## THE  CYTOTOXIC  AND  PROLIFERATIVE  ACTIVITY  OF  COCOA  POD  HUSK  EXTRACT  (THEOBROMA CACAO L.) ON PERIODONTAL LIGAMENT FIBROBLASTS
Yani Corvianindya Rahayu*, Iin Eliana Triwahyuni **, Dewi Yunita Sari*** Banun Kusumawardhani****,

## ABSTRACT
Background: Theobroma  cacao  was  considered  agricultural  wastes.  Cocoa pod husk contain various bioactive compounds as natural antioxidants,antibacterial  and  anti-inflammatory.  A  good  biomaterial  must  be non-toxic  and have  no  detrimental effect on t he biological environment.   The a im  of  research  was  to  determine  the  cytotoxicity  and  proliferative  activity  of cocoa pod husk extract on primary cells of periodontal ligament fibroblasts.
Method: This experimental laboratory used primary cell culture of periodontal ligament fibroblasts. The cytotoxicity and proliferative activity were analyzed by MTT  assay  [2-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl  tetrazolium  bromide]. Extraction  of  cacao  pods  were  obtained  using  the  ultrasonic  homogenizer method with ethanol 70%. The cytotoxicity test was observed for 24 hours and the doubling time proliferative test was observed for 24, 48, and 72 hours. Result: Cocoa pod husk extract showed there were no cytotoxic effects with viability of primary cells of periodontal ligament fibroblasts at the concentration of 1.56 µg/ml, 3.125 µg/ml, 6.25 µg/ml, 12.5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, and 100 µg/ml. The proliferation  test  showed  increasing  of  fibroblasts  at  24  and  48 hours. Kruskal Wallis analysis obtained a significance value (p<0.05) Conclusion: C ytotoxicity and proliferation assays of Cocoa pod husk extract increased cell viability and cell proliferation of periodontal ligament fibroblast.
_______________________________________________________________________________________

## PENDAHULUAN
Rongga  mulut  mencerminkan  kesehatan tubuh  secara  umum  karena  merupakan port  de entry pertama  masuknya  makanan.  Penyakit rongga mulut bisa bersifat jinak atau ganas maupun yang  dapat  sembuh  sendiri  ( self  limiting ).  Kondisi tersebut  bisa  terjadi  tanpa  atau  dengan  keluhan, sehingga dapat mengganggu fungsi dan kenyamanan  dari  rongga  mulut  yang  dapat menyebabkan terjadinya defisiensi nutrisi. 1,2
Pengelolaan  penyakit  mulut  biasanya  sangat kompleks, umumnya masyarakat akan mengkonsumsi  obat-obatan.  Beberapa  obat  non- steroid anti inflamasi memiliki efek samping seperti gangguan saluran cerna, hipertensi, dan
perdarahan,  sehingga,  diperlukan  suatu  bahan alami  yang  memiliki  efek  samping  seminimal mungkin tetapi memiliki efektivitas tinggi. 3,4
Kulit  buah  kakao (Theobroma  cacao  L.) merupakan limbah dari industri pengolahan cokelat. Jember  merupakan  produsen  kakao  terbesar  di Jawa  Timur,  selama  ini  hanya  memanfaatkan limbah kulit kakao sebagai pakan ternak saja. Kulit biji  kakao  diketahuin  kaya  dengan  kandungan polifenol,  dan  kandungan  flavonolnya  lebih  tinggi dibanding dengan tanaman lain, Polifenol merupakan  senyawa  fitokimia  berupa  flavonoid, tannin,  proantosianidin,  katekin,  dan  epikatekin. 5 Polifenol  dapat  dimanfaatkan  sebagai  antioksidan alami,  antiinflamasi, dan antibakteri.  Polifenol juga
*Departemen Biologi Oral Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember **Departemen Ilmu Penyakit Mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember ***Program Pendidikan Sarjana Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember ****Departemen Biomedik Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember
Correspondence: yani.fkg@unej.ac.id

## Keywords:
Cocoa pod husk; Cytotoxicity; Proliferative; Periodontal ligament fibroblasts
memiliki  manfaat  bagi  proses  penyembuhan  luka dengan mempercepat regenerasi jaringan. 6
Biomaterial di bidang kedokteran gigi harus memenuhi  persyaratan,  yaitu  biokompatibilitas yang  baik,  tidak  toksis,  non  iritan,  dan  tidak merugikan  lingkungan  biologis.  Evaluasi  bahan kedokteran  gigi  dapat  dilakukan  dengan  uji toksisitas,  untuk  mengukur  efek  toksik  bahan terhadap sel atau untuk mengetahui apakah bahan tersebut  memenuhi  syarat  untuk  diterima  dalam jaringan.  Efek  sitotoksisitas  suatu  bahan  diukur dengan melakukan pengukuran terhadap viabilitas sel  pada  kultur. 7 Kultur  sel  fibroblas  dapat  diambil dari jaringan ligamen periodontal manusia.
