## BIOTROPIKA Journal of Tropical Biology
https://biotropika.ub.ac.id/
Vol. 8   |   No. 2   |   2020   |   DOI: 10.21776/ub.biotropika.2020.008.02.06

## PENGARUH PROTEIN CSN1S2 DARI SUSU DAN YOGURT KAMBING PERANAKAN ETHAWAH TERHADAP KOMPOSISI MIKROBIOTA PADA FESES TIKUS RA-CFA

## EFFECT OF CSN1S2 PROTEIN ETHAWAH CROSSBREED MILK AND YOGURT ON THE COMPOSITION OF MICROBIOTA IN RA-CFA FECAL RATS
Adhya Dava Aligarh Yahya 1) , Eko Suyanto 1,2) , Fatchiyah Fatchiyah 1,2)*

## ABSTRAK
Rheumatoid  arthritis  (RA)  merupakan  salah  satu  penyakit  autoimun  yang menyebabkan inflamasi pada jaringan sinovial. Prevalensi RA semakin meningkat setiap tahunnya dan berpotensi menghambat produktivitas. Komposisi mikrobiota merupakan  salah  satu  faktor  lingkungan  yang  mempengaruhi  perkembangan penyakit  RA.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengamati  efek  pemberian protein  CSN1S2  susu  dan  yogurt  peranakan  Ethawah  terhadap  komposisi mikrobiota  pada  usus  tikus  rheumatoid  arthritis  yang  diinduksi  Complete Freund’s Adjuvant (CFA). Tikus dibagi menjadi dua model yakni kontrol dan RA yang masing – masing diberi perlakukan protein CSN1S2 susu dan yogurt. Feses yang diperoleh lalu dianalisis total koloni bakteri, isolasi bakteri, karakterisasi, perhitungan indeks Simpson, isolasi DNA bakteri dan amplifikasi gen 16S sRNA. Hasil  menunjukkan  bahwa  pemberian  protein  CSN1S2  pada  model  hewan mempengaruhi komposisi bakteri dengan peningkatan jumlah koloni bakteri pada kelompok  RAM  dan  RAY.  Pada  perlakuan  kontrol  dan  RA  didominasi  oleh kelompok  bakteri  Lactobacillus  berdasarkan  analisis  gen  16S  rRNA.  Kelompok Lactobacillus lebih banyak ditemukan pada perlakuan kontrol dibandingkan RA. Lactobacillus berperan dalam mempengaruhi perkembangan penyakit RA, serta mampu  menghambat  bakteri  patogen  dari  golongan  Clostridium  dan Enterococcus, ini bergantung pada tingkat spesies bakteri tersebut.
Kata kunci: disbiosis, mikrobiota usus, rheumatoid arthritis, susu, yogurt

## ABSTRACT
Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease that causes inflammation of the  synovial  tissue.  The  prevalence  of  RA  is  increasing  every  year  and  has  the potential  to  hamper  productivity.  Microbiota  composition  is  an  environmental factor that influences the development of RA. The aim of this study was to observe the  effect  of  CSN1S2  protein  from  ethawah  crossbreed  milk  and  yogurt  on  the composition  of  microbiota  in  rheumatoid  arthritis  rats  induced  by  Complete Freund’s Adjuvant (CFA).  Rats were divided into two models namely control and RA,  each  of  which  had  three  groups.  The  feces  obtained  were  analyzed  by calculating  total  bacterial  colonies,  isolation,  characterization,  Simpson  index, DNA isolation and 16S sRNA gene amplification. The results showed that giving CSN1S2  protein  from  milk  and  yogurt  of  Ethawah  crossbreed  goat  in  animal models affected the bacterial composition by increasing the number of colonies in the  RAM  and  RAY  groups.  The  analysis  of  the  results  of  the  16S  rRNA  gene amplification of bacteria showed that the control and RA treatments were a group of  Lactobacillus  bacteria.  The  Lactobacillus  group  was  more  prevalent  in  the control  treatment  than  RA.  Lactobacillus  plays  a  role  in  influencing  the development of RA disease, and is able to inhibit the pathogenic bacteria of the Clostridium and Enterococcus groups; this depends on the level of the bacterial species.
Keywords:  dysbiosis, intestinal microbiota, rheumatoid arthritis, milk, yogurt
Diterima   : 9 Juni 2020
Disetujui   : 19 Agustus 2020
Afiliasi Penulis:
1) Program Studi Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Indonesia 2)  Research  Center  of  Smart Molecule  of  Natural  Genetics Resources (SMONAGENES),
Universitas Brawijaya, Indonesia
Alamat Korespondensi:
*fatchiya@ub.ac.id
Cara Sitasi: Yahya,  A.D.A,  E.  Suyanto,  &  F. Fatchiyah. 2020. Pengaruh protein CSN1S2  dari  susu  dan  yogurt kambing peranakan ethawah terhadap  komposisi  mikrobiota pada feses tikus RA-CFA : Journal of Tropical Biology 8 (2): 106-115.

## PENDAHULUAN
Rheumatoid  arthritis (RA)  adalah  penyakit sistemik,  inflamasi,  dan  kronis  yang  ditandai dengan respons imun persisten yang mengarah pada peradangan dan kerusakan sendi [1]. Hal ini  menyebabkan  penderita  akan  mengalami kecacatan  fungsional  pada  sinovium,  tulang rawan  dan  tulang  sejati  [2].  Berdasarkan  hasil riset  kesehatan  dasar  tahun  2018  melaporkan bahwa  prevalensi  penderita  RA  mencapai 11,9%  dari  total  populasi  penduduk  di Indonesia.  Angka  prevalensi  diperkirakan semakin  meningkat  setiap  tahun  sehingga berpotensi  menghambat  produktivitas  serta berdampak pada kematian [3]. Studi epidemiologis menunjukkan bahwa RA sebagai hasil dari interaksi kompleks antara gen, faktor lingkungan,  hormon,  dan  sistem  kekebalan tubuh [1]. Faktor lingkungan seperti mikrobiota usus memainkan peran penting dalam perkembangan  penyakit  radang  sendi  [4]. Perubahan  komposisi  mikrobiota  pada  usus (disbiosis)  dapat  menyebabkan  perubahan lapisan  sel  epitel  usus  sehingga  meningkatkan paparan oleh berbagai bakteri [5].
