatkan  dalam  labu  yang berisi  100-500  mg  immobilisasi  lipase. Campuran  diinkubasi  pada  suhu  40  C selama 24 jam. Reaksi dihentikan penambahan  3,5  ml  etanol-aseton  dengan perbandingan  1:1.  Pada  produk  ester diperoleh  persen  konversi  sebesar  79,5%. Immobilisasi  lipase  dapat  digunakan  hingga 6x siklus pemakaian.
Pada  penelitian  yang  dilakukan  oleh  Prastia dan  Diningrum  [7],  dilakukan  immobilisasi lipase metode covalent menggunakan matriks polyurethane  foam (PUF)  yang direndam  dalam  larutan co  immobilizer dengan  perbandingan  massa  1:2,  lipase digunakan sebagai biokatalis untuk pembuatan perisa  alami. Penambahan lipase dilakukan  dengan  variabel  4%,  6%  dan  8% dari berat substrat dan variabel waktu proses esterifikasi  yaitu  30,  90  dan  150  menit. Penambahan  lipase  untuk  hasil  produk perisa alami terbaik diperoleh pada penambahan  6%  dengan  waktu  tinggal  90 menit.
Pada  penelitian  Pangesti  dan  Retno  [8] dilakukan  imobilisasi  enzim  lipase dari Mucor  meihei pada  matriks  zeolit  sebagai biokatalis  esterifikasi  pembuatan  biodiesel. Penelitian ini menggunakan metode entrapment dan  aplikasi  zeolit  digunakan sebagai  penjernih  dan    pengering  bahan pangan,  aditif  dan  tanaman  obat  yang umumnya  sensitif  terhadap  panas,  sehingga menghasilkan produk mutu yang terbaik. Berdasarkan  hasil  penelitian  terdahulu, penelitian  tersebut  dapat  digunakan  sebagai acuan  dalam  penelitian  yang  dilakukan, yakni untuk mengetahui pengaruh penambahan co  immobilized -  lipase  pada reaksi  esterifikasi  untuk  pembuatan  perisa alami.

## 2.  METODE PENELITIAN
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental,  terdiri  dari  5  tahap.  Tahap pertama  membuat  larutan crude  lipase dan larutan co  immobilized .  Tahap  kedua  yaitu immobilisasi  PUF  dengan  larutan co immobilized dan crude lipase . Tahap ketiga aplikasi  immobilisasi  ( co  immobilized dan crude  lipase )  pada  reaksi  hidrolisis.  Tahap keempat  penggunaan  immobilisasi  pada reaksi  esterifikasi  (perisa).  Tahap  terakhir yaitu analisis ester menggunakan GC-FID. 2.1.   Pembuatan larutan crude  lipase dan larutan co immobilized
Larutan crude lipase dibuat dengan menggunakan  Mucor  miehe  yang  terlebih dahulu  diinokulasikan  pada  PDA  agar miring.
Dextro Agar (PDA) yang terdapat pada agar miring. Selanjutnya, Mucor miehei dicampurkan dalam 250 ml media fermentasi  padat  yang  terdiri  dari  pepton 5%;  KH 2 PO 4 1%;  FeSO 4 .7H 2 O  0,001%; Minyak  zaitun  10%;  Minyak  kelapa  sawit 10%;  ampas  kelapa  kering  20%  dan aquad est  53,99%.  Larutan  selanjutnya diinkubasikan  pada  suhu  40  C  dengan kecepatan  120  rpm  selama  lima  hari, selanjutnya  ditambahkan buffer  phosphat dengan  perbandingan  media  padat  terhadap cair  1:4  (b/b)  dan  diinkubasi  kembali  pada suhu  40  C  dengan  kecepatan  150  rpm selama  135  menit  dan  ditambahkan tween 0,5% (v/v). langkah terakhir yaitu pemisahan padatan dengan crude lipase dan sentrifugasi  selama  30  menit  dengan kecepatan 150 rpm.
