## SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL 70% KULIT JENGKOL

## (ARCHIDENDRON JIRINGA (JACK). I.C. NIELSEN) TERHADAP PENGHAMBATAN SEL KANKER PAYUDARA MCF-7 DAN KANKER SERVIKS HELA
Submitted : 28 Januari 2019 Edited : 15 Mei 2019 Accepted : 25 Mei 2019
Harry Noviardi*, Antonius Padua Ratu, Diah Ajeng Tri R
Program Studi S1 Farmasi, Sekolah Tinggi Teknologi Industri dan Farmasi Bogor, Jl. Kumbang No. 23, Bogor, Indonesia.
Email : harry.noviardi@gmail.com

## ABSTRACT
Jengkol (Archidendron  jiringa  (Jack).I.C.  Nielsen) skin for  this  belongs  to  the  organic wastes  that  do  not  provide  economic  value.  Compounds  of  natural  ingredients on  the  Jengkol Skin among  others,  alkaloids,  flavonoids,  tannins,  saponins,  and  triterpenoids.  Some  of  the molecular  structures  of  the  compound are thought  to  potentially  in  inhibiting  the  growth  of cancer cells. This research aimed to determine the cytotoxicity effect of 70% ethanol extract of Jengkol  Skin  as  anticancer.  Jengkol  Skin  was  macerated  in  ethanol  70%  then  extract was concentrated with a rotary vacuum evaporator and water bath. Cytotoxicity test was carried out using cells MCF-7 (breast cancer) and HeLa cells (cervical cancer) based upon the method of MTT assay. The parameter was the value measured inhibition concentration (IC 50 ). Extracts of the  Jengkol  Skin  showed activity  against  cytotoxicity  MCF-7  cells  with  IC 50 values  of  51.76 μg/mL and for the IC 50 value of HeLa cells 39.618 μg/mL. IC 50 values of the cell were less than 100  μg/mL , indicated categories  of  potential  cytotoxicity. The Jengkol  Skin extract  could  be used as anticancer agents.
Keywords : Cytotoxicity, HeLa , Jengkol Skin, MCF-7, MTT assay.

## PENDAHULUAN
Di dunia, kanker merupakan penyebab kematian utama dengan estimasi sebesar  7,6  juta  kematian  (sekitar  13% seluruh  kematian)  pada  tahun  2016,  dan diperkirakan  semakin  meningkat  hingga mencapai  13,1  juta  kematian  pada  tahun 2030 (1) .  Kanker  payudara  menduduki peringkat  pertama  kasus  kanker  pada wanita  di  seluruh  dunia,  dengan  angka kejadian  sebesar  1.676.633 (2) .  Sedangkan secara nasional, prevalensi penyakit kanker  pada  penduduk  semua  umur  di Indonesia  tahun  2013  sebesar  1,4%  atau diperkirakan sekitar 347.792 orang.
Berdasarkan pada estimasi jumlah
penderita kanker, Jawa Tengah merupakan provinsi  dengan  estimasi  penderita  kanker terbanyak,  yaitu  sekitar  68.638  orang diikuti  Jawa  Timur  dengan  estimasi penderita  kanker  sebanyak  61.230  orang. Kanker tertinggi yang terjadi pada perempuan  di  Indonesia  adalah  kanker payudara dan kanker serviks (3) .
Beberapa cara  yang  telah banyak dilakukan untuk mengatasi tingginya insiden penyakit kanker payudara dan kanker serviks antara lain dengan pembedahan, kemoterapi, radioterapi,
terapi hormon atau terapi antibodi monoklonal. Hanya saja obat-obat kemoterapeutik  yang  ada,  memiliki efek
samping dengan merusak sel sehat penderita. Terutama menghambat pembelahan sel normal yang proliferasinya cepat misalnya sumsum tulang,  epitel germinativum,  mukosa saluran cerna, folikel rambut dan jaringan limfosit (4) . Selain itu dari segi biaya  yang  tinggi namun tingkat keberhasilan terapi belum optimal, sehingga
perlu dilakukan penelitian untuk mengkaji dan menemukan obat baru  yang  lebih efektif dan selektif. Hal  ini  yang  menjadi tantangan untuk mencari obat yang berasal dari bahan alam khususnya tumbuh-tumbuhan, dengan harapan dapat menemukan antikanker yang  efektif dengan efek samping  yang minimal.
