## Aktivitas Antioksidan Kedelai Edamame Hasil Fermentasi Kultur Campuran oleh Rhizopus oligosporus dan Bacillus subtilis
(Activity of Antoxidants Edamame Soybeans Fermented Result of Mixed Culture by Rhizopus oligosporus and Bacillus subtilis)
Tutus Ervian Ningsih,  Siswanto, Rudju Winarsa Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember (UNEJ) Jln. Kalimantan 37, Jember 68121
E-mail : siswanto.fmipa@unej.ac.id

## Abstrak
Kedelai edamame mengandung senyawa isoflavon yang berfungsi sebagai antioksidan. Senyawa tersebut berupa senyawa yang berikatan dengan gula melalui ikatan glikosida. Biokonversi senyawa isoflavon glikosida menjadi isoflavon aglikon yang sangat  berpotensi  tinggi  sebagai  antioksidan terjadi  selama  proses fermentasi  oleh aktivitas enzim  β-glukosidase. Dilaporkan   enzim   β-glukosidase     dihasilkan   oleh   Rhizopus   spp.   Selain   itu,   selama   proses   fermentasi   Bacillus   subtilis menghasilkan enzim nattokinase yang juga dapat meningkatkan aktivitas antioksidan. Pada penelitian ini proses fermentasi dilakukan menggunakan inokulum Rhizopus oligosporus, B. subtilis serta campuran keduanya dengan lama fermentasi 24 jam, 48 jam dan 72 jam. Kemudian aktivitas antioksidan diuji menggunakan larutan DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Proses fermentasi pada pembuatan tempe edamame dengan inokulum R. oliosporus dan B. subtilis dapat meningkatkan aktivitas   antioksidan   eksogenous.   Aktivitas   antioksidan   eksogenous   tertinggi   oleh   R.   oligosporus   sebesar   97%   pada fermentasi 72 jam.
Kata Kunci: Kedelai edamame, Isoflavon aglikon, DPPH

## Abstract
Edamame soybeans contains isoflavone compounds that act  as antioxidants. Thus compounds are binds to sugars via glycoside   bonds.   Bioconversion   of   compounds   isoflavone   glycosides   into   isoflavone   aglycone   very   high   potential   as antioxidants occur during fermentation by the activity of the enzyme β-glucosidase. It has been reported that β-glucosidase enzyme are produced by Rhizopus spp. In addition, during the fermentation process of Bacillus subtilis produces an enzyme nattokinase   also   can   increase   antioxidant   activity.   In   this   study   the   fermentation   process   using   inoculum   Rhizopus oligosporus, B. subtilis as well as a mixture of both with a long fermentation 24 hours, 48 hours and 72 hours. Then the antioxidant activity was tested using a solution of DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). The fermentation process in the manufacture of tempeh inoculum edamame with  R. olig osporus and B. subtilis can improve exogenous antioxidant activity. The highest exogenous antioxidant activity by R. oligosporus of 97% in 72 hours fermentation.
Keywords: Edamame soybeans, aglycon isoflavone, DPPH

## PENDAHULUAN
Radikal bebas merupakan molekul atau senyawa yang memiliki   elektron   yang   tidak   berpasangan,   sehingga molekul  tersebut  menjadi  tidak stabil  dan bersifat  sangat reaktif.   Radikal   bebas   dapat   mengakibatkan   terjadinya gangguan  fungsi  sel, kerusakan  struktur sel, serta  mutasi [1,2].   Untuk   mencegah   atau   mengurangi   dampak   akibat serangan   radikal   bebas   diperlukan   antioksidan.   Di   dalam tubuh terdapat antioksidan endogenous namun jika Radikal bebas mengalami overproduksi dan tidak bisa dikendalikan oleh antioksidan endogenous maka diperlukan antioksidan eksogenous   [1,3].   Salah   satunya   adalah   isoflavon   yang terdapat   dalam   kedelai   edamame.   Isoflavon   merupakan senyawa metabolit sekunder yang disintesis oleh tanaman dan senyawa tersebut tidak disintesis oleh mikroorganisme. Dari   beberapa   jenis   tanaman,   kandungan   isoflavon   yang lebih   tinggi   terdapat   pada   tanaman   Leguminosae, khususnya   pada   tanaman   kedelai   [4].   Senyawa   tersebut berupa   senyawa   yang   berikatan   dengan   senyawa   gula