2.2.   Immobilisasi PUF dengan larutan co immobilized dan crude lipase Pembuatan larutan co-immibilisasi dilakukan  dengan  mencampurkan  50  gram lesitin, 50 gram  gelatin, 20 gram PEG 6000 dan  10  gram  MgCl 2 kemudian  dilarutkan masing  –  masing  bahan  dengan  satu  liter aquadest. Selanjutnya,  rendam  PUF  dalam larutan co immobilized dengan perbandingan PUF  : Co  Immobilizer 1:15;  1:20  dan  1:25
( b/b ) selama 1 jam, keringkan menggunakan
oven  selama  1  jam  pada  suhu  30  C,  PUF hasil pengeringan direndam kembali dengan crude    lipase sebanyak  15,  20  dan  25  gram selama  24  jam,  kemudian  oven  selama  24 jam pada suhu 30  C.

## 2.3.   Penggunaan pada reaksi hidrolisis
Hasil co  immobilized dan crude  lipase selanjutnya digunakan pada reaksi hidrolisis pada  minyak  kelapa  sebanyak  10  gram dengan    perbandingan  minyak  :  akuades 1:0,6;  1:1;  1:3  dan  1:5  (b/b),  ditambahkan lipase terimmobilisasi dan larutan diinkubasikan  pada  suhu  40  C  dengan variasi  waktu  selama  5,  10,  15  dan  20  jam. Hasil  akhir  yang  didapat  yaitu  gliserol  dan FFA yang selanjutnya dipisahkan menggunakan  corong  pemisah  dan  diuji kadar  FFA-nya.  Kadar  FFA  menunjukkan banyaknya  asam  lemak  bebas  dalam minyak.

## 2.4.   Penggunaan pada reaksi esterifikasi
FFA  yang  didapatkan  dari  reaksi  hidrolisis selanjutnya digunakan untuk reaksi esterifikasi  dengan  perbandungan massa FFA  :  Sitronelol  1:0,8;  1:1  dan  1:3.  Lipase terimmobilisasi  ditambahkan  pada  larutan, diinkubasi pada suhu 40  C selama 5, 10, 15 dan  20  jam.  Produk  yang  diperoleh  yaitu ester  (perisa)  dan  dipisahkan  menggunakan sentrifuge dengan  kecepatan  10000  rpm selama  15  menit,  kemudian  analisis  ester menggunakan GC-FID yang bertujuan untuk mengetahui  kandungan  sitronelol  yang terdapat pada ester (perisa).

## 2.5.   Variabel percobaan
Variabel  tetap  terdiri  dari  matriks  PUF  dari pasar  lokal,  larutan co  immobilized yang digunakan  terdiri  dari:  lesitin,    gelatin, MgCl 2 dan  PEG  6000  dari  pasar  lokal  dan suhu  esterifikasi  40  C.  Sedangkan  untuk variabel  berubah  terdiri  dari  perbandingan PUF :Co  Immobilized =  1:15;  1:20  dan  1:25 (b/b ) pada  reaksi  hidrolisis,  perbandingan FFA  :  Sitronelol    1:0,8;  1:1  dan  1:3  (b/b ) pada reaksi  esterifikasi,  dan waktu reaksi  5, 10, 15 dan 20 jam.
Produk  hasil  proses  esterifikasi  didapatkan dua  lapisan  cairan,  dimana  lapisan  atas merupakan ester sitronelol laurat dan lapisan bawah  merupakan  campuran  air  dan  enzim. Lapisan  atas  dianalisis  menggunakan  GC- FID  untuk  mengetahui  jumlah  sitronelol yang terkonversi menjadi produk ester.

## 3.  HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari  penelitian  ini  didapatkan  hasil  dan pembahasan tentang penambahan co immobilized – lipase pada reaksi esterifikasi pada pembuatan perisa alami.
