Abstrak—Merkuri  adalah  logam  berat  yang  sangat  tosik  dan berbahaya.  Beberapa  bakteri  dapat  hidup  di  habitat  yang tercemar  merkuri  disebut  bakteri  resisten  merkuri,  satu diantaranya  adalah  Azotobacter.  Tujuan  penelitian  adalah mendapatkan  isolat  unggul  Azotobacter  dari  lahan  Eco  Urban Farming  ITS  yang  resisten  terhadap  HgCl 2 yang  berpotensi menghasilkan  enzim  merkuri  reduktase.  Isolasi  dilakukan menggunakan  media  selektif  Azotobacter  agar.  Pengujian resistensi merkuri dilakukan dengan metode goresan agar miring yang  megandung  HgCl 2 .  Kurva  pertumbuhan  menggunakan spektrofotometri  pada  panjang  gelombang  600  nm.  Hasil  isolasi mendapakan  10  isolat  Azotobacter  resisten  HgCl 2 .  Isolat  A5,  A6 dan  A9  mempunyai  resistensi  tertinggi  pada  penambahan  HgCl 2 20 mg/L. Pada A7, A10 dan A. chroococcum resisten mencapai 15 mg/L sedangkan A1a resisten mencapai 10 mg/L. Sedangkan ang hanya resisten sampai 5 mg/L adalah isolat A1b, A2, A3, dan A8. Dari  kesepuluh  isolat  yang  berpotensi  menghasilkan  enzim merkuri reduktase adalah isolat yang memunyai resisten tertinggi yaitu isolat A5 dan A9.
Kata  kunci--Azotobacter,  enzim  merkuri  reduktase,  gen  mer operon, Merkuri HgCl 2 .

## I. PENDAHULUAN
ERKURI mempunyai toksisitas yang tinggi untuk semua organisme karena  kekuatan  afinitas terhadap grup  thiol dalam protein [1]. Mekuri dapat menyebabkan kerusakan otak, kerusakan syaraf motorik, cerebral palsy, dan retardasi mental. Keracunan  Hg  yang  akut  dapat  menyebabkan  terjadinya kerusakan  saluran  pencernaan,  gangguan  kardiovaskuler, kegagalan  ginjal  akut  maupun  shock  [2].    Ambang  batas minimal  merkuri  yang  telah  ditetapkan  Pemerintah  melalui Peraturan  Pemerintah  Republik  Indonesia  no.82  tahun  2001 adalah 0,001 mg/L.
Di  alam,  merkuri  terbagi  menjadi  tiga  bentuk  yaitu  Hg 0 (metalik  merkuri),  Hg 2+ (merkurik  merkuri)  dan  Hg 2 2+ (merkurous merkuri). Ketiga bentuk merkuri tersebut menjaga keseimbangan struktur kimia mengikuti [3]:
Hg 2 2+ ↔ Hg 0 + Hg 2+
(1)
Merkuri  mempunyai  toksisitas  yang  tinggi  untuk  semua organisme karena kekuatan  afinitas terhadap grup thiol dalam protein [1].
Bakteri  resisten  merkuri  adalah  bakteri  yang  resisten merkuri  di  lingkungan  habitatnya,  baik  yang  bersifat  bakteri gram negatif dan bakteri gram positif. Resistensi merkuri oleh
bakteri disebabkan adanya gen mer operon yang terdiri dari 2 tipe  yaitu  mer  spektrum  sempit  yang  hanya  resisten  merkuri anorganik  dan  mer  spektrum  luas  yaitu  resisten  terhadap merkuri  organik  dan  merkuri  anorganik  [4].  Gen  mer  operon terdapat  di  plasmid  [5],  kromosom,  transposons,  dan integron [3].  Bakteri  dikatakan  resisten  terhadap  merkuri  jika  mampu tumbuh  pada  medium  yang  mengandung  mekuri  lebih  dari  5 mg/L [6].
Gen mer operon terdiri dari gen-gen struktural di antaranya gen merkuri reduktase  (merA) dan gen transport protein yaitu merT dan merP yang bersebelahan oleh merR dan merD yang melibatkan  regulasi  ekspresi  gen  strutural  dalam  respon  ion garam  merkuri  [4].  MerA  mempunyai  fungsi  mereduksi  ion merkuri  yang  toksik  menjadi  logam merkuri  Hg 0 yang  kurang toksik  dan  mudah  menguap  pada  suhu  kamar,  sedangkan  gen merB  mempunyai  fungsi  mengkatalisis  pemutusan  ikatan merkurikarbon  sehingga  dihasilkan  senyawa  organik  dan  ion Hg 2+ [7].
Azotobacter  adalah  bakteri  yang  banyak  dijumpai  di rhizosfer  tanah  melimpah  di  tanah  pertanian.  Azotobacter mampu  menambat  N 2 bebas  di  atmosfer  sehingga  dapat digunakan  sebagai  biofertilizer  dan  merupakan  bakteri  aerob [8].  Eco  Uban  Farming  di ITS merupakan lahan kebun sayur sebagai  wujud  kontribusi  ITS  dalam  melaksanakan  program Eco Campus [9]. Pada lahan kebun sayur tersebut diasumsikan terdapat  bakteri  fiksasi  N 2 di  rhizosfer  tanah,  salah  satuya adalah  Azotobacter.  Tujuan  penelitian  ini  untuk  mendapatkan isolat unggul Azotobacter  yang resisten tinggi terhadap HgCl 2 yang berpotensi menghasilkan enzim merkuri redukase.

