## INDONESIA
Pengaruh Penambahan Bacillus subtilis Pada Biodegradasi DDT Oleh Phlebia brevispora
Purnomo, AS (*) ; Fajriah
1 Jurusan Kimia, FMIPA Institut Teknologi Sepuluh Nopember
Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
*e-mail: adi_setyo@chem.its.ac.id
Abstract-- DDT is a pesticide that persistent in the environment and has risk to human health. In this  study,  the  effect  of  addition  of Bacillus  subtilis on  biodegradation  of  DDT  by Phlebia brevispora was  investigated. B.  subtilis was  added  at    1,  3,  5,  7,  and  10  mL  (1  ml  ≈  6,7  ×  10 8 bacteria cell/ml culture). The highest degradation of DDT was shown in the addition of 10 mL of bacteria  about  75%  during  7-day  incubation,  and  compared  the  results  of  that  by P.  brevispora without  the  addition  of  bacteria  was  64%.  DDD,  DDE  and  DDMU  were  detected  as  metabolic products.  This  study  indicated  that  addition  of B.  subtilis can  enhance  DDT  degradation  by P. brevispora .
Keywords : Biodegradation, DDT, Phlebia brevispora, Bacillus subtilis
Abstract-- DDT  merupakan  pestisida  yang  bersifat  persisten  di  lingkungan,  dan  memiliki  resiko kesehatan  bagi  manusia.  Pada  penelitian  ini,  pengaruh  penambahan  bakteri Bacillus  subtilis pada biodegradasi  DDT  oleh  jamur Phlebia  brevispora telah  diteliti. B.  subtilis ditambahkan  pada volume 1, 3, 5, 7, dan 10 mL (1 ml ≈ 6,7 × 10 8 sel bakteri / ml kultur). Hasil degradasi DDT oleh P. brevispora tanpa  penambahan  bakteri  adalah  64%.  Degradasi  tertinggi  DDT  diperoleh  pada penambahan  10  mL  bakteri  sekitar  75%  selama  masa  inkubasi  7  hari.  DDD,  DDE  and  DDMU terdeteksi  sebagai  produk  metabolit.  Penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  penambahan B.  subtilis dapat meningkatkan degradasi DDT oleh P. brevispora.
Katakunci : Biodegradasi, DDT, Phlebia brevispora, Bacillus subtilis

## I. Pendahuluan
Dikloro-difenil-trikloroetana (DDT) merupakan insektisida  sintetik  pertama  yang  memiliki peranan  penting  dalam  membasmi  nyamuk malaria  selama  Perang  Dunia  ke  II.  Efek  DDT sebagai  pestisida  ditemukan  oleh  Paul  Muller pada  tahun  1939,  dimana  DDT  dijuluki  bahan kimia  ajaib  (the  wonder  chemical),  yang menyelamatkan  ribuan  hektar  tanaman  dari serangan  hama  serangga.  Akan  tetapi,  DDT memiliki  sifat  larut  dalam  lemak,  sehingga residunya terus terbawa dalam rantai makanan dan menumpuk  dalam  jaringan  lemak  [1].  Residu DDT  dapat  menimbulkan  masalah  kesehatan seperti  kanker  payudara,  gangguan  metabolisme
hormon,  gangguan  imunologi,  kerusakan  DNA dalam  sel,  dan  mampu  menurunkan  kemampuan reproduksi atau menyebabkan cacat pada janin [2]. Residu  DDT  hingga  kini  masih  ditemukan  di lingkungan  terutama  di  lokasi  yang  dekat  dengan aktivitas  manusia  seperti  pelabuhan,  dan  area pertanian.  Mengingat  dampak  negatif  yang ditimbulkan  dari  DDT,  diperlukan  suatu  metode yang  dapat  menghilangkan  atau  mengurangi residu DDT dan produk metabolitnya.
Beberapa  metode  untuk  proses  degradasi  DDT telah diterapkan, termasuk  secara fisikokimia dan biologi.  Pada  umumnya,  proses  kimia  dan  fisika lebih  cepat  dibandingkan  dengan  biologi,  akan tetapi  berdampak  pada  kondisi  tanah  dan memerlukan  biaya  yang  relatif  tinggi  [3,4].
Biodegradasi  merupakan  metode  paling  aman, efisien  dan  lebih  murah  dalam  mendegradasi beberapa  polutan  organik  dengan  menggunakan mikroorganisme (jamur atau bakteri) sebagai agen pendegradasi  dengan  cara  mengubah  senyawa tersebut menjadi senyawa yang kurang toksik atau senyawa tidak toksik yang ramah lingkungan [5,6]. Salah  satu  jamur  pelapuk  putih  yang  mampu mendegradasi DDT adalah Phlebia brevispora [7]. P.  brevispora hanya  mampu  mendegradasi  30% DDT  selama  21  hari  masa  inkubasi  [7],  dimana hasil  ini  relatif  rendah  dan  membutuhkan  waktu yang  lama,  sehingga  perlu  dilakukan  modifikasi kultur yang tepat untuk meningkatkan kemampuan P.  brevispora dalam  mendegradasi DDT.