Sedangkan  aktivitas  proliferasi  merupakan  salah satu  fase  dalam  penyembuhan  luka,  yaitu  fase dimana matriks fibrin mulai masuk ke daerah luka, stimulasi growth  factor, ECM,  dan  angiogenesis dimana sangat berperan dalam proses penyembuhan.
Pada penelitian ini penulis ingin mengetahui aktivitas  sitotoksisitas  dan  kemampuan  proliferasi ekstrak kulit buah kakao menggunakan menggunakan serial dilution dengan dosis konsentrasi 1.56 ; 3.125; 6.25 ; 12.5 ; 25 ; 50 ; 100, dan 200 µg/ml terhadap kultur sel primer fibroblas ligamen periodontal.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  eksperimental  laboratoris  ini telah
melalui
persetujuan
etik no.1128/UN25.8/KEPK/DL/2021  oleh  Komisi  Etik Penelitian  Kesehatan  Fkalutas  Kedokteran  gigi Universitas Jember.
Sampel  penelitian  yang  digunakan  adalah s el  fibroblas  ligamen  periodontal  yang  telah dikultur dan dilakukan kriopreservasi,
merupakan
koleksi dari Laboratorium Kedokteran  Molekular  CDAST  Universitas
Jember. Sel fibroblas dikultur dalam media DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) , ditambahkan 10  %  FBS,  2%  penisilin-streptomycin,  dan  0.5% amphotericin. diinkubasi  ke  dalam  inkubator CO 2 5% pada suhu 37 o C selama 2 hari. Panen sel dilakukan setelah mencapai 80% konfluen. Identifikasi  buah  kakao (Theobroma  cacao  L.) dengan tipe lindak (Forastero) dari PT Perkebunan Nusantara  XII  Jember.  Ekstraksi  kulit  buah  kakao menggunakan metode Ultrasonic Homogenizer.
Pada  penelitian  ini  digunakan  2  kelompok kontrol  diantaranya  kelompok  kontrol  sel  dan kontrol  media,  serta  8  kelompok  perlakuan diantaranya  konsentrasi  1.56  µg/ml,  3.125  µg/ml, 6.25  µg/ml,  12.5  µg/ml,  25  µg/ml,  50  µg/ml,  100 µg/ml, dan 200 µg/ml.

## Uji aktivitas sitotoksik dengan metode MTT
Sel  fibroblas  didistribusikan  dalam  96 sumuran,  yang  masing-masing  berisi  sel  fibroblas dan  media  kultur  DMEM  dengan  densitas  5x10 3 sel/well 100 µl, setelah itu diinkubasi selama 24 jam pada  suhu  37 o C.  Sel  fibroblas  diamati  di  bawah mikroskop inverted. Ekstrak  kulit  buah  kakao dengan osis konsentrasi 1.56 ; 3.125; 6.25 ; 12.5 ; 25  ;  50  ;  100,  dan  200  µg/ml  dimasukkan  dalam setiap sumuran, dengan tiap konsentrasi sebanyak 3  sumuran.  Setelah  itu  diinkubasi  selama  24  jam dan  ditambahkan  larutan  MTT  (Microtetrazolium) sebanyak 100 µl, dan diinkubasi kembali selama 4 jam  pada  suhu  37 o C.  Stopper  reagent  (SDS  10%
dalam 0.1 N HCL) ditambahkan untuk menghentikan  reaksi  MTT dan  digetarkan  di  atas shaker selama  1  jam.  Data  absorbansi  dibaca dengan    ELISA reader pada  λ  570  nm,  dan dinyatakan  dalam optical  density (OD),  kemudian hasil  dikonversi  ke  dalam  rumus  persentase viabilitas  sel. 7 Hasil  persentase  viabilitas  sel
Absorbansi perlakuan-absorbansi media  x 100% Absorbansi kontrol  sel-absorbansi media
dimasukkan dalam regresi linier untuk menghitung IC 50 .
