## Perancangan Primer Oligonukleotida untuk Polimerisasi in Vitro Gen Sukrosa Sintase

## Pieter  Agusthinus  Riupassa
Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Pattimura, Kotak Pos 95 Jalan Ir. M. Putuhena, Kampus Poka Ambon 97233, Tel. +62-911-3301115

## Abstract
The most important problems in using polymerase chain reaction (PCR) are the efficiency of energy, cost   and   time   due   to   gene   amplification.   Oligonucleotide   primer   design   of   sucrose   synthase   gene   was conducted as a model of preliminary experiment to amplify gene using PCR. In plant cells, this gene plays an important role in carbohydrate metabolism, a sucrose molecule break down into glucose. This design involved some computer software as bioinformatics tools. Five data sequences of legumes were downloaded from gene   bank   using   accession   number   of  AF030231,  AJ311496,   X92378,   X69773,   and   D10266   belongs   to soybean,   pea,   alnus   bean,   fava   bean,   and   mung   bean,   respectively.  After   sequences   alignment,   some conservative   regions   were  determined   as   the  basis   to   construct  forward   and   reverse   primer  candidates. Furthermore, the candidates were tested for compatibility. The results showed that the oligonucleotide primers can amplify sucrose synthase gene with  1462 bp fragment size using 5’-AACTTTgTgCTTgA-3’ and 5’- TCCTTTgACTCCTTC-3’ for forward and reverse primer, respectively. Even the PCR process weren’t applied, those primers might be universal primers to amplify sucrose synthase gene of legume plants.
Key words : sucrose synthase, oligonucleotide primes, PCR, bioinformatics

## Pendahuluan
Perancangan primer oligonukleotida memegang peran yang sangat penting dalam kegiatan   biologi   molekuler.   Perancangan   ini   diharapkan   akan   menghasilkan   primer spesifik   yang   dapat   digunakan   dalam   proses   perbanyakan   (amplifikasi)   DNA.   Primer adalah nukleotida pendek berukuran 12-20 basa yang diperlukan sebagai titik pelekatan enzim polimerase DNA pada proses pembentukan atau pemanjangan DNA suatu gen spesifik   secara in   vitro melalui   teknik   reaksi   rantai   polimerisasi   ( polymerase   chain reaction, PCR). Teknik PCR ditemukan secara tidak sengaja oleh Kary Mullis pada tahun 1989.   Sebelum   penemuan   tersebut,   para   ahli   telah   mengetahui   bahwa   penggandaan materi genetik dapat terjadi di dalam tubuh ( in-vivo ) dan merupakan mekanisme yang umum. Namun, penemuan tersebut membuktikan bahwa reaksi polimerisasi DNA dapat juga terjadi di dalam tabung ( in-vitro ). Implementasi teknik PCR pada polimerisasi gen sukrosa   sintase   membutuhkan   teknik   perancangan   primer   yang   tepat   sehingga menghasilkan primer spesifik untuk deteksi gen.
Perancangan   primer   untuk   gen   yang   berperan   dalam   metabolisme   karbohidrat, sukrosa sintase, dapat dilakukan dengan memanfaatkan kode sekuens yang tersedia dan mudah diperoleh di internet pada beberapa situs, yaitu GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) yang mencakup koleksi data sekuens di Amerika, European Molecular Biology Laboratory – European Bioinformatics Institute / EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk) mencakup Eropa, dan DDBJ (www.ddbj.nig.ac.jp) di Jepang. Ketiga situs tersebut saling bertukar informasi basis data sehingga tidak terjadi duplikasi data dan dengan cepat terjadi pembaharuan data. Penggunaan   piranti   lunak   ( software )   Clustal-W   dan   NetPrimer   telah   memberikan kemudahan dalam perancangan ini. Software tersebut dapat dengan mudah dan cepat dieksekusi   melalui   hubungan   komputer-internet.   Dengan   demikian,   bioinformatika   di Indonesia harus segera menjembatani para ahli genetika, biologi molekuler, biokimia, dan ilmu komputer dalam kegiatan rekayasa genetika secara terpadu.
Penggunaan data GeneBank, software Clustal-W (Hinggins et al. , 1994; Pearson 1990), dan NetPrimer diperlukan dalam perancangan primer gen spesifik.  Perancangan ini  juga  telah  menghemat  tenaga,  uang,  dan  waktu daripada pekerjaan  uji  coba PCR
berulang-ulang di laboratorium. Studi perancangan primer merupakan kajian awal yang memudahkan pekerjaan molekuler terhadap suatu gen menggunakan teknik PCR.