Salah  satu  tanaman  yang  telah diketahui  kadar  toksisitasnya  adalah  kulit jengkol.  Kulit  Jengkol  (Archidendron jiringa (Jack).  I.C.  Nielsen)  selama  ini tergolong  limbah  organik  yang  berserakan di  pasar  tradisional  dan  tidak  memberikan nilai  ekonomis. Kulit  jengkol  diketahui mengandung  alkaloid,  flavonoid,  tanin, polifenol  dan  saponin (5) .  Flavonoid  dalam struktur  molekulnya  mempunyai  aktivitas antioksidan dan berpotensi dalam menghambat  pertumbuhan  sel  kanker (6) . Berdasarkan  pada  penelitian (7) ,  ekstrak metanol  dari  kulit  jengkol  bersifat  toksik, dengan  nilai  LC 50 =  39,27ppm.  Metode yang  digunakan  (Brine  Shrimp  Lethality Test) (8) .
Berdasarkan  pada  uraian  diatas, pada  penelitian  ini  bertujuan menentukan sitotoksisitas dari ekstrak etanol 70% kulit jengkol  (Archidendron  jiringa (Jack).  I.C. Nielsen) terhadap penghambatan sel kanker  payudara  (MCF-7)  dan  kanker serviks  (HeLa)  menggunakan  metode kolorimetri  dengan  pewarnaan  MTT(3- (4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida). Sel kanker payudara MCF-7 banyak digunakan untuk uji secara in  vitro karena  memiliki  bentuk  terbaik
dari sel kanker lainnya (9) , karakteristik dari MCF-7  yaitu  resisten  terhadap  agen kemoterapi (10) . sedangkan pemillihan
kultur  sel  HeLa  pada  penelitian  ini merupakan Continuous  cell  line ini  lebih mudah  ditangani,  tumbuh  lebih  cepat, sehingga mampu memproduksi  lebih banyak sel (11) .

## METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah, alat  gelas, botol cokelat,  pisau, blender,  ayakan mesh 40,  kertas  saring, rotary  evaporator,  cawan  penguap,  cawan krus  porselen,  oven,  pH  meter,  timbangan analitik  (ACID  AD-300i), Microplate 96 well, inkubator  CO 2 ,  autoklaf, biological safety  cabinet II,  mikroskop inverted, mikro  pipet,  pipet  tips,  alumunium  foil, ELISA Reader.
Bahan  pada  penelitian  ini  adalah kulit  jengkol (Archidendron  jiringa) yang telah dideterminasi oleh Herbarium Bogoriense,  Pusat  Penelitian  Biologi, Lembaga  Ilmu  Pengetahuan  Indonesia (LIPI). Kultur sel kanker payudara MCF-7 dan  HeLa  koleksi  dari  Laboratorium Kultur  Sel  dan  Sitogenetika  Rumah  Sakit
Pendidikan Universitas Padjajaran Bandung.  Bahan  lain  antara  lain  adalah etanol  70%,  reagen fitokimia, RPMI
(Rosewell  Park  Memorial  Institute) 1640,
FBS (fetal bovine serum), PBS (phosphate buffered salina), DMSO (dimetil sulfoksida), Penicilline-streptomisin, Amfoterisin B,  Tripsin EDTA 5%, Tripan Blue  Stain  0,4%,  MTT  (3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium
bromida) dan doxorubicin HCl injeksi.