% Viabilitas Sel =

## Uji proliferasi sel (doubling time)
Parameter  proliferasi  sel  diuji  dengan menghitung  viabilitas  sel  tiap  24  jam,  48  jam,  dan 72  jam.  Metode  MTT  juga  digunakan  dalam  uji proliferasi  sel.  Sel  Periodontal  Ligamen  ditanam pada  microplate  96  well  dengan  kepadatan  5x10 3 sel/sumuran  dan  diinkubasi  selama  24  jam  untuk mendapatkan  pertumbuhan  yang  baik.  Medium diganti  dan  ditambahkan  larutan  uji  berbagai konsentrasi  dengan co-solvent DMSO,  diinkubasi selama  24  jam,  setelah  itu    ditambahkan  100µL media  kultur  dan  10  µL  MTT    5  mg/mL  pada  tiap sumuran. Sel  diinkubasi  kembali  selama  4-6  jam dalam  inkubator  CO 2 5%,  37 o C,  plate  dibungkus dibiarkan selama satu malam. Pengukuran dilakukan  pada  waktu  ke-0,  24,  48,  dan  72  jam. Serapan dibaca dengan microplate reader (Biorad) pada panjang gelombang 595 nm.  Uji proliferasi sel dan viabilitas sel menggunakan metode yang sama, hanya dibedakan pada variasi waktu. 10

## HASIL PENELITIAN

## Uji aktivitas sitotoksik
Berdasarkan pengamatan secara
mikroskopis, hasil uji MTT dianalisis dari perubahan warna  pada microplate ,  serta  nilai optical  density persentase sel yang hidup.
(a)
(b) (c)
Gambar  1. Gambaran  morfologi  sel  fibroblas  ligamen periodontal normal sebelum perlakuan dengan inverted microscope perbesaran  10x  (a).  Setelah  dilakukan seeding 96-well dan  inkubasi  24  jam  (b).  Setelah  diberi reagen  MTT,  terdapat  kristal  formazan  yang  terbentuk dengan perbesaran 10x menandakan sel fibroblas yang masih hidup (c)
Data hasil OD mengenai sitotoksisitas ekstrak pada dosis konsentrasi 1.56 ; 3.125; 6.25 ; 12.5 ; 25 ; 50 ;  100,  dan  200  µg/ml  terhadap  kultur  sel  primer fibroblas  ligamen  periodontal  dapat  dilihat  pada tabel 1.
Tabel 1. Rata-rata nilai OD dan persentase viabilitas sel primer fibroblas ligamen periodontal Perlakuan (µg/ml) Rata-rata OD Viabilitas sel (%) ( 𝑥 ± SD) 1.56 0.373 111.48 ± 0053 3.125 0.361 107.65 ± 0.04 6.25 0.358 106.83 ± 0.009 12.5 0.344 102.38 ± 0.046 25 0.325 96.59 ± 0.022 50 0.320 95.14 ± 0.039 100 0.309 91.52 ± 0.009 200 0.268 79.01 ± 0.014 KS 0.336 100 ± 0.029 Keterangan: KS : Kontrol Sel SD
: Standar deviasi
Klasifikasi tingkat toksisitas berdasarkan
jumlah  sel  yang  hidup  dikelompokkan sebagai  berikut:  non-toksik  (sel  yang  hidup  lebih dari 90%), sedikit toksik (sel yang hidup antara 60% sampai 90%), cukup toksik (sel yang hidup antara 30%  sampai  59%),  dan  sangat  toksik  (sel  yang hidup kurang dari 30%). 8
Rata-rata persentase viabilitas sel dihitung inhibition concentration ( IC 50 ) menggunakan regresi linier.  Hasil  penghitungan  dapat  dilihat  pada gambar berikut.