Salah  satu  metode  untuk  mengoptimalkan degradasi  DDT  oleh  jamur  adalah  dengan penambahan  bakteri.  Bakteri  mampu  hidup  pada berbagai  habitat  dan  mampu  menguraikan senyawa-senyawa  kompleks  menjadi  senyawa- senyawa yang lebih sederhana untuk memperoleh zat-zat  tertentu  yang  dibutuhkan  dalam  rangka mempertahankan  hidupnya.  Beberapa  bakteri tanah  telah  diketahui  mampu  mendegradasi senyawa-senyawa  polutan  dimana  salah  satunya adalah Bacillus  subtilis . B.  subtilis dapat medegradasi  DDT  sebesar  65%  selama  14  hari masa  inkubasi  dalam  kondisi  anaerob  [8].  Selain itu, B.  subtilis juga  pernah  dilaporkan  dapat memproduksi  biosurfaktan  surfactin  [9,10]  yang dapat  digunakan  untuk  meningkatkan  kelarutan polutan  organik.  Berdasarkan  hal  tersebut, penambahan  bakteri B.  subtilis pada  kultur jamur P.  brevispora diharapkan  dapat  meningkatkan biodegradasi  DDT,  dimana B.  subtilis akan memproduksi  biosurfaktan  untuk  meningkatkan kelarutan  DDT  yang  bersifat  nonpolar  sehingga dapat  lebih  mudah  diakses  oleh  jamur  untuk didegradasi. Selain itu B. subtilis dapat membantu mendegradasi  DDT  dan  produk  metabolit  yang dihasilkan oleh jamur.
Penggunaan kultur campuran jamur dan bakteri untuk  meningkatkan  kemampuan  degradasi  DDT telah  dilaporkan  sebelumnya.  Optimasi  degradasi DDT oleh jamur dengan penambahan bakteri telah dilakukan  oleh  Hermansyah  [11],  dimana  kultur bakteri B. subtilis ditambahkan pada kultur jamur Pleurotus  ostreatus  pada  biodegradasi  DDT  dan diperoleh  peningkatan  degradasi  sebesar  42% selama  7  hari  inkubasi.  Peningkatan  degradasi DDT  oleh  jamur  Pleurotus  eryngii  dengan
penambahan  bakteri B.  subtilis juga  pernah dilaporkan  dapat  meningkatkan  degradasi  sebesar 88% [12]. Selain itu, bakteri B. subtilis juga dapat meningkatkan degradasi DDT oleh jamur pelapuk coklat Daedalea dickinsii dan Fomitopsis pinicola masing-masing  sebesar  74%  dan  86%  [13,14]. Berdasarkan  uraian  diatas,  pada  penelitian  ini diteliti  pengaruh  penambahan B.  subtilis pada degradasi DDT oleh jamur P. brevispora .

## II. Metodologi

## 2.1 Alat dan Bahan
Alat  dan  instrumentasi  yang  digunakan  pada penelitian ini yaitu: erlenmeyer berpenutup, gelas beker,  neraca  digital,  corong  pisah,  labu  bundar, corong kaca, jarum ose, cawan steril, botol ampul, suntikan  ( syringe ),  pompa  penyedot, ultrasonic cleaner ,  evaporator, autoclave , autoshacker , kertas saring Whatman 0,2 µm diameter 110 mm, HPLC terdiri dari pompa Integral PU-1500 (Jasco, Jepang)  dan  detector  UV-Vis  MD-1510  (Jasco, Jepang)  dilengkapi  dengan  kolom  Inertsil  ODS-3 (150  mm)  dengan  diameter  dalam  4,6  mm  (GL Science, Jepang).  GC/MS dengan  system  GC  HP 6890 (HP, USA) terhubung dengan detektor mass- selective HP 5973 (HP, USA) dengan kolom DB- 5MS (30 m, J &W Scientific, CA, USA).
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu:  jamur P.  brevispora TMIC34596  dan bakteri B. subtilis NBRC 3009 yang diperoleh dari koleksi jamur Laboratorium
Kimia Mikroorganisme  Jurusan  Kimia  FMIPA  ITS, DDT, Potato  Dextrose  Agar (PDA), Potato Dextrose  Broth (PDB), Nutrient  Borth (NB), Nutrient Agar (NA),  aseton, Aqua DM, Na 2 SO 4 .xH 2 O, n -heksana,  dimethyl  sulfoxide (DMSO),  metanol, trifluoro  acid (TFA),  pirena, DDE,  DDD,  dan  DDMU.  Semua  bahan-bahan kimia  adalah  PA  grade  (99%)  yang  didapatkan secara komersil dari PT Mitra Gemilang Surabaya
2.2 Regenerasi Jamur Phlebia brevispora
Jamur pelapuk putih dari spesies P. brevispora merupakan jamur yang digunakan dalam penelitian  ini.  Miselium  jamur P.  brevispora diinokulasikan  pada  medium  PDA  dalam  cawan petri berdiameter 9 cm, dan di pre-inkubasi secara statis pada suhu 30 °C selama 7 hari.

## 2.3 Persiapan Kultur Cair Jamur
Miselium  jamur P.  brevispora hasil  regenerasi (diameter  1  cm)  diinokulasikan  ke  dalam  labu
erlenmeyer  100  mL,  yang  berisi  media  10  mL medium  PDB,  dengan  menggunakan  jarum  ose secara  aseptis,  kemudian  dipre-inkubasi  selama  7 hari pada suhu 30°C [15-20].

## 2.4 Regenerasi Bakteri
Pada  penelitian  ini  digunakan  bakteri  B. subtillis  yang  diperoleh  dari  NITE  Biological Resource Center (NBRC, Jepang). Masing-masing bakteri  diregenerasi  dengan  cara  diinokulasi  ke dalam  cawan  petri  yang  berisi  medium  NA  dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam [21].