Ekstraksi Kulit Jengkol. Kulit  jengkol  dipanen  kemudian dibersihkan
dirajang kemudian dikeringkan. Simplisia kering digiling agar memudahkan  dan  mengoptimalkan  proses
ekstraksi.  Sebanyak  700  gram  serbuk simplisia  kulit  jengkol,  masing-masing dimasukkan  pada  botol  cokelat  kemudian ditambahkan etanol 70% sampai terendam. Maserasi  dilakukan  selama  3x24  jam  dan setiap  1x24  jam  dilakukan  penggantian pelarut untuk menghindari jenuhnya pelarut.  Filtrat  yang  diperoleh  diuapkan pelarutnya dengan rotary vacuum
evaporator dan pemekatan dengan waterbath hingga diperoleh ekstrak kental. Kemudian  pada  ekstrak  kental  dilakukan penapisan  fitokimia  untuk  identifikasi senyawa  golongan  alkaloid,  flavonoid, tanin, saponin, dan triterpenoid/steroid (12) .
Preparasi Sel.
Sel  inaktif  yang  disimpan  pada freezer suhu -80 o C  dalam  ampul  segera dicairkan  pada  suhu  37 o C  kemudian disemprot  etanol  70%.  Ampul  dibuka  dan suspensi  sel  diambil  sebanyak  1  mL dimasukkan  tetes  demi  tetes  pada  falcon tube yang  berisi  media  kultur  sebanyak  3 mL.  Suspensi  sel  disentrifus  1000  rpm selama  5  menit,  lalu  bagian  supernatan dibuang. Pellet ditambahkan 20 mL media kultur dan diresuspensikan hingga homogen.  Selanjutnya  sel  ditumbuhkan pada culture  flask,  diinkubasi  pada  suhu 37 o C dengan aliran 5% CO 2 selama 24 jam (masing-masing sel 1 culture flask). Media diganti  setiap  2  hari  sekali  dan  sel ditumbuhkan  hingga  sel  80%  konfluen. Selanjutnya  media  kultur  dibuang  dan  sel dicuci  dengan  PBS  1x,  pada culture  flask ditambahkan  tripsin  sebanyak  3  mL  untuk melepaskan  sel  dari  matriks,  setelah  sel sudah  lepas  semua  ditambahkan  media kultur untuk menginaktifkan tripsin, karena  dalam  media  kultur  terdapat  FBS (fetal bovine serum) yang dapat
menetralkan tripsin. Kepadatan sel
dihitung  dengan  diambil  sebanyak  10  µL sel  ditambahkan  tripan blue sebanyak  10
µ L kemudian dimasukkan pada
Haemocytometer  Nauber dan  dilakukan perhitungan  di  bawah  mikroskop  inverted sehingga  diperoleh  kepadatan sel  untuk MCF-7  sebesar  40x10 4 sel/mL,  jumlah  sel yang  digunakan  pada  tiap  sumuran  adalah 5x10 4 sel/mL,  sehingga  volume  sel  yang dipipet  sebanyak  12,5  mL  ditambahkan media  lengkap  7,5  mL.  Sedangkan  pada sel  HeLa  sebesar  35x10 4 sel/mL,  jumlah sel  yang  digunakan  pada  tiap  sumuran sama  dengan  di  atas,  sehingga  volume  sel yang dipipet sebanyak 14,3 mL
ditambahkan  media  lengkap  5,7  mL  dan masing-masing  sel  ditransfer  ke  masing- masing  sumuran  sebanyak  200  µ L  dan  sel siap diberikan perlakuan.

