## ANALISIS AKTIVITAS TOKSISITAS BEBERAPA MINYAK ATSIRI DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST
Marsah Rahmawati Utami 1 *, Yusi Ardiyanti 2 1,2 Universitas Singaperbangsa Karawang *Korespondensi: Jl. HS.Ronggo Waluyo Telukjambe Karawang, Email: marsah.r.utami@gmail.com

## ABSTRAK
Latar Belakang: Minyak atsiri biasa digunakan sebagai bahan baku minyak wangi,  obat-obatan dan  kosmetik.  Dalam  bidang  farmasi,  minyak  atsiri  digunakan  sebagai  antibakteri,  anti  nyeri dan  anti  infeksi.  Efek  farmakologis  ini  berhubungan  dengan  metabolit  sekunder  yang terkandung  dalam  minyak  atsiri  tersebut.  Efektifitas  komponen-komponen  aktif  metabolit sekunder  sebagai  obat  dapat  ditentukan  dengan  analisis  toksisitas  sebagai  uji  pendahuluan. Analisis toksisitas yang biasa digunakan yaitu dengan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Uji ini menggambarkan  tingkat  ketoksikan  ekstrak  terhadap  larva  Artemia  salina.  Hasil  uji  ini  dapat dimanfaatkan sebagai uji pendahuluan untuk mengidentifikasi bioaktivitas tanaman yang lebih luas.
Tujuan Penelitian : Penelitian ini bertujuan menganalis aktivitas toksisitas minyak atsiri daun kemanggi, rimpang lengkuas dan daun sirih merah serta kandungan senyawa kimianya.
Metode: Minyak  atsiri  diisolasi  dengan  metode  destilasi  uap,  diuji  aktivitas  toksisitasnya dengan metode BSLT, dan kandungan senyawa kimia dianalisis dengan GC-MS.
Simpulan: Hasil  uji Brine  Shrimp  Lethality  Test menunjukkan  bahwa  minyak  atsiri  daun kemanggi,  rimpang  lengkuas, dan sirih  merah  memiliki  tingkat  toksisitas dengan  LC50  secara berturut-turut adalah 57,21 ppm,  110,01  ppm, 360,51 ppm. Berdasarkan hasil analisis GC-MS komponen  utama  senyawa  penyusun  minyak  atsiri  daun  kemanggi  adalah  lemonal  dan  beta citral,  komponen  utama  minyak  atsiri  rimpang  lengkuas  adalah  2,6-dimetilfenil  borat,  1,8- cineol,  sedangkan  komponen  utama  senyawa  penyusun    minyak  atsiri  sirih  merah  adalah sabinena dan beta mircena.
Kata kunci :  Minyak atsiri, Destilasi uap, Brine Shrimp Lethality Test

## ABSTRACT
Background : Essential oils are commonly used as raw materials for fragrance oils, medicines and cosmetics. In the pharmaceutical field, essential oils are used as antibacterial, anti-pain and anti- infection.  This  pharmacological  effect  is  related  to  secondary  metabolites  contained  in  the essential oil. The effectiveness of the active components of secondary metabolites as a drug can be determined by toxicity analysis as a preliminary test. Toxicity analysis that is commonly used is the Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT).  This  test  illustrates  the  level  of  toxicity  of  extracts  against Artemia salina larvae. The results of this test can be used as a preliminary test to identify broader plant bioactivity.
Objective :  The  aim  of  this  study  was  to  analyze  the  toxicity  activities  of  basil leaf  essential  oils, galangal rhizome and red betel leaf and their secondary metabolite content.
