Posisi Filogeni Molekuler Bakteri Bacillus sp yang Diisolasi dari Media Kultur Rotifer Berbasis Pakan Limbah Perikanan
(Molecular Phylogenetic Position of Bacillus sp Bacteria Isolated from Rotifer Culture Medium Based on Fisheries Waste Diet)
Stenly Wullur
Faculty of Fisheries and Marine Science, Sam Ratulangi University, Manado 95115, Indonesia *Author for correspondence, e-mail; stenlywullur@unsrat.ac.id

## Abstract
This  study  aims  to  identify  and  determine  the  phylogenetic  position  of  two  bacterial  isolates (F0031  and  F0033),  isolated  from  culture  media  of  Rotifer Brachionus  plicatilis sp.  complex. Genomic DNA of the bacteria was extracted using Qiaprep Miniprep Kit and the 16S rRNA gene was  amplified  using  primer  pairs  8F  (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')  and  1492R  (5'- ACCTTGTTACGACTT-3'). The sequences were analyzed using Geneious Prime ver. 2020 and bacterial  identification  was  performed  using  the  Basic  Local  Alignment  Tool  (BLAST) method.  Phylogenetic analysis was conducted using MEGA X, where the phylogenetic tree was constructed  using  the  Maximum  Likelihood  method,  and  evaluated  using  the  Bootstrap method.  Results of this study showed that both bacterial isolates (F0031 and F0033) belong to different genera, namely Bacillus (F0031) and Mesobacillus (F0033). Bacterial isolate F0031 had the closest similarity and was located at the same phylogenetic branch as B. cereus , while isolate F0033 was with M. jeotgali .
Keywords: phylogeny, molecular, bacteria, bacillus, mesobaccilus, rotifera, diet.

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan menentukan posisi filogeni  dua isolat bakteri (F0031 dan F0033) yang diisolasi dari media kultur rotifer Brachionus plicatili sp. complex.  DNA genom  dari  isolat  bakteri  diekstrak  menggunakan  Kit  Qiaprep  Miniprep  dan  gen  16S  rRNA diamplifikasi  menggunakan  pasangan  primer  8F  (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')  dan 1492R (5'-ACCTTGTTACGACTT-3').  Hasil sekuens dianalisis menggunakan Sequence scanner ver. 2.0 dan  analisis sekuens dilakukan  menggunakan Geneious  Prime  ver. 2020.   Identifikasi isolat  bakteri  dilakukan  dengan  metode  BLAST  (Basic  Local  Alignment  Tools)  dan  analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan MEGA X, dimana konstruksi filogeni menggunakan metode Maximum Likelihood yang dievaluasi dengan metode Bootstrap.
Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa  kedua  isolat  bakteri  (F0031  dan  F0033)  merupakan  isolat bakteri yang berasal dari genus berbeda, yaitu genus Bacillus (F0031) dan genus Mesobacillus (F0033).  Isolat bakteri F0031 memiliki kesamaan terdekat dan berada pada posisi percabagan filogenetik yang sama dengan B. cereus sedangkan Isolat F0033 dengan M. jeotgali Kata kunci: Filogeni, molekuler, bakteri, bacillus, mesobaccilus, rotifer, pakan