## 2.5 Persiapan Kultur Cair Bakteri
Sebanyak  1  koloni  bakteri  diinokulasikan  ke dalam  labu  erlenmeyer  (100  mL)  yang  berisi  60 mL  medium  NB.  Kultur  bakteri  diinkubasi  ke dalam  inkubator  dengan  shaker  pada  kecepatan 180 rpm dan suhu 37 °C selama 20 jam.

## 2.6 Biodegradasi DDT oleh Jamur pelapuk putih Phlebia brevispora
Setelah pre-inkubasi selama 7 hari, sebanyak 10 mL  PDB  medium  ditambahkan  ke  dalam  kultur Jamur P.  brevispora (volume  akhir  20  mL),  dan kemudian ditambahkan 50  µL DDT 5 mM dalam DMSO (konsentrasi akhir: 0,25 mmol DDT/labu). Tiap  labu  diberi  oksigen  dan  ditutup  dengan sumbat  kaca  serta  diselotip  untuk  mencegah penguapan  DDT.  Kultur  diinkubasi  secara  statis selama  7  hari  pada  suhu  30°C.  Sebagai  kontrol, kultur  dinonaktifkan  dengan autoclave pada  suhu 121°C selama 10 menit sebelum ditambah DDT.
2.7 Biodegradasi DDT oleh Bakteri Bacillus subtilis
Setelah  pre-inkubasi  selama  20  jam,  kultur bakteri  dengan  variasi  volume  1,  3,  5,  7,  dan  10 mL  (1  ml  ≈  6,7  ×  10 8 sel  bakteri  /  ml  kultur) dinokulasikan  ke  dalam  PDB  medium  (volume total  20  mL),  dan  kemudian  ditambahkan  50  µL DDT 5 mM dalam DMSO (konsentrasi akhir: 0,25 mmol  DDT/labu).  Tiap  labu  diberi  oksigen  dan ditutup  dengan  sumbat  kaca  serta  diselotip  untuk mencegah  penguapan  DDT.  Kultur  diinkubasi secara  statis  selama  7  hari  pada  suhu  30°C. Sebagai  kontrol,  kultur  dinonaktifkan  dengan autoclave  pada  suhu  121°C  selama  10  menit sebelum ditambah DDT.
2.8 Penambahan Bakteri Bacillus subtilis pada Biodegradasi DDT oleh Phlebia brevispora
Setelah  pre-inkubasi, B.  subtilis diinokulasi pada  variasi  volume  1,  3,  5,  7  dan  10  mL  secara terpisah  ke  dalam  10  mL  kultur  P.  brevispora,
kemudian  ditambahkan  PDB  sampai  didapatkan volume  akhir  20  mL.  Pada  masing-masing  labu yang  berisi  kultur  campuran  jamur  dan  bakteri ditambahkan  50  mL  DDT  5  mM  dalam  DMSO (konsentrasi  akhir:  0,25  mmol  DDT/labu).  Tiap labu diberi oksigen dan ditutup sumbat kaca serta diselotip untuk mencegah penguapan DDT. Kultur diinkubasi  secara  statis  selama  7  hari  pada  suhu 30°C. Sebagai kontrol negatif, kultur dinonaktifkan  dengan  autoclave  terlebih  dahulu pada  suhu  121°C  selama  10  menit  sebelum ditambah DDT.

## 2.9 Perolehan Ulang (Recovery) DDT dan Identifikasi Produk Metabolit
Masing-masing  kultur  hasil  inkubasi  ditambah 20  mL  metanol  dan  50  µL  pirena 5  mM.  Sampel dicuci  dengan  5  mL  aseton.  Kultur  disaring menggunakan  kertas  saring  Whatman  41  (GE healthcare life Science, UK) 0,2 µm diameter 110 mm.  Filtrat  dievaporasi  pada  suhu  64°C  dan diekstrak dengan 200 mL n-heksana. Fasa organik dipisahkan,  lalu  dikeringkan  dengan  Na 2 SO 4 anhidrat,  dan  kemudian  dievaporasi  pada  suhu 68°C  hingga  tersisa  sekitar  1  mL.  Konsentrat sampel  dianalisis  menggunakan  GCMS  dengan gas pembawa Helium, volume injeksi 1 µL, aliran spilt  54  mL/menit,  dan  suhu  oven  diatur  80°C selama 3 menit, dinaikkan  hingga 320°C, ditahan selama 2 menit dengan kenaikan konstan 20°C per menit,  kemudian  suhu  diturunkan  menjadi  300 o C dan  ditahan  selama  5  menit.  Sisa  sampel dievaporasi kembali hingga kering dan ditambah 1 mL  metanol.  Sampel  dihomogenkan  dengan ultrasonic cleaner , kemudian dianalisis menggunakan  HPLC,  dan  dielusi  dengan  82% metanol dan 18% air (1% TFA) dengan laju alir 1 ml/min [15,22,23].

