## PENGARUH SUHU EKSTRAKSI TERHADAP AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK METANOLIK Eucheuma spinosum
Putu Tara Hradaya Komala 1 , Amir Husni 2 * 1 Departemen Perikanan Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada
2 Pusat Kajian Ketahanan dan Keberlanjutan Hasil Laut Departemen Perikanan Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada
Diterima: 18 Januari 2021/Disetujui: 22 Februari 2021 *Korespondensi: a-husni@ugm.ac.id
Cara sitasi : Komala PTH, Husni A. 2021. Pengaruh suhu ekstraksi terhadap aktivitas antioksidan ekstrak metanolik Eucheuma spinosum . Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia. 24(1): 1-10.

## Abstrak
Eucheuma spinosum merupakan alga merah yang banyak dibudidayakan dan termasuk salah satu komoditas unggulan karena memiliki senyawa fenolik dan flavonoid yang mampu berperan sebagai antioksidan. Senyawa fenolik dan flavonoid pada E. spinosum dapat diperoleh melalui proses maserasi menggunakan metanol yang pada umumnya dilakukan pada suhu ruang. Proses ekstraksi untuk mendapatkan hasil maksimum dapat dipercepat dengan cara meningkatkan suhu ekstraksi. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidan E. spinosum yang diekstraksi menggunakan metanol dengan suhu 55, 65, dan 75 °C. Sebelum diekstraksi rumput laut dicuci bersih dan dikeringkan pada oven bersuhu 40 °C selama 24 jam. Ekstraksi dilakukan dengan metanol 80% (1:10, b/v). Parameter yang diuji pada penelitian ini yaitu rendemen, uji fitokimia, total fenolik, total flavonoid, dan aktivitas antioksidan meliputi uji DPPH dan FRAP. Data penelitian mengindikasikan bahwa suhu ekstraksi memengaruhi total fenolik maupun aktivitas antioksidan baik hasil uji DPPH maupun FRAP, namun tidak berpengaruh terhadap rendemen dan total flavonoid. Suhu ekstraksi 55 °C menghasilkan ekstrak dengan daya antioksidan paling tinggi (IC 50 DPPH sebesar 362,52±7,10 ppm, dan nilai FRAP sebesar 70,30±10,01 μM ekivalen Fe(II)/g).
Kata kunci: DPPH, FRAP, rumput laut merah, total fenolik, total flavonoid

## Extraction Temperature Affect on Methanolic Extract Antioxidant Activity of Eucheuma spinosum

## Abstract
A red alga Eucheuma spinosum is widely cultivated and also one of the superior commodities because it has phenolic and flavonoid compounds that can act as antioxidants. Phenolic content and flavonoids in E. spinosum can be obtained through a maceration process with methanol as a solvent which is generally carried out at room temperature. The extraction process to obtain maximum yield can be accelerated by  increasing  the  extraction  temperature.  This  research  aims  to  determine  the  antioxidant  activity  of E. spinosum extracted using methanol at temperatures of 55, 65, and 75 °C. Before extraction, the seaweed was washed and dried in an oven at 40 °C for 24 hours. Extraction was carried out with 80% methanol in a ratio of 1:10 (w/v). The parameters analyzed in this research were yield, phytochemical test, total phenolic content (TPC), total flavonoids, antioxidant activity including DPPH and FRAP.  The data indicated that the extraction temperature affected  total phenolic and antioxidant activity of both DPPH and FRAP, but did not affect the yield and total flavonoids. Extraction temperature of 55 °C resulted extract with higher antioxidant activity with an IC 50 DPPH value was 362.52±7.10 ppm and FRAP value  70.3010.01 μM equivalent to Fe (II)/g.
Keyword: DPPH, FRAP, red seaweed, total flavonoids, total phenolic content
Pengaruh suhu ekstraksi, Komala dan Husni

## PENDAHULUAN
Rumput laut adalah salah satu sumber daya hayati yang banyak tumbuh di perairan Indonesia. Fathmawati et al. (2014) menyatakan bahwa sekitar 60-70% kebutuhan pasar dunia akan rumput laut dipasok dari Indonesia. Rumput laut merah seperti Eucheuma spinosum umumnya tumbuh di perairan yang banyak tersebar hampir di seluruh perairan Indonesia (Santoso dan Nugraha 2008). Manfaat rumput laut antara lain dapat digunakan sebagai sumber antioksidan (Sari et al. 2015; Dolorosa et al. 2017; Nurjanah et al. 2017). Selain sebagai penghasil karagenan, E. spinosum juga merupakan salah satu komoditas unggulan karena memiliki senyawa fenolik yang mampu berperan sebagai antioksidan (Hanapi et al. 2013). Senyawa  fenolik  yang  ada  pada E. spinosum dapat diperoleh melalui proses  ekstraksi  dengan  pelarut  metanol (Podungge et al. 2018). Altemimi et al. (2017) menyatakan bahwa metanol merupakan pelarut polar yang memiliki efektivitas yang tinggi dan juga merupakan salah satu pelarut yang ekonomis. Proses ekstraksi E. spinosum dapat dilakukan dengan cara maserasi. Metode maserasi memiliki kekurangan utama yakni waktu ekstraksi yang diperlukan sangat lama (Maleta et al. 2018). Menurut Demsi et al.
(2019) proses ekstraksi untuk mendapatkan hasil maksimum dapat dipercepat dengan cara meningkatkan suhu ekstraksi. Hal ini diperkuat oleh Soehendro et al. (2015) yang melaporkan bahwa peningkatan suhu ekstraksi (45 ke 75 °C)  mampu meningkatkan aktivitas antioksidan (68,08±1,29 ke 80,90±0,86). Menurut Husainah (2020) suhu ekstraksi sebaiknya tidak jauh berbeda dengan titik didih pelarut. Berdasarkan hal tersebut maka pada penelitian ini digunakan variasi suhu 55, 65, dan tertinggi yakni 75 °C. Beberapa penelitian mengenai aktivitas antioksidan pada variasi suhu ekstraksi telah dilakukan sebelumnya di antaranya pada ekstraksi biji melinjo (Soehendro et al. 2015),  empulur  batang  sagu  baruk Arenga microcarpha B. (Landjang et al . 2017), dan jahe merah Zingiber officinale var. Rubrum
(Ibrahim et al. 2015). Penelitian mengenai
variasi suhu ekstraksi terhadap aktivitas antioksidan ekstrak metanol E. spinosum belum dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk  menentukan  aktivitas  antioksidan E. spinosum yang diekstraksi menggunakan metanol dengan suhu 55, 65, dan 75°C.

## BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat
Bahan utama yang dipakai pada penelitian ini antara lain rumput laut E. spinosum basah, metanol (Merck, AS), etanol (Merck,
AS), reagen follin ciocalteau , kuersetin,
AlCl, 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH) (Merck, AS), dan 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine
(TPTZ)  (Sigma-Aldrich, Jerman). Peralatan yang digunakan antara lain oven ( Drying Oven 68-DYO200, Esco, Singapura), blender (Miyako BL101PL, Miyako, Indonesia), miller (Fomac FCT-Z300, PT Toko Mesin Toksindo, Indonesia), vorteks ( Barnstead Thermolyne Tipe 37600 MixEr, AS), centrifuge (Tipe H-26F Kokusan Corporation, Jepang), hot plate stirrer (F20500011 Velp AREC Heating Stirrer , Italia), dan spektrofotometer UV-Vis (Perkinlemer Lambda 25, AS).

## Preparasi sampel
Sampel E. spinosum diambil dari Desa Batumulapan, Kecamatan Nusa Penida,
Kabupaten Klungkung, Provinsi Bali pada bulan Januari 2020. Sampel diambil pada pukul 10.00 WITA di kedalaman 20 cm dari surut terendah. Sampel yang telah diambil kemudian dimasukkan ke dalam plastik gelap dan stirofoam yang telah diberi es batu untuk selanjutnya dibawa ke laboratorium. Sampai di laboratorium, sampel dibilas memakai air tawar sampai bersih, lalu dimasukkan ke dalam freezer selanjutnya dikeringkan. Preparasi sampel kering berpedoman pada penelitian yang dilaksanakan oleh Ling et al.
(2015). Rumput laut segar dicuci dengan air tawar kemudian pelekap ( holdfast ) dan epifit yang terlihat dihilangkan. Sampel segar kemudian dikeringkan memakai oven (suhu 40 °C, 24 jam) sehingga didapatkan sampel rumput laut kering. Rumput laut kering selanjutnya digiling memakai blender dan miller kemudian diayak memakai ayakan 40 mesh untuk mendapatkan ukuran yang
seragam. Sampel dalam bentuk bubuk ditempatkan dalam wadah kedap udara dan ditempatkan dalam freezer hingga dilakukan analisis lebih lanjut.
Ekstraksi E. spinosum Ekstraksi E. spinosum dilakukan mengacu Ling et al. (2015) dengan beberapa modifikasi. Bubuk E. spinosum sebanyak 5 g ditambah 50 mL metanol 80 % (1:10, w/v). Sampel dimaserasi selama 3 jam dengan perlakuan suhu yakni 55, 65, dan 75 °C pada hot plate
stirrer dengan kecepatan 200 rpm. Campuran kemudian disentrifugasi pada 1400 rpm selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan didekantasi ke dalam botol dan residu diekstraksi kembali. Supernatan digabungkan dan selanjutnya digunakan untuk perhitungan rendemen, uji fitokimia, total fenolik,  total flavonoid, dan uji daya antioksidan.

## Perhitungan rendemen
Rendemen diperoleh dengan cara melakukan perbandingan berat ekstrak E. spinosum yang dihasilkan dengan berat bubuk rumput laut sebelum ekstraksi yang digunakan. Perhitungan rendemen mengacu pada Kurniawati et al. (2016) dengan rumus:

## Analisis total fenolik
Analisis total fenolik mengacu pada metode yang digunakan oleh Ahmad et al. (2015) dengan beberapa modifikasi. Langkah uji yang dilakukan adalah sebagai berikut: 1) Pereaksi Na 2 CO 3 7% dibuat dengan menimbang 3,5 g Na 2 CO 3 , lalu dilarutkan memakai aquabides sampai mencapai volume 50 mL. 2) Larutan standar asam galat disiapkan dengan cara menimbang 10 mg asam galat kemudian dilarutkan memakai metanol sampai mencapai volume
10 mL sampai mencapai volume 25 mL dan diperoleh larutan dengan kadar 100 ppm. Selanjutnya larutan tersebut diambil sebanyak 0,2; 0,4; 0,6; 0,8, dan 1 mL, selanjutnya diberi metanol sampai volume mencapai 10 mL sehingga didapatkan larutan masing-masing dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 ppm.
3) Larutan standar asam galat ditera dengan
cara masing-masing konsentrasi tersebut ditambah reagen Folin-Ciocalteau sebanyak 0,4 mL, kemudian dikocok lalu didiamkan 4-8 menit. Setelah didiamkan, berikutnya ditambah 0,4 mL Na 2 CO 3 7%, lalu dikocok sampai homogen. Selanjutnya dilakukan penambahan aquabides sampai volume mencapai 10 mL dan ditempatkan pada suhu ruang selama 30 menit, lalu diukur absorbansi pada panjang gelombang 744,8 nm. Kurva kalibrasi dibuat dengan cara membuat korelasi antara absorbansi  dan konsentrasi asam galat (μg/mL). Pengukuran total fenolik ekstrak E. spinosum dilakukan dengan cara larutan ekstrak diambil sebanyak 0,1 mL lalu ditambah reagen Folin-Ciocalteau sebanyak 0,4 mL, kemudian dikocok lalu didiamkan 4-8 menit. Berikutnya ditambah 0,4 mL Na2CO 3 7%, lalu dikocok hingga homogen. Selanjutnya aquabides ditambahkan hingga volume mencapai 10 mL lalu dibiarkan pada suhu ruang selama 30 menit.  Langkah berikutnya dilakukan pengukuran serapan  pada panjang gelombang 74,8 nm. Kadar total fenolik yang terkandung dalam ekstrak dinyatakan dalam ekuivalen asam galat ( Galic Acid Equivalent ). Perhitungan total fenolik mengacu metode Wan-Ibrahim et al. (2010) dengan rumus:

## Analisis total flavonoid
Pengujian total flavonoid merujuk pada metode yang digunakan oleh Ahmad et al.
(2015) dengan sedikit modifikasi yakni:  1) Larutan standar kuersetin dibuat dengan menimbang 10 mg kuersetin, kemudian diencerkan menggunakan 10 mL metanol sehingga menghasilkan larutan 1.000 ppm. Larutan tersebut diambil sebanyak 1 mL lalu diencerkan menggunakan 10 mL metanol sehingga menjadi larutan 100 ppm. Dari larutan 100 ppm selanjutnya dibuat seri konsentrasi yakni 10, 20, 30, 40, 50 ppm. Larutan standar tersebut selanjutnya ditambah metanol sebanyak 3 mL,  kalium asetat 1 M
mg g Rendemen =                      x 100%
Berat ekstrak Berat kering
Total fenolik GAE = (       GAE) = c.(     ) v m Keterangan:
c: kadar total fenolik dari kurva standar (mg/L) v: banyaknya ekstrak yang digunakan (L) m: berat ekstrak (g)
Pengaruh suhu ekstraksi, Komala dan Husni
sebanyak 0,2 mL, AlCl 3 10% sebanyak 0,2 mL, lalu diberi aquabides hingga volume menjadi 10 mL. Selanjutnya disimpan pada suhu ruang dengan waktu 30 menit. Serapan dimonitor memakai spektrofotometer UV-Vis menggunakan panjang gelombang 431 nm. Pengukuran total flavonoid dilakukan dengan cara larutan ekstrak diambil sebanyak 0,1 mL kemudian ditambah metanol sebanyak
3 mL, kalium asetat sebanyak 0,2 mL, AlCl 3 10% sebanyak 0,2 mL,  dan ditambahkan aquabides hingga volume menjadi 10 mL.
Selanjutnya larutan disimpan pada ruang kedap cahaya selama 30 menit. Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer UV-
Vis pada jarak gelombang 431 nm. Kadar flavonoid sampel dinyatakan dalam bentuk ekuivalen kuersetin ( Quercetin Equivalent ). Perhitungan total flavonoid mengacu pada metode Syafitri et al. (2014) dengan rumus:

## Penapisan fitokimia
Analisis fitokimia dilaksanakan dalam rangka menyelidiki zat metabolit sekunder yang ada pada rumput laut E. spinosum . Pengujian senyawa fitokimia merujuk pada studi yang dilakukan oleh Sangi et al. (2008) dengan beberapa modifikasi, meliputi uji steroid, triterpenoid, dan tanin.  Uji steroid dan triterpenoid dilaksanakan dengan langkah sebagai berikut: 1) Sampel yang telah diekstraksi diambil sebanyak 2 mL lalu diberi  3 mL asam asetat anhidrat, kemudian didiamkan dalam waktu 15 menit. 2) Sebanyak enam tetes larutan tersebut diteteskan ke dalam tabung reaksi lalu diberi 2-3 tetes asam sulfat pekat. Keberadaan senyawa steroid diindikasikan dengan terbentuknya warna biru, sedang senyawa triterpenoid diindikasikan dengan adanya warna merah jingga atau ungu. Langkah-langkah uji tanin yaitu: 1) Sebanyak 2 mL sampel yang telah diekstraksi diambil kemudian diberi etanol sampai ekstrak terendam. 2) Selanjutnya sebanyak 1 mL larutan dimasukkan ke dalam
v m
tabung reaksi lalu diberi  FeCl 3 1% sebanyak 2-3 tetes . Adanya senyawa tanin diindikasikan adanya warna hitam kebiruan atau hijau.
Aktivitas Antioksidan Metode Radical Scavenging Activity (RSA) DPPH Analisis aksi antioksidan menggunakan metode DPPH mengacu pada Virsa et al.
(2014). Larutan DPPH dengan konsentrasi 50 ppm disiapkan dengan menimbang 5 mg DPPH lalu dilarutkan menggunakan metanol sebanyak 100 mL dalam labu takar. Selanjutnya dibuat larutan sampel 1.000 ppm dan seri konsentrasi yakni 10, 50, 100, 150, dan 200 ppm. Larutan stok standar 100 ppm disiapkan dengan menimbang 1 mg kuersetin lalu diencerkan menggunakan metanol sampai volume 10 mL. Seri konsentrasi larutan yang dibuat yakni 5, 10, 15, 20, dan 25 ppm.
Pengukuran aksi antioksidan blangko dilaksanakan dengan cara mengambil larutan DPPH sebanyak 4 mL, di- vortex lalu disimpan pada tempat gelap dengan suhu 37 °C. Pengukuran absorbansi dilakukan memakai panjang gelombang 517 nm. Pengukuran aksi antioksidan ekstrak E. spinosum dilaksanakan melalui cara larutan sampel dari masing- masing konsentrasi diambil sebanyak 0,5 mL, lalu diberi 3,5 mL DPPH. Larutan di- vortex dan disimpan dalam ruang gelap dengan suhu 37 °C. Absorbansi ditera menggunakan panjang gelombang 517 nm. Penentuan aksi antioksidan larutan standar dilaksanakan dengan mengambil kuersetin sebanyak 0,5 mL untuk masing-masing konsentrasi. Kemudian diberi  3,5 mL larutan DPPH. Larutan di- vortex , kemudian disimpan pada ruangan gelap dengan suhu 37 °C. Absorbansi ditera memakai panjang gelombang 517 nm. Perhitungan aksi penghambatan (%) dilakukan memakai rumus:
Selanjutnya dilakukan perhitungan IC 50 dengan mengacu pada Dewi et al. (2018). Besarnya IC 50 dihitung dengan membuat kurva hubungan antara konsentrasi sampel dan % penghambatan antioksidan.
Total flavonoid QE = c.(     ) Keterangan: c: kadar flavonoid dari kurva standar (mg/L) v: isi ekstrak (L) m: berat ekstrak (g) %penghambatan =                                     x 100% Absorbansi blanko-Absorbansi sampel Absorbansi blanko

## Aktivitas Antioksidan dengan Metode
Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP)
Analisis antioksidan dengan metode FRAP dalam penelitian ini merujuk pada penelitian Selawa et al. (2013) melalui tahapan sebagai berikut: 1) Disiapkan larutan bufer asetat dengan pH 3,6 dengan cara menimbang natrium asetat trihidrat (CH 3 COONa.3H 2 O) sebanyak 0,775 g lalu ditambahkan 4 mL asam asetat pekat kemudian diencerkan memakai akuades dalam labu takar sampai volume mencapai 250 mL. 2) Pembuatan larutan  2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) dengan konsentrasi 10 mmol/mL dilakukan dengan cara 0,15 g TPTZ diencerkan dalam 40 mmol/L HCl sampai volume mencapai 50 mL. Larutan 40 mmol/L HCl disiapkan dengan cara mengencerkan HCl pekat sebanyak 0,828 mL dalam akuades sebanyak 250 mL. 3) Pembuatan larutan 20 mmol/L FeCl 3 .6H 2 O dengan cara FeCl 3 .6H 2 O ditimbang dengan jumlah 0,54 g kemudian dilarutkan menggunakan akuades dalam labu takar sampai volume mencapai 100 mL. 4)
Pembuatan reagen FRAP dilakukan dengan cara mencampurkan bufer asetat sebanyak 25 mL, larutan FeCl 3 .6H 2 O sebanyak 2,5 mL, dan larutan TPTZ sebanyak 2,5 mL dalam labu takar kemudian diberi akuades sampai volume mencapai 100 mL. 5) Pembuatan larutan larutan stock FeSO 4 .7H 2 O dengan konsentrasi 10.000 μmol/L, dilakukan dengan cara 2,78 gram FeSO 4 .7H 2 O dilarutkan menggunakan 1.000 mL akuades. Kemudian diambil 100 mL larutan stock FeSO 4 .7H 2 O konsentrasi 10.000 μmol/L lalu diencerkan sampai 1.000 mL untuk mendapat  FeSO 4 .7H 2 O dengan konsentrasi 1.000 μmol/L. Selanjutnya larutan FeSO 4 .7H 2 O dengan konsentrasi 1.000 μmol/L diambil masing-masing sebanyak 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; dan 0,5 mL lalu dimasukkan ke dalam labu ukur berbeda lalu ditambah akuades 100 mL, sehingga terbentuk larutan standar FeSO 4 .7H 2 O dengan konsentrasi berturut- turut 1, 2, 3, 4, dan 5 μmol/L. 5) Peneraan panjang gelombang maksimum didapat dari peneraan serapan dari standar FeSO 4 .7H 2 O pada konsentrasi paling besar (1.000 μmol/L). Larutan standar tersebut selanjutnya diambil 1 mL lalu diberi reagen FRAP sebanyak 3 mL dan
ditera pada setiap panjang gelombang antara 588-598 nm memakai spektrofotometer UV- Vis. 6) Absorbansi sampel diukur dengan cara larutan ekstrak E. spinosum diambil 0,1 mL lalu diberi 3 mL reagen FRAP dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Berikutnya larutan diukur serapannya memakai spektrofotometer menggunakan panjang gelombang 596 nm.