## II. URAIAN PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  dilakukan  pada  bulan  Januari-Maret  2014  di Laboratorium  Mikrobiologi  dan  Bioteknologi  Jurusan Biologi FMIPA ITS.

## A. Isolasi Azotobacter
Sampel  tanah  diambil  dari  lahan  Eco  Urban  Farming  ITS 10  gram  tanah  dimasukkan  kedalam  90  ml  akuades  steril, selanjutnya dibuat seri pengenceran 10 -1 sampai 10 -8 kemudian ditumbuhkan pada  media  selekif  Azotobacter  agar  (High selective  media  M372-500G)  dengan  0,1  mg/L  HgCl 2 dengan metode  spread  dan  diinkubasi  pada  suhu  ruang.  Koloni  yang

## Resistensi Azotobacter terhadap HgCl 2 yang Berpotensi Menghasilkan Enzim Merkuri Reduktase
Anjar Lulu Sakinah dan Enny Zulaika Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia e-mail: enny@bio.its.ac.id
M
tumbuh  diamati  karakteristik  koloninya  dibandingkan  dengan kontrol  positif  yaitu  Azotobacter  chroococcum  .  Koloni  yang diduga Azotobacter dimurnikan dengan metode 16 gores pada media  Nutrient  Agar  dan  dilakukan  pewarnaan  methylen  blue untuk pengamatan kemurnian Azotobacter. Dilakukan pewarnaan  gram  dan  pewarnaan  kista  untuk  memastikan bahwa isolat tersebut adalah Azotobacter.

## B. Uji resistensi HgCl
2 Isolat  Azotobacter  ditumbuhkan  pada  media  Azotobacter agar  dan  ditambahkan  HgCl 2 sesuai konsentrasi uji  yaitu  0,5 mg/L,  5  mg/L,  10  mg/L,  15  mg/L  dan  seterusnya  sampai konsentrasi  yang  mampu  ditoleransi  Azotobacter  dengan interval  selanjutnya  5  mg/L.  Diinkubasi  24  jam  pada  suhu ruang.
C. Pembuatan kurva pertumbuhan genera Azotobacter Azotobacter ditumbuhkan  pada  media NB- HgCl 2 0,1 mg/L dan diinkubasi diatas rotary shaker (100 rpm). Setiap selang 1 jam,  diambil  2  ml  dan  diukur  nilai  kerapatan  optik  (OD; Optical  Density)  pada  panjang  gelombang  ( λ )  600  nm). Pengukuran OD dimulai dari jam ke-0 sampai jam ke-24.