melalui   ikatan   glikosida.   Jenis   isoflavon   yang   terdapat dalam   kedelai   adalah   genistin,   daidzin,   dan   glisitin   [5]. Rerata total isoflavon edamame per 80 gram setelah diolah adalah   49   mg,   sedangkan   kedelai   biasa   adalah   24   mg. Sehingga   kandungan   isoflavon   kedelai   edamame   lebih besar   dibandingkan   kedelai   biasa   [6].   Kedelai   edamame dapat   diolah   dengan   cara   fermentasi   maupun   non- fermentasi.   Selama   proses   fermentasi   senyawa-senyawa isoflavon yang terikat akan terbebas membentuk isoflavon bebas   (aglikon)   yang   sangat   berpotensi   tinggi   sebagai antioksidan   [7].   Biotransformasi   isoflavon   glikosida menjadi   isoflavon   aglikon   merupakan   aktivitas   enzim β- glukosidase .   Dilaporkan   juga,   enzim β-glukosidase dihasilkan   oleh Rhizopus spp.   [5].   Kemudian   isoflavon aglikon akan bertransformasi lebih kanjut menjadi faktor-II [7].   Faktor-II   hanya   terdapat   pada   kedelai   yang terfermentasi dan mempunyai sifat antioksidan paling kuat dibandingkan   dengan   isoflavon   lain   dalam   kedelai   non fermentasi [8]. Selain itu, selama proses fermentasi bakteri
B. subtilis menghasilkan enzim nattokinase yang juga dapat meningkatkan aktivitas antioksidan [9].
Berdasarkan hal tersebut, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui   aktivitas   antioksidan   kedelai   edamame   hasil fermentasi   kultur   campuran   oleh R.   oligosporus dan B. subtilis serta campuran keduanya dengan lama fermentasi 24 jam, 48 jam dan 72 jam.

## METODE PENELITIAN

## Penentuan Kepadatan Spora
Kurva pertumbuhan R. olygosporus dibuat dengan cara mengkulturkan   spora R.   olygosporus pada   media     PDA miring,   kemudian   diinkubasi   pada   inkubator   pada   suhu 30°C.   Setelah   itu   kultur   PDA   miring   diamati   kepadatan sporanya   setiap   hari   berturut-turut   selama   7   hari. Pengamatan dilakukan dengan menambahkan 9 ml akuades steril pada tabung kultur. Spora dikerik menggunakan jarum inokulum   hingga   merata.   Suspensi   spora   yang   didapat dipindahkan   secara   aseptis   pada   tabung   steril   dan dihomogenkan.  Sebanyak   1  ml  suspensi  spora  diteteskan pada bidang hitung haemocytometer dan dihitung dengan menggunakan mikroskop. Spora yang dihitung adalah spora yang ada pada kotak sedang haemocytometer. Penghitungan dilakukan sebanyak lima kali ulangan. Selanjutnya, jumlah spora/ml   sampel   ditentukan   dengan   persamaan   berikut:
S = n L x t x d x 1000
Keterangan:   S=   Jumlah   spora/ml;   n   =    Jumlah   spora pada bidang yang  dihitung; L= Luas bidang; t= kedalaman; d= Faktor pengenceran Pembuatan starter R. oligosporus
Pembuatan   inokulum   diawali   dengan   pengukuran pertumbuhan R. oligosporus pada media edamame padat dan   diinkubasi   pada   suhu   30ºC   sampai   didapatkan kepadatan sel 10 8 sel/ml.
Pembuatan kurva pertumbuhan B. subtilis Pembuatan kurva pertumbuhan B. subtilis dengan cara mengkulturkan biakan B. subtilis pada media NB cair 50 ml di   dalam   erlenmeyer   dan   diinkubasi   shaker   dengan kecepatan   150   rpm   pada   suhu   30 0 C   selama   48   jam. Sebanyak 1 ml diambil dan dimasukkan ke dalam   9 ml garam   fisiologis   sebagai   pengenceran       10 -1 .   Setelah   itu diambil 100 µl  dari pengenceran  10 -1 dan dimasukkan ke dalam microtube yang   berisi   900   µl    garam   fisiologis sebagai   pengenceran   10 -2 .   Hal   tersebut   dilakukan   sampai pengenceran   10 -8 dengan   interval   4   jam.   Kemudian sebanyak   5   µl   diambil   dari   tiap-tiap   pengenceran   lalu ditumbuhkan secara drop plate ke media NA dan diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 24 jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni yang tumbuh menggunakan metode TPC (total plate count) dengan persamaan:
Jumlah sel/ml (CFU/ml) = Jumlah koloni percawan x 1000  µl x 1 5  µl

## faktor pengenceran
Pembuatan starter B. subtilis Pembuatan starter B. subtilis dngan cara mengkulturkan pada 50 ml media edamame cair dan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam.