Method : Essential oils were isolated by the steam distillation method, their toxicity activity was tested by the BSLT method, and the contents of the chemical compounds were analyzed by GC-MS. Conclusion : Brine Shrimp Lethality Test results showed that the essential oils of the leaves of the kemanggi,  galangal  rhizome,  and  red  betel  have  a  level  of  toxicity  with  LC50  respectively  57.21 ppm, 110.01 ppm, 360.51 ppm. Based on the results of GC-MS analysis, the main components  of the kemanggi leaf essentialoil are lemonal and beta citral, the main components of galangal rhizome essential  oil  are  2,6-dimethylphenyl  borate  an  1,8-cineol,  while  the  main  components  of  the  red betel essential oil are sabinena and beta mircena.
Keywords : essential oil, water distilation, Brine Shrimp Lethality Test
PENDAHULUAN Indonesia  merupakan    negara  yang kaya  akan  bahan  baku  minyak  atsiri  dan
J o u r n a l   o f   H o l i s t i c   a n d   H e a l t h   S c i e n c e s V o l . 3 ,   N o . 1 ,   J a n u a r i - J u n i   2 0 1 9 | 15
menjadi  salah  satu  produsen  minyak  atsiri terbesar  di  dunia.  Dengan  semakin meningkatnya  kebutuhan  pasar  dunia terhadap minyak atsiri, pemerintah memasukan  kelompok  minyak  atsiri  dalam 10  besar  komoditi  ekspor  Indonesia (kemendag,  2014).  Kebutuhan  pasar  yang tinggi  menunjukan,    Minyak  atsiri    disebut juga  dengan  nama  minyak  eteris  ( aetheric oil ),  minyak  esensial  ( essential  oil ),  minyak aromatik  ( aromatic  oil )  atau  minyak terbang  ( volatile  oil )  yang  dihasilkan  oleh tanaman.  Minyak  atsiri  memiliki  sifat mudah  menguap,tidak  polar,  tidak  larut dalam air dan pelarut polar lainnya.
Secara  tradisional  minyak  atsiri sering  digunakan    sebagai  bumbu  pemberi citarasa
makanan dan minuman, aromaterapi, kosmetik, dan bahan pewangi. Selain  itu  minyak  atsiri  juga  sering digunakan  sebagai  bahan  aditif  serta pengawet makanan dan minuman,
antiinflamasi, antioksidan, antiseptik,
antiserangga,  serta  obat  berbagai    jenis penyakit  pada  manusia  dan  hewan  (Burt, 2007;  Dubey  et  al.,  2010;  Koul  et  al.,  2008; Rajkumar  &  Jebanesan,  2007;  Reichling, 2009).  Pada  saat  ini  minyak  atsiri  telah banyak  digunakan  secara  luas  di  berbagai jenis  industri  bahan-bahan  kebutuhan rumah  tangga,  kosmetik,  makanan  dan minuman,  farmasi  obat-obatan,  parfum, pestisida  dan  sebagainya  (Isman,  2000; Koul et  al .,  2008).  Minyak  atsiri  juga mempunyai  peluang  untuk  dikembangkan menjadi  produk-produk  derivat  lainnya seperti  pestisida.  Pengembangan  produk- produk  derivat  dari  minyak  atsiri diharapkan dapat mengurangi atau menggantikan  produk-produk  yang  berasal dari  bahan  kimia  sintetik  (  Hartati  SY, 2012). Kemanggi,  lengkuas  dan  sirih  merah adalah beberapa tanaman yang mengandung  minyak  atsiri,  dan  banyak dikonsumsi oleh masyarakat indonesia baik sebagai  lalapan,  penambah  rasa  atau  pun obat  tradisional.  Meski  telah  banyak penelitian yang dilakukan terhadap tanaman  tersebut,  namun  penelitian mengenai  bioaktivitas  minyak  atsiri  ketiga tanaman  ini  masih  sedikit,  terutama aktivitas  toksisitasnya.  Salah  satu  metode
untuk  menentukan  aktivitas  toksisitas adalah  Metode Brine  Shrimp  Lethality  Test , BSLT  merupakan  suatu  uji  toksisitas  yang menggunakan  hewan  uji  Artemia  salina. Artemia salina digunakan sebagai  alternatif untuk  uji  toksisitas  biologis  ekstrak  herbal dan  tes  ini  berkolerasi  signifikan  dengan beberapa  model  hewan  lainnya  (Hamidi, Jovanova,  dan  Panovska,  2014),  Metode BSLT  dapat  digunakan  sebagai  uji pendahuluan  untuk  mengetahui  adanya biokativitas  tanaman  (zuraida,  2018).    Uji ini  dapat  digunakan    untuk  menentukan bioaktivitas  tanaman  seperti  aktivitas sitotoksik,  fototoksik,  pestisida,  inhibisi enzim,  dan  regulasi  ion  (Veni  & Pushpanathan,  2014).  Keunggulan    dari  uji BSLT  ini  yaitu  sederhana,  cepat,  mudah, hasilnya  dapat  diulang,  serta  tidak  mahal (Hamidi, Jovanova, dan Panovska, 2014).