## III. HASIL DAN DISKUSI

## A. Isolasi Azotobacter
Hasil  isolasi  Azotobacter  didapatkan  10  isolat  yang  diberi kode  A1a,  A1b,  A2,  A3,  A5,  A6,  A7,  A8,  A9,  dan  A10. Koloni  yang  berwarna  krem  sampai  coklat  adalah  isolat  yang diidentifikasi  sebagai  A.  chroococcum.  Perubahan  warna koloni  karena  mekanisme  pengikatan  nitrogen  bebas  dengan indikator  bromtimol  biru  dan  Isolat  A.  chroococcum  akan melakukan  metabolisme  dengan  memanfaatkan  mannitol sebagai  sumber  karbon  (C)  dan  mengubah  pH  media  menjadi asam  (pH  rendah)  ditandai  dengan  perubahan  warna  biru menjadi  krem-coklat  [10].  Selain  itu  pada  media  agar Azotobacter  ditambahkan  molibdenum  (Na 2 MoO 4 ) sebagai kofaktor  yang  sangat  esensial  yang  diperlukan  untuk metabolisme N bakteria [11]. Molibdenum adalah logam yang dibutuhkan untuk Azotobacter.

## B. Uji Resistensi HgCl 2
Pengujian  resistensi  10  isolat  Azotobacter  terhadap HgCl 2 dimulai dengan konsentrasi terendah sebesar 0,5 mg/L, kemudian dilanjutkan dengan konsentrasi 5 mg/L,10 mg/L, 15 mg/L, 15 mg/L, dan 20 mg/L. Isolat yang tumbuh pada media
yang mengandung HgCl 2 merupakan Azotobacter yang resisten terhadap  merkuri.  Hasil  uji  resistensi  ditampilkan  pada  Tabel 2.  Pada  konsentasi  5  mg/L  kesepuluh  isolat  mampu  tumbuh dengan  baik,  hal  ini  menunjukkan  10  sudah  termasuk  bakteri resisten  merkuri  (BRM).  Bakteri  dikatakan  resisten  terhadap merkuri  jika  mampu  tumbuh  pada  medium  yang  mengandung merkuri lebih dari 5 mg/L [12].
Pada  konsentrasi  HgCl 2 10  mg/L  hanya  6  isolat  ditambah isolat kontrol A. chroococcum yang mampu tumbuh yaitu A1a dengan  pertumbuhan  50%,  isolat  Azotobacter  A5,  A6  dengan pertumbuhan  100%,  isolat  Azotobacter  A7,  A9,  dan  A10 tumbuh  dengan  100%  serta  A.  chroococcum  mencapai  50%  . Selanjutnya  yang  digunakan  sebagai  isolat  yang  berpotensi memproduksi  enzim  merkuri  reduktase  adalah  isolat  yang 100%  resisten  pada  konsentrasi  HgCl 2 20  mg/L  dengan karakter  koloni  yang  berbeda  diantaraya  adalah  isolat Azotobacter  A5  dan  A9,  kemudian  ditambah  isolat Azotobacter  A1  sebagai  pembanding,  sebab  karakter  koloni Azotobacter  A1  yang  mendekati  kontrol  A.  chroococcum  dan isolat kontrol A. chroococcum.
Bakteri  resisten  merkuri  toleransi  terhadap  logam  berat karena  memunyai  gen  yang  mengontrol  mekanisme  resisten terhadap merkuri didalam kromosom, plasmid, atau transposon [13]. Secara umum ada dua kemampuan resistensi bakteri yaitu dengan mekanisme enzimatis dan mekanisme biosorpsi [14].

