## Karakterisasi Fisiologi dan Molekuler Bakteri Simbion-Nematoda Entomopatogen Berdasarkan Sekuen Gen Pengkode 16S rRNA
dari Bromo Kabupaten Probolinggo
Characterization Physiology and Molecular Bacteria Symbiont- Entomopathogenic Nematodes Based of Gene Sequences Encoding the 16S rRNA District Of Bromo Probolinggo
Bagus Setiawan *) , Didik Sulistyanto **) ,  Kartika Senjarini ***)
*,***) Biology Department, Jember University **) Faculty of Agricultutre, Jember University
*) Email: gstemha@gmail.com

## ABSTRACT
This study aims to identify entomopathogenic nematodes symbiotic bacteria phenotypically and based on the gene  encoding  16S  rRNA  sequences.  Bacterial  symbionts  of  entomopathogenic  nematodes,  obtained  from isolates from the area Wonokerto (WN01) and isolates Sukapura (SP01), Bromo, Probolinggo, two symbiont bacteria was found in entomopathogenic nematodes Steinernema sp. The method used in this study are: the isolation  of  entomopathogenic  nematodes  Steinernema  sp.  and  bacterial  symbionts  conventionally  for  the identification of phenotypically, after the characterization of bacterial isolates, the isolation of genomic DNA, 16S  rRNA  PCR,  DNA  purification  and  DNA  sequence  analysis.  The  results  based  on  phenotypic characterization  showed  that  isolates  WN01  and  SP01,  yellowish  white,  gram  positive,  negative bioluminenscene, catalase positive, can not hydrolyze urea, and also can not produce H 2 S. The results of the gene encoding 16S rRNA sequence can be deduced WN01 isolates have in common with the bacteria Bacillus strain toyonensis BCT 7112, while the SP01 isolates have in common with the bacteria Bacillus strain cereus ATCC 14 579.
Keywords : bacterial  symbionts-entomopathogenic  nematodes, physiological  characterization,  Bacillus  strain toyonensis BCT7112, Bacillus cereus ATCC 14579

## PENDAHULUAN
Identifikasi  bakteri  dapat  dilakukan  dengan menggunakan  metode  konvensional  dan molekuler.  Metode  konvensional  dapat dilakukan  berdasarkan  pada  karakteristik fenotip  yaitu  pewarnaan  Gram,  morfologi  dan reaksi  biokimia.  Namun,  metode  identifikasi bakteri  secara  konvensional  ini  memiliki beberapa  kelemahan.  Metoda  ini  tidak  dapat digunakan  untuk  organisme  yang  belum teridentifikasi.  Lebih  lanjut,  kita  kadang- kadang  dihadapkan  dengan  organisme  yang menunjukkan karakteristik biokimia yang tidak cocok  dengan  pola  setiap  genus  dan  spesies yang  dikenal.  Sementara  itu,  identifikasi organisme  yang  ketika  dikultur  tumbuhnya lambat  menjadi  sangat  sulit  (Woo,  2003). Karakter  fisik  dan  biokimiawi  merupakan karakter  yang  tidak  statis  dan  berubah  karena adanya  stress  dan  evolusi,  maka  hal  ini  juga mempengaruhi  hasil  identifikasi  (Ochman,
2005).
Sejak  penemuan  Polymerase  Chain Reaction  dan  sekuensing  DNA,  perbandingan urutan  gen  dari  spesies  bakteri  menunjukkan bahwa  gen  16S  rDNA  sangat kekal  dalam suatu  spesies  dan  antar  spesies  dengan  genus yang sama, dan dapat digunakan sebagai teknik baru  untuk  identifikasi  bakteri  pada  tingkat spesies  (Oleson,  1993).  16S  subunit  kecil ribosom  DNA  (rDNA)  adalah  molekul  yang saat ini menjadi pilihan untuk mengidentifikasi bakteri dan  mikroorganisme lainnya di tingkat spesies.  Identifikasi  berbasis  rDNA  bersifat akurat  untuk  sampai  tingkat  spesies  karena urutan  16S  rDNA  yang  memiliki  kesamaan ≥ 99%  dari  sekuen  yang  ada  di  GenBank. Identifikasi pada tingkat genus dapat dilakukan apabila  urutan  sekuen  16S  rDNA  memiliki kesamaan ≥  97%  dengan  sekuen  yang  ada  di GenBank.  Kegagalan  dalam  mengidentifikasi dimungkinkan  apabila  sekuen  16S  rDNA memiliki  homologi  lebih  rendah  dari  97% dibandingkan  sekuen  yang  ada  di GenBank pada saat analisis.  Lebih jauh lagi fleksibilitas
yang  luar  biasa  membuatnya  sangat  berarti dalam hal skrining dan identifikasi mikroorganisme.
METODE
Isolasi  nematoda
Heterorhabditis sp . dan Steinernema sp entomopatogen  bakteri  simbion pada Galleria mellonella
Isolasi  nematoda  entomopatogen  dilakukan  dengan metoda  White  trap.  Serangga  yang  digunakan sebagai  umpan  adalah  Greater  wax  moth  larva Galleria  mellonella.  Perbanyakan  nematoda  juga dilakukan  secara  in  vivo  dalam  tubuh  larva  G. mellonella (Poinar,  1979;  Woodring,  1988).  Dan didapatkan juvenil infektif (ji) sebanyak 1 ml dengan konsentrasi  200  ji/ml  dimasukkan  ke  dalam  cawan petri  (diameter  20  cm)  yang  telah  dilapisi  dengan dua lapis kertas saring Whatman No. 1. Selanjutnya 40  larva  instar akhir  G.  mellonella  dimasukkan  ke dalam cawan petri tersebut dan diinkubasi di tempat gelap  selama  48  jam.  Larva-larva  yang  mati diletakkan pada cawan petri yang telah berisi kertas tisue  lembab,  kemudian  dimasukkan  pada  sebuah kotak  plastik  berukuran  lebih  besar  dari  diameter cawan  petri.  Kotak  plastik  ini  diisi  dengan  larutan formalin 0,1% setinggi setengah tinggi cawan petri. Setelah  5-6  hari  maka  juvenil  infektif  akan terperangkap dalam air dan siap untuk dipanen.