Fermentasi dengan inokulum R. oligosporus
Edamame   sebanyak   50   g   direndam   dalam   air   dan dibiarkan   selama   9  jam   pada   suhu  45°   C)  [10].   Kedelai dikuliti,   dan   dikukus   selama   1   jam   kemudian   kotiledon kedelai (50 g) diletakkan dalam cawan petri dan disterilisasi dalam autoklaf (121° C, 2 atm, 30 menit). Setelah dingin, kotiledon tersebut  diinokulasi  dengan R. oligosporus dan diinkubasikan   pada   suhu   30°   C   selama   72   jam   sampai menjadi tempe. Pengamatan aktivitas antioksidan dilakuan setiap hari selama 3 hari.
Fermentasi dengan inokulum B. subtilis
Edamame   sebanyak   50   g   direndam   dalam   air   dan dibiarkan   selama   9  jam   pada   suhu  45°   C)  [10].   Kedelai dikuliti,   dan   dikukus   selama   1   jam   kemudian   kotiledon kedelai (50 g) diletakkan dalam cawan petri dan disterilisasi dalam autoklaf (121° C, 2 atm, 30 menit). Setelah dingin, kotiledon   tersebut   diinokulasi   dengan B.   subtilis dan diinkubasikan pada suhu 37° C selama 72 jam. Pengamatan aktivitas antioksidan dilakuan setiap hari selama 3 hari [11]. Pembuatan Tempe dengan inokulum R. oligosporus dan

## B. subtilis
Edamame   sebanyak   50   g   direndam   dalam   air   dan dibiarkan   selama   9  jam   pada   suhu  45°   C)  [10].   Kedelai dikuliti,   dan   dikukus   selama   1   jam   kemudian   kotiledon kedelai (50 g) diletakkan dalam cawan petri dan disterilisasi dalam autoklaf (121° C, 2 atm, 30 menit). Setelah dingin, kotiledon   tersebut   diinokulasi   dengan R.   oligosporus kemudian   diinokulasi   dengan   B.   subtilis   [12].   Fementasi dilakukan pada suhu 37 0 C selama 3 hari [11]. Pengamatan aktivitas antioksidan diakukan setiap hari selama 3 hari.

## Ekstraksi sampel
Ekstraksi   dilakukan   menurut   metode   Siregar   & Pawiroharsono yang dimodifikasi. Tempe 50 gr dipotong dengan ukuran 1x1 cm dan dikeringkan dalam oven [13]. Sampel   tersebut   diblender,   kemudian   disaring.   Menurut metode Weng and Chen yang telah dimodifikasi sebanyak 2 gram sampel direndam dalam 20 ml ethanol 80 % kemudian di waterbath pada suhu 60° C selama 1 jam [11]. Ekstrak kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 5000   rpm   sehingga   akan   terpisah   antara   endapan   dan supernatan.   Supernatan   yang   didapat   kemudian dikumpulkan dan disimpan untuk uji selanjutnya.
Pembuatan larutan DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) Pembuatan larutan DPPH 0,06 mM dengan menimbang Kristal DPPH sebanyak 2,4 mg dan dilarutkan dalam etanol 100 ml [4].