## PENDAHULUAN
Rotifer Brachionus  plicatilis species complex  merupakan  salah  satu  jenis zooplankton yang banyak digunakan sebagai  pakan  alami  dalam  industri pembenihan  larva  berbagai  jenis  ikan  laut (Hagiwara  et  al.  2014;  Hagiwara  et  al. 2017;  Kotani  et  al.  2017;  Wullur  2017). Beberapa  keunggulan  rotifer  sebagai pakan  alami  diantaranya  adalah;  ukuran tubuh  yang  kecil  sehingga  sesuai  dengan bukaan  mulut  larva,  laju  reproduksi  yang cepat  sehingga  memungkinkan  dirpoduksi
dalam  waktu  yang  singkat,  pertumbuhan populasi yang tinggi sehingga memungkinkan dipelihara dengan kepadatan  populasi  tinggi,  motilitas  yang relatif  lambat  sehingga  mudah  dimangsa larva,  dapat  dibudidaya  secara  massal sehingga  dapat  memenuhi  kebutuhan biomasa  larva  ikan  yang  dipelihara,  dan nilai nutrisi rotifer yang dapat dimanipulasi sesuai  dengan  sumber  pakan  yang diberikan  (Wullur  et  al.  2011;  Wullur  et  al. 2013; Hagiwara et al. 2014;  Rumengan et al. 2016; Wati and Imanto 2018; Wullur  et al.  2018;  Lee  et  al.  2019).  Prosedur  yang
digunakan  saat  ini  untuk  memproduksi rotifer,  umumnya  menggunakan mikroalga sebagai sumber nutrisi rotifer (Hagiwara et al.  2017).  Akan  tetapi,  biaya  produksi mikroalga  menjadi  kendala  dalam  industri ini sehubungan dengan biaya investasi dan operasional  kultur  mikroalga  yang  sangat tinggi  (Acien  et  al.  2017).  Dalam  upaya untuk menekan biaya produksi pakan untuk rotifer,  beberapa  fasilitas  pembenihan mencoba  menggunakan  alternatif  pakan untuk rotifer dari bahan ragi roti yang murah dari  segi  biaya    (Hagiwara  et  al.  2014; Hagiwara  et  al.  2017),  akan  tetapi,  nilai nutrisi  dari  ragi  roti  ternyata  relatif  rendah terutama untuk kandungan asam eicosapentaenoic
(20:5 n-3) dan docosahexaenoic (22:6 n-3) yang esensial dibutuhkan
untuk mendukung pertumbuhan  larva  ikan.  Selain  itu,  kultur rotifer  berbasis  ragi  roti  sering  tidak  stabil dan  bahkan  terkadang  gagal  karena penurunan  kualitas  air  budidaya  yang cepat, sehingga kultur rotifer berbasis rogi roti menjadi kurang menarik bagi pembudidaya  ikan  (Hagiwara  et  al.  2014; Hagiwara  et  al.  2017;  Ogello  et  al.  2018; Ogello  et  al.  2019;  Wullur  et  al.  2019; Ogello  et  al.  2020).  Pada  akhir  1980-an, perusahaan  industri  Chlorella  Jepang (Fukuoka, Jepang) telah mengembangkan pasta  mikroalga  Chlorella  V-12®  sebagai pakan  untuk  rotifer.  Pasta  mikroalga  ini praktis karena sudah siap pakai dan dapat disimpan  selama  sekitar  2  minggu  tanpa kehilangan  nilai  nutrisinya  yang  signifikan, serta memungkinkan pembudidaya melakukan  kultur  rotifer  kepadatan  tinggi (Hagiwara  et  al.  2014;  Hagiwara  et  al. 2017) tetapi sayangnya, harga pakan pasta mikroalga  Chlorella  V-12®  sangat  mahal dan tidak umum tersedia di fasilitas-fasilitas pembenihan  terutama  di  negara-negara berkembang termasuk di Indonesia (Hagiwara et al. 2014). Baru-baru ini, kami mengembangkan  suatu  prototipe  produk pakan  untuk  rotifer  dengan  menggunakan bahan  dasar  dari  limbah  buangan  industri periknan  yang  murah  dari  segi  biaya  dan tersedia  untuk  digunakan  kapan  saja. Produk  pakan  berbasis  limbah  perikanan ini merupakan sumber nutrisi tinggi protein yang memfasilitasi tumbuh dan