Penelitian sebelumnya tentang karakterisasi dan  pemahaman  mengenai  mikrobiota  usus telah  berkembang,  terutama  terkait  penyakit autoimun.  Mikrobiota  usus  adalah  sumber utama  mikroba  yang  dapat  memberikan  efek bermanfaat  serta  patogen  pada  kesehatan manusia  [6].  Mikrobiota  yang  seimbang menjaga respons imun melalui interaksi dengan sel epitel usus, yang membantu mempertahankan keadaan toleran dalam saluran  pencernaan  [7].  Bakteri  komensal berperan  penting  dalam  menekan  respon inflamasi dan mempromosikan toleransi imunologis. Mikrobiota dapat mengatur diferensiasi subset limfosit, selain itu mikrobiota spesifik dapat mempengaruhi fungsi kekebalan  tubuh  [8].  Penelitian  di  Amerika sebelumnya  melaporkan  bahwa  penderita  RA yang tidak diobati memiliki peningkatan jumlah bakteri Prevotella copri yang lebih banyak dan berkurangnya  kelimpahan  spesies  bakteri Bacteroides di  usus  [9].  Sebuah  penelitian  di Cina  juga  melaporkan  bahwa  pasien  RA mengalami  peningkatan  jumlah Lactobacillus salivarius dalam  usus  [10].  Komposisi mikrobiota  sebagian  besar  ditentukan  oleh kebutuhan nutrisi tubuh dan sangat bervariasi di berbagai  lokasi  saluran  usus  yang  dapat berfungsi menjadi pelindung terhadap kolonisasi bakteri patogen penyebab RA [11].
Susu kambing menawarkan banyak manfaat kesehatan  karena  rendah  lemak  dan  laktosa serta  kaya  dengan  kalsium,  antioksidan,  sifat antimikroba dan komponen fungsional lainnya [12]. Lactococcus dan Lactobacillus yang diisolasi  dari  susu  kambing  segar  dan  susu fermentasi  di  Selangor  dan  Jeniang,  Malaysia mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri patogen  pada  saluran  pencernaan  seperti, Bacillus cereus , B.  subtilis , Enterococcus faecalis , E. faecium , Listeria monocytogene , E. coli O157:H7, E. coli V517, Salmonella typhi , Pseudomonas  aeruginosa ,  dan Enterobacter aerogenes [13].  Susu  kambing  merupakan sumber  utama  peptida  bioaktif  yang  berfungsi sebagai  immunomodulator  dan  agen  anti inflamasi [14]. Penelitian sebelumnya melaporkan  bahwa  pada  susu  kambing peranakan ethawah ditemukan peptida bioaktif yaitu protein CSN1S2 dengan berat molekul 36 kDa yang memiliki fungsi salah satunya sebagai antimikroba [15].
Penelitian  mengenai  pengaruh  pemberian protein CSN1S2 dari susu dan yogurt kambing peranakan ethawah terhadap komposisi mikrobiota dalam feses tikus model RA – CFA, serta  mekanisme  penghambatan  mikrobiota usus  yang  mempengatuhi  penyakit  RA  masih belum  jelas.  Pemberian  protein  CSN1S2  dari susu  dan  yogurt  kambing  peranakan  ethawah diharapkan  mampu  menghambat  pertumbuhan bakteri patogen pada model hewan RA. Tujuan penelitian  ini  adalah  untuk  mendapatkan informasi  tentang  pengaruh  pemberian  protein CSN1S2  dari  susu  dan  yogurt  kambing peranakan Ethawah terhadap komposisi mikrobiota  dalam  feses  hewan  model  ( Rattus norvegivus) RA yang  diinduksi  dengan Complete  Freund’s  Adjuvant .  Penelitian  yang dilakukan  hanya  untuk  mengetahui  komposisi bakteri pada tingkat genus atau dalam penelitian ini tidak dilakukan teknik sekuensing.

## METODE PENELITIAN
Kode  etik. Studi  ini  telah  dievaluasi  dan disetujui  oleh  Universitas  Brawijaya,  Malang, Jawa Timur, Indonesia (nomer registrasi, KEP- 90-UB).
Isolasi  protein  dan  perlakuan  hewan . Isolasi protein CSN1S2 (berat molekul 36 kDa) pada susu dan yogurt dilakukan  menggunakan SDS-PAGE  menurut  penelitian  sebelumnya [16-17]. Tikus Wistar umur 12 minggu dengan berat  150-200  gr  diinjeksi  dengan Complete Freund’s  Adjuvant (CFA)  sesuai  prosedur sebelumnya  hingga  menjadi  tikus rheumatoid
arthritis (RA) [17]. Pembuatan tikus model RA dilakukan  menurut  penelitian  sebelumnya menggunakan  metode  induksi  CFA  sebanyak 100 µL secara subkutan (SIGMA,USA) dan 14 hari  kemudian  diinjeksi  kembali  dengan  CFA sebanyak 50 µL secara intradermal [18].
Pengambilan sampel. Sampel feses didapatkan  dari  berbagai  macam  perlakuan pada  tikus  Wistar  jantan  ( Rattus  norvegicus ) yang  terbagi  menjadi  2  kelompok  yaitu  tikus kontrol dan tikus RA. Pada tikus kontrol terdiri dari 3 perlakuan yaitu kontrol (tanpa perlakuan) (C),  perlakuan  kontrol  penambahan  protein CSN1S2  susu  (CM)  dan  perlakuan  kontrol penambahan  protein  CSN1S2  yogurt  (CY) sedangkan  pada  tikus  RA  terdiri  dari  3 perlakuan  yaitu  tikus  penyakit  RA  (RA), perlakuan  RA  penambahan  protein  CSN1S2 susu  (RAM)  dan  perlakuan  RA  penambahan protein CSN1S2 yogurt (RAY), masing-masing perlakuan  memiliki  3  ulangan.  Sampel  feses dari  tiap  perlakuan  dimasukkan  ke  dalam microtube 1,5  mL  steril  kemudian  disimpan dalam kulkas pada suhu -80 o C [19].
