Daya Hambat Ekstrak Limbah  Jeruk (Citrus Sinensis) Dengan Pelarut N-Heksana Sebagai Antibiotik Pada Ayam Broiler The Inhibitory Of Orange (Citrus sinensis) Waste  Extracted With N-Hexana Solution As Antibiotic In Broiler

## Ucop Haroen
Departement of Nutrition and Animal Feed Science Technology, Faculty of Animal Science, Jambi University Jln. Jambi-Ma Bulian Km 15 Mendalo Darat, Jambi 36361-Indonesia

## Intisari
Tujuan  penelitian  ini  ialah  mengkaji  efektifitas  antibakteri  ekstrak  limbah  jeruk menggunakan  pelarut  n-heksana  dalam  menekan  perkembangan  bakteri  patogen (E. coli dan S.enteritidis) pada ayam broiler. Pada penelitian ini menggunakan ekstrak limbah jeruk dengan pelarut  n-heksana  dan  bakteri E.coli dan S.enteridis .  Penelitian  dilakukan  dengan  metode  uji Disc  (melihat  zona  bening  sekitar  Disc)  dan  uji  MIC (minimum  inhibitory  concentration) menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) 5 perlakuan dan 5 ulangan untuk masing-masing perlakuan.  Perlakuan  P0  terdiri  dari  pemberian  antibiotik  sintetis  sebagai  kontrol,  ekstrak limbah  jeruk pelarut  n-heksana dengan kosentrasi 250 ppm (P1), 500 ppm (P2), 750 ppm (P3) dan  1000  ppm  (P4).  Hasil  pengukuran  zona  hambat,  daya  hambat  serata  indek  aktivitas antibakteri  dari  lima  perlakuan  terhadap E.coli dan S.  enteriditis berkisar  8,21-18,8;  11,94%  - 22,87% dan 1,3-2,75.  Hasil analisis ragam menunjukkan  perlakuan pemberian ekstrak limbah jeruk n-heksana  nyata  (P<0.05)  berpengaruh  terhadap  zona  hambat,  daya  hambat  serta  indek aktivitas bakteri E.coli maupun S.enteriditis . Berdasarkan uji  lanjut zona hambat,  daya hambat maupun indek aktivitas antibakteri ekstrak limbah jeruk n-heksana pada kosentrasi 1000 ppm nyata (P<0.05) lebih tinggi dibandingkan perlakuan 750 ppm, 500 ppm dan 250 ppm. Sementara itu perlakuan antibiotik sintetis menghasilkan zona  hambat, daya hambat dan indek aktivitas lebih tinggi (P<0.05) dibandingkan dengan semua perlakuan.
Key words : Limbah jeruk, bakteri patogen, MIC dan Disc, n-heksana

## Abstract
The experiment was designed to study the uses of orange waste extracts with solution of n-hexana in inhibiting the pathogen bacteria on broilers. Orange waste extracts with solution n- hexana, E.coli and S.enteridis bacteria,  were  assigned  into  the  zone  of  inhibition  (Disc)  and minimum  inhibitory  concentration  (MIC).  Completely  randomized  design  was  used  in  the present  study,  were  randomly  allocated  to  five  treatments  groups  given  varying  in concentrations of orange waste extracts. P0 = antibiotic, P1 =  250 ppm orange waste extracts, P2 =  500 ppm orange waste extracs, P3 = 750 ppm orange waste extracs and P4 = 1000 ppm orange waste extracts. Supplemented with an antibiotic only  was used as a control. The concentrations 1000  ppm  of  MIC  were  test    showed  inhibition  of  orange  waste  extracts  higher  with  a percentage  minimum    22,87  %  for  the  bacterium E. coli and  18,99  %  for  the S. enteriditis than index activity 2,50 for the bacterium E. coli and 2,75 for the S. enteriditis.
Key Words: Orange waste  extract, n-hexana , pathogen bacteria , Disc and MIC

## Pendahuluan
Penggunaan  antibiotik  sintetis untuk mengendalikan bakteri penyebab penyakit pada ayam broiler sudah  sangat  umum  digunakan dalam  industri  peternakan  modern.