## C. Kurva Pertumbuhan Genera Azotobacter
Hasil  kurva  pertumbuhan  dilakukan  pada  3  isolat Azotobacter uji ditampilkan pada Gambar 1. Pola pertumbuhan  isolat  Azotobacter  A1a,  A5  dan  A9  mempunyai pola pertumbuhan yang hampir sama yaitu fase lag merupakan fase  adaptasi,  pada  kurva  pertumbuhan  tidak  dijumpai  sebab hasil  pengukuran  OD  (Optical  Density)  dilakukan  setelah melakukan  subkultur  pada  media  yang  sama.  Apabila subkultur  dilakukan  dalam  keadaan  fase  eksponensial  pada medium yang sama maka tidak akan terjadi fase lag dan secara cepat  akan  memasuki  kedalam  fase  eksponensial  [15].  Pada penelitian  ini  pemindahan  inokulum  Azotobacter  dilakukan setelah  24  jam,  pada  medium  yang  sama  sehingga  langsung terjadi  fase  eksponensial  dan  tidak  tampak  adanya  fase
Tabel 2. Persentase (%) tumbuh hasil uji resistensi HgCl 2
Kode Isolat
Konsentrasi HgCl ₂ ₂₂ ₂ (mg/L) 0.5 5 10 15 20 A1a 100 60 50 - - A1b 100 100 - - - A2 100 100 - - - A3 100 80 - - - A5 100 90 100 50 50 A6 100 100 100 50 25 A7 100 90 100 50 - A8 100 80 - - - A9 100 100 80 35 30 A10 100 100 80 60 - Azotobacter chroococcum 100 100 50 50 - *inkubasi dilakukan 48 jam Tabel 1. Generic assigment isolat Azotobacter uji Karakter Kode isolat A1a A1b A2 A3 A5 A6 A7 A8 A9 A10 Bentuk sel basil-kokus + +
+ + +
+ + + + + Ukuran sel 1,5-2,0 µm + - - + + +
+ - + - Membentuk kista + + + + + + + + + +
Gram negatif + + + + + + + + +
+ Motil + + + + + + + + + + Fiksasi nitrogen +
+
+ + + + + + + + Membutukan Molibdenum + + + + + + + + + +
adaptasi.  Fase  eksponensial  pada  isolat  Azotobacter  A5  dan A9  mempunyai  pola  hampir  sama  yaitu  terjadi  pada  jam  ke-1 sampai  jam  ke-13  berbeda  dengan  isolat    Azotobacter  A1a mempunyai  fase  eksponensial  yang  terjadi  pada  jam  ke-1 sampai  jam  ke-17.  Pertumbuhan  sel  pada  fase  eksponensial biasanya  paling  tinggi  dibandingkan  fase-fase  yang  lain  pada pola  pertumbuhan  [15].  Selama  pertumbuhan  sel  terjadi peningkatan  massa  sitoplasma  pada  saat  fase  eksponensial akibatnya  massa  sel  akan  meningkat  pula  [16].  Waktu  pada fase  eksponen  kemudian  dilakukan  perhitungan  rata-rata sebagai umur perlakuan.
Berdasarkan  fase  pertumbuhan,  umur  perlakuan  untuk pengujian  aktivitas  enzim  merkuri  reduktase,  lebih  tepat dilakukan  saat  rata-rata  fase  eksponensial  ketika  dilakukan proses  ektraksi  enzim,  pada  isolat  Azotobacter  A1a  pada  jam ke-9  isolat  Azotobacter  A5  dan  A9  dilakukan  pada  jam  ke-7. Kurva pertumbuhan ditampilkan pada Gambar 1.