Tabel  1. Kadar  FFA  (%)  hasil  hidrolisis pada  perbandingan  PUF  : Co  immobilized 1:15 ( b/b ) Waktu Reaksi Ratio Minyak : Air ( b/b ) (Jam) 1:0,6 1:1 1:3 1:5 5 0,18 0,17 0,17 0,27 10 0,18 0,27 0,45 0,46 15 0,27 0,36 0,36 0,45 20 0,36 0,35 0,55 0,59
Tabel  2. Kadar  FFA  (%)  hasil  hidrolisis pada  perbandingan  PUF  : Co  immobilized 1:20 ( b/b ) Waktu Reaksi (Jam) Ratio Minyak : Air ( b/b ) 1:0,6 1:1 1:3 1:5 5 0,36 0,46 0,55 0,46 10 0,27 0,54 0,73 0,72 15 0,55 0,73 0,91 1,08 20 0,73 1,01 1,08 1,18
Tabel  3. Kadar  FFA  (%)  hasil  hidrolisis pada  perbandingan  PUF: Co  Immobilized 1:25 ( b/b ) Waktu Reaksi Minyak : Air ( b/b ) (Jam) 1 : 0.6 1:1 1:3 1:5 5 0,28 0,27 0,36 0,46 10 0,23 0,32 0,41 0,41 15 0,27 0,37 0,46 0,54 20 0,36 0,46 0,54 0,64
3.1.   Pengaruh
penambahan
co immobilized terhadap hasil hidrolisis pada  preparasi  pembuatan  perisa alami
Kinerja immobilisasi lipase dapat ditingkatkan dengan penambahan co immobilized untuk  mempermudah  reaksi dari gugus fungsional yang ada pada matriks sehingga  tidak  diperlukan  penambahan bahan kimia sebagai carrier [5].
Gambar 1. Waktu hidrolisis terhadap kadar FFA terbaik pada perbandingan minyak : air 1:5 ( b/b )
Kadar  FFA  hasil  hidrolisis  berdasarkan Gambar 1 menunjukkan peningkatan terhadap  kadar  FFA  awal  minyak  kelapa yaitu  0,21%.  Hal  tersebut  menunjukkan bahwa  terjadi  peningkatan  jumlah  asam lemak  bebas  yang  terbentuk  dibandingkan minyak  awal  setelah  dilakukan  hidrolisis menggunakan crude  lipase [9].  Semakin banyak  kandungan  air  akan  mengakibatkan nilai  dari  kadar  FFA  semakin  tinggi.  Hasil ini  memiliki  kecenderungan  yang  sama dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh Yulianto  dkk.  [10]  yang  mendapatkan bahwa  semakin  besar  konsentrasi  air,  maka peningkatan  jumlah  asam  yang  terbentuk juga  akan  semakin  besar.    Jumlah  air  yang semakin  besar  akan  menyebabkan  minyak semakin  sukar  untuk  diemulsikan  dalam  air dan  cenderung  membentuk  dia  lapisan, sehingga  kinerja  enzim  lipase  tidak  efektif. Kecenderungan  nilai  kadar  FFA  berbeda- beda  pada  setiap  perbandingan  PUF  : Co immobilized ,  dapat  dilihat  pada  Tabel  1-3 trend  kenaikan  kadar  FFA  lebih  kecil  pada
perbandingan  PUF  : Co  immobilized 1:15 dan 1:25 (b/b ) sedangkan pada perbandingan PUF  : Co  Immobilized 1:20  (b/b)  trend kenaikan  kadar  FFA  relatif  lebih  besar  dari pada  kedua  variabel  lainnya.  Hal  ini  dapat disebabkan oleh perbedaan penggunaan unit enzim  berperan  dalam  hal  apa  sehingga berakibat naik atau turunnya kadar FFA. Berdasarkan  data  tersebut  semakin  banyak enzim yang digunakan pada reaksi hidrolisis maka  akan  mengakibatkan  nilai  dari  kadar FFA  semakin  besar.  Hasil  penelitian  ini sependapat dengan penelitian Su’i dkk. [11] yang  menyebutkan  bahwa  penambahan enzim  terhadap  substrat  hingga  konsentrasi enzim  tertentu  (12%)  akan  meningkatkan aktivitas lipase  Caesalpinia  bonducella  L. Jika  jumlah  enzim  ditingkatkan  lagi, aktivitas lipase akan menurun yang ditunjukkan  oleh  jumlah  produk  hidrolisis yang  lebih  rendah  [11].  Jika  jumlah  enzim ditingkatkan  dengan  jumlah  substrat  yang tetap,  maka  akan  tercapai  keadaan steady state ,  jumlah  produk  tidak  dapat  meningkat lagi.  Penurunan hasil dapat  disebabkan oleh proses  pemisahan  hasil  dari  enzim  yang digunakan.