Antibiotik  sintetis  merupakan feed additive yang biasa dicampur ke dalam ransum  ayam  broiler  yang  dapat meningkatkan kesehatan ternak. Pemberian  antibiotik  sintetis  ini bertujuan untuk meningkatkan kasehatan  ternak,  memacu  partum- buhan sekaligus meningkatkan produktivitas ternak, khususnya ayam  broiler. Feed  additve yang  ada pada  saat  ini  pada  umumnya  berupa antibiotik,  enzim,  probiotik,  senyawa aktif  tanaman.  Pemberian  antibiotik sitentis diharapakan dapat mengurangi populasi mikroorganisme pengganggu  (patogen)  dalam  saluran pencernaan,  sehingga  ternak  lebih sehat  dan  dapat  memanfaatkan  zat- zat  makanan  lebih  baik  untuk pertumbuhan  dan  produksi  (Walton., 1997).  Penggunaan  antibiotik  sintetis secara terus menerus dapat menimbulkan dampak negatif terhadap  ternak  dan  konsumen  yang mengkonsumsi produk ternak
tersebut. Salah satu alternatif yang  cukup potensial digunakan untuk menghindari dampak negatif penggunaan  antibiotik  sintetis  adalah dengan penggunaan feed additive alami yang  terdapat  dalam  ekstrak  limbah jeruk. Ekstrak limbah jeruk merupakan ekstrak yang didapat dari proses  maserasi,  ekstraksi  dengan menggunakan  pelarut  organik  yang bahan  aktifnya  terdiri  limonoid, alkaloid, flavonoid, triterpenoi, steroid, saponin dan kumarin (Haroen et  al., 2013).  Senyawa  aktif  yang berasal  dari  tanaman  merupakan senyawa aktif yang lebih spesifik dan residunya mudah terurai (Soehardjan., 1994). Salah satu antibiotik  alami  yang  mampu  dan telah  terbukti  dapat  menghambat
perkembangan bakteri patogen adalah ekstrak  limbah  jeruk  menggunakan pelarut etilasetat (Haroen et al ., 2013). Ektrak  limbah  jeruk  menggu-nakan pelarut  etilasetat  memiliki  daya hambat yang sangat baik dibandingkan  dengan  ekstrak  limbah jeruk  dengan  menggunakan  pelarut metanol  (Haroen.,  2014).  Ekstrak limbah  jeruk  menggunakan  pelarut etilasetat  pada  kosentrasi  750  ppm mampu menekan perkembangan bakteri  patogen  ( E.  coli dan S. enteritidis ). Kemampuan ekstrak limbah  jeruk  menggunakan  pelarut etilasetat  dalam  menekan  perkem- bangan  bakteri  patogen  pada  ayam broiler yaitu 67% (Haroen., 2014).
Berdasarkan potensi yang dimiliki  ekstrak  limbah  jeruk  dengan menggunakan pelarut organik diharapkan dapat mengurangi populasi mikro-organisme pengganggu  (patogen)  di  dalam saluran  pencernaan  ayam  broiler, sehingga  ayam  lebih  sehat  dan  dapat memanfaatkan  gizi  pakan  lebih  baik untuk pertumbuhan dan produksi.

## Materi dan Metode
Penelitian  ini  dilakukan  pada bulan  Mei  sampai  Juli  2016  di Laboratorium  Kimia  Organik  Bahan Alam  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Andalas.  Penelitian  ini  menggunakan rancangan  acak  lengkap  (RAL) dengan  5  perlakuan  yang  diulang masing-masing  sebanyak  5  kali. Perlakuan merupakan kosentrasi ekstrak  limbah  jeruk  dengan  pelarut n-heksana  pada  kosentrasi  250  ppm (P1), 500 ppm (P2), 750 ppm (P3), 1000 ppm  (P4)  dan  antibiotik  sintetis sebagai  kontrol  (P0).  Koleksi  isolat bakteri E.  coli dan S.  enteritidis diperoleh dari Laboratorium
Mikrobiologi  Universitas  Andalas. Data  yang  diukur  adalah:  Diameter zona hambat yaitu dengan mengukur zona  bening  yang  terbentuk  pada perlakuan  ekstrak  limbah  jeruk dengan  pelarut  n-heksana,  diukur lebarnya  dari  sisi  sebelah  kiri  sampai sisi  sebelah  kanan  dan  dari  sisi sebelah  bawah  sampai  sisi  sebelah atas (mm). Kosentrasi hambat minimum dari ekstrak yang mempunyai aktivitas antibakteri yang terbesar.  Kosentrasi  terkecil  yang masih bisa menghambat pertumbuhan  mikroba  merupakan kosentrasi hambat minimum (%).