Gen sukrosa sintase (UDP-glucose: D-fructose-2  -glucosyltranseferase, SuSy, SS, nodulin-100 ,) adalah gen yang menghasilkan enzim sukrosa sintase (EC 2.4.1.13), yang berperan penting dalam metabolisme karbohidrat. Enzim ini mengatalisis reaksi reversibel dari   sukrosa   uridin-difosfat   menjadi   fruktosa   dan   UDP-glukosa.   Sukrosa   sintase menyiapkan jalur UDP-glukosa untuk menghasilkan selulosa selama deposisi dinding sel (Haigler et al. , 2001). Peran sukrose sintase, suatu enzim tetramerik, dalam perombakan sukrosa   pada   bintil   akar   tanaman   kedelai   ( Glycine   max )   dengan   aktivitasnya   dapat mencapai   20   kali   lebih   besar  daripada   di   dalam  jaringan   akar   (Thummler  dan   Verma 1987; Gordon 1999).
Perancangan primer dilakukan berdasarkan sekuens basa atau asam amino yang konservatif. Tingkat konservatif dapat diperoleh melalui penjajaran ( alignment ) beberapa sekuens. Bila data asam amino tersedia dalam perancangan primer, maka terlebih dahulu data   tersebut   dikonversi   menjadi   sekuens   basa   menurut   urutan   kodon   tertentu (Dieffenbach dan Dveksler, 1995).
Primer   adalah   oligonukleotida   sintetis,   terdiri   atas   12   hingga   20   basa,   yang berfungsi  sebagai  prekursor   sintesis   DNA dari   cetakan   DNA.   Oligonukleotida   memiliki urutan sekuens berbeda dan komplementer dengan utas yang berlawanan pada cetakan DNA. Pada PCR diperlukan satu set primer yang masing-masing terletak di kedua ujung fragmen DNA target, yaitu primer forward (arah sintesis maju) dan reverse (arah sintesis terbalik),  yang dikatalisis oleh DNA polimerase.  PCR digunakan  untuk  memperbanyak segmen DNA, yang pada kedua ujungnya telah diketahui urutan basanya (Dieffenbach dan Dveksler, 1995).
Ada   beberapa   hal   yang   perlu   diperhatikan   dalam   perancangan   primer   untuk mengoptimalkan   perolehan   hasil   amplifikasi,   yaitu  terbebas   dari   pembentukan   struktur sekunder   (hairpin/struktur   tusuk   konde, dimer / self-dimer ,   dan cross   dimer ),   besar amplikon,   panjang   primer,   titik   leleh   (T m ),   dan   kestabilan   internal   (Dieffenbach   dan Dveksler, 1995).
Struktur   sekunder   pada   primer   dapat   terjadi   melalui   tiga   cara.   Pertama, hairpin (struktur   tusuk   konde),   yaitu   komplementasi   melalui   pelipatan   kembali   dirinya   akibat adanya   ikatan   intramolekul   yang   mampu   memutar   primer   sehingga   terjadi   pengikatan sendiri. Kedua, dimer adalah komplementasi antarsesama primer. Ketiga, cross dimer , yang prosesnya hampir sama dengan dimer tetapi komplementasi terjadi antara primer forward dan reverse (Rychlik, 1995). Temperatur   leleh   ( melting   temperatur ,   T m )   primer   adalah   temperatur   ketika   50% primer telah dapat menempel pada utas pasangannya. Temperatur ini dipengaruhi oleh rasio GC/AT primer. Makin besar ratio, makin tinggi temperatur. Temperatur yang rendah menghasilkan   amplikon   nonspesifik   ( non-target )   dan   mengurangi   efisiensi   amplifikasi karena   primer   yang   telah   menempel   ( annealing atau   renaturasi)   terlepas   bila   suhu dinaikkan pada saat sintesis ( elongation ) DNA. Temperatur kedua primer ( forward dan reverse )   yang   tidak   berselang   jauh   akan   memudahkan   penentuan   waktu   denaturasi (Rychlik, 1995). Freier et al . (1986) merumuskan perhitungan yang lebih akurat atas dasar teori   termodinamik   jarak   terdekat   ( nearest   neighbor   thermodynamic   theory )   sebagai berikut.