Berdasarkan hasil penelitian, maka diperoleh  hasil  hidrolisis  terbaik  pada perbandingan  PUF  : Co  immobilized 1:20 ( b/b ) dengan rasio minyak : air 1:5 ( b/b ) dan waktu  reaksi  20  jam.  Nilai  kadar  FFA  pada waktu  tersebut  adalah  1,18%.  Hasil  dari hidrolisis  terbaik  ini  akan  digunakan  untuk esterifikasi pada pergram minyak.
3.2.   Pengaruh perbandingan  (b/b) asam lemak  bebas  :  sitronelol  terhadap konversi reaksi esterifikasi
Dalam  penelitian  variabel  yang  digunakan asam lemak bebas : sitronelol 1:0,8; 1:1 dan 1:3  dan waktu reaksi 5, 10, 15 dan 20 jam. Sedangkan  biokatalis  adalah lipase yang telah diimmobilisasi yang memiliki aktivitas sebesar 5,278 unit/gram (Tabel 4). Aktivitas 5,278  unit/gram  dipilih  sebagai  biokatalis karena  pada  saat  reaksi  hidrolisis  memiliki hasil  yang  terbaik  yaitu  PUF  : co immobilized 1:20.
Tabel  4. Hasil  uji  aktivitas  lipase  terco- immobilisasi No Co Immobilized (g) Aktivitas Lipase (U/g) 1 15 6,611 2 20 5,278 3 25 7,667
Gambar 2. Pengaruh waktu reaksi terhadap konversi  (%)  untuk  perbandingan  massa FFA : sitronelol
Dari  data  tersebut  terlihat  bahwa  untuk variabel  yang  sama  perbandingan  massa FFA  :  sitronelol 1:3  memiliki  persen konversi  yang  lebih  besar  dibandingkan 1:0,8  dan  1:1.  Reaksi  antara  FFA  dan sitronelol  merupakan  reaksi  kesetimbangan. Dengan  perbandingan  1:3  diperoleh  hasil terbaik.  Hasil  penelitian  ini  memiliki kecenderungan  yang  sama  terhadap  hasil penelitian  yang  dilakukan  oleh  Salihu  dkk. [12] dilakukan berbagai perbandingan massa asam butirat dengan n -butanol 1:1; 1:2; 1:3; 1:4;  1:5;  1:6;  1:7  dan  1:8  dengan menggunakan katalis lipase Candida cylindracea dengan  aktivitas  enzim  75 U/mg, konversi meningkat pada perbandingan massa 1:8  sebesar  63,33%, perbandingan  molar  yang  tinggi  dapat memperoleh  persen  konversi  tertinggi. Sedangkan  pada  penelitian  Salihu  dkk.  [12] pada  saat  sintesis cetyl  oleat ,  alkohol berlebih mempercepat sintesis ester dan laju paling  cepat  didapatkan  pada  perbandingan asam  dan  alkohol  1:10.  Sehingga  dalam penelitian ini, molar ratio tinggi
menghasilkan  persentase  konversi  tertinggi, hal  ini  karena  sifat  setiap  ester  yang  akan dihasilkan  menentukan  tingkat molar  ratio asam terhadap alkohol yang akan digunakan. Pada  Gambar  2  terlihat  bahwa  nilai  persen konversi ratio massa 1:0,8 dan 1:1 memiliki konversi  sebesar  100%  pada  waktu  10,  15 dan 20 jam. konversi 100% dapat disebabkan  karena  tidak  adanya  kandungan kadar sitronelol yang terdapat dalam analisis GC.  Hal  ini  diduga  pada  saat  pemisahan
PUF  dengan  produk  ester  tidak  maksimal sehingga menyebabkan tidak adanya
kandungan  sitronelol,  selain  itu  karena kandungan  sitronelol  yang  sangat  sedikit dibandingkan  asam  lemak  bebas  sehingga semuanya  terkonversi  menjadi  produk. Faktor  lainnya  karena  variasi  waktu  reaksi yang  sangat  lama,  sehingga  semakin  lama waktu  kontak  maka  produk  yang  dihasilkan juga  semakin  besar.  Hal  ini  sesuai  dengan penelitian
Saravanan [13] tentang eseterifikasi asam butirat dan sitronelol yang menggunakan  katalis lipase dari Rhizopus sp. dan Mucor  miehei yang  terimobilisasi dengan  menghasilkan  konversi  sebesar 100% setelah 24 jam.