## Karakterisasi isolat bakteri
Isolasi
dilakukan  dengan  media  Nutrient Bromthymol  Blue  Triphenyltetrazolium  Chloride Agar  (NBTA)  untuk  mendapatkan  koloni  yang mampu menyerap bromthymol blue sehingga koloni berwarna  biru.  Koloni  bakteri  fase  primer  tersebut kemudian  diperbanyak  untuk  dijadikan  sumber inokulum.  Inokulum  diperbanyak  pada  media  NB (Nutrient Broth) cair yang diinkubasi selama 24 jam suhu ruangan (27°C) (Sulistyanto, 1999).
Karakterisasi  selanjutnya  yang  dilakukan  yaitu melihat  warna  satu  ose  isolat  bakteri  dari  stok kultur/inokulum pada gelas obyek dan ditambahkan 1 tetes kristal violet, 1 tetes Gram’s iodine mordant (Emerck),  etil  alkohol  95%  sampai  kristal  violet tidak  larut  lagi  dan  safranin  kemudian  dikeringkan dan  diperiksa  dengan  mikroskop.  Bioluminescence ditentukan  dengan  mengamati  kultur  bakteri  pada media  NA  berusia  48  jam  selama  10  menit  dalam kegelapan  total.  Pengujian  katalase,  diambil  sedikit biakan  bakteri  dengan  menggunakan  jarum  ose. Disuspensikan  biakan  tersebut  pada  setetes  larutan H 2 O 2 3%  pada  gelas  objek  dan  diamati  adanya gelembung.  Tes  urease  dilakukan  dengan menginokulasi bakteri resisten ke  media padat urea Christensen, tes positif ditandai dengan terbentuknya warna  merah.  Tes  produksi  H 2 S  dilakukan  dengan menginokulasi  bakteri  resisten  ke  media  SIM (pepton 30 g/L, ekstrak daging 3 g/L, feroamonium sulfat 0,2 g/L dan natrium tiosulfat 0,025 g/L, agar 3
g/L).  Tes  positif  ditandai  dengan  terbentuknya endapan hitam.

## PCR DNA pengkode 16S rRNA
Isolat  bakteri  yang  terlihat  pita  DNA  genomnya diamplifikasi  dengan  menggunakan  primer  DNA pengkode 16S rRNA yaitu 27F (5’ AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3’), 533F (5’ GTG CCA GCM GCC  GCG  GTA  A  3’),  dan  907R  (5’  CCG  TCA ATT CMT TTG AGT TT 3’), 1492R (5’ GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3’) (Lane, 1991).