Gambar  2. Regresi  linier  pengaruh  konsentrasi  ekstrak kulit  buah  kakao  terhadap  persentase  viabilitas  sel fibroblas ligamen periodontal
Pada  analisis  regresi  linier  diperoleh persamaan yaitu y= -13.792x + 116.03 dengan nilai IC 50 sebesar  61313.78  µg/ml.  Menurut  USA
National Cancer Institut menjelaskan bahwa rentan nilai  IC 50 ≥  500  µg/ml  tidak  toksik. 9 Berdasarkan kriteria  tersebut  kelompok  perlakuan  sitotoksisitas terhadap sel fibroblas ligamen periodontal menunjukkan  bahwa  perlakuan  ekstrak  kulit  buah kakao dengan pelarut etanol 70% termasuk dalam kategori tidak toksik.
Hasil uji Kruskall  Wallis menunjukkan nilai signifikansinya  sebesar  0.025  (p<0.05)  artinya terdapat  perbedaan  viabilitas  sel  yang  antara kelompok  perlakuan  dan  kelompok  kontrol.  Untuk melihat  perbedaan  yang  terjadi  antar  setiap kelompok  dilakukan  uji Mann  Whitney diperoleh pada konsentrasi 6.25 µg/ml didapatkan perbedaan
bermakna  dengan  konsentrasi  200  µg/ml,  100 µg/ml, 25 µg/ml, serta kontrol media.

## Uji pengamatan proliferasi sel
Hasil  uji doubling  time menunjukkan peningkatan  viabilitas  sel  setelah  perlakuan  dan inkubasi selama 24 jam, 48 jam, dan menurun pada 72  jam.  Hasil  ini  terjadi  hampir  di  semua konsentrasi, terutama pada 18.75 µg/ml. Jumlah sel hidup  yang  menurun  pada  pada  jam  ke-72, disebabkan  banyak  sel  yang  mati  akibat  metabolit sel  dan  jumlah  sel  terus  meningkat  sedangkan jumlah nutrisi terus berkurang.
Gambar 3. Rata-rata viabilitas sel pada uji proliferasi doubling time 0, 24, 48 dan 72 jam
Gambar 4. Kurva kinetika aktivitas proliferasi sel fibroblas PDLSCs yang  diinkubasi selama 0, 24, 48, dan 72 jam
y = -13,792x + 116,03 R² = 0,9292 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 0,0001,0002,0003,000 Vi abil itas Sel (% ) Log Konsentrasi (µg/ml) Series1 Linear (Series1) 0 20 40 60 80 100 120 140 0 24 48 72
18,75 15,625 12,5 9,375
6,25 0 20 40 60 80 100 120 140 0 24 48 72
18,75 15,625 12,5 9,375 6,25

## DISKUSI
Metode MTT  assay merupakan  uji  yang didasarkan  pada  pemecahan  garam  tetrazolium yang  berwarna  kuning  menjadi  kristal  formazan. Intensitas  warna  dari  kristal  formazan  yang berwarna  ungu  dibaca  menggunakan  ELISA reader. Semakin  kuat  intensitas  warna  ungu  yang terbentuk maka semakin tinggi nilai absorbansinya. Semakin  tinggi  nilai  absorbansi  maka  semakin besar viabilitas selnya. 11
Persentase  sel  yang  hidup  lebih  dari  90% (tidak toksik) terdapat pada konsentrasi 1.56 µg/ml, 3.125  µg/ml,  6.25  µg/ml,  12.5  µg/ml,  25  µg/ml,  50 µg/ml, dan 100 µg/ml.   Hasil  tabel    menunjukkan bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  ekstrak  kulit buah  kakao  maka  menyebabkan  penurunan viabilitas sel fibroblas ligamen periodontal.