## 3.3.   Pengaruh  variasi  waktu  reaksi terhadap konversi reaksi esterifikasi
Tujuan  penggunaan  variabel  waktu  yang berbeda-beda  untuk  mengetahui  waktu optimum  yang  dibutuhkan  enzim  untuk mengkatalis  substrat  secara  maksimal. Pengaruh  variasi  reaksi  terhadap  konversi dapat dilihat pada Gambar 2.
Pada ratio  massa yang  sama  1:3,  persen konversi pada waktu 5 jam sebesar 90,90%, sedangkan  pada  waktu  10  jam  persen konversi sebesar 91,00% dan pada waktu 15 jam terjadi penurunan persen konversi  yaitu 90,11%. Penelitian ini memiliki kecenderungan yang sama dengan penelitian Muhamad dkk. [14], reaksi terdiri dari asam karboksilat  dan  alkohol  dengan lipase Candida antartica yang telah diimmobilisasi dan  diinkubasi  pada  suhu  37°C.  Reaksi tersebut  menghasilkan  nonyl  kaprilat  dan variabel  yang  digunakan  adalah  variasi
waktu  1  hingga  12  jam.  Dibutuhkan  sekitar 5  jam  untuk  mencapai  kesetimbangan dengan  persen  konversi  87,98%.  Persen konversi  88,5%  menunjukkan  tingginya pertambahan  selama  6  jam.  Walaupun begitu  dalam  waktu  8  jam  konversi  mulai menurun  sebesar  85,20%,  sedangkan  pada waktu  10  dan  12  jam  persen  konversi meningkat  kembali.  Persen  konversi  yang menurun  pada  waktu  8  jam  disebabkan karena  terbentuknya  molekul  air  yang mencapai  keadaan  kesetimbangan.  Disaat reaksi berjalan, konsentrasi substrat menurun  sehingga  menjadikan  menurunnya tingkat dari enzim dengan substrat.
Secara  teoritis  waktu  inkubasi  akan  terus meningkat sampai tercapainya waktu optimum reaksi.  Saat  reaksi  melebihi waktu optimum tidak ada lagi penambahan produk dan  jumlah  produk  akan  cenderung  konstan [15].  Sedangkan  dari  penelitian  ini,  persen konversi  yang  tinggi  didapat  pada  waktu reaksi  20  jam,  Sehingga  bila  waktu  reaksi tersebut  dilanjutkan  maka  akan  diketahui waktu  optimum  reaksi.  Selain  waktu  reaksi yang  harus  dilanjutkan,  faktor  lainnya karena  komponen  substrat  yang  masih  ada, dan masih bereaksi dengan enzim.

## 4.  KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat  diambil  kesimpulan  bahwa  persen konversi  tertinggi  diperoleh  pada  rasio massa      1:3  dan  waktu  reaksi  20  jam,  yaitu sebesar 92,88%.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] D.  Moentamaria,  G.  Againa,  M.  M. Ridhawati, A. Chumaidi, N. Hendrawati, Hidrolisis
Minyak Kelapa dengan Lipase Terimmobilisasi Zeolit pada Pembuatan  Perisa  Alami, Jurnal Bahan  Alam  Terbarukan ,  vol.  5,  no. 2, hal. 84-91, 2016.