## Analisis Sekuen DNA pengkode 16S rDNA
Penentuan  urutan  DNA  murni  (sekuensing) dilakukan  dengan  mengirimkan  DNA  hasil purifikasi  dari  produk  PCR  ke  Macrogen  Korea. Bioedit software digunakan untuk analisis data kasar hasil  sekuensing  (Tom  Hall,  Ibis  Therapeutics). Setelah diketahui alignment sekuen DNA pengkode 16S  rRNA  dari  masing-masing  isolat  maka sekuennya  dibandingkan  dengan  database  gen  16S rDNA menggunakan BLAST online software, untuk menentukan  spesies  dari  isolat  dan  hubungan kekerabatan dengan spesies bakteri lainnya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi  dari  isolat  bakteri  dilakukan dengan melakukan serangkaian pengujian sifat fisologis  dan  morfologi  yang  meliputi  hasil karakterisasi  isolat  bakteri  WN01  dan  SP01 didapatkan hasil bahwa isolat WN01 dan SP01 berwarna  putih  kekuningan, keduanya  Gram positif,  Bioluminenscene  negatif,  katalase positif,  tidak  dapat  menghidrolisis  urea,  dan juga  tidak  dapat  memproduksi  H2S.  Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1 Hasil uji fisiologi dan morfologi isolat Wonokerto (WN01) dan isolat bakteri
Sukapura (SP01). Uji fisiologi dan morfologi Isolat WN01 (Wonokerto) Isolat SP01 ( Sukapura) Warna koloni bakteri Putih kekuningan Putih kekuningan Gram + + Bioluminenscene - - Katalase + + Hidrolisis urea - - Produksi H 2 S - - Keterangan : (+): positip; (-): negatip Hasil  amplifikasi  DNA  pengkode  16S rRNA pada gambar 1 menunjukkan bahwa pita
DNA hasil PCR pada pasangan primer 27F dan 907R tampak sejajar dengan pita DNA marker
yang  berukuran  900  bp,  dan  relevan  dengan hasil  yang  diharapkan  yang terlihat  pada fragmen  DNA  berukuran  880  bp,  sedangkan pada  pita  DNA  pasangan  533F  dan  1492R berada  pada  kisaran  1.000  bp,  dan  hasil  ini sesuai dengan ukuran hasil PCR menggunakan pasangan  primer  tersebut  yaitu  pada    959  bp. Hasil  dari  visualisasi  elektroforesis  tampak seluruh  produk  PCR  yang  didapatkan merupakan pita tunggal, yang mengindikasikan bahwa kedua pasangan primer tersebut berhasil mengamplifikasi secara spesifik fragmen DNA pada  isolat  bakteri  WN01  dan  SP01  yang diharapkan,  yaitu    M:  Marker  1  kb;  nomor  1 dan  nomor  2:  Bakteri  Simbion  WN01  27F- 907R,533F-1492R;  nomor  3  dan  nomor  4: Bakteri Simbion SP01 27F-907R ,533F-1492R.
.
M:  Marker  1  kb DNA  ladder; Sumur 1  dan 2: Bakteri  Simbion  WN01  27F-907R,533F-1492R;
Sumur 3  dan 4:  Bakteri  Simbion  SP01  27F-907R ,533F-1492R.
Gambar 1 . Hasil elektroforesis dari  amplifikasi gen 16S rRNA isolat bakteri WN01 dan SP01.
Bakteri B. cereus adalah salah satu agensia patogen  yg  mempunyai  potensi  besar  untuk digunakan  sebagai  pengendali  hayati.  Bakteri ini  mempunyai  inang  yg  spesifik,  tidak berbahaya  bagi  musuh  alami  hama  dan organisme  non  target  lainnya,  mudah terbiodegradasi  oleh  lingkungan  serta  dapat dinaikkan  patogenisitasnya  dengan  teknik rekayasa  genetika  (Khetan,  2001).  Beberapa strain  B.  cereus  yang  patogenik  telah dikembangkan  untuk  mengendalikan  serangga hama diantaranya strain Pr 1017 yang diisolasi dari  larva  Pristiphora  erichsonii  yang  sakit (Heimpel  dan  Angus,  1963),  sedangkan Bacillus toyonensis strain BCT-7112 mempunyai  sifat  fisiologi  motil,  anaerob fakultatif,  dan  tipe  sel  single,  koloni  biasanya lebar, datar dengan seluruh tepi bergelombang
(undulate),  dan  sering  membentuk  cincin disekeliling  koloni  meluas  keluar  plate. Biasanya,  koloni  granulate,  berwarna  putih sampai  krim.  Suhu  pertumbuhannya  berkisar
antara  10-45°C,  dapat  tumbuh  optimum  pada suhu  35°C.  Memiliki  kedekatan  terdekat dengan  kelompok  bakteri  Bacillus  cereus ATCC 14579 (Jiménez, 2013).