Kulit  buah  kakao  pada  penelitian  ini merupakan  biomaterial  herbal  alternatif  yang memiliki manfaat di bidang kesehatan. Kandungan polifenol  yang  tinggi  dapat  dimanfaatkan  sebagai antioksidan  alami,  antiinflamasi,  dan  antibakteri. 6 Ekstrak kulit buah kakao yang digunakan dilarutkan menggunakan  etanol.  Dalam  proses  ekstraksi, pelarut  akan  melarutkan  bahan  yang  polaritasnya sejenis. Etanol sebagai pelarut memiliki sifat polar karena memiliki gugus hidroksil (-OH). Berdasarkan hasil  uji  fitokimia  ekstrak  kulit  buah  kakao  dengan menggunakan  pelarut  etanol  70%  menunjukkan bahwa  kandungan  flavonoid,  tanin,  saponin,  dan alkaloid  memiliki  intensitas  positif  sangat  kuat karena  etanol  lebih  mudah  berpenetrasi  ke membran  sel  untuk  mengekstrak  bahan  aktif  dari tanaman. 12
Hasil penelitian menunjukkan bahwa semakin  tinggi  konsentrasi  ekstrak  kulit  buah kakao,  maka  semakin  rendah  nilai  absorbansi (optical  density) yang  didapatkan.  Hal  ini  terbukti dari hasil yang didapat, tampak adanya penurunan viabilitas  sel  fibroblas  ligamen  periodontal  seiring
dengan peningkatan konsentrasi ekstrak kulit buah kakao.  Pada  kosentrasi  1.56  µg/ml,  3.125  µg/ml, 6.25 µg/ml, 12.5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, dan 100 µg/ml  didapatkan  viabilitas  sel  fibroblas  ligamen periodontal lebih dari 90%.
Menurut  Heravi et  al (2013),  suatu  bahan diklasifikasikan  tidak  toksik  apabila  rata-rata viabilitas  selnya  lebih  dari  90%.  Berdasarkan  hal tersebut  menunjukkan  ke-7  konsentrasi  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  tidak  toksik.  Sel fibroblas  tetap  hidup  dapat  disebabkan  karena adanya  kandungan  flavonoid  ekstrak  kulit  buah kakao  yang  berperan  sebagai  antioksidan  alami, dan  telah  dibuktikan  menggunakan  uji  aktivitas antioksidan dengan pelarut etanol 70% menggunakan metode DPPH, kemudian diperoleh nilai  IC 50 sebesar  62  mg/L  dan  tergolong  dalam kategori  antioksidan  kuat.  Pada  konsentrasi  200 µg/ml  didapatkan  viabilitas  sel  fibroblas  ligamen periodontal  79.01%  yang  termasuk  bersifat toksik. Menurut  Heravi et  al (2013),  suatu  bahan diklasifikasikan sebagai sedikit  toksik apabila rata- rata  viabilitas  selnya  antara  60%  sampai  90% . Kenaikan  konsentrasi  pada  ekstrak  kulit  buah kakao  dapat  membuat  antioksidan  senyawa flavonoid  berkurang  dan  akan  mengubah  sifat flavonoid menjadi prooksidan yang mempengaruhi sel fibroblas ligamen periodontal dengan menyebabkan nekrosis pada sel. 8
Sebagai senyawa aktif metabolit sekunder, Tanin merupakan turunan polifenol dengan tingkat kepolaran yang tinggi, oleh karena itu bila diberikan dalam  konsentrasi  tinggi  mempunyai  kemampuan untuk  menyebabkan  genotoksik,  yaitu  rusaknya informasi  genetik  dalam  sel.  Adanya  ikatan  antar senyawa  polar  dengan  lipoprotein  sel  dapat mengakibatkan  terjadinya  penimbunan  senyawa dan pemecahan lemak, sehingga, permeabilitas sel fibroblas  ligamen  periodontal  akan  terganggu menyebabkan sel menjadi bengkak dan pecah. 13