## A. Cara kerja penelitian :
1. Persiapan media agar Sterilisasi alat dan  bahan  :  Alat-alat  gelas  yang akan  digunakan  dicuci  bersih, dikeringkan  dan  akan  dibungkus dengan kertas perkamen. Kemudian    disterilkan  dalam autoclave  pada  suhu  121°C  selama 15  menit.  Jarum  oase  akan disterilkan  dengan  cara  membakar pada lampu spritus.
2. Pembuatan  media: Pembuatan media  pembenihan  dan  media Mueller  Hinton  Broth  (MHB): media  pembenihan  yang  akan digunakan  untuk  uji  antimikroba ini adalah Nutrient Agar (NA) yang terdiri  dari  5  g  peptone,  3  g  beef extract  dan  12  g  agar.    Dua  puluh gram serbuk NA  dilarutkan dalam 1 liter air suling, dipanaskan diatas penangas  air  sampai  mendidih, angkat  dan  diamkan  sebentar  lalu didistribusikan  kedalam  tabung reaksi  dan  kemudian  disterilkan dalam  autoclave  pada  suhu  121°C selama  15  menit.  Media  MHB dibuat  dengan  cara  sebanyak  21 gram  bubuk  MHB  dimasukkan  ke dalam tabung Erlenmeyer kapasitas
1000  ml  dan  ditambahkan  aquades sampai  volume  mencapai  1000  ml. Panaskan sampai mendidih, angkat dan diamkan sebentar lalu didistribusikan  ke  dalam  tabung reaksi  dan  kemudian  disterilkan dalam  autoclave  pada  suhu  121°C selama 15 menit.
3. Peremajaan  bakteri:  Jarum  ose disterilkan  diatas  nyala  Bunsen dengan cara dipijarkan dan dibiarkan  beberapa  saat  supaya dingin.  Diambil  sebanyak  1  ose biakan  murni  bakteri.  Kemudian diinokulasi  biakan  murni  tersebut kedalam  media  NA  miring  secara aseptic,  diinkubasi  selama  24  jam pada temperature 37 o C.
4. Pembuatan  suspensi  mikroba  uji: Bakteri yang akan diujikan yaitu S. enteritidis,  E.  coli. Masing-masing bakteri  yang  ada  pada  stok  kultur akan  diambil  dengan  jarum  oase dan  masing-masing  disuspensikan dalam  larutan  NaCl  fisiologis (0,85%  NaCl)  dan  dihitung  jumlah sel per ml sehingga mencapai lebih kurang  10 7 sel  per  ml  dengan menggunakan kurva standard.
5. Pelaksanaan  uji  antibakteri:  Uji antibakteri melalui penentuan zona hambat  dengan  metoda  difusi cakram. Ke dalam media pembenihan  dicelupkan  masing- masing  dua  kertas  cakram  pada tiap-tiap konsentrasi ekstrak limbah jeruk  pelarut  n-heksana  yaitu antibiotik  sintetis  (kontrol)  (P0), ekstrak limbah jeruk n-heksana 250 ppm  (P1),  500  ppm  (P2),  750  dan ppm (P3), 1000 ppm (P4). Letakkan kertas  cakram  pada  permukaan cakram yang berisi suspensi bakteri uji.  Inkubasikan  selama  24  jam pada  suhu  37 o C  dan  ukur  zona hambatnya. Jika zona hambat yang
terbentuk  lebih  besar  dari  zona hambat  kontrol  maka  dikatakan aktif antibakteri.

## B. Pengukuran peubah :
1. Uji  Disc  dan  Indek  Aktifitas  : Uji dengan    metode    Disc  juga dilakukan  untuk  melihat  zona bening  pada  bagian  disekitar  Disc. metode Long et al. (2003). dan Vust dan  Vandamme  (1994).  Prosedur pengujian  adalah  sebagai  berikut:1 ml  larutan E.  coli atau S.  enteritidis dimasukan  ke  da  lam  cawan  petri yang  berisi  MPA  dan  dibiarkan selama 10 menit hingga mengering, sisa yang tertinggal diambil dengan pipet. Pada  bagian  bawah  cawan petri  digambar  dengan  membagi menjadi  4  bagian. Disc/cakram yang terbuat dari kertas sebanyak 4 buah  direndam  dalam  larutan  dan dimasukan ke dalam atau ditempel pada permukaan cawan petri pada bagian  tengah  keempat  bagian cawan  petri  tersebut. Cawan  petri yang  berisi  biakan  kemudian diinkubasi  selama  48  jam  pada suhu  37ºc,  amati  zona  bening disekitar Disc.