berkembangnya  bakteri-bakteri  pengurai, yang  selanjutnya  lagi  dimanfaatkan  oleh rotifer  sebagai  sumber  nutrisi  untuk pertumbuhan  dan  perkembangan  rotifer (Ogello dkk., 2018; Napitupulu dkk., 2019; Ogello dkk., 2019; Wullur dkk., 2019, 2020; Ogello  dkk.,  2020).  Penerimaan  rotifer terhadap  produk  pakan  berbasis  limbah perikanan ini sangat baik, dimana pertumbuhan  populasi  rotifer  yang  diberi pakan  ini  meningkat  secara  signifikan sekitar  2000  hingga  3000  ind./ml  dalam waktu  kurang  lebih  3  hingga  5  hari budidaya  (Wullur  dkk.,  2017),  dan  nilai nutrisi  bagi  larva  ikan  yang  diberi  pakan rotifer  ini  sebanding  dengan  rotifer  yang diberi pakan pasta mikroalga (Ogello dkk., 2018; Ogello dkk., 2019; Wullur et al., 2019, 2020;  Ogello  dkk.,  2020).    Sejauh  ini, spesies bakteri yang terlibat dalam proses penguraian  produk  pakan  berbasis  limbah perikanan ini belum banyak diketahui. Hasil penelitian Wullur et al., 2020, menunjukan adanya  keterlibatan  beberapa  spesies bakteri  dalam  proses  penguraian  produk pakan berbasis limbah perikanan.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui posisi  filogeni  molekuler  dari  bakteri  yang diisolasi  dari  media  kultur  rotifer  yang berperan  dalam  proses  penguraian  pakan berbasis  limbah  perikanan,  dan  menjadi salah satu sumber nutrisi dalam pemeliharaan  rotifer B.  plicatilis sp. complex (Wullur et al., 2020).   Konstruksi filogeni  bakteri  dalam  penelitian  ini, menggunakan  gen  subunit  kecil  ribosom 16S  rRNA  sebagai  gen  target  dengan beberapa  keunggulan,  dimana  gen  16S rRNA ini cenderung memiliki sekuen yang sama pada berbagai jenis bakteri sehingga informasi  filogenetik  yang  diperoleh  dapat diterapkan pada banyak jenis bakteri.  Gen 16S rRNA juga memilik variasi yang cukup besar  pada  tingkat  yang  sesuai  dengan tingkat  perbedaan  antara  spesies  bakteri yang  memungkinkan  untuk  membedakan antara  spesies  yang  sangat  mirip  secara morfologi atau fisiologi.  Selain itu, gen 16S rRNA memiliki ukuran yang relatif panjang yaitu  sekitar  1.500  pasangan  basa  yang memungkinkan untuk menghasilkan cukup banyak  informasi filogenetik  dalam  proses analisis.    Secara  fungsi,  gen  16S  rRNA
berfungsi  untuk  menyandi  RNA  ribosom, yang  digunakan  untuk  sintesis  protein, yang mana fungsi ini sangat penting untuk seluruh  jenis  organisme,  sehingga  gen  ini jarang  hilang  atau  dimodifikasi  secara drastis selama evolusi.  Database sekuens gen  16S  rRNA  banyak  tersedia  di  basis data seperti GenBank yang memungkinkan untuk  membandingkan  sekuen  gen  16S rRNA  yang  diperoleh  dengan  sekuen  di database (Fuks dkk., 2018; Wantania dkk., 2019;  Wondal  dkk.,  2019;  Akihary  dkk., 2020).