T m =  H/(  S + R * ln(C/4)) + 16.6 log ([K + ]/(1 + 0.7 [K + ])) - 273.15
T m : temperatur leleh primer
 H : entalpi pembentukan struktur heliks
 S : entropi pembentukan struktur heliks
R : konstanta gas molar 1,987 kal mol/ o C
C : konsentrasi asam nukleat
K + : konsentrasi garam (kation)
Stabilitas internal primer merupakan perbedaan kestabilan perlekatan primer ujung 5’ dan ujung 3’ pada DNA target. Primer dengan kestabilan ujung 5’ yang lebih besar daripada ujung 3’ pada umumnya memiliki interaksi spesifik primer-cetakan yang terbaik. Primer   dengan   kestabilan   yang   rendah   pada   ujung   3’   berfungsi   lebih   baik   karena perlekatan   nontarget   ujung   3’   menjadi   tidak   stabil   untuk   diperpanjang   oleh   DNA polimerase (Rychlik, 1995).
Multiple sequence alignment adalah cara penyusunan lebih dari dua sekuens untuk memperoleh  posisi   basa  (atau  asam  amino)  yang   lebih  mementingkan   kesamaannya. Proses ini dibantu dengan pendekatan skor matriks dan gap penalties , dan dengan cepat dapat dikerjakan dengan piranti lunak (ClustalW).
NetPrimer adalah piranti lunak yang digunakan dalam pengujian kelayakan primer untuk   menghasilkan   efisiensi   interaksi   primer-cetakan   dan   menghasilkan   amplikon spesifik dalam PCR (Breslauer et al ., 1986; Freier et al ., 1986; Rychlik et al ., 1990).

## Materi dan Metode
Sekuens  gen sukrosa sintase diperoleh dari situs internet  bank data EMBL-EBI. Lima data sekuens tanaman yang diperoleh adalah kacang kedelai, kacang ercis, kacang alnus, kacang fava, dan kacang hijau, yang berturut-turut menggunakan nomor akses AF030231,   AJ311496,   X92378,   X69773,   dan   D10266.   Sekuens   diperoleh   berupa file dalam   bentuk   standar   ( gene   bank   flatfile   format ,   GBFF).   Sekuens   DNA   atau coding sequence (CDS) dituliskan kembali dalam format Fasta (Pearson, 1990) dan disimpan sebagai suatu file teks.
Situs internet http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html digunakan untuk menjalankan piranti lunak ClustalW. File teks  sekuens berformatkan  Fasta  dapat  di upload dengan mengklik tombol perintah browse atau dengan prinsip copy-paste sekuens yang berformat Fasta ke dalam kotak teks Sequences (Higgins et al ., 1994). Klik tombol perintah run ClustalW digunakan untuk melakukan alignment sequence . Hasil analisis menunjukkan tanda “” bila   sekuens   basa   sama   pada   semua   jenis   tanaman.   Tanda   tersebut menunjukkan tingkat konservatif basa pada gen. Kandidat primer forward dan reverse dipilih bila dijumpai suatu bagian yang memiliki basa konservatif berjumlah 12 hingga 15 nukleotida. Dari hasil penjajaran dapat diperoleh tiga kandidat primer forward dan dua kandidat primer reverse (Gambar 1).
Pengujian   kelayakan   primer   dilakukan   menggunakan   situs http://www . premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch.html.   Kandidat   primer   dianalisis   untuk mengetahui kemungkinan terjadinya struktur hairpin , dimer , cross dimer, palindrome , dan repeat   and   run .   Sekuens   kandidat   primer   dimasukkan   ke   dalam   kotak   teks Oligo Sequence 5’-3’. Tombol sense dipilih ketika akan memasukkan sekuens untuk kandidat primer forward , sedangkan tombol anti-sense dipilih ketika akan memasukkan sekuens untuk kandidat primer reverse . Tombol perintah analyze diklik untuk menampilkan hasil pengujian   kelayakan   primer.   Selanjutnya,   tombol tabstrip hairpin , dimer , cross   dimer , palindrome , dan repeat and run dipilih secara simultan untuk mengetahui hasil analisis kelayakan kandidat primer. Cara ini dilakukan untuk semua kandidat primer forward dan reverse . Tombol print-screen pada keyboard ditekan sehingga setiap tampilan analisis di layar   monitor   dapat   terekam   sebagai   objek clipboard (gambar   Bitmap)   di   memori komputer, dan dengan segera setiap saat dapat dilakukan copy-paste ke dokumen baru Microsoft® Word atau ke gambar Bitmap Microsoft® Paint, melalui menu Edit  Paste. Primer terbaik yang dipilih adalah primer yang tidak atau sedikit memiliki struktur hairpin , dimer , dan cross dimer (Breslauer et al ., 1986; Freier et al ., 1986; Rychlik, 1995).