## METODE PENELITIAN

## 1. Isolasi Minyak Atsiri dengan Destilasi Uap
Setelah  tanaman  dideterminasi  di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian  Biologi-LIPI  Bogor,  Tanaman didestilasi  dengan  cara  destilasi  uap. Distilat  minyak  atsiri  yang  diperoleh disimpan  di  dalam  refrigerator,  untuk diidentifikasi  dengan  GC-MS  dan  diuji aktivitas toksisitasnya.
2. Uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Penetasan telur
Telur  udang  ditempatkan  pada  gelas piala  berisi  air  laut  yang  diberi  aerasi  dan penerangan.Kemudian dibiarkan selama 48 jam. Telur akan menetas dalam 48 jam dan larva siap di uji

## Penyiapan sampel uji
Minyak  atsiri  dilarutkan  dalam  air laut  dengan  penambangan  DMSO  sebagai surfaktan  dan  dibuat  konsentrasi  10.000 ppm sebagai larutan induk dalam labu takar 5  ml.  Kemudian  dilakukan  pengenceran dengan  dibuat  larutan  2000  ppm,  1000 ppm,  800  ppm,  500  ppm,  300  ppm  dan  50 ppm Pada  setiap  tiap  botol  ukuran  10  mL dimasukkan 10 ekor larva udang alam 5 ml air laut, dengan variasi  konsentrasi minyak atsiri  50,  300,  500,  800,  1000,  dan  2000 µg/ml.  Sebagai  kontrol  (negatif)  digunakan
J o u r n a l   o f   H o l i s t i c   a n d   H e a l t h   S c i e n c e s V o l . 3 ,   N o . 1 ,   J a n u a r i - J u n i   2 0 1 9 | 16
larva  udang  dengan  5  ml  air  laut . Plat  di inkubasi  pada  suhu  kamar  selama  24  jam .
Dihitung  jumlah  larva  udang  yang  mati (tidak  menunjukkan  gerakan)  atau  hidup
(terus bergerak) . Setiap perlakuan dilakukan  sebanyak  3  kali  ulangan . LC 50 di tentukan dengan membuat kurva hubungan antara  %  kematian  larva  dan  log konsentrasi  ekstrak.  Apabila  pada  kontrol ada larva yang mati maka % kematian larva udang  ditentukan  dengan  rumus  Abbot (Meyer et al. 1982).
Keterangan : T :  jumlah larva uji yang mati K : jumlah larva kontrol yang mati
S :  jumlah larva uji 3. Uji analisis GC-MS Identifikasi Uji minyak atsiri menggunakan  alat  kromatografi  gas  yang digabung  dengan  spektrometer  massa  (GC- MS). Uji ini dilakukan di Pusat Laboratorium  Forensik  MABES  POLRI.