## METODE
Isolat  bakteri  dalam  penelitian  ini diperoleh  dari  kultur  rotifer B.  plicatilis sp. complex  yang  dipelihara  menggunakan pakan  berbasis  penguraian  bahan  limbah buangan  dari  industri  perikanan.  Prosedur persiapan pakan diadaptasi dari Paten No. P00201609066.  Kultur  rotifer  dilakukan dengan  menggunakan  air  laut  steril  yang diencerkan (25 ppt) dan ditempatkan pada ruangan  bersuhu  antara  25-28°C.  Isolasi bakteri  didapatkan  dengan  mengambil  1 mL sampel air dari kultur rotifer (kepadatan rotifer  sekitar  100  ind./ml)  dan  diencerkan secara bertahap (dari 10 hingga 1000 kali) dalam  air  laut  steril,  ditumbuhkan  pada nutrien  agar  2%  (NA)  dan  ditempatkan dalam  inkubator  selama  24-48  jam  pada suhu  37°C  untuk  pengamatan  koloni bakteri  mengikuti  Laboffe  (2012).  Koloni bakteri  yang  mencolok  secara  fenotipik diisolasi,  dibiakkan  selama  24-48 jam  dan disentrifus  pada  kecepatan  14.000  rpm selama  5  menit.  Identifikasi  molekuler dilakukan  dengan  mengekstraksi  DNA genomik  isolat  bakteri  menggunakan  Kit Qiaprep Miniprep (Qiagen, Hilden, Jerman).  Gen  16S  rRNA  isolat  bakteri diamplifikasi menggunakan pasangan primer  PCR  universal  (Integrated  DNA Technologies-IDT,  Singapura)  8F  (5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') dan 1492R (5'-ACCTTGTTACGACTT-3') (Fuks et  al.  2018; Wantania  et  al. 2019;  Wondal et  al.  2019;  Akihary  et  al.  2020).  Reaksi amplifikasi dilakukan dalam volume total 25 µl,  terdiri  dari  5  µl  5x  Hotfirepool,  17  µl ddH2O, 1 µl Primer 8F, 1 µl Primer 1492R, dan  1  µl  sampel.  Amplifikasi  dilakukan
selama  35  siklus  dalam  Thermocycler Profesional (Biometra, Analytik Jena). Profil suhu  untuk  PCR  adalah  95°C  selama  6 menit  (1  siklus),  95°C  selama  30  detik, 52°C selama 30 detik, dan 72°C selama 30 detik  (35  siklus),  diikuti  dengan  72°C selama 10 menit pada akhir siklus terakhir. Produk  PCR  dielektroforesis  pada  gel agarosa  1%  kemudian  divisualisasikan dengan pewarnaan bromida etidium  untuk memeriksa  keberhasilan  amplifikasi  PCR. Untuk  sekuensing  DNA,  amplikon  dan primer  (forward  dan  reverse)  dilakukan dengan  menggunakan  jasa  sekuensing First-Base  Co.,  Selangor,  Malaysia.  Kit sekuensing  BigDye®  Terminator  v.3.1 (Applied  Biosystems,  USA)  digunakan untuk  sekuensing  DNA  secara  dua  arah, dan dibaca menggunakan sekuenser DNA otomatis  ABI  PRISM®  377.  Kualitas sekuens yang diperoleh dianalisis menggunakan  Sequence  Scanner  version 2.0  Software  yang  dikembangkan  oleh Applied  Biosystem.  Setelah  dianalisis, sekuens  tersebut  dipotong,  dirangkai,  dan diedit secara manual menggunakan Geneious  Prime  version  2020  (Kearse  et al.,
2012), tersedia di http://www.geneious.com.  Sekuens  yang sudah diedit, selanjutnya dianalisis menggunakan Basic Local Alignment Tools (BLAST)  di  The  National  Center  for Biotechnology  Information  (NCBI),  yang dapat diakses di https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Analisis filogenetik dilakukan menggunakan MEGA
X (Kumar et al., 2018), dimana pensejajaran nukleotida dilakukan menggunakan
Clustal W dengan pengeditan  manual  jika  diperlukan.  Posisi filogeni dikonstruksi menggunakan metode Maximum  Likelihood  (ML).  Pohon  filogeni dievaluasi menggunakan metode bootstrap.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Rotifer  dilaporkan  memanfaatkan mikroorganisme  termasuk  bakteri  sebagai salah satu sumber nutrisi untuk menunjang pertumbuhan, perkembangan dan reproduksinya (Loo et al. 2016; Nevejan et al. 2018; Wullur et al. 2019, 2020). Dalam penelitian  ini,  kepadatan  populasi  rotifer
yang dikultur menggunakan pakan berbasis  limbah  perikanan  adalah  sekitar 100 ind./mL. Laporan sebelumnya menggunakan  prosedur  pemberian  pakan yang sama, menunjukan kepadatan populasi rotifer yang lebih tinggi lagi, yaitu sekitar  3000-5000  ind/mL  (Ogello  et  al. 2018; Ogello et al. 2019; Wullur et al. 2019; Ogello et al. 2020).