## Analisis Data
Analisis data penelitian dilaksanakan menggunakan IBM SPSS versi 19. Langkah pertama yang dilakukan yakni uji normalitas menggunakan Kolmogorov-Smirnov. Selanjutnya dilaksanakan uji homogenitas memakai Levene’s test. Data penelitian dapat dikatakan berdistribusi normal dan homogen dengan syarat p >0,05. Setelah mengetahui bentuk distribusi data, selanjutnya dilakukan uji beda nyata antar data. Uji data parametrik menggunakan uji Duncan, dan uji data non- parametrik memakai Kruskal-Wallis. Apabila pada uji Kruskal-Wallis terdapat beda nyata antar data maka diteruskan dengan uji Mann Whitney.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Rendemen, Total Fenolik, dan Total
Flavonoid Data pengaruh suhu ekstraksi pada rendemen, total fenolik, dan total flavonoid dapat dilihat pada Table 1 . Rendemen ekstrak E. spinosum yang diekstraksi dengan metanol 80% pada suhu 55, 65, dan 75 °C berturut-turut yakni 3,46±0,39; 3,29±0,14%; dan 2,94±0,02%. Hasil analisis menunjukkan bahwa suhu ekstraksi tidak memengaruhi ( p >0,05) rendemen ekstrak. Rendemen E. spinosum yang diekstraksi menggunakan variasi suhu jauh berbeda dengan  rendemen E. spinosum yang diekstraksi pada suhu ruang selama 24 jam (12,44%) yang dilakukan Sari et al. (2015). Menurut Kawiji et al. (2015) suhu ekstraksi yang tinggi mampu mempercepat proses reaksi tetapi hal ini juga dapat mengakibatkan sebagian pelarut menguap, dengan demikian jumlah pelarut menjadi berkurang dan tidak cukup untuk mengekstrak bahan. Total fenolik ekstrak metanol E. spinosum yang diekstraksi dengan suhu berbeda dapat dilihat pada Table 1. Total  fenolik  ekstrak
Pengaruh suhu ekstraksi, Komala dan Husni
E. spinosum yang diekstrak dengan suhu 55, 65, dan 75 °C adalah 170,02±15,37; 158,30±17,16; dan 95,71±8,35 mg GAE/g.
Perbedaan suhu ekstraksi berpengaruh nyata pada total fenolik ( p <0,05). Total fenolik ekstrak E. spinosum yang diekstraksi pada suhu 55 dan 65 °C berbeda nyata dengan 75 °C.
Total fenolik ekstrak E. spinosum mengalami penurunan yang signifikan pada suhu 75 °C. Hal ini dapat disebabkan karena fenol dapat mengalami kerusakan struktur akibat suhu ekstraksi yang tinggi  (Hwang dan Thi 2014). Fenolik merupakan senyawa termosensitif sehingga memungkinkan terjadinya hidrolisis dan pengurangan kadar fenol pada suhu tinggi (Wenjuan et al. 2010). Faktor lain yang dapat memengaruhi kandungan total fenolik yakni waktu ekstraksi. Sari et al.
(2013) menyatakan bahwa waktu ekstraksi juga dapat memengaruhi kadar fenolik karena waktu ekstraksi yang terlalu lama dapat meningkatkan peluang adanya reaksi oksidasi senyawa fenolik akibat paparan oksigen yang semakin lama dapat menurunkan jumlah total fenolik terekstrak. Data pengaruh suhu ekstraksi terhadap kadar total flavonoid ekstrak E. spinosum terdapat pada Table 1. Kadar total flavonoid ekstrak E. spinosum yang diekstrak dengan suhu 55, 65, dan 75 °C masing-masing adalah 789,21±17,25; 587,43±10,63; dan 403,50±49,09 mg QE/g. Total flavonoid mengalami penurunan dengan meningkatnya suhu esktraksi yang digunakan. Akan tetapi perubahan tersebut tidak menunjukkan pengaruh secara nyata pada total flavonoid ( p >0,05). Total flavonoid pada suatu ekstrak dapat semakin menurun kadarnya seiring dengan meningkatnya suhu ekstraksi, hal ini dapat terjadi karena flavonoid mudah rusak pada suhu tinggi (Sa’adah et al. 2017).
Turunnya total senyawa flavonoid seiring dengan meningkatnya suhu juga bisa terjadi karena suhu tinggi dapat merusak struktur sel bahan sehingga komponen yang ada mudah bermigrasi dan menjadi mudah rusak oleh bermacam reaksi kimia yang mengikutkan cahaya maupun oksigen (Zainol et al. 2009).

## Penapisan Fitokimia
Berdasarkan hasil penapisan fitokimia ekstrak E. spinosum yang diekstraksi menggunakan suhu berbeda menunjukkan bahwa E. spinosum mengandung senyawa triterpenoid, namun tidak terdeteksi adanya steroid dan tanin. Hasil positif adanya senyawa triterpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna jingga. Terbentuknya warna jingga terjadi karena triterpenoid mampu membentuk warna apabila direaksikan dengan H 2 SO 4 pekat (Yanuarti et al. 2017). Hasil penapisan fitokimia E. spinosum bersesuaian dengan hasil penelitian yang dilaksanakan Sari et al. (2015). Jenis triterpenoid yang terdapat pada E. spinosum adalah golongan triterpenoid asam karboksilat (Ahmad dan Nasrum 2013).