## Uji Penangkapan Radikal Bebas dengan Metode DPPH
DPPH   merupakan   salah   satu   metode   yang   digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan dalam makanan atau bahan   makanan.   Metode   DPPH   dapat   digunakan   untuk sampel cair ataupun padat dan tidak spesifik untuk senyawa antioksidan   tertentu   tetapi   untuk   keseluruhan   senyawa antioksidan yang ada di dalam sampel. DPPH menghasilkan radikal bebas aktif bila dilarutkan dalam alkohol. Radikal bebas   tersebut   stabil   dengan   absorpsi   maksimum   pada panjang   gelombang   517   nm   dan   dapat   direduksi   oleh senyawa   antioksidan.   Dalam   metode   tersebut   ekstraksi sampel hasil fermentasi sebanyak 1 ml ditambahkan 2 ml larutan DPPH 0,06 mM kemudian diinkubasi dalam gelap selama 30 menit dan diukur absorbansinya pada  panjang
gelombang 517 nm [14]. Larutan DPPH digunakan sebagai kontrol. Analisis dilakukan sebanyak 3 kali pada masing- masing   sampel.   Persentase   aktivitas scavenging DPPH dapat dihitung dengan rumus;
A A = ( 1 − Ab s s a m p e l Ab s k o n t r o l ) x 100 %

## Analisis Data
Data   yang   diperoleh   dianalisis   secara   deskriptif   dan disajikan dalam bentuk tabel, grafik dan foto. Analisis data pada   aktivitas   antioksidan   dari   masing-masing   sampel dilakukan   melalui   uji   penangkapan   radikal   secara semikuantitatif dengan metode DPPH.

## HASIL PENELITIAN
Pola Pertumbuhan B. subtilis
Gambar 1. Kurva pertumbuhan B. subtilis dalam media edamame
Berdasarkan   Gambar   1.   diketahui   bahwa B.   subtilis mencapai fase eksponensial atau fase logaritmik pada jam ke-24.   Fase   tersebut   digunakan   sebagai   starter   untuk inokulum.   Pada   periode   tersebut   sel   akan   mampu beradaptasi dengan cepat terhadap media edamame.
Kepadatan spora R. oligosporus
Gambar 2. Kurva kepadatan spora R. oligosporus dalam media edamame
Berdasarkan   Gambar   2.   dapat   diketahui   bahwa kepadatan spora mencapai puncak pada waktu inkubasi hari ke 4 dengan jumlah spora sebesar 5,9x 10 8 (sel/ml). Jumlah akhir spora/gram  substrat tersebut telah memenuhi syarat yang ideal  sebagai  sumber  inolukum  yaitu sebesar  10 6 – 10 8 . . Berdasarkan   hasil   penelitian   dari   Mojsov   dikatakan bahwa   jumlah   kepadatan   spora   yang   kurang   dari   10 6
spora/gram substrat atau lebih dari 10 8 spora/gram substrat dapat   mempengaruhi   aktivitas   enzim   yang   relatif   tinggi [15].
Aktivitas   antioksidan  tempe   edamame   dengan R. oligosporus
Berdasarkan Gambar 3. hasil uji penangkapan radikal bebas   dengan   metode   DPPH   menunjukkan   aktivitas penangkapan   radikal   bebas   oleh   kontrol   yang   berupa kedelai edamame tanpa isolat yaitu nilai relatifnya sebesar 23%. Aktivitas penangkapan radikal pada sampel edamame hasil   fermentasi   oleh R.   oligosporus menunjukkan   hasil sebesar   95%   pada   fermentasi   24   jam,   hasil   tersebut mengalami peningkatan menjadi 97% pada fermentasi 48 jam   dan   pada   fermentasi   72   jam   aktivitas   penangkapan radikal DPPH semakin meningkat menjadi 100%.
Aktivitas   antioksidan   menunjukkan   peningkatan   yang berbanding   lurus   dengan   lama   waktu   fermentasi   ketika difermentasikan   menggunakan   kultur R.   oligosporus. Haltersebut   berkaitan   dengan   kepadatan   spora   dari R. oligosporus (Gambar   2.) , menunjukkan   jumlah   spora R. oligosporus mengalami peningkatan hingga waktu inkubasi hari   ke   4.   Peningkatan   jumlah   spora   memiliki   pengaruh terhadap peningkatan biomassa selnya sehingga hal tersebut berpengaruh pada aktivitas enzim yang diproduksinya [15]. Oleh   karena   itu   semakin   meningkat   jumlah   sel   pada R. oligosporus maka   aktivitas   enzim β-glukosidase yang diproduksi   akan   meningkat   pula.   Enzim β-glukosidase tersebut   yang   mengkatalis   reaksi   hidrolisis   isoflavon glikosida   menjadi   aglikon   [5].   Fermentasi   kapang membutuhkan   waktu   dua   sampai   lima   hari.   Fermentasi kapang   selama   tiga   hari   akan   menghasilkan   enzim   yang paling optimum [16]. Sehingga wajar ada kenaikan aktivitas antioksidan sejalan dengan lama fermentasi.