## Penentuan Sitotoksisitas dengan Metode MTT.
Sel  yang  telah  ditransfer  ke  dalam masing-masing  sumuran,  sel  diinkubasi pada  suhu  37 o C  dengan  aliran  5%  CO 2 selama  24  jam.  Setelah  diinkubasi  dan  sel sudah  normal,  sel  diberikan  perlakuan dengan  larutan  uji  2000  µ g  kemudian ditambahkan  pelarut  DMSO  1%  dalam media  kultur  sebanyak  2000  µ L  sehingga diperoleh larutan induk dengan konsentrasi  1000  µ g/mL.  Dari  larutan induk  tersebut  dibuat  seri  konsentrasi  25, 50,  100,  200,  400  dan  800    µ g/mL  untuk perlakuan. Masing-masing konsentrasi dimasukkan  pada  tiap-tiap  sumuran  yang sudah ditentukan secara triplo. Selanjutnya diinkubasi  kembali  suhu  37 o C  dengan aliran  5%  CO 2 selama  48  jam.  Pada pengujian  ini  terdapat  beberapa  kontrol, yaitu  kontrol  media,  kontrol  pelarut DMSO  1%  dalam  media  dan  kontrol positif.  Kontrol  positif  yang  digunakan, yaitu  doxorubicin  HCl  dengan  konsentrasi 25,  50,  100,  200,  400  dan  800  µ g/mL. Setelah  48  jam,  media  kultur  dibuang kemudian  sel  dicuci  dengan  100  µ L  PBS pada tiap-tiap sumuran kemudian ditambahkan  reagen  MTT  10% dalam
media  kultur  100  µ L,  selanjutnya  sel diinkubasi  selama  4  jam  dalam  inkubator dengan  aliran  5%  CO 2. Sel  yang  hidup akan  bereaksi  dengan  reagen  MTT  yang berwarna kuning membentuk kristal formazan  berwarna  ungu.  Reaksi  MTT dihentikan  dengan  penambahan 100  µ L DMSO  pada  tiap-tiap  sumuran.  Plat  yang telah ditambahkan DMSO diinkubasi pada suhu  ruangan  selama  30  menit  kemudian dilakukan pembacaan absorbansi pada tiap sumuran  dengan  ELISA reader pada
panjang gelombang 550 nm. Data absorbansi  yang  diperoleh  dikonversi  ke dalam persen sel hidup.

## Analisis Data.
Data  absorbansi  yang  diperoleh digunakan  untuk  menghitung  persentase kematian  sel  terhadap  jumlah  sel  hidup dalam kontrol sel. Untuk menentukan nilai sitotoksik dilakukan perhitungan nilai IC 50 yang  dihitung  menggunakan  regresi  linier dari  perlakuan  terhadap  persen  hidup  sel. IC 50 merupakan  nilai  yang  menunjukkan kadar  yang  dapat  mematikan  50%  jumlah sel.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Simplisia.
Ekstraksi  maserasi  dipilih  pada proses  ekstraksi  kulit  jengkol  karena pengerjaannya  yang  cukup  sederhana  dan tidak  memerlukan  pemanasan.  Pelarut yang  digunakan  adalah  etanol  70%  karena sifatnya yang polar dan merupakan pelarut universal  sehingga  diharapkan  semua metabolit sekunder yang terkandung dalam daun  kulit  jengkol  dapat  berdifusi  ke dalam  pelarut.  Proses  maserasi  dilakukan 3x24  jam  dan  penggantian  pelarut    tiap 1x24  jam  dengan  harapan  senyawa  yang terkandung  dapat  terlarut  semua  kedalam pelarut.  Filtrat  yang  diperoleh  kemudian diuapkan pelarutnya dengan rotary vacuum evaporator dan pemekatan dengan
waterbath sehingga  diperoleh  ekstrak kental.  Ekstrak  kental  kulit  jengkol  yang diperoleh sebanyak 45 gram dari 700 gram serbuk  simplisia  kulit  jengkol  yang digunakan.
Berdasarkan pada penapisan fitokimia  yang  dilakukan,  diperoleh  hasil pada  ekstrak  kulit  jengkol  mengandung senyawa  golongan  alkaloid,  flavonoid, tanin,  saponin dan triterpenoid. Golongan senyawa  diatas  merupakan  senyawa  yang diduga dapat digunakan sebagai antikanker. Sitotoksisitas Ekstrak. Pada uji sitotoksisitas DMSO  1% sebagai pelarut juga diukur nilai
absorbansinya untuk melihat pengaruh DMSO  terhadap hasil  yang  diperoleh. Kadar  DMSO  kurang dari  3%  tidak bersifat toksik atau membunuh sel kanker sehingga dapat digunakan sebagai kontrol pelarut (13) .