Gambar 1. Hasil penjajaran untuk mendapatkan tiga kandidat primer forward (F1, F2, dan F2.1) dan dua kandidat primer reverse (R1 dan R2). Garis bergelombang menjelaskan adanya penghapusan sebagian sekuens
Figure 1. Sequence alignment to obtain three candidates of forward primers (F1, F2, and F2.1) and two candidates of reverse primers (R1 and R2).   Curve line shows deleted parts of sequences

## Hasil dan Pembahasan
Dari   hasil   analisis multiple   sequence   alignment dengan   ClustalW   diperoleh   tiga kandidat primer forward dan dua kandidat primer reverse (Tabel 1). Penentuan kandidat primer didasarkan pula atas hasil analisis dengan NetPrimer untuk masing-masing primer tunggal. Bila tidak ditemukan hairpin , dimer , dan palindrome , maka kandidat primer ini digunakan   untuk   merancang   satu   set   primer   ( forward dan reverse ).  Adanya   sekuens berulang ( repeat and run ) tidak akan mempengaruhi prioritas urutan sebagai kandidat primer.
Tabel 1.  Kandidat primer forward dan reverse Table 1. Candidates for forward and reverse primers
Kode Sekuens ∑ basa T m ( o C) % GC Repeat & Run Keterangan ( . . . . . kandidat primer forward . . . . . ) F2 5’ AACTTTGTGCTTGA 3’ 14 31,18 35,71 TTT F2.1 5’ AACTTTGTGCTTGAG 3’ 15 34,82 40,00 TTT F2 + 1 basa G F1 5’ GTTCGTCCAAGGC 3’ 13 37,36 61,54 ( . . . . .  kandidat primer reverse . . . . . ) R2 5’ TCCTTTGACTCCTTC 3’ 15 36,41 46,67 TTT R1 5’ TTTATGAGCCAACAA 3’ 15 37,09 33,33 TTT
T m dihitung berdasarkan rumus Freier et al . (1986)
Tiga kandidat primer forward dan dua kandidat primer reverse dipasangkan secara simultan   untuk   menentukan   satu   set   primer.   Hasil   analisis   dengan   NetPrimer mempertimbangkan terjadinya struktur cross dimer maksimum dua macam ditampilkan dalam   Tabel   2.   Sebaliknya,   jika   ditemukan   struktur cross   dimer lebih   dari   dua,   maka secara langsung pasangan kandidat primer tidak dapat digunakan karena menurunkan efisiensi interaksi primer-cetakan.
Tabel 2.  Pasangan satu set primer forward-reverse dengan pembentukan cross dimer maksimum 2 macam
Table 2.   Pair of primers with cross dimer formation of a maximum 2  types
No Kode   Set   Primer Forward-Reverse Dugaan panjang amplikon (bp) Selisih T m antarprimer Jumlah 3’ Cross Dimer Visualisasi 3’ cross-dimer 1. F2 –  R2 1462 5,23 tidak ada 2. F2.1 –  R2 1462 1,59 1 Gambar 2a 3. F1 –  R2 1588 0,95 2 Gambar 2b 4. F1 –  R1 1016 0,27 2 Gambar 2c
a) b) c)
Gambar 2. Visualisasi struktur 3’ cross dimer pada pasangan primer forward-reverse Figure 2. Visualization of 3’ cross dimer structures in pairs of forward-reverse primers
Hasil   analisis   NetPrimer   terhadap   kandidat   primer forward-reverse berdasarkan syarat kelayakan primer menunjukkan bahwa pasangan primer dengan kode F2 – R2 layak dijadikan sebagai primer (Tabel 1). Secara berturut-turut urutan sekuensnya adalah 5’ AACTTTGTGCTTGA 3’ (panjang 14 basa) dan 5’ TCCTTTGACTCCTTC 3’ (panjang 15 basa). Dugaan panjang amplikon yang dihasilkan dalam proses amplifikasi (PCR) adalah  1462 pb.