Pada kulit buah kakao, kandungan saponin memiliki  sifat  toksisitas  yang  cukup  kuat.  Hal tersebut dikaitkan dengan struktur saponin terdapat molekul ampifatik, yaitu molekul yang memiliki regio hidrofobik  serta  hidrofilik  yang  dapat  melarutkan protein  membran.  Ujung  hidrofobik  saponin berikatan dengan regio hidrofobik protein membran sel  dan  merusak  unsur  lipid  yang  terikat.  Ujung hidrofilik  yang  bebas  akan  membawa  protein  ke dalam  larutan  sebagai  kompleks  deterjen-protein, dan menyebabkan membran sel lisis. Saponin juga memiliki kemampuan untuk menginduksi apoptosis pada kultur sel fibroblas. 14
Alkaloid  dalam  kulit  buah  kakao  cukup tinggi  yaitu  5.06%.  Senyawa  ini  berperan  dalam mempengaruhi  kehidupan  sel  fibroblas  ligamen periodontal.  Alkaloid  bekerja  secara  spesifik  pada siklus  sel  dengan  menghambat  proses  mitosis. Adanya  hambatan  pembelahan  sel  tersebut  dapat menyebabkan  proses  proliferasi  sel  menjadi terhambat. Senyawa alkaloid juga dapat menyebabkan  adanya  ikatan  terhadap  tubulin, dengan menghambat polimerisasi protein ke dalam mikrotubulus.  Akibatnya,  fungsi  tubulin  sebagai sitoskeleton (penyusun bentuk/kerangka sel) menjadi terganggu, dan mengakibatkan gangguan transport zat ke dalam sel. 15
Penelitian  ini  sesuai  dengan  hipotesis bahwa  ekstrak  kulit  buah  kakao  pada  konsentrasi 1.56 µg/ml, 3.125 µg/ml, 6.25 µg/ml, 12.5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, dan 100 µg/ml tidak memiliki efek toksik  terhadap  kultur  sel  primer  fibroblas  ligamen periodontal.  Hal  tersebut  didukung  dengan  hasil penelitian  sebelumnya,  bahwa  daun  cengkeh (Syzygium  aromaticum) yang  memiliki  kandungan senyawa  aktif  meliputi  flavonoid,  tanin,  saponin, dan  alkaloid  pada  konsentrasi  sampai  125  µg/ml juga  bersifat  tidak  toksik  terhadap  sel  fibroblas. Senyawa  yang  menyebabkan  toksisitas  dapat melalui mekanisme yang berbeda, seperti
kerusakan  membran  sel,  pencegahan  sintesis protein,  penghambatan  rantai  nukleotida,  dan reaksi  enzimatik.  Selain  itu,  faktor  yang  mungkin berperan dalam sitotoksisitas bahan adalah waktu pemaparan  dan  mekanisme  toksisitas  senyawa tersebut.  Kematian  sel  terjadi  apabila  terdapat senyawa  yang  merusak  membran  sel,  sehingga terjadi gangguan pada sel untuk mempertahankan homeostasis, menyebabkan air dan ion ekstraseluler  masuk  ke  dalam  sel.  organel intraseluler, meliputi mitokondria akan membengkak dan pecah (lisis). 16

## KESIMPULAN
Uji  sitotoksisitas  ekstrak  kulit  buah  kakao memiliki  viabilitas  tinggi  pada  dosis  1.56  µg/ml, 3.125  µg/ml,  6.25  µg/ml,  12.5  µg/ml,  25  µg/ml,  50 µg/ml, 100 µg/ml, sehingga termasuk kategori tidak toksik. Melalui uji proliferasi pada konsentrasi yang sama  juga  terbukti  meningkatkan  proliferasi  sel pada 24 dan 48 jam.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian  ini  didukung  oleh  LP2M  Universitas Jember melalui bantuan dana hibah kelompok riset tahun 2020. .

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Thantawi  A,  Nova  M  M,  Marlisa  S,  Bakar  A . Stomatitis  apthosa  rekuren  (SAR)  minor multiple  pre  menstruasi  (laporan  kasus). ODONTO: Dental Journal. 2014;1(2):57-62.
2.  Ernawati  DS. Ilmu  Penyakit  Mulut  (Oral
Medicine) sebagai Jembatan yang Memfasilitasi  Ilmu  Kedokteran  Gigi  dan Kedokteran . Perpustakaan
Universitas Airlangga. 2011.