Aktivitas sitotoksik sel kanker MCF-7  dan  sel  HeLa  juga  dapat  diamati secara  mikroskopis  dengan  mikroskop inverted untuk  melihat  morfologi  sel MCF-7  dan  sel  HeLa  tanpa  pemberian ekstrak  dan  setelah  pemberian  ekstrak konsentrasi 800 ppm. Hasil uji tersaji pada Gambar 1 dan Gambar 2.
Bedasarkan  pada  pengujian  MTT ekstrak  kulit  jengkol  terhadap  sel  MCF-7 dan  sel  HeLa  diperoleh  data  absorbansi yang kemudian digunakan untuk menghitung  persen  sel  hidup.  Untuk mengetahui  efek  sitotoksik  dari  sampel perlu  dilakukan  penghitungan  IC 50 dari persentase sel hidup tersebut dibandingkan dengan log konsentrasi sehingga diperoleh persamaan  regresi  linier.  Nilai  IC 50 merupakan konsentrasi yang menghasilkan hambatan  proliferasi  sel  kanker  sebanyak 50%  dan  menunjukkan  potensi  ketoksikan suatu  senyawa  terhadap  sel (14) .  Dari persamaan tersebut dihitung nilai
inhibition concentration (IC 50 ) dari ekstrak kulit  jengkol  terhadap  penghambatan  sel MCF-7 dan sel HeLa. Semakin besar kadar senyawa uji yang diberikan  pada suspensi sel,  maka  semakin  kecil  persentase  sel hidup yang dihasilkan. Nilai IC 50 merupakan  besarnya  konsentrasi  suatu yang menimbulkan penghambatan
kehidupan  dari  50%  sel (15) .  Nilai  IC 50 sel MCF-7  dapat  dilihat  pada  Gambar  3 sedangkan untuk  nilai  IC 50 sel  HeLa  dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 1. Perlakuan sel MCF-7 tanpa penambahan ekstrak (A), setelah penambahan ekstrak konsentrasi 800 ppm (B).
Gambar 2. Perlakuan sel HeLa tanpa penambahan ekstrak (A), setelah penambahan ekstrak konsentrasi 800 ppm (B).
Gambar 3. Nilai IC 50 ekstrak kulit jengkol dan doxorubicin  terhadap sel MCF-7.
- 10 20 30 40 50 60 Ekstrak Kulit Jengkol Doxorubicin IC 50 51,76 19,39 Perlakuan N il a i IC 50

## Gambar 4. Nilai IC 50 ekstrak kulit jengkol dan doxorubicin  terhadap sel HeLa
Berdasarkan pada data yang disajikan diatas  nilai  IC 50 ekstrak  kulit  jengkol terhadap  sel  MCF- 7  sebesar  51,76  μg/mL termasuk dalam kategori sitotoksisitas potensial sedangkan nilai IC 50 kontrol positif doxorubicin terhadap sel MCF-7 lebih kecil, yaitu  19,39  μg/mL  tergolong  antikanker. Doxorubicin  memiliki  nilai  IC 50 jauh  lebih kuat  dibandingkan  dengan pengaruh ekstrak kulit  jengkol  terhadap  sel  MCF-7.  Hal tersebut
dikarenakan doxorubicin merupakan  obat  kanker  yang  telah  teruji aktivitasnya dan pengaruh doxorubicin yang lebih sensitif terhadap sel kanker MCF-7 (16) .
Sedangkan  nilai  IC 50 ekstrak  kulit  jengkol terhadap  sel  HeLa  sebesar  39,618  μg/m L termasuk dalam kategori sitotoksisitas potensial sedangkan nilai IC 50 kontrol positif doxorubicin  terhadap  sel  HeLa  lebih  besar, yaitu 71,44 μg/mL termasuk dalam  kategori sitotoksisitas potensial.