## Aktivitas Antioksidan RSA DPPH
Pengaruh suhu ekstraksi E. spinosum terhadap aktivitas antioksidan DPPH (IC 50 ) terdapat pada Table 2. Aktivitas antioksidan DPPH yang dinyatakan dalam IC 50 untuk ekstrak E. spinosum yang diekstraksi dengan suhu 55, 65, dan 75 °C secara berturut- turut adalah 362,52±7,10; 417,77±18,72; dan 437,03±35,03 ppm. Hasil analisis data menunjukkan perbedaan suhu ekstraksi berpengaruh secara signifikan terhadap aktivitas antioksidan ekstrak E. spinosum suhu 55 °C dan suhu 75 °C ( p <0,05).
Table 1Effect of extraction temperature on yield, total phenol, and total flavonoids of E. spinosum total methanolic extract Extraction temperature Yield (%) Total phenolic (mg GAE/g extract) Total flavonoids (mg QE/g extract) 55 °C 3.46±0.39 a 170.02±15.37 a 789.21±17.25 a 65 °C 3.29±0.14 a 158.30±17.16 a 587.43±10.63 a 75 °C 2.94±0.02 a 95.71±8.35 b 403.50±49.09 a
Note: a same letter in the same column indicate no significant difference ( p > 0.05)
Berdasarkan nilai IC 50 , E. spinosum yang diekstrak pada suhu 55 °C lebih kecil dibanding suhu 75 °C. Hasil tersebut menunjukkan peningkatan suhu ekstraksi dari 55 °C menjadi 75 °C menyebabkan penurunan aktivitas antioksidan (Dewi et al. 2018). Perubahan nilai IC 50 ini dapat disebabkan karena berkurangnya senyawa yang dapat berperan sebagai antioksidan karena pengaruh suhu tinggi. Menurut Hwang dan Thi (2014), penggunaan ekstraksi dengan suhu yang terlalu tinggi dapat  berpengaruh pada kerusakan senyawa bioaktif seperti senyawa fenolik sehingga dapat menurunkan aktivitas penghambatan radikal bebas. Aktivitas antioksidan DPPH E. spinosum yang diekstrak dengan suhu 55 °C lebih tinggi dibanding dengan E. spinosum yang dimaserasi oleh Sari et al. (2015) memakai etanol 70 % dengan waktu 24 jam pada suhu ruang (IC 50 472,14 ppm). Dengan demikian peningkatan suhu ekstraksi hingga 55 °C memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi daripada ekstraksi pada suhu ruang. Penurunan aktivitas antioksidan ini berbanding lurus dengan penurunan total fenolik. Lalu lanjut menurut Soehendro et al. (2015), ekstraksi dengan suhu tinggi dapat meningkatkan kelarutan fenol akibat rusaknya struktur sel bahan. Hal ini mungkin yang menyebabkan ekstrak E. spinosum dengan suhu tinggi mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih besar. Menurut Sari et al. (2013) peningkatan kadar fenol dapat terjadi hingga mencapai suhu tertentu namun ketika suhu optimum sudah tercapai maka dapat menyebabkan penurunan kadar total fenolik yang disebabkan oleh terdekomposisinya senyawa fenolik oleh suhu yang terlau tinggi. Pada penelitian ini suhu optimum untuk ekstraksi E. spinosum adalah
55 °C karena aktivitas antioksidannya lebih besar apabila dibandingkan dengan ekstrak E. spinosum suhu 75 °C.

## Aktivitas Antioksidan Metode FRAP
Pengaruh suhu ekstraksi E. spinosum terhadap nilai FRAP terdapat pada Table 2.
Nilai FRAP E. spinosum yang diekstraksi pada suhu 55, 65, dan 75 °C secara berturut- turut yakni 70,30±10,01; 78,44±3,66; dan 95,04±13,62 μM ekuivalen Fe(II)/g. Analisis statistik mengindikasikan bahwa adanya perbedaan suhu ekstraksi berpengaruh yang nyata terhadap nilai FRAP ( p <0,05). Nilai FRAP E. spinosum yang diekstraksi dengan suhu 55 °C lebih kecil dan mempunyai perbedaan yang nyata ( p <0,05) apabila dibandingkan dengan suhu 75 °C. Hal ini menandakan kemampuan mereduksi pada ekstrak E. spinosum yang diekstraksi dengan suhu 55 °C lebih tinggi jika dibandingkan dengan ekstrak suhu 75 °C.
Nilai FRAP ekstrak E. spinosum cenderung bertambah bersamaan dengan semakin tinggirnya suhu ekstraksi. Hal ini mengindikasikan semakin tinggi suhu ekstraksi yang dipakai maka kemampuan ekstrak untuk mereduksi Fe 3+ menjadi Fe 2+ semakin berkurang. Metode FRAP adalah salah satu metode penentuan kandungan antioksidan secara spektrofotometri yang berdasarkan pada reduksi analog ferroin, kompleks Fe 3+ dari tripiridiltriazin Fe(TPTZ) 3+ menjadi kompleks Fe 2+ , Fe(TPTZ) 2+ yang berwarna biru intensif oleh antioksidan pada suasana asam (Yefrida et al. 2015). Menurut Neoh et al. (2016) kemampuan mereduksi dari rumput laut sebagian besar berkaitan dengan kandungan fenoliknya. Hal ini seiring dengan data total fenolik ( Table 1 ) cenderung
Table 2 Effect of extraction temperature on antioxidant acitivity (DPPH & FRAP) of E. spinosum methanolic extract Extraction temperature Antioxidant activity DPPH (IC 50 , ppm) FRAP (µM/g) 55 °C 362.52±07.10 b 70.30±10.01 b 65 °C 417.77±18.72 bc 78.44±03.66 bc 75 °C 437.03±35.03 c 95.04±13.62 c Quercetin 14.77±00.42 a 51.90±01.83 a
Note: a same letter in the same column indicate no significant difference ( p > 0.05)
Pengaruh suhu ekstraksi, Komala dan Husni
menurun dengan meningkatnya suhu ekstraksi sehingga kemampuan mereduksi juga menurun seiring dengan bertambahnya suhu ekstraksi.  Ekstrak E. spinosum yang diekstrak dengan berbagai suhu yang berbeda memiliki aktivitas antioksidan DPPH cenderung sama jika dibandingkan dengan metode FRAP. Kecenderungan seperti ini juga terjadi pada dua spesies rumput laut merah, Amansia multifida dan Meristiella echinocarpa ,  dari  pantai  Timur  laut  Brazil
(De-Alencar et al. 2014). Hasil FRAP standar kuersetin memiliki nilai lebih kecil jika dibandingkan dengan nilai FRAP ekstrak E. spinosum pada suhu
55 °C, hal ini menandakan kemampuan mereduksi dari kuersetin lebih tinggi jika dibandingkan dengan ekstrak E. spinosum pada suhu 55 °C. Kuersetin merupakan salah satu jenis antioksidan alami dan banyak ditemukan pada hampir setiap jenis tanaman yang mempunyai aktivitas antioksidan yang sangat kuat sehingga kemampuannya untuk mereduksi juga tinggi (Jusuf 2010)