Instrumen  GCMSD  5973    menggunakan
kolom  kapiler  Agilent  19091S-433,  dengan kondisi  laju  alir  0.6μl/menit,  gas  pembawa Helium, suhu injektor 250 o C, suhu interface 280 o C.  Kondisi  spektrofotometer  massanya adalah  energi  ionisasi  70eV,  metode ionisasinya adalah Electron Impact

## HASIL PENELITIAN
Hasil  Uji  Aktivitas  Toksisitas  Minyak Atsiri
Uji  Aktivitas  toksisitas  minyak  atsiri dilakukan  dengan  metode  BSLT  ( Brine
Shrimp  Letality  Test ).    Uji  toksisitas dilakukan  dengan  menghitung  persen mortalitas  (kematian)  larva Artemia  salina pada variasi  konsentrasi 50 ppm, 300 ppm,
500  ppm,  800  pmm,  1000  ppm  dan  2000 ppm,  dengan  3  kali  pengulangan    lalu dibandingkan dengan kontrol dan dilakukan  analisis  hasil  sehingga  diperoleh nilai  LC 50 .  Hasil  uji  BSLT  minyak  atsiri kemanggi,  rimpang  lengkuas  dan  sirih merah disajikan pada Tabel berikut.
Tabel 1 Hasil uji toksisitas minyak atsiri daun kemanggi Konsentrasi (ppm) Log Konsentrasi Jumlah larva yang hidup % kematian 1 2 3 2000 3,301 0 0 0 83,3 1000 3,00 0 0 0 83,3 800 2,903 0 0 0 83,3 500 2,699 1 0 1 76,6 300 2,477 2 3 2 60 50 1,699 4 3 3 50
Tingkat  toksisitas  minyak  atsiri ditunjukkan  dengan  nilai  LC 50 yang menyatakan  konsentrasi    suatu  zat  yang menyebabkan  50%  kematian  hewan  uji. Nilai  LC 50 diperoleh  dari  analisis  probit
menggunakan  Microsoft  Excel  dengan persamaan    y=0,693877x  +3,780527, diperoleh  Nilai  LC 50 minyak  atsiri  daun kemanggi  adalah 57,21 ppm.
Tabel 2 Hasil uji toksisitas minyak atsiri rimpang lengkuas Konsentrasi (ppm) Log Konsentrasi Jumlah larva yang hidup % kematian 1 2 3 2000 3,301 0 0 0 83,3 1000 3,00 1 1 1 73,3 800 2,903 2 1 1 70 500 2,699 3 2 1 63,3 300 2,477 4 2 3 53,3 50 1,699 5 4 2 46,6
Berdasarkan analisis probit diperoleh persamaan  y=  0,6292x  +  3,7155  dengan
nilai  LC 50 minyak  atsiri  rimpang  lengkuas sebesar 110,01 ppm.
Tabel 3 Hasil uji toksisitas minyak atsiri daun sirih merah Konsentrasi (ppm) Log Konsentrasi Jumlah larva yang hidup % kematian 1 2 3 2000 3,301 0 0 0 83,3 1000 3,00 3 1 2 63,3 800 2,903 2 2 3 60 500 2,699 3 4 3 50 300 2,477 4 5 4 40 50 1,699 4 5 6 26,6 Berdasarkan analis probit diperoleh persamaan y = 0,9085x +  2,6772 dengan  nilai  LC 50 minyak  atsiri  daun  sirih merah sebesar  360,51 ppm.
Hasil Analisis GC MS minyak atsiri
Identifikasi  kandungan  senyawa- senyawa yang terdapat dalam distilat kasar, minyak  kemanggi,  lengkuas,  dan    sirih merah dilakukan dengan instrumen GC-MS.