Kategori  nilai  sitotoksisitas  dapat dikelompokkan menjadi  tiga  kelompok yaitu: (1) sitotoksik potensial jika IC 50 < 100 μg/mL,  (2)  sitotoksik  moderat  jika  100 μg/mL  <    IC 50 <  1000  μg/mL  dan  tidak toksik  jika  IC 50 >  1000  μg/mL.  kelompok senyawa  dengan  sitotoksisitas  potensial dapat  digunakan  sebagai  agen  antikanker sedangkan  sitotoksisitas  moderat  dapat dimanfaatkan  untuk  kemoprevensi  yang dapat mencegah dan menghambat
pertumbuhan  sel  kanker. National  Cancer Institute (NCI)  mengelompokkan  suatu senyawa  tergolong  antikanker  jika  IC 50 <  20 μg/ mL (17) . Berdasarkan pada kategori sitotoksisitas  tersebut  maka  ekstrak  kulit jengkol  dapat  digunakan  sebagai  agen antikanker yang potensial terhadap kultur sel MCF-7 dan sel HeLa. Namun, untuk melihat tingkat  selektivitas  ekstrak  kulit  jengkol dalam  penghambatan  sel  maka  perlu dilakukan  pengujian  terhadap  sel  normal kanker payudara dan kanker serviks.

## SIMPULAN
Kandungan senyawa pada ekstrak etanol  70%  kulit jengkol berdasarkan pada penapisan fitokimia menunjukkan
keberadaan golongan senyawa  alkaloid, flavonoid,  tanin, triterpenoid,  dan saponin. Hasil rendemen ekstrak kulit jengkol sebesar 6%.Nilai  IC 50 ekstrak kulit jengkol terhadap sel  MCF- 7  sebesar  51,76  μg/mL  termasuk dalam kategori sitotoksisitas potensial
sedangkan nilai IC 50 kontrol positif doxorubicin terhadap sel MCF-7 lebih kecil, yaitu  19,39  μg/mL  tergolong antikanker. Nilai  IC 50 ekstrak kulit jengkol terhadap sel HeLa sebesar 39,618 μg/mL termasuk dalam kategori sitotoksisitas potensial dan nilai IC 50 kontrol positif doxorubicin terhadap sel HeLa lebih besar, yaitu  71,44  μg/mL termasuk dalam kategori sitotoksisitas potensial. Berdasarkan pada kategori
- 10 20 30 40 50 60 70 80 Ekstrak Kulit Jengkol Doxorubicin IC 50 39,618 71,44 Perlakuan
sitotoksisitas tersebut maka ekstrak kulit jengkol dapat digunakan sebagai agen antikanker yang potensial terhadap kultur sel MCF-7 dan sel HeLa.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih kepada  LPPM  Sekolah  Tinggi  Teknologi Industri  dan  Farmasi  Bogor.  Penelitian didanai  oleh  Sekolah  Tinggi  Teknologi Industri  dan  Farmasi  Bogor  melalui  Hibah Internal Dosen STTIF Tahun 2018.

## DAFTAR PUSTAKA
1. [WHO]  World  Health  Organization, 2016,  Prevention.  Cancer  control: knowledge into action: WHO guide for effective  programmes:  module  2).
Geneva:  World  Health  Organization,
Indonesian Journal of Cancer, 11(1):1-
3.
2. [IARC] International Agency for Research  on Cancer,  2015,Globocan 2015:  Estimated  Cancer  Insidence, Mortality  and  Prevalence    Worldwide in 2012, Diakses melalui http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets _population.aspx.  pada  tanggal  5  Mei
2018 jam 11.20 WIB.
3. [Kemenkes RI] Kementerian Kesehatan Republik  Indonesia,  2016, Pusat  Data dan  Informasi  Kementerian  Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta: Kementerian Kesehatan RI, Hlm 4.
4. Tanu,  I,  2012, Antikanker, Di  dalam: Sulistia,  G.  G.,  Rianto,  S.,  Nafrialdi, Elysabeth,  editor, Farmakologi  dan
Terapi,  Edisi  IV,  Jakarta  :  Departemen
Farmakologi  dan  Terapeutik  Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Hlm
686-701.