Hasil  sampling  bakteri  dari  medium kultur  rotifer  didapat  sebanyak  2  isolat bakteri  yang  teridentifikasi  sebagai  bakteri dari genus Bacillus (F0031) dan Mesobacillus (F0033).  Kedua isolat bakteri tersebut menampakkan karakter  morfologi yang  berbeda,  dimana  isolat  F0031 memiliki ukuran koloni yang besar dengan margin erosi, sedangkan F0031 berukuran lebih  kecil  dengan  margin  halus.  Warna koloni  kedua  isolat  adalah  putih  susu dengan  elevasi  umbonat    Hasil  BLAST sekuens nukleotida gen 16S rRNA dari ke 2  isolat  bakteri  (F0031  dan  F0033)  pada situs GenBank (NCBI), menunjukan kesamaan  tertinggi  pada  species Bacillus cereus (F0031)  dan Mesobacilus  jeotgali (F0033). B.  cereus dilaporkan memiliki pengaruh  positif  dimana  keberadaan B. cereus dalam  media  kultur  dilaporkan dapat meningkatkan produksi enzim pencernaan pada ikan kerapu ( Epinephelus lanceolatus dan E. fuscoguttatus ), menghambat pertumbuhan bakteri  patogen (Divya  et  al.  2015;  Murillo dan Villamil 2011). Dipihak yang sama, M. jeotgali yang adalah basonym dari Bacillus jeotgali (Patel and Gupta, 2020) merupakan bakteri  probiotik  yang  diisolasi dari  makanan  laut  fermentasi  tradisional Korea  (Jeotgal)  dari  organisme  laut  yang diasinkan,  seperti:  ikan,  moluska,  dan crustacean  (Yao  et  al.  2019).  Sejauh  ini, belum  ada  laporan  sebelumnya  tentang keberadaan  bakteri  probiotik  ini  dalam budidaya  rotifer,  tetapi  bakteri  tersebut dilaporkan  memiliki  efek  menguntungkan pada kelangsungan hidup dan
perkembangan larva Litopenaeus
vannamei (Xue et al. 2016).
Hasil konstruksi posisi filogeni molekuler kedua isolat (F0031 dan F0033) dalam  penelitian  ini  ditampilkan  pada gambar 1.   Posisi isolat F0031 dan F0033
berada  pada  kelompok  percabangan berbeda dimana Isolat F0031 berada pada kelompok  genus Bacilus sedangkan  isolat F0033  berada  pada  kelompok  genus Mesobacillus .    Spesies  bakteri  yang tergabung dalam genus Mesobacillus pada awalnya  merupakan  kelompok  species pada genus Bacillus namun setelah melalui analisis filogenetik dan kajian lanjut lainnya yang  didasari  pada  perbedaan  sifat-sifat fenotipik  dan  genotipik,  seperti  morfologi sel,  suhu  optimal  pertumbuhan,  dan analisis filogenetik berdasarkan 16S rRNA, maka kelompok spesies tersebut kemudian dikelompokan kedalam
genus Mesobacillus .
Spesies bakteri yang termasuk dalam kelompok  genus Bacillus sebagaimana ditampilkan  pada  Gambar  1,  diantaranya adalah; B.  clarus,  B.  proteolitycus,  B. manliponensis, B. gaemokensis, B.cytotoxicus, B. mobilis, B. myocoides, B. cereus,  B.  paranthracis,  B.  luti,  B. alkalicellulosilyticus, B. alkalisoli, B. australimalis,  B.  aerius,  B.  altitudinis,  B. badius,  B.  acidicola,  B.  alveayuensis,  B. foraminis dan B. canaveralius .  Sedangkan, spesies  bakteri  yang  termasuk  dalam kelompok  genus Mesobacillus diantarnya adalah; M.  maritimus,  M.  rigliprofundi,  M. persicus,  M.  harenae,  M.  zeae,  M. foraminis, M. jeotgali, M. selenatarsenatis, M. thioparans dan M. stansii. Isolat F0031 berada pada kelompok percabangan yang sama  dengan B.  cereus, namun  juga dengan B. myiocoides. Secara  filogenetik,
B.  cereus termasuk  dalam  kelompok B. cereus sensu  lato,  yang  mencakup sejumlah  spesies  dan  subspesies  yang serupa  secara  morfologi  dan  fisiologis. Beberapa subspesies dari B. cereus sensu lato,  seperti B.  anthracis , B.  thuringiensis , dan B.  mycoides ,  memiliki  sifat  yang berbeda  dan  seringkali  dikelompokkan sebagai  spesies  yang  sama.  Isolat  F0032 berada pada kelompok percabangan yang sama  dengan Mesobacillus  jeotgali ,  yang mana berada pula pada percabangan yang sama  dengan M.  selenatarsenatis,  M. thioparans dan M.  stansii .    Meskipun spesies-spesies  bakteri  ini  menunjukan kesamaan  dalam  hal  fisiologi  dan  genetik
namun spesies-spesies ini memilik keunikan taksonomi yang berbeda.