## III. Hasil dan Pembahasan
3.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum dan Pembuatan Kurva Kalibrasi
P.  brevispora telah  dilaporkan  memiliki kemampuan  untuk  mendegradasi  DDT  masing- masing sekitar 9% dan 30% selama inkubasi 7 dan 21  hari  pada  media low  nitrogen (LN)  [7].  Akan tetapi,  hasil  degradasi  tersebut  relatif  rendah  dan membutuhkan waktu inkubasi yang panjang. Oleh karena  itu,  kemampuan P.  brevispora dalam mendegradasi  DDT  perlu  ditingkatkan  dengan penambahan  bakteri B.  subtilis .  Bakteri  ini  telah dilaporkan sebagai bakteri yang dapat memproduksi biosurfaktan, yang dapat digunakan
untuk  meningkatkan  kelarutan  zat  organik hidrofobik termasuk DDT, untuk mengoptimalkan akses penyerapan oleh jamur [24-26].
Dalam  penelitian  ini, P.  brevispora memiliki kemampuan  untuk  mendegradasi  DDT  sekitar 64%  selama  inkubasi  7  hari  dalam  media  PDB. Dalam  penelitian  ini,  hasil  degradasi  (64%)  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  hasil  degradasi  yang telah dilaporankan sebelumnya (9%) oleh Xiao et al.  [7],  pada  konsentrasi  DDT  (konsentrasi  akhir: 0,25 mmol DDT/labu) dan waktu inkubasi (7 hari) yang  sama.  Dalam  penelitian  ini,  media  PDB digunakan  sebagai  media  P.  brevispora,  dimana media  PDB  ini  mengandung  nutrisi  yang  lebih lengkap dibandingkan dengan media LN, sehingga P. brevispora lebih cocok untuk tumbuh dan  dapat  mendegradasi  DDT  yang  lebih  tinggi. Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  komposisi  media pertumbuhan  berpengaruh  dalam  meningkatkan kemampuan P.  brevispora untuk  mendegradasi DDT.
Hasil  dari  degradasi  DDT  oleh B.  subtilis ditunjukkan dalam Tabel 1. Bakteri mendegradasi DDT  masing-masing  sekitar  35%,  66%,  80%, 84% dan 86% pada volume 1, 3, 5, 7, dan 10 mL bakteri dalam media PDB. Hasil ini menunjukkan bahwa  semakin  banyak  jumlah  bakteri B.  subtilis pada  media  PDB,  semakin  tinggi  juga  jumlah DDT  yang  terdegradasi.  Kantachote  et  al.  [27] telah  melaporkan  bahwa  Bacillus  sp.  mampu menurunkan  DDT  oleh  51%  dalam  kultur  cair selama  masa  inkubasi  7  hari. Bacillus  cereus, Bacillus  coagulans , B.  subtilis , Escherichia  coli dan Enterobacter aerogenes juga dapat mendegradasi  DDT  [28].  Selain  itu, B.  subtilis juga  telah  dilaporkan  mampu  mendegradasi beberapa  polutan  organik  yang  persisten  (POPs), termasuk  DDT  [8,28,29].  Hal  ini  menunjukkan bahwa  bakteri B.  subtilis memiliki  kemampuan untuk  mendegradasi  DDT  selain  menghasilkan biosurfaktan.
Kemampuan jamur P. brevispora mendegradasi DDT  dengan  penambahan  bakteri B.  subtilis ditunjukkan  dalam  Tabel  1.  Setelah  inkubasi selama  7  hari,  masing-masing  sekitar  56%,  58%, 60%,  66%  dan  75%  dari  DDT  terdegradasi  oleh campuran  kultur  jamur  dan  bakteri  dengan penambahan  bakteri  pada  1,  3,  5,  7,  dan  10  mL (Tabel.  1).  Hasil  ini  menunjukkan  bahwa penambahan bakteri B. subtilis dapat meningkatan degradasi DDT oleh P. brevispora . Hai et al. [30] melaporkan  bahwa  kultur  campuran  bakteri  dari
lumpur  dan  jamur  pelapuk  putih Coriolus versicolor bisa  menghilangkan  pestisida  aldicarb, atrazin, dan alachlor masing-masing sebesar 82%, 77%,  dan  67%  setelah  diinkuasi  selama  7  hari. Selain  itu,  kultur  campuran  jamur-bakteri  juga dapat  menghilangkan  pirena  lebih  tinggi  (67%), dibandingkan  dengan  kultur  campuran  jamur- jamur (39%) dan campuran bakteri-bakteri (56%) selama  inkubasi  28  hari,  serta  dalam  degradasi fenantrena  dan  fluorantena  [31].  Data  ini menunjukkan  bahwa  kultur  campuran  jamur- bakteri  bisa  menurunkan  polutan  organik  secara efektif.
Penambahan B.  subtilis dalam  kultur  jamur P. brevispora memiliki pengaruh yang berbeda-beda pada proses degradasi DDT. Degradasi DDT oleh P. brevispora meningkat pada penambahan 7 dan 10  mL  bakteri B.  subtilis ,  sedangkan  pada penambahan  1,  3  dan  5  mL,  mengakibatkan penurunan  jumlah  degradasi  DDT  karena  bakteri tidak  cukup  untuk  menghasilkan  biosurfaktan. Penambahan 10 ml bakteri B. subtilis pada kultur jamur P.  brevispora menghasilkan  degradasi paling tinggi sekitar 75%. B. subtilis menghasilkan  biosurfaktan  lipopeptida  yang meningkatkan kelarutan zat non-polar [24,32].