Kenaikan aktivitas antioksidan dapat dilihat berdasarkan perubahan warna pada uji DPPH dari warna ungu menjadi kekuningan.   Perubahan   warna   ungu   menjadi   kekuningan terjadi   karena   elektron   bebas   dari   radikal   bebas   DPPH menjadi   berpasangan   dengan   atom   hidrogen   yang dilepaskan  oleh antioksidan sampel  membentuk DPPH-H berwarna kuning dan bersifat stabil [17]. Perubahan warna ini sebanding dengan jumlah elektron zat antioksidan yang diambil   oleh   radikal   DPPH.   Semakin   tinggi   aktivitas antioksidan maka warnanya semakin pudar [18].
Aktivitas   antioksidan   tempe   edamame  dengan  B. subtilis
BERKALA SAINSTEK 2018, VI (1): 17-21 ISSN : 2339-0069
Berdasarkan  Gambar 3. aktivitas penangkapan radikal DPPH   pada   sampel   edamame   yang   difermentasi   oleh B . subtilis selama   24   jam   menunjukkan   hasil   nilai   relatif sebesar 84% dan mengalami penurunan menjadi 46% untuk fermentasi selama 48 jam serta pada fermentasi selama 72 jam menunjukkan penurunan aktivitas antioksidan menjadi 42%.
Peningkatan aktivitas antioksidan  pada  produk olahan kedelai fermentasi disebabkan oleh enzim nattokinase yang diproduksi oleh B. subtilis selama fermentasi. Mekanisme dari   senyawa   isoflavon   pada natto dalam   mengurangi pembentukan senyawa radikal bebas DPPH dapat melalui dua   cara   yaitu   dengan   mendonorkan   ion   hidrogen   dari ikatannya   dan   berperan   sebagai   penangkap   radikal   bebas secara langsung [19].
Aktivitas antioksidan kedelai edamame hasil fermentasi oleh B. subtilis mengalami peningkatan dan penurunan, hal tersebut   dikorelasikan   dengan   pertumbuhan B.   subtilis dalam   media   kedelai   edamame.   Pertumbuhan B.   subtilis dalam media kedelai edamame (Gambar 1.) menunjukkan bahwa   aktivitas   antioksidan   berbanding   lurus   dengan jumlah B.   subtilis dalam   kedelai   edamame.   Aktivitas tersebut meningkat pada fermentasi ke 24 jam yaitu sebesar 84%,   kemudian   pada   fermentasi   ke   48   jam   mengalami penurunan   hingga   fermentasi   ke   72   jam.   Hal   tersebut berkaitan   dengan   pertumbuhan B.   subtilis dalam   media kedelai   edamame.   Penurunan   persentase   penangkapan radikal oleh sampel kedelai hasil fermentasi oleh B. subtilis dapat   dipengaruhi   oleh   radikal   yang   dihasilkan   selama proses fermentasi. B. subtilis memiliki sistem pertahanan terhadap   ROS   yang   dihasilkan   selama   proses   fermentasi untuk menghindari kondisi tekanan oksidatif [20]. Aktivitas   antioksidan   tempe   edamame   dengan R. oligosporus dan B. subtilis Pada fermentasi dengan kultur campuran R. oligosporus dan B. subtilis berdasarkan Gambar 3 . menunjukkan nilai relatif penangkapan radikal DPPH sebesar 89% pada lama waktu   fermentasi   24   jam,   aktivitas   penangkapan   radikal tesebut   mengalami   peningkatan   menjadi   99%   pada fermentasi   ke   48   jam   dan   mengalami   penurunan   pada fermentasi ke 72 jam sebesar 94%.