Perbedaan  senyawa-senyawa  utama  yang terkandung  dalam  ekstrak  minyak  atsiri disajikan pada Tabel 4. Tabel 4 Identifikasi komponen - komponen utama ekstrak minyak atsiri menggunakan uji GC-MS. Minyak atsiri Nama senyawa Rendemen (%) Kemanggi 6-metil-5-hepten-2-on linalool Terpineol Cis-geraniol Beta-citral Geraniol lemonal Eugenol sikloheksil format Beta.-kariofilena 1,3-sikloheksadiena Trans-beta-farnesen Alpha.-humulena Germacrene D Cis-.alpha.-bisabolena 1.25 5.08 1.13 2.34 28.43 2.07 37.9 1.44 1.26 3.39 1.50 1.12 1.38 1.39 5.12 Lengkuas Beta-pinena 1,8-cineol Phenol, 4-(2-propenil) Beta-Elemena Kariofillena Trans-beta-farnesen Germacrene D Germacrene B Beta-bisabolene 2,6-dimetilfenil borat 8-heptadekena Farnesol asetat Cis-isoeugenol 3.21 17.97 6.58 4.07 4.72 12.46 10.35 1.43 1.23 20.26 2.15 1.22 0.97 Alpha tuhyena Beta pinena 2.03 1.05
Sirih Merah Sabinena Beta mircena Alpha terpinena Gamma terpinena Alpha terpinolena Linalool 4-terpineol Trans kariofilena Germakrena D Alpha kopaena 30.51 15.22 1.40 3.21 0.90 7.20 4.03 1.97 5.02 0.13

## PEMBAHASAN
Uji  toksisitas  dengan  metode  BSLT dengan  hewan  uji  A.  salina  merupakan  uji pendahuluan  sederhana  untuk  mengetahui adanya  aktivitas  biologis  dari  suatu tanaman.  Sesuai  dengan  penelitian  yang telah  dilakuan  Meyer,  et  al  (1982)  bahwa BSLT  telah  diterapkan  sebagai  salah  satu teknik bioassay untuk menentukan toksisitas ekstrak tanaman, toksisitas logam berat  (Martinez,et  al,  1999),  Toksisitas nanopartikel  (  Maure  Jones  et  al.,  2013). Janakiraman  dan  Johnson  (2016)  juga menyatakan  bahwa  uji  BSLT  dapat digunakan sebagai dasar untuk uji toksisitas terhadap  sel  line,  aktivitas  anti-tumor  dan anti-kanker.
Hasil  uji  toksisitas  dinyatakan dengan Lethal  Concentration 50  (LC50), yakni  konsentrasi  optimum  ekstrak  yang mampu  membunuh  50%  populasi  larva  A. salina.  Nilai  LC50  yang  semakin  rendah menunjukkan  efek  toksisitas  yang  semakin tinggi.  Menurut  Meyer  et  al.,(1982),  suatu senyawa dapat dikatakan memiliki bioaktivitas  jika  dalam  uji  toksisitas  nilai LC 50 <1000  μg/mL.  Berdasarkan  data penelitian  ini  toksisitas  minyak  atsiri kemanggi,  lengkuas  dan  sirih  merah berturut-turut  adalah  57,21  ppm,  110,01 ppm,  dan  360,51  ppm,  yang  dapat disimpulkan  sementara  bahwa  ketiga sampel  minyak  atsiri  tersebut  memiliki bioaktivitas  dan  bersifat  toksik.  Dengan aktivitas  ketoksikan  tertinggi  pada  minyak atsiri  kemanggi  dengan  LC 50 sebesar  57,21 ppm  dan    aktivitas  ketoksikan  terendah adalah  minyak  atsiri  sirih  merah  dengan LC 50 sebesar  360,51  ppm.  Suatu  ekstrak dikatakan  tidak  toksik  jika  LC 50 >1000 µg/mL, toksik rendah jika LC 50 bernilai 500- 1000  µg/mL,  toksik  sedang  jika    LC 50 100- 500 µg/mL, dan toksik tinggi jika LC 50 0-100
µg/mL  (Hamidi,  Jovanova,  dan  Panovska, 2014).  Dengan  demikian  dapat  dikatakan minyak  atsiri  kemanggi  berada  pada kriteria  toksik  tinggi,sedangkan  minyat atsiri lengkuas dan sirih merah berada pada kriteria  sedang.  Kematian  larva    diduga karena  adanya  potensi  golongan  senyawa yang  terdapat  dalam  minyak  atsiri  yaitu golongan monoterpen, monoterpena, sesquiterpen dan senyawa turunannya yang bersifat  toksik,  menurut  Dirgantara  S  et  al (2018) mekanisme kematian larva pada uji toksisitas  diduga  karena  potensi  golongan senyawa  yang  terdapat  di  dalam  ekstrak yang dapat  menghambat daya makan larva ( antifeedant /  pengelak  makan)  dengan bertindak  sebagai stomach  poisoning atau racun perut (Dirgantara S, et al (2018). Nilai LC50  yang  berbeda  pada  setiap  minyak atsiri  tanaman  dapat  disebabkan  oleh perbedaan  jenis  dan  kandungan  senyawa monoterpen,  sesquiterpen  dan  senyawa turunanya.  perbedaan kandungan senyawa kimia  pada  masing-masing  minyak  atsiri dapat dilihat pada data GCMS Tabel 4.