Total  koloni  bakteri. Perhitungan  jumlah total  bakteri  dilakukan  menggunakan  metode total plate count (TPC) pada media Plate Count Agar (PCA).  Sampel  feses  sebanyak  1  g disuspensikan  dalam  9  mL  garam  fisiologis (NaCl  0,9%)  dalam  masing  –  masing  tabung reaksi kemudian dilakukan serial dilusi. Sampel hasil  dilusi  diambil  sebanyak  0,1  mL  lalu diinokulasi  menggunakan  teknik pour  plate pada  cawan  petri  yang  berisi  medium  PCA. Sampel  diinkubasi  pada  suhu  37⁰C  selama  48 jam.  Koloni  bakteri  yang  tumbuh  dihitung menggunakan colony  counter dan  dikonversi melalui  perhitungan  hingga  diperoleh  total koloni bakteri.
Indeks  keragaman. Keragaman  bakteri pada  feses  tikus  dari  tiap  perlakuan  dapat diketahui  dengan  perhitungan  menggunakan indeks  keragaman  Simpson.  Jumlah  koloni bakteri  yang  memiliki  morfologi  berbeda dihitung.  Data  yang  didapatkan  kemudian dihitung menggunakan rumus Id [20].
Keterangan: D = indeks diversitas n = jumlah individu
N = jumlah total individu yang ditemukan
Nilai  indeks  keragaman  Simpson  berkisar antara  0  –  1  dengan  representasi  sebagai berikut:
0-0,30 Dominansi rendah, keragaman tinggi.
0,31-0,6 Dominansi sedang, keragaman sedang.
0,61-1 Dominansi tinggi, keragaman rendah.

## Isolasi dan karakterisasi bakteri anaerob.
Bakteri  feses  diisolasi  menggunakan  teknik serial  dilusi  pada  pelarut  NaCl  0,9%. Sampel yang  diperoleh  dari  hasil  pengenceran  berseri diambil sebanyak 0,1 mL dan diinokulasikan ke dalam cawan petri steril. Media yang digunakan yaitu peptone yeast glucose (PYG) agar untuk mengisolasi  bakteri  anaerob  fakultatif  dan obligat, kemudian dilakukan teknik pour plate . Inkubasi dilakukan dalam anaerobic jar selama 48  jam  pada  suhu  37 o C.  Karakterisasi  koloni dilakukan  dengan  cara  mengamati  karakter morfologi yang tampak. Karakter yang diamati diantaranya  yaitu  bentuk,  konfigurasi,  elevasi, ciri optik, tekstur, warna, tepi dan adanya zona bening.  Pemurnian  dilakukan  menggunakan teknis four  way  streak  plate hingga  diperoleh kultur murni. Isolat murni dikultur pada media agar  sebagai  isolat  stok  dan  disimpan  pada coolroom dengan  suhu  4⁰C  untuk  digunakan pada uji selanjutnya .
Isolasi DNA bakteri. Bakteri ditumbuhkan dalam  media Luria  Bertani (LB) broth sebanyak 3 mL selama 16 jam pada suhu 37 o C. Kultur  bakteri  dalam  media  LB  disentrifus dengan  kecepatan  10.000  rpm,  suhu  25 o C selama 5 menit. Pelet yang diperoleh ditambah buffer lysis (EDTA 0,5M pH 8, Tris-Cl 1M pH 8,  NaCl  5  M,  sodium  dedocyl  sulfate  (SDS) 10%,  akuades  dan  proteinase-K  5  mg/ml) sebanyak 1mL dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 jam. Selanjutnya tahapan isolasi DNA bakteri  anaerob  pada  sampel  feses  mengikuti metode  sebelumnya  [21].  Ekstrak  DNA  yang didapatkan  dideteksi  dengan  elektroforesis  gel agarosa 0,8% dengan tegangan 100 volt selama 60  menit.  Pita  DNA  yang terbentuk  kemudian dibandingkan dengan marker 1 kb.
Amplifikasi dengan PCR. DNA kromosomal diamplifikasi menggunakan metode Polymerase  Chain  Reaction (PCR). Primer  yang  digunakan  yaitu  Universal, Bacteroides , Clostridium , Bifidobacterium , Enterococcus , dan Lactobacillus (tabel 1) [22].
Ekstrak  DNA  dilarutkan  dengan mix  solution PCR.  Campuran  larutan  tersebut  kemudian dimasukkan  dalam  mesin PCR,  hot start  95⁰C selama  3  menit,  denaturasi  pada  suhu  95⁰C selama 30 detik, annealing pada 55⁰C selama 30 detik, ekstensi 72⁰C 5 menit, dan post ekstensi. Program  ini  dilakukan  sebanyak  31  siklus.. Amplikon dilihat menggunakan gel elektroforesis. Konsentrasi gel agarose yang
digunakan  yaitu  1,5%  dan  di running pada voltase 100 volt selama 45 menit. Marker yang digunakan adalah DNA ladder 100 bp. Gel yang berisi amplikon PCR divisualisasikan menggunakan gel doc .
Tabel 1. Primer amplifikasi DNA bakteri yang digunakan dalam penelitian ini [22]
Primer Primer sequence (5’-3’) V6-V8:_F TACGGGAGGCAGCAG V6-V8:_R ATTAACCGCGGCTGCTGG g-Bifid F CTCCTGGAAACGGGTGG g-Bifid R GGTGTTCTTCCCGATATCTACA Ent.1017F CCTTTGACCACTCTAGAG Ent.1263R CTTAGCCTCGCGACT Lac1F AGCAGTAGGGAATCTTCCA Lac2R ATTYCACCGCTACACATG Bact_596F TCAGTTGTGAAAGTTTGCG Bact_826R GTRTATCGCMAACAGCGA Ccoc_F AAATGACGGTACCTGACTAA Ccoc_R CTTTGAGTTTYATTCTTGCGAA
Analisis  statistik. Rancangan  penelitian yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap (RAL). Analisis komposisi bakteri pada sampel menggunakan  indeks  Simpson.  Analisis  data melalui  statistika  deskriptif  dengan One  Way ANOVA  menggunakan  SPSS  16.0  pada signifikansi p <0,05.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Total koloni yang tumbuh pada media PCA sangat  beragam  pada  masing  –  masing perlakuan. Perlakuan kontrol (C) memiliki nilai TPC  sebesar  2,85x10⁵  CFU/mL,  sedangkan kontrol yang diberi perlakuan protein CSN1S2 susu (CM) memiliki nilai paling kecil 0,46x10⁵ CFU/mL  dan  signifikan  terhadap  RAM (p<0,05). Kontrol yang diberi perlakuan protein CSN1S2  yogurt  (CY)  memiliki  nilai  1,53x10⁵ CFU/mL,  sedangkan  pada  tikus  RA  memiliki nilai  total  bakteri  0,61x10⁵  CFU/mL  dan signifikan  terhadap  RAM  (p<0,05).  Tikus  RA yang  diberi  perlakuan  protein  CSN1S2  susu (RAM) menunjukkan peningkatan yang signifikan  dengan  jumlah  bakteri  yang  lebih besar  dibanding  perlakuan  lainnya  yaitu 8,00x10⁵  CFU/ml  serta  signifikan  terhadap perlakuan  CM  dan  RA  (p<0,05),  kemudian yang terakhir RA yang diberi perlakuan yogurt (RAY)  juga  terjadi  peningkatan  total  koloni yaitu 3,23x10⁵ CFU/ml.