## 3.2 Identifikasi Produk Metbolit
Identifikasi produk metabolit dari DDT oleh P. brevispora , B.  subtilis dan  kultur  campuran, dianalisa menggunakan GCMC dengan membandingkan  waktu  retensi  dan  spektrum massa. Pada P. brevispora , produk metabolit dari DDT  teridentifikasi  antara lain  DDD  (1,1-dikloro 2,2-bis  (4-klorofenil)  etana),  DDE  (1,1-dikloro 2,2-bis  (4-klorofenil)  etilen  )  dan  DDMU  (1- chloro  2,2-bis  (4-klorofenil)  etana)  (data  tidak ditampilkan).  Xiao  et  al.  [7]  telah  melaporkan bahwa P. brevispora mendegradasi DDT menjadi DDD, dan kemudian mengkonversi DDD menjadi 2,2-bis  (4-klorofenil)  asam  asetat  (DDA)  dan kemudian  diikuti  menjadi  4,4-diklorobenzofenon (DBP) dan 4,4 -diklorobenzihidrol (DBH) selama masa inkubasi 21 hari. Dalam studi ini, DDD juga terdeteksi  sebagai  metabolit  utama,  selain  DDE dan  DDMU.  Metabolit  ini  mungkin  dihasilkan selama  degradasi  awal,  yang  kemudian  diubah menjadi metabolit seperti dilaporkan oleh Xiao et al. [7]. DDMU dihasilkan dari reduktif deklorinasi reduktif  DDD  atau  dehidroklorinasi  dari  DDE. Dalam  kasus B.  subtilis ,  metabolit  DDT diidentifikasi seperti DDD dan DDMU (data tidak ditampilkan).  DDD  juga  terdeteksi  sebagai
metabolit  utama,  dimana  DDMU  dihasilkan  dari redukti deklorinasi dari DDD.
Pada  kultur  campuran P.  brevispora dengan penambahan B. subtilis , metabolit DDT teridentifikasi  seperti  DDD,  DDE  dan  DDMU. Kromatogram produk metabolit DDT ditunjukkan pada Gambar. 1, dimana pirena digunakan sebagai standar  internal.  Puncak  dari  pirena,  DDD,  DDE, dan  DDMU  memiliki  waktu  retensi  masing- masing  11,7,  13,4,  12,2  dan  11,3  menit,  yang memiliki  m/z  masing-masing  202,  235,  246, 212. Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  produk  metabolit
dari  DDT  oleh  kultur  campuran  adalah  produk metabolit  DDT  oleh P.  brevispora tanpa penambahan bakteri. Hal ini menunjukkan bahwa P.  brevispora merupakan  biota  utama  pada degradasi  DDT  oleh  kultur  campuran  jamur- bakteri. B.  subtilis mungkin  mendukung  pada produksi biosurfaktan untuk meningkatkan degradasi  DDT  bukan  untuk  mendegradasi  DDT itu sendiri. Akan tetapi, penyelidikan tentang jalur degradasi  DDT  oleh  kultur  campuran  jamur- bakteri memerlukan penyelidikan lebih lanjut.
Tabel 1. Degradasi DDT oleh jamur P. brevispora , bakteri B. subtilis dan kultur campuran dalam media PDB selama inkubasi 7 hari.
Volume B. subtilis (mL) Degradasi DDT (%) B. subtillis Kultur Campuran (hanya P. brevispora) 64.25 ± 3.86 1 35.38 ± 6.36 55.73 ± 0.19 3 66.21 ± 0.64 57.84 ± 0.98 5 79.51 ± 0.04 59.89 ± 0.27 7 84.06 ± 1.76 66.35 ± 1.31 10 86.44 ± 1.64 75.00 ± 0.01
Analisa dilakukan menggunakan HPLC. Data merupakan rata-rata ± standard deviasi (n = 3). 1 mL bakteri setara dengan 6.7 × 10 8 sel bakteri /mL kultur.
28.  Bezza,  F.A.,  &  Chirwa,  E.M.N.  (2015).  Production  and  applications  of  lipopeptide biosurfactant for bioremediation and oil recovery by Bacillus subtilis CN2. Biochemical Engineering Journal 101 , 168-178.
Table 1 . Degradation of DDT by Bacillus subtilis in PDB medium during 7-days incubation period.
Bacteria Amount (mL) % DDT Degradation
1 3 5 7
10
38.69 ± 6.36
69.52 ± 0.64
82.82 ± 0.04 87.36 ± 1.76 89.74 ± 1.64
Table 2 . Degradation of DDT by mixed cultures of P. brevispora and B. subtilis in PDB medium during 7-days incubation period. Addition of Bacteria (mL) % DDT Degradation 1 3 5 7 10
55.73 ± 0.19 57.84 ± 0.98
59.89 ± 0.27
66.35 ± 1.31 75.00 ± 0.01
Figure 1 Chromatogram of DDT degradation by mixed culture P. brevispora and B. subtilis during 7 days incubation period.