Berdasarkan  analisis  data  GC-MS pada  Tabel  4,  minyak  atsiri  kemanggi mengandung  komponen  senyawa  kimia golongan monoterpen, monoterpen alkohol, monoterpen aldehid, ester dan sesquitepen dengan  komponen  yang  memiliki  kadar paling  tinggi  diatas  5%  yaitu  beta  sitral (28,43  %),lemonal  (37.9%)  yang  keduanya merupakan  senyawa  kimia  golongan monoterpen  aldehid  dan  Cis-.alpha.- bisabolena  (5.12%)  golongan  sesquiterpen. Pada  minyak  atsiri  lengkuas  mengandung komponen senyawa kimia golongan monoterpen,monoterpen alkohol, sesquiterpen,  dan  ester,  komponen  utama penyusun  minyak  atsiri  dengan  kadar tertinggi adalah 1,8-cineol (17.97%), Trans- beta-farnesen  (12,46%)  dan  Germacrene  D
J o u r n a l   o f   H o l i s t i c   a n d   H e a l t h   S c i e n c e s V o l . 3 ,   N o . 1 ,   J a n u a r i - J u n i   2 0 1 9 | 19
(10.35%)  yang  merupakan  golongan sesquiterpen.  Minyak  atsiri  sirih  merah mengandung  komponen  senyawa  kimia golongan  monoterpen, monoterpen  alkohol dan sesquiterpen, dengan komponen utama penyusun minyak atsirinya adalah Sabinena (36.64%),  Beta  mircena  (11,22%)  yang merupakan  golongan  sesquiterpen  dan Linalool  (8.27%)  golongan  monoterpen alkohol. LC50 minyak atsiri kemanggi paling rendah dibandingkan minyak atsiri lainnya, hal  ini  bisa  disebabkan  pada  minyak  atsiri kemanggi  mengandung  beta  sitral  dan lemonal yang merupakan golongan monoterpen aldehid dan senyawa dominan penyusun minyak atsiri kemanggi.

## SIMPULAN
Hasil  uji Brine  Shrimp  Lethality  Test menunjukkan  bahwa  minyak  atsiri  daun kemanggi,  rimpang  lengkuas,  dan  sirih merah  memiliki  tingkat  toksisitas  dengan LC 50 secara  berturut-turut  adalah  57,21 ppm,  110,01  ppm,  360,51  ppm  yang bersifat  toksik.  Berdasarkan  hasil  analisis GC-MS komponen utama senyawa penyusun  minyak  atsiri  daun  kemanggi adalah  lemonal  dan  beta  citral,  komponen utama  minyak  atsiri  rimpang  lengkuas adalah  2,6-dimetilfenil  borat,  1,8-cineol, sedangkan  komponen  utama  senyawa penyusun  minyak atsiri sirih merah adalah sabinena dan beta mircena.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Burt,  S.  2007.  Antibacterial  activity  of essential  oils:  potential  application  in food.  Ph.D.  thesis.  Institute  for  Risk Assesment  Sciences,  Division of Veterinary  Medicine,  Public  Health.