2. Uji  MIC  ( Miinimum  Inhibitory Consentration )  : Pengujian  dengan metode  MIC  adalah  digunakan pada  kosentrasi  larutan  tertentu dari  spesies  bakteri E.  coli atau S. enteritidis , mulai menghambat pertumbuhan bakteri E. coli atau S. enteritidis . Prosedur pengujian adalah  sebagai  berikut: Tabung kemudian  diisi  dengan  larutan E. coli atau S.  enteritidis dengan konsentrasi  10 6 cfu/ml  dalam larutan Muller Hinton Broth (MHB) sesuai  standard  McFarland  dengan menggunakan Spektrometer.
Masing-masing tabung diisi
berturut-turut mulai pertama sampai  tabung  kelima  adalah sebanyak 4.5 ml. 4.0 ml, 3.5 ml, 3.0 ml,  dan  2.5  ml. Tabung  kemudian diisi lagi dengan supernatant/larutan masing- masing  berturut-tuut  mulai  dari pertama  sampai  kelima  adalah  0.5 ml, 1.0 ml, 1.5 ml, 2.0 ml dan 2.5 ml, sehingga  kosentrasi  supernatant dalam  tabung  adalah  10%,  20%, 30%,  40%  dan  50%. Tabung kemudian  diinku-basikan  selama 48  jam  pada  suhu    37 o c.  Amati kekeruhan pada tabung, bila keruh bakteri E.  coli atau S . entertidis tumbuh  bila  bening  bakteri E.  coli atau S. entertidis tidak tumbuh.

## Hasil dan Pembahasan
Pengaruh  pemberian  ekstrak limbah jeruk n-heksana terhadap zona hambat bakteri E. coli dan S . enteritidis. Hasil  pengukuran  zona  hambat  dari ekstrak  limbah  jeruk  n-heksana terhadap  bakteri E.  coli dan S. enteritidis tercantum pada Tabel 1.
Dari  Tabel  1  di  atas  terlihat bahwa  zona  hambat  dari  ektrak limbah jeruk n-heksana pada kosentrasi  1000  ppm  lebih  tinggi  dari pada perlakuan yang lainnya terhadap  bakteri E.  coli dan S. enteriditis .  Hasil  analisis  ragam menunjukkan bahwa perlakuan pemberian  ekstrak  limbah  jeruk dengan  pelarut  n-heksana  nyata (P<0.05)  berpengaruh  terhadap  zona hambat  bakteri E.coli dan S.enteriditis.
Dari  uji  Duncan  menunjukkan  zona hambat  terhadap E.  coli maupun S. enteriditis yang  mendapat  perlakuan P0  (antibiotik)  nyata  (P<0.05)  lebih tinggi dibandingkan perlakuan
Tabel 1.  Hasil  Uji  Disc  dan  indek  aktivitas  ekstrak  limbah  jeruk  n-heksana terhadap E. coli dan S. enteritidis Perlakuan Zona hambat (mm) Indek Aktivitas Limbah jeruk n- heksana (ppm) E. coli S. enteritidis E. coli S. enteritidis P0 20,15 a 18,10 a 3,42 a 3,01 a P1 8,21 b 8,51 b 1,33 b 1,56 b P2 9,50 b 9,10 b 1,37 b 1,96 b P3 12,90 d 12,54 d 1,45 b 2,28 c P4 18,81 e 17,89 a 2,50 c 2,75 c
Keterangan : Konsentrasi Disc 30 mg/ml.