DDD DDE DDMU Pyren
Gambar 1. Kromatogram hasil degradasi DDT oleh kultur campuran P. brevispora dan B. subtilis
Jamur pelapuk putih termasuk beberapa spesies Phlebia merupakan jamur yang dapat menghasilkan  ekstraselular  enzim  ligninolitik seperti  lakase,  MnP  dan  LiP,  yang  bertanggung jawab  untuk  mendegradasi  lignin  serta  polutan [33-36].  Namun,  keterlibatan  enzim  ini  dalam degradasi DDT belum diketahui. Selain itu, enzim intraseluler  mungkin  terlibat  dalam  degradasi DDT,  yang  salah  satunya  adalah  sitokrom  P450 monooksigenase (P450). Enzim
P450
mengkatalisis berbagai reaksi seperti hidroksilasi, oksidasi, reduksi, dehalogenasi, dan dehidrogenasi. P450  terlibat  dalam  degradasi  beberapa  polutan [37-43]. Dalam kondisi aerobik, DDT dimetabolisme  menjadi  DDD,  dicofol  dan  2,2-bis (4-klorofenil)  asam  asetat  (DDA)  oleh  P450 [44,45],  dimana  DDT  monohydroxylation  dari cincin  aromatik  dengan  P450  diusulkan  sebagai jalur  metabolisme  baru  DDT  biodegradasi  [46]. Hal ini diasumsikan bahwa baik enzim ekstraselular  ligninolitik  dan  enzim  intraselular P450  memiliki  peran  penting  dalam  metabolisme DDT.

## IV. Kesimpulan
Penambahan bakteri B. subtilis dapat meningkatkan  degradasi  DDT  oleh P.  brevispora selama masa inkubasi 7 hari, dimana penambahan 10  mL B.  subtilis menunjukkan  degradasi  DDT tertinggi  (75%).  DDD,  DDE  dan  DDMU terdeteksi  sebagai  produk  metabolik.  Penelitian menunjukkan  bahwa B.  subtilis dapat  digunakan untuk  meningkatkan  degradasi  DDT  oleh P. brevispora.

## V. Ucapan Terimakasih
Penulis  berterima  kasih  kepada  Prof.  Ichiro Kamei,  dari  University  of  Miyazaki  yang  telah membantu dalam penyedian instrumen HPLC dan GCMS.  Penelitian  ini  dibiayai  dari  hibah penelitian  skem  Penelitian  Unggulan  Perguruan Tinggi (PUPT) 2016 No: 01714 / IT2.11 / PN.08 / 2016, dari Direktorat Jenderal Penguatan
Penelitian dan Pengembangan, Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi, Indonesia.

## Daftar Pustaka
[1] World  Health  Organization,  “Environmental Health  Criteria  9:  DDT  and  its  derivatives,” WHO, Geneva, 1979.
[2] M.  A.  Dalvie,  “DDT:  Health  Effects.  University of  Cape  Town,  Cape  Town,  South  Africa.” Elsevier, 2011.
[3] R.  Boussahel,  D.  Harik,  M.  Mammar  and  S. Lamara-Mohamed,  “Degradation  of  obsoletes DDT by Fenton oxidation with zero-valent iron.” Desalination, vol. 206(1), 2007, pp. 369-372.
[4] R. Borello, C. Minero, E. Pramauro, E. Pelizzetti, N.  Serpone,  and  H.  Hidaka,  “Photocatalytic degradation  of  DDT  mediated  in  aqueous semiconductor  slurries  by  simulated  sunlight.” Environ.  Toxicol.  Chem.,  vol.  8(11),  1989.  pp. 997-1002.
[5] J. Bumpus, D. D. Focht, M. Alexander, and S. D. Aust, “Biodegradation of DDT (1,1,1 trikloro-2,2- bis  (4-klorofenil)  etane)  by  “ Phanerochaete chrysosporium .”  Chemosphere,  vol.  19,  1985, Issues 8-9.
[6] J.  M.  Aislabie,  N.  K.  Richards,  and  H.  L.  Boul, “Microbial  degradation  of  DDT  and  its residues—a  review.”  NZJ.  Agricul.  Res.,  vol. 40(2), 1997, pp. 269-282.
[7] P.  Xiao,  T.  Mori,  I.  Kamei,  and  R.  Kondo,  “A novel  metabolic  pathway  for  biodegradation  of DDT by the white rot fungi, Phlebia lindtneri and Phlebia  brevispora .”  Biodegradation,  vol.  22(5),
2011, pp. 859-867.
[8] B. T. Johnson, and J. O. Kennedy, “Biomagnification of p,p'-DDT and methoxychlor by bacteria.” Appl. Microbiol., vol. 26, 1973, pp. 66-71.
[9] N.  Awasthi,  A.  Kumar,  R.  Makkar,  and  S. Cameotra, “Enhanced biodegradation of endosulfan, a chlorinated pesticide in presence of a biosurfactant.” J. Environ. Sci. Health B, vol. 34, 1999, pp. 793-803.
[10] C.  N.  Mulligan,  “Environmental  application  for biosurfactans.” Environ. J., vol. 133(2), 2005, pp. 183-198.
[11] F.  T.  Hermansyah,  “Optimasi  degradasi  DDT oleh Pleurotus  ostreatus dengan  penambahan bakteri Bacillus subtilis ”,  Skripsi,  Institut Teknologi Sepuluh November, Surabaya, 2014.
[12] D.  Lestari,  “Pengaruh  penambahan  bakteri Bacillus subtilis terhadap biodegradasi DDT oleh jamur  pelapuk  putih Pleurotus  eryngii ”,  Skripsi, Institut  Teknologi  Sepuluh  November,  Surabaya, 2016.
[13] H.  D.  Rizqi,  “Pengaruh  penambahan  bakteri terhadap  biodegradasi  DDT  oleh Daedalea dickinsii ”,  Tesis,  Institut  Teknologi  Sepuluh November, Surabaya, 2016.