Utrecht University. 2. Chapman  RF  dan  Boer  GD,  1995. Regulatory Mechanism in Insect Feeding. New york :Chapman & Hall. 3. Dirgantara  S,  RHR.  Tanjung  ,  H  K. Maury  ,  E  Meiyanto.2018.  Cytotoxic
Activity  and  Phytochemical  Analysis  of Breynia cernua from Papua. Indonesian Journal  of  Pharmaceutical  Science  and Technology 1(1) ; 31-36.
4. Dubey,  N.  K.,  R.  Shukla,  A.  Kumar,  P. Singh,  and  B.  Prakash.2010.  Prospects of  botanical  pesticides  in  sustainable
agriculure.  Current  Science  4(25):479- 480. 5. Hartati, S. Y. 2012. Prospek Pengembangan  Minyak  Atsiri    sebagai Pestisida Nabati. Perspektif  11(1) : 45- 58 .
6. Hamidi, М., Jovanova, B., & Panovska, Т. (2014).  Toxicоlogical  evaluation  of  the plant  products  using  Brine  Shrimp (Artemia salina L .) model. Macedonian
Pharmaceutical Bulletin, 60(1), 9–18. 7. Isman,  M.  B.  2000.  Plant  essential  oils for pest and disease management. Crop Protection. 19: 603-608 8. Janakiraman, N., & Johnson, M. (2016). Ethanol  extracts  of  selected  cyathea species  decreased  cell  viability  and inhibited  growth  in  MCF  7  cell  line cultures.  Journal  of  Acupuncture  and Meridian Studies, 9(3), 151–155.
9. Koul,  O.,  S.  Walia,  and  G.  S.  Dhaliwal. 2008. Essential oils as green pesticides: Potential and constrains. Biopesticides.
Int. 4 (1): 63-84. 10. Lenny,  S.  2006.  Senyawa  Terpenoida dan  Steroida.Karya  Ilmiah.Medan  : Universitas Sumatera Utara.
11. Martínez, M., Del Ramo, J., Torreblanca, A.,  Díaz-Mayans,  J.,  1999.  Effect  of cadmium exposure on zinc levels in the brine shrimp Artemia parthenogenetica .  Aquaculture.  172, 315- 325.
12. Maurer-Jones, M.A., Love, S.A.,
Meierhofer,  S.,  Marquis,  B.J.,  Liu,  Z.,
Haynes,  C.L.,  2013.  Toxicity  of nanoparticles  to  brine  shrimp:  An introduction  to  nanotoxicity  and interdisciplinary  science.  J  Chem  Edu.
90, 475-478. 13. Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E., McLaughlin, J.L., 1982. Brine Shrimp: A convenient  general  bioassay  for  active plant  constituents.  Planta  Medica.  45, 31-34.
14. Rajkumar,  S.  and  A.  Jebanesan.  2007.
Repellent  activity  of  selected  plant essential oils against the malarial fever mosquito Anopheles stephensi. Tropical Biomedicine 24 (2): 71-75. 15. Veni,  T.,  &  Pushpanathan,  T.  (2014).  C omparison  of  the  Artemia  toxicity  of  I
J o u r n a l   o f   H o l i s t i c   a n d   H e a l t h   S c i e n c e s V o l . 3 ,   N o . 1 ,   J a n u a r i - J u n i   2 0 1 9 | 20
ndian  medicinal  salina  and  Artemia fransiscana  bioassays  for  plants. Journal  of  Coastal  Life  Medicine,  2(6), 453–457. 16. Zuraida.2019. Analisis toksisitas beberapa  tumbuhan  hutan  dengan metode  brine  shrimp  lethality  test (bslt). Jurnal Penelitian Hasil Hutan Vol. 36 No. 3 : 239-246