Gambar 1. Posisi filogenetik isolat bakteri (F0031 dan F0032) yang diisolasi dari kultur medium Rotifer yang diberi pakan berbasis penguraian limbah perikanan.  Konstruksi filogeni menggunakan metode Maximum Likelihood yang diuji menggunakan metode Bootstrap dan substitusi nukleotida
menggunakan model Tamura Nei.
B.  cereus dan M.  jeotgali adalah bakteri  yang  memiliki  potensi  sebagai probiotik, yang perlu penelitian lebih lanjut untuk memastikan efektivitas dan keamanan penggunaannya sebagai bakteri probiotik. Beberapa penelitian telah menunjukkan  bahwa B  cereus dapat meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan  hidup  ikan  dalam  budidaya perikanan, serta memiliki aktivitas antimikroba  terhadap  beberapa  patogen ikan  (Khansari  and  Karimzadeh,  2012; Abedi  and  Feizi,  2014;  Ouwehand  et  al., 2016).  Sementara  itu, M  jeotgali memiliki potensi sebagai probiotik dalam meningkatkan
pertumbuhan
dan kelangsungan hidup udang dalam budidaya  perikanan  (Ma  et  al.,  2019). Seperti  halnya  dengan  semua  bakteri probiotik, penting untuk memastikan bahwa
penggunaan  kedua  isolat  ini  aman  dan tidak  menimbulkan  risiko  kesehatan  atau lingkungan yang tidak diinginkan khususnya dalam pemanfaatannya sebagai  inokulan  bakteri  pengurai  pakan rotifer berbasis limbah perikanan.

## KESIMPULAN
Hasil penentuan posisi filogeni molekuler  dua  isolat  bakteri  yang  diisolasi dari  media  kultur  rotifer B.  plicatilis sp. complex,  yang  dipelihara  menggunakan pakan berbasis limbah perikanan,
menunjukan bahwa;
Isolat bakteri F0031 dan F0033 merupakan isolat  bakteri  yang  berasal  dari  genus berbeda, yaitu genus Bacillus (F0031) dan genus Mesobacillus (F0033).
Isolat  bakteri  F0031  memiliki  kesamaan terdekat dan berada pada posisi

## percabagan filogenetik yang sama dengan

## B. cereus.
Isolat  F0033  memiliki  kesamaan  terdekat dan  berada  pada  posisi  percabagan filogenetik yang sama dengan M. jeotgali.

## SARAN
Isolat bakteri B. cereus dan M. jeotgali dalam  penelitian  ini  perlu  melalui  tahapan uji  selanjutnya,  diataranya;  uji  toksisitas dan  uji  patogenitas  untuk  menjamin penggunaannya  sebagai  inokulan  bakteri probiotik  pengurai  pakan  rotifer  berbasis penguraian limbah perikanan.

## DAFTAR PUSTAKA
Abedi, D., & Feizi, H. (2014). Antibacterial activity  of  Bacillus  cereus  isolated from  rainbow  trout  (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) hatcheries against some fish pathogenic bacteria. Journal  of  aquatic  animal  health, 26(3), 175-181.