[14] A.  Sariwati,  “Pengaruh  penambahan  bakteri terhadap  biodegradasi  DDT  oleh  jamur  pelapuk coklat Fomitopsis  pinicola ”,  Tesis,  Institut Teknologi Sepuluh November, Surabaya, 2016.
[15] A.  S.  Purnomo,  I.  Kamei,  and  R.  Kondo, “Degradation of 1,1,1-trichlro-2,2-bis (4-
chlorophenyl) ethane (DDT) by brown-rot fungi.” J. Biosci. Bioeng., vol. 105 (6), 2008, pp. 614-621.
[16] A.  S.  Purnomo,  F.  Koyama,  T.  Mori,  and  R. Kondo,  ”DDT  degradation  potential  of  cattle manure  compost.”  Chemosphere,  vol.  80  (6), 2010, pp. 619-624.
[17] A. S. Purnomo, T. Mori, I. Kamei, T. Nishii, and R.  Kondo,  ”Application  of  mushroom  waste medium from Pleurotus ostreatus for bioremediation of DDT-contaminated soil.” Inter. Biodet. Biodeg., vol. 64 (5), 2010, pp. 397-402.
[18] A. S. Purnomo, T. Mori, and R. Kondo, ”Involvement of Fenton reaction in DDT degradation  by  brown-rot  fungi.”  Inter.  Biodet. Biodeg., vol. 64 (7), 2010, pp. 560-565.
[19] A.  S.  Purnomo,  T.  Mori,  K.  Takagi,  and  R. Kondo,  ”Bioremediation  of  DDT  contaminated soil using brown-rot fungi.” Inter. Biodet. Biodeg., vol. 65 (5), 2011, pp. 691-695.
[20] A.  S.  Purnomo,  T.  Mori,  I.  Kamei,  and  R. Kondo,  ”Basic  studies  and  applications  on bioremediation of DDT: A review.” Inter. Biodet. Biodeg., vol. 65 (7), 2011, pp. 921-930.
[21] S.  Wahyuni,  M.  T.    Suhartono,  A.  Khaeruni,  A. S.Purnomo,  Asranudin,  Holilah,  P.  A.  Riupassa,
“Purification and Characterization of
Thermostable  Chitinase  from  Bacillus  SW41  for Chitin Oligomer Production.” Asian J. Chem., vol. 28(12), 2016, pp. 2731-2736.
[22] A.  S.  Purnomo,  T.  Mori,  S.  R.  Putra,  and  R. Kondo,  R.  ”Biotransformation  of  heptachlor  and heptachlor epoxide by white-rot fungus Pleurotus ostreatus .” Inter. Biodet. Biodeg., vol.  82, 2013, pp. 40-44.
[23] A.  S.  Purnomo,  S.  R.  Putra,  K.  Shimizu,  and  R. Kondo,  ”Biodegradation  of  heptachlor  and heptachlor  epoxide-contaminated  soils  by  white- rot fungal inocula.” Environ. Sci. Poll. Res., vol. 21, 2014, pp. 11305-11312.
[24] N.  Pornsunthorntawee,  N.  Arttaweeporn,  S. Paisanjit,  P.  Somboonthanate,  M.  Abe,  R. Rujiravanit,  and  S.  Chavadej,  “Isolation  and comparison  of  biosurfactants  produced  by Bacillus subtilis Pt2 and Pseudomonas aeruginosa SP4 for microbial surfactant- enhanced oil recovery.” Biochem. Eng. J., vol. 42, 2008, pp. 172-179.
[25] E.  J.  Gudiña,  V.  Rangarajan,  R.  Sen,  and  L.  R. Rodrigues,  “Potential  therapeutic  applications  of biosurfactants.”  Trends  Pharmac.  Sci.,  vol.  34, 2013, pp. 667-675.
[26] R.  Zouari,  S.  E.  Chaabouni,  and  D.  G.  Aydi, “Optimization  of Bacillus subtilis SPB1
biosurfactant production under solid-state
fermentation  using  by-products  of  a  traditional olive mill factory.” Achiev. Life Sci., vol. 8, 2014, pp. 162-169.
[27] D.  Kantachote,  I.  Singleton,  N.  McClure,  R. Naidu,  M.  Megharaj,  and  B.  D.  Harch,  “DDT resistance  and  transformation  by  different microbial strains isolated from DDT- contaminated  soils  and  compost  materials.” Compost  Sci.  Utiliz.,  vol.  11  (4),  2003,  pp.  300- 310.
[28] B.  E.  Langlois,  J.  A.  Collins,  and  K.  G.  Sides, “Some factors affecting degradation of organochlorine  pesticide  by  bacteria.”  J.  Dairy Sci., vol. 53, 1970, pp. 1671-1675.
[29] R.  Bidlan,  “Studies  on  DDT  degradation  by bacterial  strains.”  PhD  Thesis,  Central  Food Technological  Research  Institute,  University  of Mysore, India, 2003.
[30] F. I. Hai, O. Modin, K. Yamamoto, K. Fukushi, F. Nakajima, and L. D. Nghiem, “Pesticide removal by  a  mixed  culture  of  bacteria  and  white-rot fungi.” J. Taiwan Inst. Chem. Eng., vol. 43, 2012, pp. 459-462.