Huruf  kecil  yang  berbeda  pada  kolom  yang  sama    menunjukkan    berbeda  nyata (P<0.05)
perlakuan  P1  dan  P2  tidak  nyata lainnya. Sementara itu antara berbeda (P<0.05) dalam menghambat perkembangan  bakteri E.  coli dan S. enteriditis. Tetapi  antara  perlakuan  P3 dan P4 nyata (P<0.05) lebih tinggi dari perlakuan  P1  dan  P2.  Hasil  ini menunjukkan  bahwa  makin  tinggi kosentrasi  ekstrak    limbah  jeruk  n- heksana  ternyata  lebih  efektif  dalam menghambat  perkembangan  bakteri E. coli dan S. enteriditis. Zona  hambat yang  terbentuk  dari  perlakuan pemberian  ekstrak  limbah  jeruk  n- heksana  pada  kosentrasi  1000  ppm terhadap  bakteri E.  coli dan S. enteriditis sebesar 18,81 mm dan 17,89 mm.    Hasil  ini  lebih  tinggi  dari  yang dilaporkan  Ekwenye  dan  Edeha (2010),  dimana  zona  hambat  pada penggunaan  dari  ekstrak  kulit  jeruk dengan  pelarut  etanol  terhadap  zona hambat bakteri E. coli dan S. enteriditis sebesar 13 mm dan 17 mm. Sementara Kirbaslar et  al. (2009)  memperoleh zona  hambat  pada  penggunaan ekstrak  kulit  jeruk  lemon  dengan menggunakan  pelarut  etilasetat  dan ekstrak  kulit  jeruk  senensis  dengan pelarut  etilasetat  dan  ekstrak  kulit jeruk sinensis dengan pelarut etilasetat  terhadap  zona  hambat
bakteri E.  coli sebesar  14  mm  dan  13 mm.  Adanya  variasi  zona  hambat bakteri  yang  diperoleh  kemungkinan disebabkan karena adanya  perbedaan komposisi  fitokimia  dari  masing- masing  ekstrak  yang  dihasilkan. Sedangkan  komposisi  kandungan fitokimia  dari  masing-masing  ekstrak tanaman  dipengaruhi  oleh  profil tanah, waktu panen, metode ekstraksi, kosentrasi,  waktu,  suhu  dan  sifat pelarut  yang  digunakan  (Lia et  al., 2006 ; Garau et al., 2007). Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlakuan  P0  nyata    (P<0.05) berpengaruh  terhadap  zona  hambat dan  indek  aktivitas  pada  bakteri E. coli dan S  enteriditis. Dari  uji  Duncan menunjukkan zona hambat dan indek aktifitas  ekstrak  limbah  jeruk  n- heksana  1000  ppm  (P4)  lebih  tinggi (P<0.05)  dibanding  konsentrasi  250 ppm (P1), 500 ppm (P2) dan 750 ppm (P3).  Sementara  itu  antibiotik  sintetis (P0)  mengasilkan  daya  hambat  dan indek  aktifitas  lebih  tinggi  (P<0.05) dibandingkan dengan semua perlakuan  yang  diberikan.  Ada kencenderungan  yang  terlihat  bahwa semakin  tinggi  kosentrasi  ekstrak limbah jeruk n-heksana maka semakin tinggi  zona  hambat  dan  indek
aktivitas anti bakteri yang  dihasilkan. Hal  ini  kemungkinan  disebabkan karena  ekstrak  limbah  jeruk  n- heksana  pada  perlakuan  P4  (1000 ppm) mengandung komponen fitokimia yang lain dengan kosentrasi yang lebih tinggi  yang juga memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Hasil  pengukuran  daya  hambat dari  ekstrak  limbah  jeruk  n-heksana terhadap  bakteri E.  coli dan S. enteriditis tercantum pada Tabel 2. Hasil  analisis  ragam  menun- jukkan  bahwa  perlakuan  pemberian ekstrak limbah jeruk n-hekasana nyata (P<0.05)  berpengaruh  terhadap  daya hambat minimum (MIC) pada bakteri E. coli dan S. enteriditis .  Hasil  uji  MIC terhadap  bakteri E.  coli dan S. enteriditis yang  diperoleh  dalam penelitian ini berkisar 18,64% -22,87% dan  11,94%  -  18,99%.  Dari  uji  MIC terlihat bahwa ekstrak limbah jeruk n- heksana  ternyata  lebih  efektif  dalam menghambat  perkembangan  bakteri E. coli dari pada bakteri S. enteriditis . Dari  uji  Duncan  hasil  uji  MIC dari perlakuan 1000 ppm (P4) berbeda nyata (P<0.05) lebih
tinggi dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Sementara itu uji MIC antara perlakuan  P0  (antibiotik  sintetis)  dan perlakuan  P1(1000  ppm)  nyata
(P<0.05)  lebih  tinggi  terhadap  daya hambat E. coli dan S. enteriditis .  Lebih efektifnya  perlakuan  P0  (antibiotik sintetis) dibandingkan perlakuan ekstrak limbah jeruk n-heksana dalam meng-hasilkan  nilai  MIC  kemung- kinan disebabkan karena sifat pelarut yang  digunakan  pada  penelitian  ini ektraksi  dan  maserasi  dilakukan dengan  pelarut  non  polar  dimana komponen  yang  dapat  diekstraknya hanya  komponen  yang  bersifat  non polar.  Senyawa-senyawa  aktif  yang terkandung  didalam  limbah  jeruk sebagian besar bersifat semi polar dan polar  Haroen  (2014).    Fu et al.,  ( 2005) mengatakan  hasil  ekstraksi,  maserasi dari berbagai ekstrak tanaman ditentukan  dari  sifat  pelarut  yang digunakan,  metode  ekstraksi  dan waktu serta suhu yang digunakan.