## IV. KESIMPULAN
Kesimpulan  dari  penelitian  ini  adalah  hasil  dari  isolasi Azotobacter yang resisten HgCl 2 dari lahan eco urban farming ITS adalah 10 isolat yaitu A1a, A1b, A2, A3, A5, A6, A7, A8, A9, A10. Pada isolat A5, A6 dan A9 resisten sampai 20 mg/L HgCl 2 , isolat A7,  A10  dan  kontrol    A.  chroococcum  resisten sampai  15  mg/L,  isolat  A1a  resisten  sampai  10  mg/L  HgCl 2 , isolat  A1b,  A2,  A3  dan  A8  resisten  sampai  10  mg/L  HgCl 2 . isolat  yang  berpotensi  memproduksi  enzim  merkuri  reduktase adalah  isolat  yang  100%  resisten  pada  konsentrasi  HgCl 2 20 mg/L  dengan  karakter  koloni  yang  berbeda  diantaraya  adalah isolat Azotobacter A5 dan A9.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  A.  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Dr.  Enny Zulaika, MP. selaku Dosen Pembimbing penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Takeuchi,  F.  and  Sugio,  T.  2006.  Volatilization  and  Recovery  of Mercury  from  Mecury  Pluted  Soils  and  Wastewater  Using  Mercury Resistant Acidithiobacillus ferrooxidans  Strains SUG 2-2 and MON-1. Research Microbiology. 152: 503–514.
[2] Sudarmaji, Mukono, J. dan I.P, Corie. 2006. Toksikologi Logam  Berat B3  dan  Dampaknya  Terhadap  Kesehatan.  Bagian  Kesehatan
Lingkungan FKM. Jurnal Kesehatan Lingkungan.2(2) : 129-142.
[3] Dash,  H.R.  and  Das,  S.  2012.  Bioremidiation  of  Mercury  and Importance  of  Bacterial  Mer  Genes.  International  Biodeterioration  and Biodegradation 75: 207-213.
[4] Brown,  N.L.,  Shih,  Y.C.,  Leang,  C.,  Glendinning,  K.J.,  Hobman,  J.L. and Wilson, J.R. 2003. Mercury Transport and Resistance. Biochemical Society Transactions. 30 (4): 715-718.
[5] Fox,  B.  and  Walsh,  C.T.  1982.  Mercuric  Reduktase.  Purification  and Characterization  of  a  Transposon-encoded  Flavoprotein  Containing  an Oxidation  Reductionactive  Disulfide.  Journal  Biology  Chemistry.  257: 2498-2503.
[6] De,    J.,  Ramaiah,  N.  and  Vardanyan,    L.  2008.  Detoxificatin  of  Toxic Heavy  Metals  by  Marine  Bateria  Highly  Resistant  to  Mercury.  Marine Biotechnology. 10: 471–477.
[7] Barkay,  T.,  Miller, S.M. and  Summers, A.O.  2003.   Bacterial  Mercury Resistance  from    Atoms  to    Ecosystems.  FEMS  Microbioiological Reviews. 27:355-384.
[8] Salhia,  Basel  M.  2010.  The  Effect  of  Azotobacter  chrococcum  as Nitrogen  Biofertilizer  on  the  growth  and  yield  of  Cucumis  Sativus. Thesis  Master  of  Biological  Sciences  Botany.  The  Islamic  University: Gaza.
[9] Institut  Teknologi  Sepuluh  Nopember.  2013.  ITS  Eco  Urban  Farming. https://www.its.ac.id/article/urban-farming/en.>  [25  Nopember  2013. Pukul 19.15 WIB.]
[10] Muhaimin,  A.N., Siswanto,  H.P., Tyasningsih, W. dan Suryanie. 2013. Perbedaan  Warna  Koloni  Escherichia  coli  dan  Pseudomonas aeruginosa  pada  Media  Ekstrak  Daging  Sapi  dan  Sari  Kacang  Hijau yang Ditambah Sitrat dan Bromthymol Blue. Veterinaria Medika. Vol.6 (1). 9-14.
[11] Armiadi.  2009.  Peranan  Unsur  Hara  Molibdenum  Dalam  Penambatan Nitrogen. Wartazoa. Vol.19 (3). 150-155.
[12] De,  J., Ramaiah, N. and Vardanyan,  L. 2008. Detoxificatin of Toxic Heavy Metals by Marine Bateria Highly Resistant to Mercury. Marine Biotechnology. 10: 471–477.
[13] Zulaika,  E.  and  Sembiring,  L.  2013.  Indigenous  Mercury  Resistant Bacterial  Isolates  Belong  To  The  Genus  Bacillus  From  Kalimas Surabaya  As  A  Potential  Mercury  Bioreducer  .  J.  Appl.  Environ.  Biol. Sci. 4(1)72-76.
[14] Rehman,  A.,  Ali,  A.,  Muneer,  B.  and Shakoori,  A.R.  2007. Resistance and  Biosorption  of  Mecury  by  Bcateria  Isolated  from  Industrial Effluents. Pakistan j. Zool., vol. 39 (3). 137-146.
[15] Madigan,  M.T.,  Martinko,  J.M.,  Stahl,  D.A.  and  Clark,  D.P.  2006. Biology  of  Microorganisms.  Pearson  Education,  Inc.  Benjamin Cummings: Netherlands.
[16] Cooper, Stephen. 2003. Distinguishing Between Linear and Exponential Cell  Growth  During  The  Division  Cycle:  Single-cell  Studies,  Cell- culture  Studies,  and  The  object  of  Cell-cycle  Research.  Theoretical Biology and Medical Modelling. 3(10). 1-15.
Gambar. 1.  Kurva pertumbuhan Azotobacter A1a, A5 dan A9