Tiga   set   primer forward-reverse yang   lain   (F2.1-R1,   F1-R2,   dan   F1-R1)   tidak direkomendasikan   untuk   digunakan   sebagai   primer.   Hal   tersebut   disertai   dengan konsekuensi   rendahnya   amplikon   yang   dihasilkan   karena   rendahnya   interaksi   primer dengan cetakan oleh struktur cross dimer yang terbentuk. Namun, bila kepentingan pada persyaratan faktor selisih suhu T m antarprimer kecil (1,59 o C), dan persyaratan persentase GC primer forward yang lebih tinggi (dari 35,71 menjadi 40%) (Tabel 1), maka prioritas urutan pasangan primer yang disarankan adalah F2.1 – R2. Berturut-turut sekuensnya adalah 5’ AACTTTGTGCTTGAG 3’ (panjang 15 basa) dan 5’ TCCTTTGACTCCTTC 3’ (panjang 15 basa), disertai dengan konsekuensi terbentuknya satu macam cross dimer (Gambar 2a).
Kini   dapat   difahami   bahwa   dengan   penambahan   atau   pengurangan   satu   basa mungkin memberikan arti penting dalam proses perancangan primer. Hal ini terjadi pada kandidat primer forward (F2.1) yang hanya dengan penambahan satu basa guanin telah menyebabkan struktur cross dimer dengan pasangan primer reverse -nya.
Penelitian   ini   masih   pada   tingkatan   perancangan   primer   saja,   dan   belum   pada tingkat   selanjutnya,   yaitu   penggunaan   primer   dalam   amplifikasi   fragmen   gen sukrosa sintase tanaman yang berkaitan dengan isolasi gen dan kloning.
Pemanfaatan   piranti   lunak   yang   lebih   komprehensif   lebih   disarankan   untuk menghasilkan   primer   yang   baik.   Primer   Premier   5   dari   Premier   Biosoft   International adalah software yang terintegrasi dengan keunggulan utama dalam perancangan primer untuk   amplifikasi   sekuens   dari multiple   species ,   perancangan   primer   untuk highly
conserved   regions pada   proses   deteksi   patogen,   dan   perancangan   primer   untuk amplifikasi khusus suatu sekuens tunggal ( allele specific primers ).

## Kesimpulan
Perancangan   primer   pada   penelitian   ini   menghasilkan   sepasang   primer   untuk amplifikasi   fragmen   gen sukrosa   sintase (dengan   amplikon  1462   bp)   berupa   5’ AACTTTgTgCTTgA   3’   (dengan   panjang   14   basa)   sebagai   primer forward dan   5’ TCCTTTgACTCCTTC 3’ (dengan panjang 15 basa) sebagai primer reverse .

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Pusat Studi Keragaman Mikrob ( Research Center for Microbial Diversity , RCMD), Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut   Pertanian   Bogor   dan   Lembaga   Penelitian   Universitas   Pattimura   Ambon   atas dukungan dana bagi penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Breslauer, K.J., Frank, R., Blocker, H., Markey, L.A. 1986. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 3746-3750.
Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S. 1995.  PCR Primer, a Laboratory Manual.   Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Freier, S.M., Kierzek, R., Jaeger, J.A., Sugimoto, N., Caruthers, M.H., Neilson, T., and Turner,   D.H.   1986.   Improved   free-energy   parameters   for   predictions   of   RNA duplex stability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9373-9377.
Gordon,  A.J.,  Minchin,  F.R.,  James,  C.L.,  and  Komina,   O.  1999.  Sucrose  synthase  in legume nodules is essential for nitrogen fixation. Plant Physiol.,120, 867-878.
Higgins, D.G., Thompson, J.D., and Gibson, T.J. 1994. Clustal W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Res., 22, 4673- 4680.
Pearson, W.R. 1990. Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP dan FASTA. Methods Enzymology, 183, 63-98.
Rychlik,   W.   1995.   Selection   of   primers   for   polymerase   chain   reaction.   Molecular Biotechnology, 3, 129-134.
Thummler,  F.,   Verma,   D.P.S.   1987.  Nodulin-100  of   soybean  is   the   subunit   of   sucrose synthase regulated by the availability of free heme in nodules. J. of Biological Chem., 262(30), 14730-14736.