Gambar  1. Jumlah  total  koloni  bakteri  pada tiap perlakuan
Usus  manusia  memiliki  beragam  jenis mikroorganisme yang dapat membentuk sistem kekebalan pada tubuh manusia [23].
Berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan adanya perbedaan signifikan pada jumlah total koloni bakteri perlakuan RA dan kontrol yang telah diberi perlakuan protein CSN1S2 susu dan yogurt.  Di  sana  terjadi  penurunan  total  koloni bakteri  pada  perlakuan  RA  jika  dibandingkan dengan  perlakuan  C.  Nilai  TPC  yang  berbeda pada  setiap  perlakuan  disebabkan  oleh perlakuan  yang  diberikan  pada  hewan  model RA.  Komposisi  mikrobiota  pada  tikus  RA berbeda  dengan  kontrol,  dengan  pengurangan atau  penambahan  jenis  bakteri  tertentu.  Ada beberapa faktor yang dapat mengubah komposisi  mikrobiota  usus,  termasuk  genetik inang, diet, usia, tipe  kelahiran, dan pemakaian antibiotik  [24-27]. Perubahan penurunan komposisi  mikrobiota  pada  model  hewan  RA menyebakan  kondisi  yang  disebut  dengan disbiosis yang dapat dianalisis melalui analisis feses [28]. Tikus yang diinduksi  dengan CFA mempengaruhi komposisi mikrobiota usus pada model  hewan  RA.  Hal  ini  terlihat  pada  model hewan  RA,  dimana  terjadi  perubahan  yakni penurunan  jumlah total koloni bakteri. Penelitian  sebelumnya  menyebutkan  bahwa induksi  CFA  menyebabkan  penurunan  pada jenis bakteri Bacteroides dan terjadi peningkatan    pada  jenis  Lactobacillaceae  and Lachnospiraceae [29].
Senyawa  CFA  efektif  dalam  merangsang imunitas  yang  diperantarai  sel  dan  mengarah pada  potensiasi  sel  T-helper  yang  mengarah pada produksi imunoglobulin dan sel T efektor tertentu [30]. Injeksi model hewan RA dengan CFA sebagai agen inflamasi dapat menginduksi imunitas adaptif yang merangsang sel T-helper untuk  melepaskan  IL-17  sehingga  terjadi respon inflamasi yang menyebabkan kerusakan pada usus [18]. Studi dengan tikus gnotobiotik
telah  menunjukkan  bahwa  gangguan  pada mikrobiota  usus  dapat  menyebabkan  produksi sitokin proinflamasi, interleukin-17, dan peningkatan  kadar  sel  Th17.  Sel  Th17 kemudian  bermigrasi  ke  jaringan  limfoid perifer  dan  mengeluarkan  IL-17,  yang  pada gilirannya,  bertindak  langsung  pada  sel  B  dan menginduksi  diferensiasi  sel  B  sistemik  dan produksi  antibodi,  yang  akhirnya  dapat mengarah pada pengembangan penyakit autoimun melalui pengenalan pola molekul dari mikrobiota usus [1]. Protein CSN1S2 susu dan yogurt  dapat  menekan  efek  inflamasi  secara tidak  langsung  melalui  peningkatan  IL-10 terhadap IL-17. Studi terbaru juga melaporkan bahwa  IL-10  dapat  menekan  Th-17  sehingga menurunkan  level  IL-17  [31].  Hal  ini ditunjukkan dari perubahan jumlah total koloni bakteri pada RA yang diberi perlakuan protein CSN1S2  susu  dan  yogurt,  dimana  terjadi peningkatan  yang  signifikan  pada  perlakuan RAM dibandingkan RAY (meningkat dibandingkan  CM  dan  CY),  sehingga  dapat dikatakan  bahwa  pemberian  protein  CSN1S2 susu  dan  yogurt  kambing  ethawah  dapat
mengembalikan koloni bakteri yang berkurang akibat inflamasi yang terjadi pada model hewan RA.  Meningkatnya  total  koloni  bakteri  pada perlakuan  RAM  dan  RAY  menunjukkan adanya  pengaruh  dari  pemberian  protein CSN1S2  susu  dan  yogurt  kambing  ethawah yang mampu mengembalikan koloni komensal bakteri di usus.
Susu dianggap berperan penting dalam diet yang  seimbang  karena  kaya  akan  protein berkualitas  tinggi,  serta  komponen  bioaktif yang mempromosikan kesehatan [32]. Meningkatnya  jumlah  total  koloni  pada perlakuan  RA  yang  diberi  susu  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  RA  yang  diberi  yogurt dapat  disebabkan  oleh  peptida  bioaktif  yang berasal  dari  protein  susu. Susu  kambing  dapat membantu dalam mempertahankan homeostasis  inflamasi  dengan  merangsang produksi  beberapa  sitokin  dengan  berbagai efek, seperti TNF-α (sitokin proinflamasi), IL-6 (reaktan  fase  akut  dan  faktor  pertumbuhan untuk sel B), dan IL -10 (sitokin anti inflamasi) [33].
Tabel 2. Karakter morfologi bakteri anaerob
Protein  kasein  seperti  CSN1S2  dari  susu kambing  Ethawah  memiliki  fungsi  biologis sebagai  imunomodulator,  namun  memiliki respon  yang  berbeda  dari  protein  yogurt CSN1S2  [18].  Protein  CSN1S2  pada  yogurt kambing Ethawah memiliki mekanisme
berbeda  untuk  mengontrol  fungsi  fisiologis yang  mungkin  gagal  untuk  mengontrol ketidakseimbangan flora di usus [34], sehingga tampak perubahan yang tidak terlalu signifikan pada RA yang diberi perlakuan yogurt.