Terjadinya   peningkatan   aktivitas   antioksidan   pada fermentasi ke 48 jam diduga karena peningkatan aktivitas enzim   yang   dihasilkan   dari R . oligosporus sehinga menyebabkan senyawa radikal DPPH yang tertangkap oleh antioksidan lebih besar dari fermentasi ke 24 jam. Selama proses fermentasi kemungkinan besar aktivitas antioksidan berasal   dari R . oligosporus karena B.   subtilis kemampuannya   semakin   menurun   dan   membebani R . oligosporus .   Pada   fermentasi   ke   72   jam   mengalami penurunan   hal   ini   diduga   karena B.   subtilis selain menangkap radikal DPPH juga menangkap senyawa radikal lain yaitu hidrogen peroksida yang dihasilkan dari proses metabolisme   dalam   selnya   [21,22].   Hidrogen   peroksida (H 2 O 2 ) merupakan radikal yang kurang reaktif akan tetapi pada   kondisi   tertentu   dapat   meracuni   sel   karena meningkatkan kandungan radikal hidroksil [23]. Selain itu selama proses fermentasi B. subtilis diduga menghasilkan asam   organik   seperti   asam   laktat   sehingga   menyebabkan pertumbuhan B. subtilis pada fermentasi ke 72 jam menjadi
semakin   tertekan   sehingga   jumlah   sel   yang   hidup   lebih sedikit dibandingkan sel yang mati akibatnya enzim yang dihasilkan menjadi berkurang.
Persentase peningkatan aktivitas antioksidan total pada kedelai edamame hasil fermentasi campuran R . oligosporus dan B.   subtilis menunjukkan   nilai   relatif   tidak   terlalu berbeda jauh. Sehingga dengan adanya pencampuran kultur malah   menurunkan   optimasi   dari R . oligosporus dalam meningkatkan aktivitas antioksidan. Dengan kata lain tidak ada pengaruh apabila kultur R . oligosporus dan B. subtilis digabung dalam froses fermentasi.

## KESIMPULAN
Proses   fermentasi   pada   pembuatan   tempe   edamame dengan   inokulum R.   oliosporus dan B.   subtilis dapat meningkatkan  aktivitas  antioksidan  eksogenous. Aktivitas antioksidan   eksogenous   tertinggi   oleh R.   oligosporus sebesar   97%   pada   inkubasi   3   hari.   Aktivitas   antioksidan eksogenous oleh B. subtilis sebesar 81% pada inkubasi 24 jam.   Dalam   inokulum   campuran   tidak   memberikan pengaruh   terhadap   peningkatan   aktivitas   antioksidan   jika dibandingkan dengan kultur tunggal R. oligosporus .
Proses   fermentasi   dengan   menggunakan   kultur campuran   antara R.   oliosporus dan B.   subtilis perlu dilakukan   penelitian   yang   lebih   lanjut   dengan   metode pencampuran   yang   divariasi   dan   juga   perlu   dilakukan penghitungan populasi setelah pencampuran.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Winarsi,   H.   2007. Antioksidan   Alami   Dan   Radikal Bebas . Yogyakarta: Kanisius.
[2] Ramasarma, T. 2012. Emergencce of Oxyl Radicals as Selective   Oxidants. Indian   Journal   of   Biochemistry and Biophysics , 49: 295-305.
[3] Youngson, R. 2005. Antioksidan: Manfaat Vitamin C Dan E Bagi Kesehatan . Jakarta: Arcan.
[4] Istiani,   Y.   2010. Karakterisasi   Senyawa   Bioaktif Isoflavondan Uji Aktivitas Antioksidan Dari  Ekstrak Etanol   Tempe   Berbahan   Baku   Koro   Pedang (Canavalia   Ensiformis). [Tesis].   Surakarta:   Program Studi Biosains, Universitas Sebelas Maret.
[5] Purwoko, T., Pawiroharsono, S., dan Gandjar, I. 2001. Biotransformasi Isoflavon oleh Rhizopus oryzae UICC 524. Biosmart , 3(2), 7-12.
[6] Riyanto,   C.   2014. Kualitas   Mi   Basah   Dengan Kombinasi Edamame (Glycine Max (L.) Merrill) Dan Bekatul Beras Merah . [Skripsi]. Yogyakarta: Program Studi Biologi, Universitas Atma Jaya Yogyakarta.
[7] Gyorgy,   P.,   Murata,   K.,     and   Ikehata,   H.   1964. Antioxidants   Isolated   from   Fermented   Soybeans (Tempeh). Nature . 203: 870-872.