5. Syafinir,  L.,  Krishnamurti,  Y.,  Ilma, M.,  2014,  Uji  aktivitas  antibiabetes ekstrak etanol kulit jengkol
(Arhidendron  pauciflorum  (Benth)  I.C.
Nielsen. Prosiding  SnaPP  2014  Sains,
Teknologi,  dan  Kesehatan,  Bandung:
FMIPA,  Universitas  Islam  Bandung, Hlm 67-72.
6. Simanjuntak, K., 2012, Peran Antioksidan Flavonoid Dalam
Meningkatkan  Kesehatan, Bina  Widya. 23:135-140. 7. Lubis,  M.  Y.,  Lamek,  M.,  M. Pandapotan,  N.,  Partomuan,  S.,  2016, Uji  Fenolik  dan  Uji  Toksisitas  Ekstrak Metanol  Kulit  Jengkol  (Archidendron jiringa). Chempublish Journal, 1
(2):42-51.
8. Meyer, B.N., Ferrigni, N. R., Putnam, J.
E.,  Jacobsen,  L.  B.,  Nichols,  D. E.  dan McLaughlin, J. L., 1982, Brine Shrimp: A  Convenient  General  Bioassay  for Active Plant Constituent, Planta Medica, 45:31-34.
9. Widowati,  L.  dan  Mudahar,  H.,  2009, Uji  aktivitas  ekstrak  etanol 50%  umbi keladi  tikus  (Typhonium  flagelliforme (lood) bi) terhadap sel kanker payudara MCF-7  in  vitro,  [Skripsi],  Media Litbang Kesehatan, Hlm 3 – 8. 10. Meiyanto, E., Susidarti, R.A., Handayani,  S.,  dan  Rahmi,  F.,  2008, Ekstrak  Etanolik  Biji  Buah  Pinang (Areca catechu L.) Mampu Menghambat  Proliferasi  dan  Memacu Apoptosis Sel MCF-7, Majalah Farmasi Indonesia,15(1):12-19.
11. Anggrianti,  P.,  2008,  Uji  Sitotoksisitas Ekstrak  Etanol  70%  Buah  Kemukus (Piper  cubeba L.)  Terhadap  Sel  HeLa, [Skripsi],  Surakarta: Fakultas  Farmasi
Universitas  Muhammadiyah  Surakarta, Hlm 20-21. 12. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: penuntun cara modern menganalisis tumbuhan oleh J.B.
Harborne,  terbitan  ke-2. Bandung:
Penerbit ITB, Terjemahan dari: Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro,  Hlm
24-35.
13. Medisusyanti,  A.S.,  Haryoto.  2018.
Aktivitas Sitotoksik Fraksi  Polar  Umbi
Bawang Putih  (Allium  sativumL.) terhadap Sel  T47D. Surakarta: The  7th University  Research  Colloqium.  Hlm 375-376. 14. Son, H.L., Anh, N.P., 2013, Phytochemical  composition,  in  vitro antioxidant  and  anticancer  activities  of quercetin  from  methanol  extract  of Asparagus  cochinchinensis, Academic Journal, 7(46): 3360-3366.
15. Sieuwerts,  A.  M.,  Klijn,  J.  G.  M.,
Peters, H. A., dan Foekens, J. A, 1995, The  MTT  Tetrazolium  salt  assay scrutinized:  How  to  use  this  assay reliably  to  measure  metabolic  activity of  cell  cultures  in  vitro  for  the assessment  of  growth  characteristics, IC 50 -values  and  cell  survival, Eur.  J. Clin. Chem. Clin. Biochem,33:813-823.
16. Putram,  N.M.,  Iriani,  S.,  Kustiariyah, T.,  Muhammad,  N.,  2017,  Aktivitas Antikanker Dari Fraksi Aktif Teripang. Jurnal  Pengolahan  Hasil  Perikanan Indonesia,20(1): 53-62. 17. [NCI]  National  Cancer  Institute,  2001. Measuring Cancer Death.Diakses: melalui http://www.cancer.gov/csr, Pada  tanggal  12  Agustus  2018  jam 10:42 WIB.