ISOLAT Bentuk Konfigurasi Elevasi Ciri Optik Tektstur Warna Tepi 2 tidak teratur beralun datar Opalesens kasar putih bergerigi 4 bulat menyeluruh datar miring vertikal halus putih halus 6 bulat menyeluruh datar pudar halus putih halus 7 bulat menyeluruh datar miring horizontal halus putih halus 11 tidak teratur berserabut datar seperti debu kasar putih bening serabut 13 Bulat Menyeluruh Datar Kecil Halus Putih Halus 17 bulat menyeluruh datar mengkilat, opalesens halus putih menyala halus 20 bulat menyeluruh datar miring horizontal, pudar,tipis halus putih tipis halus 21 bulat menyeluruh datar mengkilat, iridesens kasar putih menyala beralun 26 bulat menyeluruh datar pudar halus putih tipis halus
Berdasarkan  hasil  isolasi  bakteri  anaerobik dari sampel feses berbagai perlakuan selama 48 jam  di  dalam anaerobic  jar diperoleh  isolat dengan karakteristik morfologi yang berbeda – beda. Karakterisasi secara makroskopik meliputi  pengamatan  morfologi  koloni  bakteri dengan mengamati bentuk, konfigurasi, elevasi, ciri optik, tekstur, warna, dan tepi yang tumbuh pada media peptone yeast glucose (PYG). Hasil pengamatan  makroskopik  koloni  bakteri  yang berhasil diisolasi dapat dilihat pada Tabel 2.
Berdasarkan  hasil  karakteristik  morfologi yang  telah  dilakukan,  kemudian  digunakan untuk  menentukan  indeks  diversitas.  Indeks diversitas  yang  digunakan  adalah  indeks Simpson  yang  berfungsi  untuk  mengetahui tingkat  dominansi  pada  masing  –  masing perlakuan.  Hasil  menunjukkan  nilai  indeks Simpson yang beragam baik C, CM, CY, RA, RAM,  dan  RAY.  Secara  berturut  –  turut  nilai indeks  Simpson  yaitu  0,98,  0,97,  0,60,  0,89, 0,93,  0,83.  Perlakuan  C  memiliki  nilai  indeks Simpson  paling  tinggi  dan  CY  memiliki  nilai indeks Simpson paling rendah. Tingginya nilai indeks Simpson menunjukkan adanya dominansi bakteri pada perlakuan C, CM, RA, RAM,  RAY,  dan  dominansi  sedang  pada perlakuan  CY.  Isolat  yang  mendominasi  pada setiap  perlakuan  yaitu  isolat  13  dan  Isolat  4, dimana  isolat  tersebut  terdapat  pada  setiap perlakuan,  sehingga  menyebabkan  adanya kodominan pada perlakuan C, CM, RA, RAM, dan RAY (Gambar 2).
Ketidakseimbangan  flora  di  usus  dapat diketahui dengan analisis
indeks keanekaragaman.  Pengamatan  koloni  bakteri secara makroskopis pada media PYG ditemukan  sebanyak  26  isolat  yang  memiliki karakter  morfologi  yang  berbeda  –  beda.  Data morfologi yang didapatkan selanjutnya dipakai untuk  mengetahui  keanekaragaman  mikroba dengan indeks Simpson. Nilai indeks Simpson menunjukkan  adanya  dominansi  yang  terjadi pada  setiap  perlakuan.  Dapat  dilihat  pada Gambar 2 perlakuan kontrol memiliki dominansi paling tinggi dibandingkan perlakuan lain, sehingga dapat diketahui bahwa keanekaragaman  bakteri  pada  kelompok  RA lebih beragam dibandingkan perlakuan lain.
Komposisi  mikrobiota  usus  ditentukan  dan dipengaruhi oleh sejumlah faktor endogen dan eksogen,  seperti  asal  geografis,  usia,  genetika, pola  makan,  dan  penggunaan  prebiotik  dan antibiotik [35]. Pola makan sangat mempengaruhi  kesehatan  manusia,  sebagian besar dengan memodulasi komposisi mikrobiota  yang  ada  di  usus  [36].  Susu  dan
yogurt  dalam  hal  ini  merupakan  salah  satu nutrisi yang mempengaruhi komposisi mikrobiota pada model hewan kontrol dan RA.
Gambar  2. Diversitas  komposisi  bakteri anaerob pada   setiap perlakuan
Isolat  terpilih  yang  telah  dikarakterisasi sebelumnya, selanjutnya dilakukan identifikasi famili menggunakan teknik molekuler gen 16S rRNA. Isolat yang dipilih merupakan perwakilan  dari  masing  –  masing  kelompok perlakuan. Isolasi total genom dilakukan untuk mendapatkan ekstrak DNA. Hasil isolasi DNA whole  genom bakteri  yang  telah  didapatkan kemudian  digunakan  untuk  amplifikasi  gen target  dengan  primer  spesifik  yang  telah ditentukan  (Tabel  1).  Produk  PCR  yang dihasilkan  selanjutnya  dielektroforesis  untuk mengetahui ukuran hasil amplifikasi dan famili dari  setiap  isolat  terpilih.  Hasil  amplifikasi menggunakan  primer  universal  menunjukkan bahwa  semua  isolat  terpilih  teramplifikasi. Hasil  amplifikasi  pada  kelompok  bakteri Lactobacillus menunjukkan  hal  yang  sama, dimana  semua  isolat  terpilih  teramplifikasi. Namun  semua  isolat  tidak  teramplifikasi menggunakan primer lain seperti Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, dan Enterococcus, yang  dapat  dikatakan  bahwa semua  isolat  tidak  termasuk  kedalam  famili bakteri yang telah disebutkan sebelumnya. Dari hasil  ini  ketahui  bahwa  sampel  feses  tersebut didominasi oleh bakteri Lactobacillus .
Studi  yang  menggunakan  amplifikasi  PCR gen  16S  RNA  dengan  enam  primer  yang berbeda  menunjukkan  bahwa  sepuluh  isolat terpilih  diatas,  telah  teramplifikasi  dengan primer Lactobacillus .  Hal  ini  menunjukkan bahwa  10  isolat  yang  terpilih  dari  perwakilan masing – masing perlakuan, termasuk ke dalam kelompok  bakteri Lactobacillus baik  yang ditemukan  ada  sampel  kontrol  dan  RA.