[8] Afiyata,   N.,   Sarosa,   H.,   dan   Sumarawati,   T.   2011. Pengaruh   Tempe   terhadap   Kemampuan   Fagositosis Makrofag   Studi   Eksperimental   pada   Mencit   Jantan Strain Balb/c. Sains Medika , 3(1): 54-62.
[9] Putri,   Y.E.K.,   Susilowati   dan   Lestari,   S.R.   2013. Pengaruh   Natto   Kedelai   Hitam   ( Glycine   soja L.)
Terhadap Kadar Malondialdehid (Mda) Hepar Mencit yang   Diinduksi   Diet   Tinggi   Lemak.   [Artikel Penelitian].   Malang:   Jurusan   Biologi,   FMIPA,
Universitas Negeri Malang.
[10] Purwoko,   T.   2004.   Kandungan   Isoflavon   Aglikon pada Tempe Hasil Fermentasi Rhizopus microsporus var. oligosporus : Pengaruh Perendaman. BioSMART , 6(2): 85-87.
[11] Weng, T.M., and Chen, M.T. 2011. Effect  of Two- Step   Fermentation   by Rhizopus   oligosporus and Bacillus   subtilis on   Protein   of   Fermented   Soybean.
Food Sci. Technol . Res., 17 (5), 393 – 400.
[12] Chen, L., Madl, R.L., Vadlani, P.V., Wang, L., dan Wang,   W.   2013. Value   –   Added   Products   from Soybean:   Removal   of   Anti-Nutritional   Factors   via
Bioprocessing . licensee InTech.
[13] Siregar,   E.   and   S.   Pawiroharsono.   1997.   Inocula formulation   and   its   role   for   biotransformation   of isoflavonoid compounds. Proceeding of International Tempe Symposium.
[14] Garcia, E.J., Oldoni, T.L.C., De Alencar, S.M., Reis, A.,   Loguercio,   A.L.,   dan   Grande,   R.H.M.   2012. Antioxidant   Activity   by   DPPH   Assay   Of   Potential Solutions   To   Be   Applied   on   Bleached   Teeth. Braz
Dent. J , 23(1): 22-27.
[15] Mojsov,   K.   2010.   Experimental   Investigations   of Submerged   Fermentation   and   Synthesis   of Pectinolytic Enzymes by Aspergillus niger : Effect of Inoculum   Size   and   Age   of   Spores. Journal   of Technologies and Innovations , 2 (2): 40–45.
[16] Frazier,   W.C.   and   Westhoff,   D.C.   1978. Food Microbiology .   New   York:   McGraw   Hill     Book Company.
[17] Prakash,   A.,   Rigelhof,   F.,   &   Miller,   E.   2001. Antioxidant   Activity. Medallion   Laboratories Analitical Progress , 19 (2): 1-4.
[18] Sabuluntika, N. 2013. Kadar   β -Karoten, Antosianin, Isoflavon, Dan Aktivitas Antioksidanpada Snack Bar Ubi Jalar Kedelai Hitam Sebagai Alternatif Makanan Selingan Penderita Diabetes Melitus Tipe 2 . [Artikel Penelitian].   Semarang:   Program   Ilmu   Gizi,   Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro.
[19] Pokorny,   J.,   Yanishlieva,   N.,   &   Gordon,   M.   2001. Antioxidant   In   Food:   Practical   Application .   New York: Press Cambridge.
[20] Dajanta,   K.,   Janpum,   P.   and   Leksing,   W.   2013. Antioxidant   Capacities,   Total   Phenolics   and Flavonoids in Black and Yellow Soybeans Fermented by Bacillus   subtilis :   A   Comparative   Study   of   Thai Fermented Soybeans (thua nao). International Food Research Journal. 20 (6): 3125-3132.
[21] Shrestha,   A.   K.,   Dahal,   N.   R.,   and   Ndungutse,   V. 2010. Bacillus Fermentation of Soybean: A Review. J. Food Sci &Technol , 6(1-9).
[22] Yang,   J.H.,   Mau,   J.L.,   Ko,   P.T.,   dan   Huang,   L.C. 2000. Antioxidant  Properties  of  Fermented  Soybean Broth. FoodChem . 71: 249-254.
[23] Suryanto,   E.   dan   Wehantouw,   F.   2009.   Aktivitas Penangkap Radikal Bebas dari Ekstrak Fenolik Daun Sukun ( Artocarpus altilis F.). Chem. Prog , 2(1).