Acién FG, Molina E, Fernández-Sevilla JM, Barbosa M, Gouveia L, Sepulveda C, Bazaes J, Arbib Z. 2017. Economics of microalgae production. In Microalgae-based biofuels and bioproducts.  Woodhead  Publishing, United Kingdom. Akihary CV, Kolondam BJ. 2020.
Pemanfaatan  gen  16s  rrna  sebagai perangkat  identifikasi  bakteri  untuk penelitian-penelitian  di  Indonesia. Pharmacon 9 (1): 16-22.
Fuks  G,  Elgart  M,  Amir  A,  Zeisel  A, Turnbaugh  PJ,  Soen  Y,  Shental  N. 2018.  Combining  16S  rRNA  gene variable regions
enables highresolution  microbial  community profiling. Microbiome 6 (1): 1-13.
Hagiwara A, Kim HJ, Marcial H. 2017. Mass culture and preservation of
Brachionus  plicatilis  sp.  complex.  In: Hagiwara  A,  Yoshonaga  T  (eds). Rotifers Aquaculture, Ecology,
Gerontology, and Ecotoxicology. Springer, Singapore.
Hagiwara A, Wullur S, Marcial HS, Hirai N, Sakakura  Y.  2014.  Euryhaline  rotifer Proales  similis  as  initial  live  food  for rearing  fish  with  small  mouth.
Aquaculture 432: 470-474.
Kearse M, Moir R, Wilson A, Stones-Havas S,  Cheung  M,  Sturrock S,  Buxton  S, Cooper  A,  Markowitz  S,  Duran  C,  et al.  (2012).  Geneious  basic:  an integrated  and  extendable  desktop software platform for the organization and  analysis  of  sequence  data. Bioinformatics. 28(12):1647 –1649 Khansari, A. R., & Karimzadeh, S. (2012).
Study  of  Bacillus  cereus  as  probiotic bacteria in the culture of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fry.
Aquaculture, Aquarium, Conservation & Legislation, 5(2), 89-95.
Kotani  T.  2017.  The  current  status  of  the morphological  classification  of  rotifer strain  used  in  aquaculture.  In: Hagiwara  A,  Yoshonaga  T  (eds).
Rotifers Aquaculture,
Ecology,
Gerontology, and Ecotoxicology. Springer, Singapore.
Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., &
Tamura, K. (2018). MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Molecular  biology  and  evolution, 35(6): 1547.
Lee MC, Park JC, Yoon DS, Choi H, Shin KH,  Kim  HJ,  Hagiwara  A,  Lee  JS. 2019. Lipid metabolism modulation by five  different  food  types  in  the monogonont marine rotifer
Brachionus  koreanus.  Aquaculture 503: 596-601.
Ma,  Y.,  Li,  X.,  Zhu,  Y.,  &  Li,  J.  (2019). Evaluation of the probiotic potential of Mesobacillus  jeotgali  P3B3  against pathogenic  Vibrio  alginolyticus  in Pacific  white  shrimp  (Litopenaeus vannamei) and its effects on immune- related  genes  expression.  Fish  & Shellfish Immunology, 89, 411-417.
Napitupulu,  H.  G.,  Rumengan,  I.  F.  M.,
Wullur,  S.,  Ginting,  E.  L.,  Rimper,  J. R.  T.  S.  L.,  &  Toloh,  B.  H.  (2019). Bacillus  sp.  As  a  Decomposition Agent in The Maintenance of Brachionus rotundiformis Which Uses Raw Fish As a Source of Nutrition. Jurnal Ilmiah PLATAX , 7 (1),
158 –169.
https://doi.org/10.35800/jip.7.1.2019. 22627 [Indonesian].
Ogello  EO,  Wullur  S,  Hagiwara  A.  2019. Blending  fishwastes  and  chicken manure extract as low-cost and stable diet  for  mass  culture  of  freshwater zooplankton, optimized for aquaculture. IOP Conf Ser Mater Sci Eng 567: 012022. DOI: 10.1088/1757-899X/567/1/012022
Ogello  EO,  Wullur  S,  Sakakura  Y, Hagiwara  A.  2018.  Composting fishwastes as low-cost and stable diet for culturing Brachionus rotundiformis Tschugunoff  (Rotifera):  Influence  on water quality and microbiota.