3.  Imananta  FP,  Sulistiyaningsih  S.  Artikel Tinjauan: Penggunaan  Nsaids  (Non  Steroidal Anti Inflamation Drugs)
Menginduksi
Peningkatan  Tekanan  Darah  Pada  Pasien Arthritis. Farmaka. 2018;16(1):72-79.
4.  Hapsari  K. Efektivitas  Salep  Ekstrak  Etanol Daun  Kamboja  (Plumeria  accuminata  Ait) terhadap  Penyembuhan Luka Gingival  Melalui
Pengamatan  Sel  PMN  (Polimorfonuklear ). 2014. Yogyakarta: Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.
5. Rahayu  YC,  Dharmayanti  AWS,  Putri  YE, Irmawati  A. The  analysis  of  poanthocyanidins cacao  peel  extract  (Theobroma  cacao  L) potential of the expression of TNF-a and COX- 2 on
periodontitis rats . a nd
COX-2 Intl  J  Pharmaceutical  Res.  2020;12(4):4337- 4343.
6.  Ackar  D,  Lendic  KV,  Valek  M  et  al. Cocoa Polyphenols:  Can  We  Consider  Cocoa  and Chocolate  as  Potential  Functional  Food? . Journal of Chemistry. 2013; Article ID 289392. http://dx.doi.org/10.1155/2013/289392
7.  Muslihah  K.,  Sumono  A,  Fatmawati  D  W  A. C ytotoxicity effect of pectin extract from coffea robusta  (coffea  canephora)  fruit  peels  on human  dental  pulp  fibroblasts  cell . Pustaka Kesehatan. 2018;6(1): 173-178.
8.  Heravi F, Ramezani M,  Poosti  M,  Hossein Mi, Shajiei  A,  Ahrari  F. In  Vitro  Cytotoxicity Assessment  of  an  Orthodontic  Composite Containing  Titanium –dioxide  Nano–particles.
Journal  of  Dental  Research,  Dental  Clinics, Dental Prospects. 2013;7(4): 192-198.
9.  Hameed-Abdel  ESS,  Bazaid  SA,  Shohayeb MM, El-Sayed MM, El Walkil SA.
Phytochemical  Studies  and  Evaluation  of Antioxidant,  Anticancer  and  Antimicrobial Properties of Conocarpus erectus L. Growing in
Taif,  Saudi  Arabia. European  Journal  of Medicinal Plants. 2012;2(2):93-112.
10.  Meiyanto E, Susidarti RA, Handayani S, Rahmi F. Ekstrak  etanolik  biji  buah  pinang  (Areca catechu  L.)  mampu  menghambat  proliferasi dan memacu apoptosis sel MCF- 7 . MFI. 2008; 19(1): 12-19.
11.  Hayyu N, Endah A, Djamhari M. Cytotoxicity of Garcinia  mangostana  Linn  pericarp  extract toward  human  gingival  fibroblast  cell .  Oral Medicine Dental Journal. 2013;4(1):10-16.
12.  Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G. & Kaur, H.  A  review:  Phytochemical  screening  and extraction. Internationale
Pharmaceutica Sciencia . 2011; 1(1) :98-106.
13.  Yunus  R. Uji  Sitotoksisitas  Ekstrak  Buah Mahkota  Dewa  (Phaleria  macrocarpa) .  2012. Surabaya: Universitas Airlangga.
14.  Renawati E. Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Aloe vera  Terhadap  Sel  Fibroblas  Sebagai  Bahan Medikamen Saluran Akar Secara In Vitro. 2011. Medan: Universitas Sumatra Utara.
15.  Fitriani F, Soetojo A, Subiwahjudi A. Sitotoksisitas Ekstrak Kulit Kakao (Theobroma cacao)  terhadap  Kultur  Sel  Fibroblas  BHK-21. Conservative  Dentistry  Journal.  2019;9(1):54- 65.
16.  Aslantürk  ÖS. In  vitro  cytotoxicity  and  cell viability  assays:  principles,  advantages,  and disadvantages. Genotoxicity-A Predictable
Risk  to  Our  Actual  World.  IntechOpen  Book. 2017;1-18.