[31] S.  Wang,  N.  Nomura,  T.  Nakajima,  and  H. Uchiyama,  “Case  study  of  the  relationship between  fungi  and  bacteria  associated  with  high- molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbon degradation.” J. Biosci. Bioeng., vol. 113 (5), 2012, pp. 624-630.
[32] F.  A.  Bezza,  and  E.  M.  N.  Chirwa,  “Production and  applications  of  lipopeptide  biosurfactant  for bioremediation  and  oil  recovery  by  Bacillus subtilis CN2.”  Biochem. Eng. J., vol. 101, 2015, pp. 168-178.
[33] J.  A.  Buswell,  Y.  J.  Cai,  and  S.  T.  Chang, “Fungal-and substrate- associated factors affecting  the  ability  of  individual  mushroom species  to  utilize  different  lignocellulosic  growth substrates.”  In:  S.  Chang,  J.  A.  Buswell,  and  S. Chiu,  (Eds.),  Mushroom  Biology  and  Mushroom Products.  The  Chinese  Univ.  Press,  Hong  Kong, 1993, pp. 141-150.
[34] M.  Hofrichter,  T.  Lundell,  and  A.  Hatakka, “Conversion  of  milled  pine  wood  by  manganese peroxidase from Phlebia radiata .” Appl. Environ. Microbiol., vol. 67, 2001, pp. 4588-4593
[35] T.  Vares,  M.  Kalsi,  and  A.  Hatakka,  “Lignin peroxidases,  manganese  peroxidases,  and  other ligninolytic enzymes produced by Phlebia radiata during  solid-state  fermentation  of  wheat  straw. Appl.  Environ.  Microbiol.,  vol.  61,  1995,  pp. 3515-3520.
[36] A.  A.  Leontievsky,  T.  Vares,  P.  Lankinen,  J.  K. Shergill, N. N. Pozdnyakova, N. M. Myasoedova, N. Kalkkinen,  L.  A. Golovleva, R.  Cammack,  C. F.  Thurston,  and  A.  Hatakka,  ”Blue  and  yellow laccases  of  ligninolytic  fungi.”  FEMS  Microb. Lett., vol. 156, 1997, pp. 9-14
[37] S.  Masaphy,  D.  Levanon,  Y.  Henis,  K. Venkateswarlu,  and  S.  L.  Kelly,  “Evidence  for cytochrome P-450 and P-450-mediated
benzo(a)pyrene  hydroxylation  in  the  white  rot fungus Phanerochaete  chrysosporium .”  FEMS Microbiol. Lett., vol.  135, 1996, pp. 51-55.
[38] L. Bezalel, Y. Hadar, P. P. Fu, J. P. Freeman, and C. E. Cerniglia, “Initial oxidation products in the metabolism  of  pyrene,  anthracene,  fluorene,  and dibenzothiophene  by  the  white  rot  fungus Pleurotus  ostreatus .”  Appl.  Environ.  Microbiol., vol. 62, 1996, pp. 2554-2559.
[39] I.  Kamei,  and  R.  Kondo,  “Biotransformation  of dichloro-,  trichloro-,  and  tetrachlorodibenzo-p- dioxin by the white-rot fungus Phlebia lindtneri .” Appl. Microbiol. Biotech., vol. 68, 2005, pp. 560- 566.
[40] I. Kamei, S. Sonoki, K. Haraguchi, and R. Kondo, “Fungal  bioconversion  of  toxic  polychlorinated biphenyls by white-rot fungus,” Phlebia brevispora .  Appl.  Microbiol.  Biotech.,  vol.  73, 2006, pp. 932-940.
[41] T. Mori, and R. Kondo, ”Oxidation of chlorinated dibenzo-p-dioxin  and  dibenzofuran  by  white-rot fungus, Phlebia lindtneri.” FEMS Microbiol. Lett., vol. 216, 2002, pp. 223-227.
[42] T.  Mori,  K.  Nakamura,  and  R.  Kondo,  “Fungal hydroxylation  of  polychlorinated  naphthalenes
with  chlorine  migration  by  wood  rotting  fungi.” Chemosphere, vol. 77, 2009, pp. 1230-1235.
[43] N.  Hiratsuka,  H.  Wariishi,  and  H.  Tanaka, “Degradation of diphenyl ether herbicides by the lignin-degrading basidiomycete Coriolus Versicolor. ”  Appl.  Microbiol.  Biotech.,  vol.  57, 2001, pp. 563-571.
[44] A. Cùany, M. Pralavorio, D. Pauron, J. B. Berge, D.  Fournier,  and  C.  Blais,  “Characterization  of microsomal oxidative activities in a wild-type and in  a  DDT  resistant  strain  of Drosophila melanogaster .” Pestic. Biochem. Physiol., vol. 37, 1990, pp. 293-302.
[45] N.  Joußen,  D.  G.  Heckel,  M.  Haas,  I.  Schuphan, and B. Schmidt, “Metabolism of imidacloprid and DDT by P450 CYP6G1 expressed in cell cultures of Nicotiana  tabacum suggests  detoxification  of these  insecticides  in  Cyp6g1-overexpressing strains  of Drosophila  melanogaster ,  leading  to resistance.”  Pest  Manag.  Sci.,  vol.  64,  2008,  pp. 65-73.
[46] H. Suhara, A. Adachi, I. Kamei, and N. Maekawa, “Degradation  of  chlorinated  pesticide  DDT  by litter-decomposing basidiomycetes .”
Biodegradation, vol. 22, pp. 1075-1086.