Aquaculture 486: 232-239.
Ogello  EO,  Wullur  S,  Yoshitaka  S, Hagiwara  A.  2020.  Dietary  value  of waste-fed rotifer Brachionus rotundiformis  on  the  larval  rearing  of japanese  whiting  Sillago  japonica. E3S  Web  of  Conferences.  DOI: 10.1051/e3sconf/202014701005.
Ouwehand,  A.  C.,  Ten  Bruggencate,  S.  J. M., Schonewille, A. J., Alhoniemi, E., Forssten,  S.,  &  Salminen,  S.  (2016). Lactic  acid  bacteria  supplements modified the intestinal microbiota and alleviated  inflammation  in  a  fish  oil supplemented diet in mice. Beneficial microbes, 7(6), 853-863.
Patel,  S.,  &  Gupta,  R.  S.  (2020).  A phylogenomic and comparative genomic  framework  for  resolving  the polyphyly  of  the  genus  Bacillus:
Proposal  for  six  new  genera  of Bacillus  species,  Peribacillus  gen. nov., Cytobacillus gen. nov., Mesobacillus  gen.  nov.,  Neobacillus gen. nov., Metabacillus gen. nov. and Alkalihalobacillus gen. nov.
International journal of systematic and evolutionary microbiology, 70(1), 406-
438.
Rumengan  IFM,  Sulung  M,  Lantiunga  Z,
Kekenusa J. 2016. Morfometri Rotifer Brachionus  rotundiformis  strain  SS asal  tambak  Minanga  dan  tambak Watuliney  Sulawesi  Utara  yang dikultur pada salinitas yang berbeda.
Jurnal  Riset  Akuakultur  2  (2):  221- 229. [Indonesian]
Wantania LL, Wullur S, Ginting EL, Mantiri DM,  Undap  SL,  Sumilat  DA,  Gerung GS. 2019. Isolation and amplification of  16S  rRNA  gen  of  associated microbial  isolates  in  red  algae Kappaphycus  alvarezii  from  Belang, Southeast Minahasa Regency, North Sulawesi.  Jurnal  Ilmiah  Platax  7  (1): 220-226. [Indonesian]
Wondal B, Ginting EL, Warouw V, Wullur S, Tilaar  SO,  Tilaar  FF.  2019.  Isolasi bakteri laut dari perairan Malalayang, Sulawesi  Utara.  Jurnal  Pesisir  dan Laut Tropis 7 (3): 183-189. [Indonesian] Wati  M,  Imanto  PT.  2016.  Kultur  rotifer dengan  beberapa  jenis  pakan  dan kombinasinya. Jurnal Riset Akuakultur 4 (3): 349-356.
[Indonesian]
Wullur  S,  Ginting  EL,  Waraow  V, Rumengan IFM, Ogello EO, Hagiwara A.  2019.  Growth response  of  rotifers on  a  bacterial-based  diet  made  from fishwastes.  IOP  Conf  Ser  Mater  Sci
Eng 567: 012030. DOI:
10.1088/1757-899X/567/1/012030. Wullur  S,  Kumagai  S,  Sakakura  Y, Hagiwara  A.  2018.  Assessment  of different  minute  zooplankton  in  the larval  rearing  of  rusty  angelfish Centropyge  ferrugata.  AACL  Bioflux 11 (5): 1495-1501.
Wullur  S,  Sakakura  Y,  Hagiwara  A.  2011. Application of the minute monogonont rotifer Proales similis de Beauchamp in  larval  rearing  of  seven-band grouper Epinephelus
septemfasciatus. Aquaculture 315 (3- 4): 355-360.
Wullur S, Yoshimatsu T, Tanaka H, Ohtani M, Sakakura Y, Kim HJ, Hagiwara A. 2013.  Ingestion  by  Japanese  eel Anguilla  japonica  larvae  on  various minute  zooplanktons.  Aquac  Sci  61 (4): 341-347.
Wullur  S.  2017.  Rotifer  dalam  Perspektif Marikultur.  LPPM  Press,  Manado. [Indonesian]