## KESIMPULAN
Isolat  WN01  dan  SP01  memiliki  bentuk  sel basil  dan  Gram  positif,  berwarna  putih kekuningan, keduanya Gram positif, Bioluminenscene negatif, katalase positif, tidak dapat menghidrolisis urea, dan juga tidak dapat memproduksi H2S, dan dari hasil karakterisasi secara  fisiologi  dilanjutkan  berdasarkan  hasil analisis  DNA  pengkode  16S  rRNA,  isolat bakteri WN01 merupakan bakteri jenis Bacillus toyonensis  strain  BCT  7112  sedangkan  isolat bakteri  SP01  merupakan  bakteri  Bacillus cereus  ATCC  14579  dengan  presentase kemiripan 98%.

## DAFTAR PUSTAKA
Heimpel.  AM.  and  A.l  Angus.  1963. Disease Caused  by  Certain  Sporeforming  Bacteria. In  E.A.  Steinhaus  (Eds)  Insect  Pathology and Advanced Trastise . Vol. (2); Academic
Press, New York.
Jiménez  G,  Urdiain  M,  Cifuentes  A,  López- López A, Blanch AR, Tamames J, Kämpfer P,  Kolstø  AB,  Ramón  D,  Martínez  JF, Codoñer  FM,  Rosselló-Móra  R.  2013. Description of Bacillus toyonensis sp. nov., a  novel  species  of  the  Bacillus  cereus group,  and  pairwise  genome  comparisons of the species of the group by means of ANI calculations .  Syst  Appl  Microbiol.  2013 Sep;36. Vol. (6): 383-91. Epub 2013 Jun 19
Khetan,  S.K.  2001. Microbial  Pest  Control . http://www.cplbookshop.com/contents/C15 5.htm [diakses 17 September 2015] Ochman, H. and S. R. Santos. 2005. Exploring microbial microevolution with microarrays .
Infection, Genetics and Evolution. Vol. (5):
103–108. Olsen, G. J. & Woese, C. R. 1993. Ribosomal RNA: a key to phylogeny . FASEB  J. Vol.
(7): 113-123.
Poinar,  G.O.  1990. Taxonomy  and  biology  of Steinernematidae  and  Heterorhabditidae . Entomopathogenic Nematodes in biological Control  of  Insect.  Boca  Raton.  Florida: CRC Press. Sulistyanto, D. 1999. Nematoda Entomopatogen,  Steinernema  sp.  dan
Heterorhapditis  sp.  Isolat  Lokal  sebagai Pengendali  Hayati  Serangga  Hama Perkebunan .  Makalah  Lustrum  Universitas Jember, 2 Desember 1999. Jember: 12. Woodring, J.L. and Kaya. 1988. Steinernematid and Heterorhabditid nematodes .  A  Handbook  of  Technique.. Fayatvile.  Arkansas:  Arkansas  Agric.Expt. Stst. Woo  Patrick  C.  Y.,  Ng  Kenneth  H.  L.,  Lau Susanna  K.  P.,  Yip  Kam-tong,  Fung  Ami M.  Y.,  Leung  Kit-wah,  Tam  Dorothy  M. W.,  Que  Tak-lun,  dan  Yuen  Kwok-yung. 2003. Usefulness of the MicroSeq 500 16S Ribosomal DNA-Based Bacterial Identification  System  for  Identification  of Clinically  Significant  Bacterial  Isolates with  Ambiguous  Biochemical  Profiles . Journal of Clinical Microbiology. Vol. (5): 41.