Kelompok Bakteri Bifidobacterium , Clostridium ,  dan Bacteroides mengalami penurunan  pada  penderita  RA  [37].  Hal  ini dapat  dilihat  pada  hasil  PCR  dimana  tidak teramplifikasi gen dari kelompok bakteri diatas. Suplementasi  dengan  probiotik  telah  terbukti mengurangi  aktivitas  RA  pada  arthritis  yang diinduksi kolagen dan mengurangi manifestasi penyakit. Selain itu, sitokin inflamasi (interleukin  [IL]-1b,  IL-2,  IL-6,  IL-12,  IL-17, interferon  [IFN]-γ, tumor  necrosis  factor [TNF]-α)  menurun  [38].  Strain  probiotik
Bifidobacterium, Lactobacillus , dan
Streptococcus menekan  ekspresi  sitokin  pro-
inflamasi  IL-6  dan  IL-7,  dan  menstimulasi ekspresi  protein  TJ,  yang  mengarah  pada peningkatan  stabilitas  penghalang.  Bakteri L. rhamnosus GG berinteraksi dengan sel-sel usus dan  mempertahankan  integritas gut  blood barrier (GBB) [39]. Bakteri Lactobacillus casei adalah  di  antara  sedikit lactic  acid  bacteria (LAB) yang dikenal sebagai probiotik dan telah sering  dilaporkan  memiliki  efek  pengaturan kekebalan  pada  penelitian  model  hewan  [40]. Lactobacillus  casei terbukti  secara  signifikan mengurangi ekspresi sitokin proinflamasi, yaitu aktivitas  IL-6  dan  TNF-α,  dan  COX-2, mengurangi  manifestasi  RA  [41].  Sebaliknya,
Lactobacillus bifidus menunjukkan
kemungkinan kemampuan untuk mempromosikan  pembengkakan  sendi  pada tikus bebas kuman, dengan aktivasi TLR2/TLR4  [42].  Penelitian  ini  mununjukkan jika spesies Lactobacillus yang ditemukan pada kelompok RA mungkin didominasi oleh bakteri Lactobacillus bifidus.
Gambar 3. Hasil amplifikasi gen 16S sRNA dengan enam primer target
Saluran  gastrointestinal  (GI)  membentuk ekosistem kompleks yang berfungsi bersamaan dengan mikrobiota sebagai penghalang struktural dan fungsional yang melindungi tuan rumah  dari  serangan  oleh  mikroorganisme enterovirulen berbahaya yang tidak diinginkan
[43]. Mikrobiota secara efisien dapat membatasi  infeksi  usus  oleh  bakteri  patogen. Selama  infeksi  patogen,  mikrobiota  memiliki beberapa  fungsi  utama  yaitu  menghambat pertumbuhan  patogen,  melindungi  pertahanan imun  bawaan  dan  adaptif  inang,  serta
membantu  menghilangkan  patogen dari lumen usus  pada  akhir  infeksi  [44].  Spesies  bakteri tertentu  mampu  menghambat  pertumbuhan bakteri  jenis  lain,  termasuk  patogen  dimana salah  satunya  dengan  melepaskan  metabolit penghambatan (asetat dan butirat) dan bakteriosin [45]. Bakteri Gram positif, terutama bakteri asam laktat (lactobacilli, lactococci, dan pediococci) dapat menghasilkan peptida antimikroba dan protein dalam ribosom, seperti lactacin  B  dari Lactobacillus  acidophilus . Strain Lactobacillus menampilkan  aktivitas antibakteri  dapat  menurunkan  ekspresi  faktor virulensi  patogen  enterovirulent  [46-48].    Hal ini  membuktikan  jika  bakteri  dari  strain Lactobacillus ternyata mempunyai efek positif untuk  menghambat  pertumbuhan  kelompok bakteri  Gram  negatif  seperti Clostridium dan Enterococcus .

## KESIMPULAN
Pemberian protein CSN1S2 susu dan yogurt peranakan  ethawah  memberikan  pengaruh terhadap  jumlah  bakteri  pada  model  hewan kontrol  dan  RA.    Komposisi  mikrobiota  pada usus  tikus  RA  yang  diinduksi  dengan  CFA setelah diberikan protein CSN1S2 dari susu dan yogurt  didominasi  oleh  kelompok  bakteri Lactobacillus baik  pada  kontrol  maupun  RA . Bakteri Lactobacillus dapat  berperan  dalam mempengaruhi  perkembangan  penyakit  RA, serta  mampu  menghambat  bakteri  pathogen dari golongan Clostridium dan Enterococcus .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terimakasih  atas dukungan  pendanaan  dari  grant  DPP/SPP, Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan
Alam, Universitas Brawijaya
no.
1/UN10.F09.01/PG/2019.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Baas H, Romero FG, Montiel JM, Pizano ZA,  Garcia  MM,  Ramírez  DN  (2017) Intestinal  dysbiosis  and  rheumatoid arthritis:  a  link  between  gut  microbiota and  the  pathogenesis  of  rheumatoid arthritis.  Journal  Immunol  4835189.  doi: 10.1155/2017/4835189.
[2] Halpern  MT,  Cifaldi  MA,  Kvien  TK (2009)  Impact  of  adalimumab  on  work participation  in  rheumatoid  arthritis: comparison  of  an  open-label  extension study  and  a  registrybased  control  group.
Ann  Rheum  Dis  68:  930  –  937. doi:10.1136/ard.2008.092734.
[3] RISKESDAS (2018) Hasil Utama Riskesdas. 2018. www.depkes.go.id. Accessed: April 2020.
[4] Wu  HJ,  Ivanov  II,  Darce  J  (2010)  Gut- residing  segmented  filamentous  bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity 32(6): 815–827. doi:10.1016/j.immuni.2010.06.001. [5] Asquith M, Elewaut D, Lin P,
Rosenbaum, JT (2014) The role of the gut and  microbes  in  the  pathogenesis  of spondyloarthritis.  Best  Pract.  Res.  Clin.
Rheumatol 28: 687–702.
doi:
10.1016/j.berh.2014.10.018.
[6] Luckey JD, Gomez A, Murray J, White B, Taneja V (2013) Bugs & us: the role of the gut  in  autoimmunity.  The  Indian  Journal of Medical Research 138 (5): 732– 743.