## KESIMPULAN
Aktivitas antioksidan ekstrak E. spinosum menurun seiring dengan meningkatnya suhu ekstraksi. Suhu ekstraksi 55 °C mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih besar apabila dikomparasikan dengan suhu 65 °C dan 75 °C.
Antioksidan ekstrak E. spinosum berbanding lurus dengan hasil total fenolik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Penelitian ini telah didanai melului skema Hibah Penelitian Kolaborasi Dosen dan Mahasiswa Fakultas Pertanian UGM tahun 2020 dengan nomor kontrak 1508/PN/ PT/2020.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad AR, Juwita, Ratulangi SAD, Malik A. 2015. Penetapan kadar fenolik dan flavonoid total ekstrak metanol buah dan daun patikala ( Etlingera elatior (Jack)
R.M.SM). Pharmaceutical Sciences and
Research. 2(1): 1-10. Ahmad A, Nasrum M. 2013. Inhibitive
enhancement of isoniasid treatment on
Mycobacterium tuberculosis through triterpenoid carbocylic acid from red algae Eucheuma spinosum . International Journal of Pharma and Bio Sciences . 4(2): B231-B237. Altemimi A, Lakhssassi N, Baharlouei  A, Watson DG, Lightfoot DA. 2017. Phytochemicals: extraction, isolation, and identification of bioactive compounds from plant extracts. Plants. 6 (42): 1-23. De -Alencar DB, Da-Silva SR, Pires-Cavalcante KMS, De-Lima RL, Pereira-Junior FN, De-Sousa MB, Viana FA, Nagano CS, Do-Nascimento KS, Cavada BS, Sampaio AH,  Saker-Samaio S. 2014. Antioxidant potential and cytotoxic activity of two red seaweed species, Amansia multifida and Meristiella echinocarpa , from the coast of Northeastern Brazil. Annals of the Brazilian Academy of Sciences . 86(1): 251-263. Demsi RP, Ruslan, Rahim EA, Ys  H. 2019. Ekstraksi pektin pada kulit buah kluwih ( Artocarpus camansi Blanco) pada berbagai suhu dan konsentrasi asam sitrat. Kovalen: Jurnal Riset Kimia. 5(1): 100-108.
Dewi SR, Ulya N, Argo BD. 2018. Kandungan flavonoid dan aktivitas antioksidan ekstrak Pleurotus ostreatus . Rona Teknik Pertanian. 11(1): 1-11.
Dolorosa MT, Nurjanah, Purwaningsih S,
Anwar E, Hidayat T. 2017. Kandungan senyawa bioaktif bubur rumput laut Sargassum plagyophyllum dan Eucheuma cottonii sebagai bahan baku krim pencerah kulit. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia. 20(3): 633-644. Fathmawati D, Abidin MRP, Roesyadi  A. 2014. Studi kinetika pembentukan karaginan dari rumput laut. Jurnal Teknik Pomits .
3(1): 27-32. Hanapi A, Fasya  AG, Mardiyah U, Miftahurrahmah. 2013.  Aktivitas antioksidan dan antibakteri ekstrak metanol alga merah Eucheuma spinosum dari perairan Wongsorejo Banyuwangi. Alchemy. 2(2): 126-137. Husainah NU. 2020. Variasi suhu dan jenis pelarut pada ekstraksi daun tembakau
kasturi inferior sebagai senyawa antibakteri. [Skripsi]. Jember (ID): Universitas Jember. Hwang ES, Thi ND. 2014. Effects of extraction and processing methods on antioxidant compound contents and radical scavenging activities of laver ( Porphyra tenera ). Preventive  Nutrition and Food
Science. 19(1): 40-48. Ibrahim AM, Yuniantha, Sriherfyna FH. 2015. Pengaruh suhu dan lama waktu ekstraksi terhadap sifat kimia dan fisik pada pembuatan minuman sari jahe merah
( Zingiber officinale var. rubrum ) dengan kombinasi penambahan madu sebagai pemanis. Jurnal Pangan dan Agroindustri . 3(2): 530-541. Jusuf E. 2010. Kandungan kuersetin dan pola proteomik varietas jambu batu ( Psidium guajava L.) tumbuh liar di kawasan
Cibinong, Bogor. Berita Biologi. 10(3): 401-415.
Kawiji, Khasanah LU, Utami R, Aryani NT.
2015. Ekstraksi maserasi oleoresin daun jeruk purut ( Citrus hystrix DC): optimasi rendemen dan pengujian karakteristik mutu. Agritech. 35(2): 178-184.