## Kesimpulan
Dari hasil penelitian ini disimpulkan  bahwa  ada  potensi penggunaan  senyawa  aktif  dalam ekstrak  limbah  jeruk  dengan  pelarut n-heksana  yang  digunakan  sebagai antibiotik  alami  untuk  menekan perkembangan  bakteri  patogen  pada ayam  broiler  terutama E.  coli dan S. enteriditis
Tabel 2.  Pengaruh  pemberian  ekstrak  limbah  jeruk  n-heksana  terhadap  daya hambat bakteri E. coli dan S . enteritidis.
Perlakuan Limbah jeruk n-heksana (ppm) Daya hambat ( %) E. coli S. enteriditis P0 26,70 a 26,70 a P1 19,36 b 10,95 b P2 18,64 b 11,94 b P3 21,66 c 13,46 c P4 22,87 c 18,99d
Keterangan : Konsentrasi Disc 30 mg/ml.
Huruf  kecil  yang  berbeda  pada  kolom  yang  sama    menunjukkan    berbeda  nyata (P<0.05)

## Daftar Pustaka
Ekwenye U. N. and V. E. Oghenerobo. 2010.  The  antibacterial  activity  of crude  leaf  extract  of Citrus  sinensis (sweet  orange).  J.  Pharma  and  Bio Sci. 1(4) : 742-750.
Fu  S.H,  M.H.  Yang,  H.M.  Wen,  J.C. Chern. 2005. Analysis of flavonoids in propolis by capillary electrophoresis.  J.  Food  drug  anal 13: 43-50.
Garau  MC,  S.  Simal,  C.  Rosselló,    A. Femenia.  2007.  Effect  of  air-drying temperature  on  physico-chemical properties  of  dietary  fibre  and antioxidant  capacity  of  orange ( Citrusaurantium  v.  Canoneta )  by- products.  J.  Food  Chem  104:  1014- 1024.
Haroen  U  (2014).  Kajian  ekstrak limbah  jus  jeruk  sebagai Feed Additive dan pengaruhnya terhadap performan  ayam  broiler.  Disertasi Pascasarjana  Universitas  Andalas Padang.
Haroen U, Y. Marlida, Mirzah and A. Budiansyah.  2013.  Extraction  and
isolation
phytochemical and antimicrobial  activity  of  limonoid compounds  from  orange  waste juice. Pak. J. Nutr.12(8) : 730-735.
Kirbaslar.  F.G,  A.  Tavman,  B.  Dulger And G. Turker. 2009. Antimicrobial activity  of  turkish  citrus  peel  oils. Pak. J. Bio. 41 (6) : 3207-3212.
Lia  BB,  B.  Smith,  M.  Hossain.  2006. Extraction  of  phenolics  from  citrus peels  I.  Solvent  extraction  method. Sep Purific Tech 48: 182-188.
Long  H.H,  N.  Furuya,  D.  Kurose,  M. and Y. Takanami .2003. Isolation Of endophytic  bacteria  from  salanum sp.  and  their  antibacterial  activity against plant phatogenic bacatria. J. Fac. Agr. Kejushu. 48 (12): 21-28.
Soehardjan,  M.  1994.  Konsepsi  dan Strategi Penelitian dan Pengembangan  Pestisida  Nabati. Prosiding  Seminar  Hasil  Penelitian dalam Rangka Pemanfaatan
Pestisida  Nabati.  1-2  Desember 1993. Balitro. Bogor. pp. 11-18.
Vust   L.D and   E.J. Vandamme. 1994. Antimicrobial  potential  of  lactic acid  bacteria.  InL.  D  Vust  and  E.J. Vandamme.  Baktericcins  of  lactic Acid bacteria microbiology  genetic and  aplication  balckie  academic  & professional London.
Walton,  J.R.  1977.  A  Mechanism  of growth promotion: Non-lethal feed antibiotic  induced  cell  wall  lesions inenteric  bacteria.  In:  Antibiotics and Antibiosis. Woodbine, M. (Ed). Butterworths, London. pp. 259-264.