[7] Inohara  I,  Chamaillard  M,  McDonald  C (2005)  NOD-LRR  protein:  role  in  host- microbial  interactions  and  inflammatory disease.  Annual  Review  of  Biochemistry 74:
355 – 383. DOI: 10.1146/annurev.biochem.74.082803.133 34.
[8] Round  JL,  Mazmanian  SK  (2010) Inducible  Foxp3+  regulatory  T-cell development  by  a  commensal  bacterium of  the  intestinal  microbiota.  Proc.  Natl. Acad.  Sci.  U.S.A  107:  12204–12209. doi:10.
1073/ pnas.0909122107//DCSupplemental.
[9] Scher  JU,  Sczesnak  A,  Longman  RS, Segata N, Ubeda C, Bielski C, Rostron T, Cerundolo  V,  Pamer  EG,  Abramson  SB, Huttenhower  C,  Littman  DR  (2013) Expansion  of  intestinal Prevotella  copri correlates with enhanced susceptibility to arthritis.
eLife 2: e01202.
doi:10.7554/eLife.01202.
[10] Zhang X, Zhang D, Jia H (2015) The oral and  gut  microbiomes  are  perturbed  in rheumatoid arthritis and partly normalized after  treatment.  Nat.  Med  21:  895–905. DOI: 10.1038/nm.3914.
[11] Pickard JM, Zeng MY, Caruso R., Núñez G  (2017)  Gut  microbiota:  Role  in pathogen colonization, immune
responses,  and  inflammatory  disease.
Immunol Rev
279: (1):70–89.
doi:10.1111/imr.12567.
[12] Wang Z, Jiang S, Ma C, Huo D, Peng Q, Shao Y, Zhang J (2018) Evaluation of the nutrition  and  function  of  cow  and  goat
milk  based  on  intestinal  microbiota  by metagenomic  analysis.  Food  &  Function
9(4): 2320–2327.
doi: 10.1039/c7fo01780d.
[13] Rozila I, Ezni S, Lani MN, Sharina MD, Siti  HM,  Asma  H,  Sharida  MD  (2012) Antibacterial  activity  of  lactic  acid bacteria  isolated  from  goats’  milk. International  Annual  Symposium  on Sustainability  Science  and  Management: 09-11 Juli 2012; Terengganu, Malaysia.
[14] Mukhopadhya  A,  Noronha  N,  Bahar  B, Ryan MT, Murray BA, Kelly PM (2014) Anti-inflammatory  effects  of  a  casein hydrolysate  and  its  peptide  enriched fractions  on  TNF  αα-challenged  Caco-2 cells and LPS-challenged porcine colonic explants. Food Sci Nutr 2(6): 712-23. doi: 10.1002/fsn3.153.
[15] Tripsilla  LF,  Suharjono  S,  Antonius  C,
Fatchiyah  F  (2016)  The  Comparing  of Antimicrobial Activity of CSN1S2
Protein  of  Fresh  Milk  and  Yogurt  Goat Breed  Ethawah  Inhibited  the  Pathogenic
Bacteria. Mater Sociomed 28(4): 244-248. DOI: 10.5455/msm.2016.28.244-248
[16] Budiarti  IK,  Padaga  M,  Fatchiyah  F (2013)  Nutritional  composition  and protein  profile  of  goat  yogurt  PE  with double  culture  between Streptococcus thermophilus and Lactobacillus species. Cukurova Medical Journal, 38:681–686.
[17] Fatchiyah  F,  Setiawan  B,  Suharjono  S, Noor  Z  (2015)  The  anti-osteoporosis effects  of  CSN1S2  protein  of  goat  milk and  yoghurt  on  a  complete  Freund’s adjuvant-induced  rheumatoid  arthritis model  in  rats.  Biomarkers  and  Genomic
Medicine 7(4):139–146. https://doi.org/10.1016/j.bgm.2015.10.00 1 [18] Rohmah  RN,  Widjajanto  E,  Fatchiyah  F
(2015)  Protective  effect  of  CSN1S2 protein of goat milk on ileum microstructure  and  inflammation  in  rat- CFA  induced rheumatoid  arthritis.  Asian Pacific  Journal  of  Tropical  Disease  5(7): 564-568. doi: 10.1016/S2222- 1808(15)60837-4.
[19] Lee  JY,  Mannaa  M,  Kim  Y,  Seo  YS (2019)  Comparative  analysis  of  fecal microbiota composition between rheumatoid  arthritis  and  osteoarthritis patients. Genes 10(748): 1-14.
[20] Bibi  F,  Ali  Z  (2013)  Measurement  of diversity indices of Avian communities at Taunsa barrage wildlife sanctuary,
Pakistan. The Journal of Animal Planet & Sciences 23(2): 469-474.
[21] Fatchiyah,  Arumingtyas  EL,  Widyarti  S, Rahayu  S  (2011)  Biologi  Molekuler Prinsip Dasar Analisis. Erlangga. Jakarta.
[22] Yusuf  F,  Ilyas  S,  Damanik  HAR, Fatchiyah (2016) Microbiota composition,  HSP70  and  Caspase-3 expression as marker for colorectal cancer patients in Aceh, Indonesia. The Indonesian  Journal  of  Internal  Medicine 48(4): 289-299. PMID: 28143990.
[23] Sandhya P, Danda D, Sharma D, Scaria V (2016) Does the buck stop with the bugs?: an  overview  of  microbial  dysbiosis  in rheumatoid arthritis. International Journal of Rheumatic Diseases 19: 8–20.
[24] Odamaki  T,  Kato  K,  Sugahara  H, Hashikura N, Takahashi S, Xiao JZ, Abe F, Osawa R (2016) Age-related changes in gut microbiota composition from newborn to  centenarian:  a  crosssectional  study. BMC  Microbiology  16(1):  90.  doi: 10.1186/s12866-016-0708-5.
[25] Jandhyala SM, Talukdar R., Subramanyam C, Vuyyuru H, Sasikala M, Reddy DN (2015) Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology 21(29):8787. doi: 10.3748/wjg.v21.i29.8787.