Landjang EY, Momuat LI, Suryanto E. 2017. Efek pemanasan terhadap aktivitas antioksidan ekstrak empelur batang sagu baruk ( Arenga microcarpha B.). Chemistry Progress. 10(1): 8-14. Ling ALL, Yasir S, Matanjun P, Bakar MFA. 2015. Effect of different drying techniques on the phytochemical content and antioxidant activity of Kappaphycus alvarezii.  Journal of Applied Phycology . 27: 1717-1723. Maleta HS, Indrawati1  R, Limantara L, Brotosudarmo THP. 2018. Ragam metode ekstraksi karotenoid dari sumber tumbuhan dalam dekade terakhir (telaah literatur). Jurnal Rekayasa Kimia dan Lingkungan. 13(1): 40-50.
Neoh YY, Matanjun P, Lee JS. 2016.
Comparative study of drying methods on chemical constituents of Malaysian red seaweed. Drying Technology. 34(14): 1745-1751. Nurjanah, Nurilmala M, Anwar E, Luthfiyana N, Hidayat, T 2017. Identification
of bioactive compounds of seaweed Sargassum sp and E. cotonii as raw material suncreen cream. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences . 54(4): 311-318. Podungge A, Damongilala LJ, Mewengkang HW.  2018. Kandungan antioksidan pada rumput laut Eucheuma spinosum yang diekstrak dengan metanol dan etanol. Jurnal Media Teknologi Hasil Perikanan . 6(1): 197-201. Sa’adah H, Nurhasnawati H. 2017. Perbandingan pelarut etanol dan air pada pembuatan ekstrak umbi bawang tiwai ( Eleutherine americana Merr) menggunakan metode maserasi. Jurnal Ilmiah Manuntung. 1(2): 149-153. Sangi M, Runtuwene MRJ, Simbala HEI, Makang VMA. 2008. Analisis fitokimia tumbuhan obat di Kabupaten Minahasa Utara. Chemistry Progress. 1(1): 47-53. Santoso L, Nugraha YT. 2008. Pengendalian penyakit ice-ice untuk meningkatkan produksirumput laut Indonesia. Jurnal Saintek Perikanan. 3(2): 37-43. Sari BL, Susanti N, Sutanto. 2015. Skrining fitokimia dan aktivitas antioksidan fraksi etanol alga merah Eucheuma spinosum . Pharmaceutical Sciences and Research. 2(2): 59-67.
Selawa W, Runtuwene MRJ, Citraningtyas G. 2013. Kandungan flavonoid dan kapasitas antioksidan total ekstrak etanol daun binahong ( Anredera cordifolia (Ten) Steenis.). Pharmacon. 2(1): 18-23. Setzer WN. 2008. Non-intercalative triterpenoid inhibitors of topoisomerase II: a molecular docking study. The Open Bioactive Compounds Journal. 1: 13-17. Soehendro AW, Manuhara GJ, Nurhartadi E. 2015. Pengaruh suhu terhadap aktivitas antioksidan dan antimikrobia ekstrak biji melinjo ( Gnetum gnemon L.) dengan pelarut etanol dan air. Jurnal Teknosains Pangan. 4(4): 15-24. Syafitri NE, Bintang M, Falah S. 2014. Kandungan fitokimia, total fenol, dan total flavonoid ekstrak buah harendong ( Melastoma affine D. Don). Current Biochemistry. 1(3): 105-115. Virsa H, Ahmad AR, Sudir M. 2014. Uji
Pengaruh suhu ekstraksi, Komala dan Husni
aktivitas antioksidan ekstrak metanol bunga dan daun patikala ( Etlingera elatior
(Jack) R.M.Sm) menggunakan metode DPPH. Pharmaceutical Sciences and
Research. 1(2): 86-93. Wan-Ibrahim WI, Sidik K, Kuppusamy UR. 2010. A high antioxidant level in edibleplants is associated with genotoxic properties. Food Chemistry. 122: 1139- 1144.
Wenjuan Q, Pan Z, Ma H. 2010. Extraction modeling and activities of antioxidants from pomegranate marc. Journal of Food Engineering. 99(1): 16–23.
Yanuarti R, Nurjanah, Anwar E, Hidayat
T. 2017. Profil fenolik dan aktivitas
antioksidan dari ekstrak rumput laut
Turbinaria conoides dan Eucheuma cottonii. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia . 20(2): 230-237. Yefrida, Ashikin N, Refilda. 2015. Validasi metoda FRAP modifikasi pada penentuan kandungan antioksidan total dalam sampel mangga dan rambutan. Jurnal
Riset Kimia. 8(2): 170-175. Zainol MKM, Abdul-Hamid A, Abu-Bakar F, Pak-Dek S. 2009. Effect of different drying methods on the degradation of selected flavonoids in Centella asiatica . International Food Research Journal. 16:
531-537.