[2] E.  Suyanto,  E.  S.  Soetarto,  M.  N. Cahyanto,  Produksi  Lipase  Kapang
Lipolitik Pada Limbah Ampas
Kelapa, Bioeksperimen ,  vol.  1,  no.  1, hal. 12-17, 2015.
[3] I.  Riwayati,  I.  Hartati,  L.  Kurniasari, Teknologi Imobilisasi Sel Mikroorganisme pada Produksi Enzim  Lipase,  Prosiding  SNST  ke-3, hal. A.55-A.59, 2012.
[4] X.  Zhao,   F. Qi, C. Yuan, W.  Du, D. Liu,  Lipase-catalyzed  Process  for Biodiesel Production: Enzyme
Immobilization,  Process  Simulation and  Optimization, Renewable  and Sustainable  Energy  Reviews ,  vol.  44, hal. 182-197, 2015.
[5] L.  Cao,  Carrier ‐ bound  Immobilized
Enzymes:  Principles, Application and
Design, Weinheim: Wiley ‐ VCH, 2006.
[6] R.  Awang,  M.  R.  Ghazuli,  M.  Basri, Immobilization of Lipase from Candida  Rugosa  on  Palm-Based Polyurethane  Foam  as  a  Support Material, American Journal of Biochemistry  and  Biotechnology ,  vol. 3, no. 3, hal. 163-166, 2007.
[7] D. E. Prastia, P. Diningrum, Pembuatan Perisa Alami dari Minyak Kelapa  dan  Citronellol  Berbasis Minyak  Sereh  dengan  Amobilisasi Lipase  Secara  Kontinyu,  Laporan Akhir,  Politeknik  Negeri  Malang, Indonesia, 2014.
[8] R. A. Pangesti, M. Retno, Amobilisasi  Lipase  pada  Matriks Zeolit  untuk  Sintesis  Perisa  Alami, Laporan  Akhir,  Politeknik  Negeri Malang, Indonesia, 2015.
[9] D.  Moentamaria,  Z.  Irfin, S.  Udjiana, Immobilized  Lipase  Technology  for Making  Natural  Flavor, International Journal of Engineering Research and Development , vol. 11, no. 12, hal. 30- 35, 2015.
[10]  M.  E.  Yulianto,  R.  W.  Broto,  I. Pudjihastuti,  Studi  Awal  Pembuatan
Asam  Lemak  secara  Enzimatik  dari Buah  Segar  Kelapa  Sawit,  Laporan
Akhir, Universitas Diponegoro,
Semarang, Indonesia, 2004.
[11]  M. Su’i, H. Harijono, Y. Yunianta, A. Aulani’am, Aktivitas Hidrolisis Enzim  Lipase  dari  Kentos  Kelapa Terhadap  Minyak  Kelapa, Agritech , vol. 30, no. 3, hal. 164-167, 2010.
[12]  A.  Salihu,  M.  Z.  Alam,  M.  I. AbdulKarim, H. M. Salleh, Esterification  for  Butyl  Butyrate
Formation using Candida cylindracea
Lipase  Produced  from  Palm  Oil  Mill
Effluent Supplemented Medium,
Arabian Journal of Chemistry , vol. 7,
no. 6, hal. 1159-1165, 2014.
[13]  D.  Saravanan,  Immobilized  Lipase Catayzed  Synthesis  Of  Citronellyl Butyrate  In  Organic  Media,  Mumbai: Institute  of  Chemical  Technology (ICT), 2013.
[14]  S.  K.  Muhamad,  S.  M.  Radzi,  S.  S. Othman,  M.  B.  A.  Rahman,  H.  M. Noor,  Optimization  of  Lipase  – Catalyzed Synthesis of Flavour Esters in  Solvent  Free  System, Journal  of
Fundamental  Sciences ,  vol.  6,  no.  1,
hal. 31-36, 2010.
[15]  N. D. Insani, Studi Esterifikasi antara Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Sawit dengan Sukrosa Menggunakan Lipase Candida rugosa EC 3.1.1.3 Terimobilisasi pada
Matriks  Silika  Gel  60,  Skripsi, Universitas Indonesia, 2012.