[26] Nagpal R, Tsuji H, Takahashi T, Nomoto K, Kawashima K, Nagata S, Yamashiro Y (2017) Ontogenesis of the gut microbiota composition in healthy, full-term, vaginally born and breastfed infants over the  first  3  years  of  life:  a  quantitative bird’s-eye view. Frontiers in Microbiology 8:1388. doi:10.3389/fmicb.2017.01388. [27] Goodrich JK, Waters JL, Poole AC, Sutter JL, Koren O, Blekhman R, Beaumont M, Van  Treuren  W,  Knight  R,  Bell  JT, Spector  TD,  Clark  AG,  Ley  RE  (2014) Human genetics shape the gut microbiome.  Cell  159(4):789–799.  DOI 10.1016/j.cell.2014.09.053.
[28] Bäumler, A.J. & Sperandio, V. Interactions  between  the  microbiota  and pathogenic  bacteria  in  the  gut.  Nature. 2016; 535(7610):85–93. doi: 10.1038/nature18849.
[29] Liu  X,  Zeng  B,  Zhang  J,  Li  W,  Mou  F, Wang  H  (2016)  Role  of  the  gut microbiome in modulating arthritis progression  in  mice.  Sci  Rep  6:  30594. doi:10.1038/srep30594.
[30] Armentero  MT,  Levandis  G,  Nappi  G, Bazzini  E,  Blandini  F  (2006)  Peripheral inflammation and
neuroprotection:
systemic  pretreatment  with  complete Freund's adjuvant reduces 6- hydroxydopamine  toxicity  in  a  rodent model  of  Parkinson's  disease.  Neurobiol 24(3): 492–505. doi:10.1016/j.nbd.2006.08.016.
[31] Gu  Y,  Yang  J,  Ouyang  X  (2008) Interleukin 10 suppresses Th17 cytokines secreted by macrophages and T cells. Eur
J Immunol 38(7): 1807–1813. doi:10.1002/eji.200838331.
[32] Pfeuffer M, Schrezenmeir, J (2007) Milk and the metabolic syndrome. Obes. Rev 8: 109–118.
[33] Amati L, Marzulli G, Martulli M, Tafaro A,  Jirillo  F,  Pugliese  V,  Martemucci  G, D’Alessandro  AG,  Jirillo  E  (2010)
Donkey  and  Goat  Milk  Intake  and Modulation of the Human Aged Immune Response. Current Pharmaceutical Design 16: 864-869. doi:
10.2174/138161210790883651.
[34] Serino  M,  Luche  E,  Chabo  C,  Amar  J, Burcelin  R.  Intestinal  microflora  and metabolic diseases. Diabetes Metab 35(4): 262-72.
doi: 10.1016/j.diabet.2009.03.003.
[35] Strzepa  A,  Majewska-Szczepanik  M, Lobo  FM  (2017)  Broad  spectrum antibiotic enrofloxacin modulates contact sensitivity  through  gut  microbiota  in  a murine  model.  J  Allergy  Clin  Immunol 140(1): 121–133. doi:
10.1016/j.jaci.2016.11.052.
[36] Wu  GD,  Chen  J,  Hoffmann  C  (2011) Linking  long-term  dietary  patterns  with gut  microbial  enterotypes.  Science  334 (6052):105–108. doi:10.1126/science.1208344.
[37] Seksik  P,  Rigottier-Gois  L,  Gramet  G (2003) Alterations of the dominant faecal bacterial  groups  in  patients  with  Crohn's disease of the colon. Gut 52(2): 237–242. doi:10.1136/gut.52.2.237.
[38] Amdekar S, Singh V, Singh R, Sharma P, Keshav P, Kumar A (2011) Lactobacillus casei reduces  the  inflammatory  joint damage associated with collagen-induced arthritis  (CIA)  by  reducing  the  pro- inflammatory  cytokines.  J  Clin  Immunol 31:  141–54.  doi:  10.1007/s10875-010- 9457-7.
[39] Bajaj  BK,  Claes  IJ,  Lebeer  S  (2015) Functional  mechanisms  of  probiotics.  J.
Microbiol.  Biotechnol.  Food  Sci  4:  321– 327.  doi:  10.15414/jmbfs.  2015.4.4.321- 327.
[40] Anal  AK,  Singh  H  (2007)  Recent advances in microencapsulation of probiotics  for  industrial  applications  and targeted  delivery.  Trends  Food  Sci Technol 18: 242–5.
[41] Alipour  B,  Homayouni-Rad  A,  Vaghef-
Mehrabany E, Sharif SK, VaghefMehraany  L,  Asghari-Jafarabadi
M  (2020)  Effects  of Lactobacillus  casei supplementation  on  disease  activity  and inflammatory  cytokines  in  rheumatoid arthritis  patients:  a  randomized  double- blind  clinical  trial.  Int  J  Rheum  Dis 17:519–27. doi: 10.1111/1756- 185X.12333. [42] Bdollahi-Roodsaz S, Joosten LA, Koenders  MI,  Devesa  I,  Roelofs  MF, Radstake TR (2008) Stimulation of TLR2 and TLR4 differentially skews the balance of T cells in a mouse model of arthritis. J Clin Invest 118: 205–16. doi:
10.1172/JCI32639.
[43] Lievin-Le  MV,  Servin  AL  (2006)  The front  line  of  enteric  host  defense  against unwelcome intrusion of harmful microorganisms:  mucins,  antimicrobial peptides, and microbiota. Clin. Microbiol. Rev 19: 315–337. doi:10.1128/CMR.19.2.315-337.2006.
[44] Sekirov I, Russell SL, Antunes LC, Finlay BB  (2010)  Gut  microbiota  in  health  and disease.  Physiol  90:  859-904.  doi: 10.1152/physrev.00045.2009.
[45] Stecher B, Hardt WD (2008) The role of microbiota  in  infectious  disease.  Trends Microbiol. 16: 107-114. doi: 10.1152/physrev.00045.2009.
[46] Cotter  PD,  Ross  RP,  Hill  C  (2013) Bacteriocins  a  viable  alternative  to antibiotics?  Nat.  Rev.  Microbiol  11:95– 105.  doi: 10.1038/nrmicro2937.
[47] Dobson  A,  Cotter  PD,  Ross  RP,  Hill  C (2012) Bacteriocin production: a probiotic trait?  Appl.  Environ.  Microbiol  78:1–6. doi: 10.1128/AEM.05576-11.
[48] O’Shea  EF,  Cotter  PD,  Stanton  C,  Ross RP, Hill C (2012) Production of bioactive substances by intestinal bacteria as a basis for  explaining  probiotic  mechanisms: bacteriocins and conjugated linoleic acid. Int. J. Food Microbiol 152: 189–205.